BRPI0618528A2 - método de conversão de proteìnas ativas solúveis em água em proteìnas ativas hidrofóbicas, uso das mesmas para a preparação de camadas monomoleculares de proteìnas ativas orientadas e dispositivos compreendendo as ditas proteìnas - Google Patents

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BRPI0618528A2
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Ettore Balestrieri
Romano Felicioli
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Proteogen Bio S R L
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Abstract

MéTODO DE CONVERSAO DE PROTEìNAS ATIVAS SOLúVEIS EM áGUA EM PROTEìNAS ATIVAS HIDROFóBICAS, USO DAS MESMAS PARA A PREPARAçãO DE CAMADAS MONOMOLECULARES DE PROTEìNAS ATIVAS ORIENTADAS E DISPOSITIVOS COMPREENDENDO AS DITAS PROTEìNAS. A presente invenção se refere a um método para converter proteínas ativas hidrofílicas (HPiAP) em proteínas ativas hidrofóbícas (HPoAP), adequadas para a fixação na sua forma ativa sobre substratos hidrofóbicos. A presente invenção também se refere à preparação de camadas ordenadas rnonomoleculares de proteínas ativas orientadas, mobilizadas sobre suportes sólidos hidrofóbicos, a serem usados na manipulação mecânica e em pesquisas, incluindo Microscopia de Força Atómica (AFM) em soluções aquosas e ensaios que utilizam os mesmos dispositivos.

Description

"MÉTODO DE CONVERSÃO DE PROTEÍNAS ATIVAS SOLÚVEIS EM ÁGUA
EM PROTEÍNAS ATIVAS HIDROFÓBICAS, USO DAS MESMAS PARA À PREPARAÇÃO DE CAMADAS MONOMOLECULARES DE PROTEÍNAS ATIVAS ORIENTADAS E DISPOSITIVOS COMPREENDENDO AS DITAS PROTEÍNAS"
Campo Técnico da Invenção
A presente invenção se refere a um método de conversão de proteínas ativas, hidrofílicas, so"lúveis em água (HPiAP)i em proteínas ativas hidrofóbicas (HPoAP) , através de modificações covalentes. de resíduos superficiais aminoácidos hidrofílicos, coiri reagentes hidrof óbicos em fase , heterogênea, ou em uma mistura de solventes de diferentes polaridades. As proteínas hidrofobizadas espontaneamente se auto-constroem sobre diversos diferentes süportes sólidos hidrofóbicos,em - monocámadas estatisticamente orientadas, adequadas para a produção de biorreatores e biossensores e para manipulação e, inspeções mecânicas, incluindo Micróscopia de Força Atômica (AFM.)
Antecedentes da invenção
Uma grande vâriedade de pesquisas e/ou aplicações experimentais sobre bioengenharia exigem monocamadas de- biomoléculás firmemente presas a um substrato sólido. O caso da Microscopia de Força Atômica (AFM) é o exemplo mais evidente. O Micro.scópio de Força Atômica (AFM) permite a- varredura de amostras· fixadas sobre suportes sólidos ao nível de. dimensões atômicas. 0s sinais detectados pelo cantriléver flexivel, após adequada ampliação, permitem a
análise topográfica da amostra examinada. Portanto, a
Microscopia de Força Atômica (AFM) permite o exame de
amostras còm dimensões nanoscópicas, isto é, entre 1 e 200
nm. Quando a.varredura é executada em uma solução aquosa, é
também possível analisar amostras biológicas sob condiçcfes
fisiológicas. Entretanto, para a obtenção de imagens
correspondentes à realidade é obrigatório que a amostra
biológica examinada seja uniformemente fixada a um suporte,
de modo que a ponta do microscópio não possa movimentá-la
durante a execução da ·varredura. Além disso, a amostra
deve, preferivelmente, ser organizada na forma de uma
camada molecular.
Os métodos atualmente conhecidos para a
preparação de camadas monomólecüláres imobilizadas sobre um
substrato hidrõfóbico, que exploram interações
hidrofóbicas, implicam no uso .de moléculas, naturalmente
hidrofóbicas, consultar C artigo de .Dawn S.Y. Yeo et al.,
"Combinatorial Chemistry &. High Throughput Screening" 2004,
Vol. 7, No. 3, páginas 213-221, ou o uso de proteínas
solúveis em água que adquirem propriedades: hidrofóbicas de
mudanças de conformação devido à temperatura, concentração
iônica ou modificação de pH, consultar os artigos de Kapila
Wadu-Mesthrige .et al., "Journal Scanning Microscopy", 2000,
Vol 22, páginas 338-388; Hyun J. et ai., "J. Am.. Chem. Soe"
2004, 126(23.), páginas 7330-7335. Esses métodos não possuem
seletividadé, uma vez que as modificações físico-químícas
podem também envolver o sítio ativo da proteína, com conseqüente perda da atividade biológica natural.
Alternativamente, umá- proteína hidrofobizada pode ser preparada através de processos de engenharia genética de proteínas solúveis em. água, que, entretanto, são bastante complexos e não garantem a conservação da atividade original, consultar os artigos de Hyun J. et al., (mencionado acima) ou de C. Tranchant et al., "Rev. Neurol..
(Paris)" 1996, 152' (3), páginas 153-157.
Devido a essas razões, até agora tem sido possível examinar com sucesso somente ás proteínas de membrana, que são espontaneamente fixadas a uma. camada dupla de lipídeo ou a complexos moleculares tendo altás dimensões. Imagens de proteínas solúveis não. têm sido relatadas. ·
Portanto, o escopo da presente invenção é aquele de prover novos métodos para tornar hidrofóbicas proteínas funcionais .hidrofílicas solúveis em água, sem que Sseja afetada a função biológica natural da proteína, e meios que possibilitem a varredura, formação de imagem e manipulação das proteínas solúveis em água.
Resumo da Invenção
A présente invenção se refere a métodos para a conversão dé proteínas funcionais hidrofílicas, solúveis em água. (HPiAP) em proteínas hidrofóbicas (HPoAP)", ao mesmo tempo em que 'se mantém'a "sua. atividade biológica -orig"inal.
Os métodos implicam em'modificações químicas, assimétricas das proteínas hidrofílicas, isto é, introduzindo modificações químicas sobre os resíduos superficiais aminoácidos situados numa parte- da molécula mais distante ou oposta à parte responsável pela função.da proteína. Este resultado é alcançado através da execução da reação com reagentes de "hidrofobização" em fase heterogênea ou em uma mistura de solventes de diferentés polaridades.
A presente invenção se fundamenta no conhecimento de que a solubilidade em água das proteínas devido ao equilíbrio do número de resíduos aminoácidos hidrofóbicos·e hidrofílicos que ocorrem na .sua superfície. F>m geral, nas proteínas ativas, como as enzimas, uma 'área estendida de modo- variável da- superfície é delegada- para interagir com' pequenas moléculas·solúveis em água de diferente natureza, notadamente, substratos, inibidores, cofatores e outros, isto é, o sítio ativo é principalmente hidrofílico,
O método da presente invenção explora a distribuição assimétrica da polaridade para direcionar a reação de modificação química necessária para· trocaria, natureza da proteína na área espaçada, a partir do sítio ativo ou de modo oposto a esse sítio ativo.
As proteínas - funcionais, "hidrofobizadas" assim obtidas são depois imobilizadas ou .presas sobre suportes sólidos hidrofóbicos, através de interações hidrofóbicas, a fim de se obter camadas monomoleculares orientadas -de proteína ativa.
O termo "orientada" usado na presente invenção significa que :as proteínas' imobilizadas são substancial e totalmente orientadas com a parte hidrofobizada da molécula fixada à superfície do substrato,· enquanto o sitio ativo livre se dispõe mais distante do ponto de fixação.. 0 termo não significa que as moléculas imobilizadas mostram todas a mesma orientação espacial, que, ao contrário, é aleatória.
0 termo "camada monomolecular" significa que as camadas obtidas são ria maioria das vezes é preferivelmente "monomoleculares", embora a formação de áreas limitadas indesejadas de camadas multimoleculares nem sempre possa ser evitada.
Conseqüentemente, um primeiro objetivo da invenção é um método de preparação dê uma proteína ativa hidrofóbica ou parcialmente hidrofóbica, conforme divulgado em quaisquer das reivindicações 1 a 6.
Um segundo objetivo d.a invenção é tornar uma proteína ativa naturalmente, hidrofílica em, uma proteína ativa hidrofóbica, conforme divulgado nas reivindicações 7. ou 8.
Um terceirosobjetivo da invenção é um método de preparação de um dispositivo, conforme divulgado nas reivindicações 9 e 11, e o dispositivo assim obtido.
Outros objetivos da invenção são referentes a biorreatores ou biossensores compreendendo o dispositivo.
Ainda outros objetivos da invenção são os ensaios, para -pesquisar a conformação de uma proteína solúvel em água ou a conformação de seu complexo com um ligando ou a interação entre a proteína e um ligando ou candidato, a ligando da mesma, conforme divulgado nas reivindicações 15 O objetivo final da invenção é o uso do biorreator ou do biossensor como suporte reativo sólido pa,ra a preparação de microssistemas, para análise de diagnóstico, análise genética ou imunológica ou para 5 manipulação mecânica de proteína ou material genético, ou para o tratamento de líquidos ou gases.
Existem diversos fatores normalmente capazes de influenciar as funções de uma proteína ativa como uma enzima. Por exemplo, os efeitos de conformação quando ocorrem modificações - de conformação ou de distribuição cfe carga; efeitos esféricos, quando, a interação do substrato com á enzima é afetada pelo impedimento estérico; efeitos de' posicionamento, correlacionados à natureza química do material de suporte e ao microambiente modificado.
Portanto, é 5 sabido da existência. de uma expectativá a priori de que uma reação de hidrofobização pudesse modificar a cinética é outras propriedades áa proteína ativa, por exemplo, afetando a atividade específica da enzima.
Entretanto, os resultados relatados nos exemplos mostraram que o método reivindicado elimina ou minimiza essa esperada' perda de atividade.
Breve Desdrição das Figuras
Figura 1. - A figura ilustra o desenvolvimento do tempo de 0 hora ã 6 hOras, de hidrólise de ΒΑΡΝΑ, provocado,pela solução de tripsina/cplestéril "imobilizada em uma placa de silício. Figura 2 -A figura relata a topografia da solução de tripsina/colesteril hidrofobicamente fixada em- solução aquosa a uma placa de silício (área de varredura' de. 150 nm2) . O quadro (A) mostra a imagem de uma área de· 1 μm; o quadro (B) mostra a imagem da área de 150 nm; o quadro (C) representa a seção transversal da camada monomolecular. Figura 3 - A figura relata a topografia da Solução de tripsina/colesteril fixada em solução aquosa a uma placa de sílica (área de varredura de 50 nm2) . O quadro (A) -mostra a imagem da área de 50 nm; o quadro (B) mostra a seção transversal da camada monomolecular.
Figura 4 - A figura, relata a topografia da" solução de tripsina/colesteril fixada em solução aquosa a uma placa de sílica. (área de varredura de 24 nm2) . 0 quadro (A)·mostra a imagem' da . área de 24 . nm; o quadro, (B) mostra a seção transversal da camada monomolecular.
Figura 5 - A- figura re.lata o espectro de massa de água destilada (quadro superior) passada pelo dispositivo de ponta tríptica funcionalizado: os picos de autólise da tripsina estão ausentes; e tripsina em solução ."(quadro inferior). Os pico-s da autólise sãò claramente evidentes.
Figura 6 - A -figura ilustra o espectro de massa de Albumina de Soro Humano (HSA) (quadro superior) digerido por 10 minutos pelo dispositivo de ponta tríptica funcionalizado: os picos de autólise estão ausentès enquanto os picos de HSA são totalmente presentes (quadro inferior). O HSA foi digerido durante a noite pela tripsina em solução: o -círculo mostra um pico de autólise. Figura 7 - A figura mostra a cinética de esvaziamento de quartzo induzida pelo bloqueio de moléculas de tripsina modificada de acordo com a estratégia II da invenção. A superfície do quartzo é coberta por uma lâmina de ouro bastante minúscula, tornada hidrofóbica por meio de tiocolesteróis.
Descrição Detalhada da Invenção
As proteínas ativas hidrófílicas (HPiAP) de acordo com a presente invenção São quaisquer proteínas solúveis em água selecionadas do grupo que consiste de enzimas, hormônios, receptores, antígenos, anticorpos, alérgenos, proteínas imunorreativas, parceiros de afinidade e quaisquer derivados, fragmentos e complexos funcionalmente equivalentes dos mesmos. Em particular, a proteína ativa pode ser qualquer enzima na sua forma natural, selecionada das classes gerais de oxidorredutases, transferases, hidrolases, liases, isomerases e ligases. Isto é, quaisquer das enzimas atualmente em uso na pesquisa básica e aplicada e com aplicação industrial, tais como, tripsina, aldolase de músculos, amilase, lipase, colagenase ou elastase.
Normalmente, .na prática da modificação química de proteínas, tanto a proteína, como os reagentes se encontram em solução aquosa (reação homogênea). Entretanto, duas restrições principais caracterizam a presente invenção: a proteína modifiçada, por exemplo, uma enzima, deve manter a suá atividade e os reagentes são pouco ou completamente insolúveis em água
Portanto, a fim de converter a proteína ativa hidrofilica em uma proteína hidrofóbica ou parcialmente hidrofóbica, ao mesmo tempo em que se mantém a sua funcionalidade, foram desenvolvidas duas diferentes estratégias, ambas objetivadas nas partes de "hidrofobização" da proteína mais distante ou oposta ao sítio-ativo, que deve ser conservada na sua confòrmaçã.o e natureza nativa.
Estratégia I
Uma primeira estratégia implica em um sistema heterogêneo sólido/líquido. O sítio ativo e a área envolvente é reversivelmente protegido pela- fixação do mesmo a uma matriz sólida, mediante cromatografia de afinidade. A fase sólida contém na sua superfície, um ligando específico para o sítio ativo da proteína funcional. A étapa de "hidrofobização" é então realizada na proteína imobilizada.O reagente é dissolvido em uma solução aquosa tamponada usada como eluente, isto é, a fase líquida. Desse modo, a molécula de proteína é forçada a expor ao eluente apenas- aquela parte distante do sítio ativo.
Qualquer matriz de afinidade comercialmente disponível adequada para cromatograf ia pode ser usada de- acordo com a invenção, pór exemplo, resinas à ,base de. dextrano -ou à base de -celulose, tal como, fosfocelulose. Mater-iais conhecidos são adaptados "com grupos funcionais adequados para ligação de qualquer tipo de. ligando, tais como, análogos de substratos, inibidores reversíveis, cofatores. Portanto, a preparação da fase sólida de afinidade e das condições para. introdução da, proteína hidrofílica e subseqüente elução da proteína hidrofóbizada são bem conhecidas para um especialista versado na técnica Á elução é normalmente realizada mediante elução por afinidade.
De acordo com o presente método, as moléculas acidentalmente modificadas nos resíduos aminoácidos de sítio ativo'resultam separadas na etapa de elução.
Estratégia II
Uma. segunda estratégia implica numa mistura líquido/líquido, obtida mediante uso da proteína hidrofílica. dissolvida em um solvente polar (normalmente água), com o reagente hidrofóbico dissolvido em um solvente menos polar, pelo menos parcialmente miscível em1 água. De acordo com as diferenças de polaridade entre os solventes e com os volumes envolvidos, são possíveis' dois regimes de reação:
a) os dois solventes são parcialmente imiscíveis duas fases microscópicas sãó geradas, e a reação entre a proteína hidrofílica - e o reagente hidrofóbico se realiza na interface entre as duas fases. Nessa situação, a proteína tende a orientar o seu sítio ativo na direção da fase polar, uma vez que o sítio ativo e suas vizinhanças constituem a região mais. polar da superfície da proteína. Os resíduos envolvidos na reação de hidrofobização são, portanto, localizados· distantes do sitio ativo, dessa forma, preservando a atividade da proteína. Essa modalidade da invenção é menos preferida pelo fato de que a proteína tende a se precipitar na interface, com resultante diminuição do rendimento final.
b) no regime preferido, os dois solventes são miscíveis. Nesse caso, são criados diferentes microambientes de solvatação na mistura, a nível molecular. A porção hidrofóbica das moléculas reagentes é insolúvel no solvente polar e, depois, na mistura, é solvatada pelãs moléculas do solvente menos polar. Por oütro lado as moléculas de, solvente polar estão envolvendo o lado mais hidrofílico das* moléculas de proteína. A reação de. "hidrofobização" segue um gradieinte de polaridade: a região mais polar do reàgente
hidrofóbico tende a. reagir com a região' menos polar- da- proteína (isto é a região distante do sítio ativo). Mesmo nesse caso, a probabilidade de um envolvimento dos resíduos pertencentes, à região de sítio ativo é bastante baixa e, portanto, a atividade é preservada.
Para ainda garantir a preservação de atividade, opcionalmente, é possível se- proteger os aminoácidos responsáveis pela atividade ou - engajados no seu reconhecimento e interação-e os processos catalíticos são aperfeiçoados mediante dissolução conjunta na mesma fase aquosa que protege as moléculas, tais cómo, substratos, análogos de substrato e/ou inibidores competitivos.. -
Após a reação,'a proteína quimicamente modificada pode ser adicionalmente purifiqada mediante cromatografia por interação hidrofóbica ou por meio de diálise ou por outros métodos de purificação.
O termo "solvente polar ou solução aquosa" significa qualquer solução em água, neutra para a função da proteína.
Pelo termo "solvente menos polar" é significado qualquer solvente bem conhecido, potencialmente solúvel ou insolúvel em água, por exemplo, alcoóis alquílicos, alquilaminãs, alcanos halogenados, etc.
Modificação Química
Diversos resíduos aminoácidos possuem grupos funcionais na cadeia lateral, tais como, -NH2, -OH, -SH e, portanto, são adequados ,para reação com o reagente de hidrofobização tais resíduos aminoá.cidos incluem Thr, Met, Trp, Lys, Arg, Asp, Cys, Glu, His," Ser, Tyr. Dessa lista, os aminoácidos tendo grupos amida na ca*deia lateral e7 cadeias Iateraisi de hidrocarbonetos e glicina foram excluídos,pelo fato de sua· concentração relativamente baixa nas superfícies expostas da··proteína e, ainda mais importante, pelo fato de sua cadeia lateral hidrofóbica não-reativa. Portanto é previsível um grande número de possíveis modificações.
Qualquer modificação química causada por reagentes qyímicos capazes de converter um. ou mais resíduos amino ácidps hidrofílicos em resíduos hidrofóbicos, ou capaz de fixar uma grande porção altamente, hidrofóbica a um adequado aminoácido polar, pode ser usada para converter a proteína hidrofilica solúvel em água em uma proteína hidrofóbica. Essa conversão pode ocorrer em resíduos aminoácidos idênticos ou diferentes.
Adequados reagentes- de hidrofobização são os compostos químicos capazes de executar qualquer modificação covalente, incluindo, mas não sendo limitado a O-, Ν-, S- alquilação, 0-, N-, -S-acilaçãò, ligação diazo, formação de ligação de peptídeo, arilação, formação de base de Schiff e similares Exemplos, desses reagentes incluem os anidridos. de acila, cloreto de acilã, compostos diazo, aldeídos, cetonas, mas, tambem, compostos capazes de integrar grandes porções lipofílicas, tais como, cloroformiato de colêsteril ou equivalentes.
A resultante proteína modificadâ é anfipática com maior hidrofobia que 'a forma' natural, sendo caracterizada pela distribuição assimétrica de resíduos não polares/polares e mantendo sua solubilidade em água e sua funcionalidade original, uma vez que 'o sítio ativo foi protegido no curso da reação.
De acordo com ambas as estratégias, o método pode compreender 'uma etapa adicional, de separação das proteínas ativas hidrofobizadas da proteína inativada acidentalmente. Qualquer procedimento de purificação de proteína que explora a afinidade da proteína por um substrato específico ou a maior hidrofobicidade das proteínas modificadas, pode ser usado para purificar o produto ativo. Tais procedimentos incluem a cromatografia por afinidade e os pròcedimentos_ de elução por. afinidade ou lavagem com água das moléculas de proteína diretamente sobre o substrato de AFM hidrofóbico.
Existem diversos fato-res normalmente capazes de influenciar as funções de uma proteína ativa como uma enzima. Por exemplo, os efeitos de conformação guando ocorrem modificações de conformação ou modificações da distribuição de carga efeitos estéricos guando a interação do substrato com a enzima é afetada pelo impedimento estérico efeitos de divisão, correlacionados à nature-za química do material de suporte e ao microambiente "modificado.
Portanto, foi criada a expectativa de que a hidrofobização de acordo com a presente invenção pudesse modificar a cinética e outras propriedades da proteína ativa, por exemplo, uma diminuição da atividade específica da enzima.
A contrário, os resultados relatados adiante nos exemplos mostram que o. presente método, reivindicado elimina ou minimiza a expectativa de perda de atividade. mobilização
As proteínas ativas hidrofobizadas obtidas de acordo com a presente invenção são adequadas para se ligarem a um substrato hidrofóbico, através de interações hidrofóbicas. Estas são resultantes de uma construção de camada ordenada,- preferivelmente, uma camada monomolecular de proteína sobré a superfície do substrato. Além disso, as forças hidrofóbicas se configuram como sendo suficientemente fortes para permitir a lavagem com água das moléculas não modificadas, dessa forma, disponibilizando meios de purificação altamente eficientes.
Adequados substratos hidrofóbicos incluem qualquer suporte naturalmente hidrofóbico ou tornado hidrofóbico. por derivatização. Por exemplo, o substrato pode sér tornádo hidrofóbico mediante revestimento do mesmo com lipideos funcionalizados, tais como, lipideos tiolados, por exemplo, tiocolesteróis ou outros lipideos equivalentes' capazes · de reagir com a superfície do substrato. Os substratos incluem sem que seja a isso limitado, polímeros naturais, tal como, celulose ou polímeros sintéticos,tal como, PVC, poli(met)acrilatos, náilon, polietileno, teflon, materiais de 'carbono, silício, vidro, resinas, partículas de met'al ou folhas de metal, papel e similares. O suporte pode se apresentar na forma folheados, placas, lâminas, folhas, tubos, fibras, partículas, granulados, pós (de tamanho macro, micro ou nano) e podem apresentar uma base atômica, superfície lisa ou superfície áspera.
O complexo . feito pelas proteínas ativas hidro-fobizadas, imobilizadas' sobre o substrato hidrofóbico ou hidrofobizado é um dispositivo adequado para a preparação de biorreatores ou biossensores.Estes dispositivos se apresentam na forma de folheados, placas, lâminas, folhas, tubos, partículas, fibras,granulados, pós (dê tamanho macro, micro"ou nano) -"ativados".
Os dispositivos da invenção são instalados em biorreatorès ou biossensoresPor exemplo, os granulados de partículas ativadas podem ser usados para a construção de cartuchos" empacotados em uma bancada de laboratório comum, ou para a construção de filtros empacotados em um envoltório ou em uma coluna. Placas, lâminas e folhas podem ser montadas em kits, para microssistemas de análise, de diagnóstico, análise genética, análise iinunológica ou para manipulação mecânica da proteína ou material genético;
Os presentes resultados mostram que as moléculas derivatizadas e fixadas .não. diferem de modo significativo, mas, sim, estruturalmente e funcionalmente das moléculas nativas. Os éxemplos mostram que as eijzimas mantêm a maior par/te de sua atividade nativa.
As observações de AFM e dos ensaios de atividade enzimática das placas de silica revestidas de enzima mostram, que a conformação ativa é retida nas moléculas aderidas, enquanto que, o aspecto homogêneo na varredura de AFM, junto com as dimensões -calculadas da proteína modificada, indicam que as moléculas inativas, ou erroneamente modificadas foram lavadas fora (ver as figuras 1, 2, 3 e 4).
Ainda mais importante é o fato de que as interações hidrofóbicas são tão fortes e estáveis que permitem um repetido uso do suporte revestido de proteína em um meio aquoso, por exemplo, ensaios enzimáticos repetidos.
Na medida em qué as moléculas fixadas no suporte hidrofóbico são quimicamente modifiçadas em uma região que não contém o sitio ativo, elas são, em meio aquoso, totalmente orientadás com o sitio ativo que reveste-a fase aquosa. Esta é uma condição favorável para - pesquisar em resolução atômica o mecanismo de interação da proteíria ativa com diversas pequenas moléculas, tais como, substratos, análogos de substratos, efetores alostéricos, inibidores, anticorpos, etc.
Além disso, uma vez que cada molécula de proteína é estavelmente fixada ao suporte, esta conformação fixa previne ocasionais contatos, entre as moléculas, assim, evitando indesejáveis reações prejudiciais. Portanto, contatos acidentais com moléculas (isto é, substratos, inibidores", efetores,, etc.) que ocorrem na solução aquosa estão sob controle experimental. Essas condições tornam a camada monomolecular ordenada de proteínas ativas oriêntadas, que suportam biorreatores ou bíossensores, adequada para ser usada em medicina, industrialmeríte e em ambiente de química analítica. A presente invenção proporciona um fácil procedimento para a fabricação de táis biossensores, usando as diversas centenas de enzimas solúveis em água ou outras proteínas ativas atualmente em uso, em qualquer campo de biologia apliçadar.
A invenção também se refere a ensaios que fazem uso dos biorreatores e biossensorés reivindicados, para pesquisar a conformação de uma proteína ativa solúvel em água ou a conformação, de seu complexo com um ligando, mediante formação de imagem, de camada monomolecular de proteína imobilizada orientada e/ou seus complexos por meio de Microscopia de Força Atômica (AFM). Esse- tipo de ensaio é particularmente útil para pesquisar a interação entre uma ptoteína solúvel em água e candidatos a ligandos, a fim de identificar novos ligandos. As proteínas imobilizadas da invenção são também adequadas como suporte reativo sólido para a preparação de microssistemas destinados à análise de diagnóstico, análise genética, análise imunológica ou para manipulação mecânica de proteína ou material genético.
Finalmente, o protocolo de dçrivatização pode ser modificado a fim de se obter moléculas mais intensamente "hidrofobizadas" ou moléculas modificadas aleatoriamente em diferentes regiões superficiais, incluindo o sítio ativo. Um grande número de moléculas modificadas pode, dessa forma, ser obtido. No meiõ aquoso, todas as moléculas irão espontaneamente se dispor com uma orientação aleatória, de modo a formar uma camada sobre o substrato hidrofóbico. O uso ·contemporâneo de imagem de forma ativa e de imagens múltiplas orientadas diferentemente da mesma rrtolécula irá permitir a reconstrução computadorizada precisa da imagem· da molécula original sob investigação.
A invenção é ainda descrita em maiores detalhes nos exemplos seguintes, os quais são simplesmente idealizados para descrever modalidades específicas da invenção, sem qualquer limitação do seu escopo de proteção.
Os Exemplos 1 e 2 descrevem as duas estratégias gerais idealizadas pela invenção, para preparação do suporte revestido de proteína reivindicado, para aplicações de bioengenharia, em solução aquosa. Duas enzimas nativas solúveis em água, a saber, al,dolase de músculos e tripsina foram covalentemente modificadas in vitro, mediante álquilação de grupos de amina primária,· para se obter moléculas anfipáticas.
Exemplo 1 (Estratégia I)
A HPiAP usada foi aldolage de.músculo de coelho·e o agente de alquilação foi anidrido acético. A derivatização foi realizada em uma fase heterogênea. A HPiAP foi absorvida por meio de cromatografia de afinidade em uma coluna de fosfocelulose (ahálorga ao substrato de 6- bisfosfato de frutose-1), reagida cdm â solução aquosa de percolàção do anidrido acético e depois eluida com o substrato de 6-bisfosfato de frutose-1. A titulação dos resíduos de lisila indicou que 15 resíduos, por molécula- foram -modilficados. A HPoAP recupèrada resultou ativa com. parâmetros çinéticos não-variados. A atividade da aldolase foi testada de acordo com o método de Racker, usando 5- bisfosfató d'e frutose-1 como substrato e fosfato de gliceraldeído désidrogeriase e triosofosfato isome:rase como enzimas aux-iliares (ver a Tabela I).
Tabela I
<table>table see original document page 20</column></row><table> Exemplo 2 (Estratégia II)
A HPiAP foi a tripsina e o agente de alquilação foi cloroformiato de colesteril em solução de -propanol. A solução aquosa de tripsina foi misturada com a solução de propanol de cloroformiato de colesteril sob vigorosa agitação durante 30 minutos. Após o término da reação, a tripsina Hidxofobizada foi coletada.
Após a reação, a proteína quimicamente modificada foi purificada por meio de cromatografia de interação hidrofóbica, usando resina de fenila HS, e eluindo com sulfato de amônio 0-30 mM em um tampão de Gly-HCl 20 mM. A fração que constitui o pico principal da proteína e. de atividade foi usada para experimentos dé imobilização. Após a derivatização, a atividade - da tripsina foi téstada em um pH 8, usando Na-benzoil-DL-arginina-p-nitroanilida (ΒΑΡΝΑ) como substrato sintético. A HPoAP ' mostra uma completa atividade, parâmetros cinéticos não-variados e resíduos de 3-lisila modificados por molécula (ver a Tabela II, abaixo).
Uma quantidade de sílica gel foi imersa na solução de tripsina/colesteril, repetidamente lavada com água, imersa ,na solução de substrato sintético tamponadá com BAPNA em pH 8, e incubadav à temperatura de 37°C pelo tempo relatado. Uma placa de silício imersa ná mesma solução foi usada como controle. A aparência da cor amarela indica que a solução de tripsina/colesteril fixada manteve a atividade proteolítica após diversas lavagens com água (ver a figura 1). A enzima imobilizada foi ativa durante meses, conforme ,testado por métodos espectrofotométricos, usando BAPNA (Nòí-benzoil-DL-arginina-p-nitroanilida) como substrato, indicando uma ligação' hidrofóbica. fortemente suportada entre a molécula de enzima antipática e a placa de silica hidrofóbica.
A placa- de silica revestida com a»soluçãov de tripsina/colesteril foi varrida por AFM - em 10-8 N e 1000nm/s. A formação da imagem é relatada nas figuras 2, 3 e 4.
Tabela II
<table>table see original document page 22</column></row><table>
Exemplo 3
A enzima Adenosina Deaminase foi hidrofobizada de acordo com a estratégia II de liquido/liquido da presente invenção. 0 agente de hidrofobização foi representado por cloroformiato de .colesteril dissolvido em 'solução de propanol.
Exemplo 4
A enzima Citosina Deáminase foi hidrof obizada. de acordo com a estratégia II de liquido/liquido da presente invenção. 0 esquema reacional foi similar ao do Exemplo 2. Exemplo 5
A enzima- Glutâmico-Oxaloacético Transaminase foi hidrofobizada de acordo com a estratégia I de liquido/sólido da presente invenção, usando resinas ligadas a fosfato de piridoxal como a fase sólida de cromatografia de afinidade.
Exemplo 6
A enzima Alanina-Piruvato Transaminase foi hidrofobizada de acordo com a estratégia I de liquido/sólido da presente invenção, -usando resinas ligadas a fosfato de. piridoxal.como a fase sólida de·cromatografia de afinidade
Exemplo 7
A enzima Málica Desidrogènase foi ·hidrofobizada de acordo com á estratégia I de liquido/sólido da presente invenção, usando resinas· ligadas a nicotinamida como a fase sólida de cromatograf ia de afinidáde.
Exemplo 8
A enzima Álcool Desidrogenase foi hidrofobizada de acordo com a estratégia I - de liquido/sólido da presente invenção, usando resinas ligadas a nicotinamida como a fase sólidá de cromatografi-a de afinidade. Exemplo 9
A enzima Lipase foi hidrofobizada de acordo com a estratégia-I de liquido/sólido da presente invenção, usando resinas ligadasa acetato de propionila como a fase sólida de cromatografia de afinidade.
Exemplos de Aplicação
Exemplo 10,
Um biorreator de utilidade para digerir proteínas em solução é produzido mediante derivatização de tripsina bovina, còmo no Exemplo 2 e bloqueando a mesma em grânulos de PVC- (cloreto de polivinila). Esses grânulos são usados para construir um cartucho empacotado em uma bancada de laboratório comum. Esse dispositivo é capaz de digerir a proteína em solução, com um forte aumento dos desempenhos a reação de digestão. Em particular, comparado com o protocolo clássico de digestão de proteína" mediante adição di eta de tripsina na solução, ocorrem três melhorias principais obtidas através do uso do dispositivo fünçionalizado
a) esse dispositivo não líber as. moléculas de tripsina na solução;
b) esse dispositivo reduz (ou até elimina) fragmentos de autólise de tripsina (ver as figuras 5 e 6);
c) o tempo de digestão requerido para uma satisfatória análise de proteína através de espeçtrometria de massa é reduzido do pèríodo da noite do protocolo de digestão de solução clássica para apertas alguns minutos (de 1 até 10 minutos, dependendo da concentração da proteína · a ser digerida) (ver a figura 6).
Exemplo 11
Um biorreator é construído, de modo análogo ao descrito no Exemplo 10, em que diversos cartuchos de pó de
PVC que se ligam a diferentes enzimas hidrolíticas hidrofobizadas são unidos em uma tubulação. Esse dispositivo é de utilidade para purificar águas residuais de atividades industriais. As enzimas específicas usadas nas trocas de cartuchos dependem dá composição da água residual a ser purificada; por exemplo, para purificar uma água. residual de padaria, são usados os cartuchos ativados com amilâse e tripsina. Para purificar águas residuais de curtumes, são usados cartuchos ativados com lipase, colagenase e elastase.
Exemplo 12
Um biossensor é produzido, em que um disco de quartzo é coberto por uma superfície minúscula de ouro. Essa superfície foi hidrofobizada mediante cobertura da mesma com uma camada de tiocolesteróis, que reage espontaneamente com o ouro, produzi-ndo uma camada ordenada. Essa superfície hidrofobizada.é adequada para o bloqueio de proteínas hidrofobizadas obtidas pelas duas estratégias propostas. O bloqueio da proteína pode sér medido médiante avaliação da quantidade do esvaziamento induzida pela massa da proteína na freqüência de oscilação espontânea de quartzo (ver um exemplo na figura 7). A proteína ativa, bloqueada pode ser usada como sonda para qualquer interação específica de proteína-proteína. A ligação entre a sonda e o fator específico para o/reconhecimento pode ser lida como um adicional esvaziamento na oscilação do quartzo.

Claims (27)

1. Método de preparação de uma proteína ativa hidrofóbica òu parcialmente hidrofóbica, compreendendo as etapas de reagir uma proteína ativa solúvel em água çom um reagente capaz de converter um ou mais resíduos aminoácidos hidrofílicos em resíduos hidrofóbicos, caracterizado pelo fato de que o sítio ativo responsável pela atividade da proteína é protegido mediante operação da reação de hidrofobização em uma mistura homogênea dé solventes de diferentes polaridades.
2. Método, de acordo çom a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de compreender as seguintes etapas: dissolver a proteína ativa solúvel em água em uma solução aquosa; - dissolver o reagente em um solvente de menor pola-ridade, pelo menos parcialmente miscível em água; - preparar uma mistura homogênea polar/menos polar; - reagir a proteína com o reagente; e - recuperar- a proteína ativa hidrofobizada".
3. Método, de acordo /com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de compreender" ainda,a dissolução na solução aquosa,de um ligando reversível específico para o sítio ativo da proteína.
4. Método, de acordo com quaisquer das - reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o reagente capaz de transformar resíduos aminoácidos hidrofílicos em resíduos hidrofóbicos é selecionado do grupo que consiste de compostos de alquilação, acilação, arilação, compostos' diazo, compostos"formadores de ligação de peptídeo, formadores de base de Schiff ou compostos capazes de introduzir uma porção hidrofóbica.
5. Método, de acordo com quaisquer dás reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que a proteína ativa solúvel em água é selecionada do grupo que consiste, de enzimas, hormônios, receptores, antígenos, anticorpos, alérgenos, proteínas imunorreativas, parceiros de afinidade e quaisquer derivados e fragmentos e complexos funcionalmente equivalentes dos mesmos.
6. Método, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que a proteína ativa solúvel em água, é selecionada do grupo que consiste de aldolase de músculoã, tripsina, amilase, lipase, colagenase ou elastase.
7. Proteína ativa hidrofóbizada, a qual pode ser obtida pelo método de acordo com quaisquer, das reivindicações 1,a,6, caracterizada pelo fato de que possui em uma parte da proteína mais distante ou oposta à região responsável pela atividade um ou mais resíduos aminoácidos hidrofílicos convertidos em resíduos hidrofóbicos.
8. Proteína ativa hid^ofobizada, de acordo, com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de· apresentar um ou mais - resíduos aminoácidos hidrofílicos convertidos em resíduos aminoácidos de colesteril.
9. Método de .preparação de um dispositivo consistindo de uma camada monòmolecular de proteína ativa orientada, imobilizada sobre um suporte sólido, caracterizado pelo fato de compreender a etapa de contatar a proteína hidrofobizada conforme as reivindicações 7 ou 8 com um suporte- sólido hidrofóbico.
10. Método, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o suporte sólido hidrofóbico é formado de polímeros naturais ou sintéticos, materiais de carbono, silício, metal, resinas, todos,, opcionalmente derivatizados, dé modo a torná-los hidrofóbicos.
11. Método, de acordo com as reivindicações 9 ou -10, caracterizado pelo fato de que o suporte sólido hidrofóbico se ·apresénta na forma de folheados, placas, lâminas, folh,as, tubos,fibras, partículas, granulãdos e pós.
12. Dispositivo, caracterizado pelo fato de poder ser obtido pelo método de acordo com quaisquer d,as reivindicações 9 a 11.
13. Dispositivo, cie acordo com a reivindicação -12, caracterizado pelo fato de se apresentar na forma de um cartucho embalado.em uma bancada de laboratório - ou na-forma de um filtro -ou na. forma de um suporte de' microssistema.
14. Biorreãtor ou biossénsor, caracterizado pelo fato de compreender ou consistir do dispositivo* de acordo com as reivindicações 12 ou 13.
15. Tecnologia para pesquisar a'interação entre uma proteína solúvel em água . e ,um ligando ou canelidato a ligando, caracterizada pelo fato de compreender as etapas de: - preparar um dispositivo de acordo com as reivindicações -12 ou 13; - contatar a proteína imobilizada com o ligando ou candidato a ligando; e - formar a iirtagem da proteína e/ou de seu complexo friediante Microscopia de Força Atômica (AFM).
16. Tecnologia para pesquisar a conformação de um - material de proteína solúvel em água, caracterizada- pelo fato de compreender as etapas de: - converter o material de proteína em um material aleatoriamente hidrofobizado; - contatar o material hidrofobizado com um suporte sólido hidrofóbico, de modo a obter umâ camada monomolecular de material de proteína orientada imobilizado aleatoriamente; - formar a imagem do material mediante Microscopia de Força Atômica (AFM); reconstruir a imagem do material original mediante auxílio de computador.
17. Uso do dispositivo de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o dito uso se destina à preparação de microssistemas para aáálise de diagnóstico, análise genética, análise imunológica ou para manipulação mecânica da_proteína ou material genético.
18. Hso do dispositivo de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que o dito uso" se destina à preparação de' biorre.atores para ' o tratamento de líquidos ou-gases.
19. Método de preparação de um dispositivo, o qual consiste de uma camada, monomolecular de proteína ativa orientada, imobilizada sóbre um suporte sólido, compreendendo uma primeira etapa de preparar üma proteína ativa hidrofóbica ou parcialmente hidrofóbica mediante reação de uma. proteína ativa solúvel em água com um reagente capaz de converter um ou mais resíduos aminoácidos hidrofilicos em resíduos hidrofóbicos, caracterizado pelo fato de que o sítio ativo responsável pela atividade da proteína é protegido mediante operação da reação de hidrofobização na fase heterogênea, e uma segunda etapa-de contatar a proteína hidrofobizada assim obtida, com um suporte sólido hidrofóbico.
20. Método de acordo- com a reivindicação 19, caracterizado peló fato de que a reação de hidrofobização compreende as etapas ,de: - imobil/izar a proteína ativa solúvel em água através de seu sítio ativo sobre uma matriz de afinidade; - reagir a proteína imobilizada com o reagente; e - eluir a proteína ativa hidrofobizada da matriz.
21. Métodó de acordo com quaisquer das reivindicações 19 ou 20, caracterizado pelo fato de que. o reagente capáz de transformar os resíduos aminoácidos hidrofilicos em resíduos ahidrofóbicos é selecionado", do grupo que consiste de compostos de alquilação, acilação, arilação, compostos diazo, compostos- formadores de ligação de peptídeo, formadores de base de Schiff ou compostos capazes de/introduzir uma porção hidrofóbica.
22. Método, de acordo com qüaisquer das reivindicações 19 a 21, caracterizado pelo fato de que- a proteína ativa solúvel em água é selecionada do grupo que consiste de enzimas, hormônios, receptores, antígenos, anticorpos, alérgenos, proteínas imunorreativas, parceiros de afinidade e quaisquer derivados, e fragmentos, e complexos funcionalmente equivalentes dos mesmos.
23. Método de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que a proteína ativa solúvel em água é selecionada do grupo que consiste de aldolase de músculos tripsina amilase lipase colagenase ou elastase.
24. Método de acordo com as reivindicações 19 a -23, caracterizado pelo fato de que. o suporte, sólido hidrofpbico é formado de polímeros naturais ou sintéticos,'" materiais- de carbono, silício, metal resinas todos, opcionalmente derivatizados, de modo a -torná-los hidrofóbicos.
25. Método de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de que o suporte sólido hidrofóbico se apresenta na- forma- de folheados placas lâminas, folhas tubos fibras partículas granulados e pós.
26. Dispositivo, caracterizado pelo fato de poder ser obtido pelo método dè acordo com quaisquer das reivindicações 19 a 25.
27. Dispositivo, de acordo com a reivindicação -26, caracterizado pelo fato de se apresentar na forma de um cartucho embalado em uma»bancada de laboratório ou.na forma de um filtro ou na forma d© um suporte de microssistema.
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