BRPI0618094A2 - vacinas virais derivadas de células com nìveis baixos de dna residual de célula - Google Patents

Abstract

<b>VACINAS VIRAIS DERIVADAS DE CéLULAS COM NìVEIS BAIXOS DE DNA RESIDUAL DE CéLULA<d> A presente invenção se refere aos produtos de vacina para o tratamento ou prevenção das infecções virais. São providos adicionalmente métodos para redução dos contaminantes associados à preparação das vacinas de culturais. O DNA residual da cultura de célula funcional é degradado por tratamento com um agente alquilante de DNA, tal como <225>-propiolactona (BPL), pelo que provendo uma vacina compreendendo proteínas imunogênicas derivados de um vírus propagado na cultura de célula, substancialmente isenta de DNA residual de cultura de célula funcional.

Description

VACIMAS VIRAIS DERXVADJkS DE CÉLULAS COM KÍVEIS BAIXOS

DS DRA RESIDUAL DE CÉLULATodos os documentos e informações on-line citadasaqui são incorporadas como referência em sua totalidade.

CAMPO TÉCNICO

A invenção provê produtos e processos aperfeiçoados decultura de célula com impurezas reduzidas. Especificamente,a invenção provê um método aperfeiçoado para degradação dequalquer DNA residual de cultura de célula funcionalpermanecendo associado ao produto gerado da cultura decélula. De acordo com a invenção, o DNA residual de culturade célula funcional é degradado por tratamento com umagente alquilante de DNA, tal como β-propiolactona (BPL) .Esse processo pode ser usado para tratar uma faixa deprodutos de cultura de célula incluindo vacinas e proteína^-—srecombinantes.HISTÓRICO DA INVENÇÃO

A produção comercial de vacinas virais requer,tipicamente, grandes quantidades de vírus como uma fonte deantígenos. Quantidades comerciais de vírus para prcdução devacinas podem ser obtidas por cultura e replicação de umvírus semente em um sistema de cultura de célula. Sistemasde cultura de célula apropriados para replicação viralincluem células de mamíferos, aves ou insetos, porém ossistemas de cultura de célula de mamíferos sãoespecificamente preferidos para vacinas virais de modo agarantir a glicosilação apropriada e dobra das proteínas deantígenos dos vírus. Por razões semelhantes, os sistemasde cultura de célula de mamíferos são também preferidospara expressão da proteína recombinante.Se ηεο modificadas de üeus estadoo ocorrendonaturalmente, as culturas de células possuem uma capacidadelimitada de reprodução e subseqüentemente são impraticáveise ineficientes para produção da quantidade de materialnecessária para a vacina comercial ou proteínarecombinante. Consequentemente, para fins de fabricação, épreferido que a células sejam modificadas para seremlinhagens de célula "continuas" ôu "imortalizadas81, de modoa aumentarem o número de vezes que elas podem ser dividir.Muitas dessas modificações empregam mecanismos semelhantesaos que estão implicados nas células oncogênicas. Como tal,existe uma questão que quaisquer materiais residuais dosprocessos de cultura de célula, tais como, DNA da célulahospedeira sejam removidos da formulação final de umproduto de vacina ou de proteína recombinante fabricadonesses sistemas.

Um modo padrão para remoção do DNA residual dacélula hospedeira é por tratamento com DNAse. Um métodoconveniente desse tipo é revelado na Patente Européia0870508 e Patente US 5948410, envolvendo um tratamento deduas etapas, primeiro o uso de uma DNAse (por exemplo,benzonase) e então um detergente catiônico (por exemplo,CTAB).

Esforços correntes para reduzir esse risco focarama redução da concentração total de DNA residual da célulahospedeira. É um objetivo da presente invenção reduzir orisco adicional por eliminação da funcionalidade dequalquer DNA remanescente da célula hospedeira.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

A invenção prove produtos e rocessos de cultura., decélula aperfeiçoados com impurezas reduzidas.

Especificamente, a invenção provê um método aperfeiçoadopara degradação de qualquer DNA residual de cultura decélula funcional permanecendo associado ao produto geradoda cultura de célula. De acordo com a invenção, o DNAresidual de cultura de célula funcional ê degradado portratamento com um agente alquilante de DMA, tal como β-propiolactona (BPL) . Esse Orocesso pode ser usado paratratar uma faixa de produtos de cultura de célula incluindovacinas e proteínas recombinantes.

A invenção inclui uma vacina compreendendoproteínas imunogênicas deriv idas de um vírus propagado nacultura de célula, onde a vacina é substancialmente isentade DNA residual de cultura de célula funcional. Além disso,a invenção se refere às proteínas recombinantes expressasna cultura de célula, onde a formulação final da proteínarecombinante é substancialmente isenta de DNA residual decultura de célula funcional.

A funcionalidade de qualquer DNA residual de célulahospedeira pode ser eliminada por tratamento do DNA com umagente alquilante que cliva o DNA em porções pequenas osuficiente, de modo que ele é incapaz de codificar umaproteína funcional, a ser transportada para o interior deum cromossoma de paciente humano, ou de outr? forma de serreconhecida pela maquinaria de replicação de DNA doreceptor. Preferivelmente, o comprimento do DNA residual decultura de célula degradado é inferior a 500 pares de base.Mais preferivelmente, o compr:. tento do DNA residual decultura de célula degradado é inferior a 2 00 iares de base.

DESCRIÇÃO JETALHADAA invenção prove produtos de cultura de célula eprocessos aperfeiçoados com impurezas reduzidas.Especificamente, a invenção prove um método aperfeiçoadopara degradação de qualquer DNA residual de cultura decélula funcional permanecendo associado ao produto geradoda cultura de célula. De acordo com a invenção, o DNAresidual de cultura de célula funcional é degradado portratamento com um agente alquilante de DNA, tal como 8-propiolactona (BPL) . Esse processo pode ser usado paratratar uma faixa de produtos de cultura de célula incluindovacinas e proteínas recombinantes.

A invenção inclui uma vacina compreendendoproteínas imunogênicas derivadas de um vírus propagado nacultura de célula, onde a vacina é substancialmente isentade DNA residual de cultura de célula funcional. Além disso,a invenção se refere às proteínas recombinantes expressasna cultura de célula, onde a formulação final da proteínarecombinante é substancialmente isenta de DNA residual deciiltura de célula funcional.

A funcionalidade de qualquer DNA residual de célulahospedeira pode ser eliminada por tratamento do DNA com umagente alquilante que cliva o DNA em porções pequenas osuficiente para serem incapazes de codificar uma proteínafuncional, a ser transportada para o interior α.; umcromossoma de paciente humano, ou de outra forma de serreconhecida pela maquina de replicação de DNA do receptor.0 comprimento do DNA residual de cultura de céluladegradado (não funcional) é preferivelmente inferior a1,000 pares de base (por exemplo, inferior a 1,000, 800,700, 600, 500, -00, 300, 200, 150, "00, 75, ou .0 pa ~es debase) . Preferivelmente7 o comprimento do DNA residual decultura de célula degradado ê inferior a 500 pares de base.Mais preferivelmente, o comprimento do DNA residual decultura de célula degradado é inferior a 200 pares de base.

Conforme usado aqui, a referência ao 11DNAfuncional" ou "RNA funcional" indica uma seqüêncianucleotídica capaz de ser traduzida em uma proteínafuncional ou transposta para um cromossoma de mamífero. Demodo geral, seqüências nucleotídicas capazes de seremtraduzidas em uma proteína funcional requerem regiõespromotoras, códons de partida, códons de parada eseqüências de codificação internas para proteínasfuncionais. Quando ocorre lesão ao DNA, como da adição deum agente alquilante, muitas dessas regiões são alteradasou destruídas, tal que a tradução pode prosseguir maislentamente ou apenas prosseguir para formar uma subunidadede oligopeptídeo da proteína pretendida.

"DNA residual de cultura de célula degradadofuncional" se refere ao DNA funcional que não pode sertraduzido em uma proteína funcional ou ser transportadopara um cromossoma de mamífero. Preferivelmente, "DNAresidual funcional degradado" possui um comprimentoinferior a 1,000 pares de base, mais preferivelmenteinferior a 500 pares de base, mesmo mais preferivelmenteinferior a 250 pares de base, e mais pref erivelmenteinferior a 100 pares de base. 0 comprimento do DNA residualfuncional degradado pode ser determinado por técnicaspadrão, incluindo eletroforese de gel.

A invenção provê composições de vacina eformulações çir proteína 'e-:ombinante que scosubstancialmente isentas de DNA residual de cultura decélula, funcional. Conforme usado aqui, substancialmenteisenta de DKA residual de cultura de célula funcional serefere a uma composição ou formulação onde fragmentos deDNA residual inferiores a 200 pares de base são detectáveisem menos de 10 ng por 0,5 mL. O tamanho de qualquer DNAresidual de cultura de célula pode ser medido por técnicaspadrão, incluindo eletroforese do gel por capilaridade etecnologia de ampliação de ácido nucléico.

O emprego de um agente alquilante tal como BPL nainvenção provê o benefício adicional de reduzir agregação econtaminantes. Formulações de vacina com agregadosreduzidos podem também possuir imunogenicidade melhorada. Aimunogenicidade de uma vacina se fixa na especificidade dosanticorpos para epítopos virais específicos. Se asuperfície de uma proteína estiver ligada ou mascarada pormoléculas indesejadas ou impedida através de agregação emmacromoléculas maiores, os epítopos podem ser tornar menosreconhecíveis e, portanto, menos eficazes em uma vacina.

Além disso, as formulações de vacina com agregadosreduzidos podem possuir vantagens de processamentoadicionais. Os processos de purificação se fiam noisolamento da proteína esperada, por exemplo, hemaglutininae neuraminidase em uma vacina contra. Influenza. Se aproteína for estruturalmente modificada pela presença deagregados ou reticulação, ela pode não ser reconhecida esubseqüentemente ser removida por cromatografia de coluna,filtração e centrifugação.Agentes alquilantes

Oci agentes alquilanter para emprego na irrrençâoincluem substâncias que introduzem um radical alcalino nocomposto. Preferivelmente, o agente alquilante é um agentemonoalquilante, tal como BPL. A BPL é um agentemonoalquilante amplamente empregado para inativação dosvírus na preparação de muitas vacinas. A BPL reage comvárias moléculas biológicas incluindo .rLcidos nucléicos ondee] .3 causa modificação estrutural por alquilação edepuração. A BPL é geralmente representada pela seguinteestrutura:

<formula>formula see original document page 8</formula>

A BPL, in vitro, reage de modo geral com osnucleõfilos presentes em altas concentrações, sob condiçõesfavoráveis para reações de substituição nucleófila - comoem vapor alto, concentrações altas de BPL e solventespolares apróticos - para formar ácidos propiônicosfuncionalizados, taiy como, 7-(2-carbóxietil)guanina ou 1-(2-carbóxietil)desoxiadenosina (Esquema 1). Boutwell eoutros, Annals New York Academy of Sciences, 751-764;Perrin e outros, Biologicals, 23 (1995) 207-211; Chen eoutros, Carcinogenesis, 2(2) (1981) 73-80.Esquema 1 (de Chen e outros):

<formula>formula see original document page 8</formula>

BPL, desoxiadenosina, 1-(2-carbõxietil)desoxiadenosina

Tal ligação ou alquilação das bases de DNA induzmutagenicidade por vários mecanismos incluindo substituiçõesde pares de base, especialmente depuração, deleções ereticulação dos nucleosídeos. O sito grau de mutagenicidaãee rsatividade de BPL corresponde ao extermínio rápido dosvírus e degradação de DNA subseqüente em subprodutos nãocarcinogênicos.

Qualquer DNA residual de cultura de célulafuncional é degradado por tratamento com menos de 1% BPL(por exemplo, menos de 1%, 0,75%, 0,5%, 0,25%, 0,2%, 0,1%,0,075%, 0,05%, 0,025%, 0,01% ou 0,005%). Preferivelmente, oDNA residual de cultura de célula funcional é degradado portratamento com entre 0,1% e 0,01% de BPL.

O agente alquilante é preferivelmente adicionado auma solução tamponada e o pH da solução é preferivelmentemantido entre 5 e 10. Mais preferivelmente o pH da soluçãoé mantido entre 6 e 9. Mesmo mais pref erivelmente o pH dasolução é mantido entre 7 e 8.

Em alguns métodos, o agente alquilante é adicionadomais de uma vez. Por exemplo, um primeiro tratamento comBPL pode ser realizado e então um segundo tratamento comBPL pode ser realizado. Entre o primeiro e o segundotratamentos pode haver uma etapa de remoção de agentealquilante, porém o agente alquilante pode ser adicionado aum segundo tratamento, sem remoção de qualquer agentealquilante que permaneça do primeiro tratamento.

Preferivelmente, o agente alquilante também é usadocomo agente de inativação para o vírus usado na vacina. Osagentes alquilantes da invenção são preferidos em relaçãoaos agentes de inativação tradicionais, tais como, aldeídcfórmico, que pode reticv.lar as proteínas em outro material,incluindo DNA de célula hospedeira. Tal reticulação podeconduzir â formação re agregados (t<. is como, conglomeradosde proteína-proteína, combinações de nucleotídeo ecombinações de proteína-nucleotldeo) . Em razão dos agentesalquilantes, tais como BPL, não se fiarem em taismecanismos de reticulação para inativação viral, o uso detais agentes alquilantes para inativação viral, o uso detais agentes alquilantes para inativação viral minimiza aformação de agregados e outras impurezas no produto devacina. Tais agregados podem coifrpreender proteínas ligadasiônica ou covalentemente às outras proteínas, proteínasiônica ou covalentemente ligadas aos outros nucleotídeose/ou nucleotídeos iônica ou covalentemente ligados aosoutros nucleotídeos.

Conforme usado aqui, a referência â "agregação" ou"um agregado" indica uma massa ou corpo de unidadesindividuais ou partículas ligadas em conjunto para criargrupos maiores ou partículas. A agregação pode ser, de modogeral, determinada por medições quantitativas doscomponentes desejados e após uma etapa de agregaçãopossível ou antes e após aplicação de um método deinterrupção do agregado (por exemplo, por tratamento comdetergente) por eletroforese de gel (tal como sistema deLaemmli), cromatografia, turbidez da solução ou estudos desedimentação e outros métodos bem conhecidos na arte.

0 tratamento com o agente alquilante,especificamente com BPL, pode envolver fases comtemperaturas diferentes. Por exemplo, pode haver um-·primeira fase em uma temperatura baixa (por exemplo, entre2-8°C, tal ::omo cerca de 4°C) e uma segunda fase em umatemperatura mais alta, tipicamente pelo menos 10°C maiorque a primeira fase (por exemplo, entre 25-50°C, tal comocerca de 37°C) . Esse processo de duas fases éespecificamente útil quando o agente alquilante está sendousado para ambas inativação e degradação do DNA. Em umesquema típico, a inativação do vírus ocorre durante a fasede temperatura inferior e a degradação do DNA ocorredurante a fase de temperatura mais alta. Conforme descritoem maiores detalhes a seguir, uma temperatura aumentadapode também facilitar a remoção do reagente de alquilaçãosensível ao aquecimento.

Proteínas imunogênicas

As proteínas imunogênicas apropriadas para empregona invenção podem ser derivadas de quaisquer vírus que sejao alvo de uma vacina. As proteínas imunogênicas podem serformuladas como vírus inativado (ou exterminado), vírus

atenuado, formulações de vírus dividido, formulações desubunidade purificada, proteínas virais que são isoladas,purificadas ou derivadas de um vírus e partículassemelhantes a vírus (VLPs).

As proteínas imunogênicas da invenção são antígenos

virais que preferivelmente incluem epítopos que são

expostos â superfície do vírus durante pelo menos umestágio de seu ciclo de vida. Os antígenos virais sãopreferivelmente conservados através de múltiplos sorotipos.ou isolados. Os antígenos virais incluem antígenos

derivados de um ou mais dos vírus estabelecidos a seguir,bem como os antígenos específicos identificados a seguir.Os vírus podem estar em envoltórios ou não, preferivelmenteem envoltõrior. Os vírus são preferivelmente RNA vírus e,mais pref erivelmente RNAss vírus. Eles podem ter um genornade sentido cu preferivelmente um genoma de anti-sentido.Seus genomas podem ser não segmentados ou preferivelmentesegmentados.

Orthomyxovirus: Antxgenos virais podem serderivados de um Orthomyxovirus, tal como Influanza A, B e C. Os antIgenos do Orthomyxovirus antxgenos podem serselecionados de uma ou mais das proteínas virais,hemaglutinina (HA), neuraminidase (NA), nucleoproteína(NP) , proteína de matriz (Ml) , proteína da membrana (M2) ,um ou mais dos componentes da transcriptase (PBl7 PB 2 e PA). Os antígenos preferidas incluem HA e NA.

Antxgenos de Influenza podem ser derivados decepas de Influenza. Alternativamente antxgenos paraInfluenza podem ser derivados de cepas com potencial paracausar surto pandêmico (isto é, cepas de Influenza com nova hemaglutinina em comparação a uma hemaglutinina nas cepascirculando correntemente ou cepas de Influenza que sãopatogênicas em aves e possuem o potencial de seremtransmitidas horizontalmente na população humana ou cepasde Influenza que são patogênicas aos seres humanos). Dependendo da estação específica e da natureza do antígenoincluído na vacina, os antxgenos de Influenza podem serderivados de um ou mais dentre os subtipos de hemaglutininaque se seguem: Hl7 H27 H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10,Hll, Hl2, Kl3, H14, K15 ou H16.

Os antxgenos de Influenza da invenção podem serderivados de uma cepa de Influenza, especificamente umacepa Influenza aviãrio altamente patogênica (HPAI).Alexander7 AvianDis (2003) 47(3 Suppl):976-81).

Detalhes adicionais dos a.itígenos do vírus Influenza são fornecidos a segui.r.Vírus Paramyxoviridae: Os ant Igenos virais podemser derivados do vírus Paramyxoviridae, tais comoFneuraoνIrus (RSV), ParamyxovIrus (PIV) e MorbillivIrus(sarampo).

Pneumovirus: Os antígenos virais podem serderivados de um PneumovIrus, tal como Vírus SincicialRespiratório (RSV), vírus Sincicial Respiratório Bovino,vírus da Pneumonia de camundongos e vírus derinotraqueite de perus. Preferivelmente, o PneumovIrus éRSV. Os antígenos para o PneumovIrus podem serselecionados dc. uma ou mais das proteínas que se seguem,incluindo proteínas de fusão de superfície (F) ,glicoproteína (G) e proteína hidrófoba pequena (SH) ,proteínas de matriz M e M2, proteínas de nucleocapsídeoN, PeLe proteínas não estruturais NSl e NS2.Antígenos para Pneumovírus preferidos incluem F, GeM.Vide por exemplo, J Gen Virol. 2004 Nov; 85(Pt 11):3229).Os antígenos para Pneumovírus podem também serformulados em ou derivados de vírus quiméricos. Porexemplo, vírus quiméricos RSV/PIV podem compreendercomponentes de ambos RSV e PIV.

Paramyxovxrus: Os antígenos virais podem serderivados de um ParamyxovIrus, tal como vírusParainfluenza tipos 1-4 (PIV), Caxumba, vírus Sendai,vírus de símios 5, vírus parainfluenza bovino e vírus dadoença de Newcastle. Preferivelmente, o Paramyxovírus éPIV ou de Caxumba. Os antígenos para Paramyxovírus podemser selecionados de uma ou mais das proteínas que seseguem: Hemaglutinina-Neuraminida.se (HN) , Proteínas defusão Fl e F2, NucleoproteIna (NP), f osf oproteína (P),proteína grande (L) e proteína de matriz (M) . Asproteínas de Paramyxovxrus preferidas incluem HN, Fl eF2 . Antxgenos para Paramyxovírus também podem serformulados ou derivados de vírus químéricos. Porexemplo, vírus quiméricos RSV/PIV podem compreendercomponentes de ambos RSV e PIV. Vacinas para caxumbadisponíveis comercialmente incluem vírus da caxumbaatenuado, vivo em uma forma moriovalente ou em combinaçãocom vacinas para sarampo e rubéola (MMR).

Morbillivírus: Os antígenos virais podem serderivados de um Morbillivírus, tal como Sarampo. Osantígenos para Morbillivírus podem ser selecionados deuma ou mais das seguintes proteínas: hemaglutinina (H),Glicoproteína (G) , fator de fusão (F) , proteína grande(L) , Nucleoproteína (NP) , Polimerase fosfoproteína (P) eMatriz (M) . Vacinas para sarampo disponíveiscomercialmente incluem vírus do sarampo atenuado, vivo,tipicamente em combinação com caxumba e rubéola (MMR).

Picornavlrus: Os antígenos virais podem serderivados de Picornavírus, tais como, Enterovírus,Rinovírus, Heparnavírus, Cardiovírus e Aftovírus. Osantígenos derivados de Enterovírus, tal como Poliovírussão preferidos.

Enterovírus: Os antígenos virais podem serderivados de um Enterovírus, tal como, Poliovírus tipos 1,2 ou 3, vírus Coxsackie tipos 1 a 22 e 24, vírus CoxsackieB tipos 1 a 6, Echovírus (vírus ECHO) tipos 1 a 9, 11 a 2 7e 29 a 34 e Enterovírus 68 a 71. PreferiArelmeiite, oEnterovírus é poliovírus. Os antígenos para enterovírussao preferivelmente selecionados de uma ou mais dasproteínas de capsídeo VPl que se seguem, VP2, VP3 e VP4.As vacinas contra pólio disponíveis comercialmenteincl\iem vacina para pólio inativada (IPV) e vaci.-.a parapoliovírus oral (OPV).

Heparnavírus: Os antígenos virais podem serderivados de um

Heparnavírus, tal como, vírus da Hepatite A (HAV).Vacinas contra HAV disponíveis comercialmente incluemvacina contra HAV inativada.

Togavírus: Os antígenos virais podem serderivados de um Togavírus, tal como um Rubivírus, umAlfavírus ou um Arterivírus. Os antígenos derivados deRubivírus, tais como vírus da rubéola são preferidos. Osantígenos do Togavírus podem ser selecionados de El, E2,E3, C, NSP-I, NSPO-2, NSP-3 ou NSP-4. Os antígenos paraTogavírus são selecionados preferivelmente de El, E2 ouE3. Vacinas contra rubéola disponíveis comercialmenteincluem um vírus adaptado ao frio vivo, tipicamente emcombinação com vacinas contra sarampo e rubéola (MMR).

Flavivirus: Os antígenos virais podem serderivados de um Flavivírus, tal como encefalite nata aocarrapato (TBE) , Dengue (tipos 1, 2, 3 ou 4), febreamarela, encefalite japonesa, encefalite do West Nile,,encefalite de St. Louis, encefalite de primavera-verãoda Rússia, encefalite Powassant, Antígenos paraflavivírus podem ser selecionados de PrM, M, C, E, NS-I,NS-2a, NS2b, NS3, NS4a, NS4b e NS5. Os antígenos paraFlavivírus são selecionados preferivelmente de PrM, M eE. As vacinas contra TBE comercialmente disponívei .·;incluem vacinas de vírus inati\rados.Pestivlrus: Os antígsnos virais podem serderivados de um Pestivírus, t?l como, diarréia viralbovina (BVDV), febr; suína clássica (CSFV) ou doençalimítrofe (BDV).

Hapadnavzrus: Os antlgenos virais podem serderivados de um Hepadnavírus, tal como vírus da HepatiteB. Os antígenos para Hepadnavxrus poderá ser selecionadosde antígenos de superfície e (L, M e S) , antígenos denúcleo (HBc, HBe) . Vacinas contra HBV disponíveiscomercialmente incluem vacinas de subunidadecompreendendo a proteína S do antígeno de superfície.

Vírus da Hepatite C: Os antígenos virais podem serderivados de um vírus da Hepatite C (HCV) . Os antígenospara HCV podem ser selecionados de um ou mais dentre El7E2, E1/E2, poliproteína NS345, poliproteína de núcleo NS345, núcleo, e/ou peptídeos das regiões não estruturais(Houghton e outros,, Hapatology (1991) 14:381).

Rhabdovírus: Antígenos virais podem ver derivadosde um vírus da raiva, tal como um Lyssavírus (vírus daraiva) e Vesiculovírus (VSV) . Os antígenos para o vírusda raiva podem ser selecionados da glicoproteína (G) ,nucleoproteína (N) , proteína grande (L) , proteínas nãoestruturais (NS). A vacina contra o vírus da raiva,disponível comercialmente compreende vírus mortosdesenvolvidos nas células diplóides humanas ou célulasdf; pulmão de feto de macaco rhesus.

C:,,liciviridae: Os antígenos virais podem serderivados de Caliciviridae, tais como, vírus Nor"7alk evírus semelhante ao Ksorwalk, tais como, vírus Hawaii evírus Snov,? IVruntain.Corcnavirus: Os antígenos virais poderá serderivados de um Coronavírus, SARS, coronavírusrespiratório humano, bronqui ce infecciosa de aves (IBV) ,vírus da hepatite de cawundongo (HHV) e vírus dagastroenterite transmissível dos porcos (TGEV). Osantígenos para o coronavírus podem ser selecionados doespigão (S) , invólucro (E) , matriz (M) , nucleocapsídeo(N), e glicoproteína da hemaglutinina-esterase (ΗΞ).Preferivelmente, o antígeno para o coronavírus é derivadode um vírus SARS. Os antígenos virais para SARS sãodescritos no WO 04/92360.

Retrovírus: Os antígenos virais podem serderivados de um retrovírus, tal como, oncovírus, umlentivírus ou um spumavírus. Os antígenos para oncovíruspodem ser derivados de HTLV-1, HTLV-2 ou HTLV-5. Osantígenos para lentivírus podem ser derivados de HIV-I ouHIV-2. Os antígenos para retrovírus podem ser selecionadosde gag, pol, env, tax, tat, rex, rev, nef, vif, vpu, e vpr.Os antígenos para HIV podem ser selecionados de gag (p24gage p55gag) , env (gpl60 e gp41) , pol, tat, nef, rev vpu,miniproteínns, (preferivelmente deleção de p55 gag egpl4 0v) . Os antígenos para HIV podem ser derivados de umaou mais das cepas que se seguem: KIVmb, HIVsF2, HIVLAV,HIVLAJ, HIVMN, HIV-1CM23 5, HIV-1US4.

Reovírus: Os antígenos virais podem ser derivadosde um reovírus, tal como um ortoreovíruL, um rotavírus, umorbivírus ou um coltivírus. Os antígenos para reovíruspodem ser selecionados de proteínas estruturais Λ1, Λ2, Λ3,μ1, μ2, σ1, σ2 ou σ 3 ou proteínas não estruturais, oKS,μΝS ou ols. Os antígenos para leovírus preferidos podem serselecionados de VPl, VP2, VP3, VP4 (ou o produto clivado deVP5 e VP8) , NSP 1, VP6, NSP3 , NSP2, VP7, NSP4, ou NSP5 . Osantígenos preferidos para rotavírus incluem VP4 (ou oproduto clivado de VP5 e VP8) e VP7.

Parvovírus: Os antígenos virais podem serderivados de um parvovírus, tal como, parvovírus B19. Osantígenos para parvovírus podem ser selecionados de VP-I,VP-2, VP-3, NS-I e NS-2. Preferivelmentei o antígeno doparvovírus é a proteína capsídeo VP-2.

Vírus da hepatite Delta (HDV) : Os antígenosvirais podem ser derivados de HDV, especificamente δ-antígeno de HDV (vide, por exemplo, a Patente US número5378814).

Vírus da Hepatite E (HEV) : Antígenos virais podemser derivados de HEV. Vírus da Hepatite G (HGV): Antígenosvirais podem ser derivados de HGV.

Herpesvírus humano: Os antígenos virais podem serderivados de um herpesvírus humano, tal como, vírus doherpes simples (HSV), vírus varicela-zoster (VZV), Epstein-Barr vírus (EBV), Citomegalovírus (CMV), Herpesvírus 6humano (HHV6), Herpesvírus 7 humano (HHV7) e Herpesvírus 8humano (HHV8). Os antígenos para os herpesvírus humanospodem ser selecionados de proteínas precoces imediatas (a) ,proteínas precoces (n) e proteínas tardias (y) . Osantígenos para HSV podem ser derivados das cepas HSV-I o.,HSV-2. Os antígenos para HSV podem ser selecionados deglicoproteínas gB, gC, gD e gH, proteína de fusão (gB) ouproteínas de escape imune (gC, gE ou gl) . Antígenos paraVZV podem ser selecionados de proteínas de núcleo,nucleocapsídec· tegumento ou inv61uno. Uma vacina contraVZV atenuado vivo se encontra comercialmente disponível. Osantígeno para EBV podem ser selecionados de proteínas deantígeno precoces (EA) , antígeno capsídeo viral (VCA) eglicoproteínas do antígeno de membrana (MA) . Os antígenos para CMV podem ser selecionados de proteínas de capsídeo,glicoproteínas de invólucro (tais como, gB e gH) eproteínas de tegumento.

Papovavirus: Os antígenos podem ser derivados dePapovavírus, tais como Papilomavírus e Poliomavírus. Os papilomavírus incluem sorotipos HPV 1, 2, 4, 5, 6, 8, 11,13, 16, 13, 31, 33, 35, 39, 41, 42, 47, 51, 57, 58, 63 e65. Preferivelmente, os antígenos para HPV são derivadosdos sorotipos 6, 11, 16 ou 18. Os antígenos para HPV podemser selecionados de proteínas de capsídeo (Ll) e (L2), ou El - E7, ou fusões das mesmas. Os antígenos para HPV sãopreferivelmente formulados em partículas semelhantes avírus (VLPs). Os vírus poliomavírus incluem vírus BK evírus JK. Os antígenos para poliomavírus podem serselecionados de VPl, VP2 ou VP3.

São providos ad'cionalmente os antígenos viraisdescritos em Vacinnes, 4a Edição (Plotkin and Orensteined. 2004) ; Medicai Microbiology 4a Edição (Murray eoutros, ed. 2002); Virology, 3a Edição (W.K. Joklik ed.1988); Fundamental Virology, 2nd Edição (B.N. Fields and D.M. Knipe, eds. 1991), que são contempladas em conjuntocom as composições da presente invenção.

As proteínas imunogênicas apropriadas para uso nainvenção podem ser derivadas de um vírus que causa doençarespiratória. Exemplos de ^ais antígenos respiratórios incluem proteínas derivadas de um vírus respiratório, talcomo, Orthomyxoviruses (Influenza), Pneumovírus (RSV),Paramyxovírus (PIV), Morbillivírus (sarampo), Togavxrus(Rubéola), VZV, e CoronavIrus (SARS) . As proteínasimunogênicas derivadas do vírus Influenza sãoespecificamente preferidas.

As composições da invenção podem incluir uma oumais proteínas imunogênicas apropriadas para uso emindivíduos pediátricos. Os indivíduos pediátx"icos sãotipicamente menos cie cerca de 3 anos, ou menores de cercade 2 anos ou de menos de 1 ano de idade. Os antígenospediátricos podem ser administrados várias vezes no cursode 6 meses, 1, 2 ou 3 anos. Os antígenos pediátricos podemser derivados de um vírus que pode ter como alvo populaçõespediátricas e/ou um vírus ao qual as populações pediãtricassão suscetíveis a infecção. Os antígenos virais pediátricosincluem antígenos derivados de um ou mais de Orthomyxovírus(Influenza), Pneumovírus (RSV), Paramyxovírus (PIV eCaxumba), Morbillivírus (sarampo), TogavIrus (Rubéola) ,Enterovírus (pólio), HBV, CoronavIrus (SARS), e vírusvaricela-zoster (VZV), Epstein Barr vírus (EBV).

As composições da invenção podem incluir uma oumais proteínas imunogênicas apropriadas para uso emindivíduos mais velhos e imunocomprometidos. Taisindivíduos podem precisar ser vacinados maisfreqüentemente, com doses mais altas ou com formulações comadjuvante para melhorar a resposta imune aos antígenosalvejados. Os antígenos que podem ser alvejados para uso emIdosos ou indivíduos imunocomprometidos i.ncluem antígenosderivados de um ou mais dos vírus que se seguem:Orthomyxovírus (Influcnza), Pneumovírus 'RSV),Paramyxovírus (PIV e Caxurnba) , Morbillivírus (sarampo) ,Togavírus (Rubéola), Encerovírus (pólio), HBV, Coronavírus(SARS), vírus varicela-zoster (VZV), Epstein Barr vírus(EBV) e Citomegalovírus (QW) .

Após o crescimento dos vírus, o agente alquilantepode ser usado nos vírions purificados, por exemplo, nosvírions apresentados em uma cultura de célula clarificada,ou nos vírions purificados de tal cultura de célulapurificada. Um método da invenção pode envolver remoção domaterial celular por clarificação e então purificação dosvírions da cultura de célula clarificada, por exemplo, porcromatografia. 0 agente alquilante pode ser usado nosvírions purificados dessa maneira, ou após uma etapaopcional adicional de ultrafiltração/diafiltração. Osmétodos preferidos usam o agente alquilante não nosobrenadante clarificado de uma cultura de célulainfectada, porém nos vírions purificados de talsobrenadante clarificado (de acordo com Morgeaux e outros,(1993) Vaccine 11:82-90).

0 agente alquilante é usado preferivelmente apósuma etapa de remoção de endotoxina ter acontecido.Etapas do Método

As composições de vacina da invenção podem serpreparadas por isolamento da proteína imunogê:.iica edegradação do DNA residual funcional de célula hospedeira.De modo semelhante, as formulações de proteína recombinantepodem ser preparadas por isolamento ou purificação daproteína recombinante e degradação do DNA residualfunciona] de célula hospedeira. Essas etapas podem serrealizadas seqüencial ou simultane· mente. A etapa dedecj adação do DNA residual de cultura de célula funcional érealizado por adição de um agente alquilante por exernplo,BPL.

0 agente alquilante e quaisquer produtos colateraissão preferivelmente removidos antes da formulação final davacina ou proteína recombina.nte. Pref erivelmente, acomposição de vacina ou formulação de proteína recombinantecontém menos de 0,1% de ácido propiônico livre e PBLcombinados (por exemplo, menos de 0,1%, 0,05%, 0,025%,0,01%, 0,005%, 0,001%, ou 0,01%. Preferivelmente, acomposição de vacina final ou formulação de proteínarecombinante contém menos de 0,01% de BPL.

BPL pode ser removido convenientemente poraquecimento, para causar hidrólise no ácido β-hidroxipropiônico não tóxico. O período de tempo necessáriopara hidrólise depende da quantidade total de BPL e datemperatura. Temperaturas mais altas fornecem hidrólisemais rápida, porém a temperatura não deve se elevar tãoalto de modo a danificar os ingredientes proteináceosativos. Conforme descrito a seguir, o aquecimento a cercade 3 70C por 2-2 horas e meia é apropriado para remoção daBPL.

Após tratamento do DNA, os produtos residuais doDNA podem ser retidos na composição imunogênica ourecombinante final. Mais preferivelmente, contudo, elesforam separados dos componentes desejados, por exemplo,separados dos vírions/proteínas. A separação dessa formapode remover os produtos de degradação do DNA em parte oucompletamente e preferivelmente, remove qualquer DNAdegradadc que seja superior a 2,00 pares de base. Assim, urmétodo da invenção pode incluir uma etapa de separação doDNA dos vírions. Essa etapa de separação pode envolver, porexemplo, um ou mais dentre ultrafiltração, ultracentrifugação (incluindo ultra centrifugação gradiente),transformação em microesferas do núcleo do vírus efracionamento do sobrenadante, cromatografia (tal como,cromatografia de troca de íon, por exemplo, troca deânion), adsorção, etc.

Sobretudo, portanto, um processo pode envolvertratamento com um agente alquilante para degradar ocomprimento do DNA residual e mais tarde purificação pararemover DNA residual (incluindo remoção do DNA degradado).

Cultura de Célula

As vacinas da invenção são preparadas por virus quesão propagados na cultura da célula. Além disso, a invençãoinclui formulações de proteínas recombinantes expressas nacultura de célula. As culturas de célula de mamífero sãopreferidas para ambas a replicação viral e expressão daproteína recombinante.

Várias linhagens de célula de mamífero sãoconhecidas na arte e incluem linhagens de células derivadasde células de primata humano ou não humano (por exemplo,macaco) (por exemplo, células PER.C6 que são descritas, porexemplo, no W001/38362, W001/41814, W002/40665,W02004/056 979, e W02005/080556, incorporados aqui comoreferência em sua totalidade, bem como depositados sob onúmero de depósito ECJ.CC 96022940), MRC-5 (ATCC CCL-171),WI-38 (ATCC CCL-75), células HEIR, células HeLa, células depulmão fetal de rhesus (ATCC CL-160), células de rimembrionárias (293 células, tipicamente transformadas porDNA de adenovírus compartilhado tipo 5) , células Vero (derins de macacos), cavalo, vaca (por exemplo, células HDBK),carneiro, cachorro (por exemplo, células MDCK de rins decachorro, (por exemplo, células MDCIC de rins de cachorro,ATCC CCL34 MDCK (NBL2) ou MDCK 33 016, número do depósitoDSM ACC 2219 conforme descrito no WO 97/37000 e WO97/37001), gatos e roedores (por exemplo, células dehamster, tal como BHK21-F, células HKCC, ou células deovário de hamster chinês (CHO)) e podem ser obtidas deuma grande variedade de estágios de desenvolvimento,incluindo, por exemplo, adulto, neonatal, fetal eembrião.

As células de macaco apropriadas são, porexemplo, células de macaco verde Africano, tais comocélulas de rim como na linhagem de célula Vero. CJlulasde cachorro apropriadas são, por exemplo, células de rimcomo na linhagem de célula MDCK. Assim, as linhagens decélula apropriadas incluem, porém não estão limitadas a:MDCK; CHO; 293T; BHK; Vero; MRC-5; PER.C6; WI-38; etc. Oemprego de células de mamífero significa que as vacinaspodem ser isentas de materiais, tais como, DNA degalinha, proteínas de ovo (tal como, ovalbumina eovomucóide), etc., pelo que, reduzindo a alergenicidade.

Em determinadas concretizações as células sãoimortalizadas (por exemplo, células PER.C6; ECACC96022940) . Nas concretizações preferidas, as células demamífero são utilizadas, e podem ser selecionadas e/ouderivadas de um ou mais tipos de célula não limitantesque se seguem: células de fibroblasto (por exemplo,dérmica, pulmão), células endoteliais (por exemplo,aórtica, coronária, pulmonar, vascular, microvasculardérmica, umbilical), hepatócitos, ceratinócitos, célulasimune (por exemplo, célula T, célula B, macrófago, NK,aendrítica) , células de mamíferos (por exemplo,epiteliais), células de músculo liso (por exemplo,vascular, aórtica, coronária, arterial, uterina,brônquica, cervical, pericitos retinianos), melanócitos,células neurais (por exemplo, astrocitos), células dapróstata (por exemplo, epitelial, músculo liso), célulasrenais ou dos rins (por exemplo, epitelial, mensangial,túbulo proximal), células esqueletais (por exemplo,condrócito, osteoclasto, osteoblasto), célulasmusculares (por exemplo, mioblasto, esqueletal, lisa,brônquica), células do fígado, células retinianas ouretinoblastos, células do pulmão e células estromais.

O WO97/37000 e o W097/37001 descrevem a produçãode células de animais e linhagens de células que sãocapazes de se desenvolver na suspensão e no meio isentode soro e são úteis na produção e replicação dos vírus,especificamente vírus Influenza. Detalhes adicionais sãofornecidos no W003/023021 e no W003/023025.

As linhagens de células de mamíferos preferidaspara desenvolvimento dos vírus Influenza incluem:células de MDCK, derivadas dos rins de cães Madin Darby;células Vero, derivadas dos rins de macaco verdeAfricano (Cercopith eus aethiops); ou células ΡΕΓ.C6,derivadas de retinoblastos embriônicos humanos. Essaslinhagens de células são amplamente disponíveis, porexemplo, da American Type Cell Culture (ATCC) collection,de Coriell Cell Repositories ou da ^uropean Collection ofCell Cultures (ECACC). Por exemplo, o ATCC fornecevárirs células Vero deferentes sob números de catálogoCCL-81, CCL-81.2, CRL-1586 e CRL-1587, e fornece célulasMDCK sob número de catálogo CCL-34. PER.C6 estádisponível a partir do ECACC sob número de depósito96022940.

As linhagens de células mais preferidas paradesenvolvimento dos vírus Influetiza são linhagens de célulaMDCK. A linhagem de célula MDCK original está disponível naATCC como CCL-34, porém derivados dessa linhagem de célulapodem também ser empregados. Por exemplo, W097/3 7000 revelauma linhagem de célula MDCK que foi adaptada paracrescimento na cultura de suspensão ('MDCK 33016',depositada como DSM ACC 2219) . De modo semelhante, EP-A-1260581 (WOOl/64846) revela uma linhagem de célula derivadade MDCK que se desenvolve na suspensão em cultura isenta desoro ('B-702', depositada como FERM BP-7449).W02006/071563 revela células de MDCIC não tumorigênicas,incluindo "MDCK-S' (ATCC PTA-6500), "MDCK-SF101' (ATCC PTA-6501), "MDCK-SFl021 (ATCC PTA-6502) e "MOCK-SF103 ' (PTA-6503) . WO2005/113758 revela linhagens de célula MDCK comalta suscetibilidade à infecção, incluindo células"MDCK.5F1' (ATCC CRL-12042). Qualquer uma dessas linhagens;de célula MDCK pode ser empregada.

A manipulação das culturas de células MDCK nasuspensão e culturas aderentes é descrita no W097/37000,WO97/37001, WO03/023021 e WO03/023025. Especificamente,o WO 03/023021 e o WO 03/023025 descrevem volumes deultura de célula em escala laboratorial e comercial dascélulas de suspensão MDCK em meios .ipento?.· de soro, meiosdefinidos quimicaxaente, e meios isentos de proteína. Cadareferência é incorporada aqui em sua totalidade.

Como uma alternativa às fontes de mamíferos, aslinhagens de célula para uso na invenção podem serderivadas ce fontes de aves, tais como, galinhas, patos,gansos ou faisões. As linhagens de células de aves podemser derivadas de uma variedade de está.gios dedesenvolvimento incluindo embriônico, pintinho e adulto.Preferivelmente, as linhagens de célula são derivadas decélulas embriônicas, tais como, fibroblastos embriônicos,células geminais ou órgãos individuais, incluindoneuronais, cérebro, retina, rins, fígado, coração,músculo ou tecidos extraembriônicos e membranas deproteção do embrião. Exemplos de linhagens de células deaves incluem células tronco embriônicas de aves(WOO1/8 5 938 e WOO3/076601) e células de retina de pato(W02005/042728) . Células tronco embrionárias de avesincluem a linhagem de célula EBx derivada das célulastronco embrionárias de galinha, EB45, ΞΒ14 e EB14-074(W02 006/108846) . Os fibroblastos de embriões de galinha(CEF) podem também ser usados. Essas células de aves sãoespecificamente apropriadas para o desenvolvimento dovírus Influenza.

Sistemas de expressão de células de inseto, taiscomo, sistemas de expressão recombinantes debaculovírus, são conhecidos dos versados na técnica edescritos, por exemnlo, em Summers and Smith, TexasAgricultura! Experiment Station Bullet j.n No. 1555(1987) . Os materiais e métodos para o- sistemas deexpressão da célula de inseto/bacuiovírus sãocomercialmente disponíveis na forma de kit, entreoutros, na Invitrogen, San Diego CA. As células deinseto para uso com os vetores de expressão dobaculovirus incluem, entre outros, Aecies aegypti,Autographa californica, Bombyx mori, Drosophilamelanogaster, Spodoptera frugiperda e Trichoplusia ni.

A expressão recombinante das proteínas podetambém ser conduzida em hospedeiros bacterianos, taiscomo, Escherichia coli, Bacillus subtilis , eStreptococcus spp. . Os hospedeiros levedura apropriadospara expressão recombinante das proteínas incluemSaccharomyees eerevisiae, Candida albieans, Cândidamaltosa, Hansenual polymorpha, Kluyveromyces fragilis,Kluyveromyces Iaetisf Piehia guillerimondii, Piehiapastoris, Schizosaccharomyces pombe e Yarrowlalipolytiea.

As condições da cultura para os tipos de célulaacima são bem descritas em uma variedade de publicaçõesou alternativamente meios de cultura, suplementos econdições podem ser adquiridos comercialmente, tal como,por exemplo, descrito no catálogo e literatura adicionalda Cambrex Bioproducts (East Rutherford, NJ).

Em determinadas concretizações, as célulashospedeiras usadas nos métodos descritos aqui sãocultivadas em meio isento de soro e/ou de proteína. Um meioé referido como urn meio isento de soro no contexto dapresente invenção, onde não existem aditivos do soro deorigem animal ou humana. Isento de proteína significaculturas onde a multiplicação das células ocorre comexclusão das proteínas, fatores de crescimento, outrosaditivos de proteínas e proteínas que não soro, porém podemincluir, opcionalmente proteínas, tais como, tripsina ououtras proteases que podem ser necessárias para ocrescimento viral. As células que crescem em tais culturascontém naturalmente proteína propriamente.

Os meios isentos de soro conhecidos incluem meio deIscove, meio Ultra-CHO (BioWhittaker) ou EX-CELL (JRHBioscience). Os meios contendo .soro comuns incluem MeioBasal da Eagles (BME) ou Meio Essencial Mínimo (MEM)(Eagle, Science, 130, 432 (1959)) ou Meio Eagle Modificadoda Dulbecco (DMEM ou EDM); que são geralmente usados comaté 10% de soro fetal de bezerro ou aditivos semelhantes.Opcionalmente, o Meio Essencial Mínimo (MEM) (Eagle,Science, 130, 432 (1959)) ou Meio Eagle Modificado daDulbecco (DMEM ou EDM) pode ser usado sem qualquersuplemento contendo soro. Os meios isentos de proteína comoPF-CHO (JHR Bioscience) , meios definidos quimicamenteProCHO 4 CDM (BioWhittaker) ou SMIF 7 (GibcoBRL LifeTechnologies) e peptídeos mitogênicos como Primactone,Pepticase ou HyPepTM (todos da Quest International) ouhidrolisado de lactalbumina (Gibco e outros fabricantes)são também adequadamente conhecidos na técnica anterior.Esses aditivos de meio com base nos hidrolisados de plantapossuem a vantagem especial de que a contaminação comvírus, micoplasma ou agentes de infecção desconhecidos podeser evitada.

As condições de cultura da célula (temperatura,densidade celular, valor do pH, etc.) são variáveis em umaampla faixa devido à adequabilidade da linhagem de célulaempregada de acordo com a invenção e. podem ser adaptadasaos requisitos cias condições de crescimento do vírus oudetalhes de expressão recombinante.

As células podem se desenvolver de vários modos,por exemplo, em suspensão, em cultura aderente oumicroveículos.

As células podem se desenvolver abaixo de 37°C (porexemplo, 30-36°C) durante a replicação viral (W097/370 01).

0 método para propagação do vírus em célulascultivadas geralmente inclui as etapas de inoculação.. dascélulas cultivadas com a cepa a ser cultivada, cultivo dascélulas infectadas por um período de tempo desejado para apropagação do vírus, tal como, por exemplo, conformedeterminado por titulação do vírus ou expressão do antígeno(por exemplo, entre 24 e 168 horas após a inoculação) ecoleta do vírus propagado. As células cultivadas 1:100 a1:5, mais preferivelmente 1:50 a 1:10. O vírus podem seradicionados a uma suspensão das células ou aplicado a umamonocamada de células e o vírus é absorvido nas células porpelo menos 6 0 minutos, porém geralmente menos de 300minutos, pref erivelmente entre 90 e 240 minutos a 25°C a40°C, preferivelmente 28°C a 37°C.

A cultura de célula infectada (por exemplo,monocamadas) pode ser removida tanto por congelamento-descongelamento ou ação enzimátlca para aumentar o teorviral dos sobrenadantes de cultura colhidos. Os fluidoscolhidos são então tanto inativados quanto armazenadoscongelados. As células de cultura podem ser infectadas emuma variedade de xnfecções ("m.o.i") de cerca de 0,001 a10, preferivelmente 0,002 a 5, mais preferivelmente a 0,001a 2. Ainda mais preferivelmente, as células são infectadasem uma ai.o.i de cerca de 0,01. As células infectadas podemser colhidas 30 a 60 horas após infecção. Preferivelmente,as células são colhidas 34 a 4 8 horas após a infecção.Ainda mais preferivelmente, as células são colhidas 38 a 40horas após a infecção. As proteases (tipicamente tripsina)são geralmente adicionadas durante a cultura da célula parapermitir liberação viral e as proteases podem também seradicionadas a qualquer estágio apropriado durante acultura.

As composições de vacina da invenção geralmenteserão formuladas em uma forma de sub-vírion, por exemplo,na forma de um vírus dividido, onde o invólucro de lipídeoviral foi dissolvido ou rompido ou na forma de uma ou maisproteínas virais purificadas. A composição de vacinaconterá uma quantidade suficiente do(s) antígeno(s) paraproduzir uma resposta imunológica no paciente.

Os métodos de divisão de vírus, tal como, vírusInfluenzal são bem conhecidos na arte, por exemplo, videWO02/28422, WO02/067983, WO02/074336, WO0l/21151, etc. Adivisão do vírus é realizada por interrupção oufragmentação do vírus integral, se infeccioso (tiposelvagem ou atenuado) ou não infeccioso (por exemplo,inativado) cora uma interrupção da concentração de um agentede divisão. Os agentes de divisão geralmente incluemagentes capazes de romper e dissolver as membranaslipídicas, tipicamente com uma cauda hidrôfoba anexada auma cabeça hidrófila. O agente de divisão mc-,.is preferido éao brometo de cetiltrimetilamônio (CTAB). Detalhesadicionais da divisão são fornecidos a seguir no contextoA interrupção resulta em uma sol .'oilização plena ouparcial das proteínas virais, alterando a integridade dovírus. Agentes de divisão preferidos são agentes

tensoativos não iônicos e iônicos (por exemplo,catiônicos), por exemplo, alquilglicosídeos,

alquiltioglicosídeos, açúcares acila, sulfobetainas,betainas, polioxietilenoalquiléteres, Ν,Ν-dialquil-

glicamidas, Hecameg, alquilfenóxi-polietoxietanóis,

compostos amônio quaternários, sarcosila, CTABs (brometosde cetil trimetil amônio), fosfato de tri-N-butila,Cetavlon, sais de miristiltrimetilamônio, lipofectina,lipofectamina e DOT-MA, ou octil ou nonilfenõxipolioxietanóis (por exemplo, os agentes tensoativos Triton,tais como, Triton X-IOO ou Triton ΝΙΟΙ), ésteres depolioxietileno sorbitano (os agentes tensoativos Tween),éteres polioxietileno, ésteres polioxietileno, etc.

Os métodos de purificação das proteínas individuaisdos vírus são bem conhecidos e incluem, por exemplo, etapasde filtração, cromatografia, e eluição da fibra oca. Em umaconcretização, as proteínas são purificadas por resinatrocadora de íon.

Como uma alternativa adicional, a vacina podeincluir um vírus integral, por exemplo, um vírus vivointegral atenuado ou preferivelmente, um víxus integralinativado. Os métodos para inativação ou morte dos víruspara destruir sua capacidade de infectar as células demaniíferos são bem conhecidos na arte. Tais métodos incluerrambos meios químicos e físicos. Os meios químicos parainativação de um vírus incluem tratamento ccm umaquantidaae eficaz de um ou mais dos seguintes agentes:detergentes, aldeíclo fõrmico, formalina, BPL ou luz IP/. Osmeios químicos adicionais para inativação incluemtratamento com azul de metileno, psoraleno, carboxifulereno(C60) ou uma combinação de cada um. Outros métodos deinativação viral são conhecidos na arte, tais como, porexemplo, etilamina binãria, acetil etilenoimina ouirradiação gama. Preferivelmente, o vírus é inativado comBPL.

Composições Farmacêuticas

As composições da invenção são farmaceuticamenteaceitáveis. Elas geralmente .incluem componentes diferentesdos antigenos, por exemplo, elas incluem tipicamente um oumais veículo(s) farmacêutico(s) e/ou excipiente(s) . Umadiscussão completa de tais componentes está disponível emRemington: The Science and Practice of Pharmacy (Gennaro,2000; 20a edição, ISBN: 0683306472).

As composições de modo geral estarão na formaaquosa.

A composição pode incluir um ou mais preservativos,tais como, tiomersal ou 2-fenoxietanol. Contudo, épreferido que a vacina seja substancialmente isenta (istoé, menos de 5 μg/mL) de material de mercúrio, por exemplo,isenta de tiomersal (Banzhoff (2000) Immunology Letters71:91-96; W002/097072). As vacinas não contendo mercúriosão mais preferidas. As vacinas isentas de preservativo sãoespecificamente preferidas.

F preferido incluir um sal fisiológico, tal como,um sal de sódio, por exemplo, para controlar a tonicidade.O cloreto de sódio (NaCl) é preferido, podendo estarpresente entre 1 e 20 mg/mL. Outros sais que podem estúrpresentes incluem cloreto de potássio, fosfato dediidrogênio potássio, deidrato fosfato de dissódio, cloretode magnésio, cloreto de cálcio, etc.

As composições geralmente terólo uma osrr.olal idadeentre 200 mOsm/kg e 400 mOsm/kg, preferivelmente entre 240-360 mOsm/kg e mais preferivelmente se encontram dentro dafaixa de 290-310 mOsm/kg.

As composições podem incluir um ou mais tampões. Ostampões típicos incluem: um tampão de fosfato; um tampãoTris; um tampão de borato; um tampão de succinato; umtampão de histidina (especificamente com um adjuvante dehidróxido de alumínio); ou um tampão de citrato. Os tampõestipicamente estarão incluídos na faixa de 5-20 mM.

O pH de uma composição estará, preferivelmente,entre 5,0 e 8,1 e, mais tipicamente entre 6,0 e 8,0, porexemplo, 6,5 e 7,5. Um método da invenção portanto, podeincluir uma etapa de ajuste do pH da vacina em volume antesdo embalamento.

A composição é preferivelmente estéril. Acomposição é preferivelmente não pirogênica, por exemplo,contendo < 1 EU (unidade de endotoxina, uma medida padrão)por dose e, pref erivelmente, < 0,1 EU por dose. Acomposição é preferivelmente isenta de glúten.

As composições da invenção podem incluirdetergentes, por exemplo, um agente tensoativo éstersorbitano polioxietileno (conhecido como "Tweens"), umoctoxinol (tal como, oxtoxinol-9 (Triton X-100) ou t-octilfenoxipolietoxietanol) , um brome.co de amônio cetiltrimetila (" CTAB") ou de-:oxicolato de sódio. O detergentepode estar presente apenas em quantidades de traço.A composição pode incluir material para umaimunização simples ou pode incluir material paraimunizações múltiplas (isto é, um kit de "múltiplasdoses") . A inclusão de um preservante é útil nasdisposições de múltiplas dosis. Como uma alternativa (ouadição) para inclusão de um preservante em composições demúltiplas doses, as composições podem ser contidas em umrecipiente possuindo um adaptador asséptico para remoção domaterial.

As vacinas são tipicamente administradas em um

volume de dosagem de cerca de 0,5 mL, embora uma meia dose(por exemplo, cerca de 0,25 mL) possa ser administrada àcriança.

As composições 3 kits são preferivelmentearmazenados entre 2°C e 8°C. Elas não seriam congeladas.Elas deveriam ser mantidas, de modo ideal, fora da luzdireta.

Métodos de tratamento e administração de vacinas

As composições da invenção são apropriadas paraadministração aos pacientes animais (e, especialmente ohomem) e a invenção provê um método para acionar a respostaimune em um paciente, compreendendo a etapa deadministração de uma composição da invenção ao paciente.

A invenção também provê um kit ou composição da

5 .Invenção para uso como um medicamento.

A invenção também provê o emprego de proteínasimunogênicas derivadas de um vírus propagado na cultura decélula, onde a dita vacina é substancialmente isenta de DNAresidual de cultura de CfjIula funcional, na fabricação deum medicamento para acionar a resposta imune em umpaciente.

A resposta imune acionada por esses métodos e usosincluirá, de medo geral, uma resposta de anticorpo,preferivelraente uma resposta do anticorpo de proteção. Osmétodos para avaliar as respostas do anticorpo, capacidadede neutralização e proteção após vacinação viral são bemconhecidos na arte. Para virus Influenza, por exemplo, osestudos humanos mostram que as titulações de anticorpocontra HA estão relacionadas à proteção (uma titulação deinibição de hemaglutinação da amostra de soro de cerca de30-40 fornece cerca de 50% de proteção contra infecção porum vírus homólogo) [Potter & Oxford (1979) Br Med Bull 35:69-75].

As composições da invenção podem ser administradasde vários modos, A via de imunização mais preferida é porinjeção intramuscular (por exemplo, no braço ou perna),porém outras vias disponíveis incluem injeção subeutânea,intranasal, oral, intradérmica, transcutânea, transdérmica,etc.

As vacinas preparadas de acordo com a invençãopodem ser usadas para tratar crianças e adultos. 0 pacientepode ter menos de 1 ano de idade, 1-5 anos de idade, 5-15anos de idade, 15-55 anos de idade, ou pelo menos 55 anosde idade. Os pacientes podem ser mais velhos (por exemplo,>50 anos de idade, > 6 0 anos de idade e preferivelmente >65 de idade) , e jovens (por exemplo, < 5 anos de idade) ,pacientes hospitalizados, trabalhadores da saúde, pessoaldas força armadas, mulheres grávidas e os pacientescronicamente doentes, imunodeficientes, que tomaram umcomposto antiviral (por exemplo, um composto oseltamivir ouzanamivir para Influenza; vide a seguir) nos 7 dias antesde receber a vacina, pessoas com alergias a ovos e pessoasque viajam ao exterior. As vacinas não são unicamenteapropriadas a esses grupos, contudo e podem ser usadas demodo geral na população.

O tratamento pode ser feito por uma programação dedose simples ou uma programação de múltiplas doses. Asmúltiplas doses podem ser usadas em uma programação deimunização primária e/ou em uma programação de imunizaçãode reforço. Em uma programaçáo de dose múltipla, as váriasdoses podem ser fornecidas pelas mesmas ou por viasdiferentes, por exemplo, por um reforço parenteral eraucosal, um reforço mucosal e parenteral, etc.. Aadministração de mais de uma dose (tipicamente duasdoses) é especificamente útil nos pacientes nãodesafiados imunologicamente. Doses múltiplas tipicamenteserão administradas pelo menos 1 semana separada (porexemplo, cerca de duas semanas, cerca de 3 semanas,cerca de 4 semanas, cerca de 6 semanas, cerca de 8semanas, cerca de 10 semanas, cerca de 12 semanas, cercade 16 semanas, etc.).

As vacinas produzidas pela invenção podem seradministradas aos pacientes substancialmente ao mesmotempo (por exemplo, durante a mesma consulta médica ouvisita a um profissional de saúde ou centro devacinação) que outras vacinas, por exemplo,substancialmente ao mesmo tempo em que uma. vacinabacteriana, tal como uma vacina pf.ra difteria, umavacina para tétano, uma vacina para coqueluche, umavacina para DTP, uma vacina conjugada para H.Influenzaedo tipo bf uma vacina de conjugado raeningocócico (talcomo uma vacina tetravalente A-C-W135-Y), uma vacina deconjugado pneumocócico, etc.

De modo semelhante, as vacinas d;,; invenção podemser administradas aos pacientes substancialmente aomesmo tempo (por exemplo, durante a mesma consulta ouvisita a um profissional de saúde) como um compostoantiviral eficaz contra o vírus da vacina. Quando avacina for uma vacina contra Influenza., por exemplo,o(s) composto(s) pode(m) ser um inibidor deneuraminidase (por exemplo, oseltamivir e/ou zanamivir).Esses antivirais incluem um ácido (3R,4R,5S)-4 -acetilamino-5-amino-3(1-etilpropóxi)-1-ciclohexeno-l-carboxílico ou um ácido 5-(acetilamino)-4 -[(aminoiminometil)-amino]-2,6-anidro-3,4,5-t;rideóxi-D-glicero-D-galactonon-2-enônico, incluindo ésteres dosmesmos (por exemplo, os ésteres etílicos) e sais dosmesmos (por exemplo, os sais de fosfato) . Um antiviraleficaz contra Influenza é o ácido (3R,4R,5S)-4 -acetilamino-5-amino-3(1-etilpropóxi)-1-ciclohexeno-l-carboxilico, éster etllico, fosfato (1:1), tambémconhecido como fosfato oselta.miv.ir (TAMIFLUTM) .DNA da Célula Hospedeira

A medição do DNA da célula hospedeira está dentrodas capacidades normais do versado na técnica. Aquantidade total do DNA residual nas composições dainvenção é preferivelmente inferior a 20 ng/mL porexemplo, < 10 ng/mL, < 5 ng/mL, < 1 ng/mL, < 10 0 pg/mL, <10 pg/mL, etc. Conforme descrito acima, substancialmentetodo esse DNA é pref erivelmente inferior a 500 pares debase de comprimento.

O ensaio usado para medir o DKA tipicamente seráuni ensaio validado (Guidance for Industry:BioanalyticalMethod Validacion. U.S. Department of Health and HumanServices Food and Drug Administration Center for DrugEvaluation and Research (CDER) Center for VeterinaryMedicine (CVM). Maio de 2 001; Lundblad (2001)Biotechnology and Applied Biochemistry 34:195-197). Ascaracterísticas de desempenho do ensaio validado podemser descritas em termos Matemáticos e quantificáveis esuas fontes possíveis de erro serão identificadas. 0ensaio geralmente será testado quanto as característicastais como, exatidão, precisão, especificidade. Uma vezque o ensaio tenha sido calibrado (por exemplo, contraquantidades padrão conhecidas de DNA de célula dehospedeiro) e testado, então medições de DNAquantitativas podem ser realizadas rotineiramente. Trêstécnicas principais para quantificação de DNA podem serusadas: métodos de hibridização, tais como, Southernblots ou slot blots (Ji e outros, (2002) Biotechniques.32:1162-7); métodos de imunoensaio, tais como oThresholdTM System (Briggs (1991) J Parenter SeiTechnol. 45:7-12; e PCR quantitativa (Lahijani e outros,(1998) Hum Gene Ther. 9:1173-80). Esses métodos sãotodos familiares a um versado na técnica, embora ascaracterísticas precisas de cada método possam dependerda célula de hospedeiro em questão, por exemplo, aescolha das sondas para hibridização, a escolha dosiniciacjres e/ou sondas para ampliação, etc. O sistemaThresholdTM da Molecular Devices é um ensaio quantitativopara níveis de picograma do DNA total e foi usado paramonitorar os níveis de contaminação do DNA nosbiof ariaacêuticos (Bziggs (1991) supra.). Ura ensaio tj.,;icoenvolve formação não específica de seqüência de umcomplexo de reação entre urna proteína de ligação deDNAss biotinilada, um anticorpo anti-DNAss conjugado comurease e DNA. Todos os componentes do ensaio estãoincluídos no Kit dè Ensaio de DNA total e completodisponível no fabricante. Vários fabricantes comerciaisoferecem ensaios de PCR quantitativos, para detecção doDNA residual da célula hospedeira, por exemplo, AppTecTMLaboratory Services, BioRelianceTM, Althea Technologies,etc. Uma comparação de um ensaio de hibridizaçãoquimioluminescente e do sistema ThresholdTM de DNA totalpara medição da contaminação do DNA da célula hospedeira deuma vacina viral humana pode ser encontrada em Lokteff eoutros, (2001) Biologicals. 29:123-32.

Esses vários métodos analíticos também podem serusados para medir o comprimento de um DNA residual de

célula hospedeira. Conforme mencionado acima, o comprimentomédio de um DNA residual de célula, após tratamento com oagente alquilante, é preferivelmente inferior a 500 paresde base ou mesmo inferior a 200 pares de base.

Eni relação às células caninas, especif icamente,tais como as células MDCK, a análise do genoma revela 13seqüências de codificação com < 500 pares de base decomprimento, 3 seqüências < 200 pares de base e 1 seqüência< 100 pares de base. Assim, a fragmentação do DNA para <2 00 pares de base remove substancialmente todas as

seqüências de codificação e é altamente .'.mprovávr 1 quequalquer fragmento correspondesse realmente a um dos 3genes ao redor daquele comprimento (a saber: secretina em81 pares de base; PYY em 108 pares de bare e osteocalcinaem 135 pares de base).

Adjuvantes

As composições da invenção podem incluir umadjuvante, que pode funcionar para melhorar as respostasimunes (humoral e/ou celular) promovidas em um paciente querecebe a composição. O uso de adjuvantes com vacinas viraisé bem conhecido, por exemplo, nas vacinas contra hepatite,vacinas contra pólio, etc. A vacina contra InfluenzaFLUAD™ inclui um adjuvante de emulsão de óleo e água.

Os adjuvantes que podem ser empregados com ainvenção incluem, porém não estão limitados aos sais dealumínio, oligonucleotídeos imunoinflamatórios, saponinas,análogos de lipídeo A (tais como, 3dMPL) e emulsões de óleoe água. Esses e outros adjuvantes são revelados em maioresdetalhes em Powell & Newman (Vaccine Design: The Subunitand Adjuvant Approach, Plenum Press 1995, ISBN 0-306-44867-X) e O1Hagan (Vaccine Adjuvants: PreparationMethods and Research Protocols, volume 42 of Methods inMolecular Medicine series, ISBN: 1-59259-083-7) .

Os adjuvantes conhecidos como hidróxido de alumínioe fosfato de alumínio podem ser empregados. Esses nomes sãoconvencionais, porém são usados apenas por conveniência,como nenhum é uma descrição precisa do composto químicoreal que está presente (por exemplo, vide capítulo 9 dePowell Sc Newma:..) . A invenção pode utilizar qualquer umdentre adjuvantes de "hidróxido" ou "fosfato" que são emgeral usados como adjuvantes. A absorção nesses sais épreferida.

Os oligonucleotídeos imunoestimuladores comatividade adjuvante são bem conhecidos. Eles podem conterum motivo CpG (uma seqüência de dinucleotldeo contendo umacitosina não metilada ligada por uma ligação fosfato a umaguanosina), um motivo TpG, uma seqüência oligo-dT, umaseqüência oligo-dC, RNA de filamento duplo, seqüênciaspalindrômicas, uma seqüência poli(dG), etc.

Oligonucleotldeos imunoestimuladores tipicamentecompreenderão pelo menos 20 nucleotídeos e podemcompreender pouco mais de 100 nucleotídeos.

As saponinas (capítulo 22 de Powell & Newman) sãoum grupo heterólogo de glicosídeõs de esterol e glicosídeosde triterpenóide que são encontrados nas cascas, folhas,caules, raízes e mesmo flores de uma ampla faixa deespécies de plantas. As saponinas da casca da árvore MolinaQuillaia saponaria foram amplamente estudadas comoadjuvantes. As formulações de adjuvante da saponina incluemformulações purificadas, tais como, QS21, bem comoformulações de lipídeo, tais como ISCOMs. As composições desaponina foram purificadas usando HPLC e RP-HPLC e fraçõespurificadas específicas usando essas técnicas foramidentificadas, incluindo QS7, QS17, QS18, 0S21, QH-Ai Qv-I-Be QH-C. Preferivelmente, a saponina é QS21. Um método paraprodução ode QS21 é revelado na Patente US número 5057540.

As formulações de saponina podem também compreender umesterol, tal como, colesterol (W096/33739). As combinaçõesdas saponinas e colesteròis podem ser usadas para formarpartículas únicas denominadas complexos imunoestimulantes(ISCOMs), ISCOMs, cue tipicamente também incluem umfosfolipídeo.

3dMPL (também conhecido com lipídeo ir.onofosforila A3 des-O-acilado ou lipídeo 3-O-desacil-4'-monofosforila) éum adjuvante onde a posição 3 de redução da glicosamina de extremidade no lipídeo monofosforila A foi desacilada.3dMPL foi preparado de um mutante de isento de heptose deSalmonella ivinnesota., e é quimicamente semelhante aolipídeo A, porém não possui um grupo fosforila instávelem ácido e um grupo acila instável em base. 3dMPL ,podetomar a forma de uma mistura de moléculas correlatas,variando em sua acilação (por exemplo, possuindo 3, 4, 5ou 6 cadeias de acila, que podem ser de comprimentosdiferentes).

Várias emulsões de óleo e água com atividade adjuvante são conhecidas. Elas incluem, tipicamente,pelo menos um óleo e pelo menos um agente tensoativo,com o(s) óleo(s) e ager r.e(s) tensoativo (s) sendobiodegradáveis (metábolizáveis) e biocompatíveis. Asgotículas de óleo na emulsão geralmente possuem diâmetros de submícron, com esses tamanhos pequenossendo obtidos com um microflúidificador para proveremulsões estáveis. As gotículas com um tamanho inferiora 220 nm são preferidas e podem ser submetidas àesterilização em filtro.

Adjuvantes de emulsão de óleo e água específicosúteis com a invenção incluem, porém não estão limitadosa:

- uma emulsão de submícror. de esqualeno, Tween 80e Span 85. A composição da emulsão em volume pode ser de cerca de 5% de esqualeno, 0,5% de polissorbato 80 ecerca de 0,5% de Span 85. Em termos de peso, essasrazões se tornam 4,3% de esqualeno, 0,5% de polissorbato80 e 0,48% de Span 85. Esse adjuvante é conhecido como"MF59", conforme descrito em maiores detalhes noCapítulo 10 do Powell & Newman e capítulo 12 de O1Hagan. Aemulsão MF5 9 inclui, vantajosamente, íons citrato, porexemplo, 10 mM de tampão de citrato de sódio.

- uma emulsão de esqualeno, tocoferol e Tween 80. Aemulsão pode incluir salmoura tamponada com fosfato. Elatambém pode incluir Span 85 (por exemplo a 1%) e/oulecitina. Essas emulsões podem ter de 2 a 10% de esqualeno,de 2 a 10% de tocoferol e de 0,3 a 3% de Tween 80 e a razãoem peso de esqualeno:tocoferol é preferivelmente sal comoisso provê uma emulsão mais estável. 0 esqualeno e o Tween80 podem estar presentes em razão de volume de cerca de5:2. Uma tal emulsão pode ser fabricada por dissolução doTween 80 em PBS para fornecer uma solução a 2%, então amistura de 90 ml dessa solução com uma mistura de (5 g deDL-a-tocoferol e 5 mL de esqualeno), entãomicrofluidificação da mistura. A emulsão resultante podepossuir gotículas de óleo de submícron, por exemplo, com umdiâmetro médio entre 100 e 250 nm, preferivelmente cerca de 180 nm.

- uma emulsão de esqualeno, um tocoferol e umdetergente Triton (por exemplo, Triton X-IOO). A emulsãopode também incluir 3d-MPL. A emulsão pode conter um tampãode fosfato.

- uma emulsão compreendendo um polissorbato (porexemplo, polissorbato 80), um detergente Triton (porexemplo, Triton X-100) e um tocoferol (por exemplo, umsuccinato de α-tocofaroi). A emulsão pode incluir essestrês componentes em uma razão de massa de cerca de 75:11:10(por exemplo, 750 μg/mL de polissorbato 80, 110 i-ig/vnl, deTriton X-IOO e 100 μg/mL de succinato de a-tccoferol) eessas concentrações incluiriam qualquer contribuição dessescomponentes dos antígenos. A emulsão também pode incluiresqualeno. A emulsão também pode incluir 3d-MPL. A faseaquosa pode conter um tampão fosfato.

Vacinas contra Influenza

A invenção é especificamente apropriada parapreparação de vacinas contra o virus Influenza. Váriasformas de vacinas contra vírus Influenza estão disponíveisatualmente, por exemplo, vide capítulos 17 e 18 de PlotkinSc Orenstein (Vaccines, 4a edição, 2004, ISBN: 0-7216-S688-0) . De modo geral, elas se baseiam no vírus vivo ou vírusinativado. As vacinas inativadas têm como base os víricnsintegrais, vírions "divididos" ou antígenos de superfíciepurificados (incluindo hemaglutinina). Os antígenos paraInfluenza podem também ser preparados na forma devirossomas (partículas lipossômicas semelhantes a vírusisentas de ácido nucléico). Os antígenos purificados de umhospedeiro recombinante (por exemplo, em uma linhagemcelular de isento usando um vetor de baculovírus) tambémpodem se usados.

Os meios químicos para inativar um vírus incluemtratamento com uma quantidade eficaz de um ou mais dosseguintes agentes: detergentes, aldeído fórmico, β-propiolactona, azul de metileno, psoraleno, carboxifulereno(C60) , etilamina binária, acetil etilenoimina oucombinações dos mesmos. Métodos não químicos de nativaçãoviral são conhecidos na arte, tais como, por exemplo, luzUV ou irradiação gama.

Os virions podem ser colhidos de fluidos contendovírus por vários métodos. Por exemplo, um processo depurificação pode envolver centrifugação por zona usando umasolução gradiente linear de sacarose que inclui detergentepara interromper os virions. Os antígeno..? podem então serpurificados, após diluição opcional por diafiltração.

Os virions divididos são obtidos por tratamento dosvirions purificados com detergentes (por exemplo, éteretílico, polissorbato 80, desoxicolato, fosfato de tri-N-butila, Triton X-100, Triton N101, brometo decetiltrimetilamônio, ecc.) para produzir preparações desub-virion, incluindo os processo de divisão "Tween-éter").Os métodos de divisão dos vírus Ihfluenza, são bemconhecidos na arte, por exemplo, vide W002/28422,WO02/067 983, WO02/074335, WO0l/21151, WO02/097072,WO2 00 5/113 75 6, etc. A divisão do vírus é realizada porinterrupção ou fragmentação do vírus integral, seinfeccioso ou não infeccioso com uma interrupção daconcentração de um agente de divisão. A interrupção resultaem ULna solubilização plena ou parcial das proteínas virais,alterando a integridade do vírus. Agentes de divisão,preferidos são agentes tensoativos não iônicos e iônir.os(por exemplo, catiônicos), por exemplo, alquilglicosídeos,alquilti^glicosideos, açúcares acila, sulfobetaínas,betaínas, polxoxietilanoalquiléteres, N,N-dialquil-glicamidas, Hecameg, alquilfenóxi-polietoxietanóis,compostos amônio quaternários, sarcos:la, CTABs (brometosde cetil trimetii amônio), fosfato de tri-N-butila,Cetavlon, sais de miristiltrimetilamônio, lipofectina,lipofectamina e DOT-MA, os octil ou nonilfenóxipolioxietanóis (por exemplo, os agentes tensoativos Triton,tais como, Triton X-100 ou Triton Ν1Ο1), ósteres depolioxietileno sorbitano (os agentes tensoativos Tween),éteres polioxietileno, ésteres polioxietileno, etc. Umprocedimento de divisão útil emprega os efeitosconsecutivos do desoxicolato de sódio e aldeído fórmico e adivisão pode se realizada durante a purificação inicial dovirion (por exemplo, em uma solução gradiente de densidadesacarose). Assim, um processo de divisão ode envolver aclarificação do material contendo virion (para removermaterial não virion), concentração dos virions colhidos(por exemplo, usando um método de absorção, tal como,absorção de CaHP04), separação dos virions integrais domaterial não virion, divisão dos virions usando um agentede divisão em uma etapa de centrifugação de gradiente dedensidade (por exemplo, usando um gradiente de sacarose quecontém um agente de divisão, tal como, desoxicolato desódio) e então filtração (por exemplo, ultrafiltração) pararemover os materiais indesejados. A divisão dos virionspode geralmente ser ressuspensa na solução de cloreto desódio isotônica tamponada com fosfato de sódio.

Vacinas de antigenos de supe:. fície purificadoscompreendem os antigenos de superfície do Influenza,hemaglutinina e tipicamente também neuraminidase. Osprocessos para preparação dessas proteínas na formapurificada são também bern conhecidos na arte.

As cepas do vírus Influenza para uso nas vacinasalteram de estação em estação. No período inter-pandêmicocorrente, as vacinas incluem tipicamente duas cepas deInfluenza A (H1N1 e H3N2) e uma cepa de Influenza B, asvacinas trivaloiites são típicas. A invenção também podeusar HA de cepas pandêmieaü (isto é, c-.rpas para as quais oreceptor da vacina e a população humana em geral não foramdesafiadas anterior e imunologicamente) , tais como, cepasdos subtipos H2, H5, H7 e H9 (especificamente do vírusInfluenza A) e vacinas contra Influenza para cepaspandêmicas podem ser monovalentes ou podem ter como baseuma vacina Lrivalente normal suplementada por uma cepapandêmica. Dependendo da estação específica e da naturezado antígeno incluído na vacina, contudo, a invenção podeproteger contra um ou mais dos subtipos de hemaglutininados vírus Influenza A que se seguem: Hl, H2, H3, H4, H5,H6, H7, H8, H9, H10, Hll, H12, H13, H14/H15 OU H16 .

As composições da invenção, além de seremapropriadas para imunização contra cepas inter-pandêmicas,são especificamente úteis para imunização contar cepaspandêmicas. As características de uma cepa Influenza quefornecem à mesma o potencial para causar um surto pandêmicosão: (a) ela contém uma nova hemaglutinina comparada àshemaglutininas nas cepas humanas em circulaçãocorrentemente, isto é, vima que não seja evidente napopulação humana por mais de uma década (por exemplo, H2)ou não tenha sido anteriormente vista na população humana(por exemplo, H5, H6 ou H9 que tenha sido encontrada apenasna população de pássaros) , tal que a população humana sejaimunologicamente não desafiada anteriormente com relação àhemaglutinina da cepa; (b) ela seja capaz de ser, transmitida "horizontalmente na população humana,· e (c) sejapatogênica aos seres humanos. Um vírus com hevn .glutinina dotipo H5 é preferido para imunização contra Influenzapandêmico, tal com uma cepa K5N1. Outras cepas possíveisincluem H5N3, H9N2, H2N2 , H7N1 e H7N7 e quaisquer outrascepas pandêmicas potencialmente emergentes. Dentro dosubtipo H5, um vírus pode se encontrar na classificação HA1, classificação HA 1', classificação HA 2 ou classificaçãoHA 3 (World Health Organization (2005) Emergíng InfectiousDiseases 11 (10) :1515-21), com classificações 1 e 3 senão

especificamente relevantes. Outras cepas cujos antígenospodem geralmente ser utilizados nas composições são cepasque são resistentes à terapia antiviral (por exemplo,resistentes ao oseltamivir e/ou zanamivir), incluindo cepaspandêmicas resistentes.

As composições da invenção podem incluirantígeno(s) para uma ou mais (por exemplo, 1, 2, 3, 4 oumais) cepas do vírus Influenzal incluindo vírus InfluenzaA e/ou vírus Influenza B. Uma vacina trivalente épreferida, incluindo antígenos de duas cepas de vírus

Influenza A e uma cepa do vírus Influenza B.

O vírus Influenza pode ser uma cepa ressorvente epode ter sido obtido por técnicas de genética reversa.Assim, um vírus Influenza A pode incluir um ou mais,segmentos de RKA de um vírus A/PR/8/34 (tipicamente 6segmentos de A/PR/8/34 com os segmentos HA e N sendo de umacepa de vacina, isto é, um ressorvente 6:2) . Pode tambémincluir um ou mais segmentos de RMA de um vírus A/WSN/33 oude qualquer outra cepa de vírus útil para geração de vírusressorventes para preparação da vacina. Tipicamente, a

invenção protege contra uma cepa que á capaz de transmissãohumano-a-hutna.no e assim o genoma da cepa geralmenteincluirá pelo menos um segmento de RNA que se originou emura vírus Influenza de mamífero (por exemplo, em um serhumano). Ele pode incluir o segmento WS que se originou emum vírus Influenza aviário.

HA é um imunógeno principal nas vacinas contraInfluenza inativadas correntes e doses de vacina sãopadronizadas por uma referência aos níveis de HA,tipicamente medidos por SRID. As vacinas existentes contêm,tipicamente, cerca de 15 μg de HA por cepa, embora dosesinferiores possam ser usadas, por exemplo, para crianças,ou em situações pandêmicas, ou quando se utiliza umadjuvante. As doses fracionais, tais como, 1/2 (isto é, 7,5μg de HA por cepa) , 1/4 e 1/8 vêm sendo usadas, comopossuindo doses mais altas (por exemplo, doses de 3 χ ou9x) . Assim, as vacinas podem incluir entre 0,1 e 150 μg deHA por cepa de Influenza, pref erivelmente entre 0,1 e 50μg, por exemplo, 0,1-20 μg, 0,1-15 μg, 0,1-10 μg, 0,1-7,5^ig, 0,5-5 μg, etc. Doses específicas incluem, por exemplo,cerca de 15, cerca de 10, cerca de 7,5, cerca de 5, cercade 3,8, cerca de 1,9, cerca de 1,5, etc. por cepa.

Para vacinas vivas, a dosagem é medida por doseinfecciosa de cultura de tecido mediana (TCID5 0) ao invés,de teor de HA, e uma TCID5 0 entre 106 e 108(preferivelmente entre 1065-107.5) por cepa é típica.

HA empregado na invenção pode ser um KA naturalcomo encontrado em um vírus ou pode ter sido modificado.Por exemplo, é conhecida a modificação do HA para remoçãodos determinantes (por exemplo, regiões niper-básicas aoredor do sítio de clivagem entre .HAl e HA2) que fazem comque o vírus sejei altamente patogênico nas espéciesaviárias.

Após tratar uma composição contendo vírion paradegradar o DNA da célula hospedeira (por exemplo, com BPL) ,os produtos de degradação são preferivelmente removidos dosvírions, por exemplo, por cromatografia de troca de ânion.

Uma vez que o vírus influenza tenha sido purificadoquanto a uma cepa específica, ele pode ser combinado com osvírus de outras cepas, por exemplo, para fabricar umavacina trivalente, conforme descrito acima. É preferidotratar cada cepa separadamente e misturar volumesmonovalentes para fornecer uma mistura multivalente final,ao invés de misturar os vírus e degradar o DNA de umamistura multivalente.

General

O termo "compreendendo" engloba "incluindo" bemcomo "consistindo", por exemplo, uma composição"compreendendo" X pode consistir exclusivamente em X oupode incluir alguma coisa adicional, por exemplo X + Y.

A palavra "substancialmente" não exclui"completamente", por exemplo, uma composição que é"substancialmente isenta" de Y pode ser completamenteisenta de Y. Caso necessário, a palavra "substancialmente"pode ser omitida da definição da invenção.

0 termo "cerca de" em relação a um valor numéricoχ representa, por exemplo χ ± 10%.

Os termos "isolada" e "purificada" significampelo menos 50% pura, mais pref erivelmente 60% pura (comocom a maioria das vacinas dxvididas), mais preferivelmente70% pura ou 80% pura, ou 90% pira ou 95% pura ou mais de99% pura.

A menos que especificamente declarado, uraprocesso compreendendo uma etapa de mistura de dois ou maiscomponentes não requer qualquer ordem específica demistura. Assim, os componentes podem ser misturados emqualquer ordem. Onde existem três componentes, então doiscomponentes podem ser combinados entre si, e então acombinação pode ser conjugada a um terceiro componente,etc.

Quando materiais de animais (e especificamentebovinos) forem usados na cultura das células, eles devemser obtidos de fontes que sejam isentas de encefalopatiasespongiformes transmissíveis (TSEs) e especificamenteisentas de encefalopatia espongiforme bovina (BSE). Nogeral, é preferido cultivar as célula.s na ausência total demateriais derivados de animais.

Quando um composto for administrado a um corpo comoparte de uma composição, então aquele composto pode seralternativamente substituído por um promedicamentoapropriado.

Quando um substrato de célula é usado paraprocedimentos de ressorção ou genética reversa, épreferível um que tenha sido aprovado para υsο em produçãode vacina humana, por exemplo, como no Ph Eur Generalcapítulo 5.2.3.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

As figuras 1 e 2 mostram os resultados da cmpliaçãoda PCR de seis alvos denominados no genoma MDCK. Algumasamostras foram diluídas conforme indicado, até 1:10.000antes da PCR.A figura. 3 mostra os resultados da ampliação da PCRde seqüências SINE no genoma MDCK. Como nas figuras 1 e 2,o DKA foi algumas vezes diluído antes da PCR. No painelinferior, as figuras ilustrB^n a quantidac'3 de partida deDNA na PCR (fg).

A figura 4 mostra o efeito do tratamento com BPL notamanho do DNA MDCK. O DNA genômico foi incubado com BPL emdiferentes temperaturas e por períodos de tempo diferentes.A figura 5 mostra resultados semelhantes. Os géis deagarose foram coloridos com SYBRGold.

A figura 6 mostra eletroforese por capilaridade deDNA residual (linha superior) em relação aos marcadores(linha inferior) possuindo os tamanhos indicados.

MODOS DE REALIZAR A INVENÇÃO

Vírus Influenza (A/New Cal.edonia/20/99 (HlNl) ,A/Panama/2007/9 9 (H3N2) ;B/Jiangsu/10/2003 ;A/Wyoming/3/2 0 03(H3N2)) foram desenvolvidos em células MDCKem uma cultura em suspensão, seguindo-se os ensinamentosdos ViO97/37000, W003/23025 e W004/92360. 0 meio de culturafinal foi clarificado para prover vírions que foram entãosubmetidos á cromatografia e ultrafiltração/diafiltração.Os vírions no material resultante foram inativados usandoβ-propiolactona (concentração final de 0,05% v/v; incubadapor 16-20 horas a 2-8°C e então hidrolisada para incubar a37°C por 2-2,5 horas). CTAB foi então empregado paradividir os vírions, e várias etapas de processamentoadicionais forneceram uma vacina em volume monovalentefinal contendo proteínas de superfície purificadas.

o DNA de MDCK foi caracterizado para avaliar suaquantidade, tamanho e integridade nos três ertãgios doprocesso de fabricação: (A) após a etapa deultrafiltração/diafiltração; (B) após tratamento com β-propiolactona e (C) no volume monovalente final. Aeletroforese de gel por capilaridade e a ampliação do ácidonucléico foram usadas para investigar o tamanho, aintegridade e a atividade biológica de qualquer DNAgenômico residual.

Determinação do Tamanho

Conforme mencionado acima, o tamanho do DNA dacélula hospedeira residual foi analisado nos estágios (A) ,(B) e (C) por eletroforese do gel por capilaridade. Aanálise foi realizada em cinco culturas de vírus separadas.Amostras de 500 μL; foram removidas nesses três pontos etratadas com 10 μL; de proteinase K a 56°C por 16 a 22.horas, seguido por uma extração de DNA total com o KitExtrator de DNA (Wako Chemicals) seguindo-se as instruçõesdo fabricante. 0 DNA foi ressuspenso em 500 μL de águaultrapura para eletroforese em um P/ACE MDQ MolecularCharacterization System (Beckman Coulter) a uma temperaturaconstante de 20°C. Onze marcadores de tamanho molecularforam usados, de 72 a 1.3 53 pares de base. 0 limite dedetecção do ácido nucléico (DL) para esse método foi de 0,7pg/mL.

Com base nos marcadores de tamanho e densidaderelativa das faixas de DNA, a distribuição e tamanho dosfragmentos de DNA foram determinados e avaliados paraquatro categorias de tamanho diferentes entre variação de <200 bp ã > 1.000 bp. A figura 6 mostra a eletroforese porcapilaridade de uma amostra do estágio (C) A análisemostra que todo o DNA residual detecta nessa amostra estásubstancialmente abaixo de 2,00 pares de base decomprimento.

Os resultados ponderados das cinco culturas sãomostrados na tabeIa que se segue:

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0 tratamento com BPL assim causa uma redução de -10vezes na quantidade de DNA, porém também comuta adistribuição para longe das seqüências longas na direção defragmentos pe.ruenos < 200 pares de base. 0 processamentoadicional, entre as etapas (B) e (C) , incluindo etapas decromatografia e ultrafiltração, reduziu os níveis de DNAtotal em -70 vezes e removeram todo DNA detectável s 200pares de base.

Ampliação do DNA

A transformação da célula neoplãstica é um fenômenofreqüentemente associado aos proto-oncogenes modificadose/ou genes supressores de tumor modificados. As seqüênciasde vários genes caninos foram analisadas por PCR antes eapós tratamento com BPL, isto é, nos pontos (A) e (B) . Alémdisso, o DNA das células MDCK não infectados foram tratadose testados. Os proto-oncogenes testados foram: H-ras e c-myc. Os genes supressores de tumor testados foram: p53;p21/waf-1; e PTEN. Além disso, as seqüências SINErepetitivas foram analisadas por PCR. 0 alto número decópias para SINEs fácil.'.ta a detecção sensitiva.

Todas as amostras foram providas com espigões comum DNA cie controle externo (fragmento pUC19) paramonitoramento da qualidade da preparação da amostra e aPCR. Em todos os experimentos uma ampliação consistente docontrole de espigão foi observada, indicando que BPL hidrolisada residual e subprodutos presentes nas misturasda PCR não possuem efeitos inibidores o ensaio e garantiramuma qualidade suficiente da preparação de amostra e da PCR.As amostras foram diluídas em etapas de 10 vezes antes daampliação, até os produtos da PCR não serem detectados, pelo que, indicando a redução de Iog nos níveis de DNA. 0limite de detecção para o ensaio da PCR é de 55 pg.

Os produtos da PCR foram analisados poreletroforese de gel em agarose. A figura 1 mostra osresultados obtidos nas células MDCK não infectadas e a figura 2 mostra os resultados obtidos durante a cultura dovírus. Todos os seis genes analisados mostraram um fortesinal de ampliação antes do tratamento com BLP, porém aresistência do sinal diminuiu após exposição â BPL. Emtodos os lotes de produção testados, o DNA genômico de MDCKresidual diminuiu em pelo menos 2 valores de Iog apósexposição à BPL.

Uma vez que a figura 2 mostra os resultados noestágio (B) , antes da purificação adicional, os resultadosexcedentes representara o DNA presente nas vacinas finais em volume. Devido à sensibilidade quando se utiliza seqüênciasSINE, contudo, a PCR foi também possível no estágio (C), novolume final monovalente. Os resultados dessa análise sãomostrados na figura 3. A ampliação do DNA em (A) e (B) foirelativamente semelhante à região SINE, indicando que a BPLé menos ativa em seqüências de DNA menores. Mesmo paraaquelas seqüências menores, contudo, não houve uma reduçãonotável no sinal de ampliação para todas as amostrasanalisadas. A comparação das intensidades de sinal de PCRentre o ponto de coleta de amostra (B) e (C) reflete aredução do DNA residual devido às etapas de piarif icaçãointermediárias.

A extrapola-ção da análise com base no gene e combase diretamente na análise com base em SINE, um nível deDNA total de < 1 ng por dose e freqüentemente <100 pg pordose é esperado em uma vacina final.Temperatura

O tratamento com BPL durante a inativação do vírusteve duas etapas independentes: (1) adição de BPL à misturacontendo vírion a 2-8°C; então (2) elevação da temperaturaa 37 °C para hidrólise de BPL. Os efeitos, das duas etapas deBLP na inativação do DNA MDCK e fragmentação Zoraiainvestigados .

0 DNA genômico purificado das células MDCK nãoinfectadas foi tratado com uma concentração final de 0,05%(v/v) BPL a 2-80C por 16 horas ou a 37°C ou 50°C por até 6horas e meia. A fragmentação do DNA foi verificada apósisso e os resultados são mostrados na figura 4. Essesexperimentos revelam a atividade de BPL contra DNA celular,porém as células não infectadas não refletem o estado deMDCK após crescimento viral, uma vez que o DNA celular jáestá altamente fragmentado devido à apoptose.

Em 2 - 8 ° C, a diferença entre DNA tratado e nãotratado em um gel agarose foi insignificante, sugerindo quee fragmentação do DNA por BPL não pode ocorrersubstancialmente durante essas condições. Em contraste, oDNA foi muito modificado em ambos 37°C e 50°C cora atemperatura maior conduzindo a uma cinética de reaçãoacelerada. O DNA de células não tratadas mostrou uma faixarelativamente distinta em um gel de agarose, com uma levemancha dos produtos de degradação (figura 5, raia 3). Apósum período de incubação curto de BPL a 37°C, contudo, o DNAde MDCK manchou a partir das fendas de gel e a intensidadedo sinal de faixa diminuiu (figura 5, raia 2). Os períodosde incubação mais longos resultaram no desaparecimento dasmoléculas de DNA genômico e melhora da fragmentação do DNA MDCK.

Nos experimentos adicionais, BPL foi incubadaprimeiro com células a 4°C por 16 horas. Em uma primeirapopulação, a temperatura foi elevada para 37°C por 2 horas;em uma segunda população, BPL foi removida por filtroscentrífugos e então a temperatura foi elevada Níveis deDNA residual muito mais baixos (>2 log inferior) foramvistos na primeira população.

Assim, a fragmentação do DNA observada durante otratamento da BPL parece ocorrer principalmente durante aetapa de hidrólise de BPL a 37°C ao invés de durante aetapa de inativação do vírus a 2-8°C.

Será entendido que a invenção foi descrita apenaspor meio de exemplos e modificações pciem ser feitas,enquanto permaneçam dentro do escopo e espírito da invenção.

Claims (32)

1. Vacina caracterizada pelo fato de compreenderproteínas imunogênicas derivadas de um vírus propagado nacultura de célula, caracterizada pelo fato de qre a vacinaé substancialmente isenta de DNA residual de cultura decélula funcional.

2. Vacina, de acordo com a reivindicação 1,caracterizada pelo fato de que. qualquer DNA residual decultura de célula é degradado por tratamento com um agentealquilante.

3. Vacina, de acordo com a reivindicação 2,caracterizada pelo fato de que o dito agente alquilante éρ-propiolactona (BPL).

4. Vacina, de acordo com a reivindicação 1,caracterizada pelo fato de que o comprimento do DNAresidual de cultura de célula degradado é inferior a 500pares de base.

5. Vacina, de acordo com a reivindicação 1,caracterizada pelo fato de que o comprimento do DNAresidual de cultura de célula degradado é inferior a 20 0pares de base.

6. Vacina, de acordo com a reivindicação 3,caracterizada pelo fato de que o dito DFA residual decultura de célula é degradado por tratamento com menos de-0,1% de 3-propiolactona (BPL).

7. Vacina, . de acordo com a reivindicação 1,caracterizada pelo fato de que a vacina exibe um nívelreduzido de agregação.

8. Vacina caracterizada pelo fato de compreenderproteínas imunogênicas derivadas de um vírus propagado nacultura ά,Λ célula, caracterizada pelo fato de que occrnpriraento do DI-ΙΛ residual de cultura de célula é inferiora 500 pares de base.

9. Vacina, de acordo com a reivindicação 8,caffc^erizRda pelo fato de que o DNA residual de cultura decélula é degradado por tratamento com um agente alquilante.

10. Vacina, de acordo com a reivindicação 9,earactariaada pelo fato de que o dito agente alquilante êρ-propiolactona (BPL).

11. Vacina, de acordo com a reivindicação 8,caracterizada pelo fato de que o comprimento do DNAresidual de cultura de célula é inferior a 300 pares debase.

12. Vacina, de acordo com a reivindicação 8,caracterizada pelo fato de que o comprimento do DNAresidual de cultura de célula é inferior a 200 pares debase.

13. Vacina, de acordo com a reivindicação 8,caracterizada pelo fato de que o dito DNA residual decultura de célula é degradado por tratamento com menos de-0,1% de β-propiolactona (BPL).

14. Vacina, de acordo com a reivindicação 8,caraeterizade, pelo fato de que a dita vacina exibe um nívelreduzido de agregação.

15. Vacina, de acordo com a reivindicação 10,caracterizada pelo fato de que contém menos de 0,01% deácido propiônico livre e β-propiolactona (BPL) combinados.

16. Método para preparar uma vacina caracterizadopelo fato de compreender proteínas imunogênicas derivadasde um vírus propagado em uma cultura de célula,caracterizado pelo fato de que compreende:degradação do DNA residual de cultura de célulafuncional; eisolamento das proteínas imunogênicas.

17. Método, de acordo com a reivindicação 16,caracter χ z5,do pelo fato de que a dita etapa de degradaçãodo DNA residual de cultura de célula funcional compreende otratamento do DNA de cultura de célula funcional com umagente alquilante.

18. Método, de acordo com a reivindicação 17,caracterizado pelo fato de que o dito agente alquilante éρ-propiolactona (BPL).

19. Método, de acordo com a reivindicação 18,caracterizado pelo fato de que o dito DNA da cultura decélula é degradado por tratamento com menos de 0,1% de j3-propiolactona (BPL).

20. Método, de acordo com a reivindicação 16,caracterizado pelo fato de que a dita vacina exibe um nívelreduzido de agregação.

21. Método, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 16,17,18,19 ou 20, caracterizado pelo fatode que a etapa (ii) envolve separação do DNA dos vírions.

22. Vacina, de acordo com as reivindicações 1 ou 8,caracterizada pelo fato de que o dito vírus é um vírusInfluenza.

23. Vacina, de acordo com as reivindicações 1 ou-8, caracterizada pelo fato de que a cultura de célula éselecionada do grupe consistindo nas células MDCK, célulasVero e células PER.C.6.

24. Formulação caracterizada pelo fato de quecompreende uma -proteína recorabinante expressa na cultura decélula, onde a formulação é substancialmente isenta de DNAresidual de célula funcional.

25. Formulação, de acordo com a reivindicação 24,c.jar ac teri g a. da pelo fato de que qualquer DNA residual decultura de célula é degradado por tratamento com um agentealquilante.

26. Formulação, de acordo com a reivindicação 25,caracterizada pelo fato de que o agente alquilante é |3-propiolactona (BPL).

27. Formulação, de acordo com a reivindicação 24,caracterizada pelo fato de que o comprimento do DNAresidual de cultura de célula degradado é inferior a 500pares de base.

28. Formulação, de acordo com a reivindicação 24,caracterizada pelo fato de que o comprimento do DNAresidual de cultura de célula degradado é inferior a 200pares de base.

29. Formulação, de acordo com a reivindicação 26,caracterizada pelo fato de que o dito DNA residual decultura de célula é degradado por tratamento com menos de0,1% de β-propiolactona (BPL).

30. Formulação, de acordo com a reivindicação 24,caracter:, zsda pelo fato de que a dita formulação exí.be umnível reduzido de agregação.

31. Formulação compreendendo uma proteínarecombinante expressa na cultura de célula, caracterizadapelo fato de que o comprimento ίο DNA residual de culturade célula funcional é inferior a 500 pares de base.

32. Formulação, de acordo com a reivindicação 24 ou-31, caracterizada pelo fato de que a cultura de celula eselecionada do grupo consistindo nas células MDCK, célulasVero e células PER.C [Some texts missing on original document].