BRPI0620469A2 - anticorpo humanizado anti-integrina alfa2, método para determinar se uma amostra contém a integrina alfa2, kit, ácido nucléico isolado, vetor, célula hospedeira, processo para produção de um anticorpo humanizado anti-integrina alfa2, método de triagem, composição, método para o tratamento de distúrbios associados com a integrina alfa2beta1 em pacientes, método para a inibição da ligação de leucócitos ao colágeno, método de direcionar uma molécula, uso de um anticorpo humanizado anti-integrina alfa2, embalagem e epitopo da integrina alfa2 que liga um anticorpo anti-integrina alfa 2 - Google Patents

anticorpo humanizado anti-integrina alfa2, método para determinar se uma amostra contém a integrina alfa2, kit, ácido nucléico isolado, vetor, célula hospedeira, processo para produção de um anticorpo humanizado anti-integrina alfa2, método de triagem, composição, método para o tratamento de distúrbios associados com a integrina alfa2beta1 em pacientes, método para a inibição da ligação de leucócitos ao colágeno, método de direcionar uma molécula, uso de um anticorpo humanizado anti-integrina alfa2, embalagem e epitopo da integrina alfa2 que liga um anticorpo anti-integrina alfa 2 Download PDF

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BRPI0620469A2 BRPI0620469-4A BRPI0620469A BRPI0620469A2 BR PI0620469 A2 BRPI0620469 A2 BR PI0620469A2 BR PI0620469 A BRPI0620469 A BR PI0620469A BR PI0620469 A2 BRPI0620469 A2 BR PI0620469A2
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ANTICORPO HUMANIZADO ANTI-INTEGRINA <244>2, MéTODO PARA DETERMINAR SE UMA AMOSTRA CONTéM A INTEGRINA <244>2, KIT, áCIDO NUCLéICO ISOLADO, VETOR, CéLULA HOSPEDEIRA, PROCESSO PARA PRODUçãO DE UM ANTICORPO HUMANIZADO ANTI- INTEGRINA <244>2, MéTODO DE TRIAGEM, COMPOSIçãO, MéTODO PARA O TRATAMENTO DE DISTúRBIOS ASSOCIADOS COM A INTEGRINA <244>2<225>1 EM PACIENTES, MéTODO PARA A INIBIçAO DA LIGAçãO DE LEUCóCITOS AO COLáGENO, MéTODO DE DIRECIONAR UNA MOLéCULA, USO DE UM ANTICORPO HUMANIZADO ANTI-INTEGRINA <244>2, EMBALAGEM E EPITOPO DA INTEGRINA <244>L2 QUE LIGA UM ANTICORPO ANTI-INTEGRINA <244>2. Esta invenção se refere a anticorpos anti-integrina <244>2 e suas utilizações. São descritos anticorpos humanizados que se ligam ao domínio i da integrina <244>2 e inibem a interação da integrina <244>2<225>1 com o colágeno. Também são descritos os usos terapeuticos dos anticorpos anti- integrina <244>2 no tratamento de distúrbios mediados pela <244>2<225>1, inclusive anticorpos anti-integrina <244>2 que se ligam à integrina <244>2 sem ativar as plaquetas.

Description

"ANTICORPO HUMANIZADO ΑΝΤΙ -INTEGRINA α2, MÉTODO PARA DETERMINAR SE UMA AMOSTRA CONTÉM A INTEGRINA (X2, KIT, ÁCIDO NUCLÉICO ISOLADO, VETOR, CÉLULA HOSPEDEIRA, PROCESSO PARA PRODUÇÃO DE UM ANTICORPO HUMANIZADO ANTI- INTEGRINA α2, MÉTODO DE TRIAGEM, COMPOSIÇÃO, MÉTODO PARA
O TRATAMENTO DE DISTÚRBIOS ASSOCIADOS COM A INTEGRINA α2β1 EM PACIENTES, MÉTODO PARA A INIBIÇÃO DA LIGAÇÃO DE LEUCÓCITOS AO COLÁGENO, MÉTODO DE DIRECIONAR UMA MOLÉCULA, USO DE UM ANTICORPO HUMANIZADO ANTI-INTEGRINA α2, EMBALAGEM E EPITOPO DA INTEGRINA (X2 QUE LIGA UM ANTICORPO ANTI-INTEGRINA a2". CAMPO TÉCNICO
A presente invenção refere-se no geral a anticorpos direcionados à integrina α2β1 e seus usos, inclusive anticorpos humanizados anti-integrina alfa 2 (a2) e métodos de tratamento com anticorpos anti-integrina a2.
CONTEXTO DA INVENÇÃO
A integrina α2β1 (antígeno muito tardio 2; VLA-2) é expressa em vários tipos de células, incluindo plaquetas, células endoteliais vasculares, células epiteliais, monócitos/macrófagos ativados, fibroblastos, leucócitos, linfócitos, neutrófilos ativados e mastócitos. (Hemler, Annu Rev Immunol 8:365:365-400 (1999); Wu and Santoro, Dev. Dyn. 206:169-171 (1994); Edelson et. al., Blood. 103 (6) :2214-20 (2004); Dickeson et al, Cell Adhesion and Communication. 5: 273-281 (1998)). Os ligantes mais comuns para a α2β1 são o colágeno e a laminina, ambos encontrados na matriz extracelular. Em geral, o domínio
I da integrina a2 se liga ao colágeno de maneira dependente de cátions divalentes, enquanto que o mesmo domínio se liga à laminina através de mecanismos dependentes e independentes de cátions divalentes. (Dickeson et al, Cell Adhesion and Communication. 5: 273- 281 (1998)). A especificidade da integrina α2β1 varia de acordo com o tipo de célula e funciona como um receptor de colágeno e/ou laminina para determinados tipos de células. A integrina α2β1, por exemplo, é conhecida como um receptor de colágeno para as plaquetas e como um receptor de laminina para células endoteliais. (Dickeson et al, J Biol. Chem. 272: 7661-7668 (1997)). O ecovírus- 1, a decorina, a E-caderina, a matriz metaloproteinase I (MMP-I), a endorepelina e várias colectinas e proteínas do complemento Clq também são ligantes da integrina α2β1. (Dickeson et al, J Biol. Chem. 107: 143-50 (2006)). A integrina α2β1 foi implicada em vários processos biológicos e patológicos, incluindo a agregação plaquetária induzida pelo colágeno, migração de células no colágeno, reorganização de fibras de colágeno dependente de células, assim como respostas celulares dependentes de colágeno que resultam em aumento da expressão e proliferação de citocinas, (Gendron, J. Biol. Chem. 278:48633-48643 (2003); Andreasen et al., J. Immunol. 171:2804-2811 (2003); Rao et al., J. Immunol. 165 (9) :4935-40 (2000)), aspects of T-cell, mast cell, and neutrophil function (Chan et. al., J. Immunol. 147:398- 404 (1991) ; Dustin and de Fougerolles, Curr Opin Immunol 13:286-290 (2001), Edelson et. al., Blood. 103 (6) : 2214-20 (2004), Werr et al., Blood 95:1804-1809 (2000), aspects of delayed type hyersensitivity contact hypersensitivity and collagen-induced arthritis (de Fougerolles et. al. , J. Clin. Invest. 105:721- 720 (2000); Kriegelstein et al., J. Clin. Invest. 110 (12) : 1773-82 (2002)), mammary gland ductal morphogenesis (Keely et. al., J. Cell Sei. 108:595-607 (1995); Zutter et al., Am. J. Pathol. 155 (3) :927-940 (1995)), epidermal wound healing (Pilcher et. al., J. Biol. Chem. 272:181457-54 (1997)), and processes associated with VEGF-induced angiogenesis (Senger et al., Am. J. Pathol. 160 (1) : 195-204 (2002)). As integrinas são heterodímeros compostos por uma subunidade α e uma subunidade β e constituem uma grande família de proteínas da superfície celular que serve de mediadora da adesão celular à matriz extracelular (MEC) , assim como às proteínas plasmáticas, e são essenciais para alguns tipos de interação celular. As integrinas interagem com seus componentes da matriz extracelular através de seus domínios extracelulares. (Pozzi & Zent, Exp Nephrol. 94:77-84 (2003)). Mediante a ligação aos ligantes, as integrinas fazem a transdução de sinais intracelulares para o citoesqueleto, os quais modificam a atividade celular em resposta a esses eventos de adesão celular, processo que é denominado sinalização outside-in (consulte por exemplo: Hemler, Annu Rev Immunol 8:365:365-400 (1999); Hynes, Cell. 110(6) :673-87 (2002)). Essa sinalização também pode ativar outros subtipos de integrinas expressas na mesma célula, denominada sinalização inside-out. A sinalização inside-out também ocorre através de sinais regulatórios originados no citoplasma celular, como a interrupção do clasp entre uma subunidade α e β, que são então transmitidos para o domínio externo de ligação do ligante do receptor. As integrinas podem exercer uma função importante nos eventos de adesão celular que controlam o desenvolvimento, a morfogênese, a fisiologia e patologia dos órgãos, assim como a homeostasia normal dos tecidos e as respostas imunes e trombótica, além de servirem como sensores do meio externo para a célula. Essas proteínas são caracterizadas por uma conformação fechada sob condições normais e sofrem uma rápida mudança de conformação mediante ativação, o que expõe o sítio de ligação do ligante. A microscopia por cristais de raios X é uma ferramenta recente que vem sendo usada no estudo da estrutura e dos mecanismos de ativação da integrina. A compreensão das características estruturais da integrina facilita o entendimento dos sítios de ligação, dos estados diferenciados e de suas formações ativa e inativa. Em geral, o sítio de ligação de um ligante/contra-receptor para todas as integrinas reside dentro do domínio α e é composto por um sítio de ligação dependente do íon metálico, conhecido como domínio MIDAS (Dembo et al, J Biol.Chem. 274, 32108-32111 (1988); Feuston et al. , J. Med. Chem. 46:5316-5325 (2003); Gadek et al., Science 295 (5557) :1086-9 (2002)); Gurrath et al. , Eur. J. Biochem. 210:911-921 (1992)). Nas subunidades α das integrinas ligadas ao colágeno, que incluem as integrinas αϊ, a2, alO e ali, o sítio MIDAS localiza-se em um domínio extra inserido no N-terminal conhecido como domínio I, A ou I/A, uma característica compartilhada com as subunidades α da família de leucócitos β2 de integrina (Randi and Hogg, J Biol Chem. 269: 12395-8 (1994), Larson et al J Cell Biol. 108 (2) : 703-12 (1989), Lee et al. , J Biol Chem. 269: 12395-8 (1995); Emsley et al, J. Biol. Chem. 272:28512-28517 (1997) and Cell 100:47-56 (2000)). Os domínios I são estruturalmente homólogos ao domínio Al do fator de von Willebrandt, com uma topologia de Rossman-fold de seis cadeias Folha Beta (β-sheet) cercada por sete hélices a-(Colombatti and Bonaldo, Blood 77 (11) :2305-15 (1991); Larson et al, J Cell Biol. 108 (2) :703-712 (1989); Emsley et al, J. Biol. Chem. 272:28512-28517 (1997); Noite et al; FEBS Letters, 452 (3) :379-385 (1999)). As integrinas de ligação ao colágeno apresentam uma hélice α adicional, conhecida como a hélice aC (Emsley et al, J. Biol. Chem. 272:28512- 28517 (1997) and Cell 100:47-56 (2000); Noite et al; FEBS Letters, 452(3):379-385 (1999)).
As interações integrina/ligante podem facilitar o extravasamento de leucócitos para os tecidos com processo inflamatório (Jackson et al. , J. Med. Chem. 40:3359-3368 (1997); Gadek et al., Science 295 (5557) :1086-9 (2002), Sircar et al. , Bioorg. Med. Chem. 10:2051-2066 (2002)), e exercem uma função importante nos eventos downstream após o extravasamento inicial de leucócitos da circulação para os tecidos em resposta a estímulos inf lamatórios, incluindo migração, recrutamento e ativação de células pró-inflamatórias no local da inflamação (Eble J.A., Curr. Phar. Des. 11 (7) : 867-880 (2005)). Foi relatado que alguns anticorpos que bloqueiam a integrina α2β1 apresentam impacto sobre as respostas de hipersensibilidade tardia e sobre a eficácia em um modelo murino de artrite reumatóide e um modelo de doença inflamatória do intestino (Kriegelstein et al., J. Clin. Invest. 110 (12) :1773-82 (2002); de Fougerolles et. al. , J. Clin. Invest. 105:721- 720 (2000) e que atenuam a proliferação de células endoteliais e a migração in vitro (Senger et al. , Am. J. Pathol. 160 (1) : 195-204 (2002), sugerindo que o bloqueio da integrina α2β1 pode prevenir/inibir a angiogênese anômala ou mais exacerbada que o normal, observada em vários tipos de câncer. As plaquetas normalmente circulam no sangue em um estado inativo de repouso; no entanto, são preparadas para responder rapidamente em locais de injúria, a uma grande variedade de agonistas. Quando estimuladas, as plaquetas sofrem alterações da forma e se tornam altamente reativas a proteínas plasmáticas como o fibrinogênio e o fator de von Willebrand (vWf), outras plaquetas e a camada endotelial da parede dos vasos. Todas essas interações facilitam a rápida formação do tampão hemostático de plaquetas/fibrina (Cramer, 2002 in Hemostasis and Thrombosis, 4th edition) . Com a ligação dos ligantes, os receptores das plaquetas fazem a transdução das vias do sinal outside-in, que por sua vez desencadeiam a sinalização inside-out o que resulta na ativação de receptores secundários como o receptor plaquetãrio do fibrinogênio e a integrina allbp3, causando agregação plaquetária. Acredita-se que os anticorpos ou miméticos de ligantes de peptídeo que se ligam ou interagem com os receptores plaquetários, induzam uma cascata de sinalização semelhante que leva à ativação plaquetária.
Mesmo uma pequena ativação plaquetária pode provocar respostas plaquetárias trombóticas, trombocitopenia e complicações hemorrágicas.
A α2β1 integrina 1 é a única integrina que se liga ao colágeno expressa nas plaquetas e acredita-se que tenha alguma função na adesão plaquetária ao colágeno e na hemostasia (Gruner et al., Blood 102:4021-4027 (2003); Nieswandt and Watson, Blood 102 (2):449-461 (2003); Santoro et al. , Thromb. Haemost. 74:813-821 (1995); Siljander et al., Blood 15:1333-1341 (2004); Vanhoorelbeke et al. , Curr. Drug Targets Cardiovasc. Haematol. Disord. 3 (2): 125-40 (2003)). Além disso, as α2β1 das plaquetas podem exercer uma função na regulação do tamanho do agregado plaquetário (Siljander et al., Blood 103(4):1333-1341 (2004)).
Foi também demonstrado que a integrina α2β1 é uma integrina que se liga à laminina expressa em células endoteliais (Languino et al. , J Cell Bio. 109:2455-2462 (1989)) . Acredita-se que as células endoteliais se liguem à laminina por meio de um mecanismo mediado pela integrina. No entanto, foi sugerido que o domínio oc2 I pode funcionar como uma seqüência especifica do ligante envolvida na mediação das interações das células endoteliais (Bahou et al. , Blood. 84(11) :3734- 3741(1994)).
Acredita-se que a ligação de um anticorpo terapêutico à integrina α2β1, inclusive a integrina α2β1 das plaquetas, possa resultar em complicações hemorrágicas. Por exemplo, os anticorpos que têm como alvo outros receptores plaquetários como o GPIb (Vanhoorelbeke et al. , Curr. Drug Targets Cardiovasc. Haematol. Disord. 3 (2) :125-40 (2003) ou GP Ilb/lIIa (Schell et al. , Ann. Hematol. 81:76-79 (2002), Nieswandt and Watson, Blood 102 (2) :449-461 (2003), Merlini et al. , Circulation 109:2203-2206 (2004)) foram associados com trombocitopenia, embora os mecanismos dessa associação não sejam bem compreendidos. Levantou-se a hipótese de que a ligação de um anticorpo a um receptor plaquetário pode alterar sua estrutura tridimensional e expor epitopos normalmente não expostos que, subseqüentemente, provocam a eliminação de plaquetas (Merlini et al. , Circulation 109:2203-2206 (2004). Na verdade, as complicações hemorrágicas associadas com doses orais de antagonistas de GP Ila/IIIb foram descritas como uo lado negro" dessa classe de compostos (Bhatt and Topol, Nat. Rev. Drug Discov. 2(l):15-28 (2003)). Se a integrina α2β1 tem uma função importante no movimento dos leucócitos no tecido com processo inflamatório, seria desejável desenvolver agentes terapêuticos que pudessem atuar na α2β1 para doenças associadas com a integrina α2β1 e/ou processos celulares associados a distúrbios como o câncer, doenças inflamatórias e doenças auto- imunes, se esses agentes não ativassem as plaquetas. Portanto, existe a necessidade de se desenvolver compostos que tenham como alvo a integrina α2β , tal como a integrina α2β1 nos leucócitos, que não sejam associados a complicações hemorrágicas adversas.
A anti-integrina α2β1 humana, que bloqueia o anticorpo BHA2.1, foi descrita pela primeira vez por Hangan et al., (Câncer Res. 56:3142-3149 (1996)). Outros anticorpos anti-integrina α2β1 são conhecidos e foram utilizados in vitro, como os anticorpos comercialmente disponíveis AK7 (Mazurov et al. , Thromb. Haemost. 66(4):494-9 (1991), P1E6 (Wayner et al., J. Cell Biol. 107 (5) : 1881-91 (1988)), IOGll (Giltay et al., Blood 73 (5) :1235-41 (1989) and A2-11E10 (Bergelson et al., Cell Adhes. Commun. 2(5):455-64 (1994). Hangan et ai., (Câncer Res. 56:3142- 3149 (1996)) utilizaram o anticorpo BHA2.1 in vivo para estudar os efeitos do bloqueio da função da integrina α2β1 sobre o extravasamento de células tumorais humanas no fígado e a capacidade dessas células tumorais de desenvolver focos metastáticos sob o tratamento com anticorpos. 0 anticorpo Hal/29 (Mendrick and Kelly, Lab Invest. 69 (6) :690-702 (1993)), específico para a integrina α2β1 de ratos e murinos, foi utilizado in vivo para estudar a suprarregulação da integrina α2β1 em células T após ativação viral do LCMV (Andreasen et al. , J. Immunol. 171:2804-2811 (2003)), para estudar a hipersensibilidade do tipo tardia induzida pelo SRBC e as respostas de hipersensibilidade induzida por contato com FITC e artrite induzida pelo colágenos (de Fougerolles et. al., J. Clin. Invest. 105:721- 720 (2000)), para estudar a função da integrina α2βΐ na angiogênese regulada pelo VEGF (Senger et al. , Am. J. Pathol. 160 (1) :195-204 (2002); Senger et al., PNAS 94(25): 13612- 7 (1997) ) e para estudar a função da integrina α2β1 na locomoção de leucócitos polimorfonucleares (PMN) em resposta ao fator de ativação plaquetãria (FAP) (Werr et al., Blood 95:1804-1809 (2000)).
O uso de anticorpos monoclonais de murinos, tais quais os descritos acima, como agentes terapêuticos para uso em pacientes não imunocomprometidos foi limitado por respostas imunes significativas dirigidas contra anticorpos de murino, principalmente após administrações repetidas. Essa resposta pode não somente abreviar a meia-vida efetiva dos anticorpos de murino em circulação, como também provocar reações no local de injeções profundas e/ou reações anafiláticas (Shawler et al. , J. Immunol. 135 (2) :1530 (1985)). Além disso, as funções efetoras de roedores associadas com regiões constantes (Fc) são muito menos efetivas do que a de humanos, quando a estes administrada,, resultando em perda da ativação do complemento e da atividade citotóxica mediada por células dependente de anticorpo (ADCC) potencialmente desejáveis. Portanto, existe a necessidade de se desenvolver anticorpos direcionados contra a integrina α2β1, inclusive para o tratamento de distúrbios associados à integrina α2β1, mecanismos e processos celulares, incluindo doenças inflamatórias e autoimunes. Adicionalmente, seria desejável desenvolver anticorpos anti-integrina α2β1 que não fossem associados ao desenvolvimento das reações observadas com anticorpos de murinos em pacientes.
BREVE DESCRIÇÃO DOS GRÁFICOS
Figura 1: Resultados gráficos de estudos sobre os efeitos dos anticorpos anti-integrina oi2 em doença paralítica nos modelos EAE de camundongos, quando administrado ao primeiro sinal da doença (Ver o exemplo 7) . Figura 2: Resultados gráficos de estudos sobre os efeitos da integrina ai em doença paralítica, quando administrada durante a fase de indução (Ver o exemplo 7).
RESUMO DA INVENÇÃO
A presente invenção proporciona anticorpos anti-integrina alfa 2 (ct2) e métodos para suas utilizações, especialmente os anticorpos humanizados anti-integrina alfa 2 (a2) e os métodos para utilização dos mesmos. Em determinadas utilizações, o anticorpo anti-integrina a2 inclui uma ou mais regiões constantes humanas (por exemplo: Cl e /ou CH) e uma região variável de cadeia leve composta pela seqüência de aminoácidos SEQ ID NO: 19 e/ou uma região variável de cadeia pesada composta pela seqüência de aminoácidos SEQ ID NO:21 ou variantes dessas seqüências de aminoácidos. Várias formas de anticorpos são abordadas neste documento. Por exemplo, o anticorpo anti-integrina a2 pode ser um anticorpo completo (ex: contendo regiões constantes da imunoglobulina humana) ou um fragmento de anticorpo (ex:. fragmentos Fab ou F(ab')2 ou Fab1 ou Fv ou scFv) . Além disso, o anticorpo pode ser marcado com um marcador detectável, imobilizado na fase sólida e/ou conjugado com um composto heterólogo (como um agente citotóxico).
São abordadas as utilizações diagnosticas e terapêuticas dos anticorpos anti-integrina α2, além da profilática e de prevenção. Para as utilizações diagnosticas, é apresentado um método para determinação da presença da proteína da integrina α2β1 por meio da exposição de uma amostra suspeita (que possa conter a proteína da integrina α2β1) e um anticorpo anti-integrina α.2, identificando-se a ligação do anticorpo à amostra. Para este uso, o kit fornecido é composto por um anticorpo anti-integrina a2 e instruções sobre como usar o anticorpo para detectar a proteína da integrina α2β1. As utilizações terapêuticas não se limitam ao tratamento de distúrbios, mecanismos e processos celulares associados à integrina α2β1, incluindo também doenças inflamatórias e doenças auto-imunes, em especial a esclerose múltipla. São abordadas as aplicações de anticorpos anti-integrina a2 na terapia gênica. Vários vetores (ex: vetores
retrovirais, cromossomos) que codificam as seqüências de genes das cadeias leve e pesada anti-0í2/?l podem ser transferidos para as células (ex: fibroblastos, células tronco) e gerar populações de células secretoras de anti- 0(2/31 MAb. Essas células podem possuir propriedades específicas de "homing" para diferentes tipos de células, tecidos e/ou órgãos. Essas células produtoras de anticorpos podem ser introduzidas em um paciente para liberação localizada de anticorpo monoclonal (MAb) anti- α2β1. Como exemplo, células tronco mesenquimais modificadas com um vetor anti-o;2/?l MAb poderiam ser injetadas no cérebro de um paciente com esclerose múltipla. As células tronco se diferenciam das células neurais e secretam o anti-a2jSl MAb para tratar a inflamação associada à esclerose múltipla. Além disso, o anti-o;2/3l pode ser conjugado a vírus que codificam genes terapêuticos (ex: ricina). Os vírus modificados se ligariam especificamente às células que expressam α2β1 na superfície celular, possibilitando o aumento da eficiência da transferência de transgenes.
Imunoconjugados compostos de complexos de anticorpo- lipossoma anti-o;2/3l que encapsulam ácidos nucléicos e codificam genes terapêuticos podem ser administrados ao paciente por via intravenosa. 0 imunoconjugado anti-o;2jSl se ligaria às células que expressam a integrina 0ί2β1 e facilitaria a captação eficiente de genes terapêuticos. Além disso, é fornecido um ácido nucléico isolado que codifica o anticorpo anti-integrina a2; um vetor composto por este ácido nucléico, opcionalmente e operacionalmente ligado a seqüências de controle reconhecidas pela célula do hospedeiro transformada com o vetor; uma célula do hospedeiro que contém esse vetor; um processo para a produção de anticorpo anti-integrina oc2 que consiste na cultura da célula do hospedeiro para que o ácido nucléico seja expresso e, opcionalmente, a recuperação do anticorpo da cultura da célula do hospedeiro (ex: do meio de cultura da célula do hospedeiro).
Também é fornecida uma composição contendo um anticorpo humanizado anti-integrina α2 e um carreador ou diluente farmaceuticamente aceitável . Composições para usos terapêuticos podem ser estéreis e podem ser Iiofilizadas. É fornecido, igualmente, um método para o tratamento de distúrbios associados à integrina α2β1 que consiste na administração de uma quantidade farmacologicamente eficaz de anticorpo anti-integrina α2 a um paciente, como o anticorpo humanizado anti-integrina α2 a um mamífero. Para tais utilizações terapêuticas, outros agentes (ex: outro antagonista da integrina α2β1) podem ser administrados concomi t ant ement e ao mamífero antes, após ou simultaneamente ao anticorpo anti-integrina α2. Da mesma forma, é fornecido um anticorpo humanizado anti- integrina α2 que possui uma região variável de cadeia pesada composta pela seqüência de aminoácidos (a) HCDR2 (VIWARGFTNYNSALMS, SEQ ID NO: 2), (b) HCDR1 (GFSLTNYGIH, SEQ ID NO :1), HCDR2 (VIWARGFTNYNSALMS, SEQ ID NO: 2) and HCDR3 (ANDGVY YAMD Y, SEQ ID NO: 3), ou (c) SEQ ID NO: 40. Em uma aplicação, a região variável da cadeia pesada mencionada acima é formada pela seqüência de aminoácidos SEQ ID NO:185.
Em outra aplicação, a região variável da cadeia pesada mencionada acima é formada pela seqüência de aminoácidos SEQ ID NO: 185 na qual (a) a posição 71 é Lys, (b) a posição 73 é Asn, (c) a posição 78 é Vai, ou (d) qualquer combinação de (a)-(c).
Ainda em outra aplicação, a região variável da cadeia pesada mencionada acima é formada pela seqüência de aminoácido selecionada de SEQ ID NOs: 70-79 e SEQ ID NOs:10 9-111.
Em uma aplicação, o anticorpo anti-integrina α2, mencionado acima, contém uma região FW4 formada pela seqüência de aminoácido WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:13). Em uma aplicação, o anticorpo anti-integrina a2 mencionado acima, corresponde à seqüência de aminoácidos HCDRl (SEQ ID N0:1), HCDR2 (SEQ ID NO:2) e HCDR3 (SEQ ID NO:3).
Em uma aplicação, o anticorpo anti-integrina a2, mencionado acima, contém também uma cadeia leve. A invenção fornece também um anticorpo humanizado anti- integrina a2 composto por uma região variável de cadeia leve, formada pela seqüência de aminoácidos de: (a) um LCDRl selecionado da SANSSVNYIH (SEQ ID NO:4) ou SAQSSVNYIH (SEQ ID N0:112), (b) LCDR2 (DTSKLAS; SEQ ID NO:5) e (c) LCDR3 (QQWTTNPLT, SEQ ID NO:6).
Em uma aplicação, a região variável da cadeia leve mencionada acima corresponde à seqüência de aminoácidos SEQ ID NO:186.
Em outra aplicação, a região variável da cadeia leve mencionada acima, consiste da seqüência de aminoácido SEQ ID NO:186 na qual: (a) a posição 2 é Phe, (b) a posição 45 é Lys, (c) a posição 48 é Tyr, ou (d) qualquer combinação de (a)-(c).
Em uma aplicação, a região variável da cadeia leve mencionada acima, consiste da seqüência de aminoácido selecionada de SEQ ID NO: 41, SEQ ID NOs: 80-92 e SEQ ID NO:108.
Em uma aplicação, o anticorpo humanizado anti-integrina a2 mencionado acima, consiste de uma região FW4 com a seqüência de aminoácidos FGQGTKVEIK da SEQ ID NO:38) . Em uma aplicação, o anticorpo humanizado anti-integrina a2 mencionado acima, consiste da seqüência de aminoácidos LCDRl (SEQ ID NO: 4), LCDR2 (SEQ ID NO: 5) and LCDR3 (SEQ ID NO:6).
Em uma aplicação, o anticorpo humanizado anti-integrina a2 mencionado acima, consiste também de uma cadeia pesada.
A invenção também fornece um anticorpo humanizado anti- integrina oc2 consistindo de:
(i) uma região variável de cadeia pesada composta pela seqüência de aminoácidos (a) HCDR2 (VIWARGFTNYNSALMS, SEQ ID NO: 2), (b) HCDRl (GFSLTNYGIH, SEQ ID NO:l), HCDR2 (VIWARGFTNYNSALMS, SEQ ID NO:2) e HCDR3 (ANDGVYYAMDY, SEQ ID NO:3), ou (c) SEQ ID N0:40; e (ii) uma região variável da cadeia leve composta pela seqüência de aminoácidos por (a) um LCDRl selecionado de SANSSVNYIH (SEQ ID NO:4) ou SAQSSVNYIH (SEQ ID NO:112), (b) LCDR2 (DTSKLAS; SEQ ID NO:5) e (c) LCDR3 (QQWTTNPLT, SEQ ID NO:6).
Também é fornecido o anticorpo humanizado anti-integrina ct2 mencionado acima, onde: (a) a região variável da cadeia pesada é composta pela seqüência de aminoácidos SEQ ID NO: 185, (b) a região variável da cadeia leve é composta pela seqüência de aminoácidos SEQ ID NO:186, ou (c) ambos (a) e (b).
Também é fornecido o anticorpo humanizado anti-integrina a2 mencionado acima, onde: (i) a região variável da cadeia pesada é composta pela seqüência de aminoácidos SEQ ID NO: 185 na qual (a) a posição 71 é Lys, (b) a posição 73 é Asn, (c) a posição 78 é Vai, ou (d) qualquer combinação de (a)-(c); (ii) a região variável da cadeia leve é composta pela seqüência de aminoácidos SEQ ID NO: 186 na qual (a) a posição 2 é Phe, (b) a posição 45 é Lys, (c) a posição 48 é Tyr, ou (d) qualquer combinação de (a)-(c); ou (iii) ambos (i) e (ii).
Também é fornecido o anticorpo humanizado anti-integrina a2 mencionado acima, onde: (a) a região variável da cadeia pesada é composta pela seqüência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NOs:70-79 e SEQ ID NOs:109-111; (b) a região variável da cadeia leve é composta pela seqüência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NO:41, SEQ ID NOs:80-92 and SEQ ID N0:108; ou (c) ambos (a) e (b) . Em uma aplicação, o anticorpo anti-integrina a.2 mencionado acima, reconhece o domínio da integrina a2 humana.
Em uma aplicação, o anticorpo anti-integrina a2 mencionado acima se liga à integrina α2β1. Em uma aplicação, o anticorpo anti-integrina a2 mencionado acima se liga a um epitopo da integrina a2 composto por:
(a) um resíduo Lys correspondente à posição 192 da seqüência de aminoácidos da integrina a2 expressa na SEQ
ID NO: 8 ou posição 4 0 da seqüência de aminoácidos do domínio I da integrina a2 expressa na SEQ ID NO:11;
(b) um resíduo Asn correspondente à posição 225 da seqüência de aminoácidos da integrina cx2 expressa na SEQ
ID NO: 8 ou posição 73 da seqüência de aminoácidos do domínio I da integrina a2 expressa na SEQ ID NO:11;
(c) um resíduo Gln correspondente à posição 241 da seqüência de aminoácidos da integrina ct2 expressa na SEQ
ID NO: 8 ou posição 89 da seqüência de aminoácidos do domínio I da integrina a.2 expressa na SEQ ID NO:11;
(d) um resíduo Tyr correspondente à posição 245 da seqüência de aminoácidos da integrina a2 expressa na SEQ
ID NO: 8 ou posição 93 da seqüência de aminoácidos do domínio I da integrina a2 expressa na SEQ ID NO:11;
e) um resíduo Arg correspondente à posição 317 da seqüência de aminoácidos da integrina a2 expressa na SEQ
ID NO: 8 ou posição 165 da seqüência de aminoácidos do domínio I da integrina a2 expressa na SEQ ID NO:11;
(f) um resíduo Asn correspondente à posição 318 da seqüência de aminoácidos da integrina a2 expressa na SEQ
ID NO: 8 ou posição 166 da seqüência de aminoácidos do domínio I da integrina a2 expressa na SEQ ID NO:11; ou
(g) qualquer combinação de (a) a (f) . Também é fornecido um anticorpo anti-integrina α2, onde o anticorpo se liga a um epitopo da integrina α2, epitopo composto por:
(a) um resíduo Lys correspondente à posição 192 da seqüência de aminoácidos da integrina a2 expressa na SEQ
ID NO: 8 ou posição 4 0 da seqüência de aminoácidos do domínio I da integrina a2 expressa na SEQ ID NO:11;
(b) um resíduo Asn correspondente à posição 225 da seqüência de aminoácidos da integrina a2 expressa na SEQ ID NO: 8 ou posição 73 da seqüência de aminoácidos do domínio I da integrina a2 expressa na SEQ ID NO:11;
(c) um resíduo Gln correspondente à posição 241 da seqüência de aminoácidos da integrina a2 expressa na SEQ ID NO: 8 ou posição 89 da seqüência de aminoácidos do domínio I da integrina a2 expressa na SEQ ID NO:11;
(d) um resíduo Tyr correspondente à posição 245 da seqüência de aminoácidos da integrina a2 expressa na SEQ ID NO: 8 ou posição 93 da seqüência de aminoácidos do domínio I da integrina a2 expressa na SEQ ID NO:11;
(e) um resíduo Arg correspondente à posição 317 da seqüência de aminoácidos da integrina ot2 expressa na SEQ ID NO: 8 ou posição 165 da seqüência de aminoácidos do domínio I da integrina a2 expressa na SEQ ID NO:11;
(f) um resíduo Asn correspondente à posição 318 da seqüência de aminoácidos da integrina a2 expressa na SEQ ID NO: 8 ou posição 166 da seqüência de aminoácidos do domínio I da integrina a2 expressa na SEQ ID NO:11; ou
(g) qualquer combinação de (a) a (f) . Em uma aplicação, o anticorpo humanizado anti-integrina a.2 mencionado acima é um anticorpo completo. Em uma aplicação, o anticorpo humanizado anti-integrina a2 mencionado acima é um fragmento de anticorpo.
Em uma aplicação, o anticorpo humanizado anti-integrina a2 mencionado acima se liga a um marcador detectável.
Em uma aplicação, o anticorpo humanizado anti-integrina a2 acima mencionado é imobilizado na fase sólida. Em uma aplicação, o anticorpo humanizado anti-integrina a2 mencionado acima inibe a ligação da integrina a2 ou α2βΐ a um ligante da integrina α2β1.
Em uma aplicação, o ligante da integrina α2β1 é selecionado do colágeno, laminina, Ecovírus 1, decorina, E-caderina, matriz metaloproteinase I (MMP-I) , endorepelina, colectina e proteína do complemento Clq.
A invenção também fornece um método para determinar se uma amostra contém a integrina α2, a integrina α2β1, ou ambas, colocando a amostra em contato com o anticorpo humanizado anti-integrina a2 mencionado acima e determinando se o anticorpo se liga à amostra, sendo que a ligação é uma indicação de que a amostra contém a integrina α2, integrina α2β1 ou ambas. A invenção também fornece um kit contendo o anticorpo humanizado anti-integrina α2, opcionalmente contendo instruções sobre como usá-lo para detectar a proteína da integrina cx2 ou α2β1.
A invenção também fornece um ácido nucléico isolado que codifica o anticorpo humanizado anti-integrina α2β1 mencionado acima.
A invenção também fornece um vetor composto pelo ácido nucléico mencionado acima.
A invenção também fornece uma célula hospedeira que contém o ácido nucléico ou o vetor mencionado acima.
A invenção também inclui um processo para produção de um anticorpo humanizado anti-integrina a2 que consiste na cultura da célula hospedeira mencionada acima, em condições que permitam a expressão do anticorpo. Em uma aplicação, o método compreende, além disso, a recuperação do anticorpo humanizado anti-integrina a2 da célula hospedeira. Em outra aplicação, o método compreende a recuperação do anticorpo humanizado anti-integrina cc2 de um meio de cultura de células hospedeiras..
A invenção também fornece um método de triagem que abrange: a detecção da ligação da integrina a2 ou 2βΐ a um anticorpo contendo a região VL da SEQ ID NO: 19 e a região VH da SEQ ID NO: 21 na presença versus a ausência de um anticorpo de teste e a seleção do anticorpo de teste se sua presença estiver correlacionada à redução da ligação da integrina a2 ou α2β1 ao anticorpo que contém a região VL da SEQ ID NO:19 e a região VH da SEQ ID NO:21. Em uma aplicação, a integrina c*2 ou α2β1 é imobilizada em um suporte sólido.
A invenção também fornece um método de triagem que abrange: a detecção de ligação da integrina α2β1 ao colágeno na presença de um anticorpo de teste onde o anticorpo se liga a um domínio I α2; a detecção da ligação de um anticorpo de teste ao domínio I a2 na presença de íons Mg++; a detecção da ligação do anticorpo de teste ao domínio I a2 na presença de íons Ca++; a detecção da ligação do anticorpo de teste ao domínio I α2 na presença de um meio sem cátions; e a seleção de um anticorpo de teste se for identificada inibição da ligação da integrina α2β1 ao colágeno e ligação ao domínio I α2 na presença de íon Mg++ e Ca++ e meio sem cátions.
A invenção também fornece uma composição contendo o anticorpo humanizado anti-integrina α2 mencionado acima e um carreador farmaceuticamente aceitável.
A invenção também fornece um método para o tratamento de distúrbios associados com a integrina α2β1 em pacientes, sendo que o método consiste na administração ao paciente de uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo anti-integrina a2 mencionado acima ou de uma composição.
A invenção também inclui um método para a inibição da ligação de leucócito a colágeno, que consiste na administração ao paciente de uma quantidade suficiente do anticorpo anti-integrina α2β1 mencionado acima, para inibir a ligação dos leucócitos ao colágeno.
A invenção também fornece a utilização do anticorpo humanizado anti-integrina a2 mencionado acima como um medicamento.
A invenção também fornece a utilização do anticorpo humanizado anti-integrina a2 mencionado acima ou de uma composição para o tratamento de distúrbios associados a integrina α2β1.
A invenção também fornece a utilização do anticorpo humanizado anti-integrina α2 mencionado acima ou de uma composição para a preparação de um medicamento para o tratamento de distúrbios associados à integrina α2β1.
A invenção também fornece uma composição para o tratamento de distúrbios associados à integrina α2β1, composta pelo anticorpo humanizado anti-integrina α2 mencionado acima e um carreador ou diluente farmacologicamente aceitável
A invenção também inclui uma embalagem contendo o anticorpo humanizado anti-integrina a2 mencionado acima ou uma composição, juntamente com instruções, para o tratamento de um distúrbio associado à integrina α2β1. Para as aplicações, o distúrbio associado à integrina α2β1 é diferenciado da doença inflamatória, da doença auto-imune e das doenças caracterizadas por angiogênese alterada ou aumentada.
Para as aplicações, o distúrbio associado à integrina α2β1 é diferenciado da doença inflamatória do intestino, doença de Crohn, colite ulcerativa, rejeição de transplantes, neurite óptica, trauma da coluna vertebral, artrite reumatóide, lúpus eritematoso sistêmico (LES) , diabetes mellitus, esclerose múltipla, síndrome de Reynaud, encefalomielite auto-imune experimental, síndrome de Sjorgen, escleroderma, diabetes juvenil, retinopatia diabética, degeneração macular relacionada à idade, doença cardiovascular, psoríase, câncer e infecções que induzem a uma resposta inflamatória. Para as aplicações, o distúrbio associado à integrina α2β1 é diferenciado da esclerose múltipla (ex: caracterizada por recidiva, tratamento agudo, retardo no tratamento), artrite reumatóide, neurite óptica e trauma da coluna vertebral.
Para as aplicações, o método mencionado acima não é associado a: (a) ativação plaquetária, (b) agregação plaquetária, (c) redução na contagem de plaquetas circulantes, (d) complicações hemorrágicas, ou (e) qualquer combinação de (a) a (d).
Em uma aplicação, o anticorpo anti-integrina a2 mencionado acima contém uma cadeia pesada, composta por SEQ ID NO: 174 ou SEQ ID NO: 176, e uma cadeia leve, composta por SEQ ID NO:178).
Em uma aplicação, o anticorpo anti-integrina a2 mencionado acima inibe de maneira competitiva a ligação de um anticorpo composto por uma região UL de SEQ ID NO: 19 e uma região VH de SEQ ID NO: 21 à integrina humana α2β1 ou o domínio I da mesma.
Em uma aplicação, o método mencionado acima é associado ao alívio de uma exacerbação ou seqüela neurológica decorrente de esclerose múltipla.
Em uma aplicação, o anticorpo anti-integrina a2 mencionado acima inibe a ligação da integrina α2β1 ao colágeno e não é um mimético do ligante. Inclui também um método alvo para uma dada fração, como uma molécula, proteína, ácido nucléico, vetor, composição, complexo, etc., para um sítio caracterizado pela presença de um ligante da integrina α2β1, sendo que o método consiste em anexar ou ligar uma fração ao anticorpo humanizado da integrina a2 mencionado acima.
Inclui também um epitopo da integrina a2 que liga um anticorpo anti-integrina α2, sendo que o epitopo não é composto pelo sítio de ligação do ligante da integrina α2, : Para as aplicações, a ligação ao epitopo não está associada a: (a) ativação plaquetária, (b) agregação plaquetária, (c) diminuição da contagem de plaquetas circulantes, (d) complicações hemorrágicas, (e) ativação da integrina a2 ou (f) qualquer combinação de (a) a (e). Anticorpos preferenciais se ligam ao domínio I da integrina α2β1 humana. Especificamente, os anticorpos preferenciais são capazes de bloquear a adesão dependente de oc2 de células à matriz extracelular (MEC), especificamente ao colágeno ou à laminina ou, ainda, a ambos. Anticorpos humanizados são fornecidos, incluindo anticorpos baseados em um anticorpo aqui denominado TMC- 2206. Os anticorpos anti-integrina a2 fornecidos são altamente específicos para a integrina humana α2β1, e sua administração não está associada a efeitos indesejáveis como complicações hemorrágicas ou complicações ocorridas devido à ativação celular. A especificidade da ligação (ex:, especificidade pelo epitopo) desses anticorpos está associada ao perfil não hemorrágico inesperado dos mesmos.
O anticorpo humanizado anti-integrina α2β1 pode possuir uma região variável de cadeia pesada contendo a seqüência de aminoácidos HCDRl (GFSLTNYGIH; SEQ ID NO:l) e/ou HCDR2 (VIWARGFTNYNSALMS; SEQ ID NO:2) e/ou HCDR3 (ANDGVYYAMDY; SEQ ID NO:3). O anticorpo humanizado anti-integrina α2β1 pode possuir uma região variável de cadeia leve contendo a seqüência de aminoácidos LCDR1 (SANSSVNYIH; SEQ ID NO: 4 ou SAQSSVNYIH; SEQ ID NO:112) e/ou LCDR2 (DTSKLAS; SEQ ID NO:5) e/ou LCDR3 (QQWTTNPLT; SEQ ID NO:6). Em determinadas aplicações, o anticorpo humanizado anti- integrina α2β1 pode possuir uma cadeia pesada contendo a seqüência de aminoácidos HCDRl (GFSLTNYGIH; SEQ ID NO:1) e/ou HCDR2 (VIWARGFTNYNSALMS; SEQ ID NO: 2) e/ou HCDR3 (ANDGVYYAMDY; SEQ ID NO: 3) e uma região variável de cadeia leve contendo a seqüência de aminoácidos of LCDR1 (SANSSVNYIH; SEQ ID NO: 4 ) e/ou LCDR2 (DTSKLAS; SEQ ID NO: 5) e/ou LCDR3 (QQWTTNPLT; SEQ ID NO:6). Em outras aplicações, o anticorpo é composto por uma variante de seqüência de aminoácidos de um ou mais desses CDRs, a qual é composta por uma ou mais inserções de aminoácidos no interior ou adjacente a um resíduo CDR e/ou deleção(ões) no interior ou adjacente a um resíduo CDR e/ou substituição(ões) de resíduo(s) sendo que a(s) substituição(ões) constituem o tipo preferencial de aminoácidos para a produção dessas variantes.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
A presente invenção inclui anticorpos especificamente reativos com a integrina humana alfa 2 (a2), incluindo anticorpos humanizados e métodos para o seu uso. Os anticorpos humanizados possuem regiões do arcabouço humano (framework FWs) e regiões determinantes de complementaridade (CDRs) de um anticorpo não humano, tipicamente do camundongo, especificamente reativas com a integrina humana a2. Codificações de seqüências de nucleotídeos e seqüências de aminoácidos compostas por anticorpos de cadeia pesada e leve são fornecidas. Em aplicações preferenciais, uma ou mais das regiões CDR são derivadas do, ou baseadas no anticorpo de murino secretado pelo clone hibridoma BHA2.1 [aqui denominado como anticorpo TMC-2206]. Também são incluídos anticorpos com propriedades de ligação semelhantes e anticorpos (ou outros antagonistas) com funcionalidade semelhante a dos anticorpos discutidos neste documento. Anticorpos preferenciais anti-integrina a2 incluem aqueles que: (a) se ligam ao domínio I da integrina α2, (b) inibem a função da integrina a2 (ex:, ligação ao colágeno ou à laminina) , (c) se ligam à integrina a2 em plaquetas em repouso sem induzir a ativação plaquetária e (d) reconhecem o epitopo de ligação do TMC-22 06 (ex:, competem com o TMC-22 06 para a ligação da integrina ot2) . Esses anticorpos podem se ligar preferencialmente à conformação inativa ou fechada da molécula da integrina oc2 sem competir pelo sítio de ligação do ligante. As vantagens inesperadas dos anticorpos anti-integrina α2, conforme descritas neste documento, que se ligam preferencialmente à conformação fechada da integrina α2β1 e/ou se ligam à integrina α2βΐ sem competir pelo sítio de ligação do ligante (ex: não são um ligante mimético) incluem o potencial de prevenção da ativação plaquetária, agregação plaquetária, redução na contagem de plaquetas circulantes e/ou complicações hemorrágicas em indivíduos tratados.
As "complicações hemorrágicas" mencionadas neste documento se referem a qualquer efeito adverso que ocorra em nível sangüíneo ou sua fisiologia, incluindo reações trombóticas plaquetárias, trombocitopenia, aumento do tempo de coagulação, aumento do tempo de sangramento e perda de sangue que limite o uso terapêutico do anticorpo anti-integrina α2 .
A integrina α2β1 é uma molécula composta por uma subunidade da integrina cc2 (veja ex: SEQ ID NO: 7, para a seqüência do DNA e SEQ ID NO: 8 para a seqüência da proteína da a2 humana) da família das integrinas alfa, e uma subunidade da integrina al (veja ex: SEQ ID NO: 9 para a seqüência do DNA e a seqüência da proteína SEQ ID NO: 10 da β1 humana) da família das integrinas beta, que pode ser obtida de qualquer indivíduo e também de um mamífero, mas é preferencialmente obtida de humanos. A integrina α2β1 pode ser purificada a partir de qualquer fonte natural ou pode ser produzida sinteticamente (ex: com o uso de tecnologia do DNA recombinante). As seqüências codificadas do ácido nucléico para a integrina α2 e para a integrina /31 são descritas por Takada and Hemler J. Cell Biol. 109 (1): 397-407 (1989; GenBank submission X17033; subseqüentemente atualizadas para a entrada NM 002203) e Argraves, W.S, J. Cell. Biol. Sep 105 (3):1183-90 (1987; Genbank submission X07979.1 e as seqüências relacionadas representando alternativamente variantes conjugadas), respectivamente.
O domínio 'I' da molécula da integrina α2β1 se refere a uma região dessa molécula da integrina α2β1 no interior da subunidade α2, e é descrito, por exemplo, em Kamata et al., J Biol. Chem. 2 69:9659-9663(1994); Emsley et al., J. Biol. Chem. 272:28512 (1997) and Cell 101:47 (2000). A seqüência de aminoácidos de um domínio I humano da integrina oc2 é mostrada como SEQ ID NO: 11 (veja também ex: SEQ ID NO: 107). O domínio I da integrina a2 contém um tipo MIDAS de sítio de ligação ao ligante (Metal Ion Dependent Adhesion Site [sítio de adesão dependente de ion metálico]) que requer um determinado cátion divalente específico para promover a ligação do ligante. As seqüências de aminoácidos para um domínio I da integrina α2 em ratos mostradas como SEQ ID NO: 93 (veja também, ex: SEQ ID NO: 113) e em camundongos mostradas como SEQ ID NO: 94 (veja também, ex: SEQ ID NO:114) são apresentadas na Tabela 28. Seqüências do domínio I de macacos Cynomolgus e rhesus foram clonadas de uma fração de leucócito derivada de sangue total e são apresentadas como SEQ ID NO: 103 (DNA), SEQ ID NO: 171 (aminoácido) para macacos cynomolgus e como SEQ ID NO: 104 (DNA), SEQ ID NO:172 (aminoácido) para macacos rhesus, respectivamente. Um epitopo TMC-2206 (BHA2.1) se refere a uma região do domínio I da integrina oí2 à qual o anticorpo TMC-2206 se liga. Esse epitopo engloba uma região que abrange resíduos de aminoácidos, K40, N73, Q89, Y93, R165, e N166 e opcionalmente, outros resíduos de aminoácidos do domínio I da integrina a2.
Um distúrbio associado à integrina a2 se refere a um distúrbio,doença ou condição que envolva processos/funções dependentes da integrina a2 (ex:, ligação, atividade) que mediam reações celulares aberrantes dentro do tecido alvo. Exemplos de processos dependentes da integrina a2 envolvidos em doenças incluem respostas celulares dependentes do colágeno, tais como as respostas envolvidas no aumento da expressão e proliferação de citocinas, aspectos da função das células T, mastócitos e neutrófilos, doenças inflamatórias, morfogênese dos duetos mamários, cicatrização de feridas epidérmicas e angiogênese. Exemplos de distúrbios associados à integrina a2 incluem, mas não se limitam a distúrbios ou doenças inflamatórias, que por sua vez incluem, mas não se limitam a doença inflamatória do intestino (como doença de Crohn e colite ulcerativa) , reações a transplante (incluindo rejeição do transplante), neurite óptica, trauma da coluna vertebral, artrite reumatóide, esclerose múltipla (incluindo tratamento de seqüelas neurológicas associadas com as mesmas, assim como esclerose múltipla caracterizada por recidiva), doenças ou distúrbios auto-imunes (incluindo lúpus eritematoso sistêmico (LES), diabetes mellitus, síndrome de Reynaud, encefalomielite auto-imune experimental, síndrome de Sjorgen, escleroderma) , diabetes juvenil e distúrbios associados com alteração ou elevação acima do normal da angiogênese (como retinopatia diabética, degeneração macular relacionada à idade, doença cardiovascular, psoríase, artrite reumatóide e câncer) , além de infecções que induzam uma resposta inflamatória.
O tratamento de distúrbios associados à integrina α2β1 se refere ao uso terapêutico e profilático/preventivo dos anticorpos anti-integrina ct2 descritos neste instrumento. Os indivíduos com necessidade de tratamento incluem aqueles que já receberam o diagnóstico do distúrbio, assim como os indivíduos nos quais o início da doença deve ser prevenido ou retardado.
Um mamífero, inclusive para fins de tratamento, se refere a qualquer animal classificado como mamífero, incluindo humanos, animais domésticos e de fazenda, zoológico, animais utilizados em esportes ou de estimação, como cachorros, cavalos, gatos, vacas, etc. 0 mamífero é preferencialmente humano.
Administração intermitente ou periódica é a administração contínua por um determinado período de tempo, com intervalos regulares, de preferência separados por mais de um dia.
O termo anticorpo ou imunoglobulina é utilizado no sentido mais amplo e abrange anticorpos monoclonais (anticorpos monoclonais completos), anticorpos policlonais, anticorpos muitiespecíficos e fragmentos de anticorpos desde que apresentem a atividade biológica desejada. Os fragmentos de anticorpos são compostos por uma porção de um anticorpo completo, geralmente uma ligação ao antígeno ou uma região variável do mesmo. Exemplos de fragmentos de anticorpos incluem os fragmentos Fab, Fab', F(ab')2 e Fv, diacorpos, anticorpos lineares, moléculas de anticorpos de cadeia única, anticorpos de domínio único (ex: de camelídeos) , anticorpos de domínio único NAR de tubarão e anticorpos multiespecíficos formados por fragmentos de anticorpos. Fragmentos de anticorpos também podem se referir a porções de ligação compostas por CDRs ou domínios de ligação a antígenos que incluem mas não se limitam a regiões VH (VH, Vh-Vh) , anticalinas, PepBodies™, fusões de epitopos de células T (Troybodies) ou Peptibodies. Um anticorpo monoclonal se refere a um anticorpo obtido de uma população de anticorpos substancialmente homogênea, ex: os anticorpos individuais que formam a população são idênticos, exceto por possíveis mutações ocorridas naturalmente que possam estar presentes em pequenas quantidades. Os anticorpos monoclonais são altamente específicos, sendo direcionados contra um único sítio antigênico. Além disso, ao contrário dos preparados de anticorpos convencionais (ex, policlonal) que geralmente incluem diferentes anticorpos direcionados contra diferentes determinantes (ex: epitopos) em um antígeno, cada anticorpo monoclonal é direcionado contra pelo menos um único determinante em um antígeno. 0 modificador "monoclonal" indica o caráter do anticorpo como sendo obtido de uma população substancialmente homogênea de anticorpos e não deve ser interpretado como uma necessidade de produção do anticorpo por qualquer método em particular. Por exemplo, anticorpos monoclonais podem ser produzidos pelo método hibridoma descrito pela primeira vez por Kohler et al., Nature 256:495 (1975), ou podem ser produzido por métodos de DNA recombinante (veja, e:, U.S. Patent No. 4,816,567). Os anticorpos monoclonais também podem ser isolados de bibliotecas fágicas de anticorpos , por exemplo, utilizando as técnicas descritas em Clackson et ai., Nature 352:624-628 (1991) e Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991). Os anticorpos monoclonais também podem ser isolados utilizando as técnicas descritas na U.S. Patent N°. 6,025,155 e 6,077,677 e também nas Publicações U.S. Patent Application N°. 2002/0160970 e 2003/0083293 (consulte também para ex: Lindenbaum, et al., Nucleic Acids Research 32 (21):0177 (2004)).
Os anticorpos monoclonais podem incluir anticorpos quiméricos nos quais a porção da cadeia pesada e/ou leve é idêntica ou homóloga às seqüências correspondentes de anticorpos derivados de uma espécie específica ou pertencentes a uma classe ou subclasse de anticorpos, enquanto o restante da(s) cadeia(a) é idêntico ou homólogo às seqüências correspondentes de anticorpos derivados de outra espécie ou pertencentes a uma outra classe ou subclasse de anticorpos, assim como fragmentos desses anticorpos, desde que exibam a atividade biológica desejada (consulte para ex: U.S. Patent No. 4,816,567; e Morrison et al., Proc. Natl. Acad Sei. USA 81: 6851-6855 (1984) para anticorpos quiméricos camundongos-humanos). Uma região hipervariável se refere a resíduos de aminoácidos de um anticorpo que é responsável pela ligação ao antígeno. Uma região hipervariável é composta por resíduos de aminoácidos de uma região determinante de complementaridade ou CDR (ex: resíduos 24-34 (L1), 50-56 (L2) e 89-97 (L3) no domínio variável da cadeia leve e 31-35 (Hl), 50-65 (H2) e 95-102 (H3) no domínio variável da cadeia pesada; Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)) e/ou resíduos de um Ioop hipervariável (ex:, resíduos 26-32 (L1), 50-52 (L2) e 91-96 (L3) no domínio variável da cadeia leve e 26-32 (Hl) , 53-55 (H2) e 96-101 (H3) no domínio variável da cadeia pesada; Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196: 901-917 (1987)). Resíduos do arcabouço ou FR são resíduos do domínio variável e não resíduos de regiões hipervariáveis. Para os anticorpos aqui descritos, as regiões CDR e do arcabouço (framework) são identificadas com base no sistema de numeração de Kabat, com exceção da CDRl da cadeia pesada que é definida pelo Oxford Molecular's AbM como resíduos do intervalo 26 a 35. 0 programa Oxford Molecular's AbM antibody modeling software (http://people.cryst.cck.ac.uk/~ubc07s/) (Martin et al., Proc. Natl Acad. Sei. USA, 86, 9268-9272 (1989); Martin et al., Methods Enzymol., 203, 121-153 (1991); Pedersen et al. , Inimunomethods, 1, 126 (1992); and Rees et al., In Sternberg M.J.E. (ed.), Protein Structure Prediction. Oxford University Press, Oxford, 141-172. (1996)) combina os sistemas de numeração da CDR de Kabat e da região hipervariável de Chothia para definir as CDRs.
As formas humanizadas de anticorpos não humanos (ex: murino) podem ser anticorpos quiméricos que contêm uma seqüência mínima derivada de uma imunoglobulina não humana. Na maior parte, os anticorpos humanizados são imunoglobulinas humanas (anticorpo recipiente ou aceptor) nas quais os resíduos da região hipervariável do recipiente são substituídos por resíduos da região hipervariável de espécies não humanas (anticorpo de doador) como camundongos, ratos, coelhos ou primatas não humanos que apresentem a especificidade, afinidade e capacidade desejadas. Além disso, grupos de resíduos ou resíduos individuais da região do arcabouço (framework) de imunoglobulinas humanas podem ser substituídos por resíduos não humanos correspondentes. Anticorpos humanizados podem ser compostos por resíduos que não são encontrados em um anticorpo recipiente ou em um anticorpo de doador. Essas modificações são feitas para refinar o desempenho do anticorpo. Em geral, o anticorpo humanizado será substancialmente composto por todas, de pelo menos uma, e geralmente duas, regiões ou domínios variáveis, nas quais todos os loops hipervariáveis correspondem aos da imunoglobulina não humana e todas, ou substancialmente todas as regiões do arcabouço (framework) são aquelas da seqüência da imunoglobulina humana. O anticorpo humanizado será opcionalmente composto por pelo menos uma porção de uma região constante da imunoglobulina (ex:. Fc), geralmente aquela da imunoglobulina humana (consulte para ex:, Queen et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86:10029 (1989), and Foote and Winter, J. Mol. Biol. 224: 487 (1992)). Fragmentos de anticorpos Fv ou scFv de cadeia única podem compor as regiões ou domínios Vh e Vl do anticorpo, sendo que esses domínios estão presentes em uma única cadeia de peptídeos. Geralmente, o polipetídeo Fv também é composto por um ligador do polipetídeo entre os domínios Vh e Vl que permite que o scFv forme a estrutura desejada para a ligação ao antígeno (para revisão, consulte para ex:, Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds.
Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)).
Diacorpo se refere a pequenos fragmentos de anticorpos com dois sítios de ligação ao antígeno, compostos por um domínio variável de cadeia pesada (Vh) conectado a um domínio variável de cadeia leve (Vl) na mesma cadeia do polipeptídeo (VH - Vl) . Como usa um ligador curto demais para permitir o pareamento entre os dois domínios na mesma cadeia, os domínios são forçados a parear com domínios complementares de outra cadeia e a criar sítios de ligação aos antígenos. Os diacorpos são descritos mais detalhadamente em, por exemplo, EP 404,097; WO 93/11161; and Hollinger et al. , Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90: 6444-6448 (1993) .
Anticorpo linear se refere a anticorpos como os descritos em Zapata et al. , Protein Eng. 8(10): 1057-1062 (1995).
Resumidamente, esses anticorpos são compostos por um par de segmentos tandem Fd (Vh -ChI- Vh -ChI) que forma um par de regiões de ligação aos antígenos. Os anticorpos lineares podem ser biespecíficos ou monoespecíficos. Um anticorpo isolado se refere a um anticorpo que foi identificado e separado e/ou recuperado de um componente de seu ambiente natural. Componentes contaminantes de seu ambiente natural são materiais que podem interferir nos usos diagnóstico ou terapêutico do anticorpo, e podem incluir enzimas, hormônios e outros solutos proteináceos ou não proteináceos. Em aplicações preferenciais, o anticorpo será purificado: (1) em mais de 95% pelo peso do anticorpo conforme determinado pelo método de Lowry, e de preferência em mais de 99% por peso, (2) em um grau suficiente para obter pelo menos 15 resíduos da seqüência de aminoácidos N-terminal ou internos com o uso de um seqüenciador do tipo spinning cup, ou (3) para homogeneidade por SDS-PAGE em condições de redução ou não redução, utilizando-se azul de Coomassie ou, de preferência, coloração com prata. Anticorpo isolado inclui o anticorpo in si tu dentro das células recombinantes, visto que pelo menos um componente do ambiente natural do anticorpo não estará presente. Em geral, no entanto, o anticorpo isolado será preparado com pelo menos uma etapa de purificação.
Um anticorpo com epitopo marcado refere-se aos casos em que o anticorpo da invenção é fundido a uma epitopo marcado. 0 polipetídeo do epitopo marcado contém
resíduos suficientes para prover um epitopo contra o qual um anticorpo pode ser produzido, mas é ao mesmo tempo suficientemente curto para não interferir na atividade do anticorpo anti-integrina α2β1. Preferencialmente, o epitopo marcado é suficientemente único para que não ocorra reação cruzada do anticorpo de fato com outros epitopos. Polipetídeos marcadores apropriados geralmente possuem pelos menos 6 resíduos de aminoácidos e geralmente entre 8-50 resíduos de aminoácidos (de preferência entre aproximadamente 9-30 resíduos ).
Exemplos incluem o polipeptídeo marcador flu HA polipeptídeo e seus anticorpos 12CA5 (Field et al., Mol. Cell. Biol. 8: 2159-2165 (1988)); o marcador c-myc e o 8F9, 3C7, 6E10, G4, B7 e 9E10 anticorpos do mesmo (Evan et al., Mol . Cell . Biol. 5(12):3610-3616 (1985)); e o marcador da glicoproteína do vírus do herpes Simplex D (gD) e seus anticorpos (Paborsky et al. , Protein Engineering 3 (6) : 547-553 (1990) ) . Em certas aplicações, o epitopo marcado é um epitopo de ligação do receptor de resgate, o qual é um epitopo da região Fc de uma molécula IgG (ex: IgG1, IgG2, IgG3, ou IgG4) que é responsável pelo aumento da meia-vida sérica in vivo da molécula IgG. Um agente citotóxico se refere a uma substância que inibe ou impede o funcionamento das células e/ou causa destruição das mesmas. Os agentes citotóxicos podem incluir isótopos radioativos (ex: 131I, 125I, 90Y e 186Re), agentes quimioterápicos e toxinas, como as toxinas enzimaticamente ativas de origem bacteriana, fúngica, de plantas ou animais, ou fragmentos das mesmas. Um agente não citotóxico se refere a uma substância que não inibe nem impede o funcionamento das células e/ou não causa destruição das mesmas. Um agente não citotóxico pode incluir um agente que pode ser ativado para se tornar citotóxico. Os agentes não citotóxicos podem incluir um glóbulo, lipossoma, matriz ou partícula (consulte para ex: Publicações U.S. Patent 2003/0028071 e 2003/0032995 que são incorporadas como referência no presente documento). Esses agentes podem ser conjugados, agregados, ligados ou associados com um anticorpo anti- integrina α2β1, conforme descrito neste documento. Um agente quimioterápico se refere a um composto químico utilizado no tratamento do câncer. Exemplos de agentes quimioterápicos incluem, mas não se limitam a Adriamicina, Doxorubicina, 5-Fluorouracil, Citosina arabinosida ("Ara-C"), Ciclofosfamida, Tiotepa, Taxotere (docetaxel), Busulfan, Citoxina, Taxol, Metotrexato, Cisplatina, Melfalan, Vinblastina, Bleomicina, Etoposida, Ifosfamida, Mitomicina C, Mitoxantrono, Vincristina, Vinorelbina, Carboplatina, Teniposida, Daunomicina, Carminomicina, Aminopterina, Dactinomicina, Mitomicinas, Esperamicinas (consulte U.S. Pat. No. 4,675,187), Melfalan e outras mostardas de nitrogênio relacionadas.
Uma pró-droga se refere a um precursor ou forma derivada de uma substância farmacologicamente ativa que é menos citotóxica para células tumorais em comparação ao composto primário e que pode ser enzimaticamente ativada ou convertida em uma forma primária mais ativa (consulte para ex:, Wilman, "Prodrugs in Câncer Chemotherapy" Biochemical Society Transactions, 14, pp. 375-382, 615th Meeting Belfast (1986) and Stella et al. , "Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery," Directed Drug Delivery, Borchardt et al. , (ed.), pp. 247-267, Humana Press (1985). As pró-drogas incluem, mas não se limitam a pró-drogas contendo fosfato, pró-drogas contendo tiofosfato, pró-drogas contendo sulfato, pró- drogas contendo peptídeo, pró-drogas com ácido D-amino modificado, pró-drogas glicosilatadas, pró-drogas contendo β-lactam, pró-drogas contendo opcionalmente fenoxiacetamida substituída ou pró-drogas contendo opcionalmente fenilacetamida substituída, pró-drogas contendo 5-fluorocitosina e 5-fluorouridina que podem ser convertidas em um medicamento não citotóxico mais ativo. Exemplos de drogas citotóxicas que podem ser derivatizadas em uma forma de pró-droga podem ser os agentes quimioterápicos descritos acima.
Um marcador se refere a um composto ou a uma composição detectável que é conjugado ou agregado, direta ou indiretamente, a um anticorpo. O marcador pode ser por si só detectável (ex: marcadores radioisótopos ou marcadores fluorescentes) ou, no caso de uma marcador enzimático, pode catalisar a alteração química de uma composição ou de um composto de um substrato que seja detectável.
A fase sólida se refere a uma matriz não aquosa à qual o anticorpo objeto da presente invenção pode aderir. Exemplos de fases sólidas abordadas no presente documento incluem aquelas formadas parcialmente ou totalmente do vidro (ex: vidro com poros controlados ), polissacarídeos (ex: agarose), poliacrilamidas, polistireno, polivinil álcool e silicones. Em determinadas aplicações, dependendo do contexto, a fase sólida pode ser composta por um alvéolo de uma placa de ensaio; em outros por uma coluna de purificação (ex: coluna de cromatografia de afinidade). Esse termo também inclui uma fase sólida descontínua de partículas discretas, tais como as descritas na U.S. Patent No. 4,275,149.
Um lipossoma se refere a uma pequena vesícula composta por vários tipos de lípides, fosfolipídeos e/ou surfactantes que são úteis na administração de um medicamento (como os anticorpos da invenção e, opcionalmente, um agente quimioterápico) a um mamífero. Os componentes do lipossoma são comumente organizados em uma formação de duas camadas, semelhante à organização lipídica em membranas biológicas.
Uma molécula isolada de ácido nucléico se refere a uma molécula de ácido nucléico que é identificada e separada de pelo menos uma molécula de ácido nucléico contaminante, com a qual é normalmente associada na fonte natural do ácido nucléico do anticorpo. Uma molécula isolada de ácido nucléico é diferente na forma ou na configuração daquela encontrada na natureza. Portanto, as moléculas de ácido nucléico são diferentes das moléculas de ácido nucléico encontradas em células naturais. No entanto, uma molécula isolada de ácido nucléico inclui uma molécula de ácido nucléico contida em células que normalmente expressam o anticorpo onde, por exemplo, a molécula de ácido nucléico se encontra em um local cromossomático diferente daquele em que se encontra em células naturais.
Um vetor viral se refere a um veículo para a transferência de um ácido nucléico (ex: DNA ou RNA) para as células através de infecção ou transdução viral. Exemplos de vetores virais incluem retrovirus, adenovírus, pox vírus, e baculovirus.
Um vetor não viral se refere a um veículo de ácido nucléico como um CAN, plasmídeo ou cromossomo que é transferido para a célula por meio de métodos não virais como eletroporação, injeções e transfecção mediada por reagente catiônico.
Seqüências de controle de expressão referem-se às seqüências de DNA necessárias para a expressão de uma seqüência codificada e operavelmente ligada em um organismo hospedeiro específico. As seqüências de controle que são adequadas para as células procariontes (ou procariotas), por exemplo, incluem um promotor, opcionalmente uma seqüência operadora e um sítio de ligação de ribossomos. Células eucarióticas são conhecidas por usar promotores, sinais de poliadenilação e intensificadores.
O ácido nucléico é operavelmente ligado quando é colocado em uma relação funcional com outra seqüência de ácidos nucléicos. Por exemplo, o DNA de uma pré-seqüência ou seqüência secretória líder é operavelmente ligado ao DNA de um polipeptídeo se este for expresso como uma pré- proteína que participa da secreção do polipeptídeo; um promotor ou intensificador é operavelmente ligado a uma seqüência codificante se este afetar a transcrição da seqüência; ou um sítio de ligação do ribossomo é operavelmente ligado a uma seqüência codificante se este estiver posicionado de maneira que facilite a translação. Geralmente, seqüências de DNA operavelmente ligadas são contíguas e, no caso da seqüência líder secretória, contíguas e na fase de leitura. No entanto, os intensificadores não precisam ser contíguos. A ligação é conseguida por meio da ligação em convenientes sítios de restrição. Se esses sítios não existirem, adaptadores ou ligadores de oligonucleotídeos sintéticos são utilizados de acordo com a conduta convencional.
Um outro aspecto da presente invenção é o tratamento de distúrbios associados à integrina α2β1 realizado por meio da administração a um indivíduo de uma molécula de ácido nucléico codificando um anticorpo anti-integrina oí2 da invenção. Os métodos adequados de administração incluem métodos de terapia gênica (veja a seguir). Um ácido nucléico da invenção pode ser administrado a células in vivo utilizando-se métodos como a injeção direta de DNA, captação de DNA mediada pelo receptor, transfecção mediada por vírus ou transfecção não mediada por vírus e transfecção baseada em lípides, sendo que todos esses métodos podem envolver o uso de vetores da terapia gênica. A injeção direta tem sido utilizada para introduzir DNA simples (naked) em células in vivo (consulte ex: Acsadi et al (1991) Nature 332:815-818; Wolff et al. (1990) Science 247:1465-1468). Um dispositivo de administração poderá ser usado (ex: uma "pistola de genes") para injetar DNA em células in vivo. Esse dispositivo pode estar comercialmente disponível (ex:, da BioRad) . 0 DNA simples também pode ser introduzido nas células pela complexação do DNA em um cátion, como a polilisina, que é agregada a um ligante do receptor da superfície de uma célula (consulte, por exemplo, Wu, G. and Wu, C. H. (1988) J. Biol. Chem. 263:14621; Wilson el al. (1992) J. Biol. Chem. 267:963- 967; and U.S. Pat. No. 5,166,320). A ligação de um complexo DNA-Iigante a um receptor pode facilitar a captação do DNA por endocitose mediada por receptor. Um complexo DNA-Iigante ligado a capsídeos de adenovírus que rompe endosomas, assim liberando material no citoplasma, pode ser usado para evitar degradação do complexo por lisossomas intracelulares (consulte, por exemplo, Curiel el al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:8850; Cristiano et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90 : 2122-2126).
Retrovírus defectivos são bem caracterizados para uso como vetores na terapia gênica (para revisão, consulte, Miller, A. D. (1990) Blood 76:271). Protocolos para a produção de retrovírus recombinantes e para infecção de células in vitro ou in vivo com esses vírus podem ser encontrados em Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, F. M. et al. (eds.) Greene Publishing Associates, (1989), Seções 9.10-9.14 e em outros manuais padrão de laboratório. Exemplos de retrovírus adequados incluem pLJ, pZIP, pWE e pEM, os quais são bem conhecidos por profissionais experientes. Exemplos de linhagens de vírus empacotadoras (packaging) adequadas incluem .psi.Crip, .psi.Cre, .psi.2 e .psi.Am. Os retrovírus tem sido utilizados para introduzir uma grande variedade de genes em vários tipos de células diferentes, como células epiteliais, células endoteliais, linfócitos, mioblastos, hepatócitos, células da medula óssea, in vitro e/ou in vivo (consulte, por exemplo, Eglitis, et al. (1985) Science 230:1395-1398; Danos and Mulligan (1988) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85:6460-6464; Wilson et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85:3014-3018; Armentano et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 87:6141-6145; Huber et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88:8039-8043; Ferry et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88:8377-8381; Chowdhury et al. (1991) Science 254:1802-1805; van Beusechem et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89:7640-7644; Kay et al. (1992) Human Gene Therapy 3:641- 647; Dai et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89:10892-10895; Hwu et al. (1993) J. Immunol. 150:4104- 4115; U.S. Pat. No. 4,868,116; U.S. Pat. No. 4,980,286; PCT Application WO 89/07136; PCT Application WO 89/02468; PCT Application WO 89/05345; e PCT Application WO 92/07573).
Para uso como vetor na terapia gênica, o genoma de um adenovírus pode ser manipulado de maneira que este codifique e expresse um composto do ácido nucléico da invenção, mas seja inativado em termos de sua capacidade de se replicar em um ciclo de vida viral lítico normal. Consulte por exemplo, Berkner et al. (1988) BioTechniques 6:616; Rosenfeld et al. (1991) Science 252:431-434; and Rosenfeld et al. (1992) Cell 68:143-155. Vetores de adenovírus adequados derivados da cepa de adenovírus Ad tipo 5 dl324 ou de outras cepas de adenovírus (ex:, Ad2, Ad3, Ad7 etc.) são bem conhecidos por profissionais experientes. O uso de adenovírus recombinantes é vantajoso por não haver necessidade de dividir as células para que funcionem efetivamente como veículos liberadores de genes e podem ser usados para infectar uma grande variedade de tipos de células, inclusive células epiteliais das vias aéreas (Rosenfeld et al. (1992) supra citado), células endoteliais (Lemarchand et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89:6482-6486), hepatócitos (Herz and Gerard (1993) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90:2812-2816) e células musculares (Quantin el al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89:2581-2584).
Vírus adeno-associados (VAA) podem ser usados como vetor para liberação do DNA para fins de terapia gênica. 0 VAA é um vírus defectivo que ocorre naturalmente e necessita de outro vírus, como um adenovírus ou vírus do herpes, como um vírus auxiliar para uma replicação eficiente e um ciclo de vida produtivo (Muzyczka et al. Curr. Topics in Micro, and Immunol. (1992) 158:97-129). O VAA pode ser usado para integrar o DNA em células que não se dividem (consulte, por exemplo, Flotte et al. (1992) Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol. 7:349-356; Samulski et al. (1989) J. Virol. 63:3822-3828; e McLaughlin et al. (1989) J. Virol. 62:1963-1973). Um vetor VAA conforme descrito em Tratschin et al. (1985) Mol. Cell. Biol. 5:3251-3260 pode ser usado para introduzir o DNA em células (consulte, por exemplo, Hermonat et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 81:6466-6470; Tratschin et al. (1985) Mol. Cell . Biol. 4:2072-2081; Wondisford et al. (1988) Mol. Endocrinol. 2:32-39; Tratschin et al. (1984) J. Virol. 51:611-619; e Flotte et al. (1993) J. Biol. Chem. 268:3781-3790). Vetores da terapia gênica com lentivírus também podem ser adaptados para utilização na invenção.
Os métodos gerais da terapia gênica são conhecidos por profissionais qualificados. Consulte por exemplo, U.S. Pat. No. 5,399,346 por Anderson et al. Uma cápsula biocompatível para liberação de material genético é descrita em PCT Publication WO 95/05452 por Baetge et al. Métodos de transferência de genes para células hematopoiéticas também foram relatados anteriormente (consulte Clapp, D. W., et al., Blood 78: 1132-1139 (1991); Anderson, Science 288:627-9 (2000); e Cavazzana- Calvo et al., Science 288:669-72 (2000)).
Células, linhagens celulares e cultura de células são freqüentemente utilizadas alternadamente e todas essas designações incluem progênia. Células transformantes e transformadas (ex:, obtidas por transfecção, transformação ou transdução de ácidos nucléicos, vetores, vírus, etc.) incluem a célula primária do sujeito e culturas derivadas dos mesmos sem levar em consideração o número de transferências. Também se sabe que nem toda progênia pode ser precisamente idêntica no conteúdo do DNA, devido a mutações propositais ou inadvertidas.
Foram incluídas progênias mutantes que apresentam a mesma função ou atividade biológica conforme avaliadas na célula originalmente transformada. Quando houver intenção de usar designações diferentes, as mesmas serão esclarecidas pelo contexto.
Os anticorpos humanizados descritos neste documento incluem anticorpos que possuem estrutura de região variável derivada de uma molécula de um anticorpo de um aceptor humano, seqüências hipervariáveis ou CDR de um anticorpo de doador murino e regiões constantes, se presentes, derivadas de seqüências humanas.
Os anticorpos da presente invenção foram construídos com o uso de CDRs de regiões variáveis da cadeia pesada e regiões variáveis da cadeia leve de um clone de um anticorpo monoclonal de murino BHA2.1 (Hangan et al., Câncer Res. 56:3142-3149 (1996)). Os materiais preferenciais para o início da criação de anticorpos são os anticorpos anti-integrina a2 como aqueles excretados pelo hibridoma BHA2.1 (ex:, TMC-22 06) que são anticorpos com função de bloqueio direcionados para a integrina humana e cuja ligação e atividade dependem da presença de um domínio I intacto dentro da integrina a2 alvo. Existe preferência pelos anticorpos com especificidade para o epitopo do TMC-2206 (ou BHA2.1), incluindo anticorpos que se ligam à conformação inativa da molécula da integrina (x2, e/ou não agem como miméticos do ligante. Existe preferência pelos anticorpos com especificidade para o epitopo TMC-2206 (ou BHA2.1) que, embora interajam com a integrina α2β1 presente tanto nos leucócitos quanto nas plaquetas, não causam ativação plaquetária, comprometem a agregação de plaquetas ativas no colágeno, apresentam efeito mínimo ou nenhum efeito sobre o sangramento e/ou não são associados com complicações hemorrágicas nas concentrações administradas, inclusive de doses terapêuticas in vivo.
Podem ser construídos anticorpos nos quais a molécula do aceptor humano para a região variável da cadeia leve é selecionada com base em considerações sobre a homologia entre regiões variáveis da molécula do aceptor em potencial e a região variável da cadeia leve do anticorpo de murino. Moléculas aceptoras humanas candidatas a germline são preferidas para reduzir a antigenicidade potencial. Os bancos de dados germline são formados por seqüências de anticorpos que se estendem até o final da região FW3 da cadeia pesada e parcialmente na seqüência CDR3. Para a seleção da região FW4, deve-se dar prioridade à pesquisa em bancos de dados das seqüências de anticorpos maduros que tenham sido derivadas da molécula germline selecionada e também à seleção de uma região FW4 razoavelmente homóloga para uso na molécula do anticorpo recombinante. Moléculas aceptoras humanas são preferencialmente selecionadas da mesma classe da cadeia leve da molécula do doador murino e a mesma classe estrutural canônica da região variável da molécula do doador murino. Considerações secundárias para a seleção da molécula aceptora humana para a região variável da cadeia leve incluem homologia no comprimento da CDR entre a molécula de doador murino e a molécula aceptora humana.
Moléculas de anticorpos aceptores humanos são preferencialmente selecionadas por pesquisas homológicas no banco de dados V-BASE; outros bancos de dados com o de Kabat e os banco de dados público NCBI também podem ser usados. Para os anticorpos humanizados anti-integrina a2 com a mesma especificidade ou especificidade semelhante pelo epitopo e/ou propriedades funcionais como o TMC- 2206, a molécula aceptora humana preferencial da cadeia leve é a SEQ ID NO: 37 com a seqüência de anticorpos germline A14 para a região FW 1-3 e a seqüência FGQGTKVEIK for FW4 (SEQ ID NO: 38) que representa uma FW-4 comum de cadeias leves de kappa 1 maduro (ex.: seqüência da cadeia leve AAB24132 (NCBI entrada gi/259596/gb/AAB24132).
Podem ser construídos anticorpos nos quais a molécula aceptora humana para a região variável da cadeia pesada é selecionada com base em considerações sobre a homologia entre regiões variáveis da molécula do aceptor em potencial e a região variável da cadeia pesada do anticorpo de tnurino. Moléculas aceptoras humanas candidatas a germline são preferidas para reduzir a antigenicidade potencial. Os bancos de dados Germline são formados por seqüências de anticorpos que se estendem até o final da região FW3 da cadeia pesada e parcialmente na seqüência CDR3. Para a seleção da região FW4, deve-se dar prioridade à pesquisa em bancos de dados das seqüências de anticorpos maduros que tiverem sido derivadas da molécula germline selecionada e também à seleção de uma região FW4 razoavelmente homóloga para uso na molécula do anticorpo recombinante. Moléculas aceptoras humanas são preferencialmente selecionadas da mesma classe da cadeia pesada da molécula do doador murino e a mesma classe estrutural canônica da região variável da molécula do doador murino. Considerações secundárias para a seleção da molécula aceptora humana para a região variável da cadeia pesada incluem homologia no comprimento da CDR entre a molécula de doador murino e a molécula aceptora humana. Moléculas de anticorpos aceptores humanos são preferencialmente selecionados por pesquisa da homologia no banco de dados V-BASE; embora outros bancos de dados com o de Kabat e o banco de dados público NCBI também podem ser usados. Para anticorpos ant i - integrina ct2 com a mesma especificidade ou especificidade semelhante pelo epitopo e/ou propriedades funcionais como TMC-2206, a molécula aceptora preferencial da cadeia pesada é a SEQ ID NO: 39 com a seqüência do anticorpo germline 4-59 para a região FW 1-3 (SEQ ID NO:12) e anticorpo, CAA48104.1 (NCBI entrada, gi/33583/emb/CAA48104.1) um anticorpo maduro derivado da seqüência germline 4-59 para a região FW 4 (SEQ ID NO:13) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) .
Métodos para a humanização de um anticorpo anti-integrina a2 não humano são descritos neste documento, inclusive nos exemplos abaixo. Para humanizar um anticorpo anti- integrina α.2, o material inicial não humano é obtido pela preparação da imunização ou compra de anticorpos comercialmente disponíveis. Exemplos de técnicas para a produção de anticorpos são descritos neste documento. 0 antígeno da integrina α2β1 a ser usado para a produção de anticorpos pode ser, por exemplo, uma forma solúvel da integrina α2βΐ ou outro fragmento da integrina α2β1 (ex. : um fragmento da integrina α2β1 contendo um domínio I da integrina a2 humana (SEQ ID N0.-11); consulte também, ex:, SEQ ID NO: 107) . Outras formas de utilizar a integrina α.2 para a produção de anticorpos serão evidentes para os profissionais experientes com base na seqüência da integrina a2 (ex: uma integrina a2 humana como na SEQ ID NO:8).
Os anticorpos policlonais são preferencialmente produzidos em animais pela administração de várias injeções subcutâneas (sc), intravenosas (iv) ou intraperitoneais (ip) do antígeno correspondente com ou sem um adj Uvantei Pode ser útil conjugar antígeno correspondente a uma proteína que seja imunogênica nas espécies a serem imunizadas, ex. : hemocianina do molusco "keyhole limpet", albumina sérica, tireoglobulina bovina, ou inibidor de tripsina da soja utilizando um agente bifuncional ou derivatizante, por exemplo, éster maleimidobenzol sulfosuccinamida (conjugação através de resíduos de cisteína), N-hidroxisuccinimida (através de resíduos de lisina), glutaraldeído, anidrido succinico, SOCl2, ou R1N=C=NR, onde R e R1 são diferentes grupos alquila.
Os animais podem ser imunizados contra o antígeno, conjugados imunogênicos ou derivativos pela combinação do antígeno ou conjugado (ex.: 100 μg para coelhos ou 5 ^g para camundongos) com 3 volumes do adjuvante completo de Freund e injetando-se a solução pela via intradérmica em vários locais. Um mês depois os animais recebem outra injeção do antígeno ou conjugado (ex, com 1/5 a 1/10 da quantidade original utilizada na imunização) em adjuvante completo de Freund através de injeções subcutâneas em vários locais. Sete a 14 dias depois os animais são sangrados e o soro é analisado para determinar o título de anticorpos. Os animais recebem injeções de reforço (booster) até que a concentração atinja um platô. Para imunizações do conjugado, os animais recebem preferencialmente injeções com o conjugado do mesmo antígeno, mas conjugado a uma proteína diferente e/ou através de um reagente de ligação cruzada. Os conjugados também podem ser produzidos em cultura de células recombinantes na forma de fusões de proteínas. Agentes agregantes como o alum também são adequados para intensificar a resposta imune.
Anticorpos monoclonais podem ser produzidos com o uso da técnica do hibridoma descrito pela primeira vez por Kohler et al., Nature, 256: 495 (1975), ou com o uso de métodos de DNA recombinante (ex.: U.S. Patent No. 6,204,023). Os anticorpos monoclonais também podem ser produzidos com o uso das técnicas descritas nas U.S. Patent Nos. 6,025,155 e 6,077,677 e também nas Publicações U.S. Patent Application N°. 2002/0160970 e 2003/0083293 (consulte também, ex:, Lindenbaum, et al., Nucleic Acids Research 32 (21):0177 (2004)). No método do hibridoma, um camundongo ou outro animal hospedeiro apropriado, como um rato, hamster ou macaco é imunizado, {ex;, conforme descrito acima) para evidenciar linfócitos que produzam ou possam produzir anticorpos que se ligarão especificamente ao antígeno utilizado na imunização. Como alternativa, os linfócitos podem ser imunizados in vitro. Em seguida, os linfócitos são fundidos com células de mieloma com a utilização de um agente de fusão adequado, como polietileno glicol, para formar a célula de hibridoma (consulte, ex. : Goding, Monoclonal Antibodies: Principies and Practice, pp.59-103 (Academic Press, 1986)).
As células de hibridoma assim preparadas são semeadas e crescem em um meio de cultura adequado contendo de preferência uma ou mais substâncias que inibam o crescimento ou a sobrevivência de células primárias do mieloma não fundidas. Por exemplo, se a enzima hipoxantina guanina fosforibosil transferase (HGPRT ou HPRT) não existir nas células primárias de mieloma, os meios de cultura para os hibridomas geralmente incluirão hipoxantina, aminopterina, e timidina (meio HAT), substâncias que impedem o crescimento de células deficientes HGPRT.
As células preferenciais de mieloma são aquelas que se fundem de maneira eficiente, tem produção de anticorpos estável pelas células produtoras de anticorpos selecionadas e são sensíveis a um meio como o meio HAT. Entre as linhagens de células mielomatosas preferenciais estão as linhagens de mieloma de murino, como as derivadas de tumores MOP-21 e M.C.-ll de camundongos disponíveis no Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, Calif. USA, e células SP-2 ou X63-Ag8-653 disponíveis no American Type Culture Collection, Rockville, Md. USA. As linhagens de células mielomatosas humano e de heteromieloma camundongo-humano também foram descritas para a produção de anticorpos monoclonais humanos (ex.: Kozbor, J. Immunol., 133: 3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody.Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Mareei Dekker, Inc., New York, 1987) ).
0 meio de cultura no qual as células de hibridoma são cultivadas é preparado para a produção de anticorpos monoclonais direcionados contra o antígeno. A especificidade da ligação de anticorpos monoclonais produzida por células de hibridoma é preferencialmente determinada por imunoprecipitação ou por um ensaio de ligação in vitro, como radioimunoensaio (RIA) ou ensaio imunoabsorvente ligado à enzima (ELISA).
A afinidade da ligação do anticorpo monoclonal pode ser determinada, por exemplo, pela análise de Scatchard de Munson et al., Anal. Biochem., 107: 220 (1980).
Depois que for determinado que as células de hibridoma produzem anticorpos da especificidade, afinidade e/ou atividade desejadas, os clones podem ser subclonados através da limitação dos procedimentos de diluição e crescimento com o uso de métodos padrão (Goding, Monoclonal Antibodies: Principies and Practice, pp.59-103 (Academic Press, 1986)) . Um exemplo de meio de cultura adequado para essa finalidade é o meio D-MEM ou RPMI- 1640. As células de hibridoma também podem crescer in vivo como tumores ascíticos em um animal.
Os anticorpos monoclonais secretados pelos subclones são adequadamente separados do meio de cultura, líquido ascitico ou soro com o uso de procedimentos convencionais de purificação de imunoglobulina, como por exemplo, cromatografia da proteína A, cromatografia por interação hidrofóbica, cromatografia por hidroxilapatita, eletroforese com gel, diálise, e/ou cromatografia por afinidade.
O DNA que codifica os anticorpos monoclonais é prontamente isolado e seqüenciado com o uso de procedimentos convencionais (ex. : com o uso de sondas de oligonucleotídeos que podem se ligar especificamente a genes que codificam as cadeias pesada e leve dos anticorpos monoclonais). As células de hibridoma são a fonte preferencial para esse DNA. Uma vez isolado, o DNA pode ser colocado em vetores de expressão, que são em seguida transfectados em células hospedeiras como E. coli, células COS de símios, células ovarianas de hamster chinês (CHO) ou células de mieloma, inclusive aquelas que de outra maneira não produzem a proteína imunoglobulina, para obter a síntese dos anticorpos monoclonais nas células hospedeiras recombinantes. A produção de anticorpos recombinantes é descrita com maiores detalhes a seguir.
Os exemplos aqui apresentados descrevem métodos para a humanização de um exemplar de anticorpo anti-integrina a2 Em certas aplicações, pode ser desejável produzir variantes da seqüência de aminoácidos do anticorpo humanizado, especialmente quando as mesmas melhorarem a afinidade da ligação ou outras propriedades biológicas do anticorpo humanizado.
Variantes da seqüência de aminoácidos do anticorpo humanizado anti-integrina α2β1 são preparadas com a introdução de alterações específicas do nucleotídeo no DNA do anticorpo humanizado anti-integrina α2β1 ou pela síntese do peptídeo. Essas variantes incluem, por exemplo, deleções de, e/ou inserções em e/ou substituições de resíduos dentro das seqüências de aminoácidos mostradas para o anticorpo anti-integrina α2 TMC-2206 (ex. : derivadas de ou baseadas nas seqüências da região variável conforme mostrado em SEQ ID NOS: 19 e 21) , . Quaisquer combinações de deleção, inserção e substituição de aminoácidos são feitas para se obter a estrutura final, desde que a estrutura final possua as características desejadas. As alterações nos aminoácidos também podem alterar processos pós-translacionais do anticorpo humanizado anti-integrina α2, como por exemplo, alteração no número ou posição dos sítios de glicosilação.
Existem vários métodos para tornar os anticorpos humanos ou semelhantes aos humanos (ex.: "humanização"). As abordagens utilizadas para a humanização de anticorpos têm variado com o passar dos anos. Uma abordagem foi produzir regiões variáveis de murino fundidas com regiões constantes humanas, denominadas quimeras Fc murino- humanas (consulte, ex.: Morrison et al, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 81:6851-6855 (1984); U.S. Patent No, 5,807,715). Outra abordagem explorou o fato de que as CDRs podiam ser prontamente identificadas com base em sua natureza hipervariável (Kabat et al, J. Biol. Chem. 252:6609-6616 (1977)), Kabat, Adv. Protein Chem. 32:1-75 (1978) e na sua estrutura canônica (Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196 (4) : 901-17 (1987)); Lazakani et al. , J. Mol. Biol.
2 72:929 (1997) e humanizadas enxertando-se somente as regiões CDR não humanas (denominadas CDRs de doador) em um arcabouço humano (denominadas arcabouços aceptores) conforme mostrado, por exemplo por Jones et al. , Nature 321(6069) :522-5 (1986); (consulte, ex. : U.S. Patent No. 5,225,539; U.S. Patent No. 6,548,640). Os seis ciclos da CDR são apresentados em um cluster, e com base na análise cristalográfica, é possível identificar prontamente os resíduos críticos do arcabouço da chamada zona de "Vernier" lateralmente às CDRs ou na interface da cadeia pesada-leve (consulte, ex.: Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196 (4) :901-17 (1987); Chothia et al. , J. Mol . Biol . 186 (3) :651-63 (1985); Chothia et al. , Nature 342(6252):877-83 (1989)). Esses resíduos podem sofrer mutação reversa para o resíduo de murino para restaurar a correta orientação relativa das seis CDRs (consulte ex.: Verhoyen et al. , Science 239 (4847) : 1534-6 (1988); Reichman et al. , Nature 332 (6162) :323-7 (1988); Tempest et al., Biotechnology (NY) 9(3):266-71 (1991)). Como as regiões variáveis podem ser classificadas em famílias que apresentam relativamente alta homologia entre camundongos e humanos (revisado em ex. : Pascual e Capra Adv. Immunol. 49:1-74 (1991)), esses estudos iniciais também indicaram que o potencial para perda de afinidade poderia ser minimizado no anticorpo enxertado por meio da seleção da seqüência germline humana com a homologia mais alta para o anticorpo de murino de interesse para uso como molécula do aceptor humano (consulte ex. : U.S. Patent No. 5,225,539; Verhoyen et al. , Science 239 (4847) : 1534-6 (1988)) .
Foram relatadas homologias familiares e relações estruturais que interferem na apresentação correta de um determinado tipo de estrutura canônica de uma CDR (consulte, ex. : Al-Lazakani et al., J. Mol. Biol. 273 (4) :927-48 (1997) e as referências relacionadas às mesmas). Preferencialmente, uma seqüência humana ou germline mais adequada é selecionada. Bancos de dados disponíveis de seqüências de anticorpos germline podem ser utilizados para determinar o subtipo da família de uma determinada cadeia pesada e leve de murino e para identificar as seqüências mais adequadas que podem ser usadas como arcabouços aceptores humanos dentro de uma subfamília humana. Tanto a homologia linear do aminoácido dos arcabouços do doador e do aceptor quanto da estrutura canônica da CDR são levadas em consideração. Exemplos de resíduos da cadeia pesada que podem ser substituídos em um anticorpo humanizado anti-integrina a2 incluem um ou mais dos números de resíduos do arcabouço a seguir: H37, H48, H67, H71, H73, H78 e H91 (sistema de numeração de Kabat). Pelo menos quatro desses resíduos são preferencialmente substituídos. Um conjunto de substituições particularmente preferencial para cadeia pesada em anticorpos humanizados anti-integrina a2 aqui exemplificado é o H37, H71, H73 e H78. De maneira semelhante, resíduos da cadeia leve também podem ser substituídos. Exemplos de resíduos da cadeia leve para substituição incluem um ou mais dos seguintes números de resíduos: LI, L2, L4, L6, L46, L47, L49 e L71 . Pelo menos três desses resíduos são preferencialmente substituídos. Um conjunto de substituições particularmente preferencial para cadeia leve em anticorpos humanizados anti-integrina oc2 aqui exemplificado é o L2, L4 6 e L4 9.
Um método que pode ser utilizado para a identificação de determinados resíduos ou regiões de um anticorpo humanizado anti-integrina a2 que são locais preferidos para mutagênese é denominado "mutagênese de varredura de alanina" (consulte, ex.: Cunningham and Wells Science, 244: 1081-1085 (1989)). Aqui, um resíduo ou grupo de resíduos alvo é identificado (ex: resíduos carregados como arg, asp, his, lys, e glu) e substituído por uma aminoácido neutro ou negativamente carregado (de preferência alanina ou polialanina) para interferir na interação de aminoácidos com o antígeno da integrina α2β1. Os sítios de aminoácidos que demonstrarem sensibilidade funcional às substituições são então refinados com a introdução posterior de outras variantes no ou para os sítios de substituição. Assim, embora o sítio para a introdução de uma variação da seqüência aminoácidos seja predeterminado, a natureza da mutação per se não precisa ser predeterminada. Por exemplo, para analisar o desempenho da mutação em um determinado sítio, é realizada a varredura da alanina ou mutagênese aleatória no códon ou região alvo e são separadas para a atividade desejada as variantes expressas do anticorpo humanizado anti-integrina a2.
Inserções de seqüências de aminoácidos incluem fusões amino- e/ou carbóxi-terminal variando em extensão de um resíduo a polipeptídeos contendo cem ou mais resíduos, assim como inserções de intra-sequências de um único ou vários resíduos de aminoácidos. Exemplos de inserções terminais incluem um anticorpo humanizado anti-integrina a2 com um resíduo metionil N-terminal ou anticorpo fundido com um epitopo marcado. Outras variantes de molécula de anticorpo humanizado anti-integrina a2 que podem ser inseridas incluem a fusão ao N- ou C-terminal de um anticorpo humanizado anti-integrina a2 de uma enzima ou de um polipeptídeo que aumente a meia-vida sérica do anticorpo (veja a seguir).
Outro tipo de variante é uma variante de substituição do aminoácido. Nessas variantes, pelo menos um resíduo de aminoácido em uma molécula de anticorpo humanizado anti- integrina a2 é removido e um resíduo diferente inserido em seu lugar. Os sítios de maior interesse para a mutagênese por substituição incluem os ciclos hipervariáveis, mas as alterações no arcabouço também são contempladas. Os resíduos da região hipervariável ou os resíduos do arcabouço envolvidos na ligação dos antígenos são geralmente substituídos de maneira relativamente conservadora. Essas substituições conservadoras são mostradas a seguir sob o título "substituições preferenciais". Se essas substituições resultarem em alteração da atividade biológica, serão introduzidas alterações mais substanciais denominadas "substituições exemplares" ou conforme descrito posteriormente em referência à classe de aminoácidos, e será feita a varredura dos produtos .
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Modificações consideráveis nas propriedades biológicas do anticorpo são conseguidas por meio da seleção de substituições que difiram de maneira significativa em seu efeito sobre a manutenção (a) da estrutura principal do polipeptídeo na área de substituição, por exemplo, como uma conformação de folha ou helicoidal, (b) da carga ou hidrofobicidade da molécula no sítio alvo, ou (c) do tamanho da cadeia lateral. Os resíduos que ocorrem naturalmente são divididos em grupos baseados em propriedades comuns da cadeia lateral: (1) hidrofóbico: norleucina, met, ala, vai, leu, ile; (2) hidrofílico neutro: cys, ser, thr; (3) acídico: asp, glu; (4) básico: asn, gln, his, lys, arg; (5) resíduos que influenciam a orientação da cadeia: gly, pro; e (6) aromática: trp, tyr, phe.
Substituições não conservadoras implicarão em trocar um membro de uma dessas classes por outra classe. Qualquer resíduo cisteína não envolvido na manutenção adequada da confirmação de um anticorpo humanizado anti-integrina a2 também pode ser substituído, geralmente com serina, para melhorar a estabilidade oxidativa da molécula e prevenir a ocorrência de ligação cruzada aberrante. Por outro lado, ligações de cisteína podem ser acrescentadas ao anticorpo para melhorar sua estabilidade (principalmente onde o anticorpo for um fragmento de anticorpo como o fragmento Fv).
Outro tipo de variante do aminoãcido do anticorpo altera o padrão original de glicosilação do anticorpo. Por alteração entende-se a deleção de uma ou mais porções de carboidrato encontradas no anticorpo e/ou acréscimo de um ou mais sítios de glicosilação não presentes no anticorpo.
A glicosilação de anticorpos é geralmente N-Iigada ou Co- ligada. N-Iigada se refere à anexação da porção do carboidrato à cadeia lateral de um resíduo de asparagina.
As seqüências tripeptídeos asparagina-X-serina e asparagina-X-treonina, onde X é qualquer aminoácido, exceto prolina, são as seqüências reconhecidas para anexação enzimática da porção do carboidrato à cadeia lateral de asparagina. Assim, a presença de qualquer dessas seqüências de tripeptídeos em um polipeptídeo cria um sítio de glicosilação potencial. Glicosilação O-Iigada se refere â anexação de um dos açúcares N- aceilgalactosamina, galactose, ou xilose a um ácido hidroxiamino, mais comumente serina ou treonina, embora a 5-hidroxiprolina ou 5-hidroxilisina também possam ser usadas.
O acréscimo ou a deleção de sítios de glicosilação ao anticorpo é convenientemente conseguida alterando-se a seqüência de aminoácidos de maneira que esta contenha ou não uma das seqüências de tripeptídeos mencionadas acima (para os sítios de glicosilação N-ligados). A alteração pode consistir do acréscimo, substituição ou deleção de um ou mais resíduos de serina ou treonina à seqüência do anticorpo original (para sítios de glicosilação 0- ligados). Moléculas de ácido nucléico que codificam variantes da seqüência de aminoácidos do anticorpo humanizado anti-integrina a2 são preparadas com o uso de uma variedade de métodos conhecidos por profissionais qualificados. Esses métodos incluem, mas não se limitam ao isolamento de uma fonte natural (no caso da ocorrência natural de variantes da seqüência de aminoácidos) ou preparação por mutagênese mediada por oligonucleotídeo (ou sítio-dirigida) , mutagênese por PCR, ou cassete mutagênese de uma variante previamente preparada ou uma versão não variante do anticorpo humanizado anti- integrina a2.
Normalmente, as variantes da seqüência de aminoácidos do anticorpo humanizado anti-integrina a2 conterão uma seqüência de aminoácidos com pelo menos 75% de identidade da seqüência de aminoácidos com as seqüências de aminoácidos do anticorpo humanizado original tanto da cadeia pesada como da cadeia leve (ex. : seqüências de região variável como em SEQ ID NO: 21 ou SEQ ID NO: 19, respectivamente), preferivelmente pelo menos 80%, preferivelmente pelo menos 85%, preferivelmente pelo menos 90%, preferivelmente pelo menos 95%, incluindo por exemplo, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, e 100%. A identidade ou homologia com relação a essa seqüência é aqui definida como a porcentagem de resíduos de aminoácidos na seqüência candidata que é idêntica à dos resíduos da anti-integrina humanizada α2 , depois de alinhar as seqüências e introduzir intervalos, se necessário, para conseguir a máxima identidade possível na porcentagem da seqüência, e não levando em consideração nenhuma substituição conservadora (conforme descrito acima) como parte da identidade da seqüência. Nenhum dos N-terminal, C-terminal, ou extensões internas, deleções ou inserções na seqüência de anticorpos devem ser interpretados como interferência na identidade ou homologia da seqüência. Portanto a identidade da seqüência pode ser determinada com o uso de métodos padrão que são. normalmente usados para comparar a semelhança na posição dos aminoácidos de dois polipeptídeos. Com o uso um programa de computador como o BLAST ou FASTA é possível alinhar dois polipeptídeos para uma combinação ideal de seus respectivos aminoácidos (quer ao longo da extensão total de uma ou das duas seqüências quer ao longo de uma porção predeterminada de uma ou de ambas as seqüências). Os programas fornecem uma penalidade de abertura padrão e uma penalidade de intervalo padrão e uma matriz de pontuação como a PAM2 50 (uma matriz de pontuação padrão; consulte Dayhoff et ai., in Atlas of Protein Sequence and Structure, vol 5, supp. 3 (1978)) pode ser usada em conjunto com o programa de computador. Por exemplo, o percentual de identidade pode ser calculado como: o número total de combinações idênticas multiplicado por 100 e dividido pela soma do comprimento da seqüência mais longa dentro do intervalo das combinações e o número de intervalos introduzidos nas seqüências mais longas com o objetivo de alinhar as duas seqüências.
Os anticorpos que apresentem as características aqui identificadas como sendo desejáveis em um anticorpo humanizado anti-integrina a2 são submetidos à varredura com o uso dos métodos descritos neste documento. Por exemplo, são fornecidos métodos para triagem de anticorpos anti-integrina a2 candidatos com relação às características e funcionalidades preferenciais. Esses métodos incluem a triagem de anticorpos que se ligam ao epitopo em uma integrina α2β1 ligada por um anticorpo de interesse (ex. : aqueles que competem, inibem ou bloqueiam a ligação do anticorpo TMC-2206 à integrina α2β1).
Exemplos de métodos e materiais são apresentados no Exemplo 13. Ensaios de bloqueio cruzado podem ser realizados e são descritos em Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lane (1988). O mapeamento do epitopo pode ser realizado adicionalmente ou como alternativa, por exemplo, conforme descrito em Champe et al., J. Biol. Chem. 270:1388-1394 (1995), para determinar se o anticorpo se liga a um epitopo de interesse (consulte, ex. : Exemplo 12 para estudos de mapeamento do epitopo do TMC-2206).
A integrina α2β1 imobilizada pode ser usada de maneira semelhante para determinar as potências relativas de ligação, medindo-se os valores de K± em ensaios competitivos (consulte, ex., Exemplo 2). Por exemplo, o Eu-TMC-2206 marcado fluorescentemente é usado na presença de concentrações variáveis de anticorpo candidato não marcado, por exemplo, utilizando um sistema de ensaio semelhante ao descrito acima. A quantidade de Eu-TMC- 2206 ligado é determinada após um período específico de incubação. As curvas de inibição são ajustadas com o modelo "competição de um sítio" com o uso do software Prisma (GraphPad, Inc. CA) para obter os valores da CI50 e para calcular o Ki utilizando a equação de Cheng e Prusoff (Biochem, Pharmacol. 22 (23):3099-108(1973)).
É recomendável preparar, identificar e/ou selecionar anticorpos humanizados anti-integrina a2 que possuam propriedades de ligação benéficas, por exemplo, nas condições descritas no Exemplo 2, no qual os anticorpos candidatos são testados quanto à capacidade para bloquear a adesão celular mediada pela integrina α2β1 em comparação ao TMC-2206 e ao anticorpo camundongo-humano quimérico derivado do TMC-22 06, conforme descrito no Exemplo 2. Por exemplo, células CHO que expressam a integrina a2 humana e células endógenas de hamster βΐ (Symington et al., J. Cell Biol. 120 (2):523-35 (1993)) são preparadas e marcadas com CFSE (Sondas Moleculares, OR) . As células marcadas são preparadas e a concentração da célula é ajustada; as células são mantidas no escuro até serem utilizadas. Uma placa revestida de colágeno (colágeno Tipo I da cauda de rato; BD Biosciences) é preparada e cada solução de anticorpos diluída serialmente é acrescentada à placa de colágeno. Em seguida, as células marcadas são colocadas nos alvéolos e a placa é incubada. Depois de lavadas, as células são lisadas e a intensidade de fluorescência é verificada (excitação, 485 nm; emissão, 535 nm) . A atividade inibitória de cada anticorpo é calculada.
As constantes de ligação dos anticorpos candidatos para o ligante da integrina α2βΐ imobilizada também podem ser calculadas conforme descrito no Exemplo 2. Os alvéolos de uma placa de microt itulação com 96 alvéolos são recobertos com integrina plaquetária α2βΐ(revestimento sob medida com a2pide plaquetas humanas da GTI Inc., WI) e então bloqueada. Por exemplo, para determinar a afinidade do TMC-22 0 6 por seu antígeno da integrina α2, são usados TMC-2206 marcado fluorescentemente ou anticorpo IgG de controle de isotipo (consulte os Exemplos a seguir). O anticorpo marcado fluorescentemente, incluindo o Eu-TMC-2206 ou IgG controle Eu-isotipo, é aplicado às placas de microtitulação com integrina α2β1 bloqueada. Depois da incubação das placas seladas para permitir que a interação anticorpo-antígeno atinja o equilíbrio, as amostras são transferidas para outros alvéolos contendo a solução intensificadora que permitirá a avaliação do marcador livre (não ligado). A solução intensificadora também é acrescentada aos alvéolos esvaziados para avaliação do marcador ligado. Os valores Ka do anticorpo anti-integrina α2 é calculado pela análise de Scatchard. A afinidade relativa dos derivados de TMC-2206 (incluindo anticorpos humanizados derivados ou baseados no TMC-2206) pode ser determinada por meio da determinação do valor Ki em um ensaio de competição. Por exemplo, para o ensaio de competição, o Eu-marcado TMC-2206 é colocado em alvéolos recobertos com α2β1 na presença de anticorpos anti-integrina a2 não marcados, incluindo o TMC-2206 ou anticorpos quiméricos (inclusive humanizados) derivados do ou baseados no TMC-2206, ou anticorpo IgG de controle de isotipo em várias concentrações. Após um período de incubação para atingir o equilíbrio, os alvéolos são lavados e os níveis de anticorpos marcados ligados são medidos na forma de marcador Eu retido em cada alvéolo. 0 valor de Ki pode ser derivado dos valores de EC50 utilizando-se o valor Kd obtido para o anticorpo Eu-TMC- 22 06 por estudos de ligação direta conforme descrito acima.
Em determinadas aplicações, o anticorpo humanizado anti- integrina oc2 é um fragmento de anticorpo. Várias técnicas têm sido desenvolvidas para a produção de fragmentos de anticorpos. Tradicionalmente, esses fragmentos eram obtidos por meio da digestão proteolítica de anticorpos intactos (consulte e.g., Morimoto et ai., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24: 107-117 (1992) e Brennan et al. , Science 229: 81 (1985)). No entanto, esses fragmentos podem ser produzidos diretamente por células hospedeiras recombinantes, tal como a bactéria (consulte ex. : Better et al., Science 240 (4855) :1041-1043 (1988); U.S. Patent No. 6,204,023. Por exemplo, fragmentos de Fab1-SH podem ser diretamente recuperados da E. coli e agregados quimicamente para formar fragmentos de F(ab')2 (Carter et al. , Bio/Technology 10: 163-167 (1992)) . De acordo com outra abordagem, fragmentos de F(ab')2 podem ser isolados diretamente de uma cultura de célula hospedeira recombinante. Outras técnicas para a produção de fragmentos de anticorpos serão evidentes para os profissionais experientes. Em algumas aplicações, pode ser desejável produzir anticorpos humanizados anti-integrina a2 multiespecíficos (ex. : biespecíficos) com especificidades de ligação por pelo menos dois epitopos diferentes. Anticorpos biespecíficos (ex. : com dois braços diferentes de ligação) podem se ligar a dois epitopos diferentes da proteína da integrina α2β1. Como alternativa, um braço da anti-integrina a2 pode ser combinado com um braço que se liga a uma molécula desencadeadora em um leucócito tal como a molécula do receptor da célula T (ex, CD2 ou CD3) , ou receptores Fc para o IgG (FcyR) , como a FcyRl (CD64) , FcyRII (CD32) e FcyRIII (CD16) de maneira a concentrar o mecanismo de defesa celular em uma célula que possua a integrina α2β1 ligada a sua superfície. Os anticorpos biespecíficos podem ser usados para agentes citotóxicos localizados em células com a integrina α2β1 ligada a sua superfície. Esses anticorpos possuem um braço que se liga à integrina α2β1 e um braço que se liga ao agente citotóxico ex. : gelonina, saporina, anti-interferon alfa, alcalóide da vinca, cadeia A da ricina, ou hapteno com radioisótopo). Anticorpos biespecíficos podem ser preparados com anticorpos completos ou fragmentos de anticorpos (ex. : anticorpos biespecíficos F(ab')2) ·
De acordo com outra abordagem para a produção de anticorpos biespecíficos, a interface entre um par de moléculas de anticorpos pode ser manipulada para maximizar a porcentagem de heterodímeros que são recuperados de uma cultura de célula recombinante. A interface preferencial é composta por pelo menos uma parte do domínio CH3 de um domínio constante do anticorpo. Nesse método, uma ou mais pequenas cadeias laterais de aminoácidos são substituídas por cadeias laterais maiores (ex.: tirosina ou triptofano).
Cavidades compensatórias de tamanho menor ou idêntico ao(s) da(s) cadeia(s) lateral(is) maior(es) são criados na interface do segundo anticorpo substituindo-se as grandes cadeias laterais de aminoácidos por cadeias menores (ex.: alanina ou treonina). Isso propicia um mecanismo para aumento da a produção de heterodímeros ao invés de outros produtos finais indesejáveis como os homodímeros (consulte, ex.: WO96/27011).
Anticorpos biespecíficos incluem anticorpos com ligação cruzada ou heteroconjugados. Por exemplo, um dos anticorpos no heteroconjugado pode ser agregado à avidina, o outro à biotina. Anticorpos heteroconjugados podem ser produzidos com o uso de qualquer método conveniente de ligação cruzada. Agentes de ligação cruzada adequados são bem conhecidos por profissionais qualificados e são descritos, por exemplo, na U.S. Patent No. 4,676,980 juntamente com várias técnicas de ligação cruzada.
Técnicas para a produção de anticorpos biespecíficos a partir de fragmentos de anticorpos também foram descritas na literatura. Anticorpos biespecíficos podem ser
preparados com o uso de ligação química. Por exemplo, Brennan et al., (Science 229:81 (1985)) descrevem um procedimento no qual anticorpos intactos são clivados proteoliticamente para produzir fragmentos F(ab')2· Esses fragmentos são reduzidos na presença do agente de complexação ditiol arsenito de sódio para estabilizar ditióis e prevenir a formação de disulfida intermolecular. Os fragmentos Fab1 produzidos são então convertidos em derivados de tionitrobenzoato (TNB). Um dos derivados do Fab1-TNB é então reconvertido em Fab'- tiol por meio de redução com mercaptoetilamina e ê misturada com uma quantidade equimolar de outro derivado do Fab1-TNB para formar o anticorpo biespecífico. Os anticorpos biespecíficos produzidos podem ser usados para a imobilização seletiva de enzimas.
Fragmentos de Fab'-SH, recuperados do E. coli, podem ser quimicamente agregados para formar anticorpos biespecíf icos. Por exemplo, Shalaby et al., (J. Exp. Med. 175:217-225 (1992)) descrevem a produção de uma molécula de um anticorpo biespecífico totalmente humanizado F(ab')2- Onde o fragmento Fab1 foi separadamente secretado do E. coli e submetido à agregação química direta in vitro para formar o anticorpo bioespecífico. 0 anticorpo bioespecífico assim formado foi capaz de se ligar a células que superexpressam o receptor HER2 e células T humanas normais, além de desencadear a atividade lítica de linfócitos citotóxicos humanos contra alvos tumorais da mama de humanos.
Também foram descritas várias técnicas para a produção e isolamento de fragmentos de anticorpos biespecíficos diretamente da cultura de células recombinantes. Por exemplo, anticorpos biespecíficos foram produzidos com o uso de zíperes de leucina (consulte, ex. : Kostgelny et al., J. Immunol. 148 (5) :1547-1553 (1992)). Os peptídeos do zíper de leucina das proteínas Fos e Jun foram ligados a porções Fab1 de dois diferentes anticorpos por fusão de genes. Os homodímeros do anticorpo sofreram redução na região de dobradiça para formar monômeros e em seguida foram oxidados novamente para formar heterodímeros do anticorpo. Esse método também pode ser utilizado para a produção de heterodímeros do anticorpo. A tecnologia do homodímero bivalente "diabody" (consulte, ex.: Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90:6444-6448 (1993)) ofereceu um mecanismo alternativo para a produção de fragmentos de anticorpos biespecíficos. Os fragmentos são compostos por uma região variável da cadeia pesada (VH) conectada a uma região variável da cadeia leve (VL) por um ligante que é curto demais para permitir pareação entre os dois domínios da mesma cadeia. Portanto, os domínios VH e VL de um fragmento são forçados a parear com domínios VL e VH complementares de outro fragmento, formando assim dois sítios de ligação ao antígeno. Também foi relatada uma outra estratégia para a produção de fragmentos de anticorpos biespecíficos com o uso de dímeros Fv (sFv ou scFv) de uma única cadeia (consulte, ex. : Gruber et al., J. Immunol. 152:53 68 (1994)). Como alternativa, o anticorpo biespecífico pode ser um anticorpo linear, produzido por exemplo, conforme descrito em Zapata et al., Protein Eng. 8(10): 1057-1062 (1995) .
São abordados os anticorpos com mais de duas valências. Por exemplo, anticorpos triespecíficos podem ser preparados (consulte, ex.: Tutt et al., J. Immunol. 147: 60 (1991) ) .
São abordadas outras modificações dos anticorpos anti- integrina a2 humanizados. Por exemplo, é possível
modificar a função efetora do anticorpo para aumentar ou diminuir a eficácia do mesmo, por exemplo, para o tratamento do câncer. Resíduo(s) de cisteína podem ser introduzidos na região Fc, permitindo assim a formação de ligação dissulfídica entre as cadeias na região. 0 anticorpo homodímero assim produzido pode melhorar a capacidade de internalização e/ou aumentar a morte celular mediada pelo complemento (MCM) e/ou a citotoxicidade celular dependente do anticorpo (CCDA) (consulte ex.:Caron et al. , J. Exp. Med. 176:1191-1195 (1992) e Shopes, B.J. Immunol. 148:2918-2922 (1992)). Anticorpos homodímeros com atividade antitumoral intensificada também podem ser preparados com o uso de ligadores cruzados heterobifuncionais (consulte, ex. : aqueles descritos em Wolff et al., Câncer Research 53:2560-2565 (1993)). Como alternativa, um anticorpo com duas regiões Fc pode ser manipulado e assim terem suas capacidades de CMC e/ou ADCC intensificadas (consulte, ex. : Stevenson et al. , Anti-Cancer Drug Design 3:219-230 (1989)) .
Imunoconjugados compostos por um anticorpo humanizado anti-integrina a2 conjugado para uma porção, ex:, uma molécula, composição, complexo, ou agente, por exemplo, um agente citotóxico como um agente quimioterápico, toxina (ex. : uma toxina enzimaticamente ativa de bactéria, fungo, planta ou de origem animal, ou fragmentos das mesmas), ou um isotipo radioativo (ex.: um radioconjugado), para direcionar o agente para uma célula, tecido ou órgão que expresse a anti-integrina a2 . Esse imunoconjugado pode ser usado em um método de direcionar para a porção ou agente de um sítio específico de ação caracterizado pela presença da integrina a2 ou α2β1.
Os agentes quimioterápicos que podem ser usados na produção desses imunoconjugados foram descritos acima. As toxinas e fragmentos enzimaticamente ativos dos mesmos que podem ser usados incluem a cadeia A da difteria, fragmentos ativos não ligados da toxina diftérica, cadeia A da exotoxina (de Pseudomonas aeruginosa), cadeia A da ricina, cadeia A da abrina, cadeia A da modecina, alfa- sarcina, proteínas da Aleurites fordii, proteínas da diantina, proteínas da Phytolaca americana (PAPI, PAPII, e PAP-S), inibidor da momordica charantia, curcina, crotina, inibidor da sapaonaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina ou tricotecenes. Uma grande variedade de radionuclídeos encontra-se disponível para a produção de anticorpos anti-integrina alfa 2 radioconjugados. Exemplos incluem 212 Bi, 131In, 90Y ou 186Re.
Conjugados do anticorpo e agente citotóxico são produzidos com o uso de uma grande variedade de agentes agregantes de proteína bifuncional como o N-succinimidil- 3-(2-piridilditiol) propionato (SPDP) , iminotiolano (IT) , derivados bifuncionais de imidoésteres (como o dimetil adipimidato HCL) , ésteres ativos (como o disuccinimidil suberato), aldeídos (como o gluteraldeído), compostos bis-azidos (como o bis (p-azidobenzol) hexanodiamino) , derivados de bis-diazonio (como bis-(p-diazoniobenzol)- etilenodiamina), diisocianatos (como tolueno 2,6- diisocianato), ou compostos de fluorina bis-ativa (como 1, 5-difluoro-2,4-dinitrobenzeno) . Por exemplo, uma imunotoxina da ricina pode ser preparada conforme descrito em Vitetta et al. , Science 238:1098 (1987). 0 ácido marcado com carbono-14 l-isotiocianatobenzil-3- metildietileno triaminepentaacético (MX-DTPA) é um exemplar de agente quelante para a conjugação do radionuclídeo com o anticorpo (consulte, ex.: W094/11026).
Em outra aplicação, o anticorpo pode ser conjugado a um receptor (como a estreptavidina) para uso em pré- direcionamento da célula, tecido ou órgão que expresse a integrina oc2, onde o conjugado anticorpo-receptor é administrado ao paciente seguido da remoção da circulação do conjugado não ligado com o uso de um agente específico e pela posterior administração do ligante (ex:., avidina) que é conjugado a um agente, como por exemplo um agente citotóxico (ex.: um radionuclídeo).
Os anticorpos anti-integrina a2 descritos aqui também podem ser formulados como imunolipossomas. Lipossomas contendo anticorpos são preparados com o uso de métodos conhecidos no meio profissional, conforme descrito em Epstein et al. , Proc. Natl. Acad. Sei. USA 82: 3688 (1985); Hwang et al . , Proc. Natl. Acad. Sei. USA 77: 4030 (1980); e U.S. Patent Nos. 4,485,045 e 4,544,545. Os lipossomas com tempo de circulação aumentado são descritos em U.S. Patent No. 5,013,556.
Lipossomas especialmente úteis podem ser produzidos com o uso do método da evaporação em fase reversa com uma composição de lipídeos formada por fosfatidileolina, colesterol e fosfatidiletanolamina derivada de PEG (PEG- PE) . Os lipossomas são extruídos através de filtros com tamanhos de poros definidos para produzir lipossomas com o diâmetro desejado. Fragmentos de Fab1 de um anticorpo anti-integrina a2 podem ser conjugados aos lipossomas conforme descrito em Martin et al. , J. Biol. Chem. 257: 286-288 (1982) via uma reação de troca dissulfídica. 0 lipossoma pode opcionalmente conter um agente quimioterápico (ex: doxorrubicina) (consulte, e.g., Gabizon et al. , J. National Câncer Inst. 81(19): 1484 (1989)) .
Anticorpos humanizados anti-integrina a2 também podem ser utilizados na Antibody Directed Enzyme Prodrug Therapy (ADEPT) conjugando-se o anticorpo a uma enzima ativadora da pró-droga que converte uma pró-droga (ex. : um agente quimioterápico peptidil, consulte, ex. : WO81/01145) em um medicamento ativo. (consulte, ex. : WO88/07378 e U.S. Patent No. 4,975,278). O componente enzimático do imunoconjugado útil na ADEPT inclui qualquer enzima com ação em uma pró-droga de maneira que a converta na sua forma mais ativa. As enzimas que podem ser utilizadas incluem, mas não se limitam a, fosfatase alcalina, utilizada para converter pró-drogas contendo fosfato em drogas livres; arilsulfatase, utilizada para converter pró-drogas contendo sulfato em drogas livres; citosina deaminase, utilizada para converter 5-fluorocitosina não tóxica em um medicamento antineoplásico, 5-fluorouracil ; proteases, como a protease da serratia, termolisina, subtilisina, carboxipeptidases e catepsinas (como as catepsinas BeL), que podem ser usadas para converter pró-drogas contendo peptídeos em medicamentos livres; D- alanilcarboxipeptidases, utilizadas para converter pró- drogas contendo substitutos do ácido D-amino; enzimas que clivam o carboidrato como a β-galactosidase e neuraminidase utilizadas para converter pró-drogas glicosilatadas em medicamentos livres; β-lactamase utilizadas para converter drogas derivadas com β- lactâmico em medicamentos livres; e penicilina amidases, como a penicilina V amidase ou penicilina G amidase, utilizada para converter drogas derivadas em seus amino nitrogênios com fenoxiacetil ou grupos fenilacetil, respectivamente, em medicamentos livres. Como alternativa, os anticorpos com atividade enzimática, também conhecidos como abzimas, podem ser usados para converter as pró-drogas da invenção em medicamentos ativos livres (consulte, ex.: Massey, Nature 328: 457-458 (1987)). Os conjugados anticorpo-abzima podem ser preparados conforme descrito neste documento, inclusive para apresentação da abzima a uma célula, tecido ou órgão que expresse a integrina αx2.
As enzimas podem ser ligadas de maneira covalente aos anticorpos anti-integrina a2 com o uso de técnicas bem conhecidas no meio profissional, inclusive o uso dos reagentes heterobifuncionais de ligação cruzada discutidos acima. Como alternativa, proteínas de fusão compostas pelo menos pela região de ligação do antígeno de um anticorpo anti-integrina a2 ligada a pelo menos uma porção funcionalmente ativa de uma enzima podem ser produzidas com o uso de técnicas de DNA recombinante bem conhecidas no meio profissional (consulte, ex.: Neuberger et al., Nature 312: 604-608 (1984)).
Em determinadas aplicações da invenção, pode ser recomendado usar um fragmento de anticorpo ao invés de um anticorpo intacto para, por exemplo, aumentar a penetração do tecido ou tumor. Também pode ser recomendado modificar o fragmento do anticorpo para aumentar a meia-vida sérica. Isso pode ser conseguido com a incorporação de um epitopo ligado ao receptor de resgate em um fragmento de anticorpo, por exemplo, através de mutação da região específica no fragmento do anticorpo ou com a incorporação do epitopo no peptídeo marcado que então é fundido ao fragmento do anticorpo em qualquer extremidade ou no meio, por exemplo, através da síntese do DNA ou peptídeo (consulte, ex.:, W096/32478). Podem ser feitas modificações covalentes dos anticorpos humanizados anti-integrina α2 , por exemplo, por síntese química ou por clivagem enzimática ou química do anticorpo. Outros tipos de modificações covalentes do anticorpo podem ser introduzidas na molécula por meio da reação de resíduos de aminoácidos definidos do anticorpo um agente derivado orgânico que é capaz de reagir com as cadeias laterais selecionadas ou resíduos N- ou C- terminal. Os resíduos cisteinil, por exemplo, comumente reagem com α-haloacetatos (e aminas correspondentes), como o ácido cloroacético ou cloroacetamida, para produzir derivados carboximetil ou carboxiamidometil. Os resíduos cisteinil também podem ser derivados pela reação com bromotrifluoroacetona, ácido oc-bromo-/3- (5- imidozoil)propiônico, cloroacetil fosfato, N- alquiilamaleimidas, 3-nitro-2-piridil dissulfida, metil 2-piridil dissulfida, p-cloromercuribenzoato, 2- cloromercuri-4-nitrofenol, ou cloro-7-nitrobenzo-2-oxa- 1,3-diazol. Resíduos de histidil, por exemplo, são obtidos por meio de reação com dietilpirocarbonato no pH 5.5-7.0 porque esse agente é relativamente específico para a cadeia lateral de histidil. 0 para-bromofenacil bromida também pode ser usado; a reação deve ser realizada de preferência em cacodilato de sódio a 0,1 M e pH 6,0. Lisinil e resíduos amino-terminais, por exemplo, reagem com ácido succínico ou outro ácido carboxílico anidrido. A derivatização com esses agentes apresenta o efeito de reverter a carga dos resíduos de lisinil. Outros agentes adequados para a derivatização de resíduos contendo α-amino incluem imidoésteres como o metil picolinimidato, piridoxal fosfato, piridoxal, cloroboroidrido, ácido trinitrobenzenesulfônico, 0- metilisoureia, 2,4-pentanodiona, e reação transaminase- catalizada com glioxilato. Os resíduos de arginil, por exemplo, são modificados pela reação com um ou vários reagentes convencionais, entre eles o fenilglioxal, 2,3- butanodiona, 1,2-ciclohexanodiona e ninidrina. Para a derivatização de resíduos de arginina, é necessário que a reação seja realizada em condições alcalinas devido ao alto pKa do grupo funcional de guanidina. Além disso, esses reagentes podem reagir com os grupos de lisina, além do grupo da arginina epsilon-amina. Os resíduos de tirosil, por exemplo, são especificamente modificados com a intenção específica de introduzir marcadores espectrais nos resíduos de tirosil por meio de reação com compostos aromáticos diazônio ou tetranitrometano. Mais comumente, o N-acetilimidizol e o tetranitrometano são utilizados para formar espécies 0-acetil tirosil s e derivados 3- nitro, respectivamente. Os resíduos de tirosil são iodados com o uso de 125I ou 131I para preparar proteínas marcadas para uso em radioimunoensaio. Grupos laterais carboxil, por exemplo, aspartil ou glutamil, são seletivamente modificados por reação com carbodiimidas (R-N=C=N-R'), onde ReR' representam diferentes grupos alquila, como 1-ciclohexil-3-(2-morfolinil-4-etil) carbodiimida ou l-etil-3-(4-azonia-4,4-dimetilpentil) carbodiimida. Além disso, resíduos de aspartil e glutamil são convertidos em resíduos de asparaginil e glutaminil por reação com íons de amônio. Resíduos de glutaminil e asparaginil são freqüentemente deaminados aos resíduos glutamil e aspargil correspondentes, respectivamente. Esses resíduos são deaminados em condições neutras ou básicas. A forma deaminada desses resíduos está dentro do escopo desta invenção. Outras modificações incluem a hidroxilação da prolina e lisina, fosforilação dos grupos hidroxil de resíduos de seril ou treonil, metilação dos grupos α-amino de lisina, arginina, e cadeias laterais de histidina (Τ. E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, pp. 79-86 (1983)), acetilação da amina N-terminal e a amidação de qualquer grupo carboxil C-terminal . Outro tipo de modificação covalente envolve a agregação química ou enzimática de glicosídeos ao anticorpo. A vantagem desses procedimentos é que os mesmos não requerem a produção do anticorpo em uma célula hospedeira com capacidade de glicosilação para glicosilação N- ou 0- ligada. Dependendo do modelo de agregação utilizado, o(s) açúcar(es) pode(m) ser anexado(s) à (a) arginina e histidina, (b) grupos carboxil livre, (c) grupos sulfidril livre como os da cisteína, (d) grupos hidroxil livre como os da serina, treonina, ou hidroxiprolina, (e) resíduos aromáticos como a fenilalanina, tirosina, ou triptofano, ou (f) o grupo amida de glutamina (consulte, ex. : W087/05330; Aplin and Wriston, CRC Crit. Rev. Biochem., pp. 259-306 (1981)).
É possível remover quimicamente ou enzimaticamente qualquer porção de carboidrato presente no anticorpo. A deglicosilação química requer a exposição do anticorpo ao composto de ácido trifluorometanesulfônico, ou um composto equivalente. Esse tratamento resulta em clivagem da maior parte ou de todos os açúcares, com exceção do açúcar ligado (N-acetilglicosamina ou N- acetilgalactosamina), ao mesmo tempo em que deixa o anticorpo intacto (consulte, ex. : Hakimuddin, et al., Arch. Biochem. Biophys. 259: 52 (1987); Edge et al., Anal. Biochem., 118: 131 (1981)). A clivagem enzimática de porções do carboidrato nos anticorpos podem ser conseguidas com o uso de uma grande variedade de endo e exo-glicosidases, (consulte, ex.: Thotakura et al., Meth. Enzymol. 138: 350 (1987)).
Outro tipo de modificação covalente do anticorpo é conseguida ligante-se o anticorpo a um dos vários polímeros não proteináceos, como o polietileno glicol, polipropileno glicol, ou polioxialquilenos (consulte, ex.: U.S. Patent Nos. 4,640,835; 4,496,689; 4,301,144; 4,670,417; 4,791,192 OU 4,179,337).
São aqui descritos o(s) ácido(s) nucléico(s) isolado(s) que codifica(m) um anticorpo humanizado anti-integrina α2, os vetores e as células hospedeiras que compõem o ácido nucléico e as técnicas recombinantes para a produção do anticorpo. Para a produção recombinante do anticorpo, o(s) ácido(s) nucléico(s) que codifica(m) o anticorpo são isolados e inseridos em um vetor replicável para posterior clonagem (amplif icação do DNA) ou para expressão. O DNA que codifica o anticorpo é prontamente isolado e seqüenciado com o uso de procedimentos convencionais (ex.: com o uso de sondas de oligonucleotídeos que podem se ligar especificamente a genes que codificam as cadeias pesada e leve do anticorpo). Vários vetores encontram-se disponíveis. Os componentes do vetor geralmente incluem, mas não se limitam a um ou mais dos seguintes itens: uma seqüência de sinal, uma origem de replicação, um ou mais genes marcadores, um elemento intensificador, um promotor e uma seqüência de terminação da transcrição.
Um anticorpo anti-integrina a2 pode ser produzido com técnica recombinante, inclusive como uma fusão de um polipeptídeo com um polipeptídeo heterólogo, que é preferencialmente uma seqüência de sinal ou outro polipeptídeo com um sítio de clivagem específico no N- terminus da proteína ou polipeptídeo maduro. A seqüência de sinal heterólogo selecionada é, de preferência, uma que seja reconhecida e processada (ex. : clivada por uma peptidase sinalizadora) pela célula hospedeira. Para células hospedeiras procarióticas que não reconhecem e processam uma seqüência sinalizadora eucariótica (ex;, um seqüência sinalizadora da imunoglobulina), a seqüência do sinal é substituída por uma seqüência de sinal procariótico incluindo, por exemplo, pectatoliase (como o pelB), fosfatase alcalina, penicilinase, lpp/ ou sequencia líder de enterotoxina II termoestável. Para a secreção de levedura, pode-se utilizar uma seqüência sinalizadora de fungos, incluindo, por exemplo, a seqüência líder da invertase de levedura, um fator líder (incluindo os fatores líderes α de Saccharomyces e Kluyveromyces), ou líder da fosfatase ácida, seqüência líder da glucoamilase da C. albicans, ou o sinal descrito em W090/13646. Na expressão de células de mamíferos, seqüências sinalizadoras de mamífero e seqüências líder secretórias virais, por exemplo, a seqüência sinalizadora do herpes simplex gD , encontram-se disponíveis e podem ser utilizadas. 0 DNA para essa região percussora (ex. : seqüência do sinal) é ligada ao frame de leitura do DNA que codifica um anticorpo anti-integrina oc2 . Tanto os vetores de expressão quanto os vetores de clonagem contém uma seqüência de ácido nucléico que capacita o vetor a replicar em uma ou mais células hospedeiras selecionadas. Geralmente, em vetores de clonagem, essa seqüência é uma que capacite o vetor a se replicar independentemente do DNA do cromossomo hospedeiro e inclue origens da replicação e seqüências de replicação autônomas. Essas seqüências são bem conhecidas para uma grande variedade de bactérias, leveduras e vírus. Por exemplo, a origem da replicação do plasmídeo pBR322 é adequada para a maioria das bactérias gram- negativas, a origem do plasmídeo 2 μ é adequada para leveduras, e várias origens virais (SV40, polioma, adenovírus, VSV ou BPV) são úteis para a clonagem de vetores em células de mamíferos. Geralmente, a origem do componente de replicação não é necessária para os vetores de expressão de mamíferos (ex.: a origem do SV4 0 pode ser normalmente utilizada somente porque contém um promotor precoce).
Os vetores de expressão e de clonagem podem conter um gene de seleção, também denominado marcador selecionável. Os genes de seleção comuns codificam proteínas que (a) conferem resistência aos antibióticos ou outras toxinas, ex.: ampicilina, neomicina, metotrexato, ou tetraciclina, (b) complementam deficiências auxotróficas, ou (c) fornecem nutrientes críticos indisponíveis no meio complexo, (ex. : o gene que codifica a D-alanina racemase para bacilos).
Um exemplo de esquema de seleção utiliza uma droga para interromper o crescimento de uma célula hospedeira. Essas células que são transformadas com sucesso com um gene heterólogo produzem uma proteína que confere resistência à droga e assim sobrevive ao esquema de seleção.
Exemplos dessa seleção dominante usam as drogas metotrexato, neomicina, histidinol, puromicina, ácido micofenólico e higromicina.
Outro exemplo de marcadores selecionáveis adequados para células de mamíferos são aqueles que possibilitam a identificação de células competentes para assumir o ácido nucléico do anticorpo anti-integrina α2, como o DHFR, timidina quinase, metalotioneina-I e II, de preferência genes metalotioneina de primatas, adenosina deaminase, ornitina decarboxilase, etc. Por exemplo, as células transformadas com o gene de seleção DHFR são identificadas em primeiro lugar por cultura de todos os transformantes em um meio de cultura contendo metotrexato (Mtx), um antagonista competitivo do DHFR. Uma célula hospedeira apropriada para o uso com o DHFR wwild-type" é a linhagem de célula ovariana de hamster Chinês (CHO) com deficiência na atividade de DHFR.
Como alternativa, as células hospedeiras (principalmente hospedeiras "wild-type" que contém DHFR endógeno) transformadas ou co-transformadas com seqüências de DNA que codificam o anticorpo anti-integrina cc2, a proteína DHFR "wild-type", e outro marcador selecionável como o aminoglicosídeo 3'-fosfotransferase (APH) podem ser selecionadas por crescimento celular em meio contendo um agente de seleção para o marcador selecionável, incluindo um antibiótico aminoglicosídeo, como a kanamicina, neomicina ou G418 (consulte ex. : U.S. Patent No. 4,965,199) .
Outro gene de seleção adequado para o uso em levedura é o gene trpl presente no plasmídeo de levedura YRp7 (Stinchcomb et al., Nature, 282: 39 (1979)). 0 gene trpl fornece um marcador de seleção para uma cepa mutante de levedura que não cresce em triptofano, por exemplo, ATCC No. 44076 ou PEP4-1 (consulte, ex.: Jones, Genetics, 85: 12 (1977) ) . A presença de lesão trpl no genoma da célula hospedeira da levedura oferece um ambiente eficaz para a detecção da transformação por crescimento na ausência de triptofano. De maneira semelhante, cepas de levedura deficientes em Leu2 (ATCC 20,622 ou 38,626) são complementadas por plasmídeos conhecidos contendo o gene Leu2 .
Vetores derivados do plasmídeo circular de 1.6 μ pKD1 também podem ser usados para a transformação de leveduras Kluyveromyces . Como alternativa, um sistema de expressão para produção em grande escala de quemosina recombinante de bezerro foi relatado para K. Iactis por Van den Berg, Bio/Technology, 8:135 (1990). Vetores de expressão multi- cópia estáveis para a secreção de albumina sérica recombinante humana madura por cepas industriais de Kluyveromyces também foram descritos (consulte, ex. : Fleer et al. , Bio/Technology, 9: 968-975 (1991)).
Os vetores de expressão e clonagem geralmente contêm um promotor que é reconhecido pelo organismo hospedeiro e é operavelmente ligado ao ácido nucléico do anticorpo anti- integrina a2. Os promotores adequados para uso com hospedeiros procarióticos incluem o promotor arabinose (ex. : araB) , promotor phoA, sistemas promotores β- lactamase e lactose, fosfatase alcalina, um sistema promotor triptofano (trp) e promotores híbridos como o promotor tac. No entanto, outros promotores bacterianos conhecidos são adequados. Promotores para uso em sistemas bacterianos também conterão uma seqüência Shine-Dalgamo (S.D.) operavelmente ligada ao DNA que codifica o anticorpo anti-integrina a2.
Seqüências de promotores são conhecidas para os eucariotos. A maioria dos genes eucarióticos possui uma região rica em AT localizada aproximadamente entre 25 e 30 bases acima do local onde a transcrição é iniciada. Outra seqüência encontrada entre 7 0 e 8 0 bases acima do local do início da transcrição de muitos genes é uma região CNCAAT (SEQ ID NO:115) onde o N pode ser qualquer nucleotídeo. Na extremidade 3' da maioria dos genes eucarióticos encontra-se uma seqüência AATAAA (SEQ ID NO: 116) que pode ser o sinal para o acréscimo do radical poli A no terminal 3' da seqüência de codificação. Essas seqüências são adequadamente inseridas em vetores eucarióticos de expressão.
Exemplos de seqüências de promotores adequados para uso com leveduras hospedeiras incluem, mas não se limitam aos promotores 3 -fosfoglicerato quinase ou outras enzimas glicolíticas, como a enolase, gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase, hexoquinase, piruvato decarboxilase, fosfofructoquinase, glicose-6-fosfato isomerase, 3- fosfoglicerato mutase, piruvato quinase, triosefofato isomerase, fosfoglicose isomerase, e glicoquinase. Outros promotores de leveduras, que são promotores indutíveis com a vantagem adicional de transcrição controlada por condições de crescimento são as regiões de promotores para o álcool desidrogenase 2, isocitocromo C, ácido fosfatase, enzimas degradantes associadas ao metabolismo do nitrogênio, metalotioneína, gliceraldeído- 3-fosfato desidrogenase, e enzimas responsáveis pela utilização de maltose e galactose. Os vetores e promotores adequados para uso na expressão de leveduras são descritos em EP 73,657. Os intensificadores de leveduras também são usados de maneira proveitosa com promotores de levedura..
A transcrição do anticorpo anti-integrina 2a a partir de vetores em células hospedeiras de mamíferos é controlada, por exemplo, por promotores obtidos de genomas de vírus como o vírus polioma, pox vírus aviário, adenovírus (como Adenovírus 2), vírus da papilomatose bovina, vírus do sarcoma aviário, citomegalovírus, um retrovírus, vírus da hepatite B ou o Vírus de Símio 40 (SV40), de promotores heterólogos mamíferos, por exemplo, o promotor da actina ou um promotor da imunoglobulina, dos promotores "heat- shock", contanto que esses promotores sejam compatíveis com os sistemas de células hospedeiras. Os promotores precoces e tardios do vírus SV40 são obtidos de maneira conveniente como um fragmento de restrição do SV40 que também contém o SV40 origem viral da replicação. 0 promotor precoce inicial do citomegalovírus humano é obtido de forma conveniente como um fragmento de restrição HindIII E. Um sistema para a expressão do DNA em hospedeiros mamíferos com o uso de vírus da papilomatose bovino como vetor é descrito na U.S. Patent No. 4,419,446, e uma modificação desse sistema é descrito na U.S. Patent No. 4,601,978 (consulte, também Reyes et al., Nature 297: 598-601 (1982) sobre a expressão do β- interferon humano cDNA em células de camundongos sob o controle do promotor da timidina quinase do vírus do herpes simples). Como alternativa, o terminal longo do vírus do sarcoma de Rous pode ser usado como o promotor. A transcrição do DNA que codifica o anticorpo anti- integrina -a2 por eucariotos mais elevados freqüentemente aumenta com a inserção de uma seqüência intensificadora no vetor. São conhecidas várias seqüências intensificadoras de genes de mamíferos (globina, elastase, albumina, a-fetoproteína e insulina). No entanto, é freqüente a utilização de um intensificador obtido a partir de vírus de célula eucariótica. Alguns exemplos incluem o intensificador do SV40 no lado tardio da origem da replicação (bp 100-270), o intensificador do promotor inicial do citomegalovírus, o intensificador polioma no lado tardio da origem da replicação e os intensificadores de adenovírus (consulte também, ex. : Yaniv, Nature 297: 17-18 (1982) sobre elementos intensificadores para ativação dos promotores de eucarióticos). 0 intensificador pode se unido ao vetor na posição 5' ou 3' da seqüência codificada do anticorpo anti-integrina α2, mas de preferência é localizado no sítio 5' do promotor. Outros sistemas de regulação de gene bem conhecidos no meio profissional (ex:. sistemas indutíveis, como os sistemas indutíveis de tetraciclina e de GeneSwitch™) podem ser usados para controlar a transcrição de DNA que codifica o anticorpo anti- integrina a2.
Os vetores de expressão utilizados em células hospedeiras eucarióticas (leveduras, fungos, insetos, plantas, animais, humanos, ou células nucleadas de outros organismos multicelulares) também conterão as seqüências necessárias para a terminação da transcrição para estabilizar o mRNA. Essas seqüências estão comumente disponíveis a partir da 5' e, ocasionalmente 3', regiões não traduzidas de DNAs viral ou cDNAs ou eucarióticos. Essas regiões contêmm segmentos de nucleotídeo transcritas como fragmentos poliadenilados na porção não traduzida do mRNA que codifica o anticorpo anti-α2 integrina. Um componente de terminação da transcrição útil é a região de poliadenilação do hormônio do crescimento bovino (consulte, ex, W094/11026 e o vetor de expressão descrito no mesmo).
Células hospedeiras adequadas para a clonagem ou expressão do DNA nos referidos vetores são a procariota, levedura, ou células eucarióticas mais desenvolvidas conforme descrito acima. As procariotas adequadas para esse fim incluem eubactérias gram-positivas ou gram- negativas, por exemplo, Enterobacteriaceae como a Escherichia, ex. : E. coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, ex.: Salmonella typhimurium, Serratia, ex. : Serratia marcescans, e Shigella, além de Bacilos como o B. subtilis e B. licheniformis, Pseudomonas como o P. aeruginosa, e Streptomyces. Hospedeiros adequados para clonagem do E. coli incluem o E. coli 294 (ATCC 31,446), E. coli Β, E. coli X1776 (ATCC 31,537), e E. coli W3110 (ATCC 27,325). Além dos procariotos, micróbios eucariotos como fungo filamentoso ou levedura são hospedeiros adequados para a clonagem ou expressão dos vetores que codificam o anticorpo anti-integrina alfa 2. Saccharomyces cerevisiae, ou o fermento comum utilizado para cozinhar, é o utilizado com maior freqüência entre os microorganismos hospedeiros eucarióticos menos evoluídos. No entanto, vários outros gêneros, espécies e cepas são geralmente disponíveis e úteis, como por exemplo: Schizosaccharomyces pombe; hospedeiros Kluyveromyces incluindo K. lactis, K. fragilis (ATCC 12,424), K. bulgaricus (ATCC 16,045), K. wickeramii (ATCC 24,178), K. waltii (ATCC 56,500), K. drosophilarum (ATCC 36,906), K. thermotolerans, ou K. marxianus; yarrowia (EP 402,226); Pichia pastoris (EP 183,070); Candida; Trichoderma reesia (EP 244,234); Neurospora crassa; Schwanniomyces como Schwanniomyces occidentalis; e fungos filamentosos incluindo Neurospora, Penicillium, Tolypocladium, ou hospedeiros Aspergillus como A. nidulans ou A. niger. Células hospedeiras adequadas para a expressão do anticorpo anti-integrina a2 glicosilada são derivadas de organismos multicelulares. Exemplos de células de invertebrados incluem células de plantas e de insetos. Foram identificadas várias cepas e variantes baculovirais e as células hospedeiras permissivas correspondentes de insetos como a Spodoptera frugiperda (lagarta) , Aedes aegypti (mosquito), Aedes albopictus (mosquito) ,
Drosophila melanogaster (mosca-da-fruta) e Bombyx mori . Uma grande variedade de cepas de vírus para transfecção encontra-se abertamente disponível, por exemplo, a variante L-I da Autographa californica NPV e a cepa Bm-5 da Bombyx mori NPV, e esses vírus podem ser usados especialmente para a transfecção de células de Spodoptera frugiperda.
Culturas de células de algodão, milho, batata, soja, petúnia, tomate e tabaco também podem ser utilizadas como hospedeiras.
No entanto, o interesse tem sido maior por células de vertebrados e a propagação de células de vertebrados, inclusive uma grande variedade de células de mamíferos, tornou-se procedimento de rotina. Exemplos de células hospedeiras de mamíferos que podem ser usadas incluem:
Uma linhagem de CVl de rim de macaco transformada pelo SV40 (ex. : COS - 7, ATCC CRL 1651) ; uma linhagem 293 de rim embriônico humano ou células 2 93 subclonadas para crescimento em cultura em suspensão (consulte ex:. , Graham et al. , J. Gen Virol. 36: 59 (1977)); células renais de filhotes de hamsters (ex. : BHK, ATCC CCL 10) ; células ovarianas de hamster chinês (CHO), incluindo células CHO sem DHFR (consulte, ex. : DHFR Urlaub et al. , Proc. Natl. Acad. Sei. USA 77: 4216 (1980)); células de sertoli de camundongo ((ex., TM4, Mather, Biol. Reprod.
23: 243-251 (1980)); células renais de macaco (ex. : CVl ATCC CCL 70) ; células renais de macaco verde africano (e.g. , VERO-76, ATCC CRL-1587); células de carcinoma cervical humano (ex. : HELA, ATCC CCL 2) ; células renais de cães (ex. : MDCK, ATCC CCL 34) ; células hepáticas de rato búfalo (ex. : BRL 3A, ATCC CRL 1442) ; células pulmonares humanas (ex. : W13 8, ATCC CCL 75) ; células hepáticas humanas (ex. : Hep G2, HB 8065); tumor mamário de camundongo (ex. : MMT 060562, ATCC CCL51) ; Células TRI (consulte, ex. : Mather et al. , Annals N. Y Acad. Sei. 383: 44-68 (1982)); células MRC 5; células FS4; ou uma linhagem de hepatoma humano (ex.: Hep G2).
As células hospedeiras são transformadas com os vetores de expressão ou de clonagem descritos acima para a produção de anticorpo anti-integrina a2 e cultivadas em meio nutriente convencional modificado conforme a necessidade para induzir promotores, selecionando transformantes e/ou a amplificando os genes que codificam as seqüências desejadas.
A cultura de células hospedeiras para a produção do anticorpo anti-integrina a2 pode ser feita em uma grande variedade de meios. Os meios de cultura comercialmente disponíveis como o Ham1S FlO (Sigma), Minimal Essential Médium ((MEM) , (Sigma), RPMI-1640 (Sigma), e Dulbecco' s Modified Eagle1S Médium ((DMEM), Sigma) são adequados para a cultura de células hospedeiras. Além disso, qualquer meio de cultura descrito em Ham et al. , Meth. Enz. 58: 44 (1979), Barnes et al. , Anal. Biochem. 102: 255 (1980), U.S. Patent Nos. 4,767,704; 4,657,866; 4,927,762; 4,560,655; ou 5,122,469; W090103430; WO 87/00195; ou U.S. Patent Re. No. 30,985 pode ser usado como meio de cultura para as células hospedeiras.
Qualquer desses meios de cultura pode ser suplementado conforme a necessidade com hormônios e/ou outros fatores de crescimento (como a insulina, transferrina, ou fator de crescimento epidérmico), sais (como cloreto de sódio, cálcio, magnésio e fosfato), tampões (como HEPES), nucleotídeos (como adenosina e timidina), antibióticos (como GENTAMICINA™), elementos traço (definidos como compostos inorgânicos geralmente presentes em concentrações finais no intervalo micromolar) , e glicose ou uma fonte equivalente de energia. Quaisquer outros suplementos necessários também podem ser incluídos em concentrações adequadas que são conhecidas por profissionais qualificados. As condições para a cultura, como temperatura, pH, e outras, são selecionadas por profissionais qualificados, inclusive aquelas condições de culturas previamente utilizadas com a célula hospedeira selecionada para a expressão. Os anticorpos anti-integrina a2 células podem ser purificados a partir das células, inclusive células microbianas ou de mamíferos, com o uso, por exemplo, de cromatografia de afinidade com proteína A, cromatografia de troca iônica, cromatografia de interação hidrofóbica, eletroforese em gel, diálise, e/ou cromatografia de afinidade A adequação da proteína A como um ligante de afinidade depende da espécie e do isotipo de qualquer domínio da imunoglobulina Fc presente no anticorpo. A proteína A pode ser usada para purificar anticorpos baseados nas cadeias pesadas humanas γ1, γ2, ou γ4 (consulte, ex. : Lindmark et ai., J. Immunol. Meth. 62:1- (1983)) . A proteína G pode ser usada para isotipos de camundongo e para a γ3 humana (consulte, ex.: Guss et al, EMBO J. 5:1516-1517 (1986)) . A matriz a qual o ligante é freqüentemente anexado é a agarose, mas existem outras matrizes disponíveis. Matrizes mecanicamente estáveis como o vidro com poros controlados ou poli(estireno divinil)benzeno possibilitam taxas de fluxo mais rápidas e períodos menores de processamento do que os conseguidos com a agarose. Quando o anticorpo for composto por um domínio CH3, o Bakerbond ABX™ (J.T. Baker, Phillipsburg, N.J.) pode ser usado para purificação. A purificação da proteína pode incluir uma ou mais das seguintes técnicas: fracionamento em uma coluna de troca iônica, precipitação 35 de etanol, HPLC de fase reversa, cromatografia em sílica, cromatografia em heparina SEPHAROSE™, cromatografia em uma resina de troca de ânion ou cátion (ex. : uma coluna de ácido poliaspártico), cromatoconcentração, SDS-PAGE, precipitação de sulfato de amônia e/ou cromatografia de interação hidrofóbica. Após a(s) etapa(s) de purificação, pode ser útil, por exemplo, submeter uma mistura composta pelo anticorpo de interesse e contaminantes a uma cromatografia de interação hidrofóbica de pH baixo com o uso de tampão de eluição com pH entre cerca de 2,5-4,5, de preferência realizada com baixa concentração de sal (ex.: de cerca de 0-0,25M de sal).
Formulações de um anticorpo anti-integrina α2, inclusive aqueles para administração terapêutica, são preparadas para armazenamento através da mistura do anticorpo que apresente o grau desejado de pureza com carreadores, diluentes, excipientes ou estabilizadores opcionais fisiologicamente aceitáveis (Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)), na forma de formulações liofilizadas ou soluções aquosas. Os carreadores, diluentes, excipientes, ou estabilizadores aceitáveis não são tóxicos para os recipientes nas doses e concentrações empregadas, e incluem tampões como fosfato, citrato, e outros ácidos orgânicos; antioxidantes incluindo o ácido ascórbico e metionina; conservantes (como cloreto de amônio octadecildimetilbenzil; cloreto de hexametônio; cloreto de benzalcônio, cloreto de benzetônio; fenol, butil ou benzil álcool; alquila parabenos como metil ou propil parabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol; e m-cresol); polipeptídeos de baixo peso molecular (menos de cerca de 10 resíduos); proteínas como albumina sérica, gelatina ou imunoglobulinas; polímeros hidrofílicos como polivinilpirrolidona; aminoácidos como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina ou lisina; monossacarídeos, dissacarídeos ou outros carboidratos incluindo glicose, manose, ou dextrinas; agentes quelantes como EDTA; açúcares como sucrose, manitol, trealose ou sorbitol; contra-íons formadores de sal como sódio; complexos de metal (ex., complexos prote£na-Zn) ; e/ou surfactantes não-iônicos como TWEΕΝ™, PLURONICS™ ou polietilenoglicol (PEG).
A formulação do anticorpo também pode conter mais de um composto ativo para a indicação específica do tratamento, de preferência aqueles com atividades complementares que não afetem adversamente uns aos outros. Pode ser necessário acrescentar um anticorpo anti-integrina a2 a um ou mais agentes usados no momento para tratar ou prevenir o distúrbio em questão. Também pode ser necessário usar um agente imunossupressor mais adiante. Essas moléculas estão presentes nas combinações em quantidades eficazes para o propósito desejado. Os ingredientes ativos também podem ser acondicionados em uma microcápsula preparada, por exemplo, com o uso de técnicas de coaservação ou polimerização interfacial, por exemplo, hidroximetilcelulose ou microcápsula de gelatina e microcápsula de poli-(metilmetacilato) , respectivamente, em sistemas coloidais de liberação de medicamentos (por exemplo, lipossomas, microesferas de albumina, microemulsões, nano-partículas ou nanocápsulas) ou em macroemulsões. Essas técnicas são descritas, por exemplo, em Remington1S Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980).
As formulações a serem usadas para administração in vivo devem ser preferencialmente estéreis. Isso é prontamente conseguido, por exemplo, pela filtração através de membranas de filtração estéreis.
Pode-se preparar formulações para liberação sustentada. Exemplos adequados de formulações para liberação sustentada incluem matrizes semipermeáveis de polímeros hidrofóbicos sólidos contendo o anticorpo, matrizes na forma de artigos, ex.: filmes, ou microcápsulas. Exemplos de matrizes para liberação sustentada incluem poliésteres, hidrogéis (por exemplo, poli (2-hidroxietil- metacrilato) ou poli(vinilácool)), polilactídeos (U.S. Patent No. 3,773,919), copolímeros de ácido L-glutâmico e γ etil L-glutamato, acetato etileno-vinil não degradável, copolímeros degradáveis de ácido lático-ácido glicólico como Lupron Depot™ (microesferas injetáveis compostas por copolímero de ácido lático ácido glicólico e acetato de leuprolida ) e ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutírico. Enquanto os polímeros como o acetato etileno-vinil e ácido lático-ácido glicólico possibilitam a liberação de moléculas por mais de 100 dias, determinados hidrogéis liberam proteínas por períodos menores. Quando anticorpos encapsulados permanecem no organismo por um período mais longo, a natureza dos mesmos pode mudar ou ocorrer agregação em conseqüência da umidade a 37°C, resultando em perda da atividade biológica e em possíveis alterações na imunogenicidade. Estratégias racionais podem ser elaboradas para estabilização dependendo do mecanismo envolvido. Por exemplo, se for descoberto que o mecanismo de agregação é uma formação ligada ao S-S intermolecular através da troca tio-dissulfídica, a estabilização pode ser conseguida com a modificação de resíduos de sulfidril, fazendo a liofilização de soluções acídicas, controlando o conteúdo de umidade, usando aditivos apropriados e desenvolvendo composições de matrizes poliméricas específicas.
Os anticorpos anti-a2 podem ser usados como agentes de purificação por afinidade . Nesse processo, os anticorpos são imobilizados na fase sólida como uma resina Sephadex ou filtro de papel com o uso de métodos bem conhecidos no meio profissional. 0 anticorpo imobilizado é colocado em contato com uma amostra contendo a proteína da integrina α2β1 (ou fragmento da mesma) para ser purificada e, em seguida, o suporte é lavado com um solvente adequado que removerá amplamente todo o material da amostra, exceto a proteína da integrina α2β1, que está ligada ao anticorpo imobilizado. Finalmente, o suporte é lavado com outro solvente adequado, como um tampão de glicina com pH 5,0 para soltar a proteína da integrina α2β1 do anticorpo. Os anticorpos anti-integrina a2 também podem ser úteis em ensaios para diagnóstico para a proteína da integrina α2β1, ex. : detectando sua expressão em células e tecidos específicos e no soro. Para aplicações diagnosticas, o anticorpo será geralmente marcado com uma porção detectável. Vários marcadores encontram-se disponíveis os quais podem ser em geral agrupados dentro das seguintes categorias de radioisótopos, marcadores fluorescentes e marcadores enzima-substrato. Radioisótopos como 35 S, 14C, 125I, 3H e 131I, são marcadores úteis. 0 anticorpo pode ser marcado com o radioisótopo, por exemplo, com o uso das técnicas descritas em Current Protocols in Immunology, Volumes 1 and 2, Coligen et al. , Ed. Wiley- Interscience, New York, N.Y., Pubs. (1991) e a radioatividade pode ser medida, por exemplo, por contagem de cintilação. Marcadores fluorescentes como quelatos de terras raras (quelatos de európio) ou fluoresceína e seus derivativos, rodamina e seus derivativos, dansil, Lissamina, ficoeritrina e Texas Red também podem ser utilizados. Os marcadores fluorescentes podem ser conjugados ao anticorpo, por exemplo, com o uso das técnicas descritas em Current Protocols in Immunology, supra citadas. A fluorescência pode ser quantificada, por exemplo, usando um fluorímetro. Vários marcadores enzima-substrato também podem ser usados (consulte, ex.: U.S. Patent No. 4,275,149 para uma revisão). A enzima geralmente catalisa uma alteração química do substrato cromogênico que pode medida com o uso de várias técnicas. Por exemplo, a enzima pode catalisar uma mudança de cor em um substrato, que será medida espectrofotometricamente. Como alternativa, a enzima pode alterar a fluorescência ou a quimiluminescência do substrato. As técnicas para quantificar uma alteração na fluorescência foram descritas acima. 0 substrato quimiluminescente se torna eletronicamente excitado por uma reação química e pode emitir luz que pode ser medida (ex. : com o uso de quimiluminômetro) ou doar energia para um aceptor fluorescente. Exemplos de marcadores enzimáticos incluem luciferases (ex.: luciferase de moscas de fogo e luciferase bacteriana; U.S. Patent No. 4,737,456), luciferina, 2,3-diidroftalazinedionas, malato desidrogenase, urease, peroxidase como horseradish peroxidase (HRPO) , fosfatase alcalina, β-galactosidase, glicoamilase, lisozima, oxidases de sacarídeos (ex. : glicose oxidase, galactose oxidase, e glicose-6-fosfato desidrogenase), oxidases heterocíclicas (como uricase e xantina oxidase), lactoperoxidase, microperoxidase e outros. Técnicas para a conjugação de enzimas em anticorpos são descritas, por exemplo, em 0'Sullivan et ai., Methods for the Preparation of Enzyme-Antibody Conjugates for use in Enzyme Immunoassay, in Methods in Enzym. (ed J. Langone & H. Van Vunakis), Academic press, N.Y., 73: 147-166 (1981). Exemplos de combinações de enzima-substrato incluem, por exemplo: (i) Horseradish peroxidase (HRPO) com hidrogênio peroxidase como um substrato, no qual a hidrogênio-peroxidase oxida um precursor do contraste (ex. : ortofenileno diamina (OPD) ou 3,3', 5,5'-hidrocloreto de tetrametilbenzidina (TMB)); (ii) fosfatase alcalina (AP) com fosfato de para- Nitrofenil como substrato cromogênico; e (iii) β-D- galactosidase (/S-D-Gal) com um substrato cromogênico (ex. : p-nitrof enil-/3-D-galactosidase) ou substrato fluorogênico 4-metilumbeliferil-β-D-galactosidase.
Várias outras combinações de enzima-substrato encontram- se disponíveis para profissionais qualificados (consulte, ex. : U.S. Patent Nos. 4,275,149 e 4,318,980 para uma revisão geral).
Algumas vezes, um marcador é indiretamente conjugado ao anticorpo. Um profissional experiente conhecerá as várias técnicas que podem ser usadas para conseguir esse resultado. Por exemplo, o anticorpo pode ser conjugado com biotina e qualquer uma das três amplas categorias mencionadas acima podem ser conjugadas com avidina, ou vice-versa. A biotina se liga seletivamente à avidina e assim, o marcador pode ser conjugado com o anticorpo dessa maneira indireta. Como alternativa para conseguir a conjugação indireta do marcador com o anticorpo, o anticorpo pode ser conjugado com um pequeno hapteno (ex. : digoxina) e um dos diferentes tipos de marcadores mencionados acima pode ser conjugado com o anticorpo anti-hapteno (ex.: anticorpo anti-digoxina). A conjugação indireta do marcador com o anticorpo pode ser assim conseguida.
Um anticorpo anti-integrina a2 não precisa ser marcado e a sua presença pode ser detectada com o uso de um anticorpo marcado que se ligue ao anticorpo anti- integrina a2. Anticorpos anti-integrina a2 podem ser empregados em qualquer método conhecido de ensaio, como ensaios de ligação competitiva, ensaios tipo sanduíche diretos e indiretos e ensaios de imunoprecipitação (consulte, ex:., Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, pp.147-158 (CRC Press, Inc. 1987)). Os ensaios de ligação competitiva dependem da capacidade de um padrão marcado competir com o analito da amostra testada para ligação com uma quantidade limitada do anticorpo. Por exemplo, a quantidade de proteína da integrina a2al na amostra de teste é inversamente proporcional à quantidade do padrão que se ligará aos anticorpos. Para facilitar a determinação da quantidade do padrão que se ligará, geralmente os anticorpos são insolubilizados antes e depois da competição, de maneira que o modelo e o analito que se ligarem aos anticorpos possam ser convenientemente separados do padrão e do analito que permanecem não ligados. Ensaios tipo sanduíche envolvem o uso de dois anticorpos, cada um com capacidade para se ligar a uma diferente porção imunogênica, ou epitopo, da proteína a ser detectada. Em um ensaio tipo sanduíche, o analito da amostra de teste é ligado por um primeiro anticorpo que foi imobilizado em suporte sólido, e depois um segundo anticorpo se liga ao analito, formando assim um complexo insolúvel de três partes (consulte, ex.: U.S. Patent No. 4,376,110). 0 segundo anticorpo pode ser marcado com uma porção detectável (e.gensaios tipo sanduíche diretos) ou pode ser medido com o uso de um anticorpo anti-imunoglobulina que é marcado com uma porção detectável (ex. : ensaio tipo sanduíche indireto). Um exemplo de ensaio tipo sanduíche é o ensaio ELISA, no qual a porção detectável é uma enzima.
Na imunohistoquímica, uma amostra de tecido, inclusive amostra de tumor, pode ser fresca ou congelada ou pode ser fixada em parafina com um conservante como a formalina.
Os anticorpos anti-integrina a2 também podem ser usados em ensaios diagnósticos in vivo. Em geral, o anticorpo é marcado com um radionuclídeo (111In, 99Tc, 14C, 131I, 125I, 3H, 32P ou 35S) de maneira que o tecido, por exemplo um tumor, possa ser localizado com o uso de imunocintilografia.
Por questão de conveniência, um anticorpo anti-integrina α2 pode ser fornecido em um kit, como uma combinação de reagentes em quantidades predeterminadas com instruções, inclusive para a realização de um ensaio diagnóstico. Quando o anticorpo for marcado com uma enzima, o kit incluirá os substratos e cofatores exigidos pela enzima (ex;, um substrato precursor que forneça o cromóforo ou fluoróforo detectável). Outros aditivos podem ser incluídos no kit como estabilizadores, tampões (ex. : um tampão de bloqueio ou um tampão de lise) e outros. As quantidades relativas de vários reagentes fornecidos no kit podem variar muito, por exemplo, para fornecer para a solução as concentrações de reagentes que otimizem substancialmente a sensibilidade do ensaio. Os reagentes podem ser fornecidos na forma de pó seco, geralmente liofilizado, incluindo excipientes, por exemplo, os quais mediante a dissolução fornecerão uma solução reagente com a concentração adequada.
Um anticorpo anti - integrina a.2 pode ser usado para tratar vários distúrbios associados à integrina α2β1 conforme descritos neste documento. 0 anticorpo anti-integrina a2 pode ser administrado por qualquer via adequada, incluindo a via parenteral, subcutânea, intraperitoneal, intrapulmonar ou intranasal.Se recomendado para tratamento imunossupressor local, será realizada administração intralesional do anticorpo (incluindo por perfusão ou outra forma de contato do enxerto com o anticorpo antes do transplante). A administração parenteral inclui a administração intramuscular, intravenosa, intraarterial, intraperitoneal ou subcutânea. O anticorpo anti-integrina oc2 também pode ser administrado por infusão em pulso, por exemplo, com doses reduzidas do anticorpo. A administração deve ser feita de preferência por meio de injeções intravenosas ou subcutâneas. A forma de administração pode depender, em parte, se a mesma será realizada por um curto período ou por um período prolongado.
Para prevenção ou tratamento de uma doença, a dose adequada do anticorpo dependerá do tipo da doença a ser tratada, conforme definido acima, da gravidade e do curso da doença, da finalidade, isto é, se o anticorpo anti- integrina oc2 será administrado para fins de prevenção ou terapêuticos, do tratamento anterior, da história clínica do paciente e da resposta ao anticorpo, e a critério do médico responsável pelo atendimento do paciente. O anticorpo é apropriado para uma única administração ao paciente ou uma série de tratamentos.
Dependendo do tipo e da gravidade da doença, a dose [de cerca de 1 μg/kg a cerca de 15 mg/kg ou de cerca de 0,05 μg/kg a cerca de 2 0 mg/kg] do anticorpo é a dose inicial recomendada para administração ao paciente, em uma ou mais administrações separadas ou em infusão contínua. Uma dose diária típica pode variar [de cerca de 1 μg/kg a cerca de 100 mg/kg] ou mais, dependendo dos fatores mencionados acima. Para administrações repetidas em vários dias ou em períodos mais longos, dependendo da condição, o tratamento é mantido até que ocorra a supressão desejada dos sintomas da doença. No entanto, outros esquemas de administração podem ser utilizados. A evolução dessa terapia pode ser prontamente monitorada por profissionais qualificados.
Uma composição do anticorpo anti - integrina cc2 será formulada, dosada e administrada de acordo com as boas práticas médicas. Os fatores que devem ser considerados nesse contexto incluem a doença específica que está sendo tratada, o mamífero específico que está sendo tratado, a condição clínica de cada paciente, a causa da doença, o local de administração do agente, o método de administração, o esquema de administração, os resultados de estudos farmacológicos e de toxicidade e outros fatores conhecidos pelos médicos. Uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo a ser administrada é determinada com base nesses fatores e é a quantidade mínima necessária para prevenir, melhorar ou tratar um distúrbio associado à integrina α2β1. Essa quantidade é de preferência inferior à quantidade tóxica para o hospedeiro ou torne o hospedeiro significativamente mais suscetível a infecções.
O anticorpo anti - integrina a.2 não precisa ser, mas pode ser formulado opcionalmente, administrado concomitantemente ou usado como tratamento adjuvante com um ou mais agentes usados no momento para prevenir ou tratar o distúrbio em questão. Para a artrite reumatóide, por exemplo, o anticorpo pode ser administrado em conjunto com um glicocorticosteróide, Remicaid® ou qualquer tratamento aprovado para artrite reumatóide. Para a esclerose múltipla, o anticorpo pode ser administrado em conjunto com interferonP, Avonex, Copaxon ou com outras terapias aprovadas para tratar os sinais e sintomas de esclerose múltipla. Para transplantes, o anticorpo pode ser administrado separadamente ou concomitantemente com um agente imunossupressor conforme descrito acima, como a ciclosporina A, para modular o efeito imunossupressor. Antagonistas da integrina α2β1 podem ser administrados como alternativa ou associado ao tratamento a mamíferos que sofram de distúrbios associados à integrina α2β1. A quantidade eficaz desses outros agentes depende da quantidade de anticorpo anti- integrina α2 presente na formulação, do tipo de distúrbio ou tratamento e de outros fatores discutidos acima. Esses agentes são geralmente usados nas mesmas doses e com as mesmas vias de administração utilizadas anteriormente ou cerca de 1 a 99% das doses empregadas anteriormente. É fornecido um artigo de fabricação contendo materiais, incluindo um anticorpo anti-integrina α2, útil para o tratamento dos distúrbios descritos acima. 0 artigo de fabricação é composto por um recipiente e uma etiqueta. Os recipientes incluem, por exemplo, frascos, ampolas, seringas e tubos de teste. Os recipientes podem ser fabricados com uma grande variedade de materiais como vidro ou plástico. 0 recipiente contém uma composição que é eficaz para o tratamento de uma condição e pode possuir uma porta de acesso estéril (por exemplo, o recipiente pode ser uma bolsa ou frasco de solução para administração intravenosa com tampa perfurável com uma agulha de injeção hipodérmica). 0 agente ativo na composição é o anticorpo anti-integrina alfa 2. A etiqueta sobre ou associada com o recipiente indica que a composição é utilizada para o tratamento da condição de escolha. 0 artigo de fabricação pode ainda ser composto por um segundo recipiente contendo um tampão farmacologicamente aceitável, como salina tamponada em fosfato, solução de Ringer ou solução de dextrose. 0 produto pode incluir ainda outros materiais desejados do ponto de vista comercial ou do usuário, incluindo outros tampões, diluentes, filtros, agulhas, seringas e folhetos com instruções de uso.
Os princípios descritos acima foram aplicados, por exemplo, ao anticorpo anti-integrina α2 secretado pelo hibridoma BHA2.1 (Hangan et al., Câncer Res., 56(13): 3142-9 (1996)). Esse anticorpo se liga à integrina α2β1 de ratos e de humanos, mas não se liga à integrina a2al de murinos. O anticorpo assim produzido pelo hibridoma BHA2.1 é denominado TMC-2206 e encontra-se comercialmente disponível através da Chemicon (agora parte da Milliporef número do catálogo MAB1998). Variantes quiméricas, inclusive humanizadas do TMC-2206 foram produzidas e submetidas à análise in vitro. Também foram realizados estudos in vivo, utilizando o anticorpo TMC-2206 ou um anticorpo semelhante, inclusive um anticorpo capaz de reconhecer a integrina α2β1 de murinos. Os exemplos a seguir são fornecidos como ilustração e de maneira alguma como meio de limitação. As menções a todas as citações na especificação estão expressamente incorporadas neste documento para referência. EXEMPLO 1
Anticorpos com especificidade para integrina a2al foram elaborados e preparados. Foram determinada e descritas neste documento as seqüências anteriormente desconhecidas das regiões variáveis de um anticorpo de murino designado TMC-2206 secretado pelo hibridoma BHA2.1. Os cDNAs da VH e da VL foram clonados do mRNA de células do hibridoma BHA2.1 por RT-PCR utilizando um conjunto de primers correspondente aos aminoácidos no N-terminal da região variável da cadeia pesada (VH) ou leve (VL) de murino, e um segundo conjunto de primers correspondente às regiões constantes das respectivas cadeias pesada γ1 e γ leve. A seqüência foi determinada com base no cDNA que tinha sido sintetizado do mRNA isolado de acordo com métodos padrão descritos neste documento.
O mRNA citoplásmico foi isolado de aproximadamente 1 milhão (1 χ 106) de células de hibridoma BHA2.1 que expressam o TMC-2206 com o uso técnicas moleculares padrão para profissionais experientes. Para isolar o poli A mRNA, as células foram lisadas em 5M de tiocianato de guanidino, misturadas com oligo (dT) celulose (Ambion, TX) e incubadas em temperatura ambiente com suave agitação por 60 minutos. O RNA oligo(dT) poli (A) ligado à celulose foi peletizado, lavado e, em seguida aplicado a uma coluna nWash spin" (Ambion, TX) . A coluna foi centrifugada a 3000 xg por 1 minuto, em seguida, o RNA foi extraído com 200 uL. of 10 mM Tris, tampão de ImM EDTA (TE), pH 8.0 e precipitado com 0,1 volume de acetato de amônio de 5 M (NH4Ac) e 2,5 volumes de 100% etanol a - 20°C. 0 RNA foi peletizado por centrifugação, seco e dissolvido em água tratada com DEPC.
Os cDNAs foram sintetizados de mRNA de hibridoma BHA2.1 por transcrição reversa iniciada com primers baseados no N-terminal da região variável da cadeia pesada (VH) ou leve (VL) de murino, e um segundo conjunto de primers correspondente a regiões constantes das respectivas cadeias pesada γ1 e γ leve. A seqüência do anticorpo BHA2.1 era desconhecida, portanto, foram utilizados primers de anticorpo comercial degenerado para o N- terminal das regiões variáveis da cadeia pesada e leve de murinos (Light primer mix, #27-1583-01 e Heavy Primer mix, #27-1586-01, da Amersham Biosciences) conforme mostrado na Tabela 1. Foi relatado que esses primers abrangem a composição de aminoácidos heterogêneos no N- terminal das cadeias leve e pesada de murinos, respectivamente. As reações de RT-PCR (kit Qiagen RT) foram assim ajustadas : 0.5 μg de mRNA, 10 μL, de 5x tampão RT, 2 μm de 10 mM de dNTP mix, 5 μL; de cada solução de primer de 10 mM e 2 μL· da mistura de enzimas em 50 μm do volume total. A reação foi iniciada com transcrição reversa a 500C por 30 minutos, seguida de uma etapa de ativação por PCR a 95°C por 15 minutos e terminou com um programa de PCR adequado para misturas de primers degenerados utilizados para amplificar as regiões variáveis das cadeias pesada e leve: 94°C por 3 0 segundos, 56°C por 30 segundos e 72°C por 1 minuto por 28 ciclos com uma extensão final executada por 10 minutos a 72°C. Reações por PCR subseqüentes utilizaram os pares de primers listados na Tabela 2, que foram sintetizados pela Retrogen (San Diego, CA). Todos os primers estão listados como 5' a 3' TABELA 1
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TABELA 2
<table>table see original document page 89</column></row><table> <table>table see original document page 90</column></row><table>
Produtos da PCR de aproximadamente 350 bp em comprimento foram obtidos para a VH e VL. Esses produtos da PCR foram recuperados de um gel de agorose a 1%, clonado em um vetor de clonagem pCR2.1- TOPO (Invitrogen, CA) e seqüenciado.
O seqüenciamento foi realizado em um seqüenciador de DNA CEQ com uso de primers M13 " forward" e reverso (Invitrogen, CA). DNA plasmídeo foi produzido em cultura de bactérias de 1,5 mL com o uso de kits Qiagen de acordo com as instruções do fabricante. Aproximadamente 300 ng de DNA foram utilizados para cada reação de seqüenciamento por PCR, normalmente em um volume de 10 μL. O DNA foi desnaturado a 96 0C por 2 minutos e em seguida misturado com primer de seqüenciamento na concentração final de 0,3 μΜ. Quatro μ]^ de DTCS Quick Start Master Mix (Beckman Coulter, Fullerton, CA) foram acrescentados à mistura e o seqüenciamento prosseguiu por 30 ciclos: 96 ° C por 20 segundos, 50°C por 20 segundos e 60°C por 2 minutos. As reações do seqüenciamento foram precipitadas com etanol na presença de acetato de sódio (NaAc) , EDTA e glicogênio. 0 pellet foi lavado duas vezes com etanol a 70%, seco ao livre e colocado em suspensão novamente em 2 0 μΙ; da Solução de Carregamento da Aamostra (fornecida no kit). Oito clones individuais da VH e VL foram seqüenciados com o uso de técnicas padrão, e as seqüências de aminoácidos determinadas para a VH (SEQ ID NO: 21) e VL (SEQ ID NO: 19) são apresentadas nas Tabelas 3 e 4, respectivamente. As seqüências obtidas com todos os oito clones foram idênticas, com exceção do primeiro ou dois primeiros aminoácidos. Nos clones da VL, o Glu-Asn ou Gln-Phe ocorreu com a mesma freqüência . Nos clones da VHi o Gln ou Glu ocorreu com a mesma freqüência. As seqüências foram verificadas contra o banco de dados BLAST de proteínas do NCBI (http://www.ncbi.nih.gov/BLAST/ , Ye et al. , Nucleic acids Res., Jul 1: 34 (Web Server Issue) : W6-9) . Todas as seqüências ao longo da pesquisa (ex: . VH ou VL do TMC- 2206) foram alinhadas por CLUSTALW (Multiple Sequence Alignment) no site http://clustalw.genome. jp/ (Aiyar, Methods Mol Biol., 132:221-41 (2000)). Os clones inseridos mostraram melhor combinação com a cadeia pesada (IgGl) e com a cadeia leve (κ) de murinos, que era o isotipo esperado. As seqüências das regiões VH e VL clonadas sugeriram um provável líder e seqüências da região constante laterais, que foram utilizadas para elaborar primers mais exatos para clonar toda a região variável da cadeia pesada e leve do TMC-22 06 do mRNA do hibridoma. Todos os primers foram sintetizados pela Retrogen (San Diego, CA) . 0 par de primers, VHL-for CCATGGCTGTCTTGGGGCTGCTCTTCT (SEQ ID NO:14) e HC-rev GGGGCCAGTGGATAGAC (SEQ ID NO: 15; de camundongo Fcy CHI), foi utilizado para clonar novamente a região variável da cadeia pesada e o par de primers, VLL-for CCATGGATTTTCAAGTGCAGATTTTCAG (SEQ ID NO: 16) e LCk-rev GTTGGTGCAGCATCAGC (SEQ ID N0:17), foi utilizado para clonar novamente a região variável da cadeia leve do mRNA do hibridoma utilizando as mesmas condições da PCR descritas acima. 0 seqüenciamento dos produtos confirmou que a identidade dos dois primeiros resíduos da VL do TMC-2206 é Ll-Q e L2-F e que a identidade dos dois primeiros resíduos da cadeia pesada é Hl-Q e H2-V. As seqüências de nucleotídeos restantes foram idênticas àquelas clonadas com o uso de mistura de primers degenerados. TABELA 3
<table>table see original document page 92</column></row><table> A região VL clonada possuía 106 aminoácidos e a região VH possuía 119 aminoácidos no comprimento. Conforme mostrado nas Tabelas 3 e 4, existem três CDRs (CDR1-3) e quatro "frameworks" (FW1-4) nas regiões variáveis clonadas da cadeia pesada clonada (VH) e da cadeia leve (VL) . nFrameworks" e CDRs foram identificados com base no sistema de numeração de Kabat (Kabat et al. , 1983) com a exceção da CDRl da cadeia pesada que foi definida pela definição Oxford Molecular's AbM como resíduos do intervalo 26 a 35. O software Oxford Molecular's AbM antibody modeling
(http://people.cryst.bbk.ac.uk/~ubcg07s/ , Martin et al. , Proc. Natl Acad. Sei. USA, 86, 9268-9272 (1989); Martin et al., Methods Enzymol., 203, 121-153 (1991); Pedersen et al. , Immunomethods, 1, 126 (1992); and Rees et al., In Sternberg M.J.E. (ed.), Protein Structure Prediction. Oxford University Press, Oxford, 141-172. (1996)) combina os sistemas de numeração da CDR de Kabat e da região hipervariável de Chothia para definir as CDRs. Para consistência na numeração, as inserções feitas nas regiões do ^framework" e região CDRs relativa aos padrões são nomeadas de acordo com a posição do resíduo seguido pela seqüência em ordem alfabética (por exemplo, os resíduos 82A, 82B, 82C são inseridos entre os resíduos 82 e 83 na cadeia pesada conforme mostrado na Tabela 3) . As seqüências VH e VL possuem CDR3s relativamente curtas. Existe um sítio de glicosilação potencial (Asp-Ser-Ser, NSS) dentro da CDRl da cadeia leve clonada. Esse achado é consistente com a observação de que a cadeia leve do TMC-2206 possui peso molecular de 29 kD de acordo com a técnica SDS-PAGE que pode ser alterado com tratamento com endoglicosidase para 25 kD (peso molecular típico de cadeias leves de anticorpos).
Para confirmar que as seqüências clonadas representavam a VH e VL bioativas do anticorpo TMC-2206, o anticorpo purificado a partir do meio hibridoma foi submetido à seqüenciamento do peptídeo N-terminal por degradação de Edman. A seqüência de aminoácido obtida dos clones da VH e da VL indicaram a provável presença de uma glutamina N- terminal em cada uma, o que levantou a hipótese de ocorrência de bloqueio do N-terminal pela ciclização do resíduo da glutamina N-terminal para produzir piroglutamato (pGlu). Portanto, para remover qualquer glutamina terminal potencialmente ciclizada, a proteína foi submetida à digestão com piroglutamato aminopeptidase com o uso de uma enzima tolerante ao calor do Pyrococcus furiosus antes de submeter as cadeias leve e pesada ao seqüenciamento do peptídeo N-terminal. O piroglutamato aminopeptidase purificado (0.01 U) do Pyrococcus furiosus (Sigma, St. Louis, MO) foi reconstituído em Tampão de Digestão a 50 μL (50 mM de fosfato de sódio, pH 7.0, 1 mM EDTA e 10 mM ditiotreitol (DTT)). A preparação do TMC- 2206 foi digerida com o uso de uma razão molar de 1:100 de piroglutamato aminopeptidase : proteína a 950C por 1 hora. As proteínas digeridas foram resolvidas com o uso de um gel em SDS-PAGE padrão a 10% (Tris-glycine, BioRad
Laboratories, Hercules, CA) com mercaptoacetato de sódio (0.1 g em 150 mL de Tampão Corrente) no reservatório superior. Em seguida, o gel foi transferido para membrana Immobilon P PVDF (Millipore, Billerica, MA) em Tampão de Transferência (10 mM CAPS, pH 10,5, 0,5 g/L DTT e metanol al5%) a 250 mAmp por 1 hora. Foi feita a coloração do "blot" com o uso de solução fresca Ponceau S a 0,1% em ácido acético a 1% por 1 minuto seguido por descoloração em ácido acético a 1% 0 "blot" foi submetido a seqüenciamento do peptídeo, no qual foi observado que 2 0 dos primeiros 21 aminoácidos N-terminal da cadeia leve foram seqüenciados com sucesso e mostraram identificação exata com o peptídeo obtido na seqüência obtida pela clonagem. Isto confirmou que a identidade do primeiro aminoácido da VL clonada é Glu. A VH digerida pelo piroglutamato aminopeptidase não forneceu nenhum dado de seqüenciamento do peptídeo. EXEMPLO 2 Anticorpos quiméricos com especificidade para a integrina α2β1 foram projetados e preparados, incluindo anticorpos quiméricos camundongo-humano. As regiões VH e VL do TMC- 2206 clonadas conforme descrito no Exemplo 1 foram utilizadas para elaborar e preparar cadeias quiméricas pesada e leve, respectivamente, com a utilização de técnicas de clonagem molecular padrão (consulte ex: . Molecular Biology Manual by Sambrook and Russell, 2001) . Cadeias pesadas e leves foram clonadas com a introdução de sítios de restrição conforme mostrado a seguir. Os primers, TMC-2206-r5' CCCGAATTCACAGGTGCAGTTGAAGGAGTCA SEQ ID NO:22) e TMC-22 06-r3' CGGGATCCTTAGGATCATTTACCAGGAGAG TGGGA (SEQ ID NO:23), foram utilizados para clonar a cadeia pesada do TMC-22 06 por RT-PCR a partir do mRNA do hibridoma BHA2.1 e os primers TMC-2206-k5' CCCGAATTCACAATTTGTTCTCACCCAGTCT (SEQ ID NO: 24) e TMC- 2206 -k3 ' CGGGATCCTTATCTCTAACACTCATTCCTGTTGAA (SEQ ID NO:25) foram utilizados para clonar a cadeia leve do TMC- 2206. Esses primers introduziram sítios EcoRI e BanHI nas extremidades 5' e 3', respectivamente para permitir a clonagem das cadeias pesada e leve clonadas nos vetores de expressão pIRES2-GFP e pIRES2-Ds Red de mamíferos (Clontech, nos. do catálogo 632306 e 632420), respectivamente. Os dois vetores foram manipulados para carrearem uma seqüência líder IgK METDTLLLWVLLLWVPGGSTGD (SEQ ID NO:26).
Para isolar o mRNA, aproximadamente 1 milhão de células de hibridoma que expressam o TMC-2206 foram peletizados em velocidade baixa (10 minutos a 800 rpm), lavadas com PBS, e lisados com 1 mL de Trizol (Invitrogen, CA) . Após vórtex vigoroso, a suspensão da célula foi extraída com 0,2 mL de clorofórmio e após centrifugação (14.000 rpm por 5 minutos a 4°C), o sobrenadante foi transferido para um novo tubo no qual o RNA foi precipitado pela mistura com 0,5 mL de isopropanol seguido por centrifugação (14.000 rpm por 10 minutos a 4°C). 0 pellet de RNA foi lavado com 1 mL de etanol a 75% e dissolvido em 50 μΐι de H2O tratada com DEPC.
A reação de RT-PCR (kit RT da Qiagen) foi realizada conforme descrito acima com o uso de 0,5 μg de RNA, 10 μL de 5x tampão RT, 2 μL de mistura dNTP a 10 mM, 5 μL cada de solução de primer a 10 mM e 2 μL de mistura enzimática em um volume total de 50 μL. Os produtos PCR foram digeridos com enzimas de restrição EcoRI e BamHI e os fragmentos purificados do gel de agarose a 1% foram então ligados aos sítios EcoRI/BamHI dos vetores pIRES2-GFP (cadeia pesada) e pIRES2-Ds Red (cadeia leve). O seqüenciamento subseqüente das regiões variáveis confirmou que não foram introduzidas mutações pelo RT- PCR.
O pCI-neo (Promega, catálogo no. E1841) foi escolhido como o vetor de expressão para a clonagem de moléculas de anticorpos quiméricos, inclusive humanizados, baseados ou derivados do TMC-2206 conforme descrito acima. Para reduzir a possibilidade de que mutações sejam introduzidas nas regiões constantes através de PCR, cassetes de clonagem foram preparados para a VH e VL. Em primeiro lugar, o DNA codificando um líder IgK (SEQ ID NO:26) foi clonado nos sítios de clonagem XhoI e EcoRI do pCI-neo com o uso dos oligonucleotídeos IgK-S (SEQ ID NO:27) e IgK-AS (SEQ ID NO:28) listados na Tabela 2, que foram anelados um ao outro e em seguida ligados diretamente no pCI-neo digerido pelo XhoI-EcoRI utilizando-se T4 ligase. Isto forneceu um vetor parental para todas as etapas subseqüentes de clonagem. Com base nesse vetor foram produzidos dois cassetes de expressão: um para clonagem nas regiões VH adjacentes a um IgGl Fc (hFc) humano e o segundo para clonagem em regiões VL acima da região constante da cadeia kappa humana (hKc). Não foram encontrados sítios EeoRI, XbaI, HindIII ouSalI nas seqüências da IgGl Fc (hFc) humana ou a região constante da cadeia kappa (hKc), portanto, qualquer um desses sítios de restrição poderia ser introduzido na extremidade 5' das regiões constantes para facilitar a clonagem. O sitio de clonagem SalI foi selecionado por reduzir o número de mudanças em aminoácidos na junção variável-constante. Na quimera da cadeia pesada, a introdução de um sítio Sal I na junção camundongo VH- humano Fc foi conseguida sem causar nenhuma alteração na seqüência de aminoácidos. Em primeiro lugar, um
fragmento da VH EcoRI-SalI foi produzido por PCR com a utilização do par de primers TMC-2206-r5' (SEQ ID NO:22) e TMC2206VH-hIgGl/4Fc-SalI (SEQ ID NO:29) mostrado na Tabela 2 para introduzir um sítio de restrição ao SalI na extremidade 31 da seqüência da VH de um murino com o uso de uma cadeia pesada clonada no vetor pIRES-GFP como um modelo. A IgGl Fc humana foi obtida com a amplificação do clone 20688 da IMAGE (Invitrogen, Catálogo No. 4764519) de DNA com a utilização dos primers apresentados na Tabela 2, hIgGl/4Fc-SalI-F (SEQ ID N0:30) e hIgGl/4Fc- NotI-R (SEQ ID NO: 31) . Os dois produtos da PCR foram digeridos com EcoRI/SalI e Sall/Notl, respectivamente, purificados e ligados com o vetor pCI-neo-IgK digerido por EcoRI/NotI. O vetor resultante foi denominado pCI- neo-IgK-TMCVH-hFc.
Para a quimera da cadeia leve, não foi possível criar um sítio SalI sem modificar dois aminoácidos na junção VL- kC, E105D e L106I. Isso foi conseguido pela geração de um produto de PCR com a utilização dos primers mostrados na Tabela 2, TMC-2206-k5' (SEQ ID NO:24) e TMC22 06VL-hKc- SalI (SEQ ID NO:32) para amplificar a região 2206VL a partir do plasmídeo, pIRES-DsRed2-TMC-2206LC acima. 0 produto de PCR foi digerido com EcoRI/SalI separado em gel de agarose a 1%, purificado com um Kit de Extração de Gel (Qiagen) e ligado com a região constante da cadeia leve IgK humana amplificada a partir do clone IMAGE #4704496 (ATCC) com a utilização dos primers hKc-SalI-F (SEQ ID NO: 33) e hKc-Notl-R (SEQ ID NO: 34) e do vetor descrito acima, pCL-neo- IgK. 0 plasmídeo resultante foi denominado pCI-neo-IgK-TMC2206VL-hKc.
Para avaliar se a modificação dos dois aminoácidos na junção VL-kC exerceria impacto sobre atividade do anticorpo, foi construída uma segunda quimera da cadeia leve que codifica o plasmídeo da quimera da cadeia leve da seqüência do aminoácido primário. Em primeiro lugar, as regiões constantes VL e kappa humanas foram amplificadas com par de primers TMC-2206VLwt-hKc-R e TMC- 22 06-k5 1 (SEQ ID NOS: 3 6 e 24) e com o par de primers TMC-2 2 0 6VLwt-hKc-F e hKc-Notl-R (SEQ ID NOS: 35 e 34) respectivamente, com o uso do vetor pIRES2-DsRed2-Igk- TMC22 06LC mencionado acima como modelo. Em segundo lugar, dividindo-se a extensão sobreposta os primers de PCR (Horton et al., Gene 77(1):61-8 (1989)) TMC-2206-k5' (SEQ ID NO: 24) e hKc-2\fotI-R (SEQ ID NO: 34) para ligar os dois produtos, e o produto final da PCR foi digerido e clonado em pCI-neo-Ig.
Para confirmar que o anticorpo quimérico camundongo- humano clonado apresentava a mesma especificidade do anticorpo monoclonal original TMC-2206 secretado pelo hibridoma BHA2.1, o anticorpo quimérico camundongo-humano foi expresso em células 293F com a utilização da metodologia de transfecção transitória com o uso de uma mistura composta por partes iguais de DNA/OptiMEM e 2 93fectin/OptiMEM (Invitrogen). Cada uma das soluções foi produzida com OptiMEM pré-aquecido para a temperatura ambiente. A mistura DNA/OptiMEM continha 20 µg do plasmídeo de expressão da cadeia pesada (HC), 20 µg do plasmídeo de expressão da cadeia leve (LC) e OptiMEM, perfazendo um volume total de 1,3 mL..A mistura 293fectin OptiMEM continha 53 /xL de 293fectin e OptiMEM, perfazendo um volume total de 1,3 mL. A mistura de 293fectin foi acrescentada à mistura de DNA, misturada e incubada por 20 minutos em temperatura ambiente. A mistura para transfecção de 2,6 mL foi acrescentada a um tubo contendo um cultura de células 293F de 40 mL a IO6 células/mL. Esse tubo foi incubado a 37°C, 8% CO2 com agitação a 120 rpm. Após 3 dias, a suspensão de células foi centrifugada e imediatamente submetida à cromatografia de afinidade com proteína para purificar o anticorpo. O produto final foi concentrado, analisado com o uso da técnica SDS-PAGE e a concentração da proteína foi determinada pelo método de Lowry.
Para confirmar que o anticorpo quimérico camundongo- humano apresentava a mesma atividade de ligação do anticorpo primário TMC-2206, o anticorpo quimérico camundongo-humano purificado foi testado quanto a sua capacidade de bloquear a adesão celular mediada pela integrina α2β1. Células CHO que expressavam a integrina humana a2 (SEQ ID NO: 8) e uma célula β1 endógena de hamster (Symington et al., J Cell Biol. 120(2):523-35. (1993)) foram separadas da cultura, através de incubação em PBS sem Ca++/Mg++ contendo 5 mM de EDTA. As células foram centrifugadas (1200 rpm por 8 minutos em um rotor Beckman GH 38) e o pellet foi colocado novamente em suspensão de 10 mL de RPMI-1640. 30 μL, de CFSE a 17 mM (sondas moleculares, OR) foi acrescentado à suspensão de células e a mistura foi incubada a 37°C por 15 minutos. As células marcadas foram peletizadas em velocidade baixa, colocadas novamente em suspensão de 10 mL de RPMI- 1640 com BSA a 0,1% e contadas. A concentração de células foi ajustada a 8 χ 105 células/mL e mantida no escuro até ser utilizada. Uma placa revestida com colágeno (colágeno Tipo I da cauda de rato; BD Biosciences) foi bloqueada com 100 μL/cavidade de BSA a 0,1% em PBS e incubada em temperatura ambiente por 30 minutos. Amostras de proteína foram diluídas em série em um meio livre de soro e 50μL de cada solução de anticorpos diluídos em série foram acrescentados à placa de colágeno. 50 μL/cavidade de células marcadas foram acrescentados ao alvéolo e a placa foi incubada por 1,5 hora a 37°C. Depois de lavadas, as células foram lisadas com Triton X-100 a 0,1% e a intensidade da fluorescência (excitação, 485 nm; emissão, 535 nm) foi analisada com o uso de um contador Victor2 1420 multi-label (Perkin- Elmer). A quimera do TMC-2206 clonado foi um potente inibidor da adesão celular mediada pela α2β1 ao colágeno Tipo I e apresentou potência equivalente à do TMC-2206 com um valor de EC50 de 1,8 nM em comparação a 1,2 nM, respectivamente. Nesses experimentos, o uso do controle Ig não produziu inibição da ligação, enquanto o uso do TMC-2206 de murinos ou do anticorpo quimérico produziu inibição da ligação quando testado em um intervalo de concentração molar de IO"11 a IO"6.
A afinidade do anticorpo quimérico camundongo-humano para a integrina α2β1 imobilizada também foi comparada com o anticorpo primário TMC-22 06 quanto a sua capacidade de competir com a ligação do TMC-22 06 marcado com Eu a placas revestidas com α2β1, ex: pela determinação dos valores Ki. Em primeiro lugar, a afinidade do anticorpo primário TMC-2206 pela integrina α2β1 imobilizada foi determinada pela ligação de equilíbrio. Os alvéolos de uma placa de microtitulação de 96 alvéolos foram revestidos com integrina plaquetária α2β1 (revestida a pedido com α2β1 plaquetária humana pela GTI Inc., WI) e bloqueadas com leite desnatado. Para os ensaios de ligação e de competição, foi utilizado o anticorpo TMC- 2206 fluorescentemente marcado ou o isotipo controle IgG. Para marcar os anticorpos com o reagente Eu-Nl-ITC, aproximadamente 2 mg do TMC-22 06 ou do isotipo de controle, MOPC-21 (Invitrogen) foram colocados em suspensão e dialisados em solução salina tamponada com fosfato (PBS; 1,4 7 mM KH2PO4, 8,1 mM Na2HPO4; pH 7,4, 13 8 mM NaCl e 2,67 mM KCI) . Após a concentração em concentradores MicroSep pré-lavados (30-kDa cutoff; Pall Life Sciences a 9500 rpm (7000 χ g) em um rotor JA-20 (Beckman Instruments, Inc.) por 20 minutos a 4°C), os anticorpos foram ajustados a 4,0 mg/mL com PBS contendo a concentração final de 100 mM NaHCO3, pH 9,3. A solução de mAb/bicarbonato (0, 250 mL) foi cuidadosamente misturada em um frasco contendo 0,2 mg de ácido tetraacético N1- (p-isotiocianatobenzil) - diet Ilenetriamina--N1, Nz, N3, N3 quelado com Eu3+ (Eu-Nl-ITC; Perkin Elmer Life Sciences) e deixada para reagir durante a noite a 4 0C sem mexer. Cada mistura com o anticorpo marcado foi aplicada a uma coluna PD-IO separada (GE Biosciences, Piscataway, NJ) pré-equilibrada com Tampão Corrente (50 mM Tris, pH 7,4 e 138 mM NaCl) . Frações (0,5 mL) foram coletadas e analisadas para avaliar a proteína total (Bradford reagent; Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) com a utilização do leitor de placa de absorvência SpectraMax 3 84 e o európio, após diluição de 1:10.000 em uma solução intensificadora DELFIA (Perkin- Elmer) por fluorescência tempo-sincronizada (TRF) com o uso de um leitor de placa Victor2 multi-label (Perkin Elmer). As frações positivas, tanto para o marcador da proteína como do Eu, foram agrupadas e aplicadas a novas colunas PD-IO e amostras foram colhidas e analisadas para determinação do conteúdo de proteína e európio por TRF calibrada em comparação a uma solução padrão de európio (Perkin-Elmer) para calcular o flúor: proporção de proteína. 0 anticorpo marcado fluorescentemente, seja o IgG controle Eu-TMC-2206 ou Eu-isotipo, foi então aplicado às placas de microtitulação bloqueadas da integrina α2β1 em um volume de 10 aL/alvéolo. Depois da incubação das placas seladas por lha 37°C para permitir que a ligação atingisse o equilíbrio, duas amostras de 2 μL foram transferidas de suas cavidades para uma nova cavidade contendo a solução intensificadora DELFIA (100 μL/cavidade; Perkin-Elmer) para avaliação do marcador livre (não ligado).A solução intensificadora (100 μL/alvéolo) foi acrescentada aos alvéolos esvaziados para avaliação do marcador ligado. A placa foi agitada (A placa agitadora de titulação, foi ajustada na velocidade 5 por 5 minutos em temperatura ambiente) e as intensidades TRF (time-resolved fluorescent) foram avaliadas com o uso de um leitor de placa Victor2 multi- label (Perkin-Elmer Wallac, Boston, MA) . 0 valor Kd calculado pela análise de Scatchard foi de 0.374 nM para o TMC-2 2 0 6. As potências relativas de ligação da integrina α2β1 imobilizada foram analisadas por meio da avaliação dos valores Ki em um ensaio de competição com o uso de 100 pM Eu-TMC-220 6 fluorescentemente marcado na presença de concentrações variadas do anticorpo TMC-2206 não marcado ou do anticorpo quimérico como competidores. Foi utilizado um sistema de ensaio semelhante ao descrito acima. Em seguida, essas combinações de anticorpos foram aplicadas aos alvéolos revestidos com a integrina α2β1, testadas no intervalo de concentração de 1O-11 to 1O-7 M, e a quantidade de Eu-TMC-2206 foi determinada após o período de tempo especificado. As curvas de inibição foram ajustadas com um modelo de "competição de um sítio", utilizando o software Prisma (GraphPad, Inc. CA) para obter os valores da CI50 e, utilizando para calcular o Ki, a equação de Cheng and Prusoff (1973) e o valor acima de 0,374 nM para o Kd . 0 anticorpo TMC-2206 primário apresentou um Ki de 0,22 ± 0,04 nM (n=10) em comparação ao valor de 0,27 ± 0,07 nM (n=5) para a quimera wild type (wt) . A atividade da quimera wt foi comparável a da forma quimérica na qual duas mutações do LC foram introduzidas por manipulação do sítio SalI (Κi também 0,27 nM) , confirmando que essas mutações não afetam a atividade. Nesses experimentos, os alvéolos de controle revestidos com BSA e testados com um controle IgG ou com TMC-2206 não demonstraram nenhuma ligação ao anticorpo.
EXEMPLO 3
Anticorpos humanizados com especificidade para a integrina α2β1 foram desenhados e preparados. Resíduos do anticorpo TMC-2206 clonado que é composto pelas regiões CDR das cadeias pesada e leve foram determinados e variantes humanizadas foram preparadas da seguinte maneira. Foram encontradas três regiões de hipervariabilidade dentro das regiões framework menos variáveis, tanto nas regiões variáveis da cadeia pesada quando da cadeia leve. Na maioria dos casos, essas regiões de hipervariabilidade correspondem às CDRs, mas podem se estender para além delas. As seqüências de aminoácidos das regiões variáveis da cadeia pesada e leve do TMC-2206 foram respectivamente especificadas nas Tabelas 3 e 4 acima. As regiões CDR e framework foram elucidadas em geral de acordo com o sistema de Kabat, por meio do alinhamento com outras regiões VH e VL com a utilização de pesquisa de homologia geral no banco de dados de proteínas NCBI da BLAST (http://www.ncbi.nih.gov/BLAST/, Ye et al. , Nucleic acids Res., Jul 1: 34 (Web Server Issue) : W6-9)), com exceção da HCDRl. A HCDRI foi definida com base na definição AbM como resíduos do intervalo 26 a 35. 0 Software The Oxford. Molecular' s AbM antibody modeling (http://people.cryst.bbk.ac.uk/~ubcg07s/, Martin et al. , Proc. Natl Acad. Sei. USA, 86, 9268-9272 (1989); Martin et al., Methods Enzymol., 203, 121-153 (1991); Pedersen et al. , Immunomethods, 1, 126 (1992); and Rees et al. , In Sternberg M.J.E. (ed.), Protein Structure Prediction. Oxford University Press, Oxford, 141-172. (1996)) combina os sistemas de numeração de Kabat e de Chothia para definir as CDRs. Assim, as regiões CDR da cadeia pesada foram definidas da seguinte maneira:
HCDR1 aa26- aa35
HCDR2 aa50- aa65
HCDR3 aa95- aal02
De maneira semelhante, as regiões CDR da cadeia leve foram definidas da seguinte maneira:
LCDR1 aa24- aa34
LCDR2 aa50- aa56
LCDR3 aa89- aa97
Recomenda-se manter a afinidade da ligação do anticorpo murino no anticorpo humanizado correspondente. Pode ser necessário selecionar uma molécula aceptora humana que compartilhe a homologia com o anticorpo de murino. Os aceptores humanos preferenciais são frameworks genéticos humanos, devido à ausência de mutações somáticas que possam reduzir o grau de imunogenicidade. No entanto, frameworks individuais de anticorpos maduros também podem ser usados como moléculas aceptoras. O banco de dados V- BASE (http://base.mrc-cpe.cam.ac.uk) fornece uma listagem abrangente das seqüências genéticas (germline) da cadeia pesada e leve humana e foi utilizado como fonte para comparação com a VH e a VL do TMC-2206; o banco de dados de Kabat também foi utilizado (http://kabatdatabase.com/, Johnson, G. and Wu,T.T. (2001), Nucleic Acids Res., 29, 205-206).
A VH do TMC-2206 alinhou-se bem com três das 51 seqüências genéticas humanas do banco de dados V-BASE, 4- 59, 4-61 e 4-30.4, sendo que nenhuma seqüência apresentou bom ajuste na região framework 3. Os comprimentos da Hl e H2 da CDR em 4-59 foram idênticos aos da VH do TMC- 2206, e 4-59 (SEQ ID NO:39) foi selecionada como framework aceptor. Apresentava a mesma estrutura canônica classe 1 para a CDR H1 e CDR H2 que a do TMC- 2206 CDR Hl e CDR H2. As regiões CDR3 e FW4 da VH não são incluídas nas seqüências genéticas do VBASE, porque as regiões CDR3 e FW4 são derivadas de um gene diferente e não contíguo que varia durante a mutação de cada anticorpo. A seqüência do anticorpo, CAA48104 (NCBI: gi/3 3 583/emb/CAA4 8104 ; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST) foi utilizada para fornecer seqüências CDR3 e FW 4 para alinhamento, e uma seqüência de molécula aceptora FW4 . Uma comparação da VH do TMC-2206 com 4-59 e as regiões CDR3 e FW4 da seqüência do anticorpo CAA48104 é apresentada na Tabela 5. Tabela 5 A seqüência genética (germline) , A14 (SEQ ID NO:37), foi uma das 38 seqüências de anticorpos VL humanos do banco de dados V-BASE e foi selecionada como framework aceptor VL. A14 está na família VK VI e seus LCDR1 e LCDR2 se enquadram nas classes canônicas 2 e 1, respectivamente. O LCDR2 do TMC-2206 também está incluído na classe 1, embora o LCDR1 do TMC-2206 seja semelhante, mas não idêntico, à estrutura canônica da classe 1. As seqüências genéticas VL se estendem até o CDR-L3, portanto, foi selecionada uma seqüência adicional para a FW4 da VL humana. A seqüência selecionada representa um gene em framework 4, normalmente usado para cadeias leves kappa em anticorpos humanos maduros (ex: AAB24132, NCBI: gi/2 59596/gb/AAB24132; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST). Embora a introdução de um sítio SalI tenha provocado a modificação em dois aminoácidos da seqüência, durante a construção da quimera da cadeia leve (E105D e L106I, que não tiveram impacto na ligação ao anticorpo, consulte acima), o aceptor FW-4 da cadeia leve humana já possui uma isoleucina na posição 106, portanto, essa modificação provocou uma única mutação conservadora no aminoácido (E105D) em variantes humanizadas. Uma comparação da VL do TMC-2206 com A14 e a região FW4 da seqüência do anticorpo AAB24132 é apresentada na Tabela 6. TABELA 6
<table>table see original document page 107</column></row><table> Variantes humanizadas do TMC-2206 foram preparadas com o uso de seqüências CDR das seqüências VH e VL do TMC-2206 e de frameworks humanas selecionadas, conforme descrito acima. Para manter a apresentação adequada da CDR, alguns resíduos canônicos de frameworks aceptoras (consulte, ex:., Chothia et al, 1985, 1992; Queen et al. , 1989; Foote and Winter, 1992;
http://people.cryst.bbk.ac.uk/-ubcg07s) podem ser
trocados pelos resíduos canônicos de doador murino correspondentes, um processo denominado mutação reversa. As Tabelas 7 e 8 apresentam listas de resíduos que podem afetar a conformação da CDR e o empacotamento entre cadeias, respectivamente, e mostram as diferenças entre os resíduos VH e VL do doador do TMC-2206 e os resíduos correspondentes de framework aceptora humana (destacados em negrito e em itálico) . 0 resíduo L46 marcado com um asterisco na Tabela 8 pode exercer funções na apresentação da estrutura canônica da CDR e no empacotamento entre cadeias.
Como é mostrado nas Tabelas 7 e 8, os onze resíduos de framework que afetam a apresentação canônica da CDR e dois resíduos que afetam o empacotamento entre cadeias diferem entre o TMC-22 06 do doador e as seqüências genéticas A14 e 4-59 do aceptor humano, com o resíduo L46 presente nas duas categorias. Especificamente, essas diferenças estão localizadas nas posições H37, H48, H67, H71, H73, H78, e H91 para a cadeia pesada e L2, L4, L46, L47, L49, e L71 nas regiões framework variáveis da cadeia leve. Esses resíduos foram identificados e selecionados como candidatos à mutação reversa. TABELA 7
<table>table see original document page 109</column></row><table>
TABELA 8
<table>table see original document page 109</column></row><table>
*Mutação que também afeta a conformação da CDR Os 13 candidatos identificados à mutações reversas, sendo
11 com apresentação de estrutura canônica e 2 com empacotamento entre cadeias, foram incluídos na primeira variante humanizada do TMC-2206. Um amino terminal Q também foi retido na VL humanizada. A posição foi retida com a identidade do murino por ser adjacente ao Phe na L2, que é um aminoácido pouco comum nesta posição.
Essas variantes humanizadas da cadeia pesada e leve foram denominadas TMC-2206VH1.0 e TMC-2206VL1.0. Outras variantes humanizadas foram preparadas com um número menor de mutações reversas, alterando-se os resíduos murinos novamente para resíduos de framework humano.
Dessa maneira, foram identificados resíduos de framework sensíveis à reversão para o resíduo humano (em termos da manutenção da potência do anticorpo). Paralelamente, foi realizada uma modelação por computador para ajudar na seleção de resíduos candidatos à reversão para o correspondente humano.
Os vetores de expressão pCI-neo da quimera da cadeia leve e pesada, descritos no Exemplo 1, foram utilizados para expressar todas as variantes humanizadas. A versão 1,0 da VH do TMC-2206 humanizado (hVH1.O, SEQ ID N0:40) e a versão 1.0 da VL humanizada (hVL1.O, SEQ ID NO: 41) que incorporam as 14 mutações reversas definidas acima, foram traduzidas para uma seqüência de nucleotídeos otimizadas para a expressão de células de mamíferos com o uso do software Vector NTI. Essas seqüências foram sintetizadas sob medida em tandem, dentro de um único plasmídeo construído por Retrogen (San Diego, CA) e clonados nos sítios EcoRI e SalI dos vetores de expressão LC e HC do TMC-2206 primário substituindo as regiões VH e VL de camundongo. Especificamente, a digestão no EcoRI-SalI do DNA do plasmídeo resultou em dois fragmentos de tamanhos diferentes, sendo o maior de hVHl,0 e o menor de hVLl,0. Esses dois fragmentos foram clonados nos sítios EcoRI e SalI dos vetores de expressão quiméricos LC e HC do pCI- TMC-2206 primários, substituindo as regiões VH e VL de camundongo, respectivamente, seguido de digestão do EeoRI e SalI e de purificação do gel no fragmento maior do CI- neoIgk-TMC22 06VG-hFc e pCI-neoIgK-TMC-22 06VLh*c, respectivamente. Essa estratégia foi utilizada para a preparação das variantes subseqüentes. Os plasmídeos resultantes continham: IgK líder, a seqüência de iniciação da tradução otimizada de Kozak, região variável e região constante humana.
A atividade da variante da versão 1,0 da VH do TMC-2206 humanizado (SEQ ID NO: 40) e a versão 1,0 da VL humanizada (SEQ ID NO:41), conforme descrita acima, foi testada no ensaio de adesão celular mediada pela integrina α2β1 e no ensaio de competição para ligação à integrina α2β1 imobilizada, juntamente com a quimera e o anticorpo TMC- 2206 original, conforme descrito no Exemplo 2. 0 valor Ki para o protótipo humanizado foi 0,32 nM que foi comparável ao Ki medido do anticorpo primário TMC-2206 (0,21 nM) e também à quimera (0,27 nM) , indicando que essa primeira versão humanizada manteve a afinidade de ligação. De maneira semelhante, o primeiro protótipo humanizado mostrou atividade de inibição comparável a do anticorpo primário TMC-2206 no bloqueio da adesão celular mediada pela α2β1 ao colágeno (ex: EC50 de 1,5 nM para ambos) .
Utilizando-se os dados produzidos pela versão 1.0 da variante, foi realizada uma série de mutações reversas para resíduos de framework da VH ou VL humana empregando- se a metodologia PCR e números mínimos de mutações reversas (resíduos de murino) foram determinados para evitar o comprometimento da especificidade e da afinidade do TMC-2206 mAb original. As variantes humanizadas recomendadas são aquelas que preservam a atividade biológica do anticorpo primário de murino e, também, contêm menos resíduos de murino a fim de diminuir o potencial de imunogenicidade.
As seqüências individuais de primers foram sintetizadas pela Sigma-Genosys e suas seqüências são apresentadas na Tabela 9. Os pares de primers e os modelos utilizados para as variantes produzidas são apresentados nas Tabelas 10 e 11. Foram produzidas reações por PCR nas seguintes condições: Primer 1 e 2 (concentração final de 0,6 μΜ) , dNTP (concentração final de 1 mM) , modelo de DNA (1 a 10 ng) , e 1 unidade de Pfx DNA polimerase (Invitrogen, CA) geralmente em um volume final de 50 μl;. O programa inicial da PCR consistiu de desnaturação inicial a 950C por 2 minutos, seguido de 30 ciclos, sendo cada ciclo a 95°C por 3 0 segundos, 56°C por 4 5 segundos e a 68°C por um minuto e meio. A etapa final foi realizada a 68°C por 10 minutos. TABELA 9
<table>table see original document page 112</column></row><table> <table>table see original document page 113</column></row><table> <table>table see original document page 114</column></row><table>
TABELA 10
<table>table see original document page 114</column></row><table> <table>table see original document page 115</column></row><table>
TABELA 11
<table>table see original document page 115</column></row><table> <table>table see original document page 116</column></row><table>
A Tabela 12 apresenta uma lista de variantes VH e a Tabela 13 apresenta uma lista de variantes e compara frameworks do aceptor humano selecionadas com as variantes iniciais (1.0) VH e VL. As variantes VH listadas na Tabela 12 incluem: hVHl.0 (SEQ ID NO:21); hVH2.0 (SEQ ID NO:70); hVH3.0 (SEQ ID NO:71); hVH4.0 (SEQ ID NO:72); hVH5.0 (SEQ ID NO:73); hVH6.0 (SEQ ID NO:74) ; hVH7.0 (SEQ ID NO:75); hVH8.0 (SEQ ID NO:76); hVH9.0 (SEQ ID NO:77); hVHIO.0 (SEQ ID NO:78); hVHll.O (SEQ ID NO: 79); hVH12 . 0 (SEQ ID NO: 109); hVH13 . 0 (SEQ ID NO:110); hVH14.0 (SEQ ID NO:lll). As variantes VL listadas na Tabela 13 incluem: hVLl.0 (SEQ ID NO:41); hVL2.0 (SEQ ID NO:8 0) ; hVL3.0 (SEQ ID NO:81); hVL4.0 (SEQ ID NO:82); hVL5.0 (SEQ ID NO:83); hVL6.0 (SEQ ID NO:84); hVL7.0 (SEQ ID NO:85); hVL8.0 (SEQ ID NO:86); hVL9.0 (SEQ ID NO:87); hVLlO.O (SEQ ID NO:88); hVLll.O (SEQ ID NO:89); hVL12.0 (SEQ ID NO: 108) . Os resíduos de murino retidos são mostrados em negrito. Também é apresentada cada uma das variantes adicionais construídas (veja abaixo) . Cada uma das variantes apresentadas na Tabela 12, abaixo da VH1.0, apresenta a mesma seqüência da VHl.0 (apresentada com um traço [-] ) a menos que seja mostrada uma substituição específica de aminoácidos que altere o resíduo de murino retido para a framework humana correspondente. De maneira semelhante, cada uma das variantes VL apresentadas na Tabela 13 têm a mesma seqüência da variante VLl.0, com exceção das substituições específicas de aminoácidos indicadas. Tabela 12
<table>table see original document page 117</column></row><table> Tabela 12 ( continuacao)
<table>table see original document page 118</column></row><table> TABELA 13
<table>table see original document page 119</column></row><table> Tabela 13 (continuacao)
<table>table see original document page 120</column></row><table> O alinhamento da seqüência de aminoácidos do TMC-2206 com as seqüências genéticas (germline) mostrou um agrupamento de resíduos na framework que sofreu mutação de volta para o equivalente do murino na variante inicial humanizada do TMC-2206 (TMC-2356)]. Conforme mostrado pelo alinhamento, foram verificados dois clusters entre a FW2 e FW3 na cadeia pesada, e outros dois clusters, um localizado na FWl e um na FW2, na cadeia leve. Duas variantes hVH e hVL contendo mutações reversas para os resíduos humanos nos sítios de interesse foram as variantes 3.0 e 4.0, desenhadas para realizar grupos (clusters) de mutações para ajudar a definir as regiões nas quais os resíduos de interesse podem ficar (Tabelas 12 e 13) . Além das diferenças nos resíduos, destacadas nas Tabelas 7 e 8 para as regiões VL, a posição L1 foi modificada para o Asp humano na VL4.0, já que este é um resíduo comum para as cadeias leves κ humanas. As cadeias pesadas hVH3.0 e hVH4. O foram co-transfectadas com as cadeias leves hVL3.0 e hVL4.0 em várias combinações de VH/VL e os anticorpos resultantes foram comparados com o anticorpo hVH1.0/hVL1.0, descrito acima, para verificar afinidade com o ligante por meio de comparações head-to- head (cabeça-cabeça) com o anticorpo monoclonal TMC-2206 não marcado. Na Tabela 14, os resíduos na versão 1.0 da VH ou VL humanizada que foram revertidos para resíduos humanos são apresentados em negrito e itálicos. Os números entre parênteses na Tabela 14 representam a variação em potência comparada com a variante hVHl.O, hVL1.0.
TABELA 14
<table>table see original document page 121</column></row><table> Observando-se os valores Ki, fica evidente que as mudanças na variante VH 3.0 (resíduos humanos inseridos na H67, H71, H73 e H78, designados cluster FW-3) induziram uma grande redução na potência dos anticorpos contendo a hVH3.0; de maneira semelhante, também foi observada redução para as variantes hVL4.0 (resíduos humanos inseridos no LI, L2 e L4, designados cluster FW-
1). Com exceção dos anticorpos da combinação hVHl.0/hVL3.0 e hVH4.0/hVLl.0, que apresentaram mudança de 1,9 e 1,3 vezes na potência em comparação ao anticorpo hVHl.0/hVLl.0, respectivamente, todas as combinações remanescentes apresentaram uma redução de mais de 4 vezes na potência (Tabeía 14) . Esses dados mostraram que as mutações reversas da H37 (V para I) e H48 (L para I) , sendo ambas as mudanças conservadoras de aminoácidos, foram bem toleradas. As mudanças no L46 (K para L) e L47 (W para L) dos resíduos de murino revertidos para resíduos humanos foram razoavelmente bem toleradas em associação com a hVHl.0, mas apresentaram efeito adverso sinérgico acentuado sobre a afinidade do anticorpo quando em combinação com a variante hVH3.0. 0 exame das diferenças em resíduos existentes entre frameworks da VH e VL de humanos e murinos mostrou que algumas dessas mudanças foram conservadoras. Adicionalmente, foram feitos modelos tridimensionais por computador da VH e VL do TMC-2206 de murino, de moléculas aceptoras humanas e de estruturas da hVH 1.0 e hVL 1.0. Para guiar a criação de modelos por computador, foi realizada uma pesquisa no BLAST a fim de identificar estruturas do banco de dados adequadas para a VL e VH do TMC-2206 . A estrutura ISY6.pdb (resolução 2,0 Â) foi escolhida para a VL do TMC-2206 e a estrutura IGIG.pdb (resolução 2.3Â) foi escolhida para a VH do TMC-2206 . A estrutura ICEl.pdb (resolução 1,9Á) foi escolhida para a molécula aceptora humana A14 da cadeia leve, enquanto que a estrutura IDNO (resolução 2.3Â) foi escolhida para a molécula aceptora humana da cadeia pesada, 4-59. A modelação previu a probabilidade de contato dos resíduos de murino preservados na humanização da VL 1.0 com o antígeno, com exceção de dois (LI e L4) . Os modelos também indicaram que não houve contato dos resíduos de framework genético humano com as CDRs, enquanto os resíduos preservados de framework murino foram, em geral, agrupados ao redor das CDRs.
Foram identificadas três áreas de diferenças entre as regiões VH de murino e humana modeladas, nas regiões variáveis da cadeia pesada. A primeira área foi dos resíduos H27-H33, para os quais foi considerado um provável contato com antígenos e com a CDR Hl. Esses resíduos também podem afetar o ângulo da interface VL/VH e apresentar efeitos adicionais indiretos sobre a ligação ao antígeno. A segunda área foi a primeira alça da CDR H2 que pode requerer um resíduo H71 na FW. A terceira área foi a CDR H3.
Também foram observadas três áreas de diferenças entre as estruturas VL modeladas de murino e humanas nas regiões variáveis da cadeia leve. A primeira estrutura foi a CDRl que possuía um resíduo a mais na VL do TMC-2206 murino. 0 murino Y no L71 (F em A14) foi útil para acomodar esta diferença. A segunda área foi a alça do murino L40 a L43 que foi empurrada mais para dentro do solvente em comparação ao humano, o que indicou que o L40-43 humano pode ser problemático, embora a atividade do primeiro protótipo humanizado tenha demonstrado que essas mutações reversas foram bem toleradas na hVLl.0. A terceira área foi a dos resíduos L55 a L59 de framework humana, que foram deslocados em relação à estrutura do murino. O resíduo da framework L73 (L em murinos, F em humanos) foi considerado responsável por essa diferença, embora a mutação reversa tenha sido bem tolerada na hVLl.0.
Utilizando a análise in silico, os resultados foram previstos para os resíduos da cadeia pesada específica de interesse e são resumidos na Tabela 15 a seguir. Resultados semelhantes para os resíduos da cadeia leve de interesse são apresentados na Tabela 16.
TABELA 15
<table>table see original document page 124</column></row><table>
TABELA 16
<table>table see original document page 124</column></row><table>
Com o uso da análise in silico, as posições foram avaliadas e classificadas para que reflitam a probabilidade de que uma substituição humana provoque um efeito no desempenho do anticorpo: H48, H67 < H37, H91 < H73 < H78, H71. Nessa classificação, a mutação reversa para a forma humana na posição H48 foi considerada como a que provavelmente será a mais bem tolerada, enquanto as mutações reversas nas posições H78 ou H71 foram consideradas as que serão menos toleradas. De maneira semelhante, a seguinte ordem foi prevista para as posições de interesse dentro da região da cadeia leve: Ll < L4 < L71 < L2 < L47 < L46 < L49. Em geral, essas classificações estavam de acordo com os valores Ki obtidos com as variantes hVH3.0, hVH4.0, e hVL4.0. No entanto, foi detectada uma diferença entre os efeitos previstos da substituição pela modelação por computador e os efeitos observados com as variantes produzidas na variante hVL3.0. Por exemplo, a variante do anticorpo composto pela combinação entre a VH1.0/VL3.0 mostrou atividade razoável, embora os dados do computador previssem que a atividade da variante hVL3.0 seria bastante reduzida. 0 impacto dos resíduos preservados da framework de murinos foi posteriormente avaliado pela produção de outras variantes humanizadas, incluindo oito variantes VH e seis variantes V, cada uma portando uma única mutação do resíduo preservado de murino para o correspondente humano. Foram avaliadas as contribuições relativas dessas alterações para a atividade. A Tabela 12 apresenta as variantes VH e a Tabela 13 apresenta as variantes VL.
Os valores K± que foram obtidos para essas variantes indicaram que os resíduos no H71, H78, L2 e L46 de camundongo foram preferencialmente retidos para maximizar a atividade, enquanto o H37, H48, H67, H91, LI, L4 e L71 poderiam ser alterados para seus correspondentes humanos sem causar perda significativa na atividade. Com o uso da modelação por computador, foi previsto que a alteração do resíduo do camundongo, L47 (Triptofano, um resíduo raro nessa posição em anticorpos humanos) e H73 teria impacto sobre a ligação ao antígeno. No entanto, a alteração para o Val-L47 não afetou significativamente a ligação ao antígeno e a alteração para o Thr-H73 causou apenas um pequeno desvio (redução de 1,6 ) conforme medido pelo Ki. Foi previsto que o L49 (Tirosina) se ligaria ao antígeno por modelação in silico e que a aliteração para uma lisina humana causaria grande mudança na potência. No entanto, a mudança da lisina humana para esta posição causou somente uma pequena redução de 3,3 vezes na potência, conforme avaliada pelo Ki.
Uma mudança significativa foi observada na VH para a alteração na H78 da valina de murino para a fenilalanina, que causou uma redução de 70 vezes na potência da variante hVH11.O, hVL1.0 em comparação à variante hVHl.0, hVLl.O, conforme avaliado pelo Ki. A modelação indicou que esse resíduo tem uma função na estrutura canônica da HCDRl. Esses resultados sugerem que a HCDR1 tem uma função importante na ligação ao antígeno. Para maximizar a atividade, a H71 também foi mantida. A mudança deste resíduo de Lys para Val resultou em uma redução de 6,4 vezes, observada na variante do anticorpo hVH9.0, hVLl.0. Além disso, entre os resíduos canônicos da cadeia leve, o fenilalanina na L2 apresentou sensibilidade para mudança como foi evidenciado pela perda acentuada da afinidade de ligação observada com a variante hVL4.0 em comparação às variantes hVL5.0, hVL6.0 e hVL7.0. A modelação por computador indicou que este Phe-L2 pode fazer contato extensivo com a LCDR3. Pesquisas em bancos de dados de anticorpos de murinos e humanos também indicaram que este
Phe na posição L2 é raro, sugerindo que isso possa representar uma mutação somática que apresenta impacto sobre a ligação ao antígeno.
Esses resíduos selecionados após a análise, conforme definidos acima como sendo tolerantes à mutação reversa, foram combinados com variantes hVH de 12,0 a 14,0 e as variantes da VL VL10.0 até 12, sendo que a atividade dessas variantes foi comparada com o anticorpo monoclonal original TMC-2206 e com o anticorpo quimérico camundongo- humano TMC-2206. Os resultados indicaram que o número de resíduos de murino na hVL poderia ser reduzido para três (ex: L2 [Phe] , L46 [Lys] e L49 [Tyr] ) sem causar nenhuma perda de atividade das variantes. De maneira semelhante, o número de resíduos de murino na hVH poderia ser reduzido de sete para três (ex: . H71 [Lys] , H73 [Asn] e H78 [Vai]) sem causar alterações estatisticamente significantes na afinidade e na potência . Esses 5 resultados são resumidos na Tabela 17.
TABELA 17
<table>table see original document page 127</column></row><table>
[A análise ANOVA com o teste de Dunnett para comparações múltiplas não mostrou diferenças estatisticamente significantes com TMC-2206 ou com a quimera].
Paralelamente, foram construídos homólogos dessas variantes nos quais a seqüência de glicosilação de consenso no interior da LCDRI foi alterada. A eliminação do sítio de glicosilação (NSS a QSS) pode ser útil para o processo de fabricação downstream e para o processo de desenvolvimento. A mudança do N26Q nas variantes hVLl.0, hVLlO.O e hVL12.0 (denotado hVLl.0Q [SEQ ID N0:90], hVLlO . 0Q [SEQ ID NO: 91] e hVL12 . 0Q [SEQ ID NO: 92]) foi introduzida na variante VL com o uso dos pares de primers indicados na Tabela 18, cujas seqüências são apresentadas na Tabela 9. A mudança no N2 6Q não apresentou efeito estaticamente significante sobre a atividade de nenhum dos anticorpos resultantes, conforme mostrado na Tabela 17. Embora esse sítio de glicosilação ocorra na CDR 1 da cadeia leve do anticorpo TMC-2206 wild-type, esses dados indicam que o mesmo não parece exercer alguma função na afinidade da atividade de bloqueio da função do anticorpo TMC-2206.
TABELA 18
<table>table see original document page 128</column></row><table>
EXEMPLO 4
Os anticorpos humanos da classe γ1 exercem funções efetoras associadas às funções de complemento e mediadas pelo receptor Fe. Os profissionais experientes preferem evitar a citotoxidade celular dependente do anticorpo (ADCC) e respostas do complemento a uma cadeia γ sem a sua funcionalidade, como a região constante γ4 humana. Para produzir uma versão γ4 de anticorpos VH12.0, VL10.0Q e VH14.0, VL10.0Q, uma seqüência da região constante γ1 foi substituída por uma seqüência da região constante γ4 nas cadeias pesadas VH12.0 e VH14.0, conforme descrito a seguir. A seqüência da região constante γ4 foi obtida da seqüência K01316 do Genbank. Tanto a seqüência γ1 Fc derivada do clone 20688 da IMAGE utilizada para produzir cadeias pesadas intactas de anticorpos IgGl com regiões hVH e hVL, conforme descrito neste documento, quanto a γ4 Fc derivada da seqüência KO1316, contêm um sítio de restrição Apal que ocorre naturalmente perto da junção da variável de das regiões constantes. Esse sítio foi utilizado para clonar uma região constante γ4 para substituir uma região constante γ1. Os sítios BamH1 e Not1 foram colocados na extremidade 31 da seqüência para facilitar a subclonagem no vetor de expressão pCI-neo. A seqüência γ4 (SEQ ID NOS: 105 e 106) foi então sintetizado como um gene sintético de novo pela Blue Heron Biotechnology (Bothell, WA). 0 plasmídeo da Blue Heron Biotechnology, contendo a região constante do IgG4 sintetizado de novo foi digerido com ApaI e NotI, o fragmento da região constante Ikb -γ4 foi purificado com gel e ligado aos plasmídeos pCI-VH12.0 e pCI-VH14.0 do ApaI/NotI digerido, para produzir plasmídeo que codificassem a VH12.0-y4 e VH14.0-y4. Estas foram combinadas individualmente com o plasmídeo pCI-VL10.0Q e transfectadas em células CHO. Quatro dias após a transfecção, os sobrenadantes da cultura foram colhidos e os isotipos IgG4 dos anticorpos VH12.0, VL10.0Q e dos anticorpos da VH14.0, VL10.0Q foram purificados com o uso de cromatografia de afinidade com proteína A. Outras transfecções transitórias de construções de γ1 dessas variantes foram realizadas em paralelo.
Após eluição ácida e neutralização, a cromatografia analítica por exclusão de tamanho por HPLC indicou a presença mais alta de formas oligoméricas de ordem nas formulações de IgG4 com proteína A purificada. Assim sendo, uma segunda etapa de purificação foi realizada por cromatografia de exclusão de 26/60 com o uso de Sefacril S-300 para obtenção de uma fração monomérica. Para isso, a coluna 26/60 do Sefacril S-300 foi pré-equilibrada em 660 ml SEC de Tampão Corrente (40 mM HEPES, pH 6.5, 2 0 mM L-histidina, 100 mM NaCl e 0,02% Tween-80). As frações agrupadas contendo a proteína extraída da coluna da proteína A foram carregadas (injeção de amostra de 12,5 ml) via um Superloop (Amersham Biosciences). Frações SEC (5 ml cada) foram coletadas em uma taxa de fluxo de 2,0 ml/min As frações correspondentes à forma monomérica (pico da extração a 168,4 ml) foram agrupadas, e o conteúdo da proteína foi determinado com o método de Lowry. Anticorpos IgGl exemplares possuem uma cadeia pesada hVH 14.0 γ (SEQ ID NO: 181) ou uma cadeia pesada hVH12.0 γ1 (SEQ ID NO: 182) e uma cadeia leve hVL10.0Q (SEQ ID NO:178). Anticorpos IgG4 exemplares possuem uma cadeia pesada hVH14.0 γ4 (SEQ ID NO:174) ou uma cadeia pesada hVH12.0 γ4 (SEQ ID NO: 176) e uma cadeia leve hVL 10. 0Q (SEQ ID NO:178). Anticorpos purificados foram testados no ensaio de competição para comparar a potência com o uso dos valores K± assim como no ensaio de adesão celular ao colágeno, no qual a potência é medida com base nos valores da EC50. Não foi observada diferença significativa entre os isotipos das diferentes variantes, como também não diferem significativamente no mAb do TMC- 2206 original em nenhum dos ensaios, conforme apresentados na Tabela 19.
TABELA 19
<table>table see original document page 130</column></row><table>
EXEMPLO 5
O efeito da anti-a2 sobre o extravasamento de neutrófilos foi estudado em um modelo de peritonite inflamatória de murino e rato. A administração intraperitonial de determinados antígenos como carragena ou tioglicolato induz uma rápida resposta dos mastócitos, que inicia uma reação peritoneal aguda (Edelson et al., Blood 103 (6) :2214-2220 (2004)). Essa peritonite é caracterizada por infiltração rápida de neutrófilos (em horas), seguida de infiltração mais lenta e proliferação de macrófagos (3-5 dias). Portanto, este modelo foi empregado para avaliar pela primeira vez o uso dos anticorpos anti- integrina α2 na prevenção ou redução funcional da resposta dos neutrófilos.
O modelo de peritonite aguda foi realizado em ratos e camundongos. O anticorpo TMC-2206 reconhece a integrina α2β1 de ratos, mas não de sua correspondente de murino. No entanto, vários modelos in vivo de modelos inflamatórios são realizados em camundongos e um anticorpo anti-a2 substituto, Ha 1/29 (Pharmingen, Becton Dickenson, CA, catalog no. 559987), foi utilizado no modelo de peritonite aguda de murino.
Os animais receberam injeções IV ou IP com o anticorpo anti-integrina a2 ou isotipo de controle em doses que variaram de 0,1 a 10 mg/kg 15 minutos antes do desafio. Foi administrada uma injeção IP de 1 mL de caseína a 9% (camundongo) ou carragena (ratos) e os animais foram levados de volta para suas jaulas por períodos específicos de tempo: 3 horas (camundongo) ou 5 horas (ratos) (n=4 por grupo). Os animais foram sacrificados com halotano e cavidade peritoneal foi lavada com 5 mL (camundongo) ou 10 mL (ratos) de PBS contendo 5 mM de EDTA. As células foram coletadas por centrifugação em baixa velocidade e colocadas em suspensão novamente em 5 mL de PBS/EDTA e uma alíquota de 100μL foi analisada com microscópio. Foi observado que a maioria dessas células apresentava uma morfologia polimorfonuclear compatível com neutrófilos. As células remanescentes da suspensão foram submetidas à centrifugação em baixa velocidade para obter um pellet lavado sem células.
0 conteúdo dos neutrófilos foi quantificado por meio da análise do nível de atividade da mieloperoxidase (MP0) (ex: Speyer et al. , Am J Pathol. 163 (6) : 2319-28 (2003)). 0 pellet celular foi recuperado do líquido da lavagem e ressuspendido em 500 μL de tampão de 50 mM KH2PO4 (pH 6.0) contendo 0,5% de hexadecil-trimetil-amonio brometo (HTAB; Sigma-Aldrich, MI) . As amostras foram sonicadas por 60-90 segundos e centrifugadas a 14.000 rpm por 5 minutos a 4°C. Foi realizada diluição serial 2:1 do sobrenadante limpo, transferindo-se 50 μL para 50 μL de tampão de HTAB no alvéolo de uma placa de microtitulação. Na etapa seguinte, 50 μL dessa solução do alvéolo foi transferida para outro tampão de 50 μL, e assim por diante na série de diluições. 200 μΟ L do tampão de substrato (tampão de 50 mM KH2PO4 (pH 6.0) contendo 0,168 mg /mL de o-dianisidina e 0,0005% H2O2) foi acrescentado para iniciar a reação colorimétrica que foi monitorada com um conjunto de leitor de placa Molecular Devices em um comprimento de onda de 460 nm. Foi então calculado o número de Unidades da atividade enzimática na suspensão original de células (500 μl de suspensão de células lavadas para cada animal individualmente). Uma curva de calibração, definida para titular neutrófilos/mL (avaliada por contagem direta de neutrófilos) contra a atividade do MPO, indicou uma forte correlação linear entre U/mL e o número de neutróf ilos/mL dentro do intervalo medido. Conforme mostrado na Tabela 20, tanto o anticorpo integrina anti-a2pi de murino Hal/29 quanto o TMC-2206 apresentaram efeito acentuado sobre a infiltração de neutrófilos na cavidade peritoneal após a administração de caseína a 9% em camundongos ou carragena a 1% em ratos, conforme medido pela atividade total do MP 0 recuperado do líquido de lavagem peritoneal. 0 valor da ED50 obtida em camundongo com Hal/2 9 foi de aproximadamente 0,07 mg/kg, enquanto a ED50 para TMC-2206 em ratos foi de aproximadamente 5 mg/kg. Essa diferença está em parte correlacionada com a finidade relativa da anti-integrina a2al humana pela integrina α2β1 de ratos em comparação à afinidade do anticorpo Hal/2 9 pela integrina α2β1 de camundongo e parte com as diferenças no antígeno usado em modelos de rato e de camundongo (carragena e caseína, respectivamente). TABELA 20
<table>table see original document page 133</column></row><table>
EXEMPLO 6
O efeito dos anticorpos anti-integrina a2 foi estudado em um modelo de camundongo (colite induzida por dextran sulfato) de doença inflamatória do intestino. Nesse modelo, a colite é induzida nos camundongos com a administração de uma solução de dextran sulfato de sódio a 5% (DSS) na água para beber (Elson et al. , Gastroenterology 109 (4):1344-67 (1995); Egger B., et al. , Digestion 62(4):240-8 (2000)) Foi avaliado o efeito do tratamento com o anticorpo anti-integrina α2β1 de murino sobre o desenvolvimento de sinais clínicos e sintomas de colite, além do efeito sobre a infiltração de leucócitos pró-inflamatórios no cólon.
Camundongos Balb/C (Harlan, IN) com peso de 16-21 gramas foram separados em pares. Os animais receberam água destilada ou água contendo dextran sulfato de sódio a 5 % (DSS) ; (ICN, Irvine, CA) ad libitum por 7 dias. Nesse estágio os camundongos apresentavam diarréia e notável perda de peso. 0 desenho do estudo foi de quatro grupos de seis camundongos cada; um grupo foi utilizado como controle sem tratamento; um grupo foi utilizado como controle de DSS e dois grupos foram designados para o tratamento com injeções intraperitoneais com doses de 2 ou 5 mg/kg do anticorpo anti-integrina a2 PS/2 nos Dias 0, 2, 4 e 6. Os camundongos foram sacrificados no Dia 7 (168 horas após o início da administração do DSS) . Os animais foram pesados para observar quaisquer mudanças ocorridas desde o início do estudo, o comprimento do cólon foi medido e em seguida os animais foram classificados com o uso de uma escala de 0 a 2, sendo 2 a classificação mais grave, para diarréia, sangramento do cólon e sangramento retal, conforme mostrado a seguir: sangramento retal: escore de 0 = ausência de sangue visível; 2 = sangue visível consistência das fezes: escore de 0 = normal; 1 = fezes soltas; 2 = fezes aquosas sangramento do cólon: escore de 0 = ausência de sangue visível; 2 = sangue visível
Os cólons foram processados para imunohistoquímica. Os cólons, do ceco ao reto, foram cuidadosamente removidos e fixados por 2 horas a 4 0C em paraformaldeído (PFA) a 4%, deixados de um dia para outro em sucrose a 20% e congelados rapidamente em composto OCT para congelamento (Tissue Tek). Foram feitos cortes finos (10 μΜ de espessura) em série com o uso de um criostato Leica, secos ao ar livre, bloqueados por 2 horas em soro de bode a 3% em PBS e incubado de um dia para outro em anticorpo primário em temperatura ambiente. Os anticorpos primários utilizados incluíram o anti-CDllb/mac-1 de rato-murino (um marcador para macrõfagos e neutrófilos ativados, Clone Ml/70, BD-Pharmingen), anti-CD3 de hamster-murino (um marcador de células T, BD-Pharmingen), e um clone F4/80 (um marcador de macrófagos, Research Diagnostics, Inc). As lâminas foram então lavados, incubadas por 2 horas no anticorpo secundário correspondente marcado com Alexa 488- ou TRITC (Sondas Moleculares, 0R) e lavados três vezes por 5 minutos em PBS e montados em meio Vectashield contendo DAPI (Vector Labs, CA). As secções foram analisadas com um microscópio de epifluorescência Leica conectado a uma câmera Spot RT (Research Diagnostics). A intensidade da fluorescência e o número de células fluorescentes dentro da região de interesse (ROI) selecionada que delinearam a região entre a lâmina própria e as extremidades do vilo, mas eliminaram a superfície serosa (hiperautofluorescência) e o lúmen entérico, de um total de 5 campos de visualização em cinco seções separadas, foram quantifiçados para cada animal com o uso do software ImagePro (Media Cybernectics, MD).
Conforme mostrado na Tabela 21, foi observado efeito estaticamente significante relacionado à dose do tratamento com a anti-integrina a2 de murino sobre a reversão da perda de peso e sobre a consistência das fezes associadas à alimentação com DSS. Os dois grupos de tratamento (2 mg/kg e 5 mg/kg) apresentaram efeitos significativos sobre o sangramento retal e sangramento do cólon, mas não apresentaram efeito significativo sobre o encurtamento do cólon associado com o desenvolvimento de colite. 0 tratamento também foi correlacionado com uma redução acentuada do número de leucócitos infiltrantes (dados não apresentados).
TABELA 21
<table>table see original document page 135</column></row><table> *p<0,05 **p<0,01
Em um outro estudo, foram avaliados os efeitos da anti- integrina α4 (clone PS/2; Southern Biotech, AL), da anti- integrina α2 (clone Hal/2 9, BD Pharmingen, CA) e da anti- integrina α1 (clone Ha8/31; Invitrogen, CA) em comparação a camundongos tratados somente com DSS (n=8 por grupo).
As doses do tratamento com anticorpos foram de 5 mg/kg. Foi relatado que esses anticorpos anti-integrina bloqueadores de função modulam a colite experimental (Kriegelstein et al. , J Clin Invest. 110 (12) : 1773-82 (2002); Watanabe et al, Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol.283 (6) :G1379-87 (2002)). Conforme mostrado na Tabela 22, os três anticorpos anti-integrina foram associados com uma reversão no encurtamento do cólon, mas somente o tratamento com a anti-α2 foi associado com melhora significativa na consistência das fezes (diarréia). Tanto o tratamento com anti-α2 quanto com anti-a4 resultaram em melhora significativa no sangramento do cólon. Neste estudo, nenhum dos tratamentos com anticorpos induziu efeito significativo sobre a perda de peso. Quando os números de células T, macrófagos e neutrófilos residentes foram avaliados por imunofluorescência indireta com o uso de anti-CD3, F4/80 e anti-Macl (conforme descrito anteriormente) , os três grupos tratados com anti-integrinas apresentaram redução significativa em comparação ao grupo de controle com solução salina, conforme mostrado na Tabela 23. Esses dados dão suporte à conclusão de que a função antagonizante da α2 apresenta um profundo efeito sobre os níveis no estado de equilíbrio dessas células efetoras imunes que se acumulam no cólon inflamado em resposta ao DSS e que essas alterações estão simultaneamente relacionadas com uma melhora das avaliações clínicas associadas com colite.
TABELA 22
<table>table see original document page 136</column></row><table>
*p<0,05 **p<0,01 TABELA 23
<table>table see original document page 137</column></row><table>
*p<0,05 **p<0,01
EXEMPLO 7
Os efeitos do anticorpo anti-integrina a2 foram estudados com base nos sinais e sintomas clínicos observados em um modelo de encefalomielite experimental alérgica (EAE) de esclerose múltipla. 0 modelo de EAE de esclerose múltipla, induzida por injeção de peptídeo encefalogênico sintético PLPi39-I5I juntamente com adjuvante de Freund em camundongo SJL, é considerado um modelo preditivo de recidiva-remissão de esclerose múltipla (Encinas et al., J Neurosci Res.45(6):655-69 (1996)).
Em um estudo com 4 grupos de camundongos (8/grupo; consulte a Figura 1), dois grupos receberam dose de 5mg/kg nos Dias 10, 11, 12, 14, 15, 18 e 20 com o isotipo de controle ou o anticorpo anti - integrina cx2 de murino, Hal/29, do início dos sintomas da doença até o Dia 20, que engloba a primeira exacerbação aguda. Este foi um esquema agudo de administração. O Dia 0 foi definido como o início da preparação com o peptídeo sintético PLP139-151 mais adjuvante de Freund. O início da doença foi definido como o segundo dia consecutivo de perda de peso. Os dois outros grupos foram designados para um esquema de administração tardia no qual receberam 5 mg/kg do anticorpo anti-integrina a2 de murino ou solução salina três vezes por semana do Dia 18 ao Dia 36, que deveria coincidir com a segunda exacerbação/primeira recidiva. Os camundongos foram classificados de acordo com os sinais clínicos e sintomas da seguinte maneira: escore de 0,5 =2 dias consecutivos de perda de peso
escore de 1 = cauda instavel escore de 2 = ataxia escore de 3 = paralisia de membros posteriores escore de 4 = moribundo escore de 5 = morte
Conforme mostrado na Tabela 24, o tratamento com 5 mg/kg do anticorpo anti-a2 desde o início da primeira exacerbação (ex. ; tratamento agudo) reduziu a extensão da primeira exacerbação e também limitou a extensão da segunda exacerbação. Quando a administração foi iniciada após o final da primeira exacerbação no Dia 18 (ex. : tratamento tardio; consulte a Figura 1) , os camundongos tratados com 5 mg/kg de anticorpo anti-integrina a2 de murino também apresentaram escores clínicos mais baixos durante a primeira recidiva até o Dia 32. Nesse ponto, os dois grupos apresentaram escores semelhantes para a doença conforme mostrado na Tabela 24. Quando os camundongos foram tratados somente na fase de indução conforme mostrado na Figura 2, o mAb anti-integrina ot2 apresentou pouco ou nenhum efeito sobre o primeiro ataque ou nas fases subseqüentes do modelo de EAE e os camundongos desenvolveram essencialmente a doença equivalente a dos animais tratados com o isotipo de controle. Esses resultados se contrapõem aos resultados obtidos anteriormente com o uso do anticorpo anti-a4, PS/2, no modelo de EAE (Yednock et al. , Nature 356(6364) :63-6 (1992); Theien et al. , J. Clin. Invest. 107 (8) :995-1006 (2001)), utilizado para dar suporte ao tratamento de episódios de recidiva de esclerose múltipla com o anticorpo anti-a4 natalizumabe (Miller et al. , N. Engl. J. Med. 348(1):15-23 (2003)). Esses resultados mostram que ao contrário da função que a integrina a4
cauda instável ataxia
paralisia de membros posteriores moribundo
10
morte desempenha nos distúrbios neuroinflamatórios, nos quais o antagonismo desse receptor pode retardar o início das recidivas de exacerbação associadas com a esclerose múltipla, o antagonismo à integrina a2 é uma modalidade de tratamento útil para reduzir e tratar as ocorrências de exacerbações, quando elas ocorrem.
TABELA 24
<table>table see original document page 139</column></row><table>
Exames histológicos foram realizados nos cérebros e colunas vertebrais obtidas de camundongos em estado
moribundo (estágio 4) ou no final do estudo. Os camundongos foram sacrificados com halotano no estado moribundo (escore clinico 4), ou após um período de observação de 55-60 dias. Os animais foram perfundidos com PBS, seguido de uma solução de paraf ormaldeído a 4%. Os cérebros foram divididos em cinco secções coronais, as colunas vertebrais em doze secções transversais e os tecidos foram fixados em parafina e as secções com espessura de 4 μ foram coradas com azul Luxol para visualização de mielinização. Os graus de mielinização dos tecidos, de infiltração (meningite) e de infiltrado perivascular foram classificados em esquema cego. Para a classificação das secções da coluna vertebral, cada seção foi dividida em quadrantes: o funículo anterior, o funículo posterior e cada funículo lateral. Qualquer quadrante contendo meningite, infiltrado perivascular ou desmielinação foi classificado com o escore 1 da respectiva classe patológica. Foi determinado o número total de quadrantes positivos em cada classe, em seguida dividido pelo número total de quadrantes presentes na lâmina e multiplicado por 100 para determinar a porcentagem de envolvimento para cada classe patológica. Uma classificação geral para cada classe patológica também foi determinada atribuindo-se um escore positivo se houvesse presença de lesões no quadrante.
Lesões inflamatórias desmielinantes foram observadas na coluna vertebral, mais freqüentemente no fascículo graciles do funículo posterior e na emergência da raiz ventral no funículo ântero-lateral. Foi observado somente infiltrado perivascular leve. Foi observada forte correlação entre meningite e desmielinização com sinais clínicos (r=0,84 e 0,79, respectivamente) e observou-se também escores significativamente mais baixos no grupo tratado com a anti-a2 (P<0,01 entre os grupos tratados com anti-a2 e grupo de controle com IgG para os dois parâmetros). Esses dados indicam que o tratamento com o anticorpo anti-integrina a2 inibe a meningite e a desmielinização associadas com uma exacerbação e/ou facilita a remielinização e a regeneração. 0 resultado geral é uma melhora no desfecho clínico.
Um outro estudo foi realizado (n=17 a 20 por grupo) para comparar a anti-integrina a2 com o anticorpo anti- integrina a4, PS/2 (obtido da Southern Biotech), tratamento durante a primeira exacerbação aguda até o início da remissão (Dias 10 até 20). Dois grupos adicionais foram tratados com o controle de IgG ou com a anti - integrina a2 do início da remissão (Dia 18) até a primeira recidiva (Dia 36) e no início da fase crônica da doença. Mais uma vez, o tratamento com a anti-integrina cc.2 apresentou efeito acentuado sobre a incidência de seqüelas neurológicas (paralisia) e uma redução estatisticamente significante no escore clínico médio máximo durante a primeira exacerbação de EAE e também na fase subseqüente de recidiva (fase crônica de EAE; Tabela 24) . Foi observado um pequeno efeito de melhora do tratamento tardio com a anti-a2 sobre os escores clínicos durante a fase crônica da doença. A incidência da doença durante o primeiro ataque (anti-a2, 61%; controle IgG 85%) e durante a fase crônica (anti-oc2, 77%; controle IgG 10 0%) foi mais baixa no grupo de camundongos tratados com anti-a2 em comparação ao grupo de controle. No caso do grupo tratado com a anti-a4, a incidência da doença durante o primeiro ataque (tratamento com anti-a4, 94%; controle 82%) e a recidiva (tratamento com anti-a4, 89%; controle, 92%) foi semelhante entre o grupo tratado com o anticorpo anti-a4 versus o grupo de controle. No entanto, a extensão das recidivas subseqüentes foi notavelmente reduzida. Esses dados relacionados ao anticorpo anti-a4 são comparáveis a relatos anteriores sobre o efeito do tratamento com o anticorpo anti-a4 no resultado clínico em EAE (Theien et al. , J. Clin. Invest. 107 (8) :995-1006 (2001) ) .
EXEMPLO 8
Foram estudados os efeitos da ligação à integrina α2β1 plaquetária (a α2βΐ é expressa na superfície das plaquetas), inclusive os efeitos sobre a função das plaquetas. Diferentes conjuntos de ensaios foram realizados para estudar esses efeitos.
Os primeiros estudos avaliaram se a ligação do TMC-2206 causa ativação plaquetária conforme medida pela supra- regulação da P-selectina ou ativação da integrina allba3 plaquetária que foi medida com a utilização de um anticorpo de ativação específico para allba3 como o PAC- 1. Com o uso de uma agulha de 21-gauge, foi colhido sangue venoso humano da veia cubital de doadores saudáveis, que não tinham tomados nenhum medicamento por pelo menos 10 dias, em um volume 1/10 de tampão de citrato-dextrose acidifiçado (ACD: 85 mM citrato de sódio, 111 mM dextrose, e 71 mM ácido cítrico, sem ajuste do pH) que continha 500 ng/mL de prostaglandina I2 (PGI2, Sigma-Aldrich) se utilizado para fazer plaquetas lavadas. O sangue total foi centrifugado a 160xg por 20 minutos em temperatura ambiente e o plasma rico em plaquetas (PRP) foi removido sem romper o tampão. As plaquetas lavadas foram preparadas com a diluição de 2,5 vezes de PRP com tampão de solução salina de citrato de glicose (CGS; 13 mM citrato trisódio, 120 mM cloreto de sódio e 30 mM dextrose, pH 7.0) tampão e PGI2 (500 ng/ml) e centrifugação a 160xgr por 20 minutos em temperatura ambiente para remover quaisquer leucócitos contaminantes. O sobrenadante foi colhido e centrifugado a IlOOxgr por 10 minutos e o pellet de plaquetas resultante foi levemente ressuspendido em tampão CGS, lavado e ressuspendido em tampão normal Tyrodes-Hepes (12 mM NaHCO3, 13 8 mM NaCl, 5.5 mM glicose, 2.9 mM KCl, 10 mM HEPES, 1 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, pH 7,4). As plaquetas ficaram em recuperação por até 3 0 minutos a 3 7°C. AS plaquetas lavadas foram então contadas antes do acréscimo de CaCl2 e MgCl2 to 1 mM. Plaquetas lavadas de ratos foram preparadas de maneira semelhante, contudo o sangue foi colhido da veia cava para minimizar a ativação plaquetária durante a coleta de sangue.
50 μΟ L de PRP recém preparado foram incubados com μg/mL de anticorpo TMC-2206 ou de controle de IgG por 30 minutos, lavado e incubado com anti-camundongo de cabra marcado com Alexa-594 na presença ou ausência do anticorpo seletina P marcado com Alexa 488 (BD Pharmingen, no. no catálogo 555523), anticorpo PAC-I marcado com Alexa-488 (BD Pharmingen, no. no catálogo 340507) ou 150 ng de fibrinogênio marcado com Alexa-488 (Sondas Moleculares) por 40 minutos em temperatura ambiente. A P-selectina e o PAC-1 são marcadores da ativação plaquetária e as plaquetas ativadas são capazes de se ligar ao fibrinogênio. No final do período de incubação, as plaquetas foram fixadas em um volume de 1/10 de paraformaldeído 4% e analisadas com o uso do citômetro de fluxo FACScalibur™. Os resultados desses experimentos inesperadamente mostraram que embora as plaquetas se ligassem nitidamente ao TMC-2206, conforme indicado pelo Iog shift no aumento da intensidade da fluorescência observada nas plaquetas tratadas com o TMC- 2206, mas não com as plaquetas tratadas com o controle IgG; não houve aumento concomitante na coloração da P- selectina ou PACl, o que indica que a ligação do TMC-2206 não ativou as plaquetas.
Os estudos seguintes avaliaram se a ligação do TMC-2206 causa ativação plaquetária conforme medido pelos efeitos sobre a agregação plaquetária induzida pelo colágeno. 0 colágeno solúvel é um potente agonista de agregação plaquetária e é usado rotineiramente na avaliação da responsividade plaquetária (consulte ex.: Hemostasis and Thrombosis; (2001) , ed. Colman et al) . Estudos com a deleção da a2 em camundongos sugeriram que as plaquetas desses camundongos exibem leve comprometimento da resposta ao colágeno (Holtkotter et al, J. Biol. Chem. 277 (13) : 10789-94 (2002) E. pub Jan, 11, 2002; Chen et al., Am. J. Pathol. 161 (1) : 337-344 (2002)). Para avaliar se o TMC-2206 apresentaria quaisquer efeitos adversos sobre a resposta das plaquetas ao colágeno, foram realizados ensaios de agregação plaquetária em humanos e em ratos por meio de agregometria óptica convencional com o uso do agregômetro Bio-data PAR4. 0 PRP foi preparado conforme descrito acima e a contagem de plaquetas foi ajustada a 3xl08/mL. 450 /µL de PRP ou de plaquetas lavadas foram misturadas com um bead magnético por 1 minuto a 37°C na presença de 5 μg/mL de TMC-2206 antes do acréscimo de colágeno Tipo I de pele de bezerro (Biodata Corp) para iniciar a agregação. 0 volume final de 500 μL, foi composto por tampão Tyrodes para agregação de plaquetas lavadas e por ensaios com plasma pobre em plaquetas (PPP) para plasma rico em plaquetas (PRP). 500 µL do tampão Tyrodes ou PPP foram usados como blanks para os ensaios. O PPP foi preparado pela peletização das plaquetas em PRP com centrifugação a 3000 rpm por 5 minutos em um microfuge. A taxa e a extensão da agregação plaquetária após o acréscimo do colágeno solúvel foi comparável na presença ou na ausência do TMC- 2206. Os resultados desses experimentos demonstraram que a ligação do TMC-2206 às plaquetas inesperadamente não apresentaram efeito sobre a agregação plaquetária induzida por colágeno em testes in vitro nas concentrações testadas.
Os estudos seguintes avaliaram se a ligação do TMC-22 06 causa trombocitopenia, uma conseqüência em potencial da ligação de anticorpos a plaquetas in vivo. (Hansen and Balthasar, J Pharmacol Exp Ther. 298 (1): 165-71 (2001)). Para avaliar se ocorreria trombocitopenia com a administração do TMC-2206, os ratos receberam uma dose de 10 mg/kg de TMC-2206 ou controle IgG de murino por injeção IP. Antes da injeção, sangue da cauda foi usado para a contagem de células na linha basal. Amostras de sangue foram colhidas em timepoints específicos após a administração IP do medicamento (ex.: 10, 30, 60 minutos e 4, 24 e 72 horas) de ratos não anestesiados através de punção retro-orbital utilizando-se um capilar Unopipet. Em seguida, aproximadamente 40 μL. de sangue foram transferidos para um tubo contendo 5 μL. de ACD e imediatamente analisado em um contador de células sangüíneas Hemavet (Drew Scientific). Os resultados desse estudo inesperadamente não mostraram alteração significativa em relação às contagens de plaquetas da linha basal nas doses de 5mg/kg ou 10 mg/kg de TMC-2206. Em contraste, a injeção de 0,1 mg/kg de um anticorpo a outro receptor plaquetário (αIIb, anticorpo anti-CD41 (BD Pharmingen, CA)) induziu trombocitopenia, com declínio de quase 80% na contagem de plaquetas em 15 minutos após a administração do anticorpo.
EXEMPLO 9
Foram estudados os efeitos dos anticorpos anti-integrina a2 sobre a adesão plaquetária ao colágeno, incluindo a adesão a vários subtipos de colágeno. A integrina α2β1 é a única integrina que se liga ao colágeno, embora não seja o único receptor de colágeno, expressa pelas plaquetas. No entanto, conforme discutido acima, existem outros mecanismos, especialmente mediante ativação plaquetária, que facilitam a firme adesão à matriz de colágeno. Neste exemplo, foi avaliada a capacidade do anticorpo TMC-2206 de bloquear a adesão das plaquetas ao colágeno Tipo I, II, III, IV e VI, tanto para as plaquetas inativas quanto para as ativadas com o agonista plaquetário moderado ADP.
Plaquetas Imulon II recobertas com colágeno tipos I, II, III, VI (Rockland Immunochemical) e IV (Sigma, St. Louis, MO) , que foram solubilizados sem formar espuma em 5 mM de ácido acético, para uma concentração final de 1 mg/mL.
Os alvéolos foram lavados duas vezes com o uso de tampão Tyrode-HEPES modificado sem Ca++ ou BSA, mas com 2 mM/Mg++ e bloqueado com 100 μL/alvéolo de tampão Tyrode-HEPES contendo 2 mM/Mg++ e 0,35% BSA, mas sem Ca++'
Sangue venoso humano foi utilizado para a preparação das plaquetas, incluindo PRP, conforme descrito acima no Exemplo 8. Plasma pobre em plaquetas (PPP) foi produzido pela centrifugação do PRP a 1100 χ g por 10 minutos em temperatura ambiente. 0 pellet de plaquetas resultante foi ressuspendido cuidadosamente para marcação em 1,0 mL CGS (13 mM citrato trisódico, 120 mM cloreto de sódio e 30 mM dextrose pH 7,0 , transferido para um tubo de fundo arredondado de 5 mL e 3 μL CFSE stock (concentração final de 53,7 μΜ) foram acrescentados com agitação suave por exatos 20 minutos. As plaquetas marcadas foram diluídas em tampão CGS e lavadas. O pellet de plaquetas foi ressuspendido em 1 mL de tampão CMFTH (5 mM HEPES, pH 7,3, 12 mM bicarbonato de sódio, 137 mM NaCl, 3 mM KCl, 0,3 mM NaH2PO4, 5 mM dextrose e 0,35% BSA) e mantido no escuro o máximo de tempo possível. As plaquetas lavadas de ratos foram preparadas de maneira semelhante, embora o sangue tenha sido colhido da veia cava em uma seringa contendo 500 ng/mL de PGEi em ACD para minimizar a ativação das plaquetas durante a coleta de sangue. As plaquetas marcadas com CFSE foram diluídas a 2 . OxlO5/xL utilizando-se tampão Tyrode-HEPES contendo 0,35% de BSA. As plaquetas marcadas (1. OxlO7 alvéolos) foram aplicada em alvéolos contendo 2 0 xM de ADP em tampão Tyrode-HEPES com 0,35% de BSA e concentrações variáveis do inibidor em teste. Placas de microtitulação contendo misturas de plaquetas foram centrifugadas a 550 x g por 10 minutos em temperatura ambiente e, em seguida foram incubadas no escuro por mais 10 minutos. Os alvéolos foram lavados com tampão Tyrode-HEPES. A f luorescência foi avaliada com o uso de um leitor de placa fluorescente Victor2. Para determinar a relação da intensidade da fluorescência versus o número de plaquetas, as plaquetas marcadas foram diluídas em vários níveis em tampão Tyrode-HEPES contendo 0,35% BSA (sem Ca++ ou ADP) , aplicadas aos alvéolos recobertos com colágeno Tipo I ou Tipo IV, centrifugadas, e as medidas de fluorescências do CFSE foram realizadas. Conforme mostrado na Tabela 25, o TMC-2206 bloqueou a ligação ao colágeno sob essas condições estáticas, com uma EC50 de 1,7 nM. Estudos semelhantes foram realizados com plaquetas de ratos com o uso do TMC-2206. Os valores da EC50 para inibição das plaquetas de ratos ao colágeno de rato Tipo I foram de 6,3 nM indicando um desvio de aproximadamente 5 vezes na afinidade pela α2β1 do rato em comparação a humanos sobre as plaquetas. TABELA 25
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Conforme mostrado na Tabela 25, o TMC-2206 foi um potente inibidor da adesão das plaquetas aos colágenos fibrilares, mas foi menos potente para o colágeno não fibrilar Tipo IV (10 nM em comparação a 1-2 nM) . Na presença de ADP, foi inesperadamente observada redução de 10 a 20 vezes na potência da inibição da ligação aos colágenos fibrilares e o anticorpo deixou de ser eficaz na prevenção da adesão ao colágeno Tipo IV. Essas observações inesperadas sugerem que o . TMC-2206 e os anticorpos com epitopo com a especificidade de ligação do TMC-2206 são menos ativos para inibir as interações das plaquetas ativadas ao colágeno fibrilar e teria pouco ou nenhum efeito [na faixa de dose terapêutica] sobre a ligação do colágeno Tipo IV, o subtipo de colágeno predominante na parede do vaso endotelial.
EXEMPLO 10
Foram estudados os efeitos dos anticorpos anti-integrina a2 sobre o tempo de sangramento. Os profissionais qualificados tem uma expectativa de que a administração de um anticorpo contra a integrina plaquetária possa provocar complicações hemorrágicas e levar a um aumento no tempo de coagulação em um paciente em tratamento com esse anticorpo após uma lesão aguda. Para avaliar se anticorpos direcionados contra a integrina a2 aumentariam a propensão para sangramento in vivo, foi determinado o efeito de TMC-2206 sobre o tempo de sangramento em ratos. Os ratos receberam uma injeção IP ou IV de TMC-2206 15 minutes antes do teste de tempo de sangramento. Os ratos não anestesiados foram imobilizados em um aparato para restrição e 0,8 cm da ponta da cauda foi cortado rapidamente para iniciar o sangramento. A cauda foi imediatamente colocada em uma proveta contendo 3 0 mL de PBS e mantida a 37°C. O tempo necessário para o sangramento na cauda parar foi registrado como tempo de sangramento. Conforme mostrado na Tabela 26, os dados de mostraram que a administração de doses de TMC-2206 até 10 mg/kg não tiveram efeito significativo sobre o tempo de sangramento.
TABELA 26
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EXEMPLO 11
Os efeitos dos anticorpos anti-integrina a2 foram estudados em um modelo de trombose arterial. Uma outra manifestação potencial de um distúrbio de sangramento causado pela administração de anticorpos reativos com α2β1 nas plaquetas poderia ser um aumento do tempo para oclusão trombótica que ocorre após lesão arterial aguda decorrente de efeitos indesejáveis da função das plaquetas. Dessa maneira, anticorpos anti-integrina a.2 como o TMC-22 06, foram testados em um modelo de trombose arterial em rato induzida com cloreto férrico . Este é um modelo padrão que tem sido utilizado para o desenvolvimento de agentes anti-trombóticos e a atividade é manifesta como um retardo no tempo de oclusão após exposição do leito endotelial do vaso sangüíneo a uma solução de FeCl3 (Kurz et al., Thromb Res. 60(4):269-80. (1990); Hoekstra et al., J Med Chem. 42 (25) :5254-65 (1999)).
O anticorpo TMC-2206 foi administrado a ratos por injeção na veia da cauda aproximadamente 30 minutos antes da indução da lesão arterial em doses variando de 1 mg/kg a 15 mg/kg. Para injeções IV, a maioria dos anticorpos foi concentrada a 4-5 mg/mL para reduzir os volumes da injeção para as doses mais altas. Os grupos de tratamento foram 1,0, 2,5, 5,0, 10,0 e 15 mg/kg TMC-2206, 5,0 mg/kg controle murino IgGI(k) (clone MOPC21) 5,0 mg/kg policlonal de coelho anti-vWF (DAKO) ou solução saline; cada grupo de tratamento foi composto por 3-4 animais.
Os ratos Sprague-Dawley (Harlan) pesando 220-270 gramas foram anestesiados com 60 mg/kg de pentobarbital sódico. Uma vez atingido um grau suficiente de anestesia a artéria carótida deles era exposta e colocada em um pedaço de filtro de papel (4 mm χ 5 mm) que foi dobrado do lado de 4 mm para acomodar a carótida e proporcionar uma superfície para que o cloreto férrico (35%) envolva a carótida. Doze μL de FeCl3 35% foram aplicados por 5 minutos e, em seguida, o filtro de papel foi removido e a sonda de fluxo Transonic Systems Inc. (Ithaca, NY) foi colocada ao redor da carótida. O fluxo foi medido por até 45 minutos.
Os valores médios e o SBM para taxas de fluxo de vários animais por grupo foram registrados em timepoints específicos após a administração de cloreto férrico. Não foram observadas diferenças significativas no tempo para oclusão verificado com nenhuma das doses de TMC-2206 testadas, mesmo com a dose alta de 15 mg/kg, em comparação com o controle de solução salina. Isso indica que parece não haver efeitos adversos sobre a trombose devido a administração do TMC-2206. Embora os valores iniciais de fluxo possam variar substancialmente entre os animais, o tempo para oclusão ocorreu de maneira consistente entre 10 e 16 minutos após a administração do cloreto férrico nos grupos tratados com TMC-2206. Esse tempo foi muito semelhante aos verificados nos grupos de tratados com solução salina e de controle IgG, nos quais os tempos médios para oclusão foram de 12 e 14 minutos, respectivamente. O único tratamento testado que foi associado com prevenção da oclusão foi o controle positivo, um anticorpo policlonal anti-vWf, que resultou em não redução nos parâmetros de fuxo por período de até 45 minutos após o acréscimo do FeCl3. EXEMPLO 12
As propriedades de ligação dos anticorpos anti-integrina α2 foram estudadas, incluindo estudo de mapeamento do epitopo, para caracterizar a natureza do sítio de ligação do TMC-220 6 na subunidade da integrina α2. Pode-se esperar que um anticorpo anti-integrina α2 que se ligue diretamente ao sítio de ligação do alvo e que sirva como um competidor direto para o ligante de ligação cause ativação plaquetária com a ligação à integrina α2α1. Por outro lado, um anticorpo anti-integrina cx2 que se ligue â integrina α2β1 em estado inativo e não promova a ativação da integrina pode apresentar um perfil de não ativação plaquetária semelhante àquele inesperadamente observado para o TMC-2206. Anticorpos com epitopo de ligação igual ou semelhante ao do TMC-2206 inibiriam a adesão celular dos leucócitos ao colágeno e assim possuem utilidade terapêutica significativa, mas não estariam associados com complicações hemorrágicas que um anticorpo que se ligou e ativou uma integrina α2β1 pode apresentar. Foram conduzidos estudos para investigar se o epitopo reconhecido pelo TMC-2206 está no domínio I da ligação do ligante da subunidade da integrina α2 ou se simplesmente depende da presença de um domínio I intacto (Hangan et al., Câncer Res. 56:3142-3149 (1996)). Para esses estudos, uma proteína de fusão do domínio I da GST-a.2 I foi produzida com a utilização de uma versão modificada do protocolo descrito por Tuckwell et al., J. Cell Sci. 108 (Pt 4):1629-37 (1995). O domínio I da α2 humana foi clonado a partir do raRNA isolado de aproximadamente IO6 células CHO que expressam a integrina a2 humana (Symington et al., J Cell Biol. 120(2):523-35. (1993). As células foram lisadas em reagente Trizol (Gibco) e foi acrescentado clorofórmio para extração da fase aquosa antes do acréscimo de 0,2 volumes de isopropanol para precipitar o RNA que foi coletado por centrifugação e ressuspendido em água sem RNAse.
Primers laterais do domínio I da a.2 humana foram sintetizados pela Sigma-Genosys. Os primers foram manipulados com sítios BamHI e EcoRI nas extremidades 5' e 3', respectivamente, para clonagem no vetor pGEX-2TK (GE Biosciences). Os primers halphal F
(5'GGGGATCCAGTCCTGATTTTCAGCTCTCAG; SEQ ID NO:117) e halphal R (5'GGGAATTCAACAGTACCTTCAATGCTG; SEQ ID N0:118) (consulte a Tabela 27) foram utilizados para uma reação de etapa única pela RT-PCR com a utilização de um kit padrão Qiagen para amplificar os aminoácidos 123 a 346 da subunidade da integrina a2 madura e incorporar um sítio BamHI do amino terminal (que acrescenta um GS na extremidade 5 do resíduo 124 do domínio I) e um hexapeptídeo adicional EFIVTD como parte do sítio de clonagem KcoRI através do códon final. Uma única banda foi detectada pela eletroforese em gel de agarose. A reação da PCR foi realizada com a utilização do kit Qiagen PCR Quic, o produto digerido com enzimas de restrição e clonados no vetor pGEX-2TK (Amersham, GE) com o uso de técnicas de biologia molecular padrão. As bactérias transformadas foram analisadas para detecção de inserções e vários clones seqüenciados com o uso de um sistema CEQ de Beckman-Coulter. A seqüência de aminoácidos deduzidas como clonadas foi idêntica à seqüência disponível de um domínio I da a2 humana (SEQ ID NO:11, mostrado na Tabela 28). Um único clone contendo a inserção correta de DNA foi amplificado em células DH5a (Invitrogen) e transformadas novamente em bactérias eletrocompetentes BL21 (Invitrogen). TABELA 2 7
<table>table see original document page 152</column></row><table> <table>table see original document page 153</column></row><table> <table>table see original document page 154</column></row><table>
A proteína de fusão GST com o domínio I da oí2 humana foi expressa em bactérias de crescimento logarítmico BL21 com a utilização do IPTG como agente indutor. Aproximadamente 4 horas após a indução, as bactérias foram colhidas e peletizadas a 3000 RPM em tubos cônicos de 50 mL. O pellet foi ressuspendido em PBS contendo 1% Triton X-IOO e inibidores de protease. O homogenado foi sonicado por 1 minuto e centrifugado a 3000 RPM para retirar os resíduos celulares do lisado. A proteína de fusão GST foi purificada a partir dos lisados bacterianos com o uso de resina de glutationa-Sefarose (GE-Amersham) de acordo com as instruções do fabricante e eluída em TBS (pH 8.0) contendo 20 mM de glutationa livre. O domínio I da GST- α.2 I purificada se ligou ao colágeno com a mesma especificidade relatada anteriormente (Tuckwell et al. , J Cell Sei. 108 (Pt 4):1629-37 (1995)), ou seja, uma maior afinidade pelo colágeno Tipo I em comparação ao colágeno Tipo IV. Também se ligou ao TMC-22 06 imobilizado com um Kd aparente avaliado pelo ELISA de 0,31 nM, que foi comparável à afinidade observada da ligação do TMC-2206 à integrina α2β1 intacta de 0,37 nM, obtida com base nos estudos de ligação direta descritos no Exemplo 2. Em seguida, foi avaliada a estabilidade da proteína de fusão do domínio I da GST-a2 solúvel para competir com o TMC- 2206 marcado com Eu para ligação com as placas recobertas com α2β1, conforme descrito no Exemplo 2. Foi verificado que o valor de K"i para o domínio I da GST-a2 solúvel é semelhante (0,18 nM em comparação a 0,28 nM) ao obtido com o TMC-2 2 0 6 não marcado, indicando que o sítio de ligação para o TMC-2206 se acomoda dentro domínio I da a2 e não necessitou da presença de uma subunidade βΐ. Foram realizados estudos para investigar a dependência de cátion de ligação pelo TMC-2206. A dependência de cátion indica que a porção ligante tem como alvo o sítio divalente de ligação do cátion (MIDAS) da integrina e, portanto, age como um ligante mimético. O colágeno que se liga à a2 é dependente de Mg++ em condições fisiológicas normais enquanto que a ligação não ocorre quando o Mg++ é substituído por Ca++ (Staatz et al. , Cell Biol. 108 (5):1917-24 (1989); Emsley et al. , Cell 101(1) :47-56 (2000)) . Para esses estudos, a proteína de fusão do domínio GST-a2 I foi imobilizada em placas de microtitulação Reacti-Bind revestidas com glutationa (Pierce Biotechnology, Inc. Rockford, IL) e foi determinada a capacidade do Eu-TMC-22 06 marcado de se ligar sob diferentes condições de cátions (Ca- e sem Mg, Ca++ ou Mg++ em concentrações que variam de 0,1 μΜ a 3 mM). As placas foram revestidas incubando-se 100 μL/alveolo de GST-a2I proteína de fusão (2.0 μg/mL tampão de ligação divalente sem cátions: 50 mM HEPES, pH 7,4, 150 mM NaCl e 0,5% Tween-20) por 1 hora em temperatura ambiente, e os alvéolos foram lavados quatro vezes em tampão divalente de lavagem sem cátions. Os alvéolos foram bloqueados utilizando-se tampão bloqueador 100 μL/alveolo (tampão de lavagem contendo 3,0 mg/mL de BSA sem IgG [Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc., West Grove, PA] ) por 1 hora em temperatura ambiente, lavados quatro vezes em tampão de lavagem divalente sem cátions e mergulhados em tampão de lavagem divalente sem cátions (300 μL/alvéolo) por 45 minutos em temperatura ambiente. Os alvéolos foram equilibrados em tampão de lavagem (300 μL/alvéolo) contendo o nível desejado de cátions divalentes por 30 minutos e então incubados por 1 hora a 37°C na presença de 41 pM, 199 pM 345 pM ou 1 nM de TMC- 22 06 marcado com Eu ou anticorpo de controle. 0 anticorpo murino TMC-2206 ligou-se de maneira dependente da concentração, com potência similar sob todas as condições, indicando que sua ligação ao domínio α2 I é independente de cátions e, portanto, não envolveu o sítio MIDAS. O controle IgG marcado com Eu não se ligou aos alvéolos recobertos com integrina α2βΐ confirmando que a ligação foi específica.
Estudos adicionais foram conduzidos para investigar o sítio de ligação do TMC-2206. Os ligantes da integrina possuem normalmente um ácido chave que forma a ligação quelante final para o íon metal divalente (Haas and Plow, Curr. Opin. Cell. Bio. 1994; Lee et al. , Structure 1955), uma característica partilhada por muitos antagonistas da integrina, incluindo o mAb anti-integrina al integrina, AQC2 (Karpusas et al. , J. Mol. Biol. 2 003) no qual o ácido é fornecido pelo resíduo DlOl no CDR-H3. Por analogia, o Dl00 do TMC-2206 CDR-H3 poderia fornecer este tipo de interação com o a2 MIDAS. Portanto, dois anticorpos da variante murino contendo VH foram produzidos, um com uma mutação DlOOA e outro com uma mutação DlOOR. A capacidade de competir pela ligação Eu- TMC-2206 foi então avaliada no ensaio Ki em comparação com o anticorpo quimérico camundongo-humano TMC-2206. O mutante D100A foi totalmente inativo em concentrações de até 0,9 μΜ, que representou um desvio de potência relativa maior do que 1600 vezes quando comparado ao anticorpo quimérico camundongo-humano TMC-2206. Em contraste, o mutante D100R de carga reversa foi quase tão potente quanto o anticorpo quimérico camundongo-humano TMC-2206, conforme evidenciado pelos valores similares de Ki (0,41 nM comparado a 0,52 nM) . Esse fato fornece evidência contra qualquer função do resíduo DlOO do TMC- 2206 de se acoplar ao complexo de quelação metálico que forma o sítio de ligação MIDAS. Estudos adicionais foram conduzidos para investigar a especificidade de ligação do TMC-2206, incluindo estudos de mapeamento de epitopos, com este anticorpo monoclonal de murino que é dirigido contra o domínio I da integrina α2β1 humana. O TMC-22 06 apresenta reação cruzada com a integrina α2β1 de rato, mas não apresenta reação cruzada com a integrina α2β1 de camundongo. Como as proteínas da integrina α2β1 compartilham alta homologia entres as espécies, os resíduos dentro da α2β1 que são importantes para a ligação do anticorpo foram identificados com o uso de métodos capazes de identificar as diferenças existentes entre aquelas espécies que apresentaram reação cruzada com o anticorpo comparados com aquelas que não apresentam (ex:, Champe et al., J. Biol. Chem. 270 (3): 1388-94 (1995); Karpusas et al., J. Mol. Biol. 327 (5) :1031-41 (2003); Bonnefoy et al., Blood 101 (4) :1375-83). A estrutura cristal I do domínio da integrina a2 foi analisada isoladamente e quando complexada com seu ligante alvo, colágeno (Emsley et al., J. Biol. Chem. 272 (45) :28512-7 (1997); Emsley et al., Cell 101(1):47-56 (2000)). A comparação das seqüência dos domínios I da a2 humana (SEQ ID N0:11), I da α2 I de ratos (SEQ ID NO: 93), e I da ct2 de camundongos (SEQ ID NO:94), obtidas em pesquisas no Genbank são apresentadas na Tabela 28. Essa análise revela que o domínio I de camundongos contém 14 resíduos que diferem dos domínios I da a2 de ratos e humanos (apresentado em negrito e sublinhado na Tabela 28). Esses resíduos foram utilizados para estudar mais adiante o epitopo de ligação ao TMC-2206. TABELA 2 8
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O domínio I da GST-a2 I de camundongos e ratos foram clonados como proteínas de fusão GST para confirmar se a reatividade cruzada apropriada foi mantida pelos respectivos domínios I e para isso foi utilizada a metodologia da PCR descrita no Exemplo 3. O domínio I da a2 de murino foi clonado a partir do mRNA isolado de rim de camundongo Balb/C por RT-PCR com o uso dos primers malphal F (SEQ ID NO:121) e malphal R (SEQ ID NO:122) e o domínio I da a2 do rim de rato Sprague Dawley por RT-PCR com o uso dos primers ralphal F (SEQ ID NO: 123) e ralphal R (SEQ ID NO: 124) . Além disso os domínios I da a2 de dois primatas não humanos foram clonados a partir de pellets de leucócitos obtidos por centrifugação em baixa velocidade de sangue fresco colhido de macacos rhesus e cynomolgus. Os leucócitos foram então congelados em nitrogênio líquido. No total, de 5 χ IO6 (rhesus) e 2 χ IO6 (ciynomolgus) células foram lisadas em 1 mL de Trizol (Invitrogen, Cat#15596-026) e o RNA total foi preparado conforme descrição acima. 0 pellet de RNA
final foi ressuspendido em 50 μΐ de H2O -tratado com DEPC Esse preparado serviu como modelo para a primeira etapa da transcriptase reversa (RT). A reação RT consistiu de 8 μl (2,24 μg para mRNA de Rhesus, 1,44 μg para o mRNA de cynomolgus) de RNA celular, 1 μΐ (10 mM) de DNTPs e 1 μl (2 μΜ) do primer forward do domínio I humano (GGGGATCCAGTCCTGATTT; SEQ ID NO:119). Essa mistura foi incubada a 650C por 5 min, resfriada em gelo. Cinco μΐ desse cDNA foi em seguida utilizado como modelo para amplificação por PCR, utilizando os primers forward e reverso (Forward: GGGGATCCAGTCCTGATTT, SEQ ID NO:119; Reverso: GGAATTCAACAGTACCTT, SEQ ID NO:120). Os tempos dos ciclos foram de: 1 ciclo a 94°C por 30 s, 94°C por 30 s., 55°C por 30 s, 40 ciclos a 68°C por 1 min. e 1 ciclo a 68°C por 5 min. Os produtos da PCR foram separados por eletroforese em gel de agarose a 1% e a banda (do tamanho esperado) foi purificada diretamente do gel de agarose, digerida com BamliI e EcoRI e clonada nos mesmos sítios no vetor pGEX-2TK e transformada em bactérias BL21.
Colônias únicas foram isoladas e as inserções seqüenciadas com a utilização do analisador CEQ 8000 DNA para verificar a identidade do domínio I da a2 de murinos e ratos e determinar a homologia da seqüência de duas espécie de macacos com a humana. A seqüência clonada de murino mostrou identidade exata com a região do domínio I da seqüência depositada, NM_008396.1. De maneira semelhante, a seqüência clonada de rato foi idêntica à integrina de rato depositada no Genbank, XM_34156.1, com exceção de que a seqüência clonada continha 6 resíduos adicionais em comparação à seqüência depositada, o que permitiu que a região entre o resíduo 16 e 21 (resíduos 139 a 144 da integrina a2 intacta) do domínio do rato ser traduzida com precisão. A seqüência de aminoácidos, ACPSLV, foi idêntica aos resíduos de camundongo nessas posições.
Ao nível do nucleotídeo, as duas seqüência de primatas mostraram homologia muito alta com as seqüências do domínio I da a2 humana. O domínio I da a2 de macacos rhesus na seqüência de nucleotídeos (SEQ ID NO:104) mostrou somente uma diferença na seqüência de nucleotídeos humanos, no códon 50, uma mudança de CTT para CTG, mas como ambos codificam uma leucina, as seqüências de proteínas deduzidas foram idênticas às humanas. 0 domínio I da a2 de macacos cynomolgus na seqüência de nucleotídeos (SEQ ID NO:103) foi idêntico à humana, com exceção do códon 40, no qual foi observada uma mudança de AAG para GAC humana. Isso resulta na mudança de um resíduo de lisina para ácido aspártico nessa posição. No entanto, outros estudos mostraram que essa mudança no nucleotídeo ocorre devido a um polimorfismo e que isso não ocorre em todos os animais, já que outros macacos cynomolgus exibiram 10 0% de homologia com o domínio I da a2 humana (consulte o Exemplo 18).
As proteínas de fusão foram então expressas e purificadas de acordo com a descrição acima referente à proteína de fusão do domínio I da GST-a2 humana. A análise do material extraído da coluna glutationa-Sefarose indicou que as proteínas de fusão de roedores continham formas agregadas. Portanto, estas juntamente com proteínas de fusão de primatas foram posteriormente purificadas por cromatografia de exclusão de tamanho em uma coluna de sefadex 75 10/3 0 (GE-Amersham) (primata) por FPLC em um sistema Akta-Basic FPLC (GE-Amersham) para obtenção de uma fração monomérica. Em seguida, foi avaliada a capacidade das proteínas de fusão GST de se ligar ao TMC- 2206 imobilizado, além de competir com o TMC-2206 marcado com Eu- na ligação a uma integrina α2βΐ imobilizada humana. Ensaios com o K± foram realizados conforme descrição do Exemplo 2. Para avaliar a ligação direta ao TMC-2206, Placas Immulon 4 foram revestidas com 50 mL de uma solução de bicarbonato (pH 9,0) contendo 5 Mg/ml de TMC-2206. As placas foram seladas e o revestimento ocorreu de um dia para o outro a 4°C. Na manhã seguinte, as placas foram lavadas duas vezes com solução de TBS e bloqueadas com o uso de 200 μL de solução bloqueadora, conforme descrição acima, por 1 hora em temperatura ambiente com agitação. Após o bloqueio, a solução bloqueadora foi removida, mas os alvéolos não foram lavados. Ao invés disso, foi realizada diluição em série da proteína de fusão GST, acrescentada aos alvéolos e incubada por 2 horas em temperatura ambiente com agitação. Em seguida, os alvéolos foram aspirados e um tampão de lavagem TBS foi aplicado por 5 minutos em temperatura ambiente. A etapa de lavagem foi repetida mais duas vezes antes que os anticorpos secundários fossem aplicados. A etapa de aplicação de anticorpo secundário consistiu de um anticorpo anti-GST HRP- conjugado de coelho da Amersham diluído em tampão de bloqueio a 1:2000. Cem μL. de anticorpos secundários foram acrescentados a cada alvéolo e incubados em temperatura ambiente por 1,5 horas com agitação. Os alvéolos foram novamente aspirados e lavados três vezes com tampão de lavagem antes do acréscimo a mistura do substrato para reação. Cem μL da mistura do substrato para reação (diluição de 1:1 do kit de TMB) foram então acrescentados em cada alvéolo por 6 minutos. A reação foi interrompida com o acréscimo de 100 mL de 0,1M H2SO4. Em seguida, as reações nos alvéolos foram avaliadas e quantificadas por absorção espectrofotométrica com o uso do leitor de dinâmica molecular e com o software associado Softmax, respectivamente. Os valores Kd foram então calculados com base nos valores da EC50 com o uso do software Prisma (Graphpad, CA).
Foi observado desvio de 3 vezes no Kd na ligação I da a2 de rato ao TMC-22 06 em comparação à α2 humana, enquanto a proteína de fusão α2 I-GST de murino mostrou apenas ligação levemente específica na concentração mais alta, representando um desvio maior do que 1500 vezes na afinidade (consulte a Tabela 29) . A GST-α2 I de macacos rhesus mostrou afinidade comparável à humana, enquanto a GST-α2 I de macacos cynomolgus inesperadamente mostrou afinidade detectável pelo TMC-2206 em concentrações de até 1 μΜa. Essas classificações relativas também foram observadas no ensaio de Ki A ausência de reatividade cruzada do domínio I da proteína de fusão GST de macacos cynomolgus pelo TMC-2206 indica que o resíduo K40 possa ser um determinante do epitopo. A diferença na afinidade da GST-α2 I clonada de rato (Kd de 0,54 nM e valor de Ki de 3, 8 nM) em comparação à proteína de fusão GST-humana da α2 I (Kd de 0,18 e valor de Ki de 0,33 nM) é compatível com os desvios nos valores da EC50 verificados nos ensaios realizados para avaliar a capacidade do TMC- 2206 de antagonizar a adesão de plaquetas frescas de ratos em comparação às plaquetas humanas ao colágeno Tipo I, conforme descrito acima no Exemplo 9. De maneira semelhante a ausência de reatividade cruzada da proteína de fusão GST da α2 I de camundongos pelo TMC-22 06 é consistente com a falta de reatividade cruzada do anticorpo com a integrina α2β1 intacta de camundongos.
TABELA 29
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*ND significa não detectável em concentrações de até aproximadamente 1 μΜ
Em outros estudos, os 14 resíduos correspondentes às diferenças exclusivas do domínio I da α2 I de murino em comparação aos domínios I da α2 de humanos e de ratos foram mutados individualmente na proteína de fusão do domino I da a2 clonada por meio de PCR com o uso de métodos de biologia molecular padrão (as seqüências de primer são mostradas na Tabela 30). Clones bacterianos individuais foram seqüenciados para verificar se a mutação correta tinha sido incorporada no domínio I. Uma variante testada, a G101R mutante não produziu um clone correto e não foi mais estudada. Os primers designados para criar a mutação do Y93H resultaram em um conjunto de clones com a mutação do Y93D ao invés da anterior. As duas variantes Y93 foram avaliadas. Os outros estavam corretos nas seqüência. As proteínas de fusão foram então expressas e purificadas de acordo com a descrição acima referente à proteína de fusão do domínio I da GST- a2 humana. A atividade destas foi então testada de três maneiras: em primeiro lugar, sua capacidade relativa de se ligar a diferentes colágenos para garantir que as mutações não induziram perturbações na conformação que pudessem interferir com a ligação do ligante; em segundo lugar, a afinidade aparente pelo TMC-2206 (ligação direta pelo TMC-2206 imobilizado avaliado pelo ensaio ELISA) e em terceiro lugar, a sua capacidade de agir como ligantes competitivos no ensaio Ki. Os dados referentes aos valores Ki e valores aparente de Kd também estão resumidos na Tabela 30.
TABELA 30
<table>table see original document page 163</column></row><table> <table>table see original document page 164</column></row><table>
*ND = não detectável em concentrações de até aproximadamente 1 μΜ
Dos 13 resíduos avaliados, 12 mudaram para o correspondente de murino com pequeno efeito na afinidade, mas as mudanças no Y93 causaram perda acentuada da afinidade conforme mostrado na Tabela 31. A mutação no Y93D aboliu a capacidade de ligação ao antígeno, mesmo em concentrações 3-Iogs acima do valor κ d para a proteína de fusão GST do domínio I wt. A mudança na histidina (Y93H) de murino causou uma redução de 23 vezes na afinidade aparente pelo antígeno do TMC-2206. As duas mutações aboliram a capacidade da GST do domínio I de antagonizar o anticorpo marcado com Eu. A mudança na H93 de murino para um Y conferiu capacidade do domínio I da a2 do murino de se ligar ao TMC-22 06, embora com uma redução de 200 vezes na potência relativa para o domínio I wt da a2 humana, conforme mostrado na Tabela 31.
TABELA 31
<table>table see original document page 164</column></row><table> <table>table see original document page 165</column></row><table>
A comparação das estruturas do cristal para o domínio I da ct2 I da conformação fechada (NCBI PDB entrada 1A0X) e aberta, ligada ao ligante (PDB entrada 1DZI) revela que o Y93 está localizado na face do domínio que fica atrás da hélice al, que apresenta um grande movimento para baixo quando ocorre a ligação do ligante (Emsley et al. , J. Biol. Chem. 272:28512 (1997) and Cell 100:47 (2000).· Embora não tivesse sido anteriormente identificada como uma mudança na conformação associada à ligação ao ligante, o exame das estruturas do cristal indica que na conformação fechada, o anel aromático Y93 se estende para fora da superfície da proteína, se movimenta lateralmente e para baixo para se alinhar ao longo da face do domínio I na conformação aberta do ligante ligado. Para investigar se a ligação do TMC-2206 à integrina α2βΐ depende de uma determinada conformação, foram introduzidas mutações no domínio I em favor da conformação aberta do domínio I. Foi relatado que a mutação E195W (E318 na integrina cx2 intacta) trava o domínio I da a2 humana na conformação aberta (AquiIina et al., Eur. J. Biochem. 269 (4) : 1136-44 (2002)), portanto, o seu uso permite observar se o anticorpo reconhece a confirmação dependente da ativação ou não. Os estudos cristalográficos também mostraram que o E195 forma uma ponte de sal com o resíduo R165 localizado no aC Ioopl que serve para segurar o aC Ioop em uma conformação que protege o sítio de ligação ao ligante (Emsley et ai., Cell 100:47 (2000)). 0 Ioop aC assume uma conformação estendida na posição aberta e ambos, o resíduo R165 e o resíduo adjacente R166, foram postulados para contribuir com ligação ao colágeno (Emsley et al. , J Biol Chem 272:28512 (1997) and Cell 100:47 (2000); Kâpylà et al., J Biol Chem 275:3348 (2000)). Portanto, foram construídas quatro mutações, o E195W; uma mutação R165D para reverter a carga e assim romper a ponte de sal que forma o E195W na conformação fechada, e uma mutação N166D também para reverter a carga na hélice aC. A mudança no E195W causou uma redução de 45 vezes nos valores de Ki conforme mostrado na Tabela 31 indicando que o anticorpo TMC-2206 apresenta maior afinidade pela conformação fechada. As mudanças no R165D e N166D aboliram a capacidade do domínio de se ligar ao epitopo do TMC-22 06, mesmo em concentrações de até 1 μΜ, mais uma vez sugerindo que o anticorpo TMC-2206 reconhece a conformação fechada. Com base nos estudos de mutagênese e conformação, o Y93 na conformação fechada parece exercer uma função na ligação do TMC-2206 e pode fornecer um determinante para a especificidade de ligação das espécies. Os resultados inesperados obtidos com o domínio I polimórfico do cynomolgus indicaram que o resíduo K4 0 pode também ter um papel na interação antígeno - TMC-2206. Modelos de computador do anticorpo TMC-22 06 indicaram que os CDRs formam um sítio de ligação relativamente achatado, o que sugere que o anticorpo faz múltiplos contatos com o antígeno. Visto que os resíduos nos CDRs são carregados, os resíduos carregados que circundam o Y93 na posição fechada que também exibem alterações de posição marcantes na conformação aberta foram identificados a partir das estruturas de PDB nas duas conformações aberta e fechada como K40, R69, Ν73 e Q89. As cargas de três desses resíduos foram revertidas oela geração dos seguintes mutantes K40D, R69D e N73D e modificadas no quarto pela geração de uma variante Q8 9H, conforme mostrado na Tabela 31. Além disso, uma terceira variante do resíduo 93 foi obtida, uma mudança de tirosina para fenilalanina, para determinar se o caráter aromático da tirosina era a característica estrutural importante, ou se a atividade era dependente do caráter aromático hidroxil, que é a característica da tirosina. No caso desse conjunto de mutações, todas foram submetidas a purificação HPLC para enriquecer para a fração monomérica de preparações de proteína obtidas fora da coluna de afinidade da glutationa-serafose. Cada variante foi primeiramente testada quanto a funcionalidade avaliando-se a ligação ao colágeno. Todos, exceto a variante R69D se ligaram ao colágeno com um valor EC50 similar ao domínio α2 I humano wt Consequentemente, o R69D não foi mais estudado. Dos mutantes restantes, a introdução da variante K4 0D aboliu a capacidade de competição pela ligação ao epitopo do TMC-2206. Isto foi consistente com os resultados obtidos com o domínio I clonado de cynomolgus que mostrou polimorfismo nesse resíduo (mudança de lisina para ácido aspártico). Da mesma forma, a mutação Y93F também aboliu a capacidade de competir pela ligação com o EU- TMC-2206. 0 N73D e o Q89H mostraram redução de 7,8 e 15,9 vezes os valores Kif respectivamente (Tabela 30). Analisados em conjunto, os dados sobre a mutação indicam que os resíduos K40, Y93, R165 e N166 podem ser determinantes para a ligação do TMC-2206 ao seu epitopo, e que o N73 e Q8 9 também contribuem com a energia para a ligação.
Esses dados indicam que o anticorpo TMC-22 06, seus derivados e anticorpos como o TMC-2206 (ex.AK7) que reconhecem o mesmo epitopo ou epitopo semelhante como o TMC-2206, (consulte, ex. : Exemplo 13) são antagonistas atípicos não miméticos do ligante das interações do colágeno-a2pi. Essa conclusão é fundamentada em: i) sua capacidade de bloquear a adesão ao colágeno mediada pela integrina α2β1 de maneira divalente independente de cátions, ii) sua inibição não envolve a interação de um grupo crítico, como o DlOO dentro da H-CDR3, com o MIDAS, iii) o anticorpo se liga à superfície do domínio I que é distai ao sítio direto de ligação ao ligante, iv) o sítio de ligação do TMC-2206 favorece a conformação fechada do receptor e abrange os resíduos de aminoácido K4 0, N73, Q89, Y93, R165 e N166. Conseqüentemente, a ligação do TMC-22 06 e de anticorpos como o TMC-2206 (ex. : que reconhecem o mesmo epitopo ou epitopo semelhante do TMC- 2206) não comportará a sinalização outside-in mediada pela integrina que normalmente ocorreria com o emprego do ligante cognato do colágeno e é esse modo de ligação que pode contribuir para o perfil de não- sangramento desse anticorpo e de anticorpos como o TMC-2206. EXEMPLO 13
Estudos foram realizados para comparar a ligação de outros anticorpos anti-integrina cc2 com bloqueio de função com o TMC-2206. Os resultados dos estudos de mapeamento conforme descritos no Exemplo 12 indicam que o anticorpo TMC-2206 pareceu se ligar a uma conformação fechada do domínio I da integrina oc2 e/ou não agiu como um mimético do ligante. Esses resultados esperados, juntamente como os resultados inesperados dos estudos relacionados às plaquetas descritos nos Exemplos 8, 9, 10 e 11, demonstraram que o epitopo TMC-2206 é particularmente vantajoso e que anticorpos com propriedades funcionais semelhantes aos do TMC-2206 são particularmente úteis. Foram desenvolvidos métodos de triagem para a identificação desses anticorpos semelhantes e anticorpos foram identificados por esses métodos.
Para determinar quais anticorpos anti-integrina a2 de bloqueio de função se ligaram de maneira semelhante ao TMC-2206, foi realizada uma série de estudos de competição cruzada. Para os estudos de anticorpos anti- integrina α2 humana comercialmente disponíveis, a proteína de fusão humana GST-α2 I foi imobilizada em placas de microtitulação, conforme descrito acima. Os anticorpos testados foram AK7 (Mazurov et al. , Thromb. Haemost. 66(4):494-9 (1991)), P1E6 (Wayner et al. , J. Cell Biol. 107 (5) .-1881-91 (1988)), 10G11 (Giltay et al. , Blood 73 (5) :1235-41 (1989)) e A2-11E10 (Bergelson et al. , Cell Adhes. Commun. 2(5):455-64 (1994)) comercialmente distribuídos pela Chemicon, (Temecula, CA; número do catálogo, CBL477 (AK7); MAB1950 (P1E6); MAB1988 (IOGll) e Norte do Estado, (Waltham, MA; A2-IIE10, número do catálogo 05-227), respectivamente). Os anticorpos foram testados juntamente com o mesmo lote de placas de microtitulação revestidas com α2α1 utilizadas nos estudos de mapeamento do epitopo para avaliação da capacidade do mesmo de antagonizar a ligação do TMC-2206 marcado com Eu. Em um outro conjunto de estudos, foi avaliada a capacidade dos anticorpos de antagonizar a ligação das plaquetas inativas frescas isoladas ao colágeno Tipo I. Assim, a capacidade de diferentes anticorpos direcionados contra a integrina α2 humana de antagonizar a ligação do anticorpo TMC-2206 marcado com Eu às placas de microtitulação revestidas com α2β1 plaquetária foram avaliados com valores Ki e a capacidade de antagonizar a adesão de plaquetas inativas ao colágeno Tipo I em condições estáticas foram avaliados com base nos valores da EC50. Os resultados, apresentados na Tabela 32, demonstram que o anticorpo AK7 é um competidor eficaz do TMC-2206. O clone 10G11 mostrou competição bifásica clara do TMC-2206, sugerindo que o mesmo não agiu como agosnista competitivo único. O A2-IIE10 mostrou um desvio de 10 vezes em comparação ao TMC-2206 no bloqueio da adesão plaquetária, mas um desvio de aproximadamente 350 vezes em sua capacidade de competir com o TMC-22 06 marcado com Eu, novamente indicando que não houve concordância direta entre os dois anticorpos. O Ρ1Ε6 não apresentou nenhum efeito em nenhum dos ensaios, o que indica que o mesmo reconhece uma conformação ativada.
TABELA 32
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*Não detectado sob as condições do ensaio descritas
Esses dados demonstram pela primeira vez que nem todos os anticorpos de bloqueio de função se ligam à integrina a2 da mesma maneira e mostram também os métodos para identificação de um novo subgrupo de anticorpos com especificidade do epitopo semelhante à do TMC-2206 com atividades de bloqueio de função semelhantes. Esses dados também demonstram que esse novo subgrupo de anticorpos anti-a2, que inclui o TMC-2206 e anticorpos com especificidade do epitopo semelhante ao do TMC-2206, são caracterizados por ausência inesperada in vivo de complicações hemorrágicas e/ou pela ausência de ativação da integrina α2βΐ plaquetária. A especificidade do epitopo, as atividades de bloqueio de função e as vantagens (ex. : não ativação de plaquetas) não são características de todos os anticorpos anti-a2pi de bloqueio de função, mas na verdade de um novo subgrupo de anticorpos que inclui o TMC-2206 e anticorpos semelhantes, incluindo derivados e/ou variantes do TMC- 2206, que podem ser identificados e/ou selecionados conforme descrito neste documento.
Com base no fato demonstrado de que nem todos os anticorpos com bloqueio de função que se ligam ao domínio I da a2 também se ligam ao mesmo epitopo ou epitopo semelhante do TMC-2206 (ex. : sobreposição) , estudos foram realizados para determinar se um anticorpo substituto utilizado em estudos de eficácia com murinos apresentava propriedades semelhantes à do TMC-2206. Como o anticorpo Hal/2 9 apresenta reação cruzada com a integrina a2 de ratos e camundongos, e o anticorpo TMC-2206 se liga à integrina a2 humana e de ratos, a proteína de fusão GST foi utilizada para determinar se dois anticorpos se ligam a sítios sobrepostos (ex.: especificidade compartilhada do epitopo) . Para isso, uma proteína de fusão GST do domínio I da a.2 foi imobilizada em placas de microtitulação Reacti-Bind revestidas com glutationa (Pierce Biotechnology, Inc. Rockford, IL) . Em primeiro lugar, o Kd do Eu-TMC-2206 ligado a uma proteína GST do domínio I da a2 humana e de rato imobilizada a 370C foi determinado conforme descrito no Exemplo 2. A análise de Scatchard sobre o Eu-TMC-2206 ligado versus livre mostrou valores Kd de 0,2 nM para o domínio I da a2 humana e de 1,3 nM (uma redução de 6 vezes) para o domínio I da a.2 de ratos. Em seguida, a capacidade do TMC-2206 marcado com Eu de se ligar ao domínio I da a2 de ratos na presença de diferentes concentrações do anticorpo de competição foi avaliada conforme a descrição do Exemplo 2 com o uso do valor de KcJ. de 1,3 nM para derivar um valor de Ki com base nos valores observados da EC50. 0 anticorpo Hal/29 (Mendrick and Kelly, Lab Invest. 69 (6) : 690-702 (1993)), mas não o anticorpo HMa2 (Miyake et ai. , Eur. J. Immunol . 24:2000-2005 (1994)) foi um antagonista eficaz da ligação do Eu-TMC-2206, indicando que o anticorpo Hal/29 se ligou a sítios semelhantes (ex.: sobreposição) ao sítio de ligação do TMC-2206.
EXEMPLO 14
Um outro estudo foi realizado com anticorpos IgG4 exemplares contendo uma cadeia pesada hVH14.0 γ4 (SEQ ID NO:174) ou uma cadeia pesada hVH12.0 γ4 (SEQ ID NO:176) e uma cadeia leve hVL 10.OQ (SEQ ID NO:178). Nesse estudo, foi avaliado se a ligação desses anticorpos IgG4 causa ativação plaquetária, avaliada com base nos efeitos sobre a agregação plaquetária induzida pelo colãgeno. Amostras de sangue foram colhidas por venipunção da veia antecubital em tubos para coleta a vácuo contendo citrato de sódio 3,8% após descarte dos primeiros 3,0 ml do sangue colhido. Todos os anticorpos foram diluídos em solução salina em concentrações finais de 140 Mg/ml. Cada cubeta descartável (contendo um eletrodo descartável) foi dividida em alíquotas de 0,5 ml de sangue total citratado e com 0,5 ml de solução salina ou uma solução do anticorpo. Cada cubeta foi pré-aquecida a 37 °C por 5 minutos no alvéolo de aquecimento do agregômetro (Modelo 591A, Chrono-Log, Havertown, PA), e em seguida, colocado no alvéolo para reação; a linha basal foi determinada e 2 0 μl da solução salina ou de colágeno (1 mg/ml; eqüino tipo I, Chrono-Log) foram acrescentados para iniciar a reação de agregação. Durante a agregação, ocorreu acúmulo de plaquetas nas superfícies expostas dos eletrodos, resultando em aumento da impedância. A aquisição de dados prosseguiu por 6 minutos e a mudança na impedância (ΔΩ, ohms) foi registrada por um gravador de gráfico (Modelo 707, Chrono-Log).
Os dados (Tabela 33) foram analisados com o uso do teste de Kruskal-Wallis, que testou as hipóteses de que os meios utilizados nas populações (solução salina ou colágeno) de cada um dos quatro grupos foram equivalentes, e a hipótese seria rejeitada se (95% de confiança) os valores de P fossem inferiores ou iguais a 0,05. No grupo de solução salina (valor de P = 0,148) nem o controle com isotipo nem os dois anticorpos humanizados induziram agregação plaquetária em comparação ao grupo de controle negativo de solução salina. No grupo de colágeno (valor de P = 0,201) nem o controle com isotipo nem os dois anticorpos humanizados inibiram a agregação plaquetária induzida por colágeno em comparação ao grupo de controle negativo de solução salina. Os resultados desse estudo e do Exemplo 8 mostram que a ligação do TMC-2206 e das duas variantes de anticorpos humanizados IgG4 não apresentam efeito sobre a agregação plaquetária induzida por colágeno em testes in vitro em todas as concentrações testadas.
TABELA 33
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EXEMPLO 15
A capacidade do TMC-2206 humanizado (hIgG4/kVH12.0/VL10.0Q) de bloquear adesão celular mediada pela integrina α2β1 de ligação ao colágeno tipo I foi testada com o uso de células CHO-α2, HT1080 (fibrosarcoma humano) e plaquetas humanas após os procedimentos descritos no Exemplo 2. OTMC-2206 humanizado foi um potente inibidor da ligação celular ao colágeno com valores da EC50 comparáveis aos do TMC-2206 (Tabela 34).
<table>table see original document page 173</column></row><table> EXEMPLO 16
A capacidade do TMC-2206 humanizado de se ligar à αΐβΐ humana imobilizada foi avaliada com o uso do ensaio ELISA. A integrina α 1/31 humana (Chemicon International) foi diluída em tampão para revestimento (25 mM Tris, pH 7,5, 150 mM NaCl, 1 mM MgCl2) em uma concentração final de 0,5 Mg/ml. Imunoplacas de 96 alvéolos foram revestidas com α1β1 a 50ng/alvéolo e incubadas durante a noite a 40C. As placas foram lavadas três vezes com tampão de lavagem (50 mM Tris, pH 7,5, 150 mM NaCl, 2 mM MgCl2, 0.5% Tween-20) e bloqueadas com leite desnatado 5% w/v/ em tampão de lavagem por uma hora em temperatura ambiente. Os anticorpos TMC-2206 humanizados, IgG4/κ humana (isotipo de controle) e anti-al humana de camundongo (FB-12, Chemicon International) foram diluídos em série em tampão de ligação (0,1 mg/ml BSA, IgG "livre, em tampão de lavagem). Cinqüenta microlitros/alvéolo das soluções diluídas de anticorpos foram acrescentadas à placas revestidas com αΐβΐ, que foram incubadas por uma hora em temperatura ambiente e lavadas três vezes. 0 conjugado de fosfatase alcalina e anti-IgG humana de cabra (anticorpo secundário; Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA) foi acrescentado aos alvéolos contendo o isotipo de controle e o TMC-2206 humanizado; o conjugado de fosfatase alcalina e anti-IgG de camundongos de cabra (Sigma) foi acrescentado aos alvéolos contendo FB-12. Após uma hora de incubação em temperatura ambiente, as placas foram lavadas três vezes, incubadas em solução de substrato (1 mg/ml 4- nitrofenilfosfato, 0,1 M dietanolamina, 5 mM MgCl2, pH 9.8) por 2 0 minutos e terminado com NaOH. A absorvância (405 nm) foi analisada com o uso de uma placa leitora Spectramax Plus e do do software Softmax Pro. De maneira semelhante ao TMC-2206, o TMC-2206 humanizado e os 35 anticorpos IgG4/κ não se ligaram à α1β1. 0 anticorpo de controle anti-al/31 (FB-12) se ligou à α1β1 com uma EC50 de 0,79 ± 0,15 nM. EXEMPLO 17
Os valores de K0 e Ki para o TMC-2206 e para os MAbs do TMC-2206 ligados à α2β1 imobilizada foram determinados através de um ensaio de ligação competitiva. Os alvéolos de uma placa de microt itulação de 96 alvéolos foram revestidos com a integrina plaquetária α2β1 (revestida sob medida cm α2β1 plaquetária humana pela GTI Inc., WI) e bloqueadas com leite desnatado. 0 anticorpo humanizado TMC-2206 foi marcado com o regente Eu-Nl-ITC, aproximadamente 2 mg foram colocados em suspensão e dialisados em solução salina de tampão de fosfato (PBS; 1 .4'7 mM KH2PO4, 8.1 mM Na2HPO4; pH 7 .4, 13 8 mM NaCl e 2.67 mM KCI) . Após a concentração em concentradores MicroSep pré-lavados (30-kDa cutoff; Pall Life Sciences a 9500 rpm (7000 χ g) em um rotor JA-20 (Beckman Instruments, Inc.) por 20 minutos a 4°C), o anticorpo Eoi ajustado a 4~όγ mg/mL com PBS, 10 0 mM NaHCO3, pH 9,3. A solução de MAb/bicarbonato (0,250 mL) foi cuidadosamente misturada em um frasco contendo 0,2 mg de ácido tetraacético N1-(p- isotiocianatobenzil) -dietilenetriamina-JV1, N21N31N3 quelado com Eu3+ (Eu-Nl-ITC; Perkin Elmer Life Sciences) e incubada durante a noite a 4°C sem mexer. A mistura do anticorpo marcado foi aplicada a uma coluna PD-IO separada (GE Biosciences, Piscataway, NJ) pré-equilibrada com tampão Corrente (50 mM Tris, pH 7,4 e 138 mM NaCl) . Frações (0,5 mL) foram coletadas e analisadas para avaliar a proteína total (Bradford reagent; Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) com a utilização de placa SpectraMax 384 e o európio após diluição de 1:10.000 em uma solução intensificadora DELFIA (Perkin-Elmer) por fluorescência tempo-sincronizada (TRF) com o uso de um leitor de placa Victor2 multi-label (Perkin Elmer). As frações positivas tanto para o marcador da proteína quanto para o európio foram agrupadas e aplicadas a uma nova coluna PD-10 e amostras foram colhidas e analisadas para determinação do conteúdo de proteína e európio por TRF calibrada, em comparação a uma solução padrão de európio (Perkin-Elmer) para calcular o flúor: proporção de proteína. 0 anticorpo TMC-2206 marcado com Eu foi então aplicado às placas de microtitulação bloqueadas de integrina α2β1 em um volume de 10 aL/alvéolo. Depois da incubação das placas seladas por lha 37°C, para permitir que a ligação atingisse o equilíbrio, 2 μΐ; da amostra foi transferida de cada alvéolo para um novo alvéolo contendo a solução intensificadora DELFIA (100 μL/alveolo; Perkin-Elmer) para avaliação do marcador livre (não ligado). A solução intensificadora (100 μL/alveolo) foi acrescentada aos alvéolos esvaziados para avaliação do marcador ligado. A placa foi agitada (Placa agitadora de titulação, ajuste da velocidade de 5, por 5 minutos em temperatura ambiente) e as intensidades da TRF foram avaliadas com o uso de um leitor de placa Victor2 TPerkin-Elmer WaXlac, Boston, MA). Os valores de KD foram calculados pela análise de Scatchard. As potências relativas de ligação da integrina α2β1 imobilizada foram analisadas por meio da avaliação dos valores K± em um ensaio de competição com o uso de 100 pM Eu-TMC-2206 na presença de concentrações variadas do anticorpo TMC-2206 não marcado ou do anticorpo quimérico como competidores. Foi utilizado um sistema de ensaio semelhante ao descrito acima neste exemplo. Em seguida, as combinações de anticorpos foram aplicadas aos alvéolos revestidos com a integrina α2β1 , testadas no intervalo de concentração de IO"11 to IO"7 M, e a quantidade de Eu- TMC-2206 humanizado foi determinada após o período de tempo especificado. As curvas de inibição foram ajustadas com um modelo de "competição de um sítio" com o auxilio do software Prisma (GraphPad, Inc.) para obter os valores da CI50 e para calcular o K±t utilizando a equação de Cheng and Prusoff (1973) e os respectivos valores de Kdi apresentados acima. Os valores de Kd e Ki para o TMC-2206 e TMC-2206 humanizados ficaram entre 2 vezes um do outro (Tabela 35). Portanto, as afinidades de ligação do TMC-2206 e do TMC-2206 à α2β1 foram semelhantes.
TABELA 35
<table>table see original document page 177</column></row><table>
TMC-2206 e TMC-220 6 humanizado foram submetidos a análise por ressonância de plasma de superfície (SPR) para determinar a dissociação cinética e constantes associadas, ka e ka (também conhecida como k0ff e kon), respectivamente ao domínio a.2 I. A SPR, um método utilizado para caracterizar interações macromoleculares, é uma técnica óptica que utiliza o fenômeno da onda transitória para medir com precisão pequenas alterações do índice de refração, muito próximo ao sensor de superfície. A ligação entre um antígeno em solução (ex: proteína de fusão) e seu receptor MAb (imobilizado na superfície de um sensor de chip) resulta em alteração do índice de refração. A interação é monitorizada em tempo real e a quantidade de antígeno ligado, assim como as constantes da taxa de associação e dissociação podem ser medidas com grande precisão. A constante de dissociação em equilíbrio pode ser facilmente calculada com base em: Kd = kd/ka = koff/kon. A clonagem do domínio I da a2 humana e a purificação da proteína de fusão GST-humana expressa do domínio I da oí2 foram descritas no Exemplo 12. As análises foram realizadas a 20°C com o uso de um sensor óptico Biacore 2000 com um sensor de chip de grau de pesquisa CM5 (Biacore Life Sciences, Uppsala, Sweden) e equilibrado com tampão corrente (50 mM HEPES, 150 mM NaCl, 0,25 mM MgCl2, 0,25 mM CaCl2, 0.5% Tween-20, 0,1 mg/ml BSA, pH 7,4) . Para a captura do TMC-2206 no sensor do chip, duas das superfícies das células de fluxo do chip foram revestidas com anti-IgGs de camundongos; as outras duas células de fluxo foram revestidas com Proteína A para captura do TMC-2206 humanizado. Cada ciclo do antígeno (proteína de fusão GST-humana do domínio I da cx2) ligado a superfície presa às anti-IgGs de camundongo, envolveram três etapas. Na primeira etapa, o TMC-2206 foi capturado em um superfície anti- camundongo e, em seguida, o TMC-2206 humanizado foi capturado em uma superfície da proteína A. [As outras duas superfícies (uma anti-camundongo e uma de proteína A) foram utilizadas com referências analíticas.] Na segunda etapa, a proteína de fusão GST-humana do domínio I da a2 foi injetada nas quatro superfícies. As respostas obtidas das superfícies de referência (devido à inconsistência no índice de refração entre o antígeno e o tampão corrente) foram subtraídas das repostas obtidas das superfícies de reação. Na terceira etapa, a camada externa dos complexos antígeno/anticorpo foi removida das superfícies de maneira que essas superfícies ainda pudessem ser usadas para outro ciclo de ligação. A concentração mais alta da proteína de fusão GST-humana do domínio I da oí2 foi de 41 nM. A solução do antígeno foi aplicada sobre as superfícies por 2 minutos a 50 μΐ/min e a dissociação do antígeno da superfície foi monitorada por seis minutos. As constantes das taxas para a ligação da proteína de fusão GST-humana do domínio I da a2 ao TMC-22 06 e ao TMC-22 06 humanizado foram determinadas e consideradas semelhantes (Tabela 37)
Os ensaios de ligação competitiva e a análise por SPR confirmaram que o processo de humanização não afetou a afinidade de ligação do TMC-2206 humanizado ao domínio I da oí2 I humana.
EXEMPLO 18
A reatividade cruzada entre espécies ao TMC-2206 humanizado foi avaliada por técnicas analíticas bioquímicas. No primeiro estudo, as afinidades de ligação (valores Kj) do TMC-2206, TMC-2206 humanizado, e as proteínas de fusão GST-o;2-domínio I derivadas de diferentes espécies foram determinadas (valores Ki) por ligação competitiva com o TMC-2206 humanizado e marcado com európio à placas recobertas com α.2β1 (Exemplo 17) . A clonagem dos domínios I da oí2 de humanos, macacos rhesus, ratos e camundongos foi descrita no Exemplo 12. Os domínios I da a2 de cynomolgus e outros macacos rhesus foram clonados do cDNA derivado de RNA total extraído de tecidos da pele (MediCorp, Inc., Montreal, QC). Ocorreu uma diminuição de 9 vezes no Kj para a ligação da a2 I de rato ao TMC-220 6 humanizado, em comparação com o domínio I da o;2 humana, enquanto que a proteína de fusão GST o?2 I de murino mostrou apenas discreta ligação específica na concentração mais alta (4 μΜ; Tabela 36) . [O controle negativo da proteína de fusão GST e o controle negativo do isotipo IgG4/k não mostraram qualquer efeito de ligação competitiva em concentrações de 0,4 μΜ.] As proteínas de fusão GST da a2 I de macacos rhesus, cynomolgus e humanos mostraram ligação comparável. Portanto, todas as espécies demonstraram reatividade cruzada com o TMC-2206 humanizado.
TABELA 3 6
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Em um segundo estudo, as constantes de freqüência e equilíbrio de ligação do TMC-2206 e TMC-22 06 humanizado e proteínas de fusão oi2 I-GST selecionadas foram avaliadas por análise SPR (Tabela 37) . Todas as constantes cinéticas e de equilíbrio derivadas para TMC-2206 primário e humanizado para os domínios a2 I humano e de rato foram similares. Além disso, as constantes de freqüência do TMC-2206 humanizado para os domínios a2 I humano e de cynomolgus foram similares. O TMC-2206 humanizado não se ligou ao domínio a.2 I de camundongo em concentrações de 4,0 μΜ da proteína de fusão a.2 I-GST de camundongo. A ligação comparável da proteína de fusão GST-cynomolgus-oi2-domínio I ao TMC-2206 não se mostrou consistente com o resultado do Exemplo 12 — no qual não foi observada ligação competitiva em concentrações de até 1 μΜ (Tabela 29) . No entanto, as análises das seqüências de DNA realizadas nas populações cDNAs derivadas de mRNA extraído de macacos (Medicorp Inc.) revelou um polimorfismo com um único aminoácido (posição 40) em comparação com o domínio a2-I humano. Esse polimorfismo não foi conservado entre animais, assim sendo um macaco cynomolgus e um macaco rhesus exibiram heteromorfismo, enquanto que outros animais exibiram uma homologia de 100% com o domínio cx2 I humano. A GST do domínio I da a2 de cynomolgus estudada nesse exemplo pela ligação competitiva e a análise do SPR codificaram uma seqüência idêntica ao domínio a2 I humano. Esses estudos bioquímicos demonstraram que o TMC-2206 humanizado apresentou reação cruzada com os domínios a2 I derivados de humanos, rhesus, cynomolgus e rato, mas não com o domínio a2 I de camundongos. Estudos de reatividade cruzada in vitro (Exemplo 20) foram realizados para verificar se o TMC-2206 humanizado apresentou reação cruzada com células sangüíneas de diferentes espécies.
TABELA 37
<table>table see original document page 180</column></row><table> <table>table see original document page 181</column></row><table>
EXEMPLO 19
A reatividade cruzada entre espécies foi avaliada também pela ligação do TMC-2206 a células sangüíneas de diferentes espécies por citometria de fluxo. No primeiro estudo, foi avaliada a reatividade cruzada do TMC-2206 humanizado com plaquetas de diferentes espécies. Sangue foi obtido por punção venosa de doadores humanos, ratos e macacos rhesus/cynomolgus. Sangue humano foi coletado em citrato de sódio 3,8%; sangue de macacos rhesus e cynomolgus foi coletado em 10 mM EDTA; e o sangue de ratos foi coletado em heparina. Sangue total de primatas (inumanos, rhesus, cyriomo 1 gus) foi i~ncabado com THC -22 05 humanizado em uma concentração final de 140 Mg/ml por 10 minutos em temperatura ambiente, seguido por incubação durante 10 minutos de Mab conjugado IgG4-FITC anti-humano de camundongo (Clone HP6023; Southern Biotech), seguido por incubação com anticorpos marcadores de plaqueta espécie-específicos conjugados com moléculas fluorescentes. Plaquetas humanas foram identificadas com PE-conjugado-camundongo-anti-humano CD42b (BD Biosciences) e plaquetas de rhesus/cynomolgus foram identificadas com PE-conjugado-camundongo-anti-humano CD41a (BD Biosciences). Sangue total de rato foi incubado com 500 Mg/ml de TMC-2206 humanizado conjugado com Alexa- 488 (Alexa Fluor 488 Protein Labeling kit, A10235, Sondas Moleculares) durante 10 minutos em temperatura ambiente, seguida por incubação com PE-conjugado-hamster-anti- camundongo-CD61 (marcador de plaquetas de rato; BD Biosciences). Todas as amostras foram lavadas uma vez, colocadas em suspensão em solução salina tamponada com fosfato e então submetidas à análise por citometria de fluxo. [Os canais de dispersão frontal e lateral foram utilizados para ajustar a escala logarítmica a fim discriminar melhor as plaquetas das maires células hemácias e dos leucócitos.] O TMC-2206 humanizado se ligou às plaquetas das quatro espécies (Tabela 38). No segundo estudo, foi avaliada a reatividade cruzada do TMC-2206 humanizado com leucócitos de diferentes espécies. Sangue foi obtido das mesmas quatro espécies e o sangue humano foi coletado em 10 mM de EDTA. O TMC-2206 humanizado conjugado com Alexa 4 88 foi adicionado ao sangue total (concentrações finais entre 225-400 μg/mL) por 10 minutos, seguido por incubação durante 30 minutos em temperatura ambiente com anticorpos marcadores. Anticorpos anti-CD45 foram utilizados para corar os leucócitos [para leucócitos humanos PE-Cy5-conjugado- camundongo-anti-humano (clone H130, BD Biosciences) ; para leucócitos de rhesus e cynomolgus PE-Cy5-conjugado- camundongo-ant i -humano (clone TuTl6, BD Biosciences); e para leucócitos de rato PE-Cy5-conjugado-camundongo-anti- rato (BD Biosciences). Anticorpos marcadores foram utilizados para corar as plaquetas: para plaquetas humanas PE-Cy5-conjugado-camundongo-anti-humano-CD42b (BD Biosciences); para plaquetas de rhesus e cynomolgus R-PE- conjugado-camundongo-anti-humano-CD41a (BD Biosciences) ; e para plaquetas de rato R-PE-conjugado-hamster-anti- camundongo-CD61 (BD Biosciences] . Um mililitro de água foi adicionado à reação (aproximadamente 250 μl) , incubado por 5 minutos em temperatura ambiente para lisar as hemácias, seguido pela adição de 2 ml de PBS (para colocar a tonicidade em níveis que impeçam a Iise dos leucócitos), e centrifugados. 0 pellet da célula foi colocado novamente em suspensão em 0,5 mis de PBS e submetido a análise por citometria de fluxo. [O canal de dispersão lateral foi ajustado para a escala linear e o canal CD45 foi ajustado para a escala logarítmica para discriminar granulócitos, monócitos, e linfócitos.] Como níveis variados de ativação plaquetária endógena levam à formação de microagregados plaquetas-leucócitos é essencial identificar os leucócitos que não se ligaram às plaquetas (que constitutivamente expressam a integrina α2β1). Portanto, apenas as células que eram CD45+/CD41a" CD45+/CD42b", ou CD45+/CD61" foram avaliadas quanto à ligação ao TMC-2206 humanizado. O TMC-2206 humanizado ligou-se aos linfócitos, monócitos e granulócitos das quatro espécies (Tabela 38).
Esses resultados são consistentes com os resultados do Exemplo 19, ou seja, o TMC-2206 humanizado tem reação cruzada com as proteínas de fusão GST-CX2-domínio I humanas, de macacos rhesus, cynomolgus e ratos (por análise do Kj e SPR). Uma porcentagem relativamente baixa de células sangüíneas de rato se ligaram ao TMC- 2206 humanizado em comparação com células de primatas. Em três estudos iniciais (Exemplos 9, 19, e 12), as afinidades de ligação dos anticorpos primários e TMC-2206 humanizados à subunidade integrina a2 de rato mostraram ter uma ordem de magnitude menor do que as afinidades de ligação à subunidade oí2 humana. No primeiro estudo, Exemplo 9, os valores EC50 para inibição da ligação pelo TMC-2206 de plaquetas de rato e plaquetas humanas ao colágeno tipo I de rato foi 6,3 nM e 1,7 nM, respectivamente. No Segundo estudo, Exemplo 19 (Tabela 38) , os valores de Kj para a inibição do TMC-2206 humanizado que se liga ao α2β1 imobilizado pelas proteínas de fusão competidoras GST-humana-α2-domínio I e GST-rato-a2-domínio I foram 0.57 nM e 5.23 nM, respectivamente. Da mesma maneira, no terceiro estudo, Exemplo 12 (Tabela 29), os valores de Kj para a inibição da ligação do TMC-2206 ao α2β1 pelas proteínas de fusão
GST - humana-a2-domínio I e GST-rato-a;2-domínio I foram 0,33 nM and 3,8 nM, respectivamente. Além disso, nos estudos de plaquetas e leucócitos, todas as amostras de células foram lavadas antes de serem submetidas à análise por citometria de fluxo, sendo que mais TMC-2206 humanizado foi lavado da subunidade a.2 de rato de baixa afinidade do que das subunidades a.2 de primatas. Combinado com os resultados anteriores, isto levou a uma porcentagem relativamente mais baixa de células sangüíneas de rato sendo contadas como "positivas" quando comparadas com células sangüíneas de primatas (levando em conta densidades de receptor α2β1 similares). Em resumo, as plaquetas, linfócitos, monócitos e granulócitos para as quatro espécies testadas (humanos, macaco rhesus, macaco cynomolgus e rato) se ligaram ao TMS-2206 humanizado.
TABELA 38
<table>table see original document page 184</column></row><table>
EXEMPLO 20
Um outro estudo avaliou se a ligacao de TMC-2206 ao α2β levou à ativação plaquetária, conforme mensurado por citometria de fluxo. A ativação plaquetária foi mensurada tanto como supra-regulação da P-Seletina, quanto como ativação da integrina GPIIbIIIa (αIIbβ/33). Amostras de sangue foram coletadas por punção venosa da veia antecubital em tubos à vácuo contendo citrato de sódio a 3,8% após descartar os primeiros 3,0 ml de sangue corrente. O sangue total foi diluído a 1:10 em TBS (pH 7.4) e em seguida incubado por 10 minutos em temperatura ambiente com solução salina, controle isotipo IgG4/k (concentração final de 132 jug/ml), ou TMC-2206 humanizado (concentração final del44 μg/ml). Para ativação plaquetária, o peptídeo 6 de ativação do receptor da trombina (TRAP-6, 10 μΜ concentração final; AnaSpec Inc., San Jose, CA) ou adenosina difosfato (ADP, 20 μΜ concentração final; Sigma) foi adicionado às amostras, seguida por um período de incubação de 5 minutos em temperatura ambiente. As células foram processadas para citometria de fluxo através de incubação com anticorpos marcadores: PE-Cy5-conjugado-camundongo-anti-humano-CD4 2b (BD Biosciences) para corar plaquetas; PE-conjugado- camundongo-anti-humano-CD62P (BD Biosciences) para corar a P-seletina; e FITC-conjugado-PAC-I (BD Biosciences) para corar a GPIIbIIIa ativada (PAC-1 se liga à conformação ativa da integrina GPIIbIIIa) . 0 erro de amostragem para cada amostra foi menor que 5% (intervalo de confiança de 95%).
Os primeiros experimentos avaliaram se a ligação ao TMC- 2206 humanizado leva à ativação das plaquetas como mensurado pela supra-regulação da P-seletina. A ativação foi quantificada como a porcentagem de plaquetas (CD42b+) que foram coradas pelo marcador de P-seletina (CD62P) (Tabela 39). Através de análise por ANOVA (monocaudal, intervalo de confiança de 95%), a expressão de P-seletina de plaquetas incubadas com solução salina, IgG4/k, e TMC- 2206 humanizado não foi estatisticamente diferente (P = 0.96). Portanto, a iigaçao de TML'-22Ub humanizado à plaquetas não induziu a ativação de plaquetas. Em experimentos pareados (lado-a-lado) , o TRAP-6 induziu significante aumento da expressão da P-seletina. A adição de TMC-2206 humanizado não afetou estatisticamente a expressão da P-seletina induzida pelo TRAP-6 em comparação à solução salina ou o isotipo controle (P - 0.96; ANOVA monocaudal, intervalo de confiança de 95%). Portanto, a ligação de TMC-2206 humanizado não inibiu a ativação de plaquetas induzida pelo TRAP-6.
TABELA 39
<table>table see original document page 185</column></row><table>
O estudo seguinte avaliou a supra-regulação da P-seletina após incubação com/sem o agonista ADP (porcentagem de plaquetas que expressam a P-seletina, Tabela 40) . Como anteriormente, a expressão da P-seletina sobre as plaquetas incubadas com TMC-2206 humanizado, IgG4/k e solução salina foram comparáveis e, entretanto, o TMC- 2206 humanizado não induziu a ativação plaquetária. A ADP induziu expressão da P-seletina comparável à indução pelo TRAP-6. A expressão da P-seletina teve aparentemente um aumento adicional com plaquetas incubadas com ADP, seguida pela IgG4//c ou TMC-2206 humanizado. Contudo, o aumento da supra-regulação da P-seletina foi similar para o isotipo de controle e TMC-2206 humanizado, indicando novamente que a ligação do TMC-22 06 humanizado às plaquetas não induz a ativação plaquetária. Concomitantemente, a expressão de P-seletina de plaquetas induzidas com ADP incubadas com IgG4/« ou TMC-2206 humanizado não diminuiu. Portanto, a ligação de TMC-22 06 "humanizado não inibiu a ativação de plaquetas induzida pelo ADP.
TABELA 40
<table>table see original document page 186</column></row><table>
O estudo seguinte avaliou a ativação da GPIIbIIIa após incubação com/sem agonistas TRAP-6 ou ADP, quantificando a porcentagem de plaquetas que se ligaram ao anticorpo marcador PAC-I (que se liga à conformação ativa da GPIIbIIIa; Tabela 41). 0 nível de expressão da GPIIbIIIa ativada sobre as plaquetas incubadas com TMC-2206 humanizado, IgG4/k e solução salina foram comparáveis - TMC-22 06 humanizado não induziu a ativação plaquetária. A IgG4/k e o TMC-22 06 humanizado não inibiram a ativação induzida pelo TRAP-6, nem pelo ADP. TABELA 41
<table>table see original document page 187</column></row><table>
Em resumo, o TMC-2206 humanizado não induziu a ativação plaquetária (sem aumento da supra-regulação da P-seletina ou da ativação da GPIIbIIIa), nem tampouco inibiu a ativação plaquetária induzida por agonistas (TRAP-6, ADP). Esses dados complementam o estudo da agregação plaquetária (Exemplo 15, Tabela 34) que mostrou que o TMC-2206 humanizado não induziu a agregação plaquetária e não inibiu a agregação induzida pelo colágeno.
EXEMPLO 21
O efeito do TMC-22 06 humanizado sobre as vias de coagulação extrínseca e intrínseca foi avaliado com base no tempo de protrombina (PT) e no tempo de tromboplastina parcial ativada (aPTT). Um preparado liofilizado do plasma humano (Citrex I, Bio/Data Corporation, Horsham, PA) foi utilizado para avaliar tanto o PT quanto o aPTT. TMC-2206 humanizado foi adicionado ao plasma para se obter concentrações finais de 179, 214, e 286 Mg/mL (correspondentes a Cmáx de uma dose única de anticorpos a 12,5, 15,0, e 20,0 mg/kg, respectivamente) antes de submeter as amostras aos testes de coagulação. Procedimentos padronizados foram seguidos tanto para o PT quanto para o aPTT com os tempos de coagulação medidos com um fibrômetro BBL (BD, Franklin Lakes, NJ) . A Tabela 42 resume os dados de uma série de seis experimentos (3 PT e 3 aPTT) . Um controle com solução salina foi feito para cada experimento. A análise estatística com teste de Student-t de cada par (TMC-2206 humanizado e solução salina) demonstrou em cada experimento que não houveram diferenças estatisticamente significativas entre a média do tempo de coagulação para TMC-2 2 O 6 humanizado em comparação à solução salina. (A hipótese de que o tempo de coagulação era diferente seria rejeitada a intervalos de confiança de 95% se os valores individuais de P calculados fossem menores que 0.05) Portanto, o TMC-22 06 humanizado não teve efeito sobre a coagulação de acordo com a medição pelo PT e aPPT.
TABELA 42
<table>table see original document page 188</column></row><table>
EXEMPLO 22
Foram avaliados os efeitos do TMC-2206 sobre os tempos de coagulação em ratos. Ratos Sprague-Dawley (190 - 200g) receberam injeção intravenosa (veia da cauda) de solução salina, heparina (0,6 mg/kg, controle positivo), ou TMC- 2206 humanizado em doses de 5 e 15 mg/kg, uma hora antes da transecção padronizada da ponta (0,5 mm) da cauda. Os ratos não foram anestesiados e estavam conscientes durante a observação do tempo de sangramento. A ponta da cauda cortada de cada rato foi imediatamente imersa a 2 cm de profundidade em um tubo de teste contendo solução salina a 37°C. O tempo necessário para o início de um período de 15 segundos para parada do sangramento foi quantificado como tempo de sangramento. Um tempo máximo de cut-off de 20 minutos foi utilizado. A perda sangüínea foi quantificada pela quantidade de hemoglobina liberada após hemólise (por espectrofotometria) do sangue coletado no tubo teste. 0 TMC-2206 humanizado não mostrou efeito estatisticamente significante sobre o tempo de sangramento com ambas as doses testadas em comparação com os controles naiVe e de solução salina (Tabela 43; P = 0,08, análise por ANOVA monocaudal) . 0 TMC-22 06 humanizado não mostrou efeito estatisticamente significante na a perda de sangue com ambas as doses testadas, em comparação com os controles naive e de solução salina (P = 0.22, análise por ANOVA monocaudal). Portanto, o TMC-2206 humanizado não tem efeito in vivo sobre o tempo de sangramento ou perda de sangue.
TABELA 43
<table>table see original document page 189</column></row><table>
EXEMPLO 23
Um estudo foi conduzido para determinar o efeito de uma dose única de TMC-2206 humanizado nos níveis de citocina circulante em ratos, como meio de determinar se o TMC- 2206 humanizado causa ativação de leucócitos detectável in vivo. Solução salina (controle negativo), controle isotipo IgGA/κ humana (15 mg/kg), TMC-2206 humanizado (15 mg/kg) ou lipopolissacarídeos (LPS, controle de inflamação positivo; 0.75 mg/kg) foi administrado aos ratos por via IV. Ratos que não receberam a injeção foram utilizados como controle naive (sem exposição anterior) . 2, 4, 6, e 8 horas após a injeção, amostras de sangue foram coletadas da veia safena e processadas para obtenção de plasma. As amostras de plasma foram submetidas a imunoensaio multiplex (MIA; Linco Diagnostics, St. Charles, MO) para determinar os níveis de IL-Io;, IL-IiS, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-12, GM-CSF, IFN-γ, e TNF-a (Tabela 44; pg/mL, média ± EPM) . O MIA envolve a detecção simultânea de analitos (até 100) no mesmo volume de amostra (25 μΐ) combinando diversas reações individuais de ligação antígeno-anticorpo em conjuntos de microesferas de diferentes regiões espectrais. Dependendo do antígeno, a sensibilidade do MIA é entre 1,5 - 50 pg/ml. Cada conjunto de dados de citocinas foi submetido a análise por ANOVA bicaudal com intervalo de confiança de 95%, para testar a hipótese de que os níveis individuais de citocina eram iguais para os quatro timepoints e para as quatro condições (naíve, veículo, IgG4/k e TMC-2206 humanizado). A hipótese seria rejeitada se os valores de P fossem menores que 0.05.
Não houve diferenças estatisticamente significantes em cada um dos dez conjuntos (todos os valores de P variaram de 018 a 1.0, Tabela 44) de níveis de citocina observados em ratos nos quais foram injetados o veículo, IgG4/κ, TMC-2206 humanizado ou que não receberam injeção (naíve) ·-{}- Portanto, a injeção intravenosa de uma dose única (15 mg/kg) de TMC-2206 humanizado não induziu aumento na expressão de citocinas envolvidas na inflamação.
TABELA 44
<table>table see original document page 190</column></row><table> <table>table see original document page 191</column></row><table>
Embora a presente invenção tenha sido descrita neste
documento com referência a aplicações específicas, é importante compreender que essas aplicações são meramente ilustrativas dos vários aspectos da invenção. Dessa maneira, deve-se entender que numerosas modificações podem ser feitas nas aplicações ilustrativas e outras utilizações podem ser imaginadas sem partir do princípio e escopo da invenção. LISTAGEM DE SEQÜÊNCIAS
<110> GLENMARK PHARMACEUTICALS S.A. LAZARIDES, Elias WOODS, Catherine BERNARD, Mark
<120> "ANTICORPO HUMANIZADO ANTI-INTEGRINA α2 , MÉTODO PARA DETERMINAR SE UMA AMOSTRA CONTÉM A INTEGRINA (X2, KITf ÁCIDO NUCLÉICO ISOLADO, VETOR, CÉLULA HOSPEDEIRA, PROCESSO PARA PRODUÇÃO DE UM ANTICORPO HUMANIZADO ANTI- INTEGRINA α2, MÉTODO DE TRIAGEM, COMPOSIÇÃO, MÉTODO PARA O TRATAMENTO DE DISTÚRBIOS ASSOCIADOS COM A INTEGRINA α2β1 EM PACIENTES, MÉTODO PARA A INIBIÇÃO DA LIGAÇÃO DE LEUCÓCITOS AO COLÁGENO, MÉTODO DE DIRECIONAR UMA MOLÉCULA, USO DE UM ANTICORPO HUMANIZADO ANTI- INTEGRINA cc2, EMBALAGEM E EPITOPO DA INTEGRINA <x2 QUE LIGA UM ANTICORPO ANTI-INTEGRINA a2" .
<130> 14575.2
<150> US 60/738,303
<151> 2005-11-18
<160> 186
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 10
<212 > PRT
<213> Homo Sapiens
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> hCDRl [CDR1 da região variável de cadeia pesada] <400> 1
Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr Gly Ile His 15 10
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<220>
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<213> Homo Sapiens
<220>
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<22 0 >
<221> MISC_FEATURE
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<213> Homo Sapiens
<220>
<2 21> MISC_FEATURE
<223> 1CDR3 [CDR3 da região variável de cadeia leve] <400> 6
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<210> 7
<211> 5361
<212 > DNA
<213> Homo Sapiens
<220 >
<221> misc_feature
<223> DNA da integrina alfa-2 humana <400> 7
ctgcaaaccc agcgcaacta cggtcccccg gtcagaccca ggatggggcc agaacggaca 60
ggggccgcgc cgctgccgct gctgctggtg ttagcgctca gtcaaggcat tttaaattgt 120
tgtttggcct acaatgttgg tctcccagaa gcaaaaatat tttccggtcc ttcaagtgaa 180
cagtttgggt atgcagtgca gcagtttata aatccaaaag gcaactggtt actggttggt 240
tcaccctgga gtggctttcc tgagaaccga atgggagatg tgtataaatg tcctgttgac 300
ctatccactg ccacatgtga aaaactaaat ttgcaaactt caacaagcat tccaaatgtt 360
actgagatga aaaccaacat gagcctcggc ttgatcctca ccaggaacat gggaactgga 420
ggttttctca catgtggtcc tctgtgggca cagcaatgtg ggaatcagta ttacacaacg 480
ggtgtgtgtt ctgacatcag tcctgatttt cagctctcag ccagcttctc acctgcaact 540
cagccctgcc cttccctcat agatgttgtg gttgtgtgtg atgaatcaaa tagtatttat 600
ccttgggatg cagtaaagaa ttttttggaa aaatttgtac aaggccttga tataggcccc 660
acaaagacac aggtggggtt aattcagtat gccaataatc caagagttgt gtttaacttg 720
aacacatata aaaccaaaga agaaatgatt gtagcaacat cccagacatc ccaatatggt 780
ggggacctca caaacacatt cggagcaatt caatatgcaa gaaaatatgc ctattcagca 840
gcttctggtg ggcgacgaag tgctacgaaa gtaatggtag ttgtaactga cggtgaatca 900 catgatggtt caatgttgaa agctgtgatt gatcaatgca accatgacaa tatactgagg 960
tttggcatag cagttcttgg gtacttaaac agaaacgccc ttgatactaa aaatttaata 1020
aaagaaataa aagcgatcgc tagtattcca acagaaagat actttttcaa tgtgtctgat 1080
gaagcagctc tactagaaaa ggctgggaca ttaggagaac aaattttcag cattgaaggt 114 0
actgttcaag gaggagacaa ctttcagatg gaaatgtcac aagtgggatt cagtgcagat 1200
tactcttctc aaaatgatat tctgatgctg ggtgcagtgg gagcttttgg ctggagtggg 1260
accattgtcc agaagacatc tcatggccat ttgatctttc ctaaacaagc ctttgaccaa 132 0
attctgcagg acagaaatca cagttcatat ttaggttact ctgtggctgc aatttctact 1380
ggagaaagca ctcactttgt tgctggtgct cctcgggcaa attataccgg ccagatagtg 1440
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attggctcct attttggtag tgtgctgtgt tcagttgatg tggataaaga caccattaca 1560
gacgtgctct tggtaggtgc accaatgtac atgagtgacc taaagaaaga ggaaggaaga 162 0
gtctacctgt ttactatcaa aaagggcatt ttgggtcagc accaatttct tgaaggcccc 1680
gagggcattg aaaacactcg atttggttca gcaattgcag ctctttcaga catcaacatg 1740
gatggcttta atgatgtgat tgttggttca ccactagaaa atcagaattc tggagctgta 1800
tacatttaca atggtcatca gggcactatc cgcacaaagt attcccagaa aatcttggga 1860
tccgatggag cctttaggag ccatctccag tactttggga ggtccttgga tggctatgga 1920
gatttaaatg gggattccat caccgatgtg tctattggtg cctttggaca agtggttcaa 1980
ctctggtcac aaagtattgc tgatgtagct atagaagctt cattcacacc agaaaaaatc 2040
actttggtca acaagaatgc tcagataatt ctcaaactct gcttcagtgc aaagttcaga 2100
cctactaagc aaaacaatca agtggccatt gtatataaca tcacacttga tgcagatgga 2160
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ccctctgatg ttgtcaactc tttggatttg cgtgtggaca tcagtctgga aaaccctggc 2340
actagccctg cccttgaagc ctattctgag actgccaagg tcttcagtat tcctttccac 2400
aaagactgtg gtgaggatgg actttgcatt tctgatctag tcctagatgt ccgacaaata 2460
ccagctgctc aagaacaacc ctttattgtc agcaaccaaa acaaaaggtt aacattttca 2520
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gaaaacttgt tttttgcatc attctcccta ccggttgatg ggacagaagt aacatgccag 2640
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accaaaaatc cagatgagat tgatgagacc acagagctca gtagctgaac cagcagacct 3600
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gtagggaaat aatagggaaa atacctattt tatatgatgg gggaaaaaaa gtaatcttta 3840
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gtacttccac ttgtgtatat tttaatgaat attgatgtta acaagagggg aaaacaaaac 4080
acaggttttt tcaatttatg ctgctcatcc aaagttgcca cagatgatac ttccaagtga 4140
taattttatt tataaactag gtaaaatttg ttgttggttc cttttatacc acggctgccc 4200
cttccacacc ccatcttgct ctaatgatca aaacatgctt gaataactga gcttagagta 4260
tacctcctat atgtccattt aagttaggag agggggcgat atagagacta aggcacaaaa 4320
ttttgtttaa aactcagaat ataacattta tgtaaaatcc catctgctag aagcccatcc 4380
tgtgccagag gaaggaaaag gaggaaattt cctttctctt ttaggaggca caacagttct 4440
i cttctaggat ttgtttggct gactggcagt aacctagtga atttttgaaa gatgagtaat 4500
ttctttggca accttcctcc tcccttactg aaccactctc ccacctcctg gtggtaccat 4560
tattatagaa gccctctaca gcctgacttt ctctccagcg gtccaaagtt atcccctcct 4620
ttacccctca tccaaagttc ccactccttc aggacagctg ctgtgcatta gatattaggg 4680
gggaaagtca tctgtttaat ttacacactt gcatgaatta ctgtatataa actccttaac 4740
ttcagggagc tattttcatt tagtgctaaa caagtaagaa aaataagcta gagtgaattt 4800
ctaaatgttg gaatgttatg ggatgtaaac aatgtaaagt aaaacactct caggatttca 4860
ccagaagtta cagatgaggc actggaaacc accaccaaat tagcaggtgc accttctgtg 4920
gctgtcttgt ttctgaagta ctttttcttc cacaagagtg aatttgacct aggcaagttt 4980
gttcaaaagg tagatcctga gatgatttgg tcagattggg ataaggccca gcaatctgca 5040
ttttaacaag caccccagtc actaggatgc agatggacca cactttgaga aacaccaccc 5100
atttctactt tttgcacctt attttctctg ttcctgagcc cccacattct ctaggagaaa 5160
cttagattaa aattcacaga cactacatat ctaaagcttt gacaagtcct tgacctctat 5220
aaacttcaga gtcctcatta taaaatggga agactgagct ggagttcagc agtgatgctt 5280
tttagtttta aaagtctatg atctgatctg gacttcctat aatacaaata cacaatcctc 5340
caagaatttg acttggaaaa g 5361
<210 > 8
<211> 1181
<212 > PRT
<213> Homo Sapiens
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> Integrina alfa-2 humana
<400> 8 Met Gly Pro Glu Arg Thr Gly Ala Ala Pro Leu Pro Leu Leu Leu Val 1 5 10 15 Leu Ala Leu Ser Gln Gly Ile Leu Asn Cys Cys Leu Ala Tyr Asn Val 20 25 30 Gly Leu Pro Glu Ala Lys Ile Phe Ser Gly Pro Ser Ser Glu Gln Phe 35 40 45 Gly Tyr Ala Val Gln Gln Phe Ile Asn Pro Lys Gly Asn Trp Leu Leu 50 55 60 Val Gly Ser Pro Trp Ser Gly Phe Pro Glu Asn Arg Met Gly Asp Val 65 70 75 80 Tyr Lys Cys Pro Val Asp Leu Ser Thr Ala Thr Cys Glu Lys Leu Asn 85 90 95 Leu Gln Thr Ser Thr Ser Ile Pro Asn Val Thr Glu Met Lys Thr Asn 100 105 110 Met Ser Leu Gly Leu Ile Leu Thr Arg Asn Met Gly Thr Gly Gly Phe 115 120 125 Leu Thr Cys Gly Pro Leu Trp Ala Gln Gln Cys Gly Asn Gln Tyr Tyr 130 135 140 Thr Thr Gly Val Cys Ser Asp Ile Ser Pro Asp Phe Gln Leu Ser Ala 145 150 155 160 Ser Phe Ser Pro Ala Thr Gln Pro Cys Pro Ser Leu Ile Asp Val Val 165 170 175 Val Val Cys Asp Glu Ser Asn Ser Ile Tyr Pro Trp Asp Ala Val Lys 180 185 190 Asn Phe Leu Glu Lys Phe Val Gln Gly Leu Asp Ile Gly Pro Thr Lys
195 200 205
Thr Gln Val Gly Leu Ile Gln Tyr Ala Asn Asn Pro Arg Val Val Phe
210 215 220
Asn Leu Asn Thr Tyr Lys Thr Lys Glu Glu Met Ile Val Ala Thr Ser 225 230 235 240
Gln Thr Ser Gln Tyr Gly Gly Asp Leu Thr Asn Thr Phe Gly Ala Ile
245 250 255
Gln Tyr Ala Arg Lys Tyr Ala Tyr Ser Ala Ala Ser Gly Gly Arg Arg
260 265 270
Ser Ala Thr Lys Val Met Val Val Val Thr Asp Gly Glu Ser His Asp
275 280 285
Gly Ser Met Leu Lys Ala Val Ile Asp Gln Cys Asn His Asp Asn Ile
290 295 300
Leu Arg Phe Gly Ile Ala Val Leu Gly Tyr Leu Asn Arg Asn Ala Leu 305 310 315 320
Asp Thr Lys Asn Leu Ile Lys Glu Ile Lys Ala Ile Ala Ser Ile Pro
325 330 335
Thr Glu Arg Tyr Phe Phe Asn Val Ser Asp Glu Ala Ala Leu Leu Glu
340 345 350
Lys Ala Gly Thr Leu Gly Glu Gln Ile Phe Ser Ile Glu Gly Thr Val
355 360 365
Gln Gly Gly Asp Asn Phe Gln Met Glu Met Ser Gln Val Gly Phe Ser
370 375 380
Ala Asp Tyr Ser Ser Gln Asn Asp Ile Leu Met Leu Gly Ala Val Gly 385 390 395 400
Ala Phe Gly Trp Ser Gly Thr Ile Val Gln Lys Thr Ser His Gly His
405 410 415
Leu Ile Phe Pro Lys Gln Ala Phe Asp Gln Ile Leu Gln Asp Arg Asn
420 425 430
His Ser Ser Tyr Leu Gly Tyr Ser Val Ala Ala Ile Ser Thr Gly Glu
435 440 445
Ser Thr His Phe Val Ala Gly Ala Pro Arg Ala Asn Tyr Thr Gly Gln
450 455 460
Ile Val Leu Tyr Ser Val Asn Glu Asn Gly Asn Ile Thr Val Ile Gln 465 470 475 480
Ala His Arg Gly Asp Gln Ile Gly Ser Tyr Phe Gly Ser Val Leu Cys
485 490 495
Ser Val Asp Val Asp Lys Asp Thr Ile Thr Asp Val Leu Leu Val Gly
500 505 510
Ala Pro Met Tyr Met Ser Asp Leu Lys Lys Glu Glu Gly Arg Val Tyr
515 520 525
Leu Phe Thr Ile Lys Lys Gly Ile Leu Gly Gln His Gln Phe Leu Glu
530 535 540
Gly Pro Glu Gly Ile Glu Asn Thr Arg Phe Gly Ser Ala Ile Ala Ala 545 550 555 560
Leu Ser Asp Ile Asn Met Asp Gly Phe Asn Asp Val Ile Val Gly Ser
565 570 575
Pro Leu Glu Asn Gln Asn Ser Gly Ala Val Tyr Ile Tyr Asn Gly His
580 585 590
Gln Gly Thr Ile Arg Thr Lys Tyr Ser Gln Lys Ile Leu Gly Ser Asp 595 600 605 Gly Ala Phe Arg Ser His Leu Gln Tyr Phe Gly Arg Ser Leu Asp Gly
610 615 620
Tyr Gly Asp Leu Asn Gly Asp Ser Ile Thr Asp Val Ser Ile Gly Ala 625 630 635 640
Phe Gly Gln Val Val Gln Leu Trp Ser Gln Ser Ile Ala Asp Val Ala
645 650 655
Ile Glu Ala Ser Phe Thr Pro Glu Lys Ile Thr Leu Val Asn Lys Asn
660 665 670
Ala Gln Ile Ile Leu Lys Leu Cys Phe Ser Ala Lys Phe Arg Pro Thr
675 680 685
Lys Gln Asn Asn Gln Val Ala Ile Val Tyr Asn Ile Thr Leu Asp Ala
690 695 700
Asp Gly Phe Ser Ser Arg Val Thr Ser Arg Gly Leu Phe Lys Glu Asn 705 710 715 720
Asn Glu Arg Cys Leu Gln Lys Asn Met Val Val Asn Gln Ala Gln Ser
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Cys Pro Glu His Ile Ile Tyr Ile Gln Glu Pro Ser Asp Val Val Asn
740 745 750
Ser Leu Asp Leu Arg Val Asp Ile Ser Leu Glu Asn Pro Gly Thr Ser
755 760 765
Pro Ala Leu Glu Ala Tyr Ser Glu Thr Ala Lys Val Phe Ser Ile Pro
770 775 780
Phe His Lys Asp Cys Gly Glu Asp Gly Leu Cys Ile Ser Asp Leu Val 785 790 795 800
Leu Asp Val Arg Gln Ile Pro Ala Ala Gln Glu Gln Pro Phe Ile Val
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Ser Asn Gln Asn Lys Arg Leu Thr Phe Ser Val Thr Leu Lys Asn Lys
820 825 830
Arg Glu Ser Ala Tyr Asn Thr Gly Ile Val Val Asp Phe Ser Glu Asn
835 840 845
Leu Phe Phe Ala Ser Phe Ser Leu Pro Val Asp Gly Thr Glu Val Thr
850 855 860
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Pro Ala Leu Lys Arg Glu Gln Gln Val Thr Phe Thr Ile Asn Phe Asp
885 890 895
Phe Asn Leu Gln Asn Leu Gln Asn Gln Ala Ser Leu Ser Phe Gln Ala
900 905 910
Leu Ser Glu Ser Gln Glu Glu Asn Lys Ala Asp Asn Leu Val Asn Leu
915 920 925
Lys Ile Pro Leu Leu Tyr Asp Ala Glu Ile His Leu Thr Arg Ser Thr
930 935 940
Asn Ile Asn Phe Tyr Glu Ile Ser Ser Asp Gly Asn Val Pro Ser Ile 945 950 955 960
Val His Ser Phe Glu Asp Val Gly Pro Lys Phe Ile Phe Ser Leu Lys
965 970 975
Val Thr Thr Gly Ser Val Pro Val Ser Met Ala Thr Val Ile Ile His
980 985 990
Ile Pro Gln Tyr Thr Lys Glu Lys Asn Pro Leu Met Tyr Leu Thr Gly
995 1000 1005
Val Gln Thr Asp Lys Ala Gly Asp Ile Ser Cys Asn Ala Asp Ile 1010 1015 1020 Asn Pro Leu Lys Ile Gly Gln Thr Ser Ser Ser Val Ser Phe Lys
1025 1030 1035
Ser Glu Asn Phe Arg His Thr Lys Glu Leu Asn Cys Arg Thr Ala
1040 1045 1050
Ser Cys Ser Asn Val Thr Cys Trp Leu Lys Asp Val His Met Lys
1055 1060 1065
Gly Glu Tyr Phe Val Asn Val Thr Thr Arg Ile Trp Asn Gly Thr
1070 1075 1080
Phe Ala Ser Ser Thr Phe Gln Thr Val Gln Leu Thr Ala Ala Ala
1085 1090 1095
Glu Ile Asn Thr Tyr Asn Pro Glu Ile Tyr Val Ile Glu Asp Asn
1100 1105 1110
Thr Val Thr Ile Pro Leu Met Ile Met Lys Pro Asp Glu Lys Ala
1115 1120 1125
Glu Val Pro Thr Gly Val Ile Ile Gly Ser Ile Ile Ala Gly Ile
1130 1135 1140
Leu Leu Leu Leu Ala Leu Val Ala Ile Leu Trp Lys Leu Gly Phe
1145 1150 1155
Phe Lys Arg Lys Tyr Glu Lys Met Thr Lys Asn Pro Asp Glu Ile
1160 1165 1170
Asp Glu Thr Thr Glu Leu Ser Ser
1175 1180
<210 > 9
<211> 3700
<212 > DNA
<213> Homo Sapiens
<22 0 >
<221> misc_feature
<22 3> DNA da integrina beta-1 humana <4 0 0 > 9
agccgccgcc acccgccgcg cccgacaccc gggaggcccc gccagcccgc gggagaggcc 60
cagcgggagt cgcggaacag caggcccgag cccaccgcgc cgggccccgg acgccgcgcg 12 0
gaaaagatga atttacaacc aattttctgg attggactga tcagttcagt ttgctgtgtg 180
tttgctcaaa cagatgaaaa tagatgttta aaagcaaatg ccaaatcatg tggagaatgt 240
atacaagcag ggccaaattg tgggtggtgc acaaattcaa catttttaca ggaaggaatg 300
cctacttctg cacgatgtga tgatttagaa gccttaaaaa agaagggttg ccctccagat 360
gacatagaaa atcccagagg ctccaaagat ataaagaaaa ataaaaatgt aaccaaccgt 420
agcaaaggaa cagcagagaa gctcaagcca gaggatatta ctcagatcca accacagcag 480
ttggttttgc gattaagatc aggggagcca cagacattta cattaaaatt caagagagct 540
gaagactatc ccattgacct ctactacctt atggacctgt cttactcaat gaaagacgat 600
ttggagaatg taaaaagtct tggaacagat ctgatgaatg aaatgaggag gattacttcg 660
gacttcagaa ttggatttgg ctcatttgtg gaaaagactg tgatgcctta cattagcaca 720
acaccagcta agctcaggaa cccttgcaca agtgaacaga actgcaccag cccatttagc 780
tacaaaaatg tgctcagtct tactaataaa ggagaagtat ttaatgaact tgttggaaaa 840
cagcgcatat ctggaaattt ggattctcca gaaggtggtt tcgatgccat catgcaagtt 900
gcagtttgtg gatcactgat tggctggagg aatgttacac ggctgctggt gttttccaca 960
gatgccgggt ttcactttgc tggagatggg aaacttggtg gcattgtttt accaaatgat 1020
ggacaatgtc acctggaaaa taatatgtac acaatgagcc attattatga ttatccttct 1080 attgctcacc ttgtccagaa actgagtgaa aataatattc agacaatttt tgcagttact 1140
gaagaatttc agcctgttta caaggagctg aaaaacttga tccctaagtc agcagtagga 1200
acattatctg caaattctag caatgtaatt cagttgatca ttgatgcata caattccctt 1260
tcctcagaag tcattttgga aaacggcaaa ttgtcagaag gagtaacaat aagttacaaa 1320
tcttactgca agaacggggt gaatggaaca ggggaaaatg gaagaaaatg ttccaatatt 1380
tccattggag atgaggttca atttgaaatt agcataactt caaataagtg tccaaaaaag 1440
gattctgaca gctttaaaat taggcctctg ggctttacgg aggaagtaga ggttattctt 1500
cagtacatct gtgaatgtga atgccaaagc gaaggcatcc ctgaaagtcc caagtgtcat 1560
gaaggaaatg ggacatttga gtgtggcgcg tgcaggtgca atgaagggcg tgttggtaga 162 0
cattgtgaat gcagcacaga tgaagttaac agtgaagaca tggatgctta ctgcaggaaa 1680
gaaaacagtt cagaaatctg cagtaacaat ggagagtgcg tctgcggaca gtgtgtttgt 174 0
aggaagaggg ataatacaaa tgaaatttat tctggcaaat tctgcgagtg tgataatttc 1800
aactgtgata gatccaatgg cttaatttgt ggaggaaatg gtgtttgcaa gtgtcgtgtg 1860
tgtgagtgca accccaacta cactggcagt gcatgtgact gttctttgga tactagtact 192 0
tgtgaagcca gcaacggaca gatctgcaat ggccggggca tctgcgagtg tggtgtctgt 1980
aagtgtacag atccgaagtt tcaagggcaa acgtgtgaga tgtgtcagac ctgccttggt 2 04 0
gtctgtgctg agcataaaga atgtgttcag tgcagagcct tcaataaagg agaaaagaaa 2100
gacacatgca cacaggaatg ttcctatttt aacattacca aggtagaaag tcgggacaaa 2160
ttaccccagc cggtccaacc tgatcctgtg tcccattgta aggagaagga tgttgacgac 222 0
tgttggttct attttacgta ttcagtgaat gggaacaacg aggtcatggt tcatgttgtg 2280
gagaatccag agtgtcccac tggtccagac atcattccaa ttgtagctgg tgtggttgct 2340
ggaattgttc ttattggcct tgcattactg ctgatatgga agcttttaat gataattcat 2400
gacagaaggg agtttgctaa atttgaaaag gagaaaatga atgccaaatg ggacacgggt 2460
gaaaatccta tttataagag tgccgtaaca actgtggtca atccgaagta tgagggaaaa 2520
tgagtactgc ccgtgcaaat cccacaacac tgaatgcaaa gtagcaattt ccatagtcac 2580
agttaggtag ctttagggca atattgccat ggttttactc atgtgcaggt tttgaaaatg 2640
tacaatatgt ataattttta aaatgtttta ttattttgaa aataatgttg taattcatgc 2700
cagggactga caaaagactt gagacaggat ggttattctt gtcagctaag gtcacattgt 2760
gcctttttga ccttttcttc ctggactatt gaaatcaagc ttattggatt aagtgatatt 2820
tctatagcga ttgaaagggc aatagttaaa gtaatgagca tgatgagagt ttctgttaat 2880
catgtattaa aactgatttt tagctttaca aatatgtcag tttgcagtta tgcagaatcc 2940
aaagtaaatg tcctgctagc tagttaagga ttgttttaaa tctgttattt tgctatttgc 3000
ctgttagaca tgactgatga catatctgaa agacaagtat gttgagagtt gctggtgtaa 3 060
aatacgtttg aaatagttga tctacaaagg ccatgggaaa aattcagaga gttaggaagg 3120
aaaaaccaat agctttaaaa cctgtgtgcc attttaagag ttacttaatg tttggtaact 3180
tttatgcctt cactttacaa attcaagcct tagataaaag aaccgagcaa ttttctgcta 3240
aaaagtcctt gatttagcac tatttacata caggccatac tttacaaagt.atttgctgaa 3300
tggggacctt ttgagttgaa tttattttat tatttttatt ttgtttaatg tctggtgctt 3360
tctatcacct cttctaatct tttaatgtat ttgtttgcaa ttttggggta agactttttt 3420
atgagtactt tttctttgaa gttttagcgg tcaatttgcc tttttaatga acatgtgaag 3480
ttatactgtg gctatgcaac agctctcacc tacgcgagtc ttactttgag ttagtgccat 3540
aacagaccac tgtatgttta cttctcacca tttgagttgc ccatcttgtt tcacactagt 3600
cacattcttg ttttaagtgc ctttagtttt aacagttcac tttttacagt gctatttact 3660
gaagttattt attaaatatg cctaaaatac ttaaatcgga 3700
10 798 PRT
Homo Sapiens
<210 > <211 > <212 > <213 >
<2 2 0 >
<221> MIS C_FEATURE
<223> Integrina beta-1 humana
<4 0 0 > 10 Met Asn Leu Gln Pro Ile Phe Trp Ile Gly Leu Ile Ser Ser Val Cys 15 10 15
Cys Val Phe Ala Gln Thr Asp Glu Asn Arg Cys Leu Lys Ala Asn Ala
20 25 30
Lys Ser Cys Gly Glu Cys Ile Gln Ala Gly Pro Asn Cys Gly Trp Cys
35 40 45
Thr Asn Ser Thr Phe Leu Gln Glu Gly Met Pro Thr Ser Ala Arg Cys
50 55 60
Asp Asp Leu Glu Ala Leu Lys Lys Lys Gly Cys Pro Pro Asp Asp Ile 65 70 75 80
Glu Asn Pro Arg Gly Ser Lys Asp Ile Lys Lys Asn Lys Asn Val Thr
85 90 95
Asn Arg Ser Lys Gly Thr Ala Glu Lys Leu Lys Pro Glu Asp Ile Thr
100 105 110
Gln Ile Gln Pro Gln Gln Leu Val Leu Arg Leu Arg Ser Gly Glu Pro
115 120 125
Gln Thr Phe Thr Leu Lys Phe Lys Arg Ala Glu Asp Tyr Pro Ile Asp
130 135 140
Leu Tyr Tyr Leu Met Asp Leu Ser Tyr Ser Met Lys Asp Asp Leu Glu 145 150 155 160
Asn Val Lys Ser Leu Gly Thr Asp Leu Met Asn Glu Met Arg Arg Ile
165 170 175
Thr Ser Asp Phe Arg Ile Gly Phe Gly Ser Phe Val Glu Lys Thr Val
180 185 190
Met Pro Tyr Ile Ser Thr Thr Pro Ala Lys Leu Arg Asn Pro Cys Thr
195 200 205
Ser Glu Gln Asn Cys Thr Ser Pro Phe Ser Tyr Lys Asn Val Leu Ser
210 215 220
Leu Thr Asn Lys Gly Glu Val Phe Asn Glu Leu Val Gly Lys Gln Arg 225 230 235 240
Ile Ser Gly Asn Leu Asp Ser Pro Glu Gly Gly Phe Asp Ala Ile Met
245 250 255
Gln Val Ala Val Cys Gly Ser Leu Ile Gly Trp Arg Asn Val Thr Arg
260 265 270
Leu Leu Val Phe Ser Thr Asp Ala Gly Phe His Phe Ala Gly Asp Gly
275 280 285
Lys Leu Gly Gly Ile Val Leu Pro Asn Asp Gly Gln Cys His Leu Glu
290 295 300
Asn Asn Met Tyr Thr Met Ser His Tyr Tyr Asp Tyr Pro Ser Ile Ala 305 310 315 320
His Leu Val Gln Lys Leu Ser Glu Asn Asn Ile Gln Thr Ile Phe Ala
325 330 335
Val Thr Glu Glu Phe Gln Pro Val Tyr Lys Glu Leu Lys Asn Leu Ile
340 345 350
Pro Lys Ser Ala Val Gly Thr Leu Ser Ala Asn Ser Ser Asn Val Ile
355 360 365
Gln Leu Ile Ile Asp Ala Tyr Asn Ser Leu Ser Ser Glu Val Ile Leu
370 375 380
Glu Asn Gly Lys Leu Ser Glu Gly Val Thr Ile Ser Tyr Lys Ser Tyr 385 390 395 400
Cys Lys Asn Gly Val Asn Gly Thr Gly Glu Asn Gly Arg Lys Cys Ser
405 410 415 Asn Ile Ser Ile Gly 420
Asn Lys Cys Pro Lys 435
Gly Phe Thr Glu Glu 450
Glu Cys Gln Ser Glu 465
Asn Gly Thr Phe Glu
485
Gly Arg His Cys Glu 500
Asp Ala Tyr Cys Arg 515
Gly Glu Cys Val Cys 530
Asn Glu Ile Tyr Ser 545
Asp Arg Ser Asn Gly
565
Arg Val Cys Glu Cys 580
Ser Leu Asp Thr Ser 595
Gly Arg Gly Ile Cys 610
Phe Gln Gly Gln Thr 625
Ala Glu His Lys Glu
645
Lys Lys Asp Thr Cys 660
Val Glu Ser Arg Asp 675
Ser His Cys Lys Glu 690
Tyr Ser Val Asn Gly 705
Pro Glu Cys Pro Thr
725
Val Ala Gly Ile Val 740
Leu Leu Met Ile Ile 755
Glu Lys Met Asn Ala 770
Ser Ala Val Thr Thr 785
Asp Glu Val Gln Phe 425
Lys Asp Ser Asp Ser 440
Val Glu Val Ile Leu 455
Gly Ile Pro Glu Ser 470
Cys Gly Ala Cys Arg
490
Cys Ser Thr Asp Glu 505
Lys Glu Asn Ser Ser 520
Gly Gln Cys Val Cys 535
Gly Lys Phe Cys Glu 550
Leu Ile Cys Gly Gly
570
Asn Pro Asn Tyr Thr 585
Thr Cys Glu Ala Ser 600
Glu Cys Gly Val Cys 615
Cys Glu Met Cys Gln 630
Cys Val Gln Cys Arg
650
Thr Gln Glu Cys Ser 665
Lys Leu Pro Gln Pro 680
Lys Asp Val Asp Asp 695
Asn Asn Glu Val Met 710
Gly Pro Asp Ile Ile
730
Leu Ile Gly Leu Ala 745
His Asp Arg Arg Glu 760
Lys Trp Asp Thr Gly 775
Val Val Asn Pro Lys 790
Glu Ile Ser Ile Thr Ser 430
Phe Lys Ile Arg Pro Leu 445 Gln Tyr Ile Cys Glu Cys 460 Pro Lys Cys His Glu Gly 475 480 Cys Asn Glu Gly Arg Val 495 Val Asn Ser Glu Asp Met 510 Glu Ile Cys Ser Asn Asn 525 Arg Lys Arg Asp Asn Thr 540 Cys Asp Asn Phe Asn Cys 555 560 Asn Gly Val Cys Lys Cys 575 Gly Ser Ala Cys Asp Cys 590 Asn Gly Gln Ile Cys Asn 605 Lys Cys Thr Asp Pro Lys 620 Thr Cys Leu Gly Val Cys 635 640 Ala Phe Asn Lys Gly Glu 655 Tyr Phe Asn Ile Thr Lys 670 Val Gln Pro Asp Pro Val 685 Cys Trp Phe Tyr Phe Thr 700 Val His Val Val Glu Asn 715 720 Pro Ile Val Ala Gly Val 735 Leu Leu Leu Ile Trp Lys 750 Phe Ala Lys Phe Glu Lys 765 Glu Asn Pro Ile Tyr Lys 780 Tyr Glu Gly Lys 795 <210> 11
<211> 226
<212 > PRT
<213> Homo Sapiens
<220>
<221> MISC_FEATURE
<22 3> Domínio 1 da alfa-2 humana
<400> 11
Ser Pro Asp Phe Gln Leu Ser Ala Ser Phe Ser Pro Ala Thr Gln Pro 1 5 10 15
Cys Pro Ser Leu Ile Asp Val Val Val Val Cys Asp Glu Ser Asn Ser
20 25 30
Ile Tyr Pro Trp Asp Ala Val Lys Asn Phe Leu Glu Lys Phe Val Gln
35 40 45
Gly Leu Asp Ile Gly Pro Thr Lys Thr Gln Val Gly Leu Ile Gln Tyr
50 55 60
Ala Asn Asn Pro Arg Val Val Phe Asn Leu Asn Thr Tyr Lys Thr Lys 65 70 75 80
Glu Glu Met Ile Val Ala Thr Ser Gln Thr Ser Gln Tyr Gly Gly Asp
85 90 95
Leu Thr Asn Thr Phe Gly Ala Ile Gln Tyr Ala Arg Lys Tyr Ala Tyr
100 105 110
Ser Ala Ala Ser Gly Gly Arg Arg Ser Ala Thr Lys Val Met Val Val
115 120 125
Val Thr Asp Gly Glu Ser His Asp Gly Ser Met Leu Lys Ala Val Ile
130 135 140
Asp Gln Cys Asn His Asp Asn Ile Leu Arg Phe Gly Ile Ala Val Leu 145 150 155 160
Gly Tyr Leu Asn Arg Asn Ala Leu Asp Thr Lys Asn Leu Ile Lys Glu
165 170 175
Ile Lys Ala Ile Ala Ser Ile Pro Thr Glu Arg Tyr Phe Phe Asn Val
180 185 190
Ser Asp Glu Ala Ala Leu Leu Glu Lys Ala Gly Thr Leu Gly Glu Gln
195 200 205
Ile Phe Ser Ile Glu Gly Thr Val Gln Gly Gly Asp Asn Phe Gln Met
210 215 220
Glu Met 225
<210 > 12
<211> 71
<212 > PRT
<213> Homo Sapiens
<22 0 >
<221> MISC FEATURE <223> FWl-3 4-59 [FW=l-25; FW2=26-39; FW3=40-71] <400> 12
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 15 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly
20 25 30
Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser
35 40 45
Lys Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr
50 55 60
Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg 65 70
<210 > 13
<211> 11
<212 > PRT
<213> Homo Sapiens
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> FW4 4-59 [NCBI entrada gi/33583] <4 0 0 > 13
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 15 10
<210 > 14
<211> 27
<212 > DNA
<213> Homo Sapiens
<220>
<221> misc_feature
<223> VHL-for [primer anterior]
<4 0 0 > 14
ccatggctgt cttggggctg ctcttct 27
<210 > 15
<211> 17
<212 > DNA
<213> Homo Sapiens <220>
<221> misc_feature
<223> HC-rev [primer reverso]
<400> 15 ggggccagtg gatagac
<210> 16
<211> 28
<212 > DNA
<213> Homo Sapiens
<220>
<221> misc_feature
<223> VLL-for [primer anterior]
<400> 16
ccatggattt tcaagtgcag attttcag 28
<210 > 17
<211> 17
<212 > DNA
<213> Homo Sapiens
<22 O >
<221> misc_feature
<223> LCkappa-rev [primer reverso] <400> 17
gttggtgcag catcagc 17
<210> 18
<211> 318
<212 > DNA
<213> Homo Sapiens
<22 O >
<221> misc_feature
<223 > TMC-22 06 VL
<2 2 O >
<221> CDS
<222 > (1) . . (318) <400> 18
caa ttt gtt ctc acc cag Gln Phe Val Leu Thr Gln 1 5
gag aag gtc acc atg acc Glu Lys Val Thr Met Thr 20
cac tgg tac cag cag aag His Trp Tyr Gln Gln Lys 35
gac act tcc aaa ctg gct Asp Thr Ser Lys Leu Ala 50
gga tct ggg acc tct tac Gly Ser Gly Thr Ser Tyr 65 70
gat gct gcc act tat tac Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr
85
ttc ggt gct ggg acc agg Phe Gly Ala Gly Thr Arg 100
tct cca gca ttc ttg Ser Pro Ala Phe Leu 10
tgc agt gcc aac tca Cys Ser Ala Asn Ser 25
tca ggc acc tcc ccc Ser Gly Thr Ser Pro 40
tct gga gtc cct gtt Ser Gly Val Pro Val 55
tct ctc aca ate age Ser Leu Thr Ile Ser
75
tgc cag cag tgg act Cys Gln Gln Trp Thr 90
gtg gag ctg aaa Val Glu Leu Lys 105
tct gct tct cca ggg 48 Ser Ala Ser Pro Gly 15
agt gtg aat tac att 96 Ser Val Asn Tyr Ile 30
aaa aaa tgg att tat 144 Lys Lys Trp Ile Tyr 45
cgc ttc agt ggc agt 192 Arg Phe Ser Gly Ser 60
age atg gag act gag 240 Ser Met Glu Thr Glu 80
act aac cca ctc acg 288 Thr Asn Pro Leu Thr 95
318
<210 > 19
<211> 106
<212 > PRT
<213> Homo Sapiens
<400> 19
Gln Phe Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Phe Leu Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Asn Ser Ser Val Asn Tyr Ile
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Lys Trp Ile Tyr
35 40 45
Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Val Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Thr Glu 65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Thr Thr Asn Pro Leu Thr
85 90 95
Phe Gly Ala Gly Thr Arg Val Glu Leu Lys 100 105
<210> 20
<211> 357
<212> DNA
<213> Homo sapiens <220>
<221> CDS
<222 > (1) . . (357)
<220 >
<221> misc_feature
<222 > (1) . . (357)
<223> TMC-2206 VH
<400> 20
cag gtg cag ttg aag gag Gln Val Gln Leu Lys Glu 1 5
age ctg tcc ate act tgt Ser Leu Ser Ile Thr Cys 20
ggt att cac tgg gtt cgc Gly Ile His Trp Val Arg 35
gga gtg ata tgg gct cgt Gly Val Ile Trp Ala Arg 50
tcc aga ctg ate ate aca Ser Arg Leu Ile Ile Thr 65 70
aaa atg aac agt cta caa Lys Met Asn Ser Leu Gln
85
aga gcg aac gac ggg gtc Arg Ala Asn Asp Gly Val 100
acc tca gtc acc gtc tcc Thr Ser Val Thr Val Ser 115
tca gga cct ggc ctg Ser Gly Pro Gly Leu 10
act gtc tet gga ttt Thr Val Ser Gly Phe 25
cag cct cca gga aag Gln Pro Pro Gly Lys 40
gga ttc aca aat tat Gly Phe Thr Asn Tyr 55
aaa gac aat tcc cag Lys Asp Asn Ser Gln
75
cct gat gac tca gcc Pro Asp Asp Ser Ala 90
tat tat gct atg gac Tyr Tyr Ala Met Asp 105
tca Ser
gtg gcg ccc tca cag 48 Val Ala Pro Ser Gln 15
tca tta acc aac tat 96 Ser Leu Thr Asn Tyr 30
ggt ctg gag tgg ctg 144 Gly Leu Glu Trp Leu 45
aat tcg gct ctc atg 192 Asn Ser Ala Leu Met 60
agt caa gtc ttc tta 240 Ser Gln Val Phe Leu
80
act tac ttc tgt gcc 288 Thr Tyr Phe Cys Ala 95
tac tgg ggt cag gga 33 6 Tyr Trp Gly Gln Gly 110
357
<210 > 21
<211> 119
<212 > PRT
<213> Homo sapiens
<4 0 0 > 21
Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly 1 5
Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val 20
Gly Ile His Trp Val Arg Gln Pro
35 40
Gly Val Ile Trp Ala Arg Gly Phe 50 55
Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln
10 15
Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr 25 30
Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 45
Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Leu Met 60 Ser Arg Leu Ile Ile Thr Lys Asp 65 70
Lys Met Asn Ser Leu Gln Pro Asp
85
Arg Ala Asn Asp Gly Val Tyr Tyr 100
Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115
Asn Ser Gln Ser Gln Val Phe Leu
75 80
Asp Ser Ala Thr Tyr Phe Cys Ala
90 95
Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 105 HO
<210> 22
<211> 31
<212> DNA
<213> Homo Sapiens
<220>
<221> misc_feature
<223> TMC-2206-r51 [primer anterior] <400> 22
cccgaattca caggtgcagt tgaaggagtc a 31
<210> 23
<211> 35
<212> DNA
<213> Homo Sapiens
<220>
<221> misc_feature
<223> TMC-2206-r3' [primer reverso] <400> 23
cgggatcctt aggatcattt accaggagag tggga 35
<210> 24
<211> 31
<212> DNA
<213> Homo Sapiens
<220>
<221> misc_feature
<223> TMC-2206-k51 [primer anterior]
<400> 24
cccgaattca caatttgttc tcacccagtc t
31 <210> 25
<211> 35
<212 > DNA
<213> Homo Sapiens
<220>
<221> misc_feature
<223> TMC-22 0 6-k3' [primer reverso] <400> 25
cgggatcctt atctctaaca ctcattcctg ttgaa 35
<210> 26
<211> 22
<212 > PRT
<213> Homo Sapiens
<220>
<221> MIS C_FEATURE
<223> Igkappa (Igk) seqüência líder <400> 26
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro 15 10 15
Gly Gly Ser Thr Gly Asp 20
<210> 27
<211> 76
<212 > DNA
<213> Homo Sapiens
<22 O >
<221> misc_feature
<223> Igkappa-S Oligonucleotideos [Primer] <400> 27
tcgagccacc atggagacag acacactcct gctatgggta ctgctgctct gggttccagg 60 ttccactgga gacgcg 76
<210> 28
<211> 76
<212 > DNA
<213> Homo Sapiens <220>
<221> misc_feature
<223> Igkappa-AS Oligonucleotideos [Primer] <400> 28
aattcgcgtc tccagtggaa cctggaaccc agagcagcag tacccatagc aggagtgtgt 60 ctgtctccat ggtggc 76
<210 > 29 <211 > 33 <212 > DNA <213 > Homo
<220>
<221> misc_feature
<223 > TMC22 06VH-hIgGl/4Fc-SalI
<400> 29
cttggtcgac gctgaggaga cggtgactga ggt 33
<210> 30
<211> 30
<212> DNA
<213> Homo Sapiens
<220>
<221> misc_feature
<223> hIgGl/4Fc-SalI-F [primer anterior] <400> 30
tcagcgtcga ccaagggccc atcsgtcttc 30
<210 > 31 <211 > 48 <212 > DNA <213 > Homo
<220>
<221> misc_feature
<223> hIgGl/4Fc-NotI-R [primer reverso]
<400> 31 aagggaagcg gccgcttatc atttacccyg agacagggag aggctctt
<210> 32 <211> 39 <212> DNA <213> Homo
<220>
<221> misc_feature
<223> TMC2206VL-hKc-SalI [primer reverso] <400> 32
tcgtttgatg tcgaccttgg tcccagcacc gaacgtgag
<210> 33 <211> 35 <212> DNA <213> Homo
<220>
<221> misc_feature
<223> hKc-SalI-F [primer anterior] <400> 33
accaaggtcg acatcaaacg aactgtggct gcacc
<210> 34 <211> 45 <212> DNA <213> Homo
<220>
<221> misc_feature
<223> hKc-Notl-R [primer reverso]
<400> 34
aagggaagcg gccgcttatc arcactctcc cctgttgaag ctctt
<210> 35
<211> 29
<212> DNA
<213> Homo Sapiens <220>
<221> misc_feature
<223> TMC-22O6VLwt-hKc-F [primer anterior] <4 0 0 > 35
agggtggagc tgaaacgaac tgtggctgc 29
<210 > 36
<211> 24
<212 > DNA
<213> Homo Sapiens
<2 2 0 >
<221> misc_feature
<223> TMC-2206VLwt-hKc-R [primer reverso] <4 00 > 36
tcgtttcagc tccaccctgg tccc 24
<210 > 37
<211> 107
<212 > PRT
<213> Homo Sapiens
<22 0 >
<221> MISC_FEATURE
<223> A14 VL proteína da linha germinal
<4 00 > 37 Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Phe Leu Ser Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Glu Gly Ile Gly Asn Tyr 20 25 30 Leu Tyr Trp 35 Tyr Gln Gln Lys Pro 40 Asp Gln Ala Pro Lys 45 Leu Leu Ile Lys Tyr 50 Ala Ser Gln Ser Ile 55 Ser Gly Val Pro Ser 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ala 65 70 75 80 Glu Asp Ala Ala Thr 85 Tyr Tyr Cys Gln Gln 90 Trp Thr Thr Asn Pro 95 Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 <210> 38
<211> 10
<212> PRT
<213> Homo
Sapiens
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> FW 4 da cadeia leve de kappa desenvolvida <400> 38
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 1 5 10
<210> 39 <211> 121 <212> PRT <213> Homo Sapiens
<220>
<221> MIS C_FEATURE
<223> 4-59 VH proteína da linha germinal <400> 39
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu 65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg His Asn Ser Ser Ser Trp Tyr Gly Arg Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120
<210> 40
<211> 119
<212> PRT
<213> Homo Sapiens <220>
<221> MISC_FEATURE
<223> hVHl.0
<400> 40
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu 20 Thr Cys Thr Val Ser 25 Gly Phe Ser Leu Thr 30 Asn Tyr Gly Ile His 35 Trp Val Arg Gln Pro 40 Pro Gly Lys Gly Leu 45 Glu Trp Leu Gly Val 50 Ile Trp Ala Arg Gly 55 Phe Thr Asn Tyr Asn 60 Ser Ala Leu Met Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Asn Gln Val Ser Leu 65 70 75 80 Lys Leu Ser Ser Val 85 Thr Ala Ala Asp Thr 90 Ala Val Tyr Phe Cys 95 Ala Arg Ala Asn Asp Gly Val Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val 115 Thr Val Ser Ser
<210> 41
<211> 106
<212 > PRT
<213> Homo Sapiens
<22 0>
<221> MIS C_FEATURE <223 > hVLl.0
<400> 41 Gln Phe Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Phe Leu Ser Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr 20 Ile Thr Cys Ser Ala 25 Asn Ser Ser Val Asn 30 Tyr Ile His Trp Tyr 35 Gln Gln Lys Pro Asp 40 Gln Ala Pro Lys Lys 45 Trp Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ala Glu 65 70 75 80 Asp Ala Ala Thr Tyr 85 Tyr Cys Gln Gln Trp 90 Thr Thr Asn Pro Leu 95 Thr Phe Gly Gln Gly 100 Thr Lys Val Glu Ile 105 Lys <210> 42
<211> 48
<212> DNA
<213> Homo Sapiens
<220>
<221> misc_feature
<223> hVH3.O-F [primer anterior]
<400> 42
agcgtggaca ccagcaagaa ccagttcagc ctgaagctga gcagcgtg 48
<210> 43
<211> 51
<212> DNA
<213> Homo Sapiens
<220>
<221> misc_feature
<223> hVH3.0-R [primer reverso]
<400> 43
gttcttgctg gtgtccacgc tgatggtcac gcgggacatg agagcgctgt t 51
<210> 44
<211> 48
<212> DNA
<213> Homo Sapiens
<220>
<221> misc_feature
<223> hVH4.0-F [primer anterior]
<400> 44
cctccaggca agggcctgga gtggatcggc gtgatatggg ctcgcggc 48
<210> 45
<211> 51
<212> DNA
<213> Homo Sapiens
<220>
<221> misc_feature
<223> hVH4.O-R [primer reverso] ctccaggccc ttgcctggag gctggcgtat ccagtggatg ccatagttgg
<210 > 46 <211 > 33 <212 > DNA <213 > Homo
<220>
<221> misc_feature
<223> hVL3.O-F [primer anterior]
<4 0 0 > 46
cccaagctcc tgatctatga cacttccaag ctg
<210 > 47 <211 > 42 <212 > DNA <213 > Homo
<22 0 >
<221> misc_feature
<223> hVL3.O-R [primer reverso]
<400> 47
agtgtcatag atcaggagct tgggggcctg gtcgggcttc tg
<210 > 48 <211 > 45 <212 > DNA <213 > Homo
<220>
<221> misc_feature
<223> hVL4.O-F [primer anterior]
<4 0 0 > 48
gacgcgaatt cagacgtggt gatgacccag tctccagcat tcctg
<210> 49 <211> 24 <212 > DNA <213> Homo Sapiens
<220>
<221> misc_feature
<223> hVH2.O-F [primer anterior]
<400> 49
gtgaccatca gcaaggacaa cagc 24
<210 > 50
<211> 45
<212 > DNA
<213> Homo Sapiens
<220 >
<221> misc_feature
<223> hVH2.O-R [primer reverso]
<400> 50
gctgttgtcc ttgctgatgg tcacgcggga catgagagcg ctgtt 45
<210> 51
<211> 27
<212 > DNA
<213> Homo Sapiens
<220 >
<221> misc_feature
<223> hVH5.0-F [primer anterior]
<400 > 51
atcggcgtga tatgggctcg cggcttc 27
<210 > 52
<211> 45
<212 > DNA
<213> Homo Sapiens
<220>
<221> misc_feature
<223> hVH5.0-R [primer reverso]
<400> 52
gccgcgagcc catatcacgc cgatccactc caggcccttg cctgg
45 <210> 53
<211> 24
<212> DNA
<213> Homo Sapiens
<220>
<221> misc_feature
<223> hVH6.O-F [primer anterior]
<400> 53
atatgggctc gcggcttcac aaac 24
<210> 54
<211> 24
<212> DNA
<213> Homo Sapiens
<220>
<221> misc_feature
<223> hVH6.0-R [primer reverso]
<400> 54
gtttgtgaag ccgcgagccc atat 24
<210 > 55
<211> 45
<212 > DNA
<213> Homo Sapiens
<220>
<221> misc_feature
<223> hVH7.O-F [primer anterior]
<400> 55
gccgcggaca ccgccgtgta ctactgcgcc agagccaacg acggg 45
<210> 56
<211> 27
<212> DNA
<213> Homo Sapiens
<22O> <221> misc_feature
<223> hVH7.0-R [primer reverso]
<400> 56
gtagtacacg gcggtgtccg cggcggt 2 7
<210> 57
<211> 27
<212> DNA
<213> Homo Sapiens
<220>
<221> misc_feature
<223> hVH8.O-F [primer anterior]
<400> 57
atatccaact atggcatcca ctgggtt 27
<210> 58
<211> 48
<212 > DNA
<213> Homo Sapiens
<220>
<221> misc_feature
<223> hVH8.0-R [primer reverso]
<400> 58
ccagtggatg ccatagttgg atatgctaaa tccagagacg gtacaggt 48
<210> 59
<211> 45
<212> DNA
<213> Homo Sapiens
<220>
<221> misc_feature
<223> hVL2.O-R [primer reverso]
<400> 59
cagcttggaa gtgtcataga tcaatttctt gggggcctgg tcggg
45 <210 > 60 <211 > 45 <212 > DNA <213 > Homo
<220>
<221> misc_feature
<223> hVL5.O-F [primer anterior]
<400> 60
gacgcgaatt cagacttcgt gctgacccag tctccagcat tcctg 45
<210> 61
<211> 45
<212> DNA
<213> Homo Sapiens
<220>
<221> misc_feature
<223> hVL6.O-F [primer anterior]
<4 0 0 > 61
gacgcgaatt cacagttcgt gatgacccag tctccagcat tcctg 45
<210 > 62 <211 > 45 <212 > DNA <213 > Homo
<220>
<221> misc_feature
<223> hVL7.O-F [primer anterior]
<4 0 0 > 62
gacgcgaatt cagacttcgt gatgacccag tctccagcat tcctg 45
<210 > 63
<211> 27
<212 > DNA
<213> Homo Sapiens
<220>
<221> misc feature <223> hVL8.O-F [primer anterior] <400> 63
ttcaccttca ccatcagcag cctggag 27
<210 > 64
<211> 48
<212 > DNA
<213> Homo Sapiens
<220>
<221> misc_feature
<223> hVL8.O-R [primer reverso]
<4 0 0 > 64
ctccaggctg ctgatggtga aggtgaagtc ggtgccgctg ccgctgcc 48
<210> 65
<211> 28
<212 > DNA
<213> Homo Sapiens
<220>
<221> misc_feature
<223> hLCQ3-F [primer anterior]
<4 0 0 > 65
ccaatcaagc gtgaactaca ttcactgg 28
<210 > 66
<211> 48
<212 > DNA
<213> Homo Sapiens
<2 2 0 >
<221> misc_feature
<223> hLCQ3-R [primer reverso]
<4 0 0 > 66
ccagtgaatg tagttcacgc ttgattgggc gctgcaggtg atggtcac 48 <210 > 67 <211 > 23 <212 > DNA <213 > Homo
<220>
<221> misc_feature
<223> Igk-For [primer anterior]
<400> 67
actcctgcta tgggtactgc tgc 23
<210 > 68 <211 > 22 <212 > DNA <213 > Homo
<220 >
<221> misc_feature
<223 > hlgGlFc-CHl-R [primer
<400> 68
gaagtagtcc ttgaccaggc ag
reverso]
22
<210 > 69 <211 > 22 <212 > DNA <213 > Homo
<220>
<221> misc_feature
<223> CI-neo-msc3' [Primer]
<400> 69
tttcactgca ttctagttgt gg 22
<210> 70
<211> 119
<212 > PRT
<213> Homo Sapiens
<220>
<221> MISC FEATURE <223 > hVH2.0 <400> 70
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 15 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr
20 25 30
Gly Ile His Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Val Ile Trp Ala Arg Gly Phe Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Leu Met 50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Asn Gln Val Ser Leu 65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys Ala
85 90 95
Arg Ala Asn Asp Gly Val Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115
<210 > 71
<211> 119
<212 > PRT
<213> Homo Sapiens
<220>
<221> MISC_FEATURE <223 > hVH3.0
<400> 71
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly 1 5
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val 20
Gly Ile His Trp Val Arg Gln Pro
35 40
Gly Val Ile Trp Ala Arg Gly Phe
50 55
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp 65 70
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala
85
Arg Ala Asn Asp Gly Val Tyr Tyr 100
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115
Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 10 15 Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr 25 30 Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 45 Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Leu Met 60 Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu 75 80 Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys Ala 90 95 Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 105 110 <210> 72
<211> 119
<212> PRT
<213> Homo Sapiens
<220>
<221> MIS C_FEATURE <223> hVH4.0
<400> 72
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 15 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr
20 25 30
Gly Ile His Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Val Ile Trp Ala Arg Gly Phe Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Leu Met
50 55 60
Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Asn Gln Val Ser Leu 65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys Ala
85 90 95
Arg Ala Asn Asp Gly Val Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115
<210> 73
<211> 119
<212 > PRT
<213> Homo Sapiens
<22 0 >
<221> MISC_FEATURE <223 > hVH5.0
<4 00 > 73 Gln Val Gln Leu Gln 1 5
Thr Leu Ser Leu Thr 20
Gly Ile His Trp Val 35
Gly Val Ile Trp Ala 50
Ser Arg Leu Thr Ile 65
Glu Ser Gly Pro Gly
10
Cys Thr Val Ser Gly 25
Arg Gln Pro Pro Gly 40
Arg Gly Phe Thr Asn 55
Ser Lys Asp Asn Ser 70
Leu Val Lys Pro Ser Glu
15
Phe Ser Leu Thr Asn Tyr 30
Lys Gly Leu Glu Trp Ile 45
Tyr Asn Ser Ala Leu Met 60
Lys Asn Gln Val Ser Leu 75 80 Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys Ala
85 90 95
Arg Ala Asn Asp Gly Val Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115
<210> 74
<211> 119
<212 > PRT
<213> Homo Sapiens
<220>
<221> MISC_FEATURE <2 2 3 > hVH6.0
<4 0 0 > 74 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu 20 Thr Cys Thr Val Ser 25 Gly Phe Ser Leu Thr 30 Asn Tyr Gly Ile His 35 Trp Val Arg Gln Pro 40 Pro Gly Lys Gly Leu 45 Glu Trp Ile Gly Val Ile Trp Ala Arg Gly Phe Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Leu Met 50 55 60 Ser Arg Val Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Asn Gln Val Ser Leu 65 70 75 80 Lys Leu Ser Ser Val 85 Thr Ala Ala Asp Thr 90 Ala Val Tyr Phe Cys 95 Ala Arg Ala Asn Asp Gly Val Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val 115 Thr Val Ser Ser
<210> 75
<211> 119
<212 > PRT
<213> Homo Sapiens
<2 2 0 >
<221> MISC_FEATURE <223> hVH7.0
<4 00 > 75
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 15 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val 20
Gly Ile His Trp Val Arg Gln Pro
35 40
Gly Val Ile Trp Ala Arg Gly Phe
50 55
Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp 65 70
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala
85
Arg Ala Asn Asp Gly Val Tyr Tyr 100
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115
Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr 25 30 Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 45 Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Leu Met 60 Asn Ser Lys Asn Gln Val Ser Leu 75 80 Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 90 95 Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 105 110
<210> 76
<211> 119
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> MISC_FE <223 > hVH8.0
<400> 76
Gln Val Gln Leu 1
Thr Leu Ser Leu 20
Gly Ile His Trp 35
Gly Val Ile Trp 50
Ser Arg Leu Thr 65
Lys Leu Ser Ser
Arg Ala Asn Asp 100
Thr Leu Val Thr 115
Gln Glu Ser Gly 5
Thr Cys Thr Val
Val Arg Gln Pro 40
Ala Arg Gly Phe 55
Ile Ser Lys Asp 70
Val Thr Ala Ala 85
Gly Val Tyr Tyr Val Ser Ser
Pro Gly Leu Val 10
Ser Gly Phe Ser 25
Pro Gly Lys Gly
Thr Asn Tyr Asn 60
Asn Ser Lys Asn 75
Asp Thr Ala Val 90
Ala Met Asp Tyr 105
Lys Pro Ser Glu 15
Ile Ser Asn Tyr 30
Leu Glu Trp Leu 45
Ser Ala Leu Met
Gln Phe Ser Leu 80
Tyr Phe Cys Ala 95
Trp Gly Gln Gly 110
<210> 77
<211> 119
<212> PRT
<213> Homo Sapiens
<220> <221> MISC_FEATURE
<223> hVH9.O Posição 48 pode ser Leucina ou Isoleucina <400> 77
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 15 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr
20 25 30
Gly Ile His Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Val Ile Trp Ala Arg Gly Phe Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Leu Met
50 55 60
Ser Arg Leu Thr Ile Ser Val Asp Asn Ser Lys Asn Gln Val Ser Leu 65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys Ala
85 90 95
Arg Ala Asn Asp Gly Val Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115
<210 > 78
<211> 119
<212 > PRT
<213> Homo Sapiens
<2 2 0 >
<221> MISC_FE <223 > hVHIO.O
<4 0 0 > 78 Gln Val Gln Leu 1
Thr Leu Ser Leu 20
Gly Ile His Trp 35
Gly Val Ile Trp 50
Ser Arg Leu Thr 65
Lys Leu Ser Ser
Arg Ala Asn Asp 100
Thr Leu Val Thr 115
Gln Glu Ser Gly 5
Thr Cys Thr Val
Val Arg Gln Pro 40
Ala Arg Gly Phe 55
Ile Ser Lys Asp 70
Val Thr Ala Ala 85
Gly Val Tyr Tyr Val Ser Ser
Pro Gly Leu Val 10
Ser Gly Phe Ser 25
Pro Gly Lys Gly
Thr Asn Tyr Asn 60
Thr Ser Lys Asn 75
Asp Thr Ala Val 90
Ala Met Asp Tyr 105
Lys Pro Ser Glu 15
Leu Thr Asn Tyr 30
Leu Glu Trp Leu 45
Ser Ala Leu Met
Gln Val Ser Leu 80
Tyr Phe Cys Ala 95
Trp Gly Gln Gly 110 <210> 79
<211> 119
<212 > PRT
<213> Homo Sapiens
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> hVHll.O Posição 48 pode ser Leucina ou Isoleucina <400> 79
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 15 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr
20 25 30
Gly Ile His Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Val Ile Trp Ala Arg Gly Phe Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Leu Met
50 55 60
Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu 65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys Ala
85 90 95
Arg Ala Asn Asp Gly Val Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115
<210> 80
<211> 106
<212 > PRT
<213> Homo Sapiens
<220>
<221> MISC_FEATURE <223> hVL2.0
<400> 80
Gln Phe Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Phe Leu Ser Val Thr Pro Gly 15 10 15
Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Asn Ser Ser Val Asn Tyr Ile
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ala Pro Lys Lys Leu Ile Tyr
35 40 45
Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Thr Thr Asn Pro Leu Thr
85 90 95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 81
<211> 106
<212 > PRT
<213> Homo Sapiens
<22 0 >
<221> MIS C_FEATURE <223 > hVL3.0
<400> 81
Gln Phe Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Phe Leu Ser Val Thr Pro Gly 15 10 15
Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Asn Ser Ser Val Asn Tyr Ile
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
35 40 45
Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ala Glu 65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Thr Thr Asn Pro Leu Thr
85 90 95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105
<210> 82
<211> 106
<212 > PRT
<213> Homo Sapiens
<220>
<221> MIS C_FEATURE <223> hVL4.0
<400> 82
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Phe Leu Ser Val Thr Pro Gly 15 10 15
Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Asn Ser Ser Val Asn Tyr Ile 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp 35 40
Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly 50 55
Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Phe 65 70
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln 85
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu 100
Gln Ala Pro Lys Lys Trp Ile Tyr 45
Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser 60
Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ala Glu 75 80
Gln Trp Thr Thr Asn Pro Leu Thr 90 95
Ile Lys 105
<210 > 83
<211> 106
<212 > PRT
<213> Homo Sapiens
<220>
<221> MIS C_FEATURE
<223 > hVL5.0
<400> 83
Asp Phe Val Leu Thr Gln Ser Pro 1 5
Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Ser 20
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp 35 40
Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly 50 55
Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Phe 65 70
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln 85
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu 100
Ala Phe Leu Ser Val Thr Pro Gly 10 15
Ala Asn Ser Ser Val Asn Tyr Ile 25 30
Gln Ala Pro Lys Lys Trp Ile Tyr 45
Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser 60
Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ala Glu 75 80
Gln Trp Thr Thr Asn Pro Leu Thr 90 95
Ile Lys 105
<210> 84
<211> 106
<212> PRT
<213> Homo Sapiens
<220>
<221> MIS C_FEATURE <223> hVL6.0
<400>
84 Gln Phe Val Met Thr Gln Ser Pro 1 5
Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Ser 20
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp
35 40
Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly
50 55
Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Phe 65 70
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln
85
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu 100
Ala Phe Leu Ser Val Thr Pro Gly
10 15
Ala Asn Ser Ser Val Asn Tyr Ile 25 30
Gln Ala Pro Lys Lys Trp Ile Tyr
45
Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser 60
Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ala Glu
75 80
Gln Trp Thr Thr Asn Pro Leu Thr
90 95
Ile Lys 105
<210 > 85
<211> 106
<212 > PRT
<213> Homo Sapiens
<220>
<221> MISC_FEATURE <223> hVL7.0
<400> 85
Asp Phe Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Phe Leu Ser Val Thr Pro Gly 1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Asn Ser Ser Val Asn Tyr Ile
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ala Pro Lys Lys Trp Ile Tyr
35 40 45
Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ala Glu 65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Thr Thr Asn Pro Leu Thr
85 90 95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105
<210 > 86
<211> 106
<212 > PRT
<213> Homo Sapiens
<220>
<221> MISC_FEATURE <223 > hVL8.0 <400> 86
Gln Phe Val Leu Thr Gln Ser Pro 1 5
Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Ser 20
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp
35 40
Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly
50 55
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe 65 70
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln
85
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu 100
Ala Phe Leu Ser Val Thr Pro Gly
10 15
Ala Asn Ser Ser Val Asn Tyr Ile 25 30
Gln Ala Pro Lys Lys Trp Ile Tyr
45
Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser 60
Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ala Glu
75 80
Gln Trp Thr Thr Asn Pro Leu Thr
90 95
Ile Lys 105
<210 > 87
<211> 106
<212 > PRT
<213> Homo Sapiens
<220>
<221> MIS C_FEATURE <223 > hVL9.0
<400> 87 Gln Phe Val Leu Thr 1 5
Glu Lys Val Thr Ile 20
His Trp Tyr Gln Gln 35
Asp Thr Ser Lys Leu 50
Gly Ser Gly Thr Asp 65
Asp Ala Ala Thr Tyr
85
Phe Gly Gln Gly Thr 100
Gln Ser Pro Ala Phe
10
Thr Cys Ser Ala Asn 25
Lys Pro Asp Gln Ala 40
Ala Ser Gly Val Pro 55
Tyr Thr Phe Thr Ile 70
Tyr Cys Gln Gln Trp
90
Lys Val Glu Ile Lys 105
Leu Ser Val Thr Pro Gly
15
Ser Ser Val Asn Tyr Ile 30
Pro Lys Lys Trp Ile Lys 45
Ser Arg Phe Ser Gly Ser 60
Ser Ser Leu Glu Ala Glu 75 80
Thr Thr Asn Pro Leu Thr
95
<210 > 88
<211> 106
<212 > PRT
<213> Homo Sapiens
<22 0 > <221> MISC_FEATURE <223 > hVLlO.O
<400> 88
Asp Phe Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Phe Leu Ser Val Thr Pro Gly 1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Asn Ser Ser Val Asn Tyr Ile
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ala Pro Lys Lys Leu Ile Tyr
35 40 45
Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ala Glu 65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Thr Thr Asn Pro Leu Thr
85 90 95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105
<210> 89
<211> 106
<212 > PRT
<213> Homo Sapiens
<2 2 O >
<221> MIS C_FEATURE <223 > hVLll.O
<400> 89
Asp Phe Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Phe Leu Ser Val Thr Pro Gly 15 10 15
Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Asn Ser Ser Val Asn Tyr Ile
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ala Pro Lys Lys Trp Ile Tyr
35 40 45
Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ala Glu 65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Thr Thr Asn Pro Leu Thr
85 90 95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105
<210> 90
<211> 106
<212 > PRT
<213> Homo Sapiens <220>
<221> MIS C_FEATURE <223> hVLl.OQ
<4OO> 90
Gln Phe Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Phe Leu Ser Val Thr Pro Gly 1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Gln Ser Ser Val Asn Tyr Ile
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ala Pro Lys Lys Trp Ile Tyr
35 40 45
Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ala Glu 65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Thr Thr Asn Pro Leu Thr
85 90 95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105
<210> 91
<211> 106
<212> PRT
<213> Homo Sapiens
<22O>
<221> MISC_FEATURE <223> hVLlO.OQ
<4O0> 91 Asp Phe Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Phe Leu Ser Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr 20 Ile Thr Cys Ser Ala 25 Gln Ser Ser Val Asn 30 Tyr Ile His Trp Tyr 35 Gln Gln Lys Pro Asp 40 Gln Ala Pro Lys Lys 45 Leu Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ala Glu 65 70 75 80 Asp Ala Ala Thr Tyr 85 Tyr Cys Gln Gln Trp 90 Thr Thr Asn Pro Leu 95 Thr Phe Gly Gln Gly 100 Thr Lys Val Glu Ile 105 Lys
<210> 92 <211> 106 <212> PRT <213> Homo Sapiens
<220>
<221> MIS C_FEATURE <223> hVL12.OQ
<400> 92
Asp Phe Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Phe Leu Ser Val Thr Pro Gly 15 10 15
Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Gln Ser Ser Val Asn Tyr Ile
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ala Pro Lys Lys Leu Ile Tyr
35 40 45
Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ala Glu 65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Thr Thr Asn Pro Leu Thr
85 90 95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105
<210 > 93
<211> 222
<212 > PRT
<213> Rattus rattus
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> Proteína do domínio I da integrina alfa-2 de rato <4 0 0 > 93
Ser Pro Asp Phe Gln Ser Leu Thr Ser Phe Ser Pro Ala Val Gln Asp 1 5 10 15
Val Val Val Val Cys Asp Glu Ser Asn Ser Ile Tyr Pro Trp Glu Ala
20 25 30
Val Lys Asn Phe Leu Glu Lys Phe Val Gln Gly Leu Asp Ile Gly Pro
35 40 45
Lys Lys Thr Gln Val Ala Leu Ile Gln Tyr Ala Asn Asp Pro Arg Val
50 55 60
Val Phe Asn Leu Thr Thr Tyr Lys Asn Lys Glu Asp Met Val Gln Ala 65 70 75 80
Thr Ser Glu Thr Arg Gln Tyr Gly Gly Asp Leu Thr Asn Thr Phe Lys
85 90 95
Ala Ile Gln Phe Ala Arg Asp Ile Ala Tyr Leu Pro Glu Ser Gly Gly
100 105 110
Arg Pro Gly Ala Thr Lys Val Met Val Val Val Thr Asp Gly Glu Ser 115 120 125 His Asp Gly Ser 130
Glu Ile Leu Arg 145
Ala Leu Asp Thr
Thr Pro Thr Glu 180
Leu Glu Lys Ala 195
Thr Val Gln Gly 210
Lys Leu Gln Thr 135
Phe Gly Ile Ala 150
Lys Asn Leu Ile 165
Arg Tyr Phe Phe
Gly Thr Leu Gly 200
Gly Asp Asn Phe 215
Val Ile Gln Gln 140
Val Leu Gly Tyr 155
Lys Glu Ile Lys 170
Asn Val Ala Asp 185
Glu His Ile Phe
Gln Met Glu Met 220
Cys Asn Asp Asp
Leu Asn Arg Asn 160
Ala Ile Ala Ser 175
Glu Ala Ala Leu 190
Ser Ile Glu Gly 205
Ala Gln
<210 > 94
<211> 228
<212 > PRT
<213 > Mus
musculus
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> Proteína do domínio I da integrina alfa-2 de camundongo
<400> 94 Ser Pro Asp Phe Gln Phe Leu Thr Ser Phe Ser Pro Ala Val Gln Ala 1 5 10 15 Cys Pro Ser Leu Val Asp Val Val Val Val Cys Asp Glu Ser Asn Ser 20 25 30 Ile Tyr Pro Trp Glu Ala Val Lys Asn Phe Leu Val Lys Phe Val Thr 35 40 45 Gly Leu Asp Ile Gly Pro Lys Lys Thr Gln Val Ala Leu Ile Gln Tyr 50 55 60 Ala Asn Glu Pro Arg Ile Ile Phe Asn Leu Asn Asp Phe Glu Thr Lys 65 70 75 80 Glu Asp Met Val Gln Ala Thr Ser Glu Thr Arg Gln His Gly Gly Asp 85 90 95 Leu Thr Asn Thr Phe Arg Ala Ile Glu Phe Ala Arg Asp Tyr Ala Tyr 100 105 110 Ser Gln Thr Ser Gly Gly Arg Pro Gly Ala Thr Lys Val Met Val Val 115 120 125 Val Thr Asp Gly Glu Ser His Asp Gly Ser Lys Leu Lys Thr Val Ile 130 135 140 Gln Gln Cys Asn Asp Asp Glu Ile Leu Arg Phe Gly Ile Ala Val Leu 145 150 155 160 Gly Tyr Leu Asn Arg Asn Ala Leu Asp Thr Lys Asn Leu Ile Lys Glu 165 170 175 Ile Lys Ala Ile Ala Ser Thr Pro Thr Glu Arg Tyr Phe Phe Asn Val 180 185 190 Ser Asp Glu Ala Ala Leu Leu Glu Lys Ala Gly Thr Leu Gly Glu Gln 195 200 205 Ile Phe Ser Ile Glu Gly Thr Val
210 215
Glu Met Ser Gln 225
Gln Gly Gly Asp Asn Phe Gln Met 220
<210> 95
<211> 26
<212 > DNA
<213> Homo Sapiens
<220>
<221> misc_feature <223> Kappa-F
<4 0 0 > 95
cgaactgtgg ctgcaccatc tgtctt 26
<210 > 96
<211> 41
<212 > DNA
<213> Homo Sapiens
<220>
<221> misc_feature <223 > Kappa-BamHI-R
<4 00 > 96
aattcggatc cttactaaca ctctcccctg ttgaagctct t 41
<210 > 97
<211> 40
<212 > DNA
<213> Homo Sapiens
<220>
<221> misc_feature <223 > VH12.0- (K71V) -F
<4 0 0 > 97
gcctgaccat cagcgtggac aacagcaaga accaggtgag 40
<210 > 98 <211> 40 <212 > DNA
<213> Homo Sapiens
<220>
<221> misc_feature <223 > VH12.0(K71V) -R
<400> 98
ctcacctggt tcttgctgtt gtccacgctg atggtcaggc
<210 > 99 <211 > 40 <212 > DNA <213 > Homo
<22 0 >
<221> misc_feature <223 > VHl3.0-(N73T) -F
<400 > 99
ctgaccatca gcaaggacac cagcaagaac caggtgagcc
<210 > 100 <211> 40 <212 > DNA <2 13 > Homo
<220 >
<221> misc_feature <223 > VH13.0-(N73T)R
<400> 100
ggctcacctg gttcttgctg gtgtccttgc tgatggtcag
<210 > 101
<211> 41
<212 > DNA
<213> Homo
<220>
<221> misc
<2 2 3 > VH14
Sapiens
feature 0-(V78F)-F
<400> 101 gcaaggacaa cagcaagaac cagtttagcc tgaagctgag c 41
<210> 102
<211> 41
<212 > DNA
<213> Homo Sapiens
<22 0 >
<221> misc_feature <223 > VH14.0 (V78F)-R
<400> 102
gctcagcttc aggctaaact ggttcttgct gttgtccttg c 41
<210 > 103
<211> 648
<212 > DNA
<213> Macaca
fascicularis
<220>
<221> misc_feature
<223> Domínio I da alfa-2 de Cynomolugus
<4 O O > 103
agtcctgatt ttcagctctc agccagcttc tcacctgcaa ctcagccctg cccttccctc 60
atagatgttg tggttgtgtg tgatgaatca aatagtattt atccttggga tgcagtagac 120
aattttttgg aaaaatttgt acaaggcctg gatataggcc ccacaaagac acaggtgggg 180
ttaattcagt atgccaataa tccaagagtt gtgtttaact tgaacacata taaaaccaaa 240
gaagaaatga ttgtagcaac atcccagaca tcccaatatg gtggggacct cacaaacaca 3 00
ttcggagcaa ttcaatatgc aagaaaatat gcctattcag cagcttctgg tgggcgacga 360
agtgctacga aagtaatggt agttgtaact gacggtgaat cacatgatgg ttcaatgttg 420
aaagctgtga ttgatcaatg caaccatgac aatatactga ggtttggcat agcagttctt 480
gggtacttaa acagaaacgc ccttgatact aaaaatttaa taaaagaaat aaaagcgatc 540
gctagtattc caacagaaag atactttttc aatgtgtctg atgaagcagc tctactagaa 600
aaggctggga cattaggaga acaaattttc agcattgaag gtactgtt 648
<210 > 104 <211> 648 <212 > DNA
<213> Macaca mulatta
<220>
<221> misc_feature
<223> Domínio I da alfa-2 de Rhesus
<4 0 0 > 104 agtcctgatt ttcagctctc agccagcttc tcacctgcaa ctcagccctg cccttccctc 60
atagatgttg tggttgtgtg tgatgaatca aatagtattt atccttggga tgcagtaaag 120
aattttttgg aaaaatttgt acaaggcctg gatataggcc ccacaaagac acaggtgggg 180
ttaattcagt atgccaataa tccaagagtt gtgtttaact tgaacacata taaaaccaaa 240
gaagaaatga ttgtagcaac atcccagaca tcccaatatg gtggggacct cacaaacaca 300
ttcggagcaa ttcaatatgc aagaaaatat gcctattcag cagcttctgg tgggcgacga 360
agtgctacga aagtaatggt agttgtaact gacggtgaat cacatgatgg ttcaatgttg 420
aaagctgtga ttgatcaatg caaccatgac aatatactga ggtttggcat agcagttctt 480
gggtacttaa acagaaacgc ccttgatact aaaaatttaa taaaagaaat aaaagcgatc 540
gctagtattc caacagaaag atactttttc aatgtgtctg atgaagcagc tctactagaa 600
aaggctggga cattaggaga acaaattttc agcattgaag gtactgtt 648
<210> 105
<211> 997
<212 > DNA
<213> Homo Sapiens
<220>
<221> misc_feature
<223> Região constante de IgG4
<220>
<221> CDS
<222 > (1) . . (978)
<4 0 0 > 105
tcc acc aag ggc cca tcc gtc ttc ccc ctg gcg ccc tgc tcc agg age 48
Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser
15 10 15
acc tcc gag age aca gcc gcc ctg ggc tgc ctg gtc aag gac tac ttc 96
Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe
20 25 30
ccc gaa ccg gtg acg gtg tcg tgg aac tca ggc gcc ctg acc age ggc 144
Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly
35 40 45
gtg cac acc ttc ccg gct gtc cta cag tcc tca gga ctc tac tcc ctc 192
Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu
50 55 60
age age gtg gtg acc gtg ccc tcc age age ttg ggc acg aag acc tac 240
Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr 65 70 75 80
acc tgc aac gta gat cac aag ccc age aac acc aag gtg gac aag aga 288
Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg
85 90 95
gtt gag tcc aaa tat ggt ccc cca tgc cca tca tgc cca gea cct gag 336
Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro Glu
100 105 110
ttc ctg ggg gga cca tca gtc ttc ctg ttc ccc cca aaa ccc aag gac 384
Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp 115 120 125 act CtC atg ate tcc cgg acc cct gag gtc acg tgc gtg gtg gtg gac 432 Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp 130 135 140 gtg age cag gaa gac CCC gag gtc cag ttc aac tgg tac gtg gat ggc 480 Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly 145 150 155 160 gtg gag gtg cat aat gcc aag aca aag cc g cgg gag gag cag ttc aac 528 Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn 165 170 175 age acg tac cgt gtg gtc age gtc etc acc gtc ctg cac cag gac tgg 576 Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp 180 185 190 ctg aac ggc aag gag tac aag tgc aag gtc tcc aac aaa ggc etc ccg 624 Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro 195 200 205 tcc tcc ate gag aaa acc ate tcc aaa gcc aaa ggg cag CCC cga gag 672 Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu 210 215 220 cca cag gtg tac acc ctg CCC cca tcc cag gag gag atg acc aag aac 720 Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn 225 230 235 240 cag gtc age ctg acc tgc ctg gtc aaa ggc ttc tac CCC age gac ate 768 Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile 245 250 255 gcc gtg gag tgg gag age aat ggg cag ccg gag aac aac tac aag acc 816 Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr 260 265 270 acg cct CCC gtg ctg gac tcc gac ggc tcc ttc ttc CtC tac age agg 864 Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg 275 280 285 cta acc gtg gac aag age agg tgg cag gag ggg aat gtc ttc tca tgc 912 Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys 290 295 300 tcc gtg atg cat gag gct ctg cac aac cac tac aca cag aag age ctc 960 Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu 305 310 315 320 tcc ctg tet ctg ggt aaa tgataggatc cgcggccgc 997 Ser Leu Ser Leu Gly Lys 325 <210 > 106 <211> 326 <212 > PRT <213 > Homo Sapiens <4 00 > 106 Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser 1 5 10 15 Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe 20 25 30 Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly
35 40 45 Val His Thr Phe 50
Ser Ser Val Val 65
Thr Cys Asn Val
Val Glu Ser Lys 100
Phe Leu Gly Gly 115
Thr Leu Met Ile 130
Val Ser Gln Glu 145
Val Glu Val His
Ser Thr Tyr Arg 180
Leu Asn Gly Lys 195
Ser Ser Ile Glu 210
Pro Gln Val Tyr 225
Gln Val Ser Leu
Ala Val Glu Trp 260
Thr Pro Pro Val 275
Leu Thr Val Asp 290
Ser Val Met His 305
Ser Leu Ser Leu
Pro Ala Val Leu 55
Thr Val Pro Ser 70
Asp His Lys Pro 85
Tyr Gly Pro Pro
Pro Ser Val Phe 120
Ser Arg Thr Pro 135
Asp Pro Glu Val 150
Asn Ala Lys Thr 165
Val Val Ser Val
Glu Tyr Lys Cys 200
Lys Thr Ile Ser 215
Thr Leu Pro Pro 230
Thr Cys Leu Val 245
Glu Ser Asn Gly
Leu Asp Ser Asp 280
Lys Ser Arg Trp 295
Glu Ala Leu His
310 Gly Lys 325
Gln Ser Ser Gly 60
Ser Ser Leu Gly 75
Ser Asn Thr Lys 90
Cys Pro Ser Cys 105
Leu Phe Pro Pro
Glu Val Thr Cys 140
Gln Phe Asn Trp 155
Lys Pro Arg Glu 170
Leu Thr Val Leu 185
Lys Val Ser Asn
Lys Ala Lys Gly 220
Ser Gln Glu Glu 235
Lys Gly Phe Tyr 250
Gln Pro Glu Asn 265
Gly Ser Phe Phe
Gln Glu Gly Asn 300
Asn His Tyr Thr 315
Leu Tyr Ser Leu
Thr Lys Thr Tyr 80
Val Asp Lys Arg 95
Pro Ala Pro Glu 110
Lys Pro Lys Asp 125
Val Val Val Asp
Tyr Val Asp Gly 160
Glu Gln Phe Asn 175
His Gln Asp Trp 190
Lys Gly Leu Pro 205
Gln Pro Arg Glu
Met Thr Lys Asn 240
Pro Ser Asp Ile 255
Asn Tyr Lys Thr 270
Leu Tyr Ser Arg 285
Val Phe Ser Cys
Gln Lys Ser Leu 320
<210> 107
<211> 648
<212 > DNA
<213> HOMO SAPIENS
<220>
<221> misc_feature
<223> Domínio 1 da alfa-2 humana
<4 0 0 > 107
agtcctgatt ttcagctctc agccagcttc tcacctgcaa ctcagccctg cccttccctc 60
atagatgttg tggtggtgtg tgatgaatca aatagtattt atccttggga tgcagtaaag 120
aattttttgg aaaaatttgt acaaggcctg gatataggcc ccacaaagac acaggtgggg 180
ttaattcagt atgccaataa tccaagagtt gtgtttaact tgaacacata taaaaccaaa 240 gaagaaatga ttcggagcaa agtgctacga aaagctgtga gggtacttaa gctagtattc aaggctggga
ttgtagcaac ttcaatatgc aagtaatggt ttgatcaatg acagaaacgc caacagaaag cattaggaga
atcccagaca aagaaaatat agttgtaact caaccatgac ccttgatact atactttttc acaaattttc
tcccaatatg gcctattcag gacggtgaat aatatactga aaaaatttaa aatgtgtctg agcattgaag
gtggggacct cacaaacaca 300 cagcttctgg tgggcgacga 360 cacatgatgg ttcaatgttg 420 ggtttggcat agcagttctt 480 taaaagaaat aaaagcgatc 540 atgaagcagc tctactagaa 600 gtactgtt 648
<210 > 108
<211> 106
<212 > PRT
<213> Homo Sapiens
<22 0 >
<221> MISC_FEATURE <223 > hVL12.0
<4 0 0 > 108 Asp Phe Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Phe Leu Ser Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr 20 Ile Thr Cys Ser Ala 25 Asn Ser Ser Val Asn 30 Tyr Ile His Trp Tyr 35 Gln Gln Lys Pro Asp 40 Gln Ala Pro Lys Lys 45 Leu Ile Tyr Asp Thr 50 Ser Lys Leu Ala Ser 55 Gly Val Pro Ser Arg 60 Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ala Glu 65 70 75 80 Asp Ala Ala Thr Tyr 85 Tyr Cys Gln Gln Trp 90 Thr Thr Asn Pro Leu 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210 > 109
<211> 119
<212 > PRT
<213> Homo Sapiens
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> hVH12.0 Posição 48 pode ser Leucina ou Isoleucina <400> 109
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr 20 25 30 Gly Ile His Trp Ile Arg Gln Pro
35 40
Gly Val Ile Trp Ala Arg Gly Phe
50 55
Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp 65 70
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala
85
Arg Ala Asn Asp Gly Val Tyr Tyr 100
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115
Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 45
Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Leu Met 60
Asn Ser Lys Asn Gln Val Ser Leu
75 80
Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
90 95
Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 105 HO
<210 > 110 <211> 119 <212 > PRT <213> Homo Sapiens
<220>
<221> MISC_FEATURE <223> hVH13.0
<400> 110
Gln Val Gln Leu 1
Thr Leu Ser Leu 20
Gly Ile His Trp 35
Gly Val Ile Trp 50
Ser Arg Val Thr 65
Lys Leu Ser Ser
Arg Ala Asn Asp 100
Thr Leu Val Thr 115
Gln Glu Ser Gly 5
Thr Cys Thr Val
Val Arg Gln Pro 40
Ala Arg Gly Phe 55
Ile Ser Lys Asp 70
Val Thr Ala Ala 85
Gly Val Tyr Tyr Val Ser Ser
Pro Gly Leu Val 10
Ser Gly Phe Ser 25
Pro Gly Lys Gly
Thr Asn Tyr Asn 60
Asn Ser Lys Asn 75
Asp Thr Ala Val 90
Ala Met Asp Tyr 105
Lys Pro Ser Glu 15
Leu Thr Asn Tyr 30
Leu Glu Trp Ile 45
Ser Ala Leu Met
Gln Val Ser Leu 80
Tyr Tyr Cys Ala 95
Trp Gly Gln Gly 110
<210 > 111
<211> 119 <212 > PRT <213> Homo Sapiens
<220>
<221> MISC FEATURE <223> hVH14.0 Posição 48 pode ser Leucina ou Isoleucina <400> 111 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr 20 25 30 Gly Ile His Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Gly Val Ile Trp Ala Arg Gly Phe Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Leu Met 50 55 60 Ser Arg Val Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Asn Gln Val Ser Leu 65 70 75 80 Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Ala Asn Asp Gly Val Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
<210> 112
<211> 10
<212> PRT
<213> Homo Sapiens
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> LCDRl [N26Q]
<400> 112
Ser Ala Gln Ser Ser Val Asn Tyr Ile His 15 10
<210> 113
<211> 681
<212> DNA
<213> Rattus rattus
<220>
<221> misc_feature
<223> Domínio I da alfa-2 de ratos
<400> 113
agtccagact ttcagtcgtt gacaagcttc tcacctgcag ttcaagcttg cccttccctc 60 gtagatgtcg tagttgtctg tgatgaatca aacagtattt atccctggga agcagtaaag 120 aattttttgg aaaagtttgt gcaaggcctg gatataggac ctaaaaagac acaggtggcg 180 ttaattcaat atgccaacga cccaagagtt gtctttaact tgaccactta caaaaacaaa 240 gaagatatgg ttcaggccac atccgagacg cgccagtatg gtggggacct cacaaacacc 300
ttcaaggcta tccaatttgc aagagacatt gcttatttac cggagtctgg cgggcgccca 360
ggtgctacaa aagtcatggt agttgtgact gatggggaat cccatgatgg gtcgaagctg 420
caaactgtga tccagcaatg caatgatgac gagatactga ggtttggcat agcggttctt 480
ggatatttaa acagaaatgc tcttgatact aaaaatctaa tcaaagaaat taaagcaatc 540
gctagcactc caacggagag gtactttttc aatgtggccg atgaggcggc tcttctggag 600
aaagctggca ctctagggga gcacatattc agcattgaag gcactgttca aggaggagac 660
aacttccaga tggaaatggc a 681
<210> 114
<211> 648
<212> DNA
<213 > Mus
musculus
<22 0 >
<221> misc_feature
<223> Clone do domínio I de alfa-2 de camundongos
<4 0 0 > 114
agtccagact ttcagttctt gaccagcttt tcacctgcag ttcaggcttg cccttccctc 60
gtggatgttg tagttgtatg tgatgaatca aacagtattt atccttggga agcagtaaag 120
aactttttgg taaagtttgt gacaggcctg gatataggac ctaaaaagac acaggtggcg 180
ttaattcaat atgccaatga gccgagaatt atatttaact tgaacgattt cgaaaccaaa 240
gaggatatgg tccaggccac atctgagacg cgccaacatg gtggggacct cacaaacacc 300
ttcagagcta tcgaattcgc aagagactac gcttattcac agacttctgg cgggcgcccg 360
ggtgctacaa aagtcatggt agttgtgacc gatggcgagt cccatgatgg gtcgaagctg 42 0
aaaactgtga tccagcaatg caatgatgac gagatactga ggttcggcat agcagttctt 480
gggtatttaa acagaaatgc tcttgatact aaaaatttaa tcaaagaaat aaaagcaatt 540
gctagtactc caaccgagag atactttttc aatgtggccg acgaagcggc tcttctggag 600
aaggctggaa ctctagggga gcaaatattc agcattgaag gcactgtt 648
<210> 115
<211> 6
<212 > DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> misc_feature
<223 > Exemplo de seqüência a montante do início da
transcrição de gene
<22 0 >
<221> misc_feature
<222> (2) . . (2)
<223> η is a, c, g, or t
<4 00 > 115
cncaat 6 <210 > 116
<211> 6
<212 > DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> misc_feature
<223> Exemplo de seqüência na extremidade 3'do gene <400> 116
aataaa 6
<210 > 117 <211 > 31 <212 > DNA <213 > Homo
<220>
<221> misc_feature <223> halphal F
<400> 117
ggggatccag tcctgaattt tcagctctca g 31
<210 > 118 <211 > 27 <212 > DNA <213 > Homo
<220>
<221> misc_feature <223> halphal R
<400> 118
gggaattcaa cagtaccttc aatgctg 27
<210 > 119
<211> 19
<212 > DNA
<213> Homo sapiens
<22 0 >
<221> misc feature <223> Primer anterior de domínio I humano <400> 119
ggggatccag tcctgattt 19
<210 > 120 <211 > 18 <212 > DNA <213 > Homo
<220>
<221> misc_feature
<223> Primer reverso de domínio I humano <4 0 0 > 120
ggaattcaac agtacctt 18
<210 > 121 <211 > 29 <212 > DNA <213 > Homo
<220>
<221> misc_feature <223> maIphaI F
<4 0 0 > 121
ggggatccag tccagacttt cagttcttg 29
<210 > 122 <211 > 28 <212 > DNA <213 > Homo
<220>
<221> misc_feature <223> malphal R
<4 0 0 > 122
tgggaattca acagtgcctt caatgctg 28
<210 > 123 <211> 31 <212 > DNA
<213> Homo Sapiens
<220>
<221> misc_feature <223> ralphal F
<400> 123
ggggatccag tccagacttt cagtcgttga c 31
<210> 124
<211> 31
<212> DNA
<213> Homo Sapiens
<220>
<221> misc_feature <223> ralphal R
<400> 124
tgggaattct gccatttcca tctggaagtt g 31
<210> 125 <211> 34 <212> DNA <213> Homo
<220>
<221> misc_feature <223> halphal I21V F
<400> 125
cagccctgcc cttccctcgt agatgttgtg gttg 34
<210> 126
<211> 34
<212 > DNA
<213> Homo Sapiens
<220>
<221> misc_feature <223> halphal I21V R <400> 126
caaccacaac atctacgagg gaagggcagg gctg 34
<210 > 127 <211 > 33 <212 > DNA <213 > Homo
<220>
<221> misc_feature <223> halphal E44V F
<4 OO > 127
cagtaaagaa ttttttggta aaatttgtca agg 33
<210 > 128 <211 > 33 <212 > DNA <213 > Homo
<22 0 >
<221> misc_feature <223> halphal E44V R
<4 0 0 > 128
ccttgacaaa ttttaccaaa aaattcttta ctg 33
<210 > 129 <211 > 35 <212 > DNA <213 > Homo
<22 0 >
<221> misc_feature <223> halphal Q48T F
<4 0 0 > 129
ttttggaaaa atttgtaaca ggcctggata taggc 35
<210 > 130
<211> 35
<212 > DNA
<213> Homo Sapiens <220>
<221> misc_feature <223> halphal Q48T R
<400> 130
gcctatatcc aggcctgtta caaatttttc cgggg
<210> 131 <211> 33 <212> DNA <213> Homo
<220>
<221> misc_feature <223> halphal N67E F
<400 > 131
cagtatgcca atgagccaag agttgtgttt aac
<210> 132 <211> 33 <212> DNA <213> Homo
<220>
<221> misc_feature <223> halphal N67E R
<400 > 132
gttaaacaca actcttggct cattggcata ctg
<210> 133 <211> 34 <212> DNA <213> homo
<220>
<221> misc_feature <223> halphal V70I F
<400> 133
tgccaataat ccaagaattg tgtttaactt gaac <210> 134 <211> 33 <212> DNA <213> Homo
<220>
<221> misc_feature <223> halphal V70I R
<400> 134
gttcaagtta acacaattct tggattattg gca
<210> 135 <211> 34 <212> DNA <213> Homo
<220>
<221> misc_feature <223> halphal V71I F
<400> 135
ccaataatcc aagagttatc tttaacttga acac
<210> 136 <211> 34 <212> DNA <213> Homo
<220>
<221> misc_feature <223> halphal V71I R
<400> 136
gtgttcaagt taaagataac tcttggatta ttgg
<210> 137 <211> 33 <212> DNA <213> Homo
<220> <221> misc feature <223> halphal T76D F <400> 137
gtgtttaact tgaacgacta taaaaccaaa gaa 33
<210> 138 <211> 33 <212> DNA <213> Homo
<220>
<221> misc_feature <223> haplhal T76D R
<400> 138
ttctttggtt ttatagtcgt tcaagttaaa cac 33
<210> 139 <211> 33 <212> DNA <213> Homo
<220>
<221> misc_feature <223> halphal Y77F F
<400> 139
tttaacttga acacatttaa aaccaaagaa gaa 33
<210> 140 <211> 33 <212> DNA <213> Homo
<220>
<221> misc_feature <223> halphal Y77F R
<400> 140
ttcttctttg gttttaaatg tgttcaagtt aaa 33
<210> 141 <211> 33 <212 > DNA
<213> Homo Sapiens
<220>
<221> misc_feature <223> halphal Κ78Ε F
<400 > 141
aacttgaaca catatgaaac caaagaagaa atg
<210 > 142 <211> 33 <212 > DNA <213 > Homo
<220 >
<221> misc_feature <223> halphal K78E R
<400 > 142
catttcttct ttggtttcat atgtgttcaa gtt
<210 > 143 <211 > 33 <212 > DNA <213 > Homo
<22 0>
<221> misc_feature <223> halphal Y93H F
<4 0 0 > 143
tcccagacat cccaacatgg tggggacctc aca
<210> 144
<211> 33
<212 > DNA
<213> Homo Sapiens
<220>
<221> misc_feature
<223> halphal Y93H R
<400>
144 tgtgaggtcc ccaccatgtt gggatgtctg gga
<210> 145 <211> 39 <212> DNA <213> Homo
<22O>
<221> misc_feature <223> halphal Y93F F
<4OO> 145
acatgggaga catcccaatt tggtggggac ctcacaaac
<210> 146 <211> 39 <212> DNA <213> Homo
<220>
<221> misc_feature <223> halphal Y93F R
<400> 146
gtttgtgagg tccccaccaa attgggatgt ctcccatgt
<210> 147 <211> 33 <212> DNA <213> Homo
<220>
<221> misc_feature <223> halphal Q105E F
<400> 147
ttcggagcaa ttgaatatgc aagaaaatat gcc
<210> 148
<211> 33
<212> DNA
<213> Homo Sapiens <220>
<221> misc_feature <223> halphal Q105E R
<400> 148
ggcatatttt cttgcatatt caattgctcc gaa 33
<210 > 149 <211 > 39 <212 > DNA <213 > Homo
<220>
<221> misc_feature <223> halphal A114Q F
<400> 149
aaatatgcct attcacaagc ttctggtggg cgacgaagt 39
<210 > 150 <211 > 39 <212 > DNA <213 > Homo
<220>
<221> misc_feature <223> halphal A114Q R
<400> 150
acttcgtcgc ccaccagaag cttgtgaata ggcatattt 3 9
<210> 151 <211> 39 <212 > DNA <213 > Homo
<220>
<221> misc_feature <223> halphal A115T F
<400> 151
aaatatgcct attcagcaac ttctggtggg cgacgaagt
39 <210> 152
<211> 39
<212> DNA
<213> Homo Sapiens
<220>
<221> misc_feature <223> halphal Α115Τ R
<400> 152
acttcgtcgc ccaccagaag ttgctgaata ggcatattt
<210 > 153
<211> 39
<212 > DNA
<213> Homo Sapiens
<220>
<221> misc_feature
<223> halphal A115Q F
<4 0 0 > 153
aaatatgcct attcagcaca gtctggtggg cgacgaagt
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<212 > DNA
<213> Homo Sapiens
<220>
<221> misc_feature <223> halphal A115Q R
<4 0 0 > 154
acttcgtcgc ccaccagact gtgctgaata ggcatattt
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<211> 39
<212 > DNA
<213> Homo Sapiens
<22 0 >
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<400> 155
gttcttgggt acttaaacga caacgccctt gatactaaa
<210 > 156 <211 > 39 <212 > DNA <213 > Homo
<220>
<221> misc_feature <223> halphal R165D R
<400> 156
tttagtatca agggcgttgt cgtttaagta cccaagaac
<210 > 157 <211 > 39 <212 > DNA <213 > Homo
<22 O >
<221> misc_feature <223> halphal N166D F
<400> 157
cttgggtact taaacaggga cgcccttgat actaaaaat
<210 > 158 <211 > 39 <212 > DNA <213 > Homo
<220>
<221> misc_feature
<223> halphal N166D R
<400> 158
atttttagta tcaagggcgt ccctgtttaa gtacccaag
<210> 159
<211> 40 <212> DNA
<213> Homo Sapiens
<220>
<221> misc_feature <223> halphal E195W F
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ttcaatgtgt ctgattgggc agctctacta gaaaaggctg 40
<210> 160 <211> 40 <212> DNA <213> Homo
<220>
<221> misc_feature <223> halphal E195W R
<400> 160
cagccttttc tagtagagct gcccaatcag acacattgaa 40
<210> 161 <211> 38 <212> DNA <213> Homo
<220>
<221> misc_feature <223> halphal K40D F
<400> 161
atccttggga tgcagtagac aattttttgg aaaaattt 38
<210> 162 <211> 38 <212> DNA <213> Homo Sapiens <220> <221> misc feature <223> halphal K4 0D
<400> 162 aaatttttcc aaaaaattgt ctactgcatc ccaaggat 38
<210> 163
<211> 39
<212> DNA
<213> Homo Sapiens
<220>
<221> misc_feature <223> halphal R69D F
<400> 163
cagtatgcca ataatccaga cgttgtgttt aacttgaac 39
<210> 164
<211> 39
<212> DNA
<213> Homo Sapiens
<220>
<221> misc_feature <223> halphal R69D R
<400> 164
gttcaagtta aacacaacgt ctggattatt ggcatactg 3 9
<210 > 165
<211> 36
<212 > DNA
<213> Homo Sapiens
<2 2 0 >
<221> misc_feature <223> halphal N73D F
<4 0 0 > 165
aatccaagag ttgtgtttga cttgaacaca tataaa 36
<210> 166
<211> 36
<212 > DNA
<213> Homo Sapiens <220>
<221> misc_feature <223> halphal N73D R
<400> 166
tttatatgtg ttcaagtcaa acacaactct tggatt
<210 > 167 <211 > 39 <212 > DNA <213 > Homo
<220 >
<221> misc_feature <223> halphal Q89H F
<400> 167
atgattgtag caacatccca cacatcccaa tatggtggg
<210> 168 <211> 39 <212> DNA <213> Homo
<220>
<221> misc_feature <223> halphal Q89H R
<400 > 168
atgattgtag caacatccca cacatcccaa tatggtggg
<210 > 169 <211> 40 <212 > DNA <213 > Homo
<220>
<221> misc_feature <223> malphal H93Y F
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cacatctgag acgcgccaat atggtgggga cctcacaaac <210 > 170
<211> 40
<212 > DNA
<213> Homo Sapiens
<220>
<221> misc_feature <223> maIphaI Η93Υ R
<400> 170
gtttgtgagg tccccaccat attggcgcgt ctcagatgtg 40
<210> 171
<211> 216
<212> PRT
<213> Macaca
fascicularis
<220>
<221> MISC_FEATURE <223> Cynomologus
<400> 171
Ser Pro Asp Phe Gln Leu Ser Ala Ser Phe Ser Pro Ala Thr Gln Pro 15 10 15
Cys Pro Ser Leu Ile Asp Val Val Val Val Cys Asp Glu Ser Asn Ser
20 25 30
Ile Tyr Pro Trp Asp Ala Val Asp Asn Phe Leu Glu Lys Phe Val Gln
35 40 45
Gly Leu Asp Ile Gly Pro Thr Lys Thr Gln Val Gly Leu Ile Gln Tyr
50 55 60
Ala Asn Asn Pro Arg Val Val Phe Asn Leu Asn Thr Tyr Lys Thr Lys 65 70 75 80
Glu Glu Met Ile Val Ala Thr Ser Gln Thr Ser Gln Tyr Gly Gly Asp
85 90 95
Leu Thr Asn Thr Phe Gly Ala Ile Gln Tyr Ala Arg Lys Tyr Ala Tyr
100 105 110
Ser Ala Ala Ser Gly Gly Arg Arg Ser Ala Thr Lys Val Met Val Val
115 120 125
Val Thr Asp Gly Glu Ser His Asp Gly Ser Met Leu Lys Ala Val Ile
130 135 140
Asp Gln Cys Asn His Asp Asn Ile Leu Arg Phe Gly Ile Ala Val Leu 145 150 155 160
Gly Tyr Leu Asn Arg Asn Ala Leu Asp Thr Lys Asn Leu Ile Lys Glu
165 170 175
Ile Lys Ala Ile Ala Ser Ile Pro Thr Glu Arg Tyr Phe Phe Asn Val
180 185 190
Ser Asp Glu Ala Ala Leu Leu Glu Lys Ala Gly Thr Leu Gly Glu Gln 195 200 205 Ile Phe Ser Ile Glu Gly Thr Val 210 215
<210> 172 <211> 216 <212 > PRT
<213> Macaca mulatta
<220>
<221> MIS C_FEATURE <223> Rhesus
<400> 172
Ser Pro Asp Phe Gln Leu Ser Ala Ser Phe Ser Pro Ala Thr Gln Pro 1 5 10 15
Cys Pro Ser Leu Ile Asp Val Val Val Val Cys Asp Glu Ser Asn Ser
20 25 30
Ile Tyr Pro Trp Asp Ala Val Lys Asn Phe Leu Glu Lys Phe Val Gln
35 40 45
Gly Leu Asp Ile Gly Pro Thr Lys Thr Gln Val Gly Leu Ile Gln Tyr
50 55 60
Ala Asn Asn Pro Arg Val Val Phe Asn Leu Asn Thr Tyr Lys Thr Lys 65 70 75 80
Glu Glu Met Ile Val Ala Thr Ser Gln Thr Ser Gln Tyr Gly Gly Asp
85 90 95
Leu Thr Asn Thr Phe Gly Ala Ile Gln Tyr Ala Arg Lys Tyr Ala Tyr
100 105 110
Ser Ala Ala Ser Gly Gly Arg Arg Ser Ala Thr Lys Val Met Val Val
115 120 125
Val Thr Asp Gly Glu Ser His Asp Gly Ser Met Leu Lys Ala Val Ile
130 135 140
Asp Gln Cys Asn His Asp Asn Ile Leu Arg Phe Gly Ile Ala Val Leu 145 150 155 160
Gly Tyr Leu Asn Arg Asn Ala Leu Asp Thr Lys Asn Leu Ile Lys Glu
165 170 175
Ile Lys Ala Ile Ala Ser Ile Pro Thr Glu Arg Tyr Phe Phe Asn Val
180 185 190
Ser Asp Glu Ala Ala Leu Leu Glu Lys Ala Gly Thr Leu Gly Glu Gln
195 200 205
Ile Phe Ser Ile Glu Gly Thr Val 210 215
<210> 173
<211> 1435
<212> DNA
<213> Homo Sapiens
<220> <221> misc_feature
<223> hvH14.0 Cadeia pesada IgG4
<220>
<221> CDS
<222> (22) . . (1416)
<400> 173
tctcgagaag cttccaccat g gag aca gac aca ctc ctg cta tgg gta ctg 51
Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu 1 5 10
ctg ctc tgg gtt cca ggt tcc act gga cag gtg cag ttg cag gag tca 99 Leu Leu Trp Val Pro Gly Ser Thr Gly Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser
15 20 25
ggc cct ggc ctg gtg aag ccc age gag acc ctg age ctg acc tgt acc 147 Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr
30 35 40
gtc tet gga ttt age tta acc aac tat ggc ate cac tgg ata cgc cag 195 Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr Gly Ile His Trp Ile Arg Gln
45 50 55
cct cca ggc aag ggc ctg gag tgg ctg ggc gtg ata tgg gct cgc ggc 243 Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Ala Arg Gly
60 65 70
ttc aca aac tat aac age gct ctc atg tcc cgc gtg acc ate age aag 291 Phe Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Leu Met Ser Arg Val Thr Ile Ser Lys 75 80 85 90
gac aac age aag aac cag gtg age ctg aag ctg age age gtg acc gcc 33 9 Asp Asn Ser Lys Asn Gln Val Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala
95 100 105
gcg gac acc gcc gtg tac tac tgc gcc aga gcc aac gac ggg gtc tac 3 87 Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ala Asn Asp Gly Val Tyr
110 115 120
tat gcc atg gac tac tgg ggc cag gga acc ctg gtc acc gtc age tca 435 Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
125 130 135
gcg tcc acc aag ggc cca tcc gtc ttc ccc ctg gcg ccc tgc tcc agg 483 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
140 145 150
age acc tcc gag age aca gcc gcc ctg ggc tgc ctg gtc aag gac tac 531 Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 155 160 165 170
ttc ccc gaa ccg gtg acg gtg tcg tgg aac tca ggc gcc ctg acc age 579 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
175 180 185
ggc gtg cac acc ttc ccg gct gtc cta cag tcc tca gga ctc tac tcc 627 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
190 195 200
ctc age age gtg gtg acc gtg ccc tcc age age ttg ggc acg aag acc 675 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr
205 210 215
tac acc tgc aac gta gat cac aag ccc age aac acc aag gtg gac aag 723 Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 220 225 230 aga gtt gag tcc aaa tat ggt ccc cca tgc cca tca tgc cca gca cct 771 Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro 235 240 245 250
gag ttc ctg ggg gga cca tca gtc ttc ctg ttc ccc cca aaa ccc aag 819 Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
255 260 265
gac act ctc atg ate tcc cgg acc cct gag gtc acg tgc gtg gtg gtg 867 Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
270 275 280
gac gtg age cag gaa gac ccc gag gtc cag ttc aac tgg tac gtg gat 915 Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp
285 290 295
ggc gtg gag gtg cat aat gcc aag aca aag ccg cgg gag gag cag ttc 963 Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe
300 305 310
aac age acg tac cgt gtg gtc age gtc ctc acc gtc ctg cac cag gac 1011 Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 315 320 325 330
tgg ctg aac ggc aag gag tac aag tgc aag gtc tcc aac aaa ggc ctc 1059 Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu
335 340 345
ccg tcc tcc ate gag aaa acc ate tcc aaa gcc aaa ggg cag ccc cga 1107 Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
350 355 360
gag cca cag gtg tac acc ctg ccc cca tcc cag gag gag atg acc aag 1155 Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys
365 370 375
aac cag gtc age ctg acc tgc ctg gtc aaa ggc ttc tac ccc age gac 1203 Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
380 385 390
ate gcc gtg gag tgg gag age aat ggg cag ccg gag aac aac tac aag 1251 Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 395 400 405 410
acc acg cct ccc gtg ctg gac tcc gac ggc tcc ttc ttc ctc tac age 1299 Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
415 420 425
agg cta acc gtg gac aag age agg tgg cag gag ggg aat gtc ttc tca 1347 Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser
430 435 440
tgc tcc gtg atg cat gag gct ctg cac aac cac tac aca cag aag age 1395 Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
445 450 455
ctc tcc ctg tet ctg ggt aaa tgataggatc cgcggccgc 1435
Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 460 465
<210 > 174
<211> 465
<212 > PRT
<213> Homo Sapiens
<400> 174 Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro Gly 15 10 15
Ser Thr Gly Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys
20 25 30
Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu
35 40 45
Thr Asn Tyr Gly Ile His Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Ala Arg Gly Phe Thr Asn Tyr Asn Ser 65 70 75 80
Ala Leu Met Ser Arg Val Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Asn Gln
85 90 95
Val Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr
100 105 110
Tyr Cys Ala Arg Ala Asn Asp Gly Val Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp
115 120 125
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro
130 135 140
Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr 145 150 155 160
Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr
165 170 175
Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro
180 185 190
Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr
195 200 205
Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp
210 215 220
His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr 225 230 235 240
Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro
245 250 255
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
260 265 270
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp
275 280 285
Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
290 295 300
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val 305 310 315 320
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
325 330 335
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys
340 345 350
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
355 360 365
Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
370 375 380
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu 385 390 395 400
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
405 410 415 Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys
420 425 430
Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
435 440 445
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly 450 455 460
Lys 465
<210 > 175
<211> 1435
<212 > DNA
<213> Homo Sapiens
<220>
<221> misc_feature
<223> hvH12.0 Cadeia pesada IgG4
<220>
<221> CDS
<222> (22) . . (1416)
<400> 175
tctcgagaag cttccaccat g gag aca gac aca ctc ctg cta tgg gta ctg 51
Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu 15 10
ctg ctc tgg gtt cca ggt tcc act gga cag gtg cag ttg cag gag tca 99
Leu Leu Trp Val Pro Gly Ser Thr Gly Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser
15 20 25
ggc cct ggc ctg gtg aag ccc age gag acc ctg age ctg acc tgt acc 147
Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr
30 35 40
gtc tet gga ttt age tta acc aac tat ggc ate cac tgg ata cgc cag 195
Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr Gly Ile His Trp Ile Arg Gln
45 50 55
cct cca ggc aag ggc ctg gag tgg ctg ggc gtg ata tgg gct cgc ggc 243
Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Ala Arg Gly
60 65 70
ttc aca aac tat aac age gct ctc atg tcc cgc ctg acc ate age aag 291
Phe Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Leu Met Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys 75 80 85 90
gac aac age aag aac cag gtg age ctg aag ctg age age gtg acc gcc 339
Asp Asn Ser Lys Asn Gln Val Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala
95 100 105
gcg gac acc gcc gtg tac tac tgc gcc aga gcc aac gac ggg gtc tac 387
Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ala Asn Asp Gly Val Tyr
110 115 120
tat gcc atg gac tac tgg ggc cag gga acc ctg gtc acc gtc age tca 435
Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 125 130 135 gcg tcc acc aag Ala Ser Thr Lys 140
age acc tcc gag Ser Thr Ser Glu 155
ttc ccc gaa ccg Phe Pro Glu Pro
ggc gtg cac acc Gly Val His Thr 190
ctc age age gtg Leu Ser Ser Val 205
tac acc tgc aac Tyr Thr Cys Asn 220
aga gtt gag tcc Arg Val Glu Ser 235
gag ttc ctg ggg Glu Phe Leu Gly
gac act ctc atg Asp Thr Leu Met 270
gac gtg age cag Asp Val Ser Gln 285
ggc gtg gag gtg Gly Val Glu Val 300
aac age acg tac Asn Ser Thr Tyr 315
tgg ctg aac ggc Trp Leu Asn Gly
ccg tcc tcc ate Pro Ser Ser Ile 350
gag cca cag gtg Glu Pro Gln Val 365
aac cag gtc age Asn Gln Val Ser 380
ate gcc gtg gag Ile Ala Val Glu 395
ggc cca tcc gtc Gly Pro Ser Val 145
age aca gcc gcc Ser Thr Ala Ala 160
gtg acg gtg tcg Val Thr Val Ser 175
ttc ccg gct gtc Phe Pro Ala Val
gtg acc gtg ccc Val Thr Val Pro 210
gta gat cac aag Val Asp His Lys 225
aaa tat ggt ccc Lys Tyr Gly Pro 240
gga cca tca gtc Gly Pro Ser Val 255
ate tcc cgg acc Ile Ser Arg Thr
gaa gac ccc gag Glu Asp Pro Glu 290
cat aat gcc aag His Asn Ala Lys 305
cgt gtg gtc age Arg Val Val Ser 320
aag gag tac aag Lys Glu Tyr Lys 335
gag aaa acc ate Glu Lys Thr Ile
tac acc ctg ccc Tyr Thr Leu Pro 370
ctg acc tgc ctg Leu Thr Cys Leu 385
tgg gag age aat Trp Glu Ser Asn 400
ttc ccc ctg gcg ccc Phe Pro Leu Ala Pro 150
ctg ggc tgc ctg gtc Leu Gly Cys Leu Val 165
tgg aac tca ggc gcc Trp Asn Ser Gly Ala 180
cta cag tcc tca gga Leu Gln Ser Ser Gly 195
tcc age age ttg ggc Ser Ser Ser Leu Gly 215
ccc age aac acc aag Pro Ser Asn Thr Lys 230
cca tgc cca tca tgc Pro Cys Pro Ser Cys 245
ttc ctg ttc ccc cca Phe Leu Phe Pro Pro 260
cct gag gtc acg tgc Pro Glu Val Thr Cys 275
gtc cag ttc aac tgg Val Gln Phe Asn Trp
295
aca aag ccg cgg gag Thr Lys Pro Arg Glu 310
gtc ctc acc gtc ctg Val Leu Thr Val Leu 325
tgc aag gtc tcc aac Cys Lys Val Ser Asn 340
tcc aaa gcc aaa ggg Ser Lys Ala Lys Gly 355
cca tcc cag gag gag Pro Ser Gln Glu Glu 375
gtc aaa ggc ttc tac Val Lys Gly Phe Tyr 390
ggg cag ccg gag aac Gly Gln Pro Glu Asn 405
tgc tcc agg 483 Cys Ser Arg
aag gac tac 531 Lys Asp Tyr 170
ctg acc age 579 Leu Thr Ser 185
ctc tac tcc 627 Leu Tyr Ser 200
acg aag acc 675 Thr Lys Thr
gtg gac aag 723 Val Asp Lys
cca gea cct 771 Pro Ala Pro 250
aaa ccc aag 819 Lys Pro Lys 265
gtg gtg gtg 867 Val Val Val 280
tac gtg gat 915 Tyr Val Asp
gag cag ttc 963 Glu Gln Phe
cac cag gac 1011 His Gln Asp 330
aaa ggc ctc 1059 Lys Gly Leu 345
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atg acc aag 1155 Met Thr Lys
ccc age gac 1203 Pro Ser Asp
aac tac aag 1251 Asn Tyr Lys 410 acc acg cct ccc gtg ctg gac tcc gac ggc tcc ttc ttc ctc tac age 1299 Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
415 420 425
agg cta acc gtg gac aag age agg tgg cag gag ggg aat gtc ttc tca 1347
Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser
430 435 440
tgc tcc gtg atg cat gag gct ctg cac aac cac tac aca cag aag age 13 95
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
445 450 455
ctc tcc ctg tet ctg ggt aaa tgataggatc cgcggccgc 1435
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<211> 465
<212 > PRT
<213> Homo Sapiens
<4 0 0 > 176
Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro Gly 1 5 10 15
Ser Thr Gly Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys
20 25 30
Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu
35 40 45
Thr Asn Tyr Gly Ile His Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Ala Arg Gly Phe Thr Asn Tyr Asn Ser 65 70 75 80
Ala Leu Met Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Asn Gln
85 90 95
Val Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr
100 105 110
Tyr Cys Ala Arg Ala Asn Asp Gly Val Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp
115 120 125
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro
130 135 140
Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr 145 150 155 160
Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr
165 170 175
Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro
180 185 190
Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr
195 200 205
Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp
210 215 220
His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr 225 230 235 240
Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro
245 250 255 Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
260 265 270
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp
275 280 285
Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
290 295 300
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val 305 310 315 320
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
325 330 335
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys
340 345 350
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
355 360 365
Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
370 375 380
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu 385 390 395 400
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
405 410 415
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys
420 425 430
Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
435 440 445
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly 450 455 460
Lys 465
<210> 177 <211> 744 <212> DNA <213> Homo Sapeins
<220>
<221> misc_feature
<223> VLl0.OQ Cadeia leve
<220>
<221> CDS
<222> (22) . . (720)
<400> 177
ctatctcgag aagcttccac c atg gag aca gac aca ctc ctg cta tgg gta 51
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val 1 5 10
ctg ctg ctc tgg gtt cca ggt tcc actgga gac ttc gtg atg acc cag 99
Leu Leu Leu Trp Val Pro Gly Ser Thr Gly Asp Phe Val Met Thr Gln
15 20 25 tct cca gca ttc ctg age gtg acc ccc ggc gag aag gtg acc ate acc 147 Ser Pro Ala Phe Leu Ser Val Thr Pro Gly Glu Lys Val Thr Ile Thr
30 35 40
tgc age gcc caa tca age gtg aac tac att cac tgg tac cag cag aag 195 Cys Ser Ala Gln Ser Ser Val Asn Tyr Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys
45 50 55
ccc gac cag gcc ccc aag aaa ttg ate tat gac act tcc aag ctg gcc 243 Pro Asp Gln Ala Pro Lys Lys Leu Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Leu Ala
60 65 70
age ggc gtg ccc age cgc ttc age ggc age ggc age ggc acc gac tac 2 91 Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr 75 80 85 90
acc ttc acc ate age age ctg gag gcc gag gac gct gcc acc tat tac 33 9 Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr
95 100 105
tgc cag cag tgg acc act aac cca ctg acc ttc ggc cag ggc acc aag 387 Cys Gln Gln Trp Thr Thr Asn Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys
110 115 120
gtc gaa ate aaa cga act gtg gct gca cca tct gtc ttc ate ttc ccg 435 Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro
125 130 135
cca tct gat gag cag ttg aaa tct gga act gcc tct gtt gtg tgc ctg 483 Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu
140 145 150
ctg aat aac ttc tat ccc aga gag gcc aaa gta cag tgg aag gtg gat 531 Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp 155 160 165 170
aac gcc ctc caa tcg ggt aac tcc cag gag agt gtc aca gag cag gac 579 Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp
175 180 185
age aag gac age acc tac age ctc age age acc ctg acg ctg age aaa 627 Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys
190 195 200
gca gac tac gag aaa cac aaa gtc tac gcc tgc gaa gtc acc cat cag 675 Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln
205 210 215
ggc ctg age tcg ccc gtc aca aag age ttc aac agg gga gag tgt 72 0
Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
220 225 230
tgataggatc cgcggccgca tagg 744
<210 > 178
<211> 233
<212 > PRT
<213> Homo Sapeins
<4 0 0 > 178
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu 1 5
Gly Ser Thr Gly Asp Phe Val Met 20
Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
10 15
Thr Gln Ser Pro Ala Phe Leu Ser 25 30 Val Thr Pro Gly Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Gln Ser Ser 35 40 45 Val Asn Tyr Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ala Pro Lys 50 55 60 Lys Leu Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg 65 70 75 80 Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Phe Thr Ile Ser Ser 85 90 95 Leu Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Thr Thr 100 105 110 Asn Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr 115 120 125 Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu 130 135 140 Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro 145 150 155 160 Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly 165 170 175 Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr 180 185 190 Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His 195 200 205 Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val 210 215 220 Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230
<210> 179
<211> 1460
<212 > DNA
<213> Homo Sapiens
<220 >
<221> misc_feature
<223> h2206-VH14 Cadeia pesada da IgG1 (DANS) ; Posição -24 a -25, é a seqüência líder; Posição -4 a -1 são aminoácidos extras; DANS na posição -4 a -1 é preferivelmente deletado.
<220>
<221> CDS
<222 > (22) . . (1440)
<220>
<221> mat_peptide <222> (94) . . (1440)
<400 > 179
ataggctagc ctcgagccac c atg gag aca gac aca ctc ctg cta tgg gta 51
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val
-20 -15 ctg ctg ctc tgg Leu Leu Leu Trp
cag ttg cag gag Gln Leu Gln Glu 5
age ctg acc tgt Ser Leu Thr Cys 20
cac tgg ata cgc His Trp Ile Arg 35
ata tgg gct cgc Ile Trp Ala Arg
gtg acc ate age Val Thr Ile Ser 70
age age gtg acc Ser Ser Val Thr 85
aac gac ggg gtc Asn Asp Gly Val 100
gtc acc gtc age Val Thr Val Ser 115
gea cec tcc tcc Ala Pro Ser Ser
ctg gtc aag gac Leu Val Lys Asp 150
ggc gcc ctg acc Gly Ala Leu Thr 165
tca gga ctc tac Ser Gly Leu Tyr 180
ttg ggc acc cag Leu Gly Thr Gln 195
acc aag gtg gac Thr Lys Val Asp
aca tgc cca ccg Thr Cys Pro Pro 230
ttc CtC ttc CCC
Phe Leu Phe Pro 245
gtt cca ggt tcc Val Pro Gly Ser -10
tca ggc cct ggc Ser Gly Pro Gly 10
acc gtc tet gga Thr Val Ser Gly 25
cag cct cca ggc Gln Pro Pro Gly 40
ggc ttc aca aac Gly Phe Thr Asn 55
aag gac aac age Lys Asp Asn Ser
gcc gcg gac acc Ala Ala Asp Thr 90
tac tat gcc atg Tyr Tyr Ala Met 105
tca gcg tcg acc Ser Ala Ser Thr 120
aag age acc tet Lys Ser Thr Ser 135
tac ttc ccc gaa Tyr Phe Pro Glu
age ggc gtg cac Ser Gly Val His 170
tcc ctc age age Ser Leu Ser Ser 185
acc tac ate tgc Thr Tyr Ile Cys 200
aag aaa gtt gag Lys Lys Val Glu 215
tgc cca gea cct Cys Pro Ala Pro
cca aaa ccc aag Pro Lys Pro Lys 250
act gga gac gcg aat Thr Gly Asp Ala Asn -5
ctg gtg aag ccc age Leu Val Lys Pro Ser
15
ttt age tta acc aac Phe Ser Leu Thr Asn 30
aag ggc ctg gag tgg Lys Gly Leu Glu Trp 45
tat aac age gct ctc Tyr Asn Ser Ala Leu 60
aag aac cag gtg age Lys Asn Gln Val Ser 75
gcc gtg tac tac tgc Ala Val Tyr Tyr Cys
95
gac tac tgg ggc cag Asp Tyr Trp Gly Gln 110
aag ggc cca tcg gtc Lys Gly Pro Ser Val 125
ggg ggc aca gcg gcc Gly Gly Thr Ala Ala 140
ccg gtg acg gtg tca Pro Val Thr Val Ser 155
acc ttc ccg gct gtc Thr Phe Pro Ala Val
175
gtg gtg acc gtg ccc Val Val Thr Val Pro 190
aac gtg aat cac aag Asn Val Asn His Lys 205
ccc aaa tet tgt gac Pro Lys Ser Cys Asp 220
gaa ctc ctg ggg gga Glu Leu Leu Gly Gly 235
gac acc ctc atg ate Asp Thr Leu Met Ile
255
tca cag gtg 99
Ser Gln Val
-1 1
gag acc ctg 147
Glu Thr Leu
tat ggc ate 195 Tyr Gly Ile
ctg ggc gtg 243 Leu Gly Val 50
atg tcc cgc 291 Met Ser Arg 65
ctg aag ctg 339 Leu Lys Leu 80
gcc aga gcc 3 87 Ala Arg Ala
gga acc ctg 435 Gly Thr Leu
ttc ccc ctg 483 Phe Pro Leu 130
ctg ggc tgc 531 Leu Gly Cys 145
tgg aac tca 579 Trp Asn Ser 160
cta cag tcc 627 Leu Gln Ser
tcc age age 675 Ser Ser Ser
ccc age aac 723 Pro Ser Asn 210
aaa act cac 771 Lys Thr His 225
ccg tca gtc 819 Pro Ser Val 240
tcc cgg acc 867 Ser Arg Thr cct gag gtc aca tgc gtg gtg gtg gac gtg age cac gaa gac cct gag 915 Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu
260 265 270
gtc aag ttc aac tgg tac gtg gac ggc gtg gag gtg cat aat gcc aag 963 Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 275 280 285 290
aca aag ccg cgg gag gag cag tac aac age acg tac cgt gtg gtc age 1011 Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
295 300 305
gtc ctc acc gtc ctg cac cag gac tgg ctg aat ggc aag gag tac aag 1059 Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
310 315 320
tgc aag gtc tcc aac aaa gcc ctc cca gcc ccc ate gag aaa acc ate 1107 Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile
325 330 335
tcc aaa gcc aaa ggg cag ccc cga gaa cca cag gtg tac acc ctg ccc 1155 Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
340 345 350
cca tcc cgg gat gag ctg acc aag aac cag gtc age ctg acc tgc ctg 1203 Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu 355 360 365 370
gtc aaa ggc ttc tat ccc age gac ate gcc gtg gag tgg gag age aat 1251 Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
375 380 385
ggg cag ccg gag aac aac tac aag acc acg cct ccc gtg ctg gac tcc 1299 Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
390 395 400
gac ggc tcc ttc ttc ctc tac age aag ctc acc gtg gac aag age agg 1347 Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
405 410 415
tgg cag cag ggg aac gtc ttc tca tgc tcc gtg atg cat gag gct ctg 13 95 Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
420 425 430
cac aac cac tac acg cag aag age ctc tcc ctg tet ccg ggt aaa 1440
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 445
tgataagcgg ccgcttccct 1460
<210 > 180
<211> 473
<212 > PRT
<213> Homo Sapiens
<4 0 0 > 180
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu
-20
Gly Ser Thr Gly Asp Ala Asn Ser
-5 -1
Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
10 15
Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr 25 30
Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
-15 -10
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly 1 5
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val 20
Gly Ile His Trp Ile Arg Gln Pro 35 40 Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Ala Arg Gly Phe
45 50 55
Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Leu Met Ser Arg Val Thr Ile Ser Lys Asp
60 65 70
Asn Ser Lys Asn Gln Val Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala
75 80 85
Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ala Asn Asp Gly Val Tyr Tyr
90 95 100
Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala 105 110 115 120
Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser
125 130 135
Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe
140 145 150
Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly
155 160 165
Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu
170 175 180
Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr 185 190 195 200
Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys
205 210 215
Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
220 225 230
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
235 240 245
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
250 255 260
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr 265 270 275 280
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
285 290 295
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
300 305 310
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
315 320 325
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
330 335 340
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu 345 350 355 360
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
365 370 375
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
380 385 390
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
395 400 405
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
410 415 420
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln 425 430 435 440
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
445 <210> 181
<211> 469
<212 > PRT
<213> Homo Sapiens
<220>
<221> MIS C_FEATURE
<223> hVH14.0 Cadeia pesada da IgGl [DANS-Deletado] <4OO> 181
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro 1 5 10 15
Gly Ser Thr Gly Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val
20 25 30
Lys Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser
35 40 45
Leu Thr Asn Tyr Gly Ile His Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly
50 55 60
Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Ala Arg Gly Phe Thr Asn Tyr Asn 65 70 75 80
Ser Ala Leu Met Ser Arg Val Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Asn
85 90 95
Gln Val Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Arg Ala Asn Asp Gly Val Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr
115 120 125
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly
130 135 140
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly 145 150 155 160
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
165 170 175
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
180 185 190
Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
195 200 205
Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val
210 215 220
Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys 225 230 235 240
Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu
245 250 255
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
260 265 270
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
275 280 285
Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
290 295 300
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser 305 310 315 320 Thr Tyr Arg Val
Asn Gly Lys Glu 340
Pro Ile Glu Lys 355
Gln Val Tyr Thr 370
Val Ser Leu Thr 385
Val Glu Trp Glu
Pro Pro Val Leu 420
Thr Val Asp Lys 435
Val Met His Glu 450
Leu Ser Pro Gly 465
Val Ser Val Leu 325
Tyr Lys Cys Lys
Thr Ile Ser Lys 360
Leu Pro Pro Ser 375
Cys Leu Val Lys 390
Ser Asn Gly Gln 405
Asp Ser Asp Gly
Ser Arg Trp Gln 440
Ala Leu His Asn 455
Lys
Thr Val Leu His 330
Val Ser Asn Lys 345
Ala Lys Gly Gln
Arg Asp Glu Leu 380
Gly Phe Tyr Pro 395
Pro Glu Asn Asn 410
Ser Phe Phe Leu 425
Gln Gly Asn Val
His Tyr Thr Gln 460
Gln Asp Trp Leu 335
Ala Leu Pro Ala 350
Pro Arg Glu Pro 365
Thr Lys Asn Gln
Ser Asp Ile Ala 400
Tyr Lys Thr Thr 415
Tyr Ser Lys Leu 430
Phe Ser Cys Ser 445
Lys Ser Leu Ser
<210> 182
<211> 469
<212> PRT
<213> Homo Sapeins
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> hVH12.0 Cadeia pesada da IgGl [DANS-Deletado]
<400> 182 Met Glu Thr Asp 1
Gly Ser Thr Gly 20
Lys Pro Ser Glu 35
Leu Thr Asn Tyr 50
Leu Glu Trp Leu 65
Ser Ala Leu Met
Gln Val Ser Leu 100
Tyr Tyr Cys Ala 115
Trp Gly Gln Gly 130
Thr Leu Leu Leu 5
Gln Val Gln Leu
Thr Leu Ser Leu 40
Gly Ile His Trp 55
Gly Val Ile Trp 70
Ser Arg Leu Thr 85
Lys Leu Ser Ser
Arg Ala Asn Asp 120
Thr Leu Val Thr 135
Trp Val Leu Leu 10
Gln Glu Ser Gly 25
Thr Cys Thr Val
Ile Arg Gln Pro 60
Ala Arg Gly Phe 75
Ile Ser Lys Asp 90
Val Thr Ala Ala 105
Gly Val Tyr Tyr
Val Ser Ser Ala 140
Leu Trp Val Pro 15
Pro Gly Leu Val 30
Ser Gly Phe Ser 45
Pro Gly Lys Gly
Thr Asn Tyr Asn 80
Asn Ser Lys Asn 95
Asp Thr Ala Val 110
Ala Met Asp Tyr 125
Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe 145
Thr Ala Ala Leu
Thr Val Ser Trp 180
Pro Ala Val Leu 195
Thr Val Pro Ser 210
Asn His Lys Pro 225
Ser Cys Asp Lys
Leu Gly Gly Pro 260
Leu Met Ile Ser 275
Ser His Glu Asp 290
Glu Val His Asn 305
Thr Tyr Arg Val
Asn Gly Lys Glu 340
Pro Ile Glu Lys 355
Gln Val Tyr Thr 370
Val Ser Leu Thr 385
Val Glu Trp Glu
Pro Pro Val Leu 420
Thr Val Asp Lys 435
Val Met His Glu 450
Leu Ser Pro Gly 465
Pro Leu Ala Pro 150
Gly Cys Leu Val 165
Asn Ser Gly Ala
Gln Ser Ser Gly 200
Ser Ser Leu Gly 215
Ser Asn Thr Lys 230
Thr His Thr Cys 245
Ser Val Phe Leu
Arg Thr Pro Glu 280
Pro Glu Val Lys 295
Ala Lys Thr Lys 310
Val Ser Val Leu 325
Tyr Lys Cys Lys
Thr Ile Ser Lys 360
Leu Pro Pro Ser 375
Cys Leu Val Lys 390
Ser Asn Gly Gln 405
Asp Ser Asp Gly
Ser Arg Trp Gln 440
Ala Leu His Asn 455
Lys
Ser Ser Lys Ser 155
Lys Asp Tyr Phe 170
Leu Thr Ser Gly 185
Leu Tyr Ser Leu
Thr Gln Thr Tyr 220
Val Asp Lys Lys 235
Pro Pro Cys Pro 250
Phe Pro Pro Lys 265
Val Thr Cys Val
Phe Asn Trp Tyr 300
Pro Arg Glu Glu 315
Thr Val Leu His 330
Val Ser Asn Lys 345
Ala Lys Gly Gln
Arg Asp Glu Leu 380
Gly Phe Tyr Pro 395
Pro Glu Asn Asn 410
Ser Phe Phe Leu 425
Gln Gly Asn Val
His Tyr Thr Gln 460
Thr Ser Gly Gly 160
Pro Glu Pro Val 175
Val His Thr Phe 190
Ser Ser Val Val 205
Ile Cys Asn Val
Val Glu Pro Lys 240
Ala Pro Glu Leu 255
Pro Lys Asp Thr 270
Val Val Asp Val 285
Val Asp Gly Val
Gln Tyr Asn Ser 320
Gln Asp Trp Leu 335
Ala Leu Pro Ala 350
Pro Arg Glu Pro 365
Thr Lys Asn Gln
Ser Asp Ile Ala 400
Tyr Lys Thr Thr 415
Tyr Ser Lys Leu 430
Phe Ser Cys Ser 445
Lys Ser Leu Ser
<210> 183
<211> 24
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 183
His Asn Ser Ser Ser Trp Tyr Gly Arg Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln 1 5 10 15 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 20
<210 > 184
<211> 19
<212 > PRT
<213> Homo sapiens
<400> 184
Glu Glu Gly Asn Thr Leu Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val 15 10 15
Glu Ile Lys
<210> 185
<211> 119
<212 > PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Região VH humanizada <220>
<221> VARIANT
<222> (30) . . (30)
<223> Xaa na posição 30 pode ser Thr ou Ile <220>
<221> VARIANT
<222 > (31) . . (31)
<223> Xaa na posição 31 pode ser Asn ou Ser <220>
<221> VARIANT
<222> (37) . . (37)
<223> Xaa na posição 37 pode ser Val ou Ile <220>
<221> VARIANT
<222 > (48) . . (48)
<223> Xaa na posição 48 pode ser Leu ou Ile <2 2 0 >
<221> VARIANT
<222> (67) . . (67)
<223> Xaa na posição 67 pode ser Val ou Leu <220>
<221> VARIANT <222> (71) . . (71)
<223> Xaa na posição
<220>
<221> VARIANT
<222> (73) . . (73)
<223> Xaa na posição
<220>
<221> VARIANT
<222> (78) . . (78)
<223> Xaa na posição
<220>
<221> VARIANT
<222> (94) . . (94)
<223> Xaa na posição
71 pode ser Lys ou Val
73 pode ser Asn ou Thr
78 pode ser Val ou Phe
94 pode ser Phe ou Tyr
<400> 185
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Xaa Xaa Tyr
20 25 30
Gly Ile His Trp Xaa Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Xaa
35 40 45
Gly Val Ile Trp Ala Arg Gly Phe Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Leu Met
50 55 60
Ser Arg Xaa Thr Ile Ser Xaa Asp Xaa Ser Lys Asn Gln Xaa Ser Leu 65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Xaa Cys Ala
85 90 95
Arg Ala Asn Asp Gly Val Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115
<210 > 186
<211> 106
<212> PRT
<213> Seqüência Artificial
<220>
<223> Região VL humanizada
<220>
<221> VARIANT
<222> (1) . . (1)
<223> Xaa na posição 1 pode ser Gln ou Asp <220>
<221> VARIANT
<222 > (2) . . (2)
<223> Xaa na posição 2 pode ser Phe ou Val
<220>
<221> VARIANT
<222> (4) . . (4)
<223> Xaa na posição 4 pode ser Leu ou Met
<220>
<221> VARIANT
<222> (45) . . (45)
<223> Xaa na posição 48 pode ser Lys ou Leu
<220>
<221> VARIANT
<222> (46) . . (46)
<223> Xaa na posição 46 pode ser Trp ou Leu
<220>
<221> VARIANT
<222> (48) . . (48)
<223> Xaa na posição 48 pode ser Tyr ou Lys
<220>
<221> VARIANT
<222 > (70) . . (70)
<223> Xaa na posição 70 pode ser Tyr ou Phe
<400> 186
Xaa Xaa Val Xaa Thr Gln Ser Pro 1 5
Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Ser 20
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp
35 40
Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly
50 55
Gly Ser Gly Thr Asp Xaa Thr Phe 65 70
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln
85
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu 100
Ala Phe Leu Ser Val Thr Pro Gly
10 15
Ala Asn Ser Ser Val Asn Tyr Ile 25 30
Gln Ala Pro Lys Xaa Xaa Ile Xaa
45
Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser 60
Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ala Glu
75 80
Gln Trp Thr Thr Asn Pro Leu Thr
90 95
Ile Lys 105

Claims (111)

1. Anticorpo humanizado anti-integrina a2, caracterizado pelo fato de ser composto por uma região variável de cadeia pesada contendo a seqüência de aminoácidos (a) HCDR2 (VIWARGFTNYNSALMS, SEQ ID NO: 2) , (b) HCDRl (GFSLTNYGIH, SEQ ID N0:1), HCDR2 (VIWARGFTNYNSALMS, SEQ ID NO: 2) and HCDR3 (ANDGVYYAMDY, SEQ ID N0:3), ou (c) SEQ ID NO:40
2. Anticorpo humanizado anti-integrina a2, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de a região variável da cadeia pesada ser composta pela seqüência de aminoácidos SEQ ID NO:185.
3. Anticorpo humanizado anti-integrina a2, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de a região variável da cadeia pesada ser composta pela seqüência de aminoácidos sendo que a seqüência de aminoácidos SEQ ID NO: 185 na qual (a) posição 71 é Lys, (b) a posição 73 é Asn, (c) a posição 78 é Vai, ou (d) qualquer combinação de (a) - (c).
4. Anticorpo humanizado anti-integrina a2, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de a região variável da cadeia pesada ser composta pela seqüência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NOs: 70-79 and SEQ ID NOs:109-111.
5. Anticorpo humanizado anti-integrina a2, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de ser composta também pela região FW4 formada pela seqüência de aminoácidos WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:13.
6. Anticorpo humanizado anti-integrina a2. de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de ser composto pela seqüência de aminoácidos de HCDRl (SEQ ID NO:1), HCDR2 (SEQ ID NO:2) and HCDR3 (SEQ ID N0:3).
7. Anticorpo humanizado anti-integrina a2, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1-6, caracterizado pelo fato de conter também uma cadeia leve.
8. Anticorpo humanizado anti-integrina a2, caracterizado pelo fato de deser composto por uma região variável de cadeia leve composta pela seqüência de aminoácidos (a) um LCDRl selecionado entre SANSSVNYIH (SEQ ID NO:4) ou SAQSSVNYIH (SEQ ID NO:112), (b) LCDR2 (DTSKLAS; SEQ ID NO:5) e (c) LCDR3 (QQWTTNPLT, SEQ ID N0:6).
9. Anticorpo humanizado anti-integrina a2, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de a região variável da cadeia leve ser composta pela seqüência de aminoácidos SEQ ID NO:186.
10. Anticorpo humanizado anti-integrina a2, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de a região variável da cadeia leve ser composta pela seqüência de aminoácidos SEQ ID NO: 186 na qual (a) a posição 2 é Phe, (b) a posição 45 é Lys, (c) a posição 48 é Tyr, ou (d) qualquer combinação de (a)-(c).
11. Anticorpo humanizado anti-integrina oc2, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de a região variável da cadeia leve é composta pela seqüência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NO:41, SEQ ID NOs:80-92 e SEQ ID NO:108.
12. Anticorpo humanizado anti-integrina a2, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de ser composto também pela região FW4 formada pela seqüência de aminoácidos FGQGTKVEIK of SEQ ID NO:38
13. Anticorpo humanizado anti-integrina oc2, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de ser composto pela seqüência de aminoácidos de LCDRl (SEQ ID NO:4), LCDR2 (SEQ ID NO:5) e LCDR3 (SEQ ID NO:6).
14. Anticorpo humanizado anti-integrina a2, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 8-13, caracterizado pelo fato de conter também uma cadeia pesada.
15. Anticorpo humanizado anti-integrina a2, caracterizado pelo fato de ser composto por: (i) uma região variável de cadeia pesada composta pela seqüência de aminoácidos (a) HCDR2 (VIWARGFTNYNSALMS, SEQ ID NO:2), (b) HCDRl (GFSLTNYGIH, SEQ ID NO:1), HCDR2 (VIWARGFTNYNSALMS, SEQ ID NO:2) e HCDR3 (ANDGVYYAMDY, SEQ ID NO: 3), ou (c) SEQ ID NO: 40; e (ii) uma região variável da cadeia leve composta pela seqüência de aminoácidos por (a) um LCDRl selecionado de SANSSVNYIH (SEQ ID N0:4) ou SAQSSVNYIH (SEQ ID N0:112), (b) LCDR2 (DTSKLAS; SEQ ID NO:5) e (c) LCDR3 (QQWTTNPLT, SEQ ID NO:6).
16. Anticorpo humanizado anti-integrina a2, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de (a) a região variável da cadeia pesada ser composta pela seqüência de aminoácidos SEQ ID NO:185, (b) a região variável da cadeia leve ser composta pela seqüência de aminoácidos f SEQ ID NO:186, ou (c) ambos (a) e (b) .
17. Anticorpo humanizado anti-integrina a2, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de (i) a região variável da cadeia pesada ser composta pela seqüência de aminoácidos SEQ ID NO: 185 na qual (a) a posição 71 é Lys, (b) a posição 73 é Asn, (c) a posição -78 é Vai, ou (d) qualquer combinação de (a)-(c); (ii) a região variável da cadeia leve ser composta pela seqüência de aminoácidos SEQ ID NO: 186 na qual (a) a posição 2 é Phe, (b) a posição 45 é Lys, (c) a posição 48 é Tyr, ou (d) qualquer combinação de (a)-(c); ou (iii) ambos (i) e (ii) .
18. Anticorpo humanizado anti-integrina a2, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de (a) a região variável da cadeia pesada ser composta pela seqüência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NOs:70-79 e SEQ ID NOs:109-111; (b) a região variável da cadeia leve ser composta pela seqüência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NO:41, SEQ ID NOs:80-92 and SEQ ID NO:108; ou (c) ambos (a) e (b) .
19. Anticorpo humanizado anti-integrina a2, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de o anticorpo reconhecer o dominio I da integrina a2 humana.
20. Anticorpo humanizado anti-integrina a2, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de o anticorpo reconhecer o dominio I da integrina a2 humana.
21. Anticorpo humanizado anti-integrina a2, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de o anticorpo reconhecer o domínio I da integrina a2 humana.
22. Anticorpo humanizado anti-integrina cc2, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de o anticorpo se ligar à integrina α2β1.
23. Anticorpo humanizado anti-integrina α2, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de o anticorpo se ligar à integrina α2β1.
24. Anticorpo humanizado anti-integrina a2, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de o anticorpo se ligar à integrina α2β1.
25. Anticorpo humanizado anti-integrina a2, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de o anticorpo se ligar a um epitopo da integrina a2, epitopo este composto por: (a) um resíduo Lys correspondente à posição 192 da seqüência de aminoácidos da integrina cx2 expressa na SEQ ID NO: 8 ou posição 40 da seqüência de aminoácidos do domínio I da integrina a2 expressa na SEQ ID NO:11; (b) um resíduo Asn correspondente à posição 225 da seqüência de aminoácidos da integrina a2 expressa na SEQ ID NO: 8 ou posição 73 da seqüência de aminoácidos do domínio I da integrina a2 expressa na SEQ ID NO:11; (c) um resíduo Gln correspondente à posição 241 da seqüência de aminoácidos da integrina a2 expressa na SEQ ID NO: 8 ou posição 89 da seqüência de aminoácidos do domínio I da integrina a2 expressa na SEQ ID NO:11; (d) um resíduo Lys correspondente à posição 245 da seqüência de aminoácidos da integrina a2 expressa na SEQ ID NO: 8 ou posição 93 da seqüência de aminoácidos do domínio I da integrina a.2 expressa na SEQ ID NO:11; (e) um resíduo Arg correspondente à posição 317 da seqüência de aminoácidos da integrina a2 expressa na SEQ ID NO: 8 ou posição 165 da seqüência de aminoácidos do domínio I da integrina a2 expressa na SEQ ID NO:11; (f) um resíduo Asn correspondente à posição 318 da seqüência de aminoácidos da integrina a2 expressa na SEQ ID NO: 8 ou posição 166 da seqüência de aminoácidos do domínio I da integrina ot2 expressa na SEQ ID NO: 11; ou (g) qualquer combinação de (a) a (f) .
26. Anticorpo humanizado anti-integrina a2, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de o anticorpo se ligar a um epitopo da integrina a2, epitopo este composto por: (a) um resíduo Lys correspondente à posição 192 da seqüência de aminoácidos da integrina a2 expressa na SEQ ID NO: 8 ou posição 40 da seqüência de aminoácidos do domínio I da integrina cc2 expressa na SEQ ID NO: 11; (b) um resíduo Asn correspondente à posição 225 da seqüência de aminoácidos da integrina a2 expressa na SEQ ID NO: 8 ou posição 73 da seqüência de aminoácidos do domínio I da integrina a2 expressa na SEQ ID NO:11; (c) um resíduo Gln correspondente à posição 241 da seqüência de aminoácidos da integrina a2 expressa na SEQ ID NO: 8 ou posição 89 da seqüência de aminoácidos do domínio I da integrina oc2 expressa na SEQ ID NO: 11; (d) um resíduo Lys correspondente à posição 245 da seqüência de aminoácidos da integrina a2 expressa na SEQ ID NO: 8 ou posição 93 da seqüência de aminoácidos do domínio I da integrina a2 expressa na SEQ ID NO:11; (e) um resíduo Arg correspondente à posição 317 da seqüência de aminoácidos da integrina a2 expressa na SEQ ID NO: 8 ou posição 165 da seqüência de aminoácidos do domínio I da integrina a2 expressa na SEQ ID NO:11; (f) um resíduo Asn correspondente à posição 318 da seqüência de aminoácidos da integrina a2 expressa na SEQ ID NO: 8 ou posição 166 da seqüência de aminoácidos do domínio I da integrina <x2 expressa na SEQ ID NO:11; ou (g) qualquer combinação de (a) a (f).
27. Anticorpo humanizado anti-integrina a2, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de o anticorpo se ligar a um epitopo da integrina a2, epitopo este composto por: (a) um resíduo Lys correspondente à posição 192 da seqüência de aminoácidos da integrina a2 expressa na SEQ ID NO: 8 ou posição 40 da seqüência de aminoácidos do domínio I da integrina a2 expressa na SEQ ID NO:11; (b) um resíduo Asn correspondente à posição 225 da seqüência de aminoácidos da integrina cx2 expressa na SEQ ID NO: 8 ou posição 73 da seqüência de aminoácidos do domínio I da integrina a2 expressa na SEQ ID NO:11; (c) um resíduo Gln correspondente à posição 241 da seqüência de aminoácidos da integrina a2 expressa na SEQ ID NO: 8 ou posição 89 da seqüência de aminoácidos do domínio I da integrina a2 expressa na SEQ ID NO:11; (d) um resíduo Tyr correspondente à posição 245 da seqüência de aminoácidos da integrina a2 expressa na SEQ ID NO: 8 ou posição 93 da seqüência de aminoácidos do domínio I da integrina a2 expressa na SEQ ID NO:11; (e) um resíduo Arg correspondente à posição 317 da seqüência de aminoácidos da integrina a2 expressa na SEQ ID NO: 8 ou posição 165 da seqüência de aminoácidos do domínio I da integrina a2 expressa na SEQ ID NO:11; (f) um resíduo Asn correspondente à posição 318 da seqüência de aminoácidos da integrina a2 expressa na SEQ ID NO: 8 ou posição 166 da seqüência de aminoácidos do domínio I da integrina a2 expressa na SEQ ID NO: 11; ou (g) qualquer combinação de (a) a (f).
28. Anticorpo humanizado anti-integrina a2, caracterizado pelo fato de o anticorpo se ligar a um epitopo da integrina α2, epitopo este composto por: (a) um resíduo Lys correspondente à posição 192 da seqüência de aminoácidos da integrina oc2 expressa na SEQ ID NO: 8 ou posição 40 da seqüência de aminoácidos do domínio I da integrina a2 expressa na SEQ ID NO:11; (b) um resíduo Asn correspondente à posição 225 da seqüência de aminoácidos da integrina a2 expressa na SEQ ID NO: 8 ou posição 73 da seqüência de aminoácidos do domínio I da integrina a2 expressa na SEQ ID NO:11; (c) um resíduo Gln correspondente à posição 241 da seqüência de aminoácidos da integrina a2 expressa na SEQ ID NO: 8 ou posição 89 da seqüência de aminoácidos do domínio I da integrina a2 expressa na SEQ ID NO:11; (d) um resíduo Tyr correspondente à posição 245 da seqüência de aminoácidos da integrina a2 expressa na SEQ ID NO: 8 ou posição 93 da seqüência de aminoácidos do domínio I da integrina a2 expressa na SEQ ID NO:11; (e) um resíduo Arg correspondente à posição 317 da seqüência de aminoácidos da integrina cc2 expressa na SEQ ID NO: 8 ou posição 165 da seqüência de aminoácidos do domínio I da integrina a2 expressa na SEQ ID NO:11; (f) um resíduo Asn correspondente à posição 318 da seqüência de aminoácidos da integrina a2 expressa na SEQ ID NO: 8 ou posição 166 da seqüência de aminoácidos do domínio I da integrina a2 expressa na SEQ ID NO:11; ou (g) qualquer combinação de (a) a (f).
29. Anticorpo humanizado anti-integrina a2, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de ser um anticorpo completo.
30. Anticorpo humanizado anti-integrina a2, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de ser um anticorpo completo.
31. Anticorpo humanizado anti-integrina a2, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de ser um anticorpo completo.
32. Anticorpo humanizado anti-integrina a2, de acordo com a reivindicação 28, caracterizado pelo fato de ser um anticorpo completo.
33. Anticorpo humanizado anti-integrina a2, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de ser um fragmento de anticorpo.
34. Anticorpo humanizado anti-integrina a2, de acordo com a reivindicação 8, cpfd ser um fragmento de anticorpo.
35. Anticorpo humanizado anti-integrina a2, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de ser um fragmento de anticorpo.
36. Anticorpo humanizado anti-integrina a2, de acordo com a reivindicação 28, caracterizado pelo fato de ser um fragmento de anticorpo.
37. Anticorpo humanizado anti-integrina α2, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de ser ligado a um marcador detectável.
38. Anticorpo humanizado anti-integrina α2, de acordo com a reivindicação 8, cpfd ser ligado a um marcador detectável.
39. Anticorpo humanizado anti-integrina α2, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de ser ligado a um marcador detectável.
40. Anticorpo humanizado anti-integrina α2, de acordo com a reivindicação 28, caracterizado pelo fato de ser ligado a um marcador detectável.
41. Anticorpo humanizado anti-integrina α2, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de ser imobilizado na fase sólida.
42. Anticorpo humanizado anti-integrina α2, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de ser imobilizado na fase sólida.
43. Anticorpo humanizado anti-integrina α2, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de ser imobilizado na fase sólida.
44. Anticorpo humanizado anti-integrina α2, de acordo com a reivindicação 28, caracterizado pelo fato de ser imobilizado na fase sólida.
45. Anticorpo humanizado anti-integrina α2, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de o anticorpo inibir a ligação da integrina α2 ou α2β1 a um ligante da integrina α2β1.
46. Anticorpo humanizado anti-integrina α2, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de o anticorpo inibir a ligação da integrina a2 ou α2β1 a um ligante da integrina α2β1
47. Anticorpo humanizado anti-integrina α2, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de o anticorpo inibir a ligação da integrina α2 ou α2β1 a um ligante da integrina α2β1
48. Anticorpo humanizado anti-integrina a2, de acordo com a reivindicação 28, caracterizado pelo fato de o anticorpo inibir a ligação da integrina a2 ou α2β1 a um ligante da integrina α2β1
49. Anticorpo humanizado anti-integrina a2, de acordo com a reivindicação 45, caracterizado pelo fato de o ligante da integrina α2β1 ser selecionado dentre colágeno, laminina, Ecovirus 1, decorina, E-caderina, matriz metaloproteinase I (MMP-I), endorepelina, colectina e proteína do complemente Clq.
50. Anticorpo humanizado anti-integrina a2, de acordo com a reivindicação 46, caracterizado pelo fato de o ligante da integrina α2β1 ser selecionado dentre colágeno, laminina, Ecovirus 1, decorina, E-caderina, matriz metaloproteinase I (MMP-I), endorepelina, colectina e proteína do complemente Clq.
51. Anticorpo humanizado anti-integrina a2, de acordo com a reivindicação 47, caracterizado pelo fato de o ligante da integrina α2β1 ser selecionado dentre colágeno, laminina, Ecovirus 1, decorina, E-caderina, matriz metaloproteinase I (MMP-I), endorepelina, colectina e proteína do complemente Clq.
52. Anticorpo humanizado anti-integrina a2, de acordo com a reivindicação 48, caracterizado pelo fato de o ligante da integrina α2β1 ser selecionado dentre colágeno, laminina, Ecovírus 1, decorina, E-caderina, matriz metaloproteinase I (MMP-I), endorepelina, colectina e proteína do complemente Clq.
53. Método para determinar se uma amostra contém a integrina cc2, a integrina α2β1, ou ambas, caracterizado pelo fato de compreender colocar-se a amostra em contato com o anticorpo humanizado anti-integrina a2 conforme definida na reivindicação 1 e determinar-se se o anticorpo se liga à amostra, sendo que a ligação é uma indicação de que a amostra contém a integrina a2, integrina α2β1 ou ambas.
54. Método para determinar se uma amostra contém a integrina α2, a integrina α2β1, ou ambas, caracterizado pelo fato de compreender colocar-se a amostra em contato com o anticorpo humanizado anti-integrina α2 conforme definido na reivindicação 8 e determinar-se se o anticorpo se liga à amostra, sendo que a ligação é uma indicação de que a amostra contém a integrina α2, integrina α2β1 ou ambas.
55. Método para determinar se uma amostra contém a integrina α2, a integrina α2α1, ou ambas, caracterizado pelo fato de compreender colocar-se a amostra em contato com o anticorpo humanizado anti-integrina α2 conforme definido na reivindicação 15 e determinar-se se o anticorpo se liga à amostra, sendo que a ligação é uma indicação de que a amostra contém a integrina α2, integrina α2β1 ou ambas.
56. Método para determinar se uma amostra contém a integrina α2, a integrina α2β1, ou ambas, caracterizado pelo fato de colocar-se a amostra em contato com o anticorpo humanizado anti-integrina α2 conforme definido na reivindicação 28 e determinar-se se o anticorpo se liga à amostra, sendo que a ligação é uma indicação de que a amostra contém a integrina α2, integrina α2β1 ou ambas.
57. Kit, caracterizado pelo fato de conter o anticorpo humanizado anti-integrina α2 conforme definido na reivindicação 1 e instruções sobre como utilizá-lo para detectar a proteína da integrina α2 ou α2β1.
58. Kit, caracterizado pelo fato de conter o anticorpo humanizado anti-integrina α2 conforme definido na reivindicação 8 e instruções sobre como utilizá-lo para detectar a proteína da integrina α2 ou α2β1.
59. Kit, caracterizado pelo fato de conter o anticorpo humanizado anti-integrina α2 conforme definido na reivindicação 15 e instruções sobre como utilizá-lo para detectar a proteína da integrina α2 ou α2β1.
60. Kit, caracterizado pelo fato de conter o anticorpo humanizado anti-integrina α2 conforme definido na reivindicação 28 e instruções sobre como utilizá-lo para detectar a proteína da integrina a2 ou α2β1.
61. Ácido nucléico isolado, caracterizado pelo fato de codificar o anticorpo humanizado anti-integrina α2β1 conforme definido na reivindicação 1.
62. Ácido nucléico isolado, que codifica o anticorpo humanizado anti-integrina α2β1, conforme definido na reivindicação 8.
63. Vetor, caracterizado pelo fato de ser composto pelo ácido nucléico conforme definido na reivindicação 61.
64. Vetor, caracterizado pelo fato de ser composto pelo ácido nucléico conforme definido na reivindicação 62.
65. Célula hospedeira, caracterizada pelo fato de ser composta por: (a) ácido nucléico conforme definido na reivindicação -61; (b) ácido nucléico conforme definido na reivindicação -62; (c) vetor conforme definido na reivindicação 63; (d) vetor conforme definido na reivindicação 64; ou (e) qualquer combinação de (a) a (d).
66. Processo para produção de um anticorpo humanizado anti-integrina <x2, composto por cultura da célula hospedeira da reivindicação 65 em condições que permitam a expressão do anticorpo.
67. Processo, de acordo com a reivindicação 66, caracterizado pelo fato de também incluir a recuperação do anticorpo humanizado anti-integrina a2 da célula hospedeira.
68. Processo de acordo com a reivindicação 67, caracterizado pelo fato de o anticorpo humanizado anti- integrina α2β1 é recuperado do meio de cultura da célula hospedeira..
69. Método de triagem, caracterizado pelo fato de compreender: (a) detectar a ligação da integrina a2 ou α2β1 a um anticorpo composto pela região VL de SEQ ID NO:19 e pela região VH de SEQ ID NO:21 na presença versus na ausência de um anticorpo de teste; e (b) selecionar um anticorpo de teste se a presença do mesmo estiver correlacionado com a redução da ligação da integrina a2 ou α2β1 a um anticorpo composto pela região VL de SEQ ID NO:19 e pela região VH de SEQ ID NO:21.
70. Método, de acordo com a reivindicação 69, caracterizado pelo fato de a integrina a2 ou α2β1 ser imobilizada em um suporte sólido.
71. Método de triagem, caracterizado pelo fato de compreender: (a) detectar a ligação da integrina α2β1 ao colágeno na presença de um anticorpo de teste, sendo que anticorpo de teste se refere a um anticorpo que se liga a um dominio I da a2; (b) detectar a ligação do anticorpo de teste ao dominio I da a2 na presença de ions Mg++; (c) detectar a ligação do anticorpo de teste ao dominio I da a2 na presença de ions Ca++; (d) detectar a ligação do anticorpo de teste ao dominio I da a2 na presença de meio livre de cátions; e (e) seleciolnar o anticorpo de teste se o mesmo inibir a ligação da integrina α2β1 ao colágeno e se ligar ao dominio I da ia2 na presença de ion Mg++ e ions Ca++ e meio livre de cátions.
72. Composição, caracterizada pelo fato de compreender o anticorpo humanizado anti-integrina a2, conforme definido na reivindicação 1 e um carreador farmacologicamente aceitável.
73. Composição, caracterizada pelo fato de compreender o anticorpo humanizado anti-integrina a2, conforme definido na reivindicação 8 e um carreador f armacologicamente aceitável.
74. Composição, caracterizado pelo fato de compreender o anticorpo humanizado anti-integrina a2 conforme definido na reivindicação 15 e um carreador f armacologicamente aceitável.
75. Composição, caracterizada pelo fato de compreender o anticorpo humanizado anti-integrina a2 conforme definido nda reivindicação 28 e um carreador farmacologicamente aceitável.
76. Método para o tratamento de distúrbios associados com a integrina α2β1 em pacientes, caracterizado pelo fato de compreender administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo anti-integrina oc2 conforme definido em qualquer das reivindicações de 1-52 ou a composição conforme definida em qualquer das reivindicações 72-75.
77. Método para a inibição da ligação de leucócitos ao colágeno, caracterizado pelo fato de compreender administrar uma quantidade suficiente do anticorpo anti- integrina α2β1 conforme definido na reivindicação 28 para inibir a ligação dos leucócitos ao colágeno em um paciente.
78. Método de acordo com a reivindicação 76, caracterizado pelo fato de o distúrbio associado à integrina α2β1 ser selecionado dentre: doença inflamatória, doença autoimune e uma doença caracterizada por angiogênese alterada ou aumentada.
79. Método, de acordo com a reivindicação 7 6, caracterizado pelo fato de o distúrbio associado à integrina α2β1 ser selecionado dentre: doença inflamatória do intestino, doença de Crohn, colite ulcerativa, rejeições de transplante, neurite óptica, trauma da coluna vertebral, artrite reumatóide, lúpus eritematoso sistêmico (LES), diabetes mellitus, esclerose múltipla, sindrome de Reynaud, encefalomielite autoimune experimental, sindrome de Sjorgen, escleroderma, diabetes juvenil, retinopatia diabética, degeneração macular relacionada à idade, doença cardiovascular, psoriase, câncer bem como infecções que induzem uma reação inflamatória.
80. Método, de acordo com a reivindicação 76, caracteri zado pelo fato de o distúrbio associado à integrina α2β1 ser selecionado dentre: esclerose múltipla, artrite reumatóide, neurite óptica e trauma da coluna vertebral.
81. Método, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de o método não ser associado à: (a) ativação plaquetária, (b) agregação plaquetária, (c) redução na contagem de plaquetas circulantes, (d) complicações hemorrágicas ou (e) qualquer combinação de (a) a (d)
82. Método, de acordo com a reivindicação 76, caracterizado pelo fato de o anticorpo anti-integrina a2 mencionado acima conter uma cadeia pesada composta por SEQ ID NO: 174 ou SEQ ID NO: 176 e uma cadeia leve composta por SEQ ID NO:178.
83. Método, de acordo com a reivindicação 76, caracterizado pelo fato de o anticorpo anti-integrina oc2 inibir de maneira competitiva a ligação de um anticorpo composto por uma região VL de SEQ ID NO: 19 e uma região VH de SEQ ID NO: 21 à integrina humana α2β1 ou o domínio I da mesma.
84. Método, de acordo com a reivindicação 80, caracterizado pelo fato de a esclerose múltipla ser caracterizada por recidiva.
85. Método, de acordo com a reivindicação 80, caracterizado pelo fato de o método estar associado com um alívio de uma exacerbação ou seqüela neurológica associada com a esclerose múltipla.
86. Método, de acordo com a reivindicação 76, caracterizado pelo fato de o anticorpo anti-integrina a2 inibi a ligação da integrina α2β1 ao colágeno e não ser um mimético do ligante.
87. Método de direcionar uma molécula, composição ou um complexo para um sítio definido pela presença de um ligante da integrina α2β1, caracterizado pelo fato de compreender anexar ou ligar a molécula, composição ou complexo ao anticorpo humanizado anti-integrina oc2 conforme definido na reivindicação 1.
88. Método de direcionar a uma molécula, composição ou um complexo para um sítio definido pela presença de um ligante da integrina α2β1, caracterizado pelo fato de compreender anexar ou ligar a molécula, composição ou complexo ao anticorpo humanizado anti-integrina a2 conforme definida na reivindicação 8.
89. Método de direcionar uma molécula, composição ou um complexo para um sítio definido pela presença de um ligante da integrina α2β1, caracterizado pelo fato de compreender anexar ou ligar a molécula, composição ou complexo ao anticorpo humanizado anti-integrina a2 conforme definido na reivindicação 15.
90. Método de direcionar uma molécula, composição ou um complexo para um sítio definido pela presença de um ligante da integrina α2β1, caracterizado pelo fato de compreender anexar ou ligar a molécula, composição ou complexo ao anticorpo humanizado anti-integrina a2 conforme definido na reivindicação 28.
91. Uso de um anticorpo humanizado anti-integrina a2, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1- -52, caracterizado pelo fato de ser usado como um medicamento.
92. Uso de um anticorpo humanizado anti-integrina cc2, conforme definido em qualquer das reivindicações de 1 a -52 ou composição conforme definida na reivindicação 44 caracterizado pelo fato de ser usado para o tratamento de um distúrbio associado à integrina α2β1.
93. Uso de um anticorpo humanizado anti-integrina a2, conforme definido em qualquer das reivindicações de 1 a -52, caracterizado pelo fato de ser usado para a preparação de um medicamento para o tratamento de um distúrbio associado à integrina α2β1 .
94. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações de -91 a 93, caracterizado pelo fato de o distúrbio associado à integrina α2β1 ser selecionado dentre: doença inflamatória, doença autoimune e uma doença caracterizada por angiogênese inadequada.
95. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações de - 91 a 93, caracterizado pelo fato de o distúrbio associado à integrina α2β1 ser selecionado dentre: doença inflamatória do intestino, doença de Crohn, colite ulcerativa, rejeição de transplantes, neurite óptica, trauma da coluna vertebral, artrite reumatóide, lúpus eritematoso sistêmico (LES), diabetes mellitus, esclerose múltipla, sindrome de Reynaud, encefalomielite autoimune experimental, sindrome de Sjorgen, escleroderma, diabetes juvenil, retinopatia diabética, degeneração macular relacionada à idade, doença cardiovascular, psoriase, câncer bem como infecções que induzem reação inflamatória.
96. Uso, de acordo com qualquer das reivindicações de 91 a 93, caracterizado pelo fato de o distúrbio associado à integrina α2β1 ser selecionado dentre: esclerose múltipla, artrite reumatóide, neurite óptica e trauma da coluna vertebral.
97. Composição, para o tratamento de um distúrbio associado à integrina α2β1, caracterizada pelo fato de ser formada pelo anticorpo humanizado anti-integrina a2 conforme definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 52 e um carreador ou diluente farmacologicamente aceitável.
98. Composição, de acordo com a reivindicação 97, caracterizada pelo fato de o distúrbio associado à integrina α2β1 ser selecionado dentre: doença inflamatória, doença autoimune e uma doença caracterizada por angiogênese inadequada.
99. Composição, de acordo com a reivindicação 97, caracterizada pelo fato de o distúrbio associado à integrina α2β1 ser selecionado dentre: doença inflamatória do intestino, doença de Crohn, colite ulcerativa, rejeição de transplantes, neurite óptica, trauma da coluna vertebral, artrite reumatóide, lúpus eritematoso sistêmico (LES), diabetes mellitus, esclerose múltipla, sindrome de Reynaud, encefalomielite autoimune experimental, sindrome de Sjorgen, escleroderma, diabetes juvenil, retinopatia diabética, degeneração macular relacionada à idade, doença cardiovascular, psoriase, câncer bem como infecções que induzem reação inflamatória.
100. Composição, de acordo com a reivindicação 97, caracterizado pelo fato de o distúrbio associado à integrina α2β1 ser selecionado dentre: esclerose múltipla, artrite reumatóide, neurite óptica e trauma da coluna vertebral.
101. Embalagem, caracterizada pelo fato de conter o anticorpo humanizado anti-integrina a2 conforme definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 52 ou a composição de acordo com qualquer das reivindicações de 72 a 75, juntamente com as instruções para o tratamento de um distúrbio associado à integrina α2β1 .
102. Embalagem, de acordo com a reivindicação 101, caracterizada pelo fato de o distúrbio associado à integrina α2β1 ser selecionado dentre: doença inflamatória, doença autoimune e uma doença caracterizada por angiogênese inadequada.
103. Embalagem, de acordo com a reivindicação 101, caracterizada pelo fato de o distúrbio associado à integrina α2β1 ser selecionado dentre: doença inflamatória do intestino, doença de Crohn, colite ulcerativa, rejeição de transplantes, neurite óptica, trauma da coluna vertebral, artrite reumatóide, lúpus eritematoso sistêmico (LES), diabetes mellitus, esclerose múltipla, sindrome de Reynaud, encefalomielite autoimune experimental, sindrome de Sjorgen, escleroderma, diabetes juvenil, retinopatia diabética, degeneração macular relacionada à idade, doença cardiovascular, psoriase, câncer bem como infecções que induzem reação inflamatória.
104. Embalagem, de acordo com a reivindicação 101, caracterizada pelo fato de o distúrbio associado à integrina α2β1 ser selecionado dentre: esclerose múltipla, artrite reumatóide, neurite óptica e trauma da coluna vertebral.
105. Epitopo da integrina α2 que liga um anticorpo anti- integrina α2, caracterizado pelo fato de o epitopo não ser composto pelo sitio de ligação do ligante da integrina α2,:
106. Epitopo, de acordo com a reivindicação 105, caracterizado pelo fato de a ligação ao epitopo não estar associada a (a) ativação plaquetária, (b) agregação plaquetária, (c) diminuição da contagem de plaquetas circulantes, (d) complicações hemorrágicas, (e) ativação da integrina α2 ou (f) qualquer combinação de (a) a (e) .
107. Anticorpo humanizado anti-integrina α2, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de LCDRl ser SAQSSVNYIH (SEQ ID N0:112).
108. Anticorpo humanizado anti-integrina α2, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de a região variável de cadeia pesada compreende a SEQ ID NO:109.
109. Anticorpo humanizado anti-integrina α2, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de a região variável de cadeia leve compreende a SEQ ID NO:91.
110. Anticorpo humanizado anti-integrina α2, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de: (a) região variável de cadeia pesada compreende a SEQ ID NO:109; e (b) região variável de cadeia leve compreende a SEQ ID NO:91.
111. Anticorpo humanizado anti-integrina α2, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de a asparagina (N) no aminoácido da posição 26, na SEQ ID NO: -186 ser substituída por glutamina (Q).
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