BRPI0616756A2

BRPI0616756A2 - construção genética para a hiper-expressão de uma proteìna de domìnio-f em plantas; célula de planta transgênica; célula da planta arabiposis thaliana recombinante; planta; método de modificação da produção de óleo em uma planta; e método de aumento na produção de óleo na arabidopsis thaliana

Info

Publication number: BRPI0616756A2
Application number: BRPI0616756-0A
Authority: BR
Inventors: John B Ohlrogge; Sari A Ruuska; Yonghua Li
Original assignee: Univ Michigan State
Priority date: 2005-09-26
Filing date: 2006-09-22
Publication date: 2011-06-28
Also published as: AU2006295375A1; WO2007038345A2; CA2623720A1; US20100319085A1; ATE462009T1; DE602006013162D1; US20070143879A1; AU2006295375B2; EP1929018B1; US20120017340A1; US7915480B2; CA2623720C; EP1929018A2; US9006518B2; WO2007038345A3

Abstract

CONSTRUçãO GENETICA PARA A HIPER-EXPRESSãO DE UMA PROTEìNA DE DOMíNIO-E EM PLANTAS; CéLULA DE PLANTA TRANSGêNICA; CéLULA DA PLANTA ARABIPOSIS THALIANA RECOMBINANTE; PLANTA; MéTODO DE MODIFICAçãO DA PRODUçãO DE óLEO EM UMA PLANTA; E MéTODO DE AUMENTO NA PRODUçãO DE óLEO NA ARABIDOPSIS THALIANA. Descrevem-se construções genéticas, células de plantas transgênicas e plantas transgênicas, bem como os métodos associados para aumentar a produção de óleo em uma planta utilizando-se seqúências genéticas de domínio-F.

Description

"CONSTRUÇÃO GENÉTICA PARA A HIPER-EXPRESSAO DE UMAPROTEÍNA DE DOMÍNIO-F EM PLANTAS; CÉLULA DE PLANTATRANSGÊNICA; CÉLULA DA PLANTA ARABIPOSIS THALIANARECOMBINANTE; PLANTA; MÉTODO DE MODIFICAÇÃO DA PRODUÇÃO DELEO EM UMA PLANTA; E MÉTODO DE AUMENTO NA PRODUÇÃO DE ÓLEONA ARABIDOPSIS THALIANA".

REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS DE PATENTE AFINS

Este pedido de patente reivindica o beneficio deprioridade para o pedido de patente provisório n- US60/720.424, depositado em 26 de setembro de 2005.

CAMPO TÉCNICO DA INVENÇÃOEsta invenção refere-se ao campo de agricultura emanipulação de plantas. Particularmente, esta invençã serefere a métodos e composições para aumentar o teor de óleoem plantas transgênicas, incluindo o teor de óleo desementes de Arabidopsis thaliana.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Os óleos vegetais representam uma fonte renovávelde carbono altamente reduzido. A produção mundial atual deóleos vegetais é estimada em 87 milhões de toneladasmétricas com um valor aproximado -de alguns 40 bilhões dedólares norte-americanos. A maioria do óleo vegetalatualmente vai diretamente para o consumo humano, e 25% daingestão calórica humana provêm de ácidos graxos vegetais(Broun et al., Ann. Rev. Nutr. 19:197-216 (1999)). Além dasua importância na nutrição humana, os ácidos graxosvegetais são também ingredientes importantes de produtosnão-alimenticios tais como sabões, detergentes,lubrificantes, biocombustiveis cosméticos, e tintas (videOhlrogge, Plant Physiol. 104:821-6 (1994)). Embora ademanda por óleos vegetais tenha aumentado regularmente, acapacidade de produção para atender a esta demanda é mais doque adequada e os preços dos óleos vegetais permaneceramabaixo ou perto de 0,60 dólares norte-americanos porquilograma. Este baixo custo de produção estimulouinteresse no uso de óleos vegetais como alternativasrenováveis às matérias-primas químicas derivadas dopetróleo.

Os ácidos graxos são a fonte mais abundante decadeias de carbono reduzido disponíveis na natureza e têmdiversos usos, desde alimentos a matérias-primasindustriais. As plantas representam uma fonte renovávelsignificativa de ácidos graxos porque muitas espécies osacumulam na forma de triacil-glicerina como os principaiscomponentes de armazenamento em sementes. Com o surgimentoda tecnologia de transformação de plantas, a engenhariametabólica de ácidos graxos de sementes oleaginosas setornou possível e os óleos de plantas transgênicasrepresentam alguns dos primeiros sucessos no desenho deprodutos vegetais modificados. Por exemplo, a transferênciado gene de tioesterase de uma planta da baía da Califórniapara sementes de plantas que não acumulam laurato (12:0),Arabidopsis and Brassica napus (colza) resultou na alteraçãodo processo de alongamento de cadeias acila de ácidosgraxos, para produzir laurato até 24% e 58% de ácidos graxostotais das sementes, respectivamente (vide Voelker et al.,Sei. 257:72-4 (1992); e Voelker et al.,Plant J. 9:229-41(1996), respectivamente). Assim sendo, a transferência deum único gene para uma planta pode alterar dramaticamente otipo de ácidos graxos produzidos.

Entretanto, esse sucesso com um único gene é aexceção à regra (para obter uma revisão, vide Thelen eOhlrogge, Metabol. Engineer. 4:12-21 (2002)). Além disso,para ser economicamente útil para consumo humano e usosindustriais, um aumento real no teor de ácidos graxos, aoinvés de apenas uma mudança no tipo de ácido graxoproduzido, seria altamente desejável. Embora a produção demalonlil-CoA por acetil-CoA carboxilase seja uma etapareguladora fundamental na síntese de novo de ácidos graxos,as tentativas para aumentar a taxa desta etapa aparentementelimitadora da taxa por engenharia genética atingiram nomáximo um sucesso moderado. Além disso, a superexpressão devárias enzimas sintase de ácidos graxos individuais nãoresultou em um maior fluxo da biossíntese de ácidos graxos(revisado em Thelan e Ohlrogge, Metabol. Engineer. 4:12-21(2002)).

Conseqüentemente, permanece existindo umanecessidade de se obter estratégias de engenharia genética,que aumentem a quantidade de ácido graxo produzida porplantas.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

A invenção baseia-se, em parte, na descobertainesperada de que a superexpressão de genes de F-box emplantas resulta na maior produção de óleo vegetal.Particularmnte, a superexpressão da proteína F-box deArabidopsis thaliana (N— de Acesso do GenBank NM_1114 99(DNAc) e NP_566277 (proteína) usando o promotor faseolinaespecifico de semente, sementes produzidas com um fenótipode teor mais alto de óleo (vide Figuras 1-5).

Conseqüentemente, em um aspecto, a invençãofornece uma construção genética para a expressão de umaproteína F-box em plantas. Genericamente, tais construçõesgenéticas da invenção incluem uma seqüência promotora degene; e uma seqüência que codifica uma proteína F-box daplanta, que está ligada funcionalmente à seqüência promotorado gene. Em algumas modalidades, a proteína F-box é umaproteína F-box vegetal ou codificada por um gene de F-box daplanta. Em outras modalidades, a proteína F-box é umaproteína F-box não-vegetal ou codificada por um gene de F-box não-vegetal, tal como uma proteína ou gene de F-boxanimal (por exemplo, um mamífero). Em algumas modalidades,a seqüência promotora do gene é um promotor específico desemente. Em modalidades particularmente úteis, a seqüênciapromotora do gene é faseolina. Em certas modalidadesparticularmente úteis, a construção genética compreende umvetor de expressão pBBV-PHAS.

Em outra modalidade, as construções genéticas dainvenção compreendem uma seqüência que codifica a proteínaF-box da planta tem uma seqüência de polipeptídeo que PEpelo menos 75% idêntica à seqüência de polipeptídeo de SEQID NO: 1. Em outras modalidades, a proteína F-box da plantatem uma seqüência de polipeptídeo que é pelo menos 90%idêntica à seqüência de polipeptídeo de SEQ ID NO: 1. Emainda outras modalidades úteis, as construções genéticas dainvenção compreendem uma proteína F-box vegetal que tem aseqüência de polipeptídeo de SEQ ID NO: 1. Em modalidadesespecíficas, a proteína F-box da planta é codificada pelaseqüência de ácidos nucléicos de SEQ ID NO: 2. Em outrasmodalidades, a proteína F-box é codificada por um ácidonucléico que hibridiza para a seqüência de ácidos nucléicosde SEQ ID NO: 2. Em modalidades particularmente úteis, aproteína F-box é codificada por um ácido nucléico quehibridiza sob condições severas para a seqüência de ácidosnucléicos de SEQ ID NO: 2.

Em outro aspecto, a invenção fornece célulasvegetais transgênicas que compreendem qualquer uma dasconstruções genéticas da invenção descritas acima. Emcertas modalidades úteis, a célula vegetal transgênica é umaArabidopsis thaliana. Em outras modalidades, a célulavegetal transgênica é uma planta de cultivo agrícola, talcomo milho ou trigo. Em outras modalidades, a célulavegetal transgênica é uma cultura agrícola produtora deóleo, tal como soja, palma, colza ou girassol.

Em outro aspecto, a invenção fornece uma célulavegetal de Arabiposis thaliana recombinante, que tem umaconstrução genética heteróloga que inclui uma seqüênciapromotora de gene ligada funcionalmente a uma seqüênciacodificadora de F-box. Em certas modalidades

particularmente úteis, a seqüência de F-box codificadacorresponde ao polipeptídeo de F-box vegetal de SEQ ID NO: 1e o promotor é faseolina.

Em ainda outro aspecto, a invenção fornece umaplanta que tem uma célula vegetal transgênica da invenção,como descrito acima, ou uma sua parte, propágulo ouprogênie, compreendendo uma das construções genéticas dainvenção.

Em ainda outro aspecto, a invenção fornece ummétodo para modificar a produção de óleo em uma planta,primeiramente, incorporando de forma estável no genoma daplanta uma construção genética da invenção, como descritoacima, pra produzir uma planta transformada, e depois,regenerar a planta transformada, de tal modo que a expressãoda construção genética incorporada modifique a produção deóleo na planta. Em modalidades especificas, a plantamodificada é Arabidopsis thaliana. Em outras modalidades, aplanta é uma planta de cultura agrícola, tal como milho outrigo. Em outras modalidades, a planta é uma culturaagrícola produtora de óleo, tal como soja, palma, colza ougirassol.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

A Figura 1 é uma representação gráfica deexperimentos que demonstram o teor de óleo aumentado delinhagens transgênicas de F-box-faseolina, em comparação comlinhagens de controle com vetores. Os dados ilustrados sãoa média de 18 linhagens (T2) e as barras de erros são SE.

A Figura 2 é uma representação gráfica deexperimentos que demonstram FAMEs totais de sementes delinhagens transgênicas de F-box, em comparação com o tiposelvagem (WT), e outras linhagens de controle com vetores.As barras de erros são baseadas em SE em 18 linhagens: 3duplicatas para cada linhagem.

A Figura 3 é uma representação gráfica deexperimentos que demonstram FAMEs totais de sementes delinhagens transgênicas versus WT e linhagens de controle comvetores. Os pontos grandes são as duas linhagens com teorde óleo mais alto e foram denominadas Fbox2 e Fbox3escolhidas posteriormente para a análise da próxima geração.

A Figura 4 é uma representação gráfica deexperimentos que ilustram o espectro de ácidos graxos e acomposição das razões molares de ácidos graxos de linhagenstransgênicas de F-box versus plantas de controle.

A Figura 5 é uma representação gráfica dadeterminação do peso das sementes. Cerca de 400 sementesforam contadas quanto a sementes do tipo selvagem etransformantes com genes de F-box. As sementes contadasforam guardadas em um dessecador de um dia para o outro, edepois determinadas usando uma balança analítica. As barrasde erros baseiam-se em SE em 6 réplicas.

A Figura 6 é uma representação gráfica quedemonstra FAMEs totais por semente nas sementes com F-box T3versus WT e linhagens de controle com vetores. As barras deerros são baseadas em SE em dados obtidos de 12 plantas paralinhagens com F-box2 e F-box3; 6 plantas para WT e linhagensde controle com vetores. As duas linhagens neste casodenominadas F-box2 e F-box3 são os dois pontos de dadosindicados por pontos grandes na Figura 3.

A Figura 7 é uma representação gráfica deexperimentos que demonstram FAMEs totais de sementes delinhagens transgênicas (F-box2 e F-box3) versus WT elinhagens de controle com vetores.

A Figura 8 (A) é uma representação gráfica deexperimentos que demonstram uma análise da razão C:N paraduas linhagens independentes F-box2 e F-box3. As barras deerros são baseadas em SE em seis réplicas. A Figura 8 (B) éuma representação gráfica que demonstra a correlaçãopositiva entre teor de óleo e razão C:N. As colunas vazadassão superexpressores F-box2 e F-box3; as colunas cinza sãosementes de Arabidopsis do tipo selvagem.

A Figura 9 (A) é uma representação gráfica deexperimentos que demonstram uma análise de FAMEs daslinhagens de F-box-KO.

A Figura 9 (B) é uma representação gráfica deexperimentos que demonstram o espectro de ácidos graxos delinhagens KO e WT. As barras de erros são baseadas em SE emnove réplicas independentes.

A Figura 10A é uma representação esquemática daseqüência de polipeptideo de uma proteína F-box deArabidopsis thaliana correspondente ao N2 de Acesso doGenBank NP_566277 (SEQ ID NO: 1).

A Figura 10B é uma representação esquemática daseqüência de nucleotídeos de uma proteína F-box deArabidopsis thaliana correspondente ao N2 de Acesso doGenBank NM_111499 (SEQ ID NO: 2). Os códons de iniciação eterminação previstos da estrutura de leitura aberta daproteína F-box estão sublinhados.

A Figura 11 é uma representação esquemática daseqüência de ácidos nucléicos (SEQ ID NO: 6) de pGATE-PHASE:F-box, com as seqüências codificadoras de F-box inseridasilustradas em letras maiúsculas.

A Figura 12 é uma representação diagramática dovetor específico de semente pGATE-PHASE: F-box, ilustrando ositio de clonagem atrás do promotor especifico de semente,faseolina.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

A patente e a literatura aqui referidasestabelecem o conhecimento disponível para os versadosnessas técnicas. As patentes norte-americanas, pedidos depatente concedidos, os pedidos de patente estrangeirospublicados, e as referências, incluindo as seqüências dabase de dados do GenBank, aqui citadas são aqui incorporadascomo referência até o mesmo grau em que se cada uma tivessesido especificamente e individualmente indicada para serincorporada como referência.

4.1. Informações Gerais

A invenção baseia-se, em parte, na descobertainesperada de que a superexpressão de proteínas F-boxvegetais aumenta o teor de óleo de sementes vegetais.Particularmente, a superexpressão da proteína F-box deArabidopsis thaliana (N— de Acesso do GenBank NM_111499(DNAc) e NP_566277 (proteína), usando o promotor faseolinaespecífico de semente, produziu um fenótipo de teor maisalto de ácidos graxos (vide Figuras 1-5). Conseqüentemente,genericamente, a invenção fornece plantas transgênicas queincorporam genes heterólogos de F-box, que aumentam o teorde óleo de um ou mais estágios do desenvolvimento de umaplanta vascular.

Os ácidos graxos armazenados em sementes vegetaissão usualmente compostos não-ramifiçados com um número parde carbonos na faixa entre 12 e 22 e com 0 a 3 ligaçõesduplas eis. Entretanto, existem inúmeras variações nestetema na natureza, particularmente com relação a gruposfuncionais adicionais tais como hidroxila, epóxi, ciclo-propeno ou acetileno. As plantas representam um grandereservatório de diversidade de ácidos graxos, sintetizandopelo menos 200 tipos diferentes de ácidos graxos (vide vande Loo et al.r (1993) "Unusual fatty acids" in "PlantLipids" (Editor: T. Moore), páginas 91-126, CRC, Boca Raton,FL, EUA) . 0 uso humano, entretanto, ficou predominantementerestrito a uns poucos seletos ácidos graxos que se acumulam em plantas domestiçadas. As quatro culturas de sementesoleaginosas mais importantes são em ordem descendente, soja,palma oleaginosa, colza, e girassol, as quais, em conjunto,representam 65% da produção mundial atual de óleos vegetais.Os ácidos graxos abundantes produzidos nestas principaissementes oleaginosas compreendem apenas quatro das mais de200 possibilidades, a saber, linoleato, palmitato, laurato,e oleato.

Com relação à nomenclatura de lipideos, umaanotação simples abreviada baseada no comprimento damolécula e no número e posições de ligações duplas foidesenvolvida para designar os ácidos graxos. Por exemplo, oácido graxo, ácido oléico, monoinsaturado (ácidooctadecenóico) é designado 18:1. 0 primeiro valor, 18,representa o número de carbonos. 0 segundo valor, 1, indicao número de ligações duplas. Além disso, a posição dasligações duplas, contando a partir do grupo carboxila, édesignada por delta (Δ) e o ácido oléico pode ser designadomais inteiramente como 18:1 Δ9. As ligações duplas em ácidosgraxos de ocorrência natural são quase que exclusivamenteisômeros eis, e usualmente nenhuma designação para o tipo deligação dupla é utilizada, a menos que ele seja um isômerotrans, como em 16:1 A3t. Alguns autores designam também asposições das ligações duplas em relação ao carbono doradical metila terminal. Assim sendo, um ácido graxo ômega3 contém uma ligação dupla 3 carbonos a partir daextremidade metila do ácido graxo (por exemplo, 18:3 Δ9, 12,15 é um ácido graxo ômega 3) . A posição na qual um ácidograxo é esterificado para o esqueleto glicerol deglicerolipideos é designada sn-3 (o terminal hidroxila que éfosforilado no glicerol-3-fosfato), sn-2 (a hidroxilacentral) , e sn-1 (a hidroxila terminal que que não éfosforilada).

No caso de usos comestíveis e industriais, umaumento no teor de óleo das sementes é desejável e tem sidouma meta importante da engenharia de sementes oleaginosas.Entretanto, para ser economicamente útil, essa mudança nãodeve ser à custa do volume de produção global das sementesou à perda de outros componentes de alto valor. Porexemplo, a soja é a maior fonte de óleo vegetal,compreendendo 30% do mercado mundial, e constitui agora maisde 80% de todos óleos vegetais dietéticos nos EstadosUnidos. Embora denominada uma semente oleaginosa, a sojacontém apenas 18-22% de óleo, baseado no peso seco dassementes, e é cultivada principalmente como uma farinha comalto teor protéico para rações animais. Assim sendo,aumentar o óleo na soja na maioria dos casos não será útilse este aumento advir à custa da proteína de soja de altovalor que impulsiona a economia da cultura.Comparativamente, outras culturas de sementes oleaginosas(exceto o algodão) são cultivadas principalmente devido aoseu óleo e produzem sementes com 40-60% de óleo. A amplafaixa de porcentagem de óleo das sementes, observada nanatureza, sugere que este caminho poderia ser suscetível àengenharia metabólica, particularmente em sementesoleaginosas de "baixo teor de óleo", desde que os mecanismosfundamentais que controlam o teor de óleo sejamidentificados.

4.2 Definições

Por conveniência, o significado de certos termos eexpressões empregados no relatório descritivo, nos exemplos,e nas reivindicações apensadas, é fornecido abaixo.

O termo "agonista", como aqui utilizado, significaum agente que mimetiza ou regula de forma ascendente (porexemplo, potencializa ou suplementa) uma bioatividade. Porexemplo, um agonista de F-box pode ser uma proteína F-box dotipo selvagem ou derivado dela gue tem pelo menos umabioatividade da proteína F-box do tipo selvagem. Umagonista pode ser também um composto que aumenta a interaçãode um polipeptídeo bioativo com outra molécula, por exemplo,um receptor. Os agonistas podem ser qualquer classe demolécula, tal como uma molécula pequena, incluindo um ácidonucléico, proteína, lipídeo ou combinação delas.

0 termo "alelo", que é aqui utilizado de formaintercambiável com "variante alélica", refere-se a formasalternativas de um gene ou partes dele. Os alelos ocupam omesmo lócus ou posição em cromossomas homólogos. Quando umindivíduo tem dois alelos idênticos de um gene, o indivíduoé dito como sendo homozigótico para o gene ou alelo. Quandoum indivíduo tem dois alelos diferentes de um gene, oindivíduo é dito como sendo heterozigótico para o gene oualelo. Os alelos de um gene específico podem diferir entresi em um único nucleotídeo, ou vários nucleotídeos, e podemincluir substituições, deleções, e inserções denucleotídeos. As variações de seqüências que ocorremfreqüentemente incluem mutações de transição (isto é, purinapara substituições de purina e pirimidina para substituiçõesde pirimidina, por exemplo, A para G ou C para Τ) , mutaçõestransversas (isto é, purina para pirimidina e pirimidinapara substituições de purina, por exemplo, A para T ou Cpara G), e alteração nas respectivas seqüências de DNArepetitivas (por exemplo, expansões e contrações derepetições de trinucleotídeos e seqüências de repetiçõestandem). Um alelo de um gene pode estar também na forma deum gene que contém uma mutação. 0 termo "variante alélicade uma região polimórfica de um gene" refere-se a uma regiãode um gene do lócus que tem uma ou várias diferenças deseqüências de nucleotídeos encontradas nessa região do geneem outros indivíduos.

Como aqui utilizado, o termo "F-box" ou "proteínaF-box" refere-se às seqüências de aminoácidos de proteínasenvolvidas em proteólise, incluindo, porém sem limitações,proteínas envolvidas no complexo ubiquitina-ligase obtido dequalquer espécie, incluindo espécies vegetais, de qualquerorigem, seja natural, sintética, semi-sintética ourecombinante. F-box é uma seqüência de 35-45 aminoácidos epermite que as proteínas F-box entrem dentro de complexoscom outros componentes da degradação de proteínasdependentes de ubiquitina (por exemplo, Skpl). Assim sendo,as proteínas F-box podem se ligar a Skpl, e podem conter ummodelo que apresente uma similaridade de seqüência com Grrlou Cdc4 ou com a proteína F-box de Arabidopsis thalianailustrada na Figura 10A. Este modelo estrutural conservadoestá incluído nos alinhamentos de seqüências ilustrados naFigura 7 da patente n- US 6.573.094, cujo teor é aquiincorporado como referência em sua totalidade (isto ê, osresíduos de aminoácidos que são compartilhados pelasproteínas F-box ilustradas). Entretanto, não se pretende queo termo seja limitado às seqüências exatas aqui enunciadas.Em algumas modalidades, as proteínas F-box podem compreenderainda modelos adicionais, particularmente modelos envolvidosna interação proteína-proteína. Estes modelos adicionaisestão incluídos, porém não-limitados a repetições ricas emleucina, e WD-40. In certas modalidades, a proteína F-box éde uma planta vascular, enquanto que em modalidadesparticularmente úteis, a proteína F-box é de Arabidopsisthaliana.

0 termo "antagonista", como aqui utilizado,refere-se a um agente que regula de forma descendente (porexemplo, suprime ou inibe) pelo menos a bioatividade. Umantagonista pode ser um composto que inibe ou diminui ainteração entre uma proteína e outra molécula, por exemplo,um substrato. Conseqüentemente, um antagonista útil é umcomposto que inibe ou diminui a ligação a um substrato, edesta forma, bloqueia a função da enzima. Um antagonistapode ser também um composto que regula de forma descendentea expressão de um gene ou genes, ou que reduz a quantidadede um produto gênico transladado. 0 antagonista dabioatividade-alvo pode ser uma forma negativa dominante deum polipeptideo que possui essa bioatividade, por exemplo,os antagonistas de F-box incluiriam uma forma de umpolipeptideo de F-box que é capaz de interagir com outroscomponentes da via dependente de ubiquitina, mas queinterfere com a função do complexo resultante (isto é, umaforma negativa dominante da bioatividade-alvo). Umantagonista pode ser também um ácido nucléico antisense, ouuma ribozima capaz de interagir especificamente um RNAm quecodifica a bioatividade-alvo. Ainda outros antagonistas sãomoléculas que se ligam a uma bioatividade-alvo e inibem suaação. Tais moléculas incluem peptideos tais como aquelesque se ligam a um sitio ativo de uma enzima e impedem queele interaja com o substrato. Ainda outros antagonistas dabioatividade-alvo incluem anticorpos que interagemespecificamente com um epitopo do polipeptideo-alvo, de talmodo que a ligação interfira com a função biológica dopolipeptideo. Em ainda outra modalidade útil, o antagonistaé uma molécula pequena, tal como uma molécula capaz deinibir a interação entre uma enzima-alvo e seu substrato.

"Propagação assexuada" refere-se à produção deprogênie regenerando uma planta inteira a partir de retalhosde folhas, retalhos de pedúnculos, retalhos de raízes,células vegetais individuais (protoplastos) e calos.

O termo "sítio catalítico" refere-se à parte deuma molécula que é capaz de se ligar a um reagente emelhorar a velocidade de uma reação. Os sítios catalíticospodem estar presentes em polipeptideos ou proteínas,enzimas, compostos orgânicos, compostos organometálicos,metais, e similares. Um sítio catalítico pode serconstituído de partes separadas presentes em uma ou maiscadeias do polipeptídeo ou compostos. Estas partescatalíticas separadas se associam para formar uma partemaior de um sítio catalítico. Um sítio catalítico pode serformado por um polipeptídeo ou proteína que está ligada a ummetal.

Os termos "células", "células hospedeiras" ou"células hospedeiras recombinantes" são aqui utilizados deforma intercambiável. Deve-se entender que tais termosreferem-se não apenas à célula específica do indivíduo, mastambém à progênie ou progênie potencial de tal célula.

Devido ao fato de que certas modificações podem ocorrer emgerações sucessivas, em virtude de mutação ou influênciasambientais, tal progênie, de fato, não ser idêntica à célulaparental, mas ainda assim estão incluídas dentro do âmbitodo termo como aqui utilizado.

Um "polipeptídeo quimérico" ou "polipeptídeo defusão" é uma fusão de uma primeira seqüência de aminoácidosque codifica um dos polipeptideos em questão com uma segundaseqüência de aminoácidos que define um domínio (por exemplo,parte de polipeptídeo) estranho e não substancialmentehomólogo a qualquer domínio do polipeptídeo em questão. Umpolipeptídeo quimérico pode apresentar um domínio estranhoque é encontrado (embora em um polipeptídeo diferente) em umorganismo que também expressa o primeiro polipeptídeo, ouele pode ser uma fusão "entre espécies", "intergênica",etc., de estruturas polipeptidicas expressadas pordiferentes tipos de organismos. Genericamente, umpolipeptideo de fusão pode ser representado pela fórmulagenérica X-polipeptideo-Y, onde polipeptideo representa umaprimeira ou referida proteína ou polipeptideo, e X e Y estãoindependentemente ausentes ou representam seqüências deaminoácidos que não estão relacionadas à primeira seqüênciaem um organismo, incluindo mutantes de ocorrência natural.

Como aqui utilizado, o termo "variaçõesconservativamente modificadas" de uma seqüência de ácidosnucléicos específica refere-se aos ácidos nucléicos quecodificam seqüências de aminoácidos idênticas ouessencialmente idênticas, ou onde o ácido nucléico nãocodifica uma seqüência de aminoácidos, para seqüênciasessencialmente idênticas. Por causa da degeneração docódigo genético, um grande número de ácidos nucléicosfuncionalmente idênticos codifica qualquer dado

polipeptideo. Por exemplo, os códons CGU, CGC, CGA, COG,AGA, e AGG codificam o aminoácido arginina. Assim sendo, emcada posição na qual uma arginina é especificada por umcódon, o códon pode ser alterado para qualqur um dos códonscorrespondentes descritos, sem alterar o polipeptideocodificado. Tais variações de ácidos nucléicos são"variações silenciosas," que são uma espécie de "variaçõesconservativamente modificadas". Cada seqüência de ácidosnucléicos neste caso, que codifica um polipeptideo, descrevetambém cada variação silenciosa possível. Os versadosnessas técnicas devem reconhecer que cada códon em um ácidonucléico (exceto AUG, que é normalmente o único códon parametionina) pode ser modificado para produzir uma moléculafuncionalmente idêntica por técnicas usuais.

Conseqüentemente, cada "variação silenciosa" de um ácidonucléico que codifica um polipeptideo está implícita em cadaseqüência descrita. Além disso, os versados nessas técnicasdevem reconhecer que substituições, deleções ou adiçõesindividuais que alteram, adicionam ou deletam um únicoaminoácido ou uma pequena porcentagem de aminoácidos(tipicamente menos do que 5%, mais tipicamente menos do que1%) em uma seqüência codificada, são "variaçõesconservativamente modificadas", onde as alterações resultamna substituição de um aminoácido por um aminoácidoquimicamente similar. Tabelas de substituiçõesconservativas que fornecem aminoácidos funcionalmentesimilares são bem conhecidas nessas técnicas. Os seguintesseis grupos contêm aminoácidos que são substituiçõesconservativas entre si: 1) Alanina (A), Serina (S), Treonina(T); 2) Ácido Aspártico (D), Ácido Glutâmico (E); 3)Asparagina (N), Glutamina (Q); 4) Arginina (R), Lisina (K);5) Isoleucina (I), Leucina (L), Metionina (M), Valina (V); e6) Fenilalanina (F), Tirosina (Y), Triptofano (W).

Como aqui descrito, as seqüências podem serotimizadas para a expressão em uma célula hospedeiraespecifica usada para produzir a proteína (por exemplo, umacélula vegetal, tal como um tomate, ou um sistema declonagem e expressão, tal como uma célula de levedura).Similarmente, "substituições conservativas de aminoácidos",em um ou poucos aminoácidos em uma seqüência de aminoácidossão substituídos por aminoácidos diferentes com propriedadesaltamente similares (vide a Seção de definições acima), sãotambém facilmente identificadas como sendo altamentesimilares a uma seqüência de aminoácidos especifica ou a umaseqüência de ácidos nucléicos especifica que codifica umaminoácido. Tais variações conservativamente substituídasde qualquer seqüência específica são uma característica dapresente invenção.

Um "complexo de distribuição" deve significar ummeio de assesto (por exemplo, uma molécula que resulta emligações de afinidade mais alta de uma proteína,polipeptídeo ou peptídeo, para a superfície da célula-alvoe/ou maior captação celular ou nuclear por uma célula-alvo).Os exemplos de meios de assesto incluem: esteróis (porexemplo, colesterol), lipídeos (por exemplo, lipídeocatiônico, virossoma ou lipossoma), vírus (por exemplo,vírus do mosaico do tabaco) ou agentes de ligação específicaà célula-alvo (por exemplo, ligantes reconhecidos porreceptores específicos da célula-alvo) . Os complexos úteissão suficientemente estáveis in vivo para impedir odesacoplamento significativo antes da internalização pelacélula-alvo. Entretanto, o complexo é clivável sobcondições apropriadas dentro da célula, de tal modo que ogene, proteína, polipeptídeo ou peptídeo seja liberado deuma forma funcional.

Como é bem sabido, os genes podem existir em umaúnica cópia ou em múltiplas cópias dentro do genoma de umindivíduo. Tais genes em duplicata podem ser idênticos oupodem ter certas modificações, incluindo substituições,adições ou deleções de nucleotídeos, todas elas aindacodificando polipeptideos que têm substancialmente a mesmaatividade. O termo "seqüência de DNA que codifica umpolipeptídeo-alvo" pode, assim, se referir a um ou maisgenes em um indivíduo específico. Além disso, podem existircertas diferenças em seqüências de nucleotídeos entreorganismos individuais, que são denominadas alelos. Taisdiferenças alélicas podem ou não resultar em diferenças naseqüência de aminoácidos do polipeptídeo codificado, e aindaassim codificar um polipeptídeo com a mesma atividadebiológica.

As expressões "rompimento do gene" e "rompimentoassestado" ou qualquer expressão similar refere-se àinterrupção específica do sítio de uma seqüência de DNAnativa de modo a impedir a expressão desse gene na célula,em comparação com a cópia do tipo selvagem do gene. Ainterrupção pode ser causada por deleções, inserções, oumodificações do gene, ou qualquer combinação.

O termo "sítio enzimático" refere-se à parte deuma molécula de proteína que contém um sítio catalítico. Amaioria dos sítios enzimáticos apresenta uma especificidadeseletiva de substrato muito alta. Um sítio enzimático podecompreender duas ou mais partes do sítio enzimático emsegmentos diferentes da mesma cadeia do polipeptídeo. Estaspartes do sítio enzimático são associadas entre si paraformar uma parte maior de um sítio enzimático. Uma parte deum sítio enzimático pode ser também um metal.

O termo "enzima" refere-se a uma proteína,polipeptídeo, molécula de RNA peptídica, ou proteínamultimérica capaz de acelerar ou produzir por açãocatalitica alguma mudança em um substrato pelo qual ela éfreqüentemente especifica.

0 termo "epítopo" refere-se a uma parte de umamolécula que é reconhecida especificamente por um produto deimunoglobulina. Ela é referida também como o determinanteou determinante imunogênico.

Como aqui utilizado, o termo "imunoglobulina" éuma proteína multimérica que contém partes imunologicamenteativas de uma cadeia pesada de imunoglobulina e de umacadeia leve de imunoglobulina acopladas de forma covalenteentre si e capazes de se combinarem especificamente com oantígeno.

Como aqui utilizado, um fragmento Fab é umaproteína multimérica que consiste na parte de uma moléculade imunoglobulina que contém as partes imunologicamenteativas de uma cadeia pesada de imunoglobulina e de umacadeia leve de imunoglobulina acopladas de forma covalenteentre si e capazes de se combinarem especificamente com oantígeno. Os fragmentos Fab são preparados tipicamente pordigestão proteolítica de moléculas de imunoglobulinasubstancialmente intactas com papaína, usando métodos bemconhecidos nessas técnicas. Entretanto, um fragmento Fabpode ser preparado também expressando em uma célulahospedeira apropriada as partes desejadas da cadeia pesadade imunoglobulina e da cadeia leve de de imunoglobulina,usando métodos bem conhecidos nessas técnicas.

Como aqui utilizado, um fragmentos F[v ]: umaproteína multimérica que consiste nas partesimunologicamente ativas de uma região variável da cadeiapesada de imunoglobulina e uma região da variável da cadeialeve de imunoglobulina, acopladas de forma covalente entresi e capazes de se combinarem especificamente com oantigeno. Os fragmentos F[v] são preparados tipicamenteexpressando em uma célula hospedeira apropriada as partesdesejadas da região variável da cadeia pesada deimunoglobulina e da região variável da cadeia leve deimunoglobulina, usando métodos bem conhecidos nessastécnicas.

Como aqui utilizado, o termo "gene" ou "generecombinante" refere-se a um ácido nucléico que compreendeuma estrutura de leitura aberta que codifica um polipeptideoda presente invenção, incluindo seqüências de éxons e(opcionalmente) introns. Um "gene recombinante" refere-se aum ácido nucléico que codifica tais polipeptideosreguladores, que podem incluir opcionalmente seqüências deintrons que são derivadas de um DNA cromossômico. Os genesrecombinantes exemplificativos incluem aqueles que codificamuma atividade de polipeptideo F-box.

Como aqui utilizado, o termo "DNA heterólogo" ou"ácido nucléico heterológo" inclui um DNA que não ocorrenaturalmente como parte do genoma no qual ele está presenteou que é encontrado em um local ou locais no genoma quediferem daqueles nos quais ele ocorre na natureza. 0 DNaheterólogo não é endógeno para a célula dentro da qual ele éintroduzido, mas foi obtido a partir de outra célula.Genericamente, embora não necessariamente, tal DNA codificao RNA e proteínas que não são normalmente produzidas pelascélulas na qual ele é expressado. O DNA heterólogo pode serreferido também como DNA estranho. Qualquer DNA que osversados nessas técnicas reconheceria ou consideraria comoheterólogo ou estranhopara a célula na qual ele é expressadoestá aqui englobado pelo termo DNA heterólogo. Os exemplosde DNA heterólogo incluem, porém sem limitações, DNA isoladoque codifica uma proteína F-box.

0 termo "homologia" ou "identidade" ou"similaridade" refere-se à similaridade de seqüências entredois peptídeos ou entre duas moléculas de ácidos nucléicos.A homologia pode ser determinada comparando uma posição emcada seqüência que pode ser alinhada com propósito decomparação. Quando uma posição na seqüência comparada éocupada pela mesma base ou aminoácido, então as moléculassão idênticas nessa posição. Um grau de homologia ousimilaridade ou identidade entre seqüências de ácidosnucléicos é função do número de nucleotídeos idênticos ouequivalentes em posições compartilhadas pelas seqüências deácidos nucléicos. Um grau de identidade de seqüências deaminoácidos é função do número de aminoácidos idênticos em20 posições compartilhadas pelas seqüências de aminoácidos. Umgrau de homologia ou similaridade de seqüências deaminoácidos é função do número de aminoácidos, isto é,estruturalmente relacionados, em posições compartilhadaspelas seqüências de aminoácidos. Uma seqüência "não-relacionada" ou "não-homóloga" compartilha menos do que 40%de identidade, ou menos do que 25% de identidade, com umadas seqüências da presente invenção.

O termo "inativação", com relação a genes dacélula hospedeira, significa que a produção de um produtogênico funcional é impedida ou inibida. A inativação podeser conseguida por deleção do gene, mutação do promotor, detal modo que a expressão ao ocorra, ou a mutação daseqüência codificadora, de tal modo que o produto gênicofique inativo (de forma constitutiva ou indutiva). Ainativação pode ser parcial ou total.

0 termo "interagir", como aqui utilizado,significa incluir relações ou associações detectáveis (porexemplo, interações bioquímicas) entre moléculas, tal como ainteração entre proteína-proteína, proteína-ácido nucléico,ácido nucléico-ácido nucléico, e proteína-molécula pequenaou ácido nucléico-molécula pequena na natureza.

0 termo "isolado", como aqui utilizado com relaçãoa ácidos nucléicos, tais como DNA ou RNA, refere-se amoléculas separadas de outros DNAs, ou RNAs,respectivamente, que estão presentes na origem natural damacromolécula. Por exemplo, os ácidos nucléicos quecodificam os polipeptídeos em questão incluem tipicamentenão mais do que 10 quilobases (kb) da seqüência de ácidosnucléicos que naturalmente flanqueia imediatamente esse geneno DNA genômico, ou não mais do que 5 kb dessas seqüênciasflanqueadoras de ocorrência natural, e mais utilmente menosdo que 1,5 kb da seqüência flanqueadora de ocorrêncianatural. 0 termo "isolado", como aqui utilizado, refere-setambém a um ácido nucléico ou polipeptídeo que ésubstancialmente isento de material celular material,material viral, ou meio de cultura, quando produzido portécnicas de DNA recombinante, ou precursores químicos ououtros produtos químicos quando sintetizados quimicamente.Além disso, um "ácido nucléico isolado" inclui fragmentos deácido nucléico que não são de ocorrência natural, pois osfragmentos não seriam encontrados no estado natural. 0termo "isolado" é também aqui utilizado para se referir apolipeptideos que estão isolados de outras proteínascelulares e engloba polipeptideos purificados erecombinantes.

O termo "knock-out" refere-se à supressão parcialou completa da expressão de um gene endógeno. Isso érealizado genericamente deletando uma parte do gene ousubstituindo uma parte por uma segunda seqüência, mas podeser causado também por outras modificações do gene, tal comoa introdução de códons de interrupção, a mutação deaminoácidos críticos, a remoção de uma junção de íntrons,etc.

O termo "marcador" ou "seqüência marcadora" ouexpressão similar significa qualquer gene que produz umgenótipo selecionável ou um fenótipo selecionável. Eleinclui exemplos tais como o gene de espectinomicina (spcR),neo gene (neoR), gene da proteína fluorescente verde (GFP)gene, gene de TK, gene de D-galactosidase, etc. A seqüênciamarcadora pode ser qualquer seqüência conhecida pelosversados nessas técnicas, que serve para estes propósitos,embora tipicamente a seqüência marcadora deva ser umaseqüência que codifica uma proteína que confere um traçoselecionável, tal como um gene de resistência a antibiótico,ou uma enzima que pode ser detectada e que não é tipicamenteencontrada na célula. A seqüência marcadora pode incluirtambém regiões reguladoras, tal como um promotor ouintensificador que regula a expressão dessa proteína.Entretanto, é possível também transcrever o marcador usandoseqüências reguladoras endógenas. Em uma modalidade dapresente invenção, o marcador facilita a separação decélulas transfectadas das não-transfectadas por seleção decélulas ativadas por fluorescência, por exemplo, pelo uso deum anticorpo marcado de forma fluorescente ou a expressão deuma proteína fluorescente, tal como GFP. Outras seqüênciasde DNA que facilitam a expressão de genes marcadores tambémpodem ser incorporadas nas construções de DNA da presenteinvenção. Estas seqüências incluem, porém sem limitações,sinais de iniciação e terminação da transcrição, sinais detranslação, sinais de modificação pós-translacionais,junções de íntrons removidos, sítios de ligação deribossomas, e sinais de poliadenilação, para mencionaralguns. A seqüência marcadora pode ser usada também paraapensar a seqüência ao gene-alvo. Por exemplo, ela pode serusada para adicionar um códon de interrupção à translação deF-box truncada. 0 uso de marcadores selecionáveis é bemconhecido nessas técnicas e não precisa ser aqui detalhado.O termo "modulação", como aqui utilizado, refere-se àregulação ascendente (isto é, ativação ou estimulação (porexemplo, agonizando ou potencializando)) e à regulaçãodescendente (isto é, inibição ou supressão (e.g., porexemplo, antagonizando ou inibindo)).

Um "gene mutado" ou "mutação" refere-se a umaforma alélica de um gene, que é capaz de alterar o fenótipode um indivíduo que tem o gene mutado em relação a umindivíduo que não tem o gene mutado. Caso um indivíduo sejahomozigótico para esta mutação para ter um fenótipoalterado, a mutação é dita como sendo recessiva. Caso umacópia do gene mutado seja suficiente para alterar o fenótipodo indivíduo, a mutação é dita como sendo dominante. Casoum indivíduo tenha uma cópia do gene mutado e tenha umfenótipo que é intermediário entre aquele de um homozigóticoe aquele de um indivíduo heterozigótico (para esse gene), amutação é dita como sendo co-dominante.

Como aqui utilizado, o termo "ácido nucléico"refere-se a polinucleot ídeos tal como o ácidodesoxirribonucléico (DNA), e, quando apropriado, ácidoribonucléico (RNA). O termo deve ser entendido comoincluindo formas de filamento único ou filamento duplo deácido nucléico, e, como equivalentes, análogos de RNA ouDNA. Tais análogos de ácidos nucléicos podem serconstituídos de análogos de nucleotídeos, e, conformeaplicável à modalidade que está sendo descrita, podem serpolinucleotídeos de filamento único (tal como sense ouantisense) ou filamento duplo.

A frase "seqüência de nucleotídeos complementar àseqüência de nucleotídeos enunciada em SEQ ID NO: x" refere-se à seqüência de nucleotídeos do filmento complementar deum filamento de ácido nucléico que tem SEQ ID NO: χ. Otermo "filamento complementar" é aqui utilizado de formaintercambiável com o termo "complemento". O complemento deum filamento de ácido nucléico pode ser o complemento de umfilamento codificador ou o complemento de um filamento não-codificador. Quando se faz referência a ácidos nucléicos defilamento duplo, o complemento de um ácido nucléico que temSEQ ID NO: χ refere-se ao filamento complementar dofilamento que tem SEQ ID NO: χ ou a qualquer ácido nucléicoque tem a seqüência de nucleotideos do filamentocomplementar de SEQ ID NO: x. Quando se faz referência a umácido nucléico de filamento único que tem a seqüência denucleotideos SEQ ID NO: χ, o complemento deste ácidonucléico é um ácido nucléico que tem uma seqüência denucleotideos que é complementar àquela de SEQ ID NO: x. Asseqüências de nucleotideos e suas seqüências complementaressão sempre fornecidas na direção de 5' para 3'.

A frase "ligada operacionalmente" refere-se a umaligação funcional entre um promotor e uma segunda seqüência,onde a seqüência promotora inicia a transcrição do RNAcorrespondente à segunda seqüência.

O termo "identidade percentual" refere-se àidentidade de seqüências entre duas seqüências deaminoácidos ou entre duas seqüências de nucleotideos. Cadaidentidade pode ser determinada comparando uma posição emcada seqüência que pode ser alinhada com o propósito decomparação. Quando uma posição equivalente nas seqüênciascomparadas é ocupada pela mesma base ou aminoácido, então asmoléculas são idênticas naquela posição; quando o sitioequivalente ocupado pelo mesmo resíduo de aminoácido ou porum aminoácido similar (por exemplo, similar na naturezaestérica e/ou eletrônica), então as moléculas podem serreferidas como homólogas (similares) naquela posição. Aexpressão como uma porcentagem de homologia/similaridade ouidentidade refere-se a uma função do número de aminoácidosidênticos ou similares em posições compartilhadas pelasseqüências comparadas. Vários algoritmos e/ou programas dealinhamento podem ser usados, incluindo FASTA, BLAST ouENTREZ. FASTA e BLAST estão disponíveis como parte do pacotede análise de seqüências GCG (Universidade de Wisconsin,Madison, Wisconsin), e podem ser usados, por exemplo, comajustes de omissões. ENTREZ está disponível no NationalCenter for Biotechnology Information, National Library ofMedicine, National Institutes of Health, Bethesda, MD. Emuma modalidade, a identidade percentual de duas seqüênciaspode ser determinada pelo programa GCG com peso deintervalos de 1, por exemplo, cada intervalo de aminoácido éponderado como se ele fosse um único desemparelhamento deaminoácido ou nucleotídeo entre as duas seqüências.

O termo "planta" inclui plantas integrais, órgãosde plantas (por exemplo, folhas, pedúnculos, flores, raízes,etc.), sementes e células vegetais e a progênie das mesmas.A classe de plantas que podem ser usadas no método dainvenção tão ampla quanto a classe de plantas superioressuscetíveis a técnicas de transformação, incluindo plantasmonocotilédones e dicotilédones, bem como certas plantasinferiores tais como algas. Ela inclui plantas de uma sériede níveis de ploidia, incluindo poliplóides, diplóides ehaplóides. As plantas de cultura úteis da invenção incluem,porém sem limitações, milho (Zea mays) , Brassica spp. (e.g.,canola (B. napus) , B. rapa, B. juncea) , particularmente asespécies de Brassica úteis como fontes de óleo de sementes,alfafa (Medicago sativa) , arroz (Oryza sativa) , centeio(Secale cereale), sorgo (Sorghum bicolor, Sorghum vulgare) ,painço (por exemplo, milheto-pérola (Pennisetum glaucum) ,painço (Panicum miliaceum), painço-português (Setariaitalica), capim-pé-de-galinha (Eleusine coracana) , girassol(Helianthus annuus), açafroa (Carthamus tinctorius) , trigo(Triticum aestivum), soja (Glycine max), tabaco (Nicotianatabacum), batata (Solanum tuberosum), amendoim (Arachishypogaea), algodão (Gossypium barbadense, Gossypiumhirsutum), batata-doce (Ipomoea batatus), mandioca (Manihotesculenta), café (Coffea spp.), coco (Cocos nucifera) ,abacaxi (Ananas comosus), árvores citricas (Citrus spp.),cacau (Theobroma cacao), chá-da-india (Camellia sinensis) ,banana (Musa spp.), abacate (Persea americana) , figo (Ficuscasica), goiaba (Psidium guajava) , manga (Mangifera indica),oliva (Olea europaea), mamão (Carica papaya) , caju(Anacardium occidentale), macadâmia (Maeadamiaintegrifolia) , amêndoa (Prunus amygdalus) , beterraba (Betavulgaris), cana-de-açúcar (Saeeharum spp.), aveia, cevada,vegetais, plantas ornamentais, e coniferas.

O termo "planta" refere-se ainda às seguintesclasses de espécies vegetais:

Dicotilédones (dicot): uma planta florescentecujos embriões têm duas metades de sementes ou cotilédones.

Os exemplos de dicotilédones são: tabaco; tomate; os legumesincluindo alfafa; carvalho; bordo; rosa; hortelãs; abóboras;margaridas; nozes; cactos; violetas; e botão-de-ouro.

Monocotilédones (monocot): uma planta florescentecuos embriões têm um cotilédone ou folha de semente. Osexemplos não-limitativos de monocotilédones são: lírios;gramíneas; milho; grãos, incluindo aveia, trigo e cevada;orquídeas; íris; cebolas e palmas."Planta inferior" refere-se a uma planta não-florescente, incluindo samambaias, gimnospermas, coniferas,cavalinhas, licopódios, hepáticas, ceratofiláceas, musgos,algas vermelhas, algas marrons, gametófitos, esporófitos depteridófitos, e algas verdes.

Genericamente, as plantas de interesse incluemplantas granosas que produzem sementes de interesse, plantascom sementes oleaginosas, e plantas leguminosas. Assementes de interesse incluem sementes granosas, tais comomilho, trigo, cevada, arroz, sorgo, centeio, painço, etc.

As plantas com sementes oleaginosas incluem algodão, soja,açafroa, girassol, brássica, milho, alfafa, palma, coco,linho, mamona, oliva, etc. As plantas leguminosas incluemfavas e ervilhas. As favas incluem guar, alfarroba, feno-grego, soja, feijoeiros, feijão-fradinho, feijão-da-india,feijão-de-lima, feijão-fava, lentilhas, grão-de-bico, etc.

O termo "promotor" refere-se a uma região deseqüências de ácidos nucléicos, localizada a montante e/ou ajusante do inicio da transcrição, que auxiliam noreconhecimento, ligação e/ou iniciação da RNA polimerase ououtras proteínas de transcrição que iniciam a transcrição deum gene associado. Um "promotor vegetal" é um promotorcapaz de iniciar a transcrição em células vegetais. Um"promotor leucina aminopeptidase vegetal" é um promotorderivado de um gene de leucina aminopeptidase, por exemplo,clonando, isolando ou modificando de forma recombinante umpromotor nativo a partir de um gene de leucinaaminopeptidase.Um "ácido nucléico recombinante" compreende ou écodificado por um ou mais ácidos nucléicos derivados de deum ácido nucléico construído artificialmente. Por exemplo,o ácido nucléico pode compreender ou ser codificado por umácido nucléico clonado formado unindo ácidos nucléicosheterólogos, como enunciado, por exemplo, em Berger eKimxnel, "Guide to Molecular Cloning Techniques", "Methods InEnzymology", _Volume 152 Academic Press, Inc., San Diego, CA(Berger), e em Sambrook et al., "Molecular Cloning - ALaboratory Manual" (2- edição) Volumes 1-3 (1989)(Sambrook), e em "Current Protocols In Molecular Biology",editores Ausubel, F. M.,. et al., Greene PublishingAssociates, Inc. e John Wiley & Sons, Inc., (suplemento de1996) (Ausubel) . Alternativamente, o ácido nucléico podeser sintetizado quimicamente.

Como aqui utilizado, o termo "construção de generepórter" é um ácido nucléico que inclui um "gene repórter"ligado operacionalmente a seqüências reguladorastranscricionais. A transcrição do gene repórter gene écontrolada por estas seqüências. As seqüências reguladorastranscricionais incluem as regiões do promotor e outrasregiões reguladoras, tais como seqüências intensificadoras,que modulam a atividade do promotor, ou seqüênciasreguladoras que modulam a atividade ou eficiência da RNApolimerase que reconhece o promotor, ou as seqüênciasreguladoras são reconhecidas por moléculas efetoras.

Como aqui utilizado, o termo "ácido nucléico"refere-se a polinucleotideos ou oligonucleotideos, tal comoo ácido desoxirribonucléico (DNA), e, quando apropriado, oácido ribonucléico (RNA). 0 termo deve ser entendido tambémcomo incluindo equivalentes, análogos de RNA ou DNApreparados a partir de análogos de nucleotideos, e conformeaplicável à modalidade que está sendo descrita,polinucleotideos de filamento único (sense ou antisense) ede filamento duplo.

Como aqui utilizado, o termo "promotor" significauma seqüência de DNA que regula a expressão de uma seqüênciade DNA selecionada ligada operacionalmente ao promotor, eque efetua a expressão da seqüência de DNA selecionada emcélulas. O termo engloba promotores "específicos detecidos", isto é, promotores que efetuam a expressão daseqüência de DNA selecionada apenas em células específicas(por exemplo, células de um tecido específico). O termocobre também os assim denominados promotores "leaky" queregulam a expressão de um DNA selecionado principalmente emum tecido, mas causam a expressão também em outros tecidos.

O termo engloba também promotores não-específicos de tecidose promotores que expressam de forma constitutiva ou que sãoinduzíveis (isto é, os níveis de expressão podem sercontrolados).

Os termos "proteína", "polipeptídeo" e "peptídeo"são utilizados de forma intercambiável quando se referem aum produto gênico.

0 termo "proteína recombinante" refere-se a umpolipeptídeo da presente invenção que é produzido portécnicas de DNA recombinante, onde, genericamente, o DNA quecodifica um polipeptídeo específico é inserido em um vetorde expressão apropriado, o qual, por sua vez, é usado paratransformar uma célula hospedeira · a fim de produzir aproteína heteróloga. Além disso, a frase "derivado de", comrelação a um gene-alvo recombinante, pretende incluir dentrodo significado de "proteína recombinante" as proteínas quetêm uma seqüência de aminoácidos de um polipeptídeo-alvonativo, ou uma seqüência de aminoácidos similar a ela, que égerada por mutações, incluindo substituições e deleções(incluindo truncamento) de uma forma de ocorrência naturaldo polipeptídeo.

Como aqui utilizado, o termo "célulasrecombinantes" inclui quaisquer células que forammodificadas pela introdução de DNA heterólogo. Células decontrole incluem células que são substancialmente idênticasàs células recombinantes, mas não expressam uma ou mais dasproteínas codificadas pelo DNA heterólogo, por exemplo, nãoincluem ou expressam um gene de F-box recombinante.

O termo "molécula pequena", como aqui tilizado,pretende se referir a uma composição que tem peso molecularmenor do que cerca de 5 kD, e mais preferivelmente, menor doque cerca de 4 kD. As moléculas pequenas podem ser ácidosnucléicos, peptídeos, polipeptídeos, peptidomiméticos,carboidratos, lipídeos ou outras moléculas orgânicas (quecontêm carbono) ou inorgânicas. Muitas empresasfarmacêuticas têm bibliotecas extensas de misturas químicase/ou biológicas, freqüentemente extratos fúngicos,bacterianos ou algais, que podem ser triados com qualquer umdos ensaios da invenção para identificar compostos quemodulam uma bioatividade-alvo.Como aqui utilizado, o termo "hibridizaespecificamente" ou "detecta especificamente" refere-se àcapacidade de uma molécula de ácido nucléico da invençãohibridizar para aproximadamente 6, 12, 20, 30, 50, 100, 150,200, 300, 350, 400 ou 425 nucleotideos consecutivos de umgene, mais preferivelmente um gene de F-box vegetal.

O termo "substancialmente homóloga", quandoutilizado com relação a seqüências de aminoácidos, refere-sea seqüências que são substancialmente idênticas ou similaresem seqüência, gerando uma homologia em conformação, e assimsendo, uma atividade biológica similar. O termo pretendeinferir uma evolução comum das seqüências.

Como aqui utilizado, o termo "transfecção"significa a introdução de um ácido nucléico, por exemplo,por intermédio de um vetor de expressão, em uma célularecebedora por transferência gênica mediada por ácidonucléico. Os métodos para transformação conhecidos nessastécnicas incluem qualquer meio elétrico, magnético, físico,biológico ou químico. Como aqui utilizado, o termo"transfecção" inclui técnicas específicas tais comoeletroporação, magnetoporação, tratamento com Ca++, injeção,bombardeio, infecção retroviral e lipofecção, dentre outros.O termo "transformação", como aqui utilizado, refere-se a umprocesso no qual o genótipo de uma célula é mudado comoresultado da captação celular de DNA ou RNA exógeno, e, porexemplo, a célula transformada expressa uma formarecombinante de um polipept ídeo-alvo ou, no caso daexpressão anti-sense a partir do gene transferido, aexpressão de uma forma de ocorrência natural dopolipeptídeo-alvo é rompida.

Como aqui utilizado, o termo "transgene" significauma seqüência de ácidos nucléicos (que codifica, porexemplo, um dos polipeptideos-alvo, ou um transcritoantisense a ele) que foi introduzida em uma célula. Umtransgene poderia ser parcial ou inteiramente heterólogo,isto é, estranho para o animal ou células transgênica naqual ele é introduzido, ou, é homólogo a um gene endógeno doanimal ou célula transgênica dentro da qual ele éintroduzido, mas que é desenhado para ser inserido ou éinserido no genoma do animal, de modo a alterar o genoma dacélula dentro da qual ele é inserido (por exemplo, ele éinserido em um local que difere daquele do gene natural ousua inserção resulta em knockout) . Um transgene pode estartambém presente em uma célula na forma de um epissoma. Umtransgene pode incluir uma ou mais seqüências reguladorastranscricionais e qualquer outro ácido nucléico, tais comointrons, que podem ser necessários para a expressão ideal deum ácido nucléico selecionado.

Uma "planta transgênica" refere-se a qualquerplanta na qual uma ou mais das células da planta contêm umácido nucléico introduzido por meio de intervenção humana,tal como por técnicas transgênicas bem conhecidas nessecampo cientifico. O ácido nucléico é introduzido na célula,direta ou indiretamente, pela introdução em um precursor dacélula, por meio de manipulação genética deliberada, talcomo por microinjeção ou por infecção com um virusrecombinante. O termo "manipulação genética" não incluihibridização clássica, mas ao invés disso é direcionada paraa introdução de uma molécula de DNA recombinante. Estamolécula pode ser integrada dento de um cromossoma, ou elapode ser DNA replicativo de forma extracromossômica. Nasplantas transgênicas típicas aqui descritas, o transgene fazcom que as células expressem uma forma recombinante dospolipeptídeos-alvo, por exemplo, formas agonísticas ouantagonisticas. Entretanto, as plantas transgênicas nasquais o gene-alvo recombinante é silencioso também estãocontempladas, como por exemplo, construções recombinantesdependentes FLP ou CRE. Além disso, o termo "plantatransgênica" inclui também os animais recombinantes nosquais o rompimento do gene de um ou mais genes vegetais écausada por intervenção humana, incluindo técnicas derecombinação e antisense. Uma "planta transgênica" é,ainda, uma que foi geneticamente modificada para conter eexpressar seqüências de DNA heterólogas, seja como moléculasde RNA reguladoras ou como proteínas. Como aquiespecificamente exemplificado, uma planta transgênica émodificada geneticamente para conter e expressar pelo menosuma seqüência de DNA heteróloga ligada operacionalmente esob o controle regulador de seqüências de controle datranscrição que funcionam em células ou tecidos vegetais ouem plantas integrais. Como aqui utilizado, o termo "plantatransgênica" refere-se também à progênie da plantatransgênica inicial cuja progênie contém e são capazes deexpressar a seqüência codificadora heteróloga sob o controleregulador das seqüências de controle da transcriçãoexpressáveis em plantas, aqui descritas. As sementes quecontêm embriões transgênicos estão englobadas dentro destadefinição, como o são retalhos e outros materiais da plantapara propagação vegetativa de uma planta transgênica.

Quando a expressão vegetal de um gene heterólogoou seqüência codificadora de interesse é desejada, estaseqüência codificadora é ligada operacionalmente naorientação sense a um promotor apropriado e vantajosamentesob o controle regulador de seqüências de DNA que regulamquantitativamente a transcrição de uma seqüência a jusanteem células ou tecidos vegetais ou em plantas, na mesmaorientação que o promotor, de tal modo que seja produzido umRNAm sense (isto é, funcional para a expressãotranslacional). Um sinal da terminação da transcrição, porexemplo, como sinal de poliadenilação, funcional em umacélula vegetal fica vantajosamente colocado a jusante daseqüência codificadora de resistência a metais ouorganometálicos, e um marcador selecionável que pode serexpressado em uma planta, pode ser ligado de forma covalenteà unidade de expressão induzivel, de tal modo que depoisdisso esta molécula de DNA seja introduzida em uma célula outecido vegetal, sua presença possa ser selecionada e ascélulas ou tecidos vegetais não assim transformados sejamexterminados ou impedidos de crescer. Na presente invenção,a seqüência codificadora de resistência ao mercúrio podeservir como um marcador selecionável para transformação decélulas ou tecidos vegetais. Quando a expressão de um geneconstitutivo é desejada, os promotores apropriadosexpressáveis em plantas incluem os promotores 35S ou 19S dovirus do mosaico da couve-flor, os promotores "nos", "ocs"ou "mas" de plasmideos Ti de Agrobacterium tumefaciens, eoutros conhecidos nessas técnicas. Quando a expressãoespecifica de tecidos da seqüência codificadora deresistência a metais expressável em plantas for desejada, osversados nessas técnicas devem escolher entre inúmerasseqüências bem conhecidas para mediar essa forma deexpressão gênica. Promotores regulados ambientalmente

também são conhecidos nessas técnicas, e os versados nessastécnica podem escolher entre seqüências reguladoras datranscrição para conseguir o resultado desejado.

0 termo "seqüência reguladora transcricional" é umtermo genérico utlizado neste relatório descritivo inteiropara se referir a seqüências de DNA, tais como sinais deiniciação, intensificadores e promotores que induzem oucontrolam a transcrição de seqüências codificadoras deproteínas com as quais elas estão ligadas operacionalmente.Em algumas modalidades, a transcrição de um generecombinante fica sob o controle de uma seqüência promotora(ou outra seqüência reguladora transcricional) que controlaa expressão do gene recombinante em um tipo de célula noqual a expressão é intencionada. Deve-se entender que ogene recombinante pode ficar sob o controle de seqüênciasreguladoras transcricionais que são iguais ou diferentesdaquelas seqüências que controlam a transcrição da forma deocorrência natural da proteína.

0 termo "vetor" refere-se a uma molécula de ácidonucléico capaz de transportar outro ácido nucléico ao qualele foi ligado. Um tipo de vetor útil é um epissoma, istoé, um ácido nucléico capaz de replicação extracromossômica.São particularmente úteis os vetores capazes de replicaçãoe/ou expressão autônoma de ácidos nucléicos aos quais elesestão ligados. Os vetores capazes de direcionar a expressãode genes aos quais eles estão ligados operacionalmente sãoaqui referidos como "vetores de expressão". Genericamente,os vetores de expressão de utilidade em técnicas de DNArecombinante estão freqüentemente na forma de "plasmídeos"que se referem genericamente a alças circulares de DNA defilamento duplo, as quais, na sua forma de vetor não estãoligadas ao cromossoma. No presente relatório descritivo,"plasmídeo" e "vetor" são utilizados de formaintercambiável, pois a forma mais comumente usada de vetor.Entretanto, a invenção pretende incluir outras formas devetores de expressão que servem para funções equivalentes eque se tornam conhecidos nessas técnicas subseqüentemente.

O termo "alelo do tipo selvagem" refere-se a umalelo de um gene, que, quando presente em duas cópias em umindivíduo resulta em um fenótipo do tipo selvagem. Podemexistir vários alelos do tipo selvagem diferentes de um geneespecífico, pois certas mudanças de nucleotídeos em um genepodem não afetar o fenótipo de um indivíduo que tem duascópias do gene com as cópias de nucleotídeos.

4.3 Seqüências de Ácidos Nucléicos de F-box e Polipeptídeos

As seqüências de de ácidos nucléico e proteínas F-Box da invenção incluem a proteína F-box de Arabidopsisthaliana (N— de Acesso do GenBank NM_111499 (DNAc) eNP_566277 (proteína), vide Figuras IOB e 10A,respectivamente).Outros ácidos nucléicos e polipeptideosequivalentes include aqueles discerniveis a partir dasinopse que se segue desta família de proteínas F-box(At3g0624 0).

SIMILARIDADES DE PROTEÍNAS SELECIONADAS

Comparação de seqüências em UniGene com proteínassustentadas por um genoma completo. Os alinhamentos podemsugerir a função de um gene.

A. thaliana referência: NP_566277.1 - proteínaexpressada [Arabidopsis thaliana] 100 % / 416 aa (videProtEST)

EXPRESSÃO GÊNICA

Tecidos e estágios de desenvolvimento a partir daexpressão gênica das seqüências deste gene. Ligações aoutros recursos de expressão de NCBI.

Fontes de DNAc: mistura de síliqua e flor ;síliquas verdes; raízes; semente; tecido vegetativo adulto;botões de flores; flores e botões; flores abertas seminflorescência ou mis velhas.

Perfis de GEO: Perfis da expressão gênica na basede dados do NCBI Gene Expression Omnibus.

POSIÇÃO NO MAPEAMENTO

Localização genômica especificada por mapeamentode transcritos, mapeamento de híbridos por radiação,mapeamento genético ou mapeamento citogenético.

Cromossoma de Arabidopsis: III

SEQÜENCIASAs Seqüências que representam este gene; RNAm's,ESTs, e previsões do gene fundamentadas por seqüênciastranscritas.

NM_1114 99.3 Proteína da família F-box deArabidopsis thaliana (At3g06240) RNAm, completo cds P

AY08 4 423.1 clone de Arabidopsis thaliana 108003RNAm, seqüência completa P

RNAm At3g0 62 4 0 de Arabidopsis thaliana AK118303.1para proteína desconhecida, cds completo, clone: RAFL19-58-P14 P

RNAm (At3g06240) da família de proteínas F-boxputativas do clone U50970 de Arabidopsis thalianaBTOO6048.1, cds completo P

Seqüência completa do DNAc de comprimento inteirode Arabidopsis thaliana BX824678.1 a partir do cloneGSLTPGH64ZAO6 do calo tratado com hormônio da cepa col-0 deArabidopsis thaliana (agrião-amargo) P

Seqüência completa do DNAc de comprimento inteirode Arabidopsis thaliana BX829355.1 a partir do cloneGSLTSIL94ZFll da síliqua da cepa col-0 de Arabidopsisthaliana (agrião-amargo) PSeqüências EST (19)

BP842389.1 Clone RAFL21-54-K05 5' lido

BP825839.1 Clone RAFL22-69-013 mistura de síliquae flor 5' lido

BP824 4 03.1 Clone RAFL22-09-H01 mistura de síliquae flor 5' lido

BP817574.1 Clone RAFL22-45-F24 mistura de síliquae flor 5' lidoΒΡ652696.1 Clone RAFL19-94-A01 misturas de siliquae flor 3' lido

BP644487.1 Clone RAFL19-65-J12 mistura de siliquae flor 3' lido

BP643288.1 Clone RAFL19-61-H05 mistura de siliquae flor 3' lido

CF773451.1 Clone 17B03 flores abertas seminflorescência ou mais velhas

BX8 38 532.1 Clone GSLTFB50ZF02 flores e botões 5'lido P

BX8 3 68 58.1 Clone GSLTLS7 9ZF01 tecido vegetativoadulto 5' lido

BX8 37 508.1 Clone GSLTLS7 9ZE01 tecido vegetativoaduto 5' lido P

AU239163.1 Clone RAFL19-58-P14 mistura de siliquae floro 5' lido P

AU2 304 4 0.1 Clone RAFL19-58-P14 mistura de siliquae flor 3' lido

AV562416.1 Clone SQ169Í12F siliquas verdes 3'lido A

AV551881.1 Clone RZ15g09R raízes 5' lido

AV54 04 0 6.1 Clone RZ15g09F raízes 3' lido P

AV534 311.1 Clone FB078a02F botões de flores 3'lido P

BE525819.1 Clone 600034345R1 semente 5' lidoBE523193.1 Clone M35B4 semente 5' lido P.

Proteínas F-box Homólogas

A invenção fornece ainda genes codificadores deproteínas F-box, que são homólogas àquelas aqui descritasespecificamente (por exemplo, a proteína F-box deArabidopsis thaliana ilustrada na Figura 10A, e a seqüênciacodificadora correspondente demarcada na Figura 10B). Porexemplo, as seqüências de nucleotídeos equivalentes incluemas seqüências que diferem em uma ou mais substituições,adições ou deleções de nucleotídeos, tais como as variaçõesintragênero; e incluem também seqüências que diferem daseqüência de nucleotídeos que codifica a parte da proteínaaqui representada em virtude da degeneração do códigogenético. Os ácidos nucléicos equivalentes incluem tambémas seqüências de nucleotídeos que hibridizam sob condiçõesseveras (isto é, equivalentes a cerca de 20-27° C abaixo datemperatura de fusão (Tm) do DNA duplex formado em sal cercade 1 M) para uma seqüência de nucleotídeos de um geneheterólogo da invenção.

Os ácidos nucléicos particularmente úteiscodificam polipeptídeos que compreendem uma seqüência deaminoácidos que é pelo menos 70% idêntica, 80% idêntica ou85% idêntica a uma seqüência de aminoácidos da invenção. Osácidos nucléicos que codificam polipeptídeos,particularmente polipeptídeos que retêm um atividade de umdos genes heterólogos em questão que conferem uma atividadede F-box, e que compreendem uma seqüência de aminoácidos queé pelo menos cerca de 90%, ou pelo menos cerca de 95%, emais preferivelmente pelo menos cerca de 98-99% idêntica auma seqüência de aminoácidos da invenção, também estãodentro do âmbito da invenção.

Outro aspecto da invenção fornece um ácidonucléico que hibridiza sob condições de alta ou baixaseveridade para um ácido nucléico que codifica umpolipeptideo idêntico ou homólogo a uma seqüência deaminoácidos da invenção. As condições de severidadeapropriadas, que promovem a hibridização do DNA, porexemplo, 6,0 χ cloreto de sódio/citrato de sódio (SSC) acerca de 45 °C., em seguida uma lavagem com 2,0 χ SSC a 50°C, são conhecidas pelos versados nessas técnicas ou podemser encontradas em "Current Protocols in Molecular Biology",John Wiley & Sons, NY (1989) 6.3.1-6.3.6. Por exemplo, aconcentração de sais na etapa de lavagem pode serselecionada entre uma baixa severidade de cerca de 2,0 χ SSCa 50 °C até uma alta severidade de cerca de 0,2 χ SSC a 50°C. Além disso, a temperatura na etapa de lavagem pode seraumentada de condições de baixa severidade à temperaturaambiente, cerca de 22 °C, até alta severidade a cerca de 65°C.

Os ácidos nucléicos isolados que codificam umaproteína heteróloga da presente invenção, mas que diferemdas seqüências de nucleotídeos aqui referidas, em virtude dadegeneração do código genético, também estão dentro doâmbito da invenção. Tais ácidos nucléicos são entendidoscomo sendo capazes de codificar polipeptídeos funcionalmenteequivalentes (isto é, um polipeptideo que tem pelo menos umaparte da atividade biológica de uma proteína codificadapelas seqüências enumeradas). Por exemplo, inúmerosaminoácidos são designados por mais do que um triplete. Oscódons que especificam o mesmo aminoácido (por exemplo, CAUe CAC são sinônimos de histidina) podem resultar em mutações"silenciosas" que não afetam a seqüência de aminoácidos daproteína. Entretanto, espera-se que polimorfismos deseqüências de DNA, que realmente levam a mudanças nasseqüências de aminoácidos da proteína devem existir, mesmodentro da mesma espécie. Os versados nessas técnicas devemavaliar que estas variações em um ou mais nucleotídeos (atécerca de 3-4% dos nucleotídeos) de um gene que codifica umaproteína podem existir entre células individuais de uma dadaespécie, por exemplo, entre uma população de células deArabidopsis thaliana, em virtude a uma variação alélicanatural. Qualquer uma e todas essas variações denucleotídeos e os polimorfismos de aminoácidos resultantesestão dentro do âmbito desta invenção.

Os fragmentos das partes que codificam ácidosnucléicos da F-box heteróloga em questão, tais como osfragmentos que retêm a capacidade de interagir com a viaproteolítica de ubiquitina, também estão dentro do âmbito dainvenção. Como aqui utilizados, tais fragmentos se referema seqüências de nucleotídeos que têm menos nucleotídeos doque a seqüência codificadora do gene, mas ainda assimincluem o suficiente da seqüência codificadora de modo acodificar um polipeptídeo com pelo menos uma parte daatividade da proteína de comprimento inteiro.

Em ainda outra modalidade, os genes reguladoresrecombinantes pode incluir ainda seqüências de nucleotídeosadicionais. Por exemplo, o gene recombinante pode incluirseqüências de nucleotídeos de um fragmento da PCR geradoampliando o gene a partir de uma biblioteca de DNA genômico,por exemplo, seqüências não-codificadoras de 5' e 3' dequalquer um dos genes em questão.Os ácidos nucléicos dentro do âmbito da invençãopodem conter também seqüências ligantes, sítios deendonucleases de restrição modificados e outras seqüênciasúteis para clonagem molecular, expressão ou purificação dospolipeptídeos recombinantes.

Como indicado pelos exemplos enunciados abaixo, umácido nucléico que codifica uma das proteínas em questãopode ser obtido a partir do RNAm presente em uma amostra decélulas eucarióticas, tais como aquelas de uma plantavascular. Será possível também obter ácidos nucléicos quecodificam s proteínas em questão a partir do DNA genômicoobtido a partir de tais células. Por exemplo, um gene quecodifica uma das proteínas F-box em questão pode ser clonadoa partir de um um DNAc ou uma biblioteca genômica de outrasespécies vegetais de acordo com os protocolos aquidescritos, bem como aqueles conhecidos genericamente nessastécnicas. Por exemplo, um DNAc que codifica uma proteínaheteróloga pode ser obtido isolando o RNAm total de umaplanta, gerando DNAc's de filamento duplo a partir do RNAmtotal, clonando o DNAc em um plasmídeo ou vetor bacteriófagoapropriado, e isolando os clones que expressam a proteína emquestão, usando qualquer uma das inúmeras técnicasconhecidas, por exemplo, sondas de oligonucleotídeos,análise Western blot, ou complementação. Os genes quecodificam proteínas relacionadas também podem ser clonadosusando técnicas estabelecidas de reação de polimerase emcadeia, de acordo com as informações sobre as seqüências denucleotídeos fornecidas pela invenção. 0 ácido nucléico dainvenção pode ser DNA ou RNA.Além disso, a seqüência de nucleotideosdeterminada a partir da clonagem dos genes heterólogos emquestão permitirá a geração de sondas desenhadas para uso naidentificação do DNA transgênico heterólogo, bem como paradetectar a presença do RNAm heterólogo correspondente. Porexemplo, os ácidos nucléicos em questão podem ser usadosapós o assesto transgênico para confirmar a presença e aintegridade da seqüência introduzida bem como a quantidade ea especificidade da expressão na progênie transgênica. Porexemplo, a presente invenção fornece uma sonda/iniciador quecompreende um oligonucleotideo substancialmente purificado,onde o oligonucleotideo compreende uma região da seqüênciade nucleotideos que hibridiza sob condições severas parapelo menos 10, 25, 50, ou 100 nucleotideos consecutivos daseqüência sense ou antisense de um dos ácidos nucléicos emquestão, ou seus mutantes de ocorrência natural. Em algumasmodalidades, a sonda/iniciador compreende ainda um grupomarcador anexado a à sonda/iniciador para ser detectado; porexemplo, o grupo marcador é selecionado no grupo queconsiste em radioisótopos, compostos fluorescentes, enzimas,e co-fatores de enzimas.

Outras Proteínas F-box

Ainda outras proteínas F-box para uso na invençãosão conhecidas nessas técnicas e estão descritasespecificamente alhures (vide, por exemplo, patentes n— US6.573.094 e 6.232.081, cujos teores são aqui incorporadoscomo referência em sua totalidade). Outras proteínas F-boxvegetais conhecidas incluem a proteína F-box TIR1, umreceptor de auxina (vide Dharmasiri et al., Nature. 435:441-5 (2005); η2 de Acesso do GenBank Q570C0; GI: 68053009), bemcomo três proteínas F-box adicionais, denominadas AFBl, 2, e3, que também regulam a resposta de auxina (vide Dharmasiriet al., Dev. Cell 9:109-119 (2005)). Na realidade, o genomade Arabidopsis sozinho codifica quase 700 proteínas F-box(vide Gagne et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 99:11519-24(2002)). Ainda outras proteínas F-box vegetais sãoconhecidas nessas técnicas e estão disponíveis para osversados nessas técnicas usando métodos apenas rotineiros emclonagem gênica.

Vetores

Esta invenção fornece também vetores de expressãoque incluem uma seqüência de nucleotídeos que codifica umdos polipeptídeos em questão, e ligada operacionalmente apelo menos uma seqüência reguladora. Ligadaoperacionalmente pretende significar que a seqüência denucleotídeos está ligada a uma seqüência reguladora de umamaneira que permite a expressão da seqüência denucleotídeos. As seqüências reguladoras vegetais sãoreconhecidas nessas técnicas. Conseqüentemente, o termo"seqüência reguladora" inclui promotores, intensificadores eoutros elementos de controle da expressão. As seqüênciasreguladoras vegetais exemplificativas estão descritas emYusibo et al., Curr. Top. Micro. Immun. 240:81-94 (1999) eHood et al., Adv.Exp. Med. Biol. 464:127-47 (1999). Porexemplo, qualquer uma entre uma série de seqüências decontrole da expressão que controlam a expressão de umaseqüência de DNA quando ligada operacionalmente a ela podeser usada nesses vetores para expressar seqüências de DNAque codificam as proteinas e os ácidos nucléicos dainvenção, que conferem o traço genético de Zostera. Taisseqüências úteis de controle da expressão incluem, porexemplo, o promotor constitutivo de ubiquitina do milho(promotor ubi) (Christensen et al., Plant Mol. Biol. 18:675-89 (1992); Cornejo et alPlant Mol. Biol. 23:567-81(1993)) e a seqüência terminadora PinII da batata (Δη etal., Plant Cell 1:115-22 (1989)). Outras seqüência decontrole da expressão são aquelas derivadas de virusvegetais tais como: o promotor 35S, que é derivado deseqüências do viruso do mosaico da couve-flor; e o promotorda proteína de revestimento TMV, tal como aquele contido novetor de clonagem designado "30B" que é derivado do vírus domosaico do tabaco. Estão incluídas também em certos aspectosda invenção as seqüências reguladoras transcricionais não-vegetais, tais como os promotores precoces e tardios deSV40, promotor precoce imediato de adenovírus oucitomegalovírus, os sistema lac, o sistema trp, o sistemaTAC ou TRC, promotor T7 cuja expressão é direcionada por T7RNA polimerase, as maiores regiões operadoras e promotorasdo fago lambda, as regiões de controle para a proteína derevestimento fd, o promotor para 3-fosfoglicerato cinase ououtras enzimas glicolíticas, os promotores de fosfataseácida, por exemplo, Pho5, os promotores dos fatores dereprodução "a" de leveduras, o promotor poliedro dos sistemade baculovírus e outras seqüências que reconhecidamentecontrolam a expressão de genes de células procarióticas oueucarióticas ou seus vírus, e várias combinações deles. De-se entender que o desenho do vetor de expressão podedepender de fatores tais como a escolha da célula hospedeiraa ser transformada e/ou do tipo de proteína que se desejaexpressar. Além disso, o número de cópias do vetor, acapacidade de controlar o número e a expressão de quaisqueroutras proteínas codificadas pelo vetor, tais comomarcadores de antibióticos, também devem ser considerados.

A construção recombinante da presente invençãopode incluir um marcador selecionável para propagação daconstrução. Por exemplo, uma construção a ser propagada embactérias contém, de preferência, um gene de resistência aantibiótico, tal como aquele que confere resistência àcanamicina, tetraciclina, estreptomicina, ou cloranfenicol.Os vetores apropriados para propagar a construção incluemplasmídeos, cosmídeos, bacteriófagos ou virus, paramencionar apenas alguns.

Além disso, as construções recombinantes podemincluir genes de marcadores expressáveis em plantasselecionáveis ou que podem ser triados, para isolar,identificar ou rastrear células vegetais transformadas porestas construções. Os marcadores selecionáveis incluem,porém sem limitações, genes que conferem resistências aantibióticos (por exemplo, resistência à canamicina ouhigromicina) ou resistência a herbicidas (por exemplo,resistência a sulfoniluréia, fosfinotricina, ou glifosato).

Os marcadores que podem ser triados incluem, porém semlimitações, os genes que codificam beta-glicuronidase(Jefferson, Plant Mol. Biol. Rep. 5:387-405 (1987)),luciferase (Ow et al., Sei. 234:856-859 (1986)), produtosgênicos B e Cl que regulam a produção do pigmentoantocianina (Goffet et al., EMBO J. 9:2517-2522 (1990)).

A presente invenção pode utilizar também o sistemade Agrobacterium para transformar plantas, sendo que asconstruções de DNA recombinante compreendem adicionalmentepelo menos a seqüência limítrofe direita do T-DNA queflanqueia as seqüências de DNA a serem transformadas nacélula vegetal. Em algumas modalidades, as seqüências aserem transferidas flanqueadas pelas seqüências limítrofesdireita e esquerda do T-DNA. O desenho e a construçãoapropriada desses vetores de transformação baseados em T-DNAsão bem conhecidas pelos versados nessas técnicas.

Esta invenção refere-se também a uma célulahospedeira transfectada com uma gene recombinante para queela possa expressar uma proteína recombinante da presenteinvenção. A célula hospedeira pode ser qualquer célulaprocariótica ou eucariótica. Por exemplo, uma proteína F-box vegetal da presente invenção pode ser expressada emcélulas bacterianas, tal como E. coli, células de insetos,levedura, ou células de mamíferos. Outras célulashospedeiras apropriadas são conhecidas pelos versados nessastécnicas.

Outro aspecto da presente invenção refere-se aformas recombinantes das proteínas vegetais em questão. 0termo "proteína recombinante" refere-se a uma proteína dapresente invenção que é produzida por técnicas de DNArecombinante, onde genericamente o DNA que codifica aproteína é inserido em um vetor de expressão apropriado, oqual, por sua vez, é usado para transformar uma célulahospedeira para produzir a proteína heteróloga. Além disso,o termo "derivado de", com relação a um gene recombinanteque codifica as proteínas em questão, pretende incluirdentro di significado de "proteína recombinante" asproteínas que têm uma seqüência de aminoácidos da formanativa (ou "autêntica") da proteína vegetal, ou umaseqüência de aminoácidos similar a ela, que é gerada pormutação de modo a incluir substituições e/ou deleções emrelação a uma forma de ocorrência natural da proteína. Parailustrar, as proteínas recombinantes úteis na presenteinvenção, além daquelas que têm uma seqüência de aminoácidosdas proteínas nativas, são aquelas proteínas recombinantesque têm seqüências de aminoácidos que são pelo menos 70%homólogas, ou 80% homólogas, e mais preferivelmente, 90%homólogas a uma seqüência de aminoácidos da presenteinvenção. Um polipeptídeo que tem uma seqüência deaminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, ou pelo menoscerca de 98%, e mais pref erivelmente, idêntica a uma dasseqüências de polipeptídeo da invenção, também estão dentrodo âmbito da invenção. Assim sendo, a presente invençãorefere-se a proteínas recombinantes que são derivadas, forexemplo, de genes de F-box de Arabidopsis thaliana e que têmseqüências de aminoácidos evolutivamente relacionadas a umaseqüência codificada por um gene ortólogo de outra proteínavegetal, onde "evolutivamente relacionada a" refere-se apolipeptídeos que têm seqüências de aminoácidos que surgiramnaturalmente (por exemplo, por variância alélica) , bem comovariantes mutacionais das proteínas reguladoras que sãoderivadas, por exemplo, por mutagênese combinatória.4.4 Plantas Transgênicas e Células Vegetais

As técnicas para incorporar de forma estávelconstruções genéticas no genoma de plantas-alvo são bemconhecidas nesse campo cientifico e incluem introduçãomediada por Agrobacterium tumefaciens, eletroporação, fusãode protoplastos, injeção em órgãos reprodutivos, injeção emembriões imaturos, introdução de projéteis em altavelocidade, e similares. A escolha da técnica dependerá daplanta-alvo a ser transformada. Por exemplo, plantasdicotilédones e certas monocotilédones e gimnospermas podeser transformadas pela tecnologia de plasmideo AgrobacteriumTi (como descrito, por exemplo, por Bevan, Nucl. Acids Res.12:8711-8721 (1984)). Os alvos para a introduções deconstruções genéticas da presente invenção incluem tecidos,tal como o tecido de folhas, células dissociadas,protoplastos, sementes, embriões, regiões meristemáticas;cotilédones, hipocótilos, e similares.

Depois que as células são transformadas, ascélulas que têm a construção genética da invençãoincorporada no seu genoma podem ser selecionadas por meio deum marcador, tal como o marcador de resistência à canamicinadiscutido acima. As células transgênicas podem ser entãocultivadas em um meio apropriado para regenerar plantasintegrais, usando técnicas conhecidas nesse campocientifico. No caso de protoplastos, a célula é deixada sereformar sob condições osmóticas apropriadas. No caso desementes ou embriões, um meio de germinação ou iniciação decalo apropriado é empregado. No caso de explantes, usa-seum meio de regeneração apropriado. A regeneração de plantasestá bem estabelecida para muitas espécies. Para obter umarevisão da regeneração de árvores florestais, vide Dunstanet al. A embriogênese somática em plantas lenhosas estádescrita em Thorpe, editora Τ. A., "In Vitro Embryogenesisof Plants", Volume 20 em "Current Plant Science andBiotechnology in Agriculture", Capitulo 12, páginas 471-540,1995. Os protocolos específicos para a regeneração deabeto-vermelho estão descritos por Roberts et al.r "SomaticEmbryogenesis of Spruce" em: "Synseed Applications ofsynthetic seed to crop improvement", editor Redenbaugh, K.,CRC Press, Capítulo 23, páginas 427-449, 1993. As plantastransformadas resultantes podem ser reproduzidas de formasexuada ou assexuada, usando métodos bem conhecidos nessastécnicas, para dar gerações sucessivas de plantas transgênicas.

Como discutido acima, a produção de RNA em célulasvegetais-alvo pode ser controlada pela escolha da seqüênciapromotora. Uma planta-alvo pode ser transformada com maisdo que uma construção genética da presente invenção,modulando desta forma a atividade de mais do que umpolipeptídeo, afetando a atividade dos polipeptídeos em maisdo que um tecido, ou afetando a atividade de polipeptídeosem mais do que um tempo de expressão. Similarmente, umaconstrução genética pode ser montada contendo mais do queuma estrutura de leitura aberta que codifica um polipeptídeoda invenção ou mais do que uma região não-codificadora de umgene que codifica tal polipeptídeo. Os polinucleotídeos dapresente invenção podem ser empregados também em combinaçãocom outras seqüências conhecidas que codificam ospolipeptideos envolvidos na sinalização de células vegetais.

Os polinucleotideos isolados da presente invençãopodem ser empregados como sondas para isolar outrasseqüência do DNA de F-box relacionadas, incluindo aquelas deoutras espécie vegetais, usando técnicas bem conhecidaspelos versados nessa área, tais como as técnicas usadasrotineiramente de hibridização de DNA e PCR.

Os polinucleotideos, polipeptideos e anticorpos eos anticorpos para esses polipeptideos podem ser usados paratriar moléculas que interagem com tais polinucleotideos e/oupolipeptideos e que, desta forma, modulam a sinalização decélulas. As técnicas para realizar esses ensaios são bemconhecidas nessa área. Similarmente, os polinucleotideos epolipeptideos da presente invenção podem ser empregados emestudos desenhados para elucidar o mecanismo de vias desinalização de células.

A invenção fornece inúmeros métodos para atransformação de plantas com um gene ou genes de F-boxheterólogos que contribuem para a produção de óleos naplanta recebedora, cujos detalhes estão descritosadicionalmente abaixo. Em algumas modalidades, o geneheterólogo é introduzido por transformação, e o geneintroduzido é expressado de forma estável durante a vida daplanta e é capaz ainda de ser transmitido para a progênie daplanta. Genericamente, é desejável que o transgene sejaintegrado no DNA nuclear, embora o genoma do plastideo possaser um alvo apropriado para algumas construções.A transformação da cultura e outras plantas podeser efetuada por inúmeros métodos conhecidos no campo debiotecnologia de plantas. 0 método para a transformaçãovariará com a espécie da planta a ser transformada e com opadrão desejado e a estabilidade da expressão do transgene.

Por exemplo, métodos de bombardeio de partículasdemonstraram ser eficazes na transformação de muitasespécies vegetais, incluindo aquelas anteriormenteconsideradas recalcitrantes para transformação. Este métodoé usado comumente na transformação de plantasmonocotilédones, tal como o milho. Outro método detransformação de plantas disponível é a transferência gênicamediada por Agrobacterium, que é usado comumente paratransformar culturas dicotilédones.

Ainda outros métodos disponíveis paratransformação de plantas não se baseiam em cultura detecidos para a recuperação de plantas transgênicas,permitindo desta forma a produção de transgênicos a partirde espécies vegetais para as quais não existe qualquermétodo confiável de cultura de tecidos. Por exemplo, omicroassesto de DNA ligado a partículas para dentro dotecido meristemático de brotos produz partes florescentestransgênicas a partir das quais surgem sementes transgênicas(Sautter et al., Biotech. 9:1080-85 (1991)). Sementestransgênicas podem ser criadas também por eletroforese deDNA em tecido meristemático (Griesbach, Plant Sei. 102:81-89(1994); Burchi et al., J. Genet. Breeding 49: 163-8 (1995)).

Este método demonstrou ser bem sucedido na transformação devárias espécies vegetais, incluindo orquídeas, crisântemos,cravos, lisianto, pimentas, e mesmo espécies de plantaslenhosas, tal como ameixa Plumus domestica).

Genericamente, a invenção fornece métodos ereagentes para a engenharia genética de uma plantahospedeira-alvo, tal como uma planta cultivada, com um ácidonucléiico heterólogo que codifica uma função de proteína F-box, que contribui para a produção de óleos na plantarecebedora. Um método para transformação faz uso dabactéria de solo comum supramencionada Agrobacterium (videBirch, Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 48:297-326(1997)). Este método envolve o vetor de transferência deDNA (T-DNA) modificado que carrega o fragmento de ácidonucléico desejado entre as regiões limítrofes do T-DNA(regiões de repetições diretas específicas com 25 pares debases). O vetor resultante é transferido para dentro de umhospedeiro de Agrobacterium e a planta hospedeira-alvo éinoculada com a bactéria recombinante transformada. Osprodutos gênicos virulentos de Agrobacterium, então,reconhecem ativamente, excisam, transportam e integram aregião do T-DNA dentro do genoma da planta hospedeira.

As técnicas de transformação mediadas porAgrobacterium tumefaciens, incluindo desarmamento e uso devetores binários, estão bem descritas na literaturacientífica (vide, por exemplo, Horsch, et al., Science233:496-8 (1984), e Fraley, et al., Proc. Nat. Acad. Sei.USA 80:4803 (1983)). A transformação mediada porAgrobacterium é um étodo particularmente útil paratransformação de dicotilédones.A faixa de hospedeiras naturais de Agrobacterium êlimitada e assim sendo esta abordagem para transformação nãoé praticável em algumas plantas hospedeiras-alvo,particularmente culturas de cereais e outras espéciesmonocotilédones. Para essas culturas, a invenção forneceabordagens alternativas para transformação, tal como acaptação direta de DNA nu em protoplastos ou tecidos, usandoeletroporação ou bombardeio de partículas com pistola.Neste método, a co-transformação de um gene marcadorselecionável junto com o gene de interesse permite ocrescimento preferencial das células transformadas emcultura de células. Manipulações sucessivas da composiçãoquímica do meio de cultura, especialmente hormôniosvegetais, permitem a regeneração de plantas completas. Estemétodo permitiu a recuperação de plantas geneticamentemanipuladas em virtualmente todas as plantas cultivadas.

Um método representativo para transformação diretada construção do transgene é por bombardeio de partículascontra tecidos de plantas-alvo com microprojéteis de altavelocidade (vide, por exemplo, Finer et al. Curr. Top.Micro, and Immun. 240:60-80 (1999)). Este método utiliza umacelerador de partículas ou "gene blaster" para penetrar nascamadas superficiais externas do tecido ou protoplasto daplanta (Sanford, Trends Biotech.l 6:299-302 (1998)). A"biolística", uma combinação de "biológica" e "balística",descreve uma técnica que utiliza instrumentação paraacelerar microprojéteis revestidos com DNA para dentro decélulas, atravessando a parede celular e a membrana celular.O microprojétil é genericamente pequeno o suficiente (0,5-5,0 mm) para entrar na célula vegetal sem dano demais, masainda grande o suficiente para fazer com que a massa penetrena parede celular e conduza uma quantidade apropriada de DNAsobre sua superfície para dentro do interior da célulavegetal.

Podem ser usados inúmeros desenhos diferentes depistolas de partículas. A base de todos estes desenhos éaplicar o DNA como um revestimento sobre pequenas partículasdensas e acelerar as partículas na direção de um tecido-alvo. As partículas usualmente consistem em partículasesféricas de ouro ou tungstênio, que têm um diâmetro entre0,5 e 5,0 mm. As partículas de ouro são quimicamenteinertes, geralmente com um tamanho mais uniforme do que aspartículas de tungstênio, e não produzem efeitoscitotóxicos. Conseqüentemente, as partículas de ouro sãogenericamente mais eficazes do que as partículas detungstênio. Idealmente, as partículas usadas para obombardeio devem ter boa afinidade inicial pelo DNA, masainda assim soltarem livremente o DNA depois de estaremdentro do citoplasma ou núcleo da célula-alvos.

Para preparar os microprojéteis revestidos comDNA, as partículas de ouro ou tungstênio lavadas sãomisturadas com DNA plasmídico. O DNA fica ligado sobre aspartículas usando métodos de precipitação com etanol oucloreto de cálcio, que são conhecidos nessas técnicas.

Espermidina pode ser adicionada à mistura, possivelmenteprotegendo o DNA contra degradação e/ou alterando suaconformação. Depois da precipitação, as partículas podem serlavadas, recolocadas em suspensão e secadas ou guardadassobre gelo como uma suspensão aquosa até quando fornecessário.

A pistola de partículas pode utilizar ummacrocarreador, que sustenta ou carrega as partículas e éacelerado junto com as partículas na direção do alvo. 0macrocarreador é usualmente retido por uma placa ou peneirade parada, antes que ele colida com o alvo, enquanto que aspartículas continuam ao logo do seu curso. Na maioria doscasos, as partículas são aceleradas sob vácuo parcial em umacâmara de vácuo para reduzir o arraste pelo ar. Apenetração das partículas é controlada modificando aintensidade da rajada explosiva, mudando a distância que aspartículas devem percorrer para atingir o tecido-alvo, ouusando partículas de diferentes tamanhos. Um dispositivoportátil comercial (a Pistola de Genes Helios) estádisponível em BioRad Laboratories (Hercules, CA, EUA) . Umdispositivo de bombardeio modificado com hélio, que utilizaum acúmulo contínuo de contrapressão de hélio distribuídapara um disco de ruptura que transmite uma onda de choquepara um segundo disco ou macrocarreador que retém aspartículas revestidas com DNA, também está disponível naBioRad (isto é, a unidade PDS-1000/He). Uma pistola dedescarga elétrica de alta voltagem, que causa umavaporização rápida de uma gotícula de água, a qual, por suavez, transmite uma onda de choque para uma lâmina de Mylarrevestida com partículas ligadas ao DNA, também foidesenvolvida (vide McCabe e Christou, Plant Cell Tíss.Organ. Cult. 33:227-236 (1993)). Ainda outro dispositivopara o bombardeio de partículas é um dispositivomicroapontador, que não utiliza um macrocarreador (Sautteret al. Bio/TechnoIogy 9:1080-5 (1991)). Este dispositivoacelera pequenas quantidades de uma mistura deDNA/particulas em uma corrente focalizada de nitrogênio sobalta pressão. O DNA não é precipitado sobre as partículasde ouro, mas é distribuído como uma mistura.

Vários tecidos vegetais diferentes foram usadoscomo alvos para a transformação mediada por bombardeio departículas. A seleção do tecido-alvo apropriado édependente de múltiplos fatores. Para uma análise rápida daexpressão de genes, várias construções de plasmídeos podemser introduzidas em diferentes tecidos e a expressãotransiente pode ser analisada rapidamente para avaliar aatividade do promotor, sem a produção de plantastransformadas de forma estável (vide, por exemplo, lida etal., Plant Cell Rep. 14:539-44 (1995)). Quase qualquertecido pode ser usado para estudos de expressão transiente,desde que a parede celular seja penetrável pelas partículasrevestidas com DNA. Por exemplo, culturas de célulasvegetais embriogênicas foram usadas exitosamente para aprodução de plantas transformadas (vide, por exemplo, Frommet al., Bio/TechnoIogy 8:833-9 (1990)). A transformação demeristemas apicais de brotos resulta em plantas quiméricas,onde as células transformadas geram diretamente o tecido delinhagem germinal e o DNA introduzido é então passado paraplantas progênitas. 0 bombardeio de tecidos meristemáticosde brotos, e em seguida, expansão da cultura dos tecidos dascélulas transformadas, foram usados para produzir linhagensde plantas transgênicas geneticamente transmissíveis(McCable et al., Bio/Technology 6:923-6 (1988)). Além dasculturas embriogênicas e pontas de brotos, outros tecidosque foram submetidos a bombardeio de partículas incluemfolhas (Klein et al., Proc. Nat. Acad. Sei.USA 85:8502-5(1988)), seções de raízes (Seki et al., Appl. Microbiol.Biotech. 36: 228-30 (1991)), seções de pedúnculos (Loopstraet al., Can. J. Res. 22: 993-6 (1992)), pólen (Twell et al.,Plant Physiol. 91:1270-4 (1989)), estilos (Clark e Sims,Plant Physiol. 106:25-36 (1994)), células de aleuronas decereais (Kim et al. (1992) Mol. Gen. Genet. 232:383-93(1992)) blastema de borla (Dupeuis e Pace, Plant Cell Rep.12:607-11 (1993)). Em certos casos, o tecido vegetalselecionado para transformação mediada por bombardei departículas pode ser rleativamente novo, pois as culturas decélulas prolongadas podem resultar em anormalidades quepodem comprometer a utilidade da planta transgênica, talcomo infertilidade da progênie transgênica subseqüente (videRhodes et al., Biotech. 6:56-60 (1988)).

Em certos casos, a magnitude da expressão dotransgene varia acentuadamente com o local de inserção e anatureza da(s) seqüência (s) inserida(s). Por exemplo,enquanto que uma transferência mediada por T-DNA resultatipicamente na inserção de um único fragmento de DNA intactocompleto em um único lócus, as abrodagens de transferênciadireta de DNA resultam freqüentemente em concatâmeros longosdo DNA transferido (vide, por exemplo, Czernilofsky et al.,DNA 5:473-82 (1986)). Tais múltiplas inserções tandem estãoassociadas aos fenômenos de "silenciamento" transcricionalem certos casos. Além disso, o local de inserção dentro dogenoma da planta freqüentemente afeta a intensidade daexpressão do transgene - um fenômeno conhecido como "efeitode posição". Conseqüentemente, a invenção fornece métodospara mitigar a interferência com a expressão do transgene.

Por exemplo, os efeitos da posição podem ser mitigados portransgenes flanqueadores com regiões especificas associadasà matriz, que isolam a regulação transcricional contra osefeitos da cromatina circundante (vide, por exemplo,Mlynarova et al., Plant Cell 7:599-609 (1994)). Porexemplo, regiões de anexação de armações (scaffold) (SARs,conhecidas também como região de anexação de matri ou MARs)podem ser incluídas na construção do vetor de transgene.

Utilmente, as SARs são ligadas às regiões flanqueadoras dogene de interesse. Estas seqüências são conhecidas nessastécnicas (por exemplo, uma SAR de tabaco está descrita emBreyne et al., Plant Cell 4:463-71 (1992); e Allen et al.,Plant Cell 8:899-913 (1996)). Além disso, o silenciamentodo transgene mediado por processos dependentes de homologiapode ser evitado utilizando linhagens de plantastransgênicas que evitam padrões de inserção repetidas tandemou invertidas, e limitando a homologia do transgene inseridocom qualquer gene ou genes hospedeiros endógenoscorrespondentes, manipulando por engenharia genéticasubstituições de códons pela construção de transgene, quandoapropriado. Quando o transgene é inserido como um fragentode DNA intacto em um único lócus, sua expressão comporta-segenericamente de uma maneira altamente consistente. TaisIoci transgênicos apresentam a ação aditiva esperada do genedentro dos Ioci (hemizigoto versus homozigoto) e entre Ioci(di-hibridos entre indivíduos transgênicos homozigóticos) .A perda de junção de transgenes é rara em tais linhagenstransgênicas (aproximadamente uma em cada dez mil), o que éconsistente com o desempenho de muitos genes vegetaisendógenos. As plantas transgênicas otimizadas da invençãopodem ser obtidas triando as plantas-candidatas quanto àexpressão persistente do transgene em múltiplas gerações deuniões ou rodadas de propagação vegetativa.

EXEMPLOS

Os exemplos que se seguem são fornecidos a títuloilustrativo e não limitativo.

Materiais e Métodos

AT3G06240: proteína da família F -box, contém odomínio Pfam:PF0064 6 de F-box

INICIADORES para a PCR originaldata 28/02/2002Iniciador de avanço (Fbox-For)5'-CAC CAA ACA ATG GAG GCG ACG AAG AGA G-3'Iniciador reverso (Fbox-Rev_l)5'-ATC TTA GCA AAA AGC AGA CTT C-3'

Estes iniciadores foram usados para efetuarexitosamente a RT-PCR da seqüência que se segue.

CACC AAACA ATGGAGGCGACGAAGAGAGAAAGACGGAGAGAAGATGACGACGGCGAAAAAGCTTCACCGGAATCACTCGTTCTTCCACCAGAGATCA

TTACAGAAATTCTTCTCCGATTACCAGCCAAATCGATCGGGCGATTCAGGTGCGTATCAA

AGCTCTTTTGCACTTTATCGTCGGATCCAGGGTTCGCGAAGATTCACCTCGATCTGATCCTTCGAAACGAATCCGTAAGATCGCTCCACCGTAAGCTCATTGTGTCTTCACATAATCTGT

ACTCGTTAGATTTCAATTCGATCGGTGACGGAATTAGGGATTTAGCGGCTGTGGAACACA

ATTATCCTCTTAAAGACGATCCAAGCATTTTCTCTGAGATGATT AGGAATTACGTGGGGG

ACCATCTGTACGATGATCGTCGCGTGATGCTTAAGCTGAATGCGAAATCGTATCGAAGAA

ACTGGGTTGAGATCGTTGGATCTTCCAATGGTTTAGTGTGTATCTCTCCTGGTGAAGGAG

CTGTTTTCTTGTATAATCCAACTACCGGAGATTCCAAGAGATTACCTGAAAATTTTCGTC

CCAAATCTGTAGAATACGAAAGAGATAATTTCCAAACTTATGGATTTGGTTTCGATGGTC

TCACTGATGATTACAAATTGGTGAAGCTTGTTGCTACCAGTGAAGATATTCTCGATGCTA

GTGTCTATTCCTTGAAGGCTGACTCATGGAGACGGATCTGCAATTTGAATTATGAGCACA

ACGATGGCTCCTACACGTCCGGTGTGCATTTCAACGGTGCGATTCACTGGGTGTTCACAG

AGAGTAGGCACAACCAAAGAGTGGTTGTAGCATTTGATATTCAAACTGAGGAGTTTCGAG

AGATGCCAGTGCCTGATGAAGCTGAAGATTGTTCCCATAGGTTTAGCAACTTTGTGGTCG

GAAGTCTCAATGGACGTCTCTGTGTGGTCAATAGTTGCTACGATGTGCATGATGATATAT

GGGTGATGAGTGAGTACGGTGAAGCTAAATCCTGGAGCAGAATTCGAATCAACTTGTTGTATAGGTCGATGAAACCGCTCTGTTCGACTAAGAACGATGAAGAGGTTCTTCTGGAGCTTG

ATGGAGACCTGGTGTTGTACAACTTTGAAACCAATGCATCGAGTAATCTAGGAATTTGTG

GGGTTAAGCTCAGTGACGGGTTCGAGGCAAATACATACGTAGAGAGCCTCATATCACCCA

ACTCTTATG GTATAGAGAGCTGA GGAAGTCTGCTTTTTGCTAAGAT

Um dois produtos da PCR purificado, Fbox_likel,foi então clonado no vetor GATEWAY pENTR/D-TOPO. Este foidesignado como "Clone de Entrada" e foi usado para subclonara seqüência desejada nos vetores de expressão GATEWAY(Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA, número do catálogo pENTR/D-TOPO, K240020) . Outras informações sobre as seqüênciasestão disponíveis na Invitrogen.

Um dos plasmídeos do clone de entrada de Fbox foiescolhido para o seqüenciamento de comprimento inteiro(codificado Fbox-Iike -LIG1). O clone foi seqüenciadocompletamente usando iniciadores internos e demonstrou serser de comprimento inteiro e sem erros da PCR.

A subclonagem do fragmento do gene Fbox-Iikel genepara o vetor de expressão GATEWAY pGATE-Phas está ilustradana Figura 12. 0 vetor foi construído inserindo o CasseteGateway Reading Frame Cassette b no sítio PmeI do vetorparental pBBV-Phas.

A seqüência completa de pGATE-Phas está ilustradana Figura 11 (SEQ ID NO: 6). As seqüências curtassublinhadas em cada lado da inserção foram removidas durantea reação de ligação, isto é, onde a inserção vai. Asubclonagem e a transformação de Agrobacterium da construçãoFbox foi então completada. Antes da transformação emAgrobacterium, as orientações das inserções foramverificadas por seqüenciamento, e as corretas foramutilizadas.

Depois da transformação em Agrobacterium, apresença da construção foi confirmada por PCR. Finalmente,uma mistura de 3 episódios de transformação em Agrobacteriumforam usados para transformação em Arabidopsis.

Resultados da Superexpressão de of F-box

As linhagens que têm aumento positivo no teor deóleo foram levadas para a geração T3 e/ou T4 e reanalisadas.

A triagem demonstrou que a superexpressão de F-box(At3g06240), quando impulsionada sob um promotor especificode semente, faseolina, produziu sementes com fenótipo deteor mais alto de óleo e está ilustrada nas Figuras 1-5.

Além disso, os dados obtidos para a próxima geração (T3)estão indicados nas Figuras 6-7, e outra análise de outrosaspectos das sementes transgênicas está ilustrada nasFiguras 8-9. Particularmente, a Figura 1 ilustra o teor deóleo de linhagens de faseolina-F-box em comparação comlinhagens de controle do vetor. Os dados indicados sãomédias de 18 linhagens (T2) e as barras de erros são SE. AFigura 2 ilustra as FAMEs totais de linhagens transgênicasde F-box em comparação com o tipo selvagem (WT) , e aslinhagens de controle do veotr (barras de erros são SEbaseado em 18 linhagens: 3 duplicatas para cada linhagem).

A Figura 3 ilustra as FAMEs totais de sementes de linhagenstransgênicas versus WT e linhagens de controle do vetor (ospontos grandes são as duas linhagens com teor mais alto deóleo e foram denominadas F-box2 e F-box3, escolhidasposteriormente para análise das próximas gerações). AFigura 4 ilustra o espectro de ácidos graxos e a composiçãoda razão molar de ácidos graxos das linhagens transgênicasde F-box versus plantas de controle. A Figura 5 ilustra adeterminação do peso das sementes (cerca de 400 sementesforam contadas para sementes do tipo selvagem etransformantes com genes de F-box e as sementes contadasforam guardadas em dessecadores de um dia para o outro, edepois determinadas usando uma balança analítica e as barrasde erros são SE, baseado em 6 réplicas).

Os dados na seção acima ilustram que há um aumentode >10% no teor de óleo em linhagens que superexpressam F-box, comparando com plantas do tipo selvagem. Este aumento éconfirmado na base de por mg e na base por semente. Paraconfirmar ainda mais este resultado, é essencial determinaras mudanças no teor de óleo para a próxima geração. Alémdisso, há um decréscimo pequeno, mas ainda significativo, em18:1 e 18:2 em plantas que superexpressam F-box emcomparação com o tipo selvagem, e há um aumentosignificativo em 18:3 observado. A razão para isto não estáclara.

Avaliação do gene de F-box gene na geração T3:plantas T2 de linhagens de F-box2 e F-box3 (vide Figura 3)foram desenvolvidas sob condições usuais. Para eliminar oefeito potencial de BASTA sobre o metabolismo das sementes,os transformantes foram triados por PCR ao invés de sprayBASTA. As linhagens F-box2 e F-box3 lines foramdesenvolvidas com linhagens WT e de controle do vetor. Aanálise de FAMEs de sementes T3 está ilustrada na Figura 6.

A Figura 6 ilustra FAMEs totais por semente nassementes de F-box T3 versus WT e linhagens de controle dovetor (as barras de erros são SE, basado em dados obtidos apartir de 12 plantas para as linhagens F-box2 e F-box3; 6plantas para WT e linhagens de controle do vetor; e as duaslinhagens aqui denominadas F-box2 e F-box3 são os doispontos de dados indicados por pontos grandes na Figura 3).

A Figura 7 ilustra FAMEs totais de sementes de linhagenstransgênicas (F-box2 e F-box3) versus WT e linhagens decontrole do vetor.

Análise da razão C:N para sementes T2: As duaslinhagens F-box2 e F-box3 foram escolhidas para a análise darazão C:N. Esta análise confirmará as mudanças noscompostos de estocagem de sementes (óleo versus proteína)(vide Figura 8). A Figura 8 (a) ilustra a análise da razãoC: N para duas linhagens independentes, F-box2 e F-box3. Asbarras de erros são SE, baseado em seis réplicas. A Figura8 (b) ilustra a correlação positiva entre teor de óleo erazão C:N, confirmando ainda mais o resultado (as colunasvazadas são plantas que superexpressam F-box2 e F-box3; ascolunas cinza são sementes de Arabidopsis do tipo selvagem).

Resultados do knock-out de F-box

Análise de KO (knock-out) do gene de F-box:

Linhagens de inserção de Salk T-DNA (SALK_048969 eSALK_04 8 962) foram ordenadas, e as plantas homozigóticasforam captadas por PCR a partir da linhagem SALK_048969, quetem uma inserão de T-DNA no pelo menos éxona do gene. Asplantas homzigóticas, junto com as plantas do tipo selvagem(WT) foram desenvolvidas até a maturidade; as sementes foramanalisadas quanto a FAMEs totais (vide Figura 9).

A Figura 9 (a) ilustra a ana'lise de FAMEs delinhagens KO de F-box, e a Figura 9 (b) iustra o espectro deácidos graxos de linhagens KO e WT (as barras de errosbaseiam-se em SU em ove repicas independente). Comoindicado acima, não existiram diferenças observáveis no teorde óleo entre linhagens WT e KO de F-box; entretanto, houveum aumento significativo em 18:1 e 18:2 em KO de F-box,comparando com o tipo selvagem, e houve um decréscimosignificativo em 18:3 observado. Isto espelha o perfilobservado com as linhagens de super-expressão (vide Figura-4).

Portanto, através desta análise detalhada delinhagens transgênicas de F-box, demonstrou-se que asuperexpressão do gene de F-box em Arabidopsis pode aumentaro teor total de óleo em mais do que 10%. Na realidade, esteaumento foi confirmado em duas gerações e a análise foivalidada com duas abordagens diferentes (FAMEs totais eanálise da razão de C:N).

Equivalentes

Os versados nessas técnicas devem reconhecer, ouserem capazes de determinar, usando experimentação não maisdo que rotineira, inúmeros equivalentes das modalidadesespecificas aqui descritas especificamente. Pretende-se quetais equivalentes estejam englobados no âmbito dasreivindicações que se seguem.

Claims

1. Construção genética para a hiper-expressão deuma proteína de domínio-F em plantas, CARACTERIZADA pelofato de compreender:(a) uma seqüência de promotor genético; e(b) uma seqüência que codifica uma funcionalidadeprotéica de domínio-F ligada à seqüência de promotorgenético.

2. Construção genética, de acordo com areivindicação 1, CARACTERIZADA pelo fato de que a proteínade domínio-F é uma proteína de domínio-F de planta.

3. Construção genética, de acordo com areivindicação 1, CARACTERIZADA pelo fato de que a seqüênciade promotor genético é um promotor específico de semente.

4. Construção genética, de acordo com areivindicação 3, CARACTERIZADA pelo fato de que a seqüênciade promotor genético é a faseolina.

5. Construção genética, de acordo com areivindicação 1, CARACTERIZADA pelo fato de compreender umvetor de expressão pBBV-PHAS.

6. Construção genética, de acordo com areivindicação 1, CARACTERIZADA pelo fato de que a proteínade domínio-F compreende uma seqüência de polipeptídeo, pelomenos, aproximadamente 75% idêntica à seqüência depolipeptídeo com ID de SEQ N-: 1.

7. Construção genética, de acordo com areivindicação 1, CARACTERIZADA pelo fato de que a proteínade domínio-F compreende a seqüência de polipeptídeo , pelomenos, aproximadamente, 90% idêntica à seqüência depolipeptídeo com ID de SEQ N9: 1.

8. Construção genética, de acordo com areivindicação 1, CARACTERIZADA pelo fato de que a proteínade domínio-F de planta compreende a seqüência depolipeptídeo com ID de SEQ N-: 1.

9. Construção genética, de acordo com areivindicação 1, CARACTERIZADA pelo fato de que a proteínade domínio-F é codificada por um ácido nucléico quehibridiza com a seqüência de ácido nucléico com ID de SEQN5: 2.

10. Construção genética, de acordo com areivindicação 1, CARACTERIZADA pelo fato de que a proteínade domínio-F é codificada por um ácido nucléico quehibridiza mediante rígidas condições com a seqüência deácido nucléico com ID de SEQ N-: 2.

11. Construção genética, de acordo com areivindicação 1, CARACTERIZADA pelo fato de que a proteínade domínio-F de planta é codificada pela seqüência de ácidonucléico com ID de SEQ N°: 2.

12. Célula de planta transgênica, CARACTERIZADApelo fato de que compreende uma construção genética deacordo com a reivindicação 1.

13. Célula de planta transgênica, de acordo com areivindicação 12, CARACTERIZADA pelo fato de que a planta éa Arabidopsis thaliana.

14. Célula de planta transgênica, de acordo com areivindicação 12, CARACTERIZADA pelo fato de que a planta éselecionada do grupo que consiste em feijão-soja, palmeira,semente de colza e girassol.

15. Célula da planta Arabiposis thalianarecombinante, CARACTERIZADA pelo fato de que compreender umaconstrução genética heteróloga tendo uma funcionalidade daseqüência de promotor genético ligada a uma seqüência decodificação de dominio-F de planta.

16. Célula da planta Arabiposis thalianarecombinante, de acordo com a reivindicação 13,CARACTERIZADA pelo fato de que a seqüência de domínio-F deplanta codifica o polipeptídeo com ID de SEQ N2: Ieopromotor é a faseolina.

17. Planta, CARACTERIZADA pelo fato de compreenderuma célula de planta transgênica, de acordo com areivindicação 12, ou uma parte propágula ou progênica dela,sendo que a parte propágula ou progênica compreende aconstrução genética.

18. Método de modificação da produção de óleo emuma planta, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende:incorporar, de modo estável, ao genoma da planta,uma construção genética que está de acordo com areivindicação 1, com fins de fornecer uma plantatransformada; eregenerar a planta transformada,sendo que a expressão da construção genéticaincorporada modifica a produção de óleo na planta.

19. Método, de acordo com a reivindicação 18,CARACTERIZADA pelo fato de que a planta é a Arabidopsisthaliana.

20. Método, de acordo com a reivindicação 18,CARACTERIZADA pelo fato de que a planta é selecionada dogrupo que consiste em feijão-soja, palmeira, semente decolza e girassol

21. Método de aumento na produção de óleo naArabidopsis thaliana, CARACTERIZADO pelo fato decompreender:incorporar, de modo estável, ao genoma da plantaArabidopsis thaliana, uma construção genética tendo umafuncionalidade da seqüência de promotor genético dafaseolina que codifica a ID DE SEQ N°: 1; eregenerar a planta transformada,sendo que a expressão da construção genéticaincorporada aumenta a produção de óleo na planta Arabidopsisthaliana.