BRPI0618724A2 - componentes da matriz extracelular para expansão ou diferenciação de progenitores hepáticos - Google Patents

Abstract

COMPONENTES DA MATRIZ EXTRACELULAR PARA EXPANSãO OU DIFERENCIAçãO DE PROGENITORES HEPáTICOS. A presente invenção refere-se a um método de propagar progenitores hepáticos in vitro sobre ou dentro de um ou múltiplos componentes da matriz extracelular encontrados no compartimento de célula-tronco ou nicho do fígado. Um recipiente para a propagação dos progenitores e que compreende placas de cultura, biorreatores ou chips laboratoriais.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "COMPO- NENTES DA MATRIZ EXTRACELULAR PARA EXPANSÃO OU DIFE- RENCIAÇÃO DE PROGENITORES HEPÁTICOS".

REFERÊNCIAS CRUZADAS A PEDIDOS RELACIONADOS

Esse pedido reivindica prioridade para o Pedido Provisório US Nq 60/736.873, depositado em 16 de Novembro de 2005, cuja descrição está incorporada por referência aqui em sua totalidade.

Campo da Invenção

A presente invenção refere-se geralmente a propagação ou dife- renciação ex vivo de células progenitoras hepáticas. Mais particularmente, a presente invenção refere-se a identificação e seleção de componentes de matriz extracelular, que possibilitam a propagação e/ou diferenciação de cé- lulas progenitoras hepáticas, incluindo células-tronco hepáticas, in vitro.

Antecedente da Invenção

Células-tronco hepáticas e sua progênie (por exemplo, hepato- blastos e progenitores comprometidos) têm considerável potencial de ex- pansão. Por essa razão, essas populações celulares são candidatas desejá- veis para terapias celulares, incluindo fígados bioartificiais ou transplante de células. Apesar dessa promessa, entretanto, o potencial total de terapia com célula hepática permanece a ser concretizado.

Em parte, a propagação ex vivo de células-tronco hepáticas e sua progênie provou ser desafiante. Quando as células-tronco hepáticas e sua progênie são propagadas com sucesso in vitro, as condições de cultura não são ótimas para a transição entre a bancada do laboratório e a clínica.

Por exemplo, algumas condições de cultura retardam grandemente a divisão celular ou promovem arbitrariamente a diferenciação celular, dessa maneira reduzindo a eficácia da propagação. Da mesma maneira, algumas condições de cultura requerem a adição de fatores (por exemplo, soro ou células ali- mentadoras) que podem introduzir contaminantes e dessa forma limitar sua aplicação no tratamento de humanos.

Conseqüentemente, há uma necessidade por condições de cul- tura que possam fornecer propagação ex vivo aumentada de células-tronco hepáticas e sua progênie e uma necessidade por condições que possam restringir a linhagem de células-tronco aos seus destinos apropriados. Além disso, há uma necessidade por condições de cultura que impeçam a neces- sidade atual de células alimentadoras.

Sumário da Invenção

Em uma modalidade da presente invenção, é fornecido um mé- todo de propagação de progenitores hepáticos in vitro, compreendendo: (a) fornecer progenitores hepáticos isolados e (b) cultivar os progenitores hepá- ticos isolados sobre uma camada que compreende um ou uma combinação de componentes de matriz celular encontrados no compartimento de célula- tronco do fígado. O(s) componente(s) de matriz celular pode(m) ser um co- lágeno tipo III, um colágeno tipo IV, uma laminina, hialuronanos, outros gli- cosaminoglicanos, proteoglicanos de sulfato de heparan, proteoglicanos de sulfato de condroitin ou uma combinação desses. Em algumas modalidades, a camada pode compreender outro componente de matriz extracelular, que podem ser proteoglicanos tais como agrin, perlecan, integrina, nidogênio, distroglicano ou outros, ou moléculas de adesão basal tal como fibronectina ou outras proteínas tais como elastina e combinações desses. Em uma mo- dalidade preferida da presente invenção, o primeiro componente de matriz extracelular é colágeno tipo Ill e a segunda proteína de matriz extracelular é laminina.

De acordo com o método inventivo, os progenitores hepáticos isolados podem ser células-tronco hepáticas isoladas, hepatoblastos isola- dos, progenitores hepáticos comprometidos ou uma combinação desses. Igualmente, o método ainda pode compreender cultivar os progenitores he- páticos na presença de células alimentadoras, cujas células podem ser de origem embrionária, fetal, neonatal e/ou de murino. Preferivelmente, as célu- las alimentadoras são angioblastos. O método ainda pode compreender cul- tivar os progenitores hepáticos em um meio de cultura livre de soro. Preferi- velmente, o meio livre de soro contem insulina (5 μg /ml), transferrina/fe (5 μg /ml), e uma mistura de lipídios (ácidos graxos livres, lipoproteínas de alta densidade), pouco cálcio (<0,5 mM) e pouco ou nenhum cobre. Os pro- genitores hepáticos podem ser obtidos de fígados fetais, neonatais, pediátri- cos ou de adulto.

A laminina pode estar em uma concentração entre cerca de 0,1 a cer- ca de 10 μg/cm2, preferivelmente entre cerca de 0,5 a cerca de 5 μg/cm2 e mais preferivelmente em uma concentração de cerca de 0,5 μg/cm2 ou 1 μg/cm2. Os colágenos tipo III ou IV estão individualmente em uma concen- tração entre cerca de 0,1 a cerca de 15 μg/cm2, preferivelmente entre cerca de 0,5 a cerca de 8 μg/cm2, e o mais preferivelmente entre cerca de 1 a cer- ca de 7 μg/cm2.

Em outra modalidade da presente invenção, é fornecido um mé- todo de propagar progenitores hepáticos, que compreende: (a) fornecer uma primeira camada que compreende um ou mais componentes de matriz ex- tracelular encontrados no compartimento de célula-tronco do fígado; (b) for- necer uma segunda camada que compreende um ou mais componentes de matriz extracelular encontrados no compartimento de célula-tronco do fíga- do; e (c) cultivar progenitores hepáticos isolados entre a primeira e segunda camadas. O(s) componente(s) de matriz celular pode(m) ser um colágeno tipo III, um colágeno tipo IV, uma laminina, hialuronanos, um proteoglicano (por exemplo, sulfato de heparan e/ou proteoglicano de sulfato de condroitin) ou uma combinação desses. Em algumas modalidades, a camada pode compreender outros componentes de matriz extracelular, que podem ser outros proteoglicanos (por exemplo, agrin, perlecan, nidogênio, distroglica- no), outras moléculas de adesão basal (por exemplo, fibronectina) e outra proteína de matriz extracelular (por exemplo, elastina) e combinações des- ses. Em uma modalidade preferida da presente invenção, o primeiro compo- nente de matriz extracelular é colágeno tipo III e o segundo componente de matriz extracelular é laminina.

De acordo com o método inventivo, os progenitores hepáticos isolados podem ser células-tronco hepáticas isoladas, hepatoblastos isola- dos, progenitores hepáticos comprometidos ou uma combinação desses. Igualmente, o método ainda pode compreender cultivar os progenitores he- páticos na presença de progenitores mesenquimais, apresentados como células alimentadoras, cujas células podem ser derivadas de tecidos embri- onários, fetais, neonatais, pediátricos ou adultos e podem ser de qualquer espécie de mamífero. Preferivelmente, as células alimentadoras são angio- blastos. Preferivelmente, os angioblastos se derivam do fígado e preferivel- mente os angioblastos se derivam de uma espécie idêntica àquela dos pro- genitores hepáticos. O método ainda pode compreender cultivar os progeni- tores hepáticos em um meio de cultura livre de soro. Os progenitores hepáti- cos podem ser obtidos de fígados fetais, neonatais, pediátricos ou de adul- tos.

A laminina pode estar em uma concentração entre cerca de 0,1 a cerca de 10 μg/cm2, preferivelmente entre cerca de 0,5 a cerca de 5 μg/cm2 e mais preferivelmente em uma concentração de cerca de 0,5 μg/cm2 ou 1 μg/cm2. Os colágenos tipo Ill ou IV estão individualmente em uma con- centração entre cerca de 0,1 a cerca de 15 μg/cm2, preferivelmente entre cerca de 0,5 a cerca de 8 μg/cm2, e o mais preferivelmente entre cerca de 1 a cerca de 7 μg/cm2.

Ainda em outra modalidade da presente invenção, um recipiente para propagação de progenitores hepáticos é fornecido, compreendendo: (a) um recipiente (por exemplo, placa de cultura de tecido, um chip de laborató- rio, um biorreator) e (b) uma camada insolúvel que compreende pelo menos um componente de matriz extracelular encontrado no compartimento de cé- lula-tronco ou nicho de fígados, em que o material insolúvel reveste substan- cialmente uma superfície ou está dentro do recipiente.

Como tal, aqueles versados na técnica apreciarão que a con- cepção a partir da qual essa descrição é baseada pode ser prontamente uti- lizada como uma base para a criação de outras estruturas, métodos e siste- mas para a realização dos vários propósitos da presente invenção. É impor- tante, portanto, que as reivindicações sejam consideradas como incluindo tais construções equivalentes a medida que elas não se afastem do espírito e escopo da presente invenção.

Breve Descrição dos Desenhos

Figura 1 é um desenho diagramático dos sistemas de esquema de cultura e substratos de matriz de colágeno. A.) Uma cultura de controle com hepatoblastos semeados sobre a superfície do plástico de cultura de tecido (TCP) enquanto sustentados com um meio nutritivo. B.) Apresenta uma proporção dos elementos usados para estabelecer um substrato de ma· triz de colágeno. C.) É o esquema de Placa Plana de colágeno semeado com hepatoblastos. D.) É um esquema de "Sanduíche" de colágeno e hapa- toblastos.

Figura 2 é um desenho diagramático da técnica para aplicar uma monocamada de matriz sobre uma superfície de TCP. A.) Ilustra a etapa ini- ciai utilizada para pré-revestir a superfície. As moléculas da matriz são distri- buídas heterogeneamente sobre a superfície por um período de tempo de- terminado. Β.) O processo de esterilização. C.) Três lavagens com PBS 1 χ para neutralizar o pH acético que ocorre durante procedimentos para estabe- lecer géis ou fibrilas de colágeno. D.) Produto final com células de fígado semeadas como uma monocamada sobre matrizes e sustentadas por um meio nutritivo.

Figura 3 fornece fotografias de resultados de imuno-histoquímica para componentes de matriz encontrados em culturas STO 5.

Figura 4 mostra micrografias "time-lapse" a 20x de característi- cas de célula de fígado para os dias de cultura 0, 5, 15 e 31. Figura 4A: dia 0 mostrando hepatoblastos como células grandes agrupadas junto com células isoladas interdispersas. Figura 4B: dia 5 mostrando hepatoblastos confluen- tes com células mesenquimais associadas. Figura 4C: dia 15 com quantida- des iguais de hepatoblastos e células mesenquimais. Figura 4D: dia 31 com abundância de células mesenquimais.

Figura 5 mostra o dia 10, micrografias a 10x de células de fígado fetal humano cultivadas dentro de sistemas de esquema de TCP de controle, Placa Plana e Sanduíche. A.) Resposta de cultura de controle-hepatoblastos (h) engolfados por células mesenquimais (np). B.) Resposta de cultura de Placa Plana-colônia de hepatoblastos (h) com algumas células mesenqui- mais. C.) Resposta de cultura sanduíche -colônia de hepatoblastos (h) imu- nocorada para albumina (vermelho) e CK19 (verde). Figura 6 mostra a produção de uréia de células cultivadas sobre as várias matrizes. A.) Funções de uréia encontrada em hepatoblastos culti- vados sobre colágeno III (■), colágeno IV (•), Iaminina (o) e uma mistura de colágeno IV-laminina (V) são analisadas e comparadas contra culturas de controle de plástico (V). B.) Funções de uréia para hepatoblastos cultivados sobre TCP (•), colágeno I de Placa Plana (o), e Colágeno I de Sanduíche (V).

Figura 7 mostra a produção de glicose e amônia por células cul- tivadas sobre várias matrizes. A.) Funções hepáticas de glicose para hepa- toblastos cultivados sobre sistemas de esquema de TCP de controle (■), Placa Plana (), e Sanduíche ( ). B.) Níveis hepáticos de amônia para hepa- toblastos cultivados sobre sistemas de esquema TCP de controle (H)1PIaca Plana (), e Sanduíche ( ).

Figura 8 mostra características de crescimento in vitro de células progenitoras de fígado cultivadas sobre componentes de matriz do nicho de célula-tronco. Imagens de cultura com 10 dias são apresentadas sobre toda a superfície da placa de Petri para hepatoblastos semeados sobre At.) colá- geno III, B1.) laminina e C1.) uma mistura de colágeno Ill e laminina. Com- parativamente, as mesmas culturas são observadas com ampliação de 10x (A2, B2 e C2) para ilustrar as respostas a nível celular.

Figura 9 mostra o resultado de colônias de célula-tronco hepáti- ca após semeadura de células de fígado fetal humano sobre substratos de matriz embrionária (colágeno Ill e colágeno IV). Hepatoblastos (h) do Dia 3 são evidentes sobre todos os substratos de matriz. Células não- parenquimatosas (np) também estão evidentes sob todas as condições e estão marcadas nas micrografias. Células-tronco hepáticas são encontradas inicialmente no dia 3 em culturas sobre colágeno III, mas elas também apa- recem nas culturas do dia 10 sobre TCP, colágeno Ill e colágeno IV.

Figura 10 mostra células-tronco hepáticas selecionadas de a- cordo com a presente invenção. Dinâmica de diferenciação em culturas a longo prazo com erupções de tipos celulares distintos, determinados serem hepatoblatos, que emergem das bordas de uma colônia de HSC no dia 12. A região destacada em A) ilustra a colônia de HSC conforme ela evoluiu en- tre os dias 3-11 e B) apresenta a erupção dentro de um período de tempo de 8 horas.

Figura 11 fornece um processo esquemático de purificação de estoque de célula do fígado em estoque de célula HSC.

Figura 12 fornece um desenho diagramático de um protocolo de passagem: HSCs são inicialmente semeadas em placas de TCP de controle, como ilustrado em A. A seguir, HSCs são passadas em insertos de poros de 0,4 μm mantidos em recipientes de cultura de 6 cavidades como mostrado em B. C é a visão de cima de um inserto não-tratado. D é a visão de cima de um inserto pré-revestido de colágeno III. E ilustra o produto final de célula passada em superfícies de inserto.

Figura 13: A1.) Agregado de HSC circundado por hepatoblastos semeados sobre TCP. A2.) Visão ampliada de agregado de HSC em A1. B1.) Agregado de HSC após purificação por fracionamento por Ficoll1 seme- ado sobre TCP. B2.) Visão ampliada de agregado de HSC em B1. A tabela informativa abaixo das micrografias apresenta as respostas imunofluores- centes. Altamente ativo (++), ativo (+), variável (+/-), e negativo (-).

Figura 14 mostra marcação imunofluorescente para EpCAM, CK19, e NCAM. EpCAM é altamente positivo (fase A1) vs. (fluorescente A2). Ck19 apresenta a variabilidade (fase B1 & C1) vs. (fluorescência de HSC neg B2 & fluorescência positiva C2). NCAM também apresenta variabilidade (fase D1 & E1) vs. (fluorescência de HSC positiva D2 & negativa & fluores- cência positiva E2).

Figura 15 mostra uma comparação do número de colônias de HSC formadas quando semeadas sobre TCP ou substratos de fragmento de colágeno tipo-I Bornstein & Traub (BoTr) (Colágeno Tipo III Sigma). Adicio- nalmente, o detalhe ilustra a formação de colônia sobre outras matrizes de adulto (colágeno tipo I) e fetal (Colágeno III & IV de BD).

Figura 16 mostra a resposta de expansão de colônia de HSC com semeadura sobre TCP ou substratos de colágeno tipo I de Bornstein & Traub (BoTr) (colágeno Tipo III Sigma). As setas apontam para colônias re- centemente visualizadas no dia 7. Dia 18 apresenta grandes agregados de colônia com a superfície de BoTr nessa micrografia a 4x. O dia 30 mostra agregados dispersos para ambas as superfícies de semeadura. Morfologias com detalhe a 20x são mostradas para matrizes de plástico, BoTr, e coláge- no III & IV fetal.

Figura 17 mostra os padrões totais de proliferação de agregado para HSCs semeadas sobre TCP (preto) ou substratos de fragmento de co- lágeno tipo I de Bornstein & Traub (BoTr) (Colágeno Tipo Ill Sigma) (cinza). Para a normalização da imagem, os padrões de círculos grandes com linhas "onduladas" representam a superfície de semeadura total (placa de 35 mm D). HSCs semeadas em BoTr proliferam mais cedo (dia 5), alcançam cober- tura maior da superfície (dia 20) e se dissipam da superfície mais lentamente (dia 30) do que o controle. A imagem detalhada compara o crescimento de colônia quando semeada sobre os diferentes substratos de matriz de colá- geno Ill & IV de BD e colágeno I de Vitrogen.

Figura 18 fornece quantidades de célula normalizadas para os dias 5-30 ilustrando variações no crescimento na fase Iog (dias 5-10) versus cinética de densidade de saturação (dias 10-20) versus pós-confluência (di- as 20-30). Culturas semeadas em BoTr de HSC ilustram os números de pro- liferação melhorados ao longo dos períodos de cultura.

Figura 19 mostra variações nos aspectos de "Duplicação" ou "Diminuição" da apresentação de crescimento em fase Iog (dias 5-10), ciné- tica de densidade de saturação (dias 10-20), e pós-confluência (dias 20-30) da proliferação celular.

Figura 20 mostra a passagem de HSC sobre 4 superfícies úni- cas. 17 colônias são inicialmente passadas. 14 dias após a passagem com- para os atributos de colônia de HSC. HSCs passadas sobre substratos de fragmento de colágeno tipo -I de Bornstein & Traub (BoTr) (Colágeno Tipo-Ill Sigma, 6 μg/cm2) fornece o ambiente mais eficaz.

A figura 21 mostra a função de albumina normalizada compa- rando hepatoblasto (dias 5-11), HSCs e hepatoblastos (dias 9-17), e apenas HSCs (dias 12-30). Figuras 22 mostra os níveis de atividade de telomerase de Célu- las-tronco Hepáticas cultivadas sobre TCP (barra preta) e substratos de frag- mento de colágeno tipo I de Bornstein & Traub (BoTr) (Colágeno Tipo-Ill Sigma) (barra cinza claro) nos dias 10 e 20 - com células HeLa (barra cinza escuro) como a "comparação basal". A.) apresenta atividades para amostras normalizadas para os níveis de proteína. B.) apresenta atividades para a- mostras normalizadas para Números de Célula. Micrografias são as mesmas HSCs humanas em fase, controle negativo, e com expressão de telomerase.

Descrição Detalhada da Invenção

Em uma modalidade da presente invenção, componentes da matriz extracelular foram identificados, que facilitam a ligação, sobrevivência e proliferação ex vivo de células-tronco hepáticas e sua progênie. O termo "progenitores hepáticos", como usado aqui, é amplamente definido para a- branger tanto células-tronco hepáticas como sua progênie. "Progênie" pode incluir células-tronco hepáticas auto-replicativas, hepatoblastos, progenitores pluripotentes desses e progenitores comprometidos para se diferenciar em um tipo celular particular (por exemplo, um hepatócito).

"Expansão clonogênica" refere-se à propriedade de crescimento de células que podem ser expandir a partir de uma única célula e serem subcultivadas e expandida repetidamente com retenção do fenótipo da célu- la parental. "Formação de colônia" refere-se à propriedade de células paren- quimatosas diplóides que podem sofrer um número limitado de divisões celu- lares (tipicamente 5-7 divisões celulares) dentro de uma semana ou duas e envolve células com habilidade limitada em sofrer subcultura ou passagem. "Pluripotente" significa células que podem formar células filhas de mais de um destino; "unipotente" ou "progenitores comprometidos" são células que têm um único destino adulto.

Células-tronco hepáticas (HSCs) são células pluripotentes en- contradas nas placas dos duetos (também chamadas placas limitantes) em fígados fetais e neonatais e nos Canais de Hering em fígados adultos pediá- tricos e adultos e que mostram evidência de auto-replicação (ref) com ex- pressão de telomerase e serem capazes de formar células do fígado madu- ras quando transplantadas (refs). Essas células são EpCAM+, NCAM+, ALB+, CK8/18+, CK19+, CD133/1+, e são negativas para todos os marcado- res hematopoiéticos testados (por exemplo, CD34, CD38, CD45, CD14), marcadores de células mesenquimais (CD146, VEGFr, CD31) e para ex- pressão de P450s ou alfa-fetoproteína. Foi descoberto que as HSCs são origem a hepatoblastos e a progenitores biliares comprometidos (unipoten- tes).

Hepatoblastos (HBs) são células pluripotentes encontradas por todo o parênquima de fígados fetais e neonatais e como células únicas ou pequenos agregados de células limitados às terminações dos Canais de He- ring. HBs derivam das HSCs. HBs partilham muitos antígenos presentes em HSCs, mas como distinções importantes. Por exemplo, HBs não expressam NCAM mas ao invés disso, ICAM1 e eles expressam quantidades significati- vas e alfa-fetoproteína e formas fetais de P450s. Esses HBs dão origem aos progenitores unipotentes, os progenitores hepatocíticos e biliares comprome- tidos.

Progenitores hepáticos comprometidos são progenitores unipo- tentes de uma das linhagens hepatocítica e biliar. Seu perfil antigênico so- brepõe aquele dos HBs; entretanto, progenitores comprometidos biliares ex- pressam CK19, mas não AFP ou ALB, enquanto que os progenitores hepa- tocíticos comprometidos expressam AFP e ALB mas não CK19. Progenito- res biliares comprometidos derivam diretamente de células-tronco hepáticas e também de hepatoblastos.

Células Mesenquimais (MCs) incluem células em vários estágios de linhagem dos muitos tipos de células mesenquimais diferentes (listados como células maduras e, em parênteses, seus precursores); incluindo es- troma (células-tronco mesenquimais), endotélio (angioblastos), células estre- ladas (precursores de células estreladas), e várias células hematopoiéticas (células-tronco hematopoiéticas).

Embora a maioria, mas não toda, a discussão e exemplos de progenitores hepáticos aqui contidos seja em relação às populações de célu- las derivadas de humano, os ensinamentos aqui contidos não devem ser limitados a seres humanos. De fato, espera-se que um versado na técnica possa aplicar os ensinamentos aqui contidos para a expansão de progenito- res hepáticos de mamíferos, geralmente (por exemplo, camundongos, ratos, cães, etc.). Conseqüentemente, o escopo da presente invenção pretende incluir progenitores hepáticos de qualquer e todos os mamíferos.

Também é observado que progenitores hepáticos adequados para propagação in vitro de acordo com a presente invenção não são limita- dos àqueles isolados ou identificados por nenhum método em particular. Como forma de exemplo, métodos para o isolamento e identificação dos progenitores hepáticos foram descritos em, por exemplo, USP Nq 6.069.005 e Pedidos USP Nes 09/487.318; 10/135.700; e 10/387.547, as descrições das quais estão incorporadas aqui na sua totalidade por referência.

Células-tronco hepáticas e hepatoblastos têm perfis antigênicos característicos e podem ser isolados por protocolos descritos anteriormente. Por exemplo, células-tronco hepáticas e hepatoblastos partilham vários antí- genos (por exemplo, citoqueratinas 8, 18 e 19, albumina, CD133/1, e molé- cula de adesão celular epitelial ("EpCAM") e são negativas para marcadores hematopoiéticos (por exemplo, glicoforina A, CD34, CD38, CD45, CD14) e marcadores de células mesenquimais (por exemplo, CD146, CD31, VEGFr ou KDR). Alternativamente, células-tronco hepáticas e hepatoblastos podem ser diferenciados um do outro por tamanho (as células-tronco tem 7-9 μm; os hepatoblastos tem 10-12 μm), por morfologia em culturas (as células- tronco foram colônias densas, morfologicamente uniformes, enquanto que os hepatoblastos formam estruturas semelhantes a um cordão intercaladas por canais claros, presumíveis canalículos), por distinções no padrão de expres- são de certos antígenos (EpCAM é expresso em toda a célula-tronco hepáti- ca mas está confinado à superfície celular nos hepatoblastos), ou por perfis antigênicos distintos (N-CAM está presente nas células-tronco hepáticas, enquanto que alfa-fetoproteína (AFP) e ICAM1 são expressos pelos hepato- blastos). Em fígados fetais e neonatais, as células-tronco hepáticas estão nas placas dos duetos (também chamadas "placas limitantes"), enquanto que os hepatoblastos são a população de células parenquimatosas domi- nante (>80%). Em tecidos pediátricos e adultos, as células-tronco hepáticas estão presentes nos Canais de Hering, enquanto que os hepatoblastos são células limitadas às extremidades dos Canais de Hering. Os hepatoblastos consistem em pequenos números de células em tecido normal mas encon- trados em grandes números (por exemplo, nódulos) em fígados doentes (por exemplo, cirrose).

Os presentes inventores descobriram que componentes de ma- triz extracelular encontrados nos ou próximo dos nichos de células-tronco do fígado, fornecem expansão dos progenitores hepáticos sem induzir diferen- ciação melhor do que a tecnologia existente. Como será descrito em maior detalhe abaixo, células cultivadas sobre os componentes de matriz, encon- trados em abundância nas ou próximo dos nichos de células tronco, se a- gregam para formar estruturas esferóides sobre alguns dos componentes de matriz (por exemplo, lamininas) e se espalham em monocamadas sobre ou- tros (por exemplo, colágeno tipo III). Tipos específicos de componentes da matriz extracelular, encontrados no nicho de células tronco, estão entre os sinais necessários para as células progenitoras hepáticas sofrerem expan- são de modo auto-replicativo, isso é divisões células simétricas (as células filha são idênticas ou quase idênticas às células parentais).

Acredita-se ainda que a maturação de células-tronco hepáticas ocorre concomitantemente com uma combinação única de componentes da matriz que direcionam, pelo menos em parte, sua diferenciação. Alguns componentes da matriz extracelular são permissivos para progenitores hepá- ticos sofrerem expansão associada com divisões assimétricas, isto é expan- são junto com alguma diferenciação. Outros ainda, localizados em regiões do tecido do fígado nas quais células hepáticas completamente maduras são encontradas, fazem surgir parada de crescimento e completa diferenciação das células.

Dessa forma, manutenção de células-tronco hepáticas na sua forma imatura in vitro é auxiliada por sua cultura em componentes da matriz em tecido embrionário (ou em nichos de células tronco). Da mesma forma, sua diferenciação pode ser afetada in vitro por cultura com componentes da matriz encontrados, ou em abundância em, tecido maduro. De fato, progeni- tores hepáticos plaqueados em componentes de matriz encontrados em as- sociação com células parenquimatosas maduras, tal como colágeno tipo I e certas formas de fibronectina, localizados no Espaço de Disse próximo das veias centrais do ácino do fígado, se dividem lentamente e então param de proliferar, o que é acompanhado por restrição de linhagem para o destino hepatocítico. Os progenitores hepáticos são incapazes de se ligar ou sobre- viver sobre fibronectina, e aqueles que não se ligam sofrem rápida apoptose e morte. Entretanto, os progenitores hepáticos dão origem a descendentes que requerem fibronectina para adesão, sobrevivência e funções. Dessa forma, as necessidades para tipos específicos ou químicos de componentes da matriz extracelular são dependentes da linhagem, isto é eles se correla- cionam com estágios de maturação específicos das células.

O escopo da presente invenção não deve ser limitado a nenhum componente de matriz ou combinação disso. De acordo com os ensinamen- tos aqui contidos, a presente invenção descreve e ensina o uso de qualquer um e todos os componentes de matriz extracelular e suas combinações na geração de substratos que podem ser utilizados para manutenção ex vivo de células tanto para expansão como para diferenciação. Embora muitos des- ses componentes sejam discutidos abaixo, por motivo de clareza, lamininas, colágenos tipo IV e/ou colágenos tipo III serão discutidos como meros repre- sentantes de uma classe de componentes da matriz extracelular que são encontrados em ou em grande abundância em tecidos embrionários ou em nichos de células tronco.

Exemplos não-limitantes de componentes da matriz embrionária incluem: tipos específicos de colágenos, incluindo Colágenos tipo IV (ainda incluindo a1, α2, α3, α4, α5, α6) e Colágenos Tipo III; Lamininas (incluindo, 1, γ1, β2, α3, α5); hialuronanos; formas de proteoglicanos (PGs) de sulfato de condroitin ou suas cadeias de glicosaminoglicano; e formas de sulfato de heparan-PGs ou suas cadeias de glicosaminoglicano (por exemplo, certos sindecanos). Exemplos não-limitantes de componentes da matriz encontra- dos em tecidos maduros incluem formas estáveis de colágenos (por exem- pio, tipo I e II), formas de fibronectina; sulfato de heparan-PGs (por exemplo, agrin, perlecan), heparina-PGs; dermatan-PGs (por exemplo, sulfato de dermatan associado com a cartilagem -PG); e elastinas.

Uma variedade de meios de cultura celular pode ser apropriada para a presente invenção. Pela adição ou remoção de fatores de crescimen- to e/ou diferenciação do meio de cultura, a taxa de proliferação e/ou diferen- ciação celular pode ser influenciada. Por exemplo, a adição de soro pode retardar o crescimento de progenitores hepáticos e causar restrição de li- nhagem em direção ao destino hepatocítico e, em paralelo, causa rápida expansão de populações de células mesenquimais (estroma e endotélio). A adição de fator de crescimento epidérmico leva a restrição de linhagem em direção a um destino hepatocítico.

Preferivelmente, em algumas modalidades, os componentes da matriz aqui descritos são empregados em combinação com um meio livre de soro. Um meio livre de soro foi desenvolvido anteriormente para hepatoblas- tos e é descrito no Pedido de Patente U.S. Ne 09/678.953, a descrição do qual está incorporada por referência aqui na sua totalidade. Sem estar preso ou ligado por teoria, atualmente acredita-se que os componentes de matriz da presente invenção fornecem muitos dos sinais de sobrevivência, cresci- mento e/ou proliferação, geralmente fornecidos por células alimentadoras. Dessa forma, a presente invenção pode substituir em parte significativa, a necessidade por células alimentadoras do estroma embrionário para manter a viabilidade e potencial de expansão dos progenitores hepáticos.

Uma modalidade da presente invenção será agora descrita co- mo forma de exemplos não-limitantes.

Exemplos

Meio & Tampões

A menos que observado de outra maneira, meio livre de soro foi usado durante o processamento do tecido de fígado e manutenção de cultu- ras celulares. Esse meio compreende 500 ml de RPMI 1640 suplementado com 0,1% de albumina de soro bovino, Fração V, holo-transferrina bovina 10 μg/ml (saturada com ferro), insulina 5 μg/ml, 500μl de selênio, 5 ml de L- glutamina, 270 mg de niacinamida, 5 ml de antibiótico AAS1 500μl de hidro- cortisona, 1,75 μl de 2-mercaptoetanol e 38 μl de uma mistura de ácidos graxos livres preparados como publicado no Pedido de Patente U.S. Nº 09/678.953. O meio é esterilizado e seu pH ajustado para 7.4 antes do uso.

"Tampão de Lavagem Celular" compreende 500 ml de RPMI 1640 suplementado com 1% de albumina de soro bovino, 500 μl de selênio e 5 ml de antibiótico AAS. "Tampão de Digestão Enzimática" compreende 100 ml de Tampão de Lavagem Celular suplementado com 60 mg de colagenase tipo IV e 30 mg de DNase dissolvidos a 37°C.

Aquisição & Preparação de Tecido

Tecido de fígado de fetos humanos entre 16-22 semanas de i- dade gestacional foi obtido de uma agência credenciada, tal como, por e- xemplo, Advanced Biosciences Resources of Alameda, CA. Preferivelmente, os tecidos foram recebidos dentro de 18 horas de isolamento e chegaram como seções múltiplas de tecido de fígado ou, ocasionalmente, como fígado razoavelmente intacto. Em geral, os volumes totais de tecido variaram entre cerca de 4 ml e cerca de 12 ml e continham grandes quantidades de células sangüíneas vermelhas (RBCs).

Os fígados foram dissociados mecanicamente e o tecido foi par- cialmente digerido com o tampão de digestão enzimática produzindo aglo- merados de células parenquimatosas. Esses aglomerados foram submetidos à lavagem e centrifugação em baixa velocidade para eliminar substancial- mente células hematopoiéticas flutuantes livres ainda retendo parênquima hepático. Os fígados dissociados foram então segmentados em alíquotas de 3 ml, às quais 25 ml de Tampão de Digestão Enzimática foram adicionados. Após 30 minutos de agitação moderada a 32°C, o sobrenadante foi removi- do e armazenado a 4°C. Qualquer precipitado não fragmentado residual foi re-digeridos com Tampão de Digestão Enzimática fresco por 30 minutos adi- cionais. Após o término da digestão enzimática dos fragmentos de tecido, as suspensões celulares foram centrifugadas a 250 força centrífuga relativa (RCF); os sobrenadantes removidos; e os precipitados ressuspensos em uma quantidade equivalente de Tampão de Lavagem Celular. Técnicas de isolamento

Suspensões de células hepáticas de fígados fetais estão reple- tas de células hematopoiéticas, especialmente células eritróides. De fato, suspensões celulares originais de fígados fetais humanos consistem, em média, em apenas 6-9% de células parenquimatosas com o restante sendo de várias células não-parenquimatosas, particularmente células eritróides. Como métodos de rotina para eliminação de células eritróides, tal como uso de um tampão de Iise1 podem ser tóxicos para os progenitores hepáticos, outros métodos podem ser preferíveis. Por exemplo, as células eritróides podem ser separadas das células parenquimatosas por centrifugações em baixa velocidade repetidas usando métodos previamente publicados (Lilja et al, 1997; Lilja et al., 1998).

Um método alternativo e mais eficaz, citotoxicidade mediada por complemento, pode ser utilizado para minimizar a perda de células-tronco candidatas. Após a digestão por colagenase, anticorpos anticélula vermelha sangüínea humana (RBC) podem ser incubados com a suspensão celular (diluição 1:5000) por 15 minutos a 37°C. Para puncionar e Iisar eritrócitos mar- cados com anticorpo, complemento (por exemplo, complemento LowTox de Porco da Guiné) é adicionado (diluição de 1:3000) com uma incubação de 10 minutos a 37°C. O sobrenadante celular se tornará cor-de-rosa devido à hemo- globina liberada pelos eritrócitos. As suspensões purificadas das células hema- topoiéticas consistem em pelo menos 80-90% de células parenquimatosas.

A suspensão resultante, a partir da qual as células hematopoiéti- cas foram purificadas, é então submetida a uma segunda rodada de diges- tão enzimática em solução de colagenase fresca por 30 min para minimizar a aglomeração celular, seguida por peneiração através de uma peneira de náilon de 75 μm. A viabilidade celular estimada por exclusão com azul de tripan foi habitualmente maior do que 95%. Após a filtração, a maioria dos hepatoblastos foi visualizada como células aglomeradas contendo 4 a 8 células por aglomerado. Juntas, essas técnicas ajudam a gerar suspensões celulares substancialmente livres de células sangüíneas vermelhas e ainda enriquecidas com células hepáticas parenquimatosas. Protocolos de enriquecimento adicionais incluem Fracionamento com Ficoll para isolamento de hepatoblastos. Resumidamente, as células são suspensas em 10 ml de meio basal sem vermelho de fenol e cobertas com um volume igual de Ficoll-Paque (Amersham Pharmacia) em um tubo de centrífuga de 50 ml. As células são subseqüentemente centrifugadas a 1000 χ g por 25 minutos. Tanto a interface como as células precipitadas são coletadas. O fracionamento com Ficoll produz precipitados que tem geral- mente mais do que 80% de células parenquimatosas, essencialmente todas as quais são hepatoblastos e uma interface de 13-14% da população de cé- lulas original com perfis antigênicos diversos indicando células parenquima- tosas, hemotopoiéticas e endoteliais. As células da interface do Ficoll produ- zem colônias de células da placa dos duetos a 0,1%, um aumento de 10 ve- zes sobre aquele da suspensão original de células. Embora os resultados do fracionamento com Ficoll serem mais consistentes para o isolamento de he- patoblastos, eles tendem a ser mais variáveis de preparação para prepara- ção no isolamento das células-tronco.

Imunosseleçãõ é outra técnica para enriquecimento e/ou isola- mento de células-tronco hepáticas (células da placa dos duetos) ou outras sub-populações. Protocolos de imunosseleção preferíveis são aqueles que empregam antígenos com expressão intensa sobre as células (por exemplo, EpCAM encontrado sobre todas as progenitoras hepáticas) e outros em uma subpopulação de progenitor hepático (por exemplo, NCAM sobre células da placa dos duetos). A imunosseleção pode ser por qualquer um dos diversos métodos para esses procedimentos e pode ser com citômetros, peneiração ou esferas magnéticas.

Imunosseleção Magnética compreende o isolamento de células que expressam, por exemplo, EpCAM a partir de suspensões de célula de fí- gado humano usando anticorpo monoclonal HEA125 acoplado a microesferas magnéticas e um sistema de separação de coluna magnética autoMACS™ ou CliniMACS® de Miltenyi Biotec (Bergisch Gladbach, Alemanha), seguindo os protocolos recomendados pelo fabricante. Métodos similares foram usados para imunosseleção de células NCAM, CD146, KDR (VEGFr), e CD133/1. Ensaios ,

Para todos os ensaios realizados, foram utilizadas placas de pe- tri de 6 cavidades e 0,8 x 10^6 células parenquimatosas foram semeadas por cavidade. Nas primeiras 10 horas após a semeadura inicial, o meio foi su- plementado com 10% de soro fetal bovino. Acredita-se que a suplementação com soro durante o plaqueamento inicial facilite a inativação das enzimas usadas na digestão do tecido e auxilie o acoplamento inicial. Posteriormente, apenas meio livre de soro foi usado. Geralmente, o meio foi trocado em in- tervalos de 24 horas e, em alguns casos, com intervalos de 3 dias. A menos que observado de outra maneira, os valores experimentais foram normaliza- dos para os volumes de meio nutriente e número de células. Uréia

Ensaios baseados na interação direta de uréia com monoxima de diacetila foram conduzidos para determinar a concentração de uréia de amostras de meio coletadas. Padrões e reagentes foram adquiridos como kits de diagnóstico da Sigma. Os kits foram modificados para uso em micro- placas de 96 cavidades. Para essa modificação, padrões de concentração diluídos foram inicialmente preparados. Usando diluições seriadas, as con- centrações padronizadas foram diminuídas para produzir uma faixa de pa- drões entre 0 - 30,76 mg/dl. Então, um reagente combinado ("Reagente- combinado") é feito pela mistura de reagente ácido de sangue-uréia- nitrogênio (bun) e reagente de cor bun em uma proporção de 1,3 para 1,0.

O protocolo do ensaio consistiu em um primeira aplicação de

9 ml da amostra apropriada (por exemplo, branco, padrão ou amostra) em cada cavidade da microplaca seguido por 100 ml de Reagentecombinado. A microplaca aplicada foi então aquecida a 50°C por aproximadamente 25 minutos ou até que alterações distintas do padrão de cor fossem visíveis dentro dos padrões de concentração. Depois, a base da microplaca foi res- friada com gelo por 3 minutos. Imediatamente após o resfriamento, as vari- âncias de densidade óptica foram medidas em 535 nm usando um leitor de multi-cavidades citofluor. Amônia - NHg

Ensaios colorimétricos baseados na reação de NH3 com azul de bromofenol (indicador de amônia) foram analisados com sistema químico VITROS DT60 Il (Ortho-Clinical Diagnostics, Rochester NY). O processo au- tomatizado requer uma amostra de 10 μΙ, um tempo de incubação de 5 mi- nutos, uma câmara com ambiente a 37°C e um cubo de medição de absor- bância de 605 nm. Uma vez dentro do analisador químico, a lâmina é mar- cada para variações de densidade óptica e analisada contra padrões pré- calibrados.

Glicose

O sistema químico VITROS DT60 Il usa uma seqüência de rea- ção dupla. Inicialmente, a oxidação de amostra de glicose é catalisada pela glicose oxidase para formar H2O2. Essa reação é seguida por um acopla- mento oxidativo catalisado por peroxidase na presença de precursores de corantes, na qual a intensidade do corante é medida pela luz refletida. En- saios individuais consistem em uma primeira aplicação de 10 μΙ da amostra apropriada (por exemplo, branco, padrão ou amostra) sobre cada lâmina química. Uma vez dentro do analisador químico, a lâmina é marcada para variações de densidade óptica e analisada contra padrões pré-calibrados.

Imunomanchamento

A imunomanchamento de células foi feito após a fixação da cul- tura usando uma mistura 50/50 de acetona e metanol por 2 minutos, lava- gem de novo com 1 χ PBS e bloqueio com 10% de soro de cabra por 45 mi- nutos. Então, um anticorpo humano primário, conjugado com uma sonda fluorescente, foi adicionado por uma a oito horas em temperatura ambiente. Quando um anticorpo primário não conjugado foi usado, as células foram coradas com um anticorpo secundário conjugado com uma fluorossonda.

Proliferação

A proliferação de progenitores hepáticos foi avaliada macrosco- picamente por visualização de imagem de alterações do crescimento da co- lônia usando microscopia com aumentos de 4x, 10x e 20x; as objetivas de menor aumento permitiram observação de colônias inteiras. Curvas de cres- cimento foram obtidas por imagens repetidas da colônia e as micrografias normalizadas contra dimensões pré-calibradas conhecidas pelo MetaMorph Image Software para análise estatística comparativa.

Preparação de Matrizes de Cultura de Tecido

Estudos de controle incluíram semear células de fígado fetal humano diretamente sobre plástico para cultura de tecido (TCP) (Figura 1 A). Placas de fibronectina foram preparadas em três concentrações diferentes (0,5, 1,0, ou 2 μg/cm2) e ajustadas para pH 7.5. Placas de colágeno tipo I foram preparadas em concentrações de 1 a 1,5 mg/ml. Para essa prepara- ção, Vitrogen 100 de alta densidade (Cohesion Technologies, Palo Alto, CA) foi modificado para colágeno tipo I líquido pela adição de proporções especí- ficas de DMEM 10x e NaOH 0,1 M. Mais especificamente, a Figura 1B mos- tra uma modalidade na qual 0,25ml de NaOH 0,1 M, 0,25 ml de DMEM 10x ou PBS e 1,5 mg/ml de Vitrogen 100 são combinados e cuidadosamente misturados a 4°C para gerar uma solução homogênea. Durante esse pro- cesso pode ser desejável evitar a introdução de bolhas de ar dentro das suspensões de colágeno I recentemente formadas já que lacunas de ar po- dem desestabilizar o colágeno.

As suspensões de colágeno tipo I foram utilizadas para pré- revestir superfícies de cavidades de placas de petri para ambos os esque- mas de Placa Plana (FP) e "sanduíche" como mostrado nas Figuras 1C e 1D, respectivamente. FPs foram preparadas com 0,4 ml de suspensão de colágeno I em cada cavidade de uma placa de seis cavidades. As suspen- sões de colágeno I foram deixadas gelificar a 37°C e 5% de CO2 por uma hora. Após a gelificação, as placas/cavidades estavam prontas para receber os progenitores hepáticos.

As placas sanduíche podem ser preparadas de uma maneira idêntica àquela das FPs. Entretanto, a fim de "empilhar" as células, uma se- gunda camada de suspensão de colágeno é derramada sobre uma FP com células ligadas sobre ela. Como com as FPs, as placas sanduíche foram gelificadas em incubadora a 37°C e 5% de CO2 por uma hora para solidificar a nova camada superior de colágeno. Após a gelificação, 0,5 ml de meio livre de soro foi adicionado como suporte nutritivo.

Placas revestidas com laminina foram preparadas em duas con- centrações diferentes (0,52 ou 1,0 μg/cm2) e ajustadas para pH 7,5. Reves- timentos de colágeno foram preparadas sobre placas utilizando 1 de 5 con- centrações de proteína diferentes (2,1; 4,2; 6,3; 8,3 ou 10,4 μg/cm2). Após o revestimento, a matriz foi deixada acoplar por 10 horas a 37°C e 5% de CO2. O processo de revestimento está ilustrado na Figura 2, onde moléculas alea- tórias de matriz foram distribuídas heterogeneamente dentro de tampões acéticos e dentro das placas. Em cerca de 10 horas, as moléculas de matriz se estabilizaram e se acoplaram a superfície da cavidade em arranjos ho- mogêneos simples. As placas foram subseqüentemente esterilizadas com UV por duas horas e enxaguadas com PBS 1x para neutralizar o pH ácido. Placas de colágeno III foram preparadas similarmente com ácido acético com pH 3 e placas de colágeno IV com ácido acético 0,5 M.

Onde plaqueados em combinação, colágeno tipo Ill e laminina foram co-plaqueados sobre superfícies de TCP tal que suas concentrações individuais eram 6,25 μg/cm2 e 0,52 μg/cm2 respectivamente. Colágeno tipo IV e laminina foram co-plaqueados sobre superfícies de TCP tal que suas concentrações individuais eram 4,2 μg/cm2 e 1,0 μg/cm2 respectivamente. Identificação dos Componentes da Matriz no Compartimento de Células- tronco do Fígado

Os componentes da matriz no compartimento de célula-tronco foram identificados in vivo pela imuno-histoquímica de secções de fígado fetal e in vitro por ensaios para componentes de matriz produzidos por célu- las alimentadoras mesenquimais embrionárias. Angioblastos, que são o par- ceiro mesenquimal nativo de células-tronco hepáticas e alimentadoras de estroma embrionário de murino (por exemplo, células STO) foram usados como células exemplares para esses experimentos. Como mostrado na Ta- bela I, o estudo determinou que células alimentadoras (por exemplo, angio- blastos e alimentadoras STO) produzem laminina, colágeno tipo III e coláge- no tipo IV, hialuronanos e proteoglicano de sulfato de heparan. Observe-se que células-tronco hepáticas têm receptores para ambos hialuronanos (Figu- ra 3) e colágenos identificados.

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Uma análise comparativa mais detalhada é apresentada na Tabela Il <table>table see original document page 24</column></row><table> O levantamento na Tabela Il descreve respostas de células- tronco hepáticas humanas, incluindo ligação celular, sobrevivência celular, formações de cultura geométrica, formações de colônias únicas, taxas de divisão, respostas de imunohistoquímica, junto com produções de glicose funcional e de uréia. Para a ligação, células-tronco hepáticas estabeleceram interações de matriz celular quando cultivadas tanto em Iaminina como em colágenos tipo Ill ou IV ou no substrato de colágeno tipo I adulto. O único substrato analisado no qual houve mínima ligação foi sobre fibronectina. A- lém disso, sobrevivência celular de mais do que 10 dias é evidente sobre todos os substratos da matriz exceto fibronectina, que promoveu rápida a- poptose para a poucas células que se ligaram. Isso é digno de nota, já que células parenquimatosas maduras requerem fibronectina para ligação, so- brevivência e funcionamento.

A seguir, as formações geométricas das culturas foram observa- das. Laminina e fibronectina induziram agregados esferóides 3D enquanto que outros substratos induziram monocamadas das células. Além disso, ex- pansão clonogênica foi observada para as células plaqueadas sobre Iamini- na, colágeno tipo Ille colágeno tipo IV; enquanto que a formação de colônia ou não crescimento foram observados para colágeno tipo I e fibronectina, respectivamente. Além disso, colágeno tipo III induziu taxas de divisão de menos do que cerca de 24 horas, enquanto que células semeadas sobre colágeno tipo Ill ficaram mais lentas e então entraram em parada de cresci- mento e então mantiveram as células viáveis e funcionais.

As respostas de imunohistoquímica também são comparadas para albumina (ALB), citoqueratina 19 (CK19), α-Fetoproteína (AFP), E- Caderina (E-CAD), Molécula de Adesão de Célula Epitelial (EpCAM), molé- cula de adesão de célula neural (NCAM), e Citoqueratinas 8 e 18 (CK8 e 18). A resposta mais dominante e positiva é apresentada como NCAM+, EpCAM (++), ALB (+) e CK8 e CK18 (+). De forma interessante, CK19 foi fortemente expresso por células-tronco cultivadas sobre laminina, colágeno tipo III, e colágeno IV e negativo para aquelas plaqueadas sobre colágeno tipo I e fibronectina. Esse achado sugere que atividades bipotentes precoces são restritas às linhagens por componentes de matriz em abundância em tecido maduro. Além disso, as altas atividades de AFP e ALB para células sobre colágeno I indica células parenquimatosas sofrendo restrições de li- nhagem em direção a progenitores hepatocíticos comprometidos, um acho corroborado por dados que indicam forte expressão de glicose e produção uréia.

Voltando-se primeiro para progenitores hepáticos plaqueados di- retamente sobre a superfície de TCP, características morfológicas de hepa- toblastos humanos e células-tronco hepáticas e parceiros de células mesen- quimais humanas foram acompanhadas em uma investigação por um perío- do de tempo de 31 dias. No dia 0, as células do fígado estavam homogene- amente distribuídas sobre as superfícies de TCP. As populações de hepato- blasto inicial (h) estavam organizadas como aglomerados esferóides conten- do 3-8 hepatoblastos (U) mas também foram encontradas como células úni- cas (T), como ilustrado na micrografia a 20x da Figura 4A. Nessa figura, os hepatoblastos foram identificados por um diâmetro médio de cerca de 10 μιτι a cerca de 12 μιτι, enquanto que as células menores com um diâmetro de menos do que cerca de 10 μηι eram consideradas células mesenquimais,, RBCs residuais ou células-tronco hepáticas. Culturas celulares eram não- confluentes com múltiplos agregados esferóides heterogêneos ligados sobre a superfície.

Em torno do dia 5 de cultivo, as RBCs residuais se soltaram da superfície de TCP e morreram. As populações celulares remanescentes, na maioria hepatoblastos e várias células mesenquimais (mes), estavam estabi- lizadas nas suas respectivas morfologias como mostrado na Figura 4B. Essa estabilização promoveu confluência de cultura de hepatoblastos (h) como evidenciado em populações de hepatoblastos que eram achatadas, disper- sas e tinham contato célula-célula iniciado. Além disso, hepatoblastos manti- veram boas distinções celulares com contornos de membrana nítidos, e ca- racterísticas citoplasmáticas regulares. Adicionalmente, interações co-cultura limitadas estavam presentes com poucas e discretas fronteiras entre os tipos celulares de hepatoblastos e células mesenquimais. No dia 15 (Figura 4C), os hepatoblastos tinham membranas "granulosas" e características citoplasmáticas consistentes com células em deterioração. Adicionalmente, a razão entre hepatoblasto e células mesen- quimais tinha se equalizado, sugerindo que células não-parenquimatosas estavam ocupando mais área de superfície com os hepatoblastos elimina- dos. Esse achado se assemelhou ao fenômeno clássico de "super cresci- mento de fibroblasto", mesmo na ausência de suplementação do meio com soro. Essas alterações indicaram que as condições de cultura de TCP con- duziam para expansão de células mesenquimais e não eram preferíveis para proliferação e sobrevivência de hepatoblastos. De fato, no dia 31, os hepa- toblastos haviam morrido ou se reorganizado empilhados já que as células mesenquimais preencheram a superfície da cultura, como mostrado na mi- crografia a 20x na Figura 4D.

A seguir, foi feita uma comparação de progenitores hepáticos humanos quando cultivados sobre TCP versus FP ou géis de colágeno tipo I sanduíche. Culturas de 10 dias são mostradas na Figura 5. Para o controle de cultura de "células sobre TCP", mostrado na Figura 4A, hepatoblastos (h) apresentaram características citoplasmáticas granulares com bordas celula- res indistintas. Adicionalmente, células mesenquimais (mes), na maior parte endotélio e estroma, circundaram as colônias de hepatoblastos. A aparência dos hepatoblastos (h) sobre o plástico foi acentuadamente diferente daquela quando semeada sobre colágeno tipo I (FP) para o mesmo tempo em cultura (Figura 5B). Os hepatoblastos mostraram bordas celulares definitivas e cito- plasma celular agranular - característica de hepatoblastos estáveis. Adicio- nalmente, células mesenquimais mostraram proliferação limitada, mas tam- bém mantiveram características de borda celular notáveis.

hepatoblastos cultivados usando um esquema sanduíche ilus- trado na Figura 4C demonstraram contatos célula-célula estabelecidos, bor- das celulares definitivas, e expressão dupla de funções hepatocíticas e bilia- res como evidenciado por imunomanchamento para albumina (vermelho) e CK19 (verde). Os resultados foram indicativos de estabilização de bipotência nessa população progenitora. Uréia é produzida unicamente por células maduras do fígado. Dessa forma, sua expressão pode ser indicativa de expressão gênica tecido específica e uma extensão significativa de diferenciação. Conseqüentemen- te, a fim de estudar a extensão de diferenciação das células hepáticas imatu- ras como uma função das proteínas da matriz in vitro, a concentração de uréia no meio foi determinada após várias horas em cultura.

A figura 6 mostra hepatoblastos cultivados sobre matrizes extra- celulares que são dominantes em tecidos de fígado embrionário e fetal. Uma listagem parcial dessas matrizes in vivo inclui colágeno III (■), colágeno IV (•), laminina (o), e uma mistura de colágeno IV-laminina (∇), que são anali- sadas e comparadas contra controles de TCP (▼). Para a análise de uréia, os hepatoblastos foram monitorados pelos dias 1 - 5 e seus resultados de uréia normalizados são apresentados no eixo vertical.

Em geral, as células de controle sobre TCP (▼) apresentaram atividade inferior por toda a investigação - tendo magnitudes de uréia máxi- mas e mínimas de 5,5 x 10"6 e 1,5 x 10"6 mg/dL, respectivamente. Mais es- pecificamente, distinções imediatas foram observadas no dia 1 quando os hepatoblastos semeados tanto em "colágeno IV" como "mistura de colágeno IV e laminina" atingiram níveis de uréia de 9,5 x 10"6 mg/dL; todas as outras culturas testadas tiveram níveis de uréia próximos de 5,3 x 10"6 mg/dL - ou desvios de 56% entre hepatoblastos altamente ativos e sedentários. Algu- mas mudanças foram observadas entre os resultados do dia 1 e do dia 2, exceto que hepatoblastos semeados sobre "colágeno e laminina" mostraram evidência de leves declínios na função de uréia. No dia 3, entretanto, as cul- turas em colágeno IV (●) revelaram a melhor atividade de função de uréia atingindo 1,2 x 10"5 mg/dL, enquanto que as outras culturas expressaram níveis de uréia 33% menores. No dia 5, os níveis de uréia reduziram para os níveis de expressão de uréia mínimos de 2 x 10"6 mg/dL sugerindo que a amônia foi depletada do meio de cultura já que a expressão de uréia requer fatores de amônia.

A produção de uréia é expressa como concentrações "por célu- la" de uréia (Figura 6B). Esses gráficos representam a concentração de uréia por um período de 24 horas e são marcados tal que os pontos de dados cir- culares "pretos sólidos (•)" são hepatoblastos sobre TCP (controle), pontos de dados circulares "brancos sólidos (o)" são hepatoblastos de culturas se- meadas sobre colágeno tipo I (Placa Plana, FP), e pontos de dados "cinza" triangulares (Δ) são hepatoblastos cultivados entre camadas de colágeno tipo I (esquema sanduíche), respectivamente. Dessa forma, avaliações de gasto de tempo foram analisados para os dias 3 até 6 de cultura.

Como ilustrado para cada sistema, os níveis de concentração de uréia foram altos no dia 3, mas diminuíram continuamente por toda a investi- gação. Também foram observados níveis de uréia menores no controle por todo o estudo, Hepatoblastos cultivados em configurações FP e sanduíche tiveram atividades similares de 8,0 x 10-5 e 5,0 x 10-6 mg/dL para os dias 3 e 4, respectivamente. Esses valores correspondem a melhoras de ~ 80% na atividade quando comparados a culturas de controle sobre plástico de cultu- ra. Da mesma forma, o sistema de Placa Plana revelou maior atividade de hepatoblastos nos dias 5 & 6. Como apresentado, a atividade de FP de he- patoblasto exibiu -8% melhor atividade do que Sanduíche e ~ 115% melhor atividade do que culturas analisadas em TCP.

Dois ensaios adicionais foram usados para comparar atividade funcional para células semeadas sobre as várias matrizes. A figura 7 repre- senta a produção de glicose e amônia, respectivamente, no dia 3, que foi mostrada ser o tempo da maior atividade diária de uréia (Figura 6). A compa- ração de glicose na Figura 7A, mostra níveis de controle de cultura de TCP em 1,5 x 10-3 mg/dL - marcado em preto sólido (┃), níveis de cultura de FP de colágeno tipo-l em 1,63 x 10"3 mg/dL marcado com branco sólido (∥), e níveis de cultura sanduíche de colágeno tipo I em 2,6 x 10-3 mg/dL - marca- do em cinza sólido. Comparações entre culturas sanduíche e TCP ou FP mostraram culturas sanduíche com níveis de glicose -64% mais altos do que outras respostas do sistema celular.

Figura 7B apresenta a acúmulo de amônia em culturas de TCP em magnitudes de concentração de 4,5 x 10-3 mmol/L, em sistemas de FP de 2,8 x 10"3 mmol/L e de sistemas de colágeno sanduíche de 2,6 x 10-3 mmol/L. As culturas de FP e sanduíche tiveram níveis de amônia reduzidos e os controles apresentaram níveis de amônia em magnitudes -60% maio- res.

Hepatoblastos demonstraram alterações morfológicas ditadas pela química de seu substrato, como indicado na Figura 8. As Figuras 8A1, 8B1 e 8C1 mostram imagens de baixa ampliação e características de super- fície gerais de culturas do dia 10. Figuras 8A2, 8B2 e 8C2 mostram distinção de morfologia detalhada com maiores ampliações de imagem de culturas idênticas. Na Figura 8A1, a superfície da placa de petri foi pré-revestida com 6,25 mg/cm2 de colágeno III antes de semear células hepáticas fetais. No dia 10, altas quantidade de massas de tecido interconectadas e substrato coesi- vamente gelificado foram estabelecidas. Adicionalmente essa cultura mos- trou subdivisões desenvolvidas, mas aleatoriámente dispersas, acelulares e circuiares. Para análises de imagem mais detalhadas, a micrografia da Figu- ra 8A2 mostra um segmento ampliado da Figura 8A1. Esse aumento mostra redes de hepatoblastos humanos em padrões intimamente agrupados.

Para se opor a esse efeito do ambiente celular, os estoques de hepatoblastos foram cultivados em superfícies de placas de petri revestidas com 0,52 mg/cm2 de laminina, como mostrado nas Figuras 8B1 e 8B2. Na Figura 8B1, grandes quantidades de "manchas brancas" segmentadas esta- vam dispersas por toda a superfície de semeadura. Esses grupos foram va- lidados na Figura 8B2 como agregados esferóides altamente compactos com contatos esferóide-a-superfície alongadas. Os esferóides cresceram e alteração das forças do meio fez com que esferóides grandes flutuassem, muitas das pontes de ligações de superfície se quebraram e as células fo- ram lavadas das culturas. Entretanto, os esferóides podiam ser transplanta- dos para substratos de colágeno I e colágeno Ill para induzir novamente a ligação celular e futura dispersão.

Para um terceiro contraste de efeitos de matriz celular, as mes- mas células de fígado fetal foram cultivadas sobre superfícies de placas de petri de colágeno Ill-Iaminina pré-revestidas em concentrações de 6,25 e 0,52 mg/cm2 respectivamente. Como mostrado na Figura 8C1, o efeito geral da cultura mostrou altas quantidades de massas de tecidos interconectadas usando fundos brancos. Áreas acelulares heterogêneas livres de componen- tes de tecido e matriz também foram evidenciadas. Da mesma forma, a Figu- ra 8C2 mostra hepatoblastos e células não-parenquimatosas co-cultivados que eram ativas e estáveis. A maioria das células eram hepatoblastos com disposições de cultura de "paralelepípedo" (cobblestone). Adicionalmente, algumas interações de borda entre pares de células parenquimatosas e não- parenquimatosas foram observadas.

O uso de substratos de matriz encontrados em abundância em tecidos embrionários (por exemplo, Iaminina e colágeno Ill e IV) induziu alte- rações morfológicas e funcionais específicas em hepatoblastos e também selecionou para células-tronco hepáticas (HSC), os precursores de hepato- blastos. A Figura 9 mostra a morfologia de células de fígado fetal semeadas em superfícies de TCP, laminina, colágeno Ill e colágeno IV e cultivadas por 3 a 10 dias. As imagens a 10x no dia 3 são referidas como TCP3, Iaminina3 e colágenolll3, e colágenolV3, enquanto que as imagens a 4x no dia 10 são referidas como TCP10, laminina 10, colágenollHO, e colagenolVIO.

Dia 3: as colônias de TCP3 de controle apresentaram grandes números de hepatoblastos (h) junto com pequenos números de células não- parenquimatosas (np). Comparativamente, as culturas do dia 3 sobre lamini- na consistiriam predominantemente em hepatoblastos, mas com menos cé- lulas ligadas e dispersão celular aumentada. Ao contrário, as células sobre colágeno Ill selecionaram para células-tronco hepáticas. Colônias de célu- las-tronco hepáticas foram reconhecíveis como células altamente agrupadas com morfologia uniforme e com tempos de duplicação de 1,2 dias. As célu- las tinham expressão característica de antígenos de HSC específicos (por exemplo, EpCAM+, NCAM+, albumina+, AFP-, CK19+, CK8+ e 18+). Adicio- nalmente, células de colônia de HSC tinham diâmetros característicos que variavam de 7 - 9 mm de extensão e com núcleos ocupando a maior parte do citoplasma da célula. As células de colônia se materializaram por volta do dia 3 e permaneceram circundadas por hepatoblastos. Da mesma forma, células do fígado semeadas sobre colágeno IV apresentaram muitos hepa- toblastos por toda a extensão da superfície da cultura com desenvolvimentos iniciais de duas colônias de HSC.

Dia 10: Os resultados das micrografias do Dia 10 foram tirados, em ampliação de 4x para facilitar a visualização da imagem da totalidade de algumas colônias de HSC. Para culturas de controle de TCP10, uma peque- na colônia de HSC se desenvolveu e permaneceu circundada por grandes números de hepatoblastos. Essa pequena colônia adquiriu um sulco grosso externo distinto com centro convexo. Para as culturas de Iaminina 10, hepa- toblastos se agregaram em pequenos agregados intimamente ligados for- mando estruturas tridimensionais com disposições esféricas e camadas de tecido espessas dentro de colônias de diâmetro pequeno. As culturas de colágenollMO continham grandes quantidades de colônias de HSC "achata- das e dispersas" mantidas como interações célula-célula altamente agrupa- das que aparentemente impediram a presença de outros tipos celulares. Na micrografia mostrada, alguns hepatoblastos subsistiram entre colônias em proliferação de HSC. Finalmente, as culturas de colágenolVIO continham tanto hepatoblastos como uma colônia de HSC recentemente surgida com bordas de colônia características e arestas das bordas elevadas.

Investigações mais detalhadas de colônias de HSC são mostra- das na Figura 10. Nessas figuras, o substrato de ligação era Colágeno IV revestido a 4,15 μg/cm2, e a colônia de célula-tronco hepática foi visualizada no dia 12. Como mostrado, alguns outros fenótipos celulares foram observa- dos na vizinhança dessa colônia ou em outro local da micrografia. Dessa forma, o ambiente pode ser considerado para selecionar tipos celulares em particular. Antes de adquirir a micrografia a 10x mostrada na Figura 10A, a colônia de HSC foi monitorada visualmente durante os dias 4-11. Durante esse tempo, as HSCs altamente compactadas se originaram como peque- nos agregados de menos do que cerca de 10 células e proliferaram em uma colônia maior contendo centenas a milhares de células como mostrado den- tro da área circular destacada marcada na Figura 10A.

No dia 12 e dentro de um período de tempo de 8 horas, entre- tanto, duas "erupções" ou protuberâncias significativas de células diferencia- das ocorreram nas bordas das colônias de HSC resultando em células com perfis antigênicos e morfológicos típicos de hepatoblastos. Essas protube- râncias foram distinguíveis como células diferenciadas levemente agrupa- das, com diâmetro maior e canais distintivos (canalículos biliares). A Figura 10B apresenta uma micrografia a 20x com focos centrais nas protuberâncias celulares. Nessa figura, a protuberância de células progenitoras hepáticas tinham diâmetros que variavam entre 15 e 21 nm, proporções de citoplasma para núcleo aumentadas, e um único núcleo, e um contato célula-célula sus- tentado com separação de bordas celulares e matriz extracelular definitiva. Adicionalmente, rastreamento morfológico de células diferenciadas que e- mergem de colônias de HSC mostraram cerca de 1200 novas células duran- te as primeiras 8 horas de expansão.

Componentes de matriz dentro da zona periportal e no nicho de célula-tronco do fígado são distintos daqueles encontrados em associação com as células parenquimatosas maduras e fazem surgir respostas biológi- cas distintas a partir de subpopulações purificadas de células tron- co/progenitoras hepáticas. Essas diferenças provavelmente fornecem diver- sos sinais que modificam as respostas celulares e ativam expressões dinâ- micas. Pela determinação de como as classes distintas de componentes da matriz extracelular induzem atividades celulares in vivo e in vitro, microambi- entes podem ser reproduzidos in vitro para expandir e diferenciar popula- ções de HSC para a substituição ou repopulação de tecidos doentes.

Dessa forma, células transplantadas evitam a substituição do ór- gão inteiro ao mesmo tempo. Além disso, aparelhos in vitro tais como biorre- atores podem ser semeados com progenitores hepáticos envelopados em uma matriz extracelular apropriada e ambiente de sinalização solúvel tal que eles populem subcompartimentos do aparelho com estruturas de tecidos viáveis. Dessa forma, dispositivos bioartificias podem ser utilizados para es- tudos de farmacologia, desenvolvimento de vacinas, e como ponte entre fa- lha de órgãos e transplante de órgãos. De fato, os resultados obtidos a partir dessas investigações sugerem que a utilização dessas células pode ser um caminho para melhorar limitações de fonte de células que atualmente inibem tanto a terapia celular como opções de tratamentos médicos com aparelhos biorreatores.

Embora a invenção tenha sido descrita em relação às modalida- des específicas dessa, será compreendido que ela é capaz de modificações adicionais e esse pedido pretende cobrir qualquer variação, uso ou altera- ções da invenção a seguir. Em geral, os princípios da invenção e incluindo tais desvios da presente descrição como está na prática conhecida ou co- mum dentro da técnica a qual invenção pertence e como pode ser aplicado às características essenciais descritas aqui anteriormente e como segue no escopo das reivindicações anexas.

Claims (30)

1. Método de propagar progenitores hepáticos in vitro que com- preende: (a) fornecer progenitores hepáticos isolados e (b) cultivar os progenitores hepáticos isolados sobre um ou mais componentes da matriz extracelular encontrados no compartimento de célu- la-tronco do fígado.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, no qual o componente da matriz extracelular encontrado no compartimento de célula-tronco do fígado é selecionado a partir do grupo que consiste em um colágeno tipo III, um colá- geno tipo IV, uma laminina, um hialuronano ou uma combinação desses.

3. Método de acordo com a reivindicação 2, no qual o compo- nente da matriz extracelular encontrado no compartimento de célula-tronco do fígado é um colágeno tipo Ill ou tipo IV ou uma combinação desses.

4. Método de acordo com a reivindicação 2, no qual os progeni- tores hepáticos são cultivados adicionalmente sobre um componente de ma- triz extracelular selecionado a partir do grupo que consiste em um colágeno tipo III, uma molécula de adesão basal, um proteoglicano, (PG), um glicosa- minoglicano sulfato de heparan, elastina ou combinações desses.

5. Método de acordo com a reivindicação 4, no qual a molécula de adesão basal é fibronectina.

6. Método de acordo com a reivindicação 4, no qual o PG é PG- sulfato de heparan, PGs de sulfato de condroitin ou uma combinação desses.

7. Método de acordo com a reivindicação 4, no qual o glicosami- noglicano é um sulfato de heparan, uma heparina, um sulfato de condroitin, um sulfato de dermatan, hialuronanos ou uma combinação desses.

8. Método de acordo com a reivindicação 2, no qual os componentes da ma- triz extracelular são colágeno tipo Ill e laminina.

9. Método de acordo com a reivindicação 1, no qual os progeni- tores hepáticos isolados são células-tronco hepáticas isoladas, hepatoblas- tos isolados, progenitores hepáticos comprometidos ou uma combinação desses.

10. Método de acordo com a reivindicação 9, no qual os progeni- tores hepáticos isolados são células-tronco hepáticas isoladas.

11. Método de acordo com a reivindicação 1, no qual os progeni- tores hepáticos são cultivados adicionalmente na presença de células ali- mentadoras.

12. Método de acordo com a reivindicação 11, no qual as células alimentadoras são células embrionárias ou fetais.

13. Método de acordo com a reivindicação 12, no qual as células alimentadoras são angioblastos ou células precursoras estreladas hepáticas.

14. Método de acordo com a reivindicação 11, no qual as células alimentadoras derivam de qualquer tecido de mamífero.

15. Método de acordo com a reivindicação 11, no qual as células alimentadoras derivam da mesma espécie que os progenitores hepáticos.

16. Método de acordo com a reivindicação 1, no qual as células alimentadoras são murinas.

17. Método de acordo com a reivindicação 16, no qual as células alimentadoras são células alimentadoras STO.

18. Método de acordo com a reivindicação 1 compreendendo, adicionalmente meio de cultura livre de soro.

19. Método de acordo com a reivindicação 1, no qual os progeni- tores hepáticos são obtidos de fígado de adulto.

20. Método de acordo com a reivindicação 19, no qual o fígado de adulto é um fígado de adulto humano.

21. Método de acordo com a reivindicação 2, no qual a Iaminina está em uma concentração entre cerca de 0,1 a cerca de 10 μg/cm2.

22. Método de acordo com a reivindicação 21, no qual a Iaminina está em uma concentração entre cerca de 0,5 a cerca de 5 μg/cm2.

23. Método de acordo com a reivindicação 22, no qual a Iaminina está em uma concentração de cerca de 0,5 μg/cm2.

24. Método de acordo com a reivindicação 22, no qual a Iaminina está em uma concentração de cerca de 1 μg/cm2.

25. Método de acordo com a reivindicação 2, no qual os coláge- nos tipo Ill ou IV estão individualmente em uma concentração entre cerca de -0,1 a cerca de 15 μς/οιτι2.

26. Método de acordo com a reivindicação 25, no qual os colá- genos tipo Ill ou IV estão individualmente em uma concentração entre cerca de 0,5 a cerca de 8 μς/οηι2.

27. Método de acordo com a reivindicação 25, no qual os colá- genos tipo Ill ou IV estão em uma concentração entre cerca de 1 a cerca de -7 μg/cm2.

28. Método de propagar progenitores hepáticos que compreen- de: (a) fornecer uma primeira camada que compreende um primeiro componente da matriz extracelular encontrado no compartimento de célula- tronco do fígado; (b) fornecer uma segunda camada que compreende um segundo componente da matriz extracelular encontrado no compartimento de célula- tronco de fígados; e (c) cultivar progenitores hepáticos isolados entre a primeira e segunda camadas.

29. Recipiente para propagação de progenitores hepáticos que compreende: • (a) um recipiente, e (b) um material insolúvel que compreende pelo menos um com- ponente da matriz extracelular encontrado no compartimento de célula- tronco de fígados; em que o material insolúvel reveste substancialmente pelo me- nos uma superfície do recipiente.

30. Recipiente de acordo com a reivindicação 29, no qual o reci- piente é uma placa de cultura de tecido, um biorreator, uma célula laborato- rial ou um chip laboratorial.