BRPI0616883A2 - ácidos nucléicos que codificam enzima modificada de citocromo p450 e métodos de uso dos mesmos - Google Patents

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Rachel Eachus
Dae-Kyun Ro
Yasuo Yoshikuni
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Abstract

ÁCIDOS NUCLEICOS QUE CODIFICAM ENZIMA MODIFICADA DE CITOCROMO P450 E MéTODOS DE USO DOS MESMOS. A presente invenção proporciona ácidos nuclélcos compreendendo seqúências de nucleotídeo que codificam enzima modificada de citocromo P450s; bem como vetores recombinantes e células hospedeiras compreendendo os ácidos nuclélcos. A presente invenção proporciona adicionalmente métodos de produção de um composto funcionalizado em uma célula hospedeira geneticamente modificada com um ácido nucléico compreendendo seqúências de nucleotídeo que codificam uma enzima modificada de citocromo P450.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "ÁCIDOSNUCLÉICOS QUE CODIFICAM ENZIMA MODIFICADA DE CITOCROMOP450 E MÉTODOS DE USO DOS MESMOS".
REFEÊNCIA CRUZADA
Este pedido reivindica o benefício do Pedido de Patente Provi-sório dos Estados Unidos No. 60/724.525, depositado em 7 de outubro de2005, e Pedido de Patente Provisório dos Estados Unidos No. 60/762.700,depositado em 27 de janeiro de 2006, cujos pedidos são incorporados aquipor referência em sua totalidade
CAMPO DA INVENÇÃO
A presente invenção está no campo de produção de compos-tos de isoprenóide, e, em particular, células hospedeiras que são genetica-mente modificadas com ácidos nucléicos que codificam enzimas de codifica-ção de precursor de isoprenóide.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
Os isoprenóides contituem um grupo extremamente grandee diverso de produtos naturais que têm uma origem biosintética comum, istoé, um precursor metabólico simples, isopentenil difosfato (IPP). Os compos-tos de isoprenóides são também referidos como "terpenos" ou "terpenóides."Mais de 40.000 isoprenóides foram descritos. Por definição, os isoprenóidessão produzidos das assim denominadas unidades de isopreno (C5). O nú-mero de átomos de carbono presente nos isoprenóides é tipicamente divisí-vel por cinco (C5, C10, C15, C20, C25, C30 e C40), embora isoprenóidesirregulares e politerpenos tenham sido reportados. Membros importantes dosisoprenóides incluem os carotenóides, sesquiterpenóides, diterpenóides, ehemiterpenos. Os carotenóides incluem, por exemplo, licopeno, β-caroteno,e similares, muitos dos quais funcionando como antioxidantes. Os sesquiter-penóides incluem, por exemplo, artemisinin, um composto tendo atividadeanti-malária. Os diterpenóides incluem, por exemplo, taxôl, um agente qui-mioterápico de câncer.
Os isoprenóides compreendem a família mais numerosa e es-truturalmente diversa de produtos naturais. Nesta família, os terpenóidesisolados de plantas e outras fontes naturais são usados como compostos dearoma e fragrância comerciais, bem como drogas anti-malária e anti-câncer.Uma maioria dos compostos de terpenóide em uso hoje são produtos natu-rais ou seus derivados. Os organismos fontes (por exemplo, árvores, inver-tebrados marinhos) de muitos destes produtos naturais são, nem acessíveisao cultivo de larga escala para produzir quantidades comercialmente viáveis,nem para manipulação genética para produção aumentada ou derivatizaçãodestes compostos. Portanto, os produtos naturais devem ser produzidossemi-sinteticamente de análogos, ou sintéticamente usando-se síntese quí-mica convencional. Além disso, muitos produtos naturais têm estruturascomplexas, e, como um resultado, são atualmente não-econômicos ou im-possíveis de sintetizar. Tais produtos naturais devem ser ou extraídos desuas fontes nativas, tais como árvores, esponjas, corais e micróbios mari-nhos; ou produzidos sinteticamente ou semi-sinteticamente de precursoresmais abundantes. A extração de um produto natural de uma fonte nativa élimitada pela disponibilidade da fonte nativa; e a produção sintética ou semi-sintética de produtos naturais pode sofrer de baixo rendimento e/ou alto custo. Tais problemas de produção e disponibilidade limitada da fonte naturalpodem restringir o desenvolvimento comercial e clínico de tais produtos.
A biosíntese de produtos naturais de isoprenóide em célulashospedeiras projetadas (geneticamente modificadas), por exemplo, in vitro(por exemplo, em um sistema de fermentação), ou in vivo (por exemplo, emum organismo multicelular geneticamente modificado), pode diminuir o po-tencial comercial e terapêutico não-realizados destas fontes naturais, e pro-duzir química fina e farmacêuticos menos caros e mais amplamente disponí-veis. Um obstáculo à produção de isoprenóide ou precursor de compostosde isoprenóide em hospedeiro geneticamente modificado é a produção efici-ente de enzimas que modificam os precursores de poliprenil de compostosde isoprenóide, ou que modificam os precursores de isoprenóides.
Uma das classes mais importantes de enzimas nas transfor-mações bioquímicas de muitos alvos de produto natural é a superfamília decitocromo P450 (P450), que toma parte em um espectro surpreendentemen-te amplo de reações metabólicas. Em um exemplo espantoso, P450s catali-sa 8 das aproximadamente 20 etapas na biosíntese de taxol de seu precur-sor, geranil geranil pirofosfato.
Existe uma necessidade na técnica de produção de isoprenói-de aperfeiçoado ou células hospedeiras de produção de precursor de iso-prenóide que proporcionam produção de alto nível de compostos de isopre-nóide. A presente invenção chama atenção para esta necessidade, e pro-porciona vantagens relacionadas.
Literatura
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SUMÁRIO DA INVENÇÃO
A presente invenção proporciona ácidos nucléicos compreen-dendo seqüências de nucleotídeo que codificam enzimas modificadas decitocromo P450s; bem como vetores recombinantes e células hospedeirascompreendendo os ácidos nucléicos. A presente invenção proporciona adi-cionalmente métodos de produção de composto funcionalizado em uma cé-lula hospedeira geneticamente modificada com um ácido nucléico compre-endendo seqüências de nucleotídeo que codificam uma enzima modificadade citocromo P450.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
A Figura 1 representa esquematicamente biosíntese de 8-hidroxi-õ-cadinene em E coli.
A Figura 2 representa investigação da cromatografia de gás-espectrometria de massa (GC-MS) de camada orgânica extraída de E. coliexpressando trajetória biosintética de CadOH.
A Figura 3 representa uma investigação de GC-MS da camadaorgânica extraída de mevalonato-alimentado E. coli expressando trajetóriabiosintética de CadOH, bem como uma porção da trajetória de mevalonato(pMBIS).
As Figura 4A e 4B representam várias modificações N-terminais produzidas para CadH (Figura 4A); e um curso de tempo de pro-dução de CadOH por E coli geneticamente modificada usando várias cons-truções de CadH.
A Figura 5 representa uma seqüência de amino ácido de "mistic".
A Figura 6 representa uma seqüência de amino ácido de umaIimoneno hidroxilase.
A Figura 7 representa uma seqüência de amino ácido de umaaristolocheno dihidroxilase.As Figuras 8A-D representam uma seqüência de amino ácidode cadinene hidroxilase com um domínio nativo de transmembrana (subli-nhado) (Fig. 8A); cadinene hidroxilase com um domínio heterólogo detransmembrana (texto em negrito) (Fig. 8B); cadinene hidroxilase com umdomínio de solubilização (texto em negrito) (Fig. 8C); e cadinene hidroxilasecom um domínio de secreção e um domínio heterólogo de transmembrana(texto em negrito) (Fig. 8D).
As Figuras 9A e 9B representam seqüências de amino ácidosde taxadieno hidroxilases.
A Figura 10 representa uma seqüência de amino ácido de ent-kaureno oxidase.
A Figura 11A representa uma seqüência de nucleotídeo quecodifica cadinene hidroxilase (o início atg é mostrado em negrito); e a Figura11B representa uma seqüência variante de nucleotídeo que codifica cadine-ne hidroxilase, códon otimizado para expressão em um procariote.
A Figura 12A representa uma seqüência de amino ácido deum citocromo P450 reductase (CPR) de Taxus cuspidata; A Figura 12 B re-presenta uma seqüência de amino ácido de um CPR de Candida tropicalis;A Figura 12C representa uma seqüência de amino ácido de um CPR (ATR1)de Arabidopsis thaliana\ A Figura 12D representa uma seqüência de aminoácido de um CPR (ATR2) de Arabidopsis thaiiana; e a Figura 12E representaum amino ácido ATR2 variante que carece de uma seqüência de amino áci-do que objetiva cloroplasto.
A Figura 13 representa esquematicamente duas trajetórias bi-osintéticas "heme". ,
A Figura 14 representa esquematicamente' a biosíntese deprodutos de isoprenóide exemplares taxol, artemisinin, e mentol.
A Figura 15 representa esquematicamente o esquema de rea-ção para produção de compostos de isoprenóide exemplares.
A Figura 16 é uma representação esquemática de trajetóriasmetabólicas de isoprenóide que resultam na produção dos intermediários detrajetória biosintética de isoprenóide poliprenil difosfatos geranil difosfato(GPP), farnesil difosfato (FPP), e geranilgeranil difosfato (GGPPP), de iso-pentenil difosfato (IPP) e dimetilalil difosfato (DMAPP).
A Figura 17 é uma representação esquemática da trajetória demevalonato (MEV) para a produção de IPP.
A Figura 18 é uma representação esquemática da trajetória deDXP para a produção de IPP e dimetilalil pirofosfato (DMAPP).
As Figuras 19A-C representam seqüências de amino ácido devárias enzimas P450 de modificação de intermediário de trajetória de alca-lóide.
As Figuras 20A-C representam seqüências de amino ácido devárias enzimas P450 de modificação de intermediário de trajetória de fenil-propanóide.
As Figuras 21A e 21B representam seqüências de amino ácidode várias enzimas P450 de modificação de intermediário de trajetória de po-licetide.
A Figura 22 representa esquematicamente várias construçõesde amorfadieno oxidase (AMO). (1) nAMO, seqüência AMO nativa conformeisolada de Artemisia annua; 2) sAMO, gene AMO sintético de códon otimiza-do para expressão em E colr, 3) A13-AMO, gene AMO sintético com trans-membrana tipo selvagem substituída com a seqüência A13 N-terminal de C.tropicalis; 4) A17-AMO, gene AMO sintético com transmembrana tipo selva-gem substituída com a seqüência A17 N-terminal de C. tropicalis; 5) Bov-AMO, gene AMO sintético com transmembrana tipo selvagem substituídacom a seqüência bovina microssomal N-terminal.
As Figuras 23A e B representam oxidação de amorfadieno emE coii por várias construções AMO construções.
Figuras 24A e B representam uma seqüência de nucleotídeoque codifica AMO tipo selvagem.
A Figura 25 representa um mapa de translação de seqüênciade amino ácido da seqüência de nucleotídeo representada na Figura 24.
As Figuras 26 e 27 representam uma seqüência de nucleotí-deo que codifica A13-AMO e um mapa de translação da seqüência de aminoácido, respectivamente.
As Figuras 28 e 29 representam uma seqüência de nucleotí-deo que codifica A17-AMO e o mapa de translação da seqüência de aminoácido, respectivamente.
As Figuras 30 e 31 representam uma seqüência de nucleotí-deo que codifica AMO-bovino e o mapa de translação da seqüência de ami-no ácido, respectivamente.
A Figura 32 representa a produção de CadOH em E. coli con-tendo a trajetória total de mevalonato em adição a um vetor de expressãocompreendendo seqüências de nucleotídeo que codificam CadOH1CPR, eCadS.
A Figura 33 representa uma cromatografia e espectro de GC-MS mostrando produção comparativa de ácido artemisínico em E. coli ex-pressando a trajetória de amorfadieno total e ou o plasmídeo pDUET-ctAACPR-A13AMO ou o plasmídeo pCWori-A17AMO-ctAACPR.
A Figura 34 representa cromatografias de GC-MS mostrandooxidação de álcool artemisínico em aldeído artemisínico em E. coli geneti-camente modificada com ácidos nucléicos que codificam enzimas de trajetó-ria de mevalonato e amorfadieno sintase, e com o plasmídeo pCWori-A17AMO-CtAACPR.
As Figuras 35A e 35B representam seqüências de nucleotídeoque codificam acetoacetil-CoA tiolase ("atoB"), HMGS, e HMGR truncado(tHMGR).
As Figuras 36A-D representam a seqüência de nucleotídeo depMBIS.
DEFINIÇÕES
Os termos "isoprenóide," "composto de isoprenóide," "terpe-no," "composto de terpeno," "terpenóide," e "composto de terpenóide" sãousados intercambeavelmente aqui. Os composto de isoprenóide são com-postos de vários números das assim denominadas unidades de isopreno(C5). O número de átomos de C presente nos isoprenóides é tipicamenteconstantemente divisível por cinco (por exemplo, C5, C10, C15, C20, C25,C30 e C40). Os isoprenóides e politerpenos irregulares foram reportados, esão também incluídos na definição de "isoprenóide". Os compostos de iso-prenóide incluem, mas não estão limitados a, monoterpenos, sesquiterpe-nos, triterpenos, politerpenos, e diterpenos.
Conforme aqui usado, o termo "prenil difosfato" é usado inter-cambeavelmente com "prenil pirofosfato," e incluem monoprenil difosfatostendo um grupo prenil simples (por exemplo, IPP e DMAPP), bem como po-liprenil difosfatos que incluem 2 ou mais grupos prenil. Os monoprenil difos-fatos incluem isopentenil pirofosfato (IPP) e seu isômero dimetilalil pirofosfa-to (DMAPP).
Conforme aqui usado, o termo "terpeno sintase" se refere aqualquer enzima que modifica enzimaticamente IPP, DMAPP, ou um poli-prenil pirofosfato, tal que um composto precursor de terpenóide é produzido.O termo "terpeno sintase" inclui enzimas que catalisam a conversão de umprenil difosfato em um isoprenóide ou precursor de isoprenóide.
A palavra "pirofosfato" é usada intercambeavelmente aqui com"difosfato." Desse modo, por exemplo, os termos "prenil difosfato" e "prenilpirofosfato" são intercambeáveis; os termos "isopentenil pirofosfato" e "iso-pentenil difosfato" são intercambeáveis; os termos farnesil difosfato" e farne-sil pirofosfato" são intercambeáveis; etc.
O termo "trajetória de mevalonato" ou "trajetória de MEV" éaqui usado para se referir a trajetória biosintética que converte acetil-CoAem IPP. A trajetória de mevalonato compreende enzimas que canalizam asseguintes etapas: (a) condensação de duas moléculas de acetil-CoA emacetoacetil-CoA; (b) condensação de acetoacetil-CoA com acetil-CoA paraforrrVar HMG-CoA; (c) conversão de HMG-CoA em mevalonato; (d) fosforila-ção de mevalonato em mevalonato 5-fosfato; (e) conversão de mevalonato5-fosfato em mevalonato 5-pirofosfato; e (f) conversão de mevalonato 5-pirofosfato em isopentenil pirofosfato. A trajetória de mevalonato é ilustradaesquematicamente na Figura 17. A "metade superior" da trajetória de meva-lonato se refere às enzimas responsáveis pela conversão de acetil-CoA emmevalonato através de um intermediário de· trajetória de MEV.O termo "trajetória 1-deoxi-D-xilulose 5-difosfato" ou "trajetóriaDXP", é usado aqui para se referir à trajetória que converte gliceraldeído-3-fosfato e piruvato em IPP e DMAPP através de um intermediário de trajetóriade DXP, onde a trajetória de DXP compreende enzimas que catalisam asreações representadas esquematicamente na Figura 18.
Conforme aqui usado, o termo "prenil transferase" é usado in-tercambeavelmente com os termos "isoprenil difosfato sintase" e "poliprenilsintase" (por exemplo, "GPP sintase," "FPP sintase," "OPP sintase," etc.)para se referir a uma enzima que catalisa a condensação consecutiva 1'-4de isopentenil difosfato com substratos prímeres alílicos, resultando na for-mação de prenil difosfatos de vários comprimentos de cadeia.
Os termos "polinucleotídeo" e "ácido nucléico," usados inter-cambeavelmente aqui se referem a uma forma polimérica de nucleotídeosde qualquer comprimento, ou ribonucleotídeos ou deoxinucleotídeos. Dessemodo, este termo inclui, mas não está limitado a, DNA ou RNA de trançadosimples, duplo ou múltiplo, DNA genômico, cDNA, híbridos de DNA-RNA, ouum polímero compreendendo bases de purina é pirimidina, ou outras basesde nucleotídeo naturais, quimicamente ou bioquimicamente modificadas,não-naturais, ou derivatizadas.
Os termos "peptídeo," "polipeptídeo," e "proteína" são usadosintercambeavelmente aqui, e se referem a uma forma polimérica de aminoácidos de qualquer comprimento, que podem incluir amino ácidos codifica-dos ou não-codificados, quimicamente ou bioquimicamente modificados, ouamino ácidos derivatizados, e polipeptídeos tendo suportes de peptídeo mo-dificados.
O termo "ocorrendo naturalmente" conforme aqui usado, con-forme aplicado a um ácido nucléico, a uma célula, ou a um organismo, serefere a um ácido nucléico, célula, ou organismo que é encontrado na natu-reza. Por exemplo, um polipeptídeo ou seqüência de polinucleotídeo queestá presente em um organismo (incluindo vírus) que podem ser isolados apartir de uma fonte na natureza, e que não tenha sido intencionalmente mo-dificado por um humano no laboratório, está ocorrendo naturalmente.Conforme aqui usado, o termo "isolado" é significativo paradescrever um polinucleotídeo, um polipeptídeo, ou uma célula que está emum ambiente diferente daquele no qual o polinucleotídeo, o polipeptídeo, oua célula ocorrem naturalmente. Uma célula hospedeira geneticamente modi-ficada pode estar presente em uma população misturada de células hospe-deiras geneticamente modificadas.
Conforme aqui usado, o termo "ácido nucléico exógeno" se re-fere a um ácido nucléico que não é normalmente ou naturalmente encontra-do e/ou produzido por uma dada bactéria, organismo, ou célula na natureza.Conforme aqui usado, o termo "ácido nucléico endógeno" se refere a umácido nucléico que é normalmente encontrado e/ou produzido por uma dadabactéria, organismo, ou célula na natureza. Um "ácido nucléico endógeno" étambém referido como um "ácido nucléico nativo", ou um ácido nucléico queé "nativo" para uma dada bactéria, organismo, ou célula. Por exemplo, osácidos nucléicos que codificam HMGS, mevalonato kinase, e fosfomevalona-to kinase representam ácidos nucléicos exógenos para E. coli. Estes ácidosnucléicos de trajetória de mevalonato foram clonados de Sacchromyces ce-revisiae. Em S. cerevisiae, as conseqüências que codificam HMGS, MK, ePMK no cromossomo seriam "ácidos nucléicos endógenos".
O termo "ácido nucléico heterólogo", conforme aqui usado, serefere a um ácido nucléico no qual pelo menos um dos seguintes é verdadei-ro: (a) o ácido nucléico é estranho ("exógeno") a (isto é, não naturalmenteencontrado) um dado microorganismo hospedeiro ou célula hospedeira; (b) oácido nucléico compreende uma seqüência de nucleotídeo que é natural-mente encontrada em (por exemplo, é "endógeno a") um dadò microorga-nismo hospedeiro ou célula hospedeira (por exemfblo, o ácido nucléico com-preende uma seqüência de nucleotídeo que é endógena ao microorganismohospedeiro, ou célula hospedeira), mas é, ou produzido em uma quantidadenão-natural (por exemplo, maior do que esperada ou maior do que natural-mente encontrada) na célula, ou difere em seqüência a partir da seqüênciaendógena de nucleotídeo, tal que a mesma proteína codificada (tendo amesma, ou substancialmente a mesma seqüência de amino ácido) conformeencontrada endogenamente, é produzida em uma quantidade não-natural(por exemplo, maior do que esperada ou maior do que naturalmente encon-trada) na célula; (c) o ácido nucléico compreende duas ou mais seqüênciasde nucleotídeo ou segmentos que não são encontrados no mesmo relacio-namento na natureza, por exemplo, o ácido nucléico é recombinante.
O termo "polipeptídeo heterólogo", conforme aqui usado, serefere a um polipeptídeo que não é naturalmente associado com um dadopolipeptídeo. Por exemplo, uma enzima de modificação de precursor de i-soprenóide que compreende um "domínio heterólogo de transmembrana" serefere a uma enzima de modificação de precursor de isoprenóide que com-preende um domínio de transmembrana que não é normalmente associadocom (por exemplo, não normalmente contíguo com; não normalmente en-contrado na mesma cadeia de polipeptídeo com) a enzima de modificaçãode precursor de isoprenóide na natureza. Similarmente, uma enzima de mo-dificação de precursor de isoprenóide que compreende um ou mais dentreum "domínio heterólogo de secreção", um "polipeptídeo de inserção demembrana heterólogo", e um "domínio heterólogo de solubilização" é umaenzima de modificação de precursor de isoprenóide que compreende um oumais dentre um domínio de secreção, um polipeptídeo de inserção de mem-brana, e um domínio de solubilização que não é normalmente associadocom (por exemplo, não normalmente contíguos com; não normalmente en-contrado na mesma cadeia de polipeptídeo com) a enzima de modificaçãode precursor de isoprenóide na natureza.
"Recombinante", conforme aqui usado, significa que um ácidonucléico particular (DJMA ou RNA) é o produto de várias combinações de e-tapas de clonagem, restrição, e/òu ligação, resultando em uma construçãotendo uma seqüência de codificação ou não-codificação estrutural distinguí-vel dos ácidos nucléicos endógenos encontrados nos sistemas naturais. Ge-nialmente, as seqüências de DNA que codificam a seqüência de codificaçãoestrutural podem ser montadas a partir de fragmentos de cDNA e Iigadoresde oligonucleotídeos curtos, ou a partir de uma série de oligonucleotídeossintéticos, para proporcionar um ácido nucléico sintético que é capaz dè serexpresso de uma unidade transcricional recombinante contida em uma célu-la, ou em um sistema de transcrição ou translação de célula, ou livre de célu-la. Tais seqüências podem ser providas na forma de uma estrutura de leituraaberta não-interrompida por seqüências internas não-transladadas, ou in-trons, que estão tipicamente presentes em genes eucarióticos. O DNA ge-nômico compreendendo as seqüências relevantes pode também ser usadona formação de um gene recombinante, ou unidade transcricional. As se-qüências de DNA não-transladado podem estar presentes 5' ou 3' a partir daestrutura de leitura aberta, onde tais seqüências não interferem com manipu-lação ou expressão das regiões de codificação, e podem, de fato, agirempara modular a produção de um produto desejado por vários mecanismos(ver "seqüências regulatórias de DNA", abaixo).
Desse modo, por exemplo, o termo polinucleotídeo "recombi-nante" ou ácido nucléico "recombinante" se referem a um que não está ocor-rendo naturalmente, por exemplo, é produzido pela combinação artificial dedois segmentos, de outro modo, separados, de seqüência através de inter-venção humana. Esta combinação artificial é freqüentemente acompanhadapor, ou meio de síntese química, ou pela manipulação artificial de segmentosisolados de ácidos nucléicos, por exemplo, por técnicas de projetos genéti-cas. Tal é usualmente feito para substituir um códon com um códon redun-dante que codifica o mesmo, ou um amino ácido conservativo, enquanto tipi-camente introduz ou remove um local de reconhecimento de seqüência. Al-ternativamente, é realizado unir juntos segmentos de ácido nucléico de fun-ções desejadas para gerar uma combinação desejada de funções. EstaCQmbinação artificial é freqüentemente acompanhada por, ou meio de sínte-se química, oti por manipulação artificial de segmentos isolados de ácidosnucléicos, por exemplo, por técnicas de projetos genéticas.
Similarmente, o termo polipeptídeo "recombinante" se refere aum polipeptídeo que não está ocorrendo naturalmente, por exemplo, é pro-duzido pela combinação artificial de dois segmentos, de outro modo, sepa-rados, de seqüência de amino através de intervenção humana. Desse modo,por exemplo, um polipeptídeo que compreende uma seqüência heterólogade amino ácido é recombinante.
Por "construção" ou "vetor" é significativo um ácido nucléicorecombinante, genialmente DNA recombinante, que tenha sido gerado paraa proposta da expressão e/ou propagação de uma seqüência específica denucleotídeo(s), ou é para ser usado na construção de outra seqüência re-combinante de nucleotídeos.
Conforme aqui usado, os termos "operon" e "unidade de trans-crição simples" são usados intercambeavelmente para se referirem a duasou mais regiões de codificação contíguas (seqüência de nucleotídeos quecodifica um produto de gene, tal como um RNA ou uma proteína) que sãocoordenadamente reguladas por um ou mais elementos de controle (por e-xemplo, um promotor). Conforme aqui usado, o termo "produto de gene" serefere a RNA codificado por DNA (ou vice-versa), ou proteína que é codifica-da por um RNA ou DNA, onde um gene tipicamente compreenderá uma oumais seqüências de nucleotídeo que codificam uma proteína, e pode tam-bém incluir introns e outras seqüências de não-codificação de nucleotídeos.
Os termos "seqüências regulatórias de DNA", "elementos decontrole", e "elementos regulatórios", usados intercambeavelmente aqui, sereferem a seqüências de controle transcricionais e translacionais, tais comopromotores, intensificadores, sinais de poliadenilação, terminadores, sinaisde degradação de proteína, e similares, que proporcionam e/ou regulam ex-pressão de uma seqüência de codificação e/ou produção de um polipeptídeocodificado em uma célula hospedeira.
O termo "transformação" é usado intercambeavelmente aquicom "modificação genética", e se refere a uma mudança genética permanen-te ou transiente induzida em uma célula, seguindo introdução de novo ácidonucléico (isto é, DNA exógeno à célula). A mudança genética ("modificação")pode ser acompanhada, ou pela incorporação do novo DNA no genoma dacélula hospedeira, ou por manutenção transiente ou estável do novo DNAcomo um elemento epissomal. Onde a célula é uma célula eucariótica, umamudança genética permanente é geralmente alcançada pela introdução doDNA no genoma da célula. Em células procarióticas, mudanças permanen-tes podem ser introduzidas no cromossomo, ou via elementos extracromos-somais, tais como plasmídeos e vetores de expressão, que podem conterum ou mais marcadores selecionáveis para auxiliar em sua manutenção nacélula hospedeira recombinante. Métodos adequados de modificação gené-tica incluem infecção viral, transfecção, conjugação, fusão de protoplasto,electroporação, tecnologia de canhão de partícula, precipitação de fosfato decálcio, microinjeção direta, e similares. A escolha do método é geralmentedependente do tipo de célula a ser transformada, e das circunstâncias sobas quais a transformação está ocorrendo (isto é, in vitro, ex vivo, ou in vivo).Uma discussão geral destes métodos pode ser encontrada em Ausubel, etal, Short Protocols in Molecular Biology, 3rd ed., Wiley & Sons, 1995.
"Operavelmente ligado" se refere a uma justaposição na qualos componentes assim descritos estão em um relacionamento que permiteque os mesmos funcionem em sua maneira pretendida. Por exemplo, um15 promotor é operavelmente ligado a uma seqüência de codificação se o pro-motor afeta sua transcrição ou expressão. Conforme aqui usado, os termos"promotor heterólogo" e "regiões de controle heterólogas" se referem a pro-motores e outras regiões de controle que não estão normalmente associa-das com um ácido nucléico particular na natureza. Por exemplo, uma "regi-20 ão de controle transcricional heteróloga a uma região de codificação" é umaregião de controle transcricional que não está normalmente associada com aregião de codificação na natureza.
Uma "célula hospedeira", conforme aqui usado, denota umacélula eucariótica in vivo ou in vitro, uma célula procariótica, ou uma célula25 de um organismo multicelular (por exemplo, uma linha de célula) cultivadacomo uma entidade unicelular, cujas células eucarióticas ôu procarióticaspodem ser, ou tenham sido, usadas como recipientes para um ácido nucléi-co (por exemplo, um vetor de expressão que compreende uma seqüência denucleotídeo que codifica um ou mais produtos de gene de trajetória biosinté-30 tica, tais como produtos de gene de trajetória de mevalonato), e incluem aprogenia da célula original que tenha sido geneticamente modificada peloácido nucléico. É compreendido que a progenia de uma célula simples podenão ser necessariamente completamente idêntica na mòrfologia ou no com-plemento genômico ou de DNA total como fonte original, devido à mutaçãonatural, acidental, ou deliberada. Uma "célula hospedeira recombinante"(também referida como "célula hospedeira geneticamente modificada") éuma célula hospedeira na qual tenha sido introduzido um ácido nucléico he-terólogo, por exemplo, um vetor de expressão. Por exemplo, uma célulahospedeira procariótica objeto é uma célula hospedeira procariótica geneti-camente modificada (por exemplo, uma bactéria), em virtude da introduçãoem uma célula hospedeira procariótica adequada de um ácido nucléico hete-rólogo, por exemplo, um ácido nucléico exógeno que é estranho a (não nor-malmente encontrado na natureza) célula hospedeira procariótica, ou umácido nucléico recombinante que não é normalmente encontrado na célulahospedeira procariótica; e uma célula hospedeira eucariótica objeto é umacélula hospedeira eucariótica geneticamente modificada, em virtude da in-trodução em uma célula hospedeira eucariótica adequada de um ácido nu-cléico heterólogo, por exemplo, um ácido nucléico exógeno que é estranho àcélula hospedeira eucariótica, ou um ácido nucléico recombinante que não énormalmente encontrado na célula hospedeira eucariótica.
O termo "substituição de amino ácido conservativo" se refere àintercambialidade em proteínas de resíduos de amino ácido tendo cadeiaslaterais similares. Por exemplo, um grupo de amino ácidos tendo cadeiaslaterais alifáticas consiste de glicina, alanina, valina, leucina, e isoleucina;um grupo de amino ácidos tendo cadeias laterais alifáticas-hidroxil consistede serina e treonina; um grupo de amino ácidos tendo cadeias laterais con-tendo amida consiste de asparagina e glutamina; um grupo de amino ácidostendo cadeias laterais aromáticas consiste^de fenilalanina, tirosina, e tripto-fan; um grupo de amino ácidos tendo cadeias laterais básicas consiste delisina, arginina, e histidina; e um grupo de amino ácidos tendo cadeias late-rais contendo enxofre consiste de cisteína e metionina. Grupos de substitui-ção de amino ácidos conservativos exemplares são: valina-leucina-isoleucina, fenilalanina-tirosina, lisina-arginina, alanina-valina, e asparagina-glutamina."Ácidos nucléicos sintéticos" podem ser agregados de blocosde construção de oligonucleotídeo que são quimicamente sintetizados usan-do-se procedimentos conhecidos àqueles técnicos no assunto. Estes blocosde construção são ligados e temperados para formar segmentos de geneque são, em seguida, enzimaticamente agregados para construção do genetotal. "Quimicamente sintetizado," conforme relacionado a uma seqüência deDNA, significa que os nucleotídeos do componente foram agregados in vitro.A síntese química manual de DNA pode ser acompanhada usando-se pro-cedimentos bem estabelecidos, ou síntese química automática pode ser rea-lizada usando-se um de um número de máquinas comercialmente disponí-veis. A seqüência de nucleotídeo dos ácidos nucléicos pode ser modificadapara expressão ótima baseada na otimização da seqüência de nucleotídeopara refletir o códon diagonal da célula hospedeira. O técnico no assuntoaprecia a probabilidade de expressão bem sucedida se uso do códon é incli-nado em direção àqueles códons favorecidos pelo hospedeiro. A determina-ção de códons preferidos pode estar baseada em uma sobrevivência de ge-nes derivados a partir da célula hospedeira onde informação de seqüência édisponível.
Um polinucleotídeo ou polipeptídeo tem uma certa percenta-gem de "identidade de seqüência" para outro polinucleotídeo ou polipeptí-deo, significando que, quando alinhados, que percentagem de bases ou a-mino ácidos são as mesmas, e na mesma posição relativa, quando se com-parando às duas seqüências. A similaridade da seqüência pode ser determi-nada em um número de maneiras diferentes. Para determinar identidade deseqüência, ^s seqüências podem ser alinhadas usando-se os métodos eprogramas de computador, incluindo BLAST, disponível na web mundial emncbi.nlm.nih.gov/BLAST. Ver, por exemplo, Altschul etal. (1990), J. MoL Biol.215:403-10. Outro algoritmo de alinhamento é FASTA, disponível em Gene-tics Computing Group (GCG) package, de Madison, Wisconsin, USA, umasubsidiária totalmente cessionária de Oxford Molecular Group, Inc. Outrastécnicas para alinhamento são descritas em Methods in Enzymology, vol.266: Computer Methods for Macromolecular Seqüência Analysis (1996), ed.Doolittle, Academic Press, Inc., uma divisão de Hareourt Brace & Co., SanDiego, Califórnia, USA. De interesse particular são programas de alinhamen-to que permitem folgas na seqüência. O Smith-Watermoan é um tipo de al-goritmo que permite folgas nos alinhamentos de seqüência. Ver Meth. MoLBiol. 70: 173-187 (1997). Também, o programa GAP que usa o método dealinhamento Needleman e Wunsch pode ser utilizado para alinhar seqüên-cias. Ver J. MoL Biol. 48: 443-453 (1970).
Um ácido nucléico é "hibridizável" em outro ácido nucléico, taiscomo cDNA, DNA genômico, ou RNA, quando uma forma trançada simplesdo ácido nucléico pode se fortalecer ao outro ácido nucléico sob as condi-ções apropriadas de temperatura e resistência iônica de solução. As condi-ções dé hibridização e lavagem são bem conhecidas e exemplificadas emSambrook, J., Fritsch, E. F. e Maniatis, T. Molecular Cloning: A LaboratoryManual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold SpringHarbor (1989), particularmente Capítulo 11 e Tabela 11.1 nesta; e Sambro-ok, J. and Russell, W., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Editi-on, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (2001). Ascondições de temperatura e resistência iônica determinam a "estringência"da hibridização. As condições de estringência podem ser ajustadas paraclassificar fragmentos moderadamente similares, tais como seqüências ho-mólogas de organismos distantemente relacionados, para fragmentos alta-mente similares, tais como genes que duplicam enzimas funcionais de orga-nismos proximamente relacionados. As condições de hibridização e lava-gens de pós-hibridização são úteis para obter as condições de estringênciadeterminadas desejadas da ,hibridização. Um conjunto de lavagens de pós-hibridização ilustrativo é uma série de lavagens começando com 6 χ SSC(onde SSC é 0,15 M de NaCI e 15 mM de tampão citrato), 0,5% de SDS àtemperatura ambiente por 15 minutos, em seguida repetido com 2 χ SSC,0,5% de SDS a 45°C por 30 minutos, e, em seguida, repetido duas vezescom 0,2 χ SSC, 0,5% de SDS a 50°C por 30 minutos. Outras condições es-tringentes são obtidas pelo uso de temperaturas mais altas nas quais as la-vagens são idênticas àquelas acima, exceto para a temperatura das duaslavagens finais de 30 minutes em 0,2 χ de SSC, 0,5% de SDS, que é au-mentada para 60°C. Outro conjunto de condições altamente estringentes usaduas lavagens finais em 0,1 χ de SSC, 0,1% de SDS a 65°C. Outro exemplode condições de hibridização estringentes é hibridização a 50°C, ou maisalta, e 0,IxSSC (15 mM de cloreto de sódio/1,5 mM de citrato de sódio). Ou-tro exemplo de condições de hibridização estringentes é incubação durantetoda a noite a 42eC em uma solução: 50% de formamida, 5 χ SSC (150 mMde NaCI, 15 mM de citrato de trisódio), 50 mM de fosfato de sódio (pH 7,6),solução 5 χ Denhardt, 10% de dextran sulfato, e 20 μg/ml de DNA de es-perma de salmão cisalhado desnaturado, seguido por lavagem dos filtros em0,1 χ SSC a cerca de 659C. Condições de hibridização estringentes e condi-ções de lavagem de pós-hibridização são condições de hibridização e condi-ções de lavagem de pós-hibridização que são pelo menos tão estringentesquanto às condições representativas acima.
A hibridização requer que os dois ácidos nucléicos contenhamseqüências complementares, embora, dependendo da estringência da hibri-dização, não-equiparações entre bases sejam possíveis. A estringência a-propriada para hibridizar ácidos nucléicos depende do comprimento dos áci-dos nucléicos e do grau de complementação variáveis bem conhecidos natécnica. Quanto maior o grau de similaridade ou homologia entre duas se-qüências de nucleotídeos, maior o valor da temperatura de fusão (Tm) parahíbridos de ácidos nucléicos tendo aquelas seqüências. A estabilidade relati-va (correspondente a Tm mais alta) de hibridizações de ácido nucléico au-menta na seguinte ordem: RNA:RNA, DNA:RNA, DNA:DNA. Para híbridosde mais do que 100 nucleotídeos de comprimento, equações para cálculo daTm têm sido derivadas (ver Sambrook et ai., supra, 9.50-9.51). Para hibridi-zações com ácidos nucléicos mais curtos, isto é, oligonucleotídeos, a posi-ção de união inadequada torna-se mais importante, e o comprimento do oli-gonucleotídeo determina sua especificidade (ver Sambrook et al., supra,11.7-11.8). Tipicamente, o comprimento para um ácido nucléico hibridizávelé pelo menos cerca de 10 nucleotídeos. Os comprimentos mínimos ilustrati-vos para um ácido nucléico hibridizável são: pelo menos cerca de 15 núcleo-tídeos; pelo menos cerca de 20 nucleotídeos; e pelo menos cerca de 30 nu-cleotídeos. Além disso, o técnico no assunto reconhecerá que a temperaturae concentração do sal da solução de lavagem podem ser ajustadas confor-me necessário de acordo com fatores tais como comprimento da sonda.
Antes da presente invenção ser adicionalmente descrita, é pa-ra ser compreendido que esta invenção não está limitada às concretizaçõesparticulares descritas; como tal podem, naturalmente, variar. É também paraser compreendido que a terminologia aqui usada é para a proposta de des-crever concretizações particulares somente, e não é pretendida para ser limi-tada, visto que o escopo da presente invenção estará limitado somente pelasreivindicações em anexo.
Onde uma faixa de valores é provida, é compreendido que ca-da valor interposto, ao décimo da unidade do limite inferior, a menos que ocontexto cite claramente de outro modo, entre o limite superior e inferior da-quela faixa e qualquer outro valor citado ou interposto naquela faixa citada,está envolvido dentro da invenção. Os limites superior e inferior destas fai-xas menores podem independentemente estarem incluídos nas faixas meno-res, e são também envolvidos dentro da invenção, submetido a qualquerlimite especificamente excluído na faixa citada. Onde a faixa citada inclui umou ambos dos limites, as faixas que excluem qualquer ou ambos daqueleslimites incluídos estão também incluídas na invenção.
A menos que de outro modo definido, todos os termos técnicose científicos aqui usados têm o mesmo significado conforme comumentecompreendidos por um técnico no assunto ao qual esta invenção pertence.Embora quaisquer métodos e materiais similares ou equivalentes àquelesaqui descritos possam também sefem usados na prática ou teste da presen-te invenção, os métodos e materiais preferidos são agora descritos. Todasas publicações aqui mencionadas são incorporadas aqui por referência pararevelar e descrever os métodos e/ou materiais em conjunto com os quais aspublicações são citadas.
Deve ser notado que conforme aqui usado e nas reivindica-ções em anexo, as formas singulares "um," "e," e "o" incluem referentes plu-rais, a menos que o contexto cite claramente de outro modo. Desse modo,por exemplo, referência a "uma enzima de citocromo P450" inclui uma plura-lidade de tais enzimas, e referência a "o citocromo P450 reductase" incluireferência a um ou mais citocromos P450 reductase e equivalentes destesconhecidos àquele técnico no assunto, e assim por diante. É adicionalmentenotado que as reivindicações podem ser esboçadas para excluir qualquerelemento opcional. Como tal, esta declaração é pretendida para servir comoase antecedente para uso de tal terminologia exclusiva como "somente,""apenas" e similares, em conjunto com a recitação de elementos de reivindi-cação, ou uso de uma limitação "negativa".
As publicações aqui discutidas são providas somente para suarevelação antes da data de depósito do presente pedido. Nada aqui é paraser construído como uma admissão que a presente invenção não é intituladapara antecipar tal publicação em virtude de invenção anterior. Adicionalmen-te, as datas de publicação providas podem ser diferentes das datas de publi-cação atuais que podem necessitarem de serem independentemente confir-madas
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
A presente invenção proporciona ácidos nucléicos compreen-dendo seqüências de nucleotídeos que codificam enzima modificada de cito-cromo P450s; bem como vetores recombinantes e células hospedeiras com-preendendo os ácidos nucléicos. A presente invenção adicionalmente pro-porciona métodos de produção de um composto funcionalizado em uma cé-lula hospedeira geneticamente modificada com um ácido nucléico compre-endep.do seqüência de nucleotídeos que codificam uma enzima modificadade citocromo Ρ45Ό.
A presente invenção adicionalmente proporciona ácidos nu-cléicos compreendendo seqüências de nucleotídeos que codificam enzimasde modificação de precursor de isoprenóide; bem como vetores recombinan-tes e células hospedeiras compreendendo os ácidos nucléicos. A presenteinvenção proporciona métodos de produção de uma enzima de modificaçãode precursor de isoprenóide enzimaticamente ativo em uma célula hospedei-ra. A presente invenção adicionalmente proporciona métodos de produçãode um composto de isoprenóide em uma célula hospedeira geneticamentemodificada com um ácido nucléico compreendendo seqüência de nucleotí-deos que codificam uma enzima de modificação de precursor de isoprenóide.
ÁCIDOS NUCLÊICOS, VETORES E CÉLULAS HOSPEDEIRAS
A presente invenção proporciona ácidos nucléicos compreen-dendo seqüências de nucleotídeo que codificam enzima modificada de cito-cromo P450s; bem como vetores recombinantes e células hospedeiras com-preendendo os ácidos nucléicos. A presente invenção proporciona ácidosnucléicos compreendendo seqüências de nucleotídeo que codificam enzimade modificação de precursor de isoprenóides; bem como vetores recombi-nantes e células hospedeiras compreendendo os ácidos nucléicos.
O termo "enzima modificada de citocromo P450", conformeaqui usado, se refere a uma enzima que modifica (por exemplo, "funcionali-za") um intermediário em uma trajetória biosintética. A enzima modificada decitocromo P450 codificada por um ácido nucléico objeto catalisa uma oumais das seguintes reações: hidroxilação, oxidação, epoxidação, desidrata-ção, dehidrogenação, dehalogenação, isomerização, oxidação de álcool,oxidação de aldeído, dealquilação, e clivagem de ligação C-C. Tais reaçõessão aqui referidas genericamente como "modificações intermediárias de tra-jetória biosintética." Estas reações foram descritas em, por exemplo. Sono etal. ((1996) Chem. Rev. 96:2841-2887; ver, por exemplo, Figura 3, de Sono etal., para uma representação esquemática de tais reações).
Em algumas concretizações, uma enzima modificada de cito-"Cromo P450 é uma enzima de modificação de precursor de isoprenóide. Otermo "enzima de modificação de precursor de isoprenóide," usado inter-cambeavelmente aqui com "enzima de modificação de isoprenóide," se refe-re a uma enzima que modifica um composto de precursor de isoprenóide,por exemplo, com um composto de precursor de isoprenóide como substra-to, a enzima de modificação de precursor de isoprenóide catalisa uma oumais das seguintes reações: hidroxilação, epoxidação, oxidação, desidrata-ção, dehidrogenação, dehalogenação, isomerização, oxidação de álcool,oxidação de aldeído, dealquilação, e clivagem de ligação de C-C. Tais rea-ções são referidas genericamente aqui como "modificações de precursor deisoprenóide." Estas reações foram descritas em, por exemplo, Sono et al.((1996) supra; ver, por exemplo, Figura 3 de Sono et al. para uma represen-tação esquemática de tais reações). As enzimas de modificação de precur-sor de isoprenóide são, em muitas concretizações, enzimas de citocromoP450s. Ver, por exemplo, Sono et al. (1996) supra.
Substratos de uma enzima modificada de citocromo P450
Conforme notado acima, um substrato de uma enzima modifi-cada de citocromo P450 é um intermediário em uma trajetória biosintética.Intermediários exemplares incluem, mas não estão limitados a, precursoresde isoprenóide; precursores de alcalóde; precursores de fenilpropanóide;precursores de flavonóide; precursores de esteróide; precursores de police-tide; precursores de macrolida; precursores de álcool de açúcar; precursoresde composto fenólico; e similares. Ver, por exemplo, Hwang et al. ((2003)Appi Environ. Microbiol. 69:2699-2706; Facchini et al. ((2004) TRENDSPlant Sei. 9:116.
Os produtos de trajetória biosintética de interesse incluem,mas não estão limitados a, compostos de isoprenóides, compostos de alca-lóide, compostos de fenilpropanóide, compostos de flavonóide, compostosde esteróide, compostos de policetide, compostos de macrolida, compostosde álcool de açúcar, compostos fenólicos, e similares.
Os compostos de alcalóide são um grupo diverso grande deprodutos naturais encontrados em cerca de 20% de^espécies de planta. Elessão geralmente definidos pela ocorrência de um átomo de nitrogênio em umestado oxidante dentro de um anel heterocíclico. Os compostos de alcanóideincluem compostos benzilisoquinolina alcanóide, compostos índole alcanói-de, compostos isoquinolina alcalóide, e similares. Os compostos de alcalóideincluem compostos monocíclicos de alcalóide, compostos dicíclicos de alca-lóide, compostos tricíclicos de alcalóide, compostos tetracíclicos de alcalói-de, bem como compostos de alcalóide com estruturas de gaiola. Os compos-tos de alcalóide incluem: 1) Grupo de piridina: piperina, coniina, trigonelina,arecaidina, guvacina, pilocarpina, citisina, esparteína, peletierina; 2) Grupode pirrolidina: higrina, nicotina, cuscohigrina; 3) Grupo de tropina: atropina,cocaína, ecgonina, peletierina, escopolamina; 4) Grupo de quinolina: quinina,dihidroquinina, quinidina, dihidroquinidina, estriquinina, brucina, e os alcalói-des veratrum (por exemplo, veratrina, cevadina); 5) Grupo de isoquinolina:morfina, codeína, tebaína, papaverina, narcotina, narceína, hidrastina, e ber-berina; 6) Grupo de fenetilamina: metanfetamina, mescâlina, efedrina; 7)Grupo de índole: triptaminas (por exemplo, dimetiltriptamina, psilocibin, sero-tonina), ergolinas (por exemplo, ergina, ergotamina, ácido lisérgico, etc.), ebeta-carbolinas (por exemplo, harmina, iohimbina, reserpina, emetina); 8)Grupo de purina: xantinas (por exemplo, cafeína, teobromina, teofilina); 9)Grupo de terpenóide: alcalóides de aconita (por exemplo, aconitina), e este-róides (por exemplo, solanina, samandarin); 10) Grupo de betaína: (compos-tos de amônia quaternária: por exemplo, muscarina, colina, neurina); e 11)Grupo de pirazole: pirazole, fomepizole. Compostos de alcalóide exempla-res são morfina, berberina, vinblastina, vincristina, cocaína, escopolamina,cafeína, nicotina, atropina, papaverina, emetina, quinina, reserpina, codeína,serotonina, etc. Ver, por exemplo, Facchini et al. ((2004) Trends Plant Scien-ce 9:116).
Substratos de enzima de modificação de isoprenóides
O termo "composto de precursor de isoprenóide" é usado in-tercambeavelmente com "substrato de precursor de isoprenóide" para sereferir a um composto que é um produto da reação de um terpeno sintaseem um poliprenil difosfato. O prççluto de ação de uma reação de terpenosintase (também referido como um "terpeno ciclase") é o assim denominado"esqueleto de terpeno". Em algumas concretizações, a enzima de modifica-ção de isoprenóide catalisa a modificação de um esqueleto de terpeno, ouum produto a jusante deste. Desse modo, em algumas concretizações, oprecursor de isoprenóide é um esqueleto de terpeno. Os substratos de pre-cursor de isoprenóide de uma enzima de modificação de precursor de iso-prenóide incluem monoterpenos, diterpenos, triterpenos, e sesquiterpenos.Os substratos de monoterpeno de uma enzima de modificaçãode isoprenóide condificada por um ácido nucléico objeto incluem, mas nãoestão limitados a, qualquer substrato de monoterpeno que produz um produ-to de oxidação que é um monocomposto de terpeno, ou é um intermediárioem uma trajetória biosintética que ocorre em um monocomposto de terpeno.
Substratos de monoterpeno exemplares incluem, mas não estão limitados a,substratos de monoterpeno que caem em qualquer das seguintes famílias:monoterpenos acíclicos, Dimetiloctanos, Mentanos, Monoterpenóides Irregu-lares, Cineóis, Canfanos, Isocanfanes, Monoterpenos monocíclicos, Pina-nos, Fenchanos, Tujanos, Caranos, lononos, lridanos, e Canabanóides.Substratos de monoterpeno exemplares, intermediários, e produtos incluem,mas não estão limitados a, limoneno, citranelol, geraniol, rnentoi, álcool peri-lil, linalool, e tujono.
Os substratos de diterpeno de uma enzima de modificação deisoprenóide codificada por um ácido nucléico objeto incluem, mas não estãolimitados a, qualquer substrato de diterpeno que produz um produto de oxi-dação que é um dicomposto de terpeno, ou é um intermediário em uma tra-jetória biosintética que ocorre em um dicomposto de terpeno. Substratos dediterpeno exemplares incluem, mas não estão limitados a, substratos de di-terpeno que caem em qualquer das seguintes famílias: Diterpenóides Acícli-cos, Diterpenóides Bicíclicos, Diterpenóides Monicíclicos, Labdanos, Clero-danos, Taxanos, Diterpenóides Tricíclicos, Diterpenóides Tatracíclicos, Kau-renos, Beyerenos, Atiserenos, Aphidicolins, Grayanotoxins, Gibberellins, Di-terpenos Macrocíclicos, e Elizabethatrianos. Substratos de diterpeno exem-plares, intermediários,- e produtos incluem, mas .não estão limitados a, cas-beno, eleuterobin, paclitaxef, prostratin, e pseudopterosin.
Os substratos de triterpeno de uma enzima de modificação deisoprenóide codificada por um ácido nucléico objeto incluem, mas não estãolimitados a, qualquer substrato de triterpeno que produz um produto de oxi-dação que é um tricomposto de terpeno, ou é um intermediário em uma tra-jetória biosintética que ocorre em um tricomposto de terpeno. Substratos detriterpeno exemplares, intermediários, e produtos incluem, mas não estãolimitados a, arbrusideE, bruceantin, testosterona, progesterona, cortisona, edigitoxin.
Os substratos de sesquiterpeno de uma enzima de modifica-ção de isoprenóide codificada por um ácido nucléico objeto incluem, masnão estão limitados a, qualquer substrato de sesquiterpeno que produz umproduto de oxidação que é um sesquicomposto de terpeno, ou é um inter-mediário em uma trajetória biosintética que ocorre em um sesquicompostode terpeno. Substratos de sesquiterpeno exemplares incluem, mas não es-tão limitados a, substratos de sesquiterpeno que caem em qualquer das se-guintes famílias: Farnesanos, Monociclofarnesanos, Sesquiterpenos mono-cíclicos, Sesquiterpenos bicíclicos, Biciclofarnesanos, Bisbolanos, Santala-nos, Cupranos, Herbertanos, Gimnomitranos, Tricotecanos, Chamigranos,Carotanos, Acoranos, Antisatins, Cadinanos1 Oplopananos, Copaanos, Pi-crotoxanos, Himachalanos, Longipinanos, Longiciclanos, Cariofilanos, Mode-fanos, Sifiperfolanos, Humulanos, lntergrifolianos, Lipifolianos, Protoiluda-nos, lludanos, Hirsutanos, Lactaranos, Esterpuranos, Fomanosanos, Ma-rasmanos, Germacranos, Elemanos, Eudesmanos, Bakkanos, Quilosifanos,Guaianos, Pseudoguaianos, Sesquiterpenos tricíclicos, Patchoulanos, Trixa-nos, Aromadendranos, Gorgonanos, Nardosinanos, Brasilanos1 Pinguisanos,Sesquipinanos, Sesquicamfanos, Tujopsanos, Bicilcohumulanos, Alliacanos,Esterpuranos, Lactaranos, Africanos, lntegrifolianos, Protoiludanos, Aristola-nos, e Neolemnanos. Substratos de sesquiterpeno exemplares incluem, masnão estão limitados a, amorfadieno, aloisolongifoleno, (-)-a-trans-bergamoteno, (-)-p-elemeno, (+)-germacreno A, germacrenoe Β, (+)-γ-gurjuneno, (+)-ledeno, neointermoedeol, (+)-p-selineno, e (+)-valenceno.
Modificações
Um ácido nucléico objeto compreende uma seqüência de nu-cleotídeo que codifica a enzima modificada de citocromo P450, onde a en-zima modificada de citocromo P450 codificada por um ácido nucléico objetoterá, em muitas concretizações, uma seqüência de amino ácido não-nativa(tipo não-selvagem, ou que ocorre não-naturalmente, ou variante). A enzimamodificada de citocromo P450 codificada terá uma ou mais modificações deseqüência de amino ácido (anulações, adições, inserções, substituições) queaumentam o nível de atividade da enzima modificada de citocromo P450 emuma célula hospedeira geneticamente modificada com um ácido nucléicoobjeto, e/ou que aumentam o nível de um dado produto de uma trajetóriabiosintética produzida por uma célula hospedeira geneticamente modificadacom um ácido nucléico objeto.
Em algumas concretizações, um ácido nucléico objeto com-preende uma seqüência de nucleotídeo que codifica uma enzima modificadade modificação de precursor de isoprenóide, onde a enzima de modificaçãode precursor de isoprenóide codificada por um ácido nucléico objeto terá, emmuitas concretizações, uma seqüência de amino ácido não-nativa (tipo não-selvagem, ou que ocorre naturalmente, ou variante). A enzima de modifica-ção de precursor de isoprenóide codificada terá uma ou mais modificaçõesde seqüência de amino ácido (anulações, adições, inserções, substituições)que aumentam o nível de atividade da enzima de modificação de precursorde isoprenóide em uma célula hospedeira geneticamente modificada comum ácido nucléico objeto, e/ou que aumentam o nível de um dado compostode isoprenóide produzido por uma célula hospedeira geneticamente modifi-cada com um ácido nucléico objeto. A enzima codificada de modificação deprecursor de isoprenóide incluirá, em algumas concretizações, uma ou maisdas seguintes modificações em relação a uma enzima tipo selvagem de mo-dificação de precursor de isoprenóide: a) substituição de um domínio nativode transmembrana com um domínio não-nativo de transmembrana; b) subs-tituição do domínio nativo de transmembrana com um domínio de sinal desecreção; c) substituição do domínio nativo de transmembrana com um do-mínio de solubilização; d) substituição do domínio nativo de transmembranacom domínio de inserção de membrana; e) mutilação do domínio nativo detransmembrana; e f) uma mudança na seqüência de amino ácido do domínionativo de transmembrana.
Em muitas concretizações, um ácido nucléico objeto compre-ende, na ordem de 5' ao 3', e em ligação operável, uma seqüência de nucle-otídeo que codifica um primeiro domínio selecionado de um domínio detransmembrana, um domínio de secreção, um domínio de solubilização, euma proteína de inserção de membrana; e uma seqüência de nucleotídeoque codifica o domínio catalítico de uma enzima P450 modificada (por e-xemplo, uma enzima de modificação de precursor de isoprenóide), onde oprimeiro domínio é heterólogo ao domínio catalítico. Em algumas concretiza-ções, o primeiro domínio compreende ambos um sinal de secreção e umdomínio de transmembrana.
Domínio não-nativo de transmembrana
Em algumas concretizações, a enzima modificada de citocro-mo P450 codificada (por exemplo, uma enzima de modificação de precursorde isoprenóide) compreenderá um domínio de transmembrana não-nativo(por exemplo, um heterólogo). Domínios de transmembrana não-nativos a-dequados geralmente serão selecionados de domínios de transmembranaque são funcionais em uma dada célula hospedeira. Em algumas concreti-zações, o domínio de transmembrana não-nativo é um que é funcional emuma célula hospedeira procariótica. Em outras concretizações, o domínio detransmembrana não-nativo é um que é funcional em uma célula hospedeiraeucariótica.
Por exemplo, para expressão em E. coli, um domínio detransmembrana não-nativo compreenderá, em muitas concretizações, umadas seguintes seqüências de amino ácido:
NH2-MWLLLIAVFLLTLAYLFWP-COOH (SEQ ID ΝΟ.Ί);
NH2-MALLLAVFLGLSCLLLLSLW-COOH (SEQ ID NO:2);
NH2-MAILAAIFALVVATATRV-COOH (SEQ ID NO:3);
NH2-MDASLLLSVALAVVLIPLSLALLN-COOH (SEQ ID NO:4);e
NH2-MIEQLLEYWYVVVPVLYIIKQLLAYTK-COOH (SEQ ID
NO:5).
Sinal de secreção
Em algumas concretizações, a enzima modificada de citocro-mo P450 codificada (por exemplo, uma enzima de modificação de precursorde isoprenóide), compreenderá uma seqüência de amino ácido não-nativaque proporciona secreção da proteína de fusão a partir da célula/Aquelestécnicos no assunto estão cientes de seqüências de sinal de secreção. Ossinais de secreção que são adequados para uso na bactéria incluem, masnão estão limitados a, o sinal de secreção de lipoproteína de Braun de E.coli, S. marcescens, E. amylosora, M. morganii, e P. mirabilis, a proteínaTraT de E. coli e Salmonella; a proteína penicillinase (PenP) de B. Iicheni-formis e B. cereus e S. aureus; proteínas pullulanase de Klebsiella pneumo-niae e Klebsiella aerogenese; Iipoproteinas de E. coli 1pp-28, Pai, Rp1A,Rp1B, OsmB, NIpB1 e OrM7; proteína chitobiase de V. harseyr, a proteína β-1,4-endoglucanase de Pseudomonas solanacearum, as proteínas Pal e Pcpde H. influenzae-, a proteína Oprl de P. aerugínosa; as proteínas MaIX e A-miA de S. pneumoniae; o antígeno 34 kda e proteína pTpmA de Treponemapallidum-, a proteína P37 de Mycoplasma hyorhinis; a protease neutra de Ba-cillus amyloliquefaciens] a antígeno 17 kda de Rickettsia rickettsii; a proteínade ligação de maltose malE; a proteína de ligação de ribose rbsB; fosfatasealcalina phoA; e o sinal de secreção OmpA (ver, por exemplo, Tanji et al.(1991) J Bacteriol. 173(6): 1997-2005). As seqüências de sinal de secreçãoadequadas para uso em levedura são conhecidas na técnica, e podem serusadas. Ver, por exemplo, Patente dos Estados Unidos No. 5.712,113. Ossinais de secreção rbsB, malE, e phoA são discutidos em, por exemplo, Col-Iier (1994) J. Bacteriol. 176:3013.
Em algumas concretizações, por exemplo, para expressão emuma célula hospedeira procariótica, tais como E. coli, um sinal de secreçãocompreenderá uma das seguintes seqüências de amino ácido:
NH2-MKKTAiAIAVALAGFATVAQA-COOH (SEQ ID N0:6);
nh2-mkktaiaivvalag fatvaqa-cooh (seq id no:7);nh2-mkktalalavalag fatvaqa-cooh (seq id no:8);nh2-mkiktgarilalsalttmmfsasala-cooh (seq id
N0:9);
NH2-MNMKKLATLVSAVALSATVSANAMA-COOH (SEQ ID
N0:10); e
NH2-MKQSTIALALLPLLFTPVTKA-COOH (SEQ ID NO:11).Em algumas concretizações, a enzima modificada de citocro-mo P450 codificada (por exemplo, uma enzima de modificação de precursorde isoprenóide) compreenderá ambos uma seqüência de sinal de secreçãonão-nativa e um domínio heterólogo de transmembrana. Qualquer combina-ção de seqüência de sinal de secreção e domínio heterólogo de transmem-brana pode ser usada.
Como um exemplo não-limitativo, o domínio heterólogo com-preendendo uma seqüência de sinal de secreção não-nativa e um domínioheterólogo de transmembrana terá, em algumas concretizações, a seguinteseqüência de amino ácido: NH2-MKKTAIAIAVALAGFATVAQALLEYWYVVVPVLYIIKQLLAYTK-COOH (SEQID NO: 12), onde o domínio de transmembrana é sublinhado, e o sinal de se-creção é N-terminal ao domínio de transmembrana.
Domínio de solubilização
Em algumas concretizações, a enzima modificada de citocro-mo P450 codificada (por exemplo, uma enzima de modificação de precursorde isoprenóide) compreenderá um domínio não-nativo que proporciona asolubilização da proteína.
Em algumas concretizações, um domínio de solubilizaçãocompreenderá uma ou mais das seguintes seqüências de amino ácido:
NH2-EELLKQALQQAQQLLQQAQELAKK-COOH (SEQ IDN0:13); e
NH2-MTVHDIIATYFTKWYVIVPLALIAYRVLDYFY-COOH(SEQ ID N0:14);
NH2-GLFGAIAGFIEGGWTGMIDGWYGYGGGKK-COOH(SEQ ID NO: 15); e -
NH2-MAKKTSSKG-COOH (SEQ ID Ν0.16).
Domínio de inserção de membrana
Em algumas concretizações, a enzima modificada de citocro-mo P450 modificada (por exemplo, uma enzima de modificação de precursorde isoprenóide) compreenderá uma seqüência não-nativa de amino ácidoque proporciona inserção em uma membrana. Em algumas concretizações,a enzima modificada de citocromo P450 codificada é um polipeptídeo de fu-são que compreende um co-participante de fusão heterólogo (por exemplo,uma proteína outra do que uma enzima de citocromo P450) fundido na estru-tura, ou no terminal amino, ou no terminal carboxil, onde o co-participante defusão proporciona a inserção da proteína de fusão em uma membrana bioló-gica.
Em algumas concretizações, o co-participante de fusão é umaproteína "mistic", por exemplo, uma proteína compreendendo a seqüênciade amino ácido representada na Figura 5 (N° de Acesso ao GenBankAY874162). Uma seqüência de nucleotídeo que codifica a proteína "mistic" étambém provida sob o N0 de Acesso ao GenBank AY874162. Outros poli-peptídeos que proporcionam inserção em uma membrana biológica são co-nhecidos na técnica, e são discutidos em, por exemplo, PsbW Woolhead etal. (J. Biol. Chem. 276 (18): 14607), descrevendo PsbW; e Kuhn (FEMS Mi-crobiology Reviews 17 (1992i) 285), descrevendo proteína de pró-camadaM12 e proteína de pró-camada Pf3.
Enzimas de citocromo P450
A enzima de modificação de precursor de isoprenóide codifi-cada será, em muitas concretizações, uma enzima de citocromo P450. Aenzima de citocromo P450 codificada efetuará uma ou mais das seguintesreações: hidroxilação, epoxidação, oxidação, desidratação, dehidrogenação,dehalogenação, isomerização, oxidação de álcool, oxidação de aldeído, de-alquilação, e clivagem de ligação de C-C. Tais reações são referidas generi-camente aqui como "modificações intermediárias de trajetória biosintética"ou, em concretizações particulares, "modificações de precursor de isopre-nóide." Estas reações foram descritas em, por exemplo, Sono et al. ((1996)supra] ver, por exemplo, Figura 3 de Sono et al., para uma representaçãoesquemática de tais reações). Conforme discutido acima, a enzima modifi-cada de citocromo P450 codificada (por exemplo, enzima de modificação deprecursor de isoprenóide) será, em muitas concretizações, um citocromoP450 monooxigenase, um citocromo P450 hidroxilase, um citocromo P450epoxidase, ou um citocromo P450 dehidrogenase. Uma ampla variedade decitocromos Ρ450 monooxigenases, hidroxilases, epoxidases, e dehidrogena-ses (genericamente referidos aqui como "enzimas P450") é conhecida natécnica, e a seqüência de amino ácido de qualquer enzima P450 conhecida,ou uma variante desta, pode ser modificada de acordo com a presente in-venção.
Fontes adequadas de ácido nucléicos compreendendo umaseqüência de nucleotídeo que codifica uma enzima de citocromo P450 inclu-em, mas não estão limitadas a, uma célula ou organismo de qualquer dosseis reinos, por exemplo, Bactéria (por exemplo, Eubacteria); Archaebacteri-a; Protista; Fungi; Plantae; and Animalia. Fontes adequadas de ácidos nu-cléicos exógenos incluem membros similares à planta do reino Protista, in-cluindo, mas não limitados a, alga (por exemplo, alga verde, alga vermelha,glaucofitos, cianobactéria); membros similares a fungo de Protista, por e-xemplo, moldes de lama, moldes de água, etc.; membros similares a animalde Protista, por exemplo, flageliformes (por exemplo, Euglena), amebóides(por exemplo, ameba), esporozoários (por exemplo, Apicomplexa, Myxozoa,Microsporidia), e ciliados (por exemplo, Paramecium). Fontes adequadas deácidos nucléicos exógenos incluem membros do reino Fungi, incluindo, masnão limitado a, membros de qualquer da "phyla": Basidiomycota (club fungi;por exemplo, membros de Agaricus, Amanita, Boletus, Cantherellus, etc.);Ascomycota (sac fungi, incluindo, por exemplo, Saccharomyces); Mycophy-cophyta (lichens); Zygomycota (fungos de conjugação); e Deuteromycota.Fontes adequadas de ácidos nucléicos exógenos incluem membros do reinoPlantae, incluindo, mas não limitado a, membros de qualquer das seguintesdivisões: Bryophyta (por exemplo, musgos), Anthocerqtophyta (por exemplo,ceratófilos), Hepaticophyta (por exemplo, hepáticas), Lycophyta (por exem-plo, musgos), Sphenophyta (por exemplo, cavalinhas), Psilophyta (por e-xemplo, fetos), Ophioglossophyta, Pterophyta (por exemplo, fetos), Cycado-phyta, Gingkophyta, Pinophyta, Gnetophyta, e Magnoliophyta (por exemplo,plantas florescentes. Fontes adequadas de ácidos nucléicos exógenos inclu-em membros do reino Animalia, incluindo, mas não limitado a, membros dequalquer da seguinte "phyla": Porifera (sponges); Placozoa; Orthonectida(parasitas de invertebrados marinhos); Rhombozoa; Cnidaria (corais, anê-monas, medusa, gládios de lula marinhos, amor-perfeito marinho, vespasmarinhas); Ctenophora (gelatinas de crista); Platyhelminthes (platielmintes);Nemertina (vermes de fita); Ngathostomulida (vermes de mandíbula); Gas-trotricha; Rotifera; Priapulida; Kinorhyncha; Loricifera; Acanthocephala; En-toprocta; Nemotoda; Nematomorpha; Cycliophora; Mollusca (moluscos); Si-puncula (bichos de amendoim); Annelida (vermes segmentados); Tardigrada(bichos de concha); Onychophora (vermes de veludo); Arthropoda (incluindoa "subphyla": Chelicerata, Myriapoda, Hexapoda, e Crustacea, onde os Che-licerata incluem, por exemplo, aracnídeos, Merostomata, e Pycnogonida,onde os Myriapoda incluem, por exemplo, Chilopoda (centopéias), Diplopoda(millipedes), Paropoda, e Symphyla, onde os Hexapoda incluem insetos, eonde os Crustáceos incluem camarão, krill, cracas, etc.; Phoronida; Ecto-procta (animaos de musgo); Brachiopoda; Echinodermata (por exemplo, es-trela-do-mar, margaridas do mar, comátola, ouriços-do-mar, pepeinos domar, ofiuróide, cestas quebradiças, etc.); Chaetognatha (sagitados); Hemi-chordata (vermes de glande); e Chordata. Membros adequados de Chordataincluem qualquer membro da seguinte subphyla: Urochordata (esguichosmarinhos; incluindo Ascidiacea, Thaliacea, e Larvacea); Cephalochordata(lancelets); Myxini (hagfish); e Vertebrata, onde membros de Vertebrata in-cluem, por exemplo, membros de Petromyzontida (lampreias), Chondrich-thyces (peixe cartilaginoso), Actinopterygii (arraia), Actinista (celacantos),Dipnoi (peixe dipnóico), Reptilia (répteis, por exemplo, serpentes, jacarés,crocodilos, lagartos, etc.), Aves (pássaros); e Mamíferos (mamíferos). Plan-tas adequadas incluem qualquer nocQtiledon e qualquer dicotilèdon. >-
Desse modo, por exemplo, fontes adequadas incluem célulasde organismos que incluem, mas não estão limitados a, um protozoário, umaplanta, um fungo, uma alga, uma levedura, um réptil, um anfíbio, um mamífe-ro, um microorganismo marinho, um invertebrado marinho, um artrópode, umisópode, um inseto, um aracnídeo, um archabactéria, e uma eubactéria.
Fontes procarióticas adequadas incluem bactéria (por exem-plo, Eubactéria) e archaebactéria. Fontes de archaebactéria adequadas in-cluem um metanogen, um halófilo extremo, um termófilo extremo, e simila-res. Fontes de archaebactéria adequadas incluem, mas não estão limitadasa, qualquer membro dos grupos Crenarchaeota (por exemplo, Sulfolobussolfataricus, Defulfurococcus mobilis, Pyrodictium oceultum, Thermofilumpendens, Thermoproteus tenax), Euryarchaeota (por exemplo, Thermocoe-eus eeler, Methanococcus thermolithotrophieus, Methanoeoceus jannasehii,Methanobaeterium thermoautotrophieum, Methanobaeterium formieieum, Me-thanothermus fervidus, Arehaeoglobüs fulgidus, Thermoplasma aeidophilum,Haloferax voleanni, Methanosareina barkeri, Methanosaeta eoneilli, Metha-nospririllum hungatei, Methanomierobium mobile), e Korarchaeota. Fontesadequadas de eubactéria incluem, mas não estão limitadas a, qualquermembro de Hidrogenobactéria, Thermotogales1 Bactéria de não-enxofre ver-de, Grupo Denococcus, Cianobactéria, Bactéria púrpura, Planctomyces, Spi-rochetes, Bactéria de enxofre verde, Cytophagas, e bactéria Gram positiva(por exemplo, Myeobaeterium sp., Mierococeus sp., Streptomyees sp., Lae-tobaeillus sp., Helicobaeterium sp., Clostridium sp., Myeoplasma sp., Bacillussp., etc.).
Em algumas concretizações, um ácido nucléico que codificaenzima P450 será isolado de um tecido tomado a partir de um organismo; deuma célula particular ou grupo de células isoladas de um organismo; etc. Porexemplo, onde o organismo é uma planta, o ácido nucléico será, em algu-mas concretizações, isolado a partir de xylem, do phloem, da camada decâmbio, folhas, raízes, etc. Onde o organismo é um animal, o ácido nucíéicoserá, em algumas concretizações, isolado a partir de um tecido particular(por exemplo, pulrpão, fígado, coração, rim, cérebro, baço, pele, tecido fetal,etc.), ou de um tipo de célula particular (por exemplo, células neuronais, cé-lulas epiteliais, células endoteliais, astrócitos, macrófagos, células gliais, cé-lulas "islet", linfócitos T1 linfócitos B5 etc.).
Em algumas concretizações, um ácido nucléico objeto com-preende uma seqüência de nucleotídeo que codifica uma enzima P450 quedifere de uma seqüência de nucleotídeo tipo selvagem ou que ocorre natu-ralmente que codifica uma enzima P450, por exemplo, um ácido nucléicoobjeto compreende uma seqüência de nucleotídeo que codifica uma enzimaP450 variante. Em algumas concretizações, uma variante P450 difere emseqüência de amino ácido por um amino ácido, dois amino ácidos, três ami-no ácidos, quatro amino ácidos, cinco amino ácidos, seis amino ácidos, seteamino ácidos, oito amino ácidos, nove amino ácidos, ou amino ácidos, oumais, comparado à seqüência de amino ácido de uma enzima P450 de ori-gem que ocorre naturalmente. Em algumas concretizações, uma enzimaP450 variante difere em seqüência de amino ácido por de cerca de 10 aminoácidos a cerca de 15 amino ácidos, de cerca de 15 amino ácidos a cerca de20 amino ácidos, de cerca de 20 amino ácidos a cerca de 25 amino ácidos,de cerca de 25 amino ácidos a cerca de 30 amino ácidos, de cerca de 30amino ácidos a cerca de 35 amino ácidos, de cerca de 35 amino ácidos acerca de 40 amino ácidos, de cerca de 40 amino ácidos a cerca de 50 aminoácidos, ou de cerca de 50 amino ácidos a cerca de 60 amino ácidos, oumais, comparado à seqüência de amino ácido de uma enzima P450 de ori-gem que ocorre naturalmente.
Em muitas concretizações, conforme discutido acima, a enzi-ma modificada de citocromo P450 codificada compreende uma modificaçãodo N-terminal de uma fonte (por exemplo, tipo selvagem, ou que ocorre natu-ralmente, ou nativa), por exemplo, uma modificação do domínio de trans-membrana e/ou seqüência de amino ácidos N-terminal para o domínio detransmembrana. Em algumas concretizações, a enzima modificada de cito-cromo P450 codificada incluirá adicionalmente uma ou mais modificações deseqüência de amino ácido na porção catalítica da enzima, comparado à se-qüência de amino ácido dé uma enzima tipo selvagem de citocromo P450.
xUm ácido nucléico compreendendo uma seqüência de nucleo-tídeo que codifica uma enzima P450 variante (por exemplo, modificada) éum ácido nucléico sintético. Em algumas concretizações, um ácido nucléicosintético compreendendo uma seqüência de nucleotídeo que codifica umaenzima P450 variante é um que hibridiza sob condições de hibridização a-dequadas a um ácido nucléico compreendendo uma seqüência de nucleotí-deo que codifica enzima P450 que ocorre naturalmente. Em algumas con-cretizações, um ácido nucléico sintético compreendendo uma seqüência denucleotídeo que codifica uma enzima P450 variante é um que hibridiza sobcondições de hibridização estritas a um ácido nucléico compreendendo umaseqüência de nucleotídeo que codifica uma enzima P450 que ocorre natu-ralmente. Em algumas concretizações, um ácido nucléico sintético compre-endendo uma seqüência de nucleotídeo que codifica uma enzima P450 vari-ante compreende uma enzima P450 variante que codifica seqüência de nu-cleotídeo que tem menos do que cerca de 95% de identidade de seqüênciade nucleotídeo para uma enzima P450 que ocorre naturalmente que codificaseqüência de nucleotídeo, por exemplo, a enzima P450 variante que codificaseqüência de nucleotídeo tem não mais do que cerca de 90% a cerca de95%, de cerca de 85% a cerca de 90%, de cerca de 80% a cerca de 85%, decerca de 75% a cerca de 80%, de cerca de 70% a cerca de 75%, de cercade 65% a cerca de 70%, de cerca de 60% a cerca de 65%, de cerca de 55%a cerca de 60%, ou de cerca de 50% a cerca de 55% de identidade de se-qüência de nucleotídeo para uma enzima P450 que ocorre naturalmente quecodifica seqüência de nucleotídeo.
Em algumas concretizações, a seqüência de nucleotídeo quecodifica uma enzima P450 variante codifica uma enzima P450 que tem decerca de 50% a cerca de 55%, de cerca de 55% a cerca de 60%, de cercade 60% a cerca de 65%, de cerca de 65% a cerca de 70%, de cerca de 70%a cerca de 75%%, de cerca de 75% a cerca de 80%, de cerca de 80% a cer-ca de 85%, de cerca de 85% a cerca de 90%, ou de cerca de 90% a cercade 95% de identidade de seqüência de amino ácido para a seqüência deamino ácido de, uma enzima P450 que ocorre naturalmente. As,seqüênciasde amino ácido de um número de enzimas P450 são conhecidas na técnica.'
Enzimas P450 adequadas que podem ser modificadas e codi-ficadas por uma seqüência de nucleotídeo incluída em um ácido nucléicoobjeto incluem, mas não estão limitadas a: uma limoneno-6-hidroxilase (ver,por exemplo, Figura 6; e N0S de Acesso ao GenBank AY281025 eAF124815); 5-ep/-aristolocheno dihidroxilase (ver, por exemplo, Figura 7; eN0 de Acesso ao GenBank AF368376); õ-cadineno-8-hidroxilase (ver, porexemplo, Figura 8A; e N0 de Acesso ao GenBank AF332974); taxadieno-5a-hidroxilase (ver, por exemplo, Figuras 9A e 9B; e N°s de Acesso ao Gen-Bank AY289209, AY959320, e AY364469); enf-kaureno oxidase (ver, porexemplo, Figura 10; e N0 de Acesso ao GenBank AF047719; ver, por exem-plo, Helliwell et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 95:9019-9024).
As Figuras 8B-D representam variantes P450 exemplares. A
Figura 8B representa cadinene hidroxilase com um domínio heterólogo detransmembrana; a Figura 8C representa cadinene hidroxilase com um domí-nio de solubilização; e a Figura 8C representa cadinene hidroxilase com umdomínio de secreção e um domínio heterólogo de transmembrana. A Figura22 representa adicionalmente variantes P450 exemplares, incluindo amorfa-dieno oxidase com várias seqüências N-terminais.
As enzimas de citocromo P450 de modificação de intermediá-rio de trajetória de alcalóide são conhecidas na técnica. Ver, por exemplo,Facchini et al. (2004) supra; Pauli e Kutchan ((1998) Plant J. 13:793-801;Collu et al. ((2001) FEBS Lett. 508:215-220; Schroder et al. ((1999) FEBSLett. 458:97-102. Ver também Figuras 19A-C.
As enzimas de citocromo P450 de modificação de intermediá-rio de trajetória de fenilpropanóide são conhecidas na técnica. Ver, por e-xemplo, Mizutani et al. ((1997) Plant Physiol. 113:755-763; e Gang et al.((2002) Plant Physiol. 130:1536-1544. Ver também Figuras 20A-C.
As enzimas de citocromo P450 de modificação de intermediá-rio de trajetória de policetide exemplares são representadas nas Figuras 21Ae 21B. Ver também Ikeda et al. ((1999) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 96:9509-9514; e Ward et al. ((2004) Antimicrob. Agents Ghemother.AQ-A7Q3-47M.
A enzima modificada de citocromo P450 codificada (por exem-plo, enzima de modificação de precursor de isoprenóide) é enzimaticamenteativa, por exemplo, a enzima modificada de citocromo P450 (por exemplo,enzima de modificação de precursor de isoprenóide) exibe uma ou mais dasseguintes atividades: a) modificação de um intermediário de trajetória biosin-tética por uma ou mais de: oxidação, hidroxilação, epoxidação, desidratação,dehidrogenação, dehalogenação, isomerização, oxidação de álcool, oxida-ção de aldeído, dealquilação, ou clivagem de ligação de C-C; b) modificaçãode um precursor de isoprenóide por uma ou mais de: oxidação, hidroxilação,epoxidação, desidratação, dehidrogenação, dehalogenação, isomerização,oxidação de álcool, oxidação de aldeído, dealquilação, ou clivagem de liga-ção de C-C. Se um ácido nucléico objeto codifica uma enzima enzimatica-mente ativa de citocromo P450 é prontamente determinado pela detecção deum produto da reação da enzima P450 em um substrato, e/ou detectandoum produto à jusante da reação da enzima P450 em um substrato. Por e-xemplo, se um ácido nucléico objeto codifica um terpeno oxidase enzimati-camente ativo, ou um terpeno hidroxilase, pode ser prontamente determina-do usando ensaios padrões para estas atividades enzimáticas, usando osubstrato apropriado. Os produtos da modificação enzimática são geralmen-te analisados por espectrometria de massa-cromatografia de gás. Por exem-plo, se um ácido nucléico objeto codifica um sesquiterpeno oxidase, ou umsesquiterpeno hidroxilase, pode ser prontamente determinado usando en-saios padrões para estas atividades enzimáticas. Ver, por exemplo, Publica-ção de Patente dos Estados Unidos No. 20050019882.
Em algumas concretizações, uma seqüência de nucleotídeoque codifica uma enzima modificada de citocromo P450 (por exemplo, umaenzima modificada de modificação de precursor de isoprenóide) é modifica-da para refletir uma preferência de códon para a célula hospedeira particular.Por exemplo, a seqüência de nucleotídeo será, em algumas concretizações,modificada para preferência de códon de levedura. Ver, por exemplo, Ben-netzen and Hall (1982) J. Biol. Chem. 257(6): 3026-3031. Conforme outroexemplo não-limitativo, a seq,üência de nucleotídeo sèrá em outras concreti-zações modificada para preferência de tódon de E. coli. Ver, por exemplo,Gouy e Gautier (1982) Acid nucleics fíes. 10(22):7055-7074; Eyre-Walker(1996) Moi. BioL Evol. 13(6):864-872. Ver também Nakamura et al. (2000)Acid nucleics Res. 28(1):292. Conforme um exemplo não-limitativo, a Figura11A representa uma seqüência tipo selvagem de nucleotídeo que codificacadinene hidroxilase (códon de partida atg mostrado em negrito); e a Figura11B representa uma variante otimizada de códon da seqüência representadana Figura 11 A, onde os códons são otimizados para expressão em um pro-cariote, tal como E. coli.
Citocromo P450 reductase
NADPH-citocromo P450 oxidoreductase (CPR, EC 1.6.2.4) é õco-participante redox de muitas P450-monooxygenases. Em algumas con-cretizações, um ácido nucléico objeto adicionalmente compreende uma se-qüência de nucleotídeo que codifica um citocromo P450 reductase (CPR).
Um ácido nucléico objeto compreendendo uma seqüência de nucleotídeoque codifica um CPR é referido como "um ácido nucléico de CPR." Um CPRcodificado por um ácido nucléico de CPR objeto transfere elétrons de NAD-PH para citocromo P450. Por exemplo, em algumas concretizações, umCPR codificado por um ácido nucléico de CPR objeto transfere elétrons deNADPH para uma enzima de modificação de isoprenóide, por exemplo, umasesquiterpeno oxidase, codificada por uma enzima de modificação de iso-prenóide objeto que codifica ácido nucléico.
Em algumas concretizações, um ácido nucléico objeto com-preende uma seqüência de nucleotídeo que codifica ambos uma enzimamodificada de citocromo P450 (por exemplo, uma enzima modificada demodificação de precursor de isoprenóide) e um CPR. Em algumas concreti-zações, um ácido nucléico objeto compreende uma seqüência de nucleotí-deo que codifica uma proteína de fusão que compreende uma seqüência deamino ácido de enzima modificada de citocromo P450 (por exemplo, umaenzima modificada de modificação de precursor de isoprenóide) que exibeatividade de modificação de precursor de isoprenóide, conforme descritoacima, fundida em um polipeptídeo de CPR.. Em algumas concretizações, aproteína de fusão codificada é da fórmula NH2-A-X-B-COOH, onde A é a en-zima modificada de citocromo P450, X é um Iigador opcional, e B é o poli-peptídeo de CPR. Em algumas concretizações, a proteína de fusão codifica-da é da fórmula NH2-A-X-B-COOH, onde A é o polipeptídeo de CPR, X é umligador opcional, e B é a enzima modificada de citocromo P450.
O peptídeo Iigador pode ter qualquer de uma variedade de se-qüências de amino ácido. As proteínas podem ser unidas por um peptídeoespaçador, geralmente de uma natureza flexível, embora outras ligaçõesquímicas não sejam excluídas. O Iigador pode ser um Iigador clivável. Se-qüências de Iigador adequadas serão geralmente peptídeos de entre cercade 5 e cerca de 50 amino ácidos de comprimento, ou entre cerca de 6 e cer-ca de 25 amino ácidos de comprimento. Ligadores de peptídeo com um graude flexibilidade geralmente serão usados. Os peptídeos de ligação podemter virtualmente qualquer seqüência de amino ácido, tendo-se em mente queos ligadores preferidos terão uma seqüência que resulta em um peptídeogeralmente flexível. O uso de amino ácidos pequenos, tais como glicina ealanina, são de uso na criação de um peptídeo flexível. A criação de tais se-qüências é rotina para aqueles técnicos no assunto. Uma variedade de Iiga-dores diferentes é comercialmente disponível, e é considerada adequadapara uso de acordo com a presente invenção.
Os peptídeos Iigadores adequados freqüentemente incluemseqüências de amino ácido ricas em resíduos de alanina e prolina, que sãoconhecidas por conceder flexibilidade a uma estrutura de proteína. Ligadoresexemplares têm uma combinação de resíduos de glicina, alanina, prolina emetionine, tais como AAAGGM (SEQ ID NO: 17); AAAGGMPPAAAGGM(SEQ ID NO: 18); AAAGGM (SEQ ID Ν0.Ί9); e PPAAAGGM (SEQ IDN0:20). Outros peptídeos Iigadores adequados incluem IEGR (SEQ IDN0:21); e GGKGGK (SEQ ID NO:22). Contudo, qualquer Iigador flexível ge-ralmente entre cerca de 5 e cerca de 50 amino ácidos de comprimento po-dem ser usados. Ligadores podem ter virtualmente qualquer seqüência queresulta em um peptídeo geralmente flexível, incluindo seqüências ricas emalanina-prolina do tipo aciipa exemplificado.
Em algumas concretizações, um ácido nucléico objeto com-preende uma seqüência de nucleotídeo que codifica um polipeptídeo deCPR que tem pelo menos cerca de 45%, pelo menos cerca de 50%, pelomenos cerca de 55%, pelo menos cerca de 57%, pelo menos cerca de 60%,pelo menos cerca de 65%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de75%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cer-ca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 98%, ou pelomenos cerca de 99% da identidade de seqüência de amino ácido para umpolipeptídeo de CPR que ocorre naturalmente conhecido.
Os polipeptídeos de CPR, bem como ácidos nucléicos que co-dificam os polipeptídeos de CPR, are Conhecidas na técnica, e qualquer áci-do nucléico que codifica CPR, ou uma variante deste, podem ser usados napresente invenção. Os ácidos nucléicos que codificam CPR adequados in-cluem ácidos nucléicos que codificam CPR encontrados nas plantas. Osácidos nucléicos que codificam CPR adequados incluem ácidos nucléicosque codificam CPR encontrados em fungos. Exemplos de ácidos nucléicosque codificam CPR adequados incluem: N9 de Acesso no GenBankAJ303373 (Triticum aestivum CPR); N9 de Acesso no GenBank AY959320(Taxus chinensis CPR); N9 de Acesso no GenBank AY532374 (Ammi majusCPR); N9 de Acesso no GenBank AG211221 (Oryza sativa CPR); e N9 deAcesso no GenBank AF024635 (Petroselinum crispum CPR); Candida tropi-calis citocromo P450 reductase (N9 de Acesso no GenBank M35199); Arabi-dopsis thaliana citocromo P450 reductase ATR1 (N9 de Acesso no X66016);e Arabidopsis thaliana citocromo P450 reductase ATR2 (N9 de Acesso noX66017); e putidaredoxin reductase e putidaredoxin (N9 de Acesso no Gen-Bank J05406).
Em algumas concretizações, um ácido nucléico objeto com-preende uma seqüência de nucleotídeo que codifica um polipeptídeo deCPR que é específico para uma dada enzima P450. Conforme um exemplonão-limitativo, um ácido nucléico objeto compreende uma seqüência de nu-cleotídeo que codifica Taxus cuspidata CPR (Figura 12A; N9 de Acesso noGenBank AY571340). Conforme outro exemplo não-limitativo, um ácido nu-cléico objeto compreende uma seqüência de nucleotídeo que codifica Can-dida tropicalis CPR (Figura 12B). Em outras concretizações, um ácido nu-cléico objeto compreende uma seqüência de nucleotídeo que codifica umpolipeptídeo de CPR que pode servir como um co-participante redox paraduas ou mais enzimas P450 diferentes. Um tal CPR é representado na Figu-ra 12C (Arabidopsis thaliana citocromo P450 reductase ATR1). Outro talCPR é representado na Figura 12D (Arabidopsis thaliana citocromo P450reductase ATR2). Também adequado é um modificado ou variante ATR2,por exemplo, conforme representado na Figura 12D, cuja variante ATR2 ca-rece de uma seqüência que tem como alvo cloroplasto.
O CPR codificado compreenderá, em algumas concretizações,uma seqüência heteróloga de amino ácido, ou uma seqüência variante deamino ácido (por exemplo, substituições, anulações, inserções, adições). Emalgumas concretizações, o CPR codificado incluirá, em algumas concretiza-ções, uma ou mais das seguintes modificações relativas a um CPR tipo sel-vagem: a) substituição de um domínio nativo de transmembrana com umdomínio não-nativo de transmembrana; b) substituição do domínio nativo detransmembrana com um domínio de sinal de secreção; c) substituição dodomínio nativo de transmembrana com um domínio de solubilização; d)substituição do domínio de transmembrana nativo com o domínio de inser-ção de membrana; e) mutilação do domínio nativo de transmembrana; e f)uma mudança na seqüência de amino ácido do domínio nativo de trans-membrana.
Em algumas concretizações, uma seqüência de nucleotídeoque codifica um polipeptídeo de CPR é modificada para refletir a preferênciade códon para a célula hospedeira particular. Por exemplo, a seqüência denucleotídeo será, em algumas concretizações, modificada para preferênciade códon de levedura. Ver, por exemplo, Bennetzen e Hall (1982) J. Biol.Chem. 257(6): 3026-3031. Conforme outro exemplo não-limitativo, a se-qüência de nucleotídeo será, em outras concretizações, modificada para pre-ferência de códon de E. coli. Ver, por exemplo, Gouy e Gautier (1982) Nucle-ic Acids Res. 10(22):7055-7074; Eyre-Walker (1996) Moi Biol. Evol.13(6):864-872. Ver também Nakamura et al. (2000) Nucleies Aeids Res.28(1).292.
Construções
A presente invenção adicionalmente proporciona vetores re-combinantes ("construções") compreendendo um ácido nucléico objeto. Emalgumas concretizações, um vetor recombinante objeto proporciona a ampli-ficação de um ácido nucléico objeto. Em algumas concretizações, um vetorrecombinante objeto proporciona produção de uma enzima modificada decitocromo P450 codificada (por exemplo, uma enzima de modificação de i-soprenóide), ou um CPR codificado, em uma célula eucariótica, em uma cé-lula procariótica, ou em um sistema de transcrição/translação livre de célula.Vetores de expressão adequados incluem, mas não estão limitados a, veto-res de baculovírus, vetores bacteriófago, plasmídeos, fagemídeos, cosmí-deos, fosmídeos, cromossomas artificiais bacteriais, vetores virais (por e-xemplo, vetores virais baseados em vírus de vacina, poliovírus, adenovírus,vírus adeno-associado, SV40, vírus simplex da herpes, e similares), cromos-somos artificiais baseados em P1, plasmídeos de levedura, cromossomosartificiais de levedura, e quaisquer outros vetores específicos para hospedei-ros específicos de interesse (tais como E. coli, levedura, e células de planta).
Em algumas concretizações, um vetor recombinante objetocompreende um citocromo P450 modificado objeto que codifica ácido nucléi-co, e um CPR objeto que codifica ácido nucléico. Em algumas destas con-cretizações, um vetor recombinante objeto é um vetor de expressão queproporciona produção de ambas as enzima modificada codificada de cito-cromo P450 (por exemplo, enzima modificada de modificação de isoprenói-de), e o CPR codificado em uma célula eucariótica, em uma célula procarió-tica, ou em um sistema de transcrição/translação livre de célula.
Certos tipos de vetores permitem que os cassetes de expres-são da presente invenção sejam amplificados. Outros tipos de vetores sãonecessários para introdução eficiente de ácido nucléico objeto nas células èsua expressão estável uma vez introduzido. Qualquer vetor capaz de aceitarum ácido nucléico objeto é contemplado como um vetor recombinante ade-quado para as propostas da invenção. O vetor pode ser de qualquer com-primento circular ou linear de DNA que, ou se integra no genoma do hospe-deiro, ou é mantido na forma epissomal. Os vetores podem requerer manipu-lação adicional ou condições particulares para serem eficientemente incorpo-rados em uma célula hospedeira (por exemplo, quaisquer plasmídeos deexpressão), ou podem ser parte de um sistema específico de célula auto-integrante, (por exemplo, um vírus recombinante). O vetor é, em algümasconcretizações, funcional em uma célula procariótica, onde tais vetores fun-cionam para propagar o vetor recombinante e/ou proporcionar expressão deum ácido nucléico objeto. O vetor é, em algumas concretizações, funcionalem uma célula eucariótica, onde o vetor será, em muitas concretizações, umvetor de expressão.
Numerosos vetores de expressão adequados são conhecidosàqueles técnicos no assunto, e podem ser comercialmente disponíveis. Osseguintes vetores são providos por meio de exemplo; para células hospedei-ras bacteriais: pBluescript (Stratagene, San Diego, Calif.), vetores pQE (Qia-gen), plasmídeos pBluescript, vetores pNH, vetores Iambda-ZAP (Stratage-ne); pTrc (Amann et al., Gene, 69:301-315 (1988)); pTrc99a, pKK223-3, p-DR540, e pRIT2T (Pharmacia); para célula hospedeiras eucarióticas: pXT1,pSG5 (Stratagene), pSVK3, pBPV, pMSG, e pSVLSV40 (Pharmacia). Con-tudo, qualquer outro plasmídeo ou outro vetor pode ser usado considerando-se que ele seja compatível com a célula hospedeira. Em concretizações par-ticulares, o vetor de plasmídeo pSP19g10L é usado para expressão em umacélula hospedeira procariótica. Em outras concretizações particulares, o ve-tor de plasmídeo pCWori é usado para expressão em uma célula hospedeiraprocariótica. Ver, por exemplo, Barnes ((1996) Métodos Enzymol. 272:1-14)para uma descrição de pSP19g10L e pCWori.
Em muitas concretizações, um ácido nucléico objeto compre-ende uma seqüência de nucleotídeo que codifica uma enzima de modifica-ção de isoprenóide, onde a enzima de modificação de isòprenóide que codi-fica seqüência de nucleotídeo é operavelmente ligada um ou mais elementosdescontrole transcricional e/ou translacional. Em muitas concretizações, umácido nucléico jDbjeto compreende uma seqüência de nucleotídeo que codifi-ca um CPR, onde a seqüência de nucleotídeo que codifica CPR é operavel-mente ligada a um ou mais elementos de controle transcricional e/ou trans-lacional.
Em algumas concretizações, conforme notado acima, um vetorrecombinante objeto compreende uma enzima modificada de citocromoP450 objeto que codifica ácido nucléico, e um ácido nucléico objeto que co-difica CPR. Em algumas destas concretizações, a enzima modificada de ci-tocromo P450 que codifica seqüência de nucleotídeo, e a seqüência de nu-cleotídeo que codifica PCR1 são operavelmente ligadas a elementos de con-trole transcricional diferentes. Em outras concretizações, a enzima modifica-da de citocromo P450 que codifica seqüência de nucleotídeo, e a seqüênciade nucleotídeo que codifica PCR, são operavelmente ligadas ao(s) elemen-to(s) de controle transcricional. Em algumas concretizações, a enzima modi-ficada de citocromo P450 que codifica seqüência dè nucleotídeo, e a se-qüência de nucleotídeo que codifica CPR, são operavelmente ligadas aomesmo promotor induzível. Em algumas concretizações, a enzima modifica-da de citocromo P450 que codifica seqüência de nucleotídeo, e a seqüênciade nucleotídeo que codifica PCR, são ambas operavelmente ligadas aomesmo promotor constitutivo.
Promotores adequados para uso em células hospedeiras pro-carióticas incluem, mas não estão limitados a, um promotor bacteriófago T7RNA polimerase; um promotor trp; um promotor Iac operon; um promotorhíbrido, por exemplo, um promotor híbrido lac/tac, um promotor híbridotac/trc, um promotor trp/lac, um promotor T7/lac; um promotor trc; um promo-tor tac, e similares; um promotor araBAD; promotores regulados in vivo, taisas um promotor ssaG ou um promotor relacionado (ver, por exemplo, Publi-cação de Patente dos Estados Unidos No. 20040131637), um promotorpagC (Pulkkinen and Miller, J. Bacteriol., 1991: 173(1): 86-93; Alpuche-Aranda et al., PNAS, 1992; 89(21): 10079-83), um promotor nirB (Harborneet al. (1992) Mol. Micro. 6:2805-2813), e similares (ver, por exemplo, Duns-tan et al. (1999) Infect. Immun. 67:5133-5141; McKeIvie et al. (2004lVaccine22:3243-3255; e Chatfield et al. (1992) Biotechnol. 10:888-892); um promotorsigma70, por exemplo, um promotor de consenso sigma70 (ver, por exem-plo, Nes de Acesso no GenBank AX798980, AX798961, e AX798183); umpromotor de fase estacionária, por exemplo, um promotor dps, um promotorspv, e similares; um promotor derivado de patogenicidade island SPI-2 (ver,por exemplo, W096/17951); um promotor actA (ver, por exemplo, Shetron-Rama et al. (2002) Infect. Immun. 70:1087-1096); um promotor rpsM (ver,por exemplo, Valdivia e Falkow (1996). MoL MicrobioL 22:367-378); umpromotor tet (ver, por exemplo, HiIIen1W. e Wissmann1A. (1989) In Saen-ger,W. and Heinemann1U. (eds), Topics in Molecular and Structural Biology,Proteína-Nucleic Acid Interaction. Macmillan, London1 UK, Vol. 10, pp. 143-162); um promotor SP6 {ver, por exemplo, Melton et al. (1984) NueL AeidsRes. 12:7035-7056); e similares.
Exemplos não-limitativos de promotores eucarióticos adequa-dos incluem CMV imediato precoce, HSV timidina kinase, 6 SV40 precoce eposterior, LTRs de retrovírus, e metalotioneína-l de camundongo. Em algu-mas concretizações, por exemplo, para expressão em uma célula de levedu-ra, um promotor adequado é um promotor constitutivo tais como um promo-tor ADH1, um promotor PGK1, um promotor ENO, um promotor PYK1 e simi-lares; ou um promotor regulável, tal como um promotor GAL1, um promotorGAL10, um promotor ADH2, um promotor PH05, um promotor CUP1, umpromotor GAL7, um promotor MET25, um promotor MET3, e similares. Aseleção do vetor apropriado e promotor está bem dentro do nível do técnicono assunto. O vetor de expressão pode também conter um local de ligaçãode ribossomo para iniciação de translação e um terminador de transcrição. Ovetor de expressão pode também incluir seqüências apropriadas para ampli-ficação de expressão.
Um vetor recombinante objeto conterá, em muitas concretiza-ções, um ou mais genes marcadores selecionáveis para proporcionar umtraço fenotípico para seleção de células hospedeiras transformadas. Marca-dores selecionáveis adequados incluem, mas não estão limitados a, dihidro-folato reductase, resistência a neomicin para cultura de célula eucariótica; eresistência à tetraciclina ou ampicilina em células hospedeiras procarióticas,tal como Έ. eoli.
Geralmente, os vetores de expressão recombinantes incluirãoorigens de réplica e marcadores selecionáveis, permitindo transformação dacélula hospedeira, por exemplo, o gene de resistência a ampicilina de E. eoli,o gene de S. eerevisiae TRP1, etc.; e um promotor derivado de um gene al-tamente expresso- para dirigir transcrição da seqüência de codificação. Taispromotores podem ser derivados de operons que codificam enzimas glicolíti-cas, tais como 3-fosfoglicerato kinase (PGK), fator a, fosfatase ácida, ou pro-teínas de choque térmico, entre outros.
Em muitas concretizações, uma seqüência de nucleotídeo quecodifica uma enzima modificada de citocromo P450 (por exemplo, uma en-zima de modificação de isoprenóide modificado) é operavelmente ligada aum promotor induzível. Em muitas concretizações, uma seqüência de nucle-otídeo que codifica um CPR é operavelmente ligada a um promotor induzí-vel. Os promotores induzíveis são bem conhecidos na técnica. Promotoresinduzíveis adequados incluem, mas não estão limitados a, o pL de bacterió-fago λ; Plac; Ptrp; Ptac (promotor híbrido Ptrp-lac); um promotor induzível deisopropila-beta-D-tiogalactopiranoside (IPTG), por exemplo, um promotorIacZ, um promotor induzível de tetraciclina; um promotor induzível de arabi-nose, por exemplo, Pbad (ver, por exemplo, Guzman et al. (1995) J. Bacteri-ol. 177:4121-4130); promotor induzível de xilose, por exemplo, Pxyl (ver, porexemplo, Kim et al. (1996) Gene 181:71-76); um promotor GAL1; um promo-tor de triptofan; um promotor lac; um promotor induzível de álcool, por exem-plo, promotor induzível de metanol, um promotor induzível de etanol; promo-tor induzível de rafinose; um promotor induzível de calor, por exemplo, pro-motor induzível de calor Iambda Pl, um promotor controlado por um repres-sor sensível a calor (por exemplo, vetores de expressão baseados emCI857-reprimido lambda; ver, por exemplo, Hoffmann et al. (1999) FEMSMicrobiol Lett. 177(2):327-34); e similares.
Em levedura, um número de vetores contendo promotoresconstitutivos ou induzíveis podem, ser usados. Para uma revisão, ver, Cur-rent Protocols in Molecular Biology, Vol. 2, Í988, Ed. Ausubel, et al., GreenePublish. Assoc. & Wiley lnterscience, Ch. 13; Grant, et al., 1987, Expressionand Secretion Vetors for Yeast, in Métodos in Enzymology, Eds. Wu &Grossman, 31987, Acad. Press, N.Y., Vol. 153, pp.516-544; Glover, 1986,DNA Cloning, Vol. II, IRL Press, Wash., D.C., Ch. 3; and Bitter, 1987, Hetero-Iogous Gene Expression in Yeast, Métodos in Enzymology, Eds. Berger &Kimmel, Acad. Press, N.Y., Vol. 152, pp. 673-684; e The Molecular Biologyof the Yeast Saccharomyces, 1982, Eds. Strathern et al., Cold Spring HarborPress, Vols. I and II. Um promotor de levedura constitutivo, tal como ADH ouLEU2 ou um promotor induzível, tal como GAL, podem ser usados (Cloningin Yeast, Ch. 3, R. Rothstein In: DNA Cloning Vol. 11, A Practical Approach,Ed. DM Glover1 1986, IRL Press, Wash., D.C.). Alternativamente, vetorespodem ser usados que promovem integração de seqüências de DNA estra-nhas no cromossomo de levedura.
Em algumas concretizações, um ácido nucléico objeto ou umvetor objeto compreende um promotor ou outro(s) elemento(s) regulatório(s)para expressão em uma célula de planta. Exemplos não-limitativos de pro-motores constitutivos adequados que são funcionais em uma célula de plan-ta é o promotor de vírus 355 mosáico de couve-flor, um promotor tandem35S (Kay et al·, Science 236:1299 (1987)), um promotor de vírus 19S mosai-co de couve-flor, um promotor de gene nopalina sintase (Singer et al., PlantMol. Biol. 14:433 (1990); An, Plant PhysioL 81:86 (1986), um promotor degene octopina sintase, e um promotor de ubiquitin. Promotores induzíveisadequados que são funcionais em uma célula de planta incluem, mas nãoestão limitados a, um promotor de gene de fenilalanina amônia-liase, umpromotor de gene de chalcone sintase, um promotor de gene de proteínarelacionada à patogênese, um elemento regulatório induzível de cobre (Mettet al., Proc. NatL Acad. Sei. USA 90:4567-4571 (1993); Furst et al., Cell55:705-717 (1988)); elementos regulatórios induzíveis de tetraciclina e clor-tetraciclina (Gatz et al., Plant J. 2:397-404 (1992); Rõder et al., Mol. Gen.Genet. 243:32-38 (1994); Gatz, Meth. Célula Biol. 50:411-424 (1995)); ele-mentos regulatórios de eedisona (Christopherson et al., Proc. NatL Acad.Sei. USA 89:6314-6318 (1992); Kreutzweiser et al., EcotoxicoL Environ. Sa-fety 28:14-24 (1994)); elementos regulatórios induzíveis de choque (Takaha-shi et al., Plant Physiol. 99:383-390 (1992); Yabe et al., Plant Cell PhysioL35:1207-1219 (1994); Ueda et al., Mol. Gen. Genet. 250:533-539 (1996)); eelementos de Iac operon, que são usados em combinação com um repressorde Iac constitutivamente expresso para conferir, por exemplo, expressão in-duzível de IPTG (Wilde et al., EMBO J. 11:1251-1259 (1992); um promotorinduzível de nitrato derivado de gene de nitrito de espinafre reductase (Backet al., Plant Mol. BioL 17:9 (1991)); um promotor induzível leve, tal como a-quele associado com a subunidade pequena de RuBP carboxilase ou as fa-mílias de gene LHCP (Feinbaum et al., Mol. Gen. Genet. 226:449 (1991);
Lam e Chua, Science 248:471 (1990)); um elemento regulatório responsiva àluz, conforme descrito na Publicação de Patente dos Estados Unidos No.20040038400; elementos regulatórios induzíveis por ácido salicílico (Ukneset al., Plant Cell 5:159-169 (1993); Bi et al., Plant J. 8:235-245 (1995)); ele-mentos regulatórios induzíveis por hormônio (Yamaguchi-Shinozaki et al.,Plant Mol. Biol. 15:905 (1990); Kares et al., Plant Mol. Bioi 15:225 (1990)); eelementos regulatórios induzíveis por hormônio humano, tais como o ele-mento de resposta de glucocorticóide humano (Schena et al., Proc. Nati A-cad. Sei. USA 88:10421 (1991).
Elementos regulatórios seletivos de tecido também podem serincluídos em um ácido nucléico objeto, ou em um vetor objeto. Elementosregulatórios seletivos de tecido adequados, que podem ser usados para ex-pressar ectopicamente um ácido nucléico em um tecido simples, ou em umnúmero limitado de tecidos, incluem, mas não estão limitados a, um elemen-to regulatório seletivo de xilem, um elemento regulatório seletivo de tracheid,um elemento regulatório seletivo de fibra, um elemento regulatório seletivode tricoma (ver, por exemplo, Wang et al. (2002) J. Exp. Botany 53:1891-1897), um elemento regulatório seletivo tricoma glandular, e similares.
Vetores que são adequados para uso em células de planta sãoconhecidos na técnica, e quaisquer tais vetores podem ser usados para in-troduzir um ácido nucléico objeto em uma célula hospedeira de planta. Veto- ...res adequados incluem, por exemplo, um Ti plasmídeo de Agrobacteriumtumefaciens, ou um Ri1 plasmídeo de A. rhizogenes. O Ti ou Ri1 plasmídeo étransmitido para células de planta na infecção por Agrobacterium, e é total-mente integrado no genoma de planta. J. Schell, Science, 237:1176-83(1987). Também adequado para uso é um cromossomo artificial de planta,conforme descrito em, por exemplo, Patente dos Estados Unidos No.6.900.012.Composições
A presente invenção adicionalmente proporciona composiçõescompreendendo um ácido nucléico objeto. A presente invenção adicional-mente proporciona composições compreendendo um vetor recombinanteobjeto. As composições compreendendo um ácido nucléico objeto, ou umvetor objeto de expressão, incluirão, em muitas concretizações, um ou maisde: um sal, por exemplo, NaCI, MgCI, KCI1 MgSO4, etc.; um agente de tam-ponamento, por exemplo, um tampão Tris, N-(2-Hidroxietil)piperazina-N'-(2-ácido etanosulfônico) (HEPES), 2-(N-Morfolino)ácido etanosulfônico (MES),2-(N-Morfolino)ácido etanosulfônico sal de sódio (MES), 3-(N-Morfolino)ácidopropanosulfônico (MOPS), N-tris[Hidroximetil]metil-3-ácido aminopropanosul-fônico (TAPS), etc.; um agente de solubilização; um detergente, por exem-plo, um detergente não-iônico, tal como Tween-20, etc.; um inibidor de nu-clease; e similares. Em algumas concretizações, um ácido nucléico objeto,ou um vetor recombinante objeto é liofilizado.
Células hospedeiras
A presente invenção proporciona células hospedeiras geneti-camente modificadas, por exemplo, células hospedeiras que tenham sidogeneticamente modificadas com um ácido nucléico objeto, ou um vetor re-combinante objeto. Em muitas concretizações, uma célula hospedeira gene-ticamente modificada é uma célula hospedeira in vitro. Em outras concreti-zações, uma célula hospedeira geneticamente modificada é uma célula hos-pedeira in vivo. Em outras concretizações, uma célula hospedeira genetica-mente modificada é parte de um organismo multicelular.
As células hospedeiras são, em muitas concretizações, orga-nismos unicelulares, ou são desenvolvidas em cultura in vitro como célulassimples. Em algumas concretizações, a célula hospedeira é uma célula eu-cariótica. As células hospedeiras eucarióticas incluem, mas não estão limita-dos a, células de levedura, células de inseto, células de planta, células fun-gais, e células de alga. As células hospedeiras eucarióticas adequadas in-cluem, mas não estão limitadas a, Pichia pastoris, Pichia finiandica, Pichiatrehaiophila, Pichia koelamae, Piehia membranaefaeiens, Piehia opuntiae,Pichia thermotolerans, Pichia salictaria, Pichia guercuum, Piehia pijperi, Pi-ehia stiptis, Piehia methanoiiea, Piehia sp., Saccharomyees cerevisiae, Sae-eharomyees sp., Hansenula poiymorpha, Kluyveromyces sp., Kluyveromyceslaetis, Candida albieans, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillusoryzae, Triehoderma reesei, Chrysosporium lucknowense,Fusarium sp., Fu-sarium gramineum, Fusarium venenatum, Neurospora crassa, Chlamydomo-nas reinhardtii, e similares. Em algumas concretizações, a célula hospedeiraé uma célula eucariótica outra do que uma célula de planta.
Em outras concretizações, a célula hospedeira é uma célulade planta. As células de planta incluem células de monocotiledons ("mono-cots") e dicotiledons ("dicots").
Em outras concretizações, a célula hospedeira é uma célulaprocariótica. As células procarióticas adequadas incluem, mas não estãolimitadas a, qualquer de uma variedade de cepas laboratoriais de Escheri-ehia eoli, Lactobacillus sp., Salmonella sp., Shigella sp., e similares. Ver, porexemplo, Carrier et al. (1992) J. Immunol. 148:1176-1181; Patente dos Esta-dos Unidos No. 6.447.784; e Sizemore et al. (1995) Science 270:299-302.Exemplos de cepas de Salmonella que podem ser empregadas na presenteinvenção incluem, mas não estão limitadas a, Salmonella typhie S. typhimu-rium. Cepas de Shigella adequadas incluem, mas não estão limitadas a,Shigella flexneri, Shigella sonnei, e Shigella disenteriae. Tipicamente, a cepalaboratorial é uma que é não-patogênica. Exemplos não-limitativos de outrasbactérias adequadas incluem, mas não estão limitados a, Bacillus subtilis,Pseudomonas pudita, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas mevalonii,Rhodobacter sphaeroides, Rhodobacter ceipsuiatus, Rhodospirillum rubrum,Rhodococcus sp., e similares. Em algumas concretizações, a célula hospe-deira é Escherichia eoli.
Para gerar uma célula hospedeira objeto geneticamente modi-ficada, um ácido nucléico objeto compreendendo seqüências de nucleotídeoque codificam uma enzima modificada de citocromo P450 (por exemplo, umaenzima modificada de modificação de isoprenóide) é introduzido estavelmen-te ou transientemente em uma célula hospedeira de origem, usando técnicasestabelecidas, incluindo, mas não limitadas a, eletroporação, precipitação defosfato de cálcio, transfecção mediada por DEAE-dextran, transfecção medi-ada por lipossoma, e similares. Para transformação estável, um ácido nu-cléico incluirá geralmente adicionalmente um marcador selecionável, por e-xemplo, quaisquer de vários marcadores selecionáveis bem conhecidos, taiscomo resistência a neomicin, resistência a ampicilina, resistência à tetracicli-na, resistência a cloranfenicol, resistência a kanamicin, e similares.
Em algumas concretizações, uma célula hospedeira objetogeneticamente modificada é uma célula de planta. Uma célula de planta ob-jeto geneticamente modificada é útil para produção de um composto sele-cionado de isoprenóide em cultura de célula de planta in vitro. Orientaçãocom relação à cultura de tecido de planta pode ser encontrada em, por e-xemplo: Plant Célula and Tissue Culture, 1994, Vasil and Thorpe Eds., Klu-wer Academic Publishers; e em; Plant Célula Culture Protocols (Métodos inMolecular Biology 111), 1999, Hall Eds, Humana Press.
Células hospedeiras geneticamente modificadas
Em algumas concretizações, uma célula hospedeira objetogeneticamente modificada compreende um vetor objeto de expressão, ondeo vetor objeto de expressão compreende uma seqüência de nucleotídeo quecodifica uma enzima modificada de citocromo P450. Em algumas concreti-zações, uma célula hospedeira objeto geneticamente modificada compreen-de um vetor objeto de expressão, onde o vetor objeto de expressão compre-ende uma seqüência de nucleotídeo que codifica uma enzima modificada demodificação de precursor de isoprenóide.
Em algumas concretizações, uma célula hospedeira objetogeneticamente modificada compreende um primeiro vetor objeto de expres-são, onde o primeiro vetor objeto de expressão compreende um ácido nu-cléico objeto compreendendo uma seqüência de nucleotídeo que codificauma enzima modificada de citocromo P450; e adicionalmente compreendeum segundo vetor objeto de expressão, onde o segundo vetor objeto de ex-pressão compreende um ácido nucléico objeto compreendendo uma se-qüência de nucleotídeo que codifica um CPR. Em outras concretizações,uma célula hospedeira objeto geneticamente modificada compreende umvetor objeto de expressão, no qual o vetor objeto de expressão compreendeum ácido nucléico objeto compreendendo uma seqüência de nucleotídeoque codifica uma enzima modificada de citocromo P450 e um ácido nucléicoobjeto compreendendo uma seqüência de nucleotídeo que codifica um CPR.
Em outras concretizações, uma célula hospedeira objeto geneticamente mo-dificada compreende um vetor objeto de expressão, onde o vetor objeto deexpressão compreende um ácido nucléico objeto compreendendo uma se-qüência de nucleotídeo que codifica um polipeptídeo de fusão (por exemplo,um polipeptídeo que inclui uma enzima modificada de citocromo P450 e umCPR).
Em algumas concretizações, uma célula hospedeira objetogeneticamente modificada compreende um primeiro vetor de expressão, on-de o primeiro vetor de expressão compreende ácido nucléico objeto compre-endendo uma seqüência de nucleotídeo que codifica uma enzima modificadade citocromo P450; e adicionalmente compreende um segundo vetor de ex-pressão, onde o segundo vetor de expressão compreende uma seqüênciade nucleotídeo que codifica um CPR. Em outras concretizações, uma célulahospedeira objeto geneticamente modificada compreende um vetor objetode expressão, no qual o vetor objeto de expressão compreende um ácidonucléico objeto compreendendo uma seqüência de nucleotídeo que codificauma enzima modificada de citocromo P450 e uma seqüência de nucleotídeoque codifica um CPR.
Em algumas concretizações, uma célula hospedeira objetogeneticamente modificada é adicionalmente geneticamente modificada paraincluir um ou mais ácidos nucléicos compreendendo seqüências de nucleotí-deo que codificam uma ou mais enzimas que ocorrem em um substrato parauma enzima de citocromo P450. Exemplos de tais enzimas incluem, masnão estão limitados a, terpeno sintases; prenil transferases; isopentenil difos-fato isomerase; uma ou mais enzimas em uma trajetória de mevalonato; euma ou mais enzimas em uma trajetória DXP. Em algumas concretizações,uma célula hospedeira objeto geneticamente modificada é adicionalmentegeneticamente modificada para incluir um ou mais ácidos nucléicos compre-endendo seqüências de nucleotídeos que codificam um, dois, três, quatro,cinco, seis, sete, ou oito, ou mais de: um terpeno sintase, uma prenil transfe-rase, um IPP isomerase, uma acetoacetil-CoA tiolase, um HMGS, um HM-GR, um MK, um PMK, e um MPD. Em algumas concretizações, por exem-plo, onde uma célula hospedeira objeto geneticamente modificada é adicio-nalmente geneticamente modificada para incluir um ou mais ácidos nucléi-cos compreendendo seqüências de nucleotídeo que codificam dois ou maisde um terpeno sintase, uma prenil transferase, uma IPP isomerase, uma a-cetoacetil-CoA tiolase, um HMGS, um HMGR, um MK, um PMK, e um MPD,as seqüências de nucleotídeo estão presentes em pelo menos dois operons,por exemplo, dois operons separados, três operons separados, ou quatrooperons separados.
Terpeno sintases
Em algumas concretizações, uma célula hospedeira objetogeneticamente modificada é adicionalmente geneticamente modificada paraincluir um ácido nucléico compreendendo uma seqüência de nucleotídeo quecodifica um terpeno sintase. Em algumas concretizações, o terpeno sintaseé um que modifica FPP para gerar um sesquiterpeno. Em outras concretiza-ções, o terpeno sintase é um que modifica GPP para gerar um monoterpeno.Em outras concretizações, o terpeno sintase é um que modifica GGPP paragerar um diterpeno. O terpeno sintase age em um substrato de poliprenildifosfato, modificando o substrato de poliprenil difosfato por ciclização, re-arranjo, ou acoplamento do substrato, produzindo um precursor de isopre-nóide (por exemplo, limoneno, amorfadieno, taxadieno, etc.), cujo precursorde isoprenóide é o substrato para uma enzima de modificação de precursorde isoprenóide(s). Pela ação do terpeno sintase em um substrato de polipre-nil difosfato, o substrato para uma enzima de modificação de precursor deisoprenóide é produzido.
As seqüências de nucleotídeo que codificam terpeno sintasessão conhecidas na técnica, e qualquer seqüência de nucleotídeo que codifi-ca terpeno sintase conhecida pode ser usada para modificar geneticamenteuma célula hospedeira. Por exemplo, as seguintes seqüências de nucleotí-deo que codificam terpeno sintase, seguidas por seu números de Acesso noGenBank e os organismos nos quais eles foram identificados, são conheci-das e podem ser usadas: (-)-germacreno D sintase mRNA (AY438099; Po-pulus balsamifera subsp. trichocarpa χ Populus deItoids)] E,E-alpha-farneseno sintase mRNA (AY640154; Cucumis sativus)] 1,8-cineolo sintasemRNA (AY691947; Arabidopsis thaliana), terpeno sintase 5 (TPS5) mRNA(AY518314; Zea mays); terpeno sintase 4 (TPS4) mRNA (AY518312; Zeamays), mirceno/ocimeno sintase (TPS10) (At2g24210) mRNA (NM_127982;Arabidopsis thaliana); geraniol sintase (GES) mRNA (AY362553; Ocimumbasilicum), pineno sintase mRNA (AY237645; Picea sitchensis)] mirceno sin-tase 1e20 mRNA (AY195609; Antirrhinum majus); (E)-p-ocimeno sintase(0e23) mRNA (AY195607; Antirrhinum majus), Ε-β-ocimeno sintase mRNA(AY151086; Antirrhinum majus), terpeno sintase mRNA (AF497492; Arabi-dopsis thaliana)·, (-)-camfeno sintase (AG6.5) mRNA (U87910; Abies gran-dis), (-)-gene 4S-limoneno sintase (por exemplo, seqüência genômica)(AF326518; Abies grandis)] gene delta-selineno sintase (AF326513; Abiesgrandis), 4,11-dieno-amorfo sintase mRNA (AJ251751; Artemisia annua), E-α-bisaboleno sintase mRNA (AF006195; Abies grandis), gamma-humulenosintase mRNA (U92267; Abies grandis), δ-selineno sintase mRNA (U92266;Abies grandis)] pineno sintase (AG3.18) mRNA (U87909; Abies grandis),mirceno sintase (AG2.2) mRNA (U87908; Abies grandis)] etc.
Trajetória de mevalonato
Em algumas concretizações, uma célula hospedeira objetogeneticamente modificada é uma célula hospedeira que não sintetiza nor-malmente isopentenil pirofosfato (IPP) ou mevalonato, via uma trajetória demevalonato. A trajetória de mevalonato compreende: (a) condensação deduas moléculas de acetil-CoA em acetoacetil-CoA; (b) condensação de ace-toacetil-CoA com acetil-CoA para formar HMG-CoA; (c) conversão de HMG-CoA em mevalonato; (d) fosforilação de mevalonato em mevalonato 5-fosfato; (e) conversão de mevalonato 5-fosfato em mevalonato 5-pirofosfato;e (f) conversão de mevalonato 5-pirofosfato em isopentenil pirofosfato. A tra-jetória de enzimas mevalonato requerida para produção de IPP varia, de-pendendo das condições de cultura.
Conforme notado acima, em algumas concretizações, uma cé-lula hospedeira objeto geneticamente modificada é uma célula hospedeiraque não sintetiza normalmente isopentenil pirofosfato (IPP) ou mevalonatovia uma trajetória de mevalonato. Em algumas destas concretizações, a cé-lula hospedeira é geneticamente modificada com um vetor objeto de expres-são compreendendo um ácido nucléico objeto que codifica uma enzima demodificação de isoprenóide; e a célula hospedeira é geneticamente modifi-cada com um ou mais ácidos nucléicos heterólogos compreendendo se-qüências de nucleotídeo que codificam acetoacetil-CoA tiolase, hidroximetil-glutaril-CoA sintase (HMGS), hidroximetilglutaril-CoA reductase (HMGR),mevalonato kinase (MK)1 fosfomevalonato kinase (PMK), e mevalonato piro-fosfato decarboxilase (MPD) (e opcionalmente também IPP isomerase). Emmuitas destas concretizações, a célula hospedeira é geneticamente modifi-cada com um vetor de expressão compreendendo uma seqüência de nu-cleotídeo que codifica um CPR. Em algumas destas concretizações, a célulahospedeira é geneticamente modificada com um vetor objeto de expressãocompreendendo um ácido nucléico objeto que codifica uma enzima de modi-ficação de isoprenóide; e a célula hospedeira é geneticamente modificadacom um ou mais ácidos nucléicos heterólogos compreendendo seqüênciasde nucleotídeo que codificam MK, PMK, MPD (e, opcionalmente, tambémIPP isomerase). Em muitas destas concretizações, a célula hospedeira égeneticamente modificada com um vetor de expressão compreendendo umaseqüência de nucleotídeo que codifica um CPR.
Em algumas concretizações, uma célula hospedeira objetogeneticamente modificada é uma célula hospedeira que não sintetiza nor-malmente IPP ou mevalonato via uma trajetória de mevalonato; a célulahospedeira é geneticamente modificada com um vetor objeto de expressãocompreendendo um ácido nucléico objeto que codifica uma enzima de modi-ficação de isoprenóide; e a célula hospedeira é geneticamente modificadacom um ou mais ácidos nucléicos heterólogos compreendendo seqüênciasde nucleotídeo que codificam acetoacetil-CoA tiolase, HMGS1 HMGR1 MK1PMK1 MPD1 IPP isomerase, e uma prenil transferase. Em muitas destas con-cretizações, a célula hospedeira é geneticamente modificada com um vetorde expressão compreendendo uma seqüência de nucleotídeo que codificaum CPR. Em algumas concretizações, uma célula hospedeira objeto geneti-camente modificada é uma célula hospedeira que não sintetiza normalmenteIPP ou mevalonato via uma trajetória de mevalonato; a célula hospedeira égeneticamente modificada com um vetor objeto de expressão compreenden-do um ácido nucléico objeto que codifica uma enzima de modificação de iso-prenóide; e a célula hospedeira é geneticamente modificada com um oumais ácidos nucléicos heterólogos compreendendo seqüências de nucleotí-deo que codificam MK, PMK, MPD, IPP isomerase, e uma prenil transferase.Em muitas destas concretizações, a célula hospedeira é geneticamente mo-dificada com um vetor de expressão compreendendo uma seqüência de nu-cleotídeo que codifica um CPR.
Em algumas concretizações, uma célula hospedeira objetogeneticamente modificada é uma que não sintetiza normalmente IPP ou me-valonato via uma trajetória de mevalonato, por exemplo, a célula hospedeiraé uma que compreende uma trajetória de mevalonato endógena. Em algu-mas destas concretizações, a célula hospedeira é uma célula de levedura.Em algumas destas concretizações, a célula hospedeira é Saccharomycescerevisiae.
Em algumas concretizações, uma célula hospedeira objetogeneticamente modificada é adicionalmente geneticamente modificada comum ou mais ácidos nucléicos que compreendem as seqüências de nucleotí-deo que codificam uma dehidrogenase ou dehidrogenases, cujas dehidroge-nase adicionalmente modifica um composto de isoprenóide. A dehidrogena-se codificada pode ser uma que é naturalmente encontrada em uma célulaprocariótioca, ou em uma célula eucariótica, ou pode ser uma variante de taluma dehidrogenase. Em algumas concretizações, a presente invenção pro-porciona ácidos nucléicos isolados compreendendo seqüências de nucleotí-deo que codificam tais dehidrogenases.Ácidos nucléicos de trajetória de mevalonato
As seqüências de nucleotídeos que codificam produtos de ge-ne de trajetória de MEV são conhecidas na técnica, e qualquer produto degene de trajetória de MEV conhecido que codifica seqüência de nucleotídeopode ser usado para gerar uma célula hospedeira objeto geneticamente mo-dificada. Por exemplo, seqüências de nucleotídeo que codificam acetoacetil-CoA tiolase, HMGS, HMGR, MK, PMK, MPD, e IDI são conhecidas na técni-ca. Os seguintes são exemplos não-limitativos de seqüências de nucleotí-deo conhecidas que codificam produtos de gene de trajetória de MEV, comnúmeros de acesso no GenBank e organismo seguinte de cada enzima detrajetória de MEV, em parênteses: acetoacetiI-CoA tiolase: (NC_000913REGION: 2324131 ..2325315; E. coli), (D49362; Paracoccus denitrificans), e(L20428; Saccharomyces eerevisiae); HMGS: (NC_001145. complemento19061..20536; Saccharomyees eerevisiae), (X96617; Saccharomyees cere-visiae), (X83882; Arabidopsis thaiianá), (AB037907; Kitasatospora griseoia),e (BT007302; Homo sapiens)·, HMGR: (NM_206548; Drosophila melanogas-ter), (NM_204485; Gailus gallus), (AB015627; Streptomyces sp. KO-3988)(AF542543; Nieotiana attenuata), (AB037907; Kitasatospora griseoia)(AX128213, proporcionando a seqüência que codifica um HMGR truncadoSaccharomyees eerevisiae), e (NC_001145: complemento (115734.. 118898Saccharomyees eerevisiae))·, MK: (L77688; Arabidopsis thaiianá), e (X55875Saccharomyees eerevisiae)·, PMK: (AF429385; Hevea brasiliensis)(NM_006556; Homo sapiens), (NC_001145. complemento 712315..713670Saccharomyees eerevisiae)·, MPD: (X97557; Saccharomyees eerevisiae)(AF290095; Enteroeoeeus faeeium), e (U49260; Homo sapiens)·, and IDI(NC_000913, 3031087..3031635; E. coli), e (AF082326; Haematocoeeuspluvialis).
Em algumas concretizações, a região de codificação de HM-GR codifica uma forma truncada de HMGR ("tHMGR") que carece do domí-nio de transmembrana de HMGR tipo selvagem. O domínio de transmem-brana de HMGR contém as porções regulatórias da enzima, e não tem ativi-dade catalítica.A seqüência de codificação de qualquer enzima de trajetóriade MEV conhecida pode ser alterada em vários modos conhecidos na técni-ca para gerar mudanças alvos na seqüência de amino ácido da enzima codi-ficada. O amino ácido de uma enzima de trajetória de MEV variante será u-sualmente substancialmente similar à seqüência de amino ácido de qualquerenzima de trajetória de MEV conhecida, isto é, diferirá por pelo menos umamino ácido, e pode diferir por pelo menos dois, pelo menos 5, pelo menos10, ou pelo menos 20 amino ácidos, mas tipicamente não mais do que cercade cinqüenta amino ácidos. As mudanças de seqüência podem ser substitui-ções, inserções ou anulações. Por exemplo, conforme descrito abaixo, aseqüência de nucleotídeo pode ser alterada para as inclinações de códon deuma célula hospedeira particular. Em adição, uma ou mais diferenças deseqüência de nucleotídeo podem ser introduzidas, que resultam em mudan-ças de amino ácido conservativas na proteína codificada.
Prenil transferases
Em algumas concretizações, uma célula hospedeira objetogeneticamente modificada é geneticamente modificada para incluir um ácidonucléico compreendendo uma seqüência de nucleotídeo que codifica umaenzima de modificação de isoprenóide; e, em algumas concretizações, étambém geneticamente modificada para incluir um ou mais ácidos nucléicoscompreendendo uma seqüência de nucleotídeo(s) que codifica uma ou maisenzimas de trajetória de mevalonato, conforme descrito acima; e um ácidonucléico compreendendo uma seqüência de nucleotídeo que codifica umaprenil transferase.
As preniltransferases constituem um amplo grupo de enzimasque catalisam a condensação consecutiva de IPP, resultando na formaçãode prenil difosfatos de vários comprimentos de cadeia. As preniltransferasesadequadas incluem enzimas que catalisam a condensação de IPP comsubstratos prímeres alílicos para formar composto de isoprenóides com decerca de 2 unidades de isopreno a cerca de 6000 unidades de isopreno oumais, por exemplo, 2 unidades de isopreno (Geranil pirofosfato sintase), 3unidades de isopreno (Farnesil pirofosfato sintase), 4 unidades de isopreno(geranilgeranil pirofosfato sintase), 5 unidades de isopreno, 6 unidades deisopreno (hexadecilpirofosfato sintase), 7 unidades de isopreno, 8 unidadesde isopreno (fitoeno sintase, octaprenil pirofosfato sintase), 9 unidades deisopreno (nonaprenil pirofosfato sintase, 10 unidades de sopreno (decapren-yl pirofosfato sintase), de cerca de 10 unidades de isopreno a cerca de 15unidades de isopreno, de cerca de 15 unidades de isopreno a cerca de 20unidades de isopreno, de cerca de 20 unidades de isopreno a cerca de 25unidades de isopreno, de cerca de 25 unidades de isopreno a cerca de 30unidades de isopreno, de cerca de 30 unidades de isopreno a cerca de 40unidades de isopreno, de cerca de 40 unidades de isopreno a cerca de 50unidades de isopreno, de cerca de 50 unidades de isopreno a cerca de 100unidades de isopreno, de cerca de 100 unidades de isopreno a cerca de 250unidades de isopreno, de cerca de 250 unidades de isopreno a cerca de 500unidades de isopreno, de cerca de 500 unidades de isopreno a cerca de1000 unidades de isopreno, de cerca de 1000 unidades de isopreno a cercade 2000 unidades de isopreno, de cerca de 2000 unidades de isopreno acerca de 3000 unidades de isopreno, de cerca de 3000 unidades de isopre-no a cerca de 4000 unidades de isopreno, de cerca de 4000 unidades deisopreno a cerca de 5000 unidades de isopreno, ou de cerca de 5000 unida-des de isopreno a cerca de 6000 unidades de isopreno.
Preniltransferases adequadas incluem, mas não estão limita-das a, uma E-isoprenil difosfato sintase, incluindo, mas não limitada a, gera-nil difosfato (GPP) sintase, farnesil difosfato (FPP) sintase, geranilgeranildifosfato (GGPP) sintase, hexaprenil difosfato (HexPP) sintase, heptaprenildifosfato (HepPP) sintase, octaprenil (OPP) difosfato sintase, solanesil difos-fato (SPP) sintase, decaprenil difosfato (DPP) sintase, chicle sintase, e gutta-percha sintase; e uma Z-isoprenil difosfato sintase, incluindo, mas não limi-tada a, nonaprenil difosfato (NPP) sintase, undecaprenil difosfato (UPP) sin-tase, dehidrodolichil difosfato sintase, eicosaprenil difosfato sintase, sintasede borracha natural, e outras Z-isoprenil difosfato sintases.
As seqüências de nucleotídeo de numerosas prenil transfera-ses de uma variedade de espécies são conhecidas, e podem ser usadas oumodificadas para uso na geração de uma célula hospedeira objeto geneti-camente modificada. As seqüências de nucleotídeo que codificam preniltransferases são conhecidas na técnica. Ver, por exemplo, Human farnesilpirofosfato sintetase mRNA (NQ de Acesso no GenBank J05262; Homo sapi-ens)·, gene de farnesil difosfato sintetase (FPP) (NQ de Acesso no GenBankJ05091; Saccharomyces cerevisiae)·, isopentenil gene de difosfato:dimetilalildifosfato isomerase (J05090; Saceharomyces cerevisiae)·, Wang e Ohnuma(2000) Bioehim. Biophys. Aeta 1529:33-48; Patente dos Estados Unidos No.6.645.747; Arabidopsis thaiiana farnesil pirofosfato sintetase 2 (FPS2) / FPPsintetase 2 / farnesil difosfato sintase 2 (At4g17190) mRNA (NQ de Acessono GenBank NM_202836); Ginkgo biioba geranilgeranil difosfato sintase(ggpps) mRNA (N9 de Acesso no GenBank AY371321); Arabidopsis thaiianageranilgeranil pirofosfato sintase (GGPS1) / GGPP sintetase / farnesiltrans-transferase (At4g36810) mRNA (NQ de Acesso no GenBank NM_119845);gene de Synechoeoeeus eiongatus para farnesil, geranilgeranil, geranilfarne-sil, hexaprenil, heptaprenil difosfato sintase (SeIF-HepPS) (Ne de Acesso noGenBank No. AB016095); etc.
Uso de códon
Em algumas concretizações, uma seqüência de nucleotídeousada para gerar uma célula hospedeira objeto geneticamente modificada étal que a seqüência de nucleotídeo reflete a preferência de códon para a cé-lula hospedeira particular. Por exemplo, a seqüência de nucleotídeo será,em algumas concretizações, modificada para preferência de códon de leve-dura. Ver, por exemplo, Bennetzen e Hall (1982) J. Bioi. Chem. 257(6):3026-3031. Conforme outro exemplo não-limitativo, a seqüência de nucleo-tídeo será, em outras concretizações, modificada para preferência de códonde E. eoli. Ver, por exemplo, Gouy e Gautier (1982) Nucleic Acids Res.10(22):7055-7074; Eyre-Walker (1996) Moi. BioL EvoL 13(6):864-872. Vertambém Nakamura et al. (2000) Nucleics Acids Res. 28(1):292.
Modificações genéticas adicionais
Em algumas concretizações, a célula hospedeira objeto gene-ticamente modificada é adicionalmente geneticamente modificada para umaque é geneticamente modificada para incluir um ou mais ácidos nucléicoscompreendendo uma seqüência de nucleotídeo(s) que codifica uma enzimamodificada de citocromo P450 (por exemplo, uma enzima modificada demodificação de isoprenóide); e que é adicionalmente geneticamente modifi-cada para alcançar produção de "heme" aumentada, e/ou alcançar produçãoaumentada de um intermediário de trajetória biosintética de terpeno, e/ouque é adicionalmente geneticamente modificada tal que um gene de trajetó-ria biosintética de terpeno endógeno é funcionalmente incapacitado. O termo"funcionalmente incapacitado", conforme aqui usado no contexto de um ge-ne de trajetória biosintética de terpeno exógeno, se refere a uma modifica-ção genética de um gene de trajetória biosintética de terpeno, cuja modifica-ção resulta na produção de um produto de gene codificado pelo gene que éproduzido em níveis abaixo do normal, e/ou é não-funcional.
Produção aumentada de "heme"
Em algumas concretizações, a célula hospedeira objeto gene-ticamente modificada compreende uma ou mais modificações genéticas adi-cionais que proporcionam produção aumentada de "heme", por exemplo,para alcançar um pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 15%, pelomenos cerca de 20%, pelo menos cerca de 25%, pelo menos cerca de 30%,pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de60%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cer-ca de 90%, pelo menos cerca de 2 vezes, pelo menos cerca de 2,5 vezes,pelo menos cerca de 5 vezes, pelo menos cerca de 10 vezes, pelo menoscerca de 15 vezes, pelo menos cerca de 20 vezes, ou pelo menos cerca de25 vezes, ou mais, aumento na produção de "heme", comparado a uma cé-lula hospedeira que não compreende as uma ou mais modificações genéti-cas adicionais.
A etapa Iimitante na produção de "heme" em uma célula é abiosíntese de ácido aminolevulínico (ALA). Conforme representado na Figura13, existem duas trajetórias distintas para biosíntese de ALA envolvendo ouuma trajetória C4 ou uma trajetória C5. Em algumas concretizações, uma cé-lula hospedeira objeto geneticamente modificada é adicionalmente geneti-camente modificada para sobre-expressar glútamil-tRNA reductase (GTRreductase). Em algumas concretizações, uma célula hospedeira objeto gene-ticamente modificada é adicionalmente geneticamente modificada para pro-duzir um nível de atividade de GTR reductase que é pelo menos cerca de10%, pelo menos cerca de 15%, pelo menos cerca de 20%, pelo menos cer-ca de 25%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 40%, pelo me-nos cerca de 50%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 70%,pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de2 vezes, pelo menos cerca de 2,5 vezes, pelo menos cerca de 5 vezes, pelomenos cerca de 10 vezes, pelo menos cerca de 15 vezes, pelo menos cercade 20 vezes, ou pelo menos cerca de 25 vezes, ou mais, mais alto do que onível de atividade de GTR reductase produzida em uma célula hospedeirade controle.
O aumento do nível de atividade de GTR reductase em umacélula é alcançado em um número de modos, incluindo, mas não limitado a :1) aumento da resistência do promotor do promotor ao qual a região de codi-ficação de GTR reductase é operavelmente ligada; 2) aumento do númerode cópia do plasmídeo compreendendo uma seqüência de nucleotídeo quecodifica GTR reductase; 3) aumento da estabilidade de um mRNA de GTRreductase (onde um "mRNA de GTR reductase" é um mRNA compreenden-do uma seqüência de nucleotídeo que codifica GTR reductase); 4) modifica-ção do uso de códon de GTR reductase, tal que o nível de translação domRNA de GTR reductase é aumentado; 5) aumento da estabilidade de en-zima de GTR reductase; 6) aumento da atividade específica (atividade deunidades por proteína de unidade) de GTR reductase; e 7) redução da regu-lação de realimentação negativa de GTR reductase.
Em algumas concretizações, uma modificação genética queresulta em nível aumentado de GTR reductase é uma modificação genéticaque reduz a regulação de realimentação negativa de GTR reductase. A re-dução da regulação de realimentação negativa de GTR reductase é, em al-gumas concretizações, reduzida pela inserção de uma seqüência KK positi-vamente carregada em ou perto do terminal-N.Em algumas concretizações, uma célula hospedeira objetogeneticamente modificada é adicionalmente geneticamente modificada parasobrexpressar ALA sintase. Em algumas concretizações, uma célula hospe-deira objeto geneticamente modificada é adicionalmente geneticamente mo-dificada para produzir um nível de ALA sintase que é pelo menos cerca de10%, pelo menos cerca de 15%, pelo menos cerca de 20%, pelo menos cer-ca de 25%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 40%, pelo me-nos cerca de 50%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 70%,pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de2 vezes, pelo menos cerca de 2,5 vezes, pelo menos cerca de 5 vezes, pelomenos cerca de 10 vezes, pelo menos cerca de 15 vezes, pelo menos cercade 20 vezes, ou pelo menos cerca de 25 vezes, ou mais, mais alto do que onível de atividade de ALA sintase produzida em uma célula hospedeira decontrole.
O aumento do nível de atividade de ALA sintase em uma célu-la é alcançado em um número de modos, incluindo, mas não limitado a: 1)aumento da resistência do promotor do promotor ao qual a região de codifi-cação de ALA sintase é operavelmente ligada; 2) aumento do número decópia do plasmídeo compreendendo uma seqüência de nucleotídeo que co-difica ALA sintase; 3) aumento da estabilidade de um mRNA de ALA sintase(onde um "mRNA de ALA sintase" é um mRNA compreendendo uma se-qüência de nucleotídeo que codifica ALA sintase); 4) modificação do uso decódon de ALA sintase, tal que o nível de translação do mRNA de ALA sinta-se é aumentado; 5) aumento da estabilidade de enzima de ALA sintase; 6)aumento da atividade específica (atividade de unidades por proteína de uni-dade) de ALA sintase.
Produção aumentada de um intermediário de trajetória biosintética de terpe-no endógeno
As modificações genéticas que aumentam a produção de umintermediário de trajetória biosintética de terpeno endógeno incluem, masnão estão limitadas a, modificações genéticas que resultam em um nível re-duzido e/ou atividade de uma fosfotransacetilase na célula hospedeira. Aconcentração intracelular de um intermediário de trajetória biosintética deterpeno é aumentada pelo aumento da concentração intracelular de acetil-CoA. E. coli secreta uma fração significante de acetil-CoA intracelular naforma de acetato no meio. A anulação do gene que codifica fosfotransaceti-lase, pta, a primeira enzima responsável pela transformação de acetil-CoAem acetato, reduz a secreção de acetato. As modificações genéticas quereduzem o nível e/ou atividade de fosfotransacetilase em uma célula hospe-deira procariótica são particularmente úteis onde à célula hospedeira geneti-camente é uma que é geneticamente modificada com um ácido nucléicocompreendendo seqüências de nucleotídeo que codificam um ou mais pro-dutos de gene de trajetória de MEV.
Em algumas concretizações, uma modificação genética queresulta em um nível reduzido de fosfotransacetilase em uma célula hospe-deira procariótica é uma mutação genética que incapacita funcionalmente ogene pta endógeno procariótico de célula hospedeira que codifica a fosfo-transacetilase. O gene pta pode ser funcionalmente incapacitado em qual-quer de uma variedade de modos, incluindo inserção de um elemento gené-tico móvel (por exemplo, um transposon, etc.); anulação de todo ou parte dogene, tal que o produto de gene não é produzido, ou é truncado, e é não-funcional na conversão de acetil-CoA em acetato; a mutação do gene tal queo produto de gene não é produzido, ou é truncado, e é não-funcional na con-versão de acetil-CoA em acetato; anulação ou mutação de um ou mais ele-mentos de controle que controlam a expressão do gene pta, tal que o produ-to de gene não é produzido; e similares.
Em algumas concretizações, o gene endógeno pta de uma cé-lula hospedeira geneticamente modificada é anulado. Qualquer método deanulação de um gene pode ser usado. Um exemplo não-limitativo de um mé-todo para anulação de um gene pta é pelo uso do sistema de recombinação□Vermelho. Datsenko e Wanner (2000) Proc NatIAcad Sci USA 97(12): p.6640-5. O gene pta será, em algumas concretizações, anulado de uma célu-la hospedeira (por exemplo, E. coli) que é geneticamente modificada comum ácido nucléico compreendendo seqüências de nucleotídeo que codificamMK, PMK1 MPD, e IDI. O gene pta será, em algumas concretizações, anula-do de uma célula hospedeira (por exemplo, E. coli) que é geneticamentemodificada com um ácido nucléico compreendendo seqüências de nucleotí-deo que codificam MK, PMK, MPD, e IPP. O gene pta será, em algumasconcretizações, anulado de uma célula hospedeira (por exemplo, E. coli) queé geneticamente modificada com um ácido nucléico compreendendo se-qüências de nucleotídeo que codificam MK, PMK, MPD, IPP1 e uma preniltransferase.
Trajetória de DXP funcionalmente incapacitada
Em algumas concretizações, uma célula hospedeira objetogeneticamente modificada é uma que é geneticamente modificada para in-cluir um ou mais ácidos nucléico compreendendo uma seqüência de nucleo-tídeo(s) que codifica produto(s) de gene de trajetória biosintética codificadade MEV; e que é adicionalmente geneticamente modificada tal que um genede trajetória biosintética de DXP endógeno é funcionalmente incapacitado.
Em outras concretizações, uma célula hospedeira objeto geneticamente mo-dificada é uma que é geneticamente modificada para incluir um ou mais áci-dos nucléicos compreendendo uma seqüência de nucleotídeo(s) que codificaproduto(s) de gene de trajetória biosintética de DXP; e que é adicionalmentegeneticamente modificada tal que um gene de trajetória biosintética codifica-da de MEV endógeno é funcionalmente incapacitado.
Em algumas concretizações, onde a célula hospedeira objetogeneticamente modificada é uma célula hospedeira procariótica que é gene-ticamente modificada com ácido nucléico(s) compreendendo seqüências denucleotídeo que codificam um ou mais produtos de gene de trajetória deMEV, a célula hospedeira será adicionalmente geneticamente modificada, talque um ou mais genes de trajetória DXP endógenos são funcionalmente in-capacitados. Os genes de trajetória DXP que podem ser funcionalmente in-capacitados incluem um ou mais dos genes que codificam qualquer dos se-guintes produtos de gene DXP: 1-deoxi-D-xilulose-5-fosfato sintase, 1-deoxi-D-xilulose-5-fosfato reductoisomerase, 4-difosfocitidil-2-C-metil-D-eritritol sin-tase, 4-difosfocitidil-2-C-metil-D-eritritol kinase, 2C-metil-D-eritritol 2,4-ciclodifosfato sintase, e 1-hidroxi-2-metil-2-(E)-butenil 4-difosfato sintase.
Um gene de trajetória DXP endógeno pode ser funcionalmenteincapacitado em qualquer de uma variedade de modos, incluindo inserçãode um elemento genético móvel (por exemplo, um transposon, etc.); anula-ção de todo ou parte do gene, tal que o produto de gene não é produzido, oué truncado, e é enzimaticamente inativo; mutação do gene tal que o produtode gene não é produzido, ou é truncado, e é enzimaticamente não-funcional;anulação ou mutação de um ou mais elementos de controle que controlam aexpressão do gene tal que o produto de gene não é produzido; e similares.
Em outras concretizações, onde a célula hospedeira objetogeneticamente modificada é uma célula hospedeira procariótica que é gene-ticamente modificada com ácido(s) nucléico(s) compreendendo seqüênciasde nucleotídeo que codificam um ou mais produtos de gene de trajetóriaDXP, a célula hospedeira será adicionalmente geneticamente modificada, talque um ou mais genes de trajetória de MEV endógenos é funcionalmenteincapacitado. Os genes de trajetória de MEV endógenos que podem ser fun-cionalmente incapacitados incluem um ou mais genes que codificam qual-quer dos seguintes produtos de gene de MEV: HMGS, HMGR, MK, PMK,MPD, e IDI. Um gene de trajetória de MEV endógeno pode ser funcional-mente incapacitado em qualquer de uma variedade de modos, incluindo in-serção de um elemento genético móvel (por exemplo, um transposon, etc.);anulação de todo ou parte do gene, tal que o produto de gene não é produ-zido, ou é truncado, e é enzimaticamente inativo; mutação do gene, tal que oproduto de gene não é produzido, ou é truncado, e é enzimaticamente não-funcional; anulação ou mutação de um ou mais elementos de controle quecontrolam a expressão do gene, tal que o produto de gene não é produzido;e similares.
Composições compreendendo a célula hospedeira objeto ge-neticamente modificada
A presente invenção adicionalmente proporciona composiçõescompreendendo uma célula hospedeira objeto geneticamente modificada.Uma composição objeto compreende uma célula hospedeira objeto geneti-camente modificada, e compreenderá, em algumas concretizações, um oumais componentes adicionais, cujos componentes são selecionados basea-dos em parte no uso pretendido da célula hospedeira geneticamente modifi-cada. Componentes adequados incluem, mas não estão limitados a, sais;tampões; estabilizadores; agentes de inibição de protease; agentes de inibi-ção de nuclease; compostos de preservação de membrana celular e/ou depreservação de parede, por exemplo, glicerol, dimetilsulfóxido, etc.; meionutricional apropriado à célula; e similares. Em algumas concretizações, ascélulas são liofilizadas.
Plantas Transgênicas
Em algumas concretizações, um ácido nucléico objeto, ou umvetor objeto de expressão (por exemplo, um ácido nucléico de enzima modi-ficada de citocromo P450 objeto, ou um vetor objeto de expressão compre-endendo o ácido nucléico de enzima modificada de citocromo P450) é usadocomo um transgene para gerar uma planta transgênica que produz a enzimamodificada de citocromo P450 codificada. Desse modo, a presente invençãoadicionalmente proporciona uma planta transgênica (ou uma parte de planta,semente, tecido, etc.), cuja planta compreende um transgene compreenden-do um ácido nucléico objeto compreendendo uma seqüência de nucleotídeoque codifica uma enzima modificada de citocromo P450, conforme descritoacima. Em algumas concretizações, o genoma da planta transgênica com-preende um ácido nucléico objeto. Em algumas concretizações, a plantatransgênica é homozigótica para a modificação genética. Em algumas con-cretizações, a planta transgênica é heterozigótica para a modificação genética.
Em algumas concretizações, uma planta transgênica objetoproduz um citocromo P450 transgene codificado modificado, e produz umproduto do citocromo P450 modificado em uma quantidade que é pelo me-nos cerca de 50%, pelo menos cerca de 2 vezes, pelo menos cerca de 5vezes, pelo menos cerca de 10 vezes, pelo menos cerca de 25 vezes, pelomenos cerca de 50 vezes, ou pelo menos cerca de 100 vezes, ou mais alta,do que a quantidade do produto produzido por uma planta de controle, porexemplo, uma planta não-transgênica (uma planta que não inclui o transge-ne que codifica o polipeptídeo) da mesma espécie.
Em algumas concretizações, uma planta transgênica objeto éuma versão transgênica de uma planta não-transgênica de controle quenormalmente produz um composto de isoprenóide que é gerado por, ou éum produto a jusante de uma enzima transgene codificada modificada demodificação de precursor de isoprenóide; onde a planta transgênica produzo composto de isoprenóide em uma quantidade que é pelo menos cerca de50%, pelo menos cerca de 2 vezes, pelo menos cerca de 5 vezes, pelo me-nos cerca de 10 vezes, pelo menos cerca de 25 vezes, pelo menos cerca de50 vezes, ou pelo menos cerca de 100 vezes, ou mais alta, do que a quanti-dade do composto de isoprenóide produzido pela planta de controle, por e-xemplo, um planta não-transgênica (uma planta que não inclui o transgeneque codifica o polipeptídeo) da mesma espécie.
Os métodos de introdução de ácidos nucléicos exógenos emcélulas de planta são bem conhecidos na técnica. Tais células de planta sãoconsideradas "transformadas", conforme definido acima. Métodos adequa-dos incluem infecção viral (tais como vírus de DNA de trançado duplo),transfecção, conjugação, fusão de protoplasto, eletroporação, tecnologia depistola de partícula, precipitação de fosfato de cálcio, microinjeção direta,tecnologia de carbeto de silício, transformação mediada por Agrobacterium,e similares. A escolha do método é geralmente dependente do tipo de célula /sendo transformada, e das circunstâncias sob as quais a transformação estáocorrendo (isto é, in vitro, ex vivo, ou in vivo).
Os métodos de transformação baseados na bactéria de soloAgrobacterium tumefaciens são particularmente úteis para introdução deuma molécula de ácido nucléico exógena em uma planta vascular. A formade tipo selvagem de Agrobacterium contém um plasmídeo Ti (indução detumor) que direciona produção de crescimento de bile de coroa tumorigênicoem plantas hospedeiras. A transferência da região de T-DNA de indução detumor do plasmídeo Ti para um genoma de planta requer os genes de viru-lência codificados por plasmídeo Ti, bem como limites de T-DNA, que sãoum conjunto de repetições diretas de DNA que esboçam a região a sertransferida. Um vetor baseado em Agrobacterium é uma forma modificadade um plasmídeo Ti, em que o tumor que induz funções é substituído pelaseqüência de ácido nucléico de interesse a ser introduzida no hospedeiro daplanta.
A transformação mediada por Agrobacterium geralmente em-prega vetores co-integrados ou, preferivelmente, sistemas de vetor binários,em que os componentes do plasmídeo Ti são divididos entre um vetor auxili-ador, que reside permanentemente no hospedeiro Agrobacterium, e conduzos genes de virulência, e um vetor secundário, que contém o gene de inte-resse ligado pelas seqüências de T-DNA. Uma variedade de vetores bináriosé bem conhecida na técnica, e são comercialmente disponíveis, por exem-plo, de Clontech (Paio Alto, Calif.). Métodos de co-cultura de Agrobacteriumcom células de planta cultivadas ou tecidos ofendidos, tais com tecido defolha, explantes de raiz, hipocotiledons, peças de caule ou tubérculos, porexemplo, também são bem conhecidos na técnica. Ver., por exemplo, Glicke Thompson, (eds.), Métodos in Plant Molecular Biology e Biotechnology,Boca Raton, Fla.: CRC Press (1993).
A transformação mediada por Agrobacterium é útil para produ-ção de uma variedade de plantas vasculares transgênicas (Wang et al., su-pra, 1995), incluindo pelo menos uma espécie de Eucalyptus e legumes deforragem, tais como alfafa (lucerna); trevo, trevo branco, Stylosanthes, Loto-nonis bainessii e sainfoin.
A transformação mediada por microprojétil também pode serusada para produzir uma planta transgênica objeto. Este método, primeirodescrito por Klein et al. (Nature 327:70-73 (1987)), conta com micro-projéteis, tais como ouro ou tungstênio, que são revestidos com a moléculade ácido nucléico desejada por precipitação com cloreto de cálcio, espermi-dina ou polietileno glicol. As partículas de micro-projétil são aceleradas emalta velocidade em um tecido de angiosperma usando um dispositivo tal co-mo o BIOLISTIC PD-1000 (Biorad; Hercules Calif.).
Um ácido nucléico objeto pode ser introduzido em uma plantade uma maneira tal que o ácido nucléico é capaz de entrar em uma célula(s)de planta, por exemplo, via um protocolo in vivo ou ex vivo\. Por "in vivo," ésignificativo que o ácido nucléico é administrado a um corpo vivo de umaplanta, por exemplo, infiltração. Por "ex vivo" é significativo que células ouexplantes são modificados fora da planta, e, em seguida, tais células ou ór-gãos são regenerados em uma planta. Um número de vetores adequadospara transformação estável de células de planta, ou para o estabelecimentode plantas transgênicas, foram descritos, incluindo aqueles descritos emWeissbach e Weissbach, (1989) Methods for Plant Molecular Biology Aca-demic Press, e Gelvin et al., (1990) Plant Molecular Biology Manual, KluwerAcademic Publishers. Exemplos específicos incluem aqueles derivados deuma plasmídeo Ti de Agrobacterium tumefaciens, bem como aqueles reve-lados por Herrera-Estrella et al. (1983) Nature 303: 209, Bevan (1984) NuclAcid Res. 12: 8711-8721, Klee (1985) Bio/Technolo 3: 637-642. Alternativa-mente, vetores de não-Ti podem ser usados para transferir o DNA em plan-tas e células pelo uso de técnicas de distribuição de DNA livre. Pelo uso des-tes métodos, plantas transgênicas, tais como trigo, arroz (Christou (1991)Bio/Technology 9:957-962) e milho (Gordon-Kamm (1990) Plant Célula 2:603-618), podem ser produzidas. Um embrião imaturo pode também ser umbom tecido alvo para monocots para técnicas de distribuição de DNA diretapelo uso de pistola de partícula (Weeks et al. (1993) Plant Physiol 102: 1077-1084; Vasil (1993) Bio/Technolo 10: 667-674; Wan e Lemeaux (1994) PlantPhysiol 104: 37-48, e para transferência de DNA mediada por Agrobacterium(Ishida et al. (1996) Nature Biòtech 14: 745-750). Métodos exemplares paraintrodução de DNA em cloroplastos são bombardeio biolístico, transforma-ção de polietileno glicol de protoplastos, e microinjeção (Danieli et al Nat.Biotechnol 16:345-348, 1998; Staub et al Nat. Biotechnol 18: 333-338, 2000;0'Neill et al Plant J. 3:729-738, 1993; Knoblauch et al Nat. Biotechnol 17:906-909; Patentes dos Estados Unidos Nos. 5.451.513, 5.545.817,5.545.818 e 5.576.198; Pedido de Patente Internacional No. WO 95/16783; eem Boynton et al., Methods in Enzymology 217: 510-536 (1993), Svab et al.,Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90: 913-917 (1993), e McBride et al., Proc. Nati.Acad. Sei. USA 91: 7301-7305 (1994)). Qualquer vetor adequado para osmétodos de bombardeio biolístico, transformação de polietileno glicol de pro-toplastos e microinjeção serão adequados como um vetor alvo para trans-formação de cloroplasto. Qualquer vetor de DNA de trançado duplo pode serusado como um vetor de transformação, especialmente quando o método deintrodução não utiliza Agrobacterium.
Plantas que podem ser geneticamente modificadas incluemgrãos, colheitas de forragem, frutas, vegetais, colheitas de semente de óleo,palmas, silvicultura, e videiras. Exemplos específicos de plantas que podemser modificadas se seguem: milho, banana, amendoim, ervilhas do campo,girassol, tomate, canola, tabaco, trigo, cevada, aveias, batata, feijão-soja,algodão, cravos, sorgo, tremoço e arroz. Outros exemplos incluem Artemisiaannua, ou outras plantas conhecidas para produzir composto de isoprenói-des de interesse.
Também providas pela presente invenção são células de plan-ta transformadas, tecidos, sementes, plantas, e produtos que contêm as cé-lulas de planta transformadas. Uma característica das células transformadasobjetos, e tecidos e produtos que incluem as mesmas, é a presença de umácido nucléico objeto integrado no genoma, e produção por células de plantade uma enzima modificada de citocromo P450. Células de planta recombi-nantes da presente invenção são úteis como populações de células recom-binantes, ou como um tecido, semente, planta total, caule, fruto, folha, raiz,flor, caule, tubérculo, grão, alimentação de animal, um campo de plantas, esimilares.
Também provido pela presente invenção é material reproduti-vo de uma planta transgênica objeto, onde o material reprodutivo inclui se-mentes, plantas de progenia e material clonal.
MÉTODOS DE PRODUÇÃO DE UM PRODUTO DE UMA TRAJETÓRIABIOSINTÉTICA
A presente invenção proporciona métodos de produção de umproduto de trajetória biosintética. Os métodos geralmente envolvem culturade uma célula hospedeira objeto geneticamente modificada em um meio a-dequado. A célula hospedeira objeto geneticamente modificada é uma quefoi geneticamente modificada com um ácido nucléico compreendendo a se-qüência de nucleotídeo que codifica uma enzima modificada de citocromoP450 operavelmente ligada a um domínio selecionado de um domínio detransmembrana, um domínio de secreção, um domínio de solubilização, euma proteína de inserção de membrana, para produzir uma enzima modifi-cada de citocromo P450. Na presença de um intermediário de trajetória bio-sintética, a produção da enzima modificada de citocromo P450 resulta emmodificação enzimática do intermediário, e produção de um produto de traje-tória biosintética. Em outras concretizações, os métodos geralmente envol-vem manutenção de uma planta transgênica objeto sob condições que favo-recem a produção da enzima modificada de citocromo P450 codificada. Aprodução da enzima modificada de citocromo P450 resulta na produção doproduto de trajetória biosintética. Tipicamente, o método é efetuado in vitro(por exemplo, em uma célula viva cultivada in vitro), embora produção in vivode um produto de trajetória biosintética seja também contemplada. Em al-gumas destas concretizações, a célula hospedeira é uma célula eucariótica,por exemplo, uma célula de levedura. Em outras concretizações, a célulahospedeira é uma célula procariótica. Em algumas destas concretizações, acélula hospedeira é uma célula de planta. Em algumas concretizações, ométodo é efetuado em uma planta transgênica objeto.
Uma célula hospedeira objeto geneticamente modificada pro-porciona produção aumentada de um produto de trajetória biosintética, com-parada a uma célula hospedeira de origem de controle. Desse modo, porexemplo, a produção de um produto de trajetória biosintética é aumentadapor pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 20%, pelo menos cercade 50%, pelo menos cerca de 2 vezes, pelo menos cerca de 2,5 vezes, pelomenos cerca de 5 vezes, pelo menos cerca de 10 vezes, pelo menos cercade 20 vezes, pelo menos cerca de 30 vezes, pelo menos cerca de 40 vezes,pelo menos cerca de 50 vezes, pelo menos cerca de 75 vezes, pelo menoscerca de 100 vezes, pelo menos cerca de 200 vezes, pelo menos cerca de300 vezes, pelo menos cerca de 400 vezes, ou pelo menos cerca de 500vezes, ou mais, na célula hospedeira geneticamente modificada, comparadaao nível do produto produzido em uma célula hospedeira de origem de con-trole. Uma célula hospedeira de origem de controle não compreende a(s)presentes modificação(ões) genética(s) presente(s) na célula hospedeirageneticamente modificada.
Em algumas concretizações, uma célula hospedeira objetogeneticamente modificada proporciona produção aumentada de um produtode trajetória biosintética, comparada a uma célula hospedeira de controle.Desse modo, por exemplo, a produção de um produto de trajetória biosintéti-ca é aumentada por pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 20%,pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 2 vezes, pelo menos cercade 2,5 vezes, pelo menos cerca de 5 vezes, pelo menos cerca de 10 vezes,pelo menos cerca de 20 vezes, pelo menos cerca de 30 vezes, pelo menoscerca de 40 vezes, pelo menos cerca de 50 vezes, pelo menos cerca de 75vezes, pelo menos cerca de 100 vezes, pelo menos cerca de 200 vezes,pelo menos cerca de 300 vezes, pelo menos cerca de 400 vezes, ou pelomenos cerca de 500 vezes, ou mais, na célula hospedeira geneticamentemodificada, comparada ao nível do produto produzido em uma célula hospe-deira de controle. Em algumas destas concretizações, a célula hospedeirade controle não compreende modificação(ões) genética(s) presente(s) nacélula hospedeira geneticamente modificada, por exemplo, a enzima de mo-dificação de isoprenóide que codifica ácido nucléico (por exemplo, a enzimade citocromo P450 que codifica ácido nucléico) na célula hospedeira de con-trole é operavelmente ligada a um ou mais de um domínio nativo de trans-membrana, um domínio nativo de secreção, um domínio nativo de solubiliza-ção, e um polipeptídeo de inserção de membrana nativa, enquanto a célulahospedeira geneticamente modificada compreende uma enzima de modifi-cação de isoprenóide que codifica ácido nucléico operavelmente ligado a umou mais domínio não-nativo (por exemplo, heterólogo) de transmembrana,um domínio não-nativo de secreção, um domínio não-nativo de solubiliza-ção, e um domínio não-nativo de inserção de membrana. Como um exem-plo, onde a célula hospedeira geneticamente modificada compreende umaenzima de modificação de isoprenóide que codifica ácido nucléico operavel-mente ligado a uma enzima não-nativa de modificação de isoprenóide quecodifica ácido nucléico, uma célula hospedeira de controle adequada com-preende a enzima de modificação de isoprenóide que codifica ácido nucléicooperavelmente ligado a um domínio nativo de transmembrana. Como outroexemplo, onde a célula hospedeira geneticamente modificada compreendeuma enzima de modificação de isoprenóide que codifica ácido nucléico ope-ravelmente ligado a um sinal heterólogo de domínio de secreção, uma célulahospedeira de controle adequada compreende a enzima de modificação deisoprenóide que codifica ácido nucléico operavelmente ligado a um domínionativo de transmembrana. Como outro exemplo, onde a célula hospedeirageneticamente modificada compreende uma enzima de modificação de iso-prenóide que codifica ácido nucléico operavelmente ligado a um domínioheterólogo de solubilização, uma célula hospedeira de controle adequadacompreende a enzima de modificação de isoprenóide que codifica ácido nu-
Acléico operavelmente ligado a um domínio nativo de transmembrana. Comooutro exemplo, onde a célula hospedeira geneticamente modificada compre-ende uma enzima de modificação de isoprenóide que codifica ácido nucléicooperavelmente ligado a um domínio de inserção de membrana heterólogo,uma célula hospedeira de controle adequada compreende a enzima de mo-dificação de isoprenóide que codifica ácido nucléico operavelmente ligado aum domínio nativo de transmembrana. Como outro exemplo, onde célulahospedeira geneticamente modificada compreende uma enzima de modifi-cação de isoprenóide que codifica ácido nucléico operavelmente ligado a umdomínio variante de transmembrana (por exemplo, uma mutilação do domí-nio nativo de transmembrana; um domínio de transmembrana compreen-dendo uma mudança na seqüência de amino ácido comparada à seqüênciade amino ácido do domínio nativo de transmembrana), uma célula hospedei-ra de controle adequada compreende a enzima de modificação de isopre-nóide que codifica ácido nucléico operavelmente ligado a domínio nativo detransmembrana.
A presente invenção proporciona métodos de produção decomposto de isoprenóide. Os métodos geralmente envolvem cultura de umacélula hospedeira objeto geneticamente modificada em um meio adequado,onde a célula hospedeira objeto geneticamente modificada é uma que foigeneticamente modificada com um ácido nucléico compreendendo uma se-qüência de nucleotídeo que codifica uma enzima de modificação de precur-sor de isoprenóide operavelmente ligada a um domínio selecionado de umdomínio de transmembrana, um domínio de secreção, um domínio de solubi-lização, e uma proteína de inserção de membrana, para produzir uma enzi-ma de modificação de precursor de isoprenóide. Na presença de um precur-sor de composto de isoprenóide, a produção da enzima de modificação deprecursor de isoprenóide resulta em modificação enzimática do precursor deisoprenóide, e produção do composto de isoprenóide. Em outras concretiza-ções, os métodos geralmente envolvem manutenção de uma planta transgê-nica objeto sob condições que favorecem a produção da enzima de modifi-cação de precursor de isoprenóide codificada. A produção da enzima de mo-dificação de precursor de isoprenóide resulta na produção do composto deisoprenóide. Por exemplo, em algumas concretizações, os métodos geral-mente envolvem cultura de uma célula hospedeira geneticamente modifica-da em um meio adequado, no qual referida célula hospedeira é genetica-mente modificada com um ácido nucléico objeto compreendendo uma se-qüência de nucleotídeo que codifica uma enzima de modificação de terpeno,por exemplo, um terpeno oxidase, um terpeno hidroxilase, etc. A produçãodo terpeno oxidase resulta na produção do composto de isoprenóide. Tipi-camente, o método é efetuado in vitro (por exemplo, em uma célula viva cul-tivada in vitro), embora produção in vivo de um composto de isoprenóideseja também contemplada. Em algumas destas concretizações, a célulahospedeira é uma célula eucariótica, por exemplo, uma célula de levedura.Em outras concretizações, a célula hospedeira é uma célula procariótica. Emalgumas destas concretizações, a célula hospedeira é uma célula de planta.Em algumas concretizações, o método é efetuado em uma planta transgêni-ca objeto.
Uma célula hospedeira objeto geneticamente modificada pro-porciona produção aumentada de um composto de isoprenóide, comparadaa uma célula hospedeira de origem de controle. Desse modo, por exemplo, aprodução de um isoprenóide ou precursor de isoprenóide é aumentada porpelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de50%, pelo menos cerca de 2 vezes, pelo menos cerca de 2,5 vezes, pelomenos cerca de 5 vezes, pelo menos cerca de 10 vezes, pelo menos cercade 20 vezes, pelo menos cerca de 30 vezes, pelo menos cerca de 40 vezes,pelo menos cerca de 50 vezes, pelo menos cerca de 75 vezes, pelo menoscerca de 100 vezes, pelo menos cerca de 200 vezes, pelo menos cerca de300 vezes, pelo menos cerca de 400 vezes, ou pelo menos cerca de 500vezes, ou mais, na célula hospedeira geneticamente modificada, comparadaa uma célula hospedeira de origem de controle. Uma célula hospedeira deorigem de controle não compreende a(s) modificação(ões) genética(s) pre-sente(s) na célula hospedeira geneticamente modificada.
Em algumas concretizações, uma célula hospedeira objetogeneticamente modificada proporciona produção aumentada de um compos-to de isoprenóide, comparada a uma célula hospedeira de controle. Dessemodo, por exemplo, a produção de um isoprenóide ou precursor de isopre-nóide é aumentada por pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de20%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 2 vezes, pelo menoscerca de 2,5 vezes, pelo menos cerca de 5 vezes, pelo menos cerca de 10vezes, pelo menos cerca de 20 vezes, pelo menos cerca de 30 vezes, pelomenos cerca de 40 vezes, pelo menos cerca de 50 vezes, pelo menos cercade 75 vezes, pelo menos cerca de 100 vezes, pelo menos cerca de 200 ve-zes, pelo menos cerca de 300 vezes, pelo menos cerca de 400 vezes, oupelo menos cerca de 500 vezes, ou mais, na célula hospedeira genetica-mente modificada, comparada a uma célula hospedeira de controle. Em al-gumas destas concretizações, a célula hospedeira de controle não compre-ende a(s) modificação(ões) genética(s) presente(s) na célula hospedeira ge-neticamente modificada, por exemplo, a enzima de modificação de isopre-nóide que codifica ácido nucléico (por exemplo, a enzima de citocromo P450que codifica ácido nucléico) na célula hospedeira de controle é operavelmen-te ligada a um ou mais de um domínio nativo de transmembrana, um domí-nio nativo de secreção, um domínio nativo de solubilização, e um polipeptí-deo de inserção de membrana nativo, enquanto a célula hospedeira geneti-camente modificada compreende uma enzima de modificação de isoprenói-de que codifica ácido nucléico operavelmente ligado a um ou mais de umdomínio não-nativo (por exemplo, heterólogo) de transmembrana, um domí-nio não-nativo de secreção, um domínio não-nativo de solubilização, e umdomínio não-nativo de inserção de membrana. Como um exemplo, onde cé-lula hospedeira geneticamente modificada compreende uma enzima de mo-dificação de isoprenóide que codifica ácido nucléico operavelmente ligada auma enzima não-nativa de modificação de isoprenóide que codifica ácidonucléico, uma célula hospedeira de controle adequada compreende a enzi-ma de modificação de isoprenóide que codifica ácido nucléico operavelmen-te ligado a um domínio nativo de transmembrana. Como outro exemplo, on-de a célula hospedeira geneticamente modificada compreende uma enzimade modificação de isoprenóide que codifica ácido nucléico operavelmenteligado a um sinal heterólogo de domínio de secreção, uma célula hospedeirade controle adequada compreende a enzima de modificação de isoprenóideque codifica ácido nucléico operavelmente ligado a um domínio nativo detransmembrana. Como outro exemplo, onde a célula hospedeira genetica-mente modificada compreende uma enzima de modificação de isoprenóideque codifica ácido nucléico operavelmente ligado a um domínio heterólogode solubilização, uma célula hospedeira de controle adequada compreendea enzima de modificação de isoprenóide que codifica ácido nucléico opera-velmente ligado a um domínio nativo de transmembrana. Como outro exem-plo, onde célula hospedeira geneticamente modificada compreende umaenzima de modificação de isoprenóide que codifica ácido nucléico operavel-mente ligado a um domínio de inserção de membrana heterólogo, uma célu-la hospedeira de controle adequada compreende a enzima de modificaçãode isoprenóide que codifica ácido nucléico operavelmente ligado a um domí-nio nativo de transmembrana. Como outro exemplo, onde a célula hospedei-ra geneticamente modificada compreende uma enzima de modificação deisoprenóide que codifica ácido nucléico operavélmente ligado a um domíniovariante de transmembrana (por exemplo, uma mutilação do domínio nativode transmembrana; um domínio de transmembrana compreendendo umamudança na seqüência de amino ácido comparada à seqüência de aminoácido do domínio nativo de transmembrana), uma célula hospedeira de con-trole adequada compreende a enzima de modificação de isoprenóide quecodifica ácido nucléico operavelmente ligado a um domínio nativo de trans-membrana.
Desse modo, em algumas concretizações, uma célula hospe-deira objeto geneticamente modificada produz, em uma célula base, um ní-vel de um composto de isoprenóide que é pelo menos cerca de 10%, pelomenos cerca de 15%, pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 25%,pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 35%, pelo menos cerca de40%, pelo menos cerca de 45%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cer-ca de 60%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, pelo me-nos cerca de 90%, pelo menos cerca de 2 vezes, pelo menos cerca de 2,5vezes, pelo menos cerca de 5 vezes, pelo menos cerca de 10 vezes, pelomenos cerca de 20 vezes, pelo menos cerca de 30 vezes, pelo menos cercade 40 vezes, pelo menos cerca de 50 vezes, pelo menos cerca de 75 vezes,pelo menos cerca de 100 vezes, pelo menos cerca de 200 vezes, pelo me-nos cerca de 300 vezes, pelo menos cerca de 400 vezes, ou pelo menoscerca de 500 vezes, ou mais, mais alto do que o nível do composto de iso-prenóide produzido em uma célula hospedeira de controle não compreendea uma ou mais modificações genéticas que a célula hospedeira genetica-mente modificada compreende. O crescimento de células hospedeiras ge-neticamente modificadas é prontamente determinado usando-se métodosbem conhecidos, por exemplo, medição de densidade ótica (OD) a cerca de600 nm (OD6oo) de culturas líquidas de bactéria; tamanho de colônia; taxa decrescimento; e similares.
Em algumas concretizações, uma célula hospedeira objetogeneticamente modificada produz um composto de isoprenóide em umaquantidade recuperável de pelo menos cerca de 1mg/L, pelo menos cercade 5 mg/L, pelo menos cerca de 10 mg/L, pelo menos cerca de 15 mg/L, pe-lo menos cerca de 20 mg/L, pelo menos cerca de 25 mg/L, pelo menos cercade 30 mg/L, pelo menos cerca de 35 mg/L, pelo menos cerca de 40 mg/L,pelo menos cerca de 50 mg/L, pelo menos cerca de 75 mg/L, pelo menoscerca de 100 mg/L, pelo menos cerca de 125 mg/L, pelo menos cerca de150 mg/L, pelo menos cerca de 200 mg/L, pelo menos cerca de 300 mg/L,pelo menos cerca de 500 mg/L, pelo menos cerca de 1000 mg/L, ou pelomenos cerca de 5000 mg/L.
Em algumas concretizações, uma célula hospedeira objetogeneticamente modificada produz um composto de isoprenóide em umaquantidade recuperável de cerca de 1 mg/L a cerca de 5000 mg/L, por e-xemplo, de cerca de 1 mg/L a cerca de 2 mg/L, de cerca de 2 mg/L a cercade 5 mg/L, de cerca de 5 mg/L a cerca de 10 mg/L, de cerca de 10 mg/L acerca de 15 mg/L, de cerca de 15 mg/L a cerca de 20 mg/L, de cerca de 20mg/L a cerca de 25 mg/L, de cerca de 25 mg/L a cerca de 50 mg/L, de cercade 50 mg/L a cerca de 75 mg/L, de cerca de 75 mg/L a cerca de 100 mg/L,de cerca de 100 mg/L a cerca de 150 mg/L, de cerca de 150 mg/L a cercade 200 mg/L, de cerca de 200 mg/L a cerca de 250 mg/L, de cerca de 250mg/L a cerca de 300 mg/L, de cerca de 300 mg/L a cerca de 350 mg/L, decerca de 350 mg/L a cerca de 400 mg/L, de cerca de 400 mg/L a cerca de450 mg/L, de cerca de 450 mg/L a cerca de 500 mg/L, de cerca de 500mg/L a cerca de 1000 mg/L, de cerca de 1000 mg/L a cerca de 2000 mg/L,de cerca de 2000 mg/L a cerca de 3000 mg/L, de cerca de 3000 mg/L acerca de 4000 mg/L, ou de cerca de 4000 mg/L a cerca de 5000 mg/L. Osisoprenóides produzidos podem ser recuperados a partir do meio, ou a partirda célula hospedeira, por exemplo, a partir do meio de cultura, ou a partir deuma célula lisato, ou uma fração de uma célula lisato. Os métodos de recu-peração podem variar, dependendo de uma variedade de fatores, por exem-plo, da natureza dos isoprenóides específicos que são produzidos.
As Figuras 14 e 15 representam esquematicamente a biosín-tese de produtos de isoprenóide exemplares. A conversão de poliprenil difos-fatos lineares é catalisada por terpeno sintases; e os produtos da conversãosão os substratos de uma enzima de modificação de precursor de isoprenói-de (por exemplo, uma enzima P450). A funcionalização específica, em se-guida, ocorre por reação do esqueleto de carbono do precursor, catalisadopor um P450 e seu co-participante redox, um CPR.
Em algumas concretizações, a célula hospedeira genetica-mente modificada é adicionalmente geneticamente modificada com um ácidonucléico compreendendo uma seqüência de nucleotídeo que codifica umterpeno sintase, que pode ser um terpeno sintase heterólogo (por exemplo,um terpeno sintase não normalmente produzido na célula hospedeira). Des-se modo, por exemplo, a célula hospedeira é, em algumas concretizações,geneticamente modificada com um ou mais ácidos nucléicos compreenden-do seqüências de nucleotídeo que codificam um terpeno sintase, e uma en-zima de modificação de isoprenóide (por exemplo, um sesquiterpeno oxida-se). A cultura de tal célula hospedeira em um meio de cultura adequado pro-porciona produção do terpeno sintase, e a enzima de modificação de isopre-nóide (por exemplo, um sesquiterpeno oxidase). Por exemplo, o terpeno sin-tase modifica um farnesil pirofosfato para gerar um sesquiterpeno substratopara referido sesquiterpeno oxidase.
Em algumas concretizações, a célula hospedeira é adicional-mente geneticamente modificada com um ácido nucléico compreendendouma seqüência de nucleotídeo que codifica um citocromo P450 reductase(CPR). Uma ampla variedade de seqüências de nucleotídeos de CPR é co-nhecida, e qualquer ácido nucléico que codifica CPR conhecido pode serusado, considerando-se que o CPR codificado exibe atividade na transferên-cia de elétrons a partir de NADPH. Em algumas concretizações, o ácido nu-cléico que codifica CPR codifica um CPR que transfere elétrons de NADPHpara uma enzima de modificação de isoprenóide, por exemplo, um sesqui-terpeno oxidase, codificado por uma enzima de modificação de isoprenóideque codifica ácido nucléico.
Em algumas concretizações, uma célula hospedeira é adicio-nalmente geneticamente modificada para produzir uma prenil transferasee/ou uma ou mais enzimas em uma trajetória biosintética para produzir iso-pentenil pirofosfato. As células tipicamente usam uma de duas trajetóriaspara gerar isoprenóides ou precursores de isoprenóide (por exemplo, IPP1poliprenil difosfatos, etc.)· As Figuras 16-18 servem para ilustrar as trajetó-rias usadas pelas células para gerar compostos de isoprenóide, ou precurso-res, tais como poliprenil difosfatos.
A Figura 16 representa trajetórias de isoprenóide envolvendomodificação de isopentenil difosfato (IPP) e/ou seu isômero dimetilalil difos-fato (DMAPP) por prenil transferases para gerar os poliprenil difosfatos ge-ranil difosfato (GPP), farnesil difosfato (FPP)1 e geranilgeranil difosfato(GGPP). GPP e FPP são adicionalmente modificados por terpeno sintasespara gerar monoterpenos e sesquiterpenos, respectivamente; e GGPP é a-dicionalmente modificado por terpeno sintases para gerar diterpenos e caro-tenóides. IPP e DMAPP são gerados por uma de duas trajetórias: a trajetóriade mevalonato (MEV) e a trajetória de 1-deoxi-D-xilulose-5-fosfato (DXP).
A Figura 17 representa esquematicamente a trajetória deMEV, onde acetil CoA é convertida via uma série de reações para IPP.
A Figura 18 representa esquematicamente a trajetória de DXP,na qual piruvato e D-gliceraldeído-3-fosfato são convertidos via uma série dereações a IPP e DMAPP. Células eucarióticas outras do que células de plan-ta usam a trajetória de isoprenóide de MEV exclusivamente para converteracetil-coenzima A (acetil-CoA) em IPP, que é subseqüentemente isomeriza-do a DMAPP. As plantas usam ambos o MEV e o mevalonato independente,ou trajetórias de DXP para síntese de isoprenóide. As procariótes, com al-gumas exceções, usam a trajetória de DPX para produzir IPP e DMAPP se-paradamente através de um ponto de desvio.
Dependendo do meio de cultura no qual a célula hospedeira écultivada, e dependendo se a célula hospedeira sintetiza IPP, via uma traje-tória de DXP, ou via uma trajetória de mevalonato, a célula hospedeira inclui-rá, em algumas concretizações, adicionalmente modificações genéticas. Porexemplo, em algumas concretizações, a célula hospedeira é uma que nãotem uma trajetória endógena de mevalonato, por exemplo, a célula hospe-deira é uma que normalmente não sintetiza IPP ou mevalonato via uma tra-jetória de mevalonato. Por exemplo, em algumas concretizações, a célulahospedeira é uma que não sintetiza normalmente IPP, via uma trajetória demevalonato, e a célula hospedeira é geneticamente modificada com um oumais ácidos nucléicos compreendendo seqüências de nucleotídeo que codi-ficam duas ou mais enzimas na trajetória de mevalonato, um IPP isomerase,uma preniltransferase, um terpeno sintase, e uma enzima de modificação deisoprenóide (por exemplo, uma enzima de modificação de isoprenóide codifi-cada por um ácido nucléico objeto). A cultura de tal célula hospedeira pro-porciona produção da trajetória de enzimas de mevalonato, o IPP isomerase,a preniltransferase, o terpeno sintase, e a enzima de modificação de isopre-nóide (por exemplo, um sesquiterpeno oxidase). A produção da trajetória deenzimas de mevalonato, do IPP isomerase, da preniltransferase, do terpenosintase, e da enzima de modificação de isoprenóide (por exemplo, um ses-quiterpeno oxidase) resulta na produção de um composto de isoprenóide.
Em muitas concretizações, a preniltransferase é uma FPP sintase, que geraum substrato de sesquiterpeno para um sesquiterpeno oxidase codificadopor um ácido nucléico objeto; e a produção do sesquiterpeno oxidase resultana oxidação do substrato de sesquiterpeno na célula hospedeira. Quaisquerácidos nucléicos que codificam as enzimas de trajetória de mevalonato, oIPP isomerase, a preniltransferase, e o terpeno sintase, são adequados parauso. Por exemplo, ácidos nucléicos adequados são descritos em, por exem-plo, Martin et al. (2003) supra.
Em algumas das concretizações acima descritas, onde a célu-la hospedeira é geneticamente modificada com um ou mais ácidos nucléicoscompreendendo seqüências de nucleotídeo que codificam duas ou mais en-zimas de trajetória de mevalonato, as duas ou mais enzimas de trajetória demevalonato incluem MK, PMK, e MPD, e a célula hospedeira é cultivada emmeio que inclui mevalonato. Em outras concretizações, as duas ou mais en-zimas de trajetória de mevalonato incluem acetoacetil CoA tiolase, HMGS,HMGR, MK, PMK, e MPD.
Em algumas concretizações, a célula hospedeira é uma quenão sintetiza normalmente IPP via trajetória de mevalonato, a célula hospe-deira é geneticamente modificada conforme descrito acima, e a célula hos-pedeira adicionalmente compreende uma trajetória funcionalmente incapaci-tada de DXP.
Um método objeto é útil para produção de uma variedade decomposto de isoprenóides, incluindo, mas não limitado a, ácido artemisínico(por exemplo, onde o substrato de sesquiterpeno é 4,11-dieno amorfo), aloi-solongifoleno álcool (por exemplo, onde o substrato é aloisolongifoleno), (E)-trans-bergamota-2,12-dien-14-ol (por exemplo, onde o substrato é (-)-a-trans-bergamotene), (-)-elema-1,3,11(13)-trien-12-ol (por exemplo, onde osubstrato é (-)-p-elemene), germacra-1(10),4,11(13)-trien-12-ol (por exem-plo, onde o substrato é (+)-germacrene A), germacrene B álcool (por exem-plo, onde o substrato é germacreno B), 5,11(13)-guaiadieno-12-ol (por e-xemplo, onde o substrato é (+)-Y-gurjuneno), Iedeno álcool (por exemplo,onde o substrato é (+)-ledeno), 4p-H-eudesm-11(13)-ene-4,12-diol (por e-xemplo, onde o substrato é neointermoedeol), (+)-p-costol (por exemplo, on-de o substrato é (+)-p-selineno, e similares; e adicionalmente derivados dequalquer dos precedentes.
Uma célula hospedeira objeto geneticamente modificada é, emmuitas concretizações, cultivada in vitro em um meio adequado e a umatemperatura adequada. A temperatura na qual as células são cultivadas égeralmente de cerca de 18°C a cerca de 40°C, por exemplo, de cerca de18°C a cerca de 20°C, de cerca de 20°C a cerca de 25°C, de cerca de25°C a cerca de 30°C, de cerca de 30°C a cerca de 35°C, ou de cerca de35°C a cerca de 40°C (por exemplo, a cerca de 37°C).
Em algumas concretizações, uma célula hospedeira objetogeneticamente modificada é cultivada em um meio adequado (por exemplo,caldo de Luria-Bertoni, opcionalmente suplementado com um ou mais agen-tes adicionais, tais como um indutor (por exemplo, onde a enzima de modifi-cação de isoprenóide que codifica seqüência de nucleotídeo está sob o con-trole de um promotor induzível), etc.); e o meio de cultura é sobreposto comum solvente orgânico, por exemplo, dodecano, formando uma camada orgâ-nica. O composto de isoprenóide produzido pela célula hospedeira geneti-camente modificada se divide na camada orgânica, a partir da qual ele podeser purificado. Em algumas concretizações, onde a enzima de modificaçãode isoprenóide que codifica seqüência de nucleotídeo é operavelmente liga-da a um promotor induzível, um indutor é adicionado ao meio de cultura; e,após um tempo adequado, o composto de isoprenóide é isolado a partir dacamada orgânica sobreposta no meio de cultura.
Em algumas concretizações, o composto de isoprenóide seráseparado a partir de outros produtos que podem estar presentes na camadaorgânica. A separação do composto de isoprenóide de outros produtos quepodem estar presentes na camada orgânica é prontamente efetuada usan-do-se, por exemplo, técnicas de cromatografia padrões.
Em algumas concretizações, um composto de isoprenóide sin-tetizado por um método objeto é adicionalmente quimicamente modificadoem uma reação de célula livre. Por exemplo, em algumas concretizações,ácido artemisínico é isolado do meio de cultura e/ou uma célula lisato, e oácido artemisínico é adicionalmente quimicamente modificado em uma rea-ção de célula livre para gerar artemisinin.
Em algumas concretizações, o composto de isoprenóide é pu-ro, por exemplo, pelo menos cerca de 40% puro, pelo menos cerca de 50%puro, pelo menos cerca de 60% puro, pelo menos cerca de 70% puro, pelomenos cerca de 80% puro, pelo menos cerca de 90% puro, pelo menos cer-ca de 95% puro, pelo menos cerca de 98%, ou mais do que 98% puro, onde"puro" no contexto de um composto de isoprenóide se refere a um compostode isoprenóide que é livre de outros compostos de isoprenóide, macromolé-cuias, contaminastes, etc.
EXEMPLOS
Os seguintes exemplos são colocados de modo a proporcionaràqueles técnicos no assunto com uma revelação completa e descrição decomo produzir e usar a presente invenção, e não são pretendidos para Iimi-tar o escopo de o que os inventores pretendem com sua invenção, nem sãoeles pretendidos para representar que os experimentos abaixo são todos ousomente experimentos realizados. Esforços foram feitos para assegurar pre-cisão com relação a números usados (por exemplo, quantidades, temperatu-ra, etc.), mas alguns erros experimentais e desvios devem ser considerados.A menos que de outro modo indicado, partes são partes por peso, peso mo-lecular é peso molecular médio de peso, temperatura é em graus Celsius, epressão é em ou perto de atmosférica. Abreviações padrões podem ser usa-das, por exemplo, bp, par(es) base(s); kb, kilobase(s); pl, picolitro(s); s ouseg, segundo(s); min, minuto(s); h ou hr, hora(s); aa, amino ácido(s); kb, ki-lobase(s); bp, par(es) base(s); nt, nucleotídeo(s); i.m., intramuscular(mente);i.p., intraperitoneal(mente); s.c., subcutânea(mente); e similares.
Exemplo 1: Produção de 8-hidroxi-õ-cádineno em Escherichiacoli
Este exemplo descreve a produção de um substrato produzidoin vivo em níveis altos (até 30 mg L-1) usando-se o P450 nativo que participana trajetória biosintética. D-Cadineno-S-Iiidroxilase (CadH) é uma P450 Iiga-da a uma membrana derivada de planta que hidroxilata o sesquiterpeno, D-cadineno (cad), em 8-hidroxi-D-cadineno (CadOH) na biosíntese de gossi-pol, um composto de defesa de planta. A biosíntese de CadOH em E. coli érepresentada esquematicamente na Figura 1. O substrato (Cad) é produzidode farnesil pirofosfato endógeno (FPP) em E. coli por terpeno sintase CadS.Cad é adicionalmente hidroxilatado em produto (CadOH) pela ação de CadHjunto com seu co-participante redox(CPR).
O vetor de expressão de CadH inclui ambos o gene de CadH,bem como o gene que codifica um citocromo P450 reductase (CPR) redoxco-participante de Candida tropicalis. Esta construção foi co-transformadoem E. coli junto com um vetor de expressão compatível com □-cadineno sin-tase (CadS), proporcionando, desse modo, o substrato para CadH. Esta ce-pa foi desenvolvida em meio rico, e induzida na presença de suplementos"heme" por 48 horas a 20SC antes da extração do meio com solvente orgâni-co. Os resultados, representados na Figura 2, mostram uma quantidade cla-ramente detectável de CadOH (-100 Dg L-1) produzida neste sistema medi-do por GC-MS (cromatografia de gás-espectrometria de massa.
Figura 2. Traço de GC-MS de camada orgânica extraída de E.coli expressando trajetória biosintética de CadOH. A inserção mostra ampli-ação da região mostrando CadOH (pico 1), e as espécies de cetona putati-vas (pico 2). A linha superior corresponde a amostras que expressam CadS1CadH, e CPR, enquanto a linha inferior corresponde aos controles negativosque expressam CadS e CPR somente, sem CadH.
Em adição, uma pequena quantidade de um produto de cetonaputativo ([M+]: m/z = 218) foi também observada (inserção da Figura 2, linhasuperior, pico 2), significando que circulações múltiplas pela mesma enzimapodem ser possíveis. O plasmídeo de controle negativo contendo o CPRsomente e não CadH1 não exibiu pico de produto no traço de GC-MS (inser-ção da Figura 2, linha inferior). O espectro de massa do CadOH produzido invivo por E coli usando este sistema e o espectro de literatura de CadOH sãomuito similares [4\. Tentativas anteriores de usar P450s nativas para produ-ção in vivo de produtos naturais funcionalizados em uma família similar decompostos foram mal sucedidas, e apontaram problemas de acesabilidadedo substrato.
A produção de CadOH foi significantemente aumentada peloaumento da quantidade de FPP produzido em E. coli usando o plasmídeo depMBIS, que permite que E. coli produza FPP a partir de mevalonato [6]. Aseqüência de nucleotídeo de pMBIS está representada nas Figuras 36A-D(SEQ ID NO:62). pMBIS é também descrito nas Publicações de Patente dosEstados Unidos Nos. 2003/0148479; e 2004/0005678; e compreende se-qüências de nucleotídeo que codificam mevalonato kinase, fosfomevalonatokinase, mevalonato pirofosfato decarboxilase, IPP isomerase, e FPP sintase.Nestes estudos, E. coli foi transformada com três plasmídeos de expressão:(1) pMBIS, (2) CadS1 e (3) CadH/CPR. 20 mM de mevalonato foi adicionadosob indução. A adição de pMBIS aumentou a produção de CadOH em 74vezes comparada àquela produzida por células sem pMBIS (Figura 3). No-vamente, o controle negativo (nenhum CadH) não mostrou formação de pro-duto. Estes resultados indicam que a circulação de P450 pode estar limitadapela produção de substrato in vivo (por exemplo, em uma célula viva em cul-tura in vitro). Estas células podem também serem desenvolvidas em ummeio aquoso/orgânico misturado; a cepa foi desenvolvida e induzida na pre-sença de uma sobreposição de dodecano sem alterar significantemente aprodutividade de CadOH (~2 vezes menos).
Figura 3. Traço de GC-MS de camada orgânica extraída de E.coli alimentada de mevalonato expressando trajetória biosintética de CadOH,bem como pMBIS. Cad e CadOH são indicados no traço.
Foi adicionalmente mostrado que a produtividade é aumentadapelo manejo do P450 sem perda de especificidade de produto. A produção iηvivo com o gene nativo (nCadH), versus um gene sintético (sCadH) com usode códon otimizado para expressão em E. coli, foi comparada (Figura 4B).Esta comparação indica que o gene sintético se realiza levemente melhor doque o gene nativo.
O domínio N-terminal tipo selvagem de transmembrana (TM)foi substituído com seqüências que são conhecidas para funcionarem em E.coli (Figura 4A). Entre as seqüências N-terminais testadas estavam doiscondutores P450 N-terminais derivados de C. tropicalis - CYP52A13 (A13)que não contêm domínio de TM prognosticado, e CYP52A17 (A17) que nãocontém um domínio de TM [7] - bem como um condutor microssomal bovino(bovino) [8\.
O domínio de TM tipo selvagem foi removido totalmente (trun-cado), e foi substituído com uma etiqueta de secreção (OmpA), domínio desolubilização (PD1) [9], ou uma proteína de inserção de membrana (mistic)[10]. O CadH bovino realizou o CadOH tipo selvagem por aproximadamente2 vezes, produzindo -30 mg L-1 (Figura 4B).
Referências
1. M. Sono, Μ. P. Roach, E. D. Coulter, and J. H. Dawson, Chem. Rev.1996, 96, 2841-2887.
2. S. Jennewein, R. M. Long, R. M. Williams, and R. Croteau, Chem.Bioi 2004, 11, 379-387.
3. R. J. Sowden, S. Yasmin, Ν. H. Rees, S. G. Bell and L-L. Wong, Org.Biomol. Chem. 2005, 3, 57-64.
4. P. Luo, Y.-H. Wang, G.-D. Wang, M. Essenberg, and X.-Y. Chen,Plant J. 2001, 28, 95-104.
5. O. A. Carter, R. J. Peters, and R. Croteau1 Phytochem. 2003, 64,425-433.
6. V. J. J. Martin, D. J. Pitera, S. T. Withers1 J. D. Newman, and J. D.Keasling1 Nature Biotech. 2003, 21, 796-801
7. D. L. Craft, Κ. M. Madduri, M. Eshoo, and C. R. Wilson, Appl. Environ.Microbiol. 2003, 69, 5983-5991.
8. H. J. Barnes, Μ. P. Arlotto, and M. R. Watermoan, Proc. Natl. Acad.Sei. USA 1991, 88, 5597-5601.
9. G. A. Schock, R. Attias1 M. Belghazi1 Ρ. M. Dansette, and D. Werck-Reichart, Plant Physiol. 2003, 133, 1198-1208.
10. Τ. P. Roosild, J. Greenwald, M. Vega1 S. Castronovo1 R. Riek1 and S.Choe Science 2005, 307, 1317-1321.
Este exemplo descreve a oxidação in vivo (por exemplo, emuma célula viva em cultura de célula) de amorfadieno por amorfadieno oxi-dase (AMO), também denominado CYP71AV1, isolado de Artemisia annua.Várias construções compreendendo uma seqüência de nucleotídeo que co-difica AMO foram geradas e testadas de modo a otimizar a produção de pro-duto oxidado. A Figura 22 representa esquematicamente as várias constru-ções de AMO. (1) nAMO, seqüência de AMO nativa conforme isolada de A.annua. (2) sAMO, gene de AMO sintético de códon otimizado para expres-são em E. coii. (3) A13-AMO, gene de AMO sintético com transmembranatipo selvagem substituída com a seqüência A13 N-terminal de C. tropicalis.(4) A17-AMO, gene de AMO sintético com Transmenbrana tipo selvagemsubstituída com a seqüência A17 N-terminal de C. tropicalis. (5) Bov-AMO,gene de AMO sintético com transmembrana tipo selvagem substituída comseqüência N-terminal microssomal bovina. Os nucleotídeo e seqüência deamino ácidos de várias construções são representados nas Figuras 24-31.
As várias construções de ANO foram co-expressas com: a) umCPR; b) amorfadieno sintase (ADS); e c) plasmídeo pMBIS. Na presença demevalonato, amorfadieno foi observado para ser oxidado na posição C-12 aoálcool correspondente. A Figura 23A mostra a quantidade relativa de álcoolartemisínico produzida in vivo. A comparação a um padrão autêntico de ál-cool artemisínico confirma a identidade do produto (Figura 23A, painel defundo e Figura 23B).
Figuras 23A e 23B. Oxidação in vivo de amorfadieno em E. co-li por várias construções de AMO. (A) Traço de GC-MS mostrando produçãode álcool artemisínico produzido em E. coli (painel superior) por sAMO, A13-AMO1 A17-AM0, e AMO bovino, comparado ao padrão autêntico (painel defundo). (B) EI-MS do álcool artemisínico produziu em E. coli (painel superior)comparado ao padrão autêntico (painel inferior).
Exemplo 3: Oxidação de substrato em células expressando atrajetória total de mevalonato
A oxidação de substrato foi também efetuada em células ex-pressando a trajetória total de mevalonato de acetil-CoA. O exemplo seguin-te para produção de CadOH utilizou 3 plasmídeos: (1) pMevT contendo A-toB, HMGR, e HMGS, (2) pMBIS (contendo seqüências de nucleotídeo quecodificam MK1 PMK, PMD, IDI (IPP isomerase), e IspA (FPP sintase)), e (3)um vetor de expressão contendo CadH, CPR, e CadS. As células foram cul-tivadas a 20 9C em TB glicerol com a adição do suplemento de "heme", áci-do □-aminolevulínico. As células produziram CadOH até titulação de 60mg/L. Os dados são mostrados na Figura 32.
Em um segundo exemplo, ácido artemisínico foi produzido u-sando 2 plasmídeos: (1) um vetor de expressão contendo seqüências denucleotídeo que codificam o MevT (AtoB, HMGR, e HMGS) (ver Figuras 35Aand B), MBIS (MK, PMK, PMD, IDI, e IspA), e ADS operons, e (2) um vetorde expressão contendo seqüências de nucleotídeo que codificam AMO e umco-participante redox de CPR de A. annua (AACPR). Após cultura das célu-las de E. coli a 20 9C em TB glicerol com a adição do suplemento de "heme",quantidades de traço de ácido artemisínico foram observadas usando umvetor baseado em promotor T7 (Figura 33). Após mudança do vetor parapCWOri, AMO pode ser usado para as 3 etapas de oxidação de amorfadienopara produzir ácido artemisínico em E. coli em titulações de 20 mg/L (Figura33). Em adição, oxidação gradual do álcool a aldeído foi observada com oaldeído produzido em titulações de 40-80 mg/L (Figura 34).
Conquanto a presente invenção tenha sido descrita com refe-rência às concretizações específicas desta, deve ser compreendido por a-queles técnicos no assunto que várias mudanças podem ser feitas e equiva-lentes podem ser substituídos sem fugir do espírito verdadeiro e escopo dainvenção. Em adição, muitas modificações podem ser feitas para se adaptara uma situação particular, material, composição de matéria, processo, etapaou etapas de processo, ao objetivo, espírito e escopo da presente invenção.Todas tais modificações são pretendidas para estarem dentro do escopo dasreivindicações em anexo.Listagem de Seqüência
<110> CHANG, MICHELLE CHIA-YUEACHUS, RACHELRO, DAE-KYUNYOSHIKUNI, YASUOKEASLING, JAY D.
<120> Ácidos nucléicos que codificam enzima modificada de citocromo p450 emétodos de uso dos mesmos
<130> BERK-053WO<150> 60/724,525<151> 2005-10-07<150> 60/762,700<151> 2006-01-27<160> 63<170> FastSEQ for Windows 1<210> 1<211> 19<212> PRT<213> Seqüência Artificial<220> <223> Peptídeo sintético<400> 1
Met Trp Leu Leu Leu Ile Ala Val Phe Leu Leu Thr Leu Ala Tyr Leu
1 5 10 15
Phe Trp Pro
<210> 2<211> 20<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Peptídeo sintético<400> 2
Met Ala Leu Leu Leu Ala Val Phe Leu Gly Leu Ser Cys Leu Leu Leu
15 10 15
Leu Ser Leu Trp20
<210> 3<211> 18<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Peptídeo sintético<400> 3
Met Ala Ile Leu Ala Ala Ile Phe Ala Leu Val Val Ala Thr Ala Thr
1 5 10 15
Arg Val
<210> 4<211> 24<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Peptideo sintético<400> 4
Met Asp Ala Ser Leu Leu Leu Ser Val Ala Leu Ala Val Val Leu Ile
15 10 15
Pro Leu Ser Leu Ala Leu Leu Asn20
<210> 5<211> 27<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Peptídeo sintético<400> 5
Met Ile Glu Gln Leu Leu Glu Tyr Trp Tyr Val Val Val Pro Val Leu
15 10 15
Tyr Ile Ile Lys Gln Leu Leu Ala Tyr Thr Lys20 25
<210> 6<211> 21<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Peptídeo sintético<400> 6
Met Lys Lys Thr Ala Ile Ala Ile Ala Val Ala Leu Ala Gly Phe Ala
1 5 10 15
Thr Val Ala Gln Ala20
<210> 7<211> 21<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Peptídeo sintético<400> 7
Met Lys Lys Thr Ala Ile Ala Ile
1 5
Thr Val Ala Gln Ala20
Val Val Ala Leu Ala Gly Phe Ala10 15
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<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Peptídeo sintético<400> 8
Met Lys Lys Thr Ala Leu Ala Leu Ala Val Ala Leu Ala Gly Phe Ala
15 10 15
Thr Val Ala Gln Ala20
<210> 9<211> 26<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Peptídeo sintético<400> 9
Met Lys Ile Lys Thr Gly Ala Arg
1 5
Thr Met Met Phe Ser Ala Ser Ala20
Ile Leu Ala Leu Ser Ala Leu Thr
10 15
Leu Ala25
<210> 10<211> 25<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Peptídeo sintético<400> 10
Met Asn Met Lys Lys Leu Ala Thr
1 5
Ala Thr Val Ser Ala Asn Ala Met20
Leu Val Ser Ala Val Ala Leu Ser10 15
Ala25
<210> 11<211> 21<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Peptídeo sintético<400> 11
Met Lys Gln Ser Thr Ile Ala Leu Ala Leu Leu Pro Leu Leu Phe Thr
15 10 15
Pro Val Thr Lys Ala20<210> 12<211> 44<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Peptideo sintético<400> 12
Met Lys Lys Thr Ala Ile Ala Ile Ala Val Ala Leu Ala Gly Phe Ala
1 5 10 15
Thr Val Ala Gln Ala Leu Leu Glu Tyr Trp Tyr Val Val Val Pro Val
20 25 30
Leu Tyr Ile Ile Lys Gln Leu Leu Ala Tyr Thr Lys35 40
<210> 13<211> 24<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Peptídeo sintético<400> 13
Glu Glu Leu Leu Lys Gln Ala Leu
1 5
Gln Ala Gln Glu Leu Ala Lys Lys20
Gln Gln Ala Gln Gln Leu Leu Gln10 15
<210> 14<211> 32<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Peptideo sintético<400> 14
Met Thr Val His Asp Ile Ile Ala Thr Tyr Phe Thr Lys Trp Tyr Val
15 10 15
Ile Val Pro Leu Ala Leu Ile Ala Tyr Arg Val Leu Asp Tyr Phe Tyr20 25 30
<210> 15<211> 29<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Peptideo sintético<400> 15
Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly
1 5
Met Ile Asp Gly Trp Tyr Gly Tyr20
Phe Ile Glu Gly Gly Trp Thr Gly
10 15
Gly Gly Gly Lys Lys25
<210> 16<211> 9<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Peptídeo sintético<400> 16
Met Ala Lys Lys Thr Ser Ser Lys Gly1 5
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<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Peptídeo sintético<400> 17
Ala Ala Ala Gly Gly Met1 5
<210> 18<211> 14<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Peptídeo sintético<400> 18
Ala Ala Ala Gly Gly Met Pro Pro Ala Ala Ala Gly Gly Met
1 5 10
<210> 19<211> 6<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> linker peptide<400> 19
Ala Ala Ala Gly Gly Met1 5
<210> 20<211> 8<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> linker peptide<400> 20
Pro Pro Ala Ala Ala Gly Gly Met1 5
<210> 21<211> 4<212> PRT
<213> Seqüência Artificial
<220>
<223> linker peptide<400> 21Ile Glu Gly Arg1
<210> 22<211> 6<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> linker peptide<400> 22
Gly Gly Lys Gly Gly Lys1 5
<210> 23<211> 23<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Peptideo sintético<400> 23
Met Leu Phe Pro Val Ala Leu Ser Phe Leu Val Ala Ile Leu Gly Ile
15 10 15
Ser Leu Trp His Val Trp Thr20
<210> 24<211> 110<212> PRT
<213> Bacillus subtilis<400> 24
Met Phe Cys Thr Phe Phe Glu Lys His His Arg Lys Trp Asp Ile Leu
1 5 10 15
Leu Glu Lys Ser Thr Gly Val Met Glu Ala Met Lys Val Thr Ser Glu
20 25 30
Glu Lys Glu Gln Leu Ser Thr Ala Ile Asp Arg. Met Asn Glu Gly Leu
35 40 45
Asp Ala 50 Phe Ile Gln Leu Tyr 55 Asn Glu Ser Glu Ile 60 Asp Glu Pro LeuIle Gln Leu Asp Asp Asp Thr Ala Glu Leu Met Lys Gln Ala Arg Asp65 70 75 80Met Tyr Gly Gln Glu 85 Lys Leu Asn Glu Lys 90 Leu Asn Thr Ile Ile 95 LysGln Ile Leu Ser Ile Ser Val Ser Glu Glu Gly Glu Lys Glu
100 105 110
<210> 25<211> 496<212> PRT
<213> Mentha χ gracilis<400> 25
Met Glu Leu Asp Leu Leu Ser Ala
1 5
Ile Val Ser Leu Leu Ile Asn Gln20
Asn Leu Pro Pro Ser Pro Pro Lys
Ile Ile Ile Leu Val Ala Thr Tyr
10 15
Trp Arg Lys Ser Lys Ser Gln Gln25 30
Leu Pro Val Ile Gly His Leu His35 40 45 Phe Leu Trp Gly Gly Leu Pro Gln His Val Phe Arg Ser Ile Ala Gln 50 55 60 Lys Tyr Gly Pro Val Ala His Val Gln Leu Gly Glu Val Tyr Ser Val65 70 75 80Val Leu Ser Ser Ala Glu Ala Ala Lys Gln Ala Met Lys Val Leu Asp 85 90 95 Pro Asn Phe Ala Asp Arg Phe Asp Gly Ile Gly Ser Arg Thr Met Trp 100 105 110 Tyr Asp Lys Asp Asp Ile Ile Phe Ser Pro Tyr Asn Asp His Trp Arg 115 120 125 Gln Met Arg Arg Ile Cys Val Thr Glu Leu Leu Ser Pro Lys Asn Val 130 135 140 Arg Ser Phe Gly Tyr Ile Arg Gln Glu Glu Ile Glu Arg Leu Ile Arg145 150 155 160Leu Leu Gly Ser Ser Gly Gly Ala Pro Val Asp Val Thr Glu Glu Val 165 170 175 Ser Lys Met Ser Cys Val Val Val Cys Arg Ala Ala Phe Gly Ser Val 180 185 190 Leu Lys Asp Gln Gly Ser Leu Ala Glu Leu Val Lys Glu Ser Leu Ala 195 200 205 Leu Ala Ser Gly Phe Glu Leu Ala Asp Leu Tyr Pro Ser Ser Trp Leu 210 215 220 Leu Asn Leu Leu Ser Leu Asn Lys Tyr Arg Leu Gln Arg Met Arg Arg225 230 235 240Arg Leu Asp His Ile Leu Asp Gly Phe Leu Glu Glu His Arg Glu Lys 245 250 255 Lys Ser Gly Glu Phe Gly Gly Glu Asp Ile Val Asp Val Leu Phe Arg 260 265 270 Met Gln Lys Gly Ser Asp Ile Lys Ile Pro Ile Thr Ser Asn Cys Ile 275 280 285 Lys Gly Phe Ile Phe Asp Thr Phe Ser Ala Gly Ala Glu Thr Ser Ser 290 295 300 Thr Thr Ile Ser Trp Ala Leu Ser Glu Leu Met Arg Asn Pro Ala Lys305 310 315 320Met Ala Lys Val Gln Ala Glu Val Arg Glu Ala Leu Lys Gly Lys Thr 325 330 335 Val Val Asp Leu Ser Glu Val Gln Glu Leu Lys Tyr Leu Arg Ser Val 340 345 350 Leu Lys Glu Thr Leu Arg Leu His Pro Pro Phe Pro Leu Ile Pro Arg 355 360 365 Gln Ser Arg Glu Glu Cys Glu Val Asn Gly Tyr Thr Ile Pro Ala Lys 370 375 380 Thr Arg Ile Phe Ile Asn Val Trp Ala Ile Gly Arg Asp Pro Gln Tyr385 390 395 400Trp Glu Asp Pro Asp Thr Phe Arg Pro Glu Arg Phe Asp Glu Val Ser 405 410 415 Arg Asp Phe Met Gly Asn Asp Phe Glu Phe Ile Pro Phe Gly Ala Gly 420 425 430 Arg Arg Ile Cys Pro Gly Leu His Phe Gly Leu Ala Asn Val Glu Ile 435 440 445 Pro Leu Ala Gln Leu Leu Tyr His Phe Asp Trp Lys Leu Pro Gln Gly 450 455 460 Met Thr Asp Ala Asp Leu Asp Met Thr Glu Thr Pro Gly Leu Ser Gly465 470 475 480Pro Lys Lys Lys Asn Val Cys Leu Val Pro Thr Leu Tyr Lys Ser Pro 485 490 495
<210> 26<211> 473<212> PRT
<213> Nicotiana tabacum
<400> 26
Met Gln Phe Phe Ser Leu Val Ser Ile Phe Leu Phe Leu Ala Phe Leu15 10 15Phe Leu Leu Arg Lys Trp Lys Asn Ser Asn Ser Gln Ser Lys Lys Leu 20 25 30 Pro Pro Gly Pro Trp Lys Ile Pro Ile Leu Gly Ser Met Leu His Met 35 40 45 Ile Gly Gly Glu Pro His His Val Leu Arg Asp Leu Ala Lys Lys Tyr 50 55 60 Gly Pro Leu Met His Leu Gln Leu Gly Glu Ile Ser Ala Val Val Val65 70 75 80Thr Ser Arg Asp Met Ala Lys Glu Val Leu Lys Thr His Asp Val Val 85 90 95 Phe Ala Ser Arg Pro Lys Ile Val Ala Met Asp Ile Ile Cys Tyr Asn 100 105 110 Gln Ser Asp Ile Ala Phe Ser Pro Tyr Gly Asp His Trp Arg Gln Met 115 120 125 Arg Lys Ile Cys Val Met Glu Leu Leu Asn Ala Lys Asn Val Arg Ser 130 135 140 Phe Ser Ser Ile Arg Arg Asp Glu Val Val Arg Leu Ile Asp Ser. Ile145 150 155 160Arg Ser Asp Ser Ser Ser Gly Glu Leu Val Asn Phe Thr Gln Arg Ile 165 170 175 Ile Trp Phe Ala Ser Ser Met Thr Cys Arg Ser Ala Phe Gly Gln Val 180 185 190 Leu Lys Gly Gln Asp Ile Phe Ala Lys Lys Ile Arg Glu Val Ile Gly 195 200 205 Leu Ala Glu Gly Phe Asp Val Val Asp Ile Phe Pro Thr Tyr Lys Phe 210 215 220 Leu His Val Leu Ser Gly Met Lys Arg Lys Leu Leu Asn Ala His Leu225 230 235 240Lys Val Asp Ala Ile Val Glu Asp Val Ile Asn Glu His Lys Lys Asn 245 250 255 Leu Ala Ala Gly Lys Ser Asn Gly Ala Leu Glu Asp Met Phe Ala Ala 260 265 270 Gly Thr Glu Thr Ser Ser Thr Thr Thr Val Trp Ala Met Ala Glu Met 275 280 285 Met Lys Asn Pro Ser Val Phe Thr Lys Ala Gln Ala Glu Val Arg Glu 290 295 300. Ala Phe Arg Asp Lys Val Ser Phe Asp Glu Asn Asp Val Glu Glu Leu305 310 315 320Lys Tyr Leu Lys Leu Val Ile Lys Glu Thr Leu Arg Leu His Pro Pro 325 330 335 Ser Pro Leu Leu Val Pro Arg Glu Cys Arg Glu Asp Thr Asp Ile Asn 340 345 350 Gly Tyr Thr Ile Pro Ala Lys Thr Lys Val Met Val Asn Val Trp Ala 355 360 365 Leu Gly Arg Asp Pro Lys Tyr Trp Asp Asp Ala Glu Ser Phe Lys Pro 370 375 380 Glu Arg Phe Glu Gln Cys Ser Val Asp Phe Phe Gly Asn Asn Phe Glu385 390 395 400Phe Leu Pro Phe Gly Gly Gly Arg Arg Ile Cys Pro Gly Met Ser Phe 405 410 415 Gly Leu Ala Asn Leu Tyr Leu Pro Leu Ala Gln Leu Leu Tyr His Phe 420 425 430 Asp Trp Lys Leu Pro Thr Gly Ile Met Pro Arg Asp Leu Asp Leu Thr 435 440 445 Glu Leu Ser Gly Ile Thr Ile Ala Arg Lys Gly Asp Leu Tyr Leu Asn 450 455 460 Ala Thr Pro Tyr Gln Pro Ser Arg Glu 465 470
<210> 27<211> 536<212> PRT
<213> Gossypium arboreum
<400> 27
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Asn Gln Lys Asp Gly Met Leu Phe Pro Val Ala Leu Ser Phe Leu Val
20 25 30
Ala Ile Leu Gly Ile Ser Leu Trp His Val Trp Thr Ile Arg Lys Pro
35 40 45
Lys Lys Asp Ile Ala Pro Leu Pro Pro Gly Pro Arg Gly Leu Pro Ile
50 55 60
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Thr Asp Leu Ala Ala Ala Tyr Gly Pro Ile Tyr Lys Leu Trp Leu Gly
85 90 95
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100 105 110
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115 120 125
Ala Lys Ile Ile Thr Phe Gly Leu Asn Asp Ile Val Phe Asp Ser Tyr
130 135 140
Ser Ser Pro Asp Trp Arg Met Lys Arg Lys Val Leu Val Arg Glu Met145 150 155 160
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165 170 175
Val Leu Lys Gly Val Gln Asn Val Ala Gln Ser Ala Gly Lys Pro Ile
180 185 190
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195 200 205
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210 215 220
Trp Gly Gln Phe Arg Asp Leu Ile Thr Glu Leu Met Val Ile Leu Gly225 230 235 240
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260 265 270
Leu Phe Asn Ser Met Ile Glu Glu Arg Glu Asn Phe Ser Asn Lys Leu
275 280 285
Ser Lys Glu Asp Gly Asn Thr Glu Thr Lys Asp Phe Leu Gln Leu Leu
290 295 300
Leu Asp Leu Lys Gln Lys Asn Asp Ser Gly Ile Ser Ile Thr Met Asn305 310 315 320
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325 330 335
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340 345 350
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355 360 365
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370 375 380
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435 440 445
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450 455 460
Pro Phe Gly Ser Gly Arg Arg Met Cys Ala Gly Val Ser Leu Gly Glu465 470 475 480
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Asn Leu Ala Asp Gly Glu Glu Asn Asp Leu Ile Gly Leu Phe Gly Ile
500 505 510
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515 520 525
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<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Modified Ρ450 monooxygenase<400> 28
Met Ala Leu Leu Leu Ala Val Phe Leu Gly Leu Ser Cys Leu Leu Leu
1 5 10 15
Leu Ser Leu Trp Ile Arg Lys Pro Lys Lys Asp Ile Ala Pro Leu Pro
20 25 30
Pro Gly Pro Arg Gly Leu Pro Ile Val Gly Tyr Leu Pro Tyr Leu Gly
35 40 45
Thr Asp Asn Leu His Leu Val Phe Thr Asp Leu Ala Ala Ala Tyr Gly
50 55 60
Pro Ile Tyr Lys Leu Trp Leu Gly Asn Lys Leu Cys Val Val Ile Ser65 70 75 80
Ser Ala Pro Leu Ala Lys Glu Val Val Arg Asp Asn Asp Ile Thr Phe
85 90 95
Ser Glu Arg Asp Pro Pro Val Cys Ala Lys Ile Ile Thr Phe Gly Leu
100 105 110
Asn Asp Ile Val Phe Asp Ser Tyr Ser Ser Pro Asp Trp Arg Met Lys
115 120 125
Arg Lys Val Leu Val Arg Glu Met Leu Ser His Ser Ser Ile Lys Ala
130 135 140
Cys Tyr Gly Leu Arg Arg Glu Gln Val Leu Lys Gly Val Gln Asn Val145 150 155 160
Ala Gln Ser Ala Gly Lys Pro Ile Asp Phe Gly Glu Thr Ala Phe Leu
165 170 175
Thr Ser Ile Asn Ala Met Met Ser Met Leu Trp Gly Gly Lys Gln Gly
180 185 190
Gly Glu Arg Lys Gly Ala Asp Val Trp Gly Gln Phe Arg Asp Leu Ile
195 200 205
Thr Glu Leu Met Val Ile Leu Gly Lys Pro Asn Val Ser Asp Ile Phe
210 215 220
Pro Val Leu Ala Arg Phe Asp Ile Gln Gly Leu Glu Lys Glu Met Thr225 230 235 240
Lys Ile Val Asn Ser Phe Asp Lys Leu Phe Asn Ser Met Ile Glu Glu
245 250 255
Arg Glu Asn Phe Ser Asn Lys Leu Ser Lys Glu Asp Gly Asn Thr Glu
260 265 270
Thr Lys Asp Phe Leu Gln Leu Leu Leu Asp Leu Lys Gln Lys Asn Asp
275 280 285
Ser Gly Ile Ser Ile Thr Met Asn Gln Val Lys Ala Leu Leu Met Asp
290 295 300
Ile Val Val Gly Gly Thr Asp Thr Thr Ser Thr Met Met Glu Trp Thr305 310 315 320
Met Ala Glu Leu Ile Ala Asn Pro Glu Ala Met Lys Lys Val Lys Gln
325 330 335
Glu Ile Asp Asp Val Val Gly Ser Asp Gly Ala Val Asp Glu Thr His
340 345 350
Leu Pro Lys Leu Arg Tyr Leu Asp Ala Ala Val Lys Glu Thr Phe Arg
355 360 365
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370 375 380
Ser Asn Val Gly Gly Tyr Ser Val Pro Lys Gly Thr Arg Val Phe Leu385 390 395 400
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420 425 430
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<210> 29<211> 516<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Modified Ρ450 monooxygenase<400> 29
Glu Glu Leu Leu Lys Gln Ala Leu Gln Gln Ala Gln Gln Leu Leu Gln
1 5 10 15 Gln Ala Gln Glu Leu Ala Lys Lys Ile Arg Lys Pro Lys Lys Asp Ile 20 25 30 Ala Pro Leu Pro Pro Gly Pro Arg Gly Leu Pro Ile Val Gly Tyr Leu 35 40 45 Pro Tyr Leu Gly Thr Asp Asn Leu His Leu Val Phe Thr Asp Leu Ala 50 55 60 Ala Ala Tyr Gly Pro Ile Tyr Lys Leu Trp Leu Gly Asn Lys Leu Cys65 70 75 80Val Val Ile Ser Ser Ala Pro Leu Ala Lys Glu Val Val Arg Asp Asn 85 90 95 Asp Ile Thr Phe Ser Glu Arg Asp Pro Pro Val Cys Ala Lys Ile Ile 100 105 110 Thr Phe Gly Leu Asn Asp Ile Val Phe Asp Ser Tyr Ser Ser Pro Asp 115 120 125 Trp Arg Met Lys Arg Lys Val Leu Val Arg Glu Met Leu Ser His Ser 130 135 140 Ser Ile Lys Ala Cys Tyr Gly Leu Arg Arg Glu Gln Val Leu Lys Gly145 150 155 160Val Gln Asn Val Ala Gln Ser Ala Gly Lys Pro Ile Asp Phe Gly Glu 165 170 175 Thr Ala Phe Leu Thr Ser Ile Asn Ala Met Met Ser Met Leu Trp Gly 180 185 190 Gly Lys Gln Gly Gly Glu Arg Lys Gly Ala Asp Val Trp Gly Gln Phe 195 200 205 Arg Asp Leu Ile Thr Glu Leu Met Val Ile Leu Gly Lys Pro Asn Val 210 215 220 Ser Asp Ile Phe Pro Val Leu Ala Arg Phe Asp Ile Gln Gly Leu Glu225 230 235 240Lys Glu Met Thr Lys Ile Val Asn Ser Phe Asp Lys Leu Phe Asn Ser 245 250 255 Met Ile Glu Glu Arg Glu Asn Phe Ser Asn Lys Leu Ser Lys Glu Asp 260 265 270 Gly Asn Thr Glu Thr Lys Asp Phe Leu Gln Leu Leu Leu Asp Leu Lys 275 280 285 Gln Lys Asn Asp Ser Gly Ile Ser Ile Thr Met Asn Gln Val Lys Ala 290 295 300 Leu Leu Met Asp Ile Val Val Gly Gly Thr Asp Thr Thr Ser Thr Met305 310 315 320Met Glu Trp Thr Met Ala Glu Leu Ile Ala Asn Pro Glu Ala Met Lys 325 330 335 Lys Val Lys Gln Glu Ile Asp Asp Val Val Gly Ser Asp Gly Ala Val 340 345 350 Asp Glu Thr His Leu Pro Lys Leu Arg Tyr Leu Asp Ala Ala Val Lys 355 360 365 Glu Thr Phe Arg Leu His Pro Pro Met Pro Leu Leu Val Pro Arg Cys 370 375 380Pro Gly Asp Ser Ser Asn Val Gly Gly Tyr Ser Val Pro Lys Gly Thr385 390 395 400
Arg Val Phe Leu Asn Ile Trp Cys Ile Gln Arg Asp Pro Gln Leu Trp
405 410 415
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420 425 430
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435 440 445
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500 505 510
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<210> 30<211> 536<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Modified P450 monooxygenase<400> 30
Met Lys Lys Thr Ala Ile Ala Ile Ala Val Ala Leu Ala Gly Phe Ala
15 10 15
Thr Val Ala Gln Ala Leu Leu Glu Tyr Trp Tyr Val Val Val Pro Val
20 25 30
Leu Tyr Ile Ile Lys Gln Leu Leu Ala Tyr Thr Lys Ile Arg Lys Pro
35 40 45
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50 55 60
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85 90 95
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Val Arg Asp Asn Asp Ile Thr Phe Ser Glu Arg Asp Pro Pro Val Cys
115 120 125
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130 135 140
Ser Ser Pro Asp Trp Arg Met Lys Arg Lys Val Leu Val Arg Glu Met145 150 155 160
Leu Ser His Ser Ser Ile Lys Ala Cys Tyr Gly Leu Arg Arg Glu Gln
165 170 175
Val Leu Lys Gly Val Gln Asn Val Ala Gln Ser Ala Gly Lys Pro Ile
180 185 190
Asp Phe Gly Glu Thr Ala Phe Leu Thr Ser Ile Asn Ala Met Met Ser
195 200 205
Met Leu Trp Gly Gly Lys Gln Gly Gly Glu Arg Lys Gly Ala Asp Val
210 215 220
Trp Gly Gln Phe Arg Asp Leu Ile Thr Glu Leu Met Val Ile Leu Gly225 230 235 240
Lys Pro Asn Val Ser Asp Ile Phe Pro Val Leu Ala Arg Phe Asp Ile
245 250 255
Gln Gly Leu Glu Lys Glu Met Thr Lys Ile Val Asn Ser Phe Asp Lys
260 265 270
Leu Phe Asn Ser Met Ile Glu Glu Arg Glu Asn Phe Ser Asn Lys Leu
275 280 285
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325 330 335
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340 345 350
Glu Ala Met Lys Lys Val Lys Gln Glu Ile Asp Asp Val Val Gly Ser
355 360 365
Asp Gly Ala Val Asp Glu Thr His Leu Pro Lys Leu Arg Tyr Leu Asp
370 375 380
Ala Ala Val Lys Glu Thr Phe Arg Leu His Pro Pro Met Pro Leu Leu385 390 395 400
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405 410 415
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420 425 430
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435 440 445
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450 455 460
Pro Phe Gly Ser Gly Arg Arg Met Cys Ala Gly Val Ser Leu Gly Glu465 470 475 480
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485 490 495
Asn Leu Ala Asp Gly Glu Glu Asn Asp Leu Ile Gly Leu Phe Gly Ile
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Ile Met Lys Lys Lys Lys Pro Leu Ile Leu Val Pro Thr Pro Arg Pro
515 520 525
Ser Asn Leu Gln His Tyr Met Lys530 535
<210> 31<211> 502<212> PRT
<213> Taxus cuspidata<400> 31
Met Asp Ala Leu Tyr Lys Ser Thr Val Ala Lys Phe Asn Glu Val Thr
15 10 15
Gln Leu Asp Cys Ser Thr Glu Ser Phe Ser Ile Ala Leu Ser Ala Ile
20 25 30
Ala Gly Ile Leu Leu Leu Leu Leu Leu Phe Arg Ser Lys Arg His Ser
35 40 45
Ser Leu Lys Leu Pro Pro Gly Lys Leu Gly Ile Pro Phe Ile Gly Glu
50 55 60
Ser Phe Ile Phe Leu Arg Ala Leu Arg Ser Asn Ser Leu Glu Gln Phe65 70 75 80
Phe Asp Glu Arg Val Lys Lys Phe Gly Leu Val Phe Lys Thr Ser Leu
85 90 95
Ile Gly His Pro Thr Val Val Leu Cys Gly Pro Ala Gly Asn Arg Leu
100 105 110
Ile Leu Ser Asn Glu Glu Lys Leu Val Gln Met Ser Trp Pro Ala Gln
115 120 125
Phe Met Lys Leu Met Gly Glu Asn Ser Val Ala Thr Arg Arg Gly Glu
130 135 140
Asp His Ile Val Met Arg Ser Ala Leu Ala Gly Phe Phe Gly Pro Gly145 150 155 160
Ala Leu Gln Ser Tyr Ile Gly Lys Met Asn Thr Glu Ile Gln Ser His
165 170 175
Ile Asn Glu Lys Trp Lys Gly Lys Asp Glu Val Asn Val Leu Pro Leu
180 185 190
Val Arg Glu Leu Val Phe Asn Ile Ser Ala Ile Leu Phe Phe Asn Ile
195 200 205
Tyr Asp Lys Gln Glu Gln Asp Arg Leu His Lys Leu Leu Glu Thr Ile
210 215 220
Leu Val Gly Ser Phe Ala Leu Pro Ile Asp Leu Pro Gly Phe Gly Phe225 230 235 240
His Arg Ala Leu Gln Gly Arg Ala Lys Leu Asn Lys Ile Met Leu Ser
245 250 255
Leu Ile Lys Lys Arg Lys Glu Asp Leu Gln Ser Gly Ser Ala Thr Ala
260 265 270
Thr Gln Asp Leu Leu Ser Val Leu Leu Thr Phe Arg Asp Asp Lys Gly
275 280 285
Thr Pro Leu Thr Asn Asp Glu Ile Leu Asp Asn Phe Ser Ser Leu Leu
290 295 300
His Ala Ser Tyr Asp Thr Thr Thr Ser Pro Met Ala Leu Ile Phe Lys305 310 315 320
Leu Leu Ser Ser Asn Pro Glu Cys Tyr Gln Lys Val Val Gln Glu Gln
325 330 335
Leu Glu Ile Leu Ser Asn Lys Glu Glu Gly Glu Glu Ile Thr Trp Lys
340 345 350
Asp Leu Lys Ala Met Lys Tyr Thr Trp Gln Val Ala Gln Glu Thr Leu
355 360 365
Arg Met Phe Pro Pro Val Phe Gly Thr Phe Arg Lys Ala Ile Thr Asp
370 375 380
Ile Gln Tyr Asp Gly Tyr Thr Ile Pro Lys Gly Trp Lys Leu Leu Trp385 390 395 400
Thr Thr Tyr Ser Thr His Pro Lys Asp Leu Tyr Phe Asn Glu Pro Glu
405 410 415
Lys Phe Met Pro Ser Arg Phe Asp Gln Glu Gly Lys His Val Ala Pro
420 425 430
Tyr Thr Phe Leu Pro Phe Gly Gly Gly Gln Arg Ser Cys Val Gly Trp
435 440 445
Glu Phe Ser Lys Met Glu Ile Leu Leu Phe Val His His Phe Val Lys
450 455 460
Thr Phe Ser Ser Tyr Thr Pro Val Asp Pro Asp Glu Lys Ile Ser Gly465 470 475 480
Asp Pro Leu Pro Pro Leu Pro Ser Lys Gly Phe Ser Ile Lys Leu Phe
485 490 495
Pro Glu Thr Ile Val Asn500
<210> 32<211> 502<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Modified taxadiene-5a-hydroxylase
<400> 32
Met Asp Ala Leu Tyr Lys Ser Thr Val Ala Lys Phe Asn Glu Val Thr1 5 10 15 Gln Leu Asp Cys 20 Ser Thr Glu Ser Phe 25 Ser Ile Ala Leu Ser 30 Ser IleAla Gly Ile 35 Leu Leu Leu Leu Leu 40 Leu Phe Arg Ser Lys 45 Arg His SerSer Leu Lys Leu Pro Pro Gly Lys Leu Gly Ile Pro Phe Ile Gly Glu 50 55 60 Ser Phe Ile Phe Leu Arg Ala Leu Arg Ser Asn Ser Leu Glu Gln Phe65 70 75 80Phe Asp Glu Arg Val Lys Lys Phe Gly Leu Val Phe Lys Thr Ser Leu 85 90 95 Ile Gly His Pro Thr Val Val Leu Cys Gly Pro Ala Gly Asn Arg Leu 100 105 110 Ile Leu Ser 115 Asn Glu Glu Lys Leu 120 Val Gln Met Ser Trp 125 Pro Ala GlnPhe Met Lys Leu Met Gly Glu Asn Ser Val Ala Thr Arg Arg Gly Glu 130 135 140 Asp His Ile Val Met Arg Ser Ala Leu Ala Gly Phe Phe Gly Pro Gly145 150 155 160Ala Leu Gln Ser Tyr Ile Gly Lys Met Asn Thr Glu Ile Gln Asn His165 170 175 Ile Asn Glu Lys Trp Lys Gly Lys Asp Glu Val Asn Val Leu Pro Leu 180 185 190 Val Arg Glu Leu Val Phe Asn Ile Ser Ala Ile Leu Phe Phe Asn Ile 195 200 205 Tyr Asp Lys Gln Glu Gln Asp Arg Leu His Lys Leu Leu Glu Thr Ile 210 215 220 Leu Val Gly Ser Phe Ala Leu Pro Ile Asp Leu Pro Gly Phe Gly Phe225 230 235 240His Arg Ala Leu Gln Gly Arg Ala Thr Leu Asn Lys Ile Met Leu Ser 245 250 255 Leu Ile Lys Lys Arg Lys Glu Asp Leu Gln Ser Gly Ser Ala Thr Ala 260 265 270 Thr Gln Asp Leu Leu Ser Val Leu Leu Thr Phe Arg Asp Asp Lys Gly 275 280 285 Thr Pro Leu Thr Asn Asp Glu Ile Leu Asp Asn Phe Ser Ser Leu Leu 290 295 300 His Ala Ser Tyr Asp Thr Thr Thr Ser Pro Met Ala Leu Ile Phe Lys305 310 315 320Leu Leu Ser Ser Asn Pro Glu Cys Tyr Gln Lys Val Val Gln Glu Gln 325 330 335 Leu Glu Ile Leu Ser Asn Lys Glu Glu Gly Glu Glu Ile Thr Trp Lys 340 345 350 Asp Leu Lys Ala Met Lys Tyr Thr Trp Gln Val Ala Gln Glu Thr Leu 355 360 365 Arg Met Phe Pro Pro Val Phe Gly Thr Phe Arg Lys Ala Ile Thr Asp 370 375 380 Ile Gln Tyr Asp Gly Tyr Thr Ile Pro Lys Gly Trp Lys Leu Leu Trp385 390 395 400Thr Thr Tyr Ser Thr His Pro Lys Asp Leu Tyr Phe Ser Glu Pro Glu 405 410 415 Lys Phe Met Pro Ser Arg Phe Asp Gln Glu Gly Lys His Val Ala Pro 420 425 430 Tyr Thr Phe Leu Pro Phe Gly Gly Gly Gln Arg Ser Cys Val Gly Trp 435 440 445 Glu Phe Ser Lys Met Glu Ile Leu Leu Phe Val His His Phe Val Lys 450 455 460 Thr Phe Ser Ser Tyr Thr Pro Val Asp Pro Asp Glu Lys Ile Ser Gly465 470 475 480Asp Pro Leu Pro Pro Leu Pro Ser Lys Gly Phe Ser Ile Lys Leu Phe 485 490 495 Pro Glu Thr Ile Val Asn 500 <210> 33 <211> 509 <212> PRT <213> Arabidopsis thaliana <400> 33 Met Ala Phe Phe Ser Met Ile Ser Ile Leu Leu Gly Phe Val Ile Ser1 5 10 15 Ser Phe Ile Phe Ile Phe Phe Phe Lys Lys Leu Leu Ser Phe Ser Arg 20 25 30 Lys Asn Met Ser Glu Val Ser Thr Leu Pro Ser Val Pro Val Val Pro 35 40 45 Gly Phe Pro Val Ile Gly Asn Leu Leu Gln Leu Lys Glu Lys Lys Pro 50 55 60 His Lys Thr Phe Thr Arg Trp Ser Glu Ile Tyr Gly Pro Ile Tyr Ser65 70 75 80Ile Lys Met Gly Ser Ser Ser Leu Ile Val Leu Asn Ser Thr Glu Thr 85 90 95 Ala Lys Glu Ala Met Val Thr Arg Phe Ser Ser Ile Ser Thr Arg Lys 100 105 110 Leu Ser Asn Ala Leu Thr Val Leu Thr Cys Asp Lys Ser Met Val Ala 115 120 125Thr Ser 130 Asp Tyr Asp Asp Phe 135 His Lys Leu Val Lys 140 Arg Cys Leu LeuAsn Gly Leu Leu Gly Ala Asn Ala Gln Lys Arg Lys Arg His Tyr Arg145 150 155 160Asp Ala Leu Ile Glu 165 Asn Val Ser Ser Lys 170 Leu His Ala His Ala 175 ArgAsp His Pro Gln 180 Glu Pro Val Asn Phe 185 Arg Ala Ile Phe Glu 190 His GluLeu Phe Gly Val Ala Leu Lys Gln Ala Phe Gly Lys Asp Val Glu Ser 195 200 205 Ile Tyr 210 Val Lys Glu Leu Gly 215 Val Thr Leu Ser Lys 220 Asp Glu Ile PheLys Val Leu Val His Asp Met Met Glu Gly Ala Ile Asp Val Asp Trp225 230 235 240Arg Asp Phe Phe Pro 245 Tyr Leu Lys Trp Ile 250 Pro Asn Lys Ser Phe 255 GluAla Arg Ile Gln 260 Gln Lys His Lys Arg 265 Arg Leu Ala Val Met 270 Asn AlaLeu Ile Gln 275 Asp Arg Leu Lys Gln 280 Asn Gly Ser Glu Ser 285 Asp Asp AspCys Tyr 290 Leu Asn Phe Leu Met 295 Ser Glu Ala Lys Thr 300 Leu Thr Lys GluGln Ile Ala Ile Leu Val Trp Glu Thr Ile Ile Glu Thr Ala Asp Thr305 310 315 320Thr Leu Val Thr Thr 325 Glu Trp Ala Ile Tyr 330 Glu Leu Ala Lys His 335 ProSer Val Gln Asp 340 Arg Leu Cys Lys Glu 345 Ile Gln Asn Val Cys 350 Gly GlyGlu Lys Phe 355 Lys Glu Glu Gln Leu 360 Ser Gln Val Pro Tyr 365 Leu Asn GlyVal Phe 370 His Glu Thr Leu Arg 375 Lys Tyr Ser Pro Ala 380 Pro Leu Val ProIle Arg Tyr Ala His Glu Asp Thr Gln Ile Gly Gly Tyr His Val Pro385 390 395 400Ala Gly Ser Glu Ile 405 Ala Ile Asn Ile Tyr 410 Gly Cys Asn Met Asp 415 LysLys Arg Trp Glu 420 Arg Pro Glu Asp Trp 425 Trp Pro Glu Arg Phe 430 Leu AspAsp Gly Lys 435 Tyr Glu Thr Ser Asp 440 Leu His Lys Thr Met 445 Ala Phe GlyAla Gly 450 Lys Arg Val Cys Ala 455 Gly Ala Leu Gln Ala 460 Ser Leu Met AlaGly Ile Ala Ile Gly Arg Leu Val Gln Glu Phe Glu Trp Lys Leu Arg465 470 475 480Asp Gly Glu Glu Glu 485 Asn Val Asp Thr Tyr 490 Gly Leu Thr Ser Gln 495 LysLeu Tyr Pro Leu 500 Met Ala Ile Ile Asn 505 Pro Arg Arg Ser
<210> 34<211> 1896<212> DNA
<213> Gossypium arboreum<400> 34
ccacttcgca gcaatattat tgcagttcct ggttggctac ctctgagttt tcaacttaaa 60
atttcttggt tttcctcaag aaggaagaag atgttgcaaa tagctttcag ctcgtattca 120
tggctgttga ctgctagcaa ccagaaagat ggaatgttgt tcccagtagc tttgtcattt 180
ttggtagcca tattgggaat ttcactgtgg cacgtatgga ccataaggaa gccaaagaaa 240
gacatcgccc cattaccgcc gggtccccgt gggttgccaa tagtgggata tcttccatat 300
cttggaactg ataatcttca cttggtgttt acagatttgg ctgcagctta cggtcccatc 360
tacaagcttt ggctaggaaa caaattatgc gtagtcatta gctcggcacc actggcgaaa 420
gaagtggttc gtgacaacga catcacattt tctgaaaggg atcctcccgt ttgtgcaaag 480
attattacct ttggcctcaa tgatattgta tttgattctt acagtagtcc agattggaga 540
atgaagagaa aagtgctggt acgtgaaatg cttagccata gtagcattaa agcttgttat 600
ggtctaagga gggaacaagt gcttaaaggc gtacaaaatg ttgctcaaag tgctggcaag 660ccaattgatt ttggtgaaac ggcatttttatggggtggca aacagggagg agagcggaaactcataaccg aactaatggt gatacttggacttgcaaggt ttgacataca gggattggaggataagcttt tcaactccat gattgaagaagaagatggaa acactgaaac aaaagacttcaacgatagcg gaatategat aacaatgaatgtcggtggaa ctgatacaac atcaaccatgaatcctgaag caatgaaaaa ggtgaagcaagccgtcgatg agactcactt gcctaagttgttccgattgc acccaccgat gecactccttgttggtggct atagcgtacc aaagggcaccagggatccac agctttggga aaatcctttacatgagaagc tcgattattt aggaaacgatagaatgtgtg ccggagtatc tctcggtgaaatccatgctt atgattggaa cttggccgacggaattatta tgaagaaaaa gaagcctttactccagcact atatgaagta actttactattttgtcatgt ttaggcaaca attctaagtatgtttattat acatcataag caatgagctcgtgtattaag tgaaatcaac aaatctttta
acatcaatca atgcgatgat gagcatgctg 720ggggccgacg tttggggcca atttcgagat 780aaaccaaacg tttctgatat tttcccggtg 840aaggaaatga ctaaaatcgt taattctttc 900agagagaact ttagcaacaa attgagcaaa 960ttgcagcttc tgttggacct caagcagaag 1020caagtcaagg ccttgctcat ggacattgtg 1080atggaatgga caatggctga actaattgca 1140gaaatagacg atgttgtcgg ttcggatggc 12 00cgctatctag atgctgcagt aaaggagacc 12 60gtaccccgtt gcccgggcga ctcaagcaac 1320agggtcttct taaacatttg gtgtattcag 1380gaattcaagc ctgagaggtt cttgactgat 1440tcccggtaca tgccgtttgg ttctggaagg 1500aagatgttgt attcctcctt ggcagcaatg 1560ggtgaagaaa atgacttgat tggcttattt 162 0attcttgttc ctacaccaag accatcaaat 1680tgtatttctt ttataccact ttattgcctc 1740atãagtttgg ctatatggtg aacaataatg 1800ttcccgaccc tagggcaata caatgatact 1860ttctaa 1896
<210> 35<211> 1677<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<400> 35
atgctgcaga
ggcatgctgt
cacgtgtgga
ggcctgccga
accgacctgg
gtagttatct
tccgaacgtg
ttcgactcct
ctgtcccaca
gtacaaaacg
actagcatca
ggcgccgacg
aaaccgaacg
aaagaaatga
cgcgaaaatt
ctgcagctgc
caagtgaaag
atggaatgga
gaaattgatg
cgttatctgg
gttccacgtt
cgtgtgttcc
gagttcaaac
tcccgttaca
aaaatgctgt
ggtgaagaga
atcctggtgc
ggctctaaag
ttgctttttctcccggtggcctatccgtaatcgttggctacagccgcgtacctctgctccacccaccggtatagctctccgctccattaatagcgcagtcacgctatgattatggggccatcagcgacatccaagatcgttctctaacaatgctggacctcgctgctgatcgatggcagaatgtagtgggacgcagccgtgcccaggcgatgaatatctgctgaacgctttgccgttcggactctagcctacgacctgatcgactccgcgaaaccgctgc
ttcttattctgctgagcttcaccgaagaaacctgccgtatcggtccgatctctggcgaagctgtgctaaatgactggcgtggcatgctaccgcgggcaaagtccatgctggtttcgtgaccttcccggttcaactctttcactgagcaaagaaacaaaagggacattgttactgattgctctctgatggtgaaagaaaccttccagcaacgtgcattcagcctgaccgacttctggccgtggctgccatgcggcctgttctccaagcaactgcaaaattc
tggctgctgactggtggcaagatatcgcacctgggcaccgtacaaactgtgaggtggttcatcatcacctatgaaacgtaggcctgcgtcccgatcgatttggggtggtactgatcaccgctggctcgctgacaaactgtgaagatggcaaacgattctggtgggtggtaaatccggaaggcggtagacgttccgtctgcgttggtggctcgcgacccgccatgaaaagccgtatgtgcgatccacgcttggcatcattactgcagcactgaacgtcagc
ccgcttctaatcctgggcatcgctgccaccacaacctgcaggctgggcaagcgacaacgatcggcctgaaaggttctggtgcgaacaggttcggcgaaacaacagggcggaactgatggttcgacatccattaactccatacaccgaaacgtatctccatctgacaccaccgatgaagaaagacgcacctatccgcctatatagcgtaccagctgtgggatggactacctcaggcgtctcacgactggaatgaaaaagaaacatgaaactacatggacag
ccagaaagactagcctgtgggggtccgcgtcctggtgttctaaactgtgccatcaccttccgacatcgtaacgcgagatgactgaaaggcggccttcctgcgagcgtaaagattctgggcgggcctggaagatcgaagaataaagatttctaccatgaacttctaccatgagtgaaacaagcctaagctggccgctgctggaagggtaccaaacccgctggggcaacgatcctgggcgagcctggcagataaagccgctgggtgccgcgtctaataa
60120180240300360420480540600660720780840900960102010801140120012601320138014401500156016201677
<210> 36<211> 717<212> PRT
<213> Taxus cuspidata
<400> 36
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Leu Leu Asp Ile Ser Arg Leu Asp His Ile Phe Ala Leu Leu Leu Asn 20 25 30 Gly Lys Gly Gly Asp Leu Gly Ala Met Thr Gly Ser Ala Leu Ile Leu 35 40 45 Thr Glu Asn Ser Gln Asn Leu Met Ile Leu Thr Thr Ala Leu Ala Val 50 55 60 Leu Val Ala Cys Val Phe Phe Phe Val Trp Arg Arg Gly Gly Ser Asp65 70 75 80Thr Gln Lys Pro Ala Val Arg Pro Thr Pro Leu Val Lys Glu Glu Asp 85 90 95 Glu Glu Glu Glu Asp Asp Ser Ala Lys Lys Lys Val Thr Ile Phe Phe 100 105 110 Gly Thr Gln Thr Gly Thr Ala Glu Gly Phe Ala Lys Ala Leu Ala Glu 115 120 125 Glu Ala Lys Ala Arg Tyr Glu Lys Ala Val Phe Lys Val Val Asp Leu 130 135 140 Asp Asn Tyr Ala Ala Asp Asp Glu Gln Tyr Glu Glu Lys Leu Lys Lys145 150 155 160Glu Lys Leu Ala Phe Phe Met Leu Ala Thr Tyr Gly Asp Gly Glu Pro 165 170 175 Thr Asp Asn Ala Ala Arg Phe Tyr Lys Trp Phe Leu Glu Gly Lys Glu 180 185 190 Arg Glu Pro Trp Leu Ser Asp Leu Thr Tyr Gly Val Phe Gly Leu Gly 195 200 205 Asn Arg Gln Tyr Glu His Phe Asn Lys Val Ala Lys Ala Val Asp Glu 210 215 220 Val Leu Ile Glu Gln Gly Ala Lys Arg Leu Val Pro Val Gly Leu Gly225 230 235 240Asp Asp Asp Gln Cys Ile Glu Asp Asp Phe Thr Ala Trp Arg Glu Gln 245 250 255 Val Trp Pro Glu Leu Asp Gln Leu Leu Arg Asp Glu Asp Asp Glu Pro 260 265 270 Thr Ser Ala Thr Pro Tyr Thr Ala Ala Ile Pro Glu Tyr Arg Val Glu 275 280 285 Ile Tyr Asp Ser Val Val Ser Val Tyr Glu Glu Thr His Ala Leu Lys 290 295 300 Gln Asn Gly Gln Ala Val Tyr Asp Ile His His Pro Cys Arg Ser Asn305 310 315 320Val Ala Val Arg Arg Glu Leu His Thr Pro Leu Ser Asp Arg Ser Cys 325 330 335 Ile His Leu Glu Phe Asp Ile Ser Asp Thr Gly Leu Ile Tyr Glu Thr 340 345 350 Gly Asp His Val Gly Val His Thr Glu Asn Ser Ile Glu Thr Val Glu 355 360 365 Glu Ala Ala Lys Leu Leu Gly Tyr Gln Leu Asp Thr Ile Phe Ser Val 370 375 380 His Gly Asp Lys Glu Asp Gly Thr Pro Leu Gly Gly Ser Ser Leu Pro385 390 395 400Pro Pro Phe Pro Gly Pro Cys Thr Leu Arg Thr Ala Leu Ala Arg Tyr 405 410 415 Ala Asp Leu Leu Asn Pro Pro Arg Lys Ala Ala Phe Leu Ala Leu Ala 420 425 430 Ala His Ala Ser Asp Pro Ala Glu Ala Glu Arg Leu Lys Phe Leu Ser 435 440 445 Ser Pro Ala Gly Lys Asp Glu Tyr Ser Gln Trp Val Thr Ala Ser Gln 450 455 460 Arg Ser Leu Leu Glu Ile Met Ala Glu Phe Pro Ser Ala Lys Pro Pro465 470 475 480Leu Gly Val Phe Phe Ala Ala Ile Ala Pro Arg Leu Gln Pro Arg Tyr 485 490 495 Tyr Ser Ile Ser Ser Ser Pro Arg Phe Ala Pro Ser Arg Ile His Val 500 505 510 Thr Cys Ala Leu Val Tyr Gly Pro Ser Pro Thr Gly Arg Ile His Lys 515 520 525 Gly Val Cys Ser Asn Trp Met Lys Asn Ser Leu Pro Ser Glu Glu Thr 530 535 540His Asp Cys Ser Trp Ala Pro Val Phe Val Arg Gln Ser Asn Phe Lys545 550 555 560
Leu Pro Ala Asp Ser Thr Thr Pro Ile Val Met Val Gly Pro Gly Thr
565 570 575
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580 585 590
Glu Ala Gly Glu Lys Leu Gly Pro Ala Val Leu Phe Phe Gly Cys Arg
595 600 605
Asn Arg Gln Met Asp Tyr Ile Tyr Glu Asp Glu Leu Lys Gly Tyr Val
610 615 620
Glu Lys Gly Ile Leu Thr Asn Leu Ile Val Ala Phe Ser Arg Glu Gly625 630 635 640
Ala Thr Lys Glu Tyr Val Gln His Lys Met Leu Glu Lys Ala Ser Asp
645 650 655
Thr Trp Ser Leu Ile Ala Gln Gly Gly Tyr Leu Tyr Val Cys Gly Asp
660 665 670
Ala Lys Gly Met Ala Arg Asp Val His Arg Thr Leu His Thr Ile Val
675 680 685
Gln Glu Gln Glu Ser Val Asp Ser Ser Lys Ala Glu Phe Leu Val Lys
690 695 700
Lys Leu Gln Met Asp Gly Arg Tyr Leu Arg Asp Ile Trp705 710 715
<210> 37<211> 680<212> PRT
<213> Candida tropicalis
<400> 37
Met Ala Leu Asp Lys Leu Asp Leu Tyr Val Ile Ile Thr Leu Val Val1 5 10 15 Ala Ile Ala Ala Tyr Phe Ala Lys Asn Gln Phe Leu Asp Gln Gln Gln 20 25 30 Asp Thr Gly Phe Leu Asn Thr Asp Ser Gly Asp Gly Asn Ser Arg Asp 35 40 45 Ile Leu Gln Ala Leu Lys Lys Asn Asn Lys Asn Thr Leu Leu Leu Phe 50 55 60 Gly Ser Gln Thr Gly Thr Ala Glu Asp Tyr Ala Asn Lys Leu Ser Arg65 70 75 80Glu Leu His Ser Arg Phe Gly Leu Lys Thr Met Val Ala Asp Phe Ala 85 90 95 Asp Tyr Asp Phe Glu Asn Phe Gly Asp Ile Thr Glu Asp Ile Leu Val 100 105 110 Phe Phe Ile Val Ala Thr Tyr Gly Glu Gly Glu Pro Thr Asp Asn Ala 115 120 125 Asp Glu Phe His Thr Trp Leu Thr Glu Glu Ala Asp Thr Leu Ser Thr 130 135 140 Leu Lys Tyr Thr Val Phe Gly Leu Gly Asn Ser Thr Tyr Glu Phe Phe145 150 155 160Asn Ala Ile Gly Arg Lys Phe Asp Arg Leu Leu Gly Glu Lys Gly Gly 165 170 175 Asp Arg Phe Ala Glu Tyr Gly Glu Gly Asp Asp Gly Thr Gly Thr Leu 180 185 190 Asp Glu Asp Phe Leu Ala Trp Lys Asp Asn Val Phe Asp Ser Leu Lys 195 200 205 Asn Asp Leu Asn Phe Glu Glu Lys Glu Leu Lys Tyr Glu Pro Asn Val 210 215 220 Lys Leu Thr Glu Arg Asp Asp Leu Ser Gly Asn Asp Pro Asp Val Ser225 230 235 240Leu Gly Glu Pro Asn Val Lys Tyr Ile Lys Ser Glu Gly Val Asp Leu 245 250 255 Thr Lys Gly Pro Phe Asp His Thr His Pro Phe Leu Ala Arg Ile Val 260 265 270 Lys Thr Lys Glu Leu Phe Thr Ser Glu Asp Arg His Cys Val His Val 275 280 285 Glu Phe Asp Ile Ser Glu Ser Asn Leu Lys Tyr Thr Thr Gly Asp His290 295 300
Leu Ala Ile Trp Pro Ser Asn Ser Asp Glu Asn Ile Lys Gln Phe Ala305 310 315 320
Lys Cys Phe Gly Leu Glu Asp Lys Leu Asp Thr Val Ile Glu Leu Lys
325 330 335
Ala Leu Asp Ser Thr Tyr Ser Ile Pro Phe Pro Asn Pro Ile Thr Tyr
340 345 350
Gly Ala Val Ile Arg His His Leu Glu Ile Ser Gly Pro Val Ser Arg
355 360 365
Gln Phe Phe Leu Ser Ile Ala Gly Phe Ala Pro Asp Glu Glu Thr Lys
370 375 380
Lys Ser Phe Thr Arg Ile Gly Gly Asp Lys Gln Glu Phe Ala Ser Lys385 390 395 400
Val Thr Arg Arg Lys Phe Asn Ile Ala Asp Ala Leu Leu Phe Ala Ser
405 410 415
Asn Asn Arg Pro Trp Ser Asp Val Pro Phe Glu Phe Leu Ile Glu Asn
420 425 430
Val Gln His Leu Thr Pro Arg Tyr Tyr Ser Ile Ser Ser Ser Ser Leu
435 440 445
Ser Glu Lys Gln Thr Ile Asn Val Thr Ala Val Val Glu Ala Glu Glu
450 455 460
Glu Ala Asp Gly Arg Pro Val Thr Gly Val Val Thr Asn Leu Leu Lys465 470 475 480
Asn Ile Glu Ile Glu Gln Asn Lys Thr Gly Glu Thr Pro Met Val His
485 490 495
Tyr Asp Leu Asn Gly Pro Arg Gly Lys Phe Ser Lys Phe Arg Leu Pro
500 505 510
Val His Val Arg Arg Ser Asn Phe Lys Leu Pro Lys Asn Ser Thr Thr
515 520 525
Pro Val Ile Leu Ile Gly Pro Gly Thr Gly Val Ala Pro Leu Arg Gly
530 535 540
Phe Val Arg Glu Arg Val Gln Gln Val Lys Asn Gly Val Asn Val Gly545 550 555 560
Lys Thr Val Leu Phe Tyr Gly Cys Arg Asn Ser Glu Gln Asp Phe Leu
565 570 575
Tyr Lys Gln Glu Trp Ser Glu Tyr Ala Ser Val Leu Gly Glu Asn Phe
580 585 590
Glu Met Phe Asn Ala Phe Ser Arg Gln Asp Pro Thr Lys Lys Val Tyr
595 600 605
Val Gln Asp Lys Ile Leu Glu Asn Ser Ala Leu Val Asp Glu Leu Leu
610 615 620
Ser Ser Gly Ala Ile Ile Tyr Val Cys Gly Asp Ala Ser Arg Met Ala625 630 635 640
Arg Asp Val Gln Ala Ala Ile Ala Lys Ile Val Ala Lys Ser Arg Asp
645 650 655
Ile His Glu Asp Lys Ala Ala Glu Leu Val Lys Ser Trp Lys Val Gln
660 665 670
Asn Arg Tyr Gln Glu Asp Val Trp675 680
<210> 38<211> 692<212> PRT
<213> Arabidopsis thaliana<400> 38
Met Thr Ser Ala Leu Tyr Ala Ser Asp Leu Phe Lys Gln Leu Lys Ser
15 10 15
Ile Met Gly Thr Asp Ser Leu Ser Asp Asp Val Val Leu Val Ile Ala
20 25 30
Thr Thr Ser Leu Ala Leu Val Ala Gly Phe Val Val Leu Leu Trp Lys
35 40 45
Lys Thr Thr Ala Asp Arg Ser Gly Glu Leu Lys Pro Leu Met Ile Pro
50 55 60
Lys Ser Leu Met Ala Lys Asp Glu Asp Asp Asp Leu Asp Leu Gly Ser65 70 75 80Gly Lys Thr Arg Val Ser Ile Phe Phe Gly Thr Gln Thr Gly Thr Ala 85 90 95 Glu Gly Phe Ala Lys Ala Leu Ser Glu Glu Ile Lys Ala Arg Tyr Glu 100 105 110 Lys Ala Ala Val Lys Val Ile Asp Leu Asp Asp Tyr Ala Ala Asp Asp 115 120 125 Asp Gln Tyr Glu Glu Lys Leu Lys Lys Glu Thr Leu Ala Phe Phe Cys 130 135 140 Val Ala Thr Tyr Gly Asp Gly Glu Pro Thr Asp Asn Ala Ala Arg Phe145 150 155 160Ser Lys Trp Phe Thr Glu Glu Asn Glu Arg Asp Ile Lys Leu Gln Gln 165 170 175 Leu Ala Tyr Gly Val Phe Ala Leu Gly Asn Arg Gln Tyr Glu His Phe 180 185 190 Asn Lys Ile Gly Ile Val Leu Asp Glu Glu Leu Cys Lys Lys Gly Ala 195 200 205 Lys Arg Leu Ile Glu Val Gly Leu Gly Asp Asp Asp Gln Ser Ile Glu 210 215 220 Asp Asp Phe Asn Ala Trp Lys Glu Ser Leu Trp Ser Glu Leu Asp Lys225 230 235 240Leu Leu Lys Asp Glu Asp Asp Lys Ser Val Ala Thr Pro Tyr Thr Ala 245 250 255 Val Ile Pro Glu Tyr Arg Val Val Thr His Asp Pro Arg Phe Thr Thr 260 2 65 270 Gln Lys Ser Met Glu Ser Asn Val Ala Asn Gly Asn Thr Thr Ile Asp 275 280 285 Ile His His Pro Cys Arg Val Asp Val Ala Val Gln Lys Glu Leu His 290 295 300 Thr His Glu Ser Asp Arg Ser Cys Ile His Leu Glu Phe Asp Ile Ser305 310 315 320Arg Thr Gly Ile Thr Tyr Glu Thr Gly Asp His Val Gly Val Tyr Ala 325 330 335 Glu Asn His Val Glu Ile Val Glu Glu Ala Gly Lys Leu Leu Gly His 340 345 350 Ser Leu Asp Leu Val Phe Ser Ile His Ala Asp Lys Glu Asp Gly Ser 355 360 365 Pro Leu Glu Ser Ala Val Pro Pro Pro Phe Pro Gly Pro Cys Thr Leu 370 375 380 Gly Thr Gly Leu Ala Arg Tyr Ala Asp Leu Leu Asn Pro Pro Arg Lys385 390 395 400Ser Ala Leu Val Ala Leu Ala Ala Tyr Ala Thr Glu Pro Ser Glu Ala 405 410 415 Glu Lys Leu Lys His Leu Thr Ser Pro Asp Gly Lys Asp Glu Tyr Ser 420 425 430 Gln Trp Ile Val Ala Ser Gln Arg Ser Leu Leu Glu Val Met Ala Ala 435 440 445 Phe Pro Ser Ala Lys Pro Pro Leu Gly Val Phe Phe Ala Ala Ile Ala 450 455 460 Pro Arg Leu Gln Pro Arg Tyr Tyr Ser Ile Ser Ser Cys Gln Asp Trp465 470 475 480Ala Pro Ser Arg Val His Val Thr Ser Ala Leu Val Tyr Gly Pro Thr 485 490 495 Pro Thr Gly Arg Ile His Lys Gly Val Cys Ser Thr Trp Met Lys Asn 500 505 510 Ala Val Pro Ala Glu Lys Ser His Glu Cys Ser Gly Ala Pro Ile Phe 515 520 525 Ile Arg Ala Ser Asn Phe Lys Leu Pro Ser Asn Pro Ser Thr Pro Ile 530 535 540 Val Met Val Gly Pro Gly Thr Gly Leu Ala Pro Phe Arg Gly Phe Leu545 550 555 560Gln Glu Arg Met Ala Leu Lys Glu Asp Gly Glu Glu Leu Gly Ser Ser 565 570 575 Leu Leu Phe Phe Gly Cys Arg Asn Arg Gln Met Asp Phe Ile Tyr Glu 580 585 590 Asp Glu Leu Asn Asn Phe Val Asp Gln Gly Val Ile Ser Glu Leu Ile 595 600 605 Met Ala Phe Ser Arg Glu Gly Ala Gln Lys Glu Tyr Val Gln His Lys610 615 620
Met Met Glu Lys Ala Ala Gln Val Trp Asp Leu Ile Lys Glu Glu Gly625 630 635 640
Tyr Leu Tyr Val Cys Gly Asp Ala Lys Gly Met Ala Arg Asp Val His
645 650 655
Arg Thr Leu His Thr Ile Val Gln Glu Gln Glu Gly Val Ser Ser Ser
660 665 670
Glu Ala Glu Ala Ile Val Lys Lys Leu Gln Thr Glu Gly Arg Tyr Leu
675 680 685
Arg Asp Val Trp690
<210> 39<211> 712<212> PRT
<213> Arabidopsis thaliana<400> 39
Met Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Thr Ser Met Ile Asp Leu Met Ala
1 5 10 15
Ala Ile Ile Lys Gly Glu Pro Val Ile Val Ser Asp Pro Ala Asn Ala
20 25 30
Ser Ala Tyr Glu Ser Val Ala Ala Glu Leu Ser Ser Met Leu Ile Glu
35 40 45
Asn Arg Gln Phe Ala Met Ile Val Thr Thr Ser Ile Ala Val Leu Ile
50 55 60
Gly Cys Ile Val Met Leu Val Trp Arg Arg Ser Gly Ser Gly Asn Ser65 70 75 80
Lys Arg Val Glu Pro Leu Lys Pro Leu Val Ile Lys Pro Arg Glu Glu
85 90 95
Glu Ile Asp Asp Gly Arg Lys Lys Val Thr Ile Phe Phe Gly Thr Gln
100 105 110
Thr Gly Thr Ala Glu Gly Phe Ala Lys Ala Leu Gly Glu Glu Ala Lys
115 120 125
Ala Arg Tyr Glu Lys Thr Arg Phe Lys Ile Val Asp Leu Asp Asp Tyr
130 135 140
Ala Ala Asp Asp Asp Glu Tyr Glu Glu Lys Leu Lys Lys Glu Asp Val145 150 155 160
Ala Phe Phe Phe Leu Ala Thr Tyr Gly Asp Gly Glu Pro Thr Asp Asn
165 170 175
Ala Ala Arg Phe Tyr Lys Trp Phe Thr Glu Gly Asn Asp Arg Gly Glu
180 185 190
Trp Leu Lys Asn Leu Lys Tyr Gly Val Phe Gly Leu Gly Asn Arg Gln
195 200 205
Tyr Glu His Phe Asn Lys Val Ala Lys Val Val Asp Asp Ile Leu Val
210 215 220
Glu Gln Gly Ala Gln Arg Leu Val Gln Val Gly Leu Gly Asp Asp Asp225 230 235 240
Gln Cys Ile Glu Asp Asp Phe Thr Ala Trp Arg Glu Ala Leu Trp Pro
245 250 255
Glu Leu Asp Thr Ile Leu Arg Glu Glu Gly Asp Thr Ala Val Ala Thr
260 265 270
Pro Tyr Thr Ala Ala Val Leu Glu Tyr Arg Val Ser Ile His Asp Ser
275 280 285
Glu Asp Ala Lys Phe Asn Asp Ile Thr Leu Ala Asn Gly Asn Gly Tyr
290 295 300
Thr Val Phe Asp Ala Gln His Pro Tyr Lys Ala Asn Val Ala Val Lys305 310 315 320
Arg Glu Leu His Thr Pro Glu Ser Asp Arg Ser Cys Ile His Leu Glu
325 330 335
Phe Asp Ile Ala Gly Ser Gly Leu Thr Met Lys Leu Gly Asp His Val
340 345 350
Gly Val Leu Cys Asp Asn Leu Ser Glu Thr Val Asp Glu Ala Leu Arg
355 360 365
Leu Leu Asp Met Ser Pro Asp Thr Tyr Phe Ser Leu His Ala Glu Lys370 375 380Glu Asp Gly Thr Pro Ile Ser Ser Ser Leu Pro Pro Pro Phe Pro Pro385 390 395 400
Cys Asn Leu Arg Thr Ala Leu Thr Arg Tyr Ala Cys Leu Leu Ser Ser
405 410 415
Pro Lys Lys Ser Ala Leu Val Ala Leu Ala Ala His Ala Ser Asp Pro
420 425 430
Thr Glu Ala Glu Arg Leu Lys His Leu Ala Ser Pro Ala Gly Lys Asp
435 440 445
Glu Tyr Ser Lys Trp Val Val Glu Ser Gln Arg Ser Leu Leu Glu Val
450 455 460
Met Ala Glu Phe Pro Ser Ala Lys Pro Pro Leu Gly Val Phe Phe Ala465 470 475 480
Gly Val Ala Pro Arg Leu Gln Pro Arg Phe Tyr Ser Ile Ser Ser Ser
485 490 495
Pro Lys Ile Ala Glu Thr Arg Ile His Val Thr Cys Ala Leu Val Tyr
500 505 510
Glu Lys Met Pro Thr Gly Arg Ile His Lys Gly Val Cys Ser Thr Trp
515 520 525
Met Lys Asn Ala Val Pro Tyr Glu Lys Ser Glu Lys Leu Phe Leu Gly
530 535 540
Arg Pro Ile Phe Val Arg Gln Ser Asn Phe Lys Leu Pro Ser Asp Ser545 550 555 560
Lys Val Pro Ile Ile Met Ile Gly Pro Gly Thr Gly Leu Ala Pro Phe
565 570 575
Arg Gly Phe Leu Gln Glu Arg Leu Ala Leu Val Glu Ser Gly Val Glu
580 585 590
Leu Gly Pro Ser Val Leu Phe Phe Gly Cys Arg Asn Arg Arg Met Asp
595 600 605
Phe Ile Tyr Glu Glu Glu Leu Gln Arg Phe Val Glu Ser Gly Ala Leu
610 615 620
Ala Glu Leu Ser Val Ala Phe Ser Arg Glu Gly Pro Thr Lys Glu Tyr625 630 635 640
Val Gln His Lys Met Met Asp Lys Ala Ser Asp Ile Trp Asn Met Ile
645 650 655
Ser Gln Gly Ala Tyr Leu Tyr Val Cys Gly Asp Ala Lys Gly Met Ala
660 665 670
Arg Asp Val His Arg Ser Leu His Thr Ile Ala Gln Glu Gln Gly Ser
675 680 685
Met Asp Ser Thr Lys Ala Glu Gly Phe Val Lys Asn Leu Gln Thr Ser
690 695 700
Gly Arg Tyr Leu Arg Asp Val Trp705 710
<210> 40<211> 667<212> PRT
<213> Arabidopsis thaliana<400> 40
Met Leu Ile Glu Asn Arg Gln Phe Ala Met Ile Val Thr Thr Ser Ile
1 5 10 15
Ala Val Leu Ile Gly Cys Ile Val Met Leu Val Trp Arg Arg Ser Gly
20 25 30
Ser Gly Asn Ser Lys Arg Val Glu Pro Leu Lys Pro Leu Val Ile Lys
35 40 45
Pro Arg Glu Glu Glu Ile Asp Asp Gly Arg Lys Lys Val Thr Ile Phe
50 55 60
Phe Gly Thr Gln Thr Gly Thr Ala Glu Gly Phe Ala Lys Ala Leu Gly65 70 75 80
Glu Glu Ala Lys Ala Arg Tyr Glu Lys Thr Arg Phe Lys Ile Val Asp
85 90 95
Leu Asp Asp Tyr Ala Ala Asp Asp Asp Glu Tyr Glu Glu Lys Leu Lys
100 105 110
Lys Glu Asp Val Ala Phe Phe Phe Leu Ala Thr Tyr Gly Asp Gly Glu
115 120 125
Pro Thr Asp Asn Ala Ala Arg Phe Tyr Lys Trp Phe Thr Glu Gly Asn130 135 140 Asp Arg Gly Glu Trp Leu Lys Asn Leu Lys Tyr Gly Val Phe Gly Leu 145 150 155 160Gly Asn Arg Gln Tyr Glu His Phe Asn Lys Val Ala Lys Val Val Asp 165 170 175 Asp Ile Leu Val Glu Gln Gly Ala Gln Arg Leu Val Gln Val Gly Leu 180 185 190 Gly Asp Asp Asp Gln Cys Ile Glu Asp Asp Phe Thr Ala Trp Arg Glu 195 200 205 Ala Leu Trp Pro Glu Leu Asp Thr Ile Leu Arg Glu Glu Gly Asp Thr 210 215 220 Ala Val Ala Thr Pro Tyr Thr Ala Ala Val Leu Glu Tyr Arg Val Ser225 230 235 240Ile His Asp Ser Glu Asp Ala Lys Phe Asn Asp Ile Asn Met Ala Asn 245 250 255 Gly Asn Gly Tyr Thr Val Phe Asp Ala Gln His Pro Tyr Lys Ala Asn 260 265 270 Val Ala Val Lys Arg Glu Leu His Thr Pro Glu Ser Asp Arg Ser Cys 275 280 285 Ile His Leu Glu Phe Asp Ile Ala Gly Ser Gly Leu Thr Tyr Glu Thr 290 295 300 Gly Asp His Val Gly Val Leu Cys Asp Asn Leu Ser Glu Thr Val Asp305 310 315 320Glu Ala Leu Arg Leu Leu Asp Met Ser Pro Asp Thr Tyr Phe Ser Leu 325 330 335 His Ala Glu Lys Glu Asp Gly Thr Pro Ile Ser Ser Ser Leu Pro Pro 340 345 350 Pro Phe Pro Pro Cys Asn Leu Arg Thr Ala Leu Thr Arg Tyr Ala Cys 355 360 365 Leu Leu Ser Ser Pro Lys Lys Ser Ala Leu Val Ala Leu Ala Ala His 370 375 380 Ala Ser Asp Pro Thr Glu Ala Glu Arg Leu Lys His Leu Ala Ser Pro385 390 395 400Ala Gly Lys Asp Glu Tyr Ser Lys Trp Val Val Glu Ser Gln Arg Ser 405 410 415 Leu Leu Glu Val Met Ala Glu Phe Pro Ser Ala Lys Pro Pro Leu Gly 420 425 430 Val Phe Phe Ala Gly Val Ala Pro Arg Leu Gln Pro Arg Phe Tyr Ser 435 440 445 Ile Ser Ser Ser Pro Lys Ile Ala Glu Thr Arg Ile His Val Thr Cys 450 455 460 Ala Leu Val Tyr Glu Lys Met Pro Thr Gly Arg Ile His Lys Gly Val 465 470 475 480Cys Ser Thr Trp Met Lys Asn Ala Val Pro Tyr Glu Lys Ser Glu Asn 485 490 495 Cys Ser Ser Ala Pro Ile Phe Val Arg Gln Ser Asn Phe Lys Leu Pro 500 505 510 Ser Asp Ser Lys Val Pro Ile Ile Met Ile Gly Pro Gly Thr Gly Leu 515 520 525 Ala Pro Phe Arg Gly Phe Leu Gln Glu Arg Leu Ala Leu Val Glu Ser 530 535 540 Gly Val Glu Leu Gly Pro Ser Val Leu Phe Phe Gly Cys Arg Asn Arg545 550 555 560Arg Met Asp Phe Ile Tyr Glu Glu Glu Leu Gln Arg Phe Val Glu Ser 565 570 575 Gly Ala Leu Ala Glu Leu Ser Val Ala Phe Ser Arg Glu Gly Pro Thr 580 585 590 Lys Glu Tyr Val Gln His Lys Met Met Asp Lys Ala Ser Asp Ile Trp 595 600 605 Asn Met Ile Ser Gln Gly Ala Tyr Leu Tyr Val Cys Gly Asp Ala Lys 610 615 620 Gly Met Ala Arg Asp Val His Arg Ser Leu His Thr Ile Ala Gln Glu625 630 635 640Gln Gly Ser Met Asp Ser Thr Lys Ala Glu Gly Phe Val Lys Asn Leu 645 650 655 Gln Thr Ser Gly Arg Tyr Leu Arg Asp Val Trp 660 665<210> 41<211> 560<212> PRT
<213> Eschscholzia stolonifera
<400> 41
Met Glu Lys Pro Ile Leu Leu Gln Leu Gln Ala Gly Ile Leu Gly Leu1 5 10 15 Leu Ala Leu Ile Cys Phe Leu Tyr Tyr Val Ile Lys Val Ser Leu Ser 20 25 30 Thr Arg Asn Cys Asn Gln Leu Val Lys His Pro Pro Glu Ala Ala Gly 35 40 45 Ser Trp Pro Ile Val Gly His Leu Pro Gln Leu Val Gly Ser Gly Lys 50 55 60 Pro Leu Phe Arg Val Leu Gly Asp Met Ala Asp Lys Phe Gly Pro Ile65 70 75 80Phe Met Val Arg Phe Gly Val Tyr Pro Thr Leu Val Val Ser Thr Trp 85 90 95 Glu Met Ala Lys Glu Cys Phe Thr Ser Asn Asp Lys Phe Leu Ala Ser 100 105 110 Arg Pro Pro Ser Ala Ala Ser Ser Tyr Met Thr Tyr Asp His Ala Met 115 120 125 Phe Gly Phe Ser Phe Tyr Gly Pro Tyr Trp Arg Glu Ile Arg Lys Ile 130 135 140 Ser Thr Leu His Leu Leu Ser His Arg Arg Leu Glu Leu Leu Lys His145 150 155 160Val Pro His Thr Glu Ile His Asn Phe Ile Lys Gly Leu Phe Gly Ile 165 170 175 Trp Lys Asp His Gln Lys Gln Gln Gln Pro Thr Gly Arg Glu Asp Arg 180 185 190 Asp Ser Val Met Leu Glu Met Ser Gln Leu Phe Gly Tyr Leu Thr Leu 195 200 205 Asn Val Val Leu Ser Leu Val Val Gly Lys Arg Val Cys Asn Tyr His 210 215 220 Ala Asp Gly His Leu Asp Asp Gly Glu Glu Ala Gly Gln Gly Gln Lys225 230 235 240Leu HiS Gln Thr Ile Thr Asp Phe Phe Lys Leu Ser Gly Val Ser Val 245 250 255 Ala Ser Asp Ala Leu Pro Leu Leu Gly Leu Phe Asp Leu Gly Gly Lys 260 265 270 Lys Glu Ser Met Lys Arg Val Ala Lys Glu Met Asp Phe Phe Ala Glu 275 280 285 Arg Trp Leu Gln Asp Lys Lys Leu Ser Leu Ser Leu Ser Ser Glu Thr 290 295 300 Asn Asn Lys Gln Asn Asp Ala Gly Glu Gly Asp Gly Asp Asp Phe Met305 310 315 320Asp Val Leu Met Ser Ile Leu Pro Asp Asp Asp Asp Ser Leu Phe Thr 325 330 335 Lys Tyr Ser Arg Asp Thr Val Ile Lys Ala Thr Ser Leu Ser Met Val 340 345 350 Val Ala Ala Ser Asp Thr Thr Ser Val Ser Leu Thr Trp Ala Leu Ser 355 360 365 Leu Leu Leu Asn Asn Ile Gln Val Leu Arg Lys Ala Gln Asp Glu Leu 370 375 380 Asp Thr Lys Val Gly Arg Asp Arg His Val Glu Glu Lys Asp Ile Asp385 390 395 400Asn Leu Val Tyr Leu Gln Ala Ile Val Lys Glu Thr Leu Arg Met Tyr 405 410 415 Pro Ala Gly Pro Leu Ser Val Pro His Glu Ala Ile Glu Asp Cys Asn 420 425 430 Val Gly Gly Tyr His Ile Lys Thr Gly Thr Arg Leu Leu Val Asn Ile 435 440 445 Trp Lys Leu Gln Arg Asp Pro Arg Val Trp Ser Asn Pro Ser Glu Phe 450 455 460 Arg Pro Glu Arg Phe Leu Asp Asn Gln Ser Asn Gly Thr Leu Leu Asp465 470
Phe Arg Gly Gln His Phe Glu Tyr485
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530 535
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490 495
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Leu Pro Leu Pro Leu Tyr Asp Tyr555 560
<210> 42<211> 493<212> PRT
<213> Catharanthus roseus<400> 42
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1 5 10 15
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20 25 30
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35 40 45
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50 55 60
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100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
Leu Arg Thr Arg Lys Val Gln Glu Leu Ile Ala Tyr Cys Arg Lys Asn145 150 155 160
Ser Gln Ser Gly Glu Ala Val Asp Val Gly Arg Ala Ala Phe Arg Thr
165 170 175
Ser Leu Asn Leu Leu Ser Asn Leu Ile Phe Ser Lys Asp Leu Thr Asp
180 185 190
Pro Tyr Ser Asp Ser Ala Lys Glu Phe Lys Asp Leu Val Trp Asn Ile
195 200 205
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210 215 220
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275 280 285
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290 295 300
Thr Leu Glu Trp Ala Met Ser Glu Met Leu Lys Asn Pro Asp Lys Met305 310 315 320
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325 330 335
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340 345 350
Lys Glu Thr Leu Arg Ile His Pro Pro Val Pro Phe Leu Ile Pro Arg
355 360 365
Lys Val Glu Gln Ser Val Glu Val Cys Gly Tyr Asn Val Pro Lys Gly370 375 380Ser Gln Val Leu Val Asn Ala Trp Ala Ile Gly Arg Asp Glu Thr Val385 390 395 400Trp Asp Asp Ala Leu 405 Ala Phe Lys Pro Glu 410 Arg Phe Met Glu Ser 415 GluLeu Asp Ile Arg Gly Arg Asp Phe Glu Leu Ile Pro Phe Gly Ala Gly 420 425 430 Arg Arg Ile 435 Cys Pro Gly Leu Pro 440 Leu Ala Leu Arg Thr 445 Val Pro LeuMet Leu Gly Ser Leu Leu Asn Ser Phe Asn Trp Lys Leu Glu Gly Gly 450 455 460 Met Ala Pro Lys Asp Leu Asp Met Glu Glu Lys Phe Gly Ile Thr Leu465 470 475 480Gln Lys Ala His Pro 485 Leu Arg Ala Val Pro 490 Ser Thr Leu
<210> 43<211> 496<212> PRT
<213> Catharanthus roseus
<400> 43
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370 375 380
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405 410 415
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420 425 430
Gly Arg Arg Ile Cys Pro Gly Ile Thr Phe Ala Leu Ala Asn Ile Glu
435 440 445
Leu Pro Leu Ala Gln Leu Leu Phe His Phe Asp Trp Gln Ser Asn Thr
450 455 460
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<210> 44<211> 505<212> PRT
<213> Arabidopsis thaliana<400> 44
Met Asp Leu Leu Leu Leu Glu Lys Ser Leu Ile Ala Val Phe Val Ala
15 10 15
Val Ile Leu Ala Thr Val Ile Ser Lys Leu Arg Gly Lys Lys Leu Lys
20 25 30
Leu Pro Pro Gly Pro Ile Pro Ile Pro Ile Phe Gly Asn Trp Leu Gln
35 40 45
Val Gly Asp Asp Leu Asn His Arg Asn Leu Val Asp Tyr Ala Lys Lys
50 55 60
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85 90 95
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100 105 110
Lys Gly Gln Asp Met Val Phe Thr Val Tyr Gly Glu His Trp Arg Lys
115 120 125
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130 135 140
Gln Asn Arg Glu Gly Trp Glu Phe Glu Ala Ala Ser Val Val Glu Asp145 150 155 160
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165 170 175
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180 185 190
Arg Arg Phe Glu Ser Glu Asp Asp Pro Leu Phe Leu Arg Leu Lys Ala
195 200 205
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245 250 255
Phe Val Asp Glu Arg Lys Gln Ile Ala Ser Ser Lys Pro Thr Gly Ser
260 265 270
Glu Gly Leu Lys Cys Ala Ile Asp His Ile Leu Glu Ala Glu Gln Lys
275 280 285
Gly Glu Ile Asn Glu Asp Asn Val Leu Tyr Ile Val Glu Asn Ile Asn
290 295 300
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<210> 45<211> 512<212> PRT<213> Ocimum basilicum<400> 45
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Asp Ala Phe Ala Lys His Gly Ala Arg Arg Asp Gln Leu Thr Arg Glu245 250 255
Ile Met Glu Glu His Thr Arg Ala Arg Glu Glu Ser Gly Gly Ala Lys260 265 270
Gln His Phe Phe Asp Ala Leu Leu Thr Leu Lys Asp Lys Tyr Asp Leu275 280 285
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Lys Asn Pro Arg Val Gln Gln Lys Ala Gln Glu Glu Leu Asp Arg Val
325 330 335
Ile Gly Tyr Glu Arg Val Met Thr Glu Leu Asp Phe Ser Asn Leu Pro
340 345 350
Tyr Leu Gln Cys Val Ala Lys Glu Ala Leu Arg Leu His Pro Pro Thr
355 360 365
Pro Leu Met Leu Pro His Arg Ser Asn Ser Asn Val Lys Ile Gly Gly
370 375 380
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Ala Arg Asp Pro Ala Val Trp Lys Asn Pro Cys Glu Phe Arg Pro Glu
405 410 415
Arg Phe Leu Glu Glu Asp Val Asp Met Lys Gly His Asp Phe Arg Leu
420 425 430
Leu Pro Phe Gly Ala Gly Arg Arg Val Cys Pro Gly Ala Gln Leu Gly
435 440 445
Ile Asn Leu Val Thr Ser Met Ile Gly His Leu Leu His His Phe Asn
450 455 460
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<210> 46
<211> 521
<212> PRT
<213> Glycine max
<400> 46
Met Leu Leu Glu Leu Ala Leu Gly Leu Phe Val Leu Ala Leu Phe Leu
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His Leu Arg Pro Thr Pro Ser Ala Lys Ser Lys Ala Leu Arg His Leu
20 25 30
Pro Asn Pro Pro Ser Pro Lys Pro Arg Leu Pro Phe Ile Gly His Leu
35 40 45
His Leu Leu Lys Asp Lys Leu Leu His Tyr Ala Leu Ile Asp Leu Ser
50 55 60
Lys Lys His Gly Pro Leu Phe Ser Leu Ser Phe Gly Ser Met Pro Thr65 70 75 80
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100 105 HO
Leu Thr Tyr Asp Asn Ser Val Ala Met Val Pro Phe Gly Pro Tyr Trp
115 120 125
Lys Phe Val Arg Lys Leu Ile Met Asn Asp Leu Leu Asn Ala Thr Thr
130 135 140
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180 185 190
Gly Glu Ala Glu Glu Ile Arg Asp Ile Ala Arg Glu Val Leu Lys Ile
195 200 205
Phe Gly Glu Tyr Ser Leu Thr Asp Phe Ile Trp Pro Leu Lys Tyr Leu
210 215 220
Lys Val Gly Lys Tyr Glu Lys Arg Ile Asp Asp Ile Leu Asn Lys Phe225 230 235 240
Asp Pro Val Val Glu Arg Val Ile Lys Lys Arg Arg Glu Ile Val Arg245 250 255Arg Arg Lys Asn Gly Glu Val Val Glu Gly Glu Ala Ser Gly Val Phe 260 265 270 Leu Asp Thr Leu Leu Glu Phe Ala Glu Asp Glu Thr Met Glu Ile Lys 275 280 285 Ile Thr 290 Lys Glu Gln Ile Lys 295 Gly Leu Val Val Asp 300 Phe Phe Ser AlaGly Thr Asp Ser Thr Ala Val Ala Thr Glu Trp Ala Leu Ala Glu Leu305 310 315 320Ile Asn Asn Pro Arg 325 Val Leu Gln Lys Ala 330 Arg Glu Glu Val Tyr 335 SerVal Val Gly Lys 340 Asp Arg Leu Val Asp 345 Glu Val Asp Thr Gln 350 Asn LeuPro Tyr Ile 355 Arg Ala Ile Val Lys 360 Glu Thr Phe Arg Met 365 His Pro ProLeu Pro 370 Val Val Lys Arg Lys 375 Cys Thr Glu Glu Cys 380 Glu Ile Asn GlyTyr Val Ile Pro Glu Gly Ala Leu Val Leu Phe Asn Val Trp Gln Val385 390 395 400Gly Arg Asp Pro Lys 405 Tyr Trp Asp Arg Pro 410 Ser Glu Phe Arg Pro 415 GluArg Phe Leu Glu Thr Gly Ala Glu Gly Glu Ala Gly Pro Leu Asp Leu 420 425 430 Arg Gly Gln His Phe Gln Leu Leu Pro Phe Gly Ser Gly Arg Arg Met 435 440 445 Cys Pro Gly Val Asn Leu Ala Thr Ser Gly Met Ala Thr Leu Leu Ala 450 455 460 Ser Leu Ile Gln Cys Phe Asp Leu Gln Val Leu Gly Pro Gln Gly Gln465 470 475 480Ile Leu Lys Gly Asp 485 Asp Ala Lys Val Ser 490 Met Glu Glu Arg Ala 495 GlyLeu Thr Val Pro 500 Arg Ala His Ser Leu 505 Val Cys Val Pro Leu 510 Ala ArgIle Gly Val 515 Ala Ser Lys Leu Leu 520 Ser
<210> 47<211> 456<212> PRT
<213> Streptomyces avermitilis<400> 47
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Trp Lys Thr Glu Met Val Val Arg Gly Pro Arg Thr Met Leu Val Gly385 390 395 400
Trp
<210> 49<211> 1497<212> DNA
<213> Artemisia annua<400> 49
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caccgtggcg tacgcgacct ggcgcgtaag tacggctctc tgatgcatct gcagctgggc 240
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gacatcactt tcgccaaccg cccggaaacg ctgaccggcg aaattgtcct gtaccataac 360
acggatgtgg ttctggcccc gtacggtgag tactggcgcc agctgcgcaa aatttgtact 42 0
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tggaacctgg tgcaggagat taaagcgtct ggcagcggtc gtccagttaa cctgtctgag 540
aatgttttta aactgatcgc tactatcctg tctcgcgcgg cattcggtaa aggtatcaaa 600
gatcagaaag aactgaccga aatcgttaag gaaatcctgc gccagactgg tggcttcgac 660
gttgcggaca tcttcccgtc caaaaagttc ctgcaccatc tgtctggcaa acgcgctcgt 720
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gccggtaccg atacgtcctc ttccacgatt gagtgggcta tttccgaact gatcaaatgc 960
ccgaaggcga tggaaaaagt gcaggcggaa ctgcgtaaag cgctgaacgg taaagagaaa 1020
attcatgaag aggacatcca ggaactgtcc tacctgaata tggtaatcaa agaaactctg 1080
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gccggctaca acattccgaa caaaacgaag ctgatcgtca acgttttcgc gatcaaccgc 1200
gatcctgaat actggaaaga cgcggaagcg ttcattccgg aacgctttga gaactcctct 1260
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<220>
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ctgtctctga ccactagcat cgccctggcg 60acccgttcta aaagcactaa gaaatctctg 120cacatgcacc acctgatcgg caccaccccg 180tacggctctc tgatgcatct gcagctgggc 240aagtgggcca aagaaatcct gactacctat 300ctgaccggcg aaattgtcct gtaccataac 360tactggcgcc agctgcgcaa aatttgtact 420tccttccaga gcctgcgtga agaggaatgc 480ggcagcggtc gtccagttaa cctgtctgag 540tctcgcgcgg cattcggtaa aggtatcaaa 600gaaatcctgc gccagactgg tggcttcgac 660ctgcaccatc tgtctggcaa acgcgctcgt 720ctgattgaca acctggtcgc tgagcacact 780ctgctggacg tactgctgcg cctgaaggac 840atcaaagcaa tcatcctgga catgttcggc 900gagtgggcta tttccgaact gatcaaatgc 960ctgcgtaaag cgctgaacgg taaagagaaa 1020tacctgaata tggtaatcaa agaaactctg 1080ccgcgtgaat gccgtcagcc ggttaacctg 1140ctgatcgtca acgttttcgc gatcaaccgc 1200ttcattccgg aacgctttga gaactcctct 1260ctgccgttcg gtgcgggtcg ccgtatgtgc 1320caactgccac tggcgaacat cctgtaccac 1380tatgatcaaa tcgacatgac cgaaagctcc 1440ctgctggttc cgtcctttta acctagg 1497
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<213> Seqüência Artificial<220>
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<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Modified amorphadiene oxidase nucleic acid
<400> 53
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ctggcactga
aagaaatctc
ggcaccaccc
ctgcagctgg
ctgactacct
ctgtaccata
aaaatttgta
gaagaggaat
aacctgtctg
aaaggtatca
ggtggcttcg
aaacgcgctc
gctgagcaca
cgcctgaagg
gacatgttcg
ctgatcaaat
ggtaaagaga
aaagaaactc
ccggttaacc
gcgatcaacc
gagaactcct
cgccgtatgt
atcctgtacc
accgaaagct
taacctaggc
attgtgccgc
aaaagcacta
cacctgatcg
ctgatgcatc
aaagaaatcc
gaaattgtcc
cagctgcgca
agcctgcgtg
cgtccagtta
gcattcggta
cgccagactg
ctgtctggca
aacctggtcg
gtactgctgc
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atttccgaac
gcgctgaacg
atggtaatca
tgccgtcagc
aacgttttcg
gaacgctttg
ggtgcgggtc
ctggcgaaca
atcgacatga
ccgtcctttt
tacacgacatttgcgtatcgtgccggaacccgcaccgtgggcgaggtaccatgacatcacacacggatgtctctggaactgctggaacctagaatgttttaagatcagaaacgttgcggagtctgacctcctgtgaacacactctgccgagcgccggtacgcccgaaggcaaattcatgatgcgtctgcatggccggctagcgatcctgactgccaccgtgcccgggtgcacttcaactgccggcgcgacatatgaccgttggcactgatagaaatctctgcaccacccctgcagctgggtgactacctatgtaccataaaaatttgtacaagaggaatgacctgtctgaaaggtatcaagtggcttcgaaacgcgctcgctgagcacacgcctgaaggaacatgttcggtgatcaaatggtaaagagaaaagaaactctcggttaacctcgatcaaccgagaactcctcgccgtatgtgtcctgtaccaccgaaagctcaacctagg
catcgcaacgcgtgctggatgtggcgtctgcgtacgcgactactatcgtctttcgccaacggttctggccgctgagcgttggtgcaggagtaaactgatcagaactgacccatcttcccgcctgcgtaagctcttctaaaatttccactgcgatacgtccgatggaaaaaagaggacatctccgccgctgcaacattccgatactggaaatatgggcgcttgcactgggcgaaactgcctcatgcagcgtacacgacatctgcgtatcgcgccggaaccggcaccgtggccgaggtaccttgacatcactcacggatgtgtctggaactgctggaacctggaatgtttttagatcagaaacgttgcggactctgacctcctgtgaacaccctctgccgaacgccggtacccccgaaggcgaattcatgaagcgtctgcatggccggctaccgatcctgaatgccaccgttcccgggtgctcttcaactggcggcgcgacc
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aatggtacgtcgacccgttcgtcacatgcaagtacggctccgaagtgggccgctgaccggagtactggcgaatccttccactggcagcggtgtctcgcgcaggaaatccttcctgcaccaacctgattgaccctgctggaatatcaaagcttgagtgggcaactgcgtaacctacctgaatgccgcgtgaagctgatcgtcgttcattccacctgccgttttcaactgcccttatgatcatgctgctggtacttcactaaatttctacgccaatcatcggtggcgcgtaatttcctccccgcccggaaaccgtacggtgaaaaaggttaattaaagcgtcctactatcctaaatcgttaaccaaaaagttaaattgataaccaacgaaacctagcgacaacttccacgattgcaggcggaaggaactgtccactggttctacaaaacgaaacgcggaagcaatacgagtatggcgaacgtacggcgtatcaaaccgaact
aattgtgccgtaaaagcactccacctgatctctgatgcatcaaagaaatccgaaattgtcccagctgcgcgagcctgcgttcgtccagttggcattcggtgcgccagacttctgtctggccaacctggtccgtactgctgaatcatcctgtatttccgaaagcgctgaactatggtaatcatgccgtcagcaacgttttcggaacgctttcggtgcgggtactggcgaacaatcgacatgtccgtcctttatggtacgtagacccgttcttcacatgcacgtacggctctgaagtgggccgctgaccggcgtactggcgcatccttccagtggcagcggtgtctcgcgcgggaaatcctgcctgcaccatcctgattgaccctgctggactatcaaagcatgagtgggctactgcgtaaactacctgaatgccgcgtgaagctgatcgtcgttcattccgcctgccgttctcaactgccattatgatcaagctgctggtt
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<210> 54<211> 1500<212> DNA
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<223> Modified amorphadiene oxidase nucleic acid
<400> 54
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cgcaacgtacgctggattatgcgtctgccaacgcgacctgtatcgtcgttcgccaaccgctctggccccggagcgttaaagcaggagattactgatcgctactgaccgaacttcccgtccgcgtaagaaattctaaaacctccactgacttacgtcctctggaaaaagtgggacatccaggccgctgccacattccgaacctggaaagacgggcgctgaaactgggcctgactgcctaacgcagcgtaaa
ttcactaaatttctacgcgaatcatcggtcgcgcgtaagttcctccccgaccggaaacgctacggtgagtaaggttaaataaagcgtctgactatcctgtatcgttaaggaaaaagttccattgataaccaacgaaacccagcgacaatatccacgattgcaggcggaacgaactgtcctctggttctgcaaaacgaagcgcggaagcgttacgagtaccgcgaacgttcggcgtatcttaccgaactgc
ggtacgtaatcccgttctaaacatgcaccaacggctctctagtgggccaatgaccggcgaactggcgccaccttccagaggcagcggtcgctcgcgcggcaaatcctgcgtgcaccatcttgattgacaatgctggacgttcaaagcaatagtgggctattgcgtaaagcacctgaatatcgcgtgaatgtgatcgtcaatcattccggatgccgttcggaactgccactatgatcaaattgctggttcc
tgtgccgctgaagcactaagcctgatcggcgatgcatctgagaaatcctgaattgtcctggctgcgcaaacctgcgtgaatccagttaacattcggtaaaccagactggtgtctggcaàacctggtcgctactgctgcgccatcctggacttccgaactggctgaacggtggtaatcaaaccgtcagccgcgttttcgcgacgctttgagtgcgggtcgcggcgaacatccgacatgaccgtccttttaa
60
120
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360
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Met Thr Val His Asp Ile Ile Ala Thr Tyr Phe Thr Lys Trp Tyr Val
1 5 10 15
Ile Val Pro Leu Ala Leu Ile Ala Tyr Arg Val Leu Asp Tyr Phe Tyr
20 25 30
Ala Thr Arg Ser Lys Ser Thr Lys Lys Ser Leu Pro Glu Pro Trp Arg
35 40 45
Leu Pro Ile Ile Gly His Met His His Leu Ile Gly Thr Thr Pro His
50 55 60
Arg Gly Val Arg Asp Leu Ala Arg Lys Tyr Gly Ser Leu Met His Leu65 70 75 80
Gln Leu Gly Glu Val Pro Thr Ile Val Val Ser Ser Pro Lys Trp Ala
85 90 95
Lys Glu Ile Leu Thr Thr Tyr Asp Ile Thr Phe Ala Asn Arg Pro Glu
100 105 110
Thr Leu Thr Gly Glu Ile Val Leu Tyr His Asn Thr Asp Val Val Leu
115 120 125
Ala Pro Tyr Gly Glu Tyr Trp Arg Gln Leu Arg Lys Ile Cys Thr Leu
130 135 140
Glu Leu Leu Ser Val Lys Lys Val Lys Ser Phe Gln Ser Leu Arg Glu145 150 155 160
Glu Glu Cys Trp Asn Leu Val Gln Glu Ile Lys Ala Ser Gly Ser Gly
165 170 175
Arg Pro Val Asn Leu Ser Glu Asn Val Phe Lys Leu Ile Ala Thr Ile
180 185 190
Leu Ser Arg Ala Ala Phe Gly Lys Gly Ile Lys Asp Gln Lys Glu Leu
195 200 205
Thr Glu Ile Val Lys Glu Ile Leu Arg Gln Thr Gly Gly Phe Asp Val210 215 220 Ala Asp Ile Phe Pro Ser Lys Lys Phe Leu His His Leu Ser Gly Lys225 230 235 240Arg Ala Arg Leu Thr Ser Leu Arg Lys Lys Ile Asp Asn Leu Ile Asp 245 250 255 Asn Leu Val Ala Glu His Thr Val Asn Thr Ser Ser Lys Thr Asn Glu 260 265 270 Thr Leu Leu Asp Val Leu Leu Arg Leu Lys Asp Ser Ala Glu Phe Pro 275 280 285 Leu Thr Ser Asp Asn Ile Lys Ala Ile Ile Leu Asp Met Phe Gly Ala 290 295 300 Gly Thr Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ile Glu Trp Ala Ile Ser Glu Leu305 310 315 320Ile Lys Cys Pro Lys Ala Met Glu Lys Val Gln Ala Glu Leu Arg Lys 325 330 335 Ala Léu Asn Gly Lys Glu Lys Ile His Glu Glu Asp Ile Gln Glu Leu 340 345 350 Ser Tyr Leu Asn Met Val Ile Lys Glu Thr Leu Arg Leu His Pro Pro 355 360 365 Leu Pro Leu Val Leu Pro Arg Glu Cys Arg Gln Pro Val Asn Leu Ala 370 375 380 Gly Tyr Asn Ile Pro Asn Lys Thr Lys Leu Ile Val Asn Val Phe Ala385 390 395 400Ile Asn Arg Asp Pro Glu Tyr Trp Lys Asp Ala Glu Ala Phe Ile Pro 405 410 415 Glu Arg Phe Glu Asn Ser Ser Ala Thr Val Met Gly Ala Glu Tyr Glu 420 425 430 Tyr Leu Pro Phe Gly Ala Gly Arg Arg Met Cys Pro Gly Ala Ala Leu 435 440 445 Gly Leu Ala Asn Val Gln Leu Pro Leu Ala Asn Ile Leu Tyr His Phe 450 455 460 Asn Trp Lys Leu Pro Asn Gly Val Ser Tyr Asp Gln Ile Asp Met Thr465 470 475 480Glu Ser Ser Gly Ala Thr Met Gln Arg Lys Thr Glu Leu Leu Leu Val 485 490 495 Pro Ser Phe
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<210> 57<211> 1485<212> DNA
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<223> Modified amorphadiene oxidase nucleic acid<400> 57
atgatcgaac aactgctgga atactggtaccagctgctgg cgtacactaa agcgacccgtccgtggcgtc tgccaatcat cggtcacatgggcgtacgcg acctggcgcg taagtacggccctactatcg tcgtttcctc cccgaagtggactttcgcca accgcccgga aacgctgaccgtggttctgg ccccgtacgg tgagtactggctgctgagcg ttaaaaaggt taaatccttcctggtgcagg agattaaagc gtctggcagctttaaactga tcgctactat cctgtctcgcaaagaactga ccgaaatcgt taaggaaatcgacatcttcc cgtccaaaaa gttcctgcactccctgcgta agaaaattga taacctgattacctcttcta aaaccaacga aaccctgctggaatttccac tgactagcga caatatcaaaaccgatacgt cctcttccac gattgagtgggcgatggaaa aagtgcaggc ggaactgcgtgaagaggaca tccaggaact gtcctacctgcatccgccgc tgccactggt tctgccgcgttacaacattc cgaacaaaac gaagctgatcgaatactgga aagacgcgga agcgttcattgttatgggcg ctgaatacga gtacctgccggctgcactgg gcctggcgaa cgttcaactgtggaaactgc ctaacggcgt atcttatgataccatgcagc gtaaaaccga actgctgctg
gtggttgtgc ctgttctgta tattatcaaa 60tctaaaagca ctaagaaatc tctgccggaa 120caccacctga tcggcaccac cccgcaccgt 180tctctgatgc atctgcagct gggcgaggta 240gccaaagaaa tcctgactac ctatgacatc 300ggcgaaattg tcctgtacca taacacggat 360cgccagctgc gcaaaatttg tactctggaa 420cagagcctgc gtgaagagga atgctggaac 480ggtcgtccag ttaacctgtc tgagaatgtt 540gcggcattcg gtaaaggtat caaagatcag 600ctgcgccaga ctggtggctt cgacgttgcg 660catctgtctg gcaaacgcgc tcgtctgacc 720gacaacctgg tcgctgagca cactgtgaac 780gacgtactgc tgcgcctgaa ggactctgcc 840gcaatcatcc tggacatgtt cggcgccggt 900gctatttccg aactgatcaa atgcccgaag 960aaagcgctga acggtaaaga gaaaattcat 1020aatatggtaa tcaaagaaac tctgcgtctg 1080gaatgccgtc agccggttaa cctggccggc 1140gtcaacgttt tcgcgatcaa ccgcgatcct 1200ccggaacgct ttgagaactc ctctgccacc 1260ttcggtgcgg gtcgccgtat gtgcccgggt 1320ccactggcga acatcctgta ccacttcaac 1380caaatcgaca tgraccgaaag ctccggcgcg 1440gttccgtcct tttaa 1485<210> 58<211> 494<212> PRT
<213> Seqüência Artificial
<220>
<223> Modified amorphadiene oxidase <400> 58 Met Ile Glu Gln Leu Leu Glu Tyr Trp Tyr Val Val Val Pro Val Leu1 5 10 15 Tyr Ile Ile Lys Gln Leu Leu Ala Tyr Thr Lys Ala Thr Arg Ser Lys 20 25 30 Ser Thr Lys Lys Ser Leu Pro Glu Pro Trp Arg Leu Pro Ile Ile Gly 35 40 45 His Met His His Leu Ile Gly Thr Thr Pro His Arg Gly Val Arg Asp 50 55 60 Leu Ala Arg Lys Tyr Gly Ser Leu Met His Leu Gln Leu Gly Glu Val65 70 75 80Pro Thr Ile Val Val Ser Ser Pro Lys Trp Ala Lys Glu Ile Leu Thr 85 90 95 Thr Tyr Asp Ile Thr Phe Ala Asn Arg Pro Glu Thr Leu Thr Gly Glu 100 105 110 Ile Val Leu Tyr His Asn Thr Asp Val Val Leu Ala Pro Tyr Gly Glu 115 120 125 Tyr Trp Arg Gln Leu Arg Lys Ile Cys Thr Leu Glu Leu Leu Ser Val 130 135 140 Lys Lys Val Lys Ser Phe Gln Ser Leu Arg Glu Glu Glu Cys Trp Asn145 150 155 160Leu Val Gln Glu Ile Lys Ala Ser Gly Ser Gly Arg Pro Val Asn Leu 165 170 175 Ser Glu Asn Val Phe Lys Leu Ile Ala Thr Ile Leu Ser Arg Ala Ala 180 185 190 Phe Gly Lys Gly Ile Lys Asp Gln Lys Glu Leu Thr Glu Ile Val Lys 195 200 205 Glu Ile Leu Arg Gln Thr Gly Gly Phe Asp Val Ala Asp Ile Phe Pro 210 215 220 Ser Lys Lys Phe Leu His His Leu Ser Gly Lys Arg Ala Arg Leu Thr225 230 235 240Ser Leu Arg Lys Lys Ile Asp Asn Leu Ile Asp Asn Leu Val Ala Glu 245 250 255 His Thr Val Asn Thr Ser Ser Lys Thr Asn Glu Thr Leu Leu Asp Val 260 265 270 Leu Leu Arg Leu Lys Asp Ser Ala Glu Phe Pro Leu Thr Ser Asp Asn 275 280 285 Ile Lys Ala Ile Ile Leu Asp Met Phe Gly Ala Gly Thr Asp Thr Ser 290 295 300 Ser Ser Thr Ile Glu Trp Ala Ile Ser Glu Leu Ile Lys Cys Pro Lys305 310 315 320Ala Met Glu Lys Val Gln Ala Glu Leu Arg Lys Ala Leu Asn Gly Lys 325 330 335 Glu Lys Ile His Glu Glu Asp Ile Gln Glu Leu Ser Tyr Leu Asn Met 340 345 350 Val Ile Lys Glu Thr Leu Arg Leu His Pro Pro Leu Pro Leu Val Leu 355 360 365 Pro Arg Glu Cys Arg Gln Pro Val Asn Leu Ala Gly Tyr Asn Ile Pro 370 375 380 Asn Lys Thr Lys Leu Ile Val Asn Val Phe Ala Ile Asn Arg Asp Pro385 390 395 400Glu Tyr Trp Lys Asp Ala Glu Ala Phe Ile Pro Glu Arg Phe Glu Asn 405 410 415 Ser Ser Ala Thr Val Met Gly Ala Glu Tyr Glu Tyr Leu Pro Phe Gly 420 425 430 Ala Gly Arg Arg Met Cys Pro Gly Ala Ala Leu Gly Leu Ala Asn Val 435 440 445 Gln Leu Pro Leu Ala Asn Ile Leu Tyr His Phe Asn Trp Lys Leu Pro 450 455 460Asn Gly Val Ser Tyr Asp Gln Ile Asp Met Thr Glu Ser Ser Gly Ala465 470 475 480
Thr Met Gln Arg Lys Thr Glu Leu Leu Leu Val Pro Ser Phe485 490
<210> 59<211> 2946<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Modified amorphadiene oxidase nucleic acid<400> 59
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ggtatcaaag atcagaaaga actgaccgaa atcgttaagg aaatcctgcg ccagactggt 2100
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atggctctgc
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ggtcacatgc
aagtacggct
ccgaagtggg
acgctgaccg
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tgctggctgtctaaaagcacaccacctgatctctgatgcaccaaagaaatgcgaaattgtgccagctgcgagagcctgcggtcgtccagtcggcattcggtgcgccagacatctgtctggacaacctggtacgtactgctcaatcatcctctatttccgaaagcgctgaaatatggtaataatgccgtcatcaacgttttcggaacgctttcggtgcgggcactggcgaaaaatcgacatttccgtcctt
cttcctgggttaagaaatctcggcaccacctctgcagctgcctgactacccctgtaccatcaaaatttgttgaagaggaataacctgtcttaaaggtatctggtggcttccaaacgcgctcgctgagcacgcgcctgaagggacatgttcactgatcaaacggtaaagagcaaagaaactgccggttaaccgcgatcaactgagaactcctcgccgtatgcatcctgtacgaccgaaagcttaa
ctgtcctgccctgccggaacccgcaccgtgggcgaggtactatgacatcaaacacggatgactctggaactgctggaaccgagaatgtttaaagatcagagacgttgcggcgtctgacctactgtgaacagactctgccgggcgccggtatgcccgaaggaaaattcatgctgcgtctgcctggccggctcgcgatcctgtctgccaccgtgcccgggtgcacttcaacttccggcgcga
tgctgctgctcgtggcgtctgcgtacgcgactactatcgtctttcgccaatggttctggctgctgagcgttggtgcaggattaaactgataagaactgacacatcttcccccctgcgtaacctcttctaaaatttccactccgatacgtccgatggaaaaaagaggacatatccgccgctacaacattccaatactggaattatgggcgcctgcactgggggaaactgccccatgcagcg
gtccctgtgggccaatcatccctggcgcgtcgtttcctccccgcccggaacccgtacggttaaaaaggttgattaaagcgcgctactatccgaaatcgttgtccaaaaaggaaaattgataaccaacgaagactagcgacctcttccacgagtgcaggcgccaggaactggccactggttgaacaaaacgagacgcggaatgaatacgagcctggcgaactaacggcgtataaaaccgaa
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<223> Modified amorphadiene oxidase
<400> 61
Met Ala Leu Leu Leu Ala Val Phe Leu Gly Leu Ser Cys Leu Leu Leu
1 5 10 15
Leu Ser Leu Trp Ala Thr Arg Ser Lys Ser Thr Lys Lys Ser Leu Pro
20 25 30
Glu Pro Trp Arg Leu Pro Ile Ile Gly His Met His His Leu Ile Gly
35 40 45
Thr Thr Pro His Arg Gly Val Arg Asp Leu Ala Arg Lys Tyr Gly Ser
50 55 60
Leu Met His Leu Gln Leu Gly Glu Val Pro Thr Ile Val Val Ser Ser65 70 75 80
Pro Lys Trp Ala Lys Glu Ile Leu Thr Thr Tyr Asp Ile Thr Phe Ala
85 90 95
Asn Arg Pro Glu Thr Leu Thr Gly Glu Ile Val Leu Tyr His Asn Thr
100 105 110
Asp Val Val Leu Ala Pro Tyr Gly Glu Tyr Trp Arg Gln Leu Arg Lys
115 120 125
Ile Cys Thr Leu Glu Leu Leu Ser Val Lys Lys Val Lys Ser Phe Gln
130 135 140
Ser Leu Arg Glu Glu Glu Cys Trp Asn Leu Val Gln Glu Ile Lys Ala145 150 155 160
Ser Gly Ser Gly Arg Pro Val Asn Leu Ser Glu Asn Val Phe Lys Leu
165 170 175
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195 200 205
Gly Phe Asp Val Ala Asp Ile Phe Pro Ser Lys Lys Phe Leu His His
210 215 220
Leu Ser Gly Lys Arg Ala Arg Leu Thr Ser Leu Arg Lys Lys Ile Asp225 230 235 240
Asn Leu Ile Asp Asn Leu Val Ala Glu His Thr Val Asn Thr Ser Ser
245 250 255
Lys Thr Asn Glu Thr Leu Leu Asp Val Leu Leu Arg Leu Lys Asp Ser
260 265 270
Ala Glu Phe Pro Leu Thr Ser Asp Asn Ile Lys Ala Ile Ile Leu Asp
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Met Phe Gly Ala Gly Thr Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ile Glu Trp Ala
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Ile Ser Glu Leu Ile Lys Cys Pro Lys Ala Met Glu Lys Val Gln Ala305 310 315 320
Glu Leu Arg Lys Ala Leu Asn Gly Lys Glu Lys Ile His Glu Glu Asp
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Ile Gln Glu Leu Ser Tyr Leu Asn Met Val Ile Lys Glu Thr Leu Arg
340 345 350
Leu His Pro Pro Leu Pro Leu Val Leu Pro Arg Glu Cys Arg Gln Pro
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Val Asn Leu Ala Gly Tyr Asn Ile Pro Asn Lys Thr Lys Leu Ile Val
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Asn Val Phe Ala Ile Asn Arg Asp Pro Glu Tyr Trp Lys Asp Ala Glu385 390 395 400
Ala Phe Ile Pro Glu Arg Phe Glu Asn Ser Ser Ala Thr Val Met Gly
405 410 415
Ala Glu Tyr Glu Tyr Leu Pro Phe Gly Ala Gly Arg Arg Met Cys Pro
420 425 430
Gly Ala Ala Leu Gly Leu Ala Asn Val Gln Leu Pro Leu Ala Asn Ile
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Leu Tyr His Phe Asn Trp Lys Leu Pro Asn Gly Val Ser Tyr Asp Gln
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Ile Asp Met Thr Glu Ser Ser Gly Ala Thr Met Gln Arg Lys Thr Glu465 470 475 480
Leu Leu Leu Val Pro Ser Phe485
<210> 62<211> 10633<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Recombinant plasmid<400> 62
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agctttaatg cggtagttta tcacagttaa attgctaacg cagtcaggca ccgtgtatga 360
aatctaacaa tgcgctcatc gtcatcctcg gcaccgtcac cctggatgct gtaggcatag 42 0
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cgcgcaatta accctcacta aagggaacaa aagctgggta ccgggccccc 1920cctcgaggtc gacggtatcg ataagcttga tatcgaattc ctgcagtagg aggaattaac 1980catgtcatta ccgttcttaa cttctgcacc gggaaaggtt attatttttg gtgaacactc 2040tgctgtgtac aacaagcctg ccgtcgctgc tagtgtgtct gcgttgagaa cctacctgct 2100aataagcgag tcatctgcac cagatactat tgaattggac ttcccggaca ttagctttaa 2160tcataagtgg tccatcaatg atttcaatgc catcaccgag gatcaagtaa actcccaaaa 2220attggccaag gctcaacaag ccaccgatgg cttgtctcag gaactcgtta gtcttttgga 2280tccgttgtta gctcaactat ccgaatcctt ccactaccat gcagcgtttt gtttcctgta 2340tatgtttgtt tgcctatgcc cccatgccaa gaatattaag ttttctttaa agtctacttt 2400acccatcggt gctgggttgg gctcaagcgc ctctatttct gtatcactgg ccttagctat 2460ggcctacttg ggggggttaa taggatctaa tgacttggaa aagctgtcag aaaacgataa 2520gcatatagtg aatcaatggg ccttcatagg tgaaaagtgt attcacggta ccccttcagg 2580aatagataac gctgtggcca cttatggtaa tgccctgcta tttgaaaaag actcacataa 2640tggaacaata aacacaaaca attttaagtt cttagatgat ttcccagcca ttccaatgat 2700cctaacctat actagaattc 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ttccatgcca catgtttggacacttccaag cgtatcatca gttggtgccacgttgcatac acgtttgatg caggtccaaagtcgaaactc tttgcattta tctataaattatttactact gagcagcttg aggctttcaaacgtgaattg gatcttgagt tgcaaaaggattcaggccca caagaaacaa acgaatctttataactgcag cccgggagga ggattactatgcacagggag ttcccacggg tacgctggaattacatctcg cgttctccag ttggctgtttcgcgcactga gcaaaaaagc atggcctggccaactgggag aaagcaacga agacgcagtggaaattacgc ctcctgaatc tatctatcctggcattgtgg aaaatgaagt gtgtccggtaatcaatgatg atgaagtgat ggattatcaaattgatgcca cgccgtgggc gttcagtccggccagaaaac gattatctgc atttacccagagagcggccg ccaccgcgga ggaggaatgatgcgttaagc aggccaacca ggcgctgagcactcccgtgg tcgaaaccat gcagtatggcttcctggttt atgccaccgg tcatatgttcgctgccgccg ttgagtgtat ccacgcttacgatgatgacg atctgcgtcg cggtttgccagcgattctcg ctggcgacgc tttacaaacgatgccggaag tgtcggaccg cgacagaattggtattgccg gaatgtgcgg tggtcaggcacctctggacg cgcttgagcg tattcatcgtgttcgccttg gtgcattaag cgccggagataagtatgcag agagcatcgg ccttgccttcggagatactg caacgttggg aaaacgccagtaccctgcac ttctgggtct tgagcaagccgcccgtcagt cgctgaaaca actggctgaactagcggact acatcatcca gcgtaataaagtattacgcg cgctcactgg ccgtcgtttttacccaactt aatcgccttg cagcacatccggcccgcacc gatcgccctt cccaacagttagcgttaata ttttgttaaa attcgcgttacaataggccg actgcgatga gtggcagggctgcccttaaa cgcctggtgc tacgcctgaaattcgaaagc aaattcgacc cggtcgtcggtgtctattgc tggtttaccg gtttattgacaaatgcctga ggccagtttg ctcaggctctcatttattct gcctcccaga gcctgataaagcttccattc aggtcgaggt ggcccggctcacaaggtata gggcggcgag gcggctacagtgctgcgcaa cccaagtgct accggcgcggctcgccatcg tccagaaaac acggctcatcttcccattcc tccgtttcgg tcaaggctggctggctgggc ggctcctcgc cggggccggtcgggatgcgg cgcaggtcgc catgccccaacaccacggcg gcactgaaca ccgacaggcggcggtcattg accacgtagg ccgacacggtccagcgctcg gccaccaagt ccttgactgcgagcttggaa agtgtcttct ggctgaccacgaggtgatgc agcagcattg ccgccgtgggatgcgctttg cgttccgttt gcacccagtgttctctggac tgcgtggcca tgcttatctcccatgcgcaa tcagctgcaa cttttcggcatggcagtcaa ttacagattt tctttaacctatgagctgtt gcgtaccccc cttttttaagcctatatcta gttctttggt gcccaaagaa
tagaatagca agaaaggggt ctggttcagc 5160ctgggaaatg ggaaaagctg aagatggtca 5220ctctgactgg cctcagatga aagcttgtgt 5280gagttccact cagggtatgc aattgaccgt 5340tgaacatgtc gtaccaaaga gatttgaagt 5400cgccaccttt gcaaaggaaa caatgatgga 5460ctctttccct ccaatattct acatgaatga 5520caccattaat cagttttacg gagaaacaat 5580tgctgtgttg tactacttag ctgaaaatga 5640gtttggctct gttcctggat gggacaagaa 5700ccatcaattt gaatcatcta actttactgc 5760tgttgccaga gtgattttaa ctcaagtcgg 5820gattgacgca aagactggtc taccaaagga 5880atgcaaacgg aacacgtcat tttattgaat 5940aagtatgccg cacacacggc agacacccgc 6000aatgccaaag gacaattatt agttacccgc 6060gtgtggacta actcggtttg tgggcaccca 612 0atccgccgtt gccgttatga gcttggcgtg 6180gactttcgct accgcgccac cgatccgagt 6240tttgccgcac gcaccactag tgcgttacag 63 00tggtgtgatt tagcagatgt attacacggt 63 60tggatggtga tgcaggcgac aaatcgcgaa 6420cttaaataac ccgggggatc cactagttct 6480gtaatggact ttccgcagca actcgaagcc 6540cgttttatcg ccccactgcc ctttcagaac 6600gcattattag gtggtaagcg cctgcgacct 6660ggcgttagca caaacacgct ggacgcaccc 672 0tcattaattc atgatgattt accggcaatg 6780acctgccatg tgaagtttgg cgaagcaaac 6840ctggcgttct cgattttaag cgatgccgat 6900tcgatgattt ctgaactggc gagcgccagt 6960ttagatttag acgcggaagg caaacacgta 702 0cataaaaccg gcgcattgat tcgcgccgcc 7080aaaggacgtc gtgctctgcc ggtactcgac 7140caggttcagg atgacatcct ggatgtggtg 7200ggtgccgacc agcaacttgg taaaagtacc 72 60cggaagaaag cccgggatct gatcgacgat 7320cagtcactcg atacctcggc actggaagcg 7380taagagctcc aattcgccct atagtgagtc 7440acaacgtcgt gactgggaaa accctggcgt 7500ccctttcgcc agctggcgta atagcgaaga 7560gcgcagcctg aatggcgaat ggaaattgta 7620aatttttgtt aaatcagctc attttttaac 7680ggggcgtaat ttttttaagg cagttattgg 7740taagtgataa taagcggatg aatggcagaa 7800ttcagggcag ggtcgttaaa tagccgctta 7860taccggaagc agtgtgaccg tgtgcttctc 7920ccccgtggag gtaataattg acgatatgat 7980aacggtgaat ccgttagcga ggtgccgccg 8040catgcaccgc gacgcaacgc ggggaggcag 8100ccgatagtct ggaacagcgc acttacgggt 8160cagcgtgacc cgtgtcggcg gctccaacgg 8220gggcatcggc aggcgctgct gcccgcgccg 8280caggtctggt tccatgcccg gaatgccggg 8340cggtagttgc tgctcgcccg gatacagggt 8400cagcgattcg tcctggtcgt cgtgatcaac 8460caactggtcg cggggctggc cccacgccac 8520gccggggccg ttgagcttca cgacggagat 8580gtattggacc gtccgcaaag aacgtccgat 8640cacggcgttc tggtggccca tctgcgccac 8700tttcctcgca ataagcccgg cccacgcctc 8760accgggcttg ttcttggctt gaatgccgat 8820catgcggtag ggtgccgcac ggttgcggca 8880gcgcgacaac aattatgcgt tgcgtaaaag 8940acgcaatgag ctattgcggg gggtgccgca 9000ttgttgattt ttaagtcttt cgcatttcgc 9060gggcacccct gcggggttcc cccacgcctt 9120cggcgcggct ccccctccgg caaaaagtgg cccctccggg gcttgttgat cgactgcgcg 9180gccttcggcc ttgcccaagg tggcgctgcc cccttggaac ccccgcactc gccgccgtga 9240ggctcggggg gcaggcgggc gggcttcgcc ttcgactgcc cccactcgca taggcttggg 9300tcgttccagg cgcgtcaagg ccaagccgct gcgcggtcgc tgcgcgagcc ttgacccgcc 9360ttccacttgg tgtccaaccg gcaagcgaag cgcgcaggcc gcaggccgga ggcttttccc 942 0cagagaaaat taaaaaaatt gatggggcaa ggccgcaggc cgcgcagttg gagccggtgg 9480gtatgtggtc gaaggctggg tagccggtgg gcaatccctg tggtcaagct cgtgggcagg 9540cgcagcctgt ccatcagctt gtccagcagg gttgtccacg ggccgagcga agcgagccag 9600ccggtggccg ctcgcggcca tcgtccacat atccacgggc tggcaaggga gcgcagcgac 9660cgcgcagggc gaagcccgga gagcaagccc gtagggcgcc gcagccgccg taggcggtca 9720cgactttgcg aagcaaagtc tagtgagtat actcaagcat tgagtggccc gccggaggca 9780ccgccttgcg ctgcccccgt cgagccggtt ggacaccaaa agggaggggc aggcatggcg 9840gcatacgcga tcatgcgatg caagaagctg gcgaaaatgg gcaacgtggc ggccagtctc 9900aagcacgcct accgcgagcg cgagacgccc aacgctgacg ccagcaggac gccagagaac 9960gagcactggg cggccagcag caccgatgaa gcgatgggcc gactgcgcga gttgctgcca 10020gagaagcggc gcaaggacgc tgtgttggcg gtcgagtacg tcatgacggc cagcccggaa 10080tggtggaagt cggccagcca agaacagcag gcggcgttct tcgagaaggc gcacaagtgg 10140ctggcggaca agtacggggc ggatcgcatc gtgacggcca gcatccaccg tgacgaaacc 10200agcccgcaca tgaccgcgtt cgtggtgccg ctgacgcagg acggcaggct gtcggccaag 10260gagttcatcg gcaacaaagc gcagatgacc cgcgaccaga ccacgtttgc ggccgctgtg 10320gccgatctag ggctgcaacg gggcatcgag ggcagcaagg cacgtcacac gcgcattcag 103 80gcgttctacg aggccctgga gcggccacca gtgggccacg tcaccatcag cccgcaagcg 10440gtcgagccac gcgcctatgc accgcaggga ttggccgaaa agctgggaat ctcaaagcgc 10500gttgagacgc cggaagccgt ggccgaccgg ctgacaaaag cggttcggca ggggtatgag 10560cctgccctac aggccgccgc aggagcgcgt gagatgcgca agaaggccga teaagcccaa 1062 0gagacggccc gag 10633
<210> 63<211> 4263<212> DNA<213> Seqüência Artificial<220><223> Polinucleotideo recombinante<400> 63
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tacattcaca gcgtaaagcg gcagccgcaa ttgagtccgg tgcttttaca gccgaaatcg 660
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ctgcacagtt ccttgccgtt gggaaaaacc tgggctttga ttctgagaaa gtgaatgtca 1080
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caacaattac acaatacaaa cttgcaaatg actgaactaa aaaaacaaaa gaccgctgaa 1380
caaaaaacca gacctcaaaa tgtcggtatt aaaggtatcc aaatttacat cccaactcaa 1440
tgtgtcaacc aatctgagct agagaaattt gatggcgttt ctcaaggtaa atacacaatt 1500
ggtçtgggcc aaaccaacat gtcttttgtc aatgacagag aagatatcta ctcgatgtcc 1560
ctaactgttt tgtctaagtt gatcaagagt tacaacatcg acaccaacaa aattggtaga 1620
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4263

Claims (28)

1. Ácido nucléico compreendendo, na ordem de 5' a 3' e emligação operável, uma seqüência de nucleotídeo que codifica um domínioselecionado a partir de um domínio de transmembrana, um domínio de se-creção, um domínio de solubilização, e uma proteína de inserção de mem-brana, e uma seqüência de nucleotídeo que codifica uma enzima de cito-cromo P450, no qual referido domínio é heterólogo à enzima de citocromoP450.
2. Ácido nucléico, de acordo com a reivindicação 1, no qual odomínio de transmembrana é funcional em uma célula hospedeira procariótica.
3. Ácido nucléico, de acordo com a reivindicação 1, no qual aenzima de citocromo P450 que codifica seqüência de nucleotídeo é de có-don otimizado para expressão em uma célula hospedeira procariótica.
4. Ácido nucléico, de acordo com a reivindicação 1, no qual aenzima de citocromo P450 é uma enzima de modificação de precursor deisoprenóide que catalisa modificação de um precursor de isoprenóide.
5. Ácido nucléico, de acordo com a reivindicação 4, no qual amodificação é selecionada de oxidação, hidroxilação, e epoxidação.
6. Ácido nucléico, de acordo com a reivindicação 1, compreen-dendo adicionalmente uma seqüência de nucleotídeo que codifica um cito-cromo P450 reductase.
7. Vetor de expressão compreendendo o ácido nucléico de a-cordo com a reivindicação 1.
8. Célula hospedeira compreendendo o vetor de expressão deacordo com a reivindicação 7.
9. Célula hospedeira, de acordo com a reivindicação 8, no qualreferida célula hospedeira é uma que não produz normalmente isopentenilpirofosfato via uma trajetória de mevalonato.
10. Célula hospedeira, de acordo com a reivindicação 9, no qualreferida célula hospedeira é procariótica.
11. Célula hospedeira, de acordo com a reivindicação 8, no quala célula hospedeira compreende adicionalmente um ácido nucléico compre-endendo uma seqüência de nucleotídeo que codifica um terpeno sintase he-terólogo.
12. Célula hospedeira, de acordo com a reivindicação 8, no quala célula hospedeira compreende adicionalmente um ácido nucléico compre-endendo uma seqüência de nucleotídeo que codifica um citocromo P450red uctase.
13. Célula hospedeira, de acordo com a reivindicação 9, no qualreferida célula hospedeira é geneticamente modificada com um ou mais áci-dos nucléicos compreendendo seqüências de nucleotídeo que codificam du-as ou mais enzimas de trajetória de mevalonato.
14. Método de produção de um produto de trajetória biosintéticaem uma célula hospedeira, o método compreendendo:cultura de uma célula hospedeira geneticamente modificada emum meio adequado, no qual referida célula hospedeira é geneticamente mo-dificada com um ácido nucléico compreendendo uma seqüência de nucleotí-deo que codifica enzima de citocromo P450 operavelmente ligada a um do-mínio selecionado a partir de um domínio de transmembrana, um domínio desecreção, um domínio de solubilização, e uma proteína de inserção demembrana, para produzir uma enzima de citrocromo P450 modificada, enzi-maticamente ativa,no qual, na presença de um intermediário de trajetória biosintéti-ca, referida produção de referida enzima de citocromo P450 modificada re-sulta em modificação enzimática do intermediário de trajetória biosintética eprodução do produto de trajetória biosintética.
15. Método, de acordo com a reivindicação 14, no qual referidaenzima de citocromo P450 é uma enzima de modificação de precursor deisoprenóide e no qual, na presença de um composto de precursor de isopre-nóide, referida produção de referida enzima de modificação de precursor deisoprenóide resulta em modificação enzimática do precursor de isoprenóide,e produção do composto de isoprenóide.
16. Método, de acordo com a reivindicação 14, no qual referidacélula hospedeira é uma célula hospedeira eucariótica.
17. Método, de acordo com a reivindicação 16, no qual referidacélula hospedeira é um célula de levedura.
18. Método, de acordo com a reivindicação 16, no qual referidacélula hospedeira é uma célula de planta.
19. Método, de acordo com a reivindicação 14, no qual referidacélula hospedeira é uma célula procariótica.
20. Método, de acordo com a reivindicação 15, no qual referidacélula hospedeira é adicionalmente geneticamente modificada com um ácidonucléico compreendendo uma seqüência de nucleotídeo que codifica umterpeno sintase heterólogo, no qual referida cultura proporciona produção dereferido terpeno sintase, no qual referido terpeno sintase modifica um poli-prenil pirofosfato para gerar um substrato para referida enzima de modifica-ção de isoprenóide.
21. Método, de acordo com a reivindicação 20, no qual referidopoliprenil pirofosfato é selecionado de farnesil pirofosfato, geranil pirofosfato,and geranilgeranil pirofosfato.
22. Método, de acordo com a reivindicação 14, no qual referidacélula hospedeira é adicionalmente geneticamente modificada com um ácidonucléico compreendendo uma seqüência de nucleotídeo que codifica umcitocromo P450 reductase (CPR).
23. Método, de acordo com a reivindicação 15, no qual referidacélula hospedeira é uma que não sintetiza normalmente isopentenil pirofos-fato (IPP) via uma trajetória de mevalonato, e no qual a célula hospedeira égeneticamente modificada com um ou mais ácidos nucléicos compreenden-do as seqüências de nucleotídeo que codificam duas ou mais enzimas natrajetória de mevalonato, uma isomerase de IPP, uma preniltransferase, eum terpeno sintase, referida cultura proporcionando produção das enzimasde trajetória de mevalonato, no qual referida produção de referidas duas ou mais enzimas de trajetória de mevalonato, referida isomerase de IPP, referi-da preniltransferase, referido terpeno sintase, e referida enzima de modifica-ção de precursor de isoprenóide resulta na produção de um composto deisoprenóide.
24. Método, de acordo com a reivindicação 23, no qual referidasduas ou mais enzimas de trajetória de mevalonato compreendem mevalona-to kinase, fosfomevalonato kinase, e mevalonato pirofosfato decarboxilase, eno qual a célula hospedeira é cultivada na presença de mevalonato.
25. Método, de acordo com a reivindicação 23, no qual referidasduas ou mais enzimas de trajetória de mevalonato compreendem acetoace-til-CoA tiolase, hidroximetilglutaril-CoA sintase, hidroximetilglutaril-CoA reduc-tase, mevalonato kinase, fosfomevalonato kinase, e mevalonato pirofosfatodecarboxilase.
26. Método, de acordo com a reivindicação 14, no qual referidaenzima de citocromo P450 que codifica seqüência de nucleotídeo é opera-velmente ligada a um promotor indizível.
27. Método, de acordo com a reivindicação 15, no qual o com-posto de isoprenóide é produzido em uma quantidade de pelo menos cercade 10 mg por litro.
28. Método, de acordo com a reivindicação 14, compreendendoadicionalmente isolar o produto de trajetória biosintética.
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