BRPI0617769A2 - molécula de ácido nucléico isolada, construção de dna, vetor, célula vegetal, planta, semente, métodos para expressar uma seqüência de nucleotìdeo em uma planta, em uma célula vegetal, método de expressão seletiva - Google Patents

Abstract

<B>MOLéCULA DE áCIDO NUCLEICO ISOLADA, CONSTRUçAO DE DNA, VETOR, CéLULA VEGETAL, PLANTA, SEMENTE, MéTODOS PARA EXPRESSAR UMA SEQUêNCIA DE NUCLEOTìDEO EM UMA PLANTA, EM UMA CéLULA VEGETAL, MéTODO DE EXPRESSAO SELETIVA <D>A presente invenção fornece composições e métodos para regular a expressão de sequências de nucleotídeo heterólogas em uma planta. As composições incluem uma nova sequência de nucleotídeo para um promotor tecido-preferencial de milho. é fornecido um método para expressar uma sequência de nucleotideo heteróloga em uma planta usando a sequência promotora aqui apresentada. O método compreende incorporar estavelmente no genoma de uma célula vegetal uma sequência de nucleotídeo operacionalmente ligada ao promotor raiz- preferencial da presente invenção e regenerar plantas estavelmente transformadas que expressam a sequência de nucleotideo.

Description

MOLÉCULA DE ÁCIDO NUCLÉICO ISOLADA, CONSTRUÇÃO DE DNA,VETOR, CÉLULA VEGETAL, PLANTA, SEMENTE, MÉTODOS PARAEXPRESSAR UMA SEQÜÊNCIA DE NUCLEOTÍDEO EM UMA PLANTA, EM UMACÉLULA VEGETAL, MÉTODO DE EXPRESSÃO SELETIVA

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção se refere ao campo da biologiamolecular de plantas, mais especificamente à regulação daexpressão gênica em plantas.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

Avanços recentes na engenharia genética de plantaspermitiram a criação de plantas apresentando característicasou traços melhorados, tais como resistência a doença,resistência a insetos, resistência a herbicidas, maiorestabilidade ou vida útil do produto final disponibilizadopara o consumidor obtido a partir de plantas e melhoria daqualidade nutricional das partes comestíveis da planta.Portanto, um ou mais genes desejados provenientes de umafonte diferente da planta, mas construídos para conferircaracterísticas ou qualidades diferentes ou melhoradas,podem ser incorporados ao genoma da planta. Um ou mais novosgenes podem, então, ser expressos na célula da planta paraapresentar o fenótipo desejado, tal como um novo traço ounova característica.

Os sinais regulatórios adequados devem estar presentese devem estar no local adequado no tocante ao gene, a fim dese obter a expressão do gene recém-inserido na célula daplanta. Estes sinais regulatórios podem incluir uma regiãopromotora, uma seqüência líder 5' não traduzida e umaseqüência 3' de terminação / poliadenilação de transcrição.

Um promotor é uma seqüência de DNA que dirige amaquinaria celular de uma planta para produzir RNA a partirde seqüência de codificação contígua a jusante (3') dopromotor. A região promotora influencia a taxa, o estágio dedesenvolvimento e o tipo de célula em que o transcrito deRNA do gene é produzido. A transcrição do RNA é processadapara produzir RNA mensageiro (mRNA) que serve como um moldepara a tradução da seqüência de RNA na seqüência deaminoácidos do polipeptídeo codificado. A seqüência líder5'não traduzida é uma região do mRNA a montante da região decodificação de proteína que pode representar um papel nainiciação e tradução do mRNA. 0 sinal 3' de terminação/poliadenilação de transcrição é uma região não traduzida ajusante da região de codificação da proteína, que funcionanas células vegetais para produzir a terminação datranscrição de RNA e a adição dos nucleotídeos poliadenilatoà extremidade 3' do RNA.

A expressão das seqüências heterólogas de DNA em umhospedeiro vegetal depende da presença de um promotoroperacionalmente ligado que seja funcional dentro dohospedeiro vegetal. 0 tipo de seqüência de promotorescolhido se baseia em quando e como, dentro do organismo,se deseja a expressão do DNA heterólogo. Quando se desejaexpressão em tecidos ou órgãos específicos, promotorespreferenciais para tecidos podem ser usados. Quando sedeseja expressão de gene em resposta a um estímulo,promotores induzíveis são o elemento regulador de escolha.Em contraste, quando se deseja expressão contínua em todasas células de uma planta, promotores constitutivos sãoutilizados.

Um promotor induzível é um promotor que é capaz deativar direta ou indiretamente a transcrição de uma ou maisseqüências de DNA ou de genes em resposta a um indutor. Naausência de um indutor as seqüências de DNA ou genes nãoserão transcritos. 0 indutor pode ser um agente químico, talcomo um metabólito, regulador de crescimento, herbicida oucomposto fenólico, ou um estresse fisiológico impostodiretamente à planta, tal como frio, calor, sal, toxinas. Nocaso de combater pragas de plantas, é também desejável terum promotor que seja induzido por patógenos de plantas,incluindo pragas de inseto em plantas, nematóides ou agentesde doença, tais como uma bactéria, vírus ou fungos. Ocontato com o patógeno induzirá a ativação da transcrição,de modo tal que será produzida uma proteína de combate aopatógeno em um momento em que ela será eficaz na defesa daplanta. Um promotor induzido por patógeno pode também serusado para detectar o contato com um patógeno, por exemplo,por expressão de um marcador detectável de modo que pode seravaliada a necessidade de aplicar pesticidas. Uma célulavegetal que contém um promotor induzível pode ser exposta aum indutor por aplicação externa do indutor à célula ou àplanta tal como por pulverização, aspersão, aquecimento oupor exposição ao patógeno operativo.

Um promotor constitutivo é um promotor que dirige aexpressão de um gene nas diversas partes de uma planta econtinuamente durante todo o desenvolvimento da planta.Exemplos de alguns promotores constitutivos que sãoamplamente usados para induzir a expressão de genesheterólogos em plantas transgênicas incluem o promotor degene nopalina sintase (NOS), proveniente de Agrobacteriumtumefaciens, (patente US 6.034.322), promotores de virusmosaico de couve flor (CaMv) 35S e 19S (patente US5.352.605), aqueles derivados de qualquer um dos diversosgenes de actina, que são conhecidos como sendo expressos namaioria dos tipos de células (patente US 6.002.068) e opromotor de ubiquitina (Christensen et al. (1989) Plant Mol.Biol. 12:619-632 e Christensen et al. (1992) 18:675-689) queé um produto gênico conhecido por acumular em muitos tiposde células.

Seqüências reguladoras adicionais a montante e/ou ajusante da seqüência do núcleo do promotor podem serincluídas em construções de expressão de vetores detransformação para produzir níveis variáveis de expressão deseqüências de nucleotídeos heterólogos em uma plantatransgênica. A alteração genética de plantas com o uso detécnicas de engenharia genética para produzir plantas comtraços úteis exige, portanto, a disponibilidade de umavariedade de promotores.

A fim de elevar ao máximo a aplicação comercial datecnologia de plantas transgênicas, é importante direcionara expressão do DNA introduzido de um modo específico para umlocal. É desejável produzir compostos defensivos tóxicos,por exemplo, em tecidos sujeitos ao ataque por patógenos,mas não em tecidos que devem ser colhidos e comidos porconsumidores. Direcionando ao sítio a síntese ou aarmazenagem de proteínas ou compostos desejáveis, as plantaspodem ser manipuladas como fábricas, ou sistemas deprodução, para uma variedade tremenda de compostos comutilidade comercial. Os promotores específicos de célulasproporcionam a capacidade de dirigir a síntese de compostos,no tempo e no espaço, para tecidos ou órgãos altamenteespecializados, tais como raízes, folhas, tecidosvasculares, embriões, sementes ou flores.

Alternativamente, poderia ser desejável inibir aexpressão de uma seqüência de DNA nativa dentro de tecidosde uma planta para obter um fenótipo desejado. Neste caso,tal inibição poderia ser obtida com a transformação daplanta para compreender um promotor com preferência portecido ligado operacionalmente a uma seqüência denucleotídeos antisense, de modo tal que a expressão daseqüência antisense produza uma transcrição de RNA queinterfira com a tradução do mRNA da seqüência de DNA nativa.

Como os padrões de expressão de um gene (ou genes)quimérico(s) introduzido(s) em uma planta são controladosusando promotores, há um interesse constante no isolamento ena identificação de promotores inéditos que sejam capazes decontrolar a expressão de um gene (ou genes) quimérico(quiméricos).

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

São propostos composições e métodos para a regulação daexpressão gênica em uma planta. As composições compreendemseqüências de nucleotídeos novas para um promotor que iniciaa transcrição de um modo tecido-especifico. Maisespecificamente uma região de iniciação de transcriçãoisolada de um gene de planta rico em prolina é proposta.Outras concretizações da invenção compreendem a seqüência denucleotideos apresentada em SEQ ID NO: 1, a seqüência denucleotideos apresentada na SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQID NO: 4, SEQ ID NO: 5, fragmentos das seqüências denucleotideos apresentadas nas SEQ ID Nos: 1-5 e a seqüênciade promotor de planta depositada como Depósito de PatenteNo. NRRL B-30879 na Coleção de Cultura do Serviço depesquisa Agrária, do inglês - Agricultural Research Service(ARS) Culture Collection, sediada na Unidade de Pesquisa emGenômica Microbiana e Bioprocessos do Centro Nacional dePesquisa para a Utilização da Agricultura, do inglêsMicrobial Genomics and Bioprocessing Research Unit doNational Center for Agricultural Utilization Research(NCAUR) nos termos e condições do Tratado de Budapest. Ascomposições das concretizações compreendem ainda seqüênciasde nucleotideos que têm pelo menos 70% de identidade deseqüências com as seqüências apresentadas nas SEQ ID NOs: 1-5, e que dirigem a expressão tecido-especifica de umaseqüência de nucleotideos operacionalmente ligada. Tambémsão incluídas seqüências de nucleotideos que se hibridizamem condições estringentes ou com a seqüência apresentada emSEQ ID NOs: 1, 3, 4, e 5 ou com a seqüência de promotor deplanta depositada em hospedeiros bacterianos como Depósitode Patente NO. NRRL B-30879, ou seus complementos.

As composições também incluem construções de DNA quecompreendem um promotor das concretizações ligadooperacionalmente a uma seqüência de nucleotídeo heterólogade interesse, em que o promotor é capaz de dirigir aexpressão da seqüência de nucleotídeo em uma célula deplanta e o promotor compreende as seqüências de nucleotídeodas concretizações. As concretizações propõem ainda vetoresde expressão e plantas ou células de planta tendoestavelmente incorporado aos seus genomas uma construção deDNA mencionado acima. Além disso, as composições incluemsementes transgênicas de tais plantas.

Métodos das concretizações compreendem um meio paraexpressar seletivamente uma seqüência de nucleotídeo em umaplanta, compreendendo a transformação de uma célula deplanta com uma construção de DNA e a regeneração de umaplanta transformada a partir da referida célula de planta, aconstrução de DNA compreendendo um promotor e uma seqüênciade nucleotídeo heteróloga ligada operacionalmente aopromotor, em que o promotor inicia a transcrição tecido-específica da seqüência de nucleotídeo em uma célula deplanta. Deste modo, as seqüências de promotor são úteis parao controle da expressão de seqüências de codificação ligadasoperacionalmente de um modo específico para tecido.

A jusante e sob a regulação de iniciação transcricionaldo promotor haverá uma seqüência de interesse que produziráa modificação do fenótipo da planta. Tal modificação incluia modulação da produção de produto endógeno, quanto aquantidade, distribuição relativa, ou semelhantes, ou aprodução de um produto de expressão exógena paraproporcionar uma função inédita ou produto inédito naplanta. Por exemplo, uma seqüência de nucleotídeo heterólogaque codifica um produto de gene que confere resistência apatógeno, herbicida, sal, frio, seca ou inseto incide noâmbito da invenção.

Em outro aspecto, os métodos descritos se referem a ummétodo para a modulação da expressão em tecidos selecionadosde uma planta transformada estavelmente compreendendo asetapas de (a) transformação de uma célula vegetal com umaconstrução de DNA compreendendo o promotor dasconcretizações ligado operacionalmente a pelo menos umaseqüência de nucleotídeo; (b) cultivo da célula de planta emcondições de crescimento da planta e (c) regeneração de umaplanta estavelmente transformada a partir da célula deplanta, em que a expressão da seqüência de nucleotídeoaltera o fenótipo da planta.

DESCRIÇÃO SUCINTA DOS DESENHOS

A Figura 1 é um gráfico mostrando os níveis deexpressão de duas construções compreendendo o promotorSilk419, uma com o íntron ADHI de milho e uma sem ele,juntamente com um vetor de controle UBI:GUS, em plantastransformadas estáveis TO no estágio VlO. Os dados deexpressão foram obtidos usando protocolos de ensaio MUG.

A Figura 2 é um gráfico mostrando os níveis deexpressão de duas construções que compreendem o promotorSilk419, uma com o íntron ADHI de milho e oura sem ele, emplantas transformadas estáveis TO no estágio RI. Os dados deexpressão foram obtidos usando protocolos de ensaio MUG.Figura 3 é um gráfico mostrando os níveis de expressãode uma construção que compreende o promotor Silk419 com ointron ADHI do milho em plantas transformadas estáveis Tl noestágio VlO. Os dados de expressão foram obtidos usandoprotocolos de ensaios MUG.

A Figura 4 é um gráfico mostrando os níveis médios deexpressão de uma construção compreendendo o promotor Silk419com o intron ADHI do milho em plantas transformadas estáveisT1 no estágio RI. Os dados de expressão foram obtidos usandoprotocolos de ensaios MUG.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

As composições das concretizações compreendemseqüências de nucleotídeos inéditas para promotores deplanta, especialmente um promotor tecido-preferencial de umgene do milho, mais especificamente, o promotor "419" domilho. Em particular, as concretizações propõem moléculas deácido nucléico isoladas compreendendo a seqüência denucleotídeos apresentada nas SEQ ID NOs: 1-5 e a seqüênciade promotor de planta depositada em hospedeiros bacterianoscomo Depósito de Patente No. NRRL B-30879 em 22 de setembrode 2005 e seus fragmentos, variantes e complementos.

Um depósito do promotor "419" do milho foi feito em 22de setembro de 2005 no Agricultural Research Service (ARS)Culture Collection, localizado na Microbial Genomics andBioprocessing Research Unit do National Center forAgricultural Utilization Research (NCAUR), nos termos doTratado de Budapeste. 0 depósito recebeu o seguinte númerode acesso: NRRL B-30879. 0 endereço de NCAUR é 1815 N.University Street, Peoria, IL, 61604. Este depósito serámantido nos termos do Tratado de Budapeste sobre oReconhecimento Internacional do Depósito de Microorganismospara os fins de Procedimentos de Patentes. Este depósito foifeito simplesmente como uma conveniência para os versados natécnica e não é uma admissão de que um depósito é exigidonos termos de 35 U.S.C.§ 112. 0 depósito estará disponívelirrevogavelmente e sem restrição ou condição para o públicoapós a concessão de uma patente. No entanto, deve ficarsubentendido que a disponibilidade de um depósito nãoconstitui uma licença para a prática da invenção em questãoem derrogação de direitos de patentes concedidos por açãogovernamental.

As seqüências de promotor das concretizações são úteispara a expressão de seqüências de nucleotídeos ligadasoperacionalmente de um modo tecido-preferencial. Maisespecificamente, o promotor das concretizações, quando usadoem conjunto com o íntron ADHI do milho e incluindo a 5' UTRnativo, dirige a expressão a níveis altos em diferentestecidos da planta, mas não constitutivamente. 0 padrão deexpressão é de interesse, pois ele inclui tecidos que sãoafetados pela podridão do caule e espiga do milho. 0promotor dirige a expressão no comprimento do caule, nasraízes, na epiderme interna das bainhas da folha, nas glumasde inflorescência, nas inflorescências femininas, e nostecidos vasculares do sabugo imediatamente abaixo dos pontosde ligação aos floretes. O promotor é também ativo nopericarpo, mas somente naquela porção do pericarpolocalizada na base do grão na semente madura. O promotor nãoé ativo no pólen e é somente fracamente ativo nas lâminas dafolha. As seqüências das concretizações também encontram usona construção de vetores de expressão para transformaçãosubseqüente em plantas de interesse, como marcadoresmoleculares, e semelhantes. As seqüências de promotor 419das concretizações dirigem a expressão de seqüências denucleotideos ligadas operacionalmente de um modo tecido-preferencial. Portanto, as seqüências de promotor 419encontram uso na expressão tecido-preferencial de umaseqüência de nucleotideos ligada operacionalmente deinteresse. 0 método especifico usado para obter o promotor419 das concretizações da presente invenção é descrito noExemplo 5 que aparece na seção dos Exemplos deste pedido.

As concretizações abrangem composições de ácidonucléico isolado ou substancialmente purificado. Umamolécula de ácido nucléico "isolada" ou "purificada", ouporção biologicamente ativa sua, é substancialmente isentade outro material celular, ou de meio de cultura quandoproduzida por técnicas recombinantes, ou substancialmenteisenta de precursores químicos ou de outras substânciasquímicas quando sintetizada quimicamente. Um ácido nucléico"isolado" é essencialmente isento de seqüências (depreferência seqüências codificadoras de proteína) quenaturalmente flanqueiam o ácido nucléico (isto é, seqüênciaslocalizadas nas extremidades 3' e 5' do ácido nucléico) noDNA genômico do organismo do qual é derivado o ácidonucléico. Em diversas concretizações, por exemplo, amolécula isolada de ácido nucléico pode conter menos deaproximadamente 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0,5 kb, ou 0,1kb de seqüências de nucleotideos que naturalmente flanqueiama molécula de ácido nucléico no DNA genômico da célula daqual é derivado o ácido nucléico.

O promotor 419 dirige a expressão endógena de um genede milho que codifica uma proteína rica em prolina (SEQ IDNO: 6) que tem alguma semelhança a uma proteína putativalipase/hidrolase de motivo GDSL proveniente de arroz(AK100754). Os genes ricos em prolina são conhecidos natécnica como tendo uma ampla variedade de funções emplantas. As lipases da classe GDSL são conhecidas comoexistindo em plantas (veja Helliwell et al. (2001) PlantCell 13(9):2115-2126; Cummins & Edwards (2004) Plant Journal39: 894-904), mas são mais bem conhecidas e caracterizadasem bactérias, nas quais elas geralmente existem com enzimassecretadas ou ligadas a membrana e usam moléculasespecíficas diferentes como substratos. Veja, por exemplo,Flieger et al. (2002) Infect. Immun. 70(11): 6094-6106; Farnet al. (2001) J. Bacteriol. 183 (22):6717-6720; e Carinato etal. (1998) J. Bacteriol. 180(14): 3517-3521.

As composições das concretizações incluem moléculas deácido nucléico isoladas compreendendo as seqüências denucleotídeo promotor apresentadas em SEQ ID NOs: 1, 3, 4 e5. 0 termo "promotor" se destina a significar uma regiãoreguladora de DNA geralmente compreendendo um TATA-box capazde dirigir a RNA polimerase II para iniciar a síntese de RNAno sitio de iniciação de transcrição apropriado para umaseqüência de codificação especifica. Um promotor pode, alémdisso, compreender outras seqüências de reconhecimentogeralmente posicionadas a montante ou 5' do TATA-box,denominadas elementos promotores a montante, que influenciama velocidade de iniciação de transcrição. É fato reconhecidoque, tendo-se identificado as seqüências de nucleotideospara as regiões promotoras descritas no presente documento,a capacidade de isolar e identificar outros elementosregulatórios na região 5' não traduzida a montante dasregiões promotoras especificas identificadas no presentedocumento incide no estado da técnica. Portanto, as regiõespromotoras descritas no presente documento podem, porexemplo, ainda compreender elementos regulatórios a montantetais como aqueles responsáveis pela expressão tecidual etemporal da seqüência de codificação, acentuadores esemelhantes. Veja especialmente patente australiana NO. AU-A-77751/94 e patentes US 5.466.785 e 5.635.618. Do mesmomodo os elementos do promotor que permitem a expressão nostecidos desejados podem ser identificados, isolados e usadoscom outros promotores de núcleo para conferir expressão compreferência por tecido. Neste aspecto das concretizações, um"núcleo do promotor" se destina a significar um promotor semelementos promotores.

Dentro do contexto desta descrição, o termo "elementoregulador" também se refere a uma seqüência de DNA,geralmente, mas nem sempre, a montante (5' ) da seqüência decodificação de um gene estrutural que inclui seqüências quecontrolam a expressão da região de codificaçãoproporcionando o reconhecimento de RNA polimerase e/ououtros fatores necessários para que a transcrição sejainiciada em um sitio especifico. Um exemplo de um elementoregulador que provê o reconhecimento de RNA polimerase ououtros fatores de transcrição para assegurar a iniciação emum sitio especifico é um elemento promotor. Um elementopromotor compreende um elemento núcleo do promotor,responsável pela iniciação da transcrição, assim como outroselementos regulatórios (conforme será discutido em outrolocal neste pedido) que modificam a expressão genética. Devetambém ficar subentendido que seqüências de nucleotideoslocalizadas dentro de introns, ou a 3' da seqüência deregião de codificação, podem também contribuir para aregulação da expressão de uma região de codificação deinteresse. Exemplos de introns adequados incluem, semlimitação, o intron IVS6 do milho ou o intron da actina domilho. Um elemento regulador pode também incluir aqueleselementos que estão localizados a jusante (3') do sitio deiniciação de transcrição, ou no interior de regiõestranscritas, ou ambos. Dentro do contexto desta descrição,um elemento regulador pós-transcricional pode incluirelementos que são ativos depois da iniciação da transcrição,por exemplo, acentuadores de tradução e de transcrição,repressores de tradução e de transcrição e determinantes deestabilidade de mRNA.

Os elementos regulatórios, ou seus fragmentos, dasconcretizações podem ser associados operacionalmente comelementos regulatórios heterólogos ou promotores a fim demodular a atividade do elemento regulador heterólogo. Talmodulação inclui a intensificação ou a repressão daatividade de transcrição do elemento regulador heterólogo, amodulação dos eventos pós-transcricionais ou tanto aintensificação ou a repressão da atividade de transcrição doelemento regulador heterólogo como a modulação de eventospós-transcricionais. Um ou mais elementos regulatórios, porexemplo, ou seus fragmentos, das concretizações podem serassociados operacionalmente com promotores constitutivos,induziveis ou tecido-preferenciais ou seus fragmentos, paramodular a atividade de tais promotores no interior dostecidos desejados dentro de células de planta.

As seqüências promotoras tecido-preferenciais de milhodas concretizações, quando montadas no interior de umaconstrução de DNA de tal modo que o promotor esteja ligadooperacionalmente a uma seqüência de nucleotideos deinteresse, permitem a expressão da seqüência de nucleotideosnas células de uma planta transformada estavelmente com esteconstruto de DNA. O termo "operacionalmente ligado" sedestina a significar que a transcrição ou tradução daseqüência de nucleotideo heteróloga se encontra sob ainfluência da seqüência de promotor. "Operacionalmenteligado" também se destina a significar a ligação de duasseqüências de nucleotideos de modo tal que a seqüência decodificação de cada fragmento de DNA permaneça dentro damatriz de leitura adequada. Deste modo, as seqüências denucleotideos para os promotores das concretizações sãoprovidas em construções de DNA juntamente com a seqüência denucleotideo de interesse, tipicamente uma seqüência denucleotideo heteróloga para a expressão na planta deinteresse. O termo "seqüência de nucleotideo heteróloga" sedestina a significar uma seqüência que não está naturalmenteligada operacionalmente com a seqüência de promotor. Emboraesta seqüência de nucleotideo seja heteróloga em relação àseqüência de promotor, ela pode ser homóloga ou nativa; ouheteróloga, ou estranha ao hospedeiro na planta.

É fato reconhecido que os promotores das concretizaçõespodem ser usados com suas seqüências de codificação nativaspara aumentar ou reduzir a expressão, resultando assim emuma alteração no fenótipo da planta transformada.

As modificações das seqüências promotoras isoladas dasconcretizações podem proporcionar uma faixa de expressão daseqüência de nucleotideos heteróloga. Assim, elas podem sermodificadas para se tornarem promotores fracos ou promotoresfortes. Geralmente um "promotor fraco" se destina asignificar um promotor que dirige a expressão de umaseqüência de codificação a um nivel baixo. Um "nível baixo"de expressão se destina a significar a expressão a níveis deaproximadamente 1/10.000 transcritos a aproximadamente1/10.000 transcritos a aproximadamente 1/500.000transcritos. Por outro lado, um promotor forte dirige aexpressão de uma seqüência de codificação a um nível alto,ou a aproximadamente 1/10 transcritos a aproximadamente1/100 transcritos a aproximadamente 1/1.000 transcritos.

Os fragmentos e variantes das seqüências de promotordescritas também incidem no âmbito da invenção. Um"fragmento" significa uma porção da seqüência de promotor.Os fragmentos de uma seqüência de promotor podem conservaratividade biológica e, portanto abranger fragmentos capazesde dirigir a expressão preferida pelo tecido de umaseqüência de nucleotideos operacionalmente ligada. Portanto,menos do que a seqüência de promotor inteira, por exemplo,descrita no presente documento pode ser utilizada paradirigir a expressão de uma seqüência de nucleotideosoperacionalmente ligada de interesse, tal como uma seqüênciade nucleotideos que codifica uma proteína heteróloga. Adeterminação de que tais fragmentos reduzem ou não os níveisde expressão ou alteram ou não a natureza da expressão, istoé, a expressão constitutiva ou induzível, incide no estadoda técnica. Alternativamente, os fragmentos de uma seqüênciade nucleotideos promotora que são úteis como sondas dehibridização, tais como as descritas abaixo, geralmente nãoconservam esta atividade reguladora. Portanto, os fragmentosde uma seqüência de nucleotideos podem variar de pelo menosaproximadamente 20 nucleotideos aproximadamente 50nucleotideos, aproximadamente 100 nucleotideos e até asseqüências de nucleotideos de comprimento total descritas nopresente documento.

Assim, um fragmento da seqüência de nucleotideospromotora 419 do milho pode codificar uma porçãobiologicamente ativa do promotor 419 do milho ou podeconsistir em um fragmento que pode ser usado como uma sondade hibridização ou como um "primer" (oligonucleotídeoiniciador) de PCR usando métodos descritos abaixo. Umaporção biologicamente ativa do promotor 419 do milho podeser preparada isolando uma porção de uma das seqüências denucleotideos promotora 419 do milho e avaliando a atividadedessa porção do promotor 419 do milho. As moléculas de ácidonucléico que são fragmentos de uma seqüência de nucleotideospromotora compreendem pelo menos 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45,50, 75, 100, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 500, 550, 600,650, 700, 800, 900, 1000 ou até o número de nucleotídeospresentes na seqüência de nucleotídeos promotora decomprimento total descrita no presente documento, tal como1101 nucleotídeos para SEQ ID NO:l. Três fragmentosespecíficos do promotor 419, por exemplo, que conservam aatividade promotora são descritos no pedido como SEQ ID NOs:4, 5 e 6. Os fragmentos truncados do promotor têm 602 pb(SEQ ID NO: 4), 350 pb (SEQ ID NO: 5) e 129 pb (SEQ ID NO:6) de comprimento.

Os nucleotídeos de tais fragmentos geralmentecompreenderão a seqüência de reconhecimento TATA daseqüência de promotor específica. Tais fragmentos podem serobtidos pelo uso de enzimas de restrição para clivar aseqüência de nucleotídeos promotora que ocorre naturalmentedescrita no presente documento; sintetizando uma seqüênciade nucleotídeos a partir da seqüência que ocorrenaturalmente da seqüência de DNA promotor; ou podem serobtidos com o uso de tecnologia PCR. Veja, maisespecificamente, Mullis et al. (1987) Methods Enzymol.155:335-350, e Erlich, ed. (1989) PCR Technology (StocktonPress, Nova York). Variantes destes fragmentos de promotor,tais como as que resultam de mutagênese sítio-direcionada ede um procedimento tal como o "rearranjo" de DNA, são tambémabrangidas pelas composições.

Um "análogo" dos elementos regulatórios dasconcretizações inclui qualquer substituição, deleção ouadição à seqüência de um elemento regulador desde que oanálogo conserve pelo menos uma propriedade reguladoraassociada com a atividade do elemento regulador dasconcretizações. Tais propriedades incluem o direcionamentode preferência por órgão ou tecido, ou uma combinação delas,ou atividade temporal, ou atividade de desenvolvimento, ouuma combinação delas".

O termo "variantes" se destina a significar seqüênciasque têm uma similaridade substancial com uma seqüência depromotor descrita no presente documento. As seqüências denucleotideos, variantes que ocorrem naturalmente tais comoestas podem ser identificadas com o uso de técnicas debiologia molecular conhecidas, tais como, por exemplo, comreação em cadeia de polimerase (PCR) e técnicas dehibridização conforme delineado abaixo. As seqüências denucleotideos variantes também incluem seqüências denucleotideos derivadas sinteticamente tais como as geradasusando-se, por exemplo, mutagênese sitio-direcionada.Geralmente, as variantes de uma seqüência de nucleotideosespecifica terão pelo menos 40%, 50%, 60%, 65%, 70%,geralmente pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%,94%, to 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade deseqüência com aquela seqüência de nucleotideos especificaconforme determinado por programas de alinhamento deseqüências descritos em outro ponto do presente documentousando-se parâmetros default. As variantes biologicamenteativas também incidem no âmbito da presente invenção. Asvariantes biologicamente ativas incluem, por exemplo, aseqüência de promotor nativa tendo uma ou maissubstituições, deleções ou inserções de nucleotideos. Aatividade de promotor pode ser medida usando-se técnicastais como análise Northern blot, medições de atividaderepórter tomadas de fusões transcricionais e semelhantes.Veja, por exemplo, Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning:A Laboratory Manual (2a. ed., Cold Spring Harbor LaboratoryPress, Cold Spring Harbor, Nova York), doravante "Sambrook",incorporado ao presente documento a titulo de referência.Alternativamente, os níveis de um gene repórter tal como aproteína fluorescente verde (GFP) ou semelhante produzidosob o controle de um fragmento ou variante de promotor podemser medidos. Veja, por exemplo, patente US 6.072.050,incorporada ao presente documento a título de referência.

Os métodos para a mutagênese e alterações de seqüênciasde nucleotídeos são conhecidos na técnica. Veja, porexemplo, Kunkel (1985) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 82:488-492; Kunkel et al. (1987) Methods in Enzymol. 154:367-382;patente U.S. No. 4.873.192; Walker e Gaastra, eds. (1983)Techniques in Molecular Biology (MacMillan PublishingCompany, Nova York) e as referências citadas nelas.

As variantes de seqüências de nucleotídeo promotortambém abrangem seqüências derivadas de um procedimentomutagênico e recombinogênico tal como rearranjo de DNA. Comtal procedimento, uma ou mais seqüências de promotordiferentes podem ser manipuladas para criar um novo promotor que possui as propriedades desejadas. Deste modo são geradasbibliotecas de polinucleotídeos recombinantes de umapopulação de polinucleotídeos de seqüências relacionadascompreendendo regiões de seqüência que têm uma identidade deseqüências substancial e podem ser recombinadas de modohomólogo in vitro ou in vivo. As estratégias para talrearranjo de DNA são conhecidas na técnica. Veja, porexemplo, Stemmer (1994) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 91:10747-10751; Stemmer (1994) Nature 370:389-391; Crameri et al.(1997) Nature Biotech. 15:436-438; Moore et al. (1997) J.Mol. Biol. 272:336-347; Zhang et al. (1997) Proc. Natl.Acad. Sei. USA 94:4504-4509; Crameri et al. (1998) Nature391:288-291; e patentes US 5.605.793 e 5.837.458.

As seqüências de nucleotideos das concretizações podemser usadas para isolar as seqüências correspondentesprovenientes de outros organismos, especialmente de outrasplantas, de outras monocotiledôneas, por exemplo. Destemodo, podem ser usados métodos tais com PCR, hibridização esemelhantes para se identificar tais seqüências baseadas emsua homologia de seqüências à seqüência apresentada nopresente documento. Incidem também no âmbito da presenteinvenção as seqüências isoladas com base na sua identidadede seqüência à seqüência integral de promotor 419 do milhoapresentada no presente documento ou a seus fragmentos. Asregiões de promotor das concretizações podem ser isoladas dequalquer planta, incluindo, sem limitação, milho (Zea mays),Brassica (Brassica napus, Brassica rapa ssp.) , alfafa(Medicago sativa) , arroz (Oryza sativa) , centeio (Secalecereale), sorgo (Sorghum bicolor, Sorghum vulgare) , girassol(Helianthus annuus), trigo (Triticum aestivum) , soja(Glyeine max), tabaco (Nicotiana tabaeum), batata inglesa(Solanum tuberosum), amendoim (Araehis hypogaea), algodão(Gossypium hirsutum), batata doce (Ipomoea batatus), aipim(Manihot esculenta), café (Cofea spp.), coco (Cocosnucifera), abacaxi (Ananas comosus), árvores citricas(Citrus spp.), cacau (Theobroma cacao), chá (Camelliasinensis), banana (Musa spp.), abacate (Persea americana),figo (Ficus casica), goiaba (Psidium guajava), manga(Mangifera indica), azeitona (Olea europaea), aveia, cevada,vegetais, plantas ornamentais, e coniferas. As plantasincluem milho, soja, girassol, cártamo, Brassica ou canola,trigo, cevada, centeio, alfafa, e sorgo.

Em uma abordagem de PCR, podem ser projetados primersde oligonucleotideos para uso em reações de PCR paraamplificar as seqüências correspondentes de DNA a partir decDNA ou de DNA genômico extraído de qualquer planta deinteresse. Métodos para projeto de primers de PCR e para aclonagem por PCR são geralmente conhecidos na técnica e sãodescritos em Sambrook, acima. Veja também Innis et al., eds.(1990) PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications(Academic Press, Nova York); Innis e Gelfand, eds. (1995)PCR Strategies (Academic Press, Nova York); e Innis eGelfand, eds. (1999) PCR Methods Manual (Academic Press,Nova York). Métodos conhecidos de PCR incluem, semlimitação, métodos usando-se primers pareados, primersaninhados, primers específicos individuais, primersdegenerados, primers específicos de gene, primersespecíficos de vetor, primers parcialmente malpareados esemelhantes.

Em técnicas de hibridização, toda a seqüência denucleotídeos conhecida ou parte dela é usada como uma sondaque hibridiza seletivamente a outras seqüências denucleotídeos correspondentes presentes em uma população defragmentos de DNA genômico clonados ou fragmentos de cDNA(isto é, bibliotecas genômicas ou de cDNA) de um organismoescolhido. As sondas de hibridização podem consistir emfragmentos de DNA genômico, fragmentos de cDNA, fragmentosde RNA ou outros oligonucleotideos, e podem ser marcadas comum grupo detectável tal como 32P ou qualquer outro marcadordetectável. Portanto, sondas para hibridização podem, porexemplo, ser produzidas por marcação de oligonucleotideossintéticos baseados nas seqüências de promotor 419 do milhodas concretizações. Os métodos para a preparação de sondaspara a hibridização e para a construção de cDNA e debibliotecas genômicas são geralmente conhecidos na técnica esão descritos em Sambrook, acima.

A hibridização de tais seqüências pode ser conduzida emcondições estringentes. "Condições estringentes" ou"condições de hibridização estringentes" consistem emcondições pretendidas nas quais uma sonda se hibridizará àsua seqüência alvo até um ponto detectavelmente maior do quea outras seqüências (pelo menos duas vezes em relação aofundo, por exemplo). As condições estringentes sãodependentes de seqüência e serão diferentes emcircunstâncias diferentes. Controlando-se a estringência dascondições de hibridização e/ou de lavagem, podem seridentificadas seqüências alvo que tem 100% decomplementaridade à sonda (sondagem homóloga) .

Alternativamente, as condições de estringência podem serajustadas para permitir um mau alinhamento nas seqüências demodo que sejam detectados graus inferiores de similaridade(sondagem heteróloga). Geralmente, uma sonda tem menos deaproximadamente 1000 nucleotideos de comprimento,freqüentemente menos de 500 nucleotideos de comprimento.

Tipicamente, as condições estringentes serão aquelasnas quais a concentração de sal é inferior a aproximadamente1,5 de ion Na, tipicamente de aproximadamente 0,01 a 1,0M deion Na de concentração (ou de outros sais) a um pH de 7,0 a8,3 e a temperatura é de pelo menos aproximadamente 30°Cpara sondas curtas (10 a 50 nucleotideos, por exemplo) e depelo menos aproximadamente 60°C para sondas longas (acima de50 nucleotideos, por exemplo). As condições estringentespodem também ser obtidas com a adição de agentesdesestabilizantes tais como formamida. As condições de baixaestringência exemplares incluem a hibridização com umasolução tampão de formamida a 30 a 35%, NaCl a 1M, SDS(dodecil sulfato de sódio) a 1% a 37°C, e uma lavagem em 1 Xa 2 X SSC (20 X SSC = NaCl a 3,0M/citrato trissódico a 0,3M)a uma temperatura de 50 a 55°C. Condições de estringênciamoderada exemplar incluem hibridização em formamida a 40 a45%, NaCl a 1,0M, SDS a 1% a 37°C, e uma lavagem em 0,5 X a1 X de SSC a uma temperatura de 55 a 60°C. As condições dealta estringência exemplares incluem a hibridização emformamida a 50%, NaCl a 1M, SDS a 1% a 370C e uma lavagem em0,1 x SSC a uma temperatura de 60 a 65°C durante pelo menos30 minutos. A duração de hibridização é geralmente inferiora aproximadamente 24 horas, geralmente de aproximadamente 4a aproximadamente 12 horas.

A especificidade é tipicamente a função de lavagenspós-hibridização, sendo os fatores críticos a intensidadeiônica e a temperatura da solução final de lavagem. Parahíbridos de DNA-DNA, o ponto de fusão térmico (Tm) pode seraproximado da equação de Meinkoth e Wahl (1984) Anal.Biochem. 138:267-284: Tm = 81,5°C + 16,6 (log M) + 0,41 (%de GC) - 0,61 (% de form) - 500/L; em que M é a molaridadedos cátions monovalentes,% de GC é porcentagem denucleotídeos de guanosina e citosina no DNA,% de form é aporcentagem de formamida na solução de hibridização e L é ocomprimento do híbrido nos pares de bases. A Tm é atemperatura (em condições de resistência iônica e pHdefinidos) à qual 50% de uma seqüência alvo complementar sehibridiza a uma sonda perfeitamente pareada. Tm é reduzidade aproximadamente 1°C para cada 1% de malpareamentos;portanto a Tm, as condições de hibridização e/ou condiçõesde lavagem podem ser ajustadas para se hibridizar aseqüências da identidade desejada. Se as seqüências com >90% de identidade são procuradas, por exemplo, a Tm pode serreduzida de 10°C. Geralmente as condições estringentes sãoselecionadas para se encontrarem aproximadamente 5°C abaixoda Tm para a seqüência específica e o seu comprimento a umaintensidade iônica e pH definidos. NO entanto, condiçõesgravemente estringentes podem utilizar uma hibridização e/oulavagem a 1, 2, 3, e 4 0C abaixo da Tm; condições deestringência moderada podem utilizar uma hibridização e/oulavagem a 6, 7, 8 9 ou 10°C abaixo da Tm; condições de baixaestringência podem utilizar uma hibridização e/ou lavagem a11, 12, 13, 14 15 ou 20°C abaixo da Tm. Usando-se a equação,composições de hibridização e de lavagem e Tm desejada, osversados na técnica compreenderão que as variações naestringência das soluções de hibridização e/ou lavagem sãoinerentemente descritas. Se o grau desejado de malpareamentoresultar em uma Tm de menos de 45°C (solução aquosa) ou 32°C(solução em formamida), é preferível se aumentar aconcentração de SSC de modo que possa ser usada umatemperatura mais elevada. Um guia extenso para ahibridização de ácidos nucléicos se encontra em Tijssen(1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and MolecularBiology-Hybridization with Nucleic Acid Probes, Parte I,Capítulo 2 (Elsevier, Nova York) ; e Ausubel et al. , eds.(1995) Current Protocols in Molecular Biology, Capítulo 2(Greene Publishing and Wiley-Interscience, Nova York),doravante "Ausubel". Veja, também, Sambrook acima.

Assim, incidem no âmbito da presente invenção asseqüências isoladas que têm atividade de promotor tecido-preferencial e que se hibridizam em condições estringentesàs seqüências promotoras 419 do milho descritas no presentedocumento, ou com seus fragmentos.

Em geral, as seqüências que têm atividade promotora eque se hibridizam às seqüências de promotor descritas nopresente serão pelo menos 40% a 50% homólogas,aproximadamente 60% a 70% homólogas e até mesmoaproximadamente 80%, 85%, 90%, 95% a 98% homólogas ou maisàs seqüências descritas. Isto é, a similaridade deseqüências das seqüências pode variar, compartilhando pelomenos aproximadamente 40% a 50%, aproximadamente 60% a 70%,e até mesmo 80%, 85%, 90%, 95% a 98% de similaridade deseqüências.

Os termos abaixo são usados para descrever as relaçõesentre seqüências entre dois ou mais ácidos nucléicos oupolinucleotideos: (a) "seqüência de referência", (b) "janelade comparação", (c) "identidade de seqüências", (d)"porcentagem de identidade de seqüências" e (e) "identidadesubstancial".

(a) Conforme empregado no presente, "seqüência dereferência" é uma seqüência definida usada como uma basepara a comparação de seqüências. Uma seqüência de referênciapode ser um subconjunto de uma seqüência especificada ou aseqüência integral; como um segmento de um cDNA ou seqüênciade gene de comprimento total, por exemplo, ou o cDNA ouseqüência de gene completas.

(b) Conforme empregado no presente, "janela decomparação" faz referência a um segmento contíguo eespecificado de uma seqüência de polinucleotídeo em que aseqüência de polinucleotídeo na janela de comparação podecompreender adições ou deleções (isto é, falhas) emcomparação com a seqüência de referência (que não compreendenem adições nem deleções) para um alinhamento ótimo das duasseqüências. Geralmente a janela de comparação tem pelo menos20 nucleotídeos contíguos de comprimento e opcionalmentepode ter 30, 40, 50, 100 ou mais. Os versados na técnicaobservarão que para se evitar um alto grau de similaridade auma seqüência de referência devido à inclusão de falhas naseqüência de polinucleotídeo uma penalidade para a falha étipicamente introduzida e é subtraída do número depareamentos.

Os métodos de alinhamento de seqüências para comparaçãosão bem conhecidos na técnica. Portanto, a determinação deporcentagem de identidade de seqüências entre quaisquer duasseqüências pode ser obtida usando-se um algoritmomatemático. Exemplos não limitantes de tais algoritmosmatemáticos são o algoritmo de Myers e Miller (1988) CABIOS4:11-17; o algoritmo de homologia local de Smith et al.

(1981) Adv. Appl. Math. 2:482; o algoritmo de alinhamentopor homologia de Needleman e Wunsch (1970) J. Mol. Biol.48:443-453; o método de busca por similaridade de Pearson eLipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sei. 85:2444-2448; oalgoritmo de Karlin e Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sei.USA 87:2264-2268, modificado como em Karlin e Altschul(1993) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90:5873-5877.

As implementações por computador destes algoritmosmatemáticos podem ser utilizadas para a comparação deseqüências para se determinar a identidade de seqüências.Tais implementações incluem, sem limitação: CLUSTAL noprograma PC/Gene (disponível de Intelligenetics, MountainView, Califórnia); o programa ALIGN (Versão 2.0); o programaALIGN PLUS (Versão 3.0, copyright 1997): e GAP, BESTFIT,BLAST, FASTA, e TFASTA no Wisconsin Genetics SoftwarePackage de Genetics Computer Group, Versão 10 (disponível deAccelrys, 9685 Scranton Road, San Diego, CA, 92121, USA). Amatriz de contagem usada na Versão 10 do Wisconsin GeneticsSoftware Package é BLOSUM62 (veja Henikoff e Henikoff (1989)Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89:10915).

Os alinhamentos que usam estes programas podem serconduzidos usando-se os parâmetros default. 0 programaCLUSTAL é descrito por Higgins et al. (1988) Gene 73:237-244(1988); Higgins et al. (1989) CABIOS 5:151-153; Corpet etal. (1988) Nucleic Acids Res. 16:10881-90; Huang et al.(1992) CABIOS 8:155-65; e Pearson et al. (1994) Meth. Mol.Biol. 24:307-331. Os programas ALIGN e ALIGN PLUS sãobaseados no algoritmo de Myers e Miller (1988) acima. Umatabela de resíduos de peso PAM120, uma penalidade paraprolongamento de falha de 12 e uma penalidade para a falhade 4 pode ser usada com o programa ALIGN quando se comparamseqüências de aminoácidos. Os programas BLAST de Altschul etal.. (1990) J. MOl. Biol. 215:403 são baseados no algoritmode Karlin e Altschul (1990) acima. As buscas de nucleotídeos por BLAST podem ser conduzidas com o programa BALSTN,contagem = 100, comprimento de palavra = 12, para obterseqüências de nucleotídeos homólogas a uma seqüência denucleotídeos que codifica uma proteína das concretizações.As buscas de proteínas por BLAST podem ser conduzidas com o programa BALSTX, contagem = 50, comprimento de palavra = 3,para se obter seqüências de aminoácidos homólogas à proteínaou polipeptídeo das concretizações. Para se obter osalinhamentos com falhas para fins de comparação pode serutilizado Gapped BLAST (em BLAST 2.0) conforme descrito emAltschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389.Alternativamente, PSI-BLAST (em BLAST 2.0) pode ser usadopara conduzir a busca repetida que detecta relaçõesdistantes entre moléculas. Veja Altschul et al. (1997)acima. Quando se utiliza BLAST, Gapped BLAST, PSI-BLAST os parâmetros default dos programas respectivos (BLASTN, porexemplo, para seqüências de nucleotídeos, BALSTX paraproteínas) pode ser usado. Veja o sítio na Internet para oNational Center for Biotechnology Information.A não ser que seja declarado em contrário, os valoresde identidade/similaridade de seqüências fornecidos nopresente documento se referem ao valor obtido usando-se oprograma GAP com parâmetros default, ou qualquer programaequivalente. "Programa equivalente" se destina a descreverqualquer programa de comparação de seqüências que, paraquaisquer duas seqüências em questão, gera um alinhamentoque tem pareamentos de nucleotideos ou de resíduos deaminoácidos idênticos e uma identidade de seqüências deporcentagem idêntica quando comparado com o alinhamentocorrespondente gerado por GAP.

O programa GAP usa o algoritmo de Needleman e Wunsch(1980) acima, para encontrar o alinhamento de duasseqüências completas que maximiza o número de pareamentos eminimiza o número de falhas. GAP considera todos osalinhamentos e posições de falhas possíveis e cria oalinhamento com o número máximo de bases pareadas e com umnúmero mínimo de falhas. Ele permite que se crie umapenalidade para a criação de falha e uma penalidade para oprolongamento da falha em unidades de bases pareadas. GAPdeve fazer um ganho do número de pareamentos por penalidadepara a criação de falha para cada falha que ele insere. Sefor selecionada uma penalidade para o prolongamento de falhaacima de zero, GAP deve, além disso, fazer um ganho paracada falha inserida do comprimento da falha vezes apenalidade para o prolongamento de falha. Os valores depenalidade para a criação de falha default e os valores depenalidade para o prolongamento de falha na Versão 10 doWisconsin Genetics Software Package para seqüências deproteína são 8 e 2 respectivamente. Para seqüências denucleotídeos a penalidade para a criação de falha default é50 ao passo que a penalidade para o prolongamento de falhadefault é 3. As penalidades para a criação de falha e para oprolongamento de falha podem ser expressas como um númerointeiro selecionado do grupo de números inteiros consistindoem 0 a 200. Assim, as penalidades para a criação de falha epara o prolongamento de falha podem ser 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6,7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65 oumais.

(c) Conforme empregado no presente, "identidade deseqüências" ou "identidade" dentro do contexto de duasseqüências de ácidos nucléicos ou de polipeptídeos fazreferência aos resíduos nas duas seqüências que são iguaisquando alinhadas para uma correspondência máxima sobre umajanela de comparação especificada. Quando a porcentagem deidentidade de seqüências é usada com referência a proteínas,é reconhecido o fato de que as posições de resíduos que nãosão idênticas freqüentemente diferem por substituiçõesconservadas de aminoácidos, em que os resíduos deaminoácidos são usados em vez de outros resíduos deaminoácidos com propriedades químicas semelhantes (carga ouhidrofobicidade, por exemplo) e não alteram, portanto, aspropriedades funcionais da molécula. Quando as seqüênciasdiferem em substituições conservadas, a porcentagem deidentidade de seqüências pode ser ajustada para cima paracorrigir a natureza conservadora da substituição. Diz-se queas seqüências que diferem por tais substituições conservadastêm "similaridade de seqüências" ou "similaridade". Os meiospara a produção deste ajuste são conhecidos dos versados natécnica. Tipicamente isto envolve se dar uma contagem de umasubstituição conservada como um malpareamento parcial e nãoum malpareamento total, aumentando assim a porcentagem deidentidade de seqüências. Assim, no caso em que umaminoácido idêntico recebe uma contagem de 1, por exemplo, euma substituição não conservada recebe uma classificação dezero, uma substituição conservada recebe uma contagem entrezero e 1. A contagem de substituições conservadas écalculada conforme implementado no programa PC/GENE(Intelligenetics, Mountain View, Califórnia), por exemplo.

(d) Conforme empregado no presente, "porcentagem deidentidade de seqüências" significa o valor determinadocomparando-se duas seqüências com alinhamento ótimo sobreuma janela de comparação, em que a porção da seqüência depolinucleotideo na janela de comparação pode compreenderadições ou deleções (isto é, falhas) em comparação com aseqüência de referência (que não compreende nem adições nemdeleções) para alinhamento ótimo das duas seqüências. Aporcentagem é calculada determinando-se o número de posiçõesem que ocorre uma base de ácido nucléico ou resíduo deaminoácido idêntico nas duas seqüências para produzir onúmero de posições pareadas, dividindo-se o número deposições pareadas pelo número total de posições na janela decomparação, e multiplicando-se o resultado por 100, para seobter a porcentagem de identidade de seqüências.

(e) (i) O termo "identidade substancial" de seqüênciasde polinucleotídeos significa que um polinucleotideocompreende uma seqüência que tem pelo menos 7 0% deidentidade de seqüências, pelo menos 80%, 90%, ou 95%, emcomparação a uma seqüência de referência usando-se um dosprogramas de alinhamento descritos usando-se parâmetrospadrão. Os versados na técnica reconhecerão que estesvalores podem ser adequadamente ajustados para se determinara identidade correspondente de proteínas codificadas porduas seqüências de nucleotídeos levando-se em conta adegeneração do códon, a similaridade de aminoácidos, oposicionamento da matriz de leitura e semelhantes. Aidentidade substancial de seqüências de aminoácidos paratais fins normalmente significa uma identidade de seqüênciasde pelo menos 60%, 70%, 80%, 90% ou 95%.

Uma outra indicação de que as seqüências denucleotídeos são substancialmente idênticas é o fato de queduas moléculas se hibridizam entre si em condiçõesestringentes. Geralmente as condições estringentes sãoselecionadas para se encontrarem aproximadamente 5°C abaixoda Tm para a seqüência específica a uma intensidade iônicadefinida e a um pH definido. No entanto as condiçõesestringentes abrangem temperaturas na faixa deaproximadamente 1°C a aproximadamente 20°C abaixo da Tm,dependendo do grau desejado de estringência, conformequalificado de outro modo no presente documento. Os ácidosnucléicos que não se hibridizam entre si em condiçõesestringentes ainda serão substancialmente idênticos se ospolipeptídeos que eles codificam são substancialmenteidênticos. Isto pode ocorrer, quando uma cópia de um ácidonucléico, por exemplo, é criada usando-se o máximo dedegeneração de códon permitida pelo código genético. Umaindicação de que duas seqüências de ácidos nucléicos sãosubstancialmente idênticas é quando o polipeptideocodificado pelo primeiro ácido nucléico é imunologicamentetrans-reativo com o polipeptideo codificado pelo segundoácido nucléico.

A seqüência de promotor 419 do milho, descrita nopresente documento, assim como suas variantes e fragmentos,são úteis para a engenharia genética de plantas, porexemplo, para a produção de uma planta transformada outransgênica, para expressar um fenótipo de interesse.Conforme empregado no presente, os termos "plantatransformada" e "planta transgênica" se referem a uma plantaque compreende no interior do seu genoma um polinucleotideoheterólogo. Geralmente o polinucleotideo heterólogo éestavelmente integrado no interior do genoma de uma plantatransgênica ou transformada de modo tal que opolinucleotideo é passado para gerações sucessivas. 0polinucleotideo heterólogo pode ser integrado ao genomasozinho ou como parte de uma construção recombinante de DNA.Deve ficar subentendido que conforme empregado no presente,o termo "transgênico" inclui qualquer célula, linhagem decélulas, calo, tecido, parte de planta ou planta cujogenótipo tenha sido alterado pela presença do ácido nucléicoheterólogo incluindo aqueles transgênicos deste modoalterados assim como aqueles criados por cruzamento sexualou propagação assexuada a partir do transgênico inicial. Otermo "transgênico", conforme empregado no presente, nãoabrange a alteração do genoma (cromossômico ou extra-cromossômico) por métodos de cruzamento vegetal convencionalou por eventos que ocorrem naturalmente tais comofertilização cruzada aleatória, infecção viral nãorecombinante, transformação bacteriana não recombinante,transposição não recombinante, ou mutação espontânea.

Um "evento" transgênico é produzido pela transformaçãode células vegetais com uma construção de DNA heterólogo,incluindo uma construção de ácido nucléico de DNA quecompreende um transgene de interesse, a regeneração de umapopulação de plantas resultante da inserção do transgene nogenoma da planta e a seleção de uma planta especificacaracterizada pela inserção em um local especifico dogenoma. Um evento é fenotipicamente caracterizado pelaexpressão do transgene. A nível genético, um evento é parteda constituição genética de uma planta. O termo "evento"também e refere à progênie produzida por um extra-cruzamentosexual entre o transformante e uma outra variedade queinclui o DNA heterólogo.

Conforme empregado no presente, o termo "planta" incluireferência a plantas integrais, órgãos de plantas (folhas,caule, raízes, por exemplo, etc.), sementes, células deplanta e sua prole. Deve ficar subentendido que partes deplantas transgênicas, dentro do âmbito das concretizaçõescompreendem, por exemplo, células de planta, protoplastos,tecidos,, calo, embriões, assim como flores, caules, frutos,óvulos, folhas ou raízes se originando em plantastransgênicas ou sua progênie anteriormente transformada comuma molécula de DNA da invenção, e consistindo, portanto,pelo menos em parte em células transgênicas.Conforme empregado no presente, o termo "célula deplanta" inclui, sem limitação, culturas de suspensão desementes, embriões, regiões meristemáticas, tecido do calo,folhas, raízes, brotos, gametófitos, esporófitos, pólen emicrósporos. A classe de plantas que pode ser usada nosmétodos das concretizações é geralmente é tão ampla como aclasse de plantas superiores passíveis de serem submetidas atécnicas de transformação, incluindo tanto plantasmonocotiledôneas como dicotiledôneas.

As seqüências de promotor e os métodos descritos nopresente documento são úteis na regulação da expressão dequalquer seqüência de nucleotídeos heteróloga em uma plantahospedeira. Portanto, a seqüência de nucleotídeos heterólogaligada operacionalmente aos promotores descritos no presentedocumento pode consistir em um gene estrutural codificandouma proteína de interesse. Os genes de interesse refletem osmercados comerciais e os interesses dos envolvidos nodesenvolvimento da cultura. As culturas e os mercados deinteresse se modificam, e à medida que as nações emdesenvolvimento abrem mercados globais, também emergirãonovas culturas e tecnologias. Além disso, à medida queaumenta a nossa compreensão das características e facetasagronômicas tais como rendimento e heterose, a escolha degenes para a transformação se alterará proporcionalmente. Ascategorias gerais de genes de interesse para asconcretizações incluem, por exemplo, aqueles genesenvolvidos em informação, tais como "zinc fingers", osenvolvidos em comunicação, tais como as quinases e osenvolvidos em administração, tais como proteína de choquetérmico. As categorias mais especificas de transgenesincluem, por exemplo, genes gue codificam proteínas gueconferem resistência a estresse abiótico, tal como estiagem,temperatura, salinidade e toxinas tais como pesticidas eherbicidas ou a estresse biótico, tal como atagues porfungos, vírus, bactérias, insetos e nematóides, edesenvolvimento de doenças associadas com estes organismos.Diversas alterações no fenótipo são de interesse incluindo amodificação da expressão de um gene em um tecido vegetalespecífico, a alteração de um mecanismo de defesa da plantacontra patógeno ou inseto, o aumento da tolerância da plantaa herbicidas, a alteração do desenvolvimento tecidual pararesponder ao estresse do ambiente e semelhantes. Osresultados podem ser obtidos provendo-se a expressão deprodutos heterólogos ou um aumento da expressão de produtosendógenos nas plantas. Alternativamente, os resultados podemser obtidos provendo-se a redução da expressão de um ou maisprodutos endógenos, especialmente de enzimas,

transportadores, ou cofatores, ou afetando a absorção denutrientes na planta. Estas alterações resultam em umaalteração no fenótipo da planta transformada.

É fato reconhecido gue gualguer gene de interesse podeser ligado operacionalmente às següências promotorasdescritas no presente documento e expressas em tecidos deplanta.

Uma construção de DNA que compreende um destes genes deinteresse pode ser usado com técnicas de transformação, taiscomo as descritas abaixo para criar resistência a doença oua insetos em fenótipos de plantas suscetíveis ou paraaumentar a resistência a doença ou a insetos em fenótipos deplantas resistentes. Conseqüentemente esta divulgaçãoabrange métodos que são voltados para a proteção de plantascontra patógenos fúngicos, bactérias, vírus, nematóide,insetos e semelhantes. "Resistência a doença" ou"resistência a insetos" significa que as plantas evitamsintomas prejudiciais que são o resultado de interaçõesplanta-patógeno.

Os genes de resistência a doença e de resistência ainsetos tais com lisozimas, cecropinas, maganinas outioninas para proteção antibacteriana ou as proteínasrelacionadas com a patogênese (PR) tais como as glucanases equitinases para proteção antifúngica, ou endotoxinasBacillus thuringíensis, inibidores de protease, colagenases,lectinas, e glicosidases para o controle de nematóides ou deinsetos são todos exemplos de produtos genéticos úteis.

Os patógenos das concretizações incluem, sem limitação,vírus ou viróides, bactérias, insetos, nematóides, fungos esemelhantes. Os vírus incluem vírus mosaico do tabaco oupepino, vírus de mancha anular, vírus da necrose, vírusmosaico anão do milho etc. Os nematóides incluem nematóidesparasíticos tais como nó da raiz, cisto e nematóides delesão etc.

Os genes que codificam traços de resistência a doençaincluem genes de detoxificação, tais como contra fumonisina(patente US 5.792.931) genes de avirulência (avr) e deresistência a doença (R) (Jones et al. (1994) Science266:789; Martin et al. (1993) Science 262:1432; Mindrinos etal. (1994) Cell 78:1089); e semelhantes. Os genes deresistência a insetos podem codificar a resistência a pragasque tem um grande impacto sobre o rendimento tais como vermeda raiz, verme cortador, broca européia do milho, esemelhantes. Tais genes incluem, por exemplo, genes deproteína tóxica a Bacillus thuringiensis (patentes US5.366.892; 5.747.450; 5.737.514; 5. 723.75 6; 5.593.881; eGeiser et al. (1986) Gene 48:109); Iectinas (Van Damme etal. (1994) Plant Mol. Biol. 24:825); e semelhantes.

Os traços de resistência a herbicida podem serintroduzidos em plantas por genes que codificam aresistência a herbicidas que atuam para inibir a ação deacetolactato sintase (ALS), especialmente os herbicidas dotipo sulfoniluréia (o gene de acetolactato sintase (ALS),por exemplo, contendo mutações que levam a tal resistência,especialmente as mutações S4 e/ou Hra), genes que codificama resistência a herbicidas que atuam para inibir a ação deglutamina sintase, tais como fosfinotricina ou Basta®(glufosinato) (o gene bar, por exemplo) ou outros tais genesconhecidos na técnica. 0 gene bar codifica resistência aoherbicida Basta®, o gene nptll codifica a resistência aosantibióticos canamicina e geneticina e o gene de ALScodifica a resistência ao herbicida clorsulfuron.

A resistência a glifosato é conferida por genes de 5-enolpiruvl-3-fosfiquimato sintase (EPSP) mutante e aroA.Veja, por exemplo, a patente US 4.940.835 concedida a Shahet al., que divulga a seqüência de nucleotídeos de uma formade EPSPS que pode conferir resistência a glifosato. Apatente US No. 5.627.061 concedida a Barry et al. tambémdescreve genes que codificam enzimas EPSPS. Veja tambémpatentes US 6.248.876; 6.040.497; 5.804.425; 5.633.4355.145.783; 4.971.908; 5.312.910; 5.188.642; 4.940.8355.866.775; 6.225.114; 6.130.366; 5.310.667; 4.535.0604.769.061; 5.633.448; 5.510.471; RE 36.449; RE 37.287; e5.491.288; e as publicações internacionais WO 97/04103; WO97/04114; WO 00/66746; WO 01/66704; WO 00/66747 e WO00/66748, que são incorporadas ao presente documento atitulo de referência para tal fim. A resistência a glifosatoé também conferida a plantas que expressam um gene quecodifica uma enzima glifosato óxido-reductase, conformedescrito com mais detalhes nas patentes U.S. Nos. 5.776.760e 5.463.175, que são incorporadas ao presente documento atitulo de referência para tal fim. Além da resistência aglifosato, pode ser conferida a plantas pela super-expressãode genes que codificam glifosato N-acetil-transferase. Veja,por exemplo, pedidos de patentes US Nos. de Série10/004.357; e 10/427.692.

Os genes da esterilidade podem também ser codificadosem uma construção de DNA e proporcionar uma alternativa àretirada física do cacho. Exemplos de genes usados de talmodo incluem genes com preferência a tecido masculino egenes com fenótipos de esterilidade masculina tais como QM,descrito na patente US 5.583.210. Outros genes incluemquinases e os que codificam compostos tóxicos ou aodesenvolvimento gametofítico masculino ou feminino.

Os traços comerciais podem também ser codificados em umgene ou genes que poderiam aumentar, por exemplo, amido paraa produção de etanol ou proporcionar a expressão deproteínas. Um outro uso comercial importante de plantastransformadas é a produção de polímeros e bioplásticos taiscomo os descritos na patente U.S. No. 5.602.321. Genes taiscomo β-cetotiolase, PHBase (poliidróxi-butirato sintase) eacetoacetil-CoA reductase (veja Schubert et al. (1988) J.

Bacteriol. 170: 583705847) facilitam a expressão depolihidróxi-alcanoatos (PHAs).

Os traços agronomicamente importante que afetam aqualidade do grão, tais como níveis e tipos de óleos,saturados e insaturados, qualidade e quantidade deaminoácidos essenciais, níveis de celulose, amido e teor deproteína podem ser geneticamente alterados usando-se osmétodos das concretizações. As modificações incluem oaumento do teor de ácido oléico, óleos saturados einsaturados, o aumento de níveis de lisina e enxofre, aprovisão de aminoácidos essenciais e a modificação do amido.As modificações da proteína hordotionina em milho sãodescritas nas patentes US 5.990.389; 5.885.801; 5.885.802 e5.703.049; incorporadas ao presente documento a título dereferência. Um outro exemplo consiste em proteína de sementerica em lisina e/ou enxofre codificada pelo de albumina 2Sde soja descrita na patente US 5.850.016, depositado em 20de março de 1996, e o inibidor de quimotripsina da cevada,Williamson et al. (1987) Eur. J. Biochem. 165:99-106, cujoconteúdo é incorporado ao presente documento a título dereferência.

Os produtos exógenos incluem enzimas e produtosvegetais assim como os provenientes de outras fontesincluindo procariontes e outros eucariontes. Tais produtosincluem enzimas, cofatores, hormônios e semelhantes.Exemplos de outros genes aplicáveis e seu fenótipoassociado incluem o gene que codifica a proteína do capsídeoviral e/ou RN, ou outros genes virais ou de plantas queconferem resistência viral; genes que conferem resistência afungos; genes que conferem resistência a insetos; genes quepromovem o aumento do rendimento; e genes que proporcionamresistência a estresse, tal como a desidratação resultantede calor e salinidade, metais tóxico ou elementos de traços,ou semelhantes.

"RNAi" se refere a uma série de técnicas correlataspara a redução da expressão de genes (veja, por exemplo,patente US 6.506.559). Técnicas mais antigas denominadas poroutros nomes são consideradas hoje em dia como se apoiandono mesmo mecanismo, mas receberam nomes diferentes naliteratura. Estes incluem "inibição antisense", a produçãode transcritos de RNA antisense capazes de suprimir aexpressão da proteína alvo, e "co-supressão" ou "supressãosense" que se referem à produção de transcritos de RNA nosentido, capazes de suprimir a expressão de genes estranhosou endógenos idênticos ou substancialmente semelhantes(patente US 5.231.020, incorporada ao presente documento atítulo de referência) . Tais técnicas se apoiam no uso deconstruções que resultam no acúmulo de RNA de doisfilamentos com uma complementaridade de filamento ao genealvo a ser silenciado. A seqüência de promotor 419 do milhoe os seus fragmentos ou variantes correlatas biologicamenteativas descritas no presente documento, podem ser usada paradirigir a expressão de construções que resultará nainterferência no RNA incluindo microRNAs e siRNAs.A seqüência de nucleotideos heteróloga ligada de modooperativo ao promotor 419 do milho e a seqüências promotorascorrelatas descritas no presente documento podem consistirem uma seqüência antisense para um gene alvo. A terminologia"seqüência de nucleotideos de DNA antisense" se destina asignificar uma seqüência que tem uma orientação inversa àorientação normal 5- a 3' daquela seqüência de nucleotideos.Quando fornecida em uma célula de planta, a expressão daseqüência de DNA antisense impede a expressão normal daseqüência de nucleotideos de DNA para o gene alto. Aseqüência de nucleotideos antisense codifica uma transcriçãode RNA que é completar e capaz de se hibridizar com o RNAmensageiro (mRNA) endógeno produzido pela transcrição daseqüência de nucleotideos de DNA para o gene alvo. Nestecaso, a produção da proteína nativa codificada pelo genealvo é inibida para se obter uma resposta fenotípicadesejada. As modificações das seqüências antisense podem serfeitas desde que as seqüências se hibridizem e interfiram naexpressão do mRNA correspondente. Deste modo, podem serusadas construções antisense que têm pelo menos 70%, 80% ou85% ou mais de identidade de seqüências às seqüênciasantisense correspondentes. Além disso, porções dosnucleotideos antisense podem ser usadas para destruir aexpressão do gene alvo. Geralmente, podem ser usadasseqüências de pelo menos 50 nucleotideos, 100 nucleotideos,200 nucleotideos ou mais. Portanto, as seqüências promotorasdescritas no presente documento podem ser ligadasoperacionalmente a seqüências de DNA antisense para reduzirou inibir a expressão de uma proteína nativa nos tecidos deplanta selecionados.

Em uma concretização, as construções de DNAcompreenderão uma região de iniciação de transcriçãocompreendendo uma das seqüências de nucleotídeos de promotordescritas no presente documento, ou variantes ou fragmentosseus, ligados operacionalmente a uma seqüência denucleotídeos heteróloga cuja expressão deve ser controladapelo promotor com preferência a tecido das concretizações.

Tal construção de DNA é dotada com uma multiplicidade desítio de restrição para a inserção da seqüência denucleotídeos a se encontrar sob a regulação transcricionaldas regiões reguladoras. A construção de DNA pode, alémdisso, conter genes marcadores de seleção.

A construção de DNA incluirá na direção 5'-3' datranscrição, uma região de iniciação de transcrição (isto éum promotor com preferência a tecido das concretizações),região de iniciação da tradução, uma seqüência denucleotídeos heteróloga de interesse, uma região determinação da tradução e, opcionalmente, uma região determinação de transcrição funcional no organismo dohospedeiro. As regiões reguladoras (isto é, promotores,regiões reguladoras transcricionais e regiões de terminaçãoda tradução) e/ou o polinucleotídeo das concretizações podeser nativo/análogo à célula hospedeira ou um ao outro.

Alternativamente, as regiões reguladoras e/ou opolinucleotídeo das concretizações podem ser heterólogos àcélula hospedeira ou um em relação ao outro. Conformeempregado no presente, "heterólogo" com referência a umaseqüência é uma seqüência que se origina de uma espécieestranha, ou, se for proveniente da mesma espécie, ésubstancialmente modificada a partir da sua forma nativa nacomposição e/ou lócus genômico por intervenção humanadeliberada. Um promotor operacionalmente ligado a umpolinucleotideo heterólogo, por exemplo, é proveniente deuma espécie diferente da espécie da qual o polinucleotideofoi derivado, ou, se for da mesma espécie/espécie análoga,um ou os dois são substancialmente modificados a partir da sua forma original e/ou o lócus genômico, ou o promotor nãoé o promotor nativo para o polinucleotideo operacionalmenteligado.

A região de terminação opcionalmente incluída pode sernativa com a região de iniciação de transcrição, pode sernativa com o polinucleotideo operacionalmente ligado deinteresse, pode ser nativa com a planta hospedeira ou podeser derivada de outra fonte (isto é, ser estranha ouheteróloga) ao promotor, ao polinucleotideo de interesse, àhospedeira ou à qualquer combinação deles. As regiões determinação convenientes são disponíveis de plasmídeo-Ti deA. tumefaciens, tais como regiões de terminação de octopinasintase e nopalina sintase. Veja também Guerineau et al.(1991) Mol. Gen. Genet. 262:141-144; Proudfoot (1991) Cell64:671-674; Sanfacon et al. (1991) Genes Dev. 5:141-149;Mogen et al. (1990) Plant Cell 2:1261-1272; Munroe et al.(1990) Gene 91 :151-158; Bailas et al. (1989) Nucleic AcidsRes. 17:7891-7903; e Joshi et al. (1987) Nucleic Acids Res.15:9627-9639. Em concretizações específicas é utilizado oterminador do gene do inibidor II (PinII) de protease debatata particular. Veja, por exemplo, Keil et al. (1986)Nucl. Acids Res. 14:5641-5650; e An et al. (1989) Plant Cell1:115-122, incorporados ao presente documento a titulo dereferência integralmente.

A construção de DNA que compreende uma seqüência depromotor das concretizações ligada operacionalmente a umaseqüência de nucleotideos heteróloga pode também conter pelomenos uma seqüência de nucleotideos adicional para um gene aser co-transformado no organismo. Alternativamente, pode(m)ser provida(s) seqüência(s) adicional(ais) em uma outraconstrução de DNA.

Caso seja adequado, a seqüência de nucleotideosheteróloga cuja expressão se encontra sob o controle daseqüência de promotor tecido-preferencial das concretizaçõese qualquer(quaisquer) seqüência(s) de nucleotideosadicional (ais) pode(m) ser otimizada(s) para um aumento daexpressão na planta transformada. Isto é, estas seqüênciasde nucleotideos podem ser sintetizadas usando-se códons compreferência para a planta para um aumento da expressão.Existem métodos disponíveis na técnica para a síntese deseqüências de nucleotideos com preferência para a planta.Veja, por exemplo, patentes US 5.380.831 e 5.436.391, eMurray et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:477-498,incorporados ao presente documento a título de referência.

Modificações de seqüências adicionais são conhecidaspor aumentar a expressão gênica em um hospedeiro celular.Estas modificações incluem a eliminação de seqüências quecodificam sinais de poliadenilação espúrios, sinais de sítioda recomposição éxon-íntron, repetições semelhantes àtransposons, e outras seqüências tais bem caracterizadas quepodem ser prejudiciais à expressão genética. 0 teor de G-Cda seqüência de nucleotideos heteróloga pode ser ajustado àmédia de níveis para um hospedeiro celular dado, conformecalculado por referência a genes conhecidos expressos nacélula hospedeira. Quando possível, a seqüência é modificadapara evitar estruturas de mRNA secundárias em "hairpin"previstas.

As construções de DNA podem, além disso, conterseqüências líderes 5'. Tais seqüências líderes podem atuarpara melhorar a tradução. Os líderes de tradução sãoconhecidos na técnica e incluem: líderes picornavírus, líderEMCV (região 5' não codificadora de encefalomiocardite)(Elroy-Stein et al. (1989) Proc. Nat. Acad. Sei. USA86:6126-6130), por exemplo; líderes potivírus, líder TEV(Vírus de Entalhe do Tabaco), por exemplo, (Allison et al.(1986) Virology 154:9-20); líder MDMV (Vírus do Mosaico Anãodo Milho); proteína de ligação de cadeia pesada deimunoglobulina humana (BiP) (Macejak et al. (1991) Nature353:90-94); líder não traduzido do mRNA da proteína docapsídeo do vírus do mosaico da alfafa (AMV RNA 4) (Joblinget al. (1987) Nature 325:622-625); líder vírus do mosaico dotabaco (TMV) (Gallie et al. (1989) Molecular Biology of RNA,páginas 237-256); e líder de vírus de manchas cloróticas domilho (MCMV) (Lommel et al. (1991) Virology 81:382-385).Veja, também, Della-Cioppa et al. (1987) Plant Physiology84:965-968. Outros métodos para se aumentar a tradução e/oua estabilidade de mRNA podem também ser utilizados, íntrons,por exemplo, tais como o íntron de ubiquitina do milho(Christensen e Quail (1996) Transgenic Res. 5:213-218;Christensen et al. (1992) Plant Molecular Biology 18:675-689) ou o intron AdhI do milho (Kyozuka et al. (1991 ) Mol.Gen. Genet. 228:40-48/ Kyozuka et al. (1990) Maydica 35:353-357), e semelhantes.

As construções de DNA das concretizações podem tambémincluir outros acentuadores ("enhancers") , ou acentuadoresde tradução ou de transcrição, conforme possam sernecessários. Estas regiões de acentuador são bem conhecidasdos versados na técnica e podem incluir o códon de iniciaçãoAT e seqüências adjacentes. O códon de iniciação deve estarem fase com a matriz de leitura da seqüência de codificaçãopara assegurar a tradução da seqüência integral. Os sinaisde controle de tradução e os códons de iniciação podem serprovenientes de uma variedade de origens, tanto natural comsintética. As regiões de iniciação da tradução podem serprovidas da fonte da região de iniciação de transcrição oudo gene estrutural. A seqüência pode também ser derivada doelemento regulador selecionado para expressar o gene e podeser especificamente modificada de modo a aumentar a traduçãodo mRNA. É fato reconhecido que para se aumentar os níveisde transcrição, podem ser utilizados acentuadores emcombinação com as regiões de promotor da descrição. Osacentuadores são conhecidos na técnica e incluem a regiãoacentuadora SV40, o elemento acentuador 35S e semelhantes.

Ao se preparar a construção de DNA, podem sermanipulados os diversos fragmentos de DNA, de modo aproporcionar as seqüências de DNA na orientação adequada e,conforme apropriado na matriz de leitura adequada. Para talfim, podem ser empregados adaptadores ou "linkers" paraligar os fragmentos de DNA ou outras manipulações podemestar envolvidas para proporcionar sítios de restriçãoconvenientes. Podem ser acrescentados ou removidos sítios derestrição, pode ser removido o DNA supérfluo ou podem serintroduzidas outras modificações semelhantes nas seqüênciasdas concretizações. Para tal fim, pode estar envolvidamutagênese in vitro, reparo de primer, restrição,desnaturação, re-substituições, tais como transições etransversões, por exemplo.

Os genes repórteres ou genes marcadores de seleçãopodem ser incluídos nas construções de DNA. Exemplos degenes repórteres adequados conhecidos na técnica podem serencontrados, por exemplo, em Jefferson et al. (1991) emPlant Molecular Biology Manual, ed. Gelvin et al. (KluwerAcademic Publishers), pp. 1-33; DeWet et al. (1987) Mol.Cell. Biol. 7:725-737; Goff et al. (1990) EMBO J. 9:2517-2522; Kain et al. (1995) BioTechniques 79:650-655; e Chiu etal. (1996) Current Biology 6:325-330.

Os genes marcadores de seleção para a seleção decélulas ou tecidos transformados podem incluir genes queconferem resistência a antibiótico ou resistência aherbicidas. Exemplos de genes marcadores de seleçãoadequados incluem, sem limitação, os genes que codificamresistência a cloranfenicol (Herrera Estrella et al. (1983)EMBO J. 2:987-992); metotrexato (Herrera Estrella et al.(1983) Nature 303:209- 213; Meijer et al. (1991) Plant Mol.Biol. 76:807-820); higromicina (Waldron et al. (1985) PlantMol. Biol. 5:103-108; Zhijian et al. (1995) Plant Science708:219- 227); estreptomicina (Jones et al. (1987) Mol. Gen.Genet. 270:86-91); espectinomicina (Bretagne-Sagnard et al.(1996) Transgenic Res. 5:131-137); bleomicina (Hille et al.(1990) Plant Mol. Biol. 7:171-176); sulfonamida (Guerineauet al. (1990) Plant Mol. Biol. 75:127-136); bromoxinila(Stalker et al. (1988) Science 242:419-423); glifosato (Shawet al. (1986) Science 233:478-481); fosfinotricina (DeBlocket al. (1987) EMBO J. 6:2513-2518).

Outros genes que poderiam servir na recuperação deeventos transgênicos, mas que poderiam não ser necessáriosno produto final incluiriam, sem limitação, exemplos taiscomo GUS (b-glicuronidase; Jefferson (1987) Plant Mol. Biol.Rep. 5:387), GFP (proteína de fluorescência verde; Chalfieet al. (1994) Science 263:802), luciferase (Riggs et al.(1987) Nucleic Acids Res. 75(19) :8115 e Luehrsen et al.(1992) Methods Enzymol. 27 6:397-414), e os genes do milhoque codificam a produção de antocianina (Ludwig et al.(1990) Science 247:449).

As moléculas de ácido nucléico das concretizações sãoúteis nos métodos direcionados à expressão de uma seqüênciade nucleotídeos em uma plana. Isto pode ser obtido portransformação de uma célula de planta de interesse com umaconstrução de DNA compreendendo um promotor identificado nopresente documento, ligado operacionalmente a uma seqüênciade nucleotídeos heteróloga e por regeneração de uma plantaestavelmente transformada a partir da célula de planta. Osmétodos das concretizações são também direcionados aexpressão seletiva de uma seqüência de nucleotídeos em umtecido vegetal. Esses métodos compreendem a transformação deuma célula de planta com uma construção de DNA quecompreende um promotor identificado no presente documentoque inicia a transcrição tecido-preferencial em uma célulade planta ligado operacionalmente a uma seqüência denucleotideos heteróloga e a regeneração de uma plantatransformada a partir da célula de planta.

A construção de DNA que compreende a seqüência depromotor especifico das concretizações operacionalmenteligada a uma seqüência de nucleotideos de interesse pode serusada para a transformação de qualquer planta. Deste modo,podem ser obtidas plantas, células de planta, tecidosvegetais, sementes, raízes e semelhantes geneticamentemodificados, isto é, transgênicos ou transformados.

As espécies de plantas adequadas para as concretizaçõesincluem, sem limitação, milho (Zea mays) , Brassica sp. (B.napus, B. rapa, B. juncea, por exemplo) , especialmenteaquelas espécies de Brassica úteis como fontes de óleo desementes, alfafa (Medicago sativa), arroz (Oryza sativa) ,centeio (Secale cereale) , sorgo (Sorghum bicolor, Sorghumvulgare), painço (por exemplo, pearl millet (Pennisetumglaucum), proso millet (Panicum miliaceum), foxtail millet(Setaria itálica), finger millet (Eleusine coracana) ,girassol (Helianthus annuus), cártamo (Carthamustinctorius), trigo (Triticum aestivum) , soja (Glycine max),tabaco (Nicotiana tabaeum), batata inglesa (Solanumtuberosum), amendoim (Arachis hypogaea) , algodão (Gossypiumbarbadense, Gossypium hirsutum), batata doce (Ipomoeabatatus), aipim (Manihot eseulenta) , café (Cofea spp.), coco(Cocos nucifera) , abacaxi (Ananas comosus) , árvores cítricas(Citrus spp.), cacau (Theobroma cacao) , chá (Camelliasinensis), banana (Musa spp.), abacate (Persea americana) ,figo (Ficus casica) , goiaba (Psidium guajava) , manga(Mangifera indica), azeitona (Olea europaea) , mamão (Caricapapaya), caju (Anacardium occidentale) , macadâmia (Macadamiaintegrifolia) , amêndoa (Prunus amygdalus) , beterrabaaçucareira (Beta vulgaris) , cana de açúcar (Saeeharum spp.),aveia, cevada, vegetais, plantas ornamentais e coniferas.

Os legumes incluem tomates {Lycopersicon eseulentum),alface (Laetuea sativa, por exemplo), vagem (Phaseolusvulgaris), feijão lima (Phaseolus limensis), ervilhas(Lathyrus spp.), e membros do gênero Cueumis, tais comopepino (C. sativus), cantalupo (C. eantalupensis), e melão(C. melo) . As plantas ornamentais incluem azálea(Rhododendron spp.), hortênsia (Maerophylla hydrangea) ,hibiscos (Hibiseus rosasanensis) , rosas (Rosa spp.), tulipas(Tulipa spp.)/· narcisos (Nareissus spp.), petúnias (Petuniahybrida), cravo (Dianthus earyophyllus) , bico de papagaio(Euphorbia puleherrima), e crisântemo.

As coniferas que podem ser empregadas na colocação emprática das concretizações incluem, por exemplo, pinheirostais como Pinus taeda, Pinus elliotii, pinheiro ponderosa(Pinus ponderosa), pinheiro lodgepole (Pinus eontorta), epinheiro de Monterey (Pinus radiata); pinheiro Douglas-fir(Pseudotsuga menziesii); cicuta do oeste (Tsuga eanadensis) ;abeto de Sitka (Pieea glauca) ; sequóia (Sequoiasempervirens); pinheiros verdadeiros como pinheiro prateado(Abies amabilis) e pinheiro do bálsamo (Abies balsamea) ; ecedros tais como o cedro vermelho do Oeste (Thuja plicata) ecedro amarelo do Alaska {Chamaecyparis nootkatensis) .Plantas das concretizações podem ser plantas de culturas(por exemplo, milho, alfafa, girassol, Brassica, soja,algodão, cártamo, amendoim, sorgo, trigo, painço, tabacoetc.) A presente invenção é especialmente adequada paraqualquer membro da família de plantas monocotiledôneas queinclui, sem limitação, milho, arroz, cevada, aveia, trigo,sorgo, centeio, cana de açúcar, abacaxi, inhame, cebola,banana, coco e tâmaras.

Conforme empregado no presente, "vetor" se refere a umamolécula de DNA tal como plasmídeo, cosmídeo, ou fagobacteriano para a introdução de uma construção denucleotídeo, por exemplo, uma construção de DNA em umacélula hospedeira. Os vetores de clonagem contêm tipicamenteum sítio de restrição ou um número pequeno de sítios derestrição de reconhecimento de endonuclease em que podem serinseridas seqüências de DNA estranho de um modo determinávelsem perda de uma função biológica essencial do vetor, assimcomo um gene marcador que é adequado para uso naidentificação e seleção de células transformadas com o vetorde clonagem. Os genes marcadores tipicamente incluem genesque proporcionam resistência a tetraciclina, resistência ahigromicina ou resistência a ampicilina.

Os métodos das concretizações envolvem a introdução deuma construção de nucleotídeo em uma planta. 0 termo"introdução" é usado no presente documento para significar aapresentação à planta da construção de nucleotídeo de talmodo que a construção ganhe acesso ao interior de uma célulada planta. Os métodos das concretizações não dependem de ummétodo específico para a introdução de uma construção denucleotídeo a uma planta, sendo necessário somente que aconstrução de nucleotídeo ganhe acesso ao interior de pelomenos uma célula da planta. Os métodos para a introdução deconstruções de nucleotídeo nas plantas são conhecidos natécnica, incluindo, sem limitação, métodos de transformaçãoestável, métodos de transformação transitória e métodosmediados por vírus.

"Transformação estável" se destina a significar que aconstrução de nucleotídeo é introduzida em uma planta seintegra ao genoma da planta e é capaz de ser herdada por suaprogênie. "Transformação transitória" se destina asignificar que a construção de nucleotídeo introduzida emuma planta não se integra ao genoma da planta.

As construções de nucleotídeos das concretizações podemser introduzidas em plantas colocando-se as plantas emcontato com um vírus ou com ácidos nucléicos virais.Geralmente tais métodos envolvem a incorporação de umaconstrução de nucleotídeo das concretizações ao interior deuma molécula de DNA ou RNA viral. Os métodos para aintrodução de construções de nucleotídeos nas plantas e aexpressão e uma proteína neles codificada, envolvendomoléculas de DNA ou RNA viral são conhecidos na técnica.Veja, por exemplo, patentes US 5.889.191, 5.889.190,5.866.785, 5.589.367 e 5.316.931; incorporadas ao presentedocumento a título de referência.

Os protocolos de transformação assim como os protocolospara a introdução de seqüências de nucleotídeos em plantaspodem variar dependendo do tipo de planta ou célula deplanta, isto é, monocotiledôneas ou dicotiledôneas, visadaspara a transformação. Os métodos adequados para a introduçãode seqüências de nucleotideos em células de planta e ainserção subseqüente no genoma da planta incluemmicroinjeção (Crossway et al. (1986) Biotechniques 4:320-334), eletroporação (Riggs et al. (1986) Proc. Natl. Acad.Sei. USA 83:5602-5606, transformação mediada porAgrobacterium (patentes U.S. Nos. 5.981.840 e 5.563.055),transferência genética direta (Paszkowski et al. (1984) EMBOJ. 3:2717-2722), e aceleração de partícula balística (veja,por exemplo, patentes US 4.945.050; 5.879.918; 5.886.244;5.932.782; Tomes et al. (1995) in Plant Cell, Tissue, andOrgan Culture: Fundamental Methods, ed. Gamborg e Phillips(Springer-Verlag, Berlin); e McCabe et al. (1988)Biotechnology 6:923-926). Veja também Weissinger et al.(1988) Ann. Rev. Genet. 22:421-477; Sanford et al. (1987)Particulate Science and Technology 5:27-37 (cebola);Christou et al. (1988) Plant Physiol. 87:671-674 (soja);McCabe et al. (1988) Bio/Technology 6:923-926 (soja); Finer e McMullen (1991) In Vitro Cell Dev. Biol. 27P:175-182(soja); Singh et al. (1998) Theor. Appl. Genet. 96:319-324(soja); Datta et al. (1990) Biotechnology 8:736-740 (arroz);Klein et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85:4305-4309(milho); Klein et al. (1988) Biotechnology 6:559-563(milho); patentes U.S. Nos. 5.240.855; 5.322.783 e5.324.646; Klein et al. (1988) Plant Physiol. 97:440-444(milho); Fromm et al. (1990) Biotechnology 8:833-839(milho); Hooykaas-Van Slogteren et al. (1984) Nature(Londres) 311:763-764; patente U.S. No.. 5.736.369(cereais); Bytebier et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sei. USk84 :5345-5349 (Liliaceae) ; De Wet et al. (1985) em TheExperimental Manipulation of Ovule Tissues, ed. Chapman etal. (Longman, Nova York), pp. 197-209 (pólen); Kaeppler etal. (1990) Plant Cell Reports 9:415-418 and Kaeppler et al.(1992) Theor. Appl. Genet. 84:560-566 (transformação mediadapor vibrissas); D'Halluin et al. (1992) Plant Cell 4:1495-1505 (eletroporação) ; Li et al. (1993) Plant Cell Reports72:250-255 e Christou e Ford (1995) Annals of Botany 75:407-413 (arroz); Osjoda et al. (1996) Nature Biotechnology14:745-750 (milho por meio de Agrobacterium tumefaciens) ;todas incorporadas ao presente documento a titulo dereferência.

As células que tiverem sido transformadas podem sercultivadas em plantas de acordo com meios convencionais.Veja, por exemplo, McCormick et al. (1986) Plant CellReports 5:81-84. Estas plantas podem então ser cultivadas eou polinizadas com a mesma cepa transformada ou diferentescepas, e o híbrido resultante tendo a expressão compreferência a tecido da característica fenotípica desejadaidentificada. Duas ou mais gerações podem ser cultivadaspara se assegurar de que a expressão tecido-preferencial dacaracterística fenotípica desejada é mantida de modo estávele é herdada, sendo então as sementes colhidas para seassegurar e que a expressão com preferência a tecido dacaracterística fenotípica desejada foi atingida. Portanto,conforme empregado no presente, "sementes" transformadas sereferem a sementes que contêm a construção de nucleotídeoestavelmente integrado ao genoma da planta.Há uma variedade de métodos para a regeneração deplantas a partir de tecido vegetal. 0 método especifico deregeneração dependerá do tecido vegetal de partida e daespécie da planta especifica a ser regenerada. Aregeneração, o desenvolvimento, e o cultivo de plantas apartir de transformantes de protoplastos de uma única plantaou de diversos explantes transformados são conhecidos natécnica (Weissbach e Weissbach, (1988) Em: Methods for PlantMolecular Biology, (Eds.), Academic Press, Inc., San Diego,CA) . Este processo de regeneração e cultivo tipicamenteinclui as etapas de seleção de células transformadas,cultura destas células individualizadas através dos estágioshabituais do desenvolvimento embrionário através do estágiode plântulas enraizadas. Os embriões e sementes transgênicassão regeneradas de modo análogo. Os brotos enraizadostransgênicos resultantes são em seguida plantados em um meiode cultura adequada para plantas tal como solo. As plantasregeneradas são geralmente auto-polinizadas para produzirplantas transgênicas homozigóticas. Caso contrário, o pólenobtido das plantas regeneradas é cruzado com plantas criadasde sementes de linhagens agronomicamente importantes. Poroutro lado, o pólen proveniente de plantas destas linhagensimportantes é usado para polinizar as plantas regeneradas.Uma planta transgênica das concretizações que contêm umpolipeptideo desejado é cultivada usando-se métodosconhecidos dos versados na técnica.

As concretizações proporcionam composições para testarcompostos que modulam a expressão no interior de tecidosselecionados de embriões e plantas. Os vetores, células eplantas podem ser usados para se testar moléculas candidataspara agonistas e antagonistas do promotor 419 do milho. Umgene repórter pode ser ligado operacionalmente a um promotor419 do milho e ser expresso como um transgene em uma planta.

Os compostos a serem testados são acrescentados e aexpressão do gene repórter é medida para se determinar oefeito sobre a atividade do promotor.

Os exemplos abaixo são dados a titulo de ilustração enão como limitação.

EXPERIMENTOS

As concretizações são ainda definidas nos exemplosabaixo, em que as partes e porcentagens são em peso e osgraus são Celsius, a não ser que seja declarado emcontrário. As técnicas em biologia molecular foramtipicamente conduzidas conforme descrito em Ausubel ouSambrook, acima. Deve ficar subentendido que estes Exemplos,embora indicando determinadas concretizações, são dados atitulo de ilustração somente. Da discussão abaixo e destesExemplos, os versados na técnica poderão determinar ascaracterísticas das concretizações, e sem se afastar doespírito e âmbito delas, pode introduzir diversas alteraçõese modificações nas concretizações para adaptá-las a diversosusos e condições. Assim, diversas modificações dasconcretizações além das apresentadas e descritas no presentedocumento se tornarão aparentes aos versados na técnica coma leitura da descrição acima. Tais modificações são tambémdestinadas a incidir no âmbito das reivindicações apensas.O conteúdo de cada referência apresentada no presentedocumento é integralmente incorporado a titulo dereferência.

Exemplo 1: Identificação de gene em bibliotecaenriquecida com inflorescência feminina.

0 gene 419 foi identificado como tendo um promotor quepoderia dirigir a expressão preferencialmente em umabiblioteca de espiga imatura durante um teste de cDNAsubtrativo. Foi construída uma biblioteca de cDNA a partirde espigas imaturas de milho em lambda ZAP™ (Stratagene,LaJolla, CA) usando os protocolos recomendados pelofabricante. Os sobrenadantes de colônia foram testados comsonda marcada com 32P sintetizada a partir de mRNA isoladode espigas imaturas de milho (Sambrook). Os clones que sehibridizaram bem acima do fundo foram purificados eseqüenciados.

Exemplo 2: Caracterização da expressão usando NorthernBlots

As hibridizações Northern foram usadas para confirmar oenriquecimento em espiga imatura do gene 419. Foi conduzidoum exame de tecidos de milho numa variedade de estágios dedesenvolvimento. 0 total de RNA foi extraído usando-seTriReagent™ (Molecular Research Center, Inc., Cincinati,OH) de acordo com as instruções do fabricante, com base nosmétodos desenvolvidos por Chomczynski e Sacchi ((1987))Anal. Biochem. 162, 156-159). RNA foi fracionado em géis deagarose a 1,3% contendo aldeido fórmico a 2,2M (Sambrook), etransferido para membrana de GT ZetaProbe™ (Bio-Rad,Hercules, CA) por ação capilar usando-se 20 X SSC. Asmanchas foram submetidas a 120.000 yJ/cm2 de luz UV paraproduzir a reticulação do RNA. A pré-hibridizaçâo e ahibridização ocorreram a 65°C em fosfato de sódio a 0,25M,pH 7,2, SDS a 7%. A sonda consistia em 419 cDNA rotulado com32P. As manchas foram lavadas duas vezes, durante 30 minutoscada, em fosfato de sódio a 20M, pH 7,2, SDS a 7%, emseguida mais duas vezes durante 30 minutos cada, em fosfatode sódio a 20 mM, pH 7,2, SDS a 1%, todas a 65°C. Depois dalavagem, as manchas foram secadas ao ar, cobertas com filmeplástico e expostas a uma película de raios X. Nenhumaexpressão foi detectada nas raízes, lâminas foliares em Rl(o estágio no qual a planta do milho está em flor), no pólenou no cerne do caule em RI. Foi detectada uma expressãomoderada em folhas cotiledonares, nas cascas, nas bainhas defolhas Rl, grãos e espigas imaturas 8 dap (dias após apolinização). Foram detectados níveis muito altos deexpressão em inflorescências femininas receptivas nãopolinizados, no cacho pré-meiótico e nas língulas.

Exemplo 3: Organização genômica (Southern blots)Hibridizações Southern usando a seqüência cDNA 419 comouma sonda indicam que o gene é uma cópia única. O DNAgenômico foi extraído de folhas cotiledonares do milho deacordo com Chen e Dellaporta (Urea-based Plant DNA MiniprepIn Freeling, Μ; Walbot, V, eds, (1994) The Maize Handbook.Springer-Verlag, Nova York, pp 526-527). Os southern-blotsforam construídos usando DNA digerido com SstI, HindIII ouEcoRV de acordo com Dellaporta e Moreno (Southern BlotHybridization In The Maize Handbook, supra, pp 569-572). Oblotting, hibridização, lavagem e detecção foram conduzidoscomo para os northern-blots, veja o Exemplo 2, exceto gue atransferência de DNA para a membrana de náilon ocorreu em 10X SSC. Em cada caso, foi detectada somente uma faixa comhibridização intensa.

Exemplo 4: Experimentos in situ

A sonda usada para os protocolos in situ tinha a metadedo comprimento de clone de cDNA (-0,7 kb) no fagemídeo pBK-CMV (Stratagene). 0 plasmídeo foi linearizado com Sad para asonda antisense (T7) e com SmaI para a sonda no sentido (T3)usando as RNA polimerases correspondentes (RocheDiagnostics, Mannheim, Alemanha). As sondas de RNA forammarcadas com digoxigenina e hibridizadas a seções de tecidode acordo com Jackson (Jackson, DP (1991) In situhybridization in plants. Em DJ Bowles, SJ Gurr, M.McPherson, eds, Molecular Plant Pathology: A PracticalApproach. Oxford University Press, Oxford, pp 163-174), commodificações de acordo com Bradley et al. (Bradley D, et al.(1993) Cell 72:85-95.). A detecção mediada por anticorpolevou ao desenvolvimento do sinal depois de uma incubação deum dia para o outro indicando um nível alto de expressão.Em inflorescências femininas maduras antes dafertilização (ponta, meio e base), foi observada umaexpressão intensa em todas as células em todos asinflorescências femininas, incluindo epiderme, mas aexpressão era fraca ou ausente na parte de floema dos feixesvasculares. Os elementos do xilema mostraram um sinalintenso.

Em espigas imaturas, foi observada uma expressãointensa na célula mãe de megasporos de óvulos nas espigasprimárias de plantas de 7 semanas. Neste estágio, asinflorescências femininas começaram a crescer, mas o seucomprimento não excede o da inflorescência como um todo. 419foi expresso nos fios vasculares da inflorescência feminina,mas não nas demais células da inflorescência feminina. 0sinal foi também detectado nos estames, no floreterudimentar (inferior) e nos feixes vasculares da espiga. Foiobservado em toda a espiga um nivel muito baixo de sinal,possivelmente não acima do fundo.

Nos grãos e glumas em desenvolvimento, antes dafertilização foi observada uma expressão total de baixonivel do gene, mas o sinal era mais intenso nas glumasexternas.

Em espigas primárias imaturas de plantas de 5 semanas,419 estava expresso a um nivel muito baixo, quando era, emtodo o meristema da espiga e nas folhas jovens das cascas. Aexpressão era sucessivamente mais intensa em folhas decascas mais velhas (externas). Neste estágio, os primórdiosdas espiculas já estavam formados, mas os primórdios doórgão floral ainda não tinham se diferenciado.Nos raeristemas de brotos vegetativos de plantas de 17dias, 419 estava expresso a um nível muito baixo, quandoestava. A expressão era sucessivamente mais intensa emfolhas mais velhas (externas) e no tecido dos nós.

Foi observada uma expressão intensa em todas as célulasda auricula, incluindo na epiderme. 0 sinal parecia um tantomais fraco nas células com paredes celulares especialmentefortes, tais como os elementos metaxilêmicos dos feixesvasculares e nas células esclerenquimatosas localizadasacima e abaixo dos feixes vasculares principais.

Foi observada uma expressão intensa em todas as célulasda lingula, incluindo na epiderme. Não havia nenhum sinalnas células com reforços de parede celular forte que estavamlocalizados na periferia.Havia uma expressão intensa na lâmina foliar empraticamente todas as células. Foi observado um sinalespecialmente intenso nos feixes vasculares (xilema efloema) e nas células do esclerênquima.

Nas pontas das raízes adventícias de plantas de 3semanas, praticamente nenhuma expressão detectável na coifada raiz e no meristema radicular. 0 sinal foi sucessivamentemais intenso em células mais diferenciadas ao longo do eixoda raiz.

Controle Negativo: Uma sonda sense não produziu nenhumsinal em qualquer um dos tecidos descritos acima. Umaexceção consistiu na lâmina foliar, onde houve um sinalfraco no esclerênquima e em alguns dos elementos menores doxilema. No entanto, a diferença em intensidade de sinal emcomparação com a sonda antisense era muito evidente.Concluindo, o gene 419 mostrou uma expressão intensanas inflorescências femininas, mas não exclusivamente nestetecido. A lingula, a auricula e a lâmina foliar tambémapresentaram uma expressão intensa e ocorreu uma expressãofraca nos grãos, glumas, espigas imaturas, ápice vegetativo,folhas jovens e pontas das raizes. Uma observaçãointeressante consistiu na expressão intensa especifica àcélula mãe de megasporo, implicando uma função neste tecido.

Exemplo 5: Isolamento e clonagem do promotorO procedimento para o isolamento do gene é descrito noManual do usuário para o kit Genome Walker vendido por BDBioSciences (anteriormente Clontech Laboratories, Inc.) PaloAlto, Calif. DNA genômico proveniente de uma linhagem demilho foi isolado usando-se reagentes Puregene® adquiridosde Gentra Systems, Inc., Minneapolis, MN, usado de acordocom as instruções do fabricante. O DNA foi então usadoexatamente conforme descrito no Manual de Uso doGenomeWalker™ (Clontech PT3042-1). Resumindo, o DNA foidigerido separadamente com as enzimas de restrição DraI,EcoRV, PvuII e StuI, todos cortadores de ponta cega. O DNAfoi extraído com fenol, em seguida com clorofórmio,precipitando-se então com etanol. Os adaptadores deGenomeWalker™ foram ligados nas extremidades do DNArestrito. Refere-se ao DNA resultante como DL 1-4,respectivamente.

Para o isolamento do promotor 419 foram projetadosprimers aninhados tendo aproximadamente 250 pb e 150 pb,respectivamente, 3' de ATG de 419. Estes foram usadas comcada amostra de DNA (DL 1-4) e os primers GenomeWalker™adequados em duas séries de PCRs. As combinações de primerse o modo como estas PCR foi conduzida são descritos abaixo:

Na primeira série de PCR, foi usado o primer ClontechAPl (SEQ ID NO: 7) e o primer 1 especifico a gene (gspl)(SEQ ID NO: 8) . A PCR foi conduzida em um ciclador térmicomodelo PTC-IOO com Hot Bonnet® de MJ Research (Watertown,Maine) usando-se reagentes fornecidos juntamente com o kitGenomeWalker™, exceto que foi usada a mistura depolimerases de 2 DNAs Advantage™, adquirida da mesmaempresa, em vez da mistura de polimerases Tth fornecida como kit. Foram usados os seguintes parâmetros de ciclização:sete ciclos de 94°C durante 2 segundos, em seguida a 72°Cdurante 3 minutos, em seguida 28 ciclos de 94°C por 2segundos, e 670C durante 3 minutos. Finalmente as amostrasforam mantidas a 670C durante 7 minutos, em seguida a 40Caté uma análise subseqüente. Conforme descrito no Manual dousuário, o DNA proveniente da primeira série de PCR foientão diluído e serviu como um molde em uma segunda série dePCR usando o primer Clontech AP2 (SEQ ID NO: 9) e gsp2 (SEQID NO: 10) . Os parâmetros de ciclagem para a segunda sérieeram: 5 ciclos a 94 0C durante 2 segundos, em seguida a 72°Cdurante 3 minutos, em seguida 20 ciclos a 94°C durante 2segundos, e a 67°C durante 3 minutos e finalmente 7 minutosa 67°C. Aproximadamente 8 μΙ* de cada reação foram usados emum gel de agarose a 1,0%, e as faixas foram excisadas epurificadas com o kit Sephaglas™ BandPrep Kit (AmershamBiosciences) e clonadas dentro de um vetor TA (Invitrogen,San Diego, Calif.). Os clones foram seqüenciados paraverificação.

Exemplo 6: Ensaio transitório de inflorescênciafeminina

A indicação inicial da atividade do promotor 3419 foiobservada nos ensaios transitórios usando-se um sistematransitório de inflorescência feminina. 0 promotor 419 de949 pb e o 5' UTR de 152 pb (SEQ ID NO: 1) foramoperacionalmente conectados na frente tanto do gene de beta-glicuronidase (doravante GUS) e do gene de Zs-Amarelo (BDBioSciences) . As construções foram também preparados ligandooperacionalmente o intron AdhI 3' do promotor 419/UTR e 5'do gene de GUS ou de Zs-Amarelo.

As espigas provenientes de uma linhagem de milhoextremamente transformável foram colhidas da estufa noestágio do desenvolvimento indicado (a partir de 0 a 2 diasapós a polinização). A casca teve a superfície esterilizadacom etanol a 70% e as folhas foram retiradas, revelando asinflorescências femininas ligadas à espiga. 0 comprimento daespiga foi medido e os explantes foram preparados dentro deuma hora após a colheita da espiga. Foram preparadas placasde explantes destacados de inflorescência feminina usando-sefragmentos de 4 cm de 10 a 15 inf lorescência feminina(cortados a 1 cm da base da inflorescência) , colocadas nasuperfície do meio. Os explantes de inflorescência femininafixados eram constituídos por fragmentos de 1 cm de sabugodividido ao meio, sendo as inflorescências femininasaparadas até 5 cm a partir da base da inflorescência. O meioconsistia em agar em água a 0,7%, com ou sem ácido ascórbicoa 10 mg/L. Os explantes foram bombardeados dentro de duashoras após a colheita usando-se um sistema PDS-1000/He(DuPont Company, Wilmington, Del., USA). Para cadaconstrução de marcador usada nestes experimentos,precipitou-se 5 μL de DNA (1 μg/μL) com 50 μL de CaCl2 a2,5M e 20 μL de espermidina a 0,1M em 50 μL de partículas detungstênio (1,0 ym a uma densidade de partículas de 15 mg/mL).

Aproximadamente 600 ng de DNA por detonação foramfornecidos a 650 psi sob 27 polegadas de Hg de vácuo, a umadistância de 5 cm da placa de detenção. Duas a três réplicaspor espiga e uma a duas espigas por estágio desenvolvimentalforam tratadas para cada construção. As placas foramlacradas depois do bombardeio e armazenadas a 28-30°C noescuro durante 48 horas. Quarenta e oito horas depois dobombardeio, os explantes foram examinados para a expressãotransgênica. Os explantes bombardeados com construções deGUS foram tingidos com tampão de McCabe contendo DMSO e x-glicuronidase (McCabe, D. E. et al. (1988) Bio/Technology 6:923-926) durante 24 horas à temperatura ambiente antes de sefazerem as observações. Os explantes bombardeados comZsAmarelo (Clontech) foram observados com grandeamplificação usando-se um microscópio Leica ligado a umafonte de luz de xenônio, usando-se um filtro 30 paraZsAmarelo. Foram obtidas micrografias que representavam aresposta observada média.As inflorescências femininas destacadas forambombardeadas com ubi:GUS usando-se um protocolo padrão ecolocados sobre agar em água a 0,7%, mais ou menos 10 mg/Lde ácido ascórbico. Depois de 48 horas sobre o meio, asinflorescências femininas foram tingidas com Tampão deMcCabe contendo DMSO e x-glucuronidase durante 24 horasantes de se fazerem as observações. O número total demanchas azuis por inflorescência foi registrado para todasas inflorescências femininas por placa, quatro placas portratamento. O número médio de manchas azuis porinflorescência destacada era significativamente maiorusando-se meio de ágar me água contendo o ácido ascórbico(11 manchas por inflorescência), em comparação com asinflorescências femininas destacadas (3,5 manchas porinflorescência). As manchas tinham também tamanhos maiores eeram de aparência mais escura.

Deixando-se as inflorescências femininas ligadas aosabugo no meio de ágar em água contendo ácido ascórbicoverificou-se um aumento significativo na transformação emrelação as inflorescências femininas destacadas (19 a 23manchas por inflorescência contra 11 manchas porinflorescência). No entanto, a comparação entreinflorescências femininas aparadas e não aparadas, ou aadição de sacarose a 1,0% ao meio não apresentou nenhumaalteração significativa na transformação de inflorescênciafeminina ligadas ao sabugo.

Exemplo 7: Teste dos fragmentos truncados do promotorTrês fragmentos truncados do promotor 419 foram usadospara análises transitórias. Em cada caso, o fragmento depromotor foi fundido a 5' da região 5' UTR de 419 + proteínafluorescente ZsAmarelo. Estas construções de DNA forambombardeadas com plasmídeos. 0 promotor 419 de comprimentototal tendo 949 pb a montante de 5'UTR, foi analisado, assimcomo 3 fragmentos truncados de 602 pb (TRl, SEQ ID NO: 4),350 pb (TR2, SEQ ID NO: 5), e 129 pb (TR3, SEQ ID NO: 6).Este teste foi conduzido para se demonstrar que osfragmentos do promotor eram funcionais. Os bombardeios foramconduzidos conforme descrito nos métodos abaixo em trêsexperimentos separados com resultados análogos de cada vez.Os resultados de um experimento representativo são mostradosna tabela 1. O controle negativo que consistia na construçãode ZsAmarelo sozinho, continha a seqüência de codificaçãopara a proteína fluorescente sem nenhum elemento reguladorconhecido 5' . Um outro controle negativo consistia em umexplante que não tinha sido atingido com nenhuma construção.A versão TR3 do promotor 419 proporcionou somente 7% daexpressão do promotor de comprimento total provido.

Materiais e Métodos

Espigas não polinizadas de sete a dez centímetros deuma linhagem de milho extremamente transformável foramcolhidas da estufa. A casca teve a superfície esterilizadacom etanol a 70% e foi descascado, revelando asinflorescências femininas ligadas à espiga. 0 comprimento daespiga foi medido e os explantes foram preparados dentro deuma hora depois da colheita da espiga. As placas deexplantes de inflorescência feminina ligados consistiam emfragmentos de 1 cm do sabugo com inflorescência femininafixados aparados até 5 cm a partir da base dainflorescência. Os explantes foram colocados em um meio deagar em água a 0,7% contendo 10 mg/L de ácido ascórbico.

Para cada construção marcadora usada nestesexperimentos fez-se precipitar 5 μl, de DNA + água com 50 μlde CaCl2 a 2,5M e 20 μl de espermidina a 0,1M sobre 50 μl, departículas de tungstênio (1,0 pm com uma densidade departículas de 15 mg/mL) . Aproximadamente 3,8 χ IO8 nmol deDNA foi usado por detonação, fornecido ao tecido a 650 psi(4481, 59 kPa) , a 5 cm da placa de detenção. Para cadaexperimento, foram usadas 3 a 4 réplicas por espiga paracada construção. As placas foram lacradas depois dobombardeio e armazenadas a 28-30°C no escuro durante 48 a 72horas.

Observações e Coleta de Dados

Quarenta e oito a 72 horas depois do bombardeio, osexplantes foram examinados para a expressão transgênica. Osexplantes bombardeados com ZsYellow foram observados comalta ampliação usando-se um microscópio Leica ligado a umafonte de luz de xenônio usando-se um filtro de ZS Yellow(500/530) . As micrografias foram tiradas com tempos deexposição em que não ocorria nenhuma fluorescência de fundode controle. O número de manchas foi contado e registradouma resposta média.Tabela 1: Resultados do ensaio por Bombardeio para osfragmentos truncados de promotor

<table>table see original document page 72</column></row><table>Exemplo 8: Transformação de Milho por Bombardeio departículas e Regeneração de Plantas Transgênicas

Foram bombardeados embriões imaturos de milho,provenientes de plantas de casa de vegetação doadoras, comuma molécula de DNA contendo um promotor da invenção ligadooperacionalmente a um gene de interesse. Um marcador deseleção é provido no mesmo vetor de transformação, oualternativamente, o gene de marcador de seleção é provido emuma molécula de DNA separada. A transformação é conduzida doseguinte modo. As receitas dos meios seguem abaixo.

Preparação do Tecido Alvo

As espigas são descascadas e têm a superfícieesterilizada em alvejante Clorox™ a 30% acrescido dedetergente Micro a 0,5% durante 20 minutos, sendo entãoenxaguadas duas vezes com água estéril. Os embriões imaturossão excisados e colocados com o lado do eixo do embriãovoltado para baixo (lado do escutelo voltado para cima), 25embriões por placa sobre meio 560Y durante 4 horasalinhando-se então dentro de uma zona alvo de 2,5 cm empreparação para o bombardeio.

Preparação de DNA

Prepara-se um vetor de plasmídeo compreendendo umaseqüência de promotor da invenção. O vetor contém ainda umgene marcador de seleção PAT acionado por um promotor deCAMV35S e inclui um terminador de CAMV35S. Opcionalmente omarcador de seleção pode residir em um plasmídeo separado.Uma molécula de DNA compreendendo uma seqüência de promotorda invenção assim como um marcador de seleção PAT éprecipitado sobre grânulos de tungstênio de 1,1 ym (diâmetromédio) usando-se um procedimento de precipitação por CaCl2conforme segue:

100 uL de partículas de tungstênio preparado em água10 uL (1 ug) de DNA em tampão de Tris EDTA (1 yg totalde DNA)

100 uL de CaCl2 a 2 , 5M10 uL de espermidina a 0,1M

Cada reagente é acrescentado em seqüência a umasuspensão de partículas de tungstênio, mantendo-se o mesmosobre um vortex multitubos. A mistura final é rapidamentesonicada e deixa-se que se incube com uma rotação em cicloneconstante durante 10 minutos. Depois do período deprecipitação, rapidamente centrifugam-se os tubos, remove-seo líquido, lava-se com 500 mL de etanol a 100% e centrifuga-se durante 30 segundos. Novamente remove-se o líquido eacrescentara-se 105 yL de etanol a 100% ao pélete departículas de tungstênio final. Para o bombardeio compistola de partículas, as partículas de tungstênio/DNA sãorapidamente sonicadas e 10 yL pingados sobre o centro decada macrocarreador e colocadas para secar duranteaproximadamente 2 minutos antes do bombardeio.

Tratamento com Pistola de PartículasAs placas de amostras são bombardeadas a nível #4 napistola de partículas #HE34-1 ou #HE34-2. Todas as amostrasreceberam um único impacto a 650 psi (4481, 59 kPa) com umtotal de dez alíquotas tomadas de cada tubo de partículapreparadas/DNA.

Tratamento Subseqüente

Depois do bombardeio, os embriões são mantidos em meio560 Y durante 2 dias, sendo então transferidos para meio deseleção 560R contendo 3 mg/L de Bialafos, e sub-cultivados acada 2 semanas. Depois de aproximadamente 10 semanas deseleção, os clones de calo resistência a seleção sãotransferidos para meio 288J para iniciar a regeneração da planta. Depois da maturação somática do embrião (2-4semanas), os embriões somáticos bem desenvolvidos sãotransferidos para o meio para germinação e transferidos paraum recinto de cultura iluminado. Aproximadamente 7-10 diasmais tarde, as plântulas em desenvolvimento são transferidas para meio 272V isento de hormônio em tubos durante 7-10 diasaté as plântulas estarem bem estabelecidas. As plantas sãoentão transferidas para inserções em bandejas (equivalente aum vaso de 2,5" contendo solo para vasos e cultivadasdurante 1 semana em uma câmara de cultura, sendo subseqüentemente cultivadas durante outras 1-2 semanas nacasa de vegetação, sendo então transferidas para vasosclássicos 600 (1,6 galões) e cultivadas até maturidade. Asplantas são monitoradas e recebem uma contagem para aexpressão por ensaios conhecidos na técnica, tais como, porexemplo, imunoensaios e western blot com um anticorpo que seliga à proteina de interesse.

Bombardeio e Meios de Cultura

O meio de bombardeio (560Y) compreende 4,0 g/L de saisbasais N6 (SIGMA C- 1416), 1,0 mL/L de Eriksson's VitaminMix (1000 χ SIGMA-1511), 0,5 mg/L de tiamina HCl, 120,0 g/Lde sacarose, 1,0' mg/L de 2,4-D, e 2,88 g/L de L-prolina(levado ao volume com H2O dl depois do ajuste do pH para 5,8com KOH) ; 2,0 g/L de Gelrite™ (acrescentado depois de seter levado ao volume com H2O dl); e 8,5 mg/L de nitrato deprata (acrescentado depois da esterilização do meio eresfriamento até a temperatura ambiente) . O meio de seleção(560R) compreende 4,0 g/L de sais basais N6 (SIGMA C-1416) ,1,0 mL/L de Eriksson's Vitamin Mix (1000 χ SIGMA-1511), 0,5mg/L de tiamina HCl, 30.0 g/L de sacarose e 2,0 mg/L 2,4-D(levado ao volume com H2O dl depois de se ter ajustado o pHpara 5.8 com KOH) ; 3,0 g/L Gelrite™ (acrescentado depois dese ter chegado ao volume com H2O dl); e 0,85 mg/L de nitratode prata e 3,0 mg/L Bialafos (ambos acrescentados depois dese ter esterilizado o meio e se ter resfriado até atemperatura ambiente).

O meio de regeneração de planta (288J) compreende 4,3g/L de sais MS (GIBCO 11117-074), 5, 0 mL/L de solução deestoque de vitaminas em MS (0,100 g de ácido nicotinico,0,02 g/L de tiamina HCl, 0,10 g/L de piridoxina HCl, e 0,40g/L de glicina levado a volume com H2O deionizada)(Murashige e Skoog (1962) Physiol. Plant. 15:473), 100 mg/Lde mio-inositol, 0,5 mg/L de zeatina, 60 g/L de sacarose, e1,0 itiL/L de ácido abscísico a 0,1 mM (levado ao volume comH2O deionizada depois de se ter ajustado o pH para 5,6); 3,0g/L de Gelrite™ (acrescentado depois de se levar ao volumecom H2O deionizada); e 1,0 mg/L de ácido indolacético e 3,0mg/L Bialafos (acrescentado depois da esterilização do meioe do resfriamento até 60°C). O meio isento de hormônio(272V) compreende 4,3 g/L de sais MS (GIBCO 11117-074), 5,0mL/L de solução de estoque de vitaminas MS (0,100 g/L deácido nicotinico, 0,02 g/L de tiamina HCl, 0,10 g/L depiridoxina HCl, e 0,40 g/L de glicina levada a volume comH2O deionizada), 0,1 g/L de mio-inositol, e 40,0 g/L desacarose (levado ao volume com H2O deionizada depois de seter ajustado o pH para 5,6); e 6 g/L de Bacto-agar(acrescentado depois de se levar ao volume com H2Odeionizada), e esterilizado e resfriado até 60°C.

Exemplo 9: Transformação do Milho Mediada porAgrobacterium e Regeneração de Plantas Transgênicas

Para a transformação do milho mediada por Agrobacteriumcom uma seqüência de promotor da invenção, foi empregado ométodo de Zhao (patente US 5.981.840 e publicação de patentePCT W098/32326; cujo conteúdo é incorporado ao presentedocumento a titulo de referência). Resumindo, embriõesimaturos foram isolados do milho e colocados em contato comuma suspensão de Agrobacterium em condições em que abactéria seria capaz de transferir a seqüência de promotorda invenção para pelo menos uma célula de pelo menos um dosembriões imaturos (etapa 1: a etapa de infecção). Nestaetapa, os embriões imaturos foram imersos em uma suspensãode Agrobacterium para a iniciação da inoculação. Os embriõesforam co-cultivados durante um tempo com o Agrobacterium(etapa 2: a etapa de co-cultivo). Os embriões imaturos foramcultivados em meio sólido depois da etapa de infecção.

Depois do período de co-cultivo, foi conduzida uma etapaopcional de "repouso". Nesta etapa de repouso, os embriõesforam incubados na presença de pelo menos um antibióticoconhecido como inibindo o crescimento de Agrobacterium sem aadição de um agente seletivo para transformantes vegetais(etapa 3: etapa de repouso). Os embriões imaturos foramcultivados sobre meio sólido com antibiótico, mas sem umagente seletor, para a eliminação de Agrobacterium e parauma fase de repouso para as células infectadas. Em seguida,os embriões inoculados foram cultivados sobre meio contendoum agente seletivo e o calo transformado em crescimento foirecuperado (etapa 4: a etapa de seleção). Os embriõesimaturos foram cultivados sobre meio sólido com um agenteseletivo resultando no crescimento seletivo de célulastransformadas. O calo foi então regenerado em plantas (etapa5: a etapa de regeneração), e calos cultivados sobre meioseletivo foram cultivados sobre meio sólido para regeneraras plantas.

Exemplo 10: Atividade transgênica estável do promotor"419" e 5' UTR (SEQ ID #1) no milhoA fim de se determinar a atividade temporal e espacialdo promotor 419 acrescido de 5'UTR (SEQ ID NO: 1) em tecidodiferenciado em desenvolvimento foram introduzidas duasconstruções de expressão GUS (GUS1 e GUS2) contendo opromotor 419 e 5'UTR separadamente em uma linhagemextremamente transformável do milho, usando-se Agrobacterium(veja Exemplo 9): Uma das duas construções (GUS2) continha ointron ADHI do milho. A construção UBI:GUS foi usada comocontrole.

Aproximadamente 20 eventos TO do calo foram geradosusando-se cada construção. Embriões somáticos foram de talmodo escolhidos que fossem regeneradas por evento trêsplantas, pressupostamente clonais. Para a maioria doseventos uma planta teve uma amostra tirada de mododestrutivo no estágio VlO (pré-floração) , um no Rl (defloração) e um foi auto-polinizado para a produção desementes Tl. Foram conduzidos ensaios histoquimicos ebioquímicos (veja métodos de ensaio MUG, abaixo).

A atividade do promotor 419 no estágio VlO éapresentada na Figura 1 em termos de atividade MUG. Em todosos casos, a atividade MUG é apresentada como uma taxa deacúmulo de produto normalizada para o teor de proteína doensaio. As taxas mostradas na Figura 1 são médias deamostras tiradas de tantos dos 20 eventos gerados porconstrução quantos eram possíveis, geralmente de 15-18; asbarras de erro representam erro padrão.

Em comparação com a expressão acionada por promotor deubiquitina bem caracterizado constitutivo do milho, opromotor 419 é muito ativo na bainha da folha, na língula ena aurícula, com níveis muito inferiores na lâmina da folha,a presença do íntron ADHI do milho resultou em uma atividadeacentuada do promotor, variando de aproximadamente 0,5 a 3vezes, dependendo do tecido.

A expressão das construções GUSl e GUS2 no estágio Rl(de floração) é observada na Figura 2. A expressão nesteestágio ocorre principalmente nos tecidos da língula, dascascas e do caule.

A análise de Tl quanto a atividade do promotor 419 seconcentrou na construção GUS contendo o íntron ADHl devido àacentuação observada neste material a partir de experimentosde expressão anteriores. As amostras de 2 ou 3 plantas Tl(isto é, irmãs) provenientes de 3 ou 4 eventos TO diferentesque expressavam foram testadas nos estágios V10, Rl edurante a maturação dos grãos. Foram observados altos níveisde atividade de promotor 419 na raiz, no nó do caule, nabainha da folha e na junta da folha (aurícula e língulajuntas) no estágio VlO conforme mostrado na Figura 3. Noestágio rl, conforme mostrado na Figura 4, a atividade dopromotor é caracterizada por expressão forte no nó do caule,na bainha da folha e na raiz. Quando analisado por evento,observa-se alguma variabilidade entre eventos e plantasirmãs na geração TI.

A atividade do promotor 419 no tecido reprodutor foideterminada histoquimicamente. Nos cachos pré-meióticoscontendo a construção GUS2, as paredes das anteras se tingemde azul e o tecido das glumas circundante não se tinge. Nodesprendimento de pólen, o padrão é invertido. As glumas setingem com uma cor escura. Nenhuma expressão foi observadanas anteras nem no pólen. A atividade de promotor 419 emórgãos femininos no estágio Rl é restrita as inflorescênciasfemininas, aumentando a níveis muito altos na base dainflorescência, nas pontas dos glumes circundantes e emmanchas de tecido do sabugo na periferia do sabugo, naregião entre o pedicelo (ou base) de cada ovário. Aatividade do promotor nos grãos em desenvolvimento atingemáximos ao redor de 21 dap e é restrita ao pericarpo na basedo grão.

Protocolos de Ensaio MUG

Amostras de tecido foram coletadas em tubos demicrotitulação e armazenadas a -80°C até o dia do ensaio. Nodia do ensaio, acrescentou-se a cada tubo 200 yL de tampãode lise (fosfato de sódio a 50mM, EDTA a IOmM, Triton a 1% ebeta-mercapto-etanol a 0,07 %) e um BB de 1/16" (0,16 cm).Depois do tecido ter sido triturado durante 60 segundos a800 golpes por minuto, coletou-se aproximadamente 150 μΐ,depois de 15 minutos de centrifugação a 5200 rpm. Os ensaiosMUG em placas de microtitulação foram conduzidos emduplicata para cada extrato de amostras usando-se um volumede reação de 100 pL contendo 25 yL do extrato e MUG a ImM(Sigma) para cada ponto no tempo. As placas foram incubadasem Fluorskan Ascent® FL (Thermo Labsystems) durante 55minutos, em que as reações foram interrompidas depois de 10,25 e 55 minutos com o tampão de interrupção (Na2CC>3 a 0,2M)e a fluorescência para todas as amostras foi lida depois doponto no tempo de 55 minutos (filtro ajustado: 355 nm deexcitação, 4 60 nm de emissão) . A concentração de MUG foideterminada por uma curva padrão contendo seis padrões de MUpreparados em água. A atividade de GUS foi calculadatirando-se a média da inclinação da produção de MU a partirde reações das amostras. Veja, por exemplo, Gallagher, S. R.

(1992) GUS Protocols. Using the GFUS gene as a Repórter ofGene expression. (Boston: Academic Press, p. 221).

As concentrações de proteína foram determinadas usando-se o kit Bio-Rad Bradford Protein Assay kit (Bio-Rad)misturando-se 1 pL de extrato de amostras em um volume dereação de 200 yL, e fazendo-se a leitura em umespectrofotômetro padrão, juntamente com padrões de proteínade BSA. As amostras foram preparadas para incidir dentro doslimites lineares do ensaio.

Todas as publicações e pedidos de patentes mencionadosno presente relatório são indicadores do nível dos versadosna técnica a que esta invenção pertence. Todas aspublicações e pedidos de patentes são incorporados aopresente documento a título de referência na mesma medida emque seriam se cada publicação individual ou pedido depatente individual tivesse sido específica e individualmenteindicada ou indicado como sendo incorporado ao presentedocumento a título de referência.

Embora a invenção anterior tenha sido descrita emalguns detalhes como ilustração e exemplo para fins declareza da compreensão, será obvio que certas mudanças emodificações podem ser praticadas dentro do escopo dasreivindicações em anexo.LISTAGEM DE SEQÜÊNCIAS

<110> Requerente: Pioneer Hi-Bred International, Inc.

<120> Titulo: MOLÉCULA DE ÁCIDO NUCLÉICO ISOLADA, CONSTRUÇÃO DE DNA, VETOR,CÉLULA VEGETAL, PLANTA, SEMENTE, MÉTODOS PARA EXPRESSAR UMA SEQÜÊNCIA DENUCLEOTÍDEO EM UMA PLANTA, EM UMA CÉLULA VEGETAL, MÉTODO DE EXPRESSÃO SELETIVA

<130> Referência do Documento: 1906-PCT

<150> No. do Pedido de Prioridade: 60/729,772

<151> Data de depósito do Pedido de Prioridade: 24-10-2005

<160> Quantidade de SEQ ID Nos.: 11

<170> Software: FastSEQ for Windows Version 4.0

<210> SEQ ID No: 1

<211> Comprimento: 1101

<212> Tipo: DNA

<213> Organismo: Zea mays

<220> Características:

<221> Nome/chave: misc_feature

<222> Localização: (0)...(0)

<223> Outras informações: promotor 419 com região 5'não traduzida

<400> Seqüência: 1

tcgacggccc ggtgctctgg gctggacggt ccgccagtgg caacactttc ttcttgtctt 60

ggactttgct tgatactcgt tgatcttcac atatggtctt cttaatgtct tcctttgagg 120

ttttgcttcc tcaatgcctt agtccaagtc gttttagcat catactacaa acacaaaccc 180

tatcaatcac attagttcac gggctatgtt gataatcaaa catcaaaatc aattagtcaa 240

atgggtgagg tccatttttc ttacatatcc gacggctgtc gctagggccg taggacttaa 300

ctgttacttt cgacggctac taggtaccgt cggatataac atagctgtcg acggtttctt 360

acaaagtcgt cgtacatttc ctgttttatt gttttgggga ggggctggtc agttgcagtg 420

acgatataga tttgacgttg acaaagatac acgtagaaag tagaataatt atattccacg 480

gtggccgttc cctgctttgt gcacgttgct attttttttt gaaaatattg tgctgtttgg 540

ttcacatatt ggtaacgtaa tgggtaaccg ataacgttaa atcatatttg tttaagttaa 600

ccgtaatcga tagtacacta taaaatggat accgccttat ttaaatttgt tatcaccggt 660

attcaagtat gaatcattat cattatcatt tacgttatat ttcgtgaacc caaagacacc 720

tacgtggttg tgttatctta attgtcacgt actcccaacc accatgttca gtacgaatgt 780

catgtggaga aagaagcgtc tagctaccta cctacccgca ccgaattgaa cacagtaata 840

cattccaata atcgcgtcac tgtacgtgaa gcagcgtgta tcacgttgga tctaacacta 900

taaataccac caggcttcaa gcgtccctcc tcactccaaa ctccaaagcc aacaaacaga 960

gctccaactc agaaagcatc cgtcccttgg cagcagcaac aagctactag ctatgtgtgt 1020

ttagagcgag cgagggaaaa aaaagaaaac atctaagata tactccatca tcttcgtttg 1080

attagcccgc ccagtaaagc c 1101

<210> SEQ ID No: 2<211> Comprimento: 152<212> Tipo: DNA<213> Organismo: Zea mays

<220> Características:<221> Nome/chave: misc_feature

<222> Localização: (0)...(0)

<223> Outras informações: região 5' não traduzida do promotor 419

<400> Seqüência: 2

caacaaacag agctccaact cagaaagcat ccgtcccttg gcagcagcaa caagctacta 60gctatgtgtg tttagagcga gcgagggaaa aaaaagaaaa catctaagat atactccatc 120atcttcgttt gattagcccg cccagtaaag cc 152

<210> SEQ ID No: 3

<211> Comprimento: 949

<212> Tipo: DNA

<213> Organismo: Zea mays

<220> Características:

<221> Nome/chave: misc_feature

<222> Localização: (0)...(0)

<223> Outras informações: promotor 419 sem a região 5' não traduzida

<400> Seqüência: 3

tcgacggccc ggtgctctgg gctggacggt ccgccagtgg caacactttcggactttgct tgatactcgt tgatcttcac atatggtctt cttaatgtctttttgcttcc tcaatgcctt agtccaagtc gttttagcat catactacaatatcaatcac attagttcac gggctatgtt gataatcaaa catcaaaatcatgggtgagg tccatttttc ttacatatcc gacggctgtc gctagggccgctgttacttt cgacggctac taggtaccgt cggatataac atagctgtcgacaaagtcgt cgtacatttc ctgttttatt gttttgggga ggggctggtcacgatataga tttgacgttg acaaagatac acgtagaaag tagaataattgtggccgttc cctgctttgt gcacgttgct attttttttt gaaaatattgttcacatatt ggtaacgtaa tgggtaaccg ataacgttaa atcatatttgccgtaatcga tagtacacta taaaatggat accgccttat ttaaatttgtattcaagtat gaatcattat cattatcatt tacgttatat ttcgtgaacctacgtggttg tgttatctta attgtcacgt actcccaacc accatgttcacatgtggaga aagaagcgtc tagctaccta cctacccgca ccgaattgaacattccaata atcgcgtcac tgtacgtgaa gcagcgtgta tcacgttggataaataccac caggcttcaa gcgtccctcc tcactccaaa ctccaaagc

ttcttgtctt 60tcctttgagg 120acacaaaccc 180aattagtcaa 240taggacttaa 300acggtttctt 360agttgcagtg 420atattccacg 480tgctgtttgg 540tttaagttaa 600tatcaccggt 660caaagacacc 720gtacgaatgt 780cacagtaata 840tctaacacta 900949

<210> SEQ ID No: 4<211> Comprimento: 602<212> Tipo: DNA<213> Organismo: Zea mays

<220> Características:

<221> Nome/chave: misc_feature

<222> Localização: (0)...(0)

<223> Outras informações: truncagem de 602 pb do promotor 419.<400> Seqüência: 4

tcgacggttt cttacaaagt cgtcgtacat ttcctgtttt attgttttgg ggaggggctg 60gtcagttgca gtgacgatat agatttgacg ttgacaaaga tacacgtaga aagtagaata 120attatattcc acggtggccg ttccctgctt tgtgcacgtt gctatttttt tttgaaaata 180ttgtgctgtt tggttcacat attggtaacg taatgggtaa ccgataacgt taaatcatat 240ttgtttaagt taaccgtaat cgatagtaca ctataaaatg gataccgcct tatttaaatt 300tgttatcacc ggtattcaag tatgaatcat tatcattatc atttacgtta tatttcgtga 360acccaaagac acctacgtgg ttgtgttatc ttaattgtca cgtactccca accaccatgt 420tcagtacgaa tgtcatgtgggaacacagta atacattccaggatctaaca ctataaatacgc

agaaagaagc gtctagctacataatcgcgt cactgtacgtcaccaggctt caagcgtccc

ctacctaccc gcaccgaatt 480gaagcagcgt gtatcacgtt 540tcctcactcc aaactccaaa 600

602

<210> SEQ ID No: 5<211> Comprimento: 351<212> Tipo: DNA<213> Organismo: Zea mays

<220> Características:

<221> Nome/chave: misc_feature

<222> Localização: (0)...(0)

<223> Outras informações: truncagem de 350 pb do promotor 419<400> Seqüência: 5

aaccgtaatc gatagtacac tataaaatgg ataccgcctt atttaaattt gttatcaccg 60gtattcaagt atgaatcatt atcattatca tttacgttat atttcgtgaa cccaaagaca 120cctacgtggt tgtgttatct taattgtcac gtactcccaa ccaccatgtt cagtacgaat 180gtcatgtgga gaaagaagcg tctagctacc tacctacccg caccgaattg aacacagtaa 240tacattccaa taatcgcgtc actgtacgtg aagcagcgtg tatcacgttg gatctaacac 300tataaatacc accaggcttc aagcgtccct cctcactcca aactccaaag c 351

<210> SEQ ID No: 6<211> Comprimento: 129<212> Tipo: DNA<213> Organismo: Zea mays

<220> Características:

<221> Nome/chave: misc_feature

<222> Localização: (0)...(0)

<223> Outras informações: truncagem de 129 pb do promotor 419<400> Seqüência: 6

ccgaattgaa cacagtaata cattccaata atcgcgtcac tgtacgtgaa gcagcgtgta 60tcacgttgga tctaacacta taaataccac caggcttcaa gcgtccctcc tcactccaaa 120ctccaaagc 129

<210> SEQ ID No: 7<211> Comprimento: 390<212> Tipo: PRT<213> Organismo: Zea mays

<220> Características:<221> Nome/chave: PEPTIDE<222> Localização: (0)...(0)

<223> Outras informações: Tradução predita da proteína expressa pelogene 419 da superfamília GDSL

<400> Seqüência: 7

Met Gly Thr Asn Tyr Arg Ala Val Ile Ser Leu Val Leu Leu Val Cys

15 10 15

Ile Ala Ser Arg Ser Ser Leu Gly Ala Ala Glu Thr Asp Val Glu Gln

20 25 30

Lys Arg Ser Ser Val Pro Leu Met Phe Val Phe Gly Asp Ser Leu Val35 40 45

Asp Val Gly Asn Asn Asn Phe Leu Pro Pro Pro Ala Pro Arg Ala Ala

50 55 60

Ser Pro Tyr Gly Ile Asp Phe Pro Ser Gly Thr Pro Gly Ala Val Ser

65 70 75 80

Gly Arg Phe Thr Asn Gly Tyr Asn Leu Ala Asp Leu Val Ala Arg Arg

85 90 95

Leu Gly Phe Lys Met Ser Pro Pro Ala Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Val

100 105 110

Ser Lys Phe Asp Leu Phe Thr Cys Arg Ile Gly Ala Asn Tyr Ala Ser

115 120 125

Gly Gly Ser Gly Ile Leu Asn Thr Thr Gly Asn Gly Thr Leu Thr Leu

130 135 140

Gln Lys Gln Ile Thr Leu Phe Ser Lys Thr Lys Ala Arg Met Ser Trp

145 150 155 160

Ala Arg Cys Lys Leu Ser Ser Met Val Ser Arg Ser Leu Phe Leu Ile

165 170 175

Ser Ala Gly Gly Asn Asp Phe Ser Ala Phe Ser Glu Met Gly Met Gly

180 185 190

Glu Gln Asp Ala Pro Ala Tyr Ile Ser Ser Met Val Ser Thr Tyr Val

195 200 205

Gln His Ile Asp Ala Leu Tyr Lys Leu Gly Ala Arg Arg Leu Gly Ile

210 215 220

Leu Asp Val Pro Ala Ile Gly Cys Thr Pro Gly Ser Arg Val Pro Met

225 230 235 240

Ala Asn Gly Gly Cys Asn Asp Ala Ala Asn Ser Met Ala Gln Asn Phe

245 250 255

Asn Arg Leu Leu Arg Leu Glu Val Ala Lys Ala Val Ala Ser Ser Met

260 265 270

Pro Gly Met Lys Tyr Ser Ile Ala Ser Thr Tyr Asn Phe Val Thr Asp

275 280 285

Leu Met Asn Ser His Leu Val Ala Gly Leu Arg Val Val Asp Arg Ala

290 295 300

Cys Cys Gly Ser Gly Lys Leu Asn Ala Ala Val Met Cys Ala Gln Pro

305 310 315 320

Asn Thr Thr Tyr Cys Ser Asp Arg Asp Asp Tyr Met Phe Trp Asp Met

325 330 335

Leu His Pro Thr Gln Ala Thr Asn Glu Arg Gly Val Val Ala Ile Phe

340 345 350

Tyr Gly Pro Gln Glu Tyr Ala Asp Pro Ile Asn Phe Ala Gln Leu Ala

355 360 365

Ala Ala Thr Ala Asn Asp Asp Asp Asp Ile Asn Thr Ala Met Thr Ala

370 375 380

Gly Val Tyr Ala Ala Ile

385 390

<210> SEQ ID No: 8<211> Comprimento: 22<212> Tipo: DNA

<213> Organismo: Seqüência Artificial<220> Características:

<223> Outras informações: Oligonucleotídeo iniciador Clontech APl

<400> Seqüência: 8gtaatacgac tcactatagg gc<210> SEQ ID No: 9

<211> Comprimento: 26

<212> Tipo: DNA

<213> Organismo: Seqüência Artificial<220> Características:

<223> Outras informações: Oligonucleotideo iniciador gspl gene specífico

<400> Seqüência: 9

ccagcgaatc accgaacaca aacatc 26

<210> SEQ ID No: 10

<211> Comprimento: 19

<212> Tipo: DNA

<213> Organismo: Seqüência Artificial

<220> Características:

<223> Outras informações: Oligonucleotideo iniciador Clontech AP2

<400> Seqüência: 10

actatagggc acgcgtggt 19

<210> SEQ ID No: 11

<211> Comprimento: 26

<212> Tipo: DNA

<213> Organismo: Seqüência Artificial

<220> Características:

<223> Outras informações Oligonucleotideo iniciador gsp2 gene specífico

<400> Seqüência: 11gcttctgctc aacgtcagtt tcagcg

Claims (30)

1. Molécula de ácido nucléico isolada caracterizadapor compreender uma seqüência de nucleotideo selecionada dogrupo consistindo de:a) Uma seqüência de nucleotideo compreendendo aseqüência definida em SEQ ID N0:1, SEQ ID N0:2,SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 ou SEQID NO: 6, ou um complemento destas;b) Uma seqüência de nucleotideo compreendendo aseqüência promotora vegetal compreendida noDepósito de Patente No. NRRL B-30879, ou umcomplemento desta;c) Uma seqüência de nucleotideo compreendendo umfragmento da seqüência definida em SEQ ID N0:1,na qual a referida seqüência inicia atranscrição em uma célula vegetal, e;d) Uma seqüência de nucleotideo compreendendo umaseqüência apresentando pelo menos 90% deidentidade de seqüência com a seqüênciadefinida em SEQ ID N0:1, na qual a referidaseqüência inicia a transcrição em uma célulavegetal.

2. Construção de DNA caracterizada por compreenderuma seqüência de nucleotideo de acordo com a reivindicação 1operacionalmente ligada a uma seqüência de nucleotideosheteróloga de interesse.

3. Vetor caracterizado por compreender a construçãode DNA da reivindicação 2.

4. Célula vegetal caracterizada por ter estavelmenteincorporado em seu genoma a construção de DNA dareivindicação 2.

5. Célula vegetal de acordo com a reivindicação 4,caracterizada pelo fato de que a referida célula vegetal éde uma monocotiledônea.

6. Célula vegetal de acordo com a reivindicação 5,caracterizada pelo fato de que a referida monocotiledônea émilho.

7. Célula vegetal de acordo com a reivindicação 4,caracterizada pelo fato de que a referida célula vegetal éde uma dicotiledônea.

8. Planta caracterizada por ter estavelmenteincorporado em seu genoma a construção de DNA dareivindicação 2.

9. Planta de acordo com a reivindicação 8,caracterizada pelo fato de que a referida planta é umamonocotiledônea.

10. Planta de acordo com a reivindicação 9,caracterizada pelo fato de que a referida monocotiledônea émilho.

11. Planta de acordo com a reivindicação 8,caracterizada pelo fato de que a referida planta é umadicotiledônea.

12. Semente transgênica da planta de acordo com areivindicação 8, caracterizada pelo fato de que a referidasemente compreende a construção de DNA.

13. Planta de acordo com a reivindicação 8,caracterizada pelo fato de que a seqüência de nucleotideoheteróloga de interesse codifica um produto gênico queconfere resistência a herbicida, sal, frio, seca, patógenoou inseto.

14. Método para expressar uma seqüência de nucleotideoem uma planta, caracterizado pelo fato de que o referidométodo compreende introduzir uma construção de DNA em umaplanta, a referida construção de DNA compreendendo umpromotor e operacionalmente ligada ao referido promotor umaseqüência de nucleotideo heteróloga de interesse, onde oreferido promotor compreende uma seqüência de nucleotideoselecionada a partir do grupo consistindo de:a) Uma seqüência de nucleotideo compreendendo aseqüência definida em SEQ ID N0:1, SEQ ID NO:-3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 ou SEQ ID NO: 6,ou um complemento destas;b) Uma seqüência de nucleotideo compreendendo aseqüência promotora vegetal compreendida noDepósito de Patente No. NRRL B-30879, ou umcomplemento desta;c) Uma seqüência de nucleotideo compreendendo umfragmento da seqüência definida em SEQ ID N0:1,na qual a referida seqüência inicia atranscrição em uma célula vegetal, e;d) Uma seqüência de nucleotideo compreendendo umaseqüência apresentando pelo menos 90% deidentidade de seqüência com a seqüênciadefinida em SEQ ID NO:l, na qual a referidaseqüência inicia a transcrição em uma célulavegetal.

15. Método de acordo com a reivindicação 14,caracterizado pelo fato de que a referida seqüência denucleotideo heteróloga de interesse é seletivamente expressaem raiz, nós de talo, epiderme interna da bainha foliar,glumas de inflorescência, inflorescência feminina, e emtecido vascular de sabugo abaixo dos pontos de fixação.

16. Método de acordo com a reivindicação 14,caracterizado pelo fato de que a referida planta é umadicotiledônea.

17. Método de acordo com a reivindicação 14,caracterizado pelo fato de que a referida planta é umamonocotiledônea.

18. Método de acordo com a reivindicação 17,caracterizado pelo fato de que a referida monocotiledônea émilho.

19. Método de acordo com a reivindicação 14,caracterizado pelo fato de que a seqüência de nucleotideoheteróloga de interesse codifica um produto gênico queconfere resistência a herbicida, sal, frio, seca, patógenoou inseto.

20. Método para expressar uma seqüência de nucleotideoem uma célula vegetal, caracterizado pelo fato de que oreferido método compreende introduzir em uma célula vegetal,uma construção de DNA compreendendo um promotoroperacionalmente ligado a uma seqüência de nucleotideoheteróloga de interesse, onde o referido promotor compreendeuma seqüência de nucleotideo selecionada a partir do grupoconsistindo de:a) Uma seqüência de nucleotideo compreendendo aseqüência definida em SEQ ID NO:l, SEQ ID NO:-3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 ou SEQ ID NO: 6,ou um complemento destas;b) Uma seqüência de nucleotideo compreendendo aseqüência promotora vegetal compreendida noDepósito de Patente No. NRRL B-30879, ou umcomplemento desta;c) Uma seqüência de nucleotideo compreendendo umfragmento da seqüência definida em SEQ ID NO:l,na qual a referida seqüência inicia atranscrição em uma célula vegetal, e;d) Uma seqüência de nucleotideo compreendendo umaseqüência apresentando pelo menos 90% deidentidade de seqüência com a seqüênciadefinida em SEQ ID N0:1, na qual a referidaseqüência inicia a transcrição em uma célulavegetal.

21. Método de acordo com a reivindicação 20,caracterizado pelo fato de que a referida célula vegetal éde uma monocotiledônea.

22. Método de acordo com a reivindicação 21,caracterizado pelo fato de que a referida monocotiledônea émilho.

23. Método de acordo com a reivindicação 20,caracterizado pelo fato de que a referida célula vegetal éde uma dicotiledônea.

24. Método de acordo com a reivindicação 20,caracterizado pelo fato de que a seqüência de nucleotideoheteróloga codifica um produto gênico que confereresistência a herbicida, sal, frio, seca, patógeno ouinseto.

25. Método de expressão seletiva, caracterizado porexpressar seletivamente uma seqüência de nucleotideo em raizvegetal, nós de talo, epiderme interna da bainha foliar,glumas de inflorescência, inflorescência feminina, e emtecido vascular de sabugo abaixo dos pontos de fixação, oreferido método compreendendo introduzir uma construção deDNA em uma célula vegetal, e regenerar uma plantatransformada a partir da referida célula vegetal, a referidaconstrução de DNA compreendendo um promotor e uma seqüênciade nucleotideo heteróloga operacionalmente ligada aoreferido promotor, onde o referido promotor compreende umaseqüência de nucleotideo selecionada a partir do grupoconsistindo de:a) Uma seqüência de nucleotideo compreendendo aseqüência definida em SEQ ID N0:1, SEQ ID NO:-3, SEQ ID NO: 4, ou SEQ ID NO: 5, ou umcomplemento destas;b) Uma seqüência de nucleotideo compreendendo aseqüência promotora vegetal compreendida noDepósito de Patente No. NRRL B-30879, ou umcomplemento desta;c) Uma seqüência de nucleotideo compreendendo umfragmento da seqüência definida em SEQ ID N0:1,na qual a referida seqüência inicia atranscrição em uma célula vegetal, e;d) Uma seqüência de nucleotideo compreendendo umaseqüência apresentando pelo menos 90% deidentidade de seqüência com a seqüênciadefinida em SEQ ID N0:1, na qual a referidaseqüência inicia a transcrição em uma célulavegetal.

26. Método de acordo com a reivindicação 25,caracterizado pelo fato de que a expressão da referidaseqüência de nucleotídeo heteróloga altera o fenótipo daplanta.

27. Método de acordo com a reivindicação 25,caracterizado pelo fato de que a planta é umamonocotiledônea.

28. Método de acordo com a reivindicação 27,caracterizado pelo fato de que a monocotiledônea é milho.

29. Método de acordo com a reivindicação 25,caracterizado pelo fato de que a planta é uma dicotiledônea

30. Método de acordo com a reivindicação 25,caracterizado pelo fato de que a seqüência de nucleotídeoheteróloga codifica um produto gênico que confereresistência a herbicida, sal, frio, seca, patógeno ouinseto.