BRPI0617687A2

BRPI0617687A2 - composto, método para proteger um indivìduo mamìfero contra, ou tratar, um vìrus, infecção microbiana, parasita, uma doença auto-imune, cáncer, alergia ou asma, e, composição farmacêutica

Info

Publication number: BRPI0617687A2
Application number: BRPI0617687-9A
Authority: BR
Inventors: Vincenzo Cerundolo; Richard Schmidt; Gopal Reddy; Rengarajan Balamurugan; Gerd Ritter; Gurdyal Besra; Mariolina Salio; Jonathan Silk
Original assignee: Ludwig Inst Cancer Res
Priority date: 2005-10-25
Filing date: 2006-10-25
Publication date: 2011-08-02
Also published as: US20090239813A1; US20120269857A1; CA2626997A1; EP1945651B1; WO2007050668A1; EP1945651A4; US8188313B2; CA2626997C; EP1945651A1; CN101331146A; US8334408B2; US8039670B2; US20120034269A1; JP2009513646A; CN101331146B

Abstract

COMPOSTO, MéTODO PARA PROTEGER UM INDIVìDUO MAMìFERO CONTRA, OU TRATAR, UM VìRUS, INFECçãO MICROBIANA, PARASITA, UMA DOENçA AUTO-IMUNE, CáNCER, ALERGIA OU ASMA, E, COMPOSIçãO FARMACEUTICA Descreve-se um composto de fórmula 1, sendo que R~ 1~ representa uma porção hidrofóbica adaptada para ocupar o canal C' de CDíd humana, R~ 2~ representa uma porção hidrofóbica adaptada para ocupar o canal A' de CD 1d humana, de tal forma que R~ 1~ preencha pelo menos pelo menos 30% do volume ocupado do canal C' comparado com o volume ocupado pelo nC~ 14~H~ 29~ terminal da cadeiaesfingosina de cx-gaLactosilceramida quando ligado a CD1d humana e R2 preenche pelo menos 30% do volume ocupado do canal A' comparado com o volume ocupado pelo nC~ 25~H~ 51~ terminal da cadeia acila da <244>- galactosilceramida quando ligado a CD 1 d humana R3 representa hidrogênio a b ou OH, R e R representa, cada um, hidrogênio, e, adicionalmente, quando R3 representa hidrogênio, R^ a^ e R^ b^ em conjunto, podem formar uma ligação simples, X representa ou -CHA(CHOH)~ n~Y ou - P(~0)(0)0CH~ 2~(CH0H)~ m~Y,sendo que Y representa CHB~ 1~B~ 2~, n representa um número inteiro de 1 a 4, m representa 0 ou 1, A representa hidrogênio, um de B~ 1~ e B~ 2~ representa H, OH ou fenila, e o outro representa hidrogênio ou um de B~ 1~ e B~ 2~ representahidroxila e o outro representa fenila, adicionalmente, quando n representa 4, então A juntamente com um de B~ 1~ e B~ 2~ forma, em conjunto, uma ligação simples, e o outro de B~ 1~ e B~ 2~ representa H, OH ou OSO~ 3~H e sais farmaceuticamente aceitáveis do mesmo; os compostos de fórmula 1 são indicados para uso no tratamento de um vírus, infecção microbiana, parasita, uma doença auto-imune, câncer, alergia ou asma.

Description

"COMPOSTO, MÉTODO PARA PROTEGER UM INDIVÍDUOMAMÍFERO CONTRA, OU TRATAR, UM VÍRUS, INFECÇÃOMICROBIANA, PARASITA, UMA DOENÇA AUTO-IMUNE,CÂNCER, ALERGIA OU ASMA, E, COMPOSIÇÃOFARMACÊUTICA"CAMPO DA INVENÇÃO

Esta invenção refere-se a novos derivados de ceramida esíntese dos mesmos. Estes compostos são eficazes como estimuladoresimunes, e têm um efeito que pode ser referido a um efeito imunomoduladorou adjuvante.

ANTERIORIDADES DA INVENÇÃO

α Galactosilceramida, composto A, e seus derivados, temsido conhecida já há algum tempo como agentes biologicamente ativos.Ver, p. ex., Patente dos Estados Unidos n° 5.936.076 para Higa, et al, ePatente dos Estados Unidos n° 6.531.453 para Taniguchi, et al,descrevendo diversos derivados como agentes anti-tumor e tambémimunoestimuladores, sendo que ambos são incorporados integralmente porreferência.

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Composto A: α galactosilceramida

O composto de base, i.e., α-galactosilceramida ou "aGal-Cer" a seguir por Nattori, et al, Tetrahedron, 50:2271 (1994), incorporadopor referência, mostrou por si só inibir crescimento de tumor. Ver,Koejuka, et al, Recent Res. Câncer, 1:341 (1999). Sharif, et al, NatureMed., 7:1057 (2001), e Hong, et al, Nature Med., 7:1052 (2002), mostraeficácia contra diabetes de tipo I.Estudo da estrutura de aGal-Cer mostra que contém umacadeia esfingosina. MIYAMOTO, et al, Nature, 413:531 (2001), mostrouque a truncação desta cadeia resulta em um composto que previneencefalite auto-imune.

Em trabalho paralelo mostrou-se que células Texterminadoras naturais (células NKT [natural killer cells]) reconhecemantígenos lipídicos que são apresentados pela proteína similar a classe I doComplexo de Histocompatibilidade Maior, CDl d, por exemplo. Ver,Godfrey et al, J. Clin. Invest., 114:1379-1388 (2004).

Singh, et al, J. Immunol.. 163:2373 (1999), e Burdin, et al,Eur. J. Immunol.. 29:2014 (1999), mostraram que aGal-Cer e CDldpotencializam respostas imunológicas adaptativas mediadas com Th2, viaativação de Va 14 (NKT) células T exterminadoras naturais (NKT) Va 14.

O mecanismo proposto através do qual aGal-Cer previnedoença é sua capacidade de suprimir interferon-gama, mas nãointerleucina-4, por células NKT. Ver, p. ex., Brossay, et al, J. Exp. Med.,188:1521 (1998); Spada, et al, J. Exp. Med., 188:1529 (1998), quemostraram o reconhecimento de aGal-Cer por células NKT, sugerindoeficácia terapêutica em humanos.

aGal-Cer foi desenvolvido como um composto terapêuticopotencial e levado a testes clínicos, ver, por exemplo, Giaccone et al, ClinCanc. Res., 8, 3702-3709 (2002). No entanto, após tratamento com aGal-Cer, o nível de células NKT no sangue periférico de pacientes de câncertratado que foram tratados caiu a níveis indetectáveis dentro de 24 horas detratamento e não atingiu novamente níveis pré-tratamento durante operíodo remanescente do estudo.

A perda de níveis circulantes de células NKT poderiarepresentar uma limitação significativa do ponto de vista terapêutico àmedida que poderia sugerir que a estimulação terapêutica de células NKTnão poderia ser usada como um tratamento repetido.

Assim, há um interesse na síntese de análogos de αGal-Cerque atuam como estimuladores de células NKT mas que não levam a perdarápida de níveis circulantes de populações de células NKT apósadministração terapêutica.

Diversas publicações descrevem a síntese de αGal-Cer eseus derivados. Uma lista exemplar, mas de modo algum exaustiva dessasreferências inclui Morita, et al, J. Med. Chem., 38:2176 (1995); Sakai, etal, J. Med. Chem., 38: 1836 (1995); Morita, et al, Bioorg. Med. Chem.Lett., 5:699 (1995); Takakawa, et al, Tetrahedron, 54:3150 (1998); Sakai,et al, Org. Lett., 1:359 (1998); Figueroa-Perez, et al, Carbohydr. Res.,328:95 (2000); Plettenburg, et al, Carbohydr. Res.. 67:4559 (2002); Yang,et al, Angew. Chem., 116:3906 (2004); Yang, et al, Angew. Chem. Int. Ed.,43:3818 (2004); e, Yu, et al, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 102(9):3383-3388(2005).

Realizou-se estudos para examinar o impacto biológico damolécula αGal-Cer quando se realizou modificações em sua estrutura.Higa, et al, supra, e também, Zhou, et al, Org. Lett., 4:1267 (2002);Schmieg, et al, J. Exp. Med.. 198:1631 (2003), Barbieri, et al, Carbohydr.Res., 468 (2004); e Fan, et al, Tetrahedron, 61:1855 (2005), são exemplosda literatura limitada neste tópico. Tsuji, et al, J. Exp. Med., 198:1631(2003), prepararam um análogo sintético de C-glicosídeo, i.e., a-C-Gal-Cer, que atua em células NKT, in vivo, estimulando respostas imunológicasincrementadas de tipo Thl em camundongos. A proteção contra infecçãomicrobiana e eficácia anti-tumor (Skold, et al, Infect. Immun., 71:5447(2003); Sharif, et al, supra; Hong, et al, supra) são de interesse especial.

Trabalho adicional nos mecanismos de ação destescompostos é mostrado, por exemplo, por Parekh, et al, J. Immunol.,173:3693-3706 (2004), e Brossay, et al, supra.Exemplos de patentes dos Estados Unidos e Pedidos dePatentes ou Pedidos de Patentes Internacionais que descrevem casos dereferidos derivados e ou a atividade biológica de análogos de aGal-Cerincluem a Patente dos Estados Unidos n° 5.936.076 para Higa, et al, ePatente dos Estados Unidos n° 6.531.453 para Taniguchi, et al, Patente dosEstados Unidos n° 5.853.737 para Modlin et al, Pedido de Patente dosEstados Unidos 2003030611 para Jiang et al, Pedido de Patente dosEstados Unidos 20030157135 para Tsuiji et al, Pedido de Patente dosEstados Unidos 20040242499 para Uematsu et al e Pedidos de PatentesInternacionais descrevendo No. PCT/JP20021008280 para Yamamura et al.

Essencialmente, todos estes exemplos anteriores descrevemestruturas análogas baseadas em aGal-Cer. A identificação e caracterizaçãode moléculas que não são glicolipídeos, como aGal-Cer e seus análogos,tem sido limitada. Exemplos de Pedidos de Patentes descrevendo estruturasque não parecem ser análogas a aGal-Cer incluem peptídios de acila doPedido de Patente dos Estados Unidos n° 20040265976 para Moody et al, ePedido de Patente JP 34540997 para Masunaga et al.

Verificou-se agora um grupo inédito de compostos queemulam substancialmente as propriedades de ligação de um α-GalCer coma molécula CDld humana, mas difere significativamente quanto à interaçãocom receptores de células T (TCR, T-cell receptors), levando apropriedades inesperadas e vantajosas em comparação com a-GalCer.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

Fig. 1 - Comparação da taxa de dissociação de OCH e a-GalCer. Dissociação de ligante de hCDld. O complexo de hCDld (a-GalCer ou OCH) indicado foi carregado sobre uma superfície de sensor deressonância de plasmon de superfície (Biacore) em t = 0 e mediu-se aquantidade de hCDld remanescente no momento indicado usando o Fab 9B.Fig. 2 - Comparação da afinidade de ligação de TCR paraOCH e a-GalCer;

Afinidade e cinética da ligação de TCR /NKT a hCDldcomplexado com α-GalCer ou OCH. Concentrações crescentes de 0,4 μΜ a194 μΜ (diluição de duas vezes) de TCR MO foram injetadas durante 5segundos sobre os complexos hCD Id-GSL indicados. As respostas deligação de 5 concentrações são mostradas superpostas. Os quadros à direitamostram resposta de ligação em equilíbrio.

Fig. 3 - Medições de ressonância de plasmon de superfície(Biacore) de análogos de baixa afinidade de a-GalCer

Mediu-se as afinidades de um TCR de célula NKT solúvelpara moléculas CDld humanas redobradas com diferentes análogos de a-GalCer. Realizou-se medições de ligação e cinética, respectivamente, paraα-GalCer (A e B), treitolceramida (C e D), 4S-treitolceramida (E e F), 4R-treitolceramida (G e H). Os valores IQ (μΜ) foram calculados da ligação deequilíbrio. Os valores Kon foram calculados de Koff e Kd.

Fig. 4 - DC [células dendríticas] humanas são maturadascom análogos de α-GalCer in vitro quando co-cultivadas com células /NKTDiferentes análogos de α-GalCer como indicado ou LPSforam adicionados a co-culturas de DC humanas e células /NKT. (A)Maturação das DC foi avaliada após 40 h, direcionando a células positivaspara CDl lc. Histogramas indicam os perfis CD83 e CD86 de DC dediferentes tratamentos; os percentuais indicam o percentual de DC madurasCD83hi e os números em parênteses, a intensidade de fluorescência médiada população contida na porta marcada. DC e células /NKT foram co-cultivadas na presença de diferentes análogos de α-GalCer durante 24horas. Sorbrenadantes foram analisados usando ELISA quanto à presençade (B) IL-12p40 liberado pelas DC e (C) LFN-γ das células /NKT. Todosos compostos testados induziram produção de citocina mais fraca, porémsignificativa, do que α-GalCer, com a exceção de arabinitolceramida. (D)Titulação de α-GalCer, OCH ou treitolceramida em DCs e co-cultivo comcélulas /NKT induz maturação de DC in vitro. Células foram co-cultivadasna presença da concentração indicada de análogo e mostra-se ospercentuais de DC com CD83/CD80 incrementado. (E) Titulação de a-GalCer induz morte significativa de DC in vitro quando co-cultivadas comcélulas /NKT5 enquanto que análogos de baixa afinidade não o fazem.Viabilidade de α-GalCer ou DC pulsado com análogo foi avaliada após 40horas de co-cultura na presença de células /NKT por meio de citometria defluxo. Células foram manchadas com iodeto de piridínio e mostra-se opercentual de células direcionadas com CDllc vivas remanescentes nacultura.

Fig. 5 - Análogos não-glicolipídicos de α-GalCer estimulamativação de células /NKT e subseqüente maturação de DC in vivo.

Camundongos C57BL/6 ou /NKT"" receberam injeção i.v.com 1 μg de carreador, α-GalCer, análogo ou 25 μg de MPL. Vinte horasapós a injeção esplenócitos foram manchados com anticorpos contraCDl lc, B220 e CD86 e analisados por meio de citometria de fluxo. (A)Maturação foi avaliada por meio de regulação para cima de CD86 nasuperfície da célula, direcionando em DC (CDllc+). Indica-se aintensidade de fluorescência média para cada histograma. Estes são perfisrepresentativos de dois experimentos independentes. Duas, 6 e de 18 a 24 hapós injeção como descrito, os camundongos foram sangrados e o soro foitestado com ELISA quanto à presença de (B) IL-4 e (C) IFN-γ liberadas emresposta ao análogo.

Fig. 6 - Antígenos não-glicolipídicos como adjuvantesefetivos quando co-administrados com um antígeno-alvo.

(A) camundongos C57BL/6 foram co-injetados com 1 μg deα-GalCer ou análogo e 800 μg de OVA. 6 dias mais tarde coletou-seamostras de sangue da veia caudal que foram manchadas diretamente exvivo com tetrâmeros SIINFEKL-K^b fluorescentes e um anticorpo anti-CD8e analisados por meio de citometria de fluxo. Dados são mostrados comocélulas positivas para tetrâmero como um percentual de células CD8+. (B) 7dias após a injeção, os camundongos foram expostos em um cenárioprofilático com 10x10^6 células de tumor E.G7-OVA s.c. e monitorou-se otamanho do tumor durante dias subseqüentes. Houve pouco ou nenhumcrescimento de tumor em camundongos injetados com α-GalCer, arabinitolou treitolceramida com OVA.

Fig. 7 - Análogos não-glicolipídicos de α-GalCer estimulammaturação de células B na presença de células iNKT in vivo e subseqüenteprodução de anticorpos.

(A) camundongos C57BL/6 ou c57BL/6 OU iNKT-/- receberam injeçãoi.v. com 1 μg de carreador, α-GalCer, análogo ou 25 μg de MPL. Vintehoras após injeção esplenócitos foram manchados com anticorpos contraB220 e CD86 e analisados por meio de citometria de fluxo. Maturação foiavaliada por meio de regulação para cima de CD86 na superfície da célula,direcionando em células B (B220+). Indica-se a intensidade defluorescência média para cada histograma. (B) Administração simultâneade 1 μg a-GalCer ou análogos e 400 μg de OVA induz IgGs específicaspara OVA que são significativas. Camundongos foram sangrados de 11 a14 dias após a administração e o soro foi testado com ELISA quanto aanticorpos. Em resumo, placas ELISA foram revestidas com 10 μg/ml deOVA e adicionou-se então diluições seriais de soros e isto foi incubado deum dia para o outro a 4°C antes de detecção com uma IgG anti-camundongo de cabra conjugada com HRP.

Fig. 8 - Expansão de células T CD8+ específicas para MelanA com DC pulsadas com treitolceramida é pelo menos tão efetiva quantocom DC pulsadas com α-GalCer in vitroA expansão de células T CD8++ específicas para MelanA com DC pulsadas com treitolceramida é pelo menos tão efetivaquanto com DC pulsadas com a-GalCer in vitro. A adição de diferentesanálogos de α-GalCer e peptídio Melan-A26-35 a PBMCs humanasinduziu maturação de DC e subseqüente expansão de células T CD8+específicas para Melan-A como avaliado por meio de análise detetrâmero HLA-A2/Melan-A26-35· Citometria de fluxo de culturas nosdias de 10 a 15 de PBMCs co-cultivadas com APCs irradiadasautólogas, pulsadas com peptídio Melan-A26-35 foram manchadas com otetrâmero e FITC anti-CD8+. Indica-se os percentuais de célulaspositivas para tetrâmero [tetrâmero+] como um percentual do total decélulas CD8+ ± SE..

Fig. 9 - Derivados de α-GalCer à base de inositol sãofuncionais in vitro. DC derivadas de monócitos humanos foram pulsadascom 150 ng de diferentes análogos de inositol e co-cultivadas com células/NKT durante 24 h. Os análogos de 6-desóxi- e 6-sulfono-mio-inositolceramida foram apenas ligeiramente menos potentes do que a-GalCer conforme avaliado por meio de regulação para cima de CD83 eCD86. Números indicam a intensidade de fluorescência média dohistograma direcionado em células CDllc+. 6-Desóxi e 6-sulfono-mio-inositolceramida induzem produção significativa de (B) IL-12p40 e (C)IFN-γ por DC e células /NKT respectivamente nos sobrenadantes de DCco- cultivadas e células /NKT. Sobrenadantes foram testados com ELISA erevelam que 6-Desóxi-mio-inositolceramida induz liberação deconcentrações similares de IL-12p40 e IFN-γ àquelas observadas com a-GalCer. A liberação de (D) IFN-g e (E) IL-4 de células /NKT após 24 h emcultura com células CDld humanas de ClR pulsadas com α-GalCer, 6-Desóxi- ou 6-Sulfono-mio-inositolceramida. Titulações dos análogossugerem que o TCR de célula /NKT humana tem uma menor afinidade porestes compostos.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

De acordo com a invenção proporciona-se um composto defórmula I,

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em que

R1 representa uma porção hidrofóbica adaptada para ocuparo canal C' de CDld humanas, R representa uma porção hidrofóbicaadaptada para ocupar o canal A' de CDld humanas, de tal forma que R1preencha pelo menos 30% do volume ocupado do canal C' comparado como volume ocupado pelo nC14H29 terminal da cadeia esfingosina de a-galactosilceramida quando ligado a CDld humanas e R preenche pelomenos 30% do volume ocupado do canal A' comparado com o volumeocupado pelo nC25H51 terminal da cadeia acila de a-galactosilceramidaquando ligado a CDld humana R representa hidrogênio ou OH,

Ra e Rb representa, cada um, hidrogênio e, adicionalmente,quando R3 representa hidrogênio, Ra e Rb em conjunto podem formar umaligação simples,

X representa ou -CHA(CHOH)nY ou

P(=0)(0)0CH2(CH0H)mY, sendo que Y representa CHB1B2

η representa um número inteiro de 1 a 4,

m representa 0 ou 1,

A representa hidrogênio, um de B1 e B2 representa H, OHou fenila, e o outro representa hidrogênio ou um de B1 e B2 representahidroxila e o outro representa fenila, adicionalmente, quando η representa4, então A, em conjunto com um de Bi e B2 forma, conjuntamente, umaligação simples e o outro de Bi e B2 representa H, OH ou OSO3H e saisfarmaceuticamente aceitáveis dos mesmos.

De acordo com a invenção nós também proporcionamos umprocesso para a produção de compostos de fórmula I, ou um sal dosmesmos, ou um derivado farmaceuticamente aceitável dos mesmos, quecompreendem a remoção de um ou mais grupos protetores de um compostode fórmula II correspondente,

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em que Xp representa X protegido, Rp é um grupo protetorde hidroxila, R3p representa um grupo hidroxila protegido ou umhidrogênio e R1, R2, Ra e Rb são como definido acima.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Grupos protetores vantajosos em Xp que podem ser usadospara proteger X incluem grupos protetores bem conhecidos por pessoasversadas na arte da síntese de carboidratos, em particular para protegergrupos hidroxila isolados e grupos hidroxila adjacentes. Exemplos degrupos protetores são dados em Protecting Groups por PJ. Kocienski(Editor, Thieme Publishing Group, ISBN 3131356030), cujo teor éincorporado aqui por referência. Exemplos adicionais são dados emCarbohydrate Chemistry por Geert-Jan Boons (Editor, G. J. Boons,Publisher, Springer, ISBN 0751403962), cujo teor é incorporado aqui porreferência.

Grupos protetores de OH particulares para Xp incluemgrupos bis-O-isopropilideno, bis-O-cicloexilideno, t-butildifenilsilila, alilae benzilóxi. A reação de desproteção pode ser realizada com ácidotrifluoroacético em uma mistura de metanol:diclorometano à temperaturaambiente ao longo de vários dias. A desproteção pode envolver Pd/C napresença de gás de hidrogênio em metanol ou mistura de metanol/EtOAc.Onde o grupo Xp contém uma ligação O-P5 a trietilamina também pode seradicionada para formar o sal de amônio.

Grupos protetores vantajosos para Rp e R3p incluem gruposO-benzila e em que Rp e R3p formando em conjunto um grupo bis-O-isopropilideno.

Compostos de fórmula II, em que ORp e R3p são grupos O-benzila, R é um grupo C25H51, e em que Xp é representado pela fórmula,

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podem ser preparados por meio da redução de composto dafórmula Ila, sendo que Xp é

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E onde ORp e R3p, grupos R2 são definidos acima e ondegrupo W é grupo éster fenoxitiocarbonila. A reação pode ser realizada comhidreto de tributil estanho, AIBN em tolueno aquecido em refluxo durante4 horas.

Compostos de fórmula IIa podem ser preparados a partir decomposto de fórmula IIb em que Xp é representado pela fórmula,

<formula>formula see original document page 12</formula>em que OR , Rp, R são definidos acima e W é umhidrogênio. A reação pode ser realizada com cloreto de fenoxitiocarbonila,piridina, DMAP e diclorometano à temperatura ambiente durante 30minutos.

Compostos de fórmula IIb podem ser preparados a partir decompostos de fórmula IIc em que Xp é representado pela fórmula,

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sendo que

ORp, R3p5 R2 são definidos acima e W é grupoAl 1. A reação pode ser realizada com cloreto de tris(trifenilfosfino)rutênÍo(II), DBU, 90°C, 30 minutos seguido da adição de IM de HCl/acetona.

Compostos de fórmula II e IIc podem ser preparadosreagindo-se compostos de fórmula III,

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em que R é definido acima, com um composto de fórmulaNH2

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sendo que Xp, ORp, R3p, R1, Ra e Rb são definidos acima,desde que Xp não seja

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a reação pode ser realizada com EDC, HOBt, TEA emDMF a 45°C durante 24 horas.Compostos de fórmula III são obteníveis comercialmente oupodem ser preparados de materiais comerciais por meio de métodosconvencionais per se.

Compostos de fórmula IV podem ser preparados reagindo-se compostos de fórmula V,

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sendo que Xp5 ORp, R3p5 R1, Ra e Rb são definidos acima. Areação pode ser realizada com LiAlH4 em éter a O0C aquecendo-se àtemperatura ambiente ao longo de 1 hora.

Compostos de fórmula V, sendo que ORp e R3p sao gruposbenzilóxi e sendo que Xp é representado pela fórmula,

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podem ser preparados por meio da proteção benzila acompostos de fórmula Va, sendo que ORp e R3p são definidos acima, e Xpé representado pelo grupo,

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A reação pode ser realizada na presença de NaH, BnBr,DMF à temperatura ambiente durante 5 horas.

Compostos de fórmula Va podem ser preparados por meioda desproteção de composto de fórmula Vb, sendo que ORp, R3p sãodefinidos acima e Xp é representado pelo grupo,<formula>formula see original document page 15</formula>

A reação pode ser realizada na presença de ácido clorídricoem uma mistura de tolueno/etanol,

Compostos de fórmula V e Vb, podem ser preparadosreagindo compostos de fórmula VI,

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sendo que ORp, R3p, R1, Ra e Rb são definidos acima comum composto de fórmula VII,

<formula>formula see original document page 15</formula>

e sendo que o grupo Xp é definido acima, exceto que ogrupo Xp não é representado pela fórmula

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A reação pode ser realizada na presença de hidreto de sódioem THF, a O0C aquecendo à temperatura ambiente de um dia para o outro.

Compostos de fórmula VI são comercialmente obteníveis oupodem ser preparados de materiais comercialmente obteníveis por meio demétodos convencionais per se.

Compostos de fórmula VII podem ser preparados reagindocompostos de fórmula VIII,

Xp-OH VIIIsendo que Xp é como definido acima com anidrido tríflicoem diclorometano e 2,6-di-t-butilpiridina.

Compostos de fórmula VIII são obteníveis comercialmenteou podem ser preparados a partir de materiais comercialmente obteníveispor meio de métodos convencionais per se.

Ou, alternativamente, compostos de fórmula VIII podemapresentar a forma de compostos da fórmula IX:

Sendo que R é hidrogênio. Compostos de fórmula IXpodem ser preparados desprotegendo-se compostos de fórmula X,

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por meio de hidrogenação catalítica, sendo que o grupo R édefinido acima, e grupo protetor P é um grupo benzila. A reação pode serrealizada com 10% de Pd/C, H2, em MeOH/EtOAc (2:3) de um dia para ooutro.

Compostos de fórmula X podem ser preparados a partir decompostos de fórmula XI,

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sendo que P é definido acima eR3 é um éster defenoxitiocarbonila. A reação pode ser realizada com hidreto de tributilestanho, AIBN em tolueno aquecido em refluxo durante 4 horas.

Compostos de fórmula XI podem ser preparados a partir docomposto de fórmula XII,

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sendo que P é definido acima e R3 é um grupo hidroxila. Areação pode ser realizada com cloreto de fenoxitiocarbonila, piridina,DMAP e diclorometano à temperatura ambiente durante 30 minutos.

Compostos de fórmula XII são comercialmente obteníveisou podem ser preparados a partir de materiais comercialmente obteníveispor meio de métodos convencionais per se.

Ou, também alternativamente, compostos de fórmula VIII,podem apresentar a forma de compostos da fórmula XIII,

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Sendo que P2 é um hidrogênio e P3 é, ou um grupo benzilaou um grupo Ali. Compostos de fórmula XIII podem ser preparados pormeio de proteção de compostos de fórmula XIV com um grupo benzila,

<formula>formula see original document page 17</formula>

Sendo que P2 e P3 é definido acima. A reação pode serrealizada com NaH, BnBr em tolueno aquecida em refluxo durante 10horas, seguido de separação de isômeros.

Compostos de fórmula XIV são comercialmente obteníveisou podem ser preparados a partir de materiais comercialmente obteníveispor meio de métodos convencionais per se.

Compostos de fórmula II, sendo que R2 é C25H51, ORp e R3p,em conjunto, formam um grupo protetor de bis-O-isopropilideno e Xp érepresentado pela fórmula,

<formula>formula see original document page 18</formula>

podem ser preparados reagindo-se compostos de fórmula

XV,

<formula>formula see original document page 18</formula>

sendo que R2 é definido acima, com compostos de fórmula

XVI

<formula>formula see original document page 18</formula>

A reação pode ser realizada com tetrazol em diclorometanoà temperatura ambiente durante 3 horas como um ativador, seguido deadição de t-BuOOH como um oxidante.

Compostos XV e XVI são comercialmente obteníveis oupodem ser preparados a partir de materiais comercialmente obteníveis pormeio de métodos convencionais per se.Compostos de fórmula III podem apresentar a forma decompostos da fórmula XVII

<formula>formula see original document page 19</formula>

Compostos de fórmula XVII podem ser preparados a partirde compostos de XVIII, sendo que η e Q são definidos acima,

<formula>formula see original document page 19</formula>

A reação pode ser realizada na presença de NaOH (em que η= 20) e LiOH (em que η = 17) aquecendo-se em refluxo em metanoldurante 2 horas, seguido da adição de ácido.

Compostos de fórmula XVIII podem ser preparados a partirde compostos de XIX,

<formula>formula see original document page 19</formula>

A reação pode ser realizada na presença de brometo debrometo de n-butiltrifenilfosfônio (em que n = 20), e brometo deheptenotrifenilfosfônio (em que n = 17), com bis(trimetilsilil)amida desódio a -78°C de um dia para o outro.

Compostos de fórmula XIX podem ser preparados a partirde compostos de XX, sendo que η é definido acima

<formula>formula see original document page 19</formula>A reação pode ser realizada na presença DMP emdiclorometano à temperatura ambiente durante de 3 a 4 horas.

Compostos de fórmula XX podem ser preparados a partir decompostos de XXI, sendo que η é definido acima

<formula>formula see original document page 20</formula>

A reação pode ser realizada na presença de p-TSA emmetanol durante de 3 a 4 horas.

Compostos de fórmula XXI podem ser preparados a partirde compostos de XXII, sendo que η é definido acima

<formula>formula see original document page 20</formula>

A reação pode ser realizada na presença de diazometano emTHF ao longo de 4 horas a O0C aquecendo-se à temperatura ambiente.

Compostos de fórmula XXII podem ser preparados a partirde compostos de XXIII, sendo que m = 9 (em que η = 20), e m = 6 (em quen= 17)

<formula>formula see original document page 20</formula>

com um composto de fórmula XXIV

<formula>formula see original document page 20</formula>

A reação pode ser realizada na presença de MeMgCl,L12CUCI4 em THF a -20°C à temperatura ambiente ao longo de 16 horas.

Compostos de fórmula XXIII podem ser preparados a partirde compostos de XXV, sendo que m é definido acima

<formula>formula see original document page 20</formula>A reação pode ser realizada na presença de Mg, refluxo deTHF durante 4 horas.

Compostos de fórmula XXV podem ser preparados a partirde compostos de XXVI, sendo que m é definido acima

<formula>formula see original document page 21</formula>

A reação pode ser realizada na presença de 3,4-diidro-2H-pirano, PPTS.

Compostos XXIV e XXVI são comercialmente obteníveisou podem ser preparados a partir de materiais comercialmente obteníveispor meio de métodos convencionais per se.

Sais farmaceuticamente aceitáveis vantajosos doscompostos de fórmula I com bases vantajosas. Exemplos de referidos saisincluem sais de metal alcalino, p. ex., sódio e potássio, e metal alcalinoterroso, p. ex., cálcio e magnésio.

O composto de fórmula I podem ser obtido em forma de umsal, vantajosamente um sal farmaceuticamente aceitável.

Onde desejado, referidos sais podem ser convertidos àsbases livres usando-se métodos convencionais. Sais farmaceuticamenteaceitáveis podem ser preparados reagindo-se o composto de fórmula I comum ácido ou base apropriada na presença de um solvente vantajoso.

Os compostos de fórmula I podem apresentar tautomerismo,eles também podem conter um ou mais átomos de carbono assimétricos e,portanto, podem apresentar óptico e/ou diastereoisomerismo.

Diastereoisômeros podem ser separados usando-se técnicas convencionais,p. ex. cromatografia ou cristalização fracionada. Os vários isômeros ópticospodem ser isolados por meio de separação de uma mistura racêmica ououtra mistura dos compostos usando-se técnicas convencionais, p. ex.cristalização fracionada ou HPLC. Alternativamente, os desejados isômerosópticos podem ser preparados por meio de reação dos materiais de partidaopticamente ativos apropriados em condições que não causam racemização.Nós preferimos particularmente compostos de fórmula I em que aestereoquímica a porção hidrofílica é análoga àquela encontrada na porçãoα-galactose de a-GalCer.

As condições para uma ocupação substancialmente plena deambos os canais A' e C', como apresentado por α-GalCer encontram-sedescritos detalhadamente em Koch et al, Nature Immunology, 6(8) 819 -826 (2005). Em Koch et al, cavidades foram identificadas como superfíciesacessíveis a moléculas de água (raio, 1,4 Â) mas não sondas maiores (raio,6 Â) com o programa VOLUMES (R. Esnouf, University of Oxford,Oxford, UK). A natureza aberta dos bolsos na superfície dereconhecimento de TCR requereu imposição de uma definição auto-consistente para o limite exterior do bolso, e, com base nisto os autorescalcularam os volumes do bolso para CDl d, CDla e CDlb decamundongo, e também CDld humana. Embora isto resultasse em algumasdiferenças em valores absolutos daqueles reportados antes, observou-se asmesmas tendências relativas. Análise de complementaridade de forma foirealizada usando-se o programa SC (http://www.ccp4.ac.uk/ccp4i main.html). Nós preferimos particularmente compostos de fórmula I que seligam a CDld humanas com uma boa complementaridade de forma, ouseja, com um Sc maior do que 0,50, mais preferivelmente maior que 0,55,particularmente maior do que 0,60.

A cadeia acila de 26 carbonos e a cadeia esfingosina de 18carbonos de um α GalCer coube nos bolsos A' e C', respectivamente, comboa complementaridade de forma (Sc 0,61). O volume total destascavidades (1,400 À3) na fenda de ligação de CDld humana é preenchidaessencialmente com as cadeias de hidrocarboneto. A cadeia acila cabe nobolso A' adotando-se uma curva circular no sentido contrário ao dosponteiros do relógio como observado de acima da fenda de ligação,enchendo o bolso. A cadeia esfmgosina adota uma conformação maisestreita para caber no bolso C' e termina na extremidade da fenda deligação. Assim, é provável que α-GalCer apresente comprimentos de cadeialipídica máximos que são capazes de caber na fenda de ligação de antígenode CDld humanas. Assim, nós preferimos que o comprimento de R (acadeia acila) não exceda 25 ligações simples carbono-carbono decomprimento e R1 (a cadeia esfmgosina) não exceda 13 ligações simplescarbono-carbono de comprimento. A partir de estudos de ligaçãoreportados na literatura, é de conhecimento geral que duplas ligaçõescarbono-carbono podem ser substituídas por diversas das ligações simplescarbono-carbono, desde que as porções hidrofóbicas ainda sejam capazesde ocupar as conformações necessárias para ligação com seus respectivoscanais. Alguns estudos mostraram, por exemplo, que os canais são capazesde aceitar radicais hidrofóbicos relativamente volumosos, como fenila.

Nós preferimos compostos de fórmula I em que R1 preenchepelo menos 35%, mais preferivelmente pelo menos 60%, ainda maispreferivelmente pelo menos 80% e, particularmente, pelo menos 90% dovolume ocupado do canal C' como definido acima.

Prefere-se compostos de fórmula I em que R preenche pelomenos 40%, mais preferivelmente pelo menos 50%, ainda maispreferivelmente pelo menos 60%, particularmente pelo menos 70% e,particularmente, pelo menos 80% do volume ocupado do canal A' comodefinido previamente.

A partir de estudos de difração de raios-X e experimentos demodelagem, parece que quando o grupocomprimento máximo preferido, o espaço remanescente pode ser ocupadopor moléculas "espaçadoras" que ocorrem naturalmente no corpo e que sãosuficientemente disponíveis para ocupar espaços vazios na molécula deCD1d. Referidas moléculas espaçadoras são lipídeos, e análogos. Emvirtude disto, compostos de fórmula 1 em que R é um tanto menor do queo necessário para ocupação máxima do canal A1 ainda se ligarão bem àmolécula de CDl d.

De preferência, R tem um comprimento de pelo menos umaunidade de carbono (i.e. metila), mais preferivelmente pelo menos 5unidades de carbono de comprimento e, particularmente, pelo menos 8unidades de carbono de comprimento. Nós preferimos compostos defórmula 1 em que R representa uma cadeia de hidrocarboneto linearsaturada ou insaturada contendo de 1 a 25, mais preferivelmente 5 a 25 e,particularmente, 8 a 25 átomos de carbono.

Parece que a ligação da cadeia esfingosina é maisdependente da proporção de ocupação do canal C', do que a ligação dacadeia acila ao canal A', pelo fato de que a ocupação deste canal pormoléculas espaçadoras ainda não foi, que o saibam os inventores,observada até aqui. Assim, R1 tem, de preferência, pelo menos 5 ligaçõessimples carbono-carbono de comprimento, mais preferivelmente pelomenos 11 ligações simples carbono-carbono de comprimento e,particularmente, 12 ou 13 ligações simples carbono-carbono decomprimento.

Prefere-se compostos de fórmula I, sendo que um ou ambosde R1 ou R2 contém uma ou mais duplas ligações. Nós preferimosparticularmente aqueles compostos em que um ou ambos de R oucontém uma, duas ou três duplas ligações. Nós preferimos aquelescompostos em que R2 contém duplas ligações.

Prefere-se aqueles compostos em que as duplas ligações sãocis (Z).

Prefere-se aqueles compostos em que X representaCHA(CHOH)nCHB1B2.Prefere-se compostos de fórmula I em que X representaCH2(CHOH)nCHBiB2.

Prefere-se compostos de fórmula I em que η representa 1, 2ou 3, especificamente 2.

Prefere-se compostos de fórmula I e em que η representa 2que se encontra na configuração treo, em oposição à configuração erito.

Prefere-se compostos de fórmula I em que R representahidrogênio.

Prefere-se compostos de fórmula I em que Ra e Rrepresentam, ambos, hidrogênio.

Prefere-se compostos de fórmula I em que um de Bj e B2representa hidrogênio e o outro representa hidroxila.

Prefere-se compostos de fórmula I em que m representa 1Prefere-se compostos de fórmula I em que Y representaCH2OH, CH2PH ou C(OH)(Ph). Nós preferimos particularmentecompostos em que Y representa CH2OH.

Prefere-se também compostos de fórmula I em que ηrepresenta 4, e em que A e B1 e B2 formam, em conjunto, uma ligaçãosimples e o outro de B e B é OH ou OSO3H.

A capacidade dos compostos de fórmula I de modularrespostas imunes específicas para antígeno permite que os compostos sejamúteis na terapia do câncer, vacinas preventivas e terapêuticas, alergias edoenças auto-imunes.

De acordo com a invenção proporciona-se também umcomposto de fórmula I para uso como um medicamento.

De acordo com a invenção proporciona-se também ummétodo de proteger um sujeito mamífero contra, ou de tratar, um vírus,infecção microbiana, parasita, uma doença auto-imune, câncer, alergia ouasma que compreende administrar ao sujeito uma quantidadefarmaceuticamente efetiva de um composto de acordo com a invenção queapresenta atividade farmacêutica contra, ou de tratar, um vírus do tiporeferido, infecção microbiana, parasita, uma doença auto-imune, câncer,alergia ou asma.

De acordo com a invenção nós também proporcionamos ouso de compostos de fórmula I e seus sais na preparação de ummedicamento para o tratamento ou profilaxia de um vírus, infecçãomicrobiana, parasita, uma doença auto-imune, câncer, alergia ou asma. Emparticular, os compostos de fórmula I podem ser usados no tratamento ouprofilaxia das doenças a seguir:

Cânceres: Por exemplo Carcinoma de Células Basais,Câncer de Mama

Leucemia, Linfoma de Burkitt, Câncer do Colo, Câncer doEsôfago, Câncer da Bexiga, Câncer Gástrico, Câncer da Cabeça e Pescoço,Câncer Hepatocelular, Linfoma de Hodgkin, Leucemia de Células Peludas,Tumor de Wilms, Câncer da Tireóide, Timoma e Carcinoma Tímico,Câncer Testicular, Linfoma de Células T, Câncer da Próstata, Câncer doPulmão de Células não-Pequenas, Câncer do Fígado, Câncer de CélulasRenais, e Melanoma.

Infecções virais que podem ser mencionadas incluem:

Hepatite Viral, por exemplo, HBV, HCV;

Infecção por herpes vírus, por exemplo, vírus Herpessimplex.

Outros vírus trópicos da pele, como vírus do papilomahumano.

Vírus trópicos do pulmão, como vírus da influenza ou vírussincicial respiratório.

Infecções virais crônicas ou agudas com HIV, EBV ouCMV ou combinações de infecções virais ou infecções virais e bacterianas.Infecções bacterianas do pulmão com, por exemplo, Haemophilusinfluenzae ou micobactérias, por exemplo, Mycobacterium tuberculosis einfecções bacterianas do intestino, por exemplo, Helicobaeter pylori ou oStaphylocoeeus aureus similar à pele.

Asma, asma induzida com alérgeno, dermatite de contato,psoríase, doença de Crohn.

Mais particularmente, doenças que podem ser tratadas comcompostos de fórmula I são [infecção por] vírus, infecção microbiana,parasita, câncer.

Os compostos de fórmula I podem ser usados sozinho ou emcombinação com outros agentes terapêuticos. Combinações com outrosagentes terapêuticos incluem:

Moduladores imunes, como anticorpo anti CD40/CD40L,anticorpo bloqueador de anti-CTLA-4 ou moduladores imunes baseadosem LAG3 solúvel, agonistas de receptor similar a Toll, como MPL, CpG,RNA de filamento simples, nucleotídeos, análogos de nucleotídios, comoCL087 ou loxoribina, ácido poliinosina-policitidílico, flagelina, resiquimodou immiquimod, gardiquimod entre outros. Ligantes NOD, comodipeptídio de Muramila, Murabutida ou Peptidoglicano, dipeptídio deMuramila entre outros. Anti-virais, como fosfato de oseltamivir,antifungicos, como Anfotericina B e antibióticos. Anticorpos antivirais,como palivizumab.

Outras combinações úteis incluem outros terapáicos imunespara câncer, como herceptina, alemtuzumab, gemtuzumab, rituximab,ibritumomab tiuxetano e outros tratamentos de câncer à base de anticorposmonoclonais. Agentes quimioterápicos, inibidores de quinase, comoImatinib ou Erlotinib ou agentes citotóxicos, como ciclofosfamida. Anti-asmáticos e anti-histaminas e drogas antiinflamatórias também poderiamser usados em combinação. Outras combinações potenciais incluemadjuvantes de vacina, como partículas similares a vírus (VLPs, virus-likeparticles), liposomas, e células apresentadoras de antígenos artificiais. Podeser usado como um aditivo na terapia de células vivas, por exemplo,imunoterapia baseada em DC. Outras combinações potenciais incluemanticorpos bloqueadores de citocina ou quimiocina, como infliximab,Adalimumab e basiliximab.

Proporcionou-se também uma composição farmacêuticacompreendendo um composto de acordo com a invenção em mistura comum excipiente, carreador ou adjuvante farmaceuticamente aceitável.Referidas formulações são geralmente bem conhecidas pela pessoa versadana arte e podem ser análogas àquelas descritas nas EP 0 609 437B, EP-A-I437 358 e WO 2004/028475, cujos teores são incorporados aqui porreferência.

Composições em uma forma vantajosa para administraçãotópica no pulmão incluem aerossóis, p. ex. composições em pópressurizadas ou não-pressurizadas;

Composições em uma forma vantajosa para administraçãoesofagal incluem tabletes, cápsulas e drágeas;

Composições em uma forma vantajosa para administraçãona pele incluem cremes, p. ex. emulsões óleo-em-água ou emulsões água-em-óleo;

Composições em uma forma vantajosa para administraçãointravenosa incluem injeções e infusões; e composições em uma formavantajosa para administração no olho incluem gotas e ungüentos.

De acordo com a invenção proporciona-se também umacomposição farmacêutica compreendendo, de preferência, menos de 80% emais preferivelmente menos de 50% em peso de um composto de fórmula Iou um derivado farmaceuticamente aceitável do mesmo, em mistura comum diluente ou carreador farmaceuticamente aceitável.Exemplos de referidos diluentes e carreadores são: paratabletes e drágeas - lactose, amido, talco, ácido esteárico; para cápsulas -ácido tartárico ou lactose; e para soluções injetáveis - água, alcoóis,glicerina, óleo vegetais.

Quando o composto de fórmula I for administrado nopulmão ele pode ser inalado como um pó que pode ser pressurizado ou não-pressurizado. Composições de pó pressurizado dos compostos de fórmula 1podem conter um propelente de gás liqüefeito ou um gás comprimido. Emcomposições de pó não-pressurizado o ingrediente ativo em formafinamente dividida pode ser usado em mistura com um carreadorfarmaceuticamente aceitável de maior tamanho compreendendo partículascom até, por exemplo, 100 μιη de diâmetro.

Carreadores inertes vantajosos incluem, p. ex., lactosecristalina.

Para os usos mencionados acima, as doses administradasvariarão evidentemente com o composto empregado, o modo deadministração e o tratamento desejado. No entanto, em geral, obtém-seresultados satisfatórios quando o composto de fórmula I é administrado emdosagem diária de cerca de 1 μg a cerca de 20 mg por kg de peso corporalanimal, de preferência, dada em doses divididas de 1 a 4 vezes por dia ouem forma de liberação sustentada.

Para o Homem, a dose diária total situa-se na faixa de 70 μga 1.400 mg e formas de dosagem unitária vantajosas para administraçãocompreendem de 20 mg a 1.400 mg do composto misturado com umdiluente ou carreador farmacêutico sólido ou líquido.

Os compostos de fórmula I apresentam a vantagem de quesão menos tóxicos, mais eficazes, têm ação mais prolongada, possuemmaior faixa de atividade, são mais potentes, produzem menos efeitoscolaterais, são mais facilmente absorvidos ou possuem outras propriedadesfarmacológicas úteis, do que compostos com estrutura similar, por exemploGalCer.

Vários dos análogos da presente invenção apresentaramexcelente atividade imunomoduladora conforme evidenciado pelo fato deque (a) análogos atuaram como imunoestimuladores ou adjuvantes quandoinjetados em camundongos juntamente com antígenos como evidenciadopela geração de respostas IgG específicas para antígeno, ou respostas delinfócitos T CD8+ citotóxicos específicos para antígeno, ou comoevidenciado pela proteção de camundongos contra a morte quando seinjetou análogos como monoterapia em animais, tanto em modelosprotetores e estabelecidos de crescimento de tumor.

Adicionalmente, análogos atuaram como imunostimulantesquando injetados como monoterapia em camundongos, como evidenciadopela indução de respostas de IL-12, ou como evidenciado pela proteção decamundongos contra perda de peso e/ou morte em modelos estabelecidosde infecção por influenza.

Adicionalmente, análogos atuaram como imunostimulantesou adjuvantes quando adicionados a amostras de linfócitos do sangueperiférico humano (TBLs', human peripheral blood lymphocytes) comoevidenciado pela indução de marcadores de maturação de célulasdendríticas em referidas amostras de PBL, ou quando adicionados aamostras de PBLs humanos que foram pulsados com a adição do peptídioMelanA26-35 imunogênico conhecido, ELAGIGELTV (SEQ ID NO: 1),como evidenciado pela indução de células T CD8+ que foram específicaspara o peptídio MelanA26-35 alvo.

É importante observar que muitos análogos de aGal-Cer doestado da técnica induzem respostas tão fortes de citocina de NKT in vivoque células NKT são levadas a um estado não-responsivo e tornam-serefratárias a imunoestimulação adicional, ver, Parekh et al., J. Clin. Invest.,115:2572-2583 (2005).

Em contraste a compostos do estado da técnica,determinados análogos da presente invenção são indutores altamenteefetivos da maturação de células dendríticas humanas, ao mesmo tempoque produzem respostas de citocinas de NKT meramente limitadas emcélulas NKT humanas, em comparação com aGal-Cer. Referida separaçãode estimulação de células dendríticas e conseqüente maturação na ausênciade secreção de citocina de NKT é um aspecto único da presente invenção.

Antecipa-se que este aspecto único e inédito permiteestimulação repetida de células dendríticas sem exaustão ou depleção dapopulação de células NKT após administração de compostos da presenteinvenção.

Nos exemplos a seguir descreve-se moléculas novas,juntamente com métodos para sua síntese. Estes exemplos são seguidosmostrando-se as propriedades imunomoduladoras destas moléculas.

A estimulação referida acima pode proporcionar proteçãocontra condições em que é desejável que o sistema imunológico respondaefetivamente, como doença infecciosa ou câncer.

Adicionalmente, compostos da invenção podem ser usadosem combinação com ligantes de TLR, como poli LC (TLR3), MPL(TLR4), imiquimod (TLR7), R848 (TLR8) ou CpG (TLR9) para produziruma estimulação imune incrementada e proteção resultante de condiçõesem que é desejável que o sistema imunológico responda efetivamente,como doença infecciosa ou câncer.

Compostos da invenção também podem ser usados comoimuno-estimulantes ou adjuvantes em uso combinado com materiais deantígeno, como, sem limitação, proteínas, peptídios, ou ácidos nucleicosetc. para produzir respostas imunes protetoras, como uma resposta deanticorpo de IgG e células B, ao antígeno administrado.Compostos da invenção também podem ser usados comoimunoestimulantes ou adjuvantes em uso combinado com materiais deantígeno, como, sem limitação, proteínas, peptídios, ou ácidos nucleicosetc. para produzir respostas imunes protetoras, como uma resposta de CTLou células T ao antígeno administrado.

Referidos materiais de antígeno poderiam ser quaisquermateriais vantajosos para prevenção ou terapia daquela doença particular.Especificamente com relação ao câncer, exemplos de antígenos de proteínae peptídio associados com tumor que podem ser administrados para induzirou incrementar uma resposta imune são derivados de genes associados comtumor e proteínas codificadas, incluindo MAGE-A1, MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A5, MAGE-A6, MAGE-A7, MAGE-A8, MAGE-A9, MAGE-A10, MAGE-Al 1, MAGE-A12, MAGE-Al3, GAGE-1,GAGE-2, GAGE-3, GAGE-4, GAGE-5, GAGE-6, GAGE-7, GAGE-8,BAGE-1, RAGE- 1, LB33/MUM-1, PRAME, NAG, MAGE-Xp2 (MAGE-B2), MAGE-Xp3 (MAGE-B3), MAGE-Xp4 (MAGE-B4), tirosinase,glicogênio fosforilase de cérebro, Melan-A, MAGE-C1, MAGE-C2, NY-ESO-1, LAGE-1, SSX-1, SSX-2(HOM-MEL-40), SSX-1, SSX-4, SSX-5,SCP-I e CT-7. Por exemplo, peptídios antigênicos característicos detumores incluem aqueles listados no pedido PCT publicado WO00/20581(PCT/US99/21230).

Os compostos da invenção são eficazes tanto in vitro comoin vivo, e tanto em camundongos como em humanos, como se mostrou.Assim, um aspecto da invenção refere-se a estimular uma resposta imuneem um sujeito, por meio de administração de um ou mais dos compostos dainvenção com ou sem uma molécula antigênica, numa quantidadesuficiente para estimular uma resposta imune favorável em referidossujeito.

Está claro que composições e ou kits, compreendendo umou mais dos derivados da invenção, em conjunto com um ou mais peptídiosou proteínas (como composições), ou como porções separadas de derivadoe proteína ou peptídio, (como kits), são outra característica da invenção.

Outras facetas da invenção estarão claras para a pessoaversada e não precisam ser reiteradas aqui.

Há dois parâmetros principais que determinam a ativação decélulas NKT por seu ligante CDl d,

1) A afinidade do TCR de /NKT a CDld (amplamentedeterminado pela natureza do ligante ligado a CDl d).

2) A estabilidade do complexo de CDld (determinado pelanatureza do ligante ligado a CDl d).

Análises estruturais, cinéticas e funcionais combinadas daligação de TCR solúvel a complexos CDld-lipídeo e ativação de célulasNKT invariantes (ζ'ΝΚΤ) forneceram compreensões importantes sobre aidentificação ótima de agonistas de células /NKT para uso clínico. Oobjetivo destes estudos consistiu em identificar agonistas de células /NKTque, diferentemente de a-Galactosilceramida (α-GalCer), foram capazes depreencher 3 critérios: a) capacidade de induzir ativação de células /NKT,sem super-estimulação de células /NKT para minimizar tempestade decitocinas e Iise de células dendríticas (DC, Dendritic Cells) dependente decélulas /NKT; b) capacidade de assegurar maturação de DC c) capacidadede assegurar preparação ótima de células T específicas para antígeno.

O conhecimento derivado da estrutura de TCRs específicospara CDld-a-GalCer (Gadola, Koch et al, JExp Med, 2006, 203; 699-710)e da estrutura de moléculas CDld humanas vazias e carregadas com a-GalCer (Koch, Strange et al, Nat Immunol, 2005, 6; 819-26) suscitaram-nos a realizar uma série de experimentos cinéticos e funcionais para avaliaro papel da cabeça polar e o comprimento e saturação de cadeias alquila deα-GalCer no controle da taxa de dissociação de lipídeos ligados amoléculas CDl d, e a afinidade de ligação de TCR específico para lipídeo.

Para tratar destas questões, nós manipulamos dois reagentes:i) Um TCR solúvel de um clone de célula /NKT e ii) um anticorpoespecífico para complexo CDld-a-GalCer. Usando estes dois reagentes nósrealizamos estudos cinéticos e funcionais combinados para comparar aafinidade da ligação de TCR de /NKT a moléculas CDld humanascarregadas com α-GalCer ou seus análogos com cadeias esfingosina e acilatruncadas ou cabeças polares modificadas.

Papel do comprimento de lipídeos no controle daestabilidade de complexos CDld/lipídeo /NKT e na modulação daafinidade de ligação de TCR ao complexo CDld-lipídeo.

Foram redobrados in vitro monômeros de CDld reduzidos ebiotinilados, e carregamos os mesmos com uma faixa de análogos de a-GalCer com cadeias esfingosina ou acila truncadas. Em seguida, nósanalisamos independentemente a taxa de dissociação dos análogos demoléculas de CDld e a afinidade de ligação a um TCR de /NKT solúvel.

Foram testados α-GalCer e (2S,3S,4R)-l-0-(a-D-galactopiranosil)-N-tetracosanoil-2-amino-1,3,4-nonanotriol (referido aseguir como OCH), que apresenta uma cadeia esfingosina mais curta doque α-GalCer e que apresentou previamente ligação com moléculas CDldde camundongo com uma meia-vida menor, resultando numa ativação maisfraca de células /NKT de camundongo (Miyamoto, Miyake et al, Nature,2001, 413; 531-4, Old, Chiba et al, J Clin Invest, 2004, 113; 1631-40).

Para medir a taxa de dissociação de moléculas CDl d, nósgeramos, por meio de biblioteca de apresentação de fago, um anticorpo Fabespecífico para moléculas CDld carregado com α-GalCer (referido a seguircomo 9B Fab), medições iniciais Biacore e manchamento com FACS decélulas ClR-CDld pulsadas com lipídeo demonstraram que o Fab 9Breconheceu especificamente moléculas CDld humanas carregadas comtodos os compostos testados, embora falhasse em manchar células ClR-CD1d impulsadas (dados não mostrados). Usando o Fab 9B nósverificamos a taxa de dissociação de todos os compostos testados demoléculas CD1d humanas solúveis usando ressonância do plasmon desuperfície. Complexos de CD1d-lipídeo biotinilados foram imobilizadossobre cavacos [chips] revestidos com estreptavidina e mediu-se ao longo dotempo o nível de ligação do Fab 9B. A perda de ligação do anticorpo aolongo do tempo foi usada para determinar a taxa de dissociação de lipídeode moléculas CDld.

Resultados: OCH apresentou uma taxa de dissociação 3,9vezes mais rápida do que α-GalCer, respectivamente (Fig. 1). Estesresultados foram consistentes com dados previamente publicados,demonstrando que a estabilidade de glicolipídeos ligados a moléculasCD1d depende do comprimento das cadeias alquila (Old, Chiba et al, JClin Invest, 2004, 113; 1631 -40).

Foi avaliado então se o comprimento das cadeias acila eesfingosina poderia afetar a afinidade da ligação de TCR de /NfCT aocomplexo glicolipídeo-CD1d. Nós redobramos cadeias Va24 e Vβ11 doTCR de /NKT como previamente descrito (Gadola, Koch et al, J Exp Med,2006, 203; 699-710) e usamos o TCR de /NKT purificado e redobrado emestudos de ressonância do plasmon de superfície contra monômeros deCD1d biotinilados imobilizados carregados com α-GalCer ou OCH. Osresultados destes experimentos demonstraram que um aumento docomprimento da cadeia esfingosina correlacionou-se com um aumento daafinidade de ligação de TCR, sugerindo que uma redução do comprimentoda cadeia de lipídeo afeta negativamente a afinidade de ligação de TCR acomplexos lipídeo-CD1d (Fig. 2).

Conclusões: A estrutura cristalina de CD1d humanas-GalCer demonstrou que α-GalCer explora totalmente a capacidade deligação de CDl d. Usando ressonância do plasmon de superfície, nósverificamos que: i) encurtamento de qualquer uma das cadeias alquilareduziu significativamente a estabilidade de complexos CDld/lipídeo (Fig.1 e dados não mostrados); ii) encurtamento da cadeia esfingosina de a-GalCer reduz a afinidade de TCR de células /NKT em 100 vezes (Fig. 2),resultando em alterações na sinapse imunológica de células zNKT,polarização de grânulos citotóxicos de células /NKT e ativação de células/NKT (dados não mostrados). Em contraste, variações do comprimento oua saturação da cadeia acila não altera afinidade de TCR de células /NKT(dados não mostrados). Análise de estruturas previamente reportadas demoléculas CDld humanas vazias e carregadas sugere que a ocupaçãoincompleta da fenda de ligação por uma cadeia esfingosina encurtadapoderia resultar em diferenças conformacionais na superfície dereconhecimento do TCR. Este efeito indireto proporciona um mecanismogeral por meio do qual o comprimento da cadeia lipídica que ocupa o canalC' de CDld desempenha um papel no controle da afinidade de células Trestritas a CDld específicas para lipídeo.

A modulação observada da afinidade de ligação de TCR docomplexo OCH/CDld é obtida, portanto, ao custo de maior instabilidadedo complexo CDld lipídeo, causada pela cadeia esfingosina encurtada.Como agonistas de células NKT com cadeias esfingosina mais curtasapresentarão uma menor duração de vida in vivo, nós objetivamos definiruma nova família de compostos capazes de se ligarem com alta afinidade aCDl d. Referida nova classe de moléculas poderia dotar-nos com umaoportunidade de realizar o ajuste fino da faixa de afinidade de ligação entreo TCR de NKT e os complexos CDld/lipídeo.

Modificação da cabeça polar.

i. Derivados de glicerol ceramida

Afinidade menor do TCR invariante por análogos de a-GalCer.

Para caracterizar a afinidade de análogos de a-GalCer,gerou-se monômeros de hCDld biotinilados usando protocolospreviamente descritos (Karadimitris, Gadola et al, Proc Natl Acad Sei U SA, 2001, 98; 3294-8) ligados aos diferentes análogos. Realizou-se análisede ressonância de plasmon de superfície (Biacore) usando um TCR deVa24+/Vpi I + invariante humano ligado a dissulfeto solúvel (Gadola, Kochet al, J Exp Med, 2006, 203; 699-710) para medir as constantes dedissociação em equilíbrio (Kd) da ligação do TCR aos diferentesmonômeros (Fig. 3).

A Kd da ligação de TCR ao monômero contendo a-GalCerfoi de 1,29 μΜ, enquanto que aquela da treitolceramida foi [afinidade]menor a 5,78 μΜ. A ligação do TCR aos monômeros de treitolamina 4S e4R foi ligeiramente maior do que a treitolamina não-modificada a 3,84 μΜe 4,25 μΜ respectivamente.

Diferenças na medição cinética da taxa de dissociação (Koff)entre o TCR e os diferentes monômeros apresentaram magnitude similarentre os análogos como nos estudos de equilíbrio (Fig. 3) com 0,37s_1 paraα-GalCer e 0,506 e 0,650s_1 para os derivados de treitolceramida 4R e 4Srespectivamente. A Koff mais rápida dos testados foi com o análogo detreitolceramida não modificado a 1,04s"' indicativo de uma menor interaçãode afinidade. E tentador especular que a diferença de afinidade observadaentre as variantes 4 S e 4R tenha se devido à maior estabilidade do grupoprincipal de fenil-treitol interagindo com o TCR. Estes dados sugerem quea estrutura previamente gerada pode ser útil no projeto racional de análogosde ligação de CDld que podem apresentar diferentes propriedades a a-GalCer.

Em um esforço para identificar os radicais mínimosnecessários para estimular células /NKT, nós decidimos gerar uma famíliade compostos que conservam alta afinidade por moléculas CDld (i.e. commáximo comprimento de ambas as cadeias alquila), e contendo, ou um 3-carbono i.e. grupo principal emulando glicerol), um 4-carbono (i.e. grupoprincipal emulando treitol, referido a seguir como treitol-ceramida ) ou um5-carbono (i.e. grupo principal emulando arabinitol).

DC humanas imaturas foram cultivadas na presença de umclone de células iNKT humanas com ou sem análogos ou carreador emdiferentes concentrações. Após 24 horas, DC foram analisadas por meio decitometria de fluxo para a regulação para cima de diferentes marcadores dematuração, α-GalCer induziu significativa regulação para cima de todos osmarcadores examinados (CD83, CD86 e CD38) (Fig 4 e dados não-publicados). Em cada caso, o grau de maturação observado com umanálogo foi reduzido em comparação com α-GalCer. Treitolceramida foimais potente do que glicerolceramida e arabinitolceramida, enquanto quemodificações nas variantes fenila 4R-treitolceramida e 4S-treitolceramidanão parecem ter afetado sua função. E interessante observar que aarabinitolceramida pareceu ser apenas fracamente funcional neste sistema,que pode ser significativa e indica o grau de interação necessário paraestimulação através do TCR invariante humano.

Liberação de IL-12p40 (e p75 bioativo) por DC é ummarcador de ativação e considera-se que desempenha um papel importantena regulação do perfil da resposta imune gerada em resposta a estas DC(Trinchieri et al, Nat Rev Immunol, 2003, 3; 133-46). IL-12p40 foi medidoa partir dos sobrenadantes das culturas mistas e a concentração de IL-12p40liberada (Fig. 4B) refletiu as respostas de maturação previamente descritas(Fig. 4A). α-GalCer induziu níveis significativos de IL-12p40, enquantoque treitolceramida e glicerolceramida induziu aproximadamente 50% donível observado na presença de α-GalCer. Ambas, treitolceramida 4R e 4S,induziram uma resposta menos potente, enquanto que se detectou pouca IL-12p40 na presença de arabinitolceramida.

Obteve-se respostas similares quando se examinou aativação de células /NKT. A liberação de IFN-γ pelas células /NKT emresposta à estimulação por análogos apresentados por DC induziuaproximadamente 40 ng/ml de IFN-γ na presença de a-GalCer, 20 ng/mlcom treitolceramida e glicerolceramida e não se detectou qualquer IFNydetectável quando se adicionou arabinitolceramida à cultura (Fig. 4C).

A partir destes ensaios verificou-se que treitolceramida é umanálogo de α-GalCer potente, com menor afinidade. Para comparar asfunções de α-GalCer com alta afinidade, tretitolceramida com afinidadeintermediária, com o conhecido análogo de OCH com baixa afinidade, ostrês compostos foram titulados sobre DC e usados para apresentar [] acélulas /NKT. A maturação de DC e a viabilidade de DC foram examinadasapós 48 horas. Embora α-GalCer induzisse máxima maturação de DCmesmo a 0,8 ng/ml, em comparação com 67 ng/ml para treitolceramida ouOCH, nas mesmas concentrações (Fig. 4D), apenas 10% de DC ainda semostravam viáveis quando estimulava com α-GalCer, enquanto que umaproporção significativamente maior de DC foi negativa para iodeto depropídio quando se usou qualquer um dos análogos (Fig 4E). Estes dadosmostram que treitolceramida pode induzir boas respostas funcionais decélulas /NKT in vitro, enquanto mantém significativa viabilidade de DC emcomparação com α-GalCer.

Estes dados sugerem que análogos de α-GalCer com menorafinidade podem estimular maturação potente de DC dependente de células/NKT sem a significativa eliminação observada com α-GalCer.Diferentemente de OCH, treitolceramida deveria ter a mesma afinidade deligação por CDld que a esfingosina e cadeias acila são idênticas àquelasem α-GalCer.

Os experimentos a seguir exemplificam adicionalmente usospotenciais desta nova classe de ligantes de CDl d:

A estimulação de células NKT com α-GalCer no contextode CDld induz rapidamente liberação de níveis significativos de umaquantidade de citocinas, incluindo IFN-γ e IL-4 (Burdin, Brossay et al, JImmunol, 1998, 161; 3271-81), IL-3 e GM-CSF (Leite-de-Moraes,Lisbonne et al, Eur J Immunol, 2002, 32; 1897-904) com outros tipos decélulas a jusante incluindo ativação de DC (Kitamura, Iwakabe et al, J ExpMed, 1999, 189; 1121-8) e células NK (Carnaud, Lee et al, J Immunol,1999, 163; 4647-50). Mostrou-se que análogos, como OCH (Miyamoto,Miyake et al, Nature, 2001, 413; 531-4) e 20:2 (Yu, Im et al, Proc NatlAcad Sci USA, 2005, 102; 3383-8) induzem uma resposta de citocinamodificada, com liberação de IL-4 mas com pouca ou nenhuma IFN-γ.Injeção de glicerolceramida em camundongos de tipo selvagem não induziuqualquer liberação detectável de citocina (Fig 5. B e C) como seria de seesperar pela falta de DC dependentes de células iNKGT (Fig. 5A). Noentanto, quando se injetou treitolceramida ou arabintolceramida, IL-4 (Fig.4B), IFN-γ (Fig. 5C) e IL-12p40/70 (dados não mostrados) foramdetectadas no soro com um decurso similar àquele observado com a-GalCer. Ambos os compostos foram menos potentes do que α-GalCer emdoses equivalentes. Nenhum composto mostrou uma resposta enviesada decitocina Th2 como observado com OCH (Miyamoto, Miyake et al, Nature,2001, 413; 531-4, Silk, Hermans et al,JClin Invest, 2004, 114; 1800-11).

Função adjuvante de análogos de α-GalCer induz efetivasrespostas de células T específicas para tumor, in vivo.

Previamente, nós e outros mostramos que a co-injeção deantígenos modelo, como OVA (Silk, Hermans et al, J Clin Invest, 2004,114; 1800-11, Fujii, Shimizu et al, J Exp Med, 2003, 198; 267-79,Hermans, Silk et al, JImmunol, 2003, 171; 5140-7) e β-galactosidase (Silk,Hermans et al, J Clin Invest, 2004, 114; 1800-11) em conjunto com a-GalCer induz respostas incrementadas de células B e células T CD8+,CD4+. Estas foram efetivas para terapia contra células de tumorexpressando o antígeno-alvo. Os diversos análogos foram co-injetados comOVA em camundongos de tipo selvagem, e 6 dias mais tarde examinou-seo sangue quanto à presença de células T CD8+ específicas para antígenousando tetrâmeros Kb-SIINFEKL fluorescentes. Ambas, arabintolceramidae treitolceramida, induziram uma significativa resposta de células T CD8+após 6 dias, embora de forma menos potente do que α-GalCer, enquantoque glicerolceramida não o fez (Fig. 6A). Soros dos camundongos foramexaminados quanto à presença de anticorpos específicos para OVA usando-se ELISA e isto mostrou respostas de ordem de classificação similaràquelas observadas com células T CD8+ (Fig. 7B e 7C).

Respostas de células B

Análogos não-glicolipídicos de α-GalCer estimulammaturação de células B na presença de células /NKT in vivo e subseqüenteprodução de anticorpos. (A) camundongos C57BL/6 ou zNKT"7" receberaminjeções i.v. com 1 μg de carreador, α-GalCer, análogo ou 25 μg de MPL.Vinte horas após a injeção esplenócitos foram manchados com anticorposcontra B220 e CD86 e analisados por meio de citometria de fluxo. Amaturação foi avaliada por meio da regulação para cima de CD86 nasuperfície da célula, direcionando em células B (B220+) (Fig 7 A). Indica-se a intensidade de fluorescência média para cada histograma. (B)administração simultânea de 1 μg de α-GalCer ou análogos e 400 μg deOVA induz significas IgGs específicas para OVA. Camundongos foramsangrados de 11 a 14 dias após a administração e o soro foi testado quantoa anticorpos por meio de ELISA (Fig 7 B).

Preparação de repostas de células T específicas paraantígeno usando modelo de preparação humano in vitro.

Experimentos realizados com linfócitos do sangue periféricohumano demonstraram que treitol-ceramida é superior à glicerol-ceramidana expansão de respostas de células T específicas para Melan-A 26-35· (Fig8)

II. Análogos de derivado de inositol de a-GalCer

Subseqüentemente gerou-se um novo grupo de análogosinéditos de α-GalCer. O primeiro foi uma inositolceramida com uma cadeiade ácido graxo de 25 carbonos (INOC-25). INOC-25 induziu maturaçãodetectável de DC e produção de citocina a partir de células zNKT. (Dadosnão mostrados). Realizou-se modificações estruturais adicionais para gerar6-Sulfono-mio-inositolceramida e 6-Desóxi-mio-inositolceramida. Estescompostos foram testados quanto a seus efeitos sobre a maturação de DCno sistema de co-cultura humana (Fig. 9A) e em camundongos in vivo(dados não-publicados). Enquanto o derivado de inositol INOC-25induzisse pouca maturação de DC (dados não mostrados) por meio deregulação para cima de CD83 e CD86, ambas, 6-Desóxi e 6-Sulfono-mio-inositolceramida, induziram significativa maturação de DC de uma maneiradependente de células /NKT (Fig. 9 A.) em extensão similar àquelaobservada com a-GalCer.

De forma similar àquela observada com maturação de DC(Fig. 9 A.), produção de IL-12p40 pelas DC foi quase idêntica entre a-GalCer e 6-Desóxi-mio-inositolceramida, enquanto que o derivado de 6-Sulfono foi ligeiramente mais fraco (Fig. 9B). No entanto, a quantidade deIL-12p40 produzida pelas DC em resposta a células /NKT estimuladas comos análogos de derivados de 6-Desóxi e 6-Sulfono foi significativamentesuperior àquela de INOC-25 (não mostrado) e também maior do que aquelaobservada com LPS. Os sobrenadantes das co-culturas de DC com oscompostos de derivados de inositol foram examinados quanto a IFN-γcomo uma medida da ativação de células /NKT. Embora o composto 6-Desóxi induza liberação similar de IFN-γ àquela observada com adição deα-GalCer (Fig. 9C), 6-Sulfono-mio-mositolceramida induziu muito poucaliberação de IFN-γ das células zNKT.

Os três compostos de inositol foram titulados em célulasClR expressando CDld humanas e usados para estimular um clone decélulas zNKT. De ambos, a liberação de IFN-γ (Fig. 9D.) e IL-4 (Fig. 9E.)parece que, embora o INOC-25 induzisse pouca ou nenhuma IFN-γ e IL-4,6-Desóxi inositolceramida estimulou a liberação de níveis significativos deambas as citocinas das células /NKT. E interessante observar que,conforme observado quando co-cultivadas com DC (Fig. 9C), embora 6-Sulfono inositolceramida estimulasse pouca ou nenhuma liberação de IFN-γ (Fig. 9D), produziu-se IL-4 detectável quando se usou concentraçõesmaiores do composto (Fig. 9E).

Em comparação com α-GalCer, cada um dos compostos dederivados de inositol pareceu apresentar menor afinidade. Tanto em termosde IFN-γ (Fig. 9C) e IL-4 (Fig. 9B) α-GalCer induz a liberação deconcentrações significativamente maiores de citocinas. IFN-γ e IL-4pareceram aproximar-se de um platô quando estimuladas com 200 ng/ml deα-GalCer. Embora IFN-γ e IL-4 induzidas pelos derivados de inositoltambém pareçam titular [] com concentração crescente de composto, elasnão se aproximaram dos níveis induzidos por α-GalCer.

É possível que, embora células ClR sejam efetivas naapresentação de quantidades maiores de ligantes, como α-GalCer, elas sãomenos efetivas para apresentar compostos com menor afinidade do queAPCs profissionais, como DC. Isto pode explicar a diferença na magnitudeda produção de citocina observada entre análogos apresentados por DC epor células ClR transfectadas com CDld.

Conclusões: O ajuste fino da afinidade de ligação do TCRde /NKT com o complexo CDld/lipídeo e a estabilidade de ligantes delipídeos a moléculas CDld levou à identificação de um novo grupo decompostos capazes de induzir ativação de células íNKT, sem super-estimular células /NKT. Esta classe inédita de compostos é eficiente paraestabilizar moléculas CDld e isto é otimizado para estimulação de NKTporque minimiza a liberação de citocina e Iise de DC dependente de célulasNKT, ao mesmo tempo que assegura a maturação de DC e preparação decélulas BeT específicas para antígeno. Esta combinação inédita deatributos biológicos e moleculares úteis foi obtida projetando-se uma classede ligantes de CDld que otimizam a interação de /NKT/CDld semcomprometer a estabilidade do complexo CDld/ligand. Portanto, referidoscompostos podem ser usados numa faixa de dosagem efetiva mais amplado que compostos existentes.

Exemplo A

Estes experimentos descrevem a preparação de célulasdendríticas (a seguir denominadas de DCs [dendritic cells]). Neste e nosexemplos a seguir usou-se, Composto 1, arabinitol ceramida; Composto 2,glicerol ceramida; ou Composto 3, derivados de treitol ceramida).

Seguiu-se a metodologia de Salio, et al, J. Immunol.,167:1188-1197 (2001), incorporada por referência. Em resumo, 2x105 DCsderivadas de monócitos humanos foram pulsadas com 100 ng/ml de um dosCompostos 2, 3, aGal-Cer, ou solução de carreador, como um controle.Para pulsação de DC, cada um de arabinitol ceramida (Composto 1), treitolceramida (Composto 3), glicerol ceramida (Composto 2) e aGal-Cer foisolubilizado em solução de carreador (0,5% de Tween 20/PBS), eadicionado ao meio das culturas de DC. Células NKT também foramadicionadas às culturas de DC numa relação de 10 células DC/NKT. Após36 horas, sobrenadante foi removido das culturas e analisado quanto àpresença de marcadores de maturação de DC conhecidos CD83, CD80,CD86, CD25, e CD38, sendo que todos estes foram analisados via FACS,usando-se métodos bem conhecidos.Os resultados indicaram que DCs são combinadas comNKTs na presença de Composto 1 (arabinitol ceramida) ou Composto 2(glicerol ceramida) ou Composto 3 (treitol ceramida) induz-se marcadoresde maturação de DC. Níveis de indução de marcadores de maturação sãosimilares àqueles observados com aGal-Cer. Não se observou regulaçãopara cima com controles.

Adicionalmente, níveis de interleucina-12 (EL-12) forammedidos como uma indicação da estimulação de DC por meio de detecçãode p40 de IL-12 via ELISA, usando-se métodos convencionais. As célulasNKT não produzem IL-12 isto indica uma resposta específica de DC.Todos os compostos produziram secreção de IL-12 neste ensaio. Observou-se que Composto 3 é aproximadamente 50% tão potente quanto aGal-Cerneste ensaio, enquanto que Compostos 1 e 2 foram aproximadamente 1000vezes menos potentes do que Composto 3 confirmando diferentesatividades biológicas destes compostos neste sistema de ensaio.Exemplo B

Nestes experimentos mediu-se a expansão de células T pormeio de pulsação de DCs humanos a partir de PBLs com 100 nM dopeptídio de MelanA26-35 imunogênico conhecido, ELAGIGILTV. Opeptídio foi adicionado às DCs juntamente com PBLs sinergéticos domesmo doador. Para detalhar estes experimentos mais plenamente,amostras de DCs foram irradiadas com 3000 rads, seguido de um pulso de3 horas com o peptídio, em meio isento de soro.

As células foram então lavadas cuidadosamente e incubadascom PBLs autólogos, numa relação de 1:10, em RPMI 1640/5% de sorohumano. Adicionou-se IL-2 humana recombinante a 10 U/ml do dia 4 aodia 7. No dia 10, após a adição dos PBLs, células foram analisadas. Célulascultivadas foram manchadas com anti-CD8 e A2/tetrâmero MelanA25-35.O percentual de células T CD8 específicas para MelanA de um total decélulas positivas para CD8 foi medido por meio de análise de FACS.

Os resultados indicaram que quando DCs humanas sãoincubadas na presença de células NKT, ocorre preparação cruzada de treitole glicerol e ambos os compostos se mostraram estimuladores mais potentesde respostas de CTL específicos para antígeno, in vitro, do que aGal-Cer.Isto confirma que tanto Composto 2, glicerol ceramida e Composto 3,treitol ceramida, são provavelmente úteis como imunoestimulantes de CTLCD8+, e sugere que outros compostos da invenção podem comportar-se demaneira similar.

Exemplo C

Estes experimentos animais detalham trabalho projetadopara estudar o impacto dos compostos da invenção in vivo.

Animais-sujeito, cinco camundongos por grupo, receberamuma injeção intravenosa de 400 μg de ovalbumina (OVA) juntamente com1 μg de um dos compostos da invenção em exame, ou um volumeequivalente de solução de carreador diluída com PBS. Um subconjunto decamundongos recebeu injeção com 25 μg da molécula MPL (Sigma-Aldrich; extraído de Salmonella Minnesota) solubilizada em PB S.

Após as injeções, obteve-se sangeu das veias laterais dacauda, e PBLs foram isolados usando-se métodos convencionais. Os PBLsforam então manchados, diretamente, in vivo, com complexos tetraméricos,H-2Kb/OVA 257-264, H-2Kb, de acordo com Palmowski, et al, J.Immunol., 168:4391-4398 (2002), incorporado por referência. Ostetrâmeros foram preparados de acordo com Whilan, et al, J. Immunol.,163:4342-4348 (1999), incorporado por referência.

Quando os PBLs de animais não-tratados foram comparadoscom aqueles de animais manchados com tetrâmeros irrelevantes, osmanchamentos de fundo foram equivalentes.

Houve um incremento da resposta específica para OVAquando se usou αGal-Cer, Composto 1, arabinitol ceramida, ou Composto3, treitol ceramida. O incremento foi mais fraco com Composto 2, glicerolceramida.

Quando MPL foi co-injetado com aGal-Cer ou Composto 3,treitol ceramida, houve um incremento da resposta de CTL como seria dese esperar considerando Silk et al., J. Clin. Invest., 114:1800-1811, 2004.

Exemplo D

Estes experimentos avaliaram a presença de anticorpos deIgG específicos para OVA no soro de camundongos que foram injetadoscom a proteína de OVA.

Placas ELISA revestidas com proteína de OVA forampreparadas usando-se métodos bem conhecidos. Em seguida coletou-seamostras de sangue, dez dias após a imunização, e preparou-se soro.

As amostras foram colhidas de camundongos que haviamsido imunizados apenas com OVA, OVA e Composto 1, arabinitolceramida, OVA e αGal-Cer, ou OVA e Composto 2, glicerol ceramida.Adicionalmente, camundongos foram imunizados com cada um destesprogramas de dosagem com adição de MPL. Mediu-se as titulações de IgGpor meio da adição de diluições seriais de soro de mouse [que foram] foramdetectadas usando IgG de camundongo α conjugada com peroxidase derabanete (peroxidase de rabanete ("HRP", horseradish peroxidase).

Os dados indicaram que os compostos da invençãoproduzem respostas de anticorpos específicas para OVA. Verificou-se queComposto 1, arabinitol ceramida e aGal-Cer são mais efetivos comoadjuvantes do que MPL, enquanto que Composto 2, glicerol ceramida, foimenos efetivo do que MPL, ao mesmo tempo em que ainda produzanticorpos específicos para OVA.

Adicionalmente, quando se adicionou MPL foi possívelobservar forte incremento da resposta em todos os casos, demonstrando quecompostos da invenção, quando usados em combinação com um ligante deTLR4, são extremamente eficientes para expandir a titulação de anticorposespecíficos para antígeno.

Exemplo E

Nestes experimentos, as DCs obtidas do baço de animais-sujeito foram fenotipificadas.

Em resumo, em cada experimento, 1 μg de um dentre umaseleção de compostos da invenção foi injetado na veia caudal decamundongos-sujeitos. 24 h mais tarde removeu-se tecido do baço dosanimais e cuidadosamente passou-se isto através de gaze para meiocompleto, suplementado com 5 mM de EDTA. Células foram enriquecidaspara CD11c com pérolas magnéticas anti-CD11, usando-se técnicaspublicadas. Uma vez enriquecidas, elas foram analisadas quanto amarcadores de maturação usando manchamento de anticorpo e citometriade fluxo. Manchamento não-específico foi realizado usando-se umanticorpo específico para o receptor de Fc-RIII/II.

Todos, Composto 1, arabinitol ceramida, e Composto 2,treitol ceramida e aGal-Cer, induziram CD86 in vivo de maneira similar,confirmando que ambos estes compostos em camundongos são altamenteeficiente na produção de células T e também respostas de células B. Emcontraste, Composto 3, glicerol ceramida, não induziu o marcador DC86significativamente. Estes resultados mostram que, embora a combinação deMPL e glicerol seja efetiva para suscitar respostas de células B específicaspara antígeno (Exemplos 25 e 26) em camundongos, a maturação de DC eexpansão de células T não parecem ser incrementadas significativamentepelo Composto 2, glicerol ceramida. Isto contrasta com a verificação, emhumanos, onde Composto 2, glicerol ceramida, amadurece células DC napresença de células NKT que, então, servem como preparadores eficientesde CTLs humanos.Exemplo F

Estes experimentos foram realizados para determinar oefeito de compostos selecionados da invenção na estimulação da produçãode JDL-12 em animais indivíduos. Os animais receberam 1 μ§ ou 10 μ§ detreitol, glicerol ou Gal-Cer. Um grupo de animais também recebeu 50 μ§ deMPL. Seis horas após a injeção coletou-se amostras de sangue caudal, edeterminou-se a proteína p70 de IL-12 usando um ELISA de acordo comprocedimentos convencionais.

Observou-se aumentos dependentes da dose na secreção deIL-12/p70 com o Composto 3, camundongos tratados com treitol ceramida,confirmando a potência desta molécula na indução da liberação de IL-12/p70. A efetividade do Composto 3 compara-se de forma extremamentefavorável com MPL.

DESCRIÇÃO DETALHADA DE CONCRETIZAÇÕES PREFERIDAS

Composto 1: Arabinitol Ceramida

(a) L(+) arabinose foi convertida ao composto de triflato dearabinitol, i.e.

<formula>formula see original document page 49</formula>

de acordo com procedimentos bem conhecidos. Ver, Zinneret al, Chem. Ber., 92:1614 (1959); Qin, et al, Can. J. Chem., 77:481(1999); e Yann, et al, Carbohydr. Res., 74:323 (1979), todos incorporadospor referência. Este composto foi combinado com um componente deesfingosina, i.e.,

<formula>formula see original document page 49</formula>que foi sintetizado a partir de 4,6-O-benzilideno-D-

galactose (Gros, et al, Carbohydr. Res., 29:3647 (1941)), segundo qualquerdentre Zimmermann, et al, Liebigs Ann. Chem., 663 (1988); Schmidt, et al,Carbohydr. Res., 172:169 (1988) e Figueroa-Perez, et al, Carbohydr. Res.,328:95 (2000).

Uma vez que estes dois compostos se tornaram disponíveis,adiciona-se uma solução do componente esfingosina (220 mg, 0,575mmol), em 3 ml de THF anidro, e 95% de NaH (17 mg, 0,708 mmol), aO0C. Após 15 minutos de agitação, adicionou-se uma solução do compostode triflato de arabinitol (251 mg, 0,690 mmol), em 2 ml de THF anidro, àmesma temperatura. A mistura resultante foi aquecida lentamente àtemperatura ambiente, e depois agitada de um dia para o outro. A misturade reação foi extinta com uma solução aquosa de NH4Cl, recolhida emEtOAc, e as camadas foram separadas.

A camada orgânica foi lavada com água, secada sobreMgSO4 anidro, e evaporada à secura. Material bruto foi purificado viacromatografia de flash (1:9, acetato de etila: éter de petróleo, dando:

<formula>formula see original document page 50</formula>

como um líquido incolor (rendimento: 95%). Rf= 0,54 (1:9,acetato de etila: éter de petróleo), [ag = + 5,2 (c 1,0, CHCl3). RMN 1H(250 MHz, CDCl3): δ 4,19-4,00 (m, 5H), 3,99-3,86 (m, 2H), 3,84-3,61 (m,5H), 1,60-1,25 (m, 26H), 1,41 (s, 3H), 1,40 (br s, 6H), 1,38 (s, 3H), 1,33 (s,3H), 1,30 (s, 3H), 0,87 (t, J = 6.5 Hz, 3H). RMN 13C (62,5 MHz, CDCl3): δ109,6, 108,2, 96,0, 79,7, 77,7, 77,07, 77,3, 75,7, 72,8, 71,8, 67,5, 60,0,31,9, 29,6, 29,5, 29,66, 29,62 29,59, 29,56, 29,4, 29,3, 28,1, 26,9, 26,6,26,4, 25,6, 25,2, 22,6, 14,1. MALDI-MS (modo positivo, Matriz CHCA):m/z 620,2 [M + Na]+. Cale. anal. para C32H59N3O7 (597,43): C, 64,29; H,9,95; N, 7,03. Encontrado: C, 64,35; H, 10,01; N, 7,15

(b) O produto de (a) acima (150 mg, 0,251 mmol), e 10% dePd/C (100 mg) em 4 ml de metanol com uma gota de ácido acético foiagitado, sob uma atmosfera de H2, durante 20 horas, à temperaturaambiente. Em seguida, a mistura foi filtrada, concentrada, e co-evaporadacom tolueno. O xarope resultante foi dissolvido em 5 ml de DMF seco, eentão adicionou-se sucessivamente ácido hexacosanóico (Fluka) (120 mg,0,303 mmol), N-hidróxi-benzotriazol (40 mg, 0,301 mmol), e cloridrato del-[3-(dimetilamino-propil]-3 etilcarbodiimida (EDC, 58 mg, 0,303 mmol),e a mistura resultante foi agitada a 45°C durante 1 dia. A mistura foirecolhida em acetato de etila, lavada com água, solução de salmourasaturada, secada sobre MgSO4 anidro, e concentrada. Resíduo foipurificado por meio de cromatografia de flash dando 182 mg de

<formula>formula see original document page 51</formula>

como um sólido incolor (rendimento: 75%). p.f. 89°C. Rf0,46 (2:8, acetato de etila: éter de petróleo), [ct]2D5= + 11,4 (c 1,0, CHCl3).RMN 1H (250 MHz, CDCl3): δ 5,84 (d, J= 8,5 Hz, 1H), 4,25-4,00 (m, 6H),3,98-3,92 (m, 1H), 3,85-3,74 (m, 2H), 3,70-3,62 (m, 1H), 3,56-3,49 (m,2H), 2,17-2,11 (m, 2H), 1,60-1,24 (m, 72H), 1,41 (s, 3H), 1,38 (s, 6H), 1,36(s, 3H), 1,32 (br s, 6H), 0,86 (t, J = 6,7 Hz, 3H). RMN 13C (62,5 MHz,CDCl3): δ 172,4, 109,6, 107,8, 79,8, 77,9, 77,8, 77,1, 76,1, 72,4, 71,3, 67,6,48,3, 36,9, 29,69, 29,64, 29,5, 29,3, 29,0, 28,0, 27,1, 27,0, 26,7, 26,4,25,77, 25,72, 25,2, 22,6, 14,0. MALDI-MS (modo positivo, MatrizCHCA): m/z 972,6 [Μ + Na]+. Cale. anal. para C58HfljNO8 (949,83): C,73,29; H, 11,77; N, 1,47. Encontrado: C, 73,59; H, 11,99; N, 1,41

(c) O produto de (b) acima (120 mg, 0,123 mmol) emMeOH:CH2Cl2 (10:1, 22 ml) contendo TFA (100 μΐ), foi agitado àtemperatura ambiente durante 3 dias. O sólido resultante foi filtrado esecado dando

<formula>formula see original document page 52</formula>

, referido a seguir como Composto 1 ('arabinitol-ceramida'),63 mg, 60% de rendimento, p.f. 125°C. RMN 1H (400 MHz, C5D5N): δ8,66 (d, J= 8,8 Hz, 1H), 5,30-5,25 (m, 2H), 4,98- 4,94 (m, 1H), 4,66-4,58(m, 2H), 4,44-4,22 (m, 7H), 2,57-2,53 (m, 2H), 2,07-1,37 (m, 72H), 0,99 (t,J= 6,7 Hz, 6H). RMN 13C (150,9 MHz, C5D5N): δ 173,3, 78,1, 76,3, 74,6,73,2, 72,7, 71,3, 70,0, 65,4, 51,8, 36,8, 32,1-29,6 (m), 26,4, 22,9, 14,1.MALDI-MS (modo positivo, Matriz CHCA): m/z 853,3 [M + Na]+. Cale.anal. para C49H99NO8 (830,73): C, 70,88; H, 12,02; N, 1,69. Encontrado: C,73,59; H, 11,99; N, 1,41.

Composto 2: Glicerol Ceramida

O procedimento de 1 (a) acima foi repetido usando

<formula>formula see original document page 52</formula>

como o material de partida de triflato (Cassei, et al, Eur. J.Org Chem., 875 (2001)) dando

<formula>formula see original document page 52</formula>como um sólido incolor (rendimento: 90%). Rf = 0,47 (1:9,acetato de etila: éter de petróleo), [ag= + 24,6 (c 1,0, CHCl3). RMN 1H(250 MHz, CDCl3): δ 4,32-4,23 (m, 1H), 4,16- 4,04 (m, 2H), 3,96 (d, J =7,8 Hz, 1H), 3,87-3,76 (m, 2H), 3,68-3,48 (m, 4H), 1,57-1,18 (m, 26H),1,42 (s, 3H), 1,40 (s, 3H), 1,36 (s, 3H), 1,30 (s, 3H), 0,87 (t, J= 6,5 Hz,3H). RMN 13C (62,5 MHz, CDCl3): δ 109,3, 108,2, 77,7, 75,6, 74,5, 72,8,72,4, 66,7, 59,8, 31,8, 29,6, 29,5, 29,4, 29,3, 29,1, 28,0, 26,7, 26,3, 25,6,25,3, 22,6, 14, 1. MALDI-MS (modo positivo, Matriz CHCA): m/z 520,1[M + Na]+. Cale. anal. para C27HsiN3O5 (497,38): C, 65,16; H, 10,33; N,8,44. Encontrado: C, 65,25; H, 10,41; N, 8,50.

(b) O procedimento de l(b) foi repetido usando produto de(a) acima dando

<formula>formula see original document page 53</formula>

como um sólido incolor (rendimento de 72%). p.f. 81°C. Rf= 0,43 (2:8, acetato de etila: éter de petróleo), [a]" = + 13,5 (c 1,0, CHCl3).RMN 1H (400 MHz, CDCl3): δ 5,75 (d, J= 9,0 Hz, 1H), 4,27-4,00 (m, 5H),3,74 (dd, J = 9,3, 3,1 Hz, 1H), 3,69 (dd, J = 8,2, 6,2 Hz, 1H), 3,54-3,45 (m,3H), 2,20-2,07 (m, 2H), 1,60-1,23 (m, 72H), 1,40 (s, 6H), 1,34 (s, 3H), 1,31(s, 3H), 0,86 (t, J = 6,8 Hz, 6H). RMN 13C (100 MHz, CDCl3): δ 172,4,109,4, 107,8, 77,7, 75,9, 74,7, 72,5, 66,4, 48,1, 36,9, 31,8, 29,6, 29,5,29,39, 29,34, 29,2, 28,9, 27,9, 26,7, 26,4, 25,7, 25,3, 22,6, 14,1. MALDI-MS (modo positivo, Matriz CHCA): m/z 873,2 [M + Na]+. Cale. anal. paraC53H103NO6 (849,77): C, 74,86; H, 12,21; N, 1,65. Encontrado: C, 74,81;H, 12,26; N, 1,70.

(c) O procedimento de l(c) acima foi repetido usando oproduto de (b) acima dando

<formula>formula see original document page 54</formula>

como um sólido incolor, referido a seguir como Composto 2('glicerol ceramida'). Rendimento 70%, p.f. 140°C. RMN 1H (400 MHz5C5D5N): δ 8,64 (d, J= 8,67 Hz, 1H), 4,92-4,83 (m, 1H), 4,60-4,56 (m, 1H),4,41-4,31 (m, 2H), 4,12-3,96 (m, 6H), 2,57 (t, J = 7,2 Hz, 2H), 2,03-1,37(m, 72H), 0,99 (t, J= 6,8 Hz, 6H). MALDI-MS (modo positivo, MatrizCHCA): m/z 793,6 [M + Na]+. Cale. anal. para C47H95NO6 (769,72): C,73,29; H, 12,43; N, 1,82. Encontrado: C, 73,33; H, 12,47; N, 1,91.Composto 3: Treitol ceramida

Composto (100 mg, 0,4 mmol) como preparado de acordocom de acordo com procedimentos bem conhecidos (ver, Wagner, et al., J.Chem. Soe. Perkin Trans. 1, 780 (2001))

<formula>formula see original document page 54</formula>

foi adicionado a 2,6-di-t-butilpiridina (92 mg, 0,48 mmol) emCH2Cl2 anidro (1 ml), Tf2O (0,08 ml, 0,48 mmol) dissolvido em CH2Cl2 anidro(1 ml) com agitação a 0°C. A mistura de reação foi agitada à mesmatemperatura durante 1 hora. A mistura de reação foi recolhida em acetato deetila e lavada com água fria (2x15 ml). As camadas orgânicas combinadasforam lavadas com solução de salmoura, secadas e evaporadas dando o produtobruto que foi purificado por meio de cromatografia de coluna de sílica-gel(1:10, acetato de etila: éter de petróleo contendo gotas de Et3N) dando

<formula>formula see original document page 54</formula>(145 mg, 95%). Rf = 0,41 (1:10, acetato de etila: éter de

petróleo). RMN 1H (250 MHz, CDCl3): δ 7,41-7,27 (m, 5H), 4,71 (dd, J=10,9, 2,8 Hz, 1H), 4,57 (s, 2H), 4,50 (dd, J = 10,9, 4,9 Hz, 1H), 4,14 (ddd, J= 8,0, 4,9, 2,8 Hz, 1H), 4,05 (ddd, J = 8,1, 6,3, 4,5 Hz, 1H), 3,73 (dd, J=9,7, 4,5 Hz, 1H), 3,55 (dd, J= 9,7, 6,3 Hz, 1H), 1,42 (s, 6H). RMN 13C(62,5 MHz, CDCl3): δ 128,6, 128,5, 128,0, 127,7, 1 10,7, 76,8, 75,03,75,00, 73,8, 69,9, 26,9, 26,6.

(b) O procedimento de l(a) acima foi seguido usando-se oproduto de (a) acima dando

<formula>formula see original document page 55</formula>

que foi purificado por meio de cromatografia de flash (1:9,acetato de etila: éter de petróleo) dando um líquido incolor (306 mg, 94%). Rf =0,46 (1:9, acetato de etila: éter de petróleo), ^^ = + 7,3 (c 1,0, CHCl3). RMN1H (250 MHz, CDCl3): δ 7,36-7,23 (m, 5 H), 4,50 (s, 2H), 4,17-3,98 (m, 3H),3,94 (dd, J = 9,8, 2,0 Hz, 1H), 3,83 (dd, J = 9,2, 5,6 Hz, 1H), 3,70- 3,53 (m,6H), 1,62-1,21 (m, 26 H), 1,43 (s, 6H), 1,40 (s, 3H), 1,30 (s, 3H), 0,88 (t, J= 6,2Hz, 3H). RMN 13C (62,5 MHz, CDCl3): δ 138,0, 128,3, 127,63, 128,60, 109,6,108,2, 77,8, 77,5, 77,4, 75,7, 73,5, 72,9, 72,2, 70,6, 60,0, 31,9, 29,7, 29,62,29,57, 20,5, 29,4, 29,3, 28,1, 27,0, 26,4, 25,6, 22,7, 14,1, 4,8. MALDI-MS(modo positivo, Matriz DHB): m/z 640,9 [M + Na]+.

(c) O procedimento de l(b) acima foi seguido usando oproduto de (b) acima dando

<formula>formula see original document page 55</formula>que foi purificado por meio de cromatografia de flash (4:6,acetato de etila: éter de petróleo) dando um sólido incolor (116 mg, 81%). Rf= 0,23 (3:7, acetato de etila: éter de petróleo). RMN 1H (250 MHz, CDCl3): δ5,74 (d, J = 8,7 Hz, 1H), 4,27-4,14 (m, 1H), 4,13-3,99 (m, 3H), 3,93-3,87 (m,1H), 3,81 (3,55 (m, 6H), 2,20-2,13 (m, 2H), 1,65-1,20 (m, 72H), 1,42 (s, 9H),1,33 (s, 3H), 0,88 (t, J= 6,3 Hz, 6H). RMN 13C (62,5 MHz, CDCl3): δ 172,6,109,2, 107,9, 79,2, 77,7, 76,7, 76,2, 71,9, 71,6, 62,4, 48,1, 36,9, 31,9, 29,6,29,5, 29,4, 29,3, 29,0, 27,9, 26,9, 26,4, 25,7, 25,6, 22,6, 14,4, 14,0. MALDI-MS (modo positivo, Matriz DHB): m/z 902,4 [M + Na]+.

(d) O procedimento de l(c) acima foi repetido usando osprodutos de (c) acima dando

<formula>formula see original document page 56</formula>

um sólido incolor (71 mg, rendimento de 71%), referido aseguir como Composto 3 ('treitol ceramida').

RMN 1H (250 MHz, C5D5N):δ 8,62 (d, J= 8,6 Hz, 1H), 4,81-4,05 (m, 9H), 2,52-2,39 (m, 2H), 2,35-1,15(m, 72 H), 0,87-0,83 (m, 6H). MALDI-MS (modo positivo, Matriz CHCA):m/z 822,9 [M + Na]+.

Composto 4: Treitol ceramida C15 acila

(a) O produto de 3(b) acima p. ex.

<formula>formula see original document page 56</formula>

(175 mg, 0,284 mmol) e 10% de Pd/C (150 mg) em metanol(3 ml) contendo uma gota de ácido acético foi agitada sob atmosfera de H2(balão) à temperatura ambiente durante 22 horas. Em seguida, a mistura foifiltrada, concentrada e co-evaporada com tolueno. O xarope resultante foidissolvido em DMF seco (4 ml). Adicionou-se sucessivamente ácidopalmítico (Fluka) (73 mg, 0,284 mmol), N-hidroxibenzotriazol (38 mg,0,284 mmol) e cloridrato de l-[3-(dimetilamino)-propil]-3-etilcarbodiimida(54 mg, 0,284 mmol) e a mistura resultante foi agitada a 45°C durante 1dia. Em seguida foi recolhida em acetato de etila, lavada com água, soluçãode salmoura saturada, secada sobre MgSC>4 anidro, e concentrada. Oresíduo foi purificado por meio de cromatografia em sílica-gel (4:6, acetatode etila: éter de petróleo) dando

<formula>formula see original document page 57</formula>

(168 mg, 80%). Rf = 0,16 (7:3 acetato de etila: éter depetróleo), [«£= + 11,6 (c 1,0, CHCl3). RMN 1H (250 MHz, CDCl3): δ 5,77(d, J = 9,4 Hz, 1H), 4,27-4,14 (m, 1H), 4,13-3,99 (m, 3H), 3,93-3,87 (m,1H), 3,81-3,55 (m, 6H), 2,20-2,13 (m, 2H), 1,75-1,20 (m, 52H), 1,42 (s,9H), 1,33 (s, 3H), 0,88 (t, J = 6,4 Hz, 6H). MALDI-MS (modo positivo,CHCA): m/z 762,9 [M + Na]+. 778,8 [M + K]+.

(b) O produto de (a) acima (120 mg, 0,162 mmol) emMeOH/CH2Cl2 (10:1, 22 ml) contendo TFA (100 μΐ) foi agitado àtemperatura ambiente durante 65 horas. O sólido que precipitou foi filtradoe secado para se obter

<formula>formula see original document page 57</formula>(70 mg, rendimento de 65%) referido a seguir comoComposto 4, ('treitol ceramida Cl5 acila') RMN 1H (250 MHz, DMSOd6):δ 5,45-5,35 (m, 1H), 4,60-3,75 (m, 10 H), 2,04-1,89 (m, 2H), 1,57-1,02 (m,52H), 0,83-0,72 (m, 6H). MALDI-MS (modo positivo, CHCA): m/z 682,8[M+Na]+, 698,6 [M+K]+.

Síntese ácido 22-(Z)-hexacosanóico

(a) 11-bromoundecanol protegido com THP (10,0 g, 29,85mmol) p. ex.

<formula>formula see original document page 58</formula>

e magnésio (1,0 g, 41,66 mmol) em THF seco (150 ml),foram aquecidos em refluxo para um período de 3 a 4 horas para preparar oreagente de Grignard. Isto foi adicionado a ácido 11-bromoundecanóico(8,0 g, 30,22 mmol) p. ex.

<formula>formula see original document page 58</formula>

em THF seco (100 ml) sob argônio a -20°C. Adicionou-seCloreto de metilmagnésio em THF (-10,2 ml, 3 M) até cessar a evoluçãode gás, adicionando-se então Li2CuCU, agitação a -20°C prosseguiu durante1 hora, e então deixou-se a temperatura elevar à temperatura ambiente.

Após 15 horas, a mistura de reação foi cuidadosamente neutralizada com10% de H2SO4 e extraída com acetato de etila (2 χ 150 ml). A camadaorgânica foi secada sobre MgSÜ4, e concentrada dando sólido incolor, quefoi purificado por meio de cromatografia de flash (1:9 acetato de etila: éterde petróleo) dando

<formula>formula see original document page 58</formula>

(10,9 g, 82% de rendimento). Este composto foi dissolvidoem THF (50 ml) e esterificado com diazometano. O solvente foi evaporado,e purificado por meio de cromatografia (5:95 de acetato de etila: éter depetróleo) dando o éster de 11-bromoundecanol protegido com THP, p. ex.

<formula>formula see original document page 59</formula>

como um sólido incolor (10,9 g, 97% de rendimento). Rf=0,65 (5:95, acetato de etila: éter de petróleo). RMN 1H (250 MHz, CDCl3):δ 4,56 (t, J= 3,3 Hz, 1H), 3,90-3,81 (m, 1H), 3,76-3,65 (m, 1H), 3,65 (s,3H), 3,52-3,45 (m, 1H), 3,40-3,31 (m, 1H), 2,28 (t, J= 7,5 Hz, 2H), 1,62-1,51 (m, 10H), 1,23 (br. s, 32H). RMN 13C (62,5 MHz, CDCl3): δ 174,3,98,8, 67,7, 62,3, 51,4, 34,1, 30,7, 29,7, 29,68, 29,63, 29,60, 29,49, 29,44,29,2, 29,1, 26,2, 25,5, 24,9, 19,6. MALDI-MS (modo positivo, CHCA):m/z 477,3 [M + Na]+.

(b) O produto de (a) acima (8,0 g, 17,62 mmol) em metanol(200 ml) foi tratado com ácido p-toluenossulfônico (6,7 g, 35,26 mmol). Amistura de reação foi agitada durante de 3 a 4 horas. Após completamentoda reação, (monitoração com TLC) o solvente foi evaporado e o resíduo foidissolvido em clorofórmio e lavado com solução saturada de NaHCO3. Acamada de clorofórmio foi secada e concentrada dando sólido incolor, quefoi recristalizado (éter de petróleo/acetato de etila) dando

<formula>formula see original document page 59</formula>

como cristais incolores (6,4 g, 98% de rendimento). Rf =0,21 (2:8, acetato de etila: éter de petróleo). RMN 1H (250 MHz, CDCl3): δ3,66 (s, 3H), 3,63 (t, J = 6,5 Hz, 2H), 2,30 (t, J = 7,5 Hz, 1H), 1,64-1,53 (m,4H), 1,25 (br. s, 32H). RMN 13C (62,5 MHz, CDCl3): δ 174,3, 63,0, 51,4,34,1, 32,8, 29,6, 29,59, 29,58, 29,4, 29,2, 29,1, 25,7, 24,9. MALDI-MS(modo positivo, CHCA): m/z 393,8 [M + Na]+.(c) O produto de (b) acima (6,0 g, 16,21 mmol) em CH2CI2seco (200 ml), foi tratado com periodinano de Dess-Martin (DMP) (13,74g, 32,42 mmol). A mistura de reação foi agitada durante de 3 a 4 horas àtemperatura ambiente. Após completamento da reação, solvente foievaporado; resíduo foi suspenso em éter de dietila e removido por filtração.

O filtrado foi lavado com solução de NaHCO3, depois solução de salmoura.A camada de éter foi secada e concentrada dando sólido, que foi purificadopor meio de cromatografia de flash (5:95, acetato de etila: éter de petróleo)dando

<formula>formula see original document page 60</formula>

como um sólido incolor (5,5 g, 92% de rendimento). Rf =0,62 (5:95, acetato de etila: éter de petróleo). RMN 1H (250 MHz, CDCl3):δ 9,73 (t, J= 1,8 Hz, 1H), 3,63 (s, 3H), 2,39 (dt, J= 14,0, 7,5, 2,0 Hz, 2H),2,26 (t, J= 7,5 Hz, 2H), 1,66-1,56 (m, 4H), 1,21 (br. s, 32H). RMN 13C(62,5 MHz, CDCl3): δ 202,8, 174,2, 51,3, 43,8, 34,0, 29,65, 29,61, 29,5,29,49, 29,42, 29,40, 29,3, 29,2, 29,1, 24,9, 22,0. MALDI-MS (modopositivo, CHCA): m/z 391,9 [M + Na]+.

(d) Uma suspensão de brometo de n-butiltrifenilfosfônio(8,66 g, 21,73 mmol) em THF seco (80 ml) sob argônio a -78°C, foi tratadacom bis(trimetilsilil) amida de sódio (21,73 ml, 1,0 Μ). A mistura dereação foi agitada durante 15 minutos, à mesma temperatura, antes de seadicionar uma solução do produto de (c) acima (5 g, 13,58 mmol) em THFseco (30 ml), e então a temperatura foi deixada elevar-se à temperaturaambiente. Após completamento da reação, esta foi extinta com soluçãoaquosa de NH4Cl e então extraída com éter de dietila (2 χ 80 ml). Acamada de éter foi lavada com salmoura, secada e evaporada dandoresíduo, que foi purificado por meio de cromatografia de flash (5:95,acetato de etila: éter de petróleo) dando

<formula>formula see original document page 61</formula>

como um sólido incolor (5,42 g, 98% de rendimento). Rf =0,65 (5:95, acetato de etila: éter de petróleo). RMN 1H (250 MHz, CDCl3):δ 5,38-5,33 (m, 2H), 3,66 (s, 3H), 2,30 (t, J= 7,5 Hz, 2H), 2,04-196 (m.4H), 1,67-1,56 (m, 2H), 1,40-1,25 (m, 36H), 0,90 (t, J= 7,5 Hz, 3H). RMN13C (62,5 MHz, CDCl3): δ 174,3, 130,0, 129,5, 51,3, 34,1, 29,7, 29,69,29,64, 29,59, 29,56, 29,4, 29,3, 29,28, 29,25, 29,1, 27,2, 24,9, 22,8, 13,7.MALDI-MS (modo positivo, CHCA): m/z 431,8 [M + Na]+.

(e) O produto de (d) acima (2 g, 4,893 mmol) e hidróxido desódio (2,3 g, 5,872 mmol) em metanol foi aquecida em refluxo durante 2horas após resfriamento com gelo, o precipitado foi recolhido, suspenso emágua e acidificado com ácido clorídrico concentrado (~ pH 1). O produtofoi removido por filtração e recristalizado de ácido acético glacial dandoácido 22-(Z)-hexacosanóico p. ex.

<formula>formula see original document page 61</formula>

como cristais incolores (1,9 g, 98%). RMN 1H (250 MHz,CDCl3): δ 12,11 (s, 1H), 5,38- 3,33 (m, 2H), 2,26 (t, J- 7,5 Hz, 2H), 2,02-1,99 (m, 4H), 1,64-1,58 (m, 2H), 1,38-1,26 (m, 36H), 0,90 (t, J= 7,5 Hz,3H). RMN 13C (62,5 MHz, CDCl3): δ 176,6, 129,8, 129,3, 33,9, 29,5,29,49, 29,41, 29, 38, 29,35, 29,31, 29,2, 29,1, 29,0, 28,9, 26,9, 24,7, 22,6,13,5.

Composto 5: Treitol-22-(Z)-Ceramida

(a) O procedimento de l(b) acima foi repetido usando ácido22-(Z)-hexacosanóico e o produto de 3(b) p. ex.<formula>formula see original document page 62</formula>

como um sólido incolor (rendimento: 68%). Rf= 0,23 (3:7,

acetato de etila: éter de petróleo), [αβ5= + 12,7 (c 1,0, CHCl3). RMN 1H(250 MHz, CDCl3): δ 5,71 (d, J= 9,5 Hz, 1H), 5,35-5,31 (m, 2H), 4,21-3,97(m, 4H), 3,91-3,84 (m, 1H), 3,78-3,63 (m, 5H), 3,59-3,52 (m, 1H), 2,35 (br.t, J= 6,7 Hz, 1H), 2,14 (dt, J= 10,5, 7,5, 3,0 Hz, 2H), 2,01-1,94 (m, 4H),1,61-1,22 (m, 76H), 0,90-0,82 (m, 6H). RMN 13C (62,5 MHz, CDCl3): δ172,5, 130,0, 129,5, 109,2, 107,9, 79,1, 77,7, 76,6, 76,1, 71,8, 71,6, 62,3,48,1, 36,8, 31,8, 29,66, 29,60, 29,5, 29,37, 29,32, 29,28, 29,26, 29,23, 28,9,27,8, 27,1, 26,9, 26,4, 25,69, 25,64, 22,8, 22,6, 14,0, 13,7. MALDI-MS(modo positivo, DHB): m/z 902,3 [M + Na]+. Cale. anal. para C54H103NO7(877,77): C, 73,84; H, 11,82; N, 1,59. Encontrado: C, 73,97; H, 11,96; N,1,67.

(b) O procedimento de l(c) acima foi seguido usando oproduto de (a) acima dando

<formula>formula see original document page 62</formula>

como um sólido incolor, referido a seguir como Composto 5(Treitol-22-(Z)-Ceramida') (rendimento: 81%). RMN 1H (250 MHz,C5D5N): δ 8,48 (d, J= 8,7 Hz, 1H), 5,39-5,30 (m, 2H), 4,39-4,35 (m, 1H),4,42-4,08 (m, 8Η), 3,97-3,95 (m, 2Η), 2,32 (t, J= 7,5 Hz, 2Η), 1,99-1,87(m, 4Η), 1,81-1,64 (m, 4Η), 1,77-1,12 (m, 60Η), 0,78-0,71 (m, 6Η).MALDI-MS (modo positivo, Matriz CHCA): m/z 820,8 [M + Na]+. Cale.anal. para C48H95NO7 (797,71): C, 72,22; H, 12,00; N, 1,75: C, 72,29; H,11,93; N, 1,80.

Composto 6: 4-Desóxi-4-Fenil-TreitoI-Ceramida

(a) Composto

<formula>formula see original document page 63</formula>

foi preparado com procedimentos bem conhecidos (ver, Su,et al, Tetrahedron, 57:2147 (2001)); Surivet, et al, Tetrahedron Lett.,39:7299 (1998) e Surivet, et al, Tetrahedron, 55:1311 (1999)). O compostoacima (1 g, 3,048 mmol) em CH2Cl2 (20 ml) foi tratado com piridina (1,48ml, 18,291 mmol) e 4-dimetilamino piridina (4-DMAP) (110 mg, 0,901mmol) seguido de cloreto de fenoxitiocarbonila (0,630 ml, 4,56 mmol) àtemperatura ambiente. Após 30 min, a mistura de reação foi diluída comCH2Cl2, lavada com solução de NaHCO3 a 10%, água, secada sobreMgSO4 e co-evaporada com tolueno dando resíduo. O produto bruto foidissolvido em tolueno (30 ml), hidreto de tributil estanho (2,45 ml, 9,144mmol) e adicionou-se AIBN (150 mg, 0,914 mmol), e a mistura de reaçãofoi refluxada sob atmosfera de argônio durante 4 horas. Concentrada epurificada por meio de cromatografia de flash (1:9, acetato de etila: éter depetróleo) dando o produto de redução

<formula>formula see original document page 63</formula>como um líquido incolor (900 mg, 95% de rendimento). Rf =

0,40 (1:9, acetato de etila: éter de petróleo), = -10,2 (c 1,0, CHCl3). RMN 1H(250 MHz, CDCl3): δ 7,31-7,13 (m, 10H), 3,99 (br. s, 2H), 4,01-3,93 (m, 2H),3,87-3,80 (m, 2H), 3,31-3,18 (m, 2H), 2,92 (dd, J = 13,7, 6,5 Hz, 1H), 2,77 (dd,J = 13,7, 6,5 Hz, 1H), 1,31 (s, 6H). RMN 13C (62,5 MHz, CDCl3): δ 137,9,137,2, 129,3,128,2, 127,5, 126,4, 108,9, 79,6, 78,4, 76,4, 73,3, 70,3, 39,4,27,1,26,9. MALDI-MS (modo positivo, CHCA): m/z 335,1 [M + Na]+.

(b) O produto de (a) acima (890 mg, 2,852 mmol) e 10% dePd/C (200 mg) em acetato de etila: metanol (3:2, 20 ml), agitado sobatmosfera de H2 (balão) à temperatura ambiente durante 8 e, em seguida, amistura foi filtrada, concentrada e purificada por meio de cromatografia deflash (2:8, acetato de etila: éter de petróleo) para se obter

<formula>formula see original document page 64</formula>

(608 mg, 96% de rendimento). Rf = 0,20 (2:8, acetato de etila:éter de petróleo), [ag= -19,0 (c 1,0, CHCl3). RMN 1H (250 MHz, CDCl3): δ7,28-7,19 (m, 5H), 4,12 (dt, J = 12,5, 8,2, 6,2 Hz, 1H), 3,80 (ddd, J = 8,0,4,7,3,0Hz, 1H), 3,51 (dd, J = 12,0, 3,0 Hz, 1H), 3,28 (dd, J = 12,0, 4,7 Hz, 1H), 3,04(dd, J= 14,0, 6,5 Hz, 1H), 2,82 (dd, J= 14,0, 6,5 Hz, 1H), 1,40 (s, 6H). RMN 13C(62,5 MHz, CDCl3): δ 136,9, 129,2, 128,4, 126,6, 108,7, 81,1, 77,06, 61,9, 39,3,27,2,27,0. MALDI-MS (modo positivo, CHCA): m/z 345,0 [M + Na]+.

(c) O produto de (b) acima, foi convertido ao produto detriflato usando-se o método mencionado no procedimento l(a) acima dando

<formula>formula see original document page 64</formula>como um líquido incolor (rendimento: 78%). ^^= -15,5 (c

1,0, CHCl3). RMN 1H (250 MHz, CDCl3): δ 7,32-7,19 (m, 5H), 4,23-4,08 (m,2H), 4,01-3,91 (m, 2H), 3,16 (dd, J = 13,5, 6,0 Hz, 1H), 2,81 (dd, J= 13,5, 6,0Hz, 1H), 1,42 (s, 3H), 1,39 (s, 3H). RMN 13C (62,5 MHz, CDCl3): δ 211,4,135,8,129,1, 128,8, 127,2, 110,0, 77,7, 76,9, 74,5, 39,2,27,2,26,6.

(d) O procedimento de l(a) acima foi repetido usando oproduto de (c) acima dando

<formula>formula see original document page 65</formula>

que foi purificado por meio de cromatografia de flash (1:9,acetato de etila: éter de petróleo) como um líquido incolor (rendimento:93%). Rf = 0,42 (15:85, acetato de etila: éter de petróleo), [a£5= + 4,9 (c1,0, CHCl3). RMN 1H (250 MHz, CDCl3): δ 7,30-7,22 (m, 5H), 4,13-4,05(m, 2H), 3,92-3,80 (m, 3H), 3,61-3,53 (m, 2H), 3,45-3,34 (m, 2H), 3,03(dd, J= 14,0, 6,7 Hz, 1H), 2,88 (dd, J = 14,0, 6,7 Hz, 1H), 1,53-1,24 (m,26H), 1,37 (br. s, 12H), 0,86 (t, J= 6,5 Hz, 3H). RMN 13C (62,5 MHz,CDCl3): δ 137,3, 129,3, 128,3, 127,6, 126,5, 108,9, 108,2, 79,7, 78,2, 77,7,75,6, 72,7, 71,9, 59,8, 39,5, 31,9, 29,67, 29,64, 29,58, 29,54, 29,4, 29,3,28,1, 27,2, 26,9, 26,4, 25,6, 22,6, 14,1. MALDI-MS (modo positivo,CHCA): m/z 610,9 [M + Na]+.

(e) O procedimento de l(b) foi repetido usando o produto de(d) acima dando

<formula>formula see original document page 65</formula>que foi purificado por meio de cromatografia de flash

(15:85, acetato de etila: éter de petróleo) como um sólido incolor(rendimento: 72%). Rf= 0,35 (2:8, acetato de etila: éter de petróleo), [α^5=+ 9,2 (c 1,0, CHCl3). RMN 1H (250 MHz, CDCl3): δ 7,31-7,23 (m, 5H),5,70 (d, J = 9,0 Hz, 1H), 4,19-4,00 (m, 4H), 3,95-3,88 (m, 1H), 3,71 (dd, J= 9,7, 3,0 Hz, 1H), 3,46-3,33 (m, 3H), 3,03 (dd, J = 14,0, 6,5 Hz, 1H), 2,88(dd, J = 14,0, 6,5 Hz, 1H), 2,14 (dt, J = 10,5, 7,2, 2,7 Hz, 1H), 1,66-1,27(m, 84H), 0,90 (t, J = 6,5 Hz, 6H). RMN 13C (62,5 MHz, CDCl3): δ 172,3,137,2, 129,3, 128,3, 126,5, 109,0, 107,8, 79,7, 78,4, 77,7, 75,9, 72,1, 48,1,39,6, 36,9, 31,9, 29,6, 29,5, 29,4, 29,35, 29,32, 29,0, 28,0, 27,3, 27,1, 26,4,25,79, 25,72, 22,6, 14,1. MALDI-MS (modo positivo, DHB): m/z 962,4 [M+ Na]+. Cale. anal. para C60Hio9NO6 (939,83): C, 76,62; H, 11,68; N, 1,49.

Encontrado: C, 76,70; H, 11,59; N, 1,53.

(f) O procedimento de l(c) foi repetido usando o produto de(e) acima dando

<formula>formula see original document page 66</formula>

seguir como Composto 6 ('análogo de 4-Desóxi-4-Fenil-Treitol-Ceramida').RMN 1H (250 MHz, C5D5N): δ 8,46 (d, J= 8,5 Hz, 1H), 7,37-7,13 (m, 5H),4,22-4,04 (m, 7H), 3,94-3,92 (m, 2H), 3,17 (dd, J= 14,0, 4,6 Hz, 1H), 3,03(dd, J = 14,0, 7,5 Hz, 1H), 2,31 (br. t, J = 7,2 Hz, 2H), 1,73- 1,70 (m, 4H),1,19-1,13 (m, 68H), 0,74 (t, J = 6,7 Hz, 6H). MALDI-MS (modo positivo,DHB): m/z 882,9 [M + Na]+. Cale. anal. para C54H1OiNO6 (859,76): C,75,38; H, 11,83; N, 1,63. Encontrado: C, 75,36; H, 12,03; N, 1,68.

Composto 7: 4-Desóxi-4-Fenil-Treitol-22-(Z)-Ceramida

(a) O procedimento de l(b) foi repetido usando ácido 22-

R s CggHg

como um sólido incolor (rendimento: 70%), referido a(Z)-hexacosanóico e o produto de 6(d) acima, p. ex.,

<formula>formula see original document page 67</formula>

como um sólido incolor (rendimento: 72%). Rf=0,38 (2:8,acetato de etila: éter de petróleo), [a]25D = + 8,0 (c 1,0, CHCl3). RMN 1H(250 MHz, CDCl3): δ 7,31-7,22 (m, 5H), 5,66 (d, J=9,2 Hz, 1H), 5,36-5,31(m, 2H), 4,12-3,98 (m, 4H), 3,91-3,84 (m, 1H), 3,67 (dd, J=10,0, 3,5 Hz,1H), 3,43-3,28 (m, 3H), 2,99 (dd, J=14,0, 6,6 Hz, 1H), 2,84 (dd, J=14,0, 6,5Hz, 1H), 2,00 (dt, J=10,5, 7,2, 2,7 Hz, 2H), 2,02-1,97 (m, 4H), 1,57-1,23(m, 76H), 0,91-0,81 (m, 6H). RMN 13C (62,5 MHz, CDCl3): δ 172,3,137,2, 130,1, 129,5, 129,3, 128,4, 126,6, 109,0, 107,8, 79,7, 78,4, 77,7,75,9, 72,2, 71,2, 48,1, 39,6, 36,9, 31,9, 29,76, 29,71, 29,5, 29,4, 29,36,29,31, 29,2, 29,0, 28,0, 27,3, 27,2, 27,1, 26,4, 25,8, 25,7, 22,8, 22,6, 14,1,13,8. MALDI-MS (modo positivo, DHB): m/z 960,1 [M + Na]+, Anal,Calcd for C60Hio7NO6 (937,81): C, 76,79; H, 11,49; N, 1,49. Encontrado:C, 76,86; H, 11,57;N, 1,55.

(b) O procedimento de 1 (c) foi repetido usando o produto de

(a) acima dando

<formula>formula see original document page 67</formula>como um sólido incolor referido a seguir como Composto 7('4-Desóxi-4-Fenil-Treitol-22-(Z)-Ceramida') (rendimento: 68%). RMN 1H(250 MHz, C5D5N): δ 8,46 (d, J=8,4 Hz5 1H), 7,37-7,13 (m, 5H), 5,41-5,25(m, 2H), 4,22-4,05 (m, 7H), 3,94-3,92 (m, 2H), 3,17 (dd, J=14,0, 4,6 Hz,1H), 3,05 (dd, J=14,0, 7,5 Hz, 1H), 2,31 (br, t, J=7,2 Hz, 2H), 1,99-1,87 (m,4H), 1,80-1,64 (m, 4H), 1,17-1,13 (m, 60H), 0,79-0,71 (m, 6H). MALDI-MS (modo positivo, DHB): m/z 881,1 [M + Na]+, Anal, Calcd forC54H99NO6 (857,75): C, 75,56; H, 11,63; N, 1,63. Encontrado: C, 75,47; H,11,58; N, 1,68.

Composto 8: D-Glicerol-fosfato Ceramida

(a) Uma solução de

<formula>formula see original document page 68</formula>

(150 mg, 0,204 mmol) em CH2Cl2 (4 ml), foi preparadacomo descrito por Mayer, et al, Angew. Chem., 106:2289 (1994); Angew.Chem., Int. Ed., 33:2177 (1994) e Kratzer, et al, Eur. J. Org Chem., 291(1998), e combinado com solução 0,45 M de tetrazol em acetonitrila (1,16ml, 0,50 mmol) à temperatura ambiente. Após ser agitada durante 10minutos, uma solução de composto

<formula>formula see original document page 68</formula>

como descrito por Chen, et al, J. Org. Chem., 63:6511(1998), (97 mg, 0,265 mmol), em CH2Cl2 seco (3 ml) foi adicionada àmesma temperatura. A mistura de reação foi agitada durante 2,5 horas, eentão adicionou-se hidroperóxido de t-butila (0,26 ml, 0,266 mmol) àmistura de reação. A mistura de reação foi agitada adicionalmente durante15 minutos e a mistura foi extraída com CH2CI2 e água, a camada orgânicafoi lavada com NaHCOs saturada e salmoura, secada sobre MgSO4 anidro.O solvente foi evaporado dando material bruto, que foi purificado por meiode cromatografia de flash (4:6, acetato de etila: éter de petróleo) dando

<formula>formula see original document page 69</formula>

puro como um sólido incolor (191 mg, 92%) p.f. 87°C. Rf0,40 (6:4, acetato de etila: éter de petróleo). [a]25D= + 4,0 (c 1,0, CHCl3).RMN 1H (400 MHz, CDCl3, mistura de diastereômeros): δ 7,36-7,32 (m,5H), 6,01 (d, J=8,9 Hz, 1H), 5,89 (d, J=9,3 Hz, 1H), 5,07 (d, J=8,5 Hz, 2H),5,04 (d, J=8,6 Hz, 2H), 4,29-4,19 (m, 3H), 4,10-3,86 (m, 6H), 3,76-3,69(m, 1H), 2,11-2,03 (m, 2H), 1,55-1,18 (m, 72H), 1,38 (s, 6H), 1,37 (s, 3H),1,36 (s, 3H), 1,31 (s, 6H), 1,28 (s, 3H), 1,27 (s, 3H), 0,85 (t, J=6,6 Hz, 6H).RMN 13C (100 MHz, CDCl3): δ 172,64, 172,61, 135,6, 135,5, 128,6-127,7(m), 109,9, 108,0, 77,5, 75,3, 73,9, 65,9, 48,2, 36,7, 31,9, 29,6, 29,5, 29,3,27,8, 26,5, 25,5, 25,1, 22,6, 14,1,31P NMR (162 MHz, CDCl3): δ 0,1, 0,04.MALDI-MS (modo positivo, Matriz CHCA): m/z 1043,2 [M + Na]+, calc.anal. para C60HiI0NO9P (1019,79): C, 70,62; H, 10,86; N, 1,37.Encontrado: C, 70,66; H, 10,94; N, 1,41.

(b) O produto de (a) acima (160 mg, 0,157 mmol) e 10% dePd/C (50 mg) em metanol (8 ml) foi agitada sob atmosfera de H2 àtemperatura ambiente durante 1 hora. A esta mistura de reação adicionou-se trietil amina (26 μΐ, 0,188 mmol), e após ser agitada durante 15 minutos,isto foi filtrado através de Celite e evaporado dando material bruto que foisubmetido a reação subseqüente sem qualquer purificação adicional. Ocomposto resultante

<formula>formula see original document page 70</formula>

foi dissolvido em MeOH/CH2Cl2 (10:1, 22 ml) contendoTFA (150 μΐ), e foi agitado à temperatura ambiente durante 3 dias. Osolvente foi evaporado dando um sólido. O sólido foi filtrado e lavadocuidadosamente com acetato de etila e CH2Cl2 (para remover materialorgânico solúvel). Este sólido foi dissolvido em dioxano (1 ml), adicionou-se algumas poucas gotas de MeOH e trietilamina (26 μΐ, 0,188 mmol) comaquecimento a 60°C. Esta mistura foi liofilizada dando molécula-alvo não-protegida

<formula>formula see original document page 70</formula>

referida a seguir como Composto 8 (lD-Glicerol-FosfatoCeramida'); como um sólido incolor (97 mg, 60%). RMN 1H (250 MHz,C5D5N): δ 9,09 (d, J=8,5 Hz, 1H), 5,24-5,09 (m, 2H), 4,96-4,90 (m, 1H),4,80-4,75 (m, 2H), 4,60-4,52 (m, 2H), 4,44-4,40 (m, 1H), 4,28 (br, d, J=5,5Hz, 2H), 3,10 (q, J=7,5 Hz, 6H), 2,60 (t, J=6,7 Hz, 2H), 2,05-1,32 (m,81H), 0,97-0,95 (m, 6H). RMN 13C (150,9 MHz, C5D5N): δ 173,4, 75,5,72,67, 72,65, 72,5, 68,3, 65,94, 65,92, 65,8, 45,7, 36,8, 33,3, 32,1, 30,3,30,2, 30,0, 29,8, 29,6, 29,2, 6,4, 22,9, 14,2. RMN 31P (162 MHz, C5D5N): δ3,0. MALDI-MS (modo negativo, Matriz ATT): m/z 929,1 [M - HNEt3)]",Cale. anal. para C59Hn9NO9P (1031,86): C, 68,70; H, 11,63; N, 2,72.Encontrado: C, 68,75; H, 10,99; N, 2,79.Composto 9: L-Glicerol-fosfato Ceramida

o procedimento descrito em 8(a) acima foi seguido usando-se o isômero

<formula>formula see original document page 71</formula>

dando um material bruto que foi purificado por meio decromatografia de flash (4:6, acetato de etila: éter de petróleo) dando

<formula>formula see original document page 71</formula>

puro como um sólido incolor (195 mg, 94%) p.f. 85°C. Rf0,47 (6:4, acetato de etila: éter de petróleo), [a]25D = + 2,5 (c 1,0, CHCl3).RMN 1H (400 MHz, CDCl3, mistura de diaesterômeros): δ 7,40-7,30 (m,5H), 6,05 (d, J=9,l Hz, 1H), 5,99 (d, J=9,2 Hz, 1H), 4,32-4,20 (m, 3H),4,13-3,93 (m, 6H), 3,75 (br, dd, J=8,8, 5,6 Hz, 1H), 2,20-2,09 (m, 2H),1,58-1,13 (m, 72H), 1,38 (s, 6H), 1,34 (s, 3H), 1,35 (s, 3H), 1,31 (s, 6H),1,29 (s, 3H), 1,25 (s, 3H), 0,93 (t, J=6,6 Hz, 6H). RMN 13C (100 MHz,CDCl3): δ 172,64, 172,61, 135,6, 135,5, 128,6-127,7 (m), 109,9, 108,0,108,0, 77,65, 77,63, 75,46, 75,43, 73,9, 73,8, 65,9, 48,2, 36,7, 31,9, 29,6,29,5, 29,3, 28,9, 27,9, 27,8, 26,6, 26,5, 25,5, 25,1, 22,6, 14,1. RMN 31P(162 MHz, CDCl3): δ 0,3, 0,2. MALDI-MS (modo positivo, MatrizCHCA): m/z 1043,2 [M + Na]+, calc. anal. para C60Hl IONO9P (1019,79):C, 70,62; H, 10,86; N, 1,37. Encontrado: C, 70,69; H, 10,98; N, 1,47.

(b) O procedimento descrito em 8(a) acima foi usado dando

<formula>formula see original document page 71</formula>71

referido a seguir como Composto 9 ('L-Glicerol-fosfatoCeramida'); como um sólido incolor (83 mg, 55%). RMN 1H (250 MHz,C5D5N): δ 9,09 (d, J=8,4 Hz, 1H), 4,87-4,65 (m, 5H), 4,59-4,33 (m, 3H), 4,28(br, d, J=5,0 Hz, 2H), 3,10 (q, J=7,5 Hz, 6H), 2,63 (t, J=6,7 Hz, 2H), 2,05-1,37(m, 81H), 0,99-0,96 (m, 6H). RMN 13C (150,9 MHz, C5D5N): δ 173,4, 75,6,72,65, 72,5, 68,4, 65,96, 65,7, 46,0, 36,9, 33,4, 32,1, 31,6, 31,2, 31,0, 29,8, 29,6,29,2, 26,4, 22,9, 14,2. RMN 31P (162 MHz, C5D5N): δ 3,6. MALDI-MS (modonegativo, Matriz ATT): m/z 929,1 [M - HNEt3)]-, calc. anal. para C59H119NO9P(1031,86): C, 68,70; Η, 11,63; N, 2,72. Encontrado: C, 68,79; H, 10,95; N, 2,78.Composto 10: Inositol cerimida

(a) Uma solução agitada de (366 mg, 0,691 mmol) do

composto

<formula>formula see original document page 72</formula>

obtida de acordo com procedimentos bem conhecidos, verMayer, et al, Liebigs Ann./Recueil, 859 (1997) e Jiang, et al, J. Carbohydr.Chem.. 6:319 (1987), foi misturada com 2,6-di-t-butilpiridina (159 mg, 0,83mmol) em CH2Cl2 anidro (3 ml) e Tf2O (136 μl, 0,83 mmol) que foi dissolvidaem 2 ml de CH2Cl2, a OC. A mistura de reação foi agitada à mesmatemperatura durante 3 horas. A mistura de reação foi recolhida em acetato deetila e lavada com água fria (2 χ 25 ml). As camadas orgânicas combinadasforam lavadas com salmoura, secadas e evaporadas dando o produto bruto quefoi purificado por meio de cromatografia de flash (8:92 acetato de etila: éter depetróleo contendo gotas de Et3N) dando (413 mg, 90%) de

<formula>formula see original document page 72</formula>Rf 0,41 (1:9, acetato de etila: éter de petróleo). RMN 1H(250 MHz, CDCl3): δ 7,41-7,28 (m, 15H), 4,88 (d, J=I 1,9 Hz, 1H), 4,78-4,67 (m, 5H), 4,30 (dd, J=6,0, 3,7 Hz, 1H), 4,17 (t, J=6,4 Hz, 1H), 4,03 (t,J=7,6 Hz, 1H), 3,97 (dd, J=9,l, 6,5 Hz, 1H), 3,77 (dd, J=8,0, 3,6 Hz, 1H),1,83-1,30 (m, 10 H). RMN 13C (62,5 MHz, CDCl3): δ 137,6, 137,32,137,29, 128,4, 128,3, 128,2, 128,1, 128,0, 127,9, 127,7, 111,1, 87,7, 79,0,77,83, 77,77, 76,4, 74,6, 73,6, 73,3, 37,0, 34,5, 25,0, 23,9, 23,6.

(b) O procedimento de l(a) acima foi repetido usando-seuma solução de NaH (60%, 7 mg, 0,181 mmol), 58 mg (0,151 mmol) decomponente esfingosina i.e.

<formula>formula see original document page 73</formula>

em 1 ml de DMF anidro. Após trinta minutos de agitação,adicionou-se uma solução do produto de (a) acima, (100 mg, 0,151 mmol)em DMF anidro (1,5 ml), a esta mesma temperatura. Após agitação de umdia para o outro, a mistura de reação foi extinta por meio de adição de umasolução aquosa de NH4Cl. Isto foi recolhido em EtOAc e as camadas foramseparadas. A camada orgânica foi lavada com água, secada sobre MgSO4anidro e evaporada à secura. O material bruto foi purificado por meio decromatografia de flash (1:9, acetato de etila: éter de petróleo) dando ocomposto puro

como um líquido incolor (108 mg, 80%), Rf =0,44 (1:9,acetato de etila: éter de petróleo). RMN 1H (250 MHz, CDCl3): δ 7,45-7,23(m, 15H), 4,88-4,63 (m, 6H), 4,30-3,83 (m, 8H, 3,75-3,69 (m, 1H), 3,56-3,47 (m, 1H), 3,40-3,35 (m, 1H), 1,72-1,26 (m, 36 H), 1,37 (s, 3H), 1,35 (s,3H), 0,88 (t, J=7,2 Hz, 3H). RMN 13C (62,5 MHz, CDCl3): δ 139,0, 138,8,138,7, 138,6, 138,4, 138,3, 128,3, 128,22, 128,18, 128,1, 128,0, 127,59,127,55, 127,5, 127,4, 127,3, 109,7, 108,0, 79,2, 79,1, 78,9, 78,8, 78,7, 78,0,77,9, 77,8, 77,2, 76,25, 76,20, 75,4, 75,3, 74,2, 73,9, 73,7, 73,4, 73,3,73,13, 73,09, 71,7, 71,5, 60,22, 60,16, 37,9, 35,3, 31,9, 29,64, 29,61, 29,5,29,3, 28,13, 28,10, 26,4, 25,7, 25,1, 24,0, 23,5, 22,6, 14,0. MALDI-MS(modo positivo, DHB): m/z 919,8 [M + Na]+, calc. anal. para C54H77N3O8(896,20): C, 72,37; H, 8,66; N, 4,69. Encontrado: C, 71,91; H, 8,36; N,4,68,

de Pd(OH)2/C em MeOH2CH2CyH2O (7,5:7,5:1, 3 ml) foi agitada sobatmosfera de H2 à temperatura ambiente de um dia para o outro. Em seguida, amistura foi filtrada, concentrada e co-evaporada com tolueno. O xaroperesultante foi dissolvido em DMF seco (4 ml). Adicionou-se sucessivamenteácido hexacosonóico (71 mg, 0,178 mmol), N-hidroxibenzotriazol (24 mg,0,178 mmol) e cloridrato de l-[3-(dimetilamino)-propil]-3-etilcarbodiimida (34mg, 0,178 mmol) e a mistura resultante foi agitada, a 45°C durante 1 dia. Emseguida, isto foi recolhido em acetato de etila, lavado com água, solução desalmoura saturada, secado sobre MgSO4 anidro, e concentrado. O resíduo foipurificado por meio de cromatografia de coluna de flash (7:3, acetato de etila:éter de petróleo) dando o composto

(c) O produto de (b) acima 160 mg (0,178 mmol), e uma pitada(75 mg, 43%). Rf= 0,23 (7,5: 2,5, acetato de etila: éter depetróleo). RMN 1H (250 MHz, CDCl3): δ 6,09 (t, J=9,5 Hz, 1H), 4,47-4,40(m, 1H), 4,27-3,68 (m, 10H), 2,36-2,11 (m, 2H), 1,72-1,18 (m, 82 H), 1,44(s, 3H), 1,34 (s, 3H), 0,88 (t, J=6,4 Hz, 6H). MALDI-MS (modo positivo,DHB): 1002,0 [M + Na]+, calc. anal. para C59HmNO9 (978,51): C, 72,42;Η, 11,43; N, 1,43. Encontrado: C, 72,16; Η, 11,46; N, 1,36.

(d) Uma solução do produto (c) acima (46 mg, 0,047 mmol),em MeOH/CH2Cl2 (1:1, 2 ml), com alguns poucos cristais de CSA foramagitados, à temperatura ambiente, durante 2 dias. O sólido despejado foisecado dando 22 mg do composto

<formula>formula see original document page 75</formula>

R = C25H51

referido a seguir como Composto 10 ('inositol-ceramida');(55% de rendimento). RMN 1H (250 MHz, C5D5N): δ 5,20-4,15 (m, HH),2,49-2,38 (m, 2H), 2,38-1,10 (m, 72H), 0,91-0,80 (m, 6H). MALDI-MS(modo positivo, DHB): m/z 881,6 [M + Na]+, calc. anal. para C5OH99NO9(858,32): C, 69,97; H, 11,63; N, 1,63. Encontrado: C, 70,07; H, 11,70; N,1,67.

Composto 11: Inositol ceramida C15 acila

(a) O produto de 10(b) (114 mg (0,127 mmol) p. ex.

<formula>formula see original document page 75</formula>

foi combinado com 10% de Pd/C (100 ng) emMeOHZCH2Cl2ZH2O (7,5:7,5:1, 3 ml) e agitado sob uma atmosfera de H2 àtemperatura ambiente de um dia para o outro. Em seguida, a mistura foifiltrada, concentrada e co-evaporada com tolueno. O xarope resultante foidissolvido em DMF seco (4 ml). Adicionou-se sucessivamente ácido palmítico(33 mg, 0,127 mmol), N-Wdroxibenzotriazol (17 mg, 0,127 mmol) e cloridratode l-[3-(dimetilamino)-propil]-3-etilcarbodiimida (24 mg, 0,127 mmol) e amistura resultante foi agitada a 45°C durante 1 dia. Em seguida, isto foirecolhido em acetato de etila, lavado com água, solução de salmoura saturada,secado sobre MgS04 anidro, e concentrado. O resíduo foi purificado por meiode cromatografia de flash (7:3, acetato de etila: éter de petróleo) dando

<formula>formula see original document page 76</formula>

(48 mg, 45%). Rf = 0,24 (3:4, acetato de etila: éter depetróleo). RMN 1H (250 MHz, CDCl3): δ 6,05 (t, J=9,3 Hz, 1H), 4,47-4,39(m, 1H), 4,27-3,67 (m, 10H), 2,28-2,13 (m, 2H), 1,72-1,20 (m, 62 H), 1,44(s, 3H), 1,34 (s, 3H), 0,88 (t, J=6,4 Hz, 6H). MALDI-MS (modo positivo,DHB): 861,7 [M + Na]+, calc. anal. para C49H91NO9 (838,24): C, 70,11; H,10,94; N, 1,67. Encontrado: C, 70,19; H, 11,03; N, 1,69.

b) O produto de (a) acima (44 mg, 0,047 mmol) emMeORCH2Cl2 (1:12 ml) contendo alguns poucos cristais de CSA foiagitado à temperatura ambiente durante 36 horas. O sólido despejado foifiltrado e secado dando

<formula>formula see original document page 76</formula>referido a seguir como Composto 11 ('inositol-ceramida C15acila'); (19 mg, 50%). RMN 1H (250 MHz5 C5D5N): δ 5,35-4,25 (m, 1 1H),2,48-2,37 (m, 2H), 2,37-1,10 (m, 52H), 0,90-0,78 (m, 6H). MALDI-MS(modo positivo, DHB): 741,2 [M + Na]+, calc. anal. para C40H79NO9(718,05): C, 66,91; H, 11,09; N, 1,95. Encontrado: C, 66,98; H, 11,47; N,1,39.

Composto 12: O-mio-lnositol Ceramida

(a) Composto

<formula>formula see original document page 77</formula>

foi preparado com procedimentos bem conhecidos, verStadelmaier, et al, Carbohydr. Res., 338:2557 (2003). O composto acima(2,66 g, 6,820 mmol) em tolueno seco (25 ml), foi tratado com NaH (95%em óleo mineral, 200 mg, 8,333 mmol), brometo de benzila (900 μΐ, 7,578mmol). A mistura de reação foi refluxada durante 10 horas. A mistura dereação foi resfriada à temperatura ambiente, e diluída com acetato de etila,lavada com água, secada sobre MgSO4 e evaporada dando resíduo que foipurificado por meio de cromatografia de flash (15:85, acetato de etila: éterde petróleo) de uma mistura de isômeros (-1:1,4) (75% de rendimento)dando

<formula>formula see original document page 77</formula>

Rf= 0,32 (15:85, acetato de etila: éter de petróleo). RMN 1H(600 MHz, CDCl3): δ 7,37-7,28 (m, 10H), 5,96-5,90 (m, 1H), 5,29 (dd,J= 17,4, 1,8 Hz, 1H), 5,18 (dd, J=10,8, 1,8 Hz, 1H), 4,87 (d, J=I 1,4 Hz, 1H,

BnObenzil-H)), 4,76-4,71 (m, 3H, benzil-H), 4,38-4,36 (m, 1H, alil-H), 4,29(dd, J=6,0, 4,2 Hz, 1H, H-4),4,23-4,21 (m, 1H, alil-H), 4,01 (dd, J=7,2, 6,0Hz, 1H, H-5), 3,79 (t, J=8,l Hz, 1H, H-2), 3,68 (dd, J=8,l, 3,9 Hz, 1H, H-3), 3,59 (dd, J=9,6, 7,2 Hz, 1H, H-6), 3,44 (dd, J=9,6, 8,1 Hz, 1H, H-1),2,32 (br, s, 1H, -OH), 1,80-1,41 (m, 10H). RMN 13C (150 MHz, CDCl3): δ138,5, 138,1, 135,0, 128,59, 128,57, 128,47, 128,43, 128,0, 127,98, 127,94,127,8, 127,7, 117,2, 110,4, 81,4 (C-6), 80,6 (C-2), 78,4 (C-5), 77,4 (C-3),74,6, 74,0 (C-4), 73,3 (C-l), 72,8, 72,2, 37,3, 35,0, 25,0, 23,9, 23,6.MALDI-MS (modo positivo, DHB): m/z 503,5 [M + Na]+.

(b) Os procedimentos de l(a) e l(b) foram repetidos usando-se o produto de (a) acima dando

<formula>formula see original document page 78</formula>

que foi purificado por meio de cromatografia de flash (5:95,acetato de etila: éter de petróleo), (rendimento: 87%). Rf=O,54 (1:9, acetatode etila: éter de petróleo), [a]25D = + 1,4 (c 1,0, CHCl3). RMN 1H (600MHz, CDCl3): δ 7,39-7,23 (m, 20H), 5,96-5,90 (m, 1H), 5,20 (dd, J=I7,4,1,8, Hz, IH,), 5,10 (dd, J=10,8, 1,8 Hz, 1H), 4,84-4,81 (m, 2H, benzil-H),4,72 (d, J=I2,0 Hz, 1H, benzil-H), 4,68-4,64 (m, 2H, benzil-H), 4,59-4,54(m, 2H, benzil-H), 4,46 (d, J=I 1,4 Hz, 1H, benzil-H), 4,26 (t, J=4,8 Hz, 1H,H-4), 4,19-4,16 (m, 3H, H-5, H-3, alil-H), 4,14-4,06 (m, 2H, H-I', alil-H),3,99-3,96 (m, 1H, H-I'), 3,81 (d, J=I,8 Hz, 1H, H-l), 3,75 (dd, J=9,6, 1,8Hz, 1H, H-2), 3,72-3,70 (m, 1H, H-2'), 3,58-3,56 (m, 2H, H-3', H-4'), 3,33(dd, J=8,4, 2,4 Hz, 1H, H-6), 1,61-1,41 (m, 10H), 1,26-1,24 (m, 26H), 0,88(t, J=7,2 Hz, 1H, 3H). RMN 13C (150 MHz, CDCl3): δ 138,5-127,4 (m,24C), 135,1, 116,8, 109,7, 79,6 (C-4'), 79,1 (C-l, C-6), 78,8 (C-2), 78,7 (C-3'), 78,0 (C-5), 76,3 (C-3), 73,8 (C-4), 73,6, 73,5 (C-l*), 73,3, 71,9, 70,9,62,4 (C-21), 37,5, 35,0, 25,0, 23,9, 23,6, 22,7, 14,1. MALDI-MS (modopositivo, DHB): m/z 1009,1 [M + Na]+, calc. anal. para C6IH83N3O8(985,62): C, 74,28; H, 8,48; N, 4,26. Encontrado: C, 74,19; H, 8,42; N, 4,28.

(c) O produto de (b) acima (700 mg, 0,710 mmol) em umamistura de tolueno/etanol/1 M de HCl aq. (3:6:1, 15 ml) foi aquecido a60°C durante 3 horas. O solvente foi co-evaporado com tolueno, secado emvácuo, o resíduo foi dissolvido em DMF seco (10 ml), NaH (60% de óleomineral, 85 mg, 3,553 mmol) foi adicionado e agitado durante 30 minutos,à temperatura ambiente, e então adicionou-se brometo de benzila (220 μΐ,1,77 mmol). A mistura de reação foi agitada durante mais 5 horas, e entãoextraída com éter de dietila (2 χ 20 ml), a camada de éter foi lavada comágua, secada sobre MgSO4 e evaporada dando material bruto, que foipurificado por meio de cromatografia de flash (5:95, acetato de etila: éterde petróleo) dando

<formula>formula see original document page 79</formula>

(655 mg, 85% de rendimento). Rf=O,40 (5:95, acetato deetila: éter de petróleo), [a]25D= + 2,8 (c 1,0, CHCl3). RMN 1H (600 MHz,CDCl3): δ 7,44-7,28 (m, 30H), 5,96-5,90 (m, 1H), 5,32 (dd, J=17,4, 1,8 Hz,1H), 5,14 (dd, J=10,8, 1,8 Hz, 1H), 4,88-4,62 (m, HH), 4,54 (d, J=I 1,4 Hz,1H), 4,29-4,27 (m, 1H), 4,22-4,12 (m, 3H), 4,08 (br, s, 1H), 3,96 (br, s,3H), 3,87-3,83 (m, 3H), 3,68-3,66 (m, 2H), 1,49-1,32 (m, 26H), 0,94 (t,J=7,2 Hz, 3H). RMN 13C (150 MHz, CDCl3): δ 138,5-127,2 (in, 36C),135,4, 116,2, 79,8, 79,2, 79,0, 78,9, 78,7, 78,38, 78,36, 76,0, 74,6, 74,4,73,8, 73,17, 73,15, 73,0, 72,18, 72,10, 62,5, 32,0, 29,9, 29,89, 29,80, 29,79,29,76, 29,4, 27,0, 25,7, 22,7, 14,2. MALDI-MS (modo positivo, DHB): m/z1110,4 [M + Na]+. Calc. anal. para C69H87N3O8 (1085,65): C, 76,28; H,8,07; N, 3,87. Encontrado: C, 76,36; H, 8,17; N, 3,95.

(d) O produto de (c) acima (650 mg, 0,598 mmol) em éterde dietila (5 ml) foi adicionado a uma suspensão de LiAlH4 (46 mg, 1,210mmol) em éter de dietila (10 ml) a 0°C por gotejamento. A mistura dereação foi trazida lentamente à temperatura ambiente e refluxada durante 1hora. A mistura de reação foi extinta com metanol e extraída com acetatode etila (2x15 ml) e água. A camada orgânica foi lavada com salmoura esecada sobre MgSO4. A remoção do solvente deu uma amina bruta. Oprocedimento em l(b) acima foi repetido para o acoplamento desta aminaao ácido carboxílico dando

<formula>formula see original document page 80</formula>

(rendimento: 65%). Rf= 0,57 (15:85, acetato de etila: éter depetróleo), + 1,6 (c 1,0, CHCl3). RMN 1H (600 MHz, CDCl3): δ 7,37-7,17(m, 30H), 7,04 (d, J=8,6 Hz, 1H), 5,96-5,91 (m, 1H), 5,27 (dd, J=17,4, 1,8Hz, 1H), 5,15 (dd, J=10,8, 1,8 Hz, 1H), 4,83-4,43 (m, 13H, benzil-H, H-I'),4,33-4,31 (m, 1H), 4,23-4,21 (m, 1H), 4,19-4,02 (m, 2H, H-4, H-2'), 3,91(dd, J=9,6, 2,4 Hz, H-2), 3,88-382 (m, 3H, H-3', H-6, H-l), 3,73 (dd, J=9,6,3,0 Hz, 1H, H-3), 3,70 (dd, J=10,2, 2,4 Hz, 1H, H-5), 3,66-3,62 (m, 1H, H-1'), 3,48-3,44 (m, 1H, H-4'), 2,21-2,17 (m, 2H), 1,57-1,27 (m, 72H), 0,91 (t,J=7,2 Hz, 6H). RMN 13C (150 MHz, CDCl3): δ 172,8, 139,2-127,2 (m,36C), 135,1, 117,1, 80,8 (C-4'), 80,0 (C-l), 79,6 (C-3), 79,44 (C-2), 79,41,79,3 (C-5, C-6), 78,2 (C-3'), 75,3 (C-4), 74,6, 74,4, 73,8, 73,8 (C-I'), 73,6,73,1, 72,8, 72,7, 71,6, 51,0 (C-21), 36,8, 32,0, 29,9, 29,79, 29,77, 29,72,29,6, 29,44, 29,43, 26,4, 25,9, 25,8, 22,7, 14,1. MALDI-MS (modopositivo, DHB): m/z 1464,2 [M + Na]+, calc. anal. para C95Hi39NO9(1438,04): C, 79,29; H, 9,74; N, 0,97. Encontrado: C, 79,35; H, 9,81; N, 1,09.

(e) O composto de (d) acima (650 mg, 0,452 mmol) comouma solução em etanol (15 ml), foi tratado com DBU (10 μΐ, 0,065 mmol),e cloreto de tris(trifenilfosfino) rutênio (II) (130 mg, 0,135 mmol). Amistura de reação foi aquecida em refluxo a 90°C durante 30 minutos. Osolvente foi evaporado dando produto isomerizado (Rf = 0,54, 15:85,acetato de etila: éter de petróleo), que foi dissolvido em HCl aq. 1 M emacetona (1:9, 15 ml) e a mistura de reação foi aquecida em refluxo a 70°Cdurante 15 minutos. A mistura foi resfriada à temperatura ambiente,neutralizada com Et3N e extraída com acetato de etila (2 χ 20 ml), a faseorgânica foi lavada com água e salmoura, secada sobre MgSO4 e evaporadadando material bruto. Purificado por meio de cromatografia de flash(18:82, acetato de etila: éter de petróleo) dando

<formula>formula see original document page 81</formula>

(655 mg, 78% de rendimento). Rf= 0,2 (15:85, acetato deetila: éter de petróleo), [a]25D = -6,4 (c 1,0, CHCl3). RMN 1H (600 MHz,CDCl3): δ 7,37-7,23 (m, 30H), 7,16 (d, J-8,7 Hz, 1H), 4,88 (d, J=12,0 Hz,1H), 4,78-4,68 (m, 5H), 4,59-4,54 (m, 4H), 4,47-4,42 (m, 3H), 4,09-4,06(m, 3H), 3,95-3,93 (m, 2H), 3,76-3,3,73 (m, 2H), 3,66 (br, d, J=8,4 Hz,1H), 3,51-3,46 (m, 2H), 1,97-2,14 (m, 2H), 1,52-1,24 (m, 72H), 0,89 (t,J=7,2 Hz, 6H). RMN 13C (150 MHz, CDCl3): δ 172,9, 138,9-127,3 (m,36C), 80,7, 80,3, 79,9, 79,3, 79,1, 74,4, 74,2, 74,0, 73,9, 73,5, 73,3, 72,0,71,7, 70,2, 51,9, 36,9, 31,9, 29,9, 29,77, 29,75, 29,70, 29,5, 29,42, 29,4,26,3, 25,8, 22,7, 14,1. MALDI-MS (modo positivo, DHB): m/z 1424,7 [M+ Na]+. Cale. anal. para C92Hi35NO9 (1398,01): C, 78,98; H, 9,73; N, 1,00.

Encontrado: C, 79,08; H, 9,84; N, 1,13.

(f) O procedimento de 6(a) para reduzir um grupo OH foirepetido usando o produto de (e) acima dando

<formula>formula see original document page 82</formula>

que foi purificado por meio de cromatografia de flash (2:98acetato de etila: tolueno) como sólido incolor (60%). Rf = 0,57 (4:96,acetato de etila: tolueno), [a]25D = + 11,2 (c 1,0, CHCl3). RMN 1H (600MHz5 CDCl3): δ 7,38-7,17 (m, 30H), 6,36 (d, J=8,6 Hz, 1H, -NH), 4,83-4,36 (m, 12H, benzil-H), 4,18-4,14 (m, 2H, H-2', H-4), 4,00 (br, d, J=9,0Hz, 1H, H-I'), 3,93 (dei, J=10,0, 3,0 Hz, 1H), H-2), 3,84 (t, J=4,0 Hz, 1H,H-3'), 3,78 (d, J=3,0 Hz, 1H, H-l), 3,76 (br, t, J=9,0 Hz, 1H, H-5), 3,72(dd, J=10,0, 2,0 Hz, 1H, H-3), 3,66 (br, d, J=9,0 Hz, 1H, H-I'), 3,51 (ddd,J= 12,0, 8,0, 4,0 Hz, 1H, H-4'), 1,98-1,94 (m, 1H, H- 6), 1,824,72 (m, 2H),1,63-1,61 (m, 1H, H-6), 1,43-1,24 (m, 72H), 0,86 (t, J=6,5 Hz, 6H). RMN13C (150 MHz, CDCl3): δ 173,3, 139-127,2 (m, 36C), 80,2 (C-2, C-3'), 79,8(C-3, C-4'), 75,9 (C-4), 75,8 (C-l), 75,1 (C-5), 74,0, 73,8, 72,5, 71,9, 71,0(C-I'), 51,3 (C-2'), 36,6, 31,9, 30,5, 30,2, 29,8, 29,75, 29,73, 29,69, 29,65,29,5, 29,4, 29,3, 26,0, 25,7, 22,7, 14,1. MALDI-MS (modo positivo, DHB):m/z 1408,6 [M + Na]+, calc. anal. para C92H135NO8 (1382,02): C, 79,89; H,9,84; N, 1,01. Encontrado: C, 79,98; H, 9,99; N, 1,18.

(g) O produto de (f) acima (150 mg, 0,108 mmol) e 20% dePd(OH)2/C (150 mg) em Me0H/CH2Cl2H20 (7,5:7,5:1, 6 ml) foi agitadosob atmosfera de H2 à temperatura ambiente durante 2 horas. O produtoprecipitou-se e foi dissolvido por meio da adição de uma mistura desolventes metanol/CH2Cl2/éter de petróleo e com aquecimento. Apósfiltração, o filtrado foi concentrado dando sólido incolor

<formula>formula see original document page 83</formula>

referido a seguir como Composto 12 ('análogo de D-mio-Inositol Ceramida') (86 mg, 95% de rendimento). RMN 1H (250 MHz5C5D5N): δ 8,45 (d, J=8,5 Hz, 1H), 5,16 (dd, J=8,0, 4,2 Hz, 1H), 4,58-4,43(m, 4H), 4,33-4,22(m, 5H), 2,45-2,30 (m, 3H), 1,91-1,77 (m, 3H), 1,28-1,21 (m, 70H), 0,83 (t, J=6,7 Hz, 6H). MALDI-MS (modo positivo, DHB):m/z 864,4 [M + Na]+, calc. anal. para C50H99NO8 (841,74): C, 71,30; H,11,85; N, 1,66. Encontrado: C, 71,41; H, 11,98; N, 1,73.

Composto 13: Sal de D-mio-Inositol Ceramida

(a) A uma solução agitada do produto de 12(e) acima, p. ex.

<formula>formula see original document page 83</formula>

(200 mg, 0,143 mmol) em DMF/THF (1:1, 2 ml),adicionou-se complexo SO3eNMe3 (40 mg, 0,287 mmol), e a mistura dereação foi agitada durante 24 horas à temperatura ambiente. Apóscompletamento da reação, isto foi extraído com CH2CI2 (2x10 ml) e a faseorgânica foi secada e concentrada, purificada por meio de cromatografia deflash dando sólido incolor, que foi dissolvido em MeOH/CH2Cl2 (1:1,2 ml)e passado através de resina de troca de íon Dowex 50 X 8H+ (forma deNa+) e eluído com mistura de MeOH/CH2Cl2 (1:1, 100 ml). O solvente foievaporado para se obter sólido,

<formula>formula see original document page 84</formula>

que foi purificado por meio de cromatografia de flash dandoum sólido incolor (203 mg, 95% de rendimento). Este composto foidesbenzilado usando-se procedimento similar ao descrito para o composto12(f) acima, dando um sólido incolor

<formula>formula see original document page 84</formula>

referido a seguir como Composto 13 ('D-mio-InositolCeramida1) (rendimento: 40% de rendimento).

RMN 1H (400 MHz, C5D5N: CD3OD): δ 8,50 (d, J=8,5 Hz,1H), 5,10 (dd, J=IO,0, 2,0 Hz, 1H), 4,58-4,55 (m, 2H), 4,48-4,42 (m, 2H),4,26-4,17 (m, 3H), 4,06-3,99 (m, 2H), 3,91-3,88 (m, 1H), 2,31-2,26 (m,2H), 1,63-1,10 (m, 72H), 0,90 (t, J=5,7 Hz, 6H).

MALDI-MS (modo negativo, ATT): m/z 938,7 [M - Na] ".Cale. anal. para C50H98NNaO12S (959,67): C, 62,53; H, 10,29; N, 1,46.Encontrado: C, 62,59; H, 10,38; N, 1,51.

Composto 14: 4-(S)-Fenila TreitoI Ceramidas

(a) Acido L-(+)-tartárico foi convertido a um triflatocorrespondente de acordo com procedimentos bem conhecidos, verWagner, et al., J. Chem. Soe. Perkins Trans., 1, 780 (2001).; Su, et al.,Tetrahedron., 57 2147 (2001); Surivet, et al., Tetrahedron Lett., 39:7249(1998) e Surivet, et al, Tetrahedron., 55:1311 (1999), todos incorporadosaqui por referência. A síntese do triflato resulta numa misturadiaestereomérica. Esta mistura é separada, seguindo as referênciasindicadas acima, dando dois compostos.

<formula>formula see original document page 85</formula>

R1 = OTBDPS, R2 = H

e

R2 = OTBDPS, R1 = H

(b) O procedimento de 1(a) acima foi repetido com umtriflato de (a) acima, em que R1 = OTBDPS e R2 = H, p. ex.

<formula>formula see original document page 85</formula>

R1 = OTBDPS, R2 = 2

para dar

<formula>formula see original document page 85</formula>

R1 = OTBDPS, R2= H

que foi purificado via cromatografia de flash dando comoum líquido incolor, com um rendimento de 84%. Rf=0,62 (1:9, acetato deetila: éter de petróleo), [α]25D = + 20,5 (c 1,0, CHCl3). RMN 1H (250 MHz,CDCl3): δ 7,71-7,17 (m, 15H), 4,90 (d, J=4,5 Hz, 1H), 4,27-4,20 (m, 1H),4,15-4,06 (m, 1H), 3,95 (dd, J=8,0, 4,5 Hz, 1H), 3,79-3,70 (m, 2H), 3,52(dt, J=8,7, 2,0 Hz, 1H), 3,40 (t, J=9,0 Hz, 1H), 3,28-3,16 (m, 2H), 1,54-1,20 (m, 26H), 1,42 (s, 3H), 1,37 (s, 3H), 1,32 (s, 3H), 1,28 (s, 3H), 1,06 (s,9H), 0,88 (t, J=6,5 Hz, 3H). RMN 13C (62,5 MHz, CDCl3): δ 140,4, 136,07,136,02, 133,5, 133,2, 129,5, 129,4, 127,7, 127,4, 127,3, 127,2, 127,0,109,2, 108,1, 81,1, 77,7, 76,8, 75,7, 75,5, 72,8, 72,6, 59,7, 31,9, 29,6,29,59, 29,53, 29,4, 29,3, 28,0, 27,0, 26,88, 26,82, 26,4, 25,6, 22,6, 19,3,14,1. MALDI-MS (modo positivo, CHCA): m/z 865,2 [M + Na]+. Cale.anal. para C50H75N3O6Si (842, 23): C, 71,30; H, 8,98; N, 4,99. Encontrado:C, 71,39; H, 9,03; N, 5,07.(c) O procedimento de l(b) acima foi repetido usando oproduto de (b) acima dando

<formula>formula see original document page 86</formula>

, que foi purificado via cromatografia de flash (8:9,2 deacetato de etila:éter de petróleo), como um sólido incolor, com 72% derendimento. Rf= 0,52 (1:9, acetato de etila: éter de petróleo), [a] D = +17,9 (c 1,0, CHCl3)- RMN 1H (250 MHz, CDCl3): δ 7,69-7,16 (m, 15H),5,72 (d, J=8,7 Hz, 1H), 4,84 (d, J=4,7 Hz, 1H); 4,19-4,08 (m, 4H), 3,87 (dd,J=7,6, 4,5 Hz, 1H), 3,59 (br, d, J=9,2 Hz, 1H), 3,33 (br, d, J=10,5 Hz, 1H),3,17 (br, d, J=4,5 Hz, 2H), 2,12-2,06 (m, 2H), 1,56-1,25 (m, 72H), 1,40 (s,3H), 1,31 (s, 3H), 1,30 (s, 3H), 1,19 (s, 3H), 1,05 (s, 9H), 0,89 (t, J=6,7 Hz,6H). RMN 13C (62,5 MHz, CDCl3): δ 170,4, 139,5-127,1 (m), 109,1, 108,1,80,3, 77,6, 77,1, 75,7, 72,6, 71,7, 65,2, 58,9, 31,8, 29,6, 29,5, 29,3, 29,2,28,0, 26,9, 26,6, 26,5, 26,3, 25,5, 22,6, 20,6, 14,0. MALDI-MS (modopositivo, DHB): m/z 1217,7 [M + Na]+, calc. anal. para C76Hi27NO7Si(1194, 90): C, 76,39; H, 10,71; N, 1,17. Encontrado: C, 76,45; H, 10,81; N,

(d) O produto de (c) acima (200 mg, 0,169 mmol) em THF esolução 1,0M de TBAF (0,2 ml, 0,203 mmol), foi agitado à temperaturaambiente durante 24 horas. A mistura de reação foi então recolhida emacetato de etila, lavada com água, então solução de salmoura saturada, edepois secada sobre MgSO4 anidro, e concentrada. O resíduo foipurificado, via cromatografia de flash, dando

<formula>formula see original document page 87</formula>

como um sólido incolor (132 mg, 82% de rendimento). Rf=0,42 (4:6, acetato de etila: éter de petróleo), [a]25D = + 6,7 (c 0,5, CHCl3).RMN 1H (250 MHz, CDCl3): δ 7,41-7,32 (m, 5H), 5,68 (d, J=9,0 Hz, 1H),4,87 (d, J=5,5 Hz, 1H), 4,32-3,96 (m, 5H), 3,60 (dd, J=10,0, 3,8 Hz, 1H),3,39 (dd, J=10,0, 2,5 Hz, 1H), 3,24 (dd, J=10,5, 5,5 Hz, 1H), 3,14 (dd,J=10,5, 4,0 Hz, 1H), 2,12 (dt, J=7,5, 3,5 Hz, 2H), 1,54-1,25 (m, 72H), 1,43(s, 3H); 1,41 (s, 3H), 1,38 (s, 3H), 1,33 (s, 3H), 0,88 (t, J=6,7 Hz), 6H).RMN 13C (62,5 MHz, CDCl3): δ 172,5, 139,5, 128,3, 127,8, 126,1, 109,3,107,9, 81,0, 77,6, 76,1, 73,0, 72,1, 71,2, 48,1, 36,9, 31,9, 29,6, 29,5, 29,3,29,0, 27,05, 27,01, 26,4, 25,7, 22,6, 14,1. MALDI-MS (modo positivo,CHCA): m/z 979,4 [M + Na]+, calc. anal. para C60H109NO7 (956,51): C,75,34; H,11,49; N, 1,46. Encontrado: C, 75,40; H, 11,55; N, 1,51.

(e) Os procedimentos de l(c) acima foram repetidos usandoo produto de (d) acima, dando um sólido incolor,

<formula>formula see original document page 87</formula>

referido a seguir como Composto 14 ('4-(S)-Fenila TreitolCeramida'), com um rendimento de 68%. RMN 1H (600 MHz, C5D5N): δ8,52 (d, J=8,5 Hz, 1H), 7,79-7,27 (m, 5H), 5,39 (d, J=7,8 Hz, 1H), 5,18-4,94 (m, 1H), 4,93-4,91 (m, 1H), 4,30-4,19 (m, 5H), 4,12-4,08 (m, 2H),2,41 (br, t, J=7,5 Hz, 2H), 1,92-1,25 (m, 72H), 0,87 (t, J=6,5 Hz, 6H).RMN 13C (150,9 MHz, C5D5N): δ 173,3, 114,4, 128,3, 128,1, 127,2, 76,2,75,4, 75,2, 74,6, 72,8, 71,3, 70,0, 51,8, 36,8, 32,1, 30,3, 30,0, 29,7, 29,6,26,6, 26,4, 22,9, 14,3. MALDI-MS (modo positivo, CHA): m/z 899,1 [M +Na]+, calc. anal. para C54H1OiNO7 (876,38): C, 74,01; H, 11,62; N, 1,60.Encontrado: C, 73,98; Η, 11,59; N, 1,62.

Composto 15: 4-(R)-Fenil Treitol Ceramida(a) O procedimento de l(a) acima foi repetido usando oproduto de 14(a) acima, em que Ri = HeR2= OTBDPS, p. ex.,

<formula>formula see original document page 88</formula>

que foi purificado por meio de cromatografia de flash (7:9,3acetato de etila/éter de petróleo), como um líquido incolor, com umrendimento de 86%. Rf=O,59 (1:9, acetato de etila: éter de petróleo), [a]25 D= - 15,0 (c 1,0, CHCl3). RMN 1H (250 MHz, CDCl3): δ 7,76-7,14 (m, 15H),4,82 (d, J=6,5 Hz, 1H), 4,21-4,06 (m, 3H), 3,86 (dd, J=9,5, 5,5 Hz, 1H),3,87-3,68 (m, 3H), 3,51 (dt, J=9,5, 2,2 Hz, 1H), 3,34 (dd, J=10,0, 8,5 Hz,1H), 1,58-1,25 (m, 26H), 1,41 (s, 3H), 1,36 (s, 3H), 1,33 (s, 3H), 1,31 (s,3H), 1,04 (s, 9H), 0,87 (t, J=6,7 Hz). RMN 13C (62,5 MHz, CDCl3): δ139,5, 136,1, 135,9, 133,6, 133,3, 129,4, 129,3, 127,88, 127,80, 127,4,127,2, 127,1, 109,1, 108,1, 80,3, 77,7, 77,5, 77,1, 75,7, 72,6, 71,7, 59,7,31,8, 29,6, 29,5, 29,55, 29,50, 29,47, 29,41, 29,3, 29,2, 28,0, 27,0, 26,6,26,4, 26,3, 25,5, 25,4, 22,6, 19,3, 14,1. MALDI-MS (modo positivo,CHCA): m/z 865,4 [M + Na]+, calc. anal. para C50H75N3O6Si (842, 23): C,71,30; H, 8,98; N, 4,99. Encontrado: C, 71,42; H, 9,07; N, 5,04.

(b) Os procedimentos de 14(b) acima foram repetidos, masusando o produto de (a) acima dando

<formula>formula see original document page 89</formula>

que foi purificado por meio de cromatogrofia de flash (1:9acetato de etila/éter de petróleo)[;] o composto puro foi obtido como umsólido incolor com um rendimento de 69%. Rf=O,49 (1:9, acetato de etila:éter de petróleo), [α]25D = - 5,9 (c 1,0, CHCl3). RMN 1H (250 MHz,CDCl3): δ 7,77-7,18 (m, 15H), 5,88 (d, J=9,0 Hz, 1H), 4,74 (d, J=6,5 Hz,1H), 4,10-4,07 (m, 3H), 3,97 (dd, J=8,0, 6,5 Hz, 1H), 3,77 (dt, J= 5,7, 2,2Hz, 1H), 3,55 (br, d, J=9,0 Hz, 1H), 3,27 (br, d, J=8,5 Hz, 1H); 3,00-2,97(m, 2H), 2,16-2,08 (m, 2H), 1,58-1,25 (Μ, 72H), 1,39 (s, 3H), 1,33 (s, 3H),1,29 (s, 3H), 1,18 (s, 3H), 1,04 (s, 9H), 0,88 (t, J=6,5 Hz, 6H). RMN 13C(62,5 MHz, CDCl3): δ 172,6, 139,6, 136,1, 135,9, 133,6, 133,2, 129,4,127,9, 127,4, 127,3, 127,2, 109,2, 107,7, 80,6, 77,7, 77,1, 76,9, 75,7, 72,0,70,8, 49,4, 36,9, 31,9, 29,7, 29,5, 29,3, 29,2, 28,4, 27,0, 26,6, 26,4, 26,3,25,5, 25,4, 22,6, 19,3, 14,1. MALDI-MS (modo positivo, DHB): m/z1217,7 [M + Na]+. Calc. anal. para C76H127NO7Si (1194, 90): C, 76,39; H,10,71; N, 1,17. Encontrado: C, 76,41; H, 10,75; N, 1,22.

(c) Os procedimentos de 14(c) acima foram repetidos, masusando o produto de (b) acima dando

<formula>formula see original document page 90</formula>

R1 = H, R2=OH

que foi purificado por meio de cromatografia de flash (3:7de acetato de etila/éter de petróleo), o composto foi obtido como um sólidoincolor, com um rendimento de 85%. Rf= 0,40 (4:6, acetato de etila: éter depetróleo), [a]25D = -3,1 (c 0,5, CHCl3). RMN 1H (250 MHz, CDCl3): δ 7,38-7,36 (m, 5H), 5,58 (d, J=9,0 Hz, 1H), 4,69 (d, J=5,2 Hz, 1H), 4,13-3,91 (m,5H), 3,60 (dd, J=9,7, 3,2 Hz, 1H), 3,33 (dd, J=9,7, 2,5 Hz, 1H), 3,21 (dd,J=10,5, 5,2 Hz, 1H), 3,10 (dd, J=10,5, 3,5 Hz, 1H), 2,12 (dt, J=7,5, 3,2 Hz,2H), 1,58-1,24 (m, 72H), 1,42 (s, 6H), 1,39 (s, 3H), 1,31 (s, 3H), 0,87 (t,J=6,5 Hz, 6H). RMN 13C (62,5 MHz, CDCl3): δ 172,4, 139,6, 128,5, 128,3,126,9, 109,9, 107,8, 81,9, 77,7, 77,2, 76,8, 75,9, 5 74,9, 71,7, 71,1, 48,1,36,9, 31,9, 29,7, 29,5, 29,3, 28,9, 28,0, 27,3, 27,2, 26,4, 25,8, 25,7, 22,6,14,1. MALDI-MS (modo positivo, CHCA): m/z 979,5 [M + Na]+. Cale.anal. para C60H109NO7 (956,51): C, 75,34; H, 11,49; N, 1,46. Encontrado:C, 75,43; H, 11,48;N, 1,44.

(d) Os procedimentos de 14(d) acima foram repetidos, masusando o produto de (c) acima dando

<formula>formula see original document page 90</formula>

R1 = Ph R2 = OH

como um sólido incolor, referido a seguir como Composto15 ('4-(R)-Fenil Treitol Ceramida') obtido com um rendimento de 60%.RMN 1H (600 MHz, C5D5N): δ 8,46 (d, J=8,5 Hz, 1H), 7,82-7,28 (m, 5H),5,46 (d, J=5,4 Hz, 1H), 5,14-511 (m, 1H), 4,25-4,00 (m, 8H), 2,38 (m, 2H),1,88-1,25 (m, 72H), 0,86 (t, J=6,5 Hz, 6H). RMN 13C (150,9 MHz,C5D5N): δ 173,3, 144,4, 128,4, 127,7, 127,3, 76,6, 76,2, 75,3, 74,4, 72,7,

71.2, 71,0, 51,7, 36,8, 33,8, 32,1, 30,3, 30,1, 30,0, 29,8, 29,7, 29,6, 26,6,

26.3, 22,9, 14,2. MALDI-MS (modo positivo, CHCA): m/z 899,5 [M +Na]+. Cale. anal. para C54HioiNO7 (876,38): C, 74,01; H, 11,62; N, 1,60.Encontrado: C, 74,05; H, 11,68; N, 1,65.

Composto 16: 4-(S)-Fenil Treitol-22-(Z)-Ceramida

(a) O procedimento de l(b) acima foi repetido usando ácido22-(Z)-hexacosenóico com o produto de 9(b) acima, p. ex.,

<formula>formula see original document page 91</formula>

9,5, acetato de etila:tolueno) como um sólido incolor (rendimento: 72%). Rf= 0,53 (5:9,5, acetato de etila: tolueno), [a]25D = + 24,6 (c 1,0, CHCl3).RMN 1H (250 MHz, CDCl3): δ 7,70-7,15 (m, 15H), 5,65 (d, J=8,5 Hz, 1H),5,36-5,31 (m, 2H), 4,83 (d, J=4,5 Hz, 1H), 4,17-4,06 (m, 4H), 3,84 (dd,J=7,5, 4,5 Hz, 1H), 3,58 (dd, J=9,2, 2,2 Hz, 1H), 3,38 (dd, J=9,7, 2,1 Hz,1H), 3,16 (br, d, J=4,5 Hz, 2H), 2,13-1,94 (m, 6H), 1,61-1,17 (m, 76H),1,04 (s, 9H), 0,91-0,83 (m, 6H). RMN 13C (62,5 MHz, CDCl3): δ 172,2,140,3-127,0 (m, 17C), 109,2, 107,6, 81,5, 77,7, 76,8, 75,8, 75,6, 73,0, 70,9,

<formula>formula see original document page 91</formula>

para dar

<formula>formula see original document page 91</formula>

R1-OTBDPS1 R2 = H

que foi purificado por meio de cromatografia de flash (5:60,2, 48,1, 36,8, 31,8, 29,7, 29,6, 29,5, 29,4, 29,35, 29,31, 29,2, 28,9, 28,0,27,15, 27,11, 27,0, 26,8, 26,4, 25,7, 25,6, 22,8, 22,6, 14,1, 13,8. MALDI-MS (modo positivo, DHB): m/z 1214,3 [M + Na]+.

(b) O procedimento de 14(c) acima foi repetido usando oproduto de (a) acima e purificado por meio de cromatografia de flash (4:6de acetato de etila: éter de petróleo) dando

<formula>formula see original document page 92</formula>

como sólido incolor (rendimento: 98%). Rf = 0,31 (3:7,acetato de etila: éter de petróleo), [a]25D = + 14,9 (c 1,0, CHCl3). RMN 1H(250 MHz, CDCl3): δ 7,40-7,26 (m, 5H), 5,66 (d, J=9,0 Hz, 1H), 5,37-5,33(m, 2H), 4,88 (dd, J=5,5, 2,7 Hz, 1H), 4,23-3,96 (m, 5H), 3,60 (dd, J=I0,0,4,0 Hz, 1H), 3,39 (dd, J=9,5, 2,2 Hz, 1H), 3,23 (dd, J=10,5, 5,2 Hz, 1H),3,13 (dd, J=10,5, 4,0 Hz, 1H), 3,09 (d, J=2,7 Hz, 1H), 2,12 (dt, J=10,5, 7,5,3,5 Hz, 2H), 2,05-1,96 (m, 4H), 1,60-1,25 (m, 76H), 0,92-0,85 (m, 6H).RMN 13C (62,5 MHz, CDCl3): δ 172,4, 139,6, 130,0, 129,5, 128,2, 126,1,109,2, 107,8, 80,9, 77,6, 76,6, 76,0, 73,0, 72,0, 71,1, 48,1, 36,8, 31,8, 29,7,29,67, 29,60, 29,5, 29,38, 29,33, 29,27, 29,24, 28,8, 27,9, 27,1, 27,0, 26,9,26,4, 25,69, 25,67, 22,8, 22,6, 14,0, 13,7. MALDI-MS (modo positivo,DHB): m/z 976,7 [M + Na]+.

(c) O procedimento de 14(d) acima foi repetido usando oproduto de (b) acima para se obter um sólido incolor

<formula>formula see original document page 92</formula>referido a seguir como Composto 16 ( 4-(5)-Fenil Treitol-22-(Z)-Ceramida'), (rendimento: 67%). RMN 1H (250 MHz, C5D5N): δ8,43 (d, J=8,7 Hz, 1H), 7,70-7,16 (m, 5H), 5,39- 5,28 (m, 3H), 5,08-5,02(m, 1H), 4,89-4,79 (m, 1H), 4,23-4,07 (m, 5H), 4,05-3,95 (m, 2H), 2,30 (br.t, J=7,5 Hz, 2H), 1,99-1,87 (m, 4H), 1,80-1,67 (m, 4H), 1,17-1,13 (m,60H), 0,78-0,73 (m, 6H). MALDI-MS (modo positivo, DHB): m/z 897,1[M + Na]+. Cale. anal. para C54H99NO7 (873,74): C, 74,18; H, 11,41; N,1,60. Encontrado: C, 74,16; H, 11,49; N, 1,68.

Composto 17: 4-(R)-Fenil Treitol-22-(Z)-Ceramida

(a) O procedimento de l(b) foi repetido usando-se ácido 22-

(Z)-hexacosenóico com o produto de 15(b) acima, p. ex.

<formula>formula see original document page 93</formula>

para dar

<formula>formula see original document page 93</formula>

que foi purificado por meio de cromatografia de flash (5:9,5, acetato de etila: tolueno) como um sólido incolor (rendimento: 75%).Rf= 0,57 (5:9,5, acetato de etila: tolueno), [a]25D = - 6,0 (c 1,0, CHCl3).RMN 1H (250 MHz, CDCl3): δ 7,75-7,18 (m, 15H), 5,68 (d, J=8,0 Hz, 1H),5,40-5,33 (m, 2H), 4,72 (d, J=6,5 Hz, 1H), 4,12-4,00 (m, 3H), 3,93 (dd,J=8,0, 6,5 Hz, 1H), 3,79-3,72 (m, 1H), 3,53 (br. d, J=9,5 Hz, 1H), 3,24 (br.d, J=9,5 Hz, 1H), 3,02-2,91 (m, 2H), 2,16-1,96 (m, 6H), 1,60-1,25 (m,76H), 1,04 (s, 9H), 0,92-0,85 (m, 6H). RMN 13C (62,5 MHz, CDCl3): δ172,3, 139,6-127,2 (m, 17C), 109,1, 107,7, 80,6, 77,7, 77,1, 76,9, 75,7,72,1,70,8, 48,1, 36,9, 31,9, 29,74, 29,70 29,6, 29,5, 29,39, 29,35, 29,30,29,2,29,0, 28,0, 27,2, 26,9, 26,7, 26,4, 25,8, 25,7, 22,8, 22,6, 14,1, 13,7.MALDI-MS (modo positivo, DHB): m/z 1214,4 [M + Na]+.

(b) O procedimento de 15(c) foi repetido usando o produtode (a) acima e purificado por meio de cromatografia de flash (4:6 deacetato de etila: éter de petróleo) dando

<formula>formula see original document page 94</formula>

puro como um sólido incolor (rendimento: 98%). Rf= 0,32(3:7, acetato de etila: éter de petróleo). [a]25D = + 5,5 (c 1,0, CHCl3). RMN1H (250 MHz, CDCl3): δ 7,39-7,30 (m, 5H), 5,56 (d, J- 9,2 Hz, 1H), 5,37-5,32 (m, 2H), 4,68 (t, J=4,5 Hz, 1H), 4,13-3,94 (m, 5H), 3,59 (dd, J=9,5,3,5 Hz, 1H), 3,32 (dd, J=9,5, 3,5 Hz, 1H), 3,20 (dd, J=10,5, 5,2 Hz, 1H),3,10 (dd, J=10,2, 3,8 Hz3 1H), 2,92 (d, J=4,5 Hz, 1H), 2,11 (dt, J=10,5, 7,5,3,5 Hz, 2H), 2,03-1,95 (m, 4H), 1,60-1,24 (m, 76H), 0,91-0,84 (m, 6H).RMN 13C (62,5 MHz, CDCl3): δ 172,3, 139,6, 130,0, 129,5, 128,4, 126,9,109,8, 107,7, 81,8, 77,6, 76,7, 75,8, 74,9, 71,7, 71,1, 48,0, 36,8, 31,8, 29,7,29,69, 29,60, 29,5, 29 38, 29,32, 29,28, 29,27, 29,24, 28,9, 27,9, 27,29,27,22, 27,1, 26,4, 25,7, 25,6, 22,8, 22,6, 14,0, 13,7. MALDI-MS (modopositivo, DHB): m/z 976,6 [M + Na]+.

(c) O procedimento de 15 (d) foi repetido usando o produtode (b) acima para se obter um sólido incolor

<formula>formula see original document page 94</formula>referido a seguir como Composto 17 ('4-(R)-Fenil Treitol-22-(Z)-Ceramida'), (rendimento: 63%). RMN 1H (250 MHz, C5D5N): δ8,42 (d, J=8,7 Hz, 1H), 7,73-7,16 (m, 5H), 5,38- 5,30 (m, 3H), 5,05-5,00(m, 1H), 4,19-3,98 (m, 7H), 3,92-3,86 (m, 1H), 2,28 (br, t, J=7,5 Hz, 2H),1,98-1,87 (m, 4H), 1,80-1,65 (m, 4H), 1,17-1,12 (m, 60H), 0,78-0,71 (m,6H). MALDI-MS (modo positivo, DHB): m/z 897,4 [M + Na]+. Cale. anal.para C54H99NO7 (873,74): C, 74,18; H, 11,41; N, 1,60. Encontrado: C,74,11;H, 11,51; N, 1,66.

Síntese de ácido (19Z, 22Z)-Hexacosadienóico

(a) O procedimento para 'Síntese ácido 22-(Z)-Hexacosanóico', etapa (a) acima foi repetido a partir de ácido 11-bromoundecanóico dando

<formula>formula see original document page 95</formula>

com 97% de rendimento. RMN 1H (250 MHz, CDCl3): δ4,58 (t, J=3,2 Hz, 1H), 3,92-3,83 (m, 1H), 3,78-3,72 (m, 1H), 3,65 (s, 3H),3,52-3,46 (m, 1H), 3,42-3,36 (m, 1H), 2,30 (t, J=7,5 Hz, 2H), 1,88-1,15 (m,10 H), 1,25 (br, s, 28H). RMN 13C (62,5 MHz, CDCl3): δ 174,2, 98,7, 67,6,62,2, 51,3, 34,0, 30,7, 29,7, 29,63, 29,60, 29,5, 29,45, 29,40, 29,2, 29,1,26,2, 25,4, 24,9, 19,6. MALDI-MS (modo positivo, CHCA): m/z 436,1 [M+ Na]+.

(b) O procedimento da 'Síntese ácido 22-(Z)-hexacosanóico', etapa (b) acima, foi repetido para (a) acima dando

<formula>formula see original document page 95</formula>

com 98% de rendimento, RMN 1H (250 MHz, CDCl3): δ3,67 (s, 3H), 3,63 (t, J=6,5 Hz, 2H), 2,30 (t, J=7,5 Hz, 1H), 1,64-1,51 (m,4H), 1,25 (br, s, 26H). RMN 13C (62,5 MHz, CDCl3): δ 174,3, 63,0, 51,4,34,0, 32,7, 29,63, 29,60, 29,5, 29,58, 29,56, 29,4, 29,2, 29,1, 25,7, 24,9.MALDI-MS (modo positivo, CHCA): m/z 351,9 [M + Na]+.

(c) O procedimento da 'Síntese ácido 22-(Z)-hexacosanóico',etapa (c) acima, foi repetido para (b) acima dando

<formula>formula see original document page 96</formula>

com 90% de rendimento. RMN 1H (250 MHz, CDCl3): δ9,76 (s, 1H), 3,66 (s, 3H), 2,39 (dt, J=14,0, 7,5, 2,0 Hz, 2H), 2,26 (t, J=7,5Hz, 2H), 1,66-1,56 (m, 4H), 1,25 (br, s, 26H). RMN 13C (62,5 MHz,CDCl3): δ 202,6, 173,4, 50,7, 43,4, 33,5, 29,29, 29,23, 29,08, 29,01, 28,9,28,79, 28,76, 24,5, 21,6, ESI-MS (modo positivo) (326,2): 349,3 [M +Na]+.

(d) O procedimento da 'Síntese ácido 22-(Z)-hexacosanóico', etapa (d) acima, foi repetido para (c) acima dando

<formula>formula see original document page 96</formula>

com 98% de rendimento. RMN 1H (250 MHz, CDCl3): δ5,37-5,34 (m, 4H), 3,66 (s, 3H), 2,78 (t, J=6,2 Hz, 2H), 2,30 (t, J=7,5 Hz,2H), 2,08-1,99 (m, 4H), 1,64-1,58 (m, 2H), 1,42-1,25 (m, 30H), 0,91 (t,J=7,5 Hz, 3H). RMN 13C (62,5 MHz, CDCl3): δ 174,1, 130,0, 129,7, 128,0,127,8, 51,2, 34,0, 29,64, 29,60, 29,55, 29,51, 29,4, 29,27, 29,22, 29,1, 27,1,25,5,24,8, 22,7, 13,7.

(e) O produto de (d) acima (1,23 g, 3,022 mmol) em THF(10 ml) e hidróxido de potássio 2 N (12 ml) foi aquecido em refluxodurante 8 h, e acidificado com ácido clorídrico 2 N (~ pH 1-2). Extraídocom éter de dietila (2 χ 30 ml), secado e concentrado dando sólido incolorque foi recristalizado de ácido acético glacial dando cristais incolores(rendimento: 52%), e o licor-mãe foi concentrado e purificado por meio decromatografia de flash dando<formula>formula see original document page 97</formula>

ácido (19Z,22Z)-Hexacosadienóico como cristais incolorescom 42% de rendimento. RMN 1H (250 MHz5 CDCl3): δ 5,37-3,32 (m,4H), 2,76 (t, J=6,2 Hz, 2H), 2,33 (t, J=7,5 Hz, 2H), 2,06-1,98 (m, 4H),1,67-1,55 (m, 2H), 1,32-1,23 (m, 30H), 0,90 (t, J=7,5 Hz, 3H). RMN 13C(62,5 MHz, CDCl3): δ 180,1, 130,1, 129,8, 128,1, 127, 9, 34,0, 29,6, 29,59,29,55, 29,4, 29,3, 29,2, 29,0, 27,2, 25,6, 24,6, 22,8, 13,8, ESI-MS (modonegativo) (392,3): 391,4 [M-H]-.

Composto 18: Treitol-(19Z,22Z)Ceramida

(a) O procedimento de l(b) acima foi repetido usando ácido(19Z,22Z)-Hexacosadienóico e o produto de 3(b), p. ex.

<formula>formula see original document page 97</formula>

para dar

<formula>formula see original document page 97</formula>

líquido incolor, que solidifica ao descansar, (rendimento:71%). Rf= 0,24 (3:7, acetato de etila: éter de petróleo), z[α]25D = + 13,6 (c1,0, CHCl3). RMN 1H (250 MHz, CDCl3): δ 5,73 (d, J=9,5 Hz, 1H), 5,43-5,33 (m, 4H), 4,24-4,15 (m, 1H), 4,08-3,99 (m, 3H), 3,92- 3,86 (m, 1H),3,80-3,65 (m, 5H), 3,60-3,54 (m, 2H), 2,77 (t, J=6,2 Hz, 2H), 2,14 (dt, J=10,5, 7,5, 3,0 Hz, 2H), 2,07-1,99 (m, 4H), 1,61-1,24 (m, 74H), 0,93-0,84(m, 6H). RMN 13C (62,5 MHz, CDCl3): δ 172,5, 130,0, 129,7, 128,0,127,8, 109,2, 107,9, 79,1, 77,6, 76,6, 76,1, 71,8, 71,6, 62,3, 48,1, 36,8,31,8, 29,6, 29,5, 29,4, 29,36, 29,30, 29,26, 29,21, 28,9, 27,8, 27,1, 26,9,26,4, 25,67, 25,63, 25,5, 22,7, 22,6, 14,0, 13,7. MALDI-MS (modopositivo, DHB): m/z 899,1 [M + Na]+.

(b) O procedimento de l(c) acima foi seguido usando oproduto de (a) acima dando

<formula>formula see original document page 98</formula>

sólido incolor (rendimento: 67%), referido a seguir comoComposto 18 ('Treitol-(19Z,22Z)-Ceramida'). RMN 1H (250 MHz,C5D5N): δ 8,65 (d, J=8,5 Hz, 1H), 5,66-5,55 (m, 4H), 5,30-5,24 (m, 1H),4,63-4,45 (m, 1H), 4,42-4,32 (m, 9H), 4,18 (d, J=5,5 Hz, 2H), 3,01 (t, J=62Hz, 2H), 2,54 (t, J=7,5 Hz, 2H), 2,28-2,14 (m, 4H), 2,03-1,87 (m, 4H),1,48-1,36 (m, 58H), 1,02-0,97 (m, 6H). MALDI-MS (modo positivo,Matriz CHCA): m/z 819,8 [M + Na]+.

Claims

1. Composto, caracterizado pelo fato de que é de fórmula I:O<formula>formula see original document page 99</formula>em queR1 representa uma porção hidrofóbica adaptada para ocuparo canal C1 de CDld humana,Rzrepresenta uma porção hidrofóbica adaptada para ocuparo canal A' de CDld humana, de tal forma que R1 preencha pelo menos pelomenos 30% do volume ocupado do canal C' comparado com o volumeocupado pelo nC14H29 terminal da cadeia esfingosina da a-galactosilceramida quando ligado à CDld humana e R preenche pelomenos 30% do volume ocupado do canal A1 comparado com o volumeocupado pelo nC2sH51 terminal da cadeia acila da a-galactosilceramidaquando ligado à CDld humanaR3 representa hidrogênio ou OH,RaeRbrepresenta, cada um, hidrogênio e, adicionalmente,quando R3 representa hidrogênio, Ra e Rb em conjunto podem formar umaligação simples,X representa ou -CHA(CHOH)nY ou - P(=0)(0")OCH2(CHOH)mY, sendo que Y representa CHB1B2,n representa um número inteiro de 1 a 4, m representa 0 ou-1,A representa hidrogênio,um de Bi e B2 representa H, OH ou fenila, e o outrorepresenta hidrogênio ou um de B1 e B2 representa hidroxila e o outrorepresenta fenila,adicionalmente, quando η representa 4, então A, emconjunto com um de Bi e B2, em conjunto, formam uma ligação simples eo outro de Bi e B2 representa H, OH ou OSO3He sais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos.

2. Composto de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que R1 preenche pelo menos 35% do volume ocupado do canalC' como definido na reivindicação 1.

3. Composto de acordo com a reivindicação 1 oureivindicação 2, caracterizado pelo fato de que R preenche pelo menos 40%do volume ocupado do canal A' como definido na reivindicação 1.

4. Composto de acordo com qualquer uma dasreivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que R1 representauma cadeia de hidrocarboneto linear saturada ou insaturada contendo de 5 a-14 átomos de carbono na cadeia.

5. Composto de acordo com qualquer uma dasreivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que R1 representauma cadeia de hidrocarboneto linear saturada ou insaturada contendo de 11a 14 átomos de carbono na cadeia.

6. Composto de acordo com qualquer uma dasreivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de queR2 representauma cadeia de hidrocarboneto linear saturada ou insaturada contendo de 8 a átomos de carbono na cadeia.

7. Composto de acordo com qualquer uma dasreivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que ura ou ambos deR ou R contém uma ou mais duplas ligações.

8. Composto de acordo com qualquer uma dasreivindicações precedentes 7, caracterizado pelo fato de que um ou ambosde R1 ou R2 contém uma, duas ou três duplas ligações.

9. Composto de acordo com a reivindicação 7 oureivindicação 8, caracterizado pelo fato de que as duplas ligações são eis(Z).

10. Composto de acordo com qualquer uma dasreivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que X representaCHA(CHOH)n^CHB1B2.

11. Composto de acordo com qualquer uma dasreivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que X representaCH2(CHOH)nCHB1B2.

12. Composto de acordo com qualquer uma dasreivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que n representa 1, 2ou 3.

13. Composto de acordo com qualquer uma dasreivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que Rj representahidrogênio.

14. Composto de acordo com qualquer uma dasreivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que Ra e Rb, ambos,representam hidrogênio.

15. Composto de acordo com qualquer uma dasreivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que um de B1 e B2representa hidrogênio e o outro representa hidróxi.

16. Composto de acordo com qualquer uma dasreivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que é para uso comoum medicamento.

17. Método para proteger um indivíduo mamífero contra, outratar, um vírus, infecção microbiana, parasita, uma doença auto-imune,câncer, alergia ou asma, caracterizado pelo fato de que compreendeadministrar ao indivíduo uma quantidade farmaceuticamente eficaz de umcomposto como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 15 queapresenta atividade farmacêutica contra, ou no tratamento de, um referidovírus, infecção microbiana, parasita, uma doença auto-imune, câncer,alergia ou asma.

18. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de quecompreende um composto como definido em qualquer uma dasreivindicações de 1 a 15 em mistura com um excipiente, carreador ouadjuvante farmaceuticamente aceitável.