BRPI0616708A2

BRPI0616708A2 - métodos para diferenciar células-tronco e uso das mesmas no tratamento de condições dentárias

Info

Publication number: BRPI0616708A2
Application number: BRPI0616708-0A
Authority: BR
Inventors: Kurt Osther; Christian Clausen; Klaus Riskaer Pedersen
Original assignee: Copygene As
Priority date: 2005-09-30
Filing date: 2006-09-28
Publication date: 2011-06-28
Also published as: KR20080056280A; WO2007036232A1; CN101316926A; US20080253999A1; JP2009509512A; DE602006020303D1; ATE499435T1; RU2008117147A; EP1934332B1; EP1934332A1

Abstract

MéTODOS PARA DIFERENCIAR CéLULAS-TRONCO E USO DAS MESMAS NO TRATAMENTO DE CONDIçõES DENTáRIAS. A presente invenção refere-se a um método para propagar e/ou diferenciar células de mamíferos, o método compreendendo expor ou cocultivar células de mamíferos com um ou mais entre tecido de ligamento periodontal, proteínas de ligamento periodontal ou fatores derivados de tecido de ligamento periodontal, para obter células tendo características de PDL e satisfazendo no mínimo um dos seguintes: i) apresentar características periodontais conforme evidenciado com o método de Von Kossa no qual depósitos de fosfato de cálcio são corados de marrom a preto, ii) apresentar aumento de osteopontina e osteocalcina e ao mesmo tempo reduzida sialoproteina óssea (sialoproteina óssea II ou BSP), iii) serem capazes de serem implantadas para reparar e/ou regenerar tecido periodontal, iv) serem capazes de reparar distúrbios tais como paradentite também denominada paradentose, ou periodontite por cicatrização da linha gengival em direção aos dentes, e v) serem aceitas pelo hospedeiro sem significativa reação imune ou rejeição celular.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MÉTODOSPARA DIFERENCIAR CÉLULAS-TRONCO E USO DAS MESMAS NOTRATAMENTO DE CONDIÇÕES DENTÁRIAS".

Campo da Invenção

A presente invenção refere-se a um novo conceito e métodospara produzir células mamíferas diferenciadas, as quais podem ser implan-tadas para o reparo de periodontite, e outras condições dentais, onde estascélulas têm características e comportamento como células-tronco de Iiga-mento periodontal diferenciadas (por exemplo, PDLCs) ou células de Iiga-mento periodontal (PDLs). As PDLs conectam o cemento da raiz com o ossoalveolar, e são importantes para cicatrização de ferida periodontal.

Antecedentes da invenção

Foi sugerido que a medula óssea é um grupo predominante deuma "reserva de células-tronco ", contendo não somente células-troncohemopoiéticas (HSC)1 mas também células-tronco endoteliais e mesenqui-mais (ESC, MSC). É uma das áreas alvo englobadas nesta invenção paraobter material celular para ser diferenciado tanto em uma célula autólogaapropriada e/ou uma célula alogênica apropriada que tenha sido transforma-da em um tipo celular capaz de ser transplantado em um receptor sem serrejeitada ou causando uma reação enxerto versus hospedeiro.

Por exemplo, é concebível que entre outros tipos celular que po-dem ser transformdados, por exemplo, por transdiferenciação, por exemplo,co-cultivando, como por exemplo, as células sendo co-cultivadas com tecidode Iigamento periodontal ou fatores derivados do tecido de Iigamento perio-dontal, quaisquer osteoblásticos mesenquimais, ou mesmo precursores eprogenitores de linhagens osteoblásticas ou fibroblásticas podem ser usadospara produzir células PDL.

Processos, composições e usos de células hematopoiéticas fo-ram descritos previamente. Células hematopoiéticas são células, as quaispodem se diferenciar em células sangüíneas maduras quando co-cultivadascom osteoblastos. Especificamente, um processo para propagar e manter amorfologia imatura de uma célula hematopoiética co-cultivando as célulascom osteoblastos conforme descrito na patente dos Estados Unidos No.5733541.

Os osteoblastos proporcionam citocinas e/ou um microambienteo qual propaga e mantém a morfologia imatura de uma célula hematopoiéti-ca. Células hematopoiéticas são úteis no tratamento de alguns distúrbiosrelacionados com sangue e são úteis para tratamento de pacientes que ne-cessitem de células hematopoiéticas.

Um dos objetivos desta presente invenção é de fato não mantera morfologia imatura de células hematopoiéticas, mas ao invés transdiferen-ciar células-tronco mesenquimais (tal como, por exemplo, células-troncomesenquimais do cordão umbilical ou sangue do cordão umbilical), osteo-blastos e células de linhagens semelhantes, por exemplo, por exposição a,ou co-cultivadas em tecido de Iigamento periodontal ou fatores de tecido deIigamento periodontal, de modo a obter uma célula-tronco mesenquimalcom características tais como apresentando aumento da expressão de oste-opontina e de osteocalcina, e ao mesmo tempo, apresentando redução daexpressão de sialoproteína óssea (BSP) resultando em uma população celu-lar semelhante ou células PDL semelhantes. Seria muito incomum em qual-quer célula mesenquimal diferente de células de Iigamento periodontal oucélulas-tronco de Iigamento periodontal.

Injeção de células progenitoras adultas multipotentes

Depois de injeção de células progenitoras adultas multipotentesúnicas em blastocistos iniciais, foi visto que as células contribuem para amaioria dos tipos de células somáticas de todas as 3 camadas embrionárias.Além disso, células precursoras hematopoiéticas derivadas da medula ósseaparecem estar presentes em tecidos não hematogênicos, tal como por e-xemplo, tecido muscular conforme descrito por McKinney-Freeman et al.(McKinney-Freeman SL1 Jackson, KA, et al., PNAS USA (2002) 99:1341).

Células semelhantes a osteoblastos foram observadas dentro decamadas estromais e partilham várias características fenotípicas com linha-gens de células estromais (Benayahu D et al., Calcif Tissue Int. (1992),51:195-201; Benayahu D et al., Calcif Tissue Int. (1991), 49:202-207; Mathi-eu E et al., Calcif Tissue Int. (1992), 50:362-371). Por exemplo, as linhagensde células estromais da medula óssea murina BMS2 partilham uma série demarcadores osteoblásticos inclusive alto teor de fosfatase alcalina, colágeno(I) e osteopontina bem como um aumento na sialoproteína óssea (BSP), quenão é característico de uma célula-tronco de Iigamento periodontal ou célu-las de Iigamento periodontal. Além disso, RNAm para osteocalcina, uma pro-teína específica dos osteoblastos, também foi detectado em células BMS2,uma linhagem de células estromais murinas, também apresentando aumentoda expressão de sialoproteína óssea, também denominada sialoproteína óssea Il pr (BSP) (Dorheim MA et al., J Cell Physiol. (1993)154:317-328); deacordo com Dorheim et al., mesmo pré-adipócitos e adipócitos podem apre-sentar estas características osteoblásticas.

Em uma série de experimentos usando várias linhagens de célu-las estromais, Benayhu et al descobriram que todos os tipos celulares exa-minados (MBA-1: fibroblastos, MBA-2 endotelial-semelhante, MBA-13 fibro-endotelial, pré-adipócito clonado 13F1.1, MBA-15 osteoblástico) possuemalgumas características osteoblásticas, mas diferiram no grau de expressão(Benayahu D et al., Calcif Tissue Int. (1992), 51:195-201; Benayahu D et al.,Calcif Tissue Int. (1991), 49:202-207). Foi visto que proteína-2 morfogênicassea humana recombinante induz diferenciação osteoblástica na linhagemde células estromais murinas W-20-17; e experimentos de transplantação demedula ectópica demonstram claramente que osso e estroma de medulaóssea recém formada são derivados do doador, leucócitos são de origem dohospedeiro (Reddi AH1 Coll Relat Res. (1981)1:209-226; Kataoka H, UristMR, Clin Orthop Relat Res. (1993), 286:262-270).

Evidência adicional de uma ligação funcional entre células pro-genitoras hematopoiéticas e osteoblastos é proporcionada por observaçõesde que células osteoprogenitoras se originam da medula óssea. Vários in-vestigadores demonstraram que tanto células estromais da medula ósseaprimárias quanto transformadas podem adquirir o fenótipo osteoblástico umavez que é observada formação óssea in vivo depois de implantação destascélulas em câmaras de difusão (Grigoriadis et al. J Cell Biol. (1988)106:2139-51). A incubação in vitro de células da medula óssea de baixadensidade não aderentes em condições livres de soro também pode desen-volver em células semelhantes a osteoblastos, as quais podem mineralizarsua matriz extracelular (Long et al., 1990 and Campbell et at., 1987).

A literatura acima descreve essencialmente o osteoblasto comouma fonte de células estimuladoras produzindo citocinas e outros fatoresque podem auxiliar na estimulação particular de linhagens hematopoiéticas.

No entanto, o âmbito desta invenção, está criar um tipo celularútil essencialmente para a restauração de doenças dentais (tal como perio-dontite) tal como células PDL ou células com características de PDL que oupodem ser de origem alogênica, maduras ou imaturas, mas preferencialmen-te não mais abaixo na linhagem do que o nível do cordão umbilical ou san-gue do cordão umbilical. Na realidade qualquer célula mesenquimal que po-de ser transdiferenciada, por exemplo, co-cultivando uma combinação deuma célula-tronco de Iigamento periodontal humano e ou uma célula-troncooriginada do cordão umbilical ou da medula óssea. Alternativamente, qual-quer célula mesenquimal ou célula-tronco para a finalidade de ser usadacomo uma PDL ou PDLC pode ser isolada e cultivada a partir dos Iigamen-tos periodontais dos dentes molares ou de dentes do siso.

Sumário da Invenção

Em um aspecto, a presente invenção proporciona um processopara propagar ou células PDL colhidas diretamente dos dentes, como porexemplo, para uso autólogo, ou, idealmente, uma célula mesenquimal quenão será rejeitada quando implantada dentro da cavidade oral, mais especi-ficamente dentro da região periodontal, e ainda mais especificamente dentroda área dental para a fixação e ou restauração de dentes, e a área periodon-tal dos dentes, especialmente usando células de tipos mesenquimais e maisespecificamente da célula semelhante a PDL ou PDLC ou uma célula trans-formada para uma PDL ou PDLC. Este processo pode ser iniciado co-cultivando células-tronco ou precursoras derivadas do Iigamento periodontalcom células-tronco mesenquimais do cordão umbilical e/ou do sangue docordão umbilical, e visualizado do ponto da expressão de algumas proteínas,resultando em algumas células mesenquimais tendo as capacildades refe-rentes a expressão de proteínas tais como no mínimo HLA-DR positivas(HLA-DR+), CD-34 negativas (CD-34 -), Lin positivas (Lin +), Thy-1 positivas(Thy-1+), Stro-1 positivas (Stro-1 +), CD13 positivas, CD44 positivas, CD90positivas, CD73 positivas e provavelmente também CD146/MUC 18 positivas(CD146/MUC 18 +). Estas células-tronco ou progenitoras podem ser menosimunogênicas para um receptor devido ao fato de que também são célulasmultipotenciais ou células-tronco mesenquimais ou progenitoras derivadasdo cordão umbilical ou de sangue do cordão umbilical.

Descrição da invenção

A presente invenção se refere a um novo conceito e métodospara obter linhagens de células mesenquimais mamíferas que têm caracte-rísticas de células PDL. As células obtidas são e continuarão a ser HLA-DRpositivas (HLA-DR+), CD-34 negativas (CD-34 -), Lin-1 positivas (Lin-1 +),Thy-1 positivas (Thy-1+), STRO-1 positivas (STRO-1 +), CD13 positivas,CD44 positivas, CD90 positivas, CD73 positivas e provavelmente tambémCD146/MUC 18 positivas (CD146/MUC 18 +). Estas células são preferenci-almente células de Iigamento periodontal, ou imaturas do tipo células-troncode ligamento periodontal ou preferencialmente do tipo células-tronco de Ii-gamento periodontal humanas (hPDLCs) ou células estromais ou mesen-quimais imaturas de sangue do cordão ou preferencialmente de sangue docordão humano, por exemplo, obtidas por co-cultura, por exemplo, co-cultivadas junto com tecido de ligamento periodontal ou fatores de tecido deligamento periodontal. As células também podem ser de origem osteogênicaque quando expostas a ou cultivadas em tecido de ligamento periodontal oufatores deste tecido, apresentariam características de células PDL. Célulasde ligamento periodontal e/ou células-tronco de ligamento periodontal emteoria podem ser caracterizadas pela expressão de osteocalcina e osteopon-tina e o mais provavelmente por uma redução da expressão ou mesmo faltade expressão de sialoproteína óssea, de modo diverso normalmente obser-vada em culturas celulares osteogênicas e em condrogênicas.

As células tendo características de PDL são adequadas parauso para a restauração ou o tratamento de distúrbios dentais especialmenteperiodontite.

De modo a obter uma regeneração periodontal previsível, sãoessenciais adesão seletiva e proliferação de células PDL. Estes tipos de cé-lulas podem reparar tanto Iigamentos periodontais prejudicados (por exem-plo, periodontite e distúrbios semelhantes) quanto ao mesmo tempo, por e-xemplo, produzir cemento ligando o tecido fibroso com o osso e podem sercapazes de tratar defeitos periodontais, deste modo reestabelecendo a ade-são de dentes em perigo de serem perdidos devido a periodonte.

De acordo com esta invenção, estas células PDL, as quais es-sencialmente são as células especializadas, as quais serão a matéria-primapara a cultura celular que pode ser usada para a restauração descrita acima,tal como por exemplo, periodontite, e etc. Logicamente seria preferencial, seestas células fossem autólogas, significando colhidas dos dentes, tal como odente do siso ao mesmo tempo que é extraído (de modo que as células po-dem ser colhidas imediatamente em combinação com a extração ou o denteextraído pode ser enviado ao laboratório em Meio de transporte dentro de,por exemplo, 24 horas e as células PDL podem ser colhidas e ou cultivadasimediatamente ou congeladas em tanque de nitrogênio líquido para uso posterior.

Pode ser possível que outras células possam ser usadas para omesmo fim tal como osteoblastos autólogos ou alogênicos, colhidas ou doosso maxilar ou de outra estrutura óssea sobre o paciente. Estas célulasprecursoras mesenquimais ou células progenitoras, também podem ser usa-das para a finalidade de reparar periodontite, e etc. Ainda outro grupo decélulas, as quais podem ser derivadas de uma célula-tronco mesenquimalmultipotente originada do cordão umbilical ou do sangue do cordão umbilical,a qual ou pode ser derivada como uma célula autóloga (tirada de sangue docordão umbilical armazenado e usado para - posteriormente na vida - repa-rar periodontite em um paciente que doou seu sangue do cordão umbilicalna ocasião do parto. Ou estas células-tronco mesenquimais multipotentesdo cordão umbilical de outros indivíduos podem apresentar menor tendênciaa serem imunogênicas, e portanto úteis como células "doadoras" para repa-rar periodontite e etc. Quando as células referidas são usadas elas foramsubmetidas a um processo de co-cultura, em que as células foram expostasa ou cultivadas junto com um ou mais entre tecido de ligamento periodontal,proteínas de ligamento periodontal ou fatores derivados de tecido de liga-mento periodontal de modo a obter características de PDL.

Estaria dentro do âmbito desta invenção que se pode co-cultivarcélulas adequadas para agir como células PDL ou PDLCs com outras célu-las precursoras mesenquimais mamíferas (por exemplo, quaisquer células-tronco mesenquimais mamíferas tais como células precursoras mesenqui-mais adultas, as células PDL também podem, de acordo com esta invenção,1,1 por exemplo, ser co-cultivadas com células-tronco mesenquimais multipo-tentes, por exemplo, as células-tronco referidas originadas do cordão umbi-lical ou de sangue do cordão umbilical, e desta maneira, pode-se obter umacélula co-cultivada adequada para uso na restauração de periodontite, e etc.

De modo a obter uma população de células-tronco de ligamentoperiodontal, pode-se co-cultivar as células-tronco mesenquimais com tecidode ligamento periodontal, proteínas de ligamento periodontal, ou fatores detecido de ligamento periodontal com ou sem o conteúdo de células periodon-tais presente, ou pode ser ao invés primeiro eliminando a presença de célu-las viáveis no tecido de ligamento periodontal colhidas a serem adicionadasao meio de cultura no qual as células mesenquimais devem ser cultivadaspara diferenciar ou transdiferenciar em células PDL. É previsto que a culturapode variar de uma exposição de curta duração das células ao tecido de Ii-gamento periodontal ou proteínas, até uma completa expansão de uma cul-tura celular em meio de cultura que no mínimo contém tecido de Iigamentoperiodontal, proteínas de ligamento periodontal ou fatores do mesmo duran-do várias semanas até ter sido obtida uma quantidade suficiente de células.

Esta metodologia de cultura celular pode ser usada sobre células-troncomesenquimais derivadas do cordão umbilical e/ou do sangue do cordão um-bilical. Deste modo células-tronco mesenquimais do cordão umbilical ou dosangue do cordão umbilical, junto com tecido de ligamento periodontal, pro-teínas de Iigamento periodontal e/ou fatores derivados do mesmo, podeminduzir células-tronco mesenquimais para obter características semelhantesa Iigamento periodontal e deste modo ser útil como implantes celulares comou sem um matriz biológica ou artificial (scaffold) na aplicação clínica parareparar e regenerar tecido periodontal.

Matéria-prima - células mesenquimais mamíferas

As células PDL bem como as células tronco mesenquimais - ouprecursoras de quaisquer das combinações acima podem ser diferenciadaspara PDLs ou PDLCs sendo expostas estas células e/ou co-cultivando asmesmas com tecido de Iigamento periodontal ou fatores derivados de Iiga-mento periodontal, os quais podem induzir as células precursoras, ou evitarque células tais como PDLs desdiferenciem.

Portanto deve ser entendido e está dentro do âmbito desta in-venção que os tipos celulares descritos acima, podem, quando expostas a,co-cultivadas com e/ou induzidas por tecido de Iigamento periodontal ou fa-tores derivados de Iigamento periodontal ser diferenciadas ou transdiferenci-adas para PDLs ou PDLCs, - ou caso no início de fato forem PDLs, estascélulas não des-diferenciariam. O mesmo tecido de Iigamento periodontalcolhido ou fatores derivados deste tecido podem, quando usados no meio,quando usando o meio para co-cultivar células-tronco mesenquimais do cor-dão umbilical, resultar em PDLs ou células tendo as mesmas capacidadesque PDLs, para permitir o uso das mesmas para o tratamento de periodonti-te, e etc.

Usando os métodos descrito acima, pode-se permitir que os in-ventores cultivem osteoblastos ou progenitores de células osteogênicas,como por exemplo, obtidas por explantação de biópsias de um mamífero,por exemplo, do osso, especialmente estruturas ósseas obtidas do pacientea serem desenvolvidas para PDLs ou células com comportamento de PDLpara o tratamento de periodontite posteriormente na vida do paciente, signi-ficando desta maneira utilizar uma metodologia de implantação de célulasautólogas, quando não se tem acesso a culturas primárias de PDLs.

Tecidos de Iigamento periodontal usado no meio de cultura celular como in-dutor de PDL.

Fonte de tecido de Iiaamento periodontal

A fonte de tecido de Iigamento periodontal, proteínas de Iiga-mento periodontal e/ou fatores derivados de Iigamentos periodontais podeser de origem autóloga, alogênica ou xenogênica (por exemplo, dentes por-cinos extraídos ou arrancados). No entanto, é previsto que o processamentode ou células de Iigamento periodontal, o Iigamento periodontal ou fatoresdevem ser colhidos e processados, enquanto o tecido ainda está viável enão sofreu desintegração de quaisquer dos ingredientes necessários reque-ridos para obter e possivelmente para manter as células cultivadas comoPDLs ou PDLCs ou células expressando as próprias como PDLs ou PDLCs.

"Sugestões para tratamento do tecido periodontal são descritas em "Coleta epreservação de tecido periodontal".

O Iigamento periodontal a ser usado no meio de cultura para in-duzir "efeito de PDL" nas células cultivadas em questão, pode ser colhidopor exemplo, de dentes molares ou de dentes do siso. Deste modo, o Iiga-mento periodontal pode ser ou colhido junto com as células PDL já incorpo-radas no Iigamento periodontal, ou o tecido de Iigamento periodontal podeser exaurido destas células, e consistir em tecido de Iigamento periodontal,ou mesmo ser fatores derivados de tecido de Iigamento periodontal para usofuturo em cultura de células PDL ou nas tentativas de transdiferenciar asoutras células mesenquimais descritas acima para serem PDLs.

Este "tecido de Iigamento periodontal", o qual de acordo comesta invenção pode ser definido como uma mistura indutora para adicionar auma cultura de células PDL ou a uma cultura de células mesenquimais (quese pretende que sejam usadas como células PDL). Este pode ser armaze-nado congelado (por exemplo, em um tanque de nitrogênio), ou uso podeser usado diretamente misturado junto com um meio de crescimento ade-quado (meio de cultura) no qual as células devem ser cultivadas para os finsde evitar que as células PDL des-diferenciem para outras células não PDL,bem como diferenciar ou transdiferenciar outras células selecionadas parase transformarem em ou se assemelharem a PDLs ou PDLCs. A composi-ção do meio referido contendo o tecido de ligamento periodontal ou fatoresde ligamentos periodontais por conseguinte pode ser usado como meio decrescimento, o qual manterá células PDL e deste modo evitar des-diferenciação ou "derivação" celular.

Conforme descrito previamente este tecido de Iigamento perio-dontal, (por exemplo, exaurido de células), também pode ser coletado, ca-racterizado e reunido, ou ser usado junto com meio de cultura para cultivarcélulas mesenquimais de modo a induzir características de células PDL re-sultando na referida população celular que pode ser caracterizada comouma célula de Iigamento periodontal ou uma célula precursora do tipo referi-do. As características de células PDL obtidas, por exemplo, por diferencia-ção de células mesenquimais pelo uso indutivo do tecido de Iigamento peri-odontal podem ser demonstradas mostrando que as referidas células PDLou semelhantes a PDL apresentarão aumento de expressão de osteopontinae osteocalcina e expressão reduzida de sialoproteína óssea (expressão re-duzida de BSP), também denominada sialoproteína óssea II.

Coleta e preservação de tecido periodontal

De modo a utilizar tecido periodontal nas quantidades que po-dem ser necessárias para a indução, transdiferenciação ou transformaçãode células mesenquimais para produzir células de Iigamento periodontal oucélulas que podem se comportar como células de Iigamento periodontal, po-de ser necessário preparar um sistema logístico para manter vivas célulasdos dentes extraídos (por exemplo, dentes do siso extraídos coletados devárias clínicas dentais) bem como evitando que o tecido periodontal dos den-tes extraídos desintegrem, o mais provavelmente significando que os dentesextraídos são mantidos vivos e em condições assépticas para prevenir con-taminação microbiana (a contaminação microbiana pode ser mantida em ummínimo usando tantos métodos assépticos quanto possível e adicionar quan-tidades suficientes de antibióticos e antifúngicos presentes no transporte oumeio de cultura usado para armazenamento). Sigalas et al. recentementetestaram métodos para manter as células de dentes extraídos vivos. Muitassoluções foram examinadas como meios de armazenamento possíveis paradentes extraídos. Sigalas et al recentemente reportaram que quanto célulasde ligamento periodontal humano (PDL) foram expostas por 1 h a meio decultura, leite, Solução Salina Balanceada de Hank (HBSS), soluções paralente de contato Soft Wear, Opti Free, e Solo Care, Gatorade, e água corren-te, em temperatura ambiente e sobre gelo. O número de células viáveis foicontado usando a técnica de exclusão de azul de tripano, imediatamentedepois de exposição (O h) e em 24 e 48 h, a capacidade proliferativa dascélulas foi testada depois de tratamento (Sigalas E, Regan JD et al. Dent.Traumatol. (2004) 20:21-28). Este estudo mostrou que foi visto que SoluçãoSalina Balanceada de Hank HBSS é o meio de armazenamento ótimo paradentes extraídos. É concebível que muitos outros tipos de meio de culturacom ou sem a adição de tecido de ligamento periodontal presente desde oinício, e o mais provavelmente contendo proteínas séricas. Os dentes, ascélulas relacionadas com Iigamento periodontal ou o tecido de Iigamentoperiodontal podem ser congelados em um tanque de nitrogênio.

A maneira para estabelecer que células não se diferenciaram emPDL ou que células PDL se des-difenciaram ou derivaram a sialoproteínaóssea (também denominada sialoproteína óssea II ou BSP) será aumentadae de fato demonstram que as células cultivadas de fato são osteoblastos ecertamente não-células PDL. Na realidade, quando a sialoproteína II ou BSPpuder ser identificada (ou demonstrado que aumenta) se estará ciente deque a cultura de células PDL foi mudada para células osteogênicas (por e-xemplo, osteoblastos e células mesenquimais não PDL- ou não PDLC- dife-renciadas (Fisher LW1 McBride OW, et al. J. Biol. Chemistry (1990),265:2347-2351). A proteína BSP codificada por este gene é uma proteínaestrutural importante da matriz óssea. Constitui cerca de 12% das proteínasnão-colagenosas em osso humano e é sintetizada por tipos celulares asso-ciados com o esqueleto, inclusive condrócitos hipertróficos, osteoblastos,osteócitos, e osteoclastos. Esta proteína liga a cálcio e hidroxiapatita atravésde seus clusters de aminoácidos acidíferos, e media a fixação celular atra-vés de uma seqüência RGD que reconhece o receptor de vitronectina. Ogene de BSP também é identificado como gene ID: 3381 e expressa sialo-proteína de ligação de integrina (sialoproteína óssea, também denominadasialoproteína óssea II, abreviada para IBSP). Foi descoberto previamentepor análise Affymetrix Gene Chip que a expressão de receptor de vitronecti-na também é apresentada em condrócitos tanto de pacientes com Osteoar-trite quanto de pacientes não-osteoartríticos (próprias observações). No en-tanto, esta expressão ainda não foi testada em PDLs ou PDLCs.

Também está dentro do âmbito desta invenção que as célulasimplantadas para a restauração periodontal e/ou restauração dental podemser células-tronco mesenquimais autólogas, células precursoras ou progeni-toras como, por exemplo, colhidas como células-tronco ou precursoras deáreas periodontais ou um ou mais Iigamentos periodontais, ou mesmo célu-las mesenquimais originadas de biópsias do osso maxilar podem ser dife-renciadas para PDLs quando expostas a tecido de Iigamento periodontal.

Portanto em teoria e de fato na prática pode-se usar a tecnologia de culturade explante para expandir células mesenquimais ou de preferência osteo-blastos ou precursores dos mesmos para produzir células PDL. Estas célu-las PDL podem ser então usadas para implantação no paciente para repararperiodontite, e etc.

Pode-se esperar que estas células posteriormente se diferenci-em em células mesenquimais mamíferas, as quais podem ser englobadasde preferência no processo complexo, produzindo uma identidade celularque se assemelha a linhagens de células mesenquimais mamíferas, asquais podem ser identificadas continuando a ser no mínimo HLA-DR positi-vas (HLA-DR+), CD-34 negativas (CD-34 -), Lin-1 positivas (Lin-1 +), Thy-1positivas (Thy-1+) e Stro-1 positivas (Stro-1 +), CD13 positivas, CD44 positi-vas, CD90 positivas, CD73 positivas e possivelmente, positivas para outraproteína, CD146/MUC18, porém negativas para CD31 (um marcador hema-topoiética).

Está dentro do âmbito desta invenção chegar a um ou váriostipos de células mamíferas que podem ser transplantadas em mamíferosincluindo seres humanos sem causar rejeição das células transplantadas ouimplantadas ou produzir uma rejeição "enxerto vs. hospedeiro" (GVH) , nemse tornando apoptóticas ou induzindo apoptose ou, quando transplantadas,sem se transformarem em linhagens celulares imortalizadas.

Ao usar células-tronco mesenquimais embrionárias para implan-tação, por exemplo, nas articulações, em tentativas de desenvolver métodospara restauração de cartilagem ou osteoartrite, semelhante implantação comcélulas-tronco mesenquimais embrionárias mostrou que estas células po-dem conservar a função de transformar durante diferenciação em células deendoderma mesoderma ectoderma mistos com comportamento imortalizadoaparecendo como teratomas em uma quantidade significante de camundon-go SCID sob experimentos, onde as referidas células-tronco embrionáriasde fato induziram estes teratomas imortalizados ( Wakitani S, Takaoka K,Hattori T, Miyazawa N1 Iwanaga T, Takeda S, Watanabe TK and Tanigami A,Rheumatology (2003), 42:162-165) indicando que ao usar mais células ima-turas, por exemplo, para os fins de produzir células de Iigamento periodontal,pode ser mais aconselhável usar células-tronco mesenquimais do cordãoumbilical ou a partir do cordão umbilical ou de sangue do cordão umbilical aoinvés de usar células-tronco embrionárias para este fim, porque a referidatransdiferenciação pode de fato produzir tumores, por exemplo, tais comoteratomas.

Um dos principais fatores Iimitantes para aumento do uso desangue do cordão umbilical (UCB) humano em transplantação alogênica a-dulta é o pequeno número de células progenitoras que podem ser coletadase infundidas. A expansão ex vivo de UCB pode ajudar a superar esta limita-ção. Até o momento não se descobriu se a cultura de células UCB tambémpode levar a co-expansão de células maternais contaminantes, e deste mo-do alterar as características de enxerto levando a um aumento da incidênciade rejeição celular, mas deve ser levado em conta usando células-troncomesenquimais do sangue do cordão umbilical.

Isto pode ser investigado, por exemplo, examinando o métodopara isolar células-tronco mesenquimais tais como células UCB, iniciandoculturas de células mononucleares UCB (MNC) em um meio padrão conten-do fator de célula-tronco (SCF), flt-3L, II-3, IL-6, EPO e G-CSF. Para tratar aquestão de células maternais contaminantes pode-se realizar uma denomi-nada análise de interfase FISH dos cromossomas XeY simultaneamente.Amostras de sangue do cordão masculinas (XY) podem ser investigadaspara células maternas (XX) no dia 0 e em vários pontos do tempo durante acultura.

Método para obter células PDL

Células mamíferas tal como células mesenquimais mamíferas,células mesenquimais mamíferas alogênicas inclusuve células UC ou UCB1células mesenquimais mamíferas autólogas, osteoblastos mamíferos autólo-gos. ou precursor / progenitor de osteoblastos são cultivadas junto com umou mais entre tecido de Iigamento periodontal, proteínas de Iigamento perio-dontal ou fatores derivados de tecido de Iigamento periodontal. Estas célulassão verificadas e analisadas em citometria de fluxo usando anticorpos mo-noclonais conjugados contra; CD13, CD44, CD90, CD73 e CD31. Marcardo-res tis como CD13, CD44, CD90, CD73 são todos considerados marcadoresde células-tronco mesenquimais ao passo que CD31 é um marcador hema-topoiético. Foi demonstrado que hPDLCs são positivas para todos os quatromarcadores de células tronco, ao passo que negativas para CD31.

Se for empregado tecido de Iigamento periodontal, este tecido éprimeiro submetido a cultura usando um meio adequado, por exemplo, con-forme descrito nos Exemplos 1 ou 6 aqui, neste requerimento de patente. Omeio de crescimento é trocado regularmente, por exemplo, a cada 1 a 5 diastal como a cada 3 a 4 dias durante todo o período de cultura. Depois de umperíodo de tempo (normalmente 8 a 11 dias) as células (hPDLCs) migram doIigamento e quanto suficientemente confluentes, as células são colhidas, porexemplo, usando tratamento enzimático como tratamento com tripsina / EDTA.

Células mamíferas e células hPDLCs foram cultivadas em pla-cas de cultura adequadas e alimentadas com meio de crescimento (por e-xemplo, DMEM/F12, contendo 16% de FCS, ácido ascórbico, gentamicina efungizona) a 37°C e 5% de CO2. O meio de crescimento foi trocado a cada 3a 4 dias durante todo o período de cultura.Depois de 8 a 11 dias as células (denominadas hPDLCs) come-çam em geral a migrar para fora dos pequenos pedaços de ligamentos peri-odontais. Quando a cultura estava 70 a 80% confluente (cerca de 3 sema-nas) as células foram destacadas usando tratamento com tripsina / EDTA eforam usadas para os experimentos descritos abaixo.

Alternativamente, células mamíferas podem ser cultivadas emplacas de cultura adequadas no DMEM/F12 descrito acima, contendo FCS1e outros ingredientes descritos acima, com troca de meio a cada 3 a 4 diasdurante todo o período de cultura celular, depois de um período de 11 diasou mais, fatores tais como por exemplo, proteínas de Iigamento periodontalpodem ser adicionados como indutores em células, onde se tenta transdife-1,1 renciar estas em PDLs.

Matrizes biológicas ou artificiais ("SCAFFOLD")

Células ósseas ou células osteogênicas cultivadas sobre váriasmatrizes biológicas ou artificiais biodegradáveis podem criar interação entrea matriz biológica ou artificial e as células, ao permitir que estas venham aaderir durante transplantação ou implantação. Isto pode ser realizado entreoutros, usando vários polímeros biorreabsorvíveis tais como matrizes bioló-gicas ou artificiais de PLGA.

Será adiantado que vários tipos de matrizes biológicas ou artifi-ciais podem ser testados e podem ser capazes de serem usado com suces-so para células de Iigamento periodontal e/ou células-tronco de Iigamentoperiodontal ou células-tronco mesenquimais, as quais tenham sido induzi-das para serem usadas como tecido de Iigamento periodontal.

As células a serem implantadas podem ser implantadas juntocom uma matriz biológica ou artificial tal como por exemplo, um veículo dehidroxila apatita, que pode aumentar tanto um Iigamento periodontal quantomesmo cemento bem como produzindo uma estrutura fibrosa tal como seassemelhando a fibras de Sharpey, que insere tanto no cemento quanto noosso enquanto mantendo os dentes no local.

Uso de células transplantadas ou implantadas para o tratamento de perio-dontiteUma das finalidades do uso de células diferenciadas ou transdi-ferenciadas é desenvolver uma material celular ou tecidual que pode ser u-sado para, por exemplo, tratar tecido periodontal destruído, o qual entre ou-tros está causando "periodontite". O distúrbio oral, denominado periodontite,normalmente se inicia como uma infecção induzida por uma infecção micro-biana (por exemplo, bacteriana ou fúngica) por exemplo, na linha gengival,diagnosticada como uma gengivite ou uma gengivite aguda. Este tipo de in-fecção pode inicialmente parecer inócuo, mas com o tempo esta infecçãopode levar a necrose de tecido essencial para a cavidade oral, e especial-mente do Iigamento periodontal, ligando os dentes ao osso alveolar (juntocom cemento). Esta necrose é provocada, entre outros, por aumento da sín-tese de enzimas destruidoras de tecido, tais como, por exemplo, colagenase,bem como ativação de decomposição de tecido ósseo causada por osteo-clastos. Estes processos têm a capacidade de destruir estas estruturas teci-duais, as quais normalmente mantêm os dentes ancorados no osso no maxi-lar superior - e inferior (vide a figura 1).

Estes métodos podem mudar o tratamento de periodontite con-sideravelmente para uma restauração de implantação celular, possivelmentejunto com uma matriz biológica ou artificial.

A raiz do dente se ajusta precisamente dentro da "cavidade" naestrutura óssea (o osso alveolar) em tecido periodontal saudável (vide a Fi-gura 1). O dente é mantido in situ pelos Iigamentos periodontais.

Durante a periodontite na verdade são os Iigamentos periodon-tais, os quais são afetados e eventualmente resultarão em desprendimentodo dente conforme mostrado na figura 2.

Por conseguinte o tratamento celular se baseia em cultura celu-lar ex vivo de por exemplo, células tais como PDL e/ou PDLC que podem serobtidas de várias maneiras, por exemplo, conforme descrito acima por expo-sição ou a co-cultura com Iigamentos periodontais ou derivados dos mesmosou criadas combinando populações de células-tronco mesenquimais con-forme por exemplo, progenitoras ou precursoras de células ósseas e podemser outros tipos de células mesenquimais tais como por exemplo, PDL e/ouPDLC que, por exemplo, também podem ser combinadas com células-troncomesenquimais, por exemplo, a partir de células-tronco multipotentes me·senquimais, por exemplo, originadas de células do cordão umbilical ou desangue do cordão umbilical como células alogênicas com menor tendência adar origem a reações tais como por exemplo, rejeição das células, ou ser deorigem autóloga e portanto não apresentar evidência de rejeição. As célulasmesenquimais autólogas podem ser de origem osteogênica ou mesmo deorigem fibroblástica, ou mesmo de quaisquer dos tipos celulares que podemser obtidos a partir da diferenciação de células mesenquimais.

Também está dentro do âmbito desta invenção combinar as cé-lulas a serem implantadas com matrizes biológicas ou artificiais apropriados,de modo que uma pessoa pode modelar e ajustar o produto pretendido paraa área de aplicação em particular, e mesmo cobrir as células transplantadas,para manter sua função, proteger as mesmas contra infecção e mesmo Iimi-tar as células contra crescimento para dentro de áreas indesejadas na cavi-dade oral.

Legendas das figuras

Figura 1. Desenho de dente no local em seu alvéolo

Figura 2. Periodontite, infecção crônica das gengivas a qual secaracteriza por uma perda de fixação entre o dente e o osso maxilar se iniciacom uma forma mais branda denominada gengivite (vide "1")

Figura 3. É mostrada uma cultura subconfluente de hPDLCs.

Quando as células estão 70% confluentes, elas são tripsinizadas

Figura 4. As amostras foram analisadas em um fluxocitômetroBeckman Coulter Epics XL (flowcytometer). Células mortas e fragmentosforam excluídos da análise por regiões de células dos histogramas de volu-me e complexidade ("forward - e sidescatter gating").

Figura 5. As células foram coradas para atividade de fosfatasealcalina, estudada usando um protocolo de coloração específica e a diferen-ciação osteogênica é mostrada nesta figura

A invenção é ilustrada nos exemplos não Iimitantes seguintes.

Exemplo 1Cultura de hPDLC

Terceiros molares humanos foram dispostos em placas de Petri,e 2 ml de meio de crescimento (DMEM/F12 contendo 16% de FCS, Genta-micina, Ácido Ascórbico e Fungizone) foram aplicados aos molares.

O ligamento periodontal foi gentilmente separado da superfícieda raiz com um bisturi estéril e o tecido foi transferido para uma nova placade Petri.

2 ml de meio de crescimento foram aplicados ao tecido de liga-mento periodontal e pequenos explantes foram gerados com um bisturi estéril.

Os explantes do tecido de ligamento periodontal foram transferi-dos para um frasco de cultura de 75 cm2 contendo meio de crescimento ecultivados a 37°C em uma incubadora de CO2. Os explantes produzindo cul-turas celulares em unidades formadoras de colônia da cultura celular primá-ria foram isolados.

Exemplo 2

Expressão de Marcador Superficial

hPDLCs da cultura primária (EiP0) (definida como a CFU inicialde células sendo essencialmente cultivadas a partir do explante, as quaisainda não foram passadas) foram analisadas em citometria de fluxo usandoanticorpos monoclonais conjugados contra; CD13, CD44, CD90, CD73 eCD31.

CD13, CD44, CD90, CD73 são todos considerados como mar-cadores de células-tronco mesenquimais ao passo que CD31 é um marca-dor hematopoiético.

Foi demonstrado que hPDLCs são positivas para todos os qua-tro marcadores de células tronco, ao passo que negativas para CD31.

Isto sugere que a população de hPDLC é composta de célulasprogenitoras mesenquimais.

Exemplo 3

Diferenciação Osteoqênica (Expressão genética)

hPDLCs foram semeadas em lâmina de 6 cavidades e induzidaspara diferenciar ao longo do caminho osteogênico trocando o meio de meiode crescimento normal para meio osteogênico (DMEM/F12 contendo 10% deFCS, Ácido Ascórbico, 10"7 M de dexametasona, 8 mM de D-Glicerofosfato).

Como controle, hPDLCs foram cultivadas em meio de cresci-mento normal contendo 10% de FCS.

Depois de 14 dias em cultura, hPDLCs foram lavadas em PBS eRNA foi isolado das culturas induzidas e das culturas controle.

Usando RT-PCR foram avaliadas a expressão de fosfatase alca-Iina (ALP), colágeno tipo 1 (CoM) e osteocalcina (OC).

Exemplo 4

Diferenciação Osteoqênica (Análise histoquímica)

hPDLCs foram semeadas em lâminas de 6 cavidades e induzi-das para diferenciar ao longo do caminho osteogênico trocando o meio domeio de crescimento normal para meio osteogênico (DMEM/F12 contendo10% de FCS, Ácido Ascórbico, 10"7 M de dexametasona, 8 mM de □-Glicerofosfato). Como controle, hPDLCs foram cultivadas em meio de cres-cimento normal contendo 10% de FCS.

Depois de 14 dias em cultura, hPDLCs foram lavadas uma vezem PBS. Subseqüentemente, culturas induzidas e controle foram coradaspara ou atividade de ALP ou a presença de depósitos de cálcio (mancha deVon Kossa).

Foram demonstrados tanto um aumento da atividade de ALPquanto um aumento da deposição de cálcio apra as culturas induzidas cor-roborando os resultados de expressão genética.

Todos os três marcadores foram hiper-regulados nas culturasinduzidas; demonstrando que hPDLCs foram capazes de diferenciar ao lon-go do caminho osteogênico, sugerindo que esta população celular consisteem células-tronco mesenquimais imaturas.

Exemplo 5

Congelamento de hPDLCs

hPDLCs foram tripsinizadas e filtradas através de um filtro estérilde 70 μm e em seguida centrifugadas. O pélete foi ressuspendido em meiode congelamento (FCS + 10% de DMSO) e as células foram transferidaspara um tubo de armazenamento criogênico cryo-vial.

Um processo de congelamento graduado foi iniciado, começan-do em 4 -C por 1 hora, -20 -C por 4 horas, -80 -C durante a noite e finalmen-te para N2 líquido.

Exemplo 6

Terceiros molares humanos normais foram coletados de 3 indi-víduos imediatamente depois da extração. Os ligamentos periodontais foramgentilmente separados da superfície da raiz, e foram em seguida picados empequenos pedaços. Em seguida foram transferidos para frascos de culturaT-75 e alimentados com meio de crescimento (DMEM/F12, contendo 16% deFCS, ácido ascórbico, gentamicina e fungizone) a 37°C e 5% CO2. O meiode crescimento foi trocado a cada 3 a 4 dias durante todo o período de cultura.

Depois de 8 a 11 dias as células (denominadas hPDLCs) come-çaram a migrar a partir de pequenos pedaços de ligamentos periodontais.Quando a cultura estava 70 a 80% confluente (aprox. 3 semanas) as célulasforam destacadas usando tratamento com tripsina / EDTA e usadas para osexperimentos descritos abaixo.

Uma cultura subconfluente de hPDLCs é mostrada na Figura 3.

Análise da citometria de fluxo

Foi realizada análise da citometria de fluxo de modo a estudar aspropriedades das células-tronco de hPDLCs.

Suspensões celulares únicas de hPDLCs foram incubadas emtemperatura ambiente com anticorpos monoclonais conjugados a FITC con-tra CD73, CD90, conhecidas como marcadores de células-tronco mesen-quimais. Depois de incubação, as amostras foram analisadas sobre um flu-xocitômetro Beckman Coulter Epics XL. Células mortes e fragmentos foramexcluídos da análise por regiões de células dos histogramas de volume ecomplexidade.

Os resultados são mostrados na Figura 4.

Diferenciação osteogênicaAs células foram semeadas a 0,5x104 células/cm2 e cultivadasde um dia para o outro em meio de crescimento. Foi induzida diferenciaçãoosteogênica por 3 semanas trocando as células do meio de crescimento pa-ra um meio osteoindutivo (OIM)1 composto de DMEMF12 com 10% de FBS185 Dg/mL de 2-fosfato de ácido L-ascórbico, 10"7 M de dexametasona, e 8mM de β-glicerofosfato. Culturas controle sem os estímulos de diferenciaçãoforam cultivadas em SCM contendo 10% de FBS. Foram feitas trocas demeio duas vezes por semana.

Calcificação da matriz extracelular (ECM) pode ser detectadapelo método de Von Kossa no qual depósitos de fosfato de cálcio são cora-dos de marrom a preto. As células foram semeadas em lâminas de 6 cavi-dades em uma densidade de 0,5x104 células/cm2 e cultivadas por 21 diasem OIM. Além disso foi estudada a atividade da fosfatase alcalina usandoum protocolo de mancha específico.

Resultados da diferenciação osteogênica são mostrados na Figura 5.

Com base nos achados acima concluiu-se que hPDLCs cultiva-das no meio de crescimento acima descrito são capazes de se diferenciar aolongo do caminho osteogênico.

Além do mais esta população celular apresenta dois marcadoressuperficiais, característicos para célula-tronco mesenquimal.

Modalidades Específicas da Invenção

1. Um processo para propagar células mesenquimais mamífe-ras, que tenham sido expostas a e/ou co-cultivadas com tecido de Iigamentoperiodontal, proteínas de Iigamento periodontal ou fatores derivados de teci-do de Iigamento periodontal e induzidas por estes fatores para

a. Obter características periodontais

b. Apresentarem aumento de osteopontina e osteocalcina e umaredução na sialoproteína óssea, também denominada sialoproteína óssea Ilou BSP

c. Serem capazes de serem implantadas para reparar e/ou re-generar tecido periodontald. Capazes de reparar distúrbios tais como paradentite tambémdenominada paradentose

e. Serem aceitas pelo hospedeiro sem significativa reação imuneou rejeição celular

2. Um processo para progagar células mesenquimais mamíferasalogênicas derivadas do cordão umbilical e/ou sangue do cordão umbilical, eas quais tenham sido expostas a ou co-cultivadas com tecido de ligamentoperiodontal, proteínas de ligamento periodontal ou fatores derivados de teci-do de ligamento periodontal e induzidas por estes fatores para:

a. Obter características periodontais

b. Apresentarem aumento de osteopontina e osteocalcina e umaredução na sialoproteína óssea

c. Serem capazes de serem implantadas para reparar e/ou re-generar tecido periodontal

d. Capazes de reparar distúrbios tais como paradentite tambémdenominada paradentose

3. Um processo para propagar células mesenquimais autólogasque tenham sido expostas a ou co-cultivadas com tecido de ligamento perio-dontal, proteínas de ligamento periodontal ou fatores derivados de tecido deligamento periodontal e induzidas por estes fatores para

a. Obter características periodontais

4. Um processo para propagar osteoblastos autólogos ou célulasprecursoras / progenitoras que tenham sido expostas ou co-cultivadas comtecido de Iigamento periodontal, proteínas de Iigamento periodontal ou fato-res derivados de tecido de Iigamento periodontal e induzidas por estes fato-res para:

a. Obter características periodontais

5. Um processo para propagar células conforme descrito nositens 1 a 4 e sendo injetadas diretamente até os Iigamentos periodontais re-manescentes

6. Um processo para propagar células mesenquimais autólogaspara serem injetadas diretamente dentro do Iigamento periodontal in situ,deste modo serem capazes de transdiferenciar in situ

7. Um processo para propagar e manter a morfologia imatura decélulas mamíferas, a morfologia imatura referida sendo definida como HLA-DR positivas (HLA-DR+), Lin positivas (Lin +), Thy-1 positivas (Thy-1+), Stro-1 positivas (Stro-1 +), CD-13 positivas, CD-44 positivas, CD-90 positivas,CD-73 positivas e, possivelmente CD146/MUC 18 positivas serão:

a. capazes de serem co-cultivadas com células-tronco mesen-quimais mamíferas do cordão umbilical

b. capazes de serem co-cultivadas com células-tronco mesen-quimais mamíferas de sangue do cordão umbilical

d. Capazes de reparar distúrbios tais como paradentite tambémdenominada paradentosee. Serem aceitas pelo hospedeiro sem significativa reação imuneou rejeição celular

8. Um processo para propagar e manter a morfologia imatura decélulas mamíferas, a morfologia imatura referida sendo definida como HLA-DR positivas (HLA-DR+), CD-34 negativas (CD-34 -), Lin positivas (Lin +),Thy-1 positivas (Thy-1+), Stro-1 positivas (Stro-1 +), CD-13 positivas, CD-44positivas, CD-90 positivas, CD-73 positivas e, possivelmente CD146/MUC 18positivas serão:

9. Capazes de serem co-cultivadas com células mamíferas deri-vadas de células da medula óssea ou colônias das mesmas a partir de oudoadores autólogos ou de doadores alogênicos, expostas ou co-cultivadascom tecido de Iigamento periodontal, proteínas de Iigamento periodontal oufatores derivados de tecido de Iigamento periodontal e induzidas por estesfatores para:

a. Obter características periodontais

d. Serem capazes de serem implantadas para reparar e/ou re-generar tecido periodontal

e. Capazes de reparar distúrbios tais como paradentite tambémdenominada paradentose

f. Serem aceitas pelo hospedeiro sem significativa reação imuneou rejeição celular

10. Um processo para propagar e manter a morfologia imaturade células mamíferas, a morfologia imatura referida sendo definida comoHLA-DR positivas (HLA-DR+), Lin positivas (Lin +), Thy-1 positivas (Thy-1+),Stro-1 positivas (Stro-1 +), CD-13 positivas, CD-44 positivas, CD-90 positi-vas, CD-73 positivas e, possivelmente CD146/MUC 18 positivas o processocompreendendo parte da identidade de células de Iigamento periodontal10 mamíferas podem ser:

a. capazes de serem co-cultivadas com células-tronco mesen-1,1 quimais mamíferas do cordão umbilical

11. A população resultante processada conforme descrito em 1,e 2, definida como HLA-DR positivas (HLA-DR+), Lin positivas (Lin +), Thy-1positivas (Thy-1+) e Stro-1 positivas (Stro-1 +), CD-13 positivas, CD-44 posi-tivas, CD-90 positivas, CD-73 positivas e, possivelmente CD146/MUC 18positivas serão transplantáveis em mamíferos

a. dentro de sua cavidade oral sem serem rejeitadas

b. dentro da área periodontal sem serem rejeitadas

c. dentro de defeitos dentais sem serem rejeitadas

12. A população resultante processada conforme descrito em 1,e 2, definida como HLA-DR positivas (HLA-DR+), Lin positivas (Lin +), Thy-1positivas (Thy-1+) e Stro-1 positivas (Stro-1 +), CD-13 positivas, CD-44 posi-tivas, CD-90 positivas, CD-73 positivas e, possivelmente CD146/MUC 18positivas serão transplantáveis em mamíferos

d. dentro de sua cavidade oral sem serem rejeitadas

e. dentro da área periodontal sem serem rejeitadas

f. dentro de defeitos dentais sem serem rejeitadas

13. O método para implantar células conforme descrito nos itens1 a 11 usando uma combinação de células e uma ou mais matrizes biológi-cas ou artificiais

14. Um processo para propagar Células (células tronco) Positi-vas para Ligamento Periodontal Autólogas mamíferas a serem transplantáveis:

a. dentro de uma cavidade oral sem serem rejeitadas

b. dentro de uma área periodontal sem serem rejeitadas

c. dentro de defeitos dentais sem serem rejeitadas.

15. O método para implantar células conforme descrito nas rei-vindicações acima usando uma combinação de células e um ou mais matri-zes biológicas ou artificiais.

16. O uso de Iigamento periodontal ou extratos do mesmo a par-tir ou de fonte autóloga, ou alogênica e/ou xenogênica para permitir que ascélulas se diferenciem.

17. O uso de Iigamento periodontal ou extratos do mesmo a par-tir ou de fonte autóloga. ou alogênica e/ou xenogênica para permitir que ascélulas se diferenciem em células periodontais, células-tronco periodontaise/ou células expressando comportamento periodontal.

Claims

1. Método para propagar e/ou diferenciar células de mamíferos,o método compreendendo expor ou co-cultivar células de mamíferos comum ou mais entre tecido de Iigamento periodontal, proteínas de Iigamentoperiodontal ou fatores derivados de tecido de Iigamento periodontal, paraobter células tendo características de PDL e satisfazendo no mínimo um dosseguintes:i) apresentar características periodontais conforme evidenciadocom o método de Von Kossa, no qual depósitos de fosfato de cálcio são co-rados de marrom a preto,ii) apresentar aumento de osteopontina e osteocalcina e aomesmo tempo reduzir sialoproteína óssea (sialoproteína óssea Il ou BSP),iii) serem capazes de serem implantadas para reparar e/ou re-generar tecido periodontal,iv) serem capazes de reparar distúrbios tais como paradentitetambém denominada paradentose, ou periodontite, por cicatrização da linhagengival em direção aos dentes, ev) serem aceitas pelo hospedeiro sem significativa reação imuneou rejeição celular.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, em que as célulasde mamíferos são propagadas em um meio de crescimento, em seguida in-duzidas para diferenciação alterando o meio de crescimento para um meiode diferenciação tal como um meio osteoindutivo, no qual as células comcaracterísticas de PDL obtidas são colhidas.

3. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, em que as cé-lulas de mamíferos são células mesenquimais de mamíferos, células me-senquimais de mamíferos alogênicas derivadas do cordão umbilical e/ousangue do cordão umbilical, células mesenquimais de mamíferos autólogas,osteoblastos de mamíferos autólogos ou precursor / progenitor de osteoblas-tos, em que estas células por exposição à proteína de Iigamento periodontaldiferenciarão em células PDL.

4. Método de acordo com a reivindicação 3, em que as célulasmesenquimais de mamíferos que são propagadas são células mesenquimaisautólogas e as células obtidas são capazes de transdiferenciar in situ paracélulas PDL ou para células apresentando características de PDL.

5. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a-4, em que as células obtidas com características de PDL são HLA-DR positi-vas (HLA-DR+), Lin positivas (Lin +), Thy-1 positivas (Thy-1+), Stro-1 positi-vas (Stro-1 +), CD-13 positivas, CD-44 positivas, CD-90 positivas, CD-73positivas e, possivelmente CD146/MUC 18 positivas, porém negativas paraCD31.

6. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a-5, em que as células obtidas com características de PDL são CD-34 negativas.

7. População celular tendo características de PDL e obtenívelpelo método como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6.

8. Método para o tratamento de distúrbios no tecido periodontal,o método compreendendo injetar células obtidas pelo método como definidoem qualquer uma das reivindicações 1 a 3 diretamente até os Iigamentosperiodontais e resultando em aderência das células ao canal da raiz circun-jacente.

9. Método de acordo com a reivindicação 8, em que a implanta-ção de células emprega uma combinação de células e uma ou mais matrizesbiológicas ou artificiais.

10. Composição de tecido consistindo essencialmente em prote-ínas de Iigamento periodontal capazes de induzir características de célulasPDL, a composição sendo obtenível cultivando um explante de Iigamentoperiodontal em um meio de cultura para obter migração de células e colhen-do estas células.

11. Células como definidas na reivindicação 10, capazes de se-rem co-cultivadas com células de mamíferos derivadas de células da medulaóssea ou colônias das mesmas a partir de, ou doadores autólogos ou dedoadores alogênicos, expostas ou co-cultivadas com tecido de Iigamentoperiodontal, proteínas de Iigamento periodontal, ou fatores derivados de te-cido de ligamento periodontal e induzidas por estes fatores paraa. obterem características periodontais apresentando aumentadaosteopontina e osteocalcina e uma redução na sialoproteína ósseab. serem capazes de serem implantadas para reparar e/ou rege-nerar tecido periodontalc. serem capazes de serem implantadas para reparar e/ou rege-nerar tecido periodontald. serem capazes de reparar distúrbios tais como paradentite,também denominada paradentosee. serem aceitas pelo hospedeiro sem significativa reação imuneou rejeição celular.