BRPI0620053A2 - extratos de phaseolus vulgaris, seu uso, e formulações que os contêm - Google Patents
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Abstract
EXTRATOS DE PHASEOLUS VULGARIS, SEU USO, E FORMULAçõES QUE OS CONTéM. A presente invenção refere-se a extratos obteníveis por extração de Phaseolus sp. com soluções aquosas, distinguidos por um teor de inibidores de <244>-amiIase com uma atividade igual ou maior do que 1.800 USP/mg (título por HPLC igual ou maior do que 15% em peso) e um teor de fitoemaglutininas entre 1.500 e 6.000 HAU/g, e um processo para sua preparação.
Description
Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "EXTRATOS DE PHASEOLUS VULGARIS, SEU USO, E FORMULAÇÕES QUE OS CONTÊM".
Sumário da Invenção
A presente invenção refere-se a extratos obtidos a partir de se- mentes de plantas do gênero Phaseolus, e o processo para sua preparação.
Mais particularmente, a invenção refere-se a extratos de semen- tes de Phaseolus vulgaris, distinguidos por um teor de inibidores de a- amilase e fitoemaglutininas em proporções estabelecidas, que reduzem a absorção de glicose originada de amidos na dieta, e reduzem o apetite de- pois de administração repetida.
Antecedentes da Invenção
Um inibidor de α-amilase (aAI) é uma glicoproteína contida nas sementes de feijão-comum (Phaseolus vulgaris), que inibe a atividade enzi- mática de amilase de origem animal, e especialmente amilase humana, de uma maneira diferenciada dependente da espécie. Este inibidor, que foi puri- ficado pela primeira vez por Marshall e Lauda em 1974 (J. BioL Chem. 250(20):8030-8037 (1975)), tem atraído interesse por causa dos efeitos que sua atividade inibidora de amilase pancreática podem exercer sobre a ab- sorção intestinal de glicose (derivada da hidrólise enzimática de amido), e acima de tudo, pela sua aplicação potencial na indústria dietética. Os carboi- dratos são uma fonte importante de calorias e contribuem para a síntese de gorduras em indivíduos predispostos à obesidade ou diabetes Tipo II. Na natureza, na evolução das espécies, a disponibilidade de alimentos para so- brevivência era intermitente, de modo que a capacidade de acumular ener- gia além da quantidade necessária para uso imediato era essencial. As célu- las adiposas, desenvolvidas em diferentes partes do corpo, estão entre os locais onde a energia é acumulada, de tal modo que ela esteja facilmente disponível quando o corpo a necessita. Este sistema fisiológico, orquestrado por secreções endócrinas e neuronais, permite que os seres humanos so- brevivam por longos períodos, mesmo na ausência de alimento. Entretanto, no caso de alimento abundante, o estilo de vida sedentário e razões genéti- cas associadas a estilos de vida de países industrializados, o sistema au- menta descontroladamente os depósitos de energia adiposa com conse- qüências adversas, tais como imperfeições cosméticas, e em seguida, uma sobrecarga do sistema cardiocirculatório. Um dos principais problemas é a obesidade, que atingiu níveis altos em alguns países, tal como nos Estados Unidos da América. A obesidade é a principal causa de doença cardiovascu- lar, hipertensão e diabetes. O excesso de peso, que é comum entre homens e também mulheres, faz com que o indivíduo coma quantidades cada vez maiores de comida, e o resultado é uma deterioração da saúde. Um excesso de glicose no sangue leva a um aumento em depósitos de energia, e a dis- ponibilidade de substâncias que reduzem a absorção de glicose é muito im- portante.
A demanda mundial por substâncias contra a obesidade levou à pesquisa e estudo de alimentos que contrabalançam a acumulação progres- siva do peso corporal.
Os inibidores de α-amilase foram identificados há muito tempo em diferentes legumes e no milho, e ensaios clínicos específicos foram con- duzidos nos últimos anos, com resultados dúbios. Dependendo do processo de preparação usado para a concentração e isolamento desses inibidores, os resultados foram contraditórios, pois muitas preparações comerciais de- monstraram falta de atividade eficaz in vivo. De acordo com os primeiros estudos de Layer, Carlson e Di Magno (Gastroenterology 88(6): 1895-1902 (1985)), este problema deve-se aparentemente ao alto grau de diluição do inibidor em preparações altamente impuras; de fato, as preparações de ini- bidor purificado comprovam ser ativas sobre a α-amilase quando são intro- duzidas diretamente dentro do lúmen intestinal.
Sabe-se há muito tempo que algumas sementes e legumes con- têm substâncias, as quais, se ingeridas antes de serem completamente co- zidas, podem ser tóxicas ou enfraquecer a dieta normal. De fato, o inibidor de α-amilase não está presente nos extratos isoladamente, mas está sem- pre no feijão-comum acompanhado de grandes quantidades de fitoemagluti- ninas que são consideradas tóxicas. A toxidez das fitoemaglutininas é nor- malmente alta nas doses nas quais elas estão presentes na natureza. As fitoemaglutininas são glicoproteínas semelhantes a inibidores de a-amilase, e causam hiperplasia, hipertrofia e aumentam a função pancreática em altas doses. As fitoemaglutininas reconhecidamente causam aumento do tamanho do pâncreas em doses relativamente altas, aumentando assim a acumula- ção de poliaminas e a secreção enzimática. Estas glicoproteínas sobrevivem ao trânsito intestinal e se ligam a enterócitos, onde elas induzem a secreção de colecistocinina, um hormônio trófico que estimula a secreção pancreática. Além destes efeitos aparentemente desfavoráveis sobre o pâncreas e o in- testino, a colecistocinina também inibe o apetite, uma propriedade vital na redução da obesidade.
Os processos fragmentários descritos a literatura para a prepa- ração de inibidores de α-amilase envolvem a extração com tampão de fosfa- to e a insolubilização de proteínas com sulfato de amônio, e não proporcio- nam qualquer seletividade, produzindo assim extratos que contêm altas con- centrações de fitoemaglutininas, e devem ser diluídos para obter extratos com um nível aceitável de toxidez. Além do aspecto biológico, os processos conhecidos incluem algumas etapas que tornam difícil preparar um produto que é ativo e também seguro. Os problemas que advêm durante a extração com tampões de diferentes intensidades iônicas e pH devem-se à alta con- centração de contaminantes protéicos e de polissacarídeos, que os tornam altamente viscosos, levando a problemas de baixa capacidade de filtração e tempos mais longos de processamento. Como elas são extrações aquosas, há também um alto risco de contaminação microbiana do extrato protéico, que é difícil de controlar, especialmente no caso de preparações altamente viscosas. Todas estas condições levam a uma perda de produto e tornam difícil obter extratos finais com um baixo teor de fitoemaglutininas e a corres- pondente padronização de multicomponentes. Vários processos foram usa- dos para solucionar o problema de limitar fitoemaglutininas, incluindo trata- mentos térmicos, que levam à degradação não apenas de fitoemaglutininas, mas também de inibidores de α-amilase, com o resultado de que os produ- tos obtidos são parcamente ativos. Na prática, os produtos existentes no mercado têm um teor muito baixo de inibidores de α-amilase. Outros produ- tos que são enriquecidos demais em inibidores de α-amilase causam pro- blemas desagradáveis de flatulência quando administrados em doses gran- des.
Descrição Detalhada Da Invenção
Descobriu-se surpreendentemente que preparando produtos en- riquecidos em inibidores de α-amilase, que têm um teor de fitoemaglutininas dentro de limites perfeitamente toleráveis, pode ser obtida uma redução no peso corporal proporcional à dose administrada. Os dados em ratos suge- rem que o efeito sobre a redução do peso corporal está associado não ape- nas a uma redução no nível plasmático de glicose, mas também a uma re- dução acentuada no consumo de alimentos. Vários experimentos farmacoló- gicos demonstram que esta redução na ingestão de alimentos, embora os alimentos estejam livremente disponíveis, não está associada com um efeito tóxico, mas com uma mudança no desejo de comer. Vários experimentos conduzidos primeiramente em animais e subseqüentemente em seres hu- manos permitiram o equilíbrio correto entre os componentes responsáveis pela redução no peso corporal, sem causar efeitos colaterais indesejáveis.
Os produtos de acordo com a invenção são preparados por exr tração aquosa e subseqüente precipitação fracionada com misturas apropri- adas de etanol e água.
O processo de acordo com a invenção usa misturas de etanol e água e produz um extrato enriquecido em inibidor de α-amilase, cuja ativida- de é igual ou maior do que 1.800 USP/mg (título por HPLC igual ou maior do que 15% em peso) e um teor de fitoemaglutininas entre 1.500 e 6.000 HAU/g, de tal modo que ele possa ser formulado em produtos para uso die- tético em doses suficientemente baixas, para obter o resultado desejado.
Além desta vantagem importante, o processo da invenção produz uma redu- ção significativa na contagem microbiana. Outra vantagem importante é a possibilidade de obter uma separação perfeita dos componentes principais contidos no extrato de partida, e conseqüentemente, um produto final alta- mente enriquecido em inibidor de α-amilase, com proporções definidas de fitoemaglutininas.
O processo da invenção compreende a extração de biomassa com tampões que têm um pH na faixa entre 3 e 6,5, de preferência pH 3,5- 5,5, e ainda mais preferivelmente pH 4, em temperaturas entre 2 e 25°C, de preferência entre 4 e 18°C, e a subseqüente separação do extrato da bio- massa por centrifugação.
Os tampões apropriados para a extração são tipicamente os tampões de fosfato, citrato ou acetato ou tampões de aminoácidos dicarboxí- licos, de preferência tampão de fosfato ou citrato.
Dependendo dos extratores usados e do ciclo de extração, são usados 5 a 20 volumes de tampão por parte do material de partida, de prefe- rência 10-12,5 partes, e a mistura é agitada por 1-4 horas, de preferência 2 horas; a biomassa pode ser extraída adicionalmente três vezes ou mais com uma quantidade apropriada de tampão, e em qualquer caso até que seu teor de inibidor de α-amilase e fitoemaglutininas seja exaurido.
Os extratos são combinados são clarificados por filtração e cen- trifugação, e concentrados sob vácuo em uma temperatura entre 25°C e 35°C, de preferência 30°C, ou por ultrafiltração (corte em 10.000 Da) até um volume correspondente a aproximadamente 10% do peso do extrato depois da centrifugação.
A próxima etapa é uma precipitação diferencial do extrato aquo- so concentrado com etanol diluído, em ua concentração final entre 40 e 50% em volume, de preferência 45% em volume, operando em uma temperatura entre 18°C e 30°C, e de preferência entre 20°C e 25°C. O precipitado enri- quecido em fitoemaglutininas é separado, e o filtrado é diluído adicionalmen- te com etanol até uma concentração de álcool de 60-70%, de preferência 65%.
O precipitado obtido pode ser centrifugado e/ou filtrado, redissol- vido em água desmineralizada e precipitado novamente em etanol a 60% para reduzir a parte salina. Alternativamente, ele pode ser diafiltrado através de uma membrana com um corte de 10.000 Da. O sedimento da precipita- ção, que constitui o extrato de acordo com a invenção, é secado. Caso estes processos sejam usados, pode ser obtido um extrato com as seguintes características:
- título por HPLC: > 15% em peso
- atividade inibitória de α-amilase: > 1.800 USP/mg - atividade hemaglutinante: > 1.500 < 6.00 HAU/g
A eficácia dos extratos foi comprovada em ratos que tiveram a- cesso livre a alimento, consistindo em uma dieta especial enriquecida em amido. Ratos Wistar, alojados individualmente em gaiolas em uma tempera- tura constante de 22 ± 2°C e 60% de umidade, foram divididos em grupos de 8-9 animais e tratados com uma sonda gástrica por 5 dias, em uma dose diária de acordo com o seguinte padrão:
-1° grupo: veículo (0,5% de metil-celulose, 4 mUkg);
- 2° grupo: 300 mg/kg do extrato descrito no Exemplo 2.
O consumo de alimento foi registrado imediatamente depois do final de cada sessão diária pesando os péletes (com uma precisão de 0,1 g). O consumo de alimento e o peso foram registrados durante o tratamento inteiro. A análise estatística foi conduzida com o teste ANOVA. Tabela 1
Consumo de Alimento (gramas/animal/dia) Durante os 5 Dias de Tratamen- to. Média (com η = 8-9) ± Erro-padrão
<table>table see original document page 7</column></row><table>
Plotagem dividida ANOVA versus controle e Dia 1 (* ρ < 0,05); porcentagens calculadas versus Dia 1.
Durante o tratamento, o extrato descrito no Exemplo 2 reduz o consumo de alimento, enquanto que o consumo de água permanece inalte- rado.
Durante os 5 dias depois da descontinuação do tratamento, o consumo de alimento foi uniforme e dentro da faixa normal (valores para o grupo de controle na Tabela 1) para todos grupos.
A Tabela 2 indica os dados de aumento de peso durante o tra- tamento.
Tabela 2
Peso Corporal (gramas/animal/dia) Durante os 5 Dias de Tratamento. Média (com n = 8-9) ± Erro-padrão
<table>table see original document page 8</column></row><table>
Plotagem dividida ANOVA versus controle (* ρ < 0,05); porcentagens calcu- ladas versus Dia 1.
O produto de acordo com a invenção é perfeitamente tolerado, e pode ser incorporado em formulações farmacêuticas ou dietéticas em doses na faixa entre 100 e 1.000 mg, para serem tomadas nas refeições principais. O extrato pode ser incorporado em formas bebíveis ou similares, para serem tomadas como supressores do apetite.
Os exemplos abaixo ilustram a preparação e as vantagens da invenção.
Exemplo 1
Preparação de um Extrato de Feijão-comum Enriquecido em Inibidor de a- Amilase por Extração com Tampão de Fosfato e Precipitações Seletivas com Etanol
Uma suspensão de 490 g de farinha de feijão-comum em 4,9 L de tampão de fosfato pH 4,2 foi agitada por 1 hora a +22°C.
A suspensão foi centrifugada e, depois da clarificação do centri- fugado aquoso sobre papel, concentrada até um peso correspondente àque- le do material extraído. O concentrado foi diluído com etanol a 95% até uma concentração de 45% de etanol, para dar um precipitado (rico em fitoema- glutininas e proteínas inutilizáveis) que foi separado por centrifugação a +25°C e descartado. O líquido centrifugado foi diluído adicionalmente com etanol a 95% até uma concentração de 65%, para dar um precipitado que, depois de centrifugação e lavagem com etanol a 65%, foi secado sob vácuo em uma temperatura menor do que 50°C. O produto obtido (rendimento de 1,2%) tem uma atividade inibitória de α-amilase de 4.200 U/mg, e uma ativi- dade hemaglutinante de 3.500 HAU/g (título por HPLC 35,6% em peso).
Exemplo 2
Preparação de um Extrato de Feijão-comum Enriquecido em Inibidor de a- Amilase por Extração com Tampão de Citrato e Precipitações Seletivas com
Etanol
Uma suspensão de 100 g de farinha de feijão-comum em 1,0 L de ácido cítrico a 5,75 g/L foi agitada por 4 horas a +4°C.
A suspensão foi centrifugada, e o centrifugado aquoso foi con- centrado 7,6 vezes (resíduo seco, 15,8% em peso). O concentrado foi diluí- do com etanol a 95% até uma concentração de 45% de etanol, para dar um precipitado (rico em fitoemaglutininas e proteínas inutilizáveis) que foi sepa- rado por centrifugação a +25°C e descartado. O líquido centrifugado foi dilu- ído adicionalmente com etanol a 95% até uma concentração de 65%, para dar um precipitado que, depois de centrifugação, foi secado sob vácuo em uma temperatura menor do que 50°C. O produto obtido (rendimento de 1,59%) tem uma atividade inibitória de α-amilase de 2.200 U/mg, uma ativi- dade hemaglutinante de 1.800 HAU/g e um título por HPLC 17,8% em peso).
Exemplo 3
Preparação de um Extrato de Feijão-comum Enriquecido em Inibidor de a- Amilase por Extração com Tampão de Citrato e Precipitação Seletiva com
Etanol
Uma suspensão de 120 g de farinha de feijão-comum em 1,2 L de ácido cítrico a 5,75 g/L foi agitada por 2 horas a +4°C.
A suspensão foi centrifugada, e o centrifugado aquoso foi con- centrado 6,8 vezes (resíduo seco, 10,0% em peso). O concentrado foi diluí- do com etanol a 95% até uma concentração de 45% de etanol, para dar um precipitado (rico em fitoemaglutininas e proteínas inutilizáveis) que foi sepa- rado por centrifugação a +25°C e descartado. O líquido centrifugado foi dilu- ído adicionalmente com etanol a 95% até uma concentração de 65%, para dar um precipitado que, depois de centrifugação, foi secado sob vácuo em uma temperatura menor do que 50°C. O produto obtido (rendimento de 0,85%) tem uma atividade inibitória de α-amilase de 3.650 U/mg, uma ativi- dade hemaglutinante de 1.900 HAU/g e um título por HPLC 34,3% em peso).
Claims (5)
1. Extrato obtenível por extração de Phaseolus sp. com soluções aquosas, caracterizado pelo fato de que tem um teor de inibidor de a- amilase com uma atividade igual ou maior do que 1.800 USP/mg (título por HPLC igual ou maior do que 15% em peso) e um teor de fitoemaglutininas entre 1.500 e 6.000 HAU/g.
2. Processo para a preparação do extrato como definido na rei- vindicação 1, compreendendo: (a) Extração de Phaseolus sp. com tampões aquosos que têm um pH na faixa entre 3 e 6,5, e subseqüente separação do extrato da bio- massa, que pode ser extraída adicionalmente com o tampão, caso necessá- rio, até que os inibidores de α-amilase e as fitoemaglutininas sejam exauri- dos; (b) Filtração ou centrifugação dos extratos combinados, e con- centração até um volume correspondente a aproximadamente 10% do peso do extrato depois da centrifugação; (c) Precipitação diferencial do extrato aquoso concentrado com etanol diluído, em uma concentração final de álcool entre 40 e 50% em vo- lume; (d) Separação do precipitado enriquecido em fitoemaglutininas e diluição adicional do filtrado ou centrifugado com etanol, até uma concentra- ção de álcool de 60-70%; (e) Separação do precipitado e reprecipitação a partir de água desmineralizada com etanol a 60%, ou diafiltração através de uma membra- na com corte em 10.000 Da, e secagem do resíduo da precipitação.
3. Processo, de acordo com a reivindicação 2, onde são usados tampões de fosfato, citrato ou acetato ou tampões de aminoácidos dicarboxí- licos.
4. Uso dos extratos como definido na reivindicação 1, para pre- parar supressores do apetite.
5. Composições que contêm os extratos como definido na rei- vindicação 1.
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