BRPI0617775A2 - sistemas de liberação de fármaco - Google Patents

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BRPI0617775A2
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delivery systems
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signal
particulate
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BRPI0617775-1A
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Seiler Matthias
Windhab Norbert
Stickler Manfred
Petereit Hans-Ulrich
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Evonik Degussa Gmbh
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Abstract

<B>SISTEMAS DE LIBERAçãO DE FáRMACO<D>A presente invenção refere-se a novos sistemas de liberação de medicamento particulados com base em um suporte polimérico contendo pelo menos um polímero linear, ramificado ou reticulado em uma fração de mais de 50 por cento em peso em relação ao peso total do suporte. O siste- ma é caracterizado pelo fato de que pelo menos uma substância de sinal para o transporte através de uma barreira biologia e pelo menos um ingredi- ente são armazenados, o suporte, a substância de sinal e o ingrediente não tendo nenhuma ligação covalente e nenhuma ligação coordenativa específi- ca do ingrediente e específica da substância de sinal entre um com o outro.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "SISTEMASDE LIBERAÇÃO DE FÁRMACO".
A presente invenção refere-se a novos sistemas de liberação defármacos baseados em veículos poliméricos, em particular veículos ramifi-cados, reticulados ou dendríticos que compreendem tanto pelo menos umingrediente ativo quanto pelo menos uma substância de sinal, onde o veícu-lo, ingrediente ativo e substância de sinal não são especificamente ligadosentre si ou juntamente complementares.
Um dos maiores problemas no tratamento médico de doenças érepresentado pelo transporte direcionado de ingredientes ativos para dentrodo sítio alvo doente, isto é, dentro de um tecido, um órgão ou dentro das cé-lulas apropriadas. As membranas são neste contexto as barreiras mais im-portantes que protegem o sítio alvo (sítio de ação) das substâncias ativas aserem transportadas. Um outro problema é a degradação ou derivatizaçãodos ingredientes ativos livres no corpo. Uma tal metabolização reduz ou mui-tas vezes bloqueia um efeito farmacológico direcionado dos ingredientesativos no sítio alvo. Além disso, os ingredientes ativos incorretamente distri-buídos ou alterados podem, especialmente se eles tiverem toxicidade localou sistêmica, conduzir a efeitos secundários indesejáveis no organismo.
Um caminho que já foi tentado para evitar estas desvantagens éa produção de formulações de ingrediente ativo particuladas, onde o ingredi-ente ativo está presente ligado em uma estrutura ou matriz polimérica (Ni-shiyama et al., Drug Discovery Today: Technologies (2005), 2(1), 21-26. Pu-blisher: Elsevier B.V.). Geralmente é possível a este respeito distinguir veícu-los de volume puros em que o ingrediente ativo é fechado em um tipo devesícula recipiente polimérica de veículos poliméricos quimicamente funcio-nalizados na qual os ingredientes individuais, por exemplo, ingredientes ati-vos ou substâncias de sinal, são quimicamente ligados ao veículo funcionali-zado (tipo matriz).
O transporte do ingrediente ativo para dentro do tecido doenteocorre no caso de simples formulações de veículo/ingrediente ativo mediantea simples liberação e difusão (equilíbrio). A fim de melhorar a orientação dosingredientes ativos particulares para o alvo, freqüentemente as substânciasde sinal são ligadas covalentemente ou pela coordenação com o ingredienteativo ou com o veículo, em cujo caso a substância de sinal se liga especifi-camente às membranas celulares do tecido doente e inicia a absorção en-docitótica descrita do ingrediente ativo dentro da célula (por exemplo, WO2005/084158, WO 2004/072153, Pitard, B. et al., Proceedings of the NationalAcademy of Sciences of the United States of America (1999), 96(6), 2621-2626).
Embora seja possível mediante a ligação das substâncias desinal que iniciam a absorção endocitótica do ingrediente ativo ou do sistemade transporte particulado para melhorar a orientação do ingrediente ativo aoalvo em comparação com a absorção puramente difusional, novos proble-mas também são gerados pela funcionalização química do veículo e pelaligação, covalentemente ou por coordenação, da substância de sinal com oingrediente ativo.
Assim, em particular, a otimização dos ingredientes farmacêuti-cos ativos é necessária em relação à sua absorção, distribuição, metabolis-mo e excreção (parâmetros ADME) e em relação ao seu «feito e toxicidade.A ligação de uma substância sinal com o ingrediente ativo freqüentementealtera estas propriedades, e o ingrediente ativo pode assim ser restrito nasua capacidade de utilização farmacêutica ou mesmo se torna inútil. A liga-ção de um ingrediente ativo a um veículo funcionalizado geralmente dá ori-gem a problemas similares. Além disso, o veículo, substância de sinal e in-grediente ativo freqüentemente requerem funcionalização extra adequada demodo a tornar a ligação específica apropriada possível. Tais veículos e subs-tâncias de sinal quimicamente funcionalizadas conseqüentemente permitemapenas combinações de veículo restrito, substância de sinal, ingrediente ati-vo. Além do mais, estes sistemas de liberação de fármaco são complicadospara se produzir, e o ingrediente ativo deve, se for covalentemente ligado oupela coordenação à substância de sinal ou ao veículo, geralmente ser quimi-camente liberado no sítio alvo. A ligação, covalentemente ou pela coordena-ção, de uma substância de sinal ou veículo além do mais resulta em um no-vo ingrediente ativo químico que requer teste clínico elaborado.
O objetivo da presente invenção seria agora fornecer novos sis-temas de liberação de fármaco que tornam o transporte direcionado de in-grediente ativo através de barreiras biológicas possível e que eliminam pelomenos alguns dos problemas mencionados.
Foi surpreendentemente observado neste contexto que é sufici-ente utilizar sistemas de liberação de fármaco particulados baseados em umveículo polimérico ramificado ou reticulado que não são especificamente a-gregados tanto com os ingredientes ativos respectivamente empregadosquanto com as substâncias de sinal utilizadas, sem a necessidade de liga-ção, covalentemente ou pela coordenação, da substância de sinal com oingrediente ativo ou com o veículo.
Embora os modelos endocitóticos e difusores que foram debati-dos até esta data não tenham sido capazes de explicar o transporte de in-grediente ativo através das membranas biológicas sem contradição, foi taci-tamente assumido até esta data que uma ligação específica deve existir en-tre o ingrediente ativo e a substância de sinal iniciadora do transporte e entrea substância de sinal e as outras unidades de fusão ou entre a substância desinal e o veículo contendo ingrediente ativo com relação ao transporte endo-citótico de um ingrediente ativo através de uma membrana celular, havendotransporte dentro da célula no primeiro caso diretamente do ingrediente ativoe no segundo caso do veículo com o ingrediente ativo. No entanto, de acor-do com a presente invenção, um tal acoplamento químico específico é preci-samente desnecessário. Este transporte de ingrediente ativo poderia, nestecaso, ser imputável a um mecanismo anteriormente desconhecido para aabsorção celular de ingredientes ativos (figura 1).
Assim, a presente invenção refere-se a um sistema de liberaçãode fármaco com base em um veículo polimérico, caracterizado pelo fato deque pelo menos uma substância de sinal para o transporte através de umabarreira biológica e pelo menos um ingrediente ativo são incluídos, com veí-culo, substância de sinal e ingrediente ativo não apresentando nenhuma li-gação covalente uns com os outros.Os veículos adequados são polímeros lineares tais como, porexemplo, polilactídeos. No entanto, os veículos poliméricos preferidos com-preendem pelo menos um polímero ramificado ou reticulado, porque os po-límeros ramificados ou reticulados são particularmente adequados para asimples agregação da substância de sinal, ingrediente ativo e veículo. A pro-porção de polímeros veículos ramificados ou reticulados é de preferênciamais do que 10 % em peso, em particular mais de 50 % em peso, com baseno peso total do veículo.
As substâncias de sinal e ingredientes ativos estão preferivel-mente neste caso presentes dispersos ou submetidos a coacervação no veí-culo polimérico. Particularmente adequados para este fim são os polímerosdendríticos ou altamente reticulados, e polímeros em pente. De interesseparticular a este respeito são os polímeros idênticos por natureza ou isomé-ricos por natureza.
Os veículos particularmente preferíveis são os polímeros globu-lares altamente ramificados que são também referidos na literatura especia-lizada como "polímeros dendríticos". Estes polímeros dendríticos, que sãosintetizados a partir de monômeros multifuncionais podem ser divididos emduas categorias diferentes, os "dendrímeros" e os "polímeros hiper-ramificados". Os dendrímeros possuem uma estrutura de geração muito re-gular radialmente simétrica. Eles representam polímeros globulares mono-dispersos que, em comparação com os polímeros hiper-ramificados, sãopreparados na síntese de múltiplas etapas. A estrutura é além do mais ca-racterizada por três diferentes áreas:
- o núcleo polifuncional que representa o centro de simetria,
- várias camadas bem-definidas radialmente simétricas de umaunidade de repetição (geração) e
- os grupos terminais.
Em contraste com os dendrímeros, os polímeros hiper-ramificados são polidispersos e irregulares em termos da sua ramificação eestrutura. Além das unidades dendríticas e lineares, os polímeros hiper-ramificados também - em contraste com os dendrímeros - incluem unidadeslineares. Um exemplo de cada dendrímero (figura 2a) e polímero hiper-ramificado (figura 2b), construído a partir das unidades de repetição que ca-da um tem três possibilidades de ligação, é retratado diagramaticamente nafigura 2. Onde os polímeros dendríticos aqui utilizados possuem pelo menos3 unidades de repetição por molécula, preferivelmente pelo menos 10 unida-des de repetição por molécula e particularmente de preferência pelo menos100 unidades de repetição por molécula e muito particularmente preferívelpelo menos 200 unidades de repetição por molécula ou ainda melhor pelomenos 400 unidades de repetição por molécula, que por sua vez cada umapossui pelo menos três, preferivelmente pelo menos quatro, possibilidadesde ligação, onde pelo menos 3 destas unidades de repetição, particularmen-te preferível pelo menos 10 e além do mais preferivelmente pelo menos 20são cada uma ligada através de pelo menos três, preferivelmente através depelo menos quatro, possibilidades de ligação em pelo menos três, de prefe-rência pelo menos quatro, outras unidades de repetição. Os polímeros hiper-ramificados normalmente possuem um máximo de 10.000, de preferênciaum máximo de 5.000 e particularmente preferível um máximo de 2.500 uni-dades de repetição.
Em uma modalidade preferida, o polímero dendrítico altamenteramificado possui pelo menos três unidades de repetição cada uma dasquais possui pelo menos três possibilidades de ligação possíveis, onde pelomenos três destas unidades de repetição possuem pelo menos duas possibi-lidades de ligação possíveis.
Neste contexto, o termo "unidade de repetição" preferivelmentesignifica uma estrutura que é continuamente repetida dentro da moléculahiper-ramifiçada, por exemplo, unidades lineares, dendríticas ou terminaiscomo é definido na Seiler, Fortschritt-Berichte VDI, Series 3, No. 820 ISBN3-18-382003-x e Gao, C. et al., Hyperbranched Polymers: from synthesis toapplication, Prog. Polym. Sci., 29 (2004) 183-275. O termo "possibilidade deligação" de preferência significa que a estrutura funcional dentro de uma u-nidade de repetição com a qual se liga a uma outra unidade de repetição épossível. Em relação aos exemplos descritos acima de um polímero dendrí-mero ou hiper-ramifiçado, a unidade de repetição é uma estrutura tendo emcada caso três possibilidades de ligação (Χ, Υ, Z):
<formula>formula see original document page 7</formula>
A ligação das unidades de ligação individuais umas com as ou-tras pode ocorrer pela polimerização de condensação, pela polimerização deradicais livres, pela polimerização aniônica, pela polimerização catiônica,pela polimerização de transferência de grupo, pela polimerização de coorde-nação, pela polimerização de abertura de anel ou pela polimerização enzi-maticamente catalisada.
Os dendrímeros particularmente preferidos são os dendrímerosde poliamidoamina (PAMAM) Starbust®, dendrímeros de polipropilenoimina,dendrímeros com base em oxido de polietileno, dendrímeros de poliéter,dendrímeros revestidos PAMAM, por exemplo, com revestimento de polilac-tídeo-co-glicolídeo, dendrímeros de polilisina, incluindo dendrímeros de poli-lisina-bloco-PEG-bloco-polilisina, éteres poliarílicos. Tais dendrímeros prefe-ridos são descritos, por exemplo, em Frechet, J.M.J. et al., Dendrimers andOther Dendritic Polymers, John Wiley & Sons Ltd., West Sussex, UK (2001);Malik, N. et al., Journal of Controlled Release 65, (2000), 133-148; Frey1 H.et al., Reviews in Molecular Biotechnology 90 (2002) 257-267; Jikei, M. et al.,Hyperbranched Polymers: a promising new class of materiais, Prog. Polym.Sci., 26(2001), 1233-1285.
Os polímeros veículos lineares ou hiper-ramificados que sãopreferíveis neste contexto são poliésteres, poliesteramidas, poliéteres, pol-yamidas, polietilenoiminas, poligliceróis, poliglicolídeos, polilactídeos, polilac-tídeo-co-glicolídeos, politartratos e polissacarídeos. Os polímeros particular-mente preferidos entre estes são os poliésteres hiper-ramificados já disponí-veis comercialmente sob o nome comercial Boltorn® da Perstorp AB, comopoliesteramidas hiper-ramificadas obtidas sob o nome comercial Hybrane®da DSM BV Niederlande, os poligliceróis produzidos por HiperpolímerosGmbH, e as polietilenoiminas hiper-ramificadas obtidas como Polyimin® daBASF AG.
Outros polímeros veículos ramificados preferidos são policapro-lactonas, copolímeros tais como poli(D,L-lactídeo-co-glicolídeos) e os com-postos de poliéster produzidos pela Degussa AG das famílias de produtoDynapoI(B)S e Dynacoll®.
Os polímeros dendríticos particularmente preferidos são políme-ros tendo uma massa molar entre 1000 g/moí e 2.000.000 g/mol, particular-mente preferível entre 2000 g/mol e 700.000 g/mol e muito particularmentepreferível entre 6000 g/mol e 100.000 g/mol, um ponto de fusão de preferên-cia entre 0 9C e 150 qC e/ou uma viscosidade em fusão dos polímeros veícu-los preferidos de menos do que 3,0 Pas, preferivelmente menos do que 2,5Pas, em particular menos do que 2,0 Pas, medido a 80 °C. Os veículos poli-méricos hiper-ramifiçados possuem, além disso, em particular, um grau deramificação entre 20 % e 100 %, de preferência entre 30 % e 70 % e/ou umnúmero hidróxi entre 10 mg de KOH/g e 600 mg de KOH/g. O grau de ramifi-cação dos dendrímeros está preferencialmente entre 25 % e 75 %.
Outros polímeros veículos preferidos são homo- ou heteropolí-meros ramificados ou reticulados de carboidratos (polissacarídeos), de ami-noácidos naturais e artificiais; de ácidos nucléicos naturais e artificiais; depoliaminas, de poliésteres; de poliéteres; de polióis, em particular álcooispolivinílicos, de poliolefinas, em particular de poliisoprenos, polietilenos, poli-propilenos, polibutadienos ou poliestirenos; de polialquilenos glicóis, em par-ticular de polietilenos glicóis, de poliamidas, de poliacetais, de poliacrilatos;de poliacetatos, em particular de acetatos de polivinila; de poliuretanos; depolímeros de organossilício tais como, por exemplo, silicones, de resinasepóxi, de politióis ou de policarbonatos.
Outros veículos poliméricos preferidos são biocompatíveis e en-zimaticamente degradáveis com um atraso. Referência especial deve serfeita neste contexto de polímeros veículos ramificados ou reticulados enzi-maticamente degradáveis do grupo de policaprolactonas, poliglicolídeos,polilactídeos, polilactídeo-co-glicolídeos, politartratos ou poliésteres. Os po-lissacarídeos ramificados ou reticulados baseados em celulose, pectina, ami-lopectina ou dextranos são particularmente preferidos.
Os polímeros veículos reticulados particularmente preferidossão hidrogéis, especialmente hidrogéis dendríticos tais como aqueles descri-tos, por exemplo, em Rueda, J.C., et ai., Macromol. Chem. Phys. 2003, 204,947-953; Hatice, K.C. et al., published online 24 October 2003 in Wiley In-terScience DOI 10.1002/app.13125; Knischka, R. etal., Polymeric Materials:Science & Engineering 2001, 84, 945.
Os veículos poliméricos utilizados em uma forma de realizaçãoparticularmente preferida são deixados sempre que possível no estado natu-ral ou quase natural e em particular não são ainda funcionalizados ou deriva-tizados. Por um lado, é possível desta maneira assegurar que nenhuma rea-ção química índesejada prosseguirá com os ingredientes ativos ou as subs-tâncias de sinal, assim possivelmente alterando seu perfil de propriedadefarmacológica, e, por outro lado, o risco de uma reação alérgica ao sistemade liberação de fármaco é desta maneira minimizado.
Em uma modalidade preferida, os polímeros ramificados ou reti-culados possuem um teor de pelo menos 50 % em peso, preferivelmentemais do que 75 % em peso, com base no peso total do veículo. É adicional-mente possível misturar outros polímeros, em particular também polímerosnão ramificados não reticulados das classes poliméricas recentemente men-cionadas, com o veículo. Em uma modalidade particularmente preferida, ospolímeros exclusivamente ramificados ou reticulados são empregados comoveículo.
A proporção do veículo no sistema de liberação de fármaco rei-vindicado está preferivelmente entre 30 % em peso e 99,5 % em peso, depreferência entre 50 % em peso e 98 % em peso, com base no peso total dosistema de liberação de fármaco particulado. Onde as formulações com in-gredientes altamente ativos preferivelmente possuem uma proporção demais do que 80 % em peso a 99,5 % em peso, em particular entre 90 % empeso e 99 % em peso, de veículo. As formulações com ingredientes ativoscostumeiros em contrapartida possuem uma proporção preferida de 55 %em peso a 94,5 % em peso, particularmente preferível entre 65 % em peso e94 % em peso, de veículo.
As substâncias de sinal significam no contexto da presente in-venção todas as substâncias que são capazes de iniciar um transporte dire-cionado de um ingrediente ativo através de uma barreira biológica. Por istosão dispostos em particular peptídeos específicos do organismo, incluindopeptídeos específicos da espécie, em particular específicos de mamífero, depreferência peptídeos específicos de ser humano, que são capazes de terum efeito estimulante de transporte em relação à barreira biológica a ser a-travessada. Estes incluem muito geralmente sinais de estímulo de todos osdomínios de transdução biológicos, biomórficos ou bioanálogos (PTDs), es-pecialmente peptídeos de ligação ao receptor, peptídeos d-análogos, anti-corpos ou fragmentos de ditos peptídeos ou proteínas. As substâncias en-contradas "de novo" (por exemplo, pesquisa Blast em bases de dados) taiscomo, por exemplo, haptenos, agonistas e antagonistas receptores podem,além disso, também ser empregadas como estímulo de transporte comosubstância de sinal. Os peptídeos de sinal conhecidos preferidos são sele-cionados do grupo de "VP22" (proteínas do vírus da herpes simples), "Antp"(tendo a seqüência de aminoácido RQIKIWFQNRRMKWKK), "R9" (tendo aseqüência de aminoácido RRRRRRRRR) e "Tat" (tendo a seqüência de a-minoácido YGRKKRRQRRR).
O peptídeo de sinal preferivelmente empregado é Iactoferrina1em particular Iactoferrina humana ou bovina, ou um peptídeo compreenden-do um fragmento de Iactoferrina de pelo menos 8 aminoácidos constitutivos,com o dito peptídeo atuando como peptídeo penetrante de célula (CPP).
Em uma modalidade preferida, os ditos peptídeos de sinal com-preendem pelo menos quatro aminoácidos catiônicos. Os peptídeos de sinalcatiônicos preferidos possuem em particular uma carga líquida positiva emvalores de pH fisiológico. Em uma outra modalidade preferida, a substânciade sinal empregada é um peptídeo derivado de lactoferrina, que compreendepelo menos duas cisteínas ou um análogo apropriado. Em uma forma derealização particularmente preferida, o peptídeo de sinal compreende umaponte de dissulfeto formada dos dois resíduos de cisteína ou de uma articu-lação análoga formada por um análogo de cisteína. As duas cisteínas ouseus análogos são preferivelmente separadas uma da outra por 8 a 20 ami-noácidos, em particular por 14 a 18 aminoácidos, particularmente preferívelpor 16 aminoácidos. As duas cisteínas ou seus análogos podem diretamenteformar a extremidade C-terminal e/ou N-terminal do peptídeo sinal ou serlocalizadas nas imediações da extremidade C- e/ou N-terminal. Tais peptí-deos de sinal estabilizados com ponte normalmente possuem uma estruturaem Ioop que possui uma maior estabilidade para a degradação enzimática,em particular, para a degradação de protease.
Em uma modalidade preferida, uma proteína Iactoferrina huma-na tendo a seqüência de aminoácido SEQ ID No. 1 ou uma proteína de Iac-toferrina bovina tendo uma seqüência de aminoácido SEQ ID No. 2 é utiliza-da.
Em uma outra modalidade, os peptídeos de sinal derivados dalactoferrina compreendem uma região com uma conformação alfa-helicoidal,preferivelmente com um comprimento de 12 a 20 aminoácidos, ou uma regi-ão com uma conformação de lâmina beta-dobrada, de preferência com umcomprimento de 8 a 12 aminoácidos. Os peptídeos de sinal particularmentepreferidos possuem um motivo de lâmina de inclinação helicoidal.
Em uma outra modalidade preferida, os peptídeos de sinal deri-vados da Iactoferrina incluem de 8 a 60 aminoácidos, de preferência de 20 aaminoácidos, particularmente preferível de 18 a 22 aminoácidos.
Os peptídeos de sinal particularmente preferidos derivados dalactoferrina são aqueles tendo uma seqüência de aminoácido corresponden-do aos aminoácidos da posição de 20 a 64 da seqüência de aminoácidoSEQ ID No. 1.
É ainda possível utilizar peptídeos de sinal cuja extremidade N-terminal é uma seqüência correspondendo aos de aminoácidos da posiçãode 20 a 64 das seqüências de aminoácido SEQ ID No. 1 ou SEQ ID No. 2.
Exemplos de tais peptídeos de sinal são peptídeos tendo uma seqüência deaminoácido de acordo com as posições de 20 a 711 correspondendo à SEQID No. 1 ou de acordo com as posições de 20 a 708 correspondendo à SEQID No. 2.
Em uma modalidade particularmente preferida, um peptídeo desinal é selecionado do grupo de peptídeos tendo uma seqüência de aminoá-cido
KCFQWQRNMRKVRGPPVSCIKR (SEQ ID No. 3),CFQWQRNMRKVRGPPVSC (SEQ ID No. 4),FQWQRNMRKVRGPPVS (SEQ ID No. 5),FQWQRNMRKVR (SEQ ID No. 6),KCRRWQWRMKKLGAPSITCVRR (SEQ ID No. 29) eCRRWQWRMKKLGAPSITC (SEQ ID No. 30)
Ou um derivado destes.
Em uma modalidade preferida, os peptídeos penetrantes da cé-lula compreendendo uma seqüência de aminoácido como mostrado na SEQID No. 3, SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 29 ou SEQ ID No. 30 ou uma seqüênciacorrespondente com uma identidade de pelo menos 40 %, preferivelmentepelo menos 50 %, particularmente preferível com uma identidade de mais doque 75 % ou mais vantajoso de mais do que 90 %.
Os peptídeos de sinal compreendendo uma seqüência de ami-noácido com uma identidade de pelo menos 40 % para a SEQ ID No. 3,SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 29 ou SEQ ID No. 30 são preferivelmente carac-terizados pela troca e/ou eliminação de 1 a 13 aminoácidos em comparaçãocom a SEQ ID No. 3 ou a SEQ ID No. 29, ou de 1 a 10 de aminoácidos emcomparação com a SEQ ID No. 4 ou a SEQ ID No. 30. Onde as seqüênciasque através da troca de um ou mais aminoácidos por aminoácido homólogosão do maior interesse.
Os peptídeos que incluem uma seqüência de aminoácido comomostrados na SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 29 ou SEQ ID No.30 ou uma seqüência correspondente com uma identidade de pelo menos40 % consistem em pelo menos 8 aminoácidos (com relação aos peptídeosde sinal derivados da SEQ ID No. 3 ou SEQ ID No. 29) ou de pelo menos 9aminoácidos (com relação aos peptídeos de sinal derivados da SEQ ID No.4 ou SEQ ID No. 30). Os peptídeos de sinal preferivelmente possuem de 10a 45 aminoácidos, particularmente preferível de 14 a 25 aminoácidos.
A troca de um aminoácido homólogo preferivelmente significa atroca de um aminoácido por outra do mesmo grupo. Neste contexto, os ami-noácidos podem ser divididos em aminoácidos hidrofóbicos (incluindo osaminoácidos alifáticos), aminoácidos aromáticos, aminoácidos catiônicos eaniônicos, aminoácidos neutros, aminoácidos contendo enxofre e aminoáci-dos heterocíclicos. Os aminoácidos hidrofóbicos são preferivelmente glicina,alanina, valina, leucina, isoleucina, os aminoácidos aromáticos são preferi-velmente fenilalanina, tirosina e triptofano, os aminoácidos tônicos são prefe-rivelmente aminoácidos catiônicos tais como lisina, arginina, histidina, e osaminoácidos aniônicos tais como aspartato e glutamato, os aminoácidosneutros são preferivelmente serina, treoninas, asparagina, glutamina e meti-onina, os aminoácidos contendo enxofre são preferivelmente cisteína e me-tionina e os aminoácidos heterocíclicos são preferivelmente prolina e histidi-na.
Os peptídeos de sinal preferidos como mostrados na SEQ IDNo. 3, SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 29 ou SEQ ID No. 30 ou uma seqüênciacorrespondente com uma identidade de pelo menos 40 % possuem umacarga catiônica, em particular através de pelo menos quatro aminoácidoscatiônicos que são localizados dentro da SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 4, SEQID No. 29 ou SEQ ID No. 30. Um outro aspecto preferido de ditos peptídeosde sinal é a presença de pelo menos dois resíduos de cisteína ou análogosde cisteína capazes de formar uma ponte de dissulfeto ou uma ponte análo-ga a esta. As duas cisteínas ou seus análogos incluem pelo menos 6, depreferência entre 12 e 43 aminoácidos.
Em uma outra modalidade preferida existem os derivados depeptídeos tendo uma seqüência de aminoácido como mostrada na SEQ IDNo. 3-6, onde o resíduo metionina é substituído por um aminoácido selecio-nado do grupo que compreende valina, isoleucina, norvalina, leucina e nor-leucina. Exemplos de tais peptídeos são peptídeos tendo uma seqüência deaminoácido:
KCFQWQRNVRKVRGPPVSCIKR (SEQ ID No. 7),KCFQWQRNIRKVRGPPVSCIKR (SEQ ID No. 8),KCFQWQRNXRKVRGPPVSCIKR (SEQ ID No. 9), onde X énorvalina,
KCFQWQRNLRKVRGPPVSCIKR (SEQ ID No. 10),KCFQWQRNXRKVRGPPVSCIKR (SEQ ID No. 28), onde X énorleucina,
CFQWQRNVRKVRGPPVSC (SEQ ID No. 11),CFQWQRNIRKVRGPPVSC (SEQ ID No. 12),CFQWQRNXRKVRGPPVSC (SEQ ID No. 13), onde X é norva-lina,
CFQWQRNLRKVRGPPVSC (SEQ ID No. 14),CFQWQRNXRKVRGPPVSC (SEQ ID No. 15), onde X é norleu-cina,
FQWQRNVRKVRGPPVS (SEQ ID No. 16),FQWQRNIRKVRGPPVS (SEQ ID No. 17),FQWQRNXRKVRGPPVS (SEQ ID No. 18), onde X é norvalina,FQWQRNLRKVRGPPVS (SEQ ID No. 19),FQWQRNXRKVRGPPVS (SEQ ID No. 20), onde X é norleucina,FQWQRNVRKVR (SEQ ID No. 21),FQWQRNIRKVR (SEQ ID No. 22),FQWQRNXRKVR (SEQ ID No. 23), onde X é norvalina,FQWQRNLRKVR (SEQ ID No. 24),FQWQRNXRKVR (SEQ ID No. 25), onde X é norleucina.Em uma outra modalidade preferida, os peptídeos de sinal tam-bém incluem aqueles derivados compreendendo um grupo ligador, preferi-velmente selecionados do grupo de tioésteres, onde o grupo ligador substituia ponte de dissulfeto. Além disso é possível incorporar no peptídeo gruposIigadores que estrutural e funcionalmente substituem a ponte de dissulfeto,mas não estão sujeitos à clivagem redutiva. Exemplos de tal grupo ligadorsão as pontes de etileno (JACS, 1985, 107, 2986-2987, Bioorg. Med. Chem.Letter 1999, 9, 1767-1772, J. Med. Chem. 2002, 45, 1767-1777), pontes detioéter (Yu et al. Tetrahedron Lett. 1998, 39, 6633-6636), pontes de carbonila(Pawlak et al., J. Pept. Sei. 2001, 7, 128-140), pontes alifáticas mais longas,em particular tendo até 10 átomos de carbono (Tetrahedron Lett. 2001, 42,5804). Uma outra possibilidade é também substituir um resíduo de cisteínapor outros resíduos tais como, por exemplo, homoserina (Yu et al., Tetrahe-dron Lett. 1998, 39 6633-6636).
Ditas substâncias de sinal peptídicas podem também ser radior-rotuladas, de preferência com um aminoácido radiorrotulado, em particularcom o aminoácido rotulado por trítio. As substâncias de sinal podem, alémdisso, ser modificadas com grupos detectáveis, tais grupos preferivelmentesendo selecionados do grupo de fluoroforos, de marcadores radioativos ehaptenos, a biotina de hapteno sendo particularmente adequado.
É possível através do uso de substâncias de sinal humanas, emparticular de peptídeos penetrantes da célula derivados de lactoferrina, emparticular para minimizar as reações alérgicas direcionadas contra o sistemade liberação de fármaco. Os peptídeos derivados de lactoferrina ainda apre-sentam uma eficiência elevada na penetração celular tanto em relação àquantidade de peptídeo ou formulação de peptídeo absorvida na célula,quanto em relação ao tempo necessário para a absorção. É mais vantajosoque os peptídeos, formulações ou ingredientes das formulações que sãoabsorvidos, sejam transportados para dentro do citoplasma da célula.
Os peptídeos de sinal derivados da lactoferrina são de interes-se, em particular com relação ao transporte de ingredientes ativos através doepitélio intestinal, em cujo caso o ingrediente ativo é transportado com altaeficiência nas células epiteliais e é subseqüentemente liberado dentro dacorrente sangüínea. O peptídeo de sinal também pode ser mascarado para otransporte direcionado de ingredientes ativos, por exemplo, nas células tu-morais. O peptídeo mascarado pode então ser clivado, por uma clivagemproteolítica, por exemplo, por proteases que são liberadas pelas células tu-morais, em sua forma funcional de penetração celular (análogo a Jiang, T. etal., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 17867-17872, 2004).
Ditos peptídeos de sinal podem ainda estar em uma forma deri-vatizada pelos métodos usuais. Menção particular deve ser feita neste con-texto de peptídeos C-terminalmente submetidos a acetila ou submetidos aamida, que são freqüentemente distintos pela boa estabilidade sob condi-ções fisiológicas. No entanto, os peptídeos de sinal não modificados são pre-ferivelmente utilizados.
A carga do veículo com uma substância de sinal tipicamenteocorre com uma quantidade entre 0,5 % em peso e 20 % em peso, preferi-velmente entre 1 % em peso e 10 % em peso, com base no peso total dosistema de liberação de fármaco particulado.
É ainda conhecido em particular da tecnologia de "anti-sentido"que os compostos iônicos, ácidos nucléicos, fragmentos de ácido nucléico,conjugados de ácido nucléico e análogos de ácido nucléico podem intensifi-car os transportes de membrana, isto é, fragmentos puros ou quimicamentemodificados são da mesma maneira empregados como estímulo suplemen-tar.
Visto que nenhum acoplamento específico dos ingredientes ati-vos ou das substâncias de sinal ocorre, a carga do veículo polimérico não érestrita em relação aos ingredientes ativos e substâncias de sinal que podemser utilizados para produzir os sistemas de liberação de fármaco particula-dos. No entanto, os sistemas de transporte aqui descritos devem ser consi-derados como particularmente vantajosos para os ingredientes ativos oumisturas de ingrediente ativo que devem ser protegidos da degradação quí-mica ou enzimática durante o transporte para o sítio alvo e que, para evitarefeitos colaterais, devem ser liberados apenas no sítio alvo. Conseqüente-mente, os sistemas de liberação de fármaco descritos são particularmenteadequados para o transporte de peptídeos ou proteínas farmaceuticamenteeficazes. Tais ingredientes ativos são, por exemplo, proteínas farmacêuticasou ingredientes proteo ativos, tais como, por exemplo, anticorpos, hormôniosde peptídeo, receptores ou Iigandos peptídicos destes ou enzimas. Exem-plos destes que podem ser mencionados são os inibidores da α1 -protease,eglina, elastase, α1-antitripsina (enfisemas), antitrombina (anticoagulante),angiotensinase (pressão arterial elevada), fator VII, VIII, IX, X, fibrinogênio,trombina, inibidor do ativador do plasminogênio (distúrbios de coagulação),imunoglobulinas (imunização passiva), ganciclovir, aciclovir, interferons (in-fecções virais, terapia de tumores), fator da necrose tumoral, caquectina,diidrofolato reductase, linfotoxina, interleucinas, proteínas supressoras detumor tais como, por exemplo, P53 (câncer), plasmina, urocinase, hirudina,estreptocinase, urocinase, ativador de plasminogênio do tecido, proteína C,proteína S (trombólise), fosfolipase A2, uromodulina, proteína Tamm-Horsfall(inflamações), insulina (diabetes), inibidor da tripsina (pancreatite), lisozima,timopoietina, antibióticos de peptídeo (infecções bacterianas), eritropoietina(anemia). No entanto, os sistemas de liberação de fármaco aqui descritosnão se limitam a tais ingredientes ativos; também é possível empregar in-gredientes ativos de peso molecular baixo (moléculas pequenas) tais como,por exemplo, muitas substâncias antivirais, substâncias hepatoterapêuticas,substâncias neuroprotetoras, imunoterapêuticos e imunossupressores, in-gredientes ativos de peso molecular baixo para distúrbios cardiovascularesou câncer, analgésicos, antiinflamatório de peso molecular baixo, ingredien-tes ativos antibióticos e antimicrobianos e hormônios de peso molecular bai-xo, ou ingredientes ativos macromoleculares tais como, por exemplo, frag-mentos de ácido nucléico ou ácidos nucléicos (DNA genômico, cDNA, mR-NA, siRNA, oligonucleotídeos anti-sentido etc). Exemplos de ingredientesativos de peso molecular baixo são análogos de nucleosídeo, β-interferons,ácido α-lipóico, análogos de peptídeo, inibidores de enzima ou receptor, a-gonistas e antagonistas, prostaglandinas, esteróides, citostáticos e antibióti-cos heterocíclicos. Também é possível em particular empregar ingredientesativos na forma de seus pró-fármacos.
Uma das vantagens das presentes partículas de transporte éque também é possível incorporar dois ou mais ingredientes ativos, em par-ticular também tendo diferentes propriedades físicas, tais como, por exem-plo, diferente capacidade hidrofílica, ao mesmo tempo em uma formulação.Uma classificação farmacológica a este respeito é fornecida pelo sistemaBCS que foi desenvolvido pelo FDA e divide os ingredientes farmacêuticosativos em quatro diferentes classes. As partículas aqui descritas são particu-larmente adequadas para justamente incluir os ingredientes ativos de dife-rentes classes de um sistema de transporte.
A carga do veículo com um ingrediente ativo tipicamente ocorrecom uma quantidade entre 0,001 % em peso a 50 % em peso com base nopeso total do sistema de liberação de fármaco particulado. Onde os ingredi-entes ativos tendo uma atividade elevada estão preferívelmente presentesem uma quantidade entre 0,01 % em peso e 1 % em peso, em particular pre-ferívelmente abaixo de 0,1 % em peso. Outros ingredientes ativos são ge-ralmente empregados em uma quantidade entre 1 % em peso e 30 % empeso, de preferência entre 5 % em peso e 25 % em peso.
O teor de ingrediente ativo no sistema de liberação de fármacoparticulado é selecionado para a formulação farmacêutica de modo que pre-ferívelmente entre 0,1 mg e 100 mg de ingrediente ativo por kg de peso cor-poral do paciente sejam atingidos. No caso de ingredientes ativos tendo ati-vidade elevada, tais como, por exemplo, hormônios, dosagens mais baixastambém são suficientes.
Um aspecto particularmente preferido das substâncias de sinal eingredientes ativos aqui utilizados é que eles são não modificados. "Nãomodificado" significa no contexto da presente invenção que a substância desinal ou o ingrediente ativo não é derivatizado com quaisquer grupos funcio-nais adicionais ou Iigadores de modo a produzir coordenação ou ligação co-valente ao veículo ou um com o outro possível.
O termo "barreira biológica" significa no contexto da presenteinvenção além da membrana celular em geral, em particular também as ca-madas celulares epiteliais e endoteliais. Conseqüentemente, a expressãobarreira biológica abrange também as barreiras de órgãos e tecidos tais co-mo, por exemplo, a barreira hematoencefálica ou o epitélio intestinal. Onde avascularização garante boa farmacocinética promove transporte (sucção deingrediente ativo) após a barreira ter sido atravessada.
É crucial para a construção dos sistemas de liberação de fárma-co particulados de acordo com a invenção que tanto os ingredientes ativosquanto as substâncias estão em agregação não específica com o veículopolimérico ramificado ou reticulado, isto é, não entra em qualquer ligaçãocovalente um com o outro. O termo ligação covalente também inclui as liga-ções de coordenação onde o par de elétrons de ligação é fornecido por umparceiro de ligação à um aceitante de par de elétrons definido. O termo liga-ção de coordenação não inclui quaisquer ligações não específicas que se-jam instáveis e não seletivas sob condições fisiológicas. As ligações de co-ordenação específicas são representadas, por exemplo, por complexos taiscomo ligações de epitopo ou ligações semelhantes a haptâmero ou ligaçõessemelhantes a aptâmero. As ligações também geralmente designadas comoligações hospedeiras-hóspedes devem ser consideradas como uma ligaçãode formação complexa. Tais ligações de coordenação são distintas pela suaestabilidade e seletividade da ligação sob condições fisiológicas. As ligaçõesnão específicas não seletivas no sentido da presente invenção são intera-ções polares ou interações lipofílicas e interações Van der Waals que geral-mente possuem uma entalpia de ligação de menos do que 50 kJ/mol ou me-nos do que 20 kJ/mol (dependendo do radical considerado que está disponí-vel para uma tal ligação). Nos sistemas de transporte particulados aqui des-critos, ao contrário, tanto as substâncias de sinal quanto os ingredientes ati-vos apropriados são preferivelmente de forma simples dispersos ou subme-tidos a coacervação no material veículo polimérico.
Os sistemas de liberação de fármaco configurados desta manei-ra possuem diversas vantagens sobre as formulações de ingrediente ativoconvencionais. Assim, os ingredientes ativos e as substâncias de sinal po-dem ser empregados sem modificações químicas, desta maneira retendosuas propriedades, em particular em relação aos seus efeitos e em relaçãoaos parâmetros ADME. É ainda possível também empregar veículos polimé-ricos ramificados ou reticulados naturais ou aqueles compostos de monôme-ros de ocorrência natural. É assim possível obter sistemas de liberação defármaco particulados bem tolerados que devem em particular também servantajosos evitando reações alérgicas. Os sistemas de liberação de fármacode acordo com a invenção também são mais fáceis de produzir porque nema funcionalização adicional de componentes individuais nem uma ligaçãoespecífica entre veículo, substância de sinal e/ou ingrediente ativo são ne-cessárias. E desta maneira adicionalmente possível simplesmente combinarentre si diferentes substâncias sinal e ingredientes ativos sem um novo in-grediente ativo resultante, como seria o caso, por exemplo, na ligação cova-lente da proteína Tat (substância de sinal) com uma proteína p53 (ingredien-te ativo) (proteína de fusão Tat-p53). Além disso, também é desnecessáriapara o ingrediente ativo ser liberado, por exemplo, por uma eliminação pro-teolítica ou enzimática do veículo e/ou da substância de sinal. Uma outravantagem do sistema de liberação de fármaco descrito deve ser consideradacomo o fato de que diferentes substâncias de sinal e ingredientes ativos po-dem ser formuladas entre si em um sistema de transporte. As quantidadesdas substâncias de sinal e ingredientes ativos com as quais as partículas detransporte são carregadas também podem ser selecionadas livremente epodem assim ser adaptadas sem dificuldade à respectiva indicação.
Em particular, através da utilização de polímeros veículos den-dríticos é possível ajustar através do tipo e número de grupos funcionais, emparticular dos grupos polares, no veículo a concentração de carga das partí-culas com um ingrediente ativo e uma substância de sinal, e além disso épossível alcançar extraordinariamente altas concentrações de carga de maisdo que 20 % em peso do ingrediente ativo e substância de sinal com baseno peso total das partículas. Além disso, a quantidade de ingrediente ativoliberada por unidade de tempo também pode ser controlada através do nú-mero de grupos funcionais.
Em uma modalidade preferida, os peptídeos derivados do Iacto-ferrina são incorporados como substâncias de sinal no sistema de liberaçãode fármaco reivindicado, que utiliza a formulação negativamente carregadaou veículos facilmente polarizáveis. Uma possibilidade alternativa é tambémempregar veículos com uma carga líquida positiva, utilizando uma formula-ção negativa carregada auxiliar, tal como, por exemplo, por meio de frag-mentos de ácido nucléico.
Conseqüentemente, os sistemas de liberação de fármaco deinteresse particular compreendem
a)um peptídéo de sinal penetrante celular (CPP) derivado delactoferrina,
b) um ingrediente ativo farmacêutico e
c) um veículo polimérico composto por homo- ou heteropolíme-ros ramificados ou reticulados de carboidratos (polissacarídeos); de poliés-ter; de poliéteres; de polióis, de poliolefinas, de polialquilenos glicóis, de po-liamidas, de poliacetáis, de poliacrilatos; de poliacetatos, de poliuretanos, depolímeros de organossilício, de resinas de epóxi, de politióis, de policarbona-tos, de policaprolactonas, de poliglicolídeos, de polilactídeos, de polilactídeo-co-glícolídeos ou de politartratos.
Tais formulações são particularmente adequadas com relaçãoao transporte transcelular de ingredientes farmacêuticos ativos através doepitélio intestinal. Conseqüentemente, a combinação de CPPs derivados delactoferrina e hepatoterapêuticos tais como, por exemplo, certos citostáticos,análogos de nucleosídeo ou ácido α-lipóico, interferon, lamivudina, corticói-des, azathioprina, clorambucil, colquizina, metotrexato, ácido ursodeoxicóli-co, naloxona, anfotericina B, fluconazol, albendazol, é particularmente prefe-rida.
Os sistemas de liberação de fármaco particulados podem seradministrados, por exemplo, pela via oral, pulmonar, sublingual, bucal, nasal,ocular ou via gastrointestinal. De interesse particular neste contexto são, emparticular, a forma de administração oral e intravenosa. Para este propósito,as partículas de transporte podem ser encapsuladas sem perda da funçãoadicionalmente com substâncias farmacêuticas comercialmente disponíveis,tais como Eudragit® por exemplo.
Os sistemas de liberação de fármaco particulados podem serproduzidos por vários métodos. Neste contexto, o método de coacervaçãoalém da secagem por atomização, o método de alta pressão com gasescomprimidos e a evaporação do solvente revelou-se ser um método preferi-do. É possível, em princípio, com relação ao ingrediente ativo e a substânciade sinal serem formulados em conjunto ou em operações separadas com ossistemas de liberação de fármaco da invenção.
A coacervação é uma separação de fase forçada para precipitaros colóides e produzir partículas. Esta pode se induzida por vários estímulosexternos tais como a temperatura, pH, soluções salinas ou não solventes.Finalmente, as partículas resultantes são consolidadas pelo calor, reticula-ção, remoção de solvente ou secagem. O método de coacervaçãô é muitoversátil e pode ser realizado com vários polímeros. Além disso é possívelcom relação à espessura de parede e o tamanho das partículas, e o grau decarga de um ingrediente ativo (ativo), serem variados sem restrição. Alémdisso, é possível com relação ao perfil de liberação do ingrediente ativo en-capsulado ser ajustado conforme desejado. O método de coacervação é ummétodo muito eficaz para produzir formulações de particulado uma vez quepermite um alto rendimento, uma elevada taxa de carga e uma boa capaci-dade de reprodução.
É feita uma distinção entre a coacervação simples e complexa,e entre a separação de fase aquosa e orgânica (Arshady, R. Microspheresand microcapsules, a survey of manufacturing techniques, Part II, Coacerva-tion, Polymer Engineering and Science, 30 (15), 905, 1990). Na coacervaçãosimples existe o uso de um componente coloidal, por exemplo, gelatina, e nacoacervação complexa existe o uso de dois componentes coloidais oposta-mente carregados, por exemplo, gelatina e goma arábica. O princípio de co-acervação consiste em, por exemplo, converter uma solução aquosa de ge-latina mediante a adição de etahol em um sistema de duas fases que consis-te em uma fase rica em gelatina (coacervada) e pobre em gelatina. Isto émuito similar a um fracionamento polimérico, embora neste caso as micro-partículas com um tamanho médio de 2 a 5000 μιτι são produzidos pela a-ção das forças de cisalhamento.
A produção de microcápsulas por coacervação pode ser divididaem três etapas: (1) geração de três fases imiscíveis, (2) deposição do colói-de como estrutura de cápsula e (3) consolidação da estrutura de cápsula. Astrês fases imiscíveis consistem em um meio externo, um material de núcleoe o material de estrutura de cápsula. O material de estrutura de cápsula édissolvido no meio externo, e o material de núcleo é nele disperso. Quandoum estímulo externo (temperatura, pH, eletrólitos) atua, o material de estru-tura de cápsula torna-se insolúvel no meio externo e é depositado na interfa-ce com o material de núcleo disperso. Após filtração, a estrutura de cápsulaé finalmente endurecida pela ação do calor, reticulação ou remoção de sol-vente ou seca mediante a secagem por atomização ou secagem por conge-lamento.
A formulação de ingrediente ativo particulada é seca particular-mente de forma vantajosa mediante a lavagem das partículas em um solven-te particularmente volátil (por exemplo, etanol, propanol, acetona, diclorome-tano), com secagem subseqüente em um vácuo, secador de placa ou derolagem. Alternativamente, pode também ocorrer pela secagem por atomi-zação ou congelamento. A fase rica em solvente que permanece sobre aremoção das partículas pode ser reciclada em uma escala relativamente e-levada.
As micropartículas podem ser carregadas com um ingrediente(ativo), isto é, que o material de núcleo corresponda a este ingrediente ativo.Isto pode implicar substâncias hidrofóbicas ou hidrofílicas, levando à neces-sidade de usar uma separação de fase aquosa ou orgânica. No caso da se-paração de fase aquosa é possível para as substâncias hidrofóbicas seremfechadas/encapsuladas. Inversamente, uma separação de fase orgânica érequerida para as substâncias hidrofílicas, ou seja, o colóide é dissolvido nafase orgânica e, após a ação de um estímulo externo, se acumula na interfa-ce com a substância hidrofílica. Os termos coacervação aquosa e orgânicadesta maneira substituem, em cada caso, os colóides solúveis em água eem óleo. O carregamento das microcápsulas com a substância de sinal e oingrediente ativo é de 0,5 a 70 % em peso e a liberação da substância inclu-ída pode ser iniciada por vários mecanismos: difusão, dissolução do materialde estrutura da cápsula, degradação enzimática, etc. Os seguintes materiaisde estrutura de cápsula são preferivelmente utilizados na simples coacerva-ção: carboximetilcelulose, nitrocelulose, álcool polivinílico, poliuretanos, laca,carragenina, alginatos, gelatina, albumina, colágeno, acetato de celulose,ftalatos, etilcelulose, poligliceróis, poliésteres, Eudragits®, etc. No caso dacoacervação complexa, preferivelmente as seguintes combinações com ge-latina são utilizadas: gelatina com goma arábica, Carbopol ou pectina.
Uma outra possibilidade para produzir as formulações de ingre-diente ativo particuladas de acordo com a invenção é representada por pro-cessos de alta pressão com fluidos comprimidos ou supercríticos (Gamseet al., in Chemie Ingenieur Technik 77 (2005) 669-680; McHugh and Kruko-nis in "Supercritical Fluid Extraction: Principies and Practices", Stoneham MA1986, Fages et al., Powder Technology 141 (2004) 219-226 and Bungert etal., Ind. Eng. Chem. Res., 37, (1997) 3208-3220).
Os métodos mais conhecidos para a produção de partículascom gases comprimidos são o processo GAS (Antissolvente gasoso), o pro-cesso PCA (Precipitação com um antissolvente fluido comprimido), o pro-cesso PGSS (Partículas de soluções saturadas gasosas) e o processoRESS (Expansão Rápida de Soluções Supercríticas). Estes métodos sãoexplicados de forma sucinta abaixo.
No processo GAS, uma solução que compreende polímero, in-grediente ativo, substância de sinal e solvente é introduzida em uma auto-clave em temperatura constante e, em seguida, exposta a um gás comonão-solvente, de modo que o polímero e o ingrediente ativo precipitem comopartículas finas. Neste caso, a mistura da solução/suspensão por meio deum agitador é sensível a fim de evitar a aglomeração das partículas.
As moléculas de substância de sinal e ingrediente ativo podemdurante a precipitação ser ligadas na matriz polimérica ou estar presentescomo núcleo (reservatório) em torno do qual um revestimento polimérico te-nha se formado. A suspensão é depois formada e pode ser fracionada porfiltração. Os resíduos de solvente podem ser extraídos mediante a lavagemdas partículas em um fluido supercrítico. Além da possibilidade de realizar oprocesso em temperaturas baixas e assim separando o ingrediente ativo,particularmente importante é a influência dos cinéticos da fase de transição,isto é, da formação de partícula. A distribuição do tamanho de partículastambém pode ser selecionada mediante o controle da supersaturação pelodecurso do tempo e da intensidade da adição de gás. Em uma primeira eta-pa, a separação de fase é iniciada e existe formação de núcleos cristaliza-ção na forma de gotículas da fase rica em polímero resultante, das micropar-tículas posteriores. Agora é importante não permitir que estas gotículas coa-lesçam e cresçam, mas garantir que o solvente seja extraído tão rapidamen-te quanto possível para fora destas gotas. As partículas resultantes entãopossuem diâmetros pequenos (Gamse et al., Chemie Ingenieur Technik 77(2005) 669-680 and Bungert et al., Ind'. Eng. Chem. Res., 37, (1997) 3208-3220). A distribuição de partícula e o tamanho de partícula podem ser ajus-tados pela variação direcionada destas duas etapas.
O processo PCA ou então processo SEDS (Dispersão Intensifi-cada da Solução por Fluidos Supercríticos) otimiza as duas quantidades Iimi-tativas do processo GAS, ou seja, a taxa de formação de pressão como ini-ciador da formação de partícula e o transporte da matéria a fim de remover osolvente para fora das gotas (Gamse et al., in Chemie Ingenieur Technik 77(2005) 669-680; Fages et al., Powder Technology 141 (2004) 219-226 andBungert et al., Ind. Eng. Chem. Res., 37, (1997) 3208-3220). A solução desubstância de sinal - ingrediente ativo - polímero da autoclave é neste casocomprimida e levada em contato em um bico de injeção com o gás supercrí-tico e pulverjzado conjuntamente na unidade de precipitação. Em uma etapade lavagem final, o solvente é removido das partículas mediante a extraçãocom o fluido supercrítico. Uma taxa elevada da formação de pressão podeser alcançada através do tempo de contato curto por levar a solução e o flui-do supercrítico juntos pouco antes da etapa de pulverização no esguicho.Como já mencionado acima, o resultado disto é uma supersaturação eleva-da da solução de polímero - ingrediente ativo - sinal de substância. É possí-vel desta forma alcançar distribuições homogêneas e pequenos tamanhosde partícula, visto que a separação de fase inicial é seguida, através da pul-verização, mediante uma dispersão fina em que um transporte melhorado damatéria do solvente dentro do gás comprimido ou supercrítico pode ocorrerdevido à área superficial específica elevada das gotas de solução polimérica.É possível através da secagem por atomização supercrítica combinar crista-lização por deslocamento e cristalização por evaporação de solvente.
O processo PGSS difere fundamentalmente dos processos dealta pressão descritos acima, porque ele produz sem a utilização de um (fre-qüentemente tóxico) solvente para o polímero. Conforme descrito por Weid-ner no WO 95/21688, Gamse etal. in Chemie Ingenieur Technik 77 (2005)669-680, Fages etal., Powder Technology 141 (2004) 219-226 and Bungertet al., Ind. Eng. Chem. Res., 37, (1997) 3208-3220, este processo faz uso doefeito da redução da temperatura de transição vítrea de um polímero pelofluido supercrítico. O polímero é fundido no fluido supercrítico, e o ingredien-te ativo é disperso na solução. Durante isto, a viscosidade da fusão poliméri-ca também diminui. A fusão de polímero-gás com o ingrediente ativo e asubstância de sinal dispersas é descomprimida na unidade de precipitaçãoatravés de um esguicho, com o esguicho adicionalmente da mesma formapossivelmente sendo fornecido com gás supercrítico. Como um resultado daredução da temperatura através do efeito Joule-Thomson, a solução esfria, eo polímero se precipita como pó fino. As partículas podem ser removidas dacorrente de gás em um ciclone ou um eletrofiltro a jusante. As frações detamanho diferente podem ser fracionadas desta forma. O ingrediente ativopode ser disperso na matriz polimérica devido à fusão do polímero. A des-compressão no esguicho resulta em partículas monodispersas finas.
O processo RESS se parece com o processo PGSS porque ne-nhum solvente orgânico é utilizado neste processo. Conforme descrito porGamse et al. in Chemie Ingenieur Techriik 77 (2005) 669-680, Fages et al.,Powder Technology 141 (2004) 219-226 and Bungert et al., Ind. Eng. Chem.Res., 37, (1997) 3208-3220, em primeiro lugar o polímero é dissolvido emuma autoclave de alta pressão. O ingrediente ativo e a substância de sinalsão igualmente dissolvidos ou dispersos com um agitador. No caso das mi-cropartículas carregadas, a dispersão homogênea do ingrediente ativo e dasubstância de sinal na fusão é extremamente importante, pois em última a-nálise o tamanho das moléculas de ingrediente ativo representa a limitaçãocrucial para o tamanho das micropartículas (Gamse et al., Chemie IngenieurTechnik 77 (2005) 669-680; Fages etal., Powder Technology 141 (2004)219-226 and Bungert et al., Ind. Eng. Chem. Res., 37, (1997) 3208-3220). Asolução supercrítico é pulverizada em uma unidade de precipitação empressão ambiente. A supersaturação da solução ou das gotículas na des-compressão ocorre com uma velocidade muito maior em comparação comos métodos descritos acima. Devido à descompressão, a densidade do flui-do supercrítico e desta maneira também a força de dissolução cai em umtempo muito curto para os valores típicos de gás. A formação e transporte denúcleo da matéria ocorrem em sucessão direta neste processo e são otimi-zados muitas vezes pela comparação com os outros métodos (Gamse et al.,Chemie Ingenieur Technik 77 (2005) 669-680; Fages et al., Powder Techno-logy 141 (2004) 219-226 and Bungert et al., Ind. Eng. Chem. Res., 37,(1997)3208-3220).
Os sistemas de liberação de fármaco particulados com um diâ-metro de partícula preferido de menos do que 900 μπι, preferivelmente demenos do que 500 pm, podem ser obtidos facilmente com os métodos des-critos. Também é possível com os métodos descritos produzir sistemas deliberação de fármaco com um diâmetro de partícula entre 100 nm e 100 μm,as partículas normalmente empregadas tendo um diâmetro de partícula en-tre 500 nm e 10 μπι.
A carga de ingrediente ativo e substância de sinal do veículomediante a coacervação ou a dispersão de ingrediente ativo e substância desinal em uma fusão polimérica veículo ou uma solução rica em polímero veí-culo preferivelmente ocorre em uma faixa de temperatura entre -30 °C e+100 °C, particularmente preferível entre 0 °C e 60 °C. A pressão duranteestes processos está preferivelmente entre 10 Pa e 2 Mpa (0,1 mbar e 20bar), particularmente preferível entre 100 Pa e 1 Mpa (1 mbar e 10 bar).
A produção alternativa da formulação de ingrediente ativo deacordo com a invenção mediante a secagem por atomização, o processoGAS (Antissolvente Gasoso), o processo PCA (Precipitação com um Antis-solvente fluido comprimido), o processo PGSS (Partículas de soluções satu-radas com gás) e o processo RPESS (expansão rápida das soluções super-críticas) preferivelmente ocorre na faixa de temperatura entre -30 °C e +150°C, de preferência entre 0 -C e 100 -C e com pressões de sistema entre 10Pa e 25 Mpa (0,1 mbar e 250 bar), preferivelmente entre 0,1 Mpa e 18 Mpa(1 bar e 180 bar).
Os solventes adequados que devem ser mencionados para osmétodos de produção descritos são em particular água, álcoois tais como,por exemplo, etanol ou isopropanol, CO2 comprimido, propano comprimido,tetraidrofurano, tolueno, acetona, peróxido de benzoíla, solução aquosa deHCL1 hexano, ácido acético, etanodiol, diclorometano, dicloroetano e líquidostônicos.
O encapsulamento dos sistemas de liberação de fármaco partí-culados fornecidos desta maneira, em particular para a disponibilidade oralem princípio, é possível sem perda da função usando substâncias farmacêu-ticas comercialmente disponíveis tais como, por exemplo, com EUDRAGIT®(Degussa AG, DE).
Se as variantes especiais do método de coacervação ou méto-dos de revestimento especial (secagem por atomização, processo de mi-crosfera Brace, bocal coaxial, revestimento de leito fluidificado) forem em-pregadas, os ingredientes ativos e as substâncias de sinal podem ser envol-vidos ou revestidos com um ou mais polímeros veículos em uma pluralidadede camadas. Assim, por exemplo, as substâncias de sinal podem ser incor-poradas na camada externa, e os ingredientes ativos na camada interna, demodo que primeiro a substância de sinal e depois o ingrediente ativo sejaliberado. É ainda possível para uma pluralidade de diferentes ingredientesativos também ser agregada em diferentes camadas de partícula.
Quando os ingredientes farmacêuticos ativos forem incorpora-dos nas formulações farmacêuticas, por exemplo, utilizando os métodos hápouco descritos, requisitos sempre mais específicos devem ser encontradospela estabilidade das formulações de ingrediente ativo, pelo perfil de propri-edade do polímero veículo, pelo acionador da liberação e os cinéticos deliberação. Isto ocorre porque os ingredientes ativos ocasionalmente mostramuma reação sensível ao seu meio ambiente (degradação enzimática, tempe-ratura, alterações de pH), são insolúveis ou são não-lipofílicos. Os sistemasde liberação de fármaco particulados produzidos com estes métodos utili-zando os veículos poliméricos lineares ou ramificados ou reticulados acimadescritos mostram uma estabilidade particularmente elevada, tornando-oassim possível em particular para ingredientes farmacêuticos ativos tóxicos,sensíveis, reativos ou instável a serem liberados em uma maneira controladae estabilizada juntamente com as substâncias de sinal. Se os polímeros veí-culos ramificados ou reticulados, de preferência polímeros dendríticos e par-ticularmente preferíveis polímeros hiper-ramificados contendo grupo de poli-éster, poligliceróis hiper-rámificados, polissacarídeos ou dendrímeros PA-MAM como materiais veículos para ingredientes ativos biologicamente ativose substâncias de sinal forem possíveis com relação às desvantagens descri- tas a serem reduzidas ou totalmente eliminadas.
Além disso, em particular, os polímeros veículos dendríticos,provavelmente por causa de suas viscosidades e fusão e em solução quesão comparativamente baixas para polímeros, os métodos de encapsula-mento podem ser operados com quantidades distintamente reduzidas desolventes ou gases comprimidos. O polímero dendrítico atua neste casopropriamente dito como solvente/dispersante. A ocorrência reduzida de sol-vente torna a produção dos sistemas de transporte particulados mais segu-ros, em particular a liberação de vapores, que são explosivos ou prejudiciaisà saúde é distintamente reduzida.
A liberação controlada de ingrediente ativo pode ser influencia-da, em particular, pela espessura da camada de polímero veículo que cir-cunda o ingrediente ativo e a substância de sinal, pela natureza e pelo nú-mero dos grupos funcionais no polímero veículo e pelo tipo de método deencapsulamento. O período de liberação torna-se mais longo quando a es-trutura polimérica do veículo torna-se mais espessa. A espessura do veículopode ser alcançada, além da variação dos parâmetros do processo (pH,temperatura, solvente), em particular através da alteração da concentraçãopolimérica na mistura inicial. É possível através da utilização de polímerosdendríticos como veículo aumentar a carga do veículo com ingredientes ati- vos e substâncias de sinal até 70 % em peso, de modo que os tempos deliberação particularmente longos com grandes quantidades de ingredienteativo liberadas podem ser alcançados. Além da espessura da estrutura dopolímero veículo, o período de liberação é decidido pelo grau de funcionali-zação e pelo número de hidróxi. Se os ingredientes ativos fossem liberadosem meio polar, a liberação se tornaria mais lenta quando menos grupos po-lares livres, por exemplo, grupos de OH, estivessem presentes no polímeroveículo. O número de grupos de OH livres pode por sua vez ser influenciadopela esterificação com ácidos graxos.
A liberação das substâncias de sinal e ingredientes ativos dosistema de liberação de fármaco particulado ocorre por vários mecanismostais como, por exemplo, pela degradação enzimática do polímero veículo,por processos hidrolíticos, mudanças de pH ou modificações de temperatu-ra. A degradação enzimática do veículo é de particular interesse para a libe-ração direcionada ingredientes ativos farmacológicos. Os veículos poliméri-cos particularmente adequados a este respeito são polímeros que carregamgrupo de éster, especialmente poliésteres ramificados ou reticulados ou, depreferência dendríticos.
Os sistemas de liberação de medicamento particulados podemainda compreender excipientes convencionais tais como, por exemplo, esta-bilizantes, tensoativos, lubrificantes, óleos, ceras, estratos de planta, levedu-ra ou alga, aminoácidos, derivados de aminoácido, vitaminas e seus deriva- dos, lipídios bioativos tais como colesterol, ceramidas, pseudoceramidas,antioxidantes, conservantes, colorantes e pigmentos.
DESCRIÇÃO PAS FIGURAS
A figura 1a mostra por meio de exemplo, um agregado de veícu-lo - ingrediente ativo - substância de sinal consistindo de uma substância desinal de barreira não especificamente incorporada, não modificada (1), porexemplo, a proteína Tat, de um ingrediente ativo não especificamente incor-porado, não modificado (2), com a substância de sinal e o ingrediente ativosendo submetidos à coacervação em duas camadas com um veículo polimé-rico ramificado (3). A formulação de ingrediente ativo é adicionalmente cir-cundada por uma camada digestiva oral (4), por exemplo, de Eudragit®.
A figura 1b mostra a liberação da substância sinal (8) na matrizextracelular (5), pela qual a captação (9) do sistema de transporte através damembrana celular (7) no citoplasma (6) ocorre. A figura 1c depois mostra aseguinte liberação (10) do ingrediente ativo na célula.
A figura 2 mostra exemplos diagramáticos de uma material veí-culo dendrítico, a figura 2a mostra por meio de exemplo um dendrímero, afigura 2b um polímero hiper-ramificado.
A figura 3 mostra um micrógrafo de fluorescência de célulasCHO que foram tratadas com os sistemas dè liberação de fármaco de acor-do com a invenção, empregando o peptídeo Tat como substância de sinal, ecarboxifluorescina (marcadores) como análogo de ingrediente ativo. A cap-tação direcionada do marcador dentro das células CHO é evidente; a fluo-rescência é virtualmente não mais evidente fora das células CHO após aincubação durante 30 minutos. Este efeito sustenta a idéia de que os ingre-dientes ativos podem ser transportados através de uma membrana celular(barreira) com o sistema de liberação de fármaco descrito mesmo por meiode estímulos extracelulares não especificamente ligados ("pulo").
A figura 4 mostra a dependência de concentração, medida pelacitometria de fluxo, da captação de várias substâncias de sinal de peptídeoem células HeLa (peptídeo Tat, peptídeo Antp, peptídeo hLF (com uma se-qüência de aminoácido de acordo com as posições de 38 a 59 corrèspon-dendo à SEQ ID No. 1 ), peptídeo bLF (com uma seqüência de aminoácido,de acordo com as posições de 33 a 50 correspondendo à SEQ ID No. 2)).
A figura 5 mostra a captação, determinada pela citometria defluxo, de peptídeos hFL rotulados por fluoresceína (com uma seqüência deaminoácido de acordo com as posições de 38 a 59 correspondendo à SEQID No. 1) comparado com os peptídeos truncado LF1 e LF2 (com uma se-qüência de aminoácido de acordo com as posições de 40 a 55 correspon-dendo à SEQ ID No. 1 (LF1) e com uma seqüência de aminoácido, de acor-do com as posições de 40 a 50 correspondendo à SEQ ID No. 1 (LF2)).
A figura 6 mostra o resultado das investigações sobre a toxici-dade em células HeLa na incubação com várias concentrações de peptídeoshLF (com uma seqüência de aminoácido de acordo com as posições de 38 a59 correspondendo à SEQ ID No. 1) durante 0,5 hora ou 6 horas.A figura 7 mostra os sistemas de liberação de fármaco particu-Iados que compreendem ácido α-lipóico (figuras 7 A e B) ou um peptídeo desinal derivado de Iactoferrina humana e ácido a-lipóico.
MODALIDADES EXEMPLARES
As seguintes abreviações são usadas nas modalidades exem-plares:
Boc terc-Butiloxicarbonila
DIPEA Diisopropiletilamina
DMF Dimetilformamidâ
EDT Etanoditiol
Fmoc 9-Fluorenilmetoxicarbonila
HBTU hexafluorofosfato de 2-(1H-benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametilurônio
cromatografia líquida de alta pressão2,2,5,7,8-Pentametilcromansulfonilaterc-butilaTrietilsilanoÁcido trifluoroacéticoTrifenilmetila
XEMPLO 1: PRODUÇÃO DE UM ADJUVANTE DE SINAL DE PEPTÍDEO
Um peptídeo de sinal idêntico por natureza com a seqüênciaTyr-Gly-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg (seqüência Tat) é produzidopela estratégia Fmoc/tBu, com a alfa-aminofunção dos L-aminoácidos em-pregados sendo Fmoc-protegido, e as cadeias laterais dos aminoácidos tri-funcionais sendo protegidas pelos seguintes grupos de proteção: Boc paraIisina e triptofano; tBu para ácido aspártico, ácido glutâmico, serina, treoninae tirosina; Pmc para arginina; Trt para cisteína, histidina, asparagina e glu-tamina.
O peptídeo é produzido automaticamente em um sintetizador depeptídeo Syroll (MuItiSynTech1 Witten, DE). Para este propósito, em cadacaso, 70 mg de Fmoc-Gly-tritil-resina (carga de 0,85 mmol/g; 59,5 μιηοΙ) sãointroduzidos em seringas plásticas de 5 ml de substâncias vítreas plásticas.Os aminoácidos de Fmoc protegidos pela cadeia lateral são dissolvidos em0,4 M DMF1 e 0,4 M HBTU em DMF e 0,8 M DIPEA em DMF são emprega-dos como reagentes de ativação, e o grupo de proteção Fmoc temporário éeliminado com 40 % de piperidina em DMF. O acoplamento dos aminoáci-dos, a eliminação do grupo de proteção Fmoc e as etapas de lavagem ocor-rem enquanto se agita com um agitador magnético.
Protocolo da síntese: a resina é primeiro intumescida com 2 mlde DMF durante 5 min e extraída por filtração com sucção e depois lavadatrês vezes mais com 2 ml de DMF. Para eliminar o grupo de proteção Fmocda Fmoc-glicina primária, a resina é misturada com 1,2 ml de piperidina/DMFa 40 % durante 15 min, extraída por filtração com sucção e novamente mis-turada com 1,2 ml de piperidina/DMF a 40 % durante 15 min, extraída porfiltração com sucção e lavada quatro vezes com 2 ml de DMF. Para o aco-plamento, em primeiro lugar 600 μΙ da respectiva solução de aminoácido 0,4M em DMF (240 μ mol, 4 eq) e depois 600 μΙ de 0,8 M DIPEA/DMF (480μιτιοΙ, 8 eq) e subseqüentemente 600 μΙ de 0,4 M HBTU/DMF (240 μιηοΙ, 4eq) são adicionados à resina. Após 1 h, a solução de acoplamento é extraídapor filtração com sucção e a resina é lavada quatro vezes com 2 ml de DMF.Os outros ciclos de acoplamento são realizados em analogia à primeira po-sição, com a eliminação de Fmoc que ocorre primeiro como exatamentedescrito. Um outro aminoácido protegido por Fmoc é depois acoplado noproduto ativado lavado, e o produto de acoplamento resultante é novamentelavado. Após o último aminoácido ter sido acoplado, o grupo de proteçãoFmoc é eliminado como indicado acima, e a resina é depois lavada quatrovezes com 2 ml de DMF, 2 ml de metanol e 2 ml de diclorometano e sugadoseco. Subseqüentemente, o peptídeo resultante é tratado com 1,5 ml deTFA/EDT/TES/H20 (92,5:2,5:2,5:2,5) durante 3 h de modo a remover osgrupos de proteção de cadeia lateral e eliminar o peptídeo montado a partirdo suporte sólido. Após filtração do peptídeo resultante, o filtrado contendopeptídeo é concentrado em um evaporador a vácuo IR (TecConsuIt + Tra-ding, Eggstàtt, DE) de 0,5 ml em cada caso e, após a adição de 3,5 ml deéter dietílico gelado, armazenado em -20 0C durante 2 h. O peptídeo precipi-tado é girado para baixo e em três outras ocasiões misturado com 3,5 ml deéter dietílico gelado, transformado em pasta fluida, armazenado a -20 0Cdurante 2 h e girado para baixo novamente. O peptídeo resultante é depoissecado in vácuo. O produto resultante foi examinado por HPLC e espectro-metria de massa.
Os compostos descontaminantes requeridos para a síntese fo-ram adquiridos da Fluká (Seelze, DE). A resina da síntese oriunda da RappPolymere (Tübingen, DE), e os aminoácidos de Fmoc de proteção de cadeialateral e HBTU oriundos da Novabiochem (Bad Soden, DE).
EXEMPLO 2: PRODUÇÃO DE UMA FORMULAÇÃO PARTICULADA
Para este propósito, um polímero dendrítico (dendrímero de po-liamidoamina (PAMAM)), com uma massa molar Mw de 6909 g/mol, uma vis-cosidade em fusão a 80°C de menos do que 3 Pa s, um grau de ramificaçãode 100 % e um diâmetro da molécula portadora PAMAM de cerca de 36 Á a100°C é fundido em um primeiro recipiente de mistura.
Carboxifluoresceína (marcador) é usada para simular um ingre-diente ativo. A carboxifluoresceína é medida em juntamente com o peptídeode sinal produzido no Exemplo 1 no primeiro recipiente de mistura até queum teor de marcador de cerca de 1 % em peso e um teor de peptídeo desinal de cerca de 1 % em peso com base na fusão polimérica sejam atingi-dos. A carboxifluoresceína e o peptídeo de sinal são dispersos na fusão po-limérica pela mistura vigorosa.
Uma mistura de 2 % em peso de pectina (estabilizante), 1 % empeso de sulfato de éter laurílico (emulsificante) em 87 % em peso de água(solvente) é introduzida em um segundo recipiente de mistura a 50 0C comagitação, em que 10 % em peso de dispersão polimérica/marcador/peptídeode sinal são medidos a partir do primeiro recipiente de misturar enquanto seagita continuamente (os dados de % em peso são aqui baseados sobre opeso total da emulsão no segundo recipiente de mistura). Após um tempo depermanência de até 10 minutos, as formulações particuladas resultantes sesedimentam. As partículas resultantes são depois extraídas por filtração,lavadas com o solvente volátil etanol e depois secadas em um vácuo, seca-dor de placa ou tombo.
A maioria das partículas resultantes possuem um tamanho departícula entre 1 pm e 200 pm.
EXEMPLO 3: PROVA DE TRANSPORTE DE BARREIRA DOS SISTEMASDE LIBERAÇÃO DE FÁRMACO PARTICULADOS
Para este propósito, as células HeLa e CHO são incubadas emargilas líquidas cobertas com 8 câmaras (Nunc)1 em um meio de Eagle modi-ficado da Dulbecco com e sem indicadores de pH compreendendo 10 μΜdos sistemas de liberação de fármaco particulados produzidos no Exemplo 2a 37°C durante 30 min. As células são depois lavadas com médio, destaca-das por tripsinização durante 5 min, colocadas em suspensão em PBS e i-mediatamente depois disso, a intensidade de fluorescência média/célula édeterminada para um total de 10.000 células usando citômetro de fluxo (BDFACSCaIibur System, Becton Dickinson, Heidelberg, DE). As células vivassão selecionadas com base em dispersões laterais e dianteiras. As célulasselecionadas mostram uma morfologia não prejudicada.
Todas as medições de captação de ingrediente ativo são reali-zadas com células vivas com um microscópio de expulsão a laser LSM510inverso (Carl Zeiss, Gõttingen, DE), utilizando uma objetiva Plan-Apochromat63x 1.4 N.A. A incubação com peptídeo ocorre como descrito para a citome-tria de fluxo. Para detectar a carboxifluorescéína, a fluorescência é excitadacom a linhagem 488 nm de um laser de íon de argônio através de um divisorde feixe HFT UV/488; a fluorescência é detectada com um filtro BP 505-550bandpass.
A figura 3 mostra por meio de exemplo a mudança nos sinais decélulas CHO após incubação durante 30 minutos sob o microscópio de fluo-rescência confocal. A boa profundidade de penetração do sinal de fluores-cência (sinal de "ingrediente ativo") é evidente. Conseqüentemente, nenhu-ma ligação covalente do peptídeo de sinal para o ingrediente ativo ou para oveículo polimérico é necessária a fim de garantir o transporte do ingredienteativo através da membrana celular.
Em uma outra experiência, um sistema de liberação de fármacoparticulado foi produzido em analogia aos exemplos 1 e 2 com uma combi-nação das tinturas fluorescentes Cy3 (0,5 % em peso) e Cy5 (0,5 % em pe-so), e as células CHO foram incubadas com elas. A absorção direcionada deambas as tinturas nas células CHO foi detectável também neste caso.
EXEMPLO 4: LACTOFERRINA HUMANA E BOVINA COMO SUBSTÂNCIADE SINAL GERAL:
Células e réagentes: As células de carcinoma HeLa humanasutilizadas são derivadas da American Type Culture Collection (Manassas,VA, USA). As células HeLa foram cultivadas em meio RPMI 1640 estabiliza-do com glutamina e 2,0 g/l de NaHCO3 (PAN Biotech, Aidenbach, Germany)e com 10 % soro de bezerro fetal (PAN Biotech). Clorbromazina foi adquiridada (Calbiochem (Bad Soden, Germany), 5-(N-etil-Nisopropil)amilorida (El-PA), metil-p-ciclodextrina (MpCD) e MTT [brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio] foram adquiridos da Sigma (Deisenhofen, Germany).
Peptídeos: Os peptídeos utilizados foram sintetizados por mi-crocoleções EMC (Tübingen, Germany). A pureza de todos os peptídeos foiverificada por HPLC analítica. A identidade dos peptídeos foi confirmada porespectrometria de massa MALDI-TOF. A pureza de todos os peptídeos foi >95 % (214 nm HPLC). Os peptídeos foram N-terminalmente rotulados comcarboxifIuoresceína (como descrito na Fischer et al., Bioconjugate Chem. 14,653-660,2003).
Solução de matéria-prima dos peptídeos: Os peptídeos foramabsorvidos em DMSO para resultar em uma solução de 10 mM. A soluçãode matéria-prima resultante foi misturada com PBS ou meio. A concentraçãode peptídeo da solução de matéria-prima DMSO foi verificada por meio daabsorção de carboxifIuoresceína. Isso ocorreu pela espectrometria deUV/VIS com uma diluição de 1:100 da solução de matéria-prima com tampão0,1 M Tris/HCI (pH 8,8), a absorção em 492 nm foi medida, e carboxifluores-ceína foi assumida de ter um coeficiente de extinção de 75.000 l/(molcm).
Citometria de fluxo: Para determinar a eficiência de carga compeptídeos, as células HeLa foram introduzidas em uma densidade de 50.000por cavidade em uma placa de 24 cavidades (Sarstedt, Nümbrecht, Ger-many) em soro contendo RPMI 1640. Depois de um dia, as células foramlavadas com meio e dissolvidas com os peptídeos nas concentrações dese-jadas e incubadas em 300 μl de RPMI 1640 durante 30 min. Cada mistura foirealizada em triplicata. Após a incubação, as células foram lavadas commeio e destacadas por tripsinização durante 5 minutos, colocadas em sus-pensão em PBS gelado contendo 0,1% (p/v) BSA e imediatamente determi-nadas por citometria de fluxo (BD FACS Calibur Systems, Becton Dickinson,Heidelberg, Germany). A fluorescência de 7000 células vitais foi alcançadaem cada amostra. As células vitais foram identificadas pela dispersão lateralou dianteira.
EXEMPLO 4.1: EFICIÊNCIA DA ABSORÇÃO DE PEPTÍDEOS DE LACTO-FERRINA HUMANA E BOVINA
Os peptídeos derivados de lactoferrina humana ou bovina forampreparados pela síntese de peptídeo de fase sólida. Para verificar a absor-ção e a distribuição intracelular dos peptídeos em células vivas, ambos ospeptídeos foram modificados com carboxifluoresceína no N terminal. A fimde determinar se os peptídeos de Iactoferrina derivados possuem uma ativi-dade como peptídeos penetrantes de célula, a fluorescência associada coma célula das células HeLa incubadas com peptídeos bLF ou peptídeos hLFfoi determinada por citometria de fluxo. Para comparação, os peptídeos Antpe Tat foram selecionados como peptídeos penetrantes da célula bem esta-belecidos.
Como mostrado na figura. 4, a fluorescência celular, medido porcitometria de fluxo, aumenta com o aumento da concentração de peptídeopara todos os quatro peptídeos.
EXEMPLO 4.2: DETERMINAÇÃO DAS CONEXÕES ESTRUTURA-ATIVIDADE
O peptídeo hLF, tendo 22 aminoácidos, é um peptídeo pene-trante da célula de comprimento médio. A nonaarginina possui apenas noveaminoácidos, enquanto o peptídeo penetrante da célula popular transportanpossui 27. Quatro dos sete aminoácidos catiônicos e o aminoácido aromáti-co estão neste caso localizados perto do resíduo de citosina. Na proteínacompleta, o resíduo de citosina forma uma ponte de dissulfeto, por meio daqual o domínio forma uma conformação em loop. Além disso, a absorçãocelular dos peptídeos truncados (LF1 e LF2, Tabela 1) desprovidos do resí-duo de cisteína terminal em comparação com as proteínas completas foi tes-tada.
TABELA 1: ESTRUTURA PRIMÁRIA DOS PEPTÍDEOS TESTADOS
Ne peptídeo Seqüência
1 peptídeo Tat Fluo-YGRKKRRQRRR-CONH2
2 peptídeo Antp Fluo-RQIKIWFQNRRMKWKK-CONH2
3 peptídeo hLF Fluo-KCFQWQRNMRKVRGPPVSCIKR- CONH2
4 peptídeo bLF Fluo-PEWFKCRRWQWRMKKLGA-CONH2
5 peptídeo LF1 Fluo-FQWQRNMRKVRGPPVS-CONH2
6 peptídeo LF2 Fluo-FQWQRNMRKVR-CONH2
Todos os peptídeos foram sintetizados como amidas de peptí-deo. "Fluo" representa 5(6)-carboxifluoresceína, e CONH2 representa o Cterminal submetido a amida dos peptídeos. As seqüências de aminoácidoinalteradas correspondem à SEQ ID Nes 3-6 (Tabela 1 entrada No. 3-6), aseqüência Tat inalterada corresponde à SEQ ID No. 27, e a seqüência Antpinalterada corresponde à SEQ ID No. 28.
Os resultados da citometria de fluxo são representados na figura5. A absorção dos peptídeos LF1 e LF2, desprovidos das cisteínas, foi ape-nas um décimo da quantidade absorvida de peptídeo hLF que compreendeigualmente resíduos de cisteína.
EXEMPLO 4.3: CITOTOXICIDADE DE PEPTÍDEOS HLF
Nas experiências acima descritas, as concentrações de peptí-deo hLF de cerca de 40 μΜ foram empregadas, pelas quais nenhum efeitocitotóxico foi observado. No entanto, os tempos de incubação relativamentecurtos de menos do que uma hora foram utilizados quando se observa a ab-sorção de peptídeo em células vivas. Além disso, por conseguinte, o efeitodos tempos de incubação mais longos e concentrações mais elevadas dospeptídeos sobre a capacidade das células de sobreviver foi testado. As célu-Ias HeLa foram para este propósito incubadas com peptídeo hLF em umaconcentração de 1,25 μΜ a 160 μιτι durante 0,5 ou 6 h. A vitalidade das célu-las foi então determinada com um teste MTT. Os resultados são resumidosna figura. 6.
Nenhum efeito citotóxico pode ser observado nas células incu-badas durante apenas 30 min com o peptídeo até uma concentração de 40μΜ. A capacidade das células de sobreviver foi ligeiramente reduzida emuma concentração de peptídeo de 5 μΜ após 6 h. As células foram mortasem concentrações acima de 40 μΜ.
EXEMPLO 5
Carga de partículas de liberação de fármaco com e sem peptí-deos de sinal derivados da Iactoferrina humana e ácido a-lipóico.
EXEMPLO 5.1
O poliéster hiper-ramificado empregado foi obtido pela transfor-mação hidrofóbica de um poliéster hiper-ramificado hidrofílico (comercial-mente disponível da Perstorp® sob o nome Boltorn H30®) que tinha um pe-so molecular médio ponderado Mw de 3500 g/mol, uma temperatura de tran-sição vítrea de cerca de 35 0C e um número de hidróxi de cerca de 490 mgde KOH/g. A transformação hidrofóbica ocorreria pela esterificação do polí-mero hidrofílico com uma mistura de ácido esteárico e ácido palmítico (rela-ção de ácido esteárico para ácido palmítico = 2 para 1 com base na massa),com 50 % dos grupos de hidróxi do polímero hidrofílico sendo reagido. Opeso molecular Mw era 7500 g/mol.
O produto foi produzido pela dissolução de 20 %, em peso, deácido α-lipóico (CAS: 62-46-4; comercialmente disponível da Degussa® AG)no polímero fundido em uma temperatura de cerca de 65 0C com uma agita-dor espiral (200 rpm) em um primeiro recipiente de mistura dentro de 5 minu-tos.
Uma mistura de tensoativos consistindo em 1 % em peso deálcool polivinílico (M = 6000 g/mol, Polisciences®, Warrington, USA) e 0,1 %em peso de um álcool graxo etoxilado (Tego® Alkanol L4 da Degussa® AG)foi introduzida em água a 50 0C com agitação em um outro recipiente demistura.
Subseqüentemente, a fusão polimérica preparada no primeirorecipiente de mistura e contendo além do polímero também a substância aser encapsulada foi transferida do primeiro recipiente de mistura durante aagitação contínua (ULTRA-TURRAX, 3000 rpm) para o segundo recipientede mistura a 50 °C.
As partículas formadas após um tempo de permanência de 2minutos e esfriamento da composição contida no segundo recipiente de mis-tura a uma temperatura que foi 25°C abaixo do ponto de fusão do polímero.A suspensão foi passada através de uma bomba de tubulação para umacentrífuga em que as partículas de ingrediente ativo foram separadas da fa-se contínua a 25 °C. As partículas de ingrediente ativo foram depois secadasem 25-C e 103 Pa 10 mbar em um secador a vácuo durante 100 h.
As partículas eram isentas de solventes indesejados e consistiaem poliéster modificado por ácido graxo hiper-ramificado e cerca de 4 % empeso de ácido α-lipóico, com base na massa de partículas.
O teor de partícula de ácido α-lipóico foi determinado por HPLCapós extração com metanol ou metanol/água, e 5,4 % em peso de ácido a-lipóico (ácido tiótico) estiveram presente.
Uma amostra das partículas obtidas desta maneira foi intumes-cida com o peptídeo de sinal do Exemplo 4, Tabela 1, Ne 3 em uma soluçãode acetonitrila/água durante cerca de 30 min e extraída por filtração comsucção em um filtro, e o material polimérico fluorescente externamente secofoi depois fixado em um suporte de tântalo de uma tira de filtro de papel como material polimérico carregado por meio de fita adesiva e secado sob vácuoelevado durante a noite a fim de remover os vestígios de acetonitrila.
Parte das amostras foi seca e fixada e colocada em contato so-bre uma lâmina adesiva de grafita. A morfologia sobre o material de amostrafoi visualizada por micrógrafos eletrônicos de varredura. Os exames corres-pondentes são representados na figura. 7. As figuras 7 A e 7 B mostram mi-crógrafos eletrônicos de partículas carregadas com ácido α-lipóico. As figu-ras 7 C e 7 D mostram mierógrafos eletrônicos de partículas carregadas comácido lipóico e o peptídeo de sinal.
<table>table see original document page 41</column></row><table>As partículas resultantes (com e sem carga de peptídeo de si-nal) foram caracterizadas por espectroscopia eletrônica de fóton com raio Xanalítico superficial (XPS) (analisador de superfície XPS da Leybold, Colog-ne, Mg edge). Os resultados estão representados nas Tabelas 2 e 3. As par-tículas sem peptídeos mostraram os sinais específicos do átomo do polímeroveículo (C e O), e a formulação com peptídeo de sinal adicionalmente apre-sentou o sinal de nitrogênio (N) característico. O resultado mostra que o veí-culo, peptídeo sinal e ingrediente ativo estão na forma de uma agregaçãosimples, que não é covalentemente ligado. O peptídeo de sinal é adicional-mente detectável sobre a superfície de partícula.<table>table see original document page 41</column></row><table>EXEMPLO 5.2:
0 produto foi produzido por dissolver 1 % em peso de ácido a-lipóico (CAS: 62-46-4; comercialmente disponível da Degussa® AG) e 4 %em peso de poli(DL-lactídeo-co-glicolídeo) (CAS: 26780-50-7, comercialmen-te disponível como RESOMER® RG 502H da Boehringer Ingelheim) em 95% em volume de acetonitrila na temperatura ambiente usando uma agitadorde pá (200 rpm) em um primeiro recipiente de mistura dentro de 5 minutos.
1 % em peso de um álcool graxo etoxilado (Tego® Alkanol L4da Degussa® AG) em óleo de colza (ΕΑΝ Ne 22112682, obtido da Associa-ted Oil Packers GmbH) foi introduzido com a agitação em temperatura ambi-ente em um outro recipiente de mistura.
Depois a solução polimérica que foi preparada no primeiro reci-piente de mistura e que, além do polímero, também compreendia a substân-cia sendo encapsulada, foi transferida do primeiro recipiente de mistura du-rante a agitação contínua (agitador de hélice, 500 rpm) para dentro de umsegundo recipiente de mistura em temperatura ambiente.
Após um tempo de permanência de 3 horas, o solvente orgânicofoi evaporado e as partículas formadas. O óleo vegetal é misturado com n-hexano (na relação de 1:1 em massa) no mesmo recipiente de mistura e de-pois as partículas são extraídas por filtração. As partículas filtradas foramsecadas em um secador a vácuo em 50°C e 103 Pa (10 mbar) durante 100h.
O teor de partícula de ácido α-lipóico foi determinado por HPLCapós extração com metanol ou metanol/água, e 0,4 % em peso de ácido a-lipóico (ácido tiótico) estava presente.

Claims (16)

1. Sistemas de liberação de medicamento particulados com ba-se em um veículo polimérico, caracterizados pelo fato de que pelo menosuma substância de sinal para o transporte através de uma barreira biológicae pelo menos um ingrediente ativo são incluídos, com o veículo, a substân-cia de sinal e o ingrediente ativo não apresentando nenhuma ligação cova-lente de um com o outro.
2. Sistemas de liberação de medicamento particulados de acor-do com reivindicação 1, caracterizados pelo fato de que tanto a substânciade sinal quanto o ingrediente ativo estão presentes dispersos ou submetidosa coacervação no veículo polimérico.
3. Sistemas de liberação de medicamento particulados de acor-do com a reivindicação 1 ou 2, caracterizados pelo fato de que o veículo po-limérico compreende pelo menos um polímero ramificado ou reticulado comuma proporção de mais do que 50 % em peso com base no peso total do veículo.
4. Sistemas de liberação de medicamento particulados de acor-do com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizados pelo fato deque um polímero dendrítico é empregado como veículo polimérico.
5. Sistemas de liberação de medicamento particulados de acor-do com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizados pelo fato deque o veículo polimérico ramificado é um hidrogel ou um polímero em pente.
6. Sistemas de liberação de medicamento particulados de acor-do com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizados pelo fato deque um polímero dendrítico tendo uma massa molar acima de 1000 g/mole/ou uma viscosidade de fusão de menos do que 3,0 Pas a 80 0C é empre-gado como veículo polimérico.
7. Sistemas de liberação de medicamento particulados de acor-do com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizados pelo fato deque o polímero veículo é um polímero veículo dendrítico selecionado do gru-po de dendrímeros de poliamidoamina, de dendrímeros de polipropilenoimina, de dendrímeros com base em oxido de polietileno, de dendrímeros depoliéter, dendrímeros de poliamido, de dendrímeros de polilisina, de dendrí-meros de éter poliarílico;e/ou um polímero dendrítico do grupo de poliésteres, polieste-ramidas, poliéteres, polyamidas, polietilenoiminas; policaprolactonas, poligli-ceróis, poliglicolídeos, polilactídeos, polilactídeo-co-glicolídeos, politartaratose polissacarídeos;e/ou um polímero veículo reticulado selecionado do grupo dehomo- ou copolímeros de carboidrato naturais e artificiais, de polímeros deaminoácido naturais e artificiais, de ácidos nucléicos naturais e artificiais, depoliaminas, de poliiminas, de poliésteres, de poliéteres, de polióis, de poliole-finas, de polialquilenos glicóis, de poliamidas, de poliacetáis, de poliacrilatos,de poliacetatos, de poliuretanos, de polímeros de organossilício, de resinasepóxi, de politióis, de policarbonatos, de policaprolactonas, de poliglicolí-deos, de polilactídeos, de polilactídeo-co-glicolídeos e de politartaratos.
8. Sistemas de liberação de medicamento particulados de acor-do com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizados pelo fato deque a substância de sinal é uma substância de sinal inalterada que compre-ende um domínio de transdução (PTD).
9. Sistemas de liberação de medicamento particulados de acor-do com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizados pelo fato deque a substância de sinal é Iactoferrina ou um peptídeo derivado de Iactofer-rina.
10. Sistemas de liberação de medicamento particulados de a-cordo com a reivindicação 9, caracterizados pelo fato de que o peptídeo de-rivado de Iactoferrina compreende uma seqüência como mostrado na SEQID No. 3, SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 29, SEQ ID No. 30 ou uma variantedestas com uma identidade de mais do que 40 %.
11. Sistemas de liberação de medicamento particulados de a-cordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizados pelo fatode que o ingrediente ativo é um ingrediente farmacêutico ativo não modifica-do.
12. Sistemas de liberação de medicamento particulados de a-cordo com qualquer umadas reivindicações 1 a 11, caracterizados pelo fatode que os ingredientes ativos e/ou substâncias de sinal contidos são nãoespecificamente agregados em diferentes camadas nas partículas de Iibera-ção de medicamento.
13. Sistemas de liberação de medicamento particulados de a -cordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizados pelo fatode que existe agregação não específica de ingrediente ativo em uma cama-da interna e da substância de sinal em uma camada subseqüente no siste-ma de transporte particulado.
14. Uso de veículos poliméricos ramificados ou reticulados ca-racterizado pelo fato de ser para produzir sistemas de liberação de medica-mento particulados como definidos em qualquer uma das reivindicações 1 a-13, compreendendo pelo menos uma substância de sinal não especifica-mente agregada com o veículo polimérico, e pelo menos um ingrediente ati-vo.
15. Uso de veículos poliméricos ramificados ou reticulados, ca-racterizado pelo fato de ser para produzir sistemas de liberação de medica-mento particulados como definidos na reivindicação 14, compreendendo Iac-toferrina ou um peptídeo derivado de Iactoferrina como substância de sinal.
16. Processo para produzir sistemas de liberação de medica-mento particulados, como definidos em qualquer uma das reivindicações 1 a-13, caracterizado pelo fato de que as partículas dos sistemas de liberaçãode medicamento são geradas por coacervação ou por meio de um métodode alta pressão utilizando um gás comprimido ou supercrítico em uma faixade temperatura entre -30 0C e +150 eC e uma pressão entre 10 Pa e 25 Mpa(0,1 mbar a 250 bar).
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