BRPI0617860A2 - pequenos oligonucleotìdeos de interferência que compreendem nucleotìdeos modificados com arabinose - Google Patents
pequenos oligonucleotìdeos de interferência que compreendem nucleotìdeos modificados com arabinose Download PDFInfo
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Abstract
<B>PEQUENOS OLIGONUCLEOTìDEOS DE INTERFERêNCIA QUE COMPREENDEM NUCLEOTìDEOS MODIFICADOS COM ARABINOSE.<D> A presente invenção refere-se a dúplex de pequenos ácidos ribonucléicos de interferência que inibem a expressão gênica, contendo pelo menos um nucleotídeo modificado com arabinose. Preferivelmente, os dúplex contém ribonucleotídeos em que pelo menos um nucleotídeo modificado com arabinose é o nucleotídeo 2'-desóxi-2'-fluoroarabinonucleotídeo (FANA).
Description
Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "PEQUENOSOLIGONUCLEOTÍDEOS DE INTERFERÊNCIA QUE COMPREENDEMNUCLEOTÍDEOS MODIFICADOS COM ARABINOSE".Campo da Invenção
A presente invenção refere-se geralmente a pequenos dúplicesde RNA de interferência (siRNA) que contêm pelo menos um nucleotídeomodificado por arabinose, assim como pequenos híbridos de interferência deácido 2'-desóxi-2'-fluoroarabinonucléico:RNA para a regulação negativa deexpressão gênica.Antecedentes da Invenção
Várias estratégias para silenciamento de expressão gênica commoléculas à base de ácido nucléico estão sob desenvolvimento [Stephen-son, M. L. & Zamecnik, P. C. Inhibition of Rous sarcoma viral RNAtranslation by a specific oligodeoxynucleotide. Proc. Natl. Acad. Sei.USA 74, 4370-4373 (1977); Opalinska, J.B. & Gewirtz, A.M. Nucleic-acidtherapeuties: basic principies and recent applications. Nature Rev. 1(July), 1-10 (2002)]. Dessas, as estratégias "antisentido" direcionadas porhibridização, usando ribozimas, DNAzimas e oligonucleotídeos antisentidotais como RNA-DNA quimérico (gapmers) ou DNA fosforotioato, tem recebi-do a maior atenção e são o tema de várias revisões [Stull, R.A. & Szoka, F.C. Antigene, ribozyme and aptamer nucleic acid drugs: progress andprospects. Pharmaceutical Res. 12, 465-483 (1995); Uhlmann E. & Peyx-nan, A. Antisense oligonucleotides: a new therapeutic principie. Chem.Rev. 90, 544-584 (1990)]. Mais recentemente, silenciamento gênico pós-transcricional ou interferência de RNA (RNAi) emergiu como uma alternativapotencial excitante a essas abordagens mais clássicas [Elbashir, S.M, Len-deckel, W. & Tuschl, T. RNA interference is mediated by 21- and 22 -nucleotide RNAs. Genes Dev. 15, 188-200 (2001); Caplen, N.J. et al.Specific inhibition of gene expression by small dsRNAs in invertebrateand vertebrate systems. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98, 9742-9747(2001); Nishikura, K. A short primer on RNAi: RNA-directed RNA poly-merase acts as a key catalyst. Cell 107, 415-418 (2001); Tuschl, T.Expanding small RNA interference. Nature Biotechnol. 20, 446-448(2002); Mittal, V. Improving the efficiency of RNA interference in mam-mals. Nature Rev. 5, 355- 365 (2004); Nykanen A,, Haley, B. & Zamore,P.D. ATP requirements and small interfering RNA structure in the RNAinterference pathway. Cell 107, 309-321 (2001)]. Há vários relatos quedescrevem a utilidade desse método para o silenciamento de genes em or-ganismos vivos que variam de leveduras a mamíferos [Yu, J.Y., S. L. De-Ruiter, & D.L. Turner, RNA interference by expression of short-interfering RNAs and hairpin RNAs in mammalian cells. Proc. Natl. A-cad. Sei. USA 99, 6047 (2002); Donze, 0. & D. Picard, RNA interferencein mammalian cells using siRNAs synthesized with T7 RNA polymerase.Nucleic Acids Res. 30, e46 (2002); Sui, G., C. Soohoo, B. Affar el, et al. ADNA vector-based RNAi technology to suppress gene expression inmammalian cells. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 99, 5515 (2002); Paddison,P.J., A.A. Caudy, E. Bernstein, et al. Short hairpin RNAs (shRNAs) indu-ce sequence- specific silencing in mammalian cells. Genes Dev. 16, 948(2002)].
A utilidade de siRNA in vivo e sua possível aplicação em farma-coterapia, como com outras terapias baseadas em oligonucleotídeo, enfrentaalguns obstáculos chave (por exemplo, liberação, absorção celular e bioes-tabilidade de oligonucleotídeos). Há uma necessidade de desenvolver modi-ficações químicas que resultem em moléculas clinicamente úteis. O trabalhoinicial com oligonucleotídeos antisentido e de siRNA foi realizado com molé-culas não-modificadas, naturais. Entretanto, logo ficou claro que oligonucleo-tídeos nativos eram submetidos a degradação relativamente rápida, primari-amente através da ação de 3'exonucleases, mas também como um resulta-do do ataque de endonucleases. Oligorribonucleotídeos (RNA) são, de fato,geralmente mais suscetíveis a degradação por nuclease em relação aoDNA.
Moléculas antisentido e de siRNA são agora modificadas rotinei-ramente para aumentar sua estabilidade, assim como a força de sua hibridi-zação com RNA já que esses atributos físicos são freqüentemente necessá-rios para sua aplicação terapêutica [Mangos, M.M. & Damha, M.J. Flexibleand Irozen sugar-modified nucleic acids - modulation of biological acti-vity through furanose ring dynamics in the antisense strand, Curr. Top.Med. Chem. 2, 1145-1169 (2002); Agrawal, S. & Q. Zhao. Mixed backbo-ne oligonucieotides: improvement in oligonucleotide-induced toxicity invivo. Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 8, 135 (1998); Crooke, S.T. Mo-lecular mechanisms of action of antisense drugs. Biochim. Biophys.Acta 1489, 31 (1999); Micklefield, J. Backbone modification of nucleicacids: synthesis, structure and therapeutic applications. Curr. Med.Chem. 8, 1157 (2001); Nielsen, P.E., Antisense peptide nucleic acids.Curr. Opin. Mol. Ther. 2, 282 (2000); Braasch, D.A., S. Jensen, Y. Liu, etal., RNA interference in mammalian cells by chemically-modified RNA.Biochemistry 42, 7967 (2003)]. Na presença de um veículo de liberação,ambos os tipos de moléculas são capazes de cruzar membranas celulares eentão hibridizar com seu RNA alvo pretendido. A estrutura terciária do RNAé um importante fator que governa a habilidade de oligonucleotídeos anti-sentido [Opalinska, J.B., A. Kalota, L.K. Gifford, et al. Oxetane modified,conformationally constrained, antisense oligodeoxyribonucleotidesfunction efficiently as gene silencing molecules [Nucleic Acids Res. 32,5791 (2004). Scherr, M., J.J. Rossi, G. Sczakiel, et al., RNA accessibilityprediction: a theoretical approach is consistent with experimental stu-dies in cell extracts. Nucleic Acids Res. 28, 2455 (2000). Sokol, D.L., X.Zhang, P. Lu, et al., Real time detection of DNA.RNA hybridization inliving cells. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 95, 11538 (1998)] e siRNA [Opa-linska, J.B., A. Kalota, L.K. Gifford, et al. Oxetane modified, conformati-onally constrained, antisense oligodeoxyribonucleotides function effi-ciently as gene silencing molecules. Nucleic Acids Res. 32, 5791 (2004);Scherr, M., J.J. Rossi, G. Sczakiel, et al., RNA accessibility prediction: atheoretical approach is consistent with experimental studies in cell ex-traets. Nucleic Acids Res. 28, 2455 (2000); Sokol, D.L., X. Zhang, P. Lu,et a!., Real time detection of DNA.RNA hybridization in living cells. Proc.Natl. Acad. Sei. USA 95, 11538 (1998)] hibridizarem com seus alvos. Nãose pode deixar de falar que é indesejável para qualquer tipo de moléculaexercer ligação não-seqüência específica. Reunir todos esses requisitos semostrou ser uma tarefa exigente.
Dúplices de siRNA não modificados têm sido usados com su-cesso para o silenciamento gênico, entretanto, a modificação química deuma ou de ambos os filamentos provavelmente será necessária para aplica-ções terapêuticas a fim de melhorar a bioestabilidade e as propriedades far-macocinéticas. Várias modificações químicas foram testadas quanto aosefeitos sobre a atividade de siRNA, embora não esteja claro ainda quaisdessas modificações serão as mais vantajosas. No planejamento de novosanálogos é importante reconhecer que dois aspectos-chave de siRNA dife-rem das abordagens antisentido tradicionais: (i) dúplices de RNAs são reco-nhecidos e (ii) a inibição gênica envolve RISC (Complexo de SilenciamentoInduzido por RNA) - ao invés de RNase H - para promover o reconhecimento e a clivagem do mRNA alvo [Elbashir, S.M, Lendeckel, W. & Tuschl, T.RNA interference is mediated by 21- and 22-nucleotide RNAs. GenesDev. 15, 188-200 (2001); Caplen, N.J. et al. Specific inhibition of geneexpression by small dsRNAs in invertebrate and vertebrate systems.Proc. Natl. Acad. Sei. USA 98, 9742-9747 (2001); Nishikura, Κ. A shortprimer on RNAi: RNA-directed RNA polymerase acts as a key catalyst.Cell 107, 415-418 (2001); Tuschl, T. Expanding small RNA interference.Nature Biotechnol. 20, 446-448 (2002); Mittalf V. Improving the efficiencyof RNA interference in mammals. Nature Rev. 5, 355- 365 (2004)]. Comotal, oligonucleotídeos semelhantes a RNA são os candidatos principais paraintroduzir modificações de açúcar ou do esqueleto sem perturbar a estruturahelicoidal de forma-A global que eles precisam para atividade. Uma modifi-cação promissora são os Ácidos Nucléicos Bloqueados (LNA), nos quais osbenefíciso-chave foram obtidos com relativamente poucas modificações quenão comprometem significativamente a atividade de siRNA (por exemplo,estabilidade térmica e bioestabilidade melhoradas e efeitos fora do alvo re-duzidos) [Elmen, J. et al. Locked nucleic acid (LNA) mediated improve-ments in siRNA stability and functionality. Nucl. Acids Res. 33, 439-447(2005)]. Entretanto, a atividade e especificidade de tais compostos foi verifi-cada ser altamente dependentes do sítio e do grau das modificações deLNA. Uma única substituição de LNA na extremidade 5' do filamento antisen-tido aboliu a atividade. Além disso, a atividade foi significativamente prejudi-cada quando o filamento antisentido foi modificado, enquanto que as modifi-cações de LNA no filamento de sentido foram apenas toleradas com oligo-nucleotídeos levemente modificados, exibindo atividade igual ou menor doque o siRNA não modificado. Parece haver limitações com outras químicas,incluindo toxicidade (fosforotioato-RNA) e atividade prejudicada (2'F-RNA,boranofosfato-RNA), com graus crescentes de modificação [Amarzguioui,M. et ai. Tolerance for mutations and chemical modifications in a siR-NA, Niicl. Acids. Res. 31, 589-595 (2003)]. Apesar disso ser compensado aprincípio pela estabilidade da nuclease e/ou especificidade conferida por cer-tas químicas de oligonucleotídeo, a predição de químicas eficazes de siRNApermanece um foco ativo de estudos em andamento.
Há uma necessidade de siRNAs quimicamente modificados quetem estabilidade de nuclease e/ou habilidade para inibir expressão gênica.Sumário da Invenção
De acordo com um amplo aspecto da invenção, um pequenoRNA de interferência (siRNA) para modular a expressão de um gene alvo deuma maneira seqüência-específica compreendendo um dúplex de filamentoduplo em que pelo menos um nucleotídeo de ácido ribonucléico do siRNA ésubstituído por um nucleotídeo modificado com arabinose que é fornecido. Onucleotídeo modificado com arabinose é 2'-desóxi-2'-fluoroarabinonu-cleotídeo (FANA).
Preferivelmente, o siRNA tem 15-30 nucleotídeos de extensão etem 1-3 projeções de nucleotídeos nas terminações 3' e 5'.
Em modalidades específicas, o dúplex pode ter qualquer númerode arabinonucleotídeos em qualquer localização tanto no filamento de senti-do quanto na antisentido, por exemplo:5 ' -ARARARARARARARARARARA-3 '5 ' -AARRAARRAARRAARRAARRA-3 '5 ' -AARRRRRRRRRRRRRRRRRRR-3 '5 ' -RRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRAA-3'etc.
em que A é um arabinonucleotídeo e R é um ribonucleotídeo.
Em outras modalidades da invenção, o filamento de sentido é
totalmente substituído por arabinonucleotídeos. Por exemplo:5'-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-3'
e a fita antisentido é uma fita de RNA com fita inteira de RNA ou fita parcial-mente substituída, por exemplo: 5 ' -RRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRR-3 15 ' -RRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRAA-3'5 ' -AARRRRRRRRRRRRRRRRRRRRR-3' etc.
Em outras modalidades da invenção, o arabinonucleotídeo com- preende um substituinte 2' selecionado a partir do grupo que consiste emflúor, hidroxila, amino, azido, grupos alquila, alcóxi e alcoxialquila. Em umamodalidade adicional da invenção, o grupo alquila é selecionado do grupoque consiste em metila, etila, propila, butila e grupos alquila funcionalizadostais como grupos etilamino, propilamino e butilamino. Em modalidades, ogrupo alcóxi é selecionado do grupo que consiste em metóxi, etóxi, propóxi egrupos alcóxi funcionalizados tais como -O(CH2)q-R, onde q=2-4 e -R é umgrupo -NH2, -OCH3, ou -OCH2CH3. Em modalidades, o grupo alcoxialquila éselecionado do grupo que consiste em metoxietila e etoxietila. Em modalida-des, o substituinte 2' é flúor e o arabinonucleotídeo é 2'- fluoroarabinonucleotídeo (FANA). Preferivelmente, o nucleotídeo FANA éaraF-G, araF-T, araF-U, araF- A, araF-5-metil-C.
De acordo com algumas modalidades da invenção, o siRNA épara diminuir qualquer um de expressão de luciferase, expressão de CCR3ou expressão de PDE4D. De acordo com outra modalidade da invenção, o siRNA é paradiminuir a replicação do Vírus Sincicial Respiratório.
Em outras modalidades da invenção, o dúplex compreende umaou mais ligações internucleotídeos selecionadas a partir do grupo que con-siste em:
a) fosfodiéster;
b) fosfotriéster;
c) fosforotioato;
d) metilfosfonato;
e) boranofosfato e
f) qualquer combinação de (a) a (e).
De acordo com outro amplo aspecto da invenção, é fornecidoum método para aumentar pelo menos a estabilidade de uma nuclease emodulação da atividade de um gene alvo de um siRNA que compreendesubstituir pelo menos um nucleotídeo do siRNA por um nucleotídeo modifi-cado com arabinose, preferivelmente 2'-desóxi-2'-fluoroarabinonucleotídeo(FANA).
De acordo com outro amplo aspecto da invenção, é fornecidauma composição farmacêutica, que compreende o siRNA da presente in-venção junto com um veículo farmaceuticamente aceitável.
De acordo com outro amplo aspecto da invenção, é fornecido ouso do siRNA da presente invenção para a preparação de um medicamentopara modular a expressão de um gene alvo, preferivelmente um de CCR3 ePDE4D.
De acordo com outra modalidade da invenção, é fornecido o usodo siRNA da presente invenção para a preparação de um medicamento paradiminuir a replicação do Vírus Sincicial Respiratório.
De acordo com outro amplo aspecto da invenção, é fornecidoum método para modular a expressão gênica em um paciente que necessitedisso. O método compreende administrar ao paciente uma quantidade tera-peuticamente eficaz da composição farmacêutica da invenção. Preferivel-mente, a composição farmacêutica compreende um siRNA para qualquer umde diminuição de expressão de CCR3, diminuição de expressão de PDE4De diminuição de replicação de Vírus Sincicial Respiratório.
De acordo com outro amplo aspecto da invenção, é fornecidauma embalagem comercial. A embalagem comercial compreende a compo-sição farmacêutica da presente invenção junto com instruções para seu usopara modular expressão gênica. Preferivelmente, a composição farmacêuti-ca compreende um siRNA para qualquer um de diminuição de expressão deCCR3, diminuição de expressão de PDE4D e diminuição de replicação deVírus Sincicial Respiratório.Breves Descrições dos Desenhos
A invenção será descrita agora em maiores detalhes com rela-ção aos desenhos em anexo nos quais:
figura 1 ilustra a eficácia dos diferentes siRNAs na inibição deIuciferase em células HeLa X1/5. As células foram transfectadas com 0,21pg de siRNA tendo modificações apenas no filamento de sentido (A), apenasno filamento antisentido (B) ou em ambas os filamentos sentido e antisentido(C). Os níveis de atividade da Iuciferase foram medidos 24 h após a trans-fecção e normalizados para a atividade metabólica. A atividade da Iuciferasenormalizada foi então determinada como um percentual da atividade de Iuci-ferase quando comparado a um siRNA de controle determinado em 100%.Os dados representam a atividade de Iuciferase normalizada média +/- SEM.Os níveis de mRNA de Iuciferase foram quantificados por análise de PCRem tempo real (em relação a expressão do gene regulador GAPDH) 24 hapós a transfecção. As barras mostram proporções médias de Lucifera-se/GAPDH +/-SEM.
Figura 2 mostra a potência de siRNA que contém FANA em inibira atividade de luciferase. Doses-respostas foram obtidas para cada siRNApor transfectar células com quantidades diferentes de siRNA ativo por 24 h.Doses-respostas para siRNA que tem modificações apenas no filamento desentido são mostradas em (A), apenas no filamento antisentido (B) ou emambos os filamentos sentido e antisentido (C). A atividade de luciferase foimedida e os valores normalizados para a atividade metabólica e compara-dos a um siRNA de estabelecido em 100%. Os dados representam a ativi-dade normalizada média de luciferase +/- SEM.
Figura 3 ilustra a eficácia ao longo do tempo de diferentes siRNAdirecionados para o mRNA de Iuciferase em células HeLa X1/5. Células fo-ram transfectadas com 0,21 pg de siRNA. A atividade de Iuciferase foi medi-da 4, 8, 24, 48, 72 e 96 h após a transfecção. Os dados representam a ativi-dade normaljzada média de Iuciferase +/- SEM comparados a um siRNA decontrole estabelecido em 100%.
Figura 4 ilustra a estabilidade sérica de siRNA que contém FA-NA. Os diferentes siRNAs foram incubados em soro fetal bovino 10% a 37SCe alíquotas foram retiradas nos pontos de tempo indicados. Os siRNAs fo-ram separados por PAGE e visualizados com SYBR gold. As bandas foramquantificadas por densitometria e a porcentagem de siRNA intacto da quan-tidade inicial estabelecida em 100%. A) Estabilidade sérica de siRNAs dire-cionados para Iuciferase é mostrada. A) Estabilidade sérica de siRNAs atin-gindo luciferase é mostrada, "ds" representa marcador de siRNA duplo fila-mento e "ss" fita simples. B) gráfico representando estabilidade sérica dediferentes siRNAs direcionados para luciferase. C) Gráfico representandoestabilidade sérica de diferentes siRNAs direcionados para CCR3. D) Gráfi-co representando estabilidade sérica de diferentes siRNAs direcionados paraPDE4D. Os dados representam valores médios de dois a três experimentosindependentes + SEM.
Figura 5 ilustra a eficácia de siRNAs que contêm FANA em inibira expressão de CCR3 de rato em células NIH-3T3. Quantidades crescentesde siRNAs direcionados para CCR3 de rato foram co-transfectadas com umplasmídeo que expressa o gene de CCR3 de rato em células NIH-3T3. Ní-veis de expressão de mRNA de CCR3 foram medidos 24h após a transfec-ção usando o método Quantigene (Panomics) e normalizados para os níveisde expressão de um gene de referência (Luciferase). A atividade do siRNAfoi determinada como a porcentagem de inibição em comparação a um siR-NA de controle estabelecido em 100%. Os dados representam média +/-SEM (n = 6).
Figura 6 ilustra a eficácia de siRNAs que contêm FANA direcio-nados para a proteína-P viral de RSV na produção de RSV em células A549.Células A549 foram cultivadas e semeadas a 0,1 χ 105 células por cavidadeem placas de 24 cavidades e cultivadas durante a noite a 37°C, 5% de CO2.No dia seguinte, culturas celulares foram transfectadas com 0,05 pg, 0,2 pgou 0,4 pg de siRSV-P2 (siRNA contra proteína-P viral de RSV), siRSV-P2-Mi(siRNA não pareado contra proteína-P viral de RSV), siRSV-P2-0/F4 e con-trole negativo siRNA-P2-Mi-0/F4 usando reagente de transfecção Lipofec-tamina 2000 em uma proporção de siRNA: Lipofectamina 2000 de 1:3. Cadaexperimento de transfecção foi realizado em triplicata. Um dia após a trans-fecção, as células foram infectadas com hRSV a uma M.O.I. = 1 e incubadasa 37°C, 5% de CO2 durante a noite. Os sobrenadantes foram colhidos 24horas após a infecção e avaliados por ELISA para os níveis virais por quanti-ficação de proteína de RSV. Os dados são expressos como % de inibição deRSV por siRNA em relação aos níveis de inibição de RSV pelo seu respecti-vo siRNA não-pareado.Descrição Detalhada
Essa invenção refere-se a dúplices de oligonucleotídeo modifi-cados desenhados para atingir mRNA e promover degradação de mRNAatravés do mecanismo de RNAi. Em particular, inibição seletiva da atividadede luciferase, expressão de CCR3 de rato e replicação viral de RSV usandopequenos dúplices de RNA de interferência contendo arabinonucleotídeosmodificados (FANA) é mostrada. Os métodos de RNAi descritos aqui sãodiferentes dos métodos comuns descritos acima, que se concentraram nouso de nucleotídeos modificados derivados de unidades de ocorrência natu-ral (isto é, nucleotídeos de DNA, RNA, 2' OMe-RNA, 2'F-RNA) [Allerson,CR. et al. Fully 2'- modified oligonucleotide dúplices with improved invitro potency and stability compared to unmodified small interferingRNA. J. Med. Chem. 48, 901-904 (2005)].
Essa invenção abrange a caracterização de uma série de dúpli-ces modificadas com açúcar que inibem a expressão gênica em uma linha-gem celular humana. Esses pequenos dúplices de interferência contêm nu-cleotídeos modificados com arabinose que conferem características melho-radas ao dúplex, tal como estabilidade melhorada contra nucleases presen-tes no fluido corporal. Preferivelmente, os nucleotídeos modificados com a-çúcar são 2'-desóxi-2'-fluoroarabinonucleotídeos (FANA). O método paragerar os dúplices modificados com FANA precisa da substituição de nucleo-tídeos de RNA por resíduos de FANA.
A atividade dos siRNAs modificados foi avaliada usando uma li-nhagem celular HeLa manipulada para superexpressar luciferase. Os níveisde expressão de mRNA de luciferase e níveis de atividade de luciferase fo-ram determinadas usando PCR em tempo real e técnicas de ensaio de luci-ferase, respectivamente. O desenho e seleção da seqüência de bases realdo siRNA foi realizado de acordo com Mittal et al. [Mittal, V. Improving theefficiency of RNA interference in mammals. Nature Rev. 5, 355-365(2004)] utilizando os algoritmos da Ambion e da Qiagen e pesquisas no Blastdo NCBI. Pelo menos três dúplices de siRNA candidatos foram selecionadose testados como descrito acima. Uma vez que o dúplex de siRNA mais ativofoi identificado (EC50 ~ 0,5 nM), experimentos preliminares foram realizadospara avaliar o impacto da modificação com arabinose sobre a atividade desiRNA. Inibição seletiva, específica e eficaz da atividade de luciferase de taisdúplices modificados com FANA é demonstrada (Figura 1). A substituiçãocompleta de um filamento de RNA (filamento de sentido) nos dúplices desiRNA com um filamento de FANA gera híbridos FANA:RNA que tambémfornecem regulação negativa seletiva, específica e eficaz de um mRNA alvo(Figura 1A).
Os compostos descritos aqui representam os primeiros exem-plos de dúplices modificados com FANA (siRNAs modificados com FANA, ehíbridos FANA:RNA) capazes de inibir a expressão gênica seletivamenteatravés do mecanismo de RNAi.
Especificamente essa invenção fornece nucleotídeos de FANAque são compatíveis com a atividade de dúplices de siRNA. Além disso, émostrado que um filamento de sentido de totalmente formada de FANA podese ligar a um filamento antisentido de RNA complementar não modificadagerando um dúplex que entra na via de RNAi para atingir seletivamente eeficazmente um mRNA e promover sua degradação (Figura 1A e 2A). Essesdúplices modificados são obtidos por sintetizar os filamentos constituintes(através de métodos químicos de fase sólida) e então permitir que eles ane-Iem para formar um dúplex. Inesperadamente, em todos os casos que en-volvem modificação parcial ou completa do filamento de sentido, a atividadede silenciamento gênico é similar àquela observada com os dúplices de siR-NA nativos não modificados (Figura 1A e 2A). Tratamento com dúplices mo-dificados com FANA resultou em uma redução da atividade de Iuciferase deuma forma dependente da concentração com uma EC5O estimada na faixade 0,06 a 3,6 nM. As potências observadas para os dúplices sentido modifi-cados eram comparáveis àquelas do siRNA nativo (Figs 2A - 2C), que ti-nham uma EC5O estimada de 0,20 nM nesse sistema (Tabela 1).
Essa invenção também fornece dúplices de RNA nos quais umfilamento de sentido não modificada é anelada a um filamento antisentido naqual os resíduos terminais dN pendurados (terminações 3' ou 5') são substi-tuídos por FANAs sem afetar a atividade (Figura 1B e 2B). De forma surpre-endente, substituir os dois 3'-desoxinucleotídeos por resíduos de FANA con-fere potência aumentada sobre siRNA não modificado (Figura 1B e 2B), emcontraste surpreendente aos siRNAs com modificações de LNA, onde asalterações correspondentes resultaram em uma diminuição significativa ouperda completa de atividade [Elmen, J. et al. Locked nucleic acid (LNA)mediated improvements in siRNA stability and functionality. Nucl. A-cids Res. 33, 439-447 (2005)].
Essa invenção também fornece dúplices de RNA nos quais tantoo filamento de sentido como o filamento antisentido contêm resíduos modifi-cados enquanto mantêm a atividade de RNAi (Figura 1C). Como para osdúplices de RNA que contêm FANAs em um dos dois filamentos, esses dú-plices mostraram degradação específica do alvo em potências iguais a oumaiores do que aquelas do siRNA não modificado (Figura 2C).
Da mesma forma que siRNAs não modificados, inibição susten-tada da atividade de Iuciferase foi observada quando dúplices modificadoscom arabinose foram transfectados em células por até 4 dias após a trans-fecção (Figura 3). Entretanto, nesse ponto de tempo, siRNAs modificadosforam descobertos ter maior atividade inibitória do que siRNA não modifica-do.
Aqui é apresentada evidência de que a estabilidade de nucleasede dúplices de siRNA que contêm FANA é melhorada sobre dúplices desiRNA não modificados (Figura 4). Enquanto que siRNAs não modificadossão completamente degradados dentro de 15 minutos, dúplices de siRNAque contêm um filamento de sentido completamente modificado e um fila-mento antisentido com a projeção da extremidade 3' modificada são facil-mente detectáveis após 5h. Conseqüentemente, 2'-desóxi-2'-flúor-p-D-arabino-(oligonucleotídeos), sozinhos ou em combinação com unidades deribonucleotídeo (RNA), são capazes de hibridizar os filamentos de RNAcomplementares (antisentido) para gerar dúplices de siRNA com potênciamelhorada e resistência a nuclease aumentada. Essas propriedades sãoaltamente desejáveis ao contemplar a administração in vivo desses compos-tos.
Uma "quantidade terapeuticamente eficaz" refere-se a umaquantidade eficaz, em dosagens e por períodos de tempo necessários parase obter o resultado terapêutico desejado. Uma quantidade terapeuticamen-te eficaz de um ácido nucléico modificado da invenção pode variar de acordocom fatores tais como o estado de doença, idade, sexo e peso do indivíduo,e a habilidade do ácido nucléico modificado criar uma resposta desejada noindivíduo. Regimes de dosagem podem ser ajustados para fornecer a res-posta terapêutica ótima. Uma quantidade terapeuticamente eficaz também éuma na qual quaisquer efeitos tóxicos ou prejudiciais do composto são supe-rados pelos efeitos terapeuticamente benéficos. Para qualquer indivíduo emparticular, regimes de dosagem específicos podem ser ajustados ao longodo tempo de acordo com a necessidade individual e o julgamento da pessoaque está administrando ou supervisionando a administração das composi-ções.
Como usado aqui "veículo farmaceuticamente aceitável" ou "ex-cipiente" inclui qualquer e todos os solventes, meios de dispersão, revesti-mentos, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes isotônicos e de re-tardo de absorção, e semelhantes que são fisiologicamente compatíveis. Emuma modalidade, o veículo é adequado para administração parenteral. Alter-nativamente, o veículo pode ser adequado para administração intravenosa,intraperitoneal, intramuscular, sublingual ou oral. Veículos farmaceuticamen-te aceitáveis incluem soluções ou dispersões aquosas estéreis e pós esté-reis para a preparação extemporânea de soluções ou dispersões injetáveisestéreis. O uso de tais meios e agentes para as substâncias farmaceutica-mente ativas é bem-conhecido na técnica. Exceto à medida que qualquermeio ou agente convencional seja incompatível com o composto ativo, o usodesse nas composições farmacêuticas da invenção é contemplado. Com-postos ativos suplementares também podem ser incorporados nas composi-ções.
Composições terapêuticas devem ser estéreis e estáveis sob ascondições de fabricação e armazenamento. A composição pode ser formu-lada como uma solução, microemulsão, lipossomo, ou outra estrutura orde-nada adequada para alta concentração de fármaco. O veículo pode ser umsolvente ou meio de dispersão que contêm, por exemplo, água, etanol, poliol(por exemplo, glicerol, propileno glicol, e polietileno glicol líquido, e seme-lhantes), e misturas adequadas desses. A fluidez apropriada pode ser man-tida, por exemplo, pelo uso de um revestimento tal como lecitina, pela manu-tenção do tamanho de partícula necessário no caso de dispersão e pelo usode tensoativos. Em muitos casos, será preferível incluir agentes isotônicos,por exemplo, açúcares, poliálcoois, tais como manitol, sorbitol ou cloreto desódio na composição. Absorção prolongada das composições injetáveis po-de ser obtida por incluir na composição um agente que retarda a absorção,por exemplo, sais de monoestearato e gelatina. Além disso, um dúplex deoligonucleotídeo da invenção pode ser administrado em uma formulação deliberação ao longo do tempo, por exemplo, em uma composição que incluium polímero de liberação lenta. O oligonucleotídeo modificado pode ser pre-parado com veículos que protegerão o dúplex de oligonucleotídeo modifica-do contra liberação rápida, tal como formulação de liberação controlada, in-cluindo implantes e sistemas de liberação microencapsulados. Polímerosbiodegradáveis, biocompatíveis podem ser usados, tais como acetato deetileno vinila, polianidridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres, áci-do polilático, e copolímeros poliláticos, poliglicólicos (PLG). Vários métodospara a preparação de tais formulações são patenteados ou geralmente co-nhecidos daqueles versados na técnica.
Soluções injetáveis estéreis podem ser preparadas por incorpo-ração de um composto ativo, tal como um dúplex de oligonucleotídeo da in-venção, na quantidade necessária em um solvente apropriado com um ouuma combinação de ingredientes enumerados acima, conforme necessário,seguido por esterilização por filtração. Geralmente, dispersões são prepara-das por incorporar o composto ativo em um veículo estéril que contém ummeio de dispersão básico e os outros ingredientes necessários a partir da-queles enumerados acima. No caso de pós estéreis para a preparação desoluções injetáveis estéreis, os métodos preferidos de preparação são seca-gem à vácuo e liofilização que produzem um pó do ingrediente ativo maisqualquer ingrediente adicional desejado a partir de uma solução previamenteesterilizada por filtração desse. De acordo com um aspecto alternativo dainvenção, um dúplex de oligonucleotídeo da invenção pode ser formuladocom um ou mais compostos adicionais que aumentam sua solubilidade.
Embora várias modalidades da invenção estejam descritas aqui,muitas adaptações e modificações podem ser feitas dentro do escopo dainvenção de acordo com o conhecimento geral comum daqueles versadosnessa técnica. Tais modificações incluem a substituição de equivalentes co-nhecidos para qualquer aspecto da invenção a fim de se obter o mesmo re-sultado substancialmente da mesma forma. Variações numéricas são inclu-sivas dos números que definem a variação. Nas reivindicações, a palavra"compreende" é usada como um termo ilimitado, substancialmente equiva-lente a expressão "incluindo, mas não limitado a".
Os seguintes exemplos são ilustrativos de vários aspectos da in-venção, e não limitam os amplos aspectos da invenção descrita aqui.
Exemplo 1: Síntese química de dúplices de siRNA e dúplices modifica-dos com arabinose
A seqüência e composição dos oligômeros preparados nesseestudo são mostradas na Tabela 1. Síntese de oligorribonucleotídeos, oligor-ribonucleotídeos modificados com FANA1 assim como oligonucleotídeoscompletamente formados por FANA foi executada em uma escala de 1 μmolem um sintetizador Applied Biosystems (AB!) usando a química de β-cianoetilfosforoamidita padrão de acordo com protocolos publicados [E. Via-zovkina, M.M. Mangos, M.l. Elzagheid, & M.J. Damha (2002) Current Pro-tocols in Nucleic Acid Chemistry, Unidade 4.15); M.J. Damha & K.K. O-gilvie (1993) Oligorribonucleotide synthesis - the silyl-phosphoramiditemethod in "Protocols for Oligonucieotide and Analogs: Synthesis andProperties" S. Agrawal (ed.). Methods in Molecular Biology pp.81-114,The Humana Press Inc., Totowa, New Jersey]. Oligorribonucleotídeos mo-dificados com FANA e oligorribonucleotídeos foram desprotegidos, purifica-dos e manuseados de forma idêntica. Todos os oligonucleotídeos foram puri-ficados por HPLC de troca de ânion ou eletroforese em gel, e dessalinizadosatravés de cromatografia de exclusão de tamanho usando esferas SephadexG-25. Soluções estoque de dúplices foram preparados por misturar os fila-mentos sentido e antisentido correspondentes (razão estequiométrica de1:1), Iiofilizar as amostras, e adicionar o tampão de ressuspen-são/anelamento suficiente para fazer uma solução a 20 μΜ. A composiçãodo tampão de ressuspensão/anelamento de siRNA é acetato de potássio100 mM, HEPES-KOH 30 mM, acetato de magnésio 2 mM, pH 7,4.Exemplo 2: Eficácia de siRNA que contém FANA
Esse exemplo refere-se a eficácia de siRNAs que contêm FANAcom relação a eliminação específica do mRNA alvo e redução da atividadede Iuciferase em células HeLA X1/5. A linhagem celular HeLa X1/5 foi obtidada ECACC (ECACC No. 95051229) e mantida em meio EMEM suplementa-do (Invitrogen, Burlington ON) com 10% de soro fetal bovino, L-glutamina 2mM, 1% de aminoácidos não essenciais, 1% de vitaminas, 500 Mg/ml deG418 e 300 pg/ml de Higromicina. Para a transfecção, 1,0x105 célu-las/cavidade foram plaqueadas em placas de 24 cavidades antes da trans-fecção. No dia da transfecção, as células foram transfectadas com 0,21 pgde siRNA usando Lipofectamina 2000 (Invitrogen, Burlington ON) em umaproporção de siRNA:Lipofectamina 2000 de 1:2 de acordo com as instruçõesdo fabricante. As células foram colhidas 24 h após a transfecção. A atividademetabólica da célula, como um indicador de toxicidade celular que resulta datransfecção de siRNA, foi determinada usando o ensaio fluorimétrico alamarBlue® (Medicorp, Montreal QC) de acordo com as recomendações do fabri-cante.
Ensaios de atividade de Iuciferase foram realizados usando osistema de ensaio de Iuciferase (BD Bioscience, Mississauga, ON) de acor-do com o protocolo do fabricante. Brevemente, após exposição ao siRNA, ascélulas foram lavadas com solução salina tamponada com fosfato (Invitro-gen, Burlington ON) e lisadas. Os Iisados celulares foram centrifugados pararemover restos celulares e alíquotas de 20 pL foram transferidas para placasIumitrac de 96 cavidades (Ultident; Greiner Bio-one). A luminescência foimedida usando um luminômetro de microplacas (Luminoskan Ascent, Ther-mo LabSystem) imediatamente após a adição da solução de substrato deluciferina. Os valores de luminescência foram então normalizados para osvalores de atividade metabólica da célula (alamar Blue®) para compensar atoxicidade resultante da transfecção.
Para análise de PCR em tempo real, RNA total foi extraído u-sando o mini kit RNeasy (Qiagen, Mississauga ON) de acordo com o proto-colo do fabricante. cDNA foi preparado a partir de 1 pg de RNA total usandoa Transcriptase Reversa Superscript® Il e iniciadores aleatórios (Invitrogen,Burlington ON). PCR em tempo real quantitativo foi realizado usando inicia-dores gene-específicos e sondas para o gene de Iuciferase (LUC5013 F1: 5'-acgctgggcgttaatcagag-3'; LUC5013 R1: 5' -gtcgaagatgttggggtgttg-3'; TIBMOLBIOL) e o gene regulador GAPDH (huGAPD for: 5'- ggtggtctcctctgacttc-3'; huGAPD rev: 5' -ctcttcctcttgtgctcttg-31; TIB MOLBIOL) usando condiçõesotimizadas anteriormente e o LightCycIer (Roche, Lavai QC).
Os resultados apresentados na Figura 1 indicam que FANA ébem-tolerado quando incorporado em siRNA. De fato, um siRNA que tem umfilamento de sentido totalmente modificado com FANA (F3/0) manteve suaatividade (mRNA e atividade de luciferase) quando comparado ao siRNAnão modificado (Figura 1A). Nossos dados também indicam que modifica-ções com FANA são bem-toleradas quando introduzidas no filamento anti-sentido (Figura 1 Β). A substituição dos dois desoxinucleotídeos da projeção3' por dois resíduos de FANA (0/F4 e F3/F4) resultou em uma atividade ini-bitória aumentada (65%) do dúplex quando comparado a um dúplex de SiR-NA não modificado (55%) (Figura 1B e 1C). Esses resultados são contráriosaos dados publicados nos quais modificações químicas foram mostradas serbem-toleradas em apenas uma extremidade, dependendo do tipo de modifi-cação. Entretanto, a introdução de seis FANAs, abrangendo a extremidade5' e a parte central da filamento antisentido, aboliu coletivamente a atividadedo dúplex de siRNA independente das modificações introduzidas no filamen-to de sentido (Figura 1B e 1C). Sabe-se que a porção central do filamentoantisentido do siRNA é importante para a interação do dúplex com o maqui-nário celular de RNAi e é muito sensível a modificações químicas. Preferi-velmente, portanto, modificações em ambos os filamentos sentido e antisen-tido estão dentro dos parâmetros descritos acima (Figura 1C).
Exemplo 3: Potência de siRNA que contém FANA
Esse exemplo refere-se a potência de siRNA que contêm FANAcom relação a eliminação específica da atividade de Iuciferase em célulasHeLa X1/5. Estudos dose-resposta foram realizados usando uma quantidadetotal de siRNA de 0,21 pg pela qual o siRNA eficaz foi diluído seriadamentecom um siRNA de controle, reduzindo a quantidade eficaz de oligonucleotí-deo ativo enquanto mantinha a quantidade final de siRNA constante. As cé-lulas foram colhidas 24h após a transfecção e a atividade de Iuciferase foideterminada.
Os resultados indicam que um siRNA que têm dois desoxinucle-otídeos da projeção-3' do filamento antisentido substituídos por FANAs eque têm um filamento de sentido não modificada (0/F4) ou completamentemodificada (F3/F4) inibe a atividade de Iuciferase de uma forma dependenteda concentração com potência aumentada sobre o siRNA não modificadocorrespondente (Figura 2B e 2C). Os valores de EC5O estimados são apre-sentados na Tabela 1.Exemplo 4: Duração de ação de siRNA que contém FANA
Esse exemplo mostra que siRNAs que contêm FANA têm ativi-dade inibitória mantida até 96 h. A atividade de Iuciferase foi medida em dife-rentes pontos de tempo após exposição aos diferentes siRNAs modificados e não modificados (Figura 3). Os resultados indicam que siRNAs que contêmresíduos de FANA têm atividade prolongada por até 4 dias. Além disso, osdados demonstram que siRNA que contém FANA tem atividade inibitóriaaumentada no ponto de tempo de 96h quando comparados ao siRNA nãomodificado (65% vs 45% de inibição da atividade de Iuciferase1 respectiva- mente).
Exemplo 5: Estabilidade aumentada de siRNA que contém FANA
Esse exemplo refere-se a estabilidade do dúplex de siRNA napresença de soro fetal bovino. Os resultados de experimentos são apresen-tados na Figura 4. siRNAs foram diluídos em 10% de soro fetal bovino em DMEM e incubados a 37°C. Alíquotas de 12 μL foram coletadas após 0,25;0,5; 0,45; 1; 2; 6 e 24h e congeladas em 36 μL. de tampão de corrida-TBE1,5X contendo 50% de Ficoll até a análise. As amostras foram separadas emgéis de poliacrilamida 20% sob condições não-desnaturantes e corados comSYBR gold (Invitrogen, Burlington ON). As bandas correspondentes ao siR- NA intacto foram quantificadas por análise de densitometria.
Os resultados mostram que a incorporação de FANAs no fila-mento de sentido confere resistência significativa a degradação de siRNAmediada por soro. A introdução de FANAs aumenta significativamente a re-sistência de siRNAs ao soro. Um gel representativo é mostrado na Figura 4A. Todas as formas não modificadas de siRNA (O/O), independente da se-qüência, têm meias-vidas mais curtas do que 15 minutos (Figura 4B, 4C e4D). A substituição dos dois desoxinucleotídeos da projeção-3' no filamentoantisentido por dois FANAs (0/F4) não teve impacto sobre as propriedadesde estabilidade no soro dos dúplices de siRNA (Figura 4B, 4C e 4D). Entre- tanto, ter um filamento de sentido totalmente modificada com FANA (F3/0)conferiu resistência significativa a degradação mediada por soro já que fo-ram observadas meias-vidas do dúplex de siRNA de até 4h (Figura 4B). Fi-nalmente, modificação com FANA de ambos os filamentos sentido e antisen-tido (F3/F4) resultou em uma resistência a nuclease ainda maior já que mei-as-vidas de siRNA aproximadamente 5h foram determinadas (Figura 4B e4C).
Exemplo 6: Eficácia de siRNA que contém FANA em inibir os níveis deexpressão de mRNA de CCR3.
Esse exemplo refere-se a eficácia de siRNAs que contêm FANAna eliminação específica dos níveis de expressão de mRNA de CCR3 emcélulas NIH-3T3. A linhagem celular NIH-3T3 foi obtida da ATCC (ATCCCRL-1658) e mantida em meio DMEM (Invitrogen, Burlington ON) suplemen-tado com 10% de soro fetal bovino, L-glutamina 4 mM, 3,7 g/L de bicarbona-to de sódio, 4,5 g/l de glicose e 1% de Penicilina/estreptomicina. 1,0X105células/cavidade foram semeadas em placas de 24 cavidade um dia antesda transfecção. As células foram transfectadas com 0,2 pg de plasmídeoexpressando o gene de CCR3 de rato, 0,2 pg de plasmídeo expressandoluciférase (gene de referência) e 0,01; 0,1 ou 0,2 pg de siRNA usando Lipo-fectamina 2000 (Invitrogen, Burlington ON) em uma proporção deDNA/siRNA: Lipofectamina 2000 de 1:2 de acordo com as recomendaçõesdo fabricante. As células foram coletadas 24h após a transfecção. Os níveisde expressão de CCR3 e Iuciferase foram quantificados usando o métodoQuantigene (Panomics, Fremont CA). Os níveis de expressão de CCR3 fo-ram então normalizados aos níveis medidos para luciferase.
Os resultados apresentados na Figura 5 indicam que a incorpo-ração de resíduos de FANA no siRNA resultou em um aumento dependenteda dose na atividade inibitória de um siRNA direcionado para o mRNA deCCR3 de rato. De fato, a substituição dos dois desoxinucleotídeos da proje-ção-31 no filamento antisentido por dois FANAs (0/F4) resultou em uma ati-vidade inibitória aumentada do dúplex (até 49% quando comparado a umsiRNA de CCR3 não modificado (35%)) (Figura 5). Além disso, um siRNA deCCR3 que tem um filamento de sentido totalmente modificado com FANA(F3/0) era mais ativo (75% de inibição dos níveis de mRNA de CCR3) quan-do comparado ao siRNA não modificado (Figura 5). Finalmente, a modifica-ção de ambas as fitas do dúplex de siRNA foi bem-tolerada com a atividadeinibitória atingindo 75%. Esses dados suportam a observação de que FANAé: 1) bem-tolerado quando introduzido em dúplices de siRNA e 2) aumenta aatividade inibitória do dúplex de siRNA.
Exemplo 7: eficácia aumentada de siRNA que contém FANA em inibir arepiicação viral
Esse exemplo refere-se a eficácia de dúplices de siRNA quecontêm resíduos de FANA inibirem a repiicação de vírus sincicial respiratório(RSV) em células A549. A linhagem celular A549 (ATCC, N9 CCL-185) foimantida em meio Ham F12 (HyClone, Logan UT) suplementado com 10% deFBS inativado (HyClone). 1,0x105 células foram semeadas em cavidadesindividuais de placas de 24 cavidades um dia antes da transfecção. No diada transfecção, as células foram transfectadas com 0,05 pg, 0,2 pg ou 0,4pg de siRNA em uma proporção de 1:3 de siRNA para reagente de transfec-ção (Lipofectamina 2000 (Invitrogen, Burlington ON)) de acordo com as re-comendações do fabricante. 24 horas após a transfecção as células foraminfectadas com RSV em uma multiplicidade de infecção (M.O.I.) de 1 e ainfecção viral foi deixada ocorrer por um dia. 24 horas após a exposição aovírus, os sobrenadantes celulares foram colhidos e os níveis de RSV foramavaliados usando um método de ELISA para detectar proteínas de RSV.
Os resultados indicam que um dúplex de siRNA, em que os doisdesoxinucleotídeos da projeção-3' do filamento antisentido são substituídospor FANA1S e o filamento de sentido permanece não modificado (0/F4), inibea repiicação de RSV de uma forma dependente da concentração tendo ativi-dade inibitória aumentada em comparação a siRNA não modificado em do-ses menores (Figura 6). Esses resultados suportam a observação de queFANA aumenta a atividade inibitória de siRNAs.
Todas as referências citadas estão incorporadas por referênciaaqui. Embora modalidades preferidas da invenção tenham sido descritasaqui, será compreendido pelos versados na técnica que variações podemser feitas a isso sem desconsiderar o espírito da invenção ou o escopo dasreivindicações anexas.<table>table see original document page 23</column></row><table><table>table see original document page 24</column></row><table>
aLetras maiúsculas = RNA; letras minúsculas = DNA; letras maiúsculas emnegrito = FANApor exemplo, O/O representa o siRNA não modificado enquanto que 0/F1representa um siRNA com um filamento de sentido não modificado e a modi-ficação de F1 no filamento antisentido. n.d. não determinado.Listagem de Seqüência
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<222> (20).. (21)
<223> resíduos η são 2'-desoxi-2fluoroarabinotimidina
<400> 16
uuaauuaaag acuucaagcn η
<210> 17
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Oligonucleotídeo sintético<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(4)<223> resíduos η são 2,-desoxi-2'fluoroarabinotimidina
<220>
<221> misc_feature
<222> (11)..(12)
<223> resíduos n δ§0 2'-desoxi-2'fluoroarabinotimidina
<220>
<221> misc_feature
<222> (16)..(17)
<223> resíduos n são 2,-desoxi-2'fluoroarabinotimidina
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(21)
<223> resíduos n são 2'-desoxiguanosina
<400> 17gcnngaaguc nnuaannaan n
<210> 18
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Oligonucleotídeo sintético
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(20)
<223> resíduos n são 2'-desoxi-2'fluoroarabinotimidina
<220>
<221> misc_feature
<222> (21)..(21)<223> resíduos η são 2-desoxiguanosina
<400> 18
uuaauuaaag açuucaagcn η
<210> 19
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Oligonucleotídeo sintético
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(4)
<223 > resíduos η são 2'-desoxi-2'fluoroarabinotimidina
<220>
<221> raisc_feature
<222> (11)..(12)
<223 > resíduos η são 2'-desoxi-2'fluoroarabinotimidina
<220>
<221> misc_feature
<222> (16)..(17)
<223 > resíduos η são 2'-desoxi-2'fluoroarabinotimidina
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(21)
<223> resíduos η são 2-desoxiguanosina
<400> 19
gcnngaaguc nnuaannaan η<210> 20
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Oligonucleotídeo sintético<220>
<221> misc_featnre
<222> (1)··(1)
<223> resíduo η é 2'-desoxi-2'fluoroarabinotimidina<220>
<221> misc_feature
<222> (20) .. (21)
<223> resíduos η são 2'-desoxiguanosina
<4 00> 20
nuaauuaaag acuucaagcn η
<210> 21
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
c220>
<223> Oligonucleotídeo sintético<220>
<22l> misc_feature
<222> (3)..(4)
<223> resíduos η são 2'-desoxi-2'fluoroarabinotimidina<220>
<221> misc feature<222> (11).. (12)
<223> resíduos η são 2'-desoxi-2'fluoroarabinotimidina<220>
<221> misc_feature
<222> (16) . . (17)
<223> resíduos η são 2,-desoxi-2'fluoroarabinotimidina<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(21)
<223> resíduos η são 2-desoxiguanosina
<220>
<221 > misc_feature
<222> (20). . (21)
<223> resíduos η são 2'-desoxiguanosina
<400> 21
gcnngaaguc nnuaannaan η
<210> 22
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Oligonucleotídeo sintético<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(2)
<223> resíduos η são 2'-desoxi-2'fluoroarabinotimidina<220>
<221> misc feature<222> (5)..(6)
<223> resíduos r» são 2'-desoxi-2'fluoroarabinotimidina<220>
<221> misc_feature
<222> (13)..(14)
<223 > resíduos η são 2'-desoxi-2fluoroarabinotimidina<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(21)
<223> resíduos η são 2-desoxiguanosina
<400> 22
nnaannaaag acnncaagcn η
<210> 23
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Oligonucleotídeo sintético<220>
<221> misc_feature
<222> (3) . . (4)
<223> resíduos η são 2'-desoxi-2'fluoroarabinotimidina<220>
<221> misc_fea.ture
<222> (11) . . (12)
<223> resíduos η são 2'-desoxi-2'fluoroarabinotimidina<220>
<221> misc feature<222> (16)..(17)
<223 > resíduos η são 2'-desoxi-2,fluoroarabinotimidina<220>
<221> misc_feature<222> (20)..(21)
<223> resíduos η são 2'-desoxiguanosina
<400> 23
gcnngaaguc nnuaannaan η<210> 24
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Oligonucleotídeo sintético<220>
<221> misc_feature<222> (20)..(21)
<223> resíduos η são 2,-desoxi-2'fluoroarabinotimidina
<400> 24
uuaauuaaag acuucaagcn η
<210> 25
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Oligonucleotídeo sintético
<220><22i> Base modificada<222> (1)..(21)
<223> Todos os resíduos são 2'-desoxi-2'fiuoro-arabinonucleotídeos
<400> 25
gcttgaagtc tttaattaag g 21
<210> 26
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223 > Oligonucleotídeo sintético<220>
<221> misc_feature
<222> (20).. (20)
<223> Resíduos η são 2'-desoxi-2'fluoroarabinoguanosina
<220>
<221> misc_feature<222> (21).. (21)
<223> resídU0 n é2'-desoxiguanosina
<400> 26
uuaauuaaag acuucaagcn η 21
<210> 27
<211> 21
<212> DNA
c213> Artificial
<220>
<223> Oligonucleotídeo sintético<220>
<221> Base modificada
<222> (1)..(21)
<223> Todos os resíduos são 2'-desoxi-2'fluoro-arabinonucleotídeo
<400> 27
gcttgaagtc tttaattaag g
<210> 28
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Oligonucleotídeo sintético
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(2)
<223> resíduos η são 2'-desoxi-2'fluoroarabinotimidina
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(6)
<223> resíduos η são 2,-desoxi-2'fluoroarabinotimidina
<220>
<221> misc_feature
<222> (13)..(14)
<223> resíduos η são 2'-desoxi-2'fluoroarabinotimidina
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(21)
<223 > resíduos η são 2'-desoxiguanosina<400> 28
nnaaniiaaag acnncaagcn η
<210> 29
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Oligonucleotídeo sintético<220>
<22ΐ> Base modificada
<222> (1) . . (21)
<223> Todos os resíduos são 2'-desoxi-2'fluoro-arabinonucleotídeo
<400> 29
gcttgaagtc tttaattaag g
<210> 30
<211> 21
<212> RKA
<213> Artificial
<220>
<223> Oligonucleotídeo sintético
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(21)
<222> resíduos η são 2,-desoxi-2'fluoroarabinotimidina
<400> 30
uuaauuaaag acuucaagcn η
<210> 31<211> 21<212> RNA<213> Artificial
<220>
<223> Oligonucleotídeo sintético<220>
<221> misc_feature<222> (20)..(21)
<223> resídiios η são 2'-desoxiguanosina
<400> 31
acacccuaug aauaugagun η
<210> 32
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Oligonucleotídeo sintético
<220>
<221> misc_featvire
<222> (20)..(21)
<223> resíduos η são 2'-desoxigüanosina
<400> 32
acucauauuc auagggugun η
<210> 33
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial<220>
<223> Oligònucleotídeo sintético<220>
<221> misc_feature
<222> (20).. (21)
<223> resíduos η são 2-desoxiguanosina
<400> 33
acacccuaug aauaugagun n
<210> 34
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Oligonucleotídeo sintético<220>
<221> misc_feature
<222> (20) .. (21)
<223> resíduos η são 2,-desoxi-2'fluoroarabinotimidina
<400? 34
acucauauuc auagggugun η
<210> 35
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Oligonucleotídeo sintético
<220><221> Base modificada
<222> (1)..(21)
<223> Todos os resíduos são 2'-desoxi-2'fluoro-arabinonucleotídeo
<400> 35
acaccctatg aatatgagttt
<210> 36
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Oligonucleotídeo sintético
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(21)
<223> resíduos η são 2'-desoxitimidina
<400> 36
acucauauuc auagggugun η
<210> 37
<211> -21
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Oligonucleotídeo sintético
<220>
<221>
<222> (1) .. (21)
<223> Todos os resíduos são 2'-desoxi-2'fluoro-arabinonucleotídeo<400> 37acaccctatg aatatgagtt t
<210> 38
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Oligonucleotídeo sintético
<220>
<221> misc_feature
<222> (20).. (21)
<223> resíduos n são 2'-desoxi-2'fluoroarabinotimidina
<400> 38acucauauuc auagggugun n
<210> 39
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Oligonucleotídeo sintético
<220>
<221> misc_feature
<222> (20).. (20)
<223> resíduos n são 2'-desoxiguanosina
<220>
<221> miac_feature
<222> (21). . (21)
<223> resíduos n são 2'-desoxiguanosina<400> 39
aagaacuugc cuugauguan η
<210> 40<211> 21<212> RNA<213> Artificial
<220><223> Oligonucleotídeo sintético
<220><221> (20)..(21)<223> resíduos η são 2'-desoxitimidina
<400> 40
uacaucaagg caaguucuun n
<210> 41<211> 21<212> RNA<213> Artificial
<220><223> Oligonucleotídeo sintético
<220><221> misc_feature<222> (20)..(20)<223> resíduos η são 2'-desoxitimidina
<220><221> misc_feature<222> (21).. (21)<223> resíduos η são 2'-desoxiadenosina<400> 41
aagaacuugc cuugauguan η
<210> 42
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Oligonucleotídeo sintético<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(21)
<223> resíduos η são 2'-desoxi-2fluoroarabinotimidina
<400> 42
uacaucaagg caaguucuun η
<210> 43
<211> 21
<212> ONA
<213> Artificial
<220>
<223> Oligonucleotídeo sintético
<220><221><222> (1)..(21)
<223> Todos os resíduos são 2,-desoxi-2'fluoro-arabinonucleotídeo
<400> 43aagaacttgc cttgatgtac a<210> 44
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Oligonucleotídeo sintético<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(21)
<223> resíduos η são 2'-desoxitmidina
<400> 44
uacaucaagg caaguucuun η 21
<210> 45
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Oligonucleotídeo sintético<220>
<22ΐ> Base modificada
<222> (1)..(21)
<223> Todos os resíduos são 2'-desoxi-2'fluoro-modificado arabinonucleotldeo
<400> 45
aagaacttgc cttgatgtac a 21
<210> 46
<211> 21
<212> RHA<213> Artificial<220>
<223> Oligonucleotídeo sintético<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(21)
<223 > resíduos η são 2'-desoxi-2'fluoroarabinotimidina
<400> 46
uacaucaagg caaguucuun η
<210> 47
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Oligonucleotídeo sintético<220>
<221> tnisc_f eature
<222> (20)..(21)
<223> resíduos η são 2'-desoxitimidina
<400> 47
cccuacacca agugauaaun η
<210> 48
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Oligonucleotídeo sintético<220><221> misc_feature<222> (20)..(21)<223> resíduos η são 2'-desoxitimidina
<400> 48auuaucacuu gguguagggn η 21
<210> 49<211> 21<212> RNA<213> Artificial
<220><223> Oligonucleotídeo sintético
<220><221> misc_feature<222> (20) . . (21)<223 > resíduos η são 2'-desoxitimidina
<400> 49cccuacacca agugauaaun η 21
<210> 50<211> 21<212> RNA<213> Artificial
<220><223> Oligonucleotídeo sintético
<220><22l> misc_feature<222> (20)..(21)
<223> resíduos η são 2,-desoxi-2'fluoroarabinotimidina
<400> 50 auuaucacuu gguguagggn η 21
Claims (49)
1. Pequeno RNA de interferência (siRNA) para modular a ex-pressão de um gene alvo de uma maneira seqüência-específica que com-preende um dúplex de duplo filamento em que pelo menos um nucleotídeode ácido ribonucleico do siRNA é substituído por um nucleotídeo modificadocom arabinose.
2. SiRNA de acordo com a reivindicação 1, que tem 15 a 30 nu-cleotídeos de extensão.
3. SiRNA de acordo com a reivindicação 2, que tem 1 a 3 proje-ções de nucleotídeo nas terminações 3' e 5'.
4. SiRNA de acordo com a reivindicação 3, em que o nucleotí-deo modificado com arabinose tem um substituinte 2' selecionado a partir dogrupo que consiste nos grupos flúor, hidroxila, amino, azido, alquila, alcóxi, ealcoxialquila.
5. SiRNA de acordo com a reivindicação 4, em que o grupo al-quila é selecionado a partir do grupo que consiste em metila, etila, propila,butila e grupos alquila funcionalizados, o grupo alcóxi é selecionado a partirdo grupo que consiste em metóxi, etóxi, propóxi, e grupos alcóxi funcionali-zados e o grupo alcoxialquila é selecionado a partir do grupo que consisteem metoxietila e etoxietila.
6. SiRNA de acordo com a reivindicação 5, em que o grupo al-quila funcionalizado é selecionado a partir do grupo que consiste no grupoetilamino, propilamino, e butilamino e o grupo alcóxi funcionalizado é sele-cionado a partir do grupo que consiste em -O (CH2)q-R, onde q = 2-4 e -R éum grupo -NH2, -OCH3, ou -OCH2CH3.
7. SiRNA de acordo com a reivindicação 3, em que o pelo me-nos um nucleotídeo modificado com arabinose é 2'-desóxi-2'-fluoroarabinonucleotídeo (FANA).
8. SiRNA de acordo com a reivindicação 7, em que o pelo me-nos um nucleotídeo modificado com arabinose está em um filamento de sen-tido do siRNA.
9. SiRNA de acordo com a reivindicação 7, em que o pelo me-nos um nucleotídeo modificado com arabinose está em um filamento anti-sentido do siRNA.
10. SiRNA de acordo com a reivindicação 7, em que todos osnucleotídeos no filamento de sentido são substituídos por FANA.
11. SiRNA de acordo com a reivindicação 7, em que o pelo me-nos um nucleotídeo modificado com arabinose é uma nucleotídeo suspensode pelo menos uma das projeções.
12. SiRNA de acordo com a qualquer uma das reivindicações 1a 11 para diminuir a expressão de luciferase.
13. SiRNA de acordo com a reivindicação 12 com os filamentosdo dúplex tendo as seqüências de base de SEQ ID NOS. 1 e 2.
14. SiRNA de acordo com a reivindicação 1 com os filamentosdo dúplex tendo as seqüências selecionadas a partir do grupo que consisteem SEQ ID NOS. 3 e 4; SEQ ID NOS. 5 e 6; SEQ ID NOS. 7 e 8; SEQ IDNOS. 9 e 10; SEQ ID NOS. 11 e 12; SEQ ID NOS. 13 e 14; SEQ ID NOS. 15e 16; SEQ ID NOS. 17 e 18; SEQ ID NOS. 19 e 20; SEQ ID NOS. 21 e 22;SEQ ID NOS. 23 e 24; SEQ ID NOS. 25 e 26; SEQ ID NOS. 27 e 28; e SEQID NOS. 29 e 30.
15. SiRNA de acordo com a qualquer uma das reivindicações 1a 11 para diminuir a expressão de CCR3.
16. SiRNA de acordo com a reivindicação 12 com os filamentosdo dúplex tendo as seqüências de base de SEQ ID NOS. 31 e 32.
17. SiRNA de acordo com a reivindicação 1 com os filamentosdo dúplex tendo as seqüências selecionadas a partir do grupo que consisteem SEQ ID NOS. 33 e 34; SEQ ID NOS. 35 e 36; ou SEQ ID NOS. 37 e 38.
18. SiRNA de acordo com a qualquer uma das reivindicações 1a 11 para diminuir a replicação viral do Vírus Sincicial Respiratório (RSV).
19. SiRNA de acordo com a reivindicação 12 com os filamentosdo dúplex tendo as seqüências de base de SEQ ID NOS. 47 e 48.
20. SiRNA de acordo com a reivindicação 1 com os filamentosdo dúplex tendo as seqüências que consistem em SEQ ID NOS. 49 e 50.
21. SiRNA de acordo com a qualquer uma das reivindicações 1a 11 para diminuir a expressão de PDE4D.
22. SiRNA de acordo com reivindicação 12 com os filamentos dodúplex tendo as seqüências de base de SEQ ID NOS. 39 e 40.
23. SiRNA de acordo com reivindicação 1 com os filamentos dodúplex tendo as seqüências selecionadas a partir do grupo que consiste emSEQ ID NOS. 41 e 42; SEQ ID NOS. 43 e 44; e SEQ ID NOS. 45 e 46.
24. SiRNA de acordo com a qualquer uma das reivindicações 1a 23, que contém pelo menos uma ligação internucleotídeo selecionada apartir do grupo que consiste em fosfodiéster, fosfotriéster, fosforotioato, me-tilfosfonato, boranofosfato e qualquer combinação dos mesmos.
25. Método para aumentar pelo menos um de estabilidade denuclease e inibição de atividade de gene alvo de um siRNA que compreendesubstituir pelo menos um nucleotídeo do siRNA por um nucleotídeo modifi-cado com arabinose.
26. Método de acordo com a reivindicação 25, em que o nucleo-tídeo modificado com arabinose é 2'-desóxi-2'-fluoroarabinonucleotídeo(FANA).
27. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 25a 26, em que o siRNA é um dúplex de duplo filamento e tem 15 a 30 nucleo-tídeos de extensão com 1 a 3 projeções de nucleotídeo nas terminações 3' e 5'.
28. Método de acordo com a reivindicação 27, em que o pelomenos um nucleotídeo que é substituído está em um filamento de sentido dosiRNA.
29. Método de acordo com a reivindicação 27, em que o pelomenos um nucleotídeo que é substituído está em um filamento antisentidodo siRNA.
30. Método de acordo com a reivindicação 28, em que todos osnucleotídeos no filamento de sentido são substituídos.
31. Método de acordo com a reivindicação 27, em que o pelomenos um nucleotídeo que é substituído está na projeção.
32. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 25--31, em que os filamentos do dúplex têm as seqüências de base de SEQ IDNos. 1 e 2 e o dúplex de duplo filamento de siRNA diminui a expressão deluciferase.
33. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 25a 31, em que os filamentos do dúplex têm as seqüências de SEQ ID Nos. 31e 32 e o siRNA diminui a expressão de CCR3.
34. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 25a 31, em que os filamentos do dúplex têm as seqüências de SEQ ID Nos. 39e 40 e o siRNA diminui a expressão de PDE4D.
35. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 25a 31, em que os filamentos do dúplex têm as seqüências de SEQ ID Nos. 47e 48 e o siRNA diminui a replicação do Vírus Sincicial Respiratório (RSV).
36. Composição farmacêutica que compreende o siRNA comodefinido em qualquer uma das reivindicações 1 a 24 junto com um veículofarmaceuticamente aceitável.
37. Uso do siRNA como definido em qualquer uma das reivindi-cações 1 a 24 para a preparação de um medicamento para modular a ex-pressão de um gene alvo.
38. Uso do siRNA como definido em qualquer uma das reivindi-cações 12 a 14 para a preparação de um medicamento para modular a ex-pressão de luciferase.
39. Uso do siRNA como definido em qualquer uma das reivindi-cações 15 a 17 para a preparação de um medicamento para diminuir a ex-pressão de CCR3.
40. Uso do siRNA como definido em qualquer uma das reivindi-cações 18 a 20 para a preparação de um medicamento para prevenir ou tra-tar infecção por Vírus Sincicial Respiratório (RSV).
41. Uso do siRNA como definido em qualquer uma das reivindi-cações 21 a 23 para a preparação de um medicamento para diminuir a ex-pressão de PDE4D.
42. Método de modular a expressão de um gene alvo em umpaciente que necessita disso, que compreende administrar uma quantidadeterapeuticamente eficaz da composição farmacêutica como definida em rei-vindicação 36.
43. Método de acordo com a reivindicação 42, em que o genealvo é CCR3 e a composição farmacêutica compreende o siRNA como defi-nido em qualquer uma das reivindicações 15 a 17.
44. Método de acordo com a reivindicação 42, em que o genealvo é um gene para a replicação do Vírus Sincicial Respiratório (RSV) e acomposição farmacêutica compreende o siRNA como definido em qualqueruma das reivindicações 18 a 20.
45. Método de acordo com a reivindicação 42, em que o genealvo é PDE4D e a composição farmacêutica compreende o siRNA como de-finido em qualquer uma das reivindicações 21 a 23.
46. Embalagem comercial que compreende a composição comodefinida na reivindicação 36 junto com instruções para seu uso para modulara expressão de um gene alvo.
47. Embalagem comercial de acordo com a reivindicação 46 emque o gene alvo é CCR3 e a composição farmacêutica compreende o siRNAcomo definido em qualquer uma das reivindicações 15 a 17.
48. Embalagem comercial de acordo com a reivindicação 46 emque o gene alvo é um gene para a replicação do Vírus Sincicial Respiratório(RSV) e a composição farmacêutica compreende o siRNA como definido emqualquer uma das reivindicações 18 a 20.
49. Embalagem comercial de acordo com a reivindicação 46 emque o gene alvo é PDE4D e a composição farmacêutica compreende o siR-NA como definido em qualquer uma das reivindicações 21 a 23.
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