BRPI0616923A2

BRPI0616923A2 - anticorpos monoclonais, seus usos e composição farmacêutica

Info

Publication number: BRPI0616923A2
Application number: BRPI0616923-6A
Authority: BR
Inventors: Andrew Korytko; Pamela Jean Mitchell; Linda O'bryan; Rong Wang; Bomie Han; Rosamund Carol Smith
Original assignee: Lilly Co Eli
Priority date: 2005-10-06
Filing date: 2006-10-05
Publication date: 2011-07-05
Also published as: KR101135220B1; KR20080045733A; AU2006302494A1; WO2007044411A3; US7635760B2; EP1951756B1; US7745583B2; AU2006302494B2; US20100087631A1; EP1951756A2; JP2009511480A; CN101277976A; JP5052517B2; WO2007044411A2; CN101277976B; NO20082073L; ES2533464T3; EA015589B1; EA200801027A1; IL189579A0

Abstract

ANTICORPOS MONOCLONAIS, SEUS USOS E COMPOSIçãO FARMACêUTICA. A presente invenção refere-se a um epítopo neutralizante é identificado nos aminoácidos 40 64 da forma madura de miostatina humana. Anticorpos que se ligam a esse epítopo com alta afinidade preferivelmente se ligam ao GDF-8 em relação ao GDF-1 1 e podem ser anticorpos quiméricos, humanizados ou completamente humanos, imunoconjugados dos anticorpos ou fragmentos de ligação a antígeno seus. Os anticorpos da invenção são úteis para aumentar a massa muscular, aumentar a densidade óssea ou para o tratamento de vários distúrbios em espécies de mamíferos e aves.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "ANTICOR-POS MONOCLONAIS, SEUS USOS E COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA".

CAMPO DA INVENÇÃO

A invenção está no campo da medicina, particularmente nocampo dos anticorpos monoclonais contra miostatina. Mais especificamente,a invenção se refere a anticorpos antimiostatina humanos ou humanizados,quiméricos de alta afinidade que preferivelmente se ligam à miostatina atra-vés da GDF-11 e ao uso de anticorpos para a terapia, profilaxia ou diagnosede vários distúrbios ou condições em espécies de mamíferos e aves.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Membros da superfamília de fatores de crescimento transfor-mantes beta (TGF-β) de proteínas estão envolvidos no desenvolvimentoembriônico e na homeostase de tecido adulto. Os membros da superfamíliade TGF-β compartilham uma estrutura comum incluindo uma seqüência desinal de peptídeo requerida para a secreção da proteína e um fragmento a-mino-terminal que é proteoliticamente clivado em cerca de 105 140 aminoá-cidos a partir do carbóxi-terminal da maior proteína precursora para produziruma proteína madura. A proteína madura é caracterizada por resíduos decisteína altamente conservados, enquanto que a forma ativa da proteínamadura é um homodímero ligado por dissulfeto da pro-proteína proteolitica-mente clivada (Gray, A., e Maston, A., Science, 247:1328, 1990).

Miostatina, também referida como fator de diferenciação decrescimento 8 (GDF-8), é um membro da superfamília TGF-β de proteínas.Miostatina compartilha similaridades estruturais com outros membros da fa-mília de TGF-β. Ela contém um amino-terminal hidrofóbico que age como umsinal secretório e um domínio RSRR conservado que é importante para oprocessamento proteolítico. A clivagem da proteína origina um peptídeo as-sociado com latência amino-terminal e um peptídeo de sinalização madurocarbóxi-terminal, o qual forma o homodímero biologicamente ativo. Miostati-na é expressa abundantemente em músculo esquelético adulto e em desen-volvimento e funciona como um regulador negativo do músculo esquelético.A superexpressão sistêmica da miostatina em camundongos adultos leva àperda muscular (Zimmers, et ai., Science, 296: 1486-1488, 2002), enquantoque ao contrário, um camundongo knock-out de miostatina é caracterizadopela hipertrofia e hiperplasia do músculo esquelético resultando em umamassa muscular duas ou três vezes maior do que os seus membros da ni-nhada do tipo selvagem e em um decréscimo no acúmulo de gordura (Mc-Pherron, et al. Nature, 387:83-90, 1997). Um ser humano com uma mutaçãoknock-out de miostatina foi reportada como estando associada com a hiper-trofia muscular grave (Scheulke, et al., New Eng. J. Med. 350:2682, 2004).

Existem atualmente tratamentos limitados disponíveis para a perda muscular ou para distúrbios ou condições as quais poderiam benefici-ar de um aumento na massa muscular e/ou na força muscular incluindo, porexemplo, distrofia muscular, fragilidade, atrofia por desuso e caquexia, assimcomo distúrbios os quais estejam associados com a perda muscular, porexemplo, doença renal, falência ou doença cardíaca e doença hepática. De- vido ao seu papel como regulador negativo do crescimento do músculo es-quelético, miostatina é um alvo desejável para a intervenção terapêutica ouprofilática para tais distúrbios ou condições ou para monitorar a progressãode tais distúrbios ou condições. Além de seu papel direto na regulação domúsculo esquelético, miostatina também pode estar envolvida em outrosprocessos fisiológicos incluindo a diferenciação de pré-adipócitos em adipó-citos (Kim et al. BBRC, 281:902-906, 2001) e, indiretamente, com a homeos-tase de glicose (McPherron, A e Lee S-J. JC1109: 595, 2002) e a inibição daformação óssea (Hamrick, M. MoL Cell Evoi Bioi 272 388-91, 2003; Ha-mrick et al. Calcif Tissue Int. 71:63, 2002). Dessa forma, antagonistas espe- cíficos para a miostatina, por exemplo, anticorpos específicos para miostati-na, também podem se mostrar úteis para tratar, prevenir ou monitorar distúr-bios ou condições tais como aquelas as quais se beneficiam do aumento dadensidade óssea (por exemplo, osteoporose), diabetes do tipo II, síndromemetabólica, obesidade e osteoartrite.

Miostatina é altamente conservada pelas espécies; a seqüênciade aminoácido da forma madura da miostatina em seres humanos, camun-dongos, ratos, galinhas, perus e vacas são 100% idênticas (vide figuras 2 e3). Existem mutações de miostatina de ocorrência natural em gado, as quaisforam ligadas a um fenótipo com duplo músculo (McPherron, et al. PNAS,94: 12457-61, 1997). Uma vez que a miostatina é altamente conservada naseqüência e ha função pelas espécies, não somente um anticorpo antimios-tatina proporciona uma forma promissora de aumentar a massa muscular, ouo tratamento ou prevenção de tais distúrbios ou condições listados acima emseres humanos, mas também em outros mamíferos incluindo, por exemplo,animais domésticos (por exemplo, caninos e felinos), animais de esporte(por exemplo, eqüinos), animais que são fonte de alimentos (por exemplo,bovinos, suínos e ovinos) e em espécies de aves (por exemplo, galinhas,perus, patos e outros pássaros de jogos e aves domésticas).

O fator de diferenciação de crescimento 11, também referidocomo GDF-11 ou BMP-11, é o membro da superfamília de TGF-β de proteí-nas que é o mais homólogo em relação à miostatina. A seqüência de amino-ácidos das formas maduras da miostatina humana e do GDF-11 são cercade 90% idênticas; entretanto, GDF-11 é expresso em uma faixa mais amplade tecidos do que o GDF-8 incluindo a polpa dentária, cérebro, coração, rime pulmão, assim como músculo e tecido adiposo (Nakashima, et al. Mech. ofDevelopment 80:185, 1999). Camundongos knock-out GDF-11 morrem em24 horas do nascimento com múltiplas anormalidades. Particularmente, oscamundongos exibem pares extras de costelas, não têm rins e apresentamdefeitos no estômago, baço e pâncreas (McPherron et al., Nature Genetics22:260, 1999; Esquela e Lee, Dev. Biol. 257:356, 2003; Harmon et al.,Devpt 131:6163, 2004). Foi recentemente descoberto que o GDF-11 huma-no governa as janelas temporais durante as quais os progenitores multipo-tentes retêm competência para produzir progenia neural distinta (Kim, J. etal. Science 308:1927-1930, 2005).

Existe uma necessidade terapêutica por inibir especificamenteuma atividade da miostatina enquanto não inibindo, ou inibindo minimamenteuma atividade de outras proteínas da superfamília da TGF-β, particularmenteda GDF-11, para minimizar a possibilidade de efeitos colaterais indesejáveisresultantes da ligação do antagonista da miostatina em outra proteína dasuperfamília TGF-β. Além disso, existe uma necessidade diagnostica paraum anticorpo antimiostatina que não reaja de forma cruzada, ou minimamen-te reaja de forma cruzada com outra proteína da superfamília TGF-β, particu-larmente GDF-11, para monitorar mais precisamente ou determinar os níveisde miostatina em uma amostra. Além disso, existe uma necessidade por an-ticorpos específicos para miostatina os quais se liguem especificamente epreferivelmente à miostatina com uma alta afinidade e, dessa forma, permi-tam a minimização de um nível de dosagem que os pacientes recebem, oque pode resultar nessa forma em uma dosagem menos freqüente com talanticorpo do que com um anticorpo que se ligue à miostatina com uma afini-dade menor (isto é, um Kd maior). Um anticorpo de anta afinidade também édesejável pelo fato de que ele pode permitir uma maior flexibilidade na via deadministração do anticorpo para um paciente, uma vez que ele seja menosdesejável para que um fármaco seja administrada intravenosamente do quesubcutaneamente, por exemplo. Também existe uma necessidade para anti-corpos específicos para miostatina com um valor de IC50 baixo ou, de outraforma, favorável em um ensaio de bioatividade de miostatina para gerar umanticorpo antimiostatina terapêutico com uma dose terapêutica minimamenteeficaz. Também é desejável promover anticorpos específicos para a miosta-tina onde uma resposta imune ao anticorpo evocada por um paciente rece-bendo o anticorpo seja reduzida até o mínimo. A presente invenção satisfazessas necessidades e proporciona vantagens relacionadas.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Anticorpos da invenção são anticorpos monoclonais antimiosta-tina quiméricos, humanizados ou completamente humanos, e suas porçõesde ligação ao antígeno, que antagonizam ou neutralizam pelo menos umaatividade biológica in vitro ou in vivo ou propriedade associada com miostati-na ou como uma porção sua.

Em uma modalidade, anticorpos da invenção que especifica-mente e/ou preferivelmente se ligam à miostatina são significativamente me-nos reativos com GDF-11 do que com miostatina, isto é, um anticorpo mo-noclonal da invenção se liga à miostatina pelo menos cerca de 2, 3, 5, 10,20, 22, 24 ou 25 vezes mais do que ele se liga ao GDF-11 conforme medidopor uma técnica na técnica, por exemplo, por ELISA de competição, ou porensaio de BIACORE ou KINEXA para demonstrar uma afinidade maior (istoé, um Kd mais baixo) do anticorpo em relação ao GDF-8 do que o GDF-11.Mais preferivelmente, os anticorpos da invenção, quando expressos comoFabs, não se ligam nos níveis de fundo do GDF-11 acima em qualquer en-saio de ligação disponível na técnica. Preferivelmente os anticorpos da in-venção se ligam especificamente à miostatina dentro do domínio com ampli-tude dos aminoácidos 40 - 64 [ANYCSGECEFVFLQKYPHTHLVHQA paraseres humanos], 43-57 [CSGECEFVFLQKYPH OU CSGESEFVFLQKYPHpara seres humanos] e/ou 45-59 [GECEFVFLQKYPHTH para seres huma-nos] de miostatina madura ou eles se ligam especificamente a um polipeptí-deo consistindo nos aminoácidos 40 - 64, 43 - 57 e/ou aos aminoácidos 45- 59 da miostatina madura.

Em uma modalidade, anticorpos da invenção têm uma IC5o me-nor do que ou igual a cerca de 25 nM, 20 nM, 16 nM, 14 nM, 10 nM, 9 nM, 6nM ou 5.2 nM em um ensaio de miostatina/SBE repórter in vitro (vide Exem-plo 6). Preferivelmente, tais anticorpos da invenção são adicionalmente ca-racterizados pelo fato de que eles são significativamente menos reativoscom o GDF-11 do que com o GDF-8, isto é, se ligam à miostatina pelo me-nos cerca de 2, 3, 5, 10, 20, 22, 24 ou 25 vezes mais do que se ligam aoGDF-11 conforme medido por uma técnica na técnica, por exemplo, por E-LISA de competição, ou por ensaio BIACORE ou KINEXA para demonstraruma afinidade superior (isto é, Kd inferior) do anticorpo em relação ao GDF-8em relação ao GDF-11, e mesmo mais preferivelmente eles se ligam à mios-tatina no domínio abrangendo os aminoácidos 40 - 64, 43 - 57 e/ou 45 - 59da miostatina madura, ou eles se ligam a um polipeptídeo consistindo nosaminoácidos 40 - 64, 43 - 57 e/ou 45 - 59 de miostatina madura.

Em uma modalidade, anticorpos da invenção são caracterizadospor uma forte afinidade de ligação (Kd) pela miostatina, isto é, menor do quecerca de 3 χ 10"8 M, 1 χ 10"8 M ou 1 χ 10'9 Μ, preferivelmente menor do quecerca de 9 χ 10"10 Μ, 8,7 χ 10"10 M ou, mais preferivelmente, menor do quecerca de 8 χ 10"11 Μ. Alternativamente, os anticorpos da invenção são carac-terizados por um Kd para a miostatina não maior do que cerca de 3 χ 10'8 M11 χ 10"8M, 1 χ 10'9 M ou 9 χ 10"10 M, mais preferivelmente não maior do quecerca de 8,7 χ "IO"10 Μ, e mais preferivelmente não maior do que cerca de 8 χ10"11 Μ. Preferivelmente, anticorpos da invenção caracterizados por umaforte afinidade de ligação conforme descritos acima também têm uma IC50menor do que 25 nM, 20 nM, 16 nM, 14 nM, 10 nM, 9 nM, 6 nM, ou 5,2 nMem um ensaio de miostatina/SBE repórter in vitro e/ou são significativamentemenos reativos com GDF-11 do que com GDF-8. Ainda mais preferivelmen-te, eles se ligam à miostatina no domínio abarcando os aminoácidos 40 64,43 57 e/ou 45 59 da miostatina madura e/ou se ligam a um polipeptídeo con-sistindo nos aminoácidos 40 64, 43 57 e/ou 45 59 da miostatina madura.

Em outra modalidade, um anticorpo monoclonal antimiostatinada invenção compreende um polipeptídeo da região variável de cadeia leve(LCVR) com uma seqüência de aminoácidos selecionada do grupo consis-tindo nas SEQ ID NOS: 5 12. Em outra modalidade, um anticorpo monoclo-nal antimiostatina da invenção compreende um polipeptídeo da região variá-vel de cadeia pesada (HCVR) com uma seqüência de aminoácidos selecio-nada a partir do grupo consistindo nas SEQ ID Nos: 13 26, 55 e 56. As se-qüências associadas com cada número de SEQ ID estão mostradas nas Fi-guras 5 9 aqui.

Em outra modalidade, um anticorpo monoclonal da invenção éum o qual pode competir pela ligação com a miostatina humana com um an-ticorpo competidor conforme demonstrado por um ensaio disponível na téc-nica (por exemplo, um ELISA de competição), em que o anticorpo de compe-tição compreende dois polipeptídeos com as seqüências selecionadas dogrupo consistindo em: (i) SEQ ID NOS: 5 e 15, (ii) SEQ ID NOS: 5 e 16, e (iii)SEQ ID NOS: 10 e 26. Preferivelmente, um anticorpo da invenção o qualcompete com o anticorpo competidor definido acima é adicionalmente carac-terizado pela ligação de forma preferencial ao GDF-8 em relação ao GDF-11; ainda mais preferivelmente eles se ligam à miostatina no domínio abran-gendo os aminoácidos 40 - 64, 43 - 57 e/ou 45 - 59 da miostatina madurae/ou eles se ligam a um polipeptídeo consistindo nos aminoácidos 40 - 64,43 - 57 e/ou 45 - 59 da miostatina madura. Preferivelmente1 um anticorpoda invenção o qual compete com o anticorpo competidor definido acima éadicionalmente caracterizado por ter um Kd para a miostatina que não émaior do que cerca de 3 χ 10"8M, 1 x10"8M, 1 Xio9Mougxio10MlSyx10'10 M ou 8 χ 10"11 M. Preferivelmente1 um anticorpo da invenção o qualcompete com o anticorpo competidor definido acima é adicionalmente carac-terizado por ter uma IÇ50 menor do que 25 nM, 20 nM, 16 nM, 14 nM, 10 nM,9 nM, 6 nM, ou 5,2 nM em um ensaio de miostatina/SBE repórter in vitro.

Em uma modalidade, um anticorpo antimiostatina da invençãotem uma região variável de cadeia pesada e leve, em que a região variávelda cadeia pesada compreende regiões de CDR com as seguintes seqüên-cias de aminoácidos: CDRH1 (SEQ ID NO: 59), CDRH2 (SEQ ID NO: 60) eCDRH3 (SEQ ID NO: 61); e/ou em que a região variável da cadeia levecompreende regiões CDR com as seguintes seqüências de aminoácidos:CDRL1 (SEQ ID NO: 57), CDRL2 (SEQ ID NO: 30) e CDRL3 (SEQ ID NO:58).

Um anticorpo monoclonal antimiostatina da invenção pode aindacompreender uma região constante de cadeia pesada selecionada do grupoconsistindo em IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM e IgD humana (ou subs-tancialmente de origem humana), preferivelmente IgGi ou IgG4. um anticor-po monoclonal antimiostatina da invenção pode ainda compreender umaregião constante de cadeia leve capa ou Iambda humana. Quando o anticor-po é para ser usado como um terapêutico em um humano, a região constan- te é preferivelmente substancialmente de origem humana. Quando o anti-corpo é para ser usado como um terapêutico em um animal não-humano, ouovo de um animal não-humano, a região constante preferivelmente originasubstancialmente do animal do qual o anticorpo é para ser usado como umterapêutico (vide, por exemplo, Clarkson, C. et al., Mol. Imm. 30:1195-1204, 1993; número de pedido americano 2002/01651350; e números de acessoGenbank X69797, U03778, X16701, X07174, AB016711).

Várias formas do anticorpo são aqui contempladas. Por exem-pio, um anticorpo monoclonal antimiostatina da invenção pode compreenderou consistir de um anticorpo intacto (isto é, de comprimento total, com umaregião Fc intacta), um anticorpo substancialmente intacto, uma porção deligação a antígeno sua (por exemplo, um Fab, Fab', F(ab')2) ou um fragmen-to Fv de cadeia individual. É entendido que todas as tais formas dos anticor-pos são aqui englobadas e através do termo anticorpo. Além disso, um anti-corpo da invenção pode ser marcado com um marcador detectável, imobili-zado em uma fase móvel e/ou conjugado com um composto heterólogo, porexemplo, uma enzima ou molécula de polietilenoglicol. Além disso, anticor-pos da invenção são contemplados como sendo monoclonais embora elespossam diferir quanto aos padrões de glicosilação.

Usos diagnósticos, terapêuticos e profiláticos para os anticorposmonoclonais da invenção são aqui contemplados. Em uma aplicação diag-nostica, a invenção proporciona um método para determinar a presença e/ouquantidade da proteína miostatina compreendendo a exposição de uma a-mostra teste suspeita de conter a proteína miostatina para um anticorpo an-timiostatina da invenção e para a determinação da ligação específica do an-ticorpo para a amostra. Um anticorpo antimiostatina da invenção pode serusado para determinar os níveis de miostatina nas amostras de teste pelacomparação dos valores da amostra de teste com uma curva padrão geradapela ligação do referido anticorpo com as amostras com quantidades conhe-cidas de miostatina usando qualquer método disponível na técnica, por e-xemplo, um ensaio elisa. A invenção ainda proporciona um kit compreen-dendo um anticorpo da invenção e, preferivelmente, instruções para o usodo anticorpo para detectar a proteína miostatina, por exemplo, em uma a-mostra de teste.

Em outra modalidade, a invenção proporciona uma composiçãofarmacêutica compreendendo um anticorpo antimiostatina da invenção. Acomposição farmacêutica da invenção pode compreender ainda um veículofarmaceuticamente aceitável. Na referida composição farmacêutica, o anti-corpo monoclonal antimiostatina da invenção é o ingrediente ativo. Preferi-velmente, a composição farmacêutica compreende uma população homogê-nea ou substancialmente homogênea de um anticorpo monoclonal antimios-tatina da invenção. A composição para uso terapêutico é estéril e pode serliofilizada, preferivelmente fornecida com um diluente apropriado.

A invenção proporciona um método de inibição de pelo menosuma atividade biológica de miostatina em um animal, preferivelmente umaespécie de mamífero ou de ave, preferivelmente um ser humano, necessita-do disso, compreendendo a administração de uma quantidade terapeutica-mente eficaz, ou uma quantidade profilaticamente eficaz, ou uma quantidadeneutralizante de miostatina ou inibitória de miostatina de um anticorpo mo-noclonal antimiostatina da invenção a referia espécie de mamífero ou ave. Ainvenção ainda proporciona um método de aumentar a massa muscular ou otratamento ou prevenção de uma doença ou distúrbio ou condição melhora-da pela neutralização ou antagonismo da bioatividade de miostatina quecompreenda a administração a um paciente (por exemplo, um ser humano)necessitado de tal tratamento ou prevenção de uma quantidade terapeuti-camente ou profilaticamente eficaz de um anticorpo monoclonal da invenção.

A invenção incorpora um anticorpo monoclonal antimiostatina dainvenção para uso na produção de um medicamento para a administração aum mamífero, preferivelmente um ser humano, para o tratamento de, porexemplo, fraqueza, caquexia, sarcopenia relacionada com a idade, perda oufraqueza muscular, miopatia, distrofia muscular, osteoporose, obesidade,DPOC, falência ou doença renal, falência ou doença hepática, falência oudoença cardíaca, síndrome metabólica e diabetes do tipo Il em um mamífe-ro, preferivelmente em um ser humano, necessitado disso pela administra-ção ao referido mamífero de uma quantidade terapeuticamente eficaz ouprofilaticamente eficaz de um anticorpo monoclonal antimiostatina da invenção.

A invenção incorpora um artigo de produção compreendendoum material de embalagem e um anticorpo da invenção contido no referidomaterial de embalagem e em que o material de embalagem compreende umencarte de embalagem o qual preferivelmente indica que o anticorpo especi-ficamente neutraliza ou antagoniza uma atividade de miostatina ou diminui onível de miostatina. Opcionalmente, o encarte da embalagem ainda indicaque o anticorpo preferivelmente neutraliza ou antagoniza uma atividade demiostatina em relação à atividade GDF-11 ou preferivelmente diminui o nívelde miostatina em relação à redução do nível de GDF-11 pela ligação prefe-rencial de miostatina em relação à ligação ao GDF-11.

A invenção ainda proporciona um ácido nucléico isolado quecodifica um anticorpo da invenção; um vetor (ou vetores) compreendendoaquele ácido nucléico, opcionalmente operativamente ligado às seqüênciasde controle reconhecidas por uma célula hospedeira transformada com ovetor; uma célula hospedeira compreendendo aquele vetor; um processopara a produção de um anticorpo da invenção compreendendo o cultivo dacélula hospedeira de forma que o ácido nucléico seja expresso e, opcional-mente, a recuperação do anticorpo do meio da célula hospedeira.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

figura 1 mostra a seqüência de aminoácidos da promiostatinahumana com a seqüência de sinal sublinhada e a porção da proteína no car-bóxi-terminal que compõe um monômero da forma madura de miostatina emletras em negrito.

figura 2 mostra a seqüência de aminoácidos da miostatina ma-dura humana monomérica. A miostatina humana ativa é um homodímerodesse polipeptídeo associado por ligações dissulfeto. O epítopo antigênicoda presente invenção está sublinhado. Essa seqüência é idêntica àquela damiostatina madura em camundongos, ratos, galinhas, perus, cachorros, ca-valos e porcos.

figura 3 mostra um alinhamento da seqüência de aminoácidosda miostatina madura de várias espécies de mamífero e aves.

figura 4 mostra o alinhamento da seqüência de aminoácidos daforma madura da miostatina humana e da GDF-11 humana com o epítopoantigênico da presente invenção sublinhado e os resíduos no epítopo anti-gênico que difere entre a miostatina e GDF-11 em impressão em negrito.

figura 5 mostra o alinhamento da seqüência de aminoácidos deHCVRs com uma estrutura VH2-70. Os domínios CDR estão em impressãoem negrito.

figura 6 mostra o alinhamento da seqüência de aminoácidos deHCVRs com uma estrutura VH4-39. Os domínios CDR estão em impressãoem negrito.

figuras 7 e 8 apresentam o alinhamento da seqüência de ami-noácidos de LCVRs com uma estrutura 02. Os domínios CDR estão em im-pressão em negrito.

figura 9 mostra a seqüência de aminoácidos de CDRs do LCVRe do HCVR de vários anticorpos da invenção.

figura 10 mostra a seqüência de aminoácidos de LCVR de vá-rios anticorpos antimiostatina de murino, qualquer um dos quais pode seruma molécula parente exemplar para anticorpos da invenção. Vide os pedi-dos de patentes americanas 60/559.621 e 60/555.456 aqui incorporados.

figura 11 mostra a seqüência de aminoácidos do HCVR de vá-rios anticorpos antimiostatina de murino, qualquer um dos quais pode seruma molécula de origem exemplar para anticorpos da invenção. Vide os pe-didos de patente americanas 60/559.621 e 60/555.456.DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

A invenção apresenta anticorpos monoclonais antimiostatinacapazes de se ligar especificamente à miostatina de mamíferos ou de aves(proproteína ou proteína madura ou uma porção sua; monomérica ou homo-dimérica), em que os anticorpos são adicionalmente caracterizados comosendo anticorpos quiméricos, humanizados ou completamente humanos ouporções de ligação a antígeno suas capazes de neutralizar ou antagonizarpelo menos uma atividade de miostatina in vitro e/ou in vivo·, preferivelmentedemonstrando uma IC50 menor do que cerca de 25 nM, 20 nM, 16 nM, 14nM, 10 nM, 9 nM, 6 nM, ou 5,2 nM em um ensaio de miostatina/SBE repórtere/ou demonstrando preferivelmente uma alta afinidade de ligação com a mi-ostatina. Os anticorpos da invenção são adicionalmente caracterizados pelofato de que eles se ligam à miostatina no domínio abrangendo os aminoáci-dos nos resíduos 40 64 da forma madura de miostatina (por exemplo, SEQID NO: 53) e são significativamente menos reativos com o homólogo maispróximo da miostatina, GDF-11.

DEFINIÇÕES

Quando aqui utilizado, o termo miostatina madura (vide SEQ IDNO: 2 para espécies de seres humanos, murinos, ratos, galinhas, perus, ca-ninos, eqüinos e suínos) se refere à forma monomérica ou homodimérica daproteína resultando depois da clivagem proteolítica em Arg 266 da forma daforma de proproteína de 375 aminoácidos de miostatina. Quando aqui utili-zado, o termo miostatina se refere à miostatina madura. Quando aqui utiliza-do, o termo promiostatina ou forma de proproteína de miostatina, quandousado em referência à proteína humana, se refere a uma proteína compre-endendo a seqüência mostrada na SEQ ID NO: 1, seja como um monômeroou homodímero.

Um anticorpo de comprimento total, conforme ele existe natu-ralmente, é uma molécula de imunoglobulina compreendida de quatro cadei-as de peptídeo, duas cadeias pesadas (H) (cerca de 50 70 KDa quando emcomprimento total) e duas cadeias leves (L) (cerca de 25 KDa quando emcomprimento total) interconectadas por ligações dissulfeto. A porção amino-terminal de cada cadeia inclui uma região variável de cerca de 100 110 oumais aminoácidos primariamente responsáveis pelo reconhecimento de an-tígeno. A porção carbóxi-terminal de cada cadeia define uma região constan-te primariamente responsável para a função efetora.

As cadeias leves são classificadas como kappa e Iambda e sãocaracterizadas por uma região constante particular conforme é conhecido natécnica. Cadeias pesadas são classificadas como gama, mu, alfa, delta ouépsilon, e definem o isotipo do anticorpo como IgG, IgM, IgA, IgD e I-gE,respectivamente e vários desses podem ser ainda divididos em subclas-ses (isotipos), por exemplo, IgGi, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2. Cada tipo decadeia pesada é caracterizado por uma região constante particular conheci-da na técnica. As estruturas de subunidade e as configurações tridimensio-nais das diferentes classes de anticorpos são bem-conhecidas na técnica.Cada cadeia pesada é compreendida de uma região variável de cadeia pe-sada N-terminal (aqui HCVR) e de uma região constante de cadeia pesada.A região constante de cadeia pesada é compreendida de três domínios(CH1, CH2 e CH3) para IgG1 IgD e IgA; e 4 domínios (CH1, CH2, CH3 eCH4) para IgM e IgE. Cada cadeia leve é compreendida de uma região vari-ável de cadeia leve (aqui LCVR) e uma região constante de cadeia leve, CL.

As regiões HCVR e LCVR podem ser ainda subdivididas em regiões de hi-pervariabilidade, nomeadas regiões determinantes de complementaridade(CDRs), interespaçadas com regiões que são mais conservadas, nomeadasregiões de estrutura (FR). Cada HCVR e LCVR é composto de três CDRs ede quatro FRs, arranjados do amino-terminal para o carbóxi-terminal na se- guinte ordem: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Aqui, as CDR3sda cadeia pesada são referidas como CDRH1, CDRH2 e CDRH3 e as 3CDRs da cadeia leve são referidas como CDRL1, CDRL2 e CDRL3. As C-DRs contêm a maioria dos resíduos os quais formam interações específicascom o antígeno. A atribuição dos aminoácidos a cada domínio está de acor-do com convenções bem-conhecidas [por exemplo, Kabat, Sequences ofProteins of Immunological Interest, National Institutes of Health, Béthesda,Md. (1991) ou com o esquema de numeração Chothia conforme descrito emAI-Lazikani et ai, J. Mol. Biol. 273:927-948, 1997, vide também o sítio dainternet http:www.rubic.rdg.ac.uk/~andrew/bioinf.org/abs. A capacidade fun-cional de um anticorpo de se ligar a um antígeno em particular é grandemen-te influenciada pelas seis CDRs.

O termo anticorpo, em referência a um anticorpo monoclonalantimiostatina da invenção (ou simplesmente, anticorpo monoclonal da in-venção), conforme aqui utilizado, se refere a um anticorpo monoclonal. Umanticorpo monoclonal conforme aqui utilizado, se refere a um anticorpo mo-noclonal. Um anticorpo monoclonal conforme aqui utilizado, se refere a umanticorpo quimérico, a um anticorpo humanizado ou a um anticorpo comple-tamente humano, a não ser que seja aqui indicado de outra forma. Preferi-velmente, um anticorpo monoclonal da invenção existe em' uma população30 homogênea ou substancialmente homogênea. Anticorpos monoclonais dainvenção podem ser produzidos usando, por exemplo, técnicas de hibridomabem-conhecidas na técnica, assim como tecnologias recombinantes, tecno-Iogias de exibição de fago, tecnologias sintéticas ou combinações de taistecnologias ou outras tecnologias prontamente conhecidas na técnica. Anti-corpo monoclonal se refere a um anticorpo que é derivado de uma única có-pia ou clone incluindo, por exemplo, qualquer clone de fago, eucariótico ouprocariótico, e não o método pelo qual ele é produzido. Um anticorpo mono-clonal pode ser um anticorpo intacto (compreendendo uma região Fc decomprimento completo ou total), um anticorpo substancialmente intacto ouuma porção ou fragmento de um anticorpo compreendendo uma porção deligação a antígeno, por exemplo, um fragmento Fab, um fragmento Fab' ouum fragmento F(ab')2 de um anticorpo quimérico, humanizado ou humano.

As regiões variáveis de cada par de cadeia leve/pesada formamos sítios de ligação a antígeno do anticorpo. Dessa forma, um anticorpo IgGintacto tem dois sítios de ligação. Exceto em anticorpos bifuncionais ou bies-pecíficos, os dois sítios de ligação são os mesmos. Conforme aqui utilizado,a porção de ligação a antígeno ou região de ligação a antígeno ou fragmentode ligação a antígeno se refere aqui intercambiavelmente àquela porção deuma molécula de anticorpo, na região variável, a qual contém os resíduos deaminoácidos que interagem com um antígeno e conferem no anticorpo a suaespecificidade e afinidade pelo antígeno. A porção de ligação a antígeno doanticorpo inclui os resíduos de aminoácidos da estrutura necessários paramanter a conformação própria dos resíduos de ligação a antígeno. Preferi-velmente, as CDRs da região de ligação a antígeno, ou a região de ligação aantígeno inteira dos anticorpos da invenção serão de origem de murino ousubstancialmente de origem de murino com certos resíduos de aminoácidosalterados para melhorar uma atividade particular (vide, por exemplo, figura9). Preferivelmente, as regiões de estrutura dos anticorpos da invenção sãode origem humana ou substancialmente de origem humana (pelo menos85%, 90%, 95%, 97% ou 99% de origem humana). Em outras modalidades,a região de ligação a antígeno, ou as CDRs da região de ligação a antígeno,podem ser derivadas de outras espécies não-humanas incluindo, mas semse limitar, a coelho, rato ou hâmster. Em outras modalidades, a região deligação a antígeno pode ser completamente de origem humana ou substan-cialmente de origem humana co certos resíduos de aminoácidos alteradospara melhorar uma atividade particular, por exemplo, afinidade ou especifici-dade (vide, por exemplo, as posições de aminoácidos da figura 9 as quaisestão em impressão em negrito e sublinhadas).

Além disso, um anticorpo monoclonal, conforme aqui utilizado,pode ser um fragmento Fv de cadeia individual que pode ser produzido pelajunção do DNA que codifica o LCVR e o HCVR com uma seqüência ligante.(Vide Pluckthun, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Ro-senburg e Moore eds., Springer-Verlag, Nova Iorque, pp 269-315, 1994). É entendido que independentemente de se os fragmentos ou porções são es-pecificados, o termo anticorpo conforme aqui utilizado inclui tais fragmentosou porções assim como formas de cadeia individual. Contanto que a proteí-na retenha a capacidade de se ligar especificamente ou preferivelmente aosseus alvos tencionados (isto é, epítopo ou antígeno), ela está incluída no termo anticorpo.

Uma população de anticorpos monoclonais se refere a uma po-pulação de anticorpos homogêneos ou substancialmente homogêneos (istoé, pelo menos cerca de 85%, 87%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%,mais preferivelmente pelo menos cerca de 97% ou 98% ou, mais preferivel- mente, pelo menos 99% dos anticorpos na população poderiam competir emum ensaio elisa para o mesmo antígeno ou epítopo). Anticorpos podem ounão ser glicosilados e ainda cair dentro dos limites da invenção. Anticorposmonoclonais podem ser homogêneos se eles tiverem uma seqüência de a-minoácidos idêntica embora eles possam diferir em uma modificação pós- traducional, por exemplo, padrão de glicosilação.

Um anticorpo antimiostatina variante se refere aqui a uma molé-cula a qual difere na seqüência de aminoácidos de uma seqüência de ami-noácidos de anticorpo antimiostatina de origem em virtude da adição, anula-ção e/ou substituição de um ou mais resíduo(s) de aminoácido(s) na se-qüência de anticorpo de origem. Na modalidade preferida, a variante com-preende uma ou mais substituição/substituições de aminoácido em uma oumais região/regiões CDR do anticorpo de origem. Por exemplo, a variantepode compreender pelo menos um (por exemplo, de cerca de um até cercade dez, e preferivelmente de cerca de dois até cerca de cinco substituiçõesem uma ou mais regiões CDR do anticorpo de origem. A identidade ou ho-mologia em relação à seqüência variante é definida aqui como a porcenta-gem de resíduos de aminoácidos na seqüência variante que são idênticoscom os resíduos de anticorpo de origem, depois do alinhamento das se-qüências e da introdução dos intervalos, se necessário, para alcançar a má-xima identidade porcentual de seqüência. Nenhuma das extensões, anula-ções ou inserções N-terminais, C-terminais ou internas na seqüência do an-ticorpo devem ser construídas como afetando a identidade ou homologia daseqüência. A variante retém a capacidade de se ligar à miostatina e, preferi-velmente, tem propriedades as quais são superiores àquelas do anticorpo deorigem. Por exemplo, a variante pode ter uma afinidade de ligação mais for-te, uma IC50 mais baixa em um ensaio SBE/repórter ou uma capacidadeaumentada para inibir a bioatividade da miostatina. O anticorpo variante deinteresse particular aqui é um o qual apresenta um aumento de pelo menoscerca de 2 vezes, 5 vezes, preferivelmente pelo menos cerca de 10 vezes, emais preferivelmente pelo menos cerca de 20, 30 ou 50 vezes na atividadebiológica em comparação com o anticorpo de origem.

O anticorpo de origem aqui é um o qual é codificado por umaseqüência de aminoácidos usada para a preparação da variante. O anticorpode origem pode ter uma estrutura de murino, mas preferivelmente tem umaregião de estrutura humana. O anticorpo de origem pode ser um anticorpode murino (vide, por exemplo, as Figuras 10 e 11 aqui), quimérico, humani-zado ou humano.

O termo se liga especificamente, conforme aqui utilizado, serefere à situação na qual um membro de um par de ligação específico nãose liga significativamente às moléculas diferentes de seu(s) parceiro(s) deligação específico(s) (isto é, reação cruzada de menos do que cerca de 35%,33%, 30%, 20% ou 10%) conforme medido por uma técnica na técnica, porexemplo, por ELISA de competição ou por medição do K0 com ensaio BIA-CORE ou KINEXA. O termo também é aplicável onde, por exemplo, um do-mínio de ligação a antígeno de um anticorpo da invenção é específico paraum epítopo particular que é executado por uma quantidade de antígenos, emcujo caso o anticorpo específico carregando o domínio de ligação a antígenoserá capaz de se ligar especificamente aos vários antígenos carregando oepítopo. Concordantemente, um anticorpo monoclonal da presente invençãoespecificamente se liga a um epítopo localizado nos aminoácidos 40 64, 4357 e/ou 45 59 da forma madura de miostatina.

O termo se liga preferivelmente, conforme aqui utilizado, se refe-re à situação na qual um anticorpo se liga a um antígeno específico pelomenos cerca de 2, 3, 5, 10, 20, 22, 24 ou 25 vezes maior do que ele se liga aum antígeno diferente conforme medido por uma técnica na técnica, por e-xemplo, por ELISA por competição ou pela medida de K0 com ensaio BIA-CORE ou KINEXA. Concordante mente, um anticorpo monoclonal da pre-sente invenção se liga preferivelmente ao GDF-8 em relação ao GDF-11.Semelhantemente, um anticorpo pode preferivelmente se ligar a um epítopoem um antígeno em relação a um epítopo diferente no mesmo antígeno.

O termo epítopo se refere àquela porção de uma molécula ca-paz de ser reconhecida por qualquer ligação por um anticorpo em uma oumais regiões de ligação a antígeno do anticorpo. Epítopos geralmente con-sistem em um agrupamento de moléculas de superfícies quimicamente ati-vas, tais como aminoácidos ou cadeias laterais de açúcares e têm caracte-rísticas estruturais tridimensionais específicas assim como as característicasde carga específicas. Por inibição de epítopo e/ou neutralização de epítopo étencionado por um epítopo, o qual quando no contexto da molécula intacta(nesse caso, miostatina) e quando ligado por anticorpo específico ao epíto-po, resulta na perda ou diminuição de uma atividade biológica da moléculaou organismo contendo a molécula, in vivo ou in vitro.

O termo epítopo, conforme aqui utilizado, se refere adicional-mente a uma porção de um polipeptídeo com atividade antigênica e/ou imu-nogênica em um animal, preferivelmente em um mamífero, por exemplo, emum camundongo ou humano. O termo epítopo antigênico, conforme aquiutilizado, é definido como uma porção de um polipeptídeo ao qual um anti-corpo pode se ligar especificamente conforme determinado por qualquer mé-todo bem-conhecido na técnica, por exemplo, por imunoensaios convencio-nais. Epítopos antigênicos não precisam necessariamente ser imunogênicos,mas podem ser imunogênicos. Um epítopo imunogênico, conforme aqui utili-zado, é definido como uma porção de um polipeptídeo que elicia uma res-posta de anticorpo em um animal, conforme determinado por qualquer mé-todo conhecido na técnica. Vide, por exemplo, Geysen et ai., Proc. Natl. A-cad. Sei. USA 81: 3998-4002 (1983)).

As frases propriedade biológica ou bioatividade, atividade ouatividade biológica, em referência a um anticorpo da presente invenção, sãousados intercambiavelmente aqui e incluem, mas não estão limitados, a afi-nidade e especificidade de epítopo/antígeno, capacidade de neutralizar ouantagonizar uma atividade da miostatina in vivo ou in vitro, IC5o em um en-saio repórter de miostatina/SBE ou outro ensaio de atividade in vitro, a esta-bilidade in vivo do anticorpo e das propriedades imunogênicos do anticorpo.

Outras propriedades biológicas identificáveis de um anticorpo incluem, porexemplo, reatividade cruzada (isto é, com homólogos não-humanos do pep-tídeo alvo, ou com outras proteínas ou tecidos, de um modo geral), e a ca-pacidade de preservar altos níveis de expressão de proteína em células demamíferos. As propriedades ou características anteriormente mencionadaspodem ser observadas ou medidas usando técnicas reconhecidas na áreaincluindo, mas sem se limitar, a ELISA, ELISA competitivo, análise de resso-nância de plasma de superfície, ensaios de neutralização in vitro e in vivosem limite, ligação de receptor, produção e/ou secreção de citocina ou fatorde crescimento, desenvolvimento de capa animal Xenopus, transdução desinal e imunoistoquímica com seções de tecido de diferentes fontes incluindoser humano, primata ou qualquer outra fonte conforme pode ser a necessidade.

O termo atividade de miostatina, conforme aqui utilizado, se re-fere a uma ou mais atividades morfogênicas ou fisiologicamente regulatóriasde crescimento associadas com a proteína de miostatina ativa. Por exemplo,miostatina ativa é um regulador negativo da massa de músculo esquelético.A miostatina ativa também pode modular a produção de enzimas músculo-específicas (por exemplo, creatina-quinase), estimular a proliferação de mio-blasto e modular a diferenciação de pré-adipócitos em adipócitos.

O termo inibe ou neutraliza, conforme aqui usado em relação auma atividade de um anticorpo da invenção significa a atividade para anta-gonizar, proibir, prevenir, conter, reduzir a velocidade, romper, eliminar, pa-rar, reduzir ou reverter, por exemplo, a progressão da severidade daquele oqual está sendo inibido incluindo, mas sem se limitar, à atividade ou proprie-dade biológica, uma doença ou uma condição. A inibição ou neutralização épreferivelmente pelo menos de cerca de 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%,70%, 80%, 90%, 95% ou maior.

O termo isolado quando usado em relação a um ácido nucléicoou proteína (por exemplo, um anticorpo) se refere a uma seqüência de ácidonucléico ou proteína que é identificada e separada de pelo menos um con- taminante com o qual ela está normalmente associada na sua fonte natural.Preferivelmente, um anticorpo isolado é um anticorpo que é substancialmen-te livre de outros anticorpos com diferentes especificidades antigênicas (porexemplo, composições farmacêuticas da invenção compreendem um anti-corpo isolado que se liga especificamente à miostatina e é substancialmenteivre de anticorpos que se ligam especificamente a antígenos diferentes damiostatina).

Os termos numeração de Kabat e marcação de Kabat são usa-dos intercambiavelmente aqui. Esses termos, os quais são reconhecidos natécnica, se referem a um sistema de numeração de resíduos de aminoácidosos quais são mais variáveis (isto é, hipervariáveis) do que outros resíduos deaminoácidos nas regiões variáveis de cadeia pesada e leve de um anticorpo(Kabat, et ai, Ann. NY Acad. Sei. 190: 382-93 (1971); Kabat, et al., Sequen-ces of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edição, U.S. Department ofHealth and Human Services, Publicação NIH No. 91-3242 (1991)).

Um polinucleotídeo é operativamente ligado quando ele é colo-

cado em uma relação funcional com outro polinucleotídeo. Por exemplo, umpromotor ou intensificador é operavelmente ligado a uma seqüência codifi-cadora se ela afetar a transcrição da seqüência. Um peptídeo é operavel-mente ligado a outro peptídeo quando os polinucleotídeos que os codificamsão operativamente ligados, preferivelmente quando eles estão na mesmaestrutura de leitura aberta.

Os termos indivíduo, sujeito e paciente, usados aqui intercambi-avelmente, se referem a um animal, preferivelmente a um mamífero (incluin-do um não-primata e um primata) ou espécie de ave incluindo, mas sem selimitar, a murinos, símios, humanos, animais de fazenda mamíferos (por e-xemplo, bovino, suíno, ovino), animais de esporte mamíferos (por exemplo, eqüinos) e animais de estimação mamíferos (por exemplo, caninos e feli-nos); preferivelmente, o termo se refere a seres humanos. O termo tambémse refere a espécies de aves incluindo, mas sem se limitar, a galinhas e pe-rus. Em uma certa modalidade, o sujeito, preferivelmente um mamífero, pre-ferivelmente um ser humano, é adicionalmente caracterizado com uma do- ença ou distúrbio ou condição que poderia se beneficiar de um nível diminu-ído ou de uma bioatividade diminuída de miostatina. Em outra modalidade oindivíduo, preferivelmente um mamífero, preferivelmente um humano, é adi-cionalmente caracterizado como estando em risco de desenvolver um dis-túrbio, doença ou condição que poderia se beneficiar de um risco diminuído de miostatina ou de uma bioatividade diminuída de miostatina.

O termo vetor inclui uma molécula de ácido nucléico capaz detransportar outro ácido nucléico ao qual ele tenha sido ligado incluindo, massem se limitar, a plasmídeos e a vetores virais. Certos vetores são capazesde replicação autônoma em uma célula hospedeira na qual eles são introdu- zidos enquanto outros vetores podem ser integrados no genoma de umacélula hospedeira na introdução na célula hospedeira, e dessa forma, sãoreplicados juntamente com o genoma hospedeiro. Além disso, certos vetoressão capazes de direcionar a expressão dos genes para os quais eles estãooperativamente ligados. Tais vetores são referidos aqui como vetores deexpressão recombinantes (ou simplesmente vetores de expressão e vetoresexemplares são bem-conhecidos na técnica.

Conforme aqui utilizadas, as expressões célula, célula hospedei-ra, linhagem celular, e cultura celular são usadas intercambiavelmente e in-cluem uma célula individual ou uma cultura de células que é um receptor dequalquer polinucleotídeo isolado da invenção ou qualquer/quaisquer ve-tores) recombinante(s) compreendendo uma seqüência codificando umHCVR, LCVR ou anticorpo monoclonal da invenção. Células hospedeirasincluem a progenia de uma célula hospedeira individual, e a progenia podenão necessariamente ser completamente idêntica (em morfologia ou nocomplemento de DNA total) em relação à célula de origem original devido auma mutação e/ou alteração natural, acidental ou deliberada. Uma célulahospedeira inclui células transformadas, transduzidas ou infectadas in vivoou in Vitro com um ou mais de vetores recombinantes ou um polinucleotídeoexpressando um anticorpo monoclonal da invenção ou uma cadeia leve ouuma cadeia pesada sua. Uma célula hospedeira a qual compreende um ve-tor recombinante da invenção (seja estavelmente incorporado no cromosso-mo hospedeiro ou não) também pode ser referida como a célula hospedeirarecombinante. Células hospedeiras preferidas para uso na invenção são cé-lulas CHO (por exemplo, ATCC CRL-9096), células NSO, células SP2/0 ecélulas COS (ATCC, por exemplo, CRL-1650, CRL-1651), HeLa (ATCCCCL-2). Células hospedeiras adicionais para uso na invenção incluem célu-las vegetais, células de levedura, outras células de mamíferos e células pro-carióticas.

CARACTERIZAÇÃO DO ANTICORPO

A presente invenção se refere a anticorpos isolados, monoclo-nais que se ligam especificamente à miostatina com alta afinidade. Os anti-corpos da invenção são anticorpos preferivelmente quiméricos, humanizadosou seres humanos ou porções de ligação a antígeno suas e preferivelmentese ligam à miostatina na região da forma madura de miostatina abarcandoos aminoácidos 40 64 ou, mais preferivelmente, na região da forma madurada miostatina abarcando os aminoácidos 43 57 e/ou 45 59. Além disso, anti-corpos da invenção neutralizam uma atividade biológica da miostatina in vivoou in vitro. A ligação específica de anticorpos monoclonais antimiostatina dainvenção à miostatina permite que os anticorpos da invenção sejam usadoscomo terapêuticos ou profiláticos para condições, doenças ou distúrbios as-sociados com miostatina, isto é, condições, doenças ou distúrbios os quaisse beneficiam da redução dos níveis de miostatina ou do antagonismo ou dainibição da atividade biológica de miostatina. Além disso, os anticorpos dainvenção podem ser usados para diagnosticar ou monitorar as condições,doenças ou distúrbios os quais se beneficiam de um nível ou bioatividadealterada de miostatina ou para determinar o nível de miostatina em uma a-mostra.

Em uma modalidade preferida, a invenção proporciona um anti-corpo monoclonal antimiostatina que se liga à miostatina ou a uma porçãosua com uma afinidade de ligação (K0) para a miostatina de menos do queou igual a cerca de 3 χ 10'8 Μ, 1 χ 10"8 M ou 1 χ 10"9 Μ, preferivelmente me-nor do que cerca de 9 χ 10"10 M ou 8,7 χ 10"10 M ou 8 χ 10'11 Μ. Preferivel-mente os anticorpos da invenção são caracterizados por um K0 de miostati-na não maior do que cerca de 3 XlO8M1 1 x10"8M, 1 χ IO9M ou 9 χ 10"10Me, mais preferivelmente, por um K0 de miostatina não maior do que cerca de8,7 χ 10"10 M ou 8 χ 10"11 M. Afinidades de anticorpo podem ser determina-das como descrito nos exemplos mais abaixo ou pelo uso de qualquer méto-do adequado disponível na técnica.

Em outra modalidade preferida, a invenção proporciona um anti-corpo monoclonal antimiostatina que tem uma IC5o menor do que ou igual acerca de 25 nM, 20 nM, 16 nM, 14 nM, 10 nM, 9 nM, 6 nM, 5,2 nM ou menosem um ensaio de miostatina/SBE repórter in vitro conforme descrito nos e-xemplos mais abaixo. Tais anticorpos podem ser adicionalmente caracteri-zados por um K0 de miostatina não maior do que cerca de 3 χ 10'8 Μ, 1 χ 10"8M, 1 χ 10 9 M ou 9 χ 10"10 M e, mais preferivelmente, por um K0 para a mi-ostatina não maior do que cerca de 8,7 χ 10"10 M ou 8 χ 10'11 Μ. Tais anticor-pos podem ser ainda caracterizados pela ligação preferencial da miostatinaem comparação com as suas capacidades de se ligar ao GDF-11 usandoqualquer método disponível na técnica, por exemplo, ensaio elisa ou ensaioelisa competitivo ou um valor de K0 medido, por exemplo, com um ensaio de

BIACORE ou KINEXA.Em uma modalidade, um anticorpo monoclonal da invenção temmenos do que cerca de 35, 33, 30, 28, 25, 23, ou 20% de reação cruzada(mais preferivelmente, menos do que cerca de 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12,11, 10, 9, 8, 7 ou 6, ainda mais preferivelmente, menos do que cerca de 5 ou 4 por cento de reatividade cruzada) com uma proteína não-miostatina (talcomo, por exemplo, GDF-11) ou com um peptídeo não-miostatina consistin-do em pelo menos 15, 14, 13, 12, 11, 10 ou 9 aminoácidos contíguos, con-forme medido por uma técnica padrão na área tal como por um ensaio elisa,um ensaio elisa competitivo ou valores de Kd conforme medidos, por exem- pio, com um ensaio de BIACORE ou KINEXA. Preferivelmente, um anticorpoda invenção se liga à miostatina pelo menos 2, 3, 5, 10, 20, 22, 24 ou 25 ve-zes mais do que com o que ele se liga ao GDF-11, conforme determinado,por exemplo, por ELISA de competição ou ensaio de BIACORE ou KINEXA.Mais preferivelmente, os anticorpos da invenção não se ligam ao GDF-11 em níveis maiores do que os níveis de fundo ao usar qualquer ensaio deligação disponível para uma pessoa normalmente versada na técnica. Umanticorpo monoclonal da invenção se liga a uma forma monomérica ou dimé-rica de miostatina ou a uma porção sua compreendendo resíduos abrangen-do os aminoácidos 40 64, 43 57 e/ou 45 59 ou miostatina madura.

Preferivelmente, os polipeptídeos de miostatina e de GDF-11testados para a ligação preferencial de um anticorpo da invenção são ambasformas homodiméricas da proteína madura, preferivelmente de origem ma-mífera ou de aves, ainda mais preferivelmente de origem humana. Entretan-to, os polipeptídeos de miostatina e de GDF-11 testados para a ligação pre-ferencial de um anticorpo da invenção podem ser a forma monomérica daproteína madura ou da forma de proproteína ou de um polipeptídeo compre-endendo uma porção da proteína madura abrangendo os aminoácidos 4064, 43 57 e/ou 45 59 da forma madura da proteína.

Os anticorpos monoclonais antimiostatina da invenção se ligam a um epítopo antigênico descoberto como estando localizado nos aminoáci-dos 40 64 (SEQ ID NO: 53 para humano) da miostatina madura, preferivel-mente nos aminoácidos 43 57 e/ou 45 59 da miostatina madura. Além disso,um epítopo imunogênico da miostatina da invenção está localizado nos ami-noácidos 40 64 da miostatina madura (SEQ ID NO: 53 para humano), prefe-rivelmente nos aminoácidos 43 57 e/ou 45 59 da miostatina madura de qual-quer espécie de mamífero ou ave. Um epítopo imunogênico da invençãotambém é contemplado como sendo um epítopo antigênico. O epítopo anti-gênico pode possuir resíduos de miostatina adicionais fora dos aminoácidos40 64 da miostatina madura, mas os anticorpos monoclonais da invençãonão requerem esses resíduos adicionais para se ligar especificamente à mi-ostatina. Adicionalmente, os resíduos de miostatina fora dos aminoácidos 4064 podem afetar a estrutura conformacional do domínio antigênico e, dessaforma, alterar a ligação de um anticorpo da invenção ao epítopo antigênico.Preferivelmente, os anticorpos monoclonais da invenção não reagem signifi-cativamente (isto é, se ligam) com o GDF-11 em comparação com o nívelcomo o qual eles se ligam ao GDF-8. Mais preferivelmente, os anticorposmonoclonais da invenção se ligam à miostatina pelo menos 2, 3, 5, 10, 20,22, 24 ou 25 vezes mais (por exemplo, maior afinidade ou maior especifici-dade) do que com a qual eles se ligam ao GDF-11 conforme determinado,por exemplo, por ensaio elisa, ensaio elisa de competição ou pelos valoresde Kd em um ensaio de BIACORE ou KINEXA.

Um peptídeo consistindo nos aminoácidos 40 64 (inclusive), 4357 ou 45 59 da miostatina madura ou de qualquer peptídeo consistindo emum epítopo imunogênico conforme descrito aqui pode ser usado como umpeptídeo imunogênico, preferivelmente conjugado com uma proteína carrea-dora, por exemplo, KLH, para gerar anticorpos monoclonais da invenção u-sando métodos disponíveis para uma pessoa normalmente versada na téc-nica. É contemplado que resíduos de cisteína nesses peptídeos podem seralterados para resíduos de serina e ainda funcionem como um epítopo imu-nogênico. O peptídeo imunogênico pode ser usado para imunizar um animalnão-humano, preferivelmente um mamífero, mais preferivelmente um ca-mundongo. Para um anticorpo completamente humano, o peptídeo imuno-gênico pode ser usado para imunizar uma cepa transgênica de camundongona qual a expressão do gene de anticorpo de camundongo é suprimida eefetivamente substituída com a expressão do gene de anticorpo humano. Aseguir, os anticorpos antimiostatina são isolados a partir do animal imuniza-do e testados pelos métodos bem-conhecidos na técnica para isolar aquelesanticorpos que se ligam especificamente no domínio abrangendo os amino-ácidos 40 64 da miostatina madura, preferivelmente no domínio abrangendoos aminoácidos 43 57 e/ou 45 59 preferivelmente testados para uma afinida-de de ligação menor do que cerca de 3 χ 10"8 M, 1 χ 10 8 M ou 1 χ 10'9 Μ,preferivelmente menor do que cerca de 9 χ 10"10M, 8.7 χ IO10M ou 8 χ 10"11M e/ou testados para uma IC5o menor do que ou igual a cerca de 25 nM, 20nM, 16 nM, 14 nM, 10 nM, 9 nM, 6 nM, 5,2 nM ou menos em um ensaio mi-ostatina/SBE in vitro (vide o ensaio descrito no Exemplo 6 aqui).

Anticorpos monoclonais podem ser feitos usando o método dohibridoma amplamente conhecido na técnica (vide, por exemplo, Kohler etal., Nature, 256: 495, 1975) ou podem ser feitos por métodos de DNA re-combinante (por exemplo, como na Patente Americana No. 4.816.567) ououtros métodos disponíveis na técnica. Geralmente, um hibridoma pode serproduzido pela fusão de uma linhagem celular imortal adequada (por exem-plo, uma linhagem celular de mieloma tal como SP2/0) com células produto-ras de anticorpo do animal imunizado. As células produtoras de anticorpo,preferivelmente aquelas do baço ou dos linfonodos, são obtidas a partir deanimais imunizados com o antígeno de interesse. As células fundidas (hibri-domas) podem ser isolados usando condições de cultivo seletivas, e clona-das pela limitação da diluição. O meio de cultura no qual as células de hibri-doma estão crescendo é testado para a produção de anticorpos monoclonaisdirecionados contra o antígeno. Preferivelmente, a especificidade de ligaçãodos mabs produzidos por células de hibridoma é determinada pela imuno-precipitação ou por um ensaio de ligação in vitro, tal como radioimunoensaio(RIA) ou ELISA. As células as quais produzem anticorpos com as proprieda-des de ligação desejadas podem ser selecionadas por um ensaio de varre-dura adequado. Métodos de tal isolamento e varredura são bem-conhecidosna técnica.

Outros métodos adequados de produção ou isolamento de anti-corpos os quais se ligam no domínio abrangendo os aminoácidos 40 64, 4357 ou 45 59 de miostatina madura, incluindo os anticorpos humanos ou arti-ficiais, podem ser usados incluindo, por exemplo, métodos os quais selecio-nam um anticorpo recombinante (por exemplo, Fab ou Fv de cadeia indivi-5 dual) de uma biblioteca, ou os quais se baseiam na imunização de animaistransgênicos (por exemplo, camundongos) capazes de produzir um repertó-rio de anticorpos humanos (vide, por exemplo, Jakobovits et ai, Proc. Natl.Acad. Sei. USA, 90:2551-2555, 1993; Jakobovits et ai, Nature, 362:255-258,1993; Lonberg et al., Patente Americana No. 5.545.806; Surani et ai, Paten-10 te Americana No. 5.545.807).

Anticorpos de cadeia individual, e anticorpos quiméricos, huma-nizados ou primatizados (enxertados com CDR), assim como anticorpos decadeia individual enxertados com CDR ou quiméricos e similares, compre-endendo porções derivadas de diferentes espécies, também são englobados15 pela presente invenção e pelo termo anticorpo. As várias porções dessesanticorpos podem ser unidas quimicamente por técnicas convencionais, sin-teticamente ou podem ser preparadas como uma proteína contígua usandotécnicas de engenharia genética. Por exemplo, ácidos nucléicos codificandouma cadeia quimérica ou humanizada podem ser expressos para produzir20 uma proteína contígua. Vide, por exemplo, a Patente Americana No.4.816.567; a Patente Européia No. 0.125.023 B1; Patente Americana No.4.816.397; Patente Européia No. 0.120.694 B1; WO 86/01533; Patente Eu-ropéia No. 0.194.276 B1; Patente Americana No. 5.225.539; Patente Euro-péia No. 0.239.400 B1 e as Patentes Americanas Nos. 5.585.089 e25 5.698.762. Vide também Newman. R. et al. BioTechnoIogy. 10: 1455-1460.1993, considerando anticorpo primatizado, e Ladner et ai, Patente America-na No. 4.946.778 e Bird, R. E. et ai, Science, 242: 423-426, 1988, conside-rando anticorpos de cadeia individual.

Além disso, porções funcionais de anticorpos, incluindo porções30 de ligação de antígeno de anticorpos quiméricos, humanizados, humanos oude cadeia individual, também podem ser produzidos. Porções funcionais dosanticorpos precedentes retêm pelo menos uma função de ligação a antígenoe/ou função biológica ou bioatividade do anticorpo de comprimento total apartir do qual eles são derivados. Porções funcionais preferidas retêm umafunção de ligação a antígeno de um anticorpo de comprimento total corres-pondente (pôr exemplo, a capacidade de se ligar a uma forma madura ma-mífera de miostatina). Porções ou fragmentos funcionais particularmentepreferidos retêm a capacidade de inibir uma ou mais funções ou bioativida-des características de uma miostatina madura de mamífero, tal como umaatividade de ligação, uma atividade de sinalização e/ou estimulação de umaresposta celular. Por exemplo, em uma modalidade, uma porção ou frag-mento funcional pode inibir a interação da miostatina madura com um oumais de seus Iigante se/ou pode inibir uma ou mais funções mediadas porreceptores.

Porções ou fragmentos de anticorpo capazes de se ligar à mios-tatina madura ou a uma porção sua (preferivelmente nos aminoácidos 40 64,43 57 e/ou 45 59 da miostatina madura) incluem, mas não estão limitados,aos fragmentos Fv, Fab, Fab' e F(ab')2 e são englobados pela invenção. Taisfragmentos podem ser produzidos por clivagem enzimática ou por técnicasrecombinantes. Por exemplo, a clivagem de papaína ou de pepsina podegerar fragmentos Fab ou F(ab')2, respectivamente. O menor fragmento deligação a antígeno é o Fv, o qual consiste nos domínios HCVR e LCVR. Ofragmento Fab consiste nos domínios HCVR-CH1 e LCVR-CL covalente-mente ligados por uma ponte dissulfeto entre as regiões constantes. Paracontornar a tendência de domínios HCVR e LCVR não-covalentemente liga-dos no Fv de dissociar quando co-expressos em uma célula hospedeira, umchamado fragmento Fv (scFv) de cadeia individual (sc) pode ser construído,no qual um polipeptídeo adequadamente longo e flexível se liga ou no C-terminal do HCVR ao N-terminal do LCVR ou no C-terminal do LCVR no N-terminal do HCVR. O Iigante mais comumente usado tem sido um peptídeode 15 resíduos (G^Ser)3, mas outros Iigantes também são conhecidos natécnica. Anticorpos também podem ser produzidos em uma variedade deformas cortadas usando genes de anticorpo nos quais um ou mais códonsde parada foram introduzidos a montante do sítio de parada natural. Por e-xemplo, um gene quimérico codificando uma porção de cadeia pesadaF(ab')2 pode ser projetado para incluir seqüências de DNA que codificam odomínio CH1 e uma região de articulação da cadeia pesada.

A seleção dos fragmentos de anticorpo das bibliotecas usandotecnologias de enriquecimento, tais como exposição de fago (Matthews DJ eWells JA. Science. 260:1113-7, 1993), exibição de ribossomo (Hanes, et ai.,Proc. Natl. Acad. Sei. (USA) 95:14130-5, 1998), exibição de bactéria (Samu-elson P., et ai., Journal of Biotechnoiogy. 96:129-54, 2002) ou exibição delevedura (Kieke MC, et ai, Protein Engineering, 10:1303-10, 1997) provaramser alternativas bem sucedidas à tecnologia do hibridoma clássica (revisõesrecentes: Little M. et ai., Immunology Today, 21:364-70, 2000;).

ANTICORPOS VARIANTES

Um anticorpo monoclonal de murino ou um anticorpo humano(produzido, por exemplo, em um camundongo transgênico) promovido contraum epítopo imunogênico (aminoácidos 40 64, 43 57 ou 45 59 da miostatinamadura) da invenção ou contra uma proteína compreendendo um epítopoimunogênico da invenção é um anticorpo de origem. Um anticorpo de origemde murino pode ser adicionalmente alterado para criar uma forma quiméricaou humanizada do anticorpo usando métodos bem-conhecidos na técnica.

Tais anticorpos quiméricos ou humanizados podem servir como anticorposde origem para mutagênese ou variação adicional. Anticorpos de origem dainvenção podem ser modificados adicionalmente, por exemplo, no(s) domí-nio(s) CDR (vide, por exemplo, figura 9) para criar um anticorpo variante comuma propriedade otimizada de interesse, por exemplo, afinidade de ligação,IC50, especificidade, etc. Um anticorpo variante de substituição de aminoáci-do é preferido e tem pelo menos um resíduo de aminoácido da molécula deanticorpo de origem removido e um resíduo diferente inserido no seu lugar.

Os sítios de maior interesse para a mutagênese de substituição incluem asregiões CDR, mas alterações FR também são contempladas. Substituiçõesde aminoácidos conservativas são preferidas. Se tais substituições resulta-rem em uma alteração na atividade biológica do anticorpo, então mais alte-rações substanciais, isto é, alterações de aminoácidos não-conservativas,podem ser introduzidas e os produtos testados.

Uma forma conveniente de gerar variantes de substituição é amaturação de afinidade usando exibição de fago. Resumidamente, váriossítios da região CDR são modificados para gerar todas as substituições deaminoácidos possíveis em cada sítio. As variantes de anticorpo dessa formageradas são apresentadas de uma forma monovalente a partir de partículasde fagos filamentosas como fusões para o produto do gene Ill de M13 em-pacotadas em cada partícula. As variantes de fagos apresentadas são, aseguir, testadas para as suas atividades biológicas (por exemplo, afinidadede ligação, especificidade, IC5o) conforme aqui descrito. Para identificar sí-tios dé região CDR candidatos para modificação, mutágenos de varredurade alanina podem ser efetuados para identificar resíduos da região CDRcontribuindo significativamente para a ligação de antígeno. Alternativamente,ou em adição, pode ser benéfico de analisar uma estrutura cristalina docomplexo antígeno-anticorpo para identificar pontos de contato entre o anti-corpo e miostatina. Tais resíduos de contato e resíduos vizinhos são candi-datos para a substituição de acordo com as técnicas aqui elaboradas ou co-nhecidos na técnica. Alternativamente, ou além disso, mutagêneses aleató-rias podem ser efetuadas em uma ou mais seqüências CDR em uma oumais posições de resíduo, seja enquanto a CDR é operativamente ligada naregião variável ou enquanto a CDR é independente de outras seqüências daregião variável e, então, a CDR alterada retornada para uma região variávelusando tecnologia de DNA recombinante. Uma vez que tais anticorpos vari-antes são gerados e expressos, o painel de variantes é submetido a varredu-ra conforme aqui descrito e anticorpos com propriedades superiores em umou mais ensaios relevantes podem ser selecionados para um desenvolvi-mento adicional.

Qualquer resíduo de cisteína não envolvido na manutenção daconformação própria de um anticorpo antimiostatina da invenção pode sersubstituído, geralmente com serina, para melhorar a estabilidade oxidativada molécula e prevenir a ligação cruzada de forma aberrante. Em contrapar-tida, ligação(ões) de cisteína podem ser adicionadas ao anticorpo para me-Ihorar a sua estabilidade (particularmente onde o anticorpo é um fragmentode anticorpo tal como um fragmento Fv).

Outro tipo de variante de aminoácido do anticorpo altera o pa-drão de glicosilação original do anticorpo. Por alteração se entende a anula- ção de uma ou mais porções de carboidrato encontradas no anticorpo, e/oua adição de um ou mais sítios de glicosilação que não estão presentes noanticorpo de origem.

A glicosilação dos anticorpos é tipicamente N-Iigada ou O-ligada. N-Iigada se refere à ligação da porção carboidrato na cadeia lateralde um resíduo de asparaginas. A seqüência de tripeptídeo asparaginas-X-serina e asparaginas-X-treonina, onde X é um aminoácido exceto prolina,são as seqüências de reconhecimento para a ligação enzimática da porçãocarboidrato na cadeia lateral das asparaginas. Dessa forma, a presença oudessas seqüências de tripeptídeos em um polipeptídeo cria um sítio de gli- cosilação potencial. Glicosilação O-Iigada se refere à ligação de um dos a-çúcares N-acetilgalactosamina, galactose ou xilose em um hidroxiaminoáci-do, mais comumente serina ou treonina, embora 5-hidroxiprolina ou 5-hidroxilisina possam também ser usados.

A adição de sítios de glicosilação no anticorpo é conveniente- mente efetuada pela alteração da seqüência de aminoácidos de forma queele contenha uma ou mais das seqüências de tripeptídeos acima descrita(para sítios de glicosilação N-ligados). A alteração também pode ser feitapela adição de, ou substituição por um ou mais resíduos de serina ou treoni-na na seqüência do anticorpo original (para sítios de glicosilação O-ligados).

SEQÜÊNCIA

Um anticorpo monoclonal da invenção tem um LCVR compre-endendo um peptídeo com uma seqüência selecionada do grupo consistindonas SEQ ID Nos: 5 12 e/ou uma HCVR compreendendo um peptídeo comuma seqüência selecionada do grupo consistindo nas SEQ ID NOS: 13 26, 55 e 56 (Vide figuras 5 9 aqui). Além disso, um anticorpo monoclonal da in-venção é um qual é inibido competitivamente da ligação da miostatina hu-mana madura (ou e uma porção sua) por um anticorpo monoclonal compre-endendo dois polipeptídeos com as seqüências mostradas no grupo consis-tindo em (i) SEQ ID Nos: 5 e 15; (ii) SEQ ID Nos: 5 e 16; e (iii) SEQ ID Nos:IOe 26. Tal inibição competitiva entre os anticorpos pode ser medida porensaios prontamente conhecidos por uma pessoa versada na técnica, porexemplo, um ensaio elisa de competição.

Em outra modalidade, um anticorpo monoclonal antimiostatinada invenção compreende (i) um polipeptídeo LCVR com uma seqüência deaminoácidos selecionada do grupo consistindo em SEQ ID Nos: 5 12 e (ii)um polipeptídeo da HCVR com uma seqüência de aminoácidos selecionadado grupo consistindo nas SEQ ID Nos: 13 - 26, 55 e 56.

Preferivelmente, um anticorpo compreendendo um polipeptídeoda LCVR com uma seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO:5 compreendeainda um polipeptídeo da HCVR com uma seqüência de aminoácidos sele-cionada do grupo consistindo nas SEQ ID NOS: 13 20. Preferivelmente, umanticorpo compreendendo um polipeptídeo LCVR com uma seqüência deaminoácidos da SEQ ID NO: 6 compreende ainda um polipeptídeo HCVRcom uma seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO: 14. Preferivelmente, umanticorpo compreendendo um polipeptídeo LCVR com uma seqüência deaminoácidos da SEQ ID NO: 7 compreende ainda um polipeptídeo da HCVRcom uma seqüência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo nasSEQ ID NOS: 21 25 e 56. Preferivelmente, um anticorpo compreendendo umpolipeptídeo LCVR com uma seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO: 10compreende ainda um polipeptídeo da HCVR com uma seqüência de ami-noácidos da SEQ ID NO: 26 ou 55. Preferivelmente, um anticorpo compre-endendo um polipeptídeo HCVR com uma seqüência de aminoácidos daSEQ ID NO: 55 compreende ainda um polipeptídeo LCVR com uma seqüên-cia de aminoácidos selecionada do grupo consistindo nas SEQ ID Nos: 8 12.

O versado na técnica irá perceber que os anticorpos da inven-ção não estão limitados às seqüências específicas da HCVR e da LCVRconforme estabelecido nas figuras 5 9 aqui, mas também incluem variantesdessas seqüências que retêm a capacidade de ligação a antígeno. Tais vari-antes podem ser derivadas das seqüências fornecidas usando técnicas co-nhecidas na técnica conforme descrito acima.

Em outra modalidade, um anticorpo antimiostatina da invençãotem uma região variável de cadeia pesada e de cadeia leve, em que a regiãovariável de cadeia pesada compreende regiões CDR com as seguintes se-qüências de aminoácidos: CDRH1 (SEQ ID NO: 59), CDRH2 (SEQ ID NO:60) e CDRH3 (SEQ ID NO: 61); e/ou em que a região variável da cadeia levecompreende regiões CDR com as seguintes seqüências de aminoácidos:CDRL1 (SEQ ID NO: 57), CDRL2 (SEQ ID NO: 30 ou 52) e CDRL3 (SEQ IDNO: 58). Preferivelmente, as CDRs da cadeia pesada de um anticorpo dainvenção são conforme mostrado nas figuras 5, 6 ou 9 e as CDRs de cadeialeve de um anticorpo da invenção são conforme mostrado nas figuras 7, 8 ou9 e as CDRs existem no anticorpo no local CDR definido nas figuras. Porexemplo, um anticorpo da invenção tem CDRL1 com a SEQ ID NO: 27, C-DRL2 com a SEQ ID NO: 30, CDRL3 com a SEQ ID NO: 31, CDRH1 com aSEQ ID NO: 36, CDRH2 com a SEQ ID NO: 43 e CDRH3 com a SEQ ID NO:47 (como faz o anticorpo IC7.1 na Figura 9).

É ainda contemplado que um anticorpo antimiostatina da inven-ção compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendouma região CDRH1 com uma seqüência selecionada do grupo consistindonaquela conforme mostrado nas SEQ ID Nos: 36 - 42 e/ou uma região CD-RH2 com uma seqüência com uma seqüência selecionada do grupo consis-tindo naquela conforme mostrado nas SEQ ID Nos: 43 46 e/ou uma regiãoCDRH3 com uma seqüência selecionada do grupo consistindo naquela con-forme mostrado nas SEQ ID Nos: 47 51. Em outra modalidade, um anticorpoantimiostatina da invenção compreende uma região variável de cadeia levecompreendendo uma região CDRL1 com uma seqüência selecionada dogrupo consistindo naquela conforme mostrado nas SEQ ID Nos: 27 29 e/ouuma região CDRL2 com uma seqüência selecionada do grupo consistindonaquela conforme mostrado nas SEQ ID Nos: 30 ou 52 e/ou uma regiãoCDRL3 com uma seqüência selecionada do grupo consistindo naquela con-forme mostrado nas SEQ ID Nos: 31 35. Em uma modalidade preferida, umanticorpo antimiostatina da invenção compreende uma região variável dacadeia pesada compreendendo uma região CDRH1 com uma seqüênciaselecionada do grupo consistindo naquela conforme mostrado nas SEQ IDNos: 36 42 e/ou uma região CDRH2 com uma seqüência selecionada dogrupo consistindo naquela conforme mostrado nas SEQ ID Nos: 43 46 e/ouuma região CDRH3 com uma seqüência selecionada do grupo consistindonaquela conforme mostrado nas SEQ ID Nos: 47 51, e ainda compreendeuma região variável da cadeia leve compreendendo uma região CDRLI comuma seqüência selecionada do grupo consistindo naquela conforme mostra-do na SEQ ID Nos: 27 29 e/ou uma região CDRL2 com uma seqüência sele-cionada do grupo consistindo naquela conforme mostrada nas SEQ ID Nos30 ou 52 e/ou uma região CDRL3 com uma seqüência selecionada do grupoconsistindo naquela conforme mostrado nas SEQ ID Nos: 31 35.

A estrutura para carregar uma CDR da invenção será geralmen-te uma seqüência de cadeia leve ou pesada do anticorpo ou uma porçãosubstancial sua, na qual a CDR está localizada em um local correspondendoà CDR de HCVR e LCVR de ocorrência natural (Kabat et al, Sequences ofProteins of Immunological lnterest, US Dept of HHS, 1991). Preferivelmente,as três regiões hipervariáveis (CDRs) para cada cadeia, pesada e leve, sãofornecidas em uma região de estrutura humana, por exemplo, como umaseqüência contígua representada pela seguinte fórmula: FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4. A cadeia pesada ou a cadeia leve de FR1, FR2, FR3e FR4 se combinam para formar a estrutura completa quando dispostas co-mo uma seqüência contígua com as CDRs na ordem estabelecida.

Além das seqüências CDR, a LCVR e a HCVR ainda compre-endem uma seqüência de estrutura. Em um anticorpo humanizado para usoterapêutico em humanos, a seqüência da estrutura é preferivelmente com-pletamente ou substancialmente de origem humana (isto é, pelo menos85%, 87%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de origem humana).Preferivelmente, a região de estrutura de cadeia leve de um anticorpo hu-manizado, humano ou quimérico da invenção é 02 conforme mostrado nafigura 7, compreendida de FR1 com a SEQ ID NO: 65, FR2 com a SEQ IDNO: 66, FR3 com a SEQ ID NO: 67 e FR4 com a SEQ ID NO: 68. Preferi-velmente, a região da estrutura da cadeia pesada de um anticorpo humani-zado, humano ou quimérico da invenção é VH2-70 ou VH4-39 conformemostrado nas figuras 5 e 6, respectivamente. A estrutura VH2-70 é compre-endida de FR1 com a SEQ ID NO: 69, FR2 com a SEQ ID NO: 70, FR3 com a SEQ ID NO: 71 e FR4 com a SEQ ID NO: 72. VH4-39 é compreendida deFR1 com a SEQ ID NO: 73, FR2 com a SEQ ID NO: 74, FR3 com a SEQ IDNO: 75 e FR4 com a SEQ ID NO: 76. Em um anticorpo para uso em um a-nimal não-humano, a seqüência da região de estrutura pode substancial-mente se originar de um genoma humano (preferivelmente usado em um animal não-humano quando ele é um embrião ou recém-nascido) o do ge-noma do animal no qual ele é para ser usado terapeuticamente.

Em uma modalidade, um anticorpo antimiostatina da invenção,em que toda ou uma porção da região variável é limitada por uma seqüênciaparticular conforme mostrado por uma SEQ ID NO em que é ainda caracteri- zada por ser um anticorpo quimérico, humanizado ou completamente huma-no ou porção de ligação a antígeno sua que antagoniza ou neutraliza pelomenos uma atividade da miostatina in vivo ou in vitro. Um anticorpo antimi-ostatina da invenção, em que toda ou uma porção da região variável é limi-tada por uma seqüência particular conforme mostrado por uma SEQ ID NO em que é preferivelmente ainda caracterizada pela ligação preferencial deGDF-8 em relação ao GDF-11. Mais preferivelmente, tais anticorpos se li-gam á miostatina pelo menos cerca de 2, 3, 5, 10, 20, 22, 24 ou 25 vezesmais do que ele se liga ao GDF-11. Mais preferivelmente tais anticorpos,quando expressos como Fabs, não se ligam ao GDF-11 acima dos níveis de fundo.

Um anticorpo antimiostatina da invenção, em que toda ou umaporção da região variável é limitada por uma seqüência particular conformemostrada por uma SEQ ID NO aqui são preferivelmente ainda caracteriza-dos (i) pela ligação de um peptídeo consistindo em uma seqüência de ami- noácidos conforme mostrada na SEQ ID NO: 53, preferivelmente um peptí-deo consistindo em uma seqüência de aminoácidos conforme mostrada naSEQ ID NO: 62, e/ou (ii) com uma IC5o menor do que ou igual a cerca de 25nM, 20 nM, 16 nM, 10 nM, 9 nM, 6 nM, 5,7 nM em um ensaio de miostati-na/SBE repórter in vitro e/ou (iii) com uma afinidade de ligação (K0) para amiostatina menor do que cerca de 3 χ 10"8 Μ, 1 χ 10"8 M ou 1 χ 10'9 Μ, prefe-rivelmente mènor do que cerca de 9 χ 10"10 M ou 8,7 χ 10"10 M ou 8 χ 10"11 Μ;alternativamente caracterizada como um K0 para a miostatina não maior doque cerca de 3 χ 10"8 Μ, 1 χ 10"8 Μ, 1 χ 10"9 M ou 9 χ 10"10 Μ; mais preferi-velmente um K0 não maior do que cerca de 8,7 χ 10"10" M e, mais preferivel-mente, um K0 não maior do que cerca de 8 χ 10"11 Μ.

EXPRESSÃO DE ANTICORPO

A presente invenção é também direcionada para linhagens celu-lares que expressam um anticorpo monoclonal antimiostatina da invenção ouporção sua. A criação e o isolamento das linhagens celulares produzindo umanticorpo monoclonal da invenção podem ser efetuados usando técnicaspadrões conhecidas na técnica. Linhagens celulares preferidas incluemCOS, CHO, SP2/0, NSO e levedura (disponível dos depósitos públicos taiscomo ATCC, American Type Culture Collection, Manassas, VA).

Uma ampla variedade de sistemas de expressão do hospedeiropode ser usada para expressar um anticorpo da presente invenção incluindosistemas de expressão procarióticos (bacterianos) e eucarióticos (tais comolevedura, baculovírus, vegetal, mamífero e outras células animais, animaistransgênicos e células de hibridoma), assim como sistemas de expressão deexposição de fagos. Um exemplo de um vetor de expressão bacteriano ade-quado é pUC119 e um vetor de expressão eucariótico adequado é um vetorpcDNA3.1 modificado com um sistema de seleção DHFR enfraquecido. Ou-tros sistemas de expressão de anticorpo também são conhecidos na técnicae são aqui contemplados.

Um anticorpo da invenção pode ser preparado pela expressãorecombinante de genes da cadeia leve e pesada de imunoglobulina em umacélula hospedeira. Para expressar um anticorpo recombinantemente, umacélula hospedeira é transformada, transduzida, infectada ou similar com umou mais vetores de expressão recombinantes carregando fragmentos deDNA que codificam as cadeias leve e/ou pesada de imunoglobulina do anti-corpo, de forma que as cadeias leve e/ou pesada sejam expressas na célulahospedeira. A cadeia pesada e a cadeia leve podem ser expressas indepen-dentemente de diferentes promotores para os quais eles são operativamenteligados em um vetor ou, alternativamente, a cadeia pesada e a cadeia levepodem ser expressas independentemente a partir de diferentes promotorespara os quais eles estão operativamente ligados em dois vetores um expres-sando a cadeia pesada e um expressando a cadeia leve. Opcionalmente, acadeia pesada e a cadeia leve podem ser expressas em diferentes célulashospedeiras. Preferivelmente, os anticorpos recombinantes são secretadosno meio no qual as células hospedeiras são cultivadas, a partir das quais osanticorpos podem ser recuperados ou purificados. Metodologias de DNArecombinante padrões são usadas para obter genes de cadeia pesada e le-ve de anticorpo, incorporar esses genes em vetores de expressão recombi-nantes e introduzir os vetores em células hospedeiras. Tais tecnologias deDNA recombinante padrões são descritas, por exemplo, em Sambrook,Fritsch e Maniatis (Eds.), Molecular Cloning; A Laboratory Manual, SegundaEdição, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989; Ausubel, efa/(Eds.) Current Proto-cols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates, 1989.

Um DNA isolado codificando uma região HCVR pode ser con-vertido em um gene de cadeia pesada de comprimento total pela ligação deforma operável do DNA codificando HCVR em outra molécula de DNA codi-ficando regiões constantes da cadeia pesada (CH1, CH2 e CH3). As se-qüências dos genes da região constante de cadeia pesada humanos sãoconhecidas na técnica. Vide, por exemplo, Kabat, et ai, Sequences of Prote-ins of Immunological Interest, Quinta Edição, U.S. Department of Health andHuman Services, Publicação NIH No. 91-3242 (1991). Fragmentos de DNAenglobando essas regiões podem ser obtidos, por exemplo, por amplificaçãode PCR padrão. A região constante da cadeia pesada pode ser de qualquertipo (por exemplo, IgG, IgA, IgE, IgM ou IgD), classe (por exemplo, IgGi,IgG2, IgG3 e IgG4) ou subclasse de região constante e de qualquer variantealotípica sua conforme descrito em Kabat (acima). Alternativamente, a por-ção de ligação a antígeno pode ser um fragmento Fab, um fragmento Fab',um fragmento F(ab')2, Fd ou um fragmento Fv de cadeia individual (scFv).Para um gene de cadeia pesada do fragmento Fab, o DNA que codifica HC-VR pode ser operativamente ligado a outra molécula de DNA que codificasomente umá região constante CH1 da cadeia pesada.

Um DNA isolado codificando uma região LCVR pode ser conver-tido em um gene de cadeia leve de comprimento total (assim como em umgene de cadeia leve Fab) pela ligação de forma operável do DNA que codifi-ca LCVR em outra molécula de DNA que codifica uma região constante dacadeia leve, CL. As seqüências dos genes da região constante da cadeialeve humana são conhecidas na técnica. Vide, por exemplo, Kabat, acima.Fragmentos de DNA englobando essas regiões podem ser obtidos por am-plificação de PCR padrão. A região constante da cadeia leve pode ser umaregião constante kappa ou lambda.

Para criar um gene scFv, os fragmentos de DNA que codificamHCVR- e LCVR- são operativamente ligados em outro fragmento que codifi-ca um Iigante flexível, por exemplo, codificando a seqüência de aminoácido(GIy4-Ser)3, de forma que as seqüências HCVR e LCVR possam ser expres-sas como uma proteína de cadeia individual contígua, com as regiões LCVRe HCVR unidas pelo Iigante flexível. Vide, por exemplo, Bird, et ai, Science242: 423-6, 1988; Huston, et ai, Proc. Nati Acad. Sei. USA 85: 5879-83,1988; McCafferty1 et ai, Nature 348: 552-4, 1990.

Para expressar um anticorpo da invenção, um DNA codificandouma cadeia leve e/ou pesada parcial ou de comprimento total, obtida con-forme descrito acima, é inserido em um vetor de expressão de forma que ogene esteja operativamente ligado em seqüências de controle de transcriçãoe de tradução. O vetor de expressão e as seqüências de controle de expres-são são escolhidos como sendo compatíveis com a célula hospedeira deexpressão usada. O gene da cadeia leve de anticorpo e o gene da cadeiapesada de anticorpo podem ser inseridos em vetores separados ou, maistipicamente, ambos os genes são inseridos no mesmo vetor de expressão.Os genes do anticorpo são inseridos no vetor de expressão por métodospadrões. Adicionalmente, o vetor de expressão recombinante pode codificarum peptídeo de sinal que facilite a secreção da cadeia leve e/ou pesada doanticorpo monoclonal antimiostatina de uma célula hospedeira. O gene dacadeia leve e/ou pesada do anticorpo monoclonal antimiostatina pode serclonado no vetor de forma que o peptídeo de sinal esteja operativamenteligado na estrutura no amino-terminal o gene da cadeia do anticorpo. O pep-tídeo de sinal pode ser um peptídeo de sinal de imunoglobulina ou um peptí-deo de sinal heterólogo.

Além do(s) gene(s) da cadeia pesada e/ou leve do anticorpo, umvetor de expressão recombinante da invenção carrega seqüências regulató-rias que controlam a expressão do(s) gene(s) da cadeia do anticorpo emuma célula hospedeira. O termo seqüência regulatória é tencionado paraincluir promotores, intensificadores e outros elementos de controle de ex-pressão (por exemplo, sinais de poliadenilação) conforme necessário, quecontrolam a transcrição ou tradução do(s) gene(s) da cadeia do anticorpo. Odesign do vetor de expressão, incluindo a seleção de seqüências regulató-rias, pode depender de tais fatores conforme a escolha da célula hospedeiraser transformada, do nível de expressão da proteína desejada. Seqüênciasregulatórias preferidas para a expressão de células hospedeiras de mamífe-ros incluem elementos virais que direcionam altos níveis de expressão deproteína em células de mamíferos, tais como promotores e/ou intensificado-res derivados de citomegalovírus (CMV), vírus Simian 40 (SV40), adenovírus(por exemplo, o promotor tardio principal do adenovírus (AdMLP)) e o polio-mavírus.

Além dos genes da cadeia pesada e/ou leve do anticorpo e dasseqüências regulatórias, os vetores de expressão recombinantes da inven-ção podem carregar seqüências adicionais, tais como seqüências que regu-lam a replicação do vetor nas células hospedeiras (por exemplo, origens dereplicação) e um ou mais genes marcadores selecionáveis. O gene marca-dor selecionável facilita a seleção das células hospedeiras nas quais o vetorfoi introduzido. Por exemplo, tipicamente o gene marcador selecionável con-fere resistência a fármacos, tais como G418, higromicina ou metotrexato, emuma célula hospedeira na qual o vetor tenha sido introduzido. Genes marca-dores selecionáveis preferidos incluem o gene da diidrofolato redutase (DH-FR) (para uso em células hospedeiras DHFR-menos com sele-ção/amplificação de metotrexato), o gene neo (para seleção de G418) e aglutamina siritetase (GS) em uma linhagem celular GS-negativa (tal como NSO) para seleção/amplificação.

Para a expressão das cadeias leve e/ou pesada, o(s) vetor(es)de expressão codificando as cadeias pesada e/ou leve é introduzido em umacélula hospedeira por técnicas padrões, por exemplo, eletroporação, precipi-tação com fosfato de cálcio, transfecção com DEAE-dextrana, transdução, infecção e similares. Embora seja teoricamente possível expressar os anti-corpos da invenção ou em células hospedeiras procarióticas ou eucarióticas,células eucarióticas são preferidas, e mais preferivelmente células hospedei-ras mamíferas, porque tais células são mais prováveis de montar e secretarum anticorpo imunologicamente ativo e propriamente dobrado. Células hos- pedeiras de mamíferos preferidas para expressar os anticorpos recombinan-tes da invenção incluem de Ovário de Hâmster Chinês (células CHO) (inclu-indo células DHFR-CHO, descritas em Urlaub e Chasin, Proc. Natl. Acad.Sei. USA 77: 4216-20, 1980, usadas com um marcador selecionável DHFR,por exemplo, conforme descrito em Kaufman e Sharp, J. MoL Biol. 159: 601-21, 1982, células de mieloma NSO, células COS e células SP2/0. Quan-do os vetores de expressão recombinantes que codificam genes de anticor-po são introduzidos em células hospedeiras de mamíferos, os anticorpos sãoproduzidos pelo cultivo das células hospedeiras por um período de temposuficiente para permitir a expressão do anticorpo nas células hospedeiras ou, mais preferivelmente, a secreção do anticorpo no meio de cultura no qualas células hospedeiras crescem. Anticorpos podem ser recuperados da célu-la hospedeira e/ou do meio de cultura usando métodos de purificação pa-drões.

Células hospedeiras também podem ser usadas para produzir porções, ou fragmentos de anticorpos intactos, por exemplo, fragmentos Fabou moléculas scFv por técnicas que são convencionais. Será entendido porum técnico no assunto que variações no procedimento acima estão dentrodo escopo da presente invenção. Por exemplo, pode ser desejável transfec-tar uma célula hospedeira com DNA codificando ou a cadeia leve ou a ca-deia pesada de um anticorpo dessa invenção. A tecnologia de DNA recom-binante também pode ser usada para remover parte ou todo o DNA que co-difica qualquer uma ou ambas as cadeias leve e pesada que não sejam ne-cessárias para a ligação à miostatina. As moléculas expressas a partir detais moléculas de DNA cortadas também são englobadas pelos anticorposda invenção.

Em um sistema preferido para a expressão recombinante de umanticorpo da invenção, um vetor de expressão recombinante codificando tan-to a cadeia pesada do anticorpo quanto a cadeia leve do anticorpo é introdu-zido em células DHFR-CHO, por exemplo, por transfecção mediada por fos-fato de cálcio. No vetor de expressão recombinante, os genes da cadeia pe-sada e leve do anticorpo são cada um operativamente ligados a elementosregulatórios intensificadores/promotores (por exemplo, derivados de SV40,CMV, adenovírus e similares, tais como um elemento regulatório CMV inten-sificador/AdMLP promotor ou um elemento regulatório SV40 intensifica-dor/AdMLP promotor) para direcionar altos níveis de transcrição dos genes.

O vetor de expressão recombinante também carrega um gene DHFR, o qualpermite a seleção de células CHO que tenham sido transfectadas com o ve-tor usando seleção/amplificação com metotrexato. As células hospedeirastransformantes selecionadas são cultivadas para permitir a expressão dascadeias pesada e leve do anticorpo e o anticorpo intacto é recuperado domeio de cultura. Técnicas de biologia molecular padrão são usadas parapreparar o vetor de expressão recombinante, transferir as células hospedei-ras, selecionar por transformantes, cultivar as células hospedeiras e recupe-rar o anticorpo do meio de cultura. Anticorpos, ou porções de ligação a antí-geno suas da invenção podem ser expressas em um animal (por exemplo,um camundongo) que é transgênico para genes de imunoglobulina humana(vide, por exemplo, Taylor, et ai, NucIeicAcids Res. 20:6287-95, 1992).

Uma vez expressos, os anticorpos intactos, seus dímeros, ca-deias leves e pesadas individuais ou outras formas de imunoglobulina dapresente invenção podem ser purificados de acordo com procedimentos pa-drões da técnica, incluindo precipitação com sulfato de amônio, cromatogra-fia de troca iônica, de afinidade, de fase reversa, de coluna de interação hi-drofóbica, elétroforese em gel e similares. Imunoglobulinas substancialmente puras de pelo menos cerca de 90%, 92%, 94% ou 96% de homogeneidadesão preferidas, e de 98 a 99% ou mais de homogeneidade são mais preferi-das para usos farmacêuticos. Uma vez purificados, parcialmente ou até ahomogeneidade conforme desejado, os peptídeos podem, então, ser usadosterapeuticamente ou profilaticamente, conforme aqui direcionado.

ANTICORPO QUIMÉRICO

Conforme aqui utilizado, o termo anticorpo quimérico inclui imu-noglobulinas monovalentes, divalentes ou polivalentes. Um anticorpo quimé-rico monovalente é um dímero formado por uma cadeia pesada quiméricaassociada através de pontes dissulfeto com uma cadeia leve quimérica. Um anticorpo quimérico divalente é um tetrâmero formado por dois dímeros decadeia pesada-cadeia leve associados através de pelo menos uma pontedissulfeto.

Uma cadeia pesada quimérica de um anticorpo compreendeuma região de ligação a antígeno derivada da cadeia pesada de um anticor- po não-humano específico para a miostatina, a qual é operativamente ligadaa pelo menos uma porção de uma região constante de cadeia pesada hu-mana ou substancialmente humana (ou espécies diferentes daquela da quala região de ligação a antígeno foi derivada). Uma cadeia leve quimérica deum anticorpo compreende uma região de ligação a antígeno derivada total-mente ou substancialmente da cadeia leve de um anticorpo não-humanooperativamente ligado a pelo menos uma porção de uma região constantede cadeia leve (CL) humana ou substancialmente humana (ou espécies dife-rentes daquela da qual a região de ligação a antígeno foi derivada). Anticor-pos, fragmentos ou derivados com cadeias pesadas e cadeias leves quimé-ricas da mesma ou de diferente especificidade de ligação de região variáveltambém podem ser preparados por associação apropriada nas cadeias depolipeptídeo individuais, de acordo com passos de método conhecido.Com essa proposta, hospedeiros expressando cadeias pesadasquiméricas são cultivadas em separado de hospedeiros expressando cadei-as leves quiméricas, e as cadeias de imunoglobulina são separadamenterecuperadas e, a seguir, associadas. Alternativamente, os hospedeiros po-dem ser co-cultivados e as cadeias são deixadas se associar espontanea-mente no meio de cultura, seguido pela recuperação da imunoglobulina oufragmento montado. Métodos para produzir anticorpos quiméricos são co-nhecidos na técnica (vide, por exemplo, as Patentes Americanas Nos.6.284.471; 5.807.715; 4.816.567; e 4.816.397).

ANTICORPOS HUMANIZADOS

Preferivelmente, um anticorpo da invenção a ser usado parapropósitos terapêuticos poderia ter a seqüência da região constante e daestrutura (até a extensão que ela existe no anticorpo) derivada do mamíferono qual ela poderia ser usada como terapêutico de forma a reduzir a possibi-lidade de que o mamífero possa eliciar uma resposta imune contra o anticor-po terapêutico. Anticorpos humanizados são de interesse particular, uma vezque eles são considerados como sendo valiosos para a aplicação terapêuti-ca e evitam a resposta de anticorpo anticamundongo humana freqüentemen-te observada com anticorpos de roedores. Adicionalmente, em anticorposhumanizados a porção efetora é humana de forma que ela possa interagirmelhor com as outras partes do sistema imune humano (por exemplo, des-truir as células alvo mais eficientemente pela citotoxicidade dependente decomplemento ou pela citotoxicidade celular dependente de anticorpo). Tam-bém, anticorpos humanizados injetados podem ter uma meia-vida mais simi-lar com aquela de anticorpos humanos de ocorrência natural do que, porexemplo, anticorpos de murino, permitindo dessa forma doses menores emenos freqüentes a serem dadas. O termo anticorpo humanizado, conformeaqui utilizado, refere-se a um anticorpo compreendendo porções de anticor-pos de origens diferentes, em que pelo menos uma porção é de origem hu-mana. Por exemplo, o anticorpo humanizado pode compreender porçõesderivadas de um anticorpo de origem não-humana com a especificidade ne-cessária, tal como um camundongo, e de um anticorpo de origem humana,unido quimicamente por técnicas convencionais (por exemplo, sintético) oupreparados como um polipeptídeo contíguo usando técnicas de engenhariagenética.

Preferivelmente, um anticorpo humanizado tem CDRs que seoriginam de um anticorpo não-humano (preferivelmente um anticorpo mono-clonal de camundongo) enquanto que a região constante e de estrutura, atéa extensão que elas estão presentes (ou uma porção significativa ou subs-tancial sua, isto é, pelo menos cerca de 85%, 87%, 90%, 92%, 94%, 95%,96%, 97%, 98% ou 99%) são codificadas por informação de seqüência deácido nucléico que ocorre na região de imunoglobulina de linhagem germina-tiva humana (vide, por exemplo, o Banco de Dados Internacional ImMuno-GeneTics) ou nas suas formas recombinadas ou modificadas, quer sejam osreferidos anticorpos produzidos em uma célula humana ou não. As CDRs deum anticorpo humanizado podem ser otimizadas a partir das CDRs de anti-corpo de origem não-humana a partir das quais elas se originaram para ge-rar propriedades desejadas, por exemplo, especificidade, afinidade e capa-cidade. CDRs otimizados podem ter substituições, adições e/ou anulaçõesde aminoácidos em comparação com as CDRs de origem. Por exemplo, asposições de aminoácidos das SEQ ID Nos: 57, 30, 58, 59, 60, e 61 que es-tão sublinhadas e em impressão em negrito na figura 9 são posições asquais foram otimizadas a partir das CDRs de origem conforme mostrado nasfiguras 10 e 11. Entretanto, é contemplado que qualquer anticorpo antimios-tatina não-humano (i) promovido contra um peptídeo consistindo em umaseqüência mostrada na SEQ ID NO: 53 ou 62 ou (ii) promovido contra umpeptídeo compreendendo a seqüência mostrada na SEQ ID NO: 53 ou 62 ereativo para um peptídeo consistindo na seqüência mostrada na SEQ ID NO:53 ou 62, pode servir como um anticorpo de origem o qual pode ser conver-tido em um anticorpo humanizado ou quimérico usando métodos padrõesdisponíveis na técnica.

Formas humanizadas de anticorpos não-humanos (por exemplo,de murino) incluem um anticorpo intacto, um anticorpo substancialmente in-tacto, uma porção de um anticorpo compreendendo um sítio de ligação aantígeno, ou uma porção de um anticorpo compreendendo um fragmentoFab, um fragmento Fab', f(ab')2 ou um fragmento Fv de cadeia individual.

Anticorpos humanizados preferivelmente contêm uma seqüência mínimaderivada de imunoglobulina não-humana. Anticorpos humanizados tambémpodem compreender resíduos os quais são encontrados nem no anticorporeceptor nem na CDR ou nas seqüências de estrutura importadas. Em geral,o anticorpo humanizado irá compreender substancialmente todos de pelomenos um e tipicamente dois domínios variáveis, nos quais todos ou subs-tancialmente todos os aminoácidos nas regiões CDR correspondem àquelesde uma imunoglobulina não-humana e todos ou substancialmente todos osaminoácidos nas regiões FR são aqueles de uma seqüência de consenso deimunoglobulina humana. O anticorpo humanizado otimamente também com-preende pelo menos uma porção de uma região constante de imunoglobuli-na (Fc), tipicamente aquela de uma imunoglobulina humana [Jones et al.,Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-329 (1988);e Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2:593-596 (1992).]

Anticorpos humanizados podem ser submetidos a mutagênesein vitro usando métodos de rotina usados na técnica (ou, quando um animaltransgênico para seqüências de Ig humanas é usado, mutagênese somáticain vivo) e, dessa forma, a região de estrutura de seqüências de aminoácidosdas regiões HCVR e LCVR dos anticorpos recombinantes humanizados sãoseqüências que, enquanto derivadas daquelas relacionadas com seqüênciasHCVR e LCVR de linhagem germinativa humanas, podem não existir natu-ralmente no repertório de linhagem germinativa de anticorpo humano in vivo.

É contemplado que tais seqüências de aminoácidos das regiões de estruturaHCVR e LCVR dos anticorpos recombinantes humanizados são de pelo me-nos 85%, 87%, 90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 98% ou, mais preferivelmente,pelo menos 99% idênticas com uma seqüência de linhagem germinativahumana. Preferivelmente, aqueles resíduos de estrutura do anticorpo de ori-gem (por exemplo, anticorpo de murino ou geralmente o anticorpo a partir doqual o anticorpo humanizado é derivado) os quais mantêm ou afetam estru-turas de sítio combinantes serão retidos. Esses resíduos podem ser identifi-cados, por exemplo, por cristalografia de raio-X do anticorpo de origem oufragmento Fab, identificando dessa forma a estrutura tridimensional do sítiode ligação a antígeno.

O anticorpo humanizado da presente invenção pode compreen-der ou ser derivado de uma estrutura de cadeia leve de linhagem germinati-va humana. Em modalidades particulares, a seqüência da linhagem germi-nativa de cadeia leve é selecionada de seqüências VK humanas incluindo,mas sem se limitar, a A1, A10, A11, A14, A17, A18, A19, A2, A20, A23, A26,A27, A3, A30, A5, A7, B2, B3, L1, L10, L11, L12, L14, L15, L16, L18, L19,L2, L20, L22, L23, L24, L25, L4/18a, L5, L6, L8, L9, 01, 011, 012, 014,018, 02, 04 e 08. Em certas modalidades, essa estrutura de linhagemgerminativa de cadeia leve humana é selecionada de V1-11, V1-13, V1-16,V1-17, V1-18, V1-19, V1-2, V1-20, V1-22, V1-3, V1-4, V1-5, V1-7, V1-9, V2-1, V2-11, V2-13, V2-14, V2-15, V2-17, V2-19, V2-6, V2-7, V2-8, V3-2, V3-3,V3-4, V4-1, V4-2, V4-3, V4-4, V4-6, V5-1, V5-2, V5-4, e V5-6. Vide o PCTWO 2005/005604 para uma descrição das diferentes seqüências de linha-gem germinativa.

Em outras modalidades, o anticorpo humanizado da presenteinvenção pode compreender ou ser derivado de uma linhagem germinativahumana de estrutura de cadeia pesada. Em modalidades particulares, essaestrutura de linhagem germinativa humana de cadeia pesada é selecionadade VH1-18, VH1-2, VH1-24, VH1-3, VH1-45, VH1-46, VH1-58, VH1-69, VH1-8, VH2-26, VH2-5, VH2-70, VH3-11, VH3-13, VH3-15, VH3-16, VH3-20,VH3-21, VH3-23, VH3-30, VH3-33, VH3-35, VH3-38, VH3-43, VH3-48, VH3-49, VH3-53, VH3-64, VH3-66, VH3-7, VH3-72, VH3-73, VH3-74, VH3-9,VH4-28, VH4-31, VH4-34, VH4-39, VH4-4, VH4-59, VH4-61, VH5-51, VH6-1e VH7-81. Vide PCT WO 2005/005604 para uma descrição das diferentesseqüências de linhagem germinativa.

Em modalidades particulares, a região variável da cadeia levee/ou a região variável da cadeia pesada compreende uma região de estrutu-ra de pelo menos uma porção de uma região de estrutura (por exemplo, con-tendo 2 ou 3 sub-regiões, tais como FR2 e FR3). Em certas modalidades,pelo menos FRL1, FRL2, FRL3, ou FRL4 é completamente humano. Em ou-tras modalidades, pelo menos FRH1, FRH2, FRH3, ou FRH4 é completa-mente humano. Em algumas modalidades, pelo menos FRL1, FRL2, FRL3,ou FRL4 é uma seqüência de linhagem germinativa (por exemplo, linhagem germinativa humana) ou compreende seqüências de consenso humanaspara a estrutura particular. Em outras modalidades, pelo menos FRH1, F-RH2, FRH3, ou FRH4 é uma seqüência de linhagem germinativa (por exem-plo, linhagem germinativa humana) ou compreende seqüências de consensohumanas para a estrutura particular. Em modalidades preferidas, a região deestrutura é uma região de estrutura humana.

Em geral, anticorpos humanizados podem ser produzidos pelaobtenção de seqüências de ácido nucléico codificando o HCVR e o LCVR deum anticorpo, por exemplo, de um anticorpo de murino ou de um anticorpofeito por um hibridoma, o qual se liga a um epítopo de miostatina da inven- ção, identificando as CDRs na referida HCVR e LCVR (não-humana) e en-xertando as referidas seqüências de ácido nucléico codificando CDR nasreferidas seqüências de ácido nucléico codificando a estrutura humana sele-cionada. Opcionalmente, uma região de CDR pode ser otimizada pela modi-ficação aleatoriamente ou em locais particulares para substituir, anular ou adicionar um ou mais aminoácidos na CDR antes de enxertar a região deCDR na região de estrutura. Alternativamente, uma região de CDR pode serotimizada subseqüentemente à inserção na região de estrutura humana u-sando métodos disponíveis para uma pessoa versada na técnica. Preferi-velmente, as seqüências de aminoácido de estrutura humana são seleciona- das de forma que o anticorpo resultante é provável de ser adequado para aadministração in vivo em humanos. Isso pode ser determinado, por exemplo,baseando-se no uso anterior de anticorpos contendo tal seqüência de estru-tura humana. Preferivelmente, a seqüência de estrutura humana não irá porsi só ser significativamente imunogênica.

Alternativamente, as seqüências de aminoácidos das estruturasdo anticorpo a serem humanizadas podem ser comparadas com aquelas dasseqüências de estrutura humanas conhecidas das seqüências de estruturahumanas a serem usadas para o enxerto de CDR e selecionadas baseando-se nas suas compreendendo seqüências altamente similares com aquelasdo anticorpo de origem, por exemplo, um anticorpo de murino o qual se ligueà miostatina. Várias seqüências de estrutura humana foram isoladas e suasseqüências reportadas na técnica. Isso aumenta a probabilidade de que umanticorpo humanizado enxertado com CDR resultante, o qual contém CDRsdas CDRs de origem (por exemplo, de murino) ou otimizadas do anticorpode origem enxertadas nas estruturas humanas selecionadas (e possivelmen-te também a região constante humana) irá substancialmente reter a estrutu-ra de ligação a antígeno e, dessa forma, reter a afinidade de ligação do anti-corpo de origem. Para reter um grau significativo de afinidade de ligação aantígeno, as regiões de estrutura humanas selecionadas irão preferivelmen-te ser aquelas que são esperadas como sendo adequadas para a adminis-tração in vivo, isto é, não-imunogênicas.

Em qualquer método, a seqüência de DNA que codifica as regi-ões HCVR e LCVR do preferivelmente anticorpo antimiostatina de murino éobtida. Métodos para a clonagem das seqüências de ácido nucléico codifi-cando imunoglobulinas são bem-conhecidos na técnica. Tais métodos po-dem, por exemplo, envolver a amplificação das seqüências codificadoras deimunoglobulina a serem clonadas usando iniciadores apropriados pela rea-ção em cadeia da polimerase (PCR). Iniciadores adequados para amplificarseqüências de ácido nucléico de imunoglobulina, e especificamente seqüên-cias de HCVR e de LCVR de murino foram reportadas na literatura. Depoisde tais seqüências codificando imunoglobulina terem sido clonadas, elasserão as seqüências por métodos bem-conhecidos na técnica.

Depois das seqüências codificantes de CDR serem enxertadasnas seqüências codificantes de estrutura humana selecionada, as seqüên-cias de DNA resultantes codificando as seqüências pesadas variáveis e le-ves variáveis humanizadas são, então, expressas para produzir um Fv hu-manizado ou anticorpo humanizado que se ligue à miostatina. A HCVR e aLCVR humanizada podem ser expressas como parte de uma molécula deanticorpo antimiostatina inteira, isto é, como uma proteína de fusão com se-qüências de domínio constantes humanas cujas seqüências de DNA codifi-cantes foram obtidas a partir de uma biblioteca comercialmente disponívelou a qual tenha sido obtida usando, por exemplo, um dos métodos descritosacima para obter seqüências de DNA, ou estejam na técnica.

Entretanto, as seqüências de HCVR e de LCVR também podemser expressas na ausência de seqüências constantes para produzir um Fvantimiostatina humanizado. Todavia, a fusão de seqüências constantes hu-manas na região variável é potencialmente desejável porque o anticorpo an-timiostatina humanizado resultante pode possuir funções efetoras humanas.

Métodos para sintetizar DNA que codifica uma proteína de se-qüência conhecida são bem-conhecidos na técnica. Usando tais métodos,seqüências de DNA as quais codificam as referidas seqüências de HCVR ede LCVR humanizadas (com ou sem regiões constantes) são sintetizadas, ea seguir expressas em um sistema de vetor adequado para a expressão deanticorpos recombinantes. Isso pode ser efetuado em qualquer sistema devetor o qual proporcione para as referidas HCVR e LCVR humanizadas se-qüências a serem expressas como uma proteína de fusão com seqüênciasde domínio constante humanas e se associem para produzir fragmentos deanticorpo ou anticorpos funcionais (de ligação a antígeno).

Seqüências de domínio constante humanas são bem-conhecidas na técnica, e foram reportadas na literatura. Seqüências de ca-deia leve constantes humanas preferidas incluem as seqüências de cadeialeve constante kappa e lambda. Seqüências de cadeia pesada constanteshumanas preferidas incluem IgGi humana, IgG2 humana, IgG3 humana, IgG4humana e suas versões modificadas as quais proporcionam uma função efe-tora alterada, por exemplo, meia-vida in vivo aumentada, ligação ao receptorFc reduzida ou perfil de desamidação alterado.

Caso presentes, as regiões de estrutura humanas são preferi-velmente derivadas de uma região variável de anticorpo humano com simila-ridade de seqüência à região análoga ou equivalente do doador da região deligação a antígeno (isto é, o anticorpo de origem). Outras fontes de regiõesde estrutura para porções de origem humana de um anticorpo humanizadoincluem seqüências de consenso variáveis humanas (vide, por exemplo, Ket-tleborough, C.A. et al. Protein Engineering 4:773-783 (1991); Carter et al.,WO 94/04679. Por exemplo, a seqüência do anticorpo ou da região variávelusada para obter a porção não-humana pode ser comparada com seqüên-cias humanas conforme descrito em Kabat et al. Sequences of Proteins ofImmunological Interest, Quinta Edição, NIH, U.S. Government Printing Office(1991). Em uma modalidade particularmente preferida, as regiões de estrutu-ra de um anticorpo humanizado são derivadas de uma região variável hu-mana com pelo menos cerca de 60% de identidade de seqüência global,preferivelmente pelo menos cerca de 70% de identidade de seqüência globale, mais preferivelmente, pelo menos cerca de 85% de identidade de seqüên-cia global, com a região variável do doador não-humano. Uma porção hu-mana também pode ser derivada de um anticorpo humano com pelo menoscerca de 65% de identidade de seqüência, e preferivelmente pelo menoscerca de 70% de identidade de seqüência, na porção particular (por exem-plo, FR) sendo usada, em comparação com a porção equivalente (por e-xemplo, FR) do doador não-humano.

Referências descrevendo adicionalmente métodos envolvidosna humanização de um anticorpo de camundongo que podem ser usadassão, por exemplo, Queen et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88:2869, 1991;Patente Americana No. 5.693.761; Patente Americana No. 4.816.397; Paten-te Americana No. 5.225.539; programas de computador ABMOD e ENCADconforme descrito em Levitt, M., J. Moi Biol. 168:595-620, 1983; a humani-zação pode ser essencialmente efetuada seguindo o método de Winter eoutros [Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature,332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988)].ANTICORPOS HUMANOS

Como uma alternativa à humanização, anticorpos humanos po-dem ser gerados. Anticorpos humanos podem ser produzidos usando váriastécnicas conhecidas na técnica, incluindo bibliotecas de exibição de fago.Hoogenboom e Winter, J. Mol. Biol., 227: 381 (1991); Marks et al., J. Mol.Biol., 222: 581 (1991). As técnicas de Cole et al. e de Boerner et al. tambémestão disponíveis para a preparação de anticorpos monoclonais humanos.Cole et al., Monoclonal Antibodies and Câncer Therapy, Alan R. Liss, p. 77(1985) e Boerner et al., J. Immunol. 147(1):86-95 (1991). Semelhantemente,anticorpos humanos podem ser feitos pela introdução de locais de imuno- globulina humana em animais transgênicos, por exemplo, camundongos nosquais os genes de imunoglobulina endógena foram parcialmente ou comple-tamente inativados. Na imunização, por exemplo, com um antígeno compre-endendo um epítopo imunogênico da invenção, um repertório completo daprodução de anticorpo humano é obtido, o qual lembra intimamente aquele visto em humanos em todos os aspectos, incluindo o rearranjo, a montageme o repertório de anticorpo gênico. Essa proposta é descrita, por exemplo,nas Patentes Americanas Nes. 5.545.807; 5.545.806; 5.569.825; 5.589.369;5.591.669; 5.625.126; 5.633.425; 5.661.016, e nas seguintes publicaçõescientíficas: Marks et al., BioTechnoIogy 10: 779-783, 1992; Lonberg et al., Nature 368: 856-859, 1994; Morrison, Nature 368: 812-13, 1994; Fishwild etal., Nature Biotechnology 14: 845-51, 1996; Neuberger, Nature Biotechno-Iogy 14: 826 (1996); Lonberg e Huszar, lntern. Rev. Immunol. 13: 65-93(1995) e Jobkobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 90:2551, 1993.

Genes de imunoglobulina humanos introduzidos no camundon- go, criando dessa forma camundongos transgênicos capazes de responder aantígenos com anticorpos com seqüências humanas também são descritosem Bruggemann et al. Proc. Natl Acad. Sei. USA 86:6709-6713 (1989)].Existem várias estratégias que existem para a geração de mamíferos queproduzem anticorpos humanos. Particularmente, existe a proposta de minilo- cal na qual um local de Ig exógeno é mimetizado através da inclusão de pe-ças (genes individuais) dos locais de Ig (vide, por exemplo, as Patentes A-mericanas Nos. 5.545.807, 5.545.806, 5.625.825, 5.625.126, 5.633.425,5.661.016, 5.770.429, 5.789.650 e 5.814.318, 5.612.205, 5.721.367,5.789.215), YAC introdução de fragmentos substancialmente de linhagemgerminativa e grandes do local de Ig [Vide Mendez et al. Nature Genetics 15:146-156 (1997), Green e Jakobovits J. Exp. Med. 188: 483-495 (1998)], eintrodução de locais inteiros ou substancialmente inteiros através do uso defusão de microcélulas (vide o Pedido de Patente Européia No. EP 0 843 961 A1).

Qualquer camundongo transgênico capaz de responder a imuni-zação com anticorpos com seqüências humanas pode ser usado para pro-duzir um anticorpo antimiostatina da invenção ao usar métodos disponíveispara as pessoas versadas na técnica, por exemplo, quando tal camundongoé imunizado com um polipeptídeo compreendendo um epítopo imunogênicoda invenção.

USOS

Anticorpos da presente invenção são úteis nas aplicações tera-pêuticas, profiláticas, de diagnóstico e de pesquisa conforme aqui descrito.Um anticorpo da invenção pode ser usado para diagnosticar um distúrbio oudoença associado com a expressão de miostatina humana. De um modosimilar, o anticorpo da invenção pode ser usado em um ensaio para monito-rar os níveis de miostatina em um indivíduo sendo tratado para uma condi-ção associada com a miostatina. Ensaios de diagnóstico incluem métodosque utilizam o anticorpo da invenção e um marcador para detectar miostatinaem uma amostra, por exemplo, em um fluido corporal humano ou em umextrato tecidual ou de células. Anticorpos da invenção podem ser usadoscom ou sem modificação, e são marcados por ligação covalente ou não-covalente de uma porção detectável. A porção detectável pode ser qualqueruma que seja capaz de produzir, seja direta ou indiretamente, um sinal de-tectável. Por exemplo, a porção detectável pode ser um radioisótopo tal co-mo, por exemplo, 3H, 14C, 32P, 35S, ou 125I, um composto fluorescente ouquimiluminescente, tal como isotiocianato de fluoresceína, rodamina ou Iuci-ferina; ou uma enzima, tal como fosfatase alcalina, beta-galactosidase ouperoxidase de rábano silvestre. Qualquer método conhecido na técnica paraconjugar separadamente o anticorpo com a porção detectável pode ser em-pregado, incluindo aqueles métodos descritos por Hunter, et al., Nature 144:945, 1962; David, et al., Biochemistry 13: 1014, 1974; Pain, et al., J. Immu-nol. Meth. 40: 219, 1981; e Nygren, J. Histochem. And Cytochem. 30: 407,1982.Uma variedade de protocolos convencionais para medir miosta-tina, incluindo por exemplo ELISAs, RIAs e FACS, são conhecidos na técni-ca e proporcionam uma base para o diagnóstico de níveis alterados ou a-normais de expressão de miostatina. Valores de expressão normais ou pa-drões são estabelecidos usando qualquer técnica conhecida na técnica, porexemplo, pela combinação de uma amostra compreendendo um polipeptí-deo de miostatina com, por exemplo, anticorpos sob condições adequadaspara formar um complexo antígeno:anticorpo. O anticorpo é diretamente ouindiretamente marcado com uma substância detectável para facilitar a de-tecção do anticorpo ligado ou não-ligado. Substâncias detectáveis adequa-das incluem várias enzimas, grupos prostéticos, materiais fluorescentes, ma-teriais Iuminescentes e materiais radioativos. Exemplos de enzimas adequa-das incluem peroxidase de rábano silvestre, fosfatase alcalina, β-galactosidase ou acetilcolinesterase; exemplos de complexos de grupo pros-tético adequado incluem estreptavidina/biotina e avidina/biotina; exemplosde materiais fluorescentes adequados incluem umbeliferona, fluoresceína,fluoresceína, isotiocianato, rodamina, diclorotriazinilamina fluoresceína, clo-reto de dansila ou ficoeritrina; um exemplo de um material Iuminescente in-clui luminol; e exemplos de um material radioativo incluem 125I, 131I1 35S ou3H. (Vide, por exemplo, Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techni-ques, CRC Press, Inc. (1987)).

A quantidade de um complexo padrão formado é quantificadapor vários métodos, tais como, por exemplo, por meios fotométricos. Quanti-dades de polipeptídeo miostatina expressas no indivíduo, controle e amos-tras (por exemplo, de tecido de biópsia) são, então comparadas com os valo-res padronizados. O desvio entre os valores padrões e do indivíduo estabe-lece parâmetros para a correlação de um distúrbio, estado, condição, sín-drome ou doença particular com um certo nível de expressão (ou falta sua)para um polipeptídeo de miostatina.

Uma vez que a presença de um distúrbio, estado, condição,síndrome ou doença é estabelecida e um protocolo de tratamento é iniciado,os ensaios são repetidos em uma base regular para monitorar o nível de ex-pressão de miostatina. Os resultados obtidos a partir de ensaios sucessivossão usados para mostrar a eficácia do tratamento em um período variandode vários dias até meses. Em relação a distúrbios particulares (por exemplo,fraqueza ou caquexia), a presença de uma quantidade alterada de miostati-na em fluido (por exemplo, soro ou urina) ou tecido de biópsia de um indiví-duo pode indicar uma predisposição para o desenvolvimento de um distúr-bio, estado, condição, síndrome ou doença ou ele pode proporcionar ummeio para detectar tal distúrbio, estado, condição, síndrome ou doença antesde aparecer os sintomas clínicos de fato ou ela pode definir uma populaçãomais propensa a responder terapeuticamente a um anticorpo da invenção.Uma detecção inicial mais definitiva pode permitir o tratamento precoce, pre-venindo e/ou melhorando dessa forma a progressão adicional de uma doen-ça ou distúrbio associado com a expressão da miostatina, por exemplo, de-terioração óssea ou de músculo.

Por uma questão de conveniência, o anticorpo da presente in-venção pode ser fornecido em um kit, uma combinação empacotada de rea-gentes em quantidades predeterminadas com instruções para efetuar o en-saio de diagnóstico. Onde o anticorpo é marcado com uma enzima, o kit iráincluir substratos e co-fatores requeridos pela enzima (por exemplo, um pre-cursor de substrato o qual proporciona o cromóforo ou fluoróforo detectável).Além disso, outros aditivos podem ser incluídos tais como estabilizantes,tampões (por exemplo, um tampão de bloqueio ou um tampão de lise) e si-milares. As quantidades relativas dos vários reagentes pode ser variadasamplamente para proporcionar concentrações em solução dos reagentes, osquais otimizam substancialmente a sensibilidade do ensaio. Particularmente,os reagentes podem ser proporcionados como pós secos, geralmente Iiofili-zados, incluindo excipientes os quais na dissolução irão proporcionar umasolução reagente com a concentração apropriada.

USOS TERAPÊUTICOS DO ANTICORPO

Miostatina desempenha um papel no desenvolvimento de mús-culos e em uma variedade de distúrbios ou doenças relacionadas. Em adul-tos, o RNAm da miostatina é primariamente detectado no músculo esqueléti-co, embora concentrações mais baixas também sejam encontradas no teci-do adiposo e no tecido cardíaco (Sharma, M., et al, J. Cell Physiol. 180:1,1999). Camundongos knockout de miostatina têm duas ou três vezes maismassa muscular do que seus membros de ninhada do tipo selvagem. Amassa muscular aumentada é o resultado da hipertrofia e hiperplasia de fi-bra (McPherron, A., et al. Nature 387:83-90, 1997 and Zhu1 X. et al., FEBSLetters 474:71). Além disso, os camundongos knockout de miostatina acu-mulam menos gordura do que seus membros de ninhada do tipo selvagem,mas por outro lado aparentam serem normais e saudáveis. Miostatina tam-bém foi recentemente mostrada como sendo uma importante reguladora daadipogênese (Rebbapragada, A., et al., Moi and CeH Bio. 23:7230-7242,2003). Adicionalmente, a estrutura e o conteúdo ósseo foi recentemente es-tudado em camundongos deficientes de miostatina (Hamrick M.W., et al., J.Orthopaedic Research 21:1025, 2003; Hamrick, M.W., et ai, CaIcifTissue Int71:63,2002).

Conseqüentemente, uma composição farmacêutica compreen-dendo um anticorpo monoclonal antimiostatina da invenção pode ser usadapara aumentar a massa muscular, aumentar a densidade óssea, diminuir aperda muscular ou pode ser útil para o tratamento ou prevenção das condi-ções em que a presença de miostatina causa ou contribui para efeitos pato-lógicos indesejáveis ou a redução dos níveis de miostatina tem um benefícioterapêutico em mamíferos, preferivelmente em humanos incluindo, mas semse limitar, a perda muscular, injúria muscular, cirurgia, reparo de tecido dani-ficado, fraqueza, sarcopenia relacionada com o envelhecimento, atrofia pordesuso, osteoporose, osteoartrite, crescimento e reparo do ligamento, obe-sidade, supressão do acúmulo de gordura corporal, obesidade, distrofiamuscular de qualquer tipo, miopatia de cuidado crítico, miopatia alcoólica,caquexia (por exemplo, relacionada com câncer ou induzida por HIV, ou re-sultante de DPOC, doença pulmonar crônica, recuperação da sepsia, falên-cia renal, falência hepática, falência ou doença cardíaca), síndrome metabó-lica, perda muscular pós-queimadura e diabetes do tipo II. Atrofia ou desusopode resultar de várias causas ou incidentes incluindo qualquer distúrbio oudoença ou estado o qual leve à imobilidade prolongada ou desuso ou repou-so em leito incluindo, mas sem se limitar, a transplante de órgão sólido,substituição de junta, apoplexia, injúria da medula espinal, recuperação dequeimadura severa, hemodiálise crônica sedentária, recuperação pós-sepsiae exposição à microgravidade. Uma vez que a miostatina é altamente con-servada na seqüência e função pelas espécies, os anticorpos da invençãopodem ser usados para aumentar a massa muscular, aumentar a densidadeóssea ou tratar ou prevenir condições em mamíferos não-humanos ou espé-cies de aves [por exemplo, animais domésticos (por exemplo, caninos e feli- nos), animais de esporte (por exemplo, eqüinos), animais de fonte de ali-mentação (por exemplo, bovinos, suínos e ovinos), espécies de aves (porexemplo, galinha, peru, outros pássaros de jogos ou aves domésticas)] emque a presença de miostatina causa ou contribui para efeitos patológicosindesejáveis ou o decréscimo de níveis de miostatina tem um benefício tera- pêutico.

O uso de anticorpo monoclonal antimiostatina da presente in-venção para o tratamento ou prevenção de pelo menos um dos distúrbiosanteriormente mencionados nos quais a atividade da miostatina é prejudicialou o qual favoreça para níveis reduzidos de miostatina bioativa é aqui con-templado. Adicionalmente, o uso de um anticorpo monoclonal antimiostatinada presente invenção para uso na produção de um medicamento para o tra-tamento de pelo menos um dos distúrbios anteriormente mencionados écontemplado.

Conforme aqui utilizado, os termos tratamento, tratando e simila-res, se referem à obtenção do efeito farmacológico e/ou fisiológico desejado.O efeito pode ser profilático em termos de prevenir completamente ou parci-almente uma doença ou sintoma seu e/ou pode ser terapêutico em termosde uma cura parcial ou completa para uma doença e/ou efeito adverso atri-buível à doença. Tratamento, conforme aqui utilizado, inclui a administraçãode um composto da presente invenção para o tratamento de uma doença oucondição em um mamífero, particularmente em um ser humano, e inclui: (a)a prevenção da doença da ocorrência em um indivíduo o qual pode ser pre-disposto à doença, mas que não tenha ainda sido diagnosticado como atendo; (b) inibição da doença, isto é, interrupção de seu desenvolvimento; e(c) alívio da doença, isto é, a causa da regressão da doença ou distúrbio oualívio dos sintomas ou complicações suas. Regimes de dosagem podem serajustados para proporcionar a resposta ótima desejada (por exemplo, umaresposta terapêutica ou profilática). Por exemplo, um único bólus pode seradministrado, várias doses divididas podem ser administradas no decorrerdo tempo ou a dose pode ser proporcionalmente reduzida ou aumentadaconforme indicado pelas exigências da situação terapêutica.

COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA

Um anticorpo da invenção pode ser incorporado em composi-ções farmacêuticas adequadas para a administração a um indivíduo. Oscompostos da invenção podem ser administrados sozinhos ou em combina-ção com um veículo, diluente e/ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis,em doses individuais ou múltiplas. As composições farmacêuticas para ad-ministração são projetadas para serem apropriadas para o modo seleciona-do de administração, e diluentes, veículo e/ou excipientes farmaceuticamen-te aceitáveis, tais como agentes dispersantes, tampões, tensoativos, conser-vantes, agentes solubilizantes, agentes de isotonicidade, agentes estabili-zantes e similares são usados conforme apropriado. As referidas composi-ções são projetadas de acordo com técnicas convencionais conforme, porexemplo, em Reminqton, The Science and Practice of Pharmacy, 19a Edi-ção, Gennaro, Ed., Mack Publishing Co., Easton, PA 1995, o qual proporcio-na um compêndio de técnicas de formulação conforme são geralmente co-nhecidas pelos clínicos.

Uma composição farmacêutica compreendendo um anticorpomonoclonal antimiostatina da presente invenção pode ser administrada a umindivíduo em risco para ou exibindo patologias conforme aqui descritas u-sando técnicas de administração padrão incluindo a administração oral, in-travenosa, intraperitoneal, subcutânea, pulmonar, transdérmica, intramuscu-lar, intranasal, bucal, sublingual ou via supositório.

Uma composição farmacêutica da invenção é ,preferivelmenteuma quantidade terapeuticamente eficaz ou uma quantidade profilaticamenteeficaz de um anticorpo da invenção. Uma quantidade terapeuticamente efi-caz se refere a uma quantidade eficaz, em dosagens e por períodos de tem-po necessários para alcançar o resultado terapêutico desejado. Uma quanti-dade terapeuticamente eficaz do anticorpo pode variar de acordo com fato-res tais como com o estado da doença, idade, sexo e peso do indivíduo, ecom a capacidade do anticorpo ou porção do anticorpo de eliciar uma res-posta desejada no indivíduo. Uma quantidade terapeuticamente eficaz étambém uma na qual qualquer efeito tóxico ou prejudicial do anticorpo é ex-cedido pelos efeitos terapeuticamente benéficos. Uma quantidade profilati-camente eficaz se refere a uma quantidade eficaz, em dosagens e por perí-odos de tempo necessários para alcançar o resultado profilático desejado.

Tipicamente, uma vez que a dose profilática é usada em indivíduos antes deou em um estágio inicial da doença, a quantidade profilaticamente eficazserá menor do que a quantidade terapeuticamente eficaz.

Uma quantidade terapeuticamente eficaz ou profilaticamenteeficaz é pelo menos a dose mínima, porém menor do que a dose tóxica deum agente ativo o qual é necessário para conceder benefício terapêutico aum indivíduo. Estabelecido de outra forma, uma quantidade terapeuticamen-te eficaz de um anticorpo da invenção é uma quantidade a qual em mamífe-ros, preferivelmente em seres humanos, aumenta a massa muscular, au-menta a densidade óssea ou trata condições em que a presença de miosta-tina causa ou contribui para efeitos patológicos indesejáveis Ou decréscimoem níveis de miostatina resulta em um efeito terapêutico benéfico em ummamífero, preferivelmente em um ser humano incluindo, mas sem se limitar,a perda muscular, injúria muscular, fraqueza em cirurgia, sarcopenia relacio-nada com a idade, atrofia por desuso, osteoporose, osteoartrite, crescimentoe reparo do ligamento, obesidade, supressão do acúmulo de gordura corpo-ral, distrofia muscular de qualquer tipo, miopatia de cuidado crítico, caquexia(por exemplo, relacionada com câncer ou induzida por HIV, ou resultante deDPOC, falência renal, falência hepática, falência ou doença cardíaca), sín-drome metabólica e diabetes do tipo II. Atrofia por desuso pode resultar denumerosas causas ou incidentes incluindo qualquer distúrbio ou doença ouestado o qual leve à imobilidade prolongada ou desuso ou repouso e leitoincluindo, mas sem se limitar, a transplante de órgão sólido, substituição dejunta, apoplexia, injúria da medula espinal, recuperação de queimadura se-vera, hemodiálise crônica sedentária, recuperação pós-sepsia e exposição àmicrogravidade.

A via de administração de um anticorpo da presente invençãopode ser oral, parenteral, por inalação ou tópica. Preferivelmente, os anticor-pos da invenção podem ser incorporados em uma composição farmacêuticaadequada para a administração parenteral. O termo parenteral, conformeaqui utilizado, inclui a administração intravenosa, intramuscular, subcutânea,retal, vaginal ou intraperitoneal. A distribuição sistêmica periférica por injeçãointravenosa ou intraperitoneal ou subcutânea é preferida. Veículos adequa-dos para tais injeções são diretos na técnica.

A composição farmacêutica tipicamente deve ser estéril e está-vel sob as condições da produção e estocagem no recipiente fornecido inclu-indo, por exemplo, um frasco ou seringa fechado. Conseqüentemente, com-posições farmacêuticas podem ser esterilmente filtradas depois de fazer aformulação, ou de outra forma feitas de forma microbiologicamente aceitável.

Uma composição típica para a infusão intravenosa poderia ter um volumetanto como 250 1000 mL de fluido, tal como a solução de Ringer, soluçãosalina fisiológica, solução de dextrose e solução de Hank e uma dose tera-peuticamente eficaz (por exemplo, de 1 a 100 mg/mL ou mais) de concen-tração de anticorpo. A dose pode variar dependendo do tipo e severidade dadoença. Conforme é bem-conhecido nas técnicas médicas, dosagens paraqualquer indivíduo depende de muitos fatores, incluindo o tamanho do paci-ente, a área de superfície do corpo, o composto particular a ser administra-do, sexo, tempo e via de administração, saúde geral e outros fármacos sen-do administrados concorrentemente. Uma dose típica pode estar, por exem-plo, na faixa de 0,001 a 1000 μg; entretanto, doses abaixo ou acima dessafaixa exemplar são previstas, considerando especialmente os fatores anteri-ormente mencionados. O regime de dosagem parenteral diário pode ser decerca de 0,1 μς/Kg até cerca de 100 mg/Kg de peso corporal total, preferi-velmente de cerca de 0,3 μg/Kg até cerca de 10 mg/Kg e, mais preferivel-mente, de cerca de 1 μg/Kg até 1 mg/Kg, ainda mais preferivelmente de cer-ca de 0,5 até 10 mg/Kg de peso corporal por dia. O progresso pode ser mo·nitorado por avaliação periódica. Para a administração repetida em váriosdias ou mais, dependendo da condição, o tratamento é repetido até uma su-pressão desejada dos sintomas da doença ocorrer, Entretanto, outros regi-mes de dosagem podem ser úteis e não se excluem daqui. A dosagem de-sejada pode ser distribuída por uma administração de massa individual, pormúltiplas administrações de massas ou por administração de infusão contí-nua do anticorpo, dependendo do padrão de declínio farmacocinético queum clínico deseja alcançar.

Essas quantidades sugeridas de anticorpo são sujeitas a umaconsiderável prudência terapêutica. O fator chave na seleção de uma dose ecronograma apropriado é o resultado obtido. Fatores para consideraçãonesse contexto incluem o distúrbio particular sendo tratado, o mamífero par-ticular sendo tratado, a condição clínica do paciente individual, a causa dodistúrbio, o local de distribuição do anticorpo, o tipo particular do anticorpo, ométodo de administração, o cronograma de administração e outros fatoresconhecidos para os clínicos médicos.

Agentes terapêuticos da invenção podem ser congelados ouIiofilizados para estocagem e reconstituídos em um veículo estéril adequadoantes do uso. A liofilização e a reconstituição podem levar a graus variáveisde perda de atividade de anticorpo. Dosagens podem ter que ser ajustadaspara compensar. Geralmente, um pH entre 6 e 8 é preferido.

ARTIGOS DE PRODUÇÃO

Em outra modalidade da invenção, um artigo de produção con-tendo materiais úteis para o tratamento ou prevenção dos distúrbios ou con-dições descritos acima é fornecido. O artigo de produção compreende umrecipiente e um rótulo. Recipientes adequados incluem, por exemplo, garra-fas, frascos, seringas e tubos de ensaio. Os recipientes podem ser formadosa partir de uma variedade de materiais tais como vidro ou plástico. O recipi-ente retém uma composição da invenção, a qual é eficaz para prevenir outratar o distúrbio ou condição e pode ter uma porta de acesso estéril (porexemplo, o recipiente pode ser uma bolsa de solução intravenosa ou umfrasco com uma rolha furável por uma agulha de injeção hipodérmica). Oagente ativo na composição é um anticorpo antimiostatina da invenção. Orótulo nele, ou associado com o recipiente indica que a composição é usadapara tratar a condição de escolha. O artigo de produção pode ainda compre-ender um segundo recipiente compreendendo um tampão farmaceuticamen-te aceitável, tal como solução salina tamponada com fosfato, solução deRinger e uma solução de dextrose. Ele pode ainda incluir outros materiaisdesejáveis de um ponto de vista comercial e de uso, incluindo outros tam-pões, diluentes, filtros, agulhas, seringas e inserções de embalagens cominstruções para uso.

Os seguintes exemplos são oferecidos somente para propósitosilustrativos, e não são tencionados para limitar o escopo da presente inven-ção de qualquer forma.

EXEMPLOS

EXEMPLO 1: ENSAIOS DE ELISA

A. FABS ANTIMIOSTATINA PREFERIVELMENTE SE LIGAM À MIOSTATI-NA AO INVÉS DOGDF-11.

Fabs antimiostatina (ou mAbs de comprimento total) da presenteinvenção são testados em um ensaio elisa, no qual a ligação do Fab em umamiostatina madura (forma dimérica) revestida em várias concentrações emuma placa de 96 cavidades é medida. A ligação dos Fabs ao GDF-11 é tam-bém testada.

Cada cavidade de duas placas de 96 cavidades é revestida com200 ng/cavidade de miostatina de camundongo recombinante (R&D sys-tems, Cat. #788-G8/CF, livre de veículo, em tampão de carbonato, pH 9,6)ou 200 ng/cavidade de GDF-11 humano recombinante (Peprotech, Inc., Cat.# 120-11, sem veículo, em tampão de carbonato, pH 9,6). As placas são in-cubadas a 4 eC de um dia para o outro. As cavidades são aspiradas e lava-das duas vezes com tampão de lavagem (Tris 20 mM (hidroxime-til)aminometano, pH 7,4, 0,15 M de NaCI, 0,1% de Tween-20). As placas sãobloqueadas com 200 μ\- de tampão de bloqueio por cavidade (5% de leiteinstantâneo Carnation no tampão de lavagem acima) por 5 horas.

Fabs ou mabs a serem testados são diluídos em tampão de blo-queio em várias concentrações, por exemplo, 10 μ^ί, 2 μς/ηΊΐ., 0,4 μς/ιηΙ-,0,08 μς/Γηί., e 0,016 μςι/mL. Cinqüenta microlitros de cada solução Fab sãoadicionados nas placas revestidas com GDF-8 e GDF-11 em duplicata. Asplacas são incubadas por 1 hora em temperatura ambiente. As placas são,então lavadas 3 vezes com tampão de lavagem. Anticorpo secundário con-jugado com AP (50 μι. de AP anti-kappa de cabra (Southern Biotech), diluídoem tampão de bloqueio em 1:1000) é adicionado a cada cavidade e incuba-do por 1 hora em temperatura ambiente. As cavidades são, então, lavadas 3vezes com tampão de lavagem. Cinqüenta microlitros de substrato cromo-gênico (isto é, substrato AP) são adicionados a cada cavidade e deixados desenvolver em temperatura ambiente. A absorvância das cavidades é lidaem uma OD de 560 nm. A absorvância média das cavidades em duplicata édeterminada.

Todos os anticorpos da invenção são contemplados para se li-gar à miostatina madura humana ligada à placa e preferivelmente se ligam à miostatina em comparação com a ligação do GDF-11. Em um GDF-8 downELISA, Fab C12 tem uma IC50 de 0,25 μg/mL e Fab 510C2 tem uma IC50 de0,27 μg/mL.

B. ANTICORPOS ANTIMIOSTATINA OTIMIZADOS HUMANIZADOS SELIGAM AO PEPTÍDEO DE MIOSTATINA

Em um ensaio elisa, anticorpos da invenção se ligam em umpeptídeo purificado e biotinilado com a seqüência que abrange os aminoáci-dos de 40 64 da miostatina humana madura (SEQ ID NO: 53) com a exce-ção de que um ácido aminobutírico está na posição 47 ao invés do resíduode cisteína. Anticorpos da invenção também se ligam a um peptídeo com a seqüência mostrada na SEQ ID NO: 62 (com cisteína ou serina na posição47 da miostatina madura) assim como a forma madura da miostatina nasformas monomérica e dimérica.Em um ensaio elisa exemplar, 50 μL de uma solução 1 μς/ηπί.de anticorpo kappa anti-humano de cabra (UNLB, Southern Biotech 2060-01) em tampão de bicarbonato de sódio 50 mM, pH 8,0 é usado para cobrircada cavidade de uma placa de microtitulação de alta ligação (Greiner EK20061). As cavidades são aspiradas e lavadas com PBST (PBS, 0,1% deTween) e, a seguir, bloqueados por 1 hora com PBST-BSA (PBS, BSA a 1%,0,1% de Tween). As cavidades são, a seguir, lavadas novamente comPBST. Todas as etapas do ensaio são efetuadas em temperatura ambiente.As titulações do anticorpo antimiostatina humanizados otimizados (anticorpode comprimento total compreendendo uma região Fc de lgG4, transiente-mente expressa em 293 células), diluído em PBST-BSA começando em 50ng/cavidade são adicionadas aos cavidades e a placa é adicionalmente in-cubada por 1 h, lavada conforme acima e sondadas com 50 μL do peptídeobiotinilado descrito acima em uma concentração de 50 nM (diluído emPBST-BSA). A seguir, 50 μL de NeutrAvidin-AP 2 μg/mL (1:1000 em PBST-BSA, Pierce 31002) são adicionados e a detecção é alcançada pela adiçãodo substrato AP de acordo com as instruções do fabricante (Pierce 31002).O tampão sozinho é usado como um controle. Absorvância é lida a 560 nm.Os Fabs 510C2 e C12 se ligam ao peptídeo com valores de IC5o de 6,73 e5,42 ng/cavidade, respectivamente.

Anticorpos da invenção são capazes de se ligar a um peptídeoconsistindo nos aminoácidos 40 64 (SEQ ID NO: 53) de miostatina madurae/ou um peptídeo consistindo nos aminoácidos 43 57 (SEQ ID NO: 62) damiostatina madura (com um aminoácido de cisteína ou serina na posição47). Entretanto, os anticorpos da invenção não são capazes de se ligar (emníveis significativamente maiores do que os de fundo), peptídeos consistindonos aminoácidos 60 73, 74 86, 87 97, 96 108, 16 29, 1 15 ou 30 42 da mios-tatina madura. O anticorpo de murino nomeado Mab 3 (vide os Pedidos dePatente Americanos 60/559,621 e 60/555.456 aqui incorporados), compre-endendo regiões variáveis de murino (vide as figuras 10 e 11) operativamen-te ligado à região Fc de IgGI de murino não se liga a peptídeos consistindonos aminoácidos 60 73, 74 86, 87 97, 96 108, 16 29, 1 15 ou 30 42 da mios-tatina madura e é o anticorpo de origem para anticorpos da invenção.

Anticorpos humanizados 510C2 e C12 se ligam aos peptídeosconsistindo nos aminoácidos 43 57 e 45 59 da miostatina madura (conformemostrado ná Tabela 1 abaixo) até um grau similar. Isso demonstra que oepítopo da invenção está mais especificamente localizado no peptídeo queabrange os aminoácidos 45 57 da miostatina madura. A ligação é levementereduzida quando os anticorpos são testados para a ligação a um peptídeoconsistindo nos aminoácidos 47 61 da miostatina madura, demonstrando aimportância dos aminoácidos 45 46 da miostatina madura para a ligação oupara a preservação da conformação do peptídeo que permite a ligação. Aligação é adicionalmente reduzida quando os anticorpos são testados para aligação a um peptídeo consistindo nos aminoácidos 49 63 da miostatina ma-dura, demonstrando a importância dos aminoácidos 47 48 da miostatina ma-dura para a ligação ou para a conservação da formação do peptídeo quepermite a ligação. A ligação é reduzida até níveis de fundo quando os anti-corpos são testados para a ligação a um peptídeo consistindo nos aminoáci-dos 39 53 da miostatina madura, sugerindo a importância da região dos re-síduos 54 57.

TABELA 1

Peptídeo Resíduos Ligação Seq

Relativa Id No:

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(* do resíduo é C na miostatina)

C. ENSAIO ELISA DE MAB OTIMIZADO HUMANIZADO DE MIOSTATINA

Anticorpos monoclonais de comprimento total de miostatina anti-humanos humanizados 510C2 e C12 são testados em um ensaio elisa, noqual a ligação do anticorpo com o antígeno GDF-8 revestido em uma placa émedida. A reatividade cruzada dos Mabs ao GDF-11 é também testada.Uma condição sem Mab1 um isotipo de controle de anticorpo e uma proteínairrelevante (HGF) são usados como controles negativos.

Cada cavidade de placas de 96 cavidades é revestido com 70 μΙde GDF-8 humano (sem veículo, 1 pg/ml em tampão de carbonato, pH 9,6),GDF-11 recombinante humano (da Peprotech, Inc., catálogo #120-11, semveículo, 1 pg/ml em tampão de carbonato, pH 9,6) ou HGF humano recom-binante (da R & d Systems, catálogo # 294-HG/CF, livre de veículo, 1 pg/mlem tampão de carbonato, pH 9,6). As placas são incubadas a 4 9C de umdia para o outro. As cavidades são aspiradas e lavadas duas vezes comtampão de lavagem de (Tris 20 mM (hidroximetil)aminometano, pH 7,4, 0,15M de NaCI, Tween-20 0,1%). As placas são bloqueadas com 200 uL de tam-pão de bloqueio por cavidade (5% de leite instantâneo Carnation no tampãode lavagem acima) por 4 horas em temperatura ambiente. As placas sãolavadas duas vezes com tampão de lavagem.

Mabs são diluídos em tampão de bloqueio a 1 pg/mL, 0,2pg/mL, 0,04 pg/mL, 0,008 pg/mL, 0,0016 pg/mL e 0,00032 pg/mL. Um con-trole sem Mab é usado, o qual consiste somente de tampão de bloqueio. Umanticorpo de controle de isotipo é também usado como um controle negativo,em 1 pg/ml. A seguir, 50 μΙ_ de cada solução Mab são adicionados às cavi-dades revestidas com GDF-8 e GDF-11 em duplicata. As placas são incuba-das por 1 hora em temperatura ambiente. As cavidades são, a seguir, lava-das 3 vezes com tampão de lavagem.

A seguir, 50 μΐ_ de anticorpo secundário conjugado com peroxi-dase (HRP IgG anti-humano de cabra), fragmento gama Fc específico, Jack-son ImmunoResearch, catálogo # 109-035-008), diluído 1:2000 em tampãode bloqueio, são adicionados a cada cavidade e incubados por 1 hora emtemperatura ambiente. As cavidades são, a seguir, lavadas 3 vezes comtampão de lavagem. A seguir, 50 μΐ_ de substrato cromogênico (isto é, subs-trato OPD) são adicionados em cada cavidade e deixados desenvolver emtemperatura ambiente por 2,5 minutos. A reação é interrompida pela adiçãode HCI 1 N 100 μί. em cada cavidade. A absorvância das cavidades é lidaem 490 nm. A absorvância média das cavidades em duplicata é determina-da, e esses valores são listados na Tabela 2, abaixo.

Esses dados demonstram que Mabs 510C2 e G12 se ligam àmiostatina ligada à placa. Com considerações em relação à especificidade,esses Mabs preferivelmente se ligam ao GDF-8 em relação ao GDF-11. Mab510C2 mostra aproximadamente uma ligação 5 vezes maior em relação àmiostatina do que ao GDF-11.

TABELA 2

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Além disso, mab de comprimento total C12 foi demonstrado emum ensaio elisa para não se ligar a outros membros da superfamília de TGF-β BMP-2, BMP-3, BMP-3b/GDF-10, BMP-4, BMP-7, BMP-8B, Activina A,Activina B, TGF-a, TGF-βΙ, TGF^2 e GDF-3; ele demonstrou uma ligaçãomínima ao BMP-5. É contemplado que outros anticorpos antimiostatina dainvenção semelhantemente não se ligam ou se ligam minimamente a essesoutros membros da superfamília de TGF-β.

EXEMPLO 3 ENSAIO DE NEUTRALIZAÇÃO DE MIOSTATINA

Explantes ectodérmicos são removidos dos estágios 8 - 9 dablástula de embriões de Xenopus por procedimentos padronizados e cultiva-dos em MBS 0,5x (MBS 1x: 88 mM de NaCI, 1 mM de KCIj 0,7 mM de Ca-Cl2, 1 mM de MgSO4, 5 mM de HEPES1 2,5 mM de NaHCO3, 1:1000 v/v degentamicina, 0,1% de albumina de soro bovino) com a adição do fator decrescimento (GDF8 ou GDF11) mais ou indicado, por 18 horas a 18 eC, peloque o controle do tempo dos embriões alcançou o estágio de neurula inicial(estágios 15 16). Os explantes são fotografados e a extensão de cada ex-plante é medida usando um algoritmo de análise de imagem projetado paraa quantificação de carapuça animal. Explantes não-tratados ou com fator decrescimento ou Fab (controles), se arredondam em bolas de epiderme. Mios-tatina e GDF-11 induzem o mesoderma nesses explantes ectodérmicos osquais causam o alongamento dos explantes e formam estruturas tipo haltere.Anticorpos ou Fabs, quando testados para atividade de neutralização, sãoadicionados ao meio de cultura contendo miostatina para o comprimentototal do período de cultura e sua capacidade de inibir os movimentos de a-Iongamento induzidos pelo fator de crescimento é avaliada. Miostatina é adi-cionada aos explantes em 25 ng/mL. Anticorpos ou Fabs a serem testadossão adicionados em 20 μg/mL. Um Fab gerado para um antígeno irrelevanteé usado como um controle. Um anticorpo GDF8 anticamundongo monoclo-nal comercialmente disponível pode ser testado como um controle, esse an-ticorpo é produzido em cabras imunizadas com GDF8 de camundongo puri-ficado e demonstrado pelo fabricante por neutralizar o alongamento das ca-rapuças de animal Xenopus eliciado por 25 ng/mL de GDF8 de murinoquando presente em cerca de 10 20 μg/mL (R&D Systems Cat. #MAB788).

ImagePro (v. 4.5.1.22, da Media Cybrnetics) é usado para oprocessamento de imagem. Uma macro é escrita para automatizar o proces-samento de imagens. A macro processa a imagem e registra a extensão emunidades de bits. Métodos de medição alternativos podem ser usados con-forme é conhecido na técnica. Anticorpos da invenção são contemplados porneutralizar a atividade de GDF8 no ensaio de carapuça animal e não têmatividade de neutralização de GDF-11.

EXEMPLO 4: MEDIÇÃO DE AFINIDADE DE FABS

A afinidade (Kd) e as taxas de kon e de K3ff de Fabs antimiostati-na da presente invenção são medidas usando um instrumento Biacore®2000 contendo um circuito integrado de sensor CM4.

O Biacore® utiliza as propriedades óticas de ressonância deplasmônio dé superfície para detectar alterações na concentração de proteí-na de moléculas interagindo em uma matriz de biossensor de dextrana. Ex-ceto onde notado, todos os reagentes e materiais são comprados da Biaco-re® AB (Upsala, Suécia). Todas as medições são efetuadas a 25 2C. As a -mostra contendo Fabs são dissolvidas em tampão HBS-EP (cloreto de sódio150 mM, EDTA 3 mM, tensoativo P-20 0,05% (v/v) e HEPES 10 mM, pH7,4). Miostatina de GDF-11 (R&D Systems) é imobilizada em células de fluxode um circuito integrado CM4 usando química de acoplamento de amina. Ascélulas de fluxo (1 4) são ativadas com uma mistura 1:1 de N-hidroxissuccinimida 0,1 M e 3-(N,N-dimetilamino)propil-N-etilcarbodiimida 0,1M em uma taxa de fluxo de 20 μΙ_/ηηΐη. Miostatina ou GDF-11 (2,5 μg/mL emacetato de sódio 10 mM, pH 4,5) é injetado manualmente nas células de flu-xo individuais em uma taxa de fluxo de 10 μΙ_/ηιΐη. A densidade de superfícieé monitorada e até que cada célula de fluxo alcance uma densidade de su-perfície de ~ 150 unidades de resposta (RU). As superfícies são bloqueadascom uma injeção de 50 μΙ_ de etanolamina-HCI 1 M, pH 8,5 (10 μΙ/min). Paraassegurar a completa remoção de qualquer miostatina não-covalentementeligada ou GDF-11, 15 μί de glicina 10 mM, pH 1,5 é injetado duas vezes. Otampão de corrida usado para experimentos cinéticos continha HEPES 10mM, pH 7,4, NaCI 150 mM, 0,005% de P20.

A coleta de dados de ligação de cinética é efetuada em umataxa de fluxo máxima (100 uL/min). Cada ciclo de análise consiste de (i) inje-ção de 250 μΙ_ de um Fab (faixa de concentração de 50 nM até 0,4 nM emincrementos de diluição de 2 vezes) em relação a todas as 4 células de fluxocom a célula de fluxo 1 conforme a célula de fluxo de referência, (ii) 20 minde dissociação (fluxo de tampão), (iii) regeneração da superfície GDF-8 ouGDF-11 com duas injeções de 15 μί de glicina 10 mM, pH 1,5, (iv) uma inje-ção em branco de 15 μί de tampão de corrida, e (v) um tempo de estabiliza-ção de 2 minutos antes do início do próximo ciclo. O sinal é monitorado co-mo uma célula de fluxo 2 menos a célula de fluxo 1, a célula de fluxo 3 me-nos a célula de fluxo 1 e a células de fluxo 4 menos a célula de fluxo 1. Asamostras e um branco de tampão são injetados em duplicata em uma ordemaleatória. Os dados são processados usando o programa de computadorSCRUBBER (Center for Biomolecular Interaction Analysis, Univ. de Utah).As taxas de associação e de dissociação para cada ciclo são determinadaspelo ajuste dos dados do biossensor usando para um simples modelo deassociação usando CIampXP (Center for Biomolecular Interaction Analysis,Univ. de Utah) para extrair as constantes de taxa K5n e koft; a constante deligação de equilíbrio Kd é calculada usando a relação Kd = Wkon- Os dadosde afinidade medidos para a ligação da miostatina ao Fab de 510C2 são: konde 5,4 χ 105 M"V, Krff de 4,67 χ 10"4 seg"1, e Kd (cale) of 0,87 nM.

EXEMPLO 5: MEDIÇÃO DA AFINIDADE DOS MABS

Medições de afinidade de ligação para anticorpos monoclonaisde comprimento total da invenção são determinadas usando um ensaio Sa-pidyne KINEXA. Contas de Sepharose de fluxo rápido NHS-ativadas (GEHelthcare) são pré-revestidas com um anticorpo da invenção (50 μg de anti-corpo antimiostatina por mL de contas) e bloqueadas com 10 mg/mL de BSAem Tris-HCI 1 M, pH 8,0. A seguir, 20 pM e 50 pM de um anticorpo da inven-ção são incubados com várias concentrações (por exemplo, 2,4 pM até 20nM, diluições em série) de miostatina em tampão de corrida (PBS, 0,005%(v/v), Tween 20, 1 mg/mL de ovalbumina) por 10 horas em temperatura am-biente. Para determinar o anticorpo livre presente no equilíbrio, cada amos-tra é passada através das contas revestidas com miostatina. A quantidadede anticorpo ligado à conta é, a seguir, quantificada passando uma soluçãode anticorpo Fc anti-humano de cabra marcado fluorescentemente (Cy5) ,(Jackson ImmunoResearch), diluída em 1:4000 em tampão de corrida sobreas contas. O sinal de fluorescência medido é proporcional à concentração doanticorpo livre no equilíbrio. Cada concentração de miostatina é medida emduplicata. A constante de dissociação no equilíbrio (Kd) é obtida a partir deregressão não-linear das curas de competição usando um modelo de ligaçãohomogêneo em-sítio de curva múltipla (programa de computador KINEXA) eos dados são apresentados com intervalos de confiança de 95% (Cl).

A constante da taxa de associação (kon) para a ligação do GDF-8 é também determinada usando um ensaio Sapidyne KINEXA. Vinte pM deanticorpo é misturado com GDF-8 1 nM usando as mesmas condições des-critas acima. Em vários pontos de tempo, as amostras são sondadas para oanticorpo livre usando as condições descritas acima para a ligação de equi-líbrio, e a seguir a dependência de tempo resultante é ajustada usando oprograma de computador KINEXA para determinar a taxa de associação(kon)· A constante da taxa de dissociação (K)ff) é calculada usando a expres-são koff = Kd χ kon- Quando 510C2 e C12 de comprimento total (operativa-mente ligado a uma região Fc de IgG4) é medido usando o ensaio descrito,os resultados são conforme estabelecidos na Tabela 3 abaixo.

TABELA 3

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EXEMPLO 6 ENSAIO DE MIOSTATINA/SBE REPÓRTER

Nesse ensaio de repórter, um plasmídeo codificando um generepórter, isto é, um gene da luciferase, a jusante de um elemento de ligaçãoSMAD (SBE), mais especificamente (CAGA)i2 expressa a proteína luciferasequando uma molécula tal como miostatina, GDF-11, ou outro membro dasuperfamília das TGF-β se liga ao seu próprio receptor, disparando dessaforma a sinalização SMAD a qual resulta em um complexo SMAD fosforiladoo qual é capaz de se ligar ao SBE. A seqüência CAGA foi anteriormente re-portada como sendo uma seqüência responsiva TGF-β no promotor do geneinduzido por TGF-β PAI-1 (Denner et al., EMBO J., 17:3091-3100, 1998). Aquantidade de miostatina ativa exposta para as células é diretamente pro-porcional à quantidade de enzima luciferase produzida a qual é diretamenteproporcional à quantidade de luz produzida e mensurável. A presença de uminibidor (por exemplo, um anticorpo que se liga à miostatina) reduz a quanti-dade de miostatina capaz de ativar o SBE o qual por fim resulta em umaprodução reduzida de luz. Esse ensaio é também descrito no Número dePublicação Internacional WO 2004/037861 aqui incorporado.

É contemplado que um ensaio miostatina/SBE repórter não é limitado às exatas condições aqui descritas, outros tipos de células podemser usados, por exemplo, 293(HEK) (ATCC) ou células A204 Rhabsomyo-sarcoma (vide, por exemplo, Whittemore, et al. BBRC, 200: 965-71, 2003);outros tipos de repórteres podem ser usados, por exemplo, CAT, β-gal, GFPe outras condições de crescimento para células e condições de ensaio inclu- indo quantidades variantes de miostatina na reação podem ser usadas. Umapessoa versada na técnica poderia ser prontamente capaz de discernir seum ensaio cai dentro do escopo de um ensaio miostatina/SBE repórter paraele poder ter um vetor compreendendo um elemento SBE a montante de umgene repórter introduzido em uma célula hospedeira, em que o elemento SBE usado é responsivo ao SMAD produzido em resposta à miostatina quese liga ao receptor de miostatina. R.S. Thies, et al., Growth Factors, 18:251-259, 2001 descreve um ensaio similar enquanto Wittemore, L. et al., BBRC,300:965-971, 2003 descreve a resposta do elemento SBE ao SMAD produ-zido em resposta à ligação de miostatina ao seu receptor.

Nesse ensaio, células 293E (Edge Biosystems) em meioDMEM/F12 (3:1) (Gibco 93-0152DK), FBS 10%, Hepes 20 mM, L-glutamina4 mM são semeadas em cerca de 25.000 células por cavidade em cavidadesinternas revestidas com polilisina de uma placa de 96 cavidades (BD Biocoat35-4461) e incubadas de um dia para o outro a 37 9C. No dia seguinte, ascélulas são lavadas em PBS e 50 μΙ_ de OptiMEM I (Gibco 31985-070) é a-dicionado por cavidade. As células são transfectadas com 50 μΙ_ da seguintemistura de SBE-DNA de luciferase: (i) 80 μΙ_ de Iipofectamina (Gibco 11668-019 combinado com 1,5 mL de OptiMEM e deixadas decantar por 5 minutos,a seguir adicionadas em (ii) um tubo no qual 20 μg de DNA de SBE Iucifera-se são combinados com 1,5 mL de OptiMEM e 200 μΙ_ de reagente Plus1misturadas e deixadas decantar por 5 minutos. Depois das duas misturasserem adicionadas juntas, a solução é misturada vigorosamente e deixadaem repouso por 30 minutos antes de 50 μΙ_ serem adicionados em cada ca-vidade. As células são, a seguir, incubadas de um dia para o outro a 37 eCem CO2 5%. Para cada placa de células, 5 mL de miostatina (R&D Systems788-G8) são diluídos para 20 ng/mL em meio completo. Cada anticorpo dainvenção a ser testado é titulado em meio completo, por exemplo, de cercade 40 μg/mL até cerca de 50 ng/mL. O meio de transfecção é removido dascavidades e 50 μΙ_ de uma diluição de anticorpo são adicionados por cavida-de e 50 μί de GDF-8 (miostatina) ou GDF-11 (R&D Systems) são adiciona-dos por cavidade. A placa das células é, então, incubada de um dia para ooutro a 37 eC em CO2 5%. No dia seguinte, o meio é aspirado, as célulassão lavadas em PBS e 75 μΐ_ de tampão de Iise (Promega E266A) são adi-cionados. A atividade da Iuciferase no Iisato celular é medida usando Rea-gente Luciferase de acordo com as instruções do fabricante (PromegaE2620). A luminescência é marcada contra Iogi0 da concentração de Mabg/mL) e a IC50 para cada Mab para a miostatina e GDF-11 é calculada.

Os anticorpos monoclonais 510C2, C12 quando testados nes-sas condições com GDF-8 produz valores de IC5o (de uma média de doistestes) de 5,15 nM (5,74 e 4,57 nM) e 16,07 nM (23,04 e 9,12 nM) respecti-vamente. Nem a mAbs de 510C2 nem de C12 demonstraram atividade deneutralização nesse ensaio quando testado com GDF-11 ao invés de GDF-8.

EXEMPLO 7 FARMACOCINÉTICA

A farmacocinética (PK) dos anticorpos da invenção pode seravaliada em camundongos C57B6/SCID em uma dose de 1 mg/Kg depoisde uma única administração intravenosa (IV) ou intraperitoneal (IP). Os ani-mais recebem uma mistura de anticorpo não-marcado e marcado com 125Iem uma dose descrita acima e a concentração de soro é determinada base-ando-se na radioatividade de 125I no soro e na atividade específica da doseinjetada. A concentração de soro do anticorpo administrado ou IV ou IP ver-sus tempo é marcada.

EXEMPLO 8 EFEITO IN VIVO NA MASSA E FORCA MUSCULAR

Para determinar se um anticorpo da invenção bloqueia a ativi-dade da miostatina in vivo, um anticorpo da invenção pode ser testado emcamundongos SCID adultos. Camundongos SCID sofrem de imunodeficiên-cia combinada severa, e dessa forma não geram uma reação imunológicaapós a injeção de um anticorpo da invenção. A massa muscular é usadacomo um indicador para a atividade da miostatina em camundongos tratadoscom um anticorpo da invenção.

Camundongos de oito semanas de idade C57B6 SCID machossão pesados e distribuídos uniformemente em relação ao peso corporal emgrupos de oito. Um anticorpo da invenção em tampão PBS é injetado noscamundongos IP em várias doses (por exemplo, 60, 10, 5 e 1 mg/Kg) sema-nalmente. Camundongos tratados e não-tratados com PBS são usados co-mo controles. O tratamento continua por 4-012 semanas. A massa muscu-lar é avaliada pela dissecação e peso dos músculos gastrocnêmico e doquadríceps após o tratamento.

Para determinar a força muscular, a força do membro frontal émedida com uma pinça de teste de medição de força (por exemplo, modelo1027 csx, Columbus Instruments).

Claims

1. Anticorpo monoclonal antimiostatina que se liga especifica-mente à miostatina com uma afinidade não maior do que cerca de 3 χ 10'8Μ, em que ó referido anticorpo neutraliza ou antagoniza pelo menos umaatividade de miostatina.

2. Anticorpo monoclonal, de acordo com a reivindicação 1, emque o anticorpo monoclonal se liga à miostatina com uma afinidade não mai-or do que cerca de 9 χ 10"10 Μ.

3. Anticorpo monoclonal antimiostatina que tem uma IC5o nãomenor ou igual a cerca de 25 nM em um ensaio de miostatina/SBE in vitro.

4. Anticorpo monoclonal, de acordo com qualquer uma das rei-vindicações de 1 a 3, em que o anticorpo monoclonal se liga à miostatina nodomínio que abrange os aminoácidos 40 a 64 da miostatina madura.

5. Anticorpo monoclonal, de acordo com qualquer uma das rei-vindicações de 1 a 3, em que o anticorpo monoclonal se liga a um polipeptí-deo consistindo em uma seqüência de aminoácidos conforme mostrada nogrupo consistindo em: ANYCSGECEFVFLQKYPHTHLVHQA (SEQ ID NO: 53) e CSGECEFVFLQKYPH (SEQ ID NO: 62).

6. Anticorpo monoclonal, de acordo com qualquer uma das rei-vindicações de 1 a 5, o qual se liga preferivelmente a um polipeptídeo demiostatina em relação a um polipeptídeo GDF-11.

7. Anticorpo monoclonal, de acordo com qualquer uma das rei-vindicações de 1 a 6, em que o referido anticorpo é reativo de forma cruzadaa 35% ou menos com um polipeptídeo GDF-11.

8. Anticorpo monoclonal, de acordo com qualquer uma das rei-vindicações de 1 a 7, em que o referido anticorpo é um anticorpo quimérico,humanizado ou completamente humano.

9. Anticorpo monoclonal, de acordo com qualquer uma das rei-vindicações de 1 a 8, em que o referido anticorpo compete pela ligação àmiostatina em um ensaio elisa de competição com um anticorpo compreen-dendo dois polipeptídeos com as seqüências mostradas no grupo consistindo em: (i) SEQ ID NOS: 5 e 15, (ii) SEQ ID NOS: 5 e 16, e (iii) SEQ IDNOS: 10 e 26.

10. Anticorpo monoclonal, de acordo com qualquer uma dasreivindicações de 1 a 9, compreendendo dois polipeptídeos com uma se-qüência selecionada a partir do grupo consistindo em:(i) SEQ ID NO: 6 e SEQ ID NO: 14;(ii) SEQ ID NO: 5 e SEQ ID NO: 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20;(iii) SEQ ID NO: 7 e SEQ ID NO: 21, 22, 23, 24, 25 ou 56;(iv) SEQ ID NO: 8, 9, 10, 11 ou 12 e SEQ ID NO: 55.

11. Anticorpo monoclonal, de acordo com qualquer uma dasreivindicações de 1 a 9, em que o referido anticorpo compreende uma HCVRe uma LCVR, em que a HCVR compreende um peptídeo em CDRH1 comuma seqüência conforme mostrada na SEQ ID NO: 59, um peptídeo emCDRH2 com uma seqüência conforme mostrada na SEQ ID NO: 60 e umpeptídeo em CDRH3 com uma seqüência conforme mostrada na SEQ IDNO: 61, e em que a LCVR compreende um peptídeo em CDRL1 com umaseqüência conforme mostrada na SEQ ID NO: 57, um peptídeo na CDRL2com uma seqüência conforme mostrada na SEQ ID NO: 30 ou SEQ ID NO:-52, e um peptídeo em CDRL3 com uma seqüência conforme mostrada naSEQ ID NO: 58.

12. Anticorpo monoclonal, de acordo com a reivindicação 11,compreendendo ainda uma região de estrutura humana.

13. Anticorpo monoclonal de qualquer uma das reivindicações-11 ou 12, em que o referido CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2 eCDRL3 compreende um peptídeo conforme mostrado na Figura 9 aqui nacorrespondente posição da CDR.

14. Anticorpo monoclonal de acordo com qualquer uma das rei-vindicações de 1 a 13, em que o anticorpo monoclonal é um anticorpo decomprimento total, um anticorpo substancialmente intacto, um fragmentoFab, um fragmento F(ab')2 ou um fragmento Fv de cadeia individual.

15. Anticorpo monoclonal, de acordo com qualquer uma dasReivindicações de 1 a 13, em que o anticorpo monoclonal ainda compreendeuma região constante de cadeia pesada selecionada do grupo consistindoem IgGi1 IgG2l IgG3, IgG4, IgA1 IgE1 IgM e IgD.

16. Anticorpo monoclonal, de acordo com qualquer uma dasreivindicações de 1 a 15, em que a região constante presente no anticorpose origina do genoma de um animal selecionado do grupo consistindo emanimais domésticos, animais de esporte e animais de fonte de alimento.

17. Composição farmacêutica compreendendo o anticorpo comodefinido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 16.

18. Composição farmacêutica, como definido na reivindicação-17, compreendendo ainda um veículo farmaceuticamente aceitável.

19. Anticorpo como definido em qualquer uma das reivindica-ções de 1 a 16, para uso como um medicamento.

20. Uso de uma quantidade eficaz de um anticorpo, como defi-nido em qualquer uma das reivindicações 1 a 16, na preparação de um me-dicamento para aumentar a massa muscular ou aumentar a densidade ós-sea em um indivíduo necessitado disso.

21. Uso de uma quantidade eficaz de um anticorpo como defini-do em qualquer uma das reivindicações de 1 a 14, na preparação de ummedicamento para o tratamento ou prevenção de uma ou mais condiçõesselecionadas de fraqueza, caquexia, perda muscular, fraqueza muscular,miopatia, distrofia muscular, osteoporose, DPOC, falência ou doença renal,falência ou doença hepática, falência cardíaca, diabetes do tipo Il ou sín-drome metabólica.