BRPI0616656A2 - ativador de membrana conservada de calcineurina (cmac), uma proteìna terapêutica e alvo - Google Patents

Abstract

ATIVADOR DE MEMBRANA CONSERVADA DE CALCINEURINA (cMAC), UMA PROTEìNA TERAPêUTICA E ALVO. A presente invenção refere-se à primeira função e à atividade biológica conhecidas da proteína hipotética MGC14327, agora designada cMAC, que é aqui identificada como controlador importante da ativação de células T. é contemplado aqui que cMAC é um alvo de fármaco adequado para o desenvolvimento de terapias novas para tratar distúrbios associados a cMAC. Portanto, a invenção diz respeito aos métodos para tratar as ditas condições patológicas e às composições farmacêuticas. As composições farmacêuticas compreendem moduladores com inibidor ou efeito de agonista na atividade de proteína de cMAC e/ou expressão de gene de cMAC. A invenção também diz respeito aos métodos para identificar os compostos com utilidade terapêutica para tratar as ditas condições patológicas, compreendendo identificar compostos que podem inibir ou agonizar a atividade da proteína de cMAC e/ou expressão do gene de cMAC.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "ATIVADORDE MEMBRANA CONSERVADA DE CALCINEURINA (cMAC), UMA PRO-TEÍNA TERAPÊUTICA E ALVO".

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Há muita evidência para suportar a noção que linfócitos T sãorequeridos para a progressão de doença autoimune sistêmica. Reduçãosimples em números de células T reduz a resposta imune hospedeira e me-lhora a sobrevivência em modelos animais de doença autoimune. Por exem-plo, em um modelo murino espontâneo de lúpus, a redução em células Tcom anticorpos de anticélulas T reduziu as células T circulantes, diminuiu asconcentrações de autoanticorpos, reduziu as complicações renais e melho-rou a sobrevivência dos animais (Wofsy D, Ledbettér JA, Hendler PL, Sea-man WE. (1985) Treatment of murine Iupus with monoclonal anti-T cell anti-body. J Immunol. fev;134(2):852-7).

Anticorpos que bloqueiam receptores coestimuladores de célulasT são também eficazes em prolongar a sobrevivência dos animais (Finck BK1Linsley PS, Wofsy D., (1994) Treatment of murine Iupus with CTLA4lg Sci-ence. 26 de agosto;265(5176):1225-7). Fármacos que reduzem proliferaçãoou ativação de células T são eficazes em tratar lúpus em seres humanos(ciclofosfamida, micofenolato de mofetila e cicloesporina A). Também supor-tando evidência que células T estejam envolvidas em doença autoimune emhumanos vem da observação que os pacientes de lúpus com infecções deHIV podem experimentar remissão devido à redução de células T de CD4+(Byrd VM, Sergent JS. (1996) Suppression of systemic Iupus erythematosusby the human immunodeficiency virus. J Rheumatol. jul;23(7):1295-6.)

Linfócitos T também representam um papel importante em rejei-ção de enxerto aguda. Rejeição de enxerto aguda é classicamente precedi-da pela migração de células T para o enxerto, a expansão clonal das célulasT ativadas, a proliferação de células T citotóxicas e destruição de tecidosubsequente e a perda do enxerto. A capacidade de camundongos atímicospara indefinidamente aceitar enxertos de outras espécies demonstra a im-portância particular que as células T representam em rejeição de enxerto.Igualmente, fármacos que bloqueiam respostas de células T ou eliminam ascélulas T completamente são eficazes em impedir rejeição de enxerto emhumanos (Sykes M, Auchincloss H, Sachs DH (2003) "Transplantation im-munology", em Fundamental Immunology1 ed WE Paul, Lippincott Williams &Wilkins, Filadélfia, p., 1499).

A ativação de células T puras requer estimulação do receptor decélulas T (TCR) e um receptor coestimulatório (CD28). Engaste de T-CR/CD28 ativa uma cascata de sinalização complexa que causa um aumen-to em cálcio intracelular através da liberação de armazenamentos de cálciointracelular e influxo subsequente de cálcio através do canal de CRAC (cor-rente de cálcio ativada de liberação de cálcio). O aumento em cálcio intrace-lular resulta na ativação de calcineurina que desfosforila NFAT. Proteínas deNFAT são uma família de fatores de transcrição que uma vez desfosforiladassão translocadas para o núcleo onde elas dirigem a transcrição de uma dasIinfocinas mais importantes em rejeição celular, IL-2 (Hutchinson I, (2001)"Transplantation and rejection" em Immunology, I Roitt, J Brostoff e D Male,Mosby Nova Iorque p. 389). IL-2 estimula a proliferação de células T citotóxi-cas que liberam moléculas citolíticas, performina e granzima que medeiam adestruição do enxerto. O fármaco imunossupressor cicloesporina A inibe acalcineurina da enzima fosfatase que impede a translocação de NFAT para onúcleo e desse modo impede a transcrição de IL-2.

As proteínas de TORC são coativadores de CREB que, comoNFAT, são translocados para o núcleo em resposta à mobilização de arma-zenamentos de cálcio intracelular. É acreditado que TORC facilite expressãode gene mediada por CRE. Proteínas que regulam NFAT e/ou TORC podemser alvos adequados para intervenção terapêutica. Os Requerentes relatamaqui que cMAC é um regulador potente de ativação de células T e regulatranslocação nuclear de NFAT e TORC.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se à descoberta que uma proteínade função previamente desconhecida, referida aqui como cMAC ("Ativadorde Membrana de Calcineurina conservada"), é um regulador potente de ati-vação de células T, e está envolvida na translocação nuclear mediada porcálcio de NFAT e TORCI. Como tal, cMAC é uma proteína terapêutica im-portante e alvo terapêutico para o tratamento de doenças associadas acMAC (definidas aqui), usando moléculas pequenas, anticorpos, ácidos nu-cleicos e outros agentes terapêuticos que modulam a atividade ou expressãode cMAC.

Em um aspecto a invenção diz respeito ao polipeptideo decMAC maduro ou nativo. Consequentemente, a invenção diz respeito ao po-lipeptídeo isolado da SEQ ID NO: 2, ou um fragmento desta, ou uma se-qüência de proteína substancialmente similar tendo identidade de seqüênciade pelo menos 50% com a SEQ ID NO: 2, ou um equivalente funcional des-ta, e exibindo uma atividade biológica selecionada de transporte de íon, difu-são de íon, ativação da via de calcineurina, ativação dependente de cálciode uma célula T, translocação nuclear de TORC, translocação nuclear deNFAT ou atividade de expressão de gene dirigida por Elemento de Respostade cAMP (CRE) da SEQ ID NO: 2 nativa.

Em outros aspectos, a invenção compreende uma molécula deácido nucleico isolada que codifica cMAC, um vetor compreendendo a molé-cuia de ácido nucleico, preferivelmente um vetor de expressão compreen-dendo a molécula de ácido nucleico operavelmente ligada a um promotor,uma célula hospedeira compreendendo a molécula de vetor, incluindo célu-las hospedeiras mamíferas e bacterianas, e um método de usar uma molé-cula de ácido nucleico que codifica cMAC para realizar a produção de cMAC,compreendendo cultivar uma célula hospedeira compreendendo a moléculade vetor.

Outro aspecto da invenção fornece um anticorpo ou fragmentode anticorpo que é capaz de ligar um polipeptideo de cMAC da invenção. Umaspecto adicional da invenção diz respeito a um agente de RNAi capaz de sub-regular a expressão de cMAC, preferivelmente tal agente de RNAi compreendepelo menos um ácido nucleico selecionado da Tabela 5 ou Tabela 6.Outros aspectos da invenção dizem respeito ao uso de um anti-corpo ou agente de RNAi de acordo com a invenção para a manufatura deum medicamento para o tratamento de um distúrbio associado a cMAC (co-mo definido aqui) e a um método de tratar um distúrbio em um sujeito com-preendendo administrar ao sujeito uma quantidade eficaz de um agente quemodula a quantidade ou atividade de cMAC. Consequentemente, a invençãocompreende o uso de um anticorpo, um fragmento de anticorpo ou um poli-peptídeo compreendendo uma região de ligação cMAC-específica no trata-mento de um distúrbio em um sujeito, especialmente em que o distúrbio éum distúrbio associado a cMAC. Alternativamente, a invenção compreende ouso de um agente de RNAi ou siRNA específico para cMAC no tratamentode um distúrbio em um sujeito, especialmente em que o distúrbio é um dis-túrbio associado a cMAC.

Em vários aspectos, este método compreende administrar umagente que inibe cMAC, em que o distúrbio é um distúrbio associado acMAC (como definido aqui), ou em que o agente é um anticorpo, um frag-mento de anticorpo ou um polipeptídeo contendo uma região de ligaçãocMAC-específica. Opcionalmente, o dito agente é administrado como umacomposição farmacêutica.

Em outro aspecto, este método compreende administrar ao su-jeito uma quantidade eficaz de um agente que inibe a expressão de cMAC.Tal agente inclui um ácido nucleico inibidor capaz de especificamente inibirexpressão de cMAC. Várias modalidades incluem que o dito ácido nucleico ini-bidor é selecionado de entre o grupo que consiste em um oligonucleotídeo an-tissenso, um agente de RNAi, e uma ribozima, dsRNA, siRNA, e shRNA. O ditoagente é opcionalmente administrado como uma composição farmacêutica.

Em outro aspecto, a invenção compreende um método de tratarum distúrbio em um sujeito compreendendo administrar ao sujeito umaquantidade eficaz de um agente que intensifica a atividade de cMAC. Talmétodo inclui um método compreendendo administrar ao sujeito uma quanti-dade eficaz de um agente que aumenta a expressão de cMAC, por exemploonde o agente é um vetor de terapia de gene que compreende um ácido nu-cleico que codifica cMAC ou um fragmento desta, ou onde o agente é umintensificador de transcrição de gene de cMAC.

Em termos de composições, a invenção compreende um anti-corpo ou fragmento de anticorpo que especificamente se liga o cMAC (SEQID NO.2), e qualquer polipeptídeo que compreende uma região de ligaçãocMAC-específica. Tal anticorpo inclui um fragmento de anticorpo que é umfragmento de Fab ou F(ab')2, ou em que o anticorpo é um anticorpo mono-clonal. A invenção inclui uma composição farmacêutica compreendendo umaquantidade eficaz de um agente que inibe a expressão de cMAC ou inibeuma atividade de cMAC, e um veículo farmaceuticamente aceitável. Tal a-gente pode ser um oligonucleotídeo antissenso, um agente de RNAi, umfragmento de anticorpo que especificamente se liga ao cMAC, ou um poli-peptídeo que compreende uma região de ligação cMAC-específica. Em umamodalidade preferida, a composição farmacêutica compreende um anticorpoou fragmento de anticorpo que especificamente se liga ao cMAC (SEQ IDNO.2), ou qualquer polipeptídeo que compreende uma região de ligaçãocMAC-específica que liga a um epítopo de cMAC selecionado de entre asSEQ ID NOs. 6, 7, 8, 9, 10.

A invenção também compreende um método de tratar um distúr-bio em um sujeito compreendendo administrar ao sujeito uma quantidadeeficaz de uma composição farmacêutica de um agente que inibe a atividadede cMAC, especialmente em que o distúrbio é um distúrbio associado acMAC, e em que o dito agente é um anticorpo ou fragmento deste que espe-cificamente se liga ao cMAC (SEQ ID NO: 2) ou um polipeptídeo que com-preende uma região de ligação cMAC-específica. Tal agente opcionalmenteliga a um epítopo de cMAC selecionado de entre as SEQ ID NO. 6, 7, 8, 9,10.

A invenção também compreende métodos de ensaio de triagempara identificar um composto útil para o tratamento de um distúrbio associa-do a cMAC compreendendo (a) contatar um composto de teste com cMAC; e(b) detectar uma alteração de uma atividade biológica de cMAC comparadaa cMAC não-contatado com o composto de teste, em que a detecção deuma alteração identifica o dito composto de teste como útil para o tratamentodo dito distúrbio. Similarmente a invenção compreende métodos de ensaiode triagem para identificar um composto útil para o tratamento de um distúr-bio associado a cMAC que compreende: (a) contatar um composto de testecom cMAC sob condições de amostra permissivas para atividade biológicade cMAC; (b) determinar o nível de uma atividade biológica de cMAC; (c)comparar o dito nível ao de uma amostra de controle desprovida do ditocomposto de teste; e, (d) selecionar um composto de teste que leva o ditonível a alterar para outra testagem como um agente potencial para tratamen-to do dito distúrbio. A invenção compreende um método para testar se umcomposto modula uma atividade biológica de cMAC que compreende: (a)contatar um composto de teste com cMAC; e (b) detectar uma alteração deuma atividade biológica de cMAC comparada a cMAC não-contatado com ocomposto de teste, em que a detecção de uma alteração identifica o ditocomposto de teste como um modulador de atividade biológica de cMAC. I-gualmente, a invenção compreende um método para identificar moduladoresúteis para tratar um distúrbio compreendendo avaliar quanto à capacidadede um modulador candidato inibir a atividade de uma proteína de cMAC; eum método para identificar moduladores úteis para tratar um distúrbio com-preendendo avaliar quanto à capacidade de um modulador candidato parainibir a expressão de uma proteína de cMAC.

Nestes métodos, a dita alteração ou a dita modulação podem seruma redução ou um aumento de tal atividade biológica. Também, a dita ati-vidade biológica pode ser selecionada de entre transporte de íon, difusão deíon, interação de proteína-cMAC ou modificação de cMAC, ativação depen-dente de cálcio de uma célula T, translocação nuclear de TORC1 e expres-são de gene dirigida por Elemento de Resposta de cAMP (CRE).

De acordo com a invenção, distúrbios relacionados a cMAC ouassociados a cMAC incluem, mas não são limitados, doença autoimune, i-munossupressão, doença inflamatória, câncer, doença cardiovascular e do-ença neurológica.

DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

Figura 1 - cMAC é uma proteína de membrana integral prognos-ticada. Predição do domínio de transmembrana da seqüência de cMAC deusar o algoritmo de TMHMM. Dois domínios extracelulares prognosticadospequenos estão localizados nos aminoácidos 36-49 e 101-110.

Figura 2 - cMAC é uma proteína altamente conservada. Alinha-mento de CIustaIW das proteínas vertebradas com similaridade para cMAC.Hélices de transmembrana potenciais prognosticadas pelo algoritmo de T-MHMM são indicadas pelas linhas.

Figura 3 - Níveis de mRNA de cMAC quando medidos por perfi-lação de expressão de Affymetrix.

Figura 4 - cMAC em expressão induz translocação de TORC emcélulas de HEK293. Bittenger et al. identificou TRPV6 e PKA como repeti-ções na triagem de translocação de TORC-eGFP (Bittenger et. al. Curr Biol.dezembro de 2004 14;14(23):2156-61). cMAC foi também identificado entre-tanto não previamente revelado.

Figura 5 - Translocação mediada por cMAC de TORC1-eGFP ébloqueada através de inibidor de calcineurina CsA. No painel A, células deHeLa:TORC1-eGFP foram transduzidas com vírus de códon de parada (ve-tor), ou TRPV6 humano, ou vírus de cMAC humano (50 uL). Células do pai-nel B foram tratadas como em A exceto que as células foram tratadas comcicloesporina A a 5 uM (CsA) durante 1 hora antes de fixar.

Figura 6 - cMAC induz transcrição NFAT-dependente. Células deHEK293 foram cotransfeccionadas com um plasmídeo repórter de NFAT-luciferase, controle de transfecção e as construções a seguir: Vetor vazio(CMV), TRPV6 e cMAC e tratadas com DMSO1 CsA a 5 μΜ, PMA a 10 μΜ,ou PMA a 10 μΜ e CsA a 5 μΜ.

Figura 7 - cMAC induz translocação de NFAT1 em células deJurkat. Painel A. cMAC de sobre-expressão mediada por lentivírus, vetor decontrole (seqüência de parada de translação), e TRPV6 com e sem cicloes-porina A; B. Mesmo tratamento como em A salvo que as células foram sen-sibilizadas com PMA 6 horas antes de fixar.

Figura 8 - cMAC induz translocação de NFAT2 em células deJurkat. A. cMAC de sobre-expressão mediada por vírus (pLLB1-GW-Kan),vetor de controle (seqüência de parada de translação), TRPV6 com e semcicloesporina; B. Mesmo tratamento como em A salvo as células foram sen-sibilizadas com PMA 6 horas antes de fixar.

Figura 9 - cMAC murino e sobre-expressão de homólogo de cé-lulas humanas ativa células T de Jurkat. As células de Jurkat foram transdu-zidas com vetor de expressão viral (QL-GW-final-Kan) contendo vetor vaziode controle negativo (seqüência de parada de translação), canal de cálcio deTRPV6, e NM_177244 (cMAC murino) e NM_053045 (cMAC humano). Ex-pressão de marcador de superfície de proteína de IL-2 (ELISA) e ICOS émedida 72 horas pós transdução (48 horas pós transdução, as células foramsensibilizadas com PMA e anticorpo de anti-TCR).

Figura 10 - Seqüências de shDNA virais múltiplas que direcio-nam ativação de TCR/CD28 de bloco de cMAC de células T de Jurkat. Ascélulas foram transduzidas com construções virais (pLKO.1), selecionadascom puromicina e ativadas com TCR/CD28 6 dias pós transdução. Níveis deproteína de IL-2 foram medidos e normalizados pelo número de células viá-veis presentes em cada poço. A construção de shDNA pGL3-Luc serviu co-mo o shDNA de controle negativo para transduções virais.

Figura 11 - cMAC humano: NM_053045: Proteína hipotética de Ho-mo sapiens MGC14327 (MGC14327), mRNA (gi|16596685|ref|NM_053045.1|[16596685]) (SEQ ID NO: 1) e proteína hipotética humanaLOC94107 [Homo sapiens; > gi|16596686|ref|NP_444273.1|] (SEQ ID NO: 2).

Figura 12 - Seqüência de promotor genômico de cMAC humano(NM_053045.1_5'_-3000+100 NT_024000.16 886093 882993) (SEQ ID NO: 3).

Figura 13 - Seqüência de ácido nucleico isolada para a 5'UTR decMAC (SEQ ID NO: 4) e seqüência de ácido nucleico isolada para a 3'UTRde cMAC (SEQ ID NO: 5).

Figura 14 - cMAC murino NM_177344: gene de C730025P13 decDNA de RIKEN de Mus musculus (C730025P13Rik), mRNA(gi|31340922|ref|NM_177344.2|) (SEQ ID NO: 11) e > gi|18490941 |gb|BC022606.1| gene de C730025P13 de cDNA de RIKEN de Mus musculus,mRNA (clone de cDNA MGC:31129 IMAGE:4165766), cds completos (SEQID NO 12) e seqüência de aminoácido de cMAC de camundongo translada-do de NM_177344.2 (SEQ ID NO: 13)

Figura 15 - Outros ortólogos de cMAC humano de Mus musculusde outras espécies (SEQ ID NO: 14); Rattus norvegicus (SEQ ID NO: 15);Canis familiaris (SEQ ID NO: 16); Pan troglodytes (SEQ ID NO: 17); Xeno-pus tropicalis (SEQ ID NO: 18); Danio rerio (SEQ ID NO: 19); Gallus gallus(SEQ ID NO: 20); Branchiostoma floridae (SEQ ID NO: 21)

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

DEFINIÇÕES

É contemplado que a invenção descrita aqui não é limitada àmetodologia, a protocolos, e a reagentes particulares descritos uma vez queestes podem variar. É também ser entendido que a terminologia aqui usadaé para o propósito de descrever modalidades particulares apenas, e não éintencionada a limitar o escopo da presente invenção de forma alguma.

Embora quaisquer métodos e materiais similares ou equivalenteàqueles descritos aqui possam ser usados na prática ou testagem da pre-sente invenção, os métodos, dispositivos e materiais preferidos são agoradescritos. Todas as publicações mencionadas aqui são incorporadas porreferência para o propósito de descrever e revelar os materiais e metodolo-gias que são relatados na publicação que poderia ser usada com relação àinvenção.

Na prática da presente invenção, muitas técnicas convencionaisem biologia molecular são usadas. Estas técnicas são bem-conhecidas esão explicadas em, por exemplo, "Current Protocols in Molecular Biology",Volumes I, II, e III, 1997 (F. M. Ausubel ed.); Sambrook et al., 1989, "Molecu-lar Cloning: A Laboratory Manual", segunda edição, Cold Spring Harbor La-boratory Press, Cold Spring Harbor1 N.Y.; "DNA Cloning: A Practical Approa-ch", Volumes I e II, 1985 (D. N. Glover ed.); "Oligonucleotide Synthesis",1984 (M. L. Gait ed.); "Nucleic Acid Hybridization", 1985, (Hames e Higgins);"Transcription and Translation", 1984 (Hames e Higgins eds.); Animal CellCulture, 1986 (R. I. Freshney ed.); Immobilized Cells and Enzymes, 1986(IRL Press); Perbal, 1984, A Practical Guide to Molecular Cloning; the series,Methods in Enzymology (Aeademie Press, Inc.); Gene Transfer Veetors forMammalian Cells, 1987 (J. H. Miller e Μ. P. Calos eds., Cold Spring HarborLaboratory); e Methods in Enzymology Vol. 154 e Vol. 155 (Wu and Gross-man, e Wu, eds., respectivamente).

Como aqui usado e nas reivindicações em anexo, as formas sin-gulares "um", "uma", e "o/a" incluem referência plural a menos que o contex-to do contrário dite claramente. Desse modo, por exemplo, referência a "an-ticorpo" é uma referência a um ou mais anticorpos e equivalentes destesconhecidos àqueles versados na técnica.

"cMAC" ou "Ativador de Membrana de Calcineurina conservada"é a proteína em questão da invenção e descrita abaixo em detalhes. Os vá-rios nomes atribuídos a esta proteína e gene podem ser alterados de acordocom o uso científico. Por conseguinte, as reivindicações desta patente e con-teúdo deste relatório descritivo são intencionados a referir ao gene em ques-tão e proteína da invenção, e seus vários fragmentos e formas, sem levarem conta o nome específico atribuído. Desse modo, "cMAC" é definido aquiser qualquer seqüência de polipeptídeo que possua pelo menos uma propri-edade biológica (como definida abaixo) de um polipeptídeo de ocorrêncianatural que compreende a seqüência de polipeptídeo da SEQ ID NO: 2 ouqualquer um dos ortólogos desta mostrados nas Figuras 14 e 15.

Um "distúrbio associado a cMAC" ou "distúrbio relacionado acMAC" significa um distúrbio que pode ser tratado modulando a atividade decMAC. Estes distúrbios incluem, mas não são limitados a, doença autoimu-ne, imunossupressão, doença inflamatória, câncer, doença cardiovascular edoença neurológica.

Exemplos de doenças autoimunes incluem distúrbios e/ou con-dições incluindo sarcoidose, pulmão fibroide, pneumonia intersticial idiopáti-ca, doença obstrutiva das vias aéreas, incluindo condições como asma, as-ma intrínseca, asma extrínseca, asma de pó, particularmente asma crônicaou inveterada (por exemplo asma tardia e hiperreponsividade da via aérea),bronquite, incluindo asma bronquial, asma infantil, artrite reumatoide alérgi-ca, lúpus sistêmico eritematoso, lúpus de síndrome nefrótica, tiroidite de Ha-shimoto, esclerose múltipla, miastenia grave, diabetes melito do tipo I ecomplicações associadas a esta, diabetes melito de princípio adulto do tipoII, uveíte, síndrome nefrótica, nefrose dependente de esteroide e resistente aesteroide, pustulose palmo-plantar, encefalomielite alérgica, glomerulonefri-te, psoríase, artrite psoriática, eczema atópico (dermatite atópica), dermatitede contato e outras dermatites eczematosas, dermatite seborreica, líquenplano, pênfigo, pênfigo bolhoso, epidermolise bulhosa, urticária, angioede-mas, vasculitides, eritemas, eosinofilias cutâneas, acne, alopecia areata,fasciite eosinofílico, aterosclerose, conjuntivite, ceratoconjuntivite, ceratite,conjuntivite vernal, uveíte associada à doença de Behcet, ceratite herpética,córnea cônica, distrofia corneana epitelial, ceratoleucoma, pênfigo ocular,úlcera de Mooren, esclerite, oftalmopatia de Graves, inflamação intraocularsevera, inflamação de mucosa ou vasos sangüíneos como doenças media-das por Ieucotrieno B4, úlceras gástricas, dano vascular causado por doen-ças isquêmicas e trombose, doença de intestino isquêmica, doença inflama-tória do intestino (por exemplo doença de Crohn e colite ulcerativa), entero-colite necrotizante, doenças renais incluindo nefrite intersticial, síndrome deGoodpasture síndrome urêmica hemolítica e nefropatia diabética, doençasnervosas selecionadas de miosite múltipla, síndrome de Guillain-Barre, do-ença de Meniere e radiculopatia, doença de colágeno incluindo escleroder-ma, granuloma de Wegener e síndrome de Sjogren, doenças autoimunescrônicas do fígado incluindo hepatite autoimune, cirrose biliar primária e co-Iangite esclerosante), resseção parcial do fígado, necrose aguda do fígado(por exemplo necrose causada por toxinas, hepatite viral, choque ou anoxia),hepatite viral B1 hepatite não-A/não-B e cirrose, hepatite fulminante, psoríasepustular, doença de Behcet, hepatite crônica ativa, síndrome de Evans, poli-nose, hipoparatiroidismo idiopático, doença de Addison, gastrite atrofiadaautoimune, hepatite lupoide, nefrite tubulointersticial, nefrite membranosa,esclerose lateral amiotrófica ou febre reumática.

Imunossupressão é desejável para tratamento de rejeição deenxerto aguda ou crônica como rejeição aguda ou crônica de células, alo- ouxenoenxertos de tecido ou órgão sólido por exemplo ilhotas pancreáticas,células-tronco, medula óssea, pele, músculo, tecido córneo, tecido neuronal,coração, pulmão, coração-pulmão combinados, rim, fígado, intestino, pân-creas, traqueia ou esôfago. Tratamento da doença de enxerto-versus-hospedeiro está também incluso. Rejeição crônica é também nomeada do-enças de vaso de enxerto ou vasculopatias de enxerto.

Tratamento de imunossupressão, no sentido de tratar sujeitosimunes comprometidos, pode também ser alcançado por modulação decMAC, como pode ser o resultado da ativação de células T que são não-suficientemente ativas em um sujeito para resolução da doença ou condição.Doenças causadas por resposta imune deficiente incluem, mas não são limi-tadas a, AIDS, SLE, e outros.

Doenças inflamatórias que podem ser tratadas por modulaçãode cMAC incluem aquelas doenças inflamatórias, distúrbios e/ou condiçõesacreditados responder ao tratamento de CsA.

Câncer inclui, mas não é limitado a, neoplasia e condições pré-cancerosas ou cancerosas associadas ao crescimento anormal de células.Aqueles versados na técnica estão familiarizados com as numerosas formasde câncer, neoplasia e crescimento anormal de células, em particular Iinfo-ma, leucemia, e outros cânceres hematológicos.

Doença cardiovascular inclui, mas não é limitada a, doençascardiovasculares, distúrbios e condições como hipertrofia cardíaca e paradacardíaca.Doenças neurológicas e/ou condições incluem doenças, distúr-bios e/ou condições incluindo, mas não é limitados a, Doença de Alzheimer,Doença de Parkinson e Doença de Huntington, e incluem neuroproteção quepode ser alcançada por métodos e composições para a modulação decMAC.

Embora os antagonistas ou inibidores de cMAC sejam sugeridospara uso em qualquer uma ou todas das doenças, distúrbios e/ou condiçõesacima observados, agonistas de cMAC são particularmente implicados e de-sejáveis para o tratamento de câncer, doenças causadas por resposta imunedeficiente e para neuroproteção.

"Distúrbio associado a cMAC" às vezes é referido aqui como um"condição patológica" que é associada à expressão de cMAC anormal, ativi-dade de cMAC anormal, ou ativação anormal de células T.

Como aqui usado, "distúrbio" inclui uma doença, distúrbio, oucondição, quer existente quer prognosticamente identificado, e inclui sinto-mas ou efeitos colaterais das doenças, distúrbios ou condições e os farma-cêuticos usados para tratá-los.

A capacidade de uma substância para "modular" uma proteínade cMAC (por exemplo um "modulador de cMAC") inclui, mas não é limitadoa, a capacidade de uma substância para inibir ou intensificar uma ou maisatividades biológicas de uma proteína de cMAC e/ou inibir ou intensificar suaexpressão. Tais moduladores incluem agonistas e antagonistas de atividadede cMAC. Tal modulação poderia também envolver realizar a capacidade deoutras proteínas para interagir com cMAC, por exemplo proteínas regulado-ras relacionadas ou proteínas que ligam a cMAC.

"Atividade biológica" quando usada junto com qualquer um de"cMAC isolado" ou "cMAC" significa ter uma atividade selecionada de ativi-dade de transporte de íon, atividade de difusão de íon, um ativação depen-dente de cálcio de uma atividade de células T, translocação nuclear deTORC, translocação nuclear de NFAT ou atividade de expressão de gene diri-gida por Elemento de Resposta de cAMP (CRE) quando comparada à atividadeou cMAC maduro ou nativo ou endógeno de por exemplo SEQ ID NO: 2.

O termo "agonista", como aqui usado, refere-se a uma molécula(isto é modulador) que, direta ou indiretamente, pode modular um polipeptí-deo (por exemplo um polipeptídeo de cMAC) e que aumenta a atividade bio-lógica do dito polipeptídeo. Agonistas podem incluir proteínas, ácidos nuclei-cos, carboidratos, moléculas orgânicas, moléculas orgânicas pequenas (comou sem metades inorgânicas) ou outras moléculas. Um modulador que in-tensifica transcrição de gene, atividade biológica ou a função bioquímica deuma proteína é algo que aumenta a transcrição ou estimula as propriedadesbioquímicas ou atividade da dita proteína, como pode ser o caso.

Os termos "antagonista" ou "inibidor" como aqui usados, refe-rem-se a uma molécula (isto é, modulador) que direta ou indiretamente mo-dula um polipeptídeo (por exemplo o polipeptídeo de cMAC) que bloqueia ouinibe a expressão e/ou a atividade biológica do dito polipeptídeo. Os antago-nistas e inibidores podem incluir proteínas, ácidos nucleicos, carboidratos,ou outras moléculas. Um modulador que inibe a expressão ou a função bio-química de uma proteína é algo que reduz expressão de gene ou atividadebiológica da dita proteína, respectivamente.

"Seqüência de ácido nucleico", como aqui usado, refere-se a umoligonucleotídeo, nucleotídeo ou polinucleotídeo, e fragmentos ou porçõesdestes cujos componentes poliméricos podem ser DNA, RNA, nucleotídeosmodificados, miméticos de nucleotídeo ou combinações destes; e pode serde origem genômica ou sintética, e pode ser uni ou bifilamentar, e represen-ta o filamento senso ou antissenso.

O termo "antissenso" como aqui usado, refere-se às seqüênciasde nucleotídeo que são complementares a uma seqüência de DNA ou RNAespecífica. O termo "filamento antissenso" é usado em referência a um fila-mento de ácido nucleico ao que é complementar o filamento "senso". Molé-culas antissenses podem ser produzidas por qualquer método, incluindo sín-tese ligada ao(s) gene(s) de interesse em uma orientação reversa para umpromotor viral que permite a síntese de um filamento complementar. A de-signação "negativo" às vezes é usada em referência ao filamento antissen-so, e "positivo" às vezes é usado em referência ao filamento senso.

O termo "agente de RNAi" como aqui usado, refere-se aos com-postos e composições que podem agir através de um mecanismo de interfe-rência de RNA (ou "RNAi") (vide, para referência geral, He e Hannon1 (2004)Nat. Genet. 5:522-532). Agentes de RNAi como RNA de interferência curta("siRNA"), RNA bifilamentar ("dsRNA"), RNA de alfinete curto ("shRNA",também às vezes denominado 'RNA' sintético) são comumente usados, ou-tros estão em desenvolvimento. Quando introduzidos em uma célula ou sin-tetizados dentro de uma célula, os agentes de RNAi são incorporados emum complexo macromolecular que usa filamentos do agente de RNAi paradirecionar e clivar os filamentos de RNA contendo a seqüência complemen-tar (ou substancialmente complementar).

Como contemplado aqui, oligonucleotídeos antissenses, DNA dehélice tripla, aptâmeros de RNA, agentes de RNAi como siRNA, dsRNA, eshRNA, ribozimas e RNA unifilamentar são projetados para inibir a expres-são de cMAC de modo que a seqüência de nucleotídeo escolhida da molé-cula inibidora é projetado para causar inibição da síntese de proteína decMAC endógena. Por exemplo, com base na descrição aqui, conhecimentoda seqüência de nucleotídeo de cMAC pode ser usado para projetar umamolécula de siRNA que inibe a expressão de cMAC sem experimentaçãoimprópria. Similarmente, ribozimas podem ser sintetizadas para reconheceras seqüências de nucleotídeo específicas de uma proteína de interesse eclivá-las (Cech. J. Amer. Med Assn. 260:3030 (1988)). Técnicas para o pro-jeto de tais moléculas para o uso em inibição direcionada de expressão degene são bem-conhecidas a alguém versado na técnica.

O termo "amostra" ou "amostra biológica" como aqui usado, éusado em seu sentido mais vasto. Uma amostra biológica de um sujeito po-de compreender sangue, urina ou outro material biológico com o qual a ativi-dade ou expressão de gene das proteínas de cMAC podem ser avaliadas.

Como aqui usado, o termo "anticorpo" é alternável com "imuno-globulina" e refere-se às imunoglobulinas da forma geral encontradas emespécies vertebradas incluindo mamíferos como humanos, primatas, roedo-res, coelhos, e muitas outras espécies em que tais imunoglobulinas foramidentificadas. Em particular tais imunoglobulinas incluem os anticorpos decadeia pesada, encontrados em camelídeos que são desprovidos de cadeiasleves e como resultado têm domínios variáveis que refletem a ausência deum par de VL. "Anticorpo" significa moléculas que correspondem às imuno-globulinas complementares, como também fragmentos destas, como Fa,F(ab')2, e Fv que são capazes de ligar o determinante epitópico. O termo"fragmento de anticorpo" mais especificamente refere-se a estes fragmentose ou polipeptídeos semelhantes à imunoglobulina que não compreende umaimunoglobulina completa.

O termo "anticorpo humanizado" como aqui usado, refere-se àsmoléculas de anticorpo em que aminoácidos foram substituídos nas regiõesde ligação de não-antígeno para mais estritamente assemelharem-se a umanticorpo humano, enquanto ainda retendo a capacidade de ligação original.Dependendo do contexto, esta frase pode também incluir anticorpos 'prima-tizados', em que primeiro um anticorpo obtido de um organismo não-primatafoi modificado para mais estritamente se assemelhar a uma imunoglobulinade primata.

Um "polipeptídeo que compreende uma região de ligação cMAC-específica" significa um polipeptídeo que incorpora uma ou mais regiões deligação que especificamente ligam à proteína de cMAC da SEQ ID NO: 2.Um tipo clássico de região de ligação de antígeno específica é uma regiãode determinação de complementaridade ("CDR") encontrada em uma imu-noglobulina. CDRs são seqüências de aminoácido curtas que especifica-mente ligam ao antígeno em questão e provêem a base para seletividade deligação do polipeptídeo em que reside. CDRs são tipicamente identificadasde imunoglobulinas mas podem ser geradas através de outros meios. CDRssão originalmente definidas em imunoglobulinas usando definições comunscomo a definição de Kabat, a definição de Chothia (com base na localizaçãodas regiões de alça estrutural); a definição de AbM (um acordo entre os doisusados por software de modelagem de AbM de Oxford Molecular); e a defi-nição de contato que é possivelmente a mais útil para pessoas que queremexecutar mutagênese para modificar a afinidade de um anticorpo uma vezque estes são resíduos que fazem parte em interações com antígeno. Regi-ões de ligação de antígeno específicas também incluem seqüências de ami-noácido relativamente curtas que ligam a um antígeno, até mesmo se aque-las seqüências não são derivadas de CDRs. Publicação de PCT WO2004/044011, incorporada aqui por referência, fornece um exemplo de comotais regiões de ligação de antígeno específicas (que não são CDRs) podemser identificadas e desenvolvidas. Outros métodos são conhecidos àquelesversados na técnica. Uma vez desenvolvida uma região de ligação cMAC-específica pode ser empregada em uma ampla variedade de estruturas ouandaimes conhecidos e futuras, incluindo qualquer isótipo de imunoglobulinaou fragmento deste, e outra estrutura de não-imunoglobulina ou polipeptí-deos de andaime (debatidos em outro lugar aqui)) para fornecer especifici-dade de ligação de antígeno. Todos tais polipeptídeos são considerados a-qui como "polipeptídeos compreendendo uma região de ligação cMAC-específica".

Um peptídeo mimético é um peptídeo sinteticamente derivado ouagente de não-peptídeo criado com base em um conhecimento dos resíduoscríticos de um polipeptídeo em questão que pode mimetizar a função do po-lipeptídeo normal. Miméticos de peptídeo podem romper a ligação de umpolipeptídeo a seu receptor ou a outras proteínas e desse modo interferircom a função normal de um polipeptídeo. Por exemplo, um cMAC miméticointerferiria com a função de cMAC normal.

Uma "quantidade terapeuticamente eficaz" é a quantidade defármaco suficiente para tratar, impedir ou melhorar as condições patológicasrelacionadas à função, atividade ou expressão de cMAC.

Por "tratar" inclui impedir ou melhorar, como pode implicar o con-texto, e inclui tal tratamento se a intenção for terapêutica, profiláctica, ou di-recionada ao alívio de sintomas apenas.

"Proteínas reguladoras relacionadas" e "polipeptídeos regulado-res relacionados" como aqui usados referem-se aos polipeptídeos envolvi-dos na regulação de proteínas de cMAC que podem ser identificados poralguém versado na técnica usando métodos convencionais como descritosaqui.

Ativação anormal de células T pode incluir ativação excessiva,por exemplo, estados onde o mRNA codificando a proteína de cMAC é so-brerregulado ou a proteína de cMAC tem atividade intensificada ou quanti-dades em uma célula ambos aumentam em quantidade absoluta ou ativida-de específica; ativação anormal pode também incluir também estados emque há uma sub-regulação da expressão de gene de cMAC, nível de proteí-na ou atividade de proteína ou há ativação de células T anormalmente baixa.

"Sujeito", quando usado em relação a receber tratamento, refere-se a qualquer organismo humano ou não-humano.

Em seu sentido mais vasto, o termo "substancialmente similar"ou "equivalente", quando aqui usado com respeito a uma seqüência de nu-cleotídeo, significa uma seqüência de nucleotídeo que corresponde a umaseqüência de nucleotídeo de cMAC de referência, em que a seqüência cor-respondente codifica um polipeptídeo que tem substancialmente as mesmasestrutura e função que o polipeptídeo codificado pela seqüência de nucleotí-deo de referência, por exemplo onde apenas alterações em aminoácidosque não afetam a função do polipeptídeo ocorrem. Desejavelmente a se-qüência de nucleotídeo substancialmente similar codifica o polipeptídeo codi-ficado pela seqüência de nucleotídeo de referência. A porcentagem de iden-tidade entre a seqüência de nucleotídeo substancialmente similar e a se-qüência de nucleotídeo de referência desejavelmente é pelo menos 80%,mais desejavelmente pelo menos 85%, preferivelmente pelo menos 90%,mais preferivelmente pelo menos 95%, 96%, 97%, ou 98%, ainda mais pre-ferivelmente pelo menos 99%.

Uma seqüência de nucleotídeo "substancialmente similar" à se-quência de nucleotídeo de referência hibridiza com a seqüência de nucleotí-deo de referência em 7% de sulfato de dodecila de sódio (SDS)1 NaPO4 a0,5 M, EDTA a 1 mM a 50°C com lavagem em 2X SSC1 0,1% de SDS a50°C, mais desejavelmente em 7% de sulfato de dodecila de sódio (SDS),NaPO4 a 0,5 M, EDTA a 1 mM a 50°C com lavagem em 1X SSC, 0,1% deSDS a 50°C, mais desejavelmente ainda em 7% de sulfato de dodecila desódio (SDS), NaPO4 a 0,5 M1 EDTA a 1 mM a 50°C com lavagem em 0,5XSSC, 0,1% de SDS a 50°C, preferivelmente em 7% de sulfato de dodecila desódio (SDS), NaPO4A 0,5 M, EDTA A 1 mM a 50°C com lavagem em 0,1XSSC, 0,1% SDS a 50°C, mais preferivelmente em 7% de sulfato de dodecilade sódio (SDS), NaPO4 a 0,5 M, EDTA a 1 mM a 50°C com lavagem em0,1 X SSC, 0,1% de SDS a 65°C, ainda codifica um produto de gene funcio-nalmente equivalente. Em geral, condições de hobridização podem ser alta-mente rigorosas ou menos altamente rigorosas. Em circunstâncias em queas moléculas de ácido nucleico são desoxioligonucleotídeos ("oligos"), con-dições altamente rigorosas podem se referir, por exemplo, à lavagem em 6XSSC/0,05% de pirofosfato de sódio a 37°C (para oligos de 14 bases), 48°C(para oligos de 17 bases), 55°C (para oligos de 20 bases), e 60°C (para oli-gos de 23 bases). Faixas adequadas de tais condições de severidade paraácidos nucleicos de composições variadas são descritas no Krause e Aaron-son (1991), "Methods in Enzymology", 200:546-556 além de Maniatis et al.,citado acima.

Quando usado com respeito a uma seqüência de polipeptídeo,"substancialmente similar" significa uma seqüência de proteína que corres-ponde a um polipeptídeo de cMAC revelado aqui, tal seqüência de proteínasubstancialmente tendo as mesmas estrutura e função que o polipeptídeo decMAC, incluindo isoformas, homólogos, ortólogos e seqüências modificadascontendo identidade de seqüência de aminoácido ao longo do comprimentoda proteína de pelo menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%,90%, 95% ou 98%.

"Funcionalmente equivalente", como utilizado aqui, pode referir-se a uma proteína ou polipeptídeo capazes de apresentar uma atividade invivo ou in vitro substancialmente similar que os produtos de gene diferenci-almente expressos endógenos codificados pelas seqüências de gene dife-rencialmente expressas descritas acima. "Funcionalmente equivalente" podetambém referir-se às proteínas ou polipeptídeos capazes de interagir comoutras moléculas celulares ou extracelulares de uma maneira substancial-mente similar ao modo em que a porção correspondente do produto de genediferencialmente expresso endógeno interage. Por exemplo, um peptídeo"funcionalmente equivalente" seria capaz, em um imunoensaio, de diminuir aligação de um anticorpo ao peptídeo correspondente (isto é, o peptídeo se-qüência de aminoácido da qual foi modificado para alcançar o peptídeo "fun-cionalmente equivalente") da proteína endógena, ou a própria proteína en-dógena, onde o anticorpo foi elevado contra o peptídeo correspondente daproteína endógena. Uma concentração equimolar do peptídeo funcionalmen-te equivalente diminuirá a ligação supracitada do peptídeo correspondenteem pelo menos cerca de 5%, preferivelmente entre cerca de 5% e 10%,mais preferivelmente entre cerca de 10% e 25%, até mesmo mais preferi-velmente entre cerca de 25% e 50%, e mais preferivelmente entre cerca de40% e 50%.

Um "fragmento" é uma porção de uma seqüência de cMAC decomprimento total maduro, nativo ou endógeno de ocorrência natural tendoum ou mais resíduos de aminoácido deletados. O(s) resíduo(s) de aminoáci-do deletado(s) pode(m) ocorrer em qualquer lugar no polipeptídeo, incluindono terminal N ou C ou internamente. Tal fragmento terá pelo menos umapropriedade biológica em comum com cMAC. Fragmentos de cMAC tipica-mente terão uma seqüência sucessiva de pelo menos 10, 15, 20, 25, 30, 40,50 ou 60 resíduos de aminoácido que são idênticos às seqüências do cMACisoladas de um mamífero incluindo cMAC da SEQ ID NO: 2.

"Transcrição elevada de mRNA" refere-se a uma maior quanti-dade de RNA mensageiro transcrito do gene humano endógeno natural quecodifica um polipeptídeo de cMAC da presente invenção em um tecido oucélula apropriada de um indivíduo sofrendo de uma condição patológica re-lacionada à ativação anormal da expressão de gene de cMAC ou ativaçãoanormal de células T comparado aos níveis de controle, em particular pelomenos cerca de duas vezes, preferivelmente pelo menos cerca de cinco ve-zes, mais preferivelmente pelo menos cerca de dez vezes, o mais preferi-velmente pelo menos cerca de 100 vezes a quantidade de mRNA encontra-da em tecidos correspondentes em sujeitos que não sofrem de uma tal con-dição. Tal nível elevado de mRNA pode eventualmente conduzir a níveisaumentados de proteína transladada de tal mRNA em um indivíduo sofrendoda dita condição quando comparado com um indivíduo saudável.

Uma "célula hospedeira", como aqui usado, refere-se a uma cé-lula procariótica ou eucariótica contendo DNA heterólogo que foi introduzidona célula por quaisquer meios, por exemplo, eletroporação, precipitação defosfato de cálcio, microinjeção, transformação, infecção viral, e outros.

"Heterólogo" como aqui usado significa "de origem natural dife-rente" ou representa um estado não-natural. Por exemplo, se uma célulahospedeira for transformada com um DNA ou gene derivado de outro orga-nismo, particularmente de outras espécies, aquele gene é heterólogo comrespeito àquela célula hospedeira e também com respeito aos descendentesda célula hospedeira que carrega aquele gene. Similarmente, heterólogorefere-se a uma seqüência de nucleotídeo derivada e inserida no mesmotipo de célula natural, original, mas que está presente em um estado não-natural, por exemplo um número de cópia diferente, ou sob o controle deelementos reguladores diferentes.

Uma molécula "vetor" é uma molécula de ácido nucleico à qualácido nucleico heterólogo pode ser inserido que pode depois ser introduzidaem uma célula hospedeira apropriada. Vetores preferivelmente têm uma oumais origem de replicação, e um ou mais sítios aos quais o DNA recombi-nante pode ser inserido. Vetores freqüentemente têm meios convenientespelos quais as células com vetores podem ser selecionadas daqueles sem,por exemplo, eles codificarem genes de resistência de fármaco. Vetores co-muns incluem plasmídeos, genomas virais, e (primariamente em levedura ebactéria) "cromossomos artificiais".

O termo "isolado" significa que o material é removido de seuambiente original (por exemplo, o ambiente natural se for de ocorrência natu-ral). Por exemplo, um polinucleotídeo ou polipeptídeo de ocorrência naturalpresente em um animal vivo não é isolado, mas o mesmo polinucleotídeo oupolipeptídeo, separado de alguns ou todos os materiais coexistentes no sis-tema natural, é isolado, até mesmo se subseqüentemente reintroduzido nosistema natural. Tais polinucleotídeos poderiam fazer parte de um vetor e/outais polinucleotídeos ou polipeptídeos poderiam fazer parte de uma compo-sição, e ainda serem isolados em que tal vetor ou composição não faz partede seu ambiente natural.

Como aqui usado, o termo "seqüência de controle transcripcio-nal" refere-se às seqüências de DNA, como seqüências iniciadoras, seqüên-cias intensificadoras, e seqüências promotoras que induzem, reprimem, oudo contrário controlam a transcrição da proteína que codifica as seqüênciasde ácido nucleico às quais eles estão operavelmente ligados.

Como aqui usado, "seqüências de controle transcripcionais hu-manas" é qualquer uma daquelas seqüências de controle transcripcionalnormalmente encontradas associadas a um gene humano que codifica aproteína de cMAC da presente invenção como é encontrada no respectivocromossomo humano.

Como aqui usado, "seqüência de controle transcripcional não-humana" é qualquer seqüência de controle transcripcional não encontradano genoma humano.

Como aqui usado, um "derivado químico" de um polipeptídeo dainvenção é um polipeptídeo da invenção que contém porções químicas adi-cionais não normalmente uma parte da molécula. Tais metades podem me-lhorar a solubilidade, absorção, meia-vida biológica da molécula, etc. As por-ções podem alternativamente diminuir a toxicidade da molécula, eliminar ouatenuar qualquer efeito colateral indesejável da molécula, etc. Porções ca-pazes de mediar tais efeitos são reveladas, por exemplo, em "RemingtorVsPharmaceutical Sciences", 16a ed., Mack Publishing Co., Easton, Pa. (1980).INTRODUÇÃO

A invenção imediata é com base na descoberta surpreendente5 que a proteína de cMAC ("Ativador de Membrana de Calcineurina conserva-da"). previamente referida nas bases de dados de seqüência públicas como"Proteína hipotética de Homo sapiens MGC14327 (MGC14327), mRNA. (A-cesso de GenBank No. NM_053045)" e antes de função desconhecida, é umregulador potente de translocação nuclear de NFAT e T0RC1, funciona por10 meio da via de Calcineurina, e tem um papel importante na ativação de célu-las T (Tabela 1, Figura 11).

TABELA 1

Descrição SEQ ID NO.Seqüência de cDNA do gene que codifica cMAC humano (Acesso de GenBank NM_053045). SEQ ID No. 1Seqüência de aminoácido de comprimento total da prote- ína de cMAC humano. SEQ ID No. 2

Como aqui usado "cMAC" significa, dependendo do contexto,15 uma proteína de cMAC, ou um ácido nucleico compreendendo uma seqüên-cia que codifica a proteína de cMAC (por exemplo o gene de cMAC), oufragmentos ou fusões deste.

A proteína de cMAC revelada aqui inclui o polipeptídeo de cMACidentificado aqui, qualquer uma e todas as formas destes polipeptídeos inclu-20 indo, mas não limitadas a, formas parciais, homólogos, isoformas, formas deprecursor, os polipeptídeos de comprimento totais, proteínas de fusão con-tendo a seqüência de proteína, proteínas que são substancialmente simila-res ou equivalentes a cMAC, ou fragmentos de qualquer um dos acima, dehumanos, primatas, mamíferos, vertebrados, invertebrados ou qualquer ou-25 tra espécie.

A invenção também abrange ácidos nucleicos que estão relacio-nados à transcrição, função e estabilidade de mRNA de cMAC (Tabela 2,Figuras 12 e 13):TABELA 2

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Fragmentos de cMAC de interesse incluem, mas não são limita-dos a, aqueles fragmentos contendo aminoácidos de importância particularpara função de cMAC normal. Com base na estrutura de transmembranaprognosticada de cMAC como ilustrado na Tabela 3 e Figura 1, o polipeptí-deo pode ser subdividido nos domínios a seguir:

TABELA 3

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A designação dentro e fora da membrana necessita ser confir-mada experimentalmente porém de acordo com a análise da predição deTMHMM para regiões de cMAC humano NM_053045, NP_444273.1, (porexemplo epítopos) de interesse particular para anticorpos terapêuticos inclu-em seqüências de aminoácido extramembrana 1-12, 36-49, 73-78, 102-110,131-136.

ESTRUTURA E CONSERVAÇÃO DE cMAC

O cDNA de cMAC humano codifica uma proteína hidrofóbica de136 aminoácidos. Análise da seqüência de aminoácido primária com algo-ritmos que prognosticam hélices de transmembrana indica que cMAC é umaproteína de membrana integral com quatro domínios de transmembrana edomínios citoplásmicos NeC terminais curtos Figura 1. Dois sítios potenci-ais para modificação pós-translacional da proteína foram encontrados usan-do programas de MotifsGCG. Um sítio de fosforilação de proteína quinasepotencial C (PKC) e um sítio de fosforilação de Caseína quinase Il foram i-dentificados em Serina 4. O sítio de fosforilação de PKC proposto em Ser 4é prognosticado e conservado em todos os genes de cMAC vertebrados i-dentificados. Sítios de PKC potenciais adicionais também existem no resíduo73 (SVR) e 97 (SLK). A isoforma de PKC predominante presente em célulasT é PKCG1 e é conhecida ser importante na mediação da ativação de célulasT. Durante ativação de células T PKCG localiza-se nas rafts de lipídio demembrana plasmática (Khoshnan et al. J. Immunol. 165(12): 6933-40(2000)), que são domínios de membrana ricos em colesterol insolúvel emdetergente contendo muitos componentes (às vezes transientemente sobestimulação) que contribuem para a transdução de sinal. De forma interes-sante, o canal de cálcio proposto em células B, CD20, também é uma prote-ína crítico de 4TM para ativação de células B. CD20 é conhecido estar cons-titutivamente associado a rafts de lipídio. Permanece sendo determinado secMAC for um substrato para PKC, mas está compelindo para encontrar ummotivo na seqüência de aminoácido de cMAC que pode servir como umafunção reguladora através de PKC que é ativada seguindo estimulação deTCR/CD28. Um sítio de isoprenilação foi também identificado na cisteína134 das proteínas prognosticadas de cMAC de humano, rato, camundongo,peixe-zebra e Xenopus.

cMAC é uma proteína altamente conservada. Ortólogos decMAC de outras espécies reveladas aqui são expostos nas Figuras 2 e 15. Aproteína de cMAC humano é 97% idêntica a uma proteína de camundongoprognosticada, e 82% e 78% idêntica às proteínas de Xenopus tropicalis eDanio rerio, respectivamente. De forma interessante há também um genecodificado pelas espécies vertebradas antigas Amphioxus floridae que é54% idêntica a cMAC humano. No total, 63 dos 136 aminoácidos são con-servados ao longo de todo cMAC vertebrado e 99/136 aminoácidos são i-dênticos ou representam alterações conservadoras. De forma interessante,há também proteínas similares em invertebrados com proteínas Drosophila eC. elegans de níveis significativamente inferiores de homologias (39% e 27%idênticas, respectivamente) comparadas com os ortólogos de vertebrado.

Não está claro se os genes de inseto são de fato ortólogos de cMAC. As pro-teínas de vertebrado e invertebrado descritas aqui estavam mutuamenteclasssificados com melhores Blast hits sugerindo que elas são prováveis or-tólogos e/ou derivadas de um gene ancestral simples. É interessante obser-var que a seqüência de proteína de cMAC é altamente conservada em orga-nismos contendo um sistema imune adaptável moderno. Em particular,cMAC é altamente conservado em animais contendo células T (por exemplo,>80% de identidade em mamíferos, peixes e anfíbios), é mais divergente emAmphioxus (54% idêntico), que tem muitos ortólogos e homólogos de genesdestinados a serem recrutados para imunidade adaptável mas ainda nãodesenvolveram linfócitos, e é altamente divergente em invertebrados quecarecem de qualquer correlação com linfócitos. Desse modo, está se tentan-do especular que cMAC pode ter evoluído junto com o desenvolvimento dosistema imune adaptável de vertebrado e podem ter sido um jogador centralem sinalização de cálcio capacitativa requerida em ativação de células T etalvez ativação de células B.

Em cada espécie, um ortólogo de cMAC simples está presente econservado. cMAC é prognosticado codificar uma proteína de domínio de 4TM (ilustração na Figura 1). Especulou-se que cMAC representa uma famíliade gene nova de transdutorde sinal mediado por cálcio.

Homólogos e ortólogos de cMAC incluem aqueles revelados a-qui (por exemplo Tabela 4 e Figuras 14 e 15), e aqueles que seriam eviden-tes a alguém versado na técnica, e são intencionados serem incluídos dentrodo escopo da invenção. Por exemplo, ensaios de triagem para moléculaspequenas como contempladas neste invenção poderiam usar um homólogode cMAC humano ou um ortólogo de cMAC de uma espécie diferente comooutro primata, mamífero, vertebrado ou invertebrado. É também contempla-do que proteínas de cMAC incluem aquelas isoladas de fontes de ocorrêncianatural de qualquer espécie como bibliotecas de DNA genômicas como tam-bém células hospedeiras geneticamente modificadas compreendendo siste-mas de expressão, ou produzidas através de síntese química usando, porexemplo, sintetizadores de peptídeo automatizado ou uma combinação detais métodos. Meios para isolar e preparar tais polipeptídeos são bem-entendidos na técnica.

TABELA 4

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A presente invenção também inclui qualquer fragmento de prote-ínas ou ácidos nucleicos que codificam fragmentos de proteínas expostosem SEQ ID NOs: 1-21.

Homólogos adicionais podem ser identificados e facilmente iso-lados, sem experimentação imprópria, por técnicas biológicas molecularesbem-conhecidas nâ íecnics. Também, pode existir genes ern outros Iocí ge-néticos dentro do genoma que codifica proteínas tendo homologia extensivaa um ou mais domínios de tais produtos de gene. Estes genes podem tam-bém ser identificados por meio de técnicas similares.

FUNÇÃO E PAPEL DE cMAC, E LOCALIZAÇÃO DO TIPO DE CÉLULA

Embora não querendo estar preso a qualquer teoria particular, épossível que cMAC humano seja uma proteína de trans-membrana comoilustrado na Figura 1. Análise bioinformática indica vários domínios prováveisde adotar uma conformação intramembrana e extramembrana. Esta predi-ção destaca o uso potencial de anticorpos para inibir ou ativar cMAC em umcenário terapêutico.

Uma função ou atividade biológica do polipeptídeo de cMAC éclaramente estabelecida na ativação funcional de células T, como demons-trado pelos Exemplos aqui. Outras atividades biológicas de cMAC podem sertambém elucidadas à medida que os estudos progridem. Algumas das ativi-dades biológicas mais específicas de cMAC, como conclusões podem serdeduzidas com base nos exemplos, incluem translocação nuclear de TORC,translocação nuclear de NFAT, e expressão de gene dirigida por Elementode Resposta de cAMP (CRE). cMAC poderia ter várias atividades bioquími-cas incluindo como exemplo como um canal de íon, por exemplo um canalde cálcio (com porta de voltagem ou porta de ligante); e pode ter atividadena ativação dependente de cálcio de uma célula T. Atividades bioquímicasespecíficas também incluem interações com membranas de célula e compo-nentes de célula-membranas, como um alvo para miristilização, glicosilação,fosforilação, desfosforilação e outras pós modificações translacionais. Combase na descrição aqui, aqueles versados na técnica poderão identificar es-tas e outras atividades biológicas de cMAC. A invenção descreve um métodode modular (por exemplo inibindo ou aumentando) uma ou mais destes ativi-dades de cMAC. Tais métodos podem ser para aplicação terapêutica commoduladores identificados de cMAC, ou para pesquisa e uso de descobertacomo ensaios de triagem ou outras ferramentas de pesquisa.

mRNA de cMAC foi identificado em uma variedade de tipos decélulas humanas. Figura 3 identifica o nível mais alto de cMAC em linfócitos,especificamente células Τ. A maioria dos outros tecidos também mostra al-gum nível de cMAC, que indica que cMAC pode ser de uso geral na modula-ção de doença relacionada à sinalização de cálcio.

Expressão de cMAC. Para ganhar uma visão geral das célulasque expressam cMAC, os níveis de mRNA em tecidos diferentes e tipos decélulas como indicado por perfilação de expressão de Affymetrix foi exami-nado. Como mostrado na Figura 3, cMAC foi expressado amplamente. Po-rém, os níveis mais altos de expressão vistos foram em populações de célu-las T e Β. O nível de expressão médio nestas preparações de linfócito foram3 a 10 vezes mais alto que a expressão mediana vista ao longo de todos ostecidos examinados. Embora a expressão de mRNA de cMAC e proteínaterá que ser examinada através de outros métodos, estes resultados suge-rem que cMAC possa ser enriquecido em populações de linfócito.

Presença predominante em células T indica que anticorpos deanti-cMAC e outros compostos de ligação de cMAC direcionarão predomi-nantemente células T; tais anticorpos ou compostos têm muitos usos signifi-cativos terapêuticos e de pesquisa, como descritos mais completamente emoutro lugar neste relatório descritivo.

Desse modo, a presente invenção fornece polipeptídeos isola-dos compreendendo ou consistindo em uma seqüência de aminoácido comoexposta em SEQ ID NO. 2 ou um fragmento desta, ou uma seqüência deproteína substancialmente similar tendo identidade de seqüência de pelomenos 50% com a SEQ ID NO: 2, ou um equivalente funcional desta exibin-do uma atividade biológica selecionada de transporte de íon, difusão de íon,ativação dependente de cálcio de uma célula T, translocação nuclear deTORC, translocação nuclear de NFAT ou atividade de expressão de genedirigida por Elemento de Resposta de cAMP (CRE) da SEQ ID NO: 2 nativa.Consequentemente, a presente invenção fornece também os polipeptídeosda SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20 e SEQ ID NO: 21. Também, taispolipeptídeos podem ser, por exemplo, uma proteína de fusão incluindo todaou parte da SEQ ID NO. 2.

A invenção também inclui moléculas de ácido nucleico ou denucleotídeo isoladas, preferivelmente moléculas de DNA1 em particular SEQID NO. 1, SEQ ID NO: 11 ou SEQ ID NO: 12 que codificam a proteína decMAC. A invenção também descreve uma molécula de ácido nucleico isola-da, preferivelmente uma molécula de DNA, da presente invenção que codifi-ca um polipeptídeo que compreende a seqüência de aminoácido exposta emSEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO:13 a 21.

A invenção também abrange: (a) vetores que compreendemuma seqüência de nucleotídeo de uma proteína de cMAC, particularmenteSEQ ID NO. 1, SEQ ID NO: 11 ou SEQ ID NO: 12 ou um fragmento destae/ou seus complementos (isto é, antissenso); (b) moléculas de vetor, preferi-velmente moléculas de vetor compreendendo seqüências de controle trans-cripcionais, em particular vetores de expressão compreendendo seqüênciasde codificação de qualquer uma das proteínas de cMAC reveladas aqui ope-rativamente associados a um elemento regulador que direciona a expressãodas seqüências de codificação; e (c) células hospedeiras geneticamentemodificadas contendo uma molécula de vetor como mencionada aqui ou pe-lo menos um fragmento de qualquer uma das seqüências de nucleotídeoanteriores operativamente associadas a um elemento regulador que direcio-na a expressão das seqüências de codificação na célula hospedeira. Comoaqui usado, elementos reguladores incluem, mas não são limitados a, pro-motores induzíveis e não-induzíveis, intensificadores, operadores e outroselementos conhecidos àqueles versados na técnica que regulam e dirigem aexpressão. Preferivelmente, células hospedeiras podem ser células hospe-deiras de vertebrados, preferivelmente células hospedeiras de mamíferos,como células humanas ou células de roedores, como células CHO ou BHK.Igualmente preferido, células hospedeiras podem ser células hospedeirasbacterianas, em particular células de E. coli.

A invenção portanto abrange uma molécula de vetor compreen-dendo a seqüência de ácido nucleico de cMAC (SEQ ID NO. 1), e uma célu-la hospedeira compreendendo tal molécula de vetor.

Particularmente preferido é uma célula hospedeira, em particulardo tipo acima descrito que pode ser propagado in vitro e que é capaz sobcrescimento em cultura de produzir um polipeptídeo de cMAC, em particularum polipeptídeo compreendendo ou consistindo em uma seqüência de ami-noácido exposta em SEQ ID NO: 2, em que a dita célula compreende pelomenos uma seqüência de controle transcripcional que não é uma seqüênciade controle transcripcional do gene de humano endógeno natural que codifi-ca o dito polipeptídeo, em que a dita uma ou mais seqüências de controletranscripcionais controlam a transcrição de um DNA que codifica os ditospolipeptídeos.

Este vetor ou célula hospedeira pode ser usada em um métodopara produzir um polipeptídeo de cMAC da SEQ ID NO. 2 compreendendocultivar uma célula hospedeira tendo nela incorporado um vetor de expres-são compreendendo o vetor de cMAC sob condições suficiente para expres-são do polipeptídeo na célula hospedeira.

A invenção também inclui fragmentos de qualquer uma das se-qüências de ácido nucleico reveladas aqui. Fragmentos das seqüências deácido nucleico da SEQ ID NO. 1 e SEQ ID NO. 3 podem ser usados comouma sonda de hobridização para uma biblioteca de cDNA isolar o gene decomprimento total e isolar outros genes que têm uma similaridade de se-qüência alta a um gene de cMAC de atividade biológica similar. Sondas des-te tipo preferivelmente têm pelo menos cerca de 20 bases e pode conter, porexemplo, de cerca de 30 a cerca de 50 bases, cerca de 50 a cerca de 100bases, cerca de 100 a cerca de 200 bases, ou mais de 200 bases. A sondapode também ser usada para identificar um clone de cDNA que correspondea uma transcrição de comprimento total e um clone genômico ou clones con-tendo um gene de cMAC completo incluindo regiões reguladoras e promoto-ras, éxons, e íntrons. Um exemplo de uma triagem compreende isolar a re-gião de codificação de um gene de cMAC usando a seqüência de DNA co-nhecida sintetizar uma sonda de oligonucleotídeo. Oligonucleotideos marca-dos tendo uma seqüência complementar à do gene da presente invençãosão usados para triar uma biblioteca de cDNA humano, DNA genômico oumRNA para determinar com quais membros da biblioteca que a sonda hibri-izar.

A seqüência de nucleotídeo isolada da presente invenção quecodifica um polipeptídeo de cMAC pode ser marcada e usada para triar umabiblioteca de cDNA construída de mRNA obtida do organismo de interesse.Condições de hobridização serão de uma severidade inferior quando a bibli-oteca de cDNA for derivada de um organismo diferente do tipo de organismodo qual a seqüência marcada foi derivada. Alternativamente, o fragmentomarcado pode ser usado para triar uma biblioteca genômica derivada do or-ganismo de interesse, novamente, usando condições apropriadamente rigo-rosas. Tais condições de severidade baixa serão bem-conhecidas àquelesversado na técnica, e variarão, dependendo da maneira previsível dos orga-nismos específicos de que biblioteca e seqüências marcadas são derivadas.Para orientação com relação a tais condições vide, por exemplo, Sambrooket al. citado acima.

Tecnologia de PCR pode também ser utilizada para isolar se-quências de cDNA totais ou parciais que são substancialmente similares acMAC. Por exemplo, RNA pode ser isolado, seguindo procedimentos pa-drões, de uma fonte celular ou de tecido apropriada. Uma reação de trans-crição reversa pode ser executada no RNA usando um iniciador de oligonu-cleotídeo específico para a terminação mais 5' do fragmento amplificado pa-ra a preparação da síntese de primeiro filamento. O híbrido de RNA/DNAresultante pode depois ser "seguido" com guaninas usando uma reação detransferase terminal padrão, o híbrido pode ser digerido com RNAase H, e asíntese de segundo filamento pode depois ser iniciada com um iniciador poli-C. Desse modo, seqüências de cDNA podem a montante do fragmento am-plificado ser facilmente isoladas. Para uma revisão de estratégias de clona-gem que podem ser usadas, vide por exemplo, Sambrook et al., 1989, supra.Em casos onde o gene identificado é o gene normal, ou tipo sel-vagem, este gene pode ser usado para isolar alelos mutantes do gene. Umtal isolamento é preferível em processos e distúrbios que são conhecidos oususpeitos ter uma base genética. Alelos mutantes podem ser isolados deindivíduos conhecidos ou podem ser suspeitos de terem um genótipo quecontribui para os sintomas da doença relacionada à inflamação ou respostaimune. Alelos mutantes e produtos de alelos mutantes podem depois serutilizados nos sistemas de ensaio de diagnóstico descritos abaixo.

Um cDNA do gene mutante pode ser isolado, por exemplo, u-sando PCR, uma técnica que é bem-conhecida àqueles versado na técnica.

Neste caso, o primeiro filamento de cDNA pode ser sintetizado para hibridi-zar um oligonucleotídeo de oligo-dT com mRNA isolado de tecido conhecidoou suspeito ser expresso em um indivíduo putativamente carregando o alelomutante, e estendendo o filamento novo com transcriptase reversa. O se-gundo filamento do cDNA é depois sintetizado usando um oligonucleotídeoque especificamente hibridiza na terminação 5' do gene normal. Usando es-tes dois iniciadores, o produto é depois amplificado por meio de PCR, clona-do em um vetor adequado, e submetido à análise de seqüência de DNA a-través de métodos bem-conhecidos àqueles versado na técnica. Comparan-do a seqüência de DNA do gene mutante à do gene normal, a(s) muta-ção(ões) responsável(eis) pela perda ou alteração da função do produto degene mutante pode(m) ser averiguada(s).

Alternativamente, uma biblioteca genômica ou de cDNA podeser construída e triada usando DNA ou RNA, respectivamente, de um tecidoconhecido ou suspeito de expressar o gene de interesse em um indivíduosuspeito ou conhecido carregar o alelo mutante. O gene normal ou qualquerfragmento adequado deste pode depois ser marcado e usado como umasonda para identificar o alelo mutante correspondente na biblioteca. O clonecontendo este gene pode depois ser habitualmente purificado através demétodos praticados na técnica, e submetido à análise de seqüência comodescrito acima.A presente invenção inclui proteínas que representam os produ-tos de gene de cMAC funcionalmente equivalentes. Um tal produto de geneequivalente pode conter deleções, adições ou substituições de resíduos deaminoácido dentro da seqüência de aminoácido codificada pelas seqüênciasde gene descritas, acima, desse modo produzindo um produto de gene fun-cionalmente equivalente. Substituições de aminoácido podem ser feitas embase de similaridade em polaridade, carga, solubilidade, hidrofobicidade,hidrofilicidade, e/ou da natureza anfipática dos resíduos envolvidos.

Por exemplo, aminoácidos não-polares (hidrofóbicos) incluemalanina, leucina, isoleucina, valina, prolina, fenilalanina, triptofano, e metioni-na; aminoácidos neutros polares incluem glicina, serina, treonina, cisteína,tirosina, asparagina, e glutamina; aminoácidos positivamente carregados(básicos) incluem arginina, lisina, e histidina; e aminoácidos negativamentecarregados (acídico) incluem ácido aspártico e ácido glutâmico.

Dados revelados aqui indicam fragmentos de polipeptídeo parti-culares são úteis para certas atividades da proteína de cMAC. Desse modo,estes fragmentos de peptídeo de cMAC como também fragmentos dos áci-dos nucleicos que codificam a porção ativa dos polipeptídeos de cMAC reve-lados aqui, e vetores compreendendo os ditos fragmentos, estão tambémdentro do escopo da presente invenção. Como aqui usado, um fragmento doácido nucleico que codifica a porção ativa dos polipeptídeos de cMAC refere-se a uma seqüência de nucleotídeo tendo menos nucleotídeos que a se-qüência de nucleotídeo que codifica a seqüência de aminoácido inteira deum polipeptídeo de cMAC e que codifica um peptídeo tendo uma atividadede uma proteína de cMAC (isto é, um peptídeo tendo pelo menos uma ativi-dade biológica de uma proteína de cMAC) como definida aqui. Em geral, oácido nucleico que codifica um peptídeo tendo uma atividade de uma proteí-na de cMAC será selecionado das bases que codificam a proteína madura.Porém, em algumas circunstâncias, pode ser desejável selecionar todo ouparte de um peptídeo da porção de seqüência líder dos ácidos nucleicos deuma proteína de cMAC. Estes ácidos nucleicos podem também conter se-quências ligadoras, sítios de endonuclease de restrição modificados e outrasseqüências úteis para clonagem molecular, expressão ou purificação oupeptídeos recombinantes tendo pelo menos uma atividade biológica de umaproteína de cMAC. Fragmentos de peptídeo de cMAC como também ácidosnucleicos que codificam um fragmento de peptídeo tendo uma atividade deuma proteína de cMAC podem ser obtidos de acordo com métodos conven-cionais.

Além disso, anticorpos direcionados para estes fragmentos depeptídeo podem ser feitos como descrito aqui abaixo. Modificações para es-tes fragmentos de polipeptídeo (por exemplo, substituições de aminoácido)que pode aumentar a imunogenicidade do peptídeo, podem também serempregados. Similarmente, usando métodos familiares a alguém versado natécnica, os ditos peptídeos das proteínas de cMAC podem ser modificadospara conter seqüências sinais ou líderes ou conjugados com um Iigador ououtra seqüência para facilitar as manipulações moleculares.

Os polipeptídeos da presente invenção podem ser produzidosatravés de tecnologia de DNA recombinante usando técnicas bem-conhecidas na técnica. Portanto, é fornecido um método de produzir um po-lipeptídeo da presente invenção cujo método compreende cultivar uma célu-la hospedeira tendo nele incorporado um vetor de expressão que contém umpolinucleotídeo exogenamente derivado que codifica um polipeptídeo com-preendendo uma seqüência de aminoácido como exposta nas SEQ ID NOs:2, 13-21, preferivelmente SEQ ID NO. 2, sob condições suficientes paraexpressão do polipeptídeo na célula hospedeira, assim causando a produ-ção do polipeptídeo expresso. Opcionalmente, o dito método também com-preende restabelecer o polipeptídeo produzido pela dita célula. Em uma mo-dalidade preferida de um tal método, o dito polinucleotídeo exogenamentederivado codifica um polipeptídeo que consiste em uma seqüência de ami-noácido exposta na SEQ ID NO: 2. Preferivelmente, o dito polinucleotídeoexogenamente derivado compreende a seqüência de nucleotídeo como ex-posta em qualquer uma das SEQ ID NOs: 1.Desse modo, métodos para preparar os polipeptídeos e peptí-deos da invenção expressando ácido nucleico que codifica as respectivasseqüências de polipeptídeo são descritos aqui. Métodos que são bem-conhecidos àqueles versados na técnica podem ser usados para a constru-ção de vetores de expressão contendo seqüências de codificação de proteí-na e sinais de controle transcripcional/translacional apropriados. Estes mé-todos incluem, por exemplo, técnicas de DNA recombinantes in vitro, técni-cas sintéticas e recombinação/recombinação genética in vivo. Vide, por e-xemplo, as técnicas descritas em Sambrook et al., 1989, supra, e Ausubel etal., 1989, supra. Alternativamente, RNA capaz de codificar seqüências deproteína de gene diferencialmente expressas pode ser sintetizado quimica-mente usando, por exemplo, sintetizadores. Vide, por exemplo, as técnicasdescritas em Oligonucleotide Synthesis", 1984, Andadura, M. J. ed., IRLPress, Oxford, que é incorporada aqui por referência em sua totalidade.

Uma variedade de sistemas de vetor de expressão em hospedei-ro pode ser utilizada para expressar as seqüências de codificação de geneda invenção. Tais sistemas de expressão em hospedeiro representam veícu-los pelos quais as seqüências de codificação de interesse podem ser produ-zidas e subseqüentemente purificadas, mas também representam célulasque podem, quando transformadas ou transfeccionadas com as seqüênciasde codificação de nucleotídeo apropriadas, exibir a proteína da invenção insitu. Estas incluem, mas não são limitadas a, micro-organismos como bacté-rias (por exemplo, E. coli, B. subtilis) transformados com vetores de expres-são de DNA de bacteriófago recombinante, DNA de plasmídeo ou DNA decosmídeo contendo as seqüências de codificação de proteína de cMAC; le-vedura (por exemplo Saccharomyces, Pichia) transformada com vetores deexpressão de levedura recombinantes contendo seqüências de codificaçãode proteína de cMAC; sistemas de célula de inseto infetados ou transfeccio-nados com vetores de expressão de vírus recombinantes (por exemplo, ba-culovírus) contendo seqüências de codificação de proteína de cMAC; siste-mas de célula de planta infetados com vetores de expressão de vírus re-combinantes (por exemplo, vírus do mosaico de couve-flor, CaMV; vírus domosaico de tabaco, TMV) ou transformados com vetores recombinantes,incluindo plasmídeos, (por exemplo, Plasmídeo Ti) contendo seqüências decodificação de proteína de cMAC; ou sistemas de células mamíferas (porexemplo COS, CHO1 BHK1 293, 3T3) abrigando construções de expressãorecombinantes contendo os promotores derivados do genoma de célulasmamíferas (por exemplo, promotor de metalotioneína) ou de vírus mamíferos(por exemplo, o promotor tardio de adenovírus; o promotor de 7,5K de vírusde vacínia, ou o promotor de CMV).

Expressão das proteínas de cMAC da presente invenção poruma célula de um gene de codificação de cMAC que é nativa à célula podetambém ser executada. Métodos para tal expressão são detalhados, por e-xemplo, nas Patentes U.S. Nos. 5.641.670; 5.733.761; 5.968.502; e5.994.127, todas destas são aqui incorporadas por referência em sua totali-dade. Células que foram induzidas para expressar cMAC pelos métodos dequalquer uma das patentes U.S. 5.641.670; 5.733.761; 5.968.502; e5.994.127 podem ser implantados em um tecido desejado em um animalvivo para aumentar a concentração local de cMAC no tecido. Tais métodostêm implicações terapêuticas, por exemplo, para condições neurodegenera-tivas em que perda da função de CREB ocorre e como tais agonistas e/ouproteína de cMAC exógena podem ser úteis para tratar as ditas condições.

Em sistemas bacterianos, vários vetores de expressão podemser vantajosamente selecionados dependendo do uso intencionado para aproteína sendo expressada. Por exemplo, quando uma quantidade grandede uma tal proteína for para ser produzida, para a geração de anticorpos outriagem de bibliotecas de peptídeo, por exemplo, vetores que direcionam aexpressão de níveis altos de produtos de proteína de fusão que são facil-mente purificados podem ser desejáveis. Neste respeito, proteínas de fusãoque compreendem marcadores de hexa-histidina podem ser usadas (Sisk etalk, 1994: J. Virol 68: 766-775) como fornecido por vários vendedores (porexemplo Qiagen, Valença, CA). Tais vetores incluem, mas não são limitadosa vetor de expressão de E. coli pUR278 (Ruther et al., 1983, EMBO J.,2:1791) em que a seqüência de codificação de proteína pode ser ligada indi-vidualmente no vetor na estrutura com a região de codificação de Iac Z deforma que uma proteína de fusão é produzida; vetores pIN (Inouye & Inouye11985, Nucleic Aeids Res. 13:3101-3109; Van Heeke & Schuster, 1989, J.Biol. Chem. 264:5503-5509); e outros. Vetores pGEX podem também serusados para expressar polipeptídeos estranhos como proteínas de fusãocom glutationa S-transferase (GST). Em geral, tais proteínas de fusão sãosolúveis e podem ser facilmente purificadas de células Iisadas por adsorçãopara contas de glutationa-agarose seguido por elução na presença de gluta-tiona livre. Os vetores pGEX são projetados para incluir sítios de clivagem detrombina ou protease de Fator Xa de forma que a proteína de gene-alvo clo-nada pode ser liberada da porção de GST.

Regiões de promotor podem ser selecionadas de qualquer genedesejado usando vetores contendo uma unidade de transcrição repórter quecarece de uma região de promotor, como uma cloranfenicol acetil transfera-se ("CAT"), ou a unidade de transcrição de luciferase, a jusante do sítio derestrição ou sítios para introduzir um fragmento de promotor candidato; istoé, um fragmento que pode conter um promotor. Por exemplo, introdução novetor de um fragmento contendo promotor no sítio de restrição gera produ-ção da atividade de CAT que pode ser detectada através de ensaios de CATpadrões a montante do gene de CAT. Vetores adequados para este fim sãobem-conhecidos e facilmente disponíveis. Dois tais vetores são pKK232-8 epCM7. Desse modo, os promotores para expressão de polinucleotídeos dapresente invenção não só incluem os promotores bem-conhecidos e facil-mente disponíveis, mas também promotores que podem ser facilmente obti-dos pela técnica anterior, usando um gene repórter.

Entre os promotores bacterianos conhecidos adequados paraexpressão de polinucleotídeos e polipeptídeos de acordo com a presenteinvenção estão os promotores de IacZ e Iacl de E. coli, os promotores T3 eT7, o promotor de tac T5, os promotores Iambda PR, PL e o promotor de trp.Entre os promotores eucarióticos conhecidos adequados nesta consideraçãosão o promotor prematuro imediato de CMV1 o promotor timidina quinase deHSV1 os promotores prematuros e tardios de SV40, os promotores de LTRsretrovirais, como aqueles do vírus de sarcoma de Rous ("RSV"), e promoto-res de metalotioneína, como o promotor de metalotioneína-l de camundon-go.

Em um sistema de inseto, vírus de poli-hedrose nuclear de Au-tographa californica (AcNPV) é um dos vários sistemas de inseto que podemser usados como um vetor para expressar genes estranhos. O vírus cresceem células de Spodoptera frugiperda. A seqüência de codificação pode serclonada individualmente em regiões dispensáveis (por exemplo o gene depoli-hedrina) do vírus e colocada sob controle de um promotor de AcNPV(por exemplo o promotor de poli-hedrina). Inserção com sucesso da seqüên-cia de codificação resultará em inativação do gene de poli-hedrina e produ-ção de vírus recombinante não-fechado (isto é, vírus que carece do revesti-mento proteináceo codificado pelo gene de poli-hedrina). Estes vírus recom-binantes são depois usados para infetar células de Spodoptera frugiperdanas quais o gene inserido é expressado. (Por exemplo, vide Smith et al.,1983, J. Virol. 46: 584; Smith, Patente U.S. N°. 4.215.051).

Em células hospedeiras mamíferas, vários sistemas de expres-são baseados em vírus podem ser utilizados. Em casos onde um adenovírusé usado como um vetor de expressão, a seqüência de codificação de inte-resse pode ser ligada a uma transcrição/translação de complexo de controlede adenovírus, por exemplo, a seqüência de promotor tardio e líder triparti-do. Este gene quimérico pode depois ser inserido no genoma de adenovíruspor recombinação in vitro ou in vivo. Inserção em uma região dispensável dogenoma viral (por exemplo, região E1 ou E3) resultará em um vírus recombi-nante que é viável e capaz de expressar a proteína desejada em hospedei-ros infetados. (Por exemplo, vide Logan & Shenk, 1984, Proc. Natl. Acad.Sei. USA 81:3655-3659). Sinais de iniciação específicos podem também serrequeridos para translação eficiente das seqüências de codificação de geneinseridas. Estes sinais incluem o códon de iniciação ATG e seqüências adja-centes. Em casos onde um gene inteiro, incluindo seu próprio códon de ini-ciação e seqüências adjacentes, é inserido no vetor de expressão apropria-do, de nenhum sinal de controle translacional adicional pode ser necessário.

5 Porém, em casos onde apenas uma porção da seqüência de codificação degene é inserida, sinais de controle translacionais exógenos, incluindo, talvez,o códon de iniciação de ATG, devem ser fornecidos. Além disso, o códon deiniciação deve estar em fase com a estrutura de leitura da seqüência de co-dificação desejada para assegurar translação da inserção inteira. Estes si-10 nais de controle translacionais exógenos e códons de iniciação podem serde uma variedade de origens, natural e sintética. A eficiência de expressãopode ser intensificada pela inclusão de elementos intensificadores de trans-crição apropriados, terminadores de transcrição, etc. (vide Bittner et al.,1987, Methods in Enzymol. 153:516-544). Outros sistemas comuns são com15 base em SV40, retrovírus ou vírus adenoassociado. Seleção de vetores epromotores apropriados para expressão em uma célula hospedeira é umprocedimento bem-conhecido e as técnicas requeridas para construção devetor de expressão, introdução do vetor no hospedeiro e expressão no hos-pedeiro per se são habilidades rotineiras na técnica. Em geral, vetores de20 expressão recombinantes incluirão origens de replicação, um promotor deri-vado de um gene altamente expresso para direcionar transcrição de umaseqüência estrutural a jusante, e um marcador selecionável para permitirisolamento do vetor contendo as células após exposição ao vetor.

Além disso, uma cepa de célula hospedeira pode ser seleciona-25 da que modula a expressão das seqüências inseridas, ou modifica e proces-sa o produto de gene na maneira específica desejada. Tais modificações(por exemplo, glicosilação) e processamento (por exemplo, clivagem) dosprodutos de proteína podem ser importantes para a função da proteína. Cé-lulas hospedeiras diferentes têm característica e mecanismos específicos30 para o processamento pós-translacional e modificação das proteínas. Linha-gens celulares ou sistemas hospedeiros apropriados podem ser seleciona-dos para assegurar a modificação e processamento corretos da proteínaestranha expressa. Para este fim, células hospedeiras eucarióticas que pos-suem a maquinaria celular podem ser usadas para processamento apropria-do da transcrição primária, glicosilação, e fosforilação do produto de gene.Tais células hospedeiras mamíferas incluem, mas não são limitadas a, CHO,VERO, BHK, HeLa, COS, MDCK, 293, 3T3, WI38, etc.

A presente invenção também inclui peptídeos de cMAC recom-binantes e fragmentos de peptídeo tendo uma atividade de uma proteína decMAC. O termo "peptídeo recombinante" refere-se a uma proteína da pre-sente invenção que é produzida através de técnicas recombinantes, em queem geral o DNA que codifica um fragmento ativo de cMAC é inserido em umvetor de expressão adequado que é por sua vez usado para transformaruma célula hospedeira para produzir a proteína heteróloga.

Proteínas recombinantes da presente invenção também podemincluir proteínas de fusão quiméricas ou de cMAC e polipeptídeos diferentesque podem ser feitos de acordo com as técnicas familiares a alguém versa-do na técnica (vide, por exemplo, Current Protocols in Molecular Biology;Eds Ausubel et al. John Wiley & Sons; 1992; PNAS 85:4879 (1988)).

Para a produção de rendimento alto a longo prazo das proteínasrecombinantes, expressão estável é preferida. Por exemplo, linhagens celu-lares que estavelmente expressam a proteína de gene diferencialmente ex-pressada podem ser criadas. Ao invés de usar vetores de expressão con-tendo origens virais de replicação, células hospedeiras podem ser transfor-madas com DNA controlado através de elementos de controle de expressãoapropriados (por exemplo, promotor, intensificador, seqüências, terminado-res de transcrição, sítios de poliadenilação, etc.), e um marcador selecioná-vel. Seguindo a introdução do DNA estranho, as células criadas podem serpermitidas crescer durante 1-2 dias em um meio enriquecido, e depois é tro-cado por um meio seletivo. O marcador selecionável no plasmídeo recombi-nante confere resistência à seleção e permite as células estavelmente inte-grarem-se ao plasmídeo em seus cromossomos e crescerem para formarfocos que por sua vez podem ser clonados e expandidos em linhagens celu-lares. Este método pode ser vantajosamente usado para criar linhagens ce-lulares que expressam a proteína de gene diferencialmente expressada. Taislinhagens celulares criadas podem ser particularmente úteis na triagem eavaliação dos compostos que afetam a atividade endógena da proteína ex-pressa.

Vários sistemas de seleção podem ser usados, incluindo, masnão limitados a, genes de timidina quinase de vírus do herpes simples (Wi-gler, et al., 1977, Cell 11:223), de hipoxantina-guanina fosforibosiltransferase(Szybalska & Szybalski, 1962, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 48:2026), e de a-denina fosforibosiltransferase (Lowy, et al., 1980, Cell 22:817) podem serempregados em células de tk~, hgprt" ou aprt", respectivamente. Também,resistência de antimetabólito pode ser usada como a base de seleção paradhfr que confere resistência a genes de metotrexato (Wigler, et al., 1980,Natl. Acad. Sei. USA 77:3567; 0'Hare, et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sei.USA 78:1527); gpt que confere resistência a ácido micofenólico (Mulligan &Berg, 1981, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 78:2072); neo que confere resistên-cia a aminoglicosídeo G-418 (Colberre-Garapin, et al., 1981, J. Mol. Biol.150:1); e hygro que confere resistência a higromicina (Santerre, et al., 1984,Gene 30:147).

Um sistema de proteína de fusão alternativo permite a purifica-ção imediata das proteínas de fusão não-desnaturadas expressas em linha-gens celulares humanas (Janknecht, et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sei. USA88: 8972-8976). Neste sistema, o gene de interesse é subclonado em umplasmídeo de recombinação de vacínia de modo que a estrutura de leituraaberta do gene é translacionamente fundida em um marcador amino-terminal que consiste em seis resíduos de histidina. Extratos de células infe-tadas com vírus de vacínia recombinante são carregados sobre colunas deácido nitriloacético-agarose de Ni2+ e proteínas marcadas com histidina sãoseletivamente eluídas com tampões contendo imidazol.

Quando usada como um componente em sistemas de ensaiocomo aqueles descritos abaixo, uma proteína da presente invenção pode sermarcada, direta ou indiretamente, para facilitar a detecção de um complexoformado entre a proteína e uma substância de teste. Qualquer de uma varie-dade de sistemas de marcação adequados pode ser usado incluindo masnão limitado a radioisótopos como 125I; sistemas de marcação de enzima quegeram um sinal calorimétrico ou luz detectáveis quando expostos ao substra-to; e marcações fluorescentes.

Onde tecnologia de DNA recombinante é usada para produziruma proteína da presente invenção para tais sistemas de ensaio, pode servantajoso criar proteínas de fusão que podem facilitar a marcação, !mobiliza-ção, detecção e/ou isolamento.

Marcação indireta envolve o uso de uma proteína, como um an-ticorpo marcado que especificamente liga a um polipeptídeo da presenteinvenção. Tais anticorpos incluem mas não são limitados a cadeia policlonal,monoclonal, quimérica, simples, fragmentos de Fab e fragmentos produzidospor uma biblioteca de expressão de Fab.

USO DE cMAC COMO ALVO DE FÁRMACO. EM ENSAIOS DE TRIAGEM.E PARA IDENTIFICAÇÃO DE MODULADORES DE cMAC

A invenção imediata descreve pela primeira vez que cMAC é umalvo de fármaco útil para agentes terapêuticos para o tratamento de condi-ções patológicas relacionadas à ativação anormal de células Τ. A descriçãoestabelece que moduladores (por exemplo agonistas ou inibidores) de ativi-dade de cMAC e/ou expressão podem ter muitos usos terapêuticos significa-tivos. Condições patológicas que podem ser tratadas com moduladores decMAC incluem, mas não são limitadas a, distúrbios associados a cMACs(como definidos acima).TRIAGEM

Em ainda outro aspecto, a presente invenção diz respeito a ummétodo para identificar moduladores úteis para tratar as condições patológi-cas debatidas acima compreendendo avaliar quanto à capacidade de ummodulador candidato de inibir ou intensificar a atividade de cMAC e/ou inibirou intensificar a expressão de cMAC in vitro, ex vivo ou in vivo.

Com base na descrição imediata, ensaios de triagem convencio-nais (por exemplo, in vitro, ex vivo e in vivo) podem ser usados para identifi-car moduladores que inibem ou intensificam a atividade de proteína decMAC e/ou inibem ou intensificam a expressão de cMAC.

Muitos formatos para tais ensaios estão disponíveis e conheci-dos àqueles versados na técnica. Falando em termos gerais tais ensaios sãocom base em radiomarcação, fluorescência, luminescência, acumulação desubstrato e uma gama extensiva de outros formatos básicos. Ensaios podemser projetados para empregar a proteína-alvo em um extrato de célula purifi-cado, parcialmente purificado, célula inteira ou formato de multicélulas. En-saios podem em geral ser projetados como processamento alto ou proces-samento baixo. A atividade da proteína-alvo pode ser medida direta ou indi-retamente.

A atividade de cMAC que poderia ser medida em um ensaio in-clui alguma atividade como uma função ou atividade biológica do polipeptí-deo de cMAC estabelecida na descrição imediata, incluindo a ativação fun-cional de células T. Outras atividades biológicas de cMAC que podem serintensificadas ou inibidas em um ensaio de triagem incluem translocaçãonuclear de TORC, translocação nuclear de NFAT ou expressão aumentadade dependente de NFAT usada para transcrever marcadores de genes ourepórteres, e expressão de gene dirigida por Elemento de Resposta decAMP (CRE), marcadores de ativação de células T como ICOS, CD69,CD40L e CD25. cMAC também pode funcionar como um canal de íon, porexemplo um canal de cálcio (com porta de voltagem ou porta de ligante); epode ter atividade sob ativação dependente de cálcio de uma célula T. Des-se modo a atividade de cMAC poderia ser monitorada através de efeitos eminfluxo de íon ou efluxo em cultura de célula. A um nível bioquímico maisespecífico, as atividades biológicas que poderiam ser ensaiadas para tam-bém incluir interações com membranas de célula e componentes de célula-membranas, como um alvo para miristilização, glicosilação, fosforilação, des-fosforilação e outras modificações pós-translacionais. Com base na descri-ção aqui, aqueles versados na técnica poderão identificar estas e outras ati-vidades biológicas de cMAC, qualquer uma destas poderia dar origem a umensaio de triagem adequado.

Tais ensaios tipicamente empregam controles, como controlesnegativos e/ou positivos que estabelecem a atividade de base de cMAC. A-gentes potenciais, como moléculas pequenas, anticorpos ou fragmentos deanticorpos, e outros, são seqüencialmente testado no ensaio para identificaraqueles agentes que geram um efeito mensurável na atividade de interessequando comparados aos controles. Aqueles versados na técnica estão fami-liarizados com a testagem de agentes, particularmente bibliotecas grandesde agentes, triando formatos que podem ser processamento alto ou proces-samento baixo.

A invenção portanto compreende:

Um método para identificar um composto útil para o tratamentode um distúrbio associado a cMAC compreendendo contatar um compostode teste com cMAC; e detectar uma alteração de uma atividade biológica decMAC comparado a cMAC não-contatado com o composto de teste, em quea detecção de uma alteração identifica o dito composto de teste como útilpara o tratamento do dito distúrbio.

Um método de identificar um composto útil para o tratamento deum distúrbio associado a cMAC compreendendo contatar um composto deteste com cMAC sob condições de amostra permissivas para atividade bio-lógica de cMAC que determina o nível de uma atividade biológica de cMACin vitro ou in vivo; comparar o dito nível ao de uma amostra de controle des-provida do dito composto de teste; e, selecionar um composto de teste queleva o dito nível a alterar para outra testagem como um agente potencial pa-ra tratamento do dito distúrbio; e um método para testar se um compostomodula uma atividade biológica de cMAC compreendendo: contatar in vitroou in vivo um composto de teste com cMAC; e detectar uma alteração deuma atividade biológica de cMAC comparada a cMAC não-contatado com ocomposto de teste, em que a detecção de uma alteração identifica o ditocomposto de teste como um modulador de atividade biológica de cMAC.

Em uma modalidade o método identifica inibidores de atividadebiológica de cMAC. A atividade biológica pode ser selecionada de entretransporte de íon, difusão de íon, interação de proteína-cMAC ou modifica-ção de cMAC, ativação dependente de cálcio de uma célula T1 translocaçãonuclear de TORC ou NFAT ou outra molécula dependente de cálcio, ativa-ção da via de calcineurina, e expressão de gene dirigida por Elemento deResposta de cAMP (CRE) ou NFAT.

A invenção inclui também identificar e confirmar se um compostoé útil para o tratamento de um distúrbio associado a cMAC compreendendoadministrar um composto identificado em um ensaio de triagem in vitro a ummodelo animal do dito distúrbio associado a cMAC e observar uma respostadesejada no dito animal.

Como contemplado aqui, a invenção imediata inclui um métodopara usar o gene de cMAC e produto de gene revelado aqui para descobriragonistas e antagonistas que induzem ou reprimem, respectivamente, ativi-dade de TORC, ativação de NFAT (fator nuclear de células T ativadas), e/ouativação de células T, e resulta em vários efeitos terapêuticos.

Em modalidades adicionais, a invenção relata um método paraidentificar um composto útil para o tratamento de um distúrbio relacionado acMAC compreendendo (a) contatar um composto de teste com cMAC; e (b)detectar uma alteração de uma atividade biológica de cMAC comparada acMAC não-contatado com o composto de teste, em que a detecção de umaalteração identifica o dito composto de teste como útil para o tratamento dodito distúrbio.

A invenção inclui um método de identificar um composto útil parao tratamento de um distúrbio relacionado a cMAC compreendendo (a) conta-tar um composto de teste com cMAC sob condições de amostra permissivaspara atividade biológica de cMAC; (b) determinar o nível de uma atividadebiológica de cMAC; (c) comparar o dito nível ao de uma amostra de controledesprovida do dito composto de teste; e, (d) selecionar um composto de tes-te que leva o dito nível a alterar para outra testagem como um agente poten-cial para tratamento do dito distúrbio. Alternativamente, a invenção diz res-peito a um método para testar se um composto modula uma atividade bioló-gica de cMAC compreendendo (a) contatar um composto de teste comcMAC; e (b) detectar uma alteração de uma atividade biológica de cMACcomparada a cMAC não-contatado com o composto de teste, em que a de-tecção de uma alteração identifica o dito composto de teste como um modu-Iador de atividade biológica de cMAC.

Como dito anteriormente, a alteração a ser identificada pode seruma redução de uma atividade biológica, como uma redução de transportede íon, difusão de íon, interação de proteína-cMAC ou modificação decMAC, ativação dependente de cálcio de uma célula T, ativação de uma cé-lula T, ou marcadores de ativação de células T incluindo mas não limitados a(ICOS, CD69, CD25, CD40L), translocação nuclear de NFAT ou TORC1 ex-pressão de gene dirigida por Elemento de Resposta de cAMP (CRE) e ex-pressão de gene dirigida por NFAT ou TORC.

A invenção também compreende o uso de qualquer compostoidentificado por um método de ensaio de triagem aqui no tratamento de umdistúrbio associado a cMAC.

A invenção inclui um método para identificar moduladores úteispara tratar um distúrbio compreendendo avaliar quanto à capacidade de ummodulador candidato em intensificar ou inibir a expressão de uma proteínade cMAC.

Numerosos formatos para tais ensaios são conhecidos àquelesversados na técnica. Inibidores de expressão de cMAC podem ser identifica-dos testando os moduladores candidatos para sua capacidade para inibirtranscrição de mRNA de cMAC, processamento, exportação para citosol,estabilidade, translação (ou qualquer uma das numerosas sub-etapas envol-vidas nestes processos). Por fim, inibidores de expressão são identificadospor uma redução na quantidade de proteína de cMAC funcionalmente ativacomparada aos controles. Intensificadores de expressão podem intensificarqualquer uma das etapas que conduzem à expressão e por fim resultam emum aumento na quantidade de proteína de cMAC funcionalmente ativa.

Ensaios de expressão típicos incluem ensaios de atividade depromotor. Em um ensaio de promotor padrão, um vetor é construído quecompreende toda ou parte da seqüência de promotor de cMAC da SEQ IDNO. 3 operavelmente ligada a uma seqüência de gene repórter (codificandouma proteína repórter) como CAT (Cloranfenicol acetil-transferase) ou Iucife-rase. Especialmente preferido é a seqüência de promotor da SEQ ID NO. 3que não inclui seqüências que correspondem à seqüência de cDNA da SEQID NO. 1. O vetor é transfeccionado em uma célula ou extrato de célula. Mo-duladores candidatos são testados para determinar se eles aumentam a ati-vidade de promotor medindo a atividade da proteína de repórter comparadaaos controles. Numerosos outros formatos de ensaios de atividade de pro-motor são conhecidos e disponíveis àqueles versados na técnica.

Expressão de gene de cMAC (por exemplo, níveis de mRNA)pode também ser determinada usando métodos familiares a alguém versadona técnica, incluindo, por exemplo, análise Northern convencional ou micro-arranjo comercialmente disponível. Adicionalmente, o efeito de um compostode teste nos níveis de cMAC e/ou níveis de proteína reguladora relacionadapodem ser detectados com um ensaio com base em anticorpo de ELISA ouensaio de reação de marcação fluorescente. Estas técnicas estão facilmentedisponíveis para triagem de processamento alto e estão familiarizadas a al-guém versado na técnica.

O fragmento de promotor pode também ser facilmente inseridoem qualquer vetor de gene repórter menos promotor projetado para expres-são em células humanas (por exemplo Clontech pECFP-1 de vetor de prote-ína fluorescente menos promotor intensificado, pEGFP-1, ou pEYFP, Clon-tech, Palo Alto, CA). A triagem depois consistiria em cultivar as células paraum período apropriado de tempo com um composto diferente adicionado acada poço e depois ensaiar para atividade de gene repórter.Em outra modalidade, um ensaio para moduladores de expres-são de cMAC compreende primeiro triar linhagens celulares para encontraras que expressam a proteína de cMAC de interesse. Linhagens celularesrecombinantes contendo uma expressando um gene de cMAC exógeno po-dem também ser testadas. Estas linhagens celulares poderiam ser cultiva-das, por exemplo, em placas de 96, 384 ou 1536 poços. Uma comparaçãodos efeitos de alguns modificadores conhecidos de expressão de gene porexemplo dexametasona, éster de forbol, choque térmico em culturas de teci-do primário e nas linhagens celulares permitiria a seleção da linhagem celu-lar mais apropriada a usar. A triagem depois meramente consistiria em culti-var as células para um período fixo de tempo com um composto diferenteadicionado a cada poço e depois ensaiar para atividade de cMAC.

Dados reunidos destes estudos podem ser usados para identifi-car aqueles moduladores com utilidade terapêutica para o tratamento dascondições patológicas debatidas acima; por exemplo, substâncias inibidoraspoderiam ser ensaiadas também em modelos convencionais in vitro ou invivo das ditas condições patológicas e/ou em experimentações clínicas comhumanos com as ditas condições patológicas de acordo com os métodosconvencionais para avaliar a capacidade dos ditos compostos para tratar asditas condições patológicas in vivo.

A presente invenção, tornando disponível a informação críticacom relação às porções ativas dos polipeptídeos de cMAC, permite o desen-volvimento de moduladores de função de cMAC por exemplo, anticorpos,fragmentos de anticorpos, agonistas ou antagonistas de moléculas peque-nas, empregando projeto de fármaco racional familiar a alguém versado natécnica.

USO DE MODULADORES DE cMAC NO TRATAMENTO DE DISTÚRBIOSASSOCIADOS A cMACS

Em outro aspecto, a invenção diz respeito a um método paratratar distúrbios associado a cMAC compreendendo administrar a um sujeitoem necessidade deste uma composição farmacêutica compreendendo umaquantidade eficaz de um modulador de cMAC.

É contemplado que moduladores usados para identificados edescobertos através dos ensaios de triagem de cMAC revelados aqui pode-riam ser agentes como moléculas pequenas, incluindo moléculas pequenasorgânicas (com ou sem características semelhantes às de fármaco), e inclu-indo produtos naturais. Moduladores de cMAC incluem agonistas de ativida-de biológica de cMAC ou expressão de cMAC; Moduladores adicionais in-cluem inibidores de atividade biológica de cMAC ou inibidores de expressãode cMAC. Detalhes adicionais são fornecidos em outro lugar aqui.

USO DE MODULADORES DE cMAC PARA MODULAR PROCESSOS BIO-LÓGICOS

A invenção descreve métodos de inibir processos biológicos. Emuma modalidade, a invenção diz respeito a um método de inibir atividadebiológica de cMAC em uma célula. Tal inibição pode ser alcançada conta-tando uma célula com um inibidor de cMAC, como um anticorpo de anti-cMAC, fragmento de anticorpo, ou polipeptídeo compreendendo uma regiãode ligação cMAC-específica ou com um ácido nucleico que reduz a expres-são de cMAC. A atividade biológica sendo inibida é selecionada de entre ogrupo que consiste em ativação dependente de cálcio de uma célula T,translocação nuclear de TORC, expressão de gene dirigida por Elemento deResposta de cAMP (CRE), e expressão de genes/proteínas induzíveis porNFAT como IL-2.

Alternativamente, a atividade biológica pode ser um método deseletivamente inibir a atividade de linfócito de um organismo multi-celularcompreendendo contatar o dito organismo com um anticorpo de anti-cMAC,fragmento de anticorpo, ou polipeptídeo compreendendo uma região de liga-ção cMAC-específica ou com um ácido nucleico que reduz expressão decMAC. 'Seletivamente' como aqui usado significa tender a selecionar o tipode tecido ou de célula identificado em preferência a outros tipos de tecido oude célula.

Quanto aos métodos de intensificar processos biológicos, a in-venção também diz respeito a um método de intensificar ativação de célulasT compreendendo contatar uma célula T ou uma célula de precursor de célu-las T com um polipeptídeo de cMAC purificado, um vetor de terapia de geneque compreende o gene de cMAC, ou um intensificador de expressão degene de cMAC.

Outros detalhes são fornecidos no uso de moduladores decMAC para modular processos biológicos em outro lugar aqui.ANTICORPOS PARA cMAC

Anticorpos adequados para proteínas de cMAC podem ser pro-duzidos de acordo com os métodos convencionais. Por exemplo, descritoaqui são métodos para a produção de anticorpos capazes de especificamen-te reconhecer um ou mais epítopos de gene diferencialmente expressos.Tais anticorpos podem incluir, mas não são limitados a, anticorpos policlo-nais, anticorpos monoclonais (mAbs), anticorpos humanizados ou quiméri-cos, anticorpos de cadeia simples, fragmentos de Fab, os fragmentos deF(ab')2, fragmentos produzidos por uma biblioteca de expressão de Fab, an-ticorpos anti-idiotípicos (anti-id), e fragmentos de ligação de epítopo de qual-quer um dos acima, todos como descrito na definição de 'anticorpo', supra.

Para a produção de anticorpos para os polipeptídeos de cMACdebatidos aqui, vários animais hospedeiros podem ser imunizados atravésde injeção com os polipeptídeos, ou uma porção destes. Tais animais hos-pedeiros podem incluir, mas não são limitados a, coelhos, camundongos, eratos. Podem ser usados vários adjuvantes para aumentar a resposta imuno-lógica, dependendo das espécies hospedeiras, incluindo, mas não limitadosa, Freund (completo e incompleto), géis minerais como hidróxido de alumí-nio, substâncias ativas de superfície como lisolecitina, polióis plurônicos, po-liânions, peptídeos, emulsões de óleo, hemocianina de lapa, dinitrofenol, eadjuvantes humanos potencialmente úteis como BCG (bacille Calmette-Guerin) e Corynebacterium parvum.

Anticorpos que ligam os polipeptídeos de cMAC revelados aquipodem ser preparados usando polipeptídeos de cMAC de comprimento totalou fragmentos contendo peptídeos pequenos de interesse como o antígenoimunizante. Os polipeptídeos ou peptídeos usados para imunizar um animalpodem ser derivados da translação de RNA ou podem ser quimicamentesintetizados, e podem ser conjugados com uma proteína de veículo, se de-sejado. Veículos comumente usados que são quimicamente acoplados aospeptídeos incluem albumina de soro bovino e tiroglobulina. O peptídeo aco-plado é depois usado para imunizar um animal (por exemplo, um camun-dongo, um rato ou um coelho).

Anticorpos policlonais são populações heterogêneas de molécu-Ias de anticorpo derivadas dos soros de animais imunizados com um antíge-no, como produto de gene-alvo, ou um derivado funcional antigênico deste.Para a produção de anticorpos policlonais, animais hospedeiros, como aque-les descritos acima, podem ser imunizados através de injeção com os poli-peptídeos, ou uma porção destes, suplementados com adjuvantes como15 também descritos acima.

Anticorpos monoclonais que são populações homogêneas deanticorpos a um antígeno particular, podem ser obtidos por qualquer técnicaque provê a produção de moléculas de anticorpo através de linhagens celu-lares contínuas em cultura. Estas incluem, mas não são limitada a, técnica20 de hibridoma de Kohler e Milstein, (1975, Nature 256:495-497; e PatenteU.S. N°. 4.376.110), a técnica de hibridoma de células B humanas (Kosboret al., 1983, Immunology Today 4:72; Cole etal., 1983, Proc. Natl. Acad. Sei.USA 80:2026-2030), e a técnica de EBV-hibridoma (Cole et al., 1985, Mono-clonal Antigobies and CancerTherapy, Alan R., Liss, Inc., págs. 77-96). Tais25 anticorpos podem ser de qualquer classe de imunoglobulina incluindo IgG,IgM, IgE, IgA, IgD e qualquer subclasse destas. O hibridoma que produz omAb deste invenção pode ser cultivado in vitro ou in vivo. Produção de titu-lações altas de mAbs in vivo faz disso o método presentemente preferido deprodução.

30 Além disso, técnicas desenvolvidas para a produção de "anticor-

pos quiméricos" (Morrison et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci., 81:6851-6855;Neuberger et al., 1984, Nature, 312:604-608; Takeda et ai., 1985, Nature,314:452-454) juntando os genes de uma molécula de anticorpo de camun-dongo de especificidade de antígeno apropriada junto com os genes de umamolécula de anticorpo humano de atividade biológica apropriada podem serusadas. Um anticorpo quimérico é uma molécula em que porções diferentessão derivadas de espécies animais diferentes, como aqueles tendo uma re-gião variável ou hipervariável derivada de um mAb murino e uma regiãoconstante de imunoglobulina humana.

Alternativamente, técnicas descritas para a produção de anticor-pos de cadeia simples (Patente U.S. N°. 4.946.778; Bird, 1988, Science242:423-426; Huston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85:5879-5883;e Ward et al., 1989, Nature 334:544-546) podem ser adaptadas para produ-zir anticorpos de gene de cadeia simples diferencialmente expressos. Anti-corpos de cadeia simples são formados ligando os fragmentos de cadeiapesada e leve da região de Fv por meio de uma ligação em ponte de amino-ácido, resultando em um polipeptídeo de cadeia simples.

O mais preferivelmente, técnicas úteis para a produção de "anti-corpos humanizados" podem ser adaptadas para produzir anticorpos para ospolipeptídeos, fragmentos, derivados, e equivalentes funcionais reveladosaqui. Tais técnicas são reveladas nas patentes U.S. Nos. 5.932. 448;5.693.762; 5.693.761; 5.585.089; 5.530.101; 5.910.771; 5.569.825;5.625.126; 5.633.425; 5.789.650; 5.545.580; 5.661.016; e 5.770.429, as re-velações de todas estas são aqui incorporadas por referência em sua totali-dade.

Fragmentos de anticorpo que reconhecem epítopos específicosde cMAC podem ser gerados através de técnicas conhecidas. Por exemplo,tais fragmentos incluem, mas não são limitados: os fragmentos do F(ab')2que podem ser produzidos por digestão de pepsina da molécula de anticorpoe os fragmentos de Fab que podem ser gerados reduzindo as ligações emponte de dissulfeto dos fragmentos de F(ab')2. Alternativamente, bibliotecasde expressão de Fab podem ser construídas (Huse et al., 1989, Science,246:1275-1281) para permitir identificação rápida e fácil dos fragmentos deFab monoclonais com a especificidade desejada.

Uma ampla variedade de estruturas ou andaimes de anticor-po/imunoglobulina podem ser empregados desde que o polipeptídeo resul-tante inclua uma ou mais regiões de ligação que são específicas para a pro-teína de cMAC. Tais estruturas ou andaimes incluem os 5 idiotipos principaisde imunoglobulinas humanas, ou fragmentos destes (como aqueles revela-dos em outro lugar aqui), e incluem imunoglobulinas de outras espécies ani-mais, preferivelmente tendo aspectos humanizados. Anticorpos de cadeia pe-sada simples como aqueles identificados em camelídeos são de interesse par-ticular nesta consideração. Estruturas novas, andaimes e fragmentos continu-am sendo descobertos e desenvolvidos por aqueles versados na técnica.

Alternativamente, estruturas e andaimes de não-imunoglobulinaconhecidos ou futuros podem ser empregados, contanto que eles compre-endam uma região de ligação específica para a proteína de cMAC da SEQID NO: 2. Tais compostos são conhecidos aqui como "polipeptídeos quecompreendem uma região de ligação cMAC-específica". Estruturas ou an-daimes de não-imunoglobulina conhecidos incluem Adnectinas (fibronectina)(Compound Theraputics, Inc., Waltham, MA), anquirina (Molecular PartnersAG, Zurique, Suíça), anticorpos de domínio (Domantis, Ltd (Cambridge, MA)e Ablynx nv (Zwijnaarde, Bélgica)), Iipocalina (AnticaIina) (Pieris ProteolabAG, Freising, Alemanha), produtos imuno-farmacêuticos modulares peque-nos (Trubion Pharmaceuticals Inc., Seattle, WA), maxi-corpos (Avidia, Inc.(Mountain View, CA)), Proteína A (Affibody AG, Sweden) e afilina (gama-cristalina ou ubiquitina) (Scil Proteins GmbH, Halle, Alemanha).

De acordo com a invenção imediata, o anticorpo de anti-cMACou fragmento deste, ou o polipeptídeo que compreende uma região de liga-ção cMAC-específica, independente da estrutura ou andaime empregado,pode estar ligado, ou covalente ou não-covalentemente, a uma metade adi-cional. A metade adicional pode ser um polipeptídeo, um polímero inertecomo PEG, molécula pequena, radioisótopo, metal, íon, ácido nucleico ououtro tipo de molécula biologicamente relevante. Uma tal construção quepode ser conhecida como um imunoconjugado, imunotoxina, ou outros, étambém inclusa no significado de anticorpo, fragmento de anticorpo ou poli-peptídeo compreendendo uma região de ligação cMAC-específica, comoaqui usado.

A invenção também diz respeito ao uso de um anticorpo, umfragmento de anticorpo específico para cMAC ou um polipeptídeo compre-endendo uma região de ligação cMAC-específica no tratamento de um dis-túrbio em um sujeito como descrito aqui.

A invenção também diz respeito a um anticorpo ou fragmento deanticorpo que especificamente se liga ao cMAC (SEQ ID NO. 2) ou um poli-peptídeo que compreende uma região de ligação cMAC-específica, incluindoum fragmento de anticorpo (por exemplo fragmento de Fab ou F(ab')2) ouum anticorpo monoclonal. A invenção também abrange uma composiçãofarmacêutica de tal anticorpo, fragmento de anticorpo ou região de ligaçãocontendo polipeptídeo que especificamente se liga ao cMAC.

Detecção de cMAC pelos anticorpos descritos aqui pode ser al-cançada usando ELISA padrão, análise de FACS, e técnicas de imageamen-to padrão usadas in vitro ou in vivo. Detecção pode ser facilitada acoplando(isto é, ligando fisicamente) cMAC a uma substância detectável. Exemplosde substâncias detectáveis incluem várias enzimas, grupos proféticos, mate-riais fluorescentes, materiais luminescentes, materiais bioluminescentes, emateriais radioativos. Exemplos de enzimas adequadas incluem peroxidasede raiz-forte, fosfatase alcalina, β-galactosidase, ou acetilcolinesterase; e-xemplos de complexos de grupos protéticos adequados incluem estreptavi-dina/biotina e avidina/biotina; exemplos de materiais fluorescentes adequa-dos incluem umbeliferona, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, roda-mina, fluoresceína de diclorotriazinilamina, cloreto de dansila ou ficoeritrina;um exemplo de um material Iuminescente inclui luminol; exemplos de mate-riais bioluminescentes incluem luciferase, luciferina, e equorina, e exemplosde material radioativo adequado incluem 125I1 131135S ou 3H.Particularmente preferido, para facilidade de detecção, é o en-saio em sanduíche, deste várias variações existem todas destas são inten-cionadas ser abrangidas pela presente invenção. Por exemplo, em um en-saio direto típico, anticorpo de anti-cMAC não-marcado é imobilizado em umsubstrato sólido e a amostra a ser testada colocada em contato com a molé-cula ligada. Após um período adequado de incubação, durante um períodode tempo suficiente para permitir formação de um complexo binário de anti-corpo-antígeno, um segundo anticorpo, marcado com uma molécula repórtercapaz de induzir um sinal detectável, é adicionado e incubado, permitindotempo suficiente para a formação de um complexo ternário de anticorpo-antígeno-anticorpo marcado. Qualquer material não-reagido é depois lavado,e a presença do antígeno é determinada por observação de um sinal, oupode ser quantificado comparando com uma amostra de controle que con-tém quantidades conhecidas de antígeno. Variações no ensaio direto inclu-em o ensaio simultâneo em que a amostra e anticorpo são acrescentadossimultaneamente ao anticorpo ligado, ou um ensaio reverso em que o anti-corpo marcado e amostra são combinados para serem testados primeiro,incubados e adicionados ao anticorpo ligado de superfície não-marcada. Es-tas técnicas são bem-conhecidas àqueles versados na técnica, e a possibili-dade de variações secundárias será facilmente evidente. Como aqui usado,"ensaio em sanduíche" é intencionado abranger todas as variações na técni-ca de dois sítios básicos. Para os imunoensaios da presente invenção, oúnico fator Iimitativo é aquele que o anticorpo marcado é um anticorpo que éespecífico para os polipeptídeos de cMAC ou proteínas reguladoras relacio-nadas, ou fragmentos destes.

As moléculas repórteres comumente usadas são quaisquer en-zimas, moléculas contendo fluoroforo ou radionuclídeo. No caso de um imu-noensaio de enzima uma enzima é conjugada com o segundo anticorpo, u-sualmente por meio de glutaraldeído ou periodato. Como será reconhecidofacilmente, porém, uma ampla variedade de técnicas de ligação diferentesexiste que é bem-conhecida ao versado na técnica. Enzimas comumenteusadas incluem peroxidase de raiz-forte, glicose oxidase, beta-galactosidasee fosfatase alcalina, entre outras. Os substratos a serem usados com as en-zimas específicas são em geral escolhidos para a produção, sob hidrólisepela enzima correspondente, de uma alteração de cor detectável. Por exem-plo, fosfato de p-nitrofenila é adequado para o uso com os conjugados defosfatase alcalina; para conjugados de peroxidase, 1,2-fenilenodiamina outoluidina são comumente usados. É também possível empregar substratosfluorogênicos que rendem um produto fluorescente ao invés dos substratoscromogênicos observados acima. Uma solução contendo o substrato apro-priado é depois adicionada ao complexo terciário. O substrato reage com aenzima ligada ao segundo anticorpo, fazendo um sinal visual qualitativo quepode ser também quantificado, usual e espectrofotometricamente, para daruma avaliação da quantidade de polipeptídeo ou fragmento de polipeptídeode interesse que está presente na amostra de soro.

Alternadamente, compostos fluorescentes podem ser acoplados,como fluoresceína e rodamina, quimicamente aos anticorpos sem alterar suacapacidade de ligação. Quando ativado por iluminação com luz de um com-primento de onda particular, o anticorpo marcado com fluorocromo absorve aenergia de luz, induzindo um estado de excitabilidade na molécula, seguidopor emissão da luz a um comprimento de onda mais longo característico. Aemissão aparece como uma cor característica visualmente detectável comum microscópio de luz. Técnicas de imunofluorescência e de EIA são ambasmuito bem-estabelecidas na técnica e são particularmente preferidas para ométodo presente. Porém, outras moléculas repórteres, como radioisótopos,moléculas quimioluminescentes ou bioluminescentes podem também serempregadas. Será facilmente evidente ao versado na técnica como variar oprocedimento para adequar ao uso requerido.

A invenção portanto inclui composições farmacêuticas que com-preendem anticorpos que são altamente seletivos para cMAC humano ouporções de polipeptídeos de cMAC humano, e métodos de usar tais anticor-pos. Sob administração a um sujeito, tais anticorpos podem inibir ou diminuira atividade de cMAC, ou em alguns casos podem aumentar a atividade decMAC, interagindo diretamente com a proteína. Inibidores podem bloquearsítios ativos ou bloquear o acesso dos substratos aos sítios ativos. Anticor-pos de cMAC podem também ser usados para inibir atividade de cMAC im-pedindo as interações de proteína-proteína que podem estar envolvidas naregulação das proteínas de cMAC e necessárias para a atividade de proteí-na. Anticorpos com atividade inibidora como descrita aqui podem ser produ-zidos e identificados de acordo com ensaios padrões familiares a alguémversado na técnica.

Anticorpos de cMAC podem também ser usados diagnostica-mente. Por exemplo, poder-se-ía usar estes anticorpos de acordo com osmétodos convencionais para quantificar níveis de uma proteína de cMAC emum sujeito; níveis aumentados poderiam, por exemplo, indicar ativação decélulas T indesejáveis, ativação excessiva de expressão de gene CRE-dependente (por exemplo, ativação de genes tendo CRE em suas regiõespromotoras) e possivelmente poderiam indicar o grau de ativação excessivae severidade correspondente da condição patológica relacionada. Dessemodo, níveis de cMAC diferentes poderiam ser indicativos de várias formasclínicas ou severidade de condições patológicas como distúrbios associadosa cMACs. Tal informação também seria útil para identificar subconjuntos depacientes que sofrem de uma condição patológica que pode ou não respon-der ao tratamento com moduladores de cMAC.TERAPIA DE GENE

Em outra modalidade, ácidos nucleicos que compreendem umaseqüência que codifica uma proteína de cMAC ou derivado funcional destasão administrados para propósitos terapêuticos, por via de terapia de gene.Terapia de gene refere-se à terapia executada pela administração de umácido nucleico a um sujeito. Nesta modalidade da invenção, o ácido nucleicoproduz sua proteína codificada que medeia um efeito terapêutico promoven-do ativação de células T normais.

Qualquer um dos métodos para terapia de gene disponíveis natécnica pode ser usado de acordo com a presente invenção. Métodos exem-plares são descritos abaixo.

Em um aspecto preferido, o terapêutico compreende um ácidonucleico de cMAC que faz parte de um vetor de expressão que expressauma proteína de cMAC ou fragmento ou proteína quimérica deste em umhospedeiro adequado. Em particular, um tal ácido nucleico tem um promotoroperavelmente ligado à região de codificação de cMAC, o dito promotor sen-do induzível ou constitutivo, e, opcionalmente, tecido-específico. Em outramodalidade particular, uma molécula de ácido nucleico é usada em que asseqüências de codificação de cMAC e qualquer outra seqüência desejadasão flanqueadas por regiões que promovem recombinação homóloga em umsítio desejado no genoma, desse modo provendo expressão intracromossô-mica de um ácido nucleico de cMAC (Koller e Smithies, 1989, Proc. Natl.Acad. Sei. USA 86:8932-8935; Zijlstra et al., 1989, Nature 342:435-438).

Liberação do ácido nucleico em um paciente ou pode ser direta,em cujo caso o paciente é exposto diretamente ao ácido nucleico ou vetorcarregando ácido nucleico, ou indireta em cujo caso, células são primeirotransformadas com o ácido nucleico in vitro, depois transplantadas para opaciente. Estes dois métodos são conhecidos, respectivamente, como tera-pia de gene in vivo ou ex vivo.

Em uma modalidade específica, o ácido nucleico é diretamenteadministrado in vivo, onde é expressado para produzir o produto codificado.Isto pode ser realizado por qualquer um de numerosos métodos conhecidosna técnica, por exemplo, construindo-o como parte de um vetor de expres-são de ácido nucleico apropriado e administrando-o de forma intracelular,por exemplo, através de infecção usando um vetor retroviral ou outro viraldefeituoso ou atenuado (vide, por exemplo, Patente U.S. N°. 4.980.286 eoutros mencionados infra), ou por injeção direta de DNA desprotegido, oupor uso de bombardeio de micropartículas (por exemplo, uma pistola de ge-ne; Biolistic, Dupont), ou revestindo com lipídios ou receptores de superfíciecelular ou agentes transfeccionantes, encapsulação em lipossomas, micro-partículas, ou microcápsulas, ou administrando-o em ligação a um peptídeoque é conhecido entrar no núcleo, administrando-o em ligação a um Iigantesujeito a endocitose mediada por receptor (vide por exemplo, Patentes U.S.Nos. 5.166.320; 5.728.399; 5.874.297; e 6.030.954, todas estas são incorpo-radas aqui por referência em sua totalidade) (que pode ser usado para dire-cionar tipos de células que especificamente expressam os receptores), etc.Em outra modalidade, um complexo de ácido nucleico-ligando pode ser for-mado em que o Iigante compreende um peptídeo viral fusogênico para rom-per os endossomas, permitindo o ácido nucleico evitar degradação Iisosso-mal. Em ainda outra modalidade, o ácido nucleico pode ser direcionado invivo para absorção e expressão célula-específica, direcionando um receptorespecífico (vide, por exemplo, Publicações de PCT WO 92/06180; WO92/22635; W092/20316; W093/14188; e WO 93/20221). Alternativamente, oácido nucleico pode ser introduzido intracelularmente e incorporado dentrodo DNA de célula hospedeira para expressão, através de recombinação ho-móloga (vide, por exemplo, Patentes U.S. 5.413.923; 5.416.260; e5.574.205; e Zijlstra et al., 1989, Nature 342:435-438).

Em uma modalidade específica, um vetor viral que contém umácido nucleico de cMAC é usado. Por exemplo, um vetor retroviral pode serusado (vide, por exemplo, Patentes U.S. 5.219.740; 5.604.090; e 5.834.182).Estes vetores retrovirais foram modificados para excluir seqüências retrovi-rais que não são necessárias para empacotamento do genoma viral e inte-gração no DNA da célula hospedeira. O ácido nucleico de cMAC a ser usadona terapia de gene é clonado no vetor que facilita a liberação do gene emum paciente.

Adenovírus são outros vetores virais que podem ser usados emterapia de gene. Adenovírus são veículos especialmente atrativos para libe-rar genes aos epitélios respiratórios. Adenovírus naturalmente infetam osepitélios respiratórios onde eles causam uma doença moderada. Outros al-vos para sistemas de liberação com base em adenovírus são fígado, o sis-tema nervoso central, células endoteliais, e músculo. Adenovírus têm a van-tagem de ser capaz de infetar células não-divisoras. Métodos para conduzirterapia de gene com base em adenovírus são descritos, por exemplo, nasPatentes U.S. 5.824.544; 5.868.040; 5.871.722; 5.880.102; 5.882.877;5.885.808; 5.932.210; 5.981.225; 5.994.106; 5.994.132; 5.994.134;6.001.557; e 6.033.8843, todas destas são incorporadas aqui por referênciaem sua totalidade.

Vírus adenoassociado (AAV) vem também sendo proposto para ouso em terapia de gene. Métodos para produzir e utilizar AAV são descritos, porexemplo, nas Patentes U.S. 5.173.414; 5.252.479; 5.552.311; 5.658.785;5.763.416; 5.773.289; 5.843.742; 5.869.040; 5.942.496; e 5.948.675, todas es-tas são aqui incorporadas por referência em sua totalidade.

Outra possibilidade para terapia de gene envolve transferir umgene para células em cultura de tecido portais métodos como eletroporação,lipofecção, transfecção mediada por fosfato de cálcio, ou infecção viral. Usu-almente, o método de transferência inclui a transferência de um marcadorselecionável para as células. As células são depois colocadas sob seleçãopara isolar aquelas células que foram pegas e estão expressando o genetransferido. Aquelas células são depois liberadas a um paciente.

Nesta modalidade, o ácido nucleico é introduzido em uma célulaantes da administração in vivo da célula recombinante resultante. Tal intro-dução pode ser realizada por qualquer método conhecido na técnica, inclu-indo mas não limitado a transfecção, eletroporação, microinjeção, infecçãocom um vetor viral ou de bacteriófago contendo as seqüências de ácido nu-cleico, fusão de célula, transferência de gene mediada por cromossomo,transferência de gene mediada por microcélula, fusão de esferoplastos, etc.Numerosas técnicas são conhecidas na técnica para a introdução de genesestranhos em células e podem ser usadas de acordo com a presente inven-ção, contanto que não sejam rompidas as funções desenvolventes e fisioló-gicas necessárias das células recipientes. A técnica deveria prover a transfe-rência estável do ácido nucleico à célula, de forma que o ácido nucleico sejaexprimível pela célula e preferivelmente hereditário e exprimível por sua pro-gênie de célula.

As células recombinantes resultantes podem ser liberadas a umpaciente por vários métodos conhecidos na técnica. Em uma modalidadepreferida, as células epiteliais são injetadas, por exemplo, subcutaneamente.

Em outra modalidade, células de pele recombinantes podem ser aplicadascomo um enxerto de pele sobre o paciente. Células sangüíneas recombi-nantes (por exemplo, células-tronco hematopoético ou progenitoras) são pre-ferivelmente administradas de modo intravenoso. A quantidade de célulaspressentidas para o uso depende do efeito desejado, estado de paciente,etc., e pode ser determinada por alguém versado na técnica.

Células às quais um ácido nucleico pode ser introduzido parapropósitos de terapia de gene abrangem qualquer tipo de célula desejado,disponível, e incluem, mas não são limitadas a, células epiteliais, células en-doteliais, ceratinócitos, fibroblastos, células musculares, hepatócitos; célulassangüíneas como linfócitos T, linfócitos B, monócitos, macrófagos, neutrófi-los, eosinófilos, megacariócitos, granulócitos; várias células-tronco ou pro-genitoras, em particular células-tronco hematopoético ou progenitoras, porexemplo, como obtidas da medula óssea, sangue do cordão umbilical, san-gue periférico, fígado fetal, etc.

Em uma modalidade preferida, a célula usada para terapia degene é autóloga ao paciente.

Em uma modalidade em que células recombinantes são usadasem terapia de gene, um ácido nucleico de cMAC é introduzido nas células demodo que elas sejam exprimíveis pelas células ou sua progênie, e as célulasrecombinantes são depois administradas in vivo para efeito terapêutico. Emuma modalidade específica, células-tronco ou progenitoras são usadas.

Quaisquer células-tronco e/ou progenitoras que podem ser isoladas e manti-das in vitro podem ser potencialmente usadas de acordo com esta modali-dade da presente invenção. Tais células-tronco incluem, mas não são limita-das a, células-tronco hematopoéticas (HSC)1 células-tronco de tecidos epite-liais como a pele e o revestimento do intestino, células embrionárias de mús-culo cardíaco, células-tronco de fígado (vide, por exemplo, WO 94/08598), ecélulas-tronco neurais (Stemple e Anderson1 1992, Cell 71:973-985).

Células-tronco epiteliais (ESCs) ou ceratinócitos podem ser obti-dos de tecidos como a pele e o revestimento do intestino através de proce-dimentos conhecidos (Rheinwald, 1980, Meth. Cell Bio. 21A:229). Em tecidoepitelial estratificado como a pele, renovação ocorre por mitose de células-tronco dentro da camada germinal, a camada mais íntima à lâmina basal.Células-tronco dentro do revestimento do intestino provêem uma taxa derenovação rápida deste tecido. ESCs ou ceratinócitos obtidos da pele ourevestimento do intestino de um paciente ou doador podem ser crescidos emcultura de tecido (Pittelkow e Scott, 1986, Mayo Clinic Proc. 61:771). Se asESCs forem fornecidas por um doador, um método para supressão de reati-vidade de hospedeiro-versus-enxerto (por exemplo, irradiação, administra-ção de fármaco ou anticorpo para promover imunossupressão moderada)pode também ser usado.

Com respeito às células-tronco hematopoéticas (HSC), qualquertécnica que provê isolamento, propagação, e manutenção in vitro de HSCpode ser usada nesta modalidade da invenção. Técnicas pelas quais istopode ser realizado incluem (a) o isolamento e estabelecimento de culturasde HSC de células da medula óssea isoladas do hospedeiro futuro, ou umdoador, ou (b) o uso de culturas de HSC a longo prazo previamente estabe-lecidas que pode ser alogeneica ou xenogeneica. HSC não-autólogas sãopreferivelmente usadas junto com um método de suprimir reações imunes detransplantação do hospedeiro/paciente futuro. Em uma modalidade particularda presente invenção, células de medula óssea humana podem ser obtidasda crista ilíaca posterior por aspiração com agulha (vide, por exemplo, Kodoet al., 1984, J. Clin. Invest. 73:1377-1384). Em uma modalidade preferida dapresente invenção, as HSCs podem ser feitas altamente enriquecidas ou emforma substancialmente pura. Este enriquecimento pode ser realizado antes,durante, ou após cultivo a longo prazo, e pode ser feito por qualquer técnicaconhecida na técnica. Culturas a longo prazo de células da medula ósseapodem ser estabelecidas e mantidas usando, por exemplo, técnicas de cultu-ra de células Dextra modificadas (Dexter et al., 1977, J., Cell Physiol.91:335) ou técnicas de cultivo de Witlock-Witte (Witlock e Witte, 1982, Proc.Natl. Acad. Sei. USA 79:3608-3612).

Em uma modalidade específica, o ácido nucleico a ser introduzi-do para propósitos de terapia de gene compreende um promotor induzíveloperavelmente ligado à região de codificação, de modo que expressão doácido nucleico é controlável controlando a presença ou ausência do indutorapropriado de transcrição.

As composições farmacêuticas da presente invenção podemtambém compreender substâncias que inibem a expressão de proteínas decMAC ao nível de ácido nucleico. Tais moléculas incluem ribozimas, oligo-nucleotídeos antissenses, DNA de hélice tripla, aptâmeros de RNA, siRNA, eRNA bi ou unifilamentar direcionado para uma seqüência de nucleotídeo a-propriada de um ácido nucleico de cMAC. Estes moléculas inibidoras podemser criadas usando técnicas convencionais por alguém versado na técnicasem sobrecarga ou experimentação imprópria. Por exemplo, modificações(por exemplo inibição) da expressão de gene podem ser obtidas projetandomoléculas antissenses, DNA ou RNA, para as regiões de controle de um ge-ne que codifica um polipeptídeo de cMAC debatido aqui, isto é para promo-tores, intensificadores, e íntrons. Por exemplo, oligonucleotídeos derivadosdo sítio de iniciação de transcrição, por exemplo, entre as posições -10 e+10 desde o começo sítio podem ser usados. Todavia, todas as regiões dogene podem ser usadas para projetar uma molécula antissenso para criaraquelas que rendem hobridização mais forte com o mRNA e tais oligonucleotí-deos antissenses adequados pode ser produzidos e identificados através deprocedimentos de ensaio padrões familiares a alguém versado na técnica.

Similarmente, inibição da expressão de expressão de gene podeser alcançada usando metodologia de pareamento de base de "hélice tripla".Pareamento de hélice triplo é útil porque causa inibição da capacidade dahélice dupla de abrir suficientemente para a ligação de polimerases, fatoresde transcrição, ou moléculas reguladoras. Recentes avanços terapêuticosusando DNA triplex foi descrito na literatura (Gee, J. E. et al. (1994) em: Hu-ber, Β. E. e Β. I. Carr1 Molecular and Immunologic Approaches, Futura Publi-shing Co., Mt. Kisco, N.Y.). Estas moléculas podem também ser projetadaspara bloquear a translação de mRNA impedindo a transcrição de ligar aoribossoma.

Ribozimas, moléculas de RNA enzimáticas, podem também serusadas para inibir expressão de gene catalisando a clivagem específica deRNA. O mecanismo de ação da ribozima envolve hobridização sequência-específica da molécula de ribozima para RNA alvo complementar, seguidopor clivagem endonucleolítica. Exemplos que podem ser usados incluemmoléculas de ribozima de motivo de "cabeça de martelo" ou "alfinete" cria-das que podem ser específica e eficazmente projetadas para catalisar a cli-vagem endonucleolítica das seqüências de gene, por exemplo, o mRNA pa-ra cMAC.

Sítios de clivagem de ribozima específicos dentro de qualquerRNA alvo potencial são identificados inicialmente varrendo a molécula-alvopara sítios de clivagem de ribozima que incluem as seqüências a seguir:GUA, GUU e GUC. Uma vez identificadas, seqüências de RNA curtas deentre 15 e 20 ribonucleotídeos podem ser avaliadas correspondendo à regi-ão do gene-alvo que contém o sítio de clivagem para características estrutu-rais secundárias que podem tornar o oligonucleotídeo inoperável. A conveni-ência de alvos candidatos pode também ser avaliada testando a acessibili-dade à hobridização com oligonucleotídeos complementares usando ensaiosde proteção de ribonuclease.

Métodos de ribozima incluem expor uma célula às ribozimas ouinduzir a expressão em uma célula de tais moléculas pequenas de ribozimade RNA (Grassi e Marini, 1996, Annals of Medicine 28: 499-510; Gibson,1996, Câncer and Metastase Reviews 15: 287-299). Expressão intracelularde ribozimas de cabeça de martelo ou de alfinete direcionadas para mRNAque correspondem a pelo menos um dos genes debatidos aqui pode ser uti-lizada para inibir proteína codificada pelo gene.

Ribozimas podem ser liberadas diretamente às células, na formade oligonucleotídeos de RNA que incorporam as seqüências de ribozima, oupodem ser introduzidas na célula como um vetor de expressão que codificao RNA ribozimal desejado. Ribozimas podem ser habitualmente expressa-das in vivo em número suficiente para ser cataliticamente eficaz em clivarmRNA, e assim modificando a abundância de mRNA em uma célula (Cottenet al., 1989 EMBO J. 8:3861-3866). Em particular, uma ribozima que codificaseqüência de DNA, projetada de acordo com regras bem-conhecidas con-vencionais e sintetizadas, por exemplo, através de química de fosforamiditapadrão, pode ser ligada em um sítio de enzima de restrição no tronco de an-ticódon e alça de um gene que codifica um tRNA que pode depois ser trans-formado e expresso em uma célula de interesse através de rotina dos méto-dos na técnica. Preferivelmente, um promotor induzível (por exemplo, umglicocorticoide ou um elemento de resposta de tetraciclina) é também intro-duzido nesta construção de forma que expressão de ribozima pode ser sele-tivamente controlada. Para uso de saturação, um promotor alta e constituti-vamente ativo pode ser usado. Genes de tDNA (isto é, genes que codificamtRNAs) são úteis neste pedido de patente por causa de seu tamanho peque-no, taxa alta de transcrição, e expressão ubíqua em tipos diferentes de teci-dos.

Portanto, ribozimas podem ser habitualmente projetadas paraclivar virtualmente qualquer seqüência de mRNA, e uma célula pode ser ha-bitualmente transformada com DNA que codifica para tais seqüências deribozima de modo que uma quantidade da ribozima controlável e catalitica-mente eficaz é expressada. Consequentemente a abundância de virtualmen-te qualquer espécie de RNA em uma célula pode ser modificada ou pertur-bada.

Seqüências de ribozima podem ser modificadas essencialmenteda mesma maneira como descrita para nucleotídeos antissenses, por exem-plo, a seqüência de ribozima pode compreender uma porção de base modifi-cada.

Aptâmeros de RNA podem também ser introduzidos ou expres-sos em uma célula para modificar a abundância ou atividade de RNA. Aptâ-meros de RNA são Iigantes de RNA específicos para proteínas, como paraRNA de Tat e Rev (Good et al., 1997, Gene Therapy 4: 45-54) que especifi-camente pode inibir sua translação.

Inibição específica de gene da expressão de gene pode tambémser alcançada usando estratégias de interferência de RNA ("RNAi"). RNAi éuma descoberta relativamente nova. Conta com RNA bifilamentar. Uma des-crição de tal tecnologia pode ser encontrada em WO 99/32619 que é poreste meio incorporado por referência em sua totalidade. Tecnologia de RNAiprovou-se útil como um meio para inibir expressão de gene (vide por exem-plo, Cullen, BR Nat. Immunol. 2002 jul;3(7):597-9).

Um agente de RNAi como aqui usado refere-se aos compostos ecomposições que podem atuar através de um mecanismo de RNAi (vide,para referência geral, He e Hannon, (2004) Nat. Genet. 5:522-532). Agentesde RNAi como RNA de interferência curta ("siRNA"), RNA bifilamentar ("ds-RNA"), RNA de alfinete curto ("shRNA", também às vezes chamado 'RNAsintético') são comumente usados, outros estão em desenvolvimento. Quan-do introduzidos em uma célula ou sintetizados dentro de uma célula, os a-gentes de RNAi são incorporados em um complexo macromolecular que usafilamentos do agente de RNAi para direcionar e clivar filamentos de RNAcontendo a seqüência complementar (ou substancialmente complementar).

Agentes de RNAi podem ser quimicamente modificados. Umavariedade de modificações químicas adequadas conhecidas àqueles versa-dos na técnica está exposta na publicação de PCT WO 03/070918, incorpo-rada aqui por referência. Outras modificações e combinações de modifica-ções que não abolem a atividade de RNAi do composto são também con-templadas aqui.

Agentes de RNAi adequados para o uso na invenção incluem osfilamentos de dsRNA resultantes da hobridização dos filamentos unifilamen-tares senso e antissenses indicados na Tabela 5, e Tabela 6 (vide Exem-plos) (vide Exemplos; notar que as seqüências devem ser sintetizadas comoRNA (não DNA), e podem opcionalmente ser modificadas quimicamente).

Os agentes de RNAi que podem ser preparados com base naTabela 5 ou Tabela 6, ou como do contrário projetados por alguém versadona técnica, podem ser encurtados em compostos bifilamentares de 17 a 30mer, com ou sem extensões de 3' de 1-6 nts, com ou sem modificaçõesquímicas ou modificações de terminação, e com ou sem complementaridadeexata para a sequência-alvo em cujo caso eles são referidos aqui comocompostos de RNA de interferência curta ("siRNA").

Compostos de siRNA preferidos, quando calculados usando o al-goritmo de Biopred (Huesken et al. (2005) Nat. Biotech. 23(8):995-1001) são:

TABELA 5:<table>table see original document page 70</column></row><table>

A invenção também diz respeito ao uso de um agente de RNAi,tal como um siRNA específico para cMAC, no tratamento de um distúrbio emum sujeito.

Moléculas antissenses, DNA de hélice tripla, aptâmeros de RNAe ribozimas da presente invenção podem ser preparados por qualquer méto-do conhecido na técnica pela síntese de moléculas de ácido nucleico. Estastécnicas incluem quimicamente sintetizar os oligonucleotídeos como síntesequímica de fosforamidita de fase sólida. Alternativamente, as moléculas deRNA podem ser geradas por transcrição in vitro e in vivo de seqüências deDNA que codificam os genes dos polipeptídeos debatidos aqui. Tais se-qüências de DNA podem ser incorporadas em uma ampla variedade de ve-tores com promotores de RNA polimerase adequados como T7 ou SP6. Al-ternativamente, construções de cDNA que sintetizam RNA antissenso consti-tutiva ou induzivelmente podem ser introduzidas em linhagens celulares, cé-lulas, ou tecidos.

MIMÉTICOS DE PEPTÍDEO

Miméticos de peptídeo de proteínas de cMAC também serãoprognosticados atuar como moduladores de cMAC. Desse modo, uma mo-dalidade desta invencao sao peptideos derivados ou projetados de cMACque bloqueiam a função de cMAC. Miméticos de peptídeo adequados podemser feitos para proteínas de cMAC de acordo com os métodos convencionaiscom base em uma compreensão das regiões nos polipeptídeos requeridospara atividade de proteína de cMAC. Brevemente, uma seqüência de amino-ácido curta é identificada em uma proteína através de estudos convencionaisda função da estrutura como análise de deleção ou de mutação da proteínado tipo selvagem. Uma vez que regiões críticas são identificadas é antecipa-do que se elas corresponderem a uma porção altamente conservada da pro-teína, esta região será responsável por uma função crítica (como interaçãode proteína-proteína). Um pequeno mimético sintético que é projetado paraparecer-se com a dita região crítica seria prognosticado para competir com aproteína intacta e desse modo interferir com sua função. A seqüência de a-minoácido sintética poderia ser composta de aminoácidos que emparelhamesta região em todo ou em parte. Tais aminoácidos poderiam ser substituí-dos com outras estruturas químicas se assemelhando aos aminoácidos ori-ginais mas dando propriedades farmacologicamente melhores, como ativi-dade inibidora, estabilidade, meia-vida ou biodisponibilidade mais altas.MOLÉCULAS PEQUENAS

É contemplado que moduladores identificados e descobertosatravés de ensaios de triagem de cMAC revelados aqui poderiam ser agen-tes como moléculas pequenas, incluindo moléculas pequenas orgânicas(com ou sem características semelhantes a fármaco), e incluindo produtosnaturais. Estes moduladores de moléculas pequenas de cMAC incluem ago-nistas de atividade biológica de cMAC ou expressão de cMAC; eles podemtambém incluir inibidores de atividade biológica de cMAC ou inibidores deexpressão de cMAC. Aqueles versados na técnica estão familiarizados comtriagem de bibliotecas de compostos naturais, compostos semissintéticos oubibliotecas de composto combinatórias, em formatos de processamento bai-xo, processamento médio, processamento alto e de processamento ultra-alto. Os compostos que são encontrados são identificados modular a ativi-dade de cMAC, comparados aos compostos de controle, e agrupados atra-vés de estrutura química. As estruturas químicas são depois modificadas etestadas para atividade adicional no ensaio. A relação de estrutura-atividade(SAR) do composto para o alvo é avaliada. São desenvolvidos compostoscom potência alta e seletividade alta para o alvo. Tais compostos são depoisrigorosamente testados em uma bateria de outros ensaios antes de serem tes-tados em animais e humanos para efeito terapêutico. Todas estas etapas sãobem-conhecidas àqueles versados na técnica.

OUTROS USOS DE PESQUISA DE cMAC

É também observado que a invenção imediata é útil para outrapesquisa. Por exemplo, as proteínas de cMAC de codificação de cDNA e/ouas proteínas de cMAC em si podem ser usadas para identificar outras prote-ínas, por exemplo cinases, proteases ou fatores de transcrição que são mo-dificados ou indiretamente ativados em uma cascata através de proteínas decMAC. Proteínas desse modo identificadas podem ser usadas, por exemplo,para triagem de fármaco para tratar as condições patológicas debatidas a-qui. Para identificar estes genes que estão a jusante das proteínas de cMAC,é contemplado, por exemplo, que poder-se-ía usar métodos convencionaispara tratar animais em modelos de estado de doença com um inibidor decMAC específico, sacrificar os animais, remover os tecidos relevantes e iso-lar o RNA total destas células e empregar tecnologias de ensaio de microar-ranjo padrões para identificar níveis de mensagem que são alterados comrelação a um animal de controle (animal ao qual nenhum fármaco foi admi-nistrado).

Além disso, ensaios convencionais in vitro ou in vivo podem serusados para identificar possíveis genes que levam à sobre-expressão deproteínas de cMAC. Estas proteínas reguladoras relacionadas codificadaspor genes desse modo identificadas podem ser usadas para triar fármacosque poderiam ser terapêuticas potentes para o tratamento das condiçõespatológicas debatidas aqui. Por exemplo, um ensaio de gene repórter con-vencional poderia ser usado em que a região de promotor de uma proteínade cMAC é colocada a montante de um gene repórter, a construção trans-feccionada em uma célula adequada (por exemplo de ATCC, Manassas1 VA)e usando técnicas convencionais, as células ensaiadas para um gene amontante que causa ativação do promotor de cMAC para detecção da ex-pressão do gene repórter.

É contemplado aqui que poder-se-ía inibir a função e/ou expres-são de um gene para uma proteína reguladora relacionada ou proteína quemodifica cMAC como um modo para tratar as condições patológicas debati-das aqui projetando, por exemplo, anticorpos para estas proteínas ou mimé-ticos de peptídeo e/ou projetando oligonucleotídeos antissenses inibidores,DNA de hélice tripla, ribozimas, siRNA, RNA bi ou unifilamentar e aptâmerosde RNA direcionados para os genes para tais proteínas de acordo com osmétodos convencionais. Composições farmacêuticas que compreendem taissubstâncias inibidoras para o tratamento das ditas condições patológicassão também contempladas.

COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS E ADMINISTRAÇÃO

Uma modalidade adicional da invenção diz respeito à adminis-tração de uma composição farmacêutica, junto com um veículo, excipienteou diluente farmaceuticamente aceitável, para o tratamento de qualquer umadas condições patológicas debatidas aqui. Tais composições farmacêuticaspodem compreender qualquer um dos moduladores de cMAC revelados a-qui, incluindo a proteína de cMAC, ou fragmentos desta, anticorpos para po-lipeptídeos de cMAC, ácidos nucleicos (por exemplo vetores de terapia degene, antissenso, ribozima ou agentes de RNAi), miméticos de peptídeo decMAC, moduladores de moléculas pequenas e qualquer outro modulador decMAC (por exemplo agonistas, antagonistas, ou inibidores de expressãoe/ou função de cMAC). As composições podem ser administradas sozinhasou em combinação com pelo menos um outro agente, como composto esta-bilizante que pode ser administrado em qualquer veículo farmacêutico esté-ril, biocompatível incluindo, mas não limitado a, solução salina, solução sali-na tamponada, dextrose, e água. As composições podem ser administradassozinhas a um paciente, ou em combinação com outros agentes, fármacosou hormônios.

A invenção imediata também compreende um método de tratarum distúrbio em um sujeito compreendendo administrar ao sujeito umaquantidade eficaz de um agente, ou uma composição farmacêutica de umagente que inibe ou intensifica a atividade ou expressão de cMAC.

Composições farmacêuticas que compreendem moduladores decMAC destes podem ser administradas quando julgados medicalmente be-néficos por alguém versado na técnica, por exemplo em condições em queos agonistas da função de cMAC têm um efeito terapêutico como distúrbiosneurodegenerativos como doenças Alzheimer, Parkinson e de Huntington.Tais composições farmacêuticas podem ser formuladas para o uso de acor-do com a presente invenção de uma maneira convencional usando um oumais veículos ou excipientes fisiologicamente aceitáveis.

As composições farmacêuticas reveladas aqui como úteis paraimpedir, tratar ou melhorar as condições patológicas reveladas aqui serãoadministradas a um paciente em doses terapeuticamente eficazes. Uma do-se terapeuticamente eficaz refere-se à quantidade do composto suficientepara resultar na prevenção, tratamento ou melhora das ditas condições.

Compostos e seus sais e solvatos fisiologicamente aceitáveispodem ser formulados para administração por inalação ou insuflação (ouatravés da boca ou do nariz) ou administração tópica, oral, bucal, parenteralou retal.

Para administração oral, as composições farmacêuticas podemter a forma de, por exemplo, comprimidos ou cápsulas preparadas por meiosconvencionais com excipientes farmaceuticamente aceitáveis como agentesde ligação (por exemplo, amido de milho pré-gelatinizado, polivinilpirrolidonaou hidroxipropil metilcelulose); enchedores (por exemplo, lactose, celulosemicrocristalina ou fosfato de hidrogênio de cálcio); lubrificantes (por exemplo,estearato de magnésio, talco ou sílica); desintegrantes (por exemplo, amidode batata ou glicolato de amido de sódio); ou agentes umectantes (por e-xemplo, sulfato de Iaurila de sódio). Os comprimidos podem ser revestidospor métodos bem-conhecidos na técnica. Preparações líquidas para admi-nistração oral podem ter a forma de, por exemplo, soluções, xaropes oususpensões, ou elas podem ser apresentadas como um produto seco paraconstituição com água ou outro veículo adequado antes do uso. Tais prepa-rações líquidas podem ser preparadas através de meios convencionais comaditivos farmaceuticamente aceitáveis como agentes de suspensão (por e-xemplo, xarope de sorbitol, derivados de celulose ou gorduras comestíveishidrogenadas); agentes emulsificantes (por exemplo, Iecitina óu acácia); veí-culos não-aquosos (por exemplo, óleo de amêndoa, ésteres oleosos, álcooletílico ou óleos vegetais fracionados); e conservantes (por exemplo, metil oupropil-p-hidroxibenzoatos ou ácido sórbico). As preparações podem tambémconter sais de tampão, condimento, coloração e agentes adoçantes confor-me apropriado.

Preparações podem ser adequadamente formuladas para admi-nistração oral para dar liberação controlada do composto ativo.

Para administração bucal as composições podem ter a forma decomprimidos ou pastilhas formulada de maneira convencional.

Para administração através de inalação, os compostos são parao uso de acordo com a presente invenção convenientemente liberados naforma de uma apresentação de pulverização de aerossol de pacotes pressu-rizados ou um nebulizador, com o uso de um propulsor adequado, por e-xemplo, diclorodifluorometano, triclorofluorometano, diclorotetrafluoroetano,dióxido de carbono ou outro gás adequado. No caso de um aerossol pressu-rizado a unidade de dosagem pode ser determinada fornecendo uma válvulapara liberar uma quantidade medida. Cápsulas e cartuchos de, por exemplo,gelatina para o uso em um inalador ou insuflador contendo uma mistura depó do composto e uma base de pó adequada como Iactose ou amido podemser formulados.

Os compostos podem ser formulados para administração paren-teral através de injeção, por exemplo, por injeção de bolo ou infusão contí-nua. Formulações para injeção podem ser apresentadas em forma de dosa-gem de unidade, por exemplo, em ampolas ou em recipientes de multidoses,com um conservante adicionado. As composições podem ter tais formascomo suspensões, soluções ou emulsões em veículos oleosos ou aquosos,e podem conter agentes formuladores como suspensores, agentes estabili-zantes e/ou dispersantes. Alternativamente, o ingrediente ativo pode ser emforma de pó para constituição com um veículo adequado, por exemplo, águaestéril livre de pirogênio, antes do uso.

Os compostos podem também ser formulados em composiçõesretais como supositórios ou enemas de retenção, por exemplo, contendobases de supositório convencionais tais como manteiga de cacau ou outrosglicerídeos.

Além das formulações previamente descritas, os compostos po-dem também ser formulados como uma preparação de depósito. Tais formu-lações de ação longa podem ser administradas através de implantação (porexemplo subcutânea ou intramuscularmente) ou através de injeção intra-muscular. Desse modo, por exemplo, os compostos podem ser formuladoscom materiais poliméricos ou hidrofóbicos adequados (por exemplo comouma emulsão em um óleo aceitável) ou resinas de permuta de íons, ou comoderivados de forma pulverizável solúveis, por exemplo, como um sal de for-ma pulverizável solúvel.

As composições podem, se desejado, ser apresentadas em umpacote ou dispositivo dispensador que pode conter uma ou mais formas dedosagem de unidade contendo o ingrediente ativo. O pacote pode por e-xemplo compreender metal ou chapa de plástico, como um pacote de bolha.O pacote ou dispositivo dispensador pode ser acompanhado por instruçõespara administração.

Composições farmacêuticas adequadas para o uso na invençãoincluem composições em que os ingredientes ativos são contidos em umaquantidade eficaz para alcançar o propósito intencionado. A determinação deuma dose eficaz está bem dentro da capacidade daqueles versados na técnica.

Para qualquer de composto, a dose terapeuticamente eficaz po-de ser inicialmente estimada em ensaios de cultura de célula, por exemplo,de células neoplásticas, ou em modelos animais, usualmente camundongos,coelhos, cachorros, ou porcos. O modelo animal pode também ser usadopara determinar a faixa de concentração apropriada e via de administração.Uma dose pode ser formulada em modelos animais para alcançar uma faixade concentração de plasma circulante que inclui a IC50 (isto é, a concentra-ção do composto de teste que alcança uma metade da inibição máxima dossintomas). Tal informação pode depois ser usada para determinar doses erotas úteis para administração em humanos.

Uma dose terapeuticamente eficaz refere-se à quantidade deingrediente ativo útil para impedir, tratar ou melhorar uma condição patológi-ca particular de interesse. Eficácia terapêutica e toxicidade podem ser de-terminadas através de procedimentos farmacêuticos padrões em culturas decélula ou animais experimentais, por exemplo, ED50 (a dose terapeutica-mente eficaz em 50% da população) e LD50 (a dose letal para 50% da popu-lação). A razão de dose entre efeitos tóxicos e terapêuticos é o índice tera-pêutico, e pode ser expressada como a razão, LD50/ED50. composiçõesfarmacêuticas que exibem índice terapêutico grande são preferidas. Os da-dos obtidos de ensaios de cultura de célula e estudos de animais são usa-dos formulando uma faixa de dosagem para o uso humano. A dosagem con-tida em tais composições está preferivelmente dentro de uma faixa de con-centrações circulantes que incluem a ED50 com pouca ou nenhuma toxici-dade. A dosagem varia dentro desta faixa dependendo da forma de dosa-gem empregada, sensibilidade do paciente, e a via de administração.

A dosagem exata será determinada pelo médico, levando emconta fatores relacionados ao sujeito requerendo tratamento. Dosagem eadministração são ajustadas para fornecer níveis suficientes da metade ativaou manter o efeito desejado. Fatores que podem ser levados em conta in-cluem a severidade do estado de doença, saúde geral do sujeito, idade, pe-so, e sexo do sujeito, dieta, tempo e freqüência de administração, combina-ção(ões) de fármacos, sensibilidades de reação, e tolerância/resposta à te-rapia. Composições farmacêuticas de ação longa podem ser administradas acada 3 a 4 dias, todas as semanas, ou uma vez a cada duas semanas de-pendendo da meia-vida e taxa de liberação da formulação particular.

Quantidades de dosagem normais podem variar de 0,1 a100.000 microgramas, até uma dose total de cerca de 1 g, dependendo davia de administração. Orientação sobre dosagens particulares e métodos deliberação é fornecida na literatura e em geral disponível aos médicos na téc-nica. Aqueles versados na técnica empregarão formulações diferentes paranucleotídeos que para proteínas ou seus inibidores. Similarmente, liberaçãode polinucleotídeos ou polipeptídeos será específica às células particulares,condições, localizações, etc. Formulações farmacêuticas adequadas paraadministração oral de proteínas são descritas, por exemplo, nas patentesU.S. 5.008.114; 5.505.962; 5.641.515; 5.681.811; 5.700.486; 5.766.633;5.792.451; 5.853.748; 5.972.387; 5.976.569; e 6.051.561.

É contemplado aqui que monitorando os níveis de cMAC ou deatividade e/ou detectando a expressão de cMAC (níveis de mRNA) pode serusado como parte de um procedimento de testagem clínica, por exemplo,para determinar a eficácia de um regime de tratamento dado. Por exemplo,pacientes a quem foram administrados fármacos seriam avaliados e o clínicoseria capaz de identificar aqueles pacientes nos quais os níveis de cMAC,níveis de atividade e/ou de expressão estão mais altos que desejado (isto éníveis mais altos ou mais baixos que os níveis em pacientes de controle quenão experimentam um estado de doença relacionado ou em pacientes emquem um estado de doença foi suficientemente aliviado através de interven-ção clínica). Com base nestes dados, o clínico poderia então ajustar a dosa-gem, regime de administração ou tipo de medicinal prescrito.

Fatores para consideração para otimizar uma terapia para umpaciente incluem a condição particular sendo tratada, o mamífero particularsendo tratado, a condição clínica do paciente individual, o sítio de liberaçãodo composto ativo, o tipo particular do composto ativo, o método de adminis-tração, a programação de administração, e outros fatores conhecidos aosmédicos. A quantidade terapeuticamente eficaz de um composto ativo a seradministrado será ditada por tais considerações, e é a quantidade mínimanecessária para o tratamento de uma condição patológica dada.

Os exemplos a seguir também ilustram a presente invenção enão são intencionados a limitar a invenção.EXEMPLOSMÉTODOS GERAIS

TRIAGEM DE TRANSLOCACÃO DE TORC-1

A triagem foi executada como descrita (Bittinger et. al. Curr Biol.14 de dezembro de 2004;14(23):2156-61). Brevemente, uma construção defusão fluorescente foi criada (Torci-eGFP) e a construção foi cotransfeccio-nada com 7680 clones de cDNA individuais (predominantemente da coletâ-nea de clones de MGC) em células de HeLa. A translocação nuclear da pro-teína de fusão de Torc foi avaliada usando uma plataforma de microscopiade fluorescência automatizada.

Quantificação de translocação de TORC-eGFP: Uma linhagemcelular de HeLa de expressão estável que expressa Torcl-GFP foi prepara-da e as células foram semeadas (6000 células por poço em uma placa de 96poços), e transduzidas com construções Ientivirais (pLLB1-GW-Kan) conten-do vetor vazio (seqüência de parada de translação), TRPV6 ou cMAC hu-mano. 48 horas pós transdução, as células foram tratadas com ou sem ci-cloesporina (5 μΜ) durante uma hora antes de fixar, imageamento e quantifi-cação usando uma varredura de arranjo Cellomics Il (procedimento de fixa-ção vide abaixo). A diferença entre a intensidade de fluorescência citoplás-mica nuclear e a intensidade de fluorescência citoplásmica foi determinadade 500 imagens de célula por poço.

Empacotamento das partículas de expressão de retrovírus deMoloney: 24 h antes da transfecção, 1,47X106 células de empacotamento deGP2-293 foram semeadas em placas de PDL (placas de 6 poços de poli-d-lisina, Becton Dickinson) em 10% de soro sem antibióticos. 2,5 pg de DNAde vetor de construção de expressão QL-GW-final-kan e 2,5 pg de plasmí-deo pvpackVSV-g (Stratagene) foram combinados em um volume final de250 μΙ Optimem (Life Technologies). 12 μΙ de reagente de Lipofectamina2000 foram misturados em um volume final de 250 μΙ de Optimem e incuba-dos por 5 min em temperatura ambiente. O DNA diluído foi combinado com aIipofectamina diluída (20 min em temperatura ambiente). O complexo foi a-crescentado às células de GP2 (em 2 ml de meio sem antibióticos) e incuba-do durante a noite. No dia seguinte os meios foram removidos e enchidoscom meios frescos contendo antibióticos. 48 h pós transfecção os meioscontendo o vírus foram colhidos e armazenados a 4o C; células foram enchi-10 das com meios frescos. 72 h pós transfecção, a coletânea final de vírus foifeita e agrupada com a amostra de coletânea anterior (48 h). O sobrenadan-te de vírus foi filtrado através de um filtro de PVDF de 0,45 μΜ para removerqualquer célula não-aderente e restos celulares.

Empacotamento de partículas de expressão lentiviral: 24 h antes15 da transfecção das construções de empacotamento, 1,47X106 células 293Tde embalagem foram semeadas em placas de PDL (placas de 6 poços depoli-d-lisina, Becton Dickinson) em 10% de soro sem antibióticos. 2 μg deconstrução de expressão lentiviral (pLLB1-GW-Kan) e 1 pg de plasmídeopLP-VSVG, 1 pg de pLP1, 1 pg de pLP2 (Invitrogen) suspensos em 250 μΙ20 de Optimem (Life Technologies). 12 μΙ de reagente de Iipofectamina 2000foram misturados em um volume final de 250 μΙ de Optimem e incubadospara 5 min em temperatura ambiente. O DNA diluído foi combinado com aIipofectamina diluída (20 min em temperatura ambiente). O complexo foi a-crescentado as 293 células T (em 2 ml de meios sem antibióticos) e incuba-25 do durante a noite. No dia seguindo os meios foram removidos e enchidoscom meios frescos contendo antibióticos. 48 h pós transfecção os meioscontendo o vírus foram colhidos e armazenados a 4o C; as células foram en-chidas com meios frescos. 72 h pós transfecção, a coletânea final de vírusfoi feita e agrupada com a amostra de coletânea anterior (48 h). O sobrena-30 dante de vírus foi filtrado através de um filtro de PVDF de 0,45 μΜ para re-mover qualquer célula não-aderente e restos celulares.Empacotamento das construções de shDNA lentiviral: O mesmoprocedimento geral descrito para as construções de expressão lentiviral des-critas com as exceções a seguir: 2,6X104 293T células foram semeadas emplacas de 96 poços 24 h antes da transfecção. 100 ng de construção de5 shDNA (pLKO.1) e 10 ng de plasmídeo de pLP-vsvg, 50 ng de pLP1, 50 ngde pLP2 (Invitrogen) suspensos em 30 μΙ de Optimem (Life Technologies) ecombinados com 0,6 μΙ de fugene6 (Roche). Complexo foi deixado formardurante 30 minutos antes da adição para empacotar as células.

Descrição das construções virais:

O vetor de pLL-B1-GW-Kan foi derivado de vetor de pLL3.7 de

laboratório de MIT (Luk VanParijs lab). Um cassete de Gateway foi substituídopelo marcador de eGFP e o U6 (o promotor de shRNA) foi deletado. O cassetede resistência de canamicina foi substituído pelo cassete de ampicilina.

O vetor QL-GW-final-Kan foi derivado do vetor de pQCXIX de15 BD Biosciences. O promotor de CMV e a seqüência de IRES foram removi-dos e um cassete de Gateway foi inserido no vetor. A 3'LTR foi substituída comuma 3'LTR do tipo selvagem que direciona a expressão do gene inserido.

O vetor lentiviral de pLKO.1 shDNA foi inalterado e obtido doBroad Institute (The RNAi Consortium) em Cambridge MA.20 ATIVAÇÃO DE TRANSCRIÇÃO DE NFAT

Células de HEK293 foram transfeccionadas com 20 ng de plas-mídeos indicados em combinação com 10 ng de Renill, 20 ng de pCMV-SPORT6, e 50 ng de NFAT-Luc (Stratagene Inc). Transfecções foram reali-zadas em formato de placas de 96 poços usando cerca de 20.000 células25 por poço. As células foram expostas a DMSO1 5 μΜ de CsA, 10 μΜ de PMA1ou 10 μΜ de PMA e 5 μΜ de CsA durante 16 horas. Atividades repórteresforam determinadas 72 horas após transfecção com o reagente de Dual-GloIuciferase como pelas instruções do fabricante (Promega).

Células de HeLa de Fixação: Células foram fixas com 3,7% de30 formaldeído, 0,5% de Triton X100 em PBS, 20 min em temperatura ambien-te. As células foram lavadas duas vezes com 0,5% de Triton X100 em PBS.Fixação e tingimentos das células de Jurkat1 ensaios de translo-cação de NFAT: Seguindo tratamento células de Jurkat foram ligadas àsplacas de 96 poços usando o adesivo celular Becton Dickinson Cell-Tak. Ascélulas de suspensão foram centrifugadas (800 X G) por 5 min sobre placaspré-revestidas (como pela instrução do fabricante). As células ligadas forampermeabilizadas em 3,7% de formaldeído, 0,5% de Triton X100 e lavadasduas vezes com tampão de lavagem (0,5% de Triton X100 em PBS) e blo-queadas com 2% de BSA, 0,1% de Triton X100 em PBS. As células foramincubadas em anticorpos primários NFAT-1 (Cellomics K01-0011-1 diluído1:100) e NFAT-2 (Affinity Bioreagents MA3-024 diluído 1:250) em tampão debloqueio durante 1 hora em temperatura ambiente. As células foram lavadasduas vezes com tampão de lavagem e incubadas com IgG de anti-camundongo de cabra secundário conjugada com Alexa Fluor 488 GaM (an-ticorpo de reagentes Cellomics K01-0011-1 diluído 1:2000, e tintura de Hoe-15 chst 1:2000) em tampão de bloqueio. As células foram lavadas uma vez comPBS e imageadas.

Seqüências cDNA de transferência de Gateway em vetores vi-rais: Seqüências de cDNA de genes usadas neste estudo foram obtidas datransferência de Gateway de clones obtido do cDNA da coletânea de clone20 de MGC que foram diretamente usados ou transferidos em vetores virais QL-GW-Kan/pLLB1-GW-Kan. Isto foi realizado usando uma reação de tubo sim-ples e um processo de reação de duas etapas. A reação de BP foi executa-da combinando 100 ng de cDNA de plasmídeo pCMV-Sport6 com 100 ng deplasmídeo intermediário pDONR207 (Invitrogen). A reação foi iniciada adi-25 cionando 1,5 μΙ de BP 5X tampão de Clonase (Invitrogen) e 1,5 μΙ de BPClonase (Invitrogen) em um volume total de 8 μΙ_, temperatura ambiente du-rante a noite. Reação de LR foi executada combinando 4 μΙ de reação de BPcom 100 ng de vetor de destino (QL-GW-Kan ou pLLB1-GW-Kan) com 0,4 μΙNaCL a 0,75M, 1 μΙ de 5X tampão de LR (Invitrogen) e 1,8 μΙ de LR Clonase30 em um volume final de 12 μΙ. Incubada em temperatura ambiente durante a noi-te e transformadas em células de STB3 (2 μΙ em 20 μΙ de células competentes).Transdução de células HeLa. Células foram semeadas 24 h an-tes da transdução, em placas de 96 poços tratadas com cultura de tecido defundo claro a 6000 células/poço antes da transdução, (100 μΙ por poço) emDMEM/FBS (10% de soro inativado por calor, Invitrogen) e antibiótico/antimi-5 cótico (1%, Invitrogen). Os meios foram substituídos com meios de transdu-ção a uma concentração final de 8 pg/ml de polibreno (Sigma) e tampão deHEPES a 10 mM (Invitrogen). 50 μΙ de sobrenadante retroviral foram adiciona-dos a cada poço e as placas foram centrifugadas a 800 X g durante 90 min.

Transdução e sensibilização de células de Jurkat: As células de10 Jurkat foram mantidas em RPMI 1640 (GIBCO 21870-076) 10% de Clonelfetal de FC1 (Hyclone), 1% de Pen/Strep, 1% de Glutamaxl, 0,1% de betamercaptoetanol. Antes da transdução as células foram trocadas para meiosde transdução contendo: RPMI 1640 (acima) fortalecido com 2,25 g de glico-se 1% de antibiótico/antimicótico, 1% de Hepes a 1M (Gibco)1 1% de piruva-15 to de sódio a 100 mM, 10 ml de 7,5% de Bicarbonato de sódio 10% de sorode Clonel Fetal. Células foram semeadas 5X104 em meios de transduçãocombinados com vírus (volume em lengenda) e 4 ug/ml de concentraçãofinal de polibreno e centrifugadas a -800 χ g por 3 h. Para ativação de ICOSe experimentos de expressão de IL-2 as células foram transduzidas com 5020 μΙ de sobrenadante retroviral (QL-GW-final-Kan) e 48 horas pós tradução, osmeios foram fortalecidos com PMA (13-acetato de 12-miristato de forbol) 10ng/ml e 24 horas após adição as células ou meios foram removidos paramedições de ICOS ou IL-2. Para translocação de experimentos de NFAT ascélulas foram transduzidas com 50 μΙ de sobrenadante retroviral (pLL-B1-25 GW-Kan) e 48 h após transdução as células foram sensibilizadas com PMAa 10 ng/ml durante 6 horas antes de fixar e tingir.

Análise de marcador de superfície de ICOS e expressão de pro-teína de IL-2: 1,5 uL de ICOS-PE (BD-Parmingen 557802) foi combinadocom -1X106 células de Jurkat e incubados em gelo por 30 min. As células30 foram centrifugadas -500 X g 5 min e lavadas com 2X PBS e a fluorescênciade canal médio determinada usando citometria de fluxo (BD FACSCaliber).Níveis de IL-2 foram medidos usando o kit de Elisa de IL-2 QuantiGIo (R&DSystems).

Ativação de células de Jurkat para estudos de inibição de shD-NA: Para avaliar a eficácia de shDNA, células de Jurkat (15000) foram5 transduzidas com 10 μΙ de vírus de LKO como descrito e 24 horas após atransdução os meios foram fortalecidos com puromicina (vide abaixo). Seisdias pós transdução metade das células foi ativada com anticorpos que dire-cionam receptores de TCR e de CD28 ligados a uma superfície de placa de96 poços e foram incubadas durante a noite e os meios foram colhidos para10 determinação de IL-2. As células restantes foram usadas para determinar afração de células viáveis em cada poço usando o ensaio de Titulação de Cé-Iula-Glo (vide abaixo).

As placas de ativação foram preparadas revestindo IgG de anti-camundongo de cabra, anticorpo específico de fragmento Fcy (Jackson Im-15 munoResearch Laboratories) 55 μΙ por poço a uma concentração final de 10pg/ml em PBS. As placas foram incubadas 3 horas em temperatura ambien-te. Excesso IgG foi removido e as placas foram tingidas. As placas forambloqueadas com 300 μΙ de 2% de BSA/PBS (BSA, Iiofilizado de Fração V,Roche) e incubadas durante 2 horas em temperatura ambiente. As placas20 foram lavadas 3 vezes com PBS e anticorpos estimulantes anti-TCR 0,01ug/ml (BD Biosciences 347770 clone WT31) e anti-CD28 0,3 ug/ml (BDPharmingen 555725) em 2% de volume final de BSA/PBS 50 pL/poço. Asplacas foram incubadas durante a noite e lavadas 3 vezes com PBS antesda adição de células para ativação.25 Seleção de puromicina de células de Jurkat transduzidas de

shDNA e normalização para sobrevivência das células: O vetor viral LKOusado neste estudo contém um marcador de seleção de puromicina. Célulasde Jurkat infetadas com construções de shDNA (LK0.1) são colocadas sobseleção de puromicina 24 h pós infecção mediante adição de puromicina (230 pg/ml) e mantidas para a duração do experimento (6 dias pós infecção, 3dias para quantificação de mRNA). Para responder pelas diferenças em nú-mero de célula após seleção de puromicina (possivelmente devido às varia-ções em titulação viral), adotamos um ensaio de ATP celular que é propor-cional ao número de célula (kit de Ensaio Luminescente de Titulação de Cé-lula-GIo, Promega). O ensaio foi executado como pela instrução do fabrican-te. Uma curva padrão foi gerada para cada tipo de célula para determinar alinearidade para o ensaio. As concentrações de IL-2 foram normalizadas emnúmero de célula dividindo a concentração de IL-2 calculada pelos valoresde rLU para o ensaio de titulação de célula-glo que é equivalente ao númerode expressão de IL-2/célula. Os níveis de expressão de mRNA foram deter-10 minados 3 dias pós infecção.

Determinação de choque de mRNA para cMAC: Níveis de ex-pressão de mRNA de Jurkat foram determinados 3 dias pós infecção (2 diaspós seleção de puromicina).

Preparação das construções de shDNA e ligação em vetor de15 LKO.1: oligos de DNA foram sintetizados com adaptadores para 5'Agel e3'EcoR1 com seqüência de alça TTCAAGAGA. Oligos foram anelados e li-gados diretamente em vetor de LKO pré-digeridos. Vide Tabela 6 para se-qüências de Oligo.

TABELA 6 - SEQÜÊNCIA DE ALVEJAMENTO DE shDNA E OLIGOS LIGA-20 DOS EM VETOR DE LKO.1

Sequência-alvo Oligo de DNA senso Oligo de DNA antissensocMAC BL1 gcgcctgtcgggtca- acta (SEQ ID NO: 102) ccgggcgcctgtcgggtcaactattca agagatagttgacccgacag- gcgcttttt (SEQ ID NO: 103) aattaaaaagcgcctgtcgggtcaa ctatctcttgaatagttgacccga- caggcgc (SEQ ID NO: 104)cMAC BL2 gcctttgttagatctatca (SEQ ID NO: 105) ccgggcctttgttagatctatcattcaag agatgatagatctaacaaaggcttttt (SEQ ID NO: 106) aattaaaaagcctttgttagatctat- catctcttgaatgatagatctaacaa- aggc (SEQ ID NO: 107)cMAC BL3 catctttgttggcctacga (SEQ ID NO: 108) ccggcatctttgttggcctacgattcaa gagatcgtaggccaacaaa- gatgttttt (SEQ ID NO: 109) aattaaaaacatctttgttggcctac- gatctcttgaatcgtaggccaacaa- agatg (SEQ ID NO: 110)<table>table see original document page 86</column></row><table>

EXEMPLO 1

DESCOBERTA QUE cMAC INDUZ TRANSLOCAÇÃO NUCLEAR DETORCI.NFAT, NFkB e AP-1 provavelmente são os três fatores de trans-crição mais importantes na ativação de células T (Quintana Eur J Physiol(2005) 450:1-12). Todos os três elementos de promotor são representadosno promotor de IL-2 e todos os três foram determinados ser dependentes decálcio (NFkB e AP-1 indiretamente). A ativação de células T requer translo-cação de NFAT para o núcleo. Isto é mediado pelo desmascaramento daseqüência de localização nuclear em NFAT pela enzima de fosfatase calci-neurina. Calcineurina é ativada por mobilização de cálcio e é bloqueada pelofármaco imunossupressor cicloesporina A. TORC-1 é um coativador detranscrição dependente de cAMP. TORC-1 é similar a NFAT em que Torc-1é translocado para o núcleo sob ativação seguindo mobilização de cálcio. Éjulgado que TRPV6 seja um canal de cálcio operado em armazenamento etem sido sugerido, embora controverso, ter similaridade ao canal de cálcioativado por liberação de cálcio (CRAC) que é responsável pela indução degenes regulados pela ativação de cálcio (Feske Nat Immunol. 2(4):316-24(2001)).

Uma triagem de imageamento de conteúdo alto para identificargenes que estavam envolvidos na translocação do coativador de CREB de-pendente de cAMP TORC1 foi executada. Esta triagem identificou váriosgenes como indutores de translocação nuclear de TORC Figura 4 e Tabela 7(Bittinger et al. Current Biology 14(23):2156-61 (2004)), porém a identidadede um gene previamente não-caracterizado que nós agora referimos comocMAC (Ativador de Membrana de Calcineurina conservada) não foi reveladonaquela publicação. A seqüência publicada de cMAC murino (AcessoNM_177344) e o cMAC de ortólogo humano (Acesso NM_053045) é encon-trada no GenBank. O clone de cMAC encontrado na triagem foi um clone deMGC que foi anotado como sendo similar a NM_177344. Porém,NM_177344 codifica uma proteína com uma terminação 3' alternativa quenão está presente em cDNAs humanos ou nos ortólogos prognosticados decMAC. Os cDNAs ativos na triagem primária como também o ortólogo hu-mano de cMAC murino foi recuperado, retransformado, seqüência confirma-da, e inserido nos vetores virais e introduzidos em células HeLa estavelmen-

te expressando TORCI-eGFP, e as quantidades relativas de TORCI-eGFP

no citosol e núcleo foram calculadas usando uma plataforma de microscopia

automatizada no exemplo 2 abaixo. A translocação de Torc-eGFP foi blo-

5 queada pela cicloesporina de inibidor de calcineurina A que também ilustra

que a translocação de TORC de fato induzida do cDNA ao invés de afetar a

morfologia de célula ou outros fenótipos que podem ser mal interpretados

pela plataforma de microscopia automatizada como translocação.

TABELA 7 INDUTORES PUTATIVOS DE TRANSLOCAÇÃO DE TORC

10 _

Designação Anotação Abrevi-

de MGC__ação

BC022606, 15-P2, cDNA de Mus musculus de gene de C730025P13 de cMACRIKEN1 mRNA (clone de cDNA MGC:31129 IMA-GE:4165766), cds completos.NM_177344

BC034814 Canal de cátion potencial de receptor transiente de TRPV6

Homo sapiens, subfamília V, membro 6 (TRPV6),mRNA.

_NM 018646_

EXEMPLO 2

cMAC AGE POR MEIO DE CÁLCIO E CALCINEURINA

Para determinar se translocação de TORC através de cMAC foiatravés de cálcio e calcineurina, cMAC foi sobre-expresso em células HeLa15 que estavelmente expressam a construção de fusão de Torci -eGFP infec-tando as células com partículas Ientivirais contendo o canal de cálcio TRPV6e a seqüência de cMAC humana. As células foram tratadas com o inibidor decalcineurina Cicloesporina A (CsA) uma hora antes do imageamento. Comomostrado na Figura 5: Tratamento de CsA resultou em uma reversão de20 translocação de T0RC1, resultando na maioria do TORC1-eGFP sendo re-tornado para o citoplasma. Estes dados sugerem que translocação de cMACde TORC-1 foi dependente da ativação de calcineurina. Em um conjunto se-parado de experimentos, um requerimento para cálcio extracelular foi tam-bém testado usando EGTA. A presença de EGTA no meio bloqueou translo-25 cação de T0RC1 nuclear induzida por cMAC. O efeito de EGTA poderia serrevertido porém pela adição de cálcio de excesso ao meio (dados não mos-trados). Desse modo cMAC induz translocação de TORC1 através de umaativação de calcineurina dependente de cálcio.

O efeito de sobre-expressão de cMAC no fator de transcrição deNFAT de dependente de calcineurina foi também examinada. O cMAC ouativador de NFAT previamente descrito TRPV6 foram cotransfeccionadoscom um repórter de Iuciferase dirigida NFAT. Na presença de PMA1 sobre-expressão de cMAC (e TRPV6) induziu um aumento significativo em expres-são dirigida por NFAT (Figura 6) e esta ativação foi bloqueada parcialmentepor CsA. Estes dados são consistentes com ativação de calcineurina. Deve-ria ser observado que ativação através de cMAC quase não foi tão fortequanto que pelo canal de cálcio TRPV6.EXEMPLO 3

EFEITO DE cMAC EM TRANSLOCAÇÃO NUCLEAR DE NFAT E ATIVA-ÇÃO DE CÉLULAS T

O efeito de cMAC na translocação nuclear do fator de transcri-ção NFAT e sua dependência em calcineurina foi também examinado. Célu-las de Jurkat foram transduzidas com um vetor viral vazio (seqüência de pa-rada de translação), o canal de cálcio TRPV6 ou cMAC humano. As célulasforam examinadas para a localização de proteína endógena de NFAT-1 (Fi-gura 7) e NFAT-2 (Figura 8). Embora NFAT-1 e NFAT-2 tenham sido detec-tados no citoplasma de células infectadas com vírus de controle, ambas asisoformas de NFAT foram primariamente localizadas no núcleo em uma pro-porção grande de células transduzidas com cMAC. A translocação foi de-pendente da sensibilização das células com PMA. PMA sozinho não de-monstrou dramaticamente nenhum efeito em translocação de NFAT porémPMA em combinação com cMAC ou TRPV6 aumentou a translocação nu-clear. O inibidor de calcineurina cicloesporina A que bloqueou o cMAC sen-sibilizado com PMA (e TRPV6) induziu a translocação de ambos NFAT-1 eNFAT-2.

Mobilização de cálcio e translocação de NFAT subsequente éum componente crítico na via de transdução de sinal na ativação de célulasT e NFAT é requerida para a produção de IL-2. Estes dados também suportamo papel de NFAT e calcineurina na ativação de células T e especificamentedemonstram que cMAC em expressão em uma linhagem de células T induz5 translocação de NFAT-1 e NFAT-2 endógeno dependente de calcineurina.

Foi avaliado o papel de TRPV6 e cMAC em uma triagem de ati-vação de células T. Células T de Jurkat foram transduzidas com TRPV6 ecMAC (Figura 9) e testadas para sua capacidade para induzir marcadores deativação de células T após preparação com anticorpo de anti-TCR e PMA10 (resultados similares foram obtidos com PMA sozinho). Tanto TRPV6 comocMAC foram ativadores potentes de células T quando avaliados pela indu-ção de IL-2 e a expressão do marcador de superfície ICOS, enquanto PMAsozinho ou PMA mais anti-TCR não sobrerregularam os níveis de expressãode IL-2 ou ICOS. Inversamente, expressão do cDNAs demonstrou sobrerre-15 gulação insignificante de IL-2 e ICOS sem sensibilização de PMA que é con-sistente com as descobertas observadas com a translocação de NFAT. Nes-te ensaio, cDNAs que codificam cDNAs de cMAC humano e de camundon-go, anotou como pareando as seqüências de RefSeq NM_0539045 eNM_177344, respectivamente, foram testados. Ambas as espécies de cD-20 NAs de cMAC foram similarmente ativas em induzir secreção de IL-2 e ex-pressão de ICOS. Desse modo, sobre-expressão de cMAC também induzmarcadores de ativação de células T.EXEMPLO 4

USO DE shRNA PARA DEMONSTRAR cMAC É CRÍTICO PARA A ATIVA-25 CÃO DE CÉLULAS T DE JURKAT

Para avaliar se cMAC foi essencial para ativação de células T1nós projetamos várias construções de shDNA que direcionam cMAC. Nestesexperimentos, as células T de Jurkat foram transduzidas com construçõesvirais que direcionam cMAC ou outro gene não-relacionado. 6 dias pós30 transdução, as células foram ativadas com anticorpos de TCR/CD28 e o ní-vel de mRNA de cMAC e IL-2 segregado nos meios foi medido. Todos me-nos duas construções de shDNA que direcionam cMAC demonstraram redu-ções significativas em produção IL-2. Figura 10. Em experimentos separa-dos, outros controles negativos que direcionam proteína de CD29 e um genemurino aleatório demonstraram um perfil de inibição similar como o controle5 negativo pGL3.

Para determinar a especificidade da construção de shDNA, aredução de mRNA de cMAC foi medida para cada construção (Tabela 8) ecomparada à inibição de IL-2 observada. As construções de shDNA pGL3-Luc e CD29 serviram como controles de negativo. A construção de shDNA10 de CD29 potentemente reduziu mRNA de CD29 (e proteína de CD29; dadosnão mostrados) mas não teve nenhum efeito em mensagem de cMAC. Ape-nas uma construção (BL8) demonstrou choque de mensagem satisfatório(70%) sem qualquer redução de IL-2, uma segunda construção (BL6) de-monstrou choque de mRNA marginal (36%) sem qualquer redução de IL-2.15 As construções restantes demonstraram diminuições IL-2 significativas comredução de mRNA embora em algumas reduções de mRNA de circunstân-cias fossem marginais. Naquelas circunstâncias pode ser que o shDNA estácausando diminuições na expressão de proteína de cMAC através de efeitosde microRNA. Desse modo, parece que, com a exceção de 2 construtos20 (BL6 e BL8), os construtos de IL-2 fenotipicamente ativo correlatam com osníveis de mRNA de cMAC reduzidos.

TABELA 8 REDUÇÃO DE mRNA DE cMAC MEDIADA PQR ShDNA VIRALCORRELACIONA COM INIBIÇÃO DE IL-2

Ctonstruto % de inibição média de IL-2 SEM % de inib. mé- dia de mRNA de cMAC SEMBL1 de cMAC 44,4% 9,77% 20,4% 4,80%BL2 de cMAC 75,5% 0,07% 72,6% 2,05%BL3 de cMAC 52,1% 0,25% 30,1% 7,15%BL4 de cMAC 65,7% 1,31% 56,2% 2,60%BL5 de cMAC 72,2% 2,49% 67,0% 1,40%BL6 de cMAC -9,34% 5,29% 35,8% 7,65%BL7 de cMAC 40,8% 2,04% 66,4% 1,75%BL8 de cMAC 8,03% 6,43% 70,1% 1,45%<table>table see original document page 92</column></row><table>Listagem de Seqüência

<110> Novartis AG

<120> ATIVADOR DE MEMBRANA CONSERVADA DE CALCINEURINA (cMAC), UMA PROTEÍNATERAPÊUTICA E ALVO

<130> DC/4-34542A

<150> US 60/723181

<151> 03.10.2005

<160> 137

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1576<212> DNA<213> Homo sapiens<400> 1

ggcgtccgat cgaggcgggc gttcacgggc ggccagggtt gagtcccggg tcggggccgg 60gggattgccg gcgcatcagg gccgagggct ggggctggcg gggccgctcg ctgcctctcg 120ctcgcagcag cggcggcagg cgcgggcgag ggccacgggg agaggagacg cagccccgcg 180ggtggcacgc tcggccgggc cccggcccgc gctcaacggg cgcgatgctc ttctcgctcc 240gggagctggt gcagtggcta ggcttcgcca ccttcgagat cttcgtgcac ctgctggccc 300tgttggtgtt ctctgtgctg ctggcactgc gtgtggatgg cctggtcccg ggcctctcct 360ggtggaacgt gttcgtgcct ttcttcgccg ctgacgggct cagcacctac ttcaccacca 420tcgtgtccgt gcgcctcttc caggatggag agaagcggct ggcggtgctc cgccttttct 480gggtacttac ggtcctgagt ctcaagttcg tcttcgagat gctgttgtgc cagaagctgg 540cggagcagac tcgggagctc tggttcggcc tcattacgtc cccgctcttc attctcctgc 600agctgctcat gatccgcgcc tgtcgggtca actagcctca ccgaggtgcc ggagagggag 660cgctggacaa ctagaatgtt gacctcgagc cgaggcccta cttgcagcgc accggaggag 720

aggctctcta gtctgaaggc accgccggct tgcgccgagc tgagtgccgg gtttccctat 780

tccaatcctg tttgaaatgg tttcttcagc agggcttaaa agagcagcct tcatcctgaa 840

aatgtatttc cttttgttta atgctttgag tagataatcc tgaattgagg tcatgaggag 900

gccccccagg ccagacagtc ctgaacccct ctgacacttg gaaactgaat ataagtaaaa 960

tgtccaggtg gactctgagt atttcctgtg gatcctggga aagtactgtt gcacaaaggc 1020

tgcaaagctg gactcaggaa tgtcctccaa ccagcagcgc tgacctaaga gctccctgtg 1080

ccgtctatcc agaccagact tcggtagatg cctttgttag atctatcaca tgtaaacgag 1140

cttgtatctc cttccctgtg ccacgagaga gattggcttt ttattccagt ctaggcagag 1200

10 acagaagaat gttgaataag agcacgatta gagtcctgtc tggttatctg ttgcccaaga 1260

aaagaactct gctgtccagg cactgcttgg cttactatcc cagcaaagac tgcagttttg 1320

tggacttttg accaccttgg gctggcactc ttagcacacc tgagacagat ttaagcctcc 1380

ctaagagact gaagagagga acaggtgtca gatactcata ggcactgaga tctacaaatg 1440

ggaagcttgt gagtggccca tctttgttgg cctacgaact ttggtttgat gccagtcagg 1500

15 tgccacatga gaacctttgc tgagatgcaa ataaagtaag agaatgtttt cctgaaaaaa 1560

aaaaaaaaaa aaaaaa 1576<210> 2<211> 136<212> PRT20 <213> Homo sapiens<400> 2

Met Leu Phe Ser Leu Arg Glu Leu Val Gln Trp Leu Gly Phe Ala Thr

Phe Glu Ile Phe Val His Leu Leu Ala Leu Leu Val Phe Ser Val Leu20 25 30

Leu Ala Leu Arg Val Asp Gly Leu Val Pro Gly Leu Ser Trp Trp Asn

35 40 45

Val Phe Val Pro Phe Phe Ala Ala Asp Gly Leu Ser Thr Tyr Phe Thr50 55 60

Thr Ile Val Ser Val Arg Leu Phe Gln Asp Gly Glu Lys Arg Leu Ala65 70 75 80

Val Leu Arg Leu Phe Trp Val Leu Thr Val Leu Ser Leu Lys Phe Val85 90 95

10 Phe Glu Met Leu Leu Cys Gln Lys Leu Ala Glu Gln Thr Arg Glu Leu100 105 110

Trp Phe Gly Leu Ile Thr Ser Pro Leu Phe Ile Leu Leu Gln Leu Leu

115 120 125

Met Ile Arg Ala Cys Arg Val Asn

15 130 135

<210> 3<211> 3101<212> DNA<213> Homo sapiens20 <400> 3

tcttgaactc ctgggctcaa gcgatcctcc cacctcggcc tcccaaattg ctgggattac 60

aggcatgagc cactgtgccc ggcaaacgtc tctcataaaa aactccttct ttttaactct 120ttagcctttt cacagccaga tgtggttttt tgtttgtttg ttttgttttt tgtctttttt 180ttgtttttga gacggagtct cgctctgtcg cccaggctgg agtgcagtgg cgcgatctcg 240gctcactgca agttccgcct cccgggttca cgccattctc ctgcctcagc ctcccgagta 300

gctgggacta caggtgcccg ccaccacatc cggctagttt tttgtatttt tagtagagac 360

gaggtttcac accgtgttag ccaggatggt ctcgatctcc tgacctcgtg atctgcctgc 420

ctcggcctcc caaagtgcta ggattacagg tgtgagccac agtgcccggc tctttttctt 480

tttttttttt tttttgacag agtctagctc tgtcaccagt ctggagtgca gtggcgcaat 540

ctcagctcac tgcaacttcc gactccctgg tctaagtgat tctcctgcct cagcctcccg 600

agtagctggg attacaggca cgcaccactg cgccgtgccc agctaattgt tgtaatttta 660

gtagagacgg gtttcaccat gttggccagg ctggtctcga actcctgacc tcgtgattcg 720

cccgcctcgg cctcccaaag tgctgagatt acaggcgtga gccaccgcag ccggcccgca 780

10 ctcaagacat tcttaaaaga tgctctccac tcactctctc agttgctgat ctcctgtaat 840

ctggcttctc tccccatgag ccactgaagc tgctcttcct ggtatcacca acaatccctt 900

tgccaagaaa tcccatggat ccctctcagg ctttatctga tttgacttct gtgcagcttt 960

acatgccaga gcccttcctg gaacactcac tcccccagtc ctctccttgg ggtgctgcac 1020

cctctcttct agctgcttgg tcactctcct gccctcctgg gctctaacgt tctgggcagc 1080

15 ctgtcctgtg gggagagagg agcttcctct tctcacactt ctgtattgtg gctacctcaa 1140

cacctatctc cgccccagga tcttccttgg agcgctagtc ctactgcact tctccacttc 1200

aatgtctcca ggttcccttc ctgcacagcc ccctactccc accgtgttct ctgatttctg 1260

tggatggaac caccatccat cttggttcca gagcccacat ccctgtctcg attctgcttg 1320

acctattggg tccgttccat gtcccgggga ctctctcttc ctgacaccac tgcaatgtgt 1380

20 ccacttctat cttctgccac cacttcagct cagatcggta gcatctgctg cctgtcctgt 1440

gcatctcatg gcattattcc tgctgtcctg cagaccagtg cggttttgct agcttaggaa 1500

catgactgtg tcacccctac agttccgaca acccttcatt tcaagcccat ctgccttgct 1560

gtggttactc aggctctttg gactgggcct ggcttcctgc ctctcttctc ctcccctctt 1620

gccccagtgt actcctcagc ttggccaccc tgagctgctt tccacttttc acacaaacca 1680aatcatcttt ttcctctgcg ctgactgctcgcatccttcc gtgactcagc ttacactcttggttgggtga gataaggctc gatgccccttcccagcagca ggtgtttgct ggcactgtcaaactctgcca ggatggaaat atggctgctggtgccaagaa tagaatatgt gcttaaaagaggtcatacag tctagaaata cacacaagacgaaaaataag aaaggttaaa acggataataagagagggca accggagccc ccagccccacaggtgcatga gataaaggag agctatttacgtgagggtcg agggcaggga tctgaggagccaggggggtc tccttggcct gtagttgcacgattcacctc aacaaaaaga cacacacacgcttcccaaaa cttgaccccc ttctccttta15 gagcagccag accgtcttct ctttcaggttcccttcccaa acctccttcc ctaaatccgctgcgacgcct tttgggtcga tgaccccgcgacgccgaggc cctagcgagc cctcaccaccccaagccgcc ggcgccgggc ctcgcgaccc20 gtctggctgc cgaagagcac cagaagctgctggtctgaga ctaaaaacta gaaggcagttccttccgcct tccgccgtcg accggaagtgggcgtccgat cgaggcgggc gttcacgggcgggattgccg gcgcatcagg gccgagggct

cttcttcctc ggtgcctgac tagccctcac 1740

ttcttccaga aacctctgcc tgggccccaa 1800

atcagtgctc ctgtgacata tgctactttc 1860

ttgcccgtta gctgcttctg ctacagtgtg 1920

ggttcacagc tggatcccca gcaccagact 1980

tggtcagaga attcagcaac gttccctgag 2040

ccagactaga tgcacatata gatagccctg 2100

aggctatttg gtggctacga cgagtttatt 2160

tcacggacgt tctctcaaat ccacctctga 2220

tgcacctaga cgccaggcaa tgaaaacggg 2280

cacatcaggc cagccttacc ttcatgttgt 2340

aaacaaatat caccaggggc tcgttaatca 2400

taagacctcc ggctgtaagg accgggcgtc 24 60

ctcaggctga cagggcagag ggatttatgt 2520

ccaacctcct ccaggtgcta aactgaactc 2580

cataagggaa agacccgctc tcagagaaaa 2640

aggcgggcac gccaggcctg ctcgtccccc 2700

gggtaggagt ccagggcctg cacccggcag 27 60

agtctctccg acacatcctg agccgtgcct 2820

gggctcggca tcggggtgcg cccggtggtc 2880

cccgccggcc gggttgcagg gaccgctccg 2940

acgcactagg gacgcgccct gtgggggcat 3000

ggccagggtt gagtcccggg tcggggccgg 3060

ggggctggcg g 3101<210> 4<211> 225<212> DNA<213> Homo sapiens<400> 4

ggcgtccgat cgaggcgggc gttcacgggc ggccagggtt gagtcccggg tcggggccgg 60

gggattgccg gcgcatcagg gccgagggct ggggctggcg gggccgctcg ctgcctctcg 120ctcgcagcag cggcggcagg cgcgggcgag ggccacgggg agaggagacg cagccccgcg 180ggtggcacgc tcggccgggc cccggcccgc gctcaacggg cgcga 225

10 <210> 5

<211> 941<212> DNA<213> Homo sapiens<4 00> 5

15 cctcaccgag gtgccggaga gggagcgctg gacaactaga atgttgacct cgagccgagg 60

ccctacttgc agcgcaccgg aggagaggct ctctagtctg aaggcaccgc cggcttgcgc 120

cgagctgagt gccgggtttc cctattccaa tcctgtttga aatggtttct tcagcagggc 180

ttaaaagagc agccttcatc ctgaaaatgt atttcctttt gtttaatgct ttgagtagat 240

aatcctgaat tgaggtcatg aggaggcccc ccaggccaga cagtcctgaa cccctctgac 300

20 acttggaaac tgaatataag taaaatgtcc aggtggactc tgagtatttc ctgtggatcc 360

tgggaaagta ctgttgcaca aaggctgcaa agctggactc aggaatgtcc tccaaccagc 420

agcgctgacc taagagctcc ctgtgccgtc tatccagacc agacttcggt agatgccttt 480

gttagatcta tcacatgtaa acgagcttgt atctccttcc ctgtgccacg agagagattg 540

gctttttatt ccagtctagg cagagacaga agaatgttga ataagagcac gattagagtc 600ctgtctggtt atctgttgcc caagaaaaga actctgctgt ccaggcactg cttggcttac 660tatcccagca aagactgcag ttttgtggac ttttgaccac cttgggctgg cactcttagc 720acacctgaga cagatttaag cctccctaag agactgaaga gaggaacagg tgtcagatac 780tcataggcac tgagatctac aaatgggaag cttgtgagtg gcccatcttt gttggcctac 840gaactttggt ttgatgccag tcaggtgcca catgagaacc tttgctgaga tgcaaataaa 900gtaagagaat gttttcctga aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa a 941

<210> 6<211> 12<212> PRT10 <213> Homo sapiens<4 00> 6

Met Leu Phe Ser Leu Arg Glu Leu Val Gln Trp Leu15 10

<210> 7

15 <211> 14

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<4 00> 7

Arg Val Asp Gly Leu Val Pro Gly Leu Ser Trp Trp Asn Val

20 1 5 10

<210> 8

<211> 6

<212> PRT

<213> Homo sapiens<400> 8

Gln Asp Gly Glu Lys Arg

1 5

<210> 9

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<4 00> 9

Cys Gln Lys Leu Ala Glu Gln Thr Arg1 5

<210> 10<211> 6<212> PRT<213> Homo sapiens<400> 10

Arg Ala Cys Arg Val Asn1 5

<210> 11<211> 840<212> DNA<213> Mus musculus<4 00> 11

gatagcatct ggacaccacg ggcttctgct agcctccggt tccgggtccg gggttggggtcctcagggtc gcagagcccc agggccggcg tccaggccag gttgggctgc ttgctgcctcccgtgtgcag cggcggcagc aggcggtcgc caggtctgcg gtcggagacg tcacagcccg 180

gtgcggggca ccggtggccg gtgttaagca ggcgcgatgt tattctcgct gcgggagctg 240

gtgcagtggc tgggcttcgc cacctttgag atattcgtgc acctgctggc cctgttggtg 300

ttctccgtac tgttggcact gcgagtggat ggcttgactc cgggcctctc ctggtggaac 360

5 gtctttgtgc cctttttcgc cgccgacggg ctcagtacct acttcaccac catcgtttcc 420

gttcgactct tccaagatgg ggagaagcga ctggctgtgc tgcgcctctt ctgggttctc 480

accgtcctta gcctcaagtt tgtctttgag atgttgctgt gccagaagct agtggagcag 540

agctcgagag ctctggttcg gcctgatcac gtctccggtc ttcattctcc tgcagctgct 600

catgatccgg gcttgtcgcg tcaactagcc tcttgcagtg gctggaaatg gagcactgcg 660

10 cagctggagt tctggacctc ccggtcctga cccaacttgg tgccacactg gtggagcttt 720

ggtcagaaat cagtgtttgc ttgtgcccca gtttactgtc cagttttctt tatatataag 780

atcgtttcct cgagcaaagc ttaaaagtga agtcttgttt attaaaactt atttccagtt 840<210> 12<211> 79715 <212> DNA

<213> Mus musculus<4 00> 12

acgggcttct gctagcctcc ggttccgggt ccggggttgg ggtcctcagg gtcgcagagc 60

cccagggccg gcgtccaggc caggttgggc tgcttgctgc ctcccgtgtg cagcggcggc 120

20 agcaggcggt cgccaggtct gcggtcggag acgtcacagc ccggtgcggg gcaccggtgg 180

ccggtgttaa gcaggcgcga tgttattctc gctgcgggag ctggtgcagt ggctgggctt 240

cgccaccttt gagatattcg tgcacctgct ggccctgttg gtgttctccg tactgttggc 300

actgcgagtg gatggcttga ctccgggcct ctcctggtgg aacgtctttg tgcccttttt 360

cgccgccgac gggctcagta cctacttcac caccatcgtt tccgttcgac tcttccaaga 420tggggagaag cgactggctg tgctgcgcct cttctgggtt ctcaccgtcc ttagcctcaa 480gtttgtcttt gagatgttgc tgtgccagaa gctagtggag cagactcgag agctctggtt 540cggcctgatc acgtctccgg tcttcattct cctgcagctg ctcatgatcc gggcttgtcg 600cgtcaactag cctcttgcag tggctggaaa tggagcactg cgcagctgga gttctggacc 6605 tcccggtcct gacccaactt ggtgccacac tggtggagct ttggtcagaa atcagtgttt 720gcttgtgccc agtttactgt ccagttttct ttatatataa gatcgtttcc tcgagcaaaa 780aaaaaaaaaa aaaaaaa 797

<210> 13<211> 15710 <212> PRT

<213> Mus musculus<4 00> 13

Met Leu Phe Ser Leu Arg Glu Leu Val Gln Trp Leu Gly Phe Ala Thr15 10 15

15 Phe Glu Ile Phe Val His Leu Leu Ala Leu Leu Val Phe Ser Val Leu20 25 30

Leu Ala Leu Arg Val Asp Gly Leu Thr Pro Gly Leu Ser Trp Trp Asn

35 40 .45

Val Phe Val Pro Phe Phe Ala Ala Asp Gly Leu Ser Thr Tyr Phe Thr20 50 55 60

Thr Ile Val Ser Val Arg Leu Phe Gln Asp Gly Glu Lys Arg Leu Ala65 70 75 80

Val Leu Arg Leu Phe Trp Val Leu Thr Val Leu Ser Leu Lys Phe Val85 90 95Phe Glu Met Leu Leu Cys Gln Lys Leu Val Glu Gln Ser Ser Arg Ala

100 105 110

Leu Val Arg Pro Asp His Val Ser Gly Leu His Ser Pro Ala Ala Ala

115 120 125

His Asp Pro Gly Leu Ser Arg Gln Leu Ala Ser Cys Ser Gly Trp Lys

130 135 140

Trp Ser Thr Ala Gln Leu Glu Phe Trp Thr Ser Arg Ser145 150 155

<210> 14<211> 136<212> PRT<213> Mus musculus<400> 14

Met Leu Phe Ser Leu Arg Glu Leu Val Gln Trp Leu Gly Phe Ala Thr15 10 15

Phe Glu Ile Phe Val His Leu Leu Ala Leu Leu Val Phe Ser Val Leu

20 25 30

Leu Ala Leu Arg Val Asp Gly Leu Thr Pro Gly Leu Ser Trp Trp Asn

35 40 45

Val Phe Val Pro Phe Phe Ala Ala Asp Gly Leu Ser Thr Tyr Phe Thr

50 55 60

Thr Ile Val Ser Val Arg Leu Phe Gln Asp Gly Glu Lys Arg Leu Ala65 70 75 80

Val Leu Arg Leu Phe Trp Val Leu Thr Val Leu Ser Leu Lys Phe Val85 90 95

Phe Glu Met Leu Leu Cys Gln Lys Leu Val Glu Gln Thr Arg Glu Leu

100 105 110

Trp Phe Gly Leu Ile Thr Ser Pro Val Phe Ile Leu Leu Gln Leu Leu

115 120 125

Met Ile Arg Ala Cys Arg Val Asn

130 135

<210> 15<211> 136<212> PRT

<213> Rattus norvegicus<4 00> 15

Met Leu Phe Ser Leu Arg Glu Leu Val Gln Trp Leu Gly Phe Ala Thr15 10 15

Phe Glu Ile Phe Val His Leu Leu Ala Leu Leu Val Phe Ser Val Leu

20 25 30

Leu Ala Leu Arg Val Asp Gly Leu Ala Pro Gly Leu Ser Trp Trp Asn

35 40 45

Val Phe Val Pro Phe Phe Ala Ala Asp Gly Leu Ser Thr Tyr Phe Thr

50 55 60

Thr Ile Val Ser Val Arg Leu Phe Gln Asp Gly Glu Lys Arg Leu Ala65 70 75 80

Val Leu Arg Leu Phe Trp Val Leu Thr Val Leu Ser Leu Lys Phe Val85 90 95Phe Glu Met Leu Leu Cys Gln Lys Leu Val Glu Gln Thr Arg Glu Leu

100 105 110

Trp Phe Gly Leu Ile Thr Ser Pro Val Phe Ile Leu Leu Gln Leu Leu

115 120 125

Met Ile Arg Ala Cys Arg Val Asn

130 135

<210> 16<211> 136<212> PRT

<213> Canis familiaris<400> 16

Met Leu Phe Ser Leu Arg Glu Leu Val Gln Trp Leu Gly Phe Ala Thr15 10 15

Phe Glu Ile Phe Val His Leu Leu Ala Leu Leu Val Phe Ser Val Leu

20 25 30

Leu Ala Leu Arg Val Asp Gly Leu Ala Pro Gly Leu Ser Trp Trp Asn

35 40 45

Val Phe Val Pro Phe Phe Ala Ala Asp Gly Leu Ser Thr Tyr Phe Thr

50 55 60

Thr Ile Val Ser Val Arg Leu Phe Gln Asp Gly Glu Lys Arg Leu Ala65 70 75 80

Val Leu Arg Leu Phe Trp Val Leu Thr Val Leu Ser Leu Lys Phe Val

85 90 95

Phe Glu Met Leu Leu Cys Gln Lys Leu Val Glu Gln Thr Arg Glu Leu100 105 110

Trp Phe Gly Leu Ile Thr Ser Pro Val Phe Ile Leu Leu Gln Leu Leu

115 120 125

Met Ile Arg Ala Cys Arg Val Asn

130 135

<210> 17<211> 136<212> PRT

<213> Pan troglodytes<4 00> 17

Met Leu Phe Ser Leu Arg Glu Leu Val Gln Trp Leu Gly Phe Ala Thr15 10 15

Phe Glu Ile Phe Val His Leu Leu Ala Leu Leu Val Phe Ser Val Leu

20 25 30

Leu Ala Leu Arg Val Asp Gly Leu Val Pro Gly Leu Ser Trp Trp Asn

35 40 45

Val Phe Val Pro Phe Phe Ala Ala Asp Gly Leu Ser Thr Tyr Phe Thr

50 55 60

Thr Ile Val Ser Val Arg Leu Phe Gln Asp Gly Glu Lys Arg Leu Ala65 70 75 80

Val Leu Arg Leu Phe Trp Val Leu Thr Val Leu Ser Leu Lys Phe Val

85 90 95

Phe Glu Met Leu Leu Cys Gln Lys Leu Ala Glu Gln Thr Arg Glu Leu100 105 110Trp Phe Gly Leu Ile Thr Ser Pro Leu Phe Ile Leu Leu Gln Leu Leu

115 120 125

Met Ile Arg Ala Cys Arg Val Asn

130 135

<210> 18<211> 136<212> PRT

<213> Xenopus tropicalis<400> 18

Met Leu Phe Ser Leu Leu Glu Leu Val Gln Trp Leu Gly Phe Ala Gln15 10 15

Leu Glu Ile Phe Leu His Ile Trp Ala Leu Leu Val Phe Thr Val Leu

20 25 30

Leu Ala Leu Lys Ala Asp Gly Phe Ala Pro Asp Met Ser Trp Trp Asn

35 40 45

Ile Phe Ile Pro Phe Phe Thr Ala Asp Gly Leu Ser Thr Tyr Phe Thr

50 55 60

Thr Ile Val Thr Val Arg Leu Phe Gln Asp Gly Glu Lys Arg Gln Ala65 70 75 80

Val Leu Arg Leu Phe Trp Ile Leu Thr Ile Leu Ser Leu Lys Phe Val

85 90 95

Phe Glu Met Leu Leu Cys Gln Lys Leu Val Glu Gln Ser Arg Glu Leu

100 105 110

Trp Phe Gly Leu Ile Met Ser Pro Val Phe Ile Leu Leu Gln Leu Leu115 120 125

Met Ile Arg Ala Cys Arg Val Asn

130 135

<210> 19<211> 140<212> PRT<213> Danio rerio<4 00> 19

Met Leu Phe Ser Leu Arg Glu Leu Val Gln Trp Leu Gly Phe Ala Thr15 10 15

Phe Glu Leu Phe Leu His Leu Gly Ala Leu Leu Val Phe Ser Val Leu

20 25 30

Val Ala Leu His Met Asp Val Asp Lys Gln Thr Leu Glu Met Ser Trp

35 40 45

Trp Leu Val Phe Ser Pro Leu Phe Thr Ala Asp Gly Leu Ser Thr Tyr

50 55 60

Phe Thr Ala Ile Val Ser Ile Arg Leu Tyr Gln Glu Gly Glu Lys Arg65 70 75 80

Leu Ala Val Leu Arg Leu Leu Trp Val Leu Thr Val Leu Ser Leu Lys

85 90 95

Leu Val Cys Glu Val Leu Leu Cys Gln Lys Leu Ala Glu Gln Glu Arg

100 105 110

Ala Gln Asp Leu Trp Phe Gly Leu Ile Val Ser Pro Leu Phe Ile Leu115 120 125Leu Gln Leu Leu Met Ile Arg Ala Cys Arg Val Asn130 135 140

<210> 20<211> 140<212> PRT<213> Gallus gallus<400> 20

Met Leu Phe Ser Leu Arg Glu Leu Val Gln Trp Leu Gly Phe Ala Thr

15 10 15

Phe Glu Ile Phe Leu His Gly Leu Ala Leu Leu Val Phe Ser Val Leu

20 25 30

Leu Val Leu Lys Val Asp Ser Glu Ala Ser Pro Leu Ser Trp Trp Val

35 40 45

)

Val Phe Val Pro Phe Phe Val Ala Asp Gly Leu Ser Thr Tyr Phe Thr

50 55 60

Ala Ile Val Ser Val Arg Leu Phe Gln Asp Gly Glu Lys Arg Leu Ala65 70 75 80

Val Leu Arg Leu Phe Trp Ile Leu Thr Ile Leu Ser Leu Lys Phe Val

85 90 95

Phe Glu Met Leu Leu Cys Gln Lys Leu Val Glu Arg Thr Arg Ala Val

100 105 110

Val Arg Thr His His Val Ala Arg Leu His Pro Ser Ala Ala Pro His

115 120 125

Asp Gln Gly Leu Pro Arg Glu Leu Ser Leu Arg Gly130 135 140

<210> 21<211> 135<212> PRT

<213> Branchiostoma floridae<4 00> 21

Met Leu Phe Ser Leu Lys Glu Ile Ile Gln Trp Ile Gly Leu Ser Ala15 10 15

Phe Glu Leu Trp Leu His Val Val Ser Leu Leu Val Phe Ser Ile Leu

20 25 30

Leu Ala Leu Lys Leu Glu Gly Val Leu Ser Thr Thr Trp Trp Thr Val

35 40 45

Phe Ile Pro Leu Phe Ala Ser Asp Gly Leu His Ala Tyr Phe Ser Ser

50 55 60

Ile Val Phe Leu Arg Leu Asn Leu Glu Gly Asp Leu Arg Thr Ala Gly65 70 75 80

Ile Arg Thr Ala Trp Ser Ala Val Val Leu Val Leu Leu Phe Ala Phe

85 90 95

Lys Met Leu Leu Cys Gln Lys Leu Glu Asp Gln Asn Asn Leu Thr Phe

100 105 110

Ala Met Ile Met Ser Pro Val Phe Ile Leu Leu Gln Val Leu Met Ile

115 ■ 120 125

Arg Ala Cys Gln Val Gly Asn130 135<210> 22

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial

5 <220>

<223> seqüência guia de siRNA (5' -> 3')

<4 00> 22

uaguaagcca agcagugcct g 21

<210> 23

10 <211> 21

<212> DNA

<213> Artificial<220>

<223> seqüência guia de siRNA (5' -> 3')

15 <400> 23

uugugcaaca guacuuuccc a 21

<210> 24<211> 21<212> DNA20 <213> Artificial<220>

<223> seqüência guia de siRNA (5' -> 3')<4 00> 24

uuacuuauau ucaguuucca a 21<210> 25

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> seqüência guia de siRNA (5' -> 3')

<4 00> 25

uaugaguauc ugacaccugt t 21

<210> 26

10 <211> 21

<212> DNA

<213> Artificial<220>

<223> seqüência guia de siRNA (5' -> 3')

15 <4 00> 26

uaagagugcc agcccaaggt g 21

<210> 27

<211> 21

<212> DNA

20 <213> Artificial<220>

<223> seqüência guia de siRNA (5' -> 3')

<4 00> 27

uaguugaccc gacaggcgcg g 21<210> 28

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> seqüência guia de siRNA (5' -> 3')<4 00> 28

ucguaggcca acaaagáugg g 21

<210> 2910 <211> 21<212> DNA<213> Artificial<220>

<223> seqüência guia de siRNA (5' -> 3')15 <400> 29

ucuugggcaa cagauaacca g 21

<210> 30<211> 21<212> DNA20 <213> Artificial<220>

<223> seqüência guia de siRNA (5' -> 3')<4 00> 30

ugauagaucu aacaaaggca t 21<210> 31

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> seqüência guia de siRNA (5' -> 3')

<4 00> 31

ucuuagggag gcuuaaauct g 21

<210> 32

10 <211> 21

<212> RNA

<213> Artificial<220>

<223> seqüência guia de siRNA (5' -> 3')

15 <4 00> 32

uuggaauagg gaaacccggc a 21

<210> 33

<211> 21

<212> DNA

20 <213> Artificial<220>

<223> seqüência guia de siRNA (5' -> 3')

<4 00> 33

uaguugucca gcgcucccuc t 21<210> 34

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> seqüência guia de siRNA (5' -> 3')

<4 00> 34

uucucaugug gcaccugact g 21

<210> 35

10 <211> 21

<212> RNA

<213> Artificial<220>

<223> seqüência guia de siRNA (5' -> 3')

15 <4 00> 35

ugguuggagg acauuccuga g 21

<210> 36

<211> 21

<212> RNA

20 <213> Artificial<220>

<223> seqüência guia de siRNA (5' -> 3')

<4 00> 36

uuaucuacuc aaagcauuaa a 21<210> 37

<211> 21

<212> RNA

<213> Artificial

<220>

<223> seqüência guia de siRNA (5' -> 3')<4 00> 37

uucuggcaca acagcaucuc g 21

<210> 38

<211> 21

<212> RNA

<213> Artificial<220>

<223> seqüência guia de siRNA (5' -> 3')

15 <400> 38

uuccaccagg agaggcccgg g 21

<210> 39

<211> 21

<212> RNA

20 <213> Artificial<220>

<223> seqüência guia de siRNA (5* -> 3')

<4 00> 39

ucuaaucgug cucuuauuca a 21<210> 40<211> 21<212> RNA<213> Artificial<220>

<223> seqüência guia de siRNA (5' -> 3')<400> 40

uuacuuuauu ugcaucucag c<210> 41<211> 21<212> RNA<213> Artificial<220>

<223> seqüência guia de siRNA (5' -> 3')<4 00> 41

ugaacgcccg ccucgaucgg a<210> 42<211> 21<212> RNA<213> Artificial<220>

<223> seqüência guia de siRNA (5' -> 3')<4 00> 42

uacuuuccca ggauccacag g<210> 43

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> seqüência guia de siRNA (5' -> 3')

<400> 43

auacaagcuc guuuacaugt g 21

<210> 44

<211> 21

<212> RNA

<213> Artificial<220>

<223> seqüência guia de siRNA (5' -> 3')

15 <400> 44

uacaagcucg uuuacaugug a 21

<210> 45

<211> 21

<212> RNA

20 <213> Artificial<220>

<223> seqüência guia de siRNA (5' -> 3')

<4 00> 45

uacaugugau agaucuaaca a 21<210> 46

<211> 21

<212> RNA

<213> Artificial

<220>

<223> seqüência guia de siRNA (5' -> 3')

<4 00> 46

ugugcaacag uacuuuccca g 21

<210> 47

10 <211> 21

<212> DNA

<213> Artificial<220>

<223> seqüência guia de siRNA (5' -> 3')

15 <4 00> 47

ucgaggucaa cauucuagut g 21

<210> 48

<211> 21

<212> DNA

20 <213> Artificial<220>

<223> seqüência guia de siRNA (51 -> 3')

<4 00> 48

ucuaguuguc cagcgcuccc t 21<210> 49

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> seqüência guia de siRNA (5' -> 3')

<400> 49

auuuguagau cucagugcct a 21

<210> 50

<211> 21

<212> RNA

<213> Artificial<220>

<223> seqüência guia de siRNA (5' -> 3')

<400> 50

uuugcagccu uugugcaaca g 21

<210> 51

<211> 21

<212> RNA

<213> Artificial

<220>

<223> seqüência guia de siRNA (5' -> 3')

<4 00> 51

ucaaacagga uuggaauagg g 21<210> 52

<211> 21

<212> RNA

<213> Artificial

<220>

<223> seqüência guia de siRNA (5' -> 3')

<400> 52

ugcaacagua cuuucccagg a 21

<210> 53

10 <211> 21

<212> DNA

<213> Artificial<220>

<223> seqüência guia de siRNA (5' -> 3')

15 <4 00> 53

cuuauauuca guuuccaagt g 21

<210> 54

<211> 21

<212> RNA

20 <213> Artificial<220>

<223> seqüência guia de siRNA (5' -> 3')

<4 00> 54

aaaggcacga acacguucca c 21<210> 55

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> seqüência guia de siRNA (5* -> 3')

<4 00> 55

uuuguagauc ucagugccua t 21

<210> 56

10 <211> 21

<212> DNA

<213> Artificial<220>

<223> seqüência guia de siRNA (5' -> 3')

15 <4 00> 56

aaaggcaucu accgaaguct g 21

<210> 57<211> 21<212> RNA20 <213> Artificial<220>

<223> seqüência guia de siRNA (5' -> 3')<400> 57

uucuugggca acagauaacc a 21<210> 58<211> 21<212> DNA<213> Artificial<220>

<223> seqüência guia de siRNA (5' -> 3')<4 00> 58

ugcugguugg aggacauucc t<210> 59<211> 21<212> RNA<213> Artificial<220>

<223> seqüência guia de siRNA (5' -> 3')<4 00> 59

uuucaaacag gauuggaaua g<210> 60<211> 21<212> DNA<213> Artificial<220>

<223> seqüência guia de siRNA (5' -> 3')<4 00> 60

uugcaucuca gcaaagguuc t<210> 61<211> 21<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> seqüência guia de siRNA (5' -> 3')

<400> 61

aaucgugcuc uuauucaaca t 21

<210> 62

10 <211> 21

<212> DNA

<213> Artificial<220>

<223> complemento de siRNA (5' -> 3')

15 <4 00> 62

ggcacugcuu ggcuuacuat t 21

<210> 63

<211> 21

<212> DNA

20 <213> Artificial<220>

<223> complemento de siRNA (5' -> 3')

<400> 63

ggaaaguacu guugcacaat t 21<210> 64

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> complemento de siRNA (5' -> 3')

<4 00> 64

ggaaacugaa uauaaguaat t 21

<210> 65

10 <211> 21

<212> DNA

<213> Artificial<220>

<223> complemento de siRNA (5' -> 3')

15 <400> 65

caggugucag auacucauat t 21

<210> 66

<211> 21

<212> DNA

20 <213> Artificial<220>

<223> complemento de siRNA (5' -> 3')

<4 00> 66

ccuugggcug gcacucuuat t 21<210> 67<211> 21<212> DNA<213> Artificial<220>

<223> complemento de siRNA (5' -> 3')<400> 67

gcgccugucg ggucaacuat t<210> 68<211> 21<212> DNA<213> Artificial<220>

<223> complemento de siRNA (5' -> 3')<4 00> 68

caucuuuguu ggccuacgat t<210> 69<211> 21<212> DNA<213> Artificial<220>

<223> complemento de siRNA (5' -> 3')<4 00> 69

gguuaucugu ugcccaagat t<210> 70<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial

5 <220>

<223> complemento de siRNA (5' -> 3')

<400> 70

gccuuuguua gaucuaucat t 21

<210> 71

10 <211> 21

<212> DNA

<213> Artificial<220>

<223> complemento de siRNA (5' -> 3')

15 <4 00> 71

gauuuaagcc ucccuaagat t 21

<210> 72

<211> 21

<212> DNA

20 <213> Artificial<220>

<223> complemento de siRNA (51 -> 3')

<4 00> 72

ccggguuucc cuauuccaat t 21<210> 73

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial

5 <220>

<223> complemento de siRNA (5' -> 3')

<4 00> 73

agggagcgcu ggacaacuat t 21

<210> 74

10 <211> 21

<212> DNA

<213> Artificial<220>

<223> complemento de siRNA (51 -> 3')

15 <400> 74

gucaggugcc acaugagaat t 21

<210> 75

<211> 21

<212> DNA

20 <213> Artificial<220>

<223> complemento de siRNA (5' -> 3')

<4 00> 75

caggaauguc cuccaaccat t 21210> 76<211> 21<212> DNA<213> Artificial<220>

<223> complemento de siRNA (5' -> 3')<400> 76

uaaugcuuug aguagauaat t<210> 77<211> 21<212> DNA<213> Artificial<220>

<223> complemento de siRNA (5' -> 3')<400> 77

agaugcuguu gugccagaat t<210> 78<211> 21<212> DNA<213> Artificial<220>

<223> complemento de siRNA (5' -> 3')<4 00> 78

cgggccucuc cugguggaat t<210> 79<211> 21<212> DNA<213> Artificial<220>

<223> complemento de siRNA (5' -> 3')<4 00> 79

gaauaagagc acgauuagat t<210> 80<211> 21<212> DNA<213> Artificial<220>

<223> complemento de siRNA (5' -> 3')<4 00> 80

ugagaugcaa auaaaguaat t<210> 81<211> 21<212> DNA<213> Artificial<220>

<223> complemento de siRNA (5' -> 3')<4 00> 81

cgaucgaggc gggcguucat t<210> 82

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> complemento de siRNA (5' -> 3')

<400> 82

uguggauccu gggaaaguat t 21

<210> 83

10 <211> 21

<212> DNA

<213> Artificial<220>

<223> complemento de siRNA (5' -> 3')

15 <4 00> 83

cauguaaacg agcuuguaut t 21

<210> 84<211> 21<212> DNA20 <213> Artificial<220>

<223> complemento de siRNA (5' -> 3')<4 00> 84

acauguaaac gagcuuguat t 21<210> 85

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> complemento de siRNA (5' -> 3')

<4 00> 85

guuagaucua ucacauguat t 21

<210> 86

10 <211> 21

<212> DNA

<213> Artificial<220>

<223> complemento de siRNA (5" -> 3')

15 <400> 86

gggaaaguac uguugcacat t 21

<210> 87

<211> 21

<212> DNA

20 <213> Artificial<220>

<223> complemento de siRNA (5' -> 3')

<4 00> 87

acuagaaugu ugaccucgat t 21

Â<210> 88

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> complemento de siRNA (5' -> 3')

<400> 88

ggagcgcugg acaacuagat t 21

<210> 89

10 <211> 21

<212> DNA

<213> Artificial<220>

<223> complemento de siRNA (5' -> 3')

15 <4 00> 89

ggcacugaga ucuacaaaut t 21

<210> 90<211> 21<212> DNA20 <213> Artificial<220>

<223> complemento de siRNA (5' -> 3')<4 00> 90

guugcacaaa ggcugcaaat t 21<210> 91<211> 21<212> DNA

<213> Artificial<220>

<223> complemento de siRNA (5' -> 3')<400> 91

cuauuccaau ccuguuugat t

<210> 92

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial<220>

<223> complemento de siRNA (5' -> 3')

<4 00> 92

cugggaaagu acuguugcat t

<210> 93

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial<220>

<223> complemento de siRNA (5' -> 3')

<4 00> 93

cuuggaaacu gaauauaagt t<210> 94

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> complemento de siRNA (5' -> 3')

<400> 94

ggaacguguu cgugccuuut t 21

<210> 95

10 <211> 21

<212> DNA

<213> Artificial<220>

<223> complemento de siRNA (5' -> 3')

15 <400> 95

aggcacugag aucuacaaat t 21

<210> 96

<211> 21

<212> DNA

20 <213> Artificial<220>

<223> complemento de siRNA (5' -> 3')

<4 00> 96

gacuucggua gaugccuuut t 21<210> 97<211> 21<212> DNA<213> Artificial<220>

<223> complemento de siRNA (5' -> 3')<400> 97

guuaucuguu gcccaagaat t<210> 98<211> 21<212> DNA<213> Artificial<220>

<223> complemento de siRNA (5' -> 3')<4 00> 98

gaauguccuc caaccagcat t<210> 99<211> 21<212> DNA<213> Artificial<220>

<223> complemento de siRNA (5' -> 3')<4 00> 99

auuccaaucc uguuugaaat t<210> 100

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> complemento de siRNA (5' -> 3')

<4 00> 100

aaccuuugcu gagaugcaat t 21

<210> 101

10 <211> 21

<212> DNA

<213> Artificial<220>

<223> complemento de siRNA (5' -> 3')

15 <4 00> 101

guugaauaag agcacgauut t 21

<210> 102<211> 19<212> DNA20 <213> Artificial<220>

<223> seqüência alvo de ShDNA<400> 102

gcgcctgtcg ggtcaacta 19<210> 103

<211> 56

<212> DNA

<213> Artificial<220>

<223> Oligo's de DNA de sentidos

<400> 103

ccgggcgcct gtcgggtcaa ctattcaaga gatagttgac ccgacaggcg cttttt

<210> 104

<211> 56

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Oligo's de DNA de antissentido

<4 00> 104

aattaaaaag cgcctgtcgg gtcaactatc tcttgaatag ttgacccgac aggcgc

<210> 105

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> seqüência alvo de shDNA

<4 00> 105

gcctttgtta gatctatca<210> 106<211> 56<212> DNA

<213> Artificial<220>

<223> Oligo1S de DNA de sentido

<400> 106

ccgggccttt gttagatcta tcattcaaga gatgatagat ctaacaaagg cttttt

<210> 107

<211> 56

<212> DNA

<213> Artificial<220>

<223> Antioligo1S de DNA de sentido

<400> 107

aattaaaaag cctttgttag atctatcatc tcttgaatga tagatctaac aaaggc

<210> 108

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> seqüência alvo de shDNA

<4 00> 108

catctttgtt ggcctacga<210> 109<211> 56<212> DNA

<213> Artificial<220>

<223> Oligo1S de DNA de sentido

<400> 109

ccggcatctt tgttggccta cgattcaaga gatcgtaggc caacaaagat gttttt

<210> 110

<211> 56

<212> DNA

<213> Artificial<220>

<223> Antioligo1S de DNA de sentido

<400> 110

aattaaaaac atctttgttg gcctacgatc tcttgaatcg taggccaaca aagatg

<210> 111

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial<220>

<223> seqüência alvo de shDNA

<4 00> 111

ggttatctgt tgcccaaga<210> 112<211> 56<212> DNA<213> Artificial<220>

<223> Oligo's de DNA de sentido<400> 112

ccggggttat ctgttgccca agattcaaga gatcttgggc aacagataac cttttt<210> 113<211> 56<212> DNA<213> Artificial<220>

<223> Antioligo's de DNA de sentido<4 00> 113

aattaaaaag gttatctgtt gcccaagatc tcttgaatct tgggcaacag ataacc<210> 114<211> 19<212> DNA<213> Artificial<220>

<223> seqüência alvo de shDNA<4 00> 114

gatttaagcc tccctaaga<210> 115<211> 56<212> DNA<213> Artificial<220>

<223> Oligo's de DNA de sentido<400> 115

ccgggattta agcctcccta agattcaaga gatcttaggg aggcttaaat cttttt<210> 116<211> 56<212> DNA<213> Artificial<220>

<223> Antioligo's de DNA de sentido<400> 116

aattaaaaag atttaagcct ccctaagatc tcttgaatct tagggaggct taaatc

<210> 117

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> seqüência alvo de shDNA<4 00> 117

actagaatgt tgacctcga<210> 118<211> 56<212> DNA<213> Artificial<220>

<223> Oligo1S de DNA de sentido<400> 118

ccggactaga atgttgacct cgattcaaga gatcgaggtc aacattctag tttttt<210> 119<211> 56<212> DNA<213> Artificial<220>

<223> Antioligo1S de DNA de sentido<4 00> 119

aattaaaaaa ctagaatgtt gacctcgatc tcttgaatcg aggtcaacat tctagt<210> 120<211> 19<212> DNA<213> Artificial<220>

<223> seqüência alvo de shDNA<4 00> 120

ccgggtttcc ctattccaa<210> 121

<211> 56

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Oligo's de DNA de sentido<400> 121

ccggccgggt ttccctattc caattcaaga gattggaata gggaaacccg gttttt 56

<210> 12210 <211> 56

<212> DNA

<213> Artificial<220>

<223> Antioligo1S de DNA de sentido

15 <4 00> 122

aattaaaaac cgggtttccc tattccaatc tcttgaattg gaatagggaa acccgg 56

<210> 123<211> 19<212> DNA20 <213> Artificial<220>

<223> seqüência alvo de shDNA<4 00> 123

gtcaggtgcc acatgagaa 19<210> 124

<211> 56

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Oligo1S de DNA de sentido<4 00> 124

ccgggtcagg tgccacatga gaattcaaga gattctcatg tggcacctga cttttt 56

<210> 125

10 <211> 56

<212> DNA

<213> Artificial<220>

<223> Antioligo1S de DNA de sentido

15 <4 00> 125

aattaaaaag tcaggtgcca catgagaatc tcttgaattc tcatgtggca cctgac 56

<210> 126

<211> 19

<212> DNA

20 <213> Artificial<220>

<223> seqüência alvo de shDNA

<4 00> 126

caggaatgtc ctccaacca 19<210> 127

<211> 56

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Oligo1S de DNA de sentido

<400> 127

ccggcaggaa tgtcctccaa ccattcaaga gatggttgga ggacattcct gttttt 56

<210> 128

10 <211> 56

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Antioligo's de DNA de sentido

15 <4 00> 128

aattaaaaac aggaatgtcc tccaaccatc tcttgaatgg ttggaggaca ttcctg 56

<210> 129

<211> 21

<212> DNA

20 <213> Artificial<220>

<223> seqüência alvo de shDNA

<4 00> 129

ccttgggcug gcactcttat t 21<210> 130<211> 56<212> DNA<213> Artificial<220>

<223> Oligo's de DNA de sentido<400> 130

ccggccttgg gcuggcactc ttattcaaga gataagagtg ccagcccaag gttttt<210> 131<211> 56<212> DNA<213> Artificial<220>

<223> Antioligo1S de DNA de sentido<4 00> 131

aattaaaaac cttgggctgg cactcttatc tcttgaataa gagtgccagc ccaagg<210> 132<211> 19<212> DNA<213> Artificial<220>

<223> seqüência alvo de shDNA<4 00> 132

ggtagaaagt cgggacaaa<210> 133<211> 56<212> DNA<213> Artificial<220>

<223> Oligo's de DNA de sentido<400> 133

ccggggtaga aagtcgggac aaattcaaga gatttgtccc gactttctac cttttt<210> 134<211> 56<212> DNA<213> Artificial<220>

<223> Antioligo1S de DNA de sentido<4 00> 134

aattaaaaag gtagaaagtc gggacaaatc tcttgaattt gtcccgactt tctacc<210> 135<211> 19<212> DNA<213> Artificial<220>

<223> seqüência alvo de shDNA<400> 135

cttacgctga gtacttcga<210> 136

<211> 56

<212> DNA

<213> Artificial<220>

<223> Oligo1S de DNA de sentido

<400> 136

ccggcttacg ctgagtactt cgattcaaga gatcgaagta ctcagcgtaa gttttt

<210> 137

<211> 56

<212> DNA

<213> Artificial<220>

<223> Antioligo1S de DNA de sentido

<4 00> 137

aattaaaaac ttacgctgag tacttcgatc tcttgaatcg aagtactcag cgtaag

Claims (72)

1. Polipeptídeo isolado da SEQ ID NO: 2, ou um fragmento des-ta, ou uma seqüência de proteína substancialmente similar tendo identidadede seqüência de pelo menos 50% com a SEQ ID NO: 2, ou um equivalentefuncional desta, e exibindo uma atividade biológica selecionada de transpor-te de íon, difusão de íon, ativação de via de calcineurina, ativação depen-dente de cálcio de uma célula T, translocação nuclear de TORC, transloca-ção nuclear de NFAT ou atividade de expressão de gene dirigida por Ele-mento de Resposta de cAMP (CRE) da SEQ ID NO: 2 nativa.

2. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 1, tendo uma se-qüência selecionada do grupo que consiste na SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO:-15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQID NO: 20 e SEQ ID NO: 21.

3. Anticorpo ou fragmento de anticorpo que é capaz de ligar opolipeptídeo como definido na reivindicação 1 ou 2.

4. Anticorpo ou fragmento de anticorpo que especificamente seliga ao cMAC (SEQ ID NO. 2), ou um polipeptídeo que compreende uma re-gião de ligação cMAC-específica.

5. Fragmento de anticorpo como definido na reivindicação 3 ou-4, que é um fragmento de Fab ou F(ab')2.

6. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 a-5, que é um anticorpo monoclonal.

7. Molécula de ácido nucleico isolada que codifica o polipeptídeocomo definido na reivindicação 1 ou 2.

8. Molécula de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 7,que compreende a SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 11 ou SEQ ID NO: 12.

9. Molécula de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 7ou 8, adicionalmente compreendendo um promotor operavelmente ligado àmolécula de ácido nucleico.

10. Seqüência de ácido nucleico isolada selecionada de entreSEQ ID NOs 3, 4 e 5.

11. Molécula de vetor compreendendo a molécula de ácido nu-cleico de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 10.

12. Molécula de vetor de acordo com a reivindicação 11, quecompreende a seqüência de ácido nucleico de cMAC (SEQ ID NO. 1).

13. Vetor compreendendo o promotor de cMAC (SEQ ID NO: 3)operavelmente ligado a uma seqüência de ácido nucleico de proteína repór-ter.

14. Célula hospedeira compreendendo a molécula de vetor co-mo definida em qualquer uma das reivindicações 11 a 13.

15. Método para produzir o polipeptídeo como definido na reivin-dicação 1 ou 2 compreendendo cultivar a célula hospedeira tendo nela in-corporado um vetor de expressão compreendendo o vetor como definido nareivindicação 11 ou 12 sob condições suficientes para expressão do polipep-tídeo na célula hospedeira.

16. Método para produzir um polipeptídeo de cMAC da SEQ IDNO. 2 compreendendo cultivar a célula hospedeira tendo nela incorporadoum vetor de expressão compreendendo o vetor como definido na reivindica-ção 11 ou 12 sob condições suficiente para expressão do polipeptídeo nacélula hospedeira.

17. Método de tratar um distúrbio em um sujeito compreendendoadministrar ao sujeito uma quantidade eficaz de um agente que inibe a ativi-dade de cMAC.

18. Método de acordo com a reivindicação 17, em que o distúr-bio é um distúrbio associado a cMAC.

19. Método de acordo com a reivindicação 17 ou 18, em que odito agente é anticorpo, um fragmento de anticorpo ou um polipeptídeo con-tendo uma região de ligação cMAC-específica.

20. Anticorpo, fragmento de anticorpo ou polipeptídeo de acordocom qualquer uma das reivindicações 3 a 6, compreendendo uma região deligação cMAC-específica como um medicamento.

21. Uso de um anticorpo, um fragmento de anticorpo ou um poli-peptídeo compreendendo uma região de ligação cMAC-específica no trata-mento de um distúrbio em um sujeito.

22. Uso de acordo com a reivindicação 21, em que o distúrbio éum distúrbio associado a cMAC.

23. Uso de um anticorpo como definido em qualquer uma dasreivindicações 3 a 6, para a manufatura de um medicamento para o trata-mento de um distúrbio associado a cMAC.

24. Método de tratar um distúrbio em um sujeito compreendendoadministrar ao sujeito uma quantidade eficaz de um agente que inibe a ex-pressão de cMAC.

25. Método de acordo com a reivindicação 24, em que o distúr-bio é um distúrbio associado a cMAC.

26. Método de acordo com a reivindicação 24 ou 25, em que odito agente é um ácido nucleico inibidor capaz de especificamente inibir aexpressão de cMAC.

27. Método de acordo com a reivindicação 26, em que o dito á-cido nucleico inibidor é selecionado de entre o grupo que consiste em umoligonucfeotídeo antissenso, um agente de RNAi, e uma ribozima.

28. Método de acordo com a reivindicação 27, em que o agentede RNAi é selecionado de entre o grupo que consiste em dsRNA, siRNA, eshRNA.

29. Método de acordo com a reivindicação 28, em que o agentede RNAi compreende pelo menos um ácido nucleico selecionado do grupoque consiste na SEQ ID NO: 22 a SEQ ID NO: 101, e SEQ ID NO: 106, SEQID NO: 107, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 112, SEQ IDNO: 113, SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO:-119, SEQ ID NO: 121, SEQ ID NO: 122, SEQ ID NO: 124, SEQ ID NO: 125,SEQ ID NO: 127, SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO: 131, SEQID NO: 133, SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 136, e SEQ ID NO: 137.

30. Agente de RNAi que compreende ρβΤσ menos um ácido nu-cleico selecionado do grupo que consiste na SEQ ID NO: 22 a SEQ ID NO:-101, e SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO:-110, SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 116,SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 121, SEQ ID NO: 122, SEQID NO: 124, SEQ ID NO: 125, SEQ ID NO: 127, SEQ ID NO: 128, SEQ IDNO: 130, SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO:-136, e SEQ ID NO: 137.

31. Agente de RNAi específico para cMAC selecionado de entreo grupo que consiste em dsRNA, siRNA, e shRNA como um medicamento,em que o agente de RNAi compreende pelo menos um ácido nucleico sele-cionado do grupo que consiste na SEQ ID NO: 22 a SEQ ID NO: 101, e SEQID NO: 106, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 110, SEQ IDNO: 112, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO:-118, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 121, SEQ ID NO: 122, SEQ ID NO: 124,SEQ ID NO: 125, SEQ ID NO: 127, SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO: 130, SEQID NO: 131, SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 136, e SEQ ID NO: 137.

32. Uso de um agente de RNAi ou siRNA específico para cMACno tratamento de um distúrbio em um sujeito.

33. Uso de acordo com a reivindicação 32, em que o distúrbio éum distúrbio associado a cMAC.

34. Uso do agente de RNAi como definido na reivindicação 31,para a manufatura de um medicamento para o tratamento de um distúrbioassociado a cMAC.

35. Método de tratar um distúrbio em um sujeito compreendendoadministrar ao sujeito uma quantidade eficaz de um agente que intensifica aatividade de cMAC.

36. Método de tratar um distúrbio em um sujeito compreendendoadministrar ao sujeito uma quantidade eficaz de um agente que aumenta aexpressão de cMAC.

37. Método de acordo com a reivindicação 36, em que o dito a-gente é um intensificador de transcrição de gene de cMAC.

38. Método de acordo com a reivindicação 36, em que o dito a-gente é um vetor de terapia de gene que compreende um ácido nucieico quecodifica cMAC ou um fragmento deste.

39. Método de acordo com a reivindicação 38, em que o dito a-gente é um vetor como definido na reivindicação 11 ou 12.

40. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 36a 39, em que o distúrbio é um distúrbio associado a cMAC.

41. Composição farmacêutica compreendendo uma quantidadeeficaz de um agente que inibe a expressão de cMAC ou inibe uma atividadede cMAC, e um veículo farmaceuticamente aceitável.

42. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 41,em que o agente é um oligonucleotídeo antissenso ou um agente de RNAi.

43. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 42,em que o agente de RNAi compreende pelo menos um ácido nucieico sele-cionado do grupo que consiste na SEQ ID NO: 22 a SEQ ID NO: 101, e SEQID NO: 106, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 110, SEQ IDNO: 112, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO:-118, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 121, SEQ ID NO: 122, SEQ ID NO: 124,SEQ ID NO: 125, SEQ ID NO: 127, SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO: 130, SEQID NO: 131, SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 136, e SEQ IDNO: 137.

44. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 41,em que o agente é um anticorpo um fragmento de anticorpo que especifica-mente se liga ao cMAC, ou um polipeptídeo que compreende uma região deligação cMAC-específica.

45. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 44,em que o anticorpo é o anticorpo como definido em qualquer uma das rei-vindicações 3 a 6.

46. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 44ou 45, em que o agente se liga a um epítopo de cMAC selecionado de entreas SEQ ID NO. 6, 7, 8, 9, 10.

47. Método de tratar um distúrbio em um sujeito compreendendoadministrar ao sujeito uma quantidade eficaz de uma composição farmacêu-tica de um agente que inibe a atividade de cMAC.

48. Método de acordo com a reivindicação 47, em que o distúr-bio é um distúrbio associado a cMAC.

49. Método de acordo com a reivindicação 47 ou 48, em que odito agente é anticorpo ou fragmento deste que especificamente se liga aocMAC (SEQ ID NO: 2) ou um polipeptídeo que compreende uma região deligação cMAC-específica.

50. Método de acordo com a reivindicação 49, em que o anticor-po é o anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações 3 a 6.

51. Método de acordo com a reivindicação 49, em que o agentese liga a um epítopo de cMAC selecionado de entre SEQ ID NOs. 6, 7, 8, 9 e 10.

52. Método de tratar um distúrbio em um sujeito compreendendoadministrar ao sujeito uma quantidade eficaz de uma composição farmacêu-tica de um agente que inibe a expressão de cMAC.

53. Método de acordo com a reivindicação 52, em que o dito a-gente é um ácido nucleico inibidor capaz de especificamente inibir expressãode cMAC.

54. Método de acordo com a reivindicação 53, em que o dito á-cido nucleico inibidor é selecionado de entre o grupo que consiste em umoligonucleotídeo antissenso, um agente de RNAi, e uma ribozima.

55. Método de acordo com a reivindicação 54, em que o agentede RNAi é selecionado de entre o grupo que consiste em dsRNA, siRNA, eshRNA.

56. Método de acordo com a reivindicação 55, em que o agentede RNAi compreende pelo menos um ácido nucleico selecionado do grupoque consiste na SEQ ID NO: 22 a SEQ ID NO: 101, e SEQ ID NO: 106, SEQID NO: 107, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 112, SEQ IDNO: 113, SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO:-119, SEQ ID NO: 121, SEQ ID NO: 122, SEQ ID NO: 124, SEQ ID NO: 125,SEQ ID NO: 127, SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO: 131, SEQID NO: 133, SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 136, e SEQ ID NO: 137.

57. Método para identificar um composto útil para o tratamentode um distúrbio associado a cMAC compreendendo:(a) contatar um composto de teste com cMAC; e(b) detectar uma alteração de uma atividade biológica de cMACcomparada a cMAC não-contatado com o composto de teste,em que a detecção de uma alteração identifica o dito compostode teste como útil para o tratamento do dito distúrbio.

58. Método de identificar um composto útil para o tratamento deum distúrbio associado a cMAC compreendendo:(a) contatar um composto de teste com cMAC sob condições deamostra permissivas para atividade biológica de cMAC;(b) determinar o nível de uma atividade biológica de cMAC;(c) comparar o dito nível ao de uma amostra de controle despro-vida do dito composto de teste; e,(d) selecionar um composto de teste que leva o dito nível a alte-rar para outra testagem como um agente potencial para tratamento do ditodistúrbio.

59. Método de acordo com a reivindicação 57 ou 58, em que adita alteração é uma redução de tal atividade biológica.

60. Método de acordo com as reivindicações 57 a 59, em que adita atividade biológica é selecionada de entre transporte de íon, difusão deíon, interação de proteína-cMAC ou modificação de cMAC, ativação depen-dente de cálcio de uma célula T, translocação nuclear de TORC, e expres-são de gene dirigida por Elemento de Resposta de cAMP (CRE).

61. Método para testar se um composto modula uma atividadebiológica de cMAC compreendendo:(a) contatar um composto de teste com cMAC; e(b) detectar uma alteração de uma atividade biológica de cMACcomparada a cMAC não-contatado com o composto de teste,em que a detecção de uma alteração identifica o dito compostode teste como um modulador de atividade biológica de cMAC.

62. Método para identificar moduladores úteis para tratar um dis-túrbio compreendendo avaliar quanto à capacidade de um modulador candi-dato para inibir a atividade de uma proteína de cMAC.

63. Método para identificar moduladores úteis para tratar um dis-túrbio compreendendo avaliar quanto à capacidade de um modulador candi-dato para inibir a expressão de uma proteína de cMAC.

64. Composto identificado por um método como definido emqualquer uma das reivindicações 57 a 63.

65. Método para identificar um composto útil para o tratamentode um distúrbio associado a cMAC compreendendo administrar um compos-to identificado por um método de acordo com a reivindicação 65 a um mode-lo animal do dito distúrbio associado a cMAC.

66. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 18,-25, 40, 57 a 60, ou 65 ou o uso como definido na reivindicação 22, 23, 33 ou-34, em que o distúrbio associado a cMAC é selecionado de entre o grupoque consiste em doença autoimune, imunossupressão, doença inflamatória,câncer, doença cardiovascular e doença neurológica.

67. Método de inibir atividade biológica de cMAC em uma célulacompreendendo contatar uma célula com um anticorpo de anti-cMAC ou frag-mento deste, com um polipeptídeo que compreende uma região de ligaçãocMAC-específica ou com um ácido nucleico que reduz a expressão de cMAC.

68. Método de acordo com a reivindicação 67, em que a dita ati-vidade biológica é selecionada de entre o grupo que consiste em ativaçãodependente de cálcio de uma célula T, translocação nuclear de TORC,translocação nuclear de NFAT e expressão de gene dirigida por Elemento deResposta de cAMP (CRE).

69. Método de seletivamente inibir atividade de linfócito em umorganismo multi-celular compreendendo contatar o dito organismo com umanticorpo de anti-cMAC ou fragmento deste, com um polipeptídeo que com-preende uma região de ligação cMAC-específica ou com um ácido nucleicoque reduz a expressão de cMAC.

70. Método de intensificar ativação de células T compreendendocontatar uma célula T ou uma célula de precursor de células T com um poli-peptídeo de cMAC purificado, um vetor de terapia de gene que compreendeo gene de cMAC, ou um intensificador de expressão de gene de cMAC.

71. Método de acordo com a reivindicação 70, em que o polipep-tídeo de cMAC é o polipeptídeo como definido na reivindicação 1 ou 2.

72. Método de acordo com a reivindicação 70, em que o vetor deterapia de gene que compreende o gene de cMAC é o vetor como definidona reivindicação 11 ou 12.