BRPI0618564A2 - métodos para predição e prognóstico de cáncer e para monitoração de terapia contra cáncer - Google Patents

Abstract

MéTODOS PARA PREDIçãO E PROGNóSTICO DE CáNCER E PARA MONITORAçãO DE TERAPIA CONTRA CáNCER. A presente invenção refere-se a biomarcadores e o uso de biomarcadores para a predição e prognóstico de câncer, bem como o uso de biomarcadores para monitorar a eficácia de tratamento contra câncer. Especificamente, esta invenção refere-se ao uso de VEGF-R2 solúvel como biomarcador para inibidores de múltiplas quinases.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MÉTODOS IN VITRO" PARA MONITORAR O ESTADO DE UMA DOENÇA, DE SE- LEÇÃO DE TERAPIA E DE DIAGNÓSTICO DE CÂNCER".

Campo da Invenção

A presente invenção refere-se a biomarcadores e o uso de bio- marcadores para predição e prognóstico de câncer, bem como o uso de bi- omarcadores para monitorar a eficácia de tratamento contra câncer. Especi- ficamente, esta invenção refere-se ao uso de VEGF-R2 como biomarcador para inibidores de múltiplas quinases. Antecedentes dá Invenção

Receptores de fator de crescimento endotelial vascular (VEG- FRs) e seus Iigantes1 fatores de crescimento endotelial vascular (VEGFs), desempenham papel importante na migração e proliferação de células endo- teliais. O sistema VEGFR/VEGF inclui três receptores (VEGFR-1, VEGFR-2 e VEGFR-3) e quatro Iigantes (VEGF-A, B, C, D, e E e o fator de crescimen- to placentário). O VEGF-A compreende ainda quatro isoformas, VEGF-121, VEGF-165, VEGF-185 e VEGF-204, derivadas de transcrição alternativa do gene do VEGF-A. Os receptores são proteínas integrantes da membrana plasmática com domínios intracelulares de tirosina quinase. Conforme com outras quinases protéicas, a ativação dos VEGFRs é um dos principais me- canismos na regulação de sinais para proliferação de célula endotelial, e acredita-se que anormalidades no sistema VEGFR/VEGF contribuam para angiogênese anormal em algumas doenças humanas, como psoríase e do- enças malignas.

Na embriogênese, o sistema VEGFR/VEGF é essencial para o desenvolvimento correto do sistema vascular. Em adultos, VEGFR/VEGF é importante na cicatrização de feridas, inflamação e angiogênese.

Um ensaio não invasivo de níveis circulantes de VEGF-R2 solú- vel em pacientes antes de iniciado tratamento com fármaco é um meio auxi- liar, potencialmente importante, para tomada de decisão terapêutica. Embora ensaios de VEGF-A total tenham sido utilizados em seres humanos, como indicador prognóstico de evolução de doença, até a presente exposição, não havia relatos de correlação entre níveis de VEGF-R2 solúvel, em pacientes antes de quimioterapia, e desfecho de tratamento. Por conseguinte, VEGF- R2 solúvel poderá servir como indicador prognóstico valioso, além de como biomarcador para monitorar a eficácia de tratamento com inibidor de múlti- pias quinases.

Sumário da Invenção

A presente invenção refere-se a biomarcadores e o uso de bio- marcadores para a predição e prognóstico de câncer, bem como o uso de biomarcadores para monitorar a eficácia de tratamento contra câncer. Espe- cificamente, esta invenção refere-se ao uso de VEGF-R2, como biomarca- dor, para inibidores de múltiplas quinases (por exemplo, Sorafenib).

Em uma concretização, a presente invenção está relacionada ao uso de imunoensaios quantitativos para medir níveis da proteína VEGF-R2 solúvel, em líquidos presentes no corpo humano, antes de tratamento com inibidor de múltiplas quinases (por exemplo, Sorafenib). Os referidos níveis são especialmente úteis como indicador do potencial para câncer de pacien- tes tratados com inibidor de múltiplas quinases (por exemplo, Sorafenib), de forma que estes possam se beneficiar dessa terapia.

A medição de níveis pós-tratamento de VEGF-R2 solúvel, bem como a de alteração em níveis de VEGF-R2 solúvel ao longo do tratamento, pode ser utilizada clinicamente, como auxílio terapêutico, para seleção de terapia para pacientes, para monitorar o estado de doença pré- neoplásica/neoplásica em pacientes e/ou para monitorar a resposta de um paciente, portador de doença pré-neoplásica/neoplásica, à terapia. Em uma concretização, os níveis de VEGF-R2 solúvel podem servir de auxílio na se- leção da terapia de pacientes e para tomada de decisões sobre o melhor método a ser utilizado na terapia de pacientes.

Os níveis de VEGF-R2 solúvel podem ser medidos em amostras do paciente, como, entre outras, de sangue, soro, plasma, urina, saliva, sê- men, exsudato mamário, líquido cérebro-espinhal, lágrimas, escarro, muco, linfa, citossóis, ascite, derrames pleurais, líquido amniótico, lavados de bexi- ga e outras lavagens broncoalveolares. Em outra concretização, a invenção está relacionada ao uso de imunoensaio, como método de seleção de pacientes que possivelmente se beneficiarão de tratamento com inibidor de múltiplas quinases (por exemplo, Sorafenib), pela medição de níveis pré-tratamento de VEGF-R2 solúvel, em amostras do paciente, e avaliação do desfecho provável, com base em no- mograma de possível desfecho do paciente versus os níveis de VEGF-R2 solúvel.

Um método de monitoração do estado de uma doença associa- da à via ativada do VEGF, em pacientes, pode servir para o prognóstico de uma doença, em que os níveis de proteína VEGF total, nas amostras do pa- ciente, são indicadores de melhor ou pior desfecho do tratamento para o pa- ciente. O prognóstico pode contar com desfecho clínico selecionado do gru- po constituído por taxa de resposta (RR), resposta completa (CR), resposta parcial (PR), doença estável (SD), benefício clínico (incluindo resposta com- pleta (CR), resposta parcial (PR) e doença estável (DE)), tempo para pro- gressão (TTP)1 sobrevida livre de progressão (PPS) e sobrevida global (SS).

Estes métodos podem ser de formato convencional, por exem- plo, a realização de imunoensaio do tipo sanduíche, como ensaio de imuno- absorvência por ligação enzimática (ELISA) do tipo sanduíche ou ensaio e- quivalente. Estes imunoensaios podem utilizar anticorpos monoclonais, co- mo anticorpos monoclonais anti-VEGF-R2 solúvel. Além disso, o anticorpo monoclonal pode ser biotinilado.

Outra modalidade da invenção refere-se a imunoensaio quantita- tivo para medir alterações em série nos níveis da proteína VEGF-R2 solúvel total, em amostras de pacientes, para servir como método de seleção de terapia para um paciente com uma doença, por exemplo, pré- neoplásica/neoplásica.

A título de exemplo, um destes métodos de seleção de terapia pode compreender as etapas de:

(a) detecção imunológica e quantificação do nível de proteína VEGF-R2 solúvel total em amostra de uma população de controle;

(b) detecção imunológica e quantificação do nível de proteína VEGF-R2 solúvel total em amostras coletadas de um paciente ao longo do tempo; e

(c) determinação se deverá ser utilizada terapia convencional e/ou terapia com inibidor de múltiplas quinases (por exemplo, Sorafenib) pa- ra tratar o paciente, de acordo com o nível de proteína VEGF-R2 solúvel nas amostras do paciente.

Por exemplo, se for constatado que o nível de proteína VEGF- R2 solúvel, presente em amostra do paciente, está acima de 70 pg/ml, pode- ria ser concluído que o paciente é portador de doença induzida por VEGF- R2 e ser decidido o uso de terapia com inibidor de múltiplas quinases (por exemplo, Sorafenib) para tratar o paciente, quer isoladamente ou em combi- nação com uma ou mais outras terapias.

Uma terapia dirigida à via do VEGF-R2 solúvel pode fazer uso de inibidores de múltiplas quinases, inibidores de tirosina quinase, bis-aril uréias, inibidores antisense do VEGFR-2, terapias com anticorpo monoclonal ou similares. Por exemplo, uma terapia dirigida à via do VEGF-R2 solúvel pode fazer uso de bis-aril uréia Sorafenib, o qual é inibidor da angiogênse, bem como de inibidor de tirosina quinase ou o inibidor de tirosina quinase, STI571 (conhecido também como mesilato de imatinibe ou Gleevec®).

Outra concretização da invenção refere-se ao uso de imunoen- saios quantitativos para detectar alterações em níveis de VEGF-R2 solúvel, combinado a determinação dos níveis de uma ou mais outras proteínas. Es- tais) proteína(s) adicional(is) pode(m) incluir, por exemplo, inibidores (por exemplo, inibidor tecidual de metaloproteinase-1 (TIMP-t)), oncoproteínas (por exemplo, HER-2/neu, ras p21), receptores de fator de crescimento (por exemplo, receptor de fator de crescimento epidérmico (EGFR), receptor alfa de fator de crescimento derivado de plaqueta (PDGFR-α)), proteínas de me- tástase (por exemplo, ativador de plasmogênio do tipo uroquinase (uPA)), marcadores tumorais (por exemplo, antígeno carcinoembriogênico (CEA)) e supressores tumorais (por exemplo, p53). Estes métodos podem, então, ser utilizados, como, por exemplo, ferramenta para diagnótico/prognóstico, sele- ção de terapia para pacientes portadores de doenças, monitoração do esta- do de uma doença em um paciente e monitoração de resposta de um paci- ente, portador de doença, à terapia dirigida à via do VEGF ou a outra terapi- a. Seria vantajoso que pacientes (por exemplo, pacientes portadores de câncer) fossem submetidos a testes, quanto a alterações em série em prote- ína VEGF-R2 solúvel total e em outras proteínas, como aquelas que ativam a via do VEGF, possibilitando, dessa forma, ampliar a perspectiva clínica, recursos terapêuticos e parâmetros de diagnóstico/prognóstico, a fim de se- rem selecionadas as melhores combinações terapêuticas voltadas para os desfechos de tratamento mais promissores.

Em outra concretização, a invenção provê um kit de teste para monitoração da eficácia de uma terapia, em amostra do paciente, compre- endendo um anticorpo específico para uma proteína. Em certas concretiza- ções, o kit inclui ainda instruções de uso. Em certas concretizações, o kit pode incluir ainda soluções para suspensão ou fixação das células, identifi- cadores ou marcadores detectáveis, soluções que tornam um polipeptídeo susceptível a se ligar a um anticorpo, soluções para Iise de células ou solu- ções para a purificação de polipeptídeos. Em ainda outra concretização, o anticorpo é específico para VEGF-R2 solúvel.

Descrição das Figuras

A Figura 1 ilustra os níveis médios de VEGF-R2, em populações de pacientes, na linha de base (pré-tratamento) e durante tratamento.

Descrição Detalhada da Invenção

Deverá ser entendido que esta invenção não está limitada à me- todologia, protocolos, linhagens de células, espécie ou gênero de animais, constructos e reagentes, particularmente descritos e, portanto, estes podem variar. Deverá ser entendido também que a terminologia aqui utilizada pre- tende somente descrever concretizações especificadas e não limitar o esco- po da invenção, o qual será limitado somente pelas reivindicações anexas.

Cabe observar que, conforme utilizadas neste pedido e nas rei- vindicações anexas, as formas no singular "um" "e" e "o" incluem referência no plural, a não ser que o contexto indique claramente de outra forma. Por- tanto, por exemplo, referência a "um gene" é referência a um ou mais genes e inclui equivalentes do mesmo, conhecidos de especialistas na técnica, e assim por diante.

Exceto se definido de outra forma, todos os termos técnicos e científicos, utilizados neste pedido, terão os mesmos significados, conforme habitualmente entendidos por qualquer técnico no assunto ao qual a inven- ção pertence. Embora métodos, dispositivos e materiais semelhantes ou e- quivalentes àqueles aqui descritos possam ser utilizados na prática ou teste da invenção, os métodos, dispositivos e materiais preferidos são descritos neste relatório.

Todas as publicações e patentes, citadas neste pedido, são aqui incorporadas por referência, com a finalidade de descrever e expor, por e- xemplo, os constructos e metodologias, cuja descrição consta das publica- ções, e que poderiam ser utilizadas com relação à presentemente descrita invenção. As publicações discutidas acima e por todo este pedido de patente são fornecidas exclusivamente por terem sido expostas em data anterior à do requerimento de pedido de patente da presente invenção. Nada contido neste pedido deverá ser interpretado como admissão de que os inventores não tenham direito de anteceder a data desta exposição em virtude de in- venção anterior.

Definições

A título de conveniência, o significado de certos termos e frases, empregados na exposição, exemplos e reivindicações anexadas, é fornecido abaixo.

O termo "amostra de paciente", conforme utilizado neste pedido, refere-se a uma amostra obtida de um paciente. A amostra pode ser de qualquer tecido ou líquido biológico, podendo ser derivada de um paciente. Estas amostras incluem, entre outras, amostras de sangue, soro, plasma, urina, saliva, sêmen, exsudato mamário, líquido cérebro-espinhal, lágrimas, escarro, muco, linfa, citossóis, ascite, derrame pleural, líquido peritoneal, líquido amniótico, lavado de bexiga e lavagens broncoalveolares, células do sangue (por exemplo, leucócitos), tecido ou amostras de biópsia (por exem- plo, biópsia de tumor) ou de células, provenientes desta. Amostras biológi- cas podem incluir também cortes de tecidos, como cortes congelados, cole- tados para exame histológico.

O termo "biomarcador" abrange uma ampla gama de eventos intra- e extracelulares, bem como alterações fisiológicas que ocorrem em todo o organismo. Biomarcadores podem representar essencialmente qual- quer aspecto de funcionamento celular, por exemplo, entre outros, níveis ou taxa de produção de moléculas sinalizadoras, fatores de transcrição, trans- critos de genes, bem como modificações pós-tradução de proteínas. Bio- marcadores podem incluir análise de níveis de transcrito, em todo o genoma, ou análises de níveis e/ou modificações de proteínas em todo o proteoma.

Biomarcador pode referir-se também a um gene ou produto gê- nico, regulado positiva ou negativamente em célula doente, tratada com um composto, de um indivíduo portador da doença, em comparação a uma célu- la sem doença e não tratada. Ou seja, o gene ou produto gênico é suficien- xtemente específico para a célula tratada, podendo ser utilizado, opcional- mente com outros genes ou produtos gênicos, para identificar, predizer ou detectar eficácia de uma molécula pequena. Portanto, biomarcador é um gene ou produto gênico, característico da eficácia de um composto em uma célula doente ou da resposta daquela célula doente a tratamento pelo com- posto.

O termo "câncer" inclui, entre outros, tumores sólidos, como câncer de mama, do trato respiratório, cérebro, órgãos reprodutores, trato digestivo, trato urinário, olhos, fígado, pele, cabeça e pescoço, tiróide, parati- reóide e as suas metástases distantes. O termo inclui também linfomas, sar- comas e leucemias.

Exemplos de câncer de mama incluem, entre outros, carcinoma ductal invasivo, carcinoma Iobular invasivo, carcinoma ductal in situ e carci- noma lobular in situ.

Exemplos de câncer do trato respiratório incluem, entre outros, carcinoma de pulmão de células pequenas e de células não pequenas, bem como adenoma brônquico e blastoma pleuropulmonar.

Exemplos de câncer de cérebro incluem, entre outros, glioma hipotalâmico e de tronco cerebral, astrocitoma cerebelar e cerebral, medulo- blastoma, ependimoma, bem como tumor neuroectodérmico e pineal.

Tumores dos órgãos reprodutores masculinos incluem, entre outros, de próstata e câncer de testículo. Tumores dos órgãos reprodutores femininos incluem, entre outros, câncer do endométrio, cervical, de ovário, vaginal e vulvar, bem como sarcoma do útero.

Tumores do trato digestivo incluem, entre outros, câncer de â- nus, colo, colorretal, esôfago, vesícula biliar, câncer gástrico, pancreático, retal, de intestino delgado e de glândula salivar.

Tumores do trato urinário incluem, entre outros, câncer de bexi- ga, pênis, rim, pelve renal, uretere de uretra.

Cânceres de olho incluem, entre outros, o melanoma intra-ocular e retinoblastoma.

Exemplos de cânceres de fígado incluem, entre outros, carcino- ma hepatocelular (carcinomas de células hepáticas com ou sem variante fibrolamelar), colangiocarcinoma (carcinoma intra-hepático de via biliar) e colangiocarcinoma hepatocelular misto.

Cânceres de pele incluem, entre outros, carcinoma de célula es- camosa, sarcoma de Kaposi, melanoma maligno, câncer de pele de célula de Merkel e câncer de pele não melanoma.

Cânceres de cabeça e pescoço incluem, entre outros, câncer de laringe/hipolaringeano/nasofaringeano/orofaringeano e câncer de lábios e de cavidade oral.

Linfomas incluem, entre outros, Iinfoma relacionado a AIDS, Iin- foma não de Hodgkin, Iinfoma cutâneo de célula T, doença de Hodgkin e linfoma do sistema nervoso central.

Sarcomas incluem, entre outros, sarcoma de tecido mole, oste- ossarcoma, histiocitoma fibroso maligno, Iinfossarcoma e rabdomiossarco- ma.

Leucemias incluem, entre outras, leucemia mielóide aguda, leu- cemia linfoblástica aguda, leucemia linfocítica crônica, leucemia mielogênica crônica e leucemia de células pilosas. O termo "paciente" ou "indivíduo", conforme utilizado neste pedi- do, inclui mamíferos (por exemplo, seres humanos e animais).

A presente invenção é destinada a imunoensaios quantitativos que medem os níveis de proteína VEGF-R2 solúvel em amostras de pacien- tes. Estes ensaios podem ser úteis para a seleção de terapia para paciente portador de doença, associada a uma via ativada do VEFG-R2. Conforme utilizado neste pedido, "via ativada de VEGF" é definida como uma via ativa- da do VEFG-R2 por superexpressão ou mutação da proteína VEGF-R2 so- lúvel, e como tal, abrange vias do VEGF reguladas positivamente e/ou esti- muladas por mutação.

Exemplos de doenças neoplásicas, associadas a uma via ativa- da de VEGF, bem como de pré-cânceres que levam a doenças neoplásicas, incluem os seguintes: meduloblastoma metastático, tumores estromais gas- trointestinais (GIST), dermatofibrossarcoma protuberante (DFSP), doenças mieloproliferativas crônicas (DMPC)1 câncer colorretal, câncer de colo, cân- cer de pulmão, câncer de pulmão de células não pequenas, câncer de pul- mão de células pequenas, leucemia mielogênica aguda, câncer de tiróide, câncer de pâncreas, câncer de bexiga, melanoma, câncer de mama, câncer de próstata, câncer de ovário, câncer cervical, câncer de cabeça e pescoço, tumores cerebrais, carcinoma hepatocelular e malignidades hematológicas. Portanto, os níveis da proteína VEGF-R2 solúvel, isoladamente ou em com- binação com níveis de outras proteínas (por exemplo, outras oncoproteínas), podem ser úteis para predizer desfecho clínico e/ou como auxílio em seleção de terapia.

Por conseguinte, a presente invenção expõe e reivindica a apli- cação de um imunoensaio para medir quantitativamente níveis de VEGF-R2 solúvel em amostras de pacientes (por exemplo, níveis circulantes de VEGF- R2 solúvel), a fim de avaliar a probabilidade de um paciente sofrendo de câncer se beneficiar de tratamento com inibidor de múltiplas quinases (por exemplo, Sorafenib).

Em uma concretização da invenção, a proteína VEGF-R2 solúvel é quantificada em amostras de pacientes, coletadas na ocasião do diagnós- tico (por exemplo, de carcinoma de célula renal), bem como em timepoints subseqüentes pós-tratamento (por exemplo, no 31° dia do primeiro ciclo de tratamento, no 1° dia do terceiro ciclo de tratamento). Estas amostras de pa- cientes podem ser, por exemplo, de sangue, soro, plasma, urina, saliva, sê- men, exsudato mamário, líquido cérebro-espinhal, lágrimas, escarro, muco, linfa, citossóis, ascite, derrame pleural, líquido amniótico, lavado de bexiga e lavagens broncoalveolares, entre outras amostras de líquido do corpo. As amostras dos pacientes podem ser frescas ou congeladas e serem tratadas com heparina, citrato ou EDTA.

A título de exemplo, o ensaio ELISA do tipo sanduíche é um dos imunoensaios que podem ser utilizados, de acordo com a invenção. No en- tanto, pode ser apreciado que outros métodos, além daqueles expostos no presente, servem também para quantificar proteína VEGF-R2 solúvel em amostras de pacientes. Além disso, alguns métodos de detecção permitem a visualização da proteína VEGF-R2, como o uso de marcador luminescente.

Muitos formatos podem ser adaptados para uso com os métodos da presente invenção. Por exemplo, a detecção e quantificação de proteína VEGF-R2 solúvel, em amostras de pacientes, podem ser realizadas por en- saio de imunoabsorvência por ligação enzimática, rádio-imunoensaios, en- saios de anticorpo duplo tipo sanduíche, ensaios de aglutinação, imunoen- saios por fluorescência, microscopia imunoeletrônica e de investigação, en- tre outros tipos de ensaios, comumente conhecidos na técnica. A quantifica- ção de proteína VEGF-R2 solúvel, nestes ensaios, pode ser adaptada por métodos conhecidos na técnica. Em uma concretização, alterações em série em níveis circulantes da proteína VEGF-R2 solúvel podem ser detectadas e quantificadas por ensaio do tipo sanduíche, no qual o anticorpo de captura foi imobilizado, empregando técnicas convencionais, sobre a superfície do suporte.

Suportes adequados incluem, por exemplo, suportes em políme- ro sintético, como polipropileno, poliestireno, poliestireno substituído, polia- crilamidas (como poliamidas e cloreto de polivinil), contas de vidro, agarose e nitrocelulose. Um exemplo de imunoensaio ELISA do tipo sanduíche, no qual os métodos da presente invenção podem ser empregados, usa anticorpo monoclonal purificado de camundongo anti-VEGF-R2 solúvel humano, como o anticorpo de captura, e anticorpo policlonal biotinilado de carneiro anti- VEGF-R2 solúvel humano, como o anticorpo detector. O anticorpo monoclo- nal de captura é imobilizado em microcavidades da placa de microtitulação. Amostras diluídas de soro/plasma humano ou de padrões de VEGF-R2 solú- vel (por exemplo, proteína VEGF-R2 solúvel do tipo selvagem recombinante) são incubadas nas microcavidades para permitir a ligação do antígeno VEGF-R2 solúvel ao anticorpo monoclonal de captura. Após a lavagem dos poços, o antígeno VEGF-R2 solúvel imobilizado é exposto a um anticorpo biotinilado detector, depois do que, as microcavidades são novamente lava- das. Em seguida, é acrescentado um conjugado composto por estretavidina e peroxidase de rábano silvestre. Depois de lavagem final, o Substrato Azul TMB é acrescentado às microcavidades para detectar a atividade de ligação da peroxidase. A reação é interrompida pelo acréscimo de ácido sulfúrico a 2,5 N1 e a absorvência é medida em 450 nm. A correlação de valores de ab- sorvência das amostras com os de padrões de VEGF-R2 solúvel possibilita a determinação de valor quantitativo do VEGF-R2, em pg/ml, de soro ou plas- ma.

Pode ser apreciado que outras proteínas (por exemplo, inibido- res, oncoproteínas, receptores de fator de crescimento, fatores angiogêni- cos, proteínas de metástases, marcadores tumorais, supressores tumorais, proteínas associadas à via do VEGF) podem ser adequadas para detecção e quantificação, em combinação com VEGF-R2 solúvel. Por exemplo, outras proteínas adequadas para realização do teste, junto com o VEGF-R2, inclu- em o inibidor tecidual de metaloproteinase-1 (TIMP-1), HER-2/new, ras p21, receptor de fator de crescimento epidérmico (EGFR), ativador de plasmino- gênio do tipo uroquinase (uPA), antígeno carcinoembriogênico (CEA) e p53. Estas outras proteínas podem ser detectadas, utilizando ensaios conhecidos de especialistas na técnica. Por exemplo, há disponível no mercado imuno- ensaios para quantificação de HER-2/neu e TIMP-1, como o TIMP-1 ELISA da Oncogene Science (Oncogene Science, Cambridge, MA (EUA)), que po- de detectar valores de TIMP-1, em ng/ml, em soro ou plasma humano.

A monitoração dos níveis pré-tratamento de VEGF-R2 pode ser indicativo de desfecho clínico, após tratamento clínico com um inibidor de múltiplas quinases (por exemplo, Sorafenib). Um método de avaliação de desfecho clínico pode ser a determinação de taxa de resposta (RR), respos- ta completa (CR), resposta parcial (PR), doença estável (SD), benefício clí- nico (incluindo, resposta completa (CR), resposta parcial (PR), doença está- vel (SD)), tempo para progressão (TTP), sobrevida livre de progressão (PFS) e sobrevida global (SS).

O termo "anticorpo", neste pedido, é utilizado no mais amplo sentido e abrange, especificamente, anticorpos monoclonais (incluindo, anti- corpos monoclonais de seqüência completa), anticorpos policlonais, anticor- pos multiespecíficos (por exemplo, anticorpos biespecíficos) e fragmentos de anticorpo. Anticorpos úteis, de acordo com os métodos da invenção, podem ser preparados por metodologia convencional e/ou por engenharia genética. Por exemplo, anticorpos, de acordo com a invenção, incluem aqueles que se ligam a VEGF-R2 solúvel.

"Fragmentos de anticorpo" compreendem uma parte do anticor- po de seqüência completa, geralmente incluindo o domínio de ligação do antígeno ou outro domínio variável. Exemplos de fragmentos de anticorpos incluem o Fab, Fab', F(ab)2 e fragmentos FV; anticorpos divalentes (diabodi- es); anticorpos lineares; moléculas de anticorpo de cadeia simples; anticor- pos bioespecíficos e anticorpos multiespecíficos, formados a partir de frag- mentos de anticorpos.

O termo "anticorpo monoclonal", conforme utilizado neste pedi- do, refere-se a anticorpo obtido de uma população de anticorpos substanci- almente homólogos, ou seja, cada anticorpo compreende população idênti- ca, exceto por possíveis mutações que ocorram naturalmente e que podem estar presentes em quantidades insignificantes. Anticorpos monoclonais são altamente específicos, ou seja, dirigidos contra um único sítio antigênico. Ademais, ao contrário de preparados convencionais de anticorpos (policio- nais), os quais incluem, tipicamente, anticorpos diferentes dirigidos contra determinantes diferentes (epítopos), cada anticorpo monoclonal é dirigido contra um único determinante, presente no antígeno. O modificador "mono- clonal" indica que o caráter do anticorpo foi obtido de uma população subs- tancialmente homogênea de anticorpos, não devendo ser interpretado, con- tudo, que a sua produção requeira qualquer método em particular. Por e- xemplo, os anticorpos monoclonais a serem utilizados, segundo esta inven- ção, podem ser criados pelo método empregando hibridoma, descrito pela primeira vez por Kohler et al. (Nature 256:495, 1975), ou podem ser criados por métodos que usam DNA recombinante (consultar, por exemplo, Patente U.S. N9 4 816 567). Além disso, podem ser isolados também de bibliotecas de anticorpos em fagos, empregando as técnicas descritas em, por exemplo, Clackson et. al. (Nature 352:624-628, 1991) e Marks et al. (J. Mol. Biol. 222:581-597, 1991).

Os anticorpos monoclonais, neste pedido, incluem também anti- corpos "quiméricos" (imunoglobulinas), nas quais uma parte da cadeia pesa- da e/ou leve é idêntica ou homóloga a seqüências correspondentes em anti- corpos, derivados de uma espécie em particular ou que pertençam a uma classe ou subclasse de anticorpos em particular, enquanto que o restante da(s) cadeia(s) é idêntico ou homólogo a seqüências correspondentes em anticorpos derivados de outra espécie ou que pertençam a uma outra classe ou subclasse de anticorpos, bem como fragmentos destes anticorpos, desde que eles exibam a atividade biológica desejada (consultar, por exemplo, a Patente U.S. Nq 4 816 546; e Morrison et al., Proc. NatL Acad. Sei. USA 81:6851-6855,1984).

Formas "humanizadas" de anticorpos não humanos (por exem- plo, murino) são anticorpos quiméricos que contêm seqüência mínima deri- vada de imunoglobulina não humana. Os anticorpos humanizados são, em grande parte, imunoglobulinas humanas (anticorpo recipiente), nas quais, resíduos de região hipervariável, do recipiente, são substituídos por resíduos de região hipervariável de espécies não humanas (anticorpo doador), como camundongo, rato, coelho ou primata não humano, que tenham a especifici- dade, afinidade e capacidade desejadas. Em algumas situações, resíduos da região do esqueleto (FR) da imunoglobulina humana podem ser substitu- ídos por resíduos correspondentes não humanos. Ademais, anticorpos hu- manizados podem compreender resíduos que não são encontrados no anti- corpo recipiente ou no anticorpo doador. Essas modificações são efetuadas para refinar mais ainda o desempenho do anticorpo. De modo geral, o anti- corpo humanizado pode compreender substancialmente toda a seqüência de, pelo menos, um ou, tipicamente dois domínios variáveis, em que todas ou substancialmente todas as regiões hipervariáveis correspondem àqueles de uma imunoglobulina não humana, e em que todas ou substancialmente todas as FRs são aquelas de uma seqüência de imunoglobulina humana. Opcionalmente, o anticorpo humanizado pode compreender também, pelo menos, uma parte de uma região constante (Fc) de uma imunoglobulina, tipicamente aquela de uma imunoglobulina humana. Para revisão, consultar Jones et ai, (Nature 321:522-525, 1986); Reichmann et ai, (Nature 332:323- 329, 1988) e Presta, (Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596, 1992).

Fragmentos de anticorpos de "Cadeia única Fv" ou "sFv" com- preendem os domínios Vh e Vl do anticorpo, em que estes domínios estão presentes em cadeia única de polipeptídeos. De modo geral, o polipeptídeo Fv compreende ainda um Iigante polipeptídico entre os domínios Vh e Vl, possibilitando que o SFv assuma a estrutura desejada para a ligação com o antígeno. Para revisão, consultar Pluckthun (The Pharmacology of Monoclo- rial Antibodies, Vol. 113, Rosenburg and Moore eds. Springer-Verlag, Nova lorque, páginas 269-315, 1994).

O termo "diabodies" refere-se a fragmentos pequenos de anti- corpos com dois sítios de ligação com antígeno, fragmentos estes que com- preendem um domínio variável de cadeia pesada (VH), unido a um domínio variável de cadeia leve (Vl) na mesma cadeia de polipeptídeos (VH- VL). O uso de Iigante muito curto para pareamento entre os dois domínios na mes- ma cadeia, faz com que os domínios sejam forçados a formar pares com os domínios complementares de outra cadeia e criam dois sítios de ligação com antígeno. Os diacorpos são descritos com mais detalhes em, por exemplo, EP 404 097; WO 93/11161 e Hollinger et al. (Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90:6444-6448, 1993).

A expressão "anticorpos lineares" refere-se aos anticorpos des- critos em Zapata et al. (Protein Eng. 8(10):1057-1062, 1995). Resumidamen- te, estes anticorpos compreendem um par de segmentos Fd acoplados (VH- CH1 -Vh-ChI), que formam um par de regiões de ligação com antígeno. Anti- corpos lineares podem ser biespecíficos ou monoespecíficos.

Representantes de anticorpos, úteis de acordo com esta inven- ção, incluem anticorpos monoclonais de camundongo anti-VEGF-R2 solúvel total humano, criado para medir VEGF-R2 solúvel humano (por exemplo, kit de ELISA do tipo sanduíche para VEGFR-165 da Oncogene Science). Anti- corpos monoclonais úteis, segundo esta invenção, servem para identificar proteínas VEGF-R2 em vários testes prognósticos de laboratório, por exem- plo, em amostras clínicas.

Textos gerais descrevendo técnicas adicionais de biologia mole- cular, úteis nesta exposição, incluindo o preparo de anticorpos, incluem Ber- ger e Kimmel (Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymo- logy, VoJ. 152, Academic Press, Inc.); Sambrook et al., {Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Cold Spring Harbor, N.Y.; 1989) Vol. 1-3); Current Protocols in Molecular Biology, (F.M. Ausubel et al. [Eds.], Current Protocols, a joint venture betwe- en Green Publishing Associates, Inc. and John Wiley & Sons, Inc. (supple- mented through 2000)); Harlow et al., (Monoclonal Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1988), Paul [Ed.]); Funda- mental Immunology, (Lippincott Williams & Wilkins (1998)) e Harlow et al., (Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1998)).

Os anticorpos úteis, segundo esta invenção, para identificar pro- teínas VEGF-R2 solúveis podem ser marcados empregando qualquer ma- neira convencional. A peroxidase de rábano silvestre é um exemplo de mar- cação e o uso de complexos biotina-estrepavidina é um exemplo de método de marcação de anticorpos. Conforme apropriado, anticorpos utilizados nos imunoensaios desta invenção como rastreadores podem ser marcados de qualquer manei- ra, direta ou indiretamente, de forma a resultar em sinal visível ou que possa se tornar visível. Substâncias marcadoras detectáveis incluem radionuclí- deos, como 3H, 125I e 131I; fluorescentes como, isotiocianato de fluoresceína e outros fluorocromos, ficobiliproteínas, ficoeritina, raros quelantes terrosos, vermelho do Texas, dansil e rodamina; reagentes colorimétricos (cromogê- neos); materiais eletron-opacos, como ouro coloidal; bioluminescentes; qui- mioluminescentes; corantes; enzimas como, peroxidase de rábano silvestre, fosfatases alcalinas, glicose oxidase, glicose-6-fosfato desidrogenase, acetil- colinesterase, alfa e beta galactosidase, entre outras; coenzimas; substratos de enzimas; co-fatores de enzimas; inibidores de enzimas; subunidades de enzimas; íons de metal; radicais livres; ou qualquer outra substância imuno- logicamente ativa ou inerte que forneça meios de detecção ou de medição da presença ou quantidade de imunocomplexos formados, peroxidase de rábano e tetrametil bendizina (TMB) e fosfatases alcalinas e paranitrofenil fosfato (pNPP) são exemplos de combinações de substratos de enzimas.

Outros sistemas de detecção e de quantificação, segundo esta invenção, produzem sinais luminescentes, bioluminescentes (BL) ou quimio- luminescentes (CL). Em ensaio de quimioluminescência (CL) ou de biolumi- nescência (BL), a intensidade ou emissão total de luz é metida e relacionada à concentração do analito desconhecido. A luz pode ser medida quantitati- vamente com luminônetro (tubo fotomultiplicador, como o detector) ou dispo- sitivo acoplado com carga, ou qualitativamente por meio de filme fotográfico ou de raio x. As principais vantagens de se usar estes ensaios é a sua sim- plicidade e sensibilidade analítica, possibilitando a detecção e/ou quantifica- ção de quantidades muito pequenas de analito.

Esteres de acridínio, acridínio sulfonil carboxamidas, luminol, umbeliferona, derivados de isoluminol, fotoproteínas, como aequorina, e luci- ferases de vaga-lume, bactérias marítimas e de Vargulla e Renilla são e- xemplos de marcadores por luminescência. Luminol pode ser usado, opcio- nalmente, com uma molécula intensificadora, como 4-iodofenol ou ácido 4- hidroxi-cinâmico. Tipicamente, um sinal de CL é gerado por tratamento com oxidante, sob condições básicas.

Sistemas adicionais de detecção por luminescência são aqueles em que o sinal (marcador detectável) é produzido por uma reação enzimáti- ca, na presença de substrato. Esquemas de detecção CL e BL foram desen- volvidos para condução de ensaios empregando fosfatases alcalinas (AP), glicose oxidase, glicose 6-fosfato desidrogenase, peroxidase de rábano sil- vestre (HRP) e xantina oxidase, como marcadores entre outros. AP e HRP são duas enzimas marcadoras que podem ser quantificadas por uma série de reações de CL e BL. Por exemplo, AP pode ser usada junto com substra- to composto por um adamantil 1,2-dioxetano aril fosfato (por exemplo, AMPPD ou CSPD; Kricka, L.J., "Chemiluminescence and Bioluminescence, Analysis by, Molecular Biology and Biotechnology: A Comprehensive Desk Referencen (ed. R.A. Meyers) (VCH Publishers; N.Y., N.Y., 1995)); por e- xemplo, um sal dissódico de 4-metoxi-4-(3-fosfatofenil) espiro [1,2-dioxetano- 3-2'-adamantano], com ou sem molécula intensificadora, como diocloreto de 1-(trioctilfosfônio metil)-4-(tributilfosfônio metil) benzeno. A HRP pode ser usada com substratos, como 2,,3,,6'-trifluorfenil-metoxi-10-metilacridan-9- carboxilato.

As reações de CL e BL podem ser adaptadas para análises não só de enzimas, mas também de outros substratos, co-fatores, inibidores, íons metálicos e similares. Por exemplo, reações com luminol, Iuciferase de vaga-lume e Iuciferase de bactérias marítima indicam a produção ou consu- mo de peróxido, ATP e NADPH, respectivamente. Elas podem ser acopladas a outras reações envolvendo oxidases, quinases e desidrogenases, podendo ser utilizadas para medir qualquer componente da reação acoplada (enzima, substrato, co-fator).

O marcador detectável pode estar direta ou indiretamente ligado a um anticorpo, utilizado em ensaio desta invenção. O uso de ligação entre o par formado pelo anticorpo e marcador, ou o uso de sistema de amplificação de sinal são exemplos de ligação indireta do marcador detectável.

Exemplos de pares de ligação que podem ser utilizados para ligar anticorpos a marcadores detectáveis incluem biotina/avidina, estrepta- vidina ou antibiotina; avidina/antiavidina; tiroxina/globulina de ligação com tiroxina; antígeno/anticorpo; anticorpo/antianticorpo; carboidrato/lectinas; hapteno/anticorpo anti-hapteno; corantes e moléculas hidrofóbicas/sítios de ligação de proteína hidrofóbica; inibidor de enzima, coenzima ou co- fator/enzima; ácido polinucléico/seqüência homóloga do ácido polinucléico; fluoresceína/antifluoresceína; dinitrofenol/antidinitrofenol; vitamina B12/fator intrínseco; cortisona, cortisol/proteína de ligação com cortisol e Iigantes para proteína específica de receptor/proteínas específicas de receptor, associa- das à membrana.

Existem vários meios conhecidos na técnica para ligar, direta ou indiretamente, marcadores a anticorpos. Por exemplo, a ligação dos marca- dores pode ser covalente ou não covalente. Exemplos de métodos de conju- gação de anticorpo são descritos em Avarmeas et. ai, Scan. J. Immunol. 8(Suppl. 7):7, 1978); Bayer et ai, Meth. Enzymol. 62:308, 1979; Chandler et ai, J. Immunol. Meth. 58:187, 1982; Ekeke e Abuknesha, J. Steroid Bio- chem. 11:1579, 1979; Engvall e Perlmann, J. Immunol. 109:129, 1972; Geo- ghegan et al., Immunol. Comm. 7:2, 1978 e Wilson e Nakane, Immunofluo- rescence and Related Techniques, Elsevier/North Holland Biomedical Press; Amsterdam (1978).

Dependendo da natureza do marcador, várias técnicas podem ser utilizadas para sua detecção e quantificação. Para fluorescentes, há um grande número de fluorômetros disponíveis. Para quimioluminescentes, exis- tem luminômetros ou filmes disponíveis. Com enzimas, um produto fluores- cente, quimioluminescente ou colorido pode ser determinado ou medido por fluorometria, luminometria, espectrofotometria ou visualmente.

Vários tipos de compostos quimioluminescentes contendo acri- dínio, benzacridínio ou um tipo de acridan de sistemas de anéis heterocícli- cos são outros exemplos de marcadores. Exemplos de ésteres de acridínio incluem aqueles compostos com anéis heterocíclicos ou sistemas de anéis que contenham o heteroátomo em estado de oxidação positiva, incluindo os sistemas em anéis como acridínio, benz[a]acridínio, benz[b]acridínio, benz[c]acridínio, um cátion benzamidazol, quinolínio, isoquinolínio, quinolizí- nio, um quinolínio cíclico substituído, fenantridínio e quinoxalínio.

O rastreador pode ser preparado unindo-se ao anticorpo sele- cionado, quer direta ou indiretamente, um grupo funcional reativo presente no éster de acridínio ou benzacridínio, conforme bem conhecido de especia- listas na técnica (consultar, por exemplo, Weeks et al., Clin- Chem. 29(8): 1474-1479, 1983). Esteres de acridínio e benzacridínio são exemplos de compostos com saída do grupo arila em anel e, em seu lugar, o grupo funcional reativo presente na posição para ou meta (consultar, por exemplo, a Patente U.S. N9 4 745 181 e WO 94/21823).

Conforme utilizado no presente, "terapias direcionadas à via do VEGF" incluem quaisquer terapias cujo alvo é a via do VEGF, incluindo inibi- ção de expressão da proteína VEGF (por exemplo, oligonucleotídeos anti- sensé), prevenção da localização em membrana, essencial para ativação do VEGFR ou inibição de causadores em sentido descendente do VEGFR (por exemplo, Raf serina/treonina quinases). Terapias direcionadas à via do VEGF incluem inibidores de múltiplas quinases, inibidores de tirosina quina- se, anticorpos monoclonais e bis-aril uréias.

A bis-aril uréia Sorafenib, exemplo de inibidor de quinase, é uma molécula pequena e um novo inibidor de ação dupla tanto do Raf (uma pro- teína serina/treonina quinase) como do VEGFR (receptor de fator de cresci- mento endotelial vascular, um receptor da tirosina quinase) e, conseqüente- mente, inibidor tanto da proliferação de células tumorais como da angiogê- nese (Onyx Pharmaceuticals, Richamond, CA e Bayer Pharmaceuticals Cor- poration, West Haven, CT (EUA); Lyons et al., Endocrine-Related Câncer 8:219-225, 2001). Ademais, foi constatado que o Sorafenib inibia diversos receptores de tirosina quinase, envolvidos em progressão de tumor e neo- vascularização, incluindo PDGFR-β, Flt-3 e c-KIT. O PD166285 (Pfizer, Gro- ton, CT), um inibidor geral de tirosina quinase, pode antagonizar respostas mediadas tanto pelo PDGF como pelo FGF-2 (Bansai etal., J. Neuroscience Res. 74(4):486-493, 2003).

Outros exemplos de terapias, cujo alvo é a via do VEGF, inclu- em: Sutent/SU11248, PTK 787, MLN518, PKC-412, CDP860 e XL9999. Su- tent/SU11248 (màlato de sunitibe; indolin-2-ona) (Pfizer, Groton1 CT) é dire- cionado a receptores tirosina quinases (RTKs)1 incluindo o PDGFR1 com e- feitos antiangiogênicos e antitumorais. O PDGFR desempenha papel impor- tante na promoção de angiogênese, regulando a proliferação e migração de pericitos, células que dão suporte a vasos sangüíneos, e acredita-se que o Sutent/SU11248 iniba a ação angiogênica do PDGFR.

PTK 787 (Novartis, Basiléia, Suíça e Schering AG, Berlim, Ale- manha) é um agente oral antiangiogênese de molécula pequena (anilinofta- lazina) com ação contra o PDGFR, bem como contra o VEGFR e receptores c-Kit tirosina quinases (consultar, por exemplo, Garcia-Echevera e Fabbro, Mini Reviews in Medicinal Chemistry 4(3):273-283, 2004).

MLN518 (previamente conhecido como CT53518; Millenium Pharmaceuticals, Cambridge, MA) é uma molécula pequena oral destinada a inibir receptores tirosina quinases do tipo III (RTKs), incluindo o PDGFR, FLT3 e c-Kit.

PKC-412 (midostaurino; N-benzoil-estauroporina (derivado da estauroporina, um produto da bactéria Streptomyces)] Novartis, Basiléia, Suíça) inibe o PDGFR, VEGFR e múltiplas proteínas quinases C, "o que o torna especialmente atraente para pacientes com KIT do tipo selvagem com mutações no PDGFR" (PKC 41 - An Interview with Charles Blanke, MD, FACP (www.gistsupport.org/pkc412.html); consultar também Reichardt etal., J. Clin. Oncoi 23(16S):3016, 2005).

XL999 (um dos diversos Spectrum Selective Kinase Inhibitors® (SSKIs) da Exelixis (South San Francisco, CA, EUA)) inibe o VEGFR, bem como outros RTKs1 como o PDGFR-beta, FGFR1 e FLT3.

Exemplos

As estruturas, materiais, composições e métodos descritos neste pedido pretendem ser exemplos representativos da invenção, devendo ser entendido que o escopo da invenção não será limitado pelo escopo dos e- xemplos. Especialistas na técnica reconhecerão que a invenção pode ser praticada com variações nas estruturas, materiais, composições e métodos expostos, e que estas variações são consideradas incluídas no âmbito da invenção.

Exemplo 1. Microtitulacão de fase sólida com a técnica ELISA do tipo sandu- íche para preparo de amostra de soro e plasma humanos.

Amostras adequadas para análise por ELISA de VEGF-R2 solú- vel incluem plasma, tratado com heparina, citrato ou EDTA, e soro humano. Em decorrência de possível interferência por fatores, deverá ser tomado cui- dado especial no preparo e ensaio de soro e plasma humanos. Qualquer material que provoque floculação deve ser retirado de amostras por micro- centrifugação antes de diluição. A concentração inicial da amostra de soro ou plasma a ser examinada deve ser de aproximadamente 12-13% (diluição de 1:8 do espécime em diluente da amostra). Por exemplo, 40 μl de amostra podem ser diluídos em 280 μl do diluente da amostra, e 100 μl acrescenta- dos às cavidades da microplaca.

Procedimento do Ensaio

O protocolo seguinte de ELISA é o utilizado para a análise por ELISA do tipo sanduíche (Oncogene Science, Cambridge, MA) para medir VEGFR-165 humano em plasma ou soro humano.

1. Preparar uma solução de trabalho (1X) de Platewash (forneci- do como parte do kit do ensaio).

2. Acrescentar amostras pré-diluídas e Controles, e cada um dos seis Padrões de VEGF-R2165 solúveis (0 a 8000 pg/ml), em duplicata, inse- rindo, com pipeta, 100 μl nas cavidades apropriadas, utilizando pontas de pipetas limpas para cada amostra e Padrão. Acrescentar o Padrão 0 a uma cavidade adicional a ser utilizada para determinação do branco (controle) do Substrato.

3. Cobrir as cavidades com cobertura limpa em plástico ou de vedação de placa. Incubar a placa de microtitulação por 1,5 hora a 37°C.

4. Remover cuidadosamente a cobertura em plástico ou de ve- dação da placa. Lavar as cavidades com 300 μl por cavidade, com seis ci- clos de tampão Platewash (Lavar por três ciclos, girar a placa 180° e lavar por mais três ciclos).

5. Com uma pipeta, introduzir 100 μΙ do Anticorpo Detector em todas as cavidades, exceto a cavidade do branco do Substrato, o qual é dei- xado vazio. Cobrir as cavidades com uma nova cobertura em plástico. Incu- bar a placa de microtitulação por 1 hora a 37 QC.

6. Preparar o Conjugado de trabalho por diluição de um volume apropriado de Concentrado de Conjugado (diluição de 1:50), no Diluente do Conjugado.

7. Lavar as cavidades conforme na Etapa 4. Prosseguir imedia- tamente para a Etapa 8.

8. Com uma pipeta, introduzir 100 μΙ de Conjugado de Trabalho em todas as cavidades, exceto a cavidade do branco do Substrato, o qual é deixado vazio. Cobrir as cavidades com nova cobertura em plástico. Incubar a placa de microtitulação em temperatura ambiente (20-27 eC) por 1 hora.

9. Preparar o Substrato de Trabalho, combinando partes iguais da Solução A e Solução B. Seis ml de cada solução de Substrato fornecerão -12 ml de Substrato de Trabalho, suficiente para desenvolver uma placa de microtitulação. Ajustar o volume do Substrato de Trabalho, de acordo com o número de faixas utilizadas. Misturar bastante.

10. Dispensar o Substrato de Trabalho em um canal limpo de reagentes e deixar que chegue à temperatura ambiente.

11. Lavar as cavidades, conforme a Etapa 5. ATENÇÃO: Não deixar que as placas sequem. Prosseguir imediatamente para a Etapa 12.

12. Com uma pipeta, introduzir 100 μΙ de Substrato de Trabalho em todas as cavidades e cobrir a placa com cobertura em plástico ou de ve- dação da placa. Incubar a placa de microtitulação em temperatura ambiente (20-27 5C) por 45 minutos.

13. Com uma pipeta, introduzir 100 μΙ de Solução de Parada em todas as cavidades.

14. Medir a absorvência, em cada cavidade, utilizando um leitor espectrofotométrico de placa em comprimento de onda de 650 nm. As cavi- dades devem ser lidas no período de trinta minutos da adição da Solução de Parada. Curvas Padrão

Foram realizadas análises quantitativas pela construção de uma curva padrão, utilizando padrão de VEGF-R2 (por exemplo, VEGF-R2 solú- vel humano recombinante) em 6 concentrações diferentes de 0, 150, 1000, 3000, 5000 e 8000 pg/ml.

Amostras de soro e plasma humanos

Amostras congeladas de plasma foram obtidas de pacientes com carcinoma de célula renal confirmado, antes de tratamento com Sorafe- nib.

Exemplo 2. Plasma de pacientes portadores de carcinoma de células renais Amostras em duplicata foram utilizadas para medir o nível de VEGF-R2 solúvel, empregando uma análise por ELISA de VEGF-R2 (R&D Systems, Minneãpolis, MN), de acordo com as orientações dos fabricantes. O valor médio das medições das duplicatas foi determinado para cada paci- ente. Os níveis médios do VEGF-R2 solúvel estão relatados na Tabela 1, para três timepoints, Baseline (pré-tratamento), Dia 21 do Ciclo 1 e Dia 1 do Ciclo 3, tanto para um grupo de pacientes, tratados com Sorafenib, como para um grupo de pacientes tratados com placebo. Os mesmos dados são apresentados na Figura 1. Os resultados revelam que o grupo de pacientes tratados com Sorafenib possui níveis de VEGF-R2 solúvel que diminuem significativamente desde a baseline (p«0,01, empregando teste t pareado), em ambos os timepoints, porém, o mesmo não ocorre no grupo tratado com placebo (p>0,05).

Tabela 1: VEGF-R2 solúvel

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A descrição da concretização precedente da invenção foi apre- sentada a título de ilustração e descrição. Ela não pretende ser completa ou limitar a invenção para a forma precisamente exposta, sendo obviamente possíveis muitas modificações e variações à luz dos ensinamentos acima. As concretizações foram escolhidas e descritas a fim de explicar os princí- pios da invenção e a sua aplicação prática para possibilitar, pelo mesmo, que especialistas na técnica utilizem a invenção em várias concretizações e com várias modificações, conforme adequadas para o uso em particular con- templado. Todas as referências citadas neste pedido são aqui incorporadas por referência.

Claims (19)

1. Método "in vitro" para monitorar do status de uma doença, associada com a via do VEGF-R2 solúvel em um paciente e/ou monitorar a resposta de um paciente com a referida doença a uma terapia, caracterizado pelo fato de que compreende detectar imunologicamente e quantificar alte- rações seriadas nos níveis da proteína VEGF-R2 solúvel, em amostras de pacientes coletadas ao longo do tempo, em que os níveis crescentes da pro- teína VEGF-R2 solúvel, ao longo do tempo, indica progressão da doença ou resposta negativa à referida terapia, e em que níveis decrescentes da prote- ína VEGF-R2 solúvel, ao longo do tempo, indicam remissão da doença ou resposta positiva à referida terapia.

2. Método "in vitro" de acordo com a reivindicação 1, caracteri- zado pelo fato de que a referida terapia é selecionada entre inibidores de multiquinases, inibidores de tirosina quinase, anticorpos monoclonais e bis- aril uréias.

3. Método "in vitro" de acordo com a reivindicação 1, caracteri- zado pelo fato de que a referida terapia é uma terapia direcionada à via do VEGF.

4. Método "in vitro" de acordo com a reivindicação 3, caracteri- zado pelo fato de que a referida terapia direcionada à via do VEGF é o mesi- lato de imatiníbe, inibidor da tirosina quinase, ou a bis-aril uréia, Sorafenib.

5. Método "in vitro" de acordo com a reivindicação 1, caracteri- zado pelo fato de que a referida amostra do paciente é selecionada do grupo consistindo em sangue, soro, plasma, urina, saliva, sêmen, exsudato mamá- rio, fluido cérebro-espinhal, lágrimas, escarro, muco, linfa, citossóis, ascite, efusões pleurais, líquido amniótico, lavados de bexiga e lavagens bronco- alveolares.

6. Método "in vitro" de acordo com a reivindicação 5, caracteri- zado pelo fato de que a referida amostra do paciente é amostra de soro ou plasma.

7. Método "in vitro" de acordo com a reivindicação 1, caracteri- zado pelo fato de que a referida detecção e quantificação imunológica é por meio de imunoensaio na forma de um ensaio por ELISA do tipo sanduíche ou equivalente.

8. Método "in vitro" de acordo com a reivindicação 7, caracteri- zado pelo fato de que o referido ensaio por Elisa do tipo sanduíche ou equi- valente compreende o uso de um ou mais anticorpos monoclonais que se ligam seletivamente à proteína VEGF-R2 solúvel.

9. Método "in vitro" de seleção de terapia para paciente humano portador de doença, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) detectar e quantificar imunologicamente o nível médio da pro- teína VEGF-R2 solúvel em amostras de controle, coletadas de indivíduos de uma população de controle; (b) detectar e quantificar imunologicamente modificações em série nos níveis de proteína VEGF-R2 solúvel em amostras equivalentes de paciente, coletadas do paciente ao longo do tempo; (c) comparar os níveis da proteína VEGF-R2 solúvel, nas amos- tras do paciente, com o nível médio da proteína VEGF-R2 solúvel nas amos- tras de controle; e (d) determinar se deve-se usar a terapia convencional e/ou tera- pia direcionada à via do VEGF para tratar o paciente, com base nas diferen- ças entre os níveis da proteína VEGF-R2 solúvel, nas amostras do paciente, e o nível médio da proteína VEGF-R2 solúvel nas amostras de controle, e, em vista das modificações em série, entre os níveis da proteína VEGF-R2 solúvel nas amostras do paciente.

10. Método "in vitro" de acordo com a reivindicação 9, caracteri- zado pelo fato de que as amostras do paciente são de um paciente com câncer que não respondeu a tratamento.

11. Método de diagnóstico "in vitro" para detectar doença asso- ciada a uma via do VEGF em um paciente, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) detectar e quantificar imunologicamente o nível médio da pro- teína VEGF-R2 solúvel em amostras de controle, coletadas de indivíduos de uma população de controle; (b) detectar e quantificar imunologicamente modificações em série na proteína VEGF-R2 solúvel em amostras de um paciente coletadas do paciente ao longo do tempo; (c) comparar os níveis da proteína VEGF-R2 solúvel, nas amos- tras do paciente, com o nível médio da proteína VEGF-R2 solúvel nas amos- tras de controle; em que, um nível de proteína VEGF-R2 solúvel, nas amostras do paciente, que está acima do nível médio da proteína VEGF-R2 solúvel nas amostras de controle é indicativo de uma via ativada do VEGF e a pre- sença de doença no paciente.

12. Método "in vitro" de acordo com a reivindicação 11, caracte- rizado pelo fato de que a referida detecção e quantificação imunológica das etapas (a) e (b) é efetuadas por imunoensaio na forma de ensaio por ELISA do tipo sanduíche ou equivalente.

13. Método "in vitro" de acordo com a reivindicação 1, 9 ou 11 o qual é ainda prognóstico para referida doença, caracterizado pelo fato de que os referidos níveis da proteína VEGF-R2 solúvel, nas amostras do paci- ente, são indicativos de melhor ou pior prognóstico para o referido paciente.

14. Método "in vitro" de acordo com a reivindicação 13, caracte- rizado pelo fato de que o referido prognóstico é um desfecho clínico, sele- cionado do grupo constituído por taxa de resposta (RR), resposta completa (CR), resposta parcial (PR), doença estável (SD), tempo para progressão (TTP), sobrevida livre de progressão (PFS), sobrevida global (SS) e benefí- cio clínico, sendo que este compreende resposta completa (CR), resposta parcial (PR) e doença estável (SD).

15. Método "in vitro" de acordo com a reivindicação 1, 9 ou 11, caracterizado pelo fato de que a referida doença é uma doença pré- neoplásica/neoplásica.

16. Método "in vitro" de acordo com a reivindicação 15, caracte- rizado pelo fato de que a referida doença pré-neoplásica/neoplásica associ- ada com uma via de PDGF ativada é selecionada do grupo constituído por meduloblastoma metastático, tumores do estroma gastrintestinal, dermatofi- brossarcoma protuberante, câncer colorretal, câncer de colo, câncer de pul- mão, câncer de pulmão de células não pequenas, câncer de pulmão de célu- las pequenas, doenças mieloproliferativas crônicas, leucemia mielogenosa aguda, câncer de tiróide, câncer pancreático, câncer de bexiga, câncer renal, melanoma, câncer de mama, câncer de próstata, câncer de ovário, câncer cervical, câncer de cabeça e pescoço, tumores cerebrais, carcinoma hepato- celular, malignidades hematológicas e pré-cânceres que levam aos cânceres supramencionados.

17. Método "in vitro" de acordo com a reivindicação 1, 9 ou 11, caracterizado pelo fato de que compreende ainda o uso de imunoensaio pa- ra detectar ou detectar e quantificar níveis de uma ou mais outras proteínas nas amostras do indivíduo.

18. Método "in vitro" de acordo com a reivindicação 17, caracte- rizado pelo fato de que a referida outra proteína é ou referidas outras proteí- nas são selecionadas do grupo constituído por inibidores, oncoproteínas, receptores de fator de crescimento, fatores angiogênicos, proteínas de me- tástases, marcadores tumorais e supressores tumorais.

19. Método "in vitro" de acordo com a reivindicação 18, caracte- rizado pelo fato de que o referido inibidor é o inibidor tecidual de metalopro- teinase-1 (TIMP-1), as referidas oncoproteínas são selecionadas do grupo constituído por HER-2/neu e ras p21, os referidos receptores de fator de crescimento são selecionados do grupo constituído por receptor de fator de crescimento epidérmico (EGFR) e receptor alfa de fator de crescimento deri- vado de plaqueta (PDGFR-α), o referido fator angiogênico é o fator de cres- cimento endotelial vascular (VEGF), a referida proteína de metástase é o ativador de plasminogênio do tipo uroquinase (uPA), o referido marcador tumoral é o antígeno carcinoembriogênico (CEA) e o referido supressor tu- moral é o p53.