BRPI0619741A2 - método para induzir a apoptose em uma célula alvo, molécula de ligação, molécula de anticorpo ácido nucleico, uso de uma molécula de ligação ou molécula de anticorpo, e, composição farmacêutica - Google Patents

Abstract

MéTODO PARA INDUZIR A APOPTOSE EM UMA CéLULA ALVO, MOLéCULA DE LIGAçãO, MOLéCULA DE ANTICORPO áCIDO NUCLEICO, USO DE UMA MOLéCULA DE LIGAçãO OU MOLéCULA DE ANTICORPO, E, COMPOSIçãO FARMACêUTICA. A invenção fornece moléculas de ligação, incluindo moléculas de anticorpo que ligam-se seletivamente a um antígeno de superficie celular de uma célula alvo e em que as moléculas de ligação, na ligação ao antígeno de superfície celular, induzem a apoptose da célula alvo. Também são fornecidos métodos de e composições farmacêuticas para a indução à apoptose e usos destes.

Description

"MÉTODO PARA INDUZIR A APOPTOSE EM UMA CÉLULA ALVO, MOLÉCULA DE LIGAÇÃO, MOLÉCULA DE ANTICORPO ÁCIDO NUCLEICO, USO DE UMA MOLÉCULA DE LIGAÇÃO OU MOLÉCULA DE ANTICORPO, E, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA"

A invenção diz respeito a moléculas envolvidas na indução da apoptose, métodos e composições farmacêuticas para a indução à apoptose e usos destes

Os anticorpos tornaram-se recentemente, os terapêuticos de proteína de escolha para alvejar o câncer mas também para tratar outras indicações (Brekke et al. Nat Rev Drug Discov 2003;2:52-62). O advento do projeto de anticorpo forneceu as ferramentas para a geração de anticorpos humanos de bibliotecas e fago sintético, apresentando imunogenicidade diminuída e especificidade e afinidade intensificadas devido à sua natureza humana e diversidade maior (Weiner et al. Nat Biotechnol 2005;23:556-7). As bibliotecas simples são particularmente atrativas, assim como estes podem ser usados para o isolamento de anticorpos para qualquer especificidade incluindo auto-antígenos (Griffiths et al. Embo J 1993;12:725-34), independente de imunizações e reconstrução de novas bibliotecas. Os receptores de superfície celular constituem na maioria grupos bem sucedidos de antígenos alvejados por medicamentos terapêuticos modernos, incluindo inibidores e anticorpos de molécula pequena. De interesse particular, são as células de receptores de superfície que são unicamente expressados ou que apresentam um nível de expressão aumentada em uma célula alvo e são adicionalmente capazes de transmitir os sinais de morte ou de sobrevivência da célula. Tais receptores diferencialmente expressados com as propriedades de sinalização intrínseca permitem o alvejamento com base em anticorpo de células infectadas, transformadas ou de outra maneira com mal- funcionamento.

Para o tratamento de tumores, os anticorpos que tem a capacidade para induzir a apoptose em uma célula tumoral alvo durante a economia do tecido normal são de interesse particular. Diversos tais anticorpos estão em uso, foram registrados com o US Food and Drug Administration (FDA) e fornecem alternativas aos tratamentos contra o câncer convencional, por exemplo, contra linfoma (rituximab que alveja CD20) ou contra o câncer de mama (trastuzumab ou cetuximab que alveja Her-2 e EGFR respectivamente).

Também existem outros anti-corpos com apoptose que induz efeitos correntemente em desenvolvimento clínico. Entretanto, mesmo se estes anticorpos demonstram efeitos benéficos em testes em pacientes ou em animais, uma necessidade clínica não satisfeita ainda existe.

Um alvejamento de imunoglobulina anti-idiotípica de tumores de célula B foi a primeira terapia de anticorpo monoclonal conduzida no homem (Miller et al. N Engl J Med 1982;306:517-22.). A destruição das células tumorais por tais meios de administração de anticorpo passivo (Riechmann et al. Nature 1988;332:323-7.) ou vacinação ativa dos pacientes com a própria proteína de imunoglobulina tumoral (Kwak et al. N Engl J Med 1992;327:1209-15.), visto que foi demonstrado conferir a regressão tumoral ou latência de tumor em pacientes com tipos diferentes de malignidades de célula B. Um relato mais recente descreve a geração de anticorpos anti- idiotipo totalmente humano usando-se camundongos transgênicos deficientes na produção de anticorpo de camundongo e que expressam locais de cadeia de anticorpo humano selecionado (Suarez et al. Mol Immunol 2004;41:519-26.).

Na presente invenção um método de biopanning de competição foi usado, onde o antígeno de célula alvo na forma de células totais e subtrator de antígeno celular em excesso na forma de vesículas de membrana, são expostos ao mesmo tempo à biblioteca de fago de anticorpo n- CoDeR® simples (WO 2004/023140; Soderlind et al. Nat Biotechnol 2000;18:852-6.), para reaver e subseqüentemente testar os fragmentos de anticorpo com seletividade excelente para as células alvo de B linfoma. Além disso, a funcionalidade nas moléculas de ligação selecionadas foi demonstrada pela capacidade dos anticorpos testados para induzir a apoptose no alvo mas não em células que não alvo.

As especificidades de anticorpo identificadas incluem HLA- DR/DP (o anticorpo B1 da invenção) e IgM de superfície (o anticorpo C11 da invenção), bem como ICAM-1 (o anticorpo B11 da invenção), uma molécula de adesão não previamente associados com a indução de apoptose. Os anticorpos isolados tiveram afinidades na faixa de subnanomolar à nanomolar, tornando as escolhas diretamente possíveis para a terapia de anticorpo alvejado.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Em um primeiro aspecto da invenção é fornecido um método para induzir a apoptose em uma célula alvo que compreende as etapas:

a. fornecer uma ou mais células alvo que apresentam o antígeno de superfície celular, ICAM-1;

b. fornecer uma ou mais moléculas de ligação que ligam-se seletivamente ao ICAM-I de superfície celular e, na ligação ICAM-1, induz a apoptose da célula alvo;

c. expor as células alvo de (a) às moléculas de ligação de (b) para induzir a apoptose nas células alvo.

Preferivelmente, a molécula de ligação é uma molécula de anticorpo.

Em um segundo aspecto da invenção é fornecido um método para induzir a apoptose em uma célula alvo que compreende as etapas:

a. fornecer uma ou mais células alvo que apresentam o antígeno de superfície celular, HLA-DR/DP e/ou IgM de superfície;

b. fornecer uma ou mais moléculas de anticorpo que ligam-se seletivamente à superfície celular HLA-DR/DP e/ou IgM de superfície e, na ligação HLA-DR/DP e/ou IgM de superfície, induzindo a apoptose da célula alvo;

c. expor as células alvo de (a) às moléculas de anticorpo de (b) para induzir a apoptose nas células alvo.

Em um terceiro aspecto da invenção, é fornecida uma molécula de ligação que ligam-se seletivamente à superfície celular ICAM-I e, na ligação ICAM-1, induz a apoptose da célula alvo. Alternativamente, a molécula de ligação é uma molécula de anticorpo que liga-se seletivamente à superfície celular HLA-DR/DP e/ou IgM de superfície.

O ICAM-I também é denominado CD54, mas para o propósito deste pedido, o ICAM-I será usado.

As moléculas de ligação podem ser derivadas de anticorpos e fundamentadas na estrutura de anticorpo [Clackson T et al., Nature. 1991 Aug 15;352(6336):624-8, Marks JD et al., J Mol Biol. 1991 Dec 5;222(3):581-97] que foi usado extensivamente em muitas bibliotecas, mas as moléculas de ligação também podem ser derivadas de outras estruturas moleculares, tal como uma estrutura de fíbronectina [Weng S et al., Proteoinics. 2002 Jan; 2(l):48-57] e uma estrutura de proteína A [Nord K, et al., Nat Biotechnol 1997 Aug;15(8):772-7, Hogbom M et al., Proc Natl Acad Sci USA. 2003 Mar 18;100(6):3191-6]. Cada uma destas estruturas pode ter suas vantagens dependendo da aplicação e a estrutura de anticorpo, como um exemplo, pode ser suado vantajosamente para a criação de variabilidade indistinguível da variabilidade natural.

A estrutura básica do anticorpo, uma estrutura mais comumente usada, é muito bem entendida. Em princípio, uma estrutura de armação que compreende os filamentos beta ordenados em duas chapas apresenta uma série de arcos variáveis, as denominadas Regiões de Determinação Complementares (CDRs) que tem a capacidade de ligar às moléculas de antígeno. Embora os anticorpos possam variar na estrutura da estrutura, uma variabilidade mais extensiva é vista nos CDRs. A grande variabilidade entre os anticorpos é a base para a sua capacidade de interagir, de uma maneira específica, com, em princípio todos os tipos de estruturas moleculares. Devido a esta capacidade, os anticorpos foram usados extensivamente para a geração de ligadores específicos com aplicabilidade dentro da pesquisa, diagnóstico/prognóstico de doença e como agentes terapêuticos específicos para estruturas de alvo definidas [Borrebaeck CA and Carlsson R, Curr Opin Pharmacol. 2001 Aug; l(4):404-8].

Outras, moléculas de ligação que não de anticorpo úteis nesta invenção são aquelas tendo estruturas de estrutura com um grau alto de estabilidade ainda permitindo que a variabilidade seja introduzida em certas posições. Um exemplo de uma outra molécula de ligação é um domínio de fibronectina e um domínio de proteína grande 58 aminoácidos que tolera a variabilidade. Também existem outras estruturas moleculares que permitem algum grau de variação. Tais exemplos incluem moléculas de classe I e II de complexo de histocompatibilidade principal (MHC) e recentemente uma nova classe de moléculas denominadas defensinas foram identificadas serem similares em estrutura básica enquanto ainda abriga variabilidade de seqüência extensiva entre os membros da família do gene indicando que estes são adequados como estruturas para abrigar diversidade molecular. Além disso, os ligandos naturais, por exemplo, LFA-I no caso de ICAM-I como uma molécula alvo ou variantes recombinantes destes, podem constituir moléculas de ligação específicas para induzir a apoptose em células alvo.

Além disso, a molécula de ligação pode ser qualquer molécula que liga-se seletivamente ao ICAM-I de superfície celular de uma célula alvo e, na ligação, induzindo a apoptose da célula alvo.

A molécula de ligação é, preferivelmente, uma molécula de anticorpo. Em uma forma de realização, o antígeno de superfície celular é ICAM-1. A presente avaliação recuperou um anticorpo (BI 1) específico para ICAM-I - um receptor não previamente associado com a apoptose e propriedades sinalizadoras negativas não atribuídas em células.

A identificação de ICAM-I como uma molécula indutora de apoptose foi um resultado direto da avaliação sendo projetada para isolar as especificidades para todos os receptores de superfície diferencialmente expressados entre células alvo e não alvo, irrespectivos de e sem conhecimento anterior de sua identidade respectiva. A morte celular induzida por ICAM-I foi verificada como um processo apoptótico ativo que envolveu a despolarização de membrana mitocondrial. A despolarização da membrana mitocondrial foi previamente descrita tanto para a apoptose dependente de capas quanto para a independente de caspase (Nagy et al. J Mol Med 2003;81:757-65.).

As presentes descobertas ainda indicam que o epítopo ligado pelo anticorpo B11 é expressado no tecido pelo linfoma B de origem diferente e é super-regulado em certas células de linfoma B em comparação com os leucócitos do sangue periférico restante. Importantemente, além das células de linfoma B também as células de carcinoma que expressam ICAM-I sofreram apoptose quando submetidas ao anticorpo Bll específico de ICAM-1 in vitro (ver o Exemplo 6).

Os estudos prévios demonstraram expressão restrita de ICAM- 1 em tecidos humanos normais (Smith et al. J Clin Pathol 1990;43:893-900.). O ICAM-I está envolvido na adesão de célula a célula e desempenha um papel importante nas respostas imunes e na inflamação através da ligação ao seu receptor LFA-1. Os anticorpos direcionados ao ICAM-I foram usados para interferir com as respostas imunes patológicas e inflamação. A administração in vivo de um anti-ICAM-1 mAb murino em macacos cimólogos (Cosimi et al. J Immunol 1990;144:4604-12.) ou uso em testes clínicos em pacientes humanos com artrite reumatóide ou pacientes que receberam transplantes de rim também não revelaram nenhuma toxicidade evidente (Kavanaugh et al. Arthritis Rheum 1994;37:992-9; Haug et al. Transplantation 1993;55:766-72.)·

A nova descoberta que o alvejamento de ICAM-I pode levar à apoptose demonstra a possibilidade de usar moléculas de ligação específicas de ICAM-1, tais como anticorpos para o tratamento de cânceres de origens diferentes contanto que estes expressem o antígeno.

Com base em sua expressão de ICAM-1, tipos de câncer que podem ser potencialmente tratados com um anticorpo anti-ICAM-1 indutor de apoptose, tal como Bll inclui: linfoma B, mieloma (Huang et al. (1993) Hybridoma 12 p661-75; Huang et al, (1995) Câncer Res 55 p610-6; Smallshaw et al., (2004) J Immunother 27 p419-24), câncer gástrico (Maruo et al., (2002) Int J Câncer 100 p486-90), câncer de mama (Rosette et al., (2005) Carcinogenesis 26 p943-50), câncer de fígado (Sun et al., (1999) J Câncer Res Clin Oncol 125 p28-34), câncer de pulmão (Grothey et al., (1998) Br J Câncer 77 p801-7 ), melanoma (Wang et al., (2005) Int J Câncer 27 p419-24), câncer de bexiga (Roche et al., (2003) Thromb Haemost 89 1089- 97) e câncer de próstata (Aalinkeel et al., (2004) Câncer Res 64 p5311-21). A expressão de ICAM-I também foi identificada na metástase tumoral como demontrado por (Maruo et al., 2002), (Rosette et al., 2005), (Sun et al., 1999), (Grothey et al., 1998), (Aalinkeel et al., 2004) indicando a possibilidade de intervir nos processos de metástase usando-se um anticorpo específico de ICAM-1.

Em uma outra forma de realização, o antígeno de superfície celular é HLA-DR/DP.

O HLA-DR/DP está normalmente presente em, por exemplo, células B e podem ser encontrados super-regulados em células de linfoma B.

Até hoje, três anticorpos monoclonais específicos de HLA-DR diferentes entraram nos ensaios de fase clínica. A adição mais recente que é o IgG4 totalmente humano 1D09C3, que foi isolado a partir de uma biblioteca de fago simples similarmente dimensionada em comparação com n-CoDeR®, mas usando-se panning de fase sólida em antígeno purificado (Nagy et al. Nat Med 2002;8:801-7.).

Na presente invenção, um novo anticorpo humano (Β 1) direcionado contra HLADRTDP que rapidamente e com potência alta induz a apoptose em uma multitude de linhas de células de linfoma B foi identificado, desse modo, demonstrando que o HLA-DR/DP é ligado à indução de apoptose em uma célula alvo.

O anticorpo B1 ligado a uma multitude de linhas de célula de linfoma B de origem diferente (ver Exemplo 1 e tabela 1) e foi mostrado para induzir a apoptose em células que expressam o antígeno de HLA-DR/DP. Além disso, o anticorpo Bl mostrou uma potência mais alta do que o Rituximab quando testado na linha celular de linfoma B de Raji. Isto foi particularmente evidente, quando o formato de IgG4 do anticorpo Bl foi usado (Figura 8).

A partir dos dados obtidos, este anticorpo tem características adequadas para o tratamento de HLA-DR/DP que expressa as células de linfoma B. Além disso, similar ao alvejamento de Artrite Reumatóide e SLE por Rituximab, o anticorpo B1 pode mostrar eficácia na eliminação de células B ativadas em distúrbios quando células B que expressam HLA-DR/DP são nocivas.

Ainda, em uma outra forma de realização, o antígeno de superfície celular é IgM de superfície.

O IgM em sua forma livre existe como uma estrutura pentamérica grande, cujo peso molecular mais alto tende a confiná-lo dentro de vasos sangüíneos.

O IgM monomérico pode ser encontrado nas paredes celulares de linfócitos B e funciona como um receptor de anticorpo para o reconhecimento do antígeno.

O anticorpo C11 da invenção, na ligação ao IgM de superfície, expressado nas células de linfoma B, induz a apoptose de uma maneira rápida e eficiente (ver Exemplo 1 e tabela 1). Em contraste com os anticorpos anti- IgM de idiotipo específico usado a clínica para o tratamento de linfoma B no anticorpo C11 liga-se a um epítopo não polimórfico expressado nas células B a partir de doadores diferentes e é, desta maneira, adequado para o tratamento de pacientes que sofrem de linfoma B irrespectivo do idiotipo de linfoma B.

Notavelmente, a molécula atuadora, por exemplo, o anticorpo anti-IgM também pode ser qualquer tipo de molécula de ligação específica que causa a apoptose em células que expressam IgM de idiotipos diferentes.

As cinéticas de apoptose induzida por B1, B11 e C11 IgG foram rápidas, com eficácia máxima sendo já observada após 3 horas em algumas linhas celulares. A função realizadora rápida é importante para a eficácia terapêutica assim como esta minimiza o risco de evasão de tumor resultando de, por exemplo, perda de expressão de antígeno de tumor (Uyttenhove et al. J. Exp. Med. 1983;157:1040-52; Kennedy et al. Br J Haematol 2002;119:412-6) ou mutação de epítopo (Weiner et al. J Immunol 1989;142:343-51; Bai et al. J. Clin. Invest. 2003;111:1487-96), e limita potencialmente a duração do tratamento e efeitos colaterais (Robert et al. Lancet Oncol 2005;6:491-500.).

Preferivelmente, a célula alvo é uma célula imune ou epitelial e, vantajosamente, cuja célula imune é um linfócito B.

Convenientemente, a célula alvo está associada com uma doença. Preferivelmente, a doença é selecionada do grupo que consiste de: câncer; doenças auto-imunes incluindo, mas não restritas a artrite reumatóide e SLE, distúrbios inflamatórios agudos e crônicos, sepse e doença infecciosa incluindo, mas não restrita a HIV.

Vantajosamente, a doença é um câncer selecionado de linfoma (leucemia, mieloma), câncer gástrico, câncer de mama, câncer de fígado, câncer de pulmão, melanoma, câncer de bexiga, câncer corióide, câncer pancreático, câncer de cólon e câncer de próstata.

Como definido nas seções de definição deste pedido, a frase, molécula de anticorpo, é usada por conveniência e abrange, entre outras coisas, anticorpos, fragmentos de anticorpo e derivados de anticorpo.

Convenientemente, a molécula de anticorpo é um IgG. O IgG pode ser qualquer um de IgGi, IgG2, IgG3 ou IgG4, mas preferivelmente qualquer um de IgGi e IgG^ A molécula de anticorpo é, preferivelmente humanizado ou humano.

Convenientemente, a molécula de ligação ou molécula de anticorpo da invenção tem a seqüência de qualquer um de seqüências de região variável de Figuras de 9 a 11 ou homólogos funcionalmente equivalentes destes.

Em uma forma de realização da invenção a molécula de ligação ou molécula de anticorpo tem as seqüências de região variável da Figura 9 ou homólogos funcionalmente equivalentes destes.

Em uma outra forma de realização da invenção, a molécula de ligação ou molécula de anticorpo tem as seqüências de região variável da Figura 10 ou homólogos funcionalmente equivalentes destes

Ainda, em uma outra forma de realização da invenção, a molécula de ligação ou molécula de anticorpo tem as seqüências de região variável da Figura 11 ou homólogos funcionalmente equivalentes destes.

Em um quarto aspecto da invenção é fornecida um ácido nucleico tendo uma seqüência de nucleotídeo que codifica uma molécula de ligação ou uma molécula de anticorpo como reivindicado em qualquer reivindicação prévia.

Convenientemente o ácido nucleico tem a seqüência de nucleotídeo de qualquer uma das figuras de 9 a 11. Em um quinto aspecto da invenção, é fornecido o uso de uma molécula de ligação ou molécula de anticorpo como definido no primeiro ou segundo aspecto da invenção no diagnóstico e/ou tratamento e/ou prevenção de uma doença que requer a destruição de uma célula alvo. Também é fornecido o uso de uma molécula de ligação ou molécula de anticorpo como definido no primeiro ou segundo aspecto da invenção na fabricação de um medicamento para o tratamento e/ou prevenção de uma doença que requer a destruição de uma célula alvo.

Em uma forma de realização preferida, a molécula de ligação é uma molécula de anticorpo.

Convenientemente, a doença a ser tratada é selecionada do grupo que consiste de: câncer; doenças auto-imunes incluindo, mas não restritas a artrite reumatóide e SLE, distúrbios inflamatórios agudos e crônicos, sepse e doença infecciosa incluindo, mas não restrita a HTV.

Vantajosamente, a doença a ser tratada é câncer selecionado de linfoma (leucemia, mieloma), câncer gástrico, câncer de mama, câncer de fígado, câncer de pulmão, melanoma, câncer de bexiga, câncer corióide, câncer pancreático, câncer de cólon e câncer de próstata.

Em uma forma de realização da invenção, a molécula de ligação ou molécula de anticorpo liga-se especificamente ao ICAM-I e/ou tem a seqüência da Figura 10 e é usado em reação com as doenças listadas acima com relação às doenças listadas acima.

Em uma outra forma de realização da invenção, a molécula de anticorpo liga-se especificamente ao HLA-DR/DP e/ou tem a seqüência da Figura 9 e é usado em relação às doenças de linfoma (leucemia, mieloma), câncer gástrico, câncer de mama, câncer de fígado, câncer de pulmão, melanoma, câncer de bexiga, câncer corióide, câncer pancreático, câncer de cólon e câncer de próstata.

Ainda, em uma outra forma de realização da invenção a molécula de anticorpo liga-se especificamente ao IgM de superfície e/ou tem a seqüência da Figura 11 e é usado em relação às doenças de linfoma (leucemia, mieloma), câncer gástrico, câncer de mama, câncer de fígado, câncer de pulmão, melanoma, câncer de bexiga, câncer corióide, câncer pancreático, câncer de cólon e câncer de próstata.

Em um sexto aspecto da invenção, é fornecida uma composição farmacêutica que compreende uma molécula de ligação ou molécula de anticorpo da invenção e um carreador, excipiente ou diluente farmaceuticamente aceitável.

Em uma forma de realização preferida a molécula de ligação é uma molécula de anticorpo.

Em um sétimo aspecto da invenção, é fornecido um método in vitro de induzir a apoptose em uma célula alvo que compreende as etapas de:

i) fornecer uma ou mais células alvo;

ii) fornecer uma ou mais moléculas de ligação ou moléculas de anticorpo como definido na primeira forma de realização da invenção;

iii) expor as células alvo de (i) às moléculas de ligação ou moléculas de anticorpo de (ii) a fim e induzir a apoptose nas células alvo.

Em uma forma de realização preferida a molécula de ligação é uma molécula de anticorpo.

Preferivelmente, as células alvo fornecidas na etapa (i) são células imune ou células epiteliais. Vantajosamente, as células imunes são linfócitos B.

Convenientemente, as células alvo estão associados com uma doença e em que a doença é selecionada do grupo que consiste de: câncer; doenças auto-imunes incluindo, mas não restritas a artrite reumatóide e SLE, distúrbios inflamatórios agudos e crônicos, sepse e doença infecciosa incluindo, mas não restrita a HIV.

Vantajosamente, a doença é um câncer selecionado de linfoma (leucemia, mieloma), câncer gástrico, câncer de mama, câncer de fígado, câncer de pulmão, melanoma, câncer de bexiga, câncer corióide, câncer pancreático, câncer de cólon e câncer de próstata. Significados de termos usados

O termo "molécula de anticorpo" deve ser usado para referir-se a qualquer um de um anticorpo, um fragmento de anticorpo ou derivado de anticorpo. É pretendido abranger anticorpos do tipo selvagem, anticorpos sintéticos, anticorpos recombinantes ou híbridos de anticorpo, tal como, mas não limitado a, uma molécula de anticorpo modificado de cadeia simples produzido pela apresentação de fago de cadeia leve e/ou pesada de imunoglobulina e/ou regiões constantes ou outras moléculas imunointerativas de ligação a um antígeno em um formato de imuno-ensaio que é conhecido por aqueles habilitados na técnica.

O termo "fragmento de anticorpo" deve ser usado para referir- se a qualquer um de um anticorpo, um fragmento de anticorpo ou derivado de anticorpo. É pretendido abranger anticorpos do tipo selvagem (isto é, uma molécula que compreende quatro cadeias de polipeptídeo), anticorpos sintéticos, anticorpos recombinantes ou híbridos de anticorpo, tais como, mas não limitado a, uma molécula de anticorpo modificado de cadeia simples produzidos pela apresentação de fago de regiões variáveis e/ou constantes de cadeia leve e/ou pesada de imunoglobulina ou outras moléculas imunointerativas capazes de ligar-se a um antígeno em um formato de imunoensaio que é conhecido por aqueles habilitados na técnica.

O termo "derivado de anticorpo" refere-se a qualquer molécula modificada de anticorpo que é capaz de ligar-se a um antígeno em um formato de imunoensaio que é conhecido por aqueles habilitados na técnica, tal como um fragmento de um anticorpo (por exemplo, fragmento Fab ou Fv) ou uma molécula de anticorpo modificada que é modificada pela adição de um ou mais aminoácidos ou outras moléculas para facilitar a ligação dos anticorpos a um outro peptídeo ou polipeptídeo, a uma proteína carreadora grande ou a um suporte sólido (por exemplo, os aminoácidos, tirosina, lisina, ácido glutâmico, ácido aspártico, cisteína e derivados destes, grupos NH2- acetila ou grupos amido de terminal COOH, entre outros).

O termo "molécula de ScFv" refere-se a quaisquer moléculas em que os domínios parceiros Vh e Vl são ligados por intermédio de oligopeptídeos flexíveis.

Os termos "seqüência de nucleotídeo" ou "ácido nucleico" ou "polinucleotídeo" ou "oligonucleotídeo" são usados de maneira intercambeável e referem-se a um heteropolímero de nucleotídeos ou a seqüência destes nucleotídeos. Estas frases também referem-se ao DNA ou RNA de origem genômica ou de origem sintética que podem ser de filamento simples ou de filamento duplo e podem representar o filamento sentido ou anti-sentido, para o ácido nucleico do peptídeo (PNA) ou a qualquer material semelhante a DNA ou semelhante à RNA. Nas seqüências aqui, A é adenina, C é citosina, T é timina, G é guanina e N é A, C, G ou T (U). é considerado que quando o polinucleotídeo é RNA, o T (timina) nas seqüências fornecidas neste é substituído por U (uracila). No geral, os segmentos de ácido nucleico fornecidos por esta invenção podem ser montados a partir de fragmentos do genoma e ligadores de oligonucleotídeo curtos ou de uma série de oligonucleotídeos ou de nucleotídeos individuais, para fornecer um ácido sintético que é capaz de ser expressado em uma unidade de transcrição recombinante que compreende elementos reguladores derivados de um operon microbiano ou viral ou um gene eucariótico.

Os termos "polipeptídeo" ou "peptídeo" ou "seqüência de aminoácido" refere-se a um oligopeptídeo, peptídeo, polipeptídeo ou seqüência de proteína ou fragmento destes e a moléculas de ocorrência sintética ou naturais. Um "fragmento", "porção" ou "segmento" de polipeptídeo é uma extensão de resíduos de aminoácido de pelo menos cerca de 5 aminoácidos, preferivelmente pelo menos cerca de 7 aminoácidos, mais preferivelmente pelo menos cerca de 9 aminoácidos e mais preferivelmente pelo menos cerca de 17 ou mais aminoácidos. Para ser ativo, qualquer polipeptídeo deve ter comprimento suficiente para apresentar atividade biológica e/ou imunológica.

Os termos "purificado" ou "substancialmente purificado" como usado neste indica que o ácido nucleico ou polipeptídeo indicados estão presentes na ausência substancial de outras macromoléculas biológicas, por exemplo, polinucleotídeos, proteínas e outros. Em uma forma de realização, o polinucleotídeo ou o polipeptídeo são purificados, tal que estes constituem pelo menos 95 % em peso, mais preferivelmente pelo menos 99 % em peso, as macromoléculas biológicas indicadas presentes (mas água, tampões, e outras moléculas pequenas, especialmente moléculas tendo um peso molecular menor do que 1000 daltons, podem estar presentes).

O termo "isolado" como usado neste refere-se ao ácido nucleico ou polipeptídeo deparado de pelo menos um outro componente (por exemplo, ácido nucleico ou polipeptídeo) presente com o ácido nucleico ou polipeptídeo em sua fonte natural. Em uma forma de realização, o ácido nucleico ou polipeptídeo é encontrado na presença de (se houver algum) apenas um solvente, tampão, íon ou outro componente normalmente presente em uma solução do mesmo. Os termos "isolado" e "purificado" não abrangem ácidos nucleicos ou polipeptídeos presentes em sua fonte natural.

O termo "recombinante", quando usado neste refere-se a um polipeptídeo ou proteína, significa que um polipeptídeo ou proteína é derivado de sistemas de expressão recombinantes (por exemplo, microbiano, inseto ou mamífero). "Microbiano" refere-se a polipeptídeos recombinantes ou proteínas feitas de em sistemas de expressão bacterianos ou fungicos (por exemplo, levedura). Como um produto, "microbiano recombinante" define um polipeptídeo ou proteína essencialmente isenta de substâncias endógenas naturais e não acompanhadas pela glicosilação natural associada. Os polipeptídeos ou proteínas expressados na maioria das culturas bacterianas, por exemplo, Escherichia coli, serão isentos de modificações de glicosilação; os polipeptídeos ou proteínas expressados em levedura terão um padrão de glicosilação, no geral, diferente daqueles expressados em células de mamíferos.

Os termos "ligação seletiva" e "seletividade de ligação " indica que as regiões variáveis dos anticorpos da invenção reconhecem e ligam os polipeptídeos da invenção exclusivamente (isto é, capazes de distinguir o polipeptídeo da invenção a partir de outros polipeptídeos similares a despeito da identidade, homologia ou similaridade de seqüência encontradas na família de polipeptídeos), mas também podem interagir com outras proteínas (por exemplo, proteína A de Staphylocoeeus aureus ou outros anticorpos em técnicas ELISA) através das interações com seqüências fora da região variável dos anticorpos e, em particular, na região constante da molécula. Os ensaios de avaliação para determinar a seletividade de ligação de um anticorpo da invenção são bem conhecidos e rotineiramente praticados na técnica. Para um debate compreensivo de tais ensaios, ver Harlow et al. (Eds), Antibodies A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory; Cold Spring Harbor, N.Y. (1988), Capítulo 6. Os anticorpos que reconhecem e ligam-se aos fragmentos dos polipeptídeos da invenção também são considerados, contanto que os anticorpos são primeiramente seletivos para, como definido acima, polipeptídeos de comprimento total da invenção. Assim como os anticorpos que são seletivos para os polipeptídeos de comprimento total da invenção, anticorpos da invenção que reconhecem os fragmentos são aqueles que podem distinguir os polipeptídeos da mesma família de polipeptídeos a despeito da identidade, homologia ou similaridade de seqüência inerente encontradas na família de proteínas.

O termo "afinidade de ligação" inclui o significado da força de ligação entre uma molécula de anticorpo e um antígeno.

Pelo termo "célula imune" entendemos qualquer célula que está envolvida em uma resposta imune ou inflamatória do hospedeiro, que inclui, mas não limita-se a células B e células T.

Pelo termo "célula epitelial" entendemos uma célula do epitélio. O epitélio é um tecido composto de uma camada de células. O epitélio pode ser observado o superfície isentas do revestimento interno (por exemplo, endotélio, que reveste o interior dos vasos sangüíneos) ou externos (por exemplo, pele) do corpo.

A camada mais externa da pele é composta de células epiteliais escamosas, como são as membranas mucosas que revestem o interior da boca e de cavidades corporais. Outras células epiteliais revestem as partes internas dos pulmões, o trato gastrointestinal, os tratos reprodutivos e urinários e formam as glândulas exócrinas e endócrinas. As funções das células epiteliais incluem a secreção, a absorção e a proteção. As células epiteliais acomodam-se em uma lâmina basal. Formas de Realização Preferidas

Os exemplos que modalizam certos aspectos preferidos da invenção serão descritos agora com referência As seguintes figuras em que: - Figura 1 - scFv isolado por biopanning de célula total diferencial / vesícula de membrana celular mostra especificidade de célula alvo alta.

Os clones de scFv isolados pela biopanning diferencial foram expressados em células de E. coli TOP IOe incubados com células de Ramos ou Jurkat e (A) clones de scFv expressados para a avaliação primária ou (B) setenta e dois clones de scFv aleatoriamente selecionados e expressados novamente. O scFv ligado foi detectado com anti-His Mab e Ab policlonal Cy5-anti-amundongo. A ligação celular foi detectada em um instrumento FMAT Macroconfocal High Throughput Screening. A ligação celular é descrita intensidade de fluorescência média a células de Ramos alvo (eixo Y) vs. célula Jurkat não alvos (eixo X). (C) Ligação de sete clones de scFv únicos à células de Ramos (barras cheias) e células de Jurkat (barras abertas). Um scFv controle (ctrl) não liga-se a qualquer uma das células. Figura 2. Indução de apoptose de scFv anti-Ramos.

As células de Ramos de linfoma B foram seqüencialmente incubadas com scFv anti-Ramos, anti-His mAb e Ab policlonal anti- camundongo em gelo (com lavagem intermitente para remover o excesso de anticorpo não ligado) e foram incubados em uma atmosfera umidificada de 5 % de CO2 a 37° C por 24 horas. As células foram então coletadas e submetidas ao tingimento combinado Annexin V-AF488 (AV) e iodeto de propídio (PI). As células foram registradas com viáveis (AV- PI-, círculos cheios Fig. 2C), apoptóticas precoces (AV+ PI-, triângulos abertos Fig. 2C) ou apoptóticas/necróticas posteriores (AV+ PI+, diamantes abertos Fig. 2C), com base em positividade diferencial para o tingimento com AV e PI (definido pelos portões quadrados na Fig. 2B). os resultados são apresentados plotagem (A) Forward Scatter (FSC-Height) contra Side Scatter e (B) AV (FL-I) contra PI (FL-3). O efeito titulável de scFv Bl e Fl também é apresentado (C). Os sete clones de scFv únicos foram incubados com células de linfoma B de (D) Ramos ou (E) Raji a 37° C por 24 horas em várias concentrações e o efeito na indução da apoptose estudada. Três scFv; Bl5Bll e Cl 1, mostram atividades tituláveis com relação a ambas as linhas celulares, desse modo, a apoptose induzindo a capacidade de scFv B10, ClO e G12 ser restrito às células de linfoma B de Ramos.

Figura 3. Especificidades de anticorpos isolados incluem HLA-DR/DP, IgM e ICAM-I.

A) 50 a 600 χ IO6 células de linfoma B de Raji foram lisadas com o detergente não iônico Triton X-IOO a 0,5 % v/v e imunoprecipitado com 100 pg do anticorpo do formato de IgGl totalmente humano de Bl (linha 1) e Bll (linha 2) seguido pela reticulação com a Proteína A Sepharose. Os Iisados de célula de linfoma B de Ramos, de 50 χ IO6 células, foram usados para a precipitação de 20 μg de Cll (linha 3). As faixas específicas de anticorpo foram cortadas e submetidas à digestão tríptica e analisadas por MALDI-TOF.

Β) A ligação de Bl IgG, Bll IgG e Cll IgG às células de linfoma B é especificamente bloqueada pela pré-incubação com anticorpos anti-HLA-DR/DP, anti-ICAM-1 ou anti-IgM, respectivamente .

Para confirmar as identidades de antígeno MALDI-TOF recuperado de clones de anticorpo BI, Bll e Cl 1, estudos de bloqueio com anticorpos comercialmente disponíveis foram realizados e analisados pela citometria de fluxo. As células foram pré-bloqueadas com excesso molar de 10 vezes (em comparação com o anticorpo humano) de anticorpos de bloqueio comparado por espécies por 1 hora, seguido pela adição de qualquer um dos clones de anticorpos humanos isolados. Após 30 minutos, as células foram lavadas e a ligação de anticorpo humano às células foi detectada por IgG anti-humano de cabra conjugado com PE (Caltag Laboratories, Burlingame, CA, USA). Os anticorpos de bloqueio no estudo foram; para BI, anti-HLA DR monoclonais de camundongo (Sigma, clone HKl 4) ou anti- CD40 (Beckton Dickinson, clone 5C3); para Bl 1, anti-ICAM-1 policlonais de coelho (Abcam, ab7815-250) ou anti-CD22 (Abram, ab25135-100); para Cl 1, anti-IgM policlonais de cabra (Zymed, South San Francisco, CA, USA, 62- 7500) ou anti-IgG (Zymed, 62-8400).

Figura 4. ICAM-I é um receptor de superfície celular associado com o linfoma B capaz de mediar a morte celular programada.

A. 2 μ^πιΐ de Bll ou IgGi anti-FITC-8 (controle) foi adicionado a 4 χ IO5 células de linfoma CL-Ol B, incubado por 2 horas em gelo, seguido pela adição de 10 μg/ml de anticorpo Fc anti-humano de cabra Fab'2 secundário. As células foram incubadas a 37° C por 6 horas e o efeito da incubação de anticorpo foi determinada por dois ensaios de apoptose independentes. As células foram tingidas por AV/PI (painel superior),similarmente como descrito acima ou pela incubação com 5 μ^ιηΐ do reagente de despolarização de membrana mitocondrial JC-I por 30 minutos em temperatura ambiente (painel inferior). A indução da apoptose é detectável pela diminuição na taxa de intensidade de fluorescência vermelha (eixo y)/verde (eixo x). (B) Seção de Histologia que mostra a ligação representativa de anticorpo Bll ao tecido de linfoma Β. O tecido crio- conservado obtido a partir de um paciente com linfoma de célula B grande anaplástico foi tingido com anticorpo de scFv (controle) Bll ou FITC-8. A ligação de anticorpo foi detectada com DAB (cor marrom). A figura inserida mostra o tingimento com o scFv controle. (C) As células de Ramos pré- rotuladas com CD45-PerCp-Cy5.5 mAb foram misturadas com PBMCs derivados do doador e as populações celulares diferentes foram tingidas com anticorpos específicos de CD conjugados com fluorocromo e Bll IgGI pré- rotulado com Alexa Flour 647 Zenon ou FITC-8 IgGI controle. A ligação de IgG Bl 1 às populações celulares diferentes foi registrada no canal FL4. Figura 5. Afinidades de IgG Bl e IgG Bll à células de linfoma B .

As células de Raji (painéis da esquerda, IgG BI) ou células de Ramos (painéis da direita, IgG Bl 1) foram incubadas com quantidades crescentes de proteína IgG B1 radioiodado ou proteína IgG Bll radioiodado na presença ou ausência de 0,2 mg/ml da proteína de IgG não rotulada correspondente. A ligação específica foi determinada pela subtração da ligação na presença de proteína de competição não rotulada da ligação total. A quantidade de IgG Bl ligado ou proteína de IgG Bll aumentada com quantidades crescentes de proteína de IgG livre com a ligação saturável sendo atingida em -30 nM IgG Ble-I nM de IgG Bl 1, respectivamente (painéis superiores). A análise de plotagem de Rosenthal-Scatchard (painéis inferiores) demonstrou uma constante de dissociação de ~3 nM com 400.000 locais de ligação funcional por célula de Raji por IgG Ble uma constante de dissociação de -0,3 nM com 47.400 locais de ligação funcionais por IgG Bll (células de Raji).

Figura 6 - Ligação de B1, B11, C11 IgG1 às linhas celulares tumorais de origem diferente.

A distribuição de antígeno de antígenos alvejados pelos anticorpos B1, B11 e C11 em linhas celulares de carcinoma foi investigada pela citometria de fluxo. Os histogramas mostram a ligação de Rituximab anti-CD20 Mab (picos de maioria frontal da primeira linha), B1 IgG1 (picos da segunda linha), B11 IgG1 (picos da terceira linha) ou C11 IgG1 (picos da maioria da parte posterior da quarta linha) ao carcinoma de mama MCF-7, carcinoma pancreático de HPAC, carcinoma de próstata PC-3, carcinoma colorretal LS174 T e células de leucemia monocítica THP-I como indicado.

Figure 7 — indução de apoptose de Bll IgGi em células de carcinoma

A linha celular de carcinoma de próstata PC-3 foi desenvolvida em meio de Desenvolvimento Completo (RPMI 1640, suplementado com 10 % de FCS, 10 mM de HEPES e 2 mM de LGlutamina) à 80 % de confluência em uma placa de 6 reservatórios. A linha celular de carcinoma de próstata DU145 foi desenvolvida em MEM com sais de Earl, suplementado com 10 % de FCS, 1 mM de piruvato de sódio e 1 mM de aminoácidos não essenciais e o derivado de uma linha celular de melanoma MDA MB 435 foi desenvolvido em DMEM suplementado com 10 % de FCS.

Para os ensaios de apotose, as células foram lavadas em PBS e serialmente diluídas Bll IgGi (ou Bl IgGi, Trastuzumab ou controle de anticorpo negativo para os controles) foi adicionado a reservatórios individuais e a ligação foi deixada durante uma incubação de 1 a 2 horas a 4o C. As células foram lavadas e o meio de desenvolvimento completo foi adicionado, contendo anticorpo de reticulação, Fab'2 anti-Humano de cabra Fab'2, em 10 μg/ml. As células foram incubadas em uma atmosfera umidificada com 5 % de CO2 a 37° C, for 16 a 24 horas. As células foram coletadas por tripsinação e tingidas com Alexa Fluor 488-Annexin V (AF488- AV) e iodeto de propídio (PI), de acordo com as instruções do fabricante. A porcentagem de células apoptóticas foi determinada pela fórmula: % de células apoptóticas = 100 - % de AF488 - AV/PI -/-.

A) As plotagens de perfil mostram a distribuição relativa de células PC-3 como uma função de Annexin V e Iodeto de Propídeo seguindo positivamente a incubação como acima com 2 μg/ml de IgG B11 ou IgG B1.

Β) O Gráfico de barras mostra a porcentagem média de células PC-3 apoptóticas seguindo a incubação com Bll IgG1 serialmente diluído ou 20 μg/ml de Bl IgG1.

C) O Gráfico de barras mostra a porcentagem média de células MDA MB 435 apoptóticas seguindo a incubação sem nenhum anticorpo de controle, 10 μg/ml de controle de anticorpo negativo, Bll IgG1 serialmente diluído ou 10 μg/ml de Trastuzumb IgG1.

D) O Gráfico de barras mostra a porcentagem média de células DUl 45 apoptóticas seguindo a incubação sem nenhum anticorpo de controle, 10 μg/ml de controle de anticorpo negativo, Bll IgGi serialmente diluído ou 10 μg/ml de Trastuzumb IgG1

Figura 8. Bl IgG1 e Bl IgG4 induzem a citotoxicidade celular direta em células de linfoma B de Raji na ausência de reagentes de reticulação.

As células de Raji foram incubadas com Bl IgG1, Bl IgG4, Rituximab IgG1 ou CT-17 IgG1 controle em 20, 6,7 ou 2,2 μg/ml por 24 horas. As células foram coletadas e a viabilidade foi determinada como a porcentagem de Annexin V e de células negativas duplas de Iodeto de Propídio.

Figura 9 - Seqüências de VH e VL (nucleotídeo e aminoácido) para o anticorpo Bl

Figura 10 - Seqüências VH e VL (nucleotídeo e aminoácido) para o anticorpo Bll Figura 11 - Seqüências VH e VL (nucleotídeo e aminoácido) para o anticorpo Cll

Exemplo 1 - Seleção e Avaliação (Biopanning) de anticorpos que induzem apoptose com especificidade com relação aos receptores de superfície celular associados com linfoma B Cultura celular

As linhas celulares usadas neste estudo foram obtidas a partir de ATCC (Manassas, VA, USA) ou Deutsche Sammlung von Mikroorganismen e Zellkulturen (DSMZ) GmbH (Braunschweig, Germany) e foram cultivadas em meio RPMI 1640 suplementado com 10 % de FCS5 2 mM L-Glutamina, 10 mM HEPES e 1 mM Na piruvato (todos a partir de Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) a não ser de outra maneira estabelecida. A linha celular de leucemia T Jurkat (clone E6-1, TIB-152, ATCC), as linhas celular linfoma B DOHH-2 (ACC47, DSMZ), SC-I (ACC558, DSMZ), WSU-NHL (ACC58, DSMZ), JVM-2 (ACC12, DSMZ), Jeko-I (ACC553, DSMZ desenvolvido em 20 % de FCS), Rec-I (ACC 584, DSMZ), SP-53 (Daibata et al. Câncer 1989;64:1248-53), RL (CRL-2261, ATCC), Granta 519 (DSMZ), NCEB-I (Saltman et al. Blood 1988;72:2026-30), BJAB (Menezes et al. Biomedicine 1975;22:276-84), Ramos (CRL-1596, ATCC), Raji (CCL- 86, ATCC), Daudi (CCL-213, ATCC), CL-Ol (Cerutti et al. J Immunol 1998;160:2145-57), o pré linfoma de célula B ΚΜ-3/Reh (CRL-8286, ATCC) e o mieloma múltiplo MC/CAR (CRL-8083, ATCC, desenvolvido em IMDM (Invitrogen) suplementado com 20 % de FCS) foram todos livres de micoplasma e cultivada na atmosfera umidificada a 37 °C, usando uma atmosfera de 5 % de CO2. As células foram mantidas a 2 χ IO5-I χ IO6 células/ml.

Preparação da vesícula da membrana celular Jurkat

As células Jurkat foram coletadas pela centrifugação a 300 χ g por 15 minutos em baldes de 500 ml (Coming Inc. Life Sciences, New York, USA), lavado em Dulbecco's PBS (Invitrogen), e recolocado em suspensão em tampão A (1 mM NaHCO3, 1,5 mM MgAc, pH 7,4). A concentração celular foi aproximadamente 5x107 Jurkat células/ml (5x109 células em 100 ml de tampão A).

O rompimento celular foi atingido pelo tratamento de choque hipo-osmótico (Tampão A) em gelo por 10 a 30 minutos e cavitação de nitrogênio subsequente em uma bomba de cavitação de Nitrogênio (Parr Instrument Company, Moline, IL, USA). As células foram mantidas em uma pressão constante de 40 bar (4.000 kPa) por 15 minutos a 0 °C.

As células rompidas foram coletadas em um tubo Sarstedt de 250 ml (Sarstedt AG & Co, Niimbrecht, Germany) contendo 500 μl de 0,5 M EDTA para produzir uma concentração de EDTA final de 2,5 mM. A adição de EDTA evita agregação de vesículas da membrana. O homogeneizado (100 ml) foi divido entre tubos de rotor de parece espessa de Beckman de 4 χ 25 ml (Beckman Coulter, Inc., Fullerton, CA, USA), que foram centrifugados por 10 minutos a 1900 χ g (4.000 rpm em uma rotor Sorvall SS34) a 4 ºC para remover as células, núcleos, e mitocôndrias pesadas não quebradas.

O sobrenadante foi coletado e o material granulado foi recolocado em suspensão a 25 ml de 1 mM de tampão NaHCO3 contendo 1 mM EDTA e foi centrifugado novamente (recuperação adicional de membranas Jurkat bruto granulado). As membranas Jurkat foram unidas com membranas a partir da primeira centrifugação. Os sobrenadantes contendo vesículas da membrana Jurkat brutas foram ultra centrifugadas usando um rotor tipo 45Ti Beckman a 40.000 rpm (aproximadamente 200.000 χ g) por 2,5 h a 4°C. Os sobrenadantes foram vertidos e o tampão remanescente foi removido colocando-se a borda do tubo contra um tecido (isto é Kleenex™)

O grânulo de membrana bruto foi transferido para um homogeneizador Dounce com a ajuda de uma barra metálica e foi recolocado em suspensão a 2,5 ml de tampão HES (10 mM Hepes, 1 mM EDTA, 0,25 M de sacarose, pH 7,4) por diversos golpes cuidadosos no homogeneizador. Uma concentração de suspensão de membrana equivalente de 2 x 10"9 células/ml contendo 80 a 100 mg de proteína foi, desta maneira, atingida. Seleção de fagos Abs pelo biopanning de competição de vesícula de membrana de célula/célula total

Aproximadamente 2 x 10"13 partículas de fago foram pré- aquecidas a 37 °C por 15 minutos com mistura intermitente, centrifugada por minutos a 14.000 x g para remover os precipitados, e o sobrenadante foi transferido para um tubo Eppendorf fresco. Leite seco desnatado foi adicionado a uma concentração final de 2 % (p/v). As preparações de vesícula de membrana Jurkat derivado a partir de 2 x 10"9 células (seleção de 1 ciclo; 2 e 3 seleções de ciclo de 2 x 10 células) foram descongeladas em gelo, e foram misturadas com as partículas bloqueadas de fago. A mistura foi incubada por 15 minutos em gelo.

5 x 10 (5 x 10 2° e 3° ciclos) as células de Ramos foram coletadas pela centrifligação a 1.200 rpm por 6 minutos a 4 °C. O sobrenadante foi descartado e as células de Ramos foram recolocadas em suspensão na mistura de vesícula de membrana leite-fago-Jurkat. A suspensão foi incubada a 10 °C sob rotação extremidade sobre extremidade lenta por 4 h.

A mistura de vesícula/fago de membrana célula/célula foi transferida para um tubo Falcon de 15 ml (BD Biosciences, Bedford, MA, USA), contendo 0,5 ml 100 % (azul de tripano tingido) Ficoll-Paque PLUS (Amersham Biosciences, Uppsala, Sweden) na parte inferior, e 9,5 ml 40 % (v/v) de Ficoll sobreposto em 2 % (p/v) BSA/PBS (Ficollpillar). O tubo foi centrifugado a 1.500 rpm por 10 minutos a 4 °C. O tubo foi removido da centrifuga e o tubo revestido foi atarraxado e hermeticamente selado.

A "extremidade" da parte inferior do tubo Falcon contendo 100 % de Ficoll foi cortado usando um cortador de charuto. Deste modo, muito material de densidade alta incluindo chapas de vesícula de membrana e núcleos celulares foram eliminados do tubo. O tubo revestido foi então aberto cuidadosamente interrompendo o vácuo dentro do tubo e permitindo que o líquido seja expelido ás gotas através da abertura na (corte) parte inferior do tubo.

A suspensão celular coletada foi lavada uma vez em PBS para remover o excesso de Ficoll. O grânulo foi recolocado em suspensão 1 ml de PBS (não realizado seguindo a lavagem final) e a suspensão foi recarregada na parte superior de um pilar Ficoll fresco e o procedimento de lavagem foi repetido (duas vezes em 2 e 3 ciclos).

Os fagos foram eluídos a partir de células pela adição de 150 μl de 76 mM de ácido cítrico (pH 2,5) em PBS seguido pela incubação a temperatura ambiente por 5 minutos. A mistura foi neutralizada pela adição de 200 μΐ de 1 M Tris-HCl, pH 7,4. Os sobrenadantes contendo fagos eluídos foram salvos seguindo a granulação de células a 300 x g por 5 minutos. A eluição adicional de fagos foi recolocada em suspensão e incubação do grânulo celular em 1 ml de tripsina a RT por 10 minutos.

A seguinte inativação com 40 μΐ de 1 mg/ml de aprotinina, as células foram centrifugadas e o sobrenadante contendo fagos eluídos foram salvos. Os fagos eluídos foram usados para infectar Escherichia coli HB 101 F "e as bactérias foram colocadas em meio TB contendo antibióticos apropriados e glicose. As colônias bacterianas foram contadas, raspadas a partir de placas, e usadas como inóculos para o próximo ciclo de panning. Conversão para o formato seFv, expressão seFv, purificação, e análise de ligação celular

O grupo de fagomida obtido seguindo três ciclos de seleção foi digerido com EagI para remover o gene III. O vetor resultante foi ligado novamente. Os vetores contendo fragmentos de gene III não cortado religado foram linearizados pela digestão com enzima EcoRI. O grupo de vetor scFv desta maneira gerado foi usado para transformar células de E. coli TOP 10 essencialmente como descrito anteriormente (Soderlind et al. Nat Biotechnol 2000;18:852-6.)·

As bactérias foram colocadas em placas de ágar de 500 cm grandes e clones individuais foram selecionados, transferidos para placa de 96 reservatórios, e expressado em meio TB por cultura durante a noite a 37 0C, 220 rpm usando um sistema automatizado (Hallborn Biotechniques 2002;Suppl:30-7.). Os fragmentos scFv recombinantes foram produzidos em meio TB contendo antibióticos apropriados.

Para avaliação primária da ligação de clone scFv para células de Ramos alvos e células não alvos Jurkat, 5.000 células Ramos ou Jurkat foram incubadas com 960 clones de scFv, derivados a partir do 3o ciclo de seleção e produzido como descrito acima. As células foram incubadas com 0,5 μg/ml de anti-6xHis mAb (R&D Systems, Minneapolis, MN, USA) e 0,7 15 μg /ml de reagente anti-camundongo de cabra conjugado com Cy5 (Amersham Biosciences). A ligação celular foi analisada em um instrumento 8200 Cellular Detection System Fluorescence Macroconfocal High Throughput Screening (FMAT) (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA).

A seguinte avaliação primária, setenta e dois clones bacterianos foram selecionados aleatoriamente (isto é irrespectivo da reatividade de células alvo vs. células não alvos na avaliação primária) para sequenciamento de DNA como descrito previamente (Soderlind et al. Nat Biotechnol 2000;18:852-6.) (Soderlind et al., 2000). Para avaliação de ligação de superfície celular por citometria de fluxo, As células Ramos e Jurkat (ambos adicionados a 2 χ IO5 células por teste) foram incubadas com clones scFv individuais em uma concentração de 2 a 10 μg/ml em PBS (Invitrogen) contendo 0,5 % p/v BSA (DPBS-B) por 1 h.

As células foram lavadas pela centrifugação a 300 χ g por 6 minutos. As células foram então incubadas com CD19 mAb conjugado com FITC e CD3 mAb (BD) conjugado com PE habilitando identificação subsequente de células alvos e não alvos, respectivamente. A detecção de ligação scFv foi atingida pela incubação com RPE-Cy5-estreptavidina (Dako Cytomation, Glostrup, Denmark) seguindo incubação com anti-6xHis mAb biotinilado. As células foram incubadas com reagentes secundários e terciários por 40 minutos, e 15 minutos respectivamente. Todas as incubações foram realizadas em gelo usando soluções geladas. Panning de vesícula de membrana célula/célula total diferencial

O presente estudo utiliza um protocolo de panning novo para isolar anticorpos que alvejam diferencialmente antígenos expressados na sua configuração de superfície celular natural. Seguindo três ciclos de biopanning de competição, usando células de linfoma B de Ramos total e vesículas da membrana derivadas a partir de células de leucemia T Jurkat, fago scFv recombinante foram isolados. Este foram convertidos para scFv solúvel e expressado em células de E. coli TOP 10.

Os scFv recombinantes foram incubados com células totais alvos (Ramos) ou não alvos (Jurkat) e examinados por ligação celular. A especificidade por antígenos celulares alvos dos clones de anticorpos foi notável, visto que os clones expressados 482 scFv foram mostrados ligar seletivamente por células alvos Ramos em intensidades que variam de fraca a muito forte (Fig IA). Apenas dois clones foram identificados tingindo fracamente as células Jurkat não alvo (Fig IA).

A seguir, determinamos a diversidade de genótipo de fago isolado que apresentou scFv. Setenta e dois clones scFv foram aleatoriamente selecionados (isto é irrespectivo de tropismo de ligação como determinado na avaliação primária) por sequenciamento de DNA.

Os clones foram simultaneamente re-expressados e re- avaliados por especificidade de células alvos (Ramos vs. Jurkat) pela tecnologia FMAT, como descrito (Fig 1B). Sete diferentes genótipos de anticorpos foram identificados, como determinado pelas suas seqüências CDRH3 e CDRL3 diferentes (dados não mostrados).

A alta especificidade de anti-Ramos scFv foi confirmada por três cores de análise de citometria de fluxo, seguindo incubação com números iguais das células Ramos e Jurkat e detecção de ligação scFv por meio de anticorpo anti-tag (Fig. 1 C).

As células alvos e não alvos foram definidas pela expressão CD19 e CD3, respectivamente, usando anticorpos monoclonais específicos de CA conjugados com fluorocromo. Os sete clones scFv genotipicamente únicos mostram intensidades de ligação alta ou variável por células de Ramos alvos, mas não ligando-se a células de Jurkat não alvos, ou em comparação com o controle scFv negativo. Ensaio de Apoptose

Os Níveis de lipopolisacarídeo de fragmentos scFv recombinantemente produzidos foram reduzidos usando colunas Detoxigel de acordo com as instruções do fabricante (Pierce Biotechnology, Rockford, IL, USA ). Os níveis de endotoxina remanescente foram determinados pelo ensaio de lisado de LAL-amebócito (Cambrex Bioscience, Walkersville, MD, USA).

Todas as amostras scFv foram observadas conter menos do que 0,1 IU/ml de lipopolissacarídeo. O anticorpo anti-CD20 quimérico Mabthera™ (Rituxunab) foi adquirido da Lund University Hospital (Lund, Sweden). As células de linfoma B 2 χ IO5 (Raji ou Ramos) ou células T Jurkat foram incubadas com scFv's seriamente diluído e desintoxicado em meio de cultura por 1 hora em gelo.

As células foram seqüencialmente incubadas com anti-6xHis mAb secundárias (5 μg/ml), e anticorpo Fab'2 anti-camundongo Fab'2 de cabra terciário (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc., West Grove, PA, USA). As lavagens intermitentes garantiram a remoção de reagente de anticorpo não ligado em excesso. As células foram incubadas a 37 °C em uma atmosfera umidificada de 5 % CO2 por 24 horas.

Quando os IgGs totais foram usados por indução de apoptose, o reagente de reticulação foi recolocado por anticorpo Fc γ anti-humano Fab'2 de cabra (Jackson ImmunoResearch) com a reatividade cruzada mínima com isotipos de anticorpos não-IgG (para evitar reticulação não específica de imunoglobulinas de superfície associada com linfoma B endógeno) e incubado, como descrito acima, por 6 horas.

As células apoptóticas foram, a não ser de outra maneira estabelecida, detectado pelo tingimento combinado com Annexin V Alexa Fluor 488 (AV) e Iodeto de Propídio (PI) (ambos a partir de Molecular Probes, Invitrogen) e análise de citometria de fluxo subsequente, as células foram definidas como viável (AV-/PI-), anteriormente apoptótica (AV+/ PI-) ou depois apoptótica/necrótica (AV+/PI+). Os sinais AV e PI foram registrados nos canais FL1 e FL2 ou FL3 (como indicado no texto), respectivamente, usando um instrumento FACSCalibur (BD Biosciences).

A fim de investigar a funcionalidade do scFv isolado realizamos um ensaio de avaliação de produção de apoptose alta, com base na incubação seqüencial e lavagem de células com scFv e reagente de reticulação. A dependência do clone scFv e concentração no ensaio de apoptose é demonstrado na Fig. 2 Α-C, onde o efeito de apoptose do clone scFv B1 selecionado é comparado ao - efeito de clone scFv F1 que não mostram indução de apoptose. As células Jurkat que precisam da expressão de antígeno alvo não morrem a partir da apoptose após o tratamento com qualquer do scFv examinado demonstrando que a indução de apoptose depende da ligação para antígeno alvo (dados não mostrados).

Usando o ensaio de scFv-apoptose estabelecido, avaliamos os clones por apoptose em células de linfoma B Ramos e Raji. Os efeitos de apoptose scFv-induzido foram comparados com aqueles induzidos por Rituximab anti-CD20 mAb (Fig. 2D). Três clones scFv BI,Bll eCll - foram identificados que induzem a apoptose significante tanto nas células de Ramos quanto Raji (Fig. 2 D e Ε). A indução de apoptose por scFv em células Raji correlacionada com a ligação destas células (Fig. 2D), visto que os clones scFv que falharam ao ligar as células Raji não induzem apoptose.

Os clones B1,B11 e C11 foram transferidos para anticorpos IgG 1 totalmente humanos. Tanto especificidade quando a funcionalidade permaneceram intactas após a reformação, como demonstrada por sua ligação forte e citotoxicidade potente com respeito a um painel amplo de linhas celulares de linfoma B (Tabela 1). Notavelmente, a indução de apoptose foi rápida com uma porcentagem máxima de células apoptóticas positivas de anexina V já sendo atingidas após três a seis horas em linhas celulares diversas (Tabela 1 e dados não mostrados).

Produção de IgG e ensaio de avaliação endotoxina

Os fragmentos de anticorpo scFv foram convertidos ao IgGI X de comprimento total, o formato por intermédio da clonagem de um vetor pCDNA3 modificado (Norderhaug et al. J Immunol Methods 1997;204:77- 87.), e transitoriamente transferido em células HEK293 usando reagente Lipofectamina 2000 de acordo com as instruções do fabricante (Invitrogen).

O IgG humano foi purificado a partir do meio de cultivo esgotado em uma coluna de proteína A MabSelect (Amersham Biosciences). A pureza da preparação foi >98 % como determinado pela análise SDS- PAGE. As preparações de anticorpo foram avaliadas e observada por conter < 0,1 IU/ml de endotoxina em concentrações usadas no presente estudo, e como determinado pelo teste de lisado de LAL amebócito (Cambrex Bioscience).

Exemplo 2 - Análise de especificidade de anticorpo

Identificação de antígeno

A identidade de antígenos alvejados foi determinado por imunoprecipitação de lisados celular de linfoma B. As células (50-600 χ 10"6 por ml de tampão de lise, dependendo do anticorpo e da linha celular) foram coletadas por centrifiigação, lavadas duas vezes em PBS e incubadas por 15 minutos em tampão de lise (25 mM Tris-HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, e completar com coquetel inibidor de protease isento de EDTA (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany)) contendo o detergente Triton X-IOO (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) a 0,5 % v/v.

Os detritos celulares foram rotacionados em 16.000 χ g por 15 minutos em uma centrífuga de bancada convencional e as proteínas solúveis foram pré-clareadas com Proteína A Sepharose 4 Fast Flow (Amersham Biosciences) (1/10 volume de reação) por 1 hora em rotação. Para cada amostra, 1 ml de lisado celular pré-clareado foi imunoprecipitado por 2 horas de 20 a 100 μg de qualquer um dos anticorpos humanos. A Proteína A Sepharose 4 Fast Flow foi adicionada novamente e incubada por 30 minutos, a seguir os imunocomplexos foram lavados extensivamente em tampão de lise, colocados em ebulição por 5 minutos, e finalmente reclocados em suspensão em tampão de amostra (IX NuPAGE LDS Tampão de amostra, IX NuPAGE Agente de redução de amostra) e separada em um NuPAGE Novex 4-12 % Bis-Tris Gel (todos a partir de Invitrogen).

Após o tingimento (Simply Blue Safestain, Invitrogen), as faixas de proteínas de interesse foram retiradas a partir de SDS-PAGE e submetidas a digestão tríptica, como descrito (Edvardsson et al. Electrophoresis 1999;20:935-42.).

Resumidamente, os tampões de gel foram descoloridos e equilibrados por lavagem três vezes com 200 μl 50 % de acetonitrila (ACN) sob agitação. Após secagem em um concentrador SpeedVac (Savant, Farmingdale, NY, USA) por 15 minutos, as amostras foram reduzidas pela adição de 25 μl 10 mM DTT / 100 mM NH4HCO3 e incubadas por 56 °C por 1 hora e alquilada pela adição de 25 μl 55 mM iodoacetamida /100 mM NH4HCO3 seguido pela incubação por 45 minutos em temperatura ambiente. Após duas etapas de lavagem de minutos adicionais em 100 mM NH4HCO3 seguido por uma lavagem em 50 % v/v ACN, os pedaços de gel foram secados em um concentrador SpeedVac e aumentados novamente e digeridos em 15 μΐ de 15 ng/μΐ de tripsina (Promega Corporation, Madison, WI5 USA) em 25 mM NH4HCO3 a 37 0C durante a noite. Os peptídeos foram extraídos pela adição de 50 % v/v ACN / 1 % v/v TFA e 10 minutos de incubação a RT. 1 μΐ do extrato foi manchado em placas de amostra MALDI e deixado secar. 1 μΐ de solução de matriz (5 mg/ml de ácido alfa-ciano-4- hidróxi cinâmico (CHCA) em 75 % v/v ACN / 1 % v/v TFA) foi manchado na parte superior dos peptídeos.

As massas de peptídeos foram determinados usando um Applied Biosystems 4700 Maldi Workstation. As proteínas foram identificadas pela pesquisa de banco de dados da impressão digital da massa de peptídeo usando instrumentos de busca Mascot (Matrixscience, UK). As especificidade de antígenos de clones Bl0, CIO, e G12 foram identificadas usando metodologia similar, exceto microcontas magnéticas revestidas scFv's e anti-His (Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch Gladbach, Germany) foram usadas por imunoprecipitações.

A conversão seguinte para o formato do anticorpo total BI, Bll e Cl 1 IgG foram usados por antígenos precipitados de células de linfoma B Raji e Ramos. As duas faixas do precipitado IgG Bl de aproximadamente 28 e 34-kDa, respectivamente (Fig. 3A, linha 1). Os pedaços de gel contendo estas faixas foram preparados e digeridos com tripsina e analisados pela espectrometria de massa identificando HLADR/DP como um antígeno alvo.

A especificidade de IgG Bl por HLA-DR/DP foi verificada tanto por western blotting quanto por detecção da proteína HLA-DRJDP, usando um anticorpo monoclonal comercialmente disponível, e pelo bloqueio da ligação Bl IgG seguindo a pré-incubação de células como um anticorpo monoclonal específico HLA-DR comercialmente disponível (Fig. 3B). As identidades de antígenos definidos IgG B11 e C11 foram estabelecidas usando metodologia similar. O IgG C11 foi observado precipitar uma faixa de proteína 68 kDa identificado como a forma ligada da membrana da cadeia μ de receptor celular B (Fig. 3A, linha 3). O IgG B11 precipita uma faixa de proteína 90 kDa que foi identificada como a molécula-1 de adesão de célula intercelular (ICAM-I) (Fig. 3A, linha 2). A especificidade de IgG Bll por ICAM-1, e de C11 IgG por IgM, foram confirmadas por análise MS-MS, estudos de bloqueio de anticorpo (Fig. 3B), e análise de western blot (dados não mostrados) usando anticorpos comercialmente disponível.

As especificidades de clones Bl0, C10, e G12 foram determinados, usando microcontas magnéticas revestidas scFv e anti-His por imunoprecipitação. Os três clones scFv precipitaram a faixa de proteína de 68 kDa, e análise de MS de pedaços de gel digeridos por tripsina contendo estas faixas revelaram sua especificidade com relação ao IgM de superfície. Presumidamente, estes anticorpos reconhecem o idiotipo IgM Ramos, visto que nenhum de destes reage com linfócitos B de sangue periférico ou outras linhas celulares B positivas de IgM.

Exemplo 3 - Análise de afinidades de anticorpo

Iodação in vitro de imunoglobulinas B1 e B11

A iodação de 1 mg/ml de proteínas de IgG1 B1 ou IgG1 B11 com [125I] NaI foi realizada em PBS por 10 minutos usando tubos de iodação pré-revestidos com iodogênio (Pierce). [125I] NaI livre foi removido pela dessalinização em colunas PD-10 (Amersham Biosciences), produzindo radioatividades específicas na faixa de 1000 a 1600 cpm por ng de proteína. 125I] IgG1 B1 e [125I] IgG1 B11 foi usado por determinação de afinidades de anticorpos.

Determinação de constantes de afinidades IgG B1 and IgG B11

Um IgG B1 ou IgG B11 radioiodados foram incubados com células de linfoma B em DPBS-B-hlgG (DPBS-B contendo 0,2 mg/ml de IgG humano) por 2 horas em gelo com mistura intermitente. A ligação não específica foi determinada na presença de 0,2 mg/ml de proteína IgG Bl ou IgG B11 não rotulada, como apropriado. A análise foi realizada em triplicatas.

As células foram rotuladas na parte superior de 40 % v/v de almofadas de Ficoll/DPBS-B em tubos individuais foram centrifugados a 400 χ g por 6 minutos a 4 °C. As amostras foram esfriadas a -80 °C. Os grânulos celulares e sobrenadantes celular foram isolados e analisados separadamente pelo teor de proteína 125I-IgG em um contador de gama, seguindo o corte dos tubos na metade.

As constantes de afinidade de anticorpos (valores Kd) e números de epítopo por célula foram determinados a partir da análise de plotagem de Scatchard de acordo com o Rosenthal et al. (Anal Biochem 1967;20:525-32), Bylund e Yamamura (Methods in Neurotransmitter Analysed. New York: Raven Press Ltd., 1990), e Marquardt (J. Soe. Indust. Appl. Math 1963;11:431-41), como previamente descrito (Brix et al. J. Clin. Invest. 1998;102:283-93).

A ligação IgG Bl e IgG Bll ao HLA-DR e ICAM-I foi caracterizada pela incubação de proteínas radio-iodadas com células de Raji ou Ramos na presença ou ausência de 0,2 mg/ml de proteína IgG não rotulada correspondente a 4 °C. A ligação específica de [125I]IgG à superfície celular foi calculada pela subtração da ligação não específica (ligação na presença de excesso de IgG não rotulado) a partir da ligação total.

A saturação de ligação IgG Bl específica às células de Raji foi elevada a -30 nM IgG B1 (Fig. 5). A análise de plotagem de Rosenthal- Scatchard revela uma constante de dissociação de ~3 nM com 400.000 locais de ligação funcionais por células de Raj i, assumindo uma interação epítopo- IgG bivalente (Fig. 5). Similarmente, a constante dissociação de IgG Bll foi determinado a -0,2 nM com receptores de 47.400 células de Ramos. Tabela 1. Anticorpos B1, B11 and C11 IgG totalmente humanos mostram padrões de ligação dinâmica e induzem apoptose em várias linhas celular de linfoma B.

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Indução de apoptose; determinado pela porcentagem de células viáveis após 6 horas de incubação com qualquer dos anticorpos humanos, reticulados com anticorpo específico de Fc (gama) anti-humano de cabra; viabilidade não afetada; +, 95 a 80 %; ++, 79 a 60 %; +++, 59 a 40 % células viáveis comparadas por controle (FITC-8 IgG1 humano). Os resultados são baseados em amostras em duplicatas em três experimentos independentes. bMFI; meio de intensidade de fluorescência de anticorpo de IgG anti-humano de cabra conjugado com RPE secundário. A linha celular dependente do valor MFI do anticorpo IgG FITC-8 de controle humano foi subtraída a partir de MFI de cada anticorpo humano.

Exemplo 4 - ICAM-1 é um antígeno associado ao linfoma B com propriedades de indução de apoptose

Análise de citometria de fluxo de ligação IgG a células de Ramos

As células de Ramos (13 χ 106) foram tingidas com CD45- PerCp-Cy5,5 mAb por incubação em gelo por 45 minutos, lavadas em DPBS- B, e mantidas em gelo ate mistura com PBLs purificados não rotulados.

Os revestimentos de pele humana a partir de dois voluntários saudáveis foram obtidos a partir de Lund University Hospital. Os revestimentos de pele humana foram diluídos 1:2 em PBS e lavados pela centrifugação a 500 χ g (1500 rpm de centrífuga Beckman Spinchron) por 10 minutos, a aspiração completa do sobrenadante e recolocado em suspensão em DPBS contendo 1 % de FCS inativado por calor (DPBS-HI). A lavagem foi repetida duas vezes. As células sangüíneas vermelhas foram lisadas pela incubação com solução lisadora da célula sangüínea vermelha (BD Biosciences) por 15 minutos a RT. As células foram lavadas pela centrifugação a 60 χ g (667 rpm de centrífuga Beckman spinchron) por 10 minutos e o sobrenadante cuidadosamente aspirado. As células foram contadas em uma câmara Biirker seguindo tingimento com reagente azul de tripano (Invitrogen) e exclusão de células mortas, lavadas em DPBS-HI, granuladas, e recolocadas em suspensão em DPBS-B contendo 200 μg/ml de IgG purificado humano (bloqueio de receptores Fc).

Para cada doador e condição de teste, aproximadamente 2,5 χ 106 leucócitos foram misturados com 1,6 χ IO5 PerCpCy5,5 de células de Ramos pré-rotuladas. Os anticorpos monoclonal de camundongo CD3-FITC, CD56-PE, e CD19-PerCpCy5,5 (BD Biosciences) foram adicionados e as misturas foram incubadas em gelo até a adição de IgG humano rotulado. A rotulação de anticorpos IgG humano n-CoDeR e anticorpo quimérico camundongo-humano anti-CD20 de controle positivo Rituximab com fragmentos AF647 Fab (Molecular Probes, Invitrogen) foi realizado de acordo com as instruções do fabricante.

Resumidamente, 4 μg de cada de IgG BI, Bl 1, Cl 1, e anticorpos Rituximab foram incubados com 20 μΐ de reagente de rotulação AF647-Fab por 5 minutos a RT. Seguindo a adição de 20 μΐ de reagente de bloqueio IgG humano e ainda incubação por 5 minutos, IgG rotulado com AF647 foi seriamente diluído três vezes em DBPS-B, e as proteínas IgG diluídas foram adicionadas à mistura de soluções celulares Ramos/PBL.

As amostras foram incubadas por 1 hora, lavadas, recolocadas em suspensão em DPBS-B, e analisadas pela ligação de subpopulações celulares diferentes por citometria de fluxo, seguindo calibração apropriada e compensação do instrumento por análise de quatro cores. As células de Ramos foram identificadas como a população distinta de PerCpCy5,5alta a partir da população de PerCpCy5,5baixade linfócito B. Imunoistoquímica

As biópsias de linfonodos crioconservados de pacientes com linfoma de célula B grande anaplástico (um paciente), linfoma não-Hodgkin B de Centroblástico/Centrocítico (três pacientes), e leucemia linfocítica crônica de célula B (um paciente) foram obtidas a partir do Department of Pathology at Lund University (Lund, Sweden). seções de oito-micrômetros de tecidos crio-conservados foram fixados em acetona por 10 minutos a 4 °C. a atividade de ligação de biotina endógena foi bloqueada pela tratamento seqüencial com Avidina e Biotina (Avidin/Biotin blocking kit, Invitrogen) por 20 minutos cada.

Os tecidos foram incubados com 5 μg/ml de scFv de controle ou scFv Bll por 1 hora. Seguindo lavagem, as seções foram incubadas com anti-His mAb de camundongo conjugadas com biotina (R&D Systems) por 30 minutos. A ligação scFv foi detectada seguindo tratamento com complexo ABC /reagente HRP (Dako Cytomation) por 30 minutos, e incubação subsequente com DAB por 5 minutos.

As seções foram fotógrafas usando uma câmera digital montada Leica DC 3 OOF na parte superior de um microscópio de luz/fluorescência Leica DMR.

A manipulação do tecido humano seguindo a recomendação do local Ethics Committee at Lund University Hospital. Ensaio de despolarização de membrana mitocondrial

A despolarização de membrana mitocondrial foi analisada como previamente descrito (Kim et ai. Mol Biol Cell 2004;15:420-34). Resumidamente, as células tratadas com anticorpos foram misturadas com reagente JC-I (Molecular Probes) a 5 μg/ml e incubadas por 30 minutos a RT. As células foram lavadas duas vezes em PBS gelado e recolocadas em suspensão em 300 μΐ PBS e analisadas em um FACS Aria (BD Biosciences). A fluorescência verde e vermelha foi coletada através de filtros de passagem de faixa de 494/518 nm (FL-I) e de 595/615 nm (FL-2), respectivamente.

ICAM-I é uma glicoproteína da super família da imunoglobulina (Marlin et ai. Cell 1987;51:813-9) capaz de induzir a sinalização bi-direcional (Rothlein et ai. J Immunol 1994;152:2488-95; Vyth- Dreese et al. Blood 1995;85:2802-12). ICAM-I não foi previamente demonstrado está envolvido na morte programada em células de linfoma B.

Conseqüentemente, desejamos confirmar que o IgG Bll que induziu a morte celular foi um processo ativo, por meio de outros que não a translocação de fosfatidil serina de membrana celular.

A despolarização de membrana mitocondrial foi escolhida como uma validação de apoptose, visto que esta é uma característica comum de apoptose de dependente caspase e independente de caspase que pode ser monitorada pelo tingimento celular com iodeto de 5,5',6,6'-tetracloro-l,r,3,3'- tetraetilbenzimidazolila-carbocianina (reagente JC-1).

De acordo com seu ensaio de Annexin V/iodeto de Propídio (Fig. 4A, painel superior), IgG Bll foi observado a induzir despolarização de membrana mitocondrial em CL-Ol de células de linfoma B, como determinado pela análise de citometria de fluxo seguindo tingimento com reagente JC-I (Fig. 4A, painel inferior).

A fim de excluir a possibilidade que a expressão ICAM-I foi um artefato in vitro, resultando de uma super regulação geral durante a cultura celular, examinamos a ligação de IgG B11 ao tecido obtido a partir de cinco pacientes diferentes com tumores de linfoma B diferentes.

Pela imunoistoquímica, o IgG Bll mostrou ligação forte aos cinco tecidos de linfoma (Fig. 4B), em intensidades comparáveis a, ou levemente menor do que o anticorpo IgG Bl anti-HLA-DR/DP (Tabela 2). Examinamos a ligação de IgG B11 ao linfoma B versus leucócitos de sangue periférico latentes. Ramos foi escolhido como uma linha celular de linfoma B representativo, com base nesta expressão epítopo de extremidade baixa ainda significando sensibilidade a apoptose induzido por B11. A análise de citometria de fluxo, seguindo a mistura de incubação de células de Ramos pré-rotuladas com leucócitos sangüíneos periféricos de sangue total e de anticorpos IgG B1, B11 ou C11, revelam que IgG B11 mostra ligação forte a células de Ramos.

De maneira ainda mais importante, B11 demonstra a ligação diferencial maior (sub regulação de antígeno mais forte) de três anticorpos a células de Ramos de linfoma B versus leucócitos sangüíneos periféricos normais (Fig. 4C. e dados não mostrados). A ligação IgG B11 com picos já em 0,1 μg/ml e foi super regulada 3,7 vezes em células de Ramos versus monócito (MFI 654 versus 176), super regulada 8,3 vezes em Ramos versus linfócitos B de sangue periférico (MFI 654 versus 78), e super regulada 23 vezes comparada a células NK. A ligação a outras sub-séries de leucócito sangüíneo periférico monitorado foi negativo.

Tabela 2. ICAM-I é expressado em tecido de linfoma B de origem diferente

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Exemplo 5 - Distribuição de antígeno de B1, B11, C11 IgG1 em linhas celulares de tumor de várias origens, como determinado pela citometria de fluxo.

A distribuição de antígeno de antígenos alvejados de anticorpo humano, principalmente por B11, em linhas celulares de carcinoma diferentes foi investigado. As células (carcinoma de mama MCF-7 e MDA MB 435S, carcinoma de córion JAR e JEG-3, carcinoma de pulmão A549, carcinoma da bexiga urinária TCCSUP, melanoma MDA MB 435, HPAC, carcinoma pancreático PANC-I e BxPC-3, PC-3 e carcinoma de próstata DUl 45, LS174 T, CaCo2, e carcinoma coloretal Lovo, e células de leucemia monocíticas THP-1), foram lavadas em PBS, e recolocadas em suspensão a 4 χ IO6 células/ml em meio completo (amostra de 200.000 células/50 μΐ). o controle negativo Bl IgGb Bll IgGi, Cll IgGi, FITC-8 IgGb e Rituximab anti-CD20 mAb foi seriamente diluído de 3 a 10 vezes (10-0,1 pg/ml) em meio completo (50 μl/amostra). As células foram incubadas com anticorpos por 1 hora em gelo, lavada pela re-suspensão em PBS/BSA 0,5 %, centrifugada a 1200 rpm por 5 minutos, e a aspiração completa de sobrenadantes foi realizada. As células foram incubadas com IgG anti-Humano de F(ab')2 de cabra conjugado com PE (Caltag Laboratories, Cat no: Hl0104), diluído 1/50 em PBS/BSA 0,5 %, por 30 minutos, em gelo. Seguindo a re-suspensão em 300 μΐ PBS/BSA 0,5 %, as células foram analisadas pela ligação IgG usando um instrumento FACScan.

As células de carnimoma de próstata PC-3 mostram expressão forte de ICAM-I como demonstrado pela ligação forte de Bll IgG a estas células (Fig. 6). O carcinoma de mama MCF-7, o carcinoma pancreático HPAC, e células de carcinoma coloretal LS 174 T foram também observadas expressar ICAM-I embora em intensidade menor comparado à células de câncer de próstata. Em contraste, as células de leucemia monocíticas THP-I não expressam ICAM-1. Todas as linhas celulares de carcinoma inicialmente testadas foram constatadas negativas por CD20, HLA-DR/DP, e a expressão IgM como demonstrado pela falta de ligação de Rituximab IgG, Bl IgG, e Cll IgG, respectivamente. Estudos adicionais de linhas celulares de carcinoma adicional indica que todas as células de carcinoma examinadas foram positivas para a expressão de ICAM-I (Tabela 3).

Tabela 3. O ICAM-I é expressado fortemente em linhas celulares de carcinoma de origem diferente

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Exemplo 6 - Indução de apoptose Bll IgG1 em células de carcinoma

B11 IgG1 foi mostrado no exemplo 5 por ligar fortemente as células de carcinoma. O presente exemplo examina a apoptose induzindo propriedades destes anticorpos em células de carcinoma.

As células foram semeadas em placas de 6 reservatórios com meio de desenvolvimento completo três dias antes do início do experimento. As células foram entre 50 a 75% confluente no período do experimento. As células foram lavadas com PBS gelado e incubadas com Bll IgGi seriamente diluído (20- 0,02 μg/ml como indicado nas figuras, em 1 ml de meio de desenvolvimento completo), 20 μg/ml de controle Bl IgGb 10μg/ml de controle negativo IgGi ou 10 μg/ml de Trastuzumab IgGi como indicado a 4°C por 1 a 2 horas. As células foram lavadas com, PBS gelado e anticorpo F(ab'2) anti-humano de cabra F(ab'2) secundário (diluído em meio de desenvolvimento completo a 10 μg/ml) foi adicionado. As células foram incubadas a 37°C, em uma atmosfera umidificada de 5% CO2 por 16 a 24 horas. As células totais foram coletadas pelo primeiro isolamento de sobrenadante, seguindo pelo PBS lavado e tripsinação de células aderentes remanescentes. A reação enzimática foi terminada pela re-suspensão em PBS contendo 10% de soro bovino fetal inativado por calor. As células foram lavadas em PBS gelado, submetido ao tingimento com Annexin V / iodeto de Propídio, e analisada por viabilidade/ apoptose como descrito no exemplo 5 acima.

O Bll IgGi foi mostrado para induzir apoptose nas linhas celulares de carcinoma em uma maneira específica e titulável (Figura 7). O controle IgG B 1, que não liga as células PC-3 (ver exemplo 5), também não induzem apoptose nas células PC-3. O controle negativo IgGj ou Trastuzumab IgG1 não foram capazes de induzir apoptose nas células DUl45 ou MDA MB435.

Exemplo 7- Formulações farmacêuticas e administração.

Um outro aspecto da invenção fornece uma formulação farmacêutica que compreende um composto de acordo com o primeiro aspecto da invenção na mistura com um adjuvante, diluente ou carreador farmacêutica ou veterinariamente aceitável.

Preferivelmente, a formulação é uma unidade de dosagem contendo uma dose diária ou sub-dose diária única ou uma fração apropriada destas, do ingrediente ativo.

Os compostos da invenção normalmente serão administrados oralmente ou por qualquer via parenteral, na forma de uma formulação farmacêutica que compreende o ingrediente ativo, opcionalmente na forma de um ácido orgânico ou inorgânico não tóxico ou base ou sal de adição, em uma forma de dosagem farmaceuticamente aceitável. Dependendo do distúrbio e do paciente a ser tratado, bem como a via de administração, as composições pode ser administradas em doses variadas.

Na terapia humana, os compostos da invenção podem ser administrados sozinhos mas, no geral, serão administrados na mistura com um excipiente, diluente ou carreador farmaceuticamente adequado selecionado com respeito à rota pretendida e administração e prática farmacêutica padrão.

Por exemplo, os compostos da invenção podem ser administrados oralmente, bucal ou sublingual na forma de tabletes, cápsulas, óvulos, elixires, soluções ou suspensões, que podem conter agentes flavorizantes ou corantes, pelas aplicações de liberação imediata, atrasada ou controlada. Os compostos da invenção também podem ser administrados por intermédio de injeção intracavernosa.

Tais tabletes podem conter excipientes tais como celulose microcristalina, lactose, citrato de sódio, carbonato de cálcio, fosfato de cálcio e glicina dibásicos, desintegrantes tais como amido (preferivelmente milho, batata ou amido de tapioca), glicolato de amido de sódio, croscarmelose sódica e certos complexos de silicatos, e ligadores de granulação tais como polivinilpirrolidona, hidroxipropilmetilcelulose (HPMC), hidróxi- propilcelulose (HPC), sacarose, gelatina e acácia. Adicionalmente, os agentes de lubrificação tais como estearato de magnésio, ácido esteárico, beenato de glicerila e talco podem ser incluídos.

As composições sólidas de uma tipo similar também podem ser utilizadas como cargas em cápsulas de gelatina. Os excipientes preferidos a este respeito inclui lactose, amido, uma celulose, açúcar de leite ou glicóis de polietileno de peso molecular alto. Para suspensões aquosas e/ou elixires, os compostos da invenção podem ser combinados com vários agentes adoçantes ou flavorizantes, matéria corante ou pigmentos, com agentes emulsificantes e/ou de suspensão e como diluentes tais como água, etanol, propileno glicol e glicerina, e combinações destes.

Os compostos da invenção também podem ser administrados parenteralmente, por exemplo, intravenoso, intra-arterial, intraperitoneal, intratecal, intraventricular, intrasternal, intracranial, intra-muscular ou subcutânea, ou pode ser administrados pelas técnicas de infusão. Estes são melhor usados na forma de uma solução aquosa estéril que pode conter outras substâncias, por exemplo, sais ou glicose suficiente para tornar a solução isotônica com sangue. As soluções aquosas devem ser tamponadas adequadamente (preferivelmente a um pH de 3 a 9), se necessário. A preparação das formulações parenterais adequadas estéreis é realmente realizada pelas técnicas farmacêuticas padrão bem conhecidas aqueles habilitados na técnica.

As formulações adequadas para administração parenteral inclui soluções de injeção estéril aquosa ou não aquosa que podem conter anti-oxidantes, tampões, bacteriostáticos e solutos que rendem a formulação isotônica com o sangue do recipiente pretendido; e suspensões estéreis aquosas e não aquosas que podem incluir agentes de suspensão e agentes espessantes. As formulações podem ser apresentadas em recipientes de dose única ou doses múltiplas, por exemplo ampolas seladas e frascos, e podem ser armazenadas em uma condição secada por congelamento (Iiofilizado) requerendo apenas a adição do carreador de líquido estéril, por exemplo água para injeções, imediatamente antes do uso. As soluções e suspensões de injeção extemporânea podem ser preparadas a partir de pós estéreis, grânulos e tabletes de classe previamente descrita.

Para administração oral ou parenteral a pacientes humanos, o nível de dose diária dos compostos da invenção usualmente serão de 1 mg/kg a 30 mg/kg. Deste modo, por exemplo, os tabletes ou cápsulas do composto da invenção pode conter uma dose do composto ativo para administração individualmente ou duas ou mais em um período, como apropriado. O médico em qualquer ocasião determinará a dosagem atual, que será mais adequada para qualquer paciente individual, e variará com a idade, peso e resposta do paciente particular. As dosagens acima são exemplos de casos médios. Estes podem, é claro, serem exemplos individuais onde faixas de dosagem superior ou inferior são merecidas e tais estão dentro do escopo desta invenção.

Os compostos da invenção também podem ser administrados intranasal ou por inalação e são convenientemente liberados na forma de um inalador de pó seco ou uma apresentação de pulverização de aerossol a partir de um recipiente pressurizado, bomba, pulverização ou nebulizador com o uso de um propelente adequado, isto é diclorodifluorometano, triclorofluorometano, diclorotetrafluoro-etano, um hidrofluoroalcano tal como 1,1,1,2-tetrafluoroetano (HFA 134A3 ou 1,1,1,2,3,3,3-heptafluoropropano (HFA227EA3), dióxido de carbono ou outro gás adequado. No caso de um aerossol pressurizado, a unidade de dosagem pode ser determinada pelo fornecimento de uma válvula para liberar uma quantidade medida. O recipiente pressurizado, bomba, pulverização ou nebulizador pode conter uma solução ou suspensão do composto ativo, isto é usando uma mistura de etanol e o propelente como o solvente, que pode adicionalmente conter um lubrificante, isto é trioleato de sorbitano. As cápsulas e cartuchos (feitos, por exemplo, de gelatina) para uso em um inalador ou insuflador podem ser formulados para conter uma mistura de pó de um composto da invenção e uma base de pós adequado tal como lactose ou amido.

As formulações de aerossol ou pó seco são preferivelmente dispostas de modo que cada dose medida ou "sopro" libere uma dose apropriada de um composto da invenção para liberação do paciente. Será apreciado que as doses diárias totais com um aerossol variará de paciente a paciente, e pode ser administrada em uma dose única ou, mais usualmente, em doses divididas por todo o dia.

Alternativamente, os compostos da invenção podem ser administrados na forma de um supositório ou pessário, ou podem ser aplicados topicamente na forma de uma loção, solução, creme, ungüento ou pó de polvilhamento. Os compostos da invenção também podem ser transdermicamente administrados, por exemplo, pelo uso de um emplasto para a pele. Estes também podem ser administrados pela via ocular, particularmente para tratamento de doenças dos olhos.

Para uso oftálmico, os compostos da invenção podem ser formulados como suspensões micronizadas em solução salina estéril isotônica com pH ajustado, ou preferivelmente, como soluções em solução salina estéril isotônicas com pH ajustado, opcionalmente em combinação com um conservante tal como um cloreto de benzilalcônio. Alternativamente, podem ser formulados em um ungüento tal como petrolato.

Para aplicação topicamente à pele, os compostos da invenção podem ser formulados como um ungüento adequado contendo o composto ativo colocado em suspensão ou dissolvido em, por exemplo, uma mistura com um ou mais dos seguintes: óleo mineral,petrolato líquido, petrolato branco, propileno glicol, composto de polioxietileno polioxipropileno, cera emulsificante e água. Alternativamente, podem ser formuladas como uma loção ou creme adequados, colocados em suspensão ou dissolvidos em, por exemplo, uma mistura de um ou mais dos seguintes: óleo mineral, monoestearato de sorbitano, um polietileno glicol, parafina líquida, polisorbato 60, cera de ésteres cetílicos, álcool cetearílico, 2-octildodecanol, álcool benzílico e água.

As formulações adequadas parta administração tópica na boca incluem losangos que compreendem o ingrediente ativo em uma base flavorizada, usualmente sacarose e acácia ou tragacanto; pastilhas que compreendem o ingrediente ativo em uma base inerte tal como gelatina e glicerina, ou sacarose e acácia; e lavagens bocais que compreendem o ingrediente ativo em um carreador líquido adequado.

Geralmente, em humanos, administração oral ou tópica dos compostos da invenção é a via preferida, sendo a mais conveniente. Em circunstâncias onde o recipiente sofre de um distúrbio de dilatação ou de deterioração da absorção do medicamento após a administração oral, o medicamento pode ser administrado parenteralmente, isto é sublingual ou bucal.

Para uso veterinário, um composto da invenção é administrado como uma formulação adequadamente aceitável de acordo com a prática veterinária normal e o médico veterinário determinará o regime de dosagem e a via de administração, que será mais apropriado para um animal particular.

Claims (47)

1. Método para induzir a apoptose em uma célula alvo, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas: a. fornecer uma ou mais células alvo que apresentam o antígeno de superfície celular, ICAM-1; b. fornecer uma ou mais moléculas de ligação que ligam-se seletivamentes à superfície celular ICAM-I e, na ligação ICAM-1, induz a apoptose da célula alvo; c. expor as células alvo de (a) às moléculas de ligação de (b) para induzir a apoptose nas células alvo.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as moléculas de ligação são moléculas de anticorpo.

3. Método para induzir a apoptose em uma célula alvo, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas: a. fornecer uma ou mais células alvo que apresentam o antígeno de superfície celular, HLA-DR/DP e/ou IgM de superfície; b. fornecer uma ou mais moléculas de anticorpo que ligam-se seletivamentes à superfície celular HLA-DRIDP e/ou IgM de superfície e, na ligação HLA-DR/DP e/ou IgM de superfície, induzindo a apoptose da célula alvo; c. expor as células alvo de (a) às moléculas de anticorpo de (b) para induzir a apoptose nas células alvo.

4. Molécula de ligação para o uso no método como definido na reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que liga-se seletivamente ao ICAM-I de superfície celular e, na ligação ICAM-1, induz a apoptose da célula alvo.

5. Molécula de anticorpo para o uso no método como definido na reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que liga-se a um antígeno de superfície celular de uma célula alvo e, na ligação ao antígeno de superfície celular, induz a apoptose da célula alvo e em que o antígeno de superfície celular é HLA-DR/DP e/ou IgM de superfície.

6. Molécula de ligação de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de que a molécula de ligação é uma molécula de anticorpo.

7. Molécula de ligação de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 ou 6, caracterizado pelo fato de que o antígeno de superfície celular é ICAM-1.

8. Molécula de anticorpo de acordo com a reivindicação 5 caracterizada pelo fato de que o antígeno de superfície celular é HLA-DR/DP.

9. Molécula de anticorpo de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato de que o antígeno de superfície celular é IgM de superfície.

10. Molécula de ligação ou molécula de anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações de 4 a 9, caracterizada pelo fato de que a célula alvo é uma célula imune ou uma célula epitelial.

11. Molécula de ligação ou molécula de anticorpo de acordo com a reivindicação 10, caracterizada pelo fato de que a célula imune é um linfócito B.

12. Molécula de ligação ou molécula de anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações de 4 a 11, caracterizada pelo fato de que a célula alvo está associado com uma doença.

13. Molécula de ligação ou molécula de anticorpo de acordo com a reivindicação 12, caracterizada pelo fato de que a doença é selecionada do grupo que consiste de: câncer; doenças auto-imunes incluindo, mas não restritas a artrite reumatóide e SLE, distúrbios inflamatórios agudos e crônicos, sepse e doença infecciosa incluindo, mas não restrita a HIV.

14. Molécula de ligação ou molécula de anticorpo de acordo com a reivindicação 13, caracterizada pelo fato de que a doença é um câncer selecionado de linfoma (leucemia, mieloma), câncer gástrico, câncer de mama, câncer de fígado, câncer de pulmão, melanoma, câncer de bexiga, câncer corióide, câncer pancreático, câncer de cólon e câncer de próstata.

15. Molécula de ligação ou molécula de anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações de 6 a 14, caracterizada pelo fato de que a molécula de anticorpo é um IgG.

16. Molécula de ligação ou molécula de anticorpo de acordo com a reivindicação 15, caracterizada pelo fato de que o anticorpo de cadeia simples é selecionado do grupo de um IgGj, IgG2, IgG3 ou IgG4.

17. Molécula de ligação ou molécula de anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações de 6 a 16, caracterizada pelo fato de que a molécula de anticorpo é humana ou humanizada.

18. Molécula de ligação ou molécula de anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações de 6 a 17, caracterizada pelo fato de que o anticorpo tem regiões variáveis tendo as seqüências de qualquer uma das figuras de 9 a 11 ou homólogos funcionalmente equivalentes destes.

19. Molécula de ligação ou molécula de anticorpo de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que o anticorpo tem regiões variáveis tendo as seqüências da Figura 9 ou homólogos funcionalmente equivalentes destes

20. Molécula de ligação ou molécula de anticorpo de acordo com a reivindicação 18, caracterizada pelo fato de que o anticorpo tem regiões variáveis tendo as seqüências da Figura 10 ou homólogos funcionalmente equivalentes destes

21. Molécula de ligação ou molécula de anticorpo de acordo com a reivindicação 18, caracterizada pelo fato de que o anticorpo tem regiões variáveis tendo as seqüências da Figura 11 ou homólogos funcionalmente equivalentes destes.

22. Acido nucleico, caracterizado pelo fato de que tem uma seqüência de nucleotídeo que codifica uma molécula de anticorpo como definida em qualquer uma das reivindicações de 4 a 21.

23. Acido nucleico de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que tem a seqüência de nucleotídeo de qualquer uma das figuras de 9 a 11.

24. Uso de uma molécula de ligação ou molécula de anticorpo como definida em qualquer uma das reivindicações de 4 a 21, caracterizado pelo fato de ser no diagnóstico e/ou tratamento e/ou prevenção de uma doença, o diagnóstico e/ou tratamento e/ou prevenção que requer a destruição de uma célula alvo.

25. Uso de uma molécula de ligação ou molécula de anticorpo como definida em qualquer uma das reivindicações de 4 a 21, caracterizado pelo fato de ser na fabricação de um medicamento para o tratamento e/ou prevenção de uma doença o diagnóstico e/ou tratamento e/ou prevenção que requer a destruição de uma célula alvo.

26. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 24 ou -25, caracterizado pelo fato de que a doença a ser tratada é selecionada do grupo que consiste de: câncer; doenças auto-imunes incluindo, mas não restritas a artrite reumatóide e SLE, distúrbios inflamatórios agudos e crônicos, sepse e doença infecciosa incluindo, mas não restrita a HIV.

27. Uso de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de que a doença a ser tratada é câncer selecionado de linfoma (leucemia, mieloma), câncer gástrico, câncer de mama, câncer de fígado, câncer de pulmão, melanoma, câncer de bexiga, câncer corióide, câncer pancreático, câncer de cólon e câncer de próstata.

28. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações de 24 a 27, caracterizado pelo fato de que a molécula de ligação ou molécula de anticorpo é como definida na reivindicação 8 ou 19 e a doença a ser tratada é como definida na reivindicação 24 ou 25.

29. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações de 24 a 27, caracterizado pelo fato de que a molécula de ligação ou molécula de anticorpo é como definida na reivindicação 7 ou 20 e a doença a ser tratada é um linfoma como definido na reivindicação 27.

30. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 24 a -27, caracterizado pelo fato de que a molécula de ligação ou molécula de anticorpo é como definida na reivindicação 9 ou 21 e a doença a ser tratada é um linfoma como definido na reivindicação 27.

31. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende uma molécula de ligação ou molécula de anticorpo como definida em qualquer uma das reivindicações de 4 a 21 e um carreador, excipiente ou diluente carreador, excipiente ou diluente farmaceuticamente aceitável.

32. Método para induzir a apoptose em uma célula alvo, o dito método sendo um método in vitro, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: a. fornecer uma ou mais células alvo; b. fornecer uma ou mais moléculas de ligação ou moléculas de anticorpo como definidas em qualquer uma das reivindicações 4 a 21 c. expor as células alvo de (a) às moléculas de ligação ou moléculas de anticorpo de (b) a fim de induzir a apoptose nas células alvo.

33. Método in vitro de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pelo fato de que as células alvo fornecidas na etapa (a) são células imunes ou células epiteliais.

34. Método in vitro de acordo com a reivindicação 33, caracterizado pelo fato de que as célula imunes são B-linfócitos.

35. Método in vitro de acordo com qualquer uma das reivindicações de 32 a 34, caracterizado pelo fato de que as células alvo estão associadas com uma doença.

36. Método in vitro de acordo com a reivindicação 35, caracterizado pelo fato de que a doença é selecionada do grupo que consiste de: câncer; doenças auto-imunes incluindo, mas não restritas a artrite reumatóide e SLE, distúrbios inflamatórios agudos e crônicos, sepse e doença infecciosa incluindo, mas não restrita a HTV.

37. Método in vitro de acordo com a reivindicação 36, caracterizado pelo fato de que a doença é um câncer selecionado de linfoma (leucemia, mieloma), câncer gástrico, câncer de mama, câncer de fígado, câncer de pulmão, melanoma, câncer de bexiga, câncer corióide, câncer pancreático, câncer de cólon e câncer de próstata.

38. Método para induzir a apoptose em uma célula alvo, o dito método sendo um método in vivo, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: a. fornecer uma ou mais células alvo; b. fornecer uma ou mais moléculas de ligação ou moléculas de anticorpo como definidas em qualquer uma das reivindicações de 4 a 21 c. expor as células alvo de (a) às moléculas de ligação ou moléculas de anticorpo de (b) a fim de induzir a apoptose nas células alvo.

39. Método in vivo de acordo com a reivindicação 38, caracterizado pelo fato de que as células alvo fornecidas na etapa (a) são células imunes ou células epiteliais.

40. Método in vivo de acordo com a reivindicação 39, caracterizado pelo fato de que as células imunes são B-linfócitos.

41. Método in vivo de acordo com qualquer uma das reivindicações de 38 a 40, caracterizado pelo fato de que as células alvo estão associadas com uma doença.

42. Método in vivo de acordo com a reivindicação 41, caracterizado pelo fato de que a doença é selecionada do grupo que consiste de: câncer; doenças auto-imunes incluindo, mas não restritas a artrite reumatóide e SLE, distúrbios inflamatórios agudos e crônicos, sepse e doença infecciosa incluindo, mas não restrita a HIV.

43. Método in vivo de acordo com a reivindicação 42, caracterizado pelo fato de que a doença é um câncer selecionado de linfoma (leucemia, mieloma), câncer gástrico, câncer de mama, câncer de fígado, câncer de pulmão, melanoma, câncer de bexiga, câncer corióide, câncer pancreático, câncer de cólon e câncer de próstata.

44. Método para induzir a apoptose, caracterizado pelo fato de ser substancialmente como descrito neste com referência aos exemplos e figuras.

45. Molécula de ligação ou molécula de anticorpo indutoras de apoptose, caracterizada pelo fato de ser como descrita substancialmente neste com referência aos exemplos e figuras.

46. Uso de uma molécula de ligação ou molécula de anticorpo indutoras de apoptose, caracterizado pelo fato de ser como descrito substancialmente com referência aos exemplos e figuras.

47. Composição farmacêutica indutora de apoptose, caracterizada pelo fato de ser como substancialmente descrita neste com referência aos exemplos e figuras.