BRPI0618217A2 - usos de anticorpos anti-cd40 - Google Patents

Abstract

<B>USOS DE ANTICORPOS ANTI-CD4O<D>Métodos para o tratamento de um paciente humano para uma doença inflamatória ou doença autoimune que está associada a células que expressam CD4O são fornecidos, em que o paciente humano é heterozigótico ou homozigótico para FcyRJiIIa-158F (genótipo v/F ou F/F') também são fornecidos métodos de inibição da produção de anticorpo por células B em um paciente humano que é heterozigótico ou homozigótico para FcyRIIIa-158F (genótipo v/F ou F/F). Os métodos compreendendo a administração ao paciente humano de uma quantidade terapeuticamente ou profilaticamente eficaz de um anticorpo anti-CD4O. Métodos e kits para a identificação de um paciente humano com uma doença inflamatória ou doençaautoimune que é tratável com um anticorpo anti-CD4O e que é não responsivo ou refratário ao tratamento com rituximab (Rituxan«) , bem como métodos e kits para a seleção de uma terapia com anticorpo para o tratamento de um paciente humano que tem uma doença inflamatória ou doença autoimuneque é não responsivo ou refratário ao tratamento com rituximab (Rituxan«), também são fornecidos. Os métodos da presente invenção têm uso no tratamento de doenças inflamatórias e doenças autoimunes que são associadas acélulas que expressam CD4O. Esses métodos são particularmente vantajosos com relação a doenças inflamatórias e doenças autoimunes que são associadas acélulas que expressam tanto CD4O quanto CD2O, uma vez que os métodos permitem o tratamento de pacientes que têm doença inflamatória ou autoimunes que é não responsivo ou refratário à terapia com outros agentes terapêuticos como anticorpos anti-CD2O.

Description

USOS DE ANTICORPOS ANTI-CD40

Esta invenção relaciona-se a novos usos de anticorposanti-CD40, em particular no tratamento de doençasinflamatórias e doenças autoimunes que são associadas comcélulas que expressam CD40.

Fundamento da invenção

Vários membros da família de fator de necrose tumoral(TNF) de ligantes e seus receptores correspondentes regulamo crescimento de células normais por indução de apoptose ouaumento da sobrevivência e proliferação celulares. É esseequilíbrio entre sinais apoptóticos e sinais desobrevivência e proliferação que mantém a homeostasiacelular normal. Pelo menos 26 receptores da família de TNFe 18 ligantes da família de TNF foram identificados atéhoje. As formas biologicamente ativas de ambos osreceptores e ligantes são trímeros de proteínas auto-montadas. Transmembrana e formas solúveis dos receptores eligantes foram identificadas. Embora os domíniosintracelulares dos receptores não partilhem homologia deseqüência, seus domínios extracelulares compreendem 40repetições de aminoácidos, ricas em cisteína. Seus sinaisde tails citoplasmáticos por interação com grupos dióisprincipais de proteínas intracelulares: fatores associadosa receptor de TNF (TRAFs) e proteínas que contêm domíniosde morte (DD) . A interação entre pelo menos seis TRAFshumanos e sítios de ligação de TRAF no ta.il citoplasmáticode alguns desses receptores inicia várias vias desinalização, que incluem AKT (a serina/treonina quinasereferida como proteína quinase B ou PKB), fator-KB nuclear(NF-KB), e proteína quinases ativadas por mitógeno (MAPK).Veja, por exemplo, a revisão por Younes e Kadin (2003) JClin. Oncol. 18:3526-3534.

O membro de receptor da família de TNF CD40 é umantígeno de superfície celular de 50-55 kDa presente nasuperfície de células B humanas normais e neoplásicas,células dendríticas, monócitos, macrófagos, células T CD8+,células endoteliais, e células monocíticas e epiteliais. Oantígeno CD40 é também expresso em células T ativadas,plaquetas ativadas, células de músculo liso vascularinflamadas, eosinófilos, membranas sinoviais em artritereumatóide, fibroblastos dérmicos, e outros tipos decélulas não linfóides. Dependendo do tipo de célula queexpressa CD40, a ligação pode induzir adesão intercelular,diferenciação, ativação e proliferação. Por exemplo, aligação de CD40 a seu ligante cognato, CD40L (tambémdesignado CD154), estimula a proliferação de células B ediferenciação nas células do plasma, produção de anticorpo,troca de isotipo, e geração de memória de célula B. Durantea diferenciação da célula B, CD40 é expresso em pré-célulasB, mas se perde com a diferenciação e células plasmáticas.

O ligante CD40 (CD40L), também conhecido como CD154, éuma proteína de transmembrana de 32-33 kDa que tambémexiste em duas formas solúveis menores biologicamenteativas, de 18 kDa e 31 kDa, respectivamente (Graf e cols.(1995) Eur. J. Iwmunol. 25:1749- 1754; Mazzei e cols.(1995) J. Biol. Chem. 270:7025-7028; Pietravalle e cols.(1996) J". Biol. Chem. 271:5965-5967). CD40L é expresso emcélulas T-helper CD4 + ativadas, mas não em repouso (Lane ecols. (1992) Eur. J. Immunol. 22:2573-2578; Spriggs e cols.(1992) J. Exp. Med. 176:1543-1550; and Roy e cols. (1993)J. Immunol. 151:1-14). Tanto CD40 quanto CD40L foramclonados e caracterizados (Stamenkovi e cols. (1989) EMBOJ. 8:1403-1410; Armitage e cols. (1992) Nature 357:80-82;Lederman e cols. (1992) J. Exp. Med. 175:1091-1101; eHollenbaugh e cols. (1992) EMBO J. 11:4313-4321) . Vejatambém Patente U.S. No. 5.94 5.513, que descreve CD4 0Lhumano. Células transfectadas com o gene de CD4 0L e queexpressam a proteína de CD4 0L em sua superfície podemdespertar a proliferação de células B, e, junto com outrossinais estimulatórios, podem induzir a produção deanticorpo (Armitage e cols. (1992) supra; e Patente U.S.No. 5.945.513). Pacientes com doença autoimune têm níveisséricos elevados de CD4 0L solúvel (sCD4 0L) que não sãoobservados em indivíduos saudáveis. A superexpressão deCD4 0L causa doenças autoimunes similares ao lupuseritematoso disseminado em modelos de roedor (Higuchi ecols. (2002) J. Immunol. 168:9-12). Em contraste, aausência de CD4 0L funcional rm células T ativadas causasíndrome de hiper-IgM ligada a X (Allen e cols. (1993)Science 259:990; e Korthauer e cols. (1993) Nature3 61:539) . Além disso, o bloqueio da interação de CD40/CD40Lpode evitar a rejeição de transplantes em modelos deprimatas não humanos. Veja, por exemplo, Wee e cols. (1992)Transplantation 53:501-7.

A expressão de CD4 0 em APCs tem um importante papelco-estimulante na ativação dessas células. Por exemplo,anticorpos monoclonais anti-CD40 agonísticos (mAbs)mostraram imitar os efeitos de células T helper na ativaçãode células B. Quando apresentados em células aderentes queexpressam FcyRII, esses anticorpos induzem a proliferaçãode células B (Banchereau e cols. (1989) Science 251:70).Além disso, mAbs anti-CD40 agonísticos podem substituir osinal de T helper para secreção de IgM, IgG e IgE napresença de IL-4 (Gascan e cols. (1991) J. Immunol. 147:8).

Além disso, mAbs anti-CD40 agonísticos podem evitar mortecélula programada (apoptose) de células B isoladas delinfonodos.

Essas e outras observações sustentam a atual teoria deque a interação de CD40 e CD40L tem um papel importante naregulação das respostas imunes humoral e mediada porcélulas. Estudos mais recentes revelaram um papel muitomais amplo da interação CD4 0/CD4 0L em diversos processosfisiológicos e patológicos.

A via de transdução do sinal de CD40 depende daregulação coordenada de vários fatores intracelulares.Assim como outros membros da família de receptor de TNF,CD40 ativa TRAFs, incluindo TRAF-2, -3, -5 e -6, que supra-regulam diversas vias de sinalização após encaixe de CD40com CD4 0L (seja CD40L ligado a membrana ou CD40L solúvel),incluindo quinase regulada por sinal extracelular (ERK), c-jun amino terminal quinase (JNK), p38 MAPK e NF-KB (veja,por exemplo, Younes e Carbone (1999) Int. J. Biol. Markers14:135-143; van Kooten and Banchereau (2000) J. Leukoc.Biol. 67 : 2-17) .

A sinalização via CD40 mostrou evitar a morte celularpor apoptose (Makus e cols. (2002) J. Immunol. 14:973-982).Os sinais apoptóticos são necessários para induzir a mortecelular programada em uma maneira coordenada. Os sinais demorte celular podem incluir estímulos intrínsecos da célulacomo estresse de retículo endoplasmático ou estímulosextrínsecos como ligação de receptor de FasL ou TNFa. Avia de sinalização é complexa, envolvendo a ativação decaspases como Caspase-3 e Caspase-9, e de poli (ADP ribose)polimerase (PARP). Durante a cascata, proteínas desinalização anti-apoptose, como mcl-1 e bcl-x, e membros dafamília IAP de proteínas, como Inibidor de Apoptose Ligadoa X (XIAP), são infra-regulados (Budihardjo e cols. (1999)Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 15:269-290). Por exemplo, emcélulas dendríticas, a sinalização de célula CD4 0 podebloquear os sinais de apoptose transduzidos por FasL(Bjorck e cols. (1997) Intl. Immunol. 9:365-372).

Portanto, o encaixe de CD40 por CD4 0L e a subseqüenteativação da sinalização de CD40 são etapas necessárias pararespostas imunes normais; no entanto, a desregulação dasinalização de CD40 pode levar à doença. A via desinalização de CD40 está envolvida em doença autoimune(Ichikawa e cols. (2002) J. Immuno1. 169:27812787 e Moore ecols. (2002) J. Autoimmun. 19:139-145). Adicionalmente, ainteração CD40/CD4 0L tem um papel importante nos processosinflamatórios. Por exemplo, tanto CD40 quanto CD40L sãosuperexpressos em lesões de aterosclerose humana eexperimental. O estímulo de CD40 induz a expressão deenzimas que degradam matriz e expressão de fator tecidualem tipos de célula associadas à ateroma, como célulasendoteliais, células de músculo liso, e macrófagos. Alémdisso, a estimulação de CD4 0 induz a produção de citocinaspró-inflamatórias como IL-1, IL-6 e IL-8, e adesão demoléculas como ICAM-1, E-seletina e VCAM. A inibição deinteração CD40/CD40L evita a aterogênese em modelosanimais. Em modelos de transplante, o bloqueio da interaçãoCD4 0/CD4 0L evita a inflamação. Constatou-se que a ligaçãoCD4 0/CD4 0L age de forma sinérgica com o peptídeo betaamilóide de Alzheimer para promover a ativação damicroglia, assim levando à neurotoxicidade.

Em pacientes com artrite reumatóide (AR), a expressãode CD4 0 é aumentada em condróticos articulares; assim, asinalização de CD4 0 contribuiu para a produção de citocinasdanosas e metaloproteinases de matriz. Veja Gotoh e cols.(2004) J. Rheumatol. 31:1506-1512. Além disso, constatou-seque a amplificação da resposta inflamatória sinovial ocorreatravés da ativação de MAPKs e NF-κΒ via ligação de CD40 emcélulas sinoviais CD14+ de pacientes com AR (Harigai ecols. (2004) Arthritis. Rheum. 50:2167-2177). Em um modeloexperimental de AR, o tratamento com anticorpo anti-CD4 0Levitou a indução de doença, inflamação das articulações, eprodução de anticorpo anti-colágeno (Durie e cols. (1993)Science 261:1328-1330). Finalmente, em experimentosclínicos, mostrou-se que o esgotamento de células B CD2 0+positivas de pacientes com AR por administração de Rituxan®(geralmente indicada para linfoma de células B) melhora ossintomas (Shaw e cols. (2003) Ann. Rheum. Dis. 62(Suppl.2):ii55-ii59) .

0 bloqueio das interações de CD4 0/CD4 0L durante aapresentação de antígeno para células T também mostrouinduzir a tolerância a células T. Portanto, o bloqueio dainteração CD4 0/CD4 0L evita a ativação inicial de célula Tbem como induz a tolerância de longa duração à re-exposiçãoao antígeno.

Anticorpos monoclonais humanos anti-CD4 0 e inúmerosusos destes são revelados em Pedidos de Patentes de co-propriedade publicados como WO 2005/044854, WO 2005/044304,WO 2005/044305, WO 2005/044306, WO 2005/044855, WO2005/044307 e WO 2005/044294. Aqueles pedidos revelamespecificamente um anticorpo monoclonal anti-CD40 IgG1 humano, designado como CHIR-12.12, que foi gerado porimunização de camundongos transgênicos que sustentam olócus de cadeia pesada de IgGl humana e o lócus de cadeialeve χ humana (XenoCamundongo® technology; Abgenix,Califórnia).

Como mostrado por análise FACS, CHIR-12.12 se ligaespecificamente a CD40 humano e pode evitar ligação CD4 0-ligante (CD40L). CHIR-12.12 pode competir (compete off)CD40L pré-ligado a CD40 de superfície celular. O anticorpomonoclonal CHIR-12.12 é um forte antagonista e inibe proliferação in vitro mediada por CD40L de células Bnormais e malignas. O anticorpo monoclonal CHIR-12.12 inibediretamente a sobrevivência e as vias de sinalizaçãomediadas por CD40L em linfócitos B humanos normais. Invitro, CHIR-12.12 mata células cancerosas primárias de pacientes com NHL (linfoma não Hodgkin) por ADCC. Aatividade antitumor dose-dependente foi observada em ummodelo de linfoma humano de xenoenxerto. CHIR-12.12 estáatualmente em experimentos de fase I para malignidades decélula B.

CD20 é um antígeno de superfície celular expressoprecocemente em diferenciação de célula B e permanece nasuperfície celular através do desenvolvimento da célula B.CD20 está envolvido na ativação de célula B, é expresso emníveis muito altos em células B neoplásicas, e é um alvo terapêutico clinicamente reconhecido (veja, por exemplo,Hooijberg e cols. (1995) Câncer Research 55: 2627).Anticorpos que visam CD20, como rituximab (Rituxan®), foramaprovados pela "U.S. Food and Drug Administração" para otratamento de Iinfoma não Hodgkin (veja, por exemplo, Boyee cols. (2003) Ann. Oncol. 14:520). Rituxan provou ser umtratamento eficaz para linfoma não Hodgkin (NHL) de graubaixo, intermediário e alto (veja, por exemplo, Maloney ecols. (1994) Blood 84:2457-2466), McLaughlin e cols. (1998)J. Clin. Oncol. 16:2825-2833, Maloney e cols. (1997) Blood90:2188-2195, Hainsworth e cols. (2000) Blood 95:30523056,Colombat e cols. (2001) Blood 97:101-106, Coiffer e cols.(1998) Blood 92:19271932), Foran e cols. (2000) J. Clin.Oncol. 18:317-324, Anderson e cols. (1997) Biochem. Soe.Trans. 25:705-708, ou Vose e cols. (1999) Ann. Oncol.10:58a). Rituxan® também consome células B normais, o quepode ter um papel das doenças inflamatórias e autoimunes.Ele está em experimento clínico para doenças autoimunes.

Embora o mecanismo exato de ação não seja conhecido, aevidência indica que os efeitos antilinfoma de Rituxan® sãoem parte devidos à citotoxicidade mediada por complemento,citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpo(ADCC), inibição de proliferação celular, e finalmenteindução direta de apoptose. Alguns pacientes, no entanto,tornam-se resistentes ao tratamento com Rituxan® (vejaWitzig e cols. (2002) J Clin. Oncol. 20:3262, Grillo-Lopeze cols. (1998) J Clin. Oncol. 16:2825, ou Jazirehi e cols.(2003) Mol. Câncer Ther. 2:1183-1193). Por exemplo, algunspacientes perdem expressão de CD20 em células B malignasapós terapia com anticorpo anti-CD20 (Davis e cols. (1999)Clin. Câncer Res. 5:611). Além disso, 30% a 50% dospacientes com NHL de baixo grau não exibem resposta clinicaa esse anticorpo monoclonal (Hainsworth e cols. (2000)Blood 95:3052-3056; Colombat e cols. (2001) Blood 97:101-106). A atividade clínica de rituximab em NHL tambémmostrou ser correlacionada com o genótipo de FcyRIIIa dopaciente. Pacientes com o polimorfismo 158aa de FcyRIIIa deV/V ou V/F são mais responsivos a rituximab que aqueles comF/F (por exemplo, veja, Cartron e cols. (2002) Blood99 (3): 754-758 ou DallOzzo e cols. (2004) Câncer Res.64:46644669). Para pacientes que desenvolvem resistência aesse anticorpo monoclonal, ou que têm uma doençainflamatória ou doença autoimune que é resistente à terapiainicial com esse anticorpo, formas alternativas deintervenção terapêutica são necessárias.

Além disso, Rituxan® consome células B normais empacientes. Portanto, ele pode ser usado para tratar doençasautoimunes e inflamatórias dependentes de células B.

Há, portanto, uma necessidade continuada por novosagentes terapêuticos e novas estratégias terapêuticas paradoenças inflamatórias e doenças autoimunes. Em particular,há uma necessidade por novas estratégias terapêuticas parao tratamento de pacientes refratário ao tratamento comanticorpos anti-CD20, como rituximab (Rituxan®).

Breve sumário da invenção

São fornecidos métodos para o tratamento de umpaciente humano para uma doença inflamatória ou doençaautoimune que está associada a células que expressam CD40,em que o paciente humano é heterozigótico ou homozigóticopara FcyRIIIa-158F (genótipo V/F ou F/F). Os métodoscompreendem a administração ao paciente humano de umaquantidade terapeuticamente ou profilaticamente eficaz deum anticorpo anti-CD40. A invenção também fornece o uso deuma quantidade terapeuticamente ou profilaticamente eficazde um anticorpo anti-CD40 na manufatura de um medicamentopara o tratamento de uma doença inflamatória ou doençaautoimune que está associada a células que expressam CD4 0em um paciente humano heterozigótico ou homozigótico paraFcyRIIIa 158F (genótipo V/F ou F/F).

Também são fornecidos métodos de inibição de produçãode anticorpo por células B em um paciente humanoheterozigótico ou homozigótico para FcyRIIIa-158F (genótipoV/F ou F/F), que compreende a administração ao pacientehumano de uma quantidade eficaz de um anticorpo anti-CD40.A invenção também fornece o uso de uma quantidade eficaz deum anticorpo anti-CD40 na manufatura de um medicamento parainibição da produção de anticorpo por células B em umpaciente humano heterozigótico ou homozigótico paraFcyRIIIal58F (V/F ou F/F).

Métodos e kits para a identificação de um pacientehumano com uma doença inflamatória ou autoimune que étratável com um anticorpo anti-CD4 0 e que é refratário aotratamento com rituximab (Rituxan®) são também fornecidos.Em algumas modalidades, os métodos compreendem: a) aidentificação de um paciente humano com uma doençainflamatória ou doença autoimune que está associada acélulas que expressam CD40 e que é refratária ao tratamentocom rituximab (Rituxan®); e b) a determinação do genótipoFcyRIIIa-158 do paciente humano (VN, V/F ou F/F); em que adoença inflamatória ou doença autoimune é tratável com umanticorpo anti-CD40 se o paciente humano é heterozigóticoou homozigótico para FcyRIIIal58F (genótipo V/F ou F/F). Ainvenção também pode incluir a etapa de administração a umpaciente humano identificado com o uso desse método de umaquantidade terapeuticamente ou profilaticamente eficaz deum anticorpo anti-CD40. Kits da presente invenção quefornecem a identificação de um paciente humano com umadoença inflamatória ou doença autoimune que é tratável comum anticorpo anti-CD4 0 compreendem reagentes para adeterminação de um genótipo FcyRIIIa-158 de um pacientehumano.

A invenção também fornece métodos e kits para aseleção de uma terapia com anticorpo para o tratamento deum paciente humano que tem uma doença inflamatória oudoença autoimune que é refratária ao tratamento com"15 rituximab (Rituxan®). Em algumas modalidades, os métodoscompreendem: a) a identificação de um paciente humano quetem uma doença inflamatória ou autoimune que está associadaa células que expressam CD4 0 e que é refratário aotratamento com rituximab (Rituxan®); e b) determinação dogenótipo FcyRIIIa-158 de um paciente humano (V/V, V/F ouF/F); em que, se o paciente humano é heterozigótico ouhomozigótico para FcyRIIIa-158F (genótipo V/F ou F/F), umanticorpo anti-CD40 é selecionado para o tratamento dadoença inflamatória ou doença autoimune. A invenção tambémpode incluir a etapa de administração a um paciente humanoidentificado com o uso desse método de uma quantidadeterapeuticamente ou profilaticamente eficaz de um anticorpoanti-CD40. Kits da presente invenção que fornecem a seleçãode uma terapia de anticorpo para o tratamento de umpaciente humano que tem uma doença inflamatória ouautoimune associada com células que expressam CD40compreendem reagentes para a determinação de um genótipoFcγRIIIa-158 de um paciente humano.

A presente invenção também fornece métodos para otratamento de um paciente humano para uma doençainflamatória ou doença autoimune que está associada acélulas que expressam CD40, em que os métodos compreendem aadministração ao paciente humano de um anticorpo deinternalização lenta. Em uma tal modalidade, uma quantidadeterapeuticamente ou profilaticamente eficaz de um anticorpoanti-CD40 é administrada ao paciente humano de modo que oanticorpo anti-CD40 não seja significativamenteinternalizado por células que expressam CD40 após suaadministração. Em uma outra tal modalidade, uma quantidadeterapeuticamente ou profilaticamente eficaz de um anticorpoanti-CD40 é administrada ao paciente humano de modo que oanticorpo anti-CD40 permaneça substancialmenteuniformemente distribuído na superfície de células queexpressam CD40 após sua administração. Ainda em uma outramodalidade, um anticorpo anti-CD40 é administrado aopaciente humano de modo que uma quantidade terapeuticamenteou profilaticamente eficaz do anticorpo anti-CD40 estejapresente na superfície de células que expressam CD40 nopaciente humano após sua administração.

Anticorpos anti-CD40 para uso de acordo com a presenteinvenção se ligam especificamente ao antígeno de CD40. Emalgumas modalidades, anticorpos anti-CD40 para uso nosmétodos da presente invenção, em particular, anticorposmonoclonais, exibem uma forte afinidade de ligação porFcγRIIIa-158V humano, uma forte afinidade de ligação porFcyRIIIa-158F humano, uma forte afinidade de ligação porFcyRIIIa-158V e FcyRIIIa-158F humano. Em algumas dessasmodalidades, os anticorpos anti-CD40 podem se ligar aqualquer um dos dois alótipos de aminoácido 158 de FcyRIIIa(V ou F) em células killer naturais (NK) de um pacientehumano com características de ligação que são adequadaspara causar potente citoxicidade celular dependente deanticorpo (ADCC). Anticorpos anti-CD40 adequados incluem,mas não são limitados a, anticorpos anti-CD4 0 que sãolivres de significante atividade agonista, incluindo, porexemplo, anticorpos anti-CD4 0 que são um antagonista desinalização CD40-CD40L em células que expressam CD40. Emalgumas modalidades, o anticorpo anti-CD40 é selecionado dogrupo que consiste em: a) o anticorpo monoclonal CHIR-12.12; b) o anticorpo monoclonal produzido pela linha decélulas de hibridoma 12.12; c) um anticorpo monoclonal quecompreende uma seqüência de aminoácidos selecionada dogrupo que consiste na seqüência mostrada em Id. de Seq.N0:2, a seqüência mostrada em Id. de Seq. N0:4, a seqüênciamostrada em Id. de Seq. N°:5, ambas as seqüências mostradasem Id. de Seq. N°: 2 e Id. de Seq. N° :4, e ambas asseqüências mostradas em Id. de Seq. N0 :2 e Id. de Seq.N° : 5; d) um anticorpo monoclonal que tem uma seqüência deaminoácidos codificada por uma molécula de ácido nucléicoque compreende uma seqüência de nucleotídeos selecionada dogrupo que consiste na seqüência mostrada em Id. de Seq.N°:1, a seqüência mostrada em Id. de Seq. N°:3, e ambas asseqüências mostradas em Id. de Seq. N0 :1 e Id. de Seq.N0 :3; e) um anticorpo monoclonal que se liga a um epitopocapaz de ligar o anticorpo monoclonal produzido pela linhade células de hibridoma 12.12; f) um anticorpo monoclonalque se liga a um epitopo que compreende resíduos 82-87 daseqüência de CD4 0 humano mostrada em Id. de Seq. N0 :7 ouId. de Seq. N°: 9; g) um anticorpo monoclonal que se liga aum epitopo que compreende resíduos 82-89 da seqüência deCD40 humano mostrada em Id. de Seq. N0 :7 ou Id. de Seq.N°: 9; h) um anticorpo monoclonal que compete com oanticorpo monoclonal CHIR-12.12 em um ensaio de ligaçãocompetitiva; i) o anticorpo monoclonal do item a) anteriorou um anticorpo monoclonal de qualquer um dos itensanteriores c)-h), em que o anticorpo é recombinantementeproduzido; e j) um anticorpo monoclonal que é um fragmentode ligação a antígeno de um anticorpo monoclonal dequalquer um dos itens anteriores a)-i), em que o fragmentoretém a capacidade de se ligar especificamente ao antígenoCD40 humano.

Os métodos da presente invenção têm uso no tratamentode doenças inflamatórias ou doenças autoimunes que sãoassociadas com células que expressam CD40. Exemplosincluem, sem limitação, lúpus eritematoso disseminado(LED), lúpus discóide, nefrite de lúpus, sarcoidose,artrite inflamatória incluindo artrite juvenil, artritereumatóide, artrite psoriática, síndrome de Reiter,espondilite anquilosante, artrite da gota, rejeição detransplante de órgão ou tecido, rejeição hiperaguda, agudaou crônica e/ou enxerto versus doença do hospedeiro,esclerose múltipla, síndrome de hiper IgE, poliarteritenodosa, cirrose biliar primária, doença inflamatóriaintestinal, doença de Crohn, doença celíaca (enteropatiasensível ao glúten), hepatite autoimune, anemia perniciosa,anemia hemolítica autoimune, psoríase, escleroderma,miastenia grave, púrpura trombocitopênica autoimune,tireoidite autoimune, doença de Grave, tireoidite deHashimoto, doença do complexo imune, síndrome da disfunção imune de fadiga crônica (CFIDS), polimiosite edermatomiosite, crioglobulinemia, trombólise,

cardiomiopatia, pênfigo vulgar, fibrose intersticialpulmonar, diabetes melito tipo I e tipo II,hipersensibilidade tipo retardada tipo 1, 2, 3 e 4, alergia ou distúrbios alérgicos, respostas imunes indesejadas aproteínas terapêuticas, asma, síndrome de Churg-Strauss(granulomatose alérgica), dermatite atópica, dermatite decontato irritante e alérgica, urticária, alergia mediadapor IgE, aterosclerose, vasculite, miopatias inflamatórias idiopáticas, doença hemolítica, doença de Alzheimer1S epolineuropatia desmielinizante inflamatória crônica,inflamação pulmonar incluindo, sem limitação, rejeição aenxerto pulmonar, asma, sarcoidose, enfisema, fibrosecística, fibrose pulmonar idiopática, bronquite crônica, rinite alérgica e doenças alérgicas do pulmão comopneumonite de hipersensibilidade, pneumonia eosinofílica,bronquiolite obliterante devido à transplante de medulaóssea e/ou pulmonar ou outras causas, aterosclerose deenxerto/flebosclerose de enxerto, fibrose pulmonar que resulta de doenças do colágeno, vasculares e doençasautoimunes como artrite reumatóide e lúpus eritematoso, bemcomo doenças inflamatórias ou doenças autoimunes associadasa células que expressam CD20. Os métodos da invenção sãoparticularmente vantajosos com relação a doenças inflamatórias e doenças autoimunes que são associadas comcélulas que expressam CD40 e CD20. Desse modo, a presenteinvenção permite o tratamento de pacientes que têm umadoença inflamatória ou autoimune que é não responsiva ourefratária â terapia com outros agentes terapêuticos,incluindo anticorpos anti-CD20 para pacientes que sãohomozigóticos ou heterozigótico para FcyRIIIa-158F(genótipo V/F ou F/F).Breve descrição dos desenhos

Figuras IA-IF mostram resultados de uma análise decitotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC)(ADCC) em seis linhas de células.

Figuras 2A-2D mostram resultados de uma análise decitotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC)(ADCC) em células de paciente com CLL (n = 8) .

Figura 3 resume os resultados de uma análise de ADCCem células de pacientes com CLL (n=9).

Figura 4 mostra os resultados de uma análise de ADCCem células de pacientes com CLL, com o uso de células NKefetoras de dois diferentes doadores.

Figura 5 mostra os resultados de quantificação deexpressão em superfície de célula CD4 0 e CD2 0 em células depacientes com CLL e células B normais.

Figura 6 sumariza a atividade ADCC para células comexpressão em superfície de célula CD40 e CD20 quantificada.

Figura 7 é um gráfico em barras que mostra níveis deCHIR-12.12 ligado a superfície celular em linhas de célulasDaudi e ARH77.

Figura 8 mostra os resultados de investigação deinternalização de CHIR-12.12 e rituximab em células depacientes com CLL por análise de FACS.Figura 9 mostra os resultados de investigação deinternalização de CHIR-12.12 e rituximab em células Bnormais por microscopia confocal de anticorpos rotuladoscom FITC.

Figura 10 mostra os resultados de investigação deinternalização de CHIR-12.12 e rituximab em células depacientes com CLL por microscopia confocal de anticorposrotulados com Alexa4 88.

Figura 11 resume a relação entre atividade de ADCC einternalização.

Figura 12 é um gráfico em barra que mostra percentagemde lise máxima específica de células Daudi por CHIR-12.12ou rituximab por células efetoras NK purificadas dedoadores com diferentes genótipos de FcyRIIIa.

Figura 13 é um gráfico em barra que mostra a potênciade ADCC (ED50) de CHIR-12.12 ou rituximab sobre célulasDaudi por células efetoras NK purificadas de doadores comdiferentes genótipos de FcyRIIIa.

Figura 14 resume ADCC comparativo de CHIR-12.12 erituximab contra células de paciente com CLL (n=9) porcélulas NK humanas de doadores humanos de múltiplos genótipos.

Descrição detalhada da invenção

Os inventores descobriram, de forma surpreendente, queos anticorpos anti-CD4 0, como CHIR-12.12, são capazes demediar potente citotoxicidade celular dependente deanticorpo (ADCC) de células alvo que expressam CD4 0 sobcondições em que outros anticorpos que medeiam ADCC sãomenos eficazes ou relativamente ineficazes. Ao contrário deoutros anticorpos, como rituximab (Rituxan®), anticorposanti-CD40 usados de acordo com a invenção podem se ligar aqualquer um dos dois alótipos de aminoácido 158 de FcyRIIIa(V or F) em células natural killer (NK) de paciente humanocom características de ligação que são adequadas paracausar potente ADCC. Esse achado é inesperado e representaum avanço em nossa capacidade para tratar doençasinflamatórias e doenças autoimunes por toda uma seção de umpaciente.

Portanto, anticorpos anti-CD40, como CHIR-12.12, podemser usados no tratamento de doenças inflamatórias e doençasautoimunes associadas com células que expressam CD-4 0 empacientes humanos heterozigóticos ou homozigóticos paraFcyRIIIa-158F (genótipo V/F ou F/F), além de pacienteshumanos homozigóticos para FcyRIIIa-158V (genótipo V/V).

A invenção assim fornece um método para o tratamentode um paciente humano para uma doença inflamatória oudoença autoimune que está associada a células que expressamCD4 0, em que o referido paciente humano é heterozigótico ouhomozigótico para FcyRIIIa-158F (genótipo V/F ou F/F), ométodo compreendendo a administração ao referido pacientehumano de uma quantidade terapeuticamente ouprofilaticamente eficaz de um anticorpo anti-CD40. Ainvenção também fornece o uso de uma quantidadeterapeuticamente ou profilaticamente eficaz de um anticorpoanti-CD4 0 na manufatura de um medicamento para o tratamentode uma doença inflamatória ou doença autoimune que estáassociada a células que expressam CD4 0 em um pacientehumano heterozigótico ou homozigótico para FcyRIIIa 158F(genótipo V/F ou F/F).

Como acima observado, a atividade clínica de rituximabem NHL mostrou estar correlacionada com o genótipo deFcyRIIIa do paciente. Pacientes com o polimorfismo de 158aade FcyRIIIa de F/F são menos responsivos a rituximab queaqueles com V/V ou V/F (por exemplo, veja, Cartron e cols.(2002) Blood 99 (3) : 754-758 ou DallOzzo e cols. (2004)Câncer Res. 64:4664-4669. Como acima observado, Rituxan®está em experimentos clínicos para doenças autoimunes.Portanto, a presente invenção é vantajosa para o tratamentode doenças inflamatórias e doenças autoimunes que não sãoresponsivas ao tratamento com um anticorpo anti-CD20 comorituximab (Rituxan®). Além disso, tal potente morte decélulas alvo sem a necessidade de usar um conjugadoanticorpo-toxina resultará em um medicamento de custo menorde produção e que tem menos efeitos colaterais.

Anticorpos anti-CD40, como CHIR-12.12, podem serusados em métodos para a inibição da produção de anticorpopor células B em um paciente humano heterozigótico ouhomozigótico para FcyRIIIa-158F (genótipo V/F ou F/F) , emadição a pacientes humanos homozigóticos para FcyRIIIa-158V(genótipo V/V).

Portanto, a invenção fornece um método de inibição deprodução de anticorpo por células B em um paciente humanoheterozigótico ou homozigótico para FcyRIIIa-158F (genótipoV/F ou F/F), que compreende a administração ao referidopaciente humano de uma quantidade eficaz de um anticorpoanti-CD4 0, como CHIR-12.12. A invenção também fornece o usode uma quantidade eficaz de um anticorpo anti-CD40 namanufatura de um medicamento para inibição da produção deanticorpo por células B em um paciente humanoheterozigótico ou homozigótico para FcyRIIIa-158F (V/F ouNão seria esperado por pessoa habilitada na técnicaque se pudesse inibir a produção de anticorpos por célulasB em um paciente humano heterozigótico ou homozigótico paraFcyRIIIa-158F (genótipo V/F ou F/F).

A presente invenção permite o regime de tratamentoselecionado para um paciente humano individual a serbaseado naquele genótipo de FcyRIIIa-158 do paciente poradministração de um anticorpo anti-CD4 0 que medeia ADCC.

A invenção fornece um método para a identificação deum paciente humano com uma doença inflamatória ou doençaautoimune tratável com um anticorpo anti-CD4 0 e que érefratária ao tratamento com rituximab (Rituxane), quecompreende:

a) a identificação de um paciente humano com umadoença inflamatória ou doença autoimune que está associadaa células que expressam CD4 0 e que é refratário aotratamento com rituximab (Rituxan®);

b) a determinação do referido genótipo FcyRIIIa-158 dopaciente humano (VN7 V/F ou F/F);

em que a referida doença inflamatória ou doençaautoimune é tratável com um anticorpo anti-CD4 0 se oreferido paciente humano é heterozigótico ou homozigóticopara FcyRIIIal58F (genótipo V/F ou F/F) . A invenção tambémpode incluir a etapa de administração a um paciente humanoidentificado com o uso desse método de uma quantidadeterapeuticamente ou profilaticamente eficaz de um anticorpoanti-CD40.

Esse método de identificação de um paciente humano com

3 0 uma doença inflamatória ou doença autoimune tratável com umanticorpo anti-CD40 pode ser facilmente realizável por umapessoa habilitada na técnica com o uso de um kitdiagnóstico adequado. 0 kit pode compreender reagentesadequados para a determinação de um genótipo FcyRIIIa-158de um paciente humano. Portanto, a invenção também forneceum kit para a identificação de um paciente humano com umadoença inflamatória ou doença autoimune tratável com umanticorpo anti-CD40, que compreende reagentes para adeterminação de um genótipo FcyRIIIa-15 8 de um pacientehumano. Kits adequados são descritos em maiores detalhes emoutra parte nesta especificação.

A invenção também fornece um método para seleção deuma terapia de anticorpo para tratamento de um pacientehumano que tem uma doença inflamatória ou doença autoimuneque é refratária ao tratamento com rituximab (Rituxan®),que compreende:

a) a identificação de um paciente humano que tem umadoença inflamatória ou doença autoimune que está associadaa células que expressam CD40 e que é refratária aotratamento com rituximab (Rituxan®); e

b) determinação do referido genótipo FcyRIIIa-158 deum paciente humano (V/V, V/F ou F/F);

em que, se o referido paciente humano é heterozigóticoou homozigótico para FcyRIIIa-158F (genótipo V/F ou F/F),um anticorpo anti-CD40 é selecionado para o tratamento dareferida doença inflamatória ou doença autoimune. Emparticular, um anticorpo anti-CD40 pode ser selecionado empreferência ao tratamento com rituximab (Rituxan®). Ainvenção também pode incluir a etapa de administração a umpaciente humano identificado com o uso desse método de umaquantidade terapeuticamente ou profilaticamente eficaz deum anticorpo anti-CD40.

Esse método de seleção de uma terapia de anticorpopara o tratamento de um paciente humano que tem uma doençainflamatória ou doença autoimune pode ser facilmenterealizado por uma pessoa habilitada na técnica com o uso deum kit diagnóstico adequado. 0 kit deve compreenderreagentes adequados para a determinação de um genótipoFcyRIIIa-158 de um paciente humano. Portanto, a invençãotambém fornece um kit para a seleção de uma terapia deanticorpo para tratamento de um paciente humano que tem umadoença inflamatória ou doença autoimune associada comcélulas que expressam CD4 0, que compreende reagentes para adeterminação de um genótipo FcyRIIIa-158 de um pacientehumano.

Os inventores descobriram, de forma surpreendente, queos anticorpos anti-CD4 0, como CHIR-12.12, não sãosignificativamente internalizados por células que expressamCD4 0 após administração. Ao contrário, anticorpos anti-CD4 0, como CHIR-12.12, são substancialmente uniformementedistribuídos na superfície de células que expressam CD4 0por um período de tempo significativo após a administração.Isso está em contraste com outros anticorpos, em particularanticorpos anti-CD20, como rituximab (Rituxan®).

A duração da ligação de CD4 0 na superfície de célulasque expressam CD4 0 e a distribuição uniforme do anticorpoanti-CD4 0 na superfície de células que expressam CD4 0permitem que o anticorpo anti-CD4 0 medeie potentecitotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC) decélulas alvo que expressam CD4 0, via ligação a um FcR, comoFcyRIIIa em células natural killer (NK) .

Portanto, a invenção fornece um método para otratamento de um paciente humano para uma doençainflamatória ou doença autoimune que está associada acélulas que expressam CD4 0, o método compreendendo aadministração, ao referido paciente humano de uma quantidadeterapeuticamente ou profilaticamente eficaz de um anticorpoanti-CD4 0, de modo que o anticorpo anti-CD4 0 não sejasignificativamente internalizado por células que expressamCD4 0 após a administração.

A invenção também fornece um método para o tratamentode um paciente humano para uma doença inflamatória oudoença autoimune que está associada a células que expressamCD4 0, o método compreendendo a administração ao referidopaciente humano de uma quantidade terapeuticamente ouprofilaticamente eficaz de um anticorpo anti-CD40, de modoque o anticorpo anti-CD4 0 permaneça substancialmenteuniformemente distribuído na superfície de células queexpressam CD4 0 após administração.

A invenção também fornece um método para o tratamentode um paciente humano para uma doença inflamatória oudoença autoimune que está associada a células que expressamCD4 0, o método compreendendo a administração ao referidopaciente humano de um anticorpo anti-CD40, de modo que umaquantidade terapeuticamente ou profilaticamente eficaz doanticorpo anti-CD4 0 esteja presente na superfície decélulas que expressam CD4 0 no referido paciente humano apósa administração.

Esses aspectos da invenção envolvem, assim, aadministração a um paciente de um anticorpo deinternalização lenta. Por "anticorpo de internalizaçãolenta", entende-se um anticorpo que permanece disposto nasuperfície celular por um período de tempo significativo.Como a pessoa habilitada estará ciente, essa propriedadecontrasta com propriedades consideradas vantajosas paravárias aplicações terapêuticas que realmente requereminternalização de complexo anticorpo-receptor para que aterapia seja eficaz. Nesse contexto, um período de temposignificativo geralmente excede 3 horas, preferivelmente 6horas, mais preferivelmente 12 horas, mais preferivelmente24 horas, 36 horas, 48 horas, 72 horas, 96 horas, 120horas, 144 horas, 168 horas ou mais.

Preferivelmente, pelo menos 5%, pelo menos 10%, pelomenos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%,pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos90%, ou mais do anticorpo inicialmente disposto nasuperfície de uma célula que expressa CD4 0 permanecedisposto na superfície da célula após o período de temposignificativo acima.

A internalização de anticorpos pode ser avaliada porvários ensaios. Por exemplo, linhas de células como a linhade células de Iinfoma Daudi, ou linha de células ARH77 MM,podem ser usadas para avaliar o efeito da ligação deanticorpo candidato em internalização. As células sãoincubadas com IgGl humana (anticorpo de controle) ou oanticorpo candidato em gelo (com 0,1% azida de sódio parabloquear a internalização) ou 37°C (sem azida de sódio) porum período de tempo, adequadamente 3 horas. Depois de umalavagem com tampão de coloração frio (por exemplo,PBS+l%BSA+0,1% azida de sódio), as células são coradas, porexemplo, com IgG-FITC anti-humana de cabra por 30 minutosem gelo. O grau de coloração pode ser então avaliado; nesseexemplo, a intensidade fluorescente média geométrica (MFI)pode ser registrada, como por FACS Calibur. Outros ensaiosadequados serão aqueles conhecidos por aqueles habilitadosna técnica (veja, por,exemplo,

http://wvvw.abgenix.com/documents/SBS2003%20poster.pdf) .

Em experimentos apresentados nos Exemplos 4 e 5 nestaespecificação, nenhuma diferença na MFI foi observada entrecélulas incubadas com CH12.12 em gelo na presença de azidade sódio ou a 37°C na ausência de azida de sódio (veja asFiguras 7-10). Esses dados mostram que CH12.12, apósligação a CD40, não é internalizado e continua a serapresentado na superfície celular.

Um resumo de técnicas e procedimentos padrão que podemser empregados para utilizar a invenção é dado abaixo.Deve-se entender que esta invenção não é limitada àmetodologia particular, protocolos, linhas de célula,vetores e reagentes descritos. Deve-se também compreenderque a terminologia aqui usada é para o objetivo dedescrição de modalidades particulares apenas, e não sepretende que essa terminologia limite o escopo da presenteinvenção. A extensão da invenção é limitada apenas pelostermos das reivindicações em anexo.

Abreviações padrão para nucleotideos e aminoácidos sãousadas nessa especificação.

A prática da presente invenção empregará, a menos queindicado de outra forma, técnicas convencionais de biologiamolecular, microbiologia, tecnologia de DNA recombinante eimunologia, que estão dentro da habilidade daqueles quetrabalham na técnica.

Tais técnicas são totalmente explicadas na literatura.Exemplos de textos particularmente adequados para consultaincluem os seguintes: Sambrook e cols. (198 9) MolecularCloning; A Laboratory Manual (2 a ed.); D. N Glover, ed.(1985) DNA Cloning, Volumes I e II; M.J. Gait, ed. (1984)Oligonucleotide Synthesis; B.D. Hames & S.J. Higgins, eds.(1984) Nucleic Acid Hybridization; B.D. Hames & S.J.Higgins, eds. (1984) Transcription and Translation; R.I.Freshney, ed. (1986) Animal Cell Culture; Iwmobilized Cellsand Enzymes (IRL Press, 198 6); B. Perbal (1984) A PractiealGuide to Molecular Cloning; Methods in Enzymology series(Academic Press, Inc.), especialmente volumes 154 & 155;J. H. Miller and M.P. Calos, eds. (1987) Gene TransferVectors for Mammalian Cells (Cold Spring HarborLaboratory); Mayer and Walker, eds. (1987) ImmunochemicalMethods in Cell and Molecular Biology (Academic Press,London); Scopes (1987) Protein Purification: Principies andPractice (2a ed.; Springer Verlag, N.Y.); e D.M. Weir e C.C. Blackwell, eds. (1986) Handbook of ExperimentalImmunology, Volumes I-IV.

Os métodos da invenção envolvem o uso de anticorposanti-CD40 no tratamento de doenças inflamatórias e doençasautoimunes associada com células que expressam CD40.

Por "CD40", "antígeno CD40" ou "receptor de CD40",entende-se a glicoproteína de transmembrana de 50-55 kDa dafamília de receptor de fator de necrose tumoral (TNF)(veja, por exemplo, Patentes U.S. Nos. 5.674.492 e4.708.871; Stamenkovic e cols. (1989) EMBO 8:1403; Clark(1990) Tissue Antigens 36:33; Barclay e cols. (1997) TheLeucocyte Antigen Facts Book (2a ed. ; Academic Press, SanDiego)). Foram identificadas duas isoformas de CD40 humano,codificadas por variantes de transcrito combinadasalternativamente desse gene. A primeira isoforma (tambémconhecida como "isoforma longa" ou "isoforma 1") é expressacomo um polipeptídeo precursor de 277 aminoácidos (Id. deSeq. N°:9; relatada inicialmente como N0 de Acesso noGenBank CAA43045 e identificada como isoforma 1 no N0 deAcesso no GenBank NP_001241), codificada por Id. de Seq.N°:8 (veja, NoS de Acesso no GenBank X60592 e NM_001250) ) ,que tem uma seqüência sinalizadora representada pelosprimeiros 19 resíduos. A segunda isoforma (também conhecidacomo a "isoforma curta" ou "isoforma 2") é expressa como umpolipeptídeo precursor de 203 aminoácidos (Id. de Seq.N°:7; N0 de Acesso no GenBank NP_690593), codificada porId. de Seq. N0-.6 (N° de Acesso no GenBank NM_152854) , quetambém tem uma seqüência sinalizadora representada pelosprimeiros 19 resíduos. Os polipeptídeos precursores dessasduas isoformas de CD40 humano compartilham em comum seusprimeiros 165 resíduos (ou seja, resíduos 1-165 de Id. deSeq. N0 :7 e Id. de Seq. N°: 9). O polipeptídeo precursor daisoforma curta (mostrada em Id. de Seq. N°:7) é codificadopor uma variante do transcrito (Id. de Seq. N°: 6)desprovida de um segmento codificador, o que leva a umamudança na estrutura de tradução; a isoforma de CD4 0resultante contém um terminal C mais curto e distinto(resíduos 166-203 de Id. de Seq. N°:7) daquele contido naisoforma longa de CD4 0 (terminal C mostrado nos resíduos166-277 de Id. de Seq. N°:9). Para as finalidades dapresente invenção, o termo "antígeno CD40", "antígeno desuperfície celular CD40", "receptor de CD40" ou "CD40"engloba tanto a isoforma curta quanto a longa de CD40. Oantígeno CD40 pode ser completa ou parcialmenteglicosilado.

Como apontado em outra parte nesta especificação, CD40é encontrado na superfície de células B humanas normais eneoplásicas, células dendríticas, monócitos, macrófagos,células T CD8+, células endoteliais, células monocíticas eepiteliais, células T ativadas, plaquetas ativadas, célulasde músculo liso vascular inflamadas, eosinófilos, membranassinoviais em artrite reumatóide, fibroblastos dérmicos eoutros tipos de células não linfóides.

"Células que expressam CD40" significa qualquer tipode célula normal ou maligna que expresse níveis detectáveisdo antígeno CD40. Preferivelmente, as células que expressamCD40 são células que expressam níveis detectáveis deantígeno CD40 de superfície celular. Métodos para adetecção da expressão de CD40 em células são bem conhecidosna técnica e incluem, sem limitação, técnicas de PCR,imunoistoquímica, citometria de fluxo, Western blot, ELISA,e semelhantes. Esses métodos permitem a detecção de mRNA deCD40, antígeno CD40 e antígeno CD40 de superfície celular.A detecção de expressão de CD40 de superfície celular podeser realizada como descrito no Exemplo 3 nestaespecificação, ou por outros métodos adequados.

Por "ligante de CD40" ou "CD40L", entende-seprimariamente a proteína de transmembrana de 32-33 kDa quetambém existe em duas formas menores solúveisbiologicamente ativas, de 18 kDa e 31 kDa, respectivamente(Graf e cols. (1995) Eur. J. Iwmunol. 25:1749- 1754; Mazzeie cols. (1995) J. Biol. Chem. 270:7025-7028; Pietravalle ecols. (1996) J Biol. Chem. 271:5965-5967). CD4 0L humano étambém conhecido como CD154 ou gp39. Por "ligante de CD40"ou "CD40L", também se entende qualquer outro peptídeo,polipeptídeo ou proteína que possa ligar e ativar uma oumais vias de sinalização de CD40. Portanto, "ligantes deCD40" incluem, sem limitação, proteínas de ligante de CD40de comprimento total e variantes e fragmentos destas queretêm suficiente atividade para realizar a função deligação e estímulo da sinalização de CD4 0 em células queexpressam CD40. Modificações a um ligante de CD40 nativo,por exemplo, CD4 0L humano, incluem, sem limitação,substituições, deleções, truncações, extensões, proteínasde fusão, fragmentos, peptidomiméticos e outros.

Por "sinalização de CD40", entende-se qualquer uma dasatividades biológicas que resultam da interação de CD4 0 desuperfície celular com um ligante de CD4 0 ou outroagonista, como um anticorpo agonista. Exemplos desinalização de CD4 0 são sinais que levam à proliferação esobrevivência de células que expressam CD4 0, e estímulo deuma ou mais vias de sinalização de CD4 0 em células queexpressam CD40. Uma "via de sinalização de CD40" ou "via detransdução de sinal" deve significar pelo menos uma reaçãobioquímica, ou um grupo de reações bioquímicas, queresultam de interação do receptor de CD40 com um ligante deCD4 0, por exemplo, CD4 0L, e que geram um sinal que, quandotransmitido através da via de sinal, leva à ativação de umaou mais moléculas abaixo na cascata de sinalização. As viasde transdução de sinal envolvem inúmeras moléculas detransdução de sinal que levam à transmissão de um sinal doreceptor de CD40 de superfície celular por toda a membranaplasmática de uma célula, e através de uma ou mais em umasérie de moléculas de transdução de sinal, através docitoplasma da célula, e, em alguns casos, no núcleo dacélula. De interesse particular para a presente invençãosão vias de transdução de sinal de CD40, que incluem a viade sinalização de AKT, que leva ã ativação de AKT, efinalmente à ativação de NF-κΒ por meio da via desinalização de NF-κΒ; e proteína quinase ativada por viasde sinalização de mitógeno (MAPK) , incluindo a via desinalização de MEK/ERK e a via de sinalização de MEK/p38,que levam à ativação de ERK e p38, respectivamente.

Como acima observado, a presente invenção fornece ummétodo para o tratamento de um paciente humano para umadoença inflamatória ou doença autoimune que está associadaa células que expressam CD4 0, em que o referido pacientehumano é heterozigótico ou homozigótico para FcyRIIIa-158F(genótipo V/F ou F/F), o método compreendendo aadministração ao referido paciente humano de uma quantidadeterapeuticamente ou profilaticamente eficaz de um anticorpoanti-CD40.

Por "paciente humano", entende-se um paciente humanoque é atingido, tem risco de desenvolver, ou está emrecaída de qualquer doença inflamatória ou doença autoimuneque está associada com células que expressam CD40.

Por "doença inflamatória ou doença autoimune associadacom células que expressam CD40", entende-se qualquer doençainflamatória ou doença autoimune associada com células queexpressam CD40. A doença inflamatória ou doença autoimuneassociada com células que expressam CD40 pode ser umadoença inflamatória ou doença autoimune associada com umnível indesejável de sinalização de CD4 0 em células queexpressam CD4 0, ou a doença inflamatória ou doençaautoimune pode ser apenas indiretamente associada comcélulas que expressam CD40. Por "uma doença inflamatória oudoença autoimune associada com um nível indesejável desinalização de CD40", entende-se uma doença inflamatória oudoença autoimune cujo desenvolvimento ou progressão estáassociado com um nível indesejável de sinalização de CD40.

Por "um nível indesejável de sinalização de CD4 0",entende-se qualquer nível fisiologicamente indesejável desinalização de CD4 0 que pode ocorrer em células queexpressam CD4 0 em um paciente humano que tem uma doençainflamatória ou doença autoimune.

Doenças inflamatórias são caracterizadas porinflamação e destruição tecidual, ou uma combinação destas."Doença inflamatória" inclui qualquer processo inflamatóriocom mediação imune em que o evento de iniciação ou alvo daresposta imune envolva antígeno(s) não-próprio(self),incluindo, por exemplo, aloantígenos, xenoantígenos,antígenos virais, antígenos bacterianos, antígenosdesconhecidos ou alérgenos.

Como aqui usado, o termo "auto-imunidade" é geralmentecompreendido como englobando processos inflamatórios imune-mediados que envolvem antígenos "próprio". Em doençasautoimunes, antígenos próprio despertam respostas imunes dohospedeiro.

A presente invenção pode ser usada no tratamento deinflamação associada com rejeição a transplante de tecidos."Rejeição de transplante" ou "rejeição de enxerto" serefere a qualquer resposta imune montada pelo hospedeirocontra um enxerto incluindo, sem limitação, antígenos HLA7antígenos do grupo sangüíneo, e semelhantes.

A invenção também pode ser usada para o tratamento dedoença enxerto versus hospedeiro, como a que ocorreassociada ao transplante de medula óssea, por exemplo.

Nessa doença enxerto versus hospedeiro, a medula ósseadoadora inclui linfócitos e células que amadurecemtornando-se linfócitos. Os linfócitos do doador reconhecemos antígenos do receptor como não-próprio e montam umaresposta inflamatória imune. Desse modo, como aqui usado,"doença enxerto versus hospedeiro" ou "reação enxertoversus hospedeiro" se refere a qualquer resposta imunemediada por células T na qual os linfócitos do doadorreagem com os antígenos do hospedeiro.

Doenças inflamatórias e doenças autoimunes que podemser tratadas de acordo com os métodos da invenção incluem,sem limitação, lúpus eritematoso sistêmico (LES), lúpusdiscóide, nefrite lúpica, sarcoidose, artrite inflamatória,incluindo artrite juvenil, artrite reumatóide, artritepsoriática, síndrome de Reiter, espondilite anquilosante eartrite da gota, rejeição de um transplante de órgão outecido, rejeição hiperaguda, aguda, ou crônica e/ou doençaenxerto versus hospedeiro, esclerose múltipla, síndrome dehiper IgE, poliarterite nodosa, cirrose biliar primária,doença inflamatória do intestino, doença de Crohn, doençacelíaca (enteropatia sensível ao glúten), hepatiteautoimune, anemia perniciosa, anemia hemolítica autoimune,psoríase, esclerodermia, miastenia gravis, púrpuratrombocitopênica autoimune, tireoidite autoimune, doença deGrave, tireoidite de Hashimoto, doença de complexo imune,síndrome de disfunção de fadiga crônica imune (CFIDS),polimiosite e dermatomiosite, crioglobulinemia, trombólise,cardiomiopatia, pênfigo vulgar, fibrose pulmonarintersticial, diabetes melito Tipo I e Tipo II,hipersensibilidade retardada do tipo 1, 2, 3, e 4, alergiaou distúrbios alérgicos, respostas imunes indesejadas/nãointencionais às proteínas terapêuticas (veja por exemplo,Pedido de Patente U.S. N° US 2002/0119151 e Koren, e cols.(2002) Curr. Pharm. Biotechnol. 3:349-60), asma, síndromede Churg-Strauss (granulomatose alérgica), dermatiteatópica, dermatite de contacto alérgica e irritante,urticária, alergia mediada por IgE, aterosclerose,vasculite, miopatias inflamatórias idiopáticas, doençahemolítica, doença de Alzheimer, polineuropatiadesmielinizante inflamatória crônica e semelhantes. Emoutras modalidades, os anticorpos antagonistas anti-CD40 dainvenção são úteis no tratamento de inflamação pulmonarincluindo, sem limitação, rejeição de enxerto de pulmão,asma, sarcoidose, enfisema, fibrose cística, fibrosepulmonar idiopática, bronquite crônica, rinite alérgica edoenças alérgicas do pulmão, tais como pneumonite porhipersensibilidade, pneumonia eosinofílica, bronquiliteobliterante causada por transplante de medula óssea e/ou depulmão ou por outras causas, aterosclerose doenxerto/fleboesclerose do enxerto, além de fibrose pulmonarcausada por doenças do colágeno, vasculares e autoimunes,tais como artrite reumatóide e lúpus eritematoso.

A doença inflamatória ou doença autoimune pode ser umadoença inflamatória ou doença autoimune associada comcélulas que expressam CD40. Exemplos de doenças autoimunesdependentes de anticorpo incluem artrite reumatóide,psoríase, lúpus eritematoso disseminado, doença de Crohn,miastenia grave, púrpura trombocitopênica idiopática ousíndrome de Sjogren.

Além disso, a depleção de células B e de outrascélulas que sustentam CD40 pode limitar a ativação decélulas T por sinalização através de ligação de ligante deCD40. Portanto, a depleção de células B e de outras célulasque sustentam CD4 0 pode ser usada para tratar doençasautoimunes e inflamatórias mediadas por células T, comoesclerose múltipla, rejeição a enxerto, enxerto versusdoença do hospedeiro, doença de Alzheimer ou diabetes. Elatambém pode ser útil para transplantes de medula óssea.

A presente invenção é particularmente vantajosa emrelação a doenças inflamatórias e doenças autoimunes quesão associadas com células que expressam CD40. CHIR-12.12, aqui revelado, pode ser usado para tratar pacientesque têm uma doença inflamatória ou autoimune que érefrataria à terapia com outros agentes terapêuticos,incluindo anticorpos anti-CD20, como Rituxan®, comodescrito em maiores detalhes em outra parte nestaespecificação.

"Tratamento" é aqui definido como a aplicação ouadministração de um anticorpo anti-CD40 a um indivíduo, oua aplicação ou administração de um anticorpo anti-CD40 a umtecido ou linha de células isolada de um paciente, em que oindivíduo tem uma doença autoimune e/ou doençainflamatória, um sintoma associado a uma doença autoimunee/ou doença inflamatória, ou uma predisposição para ter umadoença autoimune e/ou doença inflamatória, em que afinalidade seja a curar, cicatrizar, aliviar, alterar,remediar, melhorar, ou afetar a doença autoimune e/oudoença inflamatória, qualquer sintoma associado com adoença autoimune e/ou doença inflamatória, ou apredisposição para o desenvolvimento da doença autoimunee/ou doença inflamatória. Por "tratamento", entende-se aaplicação ou administração de uma composição farmacêuticaque compreende um anticorpo anti-CD4 0 a um indivíduo, ou aaplicação ou administração de uma composição farmacêuticaque compreende um anticorpo anti-CD4 0 a um tecido ou linhade células isoladas de um indivíduo, em que o indivíduo temuma doença autoimune e/ou doença inflamatória, um sintomaassociado a uma doença autoimune e/ou doença inflamatória,ou uma predisposição para o desenvolvimento de uma doençaautoimune e/ou doença inflamatória, em que a finalidadeseja curar, cicatrizar, aliviar, alterar, remediar,melhorar ou afetar a doença autoimune e/ou doençainflamatória, quaisquer sintomas associados da doençaautoimune e/ou doença inflamatória, ou a predisposição parao desenvolvimento de uma doença autoimune e/ou doençainflamatória.

"Atividade antiinflamatória" significa uma redução ouprevenção da inflamação. A terapia com um anticorpo anti-CD40, como definido em outra parte nesta especificação,causa uma resposta fisiológica que é benéfica com relaçãoao tratamento de uma doença autoimune e/ou de uma doençainflamatória, em que a doença envolve células que expressamo antígeno CD40. Reconhece-se que os métodos da invençãopodem ser úteis na prevenção de alteração fenotípica emcélulas, tais como proliferação, ativação, e semelhantes.

Nos métodos terapêuticos da presente invenção, pelomenos um anticorpo anti-CD40 como definido em outra seção éusado para promover uma resposta terapêutica positiva e comrelação a uma doença inflamatória ou doença autoimune.

Por "resposta terapêutica positiva", com relação a umadoença autoimune e/ou a uma doença inflamatória, entende-seuma melhora na doença em associação à atividadeantiinflamatória do anticorpo, e/ou uma melhora nossintomas associados à doença. Ou seja, pode ser observadoum efeito anti-proliferativo, a prevenção de proliferaçãoadicional da célula que expressa CD4 0, uma redução naresposta inflamatória incluindo, sem limitação, secreçãoreduzida de citocinas inflamatórias, moléculas de adesão,proteases, imunoglobulinas (nos casos em que a célula queabriga CD4 0 for uma célula Β) , combinações destes, esemelhantes, produção aumentada de proteínas

antiinflamatórias, uma redução no número de células auto-reativas, um aumento na tolerância imunológica, inibição dasobrevida de célula auto-reativa e/ou uma diminuição em umou mais sintomas mediados por estimulação de células queexpressam CD4 0. Tais respostas terapêuticas positivas nãosão limitadas pela via de administração, e podemcompreender a administração ao doador, ao tecido do doador(como, por exemplo, à perfusão do órgão), ao hospedeiro,qualquer combinação destes, e outros.

A resposta clínica pode ser avaliada com o uso detécnicas de rastreamento, tais como ressonância nuclearmagnética (RNM), exames da raios x, tomografiacomputadorizada (TC), citometria de fluxo ou análise comclassificador de células ativadas por fluorescência (FACS),histologia, patologia macroscópica, e bioquímica do sangue,incluindo, sem limitação, alterações detectáveis por ELISA,RIA, cromatografia, e outros. Além dessas respostasterapêuticas positivas, o indivíduo submetido à terapia como anticorpo anti-CD4 0 pode apresentar o efeito benéfico deuma melhora nos sintomas associados à doença.

"Dose ou quantidade terapeuticamente eficaz" significauma quantidade de anticorpo antagonista anti-CD4 0 ou defragmento de ligação de antígeno deste que, quandoadministrada, ocasiona uma resposta terapêutica positivacom relação ao tratamento de um indivíduo com uma doençaassociada ao CD40. Por "dose terapeuticamente ouprofilaticamente eficaz" ou "quantidade terapeuticamente ouprofilaticamente eficaz", entende-se uma quantidade deanticorpo anti-CD40 que, quando administrada, ocasiona umaresposta terapêutica positiva com relação ao tratamento deum indivíduo com uma doença inflamatória ou doençaautoimune associada com células que expressam CD40.Dosagens adequadas são descritas em maiores detalhes emoutra parte nesta especificação. 0 método de tratamentopode compreender uma única administração de uma doseterapeuticamente eficaz ou múltiplas administrações de umadose terapeuticamente eficaz do anticorpo anti-CD40, comodescrito em maiores detalhes em outra parte nestaespecificação.

Os métodos da invenção são particularmente úteis parao tratamento de doenças inflamatórias ou doençasautoimunes, que incluem aquelas acima listadas, que sãorefratárias a uma ou mais das terapias conhecidas paradoenças inflamatórias ou doenças autoimunes. Tais terapiasincluem, sem limitação, cirurgia ou procedimentoscirúrgicos (por exemplo, esplenectomia, linfadenectomia,tiroidectomia, plasmaforese, leucoforese, transplante decélulas, tecidos, ou órgão, procedimento intestinais,perfusão de órgão, e outros), terapia por radiação, terapiacomo terapia com esteróide e terapia não esteróide, terapiacom hormônios, terapia com citocina, terapia com agentesdermatológicos (por exemplo, agentes tópicos usados paratratar condições da pele como alergias, dermatite decontato, e psoríase), terapia imunossupressora, e outrasterapias antiinflamatórias com anticorpo monoclonal, eoutros, como descrito em maiores detalhes em outra partenesta especificação. Por "refratário", entende-se que adoença inflamatória ou doença autoimune particular éresistente, ou não responsiva a uma terapia em particular.Uma doença inflamatória ou doença autoimune pode serrefratária a uma terapia particular a partir do início dotratamento com a terapia particular (ou seja, nãoresponsiva à exposição inicial à terapia), ou como umresultado do desenvolvimento de resistência à terapia,durante um primeiro período de tratamento com a terapia oudurante um período de tratamento subseqüente com a terapia.Portanto, a presente invenção é útil para o tratamento deum paciente humano que é refratário a uma terapia paradoenças inflamatórias ou autoimunes, quando aquele pacientehumano é resistente ou não responsivo àquela terapia.

Os métodos da presente invenção envolvem o uso deanticorpos anti-CD40. "Anticorpos" são normalmenteglicoproteínas heterotetraméricas de cerca de 150.000dáltons, compostas de duas cadeias leves idênticas (L) eduas cadeias pesadas idênticas (H) . Cada cadeia leve estáligada a uma cadeia pesada por uma ligação dissulfetocovalente, embora o número de ligações dissulfeto varieentre as cadeias pesadas de isótipos diferentes deimunoglobulinas. Cada cadeia pesada e leve também tempontes dissulfeto dentro da cadeias espaçadas regularmente.Cada cadeia pesada tem em uma extremidade um domíniovariável (VH), seguido por diversos domínios constantes.

Cada cadeia leve tem um domínio variável em uma extremidade(VI) e um domínio constante na outra extremidade; o domínioconstante da cadeia leve está alinhado com o primeirodomínio constante da cadeia pesada, e o domínio variável dacadeia leve está com o domínio variável da cadeia pesada.

Acredita-se que resíduos de aminoácidos específicos formemuma interface entre os domínios variáveis da cadeia leve epesada. O termo "variável" se refere ao fato de que certasporções dos domínios variáveis diferem intensamente emtermos de seqüências entre anticorpos. As regiões variáveisconferem especificidade de ligação de antígeno. Os domíniosconstantes não estão diretamente envolvidos na ligação deum anticorpo a um antígeno, mas exibem várias funçõesefetoras, como ligação de receptor Fc (FcR), participaçãodo anticorpo em toxicidade celular dependente de anticorpo,início de citotoxicidade dependente de complemento, edesgranulação de mastócitos.

As "cadeias leves" de anticorpos (imunoglobulinas) dequalquer espécie de vertebrado podem ser designadas para umde dois tipos distintos, chamadas kappa (κ) e lambda (λ) ,com base nas seqüências de aminoácidos de seus domíniosconstantes.

Dependendo da seqüência de aminoácidos do domínioconstante de suas cadeias pesadas, as imunoglobulinascompreendem classes diferentes. Há cinco classes principaisde imunoglobulinas humanas: IgA, IgD, IgEi IgG e IgM, evárias destas podem ser ainda divididas em subclasses(isótipos), por exemplo, IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgAl eIgA2. Os domínios constantes da cadeia pesada quecorrespondem às diferentes classes de imunoglobulinas sãodenominados alfa, delta, épsilon, gama e mu,respectivamente. As estruturas da subunidade e asconfigurações tridimensionais de diferentes classes deimunoglobulinas são bem conhecidas. Isótipos diferentes têmdiferentes funções efetoras. Por exemplo, os isótipos deIgGl e IgG3 humanos têm atividade de citotoxicidade mediadapor células dependente de anticorpo (ADCC). AnticorposIgGl, em particular anticorpos IgGl humanos, sãoparticularmente úteis nos métodos da presente invenção.

"Células efetoras humanas" são leucócitos queexpressam um ou mais FcRs e realizam funções efetoras.Preferivelmente, as células expressam pelo menos FcyRIII erealizam a função efetora de citotoxicidade mediada porcélulas dependente de anticorpo (ADCC). Exemplos deleucócitos humanos que medeiam ADCC incluem célulasmononucleares do sangue periférico (PBMC), células naturalkiller (NK), monócitos, macrófagos, eosinófilos eneutrófilos, preferindo-se PBMCs e células NK. Anticorposque têm atividade de ADCC são tipicamente do isótipo IgGlou IgG3. Além do isolamento de anticorpos IgGl e IgG3,anticorpos de mediação da ADCC podem ser sintetizadosprojetando-se uma região variável a partir de um fragmentode um anticorpo ou região variável não ADCC em uma regiãoconstante de isótipo IgGl ou IgG3.

Os termos "receptor Fc" ou "FcR" são usados paradescrever um receptor que se liga à região Fc de umanticorpo. O FcR preferido é um FcR humano de seqüêncianativa. Além disso, um FcR preferido é aquele que se liga aum anticorpo IgG (um receptor gama) e inclui receptores dassubclasses FcyRI, FcyRII e FcyRIII, incluindo variantesalélicas e alternativamente formas combinadas dessesreceptores. Receptores FcyRII incluem FcyRIIA (um "receptorde ativação") e FcyRIIB (um "receptor de inibição"), quetêm seqüências de aminoácidos similares que diferemessencialmente nos domínios citoplasmáticos destas. Oreceptor de ativação FcyRIIA contém um motivo de ativaçãode imunorreceptor baseado em tirosina (ITAM) em seu domíniocitoplasmático. O receptor de inibição FcyRIIB contém ummotivo de inibição de imunorreceptor baseado em tirosina(ITIM) em seu domínio citoplasmático (veja Dacron (1997)Annu. Rev. Immuno1. 15:203). FcRs são revisados em Ravetche Kinet (1991) Annu. Rev. Immunol. 9:457-492(1991); Capei ecols. (1994) Immunomethods 4:25-34; e de Haas e cols.(1995) J. Lab. Clin. Med. 126:330-341. Outros FcRs,incluindo aqueles a serem identificados no futuro, são aquienglobados pelo termo "FcR". O termo também inclui oreceptor neonatal, FcRn, que é responsável pelatransferência de IgGs maternas ao feto (Guyer e cols.(1976) J. Immunol. 117:587, e Kim e cols. (1994) J.Immunol. 24:249).

O termo "anticorpo" é usado em seu sentido mais amploe cobre anticorpos totalmente montados, fragmentos deanticorpo que retêm a capacidade de se ligarespecificamente ao antígeno CD40 (por exemplo, Fab,F(ab')2/ Fv, e outros fragmentos), anticorpos de cadeiaúnica, diabodies, quimeras de anticorpo, anticorposhíbridos, anticorpos biespecíficos, anticorpos humanizados,e outros, e peptídeos recombinantes que compreendem oscitados anteriormente. 0 termo "anticorpo" abrange tantoanticorpos monoclonais quanto policlonais.

Como aqui usado, "anticorpos anti-CD40" englobamqualquer anticorpo que reconheça especificamente o antígenoCD40. Em algumas modalidades, anticorpos anti-CD40 para usonos métodos da presente invenção, em particular anticorposmonoclonais anti-CD40, exibem uma forte afinidade deligação para o antígeno CD40. Tais anticorpos monoclonaisexibem uma afinidade por CD40 (Kd) de pelo menos IO"5 M,pelo menos 3 X IO"5 M, preferivelmente pelo menos IO"6 M, oupelo menos IO"7 M, mais pref erivelmente pelo menos IO"8 M oupelo menos IO"12 M, medida usando um ensaio-padrão como, porexemplo, Biacore™. A análise Biacore é conhecida natécnica e são fornecidos detalhes no BlAapplicationsHandbook. Métodos descritos em WO 01/27160 podem ser usadospara modular a afinidade de ligação.

Por "reconhece especificamente" ou "se ligaespecificamente a", entende-se que o anticorpo anti-CD40não se liga a antígenos não relacionados, como o antígeno CD20.

Em algumas modalidades, anticorpos anti-CD40 para usonos métodos da presente invenção, em particular anticorposmonoclonais, exibem uma forte afinidade de ligação porFcyRIIIa-158V humano. Preferivelmente, um anticorpo anti-CD4 0 para uso nos métodos da invenção se liga a FcyRIIIa-158V humano com uma afinidade (Kd) de pelo menos cerca de0,5 μΜ quando medida com o uso de um ensaio-padrão como,por exemplo, Biacore™. Como revelado no Exemplo 6 nestaespecificação, o anticorpo CHIR-12.12 se liga a FcyRIIIa-158V humano com uma afinidade (Kd) de 4 92 nM.

Em algumas modalidades, anticorpos anti-CD40 para usonos métodos da presente invenção, em particular anticorposmonoclonais, exibem uma forte afinidade de ligação porFcyRIIIa-158F humano. Preferivelmente, um anticorpo anti-CD4 0 para uso nos métodos da invenção se liga a FcyRIIIa-158F humano como uma afinidade (Kd) de pelo menos cerca de12 μΜ quando medida com o uso de um ensaio-padrão comoBiacore™. Preferivelmente, o anticorpo anti-CD4 0 para usonos métodos da invenção se liga a FcyRIIIa-158F humano comouma afinidade (Kd) de pelo menos cerca de 10 μΜ, pelo menoscerca de 8 μΜ, pelo menos cerca de 6 μΜ, pelo menos cercade 5 μΜ, pelo menos cerca de 4 μΜ, ou pelo menos cerca deμΜ. Como revelado no Exemplo 6 nessa, o anticorpo CHIR-12.12 se liga a FcyRIIIa-158F humano com uma afinidade (Kd)de 2,8 μΜ.

Em algumas modalidades, anticorpos anti-CD4 0 para usonos métodos da presente invenção, em particular anticorposmonoclonais, exibem uma forte afinidade de ligação porFcyRIIIa-158V e FcyRIIIa-158F humanos. Preferivelmente, umanticorpo anti-CD40 para uso nos métodos da invenção seliga a FcyRIIIa-158V humano como uma afinidade (Kd) de pelomenos cerca de 0,5 μΜ e se liga a FcyRIIIa-158F humano comouma afinidade (Kd) de pelo menos cerca de 12 μΜ, quandomedida com o uso de um ensaio-padrao como Biacore .

Os anticorpos para uso nos métodos da presenteinvenção podem ser produzidos com o uso de qualquer métodode produção de anticorpo adequado conhecido por aqueles dehabilidade na técnica.

O anticorpo anti-CD40 usado nos métodos da presenteinvenção podem ser um anticorpo policlonal. Portanto, sorospoliclonais podem ser preparados por métodos convencionais.Em geral, inicialmente é usada uma solução contendo oantigeno de interesse (no caso, o antigeno CD40) paraimunizar um animal adequado, preferivelmente um camundongo,rato, coelho ou cabra. Preferem-se coelhos ou cabras para apreparação de soros policlonais em função do volume de soroque pode ser obtido e da disponibilidade de anticorposanti-coelho e anti-cabra rotulados.

Os soros desses animais imunizados pode ser rastreadoquanto à reatividade de anticorpo contra o antigenoinicial. Podem ser isolados linfócitos dos linfonodos ou decélulas esplênicas e podem ainda ser rastreados quanto àscélulas B pela seleção de células CD138-negativas e CD19-positivas. Em um aspecto, tais culturas de células B (BCCs)podem ser fundidas às células de mieloma para geraremhibridomas, como detalhado nessa.

Soros policlonais também podem ser preparados em umanimal transgênico, preferivelmente um camundongo possuindoloci de imunoglobulina humana. Em uma modalidade preferida,células Sf9 que expressam a proteína de interesse, (nessecaso, o antigeno CD40), são usadas como o imunógeno. Aimunização também pode ser realizada pela mistura ouemulsificação da solução contendo antigeno em sorofisiológico, preferivelmente em um adjuvante como, porexemplo, adjuvante completo de Freund, e injetando-se amistura ou emulsão por via parenteral (geralmente por viasubcutânea ou intramuscular). Uma dose de 50-200 pg/injeçãoé tipicamente suficiente. A imunização é geralmentereforçada 2-6 semanas mais tarde com uma ou mais injeçõesda proteína em soro fisiológico, preferivelmente usando oadjuvante incompleto de Freund. É possível,alternativamente, gerar anticorpos por imunização in vitrousando métodos conhecidos na técnica, o que, para asfinalidades desta invenção, é considerado equivalente àimunização in vivo. Anti-soros policlonais são obtidos porsangramento do animal imunizado em um recipiente de vidroou de plástico, incubação do sangue a 250C por um hora,seguindo por incubação a 4 0C por 2-18 horas. 0 soro érecuperado por centrifugação (por exemplo, 1.000 χ g por 10minutos). Cerca de 20-50 ml por sangramento podem serobtidos de coelhos.

A produção das células Sf9 (Spodoptera frugiperda) êrevelada na Patente U.S. N0 6.004.552, aqui incorporada porreferência. Resumidamente, seqüências que codificam CD4 0humano são recombinadas em um baculovírus usando vetores detransferência. Os plasmídeos são co-transfectados com DNAde baculovírus do tipo selvagem em células Sf9. Células Sf9recombinantes infectadas com baculovírus são identificadase purificadas por clonagem.

0 anticorpo anti-CD4 0 usado nos métodos da presenteinvenção pode ser um anticorpo monoclonal. 0 termo"anticorpo monoclonal" (e "mAb") como aqui usado refere-sea um anticorpo obtido a partir de uma população deanticorpos substancialmente homogêneos, ou seja, osanticorpos individuais que compreendem a população sãoidênticos, exceto quanto às possíveis mutações deocorrência natural que podem estar presentes em quantidadesmenores. O termo não se limita em relação à espécie doanticorpo e não requer a produção do anticorpo por qualquermétodo particular.

Ao contrário das preparações de anticorpo policlonal,que tipicamente incluem diferentes anticorpos dirigidoscontra diferentes determinantes antigênicos (epitopos),cada anticorpo monoclonal é dirigido contra um únicodeterminante (epitopo) no antígeno.

Por "epitopo" entende-se a parte de uma moléculaantigênica para a qual um anticorpo é produzido e à qual oanticorpo irá se ligar. Epitopos podem compreender resíduosde aminoácidos lineares (ou seja, os resíduos dentro doepitopo são dispostos seqüencialmente um após o outro deforma linear), resíduos de aminoácidos não lineares (aquidenominados "epitopos não lineares"; esses epitopos não sãodispostos seqüencialmente), ou resíduos de aminoácidostanto lineares quanto não lineares. Um anticorpo monoclonalanti-CD40 adequado para uso nos métodos da presenteinvenção será capaz de se ligar especificamente a umepitopo e, antígeno CD40 humano expresso na superfície deuma célula humana, ou seja, um epitopo qu é exposto aoexterior da célula.

Os anticorpos monoclonais as serem usados de acordocom a presente invenção podem ser feitos pelo método dehibridoma primeiramente descrito por Kohler e cols. (1975)Nature 256:495, ou podem ser feitos pelo métodos de DNArecombinante (veja, por exemplo, Patente U.S. No.4.816.567). Anticorpos monoclonais também podem serisolados de bibliotecas de fago de anticorpo geradas com autilização das técnicas descritas, por exemplo, emMcCafferty e cols. (1990) Nature 348:552-554 (1990) e naPatente U.S. N0 5.514.548. Clackson e cols. (1991) Nature352:624-628 e Marks e cols. (1991) J. Mol. Biol. 222:581-597 descrevem o isolamento de anticorpos murídeos ehumanos, respectivamente, usando bibliotecas de fago.Publicações subseqüentes descrevem a produção de anticorposhumanos de alta afinidade (na faixa de nM) porembaralhamento de cadeia (Marks e cols. (1992)Bio/Technology 10:779-783), bem como infecção combinatóriae recombinação in vivo como estratégia para a construção debibliotecas de fago bem grandes (Waterhouse e cols. (1993)Nucleic. Acids Res. 21:2.265-2.266). Desse modo, essastécnicas são alternativas viáveis às técnicas tradicionaisde hibridoma de anticorpo monoclonal para o isolamento deanticorpos monoclonais.

No método tradicional de Kohler e cols. (1975) Nature256:495-496, tipicamente, um camundongo é imunizado com umasolução contendo um antígeno. A imunização pode serrealizada pela mistura ou emulsificação da solução contendoantígeno em soro fisiológico, preferivelmente em umadjuvante como, por exemplo, adjuvante completo de Freund,e injeção da mistura ou da emulsão por via parenteral.Qualquer método de imunização conhecido na técnica pode serusado para se obter os anticorpos monoclonais da invenção.Após imunização do animal, o baço (e, opcionalmente, várioslinfonodos grandes) são removidos e dissociados em célulasúnicas. As células esplênicas podem ser rastreadas pelaaplicação de uma suspensão de células em uma placa ou poçorevestido com o antígeno de interesse. As células B queexpressam imunoglobulina ligada à membrana específica parao antígeno se ligam à placa e não saem com o enxágüe. Ascélulas B resultantes, ou todas as células esplênicasdissociadas, são então induzidas a se fundirem com célulasde mieloma para formarem hibridomas, e são cultivadas em ummeio seletivo. As células resultantes são plaqueadas pordiluição serial e são testadas quanto à produção deanticorpos que se ligam especificamente ao antígeno deinteresse (e que não se ligam aos antígenos nãorelacionados). Os hibridomas secretores de anticorpomonoclonal (mAb) selecionados são então cultivados in vitro(por exemplo, em frascos de cultura de tecido ou emreatores de fibra oca) ou in vivo (como ascites emcamundongos).

Em um outro aspecto, culturas de célula B podem seravaliadas também para reatividade contra o antígenoinicial, preferivelmente. Tais avaliações incluem ensaioimunoabsorvente ligado à enzima (ELISA) com a proteínaalvo/antígeno, um ensaio de competição com anticorposconhecidos que se ligam ao antígeno de interesse, e ligaçãoin vitro a CHO transfectada transitoriamente ou outrascélulas que expressam o antígeno alvo.

Quando os anticorpos antagonistas anti-CD4 0 dainvenção tiverem que ser preparados usando métodos de DNArecombinante, o DNA que codifica os anticorpos monoclonaisserá prontamente isolado e seqüenciado usando procedimentosconvencionais (por exemplo, com a utilização de sondas deoligonucleotídeo que são capazes de se ligarespecificamente aos genes que codificam as cadeias pesadase leves de anticorpos murídeos). As células de hibridomaaqui descritas servem como uma fonte preferida de tal DNA.

Uma vez isolado, o DNA pode ser colocado em vetores deexpressão, que são então transfectados em célulashospedeiras como, por exemplo, células de E. coli, célulasCOS de símios, células de ovário de hamster chinês (CHO) oucélulas de mieloma que de outra forma não produzem aproteína de imunoglobulina, para se obter a síntese deanticorpos monoclonais nas células hospedeirasrecombinantes. Artigos de revisão sobre expressãorecombinante em bactérias de DNA que codifica o anticorpoincluem Skerra e cols. (1993) Curr. Opinion in Immunol.5:256 e Phickthun (1992) Immunol. Revs. 130:151.

Alternativamente, o anticorpo pode ser produzido emuma linha de células como uma linha de células CHO, comorevelado nas Patentes U.S. Nos 5.545.403; 5.545.405; e5.998.144, aqui incorporadas por referência. Resumidamente,a linha de células é transfectada com vetores capazes deexpressar uma cadeia leve e uma cadeia pesada,respectivamente. Pela transfecção de duas proteínas emvetores separados, podem ser produzidos anticorposquiméricos. Outra vantagem é a glicosilação correta doanticorpo.

Uma "célula hospedeira", como aqui usada, se refere aum microorganismo ou uma célula ou linha de célulaseucarióticas cultivadas como uma entidade unicelular quepode ser, ou que foi, usada como receptora para um vetorrecombinante, ou outros polinucleotídeos de transferência,e inclui a prole da célula original que foi transfectada.Entende-se que a prole de uma única célula pode não sernecessariamente completamente idêntica em morfologia ou emcomplemento de DNA genômico ou total à parente original, emfunção de uma mutação natural, acidental ou deliberada.

Em algumas modalidades, o anticorpo anti-CD40, comoCHIR-12.12, é produzido em células CHO com o uso do sistemade expressão gênica GS (Lonza Biologics, Portsmouth, NewHampshire), que utiliza glutamina sintetase como ummarcador. Veja, também as Patentes U.S. Nos 5.122.4 64;5.591.639; 5.658.759; 5.770.359; 5.827.739; 5.879.936;5.891.693; e 5.981.216; cujos conteúdos são aquiincorporados por referência em sua totalidade.

Anticorpos monoclonais para CD40 são conhecidos natécnica. Veja, por exemplo, as seções dedicadas ao antígenoda célula B em McMichael, ed. (1987; 1989) Leukocyte TypingIII and IV (Oxford University Press, Nova York); PatentesU.S. Nos 5.674.492; 5.874.082; 5.677.165; 6.056.959;Publicação Internacional Nos WO 00/63395, WO 02/28905 e WO02/28904; Gordon e cols. (1988) J. Immunol. 140:1.425;Valle e cols. (1989) Eur. J. Immunol. 19:1.463; Clark ecols. (1986) PNAS 83:4.494; Paulie e cols. (1989) J.Immunol. 142:590; Gordon e cols. (1987) Eur. J. Immunol.17:1.535; Jabara e cols. (1990) J. Exp. Med. 172:1.861;Zhang e cols. (1991) J. Immunol. 146:1.836; Gascan e cols.(1991) J. Immunol. 147:8; Banchereau e cols. (1991) Clin.Immunol. Spectrum 3:8; e Banchereau e cols. (1991) Science251:70; todos os quais são aqui incorporados porreferência.

Como acima observado, o termo "anticorpo" como aquiusado engloba anticorpos quiméricos. Por anticorpos"quiméricos" significam anticorpos que são, principalmente,derivados com o uso de técnicas de ácidodesoxirribonucléico recombinante e que compreendemcomponentes tanto humanos (incluindo espéciesimunologicamente "relacionadas", por exemplo, chimpanzé)quanto não humanos. Desse modo, a região constante doanticorpo quimérico é, principalmente, substancialmenteidêntica à região constante de um anticorpo humano natural;a região variável do anticorpo quimérico é maispreferivelmente derivada de uma fonte não humana e tem aespecificidade antigênica desejada para o antígeno deinteresse (CD4 0). A fonte não humana pode ser qualquerfonte vertebrada que possa ser usada para gerar anticorpospara um antígeno CD40. Tais fontes não humanas incluem, semlimitação, roedores (por exemplo, coelho, rato, camundongòetc.; veja, por exemplo, a Patente U.S. N0 4.816.567, aquiincorporada por referência) e primatas não humanos (porexemplo, macaco do Velho Mundo, pongídeos etc.; veja, porexemplo, as Patentes U.S. Nos 5.750.105 e 5.756.096; aquiincorporadas por referência).

Como acima observado, o termo "anticorpo" como aquiusado engloba anticorpos humanizados. Por "Humanizados"significa formas de anticorpos que contêm seqüência mínimaderivada de seqüências de imunoglobulina não humana. Namaioria dos casos, anticorpos humanizados sãoimunoglobulinas humanas (anticorpo receptor) nas quaisresíduos de uma região hipervariável (também conhecida comoregião determinante de complementaridade ou CDR) doreceptor são substituídos por resíduos de uma regiãohipervariável de uma espécie não humana (anticorpo doador)como, por exemplo, camundongo, rato, coelho, ou primata nãohumano, tendo a especificidade, afinidade e capacidadedesejadas. A frase "região determinante decomplementaridade" se refere às seqüências de aminoácidosque em conjunto definem a afinidade e especificidade deligação da região Fv natural de um sitio de ligação nativode imunoglobulina. Veja, por exemplo, Chothia e cols.(1987) J. Mol. Biol. 196:901-917; Kabat e cols. (1991)"U.S. Dept. of Health and Human Services", Publicação doNIH N0 91-3242). A frase "região constante" se refere àporção da molécula do anticorpo que confere funçõesefetoras. Em trabalho anterior sobre a produção deanticorpos não imunogênicos para uso em terapia de doençahumana, regiões constantes de camundongo foram substituídaspor regiões constantes humanas. As regiões constantes dosanticorpos humanizados do indivíduo foram derivadas deimunoglobulinas humanas. No entanto, esses anticorposhumanizados ainda despertaram uma resposta imune indesejadae potencialmente perigosa em humanos, e houve perda deafinidade.

A humanização pode ser essencialmente realizadaseguindo o método de Winter e colaboradores (Jones e cols.(1986) Nature 321:522-525; Riechmann e cols. (1988) Nature332:323-327; Verhoeyen e cols. (1988) Science 239:1.534-1.536), pela utilização de CDRs ou seqüências de CDR deroedor ou de roedor mutante como substituição para asseqüências correspondentes de um anticorpo humano. Vejatambém as Patentes U.S. Nos 5.225.53 9; 5.585.08 9;5.693.761; 5.693.762; 5.859.205; aqui incorporadas porreferência. Em alguns casos, os resíduos dentro das regiõesestruturais de uma ou mais regiões variáveis daimunoglobulina humana são substituídos pelos resíduos nãohumanos correspondentes (veja, por exemplo, as PatentesU.S. Nos 5.585.089; 5.693.761; 5.693.762; e 6.180.370).Além disso, anticorpos humanizados podem compreenderresíduos que não são encontrados no anticorpo receptor ouno anticorpo doador. Essas modificações são feitas pararefinar ainda mais o desempenho do anticorpo (por exemplo,para obter a afinidade desejada). Em geral, o anticorpohumanizado irá compreender substancialmente todos de pelomenos um, e tipicamente dois, domínios variáveis, nos quaistodas, ou substancialmente todas, as regiões hipervariáveiscorrespondem àquelas de uma imunoglobulina não humana, etodas, ou substancialmente todas, as regiões estruturaissão aquelas de uma seqüência de imunoglobulina humana. 0anticorpo humanizado opcionalmente também irá compreenderpelo menos uma porção de uma região constante deimunoglobulina (Fc), tipicamente a de uma imunoglobulinahumana. Para mais detalhes, veja Jones e cols. (1986)

Nature 331:522-525; Riechmann e cols. (1988) Nature332:323-329; e Presta (1992) Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596; aqui incorporados por referência. Conseqüentemente,tais anticorpos "humanizados" podem incluir anticorpos nosquais substancialmente menos de um domínio variável intactohumano foi substituído pela seqüência correspondente de umaespécie não humana. Na prática, anticorpos humanizados sãotipicamente anticorpos humanos nos quais alguns resíduos deCDR e, possivelmente, alguns resíduos estruturais, sãosubstituídos por resíduos de sítios análogos em anticorposde roedores. Veja, por exemplo, as Patentes U.S. N'5.225.539; 5.585.089; 5.693.761; 5.693.762; 5.859.205. Vejatambém a Patente U.S. N0 6.180.370, e a PublicaçãoInternacional N0 WO 01/27160, em que são discutidosanticorpos humanizados e técnicas para a produção deanticorpos humanizados que melhoram a afinidade para umantígeno predeterminado

Anticorpos anti-CD4 0 humanizados também podem serproduzidos com o uso da tecnologia "Human Engineering™"(Xoma Ltd., Berkeley, Califórnia).

Anticorpos monoclonais anti-CD4 0 humanizados incluemanticorpos como SGN-40 (Tai e cols. (2004) Câncer Res.64:2846-52; Patente U.S. No. 6.838.261), que é a formahumanizada do anticorpo anti-CD40 murídeo SGN-14 (Franciscoe cols. (2000) Câncer Res. 60:3225-31), e o anticorposrevelado na Publicação de Pedido de Patente U.S. No.2004/0120948; aqui incorporados em sua totalidade porreferência.

A presente invenção também pode ser praticada com ouso de anticorpos xenogênicos produzidos em um hospedeiromamífero não humano, mais particularmente um camundongotransgênico, caracterizados por Ioci endógenos inativadosde imunoglobulina (Ig) . Nesses animais transgênicos, genesendógenos competentes para a expressão de subunidades levese pesadas de imunoglobulinas do hospedeiro são tornadas nãofuncionais e substituídas com os Ioci análogos deimunoglobulina humana. Esses animais transgênicos produzemanticorpos humanos na ausência substancial de subunidadesleves ou pesadas de imunoglobulina do hospedeiro. Veja, porexemplo, Patentes U.S. Nos 5.877.397 e 5.939.598 aquiincorporadas por referência.

Portanto, em algumas modalidades, anticorpostotalmente humanos para CD40, por exemplo, são obtidos pelaimunização de camundongos transgênicos. Um dessescamundongo é obtido com o uso de tecnologia Xenocamundongo®(Abgenix; Fremont, Califórnia), e é revelado nas PatentesU.S. Nos 6.075.181, 6.091.001, e 6.114.598, todos aquiincorporados por referência. Por exemplo, para produzir oanticorpo CHIR-12.12, camundongos transgênicos para o lócusda cadeia pesada de IgGi humana e para o lócus da cadeialeve κ humana foram imunizados com células Sf9 queexpressam CD40 humano. Os camundongos também podem sertransgênicos para outros isótipos. Anticorpos anti-CD40totalmente humanos úteis nos métodos da presente invençãosão caracterizados por propriedades de ligação similaresàquelas exibidas pelo anticorpo monoclonal CHIR-12.12.

Como acima observado, o termo "anticorpo" como aquiusado também engloba fragmentos de anticorpo que podem seligar a antígeno. "Fragmentos de anticorpos" compreendemuma porção de um anticorpo intacto, preferivelmente aregião de ligação de antígeno ou a região variável doanticorpo intacto. Exemplos de fragmentos de anticorpoincluem fragmentos Fab, Fab1, F(ab')2 e Fv;- diabodies;anticorpos lineares (Zapata e cols. (1995) Protein Eng.10:1,057); moléculas de anticorpo de cadeia única; eanticorpos multiespecíficos formados por fragmentos deanticorpo. A digestão com papaína de anticorpos produz doisfragmentos de ligação de antígeno idênticos, denominadosfragmentos "Fab", cada um com um único sítio de ligação deantígeno e um fragmento "Fc" residual, cujo nome refletesua habilidade para cristalizar prontamente. O tratamentocom pepsina gera um fragmento F(ab')2 que tem dois sítiosde combinação de antígeno e ainda é capaz de entrecruzar oantIgeno.

"Fv" é o fragmento de anticorpo mínimo que contém umsítio de reconhecimento e de ligação de antígeno completo.Essa região consiste em um dímero de um domínio variável decadeia leve e um de cadeia pesada em estreita associaçãonão covalente. É nessa configuração que as três CDRs decada domínio variável interage para definir um sítio deligação de antígeno na superfície do dímero VH-VL.Coletivamente, as seis CDRs conferem especificidade deligação de antígeno ao anticorpo. No entanto, até mesmo umúnico domínio variável (ou metade de um Fv que compreendaapenas três CDRs específicas para um antígeno) tem ahabilidade de reconhecer e se ligar ao antígeno, embora emuma afinidade menor do que todo o sítio de ligação.

0 fragmento Fab também contém o domínio constante dacadeia leve e o primeiro domínio constante (Chl) da cadeiapesada. Fragmentos Fab diferem de fragmentos Fab1 pelaadição de poucos resíduos no terminal carboxi do domínioChI de cadeia pesada que inclui uma ou mais cisteínas daregião de dobradiça do anticorpo. Fab1-SH é a designaçãoaqui utilizada para Fab1 em que o resíduo (s) de cisteínados domínios constantes abrigam um grupo tiol livre.Fragmentos Fab' são produzidos por redução da ponte dedissulfeto d cadeia pesada do fragmento F(ab')2- Também sãoconhecidos outros acoplamentos químicos de fragmentos deanticorpo.

Fragmentos de um anticorpo anti-CD40 são adequadospara uso nos métodos da invenção desde que eles retenham aafinidade desejada do anticorpo de comprimento total.Portanto, por exemplo, um fragmento de um anticorpo anti-CD4 0 irá reter a capacidade de se ligar ao antigeno deCD40. Tais fragmentos são caracterizados por propriedadessimilares ao anticorpo de comprimento total correspondente.Portanto, por exemplo, um fragmento de um anticorpo anti-CD4 0 antagonista de comprimento total será preferivelmentecapaz de se ligar especificamente a um antigeno de CD4 0humano expresso na superfície de uma célula humana, e élivre de atividade agonista significativa mas exibeatividade antagonista quando ligado a um antigeno de CD40em uma célula que expressa CD4 0 humano. Tais fragmentos sãoàquà depominados fragmentos "de ligação de antigeno".Fragmentos de um anticorpo anti-CD40 para uso nos métodosda invenção irão reter preferivelmente a capacidade de deligar a FcR ou FcRs relevantes. Portanto, por exemplo, umfragmento de um anticorpo anti-CD4 0 pode reter a capacidadede se ligar a FcyRIIIa. Portanto, por exemplo, um fragmentode um anticorpo anti-CD4 0 de comprimento total pode sercapaz de se ligar especificamente a um antigeno de CD4 0 desuperfície celular, e também capaz de se ligara FcyRIIIa emcélulas efetoras humanas, como células natural killer (NK).Tais fragmentos são aqui referidos como fragmentos de"ligação a FcR". Tais fragmento geralmente incluirão pelomenos parte do domínio constante da cadeia pesada.

Foram desenvolvidas várias técnicas para a produção defragmentos de anticorpo. Tradicionalmente, esses fragmentoseram derivados por meio de digestão proteolítica deanticorpos intactos (veja, por exemplo, Morimoto e cols.(1992) Journal of Biochemical and Biophysical Methods24:107-117 (1992) e Brennan e cols. (1985) Science 229:81).No entanto, esses fragmentos podem agora ser produzidosdiretamente por células hospedeiras recombinantes. Porexemplo, os fragmentos de anticorpo podem ser isolados apartir de bibliotecas de fago de anticorpo discutidasacima. Alternativamente, fragmentos Fab1-SH podem serrecuperados diretamente de E. coli e acoplados quimicamentepara formar fragmentos F(ab'>2 (Carter e cols. (1992)Bio/Technology 10:163-167). De acordo com outra abordagem,fragmentos Ffab1>2 podem ser isolados diretamente de umacultura de célula hospedeira recombinante. Outras técnicaspara a produção de fragmentos de anticorpo serão evidentespara o profissional experiente.

Fragmentos de ligação de antígeno adequados de umanticorpo compreendem uma porção de um anticorpo decomprimento total, geralmente a região de ligação deantigeno ou variável deste. Exemplos de fragmentos deanticorpo incluem, sem limitação, fragmentos Fab, F(ab')2 eFv e moléculas de anticorpo de cadeia única. Por "Fab"entende-se um fragmento monovalente de ligação de antígenode uma imunoglobulina que é composto da cadeia leve e parteda cadeia pesada. Por F(ab')2 entende-se um fragmentobivalente de ligação de antígeno de uma imunoglobulina quecontém tanto cadeias leves quanto parte de ambas as cadeiaspesadas. Por "Fv de cadeia única" ou "sFv" entende-sefragmentos que compreendem os domínios Vh e Vl de umanticorpo, nos quais esses domínios estão presentes em umaúnica cadeia polipeptídica. Veja, por exemplo, as PatentesU.S. Nos 4.946.778, 5.260.203, 5.455.030 e 5.856.456, aquiincorporadas por referência. Geralmente, o polipeptídeo Fvainda compreende um vinculador polipeptídico entre osdomínios Vh e Vl que permite que o sFv forme a estruturadesejada para ligação de antígeno. Para uma revisão sobresFv, veja Pluckthun (1994) em The Pharmacology ofMonoclonal Antibodies, Vol. 113, ed. Rosenburg e Moore(Springer-Verlag, Nova York), pp. 269-315. Fragmentos deligação de antígeno dos anticorpos antagonistas anti-CD40aqui revelados também podem ser conjugados a uma citotoxinapara causar a morte de células-alvo como aqui descritoabaixo.

Em algumas modalidades da invenção, o anticorpo anti-CD40 é um anticorpo anti-CD40 antagonista. Quando taisanticorpos se ligam a CD40 apresentado na superfície decélulas humanas, como células B humanas, eles não causamatividade agonista significativa. Em algumas modalidades,sua ligação a CD4 0 apresentada na superfície de célulashumanas resulta na inibição da proliferação e diferenciaçãodessas células humanas. Os anticorpos anti-CD40 adequadospara uso nos métodos da invenção incluem aqueles anticorposque podem exibir atividade antagonista contra célulashumnas normais e malignas que expressam o antígeno CD4 0 desuperfície celular.

Por "atividade agonista" entende-se que a substânciafunciona como um agonista. Um agonista combina com umreceptor em uma célula e inicia uma reação ou atividade queé similar ou igual àquela iniciada pelo ligante natural doreceptor. Um agonista de CD4 0, como C4BP, induz qualqueruma ou todas, sem limitação, as seguintes respostas:

proliferação e/ou diferenciação de células B; supra-regulação de adesão intercelular por meio de tais moléculascomo ICAM-1, E-seletina, VCAM, e outras; secreção decitocinas pró-inflamatórias, como IL-1, IL-6, IL-8, IL-12,TNF e outras; transdução de sinal através do receptor deCD4 0 por tais vias como TRAF (por exemplo, TRAF2 e/ouTRAF3), MAP quinases como NIK (quinase indutora de NF-xB),I-kapa B quinases (IKK cc/(3), fator de transcrição NF-x. 13, Ras e a via MEK/ERK, a via PI3K/AKT, a via P38 MAPK,e outras; transdução de um sinal anti-apoptótico por taismoléculas como XIAP, mcl-1, bcl-x, e outras; geração dememória de célula B e/ou T7- produção de anticorpo de célulaB; troca de isotipo de célula B, supra-regulação deexpressão de superfície celular de MHC Classe II eCD80/86,e outros.

Por atividade agonista "significativa" significa umaatividade agonista de pelo menos 30%, 35%, 40%, 45%, 50%,60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, ou 100% maior do que aatividade agonista induzida por uma substância neutra ou umcontrole negativo, como medido em um ensaio de uma respostade célula B. Preferivelmente, atividade agonista"significativa" é um atividade agonista que é pelo menos 2vezes maior ou pelo menos 3 vezes maior do que a atividadeagonista induzida por uma substância neutra ou um controlenegativo, como medido em um ensaio de uma resposta decélula B. Desse modo, por exemplo, quando a resposta decélula B de interesse for proliferação de células B,atividade agonista "significativa" seria a indução de umnível de proliferação de células B que é pelo menos 2 vezesmaior ou pelo menos 3 vezes maior do que o nível deproliferação de células B induzido por uma substâncianeutra ou por um controle negativo. Em uma modalidade, umaimunoglobulina inespecífica, por exemplo, IgGl7 que não seliga a CD4 0, serve como controle negativo. Uma substância"livre de atividade agonista significativa" exibiria umaatividade agonista de não mais que cerca de 25% maior doque a atividade agonista induzida por uma substância neutraou um controle negativo, preferivelmente no máximo cerca de20% maior, 15% maior, 10% maior, 5% maior, 1% maior, 0,5%maior ou até mesmo no máximo cerca de 0,1% maior do que aatividade agonista induzida por uma substância neutra ou umcontrole negativo, como medido em um ensaio de resposta decélula B.

Por "atividade antagonista" entende-se que asubstância funciona como um antagonista. Um anticorpoantagonista anti-CD4 0 da invenção evita ou reduz a induçãode qualquer uma das respostas induzidas por ligação doreceptor de CD4 0 a um ligante do agonista, particularmenteCD4 0L. Os antagonistas podem reduzir a indução de qualqueruma ou mais das respostas à ligação agonista em 5%, 10%,15%, 20%, 25%, 30%, 35%, pref erivelmente 40%, 45%, 50%,55%, 60%, mais pref erivelmente 70%, 80%, 85% e,principalmente, 90%, 95%, 99% ou 100%. Métodos para amedida da especificidade de ligação de ligante de CD4 0 eatividade antagonista do agente terapêutico anti-CD4 0, porexemplo, um anticorpo anti-CD4 0, são conhecidos na técnicae incluem, sem limitação, ensaios-padrão de ligaçãocompetitiva, ensaios para monitoramento da secreção deimunoglobulina por células B, ensaios de proliferação decélulas B, ensaios de proliferação de células Banchereau-Like-B, ensaios de célula T helper para a produção deanticorpo, co-estimulação de ensaios de proliferação decélulas B e ensaios para supra-regulação de marcadores daativação de célula B. Veja7 por exemplo, tais ensaiosrevelados em WO 00/75348 e Patente U.S. No. 6.087.329, aquiincorporados por referência. Veja também, WO 2005/044854,WO 2005/044304, WO 2005/044305, WO 2005/044306, WO2005/044855, WO 2005/044307, e WO 2005/044294W0, cujosconteúdos são aqui incorporados em sua totalidade porreferência.

Antagonista/ausência de atividade agonista pode seravaliada por ensaios que mostram que CHIR-12.12 édesprovido de atividade agonista. Ensaios adequados sãomostrados nos ensaios descritos em US 5677165 (ChironCorporation).

Em uma modalidade da invenção, o anticorpo antagonistaanti-CD40 é livre de atividade agonista significativa emuma resposta celular. Em outra modalidade da invenção, oanticorpo antagonista anti-CD40 é livre de atividadeagonista significativa em ensaios de mais de uma respostacelular (por exemplo, proliferação e diferenciação, ouproliferação, diferenciação e, para células B, produção deanticorpo).

De interesse particular são anticorpos anti-CD40antagonistas que são livres de atividade agonistasignificativa como aqui definido mas exibem atividadeantagonista quando ligados ao antígeno CD40 em células Bhumanas. Em uma modalidade da invenção, o anticorpo anti-CD40 antagonista é livre de atividade agonistasignificativa em uma resposta de célula B. Em uma outramodalidade da invenção, o anticorpo anti-CD40 antagonista éé livre de atividade agonista significativa em ensaios demais de uma resposta de célula B (por exemplo, proliferaçãoe diferenciação, ou proliferação, diferenciação, e produçãode anticorpo).

Qualquer um dos ensaios conhecidos na técnica pode serusado para determinar se um anticorpo anti-CD4 0 age como umantagonista de uma ou mais respostas de célula B. Emalgumas modalidades, o anticorpo anti-CD4 0 age como umantagonista de pelo menos uma resposta de célula Bselecionada do grupo que consiste em proliferação de célulaB, diferenciação de célula B, produção de anticorpo, adesãointercelular, geração de memória de célula B, troca deisotipo, supra-regulação de expressão de superfície celularde MHC Classe II eCD80/86, e secreção de citocinas pró-inflamatórias como IL-8, IL-12, e TNF. De interesseparticular são anticorpos antagonistas anti-CD4 0 que sãolivres de atividade agonista significativa com relação àproliferação de célula B quando ligados ao antígeno CD4 0humano na superfície de uma célula B humana.

Nessa modalidade, o anticorpo anti-CD4 0 é umantagonista da proliferação de célula B induzida por CD4 0Lsolúvel ou de superfície celular, como medido em um ensaiode proliferação de célula B. Ensaios de proliferação decélula B adequados são conhecidos na técnica.

Preferivelmente, o anticorpo anti-CD40 antagonista estimulaa proliferação de célula B em um nível que é de não maisque cerca de 25% maior que a proliferação de célula Binduzida por uma substância neutra ou controle negativo,preferivelmente não mais que cerca de 20% maior, 15% maior,10% maior, 5% maior, 1% maior, 0,5% maior, ou ainda nãomais que cerca de 0,1% maior que a proliferação de célula Binduzida por uma substância neutra ou controle negativo.

Em outras modalidades, o anticorpo anti-CD40 é umantagonista de proliferação de célula B que é induzida porum outro anticorpo anti-CD4 0, por exemplo, o anticorpoanti-CD4 0 S2C6, como medido em uma proliferação de célulaB, e o nível de proliferação de célula B estimulado pelooutro anticorpo anti-CD40 na presença do anticorpo anti-CD4 0 antagonista é de não mais que cerca de 25% daproliferação de célula B induzida pelo outro anticorpoanti-CD4 0 na ausência do anticorpo anti-CD4 0 antagonista(ou seja, pelo menos 75% de inibição), preferivelmente nãomais que cerca de 20%, 15%, 10%, 5%, 1%, 0,5%, ou até mesmonão mais que cerca de 0,1% da proliferação de célula Binduzida pelo outro anticorpo anti-CD40 na ausência doanticorpo anti-CD4 0 antagonista.

Ainda em outras modalidades, o anticorpo anti-CD40 éum antagonista de proliferação de célula B que é induzidapela linha de células EL4B5 como medido em um ensaio deativação de célula B, e o nível de proliferação de célula Bestimulado pela linha de células EL4B5 na presença doanticorpo anti-CD4 0 antagonista é de não mais que cerca de25% da proliferação de célula B induzida por essa linha decélulas na ausência do anticorpo anti-CD4 0 antagonista (ouseja, pelo menos 75% de inibição), preferivelmente não maisque cerca de 20%, 15%, 10%, 5%, 1%, 0,5%, ou ainda não maisque cerca de 0,1% da proliferação de célula B induzida poressa linha de células na ausência do anticorpo anti-CD4 0antagonista.

Ainda em outras modalidades, o anticorpo anti-CD40 éum antagonista da produção de anticorpos induzida porcélula T humana por células B humanas como medido no ensaiode célula T helper humana para produção de anticorpo porcélulas B. Desse modo, o nível de produção do anticorpoIgG, produção do anticorpo IgM, ou produção do anticorpoIgG e IgM por células B estimulada por células T napresença do anticorpo anti-CD4 0 antagonista é de não maisque cerca de 50% da produção do anticorpo respectivo porcélulas B estimuladas por células T na ausência doanticorpo anti-CD40 antagonista (ou seja, pelo menos 75% deinibição), preferivelmente não mais que cerca de 25%, 20%,15%, 10%, 5%, 1%, 0,5%, ou ainda não mais que cerca de 0,1%da produção do anticorpo respectivo por células Bestimuladas por células T na ausência do anticorpo anti-CD4 0 antagonista. Anticorpos anti-CD4 0 antagonistasadicionais incluem os anticorpos monoclonais referidos comoSD12, 3A8 and 3C6, que são secretado por um hibridoma quetem os números de acesso ATCC HB 1133 9, HB 12024 e HB1134 0, respectivamente. Veja, por exemplo, Patente U.S. No.6.315.998, aqui incorporada em sua totalidade porreferência.

Anticorpos anti-CD40 antagonistas são conhecidos natécnica. Veja, por exemplo, o anticorpo anti-CD4 0 humanoproduzido pelo hibridoma designado F4-465 revelado nasPublicações de Pedido de Patente U.S. Nos. 20020142358 e20030059427; aqui incorporados em sua totalidade porreferência. F4-465 foi obtido de camundongo HAC (Kuroiwa ecols. (2000) Nature Biotech. 10:1086 (2000)) e portanto,expressa a cadeia leve humana lambda. Veja também, WO2005/044854, WO 2005/044304, WO 2005/044305, WO2005/044306, WO 2005/044855, WO 2005/044307, e WO2005/044294w0, cujos conteúdos são aqui incorporados em suatotalidade por referência.

Além da atividade antagonista, o anticorpo anti-CD4 0para uso nos métodos da presente invenção terápreferivelmente um outro mecanismo de ação contra umacélula alvo. Por exemplo, o anticorpo anti-CD40 terápreferivelmente atividade de ADCC. Alternativamente, asregiões variáveis do anticorpo anti-CD4 0 podem serexpressas em um outro isotipo de anticorpo que tematividade de ADCC. Também é possível conjugar formasnativas, formas recombinantes, ou fragmento de ligação aantígenos de anticorpos anti-CD40 a uma citotoxina, umagente terapêutico, ou um íon de metal radioativo ouradioisótopo, como descrito em outra parte nessa.

Como explicado em outra parte nessa, os inventoresfizeram o achado surpreendente que, ao contrário de outrosanticorpos, anticorpos anti-CD4 0, como CHIR-12.12, sãocapazes de mediar potente citotoxicidade celular dependentede anticorpo (ADCC) (ADCC) de células alvo que expressamCD4 0 via ligação aos dois alótipos de FcyRIIIa deaminoácido 158 (V ou F) em células killer naturais (NK) depaciente humano. Portanto, anticorpos anti-CD4 0, como CHIR-12.12, podem ser usados no tratamento de doençasinflamatórias e doenças autoimunes associadas com célulasque expressam CD4 0 em pacientes humanos heterozigóticos ouhomozigóticos para FcyRIIIa-158F (genótipo V/F ou F/F),além de pacientes humanos homozigóticos para FcyRIIIa-158V(genótipo V/V) . A presente invenção é especialmentevantajosa para o tratamento de doenças inflamatórias edoenças autoimunes que não são responsivas ao tratamentocom rituximab (Rituxan®), porque a atividade clinica derituximab em NHL não está correlacionada com o genótipo deFcyRIIIa do paciente.

Portanto, anticorpos anti-CD40 particularmentepreferidos para uso nos métodos da presente invenção sãoaqueles que, além da atividade antagonista, são capazes demediar ADCC de células que expressam CD4 0 por célulasefetoras humanas, como células killer naturais (células NK)que expressam FcyRIIIa. Mais preferidos são aquelesanticorpos anti-CD40 que são capazes de se ligar aFcyRIIIa-158F e FcyRIIIa-158V com alta afinidade, comodescrito também em outra parte nessa.

Anticorpos anti-CD40 particularmente preferidos sãoaqueles revelados em WO 2005/044854, WO 2005/044304, WO2005/044305, WO 2005/044306, WO 2005/044855, WO2005/044307, e WO 2005/044294WO, cujos conteúdos são aquiincorporados em sua totalidade por referência.

De particular interesse para a presente invenção sãoanticorpos anti-CD4 0 antagonistas que partilha ascaracterísticas de ligação do anticorpo monoclonal CHIR-12.12 descrito em WO 2005/044854, WO 2005/044304, WO2005/044305, WO 2007/053661 PCT/US2006/042601, WO

2005/044306, WO 2005/044855, WO 2005/044307, e WO2005/044294. Tais anticorpos incluem, sem limitação osseguintes:

a) o anticorpo monoclonal CHIR-12.12;

b) o anticorpo monoclonal produzido pela linha decélulas de hibridoma 12.12;

c) um anticorpo monoclonal que compreende umaseqüência de aminoácidos selecionada do grupo que consistena seqüência mostrada em Id. de Seq. N0:2, a seqüênciamostrada em Id. de Seq. N0 :4, a seqüência mostrada em Id.de Seq. N° :5, ambas seqüências mostradas em Id. de Seq.N0 :2 e Id. de Seq. N° :4, e ambas seqüências mostradas emId. de Seq. N0:2 e Id. de Seq. N0:5;

d) um anticorpo monoclonal que tem uma seqüência deaminoácidos codificada pela molécula de ácido nucleico quecompreende uma seqüência de nucleotídeos selecionada dogrupo que consiste na seqüência mostrada em Id. de Seq.N0 :1, a seqüência mostrada em Id. de Seq. N0 :3, e ambasseqüências mostradas em Id. de Seq. N0 :1 and Id. de Seq.N° : 3 ;

e) um anticorpo monoclonal que se liga a um epitopocapaz de ligar o anticorpo monoclonal produzido pela linhade células de hibridoma 12.12;

f) um anticorpo monoclonal que se liga a um epitopoque compreende resíduos 82-87 da seqüência de CD40 humanomostrada em Id. de Seq. N0:7 ou Id. de Seq. N0 :9;

g) um anticorpo monoclonal que se liga a um epitopoque compreende resíduos 82-89 da seqüência de CD40 humanomostrada em Id. de Seq. N0:7 ou Id. de Seq. N0:9;

h) um anticorpo monoclonal que compete com oanticorpo monoclonal CHIR-12.12 em um ensaio de ligaçãocompetitiva;

i) o anticorpo monoclonal do item a) ou um anticorpomonoclonal de qualquer um dos itens anteriores c)-h), emque o referido anticorpo é produzido de forma recombinante;e

j) um anticorpo monoclonal que é um fragmento deligação a antígeno de um anticorpo monoclonal de qualquerum dos itens anteriores a)-i), em que o referido fragmentoretém a capacidade de ligação específica ao referidoantígeno CD4 0 humano.

0 anticorpo monoclonal CHIR-12.12 é particularmentepreferido para uso nos métodos da presente invenção.

0 anticorpo monoclonal CHIR-12.12 foi descrito emdetalhes em WO 2005/044854, WO 2005/044304, WO 2005/044305,WO 2005/044306, WO 2005/044855, WO 2005/044307, e WO2005/044294. O anticorpo CHIR-12.12 pe um anticorpomonoclonal anti-CD4 0 totalmente humano do isotipo IgGlproduzido a partir da linha de células de hibridoma153.8E2.DlO.D6.12.12 (referida como a linha de células12.12) . A linha de células foi criada com o uso deesplenócitos de camundongos xenotípicos imunizados contendoo lócus de cadeia pesada de IgGl humana e o lócus de cadeiaK. humana (tecnologia XenoCamundongo®; Abgenix; Fremont,Califórnia). As células do baço foram fundidas com ascélulas de mieloma de camundongo SP2/0 (Sierra BioSource).Os hibridomas resultantes foram subclonados várias vezespara criar a linha estável de células monoclonais 12.12.Outros anticorpos adequados para uso nos métodos dainvenção podem ser preparados de modo similar com o uso decamundongos transgênicos para lócus de imunoglobulinahumana, como descrito em outra parte nessa.

O anticorpo monoclonal CHIR-12.12 se liga a CD40solúvel em ensaios de tipo ELISA, evita a ligação deligante de CD40 a CD40 de superfície celular, e desloca oligante de CD40 pré-ligado, como determinado por ensaios decitometria de fluxo. Anticorpos CHIR 5.9 e CHIR-12.12competem um com o outro por ligação a CD4 0 mas não com15B8, o anticorpo anti-CD4 0 monoclonal descrito em PedidoProvisório U.S. No. de Série 60/237.556, intitulado "HumanAnticorpos anti-CD40," depositado em 2 de outubro de 2000,e Pedido Internacional PCT No. PCT/US01/3 0857, tambémintitulado "Human Anti-CD40 Antibodies," depositado em 2 deoutubro de 2001 (Caso No. PP16092.003) e publicado como WO2002/028904, ambos aqui incorporados em sua totalidade porreferência. Quando testado in vitro para efeitos sobre aproliferação de células B a partir de indivíduos humanosnormais, CHIR-12.12 age como anticorpo anti-CD4 0antagonista. Além disso, CHIR-12.12 não induz forteproliferação de linfócitos humanos a partir de indivíduosnormais. O anticorpo é capaz de matar células alvo queexpressam CD40 por citotoxicidade celular dependente deanticorpo (ADCC). A afinidade de ligação de CHIR-12.12 porCD40 humano é 5xlO"10 M, como determinado no ensaioBiacore™.

As seqüências de nucleotídeos e de aminoácidos dasregiões variáveis do anticorpo são aqui fornecidas, maisparticularmente, as seqüências de aminoácidos para asregiões lider, variável, e constante para a cadeia leve ecadeia pesada para mAb CHIR-12.12 são apresentadas em Id.de Seq. N°:2 (seqüência completa para a cadeia leve de mAbCHIR-12.12), Id. de Seq. N°:4 (seqüência completa para acadeia pesada para mAb CHIR-12.12), e Id. de Seq. N°: 5(seqüência completa para a variante da cadeia pesada paramAb CHIR-12.12 apresentada em Id. de Seq. N0 :4, em que avariante compreende uma substituição de serina pelo resíduode alanina na posição 153 de Id. de Seq. N0 :4) . Asseqüências de nucleotídeos que codificam a cadeia leve ecadeia pesada para mAb CHIR-12.12 são apresentadas em Id.de Seq. N0 :1 (seqüência codificadora para a cadeia levepara mAb CHIR-12.12) e Id. de Seq. N°: 3 (seqüênciacodificadora para a cadeia pesada para mAb CHIR-12.12).Hibridomas que expressam o anticorpo CHIR-12.12 foramdepositados com a ATCC com a designação de depósito depatente de PTA-5543.

Anticorpos anti-CD4 0 para uso nos métodos da presenteinvenção incluem anticorpos que diferem do anticorpomonoclonal CHIR-12.12 mas que retêm as CDRs, e anticorposcom uma ou mais adições, deleções, ou substituições deaminoácidos. Os anticorpos anti-CD40 para uso nos métodosda presente invenção também põem ser anticorposdesimunizados, particularmente anticorpos anti-CD40antagonistas desimunizados, que podem ser produzidos comodescrito, por exemplo, na Publicação Internacional Nos. WO98/52976 e WO 0034317; aqui incorporadas por referência.Dessa forma, resíduos nos anticorpos anti-CD40 antagonistasda invenção são modificados de modo a tornar os anticorposnão ou menos imunogênicos a humanos embora retenham suaatividade antagonista para células humanas que expressamCD4 0, em que tal atividade é medida por ensaios mostradosem outra parte nessa. Também incluídas no escopo dapresente invenção são proteínas de fusão que compreendem umanticorpo de interesse, por exemplo, um anticorpo anti-CD4 0antagonista ou um anticorpo anti-CD40L antagonista, ou umfragmento desses, cujas proteínas de fusão podem sersintetizadas ou expressas a partir de vetores depolinucleotídeos correspondentes, como é conhecido natécnica. Tais proteínas de fusão são descritas comreferência a conjugação de anticorpos como mostrados emoutra parte nessa.

Qualquer anticorpo conhecido que tem a especificidadede ligação de interesse pode ter variações de seqüênciaproduzidas com o uso de métodos descritos, por exemplo, nasPublicações de Patente Nos. EP 0983303 Al, WO 00/34317, eWO 98/52976, aqui incorporadas por referência. Por exemplo,foi mostrado que as seqüências na CDR podem fazer umanticorpo se ligar a MHC Classe II e despertar uma respostade célula T helper indesejada. Uma substituiçãoconservadora pode permitir que o anticorpo retenha aatividade de ligação, embora perca sua habilidade paradesencadear uma resposta indesejada de célula T. Qualqueruma dessas substituições conservadoras ou não conservadoraspode ser feita usando métodos reconhecidos na técnica, taiscomo aqueles aqui apresentados em outra seção, e osanticorpos resultantes também podem ser usados nos métodosda presente invenção. Os anticorpos variantes podem sertestados rotineiramente quanto à atividade antagonista, porexemplo, atividade antagonista, afinidade e especificidadeutilizando-se os métodos aqui descritos.

Por exemplo, variantes de seqüência de aminoácidos deum anticorpo antagonista anti-CD4 0, por exemplo, oanticorpo monoclonal CHIR-12.12, podem ser preparadas pormutações na seqüência de DNA clonado que codifica oanticorpo de interesse. Métodos para mutagênese ealterações nas seqüência de nucleotxdeos são bem conhecidosna técnica. Veja, por exemplo, Walker e Gaastra, eds.(1983) "Techniques in Molecular Biology" (MacMillanPublishing Company, Nova York); Kunkel (1985) Proc. Natl.Acad. Sei. USA 82:488-492; Kunkel e cols. (1987) MethodsEnzymol. 154:367; Sambrook e cols. (1989) MolecularCloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor, NovaYork); Patente U.S. N0 4.873.192; e as referências nelacitadas; aqui incorporados por referência. Um guia sobrecomo adequar substituições de aminoácidos que não afetem aatividade biológica do polipeptídeo de interesse pode serencontrado no modelo de Dayhoff e cols. (1978) no Atlas ofProtein Sequence e Structure (Natl. Biomed. Res. Found.,Washington, D.C.), aqui incorporado por referência.Substituições conservadores como, por exemplo, a troca deum aminoácido com outro que possui propriedades similares,podem ser preferidas. Exemplos de substituiçõesconservadoras incluem, sem limitação, Gly<=>Ala,Val<=>Ile<=>Leu, Asp<=>Glu, Lys<=>Arg, Asn<=>Gln ePhe < = >Trp< = >Tyr.

Na construção de variantes de um anticorpo deinteresse, por exemplo, um polipeptídeo de anticorpo anti-CD40 são feitas modificações de tal forma que as variantescontinuem a possuir a atividade desejada, ou seja,afinidade de ligação similar, e, no caso de anticorposanti-CD40 antagonista, que sejam capazes de se ligarespecificamente a um antígeno CD4 0 humano expresso nasuperfície de uma célula humana, e sendo livres deatividade agonista significativa, mas exibam atividadeantagonista quando ligadas a um antígeno CD4 0 em uma célulaque expressa CD4 0 humano. Obviamente, quaisquer mutaçõesfeitas no DNA que codifica o polipeptídeo variante nãodevem colocar a seqüência fora do quadro de leitura e,preferivelmente, não criarão regiões complementares quepossam produzir estrutura de mRNA secundária. Veja aPublicação de Pedido de Patente EP N0 75.444.

Além disso, a região constante de um anticorpo, porexemplo, um anticorpo anti-CD4 0 antagonista pode ser mutadapara alterar a função efetora de diversas formas. Porexemplo, consulte a Patente U.S. N0 6.737.056 Bl e aPublicação do Pedido de Patente U.S. N0 2004/0132101 Al,que revela mutações Fc que otimizam a ligação de anticorpoaos receptores Fc.

Preferivelmente, variantes de um anticorpo dereferência, por exemplo, um anticorpo antagonista anti-CD40têm seqüências de aminoácidos que possuem pelo menos 7 0% ou75% de identidade de seqüência, preferivelmente pelo menos80% ou 85% de identidade de seqüência, mais preferivelmentepelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94% ou 95% de identidade deseqüência para seqüência de aminoácidos para a molécula deanticorpo antagonista anti-CD4 0, por exemplo, o anticorpomonoclonal CHIR-12.12 aqui descrito, ou a uma porção maiscurta da molécula de anticorpo de referência. Maispreferivelmente, as moléculas compartilham pelo menos 96%,97%, 98% ou 99% de identidade de seqüência. Para asfinalidades da presente invenção, o percentual deidentidade de seqüência é determinado usando o algoritmo depesquisa de homologia de Smith-Waterman usando uma pesquisade espaços afins com uma penalidade de espaço aberto de 12e uma penalidade de extensão de espaço de 2, matriz BLOSUMde 62. O algoritmo de pesquisa de homologia de Smith-Waterman é ensinado em Smith e Waterman (1981) Adv. Appl.Math. 2:482-489. Uma variante pode, por exemplo, diferir dodo anticorpo de referência, por exemplo, anticorpoantagonista anti-CD4 0 por apenas 1 a 15 resíduos deaminoácidos, apenas 1 a 10 resíduos de aminoácidos como,por exemplo, 6-10, apenas 5, apenas 4, 3, 2 ou até mesmo 1resíduo de aminoácido.

Com relação ao alinhamento ótimo de duas seqüências deaminoácidos, o segmento contíguo da seqüência deaminoácidos variante pode ter resíduos de aminoácidosadicionais ou resíduos de aminoácidos deletados com relaçãoà seqüência de aminoácidos de referência. O segmentocontíguo usado para comparação com a seqüência deaminoácidos de referência incluirá pelo menos 2 0 resíduosde aminoácidos contíguos, e pode ter 30, 40, 50 ou maisresíduos de aminoácidos. Podem ser feitas correções para aidentidade de seqüência associadas às substituiçõesconservadoras ou espaços de resíduos (veja algoritmo depesquisa de homologia de Smith-Waterman).

A estrutura química precisa de um polipeptídeo capazde se ligar especificamente ao CD4 0 e que retém atividadeantagonista, particularmente quando ligado ao antígeno CD40em células alvo, depende de diversos fatores. Como gruposamino e carboxil ionizáveis estão presentes na molécula, umpolipeptídeo específico pode ser obtido como um sal ácidoou básico ou em forma neutral. Todas essas preparações queretêm sua atividade biológica quando colocadas em condiçõesambientais adequadas estão incluídas na definição deanticorpos antagonistas anti-CD4 0 como aqui usada. Alémdisso, a seqüência de aminoácidos primária do polipeptídeopode ser aumentada por derivação usando porções de açúcar(glicosilação) ou por outras moléculas suplementares, taiscomo lipídeos, fosfato, grupos acetil e semelhantes. Elatambém pode ser aumentada por conjugação com sacarídeos.Certos aspectos desse aumento são obtidos através desistemas de processamento pós-tradução do hospedeiroprodutor; outras dessas modificações podem ser introduzidasin vitro. Em qualquer evento, tais modificações estãoincluídas na definição de um anticorpo anti-CD40 aquiusada, desde que as propriedades antagonistas do anticorpoanti-CD4 0 não sejam destruídas. Espera-se que taismodificações possam afetar quantitativa ou qualitativamentea atividade, aumentando ou diminuindo a atividade dopolipeptídeo, nos vários ensaios. Além disso, resíduos deaminoácidos individuais na cadeia podem ser modificados poroxidação, redução ou outra derivação, e o polipeptídeo podeser clivado para a obtenção de fragmentos que retenhamatividade. Tais alterações que não destroem a atividadeantagonista não removem a seqüência de polipeptídeos dadefinição de anticorpos anti-CD40 de interesse como aquiusada.

A técnica fornece uma diretriz substancial em relaçãoà preparação e ao uso de variantes de polipeptídeo. Napreparação das variantes do anticorpo anti-CD4 0, aqueleshabilitados na técnica podem determinar prontamente quaismodificações ao nucleotídeo ou à seqüência nativa deaminoácidos resultarão em uma variante que seja adequadapara uso como um componente terapeuticamente ativo de umacomposição farmacêutica usada nos métodos da presenteinvenção.

O anticorpo anti-CD4 0 para uso nos métodos da invençãopreferivelmente possui pelo menos uma das seguintesatividades biológicas in vitro e/ou in vivo: inibição dasecreção de imunoglobulina por células B periféricashumanas normais estimulada por células T; inibição dasobrevida e/ou proliferação de células B periféricashumanas normais estimulada por células que expressam CD4 0Lou ligante de CD4 0 solúvel (sCD4 0L); inibição da sobrevidae/ou proliferação de células B periféricas humanas normaisestimulada por células T de Jurkat; inibição de sinaisintracelulares antiapoptóticos de "sobrevida" em qualquercélula estimulada por SCD4 0L ou CD4 0L de fase sólida; einibição da transmissão do sinal de CD4 0 em qualquer célulamediante ligação com SCD4 0L ou CD4 0L de fase sólida,anergyia e/ou indução de tolerância de células alvo queportam CD4 0 ou células que portam ligantes cognatos paraCD4 0 incluindo, sem limitação, células T e células B,indução da expansão ou ativação de células T reguladorasCD4+CD25+ (veja, por exemplo, rejeição de tecido especificapara aloantígeno de doador via interferência CD40-CD40L,van Maurik e cols. (2002) J. Immunol. 169:5401-5404),citotoxicidade via qualquer mecanismo (incluindo, semlimitação, citotoxicidade mediada por células dependentesde anticorpo (ADCC), citotoxicidade dependente decomplemento (CDC), infra-regulação da proliferação, e/ouapoptose em células alvo), modulação da secreção decitocina de célula alvo e/ou expressão de molécula desuperfície celular, e combinações desses.

Ensaios para tais atividades biológicas podem serrealizados como aqui descrito em pedidos provisóriosintitulados nAntagonist Anti-CD4 0 Monoclonal Antibodies andMethods for Their Use", depositado em 4 de novembro de2003, 26 de novembro de 2003 e 27 de abril de 2004, ePedidos de Patente U.S. designados Nos 60/517.337 (ProcessoN0 PP20107.001 (035784/258442)), 60/525.579 (Processo N0PP20107.002 (035784/271525)), e 60/565.710 (Processo N0PP20107.003 (035784/277214)), respectivamente, e Pedido dePatente Internacional N0 PCT/US2004/037152 (Processo N0PP20107.004 (035784/282916)), publicado como WO2005/044854, também intitulado nAntagonist Anti-CD40Monoclonal Antibodies and Methods for Their Use",depositado em 4 de novembro de 2004; cujos conteúdos sãoaqui incorporada em sua totalidade por referência. Vejatambém os ensaios descritos em Schultze e cols. (1998)Proc. Natl. Acad. Sei. USA 92:8200-8204; Denton e cols.(1998) Pediatr. Transplant. 2:6-15; Evans e cols. (2000) JImmunol. 164:688697; Noelle (1998) Agents Actions Suppl.49:17-22; Lederman e cols. (1996) Curr. Opin. Hematol.3:77-86; Coligan e cols. (1991) Current Protocols inImmunology 13:12; Kwekkeboom e cols. (1993) Immunology79:439-444; e Patentes U.S. Nos 5.674.492 e 5.847.082, aquiincorporadas por referência.

Um ensaio representativo para detectar anticorposantagonistas anti-CD40 específicos para os epitopos deantígeno CD4 0 aqui identificados é um "ensaio competitivode ligação". Ensaios competitivos de ligação são ensaiossorológicos nos quais desconhecidos são detectados equantificados quanto à sua habilidade para inibir a ligaçãode um ligante conhecido rotulado ao seu anticorpoespecífico. Esse também é denominado ensaio competitivo deinibição. Em um ensaio competitivo de ligaçãorepresentativo, polipeptídeo CD40 rotulado é precipitadopor anticorpos candidatos em uma amostra, por exemplo, emcombinação com anticorpos monoclonais despertados contra umou mais epitopos dos anticorpos monoclonais da invenção.

Anticorpos Anti-CD40 que reagem especificamente com umepitopo de interesse podem ser identificados porrastreamento de uma série de anticorpos preparados contrauma proteína CD40 ou fragmento da proteína que compreende oepitopo particular da proteína CD40 de interesse. Porexemplo, para CD40 humano, epitopos de interesse incluemepitopos que compreendem resíduos de aminoácidos linearese/ou não lineares da isoforma curta de CD40 humano (veja N0de Acesso no GenBank NP 690593) apresentada em Id. de Seq.N0 :10, codificada pela seqüência apresentada em Id. de Seq.N0:9; (veja, também No. de Acesso GenBank NM 152854), ou daisoforma longa de CD40 humano (veja N0 s de Acesso noGenBank CAA43045 e NP_001241, apresentada em Id. de Seq.N°:12, codificada pela seqüência apresentada em Id. de Seq.N0:11; veja, GenBank Nos. de Acesso X60592 e NM 001250).Alternativamente, ensaios competitivos de ligação comanticorpos antagonistas anti-CD40 identificados previamenteadequados poderiam ser usados para selecionar anticorposmonoclonais comparáveis aos anticorpos identificadospreviamente.

Anticorpos empregados em tais imunoensaios podem serrotulados ou não rotulados. Anticorpos não rotulados podemser empregados em aglutinação; anticorpos rotulados podemser empregados em uma ampla variedade de ensaios, queempregam uma ampla variedade de rótulos. A detecção daformação de um complexo antígeno-anticorpo entre umanticorpo anti-CD40 e um epitopo de interesse pode serfacilitada pela anexação de uma substância detectável aoanticorpo. Meios de detecção adequados incluem a utilizaçãode rótulos, tais como radionuclídeos, enzimas, coenzimas,substâncias fluorescentes, substâncias quimioluminescentes,cromógenos, substratos ou co-fatores de enzimas, inibidoresde enzimas, complexos de grupo prostético, radicais livres,partículas, corantes, e semelhantes. Exemplos de enzimasadequadas incluem peroxidase de raiz forte, fosfatasealcalina, β-galactosidase ou acetilcolinesterase; exemplosde complexos de grupo prostético adequados incluemestreptavidinibiotina e avidina/biotina; exemplos demateriais fluorescentes adequados incluem umbeliferona,fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina,diclorotriazinilamina fluoresceína, cloreto de dansila ouficoeritrina; um exemplo de um material luminescente éluminol; exemplos de materiais bioluminescentes incluemluciferase, luciferina e aequorina; e exemplos de materialradioativo adequado incluem 125I, 131I, 35S ou 3H. Taisreagentes rotulados podem ser usados em diversos ensaiosbem conhecidos, tais como radioimunoensaios, imunoensaiosenzimáticos, por exemplo, ELISA, imunoensaiosfluorescentes, e semelhantes. Veja, por exemplo, asPatentes U.S. Nos 3.766.162, 3.791.932, 3.817.837 e4.233.402.

É também possível construir um anticorpo para teratividade de ADCC aumentada. Em particular, a metade determinal carboxi do domínio CH2 é crítica para ADCC mediadaatravés do receptor FcRIII. Uma vez que CH2 e regiões dedobradiça têm um importante papel em funções efetoras, umaséries de anticorpos de domínios múltiplos que contêm CH2extra e/ou regiões de dobradiça pode ser criada einvestigada para quaisquer mudanas na potência efetora(veja, Greenwood, J., Gorman, S. D., Routledge, POREXEMPLO, Lloyd, I.S. & Waldmann , H., Ther Immunol. 1994Oct;1 (5) :247-55) . Uma abordagem alternativa pode ser aconstrução de domínios extra em paralelo, por exemplo,através da criação de dímeros por construção de umacisteína na cadeia H de uma Ig quimérica (veja, Shopes B.(1992) J. Immunol. 1992 1; 148(9): 2918-22). Além disso,mudanças para aumentar a atividade de ADCC podem serconstruídas por introdução de mutações na região Fc (veja,por exemplo, US 6.737.056 BI), que expressa células emlinhas de células deficientes de fucosil transferase (veja,for exemplo, US2003/0115614), ou efetuando outras mudançaspara a glicosilação do anticorpo (veja, por exemplo, US6.602.684) .

A presente invenção é especialmente vantajosa para otratamento de doenças inflamatórias e doenças autoimunesque são associadas com células que expressam CD20,particularmente em pacientes resistentes a Rituxan®, maisparticularmente naqueles que são heterozigóticos ouhomozigóticos para FcyRIIIa-158F (genótipo V/F ou F/F) .

Como aqui usado, "anticorpo anti-CD20" englobaqualquer anticorpo que reconheça especificamente o antígenode superfície celular CD20, incluindo anticorpospoliclonais, anticorpos monoclonais, anticorpos de cadeiaúnica, e fragmentos desses como Fab, F(ab')2, Fv, e outrosfragmentos que retêm a função de ligação de antígeno doanticorpo anti-CD20 parente. De interesse particular juntocom os métodos da presente invenção são anticorpos anti-CD20 ou fragmentos de ligação a antígeno desses que têm aspropriedades de ligação exibidas pelo anticorpo monoclonalIDEC-C2B8 (Biogen IDEC Inc., Cambridge, MA).

Em algumas modalidades, o anticorpos anti-CD40 usadonos métodos da invenção exibe atividade terapêutica maispotente que o anticorpo monoclonal anti-CD20 quiméricoIDEC-C2B8, em que a atividade terapêutica é avaliada comquantidades equivalentes desses anticorpos em um modeloexperimental adequado. IDECC2B8 (IDEC PharmaceuticalsCorp., San Diego, Califórnia; comercialmente disponível sobo nome comercial Rituxan®, também referido como rituximab)é um anticorpo monoclonal anti-CD20 quimérico que contémIgGl humana e regiões constantes kapa com regiões variáveisde murídeo isoladas de um anticorpo monoclonal anti-CD20 demurídeo, IDEC-2B8 (Reff e cols. (1994) Blood 83:435-445).Rituximab é licenciado para o tratamento de linfoma decélula B de baixo grau em recidiva ou linfoma não Hodgkinfolicular (NHL), e está em experimentos clínicos paradoenças autoimunes. A descoberta de anticorpos comatividade terapêutica superior comparados a rituximab podemelhorar drasticamente os métodos de terapia para doençasinflamatórias e doenças autoimunes.

Existem modelos adequados para testar a atividade emlúpus eritematoso disseminado (SLE), esclerose múltipla,inflamação e aterosclerose, transplante, e doença deAlzheimer como descrito abaixo.

Por exemplo, para testar a eficácia em lúpuseritematoso disseminado humano (LED) em que célulasmononucleares de sangue periférico (PMBCs) de pacientes comLED são enxertadas em camundongos SCID. Veja, por exemplo,o modelo descrito em Duchosal e cols. (1990).1 Exp. Med.172:985-8. Após transferência de PBMCs de pacientes com LEDem camundongos SCID, é determinado se o tratamentoinfluencia ou não a resposta de linfócito T ã produção deauto-antígeno e auto-anticorpo e manifestações de doençacomo glomerulonefrite.

Encefalite autoimune experimental de macaco Marmoset(EAE) é um modelo para esclerose múltipla humana. Veja, porexemplo, o modelo descrito em Raine e cols. (1999) Ann.Neurol. 46:144-60 e Hart e cols. (2004) Lancet Neurol.3 : 588-97.

O anticorpos pode ser testado in vitro para suacapacidade de inibir a produção induzida por CD4 0L deenzimas de degradação de matriz, expressão de fatortecidual, citocinas pró-inflamatórias e supra-regulação demoléculas de adesão. Estudos subseqüentes testam acapacidade dos anticorpos de mostrar as atividadesanti inf lamatórias in vivo com o uso de camundongostransgênicos que expressam CD4 0 humano e/ou moléculas deCD20. Veja, por exemplo, o modelo descrito em Yasui (2002)

Int. Immunol. 14:319-29.

Os anticorpos podem ser testados para sua capacidadede evitar a rejeição a transplantes em modelos de primatasnão humanos. Receptores de aloenxerto renal de macacoCynomolgus são tratados com anticorpo para demonstrar oefeito sobre a aceitação de enxerto com ou sem medicamentosimunossupressores adicionais como ciclosporina, FK506,rapamicina, corticosteróides, CTLA4-Ig, e anticorpo anti-estimulante de linfócito B, e outros. Veja, por exemplo, omodelo descrito em Wee e cols. (1992) Transplantation53:501-7.

Para doença de Alzheimer, o anticorpos pode sertestado primeiramente in vitro para sua capacidade debloquear a ativação da microglia. Estudos de eficácia invivo com o anticorpos podem ser conduzidos em camundongosduplamente transgênicos que expressam CD4 0 e/ou CD20 humanoe produzem peptídeo beta amilóide. Veja, por exemplo, omodelo descrito em Tan e cols. (2002) Nat. Neurosci.5 :1288-93.

Por "quantidade equivalente" do anticorpo anti-CD4 0 dainvenção e Rituxan® entende-se que a mesma dose ou dosemenor em mg é administrada com base no peso.

Portanto, quando o anticorpo anti-CD40 é dosado a 0,01mg/kg de peso corporal do camundongo usado no modelo,Rituxan® é também dosado a 0,01 mg/kg de peso corporal docamundongo. De modo similar, quando o anticorpo anti-CD40 édosado a 0,1, 1, ou 10 mg/kg de peso corporal do camundongousado no modelo, o Rituxan® é também dosado a 0,1, 1, ou 10mg/kg, respectivamente, do peso corporal do camundongo.

Uma outra diferença na eficácia do anticorpo é amedição in vitro da concentração de anticorpo necessáriapara obter a Iise máxima de células alvo in vitro napresença de células NK. Por exemplo, o anticorpos anti-CD4 0da invenção atinge Iise máxima de células Daudi em uma EC50de menos que 1/2, e pref erivelmente 1/4, e maispreferivelmente, 1/10 da concentração de Rituxan®. Essetipo de medição é também descrita nos Exemplos nessa.

Anticorpos anti-CD40 que se beneficiam de ter eficáciasignificativamente maior que quantidades equivalentes deRituxan® nos ensaios acima descritos podem incluir:a) o anticorpo monoclonal CHIR-12.12;

b) o anticorpo monoclonal produzido pela linha decélulas de hibridoma 12.12;

c) um anticorpo monoclonal que compreende uma seqüência de aminoácidos selecionada do grupo que consistena seqüência mostrada em Id. de Seq. Nº:2, a seqüênciamostrada em Id. de Seq. Nº :4, a seqüência mostrada em Id.de Seq. Nº :5, ambas seqüências mostradas em Id. de Seq.Nº :2 e Id. de Seq. N° :4, e ambas seqüências mostradas emId. de Seq. N°:2 e Id. de Seq. Nº:5;

d) um anticorpo monoclonal que tem uma seqüência deaminoácidos codificada por uma molécula de ácido nucleicoque compreende uma seqüência de nucleotídeos selecionada dogrupo que consiste na seqüência mostrada em Id. de Seq. N°:

1, a seqüência mostrada em Id. de Seq. N°: 3, e ambasseqüências mostradas em Id. de Seq. Nº: 1 e Id. de Seq. N°:3;

e) um anticorpo monoclonal que se liga a um epitopocapaz de ligar o anticorpo monoclonal produzido pela linhade células de hibridoma 12.12;

f) um anticorpo monoclonal que se liga a um epitopoque compreende resíduos 82-87 da seqüência de CD40 humanomostrada em Id. de Seq. N°:7 ou Id. de Seq. Nº :9;

g) um anticorpo monoclonal que se liga a um epitopo

que compreende resíduos 82-89 da seqüência de CD40 humanomostrada em Id. de Seq. N°:7 ou Id. de Seq. N° : 9;

h) um anticorpo monoclonal que compete com oanticorpo monoclonal CHIR-12.12 em um ensaio de ligaçãocompetitiva;

i) o anticorpo monoclonal do item a) ou um anticorpomonoclonal de qualquer um dos itens anteriores c)-h), emque o referido anticorpo é produzido de forma recombinante;e

j) um anticorpo monoclonal que é um fragmento deligação a antígeno de um anticorpo monoclonal de qualquerum dos itens anteriores a)-i), em que o referido fragmentoretém a capacidade de se ligar especificamente ao referidoantígeno CD4 0 humano.

A presente invenção fornece um método para aidentificação de um paciente humano com uma doençainflamatória ou doença autoimune tratável com um anticorpoanti-CD4 0, que compreende:

a) a identificação de um paciente humano com umadoença inflamatória ou doença autoimune que está associadaa células que expressam CD40; e

b) determinação do referido genótipo FcyRIIIa-158 deum paciente humano (V/V, V/F or F/F);em que a referida doença inflamatória ou doençaautoimune é tratável com anticorpo anti-CD4 0 se o referidopaciente humano é heterozigótico ou homozigótico paraFcyRIIIa 158F (genótipo V/F ou F/F) . A doença inflamatóriaou doença autoimune pode ser refratária ao tratamento comrituximab (Rituxan®).

Uma vez que um paciente humano com uma doençainflamatória ou doença autoimune tratável com um anticorpoanti-CD40 foi identificado, aquele paciente humano pode serentão tratado com um anticorpo anti-CD40. Assim, o métodopode incluir a etapa adicional de (c) administração a umpaciente humano identificado como heterozigótico ouhomozigótico para FcyRIIIa-158F (genótipo V/F ou F/F) deuma quantidade terapeuticamente ou profilaticamente eficazde um anticorpo anti-CD40.

Esse método de identificação de um paciente humano comuma doença inflamatória ou doença autoimune tratável com umanticorpo anti-CD40 pode ser facilmente realizado por umapessoa habilitada na técnica com o uso de um kitdiagnóstico adequado. 0 kit deve compreender reagentesadequados para a determinação de um genótipo FcyRIIIa-158de um paciente humano. Portanto, a invenção também forneceum kit para a identificação de um paciente humano com umadoença inflamatória ou doença autoimune tratável com umanticorpo anti-CD40, que compreende reagentes para adeterminação de um genótipo FcyRIIIa-158 de um pacientehumano. Kits adequados são descritos em maiores detalhes emoutra parte nessa.

A invenção também fornece um método para seleção deuma terapia de anticorpo para tratamento de um pacientehumano que tem uma doença inflamatória ou doença autoimune,que compreende:

(a) a identificação de um paciente humano que tem umadoença inflamatória ou doença autoimune que está associadaa células que expressam CD40; e

(b) determinação do referido genótipo FcyRIIIa-158 deum paciente humano (VN, V/F ou F/F),

em que se o referido paciente humano é heterozigóticoou homozigótico para FcyRIIIal58F (genótipo V/F ou F/F), umanticorpo anti-CD4 0 é selecionado para o tratamento dareferida doença inflamatória ou doença autoimune. A doençainflamatória ou doença autoimune pode ser refratária aotratamento com rituximab (Rituxan®).Uma vez que uma terapia com anticorpo anti-CD40 paratratamento de um paciente humano que tem uma doençainflamatória ou doença autoimune foi selecionado, aquelepaciente humano pode ser então tratado com um anticorpoanti-CD40. Portanto, o método pode incluir a etapaadicional de (c) administração a um paciente humanoidentificado como heterozigótico ou homozigótico paraFcγRIIIa-158F (genótipo V/F ou F/F) de uma quantidadeterapeuticamente ou profilaticamente eficaz de um anticorpoanti-CD4 0.

Esse método de seleção de uma terapia de anticorpopara tratamento de um paciente humano que tem uma doençainflamatória ou doença autoimune também pode ser facilmenterealizado por uma pessoa habilitada na técnica com o uso deum kit diagnóstico adequado. O kit deve compreenderreagentes adequados para a determinação de um genótipoFcγRIIIa-158 de um paciente humano. Portanto, a invençãotambém fornece um kit para a seleção de uma terapia deanticorpo para tratamento de um paciente humano que tem umadoença inflamatória ou doença autoimune associada comcélulas que expressam CD4 0, que compreende reagentes para adeterminação de um genótipo FcγRIIIa-158 de pacientehumano.

Por "tratável com um anticorpo anti-CD40" entende-seque o paciente humano (ou seja, um indivíduo com uma doençainflamatória ou doença autoimune), quando tratado com oanticorpo anti-CD40, deve se beneficiar de uma "respostaterapêutica positiva" (como definido em outra parte nessa)com relação à doença inflamatória ou autoimune doença paraqual o tratamento é pensado.Qualquer método para a determinação de um genótipoFcyRIIIa-158 de um paciente humano que usa uma amostrabiológica obtida do paciente humano é contemplado.

Por exemplo, a invenção fornece um kit para uso nadeterminação do genótipo FcyRIIIa-158 de um pacientehumano, que inclui um microarranjo que compreende pelomenos um marcador de 10 ou mais nucleotídeos de comprimentoe de uma seqüência adequada para a determinação de umgenótipo FcyRIIIa-158 de um paciente humano. RNA ou DNArotulado é hibridizado a marcadores complementares noarranjo e então detectados por rastreamento de laser. Asintensidades de hibridização para cada marcador no arranjosão determinadas e convertidas a um valor quantitativo querepresenta níveis de expressão relativos do gene. A seleçãode seqüências de marcador e comprimentos pode serfacilmente realizada por pessoa habilitada. A seqüência denucleotídeos s que codificam os alótipos de FcyRIIIa-158 Fe V é conhecida. Portanto, a pessoa habilitada podeselecionar marcadores que, sob as condições experimentaisadequadas, permitam a determinação do genótipo FcyRIIIa-158das seqüências alvo.

Técnicas para a síntese desses arranjos que usammétodos de síntese mecânica são descritos, por exemplo, naPatente U.S. No. 5.384.261, aqui incorporada em suatotalidade por referência. Embora uma superfície de arranjoa plana seja preferida, o arranjo pode ser fabricado em umasuperfície virtualmente de qualquer formato ou até mesmo emvárias superfícies.

Os arranjos podem ser peptídeos ou ácidos nucleicos emglóbulos, géis, superfícies poliméricas, fibras como fibrasóticas, vidro ou qualquer outro substrato adequado, veja,Patentes U.S. Nos. 5.770.358, 5.789.162, 5.708.153,6.04 0.193 e 5.8 0 0.992, cada uma dessas é aqui incorporadaem sua totalidade para todos os objetivos. Os arranjospodem ser embalados em uma tal forma que permita odiagnóstico ou outra manipulação de um dispositivocompleto. Veja, por exemplo, Patentes U.S. Nos. 5.856.174 e5.922.591, aqui incorporadas por referência.

Por exemplo, a invenção também fornece um kit para usona determinação de um genótipo FcyRIIIa-158 de um pacientehumano, que compreende oligonucleotídeos adequados para usocomo iniciadores em amplificação catalisada por polimeraseda região do gene ou mRNA que codifica amino ácido 158 deFcyRIIIa. A seleção das seqüências do iniciador ecomprimentos pode ser facilmente realizada por pessoahabilitada. A seqüência de nucleotídeos do gene e mRNAhumano que codifica os alótipos de FcyRIIIa-158 F e V éconhecida. Portanto, a pessoa habilitada pode selecionarmarcadores que, sob as condições experimentais adequadas,permitam a amplificação da região do gene ou mRNA quecodifica o aminoácido 158 de FcyRIIIa. A seqüênciaamplificada pode ser então seqüenciada com o uso de métodosconhecidos para determinar genótipo FcyRIIIa-158 do paciente.

Um outro método para a determinação de um genótipoFcyRIIIa-158 de um paciente humano é o uso de um métodobaseado em ácido nucleico que detecta fragmentação de DNAque é característica do genótipo FcyRIIIa-158 do pacientehumano's. Quando do uso de eletroforese em géis de agarose,DNA de cada genótipo de FcyRIIIa-15 8 tem um padrãocaracterístico. Portanto, a invenção também fornece um kitpara uso na determinação de um genótipo FcyRIIIa-158 de umpaciente humano, que compreende uma ou mais enzimas derestrição adequadas para a determinação de um genótipoFcyRIIIa-158 de um paciente humano. Enzimas de restriçãoadequadas são conhecidas na técnica (por exemplo, veja,Koene e cols., Blood, 1997, Vol. 90, No. 3, p. 1109-1114).

Os kits da invenção também podem incluir instruçõesque indicam como usar o kit para a determinação de umgenótipo FcyRIIIa-158 de um paciente humano. 0 kit tambémpode compreender, por exemplo, um agente de tamponamento,um conservante, ou um agente de estabilização de proteína.Cada componente do kit pe comumente colocado em umrecipiente individual, e todos os vários recipientes estãoem um único pacote junto com instruções que indicam comousar o kit para a determinação de um genótipo FcyRIIIa-158de um paciente humano.

A invenção fornece o uso de anticorpos anti-CD40 namanufatura de medicamentos para o tratamento de uma doençainflamatória ou doença autoimune associada com células queexpressam CD4 0, como descrito em outra parte nessa.

Os anticorpos anti-CD4 0 dessa invenção sãoadministrados em uma concentração que é terapeuticamenteeficaz para evitar ou tratar uma doença inflamatória oudoença autoimune associada com células que expressam CD40.Para atingir esse objetivo, os anticorpos podem serformulados usando diversos veículos e/ou excipientesaceitáveis conhecidos na técnica. 0 anticorpo anti-CD40pode ser administrado por uma via de administraçãoparenteral. Tipicamente, os anticorpos são administradospor injeção, por via tanto intravenosa quanto subcutânea.Métodos para se obter essa administração são conhecidos poraqueles habilitados na técnica.

A administração intravenosa ocorre preferivelmente porinfusão ao longo de um período de cerca de meia hora a 1hora a cerca de 10 horas (menos que 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7,8, 9, ou 10 horas) . As infusões subseqüentes podem seradministradas ao longo de um período de cerca de 1 a cercade 6 horas, incluindo, por exemplo, cerca de 1 a cerca de 4horas, cerca de 1 a cerca de 3 horas ou cerca de 1 a cercade 2 horas ou manos que uma hora. Alternativamente, umanticorpo anti-CD4 0 como CHIR-12.12 pode ser administradopor via subcutânea.

Uma composição farmacêutica da invenção é formuladapara ser compatível com sua via de administração desejada.Soluções ou suspensões usadas para aplicação parenteral,podem incluir os seguintes componentes: um diluente estérilcomo água para injeção, solução de soro fisiológico;agentes antibacterianos, tais como álcool benziIico oumetil parabenos; antioxidantes, como ácido ascórbico oubissulfito de sódio; agentes quelantes, tais como ácidoetilenodiaminatetraacético; tampões, tais como acetatos,citratos ou fosfatos, e agentes para o ajuste datonicidade, tais como cloreto de sódio ou dextrose. 0 pHpode ser ajustado com ácidos ou bases, tais como ácidoclorídrico ou hidróxido de sódio. A preparação parenteralpode ser embalada em ampolas, seringas descartáveis oufrascos de doses múltiplas feitos de vidro ou plástico.

Os anticorpos anti-CD40 são fornecidos tipicamente portécnica-padrão dentro de um tampão farmaceuticamenteaceitável, por exemplo, soro fisiológico estéril, águatamponada estéril, combinações dos anteriores etc. Métodospara a preparação de agentes administráveis por viaparenteral são descritos em Remington's PharmaceuticalSciences (18a ed. ; Mack Publishing Company, Eaton,Pennsylvania, 1990), aqui incorporado por referência. Vejatambém, por exemplo, a Publicação Internacional N0 WO98/56418, que descreve formulações farmacêuticasestabilizadas de anticorpo adequadas para uso nos métodosda presente invenção.

A quantidade de pelo menos um anticorpo anti-CD4 0 aser administrada é facilmente determinada por aqueleshabilitados na técnica sem experimentação desnecessária.Fatores que influenciam o modo de administração e arespectiva quantidade de pelo menos um anticorpo anti-CD4 0incluem, sem limitação, a severidade da doença, a históriada doença, a idade, peso, altura, saúde e condição físicado indivíduo submetido à terapia. Da mesma forma, aquantidade de anticorpo anti-CD4 0 a ser administrada,dependerá do modo de administração e de se o indivíduo serásubmetido a uma dose única ou a múltiplas doses desseagente antitumoral. Geralmente, uma dosagem maior deanticorpo anti-CD4 0 pe preferida com peso crescente doindivíduo que se submete à terapia.

A dose of anticorpo anti-CD40 a ser administrada estána faixa de cerca de cerca de 0,003 mg/kg a cerca de 50mg/kg, de cerca de 0,01 mg/kg a cerca de 40 mg/kg, de cercade 0,01 mg/kg a cerca de 30 mg/kg, de cerca de 0,1 mg/kg acerca de 3 0 mg/kg, de cerca de 0,5 mg/kg a cerca de 3 0mg/kg, de cerca de 1 mg/kg a cerca de 3 0 mg/kg, de cerca de3 mg/kg a cerca de 3 0 mg/kg, de cerca de 3 mg/kg a cerca de25 mg/kg, de cerca de 3 mg/kg a cerca de 20 mg/kg, de cercade 5 mg/kg a cerca de 15 mg/kg, ou de cerca de 7 mg/kg acerca de 12 mg/kg.

Portanto, por exemplo, a dose pode ser 0,3 mg/kg, 0,5mg/kg, 1 mg/kg, 1,5 mg/kg, 2 mg/kg, 2,5 mg/kg, 3 mg/kg, 5mg/kg, 7 mg/kg, 10 mg/kg, 15 mg/kg, 20 mg/kg, 25 mg/kg, 30mg/kg, 35 mg/kg, 40 mg/kg, 45 mg/kg, ou 50 mg/kg, ou outrasdoses dentro da faixa de cerca de 0,3 mg/kg a cerca de 50mg/kg.

O tratamento de um indivíduo com uma quantidadeterapeuticamente eficaz de um anticorpo pode incluir umtratamento único ou, preferivelmente, pode incluir umasérie de tratamentos. Portanto, Em outra modalidade dainvenção, o método compreende a administração de múltiplasdoses de anticorpo anti-CD40. O método pode compreender aadministração de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25,30, 35, 40, ou mais doses terapeuticamente eficazes de umacomposição farmacêutica que compreende um anticorpo anti-CD40. A freqüência e duração da administração de múltiplasdoses das composições farmacêuticas que compreendemanticorpo anti-CD4 0 pode ser facilmente determinada porpessoa habilitada na técnica sem experimentação indevida.A mesma dose terapeuticamente eficaz de um anticorpo anti-CD4 0 pode ser administrada pela duração de um período detratamento.Alternativamente,diferentes dosesterapeuticamente eficazes de um anticorpo anti-CD40 podemser usadas pela duração de um período de tratamento.

Em um exemplo preferido, um indivíduo é tratado comanticorpo anti-CD40, na faixa entre cerca de 0,1 a 20 mg/kgde peso corporal, uma vez por semana, por cerca de 1 a 10semanas, preferivelmente entre cerca de 2 a 8 semanas, maispreferivelmente entre cerca de 3 a 7 semanas e, ainda maispreferivelmente, por cerca de 4, 5 ou 6 semanas. 0tratamento pode ocorrer anualmente para a prevenção derecidivas, ou mediante uma indicação de recidiva. Serátambém observado que a dosagem eficaz de anticorpo usadapara tratamento pode aumentar ou diminuir ao longo de umasérie de tratamento em particular. Alterações na dosagempodem resultar e se tornar aparentes a partir dosresultados de ensaios diagnósticos, como aqui descrito.

Portanto, em uma modalidade, o regime de dosageminclui uma primeira administração de uma doseterapeuticamente eficaz de pelo menos um anticorpo anti-CD40 nos dias 1,8, 15 e 22 de um período de tratamento. Emoutra modalidade, o regime de dosagem inclui u regime dedosagem que tem uma primeira administração de uma doseterapeuticamente eficaz de pelo menos um anticorpo anti-CD4 0 diariamente ou nos dias 1, 3, 5 e 7 de uma semana emum período de tratamento; um regime de dosagem que incluiuma primeira administração de uma dose terapeuticamenteeficaz de pelo menos um anticorpo anti-CD40 nos dias 1 e 3-4 de uma semana em uma período de tratamento; e um regimede dosagem preferido que incluir uma primeira administraçãode uma dose terapeuticamente eficaz de pelo menos umanticorpo anti-CD4 0 no dia 1 de uma semana em uma períodode tratamento. 0 período de tratamento pode compreender 1semana, 2 semanas, 3 semanas, um mês, 2 meses, 3 meses, 6meses, ou um ano. Os períodos de tratamento podem sersubseqüentes ou separados um do outro por uma semana, 2semanas, um mês, 3 meses, 6 meses, ou um ano.

Em outras modalidades, a dose terapeuticamente eficazinicial de um anticorpo anti-CD40 como aqui definida emoutra seção, pode estar na faixa de dosagem mais baixa (ouseja, cerca de 0,003 mg/kg a cerca de 20 mg/kg) com dosessubseqüentes se situando dentro da faixa de dosagem maiselevada (ou seja, de cerca de 20 mg/kg a cerca de 50mg/kg).

Em modalidades alternativas, a dose terapeuticamenteeficaz inicial de um anticorpo anti-CD40 como aqui definidaem outra seção, pode estar na faixa de dosagem mais alta(ou seja, cerca de 20 mg/kg a cerca de 50 mg/kg) com dosessubseqüentes se situando dentro da faixa de dosagem maisbaixa (ou seja, de cerca de 0,003 mg/kg a cerca de 20mg/kg). Portanto, em algumas modalidades da invenção, aterapia com anticorpo anti-CD40 é iniciada pelaadministração de uma "dose de ataque" do anticorpo aoindivíduo que necessita de terapia. Por "cose de ataque"entende-se uma dose inicial do anticorpo anti-CD40 que éadministrada ao indivíduo, em que a dose do anticorpoadministrada se situa dentro da faixa de dosagem maiselevada (ou seja, de cerca de 20 mg/kg a cerca de 50mg/kg). A "dose de ataque" pode ser administrada como umaadministração única, por exemplo, uma infusão única na qualo anticorpo ou o fragmento de ligação de antígeno deste éadministrado IV, ou como administrações múltiplas, porexemplo, infusões múltiplas nas quais o anticorpo éadministrado IV, desde que a "dose de ataque" completa sejaadministrada aproximadamente dentro de um período de 24horas. Após a administração da "dose de ataque", oindivíduo recebe então uma ou mais doses terapeuticamenteeficazes adicionais do anticorpo antagonista anti-CD40.Doses terapeuticamente eficazes subseqüentes podem seradministradas, por exemplo, de acordo com um esquema dedosagem semanal, ou uma vez a cada duas semanas, uma vez acada três semanas ou uma vez a cada quatro semanas. Nessasmodalidades, as doses terapeuticamente eficazessubseqüentes geralmente se situam dentro da faixa dedosagem mais baixa (ou seja, 0,003 mg/kg a cerca de 20mg/kg).

Alternativamente, em algumas modalidades, após a "dosede ataque", as doses terapeuticamente eficazes subseqüentesdo anticorpo anti-CD40 são administradas de acordo com um"esquema de manutenção", no qual a dose terapeuticamenteeficaz do anticorpo é administrada uma vez ao mês, uma veza cada 6 semanas, uma vez a cada dois meses, uma vez a cada10 semanas, uma vez a cada três meses, uma vez a cada 14semanas, uma vez a cada quatro meses, uma vez a cada 18semanas, uma vez a cada cinco meses, uma vez a cada 22semanas, uma vez a cada seis meses, uma vez a cada 7 meses,uma vez a cada 8 meses, uma vez a cada 9 meses, uma vez acada 10 meses, uma vez a cada 11 meses ou uma vez a cada 12meses. Nessas modalidades, as doses terapeuticamenteeficazes do anticorpo anti-CD40 se situam dentro da faixade dosagem mais baixa (ou seja, 0,003 mg/kg a cerca de 20mg/kg), particularmente quando as doses subseqüentes sãoadministrados em intervalos mais freqüentes, por exemplo,uma vez a cada duas semanas até uma vez a cada mês, ou sesituam na faixa de dosagem mais elevada (ou seja, de cercade 20 mg/kg a cerca de 50 mg/kg), particularmente quando asdoses subseqüentes são administradas em intervalos menosfreqüentes, por exemplo, quando as doses subseqüentes sãoadministradas com intervalo de cerca de um mês a cerca demeses.

Os anticorpos anti-CD40 presentes nas composiçõesfarmacêuticas aqui descritas para uso nos métodos dainvenção podem ser nativos ou obtidos por técnicasrecombinantes, e podem ser de qualquer fonte, incluindofontes mamíferas, tais como, por exemplo, camundongo, rato,coelho, primata, porco e humana. Preferivelmente, taispolipeptídeos são derivados de uma fonte humana e, maispreferivelmente, são recombinantes, proteínas humanas delinhas de células de hibridoma.

As composições farmacêuticas úteis nos métodos dainvenção podem compreender variantes biologicamente ativasdos anticorpos antagonistas anti-CD40 da invenção, comodescrito em outra parte nessa.

Qualquer composição farmacêutica que compreenda umanticorpo anti-CD4 0 possuindo as propriedades de ligaçãoaqui descritas como o componente terapeuticamente ativopode ser usada nos métodos da invenção. Desse modo,composições líquidas, liofilizadas ou secas por vaporizaçãoque compreendem um ou mais dos anticorpos anti-CD4 0 dainvenção podem ser preparadas como uma solução ou suspensãoaquosa ou não aquosa para administração subseqüente a umindivíduo de acordo com os métodos da invenção. Cada umadessas composições compreenderá pelo menos um dosanticorpos anti-CD4 0 como um componente terapêutica ouprofilaticamente ativo. Por "componente terapêutica ouprofilaticamente ativo" significa que o anticorpo anti-CD40é especificamente incorporado na composição para produziruma resposta terapêutica ou profilática desejada comrelação ao tratamento, prevenção ou diagnóstico de umadoença ou condição em um indivíduo quando a composiçãofarmacêutica é administrada àquele indivíduo.Preferivelmente, as composições farmacêuticas compreendemagentes estabilizantes apropriados, agentes de volume, ouambos, para minimizar problemas associados à perda deestabilidade da proteína e da atividade biológica durante apreparação e estocagem.

Podem ser adicionados formulantes às composiçõesfarmacêuticas que compreendem um anticorpo anti-CD4 0 dainvenção. Esses formulantes podem incluir, sem limitação,óleos, polímeros, vitaminas, carboidratos, aminoácidos,sais, tampões, albumina, tensoativos ou agentes de volume.Preferivelmente, carboidratos incluem açúcar ou álcoois deaçúcar, tais como mono-, di- ou polissacarídeos ou glicanoshidrossolúveis. Os sacarídeos ou glicanos podem incluirfrutose, glicose, manose, sorbose, xilose, maltose,sacarose, dextrana, pululana, dextrina, α, β e γciclodextrina, amido solúvel, amido de hidroxietila ecarboximetilcelulose, ou misturas destes. "Álcool deaçúcar" é definido como um hidrocarboneto C4 a C5 com umgrupo hidroxila, e inclui galactitol, inositol, manitol,xilitol, sorbitol, glicerol e arabitol. Esses açúcares ouálcoois de açúcar podem ser usados individualmente ou emcombinação. A concentração de açúcar ou álcool de açúcar éentre 1,0% e 7% p/v, mais preferivelmente entre 2,0% e 6,0%p/v. Preferivelmente, aminoácidos incluem formas levógiras(L) de carnitina, arginina e betaína; no entanto, podemser adicionados outros aminoácidos. Polímeros preferidosincluem polivinilpirrolidona (PVP) com um peso molecularmédio entre 2.000 e 3.000, ou polietileno glicol (PEG) comum peso molecular médio entre 3.000 e 5.000. Tensoativosque podem ser adicionados à formulação são mostrados nas EPN°s 270.799 e 268.110.

Adicionalmente, os anticorpos podem ser modificadosquimicamente por conjugação covalente a um polímero paraaumentar sua meia-vida na circulação, por exemplo.

Polímeros preferidos e métodos para anexá-los aos peptídeossão mostrados nas Patentes U.S. N°s 4.766.106; 4.179.337;4.495.285; e 4.609.546; as quais são aqui incorporadas porreferência em suas totalidades. Polímeros preferidos sãopolióis polioxietilados e polietileno glicol (PEG). PEG ésolúvel em água em temperatura ambiente e tem a fórmulageral: R(O--CH2--CH2)nO-R, em que R pode ser hidrogênio, ouum grupo de proteção como, por exemplo, um grupo alquil oualcanol. Preferivelmente, o grupo de proteção tem entre 1 e8 carbonos, mais preferivelmente é metil. O símbolo η é umnúmero inteiro positivo, preferivelmente entre 1 e 1.000,mais pref erivelmente entre 2 e 500. 0 PEG tem um pesomolecular médio preferido entre 1.000 e 40.000, maispreferivelmente entre 2.000 e 20.000, principalmente entre3.000 e 12.000. Pref erivelmente, PEG tem pelo menos umgrupo hidroxi, mais preferivelmente é um grupo hidroxiterminal. É esse grupo hidroxi que é preferivelmenteativado para reagir com um grupo amino livre no inibidor.No entanto, será compreendido que o tipo e a quantidade dosgrupos reativos podem ser variados para se obter umPEG/anticorpo da presente invenção conjugado de formacovalente.

Polióis polioxietilados hidrossolúveis também sãoúteis na presente invenção. Eles incluem sorbitolpolioxietilado, glicose polioxietilada, glicerol

polioxietilado (POG), e semelhantes. POG é preferido. Umarazão é porque a estrutura central do glicerol do glicerolpolioxietilado é a mesma estrutura central de ocorrêncianatural, por exemplo, em animais e humanos em mono-, di-,triglicerídeos. Portanto, essa ramificação não serianecessariamente vista como um agente estranho no corpo. 0POG tem um peso molecular preferido na mesma faixa que o dePEG. A estrutura para POG é mostrada em Knauf e cols.(1988) J. Bio. Chem. 263:15.064-15.070, e uma discussão deconjugados de POG/IL-2 é encontrada na Patente U.S. N04.766.106, ambos aqui incorporados por referência em suastotalidades.

Outro sistema de liberação de medicamentos paraaumento da meia-vida circulatória é o lipossomo. Métodospara a preparação de sistemas de liberação de lipossomo sãodiscutidos em Gabizon e cols. (1982) Câncer Research42:4.734; Cafiso (1981) Biochem. Biophys. Acta 649:129; eSzoka (1980) Ann. Rev. Biophys. Eng. 9:467. Outros sistemasde liberação de medicamentos são conhecidos na técnica esão descritos, por exemplo, em Poznansky e cols. (198 0)Drug Delivery Systems (R.L. Juliano, ed. , Oxford, NovaYork), pp. 253-315; Poznansky (1984) Pharm. Revs. 36:277.

Os formulantes a serem incorporados em uma composiçãofarmacêutica devem fornecer a estabilidade do anticorpoanti-CD40. Ou seja, o anticorpo anti-CD40 deve reter suaestabilidade física e/ou química e ter a atividadebiológica desejada, ou seja, uma ou mais das atividadesantagonistas aqui definidas anteriormente, incluindo, semlimitação, inibição da secreção de imunoglobulina porcélulas B periféricas humanas normais estimulada porcélulas T; inibição da sobrevida e/ou proliferação decélulas B periféricas humanas normais estimulada porcélulas T de Jurkat; inibição da sobrevida e/ouproliferação de células B periféricas humanas normaisestimulada por células que expressam CD4 0L ou ligante CD4 0solúvel solúvel (sCD4 0L); inibição de sinais intracelularesantiapoptóticos de "sobrevida" em qualquer célulaestimulada por sCD4 0L ou CD4 0L de fase sólida; inibição datransmissão do sinal de CD4 0 em qualquer célula medianteligação com SCD40L ou CD40L de fase sólida; e inibição daproliferação de células B humanas malignas, como observadoem outra seção desta especificação.

Métodos para o monitoramento da estabilidade daproteína são bem conhecidos na técnica. Veja, por exemplo,Jones (1993) Adv. Drug Delivery Rev. 10:29-90; Lee, ed.(1991) Peptide and Protein Drug Delivery (Mareei Dekker,Inc., Nova York, Nova York) ; e os ensaios de estabilidadeaqui revelados abaixo. Geralmente, a estabilidade daproteína é medida em uma temperatura escolhida por umperíodo de tempo especificado. Em modalidades preferidas,uma formulação farmacêutica de anticorpo estável forneceestabilidade do anticorpo anti-CD40 quando estocada emtemperatura ambiente (cerca de 25°C) por pelo menos 1 mês,pelo menos 3 meses ou, pelo menos, 6 meses, e/ou é estávelem cerca de 2-8°C por pelo menos 6 meses, pelo menos 9meses, pelo menos 12 meses, pelo menos 18 meses, pelo menos24 meses.

Uma proteína como um anticorpo, quando formulada emuma composição farmacêutica, é considerada como retendo suaestabilidade física em certo momento caso ela não mostresinais visuais (ou seja, descoloração ou perda detransparência) ou sinais mensuráveis (por exemplo, com ouso de cromatografia por exclusão de tamanho (SEC) oudispersão da luz UV) de precipitação, agregação e/oudesnaturação naquela composição farmacêutica. Com relação àestabilidade química, uma proteína como um anticorpo,quando formulada em uma composição farmacêutica, éconsiderada como retendo sua estabilidade química em certomomento se as medidas da estabilidade química foremindicativas de que a proteína (ou seja, o anticorpo) retéma atividade biológica de interesse naquela composiçãofarmacêutica. Métodos para o monitoramento das alteraçõesna estabilidade química são bem conhecidos na técnica eincluem, sem limitação, métodos para detectar quimicamenteformas alteradas da proteína resultantes de picotes,usando, por exemplo, SDS-PAGE, SEC e/ou ionização pordessorção da matriz assistida por laser/ espectrometria demassa por tempo de vôo; e degradação associada àsalterações na carga molecular (por exemplo, associada àdesamidação), usando, por exemplo, cromatografia por trocaiônica. Veja, por exemplo, os métodos aqui reveladosabaixo.

Um anticorpo anti-CD4 0 quando formulado em umacomposição farmacêutica, é considerado como retendo umaatividade biológica desejada em certo momento se aatividade biológica desejada naquele momento for de cercade 30%, preferivelmente for de cerca de 20% da atividadebiológica desejada exibida no momento em que a composiçãofarmacêutica foi preparada, como determinado em uma análiseadequada para a atividade biológica desejada. Análises paraa medida da atividade biológica desejada dos anticorposanti-CD40 aqui revelados podem ser realizadas como descritonos Exemplos aqui apresentados. Veja também os ensaiosdescritos em Schultze e cols. (1998) Proc. Natl. Acad. Sei.USA 92:8.200-8.204; Denton e cols. (1998) Pediatr.Transplant. 2:6-15; Evans e cols. (2000). J. Iiwnunol.164:688-697; Noelle (1998) Agents Actions Suppl. 49:17-22;Lederman e cols. (1996) Curr. Opin. Hematol. 3:77-86;Coligan e cols. (1991) Current Protocols in Immunology13:12; Kwekkeboom e cols. (1993) Immunology 79:439-444; enas Patentes U.S. Nos 5.674.492 e 5.847.082, aquiincorporadas por referência.

Em algumas modalidades da invenção o anticorpo anti-CD40 é formulado como uma formulação farmacêutica líquida,a composição farmacêutica líquida. O anticorpo anti-CD40pode ser preparado com o uso de qualquer método conhecidona técnica, incluindo aqueles métodos revelados acima. Emuma modalidade, o anticorpo anti-CD40 é produzido de formarecombinante em uma linha de células CHO.

Quando o anticorpo anti-CD40 é estocado antes de suaformulação, ele pode ser congelado, por exemplo, a ≤ 20°C,e então descongelado em temperatura ambiente para posteriorformulação. A formulação farmacêutica líquida compreendeuma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo anti-CD40. A quantidade de anticorpo presente na formulação levaem consideração a via de administração e o volume de dosedesej ado.

Dessa forma, a composição farmacêutica líquidacompreendo anticorpo anti-CD40 em uma concentração de cercade 0,1 mg/ml a cerca de 50,0 mg/ml, cerca de 0,5 mg/ml acerca de 40,0 mg/ml, cerca de 1,0 mg/ml a cerca de 30,0mg/ml, cerca de 5,0 mg/ml a cerca de 25,0 mg/ml, cerca de5,0 mg/ml a cerca de 20,0 mg/ml, ou cerca de 15,0 mg/ml acerca de 25,0 mg/ml. Em algumas modalidades, a composiçãofarmacêutica líquida compreendo anticorpo anti-CD4 0 em umaconcentração de cerca de 0,1 mg/ml a cerca de 5,0 mg/ml,cerca de 5,0 mg/ml a cerca de 10,0 mg/ml, cerca de 10,0mg/ml a cerca de 15,0 mg/ml, cerca de 15,0 mg/ml a cerca de20,0 mg/ml, cerca de 20,0 mg/ml a cerca de 25,0 mg/ml,cerca de 25,0 mg/ml a cerca de 3 0.0 mg/ml, cerca de 30,0mg/ml a cerca de 35,0 mg/ml, cerca de 35,0 mg/ml a cerca de40,0 mg/ml, cerca de 4 0,0 mg/ml a cerca de 4 5,0 mg/ml, oucerca de 45,0 mg/ml a cerca de 50,0 mg/ml. Em outrasmodalidades, a composição farmacêutica líquida compreendoanticorpo anti-CD40 em uma concentração de cerca de 15,0mg/ml, cerca de 16,0 mg/ml, cerca de 17,0 mg/ml, cerca de18,0 mg/ml, cerca de 19,0 mg/ml, cerca de 20,0 mg/ml, cercade 21,0 mg/ml, cerca de 22,0 mg/ml, cerca de 23,0 mg/ml,cerca de 24,0 mg/ml, ou cerca de 25,0 mg/ml. A composiçãofarmacêutica líquida compreendo anticorpo anti-CD40 e umtampão que mantém o pH da formulação na faixa de cerca depH 5,0 a cerca de pH 7,0, incluindo cerca de pH 5,0, 5,1,5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6,0, 6,1, 6,2, 6,3,6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7,0, e outros valores nafaixa de cerca de pH 5,0 a cerca de pH 7,0. Em algumasmodalidades, o tampão mantém o pH da formulação na faixa decerca de pH 5,0 a cerca de pH 6,5, cerca de pH 5,0 a cercade pH 6,0, cerca de pH 5,0 a cerca de pH 5,5, cerca de pH5,5 a cerca de 7,0, cerca de pH 5,5 a cerca de pH 6,5, oucerca de pH 5,5 a cerca de pH 6,0.

Qualquer tampão adequado que mantenha o pH daformulação líquida de anticorpo anti-CD4 0 na faixa de cercade pH 5,0 a cerca de pH 7,0 pode ser usado na formulação,desde que a estabilidade físico-química e atividadebiológica desejada do anticorpo sejam retidas como apontadoacima. Tampões adequados incluem, sem limitação, ácidosconvencionais e sais desses, em que o contra-íon pode ser,por exemplo, sódio, potássio, amônio, cálcio, ou magnésio.Exemplos de ácidos convencionais e sais desses que podemser usados para tamponar a formulação farmacêutica líquidaincluem, sem limitação, tampões de ácido succínico ousuccinato, ácido cítrico ou citrato, ácido acético ouacetato, ácido tartárico ou tartarato, ácido fosfórico oufosfato, ácido glucônico ou gluconato, ácido glutâmico ouglutamato, ácido aspártico ou aspartato, ácido maleico oumaleato, e ácido málico ou malato. A concentração do tampãona formulação pode ser de cerca de 1 mM a cerca de 50 mM,incluindo cerca de 1 mM, 2 mM, 5 mM, 8 mM, 10 mM, 15 mM, 20mM, 25 mM, 30 mM, 35 mM, 40 mM, 45 mM, 50 mM, ou outrosvalores na faixa de cerca de 1 mM a cerca de 50 mM. Emalgumas modalidades, a concentração do tampão na formulaçãoé de cerca de 5 mM a cerca de 15 mM, incluindo cerca de 5mM, 6 mM, 7 mM, 8 mM, 9 mM, 10 mM, 11 mM, 12 mM, 13 mM, 14mM, 15 mM, ou outros valores na faixa de cerca de 5 mM acerca de 15 mM.

Em algumas modalidades da invenção, a formulaçãofarmacêutica líquida compreende uma quantidadeterapeuticamente eficaz do anticorpo anti-CD40 e tampão desuccinato ou tampão de citrato em uma concentração quemantém o pH da formulação na faixa de cerca de pH 5,0 acerca de pH 7,0, preferivelmente cerca de pH 5,0 a cerca depH 6,5. por "tampão de succinato" ou "tampão de citrato"entende-se um tampão que compreende um sal de ácidosuccínico ou um sal de ácido cítrico, respectivamente. Emuma modalidade preferida, o contra-íon de succinato oucitrato é o cátion sódio, e assim o tampão é succinato desódio ou citrato de sódio, respectivamente. No entanto,qualquer cátion deve ser eficaz. Outros cátions desuccinato ou citrato possíveis incluem, sem limitação,potássio, amônio, cálcio, e magnésio. Como acima observado,a concentração do tampão de succinato ou citrato naformulação pode ser de cerca de 1 mM a cerca de 50 mM,incluindo cerca de 1 mM, 2 mM, 5 mM, 8 mM, 10 mM, 15 mM, 20mM, 25 mM, 30 mM, 35 mM, 40 mM, 45 mM, 50 mM, ou outrosvalores na faixa de cerca de 1 mM a cerca de 50 mM. Emalgumas modalidades, a concentração de tampão na formulaçãoé de cerca de 5 mM a cerca de 15 mM, incluindo cerca de 5mM, 6 mM, 7 mM, 8 mM, 9 mM, 10 mM, 11 mM, 12 mM, 13 mM, 14mM, ou cerca de 15 mM. Em outras modalidades, a formulaçãofarmacêutica líquida compreendo anticorpo anti-CD40 em umaconcentração de cerca de 0,1 mg/ml a cerca de 50,0 mg/ml,ou cerca de 5,0 mg/ml a cerca de 25,0 mg/ml, e tampão desuccinato ou citrato, por exemplo, tampão de succinato desódio ou citrato de sódio, em uma concentração de cerca de1 mM a cerca de 20 mM, cerca de 5 mM a cerca de 15 mM,preferivelmente cerca de 10 mM.Quando é desejável para a formulação farmacêuticalíquida que seja próxima de isotônica, a formulaçãofarmacêutica líquida que compreendo anticorpo anti-CD40 eum tampão pode compreender também uma quantidade de umaagente de isotonicidade suficiente para tornar a formulaçãopróxima de isotônica. Por "próxima de isotônica" entende-seque a formulação aquosa tem uma osmolaridade de cerca de240 mmol/kg a cerca de 360 mmol/kg, preferivelmente cercade 240 a cerca de 340 mmol/kg, mais pref erivelmente cercade 250 a cerca de 330 mmol/kg, ainda mais pref erivelmentecerca de 260 a cerca de 320 mmol/kg, still maispreferivelmente cerca de 270 a cerca de 310 mmol/kg.Métodos de determinação da isotonicidade de uma solução sãoconhecidos por aqueles habilitados na técnica. Veja, porexemplo, Setnikar e cols. (1959) J Am. Pharm. Assoc.48 : 628 .

Aqueles habilitados na técnica estão familiarizadoscom vários solutos farmaceuticamente aceitáveis úteis emfornecer isotonicidade em composição farmacêuticas. 0agente de isotonicidade pode ser qualquer reagente capaz deajustar a pressão osmótica de uma formulação farmacêuticalíquida da presente invenção a um valor quase igual àquelede um fluido corporal. É desejável usar um agente deisotonicidade fisiologicamente aceitável. Portanto, aformulação farmacêutica líquida que compreende a quantidadeterapeuticamente eficaz do anticorpo anti-CD40 e um tampãotambém pode compreender componentes que podem ser usadospara fornecer isotonicidade, por exemplo, cloreto de sódio;aminoácidos como alanina, valina, e glicina; açúcares eálcoois de açúcares (polióis), incluindo, sem limitação,glicose, dextrose, frutose, sacarose, maltose, manitol,trehalose, glicerol, sorbitol, e xilitol; ácido acético,outros ácidos orgânicos ou seus sais, e quantidadesrelativamente menores de citratos ou fosfatos. A pessoa de habilidade comum é ciente de agentes adicionais que sãoadequados para fornecer tonicidade ótima da formulaçãoliquida.

Em algumas modalidades preferidas, a formulaçãofarmacêutica liquida que compreende um anticorpo anti-CD40 e um tampão também compreende cloreto de sódio como oagente de isotonicidade. A concentração de cloreto de sódiona formulação dependerá da contribuição de outroscomponentes para a tonicidade. Em algumas modalidades, aconcentração de cloreto de sódio é de cerca de 50 mM a cerca de 300 mM, cerca de 50 mM a cerca de 250 mM, cerca de50 mM a cerca de 200 mM, cerca de 50 mM a cerca de 175 mM,cerca de 50 mM a cerca de 150 mM, cerca de 75 mM a cerca de175 mM, cerca de 75 mM a cerca de 150 mM, cerca de 100 mM acerca de 175 mM, cerca de 100 mM a cerca de 200 mM, cerca de 100 mM a cerca de 150 mM, cerca de 125 mM a cerca de 175mM, cerca de 125 mM a cerca de 150 mM, cerca de 130 mM acerca de 170 mM, cerca de 130 mM a cerca de 160 mM, cercade 135 mM a cerca de 155 mM, cerca de 140 mM a cerca de 155mM, ou cerca de 145 mM a cerca de 155 mM. Em uma tal modalidade, a concentração de cloreto de sódio é de cercade 150 mM. Em outra modalidades, a concentração de cloretode sódio é de cerca de 150 mM, o tampão é succinato desódio ou citrato de sódio em uma concentração de cerca de 5mM a cerca de 15 mM, a formulação farmacêutica liquidacompreende uma quantidade terapeuticamente eficaz doanticorpo anti-CD4 0 e a formulação tem um pH de cerca de pH5,0 a cerca de pH 7,0, cerca de pH 5,0 a cerca de pH 6,0,ou cerca de pH 5,5 a cerca de pH 6,5. Em outrasmodalidades, a formulação farmacêutica líquida compreende oanticorpo anti-CD40 em uma concentração de cerca de 0,1mg/ml a cerca de 50,0 mg/ml ou cerca de 5,0 mg/ml a cercade 25,0 mg/ml, cerca de 150 mM de cloreto de sódio, e cercade 10 mM de succinato de sódio ou citrato de sódio, em umpH de cerca de pH 5,5.A degradação de proteína devida acongelamento/descongelamento ou corte mecânico durante oprocesso da formulação farmacêutica líquidas da presenteinvenção pode ser inibida por incorporação de tensoativosna formulação para diminuir a tensão de superfície em umainterface solução-ar. Portanto, em algumas modalidades, aformulação farmacêutica líquida compreende uma quantidadeterapeuticamente eficaz do anticorpo anti-CD40, um tampão,e também compreende um tensoativo. Em outras modalidades, aformulação farmacêutica líquida compreende um anticorpoanti-CD40, um tampão, um agente de isotonicidade, e tambémcompreende um tensoativo.

Tensoativos típicos empregados são tensoativos nãoiônicos, incluindo ésteres de polioxietileno sorbitol comopolissorbato 80 (Tween 80) e polissorbato 20 (Tween 20) ;ésteres de polioxipropileno-polioxietileno como PluronicF68; álcoois de polioxietileno como Brij 35; simeticona;polietileno glicol such as PEG400; lisofosfatidilcolina; epolioxietileno-p-t-octilfenol como Triton X-100. Aestabilização clássica de fármacos por tensoativos ouemulsificantes é descrita, por exemplo, em Levine e cols.(1991) J. Parenteral Sei. Technol. 45(3):160-165, aquiincorporado por referência. Um tensoativo preferidoempregado na prática da presente invenção é polissorbato80. Quando um tensoativo é incluído, ele é tipicamenteadicionado em uma quantidade de cerca de 0,001 % a cerca de1,0% (w/v), cerca de 0,001% a cerca de 0,5%, cerca de0,001% a cerca de 0,4%, cerca de 0,001% a cerca de 0,3%,cerca de 0,001% a cerca de 0,2%, cerca de 0,005% a cerca de0,5%, cerca de 0,005% a cerca de 0,2%, cerca de 0,01% acerca de 0,5%, cerca de 0,01% a cerca de 0,2%, cerca de0,03% a cerca de 0,5%, cerca de 0,03% a cerca de 0,3%,cerca de 0,05% a cerca de 0,5%, ou cerca de 0,05% a cercade 0,2%.

Portanto, em algumas modalidades, a formulaçãofarmacêutica líquida compreende uma quantidadeterapeuticamente eficaz do anticorpo anti-CD40, o tampão ésuccinato de sódio ou citrato de sódio em uma concentraçãode cerca de 1 mM a cerca de 50 mM, cerca de 5 mM a cerca demM, ou cerca de 5 mM a cerca de 15 mM; a formulação tem2 0 um pH de cerca de pH 5,0 a cerca de pH 7,0, cerca de pH 5,0a cerca de pH 6,0, ou cerca de pH 5,5 a cerca de pH 6,5; ea formulação também compreende um tensoativo, por exemplo,polissorbato 80, em uma quantidade de cerca de 0,001% acerca de 1,0% ou cerca de 0,001% to cerca de 0,5%. Taisformulações podem compreender opcionalmente um agente deisotonicidade, como cloreto de sódio em uma concentração decerca de 50 mM a cerca de 300 mM, cerca de 50 mM a cerca de200 mM, ou cerca de 50 mM a cerca de 150 mM. Em outrasmodalidades, a formulação farmacêutica líquida compreendoanticorpo anti-CD40 em uma concentração de cerca de 0,1mg/ml a cerca de 50,0 mg/ml ou cerca de 5,0 mg/ml a cercade 25,0 mg/ml, incluindo cerca de 20,0 mg/ml; cerca de 50mM a cerca de 200 mM de cloreto de sódio, incluindo cercade 150 mM de cloreto de sódio; succinato de sódio oucitrato de sódio a cerca de 5 mM a cerca de 20 mM,incluindo cerca de 10 mM de succinato de sódio ou citratode sódio; cloreto de sódio em uma concentração de cerca de50 mM a cerca de 200 mM, incluindo cerca de 150 mM; eopcionalmente um tensoativo, por exemplo, polissorbato 80,em uma quantidade de cerca de 0,001% a cerca de 1,0%,incluindo cerca de 0,001% a cerca de 0,5%; em que aformulação farmacêutica líquida tem um pH de cerca de pH5,0 a cerca de pH 7,0, cerca de pH 5,0 a cerca de pH 6,0,cerca de pH 5,0 a cerca de pH 5,5, cerca de pH 5,5 to cercade pH 6,5, ou cerca de pH 5,5 a cerca de pH 6,0.

A formulação farmacêutica líquida pode seressencialmente livre de quaisquer conservantes e outrosveículos, excipientes, ou estabilizantes apontados acima.Alternativamente, a formulação pode incluir um ou maisconservantes, por exemplo, agentes antibacterianos,veículos farmaceuticamente aceitáveis, excipientes, ouestabilizantes acima descritos desde que eles não afetam deforma adversa a estabilidade físico-química do anticorpoanti-CD40. Exemplos de veículos aceitáveis, excipientes, eestabilizantes incluem, sem limitação, agentes detamponamento adicionais, co-solventes, tensoativos,antioxidantes, incluindo ácido ascórbico e metionina,agentes quelantes como EDTA, complexos de metal (porexemplo, complexos Zn-proteína), e polímeros biodegradáveiscomo poliésteres. Uma discussão da formulação e seleção de-veículos farmaceuticamente aceitáveis, estabilizantes, eisomolitos pode ser encontrada em Remington'sPharmaceutical Sciences (18th ed.; Mack Publishing Company,Eaton, Pennsylvania, 1990), aqui incorporada by reference.

"Veículos", como aqui usados, incluem veículos,excipientes ou estabilizadores farmaceuticamenteaceitáveis, que são atóxicos para a célula ou mamífero queestá sendo exposto a ele nas dosagens e concentraçõesempregadas. Freqüentemente, o veículo fisiologicamenteaceitável é uma solução aquosa com pH tamponado. Exemplosde veículos fisiologicamente aceitáveis incluem tampõescomo fosfato, citrato e outros ácidos orgânicos;antioxidantes, incluindo ácido ascórbico; polipeptídeos combaixo peso molecular (menos do que cerca de 10 resíduos deaminoácidos); proteínas, tais como albumina sérica,gelatina ou imunoglobulinas; polímeros hidrofílicos como,por exemplo, polivinilpirrolidona; aminoácidos, tais comoglicina, glutamina, asparagina, arginina ou lisina;monossacarídeos, dissacarídeos e outros carboidratos,incluindo glicose, manose ou dextrinas; agentes quelantescomo, por exemplo, EDTA; álcoois de açúcar, tais comomanitol ou sorbitol; contra-íons formadores de sal como,por exemplo, sódio; e/ou tensoativos não iônicos como, porexemplo, TWEEN, polietileno glicol (PEG) e Plurônicos.

A administração "em combinação com" um ou mais agentesterapêuticos adicionais inclui a administração simultânea(concomitante) e consecutiva em qualquer ordem.

Depois de a formulação farmacêutica líquida ou outracomposição farmacêutica aqui descrita ser preparada, elapode ser liofilizada para evitar degradação. Métodos para aliofilização de composições líquidas são conhecidos paraaqueles habilitados na técnica. Imediatamente antes de serutilizada, a composição pode ser reconstituída com umdiluente estéril (solução de Ringer, água destilada ou sorofisiológico estéril, por exemplo) que pode incluiringredientes adicionais. Com a reconstituição, a composiçãoé administrada preferivelmente aos indivíduos com o usodaqueles métodos que são conhecidos por aqueles habilitadosna técnica.

Em algumas modalidades, o anticorpos anti-CD4 0 podeser administrado em combinação com pelo menos uma outraterapia conhecida para doenças inflamatórias e/ouautoimunes. Tais terapias incluem, sem limitação, cirurgiaou procedimentos cirúrgicos (por exemplo, esplenectomia,linfadenectomia, tireoidectomia, plasmaierese, leucoferese,transplante de células, tecidos ou órgãos, procedimentosintestinais, perfusão de órgãos, e semelhantes),radioterapia, terapias como terapia com esteróide e terapianão esteroidal, terapia hormonal, terapia com citocina,terapia com agentes dermatológicos (por exemplo, agentestópicos usados para tratar condições cutâneas, tais comoalergias, dermatite de contato e psoríase), terapiaimunossupressora, e outra terapia antiinflamatória comanticorpo monoclonal, e semelhantes. Quando os métodos dapresente invenção compreende regimes terapêuticoscombinados, essas terapias poderão ser dadassimultaneamente, ou seja, o anticorpo antagonista anti-CD40ou o fragmento de ligação de antígeno deste é administradoconcomitantemente ou dentro do mesmo intervalo de tempo quea outra terapia (ou seja, as terapias acontecemconcomitantemente, mas o anticorpo anti-CD4 0, ou fragmentode ligação de antígeno deste, não é administradoprecisamente ao mesmo tempo que a outra terapia).Alternativamente, o anticorpo antagonista anti-CD4 0 dapresente invenção, ou fragmento de ligação de antígenodeste, também pode ser administrado antes ousubseqüentemente à outra terapia. A administraçãoseqüencial das diferentes terapias anticancerígenas podeser realizada independentemente do fato de o indivíduotratado responder à primeira série de terapia para diminuira possibilidade de remissão ou recidiva.

Dessa maneira, os anticorpos anti-CD4 0 sãoadministrados em combinação com pelo menos uma outraterapia, incluindo, sem limitação, cirurgia , fusão deórgãos, terapia de radiação, terapia com esteróide eterapia não esteroidal, terapia antibiótica, terapiaantifúngica, terapia hormonal, terapia com citocina,terapia com agentes dermatológicos (por exemplo, agentestópicos usados para tratar condições cutâneas, tais comoalergias, dermatite de contato e psoríase), terapiaimunossupressora, outra terapia antiinflamatória comanticorpo monoclonal, combinações destas, e semelhantes.Assim, quando as terapias combinadas compreendem aadministração de um anticorpo anti-CD4 0 em combinação com aadministração de um outro agente terapêutico, como comesteróides como um exemplo, os métodos da invenção englobama coadministração, usando formulações separadas ou umaúnica formulação farmacêutica, e administração consecutivaem qualquer ordem.

Exemplos de medicamentos imunossupressores, que podemser administrados em combinação com anticorpos anti-CD4 0incluem, sem limitação, metotrexate, ciclofosfamida,mizoribina, clorambucil, ciclosporina, tais como, porexemplo, ciclosporina em aerossol (veja, Publicação dePedido de Patente U.S. N0 US20020006901, aqui incorporadaem sua totalidade por referência), tacrolimus (FK506;ProGraf™) , micofenolato mofetil e azatioprina (6-mercaptopurina), sirolimus (rapamicina), desoxispergualina,leflunomida e seus análogos de malononitriloamida; eproteínas imunossupressoras, incluindo,

Exemplos de agentes antiinflamatórios adequados quepodem ser administrados em combinação com anticorpos anti-CD40 incluem, sem limitação, corticosteróides como, porexemplo, clobetasol, halobetasol, hidrocortisona,triamcinolona, betametasona, fluocinola, fluocinonida,prednisona, prednisolona, metilprednisolona; medicamentosantiinflamatórias não esteróides (NSAIDs) como, porexemplo, sulfasalazina, medicações contendo mesalamina(conhecidas como agentes 5-ASA), celecoxib, diclofenaco,etodolac, fenprofeno, flurbiprofeno, ibuprofeno,cetoprofeno, meclofamato, meloxicam, nabumetona, naproxeno,oxaprozina, piroxicam, rofecoxib, salicilatos, sulindac, etolmetina; Embrel®, (um receptor de TNF solúvel),anticorpos antiinflamatórios como adalimumab (HUMIRA®, umantagonista de TNF-α) e infliximab (Remicade®, umantagonista de TNF-α), e outros.

A rejeição de transplantes e a doença enxerto versushospedeiro pode ser hiperaguda (humoral), aguda (mediadapor células T) ou crônica (etiologia desconhecida), ou umacombinação destas. Desse modo, os anticorpos anti-CD40 dainvenção são usados em algumas modalidades para evitar e/oumelhorar a rejeição e/ou sintomas associados à rejeição detransplantes hiperaguda, aguda e/ou crônica de qualquertecido, incluindo, sem limitação, fígado, rim, pâncreas,células da ilhota pancreática, intestino delgado, pulmão,coração, córneas, pela, vasos sangüíneos, osso, medulaóssea heteróloga ou autóloga, e semelhantes. Tecidos deenxerto podem ser obtidos de qualquer doador etransplantados em qualquer hospedeiro receptor e, dessemodo, o procedimento de transplante pode compreender otransplante de tecido animal para humanos (por exemplo,xenoenxertos), o transplante de tecido de um humano paraoutro humano (por exemplo, aloenxertos) e/ou o transplantede tecido de uma parte do corpo de um humano para outra(por exemplo, autoenxertos). O tratamento com os anticorposda invenção também podem reduzir as seqüelas dotransplante, tais como febre, anorexia, anormalidadeshemodinâmicas, leucopenia, infiltração leucocitária doórgão/tecido transplantado, além de infecções oportunistas.

Em modalidades em que os anticorpos anti-CD4 0 dainvenção são usados para tratar rejeição a enxerto, artritereumatóide, ou esclerose múltipla, os anticorpos podem serusados em combinação com medicamentos imunossupressoresadequados como aqui descrito.

Portanto, a invenção fornece o uso de uma quantidadeterapeuticamente ou profilaticamente eficaz de um anticorpoanti-CD4 0 na manufatura de um medicamento para otratamento de uma doença inflamatória ou doença autoimuneque está associada a células que expressam CD4 0 em umpaciente humano heterozigótico ou homozigótico paraFcyRIIIa-158F (genótipo V/F ou F/F), em que o medicamento écoordenado com tratamento com pelo menos uma outra terapia.

Por "coordenado", entende-se que o medicamento quecompreendo anticorpo anti-CD4 0 deve ser usado antes,durante ou após o tratamento do indivíduo com pelo menosuma outra terapia.

A invenção também fornece o uso de um anticorpo anti-CD4 0 na manufatura de um medicamento para o tratamento deum paciente humano para uma doença inflamatória ou doençaautoimune que está associada a células que expressam CD4 0,em que o referido paciente humano é heterozigótico ouhomozigótico para FcyRIIIa-158F (genótipo V/F ou F/F) e foipré-tratado com pelo menos um outro agente terapêutico.

Por "pré-tratado" ou "pré-tratamento" significa que oindivíduo recebeu uma ou mais outras terapias (ou seja, foitratado com pelo menos uma outra terapia), antes de receber

0 medicamento que compreende o anticorpo anti-CD40. "Pré-tratado" ou "pré-tratamento" inclui indivíduos que foramtratados com pelo menos uma outra terapia em um intervalode 2 anos, em um intervalo de 18 meses, em um intervalo de1 ano, em um intervalo de 6 meses, em um intervalo de 2meses, em um intervalo de 6 semanas, em um intervalo de 1mês, em um intervalo de 4 semanas, em um intervalo de 3semanas, em um intervalo de 2 semanas, em um intervalo de 1semana, em um intervalo de 6 dias, em um intervalo de 5dias, em um intervalo de 4 dias, em um intervalo de 3 dias,em um intervalo de 2 dias, ou até mesmo em um intervalo de1 dia, antes do início do tratamento com o medicamento quecompreende o anticorpo anti-CD40. Não é necessário que oindivíduo tenha respondido ao pré-tratamento com a terapiaanterior, ou com as terapias anteriores. Desse modo, oindivíduo que recebe o medicamento que compreende oanticorpo antagonista anti-CD4 0 poderia ter respondido ounão (ou seja, a doença foi refratária), ao pré-tratamentocom a terapia anterior, ou a uma ou mais das terapiasanteriores, em que o pré-tratamento compreendeu múltiplasterapias. Exemplos de outras terapias para as quais umindivíduo pode ter recebido pré-tratamento antes de recebero medicamento que compreende o anticorpo anti-CD40 incluem,sem limitação, as terapias para doenças inflamatórias oudoenças autoimunes descritas em outra parte nessa.

"Tratamento", no contexto do uso coordenado de ummedicamento aqui descrito com uma ou mais outras terapias,é aqui definido como a aplicação ou administração domedicamento ou da outra terapia a um indivíduo, ou aaplicação ou administração do medicamento ou outra terapiaa um tecido isolado ou linha de células de um indivíduo, emque o indivíduo tem doença inflamatória ou doença autoimuneassociada com células que expressam CD4 0, um sintomaassociado com tal doença, ou uma predisposição para odesenvolvimento de tal doença, em que o objetivo é o decurar, cicatrizar, aliviar, alterar, remediar, melhorar, ouafetar a doença, qualquer sintoma associado da doença, ou apredisposição em relação ao desenvolvimento da doença.

Em algumas modalidades, a terapia de combinaçãofornece uma melhoria sinérgica na eficácia terapêutica emrelação aos agentes terapêuticos individuais quandoadministrados isoladamente. O termo "sinergia" é usado paradescrever um efeito combinado de dois ou mais agentesativos que é maior que a soma dos efeitos individuais decada agente ativo respectivo. Portanto, quando o efeitocombinado de dois ou mais agentes resulta em "inibiçãosinérgica" de uma atividade ou processo, entende-se que ainibição da atividade ou processo é maior que a soma dosefeitos inibidores de cada agente ativo respectivo. 0 termo"efeito terapêutico sinérgico" refere-se a um efeitoterapêutico observado com uma combinação de duas ou maisterapias em que o efeito terapêutico (como medido porqualquer um de inúmeros parâmetros) é maior que a soma dosefeitos terapêuticos individuais observados com as terapiasindividuais respectivas.

Vários aspectos e modalidades da presente invençãoserão agora descritos em maiores detalhes por via exemploapenas. Deve-se perceber que modificação de detalhe podeser feita sem fugir do escopo da invenção.

EXPERIMENTAL

O anticorpo anti-CD4 0 usado nos exemplos abaixo éCHIR-12.12. A produção, seqüenciamento e caracterização doanticorpo CHIR-12.12 é descrita em detalhes nos pedidos depatente internacionais publicados como WO 2005/044854, WO2005/044304, WO 2005/044305, WO 2005/044306, WO2005/044855, WO 2005/044307, e WO 2005/044294. A linha dehibridoma 153.8E2.DlO.D6.12.12 (CMCC#12056) que expressa oanticorpo CHIR-12.12 foi depositada com a "American TypeCulture Collection "[ATCC; 10801 University Blvd.,Manassas, Virginia 20110-2209 (USA)] sob o número deDepósito de Patente PTA-5543.

Os exemplos a seguir são baseados na ligação de CHIR-12.12 a linhas de células cancerosas e células de pacientescom câncer. No entanto, todos os exemplos a seguir sãodiretamente relevantes ao o uso de CHIR-12.12 para tratardoenças inflamatórias and/ou doenças autoimunes, porqueeles ilustram características do anticorpo CHIR-12.12 quesão igualmente relevantes para o tratamento de doençasinflamatórias e/ou doenças autoimunes que usa anticorposanti-CD4 0.

Exemplo 1: Análise de ADCC em linhas de células

CHIR-12.12 e rituximab foram comparados para suaatividade de ADCC relativa contra várias linhas de célulasb malignas que expressam antígenos CD4 0 e CD2 0, incluindolinhas de células de linfoma (Daudi, Namalwa), linhas decélulas de mieloma múltiplo (ARH77, IM-9), uma linha decélulas B-ALL (CCRF-SB), e uma linha de células B-CLL(EHEB).

A eficácia de ADCC e potência medidas como Iisepercentual máxima e ED50, respectivamente, foram comparadaspara CHIR-12.12 e rituximab. Os resultados dessesexperimentos são mostrados nas Figuras IA-IF. Para todas aslinhas de células alvo, CHIR-12.12 foi um mediador maispotente e eficaz de ADCC que rituximab. Nas seis linhas decélulas testadas, o número de moléculas CD2 0 de superfíciecelular por célula era de 2,6 a 3 0,8 vezes maior que deCD4 0. Esses dados mostram que a despeito de apresentarmenos moléculas de CD40 que CD20, linhas de células Bmalignas são mais eficazmente lisadas por CHIR-12.12 querituximab.

Exemplo 2: Análise de ADCC em células de pacientes com CLL

A atividade de ADCC relativa de CHIR-12.12 e rituximabcontra células de CLL primária ex vivo de 8 pacientes foicomparada. CHIR-12.12 exibiu maior ADCC que rituximabcontra CLL de todos os pacientes (veja, Figura 2A-D eFigura 3) . Os resultados são resumidos na Figura 3. CHIR-12.12 e mais potente que rituximab.

Desenho de experimento de citotoxicida.de celular dependentede anticorpo (ADCC)

Células alvo: células de paciente com CLL,5.000/cavidade. Células efetoras: células NK humanasnormais purificadas, 50.000/cavidade. Proporção E : T: 10.concentração de Abs: 0,00001, 0,0001, 0,001, 0,01, 0,1, Ie10 μg/ml. Tempo de incubação: 4 horas. Meio de cultura:RPMI (w/o fenol vermelho) + 10% FBS + 1% P/S. Dispositivode cultura: placa de fundo redondo de 96 cavidades,leitura: liberação de Calcexna AM medida por "ArbitraryFluorescent Units" (AFU) com 485 nm excitação/535 nmemissão. Cálculo: % de lise específica = 100 x (AFU teste —AFU de liberação espontânea 1) / (AFU de liberação máxima 2— AFU espontânea). Controle negativo: Calceína liberada porcélulas alvo na ausência de anticorpo ou célula NK.Controle positivo: Calceína liberada por células alvo comlise por detergente (1% NP4 0).

Os resultados ilustrados nas Figuras 2 e 3 mostram queCHIR-12.12 medeia maior ADCC que rituximab contra célulasde paciente com CLL. A magnitude da diferença de ADCC podedepender das células alvo ou das células doadoras NK masfoi observada contra todas as amostras de paciente, quandocélulas de CLL de paciente único foram testadas com doisdiferentes doadores de NK, CHIR-12.12 mediou maior ADCC querituximab for para ambas células NK doadoras, embora amagnitude da ADCC diferencial não tenha sido idêntica(veja, Figura 4) . A base mecânica para essa ADCC superiordeve incluir os níveis de expressão relativos dos antígenosalvo (CD20 e CD40), a extensão da internalização doanticorpo, e a afinidade do anticorpo para o receptor deFcyIIIa em células NK. Portanto, a influência dessesfatores na atividade de ADCC de CHIR12.12 e rituximab foiinvestigada.

Exemplo 3: Quantificação de moléculas de CD40 e CD20 desuperfície celular

A densidade quantitativa de CD20 e CD40 em células deCLL (Exemplo 3) e o grau de internalização de anticorpo(Exemplo 4) foram investigados como razões potenciais paraa diferença acima descrita na atividade de ADCC. A maioratividade de ADCC e eficácia de CHIR-12.12 não foidependente de uma maior densidade de moléculas de CD4 0 desuperfície celular, uma vez que foram números 1,3 a 14vezes maiores de moléculas CD20 que CD40 na superfíciecelular (veja, Figura 5 e Figura 6).

Métodos

As células foram pré-incubadas com IgGl humana a 1mg/ml em tampão de coloração (PBS contém 1% BSA, 0,1% NaAzida) para bloquear sítios de ligação não específicos.Elas foram incubadas por 30 minutos a 4°C (em gelo). Entãocontrole de isotipo de IgGl humana conjugada a FITC, CHIR-12.12 conjugado a FITC, ou rituximab conjugado a FITC foramadicionados a 100, 10, 1, 0,1 pg/ml, e as células foramincubadas por 30 minutos a 40C (em gelo). As células foramlavadas com tampão de coloração (PBS+l%FBS+0,1% Azida desódio), e analisadas por FACS Calibur.

A média geométrica de intensidade de fluorescência foimedida por FACS. Moléculas de "Equivalent SolubleFluorchrome" (MESF) foram então calculadas com base nacurva padrão estabelecida por glóbulos FITC calibrados.

Exemplo 4: CHIR-12.12 não induz internalização após ligaçãoa CD40 em linhas de células

Daudi, uma linha de células de Iinfoma7 e ARH77, umalinha de células de MM, foram usadas to para avaliar oefeito da ligação de CHIR-12.12 sobre a internalização.Células foram incubadas com IgGl humana (anticorpo decontrole) ou CHIR-12.12 a 1 pg/mL em gelo (com 0,1% azidade sódio para bloquear a internalização) ou 370C (sem azidade sódio) por 3 horas. Depois de uma lavagem com tampão decoloração frio (PBS + 1% BSA + 0,1% azida de sódio), ascélulas foram coradas com IgG-FITC anti-humana de cabra por30 minutos em gelo. A média geométrica de intensidadefluorescente (MFI) foi registradas por FACS Calibur.Nenhuma diferença na MFI foi observada entre as célulasincubadas com CHIR-12.12 em gelo na presença de azida desódio ou a 37°C na ausência de azida de sódio (Figura 7) .Esses dados mostram que CHIR-12.12, com ligação a CD4 0, nãoé internalizado e continua a ser apresentado na superfíciecelular.

Exemplo 5: Internalização de CHIR-12.12 e Rituximab apósligação a células de paciente com CLL : FACS e microscopiaconfocal

Metodologia de FACS

Células foram incubadas com huIgGl, CHIR-12.12, ourituximab a 10 ug/ml por 3 horas a 40°C (com 0,1% azida deNa) ou 37°C (w/o azida de Na). As células foram lavadas comtampão de coloração (PBS + 1% FBS + 0,1% azida de Na), IgG-FITC anti-humana de cabra foi então adicionada, e então ascélulas foram incubadas por 30 minutos a 40°C, e analisadaspor FACS Calibur.

Metodologia de microscopia confocal

As células foram incubadas com Alexa 488 ou CHIR-12.12conjugado a FITC, rituximab, e IgGl a 10 pg/ml, por 3 horasa 40°C (com 0.1% azida de Na) ou 37°C (w/o azida de Na) . Ascélulas foram então lavadas e fixadas com 2% formaldeído, 5min em temperatura ambiente. As células foram então lavadase colocadas em laminas revestidas com poli-L-lisina,montadas, e seladas e então analisadas por imagem confocal.Resultados

Os resultados desses experimentos são ilustrados naFigura 8 (FACS) e Figuras 9 e 10 (microscopia confocal). Osresultados desses experimentos são resumidos na Figura 11.Esses estudos de internalização de anticorpo que usamcélulas primárias de CLL conduzidos por citometria de fluxoe microscopia confocal mostram que com ligação a CD4 0 a37°C, CHIR-12.12 permanece uniformemente distribuído nasuperfície celular, mesmo depois de 3 horas. Em contraste,depois de ligação a 37°C, rituximab é redistribuído em capse internalizado. Esses dados sugerem que a potenteatividade de ADCC de CHIR-12.12 pode ser relacionada a suacapacidade de se apresentar uniformemente na superfície decélulas alvo, permitindo ótima interação com célulasefetoras. Esses resultados sugerem que CHIR12.12 pode sereficaz na mediação de potente ADCC contra células CLL invivo.

Exemplo 6: Análise Biacore de ligação de FcyRIIIa porRituxan® e CHIR-12.12

As afinidade de alelos aal58F e aal58V de FcyRIIIa porCHIR-12.12 e rituximab foi comparada por análise padrãoBiacore®. CHIR-12.12 ligou o alelo aal58F com uma afinidade4,6 vezes maior quando comparado com rituximab (KD de 2,8μΜ versus 13 μΜ, respectivamente). Os resultados dessesexperimentos são resumidos na tabela a seguir:

<table>table see original document page 127</column></row><table>

Exemplo 7: O efeito de polimorfismo de FcpRIIIa sobre ADCCpor células efetoras NK

A citotoxicidade celular dependente de anticorpo(ADCC) (ADCC) é um mecanismo de ação principal para váriosanticorpos monoclonais comercializados e de pesquisa.Rituximab (Rituxan®), comercializado para o tratamento delinfoma folicular não Hodgkin (NHL) e ativo em outrasmalignidades de células B, tem ADCC como um de seusmecanismos de ação primários. Notavelmente, a atividadeclínica de rituximab em NHL mostrou estar correlacionadacom o genótipo FcyRIIIa. Pacientes com o polimorfismo deFcyRIIIa 158aa de V/V ou V/F são mais responsivos arituximab que aqueles com F/F (por exemplo, veja, Cartron ecols. (2002) Blood 99 (3) : 754-758 ou DallOzzo e cols.(2004) CancerRes. 64:4664-4669).

Nesses experimentos, células NK efetoras purificadasde doadores múltiplos humanos que expressam váriospolimorfismos de FcyRIIIa aal58 foram avaliadas com o usoda linha de células Daudi de linfoma humano como as célulasalvo (veja, Figuras 12 e 13) . Como ilustrado por aquelasfiguras, CHIR-12.12 induziu potente ADCC com células NK detodos os três genótipos. As ED50S de CHIR-12.12 para Iiseda linha de células Daudi foram 4, 2, e 0,4 μΜ para F/F,V/F e V/V, respectivamente (Figura 13). As ED50S derituximab para Iise da linha de células Daudi foram 53, 21,e 9 μΜ para F/F, V/F, e V/V, respectivamente (Figure 13).

As células NK efetoras purificadas de doadoresmúltiplos humanos que expressam vários polimorfismos deFcyRIIIa aal58 foram também avaliadas com o uso de célulasde paciente com CLL como as células alvo(veja, Figura 14).CHIR-12.12 foi um mediador mais potente de ADCC querituximab contra todas as células de paciente com CLLtestadas (Figura 14). Esses dados sugerem que CHIR-12.12 éum mediador mais potente de ADCC que rituximab, mesmo comcélulas NK do genótipo aal58 V/F ou F/F.

Esses achado são surpreendentes porque seria esperadoque CHIR12.12 seria significativamente menos potente emensaios de ADCC que usam células NK com o polimorfismo deFcyRIIIa 158aa de F/F ou V/F que aquelas com V/V.Novamente, a atividade clínica de rituximab em NHL mostrouestar correlacionada com o genótipo de FcyRIIIa. Pacientescom o polimorfismo de FcyRIIIa 158aa de V/V ou V/F são maisresponsivos a rituximab que aqueles com F/F. Rituximab étambém um anticorpo monoclonal IgGl que se liga a umantígeno expresso na superfície de células B, e assim seriaesperado que CHIR-12.12 apresentasse a mesma preferênciapara o polimorfismo FcyRIIIa-158 V. ao contrário,constatou-se que CHIR-12.12 induz potente ADCC com célulasNK de todos os três genótipos.

Muitas modificações e outras modalidades das invençõesaqui apresentadas ocorrem àqueles habilitados na técnica,aos quais essas invenções pertencem, tendo o benefício dosensinamentos apresentados nas descrições anteriormenteapresentadas e nos desenhos associados. Portanto, deve-seentender que as invenções não se limitam às modalidadesespecíficas reveladas e que modificações e outrasmodalidades estão incluídas dentro do escopo dasreivindicações em anexo aqui reveladas. Embora sejam aquiempregados termos específicos, eles são utilizados apenasem um sentido genérico e descritivo e não com finalidadelimitante.

Todas as publicações e pedidos de patente mencionadosnessa são aqui incorporados por referência na mesmaextensão como se cada publicação ou pedido de patenteindividual fosse específica e individualmente indicado paraser incorporado por referência.Listagem de Seqüência

<110> Aukerroan, Slxaron EteaLugsnan, Mohammad

«120» Usos de anticorpos anti-CD40

<13 Os. FP0261B5.0002(319124)

s!50> 60/732,580<151> 01/11/2005

<1«0> 9

<170> FastSEQ para Windows Versão 4-0

c2io> j

«2ll> 72 0

<2x2 > UNA

<213 > seqüência artificial

<22 ϋ>

<223 > Seqüência codificadora para cadeia leve de anticorpo anti-CD40humano 12,12

«.221» CDS

<222 > {!},,<{720}

4'

<400> 1

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ctg aat aac ttc tafc ecc aga gag gcc aaa gta cag tgg aag gtg gat 523Inem Asn Asn Whs Tyr Pro Srg Glu Ala Lya Val Gln Trp Lys Val Aso165 170 175

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<211> 239

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<2i3> Seqüência artificial<220>

«223> Cadeia leve de anticorpo anti-Cd40 humano 12.12

<40Q> 2 Met Ala teu Bro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Met Leu Trp Val Ser1 B 10 15 Gly Ser Ser Gly Asp Ile Val Met Thr Gla Ser i&ró ,Leu Ser Leu Thr 20 25 30 Val Thr Pro Gly Glu sro Ala Ser Ile Ser Cya Arg Ser Ser Gln Ser 35 40 45 Leu Iteu Tyr ser ASA Gly fyr Asn iyr Leu Asp Trp Tyr Leu Sln Lys 50 SS 60 PEO Gly Gln Ser Pro Gln Val Leu Ile Ser Lsu Gly Sar Asn Arg Ala65 70 75 SOSer Gly Val PxO ASp Arg Phe Ser Gly Sor Gly Ser Gly Thr Ã3p Phe 85 90 SS Thr Leu Lys He Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp vai Gly Val Tyr Tyr 100 105 110 Cys «et Gln Ala Arg Glii Thr Pro Phe Thr Phe Gly ?ro Gly Thr Lys 115 120 125 Val Asp Ile Arg Arg Tlir Val Ala Ala Prs Ser Val Phe Ile Phe Pro 130 135 140 WXO Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu145 ISO 155 160Leu Asn Asa, Sfee Tyr Fro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp 165 170 175 Asxt Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp 190 185 190 Ser Lys Asp Ser Ψγχ Ser Leu Ser Ser Thr Leu Ttir Leu Ser Lys 195 200 205 Ala Aap Tyr GlU kys Mis Lys vai Tyr Ala Cys GlU vai Thr His Gla 210 215 220 Gly Leu SQr Ser Fro Val Thr Lys ser Plse Asii Arg Gly Glu Cys 225 330 23S

<2i0> 3<211» 201,6<212> DNA

<213> Seqüência artificial

<220>

<223 > Seqüência codificadora para cadeia pesada de anticorpo anti-CD40 humano12.12 (com íntrons)

<4Q0> 3 atg gag ttt ggg Ctg age tgg gtt ttc Ctt gtt gct att tta aga ggt «8gtc cag tgt cag gtg cag ttg gtg gag tct ggg gga ggc gtg gtc eag 96cct 999 agg tcc ctg aga cte tcc tgt gca gcc tct gga ttc acc ttc 144agt age tat ggc atg cac tgg gtc cgc cag gct cca ggc aag ggg ctg 192gag tgg Stg gca gfct ata tca tat gag gaa agt aat aga tac cat gca 240STac tcc Sftff aag ggc cga ttc aec ate tcc aga gac aat tcc aag ate 288aeg ctg tat ctg caa atg aac age ctc aga act gag gac acg gct gtg 33 Stat tac tgt gcg aga gat ggg ggt ata gca gca ect ggg cct gac tac 384tgg ggc eag gga acc ctg gtc acc gtc tcc tca gca agt acc aag ggc 432cca tcc gtc ttc ccc ctg gcg ccc gct age aag age acc tct ggg ggc 480aca gcg gcc ctg ggc tgc ctg gtc aag gac tac ttc ccc gaa ccg gtg 528acg gtg tcg tgg àaC tca ggc gcc ctg acc age ggc gtg cac aec ttc S?6ccg gct gtc cta cag tcc tca gga ctc tac tcc ctc age age gtg gtg 624acc gtg CCC tcc age age ttg ggc acc cag acc tac ate tgc aac gtg 672 cac aag ccc age aac acc aag gtg gac aag aga gtt ggt gag agg 720cca gca cag gga ggg agg gtg tct gct SSa age cag gct cag cgc tcc 768tge ctg gac gca tcc cgg cta tgc agt CCC agt cca ggg cag caa ggc 816agg CCC cgt ctg cct Ctt cac ccg gag gcc tct gcc cgc ccc· act cat 864gct cag gga gag 991 Ctt ctg gct ttt. tcc cca ggc tct ggg cag gca 91:2cag gct agg fcgc ccc taa ccc agg ccc tgc aca caa agg ggc agg tgc 960tgg gct cag acc tgc caa gag cca tat ccg gga gga çec tgc ccc tga 1008CCt aag ccc acc cca aag gcc aaa ctc tcc act ccc tca gct cgg aca . 1056CCt tct CtC cte cea gat tcc agt aac tcc caa tefc tct ctc tgc aga 1104gcc caa ate ttg tga caa aac tca cac atg ccc acc gtg CCC agg taa usagcc age cca ggc etc gcc ctc cag Ctc aag gcg gga cag gtg ccc tag 1200agt age ctg cat cca ggg aca ggc ccc age cgg gtg ctg aca cgt cea 1248ect cea tct Ctt cct cag cac ctg aac tcc tgg ggg gac cgt cag tct 1296tcc tct tcc CCC caa aac cca agg aca eco tca tga tct ccc gga ccc 1344ctg agg bca cat gcg tgg tgg tgg acg tga gcc acg aag acc ctg agg 13 $2tca agt tca act ggt acg tgg acg gcg tgg agg tgc ata afeg cca aga 1440Cáa age cge ggg agg age agt aca aca gca cgt acc gtg tgg tca gcg 14 8 8tcc tca ecg tcc tge acc agg OCt SffC tga atg gca agg agt aca agt 1536gca agg tct cca aca aag ccc tcc cag CCC cea tcg aga aaa. cca tct 1584cca aag cca aag gtg gga CCC gtg ggg tgc gag ggc cac atg gac aga 1632ggc cgg etc ggc cca CCC tct gcc ctg aga gtg acc gct gta cca acc 1S80tct gtc cct aca ggg cag ece cga gaa cca cag gtg tac acc ctg ccc 1720cca tcc cgg gag gag atg acc aag aac cag gtc age ctg acc tgc ctg 1776gtc aaa ggc ttc tat CCC age gac ate gcc gtg gag tgg gag age aat 1824ggg cag ccg gag aac aac tac aag acc acg cct ccc gtg ctg gac tcc 1872gac S1SiC tcc ttc ttc CtC tat age aag ctc acc gtg gac aag age agg 1S20tgg cag cag ggg aac gtc ttc tca tgc tcc gtg atg cat gag gct Ctg 19S8cac aac cac tãC acg cag aag age ctc tcc ctg tct ccg ggt aaa tga 2 OlS

<210 > 4

<211> 469

<212> PRT

<213> Seqüência artificial

<220>

<223 > tadeia pesada de anticorpo anti-Cd40 humano 12.12

<400> 4

Met Glu Ehe Gly Leu Ser Trp vai Piie l»eu Val Ala Ile Leu Arg Gly

1 5 10 15

Val Gl» Cys Gln Val GIn Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln

20 2S 30

Pro Gly Arg Ser Leu Axg Leu Ser Cys Ala Alá Ser Gly Phe Tfer Plie

35 40 45

ser Ser Tyr Gly Met His Txp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lye Gly Leu50 55 60 Glu Trp Val Ala vai Ile Ser Tyr Glu Glu Ser Aen Arg Tyr Hls Ala65 70 75 80Asp Sar Val Lys Gly Arg Phe Thr Ila ser Arg Asp Asn ser Lys Ile 85 90 95 Thr Leu Tyr Leu Gln Mst As» Ser Leu Arg Thr Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Arg Aep Gly Gly Ile Ala Ala Pro Gly Pro Asp Tyr IlS 120 125 Txp Gly Gln Gly Thr Lau vai Thr vai ser ser Ala Ser Thr Lys Gly 13 0 135 140 Fro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ala Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly145 150 155 160Tht Ala Ala Leu Gly Cys teu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val 165 170 175 Thr vai Ser Trp Abh Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe 180 185 130 Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Iaeu Tyr Ser Leu âôr Ser Vai vai 195 200 aos ar Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ue cys Asn vai 210 215 220 Asii Me Lyβ Pro ser Asn Thr LyS vai Asp Lys Arg Val GlU Pro Lys225 230 235 240Ser cya Asp Lys Thx Hia Tlir çys Sro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu 245 250 2SS Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro hye Aâp Thr 260 265 270 Leu Met Ile Sor Arg Thr Pro GlU Vial Thr Cys Val vai Val Asp vai 275 280 285 Ser H13 Glu Asp Pro Glu Val !Lys Phe Asn Trp Tyr vai Asp Gly vai 290 295 300 Glu Val His Aan Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu GlU Gln Tyr Asn Sfir305 310 315 320Thr Tyr Arg Val Vai ser vai Leu 'Ihr Val Leu His Gln Asp Trp Leu 325 330 33S Asn Gly Lys Glti Tyr Lys Cye Lys Val Ser Asa Lys Ala Leu Pro Ala 340 345 350 Pro xie Glu Lys Tar Ile Ser Lys Alá Iiys Gly Gln Pro Arg Glu Pro 355 360 365 Gln Val Tyr Thr Leu Pro Paro Ser Arg Glu Glu Mefc Thr Lys Aen Gln 370 375 38Ò Val Ser Iseu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser ASP Ile Ala335 390 335 400vai Glu Trp Glu Ser Asa Gly Gln Pro Glu Aan Asn Tyr Lys Thr Thr 405 410 415 Pro Pro vai Leu Asp Sar Asp Gly Ser Flue Phe Leu Tyr ser Lys Leu 420 425 430 Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gla Gln Gly Aen vai Phe Ser Cys Ser 435 440 445 Val Met His Glw Ala Leu His Asn Hie Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser 450 4S5 460

Lau Ser Pro Giy Bys4.65

<210> 5<21i» 463<212> PHT

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Cadeia pesada de variante de anticorpo anti-CD40 humano1212

<400> 5

Met Giu ghe Gly Ser Trp vai Phe Iieu Val Ala Ile Leu Arg Gly

1 5 10 15

Val Gln Cys Gln Val Gln l»eu Val Glu Sex Gly Gly Gly Val Vâl Gln20 Pro Qly Arg ser l»eu Arg Leu Ser 35 40Ser Ser Tyr Gly Mefc His Tsp Val 50 55Glu Trp Val AIa vai Ile Ser Tyr65 70 Asp Ser Val Lys Gly Ars Phe Thr es Thr Leu Tyr IriStt Gln Met Asn Ser 100 Tyr Tyr cys Ala Arg Aap Gly Gly XlS 120Txp Gly GltL Gly Tbr Leu Val Thr £30 135Pro Ser vai Ehe Pro Isu Ala Pro145 150 Thr Ma Ma fcsu. Gly Cys Leu vai 165 Thr Vgtl Sex- Trp Ash Ser Gly Ala XSO Pro Ma vai !■eu Gln Ser Ser Gly 195 200Thr vai Pro Ser Ser Ser Leu Gly 210 215Asrv His Lys Pro ser Asn Tftr LyS22S 230 Ser Cys Aep Lye Thr HiS Thr Cys 245 Leu Giy Gly Pr© Ser Val Phe Leu 260 Leu Met lis Ser Atj Thr Pro Glu 275 280Ser HÍS GlU JUSp Pro Glu Val Lys 250 295Glw Val Hls Asn Ala Itys Thr Lys305 310 Thr Tyr Itrg vai Val Ser Vel Leu 325 Asft Gly Dys Glu Tyr Lys Cys Lya 340 Pro Ile Glu Iiys Thr Ile Ser Lys 355 360GIjs Val Tyr Thr Lau Pro Pro Ser 370 375Val sex Leu Thr Cyg Iieu Val Lys365 350 vai GlAl Trp Glu Ser Asn Gly Glh 405 Sbro Pro Val Ij eu Asp ser Asp Gly 420 Tta Val Rsp Lys Ser Arg Trp Gln 435 440vai Met His GlU Ala Leu His Asa 450 455iiéU Ser Pro Gly Lys 465

25 30 Qya Ala Ala Ser Qly Phe Thr Phe 45 JVrs Qln Ala Pro Gly Lys Gly Lau SO Glu Glu Ser Asn Arg Tyr His Ala 75 aoIle Ser Axg Asp Asn Ser Lya Jle SO 95Leu Arg Thr Glu Asp Bir Ala Val105 110 Xle Ala Ala Pro Gly Pro Asp Tyr 125 Val Ser Ser Ala Ser Tlsr Lys Gly 140 Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly 155 ISOLys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val no 175Leu Thr ser Gly Val Hls Thr Phe185 190 Lau Tyr Ser Leu Sar Ser Val Val ZOS Thr Gln Thr Tyr lie CVs Asn Val 220 vai Asp Lys Arg vai Glu Pro Lys 235 240Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu 250 25SPhe Pxo Pro Lys Pro Lys Asp Thr265 270 Val Thr cys Val Val Val Asp Val 28S Phe Asn Trp Tyr Val As p Gly vai 300 Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser 31S 320Thr Val Lea His Gln Asp Txp Leu 330 335vai Ser Asn 2»ys Ala Leu Pxo Ma345 350 Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro 3 €5 Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln 380 Giy Phe Tyr Pro Ser Asp Xle Ala 395 400Pro Glu Asn Asu Tyr Lys Thr Thr 410 4ISSer Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu425 430 Gln Gly Aan Val She Ser Cys Ser 445 HiS Tyr Thr Gln t>ys Ser Leu ser 460

<210> 6*211> 612<212> PNA<213> ΗΟΤΒΟ eapiens

<220>

<22Χ> CDS

<222> (X).,.(S12)<221> Características_misc<222> (O),.., (O)

<223> Seqüência codificadora para isoforma curta de CD40 humano<400> 6

atg gtt cgt ctg cct ctg cag tgc gtc ctc tgg ggc tgc fctg ctg acc 4»Het Vai Arg Leu Pro Lau Gln Cys VaI Iieu Trp Gly Cys Leu Leu Thr1 5 10 15

gct gtc cut cca gaa cca. ccc act gea tgc aga gaa asa cag tac cta 9£Alá Val His Pro Qlu Pro Pro Thr Ala Cys Airg Olu Lys GXn Tyr Leu20 25 30

ata aac agi cag tgc tgt tct etg tgc cag cca gga cag aaa ctg gtg 144Xle Asn Sfcr Gln Cys Cys Smr t-eu Cys Olxi Pro Gly Gln Iiya Leu Val35 40 45

agt gac tgc aca gag ttc act gaa acg gaa tgc etc cct tgc ggt gaa 132Set Asp Cys Ttor Slu Bht Thx Glu Tiir GIm Cys Leu Pro Cys Sly Glu50 SS 60

age gaa ttc cta gac acc tgg aac aga gag aca cac tgc cac cag cac 2«oSct Olu Phe Leu Asp Tlir Tzp Asn Arg Glu Thx His Cys His Gln His65 70 75 80

aãa tac Lgc gae ccc aac cta ggg ctt cgg gtc cag cag aag ggc acc 28βLye Tyr cys Asp Pro Asn Leu Gly Leu Arg Val Gln Qln Lys Gly Tkir85 90 95

tca gaa aca gac acc ate tgc acc tgt gaa gaa ggc tgg cac tgt acg 3363er Glu Thr Asp Thr Xle Cys Tlir Cys Qlu Glu Gly Trp Hie Cys Thx100 105 110

agt gag gcc tgt gag age tgt gtc ctg cac cgc tca tgc tcg ccc ggc 384Ser Glu Ala Cys Glu Ser Cys Val Leu Hia Arg Ser Cys Ser Pro Qly115 120 125

fctt ggg gtc aag cag att gct aca ggg gtt tct gat acc ate tgc gag 432Phe Gly Val Lye Gln Iie Ma Thr giy vai Ser Aso Thr lie Cys Glu130 135 140

ccc fcge eea gtc ggc ttc ttc tee aat gtg tca tct gct ttc gaa aaa 480Pro Cys Pro Val Oly Phe Ser Aen vai Ser Ser Ala Phs Glu Lys14S 150 15S 160

tgfc cac ccc tgg aca agg tec cca gga tcg gct gag age cct ggt ggt 528Cys Eis Fro Trp TSir Arg Ser Pro Qly ser Ala Olu Ser Pxo Gly Gly165 170 175

gat ccc cat cat ctt cgg gat cct gtt tgc cat cct ett ggt gct ggt 576Aap Pro His His Leu ftrg Asp Bro Val Cys His £ro Leu Gly Ala Gly180 185 190

ctt tat caa aaa ggt ggc caa gaa gcc aac caa tpâ 612

Leu Tyr Glti Lys Gly Gly Gln Glu Ala Asn Gln 195 200

<210> 7

<211> 203

<212> PRT

<213> Hoiro eapiens

<400> 7

Met Val Arg l»eu Fro Leu Gln cys

1 5

Ala Val His Pro <51u Pro Pro Thr

Val Leu Trp Gly Cys Leu Lsu Thr

10 15

Ala Cys Arg Glu hys Gln Tyr Leu20 25 30Ile Asn ser Gto Cys Cys Ser Leu Cys Gla Pxo Gly Gln Lys Leu Val 35 <5 0 45 Ser ASp Cys Thr Glu Ehe Thr Glu Thr Glu Cys Leu Pro Cys Gly Glu 50 55 60 Sex Glu P b e Leu Aep Thx Trp ftsn Arg Glw «IX His Cys His Gln HJrS'65 70 75 80UyS Tyr Cys Asp Fro Asn Leu Gly Leu Arg vai Gln Gln Lys Gly Thr 65 90 SS Sex Glu Thr Aep Thr Ile Cye Thr cys Glu Glu Gly Tip Hie Cys Thr 100 105 110 ser Glu Ala Cys Glu Ser Cys Val Leu His Arg Ser Cys Sex Pro Gly IlS 120 125 Phe Gly Val Lys Gln Xle Ala Thr Gly vai Ser Asp Thr ile Cys GlU 130 135 140 Pxo Cys Pro Val Gly Fhe Phe Ser Asn Val Ser Sex Ala Phe Glu Lys145 150 155 160Cys Hie Fro'Trp Tbr Arg Ser Pro Gly Ser Ala Qlu Ser Pro Gly Gly 265 170 175 Asp Pro HiS HiS LGU Arg Asp Pro Val Cys His Pro Leu Gly Ala Gly 180 185 190 Leu Tyr Glsi: Lys Gly Gly Glii Glu Ala Aan Gln

ZSS 200

<:21Q> 8

<212> 834

<212 > DHA

<213 > Homo sapiens

<220>

<22.1 > CDS

<222> (I)...{834}

<221> Características_misc<222> (0).,.(0)

<223 > 5eqüência codificadora para isoforma longa de CD40 humanoc40D> B

aig gtt cgt ctg ccfc ctg cag tgc gtc etc tgg ggc tgc ttg ctg aco 48Mefc Val Arg teu Bro Leu Gln Cys Vai. Leu Trp Gly Cys Leu Leii ThxIS 10 15

gct gtc caC cca gaa cca ece aet gca Cge aga gaa aaa cag tac cta 96Ala Val His Pxo Glu Prq Pro Thr Ala Cys Arg 01« Lys Glu Tyr Lec20 25 30

ata aac agt cag tgc tgt tct ttg tgc cag cca gga cag aaa ctg gtg 144Ile Asa Ser Gln Cys Cys Ser Lea Cys Sln Pro Gly Gln Ijys Lew Val3 5 4 0 45

agt gac tgc aca. gag ttc aet gaa acg gaa tgc ctt cct tgc ggt gaa 192Ser Asp Cys Tltr Glu Phe Ttor Glu Tiir Glu Cys Leu Pro Cys Gly Glii50 55 SO

age gaa ttc cta gac acc tgg aac aga gag aca cac tgc cac cag cac 240Ser Glu Phe teu Asp XJir Trp asa Arg Glu Tto His cys His GIb His65 70 75 80

aaa tac tgc gac ccc aaç cta ggg ctt cgg gtc cag cag aag ggc acc 288Lys Tyr Cys Asp Pro Asn Leu Gly Leu Arg Val GIjj Gla Lye Giy Tbr85 90 SS

tca gaa aca gac acc ate tgc acc tgt gaa gaa ggc tgg eac tgt acg 336Ser Glu Thr ,Asp Thr Ile Cys Thr Cys Glu Glu Gly Trp His Cys Thr100 IOS 110

agt gag gcc tgt gag age tgt gtc ctg cac cgç tca tgc tcg ccc ggc 384Ser Glu Ala Cys Glu Ser Cys vai Leu His Arg Ser Cys ser Pro Gly115 120 125

ttt ggg gtc aag cag att get aca ggg gtt tct gat acc ate tgc gag 432Phe Gly Val Lys Gln Ile Ala Thr Sly Val Ser Aep Thr Ile Cys Glu130 13S 140

ccc tgc cca gtc ggc ttc ttc tcc aat gtg tca tct gct ttc gaa aaa 4B0Pxo Cys Pro Val Gly Phe Phe Ser Abix Val Ser Ser Ala Phe Glu Lys145 150 155 160

tgt cac cct tgg aca age tgt gag acc aaa gac ctg gtt gtg caa cag 528Cya His Pro Trp Thr Ser Cys Glu Tta Lye Asp Leu Val Val Glm Gln165 170 175

gea ggc aca aac áag act gat gtt gtc tgt ggt ccc cag gat cgg ctg 576Ala Gly Thx Asti Lys Thr Asp Val Val Cys Gly Fro Glm Asp Arg Leu180 185 190

aga gcc ctg gtg gtg ate ccc ate ate ttc ggg ate ctg ttt gcc ate 624Arg Ala Leu Val Val Ile Pro Ile Ile Phe Gly Ile Leu Phe Alá Ile195 200 205

ctc ttg gtg ctg gtc ttt ate aaa aag gtg gcc aag aag cca acc aat 672Leu Leu Val Leu Val Phe Ile Lys Lys Val Ala Lya Lys Pro Thr Asn210 215 220

aag gçc ccc gac ccc aag cag gaa ccc cag gag ate aat ttt ccc gac 720Lys Ala Pro Bis Pro Lys Gln Glu Pro Gla Glw Xle Asn Phe Pro Asp225 230 235 240

gat ctt cct ggc tcc aac act gct gct cca gtg cag gag act tto cat 768Asp Leu Pro Gly Ser Asn Thr Ala Ala Sro Vâl Gla Glit Thr Leu Hls245 250 2SS

gga tgc eaa ecg gtc acc cag gag gat ggc aaa gag agt cgo ate tca 816Gly Cys Gla Pro vai Tlrr Gln Glu Asp Gly Lys Glu Ser Arg Ha ser260 26S 270

gtg cag gag aga cag tga 834

Val Gln Glu Arg Gln *275

<210> 9

<211> 277

<212> PRT

«213» Momo sepiens

<400> 9 Met vai Arg Leu Pro Leu Gln Cys1 S Ala, Val Hls Sro 20 GXu Pro Pro ThrIle Asn Ser 35 Gln Cys Cys Ser Leu 40Ser Afip 50 Cys Thr Glu Phe Thr 55 GluSer GlW Phe Leu Asp Thr Trp Asn65 70 Lys Tyr Cys Asp Pro 65 Asn Leu GlySer Glu Thr Aap 100 Tftr Ile cys ThrSer Glu Ala 115 Cys GlU Ser Cys Val 120Phe Gly 130 Val Lys Gln Ile Ala 13 S ThrPro cys Pro Val Gly Fhe Phe Ser

Vál Leu Trp Gly Cys Leu Leu Thr 10 15 Ala Cys Arg Glu Lys Gln Tyr Leu25 30 Cye GiJQ Pro Gly Gln Lys Leu vai 45 Thx Glu Cys Leu Pro Cys Gly Glu 60 Arg GlU Thr His Cys His Gln His 75 SOLeu Arg Val Glc Gin Lys Gly Thr 90 95 Cye Glu GlU Gly Trp His Cys Thr105 110 Leu His Arg Ser Cys Ser Pro Gly 125 Gly Val ser Asp Thr Iic Cys Glu 140 Asn Val Ser Ser Ala Phe Glu Lys145 150 15S 160Cys HiS Pro Trp Ihr Ser Cys GlU Thr £,ys Asp IUeu Val vai GIJI Gln 165 170 X7S Ala Gly te Asn Bys Thr Asp Val Val Gys Gly Pro Sln Aep Arg Leu ISO IBS 190 Arg Ala Beu Val VaX Ile l»ro lie Ile Phe Gly Ile Leu Phe Ala Ile 195 200 205 Iteu IiGit Val Leu Val Pfte lie Iiys l«ys Val Ala Lys Lys Pro Thr Asn210 2J.S 220 Lys Λ1« Pro His Pco Iiyg Gla Gltt Pro Gln Glu Ile Asn She Pro Asp225 230 235 240ASjo Ijeu Pro Gly Ser Asn Thx Ala JUa Pro vai Qln Glu Thr Leu His 245 250 255 Gly Cye Qln Pto Val Tbr Gln Glu Asp Gly Lye Glu Ser Axg Ile Ser 260 2 SS 270

Val Gln Glu Arg Gln275

Claims (53)

1. Método para o tratamento de um paciente humanopara uma doença inflamatória ou doença autoimune que estáassociada a células que expressam CD40, em que o referidopaciente humano é heterozigótico ou homozigótico paraFcγRIIIa-158F (genótipo V/F ou F/F), o método caracterizadopor compreender a administração ao referido paciente humanode uma quantidade terapeuticamente ou profilaticamenteeficaz de um anticorpo anti-CD40.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que a referida doençainflamatória ou doença autoimune é selecionada do grupo queconsiste em lúpus eritematoso disseminado (SLE) , lúpusdiscóide, nefrite de lúpus, sarcoidose, artriteinflamatória incluindo artrite juvenil, artrite reumatóide,artrite psoriática, sindrome de Reiter, espondiliteanquilosante, artrite da gota, rejeição de transplante deórgão ou tecido, rejeição hiperaguda, aguda ou crônica e/ouenxerto versus doença do hospedeiro, esclerose múltipla,sindrome de hiper IgE, poliarterite nodosa, cirrose biliarprimária, doença inflamatória intestinal, doença de Crohn,doença celíaca (enteropatia sensível ao glúten), hepatiteautoimune, anemia perniciosa, anemia hemolítica autoimune,psoríase, escleroderma, miastenia grave, púrpuratrombocitopênica autoimune, tireoidite autoimune, doença deGrave, tireoidite de Hashimoto, doença do complexo imune,sindrome da disfunção imune de fadiga crônica (CFIDS),polimiosite e dermatomiosite, crioglobulinemia, trombólise,cardiomiopatia, pênfigo vulgar, fibrose intersticialpulmonar, diabetes mellitus tipo I e tipo II,hipersensibilidade tipo retardada tipo 1, 2, 3 e 4, alergiaou distúrbios alérgicos, respostas imunes indesejadas aproteínas terapêuticas, asma, sindrome de Churg-Strauss(granulomatose alérgica), dermatite atõpica, dermatite decontato irritante e alérgica, urticária, alergia mediadapor IgE, aterosclerose, vasculite, miopatias inflamatóriasidiopáticas, doença hemolítica, doença de Alzheimer's epolineuropatia desmielinizante inflamatória crônica,inflamação pulmonar incluindo, sem limitação, rejeição aenxerto pulmonar, asma, sarcoidose, enfisema, fibrosecística, fibrose pulmonar idiopática, bronquite crônica,rinite alérgica e doenças alérgicas do pulmão comopneumonite de hipersensibilidade, pneumonia eosinofílica,bronquiolite obliterante devido à transplante de medulaóssea e/ou pulmonar ou outras causas, aterosclerose deenxerto/flebosclerose de enxerto, fibrose pulmonar queresulta de doenças do colágeno, vasculares e doençasautoimunes como artrite reumatóide e lúpus eritematoso.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que a referida doençainflamatória ou doença autoimune é uma doença inflamatóriaou doença autoimune associada a células que expressam CD20.

4. Método, de acordo com a reivindicação 3,caracterizado pelo fato de que a referida doençainflamatória ou doença autoimune é artrite reumatóide,psoriase, lúpus eritematoso disseminado, doença de Crohn,miastenia grave, púrpura trombocitopênica idiopática ousindrome de Sjogren.

5. Método, de acordo com a reivindicação 3,caracterizado pelo fato de que a referida doençainflamatória ou doença autoiraune é esclerose múltipla,rejeição a enxerto, enxerto versus doença do hospedeiro,doença de Alzheimer, ou diabetes.

6. Método, de acordo com a reivindicação 3,caracterizado pelo fato de que a referida doençainflamatória ou doença autoimune é uma doença inflamatóriaou doença autoimune que está associada a células queexpressam tanto CD40 quanto CD20.

7. Método, de acordo com a reivindicação 6,caracterizado pelo fato de que a referida doençainflamatória ou doença autoimune é artrite reumatóide,psoríase, lúpus eritematoso disseminado, doença de Crohn,miastenia grave, púrpura trombocitopênica idiopática, ousíndrome de Sjogren.

8. Método, de acordo com a reivindicação 6,caracterizado pelo fato de que a referida doençainflamatória ou doença autoimune é esclerose múltipla,rejeição a enxerto, enxerto versus doença do hospedeiro,doença de Alzheimer, ou diabetes.

9. Método, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8, caracterizado pelofato de que o referido anticorpo anti-CD40 é administradopor uma via de administração parenteral.

10. Método, de acordo com a reivindicação 9,caracterizado pelo fato de que o referido anticorpo anti-CD4 0 é administrado por via intravenosa ou subcutânea.

11. Uso de uma quantidade terapeut icamente ouprofilaticamente eficaz de um anticorpo anti-CD40caracterizado por ser para a manufatura de um medicamentopara o tratamento de uma doença inflamatória ou doençaautoimune que está associada a células que expressam CD4 0em um paciente humano heterozigótico ou homozigótico paraFcyRIIIa-158F (genótipo V/F ou F/F).

12. Uso, de acordo com a reivindicação 11,caracterizado pelo fato de que a referida doençainflamatõria ou doença autoimune é selecionada do grupo queconsiste em lúpus eritematoso disseminado (SLE), lúpusdiscóide, nefrite de lúpus, sarcoidose, artriteinflamatória incluindo artrite juvenil, artrite reumatóide,artrite psoriática, síndrome de Reiter, espondiliteanquilosante, artrite da gota, rejeição de transplante deórgão ou tecido, rejeição hiperaguda, aguda ou crônica e/ouenxerto versus doença do hospedeiro, esclerose múltipla,síndrome de hiper IgE, poliarterite nodosa, cirrose biliarprimária, doença inflamatória intestinal, doença de Crohn,doença celíaca (enteropatia sensível ao glúten), hepatiteautoimune, anemia perniciosa, anemia hemolítica autoimune,psoríase, escleroderma, miastenia grave, púrpuratrombocitopênica autoimune, tireoidite autoimune, doença deGrave, tireoidite de Hashimoto, doença do complexo imune,síndrome da disfunção imune de fadiga crônica (CFIDS) ,polimiosite e dermatomiosite, crioglobulinemia, trombólise,cardiomiopatia, pênfigo vulgar, fibrose intersticialpulmonar, diabetes mellitus tipo I e tipo II,hipersensibilidade tipo retardada tipo 1, 2, 3 e 4, alergiaou distúrbios alérgicos, respostas imunes indesejadas aproteínas terapêuticas, asma, síndrome de Churg-Strauss(granulomatose alérgica), dermatite atópica, dermatite decontato irritante e alérgica, urticária, alergia mediadapor IgE, aterosclerose, vasculite, miopatias inflamatóriasidiopáticas, doença hemolítica, doença de Alzheimer1S epolineuropatia desmielinizante inflamatória crônica,inflamação pulmonar incluindo, sem limitação, rejeição aenxerto pulmonar, asma, sarcoidose, enfisema, fibrosecística, fibrose pulmonar idiopática, bronquite crônica,rinite alérgica e doenças alérgicas do pulmão comopneumonite d hipersensibilidade, pneumonia eosinofílica,bronquiolite obliterante devido à transplante de medulaóssea e/ou pulmonar ou outras causas, aterosclerose deenxerto/flebosclerose de enxerto, bem como fibrose pulmonarque resulta de doenças do colágeno, vasculares e doençasautoimunes como artrite reumatóide e lúpus eritematoso.

13. Uso, de acordo com a reivindicação 11,caracterizado pelo fato de que a referida doençainflamatória ou doença autoimune é uma doença inflamatõriaou doença autoimune associada a células que expressam CD20.

14. Uso, de acordo com a reivindicação 13,caracterizado pelo fato de que a referida doençainflamatória ou doença autoimune é artrite reumatóide,psoriase, lúpus eritematoso disseminado, doença de Crohn,miastenia grave, púrpura trombocitopênica idiopática, ousindrome de Sjogren.

15. Uso, de acordo com a reivindicação 13,caracterizado pelo fato de que a referida doençainflamatória ou doença autoimune é esclerose múltipla,rejeição a enxerto, enxerto versus doença do hospedeiro,doença de Alzheimer, ou diabetes.

16. Uso7 de acordo com a reivindicação 13,caracterizado pelo fato de que a referida doençainflamatória ou doença autoimune é uma doença inflamatóriaou doença autoimune que está associada a células queexpressam tanto CD40 quanto CD20.

17. Uso, de acordo com a reivindicação 16,caracterizado pelo fato de que a referida doençainflamatória ou doença autoimune é artrite reumatóide,psoríase, lúpus eritematoso disseminado, doença de Crohn,miastenia grave, púrpura trombocitopênica idiopática, ousíndrome de Sjogren.

18. Uso, de acordo com a reivindicação 16,caracterizado pelo fato de que a referida doençainflamatória ou doença autoimune é esclerose múltipla,rejeição a enxerto, enxerto versus doença do hospedeiro,doença de Alzheimer, ou diabetes.

19. Uso, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 ou 18,caracterizado pelo fato de que o referido medicamento éformulado para administração por uma via de administraçãoparenteral.

20. Uso, de acordo com a reivindicação 19,caracterizado pelo fato de que o referido medicamento éformulado para administração por via intravenosa ousubcutânea.

21. Método para a inibição de produção de anticorpopor células B em um paciente humano heterozigótico ouhomozigótico para FcyRIIIa-158F (genótipo V/F ou F/F) ,caracterizado que compreende a administração ao referidopaciente humano de uma quantidade eficaz de um anticorpoanti-CD4 0.

22. Método, de acordo com a reivindicação 21,caracterizado pelo fato de que o referido paciente humanotem uma doença inflamatória ou doença autoimune que estáassociada a células que expressam CD40.

23. Uso de uma quantidade eficaz de um anticorpoanti-CD4 0 caracterizado por ser para a manufatura de ummedicamento para a inibição de produção de anticorpo porcélulas B em um paciente humano heterozigótico ouhomozigótico para FcyRIIIa-158F (V/F ou F/F).

24. Método ou uso, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13,-14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 ou 23, caracterizadopelo fato de que o referido anticorpo anti-CD40 é umanticorpo monoclonal humano.

25. Método ou uso, de acordo com a reivindicação 24,caracterizado pelo fato de que o referido anticorpomonoclonal anti-CD40 humano compreende uma região constantede cadeia pesada de IgGl humana.

26. Método ou uso, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13,-14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 OU 25,caracterizado pelo fato de que a referida IgGl humanacompreende a seqüência de aminoácidos apresentada em Id. deSeq. N°:4 ou Id. de Seq. N0:5.

27. Método ou uso, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13,-14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 ou 26,caracterizado pelo fato de que o referido anticorpo anti-CD40 é livre de significante atividade agonista.

28. Método ou uso, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13,-14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 ou 27,caracterizado pelo fato de que o referido anticorpo anti-CD40 é um antagonista de sinalização de CD40-CD40L emcélulas que expressão CD40.

29. Método ou uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13,14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27 ou28, caracterizado pelo fato de que o referido anticorpoanti-CD40 é selecionada do grupo que consiste em:a) o anticorpo monoclonal CHIR-12.12;b) ρ anticorpo monoclonal produzido pela linha decélulas de hibridoma 12.12;c) um anticorpo monoclonal que compreende umaseqüência de aminoácidos selecionada do grupo que consistena seqüência mostrada em Id. de Seq. N°:2, a seqüênciamostrada em Id. de Seq. N° :4, a seqüência mostrada em Id.de Seq. N° : 5, ambas seqüências mostradas em Id. de Seq.Nº :2 e Id. de Seq. N0 :4, e ambas seqüências mostradas emId. de Seq. N°:2 e Id. de Seq. Nº:5;d) um anticorpo monoclonal que tem uma seqüência deaminoácidos codificada por uma molécula de ácido nucleicoque compreende uma seqüência de nucleotideos selecionada dogrupo que consiste na seqüência mostrada em Id. de Seq.N° : 1, a seqüência mostrada em Id. de Seq. N°: 3, e ambasseqüências mostradas em Id. de Seq. N0 :1 e Id. de Seq. N°:3;e) um anticorpo monoclonal que se liga a um epitopocapaz de ligar o anticorpo monoclonal produzido pela linhade células de hibridoma 12.12;f) um anticorpo monoclonal que se liga a um epitopo que compreende resíduos 82-87 da seqüência de CD40 humanomostrada em Id. de Seq. N0:7 ou Id. de Seq. N° : 9;g) um anticorpo monoclonal que se liga a um epitopoque compreende resíduos 82-89 da seqüência de CD40 humanomostrada em Id. de Seq. N°:7 ou Id. de Seq. N":9;h) um anticorpo monoclonal que compete com oanticorpo monoclonal CHIR-12.12 em um ensaio de ligaçãocompetitivo;i) o anticorpo monoclonal do item anterior a) ou umanticorpo monoclonal de qualquer um dos itens anterioresc)-h), em que o referido anticorpo é recombinantementeproduzido; ej ) um anticorpo monoclonal que é um fragmento deligação a antigeno de um anticorpo monoclonal de qualquerum dos itens anteriores a)-i), em que o referido fragmentoretém a capacidade de se ligar especificamente a antigenohumano CD40.

30. Método ou uso, de acordo com a reivindicação 29,caracterizado pelo fato de que o referido anticorpo anti-CD40 é o anticorpo monoclonal CHIR-12.12.

31. Método ou uso, de acordo com a reivindicação 29,caracterizado pelo fato de que o referido fragmento deligação a antigeno é selecionada do grupo que consiste emum fragmento Fab, um fragmento F(ab')2, um fragmento Fv eum fragmento Fv de cadeia única.

32. Método para identificação de um paciente humanocom uma doença inflamatória ou doença autoimune tratávelcom um anticorpo anti-CD40 e que é refratário ao tratamentocom rituximab (Rituxan®), caracterizado por compreender:a) a identificação de um paciente humano com umadoença inflamatória ou doença autoimune que está associadaa células que expressam CD4 0; eb) a determinação do referido genótipo FcyRIIIa-158do paciente humano (VN, V/F ou F/F) ;em que a referida doença inflamatória ou doençaautoimune é tratável com um anticorpo anti-CD40 se oreferido paciente humano é heterozigótico ou homozigõticopara FcyRIIIal58F (genótipo V/F ou F/F).

33. Método para a seleção de uma terapia comanticorpo para o tratamento de um paciente humano que temuma doença inflamatória ou . doença autoimune que érefratária ao tratamento com rituximab (Rituxan®),caracterizado por compreender:a) a identificação de um paciente humano com umadoença inflamatória ou doença autoimune que está associadaa células que expressam CD40 e que é refratário aotratamento com rituximab (Rituxan®); eb) a determinação do referido genótipo FcYRIIIa-158do paciente humano (VN, V/F ou F/F) ;em que se o referido paciente humano é heterozigóticoou homozigótico para FcyRIIIa- 158F (genótipo V/F ou F/F) ,um anticorpo anti-CD40 é selecionado para o tratamento dareferida doença inflamatória ou doença autoimune.

34. Método ou uso, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13,-14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28,-29, 30, 31, 32 ou 33, caracterizado pelo fato de que oreferido paciente humano é refratário a uma terapia parauma doença inflamatória ou autoimune.

35. Método, de acordo com a reivindicação 34,caracterizado pelo fato de que o referido paciente humano érefratário a uma terapia com um anticorpo monoclonal anti-CD20.

36. Método, de acordo com a reivindicação 35,caracterizado pelo fato de que o referido paciente humano éresistente a terapia com um anticorpo monoclonal anti-CD20.

37. Método, de acordo com a reivindicação 35,caracterizado pelo fato de que o referido paciente humano énão responsivo a terapia com um anticorpo monoclonal anti-CD20.

38. Método, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 35, 3 6 ou 37, caracterizado pelo fato de queo referido anticorpo monoclonal anti-CD20 é rituximab(Rituxin®).

39. Kit para identificação de um paciente humano comuma doença inflamatória ou doença autoimune tratável com umanticorpo anti~CD40, caracterizado por compreenderreagentes para a determinação do genótipo FcYRIIIa-158 deum paciente humano.

40. Kit para a seleção de uma terapia com anticorpopara o tratamento de um paciente humano que tem uma doençainflamatória ou doença autoimune que é associada comcélulas que expressam CD40, caracterizado por compreenderreagentes para determinação do genótipo FcYRIIIa-158 de umpaciente humano.

41. Kit, de acordo com a reivindicação 39 ou 40,caracterizado por incluir um micro-arranjo que compreendepelo menos um marcador de 10 ou mais nucleotídeos decomprimento e de uma seqüência adequada para a determinaçãodo genótipo FcYRIIIa-158 de um paciente humano.

42. Kit, de acordo com a reivindicação 39 ou 40,caracterizado por compreender oligonucleotídeos adequadospara uso como iniciadores em amplificação catalisada porpolimerase da região genômica que codifica aminoácido 158de FcyRIIIa.

43. Kit, de acordo com a reivindicação 39 ou 40,caracterizado por compreender uma ou mais enzimas derestrição adequadas para a determinação do genótipoFcyRIIIa-158 de um paciente humano.

44. Método para o tratamento de um paciente humanopara uma doença inflamatória ou doença autoimune que estáassociada a células que expressam CD4 0, o métodocaracterizado por compreender a administração ao referidopaciente humano de uma quantidade terapeuticamente ouprofilaticamente eficaz de um anticorpo anti-CD40, de modoque o anticorpo anti-CD40 não seja significativamenteinternalizado por células que expressam CD4 0 após aadministração.

45. Método para o tratamento de um paciente humanopara uma doença inflamatória ou doença autoimune que estáassociada a células que expressam CD40, o métodocaracterizado por compreender a administração ao referidopaciente humano de uma quantidade terapeuticamente ouprofilaticamente eficaz de um anticorpo anti-CD40, de modoque o anticorpo anti-CD40 permaneça substancialmenteuniformemente distribuído na superfície de células queexpressam CD40 após administração.

46. Método para o tratamento de um paciente humanopara uma doença inflamatória ou doença autoimune que estáassociada a células que expressam CD40, o métodocaracterizado por compreender a administração ao referidopaciente humano um anticorpo anti-CD40, de modo que umaquantidade terapeuticamente ou profilaticamente eficaz doanticorpo anti-CD40 esteja presente na superfície decélulas que expressam CD4 0 no referido paciente humano apósadministração.

47. Método ou uso, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, -14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, -29, 30, 31, 44, 45, 46, caracterizado pelo fato de que oreferido método ou uso resulta em citotoxicidade celulardependente de anticorpo (ADCC) de células que expressamCD40 por células killer naturais (NK) que expressamFcyRIIIa de um paciente humano.

48. Método ou uso, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13,-14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28,-29, 30, 31, 44, 45, 46, caracterizado pelo fato de que oreferido anticorpo anti-CD40 é mais potente que rituximab(Rituxin®) em um ensaio de citotoxicidade celulardependente de anticorpo (ADCC), em que o ensaio compreendea incubação de células que expressam CD4 0 e células queexpressam CD20 com células killer naturais (NK) isoladashumanas na presença do anticorpo relevante.

49. Método ou uso, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13,-14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28,-29, 30, 31, 44, 45, 46, caracterizado pelo fato de que oreferido anticorpo anti-CD40 é mais potente que rituximab(Rituxin®) em um modelo de lúpus eritematoso disseminado(SLE), esclerose múltipla, inflamação e aterosclerose,transplante ou doença de Alzheimer.

50. Método ou uso, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13,-14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28,-29, 30, 31, 44, 45, 46, caracterizado pelo fato de que oreferido anticorpo anti-CD40 se liga a CD40 humano com umaafinidade (KD) de pelo menos cerca de 10-6 M a pelo menoscerca de 10-12 M.

51. Método ou uso, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13,-14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28,-29, 30, 31, 44, 45, 46, caracterizado pelo fato de que oreferido anticorpo anti-CD40 se liga a FcyRIIIa-158V humanocom uma afinidade (KD) de pelo menos cerca de 0,5 μΜ.

52. Método ou uso, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13,-14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28,-29, 30, 31, 44, 45, 46, caracterizado pelo fato de que oreferido anticorpo anti-CD40 se liga a FcyRIIIa-158F humanocom uma afinidade (KD) de pelo menos cerca de 12 μΜ.

53. Método ou uso, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13,-14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28,-29, 30, 31, 44, 45, 46, caracterizado pelo fato de que oreferido anticorpo anti-CD40 se liga a FcyRIIIa-158V humanocom uma afinidade (KD) de pelo menos cerca de 0,5 μΜ, e seliga a FcyRIIIa-158F humano com uma afinidade (KD) de pelomenos cerca de 12 μΜ.