BRPI0617496A2

BRPI0617496A2 - gene de proteÍna de cristal inseticida isolado de bacillus thuringiensis, constructo de dna recombinante, microorganismo e proteÍna de cristal inseticida de bacillus thuringiensis

Info

Publication number: BRPI0617496A2
Application number: BRPI0617496-5A
Authority: BR
Inventors: Ming Sun; Ziniu Yu; Shouwen Chen; Zhenyu Zhang; Lifang Ruan; Suxia Guo; Jingyuan Dai; Lin Li; Ziduo Liu
Original assignee: Univ Huazhong Agricultural
Priority date: 2005-10-17
Filing date: 2006-10-17
Publication date: 2011-07-26
Also published as: CN100510081C; US7838293B2; CN101292035A; EP1937818A4; CA2624158A1; ZA200802283B; AU2006303767A1; WO2007045160A1; JP2009511075A; EP1937818A1; MX2008004990A; CN1952151A; CN101292035B; US20090130758A1

Abstract

<B>GENE DE PROTEÍNA DE CRISTAL INSETICIDA ISOLADO DE BACILLUS THURINGIENSIS, CONSTRUCTO DE DNA RECOMBINANTE, MICROORGANISMO E PROTEÍNA DE CRISTAL INSETICIDA DE BACILLUS THURINGIENSIS<D>A presente invenção refere-se ao isolamento, clonagem e uso dos genes das proteínas de cristal inseticidas de Baclilus thuringiensis. A presente invenção isola um novo gene da proteína de cristal inseticida cry7Bal de B. thuringiensis, subespécie huazhongensis, cepa YBT-978, e o referido gene codifica uma nova proteína de cristal inseticida cry7Bal, a qual apresenta atividade inseticida contra insetos Lepidoptera. A presente invenção também descreve a seqúência gênica da nova proteína de cristal inseticida, usa vetores de expressão adequados para transformar microorganis- mos de forma a expressar o produto Cry7Bal codificado pelo gene e faz isso exercer a atividade inseticida da proteína contra pestes Lepidoptera.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "GENE DEPROTEÍNA DE CRISTAL INSETICIDA ISOLADO DE BACILLUS THURINGI-ENSIS, CONSTRUCTO DE DNA RECOMBINANTE, MICROORGANISMO EPROTEÍNA DE CRISTAL INSETICIDA DE BACILLUS THURINGIENSIff'.

Campo da invenção

A presente invenção refere-se à engenharia genética de micro-organismo. Particularmente, a presente invenção refere-se à separação eclonagem de proteínas de cristais inseticidas de Bacillus thuringiensis. Apresente invenção refere-se à engenharia genética de pesticidas biológicos.

Antecedentes da invenção

O Bacillus thuringiensis é uma bactéria formadora de endosporogram-positiva, em forma de bastão, a qual existe vastamente em vários ambi-entes ecológicos. Durante a fase formadora de esporos, a B. thuringiensis for-ma formas de paraesporal consistindo em Proteínas de Cristal Inseticidas(ICPs), as quais têm toxicidade específica contra insetos e atividades biológicasespecíficas para mais de 500 espécies de insetos em 10 ordens pertencendo àclasse Insecta, incluindo Lepidoptera, Diptera, Coleoptera, Hymenoptera, Ho-moptera etc, assim como até algumas espécies nocivas em Protozoa, Nema-tomorpha, Platyhelminthes (Schnepf, HE., Crickmore, N., Rie, J. V, Lereclus, D.,Baum, J., Feitelson, J., Zeigler, D. R. & Dean, D. H. 1998. Bacillus thuringiensisand its pesticidal crystal proteins. Microbiol Mol Biol Rev 62, 775-806).

Cepas selvagens de B. thuringiensis tipicamente têm genes quecodificam proteínas de cristais inseticidas e cada cepa geralmente tem múl-tiplas cópias dos referidos genes. Schnepf et al clonou o primeiro gene codi-ficando uma proteína de cristal inseticida em 1981 a partir de B. thuringien-sis, subespécie kurstaki, cepa HD1 e deduziu a seqüência de aminoácidosda primeira proteína de cristal inseticida de B. thuringiensis baseando-se naseqüência de bases de DNA (Schnepf HE, Wong HC, Whiteley HR. The a-mino acid sequence of a crystal protein from Bacillus thuringiensis deducedfrom the DNA base sequence. J Biol Chem. 25 de maio de 1985; 260 (10):6264 - 6272.). Depois disso, novos genes codificando proteínas de cristal deinseticida foram ativamente procuradas juntamente com estudos de B. thu-ringiensis. Muitos novos genes codificando proteínas de cristal inseticida fo-ram identificados, clonados e seqüenciados. Conseqüentemente, em 1995, oComitê de Nomenclatura de Proteína de Cristal Inseticida de B. thuringiensisfoi fundado por estudiosos, incluindo Crickmore no Encontro Anual da Soci-edade de Patologia Invertebrada (Annual Meeting of the Society for Inverte-brate Pathology). Em 1996, um novo sistema de classificação para as prote-ínas de cristal inseticidas de B. thuringiensis baseado na homologia das se-qüências de aminoácidos foi formalmente proposto, e regras de nomenclatu-ra e o princípio para a classificação foram estabelecidos, em que eles estipu-lam que: o gene cry é um gene inseticida da proteína de cristal paraesporalcodificante de B. thuringiensis, ou qualquer gene que tenha uma similaridadede seqüência óbvia em relação a um gene cry conhecido; o gene cry é umgene codificando uma proteína de cristal paraesporal de B. thuringiensis queexibe atividade hemolítica, ou qualquer gene codificando uma proteína quetenha similaridade de seqüência óbvia em relação a uma proteína Cyt co-nhecida. Eles são classificados em 4 graus, baseando-se na homologia daseqüência de aminoácidos deduzida do gene de comprimento total. Os limi-tes entre cada grau representam aproximadamente 95%, 78% e 45% de i-dentidade de seqüência. Os genes da proteína de cristal inseticida são clas-sificados em 4 graus. Por volta de agosto de 2005, a quantidade de genesde proteínas de cristal inseticidas de Bacillus thuringiensis alcançou 319,representando variedades de 48 tipos (Crickmore, N., D. R. Zeigler, J. Feitel-son, E. Schnepf, J. VanRie, D. Lereclus, J. Baum e D. H. Dean. 1998. Revi-sion of the nomenclature for the Bacillus thuringiensis pesticidal crystal prote-ins. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62: 807-813; vide, por exemplo, o sítio da in-ternet em lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/index.html na redemundial de computadores).

No início, pesticidas baseados em B. thuringiensis são produzi-dos com cepas selvagens testadas. Com o avanço da biologia molecular, aspessoas gradualmente alteraram as cepas selvagens por instrumentos deengenharia genética. Ao mesmo tempo, as pessoas mantiveram a transfor-mação de genes de proteínas de cristais inseticidas de B. thuringiensis emvegetais e têm produzido plantas transgênicas que são resistentes às pestesda agricultura.

Entretanto, com o desenvolvimento de pesticidas de B. t. e como uso crescente desses pesticidas, a resistência em pestes alvejadas temsido continuamente descoberta pelos cientistas. Os estudiosos estudaramextensivamente a resistência contra pesticidas B. t. em pestes alvejadas.Proteínas de cristal inseticidas de Bacillus thuringiensis têm que passar peloseguinte processo para produzir os efeitos inseticidas: a solubilização doscristais e a ativação dos cristais de protoxina, a ligação dos fragmentos detoxina aos receptores nos revestimentos epiteliais no mesentério e a inser-ção na membrana para criar poros, em que o espectro de atividade e a toxi-cidade dependem principalmente no reconhecimento e na interação dosfragmentos de toxina com os receptores específicos nos revestimentos epi-teliais no mesentério dos insetos. Além disso, o desenvolvimento da resis-tência contra os pesticidas B. t. em insetos está intimamente relacionadocom o reconhecimento e com a ligação ao receptor de pesticida. Conse-qüentemente, a clonagem e a aplicação de novos, especialmente de genesnovos de proteínas de cristal de inseticidas tem se tornado a chave paraprevenir e controlar a resistência contra os pesticidas B. t. naspestes alveja-das e a questão central nas várias estratégias de controle de insetos. Nosanos recentes, a busca e a clonagem de novos genes de proteínas de cristalinseticida tem se tornado a área mais ativa no estudo de B. thuringiensis. Asignificância da presente invenção se baseia nisso. Na China, uma novasubespécie, a cepa YBT-978, a qual é uma subespécie de B. thuringiensis,foi separada e caracterizada em 1996, a qual pertence à subespécie hua-zhongensis, sorotipo H40 (para a fonte da cepa, por favor se referir a Dai Jet al. 1996. Bacillus thuringiensis subsp. huazhongensis, serotype H40, isola-ted from soils in the People' s Republic of China. Letters in Applied Microbio-logy. 22(1): 42-45). Foi descoberto que as proteínas de cristais paraesporaistêm uma atividade inseticida altamente eficiente em relação aos insetos, in-cluindo Plutella xylostella através da extração das referidas proteínas de cris-tal paraesporais e submetendo aos bioensaios.Conteúdos da invenção

O objetivo da presente invenção é isolar e clonar os genes dasproteínas de cristais inseticidas com alta potência tóxica a partir de B. thurin-giensis, e proporcionar um uso para os mesmos.

O esquema técnico da presente invenção é conforme mostradona figura 1.

Para alcançar o objetivo acima mencionado, a presente inven-ção isola de Bacillus thuringiensis subsp. huazhongensis, sorotipo H40, cepaYBT-978 (para a fonte da cepa, favor se referir a Dai J et al. 1996. Bacillusthuringiensis subsp. huazhongensis, serotype H40, isolated from soils in thePeople' s Republic of China. Letters in Applied Microbiology. 22(1): 42-45)um novo gene de proteína cristal inseticida, a região codificadora da qualconsiste em 3465 bases e tem uma seqüência de nucleotídeos mostrada naSEQ ID NO: 1. O gene cry7Ba1 da presente invenção codifica uma proteínacry7Ba1, a qual consiste em 1154 resíduos de aminoácidos e tem uma se-qüência de aminoácidos conforme mostrada na SEQ ID NO: 2. O genecry7Ba1 da presente invenção é expresso em microorganismos como a pro-teína Cry7Ba1, a qual possui atividade inseticida contra insetos da ordemLepidoptera.

A mais alta homologia entre a proteína Cry7Ba1 da presente in-venção e qualquer uma das proteínas a qual foi descrita é de 58,2%. Alémdisso, a homologia mais elevada entre a seqüência da metade N-terminal daproteína Cry7Ba1 da presente invenção (aminoácido 1 ao 658 da seqüênciade aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 2) e qualquer uma das proteínasque foram descritas é de 37,1%.

A presente invenção proporciona a seqüência de genes anteri-ormente mencionada, a qual é um novo gene de proteína de cristal inseticidacom atividade inseticida. O referido gene pode ser usado na transformaçãode microorganismos e/ou vegetais para conceder atividade inseticida contrapestes da Lepidoptera, assim como para superar e retardar a resistência naspestes contra inseticidas geneticamente projetados e plantas transgênicas.

As seguintes descrições e exemplos descrevem a solução técni-ca em maiores detalhes:

Deve ser notado que os procedimentos padrões e os reagentesusados no DNA estão de acordo com o "Guide for Molecular Cloning Expe-riments" (referência a J. Sambrook et al (2002). Molecular Cloning: A Labo-ratory Manual. 3- edição. Traduzida por Jin Dong - yan et al. Science Press.Beijing).

1. O seqüenciamento dos aminoácidos N-terminais da proteínade cristal Cry7Ba1 em B. thuríngiensis YBT-978.

A presente invenção usa B. thuríngiensis YBT-978 como umacepa de fonte para a proteína de cristal de inseticida Cry7Ba1. B. thuríngien-sis YBT-978 é uma cepa padrão de B. thuríngiensis, sorotipo H40, a fonte daqual foi citada em Dai J et al. 1996. A cepa pode formar os cristais em formade rombo típicos, e o peso molecular do componente principal da proteínade cristal Cry7Ba1 é de cerca de 130 KDa. Os passos específicos para oseqüenciamento da seqüência de aminoácidos N-terminal de Cry7Ba1 sãoos seguintes:

(1) A cultura de cepas bacterianas e a manipulação da cultura

B. thuríngiensis YBT-978 é inoculada em 5 ml_ de LB (NaCI 1%,peptona 1%, extração de levedura 0,5%, pH 7,0) usando uma alça de inocu- lação sob condições estéreis e é incubada de um dia para o outro a 309C emum agitador a 200 rpm. A seguir, 350 μί da cultura são transferidos sobcondições estéreis para 35 mL de meio de cultura ICPM (peptona 0,6%, gli-cose 0,5%, CaCO3 0,1%, MgS04.7H20 0,1%, KH2PO4 0,05%, pH 7,0) e sãoincubados a 309C em um agitador a 200 rpm até as gemas e os cristais pa-raesporais se desprenderem completamente. A cultura é coletada e é centri-fugada por 1 minuto a 8000 rpm. Descartar o sobrenadante. Usar solução deNaCI 0,5% e água deionizada esterilizada para rinsar os precipitados por 3vezes separadamente.

(2) A eletroforese SDS-PAGE das proteínas do cristal e a trans-ferência da membrana de "blotting" PVDF.

Ressuspender os precipitados rinsados em água deionizada emuma proporção de precipitados.água deionizada = 1:5 v/v, e adicionar emum volume igual de tampão de carga 2x. Misturar e, a seguir, incubar em umbanho em ebulição por 3 a 5 minutos, centrifugar a 12000 rpm por 5 minutose efetuar a eletroforese SDS-PAGE no sobrenadante. Para a formulação dotampão de carga 2x e o procedimento para efetuar a eletroforese SDS-PAGE, favor se referir ao método citado por Laemmli (Laemmli, RU. 1970.Digestion of structural proteins during the assembly of the head of bacterio-phage T4. Nature (Londres) 227: 680-685).

A seguir, as amostras de proteína no gel são transferidas parauma membrana PVDF usando Trans- Blot SD Semi-Dry Transfer Cell (BIO-RAD) usando o método padrão (vide Cook RG. 1994. Amino acid sequenceanalysis of blotted proteins, p. 207-220. em. B. S. DunBar (ed.), Protein Blot-ting: A practical approach. Oxford University Press, Nova Iorque).

3) Determinação da seqüência de aminoácidos N-terminal daproteína de cristal

O uso de um seqüenciador de aminoácidos N-terminais da pro-teína (número do modelo: ABI 491 Protein Sequence, ABI Procise) para se-qüenciar a seqüência de aminoácidos N-terminal. O seqüenciamento resultano N-terminal-MDIRNQNKYEVVYPA-C-terminal (SEQ ID NO: 3).

2. Aquisição do fragmento de DNA da extremidade 5' da se-qüência do gene da proteína de cristal inseticida cry7Ba1

Efetuar a amplificação usando PCR de ligação ao adaptador. Osprincípios e passos do PCR de ligação ao adaptador foram descritos em S-lebert P. D. et al. (Slebert P D et al. 1995. An improved PCR method for wal-king in uncloned genomic DNA. Nucleic Acids Research 23 : 1087-1088). Ospassos específicos são os seguintes:

1) Extração de DNA total de B. thuringiensis YBT-978.

B. thuringiensis YBT-978 é inoculado em 5 mL de meio de cultu-ra LB usando uma alça de inoculação sob condições estéreis e é cultivadade um dia para o outro a 30-C em um agitador a 200 rpm. A seguir, 50 μl dacultura são transferidos sob condições estéreis para 5 mL de meio de culturaLB fresco e incubados sob as mesmas condições até a fase de crescimentologarítmico. Coletar as bactérias depois da centrifugação a 5000 rpm por 3minutos. Rinçar uma vez com 1 mL de STE. Adicionar 100 μL. de solução I e10 μL de Iisozima (50 mg/mL) e permitir a ação por 30 minutos ou mais. Adi-cionar 200 μL de SDS 2% e incubar com um banho-maria a 50 a 60QC por30 minutos. Adicionar 200 μL de NaCI 5 mols/L e misturar. Adicionar 500 μLde fenol/clorofórmio/álcool isopentílico (25:24:1 v/v) e centrifugar por 5 minu-tos a 12000 rpm. Coletar o sobrenadante e repetir a extração uma ou duasvezes. Transferir a solução de DNA da camada superior para tubos Eppen-dorf e, a seguir, adicionar volumes iguais de etanol 95%. Ajustar em tempe-ratura ambiente por 5 minutos e, a seguir, centrifugar por 5 minutos a 12000rpm. Usar 200 μL de etanol 70% para rinsar os precipitados uma vez e liofili-zar os precipitados, a seguir dissolver os precipitados Iiofilizados em 50 μLde solução TE.

2) Digestão enzimática do DNA total com endonuclease de res-trição e ligação com adaptador

(1) Permitir que o DNA total preparado de Bacillus thuríngiensisseja enzimaticamente digerido pela enzima Hpal a 37-C de um dia para o ou-tro (o sistema de digestão enzimática é 50 μL compreendendo cerca de 1 μgdo DNA total); (2) Adicionar 50 μl de produto de digestão enzimática em 250μL de fenol:clorofórmio:álcool isopentílico (25:24:1 v/v), centrifugar a 12000rpm por 5 minutos, transferir a camada superior da solução de DNA para tu-bos Eppendorf, adicionar volumes iguais de 95% de etanol, ajustar em tempe-ratura ambiente por 5 minutos e, a seguir, centrifugar a 12000 rpm por 5 minu-tos. O precipitado é rinsado com 200 μL de etanol 70% uma vez e Iiofilizado edissolvido em 50 μΐ_ de água esterilizada; (3) misturar volume igual de adap-tadores longos e curtos (50 μΜ) (a seqüência do adaptador longo é: 5GCTCGAGTCGACCGTGGTACGCGTGTGTGAGCTCCCGGGAT CCGGT-3'(SEQ ID NO: 4); a seqüência do adaptador curto é 5 ACCGGATC-NH2-3')para produzir 4 μL de solução, a qual é incubada a 70°C por 10 minutos; (4) 4μL de solução adaptadora (25 μΜ), 10 μl da solução do produto de digestãoenzimática de DNA total (contém cerca de 0,5 μg de DNA), 8U T4 ligase, 2 μl.de tampão de ligase T4 e adicionar água para fazer 20 μl de sistema. Ligar a16°C por 12 horas; (5) depois de aquecer a 60°C por 5 minutos, o sistema deligação usado como um molde para amplificação por PCR;

3) PCR aninhado e seqüenciamento

Dois ciclos de amplificação por PCR são executados com o pro-duto de ligação anteriormente mencionado.

Baseado na seqüência de aminoácidos N-terminal seqüenciada,iniciadores específicos de genes sintéticos, os quais são abreviados como130P1 e 130P2 são designados. Além disso, iniciadores de adaptadores sin-téticos abreviados como AP1 e AP2 são projetados baseando-se na seqüên-cia do adaptador longo. As seqüências dos iniciadores são as seguintes:130PI: 5-ATGGATATHMGNAATCARAAYAARTAYG-3 (SEQ EDNO: 5)

NO: 6)130P2: 5-AATAAATATGARGTWGTNTAYCCNGC-3 (SEQ ID

AP1: 5-GCTCGAGTCGACCGTGGTA-3 (SEQ ID NO: 7)AP2: 5-GTACGCGTGTGTGAGCTCC-3 (SEQ ID NO: 8)(H=A, C ou T; M-A ou C; N=A, G, C ou T; R=A ou G; Y=C ou T;W=A ou T)

(A) Primeiro ciclo de PCR. 25 μL de sistema reacional contém:2,5 μL 10 χ tampão de reação de PCR, 1 μL de dNTP (2,5 mM cada), 0,5 μL

20 de iniciador adaptador AP1 (20 mM), 0,5 μL de iniciador específico 130P1(20 mM), 1 μL de molde (o produto de ligação acima), 0,5 μL de enzima Ex-Taq. Adicionar água deionizada esterilizada para completar para 25 μL. AScondições de PCR são: 94eC, 1 minuto para 1 ciclo; 94QC, 1 minuto, 529C, 1minuto, 729C, 1,5 minuto por 25 ciclos; 72-C, 5 minutos por 1 ciclo. O produ-to de PCR do primeiro ciclo é diluído 50 vezes para fornecer o molde de am-plificação para o segundo ciclo de PCR.

(B) Segundo ciclo de PCR. 50 μL de sistema reacional contém: 5μL 10 χ tampão reacional de PCR, 2 μL. de dNTP (2,5 mM cada), 1 μL deiniciador adaptador AP2 (20 mM), 1 μL de iniciador específico 130P2 (20

30 mM), 1 μL de molde (o produto do primeiro ciclo do PCR), 1 μL de enzimaExTaq. Adicionar água deionizada esterilizada para completar para 50 μL.As condições de reação de PCR são as mesmas que as anteriormente men-cionadas, exceto que a temperatura de anelamento é dè 56°C.

(C) Os produtos do segundo ciclo de PCR são recuperados pelokit de recuperação do produto de PCR (comprado da Veta-Gene Company) esão, a seguir, ligados ao vetor Τ. O produto de ligação é usado para transfor-mar E.DH5α de E. coli. Efetuar a amplificação por PCR para fazer a varredurados transformantes pelo uso de AP2 e 130P2 como iniciadores e usando bac-téria de colônia individual como o molde. E seqüenciar os fragmentos exóge-nos no vetor T transformante positivo. O resultado do seqüenciamento é aseqüência entre a posição 19 e 491 do nucleotídeo na SEQ ID NO: 1.

Iniciadores específicos, abreviados como 130S1 e 130A1-2 sãoprojetados baseando-se no resultado do seqüenciamento acima. Eles sãousados para varrer a biblioteca genômica BAC contendo o gene para a pro-teína de cristal e vários transformantes positivos, e o tamanho do produto deamplificação é de 434 pb. As seqüências dos iniciadores são:

130S1-2: TTCTA ATAC A AC ATC A A AG TATCC ACTC (SEQ IDN0:9)

130A1-2: GGTATCGTTCCAATACTAATTCTAAAC (SEQ ID NO:10)

3. A clonagem do gene da proteína de cristal inseticida cry7Ba1de B. thuringiensis YBT-978.

1) Construção da biblioteca BAC genômica da cepa bacterianade B. thuringiensis YBT-978.

Usar o vetor da biblioteca BAC pBeloBAC11 (conforme mostradona figura 2) para construir a biblioteca BAC genômica de B. thuringiensisYBT-978 de acordo com o método descrito por Luo e Wing (2003) (referên-cia a Luo e Wing, 2003. Um método melhorado para a construção da biblio-teca BAC vegetal, p. 3 a 19. Em Grotewold, Erich, Plant functional genomic:methods and protocols. Scientific and medicai publishers,/Humana Press,Totowa, EUA). Isto é, B. thuringiensis YBT-978 é deixada crescer em meiode cultura LB até o meio da fase de crescimento logarítmica, e a seguir abactéria é coletada por centrifugação a 10000 rpm por 1 minuto em tubos decentrifugação de 50 mL limpos e esterilizados. Adicionar 1 mL de tampão TE(EDTA 1 mM, base Tris 10 mM, pH 8,0) nas bactérias coletadas, o qual é aseguir levemente disperso em um vibrador. Adicionar cerca de 40 ml_ detampão TE, ajustar para 5 minutos e coletar as bactérias por centrifugação a10000 rpm por 1 minuto. Colocar um tubo de centrifugação de 50 ml_ con-tendo as bactérias em água quente a 50QC e adicionar 1,5 mL de TE25S(sacarose 0,3 M, EDTA 25 mM, Base tris 25 mM, pH 8,0), a seguir misturarbem e adicionar 1,5 mL de gel aquecido 2% (o qual é um gel de baixo pontode fusão e especializado para fazer blocos embutidos, 0,1 g do referido gel édissolvido em 5 mL de TE25S). Misturar bem usando uma autopipeta e adi-cionar a mistura em moldes para fazer os blocos embutidos, os quais são, aseguir, esfriados em um refrigerador a 4QC para ajustar os blocos embutidos.Os passos remanescentes, os quais incluem a digestão enzimática de YBT-978 nos blocos embutidos por Hindlll e a recuperação dos produtos de di-gestão enzimáticos, a preparação do vetor da biblioteca BAC pBeloBAC11, a ligação dos produtos de digestão enzimáticos nos vetores e a qualificaçãodas bibliotecas BAC e DH10B transformadas são idênticos aos métodos re-portados por Luo e Wing (2003).

2) Varredura da biblioteca genômica BAC e clonagem do geneda proteína de cristal de inseticida cry7Ba1.

(A) Varredura da biblioteca genômica BAC

A amplificação por PCR é executada pelo uso de 130S1 e130A1 como iniciadores e usando uma bactéria de colônia individual da bi-blioteca BAC como o molde. O sistema reacional é de 25 μί, a formulaçãodo qual é idêntica à anteriormente mencionada. As condições reacionais são as mesmas das anteriormente mencionadas, exceto que a temperatura deanelamento é de 559C. O clone positivo EMB0491 é selecionado. O extratodo plasmídeo recombinante pBMB0491 de acordo com o método descritopor J. Sambrook et al (J. Sambrook et al (2002). Molecular Cloning: A Labo-ratory Manual. 3- edição. Traduzida por Jin Dong-yan et al. Science Press. Beijing). O resultado da digestão enzimática indica que pBMB0491 contémum fragmento de cerca de 60 Kb do genoma YBT-978.

(B) Aquisição do gene da proteína de cristal inseticida cry7Ba1Usar Hindlll para completar a digestão enzimática do fragmentogenômico YBT-978 nos clones positivos. O produto de digestão enzimática éligado com o vetor de clonagem pUC18 (vide figura 3) o qual é tambémcompletamente enzimaticamente digerido por Hindlll. E o produto de ligaçãoé usado para transformar E. coli. DH5oc. Os iniciadores numerados como130S1-2 e 130A1-2 são novamente usados como iniciadores e a bactéria decolônia individual transformante é usada como molde para efetuar a amplifi-cação por PCR para varrer o transformante positivo EMB0493. O plasmídeorecombinante do extrato pBMB0492 de EMB0493. O resultado da digestãoenzimática indica que pBMB0492 contém um fragmento de cerca de 16 Kbdo genoma YBT-978. A análise adicional mostrou o gene da proteína de cris-tal inseticida cry7Ba1 se localiza no fragmento Xhol de 5 Kb.

(C) Análise da seqüência no gene da proteína de cristal insetici-da cry7Ba1 e da proteína de cristal inseticida Cry7Ba1.

Analisar a seqüência de nucleotídeos do fragmento Xhol de 5 Kbno qual o gene da proteína de cristal inseticida cry7Ba1 se localiza e obteruma seqüência compreendendo 5235 pb, em que 3465 pb são a região codi-ficadora. A seqüência codificante é mostrada como SEQ ID NO: 1.

A referida seqüência codificante pode codificar um polipeptídeoconsistindo em 1154 aminoácidos, isto é, a proteína de cristal inseticidaCry7Ba1, o peso molecular da qual é deduzido como sendo 130558 Da.

Buscando e comparando esse polipeptídeo com seqüências deaminoácidos de outras proteínas Cry e Cyt conhecidas no banco de dadosde genes GenBank na rede em ncbi.nlm.nih.gov, descobriu-se que, dentretodas as proteínas descritas publicamente, aquela a qual está mais próximada proteína de cristal inseticida Cry7Ba1 é a proteína de cristal inseticidaCry7Ab2 (número de registro GenBank: U04368), Cry7Ab1 (número de re-gistro GenBank: U04367) e CryAaI (número de registro GenBank: M64478),com a homologia sendo 58,2%, 57,9% e 57,1%, respectivamente. A homo-Iogia da seqüência na porção N-terminal (posição do aminoácido 1 até o 658na SEQ ID NO: 2) é muito baixa, a qual é a homologia de 37,1%, 37,0% e36,4%, respectivamente. A referida metade é a parte responsável pela ativi-dade inseticida e é essencial e adequada para exercer atividade inseticida(Schnepf H E1 Crickmore N1 Rie J V, Lereclus D, Baum J1 Feitelson J1 ZeiglerD R, Dean D H. 1998. B. thuringiensis and its pesticidal crystal proteins. Mi-crobiol Mol Biol Rev, 62:775-806). Disto pode ser visto que o gene inseticidaé um novo gene inseticida. Conseqüentemente, o Comitê de Nomenclaturade Genes de B. thuringiensis Internacional nomeou o referido gene da prote-ína de cristal inseticida como cry7Ba1, o qual é determinado como sendo umgene modelo do gene cry7B. Além disso, a seqüência é altamente similar àsproteínas comuns na porção C-terminal (isto é, os aminoácidos da posição659 até a 1154 da SEQ ID NO: 2), com a homologia alcançando 87,9%,86,9% e 87,9%, respectivamente. A seqüência dessa parte é o domínio es-trutural funcional para formar o cristal paraesporal, o qual não é relevante àatividade inseticida.

Pode ser visto da análise de seqüência acima que, dentre todasas proteínas descritas, a homologia daquela a qual está mais próxima daproteína de cristal inseticida Cry7Ba1 da presente invenção é de 58,2%, aqual não excede 80%. Quando a homologia da seqüência de aminoácidosde uma certa proteína em relação à proteína cristal inseticida Cry7Ba1 exce-de 80%, ela é considerada como caindo dentro do escopo da proteína cristalinseticida Cry7Ba1 da presente invenção. Similarmente, dentre todas as pro-teínas descritas, a homologia daquela a qual está mais próxima da porçãoN-terminal (posição dos aminoácidos 1 a 58 da SEQ ID NO: 2) da proteínade cristal inseticida Cry7Ba1 da presente invenção é de 37,1%, a qual nãoexcede 50%. Quando a homologia da seqüência de aminoácidos de umaproteína em relação à metade N-terminal (aminoácidos da posição 1 a 658da SEQ ID NO: 2) da proteína de cristal inseticida Cry7Ba1 excede 50%, elaé considerada como caindo dentro do escopo da proteína de cristal insetici-da Cry7Ba1 da presente invenção.

4. Atividade inseticida da proteína de cristal inseticida Cry7Ba1de B. thuringiensis YBT-978.

O fragmento Xhol de 5 Kb, no qual cry7Ba1 se localiza é transfe-rido para o vetor de transferência "shuttle" E. coli-B. thuringiensis pHT304(vide figura 4, para origem do vetor, favor se referir a Arantes O e LereclusD. 1991. Construction of cloning vectors for B. thuringiensis. Gene 108:115-119) para produzir um plasmídeo recombinante pBMB0495 (vide figura 5).Então, pBMB0495 é transformado em um mutante acristalífero da cepa CryBde B. thuringiensis (para a origem da cepa, favor se referir a Wu D, FedericiBA. 1993. Uma proteína de 20 quilodáltons preserva a viabilidade celular epromove a formação do cristal CytA durante a esporulação em Bacilius thu-ringiensis. J. Bacteroil, 175: 5276-5280) usando um método de eletroporaçãobem-estabelecido (Wu Lan, Sun Ming, Yu Ziniu. A New Resolution Vectorwith crylAclO Gene Based on Bacillus thuringiensis Transposon Tn4430. Ac-ta Microbiologica Sinica. 2000, 40: 264-269) para produzir a bactéria recom-binante BMB-0502.

(1) Expressão da proteína de cristal inseticida Cry7Ba1.

Ativar BMB0502 pela sua incubação no meio de cultura LB (eri-tromicina pode ser adicionada em uma concentração final de 20 μg/mL) deum dia para o outro. A seguir, ela é transferida para um meio de culturaICPM (eritromicina pode ser adicionada em uma concentração final de 20μς/ηπί), incubar até a completa maturação da gema e a remoção. Coletar asbactérias e rinsá-las com NaCI 0,5% e água deionizada esterilizada separa-damente por 3 vezes. Remisturar a bactéria com água na proporção bacté-ria:água deionizada esterilizada = 1:5, a seguir adicionar um volume igual detampão de carga 2x e misturar bem. Incubar em um banho de água em ebu-lição por de 3 a 5 minutos, a seguir centrifugar a 12000 rpm por 5 minutos.Efetuar eletroforese SDS-PAGE com os sobrenadantes. Para a formulaçãodo tampão de carga 2x e o procedimento para efetuar a eletroforese SDS-PAGE1 favor se referir ao método citado por Laemmli (Laemmli, RU. 1970.Digestion of structural proteins during the assembly of the head of bacterio-phage T4. Nature (Londres) 227: 680-685). Conforme mostrado na figura 6,BMB0502 pode formar uma proteína de cristal de 130 KDa, o tamanho daqual sendo idêntico à YBT-978 da cepa de início, enquanto que o controlenegativo BMB0503 (o qual somente contém o vetor de transferênciapHT304) não forma tal banda correspondente.(2) Morfologia do cristal da proteína de cristal inseticida Cry7Ba1Ativar BMB0502 pela sua incubação no meio de cultura LB (eri-tromicina pode ser adicionada em uma concentração final de 20 μς/ιτι!.) deum dia para o outro. A seguir, é transferido para o meio de cultura ICPM (eri-tromicina pode ser adicionada em uma concentração final de 20 μg/mL), in-cubar até a quase maturação da gema e remover. Coletar as bactérias erinsá-las com água deionizada esterilizada uma vez. Remisturar as bactériascom água na proporção bactéria:água deionizada esterilizada = 1:5. Prepa-rar as amostras para microscopia eletrônica de transmissão (TEM) e embe-ber com Epon812. Fazer fatias ultrafinas, efetuar a observação da transmis-são e a tomada de fotos a 80 Κν. MBM0502 pode formar um cristal paraes-poral em forma de bipirâmide, o qual é mostrado na figura 7.

(3) Avaliação do efeito inseticida da proteína de cristal inseticidaCry7Ba1.

O efeito inseticida da proteína de cristal inseticida Cry7Ba1 éavaliado usando larvas na terceira muda de Plutella xylostella. AtivarBMB0502 pela sua incubação no meio de cultura LB (eritromicina pode seradicionada em uma concentração final de 20 μg/mL) de um dia para o outro.A seguir, ela é transferida para um meio de cultura ICPM (eritromicina podeser adicionada em uma concentração final de 20 μg/mL), incubar até as ge-mas quase maturarem e remover. Coletar as bactérias e rinsá-las com águadeionizada esterilizada uma vez para produzir uma mistura de cristal para-esporal. Efetuar o bioensaio usando um procedimento de ensaio padrão (fa-vor se referir a Shen Ju-qun, Wang Mian-ju, Yu Zi-niu (1990)). Standard Pro-cedure and Method for Bacillus thuringiensis formulations. Chinese Journalof Biological Control (Suppl.): 12-16). O bioensaio é repetido uma vez paracada uma das amostras. Calcular LC5O- Os resultados mostraram que a pro-teína de cristal inseticida Cry7Ba1 exerceu uma toxicidade muito elevadacontra Plutella xylostella (conforme mostrado na Tabela 1). Isso significa quea proteína Cry7Ba1 clonada na presente invenção mostra uma atividade in-seticida muito alta contra os insetos da ordem Lepidoptera.Tabela 1. Resultados experimentais do bioensaio da proteína Cry7Ba1 cio-<table>table see original document page 16</column></row><table>

Descrição dos desenhos

Figura 1: fluxograma técnico da presente invenção.

Figura 2: mapa de construção do vetor BAC pBleoBAC11 do e-xemplo da presente invenção.

Figura 3: mapa de construção do vetor de clonagem pUC18construído na presente invenção.

Figura 4: mapa de construção do vetor de transferência constru-ido no exemplo da presente invenção.

Figura 5: plasmídeo recombinante pBMB0495 construído no e-xemplo da presente invenção.

Figura 6: análise de eletroforese SDS-PAGE da proteína de cris-tal paraesporal Cry7Ba1 de Bacillus thuringiensis clonada na presente in-venção.

M: marcadores de peso molecular.

1. Proteína de cristal paraesporal da cepa YBT-978.

2. Proteína de cristal paraesporal da cepa BMB0502.

3. Cepa de controle BMB0503.

Figura 7: morfologia do cristal paraesporal produzido pelas ce-pas YBT-978 e BMB0502 de Bacillus thuringiensis envolvidas na presenteinvenção (o padrão da linha representa 1 μιη).A, B: morfologia do cristal paraesporal da cepa YBT-978;C, D: morfologia do cristal paraesporal da cepa BMB0502.Modalidades específicas da presente invenção

Os seguintes são exemplos apresentando a presente invenção.Deve ser notado que os exemplos somente demonstram a presente inven-ção, porém de forma alguma limitam a presente invenção. Os vários proce-dimentos experimentais envolvidos são técnicas padrões no campo da in-venção. Para os conteúdos que não são especificamente explicados, aspessoas versadas na técnica podem se referir a vários livros de referência,artigos científicos, manuais relevantes e manuais que são disponíveis antes dadata do pedido da presente invenção para executar os referidos conteúdos.

Exemplo 1. A clonagem do gene da proteína de cristal inseticida crv7Ba1 doYBT-978 de Bacillus thuringiensis

De acordo com o método descrito por Luo e Wing (2003), (referên-cia a Luo e Wing. 2003. An improved method for plant BAC Iibrary construction,p.3-19. In Grotewold1 Erich, Plant functional genomic: methods and protocols.Scientific and medicai publishers,/Humana Press, Totowa, EUA), o vetor dabiblioteca BAC pBeloBAC11 foi usado para construir a biblioteca BAC genômi-ca da cepa YBT-978 de Bacillus thuringiensis (para a fonte da cepa bacteriana,favor se referir a Bacillus thuringiensis, subsp. huazhongensis, sorotipo H40,isolated from soils in the people's republic of China. Letters in Applied Microbio-logy. 22 (1): 42-45). Os iniciadores numerados como 130S1-2 e 130A1-2 foramusados como iniciadores e a bactéria da colônia individual da biblioteca BAC éusada como o molde para efetuar a amplificação por PCR. O clone positivoEMB0491 foi selecionado. Hindlll foi usado para completar enzimaticamente adigestão do fragmento genômico YBT-978 nos clones positivos. O produto dedigestão enzimática foi ligado com o vetor de clonagem pUC18, o qual tambémfoi completamente enzimaticamente digerido por Hindlll para transformar aDH5oc de E. Coli. Os iniciadores numerados como 130S1-2 e 130A1-2 foramnovamente usados como iniciadores e a bactéria de colônia individual transfor-mante é usada como molde para efetuar a amplificação por PCR para varrer otransformante positivo EMB0493. O plasmídeo recombinante pBMB0492 foiextraído de EMB0493.

O resultado da digestão enzimática revelou que pBMB0492 con-tém um fragmento de cerca de 16 Kb do genoma YBT-978. A análise poste-rior mostrou que o gene da proteína cristal inseticida cry7Ba1 se localiza nofragmento Xhol de 5 Kb.

Exemplo 2. Análise da seoüência do gene da proteína de cristal inseticidacrv7Ba1 de YBT-978 de Bacillus thuringiensis.A seqüência do nucleotídeo do fragmento Xhol de 5 Kb1 no qualo gene da proteína de cristal inseticida cry7Ba1 se localiza, foi analisada. Oresultado foi que ela foi uma seqüência compreendendo 5235 pb, em que3465 pb foram a seqüência codificadora. A seqüência codificadora é mostra-da como a SEQ ID NO: 1.

A referida seqüência codificadora deve codificar um polipeptídeoconsistindo em 1154 aminoácidos, o peso molecular dos quais foi deduzidocomo sendo 130558 Da.

Comparando esse polipeptídeo com seqüências de aminoácidos de outras proteínas Cry e Cyt conhecidas, foi descoberto que ele estavamais próximo do Cry7Ab2, Cry7Abl e do CryAaI, com a homologia sendo58,2%, 57,9% e 57,1%, respectivamente. A homologia da seqüência na por-ção N-terminal (aminoácido da posição 1 até a 658 na SEQ ID NO: 1) foimuito baixa, com a homologia sendo 37,1%, 37,0% e 36,4%, respectivamen- te. Como o polipeptídeo foi similar à proteína do cristal inseticida Cry7A, elefoi nomeado pelo Comitê de Nomenclatura do Gene Bacillus thuringiensisInternacional como cry7Ba1.

Exemplo 3 Expressão do gene da proteína cristal inseticida crv7Ba1

O fragmento Xhol de 5 Kb, no qual o cry7Ba1 se localiza, foi trans-ferido para o vetor de transferência E. coli - B. Thuringiensis pHT304 (para ori-gem do vetor, favor se referir para Arantes O e Lereclus D. 1991. Constructionof cloning vectors for Bacillus thuringiensis. Gene 108:115-119) para produzir oplasmídeo recombinante pBMB0495. A seguir, o pBMB0495 foi transferido paraum mutante acristalífero da cepa CryB de Bacillus thuringiensis (para a origemda cepa, favor se referir a Wu D, Federici BA. 1993. Uma proteína de 20 quilo-dáltons preserva a viabilidade celular e promove a formação do cristal CytA du-rante a esporulação no Bacillus thuringiensis. J. Baeteroil, 175:5276-5280) u-sando o método da eletroporação bem-estabelecido (Wu Lan, Sun Ming, YuZiniu. A New Resolution Vector with crylAclO Gene Based on Bacillus thuringi-ensis Transposon Tn4430. Acta Microbiologica Sinica. 2000, 40: 264-269) paraproduzir a bactéria recombinante BMB-0502.

A bactéria recombinante acima nomeada como BMB0502 foiativada pela incubação dela com o meio de cultura LB (eritromicina poderiaser adicionada em uma concentração final de 20ug/mL) de um dia para ooutro. A seguir, ela foi transferida para um meio de cultura ICPM (eritromici-na poderia ser adicionada em uma concentração final de 20 μg/mL), a incu-bação foi executada até a completa maturação da gema e retirada. A bacté-ria foi coletada e rinsada com NaCI 0,5% e água deionizada esterilizada se-paradamente por 3 horas. A bactéria foi remisturada com água na proporçãode bactéria:água deionizada esterilizada = 1:5, a seguir um volume igual detampão de carga 2x foi adicionado e bem-misturado. A mistura foi tratada emum banho de água em ebulição por de 3 a 5 minutos, a seguir centrifugada a12000 rpm por 5 minutos. Eletroforese SDS-PAGE foi efetuada para os so-brenadantes. Para a formulação do tampão de carga 2x e o procedimentopara efetuar eletroforese SDS-PAGE, favor se referir ao método citado porLaemmli (Laemmli, RU. 1970. Digestion of structural proteins during the as-sembly of the head of bacteriophage T4. Nature (Londres) 227: 680-685).Conforme mostrado na figura 6, BMB0502 forma uma proteína de cristal de130 KDa, o tamanho da qual foi idêntica ao YBT-978 da cepa de partida,enquanto que o controle negativo BMB0503 (o qual somente continha o ve-tor de transferência pHT304) não formou tal banda correspondente.

Exemplo 4: Efeito inseticida da proteína de cristal inseticida Crv7Ba1

Efeito inseticida da proteína de cristal inseticida Cry7Ba1 foi ava-liada usando larvas na terceira muda de Plutella xylostella. BMB0502 foi ati-vada pela incubação dela em meio de cultura LB (eritromicina pode ser adi-cionada em uma concentração final de 20 μg/mL) de um dia para o outro. Aseguir, ela foi transferida para um meio de cultura ICPM (eritromicina poderiaser adicionada em uma concentração final de 20 μg/mL)J a incubação foiefetuada até a quase maturação da gema e a remoção. A bactéria foi cole-tada e rinsada com água deionizada esterilizada uma vez para produzir umamistura de cristal paraesporal. O bioensaio foi efetuado usando um procedi-mento de ensaio padrão (favor se referir a Shen Ju-qun, Wang Mian-ju, YuZi-niu (1990)). Standard Procedure and Method for Bacillus thuringiensisformulations. Chinese Journal of Biological Control (Suppl.): 12-16). O bioen-saio foi repetido uma vez para cada uma das amostras. LC50 foi calculado.Os resultados mostraram a proteína de cristal inseticida Cry7Ba1 exerceuuma toxicidade muito alta contra Plutella xylostella. Isso significa que a pro-teína Cry7Ba1 clonada na presente invenção apresentou uma atividade inse-ticida muito alto contra insetos da Lepidoptera. Os efeitos foram alcançadospela execução do exemplo que foram mostrados na Tabela 1.Listagem de Seqüência

<110> Huazhong Agricultural Univcrsity

<120> GENE CRY7BA1 CODIFICANDO UMA PROTEÍNA DE CRISTAL INSETICIDA DE BACILLUS THURINGIENSIS<130>

<141> 2005-10-13<160> 2

<170> VersSo de Patente 3.1<210> 1<211> 3465<212> DNA

<213> Bacillus thuringiensis!<220>

<221> gene<222> (1).. (3465)<223><220>

<221> CDS<222> (1).. (3465)<223 ><400> 1

atg gat ata aga aat caa aat aaa tat gaa gta gta tac cca gca ata 48

Met Asp Ile Arg Asn Gln Asn Lys Tyr Glu Val Val Tyr Pro Ala Ile1 5 10 15

aat gaa aca act tct aat aca aca tca aag tat cca ctc gca agt gat 96

Asn Glu Thr Thr Ser Asn Thr Thr Ser Lys Tyr Pro Leu Ala Ser Asp

20 25 30

cca ate aaa caa tat caa aat atg aat tat aaa gat agt ttg aat ata 144Pro Ile Lys Gln Tyr Gln Asn Met Asn Tyr Lys Asp Ser Leu Asn Ile

35 40 45

att gag ggg aat aac gta ate act cca gta tct gga act gct gtt ttg 192Ile Glu Gly Asn Asn Val Ile Thr Pro Val Ser Gly Thr Ala Val Leu50 55 60gca act goa agg aaa att ggt ggt aag ato gtt aag gct ata ggg gaa 240Ala Thr Ala Arg Ly8 Ile Gly Gly Lys Ile Val Lys Ala Ile Gly Glu65 70 75 80caa ate ttg tet aaa ate ttg aaa gag att ctt gat tat tta tgg ccg 288Gln Ile Lea Ser Lys Ile Leu Lys Glu Ile Leu Asp Tyr Leu Trp Pro85 90 95tct tca agc tcg tcc aat tca tgg gaa gag atg atg aag gaa gta gag 336Ser Ser Ser Ser Ser Asn Ser Trp Glu Glu Met Met Lys Glu Val Glu100 105 110tat ctt att gat aaa aaa ata gag gaa tat gca aga aat aag gca ott 384Tyr Leu Ile Asp Lys Lys Ile Glu Glu Tyr Ala Arg Asn Lys Ala Leu115 120 125gcg gtt ttg gaa gga ata gga aat gct gta gaa tcc tat tat agt gca 432Ala Val Leu Glu Gly Ile Gly Asn Ala Val Glu Ser Tyr Tyr Ser Ala130 135 140tta gaa gcg tgg gaa tta gaa tet agt gaa cgt agt tta gaa tta gta 480Leu Glu Ala Trp Glu Leu Glu Ser Ser Glu Arg Ser Leu Glu Leu VaI145 150 155 160ttg gaa oga tat cag ttt gcg gtg cag ttt gca aga agt tca atg cca 528Leu Glu Arg Tyr Gln Phe Ala Val Gln Phe Ala Arg Ser Ser Met Pro165 170 175tca ttt gcg att ata aat tat gaa att occ tta tta gca aca tat gca 576Ser Phe Ala Ile Ile Asn Tyr Glu Ile Pro Leu Leu Ala Thr Tyr Ala180 185 190aat gct gca aat gtt cat tta ctt tta atg aga gat ata caa ata tac 624Asn Ala Ala Asn Val His Leu Leu Leu Met Arg Asp Ile Gln Ile Tyr195 200 205ggg gat aga tgg gga ata tet caa aat gat atg aat ctc tte tta aaa 672Gly Asp Arg Trp Gly Ile Ser Gln Asn Asp Met Asn Leu Phe Leu Lys210 215 220gaa caa gaa ata tac acg tet gaa tat tcg gaa cat tgo gta aag tgg 720Glu Gln Glu Ile Tyr Thr Ser Glu Tyr Ser Glu His Cys Val Lys Trp225 230 235 240tat aat gag gga tta aat caa ttg aaa act aaa ggt ggc gea agt ggt 768Tyr Asn Glu Gly Leu Asn Gln Leu Lys Thr Lys Gly Gly Ala Ser Gly245 250 255tta gtt tgg gag aat tat aac agt ttc cgt aoa gaa atg aoa att atg 816Leu Val Trp Glu Asn Tyr Asn Ser Phe Arg Thr Glu Met Thr Ile Met

260 265 270

gta tta gat ctt gta got ata ttt cca goc tac aat atg ago aaa tat 864

Val Leu Asp Leu Val Ala Ile Phe Pro Ala Tyr Asn Met Ser Lys Tyr

275 280 285

cct ata gaa tca aca gta gaa tta aca aga aca att tat aca gat cca 912Pro Ile Glu Ser Thr Val Glu Leu Thr Arg Thr Ile Tyr Thr Asp Pro

290 295 300

ctt ggt tac aca ggg tat age aat gat gaa cat ccc aca tat tat tet 960Leu Gly Tyr Thr Gly Tyr Ser Asn Asp Glu His Pro Thr Tyr Tyr Ser305 310 315 320

tet gea aaa cca ttt tca tca ata gag agt aga gcc gta cta gea ccc 1008Ser Ala Lys Rro Phe Ser Ser Ile Glu Ser Arg Ala Val Leu Ala Pro

325 330 335

tca tta ttc aaa tgg ate act caa ott gaa gta tat aca aaa aaa tac 1056Ser Leu Phe Lys Trp Ile Thr Gln Leu Glu Val Tyr Thr Lys Lys Tyr

340 345 350

age tac tot tcc caa tat act acg ttg tgg act gga cta aga gtg att 1104Ser Tyr Ser Ser Gln Tyr Thr Thr Leu Trp Thr Gly Leu Arg Val Ile

355 360 365

gct cag cot act aaa gat ttt act gat act gta tat gat tac gga agt 1152Ala Gln Pro Thr Lys Asp Phe Thr Asp Thr Val Tyr Asp Tyr Gly Ser

370 375 380

tet tcg ggt tet gag aao aag gat gtc ttt gac ott tat ggc aat gat 1200Ser Ser Gly Ser Glu Asn Lys Asp Val Phe Asp Leu Tyr Gly Asn Asp385 390 395 400

gta tat gac aca caa agt gtt gtt tca tcg tat aag cct aca ggt ggt 1248Val Tyr Asp Thr Gln Ser Val Val Ser Ser Tyr Lys Pro Thr Gly Gly

405 410 415

ggc cat ttt ggg gtt cct cag ttt aga tta ttc tgg att act aaa tet 1296Gly His Phe Gly Val Pro Gln Phe Arg Leu Phe Trp Ile Thr Lys Ser

420 425 430

aat ggg cta aga gaa caa att ttt aat tat gcg aat aat atg ggt tet 1344Asn Gly Leu Arg Glu Gln Ile Phe Asn Tyr Ala Asn Asn Met Gly Ser435 440 445tac agt gcg tat agg ttt agt aag gao gaa tta oca ata gaa ttg ttg 1392Tyr Ser Ala Tyr Arg Phe Ser Lys Asp Glu Leu Pro Ile Glu Leu Leu

450 455 460

cag cca cct ctt ttt gga gat ata gag gaa tac agt cat agg tta agt 1440Gln Pro Pro Leu Phe Gly Asp Ile Glu Glu Tyr Ser His Arg Leu Ser465 470 475 480

oac gtt tca gag gta att aaa gat tat ggt gaa gga ate att cct gta 1488His Val Ser Glu Val Ile Lys Asp Tyr Gly Glu Gly Ile Ile Pro Val

485 490 495

tta ggt tgg aoa cat gta agt gta aot cgt gao aat aga att tat coa 1536Leu Gly Trp Thr His Val Ser Val Thr Arg Asp Asn Arg Ile Tyr Pro

500 505 510

gat aag att aca caa ctt cca gcg gta aaa atg tat gag tta cta age 1584Asp Lys Ile Thr Gln Leu Pro Ala Val Lys Met Tyr Glu Leu Leu Ser

515 520 525

tca gcc gtt gtt gta aaa gga cct gga ttt aca ggt gga gat tta gtt 1632Ser Ala Val Val Val Lys Gly Pro Gly Phe Thr Gly Gly Asp Leu Val

530 535 540

aag aga acg ggc aat ggt ggc att gga cat ttt aat gtt agt gta gag 1680Lys Arg Thr Gly Asn Gly Gly Ile Gly His Phe Asn Val Ser Val Glu545 550 555 560

tcc cct ggt act cag agg tat cgc ctg aga ata cgt tat agt tca gag 1728Ser Pro Gly Thr Gln Arg Tyr Arg Leu Arg Ile Arg Tyr Ser Ser Glu

565 570 575

gtt agt gga gta ttt cat atg caa att aac gat ata gaa act att cag 1776Val Ser Gly Val Phe His Met Gln Ile Asn Asp Ile Glu Thr Ile Gln

580 585 590

gga gaa ttt agt agt act got gat tca aca agt act ctg tca age gaa 1824Gly Glu Phe Ser Ser Thr Ala Asp Ser Thr Ser Thr Leu Ser Ser Glu

595 600 605

gea ttt caa ctt aga gaa tac tcc aot acc ttc acg ttt cca aca aat 1872Ala Phe Gln Leu Arg Glu Tyr Ser Thr Thr Phe Thr Phe Pro Thr Asn

610 615 620

atg aca aag ata aag gta tet tta ggt gct att gaa ggt gea gga gga 1920Met Thr Lys Ile Lys Val Ser Leu Gly Ala Ile Glu Gly Ala Gly Gly625 630 635 640ttc tat tta gat aga att gaa ttc att cca gta gat gaa aat cac gat 1968Phe Tyr Leu Asp Arg Ile Glu Phe Ile Pro Val Asp Glu Asn His Asp

645 650 655

aac aga gta aca cta gaa aaa gca oag aaa gcc gtg aat goc ttg ttt 2016Asn Arg Val Thr Leu Glu Lys Ala Gln Lys Ala Val Asn Ala Leu Phe

660 665 670

aca gcg gga aga aac gca ota caa aca gat gtg aca gat tac aaa gta 2064Thr Ala Gly Arg Asn Ala Leu Gln Thr Asp Val Thr Asp Tyr Lys Val

675 680 685

gat cag gtt tcc att tta gtg gat tgt gta toa ggg gag tta tat cca 2112Asp Gln Val Ser Ile Leu Val Asp Cys Val Ser Gly Glu Leu Tyr Pro

690 695 700

aat gag aaa cgc gaa cta ctc agt tta gtc aaa tac gca aaa cgt ttg 2160Asn Glu Lys Arg Glu Leu Leu Ser Leu Val Lys Tyr Ala Lys Arg Leu705 710 715 720

age tat tet cgt aat tta etc cta gat cca aca ttc gat tet att aat 2208Ser Tyr Ser Arg Asn Leu Leu Leu Asp Pro Thr Phe Asp Ser Ile Asn

725 730 735

tcg tca gat gag aat ggc tgg tac gga agt aat ggt att gca att gga 2256Ser Ser Asp Glu Asn Gly Trp Tyr Gly Ser Asn Gly Ile Ala Ile Gly

740 745 750

aat ggg aac ttt gta ttc aaa gga aac tat tta att ttc tca ggt acc 2304Asn Gly Asn Phe Val Phe Lys Gly Asn Tyr Leu Ile Phe Ser Gly Thr

755 760 765

aat gat aca caa tac cca acg tat ctc tat oaa aaa att gat gaa tcc 2352Asn Asp Thr Gln Tyr Pro Thr Tyr Leu Tyr Gln Lys Ile Asp Glu Ser

770 775 780

aag etc Eiaa gaa tat aca cgc tat aaa ctg aga gga ttt ate gaa aat 2400Lys Leu Lys Glu Tyr Thr Arg Tyr Lys Leu Arg Gly Phe Ile Glu Asn785 790 795 800

agt caa gat tta gaa gca tat gtg att cgc tat gat gca aaa cat gaa 2448Ser Gln Asp Leu Glu Ala Tyr Val Ile Arg Tyr Asp Ala Lys His Glu

805 810 815

aca ttg gat gta tcc aat aat cta ttg ccg gat att tet cct gta aat 2496Thr Leu Asp Val Ser Asn Asn Leu Leu Pro Asp Ile Ser Pro Val Asn820 825 830goa tgc gga gaa oca aat cgt tgt gct goa tta caa tac ctg gat gaa 2544Ala Cys Gly Glu Pro Asn Arg Cys Ala Ala Leu Gln Tyr Leu Asp Glu

835 840 845

aat oca agg tta gaa tgt agt tcg ata caa gac ggt att tta tct gat 2592Asn Pro Arg Leu Glu Cys Ser Ser Ile Gln Asp Gly Ile Leu Ser Asp

850 855 860

tog cat tcg ttc tct ctc aat ata gat aca ggt tot att gat ttc aat 2640Ser His Ser Phe Ser Leu Asn Ile Asp Thr Gly Ser Ile Asp Phe Asn865 870 875 880

gag aac gta gga att tgg gtg ttg ttt aaa att tcc aca ccg gaa ggg 2688Glu Asn Val Gly Ile Trp VaI Leu Phe Lys Ile Ser Thr Pro Glu Gly

885 890 895

tat gog aaa ttt gga aac cta gaa gtg att gaa gat age oca gto att 2736Tyr Ala Lys Phe Gly Asn Leu Glu Val Ile Glu Asp Ser Pro Val Ile

900 905 910

gga gaa goa tta gcc cgt gta aaa cgc caa gaa acg aag tgg cga aac 2784Gly Glu Ala Leu Ala Arg Val Lys Arg Gln Glu Thr Lys Trp Arg Asn

915 920 925

aag ttg aca caa ctg cga acg gaa aoa caa gcg att tat aca cga gea 2832Lys Leu Thr Gln Leu Arg Thr Glu Thr Gln Ala Ile Tyr Thr Arg Ala

930 935 940

aaa caa goc att gat aat gta ttc aca aat gea cag gac tct cac tta 2880Lys Gln Ala Ile Asp Asn Val Phe Thr Asn Ala Gln Asp Ser His Leu945 950 955 960

aaa ata ggt acg aca ttt gcg gea att gtg got gog cga aag att gto 2928Lys Ile Gly Thr Thr Plie Ala Ala Ile Val Ala Ala Arg Lys Ile Val

965 970 975

caa tcc ata cgc gaa gcg tat atg toa tgg tta toa ate gtt cca ggt 2976Gln Ser Ile Arg Glu Ala Tyr Met Ser Trp Leu Ser Ile Val Pro Gly

980 985 990

gta aat tat cct att ttt aca gag ttg aat gag aga gta cag cga gea 3024Val Asn Tyr Pro Ile Phe Thr Glu Leu Asn Glu Arg Val Gln Arg Ala

995 1000 1005

ttt caa tta tat gat gta ogg aat gtc gtg cgt aat ggc cga tto 3069Phe Gln Leu Tyr Asp Val Arg Asn Val Val Arg Asn Gly Arg Phe1010 1015 1020otg aat gga gta tcg gat tgg att gtg aca tct gat gta aag gta 3114Leu Asn Gly Val Ser Asp Trp IIe Val Thr Ser Asp Val Lys Val

1025 1030 1035

caa gaa gaa aat ggg aao aat gta tta gtt ctt tcc aat tgg gat 3159Gln Glu Glu Asn Gly Asn Asn Val Leu Val Leu Ser Asn Trp Asp

1040 1045 1050

gcg caa gta tta caa tgt ctg aag ctc tat caa gat cgc gga tat 3204Ala Gln Val Leu Gln Cys Leu Lys Leu Tyr Gln Asp Arg Gly Tyr

1055 1060 1065

ate ttg cgt gta acg gea cgt aaa gaa gga ttg gga gaa gga tat 3249Ile Leu Arg Val Thr Ala Arg Lys Glu Gly Leu Gly Glu Gly Tyr

1070 1075 1080

att aca att acg gat gaa gaa ggg cat aca gat caa ttg aca ttt 3294Ile Thr Ile Thr Asp Glu Glu Gly His Thr Asp Gln Leu Thr Phe

1085 1090 1095

ggc aca tgt gag gaa ata gat gea tct aac acg ttc gta acc aca 3339Gly Thr Cys Glu Glu Ile Asp Ala Ser Asn Thr Phe Val Thr Thr

1100 1105 1110

ggt tat att aca aaa gaa cta gaa ttt ttc cca gat aca gag aaa 3384Gly Tyr Ile Thr Lys Glu Leu Glu Phe Phe IYo Asp Thr Glu Lys

1115 1120 1125

gtg cgt ata gaa att ggg gaa aca gaa gga acc ttc cag gta gaa 3429Val Arg IIe Glu Ile Gly Glu Thr Glu Gly Thr Phe Gln Val Glu

1130 1135 1140

agt ata gag tta ttt ttg atg gaa gat cta tgt taa 3465

Ser Ile Glu Leu Phe Leu Met Glu Asp Leu Cys

1145 1150

<210> 2

<211> 1154

<212> PRT

<213> Bacillus thuringiensis

<400> 2

Met Asp Ile Arg Asn Gln Asn Lys Tyr Glu Val Val Tyr Pro Ala Ile1 5 10 15

Asn Glu Thr Thr Ser Asn Thr Thr Ser Lys Tyr Pro Leu Ala Ser Asp20 25 30

Pro Ile Lys Gln Tyr Gln Asn Met Asn Tyr Lys Asp Ser Leu Asn Ile

35 40 45

Ile Glu Gly Asn Asn Val Ile Thr Pro Val Ser Gly Thr Ala Val Uu

50 55 60

Ala Thr Ala Arg Lys Ile Gly Gly Lys Ile Val Lys Ala Ile Gly Glu65 70 75 80

Gln Ile Leu Ser Lys Ile Leu Lys Glu Ile Leu Asp Tyr Leu Trp Pro

85 90 95

Ser Ser Ser Ser Ser Asn Ser Trp Glu Glu Met Met Lys Glu Val Glu

100 105 110

Tyr Leu Ile Asp Lys Lys Ile Glu Glu Tyr Ala Arg Asn Lys Ala Leu

115 120 125

Ala Val Leu Glu Gly Ile Gly Asn Ala Val Glu Ser Tyr Tyr Ser Ala

130 135 140

Leu Glu Ala Trp Glu Leu Glu Ser Ser Glu Arg Ser Leu Glu Leu Val145 150 155 160

Leu Glu Arg Tyr Gln Phe Ala Val Gln Phe Ala Arg Ser Ser Met Pro

165 170 175

Ser Phe Ala Ile Ile Asn Tyr Glu Ile Pro Leu Leu Ala Thr Tyr Ala

180 185 190

Asn Ala Ala Asn Val His Leu Leu Leu Met Arg Asp Ile Gln Ile Tyr

195 200 205

Gly Asp Arg Trp Gly Ile Ser Gln Asn Asp Met Asn Leu Phe Leu Lys

210 215 220

Glu Gln Glu Ile Tyr Thr Ser Glu Tyr Ser Glu His Cys Val Lys Trp225 230 235 240

Tyr Asn Glu Gly Leu Asn Gln Leu Lys Thr Lys Gly Gly Ala Ser Gly

245 250 255-

Leu Val Trp Glu Asn Tyr Asn Ser Plie Arg Thr Glu Met Thr Ile Met

260 265 270

Val Leu Asp Leu Val Ala Ile Phe Pro Ala Tyr Asn Met Ser Lys Tyr

275 280 285

Pro Ile Glu Ser Thr Val Glu Leu Thr Arg Thr Ile Tyr Thr Asp Pro

290 295 300

Leu Gly Tyr Thr Gly Tyr Ser Asn Asp Glu His Pro Thr Tyr Tyr Ser305 310 315 320

Ser Ala Lys Pro Phe Ser Ser Ile Glu Ser Arg Ala Val Leu Ala Pro

325 330 335

Ser Leu Phe Lys Trp Ile Thr Gln Leu Glu Val Tyr Thr Lys Lys Tyr

340 345 350

Ser Tyr Ser Ser Gln Tyr Thr Thr Leu Trp Thr Gly Leu Arg Val Ile

355 360 365

Ala Gln Pro Thr Lys Asp Phe Thr Asp Thr Val Tyr Asp Tyr Gly Ser

370 375 380

Ser Ser Gly Ser Glu Asn Lys Asp Val Phe Asp Leu Tyr Gly Asn Asp385 390 395 400

Val Tyr Asp Thr Gln Ser Val Val Ser Ser Tyr Lys Pro Thr Gly Gly

405 410 415

Gly His Phe Gly Val Pro Gln Phe Arg Leu Phe Trp Ile Thr Lys Ser

420 425 430

Asn Gly Leu Arg Glu Gln Ile Phe Asn Tyr Ala Asn Asn Met Gly Ser

435 440 445

Tyr Ser Ala Tyr Arg Phe Ser Lys Asp Glu Leu Pro Ile Glu Leu Leu

450 455 460

Gln PtO Pro Leu Phe Gly Asp Ile Glu Glu Tyr Ser His Arg Leu Ser465 470 475 480

His Val Ser Glu Val Ile Lys Asp Tyr Gly Glu Gly Ile Ile Pro Val

485 490 495

Leu Gly Trp Thr Kis Val Ser Val Thr Arg Asp Asn Arg Ile Tyr Pro

500 505 510

Asp Lys Ile Thr Gln Leu Pro Ala Val Lys Met Tyr Glu Leu Leu Ser

515 520 525

Ser Ala Val Val Val Lys Gly Pro Gly Phe Thr Gly Gly Asp Leu Val

530 535 540

Lys Arg Thr Gly Asn Gly Gly Ile Gly His Phe Asn Val Ser Val Glu545 550 555 560

Ser Pro Gly Thr Gln Arg Tyr Arg Leu Arg Ile Arg Tyr Ser Ser Glu

565 570 575

Val Ser Gly Val Phe His Met Gln Ile Asn Asp Ile Glu Thr Ile Gln

580 585 590

GIy Glu Phe Ser Ser Thr Ala Asp Ser Thr Ser Thr Leu Ser Ser Glu595 600 605

Ala Phe Gln Leu Arg Glu Tyr Ser Thr Thr Phe Thr Phe Pro Thr Asn610 615 620

Met Thx Lys Ile Lys Val Ser Leu Gly Ala Ile Glu Gly Ala Gly Gly625 630 635 640

Phe Tyr Leu Asp Arg Ile Glu Phe Ile Pro Val Asp Glu Asn His Asp645 650 655

Asn Arg Val Thr Leu Glu Lys Ala Gln Lys Ala Val Asn Ala Leu Phe660 665 670

Thr Ala GIy Arg Asn Ala Leu Gln Thr Asp Val Thr Asp Tyr Lys Val675 680 685

Asp Gln Val Ser Ile Leu Val Asp Cys Val Ser Gly Glu Leu Tyr Pro690 695 700

Asn Glu Lys Arg Glu Leu Leu Ser Leu Val Lys Tyr Ala Lys Arg Leu705 710 715 720

Ser Tyr Ser Arg Asn Leu Leu Leu Asp Pro Thr Phe Asp Ser Ile Asn725 730 735

Ser Ser Asp Glu Asw Gly Trp Tyr Gly Ser Asn Gly Ile Ala Ile Gly740 745 750

Asn Gly Asn Phe Val Phe Lys Gly Asn Tyr Leu Ile Phe Ser Gly Thr755 760 765

Asn Asp Thr Gln Tyr Pro Thr Tyr Leu Tyr Gln Lys Ile Asp Glu Ser770 775 780

Lys Leu Lys Glu Tyr Thr Arg Tyr Lys Leu Arg Gly Phe Ile Glu Asn785 790 795 800

Ser Gln Asp Leu GIo Ala Tyr Val Ile Arg Tyr Asp Ala Lys His Glu805 810 815

Thr Leu Asp Val Ser Asn Asn Leu Leu Pro Asp Ile Ser Pro Val Asn820 825 830

Ala Cys Gly Glu Pro Asn Arg Cys Ala Ala Leu Gln Tyr Leu Asp Glu835 840 845

Asn Pro Arg Leu Glu Cys Ser Ser Ile Gln Asp Gly Ile Leu Ser Asp850 855 860

Ser His Ser Phe Ser Leu Asn Ile Asp Thr Gly Ser Ile Asp Phe Asn865 870 875 880

Glu Asn Val Gly Ile Trp VaI Leu Phe Lys Ile Ser Thr Pro Glu Gly885 890 895

Tyr Ala Lys Phe Gly Asn Leu Glu Val Ile Glu Asp Ser Pro Val Ile

900 905 910

Gly Glu Ala Leu Ala Arg Val Lys Arg Gln Glu Thr Lys Trp Arg Asn

915 920 925

Lys Leu Thr Gln Leu Arg Thr Glu Thr Gln Ala Ile Tyr Thr Arg Ala

930 935 940

Lys Gln Ala Ile Asp Asn Val Phe Thr Asn Ala Gln Asp Ser His Leu945 950 955 960

Lys Ile Gly Tlir Thr Phe Ala Ala Ile Val Ala Ala Arg Lys Ile Val

965 970 975

Gln Ser Ile Arg Glu Ala Tyr Met Ser Trp Leu Ser Ile Val Pro Gly

980 985 990

Val Asn Tyr Pro Ile Phe Tlir Glu Leu Asn Glu Arg Val Gln Arg Ala

995 1000 1005

Phe Gln Leu Tyr Asp Val Arg Asn Val Val Arg Asn Gly Arg Phe

1010 1015 1020

Leu Asn Gly Val Ser Asp Trp Ile Val Thr Ser Asp Val Lys Val

1025 1030 1035

Gln Glu Glu Asn Gly Asn Asn Val Leu Val Leu Ser Asn Trp Asp

1040 1045 1050

Ala Gln Val Leu Gln Cys Leu Lys Leu Tyr Gln Asp Arg Gly Tyr

1055 1060 1065

Ile Leu Arg Val Thr Ala Arg Lys Glu Gly Leu Gly Glu Gly Tyr

1070 1075 1080

Ile Thr Ile Thr Asp Glu Glu Gly His Thr Asp Gln Leu Thr Phe

1085 1090 1095

Gly Thr Cys Glu Glu Ile Asp Ala Ser Asn Thr Phe Val Thr Thr

1100 1105 1110

Gly Tyr Ile Thr Lys Glxi Leu Glu Phe Phe Pro Asp Thr Glu Lys

1115 1120 1125

Val Arg Ile Glu Ile Gly Glu Thr Glu Gly Thr Phe Gln Val Glu

1130 1135 1140

Ser Ile Glu Leu Phe Leu Met Glu Asp Leu Cys1145 1150<210>3<211>15<212> PRT

<400>3

MDIRNQNKYEWYPA

<210> 4<211> 46<212> DNA

<400> 4

GCTCGAGTCGACCGTGGTACGCGTGTGTGAGCTCCCGGGATCCGGT

<210>5<211>28<212> DNA

<223> H=A, C5 οχ Τ; M-A or C; N=A5 G5 C, or Τ; R=A or G; Y=C ογ Τ; W=A οι T<400>5

ATGGATATHMGNAATCARAAYAARTAYG

<210> 6<211> 26<212>DNA

<223> H=A, C3 or T5 M-A or C; N=A, G3 C, ar Τ; R=A or G; Y=C or Τ, W=A or T<400> 6

AATAAATATGARGTWGTOTAYCCNGC

<210>7<211>19<212> DNA

<400>7

GCTCGAGTCGACCGTGGTA

<210> 8<211> 19<212> DNA

<400> 8

GTACGCGTGTGTGAGCTCC<21G> 9<211> 28<212> DNA

<400> 9

TTCTAATACAACATCAAAGTATCCACTC 28

<210> 10<211> 27<212> DNA

<400> 10

GGTATCGTTCCAATACTAATTCTAAAC

27

Claims

1. Gene de proteína de cristal inseticida isolado de Bacillus thu-ringiensis, caracterizado pelo fato de que o referido gene codifica uma prote-ína Cry7Ba1 com pelo menos 80% de homologia em relação à seqüência deaminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 2.

2. Gene de proteína de cristal inseticida isolado de Bacillus thu-ringiensis, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que oreferido gene compreende uma seqüência de nucleotídeos mostrada naSEQ ID NO: 1.

3. Gene de proteína de cristal inseticida isolado de Bacillus thu-ringiensis, caracterizado pelo fato de que o referido gene codifica uma prote-ína Cry7Ba1 compreendendo uma seqüência de aminoácidos com pelo me-nos 50% de homologia em relação à seqüência parcial numerada de 1 a 658da SEQ ID NO: 2.

4. Constructo de DNA recombinante, caracterizado pelo fato deque compreende o gene da proteína de cristal inseticida como definido nareivindicação 1 ou 3.

5. Microorganismo, caracterizado pelo fato de que compreende oconstructo de DNA recombinante como definido na reivindicação 4.

6. Proteína de cristal inseticida de Bacillus thuringiensis, caracte-rizada pelo fato de que compreende uma seqüência de aminoácido com pelomenos 80% de homologia em relação à seqüência de aminoácidos mostradana SEQ ID NO: 2.

7. Proteína de cristal inseticida de Bacillus thuringiensis comodefinido na reivindicação 5, caracterizada pelo fato de que a referida proteí-na compreende uma seqüência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 2.

8. Proteína de cristal inseticida de Bacillus thuringiensis, caracte-rizada pelo fato de que compreende uma seqüência de aminoácidos compelo menos 50% de homologia em relação à seqüência parcial numerada de 1 a 658 da SEQ ID NO: 2.

9. Fragmento de seqüência de aminoácidos, caracterizado pelofato de ser o fragmento inseticida da seqüência de aminoácidos conformemostrada na SEQ ID NO: 2.

10. Célula vegetal, caracterizada pelo fato de ser transformadacom uma seqüência de nucleotídeos codificando a seqüência de aminoáci-dos como definida na reivindicação 9.