BRPI0617191A2 - modificação pós-traducional de polipeptìdeos expressos em fagos - Google Patents

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Feng Tian
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Abstract

MODIFICAçãO PóS-TRADUCIONAL DE POLIPEPTìDEOS EXPRESSOS EM FAGOS. A invenção se relaciona à modificação pós-traducional de polipeptídeos expressos em fagos. Estes polipeptídeos expressos compreendem pelo menos um aminoácido não natural, por exemplo, um aminoácido aril-azida tal como pazido-L-fenialanina, ou um aminoácido alquinil tal como para-propargiloxifenilalanina, que são incorporados no polipeptídeo de fusão expresso em fagos em uma posição selecionada usando um sistema de tradução ortogonal in vivo compreendendo uma aminoacil-tRNA sintetase ortogonal adequada e espécies de RNAt ortogonais adequadas. Estes aminoácidos não naturais fornecem, com vantagens, alvos para modificações pós-traducionais como reações de cicloadição [3+2] azida-alquino e modificações de Staudinger.

Description

"MODIFICAÇÃO PÓS-TRADUCIONAL DE POLIPEPTÍDEOSEXPRESSOS EM FAGOS"
Referências cruzadas à pedidos de patente relacio-nados
Este pedido de patente reivindica prioridade e be-neficio ao United States Provisional Patent Application Se-rial No. 60/726, 137, depositado em 12 de outubro de 2005 eProvisional Patent Application Serial No. 60/737,622, depo-sitado em 16 de novembro de 2005, os conteúdos dos quais sãoincorporados aqui como referência em sua totalidade para to-dos os fins.
Declaração dos Direitos de Invenção Feita sob Pes-quisa e Desenvolvimento Patrocinada pelo Governo Federal
Esta invenção foi realizada com patrocínio gover-namental do Departament of Energy sob o número ER46051, e doNational Institutes of Health sob o número GM56528. 0 gover-no pode ter certos direitos a esta invenção.
Campo da Invenção
Esta invenção se relaciona ao campo da química deproteínas, por exemplo, bioquímica da tradução. A invençãose relaciona a composições e métodos para fazer bacteriófa-gos, onde os fagos compreendem um polipeptídio expresso pos-suindo um aminoácido não natural que pode,servir como um al-vo para modificação pós-traducional covalente seletiva, re-sultando em um fago modificado pós-traducionalmente.
Antecedentes da Invenção
O estudo da estrutura e função de proteínas histo-ricamente se baseou em reações químicas que estão disponí-veis usando os grupos reativos dos aminoácidos de ocorrêncianão natural. Infelizmente, todos os organismos conhecidos,das bactérias aos humanos, codificam os mesmos vinte aminoá-cidos comuns (com a rara exceção da selenocisteina (veja,por exemplo, . Bock et ah, (1991), Molecular Microbiology5:515-20) e pirrolisina (veja, por exemplo, G. Srinivasan,et al., (2002), Science 2 9 6:1459-62). A limitada seleção degrupos R tem restringido o estudo da estrutura e função deproteínas, onde os estudos estão confinados pelas proprieda-des químicas dos aminoácidos de ocorrência natural.
O número limitante de aminoácidos naturais res-tringem a habilidade de fazer modificações pós-traducionaisaltamente direcionadas em proteínas para excluir todos osoutros aminoácidos em uma proteína. A maioria das reações demodificação atualmente usadas na área envolvem a formação deligação covalente entre parceiros de reação nucleofílicos eeletrofílicos que tem como alvo os resíduos nucleofílicos deocorrência natural nas cadeias laterais de aminoácidos, porexemplo, a reação de α-halo cetonas com cadeias laterais dehistidina e cisteinas. A seletividade nestes casos é deter-minada pelo número e acessibilidade dos resíduos nucleofíli-cos na proteína. Infelizmente, as proteínas de ocorrêncianatural freqüentemente contém sítios de reação mal posicio-nados (por exemplo, inacessíveis) ou alvos de múltiplas rea-ções (por exemplo, resíduos de lisina, histidina e cisteí-na), resultando em baixa seletividade nas reações de modifi-cação, tornando a modificação de proteínas altamente dire-cionada por reagentes nucleofílicos/eletrofílicos difícil.Além disso, os sítios de modificação são tipicamente limita-dos às cadeias laterais nucleofilicas de ocorrência naturalda lisina, histidina e cisteína. A modificação de outros sí-tios é difícil ou impossível.
Abordagens alternativas para modificar seletiva-mente proteínas com agentes sintéticos e sondas, e ligaçãocovalente de proteínas às superfícies foram tentadas. Estasincluem semi-síntese (Muir, Annu. Rev. Biochem. 2003, 72,249-289), o uso de agentes eletrofílicos que marcam seleti- vãmente resíduos de cisteína e lisina (Chilkoti et al, Bio-conjugate Chem. 1994, 5, 504-507; Rosendahl et al, Bioconju-gate Chern. 2005, 16, 200- 207), e a introdução seletiva deaminoácidos com cadeias laterais reativas em proteínas porbiosíntese in vitro com tRNAs quimicamente aminoacetilados (Bain et al, J. Am. Chem. Soe. 1989, 111, 8013-8014; Ellmanet al, Methods Enzymol. 1991, 202, 301-336). Cada uma destasabordagens sofrem a perda de especificidade alvo ou outrasimpraticalidades.
Uma estratégia para superar as limitações do re-pertório genético existente é a adição de aminoácidos quetem propriedades químicas distintas ao código genético. Estaabordagem se tornou possível usando moléculas de tRNA orto-gonal e as novas aminoacil-tRNA sintetases ortogonais cor-respondentes para adicionar aminoácidos não naturais a pro- teínas usando a maquinaria biosintética protéica in vivo deuma célula hospedeira, por exemplo, a eubactéria Escherichiacoli (E coli) . Esta abordagem é descrita em varias fontes,por exemplo, Chin et al, Science (2003) 301:964-967; Zhanget al, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 2004, 707:8882-8887;Anderson et al, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 2004,707:7566-7571; Wang et al, (2001) Science 292:498-500; Chinet al, (2002) Journal of the American Chemical Society124:9026-9027; Chin e Schultz, (2002) ChemBioChem 11:1135-1137; Chin, et al, (2002) PNAS United States of America99:11020-11024; Wang e Schultz, (2002) Chem. Comm., 1-10;Wang e Schultz "Expanding the Genetic Code," Angewandte Che-mie Int. Ed, 44(1). :34-66 (2005); e Xie e Schultz, "An Ex-panding Genetic Code," Methods 36:227-238 (2005). Veja tam-bém, International Publications WO 2002/086075, entitulada"METHODS AND COMPOSITIONS FOR THE PRODUCTION OF ORTHOGONALtRNA AMINOACYL-tRNA SYNTHETASE PAIRS;" WO 2002/085923, enti-tulada "IN VIVO INCORPORATION OF UNNATURAL AMINO ACIDS;" WO2004/094593, entitulada "EXPANDING THE EUKARYOTIC GENETICCODE;" WO 2005/019415, depositada em 7 de julho de 2004;W02005/007870, depositada em 7 de julho de 2004; WO2005/007624, depositada em 7 de julho de 2004; e Internatio-nal Publication No. W02006/034332, depositada em 20 de Se-tembro de 2005.
A tecnologia de phage display é uma técnica maleá-vel de muito utilizada que tem aplicações em diversas disci-plinas biológicas. Veja, por exemplo, Smith e Petrenko,Chem. Rev., 97:391-410 (1997); Sidhu, Bimolecular Engineer-ing 18:57-63 (2001); Rodi e Makowski, Current Opinion inBiotechnology 10:87-93 (1999); e Willats, Plant MolecularBiology 50:837-854 (2002) . Por exemplo, a técnica de phagedisplay se provou muito util para o isolamento de ligantesde alta afinidade e receptores provenientes de grandes bi-bliotecas de polipeptideos. Tem a vantagem de que as grandesbibliotecas podem ser facilmente geradas pelos métodos derecombinação, membros da biblioteca podem ser amplificadospara etapas iterativas de enriquecimento, e a estrutura pri-maria pode ser determinada por seqüenciamento de DNA. Entre-tanto, como proteínas em geral, bibliotecas de peptídeos ex-pressos em fagos também estão restritos aos blocos de cons-trução dos 20 aminoácidos comuns, limitando os grupos fun-cionais que podem ser direcionados para modificação pós-traducional. Além disso, os métodos para modificação pós-traducional de polipeptieos expressos em fagos, onde a rea-ção de modificação usa condições fisiologicamente compatí-veis que preservam a atividade da proteína e a viabilidadedo fago são um desafio ainda maior (Leieux and Bertozzi(1998) TIBTECH, 16:506).
Em uma tentativa para expandir o escopo da utili-dade da técnica de phage-display, Noren e colaboradores in-corporaram selenocistéina em peptídeos expressos em fagosusando um tRNA supressor opal selenocisteína (Sandman etal., J. Am. Chem. Soe. (2000) 122:960- 961). Roberts et al.Tentou generalizar esta abordagem para bibliotecas de peptí-deos contendo outros aminoácidos não naturais usando displayde RNAm in vitro (Li et al, J. Am. Chem. Soe, (2002)124:9972) com tRNAs supressores de âmbar quimicamente amino-acetilados (Noren et al, Science (1989) 244:182-188). Entre-tanto, a geração de um grande número de tais tRNAs é impra-ticável e eles são consumidos estequimetricamente.O que é necessário na área são novas estratégiaspara a incorporação de aminoácidos não naturais em polipep-tidios expressos em fagos para fins de modificação e estudoda estrutura e função, onde o aminoácido não natural nos po-lipeptidios expressos pode ser seletivamente direcionado pa-ra modificação pós-traducional enquanto expresso no fago.Existe uma necessidade na área para a criação de novas es-tratégias para as reações de modificação de proteína que mo-difica proteínas expressas em fagos de uma maneira altamenteseletiva, e além disso, permite a modificação de proteínasexpressas em fago sob condições fisiológicas que preservam aviabilidade do fago após a reação de modificação. 0 que énecessário na área são novos métodos para produzir modifica-ções em proteínas alvo em proteínas expressas em fagos, ondeas modificações são altamente específicas, por exemplo, mo-dificações onde nenhum dos aminoácidos de ocorrência naturalnos polipeptídios são submetidos a reações cruzadas ou rea-ções colaterais. A invenção descrita aqui satisfaz estas eoutras necessidades, conforme ficará claro pela revisão doseguinte relato.
Sumário da Invenção
Existe uma necessidade para reações químicas quemodificam proteínas, por exemplo, proteínas expressas em fa-gos, de uma maneira altamente seletiva. A maioria das rea-ções atualmente usadas na área para a modificação seletivadas proteínas tem pouca seletividade e são limitadas pelosresíduos de aminoácidos de ocorrência natural. A presenteinvenção fornece soluções destes problemas.A invenção fornece sistemas para a incorporaçãobiossintética programada, sitio especifica de aminoácidosnão naturais em proteínas expressas em fagos pela manipula-ção dos sistemas de tradução ortogonal para trabalhar emconjunto com reagentes recombinantes de expressão de fagos.A invenção fornece métodos para subseqüente modificação di-recionada destes resíduos de aminoácidos não naturais quesão incorporados em polipeptídios expressos em fagos. A in-venção fornece novas composições (por exemplo, fagos compre-endendo várias modificações pós-traducionais) e novos méto-dos para a geração de fago modificado traducionalmente.
Os sistemas para a produção de fagos fornecidosaqui tiram vantagem dos sistemas de tradução ortogonal queusam células hospedeiras de E coli para a incorporação sele-tiva de aminoácidos não naturais em polipeptídios expressosem fagos, e a subseqüente modificação destes polipeptídiosuando modificação seletiva no resíduo de aminoácido não na-tural. Várias reações químicas para a modificação de resí-duos de aminoácidos não naturais em polipeptídios expressosem fagos são demonstradas, incluindo reações de cicloadição[3+2] e ligação de Staudinger. A natureza do material que éconjugado à proteína expressa em fagos via um aminoácido nãonatural alvo não é particularmente limitada e pode ser dese-jada em sua totalidade.
A invenção fornece fago possuindo um polipeptídiode fusão expresso, onde o polipeptídio compreende pelo menosum resíduo de aminoácido não natural modificado. Uma varie-dade de aminoácidos não naturais reativos pode ser usada nopolipeptidio expresso. Por exemplo, o aminoácido não naturalpode ser um aminoácido não natural aril-azida (por exemplo,para-azido-L-fenilalanina). 0 fago pode ser um fago filamen-toso, por exemplo, um fago derivado de M-13.
O polipeptidio expresso é geralmente um polipepti-dio de fusão que compreende uma proteína do capsideo do fago(ou sua fração ou variante) e uma seqüência de aminoácido deinteresse. Em algumas modalidades, o polipeptidio de fusão édesignado para incorporar uma seqüência de reconhecimento deprotease ligante de peptídeo especificamente clivável poruma protease sítio-específica, por exemplo, fator Xa, fatorXIA, Kallikvein, trombina, fator XIIa, colagenase ou entero-quinase.
Vários tipos de reações de modificação são empre-gados para a modificação de polipeptídios expressos em fagospossuindo o aminoácido não natural. Por exemplo, uma reaçãode cicloadição [3+2] azida alquino (que produz uma ligaçãotriazol) ou uma reação de ligação de Staudinger pode ser u-sada. Devido a reação única dos grupos químicos de aril azi-da e aminoácidos não naturais alquinil, proteínas expressasem fagos nas quais eles estão incorporados podem ser modifi-cadas com seletividade extremamente alta. Em alguns casos, ogrupo reativo do aminoácido não natural tem a vantagem deser completamente diferente aos sistemas in vivo, melhoran-do, assim, a seletividade da reação. Vantajosamente, o usoda reação de Staudinger preserva a infectividade viral.
O fago modificado da invenção pode opcionalmenteser imobilizado a um suporte sólido. Em algumas modalidades,o fago compreende uma biblioteca polipeptidica de fagos, on-de uma pluralidade de polipeptidios são expressos pelos fa-gos. A pluralidade de fagos também é uma característica dainvenção. 0 fago da invenção pode ser purificado ou isolado.
Em outras modalidades, a invenção fornece métodospara a produção de fagos modificados pós-traducionalmentecitados acima. Geralmente, estes métodos tem a etapa de (a)o fornecimento de um fago compreendendo um polipeptídio,compreendendo pelo menos um resíduo de aminoácido não natu-ral aril-azida (por exemplo, para-azido-L-fenilalanina) ouum resíduo de aminoácido alquinil (por exemplo, para-propargiloxifenilalanina); e (b) reagir o fago sob condiçõesonde o citado resíduo de aminoácido não natural sofre modi-ficação covalente, produzindo assim um fago modificado póstraducionalmente. Estas reações de modificação podem usaruma reação de cicloadição[3+2] azida-alquino ou uma reaçãode ligação de Staudinger. Quando a reação de modificação deStaudinger é usada, o fago modificado resultante pode ser umvirion viável.
Mais especificamente, a produção do fago não modi-ficado pode ter as seguintes etapas: (i) o fornecimento deuma célula hospedeira de eubactéria compreendendo (A) uma mo-lécula de ácido nucléico codificando o fago, onde a fraçãode polinucleotídeo que codificando polipeptídio de fusão deinteresse compreende pelo menos um códon seletor; (B) umamolécula de ácido nucléico codificando uma aminoacil-tRNAsintetase que é ortogonal na citada célula hospedeira (0-RS); (C) uma molécula de ácido nucléico codificando um tRNAque é ortogonal na citada célula hospedeira (0-tRNA), onde acitada O-RS preferencialmente aminoacila o 0-tRNA com o ami-noácido não natural na citada célula hospedeira e onde o ci-tado códon seletor é reconhecido pelo citado 0-tRNA; e (D)um aminoácido não natural aril-azida ou alquinil; e(ii) acultura da célula hospedeira, produzindo assim um polipeptí-dio codificado pela citada subseqüência de polinucleotideo,onde um aminoácido não natural aril-azida ou alquinil é in-corporado no polipeptidio durante a tradução em resposta aocódon seletor, e a produção de um fago compreendendo um po-lipeptidio codificado pela citada subseqüência polinucleoti-dica, onde o aminoácido não natural aril-azida ou alquinil éincorporado no citado polipeptidio. Em alguns aspectos, umacélula hospedeira de E coli também é fornecida.
O RNAt e a sintetase ortogonal que são usados nosmétodos não são particularmente limitantes. Em algumas moda-lidades, a célula hospedeira compreende uma molécula de áci-do nucléico que codifica um O-RS derivado de uma aminoacil-tRNA sintetase de Methanococcus jannaschii, por exemplo, umatirosil-tRNA sintetase de Methanococcus jannasehii. Em algu-mas modalidades, o 0-tRNA é um tRNA supressor de âmbar.
Em outras modalidades, é contemplado que aminoáci-dos não naturais adicionais podem ser usados para direcionarfagos para modificações pós-traducionais, onde o aminoácidonão natural é incorporado no fago pelo uso de sistema detradução ortogonal compreendendo um tRNA supressor de âmbare sintetase mutante.Em alguns aspectos, qualquer fago compreendendo umpolipeptídio que compreende pelo menos um aminoácido não na-tural modificado permite a modificação covalente direciona-da. Em alguns aspectos, os fagos são viáveis após modifica-ção pós traducional. Aminoácidos reativos que podem ser in-corporados no fago desta maneira podem incluir para-propargiloxifenilalanina, para- -azido-L-fenilalaninaj para-acetil-L-fenilalanina, meta-acetil-L-fenilalanina, para-(3-oxobutanoil-L-fenilalanina, para-(2-amino-l- hidroxietil)-L-fenilalanina, para-isopropiltiocarbonil-L-fenilalanina e pa-ra-etiltiocarbonil-L-fenilalanina.
DEFINIÇÕES
Antes DE descrever a invenção em detalhes, deveser entendido que esta invenção não se limita à sistemas bi-ológicos em particular, que podem, é claro, variar. Também épara ser entendido que a terminologia usada aqui é para opropósito de descrever apenas modalidades particulares, enão tem a intenção de ser limitante. Como usado aqui e nasreivindicações anexadas, as formas singulares "um", "uma","a" e "o" incluem referências no plural a menos que o con-texto claramente indique o contrário. Portanto, por exemplo,referência a "uma célula" inclui combinações de duas ou maiscélulas; referência a "um polinucleotídeo" inclui, de umamaneira prática, muitas copias deste polinucleotídeo.
A menos que esteja definido de outra maneira, to-dos os termos técnicos e científicos usados aqui têm o mesmosignificado do que o comumente entendido por profissionaisda área a qual esta invenção pertence.Ortogonal: conforme usado aqui, o termo "ortogo-nal" se refere a uma molécula (por exemplo, um tRNA ortogo-nal (O-tRNA) e/ou uma aminoacil-tRNA sintetase (O-RS)) quefunciona com compoenetes endógenos de uma célula com efici-ência reduzida quando comparado com uma molécula correspon-dente que é endógena à célula ou sistema de tradução, ou quenão funciona com componentes endógenos da célula. No contex-to de tRNAs e aminoacil-tRNA sintetases, ortogonal se referea uma inabilidade ou eficiência reduzida, por exemplo, menosde 20% de eficiência, menos de 10% de eficiência, menos de5% de eficiência, menos de 1% de eficiência, de um tRNA defuncionar com a tRNA sintetase endógena quando comparada comum tRNA endógeno de funcionar com a tRNA sintetase endógena,ou de uma aminoacil-tRNA sintetase ortogonal de funcionarcom um tRNA endógeno quando comparado com uma tRNA sintetasede funcionar com o tRNA endógeno. A molécula ortogonal nãopossui uma molécula complementar endógena funcionalmentenormal na célula. Por exemplo, um tRNA ortogonal em uma cé-lula é um inoacilado por qualquer RS endógena da célula comeficiência reduzida ou mesmo nula, quando comparado a amino-acilação de tRNA endógeno pela RS endógena. Em outro exem-plo, uma RS ortogonal aminoacila qualquer tRNA endógeno emuma célula de interesse com eficiência reduzida ou mesmo nu-la, quando comparado com a aminoacilaçao do tRNA endógenopor uma RS endógena. Uma segunda molécula ortogonal pode serintroduzida na célula que funciona com a primeira moléculaortogonal. Por exemplo, um par tRNA/RS ortogonal inclui com-ponentes complementares introduzidos que funcionam juntos emuma célula com uma eficiência (por exemplo, 45% de eficiên-cia, 50% de eficiência, 60% de eficiência, 70% de eficiên-cia, 75% de eficiência, 80% de eficiência, 90% de eficiên-cia, 95% de eficiência ou 99% ou mais de eficiência) quandocomparado com o de um controle, por exemplo, um par endógenotRNA/RS correspondente, ou um par ortogonal ativo (por exem-plo, um par tirosil tRNA/RS ortogonal).
Tirosil-tRNA ortogonal: conforme usado aqui, umtirosil-tRNA ortogonal (tirosil-O-tRNA) é um RNA que é orto-gonal a um sistema de tradução de interesse, onde o tRNA é:(1) idêntico ou substancialmente similar a um tirosil-tRNAde ocorrência natural, (2) derivado de um tirosil-tRNA deocorrência natural por mutagênese natural ou artificial, (3)derivado de qualquer processo que leve em conta uma seqüên-cia de tirosil-tRNA selvagem ou seqüência de tirosil-tRNAmutante de (1) ou (2); (4) homologo a tirosil-tRNA selvagemou mutante; (5) homólogo a qualquer exemplo de tRNA que sejadesignado como um substrato para uma tirosil-tRNA sintetasena Fig. 1 ou 2, ou (6) um variante conservativo de qualquerexemplo de tRNA que seja designado como um substrato parauma tirosil-tRNA sintetase na Fig. 1 ou 2. O tirosil-tRNApode existir carregado com um aminoácido ou em estado des-carregado. Também deve ser entendido que um "tirosil-O-tRNA"opcionalmente é carregado (aminoacetilado) por uma sintetasecognata com um aminoácido diferente de tirosina ou leucina,respectivamente, por exemplo, com um aminoácido não natural.De fato, ficará claro que um tirosil-O-tRNA da invenção évantajosamente usado para inserir essencialmente qualqueraminoácido, natural ou artificial, em um polipeptídio cres-cente, durante a tradução, em resposta a um códon seletor.
Tirosil aminoácido sintetase ortogonal: conformeusado aqui, uma tirosil aminoácido sintetase (tirosil-O-RS) é uma enzima que preferencialmente aminoacila o tirosil-O-tRNA com um aminoácido em um sistema de tradução de interes-se. O aminoácido que a tirosil-O-RS carrega no tirosil-O-tRNA pode ser qualquer aminoácido, natural, não natural ouartificial, e não está limitada aqui. A sintetase é opcio-nalmente a mesma ou homóloga a uma tirosil aminoácido sinte-tase de ocorrência natural, ou a mesma ou homóloga a umasintetase designada como uma O-RS na Fig. 1 ou 2 (veja, SEQID NOS: 4-10) . Por exemplo, a O-RS pode ser uma varianteconservativa de uma tirosil-0-RS de Fig.l, e/ou pode ser pe-Lo menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% ou mais i-dêntica na seqüência de uma O-RS da Fig.l.
Cognato: o termo "cognato" se refere a componentesque funcionam juntos, por exemplo, um tRNA ortogonal e umaaminoacil-tRNA sintetase ortogonal. Os componentes tambémpodem ser considerados como sendo complementares. 1
Preferencialmente aminoacila: conforme usado aquiem relação aos sistemas de tradução ortogonais, uma O-RS"preferencialmente aminoacila" um 0-tRNA cognato quando a 0-RS carrega o 0-tRNA com um aminoácido mais eficientemente doque carrega qualquer tRNA endógeno em um sistema de expres-são. Isto é, quando o 0-tRNA e qualquer tRNA endógeno dadoestão presentes em um sistema de tradução em razoes molaresaproximadamente iguais, a O-RS vai carregar o 0-tRNA maisfreqüentemente que vai carregar o tRNA endógeno. Preferivel-mente, a razão relativa de O-tRNA carregado pela O-RS e detRNA carregado pela O-RS é alta, preferivelmente resultandona O-RS carregando exclusivamente o O-tRNA ou quase exclusi-vãmente quando o O-tRNA e o tRNA endógeno estão presentes emconcentrações molares iguais no sistema de tradução. A razãorelativa entre O-tRNA e tRNA endógeno que é carregada pela0-RS, quando o O-tRNA e a O-RS estão presentes em concentra-ções molares iguais, é superior a 1:1, preferivelmente pelomenos cerca de 2:1, mais preferivelmente 5:1, ainda maispreferivelmente 10:1, mais preferivelmente 20:1, ainda maispreferivelmente 50:1, ainda mais preferivelmente 75:1, aindamais preferivelmente 95:1, 98:1, 99:1, 100:1, 500:1, 1000:1,5000:1 ou maior.
A O-RS "preferencialmente aminoacila um O-tRNA comum aminoácido não natural" quando (a) a O-RS preferencial-mente aminoacila o O-tRNA quando comparado com um tRNA endó-geno, e (b) onde esta aminoacilação é especifica para o ami-noácido não natural quando comparado com a aminoacilação doO-tRNA pela O-RS com qualquer aminoácido natural. Isto é,quando os aminoácidos não naturais e naturais estão presen-tes em quantidades molares iguais em um sistema de traduçãocompreendendo a O-RS e O-tRNA, A O-RS vai carregar o O-tRNAcom o aminoácido não natural mais freqüentemente do que oaminoácido natural. Preferivelmente, a razão relativa do 0-tRNA carregado com o aminoácido não natural para o O-tRNAcarregado com o aminoácido natural é alta. Mais preferivel-mente, a O-RS carrega o O-tRNA exclusivamente, ou quase ex-clusivamente, como o aminoácido não natural. A razão relati-va entre o carregamento de O-tRNA com o aminoácido não natu-ral e o carregamento do O-tRNA com o aminoácido natural,quando ambos os aminoácidos naturais e não naturais estão presentes no sistema de tradução em concentrações molaresiguais, é superior a 1:1, preferivelmente pelo menos cercade 2:1, mais preferivelmente 5:1, ainda mais preferivelmente10:1, mais preferivelmente 20:1, ainda mais preferivelmente50:1, ainda mais preferivelmente 75:1, ainda mais preferi-velmente 95:1, 98:1, 99:1, 100:1, 500:1, 1000:1, 5000:1 oumaior.
Códon seletor: o termo "códon seletor" se refere acódons reconhecidos pelo O-tRNA no processo de tradução enão reconhecido por um tRNA endógeno. A alça anti-códon tRNA reconhece o códon seletor no RNAm e incorpora seu aminoáci-do, por exemplo, um aminoácido não natural, neste sitio nopolipeptidio. Os códons seletores podem incluir, por exem-plo, códons sem sentido, como códons de parada, por exemplo,códons âmbar, ocre e opal; códons de quatro ou mais bases,códons raros, códons derivados de pares de base naturais ounão naturaise/ou equivalente.
tRNA supressor: um tRNA supressor é um tRNA quealtera a leitura de um RNA mensageiro (RNAm) em um dado sis-tema de tradução, por exemplo, fornecendo um mecanismo para incorporar um aminoácido em uma cadeia polipeptidica em res-posta a um códon seletor. Por exemplo, um tRNA supressor po-de ler por, por exemplo, um códon de parada (por exemplo, umcódon âmbar, ocre ou opal), um códon de quatro bases, um có-don raro, etc.
Atividade de supressão: conforme usado aqui, otermo "atividade de supressão" se refere em geral a habili-dade de um tRNA (por exemplo, um tRNA supressor) de permitira leitura traducional de um códon (por exemplo, um codon se-letor que é um códon âmbar ou códon de 4 ou mais bases) quede outra maneira resultaria no término da tradução ou em er-ro de tradução (por exemplo, frame-shift). A atividade desupressão de um tRNA supressor pode ser pode ser expressacomo uma porcentagem da atividade de leitura traducional ob-servada quando comparada a um segundo tRNA supressor, ouquando comparada a um sistema controle, por exemplo, um sis-tema controle sem O-RS.
A presente invenção fornece vários métodos pelosquais a atividade de supressão pode ser quantificada. A por-centagem de supressão de 0-tRNA e O-RS particular contra umcódon seletor (por exemplo, um códon âmbar) de interesse serefere à porcentagem de atividade de um dado marcador deteste expressado, em um sistema de tradução de interesse,onde o sistema de tradução de interesse inclui uma O-RS e um0-tRNA, quando comparado a uma construção controle positivo,onde o controle positivo não tem o 0-tRNA, a O-RS e o códonseletor. Portanto, por exemplo, se uma construção marcadorade controle positivo que não tem um códon seletor tem umaatividade observada de X em um dado sistema de tradução, emunidades relevantes ao ensaio marcador em questão, então aporcentagem de supressão de uma construção teste compreen-dendo o códon seletor é a porcentagem de X que a construçãomarcador teste expressa sob essencialmente as mesmas condi-ções ambientais como marcador de controle positivo foi ex-presso sob, exceto pelo fato da construção marcador testeser expressa em um sistema de tradução que também inclui oO-tRNA e a O-RS. Tipicamente, o sistema de tradução expres-sando o marcador teste também inclui um aminoácido que é re-conhecido pela O-RS e O-tRNA. Opcionalmente, a medida daporcentagem de supressão pode ser refinada pela comparaçãodo marcador teste a um "background" ou construção marcadorade controle "negativo", que inclui o mesmo códon seletor queo marcador teste, mas em um sistema que não inclui o O-tRNA,O-RS e/ou aminoácido relevante reconhecido pelo O-tRNA e/ouO-RS. Este controle negativo é útil na normalização das me-didas de porcentagem de supressão para a contagem de efeitosde sinal de background do marcador no sistema de tradução deinteresse.
A eficiência de supressão pode ser determinada porqualquer um de um número de ensaios conhecidos na área. Porexemplo, um ensaio repórter de β-galactosidase pode ser usa-do, por exemplo, um plasmidio IacZ derivado (onde a constru-ção tem um códon seletor na seqüência de ácido nucléicoIacZ) é introduzido nas células provenientes de um organismoapropriado (por exemplo, um organismo onde os componentesortogonais possam ser usados) junto com o plasmidio compre-endendo um 0-tRNA da invenção. Uma sintetase cognata tambémpode ser introduzida (como um polipeptidio ou um polinucleo-tideo que codifica a sintetase cognata quando expressa). Ascélulas são cultivadas em meio ate uma densidade desejada,por exemplo, até uma D0600 de cerca de 0,5, e ensaios de β-galactosidadse são feitos, por exemplo, usando o BetaFluor™β-Galactosidase Assay Kit (Novagen). A porcentagem de su-pressão pode ser calculada como a porcentagem de atividadepara uma amostra relativa a um controle comparável, por e-xemplo, o valor observado da construção IacZ derivada, ondea construção tem um códon de sentido correspondente na posi-ção desejada ao invés de um códon seletor.
Sistema de tradução: o termo "sistema de tradução"se refere aos componentes que incorporam um aminoácido emuma cadeia polipeptidica crescente (proteína). Os componen-tes de um sistema de tradução podem incluir, por exemplo,ribossomos, tRNAs, sintetases, RNAm e equivalente.
Aminoácido não natural: conforme usado aqui, otermo "aminoácido não natural" se refere a qualquer aminoá-cido, aminoácido modificado e/ou análogo de aminoácido, quenão é um dos 20 aminoácidos comuns de ocorrência natural ouseleno cisteína ou pirrolisina. Por exemplo, o aminoácidonão natural p-azido-L-fenilalanina tem uso na invenção.
Derivado de: conforme usado aqui, o termo "deriva-do de" se refere a um componente que é isolado de ou feitousando uma molécula ou organismo específico, ou informaçãode molécula ou organismo específico. Por exemplo, um poli-peptídio que é derivado de um segundo polipeptídio pode in-cluir uma seqüência de aminoácido que é idêntica ou substan-cialmente similar à seqüência de aminoácido do segundo poli-peptídio. No caso dos polipeptídios, as espécies derivadaspodem ser obtidas por, por exemplo, mutagênese de ocorrêncianatural, mutagênese direcionada artificial ou mutagênese a-leatória artificial. Δ mutagênese usada para derivar poli-peptidios pode ser intencionalmente direcionada ou intencio-nalmente aleatória, ou uma mistura de cada. A mutagênese deum polipeptidio para criar um polipeptidio diferente deriva-do do primeiro pode ser um evento aleatório (por exemplo,causado por infidelidade da polimerase) e a identificação dopolipeptidio derivado pode ser feito por métodos de seleçãoapropirados, por exemplo, conforme discutido aqui. Mutagêne-se de um polipeptidio tipicamente significa manipulação dopolinucleotideo que codifica o polipeptidio.
Seleção positiva ou marcador de seleção positiva:conforme usado aqui, o termo "seleção positiva ou marcadorde seleção positiva" se refere a um marcador que, quandopresente, por exemplo, expresso, ativado ou equivalente, re-sulta na identificação de uma célula, que compreende o tra-ço, por exemplo, uma célula com marcador de seleção positi-va, daqueles sem o traço.
Seleção positiva ou marcador de seleção negativa:conforme usado aqui, o termo "seleção positiva ou marcadorde seleção negativa" se refere a um marcador que, quandopresente, por exemplo, expresso, ativado ou equivalente,permite a identificação de uma célula que não compreende umapropriedade ou traço selecionada (por exemplo, comparandocom uma célula que possui a propriedade ou o traço).
Repórter: conforme usado aqui, o termo "repórter"se refere a um componente que pode ser usado para identifi-car e/ou selecionar componentes alvos de um sistema de inte-resse. Por exemplo, um repórter pode incluir um proteína,por exemplo, uma enzima, que confere resistência a antibió-tico ou sensibilidade ao antibiótico (por exemplo, β-lactamase, clorafenicol acetiltransferase (CAT), e equiva-lente) , um marcador de seleção fluorescente (por exemplo,proteína fluorescente verde (por exemplo, (GFP), YFP, EGFP,RFP, etc), um marcador luminescente (por exemplo, proteínaluciferase de vagalume), um marcador de seleção baseado emafinidade, ou gene marcador selecionável positivo ou negati-vo como IacZ, β-gal/lacZ (β-galactosidase) , ADH (álcool de-sidrogenase), his3, ura3, leu2, lys2 ou equivalente.
Eucarionte: conforme usado aqui, o termo "eucari-onte" se refere aos organismos pertencentes ao Reino Eucar- ya. Os eucariontes são geralmente distinguíveis de procari-ontes por sua organização tipicamente multicelular (mas nãoexclusivamente multicelular, por exemplo, levedura), a pre-sença de um núcleo ligado à membrana e outras organelas li-gadas a membrana, material genético linear (isto é, cromos-somos lineares), a ausência de operons, a presença de in-trons, RNAm com cap e poli A, e outras características bio-químicas, como uma estrutura ribossomal distinta. Os orga-nismos eucariontes incluem, por exemplo, animais (por exem-plo, mamíferos, insetos, répteis, aves, etc), ciliados,plantas (por exemplo, monocotiledôneas, dicotiledôneas, al-gas, etc), fungo, leveduras, flagelados, microsporídio, pro-tista, etc.Procarionte: conforme usado aqui, o termo "proca-rionte" se refere aos organismos pertencentes ao Reino Mone-ra (também chamado de Procarya). Organismos procariontes sãogeralmente distinguiveis dos eucariontes por sua organizaçãounicelular, reprodução assexuada por brotamento ou fissão, aausência de um núcleo ligado a membrana ou outras organelasligadas a membranas, um cromossomo circular, a presença deoperons, a ausência de introns, RNAm com cap e poli-A e ou-tras características bioquímicas, como estrutura ribossomaldistinguível. O Procarya inclui sub-reinos Eubactéria e Ar-chaea (algumas vezes chamado de "Archaebacteria"). Cianobac-teria (alga azul) e micoplasma recebem algumas vezes classi-ficações separadas dentro do Reino Monera.
Bactéria: Conforme usado aqui, o termo "bactéria"e "eubactéria" se refere a organismos procariontes que sãodistinguiveis dos Archaea. Similarmente, Archeae se refereaos procariontes que são distinguiveis das eubactérias. Eu-bactéria e Archeae podem ser distinguidos por vários crité-rios morfológicos e bioquímicos. Por exemplo, diferenças naseqüência de RNA ribossomal, estrutura da RNA polimerase,presença ou ausência de introns, sensibilidade a antibióti-cos, presença ou ausência de peptidoglicanos na parede celu-lar e outros componentes da parede celular, as estruturasramificadas versus não ramificadas dos lipídios de membrana,e a presença/ausência de histonas e proteínas semelhantes ahistona são usadas para designar um organismo como sendo Eu-bactéria ou Archaea.Exemplos de Eubactéria incluem Escherichia coli,Thermus thermophilics e Bacillus StearoihermophXIus. Exem-plos de Archaea incluem Methanococcus jannaschii (Mj), Me-thanosarcina mazei (Mm), Methanobacterium thermoautotrophi-eum (Mt) , Methanococcus maripaludis, Methanopyrus )<:3ηάΐ6ή,Halobaeterium como Haloferax voleanii e Halobaeterium speei-es NRC-I, Archaeoglobus fulgidus (Af), Pyroeoeeus fuήosus(Pf) , Pyroeoeeus horikoshii (Ph), Pyrobaeulum aerophilum,Pyroeoeeus abyssi, Sulfolobus solfataqeus (Ss) , Sulfolobustokodaii, Aeuropyrum pernix (Ap), Thermoplasma aeidophilum eThermoplasma voleanium.·
Variante conservativo: conforme usado aqui, o ter-mo "variante conservativo", no contexto de um componente detradução, se refere a um componente da tradução, por exem-pio, um O-tRNA variante conservativo ou uma O-RS varianteconservativa, que funcionalmente é similar a um componentebase que o variante conservativo é semelhante, por exemplo,um O-tRNA ou O-RS, possuindo variações na seqüência quandocomparado com um tRNA ou O-RS de referência. Por exemplo,uma O-RS ou um variante conservativo desta 0-RS, vai aminoa-cetilar um 0-tRNA cognato com um aminoácido não natural, porexemplo, um aminoácido compreendendo uma fração N-acetilgalactosamina. Neste exemplo, a O-RS e a variante con-servativa da O-RS não tem a mesma seqüência de aminoácido. Ovariante conservativo pode ter, por exemplo, uma variação,duas variações, três variações, quatro variações ou cinco oumais variações na seqüência, desde que a variante conserva-tiva ainda seja complementar ao O-tRNA ou O-RS corresponden-te .
Em algumas modalidades, um variante conservativoda O-RS compreende uma ou mais substituições conservativasde aminoácido comparado à O-RS da qual é derivada, e alémdisso, mantém a atividade biológica da 0-RS; por exemplo,uma variante conservativa da O-RS que mantém pelo menos 10%da atividade biológica da molécula O-RS original da qual éderivada, ou alternativamente, pelo menos 20%, pelo menos30%, ou pelo menos 40%. Em algumas modalidades preferidas, avariante conservativa da O-RS mantém pelo menos 50% da ati-vidade biológica da molécula O-RS original da qual é deriva-da. As substituições de aminoácidos conservativas de uma 0-RS variante, conservativa pode ocorrer em qualquer domínio da0-RS, incluindo o aminoácido de ligação.
Agente de seleção: conforme usado aqui, o termo"agente de seleção" se refere a um agente que, quando pre-sente, permite a seleção de certos componentes de uma popu-lação. Por exemplo, um agente de seleção pode ser, mas nãose limita a, por exemplo, um nutriente, um antibiótico, umcomprimento de onda, um anticorpo, um polinucleotídeo ou e-quivalente. 0 agente de seleção pode variar, por exemplo,pela concentração, intensidade, etc.
Em resposta a: conforme usado aqui, o termo "emresposta a" se refere ao processo no qual um 0-tRNA da in-venção reconhece um códon seletor e media a incorporação deum aminoácido não natural, que é acoplado ao tRNA, na cadeiapolipeptídica crescente.Codifica: Conforme usado aqui, o termo "codifica"se refere a qualquer processo onde a informação em uma ma-cromolécula polimérica ou seqüência é usada para direcionara produção de uma segunda molécula ou seqüência que é dife-rente da primeira molécula ou seqüência. Conforme usado a-qui, o termo é usado amplamente, e pode ter uma variedade deaplicações. Em alguns aspectos, o termo "codifica" descreveo processo de replicação semi-conservativa de DNA, onde umafita de uma molécula de DNA dupla fita é usada como um moldepara codificar uma fita irmã complementar recentemente sin-tetizada por uma DNA polimerase dependente de DNA.
Em outro aspecto, o termo "codifica" se refere aqualquer processo onde a informação em uma molécula é usadapara direcionar a produção de uma segunda molécula que temuma natureza química diferente da primeira molécula. Por e-xemplo, uma molécula de DNA pode codificar uma molécula deRNA (por exemplo, pelo processo de transcrição incorporandouma enzima RNA polimerase DNA dependente). Além disso, umamolécula de RNA pode codificar um polipeptídio, como no pro-cesso de tradução. Quando usado para descrever o processo detradução, o termo "codifica" também se estende ao códon tri-plo que codifica um aminoácido. Em alguns aspectos, uma mo-lécula de RNA pode codificar uma molécula de DNA, por exem-plo, pelo processo de transcrição reversa incorporando umaDNA polimerase dependente de RNA. Em outro aspecto, uma mo-lécula de DNA pode codificar um polipeptídio, onde entende-se que "codificar" conforme usado aqui neste caso incorporaos processos de transcrição e tradução.Azido: conforme usado aqui, o termo "azido" se re-fere ao grupo químico -N3 tipicamente ligado a um átomo decarbono, possuindo a estrutura geral:R-N=N+=N"
Por exemplo, o aminoácido não natural p-azido-L-fenilalanina (FIG. 3, estrutura 2) compreende uma fração a-zido. Além disso, um corante azido é uma molécula corantecom um grupo azido substituinte (veja, por exemplo, os co-rantes azido 10 e 11, na Fig 16).'0 termo "azida se refere aum composto químico contendo o grupo azido (por exemplo,benzil azida, azida de sódio, etc.). Uma aril-azida é umamolécula aromática compreendendo um fração azida, por exem-plo, o aminoácido não natural p-azido-L-fenilalanina é umaril azida.
Alquino: Conforme usado aqui, o termo "alquino"(também chamado, as vezes, de "acetileno") se refere às es-truturas químicas contendo uma ligação tripla entre dois á-tomos de carbono, possuindo a estrutura geral:C=C-R
Onde R é qualquer átomo ou estrutura. Quando usadocomo um substituinte, a fração alquino é chamada de um grupo"alquinil". Os átomos de carbono alquinil são hibridizadossp2 e formam apenas pontes com dois outros átomos; uma des-tas ligações será uma ligação única enquanto que a segundaligação é uma ligação tripla. Por exemplo, o aminoácido pa-ra-propargiloxifenilalanina (pPRO-Phe) compreende um grupoalquinil. Veja, Fig 15, estrutura 9. Devido ao fato dossubstituintes alquinil não aparecerem em aminoácidos natu-ralmente, qualquer aminoácido alquinil é um aminoácido nãonatural. Alem disso, Fig 5, estrutura 6, fornece a estruturaquímica de corante floresceina alquino-derivado.
Polipeptídio: um polipeptídio é qualquer oligômerode aminoácidos (natural ou não natural, ou uma combinaçãodeste), de qualquer tamanho, tipicamente mas não exclusiva-mente unidos por ligação peptidica, um polipeptídio pode serde qualquer fonte, por exemplo, um polipeptídio de ocorrên-cia natural, um polipeptídio produzido por técnicas de gené-tica molecular recombinante, um polipeptídio de uma célulaou sistema de tradução, ou um polipeptídio produzido por ummeio sintético livre de células. Um polipeptídio está carac-terizado por sua seqüência de aminoácido, por exemplo, a es-trutura primaria de seus aminoácidos componentes. Conformeusado aqui, a seqüência de aminoácido de um polipeptídio nãoestá limitada por seqüências grandes, mas pode ser seqüênciaparcial ou completa. Além disso, não se tem a intenção delimitar um polipeptídio por ele possuir ou não possuir qual-quer atividade biológica particular. Conforme usado aqui, otermo "proteína" é sinônimo de polipeptídio. 0 termo "peptí-deo" se refere a um pequeno polipeptídio, por exemplo, masnão se limitando a, de 2 a 25 aminoácidos de comprimento.
Modificação pós-traducional: conforme usado aqui,uma modificação pós-traducional é uma modificação em um po-lipeptídio que pode ocorrer em uma célula ou em um sistemasem células, constantemente ou após o polipeptídio ter sidocompletamente traduzido. Modificações pós-traducionais podemser de ocorrência natural in vivo, e em muitos exemplos sãonecessárias a fim de que um polipeptidio nativo seja biolo-gicamente ativo. Uma grande variedade de modificações pós-traducionais são conhecidas por existirem in vivo, incluin-do, por exemplo, glicosilação e/ou fosforilação, e são tipi-camente regulados por componentes celulares endógenos comoproteínas celulares. Um polipeptidio pode ser submetido amúltiplos tipos de modificações pós-traducionais e as modi-ficações podem em qualquer lugar da molécula de polipeptidio.
As modificações pós-traducionais conhecidas inclu-em, sem limitação, acetilacao, acilacao, ADP-ribosilação,amidação, ligação covalente de flavina, ligação covalente deuma fração heme, ligação covalente de um nucleotídeo ou de-rivado de nucleotídeo, ligação covalente de um lipídio ouderivado de lipídio, ligação covalente de fosfatidilinosi-tol, ligação cruzada, ciclização, formação de ponte dissul-feto, demetilação, formação de ligações covalentes cruzadas,formação de cistina, formação de piroglutamato, formilação,gama-carboxilação, glicosilação, formação de ancora GPI, hi-droxilaçao, iodinação, metilaçao, miristoilação, oxidação,processamento proteolítico, fosforilação, prenilação, race-mizacação, selenoilação, sulfatação, adição mediada portransferência de RNA de aminoácidos em proteínas como argi-nilacao, e ubiquinação. Tais modificações são bemconhecidaspelos profissionais da área e foram descritas em detalhes naliteratura cientifica, como, por exemplo, Creighton, T. E.,Proteins—Structure And Molecular Properties, 2nd Ed., W. H.Freeman and Company, New York (1993); Wold, F., "Posttrans-lational Protein Modifications: Perspectives and Prospects,"in Posttranslational Covalent Modification of Proteins,Johnson, B. C, ed., Academic Press, New York (1983), pp. 1-12; Seifter et al, "Analysis for protein modifications andnonprotein cofactors," Meth. Enzymol. 182:626-646 (1990), eRattan et al, Ann. N.Y Acad. Sd, 663:48-62 (1992).
Suporte sólido: conforme usado aqui, o termo "su-porte sólido" se refere a uma matriz de um material em umarranjo substancialmente fixo que pode ser funcionalizadopara permitir síntese, ligação ou imobilização de polipeptí-dios (por exemplo, um fago compreendendo polipeptidios), di-reta ou indiretamente. O termo "suporte sólido" também en-globa termos como "resina" ou "fase sólida". Um suporte só-lido pode ser composto de polímeros, por exemplo, polímerosorgânicos como poliestireno, polietileno, polipropileno, po-Iifluoretileno, polietilenoxi e poliacrilamida, assim comoco-polímeros e seus enxertos. Um suporte sólido pode ser i-norgânico como vidro, sílica, silicone, vidro com poro con-trolado (CPG), sílica de fase reversa, ou qualquer metal a-dequado. Além destes descritos aqui, tem-se a intenção deque o termo "suporte sólido" inclua qualquer suporte sólidoque tenha recebido qualquer tipo de revestimento ou qualqueroutro tipo de tratamento secundário, por exemplo, filmes deLangmuir-Blodgett, monocamadas auto-montáveis (SAM), sol-gelou equivalente.
Arranj o: conforme usado aqui, "arranjo" ou "micro-array" é um arranjo de elementos (por exemplo, polipeptidiosexpressos em fagos), por exemplo, presente em um suporte só-lido e/ou em um arranjo de vasos. Enquanto os arranjos sãomais freqüentemente pensados como elementos físicos com umarelação espacial-fisica específica, a presente invenção tam-bém pode fazer uso de arranjos "lógicos", que não tem umaorganização espacial. Por exemplo, um sistema de computadorpode ser usado para determinar a localização de ou várioscomponentes de interesse que estão localizados nele ou com-ponentes fisicamente distantes. O sistema de computador criaum arranjo lógico fornecendo uma tabela de localização físi-ca dos membros do arranjo. Portanto, todos os componentes emmovimento podem ser parte de um arranjo lógico, desde que osmembros do arranjo possam ser especificado ou localizado.Isto é relevante, por exemplo, onde os arranjos da invençãoestão presentes em um sistema em microescala fluida, ouquando estão presentes em um ou mais bandejas de microtitu-lação.
Certos formatos de arranjos são, as vezes, chama-dos de "chip" ou "biochip". Qualquer arranjo pode compreen-der um número de baixa densidade de localizações endereçá-veis, por exemplo, 2 a cerca de 10, densidade média, por e-xemplo, cerca de cem ou mais localizações, ou número de altadensidade, por exemplo, mil ou mais. Tipicamente, o formatodo chip tem a forma geometricamente regular que permite fa-bricação facilitada, manuseio, posicionamento, empilhamento,introdução de reagente, detecção e armazenamento. Pode, en-tretanto, ser irregular. Em um formato típico, um arranjo éconfigurado em um formato de linha e coluna, com espaçamentoregular entre cada localização dos membros do arranjo. Al-ternativamente, as localizações podem ser juntadas, mistura-das ou agitadas homogeneamente para tratamento equalizado ouamostragem. Um arranjo pode compreender uma pluralidade delocalizações endereçáveis configuradas de forma que cada Io-calização seja espacialmente endereçável para manuseio comalta taxa de transferência, liberação robótica, mascaramentoou amostragem de reagentes. Um arranjo também pode ser con-figurado para facilitar a detecção e quantificação por qual-quer meio particular, incluindo mas não se limitando a, es- caneamento por iluminação a laser, luz confocal ou defleti-va, detecção por CCD e luminescência química. Formatos de"arranjo", conforme citado aqui, incluem mas não se limitama, arranjos (isto é, um arranjo de múltiplos chips), micro-chips, microarrays, um microarray montado em um único chip,arranjos de biomoléculas ligadas às placas de micropoços; ouqualquer outro formato apropriado para uso em um sistema deinteresse.
Ligação covalente: conforme usado aqui, uma liga-ção covalente 'uma ligação compreendendo elétrons comparti-lhados entre átomos. Uma ligação covalente é sinônimo de"ligação química". Uma ligação não covalente é qualquer li-gação que não seja uma ligação covalente. Um tipo de ligaçãonão covalente é uma ligação iônica. Uma ligação iônica é umaatração entre frações químicas com cargas opostas. Em uma ligação iônica, elétrons não são compartilhados, são trans-feridos não igualmente resultando na distribuição desigualde cargas e atrações de carga positiva/negativa.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURASFig. 1 fornece exemplos de seqüências de polinu-cleotideos e polipeptidios que tem uso na invenção.
Fig. 2 fornece exemplos de seqüências de aminoáci-dos de mutantes da tirosil-tRNA sintetase de Methanococcusjannaschii que tem a habilidade de carregar um tRNA ortogo-nal com o aminoácido não natural para-azido-L-fenilalanina.
Fig. 3 fornece as estruturas e nomes corresponden-tes de cinco (numerados de 1 a 5) aminoácidos não naturais,que são O-metil-tirosina (1), para-azido-L-fenilalanina (2),para-acetil-L-fenilalanina (3), para-benzoil-L-fenilalanina(4) e 3-(2-naftil)alanina (5).
Fig. 4 fornece resultados de um experimento de-monstrando os rendimentos da dependência de M13-SBP (expres-so em PFU/mL) na presença do aminoácido não natural corres-pondente.
Fig. 5 fornece a estrutura química de um corantefluresceína derivado de alquino (estrutura 6).
Fig. 6 fornece uma imagem quimioiluminescente se-guido de uma análise por Western Blot usando anticorpos pri-mários anti-fluoresceina (I) ou anti-pIII (II), onde as a-mostras constituem material para reação após as reações decicloadição [3+2] do fagp M13KE-SBP, onde o fago está prepa-rado na linhagem TTS/RS na presença de p-azido-L-fenilalanina 2 (a) ou preparado em XLl-azul (b).
Fig. 7 fornece os resultados de valor de absorbân-cia de um ELISA do fago de ligação à estreptavidina. A ab-sorbância foi medida em 492 nm.Fig. 8 fornece os resultados gráficos do ELISA dofago de ligação à estreptavidina mostrado na Fig.7. (Δ)M13 KE; (□)fago M13KE-SBP preparado na linhagem TTS/RS napresença de 3; (O) fago M13KE-SBP preparado na linhagemTTS/RS na presença de 2; (x) fago M13KE-SBP preparado emXLl-Blue.
Fig. 9 fornece os resultados da determinação dofator de enriquecimento da recuperação de fago.
Fig. 10 mostra um esquema da reação de conjugaçãode Staudinger envolvendo um polipeptidio expresso em fagocompreendendo um resíduo de para-azido-L-fenialanina (do fa-go Ph-Az) com uma fosfina 7 ou 8.
Fig. 11 fornece uma imagem quinioluminescente deuma análise por western blot do fago Ph-Az e Ph-Q após a Ii-gação de Staudinger com fosfinas 7 e 8. A análise usou anti-corpo anti-fluoresceina primário (raias 1-4) ou anticorpoprimário anti-pIII (raias 5-8).
Fig. 12 fornece uma análise MALDI-TOF dos produtosda reação da ligação de Staudinger de p-azido-L-fenilalanina2 contendo a proteína domínio Z com fosfina 7. Os picos A eB podem ser designados como produto da conjugação e redução,respectivamente; os picos menosres a2, b2, al e bl são deri-vados de adutos da matriz e a exclusão de metionina de A eB.
Fig. 13 fornece uma análise espectral de MALDI-TOFdos produtos da reação da ligação de Staudinger de pAzPhecontendo a proteína domínio Z com fosfina 8.Fig. 14 fornece uma análise de MALDI-TOF dos pro-dutos da reação da ligação de Staudinger de p-azido-L-fenilalanina 2 contendo a proteína domínio Z com fosfina 7 edopagem com uma quantidade comparativa do mutante domínio Zp-azido-L-fenilalanina 2 autentico.
Fig. 15 fornece uma estrutura química (9) do ami-noácido alquinil não natural para-propargiloxifenilalanina(pPro-Phe; também chamada de ácido 2-amino-3-[4-(prop-2-iniloxi)fenil]-propiônico de acordo com a nomenclatura daIUPAC). Fig. 15 também fornece a reação química da formaçãoirreversível das estruturas triazol por uma reação de ciclo-adição [3+2] de um azido e um alquino na presença de cobreem temperatura ambiente.
Fig. 16 fornece as estruturas químicas (10 e 11)de dois corantes azido-funcionalizados. O corante 10 contémum fluoróforo dansil, e o corante 11 contém um fluoróforofluresceína.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
Existe uma necessidade para reações químicas quemodificam proteínas expressas em fagos de uma maneira alta-mente seletiva. Existe também uma necessidade para tais rea-ções de modificação que podem operar em condições compatí-veis fisiologicmanete a fim de preservar a atividade da pro-teína e viabilidade do fago. A maioria das reações atualmen-te usadas na área para a modificação seletiva de proteínas,por exemplo, proteínas expressas em fago, envolve a formaçãode pontes covalente entre parceiros de reação nucleofílica eeletrofílica que tem como alvo resíduos nucleofílicos de o-corrência natural nas cadeias laterais de aminoácido. Sele-tividade nestes casos é determinada pelo número e acessibi-lidade dos residuos nucleofilicos na proteína. Infelizmente,as proteínas de ocorrência natural freqüentemente contém sí-tios de ração mal posicionados (por exemplo, inacessível) oumúltiplos sítios alvos (por exemplo, resíduos de lisina,histidina e cisteína), resultando na fraca seletividade nasreações de modificação, tornando as modificações de proteí-nas altamente direcionadas por reagentes nucleofíli-cos/eletrofilicos difícil. Além disso, os sítios de modifi-cação estão tipicamente limitados às cadeias laterais nucle-ofílicas de ocorrência natural da lisina, histidina ou cis-teína. A modificação de outros sítios é difícil ou impossível.
A presente invenção fornece soluções a estes pro-blemas. A invenção fornece sistemas para a incorporação bi-ossintética sitio específica programada de aminoácidos nãonaturais com novas propriedades em proteínas expressas emfagos pela manipulação de sistemas de tradução ortogonal pa-ra trabalhar em conjunto com reagentes de expressão de fagosrecombinantes. A invenção fornece métodos para a modificaçãodirecionada subseqüente destes resíduos de aminoácidos nãonaturais que são incorporados em polipeptídios expressos emfagos. Nós descrevemos aqui novas composições (por exemplo,fagos compreendendo várias modificações pós-traducionais) enovos métodos para a geração de fagos modificados pós tradu-cionalmente.Os sistemas de produção de fago fornecidos pelapresente invenção, tiram vantagem dos sistemas de traduçãoortogona.1 que usam células hospedeiras de E coli para a in-corporação seletiva de aminoácidos não naturais em polipep-tidios expressos em fagos, e modificação subseqüente destespolipeptidios usando modificação seletiva de resíduos de a-minoácidos não naturais. Várias características para a modi-ficação de resíduos de aminoácido não natural no polipeptí-dio expresso em fago são contemplados e demonstrados aqui,incluindo reações de cicloadição [3=2] de ligações de Stau-dinger.
Os sistemas de tradução ortogonal que são úteispara a invenção compreendem um RNAt ortogonal que reconheceum códon seletor e uma aminoacil tRNA sintetase que especi-ficamente carrega o RNAt ortogonal com um aminoácido não na-tural em células hospedeiras de E coli. A incorporação deaminoácido não natural na proteína expressa em fago de inte-resse pode ser programada para ocorrer em qualquer posiçãodesejada pela construção de polinucleotídeos codificando aproteína de interesse para conter o códon seletor no localdesejado, sinalizando assim a incorporação do aminoácido nãonatural.
A presente descrição descreve a incorporação de unúmero de aminoácidos não naturais nos polipeptidios expres-sos em fagos. Estes aminoácidos incluem 0-metil tirosina,para-azido-L-fenilalanina, para-acetil-L-fenilalanina, para-benzoil-L-fenilalanina e 3-(2-naftil)alanina. Aminoácidosaril-azida, por exemplo, para-azido-L-fenilalanina, são al-vos atraentes para modificações pós-traducionais régio-seletivas e especificas. Aminoácidos não naturais compreen-dendo grupos alquinil, por exemplo para-propargiloxifenilalanina também são contemplados para o usoem polipeptidios expressos em fagos como alvos para a modi-ficação pós-traducional. EM algumas modalidades da invenção,a modificação pós-traducional do aminoácido não natural nopolipeptidio expresso em fago é feita usando condições dereação in vivo ou in vitro branda e fisiologicamente compa-tiveis que preservem a viabilidade do fago.
Devido à reação única dos grupos químicos de ami-noácidos não naturais aril-azida e alquinil, proteínas ex-pressa em fagos nos quais eles estão incorporados podem sermodificadas com seletividade extremamente alta. Em algunscasos, o grupo reativo do aminoácido não natural tem a van-tagem de ser completamente diferente aos sistemas in vivo,melhorando a seletividade da reação.
A natureza do material que está conjugado a umaproteína expressa em fagos via um aminoácido não natural al-vo não está particularmente limitada e pode ser de qualquerentidade desejada, por exemplo, corantes, fluoróforos, agen-tes de reticulação, derivados sacarídicos, polímeros (porexemplo, derivados de polietilenoglicol), fotoreticulantes,compostos citotóxicos, marcadores de afinidade, derivados debiotina, resinas, esferas, uma segunda proteína ou polipep-tidio (ou mais), polinucleotídeo(s) (por exemplo, DNA, RNA,etc.), quelantes de metal, cofatores, ácidos graxos, carboi-dratos e equivalentes. Este relato descreve o uso experimen-tal de fluresceina derivada ou corantes dansil fluoróforocomo materiais conjugados. Entretanto, não temos a intençãode eu esta invenção seja limitada ao uso destes materiaisconjugados, como uma grande variedade de materiais conjugá-veis está contemplada, por exemplo, os citados acima.
PHAGE DISPLAY
A tecnologia de phage display se tornou uma técni-ca amplamente usada em diversas disciplinas biológicas,"phage display" tem encontrado uso particular em protocolosde seleção em bibliotecas de peptideos (isto é, polipeptí-dio) . Várias aplicações incluem seleção por afinidade (porexemplo, seleção de receptor alvo), mapeamento e mimetismode epitopo, identificação de novos receptores e ligantes na-turais, descoberta de drogas, descoberta de epitopos para o desenvolvimento e diagnóstico de vacina e estudo de proteí-nas de ligação ao DNA. Uma variedade de fontes estão dispo-níveis que descrevem os muitos protocolos, reagentes e geno-mas de fagos variantes ( e genes de fagos variantes) que temuso na tecnologia de phage display. Veja, por exemplo, Smith e Petrenko, Chem. Rev., 97:391-410 (1997); Sidhu, Bimolecu-Iar Engineering 18:57-63 (2001); Rodi e Makowski, CurrentOpinion in Biotechnology 10:87-93 (1999); e Willatsf PlantMolecular Biology 50:837- 854 (2002) .
Os experimentos descritos no presente relato usam o sistema de fago filamentosos M13KE (New England BioLabs,Inc.) . M13KE é um derivado de M13mpl9 projetado para a ex-pressão de peptideos como N-terminal da pIII de fusão em a-plicações de phage display (Zwick et al. (1998) Anal. Bio-chem., 264:87-97). As bibliotecas construídas em M13KE sãopentavalentes (isto ' , todas as cinco copias de pIII no vi-vrion maduro carream o peptideo fusionado). Em relação aoM13mpl9 original, sítios Acc65 I7Kpn I e Eag I foram intro-duzidos flanqueando o sítio de clivagem líder da peptidasede pIII, e o sítio Acc65I/Kpn I no sitio de clonagem múlti-pla (MCS) foi deletado. As bibliotecas de peptídeos aleató-rios expressos em fagos são construídas pelo anelamento deum primer de extensão a um oligonucleotídeo sintético codi- ficando a biblioteca de peptideo aleatório e uma fração daseqüência líder pIII, estendendo com DNA polimerase, e dige-rindo com Acc65 I e Eag I (Noren e Noren (2001) Methods23:169-178). 0 duplex resultante clivado é inserido no M13KEque foi digerido com as mesmas enzimas.
Embora os exemplos fornecidos aqui usem o sistemade fago M13KE, não se tem a intenção de que a invenção sejalimitada a este sistema em particular. De fato, um profis-sional da área reconhecerá reagentes e protocolos de phagedisplay que estão disponíveis e também tem uso com as compo-sições e métodos da invenção. Estes reagentes e protocolosalternativos não saem do escopo da invenção, e estão englo-bados pela invenção reivindicada.
A expressão de um polipeptídio de interesse é con-seguido fusionando o polipeptídio com uma proteína de capsí-deo (envoltório) do fago, ou um fragmento, mutante ou outrovariante de uma proteína de capsídeo. Estas proteínas decpasídeo podem incluir pIII, pVI, pVII, pVIII e pIX. Parafins de demonstração (mas não de limitação) da invenção, osExemplos aqui descrevem a geração de polipeptidios de fusãoexpressos em fagos compreendendo a seqüência de aminoácidoda proteína do envoltório pIII. Não temos a intenção de quea invenção seja limitada pelo uso da seqüência de polipeptí-dio pIII para a expressão da proteína fusionada de interesse.
Em alguns sistemas de fagos, uma seqüência sinalde reconhecimento de ligador de protease pode ser colocadano polipeptídio de fusão, facilitando assim a clivagem e/ouliberação da fração da proteína fusionada. Uma grande varie-dade de seqüências sinais de protease são conhecidas, inclu-indo, mas não se limitando a Factor Xa, Factor XIa, Kallik-vein, trombina, Factor XIIa, colagenase e enteroquinase.Qualquer sinal de reconhecimento de protease adequado e aprotease correspondente podem ser usados na presente invenção.
Similarmente, para demonstrar (mas não limitar) apresente invenção, o relato aqui demonstra que uma fração deaminoácido não natural pode ser incorporada em um modelo deproteína de fusão expressa em fago compreendendo o peptídeode ligação a estreptovidina (SBP), que é então modificadopós-traducionalmente. Não temos a intenção de que a incorpo-ração de aminoácido não natural seja limitado a tal modelode proteína. Do presente relato, ficará claro que a incorpo-ração de aminoácido não natural em uma dada proteína de in-teresse expressa em fago é vantajosa para uma grande varie-dade de proteínas para uso para fins terapêuticos e de pes-quisa.A invenção também fornece fagos compreendendo po-lipeptídios compreendendo pelo menos um aminoácido não natu-ral que é modificado pós-traducionalmente, onde o fago é pu-rificado ou isolado. Por exemplo, o fago pode ser purificado e/ou isolado pela precipitação por PEG e/ou centrifugação.Veja, Exemplo 3. A precipitação adicional de fagos e as téc-nicas de purificação/isolamento também são conhecidas na á-rea, por exemplo, usando esquemas de purificação por afini-dade como imuno-afinidade.
BIBLIOTECAS EXPRESSA EM FAGOS E ARRANJOS
A expressão em fagos de polipeptídios compreenden-do aminoácidos não naturais que são modificados pós-traducionalmente é encontrada m uma variedade de fontes, porexemplo, Smith e Petrenko, Chem. Rev., 97:391-410 (1997).
Em algumas modalidades, o polipeptidio expresso emfagos compreendendo um aminoácido não natural modificadopós-traducionalmente é um membro de uma pluralidade de fagoscarreando os mesmos ou diferentes polipeptídios codificados,ou variantes dos mesmos polipeptídios (todos compreendendo pelo menos um aminoácido não natural). Em algumas modalida-des, onde o fago expressa diferentes seqüências de polipep-tídios, os polipeptídios expressos compreendem uma bibliote-ca, por exemplo, uma biblioteca mutante randomizada de umaseqüência codificante de interesse.
Onde os polipeptídios expressos em fagos compreen-dendo um aminoácido não natural que é modificado pós-traducionalmente constitui umabiblioteca, existe geralmenteuma etapa de seleção que é usada para selecionar as espéciesde polipeptídios desejadas (ou o ácido nucléico codificandoesta espécie de polipeptidio) do grupo de polipeptídios ex-pressos candidatos. A seleção pode consistir da separação deuma população inicial de polipeptídios de fagos para origi-nar uma sub-população com melhores "medidas" de acordo comalguns critérios definidos pelo usuário. Em muitos casos, aentrada da biblioteca para uma primeira etapa de seleção éum número inicial muito grande, e a sub-população seleciona-da é uma fração da população inicial, onde os clones maisadequados estão super representados. Esta população pode ser"amplificada" pela infecção de células bacterianas hospedei-ras frescas, de modo que cada fago individual na sub-população seja amplificado no novo estoque "amplificada" apopulação amplificada pode então ser submetida a mais roda-das de seleção para obter um sub-grupo mais adequado para ospeptídeos de início.
Existem dois parâmetros pivôs de seleção, que po-dem freqüentemente ser manipulados até uma extensão e fim demelhorar a eficácia da seleção. Primeiro, a estringência é ograu em que os polipeptídios mais adequados são favorecidosem relação aos peptídeos menos adequados; segundo, o rendi-mento é a fração de partículas com uma dada adequação quesobrevive a seleção. O objetivo final da seleção é usualmen-te isolar peptídeos com a melhor adequação. Entretanto, aseleção para a maioria dos polipeptídios adequados deve serbalanceada com um estringência apropriada para permitir umrendimento razoável. Se a estringência for muito alta, orendimento de um fago especificamente selecionado cairá a-baixo do background de um fago isolado não especificamente,e o poder de discriminar em favor do mais adequado é perdi-do.
Uma das pressões mais comuns de seleção impostasnas populações de polipeptidio expressas em fagos é a afini-dade por um receptor alvo. A seleção por afinidade é ordina-riamente conseguida por modificações pequenas de técnicas depurificação por afinidade padrões em uso comum em bioquími-ca. Portanto, por exemplo, um receptor é preso em um suportesólido e a mistura de fagos é passada pelo receptor imobili-zado. Uma pequena minoria de polipeptídios expressos em fa-gos na biblioteca se liga ao receptor e são capturados nasuperfície ou matriz, permitindo que os fagos não ligadossejam retirados com a lavagem. Finalmente, os fagos ligados são eluidos em uma solução que diminui a interação receptor-peptideo, gerando uma população "eluida" de fagos que é ricaem clones do receptor de ligação. Os fagos eluidos ainda sãoinfectantes e são propagados simplesmente pela infecção decélulas hospedeiras bacterianas frescas, gerando um eluído "amplificado" que pode servir como entrada para outra rodadade seleção por afinidade. Clones de fagos do eluído finalsão propagados e caracterizados individualmente. As sequen-ciaas de aminoácidos dos peptídeos responsáveis pela ligaçãodo receptor alvo são determinados simplesmente pela avalia- ção da seqüência codificante correspondente no DNA viral.
Polipeptídios originados de fagos podem ser sele-cionados com base em critérios de adequação diferentes daafinidade por um receptor alvo. Por exemplo, as bibliotecasde polipeptídios podem ser selecionadas com base em uma ati-vidade biológica desejada (por exemplo, uma atividade enzi-mática, uma atividade enzimática melhorada ou uma atividadeque expresse resistência a certos agentes ou repressores).
Variações destes esquemas de seleção de fago sãonumerosas e são conhecidas pelos profissionais da área. Alémdisso, numerosas publicações são devotadas ao assunto de me-todologias de seleção de bibliotecas de fagos.
Em algumas modalidades, o fago expressando o poli-peptidio compreendendo o aminoácido não natural pode ser in-corporado no polipeptidio expresso em fago pode ser opcio-nalmente usado como uma fração reativa para formar um aco-plamento com a fase imobilizada, por exemplo, usando uma re-ação de cicloadição [3+2] ou uma reação de ligação de Stau-dinger.
A natureza do suporte sólido ao qual um fago (oubiblioteca de fago) pode ser imobilizada não é limitada. Porexemplo, o fago pode ser fixado a suportes sólidos que in-cluem placas de poliestireno, esferas de plásticos impermeá-veis, membranas de nylon ou nitrocelulose, esferas para mag-néticas e esferas de géis de agarose permeáveis. Em algumasmodalidades, os fagos imobilizados são arranjados em algumarelação especifica, isto é, eles formam um arranjo. A dis-cussão do uso de aminoácidos não naturais para formar Iiga-ções com suportes sólidos, assim como formatos de suportesólido e arranjos podem ser encontrados, por exemplo, no In-ternational Publication WO 2004/058946, intitulado "PROTEINARRAYS."COMPONENTES DE SISTEMA DE TRADUÇÃO ORTOGONAL
Em alguns aspectos da invenção, o aminoácido nãonatural p-azido-L-fenilalanina (veja Fig. 3, estrutura 2) éincorporado em um polipeptidio expresso em fagos, este ami-noácido não natural serve como alvo químico para reações decicloadição [3+2] e em reações de modificação de Staudingerpara modificação pós-traducional de polipeptídios expressosem fagos.
Componentes ortoognais para a incorporação deste aminoácido não natural são fornecidas aqui. Fig. 1 fornecesete espécies de tirosil-RNAt sintetase de Methanococcus ja-naschii (veja SEQ ID Nos: 4 a 10) que carregam um tRNA su-pressor ortogonal com p-azido-L-fenilalanina, subseqüente-mente resultando na incorporação de p-azido-L-fenilalaninadurante a tradução em resposta a um códon seletor. Um tRNAsupressor ortogonal que tem uso na invenção é fornecido na
SEQ ID NO : 1 .
tRNAs ortogonais e aminoacil-tRNA sintetases ade-quados para a incorporação de p-azido-L-fenilalanina também são descritos em Chin et ah, J. Am. Chem. Soe, (2002)124:9026-9027; e International Publications WO 2002/086075,intitulado "METHODS AND COMPOSITIONS FOR THE PRODUCTION OFORTHOGONAL tRNA AMINOACYL-tRNA SYNTHETASE PAIRS;" WO2002/085923, intitulado "IN VIVO INC0RP0RATI0N OF UNNATURALAMINO ACIDS"; cada um dos quais está incorporado aqui comoreferência em sua totalidade para todos os fins. Além disso,os conhecimentos da área e o presente relato também fornecemum guia para a síntese de tRNAs ortogonais adicionais e ami-noacil tRNA sintetases ortogonais que não estão especifica-mente citados pela seqüência.
Em outros aspectos da invenção, um aminoácido al-quinil não natural, é incorporado em um polipeptidio expres-so em fagos de interesse, também para servir como alvo paraa modificação pós-traducional. Por exemplo, um aminoácidoalquinil para-propargiloxifenilalanina (pPro-Phe; veja es-trutura 9 na Fig. 15) tem uso para este fim. Um aminoácidoalquinil pode servir como um alvo para reações de cicloadi-ção [3+2]. Os componentes ortogonais para a incorporaçãodeste aminoácido não natural são fornecidos em, por exemplo,Deiters et al, Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters15:1521-1524 (2005) e International Publication No.W02006/034332, depositado em 20 de Setembro de 2005.
REAÇÃO DE CICLOADIÇÃO [3+2]
As cadeias laterais de aminoácidos não naturais(por exemplo, um aminoácido aril-azida ou um aminoácido al-quinil) podem ser incorporados em uma proteína de interesseexpressa em fagos, então modificada especificamente e regio-seletivamente pela reação de cicloadição [3+2] de Huisgen(veja, Padwa, In Comprehensive Organic Synthesis; [Trost, B.M., Ed.] Pergamon: Oxford, 1991, Vol. 4, ρ 1069-1109; Huis-gen, In 1,3-Dipolar Cycloaddition Chemistry, [Padwa, A.,Ed.] Wiley: New York, 1984; ρ 1-176). A reacao química geralda reação de cicloadição [3+2] é mostrada na Fig. 15 ondeuma fração azida reage com a fração alquinil. Esta reação éirreversível e resulta na formação de uma ligação triazol.Conforme mostrado na Fig. 15, os grupos R que es-tão associados com substituintes azido ou alquinil na reaçãode cicloadição [3+2] não são particularmente limitantes. Emalguns aspectos, o grupo azido forma parte de uma aminoácido não natural aril-azida, por exemplo, p-azido-L-fenilalanina,que é incorporado em um polipeptidio expresso em fagos (ve-ja, Exemplo 4). Nesta configuração, a fração alquinil estáligada a um reagente (por exemplo, o corante fluresceina de-rivado do alquinil mostrado na Fig. 5, estrutura 6) que podeser reagida com o polipeptidio expresso em fago, resultandoem um fago modificado pós-traducionalmente. A natureza dogrupo R associado com o grupo alquinil não é particularmentelimitada.
Uma configuração reversa para a reação de cicloa-dição [3+2] também pode ser empregada. Neste cenário, o gru-po alquinil é parte de um aminoácido não natural alquinil,por exemplo, para-propargiloxifenilalanina (veja, Fig. 15,estrutura 9), que é incorporado em um polipeptidio expressoem fago. Nesta configuração, a fração azido está ligada a um reagente (por exemplo, os corantes dansil e fluresceina de-rivados do azido mostrado na Fig. 16, estruturas 10 e 11)que podem então reagir com o polipeptidio expresso em fago,resultando em um fago modificado pós-traducionalmente. A na-tureza do grupo R associado com o grupo azido não é particu-larmente limitada.
Os grupos químicos dos grupamentos alquinil e azi-do tem a vantagem de serem completamente diferentes dos gru-pos funcionais endógenos presentes em proteínas in vivo.Quando a reação de cicloadição [3+2] é conduzida na presençade cobre (I) em temperatura ambinete em meio aquoso (condi-ções brandas o suficiente para modificar as amostras bioló-gicas), ela ocorre de uma maneira completamente régio-seletiva (Rostovtsev et al. (2002) Angew. Chem. Int. Ed,41:2596) e podem ser usadas para modificar seletivamente asproteínas expressas em fagos cujos grupos funcionais alqui-nil ou azido foram introduzidos, por exemplo, pelo uso desistemas de tradução ortogonal (Deiters et al (2003) /. Am. Chem. Soe, 125: 11782; Wang et al (2003) J. Am. Chem. Soe,125:3192; Link and Tirrell (2003) J. Am. Chem. Soe, 125:11164) . Devido ao fato deste método envolver uma cicloadiçãoao invés de uma substituição nucleofiIica, as proteínas po-dem ser modificadas com seletividade extremamente alta. Esta reação tem o beneficio de poder der realizada em temperaturaambiente sob condições aquosas com excelente régio-seletividade (1,4>1,5) pela adição de quantidades catalíti-cas de sais de Cu(I) a mistura reacional (Tornoe et al,(2002) J. Org. Chem., 67:3057-3064; Rostovtsev et al, (2002) Angew. Chem., Int. Ed, 41:25 96-25 99).
A fim de demonstrar (mas não limitar) a invenção,os Exemplos aqui descrevem o uso de corantes dansil e fluo-resceína que foram derivatizados com frações azido ou alqui-nil e podem ser usados em reação de cicloadição [3+2] . En-tretanto, como deve ficar claro ao profissional da área, nãotemos a intenção de que a invenção seja limitada pelo usodestes corantes derivatizados na reação de cicloadição[3+2]. De fato, estes grupos químicos permitem a modificaçãopós-traducional do polipeptidio expresso em fago (como umresultado, a modificação pós-traducional do fago) com qual-quer molécula que possa ser derivatizada com uma fração azi-do ou alquinil. Está entre as habilidades de um profissionalda área a síntese de um derivado de azido ou alquinil dequalquer molécula particular de interesse. Por exemplo, mui-tos textos e protocolos estão disponíveis descrevendo comosintetizar compostos azido. Para uma referência geral veja:Patai, Saul, "The chemistry of the azido group" in The Chem-istry of Functional Groups, London, New York, IntersciencePublishers, 1971.
Em outros aspectos, a invenção fornece composiçõese métodos para a geração de polipeptídios expressos em fagosPEGuilados pelo uso de derivados azido de polietilenoglicol(azido-PEG) para o uso em reações de conjugação de cicloadi-ção [3+2] com polipeptídios expressos em fagos contendo al-quinil. A estrutura geral de azido polietilenoglicol é:
N3-CH2- (CH2-O-CH2) n-CH20R
Onde R é H ou CH3 e onde η é um inteiro entre, porexemplo, 50 e 10.000, 75 e 5.000, 100 e 2.000, 100 e 1.000,etc. Em várias modalidades da invenção, o polietilenoglicolazido tem um peso molecular de, por exemplo, cerca de 5000 acerca de 100.000 Da (isto é, entre cerca de 5 kDa e cerca de100 kDa), entre cerca de 20.000 e cerca de 50.000 Da, entrecerca de 20000 e cerca de 10.000 Da (por exemplo, 20.000Da), etc. Técnicas para a síntese de um polietilenoglicolazido são bem conhecidas pelos profissionais da área. Porexemplo, uma molécula de polietilenoglicol contendo um grupoeletrofílico (por exemplo, um brometo ou um éster N-hidroxisuccinimida) pode reagir com uma molécula eletrofíli-ca contendo um grupo azido (por exemplo, azida de sódio ou3-azidopropilamina) para gerar um polietilenoglicol.
PEG azido tem uso com a invenção quando bioconju-gado a uma proteína contendo uma proteína expressa em fagospor uma ligação triazol. A derivatização de terapêuticos ba-seado em proteínas com polietilenoglicol (PEGuilação) podefreqüentemente melhorar as propriedades farmacocinéticas efarmacodinâmicas de proteínas e assim, melhora a eficienciae minimiza a freqüência de dosagem. As várias vantagens daPEGuilção de terapêuticos protéicos são discutidas e elus-tradas em, por exemplo, Deiters et al., "Site-specific PEG-ylation of proteins containing unnatural amino acids," Bio-organic & Medicinal Chemistry Letters 14:5743-5745 (2004).
Além disso, outras vantagens associadas com a ge-racao de polipeptídios expressos em fagos compreendendo ami-noácidos não naturais que também contenham uma ligação éstersão contemplados. Por exemplo, um polipeptídio PEGuiladocriado pelo uso de um aminoácido alquinil com uma ligaçãoéster que permita a liberação lenta de polipeptídios por so-nicação das ligações éster in vivo e in vitro. Além disso,usando um suporte polimérico (uma resina azido) no lugar deuma molécula azido-PEG permite a purificação por afinidadeda proteína. A ligação covalente triazol permite fortes eta-pas de lavagens e o uso do aminoácido alquinil éster permitea liberação da proteína expressa em fagos pelo tratamentocom uma base. Significativamente, tal esquema de purificaçãopor afinidade não precisa mais da presença de um marcadorartificial (por exemplo, hexahistidina) ou epitopo na prote-ína de interesse para a purificação. Dependendo do aminoáci-do não natural usado, um polipeptídio essencialmente selva- gem (nativo) pode ser liberado da resina de afinidade após aetapa de clivagem.
Aminoácidos não naturais alquinil com ligações és-ter podem ser dintetizadas e incorporadas em proteínas. Ve-ja, por exemplo, a ligação éster de aminoácidos alquinil emInternational Publication No. W02006/034332, depositado em20 de setembro de 2005. Após a bioconjugação via cicloadição[3+2], as ligações éster poderiam ser clivadas por saponifi-cação em vivo ou in vitro; uma aplicação seria, por exemplo,a liberação lenta da parte peptídica de uma proteína expres- so em fago PEGuilado.
Em outros aspectos, a invenção fornece composiçõese métodos para a geração de polipeptídios expressos em fagosPEGuilados usando derivados alquinil de polietilenoglicol(alquinil-PEG) para uso em reações de conjugação por cicloa- dição [3+2] com aminoácidos não naturais contendo azido quesão incorporados em polipeptídios expressos em fagos.
REAÇÃO DE STAUDINGER
A ligação de Staudinger foi usada previamente paramodificar seletivamente carboidratos da superfície celular em sistemas celulares e in vivo (Saxon and Bertozzi, Science2000, 287, 2007-2010; Prescher et al, Nature 2004, 430, 873-877). A reação mantém seu excelente rendimento sob condiçõesaquosas e é altamente seletiva para frações azida. A ligaçãode Staudinger também foi usada para modificar seletivamenteproteínas que continham azidoomoalanina substituída para re-síduos de metionina (Kiick et al, Proc. Natl. Acad. ScLU.S.A. 2002, 101, 7566-7571). Entretanto, a aseletividadedesta abordagem da ligação de Staudinger está intrinsicamen-te limitada uma vez que cada resíduo de metionina em umaproteína assim como no proteoma inteiro estão susbstituidoscom azido-homoalanina, freqüentemente competindo com o ami-noácido nativo.
A invenção fornece métodos para produzir um fagomodificado pós-traducionalmente, onde o fago compreende umpolipeptídio expresso compreendendo um aminoácido não natu-ral aril-azida, por exemplo, p-azido-L-fenilalanina. 0 ami-noácido não natural é então eficientemente e especificamentemodificado usando a reação de ligação de Staudinger paraproduzir fago modificado pós-traducionalmente. Fig. 10 mos-tra um esquema da reação de ligação de Staudinger de um po-lipeptídio expresso em fago compreendendo um resíduo de p-azido-L-fenilalanina (do fago Ph-Az) com duas sondas espec-troscópica diferentes de moléculas de fosfina (estruturas 7e 8). Esta metodologia é explicada em detalhes no Exemplo 6.
Para fim de demonstrar (mas não limitar) a inven-ção, os Exemplos aqui descrevem o uso de duas sondas espec-troscópicas que foram adequadamente derivatizada para o usona reação de ligação de Staudinger. Entretanto, como deveficar claro para um profissional da área, não, temos a inten-ção de que a invenção seja limitada destas moléculas de fos-fina derivatizadas na reação de Staudinger. A química da re-ação de Staudinger permite a modificação pós-traducional dopolipeptidio expresso em fago (e como um resultado, a modi-ficação pós-traducional do fago) com qualqer molécula quepossa ser adequadamente derivatizada. Está entre as habili-dades de um profissional da área sintetizar derivados ade-quados de qualquer molécula particular de interesse para ouso na conjugação.
TECNOLOGIA DE tRNA ORTOGONAL/AMINOACIL tRNASINTETASE ORTOGONAL
A compreensão das novas composições e métodos dapresente invenção é facilitada pela compreensão das ativida-des associadas com pares tRNA ortogonal e aminoacil-tRNAsintetases. Discussões das tecnologias de tRNA e aminoacil-tRNA sintetases podem ser encontradas, por exemplo, no In-ternational Publications WO 2002/085923, WO 2002/086075, WO204/09459, WO 2005/019415, WO 2005/007870 e WO 2005/007624.Veja também, Wang e Schultz "Expanding the Genetic Code,"Angewandte Chemie Int. Ed., 44(l):34-66 (2005), o conteúdodos quais está incorporado aqui, por referência, em sua to-talidade.
A fim de adicionar aminoácidos não naturais ao có-digo genético, pares ortogonais novos compreendendo uma ami-noacil-tRNA sintetase e um tRNA adequado são necessários quepodem funcionar eficientemente na maquinaria traducional dohospedeiro, mas que são ortogonais ao sistema de tradução emquestão, significando que funciona independentemente dassintetases e trNAs endógenos ao sistema traducional. Carac-terística desejadas do par ortólogo incluem tRNA que codifi-ca ou reconhece apenas um códon específico, por exemplo, umcódon seletor, que não é codificado por qualquer tRNA endó-geno, e aminoacil-tRNA sintetases que preferencialmente ami-noacilam (ou "carrega") seu tRNA cognato com apenas um ami-noácido não natural específico. O O-tRNA também não é tipi-camente aminoacilado pelas sintetases endógenas. Por exem-plo, em E coli, um par ortogonal vai incluir uma aminoacil-tRNA sintetase que não faz reação cruzada com qualquer dostRNA endógenos, por exemplo, tem 4 0 em E coli e um tRNA or-togonal que não é aminoacetilado por qualquer das sintetasesendógenas, por exemplo, das quais existem 21 em E. coli.
A invenção fornece polipeptídios expressos em fa-gos compreendendo aminoácidos não naturais, onde o aminoáci-do não natural (e consequentemente o fago) são modificadospós-traducionalmente. A incorporação do aminoácido não natu-ral na proteína expressa em fago é obtida adaptando os paresortogonais para a codificação genética de aminoácidos nãonaturais em proteínas em E coli, onde os componentes ortogo-nais não fazem reação cruzada com componentes de E coli en-dógenos da maquinaria traducional da célula hospedeira, masreconhece o aminoácido não natural desejado e incorpora eleem proteínas em resposta ao códon seletor (por exemplo, umcódon sem sentido âmbar, TAG) . Os componentes ortogonaisfornecidos pela invenção incluem aminoacil-tRNA sintetasesortogonais derivadas da aminoacil-tRNA sintetase de Methano-coccus jannaschii, e o supressor de âmbar tirosil tRNACoA mu-tante, que funciona como um par ortogonal em uma célula hospe-deira eubacteriana. Neste sistema, as aminoacil-tRNAs sinte-tases mutantes aminoacilam o tRNA supressor com seu aminoá-cido não natural respectivo e não com qualquer um dos vinteaminoácidos comuns.
Esta invenção fornece polipeptidios expressos em fagos compreendendo aminoácidos não naturais, onde o aminoá-cido não natural (e consequentemente o fago) são modificadospós-traducionalmente, e métodos para produzir os mesmo. Es-tes métodos utilizam pares tRNA ortogonal-aminoacil-tRNAsintetase ortogonal, por exemplo, pares O-tRNA/O-RS que po-dem ser usados para incorporar o aminoácido não natural naproteína expressa no fago. Um par O-tRNA/O-RS é capaz de me-diar a incorporação de aminoácido não natural, por exemplo,um aminoácido não natural mostrado na Fig.3 ou Fig. 15 emuma proteína que é codificada por um polinucleotídeo, onde o polinucleotídeo compreende um códon seletor que é reconheci-do pela O-tRNA, por exemplo, in vivo. A alça anti-códon doO-tRNA reconhece o códon seletor em um RNAm e incorpora seuaminoácido não natural neste sítio no polipeptídio. Uma ami-noacil-tRNA sintetase ortogonal preferencialmente aminoacila(ou carrega) seu O-tRNA com apenas um aminoácido não naturalespecífico.
A habilidade de incorporar um aminoácido não natu-ral sítio-especificamente em proteínas expressas em fagospode facilitar o estudo das proteínas permitindo a modifica-ção pós-traducional destas proteínas, assim como permitindoa construção de proteínas.com novas propriedades. Por exem-plo, a expressão de proteínas contendo um ou mais aminoácidonão natural pode facilitar o estudo de proteínas por marca-ção especifica, altera a função catalitica das enzimas, me-lhora a atividade biológica ou reduz a reação cruzada com umsusbtrato, reticulando uma proteína com outras proteínas,pequenas moléculas ou biomoléculas, reduz ou elimina a de-gradação de proteínas, melhora a meia-vida de proteínas invivo (por exemplo, peguilando ou outras modificações intro-duzidas em sítios reativos), etc.
tRNA ORTOGONAL/AMINOACIL tRNA SINTETASE ORTOGONALE SEUS PARES
Os sistemas de tradução ortogonais que são adequa-dos para fazer proteínas que incluem um ou mais aminoácidosnão naturais são descritos em, por exemplo, InternationalPublication Numbers WO 2002/086075, intitulado "METHODS ANDC0MP0SITI0N FOR THE PRODUCTION OF 0RTH0G0NAL tRNA- AMINOACYL- tRNA SYNTHETASE PAIRS;" WO 2002/085923, intitulado "INVIVO INCORPORATION OF UNNATURAL AMINO ACIDS;" e WO2004/094593, intitulado "EXPANDING THE EUKARYOTIC GENETICCODE;" WO 2005/019415, depositado em 7 de julho de 2004; WO2005/007870, depositado em 7 de julho de 2004 e WO2005/007624, depositado em 7 de julho de 2004. Cada um des-tes pedidos de patente está incorporado aqui como referênciaem sua totalidade. Veja também, Wang e Schultz "Expandingthe Genetic Code," Angewandte Chemie Int. Ed, 44(l):34-66(2005); Deiters et al, Bioorganic & Medicinal Chemistry Let-ters 15:1521-1524 (2005); Chin et al, J. Am. Chem. Soe.2002, 124, 9026-9027; e International Publication No.W02006/034332, filed on September 20, 2005, os conteúdos decada um estão incorporados aqui como referência em sua tota-lidade .
Tais sistemas de tradução geralmente compreendemcélulas (que podem ser células não eucariontes como E coli,ou células eucariontes como leveduras) que incluem um tRNAortogonal (O-tRNA), uma aminoacil tRNA sintetase ortogonal(O-RS) , e um aminoácido não natural, onde a O-RS aminoacilao O-tRNA com o aminoácido não natural. Um par ortogonal dainvenção inclui um O-tRNA, por exemplo, um tRNA supressor, um tRNA frmeshift, ou equivalente, e uma O-RS. Componentesindividuais também são fornecidos na invenção.
De maneira geral, quando um par ortogonal reconhceum códon seletor e carrega um aminoácido em resposta ao có-don seletor, o par ortogonal é dito "suprimir" o códon sele- tor. Isto é, um códon seletor que não é reconhecido pela ma-quinaria endógena (por exemplo, da célula) do sistema detradução não é ordinariamente traduzido, o que pode resultarno bloqueio da produção de um polipeptidio que de outro modoseria traduzido do ácido nucléico. Um O-tRNA da invenção re- conhece um códon seletor e inclui pelo menos cerca de, porexemplo, 45%, 50%, 60%, 75%, 80% ou 90% ou mais de eficiên-cia de supressão na presença de uma sintetase cognata emresposta a um códon seletor quando comparado a eficiência desupressão de um O-tRNA compreendendo ou codificado por umaseqüência de polinucleotidio conforme mostrado na listagemde seqüência aqui. A O-RS aminoacila o o-tRNA com um aminoá-cido não natural de interesse. A célula usa o par O-tRNA/O-RS para incorporar o aminoácido não natural em uma cadeiapolipeptídica crescente, por exemplo, via um ácido nucléicoque compreende um polinucleotideo que codifica um polipepti-dio de interesse, onde o polinucleotideo compreende um códonseletor que é reconhecido pelo O-tRNA. Em certos aspectosdesejados, a célula pode incluir um par O-tRNA/O-RS adicio-nal, onde o O-tRNA adicional é carregado pela O-RS adicionalcom um aminoácido não natural diferente. Por exemplo, um dos0-tRNAs pode reconhecer um códon de quatro bases e o outropode reconhecer um códon de parada. Alternativamente, múlti- pios códons de paradas diferentes ou múltiplos códons dequatro bases diferentes podem reconhecer especificamentediferentes códons seletores.
Em certas modalidades da invenção, uma célula comouma célula de E coli ou uma célula de levedura que inclui um tRNA ortogonal (O-tRNA), uma aminoacil-tRNA ortogonal sinte-tase (O-RS), um aminoácido não natural e um ácido nucléicoque compreende um polinucleotideo que codifica um polipeptí-dio de interesse (por exemplo, um polipeptidio de fusão ex-presso em fagos), onde o polinucleotideo compreende um códonseletor que é reconhecido pelo O-tRNA. 0 sistema de traduçãotambém pode ser um sistema livre de células, por exemplo,qualquer um de uma variedade de sistemas transcri-ção/tradução "in vitro" comercialmente disponíveis em combi-nação com um par O-tRNA/O-RS e um aminoácido não natural conforme descrito aqui.
Em uma modalidade, a eficiência de supressão da 0-RS e do O-tRNA juntos é de cerca de, por exemplo, 5 vezes,10 vezes, 15 vezes, 20 vezes ou 25 vezes ou mais superiorque a eficiência de supressão do O-tRNA sem O-RS. Em algunsaspectos, a eficiência de supressão da O-RS e o-tRNA juntasé de pelo menos cerca de, por exemplo, 35%, 40%, 45%, 50%,60%, 75%, 80%, ou 90% ou mais de eficiência de supressão deum par sintetase ortogonal conforme mostrado nas listagensde seqüência aqui.
Conforme citado, a invenção opcionalmente incluimúltiplos pares O-tRNA/O-RS em uma célula ou outro sistemade tradução, que permite a incorporação de mais de um amino-ácido não natural em um polipeptidio expresso em fago. Porexemplo, a célula também pode incluir o par O-tRNA/O-RS adi-cional diferente e um segundo aminoácido não natural, ondeeste O-tRNA adicional reconhece um segundo códon seletor es-ta O-RS preferencialmente aminoacila o O-tRNA com o segundoaminoácido não natural. Por exemplo, uma célula que incluium par O-tRNA/O-RS (onde o O-tRNA reconhece, por exemplo, umcódon seletor âmbar) pode compreender um segundo par ortogo-nal, onde o segundo tRNA reconhece um códon seletor diferen-te, por exemplo um códon opal, um códon de quatro bases ouequivalente. Desejavelmente, os pares ortogonais diferentessão derivados de fontes diferentes, o que facilita o reco-nhecimento de diferentes codons seletores.
O O-tRNA e/ou O-RS pode ser de ocorrência naturalou pode ser, por exemplo, derivado pela mutação de um O-tRNAe/ou O-RS de ocorrência natural, por exemplo, gerando bibli-otecas de O-tRNA e/ou bibliotecas de 0-RS, de qualquer um deuma variedade de organismos e/ou usando qualquer uma de umavariedade de estratégias de mutação disponíveis. Por exem-pio, uma estratégia para produzir um par tRNA ortogonal/ a-minoacil-tRNA sintetase ortogonal envolve a importação de umpar tRNA/aminoacil-tRNA sintetase heterólogo (à célula hos-pedeira) de, por exemplo, uma fonte que não seja a célulahospedeira, ou múltiplas fontes, para a célula hospedeira.As propriedades do candidato à sintase heteróloga inclui,por exemplo, que ela não carregue qualquer tRNA da célulahospedeira, e as propriedades do candidato a tRNA heterólogoincluem, por exemplo, que ele não seja aminoacilado porqualquer das sintetases da célula hospedeira. Além disso, otRNA heterólogo é ortogonal a todas as sintetases da célulahospedeira.
Uma segunda estratégia para a geração de um parortogonal envolvendo a geração de bibliotecas mutantes dasquais é selecionado um O-tRNA ou O-RS. Estas estratégiastambém podem ser combinadas.
tRNA ortogonal (O-tRNA)
Um tRNA ortogonal (O-tRNA) desejavelmente media aincorporação de aminoácido não natural em uma proteína que écodificada por um polinucleotídeo que compreende um códonseletor que é reconhecido pelo O-tRNA, por exemplo, in vivoou in vitro. Em certas modalidades, um 0-tRNA da invençãoincluem pelo menos cerca de, por exemplo, 45%, 50%, 60%,75%, 80% ou 90% ou mais de eficiência de supressão no pre-sença de uma sintetase cognata em resposta a um códon sele-tor quando comparado a eficiência de supressão de um O-tRNAcompreendendo ou codificado por uma seqüência de polinucleo-tidio conforme mostrado na listagem de seqüência aqui.A eficiência de supressão pode ser determinada porqualquer um de um número de ensaios conhecidos na área. Porexemplo, um ensaio repórter de β-galactosidase pode ser usa-do, por exemplo, um plasmidio IacZ derivado (onde a constru- ção tem um códon seletor na seqüência de ácido nucléicoIacZ) é introduzido nas células provenientes de um organismoapropriado (por exemplo, um organismo onde os componentesortogonais possam ser usados) junto com o plasmidio compre-endendo um O-tRNA da invenção. Uma sintetase cognata também pode ser introduzida (como um polipeptidio ou um polinucleo-tideo que codifica a sintetase cognata quando expressa). Ascélulas são cultivadas em meio ate uma densidade desejada,por exemplo, até uma D0600 de cerca de 0,5, e ensaios de β-galactosidadse são feitos, por exemplo, usando o BetaFluor™ β-Galactosidase Assay Kit (Novagen). A porcentagem de su-pressão pode ser calculada como a porcentagem de atividadepara uma amostra relativa a um controle comparável, por e-xemplo, o valor observado da construção IacZ derivada, ondea construção tem um códon de sentido correspondente na posi- ção desejada ao invés de um códon seletor.
Exemplos de 0-tRNAs da invenção são mostrados nalistagem de seqüência aqui. Veja também, as tabelas, exem-plos e figuras aqui para exemplos de moléculas de O-tRNA eO-RS. Veja, também, a seção intitulada "Seqüência e varian- tes de ácido nucléico e polipeptidio" abaixo. Em uma molécu-la de RNA, como a molécula O-RS RNAm ou O-tRNA, timina (T) ésubstituída com uracil (U) relativo para uma dada sequnecia(ou vice-versa para um DNA codificante) ou seu complemento.Modificações adicionais destas bases também podem estar pre-sentes .
A invenção também inclui variações conservadorasde O-tRNAs correspondentes aos O-tRNAs particulares aqui.
Por exemplo, variações conservativas do O-tRNA incluem aque-las moléculas que funcionam como o O-tRNA particular, porexemplo, como na listagem de seqüência aqui e mantém a es-trutura do tRNA em forma de L em virtude da auto-complementariedade apropriada, mas que não tem uma seqüência idêntica àquelas, por exemplo, na listagem de seqüência, fi-guras e exemplos aqui (e, desejavelmente, que sejam diferen-tes das moléculas de tRNA selvagem) . Veja, também, a seçãointitulada "Seqüência e variantes de ácido nucléico e poli-peptídio" abaixo.
A composição compreendendo um O-tRNA também podeincluir uma aminoacil-tRNA sintetase (O-RS), onde o O-RSpreferencialmente aminoacila o O-tRNA com um aminoácido nãonatural. Em certas modalidades, uma composição incluindo umO-tRNA também pode incluir um sistema de tradução (por exem- pio, in vitro ou in vivo). Um ácido nucléico que compreendeum polinucleotideo que codifica um polipeptidio de interes-se, onde o polinucleotidio compreende um códon seletor que éreconhecido pelo O-tRNA, ou uma combinação de um ou maisdestes também podem estar presentes na célula. Veja, também,a seção intitulada "Aminoacil-tRNA sintetases ortogonais".
Métodos para produzir um tRNA ortogonal (O-tRNA)são conhecidos. Em certas modalidades da invenção, os 0-tRNAs podem ser produzidos pela geração de uma biblioteca demutantes. A biblioteca de tRNAs mutantes pode ser gerada vi-sando várias técnicas de mutagênese conhecidas na área. Porexemplo, os tRNAs mutantes podem ser gerados pelas mutaçõessitio especificas, mutações pontuais aleatórias, recombina-ção homóloga, DNA shuffling ou outros métodos de mutagêneserecursiva, construção quimérica ou qualquer combinação de-las, por exemplo, do exemplo O-tRNA da SEQ ID N0:1.
Mutações adicionais podem ser introduzidas em umaou mais posições especificas, por exemplo, em uma ou maisposições não conservativas, ou em uma composição conservati-va, em uma posição aleatória ou uma combinação de ambos emuma alça ou região desejada de um tRNA, por exemplo, uma al-ça anti-codon, o aceptor tronco, o braço ou alça D, o braçoou alça ΤΦ0, outras regiões da molécula de tRNA ou uma com-binação delas. Tipicamente, mutações em um trNA incluem mu-tação da alça anti-códon de cada membro da biblioteca de tR-NAs mutantes para permitir o reconhecimento de um códon se-letor. O método também pode incluir a adição de seqüênciasadicionais do O-tRNA. Tipicamente, um O-tRNA possui uma me-lhora na ortogonalidade para um organismo desejado comparadocom o material de inicio, por exemplo, a pluralidade de se-qüências de tRNAs, enquanto mantém sua afinidade pela RS de-sejada.
Os métodos opcionalmente incluem a análise de si-milaridade (e/ou homologia inferida) de seqüências de tRNAse/ou aminoacil-tRNA sintetases para determinar candidatospotenciais para um O-tRNA, O-RS e/ou seus pares, que parecemser ortogonais para um organismo especifico. Programas decomputador conhecidos na área e descrito aqui podem ser usa-dos para a análise, por exemplo, programs BLAST e. pileup po-dem ser usados. Em um exemplo, para escolher componentestraducionais ortogonais para uso em E coli, uma sintetase e/ou tRNA é escolhido que não expresse similaridade de se-qüência próxima aos organismos eubacterianos.
Tipicamente, um O-tRNA é obtido submetendo a, porexemplo, seleção negativa, uma população de células de umaprimeira espécie, onde as células compreendem um membro da pluralidade de O-tRNAs potenciais. A seleção negativa elimi-na células que compreendem um membro da biblioteca de O-tRNAs potenciais que é aminoacetilado por uma aminoacil-tRNAsintetase (RS) que é ortogonal à célula. Isto fornece umgrupo de tRNAs que são ortogonais às células da primeira es- pécie.
Em certas modalidades, na seleção negativa, um có-don seletor é introduzido em um polinucleotidio que codificaum marcador de seleção negativa, por exemplo, uma enzima queconfere resistência à antibiótico, por exemplo β-lactamase, uma enzima que confere um produto detectável, por exemplo,β-galactosidose, cloramfenicol acetiltransferase (CAT), porexemplo, um produto tóxico, como barnase, em uma posição nãoessencial (por exemplo, ainda produzindo uma barnase funcio-nal), etc. A seleção é feita opcionalmente pelo crescimento da população de células na presença de um agente seletivo(por exemplo, um antibiótico, como a ampicilina). EM uma mo-dalidade, a concentração do agente de seleção é variada.Por exemplo, para medir a atividade dos tRNAs su-pressores, um sistema de seleção é usado que se baseia nasupressão in vivo do códon seletor, por exemplo, mutaçõessem sentido (por exemplo, parada) ou frameshift introduzidasem um polinucleotideo que codifica um marcador de seleçãonegativa, por exemplo, um gene para β-lactamase (bla). Porexemplo, variantes de polinucleotideos, por exemplo, varian-tes bla, com um códon seletor em certas posições (por exem-plo, A184), são construídos. Células, por exemplo, bacté-rias, são transformadas com estes polinucleotideos. No casodo tRNA ortogonal, que não pode ser eficientemente carregadopelas sintetases endógenas de E coli, resistência a antibió-tico, por exemplo, resistência a ampicilina, deve ser a mes-ma ou menor do que para a bactéria transformada sem plasmí-dio. Se o tRNA não for ortogonal, ou se uma sintetase hete-róloga capaz de carregar o tRNA é co-expressa no sistema, umnível mais alto de antibiótico, por exemplo, ampicilina, éobservado resistência. Células, por exemplo, bactéria, sãoescolhidas as que não são capazes de crescem em placas deagar LB com concentrações de antibióticos equivalente a dascélulas transformadas sem plasmidios.
No caso de um produto tóxico (por exemplo, ribonu-clease ou barnase), quando um membro de uma pluralidade detRNAs potenciais é aminoacetilado pelo hospedeiro endógeno,por exemplo, Escherichia coli sintetases (isto é, não é or-togonal ao hospedeiro, por exemplo Escherichia coli sinteta-ses) o códon seletor é suprimido e o produto polinucleotideotóxico gerado leva a morte celular. Células possuindo tRNAsortogonais ou tRNAs não funcionais sobrevivem.
Em uma modalidade, o grupo de tRNAs que são orto-gonais a um organismo desejado são então submetidos a uma seleção positiva na qual um códon seletor é colocado em ummarcador de seleção positiva, por exemplo, codificado por umgene de resistência à droga, como o gene da β-lactamase. Aseleção positiva é feita em uma célula compreendendo um po-linucleotideo codificando ou compreendendo um membro de um pool de tRNAs que são ortogonais à célula, um polinucleotí-deo codificando um marcador de seleção positiva, e um poli-nucleotideo codificando uma RS cognata. Em certas modalida-des, a segunda população de células compreende células quenão eram eliminadas pela seleção negativa. Os polinucleoti-dios são expressos na célula e a célula cresce na presençade um agente de seleção, por exemplo, ampicilina. Os tRNAssão então selecionados por sua habilidade de ser aminoaceti-Iada pela sintase cognata co-expressada e para inserir umaminoácido em resposta a este códon seletor. Tipicamente,estas células mostram uma melhora na eficiência de supressãoquando comparado às células contendo tRNA(s) não funcionais,ou tRNAs que não podem ser eficientemente reconhecidos pelasintetase de interesse. A célula contendo os tRNAs não fun-cionais ou tRNAs que não são reconhecidos eficientemente pe- Ia sintetase de interesse, são sensíveis ao antibiótico.Portanto, tRNAs que: (i) não são substratos para hospedeirosendógenos, por exemplo, Escherichia coli, sintetases; (ii)podem ser aminoacetiladas pela sintetase de interesse; e (i-ii) são funcionais na tradução, sobrevivem ambas as sele-ções.
De fato, o mesmo marcador pode ser um marcador po-sitivo ou negativo, dependendo do contexto no qual ele é se-lecionado. Isto é, o marcador é um marcador positivo se forselecionado no contexto em que é selecionado. Isto é, o mar-cador é um marcador positivo se ele for selecionado a favor,mas é um marcador negativo se for selecionado contra.
A estringência da seleção, por exemplo, a seleção positiva, a seleção negativa ou ambas as seleções positiva enegativa, nos métodos descritos acima, opcionalmente incluema variação da estringência da seleção. Por exemplo, devido abarnase se uma proteína extremamente tóxica, a estringênciada seleção negativa pode ser controlada pela introdução de um número diferente de códons seletores no gene da barnasee/ou usando um promotor induzível. Em outro exemplo, a con-centração do agente de seleção é variada (por exemplo, con-centração de ampicilina). Em alguns aspectos da invenção, aestringência é variada devido ao fato da atividade desejada poder ser mais baixa durante as rodadas iniciais. Portanto,menos critérios de estringência de seleção são aplicados emcada rodada e mais critérios de estringência são aplicadosnas rodadas de seleção posteriores. Em certas modalidades, aseleção negativa, a seleção positiva ou ambas as seleções positiva e negativa podem ser repetidas múltiplas vezes.Múltiplos marcadores de seleção negativa, marcadores de se-leção positiva ou marcadores de seleção positiva e negativadiferentes podem ser usados. Em certas modalidades, o marca-dor de seleção positiva e negativa pode ser o mesmo.
Outros tipos de seleção podem ser usados na inven-ção para produzir componentes de tradução ortogonal, por e-xemplo, um O-tRNA, um O-RS e um par O-tRNA/O-RS que carregaem aminoácido não natural em resposta a um códon seletor.Por exemplo, o marcador de seleção negativa, marcadores deseleção positiva ou marcadores de seleção positiva e negati-va podem incluir um marcador que fluoresce ou catalisa umareação luminescente na presença de um reagente adequado. Emoutra modalidade, um produto do marcador é detectado porfluorescence-activated cell sorting (FACS) ou por lumines-cência. Opcionalmente, o marcador inclui um marcador de se-leção baseado em afinidade. Veja, também, Francisco et al,(1993) "Production and fluorescence-activated cell sortingof Escherichia coli expressing a functional antibody frag-ment on the externai surface, " Proc Natl Acad Sci USA.90:10444-8.
Métodos adicionais para a produção de um tRNA or-togonal recombinante pode ser encontrado em, por exemplo,International Application Publications WO 2002/086075, inti-tulado "METHODS AND COMPOSITIONS FOR THE PRODUCTION OF0RTH0G0NAL tRNA AMTNOACYL-tRNA SYNTHETASE PAIRS;" WO2004/094593, entitled "EXPANDING THE EUKARYOTIC GENETICCODE;" e WO 2005/019415, depositado em 7 de julho de 2004.Veja também Forster et ah, (2003) "Programming. peptidomi-metic synthetases by translating genetic codes designed denovo," PNAS 100 (11): 6353-6357; e, Feng et al, (2003), "Ex-panding tRNA recognition of a tRNA synthetase by a singleamino acid change," PNAS 100(10): 5676-5681.
Aminoacil-tRNA sintetase ortogonal(O-RS)
Uma O-RS usada na invenção preferencialmente ami-noacila um O-tRNA com um aminoácido não natural, in vitro ouin vivo. Uma O-RS pode ser fornecida ao sistema de tradução,por exemplo, uma célula, por um polipeptidio que inclui umaO-RS e/ou por um polinucleotidio que codifica um O-RS ou suafração. Por exemplo, uma O-RS compreende uma seqüência deaminoacdio conforme mostrado na listagem de seqüência e e-xemplos aqui 9veja, por exemplo, FIG. 2 e SEQ ID NO:4-7) ousua variante conservativa. Em outro exemplo, uma 0-RS, ousua fração, é codificada por uma seqüência de polinucleoti-dio que codifica um aminoácido compreendendo a seqüência nalistagem de seqüência ou exemplos aqui, ou sua seqüência depolinucleotideo complementar. Veja, por exemplo, as tabelase exemplos aqui para seqüências de moléculas de O-RS úteis.Veja também, a seção intitulada "Seqüência e variantes deácido nucléico e polipeptidio" aqui.
Métodos para identificar uma aminoacil-tRNA sinte-tase (O-RS) , por exemplo, uma 0-RS, para uso com um O-tRNA,são conhecidos. Por exemplo, um método inclui submeter a se-leção, por exemplo, seleção positiva, uma população de célu-las de uma primeira espécie, onde as células individualmentecompreendem: 1) um membro de uma pluralidade de aminoacil-tRNA sintetases (RSs), (por exemplo, a pluralidade de RSspode incluir RSs mutantes, RSs derivada de uma espécie dife-rente da primeira especie); 2) o tRNA ortogonal (O-tRNA)(por exemplo, de mais de uma espécie); e 3) um polinucleotí-deo que codifica um marcador de seleção (por exemplo, posi-tiva) e compreende pelo menos um códon seletor. As célulassão selecionadas para aqueles que mostram uma melhora na e- ficiência de supressão quando comparada às células sem oucom uma quantidade reduzida de membros de uma pluralidadesde RSs. A eficiência de supressão pode ser medida por técni-cas conhecidas na área e descritas aqui. As células possuin-do um melhoramento na eficiência de supressão compreendem uma RS ativa que aminoacila o O-tRNA. O nivel de aminoacila-ção (in vitro ou in vivo) pela RS ativa de um primeiro grupode tRNAs da primeira espécie é comparada com o nivel de ami-noacilação (in vitro ou in vivo) pela RS ativa de um segundogrupo de tRNAs da segunda espécie. O nivel de aminoacilação pode ser determinado por uma substancia detectável (por e-xemplo, um aminoácido não natural marcado). A RS ativa quemais eficientemente aminoacila o segundo grupo de tRNAs com-parado com o primeiro grupo de tRNAs é tipicamente selecio-nada, fornecendo assim uma aminoacidl-tRNA sintetase ortogo- nal eficiente (optimizada) para uso com o O-tRNA. Uma O-RS,identificada pelo metodp, também é uma característica da in-venção .
Qualquer um de vários ensaios pode ser usado paradeterminar aminoacilação. Estes ensaios podem ser feitos invitro ou in vivo. Por exemplo, ensaios de aminoacilação invitro são descritos aqui em, por . exemplo, Hoben e Soil(1985) Methods Enzvmol. 113:55-59. A aminoacilação tambémpode ser determinada pelo uso de um repórter junto com oscomponentes de tradução ortogonal e detectar o repórter emuma célula expressando um polinucleotideo compreendendo pelomenos um códon seletor que codifica um proteína. Veja tam-bém, WO 2002/085923, intitulado "IN VIVO INC0RP0RATI0N OFUNNATURAL AMINO ACIDS;" e WO 2004/094593, intitulado"EXPANDING THE EUKARYOTIC GENETIC CODE."
O-RS identificadas podem ser manipuladas para al-terar a especificidade da sintetase, de modo que apenas umaminoácido não natural desejado, mas não qualquer dos 20 a-minoácidos comuns, são carregados no 0-tRNA. Os métodos paragerar uma aminoacil-tRNA sintetase ortogonal com uma especi-ficidade de substrato para um aminoácido não natural incluemmutar a sintetase, por exemplo, no sítio ativo na sintetase,no sítio do mecanismo de edição na sintetase, ou equivalen-te, e aplicando um processo de seleção. Uma estratégia é u-sada, que é baseada na combinação de uma seleção positivaseguida de uma seleção negativa. Na seleção positiva, a su-pressão do códon seletor introduzida em uma posição não es-sencial de um marcador positivo permite que a célula sobre-viva sob pressão de seleção positiva. Na presença de ambosos aminoácidos naturais e não naturais, sobreviventes quecodificam sintetases ativas carregando o tRNA supressor or-togonal com um aminoácido natural ou não natural. Na seleçãonegativa, a supressão de um códon seletor introduz em umaposição não essencial de um marcador negativo remove sinte-tases com especificidade de aminoácidos naturais. Sintetasessobreviventes da seleção negativa e positiva codificam sin-tetases que aminoacilam (carregam) o tRNA supressor ortogo-nal com apenas aminoácidos não naturais. Estas sintetasespodem então ser submetida a mais mutagênese, por exemplo,DNA shuffling ou outros métodos de mutagênese recursiva.
Uma biblioteca de O-RSs mutantes pode ser gerada usando várias técnicas de mutagênese conhecidas na área. Porexemplo, as RSs mutantes podem ser geradas por mutações sí-tio-especificas, mutações pontuais aleatórias, recombinaçãohomóloga, DNA shuffling ou outros métodos de mutagênese re-cursiva, construção quimérica ou qualquer combinação delas. Por exemplo, uma biblioteca de RSs mutantes pode ser produ-zida de duas ou mais outras, por exemplo, menores, menos di-versificadas, "sub-bibliotecas". Bibliotecas quiméricas deRSs também estão incluídas na invenção. Deve ser notado queas bibliotecas de tRNA sintetases também estão incluídas nainvenção. Deve ficar claro que as bibliotecas de tRNA sinte-tases de vários organismos (por exemplo,microorganismos comoeubactéria ou arqueobacteria) como bibliotecas que compreen-demdiversidade natural (por exemplo, U.S. Patent No.6, 238, 884 de Short et al; U.S. Patent No. 5, 756, 316 de S-challenberger et al; U.S. Patent No. 5,783,431 de Petersenet al; U.S. Patent No. 5,824,485 de Thompson et al; U.S. Pa-tent No. 5,958,672 to Short et al), são opcionalmente cons-truídas e selecionadas para pares ortogonais.
Uma vez que as sintetases são submetidas às estra- tégias de seleção positiva e negativa, estas sintetases po-dem então ser submetidas a mais mutagênese. Para exemplo, umácido nucléico que codifica o O-RS pode ser isolado; um gru-po de polinucleotídeos que codifica O-RSs mutadas (por exem-pio, por mutagênese aleatória, mutagênese sitio-especifica,recombinação ou qualquer uma de suas combinações) podem sergeradas do ácido nucléico; e, estas etapas individuais ouuma combinação destas etapas pode ser repetida até que umaO-RS com o aminoácido não natural. Em alguns aspectos da in-venção, as etapas são feitas múltiplas vezes, por exemplo,pelo menos duas vezes.
Niveis adicionais da estringência da seleção tam-bém pode ser usada nos métodos da invenção, para produzir Ο-tRNA, O-RS ou seus pares. A estringência da seleção pode servariada em uma ou ambas as etapas do método para produziruma O-RS. Esta inclui, por exemplo, variar a quantidade doagente de seleção que é usado, etc. Rodadas adicionais deseleções positivas e/ou negativas também podem ser realiza-das. A seleção também pode compreender uma ou mais mudançasna permeabilidade do aminoácido, uma mudança na eficiênciade tradução, uma mudança na fidelidade de tradução, etc. Ti-picamente, uma ou mais mudanças são baseadas em uma mutaçãoem um ou mais genes em um organismo no qual um par tRNA-tRNAsintetase é usado para produzir a proteína.
Detalhes gerais adicionais para a produção de 0-RS, e alteração da especificidade do substrato podem ser en-contrado em Internai Publication Number WO 2002/086075, in-titulado "METH0DS AND C0MP0SITI0NS FOR THE PR0DUCTI0N OF0RTH0G0NAL tRNA AMINO ACYL-tRNA SYNTHETASE PAIRS; " e WO2004/094593, entitled "EXPANDING THE EUKARYOTIC GENETICCODE." Veja também, Wang e Schultz "Expanding the GeneticCode," Angewandte Chemie Int. Ed, 4 4 (1) :34- 66 (2005), oconteúdo dos quais está incorporado como referência em suatotalidade.
ORGANISMOS FONTE E HOSPEDEIRO
Os componentes ortogonais de tradução (0-tRNA e 0-RS) usados na invenção podem ser derivados de qualquer orga-nismo (ou uma combinação de organismos) para uso em um sis-tema hospedeiro de tradução de qualquer outra espécie, com acondição de que os componentes O-tRNA/O-RS e o sistema hos-pedeiro trabalhem de uma maneira ortogonal. Não é obrigadoque o 0-tRNA e a O-RS de um par ortogonal sejam derivados domesmo organismo. Em alguns aspectos, os componentes ortogo-nais são derivados de genes Archaea (isto é, archeabacteria)para uso em um sistema hospedeiro de eubactéria.
Por exemplo, o 0-tRNA pode ser derivado de um or-ganismo Archae, por exemplo, uma arqueobactéria, como Metha-nococcus j annaschii, Methanobacterium thermoautotrophicum,Halobacterium como Haloferax volcanii e Halobacterium espé-cie NRC-I , Archaeo globus fulgidus, Pyrococcus furiosus,Pyroeoeeus horikoshii, Aeuropyrum pernix, Methanoeoeeus ma-ripaludis, Methanopyrus kandleri, Methanosareina mazei (Mm),Pyrobaeulum aerophl' lum, Pyroeoeeus abyssi, Sulfolobus solfa-tarieus (Ss), Sulfolobus tokodaii, Thermoplasma acidophilum,Thermoplasma voleanium, ou equivalente, ou uma eubacteria,como Eseheriehia eoli, Thermus thermophilus, Baeillus stea-rothermphilus, ou equivalente, enquanto que a O-RS ortogonalpode ser derivada de um organismo ou combinação de organis-mos, por exemplo, uma arqueobactéria como Methanoeoeeus jan-nasehii, Methanobaeterium thermoautotrophicum, Halobaeterii-im como Haloferax volcanii and Halobacterium species NRC-I,Archaeo globus fulgidus, Pyrococcus furiosus, Pyroeoeeushoqkoshii, Aeuropyrum pernix, Methanoeoeeus maripaludis, Me-thanopyrus kandleri, Methanosareina mazei, Pyrobaeulum aero-philum, Pyroeoeeus abyssi, Sulfolobus solfatarieus, Sulfolo-bus tokodaii, Thermoplasma aeidophilum, Thermoplasma voleanium, ou equivalente, ou uma eubaeteria, como Eseheriehiaeoli, Thermus thermophilus, Baeillus stearothermphilus, ouequivalente. Em uma modalidade, fontes eucariontes, por e-xemplo, plantas, a,gás, protistas, fungos, leveduras, ani-mais (por exemplo, mamíferos, insetos, artrópodes, etc), ouequivalente, também podem ser usados como fontes de O-tRNAse O-RSs.
Os componentes individuais de um par O-tRNA/O-RSpodem ser derivadas do mesmo organismo ou de diferentes or-ganismos. Em uma modalidade, o par O-tRNA/O-RS é provenientedo mesmo organismo. Alternativamente, o O-tRNA e a O-RS dopar O-tRNA/O-RS são provenientes de organismos diferentes.
0 O-tRNA , O-RS ou o par O-tRNA/O-RS pode ser se-lecionado in vivo ou in vitro e/ou usado em uma célula, porexemplo, uma célula eubacteriana, para produzir um polipep-tidio com um aminoácido não natural. A célula eubacterianausada não está limitada, por exemplo, Eseheriehia eoli,Thermus thermophilus, Baeillus stearothermphilus, ou equiva-lente. As composições de células de eubactéria compreendendocomponentes de tradução da invenção também são uma caracte-rística da invenção.76Veja também, International Application PublicationNumber WO 2004/094593 , intitulado "EXPANDING THE EUKARYOTICGENETIC CODE," depositado em 16 de abril de 2004, para a se-leção de O-tRNA/O-RS em uma espécie para uso em outra espé-cie.
Em alguns aspectos, 0-tRNA , O-RS ou o par 0-tRNA/O-RS podem ser selecionados in vivo ou in vitro e/ouusado em uma célula, por exemplo, uma célula eubacteriana,para produzir um polipeptidio com um aminoácido não natural. A célula eubacteriana usada não está limitada, por exemplo,qualquer célula hospedeira adequada, como Saccharomyces ce-revisiae (S. cerevisiae) ou equivalente pode ser usada. Com-posições de células eucariontes compreendendo componentestraducionais da invenção também são uma característica dainvenção.
Embora sistemas de tradução ortogonais (por exem-plo, compreendendo uma 0-RS, um 0-tRNA e um aminoácido nãonatural) possam utilizar células hospedeiras para produzirproteínas tendo aminoácidos não naturais, não temos a inten- ção de que um sistema de tradução ortogonal da invenção ne-cessite de uma célula hospedeira intacta e viável. Por exem-plo, um sistema de tradução ortogonal pode utilizar um sis-tema livre de células na presença de um extrato de células.De fato, o uso de sistemas in vivo de transcrição/tradução,livre de células, para a produção de proteínas é uma técnicabem estabelecida. A adaptação destes sistemas in vitro paraproduzir proteínas posssuindo aminoácidos não naturais usan-do componentes do sistema de tradução ortogonal descrito a-qui está bem dentro do escopo da invenção.
CODON SELETOR
Os códons seletores em sistemas de tradução orto-gonais expandem o framework do códon genético da maquinariabiosintética da proteína. Por exemplo, um códon seletor in-clui, por exemplo, um códon único de três bases, um códonsem sentido, como um códon de parada, por exemplo, um códonâmbar (UAG), ou um códon opal (UGA), um códon não natural,pelo menos um códon de quatro bases, um códon raro ou equi-valente. Vários códons seletores podem ser introduzidos emum gene desejado, por exemplo, um ou mais, dois ou mais,mais de três, etc. Usando diferentes códons seletores, múl-tiplos pares tRNA/sintetase ortogonal podem ser usados parapermitir a incorporação simultânea sítio-específica de múl-tiplos aminoácidos não naturais, por exemplo, incluindo pelomenos um aminoácido não natural, usando estes diferentes có-dons seletores.
Em uma modalidade, os métodos envolvem o uso de umcódon seletor que é um códon de parada para a incorporaçãode um aminoácido não natural in vivo em uma célula em um po-lipeptídio expresso em fago que é o alvo de modificaçõespós-traducionais. Por exemplo, 0-tRNA é produzido que reco-nhece o códon de parada e é aminoacilado pela O-RS com umaminoácido não natural. Este 0-tRNA não é reconhecido pelasaminoacil-tRNA sintetases de ocorrência natural no hospedei-ro. A mutagênese sítio-direcionada convencional pode ser u-sada para introduzir o códon de parada em um sítio de inte-resse em um polinucleotídeo codificando um polipeptidio deinteresse. Veja, por exemplo, Sayers, J.R., et al, (1988),"5',3' Exonuclease in phosphorothioate-based oligonucleo-tide-directed mutagenesis," Nucleic Acids Res, 791-802.
Quando a O-RS, 0-tRNA e o ácido nucléico que codifica o po-lipeptidio de interesse são combinados, por exemplo, in vi-vo, o aminoácido não natural é incorporado em resposta aocódon de parada para dar um polipeptidio contendo o aminoá-cido não natural na posição especificada. Em uma modalidadesda invenção, o códon de parada usada como um códon seletor éum códon âmbar, UAG, e/ou um códon opal, UGA. Em um exemplo,o código genético no qual UAG e UGA são usados como um códonseletor pode codificar 22 aminoácidos enquanto preserva ocódon sem sentido ocre, UAA, que é o sinal de término maisabundante.
A incorporação dos aminoácidos não naturais in vi-vo pode ser feita sem pertubacao significativa da célulahospedeira. Por exemplo, em células não eucariontes, comoEscherichia coli, devido ao fato da eficiência de supressãopara o códon UAG depender da competição entre o 0-tRNA, porexemplo, o tRNA supressor de âmbar, e o fator de liberação 1(RFl) (que se liga ao códon UAG e inicia a liberação do pep-tideo crescente do ribossomo), a eficiência de supressão po-de ser modulada por, por exemplo, o aumento do nivel de ex-pressão de 0-tRNA, por exemplo, o tRNA supressor, ou usandouma linhagem deficiente de RFl. Em células eucariontes, de-vido a eficiência de supressão para o códon UAG depende dacompetição entre o O-tRNA, por exemplo, o tRNA supressor deâmbar, e um fator de liberação eucarionte (por exemplo, eRF)(que se liga a um codon de parada e inicia a liberação dopeptideo crescente do ribossomo), a eficiência de supressãopode ser modulada por, por exemplo, o aumento do nivel deexpressão do O-tRNA, por exemplo, o tRNA supressor. Alémdisso, compostos adicionais também podem estar presentes,por exemplo, agentes de redução como ditiotretiol (DTT).
Aminoácidos não naturais também podem ser codifi-cados com códons raros. Por exemplo, quando a concentraçãode arginina em uma reação de síntese protéica in vitro é re-duzida, o códon raro arginina, AGG, se mostrou eficiente pa-ra a inserção de Ala por um tRNA sintético acilado com ala-nina. Veja, por exemplo, Ma et ah, Biochemistry, 32:7939(1993) . Neste caso, o tRNA sintético compete com o tRNAArg deocorrência natural, que existe como espécie minoritária emEscherichia coli. Além disso, alguns organismos não usam to-dos os códons triplos. Um códon AGA não designado em Microc-cocus luteus foi utilizado para a inserção de aminoácidos emum extrato de transcrição/tradução in vitro. Veja, por exem-plo, Kowal e Oliver, Nucl. Acid. Res., 25:4685 (1997). Oscomponentes da invenção podem ser gerados para usar estescódons raros in vivo.
Os códons seletores também podem compreender có-dons estendidos, por exemplo, códons de quatro ou mais ba-ses, como códons de quatro, cinco, seis ou mais bases. Exem-plos de códons de quatro bases incluem, por exemplo, AGGA,CUAG, UAGA, CCCU, e equivalente. Exemplos codons de cincobases incluem, por exemplo, AGGAC, CCCCU, CCCUC, CUAGA,CUACU, UAGGC, e equivalente. Os métodos da invenção incluemo uso de condons estendidos baseado na supressão de frame-shift. Códons de quatro ou mais bases podem inserir, por e-xemplo, um ou múltiplos aminoácidos não naturais, na mesmaproteína. Em outras modalidades, as alças anticódon podemdecodificar, por exemplo, pelo menos um códon de quatro ba-ses, pelo menos um códon de cinco bases, ou pelo menos umcódon de seis bases ou mais. Uma vez que existem 256 códonsde quatro bases possíveis, múltiplos aminoácidos não natu-rais podem ser codificados na mesma célula usando um códonde quatro ou mais bases. Veja, também, nderson et al. ,(2002) "Exploring the Limits of Codon and Anticodon Size,"Chemistry and Biology. 9:237-244; and, Magliery (2001) "Ex-panding the Genetic Code: Selection of Efficient Suppressorsof Four-base Codons and Identification of "Shifty" Four-baseCodons with a Library Approach in Escherichia coli " J. MoI.Biol. 307: 755-769.
Por exemplo, códons de quatro bases tem sido usa-dos para incorporar aminoácidos não naturais em proteínasusando métodos biosintéticos in vitro. Veja, por exemplo, Maet al., (1993) Biochemistry, 32:7939; e Hohsaka et al,(1999) J. Am. Chem. Soa. 121:34. CGGG e AGGU foram usadospara simultaneamente incorporar 2-naftilalanina e um deriva-do NED da lisina na estreptoavidina in vitro com dois tRNAssupressores de frameshift quimicamente acilados. Veja, porexemplo, Hohsaka et al, (1999) J. Am. Chem. Soe, 121:12194.Em um estudo in vivo, Moore et al. examinou a habilidade dosderivados de tRNALeu com anticodons NCUA para suprimir códonsUAGN (Ν pode ser U, A, G ou C), e descobriu que o quadruple-te UAGA pode ser decodificada por um tRNALeu com um anticódonUCUA com uma eficiência de 13 dos 26% com pouca decodifica-ção no quadro 0 ou -1. Veja, Moore et al, (2000) J. MoI. Bi-ol., 298:195. Em uma modalidade, códons estendidos baseadosem códons raros ou códons sem sentido podem ser usadas nainvenção, que pode reduzir leituras com erro de sentido esupresso de frameshift em outros sítios não desejados. Có-dons de quatro bases tem sido usados como códons seletoresem uma variedade. Códons de quatro bases tem sido usados co-mo códons seletores em uma variedade de sistemas ortogonais.Veja, por exemplo, WO 2005/019415; WO 2005/007870 e WO2005/07624. Veja também, Wang e Schultz "Expanding the Gene-tic Code," Angewandte Chemie Int. Ed., 44(l):34-66 (2005), oconteúdo do qual está incorporado como referência em sua to-talidade. Enquanto os exemplos abaixo utilizam um códon se-letor âmbar, códons de quatro ou mais bases também pode serusados, modificando os exemplos aqui para incluir 0-tRNAs dequatro bases e sintetases modificadas para incluir mutaçõessimilares àquelas previamente descritas para várias O-RSs deaminoácidos não naturais.
Para um dado sistema, um códon seletor também podeincluir um dos códons naturais de três bases, onde o sistemaendógeno não usa (ou raramente usa) o códon de bases antu-rais. Por exemplo, isto inclui um istema que não tem um tRNAque reconheça o códon de três bases natural, e/ou um sistemaonde o códon de três bases é um códon raro.Os códons seletores opcionalmente incluem pares debase não naturais. Estes pares de base não naturais expandemo alfabeto genético existente. Um par de bases extra aumentao número de códons triplos de 64 a 125. Propriedades dos pa-res de três bases incluem pareamento de base seletivo e es-tável, incorporação enzimática eficiente no DNA com alta fi-delidade por uma polimerase, e a eficiente extensão continu-ada do primer após a síntese do par de bases não naturalnascente. Descrições dos pares de base não naturais que po-dem ser adaptados para em todos e composições incluem, porexemplo, Hirao, et al, (2002) "An unnatural base pair forincorporating amino acid analogues into protein," Nature Bi-otechnology, 20:177-182. Veja também Wu, Y., et al, (2002)J. Am. Chem. Soe. 124:14 626-14 630. Outras publicações rele-vantes estão listadas abaixo.
Para uso in vivo, o nucleosídio não natural é per-meável a membrana e é fosforilado para formar o trifosfatocorrespondentes. Além disso, a informação genética aumentadaé estável e não destruída pelas enzimas celulares. Estudosanteriores de Benner e outros tiraram vantagem dos padrõesde ligação do idrogenio que são diferentes daqueles nos pa-res cônicos de Watson-Crick, o exemplo mais marcante dosquais é o par isso-C:isso-G. Veja, por exemplo, Switzer etal, (1989) J. Am. Chem. Soe, 111:8322; e Piccirilli et al,(1990) Nature, 343:33; Kool, (2000) Curr. Opin. Chem. Biol..4:602. Estas bases em geral tem erro de pareamento em algumgrau com as bases naturais e não pode ser enzimaticamentereplicado. Kool e colaboradores demonstraram que as intera-ções hidrofóbicas entre bases pode substituir pontes de hi-drogênio para originar a formação do par de bases. Veja,Kool, (2000) Curr. Opin. Chem. Biol.. 4:602; e Guckian e Ko-ol, (1998) Angew. Chem. Int. Ed. Engl.. 36, 2825. Em um es- forço para desenvolver um par de bases não ntural satisfa-zendo todas as necessidades acima, Schultz, Romesberg e co-laboradores sintetizaram sistematicamente e estudaram umaserie de bases hidrofóbicas. Um auto-par PlCSrPICS é encon-trado como sendo mais estável que os pares de base naturais, e pode ser eficientemente incorporado no DNA pelo fragmentode Klenow da DNA polimerase I (KF) de Escherichia coli.Veja, por exemplo, McMinn et al, (1999) J. Am. Chem. Soe.121:11586; e Ogawa et al, (2000) J. Am. Chem. Soe. 122:3274.Um auto-par 3MN:3MN pode ser sintetizado pelo KF com efici- ência e seletividade suficiente para a função biológica. Ve-ja, por exemplo, Ogawa et al, (2000) J. Am. Chem. Soe.122:8803. Entretanto, ambas as bases atuam como um termina-dor de cadeia para mais replicação. Uma DNA polimerase mu-tante foi recentemente desenvolvida que pode ser usada parareplicar o auto-par PICS. Além disso, um auto-par 7AI podeser replicado. Veja, por exemplo, Tae et al, (2001) J. Am.Chem. Soe. 123:7439. Um novo par metalobase, DIPIC:Py, tam-bém foi desenvolvido, que forma um par estável pela ligaçãocom Cu(II). Veja, Meggers et al, (2000) J. Am. Chem. Soe.122:10714. Devido ao fato de códons estendidos e códons nãonaturais serem intrinsicamente ortogonais aos códons natu-rais, os métodos da invenção tiram vantagem desta proprieda-de para gerar tRNAs ortogonais para eles.Um sistema de bypassing traducional também podeser usado para incorporar, um aminoácido não natural em umpolipeptidio desejado. Em um sistema de bypassing traducio-nal, uma grande seqüência é inserida em um gene mas não é traduzida em proteína. A seqüência contém uma estrutura queserve como um indicador para o ribossomo pular a seqüência econtinuar a tradução depois da inserção.
AMINOÁCIDOS NÃO NATURAIS
Conforme usado aqui, um aminoácido não natural se refere a qualquer aminoácido, aminoácido modificado, ou aná-logo de aminoácido diferente da selenocisteína e/ou pirroli-sina e dos seguintes vinte alfa aminoácido geneticamente co-dificados: alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico,cisteína, glutamina, ácido glutâmico, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, proli-na, serina, treonina, triptofano, tirosina e valina. A es-trutura genética de um alfa aminoácido é ilustrada pela fór-mula I:
<formula>formula see original document page 85</formula>
Um aminoácido não natural é tipicamente qualquerestrutura com a fórmula I onde o grupo R é qualquer substi-tuinte diferente do usado nos vinte aminoácidos naturais.Veja, por exemplo, Biochemistry by L. Stryer, 3rd ed. 1988,Freeman and Company, New York, para as estruturas dos vinteaminoácidos naturais. Observe que, os aminoácidos não natu-rais da invenção podem ser compostos de ocorrência naturaldiferente dos vinte alfa aminoácidos acima.
Como os aminoácidos não naturais da invenção tipi-camente diferem das cadeias laterais dos aminoácidos natu-rais, os aminoácidos não naturais formam ligação amida comoutros aminoácidos, por exemplo naturais ou não, da mesmamaneira na qual são formadas nas proteínas de ocorrência na-tural. Entretanto, os aminoácidos não naturais tem gruposnas cadeias laterais que se distinguem dos aminoácidos natu-rais.
São de interesse particular aqui os aminoácidosnão naturais fornecidos na Fig. 3 e Fig. 15. Por exemplo,estes aminoácidos não naturais incluem mas não se limitam aaminoácidos aril-azida, por exemplo, para-azido-L-fenilalanina e aminoácidos alquinil, por exemplo, para-propargiloxifenilalanina. Ambos os entiômeros IeD destesaminoácidos não naturais tem uso na invenção.
Além destes aminoácidos não naturais aril-azida ealquinil, outros aminoácidos não naturais podem ser simulta-neamente incorporados em um polipeptídio expresso em fagosde interesse, por exemplo, usando um segundo par O-RS/O-tRNAem conjunto dom um par ortogonal para incorporar o aminoáci-do não natural aril-azida ou alquinil. Muitos destes aminoá-cidos não naturais adicionais e sistemas de pares ortogonaissão conhecidos. Veja as referências citadas aqui.
Em outros aminoácidos não naturais, por exemplo, Rna fórmula I opcionalmente compreende um alquil-, ar.il-, a-cil-, hidrazina, ciano-, halogênio-, hidrazida-, alquenil-,éter, borato, boronato, fosfo, fosfono, fosfino, enona, imi-na, éster, hidroxilamina, amina e equivalente, ou qualquerde suas combinações. Outros aminoácidos não naturais de in-teresse incluem, mas não se limitam a, aminoácidos compreen-dendo um reticulante foto-ativado, aminoácidos marcados comspin, aminoácidos fluorescentes, aminoácidos ligadores demetal, aminoácidos contendo metais, aminoácidos radioativos,aminoácidos com novos grupos funcionais, aminoácidos que in-teragem covalentemente e não covalentemente com outras molé- cuias, aminoácidos photocaged e/ou aminoácidos fotoisomeri-záveis, aminoácidos contendo biotina ou análogo da biotina,aminoácidos contendo ceto, aminoácidos glicosilados, fraçãosacaridica ligada à cadeia lateral dos aminoácidos, aminoá-cidos compreendendo polietilenoglicol ou poliéter, aminoáci- dos substituídos com átomos pesados, aminoácidos quimicamen-te cliváveis ou fotocliváveis, aminoácidos com uma cadeialateral alongada quando comparado com os aminoácidos natu-rais (por exemplo, poliéteres ou hidrocarbonetos de cadeialonga, por exemplo, mais que cerca 5, mais que cerca de 10 carbonos, etc.), aminoácidos contendo açúcar ligado à carbo-no, aminoácido contendo amino tioácido e aminoácidos conten-do uma ou mais frações tóxicas.
Em outro aspecto, a invenção fornece aminoácidosnão naturais possuindo a estrutura geral ilustrada pela fór- mula IV abaixo:<formula>formula see original document page 88</formula>
Um aminoácido não natural possuindo este estruturaé tipicamente qualquer estrutura onde R1 é um substituinteusado em um dos vinte aminoácidos não naturais (por exemplo,tirosina ou fenilalanina) e R2 é um substituinte. Portanto,este tipo de aminoácido não natural pode ser visto como umderivado de aminoácidos natural.
Além dos aminoácidos não naturais que contém novascadeias laterais como aquelas mostradas nas Figs 3 e 15, a-minoácidos não naturais também podem opcionalmente compreen-der estruturas básicas modificadas, por exemplo, como ilus-trado pelas estruturas das Fórmulas II e III:
<formula>formula see original document page 88</formula>Onde Z tipicamente compreende OH, NH2, SH, NH-R',ou S-R'; XeY, que podem ser os mesmos ou diferentes, tipi-camente compreendem S ou O, e R e R' , que é opcionalmente omesmo ou diferente, são tipicamente selecionados da mesmalista de constituintes para o grupo R descrito acima para osaminoácidos não naturais possuindo a Fórmula I assim comohidrogênio. Por exemplo, os aminoácidos não naturais da in-venção opcionalmente compreendem substituições no grupo ami-no ou carboxil conforme ilustrado pelas fórmulas II e III. Aminoácidos não naturais deste tipo incluem, mas não se li-mitam a, α-hidroxi ácidos, α-tioácidos, a-aminotiocarboxilatos, por exemplo, com cadeias laterais cor-respondentes aos vinte aminoácidos comuns ou cadeias late-rais não naturais. Além disso, substituições no carbono αopcionalmente incluem aminoácidos L, D, ou α-α-disubstituidos como D-glutamato, D-alanina, D-metil-0-tirosina, ácido aminobutirico e equivalente. Outras alterna-tivas estruturais incluem aminoácidos cíclicos, como aanálo-gos da prolina assim como análogos da prolina com anéis de3, 4, 6, 7, 8 e 9 membros, aminoácidos β e γ como β-alaninasubstituída e ácido butírico γ-amino.
Em alguns aspectos, a invenção utiliza aminoácidosnão naturais na configuração L. Entretanto, não temos a in-tenção de que a invenção seja limitada ao uso de aminoácidosnão naturais na configuração L. os D-enantiomeros destes a-minoácidos não naturias também tem uso na invenção.
Análogos da tirosina incluem tirosinas para-substituidas, tirosinas orto-substituidas, tirosinas meta-substituídas, onde a tirosina substituída compreende um gru-po alquinil, grupo acetil, grupo benzoil, grupo amino, hi-drazina, hidroxiamina, grupo tiol, grupo carboxi, grupo iso-propil, grupo metil, hidrocarboneto de C6-C20 de cadeia Ii-near ou ramificada, hidrocarboneto saturado ou insaturado,um grupo metil, um grupo poliéter, um grupo nitro, ou equi-valente. Além disso, anéis aril multiplamente substituídotambém estão contemplados. Análogos da glutamina da invençãoincluem, mas não se limitam a, derivados α-hidroxi, deriva-dos γ-substituídos, derivados cíclicos e derivados da gluta-mina amido substituídos. Exemplos de análogos da fenilalani-na incluem, mas não se limitam a, fenilalaninas para-substituidas, fenilalaninas orto-substituidas, fenilalaninasmeta-substituidas, onde o substituinte compreende um grupoalquinil, um grupo hidroxi, um grupo metoxi, um grupo metil,um grupo alil, um aldeído, um nitro, um grupo tiol, um grupoceto, ou equivalente. Exemplos específicos de aminoácidosnão naturais incluem, mas não se limitam a, p-etiltiocarbonil-L-fenilalanina, p-(3-oxobutanoil)-L-fenilalanina, 1,5-dansil-alanina, aminoácido 7-amino-coumarina, aminoácido 7-hidroxi-coumarina, nitrobenzil seri-na, 0-(2-nitrobenzil)-L-tirosina, p-carboximetil-L-fenilalanina, p-ciano-L-fenilalanina, m-ciano-L-fenilalanina, bifenilalanina, 3-amino-L-tirosina, bipiridilalanina, p-(2-amino-l-hidroxietil)-L-fenilalanina, p-isopropiltiocarbonil-L-fenilalanina, 3-nitro-L-tirosina e p-nitro-L-fenilalanina. Além disso, uma p-propargiloxifenilalanina, uma 3,4-diidroxi-L-fenilalanina(DHP) , uma 3,4,6-trihidroxi-L-fenilalanina, uma 3,4,5-trihidroxi-L-fenilalanina, 4-nitro-fenilalanina, uma p-acetil-L-fenilalanina, O-metil-L-tirosina, uma L-3-(2-naftil)alanina, uma 3-metil-fenilalanina, uma 0-4-alil-L- tirosina, uma 4-propil-L-tirosina, 3-nitro-tirosina, uma 3-tiol-tirosina, uma tri-0- acetil-GlcNAcp-serina, uma L-Dopa,uma fenilalanina fluorinada, uma isopropil-L- fenilalanina,ap-azido-L- fenilalanina, ap-acil-L- fenilalanina, ap-benzoil-L- fenilalanina, uma L-fosfoserina, uma fosfonoseri-na, uma fosfonotirosina, ap-iodo- fenilalanina, ap-bromo fe-nilalanina, ap^amino-L- fenilalanina, e uma isopropil-L- fe-nilalanina, e equivalente. As estruturas de uma variedade deaminoácidos não naturais que podem ser incorporados usandosistemas de tradução ortogonal são conhecidos. Veja as refe-rências citadas aqui, cada uma das quais está incorporadaaqui como referência em sua totalidade.
Síntese Química de Aminoácidos Não NaturaisMuitos dos aminoácidos não naturais fornecidos a-cima estão comercialmente disponíveis, por exemplo, da Sigma (USA) ou Aldrich (Milwaukee, WI, USA). Aqueles que não estãocomercialmente disponíveis são opcionalmente sintetizadosconforme citado em várias publicações ou usando métodos pa-dores conhecidos pelos profissionais da área. Para técnicasde síntese orgânica, veja, por exemplo, Organic Chemistry de Fessendon e Fessendon, (1982, Segunda Edição, Willard GrantPress, Boston Mass.); Advanced Organic Chemistry de March(Terceira Edição, 1985, Wiley and Sons, New York); e Advan-ced Organic Chemistry de Carey e Sundberg (Terceira Edição,Partes, AeB, 1990, Plenum Press, New York). Publicacoes a-dicionais descrevendo a síntese de aminoacdios não naturaisincluem, por exemplo, WO 2002/085923 intitulado "In vivo in-corporation of Unnatural Amino Acids;" Matsoukas et al., (1995) J. Med. Chem., 38, 4660-4669; King e Kidd, (1949) "ANew Synthesis of Glutamine and of γ-Dipeptides of GlutamicAcid from Phthylated Intermediates,". J. Chem. Soe, 3315-3319; Friedman, e Chatterrji (1959) "Synthesis of Deriva-tives of Glutamine as Model Substrates for Anti- TumorAgents, " J. Am. Chem. Soe. 81, 3750-3752; Craig et al,(1988) "Absolute Configuration of the Enantiomers of 7-Chloro-4 [[4-(diethylamino)-1- methylbutyl]amino]quinoline(Chloroquine)." J. Org. Chem. 53, 1167-1170; Azoulay et al.(1991) "Glutamine analogues as Potential Antimalarials," Eur. J. Med. Chem. 26, 201-5; Koskinen e Rapoport (1989)"Synthesis of 4-Substituted Prolines as ConformationallyConstrained Amino Acid Analogues,". J. Org. Chem. 54, 1859-1866; Christie e Rapoport (1985) "Synthesis of OpticallyPure Pipecolates from L-Asparagine. Application to the Total Synthesis of ( + )-Apovincamine through Amino Acid Decarbon-ylation and Iminium Ion Cyclization,". J. Ore. Chem.1989:1859-1866; Barton et al, (1987) "Synthesis of Novel a-Amino- Aeids and Derivatives Using Radical Chemistry: Syn-thesis of L- and D-a-Amino- Adipic Acids, L-a-aminopimelic Acid and Appropriate Unsaturated Derivatives," TetrahedronLett. 43:4297-4308; and, Subasinghe et al, (1992) "Quis-qualic acid analogues: synthesis of beta-heterocyclic 2-aminopropanoic acid derivatives and their activity at anovel quisqualate-sensitized site," J. Med. Chem. 35:4602-7.Veja também, International Publication WO 2004/058946, inti-tulado "PROTEIN ARRAYS," depositado em 22 de dezembro de 2003.
Captação celular de aminoácidos não naturais
A captação de aminoácidos não naturais é um pro-blema que é tipicamente considerado quando projetamos e se-lecionamos aminoácidos não naturais, por exemplo, para a in-corporação em uma proteína. Por exemplo, a alta densidade decarga dos aminoácidos sugerem que estes compostos provavel-mente não são permeáveis a célula. Os aminoácidos não natu-rais são captados pela célula via uma coleção de sistemas detransporte baseado em proteínas freqüentemente mostrando vá-rios graus de especificidade de aminoácidos. Uma rápida se-leção pode ser feita que avalia quais aminoácidos não natu-rais, se algum, são captados pelas células. Veja, por exem-plo, os ensaios de toxicidade em, por exemplo, InternationalPublication WO 2004/058946, intitulado "PROTEIN ARRAYS," de-positado em 22 de dezembro de 2003; e Liu e Schultz (1999)"Progress toward the evolution of an organism with an expan-ded genetic code," PNAS 96:4780-4785. Embora a acaptacao se-ja facilmente analisada com vários ensaios, uma alternativapara projetar aminoácidos não naturais que sejam aptos paraas vias de captação celular é fornecer vias biosintéticaspara criar aminoácidos in vivo.
Biosíntese de aminoácidos não naturais
Muitas vias biosintéticas já existiam em célulaspara a produção de aminoácidos e outros componentes. Emboraum método biosintético para um aminoácido não natural emparticular possa não existir na natureza, por exemplo, emuma célula, a invenção fornece tais métodos. Por exemplo,vias biosintéticas para aminoácidos não naturais são opcio-nalmente gerados em célula hospedeira pela adição de novasenzimas ou modificando vias existentes na célula hospedeira.Novas enzimas adicionais são opcionalmente enzimas de ocor-rência natural ou enzimas evoluídas artificialmente. Por e-xemplo, a biosíntese de p-aminofenilalanina (como apresenta-do em um exemplo na WO 2002/085923, acima) se baseia na adi-ção de uma combinação de enzimas conhecidas de outros orga-nismos. Os genes destas enzimas podem ser introduzidos emuma célula para a transformação da célula com um plasmídiocompreendendo genes. Os genes, quando expressos em uma célu-la, fornecem uma via enzimática para sintetizar o compostodesejado. Exemplos dos tipos de enzimas que são opcionalmen-te adicionados são fornecidos nos exemplos abaixo. Seqüên-cias de enzimas adicionais são encontradas, por exemplo, noGenbank. Enzimas evoluídas artificialmente também são opcio-nalmente adicionadas em uma célula da mesma maneira. Destamaneira, a maquinaria celular e os recursos de uma célulasão manipulados para produzir aminoácidos não naturais.
De fato, qualquer um de uma variedade de métodospode ser usado para produzir novas enzimas para uso em viasbiosintéticas, ou para evolução das vias existentes, para aprodução de aminoácidos não naturais, in vitro ou in vivo.Muitos métodos disponíveis de desenvolvimento de enzimas eoutros componentes da via biossintética pode ser aplicados apresente invenção para produzir aminoácidos não naturais (oupara desenvolver sintetases para ter novas especificidadesde substrato ou outras atividades de interesse). Por exem-plo, DNA shuffling é opcionalmente usado para desenvolvernovas enzimas e/ou vias de tais enzimas para a produção deaminoácidos não naturais (ou produção de novas sintetases),in vitro ou in vivo. Veja, por exemplo, Stemmer (1994),"Rapid evolution of a protein in vitro by DNA shuffling,"Nature 370(4):389-391; e, Stemmer, (1994),"DNA shuffling by random fragmentation and reassembly: In vitro recombinationfor molecular evolution," Proc. Natl. Acad. Sei. USA.,91:10747-10751. Uma abordagem relacionada misturam famíliasde genes relacionados (por exemplo, homólogo) para desenvol-ver rapidamdente enzimas com as características desejadas. Um exemplo destes métodos de "mistura de família de genes" éencontrada em Crameri et al, (1998) "DNA shuffling of a fa-mily of genes from diverse species accelerates directed evo-lution" Nature, 391(6664): 288-291. Novas enzimas (componen-tes da via biosintéticas ou sintetases) também podem ser ge- radas usando um procedimento da recombinação do DNA conheci-do como "truncamento incrementado para a criação de enzimashíbridas" ("ITCHY"), por exemplo, conforme descrito em Os-termeier et al, (1999) "A combinatorial approach to hybridenzymes independent of DNA homology" Nature Biotech 17:1205. Esta abordagem também pode ser usada para gerar umabiblioteca da enzima ou outros variantes da via que podeservir como substrato para um ou mais métodos de recombina-ção in vitro ou in vivo. Veja, também, Ostermeier et al(1999) "Combinatorial Protein Engineering by IncrementaiTruncation," Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 96: 3562-67, e Os-termeier et al. (1999), "Incrementai Truncation as a Strat-egy in the Engineering of Novel Biocatalysts," Biologicaland Medicinal Chemistry, 7: 2139-44. Outra abordagem usa mu-tagênese exponencial para produzir bibliotecas de enzimas ououtros variantes da via que são, por exemplo, selecionadosde uma habilidade de catalisar uma reação biosintética rele-vante para produzir um aminoácido não natural (ou uma novasintetase). Nesta abordagem, pequenos grupos de resíduos emuma seqüência de interesse são randomizados em paralelo paraidentificar, em cada posição alterada, aminoácidos que leva-riam a proteínas funcionais. Exemplos de tais procedimentos,que podem ser adaptados para a presente invenção a fim deproduzir novas enzimas para a produção de aminoácidos nãonaturais (ou novas sintetases) são encontradas em Delegravee Youvan (1993) Biotechnology Research 11:1548-1552. Em ou-tra abordagem, mutagênese aleatória ou semi-aleatória usandooligonucleotídeos dopados ou degenerados para a modificaçãode enzimas e/ou componentes da via podem ser usados, por e-xemplo, pelo uso de métodos de mutagênese gerais de, por e-xemplo, Arkin and Youvan (1992) "Optimizing nucleotide mix-tures to encode specific subsets of amino acids for semi-random mutagenesis" Biotechnology 10:297-300; ou Reidhaar-Olson et al. (1991) "Random mutagenesis of protein sequencesusing oligonucleotide cassettes" Methods Enzymol. 208:564-86. Outra abordagem, freqüentemente chamada de mutagênese"não estocástica", que usa rearranjo de polinucleotídeo emutagênese de saturação de sitio pode ser usada para produ-zir enzimas e/ou componentes da via, que podem então ser se-lecionados pela habilidade de fazer uma ou mais sintetase oufunção da via biosintetica (por exemplo, para a produção deaminoácidos não naturais in vivo). Veja, por exemplo, Short"NON-STOCHASTIC GENERATION OF GENETIC VACCINES AND ENZYMES"WO 00/46344.
Uma alternativa para tais métodos mutacionais en-volvem a recombinação de genomas inteiros dos organismos e aseleção da progenie resultante para funções particulares davia (freqüentemente chamado de "whole genome shuffling").Esta abordagem pode ser aplicada à presente onvenção, porexemplo, pela recombinação gênica e seleção de um organismo(por exemplo, uma E coli ou outra célula) para a habilidadede produzir um aminoácido não natural (ou seu intermediá-rio). Por exemplo, métodos ensinados nas publicações abaixopodem ser aplicados à via projetada para a evolução de viasexistente e/ou novas em células para produzir aminoácidosnão naturais em vivo: Patnaik et al. (2002) "Genome shuf-fling of lactobacillus for improved acid tolerance" NatureBiotechnology. 20(7): 707-712; e Zhang et al. (2002) "Genomeshuffling leads to rapid phenotypic improvement in bactéria"Nature, 7 de fevereiro, 415(6872): 644-646.
Outras técnicas para a modificação do organismo evias metabólicas, por exemplo, para a produção de compostosdesejados também estão disponíveis e também podem ser apli-cadas à produção de aminoácidos não naturais. Exemplos depublicações ensinando abordagens de modificação de vias ú-teis incluem: Nakamura e White (2003) "Metabolic engineeringfor the microbial production of 1,3 propanediol" Curr. Opin.Biotechnol. 14(5):454-9; Berry et al. (2002) "Application ofMetabolic Engineering to improve both the production and useof Biotech índigo" J. Industrial Microbiology and Biotech-nology 28:127-133; Banta et al. (2002) "Optimizing an arti-ficial metabolic pathway: Engineering the cofactor specific-ity of Corynebacterium 2,5-diketo-D-gluconie acid reductasefor use in vitamin C biosynthesis" Biochemistry. 41(20), 6226-36; Selivonova et al. (2001) "Rapid Evolution of NovelTraits in Microorganisms" Applied and Environmental Microbi-ology, 67:3645, e muitos outros.
Independentemente do método usado, tipicamente, oaminoácido não natural produzida com uma via biosintética modificada da invenção é produzida em uma concentração sufi-ciente para a biossintese de proteínas eficiente, por exem-plo, uma quantidade celular natural, mas não para tal grauque afete significativamente a concentração de outros amino-ácidos celulares ou acabe os recursos celulares. As concen- trações típicas produzidas em vivo desta maneira é de cercade 10 mM a cerca de 0,05 mM. Uma vez que uma célula seja mo-dificada para produzir enzimas desejadas para uma via espe-cífica e um aminoácido não natural seja gerado, seleções invivo são opcionalmente usadas para otimizar a produção do aminoácido não natural para a síntese de proteína ribossomale crescimento celular.
Componentes Ortogonais que Tem Uso na InvençãoA invenção fornece fagos que expressam polipeptí-dios compreendendo aminoácidos não naturais, onde o aminoá-cido não natural (e consequentemente o fago) são modificadospós-traducionalmente. A invenção também fornece métodos paraproduzir o fago modificado pós-traducionalmente. A invençãotambém fornece métodos para produzir o fago modificado.
A incorporação do aminoácido não natural na prote-ína expressa em fago é obtida pela adaptação dos pares orto-gonais para a codificação genética de aminoácidos não natu-rais em proteínas em E coli, onde os componentes ortogonaisnão fazem reação cruzada com componentes endógenos de E colida maquinaria traducional de célula hospedeira, mas reconhe-cem o aminoácido não natural e incorporado nas proteínas emresposta ao códon seletor (por exemplo, um códon âmbar semsentido, TAG). Os componentes ortogonais que podem ser usa-dos na invenção incluem aminoacil-tRNA sintetases ortogonaisderivadas da tirosil tRNA sintetase de Methanococcus janas-chii e o supressor de âmbar tirosil tRNACUA, que funcionacomo um par ortogonal em uma célula hospedeira de eubactériacomo E coli. Neste sistema, as aminoacil-tRNA sintetases mu-tantes aminoacilam o tRNA supressor com seu aminoácido nãonatural respectivo e não com qualquer um dos vinte aminoáci-dos comuns.
Métodos para produzir componentes ortogonais tem uso na invenção, onde estes métodos resultam na incorporaçãode aminoácidos não naturais, por exemplo, os aminoácidos nãonaturais fornecidos na Fig. 3 e Fig.15, em uma cadeia poli-peptídica crescente expressa em fago em resposta a um códonseletor, por exemplo um códon de parada âmbar, um códon semsentido, um códon de quatro ou mais bases, etc., por exem-plo, in vivo. Por exemplo, tRNAs ortogonais (O-tRNAs), ami-noacil-tRNA sintetases ortogonais (O-RSs) e seus pares sãoúteis para a invenção. Estes pares podem ser usados para in-corporar um aminoácido não natural nas cadeias polipeptídi-cas crescentes, onde o polipeptidio é incorporado em um sis-tema expresso em fago, e é subseqüentemente modificado pós-traducionalmente.
Uma aminoacil-tRNA sintetase ortogonal (O-RS) quepode ser usado na invenção inclui qualquer O-RS que prefe-rencialmente aminoacila um 0-tRNA com um aminoácido que podeser especificamente e seletivamente modificado pós-traducionalmente em um sistema expresso em fagos. Estes ami-noácidos incluem, mas não se limitam a, aminoácidos aril-azida, por exemplo, para-azido-L-fenilalanina e aminoácidosalquinil, por exemplo, para-propargiloxifenilalanina. Porexemplo, a invenção fornece fagos com um polipeptidio ex-presso compreendendo pelo menos um resíduo de aminoácido nãonatural modificado pós-traducionalmente, onde o resíduo deaminoácido pode ser seletivamente modificado. Tais aminoáci-dos incluem mas não se limitam a aminoácidos com frações ce-to, por exemplo, para-acetil-L-fenilalanina, meta-acetil-L-fenilalanina e para-(3-oxobutanoil)-L-fenilalanina (veja,por exemplo, Wang et al, Proc. Natl. Acad. ScL U.S.A. 2003,700:56-61 e Liu et al, (2003) JACS 125(7): 1702-1703). Ami-noácidos não naturais adicionais com grupos químicos reati-vos também podem ser incorporados em fago usando sistemas detradução ortogonal, onde o aminoácido não natural é um alvoseletivo para a modificação. Estes sistemas podem incorpo-rar, por exemplo, para-(2-amino-l-hidroxietil)-L-fenilalanina, para-isopropiltiocarbonil-L-fenilalanina e pa-ra-etiltiocarbonil-L-fenilalanina (veja International Appli-cation No. PCT/US2 0 05/03 9210 by Schultz et al, depositado em27 de outubro de 2005, intitulada "ORTHOGONAL T RAN S LATIONCOMPONENTS FOR THE IN VIVO INCORPORATION OF UNNATURAL AMINOACIDS").
Para a informação adicional em relação a aminoáci-dos não naturais que podem se modificado pós-traducionalmente, veja, por exemplo, os sistemas ortogonaisde aminoácidos não naturais descritos em Chin et al, Science(2003) 301:964-967; Zhang et al, Proc. Natl. Acad. Sd.U.S.A. 2004, 101:8882-8887; Anderson et al, Proc. Natl.Acad. ScL U.S.A. 2004, 101:7566-571; Wang et al, (2001) Sci-ence 292:498-500; Chin et al, (2002) Journal of the AmericanChemical Society 12 4:902 6-902 7; Chin e Schultz, (2002) Chem-BioChem 11:1135-1137; Chin, et al, (2002) PNAS United Statesof America 99:11020-11024; Wang e Schultz, (2002) Chem.Comm., 1-10; Wang and Schultz "Expanding the Genetic Code,"Angewandte Chemie Int. Ed, 4 4 (1) : 34-66 (2005); Xie e S-chultz, "An Expanding Genetic Code," Methods 36:227-238(2005) ; e Deiters et al, Bioorganic & Medicinal ChemistryLetters 15:1521-1524 (2005), cada um dos quais incorporadosaqui como referência em sua totalidade.
Veja também os sistemas ortogonais de aminoácidosnão naturais descritos em International Publications WO2002/086075, intitulado "METHODS AND COMPOSITIONS FOR THEPRODUCTION OF ORTHOGONAL tRNA AMINO ACYL-tRNA SYNTHETASEPAIRS;" WO 2002/085923, intitulado "IN VIVO INCORPORATION OFUNNATURAL AMINO ACIDS;" WO 2004/094593, intitulado"EXPANDING THE EUKARYOTIC GENETIC CODE;" WO 2005/019415, de-positado em 7 de julho de 2004; W02005/007870, depositado em7 de julho de 2004; WO 2005/007624, depositado em 7 de julhode 2004; International Publication No. W02006/034332, depo-sitado em 20 de setembro de 2005; e International Applicati- on No. PCT/US2 005/03 9210 by Schultz et al, depositado em 27de outubro de 2005, intitulado "ORTHOGONAL T RAN S LATIONCOMPONENTS FOR THE IN VIVO INCORPORATION OF UNNATURAL AMINOACIDS."
Em certas modalidades, a O-RS usada na invenção aminoacila preferencialemnte o 0-tRNA do que qualquer tRNAendógeno com um aminoácido não natural, onde a O-RS tem umviés pelo O-tRNA e onde a razão de 0-tRNA carregado com omesmo aminoácido não natural é superior a 1:1, e mais prefe-rivelmente onde a O-RS carrega o o-tRNA exclusivamente ou quase exclusivamente.
A invenção também faz uso de tRNAs ortogonais (O-tRNAs), onde o O-tRNA reconhece um códon seletor. Tipicamen-te, um 0-tRNA inclui pelo menos cerca de, por exemplo, 45%,50%, 60%, 75%, 80%, ou a 90% ou mais de eficiência de su- pressão na presença de uma sintetase cognata em resposta aum códon seletor quando comparado a eficiência de supressãode um O-tRNA compreendendo ou codificado por uma seqüênciade polinucleotideo conforme mostrado na listagem de seqüên-cia (por exemplo, SEQ ID NO:l) . Em uma modalidade, a efici-ência de supressão da O-RS e do 0-tRNA juntos é de, por e-xemplo, 5 vezes, 10 vezes, 25 vezes, 20 vezes, 25 vezes ousuperior que a eficiência de supressão do 0-tRNA na ausência de uma O-RS. Em alguns aspectos, a eficiência de supressãoda O-RS e do 0-tRNA juntos é de pelo menos 45% da eficiênciade supressão de um par tirosil-tRNA sintetase ortogonal de-rivado de Methanococcus jannaschíi.
A invenção faz uso das células (por exemplo, E co-li) compreendendo um sistema de tradução e seqüências de nu-cleotideo que programam a produção de fago, onde o sistemade tradução inclui um tRNA ortogonal (0-tRNA), uma aminoa-cil-tRNA sintetse ortogonal (O-RS) e um aminoácido não natu-ral que possa ser modificado pós-traducionalmente após sua incorporação no polipeptidio expresso em fago. Tipicamente,a O-RS preferencialmente aminoacila o 0-tRNA sobre qualquertRNA endógena com o aminoácido não natural, onde a O-RS temum viés pelo 0-tRNA, e onde a razão entre o 0-tRNA carregadocom o aminoácido não natural e o tRNA endógeno carregado com o aminoácido não natural é superior a 1:1, e mais preferi-velmente onde a O-RS carrega o o-tRNA exclusivamente ou qua-se exclusivamente. 0 0-tRNA reconhece o primeiro códon sele-tor, e a O-RS preferencialmente aminoacila o 0-tRNA com umaminoácido não natural.
Vários polinucleotideos também tem uso na inven-ção. Estes polinucleotideos incluem um polinucleotídeo arti-ficial (por exemplo, feito pelo homem, e não de ocorrêncianatural, por exemplo recombinante) compreendendo uma seqüên-cia de nucleotideo codificando uma O-RS. Um polinucleotideousado na invenção também pode incluir um ácido nucléico quese hibridiza a um polinucleotideo descrito acima, sob condi-ções altamente estringentes, sobre substancialmente toda aextensão do ácido nucléico. Vetores compreendendo polinicle-otideos também são usados na invenção. Por exemplo, um vetorpode incluir um plasmídio, um cosmidio, um fago, um virus,um vetor de expressão e/ou equivalente. Os métodos para pro-duzir componentes de um par O-tRNA/O-RS são conhecidos e po-dem ser usados na invenção. Veja o presente relato e as re-ferências citadas aqui.
SEQÜÊNCIAS E VARIANTES DE ÁCIDO NUCLÉICO E POLI-PEPTÍPIOS
Conforme descrito aqui, as seqüências de polinu-cleotideos codificando, por exemplo, 0-tRNAs e O-RSs tem usona invenção, assim como as respectivas seqüências de aminoá-cidos codificadas pelos polinucleotideos. 0 relato fornece ereferencia exemplos de seqüências de polinucleotideos e po-lipeptidios que podem ser usados na invenção. Entretanto,deve ser notado que o uso da invenção não está limitado aestas seqüências relatadas aqui. Um profissional da áreaperceberá que a invenção também fornece muitas seqüênciasrelacionadas com as funções descritas aqui, por exemplo, po-linucleotideos e polipeptidios codificando variantes conser-vativos de uma O-RS descrita aqui.
Um polinucleotideo usado na invenção também incluium polinuclotideo artificial que é, por exemplo, pelo menos75%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelomenos 98% ou mais idêntico a um de um tRNA de ocorrência na-tural (mas não é um tRNA de ocorrência natural). Um polinu-cleotideo usado na invenção também inclui um polinucleotideoartificial que é, por exemplo, pelo menos 75%, pelo menos80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou maisidêntico (mas não 100% idêntico) ao do tRNA de ocorrêncianatural.
Em certas modalidades, um vetor usado na invenção(por exemplo, um plasmidio, um cosmidio, um fago, um virus,etc.) compreende um polinucleotideo que é usado na invenção.Em algumas modalidades, o vetor é um vetor de expressão. Emoutras modalidades, o vetor de expressão inclui um promotoroperavelmente ligado a um ou mais polinucleotideos da inven-ção. Em outras modalidades, uma célula compreende um vetorque inclui um polinucleotideo usado na invenção.
Um profissional da área perceberá que muitos vari-antes das seqüências relatadas também são usados na inven-ção. Por exemplo, variações conservativas das seqüências re-latadas que produzem uma seqüência funcionalmente idênticaque é usada na invenção. Variantes das seqüências de polinu-cleotideo, onde os variantes se hibridizam a pelo menos umaseqüência relacionada, tem uso na invenção.
Variações conservativas
Devido ao fato do código genético ser degenerati-vo, "substituições silenciosas" (isto é, substituições emuma seqüência de ácido nucléico que não resultam em uma al-teração em um polipeptidio codificado) são uma característi-ca implicada de toda seqüência de ácido nucléico que codifi-ca uma seqüência de aminoácido. Similarmente, "substituiçõesconservativas de aminoácido", onde um ou um número limitadode aminoácidos em uma seqüência de aminoácido soa substituí-dos com diferentes aminoácidos com propriedades altamente similares, também são prontamente identificados como sendomuito similares a uma construção relatada. Tais variaçõesconservativas de cada seqüência relatada são uma caracterís-tica da presente invenção.
"Variações conservativas" de uma seqüência de áci- do nucléico particular se refere aqueles ácidos nucléicosque codificam seqüências de aminoácido idênticas ou essenci-almente idênticas, ou onde o ácido nucléico não codifica umaseqüência de aminoácido, para seqüências essencialmente i-dênticas. Um profissional da área reconhecerá que substitui- ções, deleções ou adições individuais que alteram, adicionamou deletam um único aminoácido ou uma pequena porcentagem deaminoácido (tipicamente menos de 5%, mais tipicamente menosde 4%, 2% ou 1%) em uma seqüência codificada são "variaçõesmodificadas conservativamente" onde as alterações resultam em uma deleção de aminoácido, adição de um aminoácido ousubstituição de um aminoácido com um aminoácido quimicamentesimilar. Portanto, "variações conservativas" de uma seqüên-cia de polipeptídios listada da presente invenção incluemsubstituições de uma pequena porcentagem, tipicamente menos de 5%, mais tipicamente menos de 2% ou 1%, de aminoácidos daseqüência polipeptídica, com um aminoácido do mesmo grupo desubstituição conservativa. Finalmente, a adição de seqüên-cias que não alteram a atividade codificada de uma moléculade ácido nucléico, como a adição de uma seqüência não fun-cional, é uma variação conservativa do ácido nucléico básico.
Tabelas de substituição conservativa fornecendoaminoácidos funcionalmente similar são bem conhecidos na á-rea, onde um resíduo de aminoácido é substituído para outroresíduo de aminoácido possuindo propriedades químicas simi-lares (por exemplo, cadeias laterais aromáticas ou cadeiaslaterais carregadas positivamente) e portanto não modificamsubstancialmente as propriedades funcionais da molécula depolipeptídio. Os seguintes conjuntos exemplificam grupos quecontenham aminoácidos não naturais de propriedades químicassemelhantes, onde as substituições dentro de um grupo é uma"substituição conservativa".
TABELA 1
Substituições Conservativas de Aminoácido
<table>table see original document page 107</column></row><table>
Hibridização de Ácido NucléicoA hibridização comparativa pode ser usada para i-dentificar ácidos nucléicos que são usados na invenção, in-cluindo variações conservativas de ácidos nucléicos forneci-dos aqui, e este método de hibridização conservativa é ummétodo preferido de distinguir ácidos nucléicos que são usa-dos na invenção. Ácidos nucléicos alvos que se hibridizam aácidos nucléicos fornecidos ou referenciados aqui sob condi-ções de alta, ultra-alta e ultra-ultra alta estringênciatambém são usados na invenção. Exemplos de tais ácidos nu-cléicos incluem aqueles com uma ou poucas substituições si-lenciosas ou conservativas de aminoácidos quando comparadasa uma dada seqüência de ácido nucléico.
Um ácido nucléico teste é dito que se hibridizaespecificamente a uma sonda de ácido nucléico quando se hi-bridiza a pelo menos 50% assim como para a sonda como o alvocomplementar que se combina perfeitamente, isto é, com a ra-zão sinal para ruido pelo menos metade tão alta quanto a hi-bridização da sonda ao alvo sob condições nas quais a sondaperfeitamente combinada se liga ao alvo complementar perfei-tamente combinado com a razão de sinal-ruido que é pelo me-nos 5x-10x tão alta quanto o observado para a hibridizaçãode qualquer um dos ácidos nucléicos alvos não combinados.
Ácidos nucléicos se "hibridizam" quando eles seassociam, tipicamente em solução. Ácidos nucléicos se hibri-dizam devido a uma variedade de forcas fisico-quimicas bemcaracterizadas, como ponte de hidrogênio, exclusão de sol-vente, empilhamento de base e equivalente. Um guia extensoda hibridização de ácidos nucléicos é encontrado em Tijssen(1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and MolecularBiology— Hybridization with Nucleie Aeid Probes, Part I,Chapter 2, "Overview of principies of hybridization and thestrategy of nucleic acid probe assays," (Elsevier, NewYork), assim como em Current Protocols in Molecular Biology,Ausubel et al. , eds., Current Protocols, uma bem-aventuradaunião entre Greene Publishing Associates, Inc. e John Wiley& Sons, Inc., (suplementada em 2004) ("Ausubel"); Hames eHiggins (1995) Gene Probes 1 IRL Press at Oxford UniversityPress, Oxford, Inglaterra, (Hames e Higgins 1) e Hames eHiggins (1995) Gene Probes 2 IRL Press at Oxford UniversityPress, Oxford, Inglaterra, (Hames e Higgins 2) fornece deta-lhes da síntese, marcação, detecção e quantificação de DNA eRNA, incluindo oligonucleotideos.
Um exemplo de condições de hibridização estringen-tes para hibridização de ácidos nucléicos complementares quetem mais de 100 resíduos complementares em um filtro em umSouthern ou Northern blot é 50% de formalina com 1 mg de he-parina à 42oC, com a hibridização sendo feita durante a noi-te. Um exemplo de condições de lavagens estringentes é umalavagem SSC 0,2x à 65°C por 15 minutos (veja Sambrook acimapara uma descrição do tampão SSC). Freqüentemente a alta es-tringência da lavagem é precedida por uma lavagem de baixaestringência para remover o sinal de background da sonda. Umexemplo de lavagem de baixa estringência é SSC 0,2x à 40°Cpor 15 minutos. Em geral, uma razão de sinal-ruído de 5x (ousuperior) que o observado para uma sonda não relacionada noensaio de hibridização particular indica a detecção de umahibridização especifica.
"Condições estringente de lavagem e hibridização"no contexto dos experimentos de hibridização de ácido nu- cléico como hibridizações de Southern e Northern são depen-dentes de seqüência, e são diferentes sob parâmetros ambien-tais diferentes. Um guia extenso da hibridização de ácidosnucléicos é encontrado em Tijssen (1993), acima, e em Hamese Higgins, 1 e 2. Condições de hibridização e lavagem podem facilmente ser determinadas por qualquer teste de ácido nu-cléico. Por exemplo, na determinação das condições estrin-gentes de lavagem e hibridização , as condições de hibridi-zação e lavagem são gradualmente aumentadas (por exemplo,pelo aumento da temperatura, redução da concentração de sal, aumento da concentração de detergente e/ou aumnto da concen-tração de solventes orgânicos como formalina na hibridizaçãoou lavagem), até que um grupo selecionado de critérios é sa-tisfeito. Por exemplo, em condições de hibridização e lava-gem altamente estringentes, as condições de hibridização e lavagem são gradualmente aumentadas até uma sonde se ligar aum alvo complementar perfeitamente combinado com uma razãode sinal-ruido de pelo menos 5x tão alto que a observada pa-ra a hibridização da sonda a um alvo não combinado.
Condições "muito estringentes" são selecionadas para serem igual ao ponto de derretimento termal ™ para umasonda em particular. 0 Tm é a temperatura (sob força iônicae pH definidos) na qual 50% das seqüências teste se hibridi-zam perfeitamente a uma sonda perfeitamente combinada. Paraos fins da presente invenção, geralmente, condições "alta-mente estringente" de lavagem e hibridização são seleciona-das para ser cerca de 5°C menor que o Tm para a seqüênciaespecifica em uma força iônica e pH definidos.
Condições de estringência "ultra-alta" de lavageme hibridização são aquelas na qual a estringência das condi-ções de hibridização e lavagem é aumentada até que a razãosinal-ruido para a ligação da sonda para o ácido nucléicocomplementar perfeitamente combinado seja pela menos IOx tãoalta quanto a observada para a hibridização de qualquer umdos ácidos nucléicos alvos não combinados. Um ácido nucléicoalvo que se hibridiza a uma sonda sob tais condições, comuma razão sinal-ruido de pelo menos ^ do ácido nucléico alvocombinado perfeitamente é dito se ligar à sonda sob condi-ções de estringência ultra alta.
Similarmente, níveis ainda mais alto de estringên-cia podem ser determinados pelo aumento gradual das condi-ções de,, hibridização e/ou lavagem dos ensaios de hibridiza-ção relevantes. Por exemplo, aqueles no qual a estringênciadas condições de hibridização e lavagem são aumentadas atéque a razão sinal-ruido para a ligação da sonda ao ácido nu-cléico alvo complementar perfeitamente combinado é de pelomenos IOx, 20X, 50X, ÍOOX, ou 500X ou mais tão alta quanto aobservada para a hibridização de qualquer dos ácidos nucléi-cos não combinados. Um ácido nucléico alvo que se hibridizaa uma sonda sob tais condições com uma razão sinal-ruido depelo menos ^ do ácido nucléico alvo complementar perfeita-mente complementar se liga as sondas sob as condições de es-tringência ultra-ultra-alta.
Ácidos nucléicos que não se hibridizam um ao outrosob condições de estringência ainda são substancialmente i-dênticas se os polipeptidios que eles codificam são substan-cialmente idênticos. Isto ocorre, por exemplo, quando umacópia de um ácido nucléico é criado usando a degeneração docódon máxima permitida pelo código genético.
Sub-seqüência únicas
Em alguns aspectos, a invenção utiliza um ácidonucléico que compreende uma sub-seqüência única em um ácidonucléico selecionado das seqüências de O-tRNAs e O-RSsrelatadas ou referenciadas aqui. A substancia única é únicaquando comparada a um ácido nucléico correspondente a qual-quer seqüência de ácido nucléico de O-tRNA ou O-RS conheci-da. Os alinhamentos podem ser feitos usando, por exemplo,BLAST programado para os parâmetros básicos. Qualquer sub-seqüência única é útil, por exemplo, como uma sonda para i-dentificar os ácidos nucléicos da invenção.
Similarmente, a invenção utiliza um polipeptidioque compreende uma sub-seqüência única em um polipeptidioselecionado das seqüências de O-RSs relatadas ou referencia-das aqui. Aqui, a sub-seqüência única é única quando compa-rada a um polipeptidio correspondente a qualquer seqüênciade polipeptidio conhecida.
A invenção também fornece para ácidos nucléicosalvos que se hibridizam sob condições estringentes a um oli-gonucleotideo codificante único que codifica uma sub-seqüência única em um polipeptidio selecionado das seqüên-cias de O-RSs onde a sub-seqüência única é única quando com-parada a um polipeptidio correspondente a qualquer um dospolipeptidios controles (por exemplo, seqüências parentais pelas quais sintetases da invencai são derivadas, por exem-plo, por mutação). Seqüências únicas são determinadas con-forme citado acima.
Comparação, Identidade e Homologia de SeqüênciaOs termos "idênticas" ou "porcentagem de identida- de", no contexto de duas ou mais seqüências de ácido nucléi-co ou polipeptidios, se referem a duas ou mais seqüências ousubseqüências que são as mesmas, quando comparado e alinhadopara a correspondência máxima, conforme medido usando um dosalgoritmos de comparação de seqüência descritos abaixo (ou outros algoritmos disponíveis para profissionais da área) oupor inspeção visual.
A frase "substancialmente idêntica", no contextode dois aminoácidos ou polipeptidios 9por exemplo, DNAs co-dificando um 0-tRNA ou O-RS), ou a seqüência de aminoácidode uma 0-RS) se refere a duas ou mais seqüências ou sub-sequencias que tenham pelo menos cerca de 60%, cerca de 80%,cerca de 90-95%, cerca de 98%, cerca de 99% ou mais identi-dade de nucleotideo ou resíduo de aminoácido, quando compa-rado e alinhado para a correspondência máxima, conforme me-dindo usando um algoritmo de comparação de seqüência ou porinspeção visual. Tais seqüências "substancialmente idênti-cas" são tipicamente consideradas como "homólogas", sem re-ferência a ancestralidade. Preferivelmente, a "identidadesubstancial" existe sobre uma região das seqüências que tempelo menos 50 resíduos de comprimento, mais preferivelmentesobre uma região de pelo menos 100 resíduos, e mais preferi-velmente, as seqüências são substancialmente idênticas empelo menos 150 resíduos, ou no comprimento total das duasseqüências a ser comparadas.
Proteínas e/ou seqüências de proteínas são "homó-logas" quando eles são derivados, naturalmente ou artifici-almente, de uma proteína ou seqüência de proteína ancestral.Similarmente, ácidos nucléicos e/ou seqüências de ácido nu-cléicos são homólogas quando eles são derivados, naturalmen-te ou artificialmente, de um ácido nucléico ou seqeuncia deácido nucléico ancestral comum. Por exemplo, qualquer ácidonucléico de ocorrência natural pode ser modificado por qual-quer método de mutagenes disponível para incluir um ou maiscódons seletores. Quando expressos, este ácido nucléico mu-tagenizado codifica um polipeptídio compreendendo um ou maisaminoácidos não naturais. O processo de mutação pode, é cla-ro, alterar adicionalmente um ou mais códons padrões, modi-ficando um ou mais aminoácidos padrões na proteína mutanteresultante também. Homologia é geralmente inferida da simi-laridade de seqüência entre dois ou mais ácidos nucléicos ouproteínas (ou suas seqüências). A porcentagem precisa de si-milaridade entre seqüências que é útil no estabelecimento dehomologia varia com o ácido nucléico e a proteína em ques-tão, mas similaridades de seqüência de apenas 25% é rotinei-ramente utilizada para estebelecer homologia. Altos níveisde similaridade de seqüência, por exemplo, 30%, 40%, 50%,60%, 70%, 80%, 90%, 95%, ou 99% ou mais, também podem serusados para estabelecer homologia. Métodos para determinaras porcentagens de similaridade de seqüência (por exemplo,BLASTP e BLASTN usando os parâmetros básicos) são descritosaqui e disponíveis em geral.
Para a comparação de seqüência e determinação dahomologia, tipicamente uma seqüência atua como uma seqüênciade referência a qual as seqüências testes são comparadas.Quando usa um algoritmo de comparação de seqüência, seqüên-cias de teste e referência são colocadas em um computador,as coordenadas das sub-sequencias são designadas, se neces-sário, e os parâmetros do programa do algoritmo de seqüênciasão designados. 0 algoritmo de comparação de seqüência entãocalculam a porcentagem de identidade de seqüência para a(s)seqüência(s) teste relativas às seqüências de referência,baseado nos parametros designados do programa.
Alinhamento ótimo de seqüências para a comparaçãopode ser conduzido, por exemplo, pelo algoritmo de homologialocal de Smith e Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981),pelo algoritmo de alinhamento de homologia de Needleman eWunsch, J. MoI. Biol. 48:443 (1970), pela pesquisa pelo mé-todo de similaridade de Pearson e Lipman, Proc. Nat1I. Acad.Sei. USA 85:2444 (1988), pela implementação computadorizadadestes algoritimos (GAP, BESTFIT, FASTA, e TFASTA in theWisconsin Genetics Software Package, Genetics ComputerGroup, 575 Science Dr., Madison, WI), ou por inspeção visual(veja Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel etal., eds., Current Protocols, uma união bem-aventurada deGreene Publishing Associates, Inc. e John Wiley & Soris,Inc., suplementada em 2004).
Um exemplo de um algoritmo que seja adequado paraa determinacao da porcentagem da identidade de seqüência eda similaridade de seqüência é o algoritmo BLAST, que é des-crito em Altschul et al, J. MoI. Biol. 215:403-410 (1990).Software fazendo análise por BLAST estão disponíveis publi-camente pelo website do National Center for BiotechnologyInformation. Este algoritmo envolve primeiro a identificaçãode pares de seqüência de alto valor (HSPs) pela identifica-ção de pequenas palavras de comprimento W na seqüência, quecombinam ou satisfazem alguns pontos avaliados positivamenteT quando alinhada com uma palavra de mesmo crescimento emuma seqüência do banco de dados. T é chamado de pontuação dapalavra vizinha (Altschul et al, acima). Estes pontos de pa-lavras vizinhas iniciais atuam como sementes para iniciarpesquisas para encontrar HSPs maiores contendo-os. Os pontosde palavra são estendidos em ambas as direções ao longo comcada seqüência por tanto quanto a pontuação de alinhamentocumulativo possa ser aumentada. Pontuações cumulativas sãocalculadas usando, para seqüências de nucleotideos, os parâ-metros M (ponto recebido para um par de resíduos combinando;sempre >0) e N (ponto perdido por resíduos mal pareados;sempre <) . Para seqüências de aminoácidos, uma matriz depontuação é usada para calcular a pontuação cumulativa. Aextensão da pontuação da palavra em cada direção é paradoquando: a pontuação de alinhamento cumulativo cai da quanti-dade X de seu valor máximo alcançado; a pontuação cumulativavai a zero ou abaixo, devido ao acúmulo de um ou mais ali-nhamentos de resíduos com pontuações negativas; ou o fim deuma das seqüências é alcançado. Os parâmetros do algoritmoBLAST W, T e X determinam a sensibilidade e velocidade doalinhamento. 0 programa BLASTN (para seqüências de nucleotí-deos) usa como padrão tamanho das palavras (W) de 11, um nú-mero esperado de seqüências (E) 10, M= 5, N=4 e uma compara-ção de ambas as fitas. Para seqüências de aminoácidos, oprograma BLASTP usa como padrão para o tamanho das pala- vras(W) 3, um número esperado de seqüências (E) de 10, e ma-triz de score BLOSUM62 (veja, por exemplo, Henikoff e Heni-koff (1989) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89: 10915).
Além disso para calcular a porcentagem de identi-dade de seqüência, o algoritmo BLAST também faz análises es- tatísticas de similaridade entre duas seqüências (veja,porexemplo, Karlin e Altschul Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90:5873-5787 (1993)). Uma medida de similaridade fornecida peloalgoritmo BLAST é a menor probabilidade de soma (P(N)) quefornece uma indicação da probabilidade de duas seqüências deaminoácidos ou nucleotídeos serem similares por acaso. Porexemplo, um ácido nucléico é considerado similar a uma se-qüência de referência se a menor probabilidade de soma doácido nucléico teste em comparação ao ácido nucléico de re-ferência for menor que cerca de 0.2, preferivelmente menor do que 0.01, ainda mais preferivelmente menor do que 0.001.
Mutagênese e Outras Técnicas de Biologia MolecularPolinucleotideos e polipeptídios da invenção e u-sados na invenção podem ser manipulados usando técnicas debiologia molecular. Textos gerais que descrevem técnicas debiologia molecular. Os textos gerais que descrevem técnicasde biologia molecular incluem Berger e Kimmel, Guide to Mo-lecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology volume 152Academic Press, Inc., San Diego, CA (Berger); Sambrook etal., Molecular Cloning - A Laboratory Manual (3rd Ed.), Vol.1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NewYork, 2001 ("Sambrook") e Current Protocols in Molecular Bi-ology, F.M. Ausubel et al, eds., Current Protocols, uma bem-aventurada união entre Greene Publishing Associates, Inc.and John Wiley & Sons, Inc., (suplementado em 2004)("Ausubel"). Estes textos descrevem mutagênese, o uso de ve-tores, promotores e muitos outros tópicos relacionados a,por exemplo, a geração de genes que incluem códons seletorespara a produção de proteínas que incluem aminoácidos não na-turais, tRNAs ortogonais, sintetases ortogonais e seus pares.
Vários tipos de mutagênese podem ser usados emconjunto com a invenção, por exemplo, para mutar moléculasde tRNA, para produzir bibliotecas de tRNAs, para produzirbibliotecas de sintetases, produzir códons seletores que co-difiquem aminoácidos não naturais em proteínas ou polipeptí-deos de interesse. Eles incluem, mas não se limitam a, muta-gênese sitio-direcionada, mutagênese aleatória, recombinaçãohomóloga, DNA shuffling ou outros métodos de mutagênese re-cursiva, construção quimérica, mutagênese usando moldes con-tendo uracil, mutagênese oligonocleotídeo-direcionada, muta-gênese de DNA fosforotioato modificado, mutagênese usandoDNA duplex interrompido ou equivalentes, ou qualquer uma desuas combinações. Mutagênese, por exemplo, envolvendo cons-trução quimérica, também está incluída na presente invenção.Em uma modalidade, mutagênese pode ser guiada por informaçãoconhecida de molécula de ocorrência natural ou alterada oumolécula de ocorrência naturalmente mutada, incluindo, masnão se limitando a, seqüências, comparação de seqüência,propriedades físicas, estrutura cristalizada ou equivalente.
Células hospedeiras são geneticamente engenheira-das (transformadas, transduzidas ou transfectadas) com ospolinucleotídeos da invenção ou construções que incluem ospolinucleotídeos, por exemplo, um vetor, que pode ser, porexemplo, um vetor de clonagem ou um vetor de expressão. Porexemplo, as regiões codificantes para o tRNA ortogonal, atRNA sintetase ortogonal e a proteína a ser derivada estãooperavelmente ligados aos elementos de controle de expressãodo gene que são funcionais na célula hospedeira desejada.Vetores típicos contêm seqüências de terminação transcricio-nais e traducionais, seqüências de iniciação transcricionaise traducionais promotores úteis para a regulação da expres-são de um ácido nucléico alvo particular. Os vetores opcio-nalmente compreendem cassetes de expressão genérica contendopelo menos uma seqüência de terminação independente, seqüên-cias permitindo a replicação dos cassetes em eucariotos, ouprocariotos ou ambos (vetores shuttle) e seleção de marcado-res para sistemas eucariotos e procariotos. Vetores são ade-quados para a replicação e integração em procariotos, euca-riotos ou preferencialmente em ambos. Veja Giliman & Smith,Gene 8: 81 (1979); Roberts, et al., Nature, 328: 731 (1987);Schneider, B., et al., Protein Expr. Purif. 6435: 10 (1995);Ausubel, Sambrook, Berger. 0 vetor pode estar, por exemplo,na forma de um plasmidio, uma bactéria, um vírus, um polinu-cleotideo conjugado ou não. Os vetores são introduzidos nascélulas e/ou microorganismos por métodos padronizados inclu-indo eletroporação (From et al. , Proc. Natl. Acad. Sei. USA82, 5824 (1985), infecção com vetores virais, penetração ba-lística de alta velocidade por pequenas partículas com o á-cido nucléico junto com a matriz das pequenas esferas oupartículas ou na superfície (Klein et al., Nature 327, 70-73(1987)) e/ou equivalente.
Um sistema de plasmidio único muito eficiente eversátil foi desenvolvido para a incorporação sítio-específica de aminoácidos não naturais em proteínas em res-posta ao códon de parada âmbar (UAG) em E coli. No novo sis-tema, o par supressor tRNAtyr(CUA) e tirosil-trna sintetasede M. jannaschii é codificado em um único plasmidio, que écompatível com a maioria dos vetores de expressão de E coli. O operon tRNA monocistrônico sob controle do promotor e ter-minador proK foi construído para a otimização da estruturasecundária e processamento de tRNA. A introdução de uma for-ma mutada do promotor glnS para a sintetase resultou em um, aumento significativo na eficiência e fidelidade de supres-são. Aumentos na eficiência de supressão também foram obti-dos por copias múltiplas do gene do tRNA assim como por mu-tação específica (D286R) na sintetase (Kobayashi et al, "S-tructural basis for orthogonal tRNA specificities of tyros-yl-tRNA synthetases for genetic code expansion," Nat. S-truct. Biol., 10(6) :425-432 [2003]). A generalidade do sis-tema otimizado também foi demonstrado por incorporação acu-rada e eficiente de vários aminoácidos não naturais diferen-tes, cujas utilidades únicas no estudo da função e estruturada proteína foram provadas anteriormente.
Um catálogo . Um catálogo de bactérias e bacterió-fagos útil para clonagem é fornecido, por exemplo, pelaATCC, The ATCC Catalogue of Bactéria and Bacteriophage (1992)Gherna et al. Publicado pela ATCC. Procedimentos bási-cos adicionais para seqüenciamento, clonagem ou outros as-pectos da biologia molecular e considerações teóricas bási-cas também são encontradas em Sambrook (acima), Ausubel (a-cima) e em Watson et al (1992) Recombinant DNA Second Editi-on Scientific American Books, NY. Além disso, essencialmentequalquer nucleotídeo (e virtualmente qualquer ácido nucléicomarcado, padronizado ou não) pode ser obtido, mandado fazerou comprado pronto em uma variedade de fontes comerciais,como A Midland Certified Reagent Company (Midland, TX), The Great Amarican Gene Company (Ramona, CA), ExpressGen Inc.(Chicago, IL), Operon Technologies Inc. (Alameda, CA) e mui-tas outras.
As células hospedeiras engenheiradas podem sercultivadas em meio nutriente convencional modificado confor- me for apropriado para atividades como, por exemplo, etapasde triagem, ativação de promotores ou seleção de transfor-mantes. Estas células podem ser opcionalmente cultivadas emorganismos transgênicos. Outras referências úteis incluem,mas não se limitam a, para cultura e isolamento de células(por exemplo, para subseqüente isolamento de nucleotideo)inclui Freshney (1994) Culture os Animal Cellsf a Manual osBasic Techniquesf terceira edição, Wiley-Lissf New York e asreferências citadas aqui; Payne et al. (1992) Plant Cell andTissue Culture in Liquid Systems John Wiley & Sons, Inc. NewYork, N.Y.; Gamborg and Phillips (eds.) (1995) Plant CellyTissue and Organ Culture; Fundamental Methods Springer LabManual, Springer-Verlag (Berlin Heidelberg New York) e Atlasand Parks (eds.) The Handbook of Microbiological Media(1993) CRC Press, Boca Raton, FL.
PROTEÍNAS E POLIPEPTIDEOS DE INTERESSE
Métodos para produzir um fago com uma proteína defusão expressa compreendendo um aminoácido não natural (umaminoácido aril-azida ou um aminoácido alquinil) em uma po-sição especificada que modificada pós-traducionalmente tam-bém são uma característica da invenção. Por exemplo, um mé-todos pode incluir crescimento, em um meio apropriado, a cé-lula com a construção do fago (por exemplo, em uma célula deE coli), onde a célula compreende um ácido nucléico que com-preende pelo menos um códon seletor e codifica uma proteína(a proteína de fusão do capsídio); e, fornecendo o aminoáci-do não natural; onde a célula também compreende: um t-RNAortogonal (0-tRNA) que funciona na célula e reconhece o có-don seletor; e, um aminoacil-tRNA sintetase (O-RS) que pre-ferencialmente aminoacila o 0-tRNA com o aminoácido não na-tural. O fago produzido na E coli compreende uma proteína defusão expressa possuindo um aminoácido não natural na posi-ção correspondente ao códon seletor. Este fago reage entãosob condições onde o aminoácido não natural sofre modifica-ção covalente, produzindo um fago modificado pós-traducionalmente.
Em certas modalidades, a O-RS compreende um viéspara a aminoacilação do 0-tRNA cognato sobre qualquer tRNAendógeno em um sistema de expressão. A razão relativa entre0-tRNA e tRNA endógeno que é carregada pela O-RS, quando o0-tRNA e a O-RS estão presentes em concentrações molares i-guais, é maior que 1:1, preferivelmente pelo menos cerca de2:1, mais preferivelmente 5:1, ainda mais preferivelmente10:1, ainda mais preferivelmente 20:1, ainda mais preferi-velmente 50:1, ainda mais preferivelmente75:1, ainda maispreferivelmente 95:1, 98:1, 99:1, 100:1, 500:1, 1.000:1,5.000:1 ou maior.
Em algumas modalidades, as proteínas de fusão mo-dificadas pós-traducionalmente, expressas em fagos podem serclivadas usando uma protease adequada e uma seqüência de re-conhecimento de protease que foi incorporada em uma proteínade fusão expressa em fago. Esta clivagem pode resultar naliberação da proteína de interesse, ou uma fração sua, docapsideo do fago. Em algumas modalidades, a proteína de in-teresse compreende uma seqüência de aminoácido que é pelomenos 75% idêntica a de uma proteína terapêutica, uma prote-ína diagnostica, uma enzima industrial ou sua fração.
O fago com a proteína de fusão expressa compreen-dendo um aminoácido natural (por exemplo, uma aminoácido a-ril-azida ou um aminoácido alquinil) em uma posição especí-fica que é modificada pós-traducionalmente é uma caracterís-tica da invenção. 0 fago é produzido em uma célula, por e-xemplo, uma célula de E. coli. Os pares 0-tRNA/0-RS tambémresidem na célula e utilizam a maquinaria de tradução da cé- lula hospedeira, que resulta na incorporação in vivo de umaminoácido não natural em uma proteína de fusão em respostaa um códon seletor e expresso no fago. A habilidade de umsistema 0-tRNA/0-RS de funcionar em uma célula hospedeirapara incorporar uma grande variedade de aminoácidos não na- turais que pode ser modificado pós-traducionalmente é conhe-cida. Veja, por exemplo, Chin et al, Science (2003) 301:964-967; Zhang et al, Proc. Natl. Acad. Sei. U.SA. · 2004,iOi:8882-8887; Anderson et al, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A.2004, 101:1566-1571; Wang et al. , (2001) Science 292:498- 500; Chin et al, (2002) Journal of the American Chemical So-ciety 124:9026-9027; Chin e Schultz, (2002) ChemBioChem11:1135-1137; Chin, et al, (2002) PNAS United States ofAmerica 99:11020-11024; Wang e Schultz, (2002) Chem. Comm.,1-10; Wang e Schultz "Expanding the Genetic Code," Ange-wandte Chemie Int. Ed, 44(l):34-66 (2005); Xie e Schultz,"An Expanding Genetic Code," Methods 36:227-238 (2005); eDeiters et al, Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters15:1521-1524 (2005),veada um dos quais está incorporado aquicomo referência em sua totalidade.
Veja também os sistemas ortogonais de aminoácidonão natural descrito em International Publications WO2002/086075, intitulado "METHODS AND COMPOSITIONS FOR THEPRODUCTION OF ORTHOGONAL tRNA AMINO ACYL-tRNA SYNTHETASEPAIRS;" WO 2002/085923, intitulado "IN VIVO INCORPORATION OFUNNATURAL AMINO ACIDS;" WO 2004/094593, intitulado"EXPANDING THE EUKARYOTIC GENETIC CODE;" WO 2005/019415, de-positado em 7 de julho de 2004; W02005/007870, depositado em7 de julho de 2004; WO 2005/007624, depositado em 7 de julhode 2004; International Publication No. W02006/034332, depo-sitado em 20 de setembro de 2005; e International Applicati-on No. PCT/US2 005/03 9210 by Schultz et al, depositado em 27de outubro de 2005, intitulado "ORTHOGONAL T RAN S LATIONCOMPONENTS FOR THE IN VIVO INCORPORATION OF UNNATURAL AMINOACIDS," cada um dos quais está incorporado aqui como refe-rência em sua totalidade.
A incorporação de um aminoácido não natural podeser feita, por exemplo, para fazer mudanças sob medida na estrutura e ou função da proteína, modificar tamanho, aci-dez, nucleofilicidade, pontes de hidrogênio, hidrofobicida-de, acessibilidade dos sítios alvos da protease, alvejar umafração (um protein array), etc. Proteínas que incluem um a-minoácido não natural podem ter melhoradas suas propriedadescatalíticas ou biofísicas ou até propriedades inteiramentenovas. Por exemplo, as seguintes propriedades são opcional-mente modificadas pela inclusão de um aminoácido não naturalem uma proteína: toxicidade, biodistribuição, propriedadesestruturais, propriedades espectroscópicas, propriedadesquímicas e/ou fotoquímicas, habilidade catalítica, meia-vida(por exemplo, meia-vida no soro), habilidade de reagir comoutras moléculas, incluindo, mas não se limitando a, cova-lentemente ou não covalentemente e equivalentes. As composi-ções incluindo proteínas que incluem pelo menos um aminoáci-do não natural são úteis para, incluindo, mas não se limi-tando a, novos terapêuticos, diagnósticos, enzimas catalíti-cas, enzimas industriais, proteínas de ligação (incluindo,mas não se limitando a, anticorpos), e incluindo, mas não selimitando a, o estudo da estrutura e função protéica. Veja,por exemplo, Dougherty, (2000) Unnatural Amino Acids asProbes of Protein Structure and Functionr Current Opinion inChemical Biology, 4:645-652. Proteínas que compreendem umaaminoácido não natural que pode ser modificada pós-traducionalmente (por exemplo, pela cicloadição [3+2} ou umamodificação de Staudinger) podem ser engenheiradas para con-ter qualquer funcionalidade desejada que possa ser acopladaao parceiro de reação. A natureza do padrão de reação não élimitada de modo algum, exceto apenas que ele compreende umafração reativa adequada que resulta na ligação covalente aoresíduo de aminoácido não natural no polipeptídio expressoem fago.
Em alguns aspectos, uma composição inclui pelo me-nos uma proteína expressa em fago com pelo menos um, por e-xemplo, pelo menos dois, pelo menos três, pelo menos quatro,pelo menos cinco, pelo menos seis, pelo menos sete, pelo me-nos oito, pelo menos nove, pelo menos dez ou mais aminoáci-dos não naturais. Os aminoácidos não naturais podem ser i-guais ou diferentes, por exemplo, eles podem estar em 1, 2,3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais diferentes locais da proteí-na que compreendem 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais a-minoácidos não naturais diferentes. Em outro aspecto, umacomposição inclui uma proteína expressa em fago com pelo me-nos um, porém menos que todos, de um aminoácido particularem uma proteína é um aminoácido não. natural. Para uma dadaproteína com mais de um aminoácido não natural, os aminoáci-dos não naturais podem ser idênticos ou diferentes (por e-xemplo, a proteína pode incluir dois ou mais tipos diferen-tes de aminoácidos não naturais, ou pode incluir dois domesmo aminoácido não natural) . Para uma dada proteína commais de dois aminoácidos não naturais, os aminoácidos nãonaturais podem ser os mesmos, diferentes ou uma combinaçãode um aminoácido não natural múltiplo do mesmo tipo com pelomenos um aminoácido não natural.
Essencialmente qualquer proteína expressa em fagos(ou sua fração) que inclua um aminoácido não natural (equalquer ácido nucléico codificante correspondente, por e-xemplo, que inclua um ou mais códons seletores) pode serproduzido usando as composições e métodos aqui. Nenhuma ten-tativa foi feita para identificar as centenas de milhares deproteins conhecidas, qualquer uma delas pode ser modificadapara incluir um ou mais aminoácidos não naturais, por exem-plo, alterando qualquer método de mutação disponível paraincluir uma ou mais códons seletores apropriados em um sis-tema de tradução relevante. Seqüências repositoras comunspara proteínas conhecidas incluem GenBank EMBL, DDBBJ eNCBI. Outros repositores podem ser facilmente identificadosprocurando na internet.
Tipicamente, as proteínas são, por exemplo, pelomenos 60%, pelo menos 70%, , pelo menos 75%, pelo menos 80%,pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 99% ou mais idên-ticas a qualquer proteína disponível (por exemplo, uma pro-teína terapêutica, uma proteína diagnostica, uma enzima in-dustrial ou sua fração e equivalente), e elas compreendemuma ou mais aminoácidos não naturais. Exemplos de proteínasterapêuticas, diagnostica e outras proteínas que possam sermodificadas para compreender um ou mais aminoácido não natu-ral pode ser encontrado, mas no se limita àqueles no Inter-national Publications WO 2004/094593, depositado em 16 deabril de 2004, intitulado "Expanding the Eukaryotic GeneticCode;" e WO 2002/085923, intitulado "IN VIVO INC0RP0RATI0NOF UNNATURAL AMINO ACIDS." Exemplos de proteínas terapêuti-cas, diagnostica e outras proteínas que possam ser modifica-das para compreender um ou mais aminoácido não natural in-cluem, mas não se limitam a, por exemplo, alfa-1 antitripsi-na, angiostatina, fator Antihemolítico, anticorpos (mais de-talhes sobre anticorpos abaixo), Apolipoproteina, Apoprotei-na, fator atril natriurético, polipeptídio atril natriuréti-co, Peptídeos Atrial, quimiocinas C-X-C (por exemplo,T39765, NAP-2, ENA-78, Gro-a, Gro-b, Gro-c, IP-10, GCP-2,NAP-4, SDF-I, PF4, MIG), Calcitonina, quimiocinas CC (porexemplo, proteína quimioatratora de monócitos-1, quimioatra-tora de monócitos -2, quimioatratora de monócitos -3, prote-ína inflamatória de monócito-1 alfa, proteína inflamatóriade monócito-1 beta, RANTES, 1309, R83915, R91733, HCC1,T58847, D31065, T64262), ligante CD40, ligante C-kit, Colá-geno, fator estimulador de colonia (CSF), fator complemento5a, inibidor complemento, receptor complemento 1, citocinas,(por exemplo, peptideo de ativação de neutrófilo epitelial-78, GROa/MGSA, GRC^, GROy, MIP-lcc, MIP- 1δ, MCP-I), fatorde crescimento Epidermal (EGF), Eritropoietina ("EPO"), to-xinas esfoliantes AeB, Fator IX, Fator VH, Fator VDI, Fa- tor X, fator de crescimento de fibroblasto (FGF), Fibrinogê-nio, Fibronectina, G-CSF, GM-CSF, Glucocerebrosidase, Gona-dotrofina, fatores de crescimento, proteínas Hedgehog (porexemplo, Sonic, Indian, Desert), Hemoglobina, fator de cres-cimento de Hepatócito (HGF), Hirudina, albumina sérica huma- na, Insulina, fator de crescimento Insulina-Iike (IGF), in-terferons (por exemplo, JFN-a, IFN-β, IFN-γ), interleucinas(por exemplo, JL-I, TL-2, JL-3, TL-4, IL-5, TL-6, JL-I, JL-S, JL-9, JL-IO, JL-I1, JL-Yl, etc.), fator de crescimento dequeratinocito (KGF) , Lactoferrina, fator inibidor de leuce- mia, Luciferase, Neurturina, fator inibidor de neutrófilo(NIF), oncostatina M, proteína osteogênica, hormônio parati-reóide, PD-ECSF, PDGF, hormônios peptídicos (por exemplo,hormônio do crescimento humano), Pleiotropina, Proteína A,Proteína G, exotoxinas pirogênicas A, B, e C, Relaxina, Re- nina, SCF, receptor complemento solúvel I, I- CAM 1 solúvel,receptores de interleucina solúveis (IL-I, 2, 3, 4, 5, 6, 7,9, 10, 11, 12, 13, 14, 15), receptor de TNF solúvel, Somato-medina, Somatostatina, Somatotropina, Streptoquinase, Supe-rantigenos, isto é, enterotoxinas Staphylococcal (SEA, SEB,SECl, SEC2, SEC3, SED, SEE), Superóxido dismutase (SOD), to-xina da síndrome do choque tóxico (TSST-I) , timosina alfa 1,ativador de palsminogenio tecidual, fator de necrose tumoralbeta (TNF beta), recpetor do fator de necrose tumoral(TNFR), Tumor necrosis factor fator de necrose tumoral-alfa(TNF alphfa), fator de crescimento endotelial vascular(VEGEF), Uroquinase e muitos outros.
Uma classe de proteínas que pode ser feita usandoas composições e métodos para a incorporação e maodificacaoin vivo de aminoácidos não naturais em proteínas expressasem fagos descritas aqui incluem moduladores transcricionaisou sua frações. Exemplos de moduladores transcricionais in-cluem proteína moduladoras transcricionais e genes que modu-lam o crescimento celular, diferenciação, regulação ou equi-valente. Moduladores transcricionais são encontrados em pro-cariontes, vírus e eucariontes, incluindo fungo, plantas,leveduras, insetos e animais, incluindo mamíferos, fornecen-do um grande variedade de alvos terapêuticos. Deve ser nota-do que ativadores de expressão e transcrição regulam atranscrição por muitos mecanismos, por exemplo, pela ligaçãoa receptores, estímulo a uma cascata de transdução de sinal,regulação da expressão de fatores de transcrição, ligação apromotores e melhoradores, ligação a proteínas e melhorado-res, DNA unwinding, splicing de pré-RNAm, poliadenilacao deRNA e degradação de RNA.
Uma classe de proteínas da invenção (por exemplo,proteínas com um ou mais aminoácidos não anturais) incluemproteínas biologicamente ativas como citocinas, moléculasinflamatórias, fatores de crescimento, seus recpetores eprodutos de oncogene, por exemplo, interleucinas (por exem-plo, JL-I, JL-2, IL-8, etc.), interferons, FG F, IGF-I, IGF-II, FGF, PDGF, TNF, TGF-a, TGF-β, EGF, KGF, SCF/c-Kit,CD40L/CD40, VLA-4/VCAM-I, ICAM- 1/LFA-l, e hialurina/CD44 ;moléculas transdutoras de sinal e produtos oncogênicos cor-respondentes, por exemplo, Mos, Ras, Raf, e Met; e supresso-res e ativadores transcricionais, por exemplo, p53, Tat,Fos, Myc, Jun, Myb, ReI e receptores de hormônios esteróidescomo aqueles para estrogênio, progesterona, testosterona,aldosterona, o ligante receptor de LDL e corticosterona.
Enzimas (por exemplo, enzimas industriais) ou suasfrações com pelo menos um aminoácido não natural também sãofornecidas pela invenção. Exemplos de enzimas incluem, masnão se limitam a, por exemplo, amidases, racemases de amino-ácidos, acilases, dealogenases, dioxigenases, diarilpropanoperoxidases, epimerases, epoxido hidrolases, esterases, iso-merases, quinases, glicose isomerases, glicosidases, glico-sil transferases, haloperoxidases, monooxygenases (por exem-plo, p450s), lipases, lignina peroxidases, nitrilo hidrata-ses, nitrilases, proteases, fosfatases, subtilisinas, tran-saminase, e nucleases.
Muitas destas proteínas estão comercialmente dis-poníveis (veja, por exemplo, o catálogo Sigma BioSciences) eas seqeuncias de proteínas correspondentes e genes e, tipi-camente, muitas de suas variações, são bem conhecidas (veja,por exemplo, GenBank). Qualquer uma delas pode ser modifica-da pela inserção de um ou mais aminoácidos não naturais deacordo com a invenção, por exemplo, para alterar a proteínacom relação a uma ou mais propriedade terapêutica, diagnos-tica ou enzimática de interesse. Exemplos de propriedadesterapeuticamente relevantes incluem meia-vida sérica, meia-vida de armazenamento, estabilidade, imunogenicidade, ativi-dade terapêutica, detectabilidade (por exemplo, pela inclu-são de grupos repórteres (por exemplo, marcadores ou sitiosde ligação a marcadores) no aminoácido não natural), reduçãoda LD5O ou outros efeitos colaterais, habilidade de entrarno corpo pelo trato gástrico (por exemplo, disponibilidadeoral), ou equivalente. Exemplos de propriedades enzimáticasrelevantes incluem, meia-vida de armazenamento, estabilida-de, atividade enzimática, capacidade de produção ou equiva- lente.
Uma variedade de outras proteínas também pode sermodificada para incluir um ou mais aminoácidos não naturaisusando composições e métodos da invenção. Por exemplo, a in-venção pode incluir a substituição de um ou mais aminoácido natural em uma ou mais proteínas de vacina com um aminoácidonão natural, por exemplo, em proteínas provenientes de fun-gos contagiosos, por exemplo, espécies de Aspergillus e Cân-dida; bactéria, particularmente E. coli, que serve um modelopara bactéria patogênica, assim como bactérias de importân- cia médica como Staphylococci (por exemplo, aureus), ou S-treptococci (por exemplo, pneumoniae); protozoários comosporozoa (por exemplo, Plasmodia), rhizopodes (por exemplo,Entamoeba) e flagelados (Trypanosoma, Leishmania, Trichomo-nas, Giardia, etc.); vírus como vírus ( + ) RNA (examplos in- cluem Poxviruses por exemplo, vaccinia; Picornaviruses, porexemplo, polio; Togaviruses, por exemplo, rubella; Flavivi-ruses, por exemplo, HCV; e Coronaviruses) , vírus (-) RNA vi-ruses (por exemplo, Rhabdoviruses, por exemplo, VSV; Paramy-xovimses, por exemplo, RSV; Orthomyxoviruses, por exemplo,influenza; Bunyaviruses; e Arenaviruses), virus dsDNA (Reoviruses, por exemplo), virus RNA para DNA isto é, Retroviru-ses, por exemplo, HIV e HTLV, e certos virus DNA para RNAcomo Hepatitis B.
Proteínas relacionadas a agricultura como proteí-nas de resistência a insetos (por exemplo, proteínas Cry),enzimas da produção de amido e lipídio, toxinas de planta einseto, proteínas de resistência a toxina, proteínas de de- toxificação de Micotoxina, exnzimas do crescimento vegetal(por exemplo, Ribulose 1, 5-bifosfato carboxilase/oxigenase,"RUBISCO"), lipoxigenase (LOX) e fosfoenolpiruvato (PEP)carboxilase também são alvos de substituição para a modifi-cação de aminoácidos não naturais.
Em certas modalidades, a proteína de interesse ex-pressa em fago modificada (ou sua fração) é codificada porum ácido nucléico. Tipicamente, o ácido nucléico compreendepelo menos um códon seletor, pelo menos dois códons seleto-res, pelo menos três códons seletores, pelo menos quatro có-dons seletores, pelo menos cinco códons seletores, pelo me-nos seis códons seletores, pelo menos sete códons seletores,pelo menos oito códons seletores, pelo menos nove códons se-letores, dez ou mais códons seletores.
Genes codificando para proteínas ou polipeptídeos de interesse podem ser mutagenizados usando métodos bem co-nhecidos para os profissionais da área e descritos aqui noitem "Mutagênese e outras técnicas de biologia molecular"para incluir, por exemplo, um ou mais códons seletores paraa incorporação de aminoácidos não naturais. Por exemplo, umácido nucléico para a proteína de interesse é mutagenizadapara incluir um ou mais códons seletores, fornecidos para aincorporação de um ou mais aminoácidos não naturais. A in-venção inclui qualquer destes variantes, mutante, versões dequalquer proteína, por exemplo, incluindo pelo menos um ami-noácido não natural. Similarmente, a invenção também incluiácidos nucléicos correspondentes, isto é, qualquer ácido nu-cléico com um ou mais códons seletores que codificam um ou mais aminoácidos não naturais.
Para fazer uma proteína expressa em fago que in-clua um aminoácido não antural modificado pós-traducionalmente, podemos usar células hospedeiras e orga-nismos que são adptados para a incorporação in vivo de ami- noácidos não naturais via pares RNAt/RS ortogonal. Célulashospedeiras são geneticamente engenheiradas (transformadas,transduzidas ou transfectadas) com um ou mais vetores queexpressam o tRNA ortogonal, a tRNA sintetase ortogonal e umvetor que codifica a proteína a ser derivada. Cada um destes componentes pode ser o mesmo vetor, ou cada um pode ser umvetor separado, ou dois componentes podem estar em um vetore o terceiro componente em um segundo vetor. 0 vetor podeestar, por exemplo, na forma de um plasmídio, uma bactéria,um vírus, um polinucleotídeo conjugado ou não.
Definindo polipeptídios por imunoreatividade
Devido ao fato dos polipeptídios da invenção for-necerem uma variedade de novas seqüências polipeptídicas(por exemplo, polipeptídios compreendendo aminoácidos nãonaturais no caso das proteínas sintetizadas nos sistemas detradução aqui, ou, por exemplo, no caso das novas sinteta-ses, novas seqüências de aminoácidos padrões), os polipeptí-dios também fornecem novas características estruturais quepodem ser reconhecidas, por exemplo, em ensaio imunológicos.A geração de anti-soro, que especificamente se liga aos po-lipeptídios da invenção, assim como os polipeptídios que es-tão ligados por este anti-soro, são uma característica dainvenção. 0 termo "anticorpo", conforme usado aqui, inclui,mas não se limita a um polipeptídio substancialmente codifi-cado por um gene da imunoglobulina ou genes da imunoglobuli-na ou seus fragmentos que se ligam especificamente e reco-nhecem um analito (antígeno). Exemplos incluem anticorpospoliclonais, monoclonais, quiméricos e de cadeia simples, eequivalente. Fragmentos de imunoglobulinas, incluindo frag-mentos Fab e fragmentos produzidos por uma biblioteca de ex-pressão, incluindo expressão em fagos, também estão incluí-dos no termo "anticorpo" conforme usado aqui. Veja, por e-xemplo, Paul, Fundamental Immunology, 4th Ed., 1999, RavenPress, New York, para estrutura e terminologia de anticorpos.
A fim de produzir anti-soro para uso em um imuno-ensaio, um ou mais polipeptídios imunogenicos são produzidose purificados conforme descrito aqui. Por exemplo, proteínasrecombinantes põem ser produzidas em uma célula recombinan-te. Uma linhagem de camundongo (usada neste ensaio porque osresultados são mais reproduzíveis devido a identidade gené-tica virtual do camundongo) é imunizada com as proteínas i-munogenicas em combinação com um adjuvante padrão , como oadjuvante de Freund e um protocolo de imunização de camun-dongo padrão (veja, por exemplo, Harlow and Lane (1988) An-tibodies. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Publicati-ons, New York, para uma descrição padrap da geração de anti-corpos, formatos de imunoensaios e condições que podem serusadas para determinar a imunoreatividade especifica. Deta-lhes adicionais sobre proteínas, anti-soro, anticorpos, etc.podem ser encontrados no International Publication NumbersWO 2004/094593, intitulado "EXPANDING THE EUKARYOTIC GENETICCODE;" WO 2002/085923, intitulado "ESf VIVO INC0RP0RATI0N OFUNNATURAL AMES[0 ACEDS;" WO 2004/035605, intitulado"GLYC0PR0TEIN SYNTHESIS;" e WO 2004/058946, intitulado"PROTEES" ARRAYS."
FOTOREGULAÇÃO E PHOTOCAGING
A invenção fornece fagos possuindo polipeptídiosexpressos compreendendo pelo menos um aminoácido não naturalque é modificado pós-traducionalmente. A modificação pós-traducional pode resultar na ligação de qualquer fração de- sejada no polipeptídio de fusão do capsídio (e consequente-mente no fago). Em algumas modalidades, a fracao conjugadaque está acoplada ao aminoácido não natural é fotoregulada,produzindo assim um aminoácido não natural modificado foto-regulado.
Aminoácidos fotoregulados (por exemplo, fotocromi-co, fotoclivável, fotoisomerável, etc.) podem ser usados pa-ra controlar espacialmente e temporalmente uma variedade deprocessos biológicos, por exemplo, pela regulação direta datividade de enzimas, receptores e canais de ions ou equiva-lente, ou modulando as concentrações intracelulares de vá-rias moléculas de sinalização. Veja, por exemplo, Shigeri etah, Pharmacol. Therapeut., 2001, 91:85; Curley, et ah, Phar- macol. Tiierapeut., 1999, 82:347; Curley, et ah, Curr. Op.Chem. Bio., 1999, 3:84; "Caged Compounds" Methods in Enzy-mology, Marriott, G., Ed, Academic Press, NY, 1998, V. 291;Adams, et ah, Amu. Rev. Physiol., 1993, 55:755+; e Bochet,et ah, J. Chem. Soe, Perkin 1, 2002, 125. Em várias modali- dades aqui, as composicoes e métodos compreendem aminoacidosfotoregulados.
"aminoácidos fotoregulados" são tipicamente, porexemplo, aminoácidos fotosensiveis. Aminoácidos fotoregula-dos em geral são aqueles que são controlados de alguma ma- neira pela luz (por exemplo, UV, IV, etc.) . Portanto, porexemplo, se um aminoácido fotoregulado é incorporado em umpolipeptidio possuindo atividade biológica, a iluminação po-de alterar o aminoácido, modificando a atividade biológicado peptideo. Alguns aminoácidos fotoregulados podem compre- ender "aminoácidos photocaged", "aminoácidos fotosensiveis","aminoácidos fotolábeis", "fotoisomerizáveis", etc. "Espé-cies caged", como aminoácidos cages, ou peptideos caged, sãoaqueles presos em uma entidade maior (por exemplo, molécula)que são liberados pela iluminação especifica. Veja, por e- xemplo, Adams, et al, Annu. Rev. Physiol., 1993, 55:755-784.Grupos "caging" de aminoácidos podem inibir ou parar ativi-dade biológica (por exemplo, rompendo ligações que normal-mente estabilizaria interações em moléculas alvo, modifi-cacndo a hidrofobiciadade ou caráter iônico de uma cadeialateral particular, ou por obstrução estérica, etc.) em umamolécula, por exemplo um peptideo compreendendo tal aminoá-cido. Aminoácidos "fotoisomerizáveis" podem trocar formas deisômeros devido a exposição a luz. Os diferentes isômeros detais aminoácidos podem acabar tendo diferentes interaçõescom outras cadeias lateriais em uma proteína por incorpora-ção. Aminoácidos fotoregulados controlam protanto a ativida-de biológica (pela ativação, ativação parcial, inativação,inativação parcial, ativação modificada, etc.) dos peptídeosnos quais eles estão presentes. Veja Adams acima e outrasreferências nesta seção para mais definições e exemplos deaminoácidos fotoregulados e moléculas.
Vários aminoácidos fotoregulados são conhecidospelos profissionais da área e muitos estão disponíveis co-mercialmente. Métodos para ligar e/ou associar frações foto-reguladoras aos aminoácidos são conhecidos. Tais aminoácidosfotoregulados em geral servem em várias modalidades aqui.Deve ser apreciado que embora várias frações possivelmentefotoreguladas, por exemplo, grupos photogaging e equivalen-tes, assim como vários aminoácidos fotoregulados estão lis-tados aqui, tal lista não deve ser considerada como limitan-te. Portanto, a presente invenção também se aplica a fraçõesfotoreguladoras e aminoácidos fotoregulados que não estãoespecificamente listados aqui.
Conforme foi falada, vários dos métodos são opcio-nalmente aplicáveis para criar um aminoácido fotoregulado.Portanto, por exemplo, um aminoácido fotoregulado, por exem-pio, um aminoácido photocaged pode ser criado protegendo seugrupo α-amino com compostos como BOC (butiloxicarbonil) eprotegendo o grupo α-carbonil com compostos como um ester t-butil. Tal proteção pode ser seguida de uma reação das ca- deias laterais de aminaocido com um grupo caging fotolábilcomo 2-nitrobenzil, em uma forma reativa como 2-nitrobenzilcloroformato, a-carboxil2-nitrobenzil metil ésterou 2-nitrobenzil diazoetano. Após a adição do grupo cage fo-tolábil, os grupos protetores podem ser removidos por proce-dimentos padrões. Veja, por exemplo, USPN 5,998,580.
Em outro exemplo, resíduos de lisina podem ser ca-ged usando 2-nitrobenzilcloroformato para derivar o grupoamino ε da lisina, eliminando assim a carga positiva. Alter-nativamente, a lisina pode ser caged pela introdução de uma carga negativa em um peptídeo (que tem tal lisina) pelo usode um grupo cage α-carboxi 2-nitrobenziloxicarbonil. Alémdisso, fosfoserina e fosfotreonina podem ser caged pelo tra-tamento do ácido fosfoamino ou fosfopeptideo com 1(2-nitrofenil)diazoetano. Veja, por exemplo, Walker et at, Meth Enzymol. 172:288-301, 1989. Vários outros aminoácidos tambémpodem facilmente ser submetidos a química de caging padrão,por exemplo, serina, treonina, histidina, glutamina, aspara-gina, ácido aspártico e ácido glutâmico. Veja, por exemplo,Wilcox et al, J. Org. Chem. 55:1585-1589, 1990). Novamente, deve ficar claro que a listagem de fotoregulados (aminoáci-dos e/ou aqueles capazes de ser convertido em formas fotore-guladas) não deve ser considerada limitante.Resíduos de aminoácidos também podem ser fotoregu-lados (por exemplo fotosensíveis ou fotolábeis) de outrasmaneiras. Por exemplo, certos resíduos de aminoácidos podemser criados de modo que a irradiação cause quebra de um es-queleto peptídico que tem o resíduo de aminoácido em parti-cular. Por exemplo, uma glicina fotolábil, 20nitrofenil gli-cina, pode funcionar de tal maneira. Veja, por exemplo, Da-vis, et al, 1973, J. Med. Chem., 16:1043-1045. A irradiaçãode peptídeos contendo 2-nitrofenil glicina vi clivar o es- queleto peptídico entre o carbono alfa e o grupo aminoa alfada 2-nitrofenil glicina. Tal estratégia de clivagem é geral-mente aplicável aos aminoácidos diferentes da glicina, se ogrupo 2-nitrobenzil é inserido entre o carbono alfa e o gru-po aminoa alfa.
Um grande número de grupos fotoregulados, por e-xemplo grupos caging, e um grande número de compostos reati-vos usados para ligar covalentemente tais grupos a outrasmoléculas como aminoácidos, são conhecidos na área. Exemplosde grupos fotoreguladores (por exemplo, fotolábil, caging)inclui, mas não se limita a: O-nitrobenzil-serina, 0-(2-nitrobenzil)-L-tirosina, nitroindolinas; N-acil-7-nitroindolinas; fenacils; hidroxifenacil; 7-hiydroxicoumarin-4-iylmetils brominados (por exemplo, Bhc);benzoin ésteres; dimetoxibenzoin; meta- fenois; 2- nitrobenzil; 1-(4,5-dimetoxi-2-nitrofenil)etil (DMNPE); 4,5-dimetoxi-2- nitrobenzil (DMNB); alfa-carboxi-2-nitrobenzil(CNB); 1-(2-nitrofenil)ethil (NPE); 5-carboximetoxi-2-nitrobenzil (CMNB); (5-carboximetoxi-2-nitrobenzil)oxi) car-bonil; (4,5-dimetoxi-2-nitrobenzil)oxi) carbonil; desoxiben-zoinil; e equivalente. Veja, USPN 5,635,608 de Haugland eGee (3 de junho de 1997) intitulado "α-carboxy caged com-pounds" Neuro 19, 465 (1997); J Physiol 508.3, 801 (1998);
Proc Natl Acad Sci USA 1988 Sep, 85 (17) :6571-5; J Biol Chem1997 Feb 14, 272 (7): 4172-8; Neuron 20, 619-624, 1998; NatureGenetics, vol. 28:2001:317-325; Nature, vol. 392, 1998:936-941; Pan, P., e Bayley, H. "Caged cysteine and thiophosphor-yl peptides" FEBS Letters 405:81-85 (1997); Pettit et al.(1997) "Chemical two-photon uncaging: a novel approach tomapping glutamate receptors" Neuron 19:465-471; Furuta etal. (1999) "Brominated 7-hydroxycoumarin-4- ylmethyls: novelphotolabile protecting groups with biologically usefulcross-sections for two photon photolysis" Proc. Natl. Acad.Sei. 96(4): 1193-1200; Zou et al. "Catalytic subunit of pro-tein kinase A caged at the activating phosphothreonine" J.Amer. Chem. Soe. (2002) 124:8220-8229; Zou et al. "CagedThiophosphotyrosine Peptides" Angew. Chem. Int. Ed. (2001)40:3049-3051; Conrad II et al. "p-Hydroxyphenacyl Phototrig-gers: The reactive Exeited State of Phosphate Photorelease"/. Am. Chem. Soe. (2000) 122:9346- 9347; Conrad II et al."New Phototriggers 10: Extending the π,π* Absorption to Re-lease Peptides in Biological Media" Org. Lett. (2000)2:1545-1547; Givens et al. "A New Phototriggers 9: p-Hydroxyphenaeyl as a C-Terminus Photoremovable ProtectingGroup for Oligopeptides" J. Am. Chem. Soe. (2000) 122:2687-2697; Bishop et al. "4O-Aminomethyl- 2,20-bipyridyl-4-carboxylic Acid (Abe) and Related Derivatives: Novel Bipyri-dine Amino Acids for the Solid-Phase Incorporation of aMetal Coordination Site Within a Peptide Backbone" Tetrahe-dron (2000) 56:4 629-4 638; Ching et al. "Polymers As Surface-Based Tethers with Photolytic triggers Enabling Laser-Induced Release/Desorption of Covalently Bound Molecules"Bioeonjugate Chemistry (1996) 7:525-8; BioProbes Handbook,2002 from Molecular Probes, Inc.; e Handbook of FluorescentProbes and Research Products, Nona Edição ou Edição Web, deMolecular Probes, Inc, assim como as referências aqui. Mui-tos compostos, kits, etc. para uso no caging de várias molé-culas estão comercilamente disponíveis, por exemplo, de Mo-lecular Probes, Inc. Referências adicionais sao encontradasem, por exemplo, Merrifield, Science 232:341 (1986) e Corri-e, J. Ε. T. e Trentham, D. R. (1993) In: Biological Applica-tions of Photochemical Switches, ed., Morrison, H., John Wi-Iey e Sons, Inc. New York, pp. 243-305. Exemplos de gruposfotosensiveis adequados incluem, mas não se limitam a, 2-nitrobenzil, esteres de benzoin, N-acil-7-nitindolinas, me-ta-fenois e fenacils.
Em algumas modalidades, um grupo de fotoregulação(por exemplo, caging) pode opcionalmente compreender umaprimeira fração de ligação, que pode se ligar a uma segundafração de ligação. Por exemplo, uma fosforamidita caged [1-N- ( 4,4'- Dimetoxitritil)-5- ( 6-biotinamidocaproamidometil)-1-(2-nitrofenil)-etil]-2-cianoetil-(N,N-diisopropil)-fosforamidita (PC Biotin Phosphoramadite, de Glen ResearchCorp.) disponível comercialmente compreende um grupofotolábil e uma biotina (a primeira fração de ligação). Umasegunda fração de ligação, por exemplo, estreptavidina oução de ligação, por exemplo, estreptavidina ou avidina, podeportanto ser ligada ao grupo caging, pode portanto ser liga-do ao grupo caging, aumentando sua densidade e sua efetiva-ção no caginhg. Em certas modalidades, um componente caged compreende dois ou mais grupos caging cada um compreendendouma primeira fração de ligação e a segunda fração de ligaçãopode se ligar a duas ou mais frações de ligação simultanea-mente. Por exemplo, o componente caged pode compreender pelomenos dois grupos caging biotinilados; a ligação de estrep-tovidina às frações de biotina múltipla em moléculas commúltiplos componentes caged ligam os componentes caged emuma grande rede. A clivagem do grupo fotolábil ligando a bi-otina ao componente resulta na dissociação da rede.
Métodos tradicionais para criar polipeptidios ca-ged (incluindo, por.exemplo, substratos peptidicos e proteí-nas como anticorpos ou fatores de transcrição) incluem, porexemplo reagindo um polipeptídio com um composto caging oupela incorporação de um aminoácido caged durante a síntesede um polipeptídio. Veja, por exemplo, US Patent No. 5,998, 580 to Fay et al. (December 7, 1999) intitulado "Pho-tosensitive caged macromolecules"; Kossel et al. (2001) PNAS98:14702-14707; Trends Plant Sd (1999) 4:330-334; PNAS(1998) 95:1568-1573; /. Am. Chem. Soe. (2002) 124:8220-8229;Pharmacology & Therapeutics (2001) 91:85-92; e Angew. Chem. Int. Ed. Engl. (2001) 40:304 9-3051. Um ligante polipeptídiofotolábil (por exemplo, para conectar um domínio de transdu-ção de proteína e um sensor, ou equivalente) podem, por e-xemplo, compreender um aminoácido fotolábil como o descritona US Patent No. 5,998,580.
A irradiação com luz pode, por exemplo, liberar umresíduo de cadeia pesada de um aminoácido que é importantepara a atividade do peptídeo compreendendo tal aminoácido.Adicionalmente, em algumas modalidades, aminoácidos não ca-ged podem clivar o esqueleto peptídico do peptídeo compreen-dendo o aminoácido e pode assim, por exemplo, abrir um pep-tídeo cíclico para um peptídeo linear com diferentes propri-edades biológicas.
A ativação de um peptídeo caged pode ser feita pe-la destruição de um grupo caging fotosensível em um aminoá-cido fotoregulável por qualquer método conhecido pelos pro-fissionais da área. Por exemplo, um aminoácido fotosensívelpode ser uncaged ou ativado pela exposição a uma fonte deluz convencional, como lasers (por exemplo, emissão na faixade UV ou na faixa de infravermelho). Os profissionais da á-rea estão familiarizados com vários lasers adicionais decomprimento de onda e energia apropriados assim como proto-colos de aplicação apropriada (por exemplo, duração da expo-sição, etc) que são aplicáveis ao uso com aminoácidos foto-regulados como aqueles utilixados aqui. A liberação de ami-noácidos caged fotoregulados permite o controle de peptídeosque compreendem tais aminoácidos. Tal controle pode ser emtermos de localização em termos de tempo. Por exemplo, expo-sição de laser focalizado pode uncage aminoácidos em uma lo-calização, enquanto que não uncaging aminoácidos em outraslocalizações.Os profissionais da área apreciarão uma variedadede ensaios pode ser usado para avaliar a atividade de um a-minoácido fotoregulado, por exemplo, os ensaios descritosnos exemplos aqui. Uma grande variedade de, por exemplo,funções celulares, funções teciduais, etc. pode ser testadaantes e depois da introdução de um peptideo compreendendo umaminoácido fotoregulado na célula ou tecido assim como apósa liberação da molécula fotoregulada.
As composições e métodos aqui podem ser utilizadasem vários aspectos. Por exemplo, aminoácidos fotoregulados(por exemplo, em paptideos) podem liberar composições tera-pêuticas em localizações discretas em um corpo uma vez que aliberação ou ativação/desativação/etc. do aminoácido fotore-gulado pode ser localizada através de exposição direcionadade luz, etc. Deve ser notado que estes métodos, estruturas ecomposições da invenção são aplicáveis a incorporação/uso deaminoácidos não naturais fotoregulados (por exemplo, aquelescom frações fotoreguladoras ligadas/associadas com eles).
Grupos fotocromicos e fotovliváveis podem ser usa-dos para controlar espacialmente e temporariamente uma vari-edade de processos biológicos, regulando diretamente a ati-vidade das enzimas (veja, por exemplo, Westmark, et al, J.Am. Chem. Soe. 1993, 115:3416-19 e Hohsaka, et al, J. Am.Chem. Soe. 1994, 116:413-4), receptores (veja, por exemplo,Bartels, et al. , Proc. Natl. Acad. ScL USA, 1971, 68:1820-3;Lester, et al, Nature 1977, 266:373-4: Cruz, et al, J. Am.Chem. Soe, 2000, 122:8777-8; e, Pollitt, et al, Angew. Chem.Int. Ed. Engl, 1998, 37:2104-7), ou canais de ions (veja,por exemplo, Lien, et al, J. Am. Chem. Soe. 1996, 118:12222-3; Borisenko, et al, J. Am. Chem. Soe. 2000, 122:6364-70; e,Banghart, et al, Nat. Neurosci. 2004, 7:1381-6.), ou modu-lando as concentrações intracelulares de várias moléculas de sinalização (veja, por exemplo, Adams, et al, Annu. Rev.Physiol. 1993, 55:755-84). Em geral, isto requer a modifica-cao química de uma proteína ou molécula menor com um ligantefotoreativo como um grupo azobenzeno ou nitrobenzil. A habi-lidade de incorporar geneticamente aminoácidos fotoresponsi- vos em proteínas em locais definidos diretamente em organis-mos vivos aumentaria significativamente o escopo desta téc-nica. Veja, por exemplo, Wu, et al., J. Am. Chem. Soe. 2004,126:14306-7.
KITS
Kits também são uma característica da invenção.Por exemplo, um kit para produzir um fago possuindo um poli-peptídio expresso compreendendo pelo menos um aminoácido nãonatural que é modificado pós-traducionalmente é uma caracte-rística da invenção. Por exemplo, tais kits podem compreen- der vários componentes selecionados de: um recipiente paramanter os componentes do kit, materiais instrucionais para aprodução de fagos modificados, um ácido nucléico compreen-dendo o material genético do fago, ácido nucléico compreen-dendo uma seqüência polinucleotidica codificando um O-tRNA,ácido nucléico compreendendo uma seqüência polinucleotidicacodificando uma 0-RS, um aminoácido não natural, por exem-plo, um aminoácido aril-azida (por exemplo, para-azido-L-fenilalanina) ou um aminoácido alquinil (por exemplo, para-propargiloxifenilalanina), reagentes para a modificação pós-traducional do aminoácido não natural (por exemplo, reagen-tes para a ligação de Staudinger ou a reação de cicloadição[3+2]) e uma linhagem de células hospedeiras E coli para aexpressão de O-tRNA/O-RS e a produção de fagos.
EXEMPLOS
Os exemplos a seguir são oferecidos para fins deilustração, mas não limitam a invenção reivindicada. Um pro-fissional da área reconhecerá uma variedade de parâmetrosnão críticos que podem ser alterados ser sair do escopo dainvenção reivindicada.
EXEMPLO 1
A geração de polipeptídios expressos em fagos com-preendendo aminoácidos não naturais
0 presente exemplo descreve composições e métodospara a geração de polipeptídios expressos em fagos compreen-dendo aminoácidos não naturais. Conforme descrito previamen-te, componentes de tradução ortogonal podem ser usados emcélulas hospedeiras adequadas para introduzir seletivamentequalquer um de um grande número de aminoácidos não naturaisem proteínas in vivo com boa eficiência e alta fidelidade.Conforme descrito aqui, estes componentes e metodologias detradução ortogonal podem ser adpatados para uso em sistemasde expressão em fagos como uma abordagem gera para a gelacaode bibliotecas de polipeptídios expressos em fagos contendoblocos de montar de aminoácidos não naturais.
Dois plasmidios, pDULE/CM e Ml 3KE, foram usadospara gerar fagos que expressem polipeptídios contendo amino-ácidos não naturais como fusões para a proteína pIII do fagofilamentoso M13. 0 plasmídio pDULE/CM, que tem uma origempl5A, constitutivamente expressa um tRNATyr supressor de âm-bar de Methanococcus jannaschii (MjRNA) e uma tirosil-tRNAsintetase mutante de M. jannaschii (MjTyrRS; clone varianteda sintetase número 7 como descrito em Chin et al, J. Am.Chem. Soe, (2002) 224:9026-9027; veja também, FIG. 2 e SEQID NO: 10) em Escherichia coli. Este mutante MjTyrRS aminoa-cila o tRNA supressor de âmbar (por exemplo, o tRNA ortogo-nal mostrado na Fig. 1; SEQ ID NO:l) com o aminoácido nãonatural desejado (por exemplo, os aminoácidos mostrados naFig. 3) . O crescimento de E. coli Top 10 F' contendo pDU-LE/CM (linhagem designada TTS) na presença do aminoácido nãonatural correspondente resulta na incorporacao do aminoácidonão natural no sitio especificado pelo códon âmbar TAG. Osegundo plasmídio, M13KE, foi um vetor fago usado para ex-pressar o pentavalente N-terminal de pIII; um derivado,pM13KE-SBP, expressando um peptídeo de ligação estreptavidi-na de fusão pIII (SBP), AGXTLLAHPQ (SEQ ID NO: 11), foi usa-do neste estudo. A seqüência N-terminal AG facilita a cliva-gem do peptídeo de sinal. 0 terceiro resíduo, X, codificadopelo códon sem sentido TAG, designa o aminoácido não naturala ser incorporado. Expressão da proteína de fusão pIII nalinhagem TTs de E coli a presença do aminoácido não naturaldeve permitir fagos viáveis que expressem o peptídeo conten-do o aminoácido não natural como um pIII de fusão. Para pre-parar o estoque de fagos inicial, plasmídio pMl3KE-SBP foitransformado na linhagem de E coli XLl-Bluef uma linhagem desupressão de âmbar que incorpora a glutamina no resíduo X.
Para examinar a dependência da formação de placasdo fago na presença do aminoácido não natural, fago pMl3KE-SBP e fagos selvagens M13KE foram plaqueados na cobertura decélulas da linhagem de E coli TTS/RS 3 (onde RS 3 designauma aminoacil tRNA sintetse específica para p-acetilfenilalanina, estrutura 3 na Fig. 3) na presença e au-sência de 2 mM de pacetilfenilalanina 3. Na presença do ami-noácido não natural, o fago pM13KE-SBP e fagos selvagensM13KE formaram placas de tamanho normal após incubação du-rante a noite à 37oC. Entretanto, na ausência do aminoácidonão natural, apenas o fago selvagemM13EK formou placas. Ne-nhuma formação de placas foi observada para o fago M13KE-SBPna ausência de p-acetil-fenilalanina. O rendimento do fagoM13KE-SBP linhagem supressora de âmbar glutaminil naturalXLl-Blue foi 2 χ IO11 unidades formadoras de placas por mi-litro de cultura (PFU/mL). 0 rendimento do fago M13KE-SBP emTTS/R 3 na presença de p-acetilfenilalanina 3 2 mM é compa-rável ao produzido em XLl-Blue e é dependente da presença dep-acetilfenialanina 3. Na presença destes aminoácidos nãonaturais, o rendimento do fago é 1,8 χ IO11 PFU/mL; na au-sência do aminoácido não natural, o rendimento do fago é re-duzido de 81 vezes (veja Fig. 4). Em uma preparação de fago em larga escala, uma diferneca no rendimento de mais de 100vezes foi obtido. Os experimentos de rendimento de fago fo-ram feitos com cinco linhagem de células de E coli TTS/RS queincorporam cinco aminoácidos não naturais distintos. Esteseram: O-metiltirosina 1, p-azidofenilalanina 2, p-acetilfenilalanina 3, p-benzoilfenilalanina 4 e 3-(2-naf til) alanina 5 (veja Fig 3) . Uma dependência similar dapresença do aminoácido não natural para o rendimento do fagofoi observado em cada sistema (veja Fig. 4), indicando queeste esquema de expressão em fago provavelmente é geral paraum grande número de aminoácidos.
EXEMPLO 2
Construções de pasmidio
O presente Exemplo descreve a construção dos plas-midios usados para expressar o tRNA ortogonal e aminoaciltRNA sintetase ortogonal nas células hospedeiras de E coli.
CONSTRUÇÃO DO PLASMÍDIO pDULE/CM
O plasmidio pDULE com um marcadr resistente de am-picilina foi digerido com Bsm I e tratado com Mung Bean nu-clease para criar uma extremidade cega. 0 DNA resultante foidigerido com Clã I e purificado por eletroforese em gel deagarose. 0 gene da clorafenicol aciltransferase foi amplifi-cado do plasmidio pACYC184 (NEB) por PCR usando os primers:
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O produto PCR foi digerido com Cla I e ligado comO pDULE para gerar pDULE/CM. A linhagem de celul TTS foigerada pela transformação do plasmidio pDULE/CM em Top 10 F'(Invitrogen).
CONSTRUÇÃO DO PLASMÍDIO pM13KE-SBP:A fusão do peptideo de ligação à estreptovidinapIII foi preparado usando o primer de extensão FT121: S'-CATGCCCGGGTACCTTTCTATTCTC (SEQ ID NO: 14) e o molde FT12 6:5'CATGTTTCGGCCGAGCCCCCACCCTGCGGATGAGCCAGCAAAGTCTAGCCGGCAGAGTGAGAATA GAAAGGTACCCGGG (SEQ ID NO: 15); digerido com Eag I eAcc65 I. A inserção deste fragmento no plasmidio pM13KE (NewEngland BioLabs) entre os sítios Eag I e Acc65 com ligase T4gerou pM13KE-SBP. O produto da ligação foi transformado emXLl-Blue e plaqueado em placas LB com um tapete de célulasXLl-Blue na presença de IPTG 20 μg/mL e XGal 20 μg/mL paragerar placas azuis de fago.
EXEMPLO 3
Protocolos de titulação de fago e cultura de fago
O presente Exemplo descreve as metodologias geraisda cultura e titulação de fagos conforme usado aqui.
PROTOCOLO GERAL DA PRODUÇÃO DE FAGOS EM E coliXLl-BLUE
Uma única placa de fago foi adicionada a 10 mL de2xYT contendo a linhagem de E coli em fase meio-log XLl-Bluee 12 μg/mL de tetraciclina. Após a incubação à 37oC por 5horas, a cultura foi centrifugada à 6000 χ g, à 4oC por 5min. O fago foi percipitado do sobrenadante com 20% de volu-me de tampão PEG (20% PEG 8000, NaCl 2,5M). A mistura foimantida à 4°C durante a noite e centrifugado à IOOOOxg por10 min à 4°C. O preciptado contendo o fago foi dissolvido em500yL de Ix PBS, pH 7,4, centrifugado à 20.OOOxg por 10 minà 4°C para remover os vestígios de células restantes, e ar-mazenado à 4°C.PROTOCOLO GERAL DA PRODUÇÃO DE FAGO EM E coli TTS
Uma única placa de fago foi adicionada a 10 mL de2x YT contendo TTS em fase meio-log e 12 μς/ιιϋΐ, de tetraci-clina, 34 μς/ηϋΐ, de clorafenicol e 2 mM do aminoácido não na- tural apropriado. 0 resto do protocolo é o mesmo da produçãode fago geral em E coli XLl-Blue.
EXPERIMENTO GERAL DE FORMAÇÃO DE PLACAS E TITULA-ÇÃO DE FAGO
Após uma série de diluições de 10 vezes em placas de microtitulação, 5 uL de fagos tipo selvagem M13KE eM13KE-SBP foram plaqueados nas placas de Agar LB com um ta-pete de células TTs/RS 3 suplementado com 20 μg/mL IPTG,XGal 20 μg/mL, tetraciclina 12 μg/mL, clorafenical 34 μg/mLe 2mM de aminoácidos não naturais correspondentes. As placas foram incubadas à 37°C durante a noite.
TITULAÇÃO DE FAGO
Após uma série de diluições de 10 vezes em placasde microtitulação, 5 μL de fagos foram plaqueados nas placasde Agar LB com um tapete de células de XLl-Blue suplementado com 20 μg/mL IPTG, XGal 20 μg/mL, tetraciclina 12 μg/mL. Asplacas foram incubadas à 37°C durante a noite.
EXEMPLO 4
Conjugação covalente de polipeptidios expressos emfagos compreendendo p-azido-L-fenilalanina usando uma reação de cicloadição [3+2]
O presente Exemplo descreve a modificação covalen-te de um polipeptidio expresso em fago compreendendo um p-azido-L-fenilalnina. Esta modificação covalente usa uma rea-ção de cicloadição [3+2} para conjugar uma fração contendoalquino ao p-azido-L-fenilalanina, resultando m uma ligaçãotriazol entre o polipeptídio e a fração contendo alquino.Fig. 15 fornece a química da reação geral de cicloadição[3+2] .
O fago M13KE-SBP foi produzido em E coli TTS/RS 2na presença de 2 mM de p-azidofenilalanina 2. 0 fago resul-tante foi então conjugado com o corante fluoresceína deriva-do de alquino mostrado na Fig.5, estrutura 6 (Deiters et ah,J. Am. Chem. Soe. (2003) 125:11782-11783) por uma cicloadi-ção [3+2] azida-alquino altamente específica (Rostovtsev etal., Angew. Chem. Int. Ed. (2002) 41:2596-2599). Fago prepa-rado em XLl-Blue foram usados como um controle negativo.
Especificamente, as reações de conjugação de ci- cloadição entre fago e corante de fluoresceína derivatizadode alquino 6 foram conduzidos da seguinte maneira. Fago deuma solução estoue (50 μΐι, cerca de 1011 pFU) foi precipita-da por PEG e dissolvida em 90 μΐι de tampão fosfato de potás-sio 100 μΜ (PB), pH 8,0. A solução de fago foi suplementadacom 5 de tert-butanol, tris (carboxietil) fosfina 2 mM
(TCEP), ligante tris(triazolil)amino 2 mM, corante de fluo-resceína 6 e CuSO4 1 mM. O volume final de reação foi de 100μ!.. Pela adição do ligante tris (triazolil) amino, o fago pre-cipitou. A mistura da reação foi incubada à 4oC por 16 horase foi centrifugado à 20000 χ g por 10 min. O fago precipitoucompletamente sob as condições relatadas
[tris(carboxietil)fosfina 2 mM (TCEP), ligante tris-(triazolil)amino 2 mM, corante de fluoresceína 6 e CuSO4 1mM era tampão fosfato de potássio (PB) em pH 8,0 com álcooltert-butil 5% como co-solvente] (veja, Wang et al, J. Am.Chem. Soe. (2003) 125:3192-3193). A substituição de TCEP comfio de Cu não geraram melhora. A precipitação foi minimizadoquando reagentes diluídos foram usados (TCEP 0,1 mM, ligante0,2 mM, corante de fluoresceina 6 0,2 mM e CuS04 0, 1 mM notampão PB em pH 8,0) . Veja, Link e Tirrell, J. Am. Chem.Soe. (2003) 125:11164-11165.
Após a conjugação, a mistura da reação foi diali-zada e submetida à SDS-PAGE e análise em Western Blot (vejaFIG. 6). A análise por Western usou anticorpos primários an-ti-fluoresceina (parte I) e anti-pIII (parte II) para veri-ficar a identidade das espécies de proteínas separadas. Es-pecificamente, o sobrenadante concentrado e o precipitado dareação de cicloadição prévia fora submetidos à eletroforeseem gel SDS-PAGE 4-20% (Invitrogen) e transferido para umamembrana de nitrocelulose (semi-seco 20V, 20 min). A membra-na foi bloqueada com leite desnatado 5% em IxPBS à 4oC du-rante a noite e incubado com uma diluição de 1/1000 de igGde coelho anti-fluoresceina (Molecular Probes) em temperatu-ra ambiente por 2 horas. A membrana foi lavada e então foicolocada a sonda com 1/10.000 de Ig G anti-coelho de camun-dongo conjugado com fosfatase alcalina (Sigma). A membranafoi lavada seis vezes com PBST (PBS, 0,5% Tween-20), desen-volvido com ECF (Amersham Biosciences) e escaneado usando umimager fosfor. Uma análise de western anti-pIII também foiconduzido, onde IgG de camundongo anti-pIII (MoBiTec) foiusado como o anticorpo primário. 0 conjugado AP anti-camundongo foi usado como anticorpo secundário.
O desenvolvimento destes blots (veja Fig. 6, parteI) revelou que o conjugado de fluoresceina foi detectado co-mo uma banda única apenas no caso do fago produzido emTTS/RS2 suplementado com 2 mM de p-azidofenilalanina 2 (raiaa) , em contraste com o fago produzido em E coli XL-I-Blue(raia b) . A identidade desta banda foi confirmada como aproteína de revestimento menor pIII pela análise por Westernblot de anti-pIII (parte II) . Estes resultados demonstraramque o aminoácido não natural é incorporado especificamentena proteína de revestimento pIII do fago não natural.
EXEMPLO 5
Preservação da atividade biológica de um polipep-tídio expresso em fago compreendendo o aminoácido não natu-ral p-azido-L-fenilalanina
O presente exemplo ilustra a preservação da ativi-dade biológica do peptídeo de fusão ligado a estreptavidinaexpressa em fago (SBP) compreendendi p-azido-L-fenilalanina.A atividade de ligação da estreptavidina foi avaliada naspreparações de fago.
Para demonstrar que o peptídeo ligado a estreptoa-vidina mutante presente no N-terminal da proteína pIII éfuncional, um ensaio de ligação de fago imunosorbente ligadoa enzima (ELISA) foi utilizado. O sistema usou fago M13KE-SBP preparado em células TTS/RS2 e TTS/RS3 suplementadas com2mM de p-azidofenilalanina 2 ou p-acetilfenilalanina 3, res-pectivamente (veja os dados na Fig. 7 e gráfico correspon-dente na Fig. 8).. O fago M13KE-SBP preparado em XLl-Blueserviu como um controle positivo, enquanto que o fago do ti-po selvagem M13KE serviu como controle negativo.
Nesta análise, placas de microtitulação revestidas com estreptoavidina (pierce) foram bloqueadas com 300 μι deBSA 4% em lxPBS, ou 4% BSA em IxPBS com 10 μΜ de biotina à4oC durante a noite. Após a lavagem, ΙΟΟμΙί de fago M13KE(1011 PFU), fago M13KE-SBP preparado em E. coli XLl-blue,M13KE-SBP preparado em TTS/RS2 ou TTS/RS3 com 2mM do aminao- cido não natural correspondente foram adicionados aos poçoscom diluições seriadas 4 vezes. Após a incubação em temper-tura ambiente por duas horas, os poços foram lavados com 200μL; de PBST três vezes e incubados com uma diluição de1/10.000 do conjugado anti-M13 HRP (Amersham Biosciences)por uma hora. Após dez lavagens com 200 μΐ, de PBST, os poçosforam desenvolvidos com 100 μι de substrato OPD em tampãoperoxidase estável (Pierce). A reação foi terminada pela a-dição de 100 μΐ, de 2,5 N H2SO4. A D0492 nm de cada poço foigravada com um leitor de placa (veja Fig. 7) . O valor de ca- da ponto na tabela mostrada na Fig. 7 é a média dos três ex-perimentos. O erro é de menos de 10%.
Estes dados são mostrados graficamente na Fig. 8.Esta figura mostra que o fago M13KE-SBP preparado em TTS/p-azidofenilalanina 2 e TTS/p-acetilfenilalanina 3 se liga aestreptovidina mais fortemente que o fago controle positivopreparado em XLl-azul. Este aumento na afinidade observadapode resultar no aumento da afinidade de ligação ou estabi-lidade proteolítica do peptideo expresso contendo o aminoá-cido não natural.
Em um experimento modelo de seleção de fago, fagodo tipo selvagem e fago carreando o SBP mutante com p-azido-L-fenilalanina foram expostos a poços revestidos com estrep-tavidina, seguido da recuperação do fago ligado. 0 titulo dofago enriquecido recuperado após a eluicao foi usado comouma medida da especificidade de ligação do fago pela estrep-toavidina.
Especificamente, dois poços de uma placa de micro-titulação revestida com estreptoavidina (Pierce) foram blo-queados com 300 pL de 4% BSA em IxPBS à 4oC durante a noite.Após a lavagem, poços revestidos com estreptoavidina separa-dos foram incubados com um número similar de fago (cada umem 100 μΙ.) de M13KE-SBP preparado em TTS/RS3 ou M13KE selva-gem em temperatura ambiente por 2 horas e lavados 10 vezescom 200 pL de PBST. O fago ligado foi eluido do suporte só-lido da placa com biotina 10 μΜ lxPBS, pH 7,4. O fago queentrava e o que saia foram titulados (veja, Fig. 9).
A taxa de recuperação do fago M13KE-SBP preparadoem TTS/RS 3 é de 9xl03 vezes maior que a do fago selvagemM13KE (Fig. 9). Estes resultados experimentais mostraram queo mutante SBP é expresso no fago e é funcional (isto é, man-tém a habilidade de se ligar especificamente a estreptoavi-dina).
A generalizacao da expressão em fago para incluiraminoácidos não naturais deveria aumentar significativamenteo escopo da tecnologia de expressão em fago. Por exemplo, aincorporação de amnoacidos não naturais em polipeptidios ex-pressos em fagos pode levar aumento da afinidade de ligaçãoe especificidade, esqueletos e cadeias laterais conformacio-nalmente retidos, e estabilidade proteolitica melhorada. A-minoácidos não naturais podem fornecer sítios reativos paraa conjugação de moléculas não peptídicas assim como marcado-res de fotoafinidade para a identificação de ligantes ou re-ceptores órfãos. Finalmente, esta metodologia também é apli-cável a outros formatos de expressão como expressão em ri-bossomo e levedura.
EXEMPLO 6
Modificação covalente seletiva de polipeptidiosexpressos em fago compreendendo p-azido-L-fenilalanina usan-do a reação de ligação de Staudinger
O presente Exemplo ilustra a modificação covalenteseletiva dos polipeptidios expressos em fago compreendendop-azido-L-fenilalanina usando a reação de ligação de Stau-dinger. Este Exemplo usou o peptídeo de ligação a estreptoa-vidina expresso em fago (SBP)/proteína de fusão pIII descri-ta no Exemplo 1 como substrato para a reação de Staudinger,conforme ilustrado na Fig. 10.
Conforme mostrado nos Exemplos 1-3, um sistema deexpressão em fagos foi criado no qual o peptídeo de ligaçãoà estreptoavidina (SBP), AGXTLLAHPQ (SEQ ID NO: 11), foi ex-presso pentavalentemente como uma fusão para a proteína pIIIdo fago filamentoso M13. A seqüência N-terminal AG facilitaa clivagem do peptídeo sinal; o terceiro resíduo, X, codifi-cado pelo códon sem sentido TAG, designou o aminoácido nãonatural a ser incorporado. 0 fago Ph-Az (codificando SBP comp-azido-L-fenilalanina 2 no resíduo X) foi preparado na li-nhagem de E coli TTS/RS na presença de 2 mM de p-azido-L-fenilalanina 2 com boa eficiência e alta fidelidade. E. coli TTS/RS contém um plasmídio que expressa constitutivamente umtRNAtyrcua supressor de âmbar mutante de Methanococcus jannas-chii (mutRNAtyrcua) e uma tirosil-tRNA sintetase (MjTyrRS) deM. jannaschii que carrega especificamente o mutRNAtyrcua comp-azido-L-fenilalanina 2. Como um controle negativo, outrofago expresso em SBP (Ph-Q) foi preparado em E coli XLl-Blue, uma linhagem supressora de âmbar natural que incorporaglutamina no resíduo X.
Usando este sistema de fago, a viabilidade do usode polipeptídios expressos em fagos compreendendo o aminoá- cido não natural p-azido-L-fenilalanina 2 como um substratopara uma modificação seletiva de Staudinger foi examinada.Fosfinas 7 e 8 derivadas de fluoresceína (veja as estruturasna Fig. 10) foram usadas para a reação de ligação de Stau-dinger uma vez que eles podem ser facilmente detectados.
0 composto 7 foi sintetizado seguindo procedimen-tos publicados (Saxon e Bertozzi, Science 2000, 287, 2007-2010; Wang et al, Bioconjugate Chem. 2003, 14, 697- 701) . 0composto 8 foi preparado pelo acoplamento da reação 2-(difenilfosfino)fenol (74 mg, 0,27 mmol), veja Suarez et al,Organometallics 2002, 21, 4611-4621, e 5(6)- carboxifluores-ceina (100 mg, 0.27 mmol) na presença de diciclohexilcarbo-diimida (62 mg, 0,3 mmol) em DMF anidro (1 mL) em temperatu-ra ambiente por 12 horas, e purificado usando TLC preparadocomo um pó vermelho (3 mg, 2%); HRMS (ESI-TOF) : CsgH24O7PitM-1]~ calcd: 635,1265; encontrado 635,1248.
De acordo com o esquema na Fig. 10, fosfina 7 podereagir com o fago Ph-Az para formar um intermediário aza-ilida (Staudinger e Meyer, HeIv. CMm. Acta 1919, 2, 635-646), seguido da ciclização intramolecular (Saxon e Bertoz-zi, Science 2000, 287, 2007-2010) para gerar no fim um pro-duto fago marcado com f luoresceina. A conjugação de 8 comPh-Az deve participar de uma ligação de Staudinger sem traçopor um mecanismo de reação similar para gerar um fago marca-do com flouresceina sem um grupo óxido interventor trifenil-fosfina.
As reações de conjugação entre as moléculas de fa-go e as fosfinas 7 e 8 com aproximadamente 1011 partículasde fago e fosfina 0,01 mM em solução salina fosfato tampona-da 10 mM (PBS, pH 7,4); reações similares foram realizadascom fago Ph-Q como um controle negativo. Um estoque (0,5 mM)de cada reagente fosfina foi preparado em DMF, e foi diluídocom tampão de reação até uma concentração final de 0,01 mM evolume total de 50 μι. As reações de ligação foram realiza-das em temperatura ambiente com agitação por 16 horas. Amistura da reação foi então dializada contra PBS e submetidoa análise subseqüente.
Os produtos da reação da ligação foram analisadospor Western blot (veja, Fig. 11) usando o protocolo descritono Exemplo 4. Os conjugados de fluoresceína foram observadoscomo uma banda única usando um anticorpo anti-fluoresceinaprimário (raia 1-4) apenas da ligação de Ph-Az com fosfina 7ou 8, e não observada no caso das reações controle usandoPh-Q. Esta banda foi identificada como a proteína de reves-timento menos PIII usando um anticorpo anti-pIII na análise(raias 5-8) . Estes resultados claramente mostra um alto graude seletividade entre fosfina 7 ou 8 e azida contendo peptí-deo em fago.
EXEMPLO 7
Preservação da viabilidade do fago após a modifi-cação seletiva Staudinger de um polipeptídio expresso em fa-go
O presente exemplo ilustra a preservação da viabi-lidade do fago após a modificação seletiva de Staudinger deum polipeptídio expresso em fagos compreendendo p-azido-L-fenilalanina.
Para mostrar que a reação de acoplamento de Stau-dinger não leva a perda de partículas de fago infectivas, aviabilidade do fago foi determinada pela titulação do fagoPh-Az antes e após a ligação de Staudinger com 7 ou 8. 0 nú-mero de partículas de fago viáveis observado de uma misturade reação de Staudinger foi (l,7±l)xl011 unidades formadorasde placa por mililitro (PFU/mL), comparada a (2,5±l)xl011PFU/mL determinada das soluções controle sem fosfina 7 ou 8.
EXEMPLO 8
Seleção de fago após a modificação de Staudingerde um polipeptídio expresso em fago
O presente exemplo ilustra a seleção de fago apósa modificação de Staudinger de um polipeptídio expresso emfago. A seleção utilizou um anticorpo anti-fluoresceína imo-bilizada para reter fago que compreendia uma fosfina conju-gada 7, que estaria presente apenas se a modificação deStaudinger fosse bem sucedida. A titulação de fago tambémrevelou a viabilidade do fago.
Em um experimento modelo de sele-ção/enriquecimento, um número similar de partículas de fagopreparadas da ligação de Staudinger mencionado anteriormenteda fosfina 7 com Ph-Az e Ph-Q foram incubados em poços sepa-rados que foram pré-revestidos com anticorpo anti- fluoresceina. Após a lavagem, o fago ligada foi eleuído comconjugado 0,05% BSA-FITC e titulado.
Mais especificamente, anticorpo anti-flouresceina(20 pg/mL, 250μL/poço) foi revestido em Na2CO3 (0,1 M, pH9,6) em oito poços de uma placa imuno (Fisher) à 37°C por 4horas. Os poços foram lavados (3x0,9% NaCl-O,05%Tween 20),bloqueado durante a noite com BSA (0,5%) à 4°C, e então in-cubados em temperatura ambiente por 5 horas com fago (ΙΟΟμΙ,)de uma reação de ligação ou uma solução controle. Após serlavado, o fago foi eluído da placa com o conjugado BSA-FITC(0,05%). 0 fago recuperado foi titulado.
A titulação de entrada de fago foram os seguintes:Ph-Az: 1, OxlO9 PFU; e Ph-Q: 2, OxlO9 PFU. A taxa de recupera-ção do fago marcado com fluoresceina derivado da ligação dePh-Az com 7 (0,12%) é 120 vezes maior do que o fago controlederivado de Ph-Q (0,001%).
Estes resultados dos Exemplos 7 e 8 demonstraramque a reação de ligação de Staudinger não afeta significati-vamente a viabilidade do fago. Em contraste, é importantenotar que o fago Ph-Az são inviáveis após a exposição dascondições da reação na cicloadição [3+2] com um grupo alqui-no terminal e cobre catalisador. Veja também, por exemplo,ostovtsev et al. , Angew. Chem. 2002, 114, 2708-2711; e An-gew. Chem. Int. Ed. 2002, 41, 2596- 2599. Foi descoberto queo catalisador de cobre é predominantemente responsável pelaperda da viabilidade; entretanto, a adição de altas concen-trações de EDTA durante a etapa da diálise não melhorou no-tavelmente a viabilidade do fago.
EXEMPLO 9
Caracterização dos produtos da reação da modifica-ção de Staudinger
Para caracterizar os produtos da ligação de Stau-dinger e determina a eficiência de conjugação, uma proteínade domínio Z representativo (Wang et al., Proc. Natl. Acad.ScL U.S.A. 2003, 100, 56-61) contendo a p-azido-fenilalanina2 no resíduo 7 foi expresso em uma linhagem de E coli usandomutRNATYRCUA (SEQ ID N0:1) e o MjTyrRS mutante (veja, Fig.l,SEQ ID NO:4) que carrega seletivamente o tRNA com p-azido-L-fenilalanina 2 (veja Wang et al. , Science 2001, 292, 498-500; Wang and Schultz, Angew. Chem. 2005, 117, 34-68; Angew.Chem. Int. Ed. 2005, 44, 34-66; e Chin et al, J. Am. Chem.Soe. 2002, 124, 9026-9027). Mais descrição geral da expres-são do domínio Z do polipeptideo podem ser encontrados emWang et al, Proc. Natl. Acad. ScL U.S.A. 2003, 100, 56-61.Este domínio Z contendo azida foi purificada e conjugado comfosfinas 7 ou 8.Para esta reação de conjugação, um estoque (10 mM)de cada reagente fosfina foi preparado em DMF, e foi diulidacom tampão de reação contendo domínio Z da proteína mutante(0,1 mM) até uma concentração final de 1 mM e o volume totalde 10 pL. As reações de ligação foram realizadas em soluçãosalina fosfato tamponada (PBS, pH7,4) em temperatura ambien-te com agitação por 16 hs. A mistura de reação foi entãopassado por uma coluna PD-10, eluído em água, dializado eanalisado com espectroscopia MALDI-TOF.
Os picos principais dos espectros observados com-binaram com os produtos de ligação de Staudinger quando u-sando a fosfina 7 como fração conjugado (veja Fig. 12). PicoA é designada ao produto da ligação Staudinger:C386Hss6N1O7Oii9SiPi, calcd: 8662; encontrado: 8664. Pico B édesignado para o produto de redução via a reação clássica deStaudinger: C344H529N105O110S1, calcd: 7928;; encontrado: 7928.Picos menosres al e bl, correspondentes a A e B, são desig-nados aos produtos derivados da proteína domínio Z mutantesem a primeira metionina. Os picos menores a2 e b2, corres-pondente a A e B, são provenientes do duto da matriz. No do-mino Z contendo azida foi observável (<1%), indicando que areação continua em rendimento maior. Para a ligação de Stau-dinger da fosfina 7, a eficiência da conjugação é estimadacomo sendo >90% baseado na razão da integração dos picos noespectro de MALDI-TOF.
Fig. 13 mostra uma análise de MALDI-TOF dos produ-tos da reação da ligação de Staudinger da proteína domínio Zcom fosfina 8. 0 pico C é designado para o produto de liga-ção de Staudinger sem traço: Ca6sH539Nio50ii6Si, calcd: 8286;encontrado: 8286. Pico D é designado ao produto da reduçãovia reação de Staudinger clássica: C344H529N10SO110S1, calcd:7928; encontrado: 7928. Pico E é designado ao intermediárioaza-ilida: C383H552N105O117S1P1, calcd: 8562; encontrado: 8563.Picos menores c2 e d2, correspondente a C e D, são do dutoda matriz.
Em contraste a ligação de Staudinger da fosfina 7,a ligação de Staudinger sem traço da fosfina 8 gerou um ren-dimento menor de ~50%. A eficiencia da menor conjugação de 8pode se dever a uma ligação mais lenta, presumidamente naetapa de ciclizacao intramolecular (Saxon e Bertozzi, Org.Lett. 2000, 2, 2141-2143) e a redução da hidrólise de fenoléster em 8. Isto levaria a um produto amino como nas reaçõesde Staudinger clássicas (Saxon e Bertozzi, Science 2000,287, 2007-2010; e Staudinger e Meyer, HeIv. CHm. Acta 1919,2, 635-646).
Experimentos com material autêntico demonstrou queo mutante 2 p-azido-L-fenilalanina é estável. Fig. 14 forne-ce uma análise MALDI-TOF dos produtos da reação da ligaçãode Staudinger de p-azido-L-fenilalanina 2 contendo a proteí-na domínio Z com fosfina 7 e dopagem com quantidade compara-tiva de domínio Z mutante da p-azido-L-fenilalanina 2.
Em resumo, é mostrado aqui que os modelos das Ii-gações de Standinger entre fosfinas fluoresceína-teterada euma p-azido-L-fenilalanina 2 contendo peptídeo expresso em-fagos ou um domínio Z mutante ocorre com excelente seletivi-dade e eficiência. A ligação de. Staudinger não afeta a via-bilidade do fago de modo que após o fim do enriquecimento daligação pode ser feito sem dificuldade. Este trabalho forne-ce métodos úteis para modificar proteínas seletivamente semalterar sua função e deve ser útil para a geração de proteí-nas PEGuiladas altamente homogêneas, proteínas imobilizadasna superfície ou proteínas modificadas com reagentes espec-troscópico ou de afinidade.
Deve ficar claro que os exemplos e modalidadesdescritos aqui são apenas para fins ilustrativos e as váriasmodificações ou mudanças em sua luz serão sugeridas por pro-fissionais da área e devem ser incluídas no espírito destepedido de patente e no escopo das reivindicações em anexo.
Embora esta invenção tenha sido descrita em algunsdetalhes para fins de esclarecimento e compreensão, deve fi-acar claro ao profissional da área pela leitura deste traba-lho que várias modificacçoes na forma e detalhe podem serfeitas sem deixar o verdadeiro escopo da invenção. Por exem-plo, todas as técnicas e equipamentos descritos acima podemser usados em várias combinações. Todas as publicações, pa-tentes, pedidos de patente e/ou outros documentos citadosneste pedido de patente estão incorporados aqui como refe-rência em sua totalidade para todos os fins na mesma exten-são que se cada publicação, patentes, pedidos de patentee/ou outros documentos individuais estivessem individualmen-te indicados para ser incorporado como referência para todosos fins.LISTAGEM DE SEQÜÊNCIA
<110> Tsao, Meng-LinTian1 FengSchultz1 Peter
<120> MODIFICAÇÃO PÓS-TRADUCIONAL DE POLIPEPTÍDEOS EXPRESSOSEM FAjGOS
<130> 54-001620US
<140> US 11/580,223<141> 2006-10-11
<150> US 60/726,137<151> 2005-10-12
<150> US 60/737,622<151> 2005-11-16
<160> 15
<170> Patentln version 3.4
<210> 1<211> 77<212> RNA
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> Tirosil-tRNA-CUA supressor mutante de Methanococcus jannaschü
<400> 1
ccggcgguag uucagcaggg cagaacggcg gacucuaaau ccgcauggcg cugguucaaa 60uccggcccgc cggacca 77
<210> 2
<211> 306
<212> PRT
<213> Methanococcus jannaschii
<400> 2
Met Asp Glu Phe Glu Met Ile Lys Arg Asn Thr Ser Glu Ile Ile Ser1 5 10 15
Glu Glu Glu Leu Arg Glu vai Leu Lys Lys Asp Glu Lys ser Ala Tyr20 25 30
Ile Gly Phe Glu Pro Ser Gly Lys Ile His Leu Gly Kis Tyr Leu Gln35 40 45
Ile Lys Lys Met Ile Asp Leu Gln Asn Ala Gly Phe Asp lie Ile Ile50 55 60
Leu Leu Ala Asp Leu His Ala Tyr Leu Asn Gln Lys Gly Glu Leu Asp65 70 75 80Glu Ile Arg Lys Ile Gly Asp Tyr Asn Lys Lys Val Phe Glu Ala Met85 90 95
Gly Leu Lys Ala Lys Tyr Val Tyr Gly Ser Glu Phe Gln Leu Asp Lys100 105 110
Asp Tyr Thr Leu Asn Val Tyr Arg Leu Ala Leu Lys Thr Thr Leu Lys115 120 125
Arg Ala Arg Arg ser Met Glu Leu Ile Ala Arg Glu Asp Glu Asn Pro130 135 140
Lys Val Ala Glu Val Ile Tyr Pro Ile Met Gln Val Asn Asp Ile His145 150 155 160
Tyr Leu Gly vai Asp Val Ala Val Gly Gly Met Glu Gln Arg Lys Ile165 170 175
His Met Leu Ala Arg Glu Leu Leu Pro Lys Lys vai Val Cys Ile His180 185 190
Asn Pro Val Leu Thr Gly Leu Asp Gly Glu Gly Lys Met Ser Ser Ser195 200 205
Lys Gly Asn Phe Ile Ala Val Asp Asp Ser Pro Glu Glu Ile Arg Ala210 215 220
Lys Ile Lys Lys Ala Tyr Cys Pro Ala Gly Val Val Glu Gly Asn Pro225 230 235 240
Ile Met Glu Ile Ala Lys Tyr Phe Leu Glu Tyr Pro Leu Thr Ile Lys245 250 255
Arg Pro Glu Lys Phe Gly Gly Asp Leu Thr Val Asn ser Tyr Glu Glu260 265 270
Leu Glu Ser Leu Phe Lys Asn Lys Glu Leu His Pro Met Asp Leu Lys275 280 285
Asn Ala vai Ala Glu Glu Leu Ile Lys Ile Leu Glu Pro Ile Arg Lys290 295 300
Arg Leu305
<210> 3<211> 918<212> DNA
<213> Methanococcus jannaschii
<400> 3 atggacgaat ttgaaatgat aaagagaaac acatctgaaa ttatcagcga ggaagagtta 60agagaggttt taaaaaaaga tgaaaaatct gcttacatag gttttgaacc aagtggtaaa 120atacatttag ggcattatct ccaaataaaa aagatgattg atttacaaaa tgctggattt 180gatataatta tattgttggc tgatttacac gcctatttaa accagaaagg agagttggat 240gagattagaa aaataggaga ttataacaaa aaagtttttg aagcaatggg gttaaaggca 300aaatatgttt atggaagtga attccagctt gataaggatt atacactgaa tgtctataga 360ttggctttaa aaactacctt aaaaagagca agaaggagta tggaacttat agcaagagag 420gatgaaaatc caaaggttgc tgaagttatc tatccaataa tgcaggttaa tgatattcat 480tatttaggcg ttgatgttgc agttggaggg atggagcaga gaaaaataca catgttagca 540agggagcttt taccaaaaaa ggttgtttgt attcacaacc ctgtcttaac gggtttggat 600ggagaaggaa agatgagttc ttcaaaaggg aattttatag ctgttgatga ctctccagaa 660gagattaggg ctaagataaa gaaagcatac tgcccagctg gagttgttga aggaaatcca 720ataatggaga tagctaaata cttccttgaa tatcctttaa ccataaaaag gccagaaaaa 780tttggtggag atttgacagt taatagctat gaggagttag agagtttatt taaaaataag 840gaattgcatc caatggattt aaaaaatgct gtagctgaag aacttataaa gattttagag 900ccaattagaa agagatta 918
<210> 4<211> 306<212> PRT
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> Seqüência de aminoácido do clone 1 da p-azido-L-fenilalanináaminoacil-tRNA sintetase (derivada da tirosil-tRNA sintetaseselvagem de Methanococcus jannaschii)
<400> 4
Met Asp Glu Phe Glu Met lie Lys Arg Asn Thr Ser Glu Ile Ile Ser1 5 10 . 15
Glu Glu Glu Leu Arg Glu vai Leu Lys Lys Asp Glu Lys Ser Ala Thr20 25 30
lie Gly Phe Glu Pro Ser Gly Lys Ile His Leu Gly His Tyr Leu Gln35 40 45
lie Lys Lys Met lie Asp Leu Gln Asn Ala Gly Phe Asp lie Ile IleLeu Leu Ala Asp Leu His Ala Tyr Leu Asn Gln Lys Gly Glu Leu Asp65 70 75 80
Glu Ile Arg Lys Ile Gly Asp Tyr Asn Lys Lys Val Phe Glu Ala Met85 90 95
Gly Leu Lys Ala Lys Tyr Val Tyr Gly Ser Asn Phe Gln Leu Asp Lys100 105 110
Asp Tyr Thr Leu Asn Val Tyr Arg Leu Ala Leu Lys Thr Thr Leu Lys115 120 125
Arg Ala Arg Arg Ser Met Glu Leu Ile Ala Arg Glu Asp Glu Asn Pro130 135 140
Lys Val Ala Glu Val Ile Tyr Pro Ile Met Gln Val Asn Pro Leu His145 150 155 160
Tyr Gln Gly Val Asp Val Ala Val Gly Gly Met Glu Gln Arg Lys Ile165 170 175
His Met Leu Ala Arg Glu Leu Leu Pro Lys Lys Val Val Cys Ile His180 185 190
Asn Pro vai Leu Thr Gly Leu Asp Gly Glu Gly Lys Met Ser Ser Ser195 200 205
Lys Gly Asn Phe Ile Ala vai Asp Asp Ser Pro Glu Glu Ile Arg Ala210 215 220
Lys lie Lys Lys Ala Tyr Cys Pro Ala Gly Val Val Glu Gly Asn Pro225 230 235 240
Ile Met Glu lie Ala Lys Tyr Phe Leu Glu Tyr Pro Leu Thr Ile Lys245 250 255
Arg Pro Glu Lys Phe Gly Gly Asp Leu Thr yal Asn Ser Tyr Glu Glu260 265 270
4
Leu Glu Ser Leu Phe Lys Asn Lys Glu Leu His Pro Met Asp Leu Lys275 280 285
Asn Ala vai Ala Glu Glu Leu Ile Lys Ile Leu Glu Pro Ile Arg Lys290 295 300Arg Leu
305
<210> 5<211> 306<212> PRT
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> Seqüência de aminoácido do clone 2 da p-azido-L-fenilalaninaaminoacil-tRNA sintetase (derivada da tirosil-tRNA. sintetaseselvagem de Methanococcus jannaschii)
<400> 5
Met Asp Glu Phe Glu Met lie Lys Arg Asn Thr Ser Glu lie lie ser1 5 10 15
Glu Glu Glu Leu Arg Glu Val Leu Lys Lys Asp Glu Lys Ser Ala Thr20 25 30
Ile Gly Phe Glu Pro Ser Gly Lys Ile His Leu Gly His Tyr Leu Gln35 40 45
Ile Lys Lys Met Ile Asp Leu Gln Asn Ala Gly Phe Asp lie Ile Ile50 55 60
Leu Leu Ala Asp Leu His Ala Tyr Leu Asn Gln Lys Gly Glu Leu Asp65 70 75 80
Glu Ile Arg Lys Ile Gly Asp Tyr Asn Lys Lys Val Phe Glu Ala Met85 90 95
Gly Leu Lys Ala Lys Tyr vai Tyr Gly Ser Ser Phe Gln Leu Asp Lys100 105 110
Asp Tyr Thr Leu Asn Val Tyr Arg Leu Ala Leu Lys Thr Thr Leu Lys115 120 125
Arg Ala Arg Arg Ser Met Glu Leu Ile Ala Arg Glu Asp Glu Asn Pro130 135 140
Lys Val Ala Glu Val Ile Tyr Pro Ile Met Gln vai Asn Pro Ser His145 150 155 ' 160
Tyr Gln Gly Val Asp vai Ala Val Gly Gly Met Glu Gln Arg Lys Ile165 170 175
His Met Leu Ala Arg Glu Leu Leu Pro Lys Lys Val Val Cys Ile His180 185 190Asn Pro Val Leu Thr Gly Leu Asp Gly Glu Gly Lys Met Ser Ser Ser195 200 205
Lys Gly Asn Phe Ile Ala Val Asp Asp Ser Pro Glu Glu Ile Arg Ala210 215 220
Lys Ile Lys Lys Ala Tyr Cys Pro Ala Gly Val Val Glu Gly Asn Pro225 230 235 240
Ile Met Glu Ile Ala Lys Tyr Phe Leu Glu Tyr Pro Leu Thr Ile Lys245 250 255
Arg Pro Glu Lys Phe Gly Gly Asp Leu Thr Val Asn Ser Tyr Glu Glu260 265 270
Leu Glu ser Leu Phe Lys Asn Lys Glu Leu His Pro Met Asp Leu Lys275 280 285
Asn Ala vai Ala Glu Glu Leu Ile Lys Ile Leu Glu Pro Ile Arq Lys290 295 300
Arg Leu305
<210> 6<211> 306<212> PRT
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> Seqüência de aminoácido do clone 3 da p-azido-L-fenilalanina aminoacil-tRNA sintetase (derivadada tirosil-tRNA sintetase selvagem deMethanococcus janna.schii)
<400> 6
Met Asp Glu Phe Glu Met Ile Lys Arg Asn Thr Ser Glu Ile Ile Ser1 5 10 15
Glu Glu Glu Leu Arg Glu vai Leu Lys Lys Asp Glu Lys Ser Ala Thr20 25 30
Ile Gly Phe Glu Pro Ser Gly Lys Ile His Leu Gly His Tyr Leu Gln35 40 45
Ile
Lys50
Lys Met Ile Asp
Leu55
Gln Asn Ala Gly
Phe Asp60
Ile Ile Ile
Leu Leu Ala Asp Leu His Ala Tyr Leu Asn Gln Lys Gly Glu Leu Asp65 70 75 80Glu Ile Arg Lys Ile Gly Asp Tyr Asn Lys Lys Val Phe Glu Ala Met85 90 95
Gly Leu Lys Ala Lys Tyr vai Tyr Gly Ser ser Phe Gln Leu Asp Lys100 105 110
Asp Tyr Thr Leu Asn Val Tyr Arg Leu Ala Leu Lys Thr Thr Leu Lys115 120 125
Arg Ala Arg Arg Ser Met Glu Leu Ile Ala Arg Glu Asp Glu Asn Pro130 135 140
Lys Val Ala Glu Val Ile Tyr Pro Ile Met Gln Val Asn Pro Leu His145 150 155 160
Tyr Gln Gly Val Asp Val Ala Val Gly Gly Met Glu Gln Arg Lys Ile165 170 175
His Met Leu Ala Arg Glu Leu Leu Pro Lys Lys Val Val Cys Ile His180 185 190
Asn Pro Val Leu Thr Gly Leu Asp Gly Glu Gly Lys Met ser Ser Ser195 200 205
Lys Gly Asn Phe Ile Ala Val Asp Asp Ser Pro Glu Glu Ile Arg Ala210 215 220
Lys lie Lys Lys Ala Tyr Cys Pro Ala Gly Val Val Glu Gly Asn Pro225 230 235 240
Ile Met Glu Ile Ala Lys Tyr Phe Leu Glu Tyr Pro Leu Thr Ile Lys245 250 255
Arg Pro Glu Lys Phe Gly Gly Asp Leu Thr Val Asn Ser Tyr Glu Glu260 265 270
Leu Glu Ser Leu Phe Lys Asn Lys Glu Leu His Pro Met Asp Leu Lys
275 280 285Asn Ala vai Ala Glu Glu Leu Ile Lys Ile Leu Glu Pro Ile Arg Lys290 295 300
Arg Leu305
<210> 7<211> 306
<212> PRT
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> Seqüencia de aminoacido do clone 4 da p-azido-L-fenilalaninaaminoacil-tRNA sintetase (derivada da tirosil-tRNA sintetaseselvagem de Methaziococcus jaimaschli)
<400> 7
Met Asp Glu Phe Glu Met Ile Lys Arg Asn Thr Ser Glu Ile Ile Ser1 5 10 15
Glu Glu Glu Leu Arg Glu vai Leu Lys Lys Asp Glu Lys Ser Ala Leu20 25 30
Ile Gly Phe Glu Pro Ser Gly Lys Ile His Leu Gly His Tyr Leu Gln35 40 45
Ile Lys Lys Met Ile Asp Leu Gln Asn Ala Gly Phe Asp Ile Ile lie50 55 60
Leu Leu Ala Asp Leu His Ala Tyr Leu Asn Gln Lys Gly Glu Leu Asp65 70 75 80
Glu lie Arg Lys Ile Gly Asp Tyr Asn Lys Lys Val Phe Glu Ala Met85 90 95
Gly Leu Lys Ala Lys Tyr Val Tyr Gly Ser Thr Phe Gln Leu Asp Lys100 105 110
Asp Tyr Thr Leu Asn Val Tyr Arg Leu Ala Leu Lys Thr Thr Leu Lys115 120 125
Arg Ala Arg Arg Ser Met Glu Leu Ile Ala Arg Glu Asp Glu Asn Pro130 135 140
Lys Val Ala Glu Val Ile Tyr Pro Ile Met Gln Val Asn Pro Val His145 150 155 160
Tyr Gln Gly Val Asp Val Ala Val Gly Gly Met Glu Gln Arg Lys lie165 170 ' 175
His Met Leu Ala Arg Glu Leu Leu Pro Lys Lys Val Val Cys Ile His180 185 190
Asn Pro vai Leu Thr Gly Leu Asp Gly Glu Gly Lys Met ser Ser Ser195 200 205-
Lys Gly Asn Phe Ile Ala Val4Asp Asp Ser Pro Glu Glu Ile Arg Ala210 215 220
Lys lie Lys Lys Ala-Tyr Cys Pro Ala Gly vai vai Glu Gly Asn Pro225 230 235 240
Ile Met Glu Ile Ala Lys Tyr Phe Leu Glu Tyr Pro Leu Thr Ile Lys245 250 255
Arg Pro Glu Lys Phe Gly Gly Asp Leu Thr Val Asn Ser Tyr Glu Glu260 265 270
Leu Glu Ser Leu Phe Lys Asn Lys Glu Leu His Pro Met Asp Leu Lys275 280 285
Asn Ala Val Ala Glu Glu Leu Ile Lys lie Leu Glu Pro lie Arg Lys290 295 300
Arg Leu305
<210> 8<211> 306<212> PRT
<213> Seqüência artificial
<223> Seqüência de aminoácido do clone 9 da p-azido-L-fenilalaninaaminoacil-tRNA sintetase (derivada da tirosil-tRHA. sintetaseselvagem de Methanococcus jannaschii)
<400> 8
Met Asp Glu Phe Glu Met lie Lys Arg Asn Thr Ser Glu Ile Ile ser1 5 10 15
Glu Glu Glu Leu Arg Glu Val Leu Lys Lys Asp Glu Lys Ser Ala Ala20 25 30
Ile Gly Phe Glu Pro Ser Gly Lys lie His Leu Gly His Tyr Leu Gln35 40 45
lie Lys Lys Met Ile Asp Leu Gln Asn Ala Gly Phe Asp Ile Ile lie50 55 60 '
Leu Leu Ala Asp Leu His Ala Tyr Leu Asn Gln Lys Gly Glu Leu Asp65 70 75 80
Glu Ile Arg Lys lie Gly Asp Tyr Asn Lys Lys vai Phe Glu Ala Met85 90 95Gly Leu Lys Ala Lys Tyr Val Tyr Gly Ser Arg Phe Gln Leu Asp LysIOO 105 110
Asp Tyr Thr Leu Asn Val Tyr Arg Leu Ala Leu Lys Thr Thr Leu Lys115 120 125
Arg Ala Arg Arg Ser Met Glu Leu Ile Ala Arg Glu Asp Glu Asn Pro130 135 140
Lys Val Ala Glu vai Ile Tyr Pro Ile Met Gln Val Asn Val Ile His145 150 155 160
Tyr Asp Gly Val Asp Val Ala Val Gly Gly Met Glu Gln Arg Lys Ile165 170 175
His Met Leu Ala Arg Glu Leu Leu Pro Lys Lys Val Val Cys Ile His180 185 190
Asn Pro Val Leu Thr Gly Leu Asp Gly Glu Gly Lys Met ser Ser ser195 200 205
Lys Gly Asn Phe Ile Ala Val Asp Asp Ser Pro Glu Glu Ile Arg Ala210 215 220
Lys lie Lys Lys Ala Tyr Cys Pro Ala Gly Val Val Glu Gly Asn Pro225 230 235 240
Ile Met Glu Ile Ala Lys Tyr Phe Leu Glu Tyr Pro Leu Thr Ile Lys245 250 255
Arg Pro Glu Lys Phe Gly Gly Asp Leu Thr Val Asn Ser Tyr Glu Glu260 265 270
Leu Glu Ser Leu Phe Lys Asn Lys Glu Leu His Pro Met Asp Leu Lys275 280 285
Asn Ala Val Ala Glu Glu Leu Ile Lys Ile Leu Glu Pro Ile Arg Lys290 295 300
Arg Leu305
<210> 9
<211> 306
<212> PRT
<213> Seqüência artificial
<220><223> Seqüência de aminoácido do clone 6 da p-azido-L-fenilalaninaaminoacil-tRNA sintetase (derivada da tirosil-tRNA. sintetaseselvagem de Methanococcus jannaschii)
<400> 9
Met Asp Glu Phe Glu Met Ile Lys Arg Asn Thr Ser Glu Ile Ile Ser1 5 10 15
Glu Glu Glu Leu Arg Glu Val Leu Lys Lys Asp Glu Lys ser Ala Gly20 25 30
Ile Gly Phe Glu Pro Ser Gly Lys Ile His Leu Gly His Tyr Leu Gln35 40 45
Ile Lys Lys Met Ile Asp Leu Gln Asn Ala Gly Phe Asp lie lie Ile50 55 60
Leu Leu Ala Asp Leu His Ala Tyr Leu Asn Gln Lys Gly Glu Leu Asp65 ' 70 75 80
Glu Ile Arg Lys Ile Gly Asp Tyr Asn Lys Lys Val Phe Glu Ala Met85 90 95
Gly Leu Lys Ala Lys Tyr vai Tyr Gly ser Thr Phei Gln Leu Asp Lys100 105 110
Asp Tyr Thr Leu Asn vai Tyr Arg Leu Ala Leu Lys Thr Thr Leu Lys115 120 125
Arg Ala Arg Arg ser Met Glu Leu Ile Ala Arg Glu Asp Glu Asn Pro130 135 140
Lys vai Ala Glu Val Ile Tyr Pro Ile Met Gln Val Asn Thr Tyr Tyr145 150 155 160
Tyr Leu Gly vai Asp Val Ala Val Gly Gly Met Glu Gln Arg Lys lie165 170 175
His Met Leu Ala Arg Glu Leu Leu Pro Lys Lys Val Val Cys lie His180 185 ", 190
Asn Pro Val Leu Thr Gly Leu Asp Gly Glu Gly Lys Met Ser ser ser195 200 205
Lys Gly Asn Phe lie Ala vai Asp Asp ser Pro Glu Glu Ile Arg Ala210 215 220
Lys Ile Lys Lys Ala Tyr Cys Pro Ala Gly vai vai Glu Gly Asn Pro225
230
235
240
Ile Met Glu Ile Ala Lys Tyr Phe Leu Glu Tyr Pro Leu Thr Ile Lys245 250 255
Arg Pro Glu Lys Phe Gly Gly Asp Leu Thr Val Asn Ser Tyr Glu Glu260 265 270
Leu Glu Ser Leu Phe Lys Asn Lys Glu Leu His Pro Met Asp Leu Lys275 280 285
Asn Ala Val Ala Glu Glu Leu Ile Lys Ile Leu Glu Pro lie Arg Lys290 295 300
Arg Leu305
<210> 10<211> 306<212> PRT
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> Seqüência de aminoácido do clone 7 da p-azido-L-fenilalaninaaminoacil-tRNA sintetase (derivada da tirosil-tRNA sintetaseselvagem de Methanococcus jannaschii)
<400> 10
Met Asp Glu Phe Glu Met Ile Lys Arg Asn Thr ser Glu lie lie Ser1 5 10 15
Glu Glu Glu Leu Arg Glu vai Leu Lys Lys Asp Glu Lys Ser Ala Leu20 25 30
Ile Gly Phe Glu Pro Ser Gly Lys lie His Leu Gly His Tyr Leu Gln35 40 45
Ile Lys Lys Met Ile Asp Leu Gln Asn Ala Gly Phe Asp Ile Ile Ile50 55 60
Leu Leu Ala Asp Leu His Ala Tyr Leu Asn Gln Lys Gly Glu Leu Asp65 70 75 80
Glu lie Arg Lys lie Gly Asp Tyr Asn Lys Lys vai Phe Glu Ala Met85 90 95
Gly Leu Lys Ala Lys Tyr vai Tyr Gly Ser Pro Phe Gln Leu Asp Lys100 105 110Asp Tyr Thr Leu Asn Val Tyr Arg Leu Ala Leu Lys Thr Thr Leu Lys115 * 120 125
Arg Ala Arg Arg Ser-Met Glu Leu Ile Ala Arg Glu Asp Glu Asn Pro130 135 140
Lys vai Ala Glu Val Ile Tyr Pro Ile Met Gln Val Asn Gln Ile His145 150 155 160
Ser ser Gly Val Asp Val Ala Val Gly Gly Met Glu Gln Arg Lys Ile165 170 175
His Met Leu Ala Arg Glu Leu Leu Pro Lys Lys Val Val Cys Ile His180 185 190
Asn Pro vai Leu Thr Gly Leu Asp Gly Glu Gly Lys Met ser ser Ser195 200 205
Lys Gly Asn Phe Ile Ala Val Asp Asp Ser Pro Glu Glu Ile Arg Ala210 215 220
Lys Ile Lys Lys Ala Tyr Cys Pro Ala Gly vai Val Glu Gly Asn Pro225 230 235 240
Ile Met Glu Ile Ala Lys Tyr Phe Leu Glu Tyr Pro Leu Thr Ile Lys245 250 255
Arg Pro Glu Lys Phe Gly Gly Asp Leu Thr vai Asn Ser Tyr Glu Glu260 265 270
Leu Glu Ser Leu Phe Lys Asn Lys Glu Leu His Pro Met Asp Leu Lys275 280 285
Asn Ala vai Ala Glu Glu Leu Ile Lys Ile Leu Glu Pro Ile Arg Lys290 295 300
Arg Leu305
<210> 11
<211> 10
<212> PRT
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> Peptideo pIII de fusão ligante de estreptavidina (SBP)
<220>
<221> MISC_FEATURE<222> (3D..C3)
<223> χ é um aminoácido não natural
<400> 11
Ala Gly Xaa Thr Leu Leu Ala His Pro Gln1 5 10
<210> 12
<211> 39
<212> DNA
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> Primer de PCR FTl8
<400> 12
gacagcttat catcgatgag acgttgatcg gcacgtaag 39
<210> 13
<211> 40
<212> DNA
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> Primer de PCR FTl 9
<400> 13
ggttggtttg cgcattcagc gctaaccgtt tttatcaggc 40
<210> 14
<211> 25
<212> DNA
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> Primer FT121
<400> 14
catgcccggg tacctttcta ttctc 25
<210> 15<211> 79<212> DNA
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> Molde FT126
<400> 15
catgtttcgg ccgagccccc accctgcgga tgagccagca aagtctagcc ggcagagtga 60gaatagaaag gtacccggg 79

Claims (25)

1. Fago, CARACTERIZADO por compreender um polipep-tideo, o citado polipeptideo compreendendo pelo menos um re-síduo de aminoácido não natural aril-azida modificado pós-traducionalmente, onde o citado resíduo de aminoácido nãonatural aril-azida modificado pós-traducionalmente é produ-zido pela reação de ligação de Staudinger.
2. Fago, de acordo com a reivindicação 1,CARACTERIZADO pelo fato do citado fago ser viável.
3. Fago, de acordo com a reivindicação 1,CARACTERIZADO pelo fato do citado fago ser um fago filamen-toso.
4. Fago, de acordo com a reivindicação 1,CARACTERIZADO pelo fato do citado fago ser um fago derivadode M13.
5. Fago, de acordo com a reivindicação 1,CARACTERIZADO pelo fato do citado polipeptideo ser um poli-peptideo de fusão.
6. Fago, de acordo com a reivindicação 5,CARACTERIZADO pelo fato do citado polipeptideo de fusão com-preender uma seqüência de reconhecimento de protease ligantede peptídeo especificamente clivável por uma protease de sí-tio específico.
7. Fago, de acordo com a reivindicação 6, CARACTERIZADO pelo fato da citada protease de sítio especí-fico ser selecionada de fator Xa, fator XIA, Kallikvein,trombina, fator XIIa, colagenase e enteroquinase.
8. Fago, de acordo com a reivindicação 1,CARACTERIZADO pelo fato do citado resíduo de aminoácido nãonatural aril-azida ser um resíduo de para-azido-L-fenilalanina.
9. Fago, de acordo com a reivindicação 1,CARACTERIZADO pelo fato do citado fago ser imobilizado a umsuporte sólido.
10. Pluralidade de fagos, CARACTERIZADOS por seremde acordo com a reivindicação 1.
11. Pluralidade de fagos, de acordo com a reivin-dicação 1, CARACTERIZADOS pelo fato da citada pluralidade defagos expressar uma pluralidade de diferentes polipeptídeos.
12. Pluralidade de fagos, de acordo com a reivin-dicação 11, CARACTERIZADOS pelo fato da citada pluralidadede fagos compreender uma biblioteca expressa em fagos.
13. Fago, de acordo com a reivindicação 1,CARACTERIZADO pelo fato do citado fago ser purificado ou i-solado.
14. Método para produzir um fago modificado pós-traducionalmente, o método sendo CARACTERIZADO por compreen-der:(a) o fornecimento de um fago compreendendo um po-lipeptídeo, o citado polipeptídeo compreendendo pelo menosum resíduo de aminoácido não natural aril-azida; e(b) a reação do citado fago sob condições onde ocitado resíduo de aminoácido não natural sofre modificaçãocovalente, onde as citadas condições compreendem uma reaçãode ligação de Staudinger, produzindo assim um fago modifica-do pós traducionalmente.
15. Método, de acordo com a reivindicação 14,CARACTERIZADO pelo fato do citado fago modificado pós-traducionalmente produzido pelo citado método ser viável.
16. Método, de acordo com a reivindicação 14,CARACTERIZADO pelo fato do citado pelo menos um resíduo deaminoácido não natural aril-azida ser um resíduo de para-aζido-L-fenilalanina .
17. Método, de acordo com a reivindicação 14,CARACTERIZADO pelo fato da citada etapa de fornecimento com-preender:(i) o fornecimento de uma célula hospedeira de eu-bactéria compreendendo:A) uma molécula de ácido nucléico codificando ocitado fago, citada molécula de ácido nucléico compreendendouma subseqüência de polinucleotídeo codificando o citado po-lipeptídeo, a citada subseqüência de polinucleotídeo compre-endendo pelo menos um códon seletor;B) uma molécula de ácido nucléico codificando umaaminoacil-tRNA sintetase que é ortogonal na citada célulahospedeira (O-RS);C) uma molécula de ácido nucléico codificando umtRNA que é ortogonal na citada célula hospedeira (0-tRNA),onde a citada O-RS preferencialmente aminoacila o citado 0-tRNA com o citado aminoácido não natural na citada célulahospedeira e onde o citado códon seletor é reconhecido pelocitado 0-tRNA; eD) um aminoácido não natural aril-azida; e(ii) a cultura da citada célula hospedeira, produ-zindo assim um polipeptideo codificado pela citada subse-qüência de polinucleotideo, onde o citado aminoácido não na-tural aril-azida é incorporado no citado polipeptideo duran-te a tradução em resposta ao códon seletor, e a produção deum fago compreendendo um polipeptideo codificado pela citadasubseqüência de polinucleotideo, onde o citado aminoácidonão natural aril-azida é incorporado no citado polipeptideo.
18. Método, de acordo com a reivindicação 17,CARACTERIZADO pela citada etapa de fornecimento compreendero fornecimento de uma célula hospedeira de E coli.
19. Método, de acordo com a reivindicação 17,CARACTERIZADO pela citada etapa de fornecimento compreendero fornecimento de uma célula hospedeira de eubactéria com-preendendo uma molécula de ácido nucléico codificando uma O-RS, onde a citada O-RS é derivada de uma aminoacil-tRNA sin-tetase de Methanococcus jannaschii.
20. Método, de acordo com a reivindicação 17,CARACTERIZADO pela citada etapa de fornecimento compreendero fornecimento de uma célula hospedeira de eubactéria com-preendendo uma molécula de ácido nucléico codificando uma 0-RS, onde a citada O-RS é derivada de uma tirosil-tRNA sinte-tase de Methanococcus jannaschii.
21. Método, de acordo com a reivindicação 17,CARACTERIZADO pela citada etapa de fornecimento compreendero fornecimento de uma célula hospedeira de eubactéria com-preendendo uma molécula de ácido nucléico codificando um 0-tRNA, onde o citado 0-tRNA é um tRNA supressor de âmbar.
22. Fago viável, CARACTERIZADO por compreender umpolipeptideo, o citado polipeptídeo compreendendo pelo menosum resíduo de aminoácido não natural modificado pós-traducionalmente.
23. Fago viável, de acordo com a reivindicação 22,CARACTERIZADO pelo fato do citado resíduo de aminoácido nãonatural modificado pós-traducionalmente ser um resíduo deaminoácido não natural aril-azida.
24. Fago viável, de acordo com a reivindicação 22,CARACTERIZADO pelo fato do citado resíduo de aminoácido nãonatural modificado pós-traducionalmente ser um resíduo depara-aζido-L-fenilalanina.
25. Fago viável, de acordo com a reivindicação 22,CARACTERIZADO pelo fato do citado resíduo de aminoácido nãonatural modificado pós-traducionalmente ser produzido poruma reação de ligação de Staudinger.
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