BRPI0618215B1 - Polipeptídeo de fusão, seqüência de polinucleotídeo isolada, vetor de expressão recombinante, método para detectar infecção por t. cruzi em uma amostra biológica, kit para detectar a referida infecção, e composição - Google Patents
Polipeptídeo de fusão, seqüência de polinucleotídeo isolada, vetor de expressão recombinante, método para detectar infecção por t. cruzi em uma amostra biológica, kit para detectar a referida infecção, e composição Download PDFInfo
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Abstract
polipeptídeo de fusão, seqüência de polinucleotídeo isolada, vetor de expressão recombinante, célula hospedeira, método para detectar infecção por t. cruzi em uma amostra biológica, kit para detectar a referida infecção, e composição. composições que compreendem polipeptídeos de fusão de epítopos de t. cruzi, junto com métodos para o uso de tais composições no diagnóstico de infecção por t. cruzi e em rastreamento de suprimentos de sangue são descritas. kits de diagnóstico que compreendem tais composições também são fornecidos.
Description
(54) Título: POLIPEPTIDEO DE FUSÃO, SEQÜÊNCIA DE POLINUCLEOTÍDEO ISOLADA, VETOR DE EXPRESSÃO RECOMBINANTE, MÉTODO PARA DETECTAR INFECÇÃO POR T. CRUZI EM UMA AMOSTRA BIOLÓGICA, KIT PARA DETECTAR A REFERIDA INFECÇÃO, E COMPOSIÇÃO (73) Titular: INBIOS INTERNATIONAL, INC., Sociedade Americana. Endereço: 562 1ST Avenue South, Suite 600, Seattle Wa 98104, ESTADOS UNIDOS DA AMÉRICA(US); INFECTIOUS DISEASE RESEARCH INSTITUTE, Sociedade Norte-Americana. Endereço: 1124 Columbia Avenue, Suite 400, Seattle WA 98104, ESTADOS UNIDOS DA AMÉRICA(US) (72) Inventor: RAYMOND L. HOUGHTON; STEVEN G. REED; SYAMAL RAYCHAUDHURI
Código de Controle: 206DB50C959EE9C1 E59D5181FE839684
Prazo de Validade: 10 (dez) anos contados a partir de 02/10/2018, observadas as condições legais
Expedida em: 02/10/2018
Assinado digitalmente por:
Liane Elizabeth Caldeira Lage
Diretora de Patentes, Programas de Computador e Topografias de Circuitos Integrados
Relatório Descritivo da Patente de Invenção para POLIPEPTÍDEO DE FUSÃO, SEQUÊNCIA DE POLINUCLEOTIDEO ISOLADA, VETOR DE EXPRESSÃO RECOMBINANTE, MÉTODO PARA DETECTAR INFECÇÃO POR T. CRUZI EM UMA AMOSTRA BIOLÓGICA, KIT PARA DETECTAR A REFERIDA INFECÇÃO, E COMPOSIÇÃO.
DECLARAÇÃO RELACIONADA À PESQUISA OU DESENVOLVIMENTO
PATROCINADO PELO GOVERNO
O Governo dos EUA tem uma licença saldada nessa invenção e o direito em circunstâncias limitadas de requerer que o proprietário da patente licencie outros em termos justos conforme fornecidos pelos termos da Concessão N°. 2 R 44AIO52683-02 outorgada pelo National Institutes of Health. CAMPO DA INVENCÃO
A presente invenção refere-se geralmente ao diagnóstico de infecção por Trypanosoma cruzi (T. cruzi). Mais especificamente, a invenção refere-se ao uso de polipeptideos antigênicos e polipeptideos de fusão de T. cruzi em métodos para rastrear indivíduos e suprimentos de sangue para infecção por T. cruzi.
ANTECEDENTES DA INVENCÃO
Parasitas protozoários são uma grave ameaça à saúde em várias áreas do mundo. Trypanosoma cruzi (T. cruzi) é um de tal parasita que infecta milhões de indivíduos. Dez a trinta por cento de indivíduos infectados com T. cruzi desenvolvem doença de Chagas sintomática crônica, que pode por sua vez levam à doença cardíaca e uma variedade de desordens do sistema imune. A infecção por T. cruzi há muito é um problema de saúde pública na América Central e do Sul. Estima-se que 18 milhões de pessoas em todo o mundo estejam cronicamente infectadas com T. cruzi, mas tratamentos com fármacos disponíveis não têm eficácia e freqüentemente causam sérios efeitos colaterais.
A via de transmissão mais significativa em áreas onde a doença é endêmica é através do contato com um inseto triatomíneo infectado. Entretanto, em outras áreas, transfusões de sangue são os meios dominantes de transmissão. Conseqüentemente, a fim de inibir a transmissão de T. cruzi, é necessário desenvolver métodos precisos para diagnosticar e infecção por de 25/06/2018, pág. 7/15
T. cruziem indivíduos e para rastrear suprimentos de sangue, Rastreamento de bancos de sangue é particularmente importante na América do Sul, onde 0,1% - 62% de amostras de sangue podem estar infectadas e onde o parasita é freqüentemente transmitido por transfusão de sangue. Devido ao alto fluxo de imigrantes para os EUA de vários países na América Central e do Sul onde a infecção por T. cruzi é endêmica, o suprimento de sangue dos EUA está se tornando em alto risco para contaminação por doadores de sangue infectados por T. cruzi. Embora haja poucos testes disponíveis para diagnosticar a infecção em indivíduos, não hã -atualmente nenhum teste a, 10 provado pelo FDA disponível nos EUA para rastreamento de doadores de sangue para infecção por T. cruzi.
1,1 O diagnó-stico de infecção por T. cruzi tem sido problemático, já que métodos precisos para detectar o parasita, que sejam adequados para uso de rotina, não estão disponíveis. Durante a fase aguda da infecção, que pode durar décadas, a infecção pode permanecer quiescente e o hospedeiro pode ser assintomático. Como um resultado, testes soroiógicos para infecção por Γ. cruzi são os mais confiáveis e a forma mais comumente usada de diagnóstico. Tais diagnósticos são complicados, entretanto, pelo ciclo de vida complexo do parasita e as diversas respostas imunes do hospedeiro. O parasita passa através de um estágio de epimastigoto no inseto vetor e dois estágios principais no hospedeiro mamífero. Um estágio do hospedeiro está presente no sangue (o estágio tripomastigoto), enquanto que um segundo estágio é intracelular (o estágio amastigoto). Os múltiplos estágios resultam em uma diversidade de antígenos sendo apresentados pelo parasita durante a infecção. Além disso, respostas imunes à infecção por protozoário são complexas, envolvendo tanto a resposta humoral como mediada por células ao grupo de antígenos do parasita.
Embora a detecção de anticorpos contra os antígenos do parasita seja o método mais comum e confiável de diagnosticar infecções clínicas e subclínicas, testes atuais para infecção por T. cruzi são geralmente insensíveis, inespeeíficos, e não- são adequados para rastreamento de suprimentos de sangue. A maioria dos testes -soroiógicos usa T. cruzi inteiro ou lisado $
e requer resultados positivos em dois de três testes, incluindo fixação de complemento, imunofluorescência indireta, aglutinação passiva ou ELISA, para detectar de forma precisa a infecção por T. cruzi. O custo e a disponibilidade de tais testes impediram o rastreamento de sangue ou soro em muitas áreas endêmicas.
As Patentes US 5.876.734 e 6.228.601 descrevem composições úteis para diagnosticar doença de Chagas que compreendem uma região não repetitiva da proteína de T. cruzi TCR27, e polipeptídeos de fusão que incluem tais regiões. A Patente US 6.419.933 descreve um polipeptídeo de fusão referido como TcF que contém os quatro peptídeos antigênicos de T. cruzi PEP-2, TcD, TcE e TcLo1.2, junto com métodos para uso do polipeptídeo de fusão na detecção de infecção por T. cruzi. Enquanto que TcF é altamente reativo com soros infectados por T. cruzi da América do Sul, ele exibe baixa atividade, e é ocasionalmente negativo com soros da América
Central. A Patente US 6.458.922 descreve um ensaio para infecção por T. cruzi que emprega composições que compreendem pelo menos seis peptídeos antigênicos de T. cruzi selecionados a partir do grupo que consiste em: SAPA, CRA, FRA, TcD, Tc24, Ag39 e MAP. O Pedido de Patente US Publicado N°. US-2004/0132077-A1 descreve polipeptídeos e polipeptídeos de fusão recombinantes (referidos como FP3, FP4, FP5, FP6, FP7, FP8, FP9 e FP10) úteis para diagnosticar infecção por T. cruzi. Os polipeptídeos de fusão descritos compreendem versões modificadas de epítopos de T. cruzi anteriormente identificados, incluindo TCR27, TCR39, SAPA e MAP. SUMÁRIO DA INVENÇÃO
A presente invenção fornece composições e métodos para detectar infecção por T. cruzi em indivíduos e em amostras biológicas, incluindo suprimentos de sangue, as composições da invenção podem ser empregadas para detectar infecção por T. cruzi em todas as áreas geográficas onde a doença de Chagas está presente e com sensibilidade melhorada em comparação a ensaios atualmente em uso.
Em uma modalidade, as composições da invenção compreendem polipeptídeo de fusão de T. cruzi TcT (SEQ ID NO: 1), ou uma variante
desse, e pelo menos um peptídeo selecionado a partir do grupo que consiste em SAPA (SEQ ID NO: 2); Pep30 (SEQ ID NO: 3); Pep36 (SEQ ID NO: 4); KMP-11 (SEQ ID NO: 5); Peptídeo 1 (SEQ ID NQ: 6; também referido como FRA; Lafaille etal., Mol. Biochem. Parasitol. 35:127-136, 1989); uma versão modificada do Peptídeo 1 (SEQ ID NO: 7); e variantes desses. O polipeptídeo de fusão TcF e o pelo menos um peptídeo podem estar presentes como componentes individuais dentro da composição ou podem estar ligados para formar um polipeptídeo de fusão. Em certas modalidades, as composições da invenção compreendem o polipeptídeo de fusão TcF em combinação com os peptídeos Pep30, Pep36 e SAPA. Tais composições podem, por exemplo, incluir o polipeptídeo de fusão de SEQ ID NO: 8 (referido aqui como ITG1,1 6). Em modalidades alternativas, as composições da invenção incluem um polipeptídeo de fusão que compreende ITC-6 em combinação com pelo menos uma repetição do peptídeo KMP-11, e/ou as seqüências de peptídeo 1 de SEQ ID NO: 6 ou 7. A seqüência de aminoácido de um polipeptídeo de fusão representativo que compreende ITC-6 mais uma repetição de KMP-11 (referido como ITG7.1) é fornecida em SEQ ID NO: 15, com a seqüência de aminoácido de um polipeptídeo de fusão representativo que compreende ITC-6 mais duas repetições de KMP-11 (referido como ITG7.2) sendo forne20 cida em SEQ ID NO: 17. SEQ ID NQ: 19 é a seqüência de aminoácido de um polipeptídeo de fusão representativo que compreende ITC7.2 mais peptídeo 1 (referido como ITC8.2), com a seqüência de DNA correspondente sendo fornecida em SEQ ID NO: 18. A seqüência de aminoácido de uma versão encurtada de ITC8.2, referida como ITG8.1, é fornecida em SEQ ID
NO: 20. SEQ ID NQ: 21 e 22 são as seqüências de DNA e aminoácido, respectivamente, para uma versão encurtada de ITC8.1.
Polinucleotideos que codificam os polipeptideos- de fusão da invenção, vetores de expressão que compreendem tais polinucleotideos, e células hospedeiras transformadas ou transfectadas com tais vetores de ex30 pressão também são fornecidos pela presente invenção.
Gomo descrito em detalhe abaixo, os inventores determinaram que as composições da invenção podem ser empregadas para detectar efi-
cazmente infecção por T. cruzi em uma amostra biológica. Conseqüentemente, em um aspecto, a presente invenção fornece métodos para detectar infecção por T. cruzi em uma amostra biológica, que compreende: (a) colocar a amostra biológica em contato com uma composição da presente invenção; e (b) detectar na amostra biológica a presença de anticorpos que se ligam a um epítopo presente dentro da composição da invenção, detectando dessa maneira a infecção por T. cruzi na amostra biológica.
Em um aspecto adicional, são fornecidos kits de diagnóstico para detectar infecção por T. cruzi em uma amostra biológica, tais kits compreendendo: (a) uma composição da presente invenção; e (b) um reagente de detecção.
As composições da invenção também podem compreender pelo menos um componente selecionado a partir do grupo que consiste em: veículos e imunoestimulantes fisiologicamente aceitáveis. Métodos para induzir imunidade protetora contra doença de Chagas em um paciente por administrar tais composições também são abrangidos pela presente invenção.
As características mencionadas acima e adicionais da presente invenção e a maneira de obtê-las se tornarão claras, e a invenção será mais bem compreendida por referência a seguinte descrição detalhada. Todas as referências descritas aqui estão por meio desse incorporadas na sua totalidade como se cada estivesse incorporada individualmente.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
Figura 1 mostra a reatividade dos polipeptídeos de fusão TcF e ITC-6 com soros infectados por T. cruzi e soros de controle de indivíduos não infectados, conforme determinado por ELISA.
Figuras 2A-C mostram a reatividade de TcF e ITC-6 com vários soros conforme determinado por ELISA. Os estados de RIPA dos soros individuais são mostrados na Tabela 1.
Figura 3 mostra a reatividade dos polipeptídeo de fusão TcF, ITC6, ITC7.1 e ITC7.2 em um painel de soros conforme determinado por ELISA.
Figura 4 mostra a reatividade dos polipeptídeos de fusão ITC7.2 e da versão encurtada de ITC8.2 fornecidos em SEQ ID NO: 22 em um painel de soros conforme determinado por ELISA.
Figura 5 mostra a atividade de soros positivos para peptídeo 1 não-absorvido e absorvido com ITC7.2, ITC8.1 e ITC8.2 encurtado (SEQ ID NO: 22).
Figuras 6A e 6B mostram a seqüência de DNA isolada e seqüência de aminoácido correspondente, respectivamente, para TC5. O inserto é mostrado em fonte em negrito, e a seqüência flanqueadora em fonte regular (não negrito).
Figuras 7A e 7B mostram a seqüência de DNA isolada e se10 qüência de aminoácido correspondente, respectivamente, para TC48. O inserto é mostrado em fonte em negrito, e a seqüência flanqueadora em fonte '·' regular (não negrito).
Figuras 8A e 8B mostram a seqüência de DNA isolada e a seqüência de aminoácido correspondente, respectivamente, para TC60. O in15 serto é mostrado em fonte em negrito, e a seqüência flanqueadora em fonte regular (não negrito).
Figuras 9A e 9B mostram a seqüência de DNA isolada e a seqüência de aminoácido correspondente, respectivamente, para TC70. O inserto é mostrado em fonte em negrito, e a seqüência flanqueadora em fonte regular (não negrito).
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
Como observado acima, a presente invenção é geralmente direcionada a composições e métodos para detectar infecção por T. cruzi em indivíduos e para rastrear suprimentos de sangue por infecção por T. cruzi. As composições dessa invenção compreendem geralmente o polipeptídeo de fusão de T. cruzi conhecido TcF (Patente US N°. 6.419.933; SEQ ID NO: 1), ou uma variante desse, e pelo menos um epítopo ou polipeptídeo antigênico de T. cruz/selecionado a partir do grupo que consiste em: SAPA (SEQ ID NO: 2); Pep30 (SEQ ID NO: 3); Pep36 (SEQ ID NO: 4); KMP-11 (SEQ ID NO: 5);
peptídeo 1 (SEQ ID NO: 6); peptídeo 1 modificado (SEQ ID NO: 7); e variantes desses. O uso de um ou mais epítopos adicionais de polipeptídeos de
T. cruzi, antes de ou em combinação com um ou mais dos polipeptídeos de
Τ. cruzi específicos descritos aqui, a fim de aumentar a sensibilidade e especificidade de detecção também é contemplado dentro da presente invenção. O polipeptídeo de fusão TcF e o pelo menos um peptídeo podem estar presentes como componentes individuais dentro da composição da invenção e/ou podem estar ligados para formar um polipeptídeo de fusão. Polipeptídeos de fusão que compreendem mais de uma repetição dos epítopos ou polipeptídeos antigênicos de T. cruzi também são contemplados e abrangidos pela presente invenção, da mesma forma que polipeptídeos de fusão nos quais os peptídeos estão ligados em uma ordem que difere daquela mostrada nas seqüências de polipeptídeo de fusão específicas fornecidas aqui.
Em uma modalidade, as composições da invenção incluem um polipeptídeo de fusão que compreende TcF, Pep30, Pep36 e SAPA, aqui referido como ITC-6 (SEQ ID NO: 8). Em modalidades alternativas, as composições da invenção incluem uma proteína de fusão selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 15 (referida como ITC7.1), SEQ ID NO: 17 (referida como ITC7.2), SEQ ID NO: 19 (referida como ITC8.2), e SEQ ID NO: 20 (referida como ITC8.1). As seqüências de DNA para ITC-6, ITC7.1, ITC7.2 e ITC8.2 são fornecidas em SEQ ID NO: 11, 14, 16 e 18, respectivamente.
Como descrito na Patente US 6.419.933, a descrição da qual está por meio desse incorporada por referência, o polipeptídeo de fusão TcF inclui quatro epítopos ou peptídeos antigênicos, referidos como PEP2, TcD, TcE e TcLo1.2. Em uma modalidade alternativa, as composições da invenção podem incluir esses quatro peptídeos individuais no lugar da proteína de fusão TcF.
Como usado aqui, o termo polipeptídeo abrange cadeias de aminoácido de qualquer extensão, incluindo proteínas de extensão completa, em que resíduos de aminoácido são ligados por ligações peptídicas covalentes. Polipeptídeos descritos aqui podem ser produtos purificados naturalmente, ou podem ser produzidos parciaimente ou integralmente usando técnicas recombinantes. Tais polipeptídeos podem ser glicosilados com carboidratos de mamífero ou outros carboidratos eucarióticos ou podem ser não glicosilados. Um polipeptídeo que compreende um epítopo pode consistir inteiramente no epítopo ou pode conter seqüências adicionais. As seqüên-
cias adicionais podem ser derivadas do antígeno nativo ou podem ser heterólogas e tais seqüências podem (mas não precisam) ser antigênicas.
Como usado aqui, um polipeptídeo de fusão é um polipeptídeo no qual epítopos de antígenos diferentes, ou variantes desses, estão unidos, por exemplo, através de uma ligação de peptídeo, em uma única cadeia de aminoácido. A cadeia de aminoácido assim formada pode ser linear, ou ramificada. Os epítopos podem ser unidos diretamente (isto é, sem aminoácidos interferentes) ou podem ser unidos por meio de uma seqüência ligante que não altera significativamente as propriedades antigênicas dos epítopos. Os . 10 epítopos de peptídeo também podem ser ligados através de ligações não peptídicas, tais como agentes hetero- ou homo-bifuncionais que se acoplam qui1,1 micamente ou fotoquimicamente entre grupos funcionais específicos em epítopos de peptídeos tais como através de grupos amino, carboxila, ou sulfidrila. Agentes bifuncionais que podem ser empregados de forma útil nos polipeptí15 deos de combinação da presente invenção são bem conhecidos dos versados na técnica. Epítopos também podem ser ligados por meio de um par ligante/antiligante complementar, tal como avidina/biotina, com um ou mais epítopos estando ligados a um primeiro membro do par ligante/antiligante e sendo ligados ao membro complementar do par de ligante/antiligante em solução ou em fase sólida. Um polipeptídeo de fusão pode conter epítopos de um ou mais antígenos de T. cruzi, ligados a um epítopo descrito aqui.
Um polinucleotídeo que codifica uma proteína de fusão da presente invenção é construído usando técnicas de DNA recombinantes conhecidas para unir polinucleotídeos separados que codificam os primeiro e se25 gundo polipeptídeos em um vetor de expressão apropriado. A extremidade 3’ de um polinucleotídeo que codifica um primeiro polipeptídeo é ligada, com ou sem um ligante de peptídeo, à extremidade 5’ de um polinucleotídeo que codifica um segundo polipeptídeo para que as fases abertas de leitura das seqüências estejam in phase para permitir a tradução do RNAm dos dois polinucleotídeos em uma única proteína de fusão que retém a atividade biológica tanto do primeiro como do segundo polipeptídeo.
Como observado acima, uma seqüência ligante de peptídeo po9 de ser empregada para separar os primeiro e segundo polipeptídeos por uma distância suficiente para garantir que cada polipeptídeo se dobre em suas estruturas secundárias e terciárias. Tal ligante de peptídeo é incorporada na proteína de fusão usando procedimentos padrão bem conhecidos na técnica. Seqüências ligantes de peptídeo adequadas podem ser escolhidas com base nos seguintes fatores: (1) sua habilidade para adotar uma conformação estendida flexível; (2) sua inabilidade para adotar uma estrutura secundária que possa interagir com epítopos funcionais nos primeiro e segundo polipeptídeos; e (3) a falta de resíduos hidrofóbicos ou carregados que possam reagir com os epítopos do polipeptídeo funcional. Seqüências ligantes de peptídeo preferidas contêm resíduos Gly, Asn e Ser. Outros aminoácidos quase neutros, tais como Thr e Ala também podem ser usados na seqüência iigante. Seqüências de aminoácido que podem ser empregadas de forma útil como ligantes incluem aquelas descritas em Maratea et al., Gene 43:39-46, 1985; Murphy etal., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 33:8258-8262, 1986; Patente U.S. N°. 4.935.233 e Patente U.S. N°. 4.751.180. A seqüência ligante pode ter de 1 a cerca de 50 aminoácidos de extensão. Seqüências ligantes de peptídeo não são necessárias quando os primeiro e segundo polipeptídeos têm regiões de aminoácido N-terminais não essenciais que podem ser usadas para separar os domínios funcionais e impedir interferência estérica. Os polinucleotídeos ligados que codificam as proteínas de fusão são clonados em sistemas de expressão adequados usando procedimentos conhecidos daqueles versados na técnica.
A presente invenção ainda fornece polinucleotídeos que codificam um polipeptídeo ou polipeptídeo de fusão da presente invenção. Polinucleotídeos que compreendem complementos de tais seqüências de polinucleotídeos, complementos reversos de tais seqüências de polinucleotídeo, ou seqüências reversas de tais seqüências de polinucleotídeo, junto com variantes de tais seqüências, também são fornecidas.
A definição dos termos complemento(s), complemento(s) reverso(s) e seqüência(s) reversa(s), como usados aqui, é mais bem ilustrada pelo seguinte exemplo. Para a seqüência 5’ AGGACC 3’, o complemento,
complemento reverso e seqüência reversa as como segue: complemento 3’ TCCTGG 5’ complemento reverso 3’ GGTCCT 5’ seqüência reversa 5’ CCAGGA 3’.
Preferivelmente, seqüências que são complementos de uma seqüência de polinucleotídeo especificamente citada são complementares por toda a extensão da seqüência de polinucleotídeo específica.
O termo polinucleotídeo(s) como usado aqui, significa um polímero de fita simples ou dupla de bases de desoxirribonucleotídeo ou ribo10 nucleotídeo e inclui moléculas de DNA e RNA correspondentes, incluindo moléculas de HnRNA e RNAm, ambas as fitas sentido e anti-sentido, e a'·' brange cDNA, DNA genômico e DNA recombinante, assim como polinucleotídeos integralmente ou parcialmente sintetizados. Uma molécula de HnRNA contém íntrons e corresponde a uma molécula de DNA geralmente de uma forma de um para um. Uma molécula de RNAm corresponde a uma molécula de HnRNA e DNA das quais os íntrons foram retirados. Um polinucleotídeo pode consistir em um gene inteiro, ou qualquer porção desse. Polinucleotídeos antisenso operáveis podem compreender um fragmento do polinucleotídeo correspondente, e a definição de polinucleotídeo, portanto inclui todos os tais fragmentos antisenso operáveis.
Todos os polipeptídeos, polipeptídeos de fusão e polinucleotídeos descritos aqui são isolados e purificados, conforme esses termos são comumente usados na técnica. Preferivelmente, os polipeptídeos, polipeptídeos de fusão e polinucleotídeos são pelo menos 80% puros, mais preferivelmente pelo menos 90% puros, e o mais preferivelmente pelo menos 99% puros.
As composições e métodos da presente invenção também abrangem variantes dos polipeptídeos, polipeptídeos de fusão e polinucleotídeos acima.
Como usado aqui, o termo variante abrange seqüências de nu30 cleotídeo ou aminoácido diferentes das seqüências especificamente identificadas, em que um ou mais nucleotídeos ou resíduos de aminoácido é(são) deletado(s), substituído(s) ou adicionado(s). Variantes podem ser variantes
alélicas de ocorrência natural ou variantes de ocorrência não natural. Seqüências variantes (polinucleotídeo ou polipeptídeo) exibem preferivelmente pelo menos 75%, mais preferivelmente pelo menos 80%, mais preferivelmente pelo menos 85%, mais preferivelmente pelo menos 90%, mais preferivelmente ain5 da pelo menos 95%, e o mais preferivelmente pelo menos 98% de identidade a uma seqüência da presente invenção. O percentual de identidade é determinado por alinhar as duas seqüências a ser comparadas como descrito abaixo, determinar o número de resíduos idênticos na porção alinhada, dividir este número pelo número total de resíduos da seqüência da invenção (pesquisa10 da), e multiplicar o resultado por 100. Além de exibir o nível citado de identidade de seqüência, seqüências variantes da presente invenção exibem preferivelmente uma funcionalidade que é substancialmente similar a funcionalidade das seqüências específicas descritas aqui. Seqüências de polipeptídeo de fusão variantes assim retêm preferivelmente as propriedades antigênicas e de diagnóstico dos polipeptídeos de fusão descritos aqui. Preferivelmente uma seqüência de peptídeo ou de polipeptídeo de fusão variante irá gerar pelo menos 80%, mais preferivelmente pelo menos 85%, mais preferivelmente pelo menos 90%, mais preferivelmente ainda pelo menos 95% e o mais preferivelmente 100% da resposta gerada pela seqüência do polipeptídeo ou polipeptí20 deo de fusão especificamente identificado em um ensaio de ligação de anticorpo, tal como um ensaio ELISA. Tais variantes podem ser geralmente identificadas por modificar uma das seqüências de polipeptídeo ou polipeptídeo de fusão descritas aqui, e avaliar as propriedades antigênicas e/ou de diagnóstico do polipeptídeo ou polipeptídeo de fusão modificado usando, por exemplo, os procedimentos representativos descritos aqui. Ensaios adequados para avaliar a reatividade com soros infectados por T. cruzi, tal como um ensaio imunoabsorvente ligado a enzima (ELISA), são descritos em mais detalhes abaixo, e em Harlow & Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988.
Seqüências variantes geralmente diferem da seqüência especificamente identificada apenas por substituições, deleções ou modificações conservativas. Como usado aqui, uma substituição conservativa é uma na qual um aminoácido é substituído por outro aminoácido que tem propriedades similares, tal que um versado na técnica de química de peptídeo possa esperar que a estrutura secundária e a natureza hidropática do polipeptídeo estejam substancialmente inalteradas. Em geral, os seguintes grupos de a5 minoácidos representam alterações conservativas: (1) ala, pro, gly, glu, asp, gin, asn, ser, thr; (2) cys, ser, tyr, thr; (3) vai, ile, leu, met, ala, phe; (4) lys, arg, his; and (5) phe, tyr, trp, his. Variantes podem também, ou alternativamente, conter outras modificações, incluindo a deleção ou adição de aminoácidos que têm influência mínima nas propriedades antigênicas, estrutura secundária e natureza hidropática do polipeptídeo. Por exemplo, um polipeptídeo pode ser conjugado a uma seqüência de sinal (ou líder) na extremida1,1 de N-terminal da proteína que direciona co-traducionalmente ou póstraducionalmente a transferência da proteína. O polipeptídeo também pode ser conjugado a um ligante ou outra seqüência para facilidade de síntese, purificação ou identificação do polipeptídeo (por exemplo, poli-His), ou para aumentar a ligação do polipeptídeo a um suporte sólido. Por exemplo, um polipeptídeo pode ser conjugado a uma região Fc de imunoglobulina.
Seqüências de polipeptídeo ou polinucleotídeo podem ser alinhadas e porcentagens de nucleotídeos idênticos em uma região especificada podem ser determinadas contra outro polinucleotídeo, usando algoritmos de computador que estão disponíveis para o público. Dois algoritmos exemplares para alinhar e identificar a identidade de seqüências de polinucleotídeo são os algoritmos BLASTN e FASTA. O alinhamento e identidade de seqüências de polipeptídeo podem ser examinados usando o algoritmo BLASTP. Os algorit25 mos BLASTX e FASTX comparam seqüências de nucleotídeo pesquisadas traduzidas em todas as fases de leitura contra seqüências de polipeptídeo. Os algoritmos FASTA e FASTX são descritos em Pearson & Lipman, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85:2444-2448, 1988; e em Pearson, Methods in Enzymol. 183:63-98, 1990. O pacote de programas FASTA está disponível pela Univer30 sity of Virgínia, Charlottesville, VA 22906-9025. O algoritmo FASTA, ajustado para os parâmetros predeterminados descritos na documentação e distribuídos com o algoritmo, podem ser usados na determinação de variantes de po13 linucleotídeos. Os arquivos leia-me para FASTA e FASTX Versão 2.0x que são distribuídos com os algoritmos descrevem o uso dos algoritmos e descrevem os parâmetros predeterminados.
O programa BLASTN está disponível no servidor FTP anônimo do NCBI e está disponível pelo National Center for Biotechnology Information (NCBI), National Library of Medicine, Edifício 38A, Sala 8N805, Bethesda, MD 20894. O algoritmo BLASTN Versão 2.0.6 [10-Set-1998] e Versão 2.0.11 [20-Jan-2000] ajustado para os parâmetros predeterminados descritos na documentação e distribuídos com o algoritmo, é preferido para uso na determinação de variantes de acordo com a presente invenção. O uso da família de algoritmos BLAST, incluindo BLASTN, é descrito no página da internet do NCBI e na publicação de Altschul, et al., Gapped BLAST and PSIBLAST: a new generation of protein database search programs, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402, 1997.
Os acertos (hits) a uma ou mais seqüências de base de dados por uma seqüência pesquisada produzidos pelos algoritmos BLASTN, BLASTP, FASTA, ou similar, alinham e identificam porções similares de seqüências. Os acertos são arrumados em ordem do grau de similaridade e da extensão de sobreposição de seqüência. Acertos a uma seqüência de base de dados representam geralmente uma sobreposição sobre apenas uma fração da extensão da seqüência ou da seqüência pesquisada. O percentual de identidade de uma seqüência de polinucleotídeo ou polipeptídeo é determinado por alinhar as seqüências de polinucleotídeo ou polipeptídeo usando algoritmos apropriados, tais como BLASTN ou BLASTP, respectivamente, ajustados para parâmetros predeterminados; identificar o número de ácidos nucléicos ou aminoácidos idênticos pelas porções alinhadas; dividir o número de ácidos nucléicos ou aminoácidos idênticos pelo número total de ácidos nucléicos ou aminoácidos do polinucleotídeo ou polipeptídeo da presente invenção; e então multiplicar por 100 para determinar a porcentagem de identidade.
Em geral, polipeptídeos e polipeptídeos de fusão de T. cruzi, e seqüências e polinucleotídeos que codificam tais polipeptídeos e polipeptídeos de fusão, podem ser preparados usando qualquer um de uma varieda&
% de de procedimentos. Por exemplo, biblioteca de cDNA ou DNA genômico de T. cruzi pode ser rastreada com grupos de soros de indivíduos infectados por T. cruzi. Tais rastreamentos podem ser geralmente realizados usando técnicas bem conhecidas dos versados na técnica, tal como aquelas descri5 tas em Sambrook etal., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989. Resumidamente, a biblioteca de bacteriófagos pode ser plaqueada e transferida para filtros. Os filtros podem então ser incubados com soro e uma reagente de detecção. No contexto dessa invenção, um reagente de detecção é qualquer com10 posto capaz de se ligar ao complexo anticorpo- antígeno que pode então ser detectado por qualquer um de uma variedade de meios conhecidos daqueles versados na técnica. Reagentes de detecção típicos para finalidades de rastreamento contêm um agente de ligação tal como Proteína A, Proteína G, IgG ou lectina, acoplado a um grupo repórter. Grupos repórter preferidos incluem, mas não são limitados a, enzimas, substratos, cofatores, inibidores, corantes, radionuclídeos, grupos luminescentes, grupos fluorescentes e biotina. Mais preferivelmente, o grupo repórter é peroxidase de rábano silvestre (HRP), que pode ser detectada por incubação com um substrato tal como tetrametilbenzidina (TMB) ou ácido 2,2’-azino-di-3-etilbenztiazolina sulfônico.
Placas contendo cDNAs que expressam uma proteína que se liga a um anticorpo no soro podem ser isoladas e purificadas por técnicas conhecidas dos versados na técnica. Métodos apropriados podem ser encontrados, por exemplo, em Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989.
Altemativamente, polinucleotídeos que codificam polipeptídeos de fusão descritos aqui podem ser amplificados a partir de DNA genômico ou cDNA de T. cruzi através de reação em cadeia da polimerase (PCR). Para essa abordagem, iniciadores seqüência-específicos podem ser desenhados com base na seqüência de nucleotídeo, e podem ser comprados ou sin30 tetizados. Uma porção amplificada das seqüências de DNA pode então ser usada para isolar os clones de cDNA ou genômicos completos usando técnicas bem conhecidas, tal como aquelas descritas em Sambrook et al., Mole15 cular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, NY (1989).
Polipeptídeos que tem menos que cerca de 100 aminoácidos, e geralmente menos do que cerca de 50 aminoácidos, podem ser sintetizados usando, por exemplo, o método de síntese em fase sólida de Merrifeld, onde aminoácidos são adicionados seqüencialmente a uma cadeia de aminoácido em crescimento. Veja, Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85:2149-2146, 1963. Equipamento para síntese automática de polipeptídeos é disponível comercialmente por fabricantes tal como Perkin Elmer/Applied Biosystems Division, Foster City, CA.
Polipeptídeos e polipeptídeos de fusão também podem ser produzidos recombinantemente por inserir um polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo de fusão em um vetor de expressão e expressar o antígeno em um hospedeiro apropriado. Qualquer um de uma variedade de vetores de expressão conhecidos daqueles versados na técnica pode ser empregado. A expressão pode ser obtida em qualquer célula hospedeira apropriada que tenha sido transformada ou transfectada com um vetor de expressão que contém uma molécula de DNA que codifica um polipeptídeo recombinante. Células hospedeiras adequadas incluem células procarióticas, de levedura e eucarióticas superiores. Preferivelmente, as células hospedeiras empregadas são E. coli, micobactéria, inseto, levedura ou uma linhagem celular de mamífero tal como COS ou CHO. Os polinucleotídeos expressos dessa maneira podem codificar antígenos de ocorrência natural, porções de antígenos de ocorrência natural, ou outras variantes desses.
Polipeptídeos e polipeptídeos de fusão expressos são geralmente isolados na forma substancialmente pura. Preferivelmente, os polipeptídeos e polipeptídeos de fusão são isolados para uma pureza de pelo menos 80% em peso, mais preferivelmente, para uma pureza de pelo menos 95% em peso, e o mais preferivelmente para uma pureza de pelo menos 99% em peso. Em geral, tal purificação pode ser obtida usando, por exemplo, as técnicas padrão de fracionamento por sulfato de amônio, eletroforese em SDSPAGE, e cromatografia de afinidade.
A presente invenção ainda fornece métodos para detectar infecção por T. cruzi em indivíduos e suprimentos de sangue. Preferivelmente, a infecção pode ser detectada em qualquer amostra biológica que contenha anticorpos. Preferivelmente, a amostra é sangue, soro, plasma, saliva, fluido cerebroespinhal ou urina. Mais preferivelmente, a amostra é uma amostra de sangue ou soro obtida de um paciente ou de um suprimento de sangue. Resumidamente, infecção por T. cruzi pode ser detectada usando qualquer um ou mais dos polipeptídeos ou polipeptídeos de fusão descritos acima, ou variantes desses, para determinar a presença ou ausência de anticorpos para o polipeptídeo ou polipeptídeo de fusão na amostra, em relação a um valor de ponto de corte predeterminado.
'·’ Há uma variedade de formatos de ensaio conhecidos dos versados na técnica para usar antígeno purificado para detectar anticorpos em uma amostra. Veja, por exemplo, Harlow & Lane, Antibodies: A Laboratory Manual,
Cold Spring Harbor Laboratory, 1988. Em uma modalidade preferida, o ensaio envolve o uso de polipeptídeo ou polipeptídeo de fusão imobilizado sobre um suporte sólido para se ligar e remover o anticorpo da amostra. O anticorpo ligado pode então ser detectado usando um reagente de detecção que se liga ao complexo anticorpo/polipeptídeo de fusão e contém um grupo repórter detectá20 vel. Reagentes de detecção adequados incluem anticorpos que se ligam ao complexo de anticorpo/polipeptídeo de fusão e liberam o polipeptídeo marcado com um grupo repórter (por exemplo, em um ensaio semicompetitivo). Alternativamente, um ensaio competitivo pode ser utilizado, no qual um anticorpo que se liga ao polipeptídeo de fusão é marcado com um grupo repórter e deixado se ligar ao antígeno imobilizado após incubação do antígeno com a amostra. A extensão à qual os componentes da amostra inibem a ligação do anticorpo marcado ao polipeptídeo de fusão é indicativa da reatividade da amostra com o polipeptídeo de fusão imobilizado.
O suporte sólido pode ser qualquer material sólido conhecido daqueles versados na técnica ao qual o polipeptídeo de fusão pode ser ligado. Por exemplo, o suporte sólido pode ser um cavidade de teste em uma placa de microtitulação, ou uma membrana de nitrocelulose ou outra memη brana adequada. Alternativamente, o suporte pode ser uma esfera ou disco, formado de vidro, fibra de vidro, látex ou um material plástico tal como poliestireno ou polivinilcloreto. O suporte também pode ser uma partícula magnética ou um sensor de fibra óptica, tais como aqueles descritos, por exem5 pio, na Patente US. N°. 5.359.681.
O polipeptídeo de fusão pode ser ligado ao suporte sólido usando uma variedade de técnicas conhecidas daqueles versados na técnica, que são amplamente descritas na literatura de patente ou científica. No contexto da presente invenção, o termo ligado refere-se tanto a associação não covalente, tal como adsorção, como a ligação covalente (que pode ser uma ligação direta entre o antígeno e grupos funcionais sobre o suporte ou pode ser uma ligação por meio de um agente reticulador). Ligação por adsorção a um cavidade em uma placa de microtitulação ou a uma membrana é preferida. Em tais casos, a adsorção pode ser obtida por colocar o polipep15 tídeo em contato, em um tampão adequado, com o suporte sólido por uma quantidade suficiente de tempo. O tempo de contato varia com a temperatura, mas está tipicamente entre cerca de 1 hora e 1 dia. Em geral, colocar um cavidade de uma placa de microtitulação (tal como poliestireno ou polivinilcloreto) em contato com uma quantidade de polipeptídeo de fusão que varia de cerca de 10 ng a cerca de 1 pg, e preferivelmente cerca de 100 ng, é suficiente para ligar uma quantidade suficiente de antígeno. A nitrocelulose ligará aproximadamente 100 pg de proteína por cm3.
Ligação covalente do polipeptídeo ou polipeptídeo de fusão a um suporte sólido pode geralmente ser obtida por reagir primeiro o suporte com um reagente bifuncional que reagirá tanto com o suporte como com um grupo funcional, tal como grupo hidroxila ou amino, sobre o polipeptídeo de fusão. Por exemplo, o polipeptídeo de fusão pode ser ligado a suportes que têm um revestimento de polímero apropriado usando benzoquinona ou por condensação de um grupo de aldeído sobre o suporte com uma amina e um hidrogênio ativo no polipeptídeo de fusão (veja, por exemplo, Pierce Immunotechnology Catalog and Handbook (1991) em A12-A13).
Em certas modalidades, o ensaio é um ensaio imunoabsorvente <Xj ligado à enzima (ELISA). Esse ensaio pode ser realizado por colocar em contato primeiro um polipeptídeo ou polipeptídeo de fusão que foi imobilizado em um suporte sólido, comumente o cavidade de uma placa de microtitulação, com a amostra, tal que anticorpos para o polipeptídeo ou polipeptídeo de fusão dentro da amostra sejam deixados ligar ao polipeptídeo ou polipeptídeo de fusão imobilizado. Amostra não ligada é então removida do polipeptídeo ou polipeptídeo de fusão imobilizado e um reagente de detecção capaz de se ligar ao complexo anticorpo-polipeptídeo imobilizado é adicionado. A quantidade de reagente de detecção que permanece ligada ao suporte sóli10 do é então determinada usando um método apropriado para o reagente de detecção específico.
'·' Uma vez que o polipeptídeo ou polipeptídeo de fusão é imobilizado sobre o suporte, os sítios de ligação de proteína remanescentes sobre o suporte são tipicamente bloqueados usando qualquer agente de bloqueio adequado conhecidos nos versados na técnica, tal como albumina sérica bovina ou Tween 20® (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO). O polipeptídeo ou polipeptídeo de fusão imobilizado é então incubado com a amostra, e o anticorpo (se presente na amostra) é deixado se ligar ao antígeno. A amostra pode ser diluída com um diluente adequado, tal como salina tamponada com fosfato (PBS) antes da incubação. Em geral, um tempo de contato apropriado (isto é, tempo de incubação) é aquele período de tempo que é suficiente para detectar a presença de anticorpo para T. cruzi dentro de uma amostra infectada por T. cruzi. Preferivelmente, o tempo de contato é suficiente para obter um nível de ligação que é de pelo menos 95% daquele obti25 do no equilíbrio entre anticorpo ligado e não ligado. Aqueles versados na técnica reconhecerão que o tempo necessário para atingir o equilíbrio pode ser facilmente determinado por testar o nível de ligação que ocorre em um período de tempo. Em temperatura ambiente, um tempo de incubação de cerca de 30 minutos é geralmente suficiente.
Amostra não ligada pode então ser removida por lavar o suporte sólido com um tampão apropriado, tal como PBS contando 0,1% de Tween 20®. Reagente de detecção pode então ser adicionado ao suporte sólido.
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Um reagente de detecção apropriado é qualquer composto que se liga ao complexo de anticorpo-polipeptídeo imobilizado e que pode ser detectado por qualquer um de uma variedade de meios conhecidos daqueles versados na técnica. Preferivelmente, o reagente de detecção contém um agente de ligação (tal como, por exemplo, Proteína A, Proteína G, imunoglobulina, lectina ou antígeno livre) conjugado a um grupo repórter. Grupos repórter preferidos incluem enzimas (tal como peroxidase de rábano silvestre), substratos, cofatores, inibidores, corantes, radionuclídeos, grupos luminescentes, grupos fluorescentes e biotina. A conjugação de agente de ligação a um grupo repórter pode ser obtida usando métodos padrão conhecidos daqueles versados na técnica. Agentes de ligação comuns conjugados a uma variedade de grupos repórter também podem ser comprados de diversas fontes (por exemplo, Zymed Laboratories, São Francisco CA e Pierce, Rockford, IL).
O reagente de detecção é então incubado com o complexo anti15 corpo-polipeptídeo imobilizado por uma quantidade de tempo suficiente para detectar o anticorpo ligado. Uma quantidade apropriada de tempo pode geralmente ser determinada a partir das instruções do fabricante ou por testar o nível de ligação que ocorre em um período de tempo. Reagente de detecção não ligado é então removido e o reagente de detecção ligado é detecta20 do usando o grupo repórter. O método empregado para detectar o grupo repórter depende da natureza do grupo repórter. Para grupos radioativos, contagem de cintilação ou métodos auto-radiográficos são geralmente apropriados. Métodos espectroscópicos podem ser usados para detectar corantes, grupos luminescentes e grupos fluorescentes. Biotina pode ser detectara usando avidina, acoplada um grupo repórter diferente (comumente um grupo radioativo ou fluorescente ou uma enzima). Grupos repórter enzimáticos podem geralmente ser detectados pela adição de substrato (geralmente por um período de tempo específico), seguido por análise espectroscópica ou outra análise dos produtos de reação.
Para determinar a presença ou ausência de anticorpos para T.
cruzi na amostra, o sinal detectado do grupo repórter que permanece ligado ao suporte sólido é geralmente comparado com um sinal que corresponde a 'Qo
um valor de ponto de corte predeterminado. Esse valor de ponto de corte é preferivelmente a média do sinal médio obtido quando o antígeno imobilizado é incubado com amostras de um paciente não infectado. Em geral, uma amostra que gera um sinal que está três desvios padrão acima da média é considerada positiva para anticorpos de T. cruzi e infecção por T. cruzi. Em uma modalidade alternativa preferida, o valor de ponto de corte é determinado usando um Receiver Operator Curve, de acordo com os métodos de Sackett et al., Clinicai Epidemiology: A Basic Science for Clinicai Medicine, p. 106-7 (Little Brown and Co., 1985). Resumidamente, nessa modalidade, o valor de ponto de corte pode ser determinado a partir de um gráfico de pares de taxas de verdadeiros positivos (isto é, sensibilidade) e taxas de falsos 1,1 positivos (especificidade-100%) que correspondem a cada valor de ponto de corte possível para o resultado do teste diagnóstico. O valor de ponto de corte no gráfico que é o mais próximo ao canto superior esquerdo (isto é, o va15 lor que abrange a maior área) é o valor de ponto de corte mais preciso, e uma amostra que gera um sinal que é maior do que o valor de ponto de corte determinado por esse método pode ser considerada positiva. Alternativamente, o valor de ponto de corte pode ser deslocado para a esquerda do gráfico, para minimizar taxa de falso positivo, ou para a direita, para minimi20 zar a taxa de falso negativo. Em gerai, uma amostra que gera um sinal que maior do que o valor de ponto de corte determinado por esse método é considerada positiva para infecção por T. cruzi.
Em uma modalidade relacionada, o ensaio é realizado em um formato de teste flow-through ou de fita, em que o polipeptideo ou polipep25 tídeo de fusão é imobilizado em uma membrana tal como nitrocelulose. No teste de flow-through anticorpos dentro da amostra se ligam ao polipeptídeo ou polipeptideo de fusão imobilizado conforme a amostra passa através da membrana. Um reagente de detecção (por exemplo, proteína A-ouro coloidal) então se liga ao complexo de anticorpo-polipeptídeo conforme a solu30 ção que contém o reagente de detecção flui através da membrana. A detecção de reagente de detecção ligado pode então ser realizada como descrito acima. No formato de teste em fita, uma extremidade da membrana a qual o
A/
polipeptideo ou polipeptideo de fusão está ligado é imersa em uma solução que contém a amostra. A amostra migra ao longo da membrana através de uma região que contém reagente de detecção e para a área de polipeptideo ou polipeptideo de fusão imobilizado. A concentração do reagente de detec5 ção no polipeptideo ou polipeptideo de fusão indica a presença de anticorpos para T. cruzi na amostra. Tais testes podem ser realizados tipicamente com uma quantidade muito pequena (por exemplo, uma gota) de soro ou sangue do paciente.
Em ainda outro aspecto dessa invenção, são fornecidos méto10 dos para detectar T. cruzi em uma amostra biológica usando anticorpos monoespecíficos (que podem ser policlonais ou monoclonais) para um ou mais polipeptideos ou polipeptideos de fusão de T. cruzi. Anticorpos para polipeptídeos purificados ou sintetizados podem ser preparados por qualquer uma de uma variedade de técnicas conhecidas dos versados na técnica. Veja, por exemplo, Harlow & Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988. Em uma de tal técnica, um imunógeno que compreende o polipeptideo antigênico é inicialmente injetado em qualquer um de uma grande variedade de mamíferos (por exemplo, camundongos, ratos, coelhos, ovelha e cabras). Nessa etapa, os polipeptideos dessa invenção podem servir como o imunógeno sem modificação. Alternativamente, particularmente para polipeptideos relativamente curtos, uma resposta imune superior pode ser criada se o polipeptideo estiver ligado a uma proteína transportadora, tal como albumina sérica bovina ou hemocianina de keyhole limpet. O imunógeno é injetado no animal hospedeiro, preferivelmente de acordo com um esquema predeterminado que incorpora uma ou mais imunizações de reforço, e os animais têm sangue retirado periodicamente. Anticorpos policlonais específicos para o polipeptideo podem ser então purificados a partir de tais antisoros, por exemplo, por cromatografia de afinidade usando o polipeptideo acoplado a um suporte sólido adequado.
Anticorpos monoclonais específicos para o polipeptideo antigênico de interesse podem ser preparados, por exemplo, usando a técnica de Kohler & Milstein, Eur. J. Immunol. 6:511-519, 1976, e melhorias a ela. Re22 sumidamente, esses métodos envolvem a preparação de linhagens celulares imortais capazes de produzir anticorpos que têm a especificidade desejada (isto é, reatividade com o polipeptídeo de interesse). Tais linhagens celulares podem ser produzidas, por exemplo, a partir de células esplênicas obtidas de um animal imunizado como descrito acima. As células esplênicas são então imortalizadas, por exemplo, por fusão com um parceiro de fusão de célula de mieloma, preferivelmente uma que é singeneica ao animal imunizado. Uma variedade de técnicas de fusão pode ser empregada. Por exemplo, as células esplênicas e células de mieloma podem ser combinadas com um detergente não-iônico por alguns minutos e então piaqueadas em uma baixa densidade em um meio seletivo que suporta o crescimento de células '·' híbridas, mas não células de mieloma. Uma técnica de seleção preferida usa seleção por HAT (hipoxantina, aminopterina, timidina). Após tempo suficiente, geralmente cerca de 1 a 2 semanas, colônias de híbridos são observa15 das. Colônias únicas são selecionadas e testadas quanto a atividade de ligação contra o polipeptídeo. Hibridomas que tem alta reatividade e especificidade são preferidos.
Anticorpos monoclonais podem ser isolados dos sobrenadantes das colônias de hibridoma em crescimento. Além disso, várias técnicas po20 dem ser empregadas para aumentar o rendimento, tal como injeção da linhagem celular de hibridoma na cavidade peritoneal de um hospedeiro vertebrado adequado, tal como um camundongo. Anticorpos monoclonais podem então ser coletados do fluido de ascite ou do sangue. Contaminantes podem ser removidos dos anticorpos por técnicas convencionais, tal como cromatografia, filtração em gel, precipitação e extração.
Anticorpos monoespecíficos para epítopos de um ou mais dos polipeptídeos ou polipeptídeos de fusão aqui descritos podem ser usados para detectar infecção por T. cruzi em uma amostra biológica usando qualquer um de uma variedade de imunoensaios, que podem ser diretos ou competitivos. Amostras biológicas adequadas para uso nesse aspecto da presente invenção são como descritas acima. Resumidamente, em um formato de ensaio direto, um anticorpo monoespecífico pode ser imobilizado
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sobre um suporte sólido (como descrito acima) e colocado em contato com a amostra a ser testada. Após remoção da amostra não ligada, um segundo anticorpo monoespecífico, que foi marcado com um grupo repórter, pode ser adicionado e usado para detectar antígeno ligado. Em um ensaio competitivo exemplar, a amostra pode ser combinada com o anticorpo monoclonal ou policlonal, que foi marcado com um grupo repórter adequado. A mistura de amostra e anticorpo pode então ser combinada com um antígeno de polipeptídeo imobilizado em um suporte sólido adequado. Anticorpo que não se ligou a um antígeno na amostra é deixado ligar ao antígeno imobilizado, e o restante da amostra e do anticorpo são removidos. Q nível de anticorpo ligado ao suporte sólido é inversamente relacionado ao nível de antígeno na amostra. Dessa forma, um menor nível de anticorpo ligado ao suporte sólido indica a presença de T. cruzi na amostra. Para determinar a presença ou ausência de infecção por T. cruzi, o sinal detectado do grupo repórter que permanece ligado ao suporte sólido é geralmente comparado a um sinal que corresponde a um valor de ponto de corte predeterminado. Tais valores de ponto de corte podem ser geralmente determinados como descrito acima. Qualquer um dos grupos repórter discutidos acima no contexto de ELISAs podem ser usados para marear os anticorpos monoespecíficos, e a ligação pode ser detectada por qualquer uma de uma variedade de técnicas apropriadas para o grupo repórter empregado. Outros formatos para usar anticorpos monoespecíficos para detectar T. cruzi em uma amostra ficarão claros para aqueles versados na técnica, e os formatos acima são fornecidos apenas para fins exemplares.
Em outro aspecto dessa invenção, são fornecidas composições para a prevenção ou tratamento de infecção por T, cruzi, e complicações dessa, em um mamífero. Tais composições compreendem geralmente um ou mais polipeptídeos de fusão descritos aqui, junto com pelo menos um componente selecionado a partir do grupo que consiste em: veículos e imu30 noestimulantes fisiologicamente aceitáveis.
Vias e freqüência de administração e doses de polipeptídeo de fusão variarão de indivíduo para indivíduo e podem corresponder àquelas
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atualmente sendo usadas em imunização contra outras infecções por protozoários. Em geral, as composições podem ser administradas por injeção (por exemplo, intracutânea, intramuscular, intravenosa ou subcutânea), intranasalmente (por exemplo, por aspiração), transdermicamente, oralmente, ou por emplastro transcutâneo como descrito, por exemplo, nas Patentes US 5.910.306 e 5.980.898, as descrições das quais estão por meios dessa incorporadas por referência. Entre 1 e 4 doses podem ser administradas por um período de 2-6 semanas. Preferivelmente, duas doses são administradas, com a segunda dose 2-4 semanas após a primeira. Uma dose adequa10 da é uma quantidade de polipeptídeo de fusão que é eficaz para criar anticorpos em um animal tratado que são suficientes para proteger o mamífero '·' de infecção por T. cruzi por um período de tempo. Em geral, a quantidade de polipeptídeo de fusão presente em uma dose varia de cerca de 1 pg a cerca de 100 mg por kg de hospedeiro, tipicamente de cerca de 10 pg a cerca de 1 mg, e preferivelmente de cerca de 100 pg a cerca de 1 pg. Medidas de doses adequadas irão variar com o tamanho do animal, mas variarão tipicamente de cerca de 0,01 mL a cerca de 5 mL para animal de 10-60 kg.
Embora qualquer veículo adequado conhecido daqueles versados na técnica possa ser empregado nas composições dessa invenção, o tipo de veículo variará dependendo do modo de administração. Para administração parenteral, tal como injeção subcutânea, o veículo compreende preferivelmente água, salina, álcool, uma gordura, uma cera, ou um tampão. Para administração oral, qualquer um dos veículos acima ou um veículo sólido tal como manitol, lactose, amido, estearato de magnésio, sacarina sódi25 ca, talco, celulose, glicose, sacarose, e carbonato de magnésio pode ser empregado. Microesferas biodegradáveis (por exemplo, galactídeo polilático) também podem ser empregadas como veículos para as composições farmacêuticas dessa invenção. Microesferas biodegradáveis adequadas são descritas, por exemplo, nas Patentes US Nos. 4.897.268 e 5.075.109.
Qualquer um de uma variedade de imunoestimulantes pode ser empregado nas composições dessa invenção para aumentar inespecificamente a resposta imune. A maioria dos adjuvantes contêm uma substância feita para proteger o antígeno de rápido catabolismo, tal como hidróxido de alumínio, ou óleo mineral, e um estimulante inespecífico de respostas imunes, tal como lipídeo A, Bortadella pertussis ou Mycobacterium tuberculosis. Adjuvantes adequados são comumente disponíveis comercialmente, como por exemplo, Adjuvante de Freund Incompleto e Adjuvante de Freund Completo (Difco Laboratories) e Adjuvante Merck 65 (Merck and Company, Inc., Rahway, NJ). Outros adjuvantes adequados incluem alume, microesferas biodegradáveis, monofosforil lipídio A e quil A.
Os seguintes exemplos são oferecidos como forma de ilustração 10 e não como forma de limitação.
Exemplo 1
Desenho e Preparação de um Polipeptídeo de Fusão Multiepítopo
Estudos de expressão sorológica empregando soros infectados por T. cruzi do México e América Central que mostram pouca ou nenhuma 15 reatividade com a proteína de fusão de T. cruzi TcF (SEQ ID NO: 1) foram realizados para identificar antígenos de T. cruzi conhecidos que complementarão TcF com o objetivo de alcançar alta sensibilidade e especificidade. TcF (SEQ ID NO: 1), SAPA (SEQ ID NO: 2), Pep30 (SEQ ID NO: 3) e Pep36 (SEQ ID NO: 4) foram descobertos ter especificidade muito boa e comple20 mentar um ao outro em amostras onde a reatividade de TcF é baixa ou zero.
Seguindo esses estudos, um polipeptídeo de fusão contendo as seqüências de TcF, Pep30, Pep36 e SAPA foi preparada em duas etapas.
Na etapa um, SAPA, Pep30 e Pep36 foram fundidos junto com sítios de restrição de EcoRI e Xhol para fornecer a seqüência de polipeptídeo 25 de SEQ ID NO: 9 (referida como SAPA3036; seqüência de DNA para expressão em E. co//'fornecida em SEQ ID NO: 10) e clonada em um vetor relacionado a pUC usando técnicas padrão. Na etapa dois, SAPA3036 foi digerida com EcoRI e Xho1, e subclonada na extremidade 3’ de TcF (SEQ ID NO: 1).
A seqüência de aminoácido do polipeptídeo de fusão resultante (referido co30 mo ITC-6) é fornecida em SEQ ID NO: 8, com a seqüência de DNA correspondente sendo fornecida em SEQ ID NO: 11. Após verificação da seqüência, a expressão foi realizada na cepa de E. coli Rosetta® pLysS (Novagen, Madi<?6
son, Wisconsin). O polipeptídeo de fusão ITC-6 tem flexibilidade suficiente ao nível de DNA para inserção de outros epítopos antigênicos, tal como a seqüência específica de T. cruzi KMP-11c (SEQ ID NO: 5; Thomas et al., Clin. Exp. Immunol. 123:465-471, 2001), a seqüência de Peptídeo 1 (SEQ ID NO:
6) e a seqüência de Peptídeo 1 modificada (SEQ ID NO: 7).
Oligonucleotídeos (SEQ ID NO: 12 e 13) foram desenhados para
PCR para a proteína de fusão SAPA3036 para clonar diretamente no vetor pET28 a fim de checar a expressão e viabilidade sem o componente de TcF. O produto de PCR resultante foi digerido com Nde1 e Xhol antes de clonar em pET28. Não houve problema com a expressão de SAPA3036 sem TcF.
É previsto que a ordem dos peptídeos no polipeptídeo de fusão '·' recombinante ITC-6 poderia ser alterada sem alterar significativamente a atividade do polipeptídeo. Ainda, a inclusão de uma ligação Gly-Cys-Gly entre os peptídeos pode aumentar a ligação à fase sólida sem afetar significatí15 vamente a atividade do polipeptídeo.
Exemplo 2
Detecção de infecção porT. cruzi em Soros usando ITC7.1 e ITC 7.2
A reatividade de soros de indivíduos infectados por T. cruzi e soros de controle de indivíduos não infectados contra os polipeptídeos de fusão 20 TcF e ITC-6 foi determinada por ELISA usando o procedimento descrito acima. Os resultados desse estudo são mostrados na figura 1. Todos os soros infectados por T. cruzi RR39, 40218, 63221, PMT201-13, RR66, 40219,
74043 e PMT201-9 haviam mostrado ser positivos para T. cruzi por ensaio de imunoradioprecipitação (RIPA). O soro 63225 é consenso positivo, com o es25 tado de RIPA sendo equívoco. NHS86, NHS92 e PMT201-15 são todos soros normais. Os soros 197001, 312001, 38001 e 505001 são todos de indivíduos infectados com leishmaniose visceral (VL). Os soros foram testados em uma diluição final de 1/100. Anti-lgG humana-HRP foi usado para detecção seguido pelo substrato TMB. Como pode ser visto a partir da figura 1, ITC-6 é ca30 paz de reconhecer soros que são negativos ou baixos com TcF.
Em estudos subseqüentes, as reatividades de 56 soros (Cruz
Vermelha Americana, 42; BBI 14) dos EUA, America Central e do Sul previ27 amente determinados positivos por RIPA, e quatro soros endêmicos de controle do México e países da América Central foram testados contra os TcF e ITC-6 recombinantes por ELISA. O estado de RIPA dos soros individuais é mostrado na Tabela 1 abaixo. A concentração de revestimento foi 100 ng por cavidade. Todos os soros foram testados a uma diluição final de 1/100. Após a incubação, os ensaios foram desenvolvidos usando anti-lgG humano-HRP e substrato de TMB.
Os resultados desses estudos são mostrados na figura 2A-C. Conforme previsto, ITC-6 detectou soros infectados por T. cruzi muito melhor do que TcF. Todos os soros endêmicos de controle eram negativos com TcF e ITC-6. Por causa da interferência e reatividade cruzada muito baixas com TcF e ITC-6, esses podem ser usados mesmo a 200 ng por cavidade. Embora houvesse 100% de concordância com RIPA, com alguns soros (mistura de RR e mistura de Teragenix), a OD era baixa. Essas são misturas de soros de título muito baixo e, portanto representam diluições de soros individuais que foram subseqüentemente usadas em rastreamento de expressão sorológica por antígenos adicionais. Nesses casos, é provável que o uso de outros peptídeos, tais como KMP-11 e peptídeo 1, em combinação com ITC6 produza O D mais alta.
Tabela 1: Estado de RIPA de diferentes soros da América do Norte, do Sul e
Central.
| Número de Série | ID do soro | Estado de RIPA |
| RR115 | T. cruzi(ARC) | Pos |
| RR99 | T. cruzi(ARC) | Pos |
| RR148 | T. cruzi(ARC) | Pos |
| RR131 | T. cruzi(ARC) | Pos |
| RR52 | T. cruzi(ARC) | Pos |
| RR167 | T. cruzi(ARC) | Pos |
| RR111 | T. cruzi(ARC) | Pos |
| RR71 | T. cruzi(ARC) | Pos |
| RR161 | T. cruzi(ARC) | Pos |
| RR78 | T. cruzi(ARC) | Pos |
| RR04 | T. cruzi(ARC) | Pos |
| RR38 | T. cruzi(ARC) | Pos |
| RR182 | T. cruzi(ARC) | Pos |
-
| Número de Série | ID do soro | Estado de RIPA |
| RR102 | T. cruzt(ARC) | Pos |
| RR112 | T. cruzi(ARC) | Pos |
| RR164 | T. cruzi(ARC) | Pos |
| CRR94 | T. cruzi(ARC) | Pos |
| RR119 | T. cruzi(ARC) | Pos |
| RR86 | T. cruzi(ARC) | Pos |
| RR85 | T. cruzi(ARC) | Pos |
| RR34 | T. cruzi(ARC) | Pos |
| RR109 | T. cruzi(ARC) | Pos |
| RR73 | T. cruzi(ARC) | Pos |
| RR190 | T. cruzi(ÂRC) | Pos |
| CRR101 | T. cruzi(ARC) | Pos |
| RR171 | T. cruzi(ARC) | Pos |
| RR128 | T. cruzi(ARC) | Pos |
| RR105 | T. cruzi(ARC) | Pos |
| RR172 | T. cruzi(ARC) | Pos |
| RR174 | T. cruzi(ARC) | Pos |
| RR150 | T. cruzifARC) | Pos |
| RR181 | T. cruzi(ARC) | Pos |
| RR75 | T. cruzi(ARC) | Pos |
| RR57 | T. cruzi(ARC) | Pos |
| RR107 | T. cruzi(ARC) | Pos |
| RR39 | T. cruzi(ARC) | Pos |
| RR189 | T. cruzi(ARC) | Pos |
| RR163 | T. cruzi(ARC) | Pos |
| RR158 | T. cruzi(ARC) | Pos |
| RR157 | T. cruzi(ARC) | Pos |
| RR26 | T. cruzi(ARC) | Pos |
| RR94 | T. cruzi(ARC) | Pos |
| PMT201-1 | T. cruzi(BBI) | Pos |
| PMT201-2 | T. cruzi(BBI) | Pos |
| PMT201-3 | T. cruzi(BBI) | Pos |
| RMT2Q1-4 | T. cruz(BBI) | Pos |
| PMT201-5 | T. cruz(BBI) | Pos |
| PMT201-6 | T. cruzi(BBI) | Pos |
| PMT201-7 | T. cruzi(BBI) | Pos |
| ΡΜΤ201-8 | T. cruzi(BBI) | Pos |
| PMT201-9 | T. cruz(BBI) | Pos |
| PMT201-10 | T. cruz(BBI) | Pos |
| PMT201-11 | T. cruzi(BBI) | Pos |
| PMT201-12 | T. cruz(BBI) | Pos |
| PMT201-13 | T. cruzi(BBI) | Pos |
| Número de Série | ID do soro | Estado de RIPA |
| PMT201-14 | T. cruzi(BBI) | Pos |
| PMT201-15 | Soro de controle (BBI) | Neg |
| NHS1 | Soro de controle | neg |
| NHS2 | Soro de controle | neg |
| NHS3 | Soro de controle | neg |
| Controle positivo fraco de T. cruzi | RR usado em clonagem de expressão | |
| Controle positivo fraco de T. cruzi I | T. cruzi de Mistura de Teragenix usado em clonagem de expressão |
Na figura 3, as reatividades de TcF e ITC-6 são comparadas com aquelas de ITC-7.1 e 7.2 em um painel de soros. ITC-7.1 e 12 contêm uma e duas repetições da seqüência de KMP-11 específica de T. cruzi. Os ensaios foram realizados conforme descrito acima. A reatividade desses so5 ros com TcF, ITC-6, ITC-7.1 e 7.2 são comparadas na figura 3. Os construtos ITC-7.1 e 7.2 mostraram atividade comparável a ITC-6 com indicações de sinal possivelmente maior.
Exemplo 3
Detecção de Infecção por T cruzi em Soros usando ITC 7.2 e ITC 8.2 10 Proteína recombinante para ITC8.2 (SEO ID NO: 19) foi expressa como descrito no Exemplo 6 abaixo. Essa proteína foi então usada como o antígeno de fase sólida em um ensaio de ELISA e comparada com ITC7.2 (SEQ ID NO: 17) que difere de ITC8.2 por não incorporar o peptídeo 1 (SEQ ID NO: 6). Incluído no grupo estava uma amostra de soro (amostra n°.
7190014) que era conhecida por reagir com peptídeo assim como com outros componentes das proteínas recombinantes multiepítopo. Os resultados desse estudo são mostrados na figura 4. Conforme mostrado, atividade comparável foi vista com ITC8.2 e ITC7.2.
Para garantir que o peptídeo 1 seja de fato funcional em ITC8.1 (contendo a forma curta do peptídeo 1 fornecida em SEQ ID NO: 7) e ITC8.2 (contendo o peptídeo 1 de extensão completa fornecido em SEQ ID NO: 6), estudos de absorção foram realizados com um soro reativo com peptídeo 1 conhecido (amostra n°. 7190014, da Universidade do Chile) absorvido com esferas revestidas com ITC7.2. A preparação de esferas revestidas com
ITC7.2 tratadas com soro n° 7190014 foi realizada como segue:
1) 100 μΙ de esferas revestidas com ITC-7.2 foram centrifugados a 2000 rpm por 1 min.
2) O tampão do sobrenadante foi cuidadosamente removido e amostra de soro n°. 7190014 diluída a 1/10 em Tris 10 mM, pH 8.0 foi adi5 cionada às esferas revestidas com ITC7.2.
3) A mistura foi gentilmente agitada por aproximadamente 1 hora a RT.
4) O tubo da mistura foi centrifugado novamente a 2000 rpm por minuto.
_ 10 5) O sobrenadante foi ainda diluído para uma diluição de 1/20-e
1/100 com Tampão de Diluição de Amostra (SDB) para IgG, EDTA 15 mM.
'·' Soro não tratado n° 7190014 também foi diluído diretamente para 1/20 e 1/100 em tampão de diluição de soro.
Todas as amostras foram então testadas em um ELISA com 100
L por cavidade de soros diluídos sendo adicionados a fitas de microtitulação (3,12 ng/cavidade) revestidas de ITC7.2, ITC8.1 encurtado (SEQ ID NO: 22) e ITC8.2 (SEQ ID NO: 19). ELISA para T. cruzi foi realizado como descrito acima no Exemplo 1. A figura 5 mostra a atividade de soros positivos para peptídeo 1 não absorvidos e absorvidos. Reatividade de peptídeo 1 residual foi observada apenas em ITC8.2, indicando que a forma encurtada do peptídeo 1 em ITC8.1 foi não reativa ou foi menos ativa do que a seqüência maior de peptídeo 1 presente em ITC8.2.
Exemplo 4
Imunoblot com proteínas ITC Recombinantes
Imunoblots de ouro coloidal foram realizados para determinar se proteínas recombinantes ITC-6 e ITC7.2 detectaram soros positivos para T. cruzi que eram pouco reativos ou negativos pela proteína TcF recombinante de origem. Também foram testadas 12 amostras de soro de leishmaniose visceral (VL) e soros de quatro doadores normais. Os dados são mostrados na Tabela 2 abaixo.
Resumidamente, as proteínas recombinantes foram pulverizadas em nitrocelulose bloqueada com leite em pó desnatado, lavada em PBS jof
Tween e cortada em tiras. As tiras foram incubadas em soro em uma diluição de 1/50 por 15 minutos a 37°C. As tiras foram então lavadas em PBS Tween e incubadas adicionalmente por 6 min em temperatura ambiente com PA-ouro (OD5) com ECL 10%. Os blots foram lavados com PBS Tween 20 e observados quanto a presença ou ausência de uma linha colorida.
Os dados (expressos como intensidade da linha) indicam que tanto ITC6 como ITC7.2 melhoram grandemente a detectabilidade de soros positivos para T. cruzi quando comparados com TcF sem especificidade prejudicial como indicado por não haver alteração no perfil de reatividade com soros de VL e de doador normal.
Tabela 2
| Amostra | Antígeno | ||
| ITC 6 | ITC 7.2 | TcF | |
| 74042 | ++++ | ++++ | |
| 40222 | ++ | ++ | |
| 74044 | ++++ | ++++ | ± |
| 40119 | ++++ | ++++ | - |
| 40224 | ++ | ++ | - |
| 74040 | ++++ | ++++ | + |
| RR148 | - | - | - |
| RR174 | + | + | - |
| RR115 | ++ | ++ | |
| RR161 | +++ | +++ | - |
| RR131 | +++ | +++ | ± |
| VL474 | - | - | - |
| VL485 | - | - | - |
| VL487 | - | - | - |
| VL494 | - | - | - |
| VL507 | - | - | - |
| VL461 | - | - | - |
| VL453 | - | - | - |
| VL495 | - | - | - |
| VL494 | - | - | - |
| VL477 | - | - | - |
| VL488 | - | - | - |
| VL505 | - | - | - |
$
| NHS108 | - | - | - |
| NHS117 | - | - | - |
| NHS126 | - | - | - |
| NHS135 | - | - | - |
Exemplo 5
Dados de teste rápido com ITC8.2
Imunoensaios rápidos de fluxo lateral foram realizados usando dipsticks preparados com ITC8.2 sobre a membrana e comparados com os 5 dados de radioimunoprecipitação, imunofluorescência, Lisado e ELISA de
ITC8.2. Os dados comparativos são mostrados na tabela 3 abaixo. Boa correlação foi visa entre todos os formatos de ensaio.
Tabela 3
| ELISA ITC8.2 | Título de IFAT | Lisado de ELISA | ELISA de peptídeo 1 | RIPA | Dipstick ITC8.2 | |
| 3,13 ng/cavidade | ||||||
| 7290140 | 2,988 | 320 | + | + | + | 4+ |
| 7290191 | 2,636 | 40 | + | + | + | 3+ |
| 7290192 | 2,785 | 40 | + | + | + | 4+ |
| 7290083 | 2,613 | 40 | + | - | + | 2+ |
| 7290062 | 1,417 | 40 | + | - | + | 1 + |
| 7190033 | 2,713 | 80 | + | + | + | 3+ |
| 7190024 | 2,677 | 40 | + | + | + | 3+ |
| 7190016 | 2,755 | 80 | + | + | + | 3+ |
| 7190120(733) | 0,055 | - | - | - | - | - |
| 7190026 | 1,966 | 40 | + | + | + | 2+ |
| 7290129 | 2,714 | 20 | + | + | + | 3+ |
| 7290189 | 1,856 | 20 | + | + | + | 1 + |
| 7290187 | 2,436 | 80 | + | + | + | 2+ |
| 7190012 | 2,732 | 160 | + | - | + | 4+ |
| 7190047 | 2,090 | 20 | + | + | + | 2+ |
| 7190052 | 0,060 | - | - | - | - | - |
| 7290183 | 0,574 | 40 | + | - | + | 2+ |
| 7290147 | 2,772 | + | + | + | + | 3+ |
| 7190045 | 2,576 | 20 | + | + | + | 4+ |
| 7190035 | 2,432 | 20 | + | + | + | 2+ |
| 7290144 | 5,412 | + | + | + | + | 4+ |
| 7190117(736) | 0,053 | - | - | - | - | +/- |
| 7190114 | 1,524 | 80 | + | - | 1 + |
ÀQ3
| 7190042 | 2,426 | 20 | + | + | + | 2+ |
| 7290146 | 2,872 | 160 | + | + | + | 4+ |
| 7190113(755) | 0,064 | - | - | - | - | - |
| 7290145 | 2,063 | 20 | + | + | + | 2+ |
| 7190036 | 2,515 | 20 | + | + | + | 3+ |
| 7190119 | 0,044 | 80 | + | - | - | - |
| 7190116 | 0,087 | 320 | + | - | - | - |
| 7190115 | 0,110 | 20 | E | - | - | - |
| 7290190 | 2,472 | 160 | + | + | + | 4+ |
| 7190118 | 0,090 | 20 | E | - | - | +/- |
| 7190014 | 2,818 | 40 | + | + | + | 4+ |
| 823 | 0,051 | - | - | - | - | - |
| 838 | 0,051 | - | - | - | - | - |
| Painel #5 | 1,576 | ND | ND | ND | ND | ND |
| Painel #6 | 1,197 | ND | ND | ND | ND | ND |
| Painel #7 | 0,535 | ND | ND | ND | ND | ND |
Exemplo 6
Expressão de ITC8.2 em sistema de expressão SUMO e Especificidade Melhorada
Dois sistemas de expressão foram comparados para determinar se expressão melhorada de ITC8.2 era possível e também melhorar em especificidade. Soros positivos e negativos para T. cruzi, e um painel de diluição de anticorpo foram usados no ensaio. Soros negativos incluíram soros normais problemáticos. Os sistemas comparados eram a expressão de ITC8.2 sinalizada com hexa-histidina em um vetor pET17 versus urrí sistema de expressão que usa o sistema de expressão SUMO (sem His Tag; Life Sensors, Inc., Malvern, PA) em que o fragmento SUMO foi cortado com a protease apropriada. Os dados, que são mostrados na Tabela 4, demonstram o potencial para melhora na especificidade obtida quando se usou o sistema recombinante derivado de SUMO versus preparar ITC8.2 hexa15 histidina em um vetor pET.
Tabela 4
| ITC8.2 (His Tag) | ITC8.2 (SUMO) | ||
| ELISA | 20 min | 20 min | |
| 7290140 | P | 4+ | 4+ |
| 7290062 | P | 1 + | 2+ |
| 7190120(733) | N | - | - |
| 7190052 | N | - | - |
| 7290183 | P | 2+ | 2+ |
| 7190117(736) | N | +/- | - |
| 7190114 | P | 1 + | 2+ |
| 7190113(755) | N | - | - |
| 7190119 | N | - | - |
| 7190116 | N | - | - |
| 7190115 | N | - | - |
| 7190118 | N | +/-? | - |
| 823 | N | - | - |
| 838 | N | - | - |
| Chagas D#2 | P | 4+ | 4+ |
| Chagas D#4 | P | 3+ | 3+ |
| Chagas D#5 | P | 2.5+ | 1 + |
| Chagas D#6 | P | 1.5+ | + |
| BM123204 | - | - | |
| BM123207 | +/ | - | |
| BM123210 | - | - | |
| SeraCare#5 | + | - | |
| SeraCare#22 | + | - | |
| SeraCare#122 | +/- | - | |
| SeraCare#154 | +/- | - |
Exemplo 7
Seqüências derivadas de clonagem de expressão sorolóqica
Preparação de biblioteca de T.cruzr.
Uma biblioteca genômica de expressão de quebra aleatória foi construída por sonicar DNA genômico de cepa CL de Trypanosoma cruzi. A sonicação produziu tamanhos de fragmento 0,5-2,0 kb. Quinze microgramas de DNA sonicado foram tratados com polimerase T4 (NEB) por 15 minutos a 12SC seguido por incubação por 20 minutos a 75SC para produzir fragmentos de extremidade cega. Adaptadores de EcoRI foram então ligados aos frag10 mentos e os adaptadores foram fosforilados com polinucleotídeo quinase de E. coli. Os fragmentos foram fracionados a seguir com uma coluna Sephacryl S400 e finalmente ligados a um vetor de expressão Lambda ZAP Express (Stratagene). O vetor ligado foi empacotado com extrato de empacotamento Gigapack III Gold (Stratagene).
Ratreamento:
A biblioteca amplificada foi plaqueada em placas de agarose LB xtô
em uma concentração de 20.000 unidades formadoras de colônia (PFU) por 35 placas. Após incubação a 42°C por 4 horas, filtros de nitrocelulose embebidos em IPTG 10 mM foram adicionados e as placas foram incubadas a 372C durante a noite. Os filtros foram removidos e lavados 3x com PBS contendo Tween 20 0,1% (PBST), bloqueados por 1 hora com BSA 1% em PBST, lavados 3x com PBST, bloqueados mais 1 hora com Tween 20 1% em PBS, lavados 3x com PBST e então incubados durante a noite a 4SC em soro, grupo #1 (mistura de RR) e/ou grupo #2 (mistura de Teragenix) de pacientes. Ambos os grupos de paciente foram obtidos a partir de soros de T. cruzi pouco reativos confirmados por RIPA. No dia seguinte, após lavar 3x com PBST, os filtros foram incubados em um anticorpo secundário de cabra anti-lg humana (IgG, IGA, IgM) com fosfatase alcalina por 1 hora em temperatura ambiente. Os filtros foram finalmente lavados 3x com PBST, 2x com tampão AP e desenvolvidos com BCIP/NBT. Os clones positivos foram purificados usando a mesma técnica. Os fagomídeos foram cortados, e o DNA de plasmídeo resultante foi seqüenciado e pesquisado contra as bases de dados de T.cruzi.
Características e resultado de rastreamento da biblioteca:
Vetor lambda:
Vetor de plasmídeo: DNA:
Titulação da biblioteca: Tamanho do inserto: Rastreado:
Soro:
Seleções primárias:
Lambda Zap Express (Stratagene) pBK-CMV (canamicina)
T. cruz/genômico
2,5x108/ml (amplificado) (total de 30 ml) 0,5-2,0 Kbp (média = 1,1)
20.000 pfu por 35 placas grupo #1 e grupo #2 de paciente (de doadores normais) diluição 1:200 31 (lg Humana) do grupo #1 de paciente (de 15 placas) (lg Humana) do grupo #2 (de 20 placas) (fraco - sinal forte)
Secundário purificado:
Submetidos para seqüenciamento:
jo5 $
Tabela 5: Acertos de rastreamento de biblioteca genômica de T.cruzi com soro agrupado de pacientes infectados
| Clone | Pontu- ação | Blastn | Homologia | Tamanho (kDa) | GenBank |
| Tc-2 | 1816 | TcOO.1047053 509181.9 | Proteína da família de genes dispersos (pseudogene DGF-1) | M90534 Proteína 1 de DGF-1 de T. cruzi | |
| Tc-5 | 883 | Tc00.1047053 507757.10 | Proteína hipotética | 14,2 | Nova |
| Tc-11 | 3025 | TcOO.1047053 509181.9 | Proteína da família de genes dispersos (pseudogene DGF-1) | M90534 proteína de DGF-1 de T. cruzi | |
| Tc-12 | 3784 | Tc00.1047053 509181.9 | Proteína da família de genes dispersos (pseudogene DGF-1) | M90534 proteín a de DGF-1 de T. cruzi | |
| Tc-13 | 2765 | Tc00.1047053 509181.9 | Proteína da família de genes dispersos (pseudogene DGF-1) | M90534 proteína de DGF-1 de T. cruzi | |
| Tc-14 | 2330 | Tc00.1047053 509659.20 | Proteína da família de genes dispersos (pseudogene DGF-1) | M90534 proteína de DGF-1 de T. cruzi | |
| Tc-15 | 3277 | Tc00.1407053 511211.170 | Choque térmico 70 | 73,2 | X58715 RNAm de hsp 70 para HSP de 70 kDa de T. cruzi |
| Tc-19 | |||||
| Tc-25 | 2964 | Tc00.1407053 507713.30 | Choque térmico 85 | 81 | M15346 Proteín a de choque térmico de 85 kDa de T.cruzi |
| Tc-26 | 3175 | Tc00.1407053 510271.20 | Proteína da família de genes dispersos (pseudogene DGF-1) | ||
| Tc-27 | 3362 | Tc00.1407053 503739.20 | trans-sialidase | ||
| Tc-31 | 3276 | Proteína associada ao microtúbulo | 125,5 |
Seqüências adicionais, referidas como Tc48, Tc60 e Tc70, tam5 bém foram identificadas. Essas seqüências, mais Tc5, foram de muito interesse para avaliação adicional. As seqüências de DNA para Tc5, Tc48, Tc60 e Tc70 são fornecidas em SEQ ID NO: 23, 25, 28 e 30, respectivamente, com as seqüências de aminoácido para Tc5, Tc60 e Tc70 sendo fornecidas em SEQ ID NO: 24, 29 e 31. A seqüência de aminoácido parcial de Tc48 é fornecida em SEQ ID NO: 26, com a seqüência de extensão completa correspondente obtida a partir da base de dados pública em SEQ ID NO: 27.
A partir do precedente, será observado que, embora modalidades específicas da invenção tenham sido descritas aqui para a finalidade de ilustração, várias modificações podem ser feitas sem desviar do espírito e escopo da invenção.
SEQ ID NO: 1-31 são demonstradas na Listagem de Seqüência anexada. Os códigos para seqüências de polinucleotídeo de polipeptídeo usados na Listagem de Seqüência anexada conferem com Padrão WIPO ST.25 (1988), Apêndice 2.
Todas as referências descritas aqui, incluindo referências de pa10 tente e referências de não-patente, estão por meio desse incorporadas por referência na sua totalidade como se cada uma estivesse incorporada individualmente.
Claims (15)
- REIVINDICAÇÕES1. Polipeptideo de fusão, caracterizado pelo fato de que compreende as sequências de aminoácido da SEQ ID NO: 1,2, 3 e 4.
- 2. Polipeptideo de fusão de acordo com a reivindicação 1, carac5 terizado pelo fato de que compreende ainda a sequência de aminoácido daSEQ ID NO: 5.
- 3. Polipeptideo de fusão de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que compreende ainda a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 6.10
- 4. Polipeptideo de fusão de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que compreende ainda a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 7.
- 5. Polipeptideo de fusão de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o polipeptideo de fusão compreende uma sequên15 cia de aminoácido selecionada a partir do grupo que consiste em: SEQ ID NO: 8, 15, 17, 19, e 20.
- 6. Polipeptideo de fusão, caracterizado pelo fato de que compreende uma sequência de aminoácido selecionada a partir do grupo que consiste nas sequências de SEQ ID NO: 8, 15, 17, 19 ou 20.20
- 7. Sequência de polinucleotideo isolada, caracterizada pelo fato de que codifica um polipeptideo de fusão como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6.
- 8. Vetor de expressão recombinante, caracterizado pelo fato de que compreende uma sequência de polinucleotideo como definida na reivindicação 7.25
- 9. Método para detectar infecção por T. cruzi em uma amostra biológica, caracterizado pelo fato de que compreende:(a) colocar a amostra biológica em contato com um polipeptideo de fusão como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6; e (b) detectar na amostra biológica a presença de anticorpos que30 se ligam ao polipeptideo de fusão, assim detectando a infecção por T. cruzi na amostra biológica.
- 10. Método de acordo com a reivindicação 9, caracterizado peloPetição 870180054525, de 25/06/2018, pág. 8/15 fato de que a amostra biológica é selecionada a partir do grupo que consiste em: sangue, soro, plasma, saliva, fluido cerebroespinhal e urina.
- 11. Kit para detectar infecção por T. cruzi em uma amostra biológica, caracterizado pelo fato de que compreende:5 (a) um polipeptídeo de fusão como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6; e (b) um reagente de detecção.
- 12. Kit de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o reagente de detecção compreende um grupo repórter.10
- 13. Kit de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o grupo repórter é selecionado a partir do grupo que consiste em: enzimas, substratos, cofatores, inibidores, corantes, radionuclídeos, grupos luminescentes, grupos fluorescentes, e biotina.
- 14. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende
- 15 uma proteína de fusão como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 6 e pelo menos um componente selecionado a partir do grupo que consiste em veículos e imunoestimulantes fisiologicamente aceitáveis.Petição 870180054525, de 25/06/2018, pág. 9/151/6
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