BRPI0619573A2 - agonista receptor de neuropeptìdeo-2, formulações farmacêuticas, uso de agonista receptor de neuropeptìdeo-2 e método de tratamento de uma doença modulada por agonistas receptores de neuropeptìdeos-2 - Google Patents

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George Ehrlich
Nader Fotouhi
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Abstract

<UM>AGONISTA RECEPTOR FR NEUROPEPTìDEO-2, FORMULAçõES FARMACêUTICAS, USO DE AGONISTA RECEPTOR DE NEUROPEPTìDEO-2 E MéTODO DE TRATAMENTO DE UMA DOENçA MODULADA POR AGONISTAS RECEPTORES DE NEUROPEPTìDEOS-2<MV>. São proporcionados agonistas receptores de neuropeptídeos-2 de fórmula (I): Y-R~1~-R~2~-X-R~3~-R~4~-R~5~-R~6~-R~7~-R~8~-R~9~-R~ 10~-R~11~-R~12~-R~13~-R~14~-NH~2~ (I). Bem como seus sais farmaceuticamente aceitáveis, derivados, fragmentos, em que os substituintes são aqueles descritos na presente invenção. Estes compostos e as composições farmacêuticas são úteis para o tratamento de doenças tais como, por exemplo, obesidade e diabetes.

Description

AGONISTA RECEPTOR DE NEÜROPEPTIDEO-2, FORMULAÇÕES FARMACÊUTICAS, USO DE AGONISTA RECEPTOR DE NEUROPEPTÍDEO-2 E MÉTODO DE TRATAMENTO DE UMA DOENÇA MODULADA POR AGONISTAS
RECEPTORES DE NEUROPEPTÍDEOS-2
A presente invenção refere-se a análogos truncados
de PIY3-36. Os análogos são agonistas de receptor neuropeptídeos-2 e são úteis para o tratamento de doenças metabólicas e desordens, tais como por exemplo, obesidade, diabetes do tipo 2, síndrome metabólica, resistência à insulina e deslipidemia. 0 agonista receptor neuropeptídeo- 2 da presente invenção possui a seguinte fórmula (I)
<formula>formula see original document page 2</formula>
em que:
X é o ácido 4-oxo-6-(1-piperazinil)-3(4H)-quinazolina- acético (Pqa),
Y é H, uma porção acila, um alquil substituído e não substituído, um alquil inferior substituído ou não substituído, um aril substitiuído ou não substituído, um heteroaril substituído ou não substituído, um alcoxi substituído ou não substituído, uma porção poli(etileno) glicol , PEGm-SSA, PEGm-S-SBA, PEGm-SPA ou PEGra-BTC,
Y1 é H, uma porção poli (etileno) glicol, PEGm-SSA, PEGm-S- SBA, PEGm-SPA ou PEGm-BTC,
Ri é lie, Ala, (D) lie, N-metil lie, Aib, 1-lAic, 2-2 Aic, Ach ou Acp, R2 é Lysf Ala, (D) Lys, NMelys, Nle ou (Lys-Gly),
R3 é Arg, Ala, (D)Arg, N-metil Arg, Phe, 3,4,5- Triflúor
Phe ou 2,3,4,5,6- Pentafluor Phe,
R4 é His, Ala, (D) His, N-metil His, 4-MeOApc, 3-Pal ou 4- Pai,
R5 é Tyr, Ala, (D) Tyr , N- metil Tyr, Trp, Tic, Bip, Dip, (I)Nalf (2)Nal, 3,4,5- Trifluor Phe ou 2,3,4,5,6- Pentafluor Phe,
R6 é Leu, Ala, (D)Leu ou N-metil Leu, R7 é Asnf Ala ou (D)Asn, R8 é Leu ou Trp,
R9 é Valf Ala, (D) Val ou N-metil Vai, R10 é Thr, Ala ou N-metil Thr, R11 é Arg, (D) Arg ou N-metil Arg, R12 e Gln ou Ala,
R13 é Arg, (D)Arg ou N-metil Arg,
R14 is Tyr, (D) Tyr ou N- metil Tyrf Tyr modificado, Phef Phe modificado, Chaf (1) Nalf (2) Nalf C-alfa-metil Tyr ou Trpf e PEGm é 1 to 60 KDaf
ou seu sal farmaceuticamente aceitável.
Todos os documentos citados são aqui expressamente incorporados como referência.
As doenças metabólicas e desordens são amplamente reconhecidas como um sério problema de saúde em países desenvolvidos, tendo atingido níveis epidêmicos nos EUA. De acordo com estudos recentes sobre obesidade, por exemplo, mais de 50% da população dos Estados Unidos da América é considerada como estando acima do peso, com mais de 25% tendo sido diagnosticado como clinicamente obesa e sob risco considerável de doenças cardíacas, diabetes do tipo-2 e certos tipos de câncer. Esta epidemia apresenta um problema significativo para o sistema de saúde em que o custo projetado em saúde é de mais de US$ 70 bilhões anuais apenas nos EUA. As estratégias para o tratamento de obesidade incluem a redução da ingestão alimentar e o aumento do gasto de energia.
O neuropeptídeo Y (NPI), um peptídeo neurotransmissor de 36 aminoãcidos, é membro dos polipeptídeos pancreáticos da classe dos neurotransmissores/neuro-hormônios que se mostrou presente tanto no sistema nervoso periférico quanto no sistema nervoso central. NPI é um dos mais potentes agentes orexigênicos conhecidos e mostraram desempenhar um papel maior na regulação da ingestão de alimentos em animais, incluindo humanos. Seis receptores neuropeptídeos Y (NPI), os subtipos Y1-, Y2-, Y3-, Y4, e Y5- e Y6, foram clonados os quais pertencem aos receptores de alcance trasmembrana do tipo rodopsina G-proteína-acoplado-7 (GPCR). O receptor NPI Y2 (Y2R) é um receptor de 381 aminoácidos que inibe a ativação da adenil ciclase via Gi enquanto mostra baixa homologia com outros receptores NPI. Há um alto grau de conservação entre receptores Y2 humanos e os receptores de ratos com 98% de identidade de aminoácido.
O receptor Y2R é amplamente distribuído dentro do sistema nervoso central, tanto em roedores quanto em humanos. No hipotãlamo, o Y2 mRNA é localizado no núcleo arqueado, no núcleo preóptico, e no núcleo dorsomedial. No cérebro humano, o Y2R é o subtipo receptor Y predominante. Dentro do núcleo arqueado, mais de 80% dos neurônios NPI coexpressam Y2R mRNA. A aplicação de um agonista Y2- seletivo mostrou reduzir a liberação de NPI em fatias de hipotálamo in vitro, enquanto que o antagonista BIIE0246 aumenta a liberação de NPI. Estas descobertas apoiam o papel da Y2R como um auto-receptor pré-sinãptico que regula a lineração de NPI e então pode estar envolvido na regulação da alimentação. (Kaga T et al., Peptides 22: 501-506 (2001) and King PJ et al., Eur J Pharmacol 396: R1- 3 (2000) ).
O peptídeo YY 3.36 (PIY 3-36) é um peptídeo linear de 34 aminoácidos que possui atividade agonista de neuropeptide Y2 (NPI2R). Foi demonstrado que as injeções de PIY 3.36 intra-arqueada (IC) ou intra-peritoneal (IP) reduziu a alimentação em ratos e, como tratamento crônico, reduziu o ganho de peso corporal. A infusão intravenosa (IV) (0.8 pmol/kg/min) por 90 min de PIY 3-36 reduziu a ingestão de alimentos em humanos obesos e normais por 24h. Estas descobertas sugerem que o sistema PIY pode ser um alvo terapêutico para o tratamento da obesidade. (Batterham RL et al., Nature 418: 650-654 (2002); Batterham RL et al., New Engl J Med 349: 941-948 (2003)). Além disso, uma versão Cys2-(D) Cys27-ciclizada de PIY em que os resíduos 5- 24 foram substituídos por uma cadeia de metileno de 5 a 8 carbonos no comprimento, mostrou ativação do receptor intestinal de PIY, conforme evidenciado pelas preparações mucosais sob voltagem e com corrente reduzida em jejuno de ratos. (Krstenansky, et al. in Peptides, Proceedings of the Twelfth American Peptide Symposium. J. Smith and J.
Rivier Editors, ESCOM. Leiden pp. 136-137) .
Além disso, a modificação covalente de proteínas com poli (etilene glicol) ou poli (óxido de etileno) (ambos referidos como PEG), foi demonstrado com superóxido dismutase (Somack, R, et al. , (1991) Free Rad Res Commun 12-13:553-562; U.S. Pat. Nos. 5,283,317 e 5,468,478) e outros tipos de proteínas, por exemplo, citocinas, por exmplo, em Cytokines (Saifer, M G P, et al., (1997) Polym Preprints 38:576-577; Sherman, M R, et al. , (1997) J M Harris, et al. , (Eds.), Poly(etilene glycol) Chemistry and Biological Applications. ACS Symposium Series 680 (pp. 155- 169) Washington, D.C.: American Chemical Society).
Além disso, dados recentes mostraram que pacientes com desvio gástrico apresentaram um aumento prematuro e exagerado nos níveis de PIY que pode ser parcialmente pelo controle glicêmico prematuro e pela manutenção do peso por um longo período de tempo, demonstrando a importância deste peptídeo na patogênese das doenças metabólicas. Outras ações conhecidas de PIY incluem: rudizdo esvaziamento gástrico e trânsito gastrointestinal que é responsável pelo controle glicêmico após as refeições. Indícios de hiperglicemia tal como HbAic e frutosamina mostram uma redução dose-dependente após a administração periférica de PIY3_36 em modelos animais de diabetes do tipo 2. Então, estes resultados indicam que PIY3-36, ou agonistas farmaceuticamente relacionados, podem oferecer uma técnica terapêutica de longo prazo para controle glicêmico e de peso corporal. (Korner et al., J Clin Endocrinol Metabol 90: 359-365 (2005); Chan JL et al., Obesity 14: 194-198 (2006); Stratis C et al., Obes Surg 16: 752-758 (2006); Borg CM et al., Br J Surg 93: 210-215 (2006); e Pittner RA et al., Int J Obes 28: 963-971 (2004)).
Existe, entretanto, uma necessidade por novos análogos engenheirados de PIY que possuam um peso molecular menor, enquanto possuem potência igual ou maior e seletividade contra receptores Yl, Y4 e Y5, propriedades farmacocinéticas e propriedades farmacológicas.
Preferivelmente, há uma necessidade por compostos que possuam uma duração maior da atividade do que aquelas previamente disponíveis. Também, há uma necessidade por análogos peguilados de PIY para, por exemplo, aumentar a meia vida da proteína e reduzir a atividade imunogênica em indivíduos que necessitem destes antagonistas.
A Figura 1 ilustra um cromatograma de HPLC de uma mistura reacional contendo o composto (exemplo 34) da presente invenção;
A Figura 2 ilustra um cromatograma HPLC de um composto purificado (exemplo 34) da presente invenção;
A Figura 3 ilustra um espectro MALDI-TOF de um composto (exemplo 34) da presente invenção; A Figura 4 ilustra um cromatograma HPLC da mistura reacional com um outro composto (exemplo 35) da presente invenção;
A Figura 5 ilustra um cromatograma HPLC de um composto purificado (exemplo 35) da presente invenção;
A Figura 6 ilustra um espectro MALDI-TOF de um composto (exemplo 35) da presente invenção;
A Figura 7 ilustra um cromatograma HPLC da mistura reacional de um composto (exemplo 36) da presente invenção;
A Figura 8 ilustra um cromatograma HPLC de um composto purificado (exemplo 36) da presente invenção;
A Figura 9 ilustra um espectro MALDI-TOF de um outro composto (exemplo 36) da presente invenção;
A Figura 10 ilustra um cromatograma HPLC de uma mistura reacional de um composto (exemplo 37) da presente invenção;
A Figura 11 ilustra um cromatograma HPLC de um composto purificado (exemplo 37) da presente invenção;
A Figura 12 ilustra um espectro MALDI-TOF de um composto (exemplo 37) da presente invenção;
A Figura 13 ilustra um cromatograma HPLC de uma mistura reacional de um outro composto (exemplo 38) da presente invenção;
A Figura 14 ilustra um cromatograma HPLC de um composto purificado (exemplo 38) da presente invenção;
A Figura 15 ilustra um espectro MALDI-TOF de um composto (exemplo 38) da presente invenção; A Figura 16 ilustra um cromatograma HPLC de uma mistura reacional de um composto (exemplo 39) da presente invenção.
A Figura 17 ilustra um cromatograma HPLC de um composto purificado (exemplo 39) da presente invenção;
A Figura 18 ilustra um espectro MALDI-TOF de ainda um outro composto (exemplo 39) da presente invenção;
A Figura 19 ilustra um cromatograma HPLC de uma mistura reacional contendo um composto (exemplo 41) da presente invenção antes da purificação;
A Figure 20 ilustra um cromagrama HPLC de uma mistura de reação desprotegida contendo um composto (exemplo 41) da presente invenção;
A Figura 21 ilustra um cromatograma HPLC de um composto purificado (exemplo 41) da presente invenção;
A Figura 22 ilustra um espectro MALDI-TOF (exemplo 41) da presente invenção ;
A Figura 23 ilustra o efeito da dosagem sub-crônica de um composto (exemplo 41) no peso corporal em ratos machos com obesidade-induzida (DIO);
A Figura 24 ilustra o efeito agudo de um composto (exemplo 41) em um teste oral de tolerância à glicose (OGTT) em camundongos fêmeas db/db.
A Figura 25 ilustra o efeito da dosagem subcrônica de um composto (exemplo 41) em glicose basal sangüínea (A) e teste de tolerância de glicose oral (B) em camundongos db/db. Apesar de quaisquer métodos, dispositivos e materiais similares ou equivalentes àquelas descritas presentemente, podem ser utilizados na prática ou nos testes da presente invenção, os métodos preferidos, dispositivos e materiais são agora descritos.
Todas as seqüências de peptídeos mencionadas presentemente são escritas de acordo com a convenção usual em que o aminoácido N-terminal está na esquerda e o aminoácido C-terminal está na direita, a menos que seja estabelecido de outra forma. Uma linha curta entre dois resíduos de aminoácidos indica uma ligação peptídeo. Onde o aminoácido possui formas isoméricas, é a forma L do aminoácido que é representada a menos que seja de outra forma expressamente indicado de outra forma. Por
conveniência na descrição da presente invenção, são utilizadas as abreviações convencionais e não convencionais para vários aminoácidos. Estas abreviações são familiares para aqueles versados na técnica, mas por clareza são listados abaixo:
Asp=D=Acido aspártico; Ala=A=Alanina;
Arg=R=Arginina; Asn=N=Asparagina; Gly=G=Glicina;
Glu=E=Acido Glutâmico; Gln=Q=Glutamina; His=H=Histidina;
Ile=I=Isoleucina; Leu=L=Leucina; Lys=K=Lisina;
Met=M=Metionina; Phe=F=Fenilalanina; Pro=P=Prolina;
Ser=S=Serina; Thr=T=Treonina; Trp=W=Triptofano;
Tyr=Y=Tirosina; Cys = C= Cisteína; e Val=V=Valina; Nle=Nor- leucina. Também, por conveniência, as seguintes abreviações ou símbolos são utilizados para representar as porções, reagentes e outros utilizados na presente invenção:
Ac acetil;
Aib ácido alfa-aminoisobutírico;
1-1-Aic ácido 1-aminoindano-l-carboxílico;
2-2-Aic ácido 2-aminoindano -2-carboxílico;
Ach ácido alfa-aminociclohexano-carboxílico;
Acp ácido alfa-aminociclopentane-carboxílico;
Tic ácido alfa-amino-1,2,3,4,
tetrahidroisoquinolina-3-carboxílico;
3-Pal ácido alfa-amino-3-piridilalanina- carboxílico;
4-Pal ácido alfa-amino-4-piridilalanina- carboxílico;
4-MeO-Apc ácido l-amino-4-(4-metoxifenil)- ciclohexano-l-carboxílico;
Bip ácido 4-fenil-fenilalanina-carboxílico;
Dip ácido 3,3-difenilalanina-carboxílico;
Pqa ácido 4-oxo-6-(1-piperazinil)-3(4H)- quinazolina-acético
(CAS 889958-08-1);
3,4,5, F3-Phe 3,4,5 -Triflúor fenilalanina;
2,3,4,5,6, F5- Phe2,3,4,5,6-PentafIuor fenilalanina;
Cha Ciclohexil Alanina;
(1) Nal 1- Naftil Alanina;
(2) Nal 2- Naftil Alanina;
Fmoc 9-Fluorenilmetiloxicarbonil; Mtt 4- Metiltritil; 2Pip 2-fenilisopropil éster; Pmc 2,2,5,7,8-Pentametilcroman-6-sulfonil; CH2Cl2 cloreto de metileno; A20 anidrido acético; CH 3 CN acetonitrila; DMAC dimetilacetamida; DMF dimetilformamida; DIPEA N, N-Diisopropiletilamina; TFA ácido Triflúoracético; HOBT N-Hidroxibenzotriazol ; DIC N, N'-Diisopropilcarbodiimida; BOP Benzotriazol-1-iloxi-tris- (dimetilamino) fosfônio- Hexaflúorfosfato; HBTU 2-(IH-Benzotriazole-1-il)-1,1,3,3- tetrametilurônio- Hexafluorfosfato; NMP 1-metil 2-Pirolidenona; SSA succinimidil succinamida; β -SBA ácido succinimidil beta-butanóico; SPA ácido succinimidil propriônico; BTC carbonato de benzotriazol; MALDI-TOF ionização de dessorção laser matriz assistida-tempo de vôo; FAB-MS espectrometria de massa de bombardeamento atômico rápido; ES-MS espectrometria de massa eletro-spray; PEGm-SSA PEGrn-CH2CH2NHCOCH2CH2CO- ;
PEGm-S-SBA PEGra-CH (CH3) CH2CO-;
PEGra-SPA PEGm-CH2CH2CO-;
PEGm-BTC PEGra-CO-; and
PEGmé uma porção poli(etilene)glicol maior do que cerca de 1 KDa.
Conforme utilizado presentemente, o termo "alquil" significa radical hidrocarbil ramificado ou não ramificado cíclico ou acíclico, saturado ou insaturado que pode ser substituído ou insubstituído. Onde for cíclico, o grupo alquila é preferivelmente C3 a C12, mais preferivelmente de C5 a Cio, mais pref erivelmente de C5 a C7. onde for acíclico , o grupo alquila é pref erivelmente de Ci to Ci0, mais pref erivelmente de C1 a C6, mais pref erivelmente metil, etil, propil (n-propil ou isopropil), butil (n- butil, isobutil ou tert-butil) ou pentil (incluindo n- pentil e isopentil), mais preferivelmente metil. Será notado que o termo "alquil" conforme utilizado presentemente inclui alquil (normal ou ramificado), alquil substituído (ramificado ou não ramificado), alquinil substituído (ramificado ou não ramificado) , cicloalquil, substituted cicloalquil, cicloalquenil, substituted cicloalquenil, cicloalquinil e cicloalquinil substituído. Os grupos alquil preferidos são acíclicos e saturados.
Conforme utilizado presentemente, o termo "alquil inferior" significa radical hidrocarbil ramificado ou não ramificado, cíclico ou acíclico, saturado ou insaturado em que o grupo alquil inferior é C5, C6 ou C7, em que grupo alquil inferior acíclico é C1, C2, C3 ou C4, e é selecionado preferivelmente a partir de metil, etil, propil (n-propil ou isopropil) or butil (n-butil, isobutil ou tert-butil). Será notado, portanto, que o termo "alquil inferior" conforme utilizado presentemente inclui alquil inferior (normal ou ramificado), alquenil inferior (normal ou ramificado), alquinil inferior (normal ou ramificado), cicloalquil inferior e cicloalquenil inferior. Grupos alquil inferior preferidos são aciclicos e saturados.
Conforme utilizado presentemente, o termo "acil" signfica grupo aril ou hetero aril opcionalmente substituído por alquil, cicloalquil, heterociclico, ligado via grupo carboni e incluil grupos tais como acetil, propionil, benzoil, 3-piridinilcarbonil, 2- morpholinocarbonil, 4-hidroxibutanoil, 4-flúorbenzoil, 2- naftoil, 2-fenilacetil, 2-metoxiacetil e outros.
Conforme utilizado presentemente, o termpo "aril" signfica grupo carbocíclico aromãtico substituído ou não substituído tais como fenil ou naftil.
O termo "heteroaril" só ou em combinação com outros gruposm significa um radical monociclo ou biciclo de 5 a 12 possuindo pelo menos um anel aromático contendo um, dois ou três heteroátomos selecionados a partir de Ν, O e S, os átomos remanescentes do anel sendo C, com o entendimento de que o ponto de ligação do radical heteroaril será em um anel aromático. Um ou dois átomos de anel carbônico do grupo heteroaril pode ser substituído por um grupo carbonil Os grupos alquil, aril podem ser substituídos ou não substituídos. Onde for substituído, haverá geralmente de 1 substituinte. Os substituintes podem incluir: grupos que contêm carbono tais como alquil, aril, arilalquil (por exemplo, fenil substituído e não substituído, benzil substituído e não substituído); átomos de halogênio e grupos contendo halogênio tais como haloalquil (por exemplo, trifluormetil); grupos contendo oxigênio tais como álcoois (por exemplo, hidroxila, hidroxialquil, aril(hidroxil)alquil), alcoxi, ariloxi, alcoxialquil, ariloxialquil, acil, ácidos (e.g. carboxi, carboxialquil), derivados de ácido tais como ésteres (por exemplo, alcoxicarbonil, alcoxicarbonilalquil, alquilcarboniloxi, alquilcarboniloxialquil), amidas (por exemplo, aminocarbonil, mono- ou di-alquilaminocarbonil, aminocarbonilalquil, mono-ou di-alquilaminocarbonilalquil, arilaminocarbonil), carbamatos (por exemplo, alcoxicarbonilamino, arloxicarbonilamino, aminocarboniloxi, mono-ou di-alquilaminocarboniloxi, arilminocarbonloxi) e uréias (por exemplo, mono- ou di- alquilaminocarbonilamino ou arilaminocarbonilamino); grupos contendo nitrogênio tais como aminas (por exemplo, amino, mono- ou di-alquilamino, aminoalquil, mono- ou di-alquilaminoalquil), azidas, nitrilas (por exemplo, ciano, cianoalquil), nitro; grupos contendo enxofre tais como tióis, tioéteres, sulfóxidos e sulfonas (por exemplo, alquiltio, alquilsulfinil, alquilsulfonil, alquiltioalquil, alquilsulfinilalquil, alquilsulfonilalquil, ariltio, arilsulfinil, arilsulfonil, ariltioalquil, arilsulfinilalquil, arilsulfonilalquil); grupos heterocíclicos contendo um ou mais, preferivelmente um, heteroátomo (por exemplo, tienil, furanil, pirrolil, imidazolil, pirazolil, tiazolil, isotiazolil, oxazolil, oxadiazolil, tiadiazolil, aziridinil, azetidinil, pirrolidinil, pirrolinil, imidazolidinil, imidazolinil, pirazolidinil, tetrahidrofuranil, piranil, pironil, piridil, pirazinil, piridazinil, piperidil, hexahidroazepinil, peperazinil, morfolinil, tianaftil, benzofuranil, isobenzofuranil, indolil, oxiindolil, isoindolil, indazolil, indolinil, 7-azaindolil, benzopiranil, coumarinil, isocoumarinil, quinolinil, isoquinolinil, nafthridinil, cinnolinil, quinazolinil, piridopiridil, benzoxazinil, quinoxalinil, cromenil, cromanii, isocromanil, ftalazinil e carbolinil).
Os grupos de alquilas inferiores podem ser substituídos ou não substituídos, preferivelmente não substituídos. Onde forem substituídos, serão geralmente de 1 a 3 substituintes presentes, preferivelmente 1. Os substituintes incluem os grupos substituintes listados acima, outros que não alquil, aril e arialquil.
Conforme utilizado presentemente, o termo "alcoxi" significa alquil-O- e "alcanoil" significa alquil-C0-. Os grupos substituintes alcoxi ou que contêm substituintes podem ser substituídos com um ou mais grupos alquila.
Conforme utilizado presentemente, o termo "halogênio" significa um radical flúor, cloro, bromo ou iodo, preferivelmente um radical flúor ou radical cloro. nSal farmaceuticamente aceitável" refere-se a sais de adição ácida convencionais que retêm a eficácia biológica e propriedades dos compostos de fórmula I e são formados a partir de ácidos orgânicos ou bases orgânicos ou inorgânicos não tóxicos. Sais de adição ácida amostrais incluem aqueles derivados de ácidos inorgânicos tais como ácido clorídrico, ácido brômico, ácido iodídrico, ácido sulfúrico, ácido sulfâmico, ácido fosfórico e ácido nítrico e aqueles derivados a partir de ácidos orgânicos tais como ácido acético, ácido p-toluenossulfônico, ácido salicílico, ácido metanossulfônico, ácido oxálico, ácido succínico, ácido cítrico, ácido málico, ácido lático, ácido fumárico, e outros. Sais de adição básica amostrais incluem aqueles derivados de amônio, potássio, sódio e hidróxidos de amônio quaternários, tais como por exemplo, hidróxido tetrametilamônio. A modificação química de um composto farmacêutico (por exemplo, droga) dentro de um sal é uma técnica bem conhecida que é utilizada na tentativa de melhorar as propriedades envolvendo propriedades de estabilidade física ou química, por exemplo, capacidade higroscópica, fluidez ou solubilidade de compostos. Ver, por exemplo, H. Ansel et. al. , Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems (6a Ed. 1995) pp. 196 e 1456- 1457.
"Éster farmaceuticamente aceitável" refere-se a um composto convencionalmente esterificado de fórmula I que possui um grupo carboxila, cujos ésteres podem reter a eficácia biológica e as propriedades dos compostos de fórmula I são clivados in vivo (no organismo) no correspondente ácido carboxílico ativo. Exemplos destes grupos de ésteres que são clivados (neste caso hidrolizados) in vivo nos correspondentes ácidos carboxílicos são aqueles em que o hidrogênio clivado é substituído por um alquil inferior que é opcionalmente substituído, por exemplo, com heterociclo, cicloalquil, etc. Exemplos de ésteres de alquil inferior são aqueles em que o alquil inferior é substituído por pirrolidina, piperidina, morfolina, N-metilpiperazina, etc. O grupo que é clivado in vivo pode ser, por exemplo, etil, morfolino etil, e dietilamino etil. Em conexão com a presente invenção, -CONH2 é também considerado um éster, como -NH2 é clivado in vivo e substituído por grupo hidroxi, para formar o correspondente ácido carboxílico.
O termo "Tyr-modifiçada" refere-se à tirosina que é modificada de alguma forma, preferivelmente pela substituição por 1 a 3, preferivelmente por 1 a 2, substituintes, independentemente selecionados a partir de um grupo que consiste de alquil inferior e halogênio. Tyr- modificadas preferidas são metil tirosina, preferivelmente, C-alfa-metil-tirosina ((3,5,-diF)Υ) , 2,6-difluor (C-alfa- Me-Tyr), 3-iodo-tirosina ((3-I)Y), 3,5-difluor-tirosina ((3,5 di F)Υ), 2,6-difluor-tirosina ((2,6 di F)Y) and 2,6- dimetil-tirosina ((2,6 di Me)Y). Uma outra tirosina- modifiçada é a meta-tirosina ((m-)Y). A tirosina modificada preferida são aquelas que ocorrem nos exemplos especcíficos abaixo. O termo "Phe-modificada" refere-se a fenilalanina que é modificada de qualquer forma, preferivelmente pela substituição por 1 a 4 substituintes independentemente selecionados a partir do grupo que consiste de alquila inferior, hidroxialquil inferior, flúor alquil inferior, alcoxi inferior, amino e halogênio. Phe-modifiçadas preferidas são 4-metoxi- fenilalanina (F(4-0-CH3) ) , 4- amino- fenilalanina ( (4-NH2)Phe), 4-fIuor-fenilalanina ((4- F)Phe), 4-hidroximetil- fenilalanina ( (4-CH2OH)Phe), 4- trifluormetil- fenilalanina ((4-CF3) Phe) , 3-flúor- fenilalanina ((3-F)Phe), 2,3,4,5,6-pentaflúor-fenilalanina ((2,3,4,5,6-penta-F)Phe) and 3,4-dichloro fenilalanina ((3,4 di-Cl)Phe). Tyr-modifiçadas preferidas são aquelas que ocorrem nos exemplos específicos abaixo.
O termo "hidroxialquil inferior" refere-se a grupos alquila inferior conforme definidos acima que são substituídos com um grupo hidroxila, preferivelmente com um grupo hidroximetil.
O termo "flúoralquil inferiorl" refere-se a grupos alquila inferiores conforme definidos acima que são mono ou multiplamente substituídos com flúor. Exemplos de grupos flúoralquila inferiores são, por exemplo, CFH2, CF2H, CF3, CF3CH2, CF3(CH2)2, (CF3)2CH e CF2H-CF2, preferivelmente CF3.
Em detalhe, a presente invenção refere-se a um agonista receptor de neuropeptídeo-2 da fórmula (I):
<formula>formula see original document page 19</formula> Y-Rl R-2 — X —R3—R4-R5-R6-R7-R8-R9-R10-R11-R12-R13-R14-NH2( (I)
Em que:
X é ο ácido 4-0x0-6-(1-piperazinil)-3(4Η)-quinazolina- acético (Pqa),
Y é Hf uma porção acila, um alquil substituído e não substituído, um alquil inferior substituído ou não substituído, um aril substitiuído ou não substituído, um heteroaril substituído ou não substituído, um alcoxi substituído ou não substituído, uma porção poli(etileno) glicol , PEGra-SSA, PEGm-S-SBA, PEGm-SPA OU PEGm-BTC, Y1 é H, uma porção poli (etileno) glicol, PEGm-SSA, PEGm-S- SBA, PEGm-SPA ou PEGm-BTC,
R1 é ILe, Ala, (D) lie, N-metil lie, Aib, 1-lAic, 2-2 Aic, Ach ou Acp,
R2 é Lys, Ala, (D) Lys1 NMelys, Nle ou (Lys-Gly) ,
R3 é Arg, Ala, (D)Arg, N-metil Arg, Phe, 3,4,5- Triflúor
Phe ou 2,3,4,5,6- Pentafluor Phe,
R4 é His, Ala, (D) His, N-metil His, 4-MeOApc, 3-Pal ou 4- Pai,
R5 é Tyr, Ala, (D) Tyr , N- metil Tyr, Trp, Tic, Bip, Dip,
(1)Nal, (2)Nal, 3,4,5- Trifluor Phe ou 2,3,4,5,6- Pentafluor Phe,
R6 é Leu, Ala, (D)Leu ou N-metil Leu,
R7 é Asn, Ala ou (D)Asn,
R8 é Leu ou Trp,
R9 é Vai, Ala, (D) Val ou N-metil Vai,
Ri0 é Thr, Ala ou N-metil Thr, R11 é Arg, (D) Arg ou N-metil Arg,
R12 é Gln ou Ala,
R13 é Arg, (D)Arg ou N-metil Arg,
R14 is Tyr, (D) Tyr ou N- metil Tyr, Tyr modificado, Phe, Phe modificado, Cha, (1) Nal, (2) Nal, C-alfa-metil Tyr ou Trp, e
PEGm é 1 to 60 KDa,
Ou seu sal farmaceuticamente aceitável.
Os compostos de fórmula (I) são individualmente preferidos e seus sais farmaceuticamente aceitáveis são individualmente preferidos, com os compostos de fórmula (I) sendo particularmente preferidos..
Agonistas receptores de neuropeptídeos-2 conforme descrito acima são caracterizados pela fórmula (Ia)
Y-R1-R2-X-R3-R4-R5-R6-R7-R8-R9-Rio-Rii-R12-Ri3-Ri4-NH2 (Ia)
Em que :
X é o ácido N-piperazin-1-il-4(3H)-quinazolinona-3-acético (Pqa),
Y é H, uma porção acila, alquil substituído ou não substituído, alquil inferior substituído ou não substituído, um aril substituído ou não substituído, um alcõxi substituído ou não substituído, uma porção poli(etileno) glicol, PEG-SSA, PEG-S-SBA, PEG-SPA ou PEG- BTC,
R1 é Ile, Ala, (D) Ile, N-metil He, Aib, 1-IAic, 2-2 Aic, Ach ou Acp,
R2 é Lys, Ala, (D) Lys, NMelys, Nle ou (Lys-Gly), R3 é Arg, Ala, (D)Arg, N-metilArg, Phe, 3,4,5- TriflúorPhe ou 2,3,4,5,6- Pentaflúor Phe,
R4 é His, Ala, (D) His, N-metil His, 4-MeOApc, 3-Pal ou 4- Pal,
R5 é Tyr, Ala, (D) Tyr , N- metil Tyr, Trp, Tic, Bip, Dip, (l)Nal, (2)Nalf 3,4,5- Trifluor Phe ou 2,3,4,5,6- Pentaflúor Phe,
R6 é Leu, Ala, (D)Leu ou N-metil Leu, R7 é Asn, Ala ou (D)Asn, R8 é Leu ou Trp,
R9 é Vai, Ala, (D) Val ou N-metil Vai, R10 é Thr, Ala ou N-metil Thr, R11 é Arg, (D) Arg ou N-metil Arg, R12 é Gln ou Ala, R13 é Arg, (D)Arg ou N-metil Arg, e R14 é Tyr, (D) Tyr ou N- metil Tyr, Tyr-modificada, Phe, Phe-modifiçada ou Trp,
Ou seu sal farmaceuticamente aceitável.
Uma modalidade preferida da presente invenção está relacionada a um agonista de receptor de neuropeptídeo-2 conforme definido acima, em que R2 é substituído com Y1 e Y' é H, uma porção poli (etileno) glicol , PEGm-SSA, PEGm- β-SBA, PEGm-SPA ou PEGm-BTC. Mais preferivelmente, Y1 é uma porção poli (etileno) glicol, PEGm-SSA, PEGm-S-SBA, PEGm-SPA ou PEGm-BTC.
Uma outra modalidade preferida da presente invenção refere- se a agonistas receptores de neuropeptídeos-2 conforme definido acima, em que: Y é H ou uma porção acil, e
Y1 é uma porção poli (etileno) glicol, PEGm-SSA, PEGm-S- SBA, PEGm-SPA ou PEGm-BTC. Mais pref erivelmente, Y' é PEGm-SSA ou PEGm-SPA.
Pref erivelmente, Y é uma porção acila. Em uma outra modalidade preferida, Y pode ser H. Além disso, é preferido que Y1 seja H.
No agonista receptor de neuropeptídeo-2 conforme definido acima, é preferido que PEGm seja de 20 a 40 KDa. Preferivelmente, PEGm é de 30 KDa. Preferivelmente, uma porção de poli (etileno) glicol possui um peso de 1 a 60 KDa, mais pref erivelmente de 20 a 40 KDa, mais preferivelmente de 3OKDa.
No agonista receptor de neuropeptxdeo-2 conforme definido acima, é preferido que R1 seja Ile. Ainda, é preferido que R2 seja Lys ou Nle. Ainda, é preferido que R3 seja Arg. Ainda, é preferido que R4 seja His. Ainda, é preferido que R5 seja Tyr. Ainda, é preferido que R6 seja Leu. Ainda, é preferido que R7 seja Asn. Ainda, é preferido que R8 seja Leu ou Trp. Ainda, é preferido que R9Seja Vai. Ainda, é preferido que R10 seja Thr. Ainda, é preferido que R11 seja Arg. Ainda, é preferido que R12 seja Gln. Ainda, é preferido que R13 seja Arg ou (N-metil)Arg.
Ainda, é preferido que R14 seja Tyr, (D) Tyr ou N- metil Tyr, Tyr-modifiçada, Phe, Phe-modifiçada ou Trp. Preferivelmente, R14 é Y, (m-)Y, (3-I)Y, (3,5 di F) Y, (2,6 di F) Y, (2,6 di Me) Y, F(4-0-CH3), F, (4-NH2)Phe, (4-F)Phe, (4 - CH2OH) Phe, (4-CF3) Phe, (3-F)Phe, (2,3,4,5,6 penta F)Phe, (3,4 di Cl)Phe, Cha, W, (1) Nal, (2) Nal ou C-alf a-Me-Tyr. Mais preferivelmente, R14 é Tyr ou (2,6 di F)Tyr. O agonista receptor de neuropeptídeo-2 preferido conforme descrito acima são aqueles selecionados a partir de um grupo que consiste de: IK-Pqa-RHILNLVTRQRY, IK-Pqa-RHILNLVTRQ(N-metil)RY, IK-Pqa-RHILNLVTRQ(N-metil)R(m-)Y, IK-Pqa-RHILNLVTRQ(N-metil)R(3-I)Y,
IK-Pqa-RHILNLVTRQ(N-metil)R(3,5 di F) Y, IK-Pqa-RHILNLVTRQ(N-metil)R(2,6 di F)Y, IK-Pqa-RHILNLVTRQ(N-metil)R(2,6 di Me)Y, IK-Pqa-RHILNLVTRQ(N-metil)RF(4-O-CH3) , IK-Pqa-RHILNLVTRQ(N-metil)RF,
IK-Pqa-RHILNLVTRQ (N-metil) R (4-NH2) Phe, IK-Pqa-RHILNLVTRQ(N-metil)R(4-F)Phe, IK - Pqa - RHILNLVTRQ (N - me t i 1) R (4 - CH2OH) Phe, IK-Pqa-RHILNLVTRQ(N-metil)R(4-CF3) Phe, IK-Pqa-RHILNLVTRQ(N-metil)R(3-F)Phe,
IK-Pqa-RHILNLVTRQ(N-metil)R(2,3,4,5,6 penta F)Phe, IK-Pqa-RHILNLVTRQ(N-metil)R(3,4 di Cl)Phe, IK-Pqa-RHILNLVTRQ(N-metil)RCha, IK-Pqa-RHILNLVTRQ(N-metil)RW, IK-Pqa-RHILNLVTRQ(N-metil)R(1)Nal, IK-Pqa-RHILNLVTRQ(N-metil)R(2)Nal, IK-Pqa-RHILNLVTRQR-C-alpha-Me-Tyr, IK-Pqa-RHILNWVTRQ(N-metil)RY, INle-Pqa-RHILNWVTRQ(N-metil)RY,
Ac-IK-Pqa-RHILNWVTRQ(N-metil)R(2,6 di F)Y,
Ac-IK-Pqa-RHILNWVTRQ(N-metil)RY,
Pentil-IK-Pqa-RHILNWVTRQ(N-metil)RY,
Trimetilacetil-IK-Pqa-RHILNWVTRQ(N-metil) RY,
Ciclohexil-IK-Pqa-RHILNWVTRQ(N-metil) RY,
Benzoil-IK-Pqa-RHILNWVTRQ(N-metil) RY,
Adamtil-IK-Pqa-RHILNWVTRQ(N-metil)RY,
(PEG 30,000 SPA)IK-Pqa-RHILNWVTRQ(N-metil)RY,
(PEG4 0,000 BTC)-IK-Pqa-RHILNWVTRQ(N-metilRY,
(PEG30, 000)-SSA-INle-Pqa-RHILNWVTRQ(N-metil)RY,
(PEG3 0, 000)-beta-SBA-INle-Pqa-RHILNWVTRQ(N-metil)RY,
Ae-Ile-Lys(PEG30,000 SPA)-Pqa-RHILNWVTRQ(N-metil)RY,
Ae-Ile-Lys(PEG30,000 SSA)-Pqa-RHILNWVTRQ(N-metil) RY, e
IK(PEG3 0,000 SSA)-Pqa-RHILNWVTRQ(N-metil)RY,
Ou seu sal farmaceuticamente aceitável.
Outro agonista receptor de neuropeptídeo-2, conforme descrito acima são aqueles selecionados a partir do grupo que consiste de Ac-Ile-Lys(PEG30,000 SPA)-Pqa-RHILNWVTRQ(N-metil)RY,
Ac-Ile-Lys(PEG30,000 SSA)-Pqa-RHILNWVTRQ(N-metil)RY, e IK(PEG3 0,000 SSA)-Pqa-RHILNWVTRQ(N-metil) RY, Ou seu sal farmaceuticamente aceitável.
Os compostos descritos acima, os quais não são sais farmaceuticamente aceitáveis, são preferidos. Cada um dos compostos individuais mencionados acima separadamente constitui uma modalidade preferida. Um agonista receptor de neuropeptídeo-2 conforme definido acima é aquele em que o agonista é Ac-IK-Pqa - RHILNWVTRQ(N-metil)R (2-6 di F)Y.
Um outro agonista receptor de neuropeptídeo-2 conforme definido acima é aquele em que o agonista é Ac-IK- Pqa -RHILNWVTRQ(N-metil)RY.
Um outro agonista receptor de neuropeptídeo-2 preferido conforme definido acima é aquele em que o agonista é (PEG 30,000)-SPA-IK-Pqa -RHILNWVTRQ(N-metil)RY.
Um outro agonista receptor de neuropeptídeo-2 particularmente preferido conforme definido acima é aquele em que o agonista é (PEG30,000)-SSA-INle-Pqa -RHILNWVTRQ(N- metil )RY.
Um outro agonista receptor de neuropeptídeo-2 particularmente preferido conforme definido acima, é aquele em que o agonista conforme definido acima é aquele em que o agonista é Ac-Ile-Lys( PEG30,000 SSA)- Pqa -RHILNWVTRQ(N- metil)RY.
Um outro agonista receptor de neuropeptídeo-2 particularmente preferido conforme definido acima é aquele em que o agonista é H-Ile-Lys( PEG30,000 SSA)- Pqa - RHILNWVTRQ(N-metil)RY.
O agonista receptor de neuropeptídeo-2 conforme descrito acima, o qual não é peguilado, i.e., em que ambos YeY' não são uma porção de poli (etileno) glicol, PEGm- SSA, PEGm-S-SBA, PEGm-SPA or PEGm-BTC, podem também ser utilizados como intermediários para a preparação dos presentes compostos, em que um ou ambos Y e Y1 são uma porção poli (etileno) glicol, PEGrn-SSA, PEGm-S-SBA, PEGm-SPA or PEGm-BTC. Tais grupos YeY' podem ser introduzidos por métodos padronizados bem conhecidos por aqueles versados na técnica.
Preferivelmente, um agonista receptor de neuropeptídeo-2 conforme descrito acima não é selecionado a partir de um grupo consistindo de:
IK-Pqa -RHILNLVTRQRY, Ac-IK-Pqa -RHILNLVTRQRY, IK-Pqa -RHILNLVTRARY, IK-Pqa -RHILNLVARQRY, IK-Pqa -RHILNLATRQRY, IK-Pqa -RHILALVTRQRY, IK-Pqa -RHYANLVTRQRY, IK-Pqa -RHALNLVTRQRY, IK-Pqa -RAILNLVTRQRY, IK-Pqa -AHILNLVTRQRY, IA-Pqa -RHILNLVTRQRY, Ac-IA-Pqa -RHILNLVTRQRY, AK-Pqa -RHILNLVTRQRY, IK-Pqa -RHILNLVTRQR(D)Y, IK-Pqa -RHILNLVTRQ(D)RY, IK-pqa -rhilnlvt(d)rqry, IK-Pqa -RHILNL(D)VTRQRY, IK-Pqa -RHIL(D)NLVTRQRY, IK-Pqa -RHY(D)LNLVTRQRY, IK-Pqa -RH(D)ILNLVTRQRY, IK-Pqa -R(D)HILNLVTRQRY, IK-Pqa - (D)RHILNLVTRQRY,
I (D)K-Pqa -RHILNLVTRQRΥ,
(D)IK-Pqa -RHILNLVTRQRΥ,
IK-Pqa -RHILNLVTRQR(N-metil) Υ,
IK-Pqa -RHILNLVTRQ(N-metil)RY,
IK-Pqa -RHILNLVT(N-metil)RQRY,
IK-Pqa -RHILNLV(N-metil)TRQRY,
IK-Pqa -RHILNL(N-metil)VTRQRY,
IK-Pqa -RHY(N-metil)LNLVTRQRY,
IK-Pqa -RH(N-metil)ILNLVTRQRY,
IK-Pqa -R(N-metil)HILNLVTRQRY,
IK-Pqa -(N-metil)RHILNLVTRQRY,
I(N-metil)K-Pqa -RHILNLVTRQRY,
(N-metil)IK-Pqa -RHILNLVTRQRY,
INle-Pqa -RHILNLVTRQRY,
Ac-INle-Pqa -RHILNLVTRQRY,
Ac-INle-Pqa -FHILNLVTRQRY,
IK-Pqa -RHWLNLVTRQRY,
IK-Pqa -AHWLNLVTRQRY,
Ae-INle-Pqa -RHILNLVTRQR(D)Y,
Ae-INle-Pqa -RHILNLVTRQR(N-metil)Y,
Ae-INle-Pqa -RHTieLNLVTRQRY,
Ae-INle-Pqa -RHBipLNLVTRQRY,
Ae-INle-Pqa -RHDipLNLVTRQRY,
Ae-INle-Pqa -RH(I)NalLNLVTRQRY,
Ae-INle-Pqa -RH(2)NaILNLVTRQRY,
Ae-INle-Pqa -RH(3.4,5 Triflúor Phe)LNLVTRQRY,
Ae-INle-Pqa -RH(2,3.4,5,6 Pentaflúor Phe)LNLVTRQRY, Ac-INle-Pqa -R(4-MeOApc)ILNLVTRQRY,
Ae-INle-Pqa -R(3-Pal)ILNLVTRQRY,
Ae-INle-Pqa -R(4-Pal)ILNLVTRQRY,
Ae-INle-Pqa -(3,4,5 Trifluro Phe)HILNLVTRQRY,
Ae-INle-Pqa -(2,3,4,5 ,6 Pentafluro Phe)HILNLVTRQRΥ,
Ae-Aib-Nle-Pqa-RHILNLVTRQRT,
Ael-I-Aie-Nle-Pqa -RHILNLVTRQRT,
Ael-I-Aie-Nle-Pqa -RHILNLVTRQRT,
Ae-2-2Aie-Nle-Pqa -RHILNLVTRQRT,
Ac-Aeh-Nle-Pqa-RHILNLVTRQRTi
Ae-Aep-Nle-Pqa -RHILNLVTRQRT,
H- INle-Pqa -RHILNLVTRQRΥ,
(PEG-10,000) INle-Pqa -RHILNLVTRQRΥ, e
(PEG-3 0,000) INle-Pqa -RHILNLVTRQRY.
Os compostos da invenção são vantajosos porque, por exemplo, são versões truncadas do PIY 3-36. Os peptídeos mais curtos, por exemplo, não apenas facilitam sínteses mais fáceis e a purificação dos compostos, mas também melhoram e reduzem o procedimento de fabricação e os custos. Além disso, os compostos da presente invenção irão interagir preferivelmente com os receptores Y2 e não com receptores homólogos tais como NPI Yl, Y4 e Y5. um agonista ou reações secundárias de antagonistas não desejados são, assim, minimizados.
Os compostos da presente invenção são preferivelmente úteis para o tratamento de doenças metabólicas e desordens. Tais doenças metabólicas e desordens incluem, por exemplo, obesidade, diabetes, diabetes do tipo 2, sindrome metabólica (também conhecida como Sindrome X), resistência à insulina, deslipidemia, aumentada permanência da glicose e aumentada tolerância à glicose.
A presente invenção, portanto, também refere-se a composições farmacêuticas compreendendo um agonista receptor de neuropeptídeo-2 conforme definido acima e um veículo farmaceuticamente aceitável e/ou um adjuvante.
A presente invenção da mesma forma engloba o agonista receptor de neuropeptídeo-2 conforme descrito acima para uso como substâncias terapeuticamente ativas, especialmente como substâncias terapeuticamente ativas, especialmente substâncias terapeuticamente ativas para o tratamento e/ou profilaxia de doenças que são moduladas por agonistas receptores de neuropeptídeos-2, particularmente, como substâncias terapeuticamente ativas para o tratamento e/ou profilaxia de obesidade, diabetes tipo 2, sindrome metabólica, resistência à insulina, deslepidemia, aumentada permanência da glicose e aumentada tolerância à glicose.
Em uma modalidade preferida, a presente invenção refere-se a um método para o tratamento terapêutico e/ou profilático de doenças que são moduladas por agonistas receptores de neuropeptídeos-2, particularmente para o tratamento terapêutico e/ou profilático de uma doença ou desordem profilática, especialmente obesidade, diabetes do tipo 2, sindrome metabólica, resistência à insulina, deslipidemia, aumentada permanência da glicose e aumentada tolerância à glicose, cujo método compreende a administração de um agonista receptor de neuropeptídeo-2 conforme definido acima em um ser humano ou aminal. Em um método preferido, o agonista receptor de neuropeptídeo-2 é administrado em um paciente uma vez ao dia.
Preferivelmente, o agonista receptor de neuropeptídeo-2 é administrado uma vez a cada três dias. Mais preferivelmente, o agonista receptor de neuropeptídeo-2 é administrado no paciente uma vez por semana. É preferido que o o agonista receptor de neuropeptídeo-2 seja administrado em um paciente por via oral, intranasal, intravenosa, subcutânea, parenteral, transdérmica, intraperitoneal, retal ou por inalação. Preferivelmente, o o agonista receptor de neuropeptídeo-2 é administrado por via intranasal. É preferido que o agonista receptor de neuropeptídeo-2 seja administrado por via subcutânea. No método descrito acima, o agonista receptor de neuropeptídeo-2, é preferivelmente administrado em uma forma de dosagem de cerca de 0,001 a cerca de 100 mg.
A presente invenção também engloba o uso de agonista receptor de neuropeptídeo-2 conforme definido acima para o tratamento terapêutico e/ou profilático conforme definido acima para o tratamento terapêutico e/ou profilático de doenças que são moduladas pelo agonista receptor de neuropeptídeo-2, particularmente para o tratamento terapêutico e/ou profilático da obesidade, diabetes tipo 2, síndrome metabólica, resistência à insulina, deslipidemia, aumentada permanência da glicose e aumentada tolerância à glicose. A presente invenção também se refere ao uso de agonista receptor de neuropeptídeo-2 conforme descrito acima, para a preparação de medicamentos para o tratamento terapêutico e/ou profilático de doenças que são moduladas pelo agonista receptor de neuropeptídeo-2 conforme descrito acima, particularmente para o tratamento terapêutico e/ou profilático de obesidade, diabetes tipo 2, síndrome metabólica, resistência à insulina, deslipidemia, aumentada permanência da glicose e aumentada tolerância à glicose. Tais medicamentos compreendem o agonista receptor de neuropeptídeo-2 conforme descrito acima.
Deve ser entendido que a presente invenção não é limitada às modalidades particulares da presente invenção, bem como as variações das modalidades particulares podem ser concretizadas ainda dentro do escopo presentemente reivindicado. Deve ser entendido também que a terminologia empregada é para fins de descrição das modalidades particulares e não limitativas. Por outro lado, o escopo da presente invenção será estabelecido pelas reivindicações em anexo.
Outras informações relativas aos exemplos o uso dos ésteres para distribuição dos compostos farmacêuticos está disponível em Design of Prodrugs. Bundgaard H. ed. (Elsevier, 1985). Ver também, H. Ansel et. ai-, Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems (6th Ed. 1995) pp. 108-109; Krogsgaard-Larsen, et. ai-, Textbook of Drug Design and Development (2d Ed. 1996) pp. 152-191. Os compostos representativos podem ser prontamente sintetizados por meio de qualquer procedimento convencional para a formação de uma ligação peptídeo entre aminoãcidos. Tais procedimentos convencionais incluem, por exemplo, qualquer procedimento de fase de solução que permita a condensação entre o grupo alfa amino livre ou resíduo deste possui seu grupo carboxila e outros grupos reativos protegidos e o grupo carboxila primária livre de outro aminoácido ou resíduo deste possuindo seu grupo amino ou outro grupo reativo protegido.
Tais procedimentos convencionais para síntese dos novos compostos da presente invenção incluem, por exemplo, qualquer método de síntese de peptídeo em fase sólida. No método de síntese dos novos compostos pode ser realizada pela incorporação seqüencial dos resíduos de aminoãcidos desejados, um por vez dentro da cadeia de peptídeo crescente de acordo com os princípios gerais dos métodos de fase sólida. Tais métodos são descritos, por exemplo, em Merrifield, R. B., J. Amer. Chem. Soe. 85, 2149-2154 (1963); Barany et al., The Peptides, Analysis, Synthesis and Biology, Vol. 2, Gross, E. and Meienhofer, J., Eds. Academic Press 1-284 (1980), que são incorporados presentemente como referência.
Comum às sínteses dos peptídeos na proteção de grupos de cadeia lateral reativos de várias porções aminoãcidos com grupos de proteção adequados, que irão prevenir uma reação química naquele sítio até que o grupo de proteção seja definitivamente removido. Normalmente, também comum é a proteção do grupo alfa amino em um fragmento de aminoácido enquanto que o composto reage no grupo carboxila, seguido pela remoção seletiva do grupo de proteção alfa amino para permitir uma reação subseqüente que ocorre neste sítio. Enquanto que os grupos de proteção específicos têm sido descritos com relação ao método de síntese m fase sólida, deve ser notado que cada aminoácido pode ser protegido por um grupo protetor convencionalmente utilizado para o respectivo aminoácido em síntese de fase de solução.
Grupos alfa amino pode ser protegido por um grupo protetor adequado selecionado a partir de grupos protetores do tipo uretano aromático, tais como aliloxicarbonil, benzilcarbonil (Z) e benziloxicarbonil substituído, tal como p-clorobenziloxicarbonil, p-nitrobenziloxicarbonil, p- bromobenziloxicarbonil, p-bifenil-isopropiloxicarbonil, 9- fluorenilmetiloxicarbonil (Fmoc) and p- metoxibenziloxicarbonil (Moz); grupos de proteção do tipo uretano, tais como t-butiloxicarbonil (Boc), diisopropilmetiloxicarbonil, isopropiloxicarbonil, e alliloxicarbonil. Presentemente, Fmoc é o mais preferido para proteção alfa amino.
Grupos guanidino pode ser protegido por um grupo de proteção adequado selecionado a partir de nitro, p- toluenossulfonil (Tos), (Z,) pentametilcromanossulfonil (Pmc), 4-Metoxi-2,3,6,-trimetilbenzenossulfonil (Mtr), (Pmc), e (Mtr) são os mais preferidos para arginina (Arg). Os grupos ε- amino podem ser protegidos pelo grupo de proteção selecionados a partir de 2-cloro benziloxicarbonil (2-Cl-Z), 2- Bromo benziloxicarbonil (2- Br-Z) - e t-butiloxicarbonil (Boc). Boc é o mais preferido para (Lys).
Grupos hidroxila (OH) pode ser protegido por um grupo de proteção adequado por um grupo de proteção adequado selecionado a partir de benzil (Bzl), 2, 6 diclorobenzil (2, 6 diCl-Bzl), e tert-butil (t-Bu), (tBu) é mais preferido para (Tyr), (Ser) e (Thr).
Os grupos β- e γ- amida podem ser protegido por um grupo de proteção adequado selecionado a partir de um grupo selecionado a partir de 4- metiltritil (Mtt) , 2, 4, 6- trimethoxibenzil (Tmob), 4, 4-DimetoxiditilBis-(4- methoxifenil) -metil (Dod) e Tritil (Trt) . Trt é o mais preferido para (Asn) e (Gln).
O grupo indol pode ser protegido por um grupo de proteção adequado selecionado a partir de formil (For), Mesitil -2- sulfonil (Mts) e t-butiloxicarbonil (Boc). Boc é o mais preferido para (Trp).
O grupo imidazol pode ser protegido por um grupo de proteção adequado selecionado a partir de Benzil (Bzl), -t- butiloxicarbonil (Boc) , e Tritil (Trt) . Trt é o mais preferido para (His).
A síntese do aminoácido Pqa é descrito por J. Hutchinson et. al (J .Med. Chem. 1996, 39, 4583-4591). O derivado Fmoc-Pqa foi comprado de NeoMPS, Inc. (San Diego CA) .
Todos os solventes, isopropanol (iPrOH), cloreto de metileno (CH2CI2), dimetilformamida (DMF) e N- metilpirrolinona (NMP) foram adquiridos de Fisher ou Burdick & Jackson e foram utilizados sem destilação adicional. O ácido trifluoracético foi adquirido a partir de Halocarbon ou Fluka e utilizado sem purificação posterior.
Diisopropilcarbodiimida (DIC) e diisopropiletilamina (DIPEA) foram adquiridos a partir de Fluka ou Aldrich e foram utilizados sem purificação posterior. Hidroxibenzotriazol (HOBT) dimetilsulfito (DMS) e 1, 2-etanoditiol (EDT) foram adquiridos a partir de Sigma Chemical Co. e utilizados used sem purificação posterior. Os aminoácidos protegidos foram geralmente de configuração L e foram obtidos comercialmente a partir de Bachem ou Neosystem. A pureza destes reagentes foi confirmada por meio de cromatografia de camada fina, RMN e ponto de fusão antes do uso. A resina benzihidrilamina (BHA) foi um copolímero de estireno - 1% divinilbenzeno (100-200 ou 200- 4 00 mesh) obtido a partir de Bachem ou Advanced Chemtech. O teor total de nitrogênio destas resinas foi geralmente de 0,3 - 1,2 meq/g.
Em uma modalidade preferida, os peptídeos foram preparados utilizando síntese em fase sólida pelo método geralmente descrito por Merrifield, (J. Amer. Chem. Soc., 85, 2149 (1963)), apesar de outra síntese química equivalente conhecida na arte poderia ser utilizado com previamente mencionado. A síntese de fase sólida é iniciada pela terminação C-terminal do peptídeo pelo acoplamento de um alfa aminoácido protegido em uma resina adequada. Tal material de partida pode ser preparado pelo acoplamento de um aminoácido alfa-amino protegido em uma ligação éster em um álcool p-benziloxibenzílico (Wang) resina, ou por uma ligação amida entre um ligante Fmoc, tal como ácido p- ( (R, S)-α-(1-(9H-fluoren-9-il)- metoxiformamido)-2,4-dimetiloxibenzil)-fenoxiacético (ligante Rink) em uma resina benzihidrilamina (BHA). A preparação da resina hidroximetil é bem conhecida na arte. Os suportes de resina Fmoc-Iigante-BHA são comercialmente disponíveis e são geralmente utilizados quando o peptídeo desejado que está sendo sintetizado possui uma amida não substituída na terminação C.
Normalmente, os aminoácidos ou miméticos são acoplados na resina Fmoc-Iigante-BHA utilizando a forma protegida Fmoc do aminoácido ou mimético, com 2-5 equivalentes de aminoácido e um reagente de acoplamento adequado. Após os acoplamentos, a resina pode ser lavada e seca sob vácuo. A carga de aminoácido na resina pode ser determinada por uma alíquota da resina Fmoc-aminoácido pela determinação de grupos Fmoc por meio de análise com UV. Quaisquer grupos não reagido pode ser cobertos pela reação da resina com anidrido acético e diispropiletilamina em cloreto de metileno. As resinas são portadas através de vários ciclos repetitivos para adicionar aminoácidos seqüencialmente. Os grupos de proteção alfa amino Fmoc são removidos sob condições básicas. Piperidina, piperazina ou morfolina (20-40% v/v) em MF pode ser utilizado para este fim. Preferivelmente, 4 0% piperidina em DMF é utilizado.
Em seguida à remoção do grupo de proteção alfa amino, os subseqüentes aminoácidos protegidos são acoplados em etapas na ordem desejada para obter um intermediário, proteína protegida-resina. Os reagentes de ativação utilizados para acoplamento dos aminoácidos na síntese de fase sólida dos peptídeos são bem conhecidos da arte. Por exemplo, os reagentes apropriados para tais sínteses são benzotriazol-l-iloxi-tri- (dimetilamino) fosfônio hexaflúorfosfato (BOP), Bromo-tris-pirrolidino-fosfônio hexaflúorfosfato (PiBroP) 2- (ΙΗ-Benzotriazol-l-il)-1,1, 3 , 3- tetrametilurônio hexaflúorfosfato (HBTU), e
diisopropilcarbodiimida (DIC). São preferidos presentemente os HBTU e DIC. Outros agentes de ativação são descritos por Barany e Merrifield (em The Peptides, Vol. 2, J. Meienhofer, ed., Academic Press, 1979, pp 1-284) e pode ser utilizado. Vários reagentes tais como 1 hidroxibenzotriazol (HOBT), N-hidroxisuccinimida (HOSu) e 3, 4-dihidro-3-hidroxi-4-oxo-1, 2, 3-benzotriazina (HOOBT) pode ser adicionado nas misturas de acoplamento para otimizar os ciclos sintéticos.É preferido o HOBT.
Para a preparação de derivados acetil N-terminal, a acetilação foi realizada pelo tratamento do peptídeo ligado por resina com anidrido acético 20% em DMF com 5% de DIEA.
Para outras acilações N-terminais, a acilação foi realizada utilizando o ácido carboxílico correspondente ativado in situ com DIC/HOBT por 30 min.
O protocolo para um ciclo sintético típico é conforme a seguir:
Protocolo 1
Etapa Reagente Tempo
1 DMF 2 χ 30 sec.
2 20 % piperidina/DMFl min.
3 20 % piperidina/DMFl5 min.
4 DMF 2 χ 30 sec.
5 iPrOH 2 X 30 sec.
6 DMF 3 χ 30 sec.
7 Acoplamento 60 min - 18 h.
8 DMF 2 χ 30 sec.
9 iPrOH 1 χ 30 sec.
10 DMF 1 χ 30 sec.
11 CH2Cl2 2 χ 30 sec.
Os solventes para todas as lavagens e acoplamentos foram medidos em volumes de 10-20mL/g de resinas. As reações de acoplamento através da síntese foram monitoradas pelo teste Kaiser Ninhidrina para determinar a extensão da compleição (Kaiser et at. Anal.Biochem.34, 595-598 (1970)).
A cinética lenta de reação foi observada para Fmoc-Arg (Pmc) e para acoplamentos em aminas secundárias por ácidos estericamente escondidos.Quaisquer reações de acoplamento incompletas foram tanto reacopladas com aminoácido recém preparado e ativado ou coberto pelo tratamento da resina de peptídeo com anidrido acético conforme descrito acima. As resinas totalmente montadas foram secas sob vácuo durante várias horas.
Para a maioria dos compostos, os grupos de bloqueio foram removidos o peptídeo clivado da resina. Por exemplo, as resinas foram tratados com 100 μΐ; de etanoditiol, 100 μΐ de dimetilsulfito, 300 μ]^ de anisol, e 9.5 mL de ácido trif luoracético, por grama de resina por grama de resina à temperatura ambiente por 180 min. Ou alternativamente, as resinas peptídeos foram tratada com 1.0 mL de triisopropil silano e 9.5 mL de ácido trifluoracético, por grama de resina à temperatura ambiente por 180 min. A resina foi filtrada e os filtrados foram precipitados em éter etílico resfriado. Os precipitados foram centrifugados. Os produtos crus foram secos sob vácuo.
Uma purificação dos peptídeos crus foi preferivelmente realizado em Shimadzu LC-8A system em uma cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC) em uma coluna de fase reversa C-18 (50x250 mm. 300 A, 10-15 pm) .
Os peptídeos foram injetados nas colunas em um volume mínimo tanto de 0.1 ACOH/H2O ou CH3CH/H20. A eluição gradiente foi iniciada geralmente à 2% B tampão, 2% -70% B por 70 min, (tampão A: 0.1% TFA/H20, tampão B: 0.1% TFA/CH3CN) a uma taxa de fluxo de 50ml/min. A detecção UV foi feita at 220/280 nm. As frações contendo os produtos foram separadas e sua pureza foi avaliada em Shimadzu LC- 10AT analytical system utilizando uma coluna Ace C18 (4.6 x50mm) de fase reversa face a uma taxa de fluxo de 2 ml/min. , gradiente (2-70 %) durante 10 min. (tampão A: 0.1% TFA/H20, tampão B: 0.1% TFA/CH3CN)). As frações avaliadas como sendo de alta pureza foram reservadas e Iiofilizadas.
A pureza dos produtos finais foi checada por meio de HPLC analítica em uma coluna de fase reversa conforme dito acima. A pureza de todos os produtos foi avaliada como sendo de aproximadamente 95 - 99%. Todos os produtos foram também submetidos à espectrometria de massa de bombardeio atômico rápido (FAB-MS) ou espectroscopia de massas de eletrspray (ES-MS).Todos os produtos renderam os íons M+H parentais dentro dos limites aceitáveis.
Os compostos da presente invenção podem ser proporcionados na forma de sais farmaceuticamente aceitáveis. Exemplos de sais preferidos são aqueles formados com ácidos orgânicos farmaceuticamente aceitáveis, por exemplo, ácido acético, lático, maléico, cítrico, málico, ascórbico, succinico, benzóico, salicílico, metanossulfônico, toluenossulfônico, trifluoracético ou ácido pamóico, bem como ácidos políméricos tais como ácido tânico ou carboximetil celulose e sais com ácidos inorgânicos, tais como ácidos halogênicos (por exemplo, ácido clorídrico), ácido sulfúrico, ou ácido fosfórico e outros. Qualquer procedimento para obtenção de sal farmaceuticamente aceitável conhecido por aqueles versados na técnica pode ser utilizado. Na prática do método da presente invenção, uma quantidade eficaz de qualquer um dos peptídeos da presente invenção ou uma combinação de qualquer um dos peptídeos desta invenção ou um sal farmaceuticamente aceitável deste, é administrado por meio de quaisquer métodos conhecidos na arte, tanto simplesmente quanto em combinação. A administração pode ser, por exemplo, uma vez ao dia, uma vez a cada três dias, ou uma vez por semana. Os compostos ou composições podem então ser administradas oralmente (por exemplo na cavidade bucal), por via sublingual, parenteral (por exemplo, por via intramuscular, intravenosa ou subcutânea), retal (por exemplo, supositõrios ou lavagens), por via transdérmica (por exemplo, eletroporação cutânea) ou por inalação (por exemplo, com aerossol), e na forma ou sólida, líquida ou gasosa, incluindo tabletes e suspensões. A administração pode ser conduzida em uma única forma de dosagem com terapia contínua ou em uma terapia de uma dose única ad libitum. A composição pode também estar na forma de uma emulsão oleosa ou dispersão em conjunção com um sal lipofílico tal como ácido pamóico, ou na forma de uma composição biodegradável de liberação sustentada para administração subcutânea ou intramuscular.
Então, o método da presente invenção é realizado quando o alívio dos sintomas é especialmente iminente. Alternativamente, o método da presente invenção é efetivamente realizado como tratamento contínuo ou profilático. Veículos farmacêuticos úteis para a preparação das composições da presente invenção podem ser sólidos líquidos ou gases; então as composições podem ter a forma de tabletes, pílulas, cápsulas, supositõrios, pós, formulações entericamente revestidas ou outra formulação protegida, (por exemplo, aglutinação de resinas trocadoras de íons, ou vesículas de empacotamento), formulações de liberação sustentada, soluções, suspensões elixires, aerosóis e outros. O veículo pode ser selecionado a partir de vários óleos incluindo aqueles de petróleo, animal, vegetal ou de origem sintética, por exemplo óleo de amendoim, óleo de soja, óleo mineral, óleo de sésamo e outros. Água, solução salina, dextrose aquosa e glicóis são os preferidos, (quando isotônica com o sangue) para soluções injetáveis.
Por exemplo, as formulações para administração intravenosa compreendem soluções aquosas estéreis do ingrediente ativo que são preparadas pela dissolução do ingrediente ativo em água para produzir uma solução aquosa e gerar a solução estéril. Os excipientes farmacêuticos adequados incluem amido, celulose, talco, glicose, lactose, talco gelatina, malte arroz, farinha, giz, sílica, estearato de magnésio, estearato de sódio, monoestearato de glicerol, cloreto de sódio, nata de leite seca, glicerol, propileno glicol, água, etanol e outros. As composições podem ser submetidas à aditivos farmacêuticos convencionais, tais como conservantes, agentes estabilizantes, agentes umidificantes ou emulsificantes, sais para ajuste da pressão osmótica, tampões e outros. Veículos farmacêuticos adequados e suas formulações são descritos em Remington1S Pharmaceutical Sciences by E. W. Martin. Tais composições irão, em qualquer evento, conter uma quantidade eficaz do composto ativo juntamente com um veiculo adequado de modo a preparar a forma de dosagem apropriada para administração no recipiente.
A dose de um composto da presente invenção depende de um número de fatores, tais como, por exemplo, a maneira de administração, a idade e o peso corporal do indivíduo e a condição do indivíduo a ser tratado, e por fim será decidido pelo médico ou veterinário encarregado. Tal quantidade do composto ativo conforme determinado pelo médico ou veterinário encarregado é referida presentemente e nas reivindicações como "quantidade eficaz". Por exemplo, a dose para administração intranasal é normalmente da faixa de cerca de 0,001 a cerca de 0.1 mg/kg do peso corporal. Em humanos a preferida uma dose subcutânea com base no teor de peptídeo é de cerca de 0,001 mg a cerca de 100 mg; preferivelmente de cerca de 0,1 mg a cerca de 15 mg. Para a API, a faixa varia de cerca de 0,015 mg a cerca de 100 mg; preferivelmente de cerca de 1 mg a cerca de 100 mg. A presente invenção será doravante descrita em termos de Exemplos dados a seguir, os quais são tidos como ilustrativos e não limitam o escopo da presente invenção.
EXEMPLOS
PREPARAÇÃO DOS REAGENTES
mPEG30k-Mesilato <formula>formula see original document page 45</formula>
Em um frasco de IL com fundo redondo, equipado com um agitador magnético, um capturador Dean-Stark, um condensador de refluxo e uma entrada para borbulhador de argônio (ou nitrogênio) foram carregadas 100 g (3.34 mmol) de mPEG 3 0 kDa (obtido da Nippon Oil and Fat) e 5 00 mL de tolueno. A solução PEG em tolueno foi seca azeotropicamente por meio da destilação de 250mL de tolueno e então a solução foi resfriada à temperatura ambiente. Na solução 2OOmL de diclorometano anidro foram adicionadas, a solução foi resfriada a 0-5°C e 0,67 mL (4.84 mmol) de trietilamina and 0,33 mL(4.34 mmol) de cloreto de metanossulfonil foram adicionados por gotejamento utilizando uma seringa através de um septo de borracha. A mistura foi agitada por 2h sob quantidades catalíticas ( catalytic amounts, ca.) a 4 0C e então agitada à temperatura ambiente durante sob gás argônio.
A mistura foi concentrada em um evaporador rotatório e foi filtrada através de peças de vidro irregulares para remover os sais. (Cuidado: aquecer as peças de vidro durante a filtração para evitar a solidificação da solução). 0 produto foi precipitado pela adição de ca. de 1800 ml de álcool isopropílico frio e dietil éter (30:70, v/v). 0 produto foi coletado e seco sob vácuo à temperatura ambiente durante a noite para gerar 9Og (90%) de um sólido branco. Etapa 2 . IttPEG30k-Amina
<formula>formula see original document page 46</formula>
Um frasco de 2L com fundo redondo foi equipado com um agitador magnético e uma entrada de borbulhador de argônio foi carregado com 90 g (3 mmol) de mPEG 3 0 kDa mesilato 2 preparado acima e 1600 mL de solução aquosa de hidróxido de amônio (30 %, v/v) . A esta solução foram adicionados 160 g de cloreto de amônio. A solução foi cuidadosamente aquecida para dissolver todo o PEG mesilato. A solução resultante foi agitada à temperatura ambiente por 48h enquanto era ventilado excesso de gases pelo borbulhador para evitar a formação de pressão no frasco de reação.
Após a reação ter sido completada, 160 g (10 wt %) de cloreto de sódio foram adicionados e a mistura foi extraída com 3 χ 200 mL = 1200 mL de diclorometano. Os extratos orgânicos combinados foram secos sob sulfato de sódio anidro por cerca de Ih, filtrado e concentrado em um evaporador rotatório. 0 produto foi precipitado pela adição de 1800 mL éter dietílico frio, filtrado e seco sob vácuo à temperatura ambiente durante a noite para gerar 85g (94%) de 3 como um sólido branco. Etapa 3. IaPEG3Qk-Succinamida Ácida
<formula>formula see original document page 47</formula>
Um frasco de IL com fundo redondo, equipado com um agitador magnético e uma entrada para borbulhador de argônio foi carregado com 6 0 g (2.00 mmol) de mPEG 30 kDa amina 3 e 500 mL acetonitrila anidra. A solução foi resfriada até ca. 4 °C, então 2 g (2 0.00 mmol) de anidrido succínico em 50 mL de acetonitrila anidra foram adicionados lentamente utilizando um funil de adição. A mistura reacional foi agitada à temperatura ambiente durante à noite sob um fluxo de argônio.
Após a reação ter sido concluída, o solvente foi evaporado à secura por um evaporador rotatório. Então, o produto foi dissolvido em 400 mL de água. O pH da solução foi ajustado a 7,0 com solução IM de NaOH e agitada por Ih enquanto mantinha o pH a 7,0. A esta solução, 4Og (10 wt. %) de cloreto de sódio foi adicionado e ajustado ao pH de ~ 4,2 com solução 6N de HCl. A mistura aquosa resultante foi extraída com 200, 100, 50 mL = 350 mL de diclorometano. Os extratos orgânicos combinados foram secos em sulfato de sódio anidro por cerca de Ih. Foi filtrado o sulfato de sódio e concentrado o filtrado em um evaporador rotatório. O produto precipitado em IL de dietil éter frio. O produto é coletado e seco sob vácuo à temperatura ambiente durante a noite para gerar 56g (93%) de 4 como um sólido branco.
Etapa 4. InPEG30k-Succinimidil Succinamida
<formula>formula see original document page 48</formula>
Um frasco de 500mL com fundo redondo equipado com agitador magnético e com entrada para borbulhador de argônio foi carregado com 56 g(1.87 mmol) de mPEG 30 kDa Succinamida ácida 4 and 500 mL de diclorometano anidro. A esta solução, 0.24 g (2.05 mmol) de N-hidroxisuccinimida e 0,46 g (2.24 mmol) de 1,3-diciclohexilcarbodiimida foram adicionados lentamente. A mistura reacional foi agitada à temperatura ambiente durante a noite sob um fluxo de gás argônio.
Após a reação ter sido completada, a mistura foi evaporada à secura em um evaporador à vapor. Então, o produto foi dissolvido em 200mL de tolueno anidro e a solução foi filtrada através de peças de vidro irregulares pré-aquecidas assentadas com uma placa de celite. O produto foi precipitado pela adição de 12 00 mL álcool isopropílico anidro e éter dietílico (30:70, v/v). O produto foi coletado e seco sob vácuo à temperatura ambiente para render 2Og (80%) de 5 como um sólido branco.
PREPARAÇÃO DOS COMPOSTOS PREFERIDOS EXEMPLO 1
Preparação de Fmoc-Ligante-BHA Resina
Benzhidrilamina copoliestireno-1% resina reticulada de divinilbenzeno (10,0 g, 9,3 mequiv, 100-200 ASTM mesh, Advanced ChemTech) foi endureccidos em 100 mL de CH2Cl2, filtrado e lavado sucessivamente com 100 ml de cada um dos CH2Cl2, 6% DIPEA/CH2C12 (duas vezes), CH2Cl2 (duas vezes). A resina foi tratada com ácido p- ((R, S)-α-(1-(9H-fluoren-9- il) -methoxiformamido)-2, 4-dimethoxibenzil)-fenoxiacético (Fmoc-Iigante) (7,01 g, 13,0 mmoles), N-hidroxibenzotriazol (2,16g, 16,0 mmoles), e diisopropil-carbodiimida (2,04 ml, 13,0 mmol) em 100 mL 25% DMF/CH2C12 por 24 h à temperatura ambiente. A resina foi filtrada sucessivamente com 100 mL de cada um dos CH2Cl2 (duas vezes), isopropanol (duas vezes), DMF, e CH2Cl2 (três vezes). A análise Kaiser Ninhidrina foi negativa. A resina foi seca sob vácuo para render 16,12 g of Fmoc-Ligante-BHA resina. Uma porção desta resina (3,5 mg) foi submetido à desproteção Fmoc e a análise quantitativa UV indicou o carregamento de 0.56 mmol/g.
EXEMPLO 2 Protocolo para a síntese de peptídeos por meio do sintetizador Applied Biosystem 433A utilizando a química de Fluorenilmetiloxicarbonil (Fmoc)
Para a síntese em escala de 0,25 mmol de peptídeo por meio do sintetizador Applied Biosystem 433A (Foster City, CA), os ciclos de FastMoc 0,25 mmoles foram utilizados tanto com o vaso de reação de 4 ImL para a amostragem de resina ou com a amostragem não resina. A resina ácida foi dissolvida com 2,1 g de NMP, 2g de 0,45M HOBT/HBTU em DMF e 2M DIEA, então transferidos para o vaso de reação. 0 ciclo de acoplamento FastMoc básico foi representado por "BADEIFD," em que cada letra representa um módulo (conforme definido por Applied Biosystems). Por exemplo:
B representa o módulo para desproteção de Fmoc utilizando 20% de Piperidina/NMP e lavagens relativas e leituras para 3 0 min. (mesmo com monitoramento UV ou condutividade); A representa o módulo para ativação de aminoácido em cartuchos com 0,4 5M de HBTU/HOBt e 2,0 M de DIEA e misturar com N2 borbulhante. D representa o módulo para lavagem NMP da resina no vaso de reação. E representa o módulo para transferência do vaso de reação para acoplamento. I representa o módulo para um período de espera de 10 minutos com formação de vórtex ativado/desativado do vaso de reação; e F representa o módulo para limpeza do cartucho, acoplamento por aproximadamente 10 minutos e drenagem do vaso de reação. Os acoplamentos foram tipicamente estendidos pela adição do módulo "I" uma vez ou múltiplas vezes. Por exemplo, os acoplamentos duplos foram realizados pelo procedimento "BADEIIADEIFD." Outros módulos foram disponíveis tais como c para lavagens de cloreto de metileno e "C" para cobertura com anidrido acético. Os módulos individuais foram também modificáveis por, por exemplo, mudando o tempo de várias funções, tais como tempo de transferência, para alterar a quantidade de solvente ou reagentes transferidos. Os ciclos acima foram tipicamente utilizados para acoplamento de um aminoácido. Para a síntese de tetrapeptídeos, entretanto, os ciclos foram repetidos e realizados conjuntamente. Por exemplo, BADEIIADEIFD foi utilizado para acomplar o primeiro aminoácido, seguido por BADEIIADEIFD para acoplar o segundo aminoácido, seguido de BADEIIADEIFD para acoplar o terceiro aminoácido, seguido por BADEIIADEIFD para acoplar o quarto aminoácido seguido por BIDDcc para desproteção final e lavagem.
EXEMPLO 3
Preparação de H-Ile-Lys-Pro-Glu-Ala-Pro-Gly-Glu-Asp-Ala- Ser-Pro-Glu-Glu-Leu-Asn-Arg-Tyr-Tyr-Ala-Ser-Leu-Arg-His- Tyr-Leu-Asn-Leu-Val-The-Arg-Gln-Arg-Tyr-NH2 (PIY 3.36)
<formula>formula see original document page 51</formula> O peptldeo acima foi sintetizado utilizando a química Fmoc em um sintentizador Applied Biosystem 433A. O sintetizador foi programado para acoplamento duplo utilizando os módulos descritos no Exemplo 2. A síntese foi realizada em uma escala 0.25 mmol utilizando o Fmoc- ligante-BHA resina (450 mg, 0.25 mmol) do Exemplo 1. No final da síntese, a resina foi transferida para um vaso de reação em um agitador para clivagem. 0 peptídeo foi clivado a partir da resina utilizando 13,5 mL 97% de TFA/ 3% de H2O e l,5mL triisopropilsilano por 180 min à temperatura ambiente. A desproteção da solução foi adicionado em IOOmL de Et2O frio e lavado com ImL de TFA e 30 mL de Et2O frio para precipitar o peptídeo. 0 peptídeo foi centrifugado em tubos de polipropileno 2x50 mL. Os precipitados foram combinados em um único tubo e lavados três vezes com Et2O e seco em um dessecador sob vácuo. O material cru foi purificado por meio de HPLC preparativa em um equipamento Pursuit C18-Column (250x50mm, 10μπ\ tamanho de partícula) e eluído com um gradiente linear de 2-70%B (tampão A: 0.1%TFA/H20; tampão B: 0.1% TFA/CH3CN) em 90 min., taxa de fluxo de 60mL/min, e detecção de 220/280 nm. As frações foram coletadas e foram checadas por meio de HPLC analítica. As frações contendo produto puro foram combinadas e liofilizadas para render 151 mg (15%) de um pó amorfo branco. (ES)+-LCMS m/e calculado ("calcd") para CieoH279N53O54 4049.55 encontrado 4050.40.
EXEMPLO 4 Preparação de H-Ile-Lys-Pga-Arg-His-Tyr-Leu-Asn-Leu-Val- Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr- NH2
<formula>formula see original document page 53</formula>
A Fmoc- ligante-BHA resina (450 mg, 0.25 mmol) do Exemplo 1 foi submetido à síntese de fase sólida e purificação de acordo com o procedimento do Exemplo 3 para render 48 mg (9%) do pó amorfo branco. (ES)+-LCMS m/e calcd para C98Hx55N33O2I 2131.53 encontrado 2130.56.
EXEMPLO 5
Preparação de H-Ile-Lys-Pqa-Arg-His-Tyr-Leu-Asn-Leu-Val- Thr-Arg-Gln- (rUMeMrgr-Tyr-NH2
<formula>formula see original document page 53</formula>
A Fmoc- ligante-BHA resina (450 mg, 0.25 mmol) do Exemplo 1 foi submetido à síntese de fase sólida (N-metil Arg foi inserido na posição 35 da seqüência) e purificação pelo seguinte procedimento no Exemplo 3 para render 32 mg (6%) do pó amorfo branco. (ES)+-LCMS m/e calcd para C99Hi55N33O2I 2143.56 encontrado 2143.50
EXEMPLO 6 Preparação de H-Ile-Lys-Pqa-Arg-His-Tyr-Leu-Asn-Leu-Val- Thr-Arg-Gln- (NMe)Arg- Ai-Tyr-NH2
<formula>formula see original document page 54</formula>
A Fmoc-ligante-BHA resina (450 mg, 0.25 mmol) do Exemplo 1 foi submetido à síntese de fase sólida e purificação pelo seguinte procedimento no Exemplo 3 para render 38.5 mg (7%) de um pó amorfo branco. (ES)+-LCMS m/e calcd para C99H155N33021 2143.5477 encontrado 2143.50. EXEMPLO 7
Preparação de H-Ile-Lys-Pqa-Arg-His-Tyr-Leu-Asn-Leu-Val- Thr-Arg-Gln- (NMe)Arg- 3-iodo-Tyr-NH2
<formula>formula see original document page 54</formula>
A Fmoc- ligante-BHA resina (450 mg, 0.25 mmol) do Exemplo 1 foi submetido à síntese de fase sólida e purificação seguindo o procedimento do Exemplo 3 para render 4Img (7%) do pó amorfo branco. (ES)+-LCMS m/e calcd para C99H154IN33021 2269.44 encontrado 2269.20. EXEMPLO 8
Preparação de H-Ile-Lys-Pqa-Arg-His-Tyr-Leu-Asn-Leu-Val- Thr-Arg-Gln- (NMe)Arg- 3,5 di F-Tyr-NH2 A Fmoc- ligante-BHA resina (450 mg, 0.25 mmol) do Exemplo 1 foi submetido à síntese de fase sólida e purificação seguindo o procedimento do Exemplo 3 para render 28mg (5%) do pó amorfo branco. (ES)+-LCMS m/e calcd para C99H153F2N33021 2179.52 encontrado 2179.46. EXEMPLO 9
Preparação de H-Ile-Lys-Pqa-Arg-His-Tyr-Leu-Asn-Leu-Val- Thr-Arg-Gln- (NMe)Arg- 2,6 di F-Tyr-NH2
A Fmoc-Iigante-BHA resina (450 mg, 0.25 mmol) do Exemplo 1 foi submetido à síntese de fase sólida e purificação seguindo o procedimento do Exemplo 3 para render 4 9.3 mg (9%) do pó amorfo branco. (ES)+-LCMS m/e calcd para C99H153F2N33021 2179.53 encontrado 2179.50.
EXEMPLO 10
Preparation of H-Ile-Lys-Pqa-Arg-His-Tyr-Leu-Asn-Leu-Val- Thr-Arg-Gln- (WMeJArg- 2,6 di Me-Tyr-NH2 <formula>formula see original document page 56</formula>
A Fmoc- ligante-BHA resina (450 mg, 0.25 mmol) do Exemplo 1 foi submetido à síntese de fase sólida e purificação seguindo o procedimento no Exemplo 3, para render 13,5 mg (3%) de pó amorfo branco. (ES)+-LCMS m/e calcd para C101H159N33021 2171.60 encontrado 2171.40.
EXEMPLO 11
Preparação de H-Ile-Lys-Pqa-Arg-His-Tyr-Leu-Asn-Leu-Val- Thr-Arg-Gln- (NMe) Arg-4 Methoxi-Phe-NH2
<formula>formula see original document page 56</formula>
A Fmoc- ligante-BHA resina (450 mg, 0.25 mmol) do Exemplo 1 foi submetido à síntese de fase sólida e purificação seguindo o procedimento do Exemplo 3 para render 72 mg (13%) do pó amorfo branco. (ES)+-LCMS m/e calcd para Cl00H157N33021 2157.57 encontrado 2157.58.
EXEMPLO 12
Preparação de H-Ile-Lys-Pqa-Arg-His-Tyr-Leu-Asn-Leu-Val- Thr-Arg-Gln- (NMe)Arg- Phe-NH2 A Fmoc- ligante-BHA resina (450 mg, 0.25 mmol) do Exemplo 1 foi submetido à síntese de fase sólida e purificação seguindo o procedimento do Exemplo 3 para render 85.3 mg (16%) do pó amorfo branco. (ES)+-LCMS m/e calcd para C99H155N33020 2127.55 encontrado 2127.53.
EXEMPLO 13
Preparação de H-Ile-Lys-Pqa-Arg-His-Tyr-Leu-Asn-Leu-Val- Thr-Arg-Gln- (NMe)Arg- 4 amino-Phe-NH2
<formula>formula see original document page 57</formula>
A Fmoc- ligante-BHA resina (450 mg, 0.25 mmol) do Exemplo 1 foi submetido à síntese de fase sólida e purificação seguindo o procedimento do Exemplo 3 para render 51.4 mg (10%) de pó amorfo branco. (ES)+-LCMS m/e calculado para C99H156N34020 2142.56 encontradol42.55.
EXEMPLO 14
Preparação de H-Ile-Lys-Pqa-Arg-His-Tyr-Leu-Asn-Leu-Val- Thr-Arg-Gln- (NMe)Arg- 4 F- Phe-NH2
<formula>formula see original document page 57</formula> <formula>formula see original document page 58</formula>
A Fmoc- ligante-BHA resina (450 mg, 0.25 mmol) do Exemplo 1 foi submetido à síntese de fase sólida e purificação seguindo o procedimento do Exemplo 3 para render 35 mg (7%) do pó amorfo branco. (ES)+-LCMS m/e calcd para C99H154FN33020 2145.54 encontrado 2145.51.
EXEMPLO 15
Preparação de H-Ile-Lys-Pqa-Arg-His-Tyr-Leu-Asn-Leu-Val- Thr-Arg-Gln- (NMe)Arg- 4- (CH20H) -Phe-NH2
<formula>formula see original document page 58</formula>
A Fmoc- ligante-BHA resina (45 0 mg, 0.25 mmol) do Exemplo 1 foi submetido à síntese de fase sólida e purificação seguindo o procedimento do Exemplo 3 para render 24 mg (4%) do pó amorfo branco. (ES)+-LCMS m/e calcd para C100H1571N33021 2157.57 encontrado 2157.56.
EXEMPLO 16
Preparação de H-Ile-Lys-Pqa-Arg-His-Tyr-Leu-Asn-Leu-Val- Thr-Arg-Gln- (NMe)Arg- 4- triflúor metil-Phe-NH2 <formula>formula see original document page 59</formula>
A Fmoc- ligante-BHA resina (450 mg, 0.25 mmol) do Exemplo 1 foi submetido à síntese de fase sólida e purificação seguindo o procedimento do Exemplo 3 para render 81 mg (15%) do pó amorfo branco. (ES)+-LCMS m/e calcd para C100H154F3N33020 2195.54 encontrado 2195.51.
EXEMPLO 17
Preparação de H-Ile-Lys-Pqa-Arg-His-Tyr-Leu-Asn-Leu-Val- Thr-Arg-Gln- (NMe)Arg- 3Flúor-Phe-NH2
<formula>formula see original document page 59</formula>
A Fmoc- ligante-BHA resina (450 mg, 0.25 mmol) do Exemplo 1 foi submetido à síntese de fase sólida e purificação seguindo o procedimento do Exemplo 3 para render 84 mg (16%) do pó amorfo branco. (ES)+-LCMS m/e calcd para C99H154FN33020 2145.54 encontrado 2145.53.
EXEMPLO 18
Preparação de H-Ile-Lys-Pqa-Arg-His-Tyr-Leu-Asn-Leu-Val- Thr-Arg-Gln- (NMe)Arg- 2,3,4,5, ,6 Penta flúor-Phe-NH2 <formula>formula see original document page 60</formula>
A Fmoc- ligante-BHA resina (450 mg, 0.25 mmol) do Exemplo 1 foi submetido à síntese de fase sólida e purificação seguindo o procedimento do Exemplo 3 para render 89 mg (16%) do pó amorfo branco. (ES)+-LCMS m/e calcd para C99H150FN33020 2217.50 encontrado 2217.48.
EXEMPLO 19
Preparação de H-Ile-Lys-Pqa-Arg-His-Tyr-Leu-Asn-Leu-Val- Thr-Arg-Gln-(NMe)Arg- 3,4- dicloro-Phen-NH2
<formula>formula see original document page 60</formula>
A Fmoc- ligante-BHA resina (450 mg, 0.25 mmol) do Exemplo 1 foi submetido à síntese de fase sólida e purificação seguindo o procedimento do Exemplo 3 para render 46 mg (8%) do pó amorfo branco. (ES)+-LCMS m/e calcd para C99H153C12N33020 2196.44 encontrado 2196.41.
EXEMPLO 20
Preparação de H-Ile-Lys-Pqa-Arg-His-Tyr-Leu-Asn-Leu-Val- Thr-Arg-Gln- (NMe)Arg- Cha-NH2 <formula>formula see original document page 61</formula>
A Fmoc- ligante-BHA resina (450 mg, 0.25 mmol) do Exemplo 1 foi submetido à síntese de fase sólida e purificação seguindo o procedimento do Exemplo 3 para render 4 9 mg (9%) do pó amorfo branco. (ES)+-LCMS m/e calcd para C106H162N34021 2248.69 para 2248.71.
EXEMPLO 21
Preparação de H-Ile-Lys-Pqa-Arg-His-Tyr-Leu-Asn-Leu-Val- Thr-Arg-Gln-(NMe)Arg- Trp-NH2
<formula>formula see original document page 61</formula>
A Fmoc- ligante-BHA resina (450 mg, 0.25 mmol) do Exemplo 1 foi submetido à síntese de fase sólida e purificação seguindo o procedimento do Exemplo 3 para render 57 mg (10%) do pó amorfo branco. (ES)+-LCMS m/e calcd para C108H157N35O21 2281.68 encontrado 2281.67.
EXEMPLO 22
Preparação de H-Ile-Lys-Pqa-Arg-His-Tyr-Leu-Asn-Leu-Val- Thr-Arg-Gln- (NMe)Arg- 1- Nal -NH2 <formula>formula see original document page 62</formula>
A Fmoc- ligante-BHA resina (450 mg, 0.25 mmol) do Exemplo 1 foi submetido à síntese de fase sólida e purificação seguindo o procedimento do Exemplo 3 para render 45 mg (8%) do pó amorfo branco. (ES)+-LCMS m/e calcd para C103H157N33020 2177.61 encontrado 2177.59.
EXEMPLO 23
Preparação de H-Ile-Lys-Pqa-Arg-His-Tyr-Leu-Asn-Leu-Val- Thr-Arg-Gln- (NMe)Arg- 2- Nal -NH2
<formula>formula see original document page 62</formula>
A Fmoc- ligante-BHA resina (450 mg, 0.25 mmol) do Exemplo 1 foi submetido à síntese de fase sólida e purificação seguindo o procedimento do Exemplo 3 para render 43 mg (8%) do pó amorfo branco. (ES)+-LCMS m/e calcd para C103H157N33020 2177.60 encontrado 2177.58.
EXEMPLO 24
Preparação de H-Ile-Lys-Pqa-Arg-His-Tyr-Leu-Asn-Leu-Val- Thr-Arg-Gln-Argr- C-a-metil Tyr- -NH2 <formula>formula see original document page 63</formula>
A Fmoc- ligante-BHA resina (450 mg, 0.25 mmol) do Exemplo 1 foi submetido à síntese de fase sólida e purificação seguindo o procedimento do Exemplo 3 para render 35.1 mg (7%) do pó amorfo branco. (ES)+-LCMS m/e calcd para C99H155N33021 2143.55 encontrado 2143.56.
EXEMPLO 25
Preparação de H-Ile-Lys-Pqa-Arg-His-Tyr-Leu-Asn-Trp-Val- Thr-Arg-Gln-(NMe)Arg- Tyr-NH2
<formula>formula see original document page 63</formula>
A Fmoc- ligante-BHA resina (450 mg, 0.25 mmol) do Exemplo 1 foi submetido à síntese de fase sólida e purificação seguindo o procedimento do Exemplo 3 para render 13 0 mg (23%) do pó amorfo branco. (ES)+-LCMS m/e calcd para C104H154N34021 2216.60 encontrado 2216.62.
EXEMPLO 26
Preparação de H-Ile-Nle-Pqa-Arg-His-Tyr-Leu-Asn-Trp-Val- Thr-Arg-Gln- (NMe)Arg- Tyr- NH2 <formula>formula see original document page 64</formula>
A Fmoc- ligante-BHA resina (450 mg, 0.25 mmol) do Exemplo 1 foi submetido à síntese de fase sólida e purificação seguindo o procedimento do Exemplo 3 para render 84 mg (15%) do pó amorfo branco. (ES)+-LCMS m/e calcd para C104H153N33021 2201.59 encontrado 2201.56. EXEMPLO 27
Preparação de Ac-Ile-Lys-Pqa-Arg-His-Tyr-Leu-Asn-Trp-Val- Thr-Arg-Gln-(NMe)Arg-2,6-F2- Tyr-NH2
<formula>formula see original document page 64</formula>
A Fmoc- ligante-BHA resina (450 mg, 0.2 5 mmol) do Exemplo 1 foi submetido à síntese de fase sólida e purificação seguindo o procedimento do Exemplo 3 para render 24 mg (4%) do pó amorfo branco. (ES)+-LCMS m/e calcd para C106H154F2N34022 2099.49 encontrado 2100.3. EXEMPLO 28
Preparação de Ac-Ile-Lys-Pqa-Arg-His-Tyr-Leu-Asn-Trp-Val- Thr-Arg-Gln-(NMe)Arg- Tyr-NH2 <formula>formula see original document page 65</formula>
A Fmoc- ligante-BHA resina (450 mg, 0.25 mmol) do Exemplo 1 foi submetido à síntese de fase sólida e purificação seguindo o procedimento do Exemplo 3 para render 68 mg (12%) do pó amorfo branco. (ES)+-LCMS m/e calcd para C106H156N34022 2258.64 encontrado 2258.61.
EXEMPLO 29
Preparação de Pentoil-Ile-Lys-Pqa-Arg-His-Tyr-Leu-Asn-Trp- Val-Thr-Arg-Gln-(NMe)Arg- Tyr-NH2
<formula>formula see original document page 65</formula>
A Fmoc- ligante-BHA resina (450 mg, 0.25 mmol) do Exemplo 1 foi submetido à síntese de fase sólida e purificação seguindo o procedimento do Exemplo 3 para render 67 mg (12%) do pó amorfo branco. (ES)+-LCMS m/e calcd para C109H162N34022 2300.72 encontrado 2300.69.
EXEMPLO 30
Preparação de Trimetilacetil-Ile-Lys-Pqa-Arg-His-Tyr-Leu- Asn-Trp-Val-Thr-Arg-Gln-(NMe)Arg- Tyr-NH2 <formula>formula see original document page 66</formula>
A Fmoc- ligante-BHA resina (450 mg, 0.2 5 mmol) do Exemplo 1 foi submetido à síntese de fase sólida e purificação seguindo o procedimento do Exemplo 3 para render 6 mg (1%) do pó amorfo branco. (ES)+-LCMS m/e calcd para C109H162F2N34022 2300.72 encontrado 2300.68.
EXEMPLO 31
Preparação de Ciclohexilacetil-Ile-Lys-Pqa-Arg-His-Tyr-Leu- Asn-Trp-Val-Thr-Arg-Gln- (NMe)Arg- Tyr-NH2
<formula>formula see original document page 66</formula>
A Fmoc- ligante-BHA resina (450 mg, 0.25 mmol) do Exemplo 1 foi submetido à síntese de fase sólida e purificação seguindo o procedimento do Exemplo 3 para render 15 mg (3%) do pó amorfo branco. (ES)+-LCMS m/e calcd para C112H166N34022 2340.79 encontrado 2340.81.
EXEMPLO 32
Preparação de Benzoil-Ile-Lys-Pqa-Arg-His-Tyr-Leu-Asn-Trp- Val-Thr-Arg-Gln-(NMe)Arg- Tyr-NH2 <formula>formula see original document page 67</formula>
A Fmoc- ligante-BHA resina (450 mg, 0.25 mmol) do Exemplo 1 foi submetido à síntese de fase sólida e purificação seguindo o procedimento do Exemplo 3 para render 23 mg (4%) do pó amorfo branco. (ES)+-LCMS m/e calcd para C111H158N34022 2320.71 encontrado 2320.68.
EXEMPLO 33
Preparação de Adamantoil-Ile-Lys-Pqa-Arg-His-Tyr-Leu-Asn- Trp-Val-Thr-Arg-Gln-(NMe)Arg- Tyr-NH2
<formula>formula see original document page 67</formula>
A Fmoc- ligante-BHA resina (450 mg, 0.25 mmol) do Exemplo 1 foi submetido à síntese de fase sólida e purificação seguindo o procedimento do Exemplo 3 para render 29 mg (5%) do pó amorfo branco. (ES)+-LCMS m/e calcd para C116H170N34022 2392.86 encontrado 2392.89.
MÉTODO ANALÍTICO PARA EXEMPLOS 34-39 E 41
Os artigos de teste e controle foram analisados utilizando o procedimento HPLC/UV de fase reversa:
Autoamostrador Alliance Waters 2690 Separation Module
Volume de Injeção 10 μL
Intetor de Temperatura Ambiente Detector Waters 996 Fotodiodo Array Detector Detector Comprimento de Onda 2 80 nm
Coluna Agilent Eclipse XDB-C8, 5 micron, 150 mm χ 4.6 mm i.d. PN:99367-906
Temperatura da Coluna 25°C
Taxa de Fluxo 1.0 mL/min (-1000 psi) Fase Móvel A Água contendo 0.05% de TFA Fase Móvel B Acetonitrila contendo 0.05% de TFA Tempo de execução Aproximadamente 30 min Preparação de Amostra aproximadamente 0.2-0.5 mg/ml Diluente Água Deionizada
Condição 1 de Gradiente de Fase Sólida (RP-HPLCl):
<table>table see original document page 68</column></row><table>
Condição 2 de Gradiente de Fase Sólida (RP-HPLC2):
<table>table see original document page 68</column></row><table>
EXEMPLO 34
Preparação da mistura de ( (PEG-30, 000) CH2CH2CO) Ile-Lys-Pqa- Arg-His-Tyr-Leu-Asn-Trp-Val-Thr-Arg-Gln- (NMe)Arg-Tyr-NH2 e Ile((PEG-30,000) CH2CH2CO) (□)Lys-Pqa-Arg-His-Tyr-Leu-Asn- Trp-Val-Thr-Arg-Gln- (NMe)Arg-Tyr-NH2 <formula>formula see original document page 69</formula>
<table>table see original document page 69</column></row><table>
24 mg do peptídeo do Exemplo 25 foi pesado e dissolvido em 50mM de Borato, peptídeo do Exemplo 25 foi pesado e dissolvido em de 50 mM Borato, tampão pH 7.5. 500 mg 30 do ácido kDa PEG-succinimidil propriônico (adquirido a partir de Nektar) foi pesado para gerar a razão molar 2:1 PEG: peptídeo e adicionado no peptídeo dissolvido. A mistura reacional foi agitada à temperatura ambiente durante a noite antes de ser diluído 10 vezes em NaOAc 2 0 mM, tampão pH 4.5 purificado por cromatografia de troca catiônica em SP-Sepharose FF. A Figura 1 é um cromatograma da mistura de reação. A reação rendeu 69,8% de um peptídeo de 3OkDa.
O peptídeo mono-peguilado PIY foi eluído utilizando uma etapa de gradiente NaCl. Normalmente, o peptídeo desejado mono-peguilado eluido com 250 mM NaCl. O peptídeo eluído do tipo PEG-PIY foi concentrado em uma célula de ultrafiltração Amicon utilizando uma membrana de corte de 10 kDa MW. Foi então diafiltrado 10 vezes com PBS.
O peptídeo concentrado do Exemplo 34 foi submetido para análise, ensaiada e armazenada a -20C. A Figura 2 é um cromatograma de HPLC de um peptídeo purificado de 30 kDa PEG-PIY (RT = 10.1 min). A pureza do peptídeo de 30kDa foi determinada como sendo >97%. E a Figura 3 é um gráfico que representa um MALDI-TOF de um peptídeo PEG-PIY de 30 kDa, que foi realizado para confirmar o peso molecular.
Uma combinação de métodos foi utilizada para determinar os sítios de modificação PEG. A combinação inclui, MALDI TOF MS, HPLC de fase reversa, digestão proteolítica e seqüenciamento N-terminal (Edman). Os resultados destas análises mostraram que a maioria dos PEG é ligada através do ε-amino grupo da posição da lisina na posição (R2) do peptídeo.
EXEMPLO 35
Preparação de uma mistura de ((PEG-40,000)CO)Ile-Lys-Pqa- Arg-His-Tyr-Leu-Asn-Trp-Val-Thr-Arg-Gln- (NMe)Arg-Tyx-NH2 e Ile((PEG-40,000)CO) (ε)Lys-Pqa-Arg-His-Tyr-Leu-Asn-Trp-Val- Thr-Arg-Gln- CWMeMrg-Tyr-NH2 <formula>formula see original document page 71</formula>
onde η = -900
<formula>formula see original document page 71</formula>
onde η = -900
<table>table see original document page 71</column></row><table>
24 mg do peptídeo do Exemplo 25 foi pesado e dissolvido em 50 mM de Borato, tampão pH 8.0. 319 mg de PEG-carbonato de benzotriazol 4 0 kDa foi pesado para atingir a razão molar de 0.8:1 A mistura reacional foi agitada à temperatura ambiente por 1 h antes de ser diluído 10 vezes em 2 0 de mM NaOAc, tampão pH 4.5 e purificado por cromatografia de troca iônica em SP-Sepharose FF. A Figura 4 é um cromatograma de HPLC da mistura reacional. A reação rendeu 60.4% de um peptídeo de 40 kDa.
O peptídeo mono-peguilado PIY foi eluído utilizando a etapa de gradiente de NaCl. Normalmente, o peptídeo mono- peguilado desejado é eluído com 250 mM de NaCl. O peptídeo eluído do tipo PEG-PIY foi concentrado em uma célula de ultrafiltração Amicon utilizando uma membrana de corte de kDa MW. Foi então diafiltrado 10 vezes com PBS. O peptídeo concentrado do Exemplo 35 foi submetido à análise, ensaiado e armazenado a -20°C. A Figura 5 é um cromatograma de HPCL de um peptídeo PEG-PIY de 4 0 kDa (RT=IO. 1 min). A pureza do peptídeo de 40 kDa foi determinado para ser >90%. E a Figura 6 é um gráfico representando um MALDI-TOF do peptídeo PEG-PIY de 40 kDa, que realizado para confirmar o peso molecular.
EXEMPLO 3 6
Preparação de ((PEG-30,000) CH2CH2NHCOCH2CH2CO) Ile-Nle-Pqa- Arg-His-Tyr-Leu-Asn-Trp-Val-Thr-Arg-Gln- (NMe) Arg-Tyr-NH2
<formula>formula see original document page 72</formula>
onde =~675
<table>table see original document page 72</column></row><table>
13 mg do peptídeo do Exemplo 26 foi pesado e dissolvido em 50 mM de Borato, tampão de pH 8.0. 624 mg de 30 kDa PEG- succinimidil succinamida foi pesado para conseguir uma razão molar de 4:1 PEG: peptídeo e adicionado no peptídeo dissolvido. A mistura reacional foi agitada à temperatura ambiente por 2h antes de ser diluída 10 vezes em 20 mM de NaOAc, tampão pH 4.5 e purificada por cromatografia de troca iônica em SP-Sepharose FF (Amersham) . A Figure 7 é um cromatograma de HPLC da mistura reacional. A reação rendeu 94.1% de peptídeo de 3 0 kDa.
O peptídeo mono-peguilado PIY foi eluído utilizando uma etapa de gradiente de NaCl. Normalmente, o peptídeo mono- peguilado PIY desejado eluído com 250mM NaCl. O peptídeo do tipo PEG-PIY eluído foi concentrado em uma célula de ultrafiltração utilizando uma membrana de corte de 10 kDa MW. Foi então diafiltrado 10 vezes com PBS. O peptídeo concentrado foi submetido por análise, ensaiada e armazenada a -20C. A Figura 8 é um cromatograma de HPLC do peptídeo PEG-PIY de 30 kDa (10.4 min). A pureza de do peptídeo de 3 0 kDa foi determinado como sendo >90%. E a Figura 9 representa um MALDI-TOF de um peptídeo PEG-PIY de 30 kDa que foi realizado para confirmar o peso molecular.
EXEMPLO 37
Preparação de ((PEG-30,000)CH(CH3) CH2CO)Ile-Nle-Pqa-Arg- His-Tyr-Leu-Asn-Trp-Val-Thr-Arg-Gln- (NMe)Arg-Tyr-NH2
<formula>formula see original document page 73</formula>
onde n=~675
<table>table see original document page 73</column></row><table> MALDI-TOF MS
Massa Média= 34.6 kDa
1.25 mg do peptídeo do Exemplo 26 foram pesados e dissolvidos em 50 mM de Borato, tampão de pH 8.0. 62 mg de 30 kDa PEG-succinimidil beta-SBA foram pesados para conseguir uma razão molar de 4:1 PEG: peptídeo e adicionados no peptídeo dissolvido. A mistura reacional foi agitada à temperatura ambiente por 2h antes de ser diluído vezes em 20 mM de NaOAc, tampão pH 4.5 e purificado por cromatografia de troca catiônica em SP-Sepharose FF IO (Amersham) . A Figura 10 é um cromatograma HPLC da mistura reacional. A reação rendeu 93.4% do peptídeo de 30 kDa. O peptídeo mono-peguilado PIY foi eluído utilizando uma etapa de gradiente de NaCl. Normalmente, o peptídeo mono- peguilado PIY desejado eluído com 250mM de NaCl. O peptídeo do tipo PEG-PIY eluído foi concentrado em uma célula de ultrafiltração utilizando uma membrana de corte de 10 kDa MW. Foi então diafiltrado 10 vezes com PBS. 0 peptídeo concentrado foi submetido à análise, ensaiado e armazenado a -2OC. A Figura 11 é um cromatograma HPLC do peptídeo PEG-PIY de 30 kDa PEG-PIY (10.5 min) . A pureza do peptídeo de 30 kDa foi determinado como sendo >90%. E a Figura 12 representa a MALDI-TOF de um peptídeo PEG-PIY de 30 kDa que foi realizado para confirmar o peso molecular.
EXEMPLO 38
Preparação de Ac-Ile (PEG-30, 000) CH2CH2CO (s)DLys-Pqa-Arg-His- Tyr-Leu-Asn-Trp-Val-Thr-Arg-Gln- (NMe)Arg-Tyr-NH2 <formula>formula see original document page 75</formula>
onde n =~675
<table>table see original document page 75</column></row><table>
100 mg do peptídeo do Exemplo 28 foi pesado e dissolvido em 50 mM de Boratof tampão pH 8.0. 1.8 g de ácido 30 kDa PEG- succinimidil propriônico (adquirido de Nektar) foi pesado para render uma razão molar de 1.5:1 PEG: razão peptideo molar e então dissolvido no peptídeo. A mistura reacional foi agitada à temperatura ambiente durante a noite antes de ser diluído 10 vezes em 20 mM de NaOAc, tampão de pH 4.5 e purificada por cromatografia de troca catiônica em SP- Sepharose FF. A Figura 13 é um cromatograma de HPLC da mistura reacional. A reação rendeu 83.3% de peptídeo 30 kDa.
0 peptídeo PIY mono-peguilado foi eluído utilizando uma etapa de gradiente de NaCl. Normalmente, o peptídeo mono- peguilado eluído com 250mM de NaCl. 0 peptídeo do tipo PEG- PIY foi concentrado em uma célula de ultrafiltração Amicon utilizando uma membrana de corte de 10 kDa MW. Foi então diafiltrado 10 vezes em PBS. O peptldeo concentrado do Exemplo 3 8 foi submetido à análise, ensaiado e armazenado à -2O0C . A Figura 14 é um cromatograma HPLC do peptideo PEG-PIY de 30 kDa (RT=9.5 min) . A pureza do peptideo de 3OkDa foi determinada como sendo >95%. E a Figura 15 é um gráfico que representa um MALDI-TOF of peptideo PEG-PIY de 30 kDa que foi realizado para confirmar o peso molecular. EXEMPLO 39
Preparação de Ac-Ile ((PEG-30, 000) CH2CH2NHCOCH2CH2CO) (e)DLys- Pqa-Arg-His-Tyr-Leu-Asn-Trp-Val-Thr-Arg-Gln- (NMe)Arg-Tyx-
<formula>formula see original document page 76</formula>
onde n=~675
<table>table see original document page 76</column></row><table>
100 mg do peptideo do Exemplo 28 foi pesado e dissolvido em 50 mM de Borato, tampão pH 8.0. 3.6 g 30 kDa PEG- succinimidil succinamida foram pesados para conseguir uma razão molar de 3:1 PEG: peptideo e adicionado no peptideo dissolvido. A mistura reacional foi agitada à temperatura ambiente durante a noite antes de ser diluído 10 vezes em 20 mM de NaOAc, tampão pH 4.5 e purificada por meio de cromatografia de troca catiônica em SP-Sepharose FF. A Figura 16 é um cromatograma da mistura reacional. A reação rendeu 81.4% de peptideo 30 kDa.
O peptideo PIY mono-peguilado foi eluído utilizando a etapa de gradiente de NaCl. Normalmente, o peptideo mono- peguilado desejado eluido com 250mM de NaCl. 0 peptideo do tipo PEG-PIY foi concentrado em uma célula de ultrafiltração utilizando uma membrana de corte de 10 kDa MW. Foi então diafiltrado 10 vezes com PBS.
O peptideo concentrado do Exemplo 39 foi submetido para análise para análise, ensaiado e armazenado a -20C. A Figura 17 é um cromatograma HPLC do peptideo PEG-PIY de 30 kDa (RT= 9.5 min) . A pureza do peptideo de 30 kDa foi determinada como sendo >97%. E a Figura 18 é um gráfico que representa um MALDI-TOF do peptideo PEG-PIY de 30 kDa que foi realizado para confirmar o peso molecular. EXEMPLO 40
Preparação de Fmoc-Ile-Lys-Pqa-Arg-His-Tyr-Leu-Asn-Trp-Val- Thr-Arg-Gln- (NMe)Arg-Tyr-NH2
<formula>formula see original document page 77</formula>
55.0 g de Fmoc-Iinker BHA 0.45 mm/g (adquirido de AnaSpec Inc. cat # 408/452-5055) foi submetido à síntese de fase sólida e purificação por meio do seguinte procedimento: Os aminoácidos protegidos com Fmoc foram acoplado via DIC/HOBt em 25% de excesso. (55.0 g X 0.45 mm/g X 1.25 eqv = 31.0 mm). Toda desproteção foi em 2 X 10 min com 20% de piperidina em DMF em aproximadamente 10 ml/g (ajustado como aumentos de volume de peptídeo-resina). Após a desproteção a resina peptídeo foi lavada 4X em DMF (20 volumes).
Todos os acoplamentos foram com -4 0 mL de DIC (-6 eqv) e 4. 5g de HOBt (1.25 eqv) . Após o acoplamento, a solução de resina foi amostrada com -.25 mL lavada com CH2Cl2 e checada via ninhidrina para compleição. Após o acoplamento em NMe-Arg e Pqa, a resina foi lavada com CH2Cl2 e checada com 3 gotas de 2% de Clorinal em DMAc e 3 gotas de 2% de acetaldeído em DMAc DMAc (sem alteração na solução amarela indicativa da ausência de amina secundária e pérolas azuis para negro indicativa de acoplamento incompleto). Se os acoplamentos foram considerados como sendo DIEA incompleto foi adicionado na solução de acoplamento e continuados por lha mais. Quando completo, a resina foi lavada 4 X com DMF (20 volumes).
Fmoc-Tyr(But)-OH: 14.Og. Fmoc-NMeArg(Mtr)-OH: 20.0g. Fmoc- Gln(Trt)-OH: 18.5g .Fmoc-Arg(Pbf)-OH: 20.Og. Fmoc-Thr(But)- OH: 18.Og. Fmoc-Val-OH: 10.5g. Fmoc-Trp-OH: 13.0. Fmoc- Asn(Trt)-OH: 18.0 g. Fmoc-Leu-OH 11.0 g, Fmoc-Tyr(But)-OH 14.Og, Fmoc-His(Trt)-OH 20.Og, Fmoc-Arg(Pbf)-OH 20.0 g, Fmoc-Pqa-OH 15.4 g, Fmoc-Lys(Boc)-OH 14.lg, Fmoc-Ile-OH 11.0 g.
A resina de peptídeo foi lavada 3 X com DMF, 3 X com CH2Cl2 e 3 X com MeOH e sob sucção para obter 115.38 g da resina peptídeo. A resina peptídeo foi partida em 6 X bateladas de 19.25g para clivagem de TFA. 19.25 g do peptídeo foi clivado com 8.0 mL 1:1:1 DTE; Anisol; Tioanisol, 8.0 mL iPr3SiH, 8.0 mL H20 e 200 mL TFA/ 6 h (6:30 AM a 13:30 PM), seguida de precipitação em Et2O frio 2.OL (~20°C) . 0 precipitado foi coletado por meio de centrifugação em tubos de polipropileno (8 X 50 mL) e lavado 3 X com Et2O frio. 0 precipitado foi então seco sob vácuo durante a noite para obter 6.5 g de peptideo cru. A quantidade total do peptídeo cru após 6 desproteções é de 38.71 g.
A purificação do peptídeo cru foi realizado em um sistema Shimadzu LC-8A por meio de cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC) era uma coluna de fase reversa Pursuit C- 18 (50x250 mm. 300 A°, IOum) . 38.71g do produto cru foi purificado em 36 etapas. Cada vez aproximadamente 1,1 g do peptídeo cru foi dissolvido em uma quantidade mínima de água e acetonitrila e foi injetado na coluna. A eluição gradiente foi geralmente iniciado em tampão 20% B, 20% - 70% B por 70 min. (tampão A: 0.1% TFA/H20, tampão B: 0.1% TFA/CH3CN) a uma taxa de fluxo de 50 ml/min. A detecção UV foi realizada a 220/280 nm. As frações contendo os produtos foram separadas e a pureza foi determinada em um sistema analítico Shimadzu LC-10AT utilizando uma coluna de fase reversa Pursuit C18 (4.6 χ 50mm) a uma taxa de fluxo de 2.5 ml/min., gradiente (20-70 %) por 10 min. [tampão A: 0.1% TFA/H20, tampão B: 0.1% TFA/CH3CN) ] . As frações determinadas como sendo de alta pureza foram reunidas e liofilizada para render um pó amorfo amarelo. 0 produto liofilizado das 36 etapas foi combinado e liofilizado novamente para render 8,233g de peptídeo puro (12.6%). A pureza do produto final ter sido checado novamente por HPCL analítica em uma coluna de fase reversa conforme definido anteriormente e foi de aproximadamente 95-99%. (ES)+-LCMS m/e calcd para C119H164N34023 2438.85, encontrado 2438.84
EXEMPLO 41
Preparação de Ile ( (PEG-30,000) CH2CH2NHCOCH2CH2CO) (ε)□Lys-Pqa- Arg-His-Tyr-Leu-Asn-Trp-Val-Thr-Arg-Gln- (NMe) Arg-Tyr-NH2
<formula>formula see original document page 80</formula>
n=~675
<table>table see original document page 80</column></row><table>
1.8 g do peptídeo do Exemplo 40 foram pesados e dissolvidos em 50 mM de Borato, tampão pH 7.5. 37.5 g de 30 kDa PEG- succinimidil succinamida foi pesado para conseguir uma razão molar aproximada de 2:1 PEG: peptideo e adicionado ao peptídeo dissolvido. A mistura reacional foi agitada à temperatura ambiente por 2h. 0 peptídeo peguilado foi desprotegido pela adição de piperidina (20%) à mistura reacional por 1 h à temperatura ambiente. A mistura reacional foi colocado em gelo e acidificado pela adição lenta de ácido acético glacial (20%). A mistura reacional foi então diluído 10 vezes em 20 mM de NaOAc, tampão pH 4.5 e purificado por meio de cromatografia de troca catiônica em SP-Sepharose FF. A Figura 19 é um cromatograma de HPLC da mistura reacional. A reação rendeu 93.8% do peptídeo peguilado protegido. A Figura 20 é um cromatograma de HPLC da mistura reacional desprotegida, em que o rendimento geral do peptídeo peguilado foi de 89,5%
O peptídeo PIY mono-peguilado foi eluído utilizando uma etapa do gradiente de NaCl. Normalmente, o peptídeo mono- peguilado eluído com 175 mM de NaCl. O peptídeo do tipo PEG-PIY foi concentrado em uma célula de ultrafiltração Amicon utilizando uma membrana de corte de 10 kDa MW. Foi diafiltrado 10- vezes com PBS.
O peptídeo concentrado foi submetido para análise, ensaiado e armazenado a -20°C. A Figura 21 é um cromatograma HPLC de peptídeo PEG-PIY de 30 kDa (RT = 10.1 min). A pureza do peptídeo de 30 kDa foi determinado como sendo >95%. E a Figura 22 é um gráfico representando um MALDI-TOF de um peptídeo PEG-PIY de 30 kDa, que foi realizado para confirmar o peso molecular.
EXEMPLO 42
Ensaio de fluxo de cálcio
As células HEK-293 estavelmente transfectadas com a proteína G quimera Gaqi9 e gene de resistência higromicina-B foram posteriormente transfectado com receptor NPI2 humano e seleção antibiótica G418. A seguinte seleção em ambos higromicina-B e G418, foram ensaiados clones para a respectiva resposta em PIY. As células transfectadas (HEK293/hNPI2R) foram cultivadas em meio DMEM suplementado com soro fetal bovino 10%, 50 μ9/πι1 de higromicina-B, 2 mM de glutamina, 100 U/ml de penicilina, 100 pg/ml estreptomicina e 250 pg/ml de G418.
As células foram cultivadas com tripsina-EDTA contada utilizando um reagente ViaCount. 0 volume de suspensão de célula foi ajustado a 4.8xl05 células /ml com meio de crescimento completo. As alíquotas de 25 μΐ foram dispersos em microplacas de 384 poços de Poly-D Lysine com revestimento escuro/claro (Falcon) e as microplatas foram colocadas em uma incubadora a CO2 37 0C durante a noite. 0 tampão de carregamento (Cálcio-3 kit de ensaio, Molecular Devices) foi preparado pela dissolução dos teores de um frasco(Express Kit) dentro de uma solução salina corrigida de Hank 1000 ml (HBSS) contendo 20 mM de HEPES e 5 mM de probenecid. As alíquotas (25 μΐ) de corante diluído foram dispersos dentro das placas de células e as placas de células foram encubadas por Ih a 37 °C.
Durante a incubação, os compostos teste foram preparados a 3,5 χ a concentração desejada em HBSS (20 mM HEPES)/0,05% BSA/1% DMSO e transferido em uma placa de 384 poços para uso em FLIPR* (FLIPR, Fluorescent Imaging Plate Reader, marca registrada de Molecular Devices Corp.). Após a incubação, tanto o composto célula e as placas de compostos foram colocadas em FLIPR® e 20 μί dos compostos diluídos foram transferidos para as placas de célula pela FLIPRe. Durante o ensaio, o as leituras de fluorescência foram tomadas simultaneamente a partir de todos 384 poços da placa de célula a cada 1.5 s. Cinco leituras foram tomadas para estabelecer a mesma linha base estável, e então 20 μl da amostra foi rapidamente (30 μΐ/sec) e simultaneamente adicionadas em cada poço da placa de célula. A fluorescência foi continuamente monitorado antes, durante e após a adição para um tempo total de 100s. As respostas (aumento do pico de f luorescência) em cada poço em seguida a adição foi determinada. A fluorescência inicial de cada poço, antes da estimulação do ligante, foi utilizado como valor de linha base zero para os dados daquele poço.As respostas utilizadas como um percentual de resposta máxima do controle positivo.
EXEMPLO 43
Ensaio clínico ΆΜΡ
Neste exemplo, os seguintes materiais foram utilizados: placa de 384 poços; kit Tropix cAMP-Screen: (Applied Biosystems, Cat. #T1504); forskolin (Calbiochem Cat. # 344270); células: HEK293/hNPI2R células; meio de plaqueamento: DMEM/F12 w/o fenol vermelho (Gibco Cat #1133032); 10% FBS desativado termicamente (Gibco Cat. # 10082-147); 1% Penicilina/Streptomicina (Gibco Cat. # 15140-122); 500 mg/ml G418 (Geneticina, Gibco Cat. # 11811- 031) .
As células HEK293/hNPI2R foram plaqueadas a uma densidade de IO4 células/poço em uma placa de 384 poços utilizando um dispensador Multi-drop e as placas foram encubadas durante a noite a 37 °C. 0 dia seguinte, as células que alcançaram 75-85% de confluência foram utilizados no experimento. Os meios e os reagentes foram aquecidos à temperatura ambiente. Antes as diluições foram preparadas, a solução estoque de ligantes de receptor Y2 e controles em dimetil sulfóxido (DMSO, Sigma Cat# D2650) foram deixados aquecer a 32°C por 5-10 min. As diluições foram realizadas utilizando meio de encubação [DMEM/F12] contendo 0.5 mM de 3-isobutil-l-metilxantina (IBMX, Calbiochem Cat # 410957) e 0.5 mg/ml BSA (Sigma Cat # A8806)]. As concentrações finais de DMSO e forskolin no meio de encubação foram 1.1% e 5 μΜ, respectivamente.
O meio de plaqueamento foi removido pela inversão suave da placa de 384 poços em uma toalha de papel e substituída com um meio de encubação (50 μΐ/poço) contendo várias concentrações de ligantes de receptor Y2 ligands (quatro réplicagens/concentração). As placas foram encubadas à temperatura ambiente por 30 minutos. Os seguintes 30 minutos do período de tratamento as placas foram encubadas à temperatura ambiente. Os seguintes 30 minutos 30 min do período de tratamento, o meio de encubação foi descartado e substituído com 50 μl/poço de Tampão de ensaio de Iise (proporcionado no kit Tropix). As células foram lisadas pelas placas de encubação por 45 min a 37°C. O lisado (20 μl) foi transferido nas placas de anticorpo pré-revestidas. (384-poços) suprida pelo kit Tropix. O conjugado AP (10 μl) e o anticorpo anti-cAMP (20 μl) foi adicionado em cada um dos poços e as placas foram encubadas em um agitador à temperatura ambiente por Ih. As placas foram lavadas 5 vezes com Tampão de lavagem (70 μl/ poço/lavagem) e as placas foram seladas secas. 0 substrato CSPD/Saphire- II RTU /intensificador de solução (30 μΐ/poço) foi adicionado e encubado por 45 minutos a temperatura ambiente. O sinal em cada uma das células foi medido (1 s/poço) utilizando um luminômetro (VICTOR-V).
Os compostos da presente invenção exibiram atividade seletiva de receptor de neuropeptídeo-2 in vivo, conforme demonstrado no ensaio de fluxo de cálcio (FLIPR®; Exemplo 42) e ensaio de AMP cíclico (Exemplo 43) . 0 sumário dos resultados in vivo, EC50 para Exemplos 3 a 3 9 e 41, são ilustrados na Tabela abaixo:
Tabela 1
<table>table see original document page 85</column></row><table> <table>table see original document page 86</column></row><table> <table>table see original document page 87</column></row><table> <table>table see original document page 88</column></row><table> <table>table see original document page 89</column></row><table> <table>table see original document page 90</column></row><table>
EXEMPLO 44
Estudos em ratos DIO crônicos
Ratos machos Sprague Dawley (7 semanas de idade)
foram obtido a partir de Charles River Laboratories (USA) e alojados e um ambiente de temperatura e umidade controladas com 12h de luz:12h escuridão. Os ratos foram admitidos ad libitum em uma dieta de alto teor de gordura (HFD; 60% das kcal como gordura, Research Diets D12492) e água através do estudo. As seguintes 7 semanas em HFD, os ratos foram escolhidos por peso corporal e engaiolados individualmente. Os ratos foram dosados antes do do ciclo escuro com um veículo (s.c.) ou composto do Exemplo 41 (1, e 10 mg/kg, s.c.) uma vez cada dois dias por 3 semanas (N = 6-8 ratos/grupo) . 0 peso corporal foi registrado em dias e indicado na Figura 23.
Análise de dadoss:
Todos os dados mostrados são significativos ± desvio padrão (s.e.m.). A availação estatística dos dados foi realizada utilizando ANOVA via única, seguido pelo teste Dunnett para determinar onde existem diferenças estatisticamente signfiicativas entre o veículo e grupos tratados com drogas. As diferenças foram consideradas estatisticamente significativa a P<0.05. A análise de dados foi realizada com GraphPad software (GraphPad Prism).
Resultados:
A administração crônica do composto do Exemplo 41 (5 e 10 mg/kg, q48 h, s.c.) em ratos machos DIO induziram um decréscimo signficativo no ganho corporal versus animais tratados com veículo seguido de um período de tratamento de 3 semanas (Figura 23).
Estudos em camundongos com db/db aguda
Camundongos fêmea db/db (C57BL/Ks J-Lepdb"db/db, Jackson Laboratories, USA) estavam com 6 semanas quando recebidos. Os camundongos foram alojados em um ambiente de temperatura e humidade controladas com ciclos de 12 horas de claridade e 12 horas de escuridão e foram admitidos em uma alimentação (Purina rodent chow 5008) e água ad libitum. Os camundongos (12-semanas de idade) foram pré- sangrados 4 dias antes do estudo e aqueles dentro de uma faixa estreita de níveis de glicose sangüínea altos foram selecionados para estudo para minimizar a variabilidade entre o controle de veículo e os grupos tratados com a droga. Os camundongos foram veículo administrados (s.c.) ou o composto do Exemplo 41 (0.3, 1 e 10 mg/kg, s.c.) 28 h antes do teste de tolerância oral à glicose (N = 10 camundongos/grupo). As mostras de sangue foram coletadas a partir de cortes da cauda seguindo de 6h de refeição para a determinação de valores de linha base (t = 0 min) . Os camundongos foram então alimentados com bolus oral de glicose (1 g/kg), e amostras adicionais de sangue foram coletadas em intervalos regulares (t = 30, 60 e 12 0 min) para medida de glicose. Para analisar os efeitos do composto do Exemplo 41 em tolerância de glicose oral, a diferença na glicose sangüínea absoluta em relação à linha base (glicose sangüínea de refeição) foi calculada para cada ponto de tempo. A área sob a curva (AUC0-I2O min) foi determinada utilizando o método trapezóide.
Análise de Dados:
Todos os dados mostrados são desvio significativo ± padrão (s.d.). A avaliação estatística dos dados foram realizados utilizando ANOVA de via única, seguido pelo teste de Dunnett para determinar onde as deficiências significativas estatisticamente existem entre o veículo e os grupos tratados com drogas. As diferenças foram consideradas estatisticamente significativos a P<0.05. A análise de dados foram realizados com GraphPad software (GraphPad Prism). Resultados:
Uma administração aguda do composto do Exemplo 41 (1 e 10 mg/kg, s.c.) em fêmeass de camundongos db/db significativamente decresceu a excursão de glicose em resposta ao ao aumento oral de glicose. (Figura 24).
Estudos de camundongos db/db crônicos
Camundongos fêmea (C57BL/KS J-Lepdb7db, Jackson Laboratories, USA) estavam com 6 semanas de idade quando recebidos. Os camundongos foram alojados em um ambiente com controle de temperatura e umidade com ciclos de 12h claridade e 12h de escuridão e admitidos em uma alimentação (Purina rodent chow 5008) e água ad libitum. Os camundongos (9 semanas de idade) foram previamente sangrados 4 dias antes do tratamento da droga, e aqueles dentro de uma faixa estreita dos niveis sangüíneos de glicose sangüínea foram selecionados no estudo para minimizar a variabilidade entre o controle de veículos e os grupos tratados com droga. Os camundongos foram dosados com veículo (s.c.) ou o composto do Exemplo 41 (1, 3 e 10 mg/kg, s.c.) uma vez a cada dois dias por 3 semanas (N = 10 camundongo/grupo). As medições de glicose sangüínea da alimentação basal (2 a 6 h) foram conduzidas semanalmente. No dia de estudo 20, o teste de tolerância de glicose foi realizado 6h em seguida à refeição. As amostras de sangue foram coletadas a partir de cortes na cauda para determinação dos valores de linha base (t = 0 min). Os camundongos foram então alimentados com bolus oral de glicose (1 g/kg), e amostras adicionais de sangue foram coletadas em intervalos regulares (t = 30, 60, and 120 min) para medida de glicose. Para analisar os efeitos do composto do Exemplo 41 em tolerância oral à glicose, a diferença absoluta na glicose sangüínea da linha base (glicose sangüínea da alimentação, t - 0 min) foi calculada para cada ponto de tempo. A área sob a curva (AUC0-120 min) foi determianda utilizando o método trapezóide.
Análise de Dadoss:
Todos os dados mostrados são significativo ± desvio padrão (s.d.). A avaliação estatística dos dados foi ralizada utilizando ANOVA de via única, seguido do teste de Dunnett para determinar onde diferenças estatisticamente significativas que existem entre o veículo e os grupos tratados com droga. A diferenças foram consideradas estatisticamente significativas a P<0.05. As análises de dados foram realizados com GraphPad software (GraphPad Prism).
Resultados:
A administração crônica do composto do Exemplo 41 (1, 3 e 10 mg/kg, q48 hr, s.c.) para camundongos fêmea db/db mice reduziu os níveiss de glicose sangüínea basal (dia 8, 15 e 21) versus animais tratados com droga durante o período de tratamento de 3 semanas (Figure 25A) . Conforme mostrado na Figura 25B, no dia 2 0 o composto do Exemplo 41 (tanto em 3 e 10 mg/kg, q48 hr, s.c.) decresceu significativamente a excursão de glicose em resposta a uma ingestão de glicose. Deve ser entendido que a invenção não é limitada pelas modalidades particulares descritas acima, bemo como
variações das modalidades particulares que podem ser realizadas e estão ainda incluidas no escopo das reivindicações apensas.
Exemplo A
Tabletes revestidos com filme contendo os seguintes ingedietes e que podem ser feitos da maneira convencional:
Ingredientes
Por
Tablete
Cerne:
Composto de formula (I) 10.0 200.0
mg mg
Celulose microcristalina 23.5 43.5
mg mg
Hidrous lactose 60.0 70.0
mg mg
Povidona K30 12.5 15.0
mg mg
Sódio amido glicolato 12.5 17.0
mg mg
Estearato de magnésio 1.5 mg 4 .5 mg
(Peso do cerne) 120.0 350.0
mg mg
Revestimento de filme:
Hidroxipropil metil celulose 3 .5 mg 7. 0 mg
Polietilene glicol 6000 0.8 mg 1.6 mg Talco 1.3 mg 2.6 mg
Óxido de ferro (amarelo) 0.8 mg 1.6 mg
Dióxido de titânio 0.8 mg 1.6 mg
O ingrediente ativo é peneirado e misturado com celulose microcristalina e a mistura é granulada com uma solução de polivinilpirrolidona em água. 0 granulado é misturado com sódio amido glicolato e mangésio estearato e comprimido para render cernes de 120 a 350 mg respectivamente. Os cernes são laqueadaso com solução aquosa/suspensão do referido resvestimento de filme.
Exemplo B
Cápsulas contendo os seguintes ingredientes podem ser fabricados da maneira convencional:
Ingredientes Por cápsula
Composto de formula (I) 2 5.0 mg
Lactose 150.0 mg
Amido de milho 20.0 mg
Talco 5.0 mg
Os componentes são peneirados e carregados em cápsulas de tamanho 2.
Exemplo C
As soluções de injeção podem ter a seguinte composição:
Composto de formula (I) 3 .0 mg
Polietileno Glicol 400 150.0 mg Acido Acético q.s. ad pH 5.0
Água para soluções de injeção ad 1.0 ml
0 ingrediente ativo é dissolvido em uma mistura de polietileno glicol 400 e água para injeção (part). 0 pH é ajustado em 5.0 com Ácido Acético. 0 volume é ajustado a 1.0 ml pela adição da quantidad residual de água. A solução é filtrada, carregada e viais utilizando o dimensionamento apropriado e esterilizado.
Exemplo D
As cápsulas de gelatina contendo os seguintes ingredientes podem ser fabricados de uma maneira convencional:
Teores de Cápsula
<table>table see original document page 97</column></row><table>
Cápsula de gelatina
<table>table see original document page 97</column></row><table> Óxido de ferro amarelo 1.1 mg
O ingrediente ativo é dissolvido por fusão dos outros ingredientes e a mistura é carregada com gelatina macia de tamanho apropriado. As cápsulas de gelatina macia são tratadas de acordo com procedimentos usuais.
Exemplo E
Sachês contendo os seguintes ingredientes podem ser fabricados da maneira convencional:
Composto de formula (I) 50.0 mg
Lactose, pó fino 1015.0 mg
Celulose microcristalina (AVICEL PH 1400.0 mg 102)
Carboximetil celulose sódica 14.0 mg
Polvinilpirrolidona K 30 10.0 mg
Estearato de magnésio 10.0 mg
Aditivos flavorizantes 1.0 mg
O ingrediente ativo é misturado com lactose, celulose microcristalina e carboximetil celulose sódica e granulada com uma mistura de polivinilpirrolidona em água. 0 granulado é misturado com estearato de magnésio e os aditivos flavorizantes e carregados em sachês. LISTAGEM DE SEQÜÊNCIA
<110> F. HOFFMANN-LA ROCHE AG
<120> NEUROPEPTIDEO-2 RECEPTOR-AGONISTA
<130> 23353
<140>
<141>
<150> 60/748,071 <151> 2005-12-07
<160> 41
<170> PatentIn Ver. 3.3
<210> 1 <211> 34 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo sintético
<400> 1
Ile Lys Pro Glu Ala Pro Gly Glu Asp Ala Ser Pro Glu Glu Leu Asn 1 5 10 15
Arg Tyr Tyr Ala Ser Leu Arg His Tyr Leu Asn Leu Val Thr Arg Gln 20 25 30
Arg Tyr
<210> 2 <211> 15 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptídeo sintético
<220>
<221> M0D_RES <222> (3) <223> Pqa
<400> 2
Ile Lys Xaa Arg His Tyr Leu Asn Leu Val Thr Arg Gln Arg Tyr 1 5 10 15 <210> 3 <211> 15 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo sintético
<220>
<221> MOD_RES <222> (3) <223> Pqa
<220>
<221> MOD_RES <222> (14) <223> (NMe)Arg
<400> 3
Ile Lys Xaa Arg His Tyr Leu Asn Leu Val Thr Arg Gln Arg Tyr 1 5 10 15
<210> 4 <211> 15 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo sintético
<220>
<221> M0D_RES <222> (3) <223> Pqa
<220>
<221> M0D_RES <222> (14) <223> (NMe)Arg
<220>
<221> M0D_RES <222> (15) <223> m-Tyr
<400> 4
Ile Lys Xaa Arg His Tyr Leu Asn Leu Val Thr Arg Gln Arg Tyr 1 5 10 15
<210> 5 <211> 15 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo sintético
<220>
<221> MOD_RES <222> (3) <223> Pqa
<220>
<221> MOD_RES <222> (14) <223> (NMe)Arg
<220>
<221> MOD_RES <222> (15) <223> 3-iodo-Tyr
<400> 5
Ile Lys Xaa Arg His Tyr Leu Asn Leu Val Thr Arg Gln Arg Tyr 1 5 10 15
<210> 6 <211> 15 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo sintético
<220>
<221> M0D_RES <222> (3) <223> Pqa
<220>
<221> M0D_RES <222> (14) <223> (NMe)Arg
<220>
<221> M0D_RES
<222> (15)
<223> 3,5 di F-Tyr
<400> 6
Ile Lys Xaa Arg His Tyr Leu Asn Leu Val Thr Arg Gln Arg Tyr 1 5 10 15
<210> 7 <211> 15 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo sintético
<220>
<221> MOD_RES <222> (3) <223> Pqa
<220>
<221> MOD_RES <222> (14) <223> (NMe)Arg
<220>
<221> MOD_RES
<222> (15)
<223> 2,6 di F-Tyr
<400> 7
Ile Lys Xaa Arg His Tyr Leu Asn Leu Val Thr Arg Gln Arg Tyr 15 10 15
<210> 8 <211> 15 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo sintético
<220>
<221> M0D_RES <222> (3) <223> Pqa
<220>
<221> M0D_RES <222> (14) <223> (NMe)Arg
<220>
<221> M0D_RES
<222> (15)
<223> 2,6 di Me-Tyr
<400> 8
Ile Lys Xaa Arg His Tyr Leu Asn Leu Val Thr Arg Gln Arg Tyr 15 10 15 <210> 9 <211> 15 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo sintético
<220>
<221> MOD_RES <222> (3) <223> Pqa
<220>
<221> MOD_RES <222> (14) <223> (NMe)Arg
<220>
<221> MOD_RES
<222> (15)
<223> 4-metóxi-Phe
<400> 9
Ile Lys Xaa Arg His Tyr Leu Asn Leu Val Thr Arg Gln Arg Phe 15 10 15
<210> 10 <211> 15 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo sintético
<220>
<221> M0D_RES <222> (3) <223> Pqa
<220>
<221> M0D_RES <222> (14) <223> (NMe)Arg
<400> 10
Ile Lys Xaa Arg His Tyr Leu Asn Leu Val Thr Arg Gln Arg Phe 15 10 15
<210> 11 <211> 15 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo sintético
<220>
<221> MOD_RES <222> (3) <223> Pqa
<220>
<221> MOD_RES <222> (14) <223> (NMe)Arg
<220>
<221> MOD_RES <222> (15) <223> 4-amino-Phe
<400> 11
Ile Lys Xaa Arg His Tyr Leu Asn Leu Val Thr Arg Gln Arg Phe 15 10 15
<210> 12 <211> 15 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo sintético
<220>
<221> M0D_RES <222> (3) <223> Pqa
<220>
<221> M0D_RES <222> (14) <223> (NMe)Arg
<220>
<221> M0D_RES <222> (15) <223> 4 F-Phe
<400> 12
Ile Lys Xaa Arg His Tyr Leu Asn Leu Val Thr Arg Gln Arg Phe 15 10 15
<210> 13 <211> 15 <212> PRT <213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo sintético
<220>
<221> MOD_RES <222> (3) <223> Pqa
<220>
<221> MOD_RES <222> (14) <223> (NMe)Arg
<220>
<221> MOD_RES
<222> (15)
<223> 4(CH20H)-Phe
<400> 13
Ile Lys Xaa Arg His Tyr Leu.Asn Leu Val Thr Arg Gln Arg Phe 15 10 15
<210> 14 <211> 15 <212> PRT .<213> Seqüência Artificial
<220>
<223> Descrição da Seqüência Artificial: peptideo sintético
<220>
<221> M0D_RES <222> (3) <223> Pqa
<220>
<221> M0D_RES <222> (14) <223> (NMe)Arg
<220>
<221> M0D_RES <222> (15)
<223> 4-trifluoro de metil-Phe <400> 14
Ile Lys Xaa Arg His Tyr Leu Asn Leu Val Thr Arg Gln Arg Phe 15 10 15
<210> 15 <211> 15 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo sintético
<220>
<221> MOD_RES <222> (3) <223> Pqa
<220>
<221> MOD_RES <222> (14) <223> (NMe)Arg
<220>
<221> MOD_RES <222> (15) <223> 3 F-Phe
<400> 15
Ile Lys Xaa Arg His Tyr Leu Asn Leu Val Thr Arg Gln Arg Phe 1 5 10 15
<210> 16 <211> 15 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo sintético
<220>
<221> M0D_RES <222> (3) <223> Pqa
<220>
<221> M0D_RES <222> (14) <223> (NMe)Arg
<220>
<221> M0D_RES <222> (15)
<223> 2,3,4,5,6 Penta F-Phe <400> 16
Ile Lys Xaa Arg His Tyr Leu Asn Leu Val Thr Arg Gln Arg Phe 1 5 10 15
<210> 17 <211> 15 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo sintético
<220>
<221> MOD_RES <222> (3) <223> Pqa
<220>
<221> MOD_RES <222> (14) <223> (NMe)Arg
<220>
<221> MOD_RES <222> (15)
<223> 3,4 dicloro-Phe <400> 17
Ile Lys Xaa Arg His Tyr Leu Asn Leu Val Thr Arg Gln Arg Phe 1 5 10 15
<210> 18 <211> 15 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial
<220>
<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo sintético
<220>
<221> M0D_RES <222> (3) <223> Pqa
<220>
<221> M0D_RES <222> (14) <223> (NMe)Arg
<220>
<221> M0D_RES <222> (15) <223> Cha
<400> 18
Ile Lys Xaa Arg His Tyr Leu Asn Leu Val Thr Arg Gln Arg Xaa 1 5 10 15 <210> 19 <211> 15 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo sintético
<220>
<221> M0D_RES <222> (3) <223> Pqa
<220>
<221> M0D_RES <222> (14) <223> (NMe)Arg
<400> 19
Ile Lys Xaa Arg His Tyr Leu Asn Leu Val Thr Arg Gln Arg Trp 15 10 15
<210> 20 <211> 15 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo sintético
<220>
<221> M0D_RES <222> (3) <223> Pqa
<220>
<221> M0D_RES <222> (14) <223> (NMe)Arg
<220>
<221> M0D_RES <222> (15) <223> I-Nal
<400> 20
Ile Lys Xaa Arg His Tyr Leu Asn Leu Val Thr Arg Gln Arg Xaa 15 10 15
<210> 21 <211> 15 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo sintético
<220>
<221> MOD_RES <222> (3) <223> Pqa
<220>
<221> MOD_RES <222> (14) <223> (NMe)Arg
<220>
<221> MOD_RES <222> (15) <223> 2-Nal
<400> 21
Ile Lys Xaa Arg His Tyr Leu Asn Leu Val Thr Arg Gln Arg Xaa 15 10 15
<210> 22 <211> 15 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo sintético
<220>
<221> M0D_RES <222> (3) <223> Pqa
<220>
<221> M0D_RES <222> (15)
<223> (C-alfa-metil)-Tyr <400> 22
Ile Lys Xaa Arg His Tyr Leu Asn Leu Val Thr Arg Gln Arg Tyr 15 10 15
<210> 23 <211> 15 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial
<220>
<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo sintético <220>
<221> MOD_RES <222> (3) <223> Pqa
<220>
<221> MOD_RES <222> (14) <223> (NMe)Arg
<400> 23
Ile Lys Xaa Arg His Tyr Leu Asn Trp Val Thr Arg Gln Arg Tyr 1 5 10 15
<210> 24 <211> 15 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo sintético
<220>
<221> M0D_RES <222> (2) <223> Nle
<220>
<221> M0D_RES <222> (3) <223> Pqa
<220>
<221> M0D_RES <222> (14) <223> (NMe)Arg
<400> 24
Ile Xaa Xaa Arg His Tyr Leu Asn Trp Val Thr Arg Gln Arg Tyr 1 5 10 15
<210> 25 <211> 15 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo sintético
<220>
<221> M0D_RES <222> (1) <223> Ac-Ile <220>
<221> MOD_RES <222> (3) <223> Pqa
<220>
<221> MOD_RES <222> (14) <223> (NMe)Arg
<220>
<221> MOD_RES <222> (15)
<223> 2,6 difluoro-Tyr <400> 25
Ile Lys Xaa Arg His Tyr Leu Asn Trp Val Thr Arg Gln Arg Tyr 15 10 15
<210> 26 <211> 15 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo sintético
<220>
<221> M0D_RES <222> (1) <223> Ac-Ile
<220>
<221> M0D_RES <222> (3) <223> Pqa
<220>
<221> M0D_RES <222> (14) <223> (NMe)Arg
<400> 26
Ile Lys Xaa Arg His Tyr Leu Asn Trp Val Thr Arg Gln Arg Tyr 15 10 15
<210> 27 <211> 15 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial
<220> <223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo sintético
<220>
<221> MOD_RES <222> (1) <223> Pentoil-Ile
<220>
<221> MOD_RES <222> (3) <223> Pqa
<220>
<221> MOD_RES <222> (14) <223> (NMe)Arg
<400> 27
Ile Lys Xaa Arg His Tyr Leu Asn Trp Val Thr Arg Gln Arg Tyr 15 10 15
<210> 28 <211> 15 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo sintético
<220>
<221> MOD_RES <222> (1)
<223> Acetil de trimetila -Ile <220>
<221> MOD_RES <222> (3) <223> Pqa
<220>
<221> MOD_RES <222> (14) <223> (NMe)Arg
<400> 28
Ile Lys Xaa Arg His Tyr Leu Asn Trp Val Thr Arg Gln Arg Tyr 15 10 15
<210> 29 <211> 15 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptídeo sintético
<220>
<221> MOD_RES <222> (1)
<223> Cicloexilacetil-Ile <220>
<221> MOD_RES <222> (3) <223> Pqa
<220>
<221> MOD_RES <222> (14) <223> (NMe)Arg
<400> 29
Ile Lys Xaa Arg His Tyr Leu Asn Trp Val Thr Arg Gln Arg Tyr 15 10 15
<210> 30 <211> 15 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo sintético
<220>
<221> M0D_RES
<222> (1)
<223> Benzoil-Ile
<220>
<221> M0D_RES <222> (3) <223> Pqa
<220>
<221> M0D_RES <222> (14) <223> (NMe)Arg
<400> 30
Ile Lys Xaa Arg His Tyr Leu Asn Trp Val Thr Arg Gln Arg Tyr 15 10 15
<210> 31 <211> 15 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo sintético
<220>
<221> MOD_RES <222> (1)
<223> Adamantoil-Ile <220>
<221> MOD_RES <222> (3) <223> Pqa
<220>
<221> MOD_RES <222> (14) <223> (NMe)Arg
<400> 31
Ile Lys Xaa Arg His Tyr Leu Asn Trp Val Thr Arg Gln Arg Tyr 15 10 15
<210> 32 <211> 15 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo sintético
<220>
<221> M0D_RES <222> (3) <223> Pqa
<220>
<221> M0D_RES <222> (14) <223> (NMe)Arg
<400> 32
Ile Lys Xaa Arg His Tyr Leu Asn Trp Val Thr Arg Gln Arg Tyr 15 10 15
<210> 33 <211> 15 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo sintético <220>
<221> MOD_RES <222> (2)
<223> Lys(PEG-30,OOO SPA) <220>
<221> MODJRES <222> (3) <223> Pqa
<220>
<221> MOD_RES <222> (14) <223> (NMe)Arg
<400> 33
Ile Lys Xaa Arg His Tyr Leu Asn Trp Val Thr Arg Gln Arg Tyr 1 5 10 15
<210> 34 <211> 15 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo sintético
<220>
<221> M0D_RES <222> (3) <223> Pqa
<220>
<221> M0D_RES <222> (14) <223> (NMe)Arg
<400> 34
Ile Lys Xaa Arg His Tyr Leu Asn Trp Val Thr Arg Gln Arg Tyr 1 5 10 15
<210> 35 <211> 15 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo sintético
<220>
<221> MOD_RES <222> (2) <223> Lys(PEG-40,OOO BTC) <220>
<221> MOD_RES <222> (3) <223> Pqa
<220>
<221> MOD_RES <222> (14) <223> (NMe)Arg
<400> 35
Ile Lys Xaa Arg His Tyr Leu Asn Trp Val Thr Arg Gln Arg Tyr 15 10 15
<210> 36 <211> 15 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptídeo sintético
<220>
<221> M0D_RES <222> (2) <223> Nle
<220>
<221> MOD_RES <222> (3) <223> Pqa
<220>
<221> MOD_RES <222> (14) <223> (NMe)Arg
<400> 36
Ile Xaa Xaa Arg His Tyr Leu Asn Trp Val Thr Arg Gln Arg Tyr 15 10 15
<210> 37 <211> 15 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo sintético
<220>
<221> MOD RES <222> (2) <223> Nle
<220> <221> MOD_RES <222> (3) <223> Pqa
<220> <221> MOD_RES <222> (14) <223> (NMe)Arg
<400> 37
Ile Xaa Xaa Arg His Tyr Leu Asn Trp Val Thr Arg Gln Arg Tyr 1 5 10 15
<210> 38 <211> 15 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220> <223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo sintético
<220> <221> M0D_RES <222> (1) <223> Ac-Ile
<220> <221> M0D_RES <222> (2) <223> Lys(PEG-30,000 SPA)
<220> <221> M0D_RES <222> (3) <223> Pqa
<220> <221> MOD_RES <222> (14) <223> (NMe)Arg
<400> 38
Ile Lys Xaa Arg His Tyr Leu Asn Trp Val Thr Arg Gln Arg Tyr 1 5 10 15
<210> 39 <211> 15 <212> PRT <213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo sintético
<220>
<221> M0D_RES <222> (1) <223> Ac-Ile
<220>
<221> M0D_RES <222> (2)
<223> Lys(PEG-30,000 SSA) <220>
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<220>
<221> MOD_RES <222> (14) <223> (NMe)Arg
<400> 39
Ile Lys Xaa Arg His Tyr Leu Asn Trp Val Thr Arg Gln Arg Tyr 15 10 15
<210> 40 <211> 15 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo sintético
<220>
<221> M0D_RES <222> (1) <223> Fmoc-Ile
<220>
<221> M0D_RES <222> (3) <223> Pqa
<220>
<221> M0D_RES <222> (14) <223> (NMe)Arg
<400> 40
Ile Lys Xaa Arg His Tyr Leu Asn Trp Val Thr Arg Gln Arg Tyr 15 10 15 <210> 41 <211> 15 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo sintético
<220>
<221> MOD_RES <222> (2)
<223> Lys(PEG-30,OOO SSA) <220>
<221> MOD_RES <222> (3) <223> Pqa
<220>
<221> MOD_RES <222> (14) <223> (NMe)Arg
<400> 41
Ile Lys Xaa Arg His Tyr Leu Asn Trp Val Thr Arg Gln Arg Tyr 15 10 15

Claims (28)

1. Agonista receptor de neuropeptídeo-2 caracterizado pelo fato de compreender a fórmula (I): <formula>formula see original document page 120</formula> em que: X é o ácido 4-0x0-6-(1-piperazinil)-3(4H)- quinazolina-acético (Pqa), Y é H, uma porção acila, um alquil substituído e não substituído, um alquil inferior substituído ou não substituído, um aril substitiuído ou não substituído, um heteroaril substituído ou não substituído, um alcoxi substituído ou não substituído, uma porção poli(etileno) glicol , PEGm-SSA, PEGm-S-SBA, PEGm-SPA ou PEGm-BTC, Y1 é H, uma porção poli (etileno) glicol, PEGm-SSA, PEGm-S-SBA, PEGm-SPA OU PEGm-BTC, R1 é Ile, Ala, (D) lie, N-metil lie, Aib, 1-lAic, -2-2 Aic, Ach ou Acp, R2 é Lys, Ala, (D) Lys, NMelys, Nle ou (Lys-Gly), R3 é Arg, Ala, (D)Arg, N-metil Arg, Phe, 3,4,5- Triflúor Phe ou 2,3,4,5,6- Pentafluor Phe, R4 é His, Ala, (D)His, N-metil His, 4-MeOApc, 3-Pal ou 4-Pai, R5 é Tyr, Ala, (D) Tyr , N- metil Tyr, Trp, Tic, Bip, Dip, (1)Nal, (2)Nal, 3,4,5- Trifluor Phe ou -2,3,4,5,6- Pentafluor Phe, R6 é Leu, Ala, (D)Leu ou N-metil Leu, R7 é Asn, Ala ou (D)Asn, R8 é Leu ou Trp, R9 é Val, Ala, (D) Val ou N-metil Vai, R10 é Thr, Ala ou N-metil Thr, R11 é Arg, (D) Arg ou N-metil Arg, R12 é Gln ou Ala, R13 é Arg, (D)Arg ou N-metil Arg, R14 is Tyr, (D) Tyr ou N- metil Tyr, Tyr modificado, Phe, Phe modificado, Cha, (1) Nal, (2) Nal, C- alfa-metil Tyr ou Trp, e PEGm é 1 to 60 KDa, Ou seu sal farmaceuticamente aceitável.
2. Agonista, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de compreender a fórmula (Ia) Y - R1 - R2 - X - R3 - R4 - R5 - R6 - R7 - R8 - R9 - R1O ~ Rn ~ R12 ~ R13 ~ R14 ~NH2 (Ia) em que : X é o ácido N-piperazin-l-il-4(3H)-quinazolinona-3- acético (Pqa), Y é H, uma porção acila, alquil substituído ou não substituído, alquil inferior substituído ou não substituído, um aril substituído ou não substituído, um alcoxi substituído ou não substituído, uma porção poli(etileno) glicol, PEG-SSA, PEG-S-SBA, PEG-SPA ou PEG- BTC, R1 é lie, Ala, (D) lie, N-metil He, Aib, 1-lAic, -2-2 Aic, Ach ou Acp, R2 é Lys, Ala, (D) Lys, NMelys, Nle ou (Lys-Gly), R3 é Arg, Ala, (D)Arg, N-metilArg, Phe, 3,4,5- TriflúorPhe ou 2,3,4,5,6- Pentaflúor Phe, R4 é His, Ala, (D)His, N-metil His, 4-MeOApc, 3-Pal ou 4-Pai, R5 é Tyr, Ala, (D) Tyr , N- metil Tyr, Trp, Tie, Bip, Dip, (1)Nal, (2)Nal, 3,4,5- Trifluor Phe ou -2,3,4,5,6- Pentaflúor Phe, R6 é Leu, Ala, (D)Leu ou N-metil Leu, R7 é Asn, Ala ou (D)Asn, R8 é Leu ou Trp, R9 é Vai, Ala, (D) Val ou N-metil Vai, R10 é Thr, Ala ou N-metil Thr, R11 é Arg, (D) Arg ou N-metil Arg, R12 é Gln ou Ala, R13 é Arg, (D)Arg ou N-metil Arg, e R14 é Tyr, (D) Tyr ou N- metil Tyr, Tyr-modifiçada, Phe, Phe-modifiçada ou Trp, Ou seu sal farmaceuticamente aceitável.
3. Agonista, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que R2 é substitutído com Y1 e Y1 é H, uma porção poli (etileno) glicol, PEGm-SSA, PEGm-S-SBA, PEGm-SPA ou PEGm-BTC.
4. Agonista, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 3, caracterizado pelo fato de que Y1 é uma porção poli (etileno) glicol, PEGm-SSA, PEGm-S-SBA, PEGm- SPA ou PEGm-BTC.
5. Agonista, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que Y é H ou uma porção acila, e Y1 é uma porção poli (etileno) glicol, PEGm-SSA, PEGm-S-SBA, PEGm-SPA ou PEGm-BTC.
6. Agonista, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que Y é uma porção acila.
7. Agonista, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que Y é H.
8. Agonista, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 3, 4,5,6, ou 7, caracterizado pelo fato de que Y' é H.
9. Agonista, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que R1 is Ile, R2 é Lys ou Nle, R3 is Arg, R4 é His, R5 is Tyr, R6 é Leu, R7 é Asn, R8 é Leu ou Trp, R9 é Vai, R10 é Thr, R11 é Arg, R12 Gln, R13 é Arg ou (N-metil)Arg, R14 é Y, (m-)Y, (3- I)Y, (3,5 di F) Y, (2,6 di F) Y, (2,6 di Me) Y, F(4-0-CH3), F, (4-NH2) Phe, (4-F) Phe , (4-CH20H) Phe, (4-CF3)Phe, (3-F)Phe, (2,3,4,5,6 penta F)Phe, (3,4 di Cl)Phe, Cha, W, (1) Nal, (2) Nal ou C-alpha-Me-Tyr.
10. Agonista, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que R14 é Tyr ou (2,6 di F)Tyr.
11. Agonista, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que PEGm é de 20 a 40 KDa.
12. Agonista, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de que PEGm é 30 KDa.
13. Agonista, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 12, caracterizado pelo fato de que é selecionado a partir de um grupo que consiste de : IK-Pqa-RHILNLVTRQRY, IK-Pqa-RHILNLVTRQ(N-metil)RY, IK-Pqa-RHILNLVTRQ(N-metil)R(m-)Y, IK-Pqa-RHILNLVTRQ(N-metil)R(3 -1)Y, IK-Pqa-RHILNLVTRQ(N-metil)R(3,5 di F)Y, IK-Pqa-RHILNLVTRQ(N-metil)R(2,6 di F)Y, IK-Pqa-RHILNLVTRQ(N-metil)R(2,6 di Me)Y, IK-Pqa-RHILNLVTRQ(N-metil)RF(4-0-CH3) , IK-Pqa-RHILNLVTRQ(N-metil)RF, IK-Pqa-RHILNLVTRQ(N-metil)R(4-NH2) Phe, IK-Pqa-RHILNLVTRQ(N-metil)R(4-F)Phe, IK-Pqa-RHI LNL VTRQ (N-metil)R(4-CH20H)Phe, IK-Pqa-RHILNLVTRQ(N-metil)R(4-CF3) Phe, IK-Pqa-RHILNLVTRQ(N-metil)R(3-F)Phe, IK-Pqa-RHILNLVTRQ(N-metil)R(2,3,4,5,6 penta F)Phe, IK-Pqa-RHILNLVTRQ(N-metil)R(3,4 di Cl)Phe, IK-Pqa-RHILNLVTRQ(N-metil)RCha, IK-Pqa-RHILNLVTRQ(N-metil)RW, IK-Pqa-RHILNLVTRQ(N-metil)R(I)Nal, IK-Pqa-RHILNLVTRQ(N-metil)R(2)Nali IK-Pqa-RHILNLVTRQR-C-alpha-Me-Tyr, IK-Pqa-RHILNWVTRQ(N-metil)RY, INle-Pqa-RHILNWVTRQ(N-metil)RYi Ac-IK-Pqa-RHILNWVTRQ(N-metil)R(2,6 di F) Y, Ac-IK-Pqa-RHILNWVTRQ(N-metil)RY, Pentil-IK-Pqa-RHILNWVTRQ(N-metil)RY, Trimetilacetil-IK-Pqa-RHILNWVTRQ(N-metil)RY, Ciclohexil-IK-Pqa-RHILNWVTRQ(N-metil)RY, Benzoil-IK-Pqa-RHILNWVTRQ(N-metil)RY, Adamtil-IK-Pqa-RHILNWVTRQ(N-metil)RY, (PEG 30,000 SPA)IK-Pqa-RHILNWVTRQ(N-metil)RY, (PEG4 0,000 BTC)-IK-Pqa-RHILNWVTRQ(N-meti)IRY, (PEG30,000)-SSA-INie-Pqa-RHILNWVTRQ(N-metil)RY, (PEG3 0,000)-beta-SBA-INle-Pqa-RHILNWVTRQ(N- metil)RY, Ae-Ile-Lys(PEG30,000 SPA) -Pqa-RHILNWVTRQ(N- metil)RY, Ac-Ile-Lys(PEG30,000 SSA)-Pqa-RHILNWVTRQ(N-metil)RY, e IK(PEG30,000 SSA)-Pqa-RHILNWVTRQ(N-metil)RY, Ou seu sal farmaeeutieamente aceitável.
14. Agonista, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizado pelo fato de ser selecionado a partir de um grupo que consiste de: Ac-Ile-Lys(PEG30,000 SPA)-Pqa-RHILNWVTRQ(N- metil)RY, Ac-Ile-Lys(PEG30,000 SSA) -Pqa-RHILNWVTRQ(N- metil)RY, e IK(PEG3 0,OOO SSA)-Pqa-RHILNWVTRQ(N-metil)RY, Ou um sal farmaceuticamente aceitável.
15. Agonista, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 14, caracterizado pelo fato de que o agonista é Ac-IK-Pqa -RHILNWVTRQ (N-metil) R (2-6 di F) Y.
16. Agonista, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizado pelo fato de que o agonista é Ac-IK-Pqa -RHILNWVTRQ(N-metil)RY.
17. Agonista, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizado pelo fato de que o agonista é (PEG 30,000)-SPA-IK-Pqa -RHILNWVTRQ(N-metil)RY.
18. Agonista, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizado pelo fato de que o agonista é (PEG30,000)-SSA-INle-Pqa -RHILNWVTRQ(N-metil)RY.
19. Agonista, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizado pelo fato de que o agonista é Ac-Ile-Lys( PEG30,000 SSA)- Pqa -RHILNWVTRQ(N- metil)RY.
20. Agonista, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizado pelo fato de que o agonista é H-Ile-Lys( PEG30,000 SSA)- Pqa -RHILNWVTRQ(N- metil)RY.
21. Composições farmacêuticas caracterizadas por compreenderem um agonista receptor de neuropeptídeo-2 conforme descrito em qualquer uma das reivindicações 1 a 20 e um veiculo farmaceuticamente aceitável e/ou adjuvante.
22. Agonista, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 20 caracterizado pelo fato de compreender substâncias terapêuticas ativas.
23. Agonista, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 20, caracterizado pelo fato de que compreende substâncias ativas para o tratamento e/ou profilaxia de doenças que são moduladas pelos agonistas receptores de neuropeptideos-2.
24. Método para tratamento terapêutico e/ou profilático de doenças que são moduladas pelos agonistas receptores de neuropeptideos-2 particularmente para o tratamento terapêutico e/ou profilático de doenças metabólicas ou desordem caracterizado por compreender a administração de um agonista receptor de neuropeptídeo-2, conforme descrito em qualquer uma das reivindicações 1 a 20 em um humano ou animal.
25. Uso de um agonista receptor de neuropeptídeo-2 conforme descrito em qualquer uma das reivindicações 1 a 20 para o tratamento terapêutico e/ou profilático de doenças que são moduladas por agonistas receptores de neuropeptídeos-2.
26. Uso de um agonista receptor de neuropeptídeo-2 conforme descrito em qualquer uma das reivindicações 1 a -20, para o tratamento terapêutico e/ou profilático da obesidade, diabetes tipo 2, síndrome metabólica, resistência à insulina, deslipidemia, aumentada permanência da glicose e aumentada tolerância à glicose.
27. Uso de um agonista receptor de neuropeptídeo-2 conforme descrito em qualquer uma das reivindicações 1 a 20 para a preparação de medicamentos para o tratamento terapêutico e/ou profilático de doenças que são moduladas por agonistas receptores de neuropeptídeos-2.
28. Uso de um agonista receptor de neuropeptídeo-2 conforme descrito em qualquer uma das reivindicações 1 a 20 para a preparação de medicamentos para o tratamento terapêutico e/ou profilático da obesidade, diabetes tipo 2, síndrome metabólica, resistência à insulina, deslipidemia, aumentada permanência da glicose e aumentada tolerância à glicose.
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