BRPI0617610A2

BRPI0617610A2 - identificaÇço e classificaÇço de partÍculas de vÍrus em micràgrafos de elÉtron texturados

Info

Publication number: BRPI0617610A2
Application number: BRPI0617610-0A
Authority: BR
Inventors: Mohammed Homman; Martin Ryner
Original assignee: Intelligent Virus Imaging Inc
Priority date: 2005-10-12
Filing date: 2006-09-12
Publication date: 2011-07-26
Also published as: CN104537337A; RU2409855C2; JP2009511046A; HK1118926A1; EP1934860A2; SI1934860T1; US8238627B2; JP5344922B2; CA2621168C; WO2007046985A3; CN104537337B; ZA200801551B; CA2621168A1; EP1934860A4; US20080212880A1; ES2498796T3; EP1934860B1; SG166120A1; WO2007046985A2; DK1934860T3

Abstract

IDENTIFICAÇçO E CLASSIFICAÇçO DE PARTÍCULAS DE VÍRUS EM MICRàGRAFOS DE ELÉTRON TEXTURADOS, o método é para a identificação e caracterização de estruturas em micrógrafos de elétron. São selecionadas estruturas em uma primeira imagem. As estruturas têm um primeiro tipo de formato deformado em uma primeira direção. As estruturas selecionadas sãotransformadas em um segundo tipo de formato diferente do primeiro tipo de formato. As estruturas transformadas do segundo tipo de formato são usadas para formar uma pluralidade de máscaras. E identificada uma nova estrutura em uma segunda imagem. A nova estrutura tem o primeiro tipo de formato. A estrutura do segundo tipo de formato, de cada máscara, é deformada na primeira direção. É determinada que máscara será a máscara preferida e que melhor combina com a nova estrutura.

Description

"IDENTIFICAÇÃO E CLASSIFICAÇÃO DE PARTÍCULAS DE VÍRUS EMMICRÓGRAFOS DE ELÉTRON TEXTURADOS".Campo da invenção

A presente invenção relaciona-se com a identificação de estruturas emimagens. Em particular, a presente invenção oferece um método que é umacombinação para a identificação e classificação de partículas de vírus emmicrógrafos de elétron texturados.

Histórico da invenção

A montagem de vírus é um processo complexo e objeto de intensaspesquisas. Os vírus utilizam uma célula hospedeira para produzir suas partículasvírus progênie através de um complexo processo de maturação e transporteintracelular. Esse processo pode ser monitorado sob alta ampliação, com o uso demicroscopia eletrônica (feixes de elétrons), que permite a identificação visual dediferentes tipos de partículas de vírus em diferentes compartimentos celulares.Questões importantes que ainda precisam ser resolvidas incluem a identidade deproteínas virais que estão envolvidas em cada passo desse processo de montagem devírus como também o mecanismo sob a translocação intracelular e localização dediferentes tipos de partículas de vírus durante a maturação do vírus. Aspectosestruturados da maturação do vírus são, em geral, difíceis de lidar embora técnicasde visualização como a tomografia e cryo EM têm contribuindo muito para as vastasinformações relacionadas com estruturas de vírus. Essas técnicas ofereceminformações sobre partículas de vírus maduras estáveis. As ferramentas genéticasajudar a produzir mutantes de componentes chave de proteína viral e os efeitosestruturais podem ser visualizados por EM. Porém, a falta de ferramentasapropriadas para caracterizar os efeitos estruturais, especialmente formasintermediária e partícula obscura e para quantificar isso de maneira apropriada eobjetiva. As ferramentas de análise de imagens para caracterizar e quantificar amaturação de partícula de vírus e transporte intracelular o que facilitaria estudosobjetivos sobre os diferentes estados de montagem de vírus, usando microscopiaeletrônica (feixes de elétrons). Muitas informações foram obtidas, mas precisam serestruturadas e estatísticas precisam ser calculadas com elas para uma corretaavaliação do efeito e para se chegar às devidas conclusões.

Resumo da presente invenção

A caracterização da morfologia estrutural de partículas de vírus emmicrógrafos de elétron é uma tarefa complexa, mas desejável para a investigação doprocesso de maturação e detecção de mudanças na morfologia de partícula viral emresposta ao efeito de uma mutação ou aplicação de medicamentos antivirais. Assim,foi desenvolvido um procedimento para a descrição e classificação de formas departícula viral em micrógrafos de elétron, com base na determinação decaracterísticas invariáveis da projeção de uma determinada estrutura de vírus.

A máscara para o vírus é criada com base nas informações obtidas deum pequeno conjunto de treinamento de micrógrafos de elétron e, então, éempregado para classificar e quantificar estruturas similares de interesse em umnúmero ilimitado de micrógrafos de elétron pelo processo de correlação. Usandoanálise de deformação linear, esse algoritmo novo, descrito aqui, pode tratar dasvariações da partícula viral como elipsidade e ainda permite a avaliação depropriedades como o tamanho e orientação da partícula viral. A aplicação práticadesse método é demonstrada pela habilidade de localizar três classes diversas departículas de vírus em micrógrafos de elétron transmissão de fibroblastos infectadoscom citomegalovirus humano.

Em resumo, o método é para a identificação e caracterização deestruturas em micrógrafos de elétron. São selecionadas estruturas em uma primeiraimagem. As estruturas têm um primeiro tipo de formato deformado em umaprimeira direção. As estruturas selecionadas são transformadas em um segundo tipode formato diferente do primeiro tipo de formato. As estruturas transformadas dosegundo tipo de formato são usadas para formar pluralidades de máscaras. Eidentificada uma nova estrutura em uma segunda imagem. A nova estrutura tem oprimeiro tipo de formato. A estrutura do segundo tipo de formato, de cada máscara,é deformada na primeira direção. É determinada que máscara será a máscarapreferida e que melhor combina com a nova estrutura.Breve Descrição dos Desenhos

As Figuras IA e IB mostram imagens típicas de micrógrafo de elétrontransmissão de vírus herpes em desenvolvimento:

A Figura 2A mostra nucleocapsídeos vazios de vírus herpes;

A Figura 2B mostra nucleocapsídeos de vírus herpes com núcleotranslúcido;

A Figura 2C mostra nucleocapsídeos de vírus herpes contendo DNAempacotado;

A Figura 3 A mostra a partícula viral com formato elíptico;

A Figura 3 B mostra a partícula viral que foi deformada para ficarcircular;

A Figura 4A-C mostra funções teste para estruturas capsídeo viral (A,B e C) em micrógrafos de elétron não empregando coeficiente de redução (nenhum)ou 80% dos coeficientes exibindo a menor variação (VAR);

A Figura 5A mostra uma combinação da função teste A para umaestrutura capsídeo autêntica e para uma estrutura similar, mas falsa;

A Figura 5BA mostra uma combinação da função teste B para umaestrutura capsídeo autêntica e uma estrutura similar, mas falsa;

A Figura 6 mostra combinação com a função teste A dentro de umavesícula;

A Figura 7A-C mostra razões de um falso positivo (FPR) e um falsonegativo (FNR) para as diferentes funções teste A, B e C, respectivamente;

A Figura B mostra as funções de probabilidade positiva (PPFs) para asfunções teste A, B e C;

A Figura 9 mostra a comparação do número total real de estruturasvirais presentes em um conjunto de imagens teste (eixo X) como determinado porum virologista para o número identificado por nosso procedimento (eixo Y); e

A Figura 10 mostra uma produção automatizada de um mapa queidentifica locais de interesse em um micrógrafo de elétron ilustrado aqui para afunção teste C.Descrição detalhada

É descrito aqui o desenvolvimento de um sistema automatizado paraassistir na identificação de partículas de vírus em micrógrafos de elétron. Comomodelo, foram usados fibroblastos infectados com citomegalovirus humano(HCMV) um vírus da classe β-herpes. Esclarecendo, que o vírus da herpes é usadoapenas como exemplo ilustrativo e a invenção não se limita ao vírus da herpes.Durante a infecção com o citomegalovirus humano, são produzidas muitasdiferentes formas intermediárias da partícula viral. Durante a montagem do vírus daherpes, a célula hospedeira é forçada a fazer cópias do material genético viral e aproduzir capsídeos, uma concha de proteínas virais, que encerra e protege o materialgenético. Os capsídeos são estruturas esféricas que podem variar com relação aotamanho e simetria e podem, quando maduros, ser envelopados por uma membranabi-camada. A maturação dos capsídeos de vírus é um estágio importante naprodução de partícula viral, e um dos mais freqüentemente estudados. Porém, aaparência dos micrógrafos de elétron varia consideravelmente, o que faz doprocesso de análise um desafio. Uma característica única do vírus da herpes é otegumento, uma camada de proteínas virais que circunda o capsídeo antes doenvelopamento final. O envelope é obtido pelo desenvolvimento do tegumento doscapsídeos em vesículas de secreção no citoplasma. Depois disso, as partículas viraisinfecciosas saem da célula hospedeira por fusão desses vírus, contendo vesículas,com a membrana de plasma.

Um procedimento objetivo para a classificação e quantificação departículas de vírus desenvolvido em micrógrafos de elétron transmissão. Na análiserelacionada de imagens de microscópio crio-elétron (cryo-EM), foram dedicadosconsideravelmente mais esforços para explorar diferentes métodos de identificação.Em crio-micrógrafos, foi usada, com sucesso, a correlação cruzada empregandomáscaras múltiplas e métodos para a detecção de extremidades.

Abordagens apropriadas permitem a caracterização e a qualificação damaturação das partículas de vírus e a translocação intracelular facilita estudosobjetivos desses fenômenos, empregando microscopia eletrônica (feixes deelétrons). Porém, as imagens de microscópio eletrônico (feixes de elétrons) sãodifíceis de ser analisadas e descritas em razão do pesado fundo texturado. Ainda,cada partícula viral, em particular, mostra uma ampla variedade de formas,dependendo da sua projeção no micrógrafo de elétron, o procedimento utilizadopara preparar amostras para a microscopia eletrônica (feixes de elétrons) e ascondições fotográficas usadas. As imagens de micrógrafo de elétron típicas 100,102, que oferecem informações valiosas, são mostradas nas Figuras IA e 1B,respectivamente.

Na presente invenção, foi usada uma abordagem para a análise deίο capsídeos HCMV no núcleo de células infectadas, que estão nos estados dematuração definidos como capsídeos vazios 104 (chamados de A), capsídeos comnúcleo translúcido 106 (chamados de B) e capsídeos contendo DNA empacotado108 (chamados de C), como bem mostrado nas Figuras 2A-C.

O método e combinação de acordo com a presente invenção sãoilustrados com partículas virais. Isso deve ser visto como um exemplo não limitante.Outros tipos de partículas, incluindo, por exemplo, objetos biológicos como célulasou estruturas de células, mas também partículas e estruturas não orgânicas, podemser identificadas e caracterizadas com pequenas modificações no método ecombinação descritos.

O método, de acordo com a invenção, inclui um passo para aquisiçãode imagem. O micrógrafo de elétron pode vir do microscópio eletrônico (feixes deelétrons) como arquivos ou figuras para digitalização. Para os próximos passos dosmétodos, é aconselhável adquirir conhecimento sobre tamanho de pixel, resolução eaumento de cada micrógrafo.

Em um passo pré-processo, as partículas relevantes são selecionadas etransformadas, de possíveis aparências deformadas para círculos.

Em um passo de formação de máscaras, as partículas selecionadas etransformadas são usadas para formar uma máscara, que pode ser caracterizada poruma função teste.Em um passo de combinação, a máscara ou função teste é utilizadapara identificar as partículas em outra(s) imagem(ns). Os passos do método serãomais descritos e exemplificados mais adiante.

Um aparato de identificação e classificação, de acordo com a presenteinvenção, pode ter como base um PC comum, mas com força suficiente para oscálculos. O aparato de identificação e classificação vem com uma interface pararecepção de micrógrafos, meios de pré-processamento para transformação deimagens deformadas, meios para formação de máscaras ou extração de funções testee meios para execução de um procedimento de combinação. Esses passos sãotipicamente e preferencialmente executados por módulos de código de software.

Culturas de células como fibroblasto pulmonar embriônico (HF) forammantidas em meio essencial mínimo, livre de bicarbonato, com sais Hank (GIBCOBRL) suplementado com 25 mM HEPES [4-(2 hidroxietil)-l-lácido etanesulfônicopiperazina], 10% soro novilho fetal calor-ativado, L-glutamina (2mM), penicilina(100 U/ml) e streptomicina (100 mg/ml) (GIBCO BRL, Grand Island, NY, USA). Acultura de células foi mantida em frascos de cultura de tecido de 175 cm (Corning,New York, USA) para um máximo de 17 passagens.

Em um passo de infecção viral, as células HF foram infectadas comHCMV cepa AD169 empregando uma multiplicidade de infecção (MOI) de 1. Osobrenadante viral foi coletado 7 ou 10 dias pós-infecção (dpi), purificado deresíduos celulares por centrifugação de baixa velocidade e congelado a -70°C até serusado para inoculação.

Para examinar células infectadas com vírus, por microscopiaeletrônica (feixes de elétrons), células não infectadas e células infectadas comHCMV foram colhidas em 1, 3, 5 e 7 dpi e, conseqüentemente, fixadas com 2%glutaraldeído em tampão 0.1 M cacodilato de sódio contendo 0.1 M sacarose e 3mM CaCl2, pH 7.4, em temperatura ambiente por 30 minutos. As células foram,então, raspadas com espátulas de madeira e transferidas para um tubo Eppendorfpara continuar a fixação durante a noite, a 4°C. Seguindo esse procedimento, ascélulas foram enxaguadas em tampão 0.15 M cacodilato de sódio contendo 3 mMCacl2, pH 7.4 e transformado em esferas por centrifugação. Essas esferas foram pós-fixadas em 2% tetróxido de ósmio dissolvido em tampão 0.07 M cacodilato desódio contendo 1.5 mM CaCl2, pH 7.4, a 4°C por 2 horas; seqüencialmentedesidratado com etanol e acetona; e fixado em LX-112 (Ladd, Burlington, VT,USA). O contraste nas seções foi obtido com uranil acetato seguido por citrato dechumbo e exame executado por um Philips 420 ou um Tecnai 10 (FEI Company,Oregon, USA) microscópio eletrônico transmissão (feixes de elétrons) em 80 kV.

Foram executadas, então, a aquisição de imagem, discretização eanálise. Os micrógrafos de elétron de células infectadas com HCMV foramdigitalizadas empregando uma escala em cinza de 8-bit, em resolução de 5.5nm/pixel em uma impressora HP Scanjet 3970. A implementação foi feita comMatlab 7.0.1 (The Mathworks Inc., Natick, MA, USA) e software Sun Java 1.4.2 emum PC Dell Optiplex GX260. Essa análise envolve uma interface gráfica fácil deusar e a automação dos parâmetros descritos abaixo para um uso rápido econveniente.

Foram desenvolvidas ferramentas confiáveis e fáceis de usar paraestudos da montagem intracelular de vírus. A abordagem baseou-se no achado deum conjunto compacto de pontos em R , o campo do micrógrafo, para cada umdeles um ponto recebeu um valor função correspondente. Esse conjunto de pontos eseus valores função são coletivamente chamados de função teste ou máscara epodem ser descritos por uma seqüência {(xk,ck)} onde χ é o ponto e c e o valorfunção. A função teste é, preferencialmente, produzida de tal maneira que aseqüência do valor função está correlacionada com os valores na escala de cinza dospontos correspondentes. De acordo, um conjunto definido de partículas de vírus domesmo tipo é necessário para treinar e conceber a seqüência para a execução de umamáscara para essa estrutura de partícula específica. Essa esparsa representação,permite a fácil deformação e os ajustes da máscara para partículas virais individuaiscujo formato no micrógrafo é, mais ou menos, elíptico.Em um passo pré-processamento de deformação, as posições dassubestruturas, dentro do mesmo tipo de partículas virais variam nas diferentesimagens. Por exemplo, as partículas virais são, algumas vezes, deformadas demaneira que apareçam em diferentes formas elípticas. Para criar as funções teste,espaços vetor-linear foram usados o que demanda que as posições espaço-vetoranalisadas sejam relativamente fixas. A transformação linear uniforme foi escolhidapara aproximar as deformações, já que cobre as deformações mais proeminentesvistas em micrógrafos. O custo computacional desses cálculos é razoavelmentebaixo e simplifica o gerenciamento de delimitações. Essa abordagem, geralmente,exige o uso de operador de transformação quadrimensional, isto é, uma matriz 2x2.

Essas variáveis envolvidas podem ser expressas como a rotação da estrutura antesda deformação (cpr), deformação radial primária (Γ), taxa de deformação originandoa estrutura elíptica (d) e a rotação seguindo a deformação (cpD). Juntos formam atransformação abaixo:

<formula>formula see original document page 9</formula>

Para identificar as variáveis de transformação para uma partícula viralindividual, um conjunto elipse foi usado manualmente para estimar a posição,tamanho e deformação de cada parede de capsídeo, como melhor mostrado pelasFiguras 3A e 3B. A imagem 110 (chamada de A) tem um formato elíptico enquantoa imagem 112 (chamada de B) foi deformada, como descrito, para obter um formatomais circular. Assim, oferecendo três (φη, r e d) das quatro variáveis. A amostra foi,então, parcialmente transformada para obter o raio primário medido semdeformação (d=l), como ilustrado na Figura 3B.

<formula>formula see original document page 9</formula>

As características que são independentes de rotação, como aarquitetura poligonal da parede do capsídeo e a posição do núcleo DNA podem serdeterminadas pelo valor <pR para cada amostra. Para achar esse valor, cada amostraparcialmente transformada pode ser normalizada ao redor de seu meio, no interiorde um círculo, cobrindo a área de imagens visualmente significativas 114a, 116a e118a, como mostrado na coluna da esquerda das Figuras 4Α-C. Então, a soma dosquadrados das distâncias na L2-sência para cada amostra pode ser minimizada comrelação aos ângulos. Já que essa minimização envolve variáveis N-1, com N sendo onúmero de amostras referência considerando uma amostra a ser fixada, esseprocedimento pode ser simplificado pela minimização das distâncias até as amostrasjá processadas, uma a uma. Todas as transformações das imagens podem, então, serimplementadas de maneira bi-linear, assim aproximando o valor da função f noponto (x,y) como:

f(x,y) = f(x,y)(1 -xm)(l -ym)+f(x,y)xm(1 -ym)+f(x,y)(l -xm)ym+f(x,y)xmym

onde xéo número inteiro menor, mais aproximado, de χ, χ é o maiornúmero inteiro aproximado e xm=x-x. A integração pode ser feita usando a mesmainterpolação. As medições obtidas desse passo de processamento apresentamindicativos da gama de propriedades de deformação, isto é, o raio principal (raioprimário) e taxa de deformação, mas esses parâmetros devem ser determinados combase em experiência adicional. Já que todos os tipos de rotação e todas as direçõesde deformação das estruturas virais devem estar presentes em micrógrafos deelétron, essas variáveis são preferencialmente não fixas.

Os pontos e valores função locais (parâmetros) para as máscaras departícula viral podem, então, ser identificados. Uma vez que as amostras deformadassão alinhadas com a estrutura parcial, nas mesmas posições, essa abordagem podeser usada para achar os valores da função invariável. Para descrever esseprocedimento mais claramente, uma amostra deformada f pode ser convertida emum gráfico dessa função pela enumeração (listar individualmente) da posição pixel χe os correspondentes valores função c como f= {(Xk, Cic) }k· O grau de combinaçãoentre duas seqüências de valores função yi e yj (chamados abaixo de vetores)contendo a mesma seqüência de posição pixel determinada usando o padrãoestimado pela correlação estatística:<formula>formula see original document page 11</formula>

Onde y é o valor médio do vetor e a combinação de todos oscoeficientes para [-1,1] é mapeado. A base lógica para o uso dessa abordagem estáno fato de que ela indica o grau de similaridade linear entre as duas estruturas.Depois de colocar os dois vetores amostra normalizados ao redor de sua média

^^dentro de colunas, em uma matriz, a seqüência de função teste

^^que faz^^tão grande quanto é determinado, assim oferecendo amelhor combinação para as amostras usadas para treinamento.

A decomposição de valor singular (SVD) pode ser descrita comosegue:

^^(v é quadrado e ortonormal) =

^^é aplicado à A onde ^^o que serja esperado.

A última expressão é maximal onde w é o eigenvector correspondente ao maioreigenvalue de Σ (que é o maior valor singular) e fc deveria então ser a coluna em Ucorrespondente. Já que essa função é uma combinação linear das colunas em A, acombinação (eq. 2a) reduz para

<formula>formula see original document page 11</formula>

A função teste nesse SVD inicial usa os coeficientes de todos ospontos associados com o primeiro suporte aceito. Alguns desses pontos selocalizam, de certo modo, fora das estruturas virais nas imagens e, em adição,existem pontos nas estruturas cujos coeficientes podem variar consideravelmente.Assim, para escalonar o significado de cada coeficiente e ali eliminar o pior davariação, o valor de

<formula>formula see original document page 11</formula>Foi calculado para cada coeficiente. Certa porcentagem de pontospode, então, ser guardada na função teste. Já que essas operações mudam de acordocom a função teste, um novo SVD foi, subseqüentemente, calculado.

As Figuras 4A-C ilustram as funções teste obtidas usando todos oscoeficientes ou apenas aqueles 80% dos coeficientes variando, identificados eexibindo, pelo menos, a menor variação, de acordo com a classificação de variação.Claramente, o tamanho do núcleo DNA varia na função teste para o capsídeo C epor essa razão os pontos mais incertos foram eliminados nas imagens da direita114b, 116b e 118b. Em conformidade, as funções teste obtidas pela redução donúmero de coeficientes, nessa maneira, foram empregadas rotineiramente.

As deformações, então, podem ser sintetizadas. Já que as estruturasanalisadas foram consideradas como orientadas em qualquer direção e linearmentedeformadas em qualquer direção, essas características devem ser automaticamenteaplicadas à função teste quando uma imagem for analisada. A informação oferecidapelo comportamento da função combinante ao deformar a função teste também é deinteresse e foi explorada em uma situação similar. Enquanto mantém a imagem B ea função teste fc fixada e variando a deformação T, análise da função combinanteS(T)-MOc(B(TxlJ)k) (on(je a seqüência {xk}k é obtida da produção de funçõesteste executadas. Para descrever T em termos de parâmetros

<formula>formula see original document page 12</formula>

seguintes SUp0sições são feitas:

(i)Para certo T ε Tbound, a função teste deformada representa a estruturamais similar ao objeto na imagem. Presume-se que esse T é o que maximiza g.

(ii)O T associado com deformação máxima deve ser localizado dentrodo interior do conjunto de deformação, e não na delimitação. Sob essas condições,mesmo se g for maximizado fora do conjunto (isto é a estrutura é muito grande,muito pequena ou está muito deformada), combinando com os pontos dedelimitação mais próximos, podendo ainda ser alto.Para ser considerado como identificado, a estrutura deve estar emconformidade com esses critérios. A maximização da função de combinação foiexecutada com um esquema descendente íngreme reverso, usando a função teste nãodeformada como ponto de início e aproximando o derivativo como um ponto-oito,esquema diferença centrada (isto é dois pontos para cada variável na deformação).

A aplicação dos critérios de combinação empregados é mostrada nasFiguras 5 e 6. A Figura 5A ilustra como esses critérios trabalham quando aplicadosa um autêntico capsídeo A, como também à uma estrutura similar, mas falsa. Naimagem 120 (chamada de A) é mostrado um capsídeo autêntico. Quando a funçãoteste é deformada, os gráficos ilustram como a função combinante g varia comtamanho radial (T) e grau de deformação (d) do ponto no conjunto de deformaçõesadmissíveis que maximizam g. A função teste deformada tem uma aparência similarà da amostra e a deformação fica dentro das delimitações. A classificação deve,então, ser positiva. Na imagem 122 (chamada de B) na Figura 5B, diferente daimagem A, o ponto no conjunto de deformação que maximiza (g) fina naextremidade e os gráficos mostram um valor combinante mais alto fora desseconjunto. Assim, essa classificação deve ser negativa. Nesse caso as delimitações dedeformação foram ajustadas para

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para propósitos ilustrativos.

Os capsídeos virais deixam o núcleo crescendo através da membranadessa organela. Em relação à esse processo é difícil discriminar entre a estruturaviral e outras estruturas, como mostrado nas imagens 126a e 126b na Figura 6. Aestrutura marcada com a cruz azul está em conformidade com os critérios decombinação (i) e (ii) onde os marcados com um círculo vermelho apenas preenchemcritério (i). Nessa Figura, uma cruz azul indica um ponto na imagem onde acombinação entre a função teste e a estrutura capsídeo é melhor que 0.8 e o grau dedeformação é aceitável. Um círculo vermelho indica uma ponte onde essacombinação é melhor que 0.8, mas onde o grau de deformação não é admissível. Aestrutura marcada como uma combinação tem um combinante de 0.94, que ébastante alto.

As estruturas de partículas virais em uma imagem de microscópioeletrônico podem, então, ser identificadas. Para procurar por estruturas em umaimagem (B) similar à função teste fc, eq 2b é expandido para convoluções. Acombinação da função teste num ponto (m) pode, assim, ser expressa como

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Porém, esse procedimento toma muito tempo. Mas ele pode seracelerado se tomadas as seguintes ações e observações:

(i) As variantes deformadas das funções teste não são ortogonaisuma para com a outra e já que essas estruturas são essencialmente independentes derotação, a combinação de funções teste não deformadas é melhor que a de certovalor para qualquer estrutura deformada admissível do mesmo tipo.

(ii) Já que a tradução deforma ainda mais a estrutura, a combinaçãocom a função teste não deformada deve ser mais alta na posição real de umapartícula viral do que em locais, pelo menos, um diâmetro da função teste longedessa posição.

Ao implementar esses critérios, é possível identificar um subconjuntode potencialmente interessante pontos dentro da imagem maior. Depois disso podeser feita outra análise do conjunto empregando a otimização descrita na seçãoanterior. Essa abordagem oferece um conjunto final de pontos na imagem que estãoassociados com os valores combinantes de^^. Para assegurar a inclusão de

todas as posições interessantes em uma imagem, o valor limiar relacionado com opressuposto (i) acima estabelecido em 0.5.

No pós-processamento do conjunto final, as partículas virais sãocontadas. Não existe valor limiar (t) que possa distinguir entre estruturas autênticase estruturas falsas em todas as imagens, isto é, a designação de estruturasempregando esse procedimento não concorda completamente com o feito por umvirologista experiente. O estabelecimento do nível limiar não é, portanto, umaopção. Ao invés disso, uma função probabilidade positiva PPF 1, pode

ser usada para determinar a probabilidade de um determinado ponto, associado comcerto valor combinante, estar realmente associado com uma partícula viral. Aextensão do valor preditivo positivo (PPV) é obtido calculando a razão entre onúmero de estruturas corretamente identificadas e o número total de estruturasidentificadas com certo valor combinante. Assim, para um conjunto (P) de estruturasidentificadas por esse procedimento contendo um subconjunto PCOrrect de pontosassociados com partículas virais de certo tipo,

<formula>formula see original document page 15</formula>

Para obter uma função em crescimento, suavemente emonotonicamente, 0.05 foi escolhido como valor para ε. A função de probabilidade

E(N)- YjPPF(M).indicando um número esperado (N) de estruturas na imagem é m^ ·

A precisão FNR/FPR do método pode ser descrita como segue. Paraorganizar partículas virais em micrógrafos de elétron, de acordo com o estágio dematuração, um modelo como o descrito aqui é necessário para retratar cada estágioem particular. Ainda, para que esse modelo seja útil para a detecção e quantizaçãode partículas de vírus em tais imagens, também precisa poder rejeitar estruturasespúrias. Assim, o modelo ideal deverá detectar todas as imagens possíveis departículas de vírus, de diferentes tipos, mas nada mais é localizado no mesmoespaço, isto é, no fundo. Para caracterizar nosso modelo nesse respeito sãoutilizadas, comumente, as razões de falso negativo (FNR) e falso positivo (FPR). Arazão FNR é definida como a razão entre o número de partículas virais autênticasrejeitadas incorretamente pelo método e o real número de partículas autênticas,enquanto a razão FPR é a razão entre o número de estruturas espúrias identificadascomo sendo autênticas e o número total de estruturas consideradas como autênticaspor essa abordagem. Assim, as duas razões recaem entre 0 e 1, com 0 sendo o ideal.

Para determinar o número de partículas de vírus com base nasinformações oferecidas pelo conjunto de valores combinantes adquiridos pela buscaem uma imagem, a função de probabilidade positiva PPF, descrita acima, pode serusada. O número esperado de partículas identificadas foi comparado com o númeroverdadeiro de partículas presentes na imagem para obter uma média e um desviopadrão para erro de contagem. Ainda, para avaliar se existe uma diferença médiasistemática, isto é, se o procedimento identifica em média muitas ou poucaspartículas, a hipótese H0 que: "A média de diferença = 0" foi testada.

A padronização e testes foram feitos em conjuntos separados deimagens, 2 para treinamento e 12 para testes. O número de amostras usadas parapadronização foi 4, 7 e 10 para as funções teste A, B, e C, respectivamente. Asimagens de teste contendo um total de 53 capsídeos A, 239 capsídeos B e 83capsídeos C e os limites de deformação foram estabelecidos em

<formula>formula see original document page 16</formula>

As razões falso negativo (FNR) e falso positivo (FPR) foram descritascomo segue. O método foi avaliado pela comparação de nossos resultados com asexperiências de virologistas. A FPR e a FNR foram calculadas como uma função devalor limiar para a medida combinante, melhor vistas nos gráficos 128, 130 e 132nas Figuras 7A-C, respectivamente. A razão FNR é definida como a razão entre onúmero de estruturas autênticas rejeitadas incorretamente pelo procedimentoempregando certo valor limiar para a medida combinante, e o número real departículas de vírus presentes, como determinado por um virologista. Analogamente,a razão FPR é a razão entre o número de estruturas espúrias identificadas comosendo autênticas e o número total de estruturas consideradas como autênticas poresse procedimento. Por comparação, com outros métodos, o cruzamento das curvasocorre em 0.25 para a função teste A, 0.13 para a função teste B e 0.23 para afunção teste C.

A quantização de estruturas em micrógrafos de elétron pode serdescrita como demonstrado abaixo. Os valores PPF 134 calculados dos resultadosapresentados acima são mostrados na Figura 8. O gráfico mostra a freqüênciarelativa das partículas de vírus identificadas corretamente por esse procedimento,em certo valor combinante. Para comparação, um método ideal que ofereça umaseparação completa entre as estruturas falsas e as estruturas verdadeiras resultariaem uma função passo Heaviside em algum valor limiar. Para comparação, umprocedimento de caso ideal que ofereça uma separação completa entre as estruturasfalsas e as estruturas verdadeiras resultaria em uma função passo Heaviside emalgum valor limiar.

Uma trama dispersa 136 do número total de partículas viraisidentificadas como presentes em um conjunto de imagens teste por nossoprocedimento em comparação com o número correto, como determinado por umvirologista, como mostrado na Figura 9 junto com a função identidade. A linhanesse gráfico mostra a função identidade. A média de diferença é de 0.16 e o desviopadrão é de 5.63. O nível de significação da hipótese nula H0, isto é, "A médiadiferença = 0", é 0.92. Claramente, não existe semelhança entre esses dois valores(média diferença = 0.16, desvio padrão 5.63), que no caso ideal seriam pontos nafunção identidade. O fato que o nível de significação de H0 foi 0.92 de acordo como t-test de Estudante indica que existe uma possibilidade de que não houve diferençasistemática entre as duas abordagens, na média. Esses resultados mostram que umaamostragem rápida do número total de estruturas virais, em diferentes estágios dematuração, em um grande conjunto de micrógrafos de elétron, é uma tarefa que, deoutra maneira, consome muito tempo e é muito tediosa para um especialista e podeser rapidamente e confiavelmente completada por nosso procedimentoautomatizado.

Isso pode ser produzido com base no conjunto de posições na imagem138 onde as estruturas de interesse são localizadas em um mapa - como mostrado naFigura 10. Isso facilita, consideravelmente, a contagem manual dessas estruturas etambém oferece uma estrutura para a análise manual. Ao invés de, simplesmente,contar e comparar as estruturas em uma imagem não processada, o virologista éajudado, consideravelmente, nessa tarefa pela disponibilidade de tal mapa. Asdiversas estruturas são separadas da direita para a esquerda, em ordem descendentede valores combinantes, começando do lado esquerdo, no topo da fila.Ao investigar o processo de montagem de vírus, as informaçõesrelacionadas com a topologia estrutural, em relação ao estágio de maturação, nãosão, geralmente, disponibilizadas ou são vagamente definidas. Portanto, sãonecessárias ferramentas para separação e classificação de partículas virais, emdiferentes estágios de maturação. Uma vez que alguns pontos iniciais foram obtidospor classificação de um conjunto de estruturas óbvias, eles podem ser usados paraexpandir o conjunto de estruturas classificadas pela identificação de estruturassimilares com a função combinante empregada. Essa abordagem ajuda a fazer comque o mapeamento de maturação de vírus, em micrógrafos de elétron, seja rápido,confiável e fácil de descrever.

Enquanto a presente invenção foi descrita de acordo com composiçõese incorporações de preferência, fica entendido que certas substituições e alteraçõespodem ser feitas sem que sejam consideradas separadas do espírito e escopo dasseguintes reivindicações.

Claims

1. Um método de identificação e caracterização de estruturas inmicrógrafos de elétron, caracterizado por: estruturas selecionadas em umaprimeira imagem, as estruturas com um primeiro tipo de formato deformado em umaprimeira direção; transformar as estruturas selecionadas em um segundo tipodiferente do primeiro tipo de formato; usar as estruturas transformadas do segundotipo de formato para formar a pluralidade de máscaras; identificação de uma novaestrutura em uma segunda imagem, a nova estrutura tendo o primeiro tipo deformato; deformação da estrutura do segundo tipo de formato em cada máscara naprimeira direção; e determinação da máscara que é a preferida e que melhorcombina com a nova estrutura.

2. O método de acordo com a reivindicação 1 é caracterizadoaonde o método ainda engloba a deformação mecânica de uma partícula viral de umformato elíptico ou de um formato substancialmente circular.

3. O método de acordo com a reivindicação 2 é caracterizadoaonde o método ainda engloba a rotação da partícula viral antes da deformação dapartícula viral.

4. O método de acordo com a reivindicação 3 é caracterizadoaonde o método ainda engloba a rotação da partícula viral subseqüente adeformação da partícula viral.

5. O método de acordo com a reivindicação 1 é caracterizadoaonde o método ainda engloba o teste de outras máscaras para verificar se a máscarapreferida oferece a melhor combinação.

6. O método de acordo com a reivindicação 5 é caracterizadoaonde o método ainda engloba a seleção de estruturas com base em parâmetrosrelacionados com o tamanho e o grau de formato elíptico das estruturas.

7. O método de acordo com a reivindicação 1 é caracterizadoaonde o método ainda engloba a deformação de pluralidades de máscaras para umformato de uma nova estrutura de formato elíptico e teste de cada máscaradeformada para verificar se as máscaras preferidas combinam precisamente com anova estrutura em formato elíptico na segunda imagem.

8. O método de acordo com a reivindicação 7 é caracterizadoaonde o método ainda engloba o teste de outras direções além da primeira direçãopara verificar se a primeira direção de deformação da melhor máscara oferece amelhor combinação para a nova estrutura em formato elíptico.

9. O método de acordo com a reivindicação 8 é caracterizadoaonde o método ainda engloba a determinação de que as outras direções são menosprecisas do que a primeira direção.

10.

O método de acordo com a reivindicação 7 é caracterizadoaonde o método ainda engloba a determinação de um estágio de maturidade e tipode estrutura da nova estrutura de formato elíptico com base na máscara preferida.11.

O método de acordo com a reivindicação 1 é caracterizadoaonde o método ainda engloba a filtragem de estruturas que são dispostas dentro deuma distância radial da nova estrutura em formato elíptico.REIVINDICAÇÕES - Retificadas[recebido pelo International Bureau em 20 de outubro de 2007(20.10.07);reivindicações originais 1-2 retificadas; reivindicação original 7cancelada;reivindicações 8-11 re-numeradas como reivindicações 7-10;permanecendo as reivindicações 3-6 inalteradas (2 páginas)]Reivindicações:-1. Um método de identificação e caracterização de estruturas emmicrógrafos de elétron, caracterizado por: estruturas selecionadas em umaprimeira imagem (110), as estruturas com um primeiro tipo de formato deformadoem uma primeira direção; transformar as estruturas selecionadas para um segundotipo de formato diferente do primeiro tipo de formato; usar as estruturastransformadas do segundo tipo de formato para formar a pluralidades de máscaras;identificação de uma nova estrutura em uma segunda imagem (112), a novaestrutura tendo o primeiro tipo de formato; deformação da estrutura do segundo tipode formato em cada máscara na primeira direção; determinação da máscara que é apreferida e que melhor combina com a nova estrutura; e a deformação depluralidades de máscaras para um formato de uma nova estrutura de formatoelíptico e teste de cada máscara deformada para verificar a máscara que oferece amelhor combinação para a nova estrutura em formato elíptico na segunda imagem.2. O método de acordo com a reivindicação 1 é caracterizadoaonde o método ainda engloba a deformação mecânica de uma partícula viral (110)de um formato elíptico ou de um formato substancialmente circular.3. O método de acordo com a reivindicação 2 é caracterizadoaonde o método ainda engloba a rotação da partícula viral (110) antes dadeformação da partícula viral.4. O método de acordo com a reivindicação 3 é caracterizadoaonde o método ainda engloba a rotação da partícula viral (110) subsequente adeformação da partícula viral.5. O método de acordo com a reivindicação 1 é caracterizadoaonde o método ainda engloba o teste de outras máscaras para verificar se a máscarapreferida oferece a melhor combinação.6. O método de acordo com a reivindicação 5 é caracterizadoaonde o método ainda engloba a seleção de estruturas com base em parâmetrosrelacionados com o tamanho e o grau de formato elíptico das estruturas.7. O método de acordo com a reivindicação 1 é caracterizadoaonde o método ainda engloba o teste de outras direções além da primeira direçãopara verificar se a primeira direção de deformação da melhor máscara oferece amelhor combinação para a nova estrutura em formato elíptico.8. O método de acordo com a reivindicação 7 é caracterizadoaonde o método ainda engloba a determinação de que as outras direções são menosprecisas do que a primeira direção.9. O método de acordo com a reivindicação 1 é caracterizadoaonde o método ainda engloba a determinação de um estágio de maturidade e tipode estrutura da nova estrutura de formato elíptico com base na máscara preferida.10. O método de acordo com a reivindicação 1 é caracterizadoaonde o método ainda engloba a filtragem de estruturas que são dispostas dentro deuma distância radial da nova estrutura em formato elíptico.