BRPI0616936A2 - peptìdeos inéditos para tratamento e prevenção de distúrbios relacionados ao sistema imunológico, incluindo o tratamento e a prevenção de infecção por modulação da imunidade inata - Google Patents

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BRPI0616936A2
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nucleic acid
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Rozek Annett
Wayne Lentz Shannon
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Abstract

PEPTIDEOS INéDITOS PARA TRATAMENTO E PREVENçAO DE DISTURBIOS RELACIONADOS AO SISTEMA IMUNOLOGICO, INCLUINDO O TRATAMENTO E A PREVENçAO DE INFECçAO POR MODULAçãO DA IMUNIDADE INATA. Em um aspecto, a presente invenção fornece peptídeos isolados inéditos que podem ser usados para modular a imunidade inata em um indivíduo e/ou para o tratamento de um distúrbio relacionado ao sistema imunológico, incluindo o tratamento e a prevenção de infecção por modulação da imunidade inata. Também são fornecidos um agente reativo com o peptídeo, uma composição farmacêutica que inclui o peptídeo, uma molécula de ácido nucléico isolado que codifica o peptídeo, uma construção de ácido nucléico recombinante que inclui a molécula de ácido nucléico, pelo menos uma célula hospedeira que compreende a construção de ácido nucléico recombinante e um método de produção do peptideo com o uso da célula hospedeira. A presente invenção ainda fornece um método para tratamento e/ou prevenção de infecção em um indivíduo por administração do peptídeo da invenção ao indivíduo modulando, dessa forma, a imunidade inata no indivíduo. Adicionalmente, a presente invenção fornece um método para prever se um indivíduo responderia ao tratamento com um peptídeo da invenção.

Description

PEPTÍDEOS INÉDITOS PARA TRATAMENTO E PREVENÇÃO DEDISTÚRBIOS RELACIONADOS AO SISTEMA IMUNOLÓGICO, INCLUINDO OTRATAMENTO E A PREVENÇÃO DE INFECÇÃO POR MODULAÇÃO DA
IMUNIDADE INATA
PEDIDOS ANTERIORES RELACIONADOSEste pedido reivindica a prioridade dos PedidosProvisórios de Patente US 60/722.962, 60/722.958 e60/722.959, depositados em 4 de outubro de 2005, todosintitulados "Novel Peptides For Treating And PreventingInfection By Modulating Innate Immunity", e que são todosaqui incorporados por referência.
CAMPO DA INVENÇÃOEsta invenção está relacionada aos peptídeos para usono tratamento e na prevenção de distúrbios relacionados aosistema imunológico, incluindo o tratamento e a prevençãode infecção por modulação da imunidade inata. Em umaspecto, a invenção está relacionada às composições e usosdestas para a modulação da imunidade inata. Em outroaspecto, a invenção fornece peptídeos inéditos e usosdestes eficazes na redução da atividade de DPPIV.
FUNDAMENTOS DA INVENÇÃODiversos microorganismos, incluindo vírus, bactérias,fungos e parasitas, podem causar doenças. As célulasmicrobianas são distintas das células de animais e plantas- que são incapazes de viver isoladamente na natureza,existindo apenas como partes de organismos multicelulares.As células microbianas . podem ser patogênicas ou nãopatogênicas, dependendo, em parte, do microorganismo e doestado do hospedeiro. Por exemplo, em um hospedeiroimunocomprometido, uma bactéria normalmente inofensiva podese tornar um patógeno. A entrada em células hospedeiras écrucial para a sobrevida de patógenos bacterianos que sereplicam em um meio intracelular. Para organismos que sereplicam em locais extracelulares, a significância daentrada bacteriana nas células hospedeiras não é tão bemdefinida.
A resistência medicamentosa permanece um obstáculo noesforço contínuo para o combate às infecções. Por exemplo,a penicilina era eficaz no tratamento de Staphylococcusaureus, até a bactéria ter se tornado resistente. Por todaa segunda metade do século 20, foram desenvolvidos novosantibióticos como, por exemplo, vancomicina e meticilina;esses curavam com sucesso infecções por S. aureus. Noentanto, surgiram cepas resistentes à meticilina de S.aureus nos anos 70, e desde então têm sido um grandeproblema em hospitais em todo o mundo. Mais recentemente,surgiram cepas resistentes à vancomicina de S. aureus.
Com a ameaça crescente da resistência aos fármacosantimicrobianos e a emergência de novas doençasinfecciosas, há uma necessidade contínua de novos compostosterapêuticos. Substâncias terapêuticas que atuam sobre ohospedeiro, e não sobre o patógeno, são desejáveis, poiselas não estimulam a resistência patogênica. Em particular,fármacos que atuam sobre o hospedeiro através do sistemaimune inato fornecem uma fonte promissora de substânciasterapêuticas.
As defesas do hospedeiro contra microorganismoscomeçam com as barreiras epiteliais do corpo e o sistemaimune inato, e culminam na indução da resposta imunológicaadaptativa. A resposta imunológica inata do hospedeiroengloba um conjunto de mecanismos altamente conservados quereconhecem e combatem infecções microbianas. Elementos deimunidade inata são mantidos continuamente em níveisbaixos, e são ativados muito rapidamente quandoestimulados. A resposta imunológica inata começa comeventos que ocorrem imediatamente após exposição e umpatógeno microbiano. Eventos associados à imunidadeadaptativa como, por exemplo, o rearranjo dos genes doreceptor de imunoglobulina, não são considerados parte daresposta inata.
Há evidências que indicam que as respostas inatasservem de instrumento no controle da maioria das infecções,e também contribuem para as respostas inflamatórias. Asrespostas inflamatórias desencadeadas pela infecção sãosabidamente componentes centrais da patogênese da doença. Aimportância de receptores Toll-Iike (TLRs) na respostaimunológica inata também foi bem caracterizada. A famíliamamífera de TLRs reconhece moléculas conservadas, muitasdas quais são encontradas nas superfícies, ou são liberadaspor patógenos microbianos. Há vários outros mecanismosmenos bem caracterizados que iniciam e/ou contribuem para adefesa inata do hospedeiro.
O sistema imune inato fornece uma gama de mecanismosprotetores, incluindo a função de barreira epitelial e asecreção de citocinas e quimiocinas. Até hoje, quatrofamílias de quimiocinas foram categorizadas, de acordo como número de motivos de cisteína conservados no terminal N:C, CC, CXC e CX3C, em que X é um resíduo de aminoácido nãoconservado. As quimiocinas CXC são conhecidas por seremquimiotáticas para células que abrigam o receptor CXCR3,incluindo monócitos, células T ativadas (Thl) e células NK(natural killer). As células epiteliais primárias da viaaérea humana e a linhagem celular 16-HBE expressamconstitutivamente o receptor CXCR3 e seus ligantes, IP-IOfI-TAC e MIG (Kelsen e cols., wThe chemokine receptor CXCR3and its splice variant are expressed in human airwayepithelial cells", Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol.,287: L584, 2004). Além disso, ligantes de CXCR3 induzemrespostas quimiotáticas e reorganização de actina emcélulas 16 - HBE (Kelsen e cols'., "The chemokine receptorCXCR3 and its splice variant are expressed in human airwayepithelial cells", Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol.,287: L584, 2004).
Além disso, a serina protease dipeptidil peptidasetransmembrana IV do tipo II (DPPIV), também conhecida comoCD26 ou proteína de ligação de adenosina desaminase, é umregulador importante de vários processos fisiológicos,incluindo funções imunológicas. CD26/DPPIV é umaglicoproteína da superfície celular de 110 kD que éexpressa principalmente em timócitos maduros, células Tativadas, células B, células NK, macrófagos e célulasepiteliais. Ela possui pelo menos duas funções, uma funçãode transdução de sinal e uma função proteolítica (MorimotoC, Schlossman S.F. "Structure and function of CD26 in theT-cell immune response". Inimunol. Review. 1998, 161: 55-70.) . Um de seus papéis celulares envolve a modulação daatividade de quimiocina por clivagem de dipeptídeos doterminal N de quimiocina. A modulação dos terminais NH2 dequimiocinas é de grande importância não apenas para aligação aos seus receptores e para as reações seguintes,mas também para alteração da especificidade do receptor daquimiocina processada. A atividade de DPPIV foi associada adiversas condições relacionadas ao sistema imunológico.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
Os inventores descobriram que peptideos que possuem aseqüência de aminoácidos de um dos peptideos listados edescritos na TABELA 1 ou um análogo, derivado ou variantedesta podem aumentar a imunidade inata de um hospedeiro. Emum aspecto, verificou-se que os peptideos imunomoduladoresda invenção são desprovidos de atividade antimicrobiana,embora demonstrem uma habilidade de aumentar a sobrevida emhospedeiros infectados. Em outro aspecto, a invençãofornece peptideos que modulam a atividade de DPPIV. Em umaspecto, a invenção fornece peptideos que reduzem aatividade de DPPIV. Ainda em outro aspecto, a invençãofornece peptideos que podem ser usados no diagnóstico,tratamento ou prevenção de um distúrbio imunológico como,por exemplo, um associado à atividade de DPPIV e/ou àimunidade inata.
Conseqüentemente, em um aspecto, a presente invençãofornece um peptídeo isolado que inclui a seqüência deaminoácidos de qualquer uma da TABELA 1, ou um análogo,derivado ou variante desta, ou um equivalente químico óbviodesta, ou um peptídeo que compreende o referido peptídeo.
Em uma modalidade, o peptídeo é de até 10 aminoácidos quecompreendem o referido peptídeo. Como exemplo, o peptídeoisolado pode ter um terminal C modificado (por exemplo, umterminal C aminado) e/ou um terminal N modificado. 0peptídeo isolado da invenção pode ainda incluir a seqüênciade aminoácidos da TABELA 1 modificada por pelo menos umasubstituição de um aminoácido D. 0 peptídeo isolado podeainda incluir uma estrutura básica modificada, comoexemplo, em que o terminal N é modificado de uma amida paraum N-metil. Em um aspecto, aqueles peptídeos modificadosque retêm a atividade imunológica do peptídeo original, eequivalentes químicos óbvios deste que retêm a referidaatividade, são englobados dentro do escopo da presenteinvenção.
Em outro aspecto, a presente invenção ainda fornece umagente reativo com um peptídeo isolado que inclui aseqüência de aminoácidos da TABELA 1 ou um análogo,derivado ou variante desta. Em uma modalidade, o agente éum anticorpo de ocorrência não natural (por exemplo, umanticorpo policlonal ou monoclonal). Em uma modalidade, oanticorpo é feito com o uso de um antígeno MAPS anexado aopeptídeo da presente invenção por meio de 2 resíduos deglicina inseridos no terminal C do peptídeo. A construçãopode então ser administrada a um animal, por exemplo, umcoelho, e o anticorpo coletado com o uso de procedimentosbem conhecidos na técnica. Em um aspecto, esses agentespodem ser marcados ou usados para marcar peptídeos dainvenção. Em outro aspecto, esses agentes podem ser usadosem métodos diagnósticos e de rastreamento para monitoraragentes que podem modular a atividade do peptídeo ou paraquantificar a quantidade do peptídeo.
Ainda em outro aspecto, a presente invenção forneceuma molécula de ácido nucléico isolado que codifica umpeptídeo isolado que possui ou que compreende uma seqüênciade aminoácidos da TABELA 1 ou um análogo, derivado ouvariante desta. Também é fornecida uma construção de ácidonucléico recombinante que inclui a molécula de ácidonucléico ligada operacionalmente a um vetor de expressão.
Em um aspecto adicional, a presente invenção fornecepelo menos uma célula hospedeira que compreende aconstrução de ácido nucléico recombinante da invenção.Também é fornecido um método para a produção de um peptídeoque possui ou que compreende a seqüência de aminoácidos daTABELA 1 ou um análogo, derivado ou variante desta, por:(a) cultivo de pelo menos uma célula hospedeira, sobcondições que permitem a expressão do peptídeo; e (b)recuperação do peptídeo dessa célula hospedeira ou meio decultura desta.
Ainda em outro aspecto, a presente invenção forneceuma composição farmacêutica que inclui um peptídeo isoladoque possui ou que compreende a seqüência de aminoácidos daTABELA 1 ou um análogo, derivado ou variante desta(incluindo um sal farmaceuticamente aceitável, sal deadição ou éster de qualquer um dos citados anteriormente oupolimorfo), em combinação com um veículo, diluente ouexcipiente farmaceuticamente aceitável.
Em outro aspecto, a presente invenção fornece ummétodo para tratamento e/ou prevenção de infecção (porexemplo, uma infecção microbiana) em um indivíduo, poradministração ao indivíduo de um peptídeo que possui ou quecompreende a seqüência de aminoácidos da TABELA 1 ou umanálogo, derivado ou variante desta, ou equivalente químicoóbvio desta. Como exemplo, o indivíduo pode ter, ou emrisco de ter, infecção. Em uma modalidade, o peptídeomodula a imunidade inata no indivíduo tratando ouprevenindo, dessa forma, a infecção no indivíduo. Apresente invenção ainda fornece um método para aidentificação de uma infecção microbiana que pode sertratada com um peptídeo da invenção. Em outro aspecto, ainvenção fornece um método para tratamento ou prevenção deuma condição ou distúrbio relacionado à DPPIV.
Infecções exemplares que podem ser tratadas e/ouevitadas pelo método da presente invenção incluem umainfecção por uma bactéria (por exemplo, uma bactéria Gram-positiva ou Gram-negativa), uma infecção por um fungo, umainfecção por um parasita e uma infecção por um vírus. Emuma modalidade da presente invenção, a infecção é umainfecção bacteriana (por exemplo, infecção por E. coli,Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Salmonellaspp., Staphylococcus aureus, Streptococcus spp. ouenterococo resistente à vancomiciria) . Em outra modalidade,a infecção é uma infecção fúngica (por exemplo, infecçãopor um bolor, uma levedura ou um fungo superior). Ainda emoutra modalidade, a infecção é uma infecção parasitária(por exemplo, infecção por um parasita unicelular oumuiticelular, incluindo Giardia duodenalis, Cryptosporidiumparvum, Cyclospora eayetanensis e Toxoplasma gondii). Aindaem outra modalidade, a infecção é uma infecção viral (porexemplo, infecção por um vírus associado à AIDS, gripeaviaria, varicela, lesões por herpes simples (eold sores),resfriado comum, gastrenterite, febre glandular, influenza,sarampo, caxumba, faringite, pneumonia, rubéola, SARS einfecção do trato respiratório inferior ou superior (porexemplo, vírus sincicial respiratório)).
De acordo com o método da presente invenção, umpeptídeo que possui ou que compreende a seqüência deaminoácidos da TABELA 1 ou um análogo, derivado ou variantedesta, pode ser administrado ao indivíduo diretamente (ouseja, por administração do· próprio peptídeo) ouindiretamente (por exemplo, por administração ao indivíduode uma seqüência de ácidos nucléicos que codifica opeptídeo, de uma forma que permita a expressão do peptídeono indivíduo). O peptídeo da invenção (ou o ácido nucléicoque o codifica) pode ser administrado ao indivíduo por viaoral, parenteral (por exemplo, intradérmica, intramuscular,intraperitoneal, intravenosa ou subcutânea), transdérmica,intranasal, por administração pulmonar (por exemplo, poradministração intratraqueal) e/ou por bomba osmótica.
Ainda em outro aspecto, a presente invenção fornece ummétodo para prever se um indivíduo responderia aotratamento com um peptídeo que compreende a seqüência deaminoácidos da TABELA 1 ou um análogo, derivado ou variantedesta, por teste de uma amostra diagnostica do indivíduoquanto à atividade de DPPIV, em que a modulação, porexemplo, a redução da atividade de DPPIV, é indicativa deque o indivíduo responderia ao tratamento pelo peptídeo. Emum aspecto, o indivíduo tem ou é suspeito de ter umacondição ou distúrbio relacionado à DPPIV.
Aspectos e vantagens adicionais da presente invençãoficarão evidentes à luz da descrição que será apresentada aseguir. Deve-se entender, no entanto, que a descriçãodetalhada e os exemplos específicos, embora indiquemmodalidades preferidas da invenção, são oferecidos apenascomo ilustração, na medida em que várias alterações emodificações dentro do espírito e do escopo da invençãoficarão evidentes para aqueles habilitados na técnica apartir dessa descrição detalhada.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
A invenção será agora descrita em relação aosdesenhos, nos quais:
As FIG. IAeB revelam os·-resultados do experimentodescrito no Exemplo 2.
%Viabilidade = a quantidade de crescimento bacteriano emrelação ao controle de veículo (Tris), que é ajustado para100% de sobrevida bacteriana com os respectivos peptideosIDS. DE SEQ. Nos: 5, e 47; Erythr. = eritromicina.
As FIG. 2 A - G revelam os resultados do experimentodescrito no Exemplo 3. 0 gráfico mostra unidades deformação de colônias por ml (CFU/ml) no eixo Y, e o grupode tratamento (controle = sem peptídeo; IDS. DE SEQ. Nos:1, 4, 5, 6, 45 e 47 = tratamento com um peptídeo que possuia respectiva seqüência de aminoácidos) no eixo X. Émostrada a contagem bacteriana de camundongos individuais.
As FIG. 3 A e B revelam os resultados do experimentodescrito no Exemplo 4. O gráfico mostra unidades deformação de colônias por ml (CFU/ml) no eixo Y, e grupo detratamento (controle = sem peptídeo; IDS. DE SEQ. Nos: 1 e5 = tratamento com um peptídeo que possui a respectivaseqüência de aminoácidos) no eixo X. É mostrada a contagembacteriana de camundongos individuais.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
Definições
"Distúrbio relacionado à DPPIV" ou "condiçãorelacionada à DPPIV" ou "condição associada à DPPIV", comoaqui usados, significam qualquer condição médica que foicorrelacionada à atividade de DPPIV e em que a modulação dareferida atividade pode ser usada para tratar e/ou evitarou diagnosticar a referida condição. Exemplos dessascondições incluem, sem limitação: HIV/AIDS, condiçõesautoimunes, tais como artrite reumatóide, esclerosemúltipla, câncer (por exemplo, do cólon e do pulmão),diabetes e doença de Graves.
"Distúrbio relacionado ao sistema imunológico" é umacondição que está associada ao sistema imune de umindivíduo, tanto através da ativação quanto da inibição dosistema imune, ou que pode ser tratada, evitada oudiagnosticada por direcionamento de certo componente daresposta imunológica em um indivíduo como, por exemplo, aresposta imunológica inata.
"Imunologicamente ativo", como aqui usado, refere-se àatividade imune inata (por exemplo, a habilidade paramodular a resposta imunológica inata ou um componente destaem um indivíduo), ou à habilidade para modular a atividadede DPPIV.
"Modular" ou "que modula", como aqui usada, porexemplo, a modulação da atividade de DPPIV ou uma respostaem particular, engloba o aumento ou a diminuição daatividade ou da resposta em relação a um controle ou aonível normal ou basal da atividade ou da resposta, sobcertas condições. Ele também pode englobar a manutenção deum nível da atividade ou da resposta sob condições quenormalmente aumentariam ou diminuiriam o nível da atividadedo peptídeo ou da resposta.
"Sais farmaceuticamente aceitáveis" referem-se aossais atóxicos de metal alcalino, metal alcalino terroso ede amônio comumente usados na, indústria farmacêutica,incluindo os sais de sódio, potássio, lítio, cálcio,magnésio, bário, amônio e zinco protamina, que sãopreparados por métodos bem conhecidos na técnica. 0 termotambém inclui sais atóxicos de adição ácida, que sãogeralmente preparados por reação dos compostos destainvenção com um ácido orgânico ou inorgânico adequado. Saisrepresentativos incluem o sal de cloridrato, hidrobrometo,sulfato, bissulfato, acetato, oxalato, valerato, oleato,laureato, borato, benzoato, lactato, fosfato, tosilato,citrato, maleato, fumarato, succinato, tartarato,napsilato, trifluoracetato e semelhantes.
"Sais de adição ácida farmaceuticamente aceitáveis"refere-se àqueles sais que retêm a eficácia biológica e aspropriedades das bases livres e que não são biologicamenteou de algum outro modo indesejáveis, formados com ácidosinorgânicos, tais como ácido clorídrico, ácidohidrobrômico, ácido sulfúrico, ácido nítrico, ácidofosfórico e semelhantes, e ácidos orgânicos, tais comoácido trifluoracético, ácido acético, ácido propiônico,ácido glicólico, ácido pirúvico, ácido oxálico, ácidomálico, ácido malônico, ácido succínico, ácido maléico,ácido fumárico, ácido tartárico, ácido cítrico, ácidobenzóico, ácido cinâmico, ácido mandélico, ácidometanossulfônico, ácido etanossulfônico, ácido p-toluenossulfônico, ácido salicílico e semelhantes. Para umadescrição de sais de adição ácida farmaceuticamenteaceitáveis como pró-fármacos, veja Bundgaard, H., ed. ,(1985) "Design of Prodrugs", Elsevier Science Publishers,Amsterdam.
"Éster farmaceuticamente aceitável" refere-se àquelesésteres que retêm, mediante hidrólise da ligação éster, aeficácia biológica e as propriedades do ácido carboxílicoou álcool, e não são biologicamente ou de algum outro modoindesejáveis. Para uma descrição de ésteresfarmaceuticamente aceitáveis como pró-fármacos, vejaBundgaard, H., supra. Esses ésteres são formadostipicamente a partir do ácido carboxílico correspondente ede um álcool. Geralmente, a formação do éster pode serobtida através de técnicas sintéticas convencionais (veja,por exemplo, March, "Advanced Organic Chemistry", 3a Ed.,John Wiley & Sons, Nova York (1985) p. 11.57 e referênciasnele citadas, e Mark e cols., "Encyclopedia of ChemicalTechnology", John Wiley & Sons, Nova York (1980)). Ocomponente alcoólico do éster compreenderá geralmente: (i)um álcool alifático C2-C12 que pode ou não conter uma oumais ligações duplas, e pode ou não conter cadeiasramificadas de carbono, ou (ii) um álcool aromático ouheteroaromático C7-C12. Esta invenção também contempla o usodaquelas composições que tanto são ésteres como aquidescritos, quanto, ao mesmo tempo, são os sais de adiçãoácida farmaceuticamente aceitáveis destes.
"Amida farmaceuticamente aceitável" refere-se àquelasamidas que retêm, mediante hidrólise da ligação amida, aeficácia biológica e as propriedades do ácido carboxílicoou amina, e não são biologicamente ou de algum outro modoindesejáveis. Para uma descrição de amidasfarmaceuticamente aceitáveis como pró-fármacos, vejaBundgaard, H., ed., supra. Essas amidas são formadastipicamente a partir do ácido carboxílico correspondente euma amina. Geralmente, a formação da amida pode ser obtidaatravés de técnicas sintéticas convencionais (veja, porexemplo, March, "Advanced Organic Chemistry", 3a Ed., JohnWiley & Sons, Nova York (1985) p. 1.152 e Mark e cols.,"Encyclopedia of Chemical Technology", John Wiley & Sons,Nova York (1980)). Esta invenção também contempla o usodaquelas composições que são tanto amidas como aquidescritas, quanto, ao mesmo tempo, são os sais de adiçãoácida farmaceuticamente aceitáveis destas.
"Veículo farmacêutica ou terapeuticamente aceitável"refere-se a um meio transportador que não interfere com aeficácia da atividade biológica dos ingredientes ativos, eque não é tóxico para o hospedeiro ou paciente.
"Estereoisômero" refere-se a um composto químico quepossui o mesmo peso molecular, composição química econstituição que outro, mas com os átomos agrupados deforma diferente. Ou seja, certas porções químicas idênticasestão em orientações diferentes no espaço e, portanto,quando puras, possuem a habilidade para girar o plano daluz polarizada. No entanto, alguns estereoisômeros purospodem ter uma rotação óptica tão discreta que éindetectável com a instrumentação atual. Os compostos dapresente invenção podem ter um ou mais átomos assimétricosde carbono e, portanto, incluem vários estereoisômeros.
Todos os estereoisômeros imunologicamente ativos estãoincluídos dentro do escopo da invenção.
O termo "quantidade terapêutica ou farmaceuticamenteeficaz", quando aplicado às composições da presenteinvenção, refere-se à quantidade de composição suficientepara induzir um resultado biológico desejado. Aqueleresultado pode ser o alívio dos sinais, sintomas ou causasde uma doença, ou qualquer outra alteração desejada de umsistema biológico. Por exemplo, na presente invenção, oresultado envolverá tipicamente o aumento da respostaimunológica inata, a redução da atividade de DPPIV e/ou amodulação (por exemplo, a inibição ou redução ou nãoestimulação) das respostas inflamatórias à infecção ou àlesão tecidual.
Os resíduos de aminoácidos nos peptídeos sãoabreviados da seguinte forma: Fenilalanina é Phe ou F;Leucina é Leu ou L; Isoleucina "é Ile ou I; Metionina é Metou M; Valina é Val ou V; Serina é Ser ou S; Prolina é Proou P; Treonina é Thr ou T; Alanina é Ala ou A; Tirosina éTyr ou Y; Histidina é His ou H; Glutamina é Gln ou Q;Asparagina é Asn ou N; Lisina é Lys ou K; Ácido aspártico éAsp ou D; Ácido glutâmico é Glu ou E; Cisteína é Cys ou C;Triptofano é Trp ou W; Arginina é Arg ou R; e Glicina é Glyou G. Além disso, a abreviação Nal é usada pra representar1-naftilalanina; Ornitina é Orn ou O, Cit é citrulina; Hcié citrulina com um ou mais grupos metileno, e Vx ou Valinax, em que o "x" refere-se a uma variação na estruturabásica do aminoácido, em que a ligação do aminoácido não émais uma ligação amida, mas uma . amina metilada, e isso seaplica similarmente a outros aminoácidos com a designação"x". Além disso, ácido 2,4-diaminobutírico é Dab; ácido2,3-diaminopropiônico é Dpr ou Dapa; N-(4-aminobutil)-glicina é Nlys; hSer é homosserina,- Hyp é hidroxiprolina;Val(betaOH) é hidroxivalina; D-Pro é 3,4-dehidroprolina;Pyr é piroglutamina (prolina com CO= no anel); prolina comsubstituições flúor no anel; ácido 1,3-tiazolidina-4-carboxílico (prolina com S no anel); Thi é beta-(2-tienil)-alanina; Abu é ácido 2-aminobutírico; Nva é norvalina; Nleé norleucina; Hol é homoleucina, e Aib é ácido alfa-aminoisobutírico.
Além dos peptldeos que consistem somente emaminoácidos de ocorrência natural, também são fornecidospeptidomiméticos ou análogos de peptídeos. Análogos depeptídeos são usados comumente na indústria farmacêuticacomo fármacos não peptídicos com propriedades análogasàquelas do peptídeo-modelo. Esses tipos de compostos nãopeptídicos são denominados "miméticos de peptídeos" ou"peptidomiméticos" (Fauchere, J., Adv. Drug Res. 15: 29(1986) ; Veber e Freidinger, TINS p. 392 (1985) ; e Evans ecols. , J. Med. Chem. 30: 1.229 (1987), que são aquiincorporados por referência). Miméticos de peptídeos quesão estruturalmente similares aos peptídeosterapeuticamente úteis podem ser usados para produzir umefeito terapêutico ou profilático equivalente ou aumentado.Geralmente, peptidomiméticos são estruturalmente similaresa um peptídeo de paradigma (ou seja, um peptídeo que possuiuma atividade biológica ou farmacológica), por exemplo,peptídeo de ligação ao receptor de ocorrência natural, masque possui uma ou mais ligações peptídicas opcionalmentesubstituídas por uma ligação selecionada do grupo queconsiste em: -CH2NH-, -CH2S-, -CH2 = CH2-, -CH=CH- (eis etrans) , -COCH2-, -CH(OH)CH2- e -CH2SO-, por métodosconhecidos na técnica e descritos adicionalmente nasseguintes referências: Spatola, A. F. em "Chemistry andBiochemistry of Amino Acids, Peptides and Proteins", B.Weinstein, eds., Mareei Dekker, Nova York, p. 267 (1983);Spatola, A. F., Vega Data (março de 1983), Vol. 1, Exemplar3, "PEPTIDE BACKBONE MODIFICATIONS" (revisão geral);Morley, Trends Pharm. Sei. (1980) pp. 463-468 (revisãogeral); Hudson, D. e cols. , Int. J. Pept. Prot. Res. 14:177-185 (1979): (-CH2NH-, CH2CH2-); Spatola e cols., LifeSei. 38: 1.243-1.249 (1986): (-CH2-S); Hann. J. Chem. Soe.Perkin Trans. I 307-314 (1982):(-CH-CH-, eis e trans);Almquist e cols., J. Med. Chem. 23: 1.392-1.398 (1980): (-COCH2-); Jennings-White e cols., Tetrahedron Lett. 23:2.533 (1982): (-COCH2-); Szelke e cols., Pedido Europeu EP45665 CA: 97: 39.405 (1982) (-CH(OH)CH2); Holladay e cols.,Tetrahedron Lett. 24: 4.401-4.404 (1983): (-C(OH)CH2-); eHruby Life Sei. 31: 189-199 (1982): (-CH2-S-); cada um dosquais é aqui incorporado por referência. Em um aspecto, aligação não peptídica é -CH2NH-. Esses miméticos depeptídeos podem ter vantagens significativas em relação àsmodalidades de polipeptídeos, incluindo, por exemplo:produção mais econômica, maior estabilidade química,propriedades farmacológicas aprimoradas (meia-vida,absorção, potência, eficácia etc.), especificidade alterada(por exemplo, um espectro amplo de atividades biológicas),antigenicidade reduzida, e outras. A marcação depeptidomiméticos normalmente envolve a adesão covalente deum ou mais marcadores, diretamente ou através de umespaçador (por exemplo, um grupo amida), em posições nãointerferentes no peptidomimético que são previstas pordados quantitativos de estrutura-atividade e/ou modelagemmolecular. Essas posições não interferentes geralmente sãoposições que formam contatos diretos com as macromoléculas(por exemplo, moléculas da superfamília dasimunoglobulinas) às quais o peptidomimético se liga paraproduzir o efeito terapêutico. A derivatização (porexemplo, marcação) de peptidomiméticos não deve interferirsubstancialmente com a atividade biológica ou farmacológicadesejada do peptidomimético. Geralmente, ospeptidomiméticos de peptideos de ligação ao receptor seligam ao receptor com alta afinidade e possuem atividadebiológica detectável (ou seja, são agonistas ouantagonistas para uma ou mais mudanças fenotípicas mediadaspor receptor).
A substituição sistemática de um ou mais aminoácidosde uma seqüência de consenso com um D-aminoácido do mesmotipo (por exemplo, D-Iisina no lugar de L-lisina) pode serusada para gerar peptideos mais estáveis. Observa-se quesão desejadas substituições de D-aminoácidos nas quais aatividade imunológica do peptideo é mantida.
Descrição
Como aqui descrito, os inventores identificarampeptideos inéditos que possuem e/ou que compreendem aseqüência de aminoácidos mostrada na TABELA 1 ou umanálogo, derivado ou variante das seqüências de aminoácidosaqui reveladas. Os inventores também demonstraram que umpeptideo que possui ou que compreende uma das seqüências deaminoácidos da TABELA 1 e um terminal C aminado possuiutilidade terapêutica no aumento da imunidade inata. Emparticular, os inventores demonstraram que um peptideo quecompreende uma seqüência de aminoácidos da TABELA 1 nãopossuía eficácia antimicrobiana contra S. aureus, emborafornecesse proteção in vivo em camundongos infectados comS. aureus. O peptideo aumentou a resposta do hospedeiro àinfecção, resultando em aumento da depuração bacteriana eda sobrevida do hospedeiro. Dessa forma, os peptídeosinéditos descritos podem ser usados como uma substânciaterapêutica para o tratamento de uma doença infecciosa. Emoutra modalidade, demonstrou-se que os peptídeos dainvenção reduzem a atividade de DPPIV, o que, conformecomprovado, está relacionado a diversos distúrbiosrelacionados ao sistema imunológico como, por exemplo, AIDSe progressão da doença pelo HIV (Blazquez e cols. 1992;Vanham e cols. 1993; Schols e cols. 1998 Oravecz e cols.1995), doença de Graves (Eguchi e cols. 1989; Nishikawa ecols. 1995) e câncer (Stecca e cols. 1997), por exemplo,câncer do pulmão e do cólon, e diabetes (Hinke e cols.2000; Marguet e cols. 2000) . Além disso, demonstrou-se queDPPIV como indicador de ativação de células T flutua emparalelo com várias doenças autoimunes como, por exemplo,artrite reumatóide (Nakao e cols., 1989) e tireoiditeautoimune (Eguchi e cols., 1989). DPPIV foi descrita comomarcador que apresenta boa correlação com o nível deatividade dessas doenças. Foi ainda estudada como indicadorde progressão da doença na esclerose múltipla crônicaprogressiva (Constantinescu e cols., 1995). Os peptídeos dainvenção podem ser usados no tratamento dessas condições.
Peptídeos da invenção
Conseqüentemente, a presente invenção fornecepeptídeos isolados que possuem ou que compreendem aseqüência de aminoácidos da TABELA 1 ou um análogo,derivado ou variante imunologicamente ativo desta. Tambémsão fornecidos sais farmaceuticamente aceitáveis, sais deadição ácida e ésteres dos peptídeos, análogos, derivados,e variantes da invenção, incluindo aqueles aqui descritos,como, por exemplo, uma substituição conservadora emodificações do terminal C e N, e modificações da estruturabásica, como aqui descritas. Como aqui usado, um peptídeo"isolado" da invenção é um peptídeo que não tem umacontraparte de ocorrência natural ou que foi separado oupurificado de componentes que naturalmente o acompanham. Umpeptídeo isolado da invenção pode ser obtido, por exemplo,por expressão de um ácido nucléico recombinante quecodifica o peptídeo, ou por síntese química. Como umpeptídeo sintetizado quimicamente é, por sua natureza,separado dos componentes que naturalmente o acompanham, opeptídeo sintético é "isolado".
Em um aspecto, o peptídeo isolado da invençãocompreende a seqüência de aminoácidos que possui a fórmula:"XiX2P" (ID. DE SEQ. N°: 55), em que: Xi é selecionado dogrupo que consiste nos compostos baseados em Κ, H, R, S, T,O, Cit, Hei, Dab, Dpr ou glicina com grupos funcionaisbásicos substituídos no terminal N (por exemplo, Nlys),hSer, Val(betaOH) ou, em outra modalidade, é selecionado dogrupo que consiste em K, R, S, Oe Cit ou, em outramodalidade, selecionado do grupo que consiste em K, R e S,ou é R; e em que X2 é selecionado do grupo que consiste emV, I, K, PeH. Em uma modalidade, o peptídeo isolado dainvenção é do ID. DE SEQ. N°: 55. Em outro aspecto, ele éum peptídeo de até 10 aminoácidos, compreendendo umaseqüência de aminoácidos do ID: DE SEQ. N° : 55. Em umamodalidade, o peptídeo isolado do ID. DE SEQ. N°: 55 é dosIDS. DE SEQ. NoS: 8, 9, 26, 39; 40, 41 e 45-53, ou umpeptídeo isolado de até 10 aminoácidos compreendendo asreferidas seqüências. Em outra modalidade, o peptídeoisolado que compreende o ID. DE SEQ. N°: 55 é o ID. DE SEQ.N°: 44, que é de até 13 aminoácidos.
Em outra modalidade, a invenção fornece um peptideoisolado que compreende a fórmula, "XiX2X3P" (ID. DE SEQ. N°:56), em que Xi é selecionado do grupo que consiste noscompostos baseados em Κ, H, R, S, T, O, Cit, Hei, Dab, Dprou glicina com grupos funcionais básicos substituídos noterminal N (por exemplo, Nlys), hSer, Val(betaOH) ou, emoutra modalidade, selecionado do grupo que consiste em K,H, R, S, T e O ou, em outra modalidade, Κ, H, R, S e T, ou,em outra modalidade, Κ, H,· R, S e O, ou, em outramodalidade, R, Η, K e S; e em que X2 é selecionado do grupoque consiste em A, I, L, V, Κ, P, G, H, R, S, O, Dab, Dpr,Cit, Hei, Abu, Nva, Nle, e em que X2 pode ser metilado no Nou, em outra modalidade, selecionado do grupo que consisteem A, I, L, V, Κ, P, G, H e R, em que ele pode ser metiladono N; e em que X3 é selecionado do grupo que consiste em I,V, P, em que, em uma modalidade, X3 não é metilado no N. Emuma modalidade, o peptideo isolado pode ser uma seqüênciade aminoácidos de até 10 aminoácidos, que compreende o ID.DE SEQ. N°: 56, incluindo OS IDS. DE SEQ. Nos: 1, 3-7, 10-16, 18, 21- 25, 27, 28, 31-39, 42, 43 ou 47, ou um peptideoisolado de até 11 aminoácidos que compreende o ID. DE SEQ.N°: 54. No entanto, em uma modalidade, quando o ID. DE SEQ.N°: 56 for um hexâmero, ele não será o ID. DE SEQ. N°: 2ou, em uma modalidade, quando ele for um pentâmero, ele nãoserá o ID. DE SEQ. N°: 17. Em uma modalidade, o peptideoisolado da invenção não compreende um peptideo quecompreende os IDS. DE SEQ. N03: 2 ou 17.
Em outra modalidade, a invenção fornece um peptideoisolado compreendendo o peptídeo que compreende a fórmulado ID. DE SEQ. N° : 56 em um pentâmero ou hexâmero. Em umamodalidade, o referido peptídeo é imunologicamente ativo.
Em uma modalidade, o peptídeo isolado da invençãocompreende um peptídeo de fórmula, ^aX1X2X3P" (ID· DE SEQ.N°: 57), em que X1, X2 e X3 são como definidos para o ID. DESEQ. N°: 56, e em que "a" é selecionado do grupo queconsiste em S, Ρ, I, R, C, T, L, V, A, G, Κ, H, R, O, C, Me F ou, em outra modalidade, é selecionado do grupo queconsiste em, S, Ρ, I, R, C, T, L, V, A, G, Κ, H, R, 0, C eM ou, em outra modalidade, é selecionado do grupo queconsiste em, S, Ρ, I, R e C ou, em outra modalidade, é S.Em uma modalidade, o peptídeo isolado compreende o ID. DESEQ. N°: 57, ou é um peptídeo de até 10 aminoãcidos quecompreende a referida seqüência. Em outra modalidade, opeptídeo isolado é dos IDS. DE SEQ. N03: 4, 47, ou quandofor um hexâmero, o ID. DE SEQV' N°: 39, ou um peptídeoisolado de até 10 aminoácidos compreendendo as referidasseqüências.
Em outra modalidade, o peptídeo isolado da invençãocompreende um peptídeo de fórmula, "X1X2X3Pb" (ID. DE SEQ.N°: 58), em que X1X2X3 são como definidos no ID. DE SEQ. N°:56 e "b" é selecionado do grupo que consiste em A, A*, G,S, L, F, K, C, I, V, Τ, Y, R, H, 0 e M, mas em umamodalidade não é P ou, em outra modalidade, é selecionadodo grupo que consiste em A, A*, G, S, L, FeK ou, em outramodalidade, é selecionado do grupo que consiste em A, A*,G, S, L, KeC ou, em uma modalidade, é selecionado dogrupo que consiste em A, A*, G, S, Le K; em que A*representa um aminoácido D de Alanina. Em uma modalidade, opeptídeo isolado é um aminoácido de até 10 aminoácidos,compreendendo o ID. DE SEQ. N°: 58. Em uma modalidade, opeptídeo isolado é ou compreende os IDS. DE SEQ. Nos: 5 -8, 10, 11, 13-16, 21-25, 27, 28, 31, 33-38 e 42-43. Em5 outra modalidade, o peptídeo é do ID. DE SEQ. N°: 58, emque "b" não é P ou Y, ou não é RIVPP (ID. DE SEQ. N°: 17);ou em que X3 não é G ou não é RIGrPA, ou X3 não é Vx ou nãoé RIVxPA.
Em uma modalidade, o peptídeo isolado da invenção é ou10 compreende um peptídeo similar ao ID. DE SEQ. N°: 58, masem que Xi é selecionado do grupo que consiste em G, GG ouCit, ou em que "b" é A, X2 é I, X3 é V, Xi é G, GG, ou Cit,ou o peptídeo é dos IDS. DE SEQ. Nos: 19, 2 0 e 36. Em umamodalidade, o peptídeo isolado compreende o ID. DE SEQ. N°:15 31. Em outra modalidade, o peptídeo isolado compreende umaseqüência reversa do ID. DE SEQ. N°: 58, ou compreende oID. DE SEQ. N°: 30.
Em uma modalidade, o peptídeo isolado da invenção é oucompreende um peptídeo que possui a seqüência de
2 0 aminoácidos do ID. DE SEQ. N°: 29.
0 peptídeo da invenção também fornece um peptídeoisolado que compreende a fórmula, "axa2 XiX2X3P" (ID. DESEQ. N°: 59), em que Χχ, X2 e X3 são como definidos no ID.DE SEQ. N°: 56 e ai é selecionado do grupo que consiste em25 Κ, I R, H, O, L, V, A e G ou, em uma modalidade, K e I, ouem uma modalidade K e a2 são selecionados do grupo queconsiste em S, P, R Τ, Η, K, O, L, V, A, G, S e I ou, emuma modalidade, S, PeR ou, em outra modalidade, SeP ou,em outra modalidade, P. Em "Uma modalidade, ax não é
3 0 acetilado, ou quando ai for Κ, K não será acetilado ou nãoserá o ID. DE SEQ. N°: 2. Em uma modalidade, o peptídeoisolado é ou compreende os IDS. DE SEQ. N0 s: 1 e 4 7 ou umpeptídeo de até 10 aminoácidos compreendendo o ID. DE SEQ.N°: 59.
Em outra modalidade, o peptídeo isolado da invenção éou compreende um peptídeo da fórmula, "a X1X2XsPb" (ID. DESEQ. N°: 60), em que Xi, X2 e X3 são como definidos no ID.DE SEQ. N°: 56 e em que "a" é selecionado do grupo queconsiste em S, R, Κ, Η, O, Τ, I, L, V, A, G ou, em outra10 modalidade, S, R e I ou, em outra modalidade, SeR, e emque "b" é selecionado do grupo que consiste em A, V, I, L,G, Κ, H, R, O, S, T, F ou, em outra modalidade, A. Em outramodalidade, o peptídeo do ID. DE SEQ. N°: 60 é dos IDS. DESEQ. Nos: 3, 12 e 39, ou um peptídeo de até 10 aminoácidos15 compreendendo o ID. DE SEQ. N°: 60 ou os IDS. DE SEQ. Nos:3, 12 ou 39.
Como aqui usado, um "peptídeo que compreende umaseqüência de aminoácidos de uma seqüência da TABELA 1" ouum "peptídeo que compreende uma seqüência de aminoácidos de20 uma seqüência da TABELA 1" inclui o próprio peptídeo,equivalentes químicos óbvios deste, isômeros deste (porexemplo, isômeros, estereoisômeros, retro-isômeros, retro-inverso isômeros, todos os isômeros [D], todos os isômeros[L] , ou isômeros mistos [L] e [D] deste) , substituições25 conservadoras nele, formas precursoras deste, formasendoproteoliticamente processadas deste, por exemplo,clivagem de aminoácidos únicos dos terminais N ou C oumetabólitos imunologicamente ativos dos peptídeos dainvenção, sais f armaceuticame.xjte aceitáveis e ésteres3 0 deste, e outras formas resultantes de modificação pós-tradução. Também está incluída qualquer seqüência parente,até, e incluindo, 10, 9, 8, 7, 6, 5e4 aminoácidos decomprimento (ciclizados ou lineares, ou ramificados daseqüência parente central), para a qual a seqüênciaespecificada é uma subseqüência. Aqueles habilitados natécnica observarão que, quando o peptídeo na tabela for umtrímero, ele poderá ser uma subseqüência de um 10, 9, 8, 7,6, 5 e 4-mer, enquanto, se o peptídeo listado na TABELA 1for um hexâmero, ele poderá ser uma subseqüência de um 10,9, 8, e 7 mer, mas não um 5 ou 4-mer. Além disso, ainvenção compreende seqüências que são maiores do que 10-mer, os IDS. DE SEQ. NoS: 44 e 54. Aqueles peptídeosmodificados que retêm a atividade imunológica dos peptídeosda invenção são englobados dentro do escopo da presenteinvenção.
Ainda como aqui usado, um "equivalente químico óbvio"de um peptídeo da invenção é uma molécula que possui amesma atividade desejada, por exemplo, atividadeimunológica, como os peptídeos aqui descritos, e exibe umaquímica trivial diferente, ou uma molécula que éconvertida, sob condições brandas, em um peptídeo dainvenção (por exemplo, ésteres, éteres, produtos de reduçãoe complexos dos peptídeos da invenção).
Adicionalmente, como aqui usadas, "substituiçõesconservadoras" são aquelas substituições de aminoácidos quesão funcionalmente equivalentes ao resíduo de aminoácidosubstituído, tanto por terem polaridade ou arranjo estéricosimilar, quanto por pertencerem à mesma classe que oresíduo substituído (por exemplo, hidrofóbico, ácido oubásico). O termo "substituições conservadoras", como aquidefinido, inclui substituições que possuem um efeitoinsignificante sobre a habilidade do peptídeo da invençãopara aumentar a imunidade inata. Exemplos de substituiçõesconservadoras incluem a substituição de um resíduo polar(hidrofílico) por outro (por exemplo, arginina/lisina,glutamina/asparagina ou treonina/serina); a substituição deum resíduo apoiar (hidrofóbico) (por exemplo, isoleucina,leucina, metionina, fenilalanina, tirosina ou valina) poroutro; a substituição de um resíduo ácido (por exemplo,ácido aspártico ou ácido glutâmico) por outro; ou asubstituição de um resíduo básico (por exemplo, arginina,histidina, lisina ou ornitina) por outro.
O termo "análogo", como aqui usado, inclui qualquerpeptídeo que possui uma seqüência de aminoácidossubstancialmente idêntica a uma seqüência aqui descrita, emque pelo menos um resíduo fol· substituído conservadoramentecom um resíduo funcionalmente similar. Um "análogo" tem 60%ou mais (preferivelmente, 70% ou mais, 80% ou mais, 85% oumais, 90% ou mais, 95% ou mais, ou 99%) de homologia deseqüência de aminoácidos com uma seqüência de aminoácidosda TABELA 1, e é um variante funcional desta. Ainda comoaqui usado, o termo "variante funcional" refere-se àatividade de um peptídeo que demonstra uma habilidade paraaumentar a imunidade inata ou reduzir a atividade de DPPIV,como aqui descrito. Um "análogo" inclui uma variante de umaminoácido da TABELA 1 que possui uma conformaçãotridimensional homóloga. Um "análogo" ainda inclui qualquersal farmaceuticamente aceitável de um análogo, como aquidescrito. Uma "variante" ainda inclui qualquer salfarmaceuticamente aceitável de uma variante, como aquidescrito.
Um "derivado", como aqui usado, refere-se a umpeptideo da invenção que possui um ou mais aminoácidosquimicamente derivatizados por reação de um grupo lateralfuncional. Moléculas derivatizadas exemplares incluem, semlimitação, moléculas de peptideos nas quais grupos aminolivres foram derivatizadas para formar sais ou amidas, poradição de grupos acetil, cloridratos de amina, gruposcarbobenzoxi, grupos cloroacetil, grupos formil, grupos p-tolueno sulfonil ou grupos ;t-butiloxicarbonil. Gruposhidroxil livres podem ser derivatizados para formarderivados O-acil ou O-alquil. Além disso, grupos carboxillivres podem ser derivatizados para formar sais, ésteres(por exemplo, metil e etil ésteres) ou hidrazidas. Dessaforma, um "derivado" ainda inclui qualquer salfarmaceuticamente aceitável de um derivado, como aquidescrito.
Em uma modalidade da presente invenção, o peptideoisolado da invenção tem um terminal C modificado e/ou umterminal N modificado. Por exemplo, o peptideo isolado podeter um terminal C amidado. Por exemplo, o terminal aminopode ser acetilado (Ac) , ou o terminal carbóxi pode seramidado (NH2) . No entanto, em uma modalidade da invenção,os peptideos da invenção preferivelmente não são acetiladoscaso essa modificação resulte na perda da atividadeimunológica desejada. Modificações do terminal aminoincluem metilação (ou seja, -NHCH3 ou -NH(CH3)2),acetilação, adição de um grupo carbobenzoil, ou bloqueio doterminal amino com qualquer grupo de bloqueio que contenhauma funcionalidade carboxilato definida por RCOO-, em que Ré selecionado do grupo que consiste em naftil, acridinil,esteroidil e grupos similares. As modificações do terminalcarbóxi incluem a substituição do ácido livre por um grupocarboxamida, ou a formação de uma lactama cíclica noterminal carbóxi para introduzir restrições estruturais.
Em uma modalidade, podem ser feitas substituições daestrutura básica como, por exemplo, NH por NCH3. 0 peptídeoisolado também pode ser uma modificação (por exemplo, umamutação pontual, por exemplo, uma inserção ou umaeliminação ou um truncamento) de, ou que compreende, umaseqüência de aminoácidos da TABELA 1. Como exemplo, opeptídeo pode compreender uma seqüência de aminoácidos daTABELA 1 modificada por pelo menos uma inserção pontual deum aminoácido D, desde que a atividade imunológica desejadaseja mantida. Em particular, podem ser empregados análogosde prolina nos quais o tamanho do anel do resíduo deprolina é trocado de 5 membros para 4, 6 ou 7 membros.Grupos cíclicos podem ser saturados ou insaturados e, seinsaturados, podem ser aromáticos ou não aromáticos.
Podem-se substituir as cadeias laterais de ocorrêncianatural dos aminoácidos geneticamente codificados (ou Daminoácidos) com outras cadeias laterais com propriedadessimilares, por exemplo, com grupos como alquil, alquilinferior, alquil cíclico de 4, 5, 6 a 7 membros, amida,amida alquil inferior, amida di(alquil inferior), alcóxiinferior, hidróxi, carbóxi e os derivados de éster inferiordestes e com heterocíclico 4, 5, 6, a 7 membros.
Tais substituições podem incluir, mas não se limitamnecessariamente a: (1) aminoácidos carregados positivamentenão padronizados, como: ornitina, Dab; ácido 2,4-diaminobutírico, que é semelhante à ornitina menos um grupometileno (ou lisina menos dois grupos metileno), Dpr ouDapa; ácido 2,3-diaminopropiônico, que é semelhante àornitina menos dois grupos metileno (ou lisina menos trêsgrupos metileno, ou serina com um grupo amino ao invés dehidroxil), Nlys; N-(4-aminobutil)-glicina, que tem a cadeialateral lisina anexada ao "terminal Ν", e compostos comgrupos aminopropil ou aminoetil anexados ao grupo amino daglicina. (2) , aminoácidos de ocorrência não natural, comoarginina, sem carga, como, Cit; citrulina e Hei; citrulinacom mais um grupo metileno; (3) aminoácidos de ocorrêncianão natural não padronizados com OH (como, por exemplo,serina), por exemplo, hSer; homoserina (mais um grupometileno, Hyp; hidroxiprolina, Val(betaOH); hidroxivalina,Pen; penicilamina, (Vai(betaSH); (4) derivados de prolinacomo, por exemplo, D-Pro, por exemplo, 3,4-dehidroprolina,Pyr; piroglutamina (prolina com C=O no anel), prolina comsubstituições de flúor no anel, ácido 1,3-tiazolidina-4-carboxílico (prolina com S no anel) ; (5) derivado dehistidina como, por exemplo, Thi; beta-(2-tienil)-alanina;ou (6) derivados de alquil como, por exemplo, Abu; ácido 2-aminobutxrico (grupo etil no C-alfa), Nva; norvalina (grupopropil no C-alfa), Nle; norleucína (grupo butil no C-alfa),Hol; homoleucina (grupo propil no C-alfa), Aib, ácido alfa-aminoisobutírico (valina sem grupo metileno). Aqueleshabilitados na técnica observarão que essas substituiçõesretêm a atividade imunológica do peptídeo/seqüênciaparente.
Em outra modalidade alternativa, o grupo carboxil doterminal C ou um éster do terminal C pode ser induzido aciclizar por deslocamento interiio do -OH ou do éster (-0R)do grupo carboxil ou éster, respectivamente, com o grupoamino do terminal N, para formar um peptídeo cíclico. Porexemplo, após síntese e clivagem para gerar o peptídeoácido, o ácido livre é convertido em um éster ativado porum ativador de grupo carboxil apropriado como, por exemplo,diciclohexilcarbodiimida (DCC) em solução, por exemplo, emmisturas de cloreto de metileno (CH2Cl2) , dimetil formamida(DMF). O peptídeo cíclico é então formado por deslocamentointerno do éster ativado com a amina do terminal Ν. Aciclização interna, ao contrário da polimerização, pode serintensificada pelo uso de soluções muito diluídas. Essesmétodos são bem conhecidos na técnica.
Pode-se também ciclizar os peptídeos da invenção, ouincorporar um resíduo desamino ou descarboxi nos terminaisdo peptídeo, de forma que não haja amino terminal ou grupocarboxil, para diminuir a suscetibilidade às proteases, oupara restringir a conformação do peptídeo. Gruposfuncionais do terminal C dos compostos da presente invençãoincluem amida, amida alquil inferior, amida di(alquilinferior), alcóxi inferior, hidróxi e carbóxi, e osderivados de éster inferior destes, e os saisfarmaceuticamente aceitáveis destes.
Pode-se também ciclizar o ,,peptídeo por adição de umacisteína no terminal N e/ou C, e ciclizar o peptídeoatravés de ligações dissulfeto ou outras interações dacadeia lateral.
Pode-se também incorporar um resíduo desamino oudescarboxi nos terminais do peptídeo, de forma que não hajaamino terminal ou grupo carboxil, para diminuir asuscetibilidade às proteases, ou para restringir aconformação do peptídeo.
Método de produção dos peptídeos
A presente invenção contempla peptídeos, incluindoanálogos de peptídeos; derivados e variantes, que sãoproduzidos sinteticamente, gerados de forma recombinante,ou isolados de células nativas. Um peptídeo da invençãopode ser sintetizado por métodos comumente conhecidos poraqueles habilitados na técnica (por exemplo, como descritoem "Modern Techniques of Peptide and Amino Acid Analysis"(Nova York: John Wiley & Sons, 1981) e Bodansky, M.,"Principies of Peptide Synthesis" (Nova York: Springer-Verlag N.Y., Inc., 1984)). Exemplos de métodos que podemser empregados na síntese dos peptídeos da invençãoincluem, sem limitação, síntese peptídica de fase sólida,síntese peptídica em solução ou por método líquido, esíntese com o uso de qualquer um dos sintetizadorespeptídicos disponíveis comercialmente. Em uma modalidade,um peptídeo da invenção é sintetizado in vitro, porexemplo, por meios químicos, ou tradução de mRNA in vitro.
Em outra modalidade, um peptídeo da invenção é produzido deforma recombinante, com o uso de técnicas convencionais ecDNA que codifica o peptídeo. As seqüências de aminoácidosda presente invenção podem ainda compreender agentes deacoplamento e grupos de proteção que são usados na síntesede seqüências peptídicas, e que são bem conhecidos poraqueles habilitados na técnica.
Análogos, derivados e variantes de peptídeos dainvenção podem ser feitos por uma ampla variedade dediferentes técnicas de mutagênese bem conhecidas poraqueles habilitados na técnica. Essas técnicas podem serencontradas em qualquer manual de laboratório de biologiamolecular, incluindo, por exemplo, Sambrook e cols.,"Molecular Cloning - A Laboratory Manual", 2a ed.(Plainview, NY: Cold Spring Harbor Press, 1989); ou Ausubele cols., "Current Protocols in Molecular Biology" (JohnWiley & Sons). Também estão disponíveis kits de mutagênesepor vários fornecedores comerciais de suprimentos debiologia molecular. Estão disponíveis métodos para arealização de mutagênese sítio-dirigida, regioespecífica oualeatória, na seqüência de aminoácidos inicial. Após aprodução dos análogos, derivados e variantes, eles podemser pesquisados quanto à habilidade desejada para aumentara imunidade inata, como aqui descrito.
Agentes que reagem com o peptídeo
A presente invenção ainda fornece um agente reativocom um peptídeo que compreende uma seqüência de aminoácidosda TABELA 1 ou um análogo, derivado ou variante desta. Comoaqui usado, "reativo" significa que o agente possuiafinidade, se liga ou é dirigido contra o peptídeo dainvenção. Ainda como aqui usado, um "agente" deve incluiruma proteína, um polipeptídeo, um peptídeo, um ácidonucléico (incluindo DNA ou RNA), um anticorpo de ocorrêncianão natural, um fragmento Fab, um fragmento F(ab')2, umamolécula, um composto, um antibiótico, um fármaco, equaisquer combinações destes.' Um fragmento Fab é umfragmento de ligação de antígeno univalente de anticorpo,que é produzido por digestão com papaína. Um fragmentoF(ab')2 é um fragmento de ligação de antígeno divalente deum anticorpo, que é produzido por digestão com pepsina. Depreferência, o agente da presente invenção é marcado com ummarcador ou rótulo detectável. Um "anticorpo de ocorrêncianão natural" significa um anticorpo que é gerado com opeptideo associado a outro composto, por exemplo, doisresíduos de glicina do terminal Ç e MAPS. 0 antígeno MAPS éanexado ao peptideo da presente invenção por meio de 2resíduos de glicina inseridos no terminal C do peptideo. Aconstrução pode então ser administrada a um animal, porexemplo, um coelho, e o anticorpo coletado com o uso deprocedimentos bem conhecidos na técnica.
Em uma modalidade da presente invenção, o agentereativo com o peptideo da invenção é um anticorpo. Comoaqui usado, o anticorpo da presente invenção pode serpoliclonal ou monoclonal. Além disso, o anticorpo dapresente invenção pode ser produzido por técnicas bemconhecidas para aqueles habilitados na técnica. O anticorpopoliclonal, por exemplo, pode ser produzido por imunizaçãode um camundongo, coelho ou rato com um peptideo dainvenção purificado. 0 anticorpo monoclonal pode então serproduzido por remoção do baço do animal imunizado, efundindo-se as células esplênicas com células de mieloma,para formar um hibridoma, o qual, quando desenvolvido emcultura, produzirá um anticorpo monoclonal. Veja, porexemplo, J.G.R. Hurrel, "Monoclonal Hybridoma Antibodies:Techniques and Applications" (Boco Raton, FL: CRC PressInc., 1982).
0 anticorpo da invenção pode ser marcado com ummarcador ou rótulo detectável. A marcação de um anticorpopode ser obtida com o uso de uma dentre diversas técnicasde marcação, incluindo peroxidase, marcadoresquimioluminescentes conhecidos na técnica, e marcadoresradioativos conhecidos na técnica. 0 marcador ou rótulodetectável da presente invenção pode ser, por exemplo, ummarcador não radioativo ou fluorescente como, por exemplo,biotina, fluoresceína (FITC), acridina, colesterol oucarbóxi-X-rodamina, que pode ser detectado com o uso defluorescência e outras técnicas de imagem facilmenteconhecidas na técnica. Alternativamente, o marcador ourótulo detectável pode ser um marcador radioativoincluindo, por exemplo, um radioisótopo. O radioisótopopode ser qualquer isótopo que emita radiação detectávelcomo, por exemplo, 35S, 32P, 125I, 3H ou 14C. A radioatividadeemitida pelo radioisótopo pode ser detectada por técnicasbem conhecidas na técnica. Por exemplo, a emissão gama doradioisótopo pode ser detectada com o uso de técnicas deimagem gama, particularmente imagens cintigráficas. Depreferência, o agente da presente invenção é um anticorpode alta afinidade marcado com um marcador ou rótulodetectável.
Moléculas de ácido nucléico isolado
Além disso, a presente invenção fornece uma moléculade ácido nucléico isolado que codifica um peptídeo quecompreende uma seqüência de aminoácidos da TABELA 1 ou umanálogo, derivado ou variante desta, incluindo um peptídeoconjugado (por exemplo, uma construção transportadora depeptídeo) ou outro peptídeo, ou um pró-peptídeo quemetaboliza ou cliva em um peptídeo imunologicamente ativoda TABELA 1. Em função da degeneração do código genético, amolécula de ácido nucléico da, invenção inclui diversassubstituições de ácidos nucléicos que também codificarão umpeptídeo da invenção. A presente invenção ainda fornece umácido nucléico que hibridiza para a molécula de ácidonucléico isolado que codifica uma seqüência de aminoácidosda TABELA 1 ou um análogo, derivado ou variante desta.
As moléculas de ácido nucléico da presente invençãopodem ser DNA ou RNA. Elas podem ser preparadas por váriastécnicas conhecidas por aqueles habilitados na técnica queincluem, sem limitação, a síntese automatizada deoligonucleotídeos com o uso de sintetizadores deoligonucleotídeos disponíveis comercialmente como, porexemplo, o sintetizador Applied Biosystems Modelo 3 92DNA/RNA. Além disso, as moléculas de ácido nucléico dapresente invenção podem ser marcadas com um ou maismarcadores ou rótulos detectáveis. A marcação das moléculasde ácido nucléico pode ser obtida com o uso de diversosmétodos conhecidos na técnica - por exemplo, tradução nick,marcação de extremidade, marcação de extremidade fill-in,reação de troca de polinucleotídeo quinase, random priming,ou SP6 polimerase (para preparação de riboprobe)juntamente com um dentre vários marcadores - por exemplo,marcadores radioativos como, por exemplo, 35S, 32P ou 3H, oumarcadores não radioativos como, por exemplo, biotina,fluoresceína (FITC), acridina, colesterol ou carbóxi-X-rodamina (ROX).
A presente invenção também fornece uma construção deácido nucléico recombinante que compreende uma molécula deácido nucléico da invenção ligada operacionalmente a umvetor de expressão. Como aqui usado, um "vetor deexpressão" é uma construção de DNA que contém uma seqüênciade DNA que está ligada operacionalmente a uma seqüência decontrole adequada capaz de efetuar a expressão do DNA era umhospedeiro adequado. 0 vetor pode ser, por exemplo, umplasmídeo, uma partícula de fago ou uma inserção genômicapotencial. Ainda como aqui usado, o termo "ligadooperacionalmente" descreve um relacionamento funcionalentre duas regiões de DNA. Vetores de expressão adequadospara uso na presente invenção compreendem pelo menos umelemento de controle de expressão (por exemplo, operador,promotor, sistema Iac, seqüência-líder, códon de terminaçãoe/ou sinal de poliadenilação) ligado operacionalmente àmolécula de ácido nucléico que codifica um peptídeo dainvenção. Em uma modalidade, o vetor de expressão é umvetor de expressão eucariótico que funciona em célulaseucarióticas (por exemplo, um vetor retroviral, um vetor dovírus da vacínia, um vetor de adenovírus, um vetor do vírusdo herpes ou um vetor do vírus fowl pox).
Uma vez ligado operacionalmente a uma molécula deácido nucléico da invenção, o vetor de expressão pode serintroduzido em uma célula receptora por qualquer meio invivo ou ex vivo adequado para transferência de ácidonucléico, incluindo, sem limitação, eletroporação,transfecção com DEAE Dextrana, transfecção com fosfato decálcio, lipofecção, fusão de lipossomo monocatiônico, fusãode lipossomo policatiônico, fusão de protoplasto, criaçãode um campo elétrico in vivo, bombardeamento demicroprojétil revestido com DNA, injeção com vírus comreplicação recombinante defeituosa, recombinação homóloga,vetores virais, transferência de DNA naked, ou qualquercombinação destas. Vetores virais recombinantes adequadospara transferência de ácidos nucléico incluem, semlimitação, vetores derivados dos genomas de vírus como, porexemplo, retrovírus, HSV, adenovírus, vírus adeno-associado, vírus Semiliki Forest, citomegalovírus e vírusda vacínia.
A presente invenção ainda fornece pelo menos umacélula hospedeira que compreende a construção de ácidonucléico recombinante da invenção. A célula hospedeira dainvenção é transformada com a construção de ácido nucléicoaqui descrita. A célula hospedeira pode ser eucariótica(por exemplo, uma célula de animal, planta, inseto oulevedura) ou procariótica (por exemplo, E. coli).
Além disso, a presente invenção fornece um método paraa produção de um peptídeo que compreende uma seqüência deaminoácidos da TABELA 1 ou de um análogo, derivado ouvariante desta. O método compreende as etapas de: (a) ocultivo de pelo menos uma célula hospedeira que compreendeuma construção de ácido nucléico recombinante, como aquidescrito, sob condições que permitem a expressão dopeptídeo; e (b) recuperação do peptídeo dessa célulahospedeira ou do meio de cultura desta. O peptídeorecombinante pode ser recuperado como um lisado bruto; eletambém pode ser purificado por procedimentos padronizadosde purificação de proteínas conhecidos na técnica,incluindo, sem limitação, cromatografia por afinidade eimunoafinidade, precipitação diferencial, eletroforese emgel, cromatografia por troca iônica, focalizaçãoisoelétrica, cromatografia por exclusão de tamanho, esemelhantes.
Composição farmacêutica
A presente invenção ainda fornece uma composiçãofarmacêutica que compreende um peptídeo compreendendo umaseqüência de aminoácidos da TABELA 1 ou IDS. DE SEQ. Nos:1, 3-16 ou 18-60, ou um análogo, derivado ou variante desta(que inclui seu sal farmaceuticamente aceitável, sal deadição ácida ou éster de qualquer um dos citadosanteriormente), em combinação com pelo menos um veículo,diluente ou excipiente farmaceuticamente aceitável. 0veículo, diluente ou excipiente farmaceuticamente aceitáveldeve ser "aceitável" no sentido de ser compatível com osoutros ingredientes da composição, e não ser prejudicial aoseu receptor. Exemplos de veículos, diluentes e excipientesfarmacêuticos aceitáveis incluem, sem limitação,carboximetil celulose, celulose cristalina, glicerina, gomaarábica, lactose, estearato de magnésio, metil celulose,pós, soro fisiológico, alginato de sódio, sacarose, amido,talco e água, dentre outros. As formulações da composiçãofarmacêutica da invenção, como aqui descritas, podem serconvenientemente apresentadas em dosagem unitária.
Usos
Os peptídeos da invenção demonstraram ter utilidadeterapêutica no aumento da imunidade inata. 0 aumento daimunidade inata é demonstrado pela ausência de atividadeantimicrobiana (Exemplo 2) e pela proteção contra infecçãoem modelos in vivo (Exemplos 3 e 4), e também pelos ensaiosde DPPIV do Exemplo 5. Conseqüentemente, a presenteinvenção também fornece um método para tratamento e/ouprevenção de infecção em um indivíduo. Como aqui usado, o"indivíduo" é um pássaro (por exemplo, uma galinha, peruetc.) ou um mamífero (por exemplo, uma vaca, um cachorro,um ser humano, um macaco, um camundongo, um porco, um ratoetc.). Em uma modalidade, o indivíduo é um ser humano. 0indivíduo pode ter, ou estar sob risco de ter, umainfecção. Como exemplo, a infecção pode ser uma infecçãomicrobiana. Infecções microbianas que podem ser tratadaspelo método da presente invenção incluem, sem limitação,infecção por uma bactéria, infecção por um fungo, infecçãopor um parasita e infecção por um vírus.
A maioria dos patógenos bacterianos está presente noambiente geral, ou na flora bacteriana normal dohospedeiro. As bactérias desenvolveram a habilidade paracausar doença grave por aquisição de diferentes mecanismos(denominados fatores de virulência) que as permitemcolonizar, se disseminar e invadir tecidos do hospedeiro.
Quando esses fatores de patogenicidade são suprimidos, asbactérias passam a não ser capazes de se manter nos tecidosdo hospedeiro, e, portanto, não podem causar doenças.
Bactérias exemplares que podem ser tratadas pelo método dapresente invenção incluem, sem limitação, E. coli,Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Salmonellaspp. (por exemplo, Salmonella typhimurium), Staphylococcusaureus, Streptococcus spp. e enterococo resistente àvancomicina.
Pseudomonas aeruginosa é uma bactéria Gram-negativaonipresente caracterizada por sua versatilidade ambiental,sua habilidade para causar doenças em indivíduossuscetíveis e sua resistência aos antibióticos. Ela é umorganismo versátil que cresce no solo, pântanos e emhabitats marinhos costeiros, e em tecidos de plantas eanimais. A complicação mais séria da fibrose cística é ainfecção do trato respiratório por P. aeruginosa. Pacientescom câncer e queimaduras também sofrem comumente infecçõessérias por esse organismo, o que também ocorre em algunsoutros indivíduos com deficiências do sistema imunológico.Diferentemente de muitas bactérias ambientais, P.aeruginosa tem uma capacidade notável para causar doençasem hospedeiros suscetíveis.
Staphylococcus aureus é uma bactéria Gram-positivaesférica, com cerca de 1 micrômetro de diâmetro, queprolifera em agrupamentos microscópicos. É um dos patógenoshumanos mais importantes, causando infecções tantoadquiridas na comunidade quanto hospitalares, que variam deendocardite a pneumonia. Embora o S. aureus sejaclassificado geralmente como um patógeno extracelular,dados recentes revelaram sua habilidade para infectarvários tipos de células hospedeiras, por exemplo, tantofagócitos profissionais quanto não fagócitos, incluindocélulas endoteliais, fibroblastos, e outros. Essa invasão éiniciada pela aderência de S. aureus à superfície celular,um processo no qual as proteínas de ligação de fibronectinaestafilocócicas têm uma participação crucial. O S. aureusfagocitado pode tanto induzir apoptose da célula hospedeiraquanto sobreviver por vários dias no citoplasma - o qualacredita-se que não possua mecanismos efetores anti-estafilocócicos.
S. aureus coloniza as passagens nasais, superfíciescutâneas, membranas mucosas e áreas em torno da boca,genitais e reto. S. aureus pode causar lesões cutâneassuperficiais, tais como abscessos, terçóis e furúnculos.Infecções mais sérias incluem pneumonia, mastite, flebite,meningite e infecções do· trato urinário; infecçõesprofundas incluem osteomielite e endocardite.
Fungos exemplares que podem ser tratados pelo métododa presente invenção incluem, sem limitação, bolores,leveduras e fungos superiores. Todos os fungos sãoeucarióticos e possuem esteróis, mas não peptidoglicano, emsuas membranas celulares. As infecções fúngicas, oumicoses, são classificadas de acordo com grau deenvolvimento tecidual e o modo de entrada no hospedeiro. Nohospedeiro imunocomprometido, diversos fungos nãopatogênicos, ou fungos que são normalmente inofensivos,podem causar infecções potencialmente fatais.
Parasitas são organismos que obtêm nutrientes eproteção de outros organismos vivos (conhecidos comohospedeiros). Eles podem ser transmitidos de animais paraos seres humanos, de seres humanos para seres humanos ou deseres humanos para animais. Vários parasitas surgiram comocausas significativas de doenças adquiridas através dealimentos e da água. Eles podem ser transmitidos dehospedeiro para hospedeiro através do consumo de alimento eágua contaminados, ou através da ingestão de uma substânciaque tenha entrado cm contato com as fezes de uma pessoa ouanimal infectado. Os parasitas vivem e se reproduzem dentrodos tecidos e órgãos de hospedeiros humanos e animaisinfectados, e são freqüentemente excretados nas fezes. Hádiferentes tipos de parasitas, variando em termos detamanho desde organismos minúsculos, unicelulares,microscópicos (protozoários), até organismos maiores,vermes multicelulares (helmintos), que podem ser observadossem um microscópio. Exemplos de parasitas comuns que podemser tratados pelo método da presente invenção incluem, semlimitação, Giardia duodenalis, Cryptosporidium parvum,Cyclospora cayetanensis e Toxoplasma gondii.
Os vírus, diferentemente dos fungos e das bactérias,são desprovidos de muitos dos atributos das células de vidalivre. Uma única partícula viral é uma estrutura estática,muito estável e incapaz de trocar ou substituir suaspartes. Somente quando associado a uma célula um vírus setorna capaz de se replicar e adquirir alguns dos atributosde um sistema vivo. Os vírus causam várias doenças,incluindo infecções do trato respiratório superior (URTIs),como o resfriado comum e a faringite (dor de garganta).
Outros exemplos de vírus que podem ser tratados pelo métododa presente invenção incluem, sem limitação, vírusassociados à AIDS, gripe aviaria, varicela, lesões porherpes simples, resfriado,· comum, gastrenterite(especialmente em crianças), febre glandular, influenza,sarampo, caxumba, faringite, pneumonia, rubéola, SARS einfecção do trato respiratório inferior (por exemplo, vírussincicial respiratório, ou RSV).
Os inventores demonstraram nesta invenção quepeptídeos que compreendem a seqüência de aminoácidos daTABELA 1 ou ID. DE SEQ. N°: 1, 3-16, 18-60, ou análogo,derivado, ou variante desta, ou equivalente químico óbviodesta, possuem eficácia na prevenção e/ou no tratamento deinfecções. Conseqüentemente, o presente método detratamento e/ou prevenção de -infecções em um indivíduocompreende a administração ao indivíduo de um peptídeo quecompreende a seqüência de aminoácidos da TABELA 1 ou ID. DESEQ. N°: 1, 3-16, 18-60, ou análogo, derivado ou variantedesta, ou equivalente químico óbvio desta. Está incluídodentro do escopo da presente invenção que o peptídeo dainvenção pode ser ligado a outro agente ou administrado emcombinação com outro agente como, por exemplo, umantibiótico (por exemplo, penicilina, meticilina ouvancomicina), a fim de aumentar . a eficácia do tratamentoe/ou da prevenção de infecção e/ou aumentar a eficácia dedirecionamento.
Em uma modalidade da presente invenção, o peptideo dainvenção compreende a seqüência de aminoácidos da TABELA 1ou ID. DE SEQ. N°: 1, 3-16, 18-60, ou análogo, derivado, ouvariante desta, ou equivalente químico óbvio desta. Emoutra modalidade, o peptídeo da invenção modula a imunidadeinata no indivíduo tratando ou prevenindo, dessa forma, ainfecção no indivíduo. A resposta imunológica inata é aresposta de primeira linha quando há o encontro com umpatógeno. Ela compreende diversos mecanismos para evitar odesenvolvimento de doenças infecciosas. Um dessesmecanismos envolve a preparação e o recrutamento de célulasimunológicas efetoras.
Em uma modalidade, os peptídeos da invenção podemaumentar a imunidade inata ou a resposta imunológica inata,ao mesmo tempo em que limitam a inflamação.
Em outra modalidade, demonstrou-se que os peptídeos dainvenção são moduladores da atividade de DPPIV. Foidemonstrado que eles reduzem a atividade de DPPIV. Comotal, eles seriam úteis no rastreamento de indivíduos quepoderiam se beneficiar da administração dos peptídeos paratratar uma condição imunológica específica, compreendendo acoleta de uma amostra de um indivíduo suspeito ou quesabidamente tem uma condição relacionada à DPPIV, a suaincubação junto com um peptídeo da invenção e um substratode DDPIV e, a seguir, o monitoramento do efeito do peptídeosobre a atividade de DDPIV, em comparação com um controle,em que a redução da atividade indicaria o beneficiopotencial da administração do peptídeo ao indivíduo paratratar a condição relacionada à DPPIV. Em outra modalidade,a modulação da atividade de DPPIV na presença do peptídeo,comparada com o controle, pode ser indicativa de umacondição relacionada à DPPIV. Como tal, os peptídeos dainvenção podem ser usados no diagnóstico de condiçõesrelacionadas à DPPIV. Em outro aspecto, os peptídeos dainvenção seriam úteis no tratamento de diversos distúrbiosimunológicos, tais como distúrbio relacionado à DPPIV, porexemplo: HIV/AIDS, doença de Grave, câncer (por exemplo,câncer do pulmão e do cólon), diabetes, e distúrbiosautoimunes como, por exemplo, artrite reumatóide eesclerose múltipla.
Administração
De acordo com o método da presente invenção, umpeptídeo da presente invenção, como aqui descrito, pode seradministrado ao indivíduo diretamente, em uma quantidadeeficaz para tratar e/ou evitar infecção no indivíduo e/oupara tratar ou evitar uma condição relacionada à DPPIV, porexemplo, uma quantidade terapêutica eficaz. Da mesma forma,um peptídeo, como aqui descrito, pode ser administrado aoindivíduo indiretamente, por administração ao indivíduo deuma seqüência de ácidos nucléicos que codifica o peptídeo,de uma forma que permita a .expressão do peptídeo noindivíduo e em uma quantidade eficaz para tratar e/ouevitar infecção.Além disso, um peptídeo da invenção, ou uma moléculade ácido nucléico que o codifica, pode ser administrado aum indivíduo em uma quantidade eficaz para tratar ainfecção no indivíduo. Como aqui usado, a frase "eficazpara tratar a infecção" significa eficaz para atenuar ouminimizar a alteração clínica ou os sintomas que resultamda infecção (por uma bactéria, fungo, parasita, vírusetc.). Por exemplo, quando o indivíduo for infectado com ummicróbio, a quantidade de peptídeo (ou de ácido nucléicoque o codifica) que é eficaz para tratar a infecçãomicrobiana será aquela que pode atenuar ou minimizar ossintomas da infecção microbiana, incluindo, sem limitação,dor de cabeça, rigidez do. pescoço, anorexia, náusea,vômitos, diarréia, desconforto abdominal, insuficiênciarenal aguda, alteração de manifestações de lesão isquêmicaa múltiplos órgãos, febre e trombocitopenia. A quantidadede peptídeo (ou de ácido nucléico que o codifica) eficazpara tratar uma infecção em um indivíduo irá variar,dependendo dos fatores específicos de cada caso, incluindoo peso do indivíduo e a gravidade da condição do indivíduo.
A quantidade apropriada de peptídeo (ou de ácido nucléicoque o codifica) pode ser facilmente determinada por aqueleshabilitados na técnica. Do mesmo modo, a quantidade eficazpara tratar uma condição relacionada à DPPIV pode variar,dependendo de diversos fatores similares conhecidos poraqueles habilitados na técnica.
Da mesma forma, no método da presente invenção, umpeptídeo da invenção, ou uma molécula de ácido nucléico queo codifica, também pode ser administrado a um indivíduo emrisco de desenvolver uma infecção, em uma quantidade eficazpara evitar a infecção no indivíduo. Como aqui usado, afrase "eficaz para evitar a infecção" inclui eficaz paraimpedir ou evitar o desenvolvimento ou a manifestação dealteração clínica ou dos sintomas que resultam da infecção(por uma bactéria, fungo, parasita, vírus etc.). Aquantidade de peptídeo (ou do ácido nucléico que ocodifica) eficaz para evitar uma infecção em um indivíduoirá variar, dependendo dos fatores específicos de cadacaso, incluindo o sexo e o peso do indivíduo e a gravidadeda condição do indivíduo, a natureza da condição, o localda infecção e o modo de administração. A quantidadeapropriada de peptídeo (ou de ácido nucléico que ocodifica) pode ser facilmente determinada por aqueleshabilitados na técnica.
O peptídeo da invenção, ou a seqüência de ácidosnucléicos que o codifica, como aqui revelado, pode seradministrado a um indivíduo humano ou animal porprocedimentos conhecidos, incluindo, sem limitação, aadministração oral, administração parenteral (por exemplo,epifascial, intracapsular, intracutânea, intradérmica,intramuscular, intra-orbitária, intraperitoneal,intramedular, intra-esternal, intravascular, intravenosa,parenquimatosa ou subcutânea), administração transdérmica,administração intranasal, administração pulmonar (porexemplo, administração intratraqueal) e administração porbomba osmótica. Em uma modalidade, o método deadministração é a administração parenteral, por injeçãointravenosa ou subcutânea.
Para administração oral, a formulação do peptídeo (oudo ácido nucléico que o codifica) pode ser apresentada comocápsulas, comprimidos, pós, grânulos ou como uma suspensãoou líquido. A formulação pode ter aditivos convencionais,tais como lactose, manitol, amido de milho ou amido debatata. A formulação também pode ser apresentada comaglutinantes, tais como celulose cristalina, derivados decelulose, acácia, amido de milho ou gelatinas.
Adicionalmente, a formulação pode ser apresentada comdesintegrantes, tais como amido de milho, amido de batata,ou carboximetilcelulose sódica. A formulação pode ainda serapresentada com fosfato dibásico de cálcio anidro ou comsódio amido glicolato. Finalmente, a formulação pode serapresentada com lubrificantes, tais como talco ou estearatode magnésio.
Para administração parenteral, o peptídeo (ou o ácidonucléico que o codifica) pode ser combinado com uma soluçãoaquosa estéril, que é preferivelmente isotônica em relaçãoao sangue do indivíduo. Uma formulação desse tipo pode serpreparada dissolvendo-se um ingrediente ativo sólido emágua contendo substâncias fisiologicamente compatíveiscomo, por exemplo, cloreto de sódio, glicina, esemelhantes, e que pode ter um pH tamponado compatível comas condições fisiológicas, de forma a produzir uma soluçãoaquosa, e depois tornando-se a referida solução estéril. Aformulação pode ser apresentada em recipientes unitários oumultidoses como, por exemplo, ampolas ou frascos lacrados.A formulação também pode ser liberada por qualquer modo deinjeção, incluindo qualquer um daqueles aqui descritos.
Para administração transdérmica, o peptídeo (ou oácido nucléico que o codifica) pode ser combinado comintensificadores da penetração cutânea como, por exemplo,propileno glicol, polietileno glicol, isopropanol, etanol,ácido oléico, N-metilpirrolidona, e semelhantes, queaumentam a permeabilidade da pele ao peptídeo ou ao ácidonucléico, e permitem que o peptídeo ou ácido nucléicopenetre através da pele e entre na corrente sangüínea. Acomposição de intensificador e peptídeo ou ácido nucléicotambém pode ainda ser combinada com a substância poliméricacomo, por exemplo, etilcelulose, hidroxipropil celulose,etileno/vinilacetato, polivinil pirrolidona, e semelhantes,para fornecer a composição na forma de gel, que pode serdissolvido em um solvente, por exemplo, cloreto demetileno, evaporado até a viscosidade desejada, e depoisaplicado ao material de forro para fornecer um emplastro. Opeptídeo ou o ácido nucléico pode ser administrado por viatransdérmica, no local (ou próximo a ele) no indivíduo ondea infecção pode estar localizada. Alternativamente, opeptídeo ou o ácido nucléico pode ser administrado por viatransdérmica em outro local diferente da área afetada, afim de se obter administração sistêmica.
Para administração intranasal (por exemplo, spraysnasais) e/ou administração pulmonar (administração porinalação), as formulações do peptídeo ou do ácido nucléico,incluindo formulações em aerossol, podem ser preparadas deacordo com procedimentos bem conhecidos por aqueleshabilitados na técnica. Formulações em aerossol podemcompreender tanto partículas sólidas quanto soluções(aquosas ou não aquosas). Nebulizadores (por exemplo,nebulizadores a jato, nebulizadores ultra-sônicos etc.) eatomizadores podem ser usados para a produção de aerossóisa partir de soluções (por exemplo, com o uso de um solventecomo, por exemplo, etanol); inaladores de dose metrificadae inaladores de pó seco podem ser usados para geraraerossóis de partículas pequenas. 0 tamanho desejado dapartícula do aerossol pode ser obtido com o emprego dequalquer um dentre vários métodos conhecidos na técnica,incluindo, sem limitação, trituração a jato, secagem poratomização e condensação por ponto crítico.
As composições farmacêuticas para administraçãointranasal podem ser formulações sólidas (por exemplo, umpó grosseiro), e podem conter excipientes (por exemplo,Iactose). Formulações sólidas podem ser administradas porum recipiente mantido próximo ao nariz, e fazendo-se umainalação rápida através das vias nasais. As composiçõespara administração intranasal também podem conter soluçõesaquosas ou oleosas de spray nasal ou gotas nasais. Para usocom um vaporizador, a formulação de peptídeo ou ácidonucléico pode compreender uma solução aquosa e agentesadicionais, que incluem, por exemplo, um excipiente, umtampão, um agente de isotonicidade, um conservante ou umtensoativo. Um spray nasal pode ser produzido, por exemplo,forçando-se uma suspensão ou solução do peptídeo ou doácido nucléico através de um bocal sob pressão.
As formulações do peptídeo ou do ácido nucléico paraadministração pulmonar podem ser apresentadas em uma formaadequada pra liberação por um dispositivo para inalação, epodem ter um tamanho de partícula eficaz para alcançar asvias aéreas inferiores dos pulmões ou os seios. Paraabsorção através de superfícies mucosas, incluindo a mucosapulmonar, a formulação da presente invenção podecompreender uma emulsão que inclui, por exemplo, umpeptídeo bioativo, diversas pártículas submícron, umamacromolécula mucoadesiva e/ou uma fase aquosa contínua. Aabsorção através de superfícies mucosa pode ser obtidaatravés de mucoadesão das partículas da emulsão.
As composições farmacêuticas para uso com umdispositivo de inalação de doses metrificadas podem incluirum pó finamente dividido contendo o peptídeo ou o ácidonucléico como uma suspensão em um meio não aquoso. Porexemplo, o peptídeo ou o ácido nucléico pode ser suspensoem um propelente com a ajuda de um tensoativo (por exemplo,trioleato de sorbitano, lecitina de soja, ou ácido oléico).Inaladores de doses metrificadas, tipicamente utilizam umgás propelente (por exemplo, um clorofluorcarbono, umhidroclorofluorcarbono, um hidrofluorcarbono ou umhidrocarboneto) estocado em um recipiente (por exemplo, umalata) como uma mistura (por exemplo, como um gás comprimidoliqüefeito). Inaladores necessitam de ativação durante ainspiração. Por exemplo, a ativação de uma válvula demetrificação pode liberar a mistura como um aerossol.Inaladores de pó seco usam ativação pela respiração de umpó misto.
O peptídeo ou ácido nucléico da presente invençãotambém pode ser liberado ou distribuído por uma minibombaosmótica ou outro dispositivo de liberação programada. Ataxa de liberação por uma minibomba osmótica elementar podeser modulada com um gel microporoso, de resposta rápida,disposto no orifício de liberação. Uma minibomba osmóticaseria útil para o controle da liberação ou liberaçãodirecionada, do peptídeo ou do ácido nucléico.
De acordo com métodos aqui descritos, o peptídeo dainvenção pode ser administrado a um indivíduo porintrodução no indivíduo do próprio peptídeo, ou porintrodução no indivíduo de um ácido nucléico que codifica opeptídeo, de uma forma que permita a expressão do peptídeo.
Conseqüentemente, em uma modalidade da presente invenção,uma infecção em um indivíduo pode ser tratada ou evitadapor administração ao indivíduo de uma quantidade de umpeptídeo da invenção. Em uma modalidade adicional dapresente invenção, a infecção no indivíduo pode ser tratadaou evitada por administração ao indivíduo de uma seqüênciade ácidos nucléicos que codifica um peptídeo da invenção,de uma forma que permita a expressão do peptídeo noindivíduo.
Os peptídeos da presente invenção podem seradministrados ou introduzidos em um indivíduo por técnicasconhecidas usadas para a introdução de proteínas e outrosfármacos, incluindo, por exemplo, injeção e transfusão.Quando uma infecção estiver localizada em uma porçãoespecífica do corpo do indivíduo, pode ser desejávelintroduzir o peptídeo terapêutico diretamente naquela áreapor injeção ou por algum outro meio (por exemplo, porintrodução do peptídeo no sangue ou em outro fluidocorporal) . A quantidade de peptídeo a ser utilizada é umaquantidade eficaz para tratar e/ou evitar a infecção noindivíduo, como definido acima,, e pode ser facilmentedeterminada por aqueles habilitados na técnica.
No método da presente invenção, o peptídeo também podeser administrado ou introduzido no indivíduo por introduçãoem um número suficiente de células do indivíduo de um ácidonucléico que codifica o peptídeo, de uma forma que permitaa expressão do peptídeo. A quantidade de ácido nucléico quecodifica o peptídeo terapêutico é uma quantidade queproduzirá o peptídeo em uma quárítidade eficaz para tratare/ou evitar infecção, como definido acima, no indivíduo.
Essa quantidade pode ser facilmente determinada por aqueleshabilitados na técnica.
O ácido nucléico que codifica o peptídeo da presenteinvenção pode ser introduzido no indivíduo com o uso deprocedimentos convencionais conhecidos na técnica,incluindo, sem limitação, eletroporação, transfecção comDEAF Dextrana, transfecção com fosfato de cálcio,lipofecção, fusão de lipossomo monocatiônico, fusão delipossomo policatiônico, fusão de protoplasto, criação deum campo elétrico in vivo, bombardeamento de microprojétilrevestido com DNA, injeção com vírus com replicaçãorecombinante defeituosa, recombinação homóloga, terapiagênica in vivo, terapia gênica ex vivo, vetores virais,transferência de DNA naked, ou qualquer combinação destas.
Vetores virais recombinantes adequados à terapia gênicaincluem, sem limitação, vetores derivados dos genomas devírus como retrovírus, HSV, adenovírus, vírus adeno-associado, vírus Semiliki Forest, citomegalovírus e vírusda vacínia.
Inclui-se também dentro dos limites da presenteinvenção que um ácido nucléico que codifica um peptídeo dainvenção pode ser introduzido', em células adequadas invitro, com o uso de procedimentos convencionais, para seobter a expressão do peptídeo terapêutico nas células. Ascélulas que expressam o peptídeo podem então serintroduzidas em um indivíduo para tratar e/ou evitarinfecção in vivo. Nessa abordagem de terapia gênica exvivo, as células são preferivelmente removidas doindivíduo, submetidas às técnicas de DNA para incorporar oácido nucléico que codifica o ;peptídeo terapêutico, edepois re-introduzidas no indivíduo.
Também está incluído dentro dos limites da presenteinvenção que uma formulação que contém um peptídeo dainvenção, ou um ácido nucléico que o codifica, pode aindaser associada a um veículo, diluente ou excipientefarmaceuticamente aceitável compreendendo, dessa forma, umacomposição farmacêutica. As composições farmacêuticas dainvenção, e os veículos, diluentes e excipientesexemplares, são descritos acima.
As formulações da presente invenção podem serpreparadas por métodos bem conhecidos nas técnicasfarmacêuticas. Por exemplo, o peptídeo da invenção, ou umácido nucléico que o codifica, pode ser associado a umveículo, diluente ou excipiente, como uma suspensão ousolução. Opcionalmente, um ou mais ingredientes acessórios(por exemplo, tampões, agentes flavorizantes, agentestensoativos, e semelhantes) também podem ser adicionados. Aescolha do veículo dependerá da via de administração. Acomposição farmacêutica seria útil para administração dopeptídeo da presente invenção, ou de uma molécula de ácidonucléico que o codifica, a um indivíduo, a fim de tratare/ou evitar infecção. 0 peptídeo ou ácido nucléico éfornecido em uma quantidade que, é eficaz para tratar e/ouevitar infecção em um indivíduo ao qual a composiçãofarmacêutica é administrada. Essa quantidade pode serfacilmente determinada por aqueles habilitados na técnica,como descrito acima.
Ensaios diagnósticos e de rastreamento
A presente invenção fornece um método para odiagnóstico de um indivíduo suspeito de ter uma condiçãoimune inata, ou uma condição relacionada à DPPIV, paraprever se um indivíduo responderia ao tratamento com umpeptídeo da invenção, por exemplo, aqueles listados naTABELA 1, ou um análogo, derivado ou variante deste, e pararastrear os agentes que modulariam (por exemplo,aumentariam, inibiriam ou simulariam) o efeito imunológicodos peptídeos da invenção. Em outra modalidade, a invençãofornece métodos para rastreamento de análogos, derivados evariantes imunologicamente ativos dos peptídeos da invençãoou aqueles listados na TABELA 1 ou das modificaçõesimunologicamente ativas destes.
Em uma modalidade, é fornecido um método para preverse um paciente com um distúrbio imunológico, por exemplo,uma condição inata relacionada ao sistema imunológico,responderia ao tratamento com um peptídeo da invenção,compreendendo a obtenção de uma amostra biológica doindivíduo, a administração de um peptídeo da invenção àreferida amostra, e o monitoramento dos níveis de ummarcador predeterminado que seja indicativo da condição,por exemplo, DPPIV para uma condição relacionada à DPPIV,um biomarcador inflamatório para uma infecção, deviabilidade celular ou carga bacteriana, em comparação comum controle positivo e/ou negativo. 0 controle positivopode ser uma amostra de um indivíduo com uma condiçãoimunológica conhecida. Um controle negativo pode ser umaamostra do mesmo indivíduo que não recebeu a administraçãodo peptídeo. Caso o peptídeo module a atividade, o nível demarcador ou a viabilidade celular em relação ao controle, oindivíduo pode ter esse distúrbio imunológico e pode sebeneficiar do tratamento com o peptídeo.
Mais particularmente, em um aspecto da invenção, casoo indivíduo tenha sob suspeita de ter uma condiçãorelacionada à DPPIV, então o monitoramento da atividade deDPPIV como marcador para a condição seria adequado. Em umaspecto, a redução da atividade de DPPIV em comparação como controle seria indicativa de que o indivíduo responderiaao tratamento com o peptídeo. Alternativamente, caso oindivíduo tenha ou fosse suspeito de ter uma infecção,então a obtenção de uma amostra do paciente, o seumonitoramento quanto à carga de patógeno ou à viabilidadecelular em comparação com uma amostra do paciente apósadministração do peptídeo, em que a carga de patógeno émenor ou a viabilidade celular é maior no paciente após aadministração do peptídeo, é indicativo de que o indivíduose beneficiaria do tratamento com peptídeo ou que ele temum distúrbio imunológico.
Em outra modalidade, caso se queira verificar se umpeptídeo ou uma modificação de um peptídeo da TABELA 1 ououtro agente teria a mesma atividade imunológica que opeptídeo da invenção, pode-se monitorar o efeito dopeptídeo sobre a atividade de DPPIV em comparação com opeptídeo de referência com efeitos moduladores conhecidos,em uma amostra (de um camundongo infectado com um agente ouuma condição relacionada à DPPIV conhecida), ou monitorar aprevenção, a administração do peptídeo ou do agente a umaamostra, a indução da referida infecção ou condiçãorelacionada ã DPPIV na referida amostra e, depois,monitorando-se se o peptídeo modulou ou inibiu odesenvolvimento da referida infecção ou condiçãorelacionada à DPPIV, ou resposta imunológica. A referidaamostra pode ser um modelo animal, em que a indução dacondição ou da infecção é feita em um modelo animal deacordo com aceito, com diretrizes éticas, e depois oanimal, ou a amostra biológica apropriada do animal, érastreada quanto ao efeito do peptídeo.
A presente invenção ainda fornece um método paraprever se um indivíduo responderia ao tratamento para umainfecção microbiana, em que o tratamento compreende aadministração ao indivíduo de um peptídeo que compreendeuma seqüência de aminoácidos da TABELA 1 ou de um análogo,derivado ou variante desta. 0 método inclui o teste de umaamostra diagnostica do indivíduo quanto a um ou maisbiomarcadores (por exemplo, um biomarcador inflamatório),em que a presença de pelo menos um biomarcador (porexemplo, um biomarcador inflamatório) é indicativa de que oindivíduo responderia ao tratamento.
Como aqui usado, o termo "biomarcador" ou "marcador"representa qualquer biomarcador adequado conhecido porestar, ou reconhecido como estando, relacionado à condição(por exemplo, condição imune, infecção, condiçãoinflamatória, condição relacionada à DPPIV, condição imuneinata), e inclui qualquer molécula derivada de um gene (porexemplo, um transcrito do gene), uma seqüência-sonda senso(codificadora) ou anti-senso (não codificadora) derivada deum gene, ou um produto da tradução de comprimento parcialou de comprimento total de um gene, ou um anticorpo contraesse, que pode ser usada para monitorar uma condição, umdistúrbio ou uma doença associada à resposta imunológica, àresposta imunológica inata, à inflamação e/ou a umacondição relacionada à DPPIV.
De acordo com o método da presente invenção, a amostradiagnostica de um indivíduo pode ser testada in vitro ou invivo. Quando o ensaio for realizado in vitro, uma amostradiagnostica do indivíduo pode ser removida com o uso deprocedimentos padronizados. A amostra diagnostica pode serum tecido, incluindo qualquer tecido muscular, tecidocutâneo ou tecido mole, que pode ser removido por umabiópsia-padrão. Além disso, A amostra diagnostica pode serum fluido corpóreo, incluindo sangue, saliva, soro ouurina. O indivíduo ou paciente pode sabidamente ter umainfecção microbiana ou outro distúrbio imunológico como,por exemplo, uma condição relacionada à DPPIV, pode sersuspeito de ter uma infecção microbiana ou outra condiçãoimunológica como, por exemplo, uma condição imune inata ouuma condição relacionada à DPPIV, ou que supostamente nãotem uma infecção microbiana ou outra condição imunológicacomo, por exemplo, uma condição imune inata, ou umacondição relacionada à DPPIV.
De acordo com o método da presente invenção, umaamostra diagnostica do indivíduo pode ser testada quanto àexpressão de um ou mais marcadores desejados. Como aquiusado, o termo "expressão" significa a transcrição de umgene de marcador inflamatório em pelo menos um transcritode mRNA, ou a tradução de pelo menos um mRNA em umaproteína marcadora. Conseqüentemente, uma amostradiagnostica pode ser testada quanto à expressão do marcadorpesquisando-se uma proteína marcadora, um cDNA marcador ouum mRNA marcador. A forma adequada do marcador ficaráevidente com base nas técnicas específicas aqui discutidas.
A proteína a ser testada pode ser isolada e purificadada amostra diagnostica do indivíduo ou paciente com o usode métodos padronizados conhecidos na técnica, incluindo,sem limitação, a extração de um tecido (por exemplo, com umdetergente que solubiliza a proteína), quando necessário,seguido por purificação por afinidade em uma coluna,cromatografia (por exemplo, FPLC e HPLC), imunoprecipitação(com um anticorpo para um marcador inflamatório deinteresse), e precipitação (por exemplo, com isopropanol eum reagente como, por exemplo, Trizol). 0 isolamento e apurificação da proteína podem ser seguidos por eletroforese(por exemplo, em um gel de SDS-poliacrilamida) . Contempla-se que a amostra diagnostica pode ser testada quanto àexpressão de qualquer uma ou de todas as formas de proteínamarcadora (incluindo formas precursoras, formas processadasde forma endoproteolítica, e outras formas resultantes demodificação pós-tradução). 0 ácido nucléico pode serisolado de uma amostra diagnostica com o uso de técnicaspadronizadas conhecidas por aqueles habilitados na técnica.
De acordo com o método da presente invenção, umaamostra diagnostica de um indivíduo pode ser testada quantoà expressão do marcador, e a expressão do marcador pode serdetectada em uma amostra diagnostica com o uso de ensaios emétodos de detecção facilmente determinados na técnicaestabelecida (por exemplo, técnicas imunológicas, análisede análise de hibridização, técnicas de imagens porfluorescência e/ou detecção de radiação), além de muitosensaios e métodos de detecção aqui revelados (por exemplo,imunoprecipitação, análise Western blot etc.). Por exemplo,uma amostra diagnostica de um indivíduo pode ser testadaquanto à expressão do marcador com o uso de um agentereativo com um marcador inflamatório. Como aqui usado,"reativo" significa que o agente possui afinidade, se ligaou é dirigido contra o marcador. Ainda como aqui usado, um"agente" deve incluir uma proteína, um polipeptídeo, umpeptídeo, um ácido nucléico (incluindo DNA ou RNA), umanticorpo, um fragmento Fab, um fragmento F(ab')2, umamolécula, um composto, um antibiótico, um fármaco, equaisquer combinações destes. De preferência, o agente dapresente invenção é rotulado com um marcador ou rótulodetectável, de acordo com as técnicas aqui descritas. Emuma modalidade da presente invenção, o agente reativo comum marcador é um anticorpo.
Quando o agente da presente invenção for um anticorporeativo com o marcador desejado, uma amostra diagnosticaretirada do indivíduo poderá ser purificada por passagematravés de uma coluna de afinidade que contém anticorpocontra o marcador, anexado como um ligante a um suportesólido (por exemplo, um polímero orgânico insolúvel naforma de um glóbulo, gel ou placa) . 0 anticorpo anexado aosuporte sólido pode ser usado na forma de uma coluna.
Exemplos de suportes sólidos adequados incluem, semlimitação, agarose, celulose, dextrana, poliacrilamida,poliestireno, sefarose, e outros polímeros orgânicosinsolúveis. 0 anticorpo para o marcador pode ainda seranexado ao suporte sólido através de uma moléculaespaçadora, se desejado. Condições de ligação adequadas(por exemplo, temperatura, pH e concentração de sal) paraassegurar a ligação do agente e do anticorpo, podem serfacilmente determinadas por aqueles habilitados na técnica.Em uma modalidade preferida, o anticorpo para o marcador éanexado a uma coluna de sefarose como, por exemplo,Sefarose 4B.
Adicionalmente, quando o agente for um anticorpo, umaamostra diagnostica do indivíduo poderá ser testada quantoà expressão do marcador imunológico com o uso de estudos deligação que utilizam um ou mais anticorpos imunorreativoscom o marcador, juntamente com técnicas padronizadas dedetecção imunológica. Por exemplo, a proteína marcadoraeluída pela coluna de afinidade pode ser submetida a umensaio ELISA, análise Western blot, citometria de fluxo, ouqualquer outro método de imunocoloração que empregue umainteração antígeno-anticorpo. De preferência, a amostradiagnostica é testada quanto à expressão do marcador com ouso de Western blotting.
Alternativamente, uma amostra diagnostica de umindivíduo pode ser testada quanto à expressão do marcadorcom o uso de análise de hibridização de ácido nucléicoextraído da amostra diagnostica retirada do indivíduo. Deacordo com esse método da presente invenção, a análise dehibridização pode ser realizada com o uso de análiseNorthern blot do mRNA. Esse método também pode serrealizado através de análise Southern blot de DNA com o usode uma ou mais sondas de ácido nucléico que hibridizam parao ácido nucléico que codifica o marcador. As sondas deácido nucléico podem ser preparadas por várias metodologiasconhecidas por aqueles habilitados na técnica, incluindo,sem limitação, as seguintes: digestão por restriçãoenzimática do ácido nucléico do marcador; e sínteseautomatizada de oligonucleotídeos que possuem as seqüênciasque correspondem às porções selecionadas da seqüência denucleotídeos do ácido nucléico do marcador, com autilização de sintetizadores de oligonucleotídeosdisponíveis comercialmente como, por exemplo, osintetizador Applied Biosystems Modelo 3 92 DNAIRNA.
As sondas de ácido nucléico usadas na presenteinvenção podem ser DNA ou RNA, _e podem variar em termos decomprimento de cerca de 8 nucleotídeos até todo ocomprimento do ácido nucléico do marcador inflamatório.
Além disso, as sondas de ácido nucléico da presenteinvenção podem ser rotuladas com um ou mais marcadores ourótulos detectáveis. A marcação das sondas de ácidonucléico pode ser obtida com o uso diversos métodosconhecidos na técnica, incluindo qualquer um daqueles aquidescritos. Combinações de duas ou mais sondas de ácidonucléico (ou iniciadores), que correspondem a regiõesdiferentes ou sobrepostas do ácido nucléico do marcador,também podem ser usadas para testar uma amostra diagnosticaquanto à expressão do marcador, usando, por exemplo, PCR ouRT-PCR.
A detecção da expressão do marcador no método dapresente invenção pode ser acompanhada por um ensaio paramedir ou quantificar a extensão da expressão do marcador emuma amostra diagnostica de um indivíduo. Esses ensaios sãobem conhecidos por aqueles habilitados na técnica, e podemincluir imunoistoquímica/imunocitoquímica, citometria defluxo, espectroscopia de massa, análise Western JbIot ou umELISA para medir as quantidades de proteína marcadora. Porexemplo, para se utilizar um ensaio de imunoistoquímica,cortes histológicos (embebidos em parafina) de tecidospodem ser colocados em lâminas, e depois incubados com umanticorpo contra um marcador. As laminas podem então serincubadas com um segundo anticorpo (contra o anticorpoprimário), que é marcado por um corante ou outro sistemacalorimétrico (por exemplo, um fluorcromo, um agenteradioativo ou um agente que possui alta capacidade devarredura de elétrons), para permitir a visualização domarcador presente nos cortes.
A presente invenção será descrita nos Exemplos aseguir, os quais são apresentados para ajudar nacompreensão da invenção, e não devem ser considerados comolimitantes de alguma forma do escopo da invenção, comodefinido nas reivindicações que serão apresentadasposteriormente.
EXEMPLOS
EXEMPLO 1 - SÍNTESE PEPTÍDICA
Os peptídeos na TABELA 1 foram sintetizados com o usode uma técnica de síntese peptídica em fase sólida.
Todos os aminoácidos protegidos com Fmoc necessáriosforam pesados com excesso molar de três vezes em relação aopeptídeo de 1 mol desejado. Os aminoácidos foram entãodissolvidos em Dimetilformamida (rDMF) (7,5 ml), para formaruma solução de 3 mMol. Uma quantidade apropriada de resinaMBHA de amida de Rink foi pesada, levando em conta asubstituição da resina. A resina foi então transferida paraum vaso de reação de um sintetizador automatizado, e foipré-embebida com Diclorometano (DCM) por 15 minutos.A resina foi desprotegida por adição de piperidina 25%em DMF (30 ml) ã resina, e misturando-se por 20 minutos.Após a desproteção da resina, foi feito o primeiroacoplamento misturando-se a solução de 3 mMol de aminoácidocom 4 mMol de hexafluorfosfato de 2-(ΙΗ-benzitriazol-l-il)-1,1,3, 3tetrametilurônio (HBTU) e 8 mMol de N,N-diisopropiletilamina (DIEPA). Deixou-se a solução ser pré-ativada por 5 minutos, antes de ser adicionada à resina.Deixou-se o aminoácido acoplar por 45 minutos.
Após o acoplamento, a resina foi cuidadosamenteenxaguada com DMF e Dimetilacetamida (DMA). 0 aminoácidoprotegido por Fmoc anexado foi desprotegido da mesma formadescrita acima, e o aminoácido seguinte foi anexado com ouso do mesmo esquema de acoplamento AA:HBTU:DIEPA.
Após o término da síntese, o peptídeo foi clivado daresina com o uso de um coquetel de clivagem contendo ácidotrifluoracético 97,5% (TFA) e água 2,5%. A resina ficou nocoquetel de clivagem por 1 H hora. A solução foi entãofiltrada por gravidade usando um funil de Buchner, e ofiltrado foi coletado em um 50 ml tubo de centrifugação. 0peptídeo foi isolado por precipitação com éter dietílicoresfriado. Após centrifugação e decantação do éterdietílico, o peptídeo bruto foi lavado com éter dietílicomais uma vez, antes de ser secó em um dessecador a vácuopor 2 horas. 0 peptídeo foi então dissolvido em águadeionizada (10 ml), congelado a -80°C, e liofilizado. 0peptídeo seco estava então pronto para purificação porHPLC.
Por causa da natureza hidrofílica desses peptídeos, oisolamento do peptídeo do éter dietílico não funcionou.Portanto, foi necessária uma extração com clorofórmio. 0TFA foi evaporado, e o resíduo de peptídeo resultante foidissolvido em ácido acético 10% ;(15 ml) . As impurezas e oslimpadores foram removidos da solução de ácido acético depeptídeo por lavagem da solução duas vezes com clorofórmio(30 ml). A solução aquosa de peptídeo foi então congelada a-80°C e liofilizada, resultando em um peptídeo em pó prontopara purificação por HPLC.
Cada um dos peptídeos dos IDS. DE SEQ. Nos: 33 e 34continha um aminoácido N-metil. Esse acoplamento foirealizado por combinação de soluções conjuntas doaminoácido N-metil, PyBroP e N-hidroxibenzotriazol*H20(HOBt) e DIEPA no vaso de reação que contém a resina. Apóspermitir o acoplamento por 4 5 minutos, o aminoácido N-metilfoi então acoplado duas vezes para assegurar o acoplamentocompleto. Observou-se que o acoplamento após o aminoácidoN-metil não era totalmente completo. Portanto, esseacoplamento foi realizado usando hexafluorfosfato deΝ,Ν,N1,N1-tetrametil-0-(7-azabenzotriazol-l-il)urônio(HATU) ao invés de HBTU. Isso ainda resultou em um peptídeobruto que tipicamente continha duas impurezas totalizando30-40% da pureza total. 0 peptídeo foi purificado sobcondições de HPLC modificadas para isolar o pico depeptídeo puro, afastando-o das impurezas que eluemproximamente.
EXEMPLO 2 - ATIVIDADE NÃO ANTIMICROBIANA
Foram semeadas bactérias (S. aureus 25923) em poçoscontendo peptídeo (200 μΜ) , veículo (Tris) ou antibiótico(eritromicina; 120 μg/ml). Permitiu-se o crescimento dasbactérias por 2 horas. A seguir, foi determinada aviabilidade bacteriana com a utilização de um ensaiocolorimétrico da viabilidade WST-I (número de catálogo 1644 807; Roche Diagnostics). ^DMEM e DMEM+WST-1 foramincluídos como controles de fundo. Como mostrado na FIG. 1A e Β, o peptídeo dos IDS. DE SEQ. Nos: 5 e 47 mostraclaramente uma ausência de atividade, comparado com umcontrole de antibiótico.
EXEMPLO 3 - PROTEÇÃO IN VIVO
Camundongos foram infectados com S. aureus 25923 pormeio de uma injeção intraperitoneal (IP). Quatro horas maistarde, o peptídeo dos IDS. DE SEQ. Nos: 1, 4, 5, 6, 45 e 47foram administrados a 12 mg/kg e 24 mg/kg para o ID. DESEQ. N°: 1 (FIG. 2A e 2B) , 9,6 mg/kg para O ID. DE SEQ. N°:5 (FIG. 2C) , 13 mg/kg para o ID. DE SEQ. N°: 47 (FIG. 2D),12 mg/kg para o ID. DE SEQ. N°:-4Λ (FIG. 2E), 9 mg/kg para oID. DE SEQ. N°: 6 (FIG. 2F) e 13 mg/kg para o ID. DE SEQ.N0 :45 (FIG. 2G) , por meio de injeção IP. Vinte e quatrohoras pós-infecção, os animais sobreviventes foramsacrificados, e líquido de lavagem intraperitoneal foiplaqueado para determinar contagens bacterianas residuais(# unidades de formação de colônias por ml (CFU/ml) ) napresença e ausência de tratamento com peptídeo.
Os animais mortos receberam a contagem bacteriana maiselevada de todos os animais do estudo. 0 peptídeo dos IDS.DE SEQ. Nos: 1, 4, 5, 6, 45 e 47 demonstrou claramenteproteção, comparado com o controle, como mostrado na FIG. 2
EXEMPLO 4 - PROTEÇÃO PROFILÁTICA IN VIVO
Vinte e quatro horas antes da infecção, o peptídeo foiadministrado a 12 mg/kg (ID. DE SEQ. N°: 1, FIG. 3A) e 11,5mg/kg (ID. DE SEQ. N°: 5, FIG. 3B), por meio de injeção IP.Os camundongos foram então infectados com S. aureus 25923por meio de injeção IP. Vinte e quatro horas pós-infecção,os animais sobreviventes foram sacrificados, e o líquido delavagem intraperitoneal foi plaqueado para determinarcontagens bacterianas residuais (# unidades de formação decolônias por ml (CFU/ml)) na presença e ausência detratamento com peptídeo.
Os animais mortos receberam a contagem bacteriana maiselevada de todos os animais do estudo. Os peptídeos do ID.DE SEQ. N°: 1 e 5 demonstraram claramente proteção (0 mortede camundongo (tratamento com peptídeo) vs. 2 camundongosmortos (controle)). Veja as Figuras 3 A e B.
Os resultados obtidos pelos inventores em relação aosexperimentos dos Exemplos 1-4 serão discutidos abaixo:
Os inventores demonstraram que um peptídeo que possuia seqüência de aminoácidos dentre aquelas mostradas naTABELA 1 ou como aqui descritas como parte da invenção podeaumentar a imunidade inata. Especificamente, os peptídeosdos IDS. DE SEQ. Nos: 1, 4, 5, 6, 45 e 47 tiveram aI habilidade para evitar e proteger contra infecção, comodemonstrado em modelos in vivo (FIG. 2 e Exemplo 3; FIG. 3e Exemplo 4). No entanto, o peptídeo dos IDS. DE SEQ. Nos:5 e 47 não possuía atividade antimicrobiana, como mostradono Exemplo 1 e na FIG. 1. Conseqüentemente, a modulação daimunidade inata através do peptídeo dos IDS. DE SEQ. Nos: 5e/ou 4 7 indica que esses peptídeos podem ser usados comouma substância terapêutica para ó tratamento de uma doençainfecciosa.
EXEMPLO 5 - ENSAIO DA ATIVIDADE PLASMÃTICA DE PLASMA COMSANGUE DE CAMUNDONGO
O sangue de camundongo foi obtido por punção cardíacade camundongos ICR, e coletado em tubos heparinizados decoleta de sangue. 0 sangue de vários camundongos foireunido em pool, e dividido em alíquotas de 300 μΐ. 0peptídeo foi dissolvido em soro fisiológico tamponado comacetato, pH 5,5, até uma concentração de 9 mM. Dessasolução de estoque, foram adicionados 3 0 μΐ aos 3 00 μΐ desangue, e misturados por re-suspensão (concentração nosangue de 0,82 mM) . Para o controle, 30 μΐ de sorofisiológico tamponado com acetato puro foram adicionadosaos 300 pl de sangue. Cada grupo de peptídeo foi preparadoem triplicata, enquanto o controle foi preparado em seisréplicas. As amostras foram incubadas a 37°C em microtubosfechados por duas horas. Após incubação, o plasma foiisolado das amostras por centrifugação a 4.000 rcf. Oplasma foi transferido para uma. placa de ensaio de 96 poçospara o ensaio de DPPIV. O ensaio-foi iniciado por adição de5 μl do substrato de DPPIV gly-prop-nitroanilida (16 mM emágua deionizada) a 95 μΐ de plasma (concentração no plasmade 0,8 mM) , e o aumento da absorbância UV (405 nm) foimonitorado ao longo de um período de tempo de 20 minutos. Ataxa da produção de p-nitroanilina por clivagem enzimáticade gly-pro-p-nitroanilida foi considerada como a atividadede DPPIV (Durinx C e cols., (2001) "Reference values forplasma dipeptidyl-peptidase IV activity and theirassociation with other laboratory parameters". Clin. Chem.Lab. Med. 39(2): 155-9).
Os resultados podem ser observados na TABELA 1. Foiobservado o efeito dos peptídeos sobre a atividade deDPPIV. Os resultados são apresentados como % de atividademédia normalizada, em relação ao controle de sorofisiológico (ajustado para 100%). Qualquer nível abaixo de100% de atividade representa uma redução da atividade deDPPIV.
Em um aspecto da invenção, uma redução da atividade deDPPIV de cerca de ou, em uma modalidade, pelo menos, 25%(ou seja, de cerca de 75%), era considerada ativa. Aqueleshabilitados na técnica observarão que o nível de atividadedesejado pode variar, dependendo do uso dos peptídeos.
Discussão
A serina protease dipeptidil peptidase transmembrana Ndo tipo II (DPPIV), também conhecida como CD26 ou proteínade ligação de adenosina desaminase, é um reguladorimportante de vários processos fisiológicos, incluindofunções imunológicas. CD26/DPPIV é uma glicoproteína dasuperfície celular de 110 kD que é expressa principalmenteem timócitos maduros, células T ativadas, células B,células NK, macrófagos e células epiteliais. Ela possuipelo menos duas funções, uma função de transdução de sinale uma função proteolítica (Morimoto C, Schlossman S.F."Structure and function of CD2 6 in the T-cell immuneresponse". Immunol. Review. 1998, 161: 55-70.). Um de seuspapéis celulares envolve a modulação da atividade dequimiocina por clivagem dos dipeptídeos do terminal N dequimiocina. A modulação do NH2 terminais de quimiocinas éde grande importância, não apenas para a ligação aos seusreceptores e nas reações seguintes, mas também paraalteração da especificidade do receptor da quimiocinaprocessada. Além disso, foi demonstrado que rCD26 solúvelaumenta a migração transendotelial de células T, ao mesmotempo em que reduz a resposta migratória de monócitos[Oravecz, T. e cols., (1997) "Regulation of the receptorspecificity and formation of the chemokine RANTES(regulated on activation, normal T cell expressed andsecreted) by dipeptydyl peptidase IV (CD26)-mediatedcleavage". J. Exp. Med. 186: 1.865-1.872; Iwata, S., ecols., (1999) "CD26/ dipeptydyl peptidase IV differentiallyregulates the chemotaxis of T cells and monocytes towardRANTES: possible mechanism for the switch from innate toacquired immune response". Int. Iwmunol. 11: 417-426).Esses resultados indicam que CD26/DPPIV reguladiferencialmente a resposta quimiotática de células T emonócitos, e está envolvida na mudança da respostaimunológica inata para adquirida. Como tal, uma redução daatividade de DPPIV teria, então, um efeito oposto,promovendo uma resposta imunológica inata e respostasmigratórias de macrófagos. Foi também relatado que ainibição farmacológica da atividade enzimática de DPPIVpoderia reduzir a progressão de artrite em um modeloexperimental em rato de RA (Tanaka S e cols., "Anti-arthritic effects of the novel dipeptidyl peptidase IVinhibitors TMC-2A and TSL-225" . Iinmunopharmacology 1998,40: 21-26; Tanaka S, e cols.,: "Suppression of arthritis bythe inhibitors of dipeptidyl peptidase IV." Int. J.Immunopharmacol. 1997, 19: 15-24), sugerindo quediminuições da atividade de DPPIV poderiam aliviar ainflamação sob algumas circunstâncias. Em conjunto, o papelantiinflamatório e sua modulação da atividade de quimiocinatornam DPPIV uma boa molécula para o rastreamento decompostos inéditos para essas atividades.
CD26/DPPIV está envolvida na patologia de diversasdoenças como, por exemplo, AIDS e progressão da doença porHIV (Blazquez e cols. 1992; Vanham e cols. 1993; Schols ecols. 1998 Oravecz e cols. 1995), doença de Graves (Eguchie cols. 1989; Nishikawa e cols. 1995) e câncer (Stecca ecols. 1997) e diabetes (Hinke e cols. 2000; Marguet e cols.2000).
Além disso, CD2 6 como indicador de ativação de célulasT demonstrou flutuar em paralelo com várias doençasautoimunes, tais como artrite reumatóide (Nakao e cols.,1989) e tireoidite autoimune (Eguchi e cols., 1989). CD26foi descrita como um marcador com boa correlação com onível de atividade dessas doenças. Além disso, ela foiestudada como indicador de progressão da doença naesclerose múltipla crônica progressiva (Constantinescu ecols., 1995).
Os peptídeos da presente invenção demonstraram quepodem reduzir a atividade de DPPIV. Como tal, eles podemser usados no tratamento de certas condições imunológicas,tais como condições relacionadas ou associadas â DPPIV, epodem, em um aspecto, modular a imunidade inata e ainflamação como, por exemplo, a inflamação que leva àsépsis.
Embora a invenção tenha sido descrita anteriormente emalgum detalhe para fins de clareza e uma melhorcompreensão, será observado por aqueles habilitados natécnica, a partir da leitura da especificação, que váriasmudanças, na forma e nos detalhes, podem ser feitas, sem seafastar do verdadeiro escopo da invenção nas reivindicações<table>table see original document page 72</column></row><table><table>table see original document page 73</column></row><table>** % Atividade de DPPIV (soro) , em que o controle éatividade de 100% (soro fisiológico ou veículoisoladamente, sem o peptídeo). São desejáveis cerca de 75%ou menos de atividade em relação ao controle de sorofisiológico.
*** OH indica a forma de ácido livre do peptídeo. Ac indicaacetilado. O indica ornitina, Cit indica citrulina, χindica estrutura NMe básica (versus estrutura amidabásica).
TABELA 1 (CONTINUAÇÃO)
Observação 1 da Tabela 1:
X1 é selecionado do grupo que consiste nos compostosbaseados em Κ, H, R, S, T, 0, Cit, Hei, Dabf Dpr ou glicinacom grupos funcionais básicos substituídos no terminal N(por exemplo, Nlys), hSer, Val(betaOH).
X2 é selecionado do grupo que consiste em V, I, K, PeH incluindo um peptídeo isolado de até 10 aminoácidos quecompreende uma seqüência de aminoácidos de ID. DE SEQ. N°:55.
Observação 2 da Tabela 1:
em que Xi é selecionado do grupo que consiste noscompostos baseados em Κ, H, R, S, T, O, Cit, Hei, Dab, Dprou glicina com grupos funcionais básicos substituídos noterminal N (por exemplo, Nlys), hSer, Val(betaOH), e em queX2 é selecionado do grupo que consistem em A, I, L, V, K,P, G, H, R, S, 0, Dab, Dpr, Cit, Hei, Abu, Nva, Nle e emque X2 pode ser N-metilado, e em que X3 é selecionado dogrupo que consiste em I, V, P, em que, em uma modalidade,X3 não é metilado no N. Em uma modalidade, o peptídeoisolado pode ser uma seqüência de aminoácidos de até 10aminoácidos, mas não é dos IDS. DE SEQ. Nos: 2 ou 17.Observação 3 da Tabela 1:
em que Xii X2 e X3 são definidos como no ID. DE SEQ.N°: 56, e em que "a" é selecionado do grupo que consiste emS, Ρ, I, R, Cf T, L, V, A, G, Κ, H, R, O, C, M, e F ou umpeptídeo isolado de até 10 aminoácidos compreendendo asreferidas seqüências.
Observação 4 da Tabela 1:
Em que XiX2X3P são como definidos no ID. DE SEQ. N°: 56e "b" é selecionado do grupo que consiste em A, A*, G, S,L, F, K, C, I, V, Τ, Y, R,'' H, O e M, mas, em umamodalidade, não P. Em uma modalidade, o peptídeo isolado é 11.·
um peptídeo de até 10 aminoácidos que compreende o ID. DESEQ. N°: 58, mas não o ID. DE SEQ. N°: 17.
Observação 5 da Tabela 1:
em que Xii X2 e X3 são como definidos no ID. DE SEQ.N°: 56, e "ax" é selecionado do grupo que consiste em Κ, IR, H, O, L, V, A e G, e "a2" é selecionado do grupo queconsiste em S, P, R Τ, Η, K, O, L, V, A, G, S, e I. Em umamodalidade, "ai" não é acetilado ou, quando ai for Κ, K nãoserá acetilado, e nem o ID. DE SEQ. N° : 2. Em umamodalidade, o peptídeo isolado compreende até 10aminoácidos que compreende o ID. DE SEQ. N°: 59.
Observação 6 da Tabela 1:
em que Xif X2 e X3 são como definidos no ID. DE SEQ.N°: 56, e em que "a" é selecionado do grupo que consiste emS, R, Κ, Η, O, Τ, I, L, V, A e G, e em que "b" éselecionado do grupo que consiste em A, V, I, L, G, Κ, H,R, O, S, TeF, ou um peptídeo de até 10 aminoácidos quecompreende o ID. DE SEQ. N°: 60.REFERÊNCIAS CITADAS
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<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> PEPTÍDEO IMUNOLÓGICO
<220>
<221> misc_feature
<222> (1) . . (1)
<223> Xaa é igual ao Acetilado K
<400 > 2
Xaa Ser Arg Ile Val Pro1 5
<210> 3<211> 6<212> PRT
<213 > Artificial
<220>
<223> PEPTÍDEO IMUNOLÓGICO<400> 3
Ser Arg Ile Val Pro Ala
<210> 4
<211> 5
<212> PRT
<213 > Artificial
<220>
<223> PEPTÍDEO IMUNOLÓGICO<400> 4
Ser Arg Ile Val Pro1 5
<210 > 5<211> 5<212 > PRT<213 > Artificial
<220>
<223> PEPTÍDEO IMUNOLÓGICO<400> 5
Arg Ile Val Pro Ala
<210> 6
<211> 5
<212> PRT
<213 > Artificial
<220>
<223> PEPTÍDEO IMUNOLÓGICO
<400> 6
Lys Ile Val Pro Ala
<210> 7
<211> 5
<212> PRT
<213 > Artificial
<220>
<223> PEPTÍDEO IMUNOLÓGICO<220>
<221> misc_feature
<222> (5) . . (5)
<223> Xaa é igual ao D- Aminoácido do Ala
<4 0 0 > 7
Arg Ile Val Pro Xaa
1 5
<210> 8
<211> 4
<212 > PRT
<213 > Artificial
<22 0 >
<223> PEPTÍDEO IMUNOLÓGICO
<4 00 > 8
Arg Val Pro Ala1
<210 > 9
<211> 4
<212 > PRT
<213 > Artificial
<22 0 >
<223> PEPTÍDEO IMUNOLÓGICO
<4 00 > 9
Arg Ile Pro Ala1
<210> 10
<211> 5
<212 > PRT
<213 > Artificial
<220>
<223> PEPTÍDEO IMUNOLÓGICO<220>
<221> misc_feature
<222> (5) . . (5)
<22 3> Xaa é igual ao Ala -OH
<400> 10
Arg Ile Val Pro Xaa1 5
<210> 11<211> 5<212> PRT
<213 > Artificial
<22 0 >
<223> PEPTÍDEO IMUNOLÓGICO
<400> 11
Arg Ala Val Pro Ala1 5
<210> 12
<211> 6
<212 > PRT
<213 > Artificial
<22 0 >
<223> PEPTÍDEO IMUNOLÓGICO
<4 00 > 12
Arg Arg Ile Val Pro Ala1 5
<210> 13
<211> 5
<212 > PRT
<213 > Artificial
<2 2 0 >
<223> PEPTÍDEO IMUNOLÓGICO
<4 0 0 > 13
Arg Lys Val Pro Ala1 5
<210> 14
<211> 5
<212> PRT
<213 > Artificial
<220>
<223> PEPTÍDEO IMUNOLÓGICO
<4 00 > 14
Arg Ile Val Pro Lys1 5
<210> 15
<211> 5
<212 > PRT
<213 > Artificial
<220>
<223> PEPTÍDEO IMUNOLÓGICO<400> 15
Arg Pro Val Pro Ala
<210> 16
<211> 5
<212 > PRT
<213 > Artificial
<220>
<223> PEPTÍDEO IMUNOLÓGICO
<400> 16
Arg Ile Pro Pro Ala
<210> 17
<211> 5
<212 > PRT
<213 > Artificial
<22 0 >
<223> PEPTÍDEO IMUNOLÓGICO
<4OO > 17
Arg Ile Val Pro Pro
<210> 18
<211> 7
<212 > PRT
<213 > Artificial
<220>
<223> PEPTÍDEO IMUNOLÓGICO
<400> 18
Arg Ile Val Pro Gly Gly Ala
<210> 19
<211> 6
<212 > PRT
<213 > Artificial
55 <220>
<22 3> PEPTÍDEO IMUNOLÓGICO
<400 > 19
Gly Gly Ile Val Pro Ala1 5<210> 20
<211> 5
<212 > PRT
<213 > Artificial
<22 0 >
<223> PEPTfDEO IMUNOLÓGICO
<4 00 > 20
Gly Ile Val Pro Ala1 5
<210 > 21
<211> 5
<212 > PRT
<213 > Artificial
<22 0 >
<223> PEPTÍDEO IMUNOLÓGICO
<4 00 > 21
Arg Gly Val Pro Ala1 5
<210> 22
<211> 5
<212> PRT
<213 > Artificial
<220>
<223> PEPTÍDEO IMUNOLÓGICO
<400> 22
Arg Ile Val Pro Gly1 5
<210 > 23
<211> 5
<212 > PRT
<213 > Artificial
<22 0 >
<223> PEPTÍDEO IMUNOLÓGICO
<4 0 0 > 23
Arg Ile Val Pro Ser1 5
<210><211><212 >
245
PRT<213 > Artificial<220>
<223> PEPTÍDEO IMUNOLÓGICO
<4 0 0 > 24
Arg Ile Val Pro Leu1 5
<210 > 25<211> 5<212 > PRT<213 > Artificial
<220>
<223> PEPTÍDEO IMUNOLÓGICO<4 0 0 > 25
Arg His Val Pro Ala
<210> 26
<211> 5
<212> PRT
<213 > Artificial
<220>
<223> PEPTÍDEO IMUNOLÓGICO
<400> 26
Arg Ile Pro Val Ala
<210 > 27
<211> 5
<212 > PRT
<213 > Artificial
<220>
<223> PEPTÍDEO IMUNOLÓGICO
<4 0 0 > 27
Arg Val Ile Pro Ala1 5
<210> 28
<211> 5
<212> PRT
<213 > Artificial
<220>
<223> PEPTÍDEO IMUNOLÓGICO<4OO> 28
Arg Ile Ile Pro Ala
<210> 29
<211> 5
<212 > PRT
<213 > Artificial
<22 0 >
<223> PEPTÍDEO IMUNOLÓGICO
<400> 29
Ala Val Pro Ile Arg
<210> 30
<211> 5
<212 > PRT
<213 > Artificial
<220>
<223> PEPTÍDEO IMUNOLÓGICO
<400> 30
Ala Pro Val Ile Arg
<210> 31
<211> 5
<212 > PRT
<213 > Artificial
<220>
<223> PEPTÍDEO IMUNOLÓGICO
<400> 31
Arg Ile Val Pro Ala
<210> 32
<211> 7
<212 > PRT
<213 > Artificial
<220>
<223 > PEPTÍDEO IMUNOLÓGICO
<400> 32
Cys Arg Ile Val Pro Ala Cys1 5<210> 33<211> 5<212> PRT<213> Artificial<220><223> PEPTÍDEO IMUNOLÓGICO<220><221> misc_feature<222> (2) . . (2)<223> Xaa é igual ao I com uma estrutura principal NMe<4 0 0 > 33
Arg Xaa Val Pro Ala1 5
<210> 34<211> 5<212 > PRT<213 > Artificial<220><223> PEPTÍDEO IMUNOLÓGICO<220><221> misc_feature<222> (5) . . (5)<223> Xaa é igual ao A com uma estrutura principal N-metilada<400> 34
Arg Ile Val Pro Xaa1 5
<210> 35<211> 5<212> PRT<213 > Artificial<220><223> PEPTÍDEO IMUNOLÓGICO<400> 35
Arg Ile Val Pro Phe
<210> 36<211> 5<212 > PRT<213 > Artificial<220><22 3> PEPTÍDEO IMUNOLÓGICO<400> 36
Cit Ile Val Pro Ala
<210> 37
<211> 5
<212 > PRT
<213 > Artificial
<220>
<223> PEPTÍDEO IMUNOLÓGICO<4 00 > 37
Arg Leu Val Pro Ala
<210> 38
<211> 5
<212 > PRT
<213 > Artificial
<220>
<223> PEPTÍDEO IMUNOLÓGICO<4 0 0 > 38
His Ile Val Pro Ala
<210> 39
<211> 6
<212> PRT
<213 > Artificial
<220>
<223> PEPTÍDEO IMUNOLÓGICO
<400> 39
Ile Arg Arg Val Pro Ala
<210><211><212 ><213 >
PRT
Artificial
<220><223 >
<400> 40
Ala Arg Val Pro Ala1 5<210> 41
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> PEPTÍDEO IMUNOLÓGICO
<400> 41
Ile Arg Val Pro Ala
<210> 42
<211> 5
<212 > PRT
<213 > Artificial
<220>
<223> PEPTÍDEO IMUNOLÓGICO<400> 42
Orn Ile Val Pro Ala
<210> 43
<211> 5
<212 > PRT
<213 > Artificial
<22 0 >
<223> PEPTÍDEO IMUNOLÓGICO
<400> 43 Ser Ile Val Pro Ala
<210> 44
<211> 13
<212 > PRT
<213 > Artificial
<220>
<223 > PEPTÍDEO IMUNOLÓGICO
<400 > 44
Val Ser Ile Ile Lys Pro Ala Arg Val Pro Ser Leu Leu1 5 10
<210> 45
<211> 7
<212 > PRT
<213 > Artificial<220>
<223> PEPTÍDEO IMUNOLÓGICO<4 00 > 45
Lys Pro Ala Arg Val Pro Ser
<210 > 46
<211> 6
<212 > PRT
<213 > Artificial
<220>
<223> PEPTÍDEO IMUNOLÓGICO
<4 0 0 > 46
Arg Val Pro Ser Leu Leu
25 <210> 47
<211> 6
<212 > PRT
<213 > Artificial
<220>
<223> PEPTÍDEO IMUNOLÓGICO
<4 0 0 > 47
Lys Pro Arg Ala Val Pro
<210> 48
40 <211> 5
<212 > PRT
<213 > Artificial
<22 0 >
<223> PEPTÍDEO IMUNOLÓGICO
<4 0 0 > 48
Pro Ala Arg Val Pro1 5
<210> 49
<211> 4
<212 > PRT
<213 > Artificial
<220>
<223> PEPTÍDEO IMUNOLÓGICO<400> 49Ile Arg Val Pro1
<210> 50
<211> 4
<212 > PRT
<213 > Artificial
<220>
<223> PEPTÍDEO IMUNOLÓGICO
<400> 50
Arg Val Pro Ser1
<210> 51
<211> 3
<212 > PRT
<213 > Artificial
<220>
<223> PEPTÍDEO IMUNOLÓGICO
<4 00 > 51
Arg Val Pro1
<210> 52
35 <211> 6
<212 > PRT
<213 > Artificial
<22 0 >
<223> PEPTÍDEO IMUNOLÓGICO
<4 00 > 52
Pro Ser Val Pro Gly Ser1 5
<210> 53
<211> 6
<212 > PRT
<213 > Artificial
<220>
<223> PEPTÍDEO IMUNOLÓGICO<400> 53
Gly Leu Lys His Pro Ser1 5<210> 54
<211> 11
<212> PRT
<213 > Artificial
<220>
<223> PEPTÍDEO IMUNOLÓGICO<4OO> 54
Arg Ile Val Pro Ala Ile Pro Val Ser Leu Leu1 5 10
<210 > 55
<211> 3
<212 > PRT
<213 > Artificial
<220>
<223> PEPTÍDEO IMUNOLÓGICO
<220>
<221> misc_feature
<222 > (1) . . (1)
<223> Xaa é selecionado do grupo consistindo de Κ, H, R, S, T, O,Cit, Hei, Dab, Dpr, ou compostos a base de glicina com gruposfuncionais básicos substituídos no N-terminal.
<22 0 >
<221> misc_feature
<222> (2) . . (2)
<223> Xaa é selecionado do grupo consistindo de V, I, Κ, P, e H.
<400> 55
Xaa Xaa Pro1
<210> 56
<211> 4
<212 > PRT
<213 > Artificial
<22 0 >
<223> PEPTÍDEO IMUNOLÓGICO<220>
<221> misc_feature<222> (1) . . (1)
<223> Xaa é selecionado do grupo consistindo de Κ, H, R, S, T, O,Cit, Hei, Dab, Dpr, ou compostos a base de glicina com gruposfuncionais básicos substituídos no N-terminal.<22 0 >
<221> misc_feature<222> (2) . . (2)
<223> Xaa é selecionado do grupo consistindo de A, I, L, V, K, P( G,H, R, S, O, Dab, Dpr, Cit, Hei, Abu, Nva, Nle e onde Xaa pode ser N-metilado.<220>
<221> misc_feature<222> (3) . . (3)
<223> Xaa é selecionado do grupo consistindo de I, V, P.
<4 0 0 > 56
Xaa Xaa Xaa Pro1
<210> 57
<211> 5
<212 > PRT
<213 > Artificial
<220>
<223> PEPTÍDEO IMUNOLÓGICO
<220>
<221> misc_feature<222> (1) . . (1)
<223> Xaa é selecionado do grupo consistindo de S, P , I, R, C, T,L, V, A, G, Κ, H, R, O, C, M, e F.
<220>
<221> misc_feature<222> (2) . . (2)
<223> Xaa é selecionado do grupo consistindo de Κ, H, R, S, T, O,Cit, Hei, Dab, Dpr, ou compostos a base de glicina com gruposfuncionais básicos substituídos no N-terminal.
<22 0 >
<221> misc_feature<222> (3) . . (3)
<223> Xaa é selecionado do grupo consistindo de A, I, L, V, Κ, P, G,H, R, S, O, Dab, Dpr, Cit, Hei, Abu, Nva, Nle e onde Xaa pode ser N-metilado.
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(4)
<223> Xaa é selecionado do grupo consistindo de I, V, P.
<400> 57
Xaa Xaa Xaa Xaa Pro
1 5
<210> 58
<211> 5
<212 > PRT
<213 > Artificial
<220>
<223> PEPTÍDEO IMUNOLÓGICO
<220>
<221> misc feature<222> (1) . . (1)
<223> Xaa é selecionado do grupo consistindo de Κ, H, R, S, T, O,Cit, Hei, Dab, Dpr, ou compostos a base de glicina com gruposfuncionais básicos substituídos no N-terminal.<220>
<221> misc_feature<222> (2) . . (2)
<223> Xaa é selecionado do grupo consistindo de A, I, L, V, Κ, P, G,H, R, S, O, Dab, Dpr, Cit, Hei, Abu, Nva, Nle e onde Xaa pode ser N-metilado.
<220>
<221> misc_feature
<222> (3) . . (3)
<223> Xaa é selecionado do grupo consistindo de I, V, P.
<22 0 >
<221> misc_feature<222> (5) . . (5)
<223> Xaa é selecionado do grupo consistindo de A, A*,G, S, L, F, K,C, I, V, Τ, Y, R, H, O, e M, onde A* denota D aminoácido de A.
<4 00 > 58
Xaa Xaa X3 Pro Xaa1 5
<210> 59
<211> 6
<212> PRT
<213 > Artificial
<22 0 >
<22 3> PEPTÍDEO IMUNOLÓGICO
<220>
<221> misc_feature<222> (1) . . (1)
<223> Xaa é selecionado do grupo consistindo de K, I,R, H, O, L, V,A, e G.
<220>
<221> misc_feature<222> (2) . . (2)
<223> Xaa é selecionado do grupo consistindo de S, P, R, Τ, Η, K, O,L, V, A, G, S, I.
<22 0 >
<221> misc_feature<222> (3) . . (3)
<223> Xaa é selecionado do grupo consistindo de Κ, H, R, S, T, O,Cit, Hei, Dab, Dpr, ou compostos a base de glicina com gruposfuncionais básicos substituídos no N-terminal.
<22 0 >
<221> misc_feature<222> (4) . . (4)<223> Xaa é selecionado do grupo consistindo de A, I, L, V, Κ, P, G,H, R, S, O, Dab, Dpr, Cit, Hei, Abu, Nva, Nle e onde Xaa pode ser N-metilado.
<220>
<221> misc_feature
<222> (5) . . (5)
<223> Xaa é selecionado do grupo consistindo de I, V, P.
<400> 59
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Pro
1 5
<210> 60
<211> 6
<212 > PRT
<213 > Artificial
<220>
<223> PEPTÍDEO IMUNOLÓGICO<22 0 >
<221> misc_feature
<222> (1) . . (1)
<223> Xaa é selecionado do grupo consistindo de S, R, Κ, Η, O, Τ, I,
L, V, A, e G.
<220>
<221> misc_feature<222> (2) . . (2)
<223> Xaa é selecionado do grupo consistindo de Κ, H, R, S, T, O,Cit, Hei, Dab, Dpr, ou compostos a base de glicina com gruposfuncionais básicos substituídos no N-terminal.
<22 0 >
<221> misc_feature<222> (3) . . (3)
<223> Xaa é selecionado do grupo consistindo de A, I, L, V, Κ, P, G,H, R, S, O, Dab, Dpr, Cit, Hei, Abu, Nva, Nle e onde Xaa pode ser N-metilado.
<22 0 >
<221> misc_feature
<222 > (4) . . (4)
<223> Xaa é selecionado do grupo consistindo de I, V, P.<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(6)
<223> Xaa é selecionado do grupo consistindo de A, V, I, L, G, Κ, H,
R, O, S, T, e F.
<4 0 0 > 60
Xaa Xaa Xaa Xaa Pro Xaa1 5

Claims (35)

1. Peptídeo isolado, caracterizado por compreender aseqüência de aminoácidos da TABELA 1 ou um análogo,derivado ou variante desta.
2. Peptídeo isolado, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado por ter um terminal C modificado e/ou umterminal N modificado.
3. Peptídeo isolado, de acordo com a reivindicação 2,caracterizado por ter um terminal C modificado.
4. Peptídeo isolado, de acordo com a reivindicação 3,caracterizado por ter um terminal C aminado.
5. Peptídeo isolado, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado por compreender a seqüência de aminoácidos daTABELA 1 modificada por pelo menos uma substituição de umaminoácido D.
6. Agente caracterizado por reagir com o peptídeo dareivindicação 1.
7. Agente, de acordo com a reivindicação 6,caracterizado por ser um anticorpo.
8. Agente, de acordo com a reivindicação 7,caracterizado por ser um anticorpo monoclonal.
9. Molécula de ácido nucléico isolado, caracterizadapor codificar o peptídeo da reivindicação 1.
10. Construção de ácido nucléico recombinante,caracterizada por compreender a molécula de ácido nucléicoda reivindicação 9 ligada operacionalmente a um vetor deexpressão.
11. Pelo menos uma célula hospedeira caracterizada porcompreender a construção de ácido nucléico recombinante dareivindicação 10.
12. Método para a produção de um peptídeo quecompreende uma seqüência de aminoácidos listada na TABELA 1ou um análogo, derivado ou variante desta, o referidométodo caracterizado por compreender as etapas de:(a) cultivo de pelo menos uma célula hospedeira dareivindicação 11, sob condições que permitem a expressão dopeptídeo; e(b) recuperação do peptídeo de pelo menos uma célulahospedeira ou meio de cultura desta.
13. Composição farmacêutica, caracterizada porcompreender o peptídeo da reivindicação 1 e um veículo,diluente ou excipiente farmaceuticamente aceitável.
14. Método para tratamento e/ou prevenção de infecçãoem um indivíduo, caracterizado por compreender aadministração ao indivíduo de um peptídeo que compreendeuma seqüência de aminoácidos listada na TABELA 1 ou umanálogo, derivado ou variante desta.
15. Método, de acordo com a reivindicação 14,caracterizado pelo fato de que o peptídeo tem a seqüênciade aminoácidos dos IDS. DE SEQ. Nos: 1, 3-16, 18-60.
16. Método, de acordo com a reivindicação 14,caracterizado pelo fato de que o peptídeo modula aimunidade inata no indivíduo tratando ou prevenindo, dessaforma, a infecção no indivíduo.
17. Método, de acordo com a reivindicação 14,caracterizado pelo fato de que "á infecção é uma infecçãomicrobiana.
18. Método, de acordo com a reivindicação 17,caracterizado pelo fato de que a infecção é selecionada dogrupo que consiste em uma infecção por uma bactéria, umainfecção por um fungo, uma infecção por um parasita e umainfecção por um vírus.
19. Método, de acordo com a reivindicação 18,caracterizado pelo fato de que a bactéria é uma bactériaGram-positiva ou Gram-negativa.
20. Método, de acordo com a reivindicação 19,caracterizado pelo fato de que a bactéria é selecionada dogrupo que consiste em E. coli, Klebsiella pneumoniae,Pseudomonas aeruginosa, Salmonella spp., Staphylococcusaureus, Streptococcus spp. e enterococo resistente àvancomicina.
21. Método, de acordo com a reivindicação 18,caracterizado pelo fato de que o fungo é selecionado dogrupo que consiste em um bolor, uma levedura e um fungosuperior.
22. Método, de acordo com a reivindicação 18,caracterizado pelo fato de que o parasita é unicelular oumulticelular.
23. Método, de acordo com a reivindicação 22,caracterizado pelo fato de que o parasita é selecionado dogrupo que consiste em Giardia duodenalis, Cryptosporidiumparvum, Cyclospora eayetanensis e Toxoplasma gondii.
24. Método, de acordo com a reivindicação 18,caracterizado pelo fato de que o vírus está associado a umacondição selecionada do grupo que consiste em AIDS, gripeaviária, varicela, lesões por herpes simples, resfriadocomum, gastrenterite, febre glandular, influenza, infecçãodo trato respiratório inferior, sarampo, caxumba,faringite, pneumonia, rubéola, SARS e infecção do tratorespiratório superior.
25. Método, de acordo com a reivindicação 24,caracterizado pelo fato de que o vírus é o vírus sincicialrespiratório (RSV).
26. Método, de acordo com a reivindicação 14,caracterizado pelo fato de que o indivíduo tem, ou está emrisco de ter, infecção.
27. Método, de acordo com a reivindicação 26,caracterizado pelo fato de que o peptídeo é administradopor via oral, parenteral, transdérmica, intranasal, poradministração pulmonar, ou por bomba osmótica.
28. Método para prever se um indivíduo responderia aotratamento para uma infecção microbiana ou um distúrbiorelacionado à imunidade, onde o tratamento compreende aadministração ao indivíduo de um peptídeo que compreendeuma seqüência de aminoácidos da TABELA 1 ou de um análogo,derivado ou variante desta, o método caracterizado pelofato de que compreende o teste de uma amostra diagnosticado indivíduo quanto à atividade de DPPIV por administraçãoà amostra do peptídeo da invenção na presença de umsubstrato de DPPIV sob condições que permitiriam que aDPPIV reagisse com o substrato, em que a redução daatividade de DPPIV, comparada com um controle sem opeptídeo, é indicativa de que o indivíduo responderia aotratamento.
29. Peptídeo isolado, caracterizado por compreenderuma seqüência de aminoácidos selecionada do grupo queconsiste nos IDS. DE SEQ. Nos: 1-60.
30. Peptídeo isolado, de acordo com a reivindicação 29, caracterizado por compreender a seqüência deaminoácidos é selecionada do grupo que consiste nos IDS. DESEQ. Nos: 1, 3-16, 18-60.
31. Peptídeo isolado, de acordo com a reivindicação-30, caracterizado pelo fato de que a seqüência deaminoácidos é selecionada do grupo que consiste nos IDS, DESEQ. Nos: 1, 3-16, 18-54.
32. Peptídeo isolado, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 2 9 ou 30, caracterizado por compreenderatividade imunológica. ;í
33. Peptídeo isolado, de acordo com a reivindicação-32, caracterizado por consistir em até 10 aminoácidos.
34. Uso de um peptídeo isolado de qualquer uma dasreivindicações 32 ou 33, caracterizado por ser para otratamento de uma condição relacionada à DPPIV.
35. Uso de um peptídeo de qualquer uma dasreivindicações 32 ou 33, caracterizado por ser para otratamento de uma infecção ou uma condição relacionada àimunidade inata.
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