BRPI0616535A2 - uso de fator de tecido (tf) lipidado ou um fragmento funcional do mesmo, produto, uso de um produto, complexo (tf::fxa), uso de um complexo, complexo tf::ncis, complexo tf::fxa:ncis, composição farmacêutica e uso de tf não-lipidado ou um fragmento funcional do mesmo - Google Patents

Abstract

USO DE FATOR DE TECIDO (TF) LIPIDADO OU UM FRAGMENTO FUNCIONAL DO MESMO, PRODUTO, USO DE UM PRODUTO, COMPLEXO (TF::FXa), USO DE UM COMPLEXO, COMPLEXO TF::NCIS, COMPLEXO TF::FXa:NCIS, COMPOSIçAO FARMACêUTICA E USO DE TF NãO-LIPIDADO OU UM FRAGMENTO FUNCIONAL DO MESMO. Agentes estimuladores do fator de coagulação X (FXa) ativado podem ser utilizados no tratamento de hemorragias em um indivíduo. Sào descritos compostos e combinações que são particularmente úteis para o tratamento tópico de hemorragias em indivíduos saudáveis ou nos pacientes com diatese hemorrágica.

Description

USO DE FATOR DE TECIDO (TF) LIPIDADO OU UMFRAGMENTO FUNCIONAL DO MESMO, PRODUTO, USO DE UM PRODUTO,COMPLEXO (TF: : FXa) , USO DE UM COMPLEXO, COMPLEXO TF::NCIS,COMPLEXO TF: : FXarNCIS, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA E USO DE TFNÃO-LIPIDADO OU UM FRAGMENTO FUNCIONAL DO MESMO

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se ao tratamento tópicode hemorragias em um indivíduo por meio da utilização deestimuladores de FXa. A presente invenção é baseada nadescoberta que o Fator de Tecido (TF) lipidizado exerce umnovo papel regulador que estimula todas as atividadesproteolíticas (atividade de protrombina amidolítica ehidrolítica) de ambas as formas de FXa, solúveis e ligadas aocomplexo de protrombinase.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

1. Fisiologia da Coagulação

A hemostasia é o mecanismo por meio do qual osseres vivos respondem a uma hemorragia, e envolve aparticipação de dois processos que se tornam funcionaisimediatamente depois de uma lesão e permanecem ativos duranteum longo período de tempo. O primeiro deles é conhecido comohemostasia primária e é caracterizado pela ocorrência devasoconstrição no local da lesão vascular e formação deagregados de plaquetas. 0 segundo é conhecido como hemostasiasecundária, sendo a fase em que o coágulo de fibrina éformado devido à ação das enzimas proteolíticas em cascata decoagulação diferente.

Os agregados de plaquetas desempenham um papelchave na hemostasia nos capilares, sendo particularmenterelevantes em hemorragias mucocutâneas. Por outro lado, aformação de coágulo de fibrina é muito mais importante nahemostasia de grandes vasos, sendo mais relevante emhemorragias internas (gastrintestinais, cerebrais, etc.). Asseguintes fases podem ser distintas durante a formação doagregado de plaquetas: (i) aderência de plaquetas àsuperfície do sub-endotélio exposta pela lesão; (ii)liberação do conteúdo granular das plaquetas como umaresposta ã sua ativação; (iii) agregação plaquetária com oseqüestro e a concentração subseqüentes de mais plaquetas nolocal da lesão; e (iv) ligação do fibrinogênio, bem como deoutras proteínas de coagulação, à superfície das plaquetaspara produzir a trombina e formar o coágulo de fibrina queirá permitir que as placas se tornem fundidas e consolidadas,estabilizando desse modo o coágulo hemostático. Além disso, ébem sabido que a contagem de plaquetas é essencial para aformação de coágulo de fibrina; contagens de plaquetas abaixode 20.000 por μΐ são acompanhadas com episódios desangramento graves.

Diversos co-fatores e enzimas proteolíticasparticipam da segunda fase do processo de coagulaçãosangüínea, os denominados fatores de coagulação, e consisteem diversas fases que terminam com a formação de fibrina apartir da hidrólise de fibrinogênio devido à ação datrombina. Além disso, a produção de trombina intensifica oagregado de plaquetas, aumentando a ativação e a agregação demais plaquetas. A trombina é formada previamente pelahidrólise proteolítica de um apoenzima, a protrombina. Essaproteólise é realizada pela protease de serina do FXa, a qualse liga à superfície das plaquetas ativadas e somente napresença de seu co-fator, o fator de coagulação ativado V(FVa) e aos íons de cálcio; essa protease de serina podehidrolisar a protrombina. 0 FXa pode ocorrer por meio de duasvias separadas, pela via intrínseca e pela via extrínseca.

A via intrínseca consiste em uma série de reaçõesque envolvem principalmente o fator de coagulação VIII(FVIII) , o fator de coagulação IX (FIX) e o fator decoagulação XI (FXI), em que cada pró-enzima é hidrolisada,resultando em sua forma de protease ativa (FVIIIa, FIXa eFXIa). Em cada etapa, a enzima proteolítica recém formada irácatalisar a ativação da pró-enzima seguinte para resultarsucessivamente na forma ativa. A ativação de fatores decoagulação diferentes envolvidos na via intrínseca ocorre,portanto, na maneira de uma cascata, uma deficiência dequalquer uma das proteínas da via intrínseca obstrui aativação da etapa seguinte, impedindo a formação de coágulo eaumentando a tendência hemorrágica. As deficiências defatores de coagulação diferentes, por exemplo, FVIII, FIX ouFXI, causam síndromes hemorrágicas graves, tais comohemofilia A, B e C, respectivamente.

Na via de coagulação sangüínea extrínseca, o TFexposto às células adventícias no local da lesão, se liga aofator de coagulação circulante Vil/fator de coagulaçãoativado (FVII/FVIIa) para formar o complexo de TF::FVIIa e,na presença de cálcio, age como um substrato para a ativaçãode FX. A via extrínseca é considerado atualmente a via maisrelevante na coagulação sangüínea e é aceito que, naeventualidade de uma hemorragia produzida por uma lesãovascular, a coagulação seja provocada devido à ativação davia extrínseca que envolve a interação do TF com seu ligando,FVII/FVIIa.

Um outro papel atribuído ao complexo de TF::FVIIana coagulação é de agir como um substrato de modo que aativação de FX ocorra devido ao FVIIa. Em conseqüência disto,aumentam os níveis basais de FXa (< 150 pM), os quais sãoinicialmente insuficientes para gerar a formação de coágulode fibrina. Isto aumenta em concentrações basais de FXa napresença de seu co-fator, Fva, e de uma superfície pró-coagulante celular, e poderia produzir a trombina requeridapara a formação de coágulo de fibrina. Atualmente é aceitoque, uma vez que as plaquetas são ativadas, elas desempenhamum papel chave na coagulação sangüínea. Elas formam asuperfície pró-coagulante rica em fosfolipídios aniônicos e,por outro lado, expõem os fatores FVa e FXa armazenadosdentro das mesmas. Tudo isto permite a união correta dosdiferentes agentes envolvidos na coagulação na superfície desuas membranas plasmáticas que formam o complexo deprotrombinase bem conhecido (que inclui FXa, FVa, protrombinae uma superfície de fosfolipídio de plaquetas pró-coagulantesaniônica).

A teoria de ativação da via extrínseca podeexplicar como a coagulação começa através do papel que foiatribuído ao complexo de TF::FVIIa. Um exemplo que ilustra arelevância biológica do complexo de TF::FVIIa no processo decoagulação sangüínea é a Síndrome de Coagulação IntravascularDisseminada (DIC). Esta condição clínica é associada com aliberação intravascular do TF e pode ocorrer no curso decondições clínicas graves (choque, septicemia, paradacardíaca, traumatismo de grande porte, doença hepática,cirurgia de grande porte, queimaduras, etc.).

Evidentemente, em um contexto em que o FVIIa nãoestá presente, tal como ocorre em uma deficiência congênitadesse fator, a coagulação hipoteticamente nunca.irá ocorrer,uma vez que o FX não será ativado em níveis suficientes e,conseqüentemente, as manifestações hemorrágicas podem serfatais. Modelos murinos confirmam essa teoria e a deficiênciade FVII é incompatível com a vida, sendo acompanhada porhemorragias fatais graves. No entanto, as deficiências deFVII congênitas descritas em seres humanos até o presente nemsempre são acompanhadas por hemorragias. Casos de deficiênciade FVII completa sem nenhum sintoma clínico e que ocorrem emindivíduos saudáveis sem nenhuma complicação hemorrágicaforam relatados. Tudo isto sugere que outros mecanismos decoagulação provocados independentemente do FVII devem existirem seres humanos.

O TF é uma glicoproteina integral da membrana quepertence à superfamília dos receptores de citocina da classeII que se ligam especificamente a FVII/FVIIa e desempenham umpapel relevante no via extrinseco de coagulação sangüínea. Ospapéis fisiológicos atribuídos ao TF são bem conhecidos; porum lado, é um receptor específico para FVIIa e, uma vez que ocomplexo de TF:: FVIIa tenha sido formado, ele age como umsubstrato de modo que a ativação de FX ocorra. De fato, apósuma lesão vascular, o TF, que é normalmente seqüestrado nasuperfície das células adventícias que circundam externamenteos vasos sangüíneos, entra em contato e interage com o seuligando, FVII, presente no sangue, para formar o complexo deTF:: FVII. Uma vez que esse complexo é formado, a auto-ativação de FVII ocorre, resultando em sua forma ativa,FVIIa. Há atualmente informações extensivas sobre a estruturado complexo de TF:: FVII. Os locais de ligação dê FVIIprincipais que participam da interação com TF ficam situadosno primeiro domínio similar àquele do fator de crescimentoepidermal (EGF) e no domínio da protease. Por outro lado,também foi relatado que outros locais de ligação menosrelevantes participam (domínio rico em 4-carbóxi glutamato(domínio de Gla) e o segundo domínio de EGF) . Os locais deligação presentes no TF ficam situados nos dois domínios defibronectina do tipo III e na região intermediária entreambos os domínios.

Estudos recentes permitiram a identificação do fatoque resíduos da Lisina 165 e da Lisina 166 do TF interagemcom o domínio de Gla de FX, nas formas ativada e não ativada.No entanto, em contraste com o que ocorre com as informaçõesque se referem ao complexo de TF:: FVIIa, pouco se sabe sobrea interação do TF com FX e FXa. Primeiramente, os dadossugerem que os resíduos de Lys (165 e 166) agem como umsubstrato para a ativação de FX. Por outro lado, foi descritorecentemente que o TF pode agir como co-fator de FXa para aativação de FVII. Isto é, a ligação de FVII ao TF estimula aauto-ativação de FVIIa e a ativação de FX. Em seguida, olimite de FXa para TF estimula a ativação de FVII que, porsua vez, aumenta a ativação de FX e conseqüentemente ahidrólise da protrombina e a formação de coágulo de fibrina.

Os autores da presente invenção descobriram que opapel postulado do TF como o co-fator para FXa é muito maisrelevante, tornando-se essencial para a hemostasia. Adespeito do papel aceito do TF como o receptor da membranapara FVII, os autores da presente invenção mostraram que o TFtambém é um estimulador potente de FXa. 0 TF age comoestimulador de FXa produzindo uma intensificaçãosignificativa em sua atividade proteolitica. Os"estimuladores de FXa", tal como utilizado nesta descrição,fazem referência a todas as formas dê FXa, tais como o FXasolúvel e o FXa ligado ao complexo de protrombinase.

É bem sabido que o FXa em concentrações picomolaresé incapaz de produzir qualquer efeito na coagulação, atémesmo na presença de seu co-fator bem conhecido, o FVa (videa Tabela 9) . Portanto, sob essas condições, o complexo deprotrombinase não é ativo. Surpreendentemente, na presença deTF (isto é, lesões ou administração exógena) , o FXa emconcentrações picomolares (isto é, concentrações basaisfisiológicas ou administradas exogenamente) causa a hidrólisede protrombina, conduzindo à formação de coágulo de fibrina,até mesmo na ausência de FVII/FVIIa (Tabela 7) .

No presente pedido de patente, os presentes autoresdescrevem que a interação de TF:: FXa é um novo mecanismo decoagulação acionado independentemente dos complexos deTF::FVIIa e da via de coagulação extrínseca.Finalmente, é bem sabido que há determinadasdoenças plaquetárias que ocorrem com distúrbios na agregaçãoplaquetária e com uma tendência maior de episódioshemorrágicos, dentre os quais se sobressaem o mal deGlanzmann e a síndrome de Bernard-Soulier, nas quais osdefeitos congênitos que afetam o receptor de fibrinogênio ouo receptor de Gplb, respectivamente, foram descritos. Poroutro lado, episódios hemorrágicos graves estão presentes emdistúrbios trombocitopênicos congênitos e adquiridos quando acontagem de plaquetas diminui abaixo de 20.000 por μl.

No presente pedido de patente, os autores dapresente invenção demonstraram que o TF lipidizado também éeficaz no tratamento de hemorragias presentes em doençasplaquetárias congênitas, adquiridas e em distúrbiostrombocitopênicos graves (abaixo de 9.000 por μl).

2. Patologia da Coagulação

As deficiências congênitas de cada fator decoagulação podem ser associadas com a ocorrência dehemorragias e geralmente envolvem uma única proteína; dessemodo, por exemplo, a hemofilia A é uma doença hemorrágicahereditária que afeta o FVIII. As doenças de coagulaçãoadquiridas ocorrem em indivíduos sem nenhum histórico préviode sangramento e podem ter múltiplas origens; para fins deilustração, a presença de inibidores específicos para osfatores de coagulação pode ocorrer nos indivíduos que foramsubmetidos a muitas transfusões. Embora as deficiências dofator de coagulação adquiridas sejam uma entidade etiológicadesconhecida que também causa problemas hemostáticos graves,elas também constituem um dos problemas mais importantes emtransfusões múltiplas às quais os pacientes com coagulopatiascongênitas são submetidos. Outra fonte importante dedistúrbios de coagulação adquiridos são as terapias comanticoagulantes, tais como as drogas heparina e varfarina.Uma porcentagem significativa (5-10%) dos pacientes tratadoscom as drogas anticoagulantes apresenta episódios desangramento, os quais são em sua maioria difíceis decontrolar.

Conforme mencionado previamente, os distúrbiosplaquetários congênitos e adquiridos também podem serassociados com as hemorragias. As diminuições na contagem deplaquetas (abaixo de 20.000 por μΐ) podem causar alteraçõesdo coágulo de fibrina normalmente acompanhadas por episódiosde sangramento graves.

O arsenal terapêutico atualmente disponível parauma hemorragia leve/moderada ou grave/fatal (por cirurgia outrauma externo) é muito limitado. Há agentes hemostáticosdiferentes que podem acelerar a coagulação sangüínea eimpedir as hemorragias, por exemplo, (1) os produtosderivados de sangue humano, tais como os concentrados dofator de coagulação e os agentes hemostáticos locais, taiscomo o colágeno fibrilar, a cola de fibrina e concentrados docomplexo de protrombina; (2) as proteínas recombinanteshumanas; (3) as drogas antifibrinolíticas, tais comõ o ácidoaminocapróico, e o ácido tranexâmico; e (4) os agenteshemostáticos locais inorgânicos, tais como as superfícies desílica e de caulim.

As seguintes limitações críticas foram relatadas:(1) Administração intravenosa

(2) Requisito de dispositivo especial para administração

(3) Foco terapêutico estreito

(4) Tratamento impróprio ou incômodo administrado emepisódios de sangramento específicos

(5) Ausência de efeito agudo

(6) Instabilidade do coágulo de fibrina

(7) Efeitos colaterais muito perigosos

(8) Tratamento caroProdutos derivados de sangue humano (fator de coagulação econcentrados de plaquetas)

Trata-se de um tratamento muito caro e de poucadisponibilidade que deve sempre ser administradointravenosamente. Eles têm um foco terapêutico muitoestreito, e só são úteis para o tratamento da sua deficiênciaespecifica. Eles são impróprios para o tratamento tópico dequalquer tipo de episódio de sangramento. Eles não são úteispara o tratamento de uma hemorragia aguda porque isto requerlongos protocolos de administração para que seja eficaz e é,sobretudo, um tratamento muito perigoso: 20% dos pacienteshemofílicos desenvolveram a hepatite, 5% desenvolveram o HIVe até 15% apresentaram anticorpos plasmáticos contra FVIII ouFIX (hemofilia adquirida), o que requer tratamentossubstitutivos especiais e muito caros (imunossupressores,doses elevadas dos fatores de coagulação, plasmaferese,etc.). Por essas razões, as organizações de saúde pública(WHO, FDA, EMEA, etc.) estão muito interessadas nodesenvolvimento de novos agentes hemostáticos melhores do queos concentrados do fator de coagulação.

Agentes hemostáticos locais

Trata-se de um tratamento caro impróprio para seradministrado em alguns episódios de sangramento (isto é,epistaxe), incômodos para o tratamento dental, forma umcoágulo de fibrina instável e, assim como os concentrados dofator de coagulação, eles têm os mesmos efeitos colateraisperigosos potenciais. Eles não devem ser utilizados nospacientes que nunca receberam produtos derivados de sanguehumano ou naqueles que estão recebendo o tratamento com FVIIIrecombinante ou FIX por causa dos riscos potenciais datransmissão viral humana.

Proteínas Recombinantes Humanas

Trata-se do tratamento mais caro (custo médio de €6.0.00) somente disponível para os países desenvolvidos. Assimcomo os concentrados do fator de coagulação, elas devem sersempre administradas intravenosamente, têm um focoterapêutico muito estreito porque só são úteis para otratamento da sua deficiência específica, são impróprias parao tratamento tópico de hemorragias, não são úteis para otratamento de uma hemorragia aguda porque também requeremlongos protocolos de administração para que sejam eficazes e,embora nenhuma transmissão viral humana tenha sido relatada,a mesma porcentagem de hemofilia adquirida foi descrita (até15% de anticorpos presentes anti-FVIII ou FIX) . Assim como osconcentrados do fator de coagulação, as autoridades públicaslimitam bastante o seu uso.

Drogas Antifibrinolíticas

Elas têm um foco terapêutico estreito, sendo estasua restrição mais relevante. Essas drogas requerem aformação de coágulo de fibrina precedente para seremeficazes. Portanto, elas só são úteis em indivíduossaudáveis, no entanto, quando o coágulo de fibrina é formadoimpropriamente (isto é, coagulopatias congênitas, tais como ahemofilia, a deficiência de FVII) a sua eficácia terapêuticadiminui drasticamente. Além disso, elas não são úteis para otratamento de uma hemorragia aguda porque também requeremlongos protocolos de administração para que sejam eficazes.

Agentes hemostáticos locais inorgânicos

A restrição mais importante para a utilizaçãodesses agentes hemostáticos é que eles são impróprios paraserem administrados em muitos tipos de hemorragias, tais comoa epistaxe dental e cirúrgica. Além disso, uma reaçãoexotérmica dolorosa tem sido relatada, reduzindosignificativamente o seu uso somente para o sangramentomucocutâneo em situações críticas (guerras).

Resumidamente, surpreendentemente não há atualmentenenhuma droga disponível que seja útil para o tratamentotópico de um episódio simples de epistaxe ou de umsangramento gengival e dental após a escovação dos dentes ousimplesmente devido a um ferimento rotineiro causado ao fazera barba, devido à veia puncionada em um exame de sangue oudevido ao ferimento por uma queda acidental na rua. Oproblema é adicionalmente agravado no caso de pacientes comdiátese hemorrágica, por exemplo, com coagulopatiascongênitas do tipo da hemofilia ou do mal de von Willebrandou pacientes com distúrbios plaquetários congênitos, do tipodo mal de Glanzmann ou da síndrome de Bernard-Soulier, oucoagulopatias adquiridas. Esses pacientes têm problemassérios com a rotina diária e, em uma extração dental simplesou em qualquer trauma menor que cause um ferimento quesangra, não dispõem de nenhum tratamento médico disponívelpara melhorar a sua qualidade de vida. O problema torna-seobviamente maior quando esses pacientes sofrem um traumaexterno ou um acidente com sangramento grave, uma vez que asua vida está em sério risco. Em todas essas situações, aúnica ferramenta farmacológica disponível é a administraçãode plasma humano que contém os fatores deficientes ou o fatorrecombinante humano específico para cada fator de coagulação.

Todas essas terapias implicam a utilização da via parenterale, não se destinam, portanto, a serem utilizadas com grandefreqüência, tal como seria o caso, por exemplo, em algumsangramento leve ou moderado do dia-a-dia. Finalmente, éextensamente aceito que os novos agentes hemostáticos locaissem as limitações descritas previamente irão representar umamelhoria significativa em relação ao tratamento atual, queirá reduzir o custo e a prevalência elevada de efeitoscolaterais.

3. Antecedentes da Invenção

Até o presente, é aceito que o TF seja o elementoprincipal responsável por provocar a coagulação sangüínea.

Para que a coagulação seja iniciada, é absolutamentenecessária a ativação do FX para FXa para começar a hidrólisede protrombina. A fonte deste FXa foi atribuídaprincipalmente à interação de FVIIa com seu receptor, TF.

Embora esteja descrito que o FXa está presente em grânulos deplaquetas e que pode ser exposto na superfície quando ocorrea sua ativação, as concentrações fisiológicas de FXa (< 150pM) presentes no sangue são insuficientes para iniciar aformação de trombina, até mesmo na presença de seu co-fator,Fva, e de uma superfície pró-coagulante de plaquetas (Figura1). Portanto, atualmente é aceito que a coagulação só podecomeçar quando as concentrações basais de FXa aumentamsignificativamente. A fonte do aumento das concentraçõesbasais de FXa foi atribuída sempre a ambos o complexo deTF::FVIIa e as atividades proteolíticas de FIXa (Figura 2).

As proteínas recombinantes do TF lipidizado podemser aceleradas somente em condições in vitro, a coagulação emamostras de sangue saudáveis e hemofílicas, em que essa açãoé atribuída ao papel clássico atribuído ao TF como o receptorde FVIIa. No entanto, nas mesmas condições experimentais, oTF não-lipidizado demonstrou uma total ausência de efeito, oque indica que a lipidização é necessária para obter afuncionalidade do TF (seção 6.1 dos resultados).

A utilização do TF lipidizado como um agentehemostático tópico nunca foi descrita como um tratamentoúnico para sangramentos leves, graves e letais (hemorragiasarteriais e venosas traumáticas ou cirúrgicas).

A patente européia EP 266993 descreve a utilizaçãode TF não-lipidizado como um agente hemostático para otratamento parenteral de síndromes hemorrágicas. No entanto,a mesma patente descreve as diferenças importantes naatividade entre o TF não-lipidizado reivindicado pela patenteEP 266993 e o TF lipidizado, objeto do presente pedido depatente.

De fato, é bem sabido que o TF lipidizado é ativoem condições in vitro e a sua administração parenteral iniciaimediatamente a coagulação intravascular disseminada comconseqüências fatais. Por outro lado, o TF não-lipidizado nãoé ativo em condições in vitro, no entanto, ele foireivindicado (patente EP 266993) para o tratamento decoagulopatias pela administração parenteral.

Até o presente, não há dados sobre o efeito deambos, o TF lipidizado e o TF não-lipidizado, para otratamento único tópico de episódios de sangramento. Nopresente pedido de patente, que utiliza o modelo detransecção da cauda de rato, os autores da presente invençãodemonstraram que o TF não-lipidizado era incapaz de parar umsangramento. Por outro lado, os autores da presente invençãomostraram, pela primeira vez, que o TF lipidizado é um agentehemostático útil para o tratamento tópico de qualquer tipo dehemorragias, inclusive em condições patológicas (animaistratados com heparina e varfarina) e em condições saudáveis(ratos do controle sem alteração de coagulação) . De maneirageral, indica que o TF lipidizado e o TF não-lipidizado sãoclaramente compostos diferentes. Conseqüentemente, autilização do TF lipidizado como um agente para o tratamentoúnico tópico das hemorragias não é óbvio para um elementoversado na técnica.

Por outro lado, a patente EP 266993 foi praticadade acordo com o estado da técnica que postula que o FVII deprotease de serina é ativado somente quando ligado ao seureceptor, TF. Portanto, de acordo com a patente EP 266993 e oestado da técnica, quando o FVII/FVIIa não está presente, oTF não deve ser ativo. Não era óbvio ao elemento versado natécnica considerar que o TF (lipidizado ou não) poderia sereficaz no tratamento de pacientes com deficiência de FVII. Osautores da presente invenção descobriram que até mesmo naausência do ErVIIa o TF age como um co-fator para FXa. Essadescoberta é fundamental para compreender que o TF não-lipidizado também pode agir como agente hemostáticoparenteral para a hemorragia em pacientes com deficiência deFVII.

O pedido de patente internacional WO 94/02172mostra que a inibição temporária de um ou maisanticoagulantes naturais pela administração sistêmica de uminibidor de um anticoagulante natural (um anticorpo) podeinibir o sangramento microvascular. Opcionalmente, o inibidorpode ser administrado em combinação com uma administraçãotópica de trombina ou TF lipidizado. É importante ressaltarque a utilização de ambos os compostos foi sempre feita comotratamentos adjuvantes opcionais e nunca como um tratamentoúnico. Além disso, o pedido de patente WO 94/02172 reivindicaa utilização desses tratamentos sinergísticos somente para osangramento capilar (sangramento microvascular, isto é,queimaduras, superfícies viscerais inflamadas, sangramento desuperfícies do fígado...) e nunca para as hemorragias graves ouletais causadas por cirurgia ou por trauma externo, as quaisenvolvem ferimento arterial e venoso. No entanto, os autoresdo pedido de patente WO 94/02172 admitem que, embora sejaobservado um efeito sinergístico por meio da administraçãotópica de trombina em combinação com o tratamento sistêmico,nenhum de tal efeito sinergístico foi observado aoadministrar topicamente TF (pedido de patente WO 94/02172,Figura 3 e página 22, linhas 14-15) . Além disso, a dosereivindicada no pedido de patente WO 94/02172 tem faixasmuito elevadas, de 0,1 a 10 mg.

Contrariamente ao pedido de patente WO 94/02172, opresente pedido de patente está reivindicando um tratamentoúnico para a hemorragia arterial ou venosa leve/moderada agrave/fatal com TF lipidizado sozinho, mostrando exemplos nosquais tal tratamento é eficaz em uma dose de proteína ativade 1,2 yg/ml para hemorragias traumáticas (vide o modelograve nas Tabelas 24 e 25) . Tal tratamento surpreendente eextraordinariamente eficaz não foi descrito até o presente,porque não era óbvio para nenhum elemento versado na técnicaque o TF lipidizado age como um estimulador da atividadeproteolítica de FXa. Os autores da presente invençãodescobriram que, na ausência de FVIIa, o TF age como um co-fator para FXa, até mesmo na ausência de seu co-fator bemconhecido, FVa. Essa descoberta é fundamental para secompreender que o TF lipidizado sozinho pode agir como umagente hemostático para a hemorragia grave em condiçõessaudáveis e patológicas.

A Patente U.S. N° . 4.721.618 mostra que a misturade fosfolipídios sinergística administrada intravenosamente(PCPS) e FXa êm concentrações elevadas (0,2 a 0,5 U/Kg) podedesviar a Deficiência do Fator VIII:C em um mamíferohemofílico, de modo que o processo de coagulação sangüínea emcascata possa continuar. As concentrações elevadas de FXasugeridas são ativas sem a necessidade das vesículas dolipídio de PCPS (que podem intensificar esta atividade) .Além disso, o pedido de patente WO 02/086118 mostra que ascomposições que incluem uma mistura de pelo menos umfosfolipídio específico e pelo menos um fator de coagulaçãosangüínea ativado pela protease serina são úteis para otratamento de distúrbios de coagulação sangüínea, diminuindoa necessidade dos fatores de coagulação sangüíneaadministrados.

Além disso, o ácido elágico e outros aceleradorestais como zeólito, sílica e materiais de óxidos inorgânicosforam utilizados para intensificar a coagulação sangüínea esão reivindicados no pedido de patente WO 02/30479.

De acordo com o pedido de patente WO 02/086118, umfator de coagulação é definido como um fator de coagulaçãosangüínea ativado pela protease de serina (página 5, linhas13-15). Portanto, o TF pode não ser considerado como um fatorde coagulação sangüínea, uma vez que o TF não é uma proteasede serina, mas um receptor específico da superfície celularpara o fator Vila.

No presente pedido de patente, os autores dapresente invenção demonstraram que os fosfolipídios(fosfatidilserina e fosfatidilcolina em porcentagens e emmolaridades diferentes) não aumentam o efeito pró-coagulantemediado pelo TF lipidizado (Tabela 21), indicando que oefeito sinergístico reivindicado no Pedido de Patente U.S.N°. 4.721.618 e no pedido de patente WO 02/086118 é exclusivopara os fatores de coagulação sangüínea ativados pelaprotease de serina, mas não para os receptores da membranatais como o TF. Surpreendentemente, quando o TF lipidizadofoi combinado simultaneamente com as superfícies inorgânicasnegativamente carregadas (NCIS), um efeito sinergísticosignificativo foi observado em condições experimentais invitro e in vivo. As NCIS utilizadas nesta descrição sãoconstituídas por uma mistura de lipídios e por um aceleradorde coagulação sangüínea, o ácido elágico. Os lipídios têmcarga negativa líquida, o que significa que a misturalipídica pode incluir lipídios neutros ou dipolares, mas deveconter uma determinada quantidade de lipídios negativamentecarregados que confira um caráter aniônico à mistura. Como umexemplo ilustrativo e não limitador, os lipídiosnegativamente carregados podem ser esfingolipídios (tais comoceramida-1-fosfatos, fosfatidiletanolamina glicosilada,sulfatídeos hidroxilados ou não-hidroxilados, gangliosídeos)e os lipídios com base em glicerol (tais como afosfatidilserina, o fosfatidilinositol, os fosfatos defosfatidilinositol, os ácidos fosfatídicos, os

fosfatidilgliceróis, as cardiolipinas). Há NCIS

comercialmente disponíveis, tais como da marca registradaDade® Actin® (Dade Behring), por exemplo, Dade® Actin® FS.

Resumidamente, o presente pedido de patentedescreve um novo agente hemostático local caracterizado pelasseguintes vantagens com respeito às drogas comercialmentedisponíveis:

(1) Administração tópica fácil

(2) Nenhum requisito de dispositivo especial para a suaadministração tópica

(3) Foco terapêutico amplo (déficits de FV, FVII, FVIII,FIX, FX, FXI, FXII e FXIII)

(4) Tratamento apropriado a ser administrado em qualquertipo de episódio de sangramento (epistaxe, sangramentodental, hemorragias mucocutâneas, traumáticas e cirúrgicas)

(5) Exerce um efeito agudo potente

(6) Formação de coágulo de fibrina fisiológica (estabilidadeextrema do coágulo)

(7) Sem efeitos colaterais

(8) Tratamento de baixo custo

0 objetivo principal da WHO, FDA, EMEA e outrasautoridades de saúde pública é a redução dos efeitoscolaterais perigosos associados ao consumo de produtosderivados de sangue humano. A presente invenção foi elaboradapara cobrir essas necessidades ainda não satisfeitas.

DESCRIÇÃO RESUMIDA DA INVENÇÃO

0 papel atribuído ao complexo de TF::FVIIa nacoagulação é extensamente conhecido. 0 complexo de TF::FVIIaage como um substrato de modo que a ativação de FX ocorra.Estudos recentes permitiram identificar que os resíduos daLisina 165 e da Lisina 166 do TF interagem com o domínio deGla de FX, nas formas ativada e não-ativada. Contrariamenteao complexo de TF::FVIIa, pouco é conhecido sobre a interaçãodo TF com FX e FXa. Somente foi descrito que o TF pode agircomo um estimulador de FXa para a ativação de FVII. Isto é, aligação de FXa ao TF deve estimular a ativação de FVII que,por sua vez, aumenta a ativação de FX.

Os autores da presente invenção descobriram que opapel do TF como um estimulador de FXa é muito maisrelevante, tornando-se essencial para a hemostasia (Figura3) . É bem sabido que FXa em concentrações picomolares éincapaz de produzir qualquer efeito na coagulação e naagregação plaquetária. A despeito do papel aceito do TF comoo receptor da membrana para FVII, os autores da presenteinvenção mostraram que o TF também age como um estimulador deFXa para intensificar a sua atividade proteolitica principal,a hidrólise de protrombina, conduzindo à formação de coágulode fibrina.

Surpreendentemente, na presença de TF (isto é,lesões ou administração exógena), o Fxa, em concentraçõespicomolares, causa a hidrólise de protrombina, conduzindo àformação de coágulo de fibrina, até mesmo na ausência de seuligando, FVII/FVIIa. Os resultados gerais indicam que o TFage como um estimulador de FXa e a ligação específica de FXaao TF é a primeira etapa que aciona a coagulação sangüínea.

Os dados dos autores da presente invenção sugeremque a rapidez com que a coagulação ocorre é dependente dainteração entre o TF e em todas as formas previamentedescritas de FXa.

Na presença de Fxa, em concentrações fisiológicas(< 150 pM) incapazes de iniciar a coagulação por si, o TFlipidizado pode iniciar rapidamente a formação de trombinacomo resultado de sua ação como um co-fator.

Esses efeitos hemostáticos são surpreendentementeindependentes da presença de FVII e FVIIa, portanto, o efeitopró-coagulante mediado pelo complexo de TF::FXa endógeno (FXa< 150 pM) é particularmente útil e relevante em amostras comdeficiência do fator VII. Não obstante, efeitos hemostáticos5 potentes também foram observados em amostras de pacientes comdefeitos congênitos de outros fatores de coagulação, taiscomo: FVIII (hemofilia A), FIX (hemofilia Β), FXI (hemofiliaC) , FV, FX, FXII e FXIII, bem como em indivíduos comdistúrbios plaquetários congênitos, tais como o mal deGlanzmann e a síndrome de Bernard Soulier e distúrbiostrombocitopênicos.

Portanto, a presente invenção é baseada no uso doTF lipidizado sozinho ou combinado com FXa e/ou com NCIS comoum novo estimulador de FXa útil para o tratamento tópico dashemorragias presentes em indivíduos saudáveis e em pacientescom diatese hemorrágica.

Os resultados obtidos pelos autores da presenteinvenção abrem as portas ã utilização de TF não-lipidizado oude um fragmento funcional do mesmo para o tratamento dahemorragia em um indivíduo com deficiência de FVII. 0 ditotratamento pode ser realizado por meio da utilização deformas de administração farmacêutica apropriadas para aadministração parenteral de TF não-lipidizado.

Portanto, em um aspecto, a invenção refere-se àutilização de TF lipidizado ou de um fragmento funcional domesmo, na preparação de uma droga para o tratamento tópico dahemorragia em um indivíduo.

Em um outro aspecto, a invenção refere-se a umproduto que compreende o TF lipidizado sozinho ou combinadocom FXa e/ou com NCIS. A utilização do dito produto como umadroga ou na preparação de uma droga para o tratamento dahemorragia em um indivíduo constitui um aspecto adicional dapresente invenção.Em um outro aspecto, a invenção refere-se a umcomplexo formado pelo TF lipidizado e um composto selecionadode FXa, NCIS e às combinações de ambos. A utilização do ditocomplexo como uma droga ou na elaboração de uma droga para otratamento da hemorragia em um indivíduo constitui um aspectoadicional da presente invenção.

Em um outro aspecto, a invenção refere-se a umacomposição farmacêutica que compreende o TF lipidizado, emconjunto com um veículo farmaceuticamente aceitável. Em umarealização particular, a dita composição farmacêuticacompreende adicionalmente FXa e/ou NCIS.

Em um outro aspecto, a invenção refere-se a umproduto que compreende a dita composição farmacêutica e umsuporte. Em uma realização particular, a dita composiçãofarmacêutica compreende adicionalmente FXa e/ou NCIS.

Em um outro aspecto, a invenção refere-se àutilização de TF não-lipidizado ou de um fragmento funcionaldo mesmo, para a preparação de uma droga para o tratamento dahemorragia em um indivíduo com deficiência de FVII. Em umadita realização particular, a droga é formulada em uma formade administração farmacêutica apropriada para a, administraçãoparenteral de TF não-lipidizado.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

A Figura 1 é uma representação esquemática quemostra concentrações basais de FXa e a formação de coágulo defibrina.

A Figura 2 é uma representação esquemática quemostra as vias intrínseca e extrínseca clássicas da

coagulação sangüínea.

A Figura 3 é uma representação esquemática quemostra o novo efeito regulador do TF lipidizado comoestimulador de FXa de acordo com a presente invenção.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃOAs descobertas da presente invenção descritasmostram pela primeira vez que o TF lipidizado, na ausência deseu ligando, FVII/FVIIa, age como um estimulador de FXa, oque faz com que essa enzima inicie a hidrólise de protrombinae, conseqüentemente, faz com que a coagulação ocorra. Essenovo mecanismo é particularmente relevante em niveis deconcentração de FXa muito baixos (abaixo daquelesconsiderados fisiológicos de 150 pM). É bem sabido que hádeterminadas doenças plaquetárias que ocorrem com distúrbiosna agregação plaquetária e com uma tendência maior deepisódios hemorrágicos. Conseqüentemente, o TF lipidizadoadministrado exogenamente é não somente útil em coagulopatiascongênitas, mas permite adicionalmente a hemostasia emdistúrbios plaquetários congênitos e adquiridos, tais como omal de Glanzmann, a Síndrome de Bernard-Soulier e osdistúrbios trombocitopênicos.

A rapidez com a qual a coagulação ocorre não é,portanto, dependente da formação do complexo de TF::FVIIa eda ativação subseqüente de FX, como se pensava até opresente, mas depende da interação do TF e do FXa emconcentrações basais fisiológicas (< 150 pM). A conseqüênciabiológica mais relevante da formação dessa interação é ageração rápida do início da coagulação e o fato de que istorequer somente a presença de FXa nas concentraçõesfisiológicas presentes no sangue e a interação com o seuestimulador, TF. 0 processo é amplificado imediatamente emconseqüência da trombina formada inicialmente pelo complexo eem conseqüência da produção maior de FXa, devido ao complexode TF::FVIIa ou devido à própria trombina.

Portanto, as descobertas dos autores da presenteinvenção mostram claramente que, na ausência de FVIIa e napresença de Fxa, em concentrações fisiológicas (< 150 pM)incapazes de iniciar a coagulação por si, o TF lipidizadoinicia rapidamente a formação de trombina em conseqüência desua nova ação como um estimulador de FXa, promovendo o inícioda hidrólise de protrombina. Por outro lado, as descobertasdos autores da presente invenção mostram que o TF lipidizado e o FXa em baixas concentrações (que não são eficazes paraexercer efeitos anti-hemorrágicos por si) quandoadministrados conjuntamente, podem causar rapidamente oinício da formação de coágulo de fibrina. Os efeitosobservados com as combinações de TF::FXa, especificamente comuma concentração de FXa < 150 pM, são muito melhores do queaqueles quando o TF lipidizado detectado é administradosozinho. A combinação de FXa e de TF lipidizado com NCIS podeintensificar o efeito hemostático ainda mais. Os resultadosobtidos sustentam a idéia que, na presença das concentrações basais de FXa presentes no plasma (< 150 pM) , incapazes degerar a resposta pró-coagulante inicial por si, essa respostaocorre quando o TF age como um estimulador de FXa.

Conseqüentemente, o TF lipidizado, sozinho oucombinado com o FXa e/ou a NCIS, pode ser utilizado comonovos agentes hemostáticos tópicos úteis para o tratamento dahemorragia presente em indivíduos saudáveis e nos pacientesque sofrem de diátese hemorrágica.

o TF não-lipidizado ou um fragmento funcional domesmo pode ser utilizado do mesmo modo como um novo agentehemostático útil para o tratamento, de preferência por meiode administração parenteral, da hemorragia presente empacientes com deficiência de FVII.

I. Utilização de TF Lipidizado no Tratamento Tópico das

Hemorragias

Os autores da presente invenção verificaramsurpreendentemente que o TF lipidizado aumenta a atividadeproteolítica de FXa e, conseqüentemente, a produção detrombina [vide a seção 1 dos resultados do exemplo incluídonesta descrição]. Os autores da presente invenção tambémobservaram que o TF lipidizado coagula o plasma e o sangue emindivíduos saudáveis e em pacientes com deficiência do fatorde coagulação, incluindo aqueles que têm deficiências de FV,FVII, FVIII, FIX, FX, FXI, FXII e FXIII, assim como empacientes anticoagulados (por meio de tratamentos comanticoagulante com drogas tais como a heparina, heparinas debaixo peso molecular ou derivados cumarínicos, em que essesexemplos não são limitadores), tanto in vitro [vide, asseções 1 a 5 dos resultados do exemplo incluído nestadescrição] quanto in vivo [vide as seções 6 e 7 dosresultados do exemplo incluído nesta descrição]. Os autoresda presente invenção verificaram adicionalmente que o TFlipidizado coagula o sangue nos pacientes que sofrem dedistúrbios plaquetários [vide a seção 5 dos resultados doexemplo incluído nesta descrição]. Esses resultados mostramclaramente que o TF lipidizado é um agente anti-hemorrágicoútil para o tratamento tópico das hemorragias em umindivíduo.

Levando em consideração o estado da técnica, não éóbvio pensar no TF como um tratamento único tópico pró-coagulante nos indivíduos saudáveis ou nos pacienteshemofílicos (com deficiência de FVIII, FIX e FXI) .

Isso era absolutamente improvável em pacientes comdeficiência de FVII porque o complexo de TF-FVII não podiaser formado; em pacientes com deficiência de FV ou FX porqueo complexo de protrombinase não podia ser unido; e empacientes heparinizados porque a trombina e o FXa sãoobstruídos pela antitrombina III, e em pacientes tratados comvarfarina porque a síntese de todos os fatores de coagulaçãodependentes da vitamina K (FVII, FIX e FX) são eliminados.

Portanto, em um aspecto, o objetivo da invenção é autilização do TF lipidizado ou de um fragmento funcionallipidizado do mesmo na preparação de uma droga para otratamento tópico das hemorragias em um indivíduo.

O TF é uma glicoproteína integral da membrana que édistribuída extensamente no reino animal. A proteína do TFtem uma estrutura de domínio, isto é, é uma proteína comregiões funcionais independentes. Cada um dos domínios daapoproteína do TF humano tem características estruturais efuncionais exclusivas: (1) um peptídeo de sinal ou uma regiãocom uma seqüência de aminoácido líder 32 que é processadapós-translacionalmente quando a proteína é processada daforma imatura para a forma madura; (2) um domínioextracelular hidrofílico N-glicosilado que compreendeaproximadamente 219 aminoácidos terminais; (3) um fragmentode aproximadamente 23 aminoácidos, principalmentehidrofóbicos, os quais se acredita serem os aminoácidos dodomínio da transmembrana; e (4) a extremidade carboxila de 21aminoácidos os quais se acredita serem os aminoácidos queformam a parte do fragmento citoplasmático da proteína. Essaestrutura do domínio da proteína permite a produção, porexemplo, do domínio extracelular da proteína ou de fragmentosfuncionais do mesmo. A seqüência de aminoácido da proteína doTF humano é conhecida e pode ser consultada em bancos dedados de proteína como, por exemplo, NCBI (hTF, Número deacesso: P13726).

0 termo "TF lipidizado", tal como utilizado napresente invenção, refere-se a qualquer fonte de TF, sendoesse TF total ou parcialmente introduzido nas vesículaslipídicas ou nas membranas celulares. Os exemplosilustrativos e não limitadores de fontes de "TF lipidizado"são: o TF lipidizado que contém o extrato (cujo isolamentopode ser obtido a partir de diversos tecidos tais como otecido cerebral, placentário e pulmonar, tecidos dediferentes animais tais como carneiros, vacas, coelhos, cães,seres humanos, etc.); componente proteináceo do TF purificadoe (re)-Iipidizado (purificado a partir de um extrato ou de umTF recombinante), isto é, ao qual o componente de lipídio foiadicionado depois de sua purificação e o qual pode serpreparado, a titulo de exemplo ilustrativo e não limitador,de acordo com o protocolo descrito previamente por Morrisey[vide o exemplo incluído nesta descrição]. No dito protocolo,o TF não-lipidizado é incorporado dentro das vesículas defosfolipídio utilizando um detergente não-iônico, tal como Ν-octil-beta-D-glicopiranosídeo, por exemplo. Os lipídios quepodem ser utilizados no TF lipidizado de acordo com ainvenção podem ter qualquer origem (animal, vegetal ousintética). Virtualmente qualquer lipídio pode ser utilizadona preparação do TF lipidizado da presente invenção. Osexemplos ilustrativos e não limitadores dos lipídios quepodem ser utilizados na preparação do TF lipidizado incluemfosfolipídios (tais como a fosfatidil colina, a fosfatidilserina, a fosfatidil etanol amina, etc.), esfingolipídios(tais como a ceramida, a esfingosina-l-fosfato, a ceramida deinositolfosfato, a ceramida de manosil-inositolfosfato, aceramida de manosil-diinositolfosfato, etc.),fosfatidilinositol (tais como L-a-fosfatidilinositol, L-oí-lisofosfatidilinositol, etc.) e fosfatos defosfatidilinositol (tais como L-α-[fosfatidilinositol-4-fosfato], 1, 2-dioctanol-sn-glicero-3-[fosfatidilinositol-3,4,5-trisfosfato] , etc.). A relação entre o componenteproteináceo do TF:lipídio (molar, em peso ou volumétrica)pode variar dentro de uma ampla faixa, por exemplo, deaproximadamente 1:50.000 a aproximadamente 1:3.000,

O termo TF, tal como utilizado na presenteinvenção, inclui diversas variantes e mutantes do TF de tiposelvagem que mantêm pelo menos uma das funções do TF de tiposelvagem, sendo que, vantajosamente, pelo menos uma dasfunções do TF de tipo selvagem se refere à coagulação.

Em uma realização particular, o TF lipidizadoutilizado na prática da presente invenção é o TF lipidizadohumano e consiste no TF obtido a partir dos extratos detecido; ou o TF consiste no componente proteináceo purificadoa partir de extratos de tecido e introduzido em um componentede lipidio (com uma relação molar entre a proteína:lipídio deaproximadamente 1:8.700; ou o TF consiste em TF recombinante(rTF) obtido por um processo tal como descrito, somente como

um exemplo ilustrativo mas não limitador, na Patente U.S. N°.6.261.803. A obtenção dos extratos e a purificação do TFpodem ser realizadas a partir de diversos tecidos tais como otecido cerebral, placentário e pulmonar e a partir dediferentes animais tais como carneiros, vacas, coelhos, cãese seres humanos.

O termo "fragmento funcional do TF lipidizado", talcomo utilizado nesta descrição, ainda inclui, embora semficar a eles limitado, os derivados de peptídeo do TF,particularmente do componente proteináceo do TF, que incluimutantes e variantes do componente proteináceo do TF de tiposelvagem, que mantêm uma ou mais funções do TF, depreferência que funcionam com respeito à coagulação, porexemplo, a potencialidade de se ligar ao FXa e/ou às NCIS ede desenvolver suas funções de formação de vasos e anti-hemorrágicas durante a cicatrização de ferimentos. Aseqüência de aminoácido do dito fragmento funcional do TFpode ser idêntica àquela de um fragmento do componenteproteináceo do TF de tipo selvagem ou pode ter inserções,apagamentos ou modificações de um ou mais aminoácidos, com acondição que pelo menos uma das funções do TF de tiposelvagem seja preservada, vantajosamente pelo menos umafunção relacionada à coagulação. Por uma questão desimplicidade, o termo "TF lipidizado" tal como utilizado napresente invenção inclui qualquer fragmento funcional do TFlipidizado.

O componente proteináceo do TF utilizado narealização da presente invenção pode adicionalmente fazerparte de uma proteína de fusão. Neste sentido, a ditaproteína de fusão pode conter uma região A, a qual consistena proteína do TF ou em um fragmento funcional da ditaproteína do TF, ligada a uma região B que consiste em umoutro fragmento do TF. A dita região B é ligada à região determinal amino da dita proteína do TF ou do dito fragmento daproteína do TF ou a alternativamente a dita região B pode serligada à região de terminal carboxila da dita proteína do TFou do dito fragmento da proteína do TF. As regiões AeBpodem ser ligadas diretamente ou então ligadas através de umpolipeptídeo do aglutinante entre as ditas regiões A e Β. Aproteína de fusão pode ser obtida pela síntese química ou pormeio da expressão de genes de codificação da seqüência denucleotídeo para a dita proteína de fusão em célulashospedeiras apropriadas.

O termo "tratamento tópico", tal como utilizado napresente invenção, refere-se à aplicação do tratamentodiretamente no local onde se faz necessário, por exemplo, emseções descontínuas da pele (cortes, etc.) e no tecidovascular (vasos rompidos, etc.).

De acordo com a presente invenção e tal comomostrado no exemplo incluído nesta descrição, o TF lipidizadoage como um estimulador de Fxa, aumentando a sua atividadeproteolítica e conseqüentemente a produção de protrombina epode, portanto, ser utilizado para o tratamento ou a correçãode distúrbios hemorrágicos, particularmente aquelesdistúrbios hemorrágicos associados com a diátese hemorrágica.

O termo "diátese hemorrágica" refere-se ao processoque causa um distúrbio hemostático e que, por conseqüência,causa a ocorrência de uma síndrome hemorrágica que podeocasionalmente ocorrer com sangramento prolongado eexcessivo. A diátese hemorrágica pode ser causada por umacoagulopatia congênita ou adquirida e/ou por um distúrbioplaquetário congênito e adquirido.

O termo "coagulopatia" refere-se a um distúrbio dofator de coagulação. Esse distúrbio pode ser devido a umadeficiência ou a um déficit especifico do fator decoagulação, cuja conseqüência será a ocorrência de umasíndrome hemorrágica, ou devido a um distúrbio do fator decoagulação. A coagulopatia pode ser geralmente umacoagulopatia congênita ou uma coagulopatia adquirida.

Como exemplos ilustrativos e não limitadores decoagulopatias congênitas, podem ser mencionadas asdeficiências dos fatores de coagulação selecionados entre FV,FVII, FVIII, FIX, FX, FXII, FXIII, e as suas combinações.

As coagulopatias adquiridas podem ter origensdiferentes. Os exemplos ilustrativos incluem deficiências dasíntese do fator de coagulação na falência hepática grave,terapia com anticoagulantes (tais como a heparina, heparinasde baixo peso molecular, varfarina, derivados de cumarina,dicumarinas, etc.). Um mecanismo alternativo é baseado em umconsumo exagerado de fatores de coagulação de modo que nãoestejam disponíveis para formar o coágulo em uma lesão comsangramento. Esse mecanismo ocorre na síndrome da coagulaçãointravascular disseminada ou na coagulopatia devido aoconsumo que ocorre em doenças múltiplas como na septicemiagrave que danifica as plaquetas que ativam o endotélio demicrocirculação e os fatores de coagulação com a formação demicrotrombos múltiplos; na invasão sangüínea por TF tal comoa liberação placentária; na retenção de um feto morto; emtraumas múltiplos com esmagamento de tecidos; em picadas decobras venenosas, etc. Na vasculite, os danos parietal eendotelial liberam ativadores de coagulação. 0 consumo defatores de coagulação é piorado pela Iise da fibrina denumerosos microtrombos devido à ação da plasmina comliberação de PDF, que são antiplaquetas e anticoagulantes.

O termo "distúrbio plaquetário" refere-se a umdistúrbio no número e na capacidade funcional das plaquetas,cujo resultado é a ocorrência de uma síndrome hemorrágica. 0dito distúrbio plaquetário pode ser congênito ou adquirido.

Em uma realização particular, o dito distúrbioplaquetário é um distúrbio plaquetário congênito. Os exemplosilustrativos e não limitadores de distúrbios plaquetárioscongênitos incluem o mal de Glanzmann, o mal de BernardSoulier, a síndrome de Bolin-Jamieson, a síndrome de Wiskott-Aldrich, a síndrome de Paris-Trousseau-Jacobsen, atrombocitopenia do cromossomo X, a síndrome das plaquetas deGray, a síndrome de Sebastian e a anemia de Fanconi.

Em uma outra dita realização particular, odistúrbio plaquetário é um distúrbio plaquetário adquirido.Os exemplos ilustrativos e não limitadores de distúrbiosplaquetários adquiridos incluem distúrbiosmieloproliferativos, tais como a trombocitemia, apolicitemia, a leucemia mielocítica crônica, etc.; hádistúrbios plaquetários funcionais na metaplasia mielóide comtempo de sangramento aumentado, defeitos da retenção degrânulos de vidro, defeito da agregação plaquetária,liberação anormal e defeito do fator de plaquetas III. Osdefeitos plaquetários funcionais foram verificados nasdisproteinemias no escorbuto e na doença cardíaca congênita ena cirrose.

Os termos "coagulopatia adquirida" e "distúrbioplaquetário adquirido" referem-se à origem do distúrbio, quepode ser iatrogênica ou secundária à outra doença.

O termo "indivíduo", tal como utilizado na presenteinvenção, inclui qualquer membro de uma espécie animal,incluindo a espécie humana; a título de um exemploilustrativo e não limitador, o dito indivíduo pode ser ummamífero, tal como um primata, um animal doméstico, umroedor, etc., sendo que o dito indivíduo é de preferência umhomem ou uma mulher de qualquer idade e raça. Em uma ditarealização particular, o indivíduo é um ser humano sem nenhumhistórico de distúrbios hemostáticos, tal como um indivíduoque não tem nenhuma coagulopatia ou distúrbio plaquetário. Emuma outra dita realização particular, o indivíduo é um serhumano que tem um histórico de distúrbios hemostáticos, talcomo um indivíduo que tem diátese hemorrágica, por exemplo,uma coagulopatia, tal como uma coagulopatia congênita ouadquirida ou um distúrbio plaquetário, tal como um distúrbioplaquetário congênito ou adquirido.

Portanto, em uma realização particular, a invençãorefere-se à utilização do TF lipidizado na preparação de umadroga para o tratamento tópico da hemorragia em um ser humanosem nenhum histórico de distúrbios hemostáticos. Em uma outrarealização particular, a invenção refere-se à utilização doTF lipidizado na preparação de uma droga para o tratamentotópico da hemorragia de um ser humano que tem uma diátesehemorrágica.

Para a administração ao indivíduo, o TF lipidizadoserá formulado em uma forma farmacêutica apropriada para asua administração tópica para o tratamento (local) tópico dahemorragia. Os exemplos ilustrativos e não limitadores dasditas formas farmacêuticas incluem aerossóis, soluções,suspensões, emulsões, géis, bálsamos, cremes, curativos,emplastros, pomadas, enxaguatórios bucais, etc. Para essafinalidade, a formulação farmacêutica que compreende o TFlipidizado irá incluir os veículos e excipientesfarmaceuticamente aceitáveis requeridos para a preparação daforma de administração farmacêutica escolhida (para maioresinformações, consultar a seção relacionada à "ComposiçãoFarmacêutica" nesta descrição).

A dose de TF lipidizado a ser administrada aoindivíduo pode variar dentro de uma faixa muito ampla, porexemplo, entre aproximadamente 0,01 pg de proteína ativa/ml e100 pg de proteína ativa/ml. A dose de TF lipidizado a seradministrada irá depender de diversos fatores, incluindoentre eles as características da proteína do TF utilizada,tais como por exemplo, a sua atividade e vida médiabiológica, a concentração da proteína do TF na formulação, acondição clínica do indivíduo ou do paciente, o distúrbiohemorrágico a ser tratado, etc. (para maiores informações,consultar a seção relacionada à "Composição Farmacêutica"nesta descrição).

II. Combinação de Produtos e Aplicações

II.1 TF lipidizado + FXa

Conforme é sabido, na via de coagulação sangüíneaextrínseca, o TF se liga ao FVIl/FVIIa circulante para formaro complexo de TF:: FVII e, na presença de cálcio, age como umsubstrato de modo que a ativação de FX ocorra. A ativação davia extrínseca envolve a interação de TF com o seu ligando,FVII/FVIIa. Esse complexo, TF::FVIIa, age como um substratode modo que a ativação de FX por FVIIa ocorra. Os autores dapresente invenção verificaram agora surpreendentemente que oTF lipidizado em conjunto com o FXa, até mesmo em indivíduoscom deficiência de FVII, induz a coagulação, de modo que o TFlipidizado aja como um estimulador de FXa, permitindo queessa protease de serina inicie a hidrólise de protrombina,para produzir a protrombina e para que a origem da coagulaçãoocorra. Tal como utilizado na presente invenção, "FXa",refere-se a uma proteína, particularmente uma protease deserina, que em sua forma ativa é responsável pela iniciaçãoda hidrólise de protrombina e causa conseqüentemente o inícioda coagulação. Essa proteólise é executada por FXa que seliga à superfície de plaquetas ativada e, na presença de FVae do cálcio iônico, hidrolisa a protrombina.

Mais especificamente, os autores da presenteinvenção verificaram surpreendentemente que a combinação deTF lipidizado e FXa, até mesmo em tais baixas concentraçõesde FXa em que não conseguem induzir a coagulação por si,coagula o plasma [consultar, por exemplo, as seções 1 (1.5) e2 dos resultados do exemplo incluído nesta descrição] .

Portanto, em um outro aspecto, a invenção refere-sea um produto que compreende (i) TF lipidizado e (ii) o FXa.Com base nos resultados previamente mencionados, o ditoproduto pode ser utilizado como uma droga e pode serparticularmente utilizado no tratamento da hemorragia, porexemplo, no tratamento tópico da hemorragia, em um indivíduo.Os ditos componentes (i) e (ii) podem estar juntos ouseparados. Em uma realização particular, o TF lipidizadoutilizado na preparação deste produto é o TF lipidizado humano.

Em uma realização particular, a invenção apresentaum produto que compreende (i) o TF lipidizado e (ii) o FXa.Ambos os componentes podem ser combinados e estar juntos namesma composição antes de sua administração ao indivíduo.

Em uma outra realização particular, a invençãoapresenta um produto que compreende, separadamente, (i) o TFlipidizado e (ii) o FXa. Em uma outra realização particular,a invenção apresenta um produto que compreende,separadamente, (i) o TF lipidizado e (ii) o FXa, como umacombinação para a sua administração simultânea ou sucessiva aum indivíduo. A administração combinada dos ditos componentes(i) e (ii) ao indivíduo pode ser realizada simultânea ouseqüencialmente, espaçada no tempo, em qualquer ordem, istoé, primeiramente o TF lipidizado e então o FXa pode seradministrado, ou vice-versa. Alternativamente, o dito TFlipidizado e o FXa podem ser simultaneamente administrados.

Para a sua administração a um indivíduo, o produtopreviamente definido será formulado em uma forma deadministração farmacêutica, de preferência uma forma deadministração farmacêutica apropriada para a suaadministração tópica, para cuja finalidade os veículos e osexcipientes farmaceuticamente aceitáveis apropriados para apreparação da forma de administração farmacêutica desejadaserão incorporados. As informações sobre os ditos veículos eexcipientes, assim como sobre a dita forma de administraçãoapropriada para a administração do dito produto da invenção,podem ser encontradas em tratados sobre farmácia galênica.Para maiores informações, consultar a seção relacionada à"Composição Farmacêutica" desta descrição.

A dose de TF lipidizado e de FXa a ser administradaao indivíduo pode variar dentro de uma ampla faixa. Para finsde ilustração, a dose de TF lipidizado a ser administradapode ficar compreendida entre aproximadamente 0,01 pg deproteína ativa/ml e 100 pg de proteína ativa/ml. Além disso,para fins de ilustração, a dose de FXa a ser administradapode ficar compreendida entre aproximadamente 17 pM e 17 nM(0,001 pg de proteína ativa/ml e 10 pg de proteína ativa/ml).

Geralmente, as doses de TF lipidizado e de FXa a seremadministradas irão depender de diversos fatores, incluindo ascaracterísticas da proteína do TF utilizada e do FXa, taiscomo, por exemplo, a sua atividade e vida média biológica, aconcentração de FXa e da proteína do TF na formulação, acondição clínica do indivíduo ou do paciente, o distúrbiohemorrágico a ser tratado, etc. (para maiores informações,consultar a seção relacionada à "Composição Farmacêutica"desta descrição).A relação entre o peso do TF lipidizado e o FXapresente no dito produto pode variar dentro de uma amplafaixa; para fins de ilustração, a dita relação entre o pesodo TF:FXa fica compreendida entre 106:1 e 10:1, embora outrasrelações de peso também sejam possíveis; em uma ditarealização particular, o produto da invenção compreende o TFlipidizado e o FXa em uma relação de peso de 1 a 0,001, istoé, para cada miligrama de proteína de TF, há 1 micrograma deproteína de FXa presente na mistura.

A utilização do produto definido previamente comouma droga, especificamente a utilização do dito produto napreparação de uma droga para o tratamento da hemorragia em umindivíduo, particularmente para o tratamento tópico dahemorragia em um indivíduo, constitui aspectos adicionais dapresente invenção.

II.2 TF Lipidizado + NCIS

Os autores da presente invenção também verificaramsurpreendentemente que a combinação de TF lipidizado e assuperfícies inorgânicas negativamente carregadas (NCIS)coagula o plasma e o sangue de indivíduos saudáveis e depacientes com deficiência do fator de coagulação tanto invitro [consultar as seções 1 (1.4), 2 (2.2), 3 (3.4), 4 (4.2)e 5 (5.2 e 5.4) dos resultados do exemplo incluído nestadescrição] quanto in vivo [consultar as seções 6.1 dosresultados do exemplo incluído nesta descrição] .

0 termo "superfície inorgânica negativamentecarregada" ou "NCIS", tal como utilizado nesta descrição, éconstituído por uma mistura de lipídios e de aceleradores dacoagulação sangüínea, tais como o ácido elágico, zeólito,sílica, materiais inorgânicos de óxidos, etc. Os lipídios têmuma carga negativa líquida, o que significa que a misturalipídica pode incluir lipídios neutros ou switeriônicos, masdeve conter uma determinada quantidade de lipídiosnegativamente carregados que confira um caráter aniônico àmistura. Como um exemplo ilustrativo e não limitador, oslipídios negativamente carregados podem ser esfingolipídios(tais como ceramida-l-fosfatos, fosfatidiletanolaminaglicosilada, sulfatídeos hidroxilados ou não-hidroxilados,gangliosídeos, etc.) e lipídios à base de glicerol (tais comofosfatidilserinas, fosfatidilinositóis, fosfatos defosfatidilinositol, ácidos fosfatidicos, fosfatidilgliceróis,cardiolipinas). No presente pedido de patente, os produtoscomercialmente disponíveis Dade® Actin® (Dade Behring, marcaregistrada) foram utilizados como uma fonte de NCIS.

Portanto, em um outro aspecto, a invenção refere-sea um produto que compreende (i) o TF lipidizado e (ii) aNCIS. Com base nos resultados previamente mencionados, o ditoproduto pode ser utilizado como uma droga e pode serparticularmente utilizado no tratamento de hemorragias, porexemplo, no tratamento tópico da hemorragia, em um indivíduo.Os ditos componentes (i) e (ii) podem estar juntos ou separados.

Em uma realização particular, a invenção apresentaum produto que compreende (i) o TF lipidizado e (ii) a NCIS.Ambos os componentes podem ser combinados e estar juntos namesma composição antes de sua administração ao indivíduo.

Em uma outra realização particular, a invençãoapresenta um produto que compreende, separadamente, (i) o TFlipidizado e (ii) a NCIS. Em uma outra realização particular,a invenção apresenta um produto que compreende,separadamente, (i) o TF lipidizado e (ii) a NCIS, como umacombinação para a sua administração simultânea ou sucessiva aum indivíduo. A administração combinada dos ditos componentes(i) e (ii) ao indivíduo pode ser realizada simultânea ouseqüencialmente, espaçada no tempo, em qualquer ordem, istoé, primeiramente o TF lipidizado e então a NCIS pode seradministrada, ou vice-versa. Alternativamente, o dito TFlipidizado e NCIS podem ser simultaneamente administrados.

Para a sua administração a um indivíduo, o produtopreviamente definido será formulado em uma forma deadministração farmacêutica, de preferência uma forma deadministração farmacêutica apropriada para a suaadministração tópica, para cuja finalidade os veículos e osexcipientes farmaceuticamente aceitáveis apropriados para apreparação da forma de administração farmacêutica desejadaserão incorporados. As informações sobre os ditos veículos eexcipientes, assim como sobre a dita forma de administraçãoapropriada para a administração do dito produto da invenção,podem ser encontradas em tratados sobre farmácia galênica.Para maiores informações, consultar a seção relacionada à"Composição Farmacêutica" desta descrição.

A dose de TF lipidizado e de NCIS a seradministrada ao indivíduo pode variar dentro de uma amplafaixa. Para fins de ilustração, a dose de TF lipidizado a seradministrada pode ficar compreendida entre aproximadamente0,01 pg de proteína ativa/ml e 100 pg de proteína ativa/ml.

Além disso, para fins de ilustração, a dose de NCIS (emvolume) a ser administrada pode ficar compreendida entreaproximadamente 0,1 e 100 μΐ para cada pg de proteína ativadapelo TF lipidizado. Geralmente, as doses de TF lipidizado ede NCIS a serem administradas irão depender de diversosfatores, incluindo as características da proteína do TFutilizada e a NCIS, tais como, por exemplo, a sua atividade evida média biológica, a concentração da proteína do TF e daNCIS na formulação, a condição clínica do indivíduo ou dopaciente, o distúrbio hemorrágico a ser tratado, etc. (paramaiores informações, consultar a seção relacionada à"Composição Farmacêutica" desta descrição).

A relação de peso/volume (w/v) entre o TFlipidizado e a NCIS presente no dito produto pode variardentro de uma ampla faixa; para fins de ilustração, a ditarelação entre TF lipidizado:NCIS w/v fica compreendida, entre1:1 e 1:106, embora outras relações de w/v também sejampossíveis; em uma realização particular, o dito produto dainvenção compreende entre 0,1 e 100 μΐ de NCIS para cada pgde proteína ativada pelo TF lipidizado.

A utilização do produto definido previamente comouma droga, especificamente a utilização do dito produto napreparação de uma droga para o tratamento de hemorragias emum indivíduo, particularmente para o tratamento tópico dahemorragia em um indivíduo, constitui aspectos adicionais dapresente invenção.

II.3 TF Lipidizado + FXa + NCIS

Os autores da presente invenção também verificaramsurpreendentemente que a combinação de TF lipidizado, FXa eNCIS coagula o plasma e o sangue de indivíduos saudáveis e depacientes com deficiência do fator de coagulação in vitro[consultar as seções 1 (1.6) e 2 (2.2) dos resultados doexemplo incluído nesta descrição].

Portanto, em um outro aspecto, a invenção refere-sea um produto que compreende (i) o TF lipidizado, (ii) o FXa e(iii) a NCIS. Com base nos resultados previamentemencionados, o dito produto pode ser utilizado como uma drogae pode ser particularmente utilizado no tratamento dehemorragias, por exemplo, no tratamento tópico da hemorragia,em um indivíduo. Os ditos componentes (i), (ii) e (iii) podemestar juntos ou separados. Alternativamente, dois doscomponentes podem estar juntos, por exemplo, (i) + (ii), (i)+ (iii) ou (ii) +(iii) e o terceiro separado.

Em uma realização particular, a invenção apresentaum produto que compreende (i) o TF lipidizado, (ii) o FXa e(iii) a NCIS. Os ditos componentes podem ser combinados eestar juntos na mesma composição antes de sua administraçãoao indivíduo.

Em uma outra realização particular, a invençãoapresenta um produto que compreende, separadamente, (i) o TFlipidizado, (ii) o FXa e (iii) a NCIS. Em uma outrarealização particular, a invenção apresenta um produto quecompreende, separadamente, (i) o TF lipidizado, (ii) o FXa e(iii) a NCIS, como uma combinação para a sua administraçãosimultânea ou sucessiva a um indivíduo. A administraçãocombinada dos ditos componentes (i) , (ii) e (iii) aoindivíduo pode ser realizada simultânea ou seqüencialmente,espaçada no tempo, em qualquer ordem, isto é, primeiramente oTF lipidizado, então o FXa e então a NCIS pode seradministrada, ou primeiramente o TF lipidizado, então a NCISe então o FXa podem ser administrados, ou primeiramente oFXa, a seguir o TF lipidizado e então a NCIS podem seradministrados, ou primeiramente o FXa, a seguir a NCIS eentão o TF lipidizado podem ser administrados, ouprimeiramente a NCIS, a seguir o FXa e então o TF lipidizadopodem ser administrados, ou primeiramente a NCIS, então o TFlipidizado e então o FXa podem ser administrados.Alternativamente, quaisquer dois ditos componentes podem sermisturados na mesma composição e ser administrados emconjunto, sendo que o terceiro pode ser adicionado antes oudepois da dita composição de componente binária. Em uma outrarealização alternativa, os ditos TF lipidizado, FXa e NCISsão administrados simultaneamente.

Para a sua administração a um indivíduo, o produtopreviamente definido será formulado em uma forma deadministração farmacêutica, de preferência uma forma deadministração farmacêutica apropriada para a suaadministração tópica, para cuja finalidade os veículos e osexcipientes farmaceuticamente aceitáveis apropriados para apreparação da forma de administração farmacêutica desejadaserão incorporados. As informações sobre os ditos veículos eexcipientes, assim como sobre a dita forma de administraçãoapropriada para a administração do dito produto da invenção,podem ser encontradas em tratados sobre farmácia galênica.Para maiores informações, consultar a seção relacionada à"Composição Farmacêutica" desta descrição.

A dose de TF lipidizado, FXa e de NCIS a seradministrada ao indivíduo pode variar dentro de uma amplafaixa. Para fins de ilustração, a dose de TF lipidizado a seradministrada pode ficar compreendida entre aproximadamente0,01 pg de proteína ativa/ml e 100 pg de proteína ativa/ml.Além disso, para fins de ilustração, a dose de FXa a seradministrada pode ficar compreendida entre aproximadamente 17 pM e 170 nM (0,001 pg de proteína e 10 pg de proteína/ml).Adicionalmente, para fins de ilustração, a dose de NCIS (emvolume) a ser administrada pode ficar compreendida entreaproximadamente 0,1 e 100 μΐ para cada pg de proteína ativadapelo TF lipidizado. Geralmente, as doses de TF lipidizado,FXa e NCIS a serem administradas irão depender de diversosfatores, incluindo as características da proteína do TF, doFXa e da NCIS utilizada, tais como, por exemplo, a suaatividade e vida média biológica, a concentração da proteínado TF, FXa e NCIS na formulação, a condição clínica doindivíduo ou do paciente, o distúrbio hemorrágico a sertratado, etc. (Para maiores informações, consultar a seçãorelacionada à "Composição Farmacêutica" desta descrição) .

A relação de peso entre o TF lipidizado, o FXa e aNCIS presente no dito produto pode variar dentro de uma amplafaixa, tal como mencionado previamente nas seções II. 1 eII. 2; não obstante, em uma realização particular, o ditoproduto da invenção compreende TF lipidizado:FXa:NCIS em umarelação de 1:0,001:100 (w:w:v).A utilização do produto definido previamente comouma droga, especificamente a utilização do dito produto napreparação de uma droga para o tratamento de hemorragias emum indivíduo, particularmente para o tratamento tópico dahemorragia em um indivíduo, constitui aspectos adicionais dapresente invenção.

III. Complexos e Aplicações

III.1 Complexo de TF::FXa

Conforme mencionado previamente (consultar a seçãoII.1 desta descrição), os autores da presente invençãoverificaram que a combinação de TF lipidizado e FXa, atémesmo em tais baixas concentrações de FXa que não consegueminduzir a coagulação por si, coagula o plasma. Embora não sepretenda ficar limitado a nenhuma teoria, acredita-se que aadministração, combinada ou separada (em qualquer ordem), dodito TF lipidizado e FXa causa a formação de um complexo quepode exercer o efeito terapêutico (anti-hemorrágico,particularmente, anti-hemorrágico tópico) observado no localonde o dito efeito terapêutico deve ser exercido.

Portanto, em um outro aspecto, a invenção refere-sea um complexo, identificado como TF::FXa nesta descrição, quecompreende o TF lipidizado e o FXa. Embora por uma questão desimplicidade o dito complexo seja representado como TF::FXa,o dito complexo poderia na verdade ser formado por diversasunidades de cada um dos ditos componentes; todas estaspossibilidades estão dentro do âmbito da invenção. Em vistados resultados previamente mencionados, o dito complexo podeser utilizado como uma droga e pode ser particularmenteutilizado no tratamento de hemorragias, por exemplo, notratamento tópico da hemorragia, em um indivíduo. Em umarealização particular, o TF lipidizado utilizado napreparação deste complexo é o TF lipidizado humano.

Para a sua administração a um indivíduo, o produtopreviamente definido será formulado em uma forma deadministração farmacêutica, de preferência uma forma deadministração farmacêutica apropriada para a suaadministração tópica, para cuja finalidade os veículos e osexcipientes farmaceuticamente aceitáveis apropriados para apreparação da forma de administração farmacêutica desejadaserão incorporados. As informações sobre os ditos veículos eexcipientes, assim como sobre a dita forma de administraçãoapropriada para a administração do dito produto da invenção,podem ser encontradas em tratados sobre farmácia galênica.

Para maiores informações, consultar a seção relacionada à"Composição Farmacêutica" desta descrição.

As doses de TF lipidizado e de FXa presentes nodito complexo a ser administrado ao indivíduo podem variardentro de uma ampla faixa. Geralmente, as ditas dosescorrespondem às doses mencionadas previamente na seção II.1,que se refere a um produto que compreende o TF lipidizado e o FXa.

A relação entre o peso do TF lipidizado e o FXapresente no dito complexo de TF::FXa pode variar dentro deuma ampla faixa; embora corresponda geralmente àquelamencionada previamente em II.1, que se refere a um produtoque compreende o TF lipidizado e o FXa.

A utilização do complexo definido previamente comouma droga, especificamente a utilização do dito complexo napreparação de uma droga para o tratamento da hemorragia em umindivíduo, particularmente para o tratamento tópico dashemorragias em um indivíduo, constitui aspectos adicionais dapresente invenção.

III.2 Complexo de TF::NCIS

Conforme mencionado previamente (consultar a seçãoII. 2 desta descrição), os autores da presente invençãoverificaram que a combinação de TF lipidizado e NCIS coagulao plasma e o sangue em indivíduos saudáveis e em pacientescom deficiência do fator de coagulação in vitro e in vivo.Embora não se pretenda fica limitado a nenhuma teoria,acredita-se que a administração, combinada ou separada (emqualquer ordem), do dito TF lipidizado e NCIS, cause aformação de um complexo que pode exercer o efeito terapêutico(anti-hemorrágico, particularmente, anti-hemorrágico tópico)observado no local onde o dito efeito terapêutico deve serexercido.

Portanto, em um outro aspecto, a invenção refere-sea um complexo, identificado como TF::NCIS nesta descrição,que compreende o TF lipidizado e a NCIS. Embora por umaquestão de simplicidade o dito complexo seja representadocomo TF::NCIS, o dito complexo poderia na verdade ser formadopor diversas unidades de cada um dos ditos componentes; todasestas possibilidades estão dentro do âmbito da invenção. Emvista dos resultados previamente mencionados, o dito complexopode ser utilizado como uma droga e pode ser particularmenteutilizado no tratamento de hemorragias, por exemplo, notratamento tópico da hemorragia, em um indivíduo. Em umarealização particular, o TF lipidizado utilizado napreparação deste complexo é o TF lipidizado humano.

Para a sua administração a um indivíduo, o produtopreviamente definido será formulado em uma forma deadministração farmacêutica, de preferência uma forma deadministração farmacêutica apropriada para a suaadministração tópica, para cuja finalidade os veículos e osexcipientes farmaceuticamente aceitáveis apropriados para apreparação da forma de administração farmacêutica desejadaserão incorporados. As informações sobre os ditos veículos eexcipientes, assim como sobre a dita forma de administraçãoapropriada para a administração do dito produto da invenção,podem ser encontradas em tratados sobre farmácia galênica.Para maiores informações, consultar a seção relacionada à"Composição Farmacêutica" desta descrição.

As doses de TF lipidizado e de NCIS presentes nodito complexo a ser administrado ao indivíduo podem variardentro de uma ampla faixa. Geralmente, as ditas dosescorrespondem às doses mencionadas previamente na seção II.2,que se refere a um produto que compreende a combinação de TFlipidizado e a NCIS.

A relação de peso/volume entre o TF lipidizado e aNCIS presente no dito complexo de TF::NCIS pode variar dentrode uma ampla faixa; embora corresponda geralmente àquelamencionada previamente em II.2, que* se refere a um produtoque compreende o TF lipidizado e a NCIS.

A utilização do complexo definido previamente comouma droga, especificamente a utilização do dito complexo napreparação de uma droga para o tratamento de hemorragias emum indivíduo, particularmente para o tratamento tópico dahemorragia em um indivíduo, constitui aspectos adicionais dapresente invenção.

III.3 Complexo de TF Lipidizado::FXa::NCIS

Conforme mencionado previamente (consultar a seçãoII.3 desta descrição), os autores da presente invençãoverificaram que a combinação de TF lipidizado, FXa e NCIScoagula o plasma. Embora não se pretenda ficar limitado anenhuma teoria, acredita-se que a administração, combinada ouseparada (em qualquer ordem), dos ditos TF lipidizado, FXa eNCIS, cause a formação de um complexo que pode exercer oefeito terapêutico (anti-hemorrágico, particularmente, anti-hemorrágico tópico) observado no local onde o dito efeitoterapêutico deve ser exercido. Portanto, em um outro aspecto,a invenção refere-se a um complexo, identificado comoTF::FXa::NCIS nesta descrição, que compreende o TFlipidizado, o FXa e a NCIS. Embora por questão desimplicidade, o dito complexo seja representado comoTF::FXa::NCIS, o dito complexo poderia na verdade ser formadopor diversas unidades de cada um dos ditos componentes, bemcomo por qualquer possibilidade de interações entre os ditoscomponentes, por exemplo, TF: :NCIS: :FXa, FXa : : NCIS: :TF,FXa: : TF : :NCIS, NCIS : : TF : : FXa OU NCIS : : FXa : : TF; todas estaspossibilidades estão dentro do âmbito da invenção. Em vistados resultados previamente mencionados, o dito complexo podeser utilizado como uma droga e pode ser particularmenteutilizado no tratamento da hemorragia, por exemplo, notratamento tópico da hemorragia, em um indivíduo. Em umarealização particular, o TF lipidizado utilizado napreparação deste complexo é o TF lipidizado humano.

Para a sua administração a um indivíduo, o produtopreviamente definido será formulado em uma forma deadministração farmacêutica, de preferência uma forma deadministração farmacêutica apropriada para a suaadministração tópica, para cuja finalidade os veículos e osexcipientes farmaceuticamente aceitáveis apropriados para apreparação da forma de administração farmacêutica desejadaserão incorporados. As informações sobre os ditos veículos eexcipientes, assim como sobre a dita forma de administraçãoapropriada para a administração do dito produto da invenção,podem ser encontradas em tratados sobre farmácia galênica.

Para maiores informações, consultar a seção relacionada à"Composição Farmacêutica" desta descrição.

As doses de TF lipidizado, FXa e NCIS presentes nodito complexo a ser administrado ao indivíduo podem variardentro de uma ampla faixa. Geralmente, as ditas dosescorrespondem às doses mencionadas previamente na seção II.3,que se refere a um produto que compreende a combinação de TFlipidizado, FXa e NCIS.

A relação entre o TF lipidizado, o FXa e a NCISpresentes no dito complexo de TF::FXa::NCIS pode variardentro de uma ampla faixa; embora corresponda geralmenteàquela mencionada previamente em II.3, que se refere a umproduto que compreende o TF lipidizado, o FXa e a NCIS.

A utilização do complexo definido previamente comouma droga, especificamente a utilização do dito complexo napreparação de uma droga para o tratamento de hemorragias emum indivíduo, particularmente para o tratamento tópico dashemorragias em um indivíduo, constitui aspectos adicionais dapresente invenção.

IV. Composição Farmacêutica

Conforme mencionado previamente, o TF lipidizadopode ser utilizado como um agente anti-hemorrágico,particularmente, como um agente anti-hemorrágico para aaplicação tópica. Portanto, em um outro aspecto, a invençãorefere-se a uma composição farmacêutica, daqui por diante, acomposição farmacêutica da invenção, que compreende o TFlipidizado em conjunto com um veículo farmaceuticamenteaceitável. Em uma realização particular, o TF lipidizado é oTF lipidizado humano.

Para a sua administração a um indivíduo, o produtopreviamente definido será formulado em uma forma deadministração farmacêutica, de preferência uma forma deadministração farmacêutica apropriada para sua administraçãotópica, para cuja finalidade os veículos e os excipientesfarmaceuticamente aceitáveis apropriados para a preparação daforma de administração farmacêutica desejada serãoincorporados. As informações sobre os ditos veículos eexcipientes, assim como sobre a dita forma de administraçãoapropriada para a administração do dito produto da invenção,podem ser encontradas em tratados sobre farmácia galênica.

Uma revisão sobre as diferentes formas de administraçãofarmacêutica das drogas em geral e de seus processos depreparação, pode ser encontrada no livro "Tratado de FarmáciaGalénica" ("Galenic Pharmacy Treatiseu) , da autoria de C.Faulí i Trillo, Ia Edição, 1993, Luzán 5, S.A. de Ediciones.

Embora formas de administração farmacêuticadiferentes do TF lipidizado possam ser utilizadas, aadministração do dito composto topicamente é mais vantajosana prática; portanto; o TF lipidizado será formulado em umaforma farmacêutica apropriada para a sua administraçãotópica. Os exemplos ilustrativos e não limitadores das ditasformas farmacêuticas incluem aerossóis, soluções, suspensões,emulsões, géis, bálsamos, cremes, curativos, emplastros,pomadas, enxaguatórios bucais, etc. Para essa finalidade, aformulação farmacêutica que compreende o TF lipidizado iráincluir os veículos e excipientes farmaceuticamenteaceitáveis requeridos para a preparação da forma deadministração farmacêutica do TF lipidizado para aadministração tópica.

Portanto, em uma realização particular, acomposição farmacêutica da invenção é uma composiçãofarmacêutica para a administração tópica do TF lipidizado,que compreende o TF lipidizado e um veículo farmaceuticamenteaceitável apropriado para a administração tópica do dito TFlipidizado.

O TF lipidizado estará presente na composiçãofarmacêutica da invenção em uma quantidade terapeuticamenteeficaz. A dita quantidade pode variar dentro de uma amplafaixa, por exemplo, entre aproximadamente 0,01 pg de proteínaativa/ml e 100 pg de proteína ativa/ml.

Em uma outra realização particular, a composiçãofarmacêutica da invenção compreende:

a) um produto que compreende (i) o TF lipidizado e(ii) o FXa, em conjunto com um veículo farmaceuticamenteaceitável; oub) separadamente, (i) o TF lipidizado em conjuntocom um veículo farmaceuticamente aceitável e (ii) o FXa emconjunto com um veículo farmaceuticamente aceitável; ou

c) um produto que compreende (i) o TF lipidizado e(ii) a NCIS, em conjunto com um veículo farmaceuticamenteaceitável; ou

d) separadamente, (i) o TF lipidizado em conjuntocom um veículo farmaceuticamente aceitável e (ii) a NCIS emconjunto com um veículo farmaceuticamente aceitável; ou

e) um produto que compreende (i) o TF lipidizado,(ii) o FXa e (iii) a NCIS, em conjunto com um veículofarmaceuticamente aceitável; ou

f) separadamente, (i) o TF lipidizado em conjuntocom um veículo farmaceuticamente aceitável, (ii) o FXa emconjunto com um veículo farmaceuticamente aceitável e (iii) aNCIS em conjunto com um veículo farmaceuticamente aceitável;ou

g) um complexo de TF:: FXa em conjunto com um

veículo farmaceuticamente aceitável; ou

h) um complexo de TF::NCIS em conjunto com umveículo farmaceuticamente aceitável; ou

i) um complexo de TF: : FXa: :NCIS em conjunto com umveículo farmaceuticamente aceitável.

A composição farmacêutica previamente definida dainvenção contém, conforme pode ser observado, o TF lipidizadosozinho ou combinado com o FXa e/ou a NCIS ou que formacomplexos com FXa e/ou NCIS, como ingrediente ativo. Em umarealização particular, o TF lipidizado presente na composiçãofarmacêutica previamente definida da invenção é o TFlipidizado humano.

Além disso, em uma realização particular, acomposição farmacêutica previamente definida da invenção seráformulada em uma forma farmacêutica para a administraçãotópica do ingrediente ativo (o TF lipidizado sozinho oucombinado com o FXa e/ou a NCIS ou que forma complexos comFXa e/ou NCIS). Os exemplos ilustrativos e não limitadoresdas ditas formas farmacêuticas incluem aerossóis, soluções,suspensões, emulsões, géis, bálsamos, cremes, curativos,emplastros, pomadas, enxaguatórios bucais, etc. Para essafinalidade, a formulação farmacêutica que compreende oingrediente ativo previamente mencionado irá incluir osveículos e excipientes farmaceuticamente aceitáveisrequeridos para a preparação da forma de administraçãofarmacêutica do dito ingrediente ativo por meio daadministração tópica.

O ingrediente ativo estará presente na composiçãofarmacêutica da invenção em uma quantidade terapeuticamenteeficaz. A dose do ingrediente ativo a ser administrada a umindivíduo irá depender, entre outros fatores, da gravidade dapatologia que o dito indivíduo está sofrendo, da forma deadministração farmacêutica escolhida etc. Por esta razão, asdoses mencionadas na presente invenção devem ser consideradassomente como guias para um elemento versado na técnica e essapessoa deve ajustar as doses de acordo com as variáveispreviamente mencionadas. Não obstante, a composiçãofarmacêutica da invenção pode ser administrada uma ou maisvezes ao dia para finalidades preventivas ou terapêuticas.

A composição farmacêutica da invenção pode serutilizada em conjunto com outras drogas adicionais úteis notratamento e/ou na prevenção de uma diátese hemorrágica (porexemplo, fatores de coagulação, plasma humano, etc.) paraprover uma terapia de combinação. As ditas drogas adicionaispodem fazer parte da mesma composição farmacêutica ou,alternativamente, podem ser fornecidas na forma de umacomposição separada para a sua administração simultânea ousucessiva (seqüencial no tempo) com respeito à administraçãoda composição farmacêutica da invenção.

V. Composição Farmacêutica Suportada

A composição farmacêutica da invenção pode sercolocada em um suporte. Portanto, em um outro aspecto, ainvenção refere-se a um produto que compreende a composiçãofarmacêutica da invenção e um suporte. O termo "suporte", talcomo utilizado na presente invenção, refere-se a um substratode material apropriado que permite a colocação da composiçãofarmacêutica da invenção no mesmo, sendo carregado e liberadono local desejado, por exemplo, no local onde a composiçãofarmacêutica da invenção exerce o seu efeito terapêutico. 0dito suporte pode ser um suporte sólido ou um suporte não-sólido, por exemplo, um suporte liquido ou um suporte gasoso.

Os exemplos ilustrativos e não limitadores de suportessólidos incluem curativos, band-aids, compressas, emplastros,etc. Os exemplos ilustrativos e não limitadores de suporteslíquidos incluem géis, sprays, enxaguatórios bucais, etc. Osexemplos ilustrativos e não limitadores de suportes gasososincluem o ar, propelentes, etc. Em uma realização particular,a composição farmacêutica da invenção depositada sobre o ditosuporte compreende:

(a) (i) um suporte, (ii) um produto que compreende

o TF lipidizado e o FXa, em conjunto com um veículofarmaceuticamente aceitável, (iii) um produto que compreende

o TF lipidizado e a NCIS, em conjunto com um veículofarmaceuticamente aceitável e (iv) um produto que compreendeTF lipidizado, FXa e NCIS, em conjunto com um veículofarmaceuticamente aceitável, ou

(b) um complexo de TF: : FXa, em conjunto com umveículo farmaceuticamente aceitável, ou

(c) um complexo de TF: :NCIS, em conjunto com umveículo farmaceuticamente aceitável, ou

(d) um complexo de TF::FXa::NCIS, em conjunto comum veículo farmaceuticamente aceitável.

Em uma realização particular, o TF lipidizadopresente na composição farmacêutica da invenção é o TFlipidizado humano.

Esse produto que compreende a composiçãofarmacêutica da invenção depositada em um suporte pode serobtido por métodos convencionais, por exemplo, ao misturar acomposição farmacêutica da invenção e o suporte. A interaçãoentre a composição farmacêutica da invenção e o suporte podeser uma interação física ou química, dependendo da naturezados componentes da composição farmacêutica da invenção e dosuporte ut i1i zado.

VI. Utilização de TF Não-lipidizado para o Tratamento deHemorragias

Os resultados obtidos nos ensaios realizados pelosautores da presente invenção mostram claramente que o TF:

- aumenta a atividade proteolítica de FXa econseqüentemente a produção de trombina,

- coagula o plasma e o sangue de indivíduossaudáveis e de pacientes com deficiência do fator decoagulação, incluindo o sangue com deficiência de FVII,

- coagula o sangue dos pacientes que sofrem dedistúrbios plaquetários, e

- interrompe as hemorragias graves e letais in vivoem modelos animais diferentes.

Portanto, esses resultados como um todo mostramclaramente que o TF lipidizado é um agente anti-hemorrágicoútil para o tratamento de hemorragias em indivíduos saudáveise com deficiências do fator de coagulação, incluindopacientes com deficiência de FVIII, FIX, FXI, FXIII, FVII, Fe FX.

A patente européia EP 266993 descreve a utilizaçãode TF não-lipidizado no tratamento da hemorragia,particularmente no tratamento da hemorragia devida a umadeficiência de um fator de coagulação, especificamente de umfator de coagulação escolhido entre FVIII, FIX, FXI ou FXIII.No entanto, a dita patente não descreve nem sugere apossibilidade de utilizar o TF não-lipidizado no tratamentoda hemorragia devida à deficiência de FVII.

A descoberta feita agora pelos autores da presenteinvenção que se refere ao papel do TF como um agenteestimulante da atividade proteolítica de Fxa, independente dofato se o indivíduo tem deficiência de FVII ou não, permiteestabelecer a possibilidade de utilizar o TF não-lipidizadoou um fragmento não-lipidizado funcional do mesmo, notratamento da hemorragia em um indivíduo com deficiência de FVII.

Portanto, em um outro aspecto, a invenção refere-seà utilização de TF não-lipidizado ou de um fragmento não-lipidizado funcional do mesmo, para a preparação de uma drogapara o tratamento da hemorragia em um indivíduo comdeficiência de FVII.

O termo "TF não-lipidizado", tal como utilizado napresente invenção, refere-se ao TF purificado (sem asmembranas lipídicas plasmáticas). O termo TF, tal comoutilizado na presente invenção, inclui variantes e mutantesdo TF de tipo selvagem que mantêm pelo menos uma das funçõesdo TF de tipo selvagem, vantajosamente pelo menos uma dasfunções do TF de tipo selvagem que se refere à coagulação. Oisolamento e a purificação do TF podem ser realizados apartir de diversos tecidos tais como tecido cerebral,placentário e pulmonar, tecidos de diferentes animais taiscomo carneiros, vacas, coelhos, cães, seres humanos, etc. OTF também pode ser TF recombinante (rTF) obtido por umprocesso tal como descrito, somente como um exemploilustrativo mas não limitador, na Patente U.S. N°. 6.261.803.Em uma realização particular, o TF não-lipidizado utilizadona prática da presente invenção é o TF não humano e consisteno componente proteináceo de um TF isolado e purificado apartir de tecido humano esgotado completamente das membranaslipxdicas plasmãticas.

O termo "fragmento funcional de TF não-lipidizado",tal como utilizado nesta descrição, inclui, embora sem ficara eles limitado, derivados de peptideo do TF, particularmentedo componente proteináceo do TF, incluindo mutantes evariantes do componente proteináceo do TF de tipo selvagem,que mantêm uma ou mais funções do TF, que. funcionam depreferência com respeito à coagulação, por exemplo, apotencialidade de se ligar ao FXa e/ou à NCIS e dedesenvolver sua função anti-hemorrágica de formação de vasosdurante a cicatrização de ferimentos. A seqüência deaminoácido do dito fragmento funcional do TF pode seridêntica àquela de um fragmento do componente proteináceo doTF de tipo selvagem ou pode ter inserções, eliminações oumodificações de um ou mais aminoácidos, com a condição quepelo menos uma das funções do TF de tipo selvagem sejapreservada, vantajosamente pelo menos uma função que serefere à coagulação. Por uma questão de simplicidade, o termo"TF não-lipidizado", tal como utilizado na presente invenção,inclui qualquer fragmento funcional de TF não-lipidizado.

0 TF não-lipidizado pode ser obtido por métodosconvencionais. Para fins de ilustração, o componenteproteináceo do TF é dissociado do componente de lipxdio pormeio da extração com solventes orgânicos. Os exemplosilustrativos do dito solvente orgânico incluem misturas depiridina, etanol, heptano-butanol, etc. 0 componenteproteináceo do TF pode ser purificado por meio de processosquxmicos convencionais. Os exemplos dos ditos processosquxmicos incluem o tratamento com detergentes, por exemplo,deoxicolato, Triton X-100, etc., a filtração em gel e aeletroforese preparativa em géis de poliacrilamida napresença de dodecil sulfato de sódio, a utilização deconcavalina A ligada a uma coluna de sefarose, a utilizaçãode colunas por afinidade utilizando anticorpos para ocomponente proteináceo (proteína) do TF, etc.

Para a sua administração a um indivíduo comdeficiência de FVII, o TF não-lipidizado será formulado emuma forma farmacêutica apropriada para a sua administraçãopor qualquer via apropriada. Embora virtualmente qualquerforma farmacêutica possa ser utilizada, a utilização deformas farmacêuticas para a administração parenteral do ditoTF não-lipidizado é vantajosa.

Portanto, em uma realização particular, a invençãorefere-se à utilização de TF não-lipidizado ou de umfragmento não-lipidizado do mesmo, na preparação de uma drogapara administração parenteral do dito TF não-lipidizado ou deum fragmentos não-lipidizados do mesmo.

Neste caso, as composições farmacêuticas que contêmo TF não-lipidizado e excipientes ou veículosfarmaceuticamente aceitáveis serão adaptadas para a suaadministração parenteral na forma, por exemplo, de soluçõesestéreis, suspensões ou produtos liofilizados na forma dedosagem apropriada; neste caso, as ditas composiçõesfarmacêuticas irão incluir excipientes apropriados, tais comotampões, tensoativos, etc. Em qualquer caso, os excipientesserão escolhidos de acordo com a administração farmacêuticaescolhida. As informações sobre os ditos veículos eexcipientes, assim como sobre a dita forma de administraçãoapropriada para a administração do dito produto da invenção,podem ser encontradas em tratados sobre farmácia galênica.Uma revisão de diferentes formas de administraçãofarmacêutica das drogas em geral e de seus processos depreparação pode ser encontrada no livro "Tratado de FarmaciaGalénica" ("Galenic Pharmacy Treatise") , da autoria de C.Faulí i Trillo, Ia Edição, 1993, Luzán 5, S.A. de Ediciones.

A dose de TF não-lipidizado a ser administrada a umindivíduo com deficiência de FVII pode variar dentro de umaampla faixa, por exemplo, entre aproximadamente 0,01 pg deproteína ativa/ml e 100 de proteína ativa/ml. A dose de TFnão-lipidizado a ser administrada irá depender de diversosfatores, incluindo as características da proteína do TFutilizada, tais como, por exemplo, a sua atividade e vidamédia biológica, a concentração de proteína de TF naformulação, a condição clínica do paciente, o distúrbiohemorrágico a ser tratado, etc.

EXEMPLO

Para a finalidade de avaliar a capacidade do TFlipidizado como um estimulador de FXa, uma série de ensaiosin vitro e in vivo foi realizada, especificamente:1. .Os ensaios in vitro demonstram que o TF lipidizado(sozinho e combinado) age como um estimulador direto de FXa,causando a formação de coágulo de fibrina e a coagulaçãosangüínea na ausência de FVII (causada por ausência,deficiência ou imunobloqueio)

1.1 O TF lipidizado aumenta a atividade proteolítica de FXae conseqüentemente a produção de trombina na ausência de FVII(ensaios cromogênicos na solução e na suspensão de plaquetaslavadas).

1.2 o TF lipidizado pode coagular o plasma e o sangue dospacientes com deficiência de FVII (ensaios de coagulação noplasma e no sangue integral não-anticoagulado).

1.3 O TF lipidizado pode coagular o plasma de indivíduossaudáveis na presença de um anticorpo monoclonal contra FVII(ensaios de coagulação).

1.4 A combinação de TF lipidizado e NCIS aumentasinergisticamente a coagulação sangüínea em plasmasdeficientes em FVII (ensaios de coagulação).

1.5 A combinação de TF lipidizado e FXa aumentasinergisticamente a coagulação sangüínea na presença deanticorpo monoclonal contra FVII)(ensaios de coagulação emplasmas deficientes em FX).

1.6 A combinação de TF lipidizado, FXa e NCIS aumentasinergisticamente a coagulação na presença do anticorpo anti-FVII (ensaio de coagulação em plasmas deficientes em FX) .

2. Os ensaios in vitro demonstram que a combinação de TFlipidizado com FXa em baixas concentrações (que não consegueminduzir quaisquer efeitos pró-coagulantes) causa a coagulaçãode plasmas deficientes em FX

2.1 0 TF lipidizado age como um estimulador de FXa quandoessa protease de serina está presente em baixasconcentrações.

2.2 A combinação de TF lipidizado com FXa e NCIS agesinergisticamente na estimulação de FXa.

3. Os ensaios in vitro demonstram que o TF lipidizado(sozinho e combinado) causa a coagulação em pacientes comdeficiências de outros fatores de coagulação que não o FVII

3.1 0 TF lipidizado coagula o plasma e o sangue dos pacientescom deficiências nos fatores de coagulação FV, FVIII, FVIII,FIX, FX, FXI, FXII e FXIII (ensaios de coagulação em plasmasdeficientes no fator de coagulação e no sangue integral não-anticoagulado a partir de FVIII e de FIX) .

3.2 O TF lipidizado coagula o sangue integral e o plasmapreviamente heparinizados.

3.3 0 TF lipidizado coagula o plasma de animais tratados comvarfarina.

3.4 A combinação de TF lipidizado com NCIS intensificasinergisticamente a coagulação sangüínea no plasma dospacientes com deficiências nos fatores de coagulação FV,FVIII, FVIII, FIX, FX, FXI, FXII e FXIII (ensaios decoagulação em plasmas deficientes no fator de coagulação) eno sangue integral dos pacientes hemofílicos.

4. Os ensaios in vitro demonstram que o TF lipidizado(sozinho e combinado) causa a coagulação sangüínea emindivíduos saudáveis

4.1 O TF lipidizado coagula o plasma e o sangue dosindivíduos saudáveis.

4.2 A combinação de TF lipidizado com NCIS intensificasinergisticamente a coagulação sangüínea no plasma e nosangue dos indivíduos saudáveis. Ausência de efeitossinergísticos quando o TF lipidizado é associado com osfosfolipídios.

5. Os ensaios in vitro demonstram o efeito coagulante do TFlipidizado (sozinho e combinado) no plasma dos pacientes comdistúrbios plaquetários (trombocitopênicos) congênitos eadquiridos

5.1 O TF lipidizado coagula o plasma dos pacientes comdistúrbios plaquetários congênitos.

5.2 A combinação de TF lipidizado com NCIS aumenta acoagulação no sangue integral dos pacientes com distúrbiosplaquetários congênitos.

5.3 O TF lipidizado coagula amostras trombocitopênicas.

6. Os ensaios in vivo demonstram que o TF é um agente útilpara o tratamento anti-hemorrágico tópico em ratos docontrole (por meio de aplicação direta sozinha ou emcombinação com NCIS no vaso sangüíneo previamente seccionado)

6.1 O TF lipidizado (sozinho ou combinado com a NCIS) é útilcomo um agente hemostático tópico em um modelo animal dehemorragia grave pela seção proximal da cauda do rato.

6.2 O TF lipidizado é útil como um agente hemostático tópicoem um modelo animal de hemorragia grave tratado previamentecom heparina ou varfarina.6.3 O TF lipidizado é útil como um agente hemostático tópicoem um modelo animal de hemorragia fatal pela seção proximalda cauda do rato.

I. MATERIAIS E MÉTODOS

Materiais

Como uma fonte de TF lipidizado, foram utilizadoso Fator de Tecido recombinante humano (rTF), Thromborel® S eNeoplastin® Plus. Os seguintes preparados comerciais foramespecificamente utilizados: Fator de tecido recombinantehumano (Não-lipidizado) (American Diagnostica, EUA),relipidizado seguindo o método descrito por Morrissey;tromboplastina placentária humana liofilizada contendo cálcio(Thromborel® S, Dade Behring, Inc.); cérebro de coelholiofilizado contendo cálcio (Neoplastin® Plus, DiagnosticaStago-Roche).

A atividade pró-coagulante da proteína do TF foideterminada por uma curva padrão utilizando como material dereferência um TF lipidizado recombinante humano (AmericanDiagnostica, EUA) e foi expressa no texto como ]iq de proteínaativa/ml e nas tabelas como pg/ml. Para fins de simplicidade,neste exemplo, os termos rTF ou TF referem-se ao TFlipidizado, a menos que esteja indicado de alguma outramaneira. Os compostos comerciais da Haematologic Technologiesforam utilizados como fontes de FXa, FII e FVa. 0 reagenteCommercial Dade® Actin® FS (Dade Behring) foi utilizado comoa NCIS. Os plasmas deficientes no fator de coagulaçãocomerciais (FV, FVII1 FVIII, FIX, FX, FXI, FXII e FXIII)foram adquiridos junto à Dade Behring Marburg GmbH.

Métodos

0 Método para a Relipidação do TF nas Vesículas do LipídioUtilizando a Diálise com Octilglicosídeo (Método de Morrisey)

O TF não-lipidizado é incorporado nas vesículas dolipídio utilizando o detergente não-iônico N-octil-beta-D-glicopiranosídeo (octilglicosídeo). 0 TF e os lipídios sãodissolvidos no octilglicosídeo formando as micelas. 0octilglicosídeo pode ser facilmente removido da solução pormeio de diálise devido à sua concentração de micelasessencial elevada (CMC = 2 0 a 50 mM) . Quando ooctilglicosídeo é removido, os lipídios são organizados nasvesículas unilamelares. O TF é embebido nestas vesículas emvirtude de seu domínio de transmembrana. Normalmente, 50 a80% das moléculas do TF são arranjadas voltadas para fora dasvesículas.

Tampões e soluções de partida

Octilglicosídeo (n-octil-beta-D-glicopiranosídeo) junto àCalbiochem.Lipídios:

Lipídio Concentração Peso molecular

PC L-alfa-fosfatidilcolina 10 ou 25 mg/ml 761

PS L-alfa-fosfatidilserina,sal de sódio de cérebro bovino 10 mg/ml

810

PE L-alfa-fosfatidiletanolamina,

fígado de bovino 10 mg/ml 768

Tampões:HBS

100 mM de NaCl 20 mM de Hepes/NaOH, pH 7,5, 0,02% (m/v) de

azida sódica

HBSA (manter a 4°C)

Albumina de soro bovino em 0,1% (m/v) de HBSOG/HBS (preparar no momento do uso)

n-octil-beta-D-glicopiranosídeo em 100 mM de HBS (29,2 mg deOG/ml de HBS)

Preparação da solução de lipídio em octilglicosídeo (OG)

1. 2,6 micromoles de lipídios totais são preparadospara cada amostra em um tubo de vidro, utilizando o raiomolar do lipídio desejado.

2. Secar a mistura do lipídio sob uma corrente deargônio ou nitrogênio.

3. Quando o tubo parecer estar seco, secar avácuo por mais sessenta minutos.

4. Adicionar 400 μl de uma solução fresca deOG/HBS (à temperatura ambiente) ao tubo que contém oslipídios secos.

Para as vesiculas de PC:PS (relação molar de 80:20)

62 μl de PC (em 25 mg/ml) = 1,58 mg =2,08 mmol

42 μl de PS (em 10 mg/ml) = 0,42 mg = 0,52 mmol

Para as vesiculas de PC:PE:PC (relação molar de 40:40:20)

32 μl de PC (em 25 mg/ml) = 0,79 mg =1,04 mmol

80 μl de PE (em 10 mg/ml) = 0,80 mg =1,04 mmol

42 μl de PS (em 10 mg/ml) = 0,42 mg =0,52 mmol

Relipidação

Adicionar a quantidade desejada de TF ao tubo quecontém 400 μl de OG/lipídios e HBSA suficiente até completaro volume final de 1 ml. Executar essa etapa à temperaturaambiente.

Obtenção de suspensões de plaquetas lavadas

As suspensões de plaquetas lavadas foram preparadasde acordo com o método descrito por Radomski M. et al.(Radomski M, Moncada S.; 1983 Thromb Res. 15; 30 (4) : 383-9) .Este é um método aprimorado para a lavagem de plaquetashumanas com prostaciclina a partir de extrações de sangue(3,15% de citrato de sódio) de voluntários saudáveis. Oprocessamento dos espécimes foi realizado sempreimediatamente depois da extração de sangue e à temperaturaambiente. Os estados de ativação e de funcionalidade deplaquetas foram testados por meio de ensaios de agregaçãoantes e durante o desempenho dos ensaios. A auto-ativação e afuncionalidade foram estimadas por meio da ativação com umagonista conhecido (colágeno).Ensaios in vitroEnsaios cromogênicos

Diferentes ensaios cromogênicos foram projetados nasolução e em suspensões ativadas por plaquetas parademonstrar o efeito do rTF na atividade proteolítica do fator Xa.

A atividade amidolítica de FXa foi determinada pormeio de um ensaio cromogênico utilizando S-2765 (Chromogenix)como o substrato cromogênico para FXa, ao passo que aatividade de formação de trombina foi analisada utilizando S-2238 (Chromogenix) como o substrato cromogênico para a trombina.

Os ensaios cromogênicos foram realizados emsuspensão (em tampão) e foram utilizadas suspensões deplaquetas lavadas. Volumes apropriados de cada um dos fatoresa serem estudados foram aplicados em uma placa de ELISA e, nocaso de utilizar a suspensão de plaquetas lavadas, em umvolume apropriado para se obter uma concentração de 250.000plaquetas/μΐ no meio. Finalmente, a adição do substratocromogênico específico permitiu a quantificação da atividadeproteolítica em questão por meio de leiturasespectrofotométricas em 4 05 nm. Nos ensaios para determinar aatividade amidolítica, somente o FXa e concentraçõesdiferentes de rTF foram aplicados, ao passo que nos ensaiospara a determinação da atividade de formação de trombina foinecessária a adição do fator II (protrombina) e FVa (esteúltimo somente no caso de ensaios em suspensão, uma vez quenos ensaios de plaquetas lavadas estes já continham FVaendógeno).

Ensaios de coagulação no plasma

A atividade pró-coagulante espontânea (não-estimulada) no plasma foi medida por meio de um ensaio decoagulação com uma determinada etapa em um coagulômetro(temporizador de coagulação Fibrintimer BFT-IIi Dade-Behring,Alemanha). Resumidamente, 50 μΐ de plasma pobre em plaquetasforam adicionados às cubetas já moderadas e 50 μΐ de águadestilada foram adicionados. Essa mistura foi colocada paraincubar por 60 segundos a 37°C e 50 μΐ de cloreto de cálcio25 mM foram adicionados imediatamente e o tempo de coagulaçãofoi determinado em segundos no coagulômetro, verificado pelaformação de coágulos. Cada uma das amostras foi testada emduplicata. Os plasmas pobres em plaquetas foram obtidos peloprocedimento de centrifugação e o número de plaquetas foideterminado por Coulter.

Ensaios de coagulação no sangue integral

A atividade pró-coagulante no sangue integral não-anticoagulado foi determinada por meio de um método decoagulação. Os diferentes agentes a serem estudados foramadicionados a 1 ml de sangue integral não-anticoagulado e otempo de coagulação foi medido com um cronômetro do início daextração até que um coágulo de sangue estável e consolidadoaparecesse. 0 efeito dos diferentes agentes foi avaliado pormeio de seus tempos de coagulação sangüínea diminuídos ouaumentados.

Ensaios in vivo

Modelo de hemorragia grave pela seção proximal da cauda de rato

Vinte e três ratos Sprague-Dawley machos pesando350-450 gramas foram distribuídos aleatoriamente em trêsgrupos de tratamento: um grupo de controle, composto decatorze animais que receberam o tratamento tópico com soluçãosalina fisiológica, sendo que outros dois grupos, tambémcompostos de cinco animais receberam tratamento tópico com1,2 pg/ml de rTF e η = 4 receberam tratamento tópico com 1,2pg/ml de rTF + NCIS (vol:vol 1:2), respectivamente. Todos oscompostos entraram em contato tópico com a seção proximal dacauda do animal ao agir hemostasticamente aplicado por umapipeta de Eppendorf de plástico. A formação de coáguloestável e consolidado foi evidenciada por meio da confirmaçãode nenhum sangramento adicional.

Modelo de hemorragia grave pela seção proximal da cauda derato em animais tratados com drogas anticoagulantes

Vinte e sete ratos Sprague-Dawley machos pesando350-4 50 gramas foram distribuídos aleatoriamente em cincogrupos de tratamento: um grupo de controle, composto decatorze animais que receberam tratamento tópico com soluçãosalina fisiológica. Dois grupos receberam 200 U/Kg daheparina i.v. quinze minutos antes para começar oprocedimento de transecção da cauda (a serem tratados com TFη = 3 e a serem tratados com solução salina η = 5) e outrosdois grupos receberam 0,1 mg/kg/dia de varfarina via oraldurante três dias antes para começar o procedimento detransecção da cauda (a serem tratados com TF η = 3 e a seremtratados com solução salina, η = 2). 0 tratamento tópico com1,2 pg/ml de rTF foi administrado a somente um de cada grupode tratamento. Portanto, havia um grupo de controle tratadopara cada tratamento de anticoagulação. 0 TF lipidizadoentrou em contato tópico com a seção proximal da cauda doanimal para agir hemostasticamente dispensado por uma pipetaplástica de Eppendorf. A formação de coágulo estável econsolidado foi evidenciada por meio da confirmação de nenhumsangramento adicional.

Modelo de hemorragia fatal pela punção na artéria carótida deratos

Cada um de quatro ratos Sprague-Dawley machospesando 350-450 gramas foi distribuído aleatoriamente em doisgrupos de tratamento incluindo dois animais. Os animais dogrupo de controle receberam a solução salina fisiológica comotratamento, sendo que o outro grupo recebeu o TF lipidizadoadministrado topicamente (na dose final de 2 pg de proteínaativa). O modelo de hemorragia fatal pela punção na artériacarótida de ratos foi realizado depois dos procedimentospadrão. O TF lipidizado e a solução salina fisiológica foramadministrados diretamente no ponto da punção em uma bandagemcontendo 3 ml de cada. Isto foi combinado com a pressão e ocontato do tratamento correspondente durante dois minutos.

II. RESULTADOS

1. Os ensaios in vitro demonstram que o TF lipidizado(sozinho e combinado) age como um estimulador direto de FXa,causando a formação de coágulo de fibrina e a coagulaçãosangüínea na ausência de FVII (causada por ausência,deficiência ou imunobloqueio)

1.1 O TF lipidizado aumenta a atividade proteolítica de FXae conseqüentemente a produção de trombina na ausência de FVII

Diversos ensaios in vitro foram executados a fim deavaliar a capacidade do TF lipidizado como um agenteestimulante do fator Xa na ausência de FVII: (i) ensaioscromogênicos para a atividade amidolítica de FXa em solução;e (ii) ensaios cromogênicos para a atividade de formação detrombina em suspensão de plaquetas lavadas.

Ensaios cromogênicos para a atividade amidolítica de FXa

Ensaios diretos para a atividade amidolítica de FXaem solução utilizando o substrato específico de FXa S-2765demonstraram que o TF lipidizado pode aumentar muitosignificativamente a atividade proteolítica de FXa. Napresença de concentrações de rTF elevadas (1 pg/ml), foiobservado um aumento da atividade produzido por concentraçõesbaixas e elevadas de FXa (p < 0,001). Efeitos estimulantessignificativos similares (p < 0,001) foram observados napresença de concentrações de TF lipidizado mais baixas (0,1pg/ml). A Tabela 1 mostra os resultados obtidos em cincoexperiências independentes.Tabela 1

TF lipidizado, na ausência de FVII, aumenta a atividadeproteolítica de FXa na ausência de FVII

<table>table see original document page 65</column></row><table>

Ensaios cromogênicos para a atividade de formação de trombinaem suspensões de plaquetas lavadas

o efeito pró-coagulante detectado foi muito maiorquando as suspensões de plaquetas foram utilizadas como fonteda superfície pró-coagulante e a formação de trombina foideterminada por meio do substrato específico S-2238 (Tabela2) . Na ausência de FXa exógeno, o TF lipidizado produziu um efeito estimulante significativo na formação de trombina (p <0,001). Efeitos estimulantes similares foram observados napresença de FXa exógeno em concentrações baixas e elevadas (p< 0,001).

Tabela 2

TF lipidizado induz a formação de trombina em plaquetaslavadas na presença de FII, mas na ausência de FVa (jápresente nas plaquetas) e de FVII

<table>table see original document page 65</column></row><table>

1.2 O TF lipidizado pode coagular o plasma e o sangue dospacientes com deficiência de FVII (ensaios de coagulação noplasma e no sangue integral não-anticoagulado) .

Uma série de ensaios de coagulação in vitro foiexecutada, a qual mostra o efeito coagulante do TF lipidizadono plasma e no sangue integral não-anticoagulado dospacientes com deficiência de FVII e, portanto, o TFlipidizado é um agente útil para o tratamento anti-hemorrágico.

Ensaios de coagulação no plasma e no sangue integral não-anticoagulado comercialmente esgotado de FVII dos pacientescom deficiência de FVII

O efeito do TF lipidizado na coagulação foiinvestigado por meio de ensaios de coagulação utilizando oplasma e o sangue integral não-anticoagulado de doispacientes com deficiência de FVII (Tabela 3). O TFlipidizado, de uma maneira dependente de concentração, pôdeacelerar significativamente a coagulação em plasmasdeficientes em FVII. Da mesma maneira, o sangue integral não-anticoagulado dos pacientes com deficiência de FVII tambémfoi coagulado na presença de concentrações baixas, médias eelevadas de TF lipidizado, indicando que pode produzir umacoagulação normal pelo TF lipidizado até mesmo na ausência deFVII. A Tabela 3 mostra os resultados obtidos de cincoexperiências independentes para plasmas esgotados de FVII.

Tabela 3

Demonstração do efeito pró-coagulante do TF lipidizado emplasmas deficientes em FVII

<table>table see original document page 66</column></row><table>O efeito do TF lipidizado no sangue do voluntáriosaudável era significativo após a concentração de 0,01 pg/ml,ao passo que concentrações maiores eram necessárias nospacientes com deficiência de FVII (Tabela 4). Embora efeitospró-coagulantes significativos (p < 0,001) detectados após0,1 pg/ml, o TF lipidizado pôde normalizar o tempo decoagulação na concentração de 0,01 pg/ml, não havendo nenhumadiferença entre os tempos de coagulação detectados emindivíduos normais em condições basais e nos indivíduos comdeficiência de FVII com a dita concentração de TF lipidizado.Finalmente, embora o TF lipidizado em 1 ug/ml não pudesseinduzir o mesmo efeito pró-coagulante forte no plasmaesgotado de FVII, um efeito muito significativo foiobservado, que indicou que o TF lipidizado pode normalizar ahemostasia nestes pacientes.

Tabela 4

Efeito pró-coagulante do TF lipidizado no sangue integralnão-anticoagulado de indivíduos saudáveis e com deficiênciade FVII

Basal rTF

0,01 ng/ml 0,1 ng/ml 1 ng/ml 10

ng/ml 100 ng/mlAmostra de controle n°15,8 4,7 4,4 3,1

2.1 1,3Amostra de controle n°27,2 6,7 5,5 3,7

2,1 1,0Paciente n° 6 deficienteem FVII 11,4 n.d. 10,5 9,5

5.2 2,3Paciente n° 7 deficienteem FVII 12,5 n.d. 11,3 10,5

6.3 3,1n.d. não determinado.1.3 O TF lipidizado pode coagular o plasma de indivíduossaudáveis na presença de um anticorpo monoclonal contra FVII(ensaios de coagulação).

Ensaios de coagulação in vitro foram executados, osquais mostram o efeito coagulante do TF lipidizado no plasmaem indivíduos saudáveis na presença de um anticorpomonoclonal contra FVII (este anticorpo pode obstruir acoagulação em plasmas normais).

Ensaios de coagulação no plasma normal esgotado de FVII pelaobstrução com anti-FVII

O efeito do TF lipidizado na coagulação do plasmafoi investigado por meio de ensaios de coagulação utilizandoplasmas de voluntários saudáveis na presença de um anticorpomonoclonal contra FVII (Tabela 5). 0 TF lipidizado pôdecausar a coagulação até mesmo na presença de um anticorpomonoclonal contra FVII, (que pode inibir completamente acoagulação sangüínea). Sob estas condições experimentais,(tal como as amostras com deficiência de FVII), o TFlipidizado pode produzir a coagulação do plasma.

Tabela 5

Demonstração do efeito pró-coagulante do TF no plasma normalna presença de um anticorpo monoclonal contra FVII

<table>table see original document page 68</column></row><table>

1.4 A combinação de TF lipidizado e NCIS aumentasinergisticamente a coagulação sangüínea em plasmasdeficientes em FVII (ensaios de coagulação)

Uma série de ensaios de coagulação in vitro foiexecutada, a qual mostra o efeito coagulante do TF lipidizadoassociado com as superfícies inorgânicas negativamentecarregadas [NCIS] no plasma deficiente em FVII. O dito efeitopró-coagulante excedeu o efeito obtido quando o TF lipidizadofoi utilizado sozinho como um agente pró-coagulante. Essesresultados mostram que o efeito mediado pelo TF lipidizado éindependente de FVII e pode induzir a coagulação do plasmaaté mesmo na ausência de seu ligando especifico. A Tabela 6mostra os resultados obtidos em cinco experiênciasindependentes.

Tabela 6

Efeito pró-coagulante do rTF associado com superfíciesinorgânicas negativamente carregadas em plasmas heparinizadose deficientes no fator de coagulação

<formula>formula see original document page 69</formula>

Plasma deficiente em FVII > 300 67 ± 11 32 ± 3,4*

1.5 A combinação de TF lipidizado e FXa aumentasinergisticamente a coagulação sangüínea na presença deanticorpo monoclonal contra FVII (ensaios de coagulação emplasmas deficientes em FX).

Os efeitos pró-coagulantes da associação de TFlipidizado e FXa em baixas concentrações (170 pM e 1700 pM)na ausência de FVII foram investigados no plasma deficienteem FXa imunobloqueado com anti-FVII (Tabela 7).

Tabela 7

Efeito pró-coagulante do TF lipidizado associado com FXa noplasma deficiente em FXa na ausência de FVII (imunobloqueadocom anti-FVII)

Plasma deficiente em FXa Tempo de coagulação (s)

Sem FXa Com FXa (1.700 Pm) Com FXa (17 0 pM)Basal (5 mM de cálcio)

> 400

133 ± 18

290 ± 10,2Mais rTF 1 μ9/τη1

253,5 ± 11 83,1 ± 3,2*

124 ± 6,1*

Mais rTF 1 μ9/πι1 + anti FVII (400 μ9/πι1) 234,5 ± 9

78 ±

2*

124 ± 6,1*

Média ± SEM (n = 5); *p < 0,001 sem FXa versus FXa. t-Student.

1.6 A combinação de TF lipidizado, FXa e NCIS aumentasinergisticamente a coagulação na presença do anticorpo anti-FVII (ensaio de coagulação em plasmas deficientes em FX) .

lipidizado, FXa em baixas concentrações (170 pM e 1700 pM) eNCIS também foram investigados no plasma deficiente em FXa(Tabela 8).

Tabela 8

Efeito pró-coagulante do rTF associado com FXa e NCIS noplasma deficiente em FXa

Plasma deficiente em FXa Tempo de coagulação (s)

Com NCIS (1 μΐ) Com

Os efeitos pró-coagulantes da associação de TF

Basal (5 mM de cálcio)

290 ± 10,2rTF 1 μg/ml + FXa (170 pM)

NCIS (2 μΐ)> 400

> 400

124 ± 6,1*

109 ± 4,1*

84 ± 3*

rTF 1 μπ/πιΐ + FXa (1.700 pM) 83,1 ± 3,2* 65,5 ± 5,2*

45,5 ± 3,2*

rTF 1 μg/ml + FXa (170 pM + anti 119 ± 5* 101 ± 5*± 3*

99

FVII (400 μg/ml)rTF 1 μ9/πι1 + FXa (1.700 pM + 78 ± 2 27,7 + 1,2

25 ± 2

anti FVII (400 μ9/πι1)

Média SEM (η = 5) ; * ρ < 0,001 sem NCIS versus NCIS. t-Student.

2. Os ensaios in vitro demonstram que a combinação de TFlipidizado com FXa em baixas concentrações (que não consegueminduzir quaisquer efeitos pró-coagulantes) causa a coagulaçãode plasmas deficientes em FX

2.1 O TF lipidizado age como um estimulador de FXa quandoessa protease de serina está presente em baixasconcentrações.

Ensaios de coagulação in vitro foram executados noplasma deficientes em FX de coagulação para mostrar que oefeito sinergístico do TF lipidizado em FXa (adicionado embaixas concentrações, 170 pM e 1.700 pM, ao plasma deficienteem FX, portanto, esses plasmas não conseguem produzir FXa apartir de qualquer via de coagulação). Os efeitos pró-coagulantes da associação de TF lipidizado e FXa em baixasconcentrações é mostrado na Tabela 9.

Tabela 9

Efeito pró-coagulante do TF lipidizado associado com o FXa emplasma deficiente em FXa

Plasma deficiente em FX Tempo de coagulação (s)

<table>table see original document page 71</column></row><table>

2.2 A combinação de TF lipidizado com FXa e NCIS agesinergisticamente na estimulação de FXa

Os efeitos pró-coagulantes da associação de TFlipidizado, FXa em baixas concentrações (170 pM e 1.700 pM) eNCIS também foram investigados no plasma deficiente em FX(Tabela 10).

Tabela 10

Efeito pró-coagulante de TF lipidizado associado com FXa eNCIS em plasma deficiente em FXa

Plasma deficiente em FX Tempo de coagulação (s)

<table>table see original document page 72</column></row><table>

3. Ensaios in vitro demonstram que o TF lipidizado (sozinho ecombinado) causa a coagulação em pacientes com deficiênciasde outros fatores de coagulação que não o FVII

3.1 O TF lipidizado coagula o plasma e o sangue dos pacientescom deficiências nos fatores de coagulação FV, FVIII, FVIII,FIX, FX, FXI, FXII e FXIII

O efeito pró-coagulante do TF lipidizado (sozinho)em plasmas deficientes no fator de coagulação foi investigadoutilizando plasmas comerciais esgotados por meio de técnicasde imunoafinidade, assim como o plasma de três pacientesdiagnosticados com hemofilia A (deficientes em FVIII) e doispacientes diagnosticados com hemofilia B (deficientes emFIX). A Tabela 11 mostra os resultados. Na concentração de 1pg/ml, o TF lipidizado pôde coagular eficazmente todos osplasmas com deficiências em FV, FVIII, FIX, FXi FXI, FXII eFXIII. Por outro lado, na ausência do co-fator de Fxaconhecido, FVa, o TF lipidizado também pôde produzir acoagulação do plasma, embora somente em concentraçõeselevadas e médias. Nas deficiências do fator de coagulaçãorestantes, o TF lipidizado foi eficaz em todas asconcentrações utilizadas, com resultados excelentes obtidosem concentrações muito baixas. Até mesmo na ausência de FX(1%), o TF lipidizado pôde coagular, mas somente emconcentrações elevadas. Todos esses resultados foramconfirmados com as amostras de pacientes com hemofilia A ehemofilia B.

Tabela 11

Efeito pró-coagulante do TF lipidizado em plasmas deficientesno fator de coagulação

<table>table see original document page 73</column></row><table><formula>formula see original document page 74</formula>

O efeito pró-coagulante do TF lipidizado (sozinho)no sangue integral não-anticoagulado de ser humano, depessoas que sofrem de hemofilia AeB, foi avaliado por meiode um ensaio de coagulação. A formação de coágulo foideterminada ao estimar o tempo em minutos para a consolidaçãodo coágulo. 0 efeito do TF lipidizado no sangue devoluntários saudáveis era significativo a partir deconcentrações de 0,001 pg/ml, sendo que doses maiores foramrequeridas em pacientes hemofílicos, efeitos pró-coagulantessignificativos (p<0,001) sendo detectados a partir de 0,01pg/ml. Na concentração de 0,1 pg/ml, o TF lipidizado podianormalizar completamente o tempo de coagulação, não havendonenhuma diferença entre os tempos de coagulação detectados emindivíduos normais e em indivíduos hemofílicos. A Tabela 12mostra os resultados obtidos de quatro amostras de indivíduossaudáveis (amostras números 1-4), sendo que três dospacientes sofrem de hemofilia A e dois sofrem de hemofilia B.

Tabela 12

Efeito pró-coagulante de TF lipidizado no sangue integral nãocoagulado de indivíduos saudáveis e de pacientes hemofílicos

<table>table see original document page 74</column></row><table>3,3 2,1 1,33,7 2,1 1,04,2 2,1 0,93,8 2,0 1,0

μ9/πα

Amostra de controle n° 15,8Amostra de controle n° 2 7,2Amostra de controle n° 3 7,2Amostra de controle n° 4 7,5Paciente n° 1 Hemofilia A 13,3 8,0 4,6

1,6

Paciente n° 2 Hemofilia A 17,3 9,0 5,6

1,0

Paciente n° 3 Hemofilia A 15,3 12,4 7,0

1,5

Paciente n° 4 Hemofilia B 20,5 11,1 6,1

1.5

Paciente n° 5 Hemofilia B 16,3 11,3 5,5

1.6

Tempo de coagulação (expresso em minutos) : o tempo que ocoágulo leva para consolidar em uma amostra de sangue não-anticoagulado.

3.2. O TF lipidizado coagula o sangue integral e o plasma

previamente heparinizado

0 TF lipidizado pôde coagular plasmas (tabela 13) esangue integral não-anticoagulado (tabela 14) previamenteincubado com elevadas concentrações de heparina, demonstrandoque o seu efeito em FXa é independente do efeito inibidormediado por essa droga anticoagulante e, até mesmo napresença de inibidores o tipo de heparina.

Tabela 13

<table>table see original document page 75</column></row><table>Heparina 3 U/ml > 600 58 ± 12

Tabela 14

Efeito de TF lipidizado no sangue integral heparinizado(tempo de coagulação em minutos)

<table>table see original document page 76</column></row><table>

3.3. O TF lipidizado coagula o plasma dos animais tratadoscom varfarina

O TF lipidizado pôde coagular plasmas dos ratostratados com varfarina depois do procedimento detalhado nosmétodos. Os resultados mostrados na tabela 15 indicam que atémesmo quando a síntese de todos os fatores de coagulaçãodependentes da vitamina K são abolidos, o TF lipidizado podecoagular, demonstrando que o seu efeito em FXa é independentedo efeito inibidor mediado por essas drogas anticoagulantes.

Tabela 15

Efeito de TF lipidizado no plasma de animais tratados comvarfarina (tempo de coagulação em segundos)

<table>table see original document page 76</column></row><table>

3.4. A combinação de TF lipidizado com NCIS intensificasinergisticamente a coagulação de sangue no plasma dospacientes com deficiências nos fatores de coagulação FV,FVIII, FVIII, FIX, FX, FXI, FXII e FXIII (ensaios decoagulação em plasmas deficientes em fator de coagulação) eno sangue integral de pacientes hemofílicosUma série de ensaios de coagulação in vitro foiexecutada, mostrando o efeito coagulante de TF lipidizadoassociado com NCIS no plasma dos pacientes deficientes emfator de coagulação (FV, FVII, FVIII, FIX, FX, FXI, FXII eFXIII). O dito efeito pró-coagulante excedeu aquele obtidoquando o TF lipidizado foi utilizado sozinho como um agentepró-coagulante. Até mesmo a baixas concentrações (1 pg/ml)com as quais o TF lipidizado não podia coagula o plasmadeficiente em FV (plasma FV-D), a combinação de ambos osagentes produziu um efeito pró-coagulante significativo. Domesmo modo, efeitos sinergísticos similares foram obtidosquando o plasma deficiente em FVII (plasma FVII-) foiutilizado. Esses resultados mostram que o efeito mediado peloTF lipidizado é independente de FVII e pode induzir acoagulação do plasma até mesmo na ausência de FV.

Analogamente, a combinação (TF lipidizado + NCIS) tambémexerceu potentes efeitos pró-coagulantes em amostras doplasma de pacientes hemofílicos (A e Β) . A tabela 16 mostraos resultados obtidos em cinco experiências independentes.

Tabela 16

Efeito pró-coagulante de rTF associado com NCIS em plasmasdeficientes em fator de coagulação

<table>table see original document page 77</column></row><table><table>table see original document page 78</column></row><table>

O efeito pró-coagulante no sangue integral não-anticoagulado da combinação de TF lipidizado e NCIS tambémfoi investigado por meio de ensaios de coagulação utilizandoo sangue dos pacientes que sofrem de hemofilia A (trêspacientes) e B (três pacientes) . Por meio da comparação comos ensaios em que TF lipidizado estava sozinho (tabela 12), oefeito pró-coagulante da associação (rTF + NCIS) foisignificativamente (p < 0,001) maior (tabela 17).

Tabela 17

Efeito pró-coagulante de rTF em conjunto com NCIS no sangueintegral

<table>table see original document page 78</column></row><table>

Tempo de coagulação (expresso em minutos) : o tempo que ocoágulo leva para consolidar em uma amostra de sangue não-anticoagulado.

4. Os ensaios in vitro demonstram que o TF lipidizado(sozinho e combinado) causa a coagulação de sangue emindivíduos saudáveis4.1. O TF lipidizado coagula o plasma e o sangue deindivíduos saudáveis

Uma série em ensaios de coagulação in vitro foiexecutada, mostrando o efeito coagulante de TF lipidizado noplasma e no sangue integral não-anticoagulado de voluntáriossaudáveis sem históricos de distúrbios hemostásicos. A tabela18 mostra os resultados obtidos de cinco experiênciasindependentes em plasmas saudáveis e a tabela 19 no sangueintegral não-anticoagulado.Tabela 18

Efeito pró-coagulante de TF lipidizado no plasma deindivíduos saudáveis

Plasma normal Tempo de coagulação (s)

Basal 281 ±12,5

rTF 0,00001 μg/ml 201 ± 12,2

rTF 0,0001 μg/ ml 184 ±5,8

rTF 0,01 μ9/πι1 73,5 ± 2,3

rTF 0,1 μ9/πι1 28,6 ± 0,1

rTF 1 μ<3/τη1 16, 4 ± 0,9

Média ± SEM (n = 5)

O TF não lipidizado nas mesmas concentrações não pôdemodificar o tempo de coagulação.Tabela 19

Efeito pró-coagulante do TF no sangue anticoagulado deindivíduos saudáveis

Basal rTF 0,01 μg/ml 0,01 μg/ml 1 μ9/πι1 Amostra n° 1 5,8 3,3 2,1Amostra n° 2 7,2 3,7 2,1Amostra n° 3 7,2 4,2 2,1Amostra n° 4 7,5 3,8 2,04.2 A combinação de TF lipidizado com NCIS

1,31,00,91,0sinergisticamente a coagulação de sangue no plasma e nosangue de indivíduos saudáveis. Há uma ausência de efeitossinérgicos quando o TF lipidizado é associado comfosfolipídios.

Uma série em ensaios de coagulação in vitro foiexecutada, mostrando o efeito coagulante do rTF associado comNCIS no plasma de voluntários saudáveis. A tabela 20 mostraos resultados obtidos de cinco experiências independentes.Por meio da comparação com os ensaios em que o rTF estavasozinho, o efeito pró-coagulante da associação (rTF + NCIS)foi significativamente maior (p < 0,001) em cada uma dasconcentrações empregadas.

Tabela 20

Efeito pró-coagulante de TF lipidizado associado com NCIS noplasma normal

<table>table see original document page 80</column></row><table>

Média ± SEM (n = 5); *p < 0,001 sem NCIS versus com NCIS; t-Student.

A tabela 21 mostra a ausência de efeitos sinérgicosquando o TF lipidizado é associado com fosfolipídios. (0,66mM de PC/PS; fosfatidil colina/fosfatidil serina a uma razãomolar diferente).

Tabela 21

Efeito de fosfolipídios lipidizados sobre a atividade pró-coagulante de TF<table>table see original document page 81</column></row><table>

5. Os ensaios in vitro demonstram o efeito coagulante de TFlipidizado (sozinho e combinado) no sangue dos pacientes comdistúrbios de plaquetas congênitos e adquiridos(trombocitopênicos).

5.1. O TF lipidizado coagula o sangue integral de pacientescom distúrbios de plaquetas congênitos

O efeito pró-coagulante de TF lipidizado nacoagulação do sangue nos pacientes com distúrbios deplaquetas foi investigado por meio de ensaios de coagulaçãoutilizando o sangue de dois pacientes que sofrem de mal deGlanzmann e da síndrome de Bernard Soulier. 0 rTF pôdeacelerar de uma maneira muito significativa, e de uma maneiradependente da concentração, a coagulação de sangue nosindivíduos que sofrem do mal de Glanzmann e da síndrome deBernard Soulier (tabela 22) ; o rTF é, portanto, um agenteútil para o tratamento anti-hemorrágico dos ditos indivíduos.

Tabela 22

Efeito pró-coagulante do TF nos pacientes com distúrbios deplaquetas

<table>table see original document page 81</column></row><table><table>table see original document page 82</column></row><table>

5.2. A combinação de TF lipidizado com NCIS aumenta acoagulação no sangue integral de pacientes com distúrbios deplaquetas congênitos

Uma série de ensaios de coagulação in vitro foiexecutada, mostrando o efeito coagulante do rTF associado comNCIS no sangue integral de pacientes com distúrbios deplaquetas congênitos. A tabela 23 mostra os resultadosobtidos de dois pacientes com mal de Glanzmann e Sindrome deBernard-Soulier. Por meio da comparação com os ensaios em queo rTF estava sozinho, o efeito pró-coagulante da associação(rTF + NCIS) foi significativamente maior (p < 0,001) em cadapaciente.

Tabela 23

Efeito pró-coagulante do rTF em conjunto com NCIS no sangueintegral

<table>table see original document page 82</column></row><table>

Tempo de coagulação (expresso em minutos) : o tempo que ocoágulo leva para consolidar em uma amostra de sangue não-anti coagulado. * ρ < 0,001 sem NCIS versus com NCIS. t-Student.

5.3. O TF lipidizado coagula amostras trombocitopênicas

Uma série de ensaios de coagulação in vitro foiexecutada, mostrando o efeito coagulante de TF lipidizado nosplasmas com contagem de plaquetas diferentes. A tabela 24mostra os resultados obtidos da contagem de plaquetas normalpara as condições trombocitopênicas.

Tabela 24

<table>table see original document page 83</column></row><table>

6. Os ensaios de vivo que demonstram que o TF é um agenteútil para o tratamento anti-hemorrágico tópico em ratos decontrole (mediante a aplicação direta no vaso sangüíneopreviamente seccionado)

6.1. O TF lipidizado é útil como um agente hemostático tópicoem um modelo animal de hemorragia grave pela seção proximaldas caudas de ratos

Os ensaios in vivo foram executados, mostrando queo TF lipidizado administrado sozinho ou associado com NCIS éum agente útil para o tratamento anti-hemorrágico tópico. Ouso de TF lipidizado como um agente hemostático tópicoadministrado sozinho ou combinado com NCIS foi avaliado pormeio do uso de uma hemorragia grave em um modelo animal pelaseção proximal das caudas de ratos. Os resultados obtidos sãomostrados na tabela 25. Conforme pode ser observado, no ditomodelo de hemorragia grave, a hemorragia coagulouespontaneamente nos animais de controle (PSS Controle,tratados com uma solução salina fisiológica) a 18,1 ± 5,98minutos; no entanto, a administração tópica de rTF lipidizadortf (sozinho) produziu uma redução significativa (11,1 ± 5,54minutos, ρ < 0,001). Quando o rTF foi administrado emcombinação com NCIS, o efeito pró-coagulante foi ainda maior(5,0 ± 1,1 minutos; ρ < 0,001).

Tabela 25

Modelo de hemorragia grave pela seção proximal das caudas deratos

<table>table see original document page 84</column></row><table>

Os resultados são expressos como o tempo em minutos paraatingir a coagulação consolidada.

Sob as mesmas condições experimentais, o TF não-lipidizado (n = 3) foi avaliado. Nenhum efeito foi observadoe o tempo de coagulação do sangramento era similar àquele dosanimais de controle. Esses resultados indicam que o TF não-lipidizado não era útil no tratamento de episódios desangramento tópico.

6.2 O TF lipidizado é útil como um agente hemostático tópicoem um modelo animal de hemorragia grave tratado previamentecom heparina ou varfarina

Os ensaios in vivo foram executados, mostrando queo TF lipidizado administrado sozinho é um agente útil para otratamento antihemorrãgico tópico em condiçõesanticoagulantes (tabela 25). O uso de TF lipidizado como umagente hemostático tópico administrado sozinho foi avaliadopor meio do uso de uma hemorragia grave em um modelo animalpela seção proximal das caudas de ratos tratadas previamentecom 200 U/Kg de heparina i.v. quinze minutos antes de começaro procedimento de transecção das caudas, ou com 0,1 mg/kg/diade varfarina oralmente durante três dias antes de começar oprocedimento de transecção das caudas. Os resultados obtidossão mostrados na tabela 26. Conforme pode ser observado, nodito modelo de hemorragia grave, o grupo de solução salina decontrole, tratado com a solução salina fisiológica, coagulouespontaneamente em 18,1 ± 5,98 minutos. A hemorragia do grupode controle tratado com heparina não coagulou espontaneamente(> 90 minutos). O grupo de controle tratado com varfarinacoagulou espontaneamente em 41,6 ±8,5 minutos. A tabela 26mostra que a administração tópica de TF lipidizado (sozinho)produziu uma redução significativa em todos os grupos detratamento.

Tabela 26

Modelo de hemorragia grave pela seção proximal das caudas deratos em animais tratados anticoagulados

<table>table see original document page 85</column></row><table>

Os resultados são expressos como o tempo em minutos paraatingir a coagulação consolidada.

6.3. O TF lipidizado é útil como um agente hemostático tópicoem um modelo animal de hemorragia letal pela perfuração naartéria carótida

Os ensaios in vivo foram executados, mostrando queo rTF administrado sozinho é um agente útil para o tratamentoanti-hemorrágico tópico aplicado diretamente no vasosangüíneo. 0 uso do rTF administrado sozinho foi avaliado pormeio do uso de uma hemorragia letal em um modelo animal pelaperfuração na artéria carótida. Os resultados obtidos sãomostrados na tabela 27 e foram muito significativos. Conformepode ser observado, no grupo de animais de controle, (PSSControle, tratados com a solução salina fisiológica), todosos animais morreram de sangramento, ao passo que no grupo deTF lipidizado nenhum animal morreu e a seção pôde ser vedadae coagulada com sucesso em todos os casos. 0 tratamento foieficaz em termos do tempo necessário para atingir acoagulação e a vedação estáveis do ferimento da perfuração.

Tabela 27

Modelo de hemorragia letal pela perfuração na artériacarótida de ratos

<table>table see original document page 86</column></row><table>

Os resultados são expressos como o tempo em segundos paraatingir a coagulação consolidada e a vedação do ferimento daperfuração. O rTF é administrado tal como indicado no textona dose de 2 pg de proteína ativa).

Em conclusão:

Os resultados do Exemplo número 1 demonstram claramente que:

1) Na ausência de seu ligando, FVII, o TF lipidizado podeinteragir diretamente com o FXa, aumentandosignificativamente a sua atividade proteolítica (tantoamidolítica quanto de formação de trombina), este resultadomostra pela primeira vez um novo papel para o TF lipidizado,agindo como um novo co-fator para FXa (independente do FVabem conhecido).

2) O TF lipidizado pode coagular plasmas defeituosos em FVII.Portanto, o TF lipidizado é uma boa alternativa para otratamento desses pacientes (atualmente o único tratamento éo FVIIa recombinante humano dispendioso).

3) O TF lipidizado age sinergisticamente com NCIS e FXa (abaixas concentrações sem poder produzir a coagulação).

Os resultados do Exemplo número 2 demonstram claramente que:

1) O TF lipidizado faz com que as concentrações de FXafisiológico, que não podem produzir nenhum efeito pró-coagulante significativo, ativem a hidrólise da protrombinae, conseqüentemente, ocorre a formação de trombina.

2) O TF lipidizado tem um novo papel agindo como um co-fatorpara todas as atividades proteolíticas de todas as formas deFXa (solúveis e ligadas ao complexo de protrombinase) .

3) Até mesmo os plasmas defeituosos em FX (que contêmresquícios de FX) podem ser coagulados pelo TF lipidizado.Portanto, o TF lipidizado é uma boa alternativa para otratamento desses pacientes.

4) O TF lipidizado age sinergisticamente com NCIS no efeitoda estimulação da atividade de FXa.

Os resultados do Exemplo número 3 demonstram claramente que:

1) O TF lipidizado pode causar a coagulação de sangue nospacientes hemofílicos (FVIII, FIX e FXI) . Portanto, o TFlipidizado é uma boa alternativa para o tratamento dessespacientes.

2) O TF lipidizado pode causar a coagulação de sangue atémesmo na ausência de FV. Esses resultados mostram claramenteque o TF lipidizado causa um forte efeito estimulador em FXa,porque na ausência de seu co-fator (plasmas deficientes emFV), o TF lipidizado age como co-fator, causando o mesmoefeito estimulador.3) O TF lipidizado pode causar a coagulação de sangue atémesmo nos plasmas defeituosos em FX (que contêm resquícios deFX) . Portanto, o TF lipidizado é uma alternativa para otratamento desses pacientes.

4) O TF lipidizado pode causar a coagulação de sangue nosplasmas tratados com heparina e varfarina, indicando que o TFlipidizado interfere no efeito da antitrombina III eprovavelmente embora o seu efeito estimulador emconcentrações basais pode coagular até mesmo em condiçõestratadas com varfarina.

5) Finalmente, o TF lipidizado age sinergisticamente com NCISno efeito pró-coagulante observado em todas as deficiênciasdo fator de coagulação.

Os resultados do Exemplo número 4 demonstram claramente que:

1) O TF lipidizado pode causar a coagulação de sangue emindivíduos saudáveis. Portanto, o TF lipidizado é uma boaalternativa para o tratamento de episódios de sangramento emindivíduos saudáveis.

2) O TF lipidizado age sinergisticamente com NCIS mas nãoapenas com os fosfolipídios no efeito pró-coagulanteobservado em indivíduos saudáveis.

Os resultados do Exemplo número 5 demonstram claramente que:

1) O TF lipidizado pode causar a coagulação de sangue nospacientes com distúrbios de plaquetas, tais como congênitos eadquiridos (isto é, a trombocitopenia). Portanto, o TFlipidizado é uma boa alternativa para o tratamento deepisódios de sangramento nos pacientes com alterações donúmero de plaquetas e/ou da funcionalidade.

Os resultados do Exemplo número 6 demonstram claramente que:

1) O TF lipidizado administrado topicamente pode parar osangramento em um modelo animal de hemorragia grave(transecção total proximal da cauda).

2) O TF lipidizado administrado topicamente pode parar osangramento em um modelo animal de hemorragia grave(transecção total proximal da cauda) complicada com terapiaanticoagulante (heparina ou varfarina).

3) O TF lipidizado administrado topicamente pode parar osangramento em um modelo animal de hemorragia letal(perfuração na artéria carótida).

Claims (29)

1. USO DE FATOR DE TECIDO (TF) LIPIDADO OU UMFRAGMENTO FUNCIONAL DO MESMO, caracterizado pelo fato deservir na manufatura de um medicamento para o tratamentotópico de hemorragias em um indivíduo.

2. USO, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que o dito indivíduo é umindivíduo saudável ou um. indivíduo com uma diátesehemorrágica, onde a dita diátese hemorrágica compreende umacoagulopatia e/ou um distúrbio de plaqueta.

3. USO, de acordo com a reivindicação 2,caracterizado pelo fato de que a dita coagulopatia é umacoagulopatia congênita ou uma coagulopatia adquirida.

4. USO, de acordo com a reivindicação 3,caracterizado pelo fato de que a dita coagulopatia congênitaé uma coagulopatia baseada em uma deficiência de um fator decoagulação escolhido entre o fator de coagulação V, o fatorde coagulação VII, o fator de coagulação VIII, o fator decoagulação IX, o fator de coagulação X, o fator de coagulaçãoXI, o fator de coagulação XII, o fator de coagulação XIII, eas combinações destes.

5. USO, de acordo com a reivindicação 3,caracterizado pelo fato de que o dito indivíduo tem umacoagulopatia adquirida produzida por um tratamentoanticoagulante com anticoagulantes.

6. USO, de acordo com a reivindicação 5,caracterizado pelo fato de que os anticoagulantes consistemem heparina, heparinas de baixo peso molecular, warfarina,derivados de cumarina ou dicumarinas.

7. USO, de acordo com a reivindicação 2,caracterizado pelo fato de que o dito indivíduo tem umdistúrbio de plaquetas congênito ou adquirido.

8. USO, de acordo com a reivindicação 7,caracterizado pelo fato de que o dito distúrbio de plaquetascongênito é selecionado entre o mal de Glanzamnn, a síndromede Bernard Soulier, a sindrome de Bolin-Jamieson, a síndromede Wiskott-Aldrich, a síndrome de Paris-Trousseau-Jacobsen, atrombocitopenia do cromossoma X, a síndrome de plaquetas deGrey, a síndrome de Sebastian e a anemia de Fanconi.

9. USO, de acordo com a reivindicação 7,caracterizado pelo fato de que o dito distúrbio de plaquetasadquirido é selecionado entre um distúrbiomieloproliferativo, tal como o trombocitemia, policitemia, ouleucemia mielocítica crônica; metaplasia mielóide;disproteinemias em escorbuto, em doença cardíaca congênita eem cirrose.

10. USO, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que o dito lipidado TF é TF humanolipidado.

11. PRODUTO, caracterizado pelo fato decompreender (i) TF lipidado e (ü) fator X de coagulação(FXa) ativado separadamente ou como uma combinação para a suaadministração simultânea ou sucessiva a um indivíduo.

12. PRODUTO, caracterizado pelo fato decompreender (!) TF lipidado e (ii) uma superfície inorgânicacarregada negativamente (NCIS) separadamente ou como umacombinação para a sua administração simultânea ou sucessiva aum indivíduo.

13. PRODUTO, caracterizado pelo fato decompreender (i) TF lipidado, (ii) Fxa, e (iü) NCISseparadamente ou como uma combinação para a sua administraçãosimultânea ou sucessiva a um indivíduo.

14. PRODUTO, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 11 a 13, caracterizado pelo fato de que o ditoTF lipidado é TF humano lipidado.

15. PRODUTO, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 11 a 14, caracterizado pelo fato de ser ummedicamento.

16. USO DE UM PRODUTO, conforme definido emqualquer uma das reivindicações 11 a 14, caracterizado pelofato de servir para a manufatura de um medicamento para otratamento de hemorragias em um indivíduo.

17. USO DE UM PRODUTO, conforme definido emqualquer uma das reivindicações 11 a 14, caracterizado pelofato de servir para a manufatura de um medicamento para otratamento tópico de hemorragias em um indivíduo.

18. COMPLEXO (TF::FXa), caracterizado pelo fato decompreender TF lipidado e FXa.

19. COMPLEXO TF::NCIS, caracterizado pelo fato decompreender TF lipidado e NCIS.

20. COMPLEXO TF::FXa:NCIS, caracterizado pelo fatode compreender TF lipidado, FXa e NCIS.

21. COMPLEXO, de acordo com qualquer uma dasreivindicações de 18 a 20, caracterizado pelo fato de ser ummedicamento.

22. USO DE UM COMPLEXO, conforme definido emqualquer uma das reivindicações de 18 a 20, caracterizadopelo fato de servir para a manufatura de um medicamento parao tratamento de hemorragias em um indivíduo.

23. USO DE UM COMPLEXO, conforme definido emqualquer uma das reivindicações de 18 a 20, caracterizadopelo fato de servir para a manufatura de um medicamento parao tratamento tópico de hemorragias em um indivíduo.

24. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, caracterizada pelofato de compreender:a) um produto de acordo com a reivindicação 11,conjuntamente com um veículo farmaceuticamente aceitável; oub) separadamente, (i) TF lipidado conjuntamentecom um veículo farmaceuticamente aceitável, e (ü) FXaconjuntamente com um veículo farmaceuticamente aceitável; ouc) um produto de acordo com a reivindicação 12,conjuntamente com um veículo farmaceuticamente aceitável; oud) separadamente, (i) TF lipidado conjuntamentecom um veículo farmaceuticamente aceitável, e (ii) NCISconjuntamente com um veículo farmaceuticamente aceitável; oue) um produto de acordo com a reivindicação 13,conjuntamente com um veículo farmaceuticamente aceitável; ouf) separadamente, (i) TF lipidado conjuntamentecom um veículo farmaceuticamente aceitável, (ii) FXaconjuntamente com um veículo farmaceuticamente aceitável, e(iii) NCIS conjuntamente com um veículo farmaceuticamenteaceitável; oug) um complexo de TF:: FXa, de acordo com areivindicação 18, conjuntamente com um veículofarmaceuticamente aceitável; ouh) um complexo de TF: =NCIS, de acordo com areivindicação 19, conjuntamente com um veículofarmaceuticamente aceitável; oui) um complexo de TF: : FXa: : NCIS, de acordo com areivindicação 20, conjuntamente com um veículofarmaceuticamente aceitável.

25. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, de acordo comreivindicação 24, caracterizada pelo fato de se apresentar emuma "forma de administração farmacêutica para a suaadministração tópica.

26. PRODUTO, caracterizado pelo fato decompreender uma composição farmacêutica conforme definido emqualquer uma das reivindicações de 24 a 25 e um suporte.

27. PRODUTO, caracterizado pelo fato decompreender uma composição farmacêutica que compreende:(i) um suporte, (ii) um produto de acordo com areivindicação 11, conjuntamente com um veículofarmaceuticamente aceitável, (iii) um produto de acordo com areivindicação 12, conjuntamente com um veículofarmaceuticamente aceitável e (iv) um produto de acordo com aveículocomumde acordocom umde acordocom umcom aveículocom aveículoreivindicação 13, conjuntamentefarmaceuticamente aceitável; ouum complexo de TF::FXareivindicação 18, conjuntamentefarmaceuticamente aceitável, ouum complexo de TF: :NCISreivindicação 19, conjuntamentefarmaceuticamente aceitável, ouum complexo de TF::FXa::NCIS de acordo com areivindicação 20, conjuntamente com um veículofarmaceuticamente aceitável.

28. USO DE TF NÃO-LIPIDADO OU UM FRAGMENTOFUNCIONAL DO MESMO, caracterizado pelo fato de servir para amanufatura de um medicamento para o tratamento de hemorragiasem um indivíduo com deficiência no fator de coagulação VII.

29. USO, de acordo com a reivindicação 28,caracterizado pelo fato de servir para a manufatura de ummedicamento para a administração parenteral de TF não-lipidado ou um fragmento do mesmo.