BRPI0620315B1 - Seqüência promotora obtida do arroz e métodos de uso - Google Patents
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Abstract
seqüência promotora obtida do arroz e métodos de uso. são proporcionados métodos pelos quais plantas oryza saliva e sementes das mesmas podem ser modificadas para expressar uma região de codificação de interesse usando uma seqúência promotora operativamente ligada à região de codificação. a seqúência promotora é uma seqúênciapromotora de antiquitina (osantl) de oryza saliva isolada, incluindo seq id no: 1. a região de codificação deinteresse pode codificar uma proteína de utilização de nitrogênio, adequadamente, aminotransferase de alanina. também são apresentados métodos de desenvolvimento de plantas oryza sativa que têm biomassa e rendimento de semente aumentado. além disso, podem ser produzidas plantas oryza sativa que mantêm um rendimento desejado, ao mesmo tempo em que reduz a necessidade de altos níveis de aplicação de nitrogênio.
Description
(54) Título: SEQÜÊNCIA PROMOTORA OBTIDA DO ARROZ E MÉTODOS DE USO (73) Titular: ARCADIA BIOSCIENCES, INC.. Endereço: 202 COUSTEAU PLACE, SUITE 200, DAVIS, CA 95616, ESTADOS UNIDOS DA AMÉRICA(US) (72) Inventor: ALLEN G. GOOD; MARY DEPAUW; ASHOK K. SHRAWAT
Código de Controle: AC7C98F28A8BFC89 96A5C52DFB31F493
Prazo de Validade: 10 (dez) anos contados a partir de 19/06/2018, observadas as condições legais
Expedida em: 19/06/2018
Assinado digitalmente por:
Liane Elizabeth Caldeira Lage
Diretora de Patentes, Programas de Computador e Topografias de Circuitos Integrados
Relatório Descritivo da Patente de Invenção para·.
SEQUÊNCIA PROMOTORA OBTIDA DO ARROZ E MÉTODOS DE USO
REFERÊNCIA REMISSIVA A PEDIDOS RELACIONADOS
O presente pedido reivindica o benefício do Pedido
Previsérie v.R.—No. 60./V53,84 8, depositado em 23 de
Dezembro de 2005.
CAMPO DA INVENÇÃO
A presente invenção se refere a uma sequência promotora obtida a partir do arroz, a métodos de uso da seqüência promotora e a plantas incluindo a sequência promotora.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
Plantas de safra têm uma dependência fundamental de fertilizantes nitrogenados inorgânicos, príncipalmente na forma de nitrato (NO3 ) e amônio (NH4 +) . A cada ano, aproximadamente 85 a 90 milhões de toneladas métricas (MMt) de fertilizantes nitrogenados são adicionados ao solo no mundo todo. Essa quantidade já foi de apenas 1,3 MMt em 1930-e de—-b0 ,C- MMt _em^-9K0 . É previsto que ela aumente para
240 MMt por volta de 2050 (Tilman et al., 1999, Proc. Nat.
Acad. Sei. USA. 96: 5995-6000). Estima-se que 50% a 70% do nitrogênio aplicado são perdidos do sistema planta-solo. Em virtude do fato de o NO:i ser solúvel e não retido pela matriz do solo, NO3' em excesso pode ser carreado pela água e pode ser consumido por microorganismos.
É importante melhorar a eficiência de uso de nitrogênio (EUN) de plantas de safra por duas razões.
_ Primeiro, ©~ uso de fertilizantes comerciais responde por um dos principais custos associados ã produção de safras de alto rendimento. Segundo, seria um benefício ambiental reduzir os níveis de fertilizantes nitrogenados que são perdidos no ecossistema. Efeitos ambientais incluem a deterioração da qualidade do solo, poluição e perigos para a saúde.
A alanina é um dos aminoácidos mais comuns em plantas.
A alanina é sintetizada pela enzima alanina aminotransferase (AlaAT) a partir de piruvato e glutamato em uma reação reversível, conforme mostrado na Figura 1. A alanina é um aminoãcido conhecido por aumentar sob outras condições ambientais específicas, tais como estiagem e estresse anaeróbico (Muench e Good, 1994, Plant Mol. Biol.
____24.:-^417---42-7-^- Vanderberge vet“ ãX.7 _1993 , Plant Physíol. 95:
655-658). Os níveis de alanina são conhecidos por aumentar substancialmente nos tecidos da raiz sob estresse anaeróbico. Como um exemplo, os níveis de alanina em raízes de cevada aumentam 20 vezes após 24 horas de estresse anaeróbico. 0 gene da AlaAT é induzido pela luz no sorgo e quando as plantas estão se recuperando de estresse por nitrogênio (Son et al., 1992, AlcIi. Bicchem. Biophys. 289:
262 266). Vanlerberge et al. (1993) mostraram que, em algas anaeróbias privadas de nitrogênio, a adição de nitrogênio na forma, de amônia resultou em 93% de um marcador Ni5 sendo incorporado diretamente na alanina. Assim, a alanina parece ser um aminoácido importante na resposta ao estresse em plantas.
A US 6.084.153 divulga a indução de AlaAT nas raízes de plantas de canola e um fenótipo eficiente de nitrogênio resultante.
WO 01/55433 ensina o uso do gene-26 de turgência da
Brassica (btg26). As proteínas relacionadas ao gene-26 de turgência foram recentemente denominadas antiquitinas (Tang et al., 2002, FEBS Lett. 516(1-3): 183-186). Plantas
Brassica napus foram recentemente transformadas com estruturas contendo o gene de AlaAT em ligação operativa com o promotor de btg26. Foi mostrado que as plantas transgênicas têm- níveús' elevados de AlaAT no tecido da raiz.
A US2005/0044585 divulga o USO de LeAMTl, LeNRTl,
GmNRT2, KDC1, PHT1, GOGAT, OsRAB5 e ALF5 para direcionar a expressão raiz-específica de um gene que codifica uma proteína de utilização de nitrogênio, por exemplo, AlaAT.
Aumento de EUN dentro do arroz também é desejado dentro da técnica. Em 2006, os acres no mundo todo, devotados ao crescimento de arroz eram de 151.730.000 hectares, com o consumo de nitrogênio estimado a 11.963
MMt. Assim, melhora da EUN em arroz não apenas diminuiría o custo de produção da safra, mas reduziría os efeitos ambientais prejudiciais de fertilizantes de nitrogênio, incluindo o desenvolvimento de zonas mortas nos oceanos do mundo, que resultam da morte e decomposição massiva de algas alimentadas por escoamento excessivo de nutrientes. SUMÁRIO DA INVENÇÃO
Objetivos da presente invenção são proporcionar uma seqüência promotora obtida a partir de Oryza sativa (arroz), métodos para uso da seqüência promotora e plantas incluindo a seqüência promotora.
Em uma modalidade, a presente invenção proporciona métodos pelos quais Oryza sativa pode ser modificada para expressar um gene alvo ou região de codificação de .interesse usando uma seqüência promotora operativamente ligada à região de codificação. Em outra modalidade, a presente invenção também proporciona métodos de produção de plantas Oryza sativa que têm biomassa e rendimento de semente aumentados. Aumentando a biomassa e rendimento de semente, são proporcionadas plantas Oryza sativa temas quais possuem um benefício ambiental devido ao fato delas poderem manter um rendimento desejado, ao mesmo tempo em que reduzem a necessidade de altos níveis de aplicação de nitrogênio.
..... São divulgados nina- sequência......pr-omofeora-—isolada de antiquitina (OsAntl} da Oryza sativa, incluindo SEQ ID NO:
1, e fragmentos da mesma.
Também é proporcionada uma estrutura genética incluindo uma seqüência promotora OsAntl, incluindo SEQ ID
NO:1 e fragmentos ativos da mesma, operativamente ligados a uma região de codificação de interesse que codifica uma proteína alvo. A proteína alvo pode ser uma proteína de utilização de nitrogênio, por exemplo, alanina aminotransferase (AlaAT).
Um vetor inclui uma estrutura genética com uma seqüência promotora OsAntl, incluindo SEQ ID NO: 1 e fragmentos ativos da mesma, operativamente ligada a uma região de codificação de interesse que codifica uma proteína alvo. _A_. proteína alvo—pode -ser—uma ypro terna- -de utilização de nitrogênio, por exemplo, AlaAT.
É descrito um método para direcionar a expressão de um gene alvo em uma planta Oryza sativa. O método pode incluir colocar em contato e introduzir, em uma planta Oryza sativa, o gene alvo em ligação operativa com uma seqüência promotora OsAntl, incluindo SEQ ID NO: 1 e fragmentos ativos da mesma, e a expressão do gene alvo. O gene alvo pode codifrcar uma proteína de utilização de nitrogênio, por exemplo, AlaAT. Além disso, a expressão do gene alvo pode ter.....ocrno ob.jet.ivo........um- tecido......-em- particular, por exemplo, a raiz da planta.
Também é deecrlto um método para aumento da biomassa de uma planta Oryza sativa através de colocar em contato e introduzir, em uma planta Oryza sativa, um gene alvo em ligação operativa com uma seqüência promotora OsAntl, incluindo SEQ ID NO: 1 e fragmentos ativos da mesma. 0 gene alvo pode codificar uma proteína de utilização de nitrogênio, por exemplo, AlaAT. Além disso, a expressão do gene alvo pode ter como objetivo um tecido em particular, por exemplo, a raiz da planta.
Também é descrito um método para aumento do rendimento de semente de uma planta Oryza sativa. O método pode incluir colocar em contato e introduzir, em uma planta
Oryza. sativa, nm. gene—alvo em-^ligaçãe- operativa—eom uma seqüência promotora OsAntl, incluindo SEQ ID NO: 1 e fragmentos ativos da mesma. 0 gene alvo pode codificar uma proteína de utilização de nitrogênio, por exemplo, AlaAT. Além disso, a expressão do gene alvo pode ter como objetivo um tecido em particular, por exemplo, à raiz da planta.
Também é descrita uma planta Oryza sativa transformada incluindo um gene alvo em ligação operativa com uma seqüência promotora Oryza sativa, incluindo SEQ ID NO: 1 e fragmentos ativos da mesma. 0 gene alvo pode codificar uma . proteína de utilização de nitrogênio, por exemplo, AlaAT.
É descrita uma semente de planta Oryza sativa incluindo um gene alvo em operação operativa com uma seqüência promotora OsAntl, incluindo SEQ ID NO: 1 e fragmentos ativos da mesma. 0 gene alvo pode codificar uma proteína de utilização de nitrogênio, por exemplo, AlaAT.
Esse sumário da invenção não descreve necessariamente todas as características da invenção.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
Essas e outras características da invenção se tornarão mais evidentes a partir da descrição a seguir, na qual é feita referência aos desenhos em anexo, em que:
A Figura 1 mostra uma representação esquemática das etapas chave na utilização de nitrogênio em uma célula de planta.—Nitrato- 4-ΝΘ3Α —é— transportado parla “célula de planta e convertido em nitrito (NO2 _) pela nitrato redutase (NR) . Nitrito é translocado do citoplasma para o cloroplasto, onde ele é reduzido pela nitrito redutase (NiR) em amônio (NH4 + ) . Glutamina sintetase (GS) funciona na assimilação ou reciclagem de amônio. Um par de enzimas, glutamina sintetase (GS)/ glutamato sintase(GOGAT) catalisa a conversão de glutamina (Gin) em glutamato (Glu)
Glutamato é um bloco de construção para muitos aminoácidos.
Além disso, alanina é sintetizada pela enzima alanina ami notra-ncif Ai-ace (.MaAT) a partir de piruvaxoe glutamato em uma reação reversível.
A Figura 2 mostra a seqüência de nucleotídeo para o promotor OsAntl da presente invenção (SEQ ID NO: 1) . A seqüência foi isolada usando uma busca pelo blastn do banco de dados NCBI usando a seqüência de nucleotídeo (366-3175 bp) do gene btg26 de Brassica (Stroeher et al., 1995, Plant
Mol. Biol. 27: 541-551) para identificar a seqüência de nucleotídeo de arroz homóloga (número de acesso AF323586).
Essa seqüência foi, então, usada, por sua vez, contra o projeto de seqüenciamento de Oryza sativa TIGR (veja: tigr.org/tdb/e2kl/osal/), conforme apresentado no Exemplo 1. A TATA box putativa é mostrada em negrito e os primers usados em amplificação por PCR da seqüência a partir do genoma uie-arroz-estão—sublinhados-.— — —--- —
A Figura 3 mostra uma representação esquemática das etapas para produção da estrutura genética OsAntlpro-Gus, usando o gene repórter de beta-glucuronidase (GUS) de acordo com o método descrito no Exemplo 2.
A Figura 4 mostra uma representação esquemática das etapas para produção da estrutura genética OsAntlpro-AlaAT de acordo com o método descrito no Exemplo 2.
A Figura 5 mostra a expressão do gene repórter GUS ri í Ή gi da peJLo promotor GsAnti da presente invenção.
Expressão está presente na área de expansão celular das pontas da raiz em raizes em desenvolvimento (Painel A) ; em pêlos da raiz de raízes em desenvolvimento (Painel B); e em raízes laterais de raízes (Painel C) de uma planta Oryza sativa transformada com a estrutura genética OsAntlpro-Gus, conforme mostrado na Figura 3, de acordo com o método descrito no Exemplo 3. Áreas coradas mais escuras indicam expressão do gene repórter GUS.
A Figura 6 mostra a biomassa média em peso seco (gramas) de plantas Oryza sativa transformadas com a estrutura genética OsAntlpro-AlaAT, conforme mostrado na
Figura 4, comparado com a biomassa média em peso seco (gramas) de plantas Oryza sativa do tipo selvagem ___submetidas às—mesmas condições de—urescimeiitoF “conforme fornecido no Exemplo 3.
A Figura 7 mostra o peso médio total de sementes (gramas) de sementes coletadas de plantas Oryza sativa transformadas com a estrutura genética OsAntlpro-AlaAT, conforme mostrado na Figura 4, comparado com o peso médio total de sementes (gramas) de sementes coletadas de plantas
Oryza sativa do tipo selvagem de controle que cresceram sob as mesmas condições de crescimento conforme fornecido no
Exemplo 3.
.5..... A......Figura 8 rrristra „a ..relação-.-satre a- biomassa -em pe-&o seco (gramas) e o peso total de semente (gramas) para cada planta transgênica.
DESCRIÇÃO DETALHADA
São descritos uma sequência promotora obtida do arroz, métodos de uso da seqüência promotora e uma planta de arroz e uma porção de uma planta de arroz incluindo a seqüência promotora.
A descrição a seguir é de uma modalidade preferida.
É descrita uma seqüência promotora para direcionar a expressão de uma região de codificação de interesse dentro de uma planta Oryza sativa. A seqüência promotora é uma seqüência promotora de antiquitina (OsAntl) de Oryza sativa isolada, incluindo SEQ ID NO: 1 e fragmentos ativos da ____mesma. ______ — ---------— ----------------------- 20 A expressão região de codificação de interesse inclui qualquer gene que é, desejavelmente, expresso em um ou mais de um tecido de planta. Exemplos de uma região de codificação de interesse a qual pode ser vantajosamente utilizada em conjunto com os métodos descritos aqui incluem sequências de ácido nucléico que codificam uma ou mais de uma proteína envolvida em assimilação de nitrogênio, utilização de nitrogênio ou combinações dos mesmos. Outros exemplos seriam sequências de ácido nucléico que codificam .uma— -orL- mais—de—«ntar—prot^íríãrenvolvida em captação e utilização de nitrogênio.
Porpromotor entenda-se a seqüência de uma molécula de DNA que direciona a transcrição de um gene a jusante ao qual ela está operativamente ligada ou que, quando fundida a um gene em particular e introduzida em uma célula, causa expressão do gene em um nível maior do que é possível na ausência da seqüência de DNA. Tais promotores podem ser promotores de comprimento total ou fragmentos ativos dos mesmos. Por fragmento ativo entenda-se um fragmento que tem pelo menos cerca de 0,1%, de preferência pelo menos cerca de 10% e, mais preferivelmente, pelo menos cerca de 25% da atividade de uma seqüência promotora de referência, conforme testado via métodos conhecidos por aqueles hab i ZJ_tados-na-técnica para Uetecção de atividade promotora, por exemplo, medição de níveis do gene repórter
GUS. Seqüências de DNA necessárias para atividade podem ser identificadas através de síntese de vários fragmentos e teste da expressão ou introdução de mutações de ponto em determinadas regiões e teste de perda de atividade.
Fragmentos heterólogos de promotores ou outras sequências promotoras podem ser combinados para mediar à atividade de uma seqüência promotora. Por exemplo, o promotor CaMV 35S ou outras seqüêncías promotoras conhecidas podem ser .5 combi narias.. com- a -seqüêne-ia —promotora descrita aqui · para mediar a expressão de uma região de codificação de interesse.
As estruturas genéticas descritas aqui também podem incluir outros intensificadores, quer intensificadores de tradução ou transcrição, conforme possa ser requerido.
Essas regiões intensificadoras são bem conhecidas por aqueles habilitados na técnica e podem incluir o códon inicial ATG e sequências adjacentes. O códon inicial deve estar em fase com a rede de leitura aberta da seqüência de codificação para assegurar tradução da seqüência inteira.
Os sinais de controle de tradução e códons iniciais podem ser de uma variedade de origens, naturais e sintéticas.
Regiões de início de tradução podem ser proporcionadas da __fonte__da -região—de- —início— de —transcri-ção ou do gene estrutural. A seqüência também pode ser derivada do promotor selecionado para expressar o gene e pode ser especificamente modificada para aumentar a tradução do mRNA.
As estruturas genéticas descritas aqui podem ainda incluir uma região não traduzida 3 ' (ou terminadora) que contém um sinal de poliadenilação e outros sinais regulatórios capazes de afetar o processamento de mRNA ou expressão- -de--gener—ΈΧθΓφΤοΒ naõ' límitativos de regiões 3 adequadas são as regiões não traduzidas 3 ’ transcritas contendo um sinal de poliadenilação de genes de plasmideo de indução de tumor (Ti) de Agrobacterium, tal como a nopalina sintase (gene Nos), genes de plantas, tais como os genes de proteína de armazenamento de soja, e a pequena subunidade do gene de carboxilase de 5-bifosfato, ribulose1 (ssRUBISCO).
Por 11 operativamente ligado ou ligação operativa entenda-se que as sequências em particular interagem, direta ou indiretamente, para realizar uma função pretendida, tal como mediação ou modulação de expressão de gene. A interação de sequências operativamente ligadas pode ser mediada, por exemplo, por proteínas que interagem com
O termo exógena, conforme usado aqui em referência a uma molécula de ácido nucléico, significa uma molécula de ácido nucléico originária do exterior da planta. Uma molécula de ácido nucléico exógena pode ter uma sequência de nucleotídeo que ocorre naturalmente ou não ocorre naturalmente. Aqueles habilitados na técnica compreenderão que uma molécula de ácido nucléico exógena pode ser uma molécula de ácido nucléico heteróloga derivada da mesma espécie de planta ou uma espécie de planta diferente da
5... plant-a—muléctrígr^é-^acictõNucléico é introduzida.
Alternativamente, ela pode ser uma molécula de ácido nuclêicõ 'derivada de uma espécie não vegetal, tal como fungos, levedos, bactérias ou outros organismos não vegetais.
Em virtude do fato de o nível de expressão de transgene em monocotiledôneas ser geralmente maior quando acionado por um promotor de monocotiledônea ao invés de um promotor de dicotiledônea, o genoma de arroz foi examinado para identificar um homólogo de btg26 de arroz. Isso foi feito usando uma busca pelo blastn usando a seqüência de aminoãcido do gene btg26 de Brassica (Stroeher et al.,
1995, Plant Mol. Bíol. 27: 541-551) contra o projeto de seqüenciamento de Oryza sativa TIGR (veja Exemplo 1) . O de üryzã sativa (OsAntl) foi identificado sobre o cromossoma 9 de arroz e uma seqüência promotora, a montante (5') do códon inicial ATG do gene
OsAntl, foi identificada (Figura 2; SEQ ID NO: 1). Essa seqüência promotora foi usada para acionar a expressão de uma região de codificação de interesse. Plantas expressando, por exemplo, mas não limitado a, AlaAT sob o controle da sequência promotora OsAntl, exibiram biomassa, rendimento de semente e EUN aumentados (veja Exemplo 3).
Portanto, é descrita a produção de plantas Oryza
- sat.úva q^ue expiessam ~ wt óu fnã: s genes alvo ou regiões de codificação de interesse. Ainda é proporcionado um método para aumento da biomassa de uma planta de arroz e um método para aumento do rendimento de semente de uma planta de arroz. Através dos métodos descritos aqui, é possível produzir plantas de arroz tendo um ou mais traços ou propriedades desejadas; por exemplo, alterar especificamente as propriedades genéticas da planta, as propriedades fisiológicas da planta ou as propriedades genéticas e fisiológicas da planta. Além disso, são descritos métodos de produção de plantas de arroz tendo expressão, nas raízes, de um ou mais de um gene desejado ou região de codificação de interesse, usando a sequência promotora OsAntl aqui divulgada.
_______________A—produção- d^ plantas “de-ãrrõz” tendo expressão de um ou mais de um gene alvo ou região de codificação de interesse é realizada usando a sequência promotora OsAntl da presente invenção, a qual direciona a expressão da região de codificação de interesse. A sequência promotora
OsAntl permite expressão da sequência alvo em um ou mais de um tecido da planta de arroz, adequadamente no tecido de raiz .
Será compreendido por aqueles habilitados na técnica que modificações podem ser feitas na sequência promotora
Osftntl út-i-1 - nos- -métodos- ê- estruturas da invenção para aperfeiçoar ou modular a atividade da seqüência promotora.
Regiões selecionadas da seqüência promotora OsAntl podem estar operativamente ligadas a uma única região de codificação alvo para alterar o nível de expressão da região de codificação ligada ou a seqüência promotora OsAntl pode estar operativamente ligada a uma ou mais de uma região de codificação alvo, de modo que a expressão de cada região de codificação alvo possa ser coordenadamente regulada. A seqüência promotora OsAntl pode ser de qualquer tamanho apropriado para permitir seu funcionamento como um promotor. A seqüência promotora OsAntl pode ser modificada usando métodos padrões conhecidos dentro da técnica, por exemplo, mas não limitado a, mutagênese, deleção, inserção, truncamento, para alterar o grau ao qual a região de codificação operativamente ligada é expresso ou alterar a especificidade de expressão dirigida pela seqüência promotora. Ainda, a colocação da seqüência promotora OsAntl com relação â região de codificação operativamente ligada pode ser modulada (por exemplo, movida para mais longe ou mais próximo da mesma) para obter um nível desejado de expressão pxomotor-dirigida.
Considera-se que a seqüência promotora OsAntl pode direcionar a expressão da região de codificação de . interessê -em- x es posta ' a uma condição ambiental ou fisiológica específica. Por exemplo, a seqüência promotora pode sêr ativada sob condições de estresse por estiagem, estresse osmótico, estresse por sal, estresse por temperatura, privação de nutriente ou sob condições de desenvolvimento específicas, por exemplo, mas não limitado a, quando de germinação, produção de frutos ou produção de semente.
Uma região de codificação de interesse, ou um gene alvo, da invenção pode ser qualquer seqüência de nucleotídeo que é, desejavelmente, expressa dentro de uma planta de arroz. Classes gerais de regiões de codificação as quais podem ser, vantajosamente, empregadas nos métodos e estruturas da invenção incluem seqüências de nucleotídeo ___.quer codií ieam—proteínas estruturais ; proteínas envolvidas no transporte de nitrogênio; proteínas envolvidas na captação de nitrogênio; proteínas envolvidas no transporte e captação de nitrogênio; enzimas e proteínas envolvidas com a utilização de nitrogênio; proteínas envolvidas com a resistência das plantas à pesticidas ou herbicidas;
proteínas envolvidas com a resistência a nematóides, vírus, insetos ou bactérias; proteínas envolvidas com a resistência ao estresse em plantas, por exemplo, mas não limitado a, estresse osmótico, temperatura, pH ou oxigênio; 5_ prot aí ng g... - crim -g - estiTOüTáçãb õü continuação de crescimento de planta; proteínas envolvidas em fitoremediação; ou proteínas com propriedades farmacêuticas ou enzimas de codificação que produzem compostos tendo propriedades farmacêuticas.
Por exemplo, a região de codificação de interesse pode codificar uma proteína de utilização de nitrogênio e, em particular, uma enzima que assimila amônia em aminoácidos ou usa os aminoácidos formados em reações biossintéticas.
Essa proteína pode ser selecionada de, umas não está limitada a, um transportador de nitrato (alta ou baixa afinidade), um transportador de amônio, um transportador de amônia, um transportador de aminoácido, alanina desidrogenase, glutamina sintetase (GS), asparaginase sinteta.se—(ASh — gluCamatxr -STnCa.se CCãmbénT conhecida como glutamato 2:oxoglutarato amino transferase e GOGAT), asparaginase (ANS), glutamato desidrogenase (GDH), nitrato redutase, aspartato aminotransferase (AspAT), alanina aminotransferase (AlaAT) e outras aminotransferases conhecidas. Tais proteínas são divulgadas na Publicação de
Pedido de Patente US Número 2005/0044585, o qual é incorporado aqui por referência em sua totalidade.
gene alvo ou região de codificação de interesse pode ser naturalmente expressa na planta de arroz ou pode ser heteróloga à pian-ta de arrcz. 0 gene pode se originar de qualquer fonte, incluindo fontes virais, bacterianas, vegetais óu animais. De preferência, a região de codificação de interesse é heteróloga à seqüência promotora OsAntl à qual ela está operativamente ligada, pelo fato de que ela não é do gene ao qual a seqüência promotora OsAntl está naturalmente relacionada.
A região de codificação pode ser modificada de qualquer forma adequada a fim de modificar um gene ou planta de arroz com propriedades desejáveis. A região de codificação pode ser modificada para ser passível de transcrição e tradução no sistema de planta; por exemplo, a seqüência de nucleotídeo que codifica a proteína de interesse pode ser modificada de modo que ela contenha jtodas - as -sequências -de-poliãdefiilãçaõ, sítios iniciais e sítios terminais necessários os quais permitem que a seqüência de codificação seja transcrita em mRNA (ácido ribonucléico mensageiro) e o mRNA seja traduzido na planta de arroz. Ainda, a região de codificação pode ser modificada de modo que seu uso de códon seja mais similar àquele de genes nativos da planta de arroz (isto é, uma sequência otimizada de planta pode ser usada). Tais modificações de sequência de nucleotídeo e os métodos pelos quais elas podem ser feitas são bem conhecidos por aqueles hab.ilitaudos na técnica.
As estruturas descritas aqui incluindo uma sequência promotora OsAntl-região de codificação de interesse são mais eficientemente introduzidas em uma planta de arroz, uma célula de planta de arroz ou protoplasto de planta através do uso de um vetor. Exemplos de vetores de expressão ou clonagem adequados para uso com a invenção são plasmídeos (tal como pAGOOl), cosmídeos, DNA ou RNA viral e mini-cromossomas. Vetores de planta apropriados são bem conhecidos na técnica (veja, por exemplo, Clark, M., ed.
(1997) Plant Molecular Biology: A Laboratory Manual.
Springer Verlag, ISBN: 3540584056, aqui incorporado por referência em sua totalidade).
Vetores podem, vantajosamente, conter um ou mais marca.dor.es- passíveis de seleção ou triagem expressáveis ou genes repórteres de plantas ou bactérias, de modo que a incorporação do vetor em uma célula ou protoplasto de planta de arroz possa ser monitorada. É preferível que tais marcadores passíveis de seleção ou triagem confiram um fenótipo prontamente detectãvel, tal como resistência a um composto de outro modo tóxico (por exemplo, resistência à canamicina) ou uma reação colorimétrica ou iuminescente quando a planta for incubada com um substrato apropriado (por exemplo, genes de beta-Glucuronidase GUS) ou ~1 uci fera.se) . Tais - genes repórteres sãc bem conhecidos na técnica.
As estruturas descritas aqui podem ser introduzidas em uma planta ou célula de planta de arroz através de qualquer método útil. Um grande número de processos estã disponível e são bem conhecidos para distribuir genes à células de planta. Um dos métodos mais conhecidos envolve o uso de
Agrobacterium, ou bactérias similares do solo como um vetor, em que a Agrobacterium ê transformada com a estrutura de interesse ou um vetor contendo a estrutura.
Tecidos alvo de uma planta são co-cultivados com a
Agrobacterium transformada a qual insere a seqüência de ácido nucléico de interesse no genoma da planta, conforme é descrito pela Patente U.S. 4.940.838 (Schilperoort et al.;
a_qual -é incorporada ^aqui por ~reTerencia em sua totalidade) e Horsch et al. (1985, Science 227: 1229-1231; o qual é incorporado aqui por referência em sua totalidade). Métodos alternativos de transferência e transformação de genes úteis na presente invenção incluem, mas não estão limitados a, lipossomas, eletroporação ou captação quimicamente mediada de DNA livre, técnicas de co-precipitação com fosfato de cálcio, microprojéteis alvejados e micro- ou macro -injeção, transformação direta de DNA e podem envolver plasmídeos Ti, plasmídeos Ri ou vetores de vírus de planta,
Tais métodos de transformação são bem documentados na técnica. Será compreendido por aqueles habilitados na técnica que o método escolhido para planta de arroz, célula de planta de arroz ou transformação de protoplasto será, em grande parte, determinado pela natureza da estrutura da seqüência promotora alvo OsAntl ou o vetor contendo a estrutura.
Uma planta Oryza sativa transformada incluindo uma região de codificação em ligação operativa com uma seqüência promotora OsAntl é descrita. Também é 15 proporcionada uma semente de planta Oryza sativa incluindo uma região de codificação em ligação operativa com a seqüência promotora OsAntl descrita aqui. As plantas de arroz transformadas e sementes produzidas de acordo com a presente invenção podem ser ainda úteis em programas de produção para a produção de plantas de arroz tendo mais de um traço desejado. Por exemplo, duas plantas de arroz transformadas da invenção, cada uma tendo expressão de um transgene desejado podem ser cruzadas usando métodos conhecidos para produzir prole que é caracterizada por ter expressão de ambos os transgenes. Dessa maneira, é possível produzir plantas de arroz transformadas tendo uma combinação de traços desejados expressos na planta.
Além disso, será compreendido por aqueles habilitados 5 na técnica- que—ãiíereTrtes^ lTariêdãdes^ de plantas podem ser mais ou menos passíveis de manipulação genética em geral;
portanto, pode ser vantajoso transformar primeiro uma variedade relacionada de planta de arroz através dos métodos e com as estruturas descritas aqui e, subseqüentemente, introduzir expressão do gene alvo na planta de arroz através de técnicas de cruzamento. Tais métodos e variedades de plantas apropriadamente relacionadas são bem conhecidos por aqueles habilitados na técnica.
Sementes podem ser coletadas de plantas de arroz transformadas, usando métodos bem conhecidos na técnica, e ainda usadas para re-crescimento das plantas transformadas e híbridos descritos aqui.
Os—métodos—e—estruturas descritos ãqui permitem a 20 produção de plantas e sementes de arroz tendo expressão de um ou mais genes desejados na planta de arroz. Há uma ampla variedade de possíveis aplicações das plantas descritas aqui incluindo, mas não limitado a, produção de plantas de arroz tendo tolerância aumentada ao estresse, captação
| aperfeiçoada | de nitrogênio, | utilização | aperfeiçoada | de |
| nitrogênio, | teor de nutriente | aperfeiçoado, rendimento | de | |
| nutriente | aperfeiçoado de | compostos | desejados | e |
| propriedades | fito-remediativas | . Aplicações | específicas | são |
ainda descritas abaixo.
As plantas descritas aqui são capazes de crescer sobre solos pobres em nutrientes. É bem conhecido na técnica que determinadas espécies de planta, particularmente plantas de safra, eliminam do solo os nutrientes necessários para sustentar o crescimento, tais como nitrogênio, fosfato e potássio. De forma a repor os nutrientes que faltam, é necessário fertilizar o solo (um procedimento caro e ambientalmente prejudicial) ou cultivar plantas conhecidas por depositar nutrientes que faltam no solo (por exemplo, trevo ou soja no caso de privação de nitrogênio). Contudo, essas alternativas podem ser menos economicamente aceitáveis. Os métodos descritos aqui permitem a expressão
| objetivada | de sequências | de | nucleotídeo | envolvidas | em |
| captação . de . nuferi-ente - | (por | êxémpTo, | moléculas | de | |
| transporte) | naqueles tecidos | i nos | quais ocorre captação ( | por | |
| exemplo, a | raiz ou pêlos | da | raiz) para | , desse modo, | |
| aperfeiçoar | a capacidade da | planta de arroz | de absorver | os |
nutrientes do ambiente.
Os métodos descritos aqui também podem ser usados para produzir plantas de arroz que expressara genes de utilização de nutriente nativos otimizados ou heterólogos ou regiões de codificação que permitem uso mais eficiente do nutriente, de modo que menos do nutriente (por exemplo, nitrogênio) é requerido para o crescimento e funcionamento normais da planta. Ainda, é possível, usando os métodos descritos aqui, expressar regiões de codificação de interesse envolvidas no uso e captação de nutrientes não usados normalmente pela planta de arroz, adequados naqueles tecidos de planta que são diretamente expostos a diferentes nutrientes (por exemplo, raiz e folha). Dessa maneira, podem ser produzidas plantas de arroz que são capazes de crescer e proliferar sobre diferentes fontes de nutriente (por exemplo, diferentes fontes de nitrogênio). Genes alvos particularmente úteis para a otimização de eficiência de nitrogênio da planta incluem: um transportador de nitrato (alta ou baixa afinidade), um transportador de amônio, um transportador- de -amônia, um transportador de aminoácido, alanina desidrogenase, glutamina sintetase (GS), asparaginase sintetase (AS), glutamato sintase (também conhecida como glutamato 2:oxoglutarato amino transferase e
GOGAT), asparaginase (ANS), glutamato desidrogenase (GDH), nitrato redutase, aspartato aminotransferase (AspAT) ou
6 alanina aminotransferase (AlaAT), tais como aqueles descritos no Pedido de Patente US Numero 2005/0044585, o qual é aqui incorporado por referência em sua totalidade.
As técnicas descritas aqui podem ser usadas para . 5 .. produzir - planta-s .....de.....arroz que podem utilizar mais eficientemente a carga de fertilizante através de captação rápida do nitrogênio fornecido pelo fertilizante e armazenamento do mesmo no momento de aplicação, desse modo, reduzindo a quantidade de fertilizante nitrogenado perdido por lixívia, etc. Isto pode permitir uma redução na quantidade de fertilizante nitrogenado necessário para ser utilizado na plantação de arroz para obter rendimentos de safra comparáveis àqueles obtidos utilizando técnicas normais de cultivo e plantas de arroz não modificadas de acordo com a presente invenção. Vantagens agronômicas adicionais podem incluir crescimento mais rápido e rendimento da safra de arroz, onde a carga de fertilizante nitrogenado é mantida em níveis usados em técnicas de
-culb ivo -de -safra —comuns.
Plantas Oryza sativa transformadas expressando uma seqüência de oligonucleotídeo que codifica alanina aminotransferase (AlaAT) em ligação operativa com a seqüência promotora OsAntl da presente invenção foram produzidas. Conforme mostrado no Exemplo 3, plantas transformadas expressando AlaAT sob o controle da sequência promotora OsAntl exibiram biomassa em peso seco maior e rendimentos aumentados de semente quando comparado com plantas de controle. Esses resultados indicam que plantas de arroz expressando uma AlaAT heteróloga sob o controle da sequência promotora OsAntl são capazes de otimizar a utilização de nitrogênio disponível, desse modo, resultando em um aumento na biomassa da planta, rendimento da semente ou uma combinação dos mesmos.
Portanto, são descritos métodos para aumento da biomassa de uma planta Oryza sativa, incluindo fornecimento de uma planta Oryza sativa com uma região de codificação de interesse em ligação operativa com uma sequência promotora
OsAntl descrita aqui. A região de codificação de interesse pode codificar uma enzima envolvida em otimização da eficiência de nitrogênio da planta, por exemplo, ela pode codificar alanina aminotransferase (AlaAT) e a expressão da região de codificação ocorre, adequadamente, na raiz.
-Também- é proporcionado' um método para aumento do rendimento de semente de uma planta Oryza sativa, incluindo fornecimento de uma planta Oryza sativa com uma região de codificação em ligação operativa com uma sequência promotora OsAntl descrita na presente invenção. A região de codificação de interesse pode codificar uma enzima envolvida em otimização da eficiência de nitrogênio da planta, por exemplo, pode codificar alanina aminotransferase (AlaAT).
A descrição acima não se destina a limitar a invenção
5_ reivindicada— de -quai-quer- maneira ã±êm “disso, a combinação discutida de características podería não ser absolutamente necessária para a solução da invenção.
Os exemplos a seguir ilustram adicionalmente determinadas modalidades da invenção.
EXEMPLOS
Exemplo 1: Isolamento e caracterização da seqüência promotora OsAntl
A seqüência de nucleotídeo (bp 366-3175) do gene btg26 (Stroeher et al. , 1995, Plant Mol. Biol. 27: 541-551;
número de acesso Ξ77096) foi usada para busca no banco de dados de nucleotídeo no NCBI usando a ferramenta de busca blastn. Uma seqüência de arroz (número de acesso AF323586) foi identificada e essa seqüência de nucleotídeo foi usada qjara— busca—no— projeto—de~ seqüenciãmento de Oryza sat iva
TIGR (tigr.org/tdb/e2kl/osal/). O homólogo de arroz de btg26, antiquitina de Oryza sativa (OsAntl), foi identificado sobre o cromossoma 9 de arroz (número de acesso AP005570; 98524-101189 pares de base). Uma seqüência de 973-bp a montante do códon inicial de OsAntl é mostrada na Figura 2 (SEQ ID NO: 1) . A seqüência dos 4 03 bps a montante (5') do códon inicial ATO do gene de OsAntl foi selecionada para análise. Para determinar se a seqüência provavelmente funcionava como uma seqüência promotora, a s&qüência foi analisada usando o software de previsão de promotor de planta TSSP encontrado em http://softberry.com/. A análise previu que a seqüência era uma seqüência promotora de planta. Foi determinada a localização mais provável da TATA box (negrito na Figura
2), bem como outros elementos da seqüência promotora,.
Uma vez que a seqüência promotora OsAntl projetada foi prevista como contendo elementos promotores de acordo com análise Softberry, as seqüências foram analisadas com relação a motivos promotores que podem ser sítios de reconhecimento para fatores de transcrição usando o Signal
Scan Software (Prestridge, 1991;
http://bimas.dcrt.nih.gov/molbio/signal). Cinco seqüências sinalizadoras diferentes foram previstas no promotor
QsAntl, incluindo - sítios de' ligação de fator de transcrição
ADR1 , DBF-A, GAL4 , HSTF e RAF.
A seqüência OsAntl foi comparada com seqüências de ácido nucléico de seqüências promotoras de bgt26 de
Brassica napus e Arabidopsis usando o software de alinhamento de múltiplas seqüências ClustalW 1.8 na homepage BCM Search Launcher (searchlauncher.bcm.tmc.edu/) e o servidor BOXSHADE {ch.embnet.org/software/B0X_/orm.html). A inspeção de nucleotídeos conservados revelou que as sequências .promotoras do gene-26 de turgência de Brassica e
Arabidopsis são mais similares uma à outra do que a seqüência OsAntl. Uma característica dentre todas as três seqüências promotoras são os tratos de polipirimidina (CT) evidentes dentro das seqüências de nucleotídeo. Esses tratos oscilam de 20-22 bases e são encontrados exatamente a montante das prováveis TATA box em todas as três seqüências promotoras. Além disso, a seqüência OsAntl tem um segundo trato de polipirimidina exatamente a montante do códon inicial ATG.
DNA genômico de arroz foi isolado do cv. Kitaake. Os seguintes primers de PCR (posições sublinhadas na Figura 2} correspondendo à região promotora OsAntl foram selecionados:
Thrimer 1: AGGAAGTGATTTTTAGCGTÃGCTG (SEQ ID NO: 2)
Primer 2: ATGGCAGAAGAGAGAGAGAGAGAGG (SEQ ID NO: 3).
PCR touch-down foi conduzido usando o DNA genômico de arroz e os primers acima. Um fragmento de 975-bp foi produzido. 0 fragmento amplificado por PCR foi ligado no vetor pCR$II-TOPO (Invitrogen) e transformado em células
TOPIO de E. coli. O plasmídeo resultante é designado pTriceOsAntlpro.
Análise de sequência indicou que o fragmento de PCR de
975-bp codifica uma sequência promotora designada a . següênri a premofeora- OsAntT. “Comparação do promotor OsAntl de cv. Kitaake com aquela do cv. Nipponbare {obtida do banco de dadõs) revelou que elas compartilham 99,9% de identidade. A TATA box putativa foi encontrada 14 5 bps a montante do códon inicial.
Exemplo 2: Estruturas genéticas contendo a sequência promotora OsAntl
Estruturas genéticas contendo a seqüência promotora OsAntl que aciona o gene repórter de beta-glucuronidase (GUS) (OsAntlpro-Gus) ou o gene AlaAT de cevada (OsAntlpro15 AlaAT) foram produzidas usando as etapas mostradas esquematicamente nas Figuras 3 e 4, respectivamente.
Estrutura RiceOsAntlpro-GUS
A estrutura RiceOsAntlpro-GUS foi produzida através de _____amplificação----do—-bemplate—pT-HiceCsAntlpro usando os seguintes primers:
Primer 3: seqüência promotora EcoRI-OsAntl
GGAATTCAGGAAGTGATTTTT (SEQ ID NO:4)
Primer 4: seqüência promotora NcoI-OsAntl
CATGCCATGGATGGCAGAAGA (SEQ ID NO:5)
Os fragmentos de PCR resultantes foram ligados no vetor binário de planta, pCAMBIAl305.1, digerido com EcoRI e Ncol para produzir uma estrutura pCAMBIA1305.1 riceOsAntlpro-GUS. As sequências de EcoRI e Ncol na „5......... extremidaêe--dos- primérs T ei 4Ç respectivamente, permitem a inserção do fragmento de PCR no vetor pCAMBIAl305.1, substituindo o promotor CaMV35s existente pela seqüência promotora OsAntl. A seqüência de Ncol (CCATGG) inclui um códon de Met, ATG, o qual esta em rede com o gene repórter
GUS e permite expressão do gene repórter GUS a partir da seqüência promotora OsAntl.
Estrutura RiceQsAntlpro-AlaAT
A estrutura RiceOsAntlpro-AlaAT foi produzida através de amplificação do template pT-RiceOsAntlpro usando os seguintes primers:
Primer 3: seqüência promotora EcoRI-OsAntl
GGAATTCAGGAAGTGATTTTT (SEQ ID NO: 4)
Primer 5: seqüência promotora Pstl-OsAntl
AAC1OCAGATGOC d^GAAGA CSEQ ID NO 6j e os fragmentos de PCR resultantes digeridos com EcoRI e PstI foram ligados no vetor binário de planta, pCAMBIA1300, digerido com EcoRI e PstI para produzir pCAMBIA1300riceOsAntlpro.
Um fragmento de DNA de AlaAT foi amplificado através de PCR usando pAGOOl como um Lemplate. pAGOOl é descrito na
Patente U.S. No. 6,084,153, onde ele é identificado como pbtg26/AlaAT/nos. Ele contém o promotor de btg26 ligado ao gene AlaAT de cevada com um terminador de nopalina sintase.
As sequências AlaAT/terminador nos de cevada foram amplificadas a partir do pAGOOl usando os seguintes primers:
Primer 6: seqüência PstlAlaAT
AACTGCAGATGGCTGCCACCG (SEQ ID NO: 7)
Primer 7: seqüência HindIII-terminador NOS
CCCAAGCTTCCCGATCTAGTA (SEQ ID NO: 8)
O fragmento AlaAT/nos resultante foi digerido com PstI e HindIII e ligado na pCAMBIA1300-riceOsAntlpro digerido com PstI e HindIII para produzir uma estrutura pCAMBIA1300riceOsAntlpro-AlaAT.
Exemplo 3: Transformação de plantas de arroz com vetores incluindo OsAntl
- -pCAf4BTA13O5 .T -riceOSAntl'pro-GÜS e pCAMBIA130020 riceOsAntlpro-AlaAT foram transferidas para a cepa EHA105 de Agrobacterium (Hood et al. , (1993) Transgenic Res. 2:
208-218) através de eletroporação (Sambrook et al., 1989 em
Molecular Cloning, A Laboratory Manual Cold Spring Harbor,
N. Y. : Cold Spring Harbor Laboratory Press) . Células de
Agrobacterium foram colocadas sobre meio AB sólido (Chilton et al. 1974) contendo 50 mg/1 de canamicina e incubadas a
28°C durante 3 dias. As bactérias foram, então, coletadas com uma espátula plana e re-suspensas em meio de cultura 5 . Líquido- - (R2--GL·, - Tabe.:a..... 1) através de ligeiro turbilhonamento antes de transformação dos tecidos de arroz.
Transformação de arroz
Sementes maduras de arroz (Oryza sativa L. cv.
Nipponbare) foram usadas no experimento de transformação.
As sementes foram descascadas e a superfície esterilizada com alvejante a 50% mais Tween-20 a 0,1% durante 10 min, seguido por imersão (1 min) em etanol a 70 % (v/v) e, então, enxaguar cinco vezes em água destilada estéril. Após esterilização, as sementes foram cultivadas sobre meio de indução de caule (NB, Tabela 1) e incubadas durante três semanas no escuro a 28°C.
Tabela 1. Meio usado para indução de caule, inoculação, cocultiira^. fase---de repouso, sêTéç ão, regeneração e enraizamento
Meio Composição
NBa Sal principal N6 e fonte de ferro
Meio de indução de (Chu (1975) Sei. Sin. 5: 659-668) +
Meio caule (esterilizar em filtro)
R2-CL
Meio de co-cultura líquido (esterilizar em filtro)
Composição sais principais e vitaminas B5 (Gamborg et al. (1968) Exp. Cell Res.
50: 151-158) + 3AA (100 mg/L de L'Trlptofano + 50 0 mg/1 de L-prolina +
500 mg/L de L-glutamina) + 500 mg/L de hidrolisato de caseína + 2,0 mg/L de 2,4-D + 0,5 mg/L de picloram + 30 g/L de sacarose, pH de 5,8, 0,3% de gelrita
Sais principais e menores R2, vitaminas e fonte de ferro sem sacarose (Ohira et al. (1973) Plant and Cell Physiol. 14.· 1113-1 121) + glicose a 0,25 M + aceto-siringona a
125 μΜ + tampão de MES a 10 mM, pH de
5,2 + tampão de fosfato de potássio a
0 mM, pH de 5,2 + 4 00 mg/L de L'cisteina + 2,0 mg/L de 2,4-D + 0,5 mg/L de picloram + 0,5 mg/L de. SAP, pH de 5,2
Sais principais e menores R2, vitaminas e fonte de ferro
R2-CS
Meio de co-cultura sem
Meio sólido (esterilizar em filtro)
R2-AS
Fase de repouso (esterilizar em filtro)
Composição sacarose (Ohira et al. (1973) Plant and Cell Physiol. 14: 1113-1 121) + glicose a 0,25 M + aceto-siringona a
ΊΖ5' μΜ + tampão de MES a 10 mM, pH de
5,2 + tampão de fosfato de potássio a 50 mM, pH de 5,2 + 400 mg/1 de Lcísteína + 2,0 mg/L de 2,4-D + 0,5 mg/L de picloram + 0,5 mg/L de BAP, pH de 5,2 + 0,3% de gelrita
Sais principais e menores R2, vitaminas e fonte de ferro sem sacarose + sacarose a 0,25 M + acetosiringona a 0,5 mM + tampão de MES a mM, pH de 5,0 + tampão de fosfato de potássio a 50 mM, pH de 5,0 + CaCl2 a 10 mM + 400 mg/L de L-cisteína +
2,0 mg/L de 2,4-D + 0,5 mg/L de pTcloram + 0,5 mg/L de BAP + 250 mg/L de cefotaxíma + 250 mg/L amoxicilina, pH de 5,0, 0,3% gelrita
R2S
Sais principais menores de de
Meio
Meio de seleção (esterilizar em filtro)
ΝΒΞ
Meio de seleção-ll (esterilizar em filtro)
PRN
Meio de préregeneração (esterilizar em filtro)
RN
-Medo denegeneração (esterilizar em filtro)
Composição vitaminas e fonte de ferro + 30 g/L de sacarose + 2,0 mg/L de 2,4-D + 0,5 mg/L de pícloram + 50 mg/L de “Tiígrõmicina + 250 mg/L de cefotaxima + 100 mg/L de amoxicilina, pH de 5,8,
0,3% de gelrita
Meio NB + 3AA + 2,0 mg/L de 2,4-D +
0,5 mg/L de Picloram + 50 mg/L de higromicina + 250 mg/L de cefotaxima + 100 mg/L de amoxicilina, pH de 5,8,
| 0,3% | de gelrita |
| Meio | NB + 3AA + 5 mg/L de ABA + 2 |
| mg/1 | de BAP + 0,5 mg/L de NAA + 50 |
| mg/L | de higromicina + 100 mg/L de |
| cefotaxima + 50 mg/L de amoxicilina, |
pH de 5,8, 0,4% de gelrita
Meio NB + 3 mg/L de BAP + 0,5 mg/L de
NAS + 50 mg/L de higromicina + 100 mg/L de cefotaxima + 50 mg/L de amoxicilina, pH de 5,8, 0,4% de gelrita
1/2 'MS (Murashíge e Skoog (1962)
Meio Composição
Meio de enraizamento Physiol. Plant 15: 473-497) + 50 mg/L (esterilizar em de higromicinab + 100 mg/L de filtro/autoclave) cefotaxima + 50 mg/L de amoxicilina, pH de 3,8, 0,3% de gelrita aMeio NB com 1,25 mg/L de CUSO4 bOpcional
Após três semanas, unidades nodulares embriogênicas de
3-5 mm de comprimento liberado do caule derivado de escutelo na interface explante/meio foram imersas em 25 ml de meio de co-cultura líquida (R2-CL, Tabela 1) contendo células de Agrobacterium na densidade de 3-5 x 10* 5 * * * 9 10 * * * * 15 células/mL (OD600 = 1 ) em uma placa de Petri de 100 mm de diâmetro durante 10-15 minutos. Unidades embriogênicas foram, então, secas sobre papel filtro esterilizado, transferidas para uma placa de Petri contendo meio de cocultura sólido (R2-C2, Tabela 1) e incubadas durante três dias a 25°C no escuro. Caule embriogênico co-cultivado foi,
----—entãortransferídó-para meio de repouso (R2-AS, Tabela 1) e incubada a 28°C no escuro durante uma semana.
Após uma semana, unidades embriogênicas não contaminadas foram, então, individualmente transferidas para meio de seleção (R2S, Tabela 1) contendo higromicina para seleção de tecido transformado e incubadas a 28 “C no escuro. Após 3 semanas de seleção sobre meio R2S, as unidades embriogênicas se tornaram marrom escuras com protuberâncias de cor marrom surgindo por toda a superfície do caule foram transferidas para meio de seleção NBS . íTahei a i) . Após 5.....semanas- de co-cuitura, as protuberâncias desenvolveram estruturas globulares de cor marrom que foram gentilmentê separadas do caule e incubadas durante 2 semanas na placa de Petri liberada. Após 2 semanas, essas estruturas globulares se converteram em caules de formato redondo, compactos e amarelados.
Os caules resistentes à higromicina, putativamente transgênicos, foram gentilmente separados, transferidos, cultivados sobre meio de pré-regeneração (PRN, Tabela 1) e, então, incubados durante mais uma semana. Todos os caules resistentes originários de uma única unidade nodular embriogênica co-cultivada foram agrupados em um setor da placa do PRN. Caules lobulados, de cor creme-branco, com uma aparência uniforme e seca foram individualmente transferidos—para- uneio —de regenerãçaó (RN, Tabela 1) , incubados durante 2 dias no escuro, então, mantidos durante três semanas sob um foto-período de 12/12-h (dia/noite) com luz proporcionada em uma intensidade de 55 pmoles/m por seg. Brotos verdes que se regeneraram de um caule resistente foram dissecados e sub-cultivados no tubo de ensaio contendo meio de enraizamento (R, Tabela 1) durante
1-2 semanas para promover raízes e brotos vigorosos antes de ser transferidos para vasos nas salas de crescimento.
Plantas transgênicas foram crescidas até maturidade em 5 vasos de 1-6 em contendo mistura para plantio em vaso sem solo (Metromix 220). As plantas foram mantidas em salas de crescimento ajustadas 28°C e fotoperíodos de 14/10 horas dia/noite. Fertilizante foi aplicado duas vezes por semana, começando duas semanas após plantio nos vasos. A mistura de fertilizante continha 225 g de fertilizante 20/20/20, 50 g de micronutrientes para planta, 6,1 g de CuSO4.5H2O, 140 g de FeEDTA,13,8 g de ZnSO4.7H2O, 260 g de MgSO4.7H2O, 3,7 g de H3BO3 para um total de 712,4 g. Dois gramas da mistura de fertilizante são dissolvidos em 8 litros de água e aplicados duas vezes por semana a 24 plantas.
Análise de expressão dirigida pela seqüência promotora
OsAntl
Indução de expressão dirigida pela seqüência promotora
Osfinbl—foi -examinada? usando plantas “dê arroz transformadas com a estrutura OsAntlpro-GUS. As plantas foram germinadas e crescidas hidroponicamente em condições estéreis em jarros Magenta. Plantas de duas semanas de idade foram coradas para atividade de GUS in vivo através de injeção, no meio de enraizamento, de 5 ml de tampão de fosfato a 50 mM (pH de 7,5) contendo X-gluc (ácido 5-bromo-4 cloro-3indolil-beta-glucurônico) a 0,2 mM e incubação das plantas nesse meio durante 1-24 horas. Tecido de raiz foi, então, visualizado sob um microscópio de dissecação e fotografias
Xorani—ti radas —as---quais- · são mo s t radá s””nã' Tigu r a 5.
Áreas coradas de escuro na Figura 5 indicam expressão do gene repórter GUS. Não há expressão do gene repórter GUS acionado pelo promotor OsAntl na ponta da raiz (especificamente, as células em divisão); contudo, expressão começa muito rapidamente na zona de expansão celular, exatamente atras da ponta da raiz. A seqüência promotora OsAntl direcionou a expressão do gene repórter GUS para os pêlos da raiz também. Ainda, da ponta da raiz em raízes mais maduras, expressão é perdida da raiz principal, mas raízes laterais coram muito pesadamente, indicando que OsAntl direciona expressão nessas raízes laterais muito fortemente.
Análise de plantas transformadas contendo a estrutura AlaAT __Cinqüenta c oito plantas transgénicas OsAnt1/AlaAT/NOS foram geradas e medições de floração, número de brotos, pesos da semente e biomassa na maturidade foram registrados para as plantas da geração TO.
A biomassa em peso seco de plantas OsAntl/AlaAT e plantas de controle foi medida na maturidade e os dados são apresentados na Figura 6. A biomassa média das plantas transgênicas OsAntl/AlaAT era raaioi do que a biomassa média de plantas de controle.
Sementes foram coletadas de plantas OsAntl/AlaAT e plantas- de eentroie na maturidade e o peso total das sementes foi medido. Os resultados são mostrados na Figura
7, a qual mostra que o peso total de semente das sementes coletadas de plantas OsAntl/AlaAT era maior do que aquele do peso das sementes de plantas de controle.
A Figura 8 mostra a relação entre a biomassa em peso seco e peso total de sementes para cada planta transgênica.
Uma substancialmente linear é mostrada, a qual indica que um aumento na biomassa resulta em um aumento correspondente em um peso total de semente em plantas OsAntl/AlaAT.
Esses resultados indicam que plantas transgênicas
OsAntl/AlaAT são capazes de otimizar a utilização de nutrientes disponíveis, desse modo, resultando em um aumento na biomassa da planta, rendimento de semente ou uma _OQTTih i n a ç§ o—dos- mesmos;--20 Todas as citações listadas aqui são aqui incorporadas por referência em sua totalidade.
A presente invenção foi descrita com relação a uma ou mais modalidades. Contudo, será evidente para aqueles habilitados na técnica que uma série de variações e modificações podem ser feitas sem se desviar do escopo da invenção, conforme definido nas reivindicações.
1/1
Claims (6)
- REIVINDICAÇÕES1. Construção genética caracterizada pelo fato de consiste de sequência promotora de antiquinina de Oryza sativa (OsAntl) definida pela SEQ ID NO:1 operativamente ligada a uma sequência de ácido nucleico heteróloga.
- 2. Construção genética, de acordo com a reivindicação1, caracterizada pelo fato de que a sequência de ácido nucleico heteróloga codifica uma proteina envolvida na utilização de nitrogênio.
- 3. Construção genética, de acordo com a reivindicação2, caracterizada pelo fato de que a proteina envolvida na utilização de nitrogênio é selecionada do grupo consistindo em um transportador de nitrato de alta afinidade, um transportador de nitrato de baixa afinidade, um transportado de amônio, um transportador de amônia, um transportador de aminoácidos, alanina desidrogenase, glutamina sintetase, asparagina sintetase, glutamato sintase, glutamato 2oxoglutarato aminotransferase, asparaginase, glutamato desidrogenase, nitrato redutase, aspartato aminotransferase e alanina aminotransferase.
- 4. Construção genética, de acordo com a reivindicação3, caracterizada pelo fato de que a proteina envolvida na utilização de nitrogênio é alanina aminotransferase.
- 5. Vetor caracterizado pelo fato de compreender a construção genética como definida na reivindicação 1.
- 6. Vetor, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o vetor é um vetor de planta binário.1/8Esquema de etapas chave em utilização de nitrogênio em uma célula de plantaParede celular2/8Região regulatória de OsAntlPrimer 1
1 AGGAAGTGAT TTTTAGCGTA GCTGTGTTTG TAGCGTAATT GCGTAAAGTC CTTTCAATTT 61 TGCTATATCT CACTCGAAAG ATTTTTTCTT ATCTCTCACT CGATTTTCTC ACTCAAATTT 121 ACAGTGTATT TTCTTGTAAG TTACAGTGTA ATTTATGAAA CTTACACTGT AACTTTTGTA 181 agttacactg TAATTTTTGA ATCTTCACAT GTAAATTTTA aattttgtat TGGATTTGGT 241 CTTTTTCTTG AGGATATGGT AATTTAATGT TCATTATGGT gtttcttaat TGCTTTTTGC 301 TTTTTATTAT ATCTATCGGA TTTTAATACA AAGATTAAAA ATCTGTGTGA TACGATTATA 361 AAAATCTTTC GAAAGATGTA TAGGTACTCC CAAGCCCTTT TAAGAAAGTT TTTCAAGACA 421 AAAGTTTTTG GATGAAAGGT AGTTATAGGG AAAAAGGAAT GTGCGTTTAT GTTTATTTGC 481 ATTGCTTATT GGCAACCAAA AACTAATCTA TAAGTAAATC TTTTATATAC GTGCGCTTAA 541 TAATTCAAAA GCAAATTCAT GTAAAATAAA ATGCGATGAA GAAACTTTAA AAAGTTATCA 601 AATTTAGATT TTATTAAATT TTAGTTTACA AGAGCGCTAC GATGAAGGCT TTAAAAAGAT 661 GGGAAAATAA AACCTTTGAC CTTTCTGGAG TTCACCAAAC AGCTCACGCT TTCGGCTTCG 721 TGCCGTCTCG TCCCGTGCTA CTGCTACCCC CTCCTGACCC CACCCGCCAC TCCACGCTCC 781 CTTCTCCTCC CCTTCCCGTG ACACACAGTC CCCACTCCAC CGCCTCCGTA TAAGTATCCC 841 TTCCTTACCG CCGGCCAGCC ACAGCCACCG CCTCCCCCAC CCCACCCCGA TCCCCTCCCC 901 GCCGTACGGG CGCAGAAGGA ACCCGTCTTC TAGAAGGAGG AGGAGGGCTA CCTCTCTCTC 961 TCTCTCTTCT Primer 2 GCC
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