BRPI0618978A2 - aumento da viabilidade e toleráncia à tensão de material biológico viável - Google Patents

Abstract

AUMENTO DA VIABILIDADE E TOLERáNCIA à TENSãO DE MATERIAL BIOLóGICO VIáVEL. A presente invenção refere-se a um método para o aperfeiçoa- mento da tolerância à tensão e/ou viabilidade de material biológico viável e manipulação do dito material compreendendo aplicação de pressão hidrostática ao dito material biológico; manutenção do dito material biológico viável na pressão hidrostática por um período de tempo predeterminado; liberação da pressão hidrostática; e manipulação do dito material para qualquer fim desejado de acordo com qualquer protocolo útil. A manipulação do dito material biológico incorpora quaisquer técnicas, protocolos que são aplicáveis no campo de técnicas reprodutivas assistidas, manipulações biotécnicas e/ou biotecnológicas.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "AUMENTO DA VIABILIDADE E TOLERÂNCIA À TENSÃO DE MATERIAL BIOLÓGICO VIÁVEL".

A presente invenção refere-se a um método de aperfeiçoamento de viabilidade e/ou tolerância a tensão de material biológico viável e uso do dito material compreendendo a aplicação de pressão hidrostática ao dito ma- terial biológico; manutenção do dito material biológico viável na pressão hi- drostática por um período de tempo predeterminado; liberação da pressão hidrostática; e uso. do dito material para qualquer finalidade desejada de a- cordo com qualquer protocolo útil. O uso do dito material biológico incorpora quaisquer técnicas, protocolos que são aplicáveis no campo de técnicas re- produtivas assistidas, manipulações biotécnicas e/ou biotecnológicas. Antecedentes da Técnica

O efeito da pressão hidrostática como um tensionador em Iiga- ção com tolerância a tensão aumentada e proteínas de impacto foi estudado em condrócitos, levedura e bactérias, mas não ainda em gametas e embri- ões.

Os mecanismos fisiológicos pelos quais microorganismos se a- daptam a tensão subletal ainda não são bem entendidos. Estudos recentes descrevem que instabilidades causadas por impacto a frio subletal na sínte- se de proteína normal em bactérias são sofridas pela síntese de proteínas de impacto a frio assim chamadas (CSPs) (Phadtare e outros, 1999). Essas CSPs são suspeitas de ter muitas funções tais como chaperonas de RNA (Graumann and Marahiel, 1999) ou ativadores de transcrição (LaTena e ou- tros, 1991); é admitido que elas podem desempenhar um papel de proteção contra congelamento (Wouters e outros, 1999). Outras investigações verifi- caram que a produção de CSPs é induzida não apenas por impacto a frio, mas também por outros tensionadores ambientais. Em Escherichia coli, por exemplo, um tipo de CSP é produzida por tensão nutricional (Yamanaka e outros, 1998).

Uma outra experiência mostrou que tratamento com alta pressão hidrostática provocou a produção de certas proteínas induzidas a frio e proteína de impacto a calor (Welch e outros, 1993). Uma vez que tanto tratamento com impacto a frio e tratamento com alta pressão aumentam níveis de CSP, experiências foram conduzidas sobre a possibilidade de proteção cruzada. Wemekamp-Kamphuis e outros (2002) verificaram que o nível de sobrevi- vência depois da pressurização de monocitógenes Listeria impactados a frio era 100 vezes mais alta do que aquela das células que se desenvolvem a 37°C.

Pressão hidrostática na faixa de 30-50 Mpa usualmente inibe o crescimento de vários organismos: a iniciação de replicação de DNA é um dos processos intracelulares mais sensíveis a pressão (Abe e outros, 1999). Os efeitos variam em severidade dependendo da magnitude e duração de compressão (Murakami and Zimmerman, 1973). A membrana de célula é observada como um sítio primário de dano de pressão (Ralou e outros, 1997). Tratamento com alta pressão hidrostática pode alterar a funcionalida- de de membrana tal como transporte ativo ou permeabilidade passiva e, por- tanto, pode perturbar o equilíbrio físico-químico da célula (Yager and Chang, 1983; Aldridge and Bruner, 1985; Macdonald, 1987; Schuster and Sleytr, 2002; Routray e outros, 2002). A aplicação da pressão pode levar a mudan- ças na estrutura de proteína, incluindo conformações parcialmente ou total- mente não desdobradas. Pressão pode causar a desnaturação de proteínas (Schmid e outros, 1975; Weber and Drickamer, 1983; Jaenicke, 1991; Gross and Jaenicke, 1994; Silva e outros, 2001). Relatórios recentes afirmam que pressão hidrostática aumenta a produção de proteínas de impacto (Welch e outros, 1993; Wemekamp-Kamphuis e outros, 2002).

Os processos físicos ou bioquímicos a condições de pressão alteradas são regulados pelo princípio de Le Chatelier: todas as reações que são realizadas por uma aceleração de diminuição de volume consideravel- mente (Murakami and Zimmerman, 1973; Welch e outros, 1993; Palou e ou- tros, 1997). O acúmulo dos efeitos de pressão é letal além de um certo nível: enquanto mudanças irreversíveis de algumas biomoléculas acontecem a pressões mais altas, a 300 Mpa a maioria das bactérias e organismos multi- celulares morrem. Entretanto tardígrados - em seu estado ativo eles morrem entre 100 e 200 Mpa - podem sobreviver até 600 Mpa se eles estiverem em um estado desidratado (Seki and Toyoshima, 1998). Uma publicação recen- te mostra que sistemas biológicos são capazes de tolerar pressões altas contanto que a pressão seja reduzida lentamente (Johnson e outros, 1954).

Pribenszky e outros (2003, 2004) também exploraram a possiblidade de re- cuperação dos embriões pressurizados e veriricaram que liberação gradual de pressão significativamente aumenta a sobrevivência.

Em respostas a vários estímulos de tensão, genes de impacto a calor são induzidos a expressar proteínas de impacto a calor (HSPs). Estu- dos anteriores revelaram que a expressão de genes de impacto a calor é regulada tanto no nível transcritivo quanto pós-transcritivo, e a indução transcritiva rápida de genes de impacto a calor envolve a ativação do fator de transcrição específico, fator de impacto a calor 1 (HSF1). Além do mais, a indução transcritiva pode variar na intensidade de cinética de um modo de- pendente de tipo de célula e de sinal. Kaarniranta e outros (1998) demons- traram que carregamento mecânico na forma de pressão hidrostática au- menta expressão de gene de impacto a calor em células de tipo condrócito de ser humano. A resposta a HHP contínua foi caracterizada pelos níveis de proteína e mRNA elevados de HSP70, sem ativação de HSF1 e indução transcritiva de gene de hsp70. A expressão aumentada de HSP70 foi media- da através da sensibilização de moléculas de mRNA de hsp70. De modo interessante, em contaste com a pressão estática, carregamento hidrostático cíclico não resultou na indução de genes de impacto a calor. As constata- ções de Kaarniranta e outros (1998) mostraram que a expressão de gene de hsp70 é regulada pós-transcritivamente sem indução transcritiva em células de tipo condrócito na exposição à alta pressão hidrostática contínua. Eles sugeriram que a regulação pós-transcritiva na forma de estabilidação de mRNA de hsp70 provê um modo adicional de regulação de gene de impacto a calor que deve provavelmente ser de importânica significativa em certas formas de tensão.

Anteriormente, os presentes inventores verificaram que uma alta pressão hidrostática (HHP), de impacto subletal, significativamente aperfeiçoa a sobrevivência pós-congelamento de blastócitos de camundongo congelados (Pribenszky e outros, 2005a, WO 2005022996). Similarmente, na criopreser- vação de sêmen, a motilidade média pós-congelamento era significativamen- te superior com pré-tratamento com pressão em cada um dos sémens bovi- no pressurizados em comparação com as amostras congeladas sem pressu- rização anterior. O resultado claramente descreve o efeito benéfico de um tratamento com pressão anterior para a motilidade pós-congelamento de sêmen de touro criopreservado (Pribenszky e outros, 2005b). Outras investi- gações para a exploração da mudança bioquímica e base biológica mudam durante o processo de HHP revelarão o mecanismo de seus efeitos proteto- res. Esses estudos, no entanto, envolvem a criopreservação do material bio- lógico depois do pré-tratamento de HHP, que é claramente impossível, ou de baixa eficácia com uma variedade de material biológico.

O processo de resfriamento ou armazenagem de sêmen a tem- peraturas acima de 0°C é bem estabelecido para armazenar espermatazói- des por um período curto de tempo [Hackett, e outros, 1982; Pinto, 1999; 0'Shea e outros, 1964]. Com o tratamento (diluição) é armazenagem ótima de sêmen à temperaturas ótimas, o sêmen pode ser inseminado com resul- tados de fertilidade aceitáveis (mas com taxas de concepção obviamente reduzidas em comparação com inseminação de sêmen fresco) no período de 1-2 dias pós-coleta [Gill e outros, 1970; Goodman and, Cain, 1993; Har- rop, 1954; Ijaz and Ducharme, 1995; Katila e outros, 1997]. Esses métodos seguem etapas básicas muito similares:

1. coleta de sêmen.

2. diluição de sêmen à temperatura de corpo.

3. configuração opcional do sêmen diluído. Reprorrogamento do sêmen para ajustar a concentração ótima do esperma.

4. manter o sêmen (re)prorrogado à temperatura ambiente ou 4- 5°C ou qualquer temperatura que esteja acima do ponto de congelamento da amostra.

5. inseminação do sêmen.

Similarmente à espermatazóides que sofrem uma perda de via- bilidade durante a armazenagem, a capacidade de sobrevivência de embri- ões ou ovócitos também reduz uma vez removido do seu envolvente fisioló- gico materno (por exemplo, por cultura in vitro, ativação, transferência de embrião, divisão, determinação de sexo, biopsia, maturação in vitro, ICSIj clonagem ou qualquer tipo de procedimento biológico). Por essa razão, aper- feiçoamento da capacidade de viabilidade/sobrevivência de gametas e em- briões antes ou depois de qualquer procedimento incluindo armazenagem, inseminação ou transferência rotineira tanto quanto o procedimento biotec- nologia) mais complexo é de maior importância científica ou econômica.

Similarmente, por exemplo, durante a preservação de microor- ganismos, tais como bactérias (por exemplo, secagem por congelamento), a viabilidade de microorganismos é grandemente comprometida. Aperfeiçoa- mento da eficácia de qualquer processo que se junta com a viabilidade aper- feiçoada porta significância científica e econômica imensa.

Como está claro a partir do exposto acima, há ainda uma neces- sidade da técnica para o aperfeiçoamento da viabilidade de material biológi- co que é amplamente usado nos protocolos biológicos.

Os presentes inventores supreendentemente verificaram que por aplicação de um desafio de pressão hidrostática a viabilidade de materiais biológicos pode ser aperfeiçoada significativamente, e pela aplicação do mé- todo, muitos estados dos protocolos biotecnológicos da técnica podem ser realizados mais eficazmente. O presente relatório mostra uma ampla faixa de exemplos nessa constatação: depois da aplicação do presente método a transferência de embrião ou inseminação de embrião, a taxa de concepção e taxa de nascimento aperfeiçoaram; por aplicação do presente método a ovó- citos, sua tolerância a tensão aumentou grandemente, que resultou em taxa de clivagem aperfeiçoada e taxa de formação de blastócito mais alta; por aplicação do presente método a sêmen, e então seguindo o estado da técni- ca de diluição e armazenagem, a motilidade dos espermatozóides foi pre- servada por um período de tempo significativamente mais longo.

Também supreendentemente que os aperfeiçoamentos eram substanciais mesmo quando se evitando aplicar temperaturas abaixo do ponto de congelamento do meio durante qualquer estágio de armazenagem e/ou manipulação do material biológico. Essa constatação tem aplicações práticas significativas para a usabilidade dos presentes métodos de HHP e similares.

Nesse contexto, deve-se enfatizar que o presente conceito in- ventivo igualmente se aplica a qualquer procedimento ou protocolo biotécni- co/biotecnológico diferente usado nas técnicas reprodutivas assistidas (ART) e outros procedimentos, e a escolha daqueles não é limitada com relação à invenção. A única etapa necessária para incluir nos protocolos aperfeiçoa- dos é a etapa de desafio de pressão hidrostática; os parâmetros dos quais pode ser facilmente otimizado por uma pesssoa versada na técnica quando após os ensinamentos da presente descrição.

Uma vez que congelamento de sêmen fornece sobrevivência pós-congelamento pobre de espermatozóides nos javalis (e também cava- los), a ferramenta mais comum de reprodução nessas espécies é a insemi- nação de sêmen fresco, prorrogado e resfriado e prorrogado e esfriado. Pelo uso de sêmen de pré-tratamento com HHP é significativamente melhor pre- servado na dada temperatura, e também, o tempo de armazenagem com qualidade mais alta é consideravelmente aumentada.

Similarmente, produção de embrião in vivo e in vitro, cultura de embriões in vitro, sexo, divisão, transferência de gene, transferência de em- brião, maturação de ovócito, ativação, ICSI, clonagem ou qualquer procedi- mento biotécnico/biotecnológico no embrião, ovócito ou esperma grande- mente reduzem sua capaciade de viabilidade/sobrevivência. Como uma ex- trapolação das características acima, pelo uso de gametas e embriões de pré-tratamento com HHP entrarão em qualquer tipo de procedimento biotéc- nico/biotecnológico ou tecnologia reprodutiva assisitida (ART) com uma ca- pacidade de sobrevivência aumentada. Descrição da Invenção

Correspondentemente, a presente invenção refere-se a um mé- todo para o aperfeiçoamento de viabilidade e/ou tolerância à tensão de ma- terial biológico viável e uso do dito material compreendendo (a) aplicação de pressão hidrostática ao dito material biológico viável;

(b) manutenção do dito material biológico viável na pressão hi- drostática por um período de tempo determinado;

(c) liberação da pressão hidrostática;

(d) uso do dito material para qualquer finalidade desejada de acordo com qualquer protocolo útil, com a condição de que o dito uso não compreende criopreservação.

Em uma concretização, pressão usada no método de acordo com a invenção está na faixa de 1 a 200 Mpa. Em concretizações preferidas, a pressão está de preferência na faixa de 10 a 100 Mpa, mais de preferência de 20 a 75 Mpa, e com mais preferência de 30 a 60 Mpa.

Em uma outra concretização, a pressão hidrostática usada no método de acordo com a invenção é aplicada por um período entre "instân- taneo" e 300 minutos. Em concretizações preferidas, a pressão é aplicada de preferência por um período de tempo entre 0,001 segundos e 600 minu- tos, de preferência de 1 segundo a 300 minutos, mais de preferência de 10 segundos a 150 minutos, com mais preferência de 20 segundos a 90 minu- tos, e ainda mais de preferência de 30 segundos a 60 minutos.

Em outras concretizações, o período de tempo para a liberação da pressão está entre 10 s e 2 horas, ou entre 1 min e 1 hora, ou em outros casos 10 min e 30 min. A liberação de pressão pode ser instântanea.

Em uma concretização preferida, a invenção refere-se a um mé- todo em que a pressão é aplicada, guardada e liberada de acordo com um perfikl de pressão predeterminado.

Em uma outra concretização preferida, a invenção refere-se a um método em que a pressão é aplicada, guardada e liberada de acordo com um perfil de temperatura predeterminado.

Em uma concretização preferida, o método de acordo com a in- venção é usado em ligação com gametas e embriões selecionados do grupo que consiste em ovócitos, espermas, zigotos, mórulas, blastócitos, embriões, células-tronco de um animal vertebrado. Concretizações preferidas referem-se a um método em que o dito animal vertebrado é um peixe, pássaro ou um mamífero, de preferência bovino, eqüino, caprino, ovino, suíno, outros animais de criação, animais de estimação, primatas, incluindo ser humano.

Em uma outra concretização, a presente invenção refere-se a um método em que o dito material biológico é uma cultura de microorganis- mos.

Em concretizações preferidas da presente invenção, a dita cultu- ra de microorganismo é uma cultura bacteriana.

A presente invenção ulteriormente refere-se a qualquer método como descrito acima, em que a armazenagem e manipulação do dito materi- al biológico incorpora quaisquer técnicas, protocolos que são aplicáveis no campo de técnicas reprodutivas assistidas, manipulações biotécnicas e/ou biotecnológicas.

Em uma concretização preferida, o protocolo usado no método de acordo com a presente invenção é a secagem por congelamento.

Em um outro aspecto, o método da presente invenção aplicado para aperfeiçoar a tolerância a tensão do material biológico, em que a tole- rância contra temperatura aumentada é aperfeiçoada.

A presente invenção é descrita em mais detalhes por uso de embriões de camundongo, espermatozóides de javali, ovócitos de porco e duas espécies de bactérias para a finalidade de demonstração do conceito inventivo. Seria evidente que os procedimentos descritos igualmente se apli- cam a todos os gametas e embriões de mamífero, ave ou peixe, que são candidatos de qualquer espécie de ART, ou mais em geral, a qualquer tipo de material biológico viável usável nos procedimentos biotécnicos ou biotec- nológicos. Em consideração a acesso e manipulações fáceis, embriões de camundongo, sêmen de javali e touro, ovócitos de porco e duas espécies de bactérias foram selecionados como os indivíduos da investigação detalhada. Em consideração a interpretação e extrapolação fácil, procedimentos de ART simples foram selecionados: transferência de embrião, inseminação artificial, ativação in vitro de ovócitos e armazenagem in vitro de sêmen. Tan- to quanto a prova de experiência de conceito com microorganismos é envol- vida, secagem por congelamento de bactéria foi selecionada para apresentar o efeito benéfico de pré/tratamento de alta pressão hiroestática. Esses pro- cedimentos são os protocolos básicos de bacteriologia, procedimentos de ART e biotecnológicos ou biotécnicos subjacentes de sua aplicabilidade de pesquisa, cuidado de saúde e industrial. No entanto, no método de acordo com a invenção e similarmente na presente descrição, o termo "embrião de camundongo" ou "sêmen de touro ou javali" pode ser usado intercambea- velmente com o termo "gameta ou embrião". Por exemplo, estágios pré- e pós-implantação de embriões, ovócitos e esperma de animais vertebrados e ser humano podem ser igualmente aplicados no presente método.

No contexto da presente invenção, a expressão "material bioló- gico viável" refere-se em geral a uma parte de ou originando-se de um orga- nismo vivo que tem uma capacidade para viver, desenvolver, ou germinar sob condições favoráveis. Sem limitação, o material biológico viável pode ser uma célula, cultura de célula, amostra de tecido, cultura de tecido, órgão, e similares.

Com relação a microorganismos, o termo refere-se a um órgão que é microscópico, isto é, demasiadamente pequeno para ser visível a olho nu. Microorganismos podem ser bactérias, fungos, archaea ou eucariotos. Microorganismos são freqüentemente descritos como organismos unicelula- res ou de célula única; no entanto, alguns protistas unicelulares são visíveis a olho nu, e algumas espécies multicelulares são microcópicas.

Como organismos eucarióticos altamente desenvolvidos, embri- ões de camundongo são mais suscetíveis ao efeito de pressão hidrostática do que tardígrados e bactérias. O primeiro objetivo, portanto, é estabelcer as características básicas de embriões de camundongo sob pressão com rela- ção a sua morfologia e sobrevivência.

Experiências cuidadosamente designadas foram conduzidas para investigar a tolerância a pressão de embriões de camundongo. A esco- lha da pressão e a escala de tempo usadas foram definidas para dar à faixa aplicável mais ampla para as últimas aplicações práticas. Portanto, a pres- são para o uso no método de acordo com a invenção é selecionada na faixa de 1 Mpa a 150 Mpa. Mais particularmente, a pressão hidrostática que pode ser aplicada aos embriões de estágio de blastócito prorrogados é de 1, 5,10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140 ou 150 Mpa, ou qualquer valor entre essas faixas intermediárias. Similarmente, um perío- do de tempo amplo pode ser selecionado para os embriões de camundongo para serem mantidos sob alta pressão hidrostática. Mais particularmente, os embriões de camundongo são mantidos sob a pressão selecionada por um período de tempo entre 1 s e 6 horas, mais especificamente de 1 s, 5 s, 10 s, 20 s, 30 s, 40 s, 50 s, 1 min, 2 min, 3 min, 4 min, 5 min, 6 min, 8 min, 10 min, 15 min, 20 min, 30 min, 40 min, 50 min, 60 min, 70 min, 80 min, 90 min, 120 min, 150 min, 180 min, 210 min, 240 min, 300 min ou 360 min. O tempo que os embriões sobrevivem sob pressão reduz com aumento de pressão.

Embriões podem sobreviver uma quantidade substancial de pressão sem qualquer mudança visível em sua morfologia (por exemplo, 90 Mpa por 1 s ou 30 Mpa por 2 h). Os embriões compactados dependem da magnitude e da duração do tratamento de pressão aplicado. Sem limitar o escopo da invenção pela teoria, adota-se que a pressão não pode ser dire- tamente responsável pela remoção de água dos blastócitos. Com base nos documentos citados, a compactação dos embriões era devido às conse- qüências de produção de pressão induzida de diferentes proteínas (proteína de impacto a frio, CSPs), alterações reversíveis na estrutura de proteína e processos metabólicos. Embriões compactados poderiam recuperar sua morfologia normal depois de 4-5 horas de cultura in vitro, e resumem simila- ridade de desenvolvimento em controles (por exemplo, embriões desafiados por 90 Mpa por 30 min ou 30 Mpa por 3 h).

Embriões oriundos da "faixa subletal" mencionada acima (por exemplo, embriões compactados) podem de preferência ser selecionados para a última transferência ou qualquer procedimento de ART ou biotecnoló- gica. Depois da pressurização, blastócitos expandidos se tornam compacta- dos e permanecem nessa forma por 3 - 4 horas, então eles reexpandem. Com base nesse fenômeno, embriões foram tratados com pressão antes que pudessem ser selecionados. Uma vez que as mudanças morfológicas dos embriões e os efeitos benéficos e/ou características e/ou a produção aumentada de proteínas induzidas por pressão diferente, o exame dessas proteínas podem ser indicativos da alta pressão hidrostática aplicada ao ma- terial biológico antes de qualquer outro processo.

Quanto mais alta a magnitude da pressão, menos tempo os em- briões sobrevivem. Impacto de pressão que excede uma certa magnitude e duração causa mudanças irreversíveis: embriões se tornam desintegrados depois de duas horas de cultura in vivo ou já foram desintegrados depois da descompressão (por exemplo, embriões desafiados por 90 Mpa por 2 h ou 30 Mpa por 5 h). A pesssoa versada na técnica seria capaz de determinar essas pressões limite e tempos limite por experimentação rotineira com rela- ção ao material biológico específico usado.

Será apreciado que a taxa de sobrevivência dos embriões pres- surizados pode ser aumentada por sua decomposição gradual. Estudos mostraram que a taxa de sobrevivência dos embriões pressurizados aumen- ta notavelmente se eles forem recuperados gradualmente. Enquanto 60 mi- nutos a 90 Mpa era letal para todos os embriões, 80% sobreviveram quando decomposição gradual por 120 min foi usada. O tempo de descompressão é também uma característica da presente invenção que é até que a pessoa versada na técnica determinar em virtude da aplicação específica. Mais par- ticularmente, os embriões de camundongos mantidos sob a pressão selecio- nada são descomprimidos por um período de tempo entre 1 s e 4 horas, mais especificamente de 1 s, 5 s, 10 s, 20 s, 30 s, 40 s, 50 s, 1 min, 2 min, 3 min, 4 min, 5 min, 6 min, 8 min, 10 min, 15 min, 20 min, 30 min, 40 min, 50 min, 60 min, 70 min, 80 min, 90 min, 120 min, 150 min, 180 min, 210 min ou 240 min.

Será apreciado pela pessoa versada na técnica que o tratamen- to com pressão de acordo com a presente invenção pode ser realizado de acordo com qualquer perfil de pressão desejado. Portanto, a dependência de tempo da pressão como ele aplicado, mantido e liberado pode variar de a- cordo com as curvas de tempo - pressão, incluindo a totalidade de ponto de tempo do tratamento com pressão, isto é, durante a aplicação da pressão, durante o curso do período de pressão máx., e durante a fase de liberação de pressão. É óbvio que o nível de pressão em qualquer ponto de tempo pode ser otimizado e estabelecido de acordo com experiências preliminares facilmente realizadas com base no presente ensinamento sem excesso de experimentação.

Em uma outra concretização preferida, o método da presente invenção pode ser realizado de acordo com um perfil de temperatura deter- minado. O termo "perfil de temperatura" refere-se ao perfil de tempo - tempe- ratura como é mensuável ou estabelecido durante o curso do tratamento de pressão, e é independentemente controlável a partir da pressão aplicada. Em concretizações preferidas, o tratamento com pressão realizado em uma única temperatura, no entanto, o material biológico de interesse pode ditar o uso de temperaturas diferentes nos estágios ou partes diferentes do trata- mento com pressão. Uma temperatura estabelecida pode ser qualquer tem- peratura, por exemplo, temperatura ambiente, o tratamento de corpo nativo onde o material biológico é originaso de uma temperatura levemente elevada da dita temperatura de corpo nativo, e similares. A pessoa versada na técni- ca pode facilmente determinar a aplicabilidade de qualquer dado perfil de temperatura por análise da eficácia do tratamento com pressão em compa- ração com uma experiência de controle.

Sem estar limitado pela teoria, uma explicação possível dessa característica poderia ser que uma quantidade considerável de CO2 é gera- da sob pressão (Abe and Horikoshi 1995). A hidratação e ionização de CO2 (HCO3" e H+) são facilitadas por pressão elevada uma vez que a reação é realizada por uma diminuição em volume (-0,26 ml/mol) de um modo depen- dente da magnitude da pressão aplicada (Palou e outros 1997, Welch e ou- tros, 1993). O dióxido de carbono intracelularmente produzido instantanea- mente se dissolve, e então dissocia para dar HCO3" e H+, assim, também redução do pH intracelular (Abe and Horikoshi 1995, 1997, 1998, Abe e ou- tros 1999). Pode ser assumido que o equilíbrio mantido pela pressão eleva- da é letal para os embriões a pressão atmosférica. Pode também levantar-se a hipótese de que a presente diminuição de pressão causa liberação eleva- da de CO2 de sua forma hidratada e ionizada do citoplasma, causando morte imediata dos embriões. Na condição de que um certo tempo de descom- pressão, as proteínas de membrana de plasma (H+-ATPase) (Schmid e ou- tros 1975, Péqueux and Gilles 1978) reversivelmente inativaram por pressão hidrostática elevada, começam a funcionar novamente, (juntamente com difusão passiva) deslocando equilíbrio gradualmente em relação ao estado fisiológico.

Depois do tratamento com parâmetros de pressurização cuida- dosamente escolhidos, os embriões foram cultivados in vitro, então foram transferidos em mães pseudográvidas. O número de cachorrinhos que nasce depois do tratamento com pressão dos embriões era mais alto do que era alcançável sem o tratamento com pressão.

Similarmente ao tratamento de embriões, ovócitos de porco fo- ram também pressurizados para examinar sua tolerância a pressão. Então, com parâmetros cuidadosamente selecionados, ovócitos foram pré-tratados, tensionados com um impulso elétrico 10 vezes mais do que o valor ótimo, e foram examinados quanto a clivagem e desenvolviemnto ulterior até o está- gio de blastócito. O número de ovócitos ativados in vitro que clivou e desen- volveu ulteriomente era mais alto com tratamento com pressão do que sem.

Similarmente ao tratamento de embriões, sêmen de touro e java- li foi também pressurizado para examinar a tolerância a pressão de esper- matozóides. Então, com parâmetros cuidadosamente selecionados, sêmen foi pré-tratado, e foi mantido in vitro a temperaturas diferentes. O número de espermatozóides móveis nos pontos de tempo diferentes depois que a cole- ta de sêmen foi mais alta com tratamento com pressão do que sem. A inse- minação de sêmen de javali tratado com pressão forneceu número um pou- co mais alto do que foi alcançável rotineiramente na instalação.

Similarmente aos tratamentos mencionados acima, amostras de Escherichia eoli and Lactobacillus plantarum foram pressurizadas para exa- minar se a sobrevivência das bactérias pode ser aumentada depois da se- cagem por congelamento. O número de bactérias sobreviventes em parâme- tros de pressão/tempo selecionados depois de secagem por congelamento era mais alto com tratamento com pressão do que sem.

As presentes descrições mostram o aperfeiçoamento na capaci- dade de viabilidade/sobrevivência de material biológico por desafio de pres- são hidrostática usando-se blastócitos de camundongo, ovócitos de porco, espermatozóides de touro e de javali e duas espécies de bactérias como sistemas de modelo. Isso pode ser avaliado por transferência dos embriões pressurizados, após seu tratamento para cultivar meio e/ou em receptores pseudográvidos; ou ativação in vitro; ou inseminação do sêmen tratado ou contagem da sobrevivência de bactérias depois da secagem por congela- mento, respectivamente. Desenvolvimento in vitro, implantação e desenvol- vimento uterino ulterior e clivagem e outro desenvevolvimento são testes óbvios da viabilidade de embriões e ovócitos. Similarmente, a armazenagem in vitro e inseminação do sêmen, fornecendo número mais alto de epermato- zóides móveis (in vitro) e taxas de gravidez mais altas suportam a aplicabili- dade do dito método.

A pressurização pode ser realizada por uso de qualquer disposi- tivo de pressurização disponível que pode ser adaptado para os protocolos de acordo com a presente invenção. Exemplos não Iimitantes de tais instru- mentos são, por exemplo, os dispositivos descritos no WO 2005022996 ou no presente documento.

A presente invenção é ulteriormente ilustrada pelos exemplos experimentais descritos abaixo, no entanto, o escopo da invenção não será de modo algum limitado pelas concretizações específicas descritas nos e- xemplos.

Exemplo 1. Sobrevivência de embriões de camundongo a pressões diferen- tes a temperatura ambiente, efeito de tratamento com pressão no implante e nas taxas de nascimento

Produção de Embrião e Cultura

Embriões de camundongo de estágio de uma célula foram cole- tados a partir de doadores de CB6F1 de 6-8 semanas de idade superovula- dos e foram cultivados a 37°C com 5% de CO2 e umidade máxima em ar em meios de G 1.2 e G2.2 (Vitrolife, Gõteborg) no estágio de blastócito expandido. Pressurização

Blastócitos foram carregados em canudos de plástico de 0,08 ml (7-9 embriões/canudo) com (M2 Sigma St. Louis, MO). Canudos, enchidos com M2 como meio de pressão, foram colocados para dentro da câmara de um dispositivo feito por encomenda que é capaz de gerar e precisamente detectar pressão hidrostática até 150 Mpa. Alcançando a quantidade dese- jada de pressão levou 20 segundos a 5 minutos (10 Mpa a 150 Mpa, respec- tivamente); a duração de liberação da pressão era de 2-4 segundos.

Transferência

Para avaliação in vivo, embriões pressurizados com 60 Mpa (600 bars) por 30 minutos foram cultivados em G 2.2 por duas horas como acima. Então, eles foram transferidos (7-12 embriões por animal) para dentro do dia 3 de receptores pseudográvidos. Blastócitos não tratados foram trans- feridos como controles.

Avaliação análise estatística

Conclusões foram tiradas dos desafios na aparência morfológica dos embriões examinados a 400 χ de ampliação durante 24 horas de cultura in vitro continuada, e da taxa de origem dos embriões transferidos. Morfolo- gia microscopicamente não mudada dos blastômetros, reexpansão da blas- tócele e nascimento a partir da zona pelúcida foram sinais de sobrevivência in vitro. O número de fetos no dia 18 de dissecação das fêmeas grávidas ou nascimento de cachorrinhos saudáveis era prova de sobrevivência in vivo dos embriões. As taxas de sobrevivência foram comparadas com controle por teste de chi-square.

Nas presentes experiências embriões foram expostos a pres- sões hidrostáticas diferentes de 10 a 150 Mpa (por aumentos de 10 Mpa) por várias horas, entre 1 s a 300 min, à temperatura ambiente.

O tratamento que excede uma certa quantidade de pressão e tempo causou mudanças morfológicas reversíveis. Os blastócitos expandi- dos compactados dentro da zona pelúcida: a blastocele desapareceu, o ta- manho dos blastômeros reduziu mas sua integridade estrutural não mostrou nenhuma alteração. Depois de 4-5 horas de cultura in vitro esses blastócitos foram reexpandidos e criados da zona pelúcida em 24 horas (a). Embriões que recebem menos impacto não mostrou nenhuma mudança morfológica e criou no período de 24 horas de cultura in vitro (b), enquanto embriões desa- fiaram com um impacto maior não expandiram do estágio compactado e de- sintegram no período de 2 horas, ou foram já desintegrados depois da des- compressão (c).

Para a avaliação in vivo, embriões desafiados foram julgados "sobrevidas" (a&b) e "mortos" (c) depois de 2 horas de cultura in vitro depois da descompressão e foram transferidos para dentro dos receptores separa- damente. Vinte e nove embriões tratados com pressão foram transferidos para mães pseudográvidas, dos quais 28 nasceram. Essa razão era mais alta do que que foi alcançável com embriões não tratados. Esse aperfeiçoa- mento significativo sobre o estado dos dados da técnica (por volta de 85%) também mostra a robustez do pré-tratamento com pressão. Quando os óti- mos parâmetros de tempo e pressão são aplicados, o aperfeiçoamento da viabiliade do material biológico ainda pode ser significativo mesmo quando os valores de linha de base totalmente altos e já satisfatórios para a indús- tria. No entanto, no campo de ART, cada ponto de percentagem pode ter significância econômica adicionada.

Exemplo 2. Sobrevivência de espermatozóides de touro a pressões diferen- tes na temperatura ambiente, efeito de tratamento com pressão na preven- ção do declínio de motilidade de esperma.

Embora sêmen de touro seja usualmente armazenado congela- do, a possibilidade do presente método foi ulteriormente testada em um si- tema industrialmente importante.

Sêmen de 13 touros foi diluído a uma concentração de esperma de 8 χ 107/ml_ com diluente AndroMed (MiniTüb, Tiefenbach, Alemanha). Esperma diluído foi carregado em canudos de 0,25 mL a 25°C. Canudos foram divididos em grupos de tratamento e grupo de controle de não trata- mento. Os grupos de tratamento foram pressurizados com máquina de pres- são controlada por computador (Crio-lnnovation, Budapest, Hungary) com 9 perfis diferentes. Para aparelho de CASA de testagem de mobilidade to- tal/progressiva, SpermVision Versão 3.0 (Minitüb, Tiefenbach, Alemanha) foi usado.

Foi concluído que tratamento com pressão abaixo da região de 60 Mpa (600 bars) não afeta negativamente sobrevivência de esperma. De- pois de 8 horas de armazenagem de sêmen à temperatura ambiente a moti- Iidade das amostras tratadas/não tratadas foram analisadas novamente: a proporção das células móveis eram mais altas nas amostras tratadas. Exemplo 3. Sobrevivência de espermatozóides de javali a pressões diferen- tes na temperatura ambiente, efeito do tratamento com pressão na preven- ção do declínio da motilidade de esperma

Para ulteriormente examinar a aplicabilidade o método de acor- do com a invenção, sobrevivência de espermatozóides de javali foi examina- da, onde armazenagem na temperatura ambiente é pelo contrário um padrão industrial.

Coleta de Sêmen

Sêmen foi coletado a partir de javalis duas vezes por semana. A fração rica em esperma filtrada foi coletada por técnica manual servido com luva para dentro de uma garrafa a vácuo isolada de 250 ml, então esperma foi avaliado (Hancock and Hovell1-1959). As frações ricas em esperma de ejaculações com mais do que 70% de esperma móvel foram usadas. Preparação de Sêmen

Preparação de sêmen congelada seguido um método anterior- mente descrito (Almlid and Johnson, 1988; Maxwell and Johnson, 1997) com uma modificação menor. Resumidamente, o sêmen foi diluído de 1:2 com 37°C de diulente de solução de descongelamento de Beltsville (BTS) na gar- rafa isolada então foi resfriada a temperatura ambiente (20-23°C) por 1 h depois da coleta. Depois do resfriamento, sêmen foi transferido para dentro de tubos de 10 ml, foi centrifugado a temperatura ambiente por 3 min a 2400 χ g, e a solução de sobrenadante foi descarregada. Os péletes foram res- suspensos em diluente de gema de ovo e Iactose a temperatura ambiente. Então, diluente de glicerol (o segundo diluente) e pasta de Equex (Minitüb, Tiefenbach, Alemanha) foi adicionada ao sêmen para dar uma concentração final de 6% de glicerol e 0,5% de Equex. Ministraws, 0,25 ml, (IMV, L'Aigle, França) foram, então, enchidos com sêmen, canudos foram selados a quen- te. A concentração foi ajustada para prover 300 x 106 esperma/ml.

Pressurizacão

Os canudos foram colocados na câmara de pressão, foram en- chidos com água como um meio de pressão, do dispositivo de pressuriza- ção, e o protocolo de pressão predeterminado foi aplicado. O dispositivo de pressurização feita por encomenda era capaz de prover precisamente pres- são controlada na faixa de 1 Mpa - 1000 Mpa (10-10000 bars). Foi produzido de aço inoxidável (KO 33) com o diâmetro interno de 20 χ 220 mm, e foi li- gado a um medidor de pressão. Um pistão, movendo na câmara de pressão gerada a pressão hidrostática. Velocidade de pressurização e despressuri- zação era de 20 Mpa/min (200 bar/min).

Amostras foram pressurizadas a temperatura ambiente (TA) ou com 20, 40 ou 80 Mpa (200, 400 ou 800 bars) ou por 40, 80 ou 120 minutos. Amostras não pressurizadas foram mantidas a temperatura ambiente para o tempo correspondentemente. Avaliação

Depois de 20 min de incubação, duas gotas de 5 μl foram trans- feridas sobre lâminas de vidro e duas lamínulas de 22 mm χ 22 mm foram aplicadas. As amostras foram inseridas no microscópio (Olympus BX 30), equipado com uma ótica de contraste de fase e de estágio de microscópio a 37°C (20X, Olympus, Japão) e 5-5 campos foram avaliados a partir de cada gota por meio de aparelho de CASA, SpermVision Version 3.0 (Minitüb, Tie- fenbach, Alemanha). Espermatozóides com VSL>10 μm/s e AOC >10 foram considerados móveis progressivos. Resultados

Depois da análise dos parâmetros de motilidade usando-se mo- delo misto (fatores; tempo, pressão, data (aleatórios)), o fator de pressão provou ser significativo (p = 0,001, motilidade total; ρ = 0,0103, motilidade progressiva). Depois das múltiplas comparações dos tratamentos com pres- são o impacto de tratamento de 80 Mpa (800 bars) provou ser significativo (P < 0,001, motilidade total; P <0,05, motilidade progressiva) pior do que os ou- tros níveis (Tabela 1.).

Tabela 1: Parâmetro de motilidade (modilidade média (erro padrão)) após os tratamentos com pressão diferentes

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tm: motilidade total; pm: motilidade progressiva. Há 2 repetições de cada combinação de tratamento.

A seguir, foi examinado se a aplicação de tratamento com pres- são afeta as taxas de motilidade de esperma depois de 5 horas de tempo de aclimatização a frio por 5 horas. Um modelo misturado foi ajustado nova- mente com pressão, tempo e exame (com dois níveis: antes e depois do tempo de aclimatização por 5 horas), interações dos fatores de fixação, e data como um fator aleatório. Apenas a pressão e fatores de exame prova- ram ser significativo (Tabela 2.).

Tabela 2: Parâmetros de motilidade (motilidade média (erro padrão)) depois de 5 horas de tempo de aclimatização a frio

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tm: motilidade total; pm: motilidade progressiva. Há 4, 3 e 2 repetições de cada um dos tratamentos de pressão durante intervalos de tempo de 40, 80 e 120 minutos, respectivamente.

A motilidade total das amostras não pressurizadas (atm) reduzia significativamente, enquanto depois de tratamento de 20 e 40 Mpa (200 e 400 bars) a motilidade não reduziu depois de 5 horas de tempo de aclimati- zação a frio, em comparação com a motilidade inicial. Exemplo 4. Efeito de tratamento com pressão na capacidade de fertilização de espermatozóides de javali

Cinco porcas, já excluídas da produção, foram inseminadas com sêmen de javali tratado com pressão, a fim de observar a capacidade de fertilização de espermatozóides tratados com pressão, bem como para in- vestigar quaisquer malformações na prole.

Ejaculações de dois javalis foram prorrogadas de 1:3 diluente comercial, na temperatura de corpo, então amostras foram deixadas se res- friar para a temperatura ambiente em 30 minutos, antes do enchimento de sêmen prorrogado em bolsas de fusão. Bolsas de infusão foram colocados para dentro da câmara de pressão de um dispositivo de pressurização au- tomático (Crio-lnnovation Ltd., Budapeste, Hungria) e programa de pressão foi realizado a temperatura ambiente.

O tratamento com pressão usado era de 30 Mpa (300 bars) por 90 minutos. Depois do tratamento, amostras de sêmen foram ulteriormente prorrogadas com o mesmo diluente comercial a temperatura ambiente, então 5 porcas foram inseminadas no período de 1 hora depois da pressurização. A inseminação foi repetida 12 horas depois da primeira inseminação com o sêmen tratado, foi deixado a 5°C pelo tempo correspondente.

No exame de ultrassom a totalidade dos cinco porcas foram pro- vadas estarem grávidas. Após o fornecimento normal, 58 leitões saudáveis nasceram. Os leitões estavam livres de quaisquer defeitos e malformações.

Foi concluído que o tratamento com pressão aplicado mantém a capacidade de fertilização de espermatozóides de javali, e não causa qual- quer efeito de malformação na prole. A ninhada menor média na fazenda era de 9,8 leitões/porca, enquanto que com o tratamento de pressão aplicado resultaria em 100% de taxa de gravidez e 11,6 de número de ninhada médio. Foi também incluído, portanto, que o tratamento de pressão aplicada aumen- ta também o número de ninhada médio.

Exemplo 5. Sobrevivência (clivagem após ativação in vitro) de ovócitos de porco depois dos tratamentos com pressão diferentes

Ovócitos de porco maduros in vitro foram ativados via eletroati- vação in vitro após as combinações de tratamento com pressão diferentes, a fim de determinar a tolerância a pressão dos ovócitos.

Seiscentos ovócitos desnudados, maduros in vitro foram dividi- dos em grupos de tratamento (n = 15-20 ovócitos/grupo) e grupos de contro- le. Grupos são pressurizados em canudos artificiais de 0,5 ml em meio de TCM-HEPES (canudos foram selados com óleo mineral e bola de metal) com 20-40 Mpa (200-400 bars) por 30 - 90 min a 24°C e a 38,5°C. Controles foram mantidos nas mesmas circunstâncias, e um grupo de controle foi dei- xado no meio de IVM no termostato pelo tempo correspondente.

Depois dos tratamentos, ovócitos foram ativados in vitro, e foram colocados para dentro de um meio de cultura para dentro de um termostato a 38,5°C para outro desenvolvimento. Clivagem foi checada 48 horas depois da ativação

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Foi calculado que tratamentos com 20-40 Mpa (200 - 400 bars) por 30 - 90 minutos não eram nocivos para os ovócitos de porco maduros. Também, o tratamento de 40 Mpa (400 bars) por 30-60 minutos a 24°C, e o tratamento de 20 Mpa (200 bars) por 30-60 minutos a 38,5°C forneceu taxas de clivagem mais altas, do que os grupos de controle correspondentes. Tra- tamentos foram também feitos com 60-80 Mpa (600 - 800 bars)/30 - 90 mi- nutos. Nesses grupos nenhum ovócito sobreviveu aos tratamentos; esses parâmetros de pressão eram nocivos.

Exemplo 6. Ovócitos de porco maduros in vitro depois de combinações de tratamento com pressão diferentes, ativados com um pulso elétrico 10 vezes mais forte do que o ótimo.

Ovócitos de porco maduros in vitro foram ativados via eletroati- vação de magnitude de 10 χ in vitro, após combinações de tratamento com pressão diferentes, a fim de examinar, se ovócitos tratados melhor sobrevi- vem ao eletrochoque nocivo.

Trezentos - seiscentos ovócitos maduros in vitro (diariamente) foram divididos em grupos de tratamento (n = 15-20 ovócitos/grupo) e gru- pos de controle. Grupos com células cumulus foram pressurizadas em canu- dos artificiais de 0,5 ml em meio de TCM-HEPES (canudos foram selados com óleo mineral e bola de metal) com 20-80 Mpa (200-800 bars) por 30 - 120 minutos a 24°C. Controles foram mantidos nas mesmas circunstâncias, e um grupo de controle foi deixado no meio de IVM no termostato para o tempo correspondente. Depois dos tratamentos, ovócitos foram desnudados com turbilhonamento, então, foram ativados in vitro com uma impulso elétri- co 10 vezes mais forte do que o impulso ótimo, e, então, foram colocados para dentro de um meio de cultura para dentro de um termostato de 38,5°C para outro desenvolvimento. Clivagem foi checada 48 horas depois da ativa- ção, formação de blastócito foi examinada no sexto dia. Experiências foram repetidas três vezes.

Tabela 4. Percentagem dos ovócitos nos grupos diferentes, que clivaram e desenvolveram ulteriormente depois de ativação in vitro com pulso elétrico de 10x.

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Tratamento de 20-40 Mpa (200 - 400 bars) por 30-60 minutos forneceram número significativamente superior de ovócitos sobrevientes do que aqueles sem tratamento ou aqueles tratados com 60 ou 40 Mpa (600 ou 800 bars). Foi concluído que os tratamentos com pressão de 20 Mpa (200 bars) por 30 ou 60 minutos provaram prover taxa de clivagem significativa- mente superior ou taxa de blastócito em comparação com os grupos de con- trole ou outros grupos.

Exemplo 7. Sobrevivência de bactérias depois das combinações de trata- mento de pressão diferentes após secagem por congelamento

Para a experiência dois micróbios, Escherichia coli e Lactobacil- Ius plantarum foram usados. Contagens de célula foram determinadas no meio nutritivo de TGE (Tripton Glucose Extract) (MERCK) e ágar de MRS (MERCK), respectivamente. Contagens de célula foram determinadas antes da preparação dos grupos de tratamento, depois do tratamento de pressão, e depois de 96 horas de incubação de 37°C após secagem por congelamen- to (c.f.u.). Tratamentos com pressão foram executados com 9 máquinas de pressurização na mesma hora de acordo com a seguinte tabela:

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Amostras foram introduzidos em canudos artificiais estéreis de 0,5 ml, e foram selados com bola de ferro estéril. Secagem por congelamen- to foi feita por equipamento de secagem por congelamento Edwards. Experi- ências foram replicadas duas vezes. Resultados são apresentados nas se- guintes tabelas.

Tabela 5.: Número de células de Lactobacillus plantarum vivas (c.f.u./0,4 ml) antes e depois secagem por congelamento (duas repetições). (Contagem de célula inicial (c.f.u./ml) antes do tratamento: 9,0 χ 10^6- 1,1 χ 107)

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Tabela 6.: Número de células de Escherichia coli vivas (c.f.u./0,4 ml) antes e depois da secagem por congelamento (duas repetições). (Contagem de cé- lula inicial (c.f.u./ml) antes do tratamento: 4.08 χ 10^8- 4,10 χ 108)

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Grupos de tratamento marcados com números em negrito repre- sentam taxa de sobrevivência de célula significativamente mais alta em comparação com o grupo de controle. Entre os grupos de tratamento, grupos No. 2 e No. 4 provaram ser superiores. Foi concluído que um tratamento de alta pressão hidrostática específico antes da secagem por congelamento aumenta significativamente a taxa de sobrevivência de célula depois da se- cagem por congelamento.

Exemplo 8. Sobrevivência de embriões bovinos depois da biopsia de embri- ão ou sexo com/sem tratamento com pressão

Coleta de ovócito e Maturação In vitro (IVM) COCs (aspirados de ovários oriundos de matadouros) são matu- rados em TCM-199 Earl's suplementados com FCS1 LH (Sigma), FSH (Sig- ma), L-Glutamina, penicilina e estreptomicina, são cobertos com óleo mine- ral, em 38°C com 5,1% de CO2 e umidade máxima em ar por 22 horas.

Preparação de esperma, Fertilização In vitro (IVF) e Cultura In vitro Culture (IVC)

Meio de fertilização era: TALP suplementado com BSA, penici- lamin (Sigma), hipotaurina (Sigma), epinefrina (Sigma) e heparina (Sigma) cobertos com óleo mineral.

Espermatozóides móveis foram obtidos por centrifugação de espermatozóides congelados-descongelados (Gentec, Cuiaba, Brasil) em um gradiente de densidade descontínuo Percoll (2 ml de Percoll a 45% so- bre 2 ml de Percoll a 90%) por 20 min a 700 g a temperatura ambiente. De- pois da ressuspenssão espermatozóides são adicionados às gotas de fertili- zação. Placas foram incubadas por 19 h em 5% de CO2 em ar umidificado a 39°C. Zigotos presumíveis foram, então, cultivados in vitro em gotículas de SOF sob óleo mineral em uma atmosfera umidificada de 5% de CO2 a 39°C. Pressurização

Blastócitos espandidos foram carregados em canudos de plásti- co de 0,25 ml sem bolhas de ar (7-9 embriões/canudo), com meio de manu- tenção de embrião, então canudos foram selados com PVC. Canudos foram colocados no dispositivo de pressurização (Crio-lnnovation Ltd., Szeged, Hungary). Embriões foram expostos a diferentes pressões hidrostática de 60 a 90 Mpa (por aumentos de 10 Mpa) por várias vezes (15, 30, 45, 50, 60, 90, 100 minutos), a temperatura ambiente. Resultados

A taxa de sobrevivência dos embriões sexuais ou embriões de- pois da biopsia é significativamente mais alta com tratamento com pressão especialmente selecionado do que sem.

Exemplo 9. Sobrevivência de embriões bovinos depois da transferência de gene com/sem tratamento com pressão

Na presente experiência embriões bovinos são expostos a pres- são hidrostática a fim de verificar se seu comportamento sob condições de pressão alterada é similar àquele dos embriões de camundongo. Depois do desafio com pressão hidrostática, amostras são submetidas a transferência de gene. Depois da cultura in vitro e transferência, a sobrevivência das a- mostras é aumentada em comparação com as amostras que não foram tra- tadas com pressão anteriormente.

Exemplo 10. Sobrevivência de embriões humanos depois do ICSI e biopsia de embrião com/sem tratamento com pressão

Na presente experiência embriões bovinos são expostos a pres- são hidrostática a fim de verificar se seu comportamento sob condições de pressão alterada é similar àquele dos embriões de camundongo. Depois do desafio com pressão hidrostática, amostras são submetidas a ICSI ou biop- sia. Depois da cultura in vitro e transferência, a sobrevivência das amostras é aumentada em comparação com as amostras que não foram tratadas com pressão anteriormente.

Exemplo 11. Sobrevivência de ovócitos (humano, bovino, caprino, suíno) depois da tratamento com pressão, maturação e armazenagem in vitro

O objetivo da presente experiência é prover que ovócitos toleram qualquer processo (incluindo armazenagem/maturação in vitro) com eficácia muito maior se eles forem tratados anteriormente com pressão hidrostática. Ovócitos são tratados com pressão hidrostática e amostras são mantidas in vitro depois da liberação da pressão. A sobreviência in vitro e in vivo dos ovócitos é aumentada em comparação com as amostras que não foram tra- tadas com pressão anteriormente.

Exemplo 12. Sobrevivência de células-tronco embriônicas depois da trata- mento com pressão, armazenagem in vitro

O objetivo da presente experiência é prover que a sobrevivência de células-tronco embriônicas é aumentada por um tratamento anterior com pressão. Células-tronco embriônicas de camundongo são tratadas com pressão hidrostática e amostras são armazenadas e tratadas depois da libe- ração da pressão. Depois da sobrevivência in vitro e in vivo das células é aumentada em comparação com as amostras que não foram tratadas com pressão anteriormente.

Os resultados apresentados nos presentes exemplos mostram que o tratamento com pressão aplicado antes de qualquer tipo de técnica reprodutiva ou biotecnológica assistida aperfeiçoa a sobrevivência (tolerân- cia a tensão) dos gametas e embriões (e células-tronco). Também, os dados apresentados nos embriões de camundongo, espermatozóides de javali e de touro indicam ampla aplicabilidade do conceito inventivo. A aplicação do mé- todo de acordo com a presente invenção pode ser útil no aperfeiçoamento de taxas de sucesso em toda a espécie de técnica reprodutiva ou biotecno- lógica assistidas, manipulação de embrião, incluindo outras espécies de mamífero, seres humanos não excluídos. O presente método também abre amplas possibilidade para outros campos onde manipulação de gametas e embriões podem encontrar suas aplicações.

Uma vez que congelamento de sêmen fornece sobrevivência de espermatozóides pós-congelamento pobre nos javalis (e também cavalos), a ferramenta mais comum de reprodução dessas espécies é a inseminação de sêmen fresco, prorrogado, prorrogado e resfriado ou prorrogado e esfriado. Pelo uso de sêmen pré-tratado com HHP é significativamente melhor pre- servado na dada temperatura, e também, o tempo de armazenagem com qualidade superior é consideramente aumentado.

Similarmente, produção de embrião in vitro e in vivo, cultura in vitro de embriões, sexo, divisão e uso de qualquer procedimento biotécni- co/biotecnológico, transferência de embrião, maturação de ovócito, ICSI ou qualquer procedimento biotécnico/biotecnológico no ovócito ou esperma grandemente reduzem sua capacidade de viabilidade/sobrevivência. Como uma extrapolação das características acima, pelo uso de gametas de pré- tratamento com HHP e embriões entrarão em qualquer tipo de tecnologia reprodutiva assistida (ART) ou procedimento biotécnico/biotecnológico com uma capacidade de sobrevivênca aumentada.

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Claims (12)

1. Método para o aperfeiçoamento da viabilidade de material biológico viável e uso do dito material compreendendo (a) aplicação de pressão hidrostática ao dito material biológico; (b) manutenção do dito material biológico viável na pressão hi- drostática por um período de tempo predeterminado; (c) liberação da pressão hidrostática; (d) uso do dito material para qualquer finalidade desejada de acordo com qualquer protocolo útil, com a condição de que o dito uso não compreende criopreservação e a dita aplicação da dita pressão hidrostática não resulta em alotriploidização do dito material biológico.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a dita pres- são hidroestática está na faixa de 1 a 200 MPa, de preferência de 10 a 100 MPa1 mais de preferência de 20 a 75 MPa1 e ainda mais preferência de 30 a 60 MPa.

3. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, em que a dita pressão hidrostática é aplicada por um período de tempo entre 0,001 segun- dos e 600 minutos, de preferência de 1 segundos a 300 minutos, mais de preferência de 10 segundos a 150 minutos, com preferência de 20 segundos a 90 minutos, e ainda mais preferência de 30 segundos a 60 minutos.

4. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, em que a dita pressão é liberada gradualmente durante um período de tempo entre liberação instantânea e 6 horas.

5. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, em que a dita pressão é aplicada, mantida e liberada de acordo com um perfil de pressão predeterminado.

6. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, em que a dita pressão é aplicada, mantida e liberada de acordo com um perfil de temperatura predeterminado.

7. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, em que o dito material biológico é um gameta ou embrião, e é de preferência selecionado do grupo que consiste em oócitos, espermas, zigotos, mórulas, blastócitos, embriões e células tronco de um animal vertebrado.

8. Método de acordo com a reivindicação 7, em que o dito ani- mal vertebrado é um peixe, pássaro, ou um mamífero, de preferência bovino, eqüino, caprino, ovino, suíno, outros animais de criação, animais de estima- ção, primatas, incluindo ser humano.

9. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a -6, em que o dito material biológico é uma cultura de microorganismos.

10. Método de acordo com a reivindicação 9, em que a dita cul- tura de microorganismo é uma cultura bacteriana.

11. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a -10, em que o dito uso do dito material biológico incorpora quaisquer técnicas ou protocolos que são aplicáveis no campo das técnicas reprodutivas assis- tidas, manipulações biotécnicas e/ou biotecnológicas.

12. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a -11, em que o dito uso é secagem por congelamento.