BRPI0620505A2

BRPI0620505A2 - polipeptìdeos, anticorpo, polipeptìdeo de fusão, composição, polinucleotìdeo, vetor, célula hospedeira, método de produção de um polipeptìdeo, biblioteca de polipeptìdeos, métodos para gerar uma composição, método para a seleção de um domìnio variável ligante ao antìgeno, método para selecionar polipeptìdeos, método para isolar um ou mais polipeptìdeos, método para o tratamento de cáncer e método para tratar

Info

Publication number: BRPI0620505A2
Application number: BRPI0620505-4A
Authority: BR
Inventors: Sachdev S Sidhu; Sara C Birtalan; Frederic A Fellouse
Original assignee: Genentech Inc
Priority date: 2005-06-22
Filing date: 2006-12-01
Publication date: 2010-06-29

Abstract

A invenção fornece anticorpos ou fragmentos destes ligantes ao antígeno para DR5 e HER-2. Os anticorpos e/ou fragmentos destes ligantes ao antígeno consistem de variantes de CDR que compreende uma diversidade de seqúências de aminoácidos altamente restritas. A invenção fornece também estes polipeptídeos como polipeptídeos de fusão para polipeptídeos heterólogos, tais como, pelo menos uma porção do fago ou proteínas da cápside viral, marcadores e ligantes. Além disso, fornece composições e métodos de utilização para o tratamento do câncer e de doenças autoimunes relacionadas.

Description

"POLIPEPTÍDEOS, ANTICORPO, POLIPEPTÍDEO DE FUSÃO,COMPOSIÇÃO, POLINUCLEOTÍDEO, VETOR, CÉLULA HOSPEDEIRA,MÉTODO DE PRODUÇÃO DE UM POLIPEPTÍDEO, BIBLIOTECA DEPOLIPEPTÍDEOS, MÉTODOS PARA GERAR UMA COMPOSIÇÃO, MÉTODOPARA A SELEÇÃO DE UM DOMÍNIO VARIÁVEL LIGANTE AO ANTÍGENO,MÉTODO PARA SELECIONAR POLIPEPTÍDEOS, MÉTODO PARA ISOLARUM OU MAIS POLIPEPTÍDEOS, MÉTODO PARA O TRATAMENTO DECÂNCER E MÉTODO PARA TRATAR"

Este é um pedido não provisório que reivindica prioridade para apatente US número de série 60/742185 depositada em 2 de Dezembro de 2005e Patente US número de série 60/805553 depositada em 22 de junho de 2006,do qual todos os pedidos são incorporados ao presente pela referência.

Campo Da Invenção

A presente invenção refere-se a variantes de CDR altamentediversificadas utilizando repertórios de aminoácido altamente restritos, ebibliotecas contendo uma variedade, de tais seqüências. A invenção também serefere à polipeptídeos de fusão contendo estes variantes de CDR. A invençãotambém se refere aos métodos e composições úteis para a identificação denovos polipeptídeos de ligação que podem ser utilizados terapeuticamente oucomo reagentes.

Antecedentes Da Invenção

A tecnologia de exibição por fagos tem fornecido uma poderosaferramenta para gerar e selecionar novas proteínas que se ligam a um ligante,tais como um antígeno. O uso de técnicas de exibição por fago permite ageração de grandes bibliotecas de variantes de proteínas que podem serrapidamente selecionadas para aqueles que se ligam a seqüências de umantígeno alvo com grande afinidade. Ácidos nucléicos codificandopolipeptídeos variantes são fundidos a uma seqüência de ácidos nucléicos quecodificam uma proteína da cápside viral, tais como a proteína do gene III ou aproteína do gene VIII. Têm sido desenvolvidos sistemas de exibição por fagomonovalente no qual as seqüências de ácidos nucléicos que codificam umaproteína ou polipeptídeo são fundidas a uma seqüência de ácidos nucléicosque codifica uma porção da proteína do gene III (Bass, S., Proteins, 8:309(1990); Lowman e Wells, Methods: A Companion to Methods in Enzymology,3:205 (1991)). Em um sistema de exibição por fagos monovalentes, o gene defusão é expresso em níveis baixos e as proteínas do gene III do tipo selvagemsão também expressas a fim de que a infecciosidade das partículas sejamantida. Métodos para gerar bibliotecas de peptídeo e a seleção dessasbibliotecas têm sido divulgados em muitas patentes (por exemplo, Patente US5.723.286, Patente US 5.432.018, Patente US 5.580.717, Patente US5.427.908 e Patente US 5.498.530).

A demonstração de expressão de peptídeos sobre a superfície defagos filamentosos e expressão de fragmentos de anticorpos funcionais noperiplasma da E. coli foi importante no desenvolvimento de anticorpos debibliotecas de exibição por fagos Smith et ai, Science (1985), 228:1315;Skerra e Pluckthun, Science (1988), 240:1038). Bibliotecas de anticorpos ouantígenos que se ligam a polipeptídeos foram preparados de várias maneiras,incluindo a alteração de um único gene, por inserção aleatória de seqüênciasde DNA ou por clonagem de uma família de genes relacionados. Métodos paraa apresentação de fragmentos que se ligam a anticorpos ou antígenosutilizando exibição por fago foram descritos nas Patentes US 5750373, US5733743, US 5837242, US 5969108, US 6172197, US 5580717 e US 5658727.

A biblioteca é então selecionada para expressão de anticorpos ou antígenosligantes às proteínas com as características desejadas.

A tecnologia de exibição por fagos tem várias vantagens sobre atecnologia convencional com hibridoma e métodos recombinantes depreparação de anticorpos com as características desejadas. Esta tecnologiapermite o desenvolvimento de grandes bibliotecas de anticorpos com diversasseqüências em menos tempo e sem a utilização de animais. A preparação dehibridomas ou de anticorpos humanizado pode facilmente exigir vários mesesde preparação. Além disso, uma vez que não é necessária uma imunização,anticorpos de bibliotecas de fagos podem ser gerados por antígenos tóxicos ouque possuem baixa antigenicidade (Hogenboom, Immunotechniques (1988),4:1-20). Bibliotecas anticorpos de fagos também podem ser utilizadas paragerar e identificar novos anticorpos humanos.

Anticorpos tornaram-se muito úteis como agentes terapêuticospara uma grande variedade de condições. Por exemplo, anticorposhumanizado contra HER-2, um antígeno tumoral, útil no diagnóstico etratamento do câncer. Outros anticorpos, como anticorpos anti-INF-y, são úteisno tratamento de condições inflamatórias, como a doença de Crohn.Bibliotecas de exibição por fagos têm sido usadas para gerar anticorposhumanos a partir de humanos imunizados e não-imunizados, seqüências delinhagens percursoras, células B naives e repertórios de Ig (Barbas & Burton,Trends Biotech (1996), 14:230; Griffiths et ai, EMBO J. (1994), 13:3245;Vaughan et ai, Nat. Biotech. (1996), 14:309; Winter patente EP 0368.684 BI).Bibliotecas de antígenos ligantes naives ou não imunes, foram gerados usandouma variedade de tecidos linfóides. Algumas destas bibliotecas são disponíveiscomercialmente, como aquelas desenvolvidas pela Cambridge AntibodyTechnology and Morphosys (Vaughan et ai, Nature Biotech 14:309 (1996);Knappik et ai, J. Mol. Bioi 296:57 (1999) ). No entanto, muitas destasbibliotecas têm a diversidade limitada.

A capacidade de identificar e isolar anticorpos de alta afinidadeem uma biblioteca de exibição por fago é importante para identificar novosanticorpos humanos para fins terapêuticos. O isolamento de anticorpos de altaafinidade em uma biblioteca está tradicionalmente associado por serdependente, pelo menos em parte, da dimensão da biblioteca, da eficiência daprodução em células bacterianas e da diversidade da biblioteca. Vide, porexemplo, Knappik et ai, J. Moi Biol. (1999), 296:57. A dimensão da bibliotecaé diminuída pela ineficiência de produção, devido o enovelamento incorreto daproteína do anticorpo ou do antígeno de ligação e a presença de códons deparada. A expressão em células bacterianas pode ser inibida se o anticorpo ouo domínio do antígeno de ligação não está devidamente dobrado. Expressãopode ser melhorada por mutações nos resíduos e modificações da interfacevariável / constante, ou em resíduos do CDR selecionados. (Deng et ai, J. Biol.Chem. (1994), 269:9533, Ulrich et ai, PNAS (1995), 92:11907-11911; Forsbergetal., J. Biol. Chem. (1997) , 272: 12430). A seqüência da região estrutural éum fator na prestação para o enovelamento adequado quando as bibliotecasde anticorpo de fagos são produzidas em células bacterianas.

A geração de uma biblioteca diversificada de anticorpos ouproteínas de antígenos ligantes também é importante para isolamento deanticorpos de alta afinidade. Bibliotecas com diversificações em CDRslimitados foram gerados usando uma variedade de abordagens. Vide, porexemplo, Tomlinson, Nature Biotech. (2000), 18:989-994. As regiões CDR3 sãode interesse, em parte porque muitas vezes encontram-se participantes daligação ao antígeno. As regiões CDR3 na cadeia pesada variam muito detamanho, seqüência e conformação estrutural.

Outros também têm gerado uma diversidade pela randomizaçãode regiões CDR variáveis das cadeias leves e pesadas utilizando todos os 20aminoácidos de cada posição. Pensou-se que utilizando todos os 20aminoácidos teria como resultado uma grande diversidade de seqüências deanticorpos variantes e aumentaria a chance de identificar novos anticorpos.(Barbas, PNAS., 91:3809 (1994); Yelton, DE, J. Immunology, 155:1994 (1995);Jackson, JR, J. Immunology, 154:3310 (1995) e Hawkins, RE, J. Mol. Biology,226:889 (1992)).

Também existem tentativas de criar diversidade pela restrição dogrupo de substituições de aminoácido em alguns CDRs de modo a refletir adistribuição de aminoácidos em anticorpos que ocorrem naturalmente. Ver,Garrard & Henner, Gene (1993), 128:103; Knappik et ai, J. Mol. Biol. (1999),296:57. No entanto, estas tentativas têm tido sucesso variado e não foramaplicadas de forma sistemática e quantitativa. Criando diversidade nas regiõesCDR ao mesmo tempo minimizando o número de mudanças de aminoácidotem sido um desafio. Além disso, em alguns casos, uma vez que uma primeirabiblioteca foi gerada de acordo com um conjunto de critérios, pode serdesejável aumentar ainda mais a diversidade da primeira biblioteca. Noentanto, isto requer que a primeira biblioteca tenha diversidade suficiente eainda permaneça suficientemente pequena em dimensão, bem como umamaior diversidade pode ser introduzida sem limitações práticassubstancialmente superiores, tais como rendimento, etc.

Alguns grupos têm relatado em análises teóricas e experimentaisdo número mínimo do repertório de aminoácido que é necessário para ageração de proteínas. No entanto, estas análises foram, em geral, limitadas noseu escopo e natureza, e questões permaneceram relativas quanto àviabilidade e aplicabilidade da produção de polipeptídeos com funçõescomplexas utilizando um conjunto restrito de tipos de aminoácido. Vide, porexemplo, Riddle ei a/., Nat. Struct. Biol. (1997), 4(10):805-809; Shang et ai,Proc. Natl. Acad. Sei. USA (1994), 91:8373-8377; Heinz et ai, Proc. Natl Acad.Sei. USA (1992), 89:3751-3755; Regan & Degrado, Science (1988), 241:976-978; Kamteker et ai, Science (1993), 262:1680-1685; Wang & Wang, NatStruct. Biol. (1999), 6(11): 1033-1038; Xiong et ai, Proc. Natl. Acad. Sei. USA(1995), 92:6349-6353; Heinz et ai, Proc. Natl. Acad. Sei. USA (1992), 89:3751-3755; Cannata et ai, Bioinformatics (2002), 18(8):1102-1108; Davidson ei a/.,Nat. Struct. Biol. (1995), 2(10):856-863; Murphy et ai, Prot. Eng. (2000),13(3):149-152; Brown & Sauer, Proc. Nati Acad. Sei. USA (1999), 96:1983-1988; Akanuma ei ai, Proc. Nati Acad. Sei. (2002), 99(21): 13549-13553;Chan, Nat. Struct. Biol. (1999), 6(11 ):994-996.

Assim, permanece a necessidade de melhorar os métodos degeração de bibliotecas que possuem um grau suficiente de diversidade deseqüência, ainda são suficientemente condescendentes para manipulaçõesadicionais direcionadas a maior diversificação da expressão de altorendimento, etc. A presente invenção descrita satisfaz essa necessidade efornece outros benefícios.

Descrição Resumida da Invenção

A presente invenção proporciona métodos simplificados e flexíveispara produzir polipeptídeos que compreendem de CDRs variantes que constamde seqüências com diversidade restrita que ainda conservam a capacidade seligar ao antígeno alvo. Ao contrário dos métodos convencionais que sebaseiam na proposição de que a diversidade adequada dos ligantes aoantígeno alvo podem ser gerados somente se um determinado CDR (s), outodos os CDRs são diversificados e, ao contrário das noções convencionais deque a diversidade adequada é dependente de uma ampla gama desubstituições de aminoácidos (geralmente pela substituição de todas ou damaior parte dos 20 aminoácidos), a invenção fornece métodos capazes degerar polipeptídeos ligantes ao alvo de alta qualidade que não sãonecessariamente dependente de uma diversificação particular de CDR(s) ou aum determinado número de CDRs de um polipeptídeo de referência ouanticorpo fonte. A invenção é baseada, pelo menos em parte, sobre osurpreendente e inesperado achado de que bibliotecas altamente diversificadasde polipeptídeos funcionais que incluem de alta qualidade capazes de se ligarao antígeno podem ser gerados por um número de diversificação mínima deposições de aminoácidos com um número muito restrito de resíduos deaminoácidos. Os métodos da invenção são rápidos, convenientes e flexíveis,baseados na utilização de um conjunto de códons restrito que codificam umnúmero reduzido de aminoácidos. A diversidade da seqüência restrita, e,portanto, geralmente menor tamanho da população (por exemplo, bibliotecas)de polipeptídeos gerados pelos métodos da invenção permite uma maiordiversificação destas populações, sempre que necessária ou desejada. Esta éuma vantagem geralmente não fornecida pelos métodos convencionais.

Polipeptídeos ligantes candidatos gerados pela invenção possuemcaracterísticas de ligação ao antígeno de alta qualidade e têm característicasestruturais que prevêem um alto rendimento de produção em cultura celular. Ainvenção fornece métodos para gerar esses polipeptídeos de ligação, métodosde utilização desses polipeptídeos e composições contendo os mesmos.

Em um aspecto, a invenção fornece polipeptídeos de fusãocompreendendo CDR(s) diversificada e uma seqüência de polipeptídeoheteróloga (em certos exemplos de realização, com pelo menos uma porção deum polipeptídeo viral), como polipeptídeo único e como membro de umapluralidade de polipeptídeos único que são candidatos a ligantes aos alvos deinteresse. Composições (tais como bibliotecas) compreendendo taispolipeptídeos encontram utilização em uma variedade de aplicações, porexemplo, como pool de polipeptídeos imunoglobulinas candidatos (porexemplo, anticorpos e fragmentos de anticorpos) que se ligam aos alvos deinteresse. Tais polipeptídeos também podem ser gerados usando moléculas-matriz "scaffolds" não imunoglobulinas (por exemplo, proteínas, tais comohormônio de crescimento humano e etc). A invenção abrange vários aspectos,incluindo polinucleotídeos e polipeptídeos produzidos de acordo com osmétodos da invenção e de sistemas, kits e artigos manufaturados para praticaros métodos da invenção, e/ou utilização dos polipeptídeos / polinucleotídeose/ou composições da invenção.

Em um aspecto, a invenção fornece um método para gerar umpolipeptídeo incluindo pelo menos um, dois, três, quatro, cinco ou todos osCDRs variantes selecionados entre grupo constituído por H1, H2, H3, L1, L2 eL3, onde o dito polipeptídeo é capaz de se ligar a um antígeno alvo deinteresse, o dito método compreende em identificar, pelo menos, um (ouqualquer número até o todo) solvente acessível e a posição do aminoácidoaltamente diversificado em uma referência CDR correspondente à variante deCDR, e; (ii) variando o aminoácido no solvente acessível e posição altamentediversificada, gerando diversos exemplares de CDR variante utilizando umconjunto de códons restrito (a definição de "conjunto de códons restrito" éespecificada abaixo).

Diversos aspectos e exemplos de realização dos métodos dainvenção são úteis para a produção e/ou utilização de um pool contendo umapluralidade de polipeptídeos da invenção, em especial para a seleção eidentificação de ligantes candidatos aos antígenos alvo de interesse. Porexemplo, a invenção fornece um método para gerar uma composição quecompreende uma pluralidade de polipeptídeos, cada polipeptídeo incluindo pelomenos um, dois, três, quatro, cinco ou todos variantes de CDR selecionados deentre o grupo de CDRs constituído por H1, H2, H3, L1, L2 e L3, onde estespolipeptídeo são capazes de se ligar a um antígeno alvo de interesse, o ditométodo compreende em identificar, pelo menos, um (ou qualquer número até otodo) solvente acessível e posição de aminoácido altamente diversificada emuma referência CDR correspondente à variante de CDR; e (ii) variando oaminoácido no solvente acessível e a posição altamente diversificada, gerandodiversos exemplares de variante de CDR utilizando um conjunto de códonrestrito; onde uma pluralidade de polipeptídeos são gerados pela ampliação deum polinucleotídeo molde com um conjunto de oligonucleotídeos constando deuma degenerescência altamente restritiva na seqüência que codifica umaminoácido variante, no qual a dita degenerescência altamente restritiva refleteo número limitado de seqüências de códons do conjunto de códon restrito.

Em outro exemplo, a invenção fornece um método quecompreende a construção de um vetor de expressão contendo uma seqüênciapolinucleotídica que codifica uma cadeia leve, uma cadeia pesada ou ambos osdomínios variáveis das cadeias leves e pesadas de um anticorpo fonte incluindopelo menos um, dois , três, quatro, cinco ou todos os CDRs selecionados do grupoconstituído por CDR L1, L2, L3, H1, H2, H3 e mutando, pelo menos, um, dois, três,quatro, cinco ou todos os CDRs do anticorpo fonte em pelo menos um (ou qualquernúmero até todos) solvente acessível e posição de aminoácido altamentediversificado utilizando um conjunto de códon restrito.

Em outro exemplo, a invenção fornece um método que inclui: aconstrução de uma biblioteca de fago ou partículas de fagomídeo que exibemuma pluralidade de polipeptídeos da invenção; expondo a biblioteca departículas com um antígeno alvo em condições adequadas para a ligação daspartículas ao antígeno alvo; e separando as partículas que se ligam a partir daaquelas que não se ligam ao antígeno.

Em um dos métodos da invenção descrito no presente, umsolvente acessível e/ou posição de aminoácido altamente diversificado podeser qualquer posição que atendam aos critérios como descrito no presente, emparticular qualquer combinação das posições como descrito no presente, porexemplo, qualquer combinação de posições de polipeptídeos descritas para ainvenção (tal como, descrito em maiores detalhes no presente). As variantes deaminoácido adequadas podem ser quaisquer que atendam aos critérios comodescrito no presente, por exemplo, os aminoácidos variantes nos polipeptídeosda invenção, como descritos em maior detalhe abaixo.O desenvolvimento de variedades de CDRs pode envolver odesenvolvimento de diversidade no comprimento e / ou na seqüência do CDR.

Por exemplo, o CDRH3 pode ser diversificado no comprimento, por exemplo, 7a 21 aminoácidos de comprimento, e/ou na sua seqüência, por exemplo, pelavariação altamente diversificada e/ou pela posição do solvente acessível comos aminoácidos codificados por um conjunto de códons restrito. Em algumasrealizações, uma porção do CDRH3 tem um comprimento variando de 5 a 21, 7a 20, 9 a 15, ou 11 a 13 aminoácidos, e tem uma variação de aminoácido emuma ou mais posições codificadas por um conjunto de códons restrito quecodificam um número limitado de aminoácidos como, por exemplo, o conjuntode códons restrito que codificam não mais que 19, 15, 10, 8, 6, 4 ou 2aminoácidos. Em alguns exemplos, a extremidade C- terminal tem umaseqüência de aminoácidos AM, AMDY, ou DY.

Em alguns exemplos de realização, os polipeptídeos da invençãopodem estar em uma variedade de formas, desde que a função de ligação aopolipeptídeos estiver mantida. Em alguns exemplos de realização, umpolipeptídeo da invenção é um polipeptídeo de fusão (ou seja, uma fusão deduas ou mais seqüências de polipeptídeos heterólogas). Polipeptídeos commuitas CDRs de acordo com a invenção pode ser preparada como uma fusãode polipeptídeos de pelo menos uma porção de uma proteína da cápside viral,por exemplo, para uso na exposição por fagos. Proteínas da cápside viral quepodem ser utilizadas para a exibição dos polipeptídeos da invençãocompreendem proteínas p III, proteína principal da cápside pVIII, Soe (fago T4),Hoc (fago T4), gpD (fago lambda), pVI, ou variantes ou fragmentos destes. Emalguns exemplos de realização, o polipeptídeo é fundido a pelo menos umaporção de uma proteína de cápside viral, como uma proteína da cápside viralselecionada a partir do grupo, constituído por, plll, pVIII, Soe, Hoc, gpD, pVI, evariantes ou fragmentos destes.Em alguns exemplos de realização, na qual o polipeptídeo comCDRs diversificados é um ou mais domínio variável de anticorpo, o domíniovariável de anticorpo pode ser exibido na superfície do vírus de várias formas,incluindo ScFv, Fab, ScFv2, F(ab')2 e F(ab)2-. Para a exposição dospolipeptídeos de forma bivalente, a proteína de fusão, em certos exemplosinclui um domínio de dimerização. O domínio de dimerização pode incluir umaseqüência de dimerização e/ou uma seqüência que inclua um ou mais resíduoscisteína. O domínio de dimerização pode estar ligado, direta ou indiretamente,à extremidade C-terminal de um domínio variável de cadeia pesada ou domínioconstante (por exemplo, CH1). A estrutura do domínio de dimerização pode servariada, dependendo se o domínio variável do anticorpo é produzido como umcomponente da proteína de fusão com o componente da proteína da cápsideviral (por exemplo, sem um códon de parada após o domínio de dimerização)ou se o domínio variável do anticorpo é produzido predominantemente sem ocomponente da proteína da cápside viral (por exemplo, com um códon deparada após o domínio de dimerização). Quando o domínio variável doanticorpo é produzido predominantemente como uma proteína de fusão com ocomponente da proteína da cápside viral, uma ou mais ligações de dissulfetoe/ou seqüência de dimerização única fornece uma exibição bivalente. Para osdomínios variáveis do anticorpo predominantemente produzidos não sendofundidos a um componente da proteína da cápside viral (por exemplo, com umcódon de parada âmbar), o domínio de dimerização pode incluir tanto umresíduo cisteína quanto uma seqüência de dimerização.

Além disso, opcionalmente, um polipeptídeo de fusão pode incluir ummarcador que pode ser útil para a purificação, detecção e/ou rastreio, tais como,FLAG, poli-his, gD tag, c-myc, proteína fluorescente ou B-galactosidase. Em umexemplo de realização, um polipeptídeo de fusão compreende a fusão de umdomínio constante ou variável da cadeia leve a um polipeptídeo marcado.Em outro aspecto da invenção, um polipeptídeo, tal como umdomínio variável de anticorpo, é obtido a partir de uma única fonte ou moléculamolde. A fonte ou molécula molde pode ser selecionada ou desenvolvida paraas características tais como o bom rendimento e estabilidade quando produzidaem cultura de células eucarióticas ou procarióticas e/ou para acomodar regiõesCDR H3 de dimensões variáveis. A seqüência da molécula molde pode seralterada para melhorar a enovelamento e/ou exibição de domínio variávelquando apresentada como uma proteína de fusão com uma proteína dacápside do fago. Por exemplo, um anticorpo fonte pode compreender aseqüência de aminoácidos do domínio variável do anticorpo humanizado 4D5(domínio variável da cadeia leve (Figura 1; SEQ ID No: 1)); (domínio variávelda cadeia pesada (Figura 1; SEQ ID No: 2)). Por exemplo, em um domíniovariável de anticorpo de cadeia leve ou pesada, resíduos da região estruturalpodem ser modificados ou alterados a partir do anticorpo fonte ou moléculamodelo para melhorar o enovelamento, o rendimento, a apresentação ou aafinidade do domínio variável do anticorpo. Em alguns exemplos de realização,resíduos da região estrutural são selecionados para serem modificados a partirdo anticorpo fonte ou molécula molde quando o aminoácido na posição daregião estrutural da molécula fonte é diferente do aminoácido ou aminoácidoscomumente encontrados na posição em que ocorrem naturalmente nosanticorpos ou em um subgrupo da seqüência de consenso. Os aminoácidosnestas posições podem ser alterados pelos aminoácidos mais comumenteencontrados nos anticorpos que ocorrem naturalmente ou em um subgrupo daseqüência de consenso naquela posição. Em um exemplo de realização, oresíduo da região estrutural 71 da cadeia pesada pode ser R, V ou A. Em outroexemplo, o resíduo da região estrutural 93 da cadeia pesada pode ser S ou A.Em outro exemplo ainda, o resíduo da região estrutural 94 é R, K ou T ou écodificada pelo MRT. Em outro exemplo, é um quadro de resíduos 93 e 94 deresíduos quadro é ainda R. Em outro exemplo, o resíduo da região estrutural49 da cadeia pesada pode ser alanina ou glicina. Os resíduos da regiãoestrutural da cadeia leve também podem ser alterados. Por exemplo, oaminoácido na posição 66 poderá ser arginina ou glicina. A região estruturalpara a seqüência da cadeia leve e pesada do anticorpo humanizado 4D5 dotipo selvagem são exibidas na figura 6 (SEQ ID Nos:6-9 e 10-13,respectivamente). As regiões estruturais para a seqüência da cadeia leve epesada do anticorpo humanizado 4D5 na qual a cadeia leve está modificada naposição 66 e a cadeia pesada está modificada nas posições 71, 73, e 78 sãoexibidas na Figura 7 (SEQ ID Nos: 14-17 e 18-21, respectivamente).

Os métodos da invenção são capazes de gerar uma grandevariedade de polipeptídeos compreende um conjunto diverso de seqüências deCDR. Em um exemplo de realização, um uma ou mais bibliotecas sãoformadas utilizando os métodos da invenção como descrito no presente. O Asbibliotecas são selecionadas para a ligação ao antígeno alvo, por exemplo,DR5 e HER-2 humanos.

É fornecido o domínio variável de cadeia pesada daimunoglobulina randomizado para proporcionar uma diversidade. Em umarealização, um polipeptídeo compreende um domínio variável de cadeiapesada de imunoglobulina, onde:

(i) CDRH1 compreende uma seqüência de aminoácidos: G-F-X1-I-X2-X3-X4-X5-I-H (SEQ ID No: 22), no qual G é a posição 26 e X1 é a posição28 de acordo com o sistema de numeração de Kabat; no qual X1 é selecionadoa partir de S e Y; no qual X2 é selecionado a partir de Y e S; no qual, X3 éselecionado a partir de Y e S; no qual, X4 é selecionado a partir de Y e S; noqual, X5 é selecionado a partir de Y e S;

(ii) CDRH2 compreende uma seqüência de aminoácidos: X1-I-X2-P-X3-X4-G-X5-T-X6-Y-A-D-S-V-K-G (SEQ ID No: 23), no qual X1 é a posição50, de acordo com o sistema de numeração de Kabat ; no qual, X1 éselecionado a partir de Y e S; no qual X2 é selecionado a partir de Y e S; noqual, X3 é selecionado a partir de Y e S; no qual, X4 é selecionado a partir de Ye S; no qual, X5 é selecionado a partir de Y e S, e no qual X6 selecionado apartir de Y e S; e

(iii) CDRH3 compreende uma seqüência de aminoácidos: X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X.14-X15-X16-D-Y (SEQ ID No ED:31), no qual, X1 é a posição 95 de acordo com o sistema de numeração deKabat, e no qual X1 é selecionado a partir de R, Y, M; X2 é selecionado a partirde Y e R; X3 é selecionado a partir de Y, S, R, P e G, X4 é selecionado a partirde Y e S; X5 é selecionado a partir de Y, S, R e H; X6 é selecionado a partir deR, Y e S; X7 é selecionado a partir de G, Y e S; X8 é selecionado a partir de R,Y e S; X9 é selecionado a partir de G, Y e S; X10 é selecionado a partir de R, Ye S; X11 é selecionado a partir de G, Y e S; X12 é selecionado a partir de S, Y,R, G e A; X13 é selecionado a partir de G e Y; X14 é selecionado a partir de L,M, R, G e A; e X15 é selecionado a partir de G, F e L ou não está presente, eX16 é F ou não está presente.

Em outro exemplo de realização, um polipeptídeo compreende umdomínio variável de cadeia pesada de imunoglobulina, onde:

(iii) CDRH3 compreende uma seqüência de aminoácidos: X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17-X18-X19-D-Y(SEQ ID No: 24), no qual, X1 é a posição 95 de acordo com o sistema denumeração de Kabat, caracterizada pelo fato dos aminoácidos em cada uma dasposições de X1-X6 serem selecionados a partir de um pool de aminoácidos numarazão molar de 50% de Y, 25% de S, e 25% de G; caracterizada pelo fato dosaminoácidos em cada uma das posições de X7-X17 serem selecionados a partir deum pool de aminoácidos numa razão molar de 50% de Y, 25% de S e 25% de G, ounão estarem presentes; no qual X18 é selecionado a partir de G e A, e no qual X19é selecionado a partir de I, M, L e F.

(ii) CDRH2 compreende uma seqüência de aminoácidos: X1-I-X2-P-X3-X4-G-X5-T-X6-Y-A-D-S-V-K-G (SEQ ID No: 23), no qual X1 é a posição 50, deacordo com o sistema de numeração de Kabat; no qual, X1 é selecionado a partirde Y e S; no qual X2 é selecionado a partir de Y e S; no qual, X3 é selecionado apartir de Y e S; no qual, X4 é selecionado a partir de Y e S; no qual, X5 éselecionado a partir de Y e S, e no qual X6 selecionado a partir de Y e S; e(iii) CDRH3 compreende uma seqüência de aminoácidos: X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11 -X12-X13-X14-X15-X16-X17-X18-X19-D-Y(SEQ ID No: 26), no qual, X1 é a posição 95 de acordo com o sistema denumeração de Kabat, caracterizada pelo fato dos aminoácidos em cada umadas posições de X1-X6 serem selecionados a partir de um pool de aminoácidosnuma razão molar de 25% de Y, 50% de S, e 25% de R; caracterizada pelo fatodos aminoácidos em cada uma das posições de X7-X17 serem selecionados apartir de um pool de aminoácidos numa razão molar de 25% de Y, 50% de S e25% de R, ou não estarem presentes; no qual, X18 é selecionado a partir de Ge A; e no qual, X19 é selecionado a partir de I, M, L e F.

(iii) CDRH3 compreende uma seqüência de aminoácidos: X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X 14-X 15-X 16-X 17-X 18-X 19-D-Y(SEQ ID No ED: 27), no qual, X1 é a posição 95 de acordo com o sistema denumeração de Kabat, caracterizada pelo fato dos aminoácidos em cada umadas posições de X1-X6 serem selecionados a partir de um pool de aminoácidosnuma razão molar de 38% de Y, 25% de S, e 25% de G e 12% de R;caracterizada pelo fato dos aminoácidos em cada uma das posições de X7-X17serem selecionados a partir de um pool de aminoácidos numa razão molar de38% de Y, 25% de S, e 25% de G e 12% de R, ou não estarem presentes; noqual, X18 é selecionado a partir de G e A, e no qual, X19 é selecionado a partirde I, M, Le F.

(iii) CDRH3 compreende uma seqüência de aminoácidos: X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17-X18-X19-D-Y(SEQ ID No ED: 28), no qual, X1 é a posição 95 de acordo com o sistema denumeração de Kabat, caracterizada pelo fato dos aminoácidos em cada umadas posições de X1-X6 serem selecionados a partir de um pool de aminoácidosnuma razão molar de 20% de Y, 26% de S, 26% de G, 13% de R, 1% de A, 1%de D, 1% de E, 1% de F, 1% de H, 1% de I, 1% de K, 1% de L, 1% de M, 1%de N, 1% de P, 1% de Q, 1% de T, 1% de V e 1% de W; caracterizada pelo fatodos aminoácidos em cada uma das posições de X7-X17 serem selecionados apartir de um pool de aminoácidos numa razão molar de 20% de Y, 26% de S,26% de G, 13% de R, 1% de A, 1% de D, 1% de E, 1% de F, 1% de H, 1% de I,1% de K, 1% de L, 1% de M, 1% de N, 1% de P, 1% de Q, 1% de T, 1% de V e1% de W, ou não estão presentes; no qual, X18 é selecionado a partir de G eA, e no qual, X19 é selecionado a partir de I, M, L e F.

Em um aspecto da invenção, a CDRH1 compreende pelo menosde uma seqüência de aminoácidos selecionada de qualquer uma das SEQs IDNos: 524-540 e 189-294 ou pelo menos de uma seqüência de aminoácidoselecionada de qualquer uma das seqüências na Figura 11A ou Figura 15. ACDRH2 compreende pelo menos de uma seqüência de aminoácidosselecionada de qualquer uma das SEQs ID Nos:.541-557 e 295-400 ou pelomenos a seqüência de aminoácidos selecionada de qualquer uma dasseqüências na Figura 11A ou Figura 15. A CDRH3 compreende pelo menos deuma seqüência de aminoácidos selecionada de qualquer uma das SEQs IDNos:.558-574 e 401-506 ou pelo menos a seqüência de aminoácidos CDRH3selecionada de qualquer uma das seqüências na Figura 11A ou Figura 15.

Em outro aspecto da invenção, a seqüência de aminoácidosCDRH3 compreende X1 é selecionado a partir de R e Y; X3 é S; X8 é S; X9 éY e X10 é é Y ou R. Em outro aspecto da invenção, a seqüência deaminoácidos CDRH3 compreende a seqüência de aminoácido X1-R-S-Y-R-Y-G-S-Y-X10-G-S-Y-X14-F-D-Y (SEQ ID No:575).

Em outro aspecto da invenção, o polipeptídeo se liga ao DR5humano ou se liga DR5 humano e DR5 murino. Em um aspecto da invenção opolipeptídeo é um anticorpo.Em uma realização, o anticorpo contém um domínio variável dacadeia pesada que compreende: i) um CDRH1 contendo uma seqüência deaminoácidos GFYISSSSIH (SEQ ID No: 576); ii) um CDRH2 contendo umaseqüência de aminoácidos SISPSSGSTYYADSVKG (SEQ NO ID: 577); e iii)um CDRH3 contendo uma seqüência de aminoácidosYRSYRYGSYYGSYGFDY (SEQ NO ID: 578). Em uma realização, o anticorpocontém um domínio variável da cadeia pesada que compreende: i) um CDRH1contendo uma seqüência de aminoácidos GFYISSSSIH (SEQ ID No: 579); ii)um CDRH2 contendo uma seqüência de aminoácidos SISPSSGYTSYADSVKG(SEQ NO ID: 580); e iii) um CDRH3 contendo uma seqüência de aminoácidosRRSYRYGSYRGSYAFDY (SEQ NO ID: 581).

Em outro aspecto, o polipeptídeo consta adicionalmente de umdomínio variável da cadeia leve, no qual:

(i) CDRL3 compreende uma seqüência de aminoácidos Q-Q-X1-X2-X3-X4-P-X5-T (ID SEQ NO: 25); no qual, X1 é a posição 91 e é selecionadoa partir de Y, H e S; X2 é selecionado de Y e S; X3 é selecionado de Y, S e T;X4 é selecionado de Y, S e T, e X5 é selecionado de S, P e Y. em umarealização, um CDRL1 que possuir a seqüência de aminoácidosRASQDVNTAVA (ID SEQ NO: 29). Em uma realização, um CDRL2 que possuira seqüência de aminoácidos SASSLYS (ID SEQ NO: 30).

Em uma realização, o anticorpo contém um domínio variável dacadeia pesada que compreende: (i) CDRH1 compreende uma seqüência deaminoácidos: G-F-X1-I-X2-X3-X4-X5-I-H (SEQ ID No: 22), no qual, X1 é aposição 28 de acordo com o sistema de numeração de Kabat e é selecionadode S e Y; X2 é selecionado a partir de S e Y; X3 é selecionado a partir de S eY; X4 é selecionado de S e Y; X5 é selecionado de S e Y; (ii) CDRH2compreende uma seqüência de aminoácidos: X1-I-X2-P-X3-X4-G-X5-T-X6-Y-A-D-S-V-K-G (SEQ ID No: 23), no qual, X1 é a posição 50, de acordo com osistema de numeração de Kabat e é selecionado a partir de S e Y; X2 éselecionado de S e Y; X3 é selecionado de S e Y; X4 é selecionado de S e Y;X5 é selecionado de S e Y, e X6 selecionado a partir de S e Y; e (iii) CDRH3compreende uma seqüência de aminoácidos: X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7- D-Y(SEQ ID No: 582), no qual, X1 é a posição do aminoácido 95 de acordo com osistema de numeração de Kabat e é selecionado a partir de S e Y; X2 éselecionado a partir de S e Y e R; X3 é selecionado de S, G, Y e H; X4 éselecionado de S, G, Y e R; X5 é selecionado de G e A; X6 é selecionado de F,M, L e A; e X7 é selecionado de F, M e L ou está ausente.

Em um aspecto da invenção, a CDRH1 compreende pelo menosde uma seqüência de aminoácidos selecionada de qualquer uma das SEQs IDNos: 189-198. A CDRH2 compreende de pelo menos uma seqüência deaminoácido selecionada de qualquer uma das SEQs ID Nos:295-304. ACDRH3 compreende pelo menos de uma seqüência de aminoácidosselecionada de qualquer uma das SEQs ID Nos: 401-410.

Em outra realização, o anticorpo contém um domínio variável dacadeia pesada que compreende: (i) CDRH1 compreende uma seqüência deaminoácidos: G-F-X1-I-X2-X3-X4-X5-I-H (SEQ ID No: 22), no qual, X1 é aposição 28 de acordo com o sistema de numeração de Kabat e é selecionadode S e Y; X2 é selecionado a partir de S e Y; X3 é selecionado a partir de S eY; X4 é selecionado de S e Y; X5 é selecionado de S e Y; (ii) CDRH2compreende uma seqüência de aminoácidos: X1-I-X2-P-X3-X4-G-X5-T-X6-Y-A-D-S-V-K-G (SEQ ID No: 23), no qual, X1 é a posição 50, de acordo com osistema de numeração de Kabat e é selecionado a partir de S e Y; X2 éselecionado de S e Y; X3 é selecionado de S e Y; X4 é selecionado de S e Y;X5 é selecionado de S e Y, e (iii) CDRH3 compreende uma seqüência deaminoácidos: X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-D-Y (SEQ ID No: 583), no qual, X1 éa posição do aminoácido 95 de acordo com o sistema de numeração de Kabate é selecionado a partir de Y, S e G; X2 é selecionado a partir de Y, S, G, R eA; X3 é selecionado de G, Y, S e R; X4 é selecionado de G, Y e F; X5 éselecionado de Y, S, N e G; X6 é selecionado de Y, R, H e W; e X7 éselecionado a partir de G e A; e X8 é selecionado a partir de F, M, L e I.

Em um aspecto da invenção, a CDRH1 compreende pelo menosde uma seqüência de aminoácidos selecionada de qualquer uma das SEQs IDNos: 199-216. A CDRH2 compreende de pelo menos uma seqüência deaminoácido selecionada de qualquer uma das SEQs ID Nos: 305-322. ACDRH3 compreende pelo menos de uma seqüência de aminoácidosselecionada de qualquer uma das SEQs ID Nos: 411-428.

Em outra realização, o anticorpo contém um domínio variável dacadeia pesada que compreende:

(i) CDRH1 compreende uma seqüência de aminoácidos: G-F-X1-I-X2-X3-X4-X5-I-H (SEQ ID No: 22), no qual, X1 é a posição 28 de acordo como sistema de numeração de Kabat e é selecionado de S e Y; X2 é selecionadoa partir de S e Y; X3 é selecionado a partir de S e Y; X4 é selecionado de S eY; X5 é selecionado de S e Y;

(ii) CDRH2 compreende uma seqüência de aminoácidos: X1-I-X2-P-X3-X4-G-X5-T-X6-Y-A-D-S-V-K-G (SEQ ID No: 23), no qual, X1 é a posição50, de acordo com o sistema de numeração de Kabat e é selecionado a partirde S e Y; X2 é selecionado de S e Y; X3 é selecionado de S e Y; X4 éselecionado de S e Y; X5 é selecionado de S e Y, e

(iii) CDRH3 compreende uma seqüência de aminoácidos: X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17-X18-X19-D-Y(SEQ ID No: 584), no qual, X1 é a posição do aminoácido 95 é selecionado apartir de Y, S, R e G; X2 é selecionado a partir de Y, S, R e G; X3 éselecionado de S, Y, G e W; X4 é selecionado de S, Y, G e Q; X5 éselecionado a partir de G, Y e S; X6 é selecionado a partir de G, Y S, R e V; X7é selecionado a partir de S, Y, G e R; X8 é selecionado a partir de Y, S, G, R, P e V;X9 é selecionado a partir de G, A,Y,S e R; X10 é selecionado de M, F, G, Y, S e R;X11 é selecionado de A, Y, S, G e R; X12 é selecionado de I, M, F, L, A, G, S, Y, Re T; X13 é selecionado de F, M, L, G, A,Y, T E S ou não está presente; X14 éselecionado de L, M, F, I, G, Y, A e T; e X15 é selecionado de M, L, Y, G e R ou nãoestá presente; X16 é selecionado de Y e G ou não está presente; X17 éselecionado de R, M e G ou não está presente; X18 é selecionado a partir de P e Aou não está presente; e X18 é L ou não está presente.

Em outra realização, um polipeptídeo compreende um domíniovariável da cadeia pesada de imunoglobulina, no qual:

(i) CDRH1 compreende uma seqüência de aminoácidos: G-F-X1-I-X2-X3-X4-X5-I-H (SEQ ID No: 22), caracterizado pelo fato de que G é a posição26 e X1 é a posição 28 de acordo com o sistema de numeração de Kabat; e no qualX1-X5 são aminoácidos naturalmente presentes que não a cisteína;

(ii) CDRH2 compreende uma seqüência de aminoácidos: X6-I-X7-P-X8-X9-G-X10-T-X11-Y-A-D-S-V-K-G, no qual, X6 é a posição 50 deacordo com o sistema de numeração de Kabat, e no qual, X6-X11 sãoaminoácidos naturalmente presentes que não a cisteína; e

(iii) CDRH3 compreende uma seqüência de aminoácidos: X12-X13-X14-X15-X16-(X17) n-X18-X19-D-Y, no qual X12 é a posição 95 de acordocom o sistema de numeração de Kabat; e no qual, n é um número adequadoque manterá a atividade funcional do domínio variável da cadeia pesada; e noqual, X12-X19 são aminoácidos naturalmente presentes que não a cisteína. Emum aspecto, n é um número de 1 a 12. Em um aspecto, X1 é selecionado apartir de Y e S; X2 é selecionado a partir de Y e S; X3 é selecionado a partir deY e S; X4 é selecionado a partir de Y e S; X5 é selecionado a partir de Y e S; eX6 é selecionado a partir de Y e S. Em um aspecto, X6 é selecionado a partirde Y e S; X7 é selecionado a partir de Y e S; X8 é selecionado a partir de Y eS; X9 é selecionado a partir de Y e S; X10 é selecionado a partir de Y e S; eX11 é selecionado a partir de Y e S. Em um aspecto, os aminoácidos em cadauma das posições X12-X17 são selecionados a partir de um pool deaminoácidos numa razão molar de 50% de Y, 25% de S e 25% de G, e X18 éselecionado a partir de G e A, e X19 é selecionado a partir de I, M, L, e F. Emum aspecto alternativo, os aminoácidos em cada uma das posições X12-X17são selecionados a partir de um pool de aminoácidos numa razão molar de25% de Y, 50% de S e 25% de R, no qual X18 é selecionado a partir de G e A,e X19 é selecionado a partir de I, M, L, e F. Em um aspecto alternativo, osaminoácidos em cada uma das posições X12-X17 são selecionados a partir deum pool de aminoácidos numa razão molar de 38% de Y, 25% de S, 25% de Ge 12% de R, no qual X18 é selecionado a partir de G e A, e X19 é selecionadoa partir de I, M, L, e F. Em um outro aspecto alternativo, os aminoácidos emcada uma das posições X12-X17 são selecionados a partir de um pool deaminoácidos numa razão molar de 20% Y, 26% S, 26% G, 13% R, 1% A, 1%D, 1% E, 1% F, 1% H, 1% I, 1% K, 1% L, 1% M, 1% N, 1% P, 1% Q, 1% T, 1%V, e de 1% W; no qual, X18 é selecionada a partir de G e A; e X19 éselecionado a partir de I, M, L, e F. Em um aspecto da invenção, a CDRH1compreende pelo menos de uma seqüência de aminoácidos selecionada dequalquer uma das SEQs ID Nos: 217-294 ou uma das seqüências CDRH1 naFigura 11. A CDRH2 compreende de pelo menos uma seqüência deaminoácido selecionada de qualquer uma das SEQs ID Nos: 323-400 ou umadas seqüências CDRH2 na Figura 11. A CDRH3 compreende pelo menos deuma seqüência de aminoácidos selecionada de qualquer uma das SEQs IDNos: 429-506 ou uma das seqüências CDRH3 na Figura 11.

Em outra realização, é fornecido um polipeptídeo quecompreende um domínio variável da cadeia pesada de imunoglobulina, noqual:(i) CDRH1 compreende uma seqüência de aminoácidos: G-F-X1-I-X2-X3-X4-X5-I-H (SEQ ID No.:_), caracterizado pelo fato de que G é aposição 26 e X1 é a posição 28 de acordo com o sistema de numeração deKabat; no qual, X1-X5 são aminoácidos naturalmente presentes que não acisteína;

(ii) CDRH2 compreende uma seqüência de aminoácidos: X6-I-X7-P-X8-X9-S-X10-T-X11-Y-A-D-S-V-K-G (SEQ ID No.:_), no qual, X6 é aposição 50 de acordo com o sistema de numeração de Kabat, e no qual, X6-X11 são aminoácidos naturalmente presentes que não a cisteína; e

(iii) CDRH3 compreende uma seqüência de aminoácidos: X12-X13-X14-(X15)n-X16-X17 (SEQ ID No.:_), no qual X14 é a posição 95 deacordo com o sistema de numeração de Kabat; e no qual, n é um númeroadequado que manterá a atividade funcional do domínio variável da cadeiapesada; e no qual, X12-X17 são aminoácidos naturalmente presentes que nãoa cisteína. Em um aspecto, n é um número de 1 a 14. Em outro aspecto, X1 éselecionado a partir de Y e S; X2 é selecionado a partir de Y e S; X3 éselecionado a partir de Y e S; X4 é selecionado a partir de Y e S; X5 éselecionado a partir de Y e S; e X6 é selecionado a partir de Y e S. Em outroaspecto, X1 é selecionado a partir de W e S; X2 é selecionado a partir de W eS; X3 é selecionado a partir de W e S; X4 é selecionado a partir de W e S eX5é selecionado a partir de W e S. Em outro aspecto, X1 é selecionado a partir deR e S; X2 é selecionado a partir de R e S; X3 é selecionado a partir de R e S;X4 é selecionado a partir de R e S e X5 é selecionado a partir de R e S. Emoutro aspecto, X1 é selecionado a partir de F e S; X2 é selecionado a partir deF e S; X3 é selecionado a partir de F e S; X4 é selecionado a partir de F e S eX5 é selecionado a partir de F e S. Em outro aspecto, X6 é selecionado a partirde Y e S; X7 é selecionado a partir de Y e S; X8 é selecionado a partir de Y eS; X9 é selecionado a partir de Y e S; X10 é selecionado a partir de Y e S; eX11 é selecionado a partir de Y e S. Em outro aspecto, X6 é selecionado apartir de W e S; X7 é selecionado a partir de W e S; X8 é selecionado a partirde W e S; X9 é selecionado a partir de W e S; X10 é selecionado a partir de We S; e X11 é selecionado a partir de W e S. Em outro aspecto, X6 éselecionado a partir de R e S; X7 é selecionado a partir de R e S; X8 éselecionado a partir de R e S; X9 é selecionado a partir de R e S; X10 éselecionado a partir de R e S; e X11 é selecionado a partir de R e S. Em outroaspecto, X6 é selecionado a partir de F e S; X7 é selecionado a partir de F e S;X8 é selecionado a partir de F e S; X9 é selecionado a partir de F e S; X10 éselecionado a partir de F e S; e X11 é selecionado a partir de F e S. Em outroaspecto, X12 é selecionado a partir de Y e S; X13 é selecionado a partir de Y eS; X14 é selecionado a partir de Y e S; X15 é selecionado a partir de Y e S;X16 é selecionado a partir de G e A; e X17 é selecionado a partir de F, L, I e M.

Em outro aspecto, X12 é selecionado a partir de W e S; X13 é selecionado apartir de W e S; X14 é selecionado a partir de W e S; X15 é selecionado a partirde W e S; X16 é selecionado a partir de G e A; e X17 é selecionado a partir deF, L, I e M. Em outro aspecto, X12 é selecionado a partir de R e S; X13 éselecionado a partir de R e S; X14 é selecionado a partir de R e S; X15 éselecionado a partir de R e S; X16 é selecionado a partir de G e A; e X17 éselecionado a partir de F, L, I e M. Em outro aspecto, X12 é selecionado apartir de F e S; X13 é selecionado a partir de F e S; X14 é selecionado a partirde F e S; X15 é selecionado a partir de F e S; X16 é selecionado a partir de Ge A; e X17 é selecionado a partir de F, L, I e M.

Em outro aspecto, os aminoácidos em cada uma das posições de X1-X15 são selecionados a partir de S e um de A, C, F, G, I, L, N, P, R, T, W ou Y, X16é selecionado a partir de G e A; e X17 é selecionado a partir de F, L, I, e M.

Em outro exemplo de realização, um polipeptídeo contendo umdomínio variável de cadeia pesada de imunoglobulina, no qual:(i) CDRH1 compreende uma seqüência de aminoácidos: G-F-X1-I-X2-X3-X4-X5-I-H, caracterizado pelo fato de que G é aposição 26 e X1 é a posição 28 de acordo com o sistemade numeração de Kabat; no qual, X1 é selecionado a partirde Y e S; no qual, X2 é selecionado a partir de Y e S; noqual, X3 é selecionado a partir de Y e S; no qual, X4 éselecionado a partir de Y e S; no qual, X5 é selecionado apartir de Y e S;

(ii) CDRH2 compreende uma seqüência de aminoácidos: X1-I-X2-P-X3-X4-G-X5-T-X6-Y-A-D-S-V-K-G, caracterizadopelo fato de que X1 é a posição 50 de acordo com osistema de numeração de Kabat ; no qual, X1 éselecionado a partir de Y e S; no qual, X2 é selecionado apartir de Y e S; no qual, X3 é selecionado a partir de Y e S;no qual, X4 é selecionado a partir de Y e S; no qual, X5 éselecionado a partir de Y e S; e no qual, X6 selecionado apartir de Y e S; e

(iii) CDRH3 compreende uma seqüência de aminoácidos: X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17-X18-X19, caracterizado pelo fato de que X1 é aposição 95 de acordo com o sistema de numeração deKabat, e no qual os aminoácidos em cada uma dasposições de X1-X17 são selecionadas a partir de A, C, F,G, I, L, N, P, R, T, W ou Y, ou não estão presentes; X18 éselecionado a partir de G e A; e X19 é selecionado a partirde F, L, I, e M.

Em um aspecto da invenção, a CDRH1 compreende pelo menosseqüência de aminoácidos selecionada de qualquer uma das SEQs IDNos: 816-842 ou uma das seqüências CDRH1 na Figura 21A. A CDRH2compreende de pelo menos uma seqüência de aminoácido selecionada dequalquer uma das SEQs ID Nos: 843-869 ou uma das seqüências CDRH2 naFigura 21A. A CDRH3 compreende pelo menos de uma seqüência deaminoácidos selecionada de qualquer uma das SEQs ID Nos: 870-896 ou umadas seqüências CDRH3 na Figura 21A.

Em outro exemplo de realização, um polipeptídeo contendo umdomínio variável de cadeia pesada de imunoglobulina, no qual:

(i) CDRH1 compreende uma seqüência de aminoácidos: G-F-X1-I-X2-X3-X4-X5-I-H, caracterizado pelo fato de que G é a posição 26 e X1 é

a posição 28 de acordo com o sistema de numeração de Kabat; e no qual osaminoácidos em cada uma das posições de X1-X5 são selecionadas a partir deS e um dentre Y, W, R ou F; e

(ii) CDRH2 compreende uma seqüência de aminoácidos: X1-I-X2-P-X3-X4-G-X5-T-X6-Y-A-D-S-V-K-G, caracterizado pelo fato de que X1 é aposição 50 de acordo com o sistema de numeração de Kabat ; e no qual osaminoácidos em cada uma das posições de X1-X6 são selecionadas a partir deS e um dentre Y, W, R ou F; e

(iii) CDRH3 compreende uma seqüência de aminoácidos: X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17-X18-X19,caracterizado pelo fato de que X1 é a posição 95 de acordo com o sistema denumeração de Kabat, e os aminoácidos em cada uma das posições de X1-X19 sãoselecionadas a partir S e um dentre Y, W, R ou F, ou não esta presente; X18 éselecionado a partir de G e A; e X19 é selecionado a partir de F, L, I, e M.

Em um aspecto da invenção, a CDRH1 compreende pelo menosde uma seqüência de aminoácidos selecionada de qualquer uma das SEQs IDNos: 924-950 ou uma das seqüências CDRH1 na Figura 24A. A CDRH2compreende de pelo menos uma seqüência de aminoácido selecionada dequalquer uma das SEQs ID Nos: 951-977 ou uma das seqüências CDRH2 naFigura 24A. A CDRH3 compreende pelo menos de uma seqüência deaminoácidos selecionada de qualquer uma das SEQs ID Nos: 978-1004 ouuma das seqüências CDRH3 na Figura 24A.

Em um aspecto da invenção, o polipeptídeo se liga ao HER-2humano. Em um aspecto adicional da invenção, o polipeptídeo compreende umanticorpo. Em um aspecto da invenção, o anticorpo compreende um domíniovariável da cadeia pesada que compreende;

i) um CDRH1 contendo uma seqüência de aminoácidosGFSIYSSYIH (SEQ ID No: 821);

ii) um CDRH2 contendo uma seqüência de aminoácidosSIYPYSGYTSYADSVKG (SEQ ID No: 848); e

iii) um CDRH3 contendo uma seqüência de aminoácidosWWSSAFDY (SEQ ID No: 875). Em outro aspecto da invenção, o anticorpocompreende um domínio variável da cadeia pesada que compreende;

i) um CDRH1 contendo uma seqüência de aminoácidosGFSIWWSWIH (SEQ ID NO: 932);

ii) um CDRH2 contendo uma seqüência de aminoácidosSISPSSGWTSYADSVKG (SEQ ID No: 959); e

iii) um CDRH3 contendo uma seqüência de aminoácidosWWSSAMDY (SEQ ID No: 986). Em outro aspecto da invenção, o anticorpocompreende um domínio variável da cadeia pesada que compreende;

i) um CDRH1 contendo uma seqüência de aminoácidosGFSISSSYIH (SEQ ID No: 944);

ii) um CDRH2 contendo uma seqüência de aminoácidosSIYPYSGYTSYADSVKG (SEQ ID No: 971); e

iii) um CDRH3 contendo uma seqüência de aminoácidosYYSYALDY (SEQ ID No: 998). Em outro aspecto da invenção, o anticorpocompreende um domínio variável da cadeia pesada que compreende;

i) um CDRH1 contendo uma seqüência de aminoácidosGFYISSSSIH (SEQ ID No: 230);

ii) um CDRH2 contendo uma seqüência de aminoácidosYIYPSSGYTSYADSVKG (SEQ ID No: 336); e

iii) um CDRH3 contendo uma seqüência de aminoácidosGYYYSYYSGYALDY (SEQ ID No: 442).

Em outro aspecto da invenção, o anticorpo compreendeadicionalmente de um domínio variável da cadeia leve, no qual o CDRL3compreende uma seqüência de aminoácidos Q-Q-X1-X2-X3-X4-P-X5-T (IDSEQ NO: 25); caracterizado pelo fado de que X1 é a posição 91 de acordo como sistema de numeração de Kabat e é selecionado a partir de S e Y; X2 éselecionado a partir de S, Y e F; X3 é selecionado a partir de Y, S e F; X4 éselecionado a partir de Y e S, e X5 é selecionado a partir de S e Y.

Em outro aspecto da invenção, é fornecido um anticorpo quecompreende um domínio variável da cadeia leve possuindo uma seqüênciaCDRL3 que possuí a seqüência de aminoácidos Q-Q-X1-X2-X3-X4-P-X5-T(SEQ ID No:_), na qual X1 é a posição 91 de acordo com a numeração deKabat e é selecionado a partir de Y e S; X2 é selecionado a partir de Y e S; X3é selecionado a partir de Y e S; X4 é selecionado a partir de Y e S; X5 éselecionado a partir de S e Y. Em outro aspecto da invenção, é fornecido umanticorpo que compreende um domínio variável da cadeia leve possuindo umaseqüência CDRL3 que possuí a seqüência de aminoácidos Q-Q-X1-X2-X3-X4-P-X5-T, na qual X1 é a posição 91 de acordo com a numeração de Kabat e osaminoácidos em cada uma das posições de X1-X5 são selecionadas a partir Se um dentre W, R ou F. Em um aspecto da invenção, a CDRL3 compreendepelo menos de uma seqüência de aminoácidos selecionada de qualquer umadas SEQs ID Nos: 83-188, 507-523, 789-815 e 879-923 ou uma dasseqüências CDRL3 na Figura 11, 15, 21 ou 24.

Em outro aspecto da invenção, é fornecido um polipeptídeo quecompreende um domínio variável da cadeia leve de imunoglobulina, no qual:

(i) CDRL1 compreende uma primeira seqüência consensohipervariável ou variante desta contendo uma substituição em uma ou maisposições, em comparação com a seqüência consenso hipervariávelcorrespondente;

(ii) CDRL2 compreende uma segunda seqüência consensohipervariável ou variante desta contendo uma substituição em uma ou maisposições, em comparação com a seqüência consenso hipervariávelcorrespondente, e

(iv) CDRL3 compreende uma seqüência de aminoácidos: Q-Q-X1-X2-X3-(X4)n-X5-X6-T (SEQ ID No.:_), no qual X1-X6são aminoácidos naturalmente presentes que não acisteína e X1 é a posição 91 de acordo com o sistema denumeração de Kabat.

Em um aspecto, X1 é a posição 91 de acordo com o sistema denumeração de Kabat eX1 é selecionado a partir de Y e S; X2 é selecionado apartir de Y e S; X3 é selecionado a partir de Y e S; X4 é selecionado a partir deY e S; X5 é selecionado a partir de P e L; e X6 é selecionado a partir de F, L, Ie V. Em um aspecto, n tem um valor de 1 a 3. Em um aspecto da invenção, aCDRL3 compreende pelo menos de uma seqüência de aminoácidosselecionada de qualquer uma das SEQs ID Nos: 83-188, 507-523, 789-815 e879-923 ou uma das seqüências CDRL3 na Figura 11, 15, 21 ou 24. Em umaspecto, a primeira seqüência consenso hipervariável é R-A-S-Q-D-V-N-T-A-V-A (SEQ ID No: 29). Em um aspecto, a segunda seqüência consensohipervariável é S-A-S-S-L-Y-S (SEQ ID No: 30).

Em outro exemplo de realização, é fornecido um polipeptídeo quecompreende um domínio variável da cadeia leve de imunoglobulina, no qual:

(iii) CDRL3 compreende uma seqüência de aminoacidos: Q-Q-X1-X2-X3-X4-P-X5-T (SEQ ID No.: _), no qual X1-X5 são aminoacidos

naturalmente presentes que não a cisteína e X1 é a posição 91 de acordo como sistema de numeração de Kabat.

Em um aspecto, X1 é a posição 91 de acordo com o sistema denumeração de Kabat e X1 é selecionado a partir de Y e S; X2 é selecionado apartir de Y e S; X3 é selecionado a partir de Y e S; X4 é selecionado a partir deY e S; X5 é selecionado a partir de Y e S. Em outro aspecto da invenção, X1 éa posição 91 de acordo com a numeração de Kabat e os aminoacidos em cadauma das posições de X1-X5 são selecionadas a partir S e um dentre Y, W, R eF. Em um aspecto da invenção, a CDRL3 compreende pelo menos de umaseqüência de aminoacidos selecionada de qualquer uma das SEQs ID Nos: 83-188, 507-523, 789-815 e 879-923 ou uma das seqüências CDRL3 na Figura11, 15, 21 ou 24. Em um aspecto, a primeira seqüência consenso hipervariávelé R-A-S-Q-D-V-N-T-A-V-A (SEQ ID No: 29). Em um aspecto, a segundaseqüência consenso hipervariável é S-A-S-S-L-Y-S (SEQ ID No: 30).

Em um exemplo de realização específico, um polipeptídeocompreende de pelo menos dois domínios variáveis de anticorpocompreendendo: no fornecimento de (a) um domínio variável de cadeia pesadade anticorpo compreendendo qualquer polipeptídeo de cadeia pesada citadoacima, e (b) um domínio variável de cadeia leve de anticorpo compreendendoqualquer polipeptídeo de cadeia leve citado acima.

Em certos exemplos de realização, são fornecidos anticorpos queincluem um polipeptídeo composto por um domínio variável de cadeia pesadade imunoglobulina de acordo com qualquer um dos polipeptídeos de cadeiapesada citados acima, e um polipeptídeo composto por um domínio variável decadeia leve de imunoglobulina de acordo com qualquer um dos polipeptídeosde cadeia leve citados acima.

Em certos aspectos, os polipeptídeos e anticorpos citados acimaincluem ainda um domínio de dimerização ligado à extremidade C-terminal deum domínio variável de cadeia pesada de anticorpo. Em alguns dessesaspectos, o domínio de dimerização compreende um domínio de zíper deleucina ou uma seqüência que incluí pelo menos um resíduo cisteína. Emalguns desses aspectos, o domínio de dimerização incluí uma região dedobradiça de um anticorpo e um zíper de leucina. Em outros aspectos, odomínio de dimerização é uma única cisteína.

Em um exemplo de realização, é fornecido um polipeptídeo defusão compreendendo qualquer polipeptídeo citado acima, no qual, um domíniovariável de anticorpo compreendendo o polipeptídeo citado acima é fundido apelo menos uma porção de uma proteína da cápside viral. Em um aspecto, aproteína da cápside viral é selecionada a partir do grupo composto pelasproteínas plll, proteína principal da cápside pVIII, Soe, Hoc, gpD, pv1, evariantes destes. Em um aspecto, o polipeptídeo de fusão ainda inclui umdomínio de dimerização entre o domínio variável e as proteínas da cápsideviral. Em tal aspecto, o domínio variável é um domínio variável de cadeiapesada. Em outro aspecto, o polipeptídeo de fusão inclui ainda um domíniovariável fundido a um peptídeo marcador. Em tal aspecto, o domínio variável éum domínio variável de cadeia leve. Em outro aspecto, o peptídeo marcado éselecionado a partir do grupo, constituído por gD, c-myc, poli-his, proteínafluorescente e 0-galactosidase.

Em um exemplo de realização, um ou mais do polipeptídeosdescritos acima possuem adicionalmente de regiões de suporte FR1, FR2,FR3, e/ou FR4 para um polipeptídeo do domínio variável correspondente àvariante de CDRH1, CDRH2, CDRH3, e/ou CDRL3, onde as regiões de suportesão obtidas a partir de um único polipeptídeo modelo. Em tais exemplos, cadauma das regiões de suporte compreende uma seqüência de aminoácidoscorrespondente a região de suporte das seqüências de aminoácidos doanticorpo 4D5 (SEQ ID No: 6 - 9 e 10-13) ou variante do anticorpo 4D5 (SEQID No: 14-17e 18-21).

Em um exemplo de realização, é fornecida uma biblioteca queconsta de uma variedade de um ou mais polipeptídeos descritos acima, na quala biblioteca tem pelo menos 1 x 104 seqüências de domínios variáveis deanticorpos.

Em outro exemplo de realização, um método para gerar umacomposição, que incluí uma variedade de polipeptídeos compreendendo em:(a) produzir uma variedade de polipeptídeos que inclui:

(i) CDRH1 compreende uma seqüência de aminoácidos: G-F-X1-I-X2-X3-X4-X5-I-H (SEQ ID No.:_), caracterizado pelo fato de que G é posição 26

e X1 é posição 28 de acordo com o sistema de numeração de Kabat; no qual oaminoácido X1 é selecionado de Y e S; X2 é selecionado de Y e S; X3 éselecionado de Y e S; X4 é selecionado de Y e S; e X5 é selecionado de Y e S;

(ii) CDRH2 compreende uma seqüência de aminoácidos: X1-I-X2-P-X3-X4-G-X5-T-X6-Y-A-D-S-V-K-G (SEQ ID No.: _) no qual, X1 é posição50 de acordo com o sistema de numeração de Kabat; no qual o aminoácido X1é selecionado de Y e S; X2 é selecionado de Y e S; X3 é selecionado de Y e S;X4 é selecionado de Y e S; X5 é selecionado de Y e S; e X6 é selecionado deYeS.e;

(iii) CDRH3 compreende uma seqüência de aminoácidos: X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17-X18-X19-D-Y(SEQ ID No.:_), no qual, X1 é posição 95 de acordo com o sistema de numeraçãode Kabat, no qual os aminoácidos em cada uma das posições de X1-X6 sãoselecionados a partir de um pool de aminoácidos numa razão molar de 50% de Y,25% de S e 25% de G, e no qual os aminoácidos em cada uma das posições deX7-X17 são selecionados a partir de um pool de aminoácidos numa razão molar de50% de Y, 25% de S e 25% de G, ou não estão presentes, no qual, X18 éselecionado de G e A e X19 é selecionado de F, L, I, e M.

Em um aspecto da invenção, o método compreendeadicionalmente:

(b) produzir uma variedade de polipeptídeos que inclui:

(i) CDRL1 compreendendo uma primeira seqüência consensohipervariável ou variante desta contendo a substituição em uma ou maisposições comparada a seqüência consenso hipervariável correspondente;

(ii) CDRL2 compreendendo uma segunda seqüência consensohipervariável ou variante desta contendo a substituição em uma ou maisposições comparada a seqüência consenso hipervariável correspondente, e;

(iii) CDRL3 compreendendo uma seqüência de aminoácido: Q-Q-X1-X2-X3-X4-X5-T, no qual X1 é posição 91 de acordo com o sistema denumeração de Kabat; no qual X1 é selecionado de Y e S; no qual X2 éselecionado de Y e S; no qual X3 é selecionado de Y e S; no qual X4 éselecionado de Y e S; no qual X5 é selecionado de Y e S.

Em um aspecto da invenção, a variedade de polipeptídeos écodificada por uma variedade de polinucleotídeos.

Em outro exemplo de realização, o método para produzir umacomposição compreende no fornecimento de uma variedade de polipeptídeos,compreendendo:

(a) em produzir uma variedade de polipeptídeos que inclui:

(i) CDRH1 que compreende uma seqüência de aminoácidos: G-F-X1-I-X2-X3-X4-X5-I-H (SEQ ID No.:_), caracterizado pelo fato de que G éposição 28 de acordo com o sistema de numeração de Kabat; no qual o aminoácidoX1 é selecionado de Y e S; X2 é selecionado de Y e S; X3 é selecionado de Y e S;X4 é selecionado de Y e S; e X5 é selecionado de Y e S,e ;

(ii) CDRH2 compreende uma seqüência de aminoácidos: X1-I-X2-P-X3-X4-G-X5-T-X6-Y-A-D-S-V-K-G (SEQ ID No.:_), caracterizado pelofato de que X1 é posição 50 de acordo com o sistema de numeração de Kabat;no qual o aminoácido X1 é selecionado de Y e S; X2 é selecionado de Y e S;X3 é selecionado de Y e S; X4 é selecionado de Y e S; X5 é selecionado de Ye S; e X6 é selecionado deYeS, e;

(iii) CDRH3 compreende uma seqüência de aminoácidos: X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17-X18-X19-D-Y(SEQ ID No.:_), caracterizado pelo fato de que X1 é posição 95 de acordocom o sistema de numeração de Kabat, no qual os aminoácidos em cada umadas posições de X1-X6 são selecionados de um pool de aminoácidos em umarelação molar de 25% de Y, 50% de S e 25% de R, e no qual os aminoácidosem cada uma das posições de X7-X17 são selecionados a partir de um pool deaminoácidos numa razão molar de 25% de Y, 50% de S e 25% de R, no qual,X18 é selecionado de G e A e X19 é selecionado de I, M, L e F.

Em um aspecto da invenção, o método compreendeadicionalmente:

(b) produzir uma variedade de polipeptídeos que inclui:

(iii) CDRL3compreende a seqüência de aminoácidos Q-Q-X1-X2-X3-X4-P-X5-T (SEQ ID No.:_), no qual X1 é posição 91 de acordo com anumeração de Kabat e é selecionado de S e Y; no qual, X2 é selecionado de Se Y; no qual, X3 é selecionado de Y e S; no qual, X4 é selecionado de Y e S;no qual, X5 é selecionado de Y e S.

(a) em produzir uma variedade de polipeptídeos que inclui:

(i) CDRH1 que compreende uma seqüência de aminoácidos:

G-F-X1-I-X2-X3-X4-X5-I-H (SEQ ID No.:_), caracterizado pelo fato de que G

é posição 26 e X1 é posição 28 de acordo com o sistema de numeração deKabat; no qual o aminoácido X1 é selecionado de Y e S; X2 é selecionado de Ye S; X3 é selecionado de Y e S; X4 é selecionado de Y e S; e X5 é selecionadode Y e S,e ;

(ii) CDRH2 compreende uma seqüência de aminoácidos: X1-I-X2-P-X3-X4-G-X5-T-X6-Y-A-D-S-V-K-G (SEQ ID No.:_), caracterizado pelofato de que X1 é posição 50 de acordo com o sistema de numeração de Kabat;

no qual o aminoácido X1 é selecionado de Y e S; X2 é selecionado de Y e S;X3 é selecionado de Y e S; X4 é selecionado de Y e S; X5 é selecionado de Ye S; e X6 é selecionado de Y e S, e;

(iii) CDRH3 compreende uma seqüência de aminoácidos: X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11 -X12-X13-X14-X15-X16-X17-X18-X19-D-Y(SEQ ID No.:_), no qual, X1 é a posição 95 de acordo com o sistema denumeração de Kabat, caracterizada pelo fato dos aminoácidos em cada umadas posições de X1-X6 serem selecionados a partir de um poo/de aminoácidosnuma razão molar de 38% de Y, 25% de S, e 25% de G e 12% de R;caracterizada pelo fato dos aminoácidos em cada uma das posições de X7-X17serem selecionados a partir de um pool de aminoácidos numa razão molar de38% de Y, 25% de S, e 25% de G e 12% de R, ou não estarem presentes; noqual, X18 é selecionado a partir de G e A, e no qual, X19 é selecionado a partirde I, M, L e F.

Em um aspecto da invenção, o método compreendeadicionalmente:

(b) produzir uma variedade de polipeptídeos que inclui:

(iii) CDRL3compreende a seqüência de aminoácidos Q-Q-X1-X2-X3-X4-P-X5-T (SEQ ID No.:_), no qual X1 é posição 91 de acordo com anumeração de Kabat e é selecionado de Y e S; no qual, X2 é selecionado de Ye S; no qual, X3 é selecionado de Y e S; no qual, X4 é selecionado de Y e S;no qual, X5 é selecionado de Y e S.

(a) em produzir uma variedade de polipeptídeos que inclui:

(i) CDRH1 que compreende uma seqüência de aminoácidos:G-F-X1-I-X2-X3-X4-X5-I-H (SEQ ID No.:_), caracterizado pelo fato de que Gé posição 26 e X1 é posição 28 de acordo com o sistema de numeração deKabat; no qual o aminoácido X1 é selecionado de Y e S; X2 é selecionado de Ye S; X3 é selecionado de Y e S; X4 é selecionado de Y e S; e X5 é selecionadodeYeS.e ;

(ii) CDRH2 compreende uma seqüência de aminoácidos: X1-I-X2-P-X3-X4-G-X5-T-X6-Y-A-D-S-V-K-G (SEQ ID No.:_), caracterizado pelofato de que X1 é posição 50 de acordo com o sistema de numeração de Kabat;no qual o aminoácido X1 é selecionado de Y e S; X2 é selecionado de Y e S;X3 é selecionado de Y e S; X4 é selecionado de Y e S; X5 é selecionado de Ye S; e X6 é selecionado de Y e S, e;

(iii) CDRH3 compreende uma seqüência de aminoácidos: X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17-X18-X19-D-Y(SEQ ID No:_), no qual, X1 é a posição 95 de acordo com o sistema denumeração de Kabat, caracterizada pelo fato dos aminoácidos em cada umadas posições de X1-X6 serem selecionados a partir de um pool de aminoácidosnuma razão molar de 20% de Y, 26% de S, 26% de G, 13% de R, 1% de A, 1%de D, 1% de E, 1% de F, 1% de H, 1% de I, 1% de K, 1% de L, 1% de M, 1%de N, 1% de P, 1% de Q, 1% de T, 1% de V e 1% de W; caracterizada pelo fatodos aminoácidos em cada uma das posições de X7-X17 serem selecionados apartir de um pool de aminoácidos numa razão molar de 20% de Y, 26% de S,26% de G, 13% de R, 1 % de A, 1 % de D, 1 % de E, 1 % de F, 1 % de H, 1 % de I,1% de K, 1% de L, 1% de M, 1% de N, 1% de P, 1% de Q, 1% de T, 1% de V e1% de W, ou não estão presentes; no qual, X18 é selecionado a partir de G eA, e no qual, X19 é selecionado a partir de I, M, L e F.Em um aspecto da invenção, o método compreendeadicionalmente:

(b) na produção de uma variedade de polipeptídeos que inclui:

(iii) CDRL3compreende a seqüência de aminoácidos Q-Q-X1-X2-X3-X4-P-X5-T (SEQ ID No.:_), no qual X1 é posição 91 de acordo com a

numeração de Kabat e é selecionado de Y e S; no qual, X2 é selecionado de Ye S; no qual, X3 é selecionado de Y e S; no qual, X4 é selecionado de Y e S;no qual, X5 é selecionado de Y e S.

Em um aspecto, a primeira seqüência consenso hipervariávelcompreende uma seqüência de consenso CDRL1 de Kabat. Em um aspecto aprimeira seqüência consenso é R-A-S-Q-D-V-N-T-A-V-A (SEQ ID No: 29). Emum aspecto, a segunda seqüência consenso hipervariável compreende umaseqüência de consenso CDRL2 de Kabat. Em um aspecto, a segundaseqüência consenso hipervariável é S-A-S-S-L-Y-S (SEQ ID No: 30). Em umaspecto da invenção, a variedade de polipeptídeos é codificada por umavariedade de polinucleotídeos.

Em um exemplo de realização, o método para produzir umacomposição compreende no fornecimento de uma variedade de polipeptídeos,compreendendo:

(a) em produzir uma variedade de polipeptídeos que inclui:

(ii) CDRH2 compreende uma seqüência de aminoácidos: X1-I-X2-P-X3-X4-G-X5-T-X6-Y-A-D-S-V-K-G (SEQ ID No: 23), no qual, X1 é a posição 50,de acordo com o sistema de numeração de Kabat e é selecionado a partir de S e Y;X2 é selecionado de S e Y; X3 é selecionado de S e Y; X4 é selecionado de S e Y;X5 é selecionado de S e Y e X6 é selecionado de S e Y, e;

(iii) CDRH3 compreende uma seqüência deaminoácidos: X1-X2-X3-X4-X5-x6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17-X18-X19-D-Y (SEQ ID No: 24), no qual, X1 é a posição 95 de acordo como sistema de numeração de Kabat, e no qual X1 é selecionado de Y, S, G e R;X2 é selecionado de Y, S, G, R e M; X3 é selecionado de G, Y, S, R e W; X4 éselecionado de Y, S, G, R e F; X5 é selecionado de G, Y, N e A; X6 éselecionado de F, M, L, A, R, G, H, W, V, Y e S; X7 é selecionado de M. L, G,A, R, F e Y, X8 é selecionado de M, L, F, I, R, G, P, V, Y e S; X9 é selecionadode G, Y e R; X10 é selecionado de M, F, G, Y, R e S; X11 é selecionado de A,G, Y, R e S; X12 é selecionado de I, M, L, F, A, G, R, T, Y e S; X13 éselecionado de F, M, L, G, A, T, Y e S; X14 é selecionado de L, F, M, l,G, A, Te Y; X15 é selecionado de M,Y G, L e R ou não está presente; X16 éselecionado de Y e G, ou não está presente; X17 é selecionado de R, M e G,ou não está presente; X18 é selecionado de P e A, ou não está presente; e X19é A, ou não está presente.

Em um aspecto da invenção, a CDRH1 compreende pelo menosde uma seqüência de aminoácidos selecionada de qualquer uma das SEQs IDNos: 189-294. Em um aspecto da invenção, a CDRH2 compreende pelo menosde uma seqüência de aminoácidos selecionada de qualquer uma das SEQs IDNos: 295-400. Em um aspecto da invenção, a CDRH3 compreende pelo menosde uma seqüência de aminoácidos selecionada de qualquer uma das SEQs IDNos: 401-506.

Em um aspecto da invenção, o método compreendeadicionalmente:

(b) na produção de uma variedade de polipeptídeos que inclui:

(iii) CDRL3 compreendendo uma seqüência de aminoácidos Q-Q-X1-X2-X3-X4-P-X5-T (ID SEQ NO: 25); caracterizado pelo fado de que X1 é a posição91 de acordo com o sistema de numeração de Kabat e é selecionado a partir de S eY; X2 é selecionado a partir de S, Y e F; X3 é selecionado a partir de Y, S e F; X4 éselecionado a partir de Y e S, e X5 é selecionado a partir de S e Y.

Em um exemplo de realização, é fornecido um método paraproduzir uma composição compreendendo uma variedade de polipeptídeos,compreendendo:

(a) em produzir uma variedade de polipeptídeos que inclui:

(i) CDRH1 que compreende uma seqüência de aminoácidos:

G-F-X1-I-X2-X3-X4-X5-I-H (SEQ ID No.:_), caracterizado pelo fato de que Gé posição 26 e X1 é posição 28 de acordo com o sistema de numeração deKabat; no qual o aminoácido X1 é selecionado de Y e S; X2 é selecionado de Ye S; X3 é selecionado de Y e S; X4 é selecionado de Y e S; e X5 é selecionadode Y e S,e ;(ii) CDRH2 compreende uma seqüência de aminoácidos: X1-I-X2-P-X3-X4-G-X5-T-X6-Y-A-D-S-V-K-G (SEQ ID No.:_), caracterizado pelofato de que X1 é posição 50 de acordo com o sistema de numeração de Kabat;

no qual o aminoácido X1 é selecionado de Y e S; X2 é selecionado de Y e S;

X3 é selecionado de Y e S; X4 é selecionado de Y e S; X5 é selecionado de Ye S; e X6 é selecionado de Y e S, e;

(iii) CDRH3 compreende uma seqüência de aminoácidos: X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17-X18-X19(SEQ ID No.:_), caracterizado pelo fato de que X1 é a posição 95 de acordocom o sistema de numeração de Kabat, e no qual os aminoácidos em cadauma das posições de X1-X17 são selecionadas a partir de A, C, F, G, I, L, N, P,R, T, W ou Y, ou não estão presentes; X18 é selecionado a partir de G e A; eX19 é selecionado a partir de F, L, I, e M.

Em um aspecto da invenção, o método compreendeadicionalmente:

(b) a produção de uma variedade de polipeptídeos que inclui:

(iii) CDRL3 compreendendo uma seqüência de aminoácidos Q-Q-X1-X2-X3-X4-P-X5-T (ID SEQ NO:_); caracterizado pelo fado de que X1 é a posição91 de acordo com o sistema de numeração de Kabat e é selecionado a partir de Y eS; X2 é selecionado a partir de Y e S; X3 é selecionado a partir de Y, S e F; X4 éselecionado a partir de Y e S, e X5 é selecionado a partir de Y e S.

(a) em produzir uma variedade de polipeptídeos que inclui:

(i) CDRH1 que compreende uma seqüência de aminoácidos:G-F-X1-I-X2-X3-X4-X5-I-H (SEQ ID No.:_), caracterizado pelo fato de que Gé posição 26 e X1 é posição 28 de acordo com o sistema de numeração deKabat; e no qual os aminoácidos em cada uma das posições de X1-X5 sãoselecionadas a partir de S e um dentre Y, W, R ou F; e

(ii) CDRH2 compreende uma seqüência de aminoácidos: X1-I-X2-P-X3-X4-G-X5-T-X6-Y-A-D-S-V-K-G (SEQ ID No.:_), caracterizado pelofato de que X1 é a posição 50 de acordo com o sistema de numeração deKabat ; e no qual os aminoácidos em cada uma das posições de X1-X6 sãoselecionadas a partir de S e um dentre Y, W, R ou F; e

(iii) CDRH3 compreende uma seqüência de aminoácidos: X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17-X18-X19(SEQ ID No.:_), caracterizado pelo fato de que X1 é a posição 95 de acordocom o sistema de numeração de Kabat, e os aminoácidos em cada uma dasposições de X1-X17 são selecionadas a partir S e um dentre Y, W, R ou F, ounão esta presente; X18 é selecionado a partir de G e A; e X19 é selecionado apartir de F, L, I, e M.

Em um aspecto da invenção, o método compreendeadicionalmente:

(b) a produção de uma variedade de polipeptídeos que inclui:

(iii) CDRL3 compreendendo uma seqüência de aminoácidos Q-Q-X1-X2-X3-X4-P-X5-T (ID SEQ NO:_); caracterizado pelo fado de que X1 é aposição 91 de acordo com o sistema de numeração de Kabat e os aminoácidosem cada uma das posições de X1-X5 são selecionadas a partir S e um dentreY, W, R ou F.

Em um exemplo de realização, é fornecido um método paraproduzir um ou mais seqüências CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2, eCDRL3 de anticorpos descritos acima, constando da:

(a) construção de um vetor de expressão contendo umaseqüência polinucleotídica que codifica uma cadeia leve, uma cadeia pesadaou ambos os domínios variáveis das cadeias leves e pesadas de um anticorpofonte incluindo pelo menos um, dois , três, quatro, cinco ou todos os CDRsselecionados do grupo constituído por CDRL1, CDRL2, CDRL3, CDRH1,CDRH2 e CDRH3; e

(b) mutando, pelo menos, um, dois, três, quatro, cinco ou todos osCDRs do anticorpo para gerar uma ou mais das regiões hipervariáveisdescritas acima.

Em um exemplo de realização, um método para selecionar umpolipeptídeo que se liga a um antígeno alvo é fornecido, compreendendo em:

(a) gerar uma composição com uma variedade de um ou maispolipeptídeos descritos acima;

(b) selecionar um ou mais polipeptídeos da composição que seliga ao antígeno alvo;

(c) isolar um ou mais polipeptídeos que se liga ao antígeno alvodos polipeptídeos que não se ligam ao antígeno alvo; e

(d) identificar um ou mais polipeptídeos que ligam ao antígenoalvo com uma afinidade de ligação ao antígeno alvo desejada.Em um exemplo de realização, é fornecido um método paraselecionar um domínio variável que se liga a antígenos alvos de uma bibliotecade anticorpos, compreendendo em:

(a) interagir uma ou mais das bibliotecas acima descritas comum antígeno alvo;

(b) separar um ou mais polipeptídeos que ligamespecificamente ao antígeno alvo dos polipeptídeos que não se ligamespecificamente ao antígeno alvo, recuperando um ou mais polipeptídeos quese ligam especificamente ao antígeno alvo e incubando um ou maispolipeptídeos que se ligam especificamente ao antígeno alvo em uma série desoluções que consiste em diminuir a quantidade de antígeno alvo a umaconcentração de cerca de 0,1 nM a cerca de 1000 nM, e

(c) Seleção de um ou mais polipeptídeos que se ligamespecificamente ao antígeno alvo e que podem ligar-se a uma baixaconcentração de antígeno alvo ou que possuem uma afinidade de cerca de 0,1nM a 200 nM.

Em um aspecto, o antígeno alvo é HER2 ou DR5. Em umaspecto, a concentração do antígeno alvo é cerca de 100 a 250 nM. Em umaspecto, a concentração do antígeno alvo é cerca de 25 nM a 100 nM. Emalguns exemplos de realização, um ou mais bibliotecas, clones oupolipeptídeos são selecionados contra um painel de antígenos que incluí oantígeno alvo. Em alguns exemplos de realização, são selecionados os clonesou polipeptídeos que se ligam especificamente ao antígeno alvo e não quereagem cruzadamente com nenhum outro antígeno do painel. O painel deantígenos pode incluir pelo menos três ou acima de 100 antígenos. Em algunscasos, o painel de antígeno incluí de 3 a100, de 3 a50, de 3 a 25, de 3 a 10antígenos diferentes.

Em um exemplo de realização, é fornecido um método paraselecionar um polipeptídeo que se liga aos antígenos alvo de uma biblioteca depolipeptídeos, compreendendo em:

(a) isolar um ou mais polipeptídeos que ligam-seespecificamente ao antígeno alvo pela interação à uma biblioteca que contenhauma variedade de polipeptídeos acima descrita com um antígeno alvoimobilizado sob condições adequadas para a ligação;

(b) separar um ou mais polipeptídeos que ligam-seespecificamente ao antígeno alvo dos polipeptídeos que não se ligamespecificamente ao antígeno alvo, e recuperar um ou mais polipeptídeos quese ligam especificamente ao antígeno alvo para obter uma subpopulaçãoenriquecida para um ou mais polipeptídeos que se ligam especificamente aoantígeno alvo; e

(c) opcionalmente, repetir as etapas (a) - (b) pelo menos duasvezes, cada repetição usando a subpopulação enriquecida para a um ou maispolipeptídeos que ligam especificamente ao antígeno alvo obtido a partir doúltimo ciclo de seleção.

Em um aspecto, o método consta adicionalmente de:

(d) incubar a subpopulação com uma concentração deantígeno alvo marcado em um intervalo de cerca de 0,1 nM a 1000 nM paraformar uma mistura, sob condições adequadas para ligação;

(e) interagir a mistura com um agente imobilizado que se ligano antígeno alvo marcado;

(f) detectar a um ou mais polipeptídeos que ligam-seespecificamente ao antígeno alvo marcado, e recuperar um ou maispolipeptídeos que liga-se especificamente ao antígeno alvo marcado doantígeno alvo marcado; e

(g) opcionalmente, repetir as etapas de (d) a (f) por pelomenos duas vezes, cada repetição usando a subpopulação enriquecida paraum ou mais polipeptídeos que ligam-se especificamente ao antígeno alvomarcado obtido a partir do última ciclo de seleção, utilizando uma concentraçãomenor de antígeno alvo marcado do que no ciclo de seleção anterior.

Em um aspecto, o método compreendendo ainda da adição deum excesso de antígeno alvo não marcado na mistura e incubar a mistura porum período de tempo suficiente para recuperar um ou mais polipeptídeos quese ligam especificamente ao antígeno alvo com baixa afinidade. Em algunsexemplos de realização, de qualquer um dos métodos descritos no presente,uma ou mais bibliotecas, clones ou polipeptídeos são selecionados contra umpainel de antígenos incluindo o antígeno alvo. Em alguns exemplos derealização, são selecionados os clones ou polipeptídeos que se ligamespecificamente ao antígeno alvo e não que reagem cruzadamente comnenhum outro antígeno do painel. O painel de antígenos pode incluir pelomenos três ou acima de 100 antígenos. Em alguns casos, o painel de antígenoinclui de 3 a100, de 3 a50, de 3 a 25, de 3 a 10 antígenos diferentes.

Em um exemplo de realização, é fornecido um método para isolarum ou mais polipeptídeos que se ligam especificamente a um antígeno alvocom alta afinidade, compreendendo em:

(a) Interagir uma biblioteca que contém uma variedade dequalquer polipeptídeo descrito acima com um antígeno alvo a umaconcentração de, pelo menos, 0,1 nM a 1000 nM para isolar um ou maispolipeptídeos que se ligam especificamente ao antígeno alvo;

(b) recuperar um ou mais polipeptídeos que ligamespecificamente ao antígeno alvo a partir do antígeno alvo para obter umasubpopulação enriquecida para uma ou mais polipeptídeos que se ligamespecificamente ao antígeno alvo; e

(c) opcionalmente repetir as etapas (a) e (b) por pelo menosduas vezes, cada repetição usando a subpopulação obtidos a partir da últimaetapa e usando uma concentração decrescente de antígeno alvo do que utilizadana etapa anterior para isolar um ou mais polipeptídeos que se ligamespecificamente ao antígeno alvo em uma concentração menor de antígeno alvo.

Em um exemplo de realização, é fornecido um método paraselecionar um ou mais polipeptídeos que se ligam especificamente a umantígeno alvo de uma biblioteca contendo uma variedade de polipeptídeosdescritos acima, compreendendo em:

(a) Interagir uma biblioteca com uma concentração deantígeno alvo marcado a uma concentração de cerca de 0,1 nM a 1000 nM sobcondições ideais pra a formação de um ou mais complexos entre o antígenoalvo marcado e um ou mais polipeptídeos que se ligam ao antígeno alvo;

(b) isolar um ou mais polipeptídeos que ligam especificamenteao antígeno alvo a partir do antígeno alvo marcado para se obter umasubpopulação enriquecida para uma ou mais polipeptídeos que se ligamespecificamente ao antígeno alvo; e

(c) opcionalmente repetir as etapas (a) e (b) por pelo menosduas vezes, cada repetição usando a subpopulação obtida a partir da últimaetapa e usando uma concentração decrescente de antígeno alvo que foiutilizada na etapa anterior.

Em um aspecto, o ensaio consta adicionalmente de na adição deum excesso de antígeno alvo não marcado para um ou mais complexos. Emum aspecto, as etapas (a) e (b) são repetidas duas vezes na qual, aconcentração de antígeno alvo na primeira etapa de seleção é de cerca de 100nM a 250 nM, na qual a concentração de antígeno alvo na segunda etapa deseleção é cerca de 25 nM a 100 nM, e na qual a concentração de antígeno alvona segunda etapa de seleção é cerca de 0,1 nM a 25 nM.

Em um exemplo de realização, é fornecido um método paraselecionar uma biblioteca que contém uma variedade de qualquer polipeptídeodescrito acima, compreendendo em:

(a) incubar uma primeira amostra da biblioteca com um antígenoalvo em condições adequadas para a ligação do polipeptídeos ao antígenoalvo;

(b) incubar uma segunda amostra da biblioteca, na ausência deum antígeno alvo;

(c) interagir cada uma da primeira e segunda amostra com umantígeno alvo imobilizado em condições adequadas para a ligação dopolipeptídeo ao antígeno alvo imobilizado;

(d) detecção dos polipeptídeos ligados ao antígeno alvoimobilizado para cada amostra, e

(e) determinar a afinidade de ligação do polipeptídeo ao antígenoalvo calculando a relação entre a quantidade de polipeptídeo ligado a partir daprimeira amostra sobre a quantidade de polipeptídeo ligado a partir da segundaamostra.

Em um aspecto, o antígeno alvo é DR5 ou HER2. Em umaspecto, a concentração do antígeno alvo é cerca de 100 a 250 nM. Em umaspecto, a concentração do antígeno alvo é cerca de 25 nM a 100 nM. Emalguns exemplos de realização, um ou mais bibliotecas, clones oupolipeptídeos são selecionados contra um painel de antígenos que incluí oantígeno alvo. Em alguns exemplos de realização, são selecionados os clonesou polipeptídeos que se ligam especificamente ao antígeno alvo e não quereagem cruzadamente com nenhum outro antígeno do painel. O painel deantígenos pode incluir pelo menos três ou acima de 100 antígenos. Em algunscasos, o painel de antígeno incluí de 3 a100, de 3 a50, de 3 a 25, de 3 a 10antígenos diferentes.

Em um exemplo de realização, um ou mais dos polipeptídeosdescritos acima se ligam especificamente ao DR5 humano. Em um aspecto, opolipeptídeo é um anticorpo que se liga especificamente ao DR5 humano. Emtal aspecto, o anticorpo compreende a região estrutural do anticorpo 4D5. Emtal aspecto, o anticorpo compreende as regiões estruturais de um anticorpo4D5 variante. Em tal aspecto, o anticorpo é um anticorpo monoclonal. Em talaspecto, o anticorpo é um anticorpo biespecífico. Em tal aspecto, o anticorpo éum anticorpo sintético.

Em um exemplo de realização, o anticorpo anti-DR5 compreendeum domínio variável da cadeia pesada de imunoglobulina, no qual: (i) CDRH1compreende uma seqüência de aminoácidos: G-F-X1-I-X2-X3-X4-X5-I-H (SEQID No: 22), no qual G é a posição 26 e X1 é a posição 28 de acordo com osistema de numeração de Kabat; no qual X1 é selecionado a partir de S e Y; noqual X2 é selecionado a partir de Y e S; no qual, X3 é selecionado a partir de Ye S; no qual, X4 é selecionado a partir de Y e S; no qual, X5 é selecionado apartir de Y e S; (ii) CDRH2 compreende uma seqüência de aminoácidos: X1-I-X2-P-X3-X4-G-X5-T-X6-Y-A-D-S-V-K-G (SEQ ID No: 23), no qual X1 é aposição 50, de acordo com o sistema de numeração de Kabat ; no qual, X1 éselecionado a partir de Y e S; no qual X2 é selecionado a partir de Y e S; noqual, X3 é selecionado a partir de Y e S; no qual, X4 é selecionado a partir de Ye S; no qual, X5 é selecionado a partir de Y e S, e no qual X6 selecionado apartir de Y e S; e (iii) CDRH3 compreende uma seqüência de aminoácidos: X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X.14-X15-X16-D-Y (SEQ ID NoED: 31), no qual, X1 é a posição 95 de acordo com o sistema de numeração deKabat, e no qual X1 é selecionado a partir de R, Y, M; X2 é selecionado a partirde Y e R; X3 é selecionado a partir de Y, S, R, P e G, X4 é selecionado a partirde Y e S; X5 é selecionado a partir de Y, S, R e H; X6 é selecionado a partir deR, Y e S; X7 é selecionado a partir de G, Y e S; X8 é selecionado a partir de R,Y e S; X9 é selecionado a partir de G, Y e S; X10 é selecionado a partir de R, Ye S; X11 é selecionado a partir de G, Y e S; X12 é selecionado a partir de S, Y,R, G e A; X13 é selecionado a partir de G e Y; X14 é selecionado a partir de L,M, R, G e A; e X15 é selecionado a partir de G, F e L ou não está presente, eX16 é F ou não está presente.

Em outro exemplo de realização, o anticorpo anti-DR5compreende um domínio variável da cadeia pesada de imunoglobulina, noqual: (i) CDRH1 compreende uma seqüência de aminoácidos: G-F-X1-I-X2-X3-X4-X5-I-H (SEQ ID No: 22), no qual G é a posição 26 e X1 é a posição 28 deacordo com o sistema de numeração de Kabat; no qual X1 é selecionado apartir de Y e S; no qual X2 é selecionado a partir de Y e S; no qual, X3 éselecionado a partir de Y e S; no qual, X4 é selecionado a partir de Y e S; noqual, X5 é selecionado a partir de Y e S; (ii) CDRH2 compreende umaseqüência de aminoácidos: X1-I-X2-P-X3-X4-G-X5-T-X6-Y-A-D-S-V-K-G (SEQID No: 23), no qual X1 é a posição 50, de acordo com o sistema de numeraçãode Kabat ; no qual, X1 é selecionado a partir de Y e S; no qual X2 éselecionado a partir de Y e S; no qual, X3 é selecionado a partir de Y e S; noqual, X4 é selecionado a partir de Y e S; no qual, X5 é selecionado a partir de Ye S, e no qual X6 selecionado a partir de Y e S; e (iii) CDRH3 compreende umaseqüência de aminoácidos: X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17-X18-X19-D-Y (SEQ ID No ED: 24), no qual, X1 é a posição95 de acordo com o sistema de numeração de Kabat, caracterizada pelo fato dosaminoácidos em cada uma das posições de X1-X6 serem selecionados a partir deum pool de aminoácidos numa razão molar de 50% de Y, 25% de S, e 25% de G;caracterizada pelo fato dos aminoácidos em cada uma das posições de X7-X17serem selecionados a partir de um pool de aminoácidos numa razão molar de 50%de Y, 25% de S e 25% de G, ou não estarem presentes; no qual X18 é selecionadoa partir de G e A, e no qual X19 é selecionado a partir de I, M, L e F.

Em outro exemplo de realização, o anticorpo anti-DR5compreende um domínio variável da cadeia pesada de imunoglobulina, noqual: (i) CDRH1 compreende uma seqüência de aminoácidos: G-F-X1-I-X2-X3-X4-X5-I-H (SEQ ID No: 22), no qual G é a posição 26 e X1 é a posição 28 deacordo com o sistema de numeração de Kabat; no qual X1 é selecionado apartir de Y e S; no qual X2 é selecionado a partir de Y e S; no qual, X3 éselecionado a partir de Y e S; no qual, X4 é selecionado a partir de Y e S; noqual, X5 é selecionado a partir de Y e S; (ii) CDRH2 compreende umaseqüência de aminoácidos: X1-I-X2-P-X3-X4-G-X5-T-X6-Y-A-D-S-V-K-G (SEQID No: 23), no qual X1 é a posição 50, de acordo com o sistema de numeraçãode Kabat ; no qual, X1 é selecionado a partir de Y e S; no qual X2 éselecionado a partir de Y e S; no qual, X3 é selecionado a partir de Y e S; noqual, X4 é selecionado a partir de Y e S; no qual, X5 é selecionado a partir de Ye S, e no qual X6 selecionado a partir de Y e S; e (iii) CDRH3 compreende umaseqüência de aminoácidos: X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17-X18-X19-D-Y (SEQ ID No: 26), no qual, X1 é a posição 95 de acordocom o sistema de numeração de Kabat, caracterizada pelo fato dos aminoácidosem cada uma das posições de X1-X6 serem selecionados a partir de um pool deaminoácidos numa razão molar de 25% de Y, 50% de S, e 25% de R; caracterizadapelo fato dos aminoácidos em cada uma das posições de X7-X17 seremselecionados a partir de um pool de aminoácidos numa razão molar de 25% de Y,50% de S e 25% de R, ou não estarem presentes; no qual, X18 é selecionado apartir de G e A; e no qual, X19 é selecionado a partir de I, M, Le F.

Em outro exemplo de realização, o anticorpo anti-DR5compreende um domínio variável da cadeia pesada de imunoglobulina, noqual: (i) CDRH1 compreende uma seqüência de aminoácidos: G-F-X1-I-X2-X3-X4-X5-I-H (SEQ ID No: 22), no qual G é a posição 26 e X1 é a posição 28 deacordo com o sistema de numeração de Kabat; no qual X1 é selecionado apartir de Y e S; no qual X2 é selecionado a partir de Y e S; no qual, X3 éselecionado a partir de Y e S; no qual, X4 é selecionado a partir de Y e S; noqual, X5 é selecionado a partir de Y e S; (ii) CDRH2 compreende umaseqüência de aminoácidos: X1-I-X2-P-X3-X4-G-X5-T-X6-Y-A-D-S-V-K-G (SEQID No: 23), no qual X1 é a posição 50, de acordo com o sistema de numeraçãode Kabat ; no qual, X1 é selecionado a partir de Y e S; no qual X2 éselecionado a partir de Y e S; no qual, X3 é selecionado a partir de Y e S; noqual, X4 é selecionado a partir de Y e S; no qual, X5 é selecionado a partir de Ye S, e no qual X6 selecionado a partir de Y e S; e (iii) CDRH3 compreende umaseqüência de aminoácidos: X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17-X18-X19-D-Y (SEQ ID No ED: 27), no qual, X1 é a posição95 de acordo com o sistema de numeração de Kabat, caracterizada pelo fatodos aminoácidos em cada uma das posições de X1-X6 serem selecionados apartir de um pool de aminoácidos numa razão molar de 38% de Y, 25% de S, e25% de G e 12% de R; caracterizada pelo fato dos aminoácidos em cada umadas posições de X7-X17 serem selecionados a partir de um pool deaminoácidos numa razão molar de 38% de Y, 25% de S, e 25% de G e 12% deR, ou não estarem presentes; no qual, X18 é selecionado a partir de G e A, eno qual, X19 é selecionado a partir de I, M, L e F.

Em outro exemplo de realização, o anticorpo anti-DR5compreende um domínio variável da cadeia pesada de imunoglobulina, noqual: (i) CDRH1 compreende uma seqüência de aminoácidos: G-F-X1-I-X2-X3-X4-X5-I-H (SEQ ID No: 22), no qual G é a posição 26 e X1 é a posição 28 deacordo com o sistema de numeração de Kabat; no qual X1 é selecionado apartir de Y e S; no qual X2 é selecionado a partir de Y e S; no qual, X3 éselecionado a partir de Y e S; no qual, X4 é selecionado a partir de Y e S; noqual, X5 é selecionado a partir de Y e S; (ii) CDRH2 compreende umaseqüência de aminoácidos: X1-I-X2-P-X3-X4-G-X5-T-X6-Y-A-D-S-V-K-G (SEQID No: 23), no qual X1 é a posição 50, de acordo com o sistema de numeraçãode Kabat ; no qual, X1 é selecionado a partir de Y e S; no qual X2 éselecionado a partir de Y e S; no qual, X3 é selecionado a partir de Y e S; noqual, X4 é selecionado a partir de Y e S; no qual, X5 é selecionado a partir de Ye S, e no qual X6 selecionado a partir de Y e S; e (iii) CDRH3 compreende umaseqüência de aminoácidos: X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17-X18-X19-D-Y (SEQ ID No ED: 28), no qual, X1 é a posição 95de acordo com o sistema de numeração de Kabat, caracterizada pelo fato dosaminoácidos em cada uma das posições de X1-X6 serem selecionados a partir deum pool de aminoácidos numa razão molar de 20% de Y, 26% de S, 26% de G,13% de R, 1% de A, 1% de D, 1% de E, 1% de F, 1% de H, 1% de I, 1% de K, 1%de L, 1% de M, 1% de N, 1% de P, 1% de Q, 1% de T, 1% de V e 1% de W;caracterizada pelo fato dos aminoácidos em cada uma das posições de X7-X17serem selecionados a partir de um pool de aminoácidos numa razão molar de 20%de Y, 26% de S, 26% de G, 13% de R, 1% de A, 1% de D, 1% de E, 1% de F, 1%de H, 1% de I, 1% de K, 1% de L, 1% de M, 1% de N, 1% de P, 1% de Q, 1% de T,1% de V e 1% de W, ou não estão presentes; no qual, X18 é selecionado a partir deG e A, e no qual, X19 é selecionado a partir de I, M, L e F.

Em alguns exemplos de realização, o anticorpo anti-DR5 possuíum CDRH1 que compreende pelo menos de uma seqüência de aminoácidosselecionada de qualquer uma das SEQs ID Nos: 524-540 como demonstradona Figura 15. O anticorpo anti-DR5 pode possuir também um CDRH2 quecompreende pelo menos uma seqüência de aminoácidos selecionada dequalquer uma das SEQs ID Nos:.541-557 como demonstrado na Figura 15. Oanticorpo anti-DR5 pode possuir também um CDRH3 que compreende pelomenos uma seqüência de aminoácidos selecionada de qualquer uma dasSEQs ID Nos:.558-574 como demonstrado na Figura 15. Em um aspecto, umanticorpo que se liga especificamente ao DR5 humano compreendemseqüências CDRH1, CDRH2, CDRH3 e CDRL3 correspondentes asseqüências CDRH1, CDRH2, CDRH3 e CDRL3 estabelecidas na figura 15 paraqualquer uma das Fabs de 1-17.

Em alguns exemplos de realização, o anticorpo anti-DR5 possuíum CDRH1 no qual a posição do aminoácido X1 é a posição 95 e este éselecionado a partir de R e Y; X3 é a posição 97 e é S; X8 é a posição doaminoácido 100b e é S; X9 é a posição do aminoácido 100c e é Y; X10 e é aposição do aminoácido 100d e é Y ou R. Em um exemplo de realização, oCRDH3 possuí a seqüência de aminoácido X1-R-S-Y-R-Y-G-S-Y-X10-G-S-Y-X14-F-D-Y (SEQ ID No:575). Em um exemplo de realização específico, umanticorpo anti-DR5 possuí um domínio variável de cadeia pesada quecompreende: i) um CDRH1 contendo uma seqüência de aminoácidosGFYISSSSIH (SEQ ID No: 576); ii) um CDRH2 contendo uma seqüência deaminoácidos SISPSSGSTYYADSVKG (SEQ NO ID: 577); e iii) um CDRH3contendo uma seqüência de aminoácidos YRSYRYGSYYGSYGFDY (SEQ NOID: 578). Em outro exemplo de realização específico, um anticorpo anti-DR5possuí um domínio variável de cadeia pesada que compreende: i) um CDRH1contendo uma seqüência de aminoácidos GFYISSSSIH (SEQ ID No: 579); ii)um CDRH2 contendo uma seqüência de aminoácidos SISPSSGYTSYADSVKG(SEQ NO ID: 580); e iii) um CDRH3 contendo uma seqüência de aminoácidosRRSYRYGSYRGSYAFDY (SEQ NO ID: 581).

Em alguns exemplos de realização, o anticorpo anti-DR5 possuíum CDRH1 compreendendo uma seqüência de aminoácido GFXIIX2SSSIH(SEQ ID No: 598) no qual, X1 e X2 são Y ou S. Em outro exemplo derealização, o anticorpo anti-DR5 possuí um CDRH2 compreendendo umaseqüência de aminoácido X1ISPX3X4GYTX6YADSKVG (SEQ ID No: 599) e noqual, X1, X2, X4 e X6 são Y ou S. Em outro exemplo de realização, o anticorpoanti-DR5 possuí um CDRH3 compreendendo uma seqüência de aminoácidoYRX3YRYGX8X9X10GSYX14X15DY (SEQ ID No:596), no qual X3 éselecionado a partir de Y, S, R, P e G; X8 é selecionado a partir de R, Y e S;X9 é selecionado a partir de G, Y e S; X10 é selecionado a partir de S, Y e R;X14 é selecionado a partir de G e A e X15 é selecionado a partir de L e F.

Em alguns exemplos de realização, o anticorpo anti-DR5 se ligaao DR5 humano com uma IC50 de 1 a 20 nM. Em outro exemplo de realização,o anticorpo anti-DR5 se liga ao DR5 murino.

Os anticorpos anti-DR5 podem opcionalmente possuir um domíniovariável de cadeia leve, no qual: (i) CDRL3 compreende uma seqüência deaminoácidos Q-Q-X1-X2-X3-X4-P-X5-T (ID SEQ NO: 25); no qual, X1 é aposição 91 e é selecionado a partir de Y, H e S; X2 é selecionado de Y e S; X3é selecionado de Y, S e T; X4 é selecionado de Y, S e T, e X5 é selecionado deS, P e Y. Os anticorpos anti-DR5 podem opcionalmente possuir um domíniovariável de cadeia leve, no qual CDRL3 compreende uma seqüência deaminoácidos QQXIX2X3SPST (SEQ ID No: 597), no qual X1, X2 e X3 são Y ouS. O domínio variável da cadeia leve pode adicionalmente possuir um CDRL3que compreende uma seqüência de aminoácido de um grupo que consiste dasSEQs ID Nos: 507 a 523, como demonstrado na Figura 15. O anticorpo podeconstar adicionalmente de um CDRL1 que compreende uma seqüência deaminoácido RASQDVNTAVA (SEQ ID No: 29). O anticorpo pode constaradicionalmente de um CDRL2 que compreende uma seqüência de aminoácidoSASSLYS (SEQ ID No: 30).

Em um aspecto, os anticorpos específicos para DR5 sãoselecionados para a atividade de agonista ou antagonista. Esses anticorpospodem ser selecionados em um ensaio de sinalização com o receptor DR5, talcomo um ensaio de apoptose como descrito no presente. Os anticorposagonistas aumentam a apoptose quando comparado com o controle e oanticorpo antagonista diminuí a apoptose.

Em um exemplo de realização, é fornecido um polinucleotídeoisolado codifica um dos anticorpos descritos acima que liga especificamente aoDR5 humano. Em um exemplo de realização, é fornecido um vetor contendoum polinucleotídeo isolado que codifica um dos anticorpos descritos acima quese liga especificamente ao DR5 humano. Em exemplo de realização, éfornecida uma célula hospedeira transformada com um vetor contendo umpolinucleotídeo isolado que codifica um dos anticorpos descritos acima que seliga especificamente ao DR5 humano. Em exemplo de realização, é fornecidoum processo de produção de anticorpo, compreendendo de uma cultura decélula hospedeira transformadas com um vetor contendo um polinucleotídeoisolado que codifica um dos anticorpos acima descritos que se ligamespecificamente ao DR5 humano de tal forma que o polinucleotídeo éexpresso. Em um aspecto, o processo compreende ainda na recuperação doanticorpo a partir da cultura da célula hospedeira. Em um aspecto, o processocompreende adicionalmente da recuperação do anticorpo do meio de culturada célula hospedeira.

Em um exemplo de realização, é fornecido um método de uso deum ou mais anticorpos descritos acima que se ligam especificamente ao DR5humano para tratar uma doença associada à angiogênese anormal em ummamífero que necessite de tal tratamento, compreendendo a etapa deadministrar um ou mais anticorpos ao mamífero. Em alguns exemplos derealização, os anticorpos contra DR5 que inibem a apoptose podem ser úteisem condições na qual a inibição da morte celular é pretendida (por exemplo,degeneração macular). Em um aspecto, a desordem é o câncer. Em algunsexemplos de realização, o anticorpo anti-DR5 aumenta a apoptose. Em umdesses aspectos, o câncer é selecionado a partir de câncer de mama, câncercolorretal, câncer de pulmão de não-pequenas células, linfoma não-Hodgkin(NHL), câncer renal, câncer de próstata, câncer de fígado, câncer de cabeça epescoço, melanoma, câncer de ovário, mesotelioma e mieloma múltiplo. Emoutro aspecto, o tratamento inclui ainda a etapa de administração de umsegundo agente terapêutico de maneira simultânea ou seqüencial com oanticorpo. Em tal aspecto, o segundo agente terapêutico é selecionada a partirde um agente anti-angiogênico, agente anti-neoplásico, agente quimioterápicoe agente citotóxico.

Em um exemplo de realização, é fornecido um método para tratarum mamífero que sofre ou possui o risco de desenvolver um distúrbioinflamatório ou imunológico, compreendendo a etapa de tratamento domamífero com um ou mais Fabs de um ou mais anticorpos descritos acima quese ligam especificamente ao DR5 humano. Em um aspecto, o distúrbio é imuneinflamatória ou artrite reumatóide. Em alguns exemplos de realização, oanticorpo anti-DR5 aumenta a apoptose.

Os métodos descritos no presente também fornecem para serisolado um anticorpo anti-HER2. Em um exemplo de realização o anticorpoanti-HER2 compreende um domínio variável da cadeia pesada deimunoglobulina, no qual: (i) CDRH1 compreende uma seqüência deaminoácidos: G-F-X1-I-X2-X3-X4-X5-I-H (SEQ ID No: 22), no qual G é aposição 26 e X1 é a posição 28 de acordo com o sistema de numeração deKabat; no qual X1 é selecionado a partir de Y e S; no qual X2 é selecionado apartir de Y e S; no qual, X3 é selecionado a partir de Y e S; no qual, X4 éselecionado a partir de Y e S; no qual, X5 é selecionado a partir de Y e S; (ii)CDRH2 compreende uma seqüência de aminoácidos: X1-I-X2-P-X3-X4-G-X5-T-X6-Y-A-D-S-V-K-G (SEQ ID No: 23), no qual X1 é a posição 50, de acordocom o sistema de numeração de Kabat; no qual, X1 é selecionado a partir deY e S; no qual X2 é selecionado a partir de Y e S; no qual, X3 é selecionado apartir de Y e S; no qual, X4 é selecionado a partir de Y e S; no qual, X5 éselecionado a partir de Y e S, e no qual X6 selecionado a partir de Y e S; e (iii)CDRH3 compreende uma seqüência de aminoácidos: X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-D-Y (SEQ ID No: 582), no qual, X1 é a posição do aminoácido 95 de acordocom o sistema de numeração de Kabat e é selecionado a partir de S e Y; X2 éselecionado a partir de S e Y e R; X3 é selecionado de S, G, Y e H; X4 éselecionado de S, G, Y e R; X5 é selecionado de G e A; X6 é selecionado de F,M, L e A; e X7 é selecionado de F, M e L ou está ausente.

Em outra realização, o anticorpo anti-HER2 contém um domíniovariável da cadeia pesada de imunoglobulina que compreende: (i) CDRH1compreende uma seqüência de aminoácidos: G-F-X1-I-X2-X3-X4-X5-I-H (SEQID No: 22), no qual, X1 é a posição 28 de acordo com o sistema de numeraçãode Kabat e é selecionado de S e Y; X2 é selecionado a partir de S e Y; X3 éselecionado a partir de S e Y; X4 é selecionado de S e Y; X5 é selecionado deS e Y; (ii) CDRH2 compreende uma seqüência de aminoácidos: X1-I-X2-P-X3-X4-G-X5-T-X6-Y-A-D-S-V-K-G (SEQ ID No: 23), no qual, X1 é a posição 50, deacordo com o sistema de numeração de Kabat e é selecionado a partir de S eY; X2 é selecionado de S e Y; X3 é selecionado de S e Y; X4 é selecionado deSe Y; X5 é selecionado de S e Y, e (iii) CDRH3 compreende uma seqüênciade aminoácidos: X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-D-Y (SEQ ID No: 583), no qual,X1 é a posição do aminoácido 95 de acordo com o sistema de numeração deKabat e é selecionado a partir de Y, S e G; X2 é selecionado a partir de Y, S,G, R e A; X3 é selecionado de G, Y, S e R; X4 é selecionado de G, Y e F; X5 éselecionado de Y, S, N e G; X6 é selecionado de Y, R, H e W; e X7 éselecionado a partir de G e A; e X8 é selecionado a partir de F, M, L e I.

Em outra realização, o anticorpo anti-HER2 contém um domíniovariável da cadeia pesada de imunoglobulina que compreende: (i) CDRH1compreende uma seqüência de aminoácidos: G-F-X1-I-X2-X3-X4-X5-I-H (SEQID No: 22), no qual, X1 é a posição 28 de acordo com o sistema de numeraçãode Kabat e é selecionado de S e Y; X2 é selecionado a partir de S e Y; X3 éselecionado a partir de S e Y; X4 é selecionado de S e Y; X5 é selecionado deS e Y; (ii) CDRH2 compreende uma seqüência de aminoácidos: X1-I-X2-P-X3-X4-G-X5-T-X6-Y-A-D-S-V-K-G (SEQ ID No: 23), no qual, X1 é a posição 50, deacordo com o sistema de numeração de Kabat e é selecionado a partir de S eY; X2 é selecionado de S e Y; X3 é selecionado de S e Y; X4 é selecionado deS e Y; X5 é selecionado de S e Y, e (iii) CDRH3 compreende uma seqüênciade aminoácidos: X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17-X18-X19-D-Y (SEQ ID No: 584), no qual, X1 é a posição doaminoácido 95 e é selecionado a partir de Y, S, R e G; X2 é selecionado apartir de Y, S, R e G; X3 é selecionado de S, Y, G e W; X4 é selecionado de S,Y, G e Q; X5 é selecionado a partir de G, Y e S; X6 é selecionado a partir de G,Y S, R e V; X7 é selecionado a partir de S, Y, G e R; X8 é selecionado a partirde Y, S, G, R, P e V; X9 é selecionado a partir de G, A,Y,S e R; X10 éselecionado de M, F, G, Y, S e R; X11 é selecionado de A, Y, S, G e R; X12 éselecionado de I, M, F, L, A, G, S, Y, R e T; X13 é selecionado de F, M, L, G,A,Y, T E S ou não está presente; X14 é selecionado de L, M, F, I, G, Y, A e T;e X15 é selecionado de M, L, Y, G e R ou não está presente; X16 éselecionado de Y e G ou não está presente; X17 é selecionado de R, M e G ounão está presente; X18 é selecionado a partir de P e A ou não está presente; eX18 é L ou não está presente.

Ainda em outro exemplo de realização, o anticorpo anti-HER2consta de um domínio variável da cadeia pesada de imunoglobulina quecompreende: (i) CDRH1 compreende uma seqüência de aminoácidos: G-F-X1-I-X2-X3-X4-X5-I-H (SEQ ID No: 22), no qual G é a posição 26 e X1 é a posição28 de acordo com o sistema de numeração de Kabat; no qual X1 é selecionadoa partir de S e Y; no qual X2 é selecionado a partir de Y e S; no qual, X3 éselecionado a partir de Y e S; no qual, X4 é selecionado a partir de Y e S; noqual, X5 é selecionado a partir de Y e S; (ii) CDRH2 compreende umaseqüência de aminoácidos: X1-I-X2-P-X3-X4-G-X5-T-X6-Y-A-D-S-V-K-G (SEQID No: 23), no qual X1 é a posição 50, de acordo com o sistema de numeraçãode Kabat ; no qual, X1 é selecionado a partir de Y e S; no qual X2 éselecionado a partir de Y e S; no qual, X3 é selecionado a partir de Y e S; noqual, X4 é selecionado a partir de Y e S; no qual, X5 é selecionado a partir de Ye S, e no qual X6 selecionado a partir de Y e S; e (iii) CDRH3 compreende umaseqüência de aminoácidos: X1 -X2-X3-X4-X5-x6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17-X18-X19-D-Y (SEQ ID No: 24), no qual, X1 é a posição 95 de acordocom o sistema de numeração de Kabat, caracterizada pelo fato dos aminoácidosem cada uma das posições de X1-X6 serem selecionados a partir de um pool deaminoácidos numa razão molar de 50% de Y, 25% de S, e 25% de G; caracterizadapelo fato dos aminoácidos em cada uma das posições de X7-X17 seremselecionados a partir de um pool de aminoácidos numa razão molar de 50% de Y,25% de S e 25% de G, ou não estarem presentes; no qual X18 é selecionado apartir de G e A, e no qual X19 é selecionado a partir de I, M, L e F.

Ainda em outro exemplo de realização, o anticorpo anti-HER2consta de um domínio variável da cadeia pesada de imunoglobulina, no qual: (i)CDRH1 compreende uma seqüência de aminoácidos: G-F-X1-I-X2-X3-X4-X5-I-H (SEQ ID No: 22), no qual G é a posição 26 e X1 é a posição 28 de acordocom o sistema de numeração de Kabat; no qual X1 é selecionado a partir de Se Y; no qual X2 é selecionado a partir de Y e S; no qual, X3 é selecionado apartir de Y e S; no qual, X4 é selecionado a partir de Y e S; no qual, X5 éselecionado a partir de Y e S; (ii) CDRH2 compreende uma seqüência deaminoácidos: X1-I-X2-P-X3-X4-G-X5-T-X6-Y-A-D-S-V-K-G (SEQ ID No: 23), noqual X1 é a posição 50, de acordo com o sistema de numeração de Kabat; noqual, X1 é selecionado a partir de Y e S; no qual X2 é selecionado a partir de Ye S; no qual, X3 é selecionado a partir de Y e S; no qual, X4 é selecionado apartir de Y e S; no qual, X5 é selecionado a partir de Y e S, e no qual X6selecionado a partir de Y e S; e (iii) CDRH3 compreende uma seqüência deaminoácidos: X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17-X18-X19-D-Y (SEQ ID No: 26), no qual, X1 é a posição 95 de acordo como sistema de numeração de Kabat, caracterizada pelo fato dos aminoácidos emcada uma das posições de X1-X6 serem selecionados a partir de um pool deaminoácidos numa razão molar de 25% de Y, 50% de S, e 25% de R; caracterizadapelo fato dos aminoácidos em cada uma das posições de X7-X17 seremselecionados a partir de um pool de aminoácidos numa razão molar de 25% de Y,50% de S e 25% de R, ou não estarem presentes; no qual, X18 é selecionado apartir de G e A; e no qual, X19 é selecionado a partir de I, M, L e F.

Ainda em outro exemplo de realização, o anticorpo anti-HER2consta de um domínio variável da cadeia pesada de imunoglobulina, no qual: (i)CDRH1 compreende uma seqüência de aminoácidos: G-F-X1-I-X2-X3-X4-X5-I-H (SEQ ID No: 22), no qual G é a posição 26 e X1 é a posição 28 de acordocom o sistema de numeração de Kabat; no qual X1 é selecionado a partir de Se Y; no qual X2 é selecionado a partir de Y e S; no qual, X3 é selecionado apartir de Y e S; no qual, X4 é selecionado a partir de Y e S; no qual, X5 éselecionado a partir de Y e S; (ii) CDRH2 compreende uma seqüência deaminoácidos: X1-I-X2-P-X3-X4-G-X5-T-X6-Y-A-D-S-V-K-G (SEQ ID No: 23), noqual X1 é a posição 50, de acordo com o sistema de numeração de Kabat; noqual, X1 é selecionado a partir de Y e S; no qual X2 é selecionado a partir de Ye S; no qual, X3 é selecionado a partir de Y e S; no qual, X4 é selecionado apartir de Y e S; no qual, X5 é selecionado a partir de Y e S, e no qual X6selecionado a partir de Y e S; e (iii) CDRH3 compreende uma seqüência deaminoácidos: X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17-X18-X19-D-Y (SEQ ID No: 27), no qual, X1 é a posição 95 de acordo como sistema de numeração de Kabat, caracterizada pelo fato dos aminoácidos emcada uma das posições de X1-X6 serem selecionados a partir de um pool deaminoácidos numa razão molar de 38% de Y, 25% de S, e 25% de G e 12% deR; caracterizada pelo fato dos aminoácidos em cada uma das posições de X7-X17 serem selecionados a partir de um pool de aminoácidos numa razão molarde 38% de Y, 25% de S, e 25% de G e 12% de R, ou não estarem presentes;no qual, X18 é selecionado a partir de G e A, e no qual, X19 é selecionado apartir de I, M, L e F.

Ainda em outro exemplo de realização, o anticorpo anti-HER2consta de um domínio variável da cadeia pesada de imunoglobulina, no qual: (i)CDRH1 compreende uma seqüência de aminoácidos: G-F-X1-I-X2-X3-X4-X5-I-H (SEQ ID No: 22), no qual G é a posição 26 e X1 é a posição 28 de acordocom o sistema de numeração de Kabat; no qual X1 é selecionado a partir de Se Y; no qual X2 é selecionado a partir de Y e S; no qual, X3 é selecionado apartir de Y e S; no qual, X4 é selecionado a partir de Y e S; no qual, X5 éselecionado a partir de Y e S; (ii) CDRH2 compreende uma seqüência deaminoácidos: X1-I-X2-P-X3-X4-G-X5-T-X6-Y-A-D-S-V-K-G (SEQ ID No: 23), noqual X1 é a posição 50, de acordo com o sistema de numeração de Kabat; noqual, X1 é selecionado a partir de Y e S; no qual X2 é selecionado a partir de Ye S; no qual, X3 é selecionado a partir de Y e S; no qual, X4 é selecionado apartir de Y e S; no qual, X5 é selecionado a partir de Y e S, e no qual X6selecionado a partir de Y e S; e (iii) CDRH3 compreende uma seqüência deaminoácidos: X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17-X18-X19-D-Y (SEQ ID No ED: 28), no qual, X1 é a posição 95 de acordocom o sistema de numeração de Kabat, caracterizada pelo fato dosaminoácidos em cada uma das posições de X1-X6 serem selecionados a partirde um pool de aminoácidos numa razão molar de 20% de Y, 26% de S, 26% deG, 13% de R, 1% de A, 1% de D, 1% de E, 1% de F, 1% de H, 1% de I, 1% deK, 1% de L, 1% de M, 1% de N, 1% de P, 1% de Q, 1% de T, 1% de V e 1% deW; caracterizada pelo fato dos aminoácidos em cada uma das posições de X7-X17 serem selecionados a partir de um pool de aminoácidos numa razão molarde 20% de Y, 26% de S, 26% de G, 13% de R, 1% de A, 1% de D, 1% de E,1% de F, 1% de H, 1% de 1,1% de K, 1% de L, 1% de M, 1% de N, 1% de P, 1% deQ, 1% de T, 1% de V e 1% de W, ou não estão presentes; no qual, X18 éselecionado a partir de G e A, e no qual, X19 é selecionado a partir de I, M, L e F.

Ainda em outro exemplo de realização, o anticorpo anti-HER2consta de um domínio variável da cadeia pesada de imunoglobulina, no qual: (i)CDRH1 compreende uma seqüência de aminoácidos: G-F-X1-I-X2-X3-X4-X5-I-H (SEQ ID No: 22), no qual G é a posição 26 e X1 é a posição 28 de acordocom o sistema de numeração de Kabat; no qual X1 é selecionado a partir de Se Y; no qual X2 é selecionado a partir de Y e S; no qual, X3 é selecionado apartir de Y e S; no qual, X4 é selecionado a partir de Y e S; no qual, X5 éselecionado a partir de Y e S; (ii) CDRH2 compreende uma seqüência deaminoácidos: X1-I-X2-P-X3-X4-G-X5-T-X6-Y-A-D-S-V-K-G (SEQ ID No: 23), noqual X1 é a posição 50, de acordo com o sistema de numeração de Kabat; noqual, X1 é selecionado a partir de Y e S; no qual X2 é selecionado a partir de Ye S; no qual, X3 é selecionado a partir de Y e S; no qual, X4 é selecionado apartir de Y e S; no qual, X5 é selecionado a partir de Y e S, e no qual X6selecionado a partir de Y e S; e (iii) CDRH3 compreende uma seqüênciade aminoácidos: X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17-X18-X19 (SEQ ID No.:_), caracterizado pelo fato de que X1 é aposição 95 de acordo com o sistema de numeração de Kabat, e no qual osaminoácidos em cada uma das posições de X1-X19 são selecionadas a partirde A, C, F, G, l, L, N, P, R, T, W ou Y, ou não estão presentes; X18 éselecionado a partir de G e A; e X19 é selecionado a partir de F, L, I, e M ounão está presente.

Ainda em outro exemplo de realização, o anticorpo anti-HER2consta de um domínio variável da cadeia pesada de imunoglobulina, no qual: (i)CDRH1 compreende uma seqüência de aminoácidos: G-F-X1-I-X2-X3-X4-X5-I-H (SEQ ID No: 22), no qual G é a posição 26 e X1 é a posição 28 de acordocom o sistema de numeração de Kabat; no qual X1 é selecionado a partir de Se Y; no qual X2 é selecionado a partir de Y e S; no qual, X3 é selecionado apartir de Y e S; no qual, X4 é selecionado a partir de Y e S; no qual, X5 éselecionado a partir de Y e S; (ii) CDRH2 compreende uma seqüência deaminoácidos: X1-I-X2-P-X3-X4-G-X5-T-X6-Y-A-D-S-V-K-G (SEQ ID No: 23), noqual X1 é a posição 50, de acordo com o sistema de numeração de Kabat; noqual, X1 é selecionado a partir de Y e S; no qual X2 é selecionado a partir de Ye S; no qual, X3 é selecionado a partir de Y e S; no qual, X4 é selecionado apartir de Y e S; no qual, X5 é selecionado a partir de Y e S, e no qual X6selecionado a partir de Y e S; e (iii) CDRH3 compreende uma seqüênciade aminoácidos: X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-

X16-X17-X18-X19 (SEQ ID No.:_), caracterizado pelo fato de que X1 é aposição 95 de acordo com o sistema de numeração de Kabat, e osaminoácidos em cada uma das posições de X1-X19 são selecionadas a partir Se um dentre Y, W, R ou F, ou não estão presentes; X18 é selecionado a partirde G e A; e X19 é selecionado a partir de F, L, I, e M.

Em alguns exemplos de realização da invenção, o anticorpo anti-HER2 pode constar de um CDRH1 que compreende pelo menos de umaseqüência de aminoácidos selecionada de um grupo consistindo de uma dasSEQs ID Nos: 189-294 como demonstrado na Figura 11. O anticorpo anti-HER2 pode constar também de um CDRH2 que compreende de pelo menos deuma seqüência de aminoácidos selecionada de um grupo consistindo de umadas SEQs ID Nos: 295-400, como demonstrado na Figura 11.0 anticorpo anti-HER2 pode constar também de um CDRH3 que compreende pelo menos deuma seqüência de aminoácidos de um grupo consistindo de uma das SEQs IDNos: 401-506 como demonstrado na Figura 11. Em alguns exemplos derealização da invenção, o anticorpo anti-HER2 pode constar de um CDRH1 quecompreende pelo menos de uma seqüência de aminoácidos selecionada de umgrupo consistindo de uma das SEQs ID Nos: 816-842 como demonstrado naFigura 21. O anticorpo anti-HER2 pode constar também de um CDRH2 quecompreende de pelo menos de uma seqüência de aminoácidos selecionada deum grupo consistindo de uma das SEQs ID Nos: 843-869, como demonstradona Figura 21. O anticorpo anti-HER2 pode constar também de um CDRH3 quecompreende pelo menos de uma seqüência de aminoácidos de um grupoconsistindo de uma das SEQs ID Nos: 870-896 como demonstrado na Figura21. Em alguns exemplos de realização da invenção, o anticorpo anti-HER2pode constar de um CDRH1 que compreende pelo menos de uma seqüênciade aminoácidos selecionada de um grupo consistindo de uma das SEQs IDNos: 924-950 como demonstrado na Figura 24A. O anticorpo anti-HER2 podeconstar também de um CDRH2 que compreende de pelo menos de umaseqüência de aminoácidos selecionada de um grupo consistindo de uma dasSEQs ID Nos: 951-977, como demonstrado na Figura 24A. O anticorpo anti-HER2 pode constar também de um CDRH3 que compreende pelo menos deuma seqüência de aminoácidos de um grupo consistindo de uma das SEQs IDNos: 978-1004 como demonstrado na Figura 24A.

Em um aspecto, um anticorpo que se liga especificamente aoHER2 humano compreende as seqüências CDRH1, CDRH2, CDRH3 e CDRL3correspondentes as seqüências CDRH1, CDRH2, CDRH3 e CDRL3estabelecidas na figura 11 para qualquer uma das Fabs de 1-106. Em umaspecto, um anticorpo que se liga especificamente ao HER2 humanocompreende as seqüências CDRH1, CDRH2, CDRH3 e CDRL3correspondentes as seqüências CDRH1, CDRH2, CDRH3 e CDRL3estabelecidas na figura 21A para qualquer uma dos clones de B1-B28. Emoutro aspecto, um anticorpo que se liga especificamente ao HER2 humanocompreende as seqüências CDRH1, CDRH2, CDRH3 e CDRL3correspondentes as seqüências CDRH1, CDRH2, CDRH3 e CDRL3estabelecidas na figura 24A para qualquer uma dos clones de G29 a G61.

Em alguns exemplos de realização, um anticorpo anti-HER2possuí um CDRH1 compreendendo uma seqüência de aminoácidoGFSIX2X3SYIH (SEQ ID No: 588) no qual, X2 e X3 são Y ou S. Um anticorpoanti-HER2 possuí um CDRH2 compreendendo uma seqüência de aminoácidoSIYPX3SGYTSYADSKVG (SEQ ID No:589) e no qual, X3 é Y ou S. Umanticorpo anti-HER2 pode possuir adicionalmente um domínio variável decadeia leva CDRL1 compreendendo uma seqüência de aminoácidoQQSYYX4PST (SEQ ID No:587), no qual X4 é Y ou S.

Em alguns exemplos de realização, um anticorpo anti-HER2possuí uma seqüência de aminoácido GFX1ISYSSIH (SEQ ID No: 590) noqual, X1 é Y ou S. Um anticorpo anti-HER2 possuí adicionalmente um CDRH2compreendendo uma seqüência de aminoácido SIYPX3YGX5TX6YADSKVG(SEQ ID No:591) e no qual, X3, X5 e X6 são Y ou S.

Em alguns exemplos de realização, um anticorpo anti-HER2possuí um CDRH1 compreendendo uma seqüência de aminoácidoGFXIISSSSIH (SEQ ID No: 593) no qual, X1 é Y ou S. Um anticorpo anti-HER2pode possuir adicionalmente um CDRH2 que possuí uma seqüência deaminoácido X1DC2PSSGYTX6YADSKVG (SEQ ID No:594) e no qual, X1, X2 eX6 são Y ou S. Um anticorpo anti-HER2 pode possuir adicionalmente umCDRH3 que possuí uma seqüência de aminoácidoXEX2X3X4YYSYYX10GX12X13X14DY (SEQ ID No:592) e no qual, X1 éselecionado de Y, S e R, X2 é selecionado de Y e S; X3 é selecionado de G, Ye S; X4 é selecionado de G, Y e S; X4 é selecionado de Y, S, R e G; X10 éselecionado de Y, S e G, X12 é selecionado de Y, S e G; X13 é selecionado deG e A e X14 é selecionado de I, F, M e L.

Em alguns exemplos de realização, o anticorpo anti-DR5 podeopcionalmente possuir um domínio variável de cadeia leve, no qual: o CDRL3compreende uma seqüência de aminoácidos Q-Q-X1-X2-X3-X4-P-X5-T (IDSEQ NO: 25); no qual, X1 é a posição 91 e é selecionado a partir de S e Y; X2é selecionado de S, Y e L; X3 é selecionado de Y, S e F; X4 é selecionado deY e S, e X5 é selecionado de S e Y. O domínio variável da cadeia leve podeadicionalmente possuir um CDRL3 que compreende uma seqüência deaminoácido de um grupo que consiste das SEQs ID Nos: 83 a 188, comodemonstrado na Figura 11, SEQs ID Nos: 789 a 815, como demonstrado naFigura 21A e SEQs ID Nos: 897 a 923, como demonstrado na Figura 24A. Oanticorpo pode constar adicionalmente de um CDRL1 que compreende umaseqüência de aminoácido RASQDVNTAVA (SEQ ID No: 29). O anticorpo podeconstar adicionalmente de um CDRL2 que compreende uma seqüência deaminoácido SASSLYS (SEQ ID No: 30).

Em um aspecto, o polipeptídeo é um anticorpo específico que seliga a HER2. Em tal aspecto, o anticorpo compreende a região estrutural doanticorpo 4D5. Em tal aspecto, o anticorpo compreende a região estrutural deum variante de anticorpo 4D5. Em tal aspecto, o anticorpo é um anticorpomonoclonal. Em tal aspecto, o anticorpo é um anticorpo biespecífico.

Em um exemplo de realização, é fornecido um polinucleotídeoisolado que codifica um dos anticorpos descritos acima que ligaespecificamente ao HER2 humano. Em um exemplo de realização, é fornecidoum vetor contendo um polinucleotídeo isolado que codifica um dos anticorposdescritos acima que se liga especificamente ao HER2 humano. Em exemplo derealização, é fornecida uma célula hospedeira transformada co m um vetorcontendo um polinucleotídeo isolado que codifica um dos anticorpos descritosacima que se liga especificamente ao HER2 humano. Em exemplo derealização, é fornecido um processo de produção de anticorpo,compreendendo de uma cultura de célula hospedeira transformadas com umvetor contendo um polinucleotídeo isolado que codifica um dos anticorposacima descritos que se ligam especificamente ao HER2 humano de forma queo polinucleotídeo é expresso. Em um aspecto, o processo compreende aindana recuperação do anticorpo a partir da cultura da célula hospedeira. Em umaspecto, o processo compreende adicionalmente da recuperação do anticorpodo meio de cultura da célula hospedeira.

Em um exemplo de realização, é fornecido um método de uso deum ou mais anticorpos descritos acima que se ligam especificamente ao HER2humano para tratar uma desordem associada a HER2, compreendendo a etapade administrar um ou mais anticorpos ao mamífero. Em outro aspecto, otratamento consta da etapa de administração de um segundo agenteterapêutico simultaneamente ou seqüencialmente com o anticorpo. Em talaspecto, o segundo agente terapêutico é selecionado a partir de uma agenteanti-angiogênico, agente anti-neoplásico, agente quimioterápico e agentecitotóxico.

Em um exemplo de realização, um método de tratamento de ummamífero a partir de sofre ou possuí risco de desenvolver um distúrbiorelacionado com HER2, incluí a etapa de tratamento do mamífero com um oumais Fabs de um ou mais anticorpos descritos acima que se ligamespecificamente ao HER2. Em um exemplo de realização, um ou mais dospolipeptídeos descritos acima se liga especificamente ao HER2.

Em um aspecto, um polipeptídeo da invenção inclui pelo menosum, ou ambos, domínio variável de cadeia pesada e leve, no qual o anticorpodomínio variável compreende uma, duas ou três CDRs variantes como descritono presente (por exemplo, como descrito anteriormente).

Em um exemplo de realização, um polipeptídeo da invenção(especificamente aquele que compreende um domínio variável de anticorpo)possuem adicionalmente uma seqüência da região estrutural do anticorpo, porexemplo, FR1, FR2, FR3, e/ou FR4 para um polipeptídeo do domínio variávelcorrespondente à variante CDR, as seqüências FR obtidas a partir de um únicoanticorpo modelo. Em tais exemplos, as seqüências FR são obtidas deanticorpos humanos. Em tais exemplos, as seqüências FR são obtidas daseqüência de consenso humano (por exemplo, seqüência de consensosubgrupo III). Em um exemplo de realização, a seqüências da região estruturalcompreende uma seqüência consenso modificada como descrito no presente(por exemplo, compreendendo modificações na posição 49, 71, 93 e/ou 94 nacadeia pesada, e/ou na posição 66, da cadeia leve). Em um exemplo de realização,as regiões estruturais têm as seqüências da região estrutural do anticorpo 4D5-8(H 10 humanizado do tipo selvagem cadeia leve e pesada (mostrado na figura 16 (SEQ IDNos: 6-9 e 10-13, respectivamente)). Em um exemplo de realização, a regiãoestrutural têm seqüências da região estrutural de uma versão variante do anticorpohumanizado 4D5-8 cadeia leve e pesada, no qual a cadeia leve é modificada naposição 66 e a cadeia pesada é modificada nas posições 71, 73 e 78 (comodemonstrado na figura 17 (SEQ ID Nos: 14-17 e 18-21)).

Em alguns exemplos de realização, um polipeptídeo da invençãoconsta de um domínio variável de uma cadeia leve e cadeia pesada deanticorpo, no qual o domínio variável de cadeia leve inclui, pelo menos, 1, 2 ou3 variantes selecionados entre o grupo de CDRs constituído por CDR L1, L2 eL3, e o domínio variável de cadeia pesada inclui, pelo menos, 1, 2 ou 3 varianteselecionados entre o grupo de CDRs constituído por CDR H1, H2 e H3.

Em alguns exemplos de realização, um polipeptídeo da invençãoé um ScFv. Em alguns exemplos de realização, é um fragmento Fab. Emalguns exemplos de realização, é um F(ab)2 ou F(ab')2. Assim, em algunsexemplos de realização, um polipeptídeo da invenção inclui ainda um domíniode dimerização. Em alguns exemplos de realização, o domínio de dimerizaçãoestá localizado entre um domínio variável de cadeia pesada ou domíniovariável de cadeia leve do anticorpo a pelo menos uma parte de uma proteínada cápside viral. O domínio de dimerização pode incluir uma seqüência dedimerização e/ou uma seqüência que inclua um ou mais resíduos cisteína. Odomínio de dimerização pode estar ligado, direta ou indiretamente, àextremidade C-terminal de um domínio variável de cadeia pesada ou domínioconstante. A estrutura do domínio de dimerização pode ser variada,dependendo se o domínio variável do anticorpo é produzido como umcomponente da proteína de fusão com o componente da proteína da cápsideviral (por exemplo, sem um códon de parada após o domínio de dimerização)ou se o domínio variável do anticorpo é produzido predominantemente sem ocomponente da proteína da cápside viral (por exemplo, com um códon deparada após o domínio de dimerização). Quando o domínio variável doanticorpo é produzido predominantemente como uma proteína de fusão com ocomponente da proteína da cápside viral, uma ou mais ligações de dissulfeto e/ouseqüência de dimerização única fornece uma exibição bivalente. Para os domíniosvariáveis do anticorpo predominantemente produzidos não sendo fundido a umcomponente da proteína da cápside viral (por exemplo, com um códon de paradaâmbar), o domínio de dimerização pode incluir tanto um resíduo cisteína quantouma seqüência de dimerização. Em alguns exemplos de realização, as cadeiaspesadas da F(ab)2 dimeriza no domínio de dimerização não incluindo a região dedobradiça. O domínio de dimerização pode incluir uma seqüência de zíper deleucina (por exemplo, uma seqüência GCN4 comoGRMKQLEDKVEELLSKNYHLENEVARLKKLVGERG (SEQ ID No: 3)).

Em alguns exemplos de realização, um polipeptídeo da invençãoinclui ainda um domínio de cadeia constante de cadeia leve fundido a umdomínio variável de cadeia leve, que em alguns exemplos de realização, incluipelo menos um, dois ou três CDRs variantes. Em alguns exemplos derealização dos polipeptídeos da invenção, o polipeptídeo compreende umdomínio constante da cadeia pesada fundido a um domínio variável de cadeiapesada, que em alguns exemplos de realização inclui pelo menos um, dois outrês CDRs variantes.

Em alguns casos, pode ser preferível a mutação de um resíduo daregião estrutural de modo que este seja variante no que diz respeito aopolipeptídeo de referência ou anticorpo fonte. Por exemplo, o resíduo da regiãoestrutural 71 da cadeia pesada pode ser R, V ou A. Em outro exemplo, oresíduo da região estrutural 93 da cadeia pesada pode ser S ou A. Em outroexemplo ainda, o resíduo da região estrutural 94 é R, K ou T ou é codificadapor MRT. Em outro exemplo, o resíduo da região estrutural 49 da cadeiapesada pode ser A ou G. Os resíduos da região estrutural da cadeia levetambém podem ser mutados. Por exemplo, o aminoácido na posição 66 poderáser R ou G.

Assim como descrito no presente, um CDR variante refere-se aum CDR com uma seqüência diferente comparada com o a seqüência de CDRcorrespondentes de um único polipeptídeo de referência / anticorpo fonte.

Conseqüentemente, os CDRs de um único polipeptídeo da invenção podem,em certos exemplos de realização, corresponder ao conjunto de CDRs de umúnico polipeptídeo de referência ou anticorpo fonte. Os polipeptídeos dainvenção podem incluir qualquer variante ou combinação de CDRs. Porexemplo, um polipeptídeo da invenção pode incluir uma variante de CDRH1 eum variante de CDRH2. Um polipeptídeo da invenção pode incluir um variantede CDRH1, variante de CDRH2 e um variante de CDRH3. Em outro exemplo,um polipeptídeo da invenção pode incluir uma variante de CDRH1, variante deCDRH2, variante de CDRH3 e a variante de CDRL3. Em outro exemplo, umpolipeptídeo da invenção compreende um variante de CDRL1, variante deCDRL2 e a variante de CDRL3. Qualquer polipeptídeo da invenção podeconstar de mais de um variante de CDRL3. Qualquer polipeptídeo da invençãopode constar de mais de um variante de CDRH3.Em um exemplo de realização, um polipeptídeo da invençãocompreende um ou mais seqüências variantes de CDR como ilustrado nasfiguras 7, 19 e 22. Em um exemplo de realização, um polipeptídeo da invençãocompreende uma ou mais seqüências variantes CDR, conforme ilustrado naFigura 11 A. Em um exemplo de realização, um polipeptídeo da invençãocompreende uma ou mais seqüências variantes de CDR, conforme ilustrado naFigura 15. Em outro exemplo de realização, um polipeptídeo da invençãocompreende uma ou mais seqüências variantes de CDR como representadonas figuras 21 A, 21B. Em outro exemplo de realização, um polipeptídeo daH 10 invenção compreende uma ou mais seqüências variantes de CDR, conformeilustrado na Figura 24A.

Polipeptídeos da invenção podem ser complexados com umoutro. Por exemplo, a invenção fornece um complexo de polipeptídeoconstituído por dois polipeptídeos, onde cada polipeptídeo é um polipeptídeoda invenção, e no qual um dos polipeptídeos mencionados inclui pelo menosuma, duas ou todas variantes de CDRs H1, H2, H3, e o outro polipeptídeocompreende uma variante CDR da cadeia leve (por exemplo, CDR L3). Umcomplexo de polipeptídeos pode constar de um primeiro e um segundopolipeptídeo (no qual o primeiro e o segundo são polipeptídeos da invenção),no qual o primeiro polipeptídeo inclui pelo menos um, dois ou três variantesCDRs de cadeia leve, e o segundo polipeptídeo inclui pelo menos um, dois ou trêsvariantes CDRs de cadeia pesada. A invenção também fornece complexos depolipeptídeos que compreendem das mesmas seqüências variantes de CDR. Aformação de complexos pode ser mediada por qualquer técnica adequada,incluindo a dimerização/ multimerização em um domínio dedimerização/multimerização tal como as descritas no presente ou por interaçõescovalentes (como, por exemplo, através de uma ponte de dissulfeto) (que emalguns contextos é parte do domínio de dimerização, por exemplo, um domínio dedimerização pode conter uma seqüência de zíper de leucina e uma cisteína).

Em outro aspecto, a invenção fornece composições contendopolipeptídeos e/ou polinucleotídeos da invenção. Por exemplo, a invençãofornece uma composição que compreende uma variedade de qualquer um dospolipeptídeos da invenção descrita no presente. A variedade mencionada podecompreender de polipeptídeos codificada por uma variedade depolinucleotídeos gerados usando um conjunto de oligonucleotídeoscompreendendo do enfraquecimento na seqüência que codifica um aminoácidovariante, no qual o dito enfraquecimento das múltiplas seqüências de códonsdo conjunto de códons restrito que codificam o aminoácido variante. Umacomposição que compreende de um polinucleotídeo ou polipeptídeo oubiblioteca da invenção pode ser sob a forma de um kit ou artigo manufaturado(opcionalmente embalados com as instruções, tampões, etc).

Em um aspecto, a invenção fornece polinucleotídeos quecodificam um polipeptídeo da invenção como descrito no presente. Em outroaspecto, a invenção fornece um vetor que compreende uma seqüência quecodifica um polipeptídeo da invenção. O vetor pode ser, por exemplo, um vetorde expressão replicável (por exemplo, um vetor de expressão replicável podeser um fago M13, fl, fd, Pf3 ou um derivado destes, ou um fago lambdóide, talcomo lambda, 21, phi80, phi81, 82, 424, 434, etc. ou um derivado destes). Ovetor pode constar de uma região promotora ligada à seqüência que codifica opolipeptídeo da invenção. O promotor pode ser apropriado para qualquerexpressão do polipeptídeo, por exemplo, o sistema promotor lac Z, fosfatasealcalina promotor pho A (AP), o promotor de bacteriófago 1pl (promotorsensível à temperatura), promotor tac, promotor de triptofano, promotor debacteriófago T7. Assim, a invenção fornece também um vetor contendo umpromotor selecionado a partir do grupo, constituído por promotores dossistemas descritos anteriormente.Os polipeptídeos da invenção podem ser exibidos sob qualquerforma adequada, de acordo com a necessidade e a vontade do profissional.

Por exemplo, um polipeptídeo da invenção pode ser exibido em uma superfícieviral, por exemplo, um fago ou partícula viral de fagomídeo. Assim, a invençãofornece partículas virais que compreendem um polipeptídeo da invenção e/oupolinucleotídicas que codificam um polipeptídeo da invenção.

Em um aspecto, a invenção fornece uma população quecompreende uma variedade de polipeptídeo ou polinucleotídeos da invenção,onde cada tipo de polipeptídeo ou polinucleotídeo é um polipeptídeo oupolinucleotídeo da invenção como descrito no presente.

Em alguns exemplos de realização, os polipeptídeos e/oupolinucleotídeos são fornecidos como uma biblioteca, por exemplo, bibliotecaque compreende uma variedade de, pelo menos, cerca de 1x104, 1x105, 1x106,1x107, 1x108 polipeptídeos e/polinucleotídeos ou seqüências da invençãodistintas. Em outro aspecto, a invenção fornece também uma biblioteca quecompreende uma variedade de vírus ou partículas virais da invenção, no qualcada vírus ou partícula viral exibe um polipeptídeo da invenção. A biblioteca dainvenção pode incluir um vírus ou partículas virais para exibir qualquer númerode polipeptídeos distintos (seqüências), por exemplo, no mínimo, cerca de1x104, 1x105, 1x106, 1x107, 1x108 polipeptídeos distintos.

Em outro aspecto, a invenção fornece células hospedeiras quepossuem um polinucleotídeo ou vetor que compreende uma seqüência codificaum polipeptídeo da invenção.

Em outro aspecto, a invenção fornece métodos para a seleção deligante de alta afinidade para antígenos alvo específicos. Em alguns dessesexemplos de realização, o antígeno alvo específico inclui, mas não se limita a,HER2 ou DR5.

Os métodos da invenção fornecem populações de polipeptídeos(por exemplo, bibliotecas de polipeptídeos (por exemplo, de domínios variáveisde anticorpos)) com um ou mais regiões CDR diversificadas. Essas bibliotecassão classificadas (selecionadas) e/ou rastreadas para identificar os ligantes dealta afinidade ao antígeno alvo. Em um aspecto, o polipeptídeo ligante dabiblioteca é selecionado para se ligar ao antígeno alvo, e ter afinidade. Opolipeptídeo ligante selecionado usando uma ou mais destas estratégias deseleção, pode ser então rastreado por afinidade e/ou especificidade (liga-seapenas ao antígeno alvo e não se liga ao outro antígeno).

Em um aspecto, um método da invenção compreende em geraruma variedade de polipeptídeos com um ou mais regiões CDR diversificadas,classificando a variedade de polipeptídeos em ligantes a um antígeno alvoexpondo a variedade de polipeptídeos a um antígeno alvo em condiçõesadequadas para a ligação; separando os ligantes ao antígeno dos que não seligam; isolando os ligantes, e identificando os ligantes com alta afinidade deligação (ou qualquer ligante que possuí uma afinidade de ligação desejada). Aafinidade dos ligantes que se ligam ao antígeno alvo pode ser determinadautilizando uma variedade de técnicas conhecidas na arte, por exemplo, acompetição por ELISA, como descrito no presente. Opcionalmente, ospolipeptídeos podem ser fundidos a um polipeptídeo marcado, tal como gD, poliHis ou FLAG, que podem ser utilizados para classificar ligantes em combinaçãocom a triagem para o antígeno alvo.

Outro exemplo de realização fornece um método de isolar ouselecionar um domínio variável de anticorpo que se liga a um antígeno alvo deuma biblioteca de domínios variáveis de anticorpos, no qual o dito métodocompreende em: a) expor uma população que compreende uma variedade depolipeptídeos imobilizados da invenção com um antígeno alvo em condiçõesadequadas para ocorrer a ligação e isolar o polipeptídeo ligante no antígenoalvo; b) separar os "polipeptídeos ligantes" dos não ligantes, e eluir os ligantesdo antígeno alvo; c) repetir opcionalmente, as etapas a e b pelo menos umavez (em alguns exemplos de realização, pelo menos duas vezes).

Em alguns exemplos de realização, um método podeadicionalmente compreender: d) incubar a subpopulação com umaconcentração de antígeno alvo marcado em um intervalo de 0,1 nM a 1000 nMpara formar uma mistura, sob condições adequadas para ligação; e) interagir amistura com um agente imobilizado que se liga no antígeno alvo marcado; f)detectar a um ou mais polipeptídeos que ligam-se especificamente ao antígenoalvo marcado, e recuperar um ou mais polipeptídeos que liga-seespecificamente ao antígeno alvo marcado do antígeno alvo marcado; e g)opcionalmente, repetir as etapas de (d) a (f) por pelo menos um vez (em algunsexemplos de realização, por pelo menos duas vezes), usando cada vezconcentrações sucessivamente mais baixas de antígeno alvo marcado.

Opcionalmente, o método pode compreender da adição de um excesso deantígeno alvo não marcado à mistura e incubando por um período suficientepara eluir ligantes de baixa afinidade do antígeno alvo marcado.

Em outro aspecto a invenção fornece um método para isolar ouselecionar ligantes de alta afinidade (ou possuindo uma afinidade de ligaçãodesejada) para um antígeno alvo. Em um exemplo de realização, o dito métodocompreende: a) expor uma população que compreende uma variedade depolipeptídeos imobilizados da invenção com um antígeno alvo, no qual oantígeno é fornecido em uma quantidade de concentração em um intervalo de0,1 nM a 1000 nM para isolar o polipeptídeo ligante ao antígeno alvo; b)separar os polipeptídeos ligantes do antígeno alvo; c) repetir opcionalmente, asetapas a e b pelo menos uma vez (em alguns exemplos de realização, pelomenos duas vezes), usando cada vez concentrações sucessivamente maisbaixas de antígeno alvo marcado, d) selecionando o polipeptídeo ligante que seliga em concentrações mais baixas de antígeno alvo por alta afinidade (ouqualquer afinidade desejada) pela incubação do polipeptídeo ligante comdiferentes diluições do antígeno alvo e determinando o IC50 do polipeptídeoligante, e; e) identificando um polipeptídeo ligante que tem uma afinidadedesejada para o antígeno alvo. A afinidade pode ser dita, por exemplo, cercade 0,1 nM a 200 nM, 0,5 nM a 150 nM, 1 nM a 100 nM e/ou 25 nM a 75 nM.

Outro exemplo de realização fornece um ensaio para isolar ouselecionar um polipeptídeo ligante compreendendo em: a) expor umapopulação que compreende uma variedade de polipeptídeos marcados dainvenção com um antígeno alvo, no qual o antígeno é fornecido em umaquantidade de concentração em um intervalo de 0,1 nM a 1000 nM emcondições adequadas para a ligação formar um complexo de polipeptídeoligante e antígeno alvo marcado; b) isolar os complexos e separar opolipeptídeo ligante do antígeno alvo marcado; c) repetir opcionalmente asetapas a e b por pelo menos uma vez, utilizando a cada etapa umaconcentração menor de antígeno alvo. Opcionalmente, o método pode aindaexpor o complexo que compreende o polipeptídeo ligante e o antígeno alvocom um excesso de antígeno alvo não marcado. Em um exemplo derealização, as etapas do método são repetidas duas vezes e a concentração doantígeno alvo na primeira etapa de seleção está na faixa de 100 nM a 250 nM,e, na segunda etapa de seleção (quando realizada) está na faixa de 25 nM a100 nM, e na terceira etapa de seleção (quando realizada) está na faixa de 0,1nM a 25 nM.

A invenção inclui também um método para rastrear umapopulação que compreende uma variedade de polipeptídeos da invenção, noqual o dito método compreende em: a) incubar uma primeira amostra dapopulação de polipeptídeos com um antígeno alvo em condições adequadaspara a ligação dos polipeptídeos ao antígeno alvo b) sujeitar uma segundaamostra da população de polipeptídeos semelhante a uma incubação mas, naausência do antígeno alvo; (c) expor cada uma da primeira e segunda amostracom o antígeno alvo imobilizado em condições adequadas para a ligação dospolipeptídeos ao antígeno alvo imobilizado; d) detectar a quantidade depolipeptídeos ligados ao antígeno alvo imobilizado em cada amostra, e)determinar afinidade de ligação de um polipeptídeo específico para o antígenoalvo calculando a relação entre a quantidade de polipeptídeo específico que seligou na primeira amostra sobre a quantidade de polipeptídeo específico que seligou na segunda amostra.

As bibliotecas geradas como descrito no presente também podemser rastreadas para se ligarem a um alvo específico e por ausência de ligaçãoa um antígeno não alvo. Em um aspecto, a invenção fornece um método pararastrear um polipeptídeo, tal como um domínio variável de anticorpo dainvenção, que se liga a um antígeno alvo específico de uma biblioteca dedomínios variáveis de anticorpos, no qual o dito método compreende em: a)gerar uma população compreendendo uma variedade de polipeptídeos dainvenção; b) expor a população de polipeptídeos à um antígeno alvo emcondições adequadas para a ligação; c) separar o polipeptídeo ligante nabiblioteca dos polipeptídeos não ligantes; d) identificar um polipeptídeo liganteespecífico para o antígeno alvo pela determinação se o polipeptídeo ligante seliga a um antígeno que não seja o antígeno alvo e; e) isolar um polipeptídeoligante específico para o antígeno alvo. Em alguns exemplos de realização, a etapa(e) compreende na eluição dos polipeptídeos classificados a partir do antígeno alvo,e amplificação de um vetor de expressão replicável que codifica o dito polipeptídeoligante. Em alguns exemplos de realização, uma ou mais bibliotecas, clones oupolipeptídeos são rastreados contra um painel de antígenos incluindo o antígenoalvo. Em alguns exemplos de realização, os clones ou polipeptídeos que ligamespecificamente ao antígeno alvo e não substancialmente reagem cruzadamentecom qualquer um dos outros antígenos no painel são selecionados. O painel deantígenos pode incluir no mínimo, três e no máximo 100 antígenos diferentes. Emalguns casos, o painel de antígenos inclui de 3 a 100, de 3 a 50, de 3 a 25, ou de 3a 10 antígenos diferentes.

Combinações de um dos métodos de triagem/ seleção descritosacima podem ser realizadas com os métodos de rastreio. Por exemplo, em umexemplo de realização, os polipeptídeos ligantes são selecionadosprimeiramente pela ligação a um antígeno alvo imobilizado. Os polipeptídeosligantes que se ligam ao antígeno alvo imobilizado podem então ser rastreadospela ligação ao antígeno e pela ausência de ligação a um antígeno que não é oantígeno alvo. Os polipeptídeos ligantes que se ligam especificamente aoantígeno alvo podem ser amplificados, quando necessário. Estes polipeptídeosligantes podem ser selecionados para uma maior afinidade pela exposição comuma concentração de antígenos alvo marcados para formar um complexo, noqual a concentração de antígeno alvo marcado é de cerca de 0,1 nM a cercade 1000 nM, e os complexos são isolados pela exposição com um agente quese liga ao marcador sobre o antígeno alvo. Um polipeptídeo ligante pode entãoser eluído do antígeno alvo marcado e opcionalmente, as etapas de seleçãosão repetidas, e a cada etapa é utilizado uma concentração menor de antígenoalvo marcado. O polipeptídeo ligante que pode ser isolado utilizando estemétodo de seleção pode então ser rastreado pela alta afinidade utilizando, porexemplo, um ensaio de ELISA na solução fase, tal como descrito, por exemplo,nos exemplos 2 e 4 ou outros métodos convencionais conhecidos no estado datécnica. As populações de polipeptídeos da invenção utilizados nos métodos dainvenção podem ser prestadas sob qualquer forma adequada de etapas de seleçãorastreio. Por exemplo, os polipeptídeos podem estar livres, na forma solúvel,anexados a uma matriz, ou presentes na superfície de uma partícula viral comofago ou partícula de fagomídeo. Em alguns exemplos de realização dos métodos dainvenção, a variedade de polipeptídeos é codificada por uma variedade de vetoresreplicáveis fornecidas sob a forma de uma biblioteca. Nos métodos de seleção /triagem descritos no presente, vetores codificando polipeptídeos ligantes podem serainda mais amplificados para fornecer quantidades suficientes de polipeptídeo parauso em repetições das etapas de seleção / triagem (que, como indicado acima, sãoopcionais nos métodos da invenção).

Em um exemplo de realização, a invenção fornece um método deseleção para um polipeptídeo que se liga a um antígeno alvo compreendendo:

a) gerar uma composição que compreende uma variedade depolipeptídeos da invenção, como descrito no presente;

b) selecionar um polipeptídeo ligante que se liga a um antígenoalvo a partir da composição;

c) isolar o polipeptídeo ligante dos polipeptídeos não ligantes;

d) identificar os ligantes de afinidade desejada a partir dospolipeptídeos ligantes isolados.

Em outro exemplo de realização, a invenção fornece um métodode seleção para um domínio variável ligante a um antígeno que se liga a umantígeno alvo de uma biblioteca de domínios variáveis de anticorposcompreendendo:

a) expor a biblioteca de domínios variáveis de anticorpos dainvenção (conforme descrito no presente) a um antígeno alvo;

b) separar os ligantes dos não ligantes, e eluir os ligantes a partirdo antígeno alvo e incubar os ligantes em uma solução com a quantidadesdecrescentes de antígeno alvo em uma concentração de cerca de 0,1 nM a1000 nM;

c) selecionar os ligantes que podem se ligar a baixasconcentrações de antígeno alvo e que possuem uma afinidade de cerca de 0,1nM a 200 nM.

Em alguns exemplos de realização, a concentração do antígenoalvo é de cerca de 100 a 250 nM, ou cerca de 25 a 100 nM.

Em um exemplo de realização, a invenção fornece um método deseleção para um polipeptídeo que se liga a um antígeno alvo a partir de umabiblioteca de polipeptídeos compreendendo:

a) isolar o polipeptídeo ligante para um antígeno alvo, expondouma biblioteca que consta de uma variedade de polipeptídeos do invento(conforme descrito no presente) com um antígeno alvo imobilizado emcondições adequadas para a ligação;

b) separar os polipeptídeos ligantes ao antígeno alvo dospolipeptídeos não ligantes e eluir os polipeptídeos ligantes ao antígeno alvopara obter uma subpopulação enriquecida de ligantes, e

c) repetir opcionalmente as etapas a e b, pelo menos uma vez(em alguns exemplos de realização, pelo menos duas vezes), cada repetiçãoutilizando a subpopulação de ligantes obtidos a partir da última etapa deseleção.

Em alguns exemplos de realização, o método da invenção podeadicionalmente compreender:

d) incubar a subpopulação do polipeptídeo ligante com umaconcentração de antígeno alvo marcado em um intervalo de 0,1 nM a 1000 nM,sob condições adequadas para ligação para formar uma mistura;

e) interagir a mistura com um agente imobilizado que se liga noantígeno alvo marcado;

f) detectar o polipeptídeo ligante que se liga especificamente aoantígeno alvo marcado e eluir o polipeptídeo ligante do antígeno alvo marcado; e

g) repetir opcionalmente as etapas de (d) a (f) por pelo menos umvez (em alguns exemplos de realização, por pelo menos duas vezes), cadarepetição utilizando a subpopulação de ligante obtido na etapa de seleçãoanterior e usando concentrações cada vez mais baixas de antígeno alvomarcado do que na etapa anterior.

Em alguns exemplos de realização, estes métodos compreendemadicionalmente da adição de um excesso de antígeno alvo não marcado namistura e da incubação por um período de tempo suficiente para eluir ligantesde baixa afinidade a partir do antígeno alvo marcado. Em outro exemplo derealização, a invenção fornece um método para isolar ligantes de alta afinidadepara o antígeno alvo compreendendo:

a) expor uma biblioteca que compreende uma variedade depolipeptídeos da invenção (como descrito no presente) com um antígeno alvoem uma concentração de 0,1 nM a 1000 nM para isolar o polipeptídeo liganteao antígeno alvo;

b) separar os polipeptídeos ligantes do antígeno alvo para seobter uma subpopulação enriquecida de polipeptídeo ligante; e

c) repetir opcionalmente, as etapas a e b pelo menos uma vez(em alguns exemplos de realização, pelo menos duas vezes), usando cada vezconcentrações sucessivamente mais baixas de antígeno alvo marcado emrelação à etapa anterior para isolar o polipeptídeo ligante que se liga emconcentrações mais baixa ao antígeno alvo.

Em um aspecto, a invenção fornece um ensaio de seleção dopolipeptídeo ligante a partir de uma biblioteca que consta de uma variedade depolipeptídeos do invento (conforme descrito no presente) compreendendo:

a) expor uma biblioteca com uma concentração de antígeno alvomarcado em uma concentração de 0,1 nM a 1000 nM sob condições ideaispara ocorrer a ligação e formar um complexo com um polipeptídeo ligante e oantígeno alvo marcado;

(b) isolar os complexos e separar os polipeptídeos ligantes doantígeno alvo marcado para se obter uma subpopulação enriquecida deligantes; e(c) opcionalmente repetir as etapas (a) e (b) pelo menos umavez (em alguns exemplos de realização, pelo menos duas vezes), cadarepetição usando a subpopulação de ligantes obtida a partir da última etapa deseleção e usando uma concentração decrescente de antígeno alvo que foiutilizada na etapa anterior.

Em alguns exemplos de realização, o método compreendeadicionalmente da adição de um excesso de antígeno alvo não marcado aocomplexo de polipeptídeo e antígeno alvo Em alguns exemplos de realização,as etapas estabelecidas acima são repetidas pelo menos uma vez (em algunsexemplos de realização, pelo menos duas vezes) e a concentração do antígenoalvo na primeira etapa de seleção está na faixa de 100 nM a 250 nM, e, nasegunda etapa de seleção está na faixa de 25 nM a 100 nM, e na terceiraetapa de seleção está na faixa de 0,1 nM a 25 nM.

Em outro aspecto, a invenção fornece também um método pararastrear uma biblioteca que compreende uma variedade de polipeptídeos dainvenção, no qual o dito método compreende em:

a) incubar uma primeira amostra da biblioteca com umaconcentração de antígeno alvo em condições adequadas para a ligação dospolipeptídeos ao antígeno alvo

b) incubar uma segunda amostra da biblioteca na ausência doantígeno alvo;

(c) expor cada uma da primeira e segunda amostra com oantígeno alvo imobilizado em condições adequadas para a ligação dospolipeptídeos ao antígeno alvo imobilizado;

d) detectar a ligação do polipeptídeo ao antígeno alvo imobilizadoem cada amostra,

e) determinar afinidade de ligação de um polipeptídeo específicopara o antígeno alvo calculando a relação entre a quantidade de polipeptídeoespecífico que se ligou na primeira amostra sobre a quantidade de polipeptídeoespecífico que se ligou na segunda amostra.

O uso diagnóstico e o uso terapêutico dos polipeptídeos ligantesda invenção são contemplados. Em um pedido diagnóstico, a invenção forneceum método para determinar a presença de uma proteína de interessecompreendendo na exposição de uma amostra suspeita de conter a proteína àum polipeptídeo ligante da invenção e determinando a ligação do polipeptídeoligante na amostra. Para este uso, a invenção fornece um kit que inclui ospolipeptídeos ligantes e instruções para a utilização dos polipeptídeos ligantespara detectar a proteína.

A invenção prevê ainda: ácidos nucléicos isolados que codificamo polipeptídeo ligante; um vetor que possuí ácidos nucléicos, opcionalmente,uma seqüência controle ligada operacionalmente, reconhecida por uma célulahospedeira transformada com o vetor; uma célula hospedeira transformadacom o vetor, um processo de produção do polipeptídeo ligante compreendendono cultivo desta célula hospedeira, a fim de que o ácido nucléico seja expressoe, opcionalmente, recuperando o polipeptídeo ligante da cultura de célulashospedeiras (por exemplo, a partir do meio de cultura da célula hospedeira).

A invenção fornece também uma composição que inclui umpolipeptídeo ligante da invenção e um veículo (por exemplo, um veículofarmaceuticamente aceitável) ou diluente. Esta composição para usoterapêutico é estéril e pode ser liofilizada. Também é contemplado o uso dopolipeptídeo ligante da presente invenção na fabricação de um medicamentopara tratar uma indicação descrita no presente. A composição pode constaradicionalmente de um segundo agente terapêutico como um agentequimioterápico, um agente citotóxico ou um agente anti-angiogênico.

A invenção fornece ainda um método para tratar um mamífero,compreendendo a adminstração de uma quantidade eficaz do polipeptídeoligante da invenção para o mamífero. O mamífero a ser tratado no métodopode ser um mamífero não humano, por exemplo, um primata ou roedoradequados para a obtenção de dados pré-clínicos (por exemplo, camundongo,rato ou coelho). Os mamíferos não humanos podem ser saudáveis (porexemplo, nos estudos toxicológicos), ou podem estar sofrendo de uma doençaa ser tratada com o polipeptídeo ligante de interesse. Em um exemplo derealização, o mamífero está sofrendo de um transtorno relacionado com DR5.Em outro exemplo de realização, o mamífero está sofrendo de um transtornorelacionado com HER2.

Em um exemplo de realização, o mamífero está sofrendo ou correo risco de desenvolver angiogênese anormal (por exemplo, angiogênesepatológica). Em um exemplo de realização específico, o distúrbio é um câncerselecionado a partir do grupo composto por câncer colorretal, carcinoma decélulas renais, câncer de ovário, câncer de pulmão de não-pequenas células(NSCLC), carcinoma broncoalveolar e câncer pancreático. Em outro exemplode realização, o distúrbio é uma doença causada pela neovascularizaçãoocular, por exemplo, cegueira diabética, retinopatias, principalmente retinopatiadiabética, degeneração macular induzida pela idade e rubeose. Em outroexemplo de realização, o mamífero a ser tratado está sofrendo ou corre o riscode desenvolver um edema (por exemplo, um edema associado com tumorescerebrais, edema associado a um acidente vascular cerebral, ou um edemacerebral). Em outro exemplo de realização, o mamífero está sofrendo de, oucorre o risco de desenvolver um transtorno ou doença selecionada a partir dogrupo composto por artrite reumatóide, doença inflamatória intestinal, asciteretrataria, psoríase, sarcoidose, arteriosclerose arterial, sepse, queimaduras epancreatite. De acordo com outro exemplo de realização, o mamífero estásofrendo ou corre o risco de desenvolver uma doença genito-urinariaselecionada a partir do grupo constituído por doença do ovário policístico (PI),endometriose e fibrose uterina. Em um exemplo de realização, o distúrbio éuma doença causada pela não regulação da sobrevivência celular (porexemplo, quantidade anormal de morte celular), incluindo, mas não se limitadoa, câncer, doenças do sistema imunológico, distúrbios do sistema nervosoe distúrbios do sistema vascular. A quantidade de polipeptídeo ligante dainvenção é que irá ser administrada é uma quantidade terapeuticamenteeficaz para tratar um distúrbio. Nos estudos de seleção d e dose, umavariedade de doses do polipeptídeo ligante pode ser administrada para omamífero. Em outro exemplo de realização, a quantidade terapeuticamenteeficaz de polipeptídeo ligante é administrada a um paciente humano paratratar um distúrbio no paciente.

Em um exemplo de realização, os polipeptídeos ligantes destainvenção úteis para tratar tumores, tumores malignos e outros distúrbiosrelacionados com a angiogênese anormal, incluindo distúrbios inflamatórios oudesordens imunológicas e/ou diabetes ou outras doenças relacionadas com ainsulina descritas no presente são anticorpos Fab ou scFv. Portanto, essespolipeptídeos ligantes podem ser utilizados na fabricação de um medicamentopara tratar uma doença inflamatória ou doença imune. Um mamífero que estásofre ou corre o risco de desenvolver um distúrbio ou doença descrita nopresente pode ser tratado pela administração, de um segundo um agenteterapêutico, simultaneamente, seqüencialmente ou em combinação com umpolipeptídeo (por exemplo, um anticorpo) da presente invenção. Deve-secompreendido que outros agentes terapêuticos, além do segundo agenteterapêutico, pode ser administrado ao mamífero ou utilizado na fabricação deum medicamento para a indicação desejada.

Estes polipeptídeos podem ser utilizados para se compreender opapel da colaboração da célula hospedeira estromal no crescimento detumores não hospedeiro implantado, tal como em modelos de camundongos noqual tumores humanos foram implantados. Estes polipeptídeos podem serutilizados em métodos para a identificação de tumores humanos que podemescapar do tratamento terapêutico ou pelo acompanhamento ou observação docrescimento do tumor implantado em um roedor ou coelho após o tratamentocom o polipeptídeo desta invenção. Os polipeptídeos desta invenção tambémpodem ser utilizados para estudar e avaliar a combinação de terapias com umpolipeptídeo esta invenção e outros agentes terapêuticos. Os polipeptídeosdesta invenção podem ser utilizados para estudar o papel de uma moléculaalvo de interesse em outras doenças pela administração dos polipeptídeos aum animal que sofre da doença ou doença similar e determinando assim se umou mais sintomas da doença são atenuadas.

Por uma questão de clareza, na descrição do presente, a menosque especificado ou contextualmente indicado de outra forma, todos asnumerações de aminoácidos estão de acordo com Kabat et ai (vide elaboraçãoadicional em "Definições" abaixo).

Breve Descrição das Figuras

A Figura 1 exibe as seqüências de um domínio de cadeia leve ecadeia pesada 4D5 (SEQ ID No: I & 2, respectivamente).

A Figura 2 exibe um modelo 3-D da estrutura do 4D5 humanizadomostrando os resíduos CDR que formam sombras contíguas. Sombrascontíguas são formadas por resíduos de aminoácidos 28, 29, 30, 31 e 32 noCDRL1; resíduos de aminoácidos 50 e 53 do CDRL2; resíduos de aminoácido91, 92, 93, 94 e 96 do CDRL3; resíduos de aminoácido 28, 30, 31, 32,33, noCDRH1; e resíduos de aminoácido 50, 52, 53, 54, 56 e 58 no CDRH2.

A Figura 3 exibe a freqüência de aminoácidos (identificada pelocódigo de letra única), nas seqüências CDR da cadeia leve do anticorpohumano do banco de dados de Kabat. A freqüência de cada aminoácido emuma determinada posição de aminoácido é exibida começando com oaminoácido mais freqüente na posição a esquerda e continuando para a direitapara os aminoácidos menos freqüentes. O número abaixo do aminoácidorepresenta o número de seqüências que ocorrem naturalmente no banco dedados Kabat que têm aquele aminoácido nessa posição.

A Figura 4 exibe a freqüência de aminoácidos (identificada pelocódigo de letra única), nas seqüências CDR da cadeia pesada do anticorpohumano do banco de dados de Kabat. A freqüência de cada aminoácido emuma determinada posição de aminoácido é exibida começando com oaminoácido mais freqüente na posição a esquerda e continuando para a direitapara os aminoácidos menos freqüentes. O número abaixo do aminoácidorepresenta o número de seqüências que ocorrem naturalmente no banco dedados Kabat que têm aquele aminoácido nessa posição. As posições dosaminoácidos na região estrutural 71, 93 e 94 também são exibidas.

A Figura 5 ilustra esquematicamente um vetor bicistrônicopermitindo a expressão de transcrições separadas para a exibição de F(ab)2.Um promotor adequado direciona a expressão de um primeiro e segundocístron. O primeiro cístron codifica uma seqüência de sinal de secreção (malEou stll), um domínio variável e constante de cadeia leve e um marcador gD. Osegundo cístron codifica uma seqüência de sinal de secreção, uma seqüênciaque codifica um domínio 1 constante e variável da cadeia pesada (CH1) e umdomínio de dimerização de cisteína e, pelo menos, uma parte da proteína dacápside viral.

Figura 6 exibe as seqüências da região estrutural das cadeiasleve e pesada do huMAb4D5-8. Os números em sobrescrito/negrito indicam asposições dos aminoácidos de acordo com a numeração de Kabat.

A Figura 7 exibe modificações/variações nas seqüências daregião estrutural das cadeias leve e pesada do huMAb4D5-8. Os números emsobrescrito/negrito indicam as posições dos aminoácidos de acordo com anumeração de Kabat.

A Figura 8 ilustra o esquema de aleatorização para cada posiçãoCDR diversificada nas bibliotecas YSGR-A, YSGR-B, YSGR-C e YSGR-D,como descrito no Exemplo 1.

As Figuras 9A-9D mostram os oligonucleotídeos mutagênicosutilizados na construção das bibliotecas YSGR-A, YSGR-B, YSGR-C, YSGR-D,como descrito no Exemplo 3. O DNA enfraquecido equimolar estãorepresentados no conjunto de códons (W = A/T, K=G/T, M=A/C, N=A/C/G/T,R=A/G, S=G/C, Y=T/C). O conjunto de códons são representados no códigoRJB. A notação "XXX" nos oligonucleotídeos H3-A6-H3-A17 representa códonsde codificação de Tyr/Ser/Gly em uma razão molar de 50/25/25,respectivamente. A notação "XXX" nos oligonucleotídeos H3-B6-H3-B17representa códons de codificação Tyr/Ser/Arg em uma razão molar de25/50/25, respectivamente. A notação "XXX" nos oligonucleotídeos H3-C6-H3-C17 representa códons de codificação de Tyr/Ser/Gly/Arg em uma razão molarde 38/25/25/12, respectivamente. A notação "XXX" nos oligonucleotídeos H3-D6-H3 a D17 representa códons de codificaçãoTyr/Ser/Gly/Arg/Ala/Asp/Glu/Phe/His/lle/Lys/Leu/Met/Asn/Pro/GIn/ThrA/al/Trpem uma razão molar de 20/26/26/13/1/1/1/1/1/1/1/1/1/1/1/1/1/1/1,respectivamente.

A Figura 10 mostra a razão de enriquecimento para a bibliotecaYSGR-A-D após 5 etapas de seleção contra o DR5 humano ou HER-2humano, tal como descrito no Exemplo 2. Os números são mostrados comoX/Y, no qual X representa o número de clones únicos e Y representa o númerode clones que se ligam especificamente ao DR5 humano ou HER-2 humano.Clones específicos são identificados como aqueles que apresentam umaligação ao DR5 humano ou HER-2 humano, pelo menos, dez vezes maior(baseado no sinal de ELISA em leitura a 450nm) do que a ligação a albuminado soro bovino (BSA).

A Figura 11A exibe as seqüências de CDRH1, CDRH2, CDRH3 eCDRL3 para 106 clones que se ligam ao HER-2 humano. A Figura 11B exibeos resultados do ensaio de ELISA para cada um dos clones estabelecidos naFigura 11A. Números em negrito indicam uma ligação forte (sinal de 2 a 10).

A Figura 12 exibe as seqüências de aminoácidos para CDRL3,CDRH1, CDRH2 e CDRH3 de ligantes específicos para o HER-2 humano comregiões isoladas curtas (por exemplo, 6-7 resíduos) de CDRH3 da bibliotecaYSGR-A-D, tal como descrito no Exemplo 2. As seqüências consenso sãoexibidas para CDRL3, CDRH1, e CDRH2. (Os números dos clonescorrespondem aos indicados na figura 11.)

A Figura 13 exibe as seqüências de aminoácidos para CDRH1,CDRH2, e CDRH3 de ligantes específicos para HER-2 humanos com umCDRH3 tendo 8 aminoácidos isolados da biblioteca YSGR-A-D tal comodescrito no Exemplo 2. As seqüências consenso são exibidas para CDRH1,CDRH2 e CDRH3. (Os números dos clones de 1-19 correspondem aosindicados na figura 11 da seguinte forma: 17, 97, 18, 19, 98, 99, 100, 20, 21,22, 23, 24, 101, 102, 25, 103,26, 27 e 28, respectivamente.)

Figura 14 mostra as seqüências de aminoácidos para CDRH1,CDRH2 e CDRH3 a partir dos ligantes específicos para HER-2 humano comregiões de comprimento médio de CDRH3 (por exemplo, cerca de 12-14aminoácidos) isolados das bibliotecas YSGR-A-D, tal como descrito noExemplo 2 . As seqüências consenso são exibidas para CDRH1, CDRH2, eCDRH3. As seqüências consenso são exibidas para CDRH3 pela transferênciade algumas das seqüências CDRH3 ao longo de dois aminoácidos, de modo aque a seqüência CDRH3 começa na posição 97 em vez da posição 95.

A Figura 15 exibe as seqüências de CDRL3, CDRH1, CDRH2 eCDRH3 de ligantes de DR5 humano, e o IC50 de alguns ligantes de DR5 humano.A Figura 16 exibe as seqüências de aminoácidos CDRL3,CDRH1, CDRH2 e CDRH3 a partir dos ligantes específicos para DR5 humanoisolado a partir das bibliotecas YSGR-A-D biblioteca, tal como descrito noExemplo 2. O IC5o dos clones par a ligação ao DR5 humano são exibidos. Osclones que reagem cruzadamente com o DR5 murino também sãoidentificados. As seqüências consenso são exibidas para CDRL3, CDRH1,CDRH2 e CDRH3. (Os números dos clones de 1-11 correspondem aosnúmeros dos clones 10, 11, 12, 8, 7, 13, 5, 9, 6, 15 e 14 da figura 15.)

A Figura 17 exibe a curva de ligação dos ligantes específicos parao DR5 humano isolado a partir da biblioteca YSGR-A-D. Alguns dos ligantesespecíficos também se ligam ao DR-5 murino.

A Figura 18 exibe um modelo 3D que ilustra o ligante Apo-2L, Oanticorpo e o anticorpo BFD1 se ligam ao receptor DR5. A região de ligaçãodos anticorpos se sobrepõe um ao outro. O sítio de ligação destes anticorpossão distintos da maior parte dos resíduos do sítio de ligação do ligante Apo-2L.

As Figuras 19A e 19B ilustram o esquema de aleatorização paracada posição CDR diversificada nas bibliotecas Binárias H3 (SAH3, SCH3,SFH3, SGH3, SIH3, SLH3, SNH3, SPH3, SRH3, STH3, SWH3 e SYH3), comodescrito no Exemplo 4. As posições de aminoácidos indicadas são numeradasde acordo com a numeração de Kabat.

As Figuras 20A-20L exibem os oligonucleotídeos mutagênicosutilizados na construção das bibliotecas Binárias H3 (SAH3 (Fig. 20A), SCH3(Fig. 20B), SFH3 (Fig. 20C), SGH3 (Fig. 20D), a SIH3 (Fig. 20E ), SLH3 (Fig.20F), SNH3 (Fig. 20G), SPH3 (Fig. 20H), SRH3 (Fig. 201), STH3 (Fig. 20J),SWH3 (Fig. 20K), e SYH3 (Fig. 20L)), Como descrito no Exemplo 4 (SEQ IDNos :618-788). A degenerescência equimolar do DNA são representadas nosconjuntos de códons (W=A/T, K=G/T, M=A/C, N=A/C/G/T, R=A/G, S=G/C,Y=T/C). Os conjuntos de códons são representados no código IUB.Figura 21A exibe as seqüências de aminoácidos CDRL3, CDRH1,CDRH2, e CDRH3 dos ligantes específicos para HER2 isolados a partir do poolde bibliotecas binárias H3 (SXH3), como descrito no Exemplo 5 (SEQ ID Nos:789-896). A Figura 21B exibe os resultados dos testes de ELISA para cada umdos clones estabelecidos na figura 21 A. O sombreamento escuro indica umforte caráter de ligação (sinal de 2 a 10).

A Figura 22A ilustra o esquema de aleatorização para cadaposição CDR diversificada nas bibliotecas Binárias de superfície (SY, SW eSF), como descrito no Exemplo 6. As posições de aminoácidos indicadas sãonumeradas de acordo com a numeração de Kabat.

A Figura 23 exibe os oligonucleotídeos mutagênicos utilizados naconstrução das bibliotecas Binárias de superfície (SY, SW e SF), como descritono Exemplo 6 (SEQ ID Nos: 1005-1013). A degenerescência equimolar do DNAsão representadas nos conjuntos de códons (W=A/T, K=G/T, M=A/C,N=A/C/G/T, R=A/G, S=G/C, Y=T/C). Os conjuntos de códons sãorepresentados no código IUB.

Figura 24A exibe as seqüências de aminoácidos CDRL3, CDRH1,CDRH2, e CDRH3 a partir de ligantes específicos de HER2 isolados de umpool de bibliotecas Binárias de superfície (SX-superfície), como descrito noExemplo 8 (SEQ ID Nos: 897-1004). A Figura 24B exibe os resultados dostestes de ELISA para cada um dos clones ilustrados na figura 24A. Osombreamento escuro indica um forte caráter de ligação (sinal de 2 a 10), Osombreamento claro indica fraca ligação (sinal de 0,25 a 2).

A Figura 25 representa graficamente a especificidade das Fabscontendo diferentes combinações binárias de aminoácidos (SenTyr, Ser:Trp,SenArg ou SenPhe) obtidas no presente a partir da biblioteca binaria SXH3 oubiblioteca binaria SX-superfície.

As Figuras 26A e 26B exibem a análises de ressonância porsuperfície plasmônica de ligações a partir de proteínas solúveis Fab de trêsclones de ligantes de HER2 (Clone B1L, clone G54 e clone YSGR-A-42) para aHER2 imobilizada. O clone B1L teve um ka de 1,9 x 106 M"1 S"1, um kdde 1,7 x10"3 S"1 e um KD de 890 nM. O clone G54 teve um ka de 2,0 x 105 M"1 S"1, um kdde 2,2 x 10"3 S~1 e um Kd de 11 nM. O clone YSGR-A-42 teve um ka de 2,7 x106 M-1S"1, um Kdde 1,5 x 10"3 s\ e um KD de 570 pM.

A Figura 27 exibe os resultados das análises por citometria defluxo da ligação dos Fabs anti-HER2 isolados de cada uma das bibliotecasYSGR (clone A-42), SX-superfície (clones G37 e G54), e SXH3 (clone B1L)para células NR6 ou H2NR6-4D5, tal como descrito no Exemplo 7.

Figura 28 exibe as seqüências para CDRH1, CDRH2, CDRH3 eCDRL3 para cada um dos IgGs ligantes de HER2 B1I, G37, G54, YSGR-A-42,YSGR-A-27, B27, G43 e YSGR-D-104. A Figura 28 também mostra os valoresda IC5o para a versão Fab de cada clone.

A Figura 29 exibe os resultados dos ensaios de ligação porcompetição descritos no Exemplo 7 para determinar a capacidade de cada umdos IgGs específicos para HER-2 indicados de competir para a ligação aoHER2 com Omnitarg, Herceptin e cada um dos outros IgGs.

Modos de Condução da Invenção

A invenção fornece novos, métodos não convencionais, muitosimplificados e flexíveis para diversificar seqüências CDR (incluindoseqüências de domínio variável de anticorpos) e bibliotecas que compreendemuma multiplicidade e geralmente uma grande multiplicidade de CDRsdiversificados (incluindo seqüências de domínio variável de anticorpos). Taisbibliotecas fornecem bibliotecas combinatórias úteis para, por exemplo,selecionar e/ou rastrear clones de anticorpos sintéticos com atividadesdesejáveis tais como, afinidade de ligação e afinidade de avidade. Estasbibliotecas são úteis para a identificação de seqüências polipeptídicas deimunoglobulinas que são capazes de interagir com qualquer um de uma amplavariedade de antígenos alvo. Por exemplo, muitas bibliotecas compreendendopolipeptídeos da imunoglobulina da invenção, expressa em exibição por fagosé particularmente útil para, e fornecer uma produção elevada, eficiente e emsistemas automatizados, de seleção e/ou rastreio de moléculas ligantes aoantígeno de interesse. Os métodos da invenção são concebidos para fornecerligantes de alta afinidade aos antígenos alvos com alterações mínimas parauma molécula fonte ou modelo e fornece um bom rendimento de produçãoquando o anticorpo ou fragmento ligante ao antígeno são produzidos emcultura de células.

Os Métodos e composições da invenção fornecem inúmerasvantagens adicionais. Por exemplo, seqüências variantes de CDRrelativamente simples podem ser gerados, usando a um conjunto de códonsque codifica um número restrito de aminoácidos (ao contrário da abordagemconvencional de utiliza um conjunto de códons para codificar o número máximode aminoácidos), apesar de manter diversidade suficiente de uma únicaseqüência de ligação ao alvo. A natureza simplificada (e em geral relativamentede menor dimensão) das seqüências geradas de acordo com a invençãopermite uma diversificação adicional em uma população ou subpopulaçãodesta, que foi identificada por possuir as características desejadas.

A natureza simplificada das seqüências dos ligantes para oantígeno alvo obtidos pelos métodos da invenção deixa um espaçosignificativamente maior para modificações adicionais nas seqüências e assimalcançar os resultados desejados. Por exemplo, a seqüência dessasmodificações é realizada rotineiramente por métodos de maturação porafinidade, humanização e etc. Pela diversificação baseada em um conjunto decódons restrito que codificam apenas um número limitado de aminoácidos,torna-se possível atingir diferentes epítopos utilizando diferentes conjuntos decódons restritos, proporcionando, assim, ao técnico do assunto um maiorcontrole da diversificação, em comparação com procedimentos dealeatorização baseadas em um número máximo de aminoácidos. Outravantagem em utilizar um conjunto de códons restrito é que podem sereliminados aminoácidos indesejáveis, por exemplo, a metionina ou códons deparada, melhorando assim a qualidade total e a produtividade da biblioteca.Além disso, em alguns casos, pode ser desejável limitar a diversidadeconformacional dos ligantes potenciais. Métodos e composições da invençãoproporcionam a flexibilidade necessária para se atingir este objetivo. Porexemplo, a presença de determinados aminoácidos, tais como a tirosina, emuma seqüência resulta em menos conformações rotacionais.

Definições

Os aminoácidos são representados neste documento tanto comopelo código de uma letra como pelo código de três letras ou ambos.

O termo "purificação por afinidade" descreve a purificação de umamolécula baseada na atração específica ou ligação da molécula a umasubstância química ou parceiro de ligação para formar uma combinação oucomplexo que permite com que a molécula seja separada das impurezas,permanecendo ligada ou atraída a molécula de ligação.

O termo "anticorpo" é utilizado no sentido mais amplo e incluiespecificamente anticorpos monoclonais (incluindo anticorpos antagonistas eagonistas), composições de anticorpos com especificidade poliepitópica,anticorpos maturados por afinidade, anticorpos humanizados, anticorposquiméricos bem como fragmentos ligantes a antígenos, por exemplo, Fab,F(ab')2, scFv e Fv, desde que exibam a atividade biológica desejada. Em umexemplo de realização, o termo "anticorpos" inclui também os anticorposhumanos. Como utilizado no presente, "domínio variável de anticorpo" refere-se às porções de cadeias leves e pesadas de moléculas de anticorpos queincluem seqüências de aminoácidos de regiões de determinação decomplementaridade (CDR, por exemplo, CDR1, CDR2 e CDR3), e regiõesdenominadas regiões estruturais (FR). Vh refere-se ao domínio variável dacadeia pesada. Vi. refere-se ao domínio variável da cadeia leve. De acordo comas composições e os métodos utilizados na presente invenção, as posições deaminoácido atribuídas aos CDRs e FRs pode ser definidas de acordo comKabat (Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes ofHealth, Bethesda, 1987 e 1991)). A numeração dos aminoácidos de anticorposou fragmentos de anticorpos ligantes de antígenos também é numerada deacordo com a numeração de Kabat.

Como utilizado no presente, o termo "região de determinação decomplementaridade" (CDRs; ou seja, CDR1, CDR2, e CDR3) refere-se apresença de resíduos de aminoácido um domínio variável de anticorpo que sãonecessários para a ligação ao antígeno. Cada domínio variável tipicamente temtrês regiões CDR identificadas como CDR1, CDR2 e CDR3. Cada região dedeterminação de complementaridade pode constar de resíduos de aminoácidosde uma "região de determinação de complementaridade" como definido porKabat (ou seja, resíduos 24- 34 (L1), 50- 56 (L2) e 89- 97 (L3) no domíniovariável de cadeia leve e 31-35 (H1), 50-65 (H2) e 95-102 (H3) no domíniovariável de cadeia pesada; Kabat ei al, Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest, 5a Ed. National Institutes of Health, Bethesda, MD 1991) e/ou osresíduos de uma "alça hipervariável" (ou seja, os resíduos 26-32 (L1), 50-52(L2) e 91-96 (L3) no domínio variável de cadeia leve e 26-32 (H1), 53-55 (H2) e96-101 (H3) no domínio variável de cadeia pesada; Chothia e Lesk, J. Mol. Biol.196: 901-917 (1987)). Em alguns casos, uma região de determinação decomplementaridade pode incluir aminoácidos a região CDR definida de acordocom Kabat e um alça hipervariável. Por exemplo, o CDRH1 da cadeia pesadado anticorpo 4D5 inclui aminoácidos de 26 a 35. A seqüência consenso paraCDRL1 (de acordo com a definição de Kabat) no anticorpo 4D5 é R-A-S-Q-D-V-N-T-A-V-A (SEQ ID No: 29). A seqüência consenso para CDRL2 (de acordocom a definição de Kabat) no anticorpo 4D5 é S-A-S-S-L-Y-S (SEQ ID No: 30).

"Região estrutural" (no presente "FR") são resíduos do domíniovariável que não são resíduos do CDR. Cada domínio variável geralmente temquatro FRs identificados como FR1, FR2, FR3 e FR4. Se os CDRs sãodefinidos de acordo com Kabat, os resíduos da cadeia leve de FR são posicionadosa cerca dos resíduos 1-23 (LCFR1), 35^9 (LCFR2), 57-88 (LCFR3) e 98-107(LCFR4) e os resíduos da cadeia pesada de FR são posicionados a cerca dosresíduos 1-30 (HCFR1), 36^9 (HCFR2), 66-94 (HCFR3) e 103-113 (HCFR4). Emalguns casos, quando os CDRs compreendem aminoácidos tanto dos CDRs comodefinido por Kabat quanto da alça hipervariável, os resíduos FR podem serajustados em conformidade. Por exemplo, quando CDRH1 inclui os aminoácidosH26-H35, os resíduos da cadeia pesada FR1 estão nas posições 1-25 e osresíduos FR2 nas posições 36-49.

Tal como utilizado no presente, "conjunto de códons" refere-se aum conjunto de diferentes seqüências de três nucleotídeos utilizados paracodificar o variante de aminoácidos pretendido. Um conjunto deoligonucleotídeos pode ser sintetizado, por exemplo, por síntese em fasesólida, incluindo seqüências que representam todas as combinações possíveisde tríades de nucleotídeos fornecidos pelo conjunto de códons que irá codificaro grupo de aminoácidos desejado. Uma forma padrão de designação de códoné a do código EJB, que é conhecida na arte e descrita no presente. Umconjunto códons é normalmente representado por 3 letras maiúsculas emitálico, por exemplo, NNK, A/A/S, XYZ, DVK e similares. Síntese dosoligonucleotídeos com a "degenerescência" de nucleotídeos selecionados emdeterminadas posições é bem conhecida no estado da técnica, por exemplo, aabordagem TRIM (Knappek et a/.; J. Mol. Biol. (1999), 296:57-86); Garrard &Henner , Gene (1993), 128:103). Tais conjuntos de oligonucleotídeos comdeterminados conjuntos de códons podem ser sintetizados usandosintetizadores de ácidos nucléicos comerciais (disponível por, por exemplo,

Applied Biosystems, Foster City, Califórnia), ou podem ser obtidos jcomercialmente (por exemplo, pela Life Technologies, Rockville, MD). Por isso, 1um conjunto de oligonucleotídeos sintetizados tendo um conjunto de códonsespecífico irá incluir normalmente uma variedade de oligonucleotídeos comseqüências diferentes, as diferenças estabelecidas pelo conjunto de códondentro da seqüência global. Oligonucleotídeos, tal como utilizado na presenteinvenção, têm seqüências que permitem a hibridização de um molde de umácido nucléico do domínio variável e também pode, mas não necessariamente,incluir locais úteis para o uso de enzimas de restrição, por exemplo, para finsde clonagem.

O termo "conjunto de códons restrito", e variações deste, comoutilizados no presente referem-se a um conjunto de códons que codifica umnumero muito mais limitado de aminoácidos do que conjuntos de códonsnormalmente utilizados nos métodos de produção de diversidade deseqüências conhecidos na arte. Em um aspecto da invenção, os conjuntos decódons restritos utilizados para codificar a diversidade de seqüência de 2 a 10,de 2 a 8, de 2 a 6, de 2 a 4 ou apenas 2 aminoácidos. Em alguns exemplos derealização, um conjunto de códons restrito utilizados para diversificação daseqüência codifica 2, mas pelo menos 10 ou menos, 8 ou menos, 6 ou menos,4 ou menos aminoácidos. Em um exemplo típico, um conjunto tetranomial decódons é utilizado. Exemplos incluem conjuntos de tetranomiais de códonsincluem RMC, RMG, RRC, RSA, MKC, YMT, RST, KMT, SRC, MRTe WMT, talcomo são conhecidos no estado da técnica. Em outro exemplo característico,são utilizados conjuntos de códons binomiais. Exemplos de conjuntos decódons binomiais incluem TMT, KAT, YAC, WAC, TWC, TYT, YTC, WTC, KTT,YCT, MCG, SCG, MGC, SGT, TAB, GKT e GYT. A determinação dos códonsrestritos adequados, bem como a identificação específica dos aminoácidoscodificados por um códon restrito específico, é bem conhecida e evidente paraum especialista no assunto. As determinações dos conjuntos de aminoácidosadequados a serem utilizados para a diversificação de uma seqüência CDRpode ser empírica e/ou guiada por critérios conhecidos no estado da técnica(por exemplo, a inclusão de uma combinação de tipos de aminoácidoshidrofóbicos e hidrofílicos, etc).

Um fragmento "Fv" é um fragmento de anticorpo que contém umsítio de reconhecimento e de ligação de antígenos completo. Esta regiãoconsiste de um dímero de domínio variável de cadeia pesada e um de cadeialeve em associação firme que pode ser covalente na natureza, por exemplo, noscFv. É nesta configuração que as três CDR de cada domínio variávelinteragem para definir um sítio de ligação de antígenos sobre a superfície dodímero VH-VL. Coletivamente, as seis regiões hipervariáveis conferemespecificidade de ligação de antígenos ao anticorpo. Entretanto, mesmo umdomínio variável isolado (ou a metade de um Fv que compreende apenas trêsregiões hipervariáveis específicas para um antígeno) possui a capacidade dereconhecer e unir o antígeno, embora em afinidade mais baixa que o sítio deligação completo.

O fragmento de "Fab" contém o domínio constante e variável dacadeia leve e o primeiro domínio constante (CH1) da cadeia pesada. Osfragmentos de anticorpos F(ab')2 constam de pares de fragmentos de Fab' quesão geralmente ligados por ligação covalente próximos a sua região carbóxi-terminal pelas cisternas da região de articulação entre eles. Outrosacoplamentos químicos de fragmentos dos anticorpos também são conhecidosno estado da técnica.

Fragmentos dos anticorpos "Fv de fita simples" ou "scFv"compreendem os domínios Vh e Vl do anticorpo, no qual esses domínios estãopresentes em uma única cadeia de polipeptídeo. Geralmente, o polipeptídeo Fvcompreende adicionalmente um ligante de polipeptídeo entre os domínios VH eVl que permite que o scFv forme a estrutura desejada para a ligação aosantígenos. Para uma revisão de scFv, vide, Plückthun em The Pharmacology ofMonoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg e Moore Eds., Springer-Verlag,Nova Iorque, págs. 269-315 (1994).

O termo "diacorpos" designa pequenos fragmentos de anticorposcom dois sítios de ligação de antígenos, que compreendem um domíniopesado variável (VH) conectado a um domínio leve variável (VL) na mesmacadeia de polipeptídeos (Vh e Vl). Utilizando um ligante que é curto demaispara permitir o pareamento entre os dois domínios sobre a mesma cadeia, osdomínios são forçados a se parear com os domínios complementares de outracadeia e criar dois sítios de ligação de antígenos. Os diacorpos são descritosmais completamente, por exemplo, na EP 404.097, WO 1993/11161 e emHollinger et ai, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 90: 6444-6448 (1993).

A expressão "anticorpos lineares" refere-se aos anticorposdescritos em Zapata et ai., Protein Eng., 8(10): 1057-1062 (1995).Resumidamente, esses anticorpos incluem um par de segmentos Fv tandem(Vh-Ch1-Vh-Ch1), que, juntamente com os polipeptídeos da cadeia levecomplementar, forma um par de regiões de ligação ao antígeno. Anticorposlineares podem ser mono ou biespecíficos.

A expressão "anticorpo monoclonal", da forma utilizada nopresente, refere-se a um anticorpo obtido a partir de uma população deanticorpos substancialmente homogêneos, ou seja, os anticorpos individuaisque compreendem a população são idênticos, exceto por possíveis mutaçõesde ocorrência natural que podem estar presentes em quantidades menores. Osanticorpos monoclonais são altamente específicos, sendo dirigidos contra umúnico sítio antigênico. Além disso, ao contrário das preparações dos anticorpospoliclonais que incluem diferentes anticorpos dirigidos a diferentesdeterminantes (epítopos), cada anticorpo monoclonal é dirigido a um únicodeterminante sobre o antígeno. O adjetivo "monoclonal" indica o caráter doanticorpo como sendo obtido a partir de uma população de anticorpossubstancialmente homogênea e não deve ser considerado como exigindo aprodução do anticorpo por meio de qualquer método específico. Os anticorposmonoclonais a serem utilizados de acordo com a presente invenção podem serpreparados, por exemplo, por meio do método de hibridoma descrito emprimeiro lugar por Kohler et al, Nature, 256: 495 (1975), ou podem serfabricados por meio de métodos de DNA recombinante (vide, por exemplo, aPatente US 4.816.567). Os "anticorpos monoclonais" podem também serisolados a partir de bibliotecas de anticorpos de fagos, utilizando as técnicasdescritas, por exemplo, em Clackson et al, Nature, 352: 624-628 (1991) eMarks et al, J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991).

Os anticorpos monoclonais do presente incluem especificamenteanticorpos "quiméricos" (imunoglobulinas), em que uma parte da cadeia levee/ou pesada é idêntica ou homóloga as seqüências correspondentes emanticorpos derivados de uma espécie específica ou pertencentes a uma classeou subclasse específica de anticorpos, enquanto o restante da(s) cadeia(s) éidêntico ou homólogo as seqüências correspondentes em anticorpos derivadosde outras espécies ou pertencentes à outra classe ou subclasse de anticorpos,bem como fragmentos desses anticorpos, desde que exibam a atividadebiológica desejada (Patente US 4.816.567; e Morrison er al, Proc. Natl. Acad.Sei. USA, 81: 6851-6855 (1984)).

As formas "humanizadas" dos anticorpos não humanos (porexemplo, murinos) são anticorpos quiméricos que contêm uma seqüênciamínima derivada de imunoglobulina não humana. Na maior parte, os anticorposhumanizados são imunoglobulinas humanas (anticorpo receptor), nas quais osresíduos de uma região hipervariável do paciente são substituídos por resíduosda região hipervariável de uma espécie não humana (anticorpo doador) talcomo camundongo, rato, coelho ou primata não humano que possui aespecificidade, afinidade e capacidade desejadas. Em alguns casos, osresíduos da região estrutural {framework) (FR) da imunoglobulina humana sãosubstituídos por resíduos não humanos correspondentes. Além disso, osanticorpos humanizados podem compreender resíduos que não sãoencontrados no anticorpo receptor nem no anticorpo doador. Essasmodificações são feitas para refinar ainda mais o desempenho do anticorpo.Geralmente, o anticorpo humanizado compreenderá substancialmente todosdentre pelo menos um, tipicamente dois domínios variáveis, em que todos ousubstancialmente todas as alças hipervariáveis correspondem aos de umaimunoglobulina não humana e todas ou substancialmente todas as regiões FRssão as de uma seqüência de imunoglobulina humana. O anticorpo humanizadotambém compreenderá opcionalmente pelo menos uma parte da regiãoconstante de imunoglobulina (Fc), tipicamente a de imunoglobulina humana.Para detalhes adicionais, vide Jones et al, Nature 321: 522-525 (1986);Riechmann et al, Nature 332: 323-329 (1988); e Presta, Curr. Op. Struct. Biol.2:593-596 (1992).

"Anticorpo dependente de espécies" é aquele que tem uma forteafinidade de ligação para um antígeno de uma primeira espécie de mamíferodo que para um antígeno homólogo de uma segunda espécie de mamífero.Normalmente, os anticorpos dependentes de espécies "ligam-seespecificamente" a um antígeno humano (isto é, tem, por exemplo, umaafinidade de ligação (Kd) de valor não superior a 1 x 10~7 M, e não mais de 1 x10"8 M, e por exemplo não mais de 1 x 10"9 M), mas tem uma afinidade deligação a um antígeno homólogo de uma segunda espécie de mamíferos nãohumanos que seja, pelo menos, cerca de 50 vezes, ou, pelo menos, 500 vezes,ou pelo menos 1000 vezes, mais fraca do que o sua afinidade de ligação parao antígeno humano. Os anticorpos dependentes de espécies pode ser qualquerum dentre os vários tipos de anticorpos, tal como definido anteriormente, maspreferencialmente é um anticorpo humanizado ou humano.

Tal como utilizado no presente, "anticorpo mutante" ou "anticorpovariante" refere-se a uma seqüência variante de aminoácido dos anticorposdependentes de espécies em que um ou mais dos resíduos de aminoácido dosanticorpos dependentes de espécies foram alterados. Tais mutantes têmnecessariamente menos de 100% de identidade de seqüência ou semelhançacom os anticorpos dependentes de espécies. Em um exemplo de realização, oanticorpo mutante terá uma seqüência de aminoácidos que possuí pelo menos75% de identidade de seqüência do aminoácido ou semelhança com aseqüência de aminoácidos, tanto do domínio variável de cadeia pesada quantodo domínio variável de cadeia leve dos anticorpos dependentes de espécies,por exemplo, pelo menos, 80 %, por exemplo, pelo menos, 85%, por exemplo,pelo menos, 90% e, por exemplo, pelo menos, 95%. Identidade ousemelhança com relação a essa seqüência é definida no presente como aporcentagem de resíduos de aminoácido na seqüência candidata que sãoidênticas (ou seja, mesmo resíduo) ou similares (ou seja, resíduos deaminoácidos provenientes do mesmo grupo com base nas propriedadescomuns de cadeia lateral, vide abaixo) com os resíduos de anticorposdependentes de espécies, após o alinhamento das seqüências e introdução degaps, se necessário, para alcançar a porcentagem máxima de identidade naseqüência. Nenhum N-terminal, C-terminal, extensões internas, deleções ouinserções na seqüência do anticorpo fora do domínio variável deve serinterpretado como uma seqüência que afeta a identidade ou similaridade.

Um anticorpo "isolado" é aquele que tenha sido identificado,separado e/ou recuperado a partir de um componente do seu ambiente natural.Os componentes contaminantes do seu ambiente natural são materiais queinterfeririam com utilizações em diagnóstico ou terapêuticos para o anticorpo epodem incluir enzimas, hormônios e outros solutos proteináceos ou nãoproteináceos. Em realizações preferidas, o anticorpo será purificado (1) atémais de 95% em peso do anticorpo, conforme determinado por meio do métodode Lowry, e, de maior preferência, mais de 99% em peso; (2) até o grausuficiente para a obtenção de pelo menos quinze resíduos de seqüência decentrifugação (spinning cup); ou (3) até a homogeneidade, por meio de SDS-PAGE, sob condições redutoras ou não redutoras, utilizando azul deCoomassie ou, preferencialmente, coloração de prata. O anticorpo isoladoinclui o anticorpo in situ em células recombinantes, desde que pelo menos umcomponente do ambiente natural do anticorpo não esteja presente.

Normalmente, entretanto, o anticorpo isolado será preparado por meio de pelomenos uma etapa de purificação.

O termo "antagonista" é utilizado no sentido amplo da palavra einclui qualquer molécula que bloqueia, iniba ou neutralize completamente ouparcialmente uma ou mais atividade biológica do antigeno alvo descrito nopresente (por exemplo, DR5 e HER-2) in vitro, in sito ou in vivo. Exemplos detais atividades biológicas do DR5 incluem a ligação ao Apo2L/TRAIL ao DR5,indução da apoptose, bem como as novas atividades relatadas na literatura.Exemplos de tais atividades biológicas do HER-2 incluem a ligação de ligantes,tais como, heregulinas, fosforilação de tirosina da HER-2, indução daproliferação, bem como a indução da apoptose, bem como novas atividadesrelatadas na literatura. Um antagonista pode ter função de forma direta ouindireta. Por exemplo, o antagonista pode ter a função de bloquear parcial outotalmente, inibir ou neutralizar uma ou mais atividades biológicas de umligante de uma molécula alvo, de maneira in vitro, in situ, ou in vivo, comoresultado da sua ligação direta à molécula alvo. O antagonista pode tambémter função indireta para bloquear parcial ou totalmente, inibir ou neutralizar umaou mais atividades biológicas da molécula alvo, in vitro, in situ, ou in vivo, comoum resultado de, por exemplo, bloquear ou inibir outra molécula efetora. Amolécula antagonista pode incluir uma atividade antagonista "dupla" no qual amolécula é capaz de bloquear parcial ou totalmente, inibindo ou neutralizandouma atividade biológica da molécula alvo.

O termo "agonista" é utilizado no sentido amplo da palavra e incluiqualquer molécula que melhore, estimule ou ative completamente ouparcialmente uma ou mais atividade biológica do antígeno alvo descrito nopresente (por exemplo, DR5 e HER-2) in vitro, in sito ou in vivo. Exemplos detais atividades biológicas do DR5 incluem a ligação ao Apo2L e apoptose, bemcomo as novas atividades relatadas na literatura. Exemplos de tais atividadesbiológicas do HER-2 incluem a ligação de ligantes, tais como, heregulinas,fosforilação de tirosina do receptor induzindo a proliferação, a apoptose, bemcomo novas atividades relatadas na literatura. Um agonista pode ter função deforma direta ou indireta. Por exemplo, o agonista pode ter a função demelhorar, estimular ou ativar parcial ou totalmente uma ou mais atividadesbiológicas de um ligante de uma molécula alvo, de maneira in vitro, in situ, ou invivo, como resultado da sua ligação direta à molécula alvo que causa aativação do receptor ou transdução de sinal. O agonista pode também terfunção indireta para melhorar, estimular ou ativar parcial ou totalmente uma oumais atividades biológicas da molécula alvo, in vitro, in situ, ou in vivo, porexemplo, estimulando outra molécula efetora que culminará na ativação damolécula alvo ou transdução de sinal. Contempla-se que um agonista podeatuar como um acentuador que funciona indiretamente para melhorar ouaumentar a ativação ou atividade da molécula alvo. Por exemplo, um agonistapode melhorar a atividade endógena do Apo-2L em um mamífero. Isto poderiaser obtido, por exemplo, pela pré-complexando DR5 ou estabilizandocomplexos dos ligantes respectivos do receptor DR5.

"Célula", "linhagem celular" e "cultura celular" são utilizadas deforma intercambiável e essas denominações incluem todas as progênies deuma célula ou cultura celular. Desta forma, as expressões "transformadas" e"células transformadas" (ou células transformadas) incluem a célula primária eas culturas dela derivadas sem considerar a quantidade de transferências.

Também se compreende que toda a prole pode não ser precisamente idênticano contexto do DNA, devido a mutações deliberadas ou inadvertidas. Asprogênies mutantes que têm a mesma função ou atividade biológicaselecionada para a célula originalmente modificada estão incluídas. Quandodesignações diferentes são pretendidas, isto será claro a partir do contexto.

A expressão "seqüências de controle" designa seqüências deDNA necessárias para a expressão de uma seqüência de codificaçãooperacionalmente ligada em um organismo hospedeiro específico. Asseqüências de controle que são apropriadas para procariotos inclue m, porexemplo, um promotor, opcionalmente uma seqüência operadora, um sítio deligação de ribossomos e possivelmente outras seqüências ainda poucocompreendidas. As células eucarióticas são conhecidas por utilizarempromotores, sinais de poliadenilação e acentuadores (enhancers).

O termo "proteína da cápside" refere-se a uma proteína, ou pelomenos uma parte da qual está presente na superfície da partícula do vírus. Apartir de uma perspectiva funcional, uma proteína da cápside é qualquerproteína, que está associada com uma partícula do vírus durante o processo demontagem viral na célula hospedeira, e continua associado com o vírusmontado até que ele infecte outra célula hospedeira. A proteína da cápsidepode ser a proteína principal da cápside (major) ou pode ser a proteínasecundária da cápside (minor). A proteína principal "major" é geralmente umaproteína da cápside que está presente na cápside viral em pelo menos cercade 5, a pelo menos 7, ou no mínimo 10 cópias das proteínas ou mais. Aproteína principal da cápside viral pode estar presente em dezenas, centenasou mesmo milhares de cópias por virião. Um exemplo de uma proteína principalda cápside é a proteína do fago filamentoso P8.

O "limite de detecção" de uma entidade química, em umdeterminado ensaio é a concentração mínima da entidade que pode serdetectada acima do nível de fundo para essa análise. Por exemplo, no ELISAcom fago o "limite de detecção" para uma determinada exibição de umfragmento ligante de antígeno específico por fago é a concentração do fago noqual o fago específico produz um sinal no ELISA abaixo do produzido por umfago controle que não exiba o fragmento de ligação ao antígeno.

"Receptor DR5" ou "DR5" quando utilizado no presente englobaseqüências nativas do receptor e seqüências variantes do receptor. Estestermos abrangem receptores DR5 expressos em uma variedade de mamíferos,incluindo seres humanos. O receptor DR5 pode ser expresso endogenamentecomo ocorre naturalmente em uma variedade linhagens de tecidos humanos,ou podem ser expressos por métodos sintéticos ou recombinantes. Uma"seqüência nativa do receptor DR5" compreende um polipeptídeo com amesma seqüência de aminoácidos de um receptor DR5 derivado da natureza.Assim, uma seqüência nativa do receptor DR5 pode ter a seqüência deaminoácidos que ocorrem naturalmente no receptor DR5 de qualquermamífero. Tais seqüências de receptor DR5 nativas podem ser isoladas danatureza ou podem ser produzidas por meios sintéticos ou recombinantes. Otermo "seqüência nativa do receptor DR5" engloba especificamente formas queocorrem naturalmente secretadas ou eliminadas (por exemplo, uma formasolúvel, contendo, por exemplo, uma seqüência do domínio extracelular),formas variantes que ocorrem naturalmente (por exemplo, formas co splicingalternativos) e variantes alélicos naturais. Variantes do receptor podem incluirfragmentos ou mutantes por deleção das seqüências nativas do receptor DR5.A seqüência de 411 aminoácidos do DR5 humano é demonstrada na Tabela 1e é a seqüência da Figura 3A, assim como publicado no documento WO98/51793 em 19 de novembro de 1998. Um splicing transcricional do DR5variante humano é conhecido no estado da técnica. Este splice variante deDR5 codifica a seqüência de 440 aminoácidos do DR5 humano demonstradonas figuras 3B e 3C conforme publicado no documento WO 98/35986 em 20 deagosto de 1998. As seqüências de polipeptídeo do DR5 murino e um domínioextracelular do DR5 também são apresentados na Tabela 1 abaixo.

Atividades biológicas do DR5 incluem (a) capacidade de induzirou estimular ou sinalizar a apoptose em, pelo menos, um tipo de células decâncer de mamíferos ou células infectadas por vírus in vivo ou ex vivo, (b)capacidade de se ligar ao polipeptídeo Apo2L/TRAIL de ocorrência natural.Ensaios para determinar a atividade biológica, como a apoptose pode serrealizado por meio de métodos conhecidos na arte, como a fragmentação doDNA (vide, por exemplo, Marsters et ai, Curr. Biology, 6: 1669 (1996)),inativação da caspase, ligação ao DR5 (vide., por exemplo, o documento WO98/51793, publicado em 19 de Novembro, 1998. Os termos "apoptose" e"atividade apoptótica" é utilizada no sentido amplo, e referem-se à morte celularde forma ordenada ou controlada em mamíferos que, geralmente, éacompanhada por um ou mais eventos celulares característicos, incluindo acondensação do citoplasma, perda das microvilosidades da membranaplasmática, segmentação do núcleo, degradação do DNA cromossomico ouperda da função mitocondrial. Esta atividade pode ser determinada emensurada, por exemplo, por ensaios de viabilidade celular (tal como coloraçãopor Alamar blue ou ensaios MTT), análise por FACS, ativação da caspase,fragmentação do DNA (vide, por exemplo, Nicoletti et a/., J. Immunol. Methods,139:271-279 (1991), e polimerase poli-ADP ribose, "PARP", ensaio de clivagemconhecidos no estado da técnica.

"Anticorpo para receptor de DR5", "anticorpos DR5", ou"anticorpos anti-DR5" são utilizados em um sentido amplo, para se referir aanticorpos que se ligam a pelo menos uma forma de um receptor DR5.Opcionalmente o anticorpo DR5 é fundido ou ligado a uma seqüência oumolécula heteróloga. De preferência a seqüência heteróloga permite ou ajuda oanticorpo formar complexos oligoméricos ou de ordem superior.

Opcionalmente, o anticorpo DR5 se liga a receptores DR5 mas não se liga oureage cruzadamente com qualquer receptor Apo-2L adicional (por exemplo,RP4, DcRI, ou DcR2). Opcionalmente, o anticorpo é um agonista da sinalizaçãoda atividade de DR5. Opcionalmente, o anticorpo DR5 da invenção liga-se aum receptor DR5 em uma concentração entre 0,1 nM a 20 mM, comomensurado em um ensaio de ligação BlAcore (tal como descrito no presente)Opcionalmente, alguns exemplos de realização, os anticorpos da invençãoexibem um valor de IC50 de cerca de 1 nM a cerca de 20 nM como mensuradoem um teste de ligação (como, por exemplo, ELISA com fagos, como descritonos exemplos abaixo).

Os termos "Apo2l_/TRAIL", "Apo-2L", e "TRAIL" são utilizados nopresente para se referir a uma seqüência de polipeptídeos no qual inclui osresíduos de aminoácidos 114-281, inclusive os resíduos, 95-281, inclusive osresíduos, 92-281, inclusive os resíduos, 91-281, inclusive os resíduos, 41-281,inclusive os resíduos, 15-281, inclusive os resíduos, 1-281, da seqüência deaminoácidos exibida na Tabela 1, bem como os fragmentos biologicamenteativos, variantes com deleções, inserções ou substituições das seqüênciasreferidas acima. Os polipeptídeos da Apo-2L podem ser codificados pelasseqüências nucleotídicas nativas como descrito e apresentado na Figura 1 dodocumento WO2005100399.

Uma "proteína de fusão" e "polipeptídeo de fusão" referem-se aum polipeptídeo que possuí duas porções ligadas covalentemente entre si,onde cada uma das porções é um polipeptídeo que possui uma propriedadediferente. A propriedade pode ser uma propriedade biológica, como a atividadein vitro ou in vivo. A propriedade também pode ser uma simples propriedadefísica ou química, tal como ligação a um antígeno alvo, uma reação de catalisee etc. As duas porções podem ser diretamente ligadas por uma única ligaçãopeptídica ou através de um peptídeo ligante contendo um ou mais resíduos deaminoácidos. Geralmente, as duas porções e o ligante estarão no quadro deleitura juntos. Em certos exemplos de realização, as duas porções dopolipeptídeo ou são obtidos de polipeptídeos diferentes ou heterólogos.

"DNA heterólogo" é qualquer DNA que é introduzida em umacélula hospedeira. O DNA pode ser derivado de diversas fontes, incluindo DNAgenômico, cDNA, DNA sintético e fusões ou combinações destes. O DNA podeincluir DNA de uma mesma célula ou tipo celular como células hospedeiras oureceptoras ou DNA de tipos de células diferentes, por exemplo, de ummamífero ou vegetal. O DNA pode, opcionalmente, incluir um gene marcadorou de seleção, por exemplo, genes que conferem resistência aos antibióticos,genes que conferem resistência à temperatura e etc.

Tal como utilizado no presente, "posição altamente diversificada"refere-se a posição de um aminoácido localizado nas regiões variáveis decadeias leves e pesadas que possui um número de aminoácidos diferentes naposição quando comparados com seqüências de aminoácidos ou fragmentosligantes ao antígeno conhecidos e/ou de ocorrência natural. As posiçõesaltamente diversificadas estão geralmente nas regiões CDR. Em um aspecto, acapacidade de determinar posições altamente diversificadas em anticorposconhecidos e/ou de ocorrência natural é facilitada pelos dados fornecidos porKabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes ofHealth, Bethesda, Md, 1987 e 1991). Um banco de dados baseado na Internetlocalizado no endereço http//:www.bioinf.org.uk.abs.structures.html ofereceuma extensa coleção e alinhamentos das seqüências de cadeia leve(http//:www.biomf.org.uk.abs.lc.aliqn) e cadeia pesada(http//:www.bioinf.orq.uk.abs.hc.aliqn) e facilita a determinação das posiçõesaltamente diversificadas, nestas seqüências. De acordo com a invenção, umaposição de aminoácido é altamente diversificada, se possuir cerca de 2 a 11, apartir de 4 a 9, e/ou cerca de 5 a 7 possíveis variações diferentes nas posiçõesdos resíduos de aminoácidos. Em alguns exemplos de realização, uma posiçãode aminoácido é altamente diversificada, se tiver, pelo menos, cerca de 2, pelomenos cerca de 4, pelo menos cerca de 6, e/ou, pelo menos cerca de 8possíveis variações diferentes nas posições dos resíduos de aminoácidos.

Tal como utilizado no presente, "biblioteca" refere-se a umavariedade de seqüências de anticorpos ou fragmentos de anticorpos (porexemplo, os polipeptídeos da invenção), ou os ácidos nucléicos que codificamessas seqüências, sendo estas seqüências diferentes na combinação devariantes de aminoácidos que são introduzidas nessas seqüências de acordocom os métodos da invenção.

"Ligação" é o processo de formação ligações de fosfodiésteresentre os dois fragmentos de ácidos nucléicos. Para a ligação dos doisfragmentos, as extremidades dos fragmentos devem ser compatíveis entre si.

Em alguns casos, as extremidades serão diretamente compatíveis após adigestão com endonucleases. No entanto, pode ser necessário primeiroconverter a extremidade escalonada comumente produzida após a digestãocom endonucleases para uma extremidade cega e torná-la compatível para aligação. Para produzir uma extremidade cega, o DNA é tratado em um tampãoadequado por, pelo menos, 15 minutos a 15 °C, com cerca de 10 unidades dofragmento Klenow da DNA polimerase I ou DNA polimerase T4, na presençados quatro desoxirribonucleotídeos trifosfatos. O DNA é então purificado porextração em fenol-clorofórmio e precipitação em etanol ou purificação por sílica.

Os fragmentos de DNA que serão ligados são colocados em uma solução comquantidades equimolares. A solução também irá conter ATP, tampão para ligase euma ligase como, por exemplo, T4 DNA ligase, cerca de 10 unidades por 0,5/ug deDNA. Se o DNA é ou está ligado em um vetor, o vetor é primeiro linearizado peladigestão com endonuclease(s) de restrição adequada(s). O fragmento linear é entãotratado com fosfatase alcalina bacteriana ou fosfatase alcalina do intestino bovinopara evitar auto ligação durante a etapa de ligação. Outros métodos são bemconhecidos no estado da técnica.

A "mutação" é uma deleção, inserção, ou substituição deum(alguns) nucleotídeo(s) em relação a uma seqüência nucleotídica dereferência como, por exemplo, uma seqüência do tipo selvagem.

A expressão anticorpo "natural" ou "naturalmente" da forma comoé utilizada no presente, refere-se aos anticorpos identificados a partir de umafonte não sintética, por exemplo, a partir de um antígeno diferenciadoespecífico de células B obtido ex vivo, ou sua linhagem de hibridoma celularcorrespondente, ou a partir de anticorpos obtidos do soro de um animal. Estesanticorpos podem incluir anticorpos produzidos em qualquer tipo de respostaimune, quer seja natural ou induzida de outra forma. Anticorpos naturaisincluem as seqüências de aminoácidos, e seqüências de nucleotídeos queconstituem ou codificam esses anticorpos, por exemplo, como identificado nobanco de dados de Kabat. Da forma como é aqui utilizado, anticorpos naturaissão diferentes de "anticorpos sintéticos", anticorpos sintéticos referem-se aseqüência de anticorpo que foram alteradas a partir de uma seqüência fonte oumodelo, por exemplo, através da substituição, deleção ou adição de umaminoácido, ou mais de um aminoácido, em uma determinada posição com umaminoácido diferente, os aminoácidos diferentes fornecem uma seqüência deanticorpo diferente a partir da seqüência de anticorpo fonte.

"Operacionalmente ligado" refere-se a um ácido nucléico significaque o ácido nucléico é colocado em relação funcional com outra seqüência deácido nucléico. O DNA para uma seqüência prévia ou líder de secreção, porexemplo, é operacionalmente ligado ao DNA que codifica um polipeptídeo casoeste seja expresso na forma de pré proteína que participa da secreção dopolipeptídeo; um promotor ou acentuador (enhancer) é operacionalmenteligado a uma seqüência de codificação caso afete a transcrição da seqüência;ou um sítio de ligação de ribossomos é operacionalmente ligado a umaseqüência de codificação caso seja posicionado de forma a possibilitar atradução. Geralmente, "operacionalmente ligado" indica que as seqüências deDNA ligadas são contíguas e, no caso do líder de secreção, contíguas e estãono quadro de leitura. Os acentuadores, entretanto, não necessitam sercontíguos. A ligação é realizada por meio de ligação em sítios de restriçãoconvenientes. Caso estes sítios não existam, adaptadores de oligonucleotídeossintéticos ou ligantes são utilizados de acordo com a prática convencional.

"Exibição por fagos" é uma técnica na qual polipeptídeosvariantes são exibidos como proteínas de fusão a pelo menos uma porção daproteína da cápside na superfície do fago, por exemplo, fago filamentoso,partículas. A utilidade da exibição por fagos reside no fato de que grandesbibliotecas de proteínas variantes aleatorizadas podem ser rapidamente eeficazmente classificadas para aquelas seqüências que se ligam a um antígenoalvo com alta afinidade. A exposição do peptídeo e da biblioteca de proteínapor fago tem sido utilizada para a triagem de milhões de polipeptídeos praselecionar aqueles com propriedades de ligação específicas. Métodos deexibição por fago polivalente foram utilizados para exibir pequenos peptídeosaleatorizados e pequenas proteínas através de fusões tanto com gene IIIquanto com o gene VIII do fago filamentoso. Wells e Lowman, Curr. Opin.Struct. Biol, 3:355-362 (1992), e as referências nele citada. Em uma exibiçãopor fago monovalente, uma biblioteca de proteína ou peptídeo é fundida comum gene III ou parte deste, e expresso em níveis baixos na presença do geneda proteína III do tipo selvagem de modo que as partículas do fago exibem umacópia ou nenhuma das proteínas de fusão. Os efeitos da avidade sãorelativamente reduzidos no fago polivalente de modo que a classificação é combase na afinidade intrínseca do ligante, e vetores de fagomídeos é utilizado, oque simplificará as manipulações do DNA. Lowman e Wells, Methods: Acompanion to Methods in Enzymology, 3:205-0216 (1991).

Um "fagomídeo" é um plasmídeo vetor tendo uma replicação deorigem bacteriana, por exemplo, ColE1, e uma cópia de uma região intergênicade um bacteriófago. O fagomídeo pode ser utilizado em qualquer bacteriófagoconhecido, incluindo bacteriófago filamentoso e bacteriófago lambdóide. Oplasmídeo geralmente também irá conter um marcador selecionável para aresistência aos antibióticos. Segmentos de DNA clonados nestes vetorespodem ser propagados como plasmídeos. Quando células contendo os vetoressão fornecidas com todos os genes necessários para a produção de partículasde fago, o modo de replicação do plasmídeo altera o rolamento círculoreplicação para gerar cópias de uma cepa do DNA plasmidial e partículas doenvelope do fago. O fagomídeo pode formar partículas de fago infecciosas emão infecciosas. Este termo inclui fagomídeos que contêm um gene daproteína da cápside do fago ou um fragmento desse ligado a um polipeptídeoheterólogo como um gene de fusão de tal forma que o polipeptídeo heterólogoé exibido na partícula da superfície do fago.

O termo "vetor de fago" significa uma forma replicativa de duplafita de um bacteriófago contendo um gene heterólogo e capaz de replicação. Ovetor de fago tem a origem de replicação do fago permitindo a replicação e aformação da partícula de fago. Em certos exemplos de realização, o fago é umbacteriófago filamentoso, tal como, fago M13, fl, fd, Pf3 ou um derivado destes,ou um fago lambdóide, tais como lambda, 21, phi80, phi81, 82, 424, 434 e etc,ou um derivado destes.

"Oligonucleotídeos" são polidesoxinucleotídeos de comprimentocurto, fita única ou dupla que são quimicamente sintetizados por métodosconhecidos (como, por exemplo, químicos fosfotriéster, fosfito ou fosforamidita,utilizando técnicas de fase sólida como descrito no documento EP 266032publicado em 4 de Maio de 1988, ou através de deoxinucleosídeo H-fosfonato,como descrito por Froeshler et ai, Nucl. Acids. Res., 14:5399-5407 (1986)).

Métodos adicionais incluem reação em cadeia da polimerase definido abaixo eoutros métodos com auto primer e sínteses de oligonucleotídeos em suportessólidos. Todos esses métodos estão descritos em Engels et aí., Agnew. Chem.Int. Ed. Engl, 28:716-734 (1989). Estes métodos são utilizados se a seqüênciacompleta de ácido nucléico dos genes é conhecida, ou se seqüência dosácidos nucléicos complementares a fita de codificação está disponível.

Alternativamente, se a seqüência de aminoácido alvo é conhecida, pode seinferir as seqüências potenciais de ácidos nucléicos utilizando resíduos decodificação conhecidos e preferidos para cada resíduo de aminoácido. Osoligonucleotídeos podem ser purificados em gel de poliacrilamida ou colunasde dimensões moleculares ou por precipitação.

O DNA é "purificado" quando o DNA está separado de impurezasque não são ácidos nucléicos. As impurezas podem ser polares, não-polares,iônicas e etc.

Um "anticorpo fonte", da formo como é utilizado no presente,refere-se a um anticorpo ou fragmento que se liga a um antígeno cujaseqüência serve como uma seqüência modelo sobre a qual a diversificação deacordo com os critérios descritos no presente é realizada. Em certos exemplosde realização, uma seqüência ligante ao antígeno geralmente inclui uma regiãovariável de anticorpo, e, pelo menos, um CDR incluindo a região estrutural.

A expressão "posição acessível ao solvente" da forma comoutilizada no presente, refere-se a uma posição de um resíduo de aminoácidonas regiões variáveis da cadeia leve e pesada de um anticorpo fonte oufragmento ligante ao antígeno que é determinado, baseado na estrutura,agrupado na estrutura e/ou modelado na estrutura do anticorpo ou fragmentoligante ao antígeno, como potencialmente disponível para acesso ao solventee/ou entrando em contato com uma molécula, tal como, um antígeno específicopara o anticorpo. Estas posições são normalmente encontradas nos CDRs e noexterior da proteína. As posições acessíveis ao solvente de um anticorpo oufragmento ligante ao antígeno, tal como definido no presente, pode serdeterminada utilizando um número de algoritmos conhecidos no estado datécnica. Em certos exemplos de realização, a posição acessível ao solventesão determinadas usando coordenadas de modelos tri-dimensionais de umanticorpo (ou parte dele, por exemplo, um domínio variável de anticorpo, ousegmento(s) CDR), utilizando um programa de computador, como o programaInsight II (Accelrys, San Diego, Califórnia). Posições acessíveis ao solventetambém pode ser determinadas utilizando algoritmos conhecidos no estado datécnica (por exemplo, Lee e Richards, J. Mol. Biol. 55, 379 (1971) e Connolly, J.Appl. Cryst. 16, 548 (1983)). A determinação das posições acessíveis aosolvente podem ser realizadas utilizando um software adequado paramodelagem e obtenção da informação estrutural tri-dimensional da proteína apartir de um anticorpo (ou porção deste). O software que pode ser utilizadopara esses fins é o SYBYL Biopolymer Module software (Tripos Associates).Geralmente, em certos exemplos de realização, onde um algoritmo (programa),exija o uso de entrada do parâmetro tamanho, o "tamanho" de uma sonda queé utilizada no cálculo é fixada em cerca de 1,4 Angstrom ou menor. Além disso,a determinação de regiões acessíveis ao solvente utilizando e métodos da áreautilizando um software para computadores pessoais foram descritos por Pacios((1994) "ARVOMOUCONTOUR: molecular surface áreas and volumes onPersonal Computers." Comput. Chem. 18(4):377-386; e (1995). "Variations ofSurface Áreas and Volumes in Distinct Molecular Suríaces of Biomolecules." J.Mol. Model. 1:46-53.)

Um "elemento regulador de transcrição" irá conter um ou mais dosseguintes elementos: um elemento potenciador (enhancer), um promotor, umaseqüência operadora, um gene repressor e uma seqüência de parada detranscrição. Estes componentes são bem conhecidos no estado da técnica.Patente US 5.667.780.

Uma célula " transformada" é uma célula que recebe e mantém oDNA como evidenciado pela expressão de um fenótipo associado com o DNA(por exemplo, a resistência aos antibióticos conferida por uma proteínacodificada pelo DNA).

"Modificação" refere-se a um processo pelo qual uma célularecebe o DNA torna-se uma célula "transformada". A captação do DNA podeser permanente ou transitória.

Um "anticorpo humano" é aquele que possuí uma seqüência deaminoácidos que corresponde ao de um anticorpo produzido por um humanoe/ou tenha sido feito usando qualquer uma das técnicas de produção deanticorpos humanos como divulgado no presente. Esta definição de anticorpohumano exclui especificamente um anticorpo humanizado conta de resíduos deligação ao antígeno não-humano.

Anticorpo "maturado por afinidade" é aquele com uma ou maisalterações em uma ou mais de suas CDRs, o que resulta em aumento daafinidade do anticorpo para o antígeno, em comparação com anticorpo parentalque não possui essa(s) alteração(ões). Em exemplos de realização preferidos,os anticorpos maturados por afinidade possuirão afinidades nanomolares ouaté picomolares para o antígeno alvo. Os anticorpos maturados por afinidadesão produzidos através de procedimentos conhecidos na técnica. Marks et al.,Bio/Technology, 10: 779-783 (1992) descreve a maturação por afinidadeatravés de troca de domínios VH e VL. A mutagênese aleatória de resíduos deestrutura e/ou CDR é descrita por: Barbas et al., Proc. Natl. Acad. Sei., U. S. A.91: 3809-3813 (1994); Schier et al., Gene, 169: 147-155 (1995); Yelton et al., J.Immunol., 155: 1994-2004 (1995); Jackson et al., J. immunol., 154 (7): 3310-9(1995); e Hawkins et al., J. Mol. Bioi, 226: 889-896 (1992).

O "Kd" ou " valor de Kd " é a constante de dissociação para ainteração de uma molécula com outra. Em um exemplo de realização, o valorde Kd é medida por um teste de ligação a uma proteína radiomarcada (RAI) .

Em um exemplo de realização, um ensaio de RIA para DR5 ou HER-2 pode serrealizado com a versão Fab de um anticorpo anti-DR5 ou anti-HER-2 e umamolécula DR5 e HER-2, respectivamente, como descrito pelo seguinte ensaiomensura a afinidade de ligação em uma solução de Fabs para DR5 ou HER-2equilibrando um Fab com uma concentração mínima de DR5 ou HER-2marcados (I125), na presença de uma titulação seriada de DR5 ou HER-2 nãomarcada, respectivamente, ou então capturando moléculas ligadas a DR5 ouHER-2 respectivamente com uma placa revestida com anticorpos anti-Fab(Chen, et al., (1999) J. Mol Biol 293:865-881). Para estabelecer as condiçõespara que o ensaio, placas de microtitulação (Dynex) são revestidas durante anoite com 5 ug/ml de anticorpo anti-Fab (Cappel Labs), em 50 mM decarbonato de sódio (pH 9,6) e, posteriormente, bloqueado com 2% (p/v) dealbumina bovina em PBS por duas a cinco horas em temperatura ambiente(cerca de 23 °C). Em uma placa não-adsorvida (Nunc # 269620), 100 pM ou 26pM de DR5 ou HER-2 [I125] são misturadas com em diluições seriadas do Fabde interesse, por exemplo, Fab-12 (Presta et al., (1997) Câncer Res. 57:4593-4599). A Fab de interesse é, em seguida, incubada overnight, no entanto, aincubação pode continuar por 65 horas para garantir que o equilíbrio sejaatingido. Em seguida, as misturas são transferidas para a placa de capturapara incubação à temperatura ambiente durante uma hora. A solução é entãoretirada e a placa lavada oito vezes com Tween-20 a 0,1%, em PBS. Quandoas placas estiverem secas, 150uL/poço de cintilante (MicroScint-20; Packard) éadicionado, e as placas são contadas em um contador Topcount gamma(Packard) durante dez minutos. As concentrações de cada Fab que forem igualou menor a 20% da ligação máxima são escolhidos para serem utilizados emensaios ligação por competição

De acordo com outro exemplo de realização o Kd ou valor de Kdpode ser mensurado pelo ensaio de ressonância plasmônica de superfícieutilizando o BIAcore™-2000 ou um BIAcore™-3000 (BlAcore, Inc., Piscataway,NJ). Em um exemplo de realização, o valor de Kd da molécula de anticorpoanti-DR5 ou anti-HER-2 é determinada utilizando uma análise BlAcore™ deacordo com o seguinte protocolo. Resumidamente, chips de biosensores dedestrano carboximetilados (CM5, BlAcore Inc.) são ativados com cloridrato deN-etil-N'-(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida (EDC) e N-hidroxisucinimida (SNS)de acordo com as instruções do fornecedor. O DR5 ou HER-2 humano édiluído com 10 mM de acetato de sódio, pH 4,8, para 5 ug/ml (~ 0,2 uM) antesde injetar a uma velocidade de fluxo de 5 ul/minuto para atingiraproximadamente 10 unidades de resposta (RU) de proteína acoplada. Após ainjeção do DR5 ou HER-2 humano, 1M de etanolamina é adicionada parabloquear grupos não reacionados. Para a mediação cinética, diluições seriadasem duplicatas de Fab (0,78 nM e 500 nM) são injetados em PBS com 0,05% deTween-20 (PBST) a 25 °C em uma taxa de fluxo de cerca de 25 ul/min. Avelocidade de associação (kon) e a velocidade de dissociação (k0ff) sãocalculadas utilizando um modelo de ligação simples um-para-um de Langmuir(BlAcore Evaluation Software version 3.2) pela montagem simultânea desensogramas de associação e dissociação. A constante de dissociação emequilíbrio (Kd) é calculado como a relação k0ff/k0n- Vide, por exemplo, Chen, Y.,et al., (1999) J. Mol Biol 293:865-881.

Um "distúrbio" é qualquer condição que poderia se beneficiar pelotratamento com uma substância/molécula ou método da invenção. Isto incluidoenças agudas e crônicas ou doenças incluindo aquelas condiçõespatológicas que predispõem o mamífero para o distúrbio em questão.

Exemplos não limitantes de doenças a ser tratadas no presente incluemtumores malignos e benignos; malignidades linfóides e não leucêmicas;distúrbios neuronais, gliais, astrocitais, do hipotálamo e outros distúrbiosglandulares, macrofágicos, epiteliais, estromais e blastocélicos; e distúrbiosinflamatórios e doenças imuno-relacionadas.

Os termos "distúrbio da proliferação celular" e "desordemproliferativa" referem-se a distúrbios que estão associados com algum grau deproliferação de células anormais. Em exemplo de realização, a desordemproliferativa é o câncer.

"Tumor", como é utilizado no presente, refere-se ao crescimento emultiplicação de todas as células neoplásicas, quer sejam malignas ou benignas, etodas as células e tecidos pré-cancerosos e cancerosos. Os termos "câncer","cancerosos", "distúrbio da proliferação celular", "desordem proliferativa" e "tumor"não são mutuamente exclusivos como referido no presente.

O termo "câncer" e "canceroso" refere-se a ou descreve acondição fisiológica em mamíferos que é tipicamente caracterizada pelocrescimento/proliferação celular não regulada. Exemplos de câncer incluem,mas sem limitar-se a, carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma, e leucemia.

Exemplos mais particulares de ditos cânceres incluem câncer de célulasescamosas, câncer do pulmão de células pequenas, câncer do pulmão decélulas não-pequenas, adenocarcinoma do pulmão, carcinoma escamoso dopulmão, câncer do peritônio, câncer hepatocelular, câncer gastrointestinal, câncerpancreático, glioblastoma, câncer cervical, câncer do ovário, câncer do fígado,câncer da bexiga, hepatoma, câncer de mama, câncer do cólon, câncer colorretal,carcinoma endometrial ou uterino, carcinoma de glândulas salivares, câncer dosrins, câncer do fígado, câncer de próstata, câncer vulval, câncer da tireóide,carcinoma hepático, e vários tipos câncer de câncer da cabeça e pescoço.

O termo "doença imune relacionada" designa uma doença ondeum componente do sistema imunológico de um mamífero causa, medeia oucontribui de uma outra maneira para a morbidade do mamífero. Também estãoinclusos doenças que estimulam ou interferem na resposta imune tendo umefeito ameliorativo na progressão da doença. Incluído com este termo estãodoenças auto-imunes, doenças inflamatórias imuno-mediadas, doençasinfecciosas e imunodeficiências. Exemplos de doenças relacionadas e doençasinflamatórias, algumas dos quais são imunes ou mediadas por células T, quepodem ser tratadas de acordo com a invenção incluem lúpus eritematoso,artrite reumatóide, artrite crônica juvenil, espondiloartropatias, esclerosesistêmica (escleroderma), miopatia inflamatória idiopática, (dermatomiosites,polimiosites), sindrome de Sjõgren, vasculite sistêmica, sarcoidose, anemiahemolítica autoimune (pancitopenia imune, hemoglobinúria paroxísticanoturna), trombocitopenia autoimune (trombocitopenia idiopática púrpura,trombocitopenia imuno-mediada), tireoidites (doença de Grave, tireoidite deHashimoto, tireoidite linfocítica juvenil, tireoidite atrópica), diabetes mellitus,doença renal imuno-mediada (glomerulonefrite, nefrite tubulointersticial),doença desmielinizante do sistema nervoso central e periférico, tal comoesclerose múltipla, polineuropatia desmielinizanate idiopática ou sindrome deGuillain-Barré e polineuropatia desmielinizanate inflamatória crônica, doençashapatobiliares tais como hepatite infecciosa (hepatites A, B, C, D, E e outrosvírus não-hepatotrópicos), hepatite ativa crônica autoimune, cirrose biliarprimária, hepatite granulomatosa, e colangite esclerosante, doenças fibróticas einflamatórias do pulmão, respostas associadas à doença intestinal inflamatória(doença de Crohn, colite úlcerativa), enteropatia glúten-sensível, e doença deWhipple, doenças da pele autoimunes ou mediadas pelo sistema imunológico,incluindo doenças da pele bolhosas, eritema multiforme e dermatite de contato,psoríase; doenças alérgicas tais como asma, rinite alérgica, dermatite atópica,hipersensibilidade alimentícia e urticária; doenças imunológicas do pulmão, taiscomo pneumonia eosinofílica.

O termo "doença autoimune" no presente é utilizado no sentidoamplo, em geral o sentido refere aos distúrbios ou condições nos mamíferosem que a destruição de tecidos saudáveis ou normais ocorre a partir daresposta imune celular ou humoral do indivíduo mamífero contra o seu própriotecido. Os exemplos incluem, mas não se limitam a, lúpus eritematososistêmico, tireoidite, artrite reumatóide, psoríase, esclerose múltipla, diabetesautoimune, e doença inflamatória intestinal (IBD).

Da forma utilizada no presente, "tratamento" indica intervençãoclínica em tentativa de alterar o curso natural do indivíduo ou da célula sendotratada e pode ser realizado para profilaxia ou durante o transcurso depatologia clínica. Os efeitos desejáveis de tratamento incluem a prevenção daocorrência ou reincidência da doença, alívio dos sintomas, redução dequaisquer conseqüências patológicas diretas ou indiretas da doença,prevenção de metástase, redução da velocidade de progresso da doença,melhoria ou redução do estado doentio e remissão, ou melhor prognóstico. Emalguns exemplos de realização, os anticorpos da invenção são usados paraatrasar o desenvolvimento da doença ou distúrbio.

"Quantidade eficaz" designa quantidade eficaz, em dosagens epor períodos de tempo necessários, para atingir o resultado terapêutico ouprofilático desejado.

Uma "quantidade terapeuticamente eficaz" da substância oumolécula da invenção,agonista ou antagonista pode variar de acordo comfatores tais como o estado da doença, idade, sexo e peso do indivíduo, bemcomo a capacidade do anticorpo de permitir reação desejada no indivíduo.

Uma quantidade terapeuticamente eficaz também é aquela em que qualquerefeito tóxico ou prejudicial do anticorpo é superado pelos efeitosterapeuticamente benéficos. "Quantidade profilaticamente eficaz" designaquantidade eficaz, em dosagens e por períodos de tempo necessários, paraatingir o resultado profilático desejado. Tipicamente, como a dose profilática éutilizada em pacientes antes ou em estado inicial da doença, a quantidadeprofilaticamente eficaz será menor que a quantidade terapeuticamente eficaz.

"Mamífero", para fins de tratamento, indica qualquer animalclassificado como mamífero, incluindo seres humanos, animais domésticos ede fazenda, animais de zoológico, esportivos ou domésticos, tais como cães,cavalos, gatos, vacas etc.

O termo "composição anti-neoplásica" refere-se a umacomposição útil no tratamento do câncer incluindo pelo menos um agenteterapêutico ativo, por exemplo, "agente anti-câncer." Exemplos de agentesterapêuticos (agentes anti-câncer) incluem, mas não estão limitados a, porexemplo, agentes quimioterápicos, agentes inibidores de crescimento, agentescitotóxicos, agentes utilizados na radioterapia, agentes anti-angiogênese,agentes apoptóticos, agentes anti-tubulina, e outros agentes para o tratamentodo câncer, como, por exemplo, anticorpos anti-CD20, antagonista do receptordo fator de crescimento epidérmico (EGFR) (por exemplo, um inibidor datirosina quinase), inibidores de HER1/EGFR (por exemplo, erlotinib(Tarceva™), inibidores do fator de crescimento derivado de plaquetas (porexemplo, Gleevec™ (Imatinib Mesylate)), um inibidor da COX-2 (por exemplo,o celecoxib), interferons, antagonistas de citocinas, (por exemplo, anticorposneutralizantes) que se ligam a uma ou mais dos seguintes alvos receptoresErbB3, ErbB4, PDGFR-beta, BlyS, APRIL, BC MA ou VEGF, TRAIL/Apo2 eoutros agentes bioativos e químicos biológicos e etc. Combinações, estãoigualmente incluídas na invenção.

O termo "epítopo marcado" quando utilizado no presente refere-sea um anticorpo mutante fundido a um "marcador do epítopo". O polipeptídeo domarcador do epítopo tem resíduos suficientes para fornecer um epítopo contrao qual um anticorpo contra este pode ser feito, sendo ainda curto o suficientepara que este não interfira com a atividade do anticorpo mutante. O marcadorde epítopo preferencialmente também é bastante singular a fim de que oanticorpo não reaja cruzadamente contra outros epítopos. Polipeptídeomarcadores adequados têm, geralmente, pelo menos 6 resíduos deaminoácido e, geralmente, entre cerca de 8-50 resíduos de aminoácidos (emcertos exemplos de realização, entre cerca de 9-30 resíduos). Os exemplosincluem, mas não estão limitados a, polipeptídeo marcador flu HA e seusanticorpos 12CA5 (Field et ai Mol. Cell. Biol. 8:2159-2165 (1988)); o marcadorc-myc e os anticorpos contra estes 8F9, 3C7, 6E10, G4, B7 e 9E10 (Evan et ai,Mol. Cell. Biol. 5 (12) :3610-3616 (1985)); e o marcador glicoproteína D (gD) dovírus da Herpes e seus anticorpos ( Paborsky et ai, Protein Engineering3(6):547-553 (1990)). Em certos exemplos de realização, o marcador deepítopo é um "epítopo ligado a receptor recuperado".

A expressão "agente citotóxico", da forma utilizada no presente,indica uma substância que inibe ou evita o funcionamento das células e/oucausa destruição das células. A expressão destina-se a incluir isótoposradioativos (tais como At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32 eisótopos radioativos de Lu), agentes quimioterápicos, por exemplo,metotrexato, adriamicina, alcalóides vinca (vincristina, vinblastina, etoposida),doxorubicina, melfalan, mitomicina C, clorambucil, daunorubicina ou outrosagentes intercalantes, enzimas e fragmentos destes como, por exemplo, ezimasnucleotídeas, antibióticos e toxinas como, por exemplo, pequenas moléculas detoxina ou toxinas ezimáticamente ativas de origem bacteriana, fúngica, vegetal ouanimal, incluindo fragmentos ou variantes destes, e vários agentes anti-câncer ouanti-tumor descritos abaixo. Outros agentes citotóxicos estão descritos abaixo. Umagente tumoricida causa destruição das células tumorais.

Um "agente quimioterápico" é um composto químico útil notratamento de condições como o câncer. Exemplos de agentes quimioterapicosincluem agentes alquilantes, tais como tiotepa e ciclofosfamida (Cytoxan®);sulfonatos de alquila, tais como busulfan, improsulfan e piposulfan; aziridinas,tais como benzodopa, carboquona, meturedopa e uredopa; etilenoiminas emetilamelaminas, incluindo altretamina, trietilenomelamina,trietilenofosforamida, trietilenotiofosforamida e trimetilolomelamina;acetogeninas (especialmente bulatacin e bulatacinona); delta-9-tetrahidrocanabinol (dronabinol, MARINOL®); beta-lapacone; lapacol;colcicines; ácido betulinico; camptotecina (incluindo o análogo sintéticotopotecan (HYCAMTIN®)), CPT-11 (irinotecan, CAMPTOSAR®),acetlcamptotecina, scopolectina e 9-(aminocamptotecina); briostatina;calistatina; CC-1065 (incluindo seus análogos sintéticos adozelesina,carzelesina e bizelesina); podofilotoxina; ácido podofilinico; teniposida;(criptoficinas particularmente a criptoficina 1 e criptoficina 8); dolastatina;duocarmicina (incluindo o análogo sintético, KW-2189 e CB1-TM1);eleuterobina; pancratistatina; sarcodictiina; espongistatina; mostardas denitrogênio, tais como clorambucil, clornafazina, colofosfamida, estramustina,ifosfamida, mecloretamina, cloridrato oxido de mecloretamina, melfalan,novembiquin, fenesterina, prednimustina, trofosfamida, mostarda de uracila;nitrossuréias, tais como carmustina, clorozotocin, fotemustina, lomustina,nimustina, ranimustina; antibióticos, tais como os antibióticos de enedina (porexemplo, caliqueamicin, especialmente caliqueamicin gamai I e caliquemicinomegall; vide, por exemplo, Agnew, Chem. Intl. Ed. Engl., 33: 183-186 (1994);dinemicina, incluindo dinemicina A; esperamicina; bem como neocarzinostatinacromóforo e cromóforos antibióticos de enedina cromoproteína relacionadas),aclacinomisinas, actinomicina, autramicina, azaserina, bleomicinas,cactinomicin, carabicina, carminomicina, carzinofilina, cromomicinas,dactinomicina, daunorrubicina, detorubicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina,cianomorfolino-doxorubicina, 2-pirrolino-doxorubicina e desoxidoxorubicina),epirubicina, esorubicina, idarubicina, marcelomicina, mitomicinas como, porexemplo mitomicina C, ácido micofenólico, nogalamicina, olivomicinas,peplomicina, potfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorrubicina,estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorubicina;antimetabólitos, tais como metotrexato, e 5-fluorouracil (5-FU); análogos deácido fólico, tais como denopterin, metotrexato, pteropterin, trimetrexato;análogos de purina, tais como fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina,tioguanina; análogos de pirimidina, tais como ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, dideoxiuridina, doxifluridina, enocitabina,floxuridina; andrógenos, tais como calusterona, propionato de dromostanolona,epitiostanol, mepitiostano, testolactona; anti-adrenais, tais comoaminoglutetimida, mitotano, trilostano; reabastecedor de ácido fólico, tal comoácido frolínico; aceglatona; aldofosfamido glicosídeo; ácido aminolevulínico;amsacrina; bestrabucil; bisantreno; edatraxato; defofamina; demecolcina;diaziquona; elfornitina; acetato de eliptínio; epotilona; etoglucídeo; nitrato degálio; hidroxiuréia; lentinan; lonidamina; maitansinóides, tais como maitansina eansamitocinas; mitoguazona; mitoxantrona; mopidamol; nitacrina; pentostatina;fenamet; pirarubicina; ácido podofilínico; 2-etilidrazida; procarbazina; PSK®complexo polissacarídico (JHS Natural Products, Eugene, OR); razoxano;rizoxin; sizofiran; espirogermânio; ácido tenuazônico; triaziquona; 2,2',2"-triclorotrietilamina; tricotecenos (especialmente toxina T-2, verracurin A, roridinA e anguidina); uretano; vindesina (ELDISINE®, FILDESIN®); dacarbazina;manomustina; mitobronitol; mitolactol; pipobroman; gacitosina; arabinosida("Ara-C"); ciclofosfamida; tiotepa; taxóides, tais como, paclitaxel TAXOL®(Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.), formulção de nanopartículasde paclitaxel construídas em albumina ABRAXANETM (AmericanPharmaceutical Partners, Schaumberg, Illinois), e doxetaxel TAXOTERE®(Rhône-Poulenc Rorer, Antony, France); clorambucil (GEMZAR®); gencitabina;6-tioguanina (VELBAN®); mercaptopurina; metotrexato; análogos de platina taiscomo cisplatina e carboplatina; vinblastina; platina; etoposida (VP-16);ifosfamida; mitoxantrona; vincristina (ONCOVIN®); oxaliplatin; leucovovin;vinorelbine (NAVELBINE®); novantrona; edatrexato; daunomicina;aminopterina; ibandronato; inibidor de topoisomerase RFS 2000;difluorometilornitina (DMFO); ácido retinóico; capecitabina (XELODA®); e ossais, ácidos ou derivados farmacêuticamente aceitáveis de quaisquer dosacima; bem como combinações de dois ou mais dos agentes descritos acimacomo, por exemplo CHOP, uma abreviação para a terapia combinada deciclofosfamidas, doxorubicina, vincristina, e prednisolona, e FOLFOX, umaabreviação para o regime de tratamento com oxaliplatina (ELOXATINTM)combinada com 5-FU e leucovovina.

São incluídos também nesta definição os agentes anti-hormonaisque agem para regular, reduzir, obstruir, ou inibir os efeitos dos hormônios quepodem promover o crescimento do câncer, e são freqüentemente forma detratamento sistêmica, ou de todo o corpo. Podem ser os próprios hormônios.Os exemplos incluem antiestrógenos e os moduladores seletivos do receptordo estrógeno (SERMs), incluindo, por exemplo, tamoxifeno (incluindo otamoxifeno NOLVADEX ), raloxifeno (EVISTA®), droloxifeno, 4-hidroxitamoxifeno, trioxifeno, keoxifeno, LY117018, onapristona, e toremifeno(FARESTON®); anti-progesteronas; reguladores supressores de receptor deestrógeno (ERDs); agentes que funcionam para suprimir o s ovários, porexemplo, hormônio agonista liberador de hormônio luteinizante (LHRH) taiscomo os acetatos de leuprolida LUPRON® e ELIGARD®, acetato de goserelina,acetato de buserelina e tripterelina; outros anti-andrógenos tais como aflutamida, nilutamida e a bicalutamida; e inibidores da aromatase que inibemenzima aromatase, que regula a produção do estrógeno nas glândulasadrenais como, por exemplo, 4(5)-imidazoles, aminoglutetimida, acetato demegestrol (MEGASE®), exemestane (AROMASIN®), formestanie, fadrozole,vorozole (RIVISOR®), letrozole (FEMARA®), e anastrozole (ARIMIDEX®). Alémdisso, tal definição de agentes quimioterápicos inclui bisfosfonatos tais como oclodronato (por exemplo, o BONEFOS® ou o OSTAC®), etidronato(DIDROCAL®), NE-58095, ácido zoledrônico / zoledronate (ZOMETA®),alendronato (FOSAMAX®), pamidronato (AREDIA®), tiludronato (SKELID®) ourisedronato (ACTONEL®); bem como a troxacitabina (um 1,3-dioxolane análogonucleosídeo da citosina); os oligonucleotídeos antisense, particularmenteaqueles que inibem a expressão dos genes da via de sinalização, implicandona proliferação aberrante da célula como, por exemplo, PKC-alfa, Raf, H-Ras eo receptor do fator de crescimento epidermal (EGF-R); vacinas tais comovacina THERATOPE® e vacinas de terapia gênica, por exemplo, vacinaALLOVECTIN®, vacina LEUVECTIN® e vacina VAXID®; inibidor datopoisomerase 1 (por exemplo, LURTOTECAN®); rmRH (por exemplo,ABARELIX®); ditosilato do lapatinib (um ErbB-2 e um EGFR molécula pequenainibidoras da quinase também conhecida como GW572016); e os sais, ácidosou derivados farmaceuticamente aceitáveis de quaisquer dos acima.

"Agente inibidor do crescimento", da forma utilizada no presente,designa o composto ou composição que inibe o crescimento celular,especialmente da célula cancerosa que expresse a molécula alvo in vitro ou invivo. Desta forma, o agente inibidor do crescimento pode reduzirsignificativamente o percentual de células que expressam a molécula alvo nafase S. Exemplos de agentes inibidores do crescimento incluem agentes quebloqueiam o progresso do ciclo celular (em local diferente da fase S), tais comoagentes que induzem a suspensão de G1 e a suspensão da fase M.Bloqueadores clássicos da fase M incluem as vincas (vincristina e vinblastina),taxanos e inibidores de topo II tais como doxorubicina, epirubicina,daunorubicina, etoposida e bleomicina. Os agentes que suspendem G1também se difundem para a suspensão da fase S, tais como agentesalquilantes de DNA como tamoxifen, prednisona, dacarbazina, mecloretamina,cisplatina, metotrexato, 5-fluorouracil e ara-C. Informações adicionais podemser encontradas em The Molecular Basis of Câncer, Mendelsohn e Israel, eds.,Capítulo 1, intitulado Cell Cycle Regulation, Oncogenes and AntineoplasticDrugs de Murakami et al (WB Saunders: Filadélfia, 1995), especialmente pág.13. Os taxanos (paclitaxel e docetaxel) são os dois fármacos anti-neoplásicosderivados da árvore teixos. Docetaxel (TAXOTERE ®, Rhone-Poulenc Rorer),obtidas a partir de teixos Europeu, é um análogo semi-sintético do paclitaxel(Taxol ®, Bristol-Myers Squibb). Docetaxel e paclitaxel promovem a montagemdos microtúbulos de dímeros de tubulina e estabiliza os microtúbulos,impedindo despolimerização, o que resulta na inibição da mitose nas células.

"Doxorrubicina" é um antibiótico antraciclina. O nome completo doproduto químico é doxorrubicina (8S-cis)-10-[(3-amino-2, 3, 6-trideoxi-a-L-lixo-hexapiranosil)oxi]-7, 8, 9, 10-tetrahidro-6, 8, 11-trihidroxi-8-(hidroxiacetíl)-1-metoxi-5, 12-naftacenediona.

O termo "pró-droga", da forma utilizada no presente pedido,designa uma forma precursora ou derivada de substância farmacêuticamenteativa que é menos citotóxica para células tumorais em comparação com adroga parental e é capaz de ser enzimaticamente ativada ou convertida naforma parental mais ativa. Vide, por exemplo, Wilman, Prodrugs em CâncerChemotherapy, Biochemical Society Transactions, 14, págs. 375-382, 615aReunião de Belfast (1986) e Stella et ai, Prodrugs: A Chemical Approach toTargeted Drug Delivery, Directed Drug Delivery, Borchardt et al., (ed.), págs.247-267, Human Press (1985). As pró-drogas de acordo com a presenteinvenção incluem, mas não se limitam a, pró-drogas que contêm fosfato, pró-drogas que contêm tiofosfato, pró-drogas que contêm sulfato, pró-drogas quecontêm peptídeos, pró-drogas modificadas com D-aminoácidos, pró-drogasglicosiladas, pró-drogas que contêm beta-lactama, pró-drogas que contêmfenoxiacetamida opcionalmente substituída ou pró-drogas que contêmfenilacetamida opcionalmente substituída, 5-fluorocitosina e outras pró-drogasde 5-fluorouridina que podem ser convertidas na droga livre citotóxica maisativa. Exemplos de drogas citotóxicas que podem ser derivadas em forma depró-droga para uso na presente invenção incluem, mas sem limitar-se a, osagentes quimioterápicos descritos acima.

Para o tratamento de artrite reumatóide ("RA"), o paciente podeser tratado com um anticorpo da invenção em conjunto com qualquer uma oumais das seguintes drogas: DMARDS (drogas anti-reumáticas modificadorasda doença (tais como metotrexato)), NSAI ou NSAID (drogas antiinflamatóriasnão-esteroidais), Humira™ (adalimumab; Abbott Laboratories), Arava®(leflunomida), Remicade® (infliximab; Centocor Inc. de Malvern PA, EstadosUnidos), Enbrel (etanercept; Immunex, WA, Estados Unidos), inibidores deCOX-2. As DMARDs comumente utilizadas em RA são hidroxicloroquina,sulfasalazina, metotrexato, leflunomida, etanercept, infliximab, azatioprina, D-penicilamina, Gold (oral), Gold (intramuscular), minociclina, ciclosporina eimunoadsorção de proteína A de estafilococo. Adalimumab é um anticorpomonoclonal humano que se liga a TNF-y. Infliximab é um anticorpo monoclonalquimérico que se liga ao TNF. Etanercept é uma proteína de fusão de"imunoadesina" que consiste da porção extracelular de ligação do ligante doreceptor humano de fator de necrose tumoral de 75 kD (p75) (TNFR) ligado àporção Fc de um lgG1 humano. Para o tratamento convencional de RA, vide,por exemplo, Guidelines for the Management of Rheumatoid Arthritis, Arthritis &Rheumatism 46 (2): 328-346 (fevereiro de 2002). Em um exemplo derealização específico, o paciente de RA é tratado com um anticorpo anti-CD20de acordo com a presente invenção em conjunto com metotrexato (MTX). Umexemplo de dosagem de MTX é de cerca de 7,5 a 25 mg/kg/semana. MTXpode ser administrado via oral e subcutânea.

Para o tratamento de espondilite anquilosante, artrite psoriática edoença de Crohn, o paciente pode ser tratado com um anticorpo da invenção emconjunto, por exemplo, com Remicade® (infliximab; da Centocor Inc. de Malvern PA,Estados Unidos), e/ou Enbrel (etanercept; Immunex WA, Estados Unidos).

Para o tratamento da SLE, o paciente pode ser tratado com umanticorpo da invenção em conjunto com, por exemplo, uma alta dose decorticosteróides e/ou ciclofosfamida (HDCC).

Para o tratamento de psoríase, os pacientes podem receber umanticorpo da presente invenção em conjunto com tratamentos tópicos, taiscomo esteróides tópicos, antralina, calcipotrieno, clobetasol e tazaroteno, oucom terapias de metotrexato, retinóides, cicloesporina, PUVA e UVB. Em umarealização, o paciente com psoríase é tratado com o anticorpo da invenção demaneira seqüencial ou simultânea com a ciclosporina.

Molécula "isolada" de ácido nucléico é uma molécula de ácidonucléico que é identificada e separada de pelo menos uma molécula de ácidonucléico contaminante com a qual normalmente está associada na fonte naturaldo ácido nucléico que codifica o anticorpo. Molécula de ácido nucléico isolada édiferente da forma na qual é encontrada na natureza. As moléculas de ácidonucléico isoladas são, portanto, diferenciadas da molécula de ácido nucléicoexistente em células naturais. Entretanto, molécula de ácido nucléico isoladainclui molécula de ácido nucléico contida em células que normalmenteexpressam o anticorpo no qual, por exemplo, a molécula de ácido nucléico"isolada" está em um sítio cromossômico diferente de células naturais.

A expressão "seqüências de controle" designa seqüências deDNA necessárias para a expressão da seqüência de codificaçãooperacionalmente ligada em um organismo hospedeiro específico. Asseqüências de controle que são apropriadas para procariotos, por exemplo,incluem promotor, opcionalmente seqüência operadora, e sítio de ligação deribossomos. As células eucarióticas são conhecidas por utilizarem promotores,sinais de poliadenilação e acentuadores (enhancers).

A "variante" ou "mutante" de um polipeptídeo inicial ou dereferencia (por exemplo, um anticorpo fonte ou seu(s) domínio(s)variável(eis)/CDR(s)), tal como uma proteína de fusão (polipeptídeo) ou umpolipeptídeo heterólogo (heterólogo de um fago), é um polipeptídeo que: 1) temuma seqüência aminoácido diferente do polipeptídeo inicial ou polipeptídeo dereferência e 2) foi derivado de um polipeptídeo inicial ou de referência, queratravés da mutagênese de polipeptídeo naturais ou artificiais (antrópica). Taisvariantes incluem, por exemplo, deleções dos, e/ou inserções nos, e/ousubstituições dos resíduos na seqüência de aminoácidos do polipeptídeo deinteresse. Por exemplo, um polipeptídeo de fusão da invenção produzidousando um oligonucleotídeo compreendendo um conjunto de códons restritoque codifica uma seqüência com um aminoácido variante (no que diz respeitoaos aminoácidos encontrados nas posições correspondentes de um anticorpofonte / fragmento de ligação ao antígeno) seriam um polipeptídeo variante comrelação a um anticorpo fonte e/ou fragmento de ligação ao antígeno e/ou umCDR. Assim, um CDR variante refere-se a um CDR que possuí uma seqüênciavariante com relação a seqüência do polipeptídeo inicial ou de referência (comoo de um anticorpo fonte / fragmento de ligação ao antígeno e/ou CDR). Umvariante de aminoácido, neste contexto, refere-se a um aminoácido diferente doaminoácido na posição correspondente em uma seqüência de polipeptídeoinicial ou de referência (como o de um anticorpo fonte / fragmento de ligação aoantígeno e/ou CDR). Qualquer combinação de deleções, inserções,substituições pode ser realizada para se chegar à construção da variante oumutante final, desde que este tenha as características funcionais desejadas.Em alguns dos exemplos descritos no presente, as seqüências ligantespossuem mutações pontuais como deleções ou adições. As modificações deaminoácido também podem ocorrer por processos pós-translacionais dopolipeptídeo, tal como a alteração no número ou na posição dos locais deglicosilação. Métodos para a produção de seqüências de aminoácidosvariantes de polipeptídeos estão descritos na Patente US 5.534.615,expressamente incorporadas ao presente pela referência.

Uma seqüência do "tipo selvagem" ou seqüência de "referência"ou seqüência de um polipeptídeo/proteína do "tipo selvagem" ou seqüência deum polipeptídeo/proteína de "referência", tais como uma proteína da cápside,ou um domínio variável CDR de um anticorpo fonte, pode ser a seqüência dereferência a partir do qual a seqüência do polipeptídeo variante é derivada pelaintrodução de mutações. Em geral, a seqüência do "tipo selvagem" para umadada seqüência protéica é a seqüência que é mais comum na natureza. Domesmo modo, uma seqüência genética do "tipo selvagem" é a seqüência degenes que é mais comumente encontrada na natureza. As mutações podemser introduzidas em um gene do "tipo selvagem" (e, portanto, que codifica asproteínas), tanto por processos naturais quanto por processos induzidos pelohomem. Os produtos de tais processos são formas "variantes" ou "mutantes"do gene ou proteína do "tipo selvagem" original.

Uma "variedade" de uma substância, como um polipeptídeo oupolinucleotídeo da invenção, como utilizado no presente, refere-se geralmentea uma coleção de dois ou mais tipos ou formas da substância. Há dois ou maistipos ou formas de uma substância se duas ou mais das substâncias sediferem uma das outras no que diz respeito a uma característica particular,como um aminoácido variante encontrado em uma determinada posição deaminoácido. Por exemplo, existe uma variedade de polipeptídeos da invenção,se houver dois ou mais polipeptídeos da invenção que são substancialmente omesmo, ou são idênticos nas seqüências exceto pela seqüência de um CDRvariante ou exceto por um variante de aminoácido em uma posição deaminoácido altamente diversificada e acessível ao solvente. Em outro exemplo,existe uma variedade de polinucleotídeo da invenção, se houver dois ou maispolinucleotídeos da invenção que são basicamente os mesmos ou idênticos naseqüência exceto pela seqüência que codifica um CDR variante ou exceto porvariante de aminoácido em uma posição de aminoácido altamente diversificadae acessível ao solvente.

A invenção fornece um novo método para produzir e isolarpolipeptídeos que ligam a um antígeno alvo, tais como anticorpos oufragmentos ligantes de antígenos, que pode ter uma alta afinidade para umantígeno selecionado. Uma variedade de diferentes polipeptídeos ligantes épreparada por mutação (diversificação) em uma ou mais posições deaminoácidos selecionadas em um domínio variável de cadeia leve e/ou pesadado anticorpo fonte com um conjunto de códons restrito para gerar umabiblioteca de polipeptídeos ligante com aminoácidos variantes em, pelo menos,uma seqüência de CDR, no qual o número de tipos de aminoácidos variantes émantido a um nível mínimo (ou seja, 19 ou menos, 15 ou menos, 10 ou menos,8 ou menos, 6 ou menos, 4 ou menos, ou 2, mas, em geral, pelo menos, 2). Asposições de aminoácidos incluem aquelas que são acessíveis ao solvente, porexemplo, como determinado pela análise estrutural de um anticorpo fonte e/ou quesão altamente diversificados e/ou polipeptídeos de imunoglobulinas de ocorrêncianatural. Outra vantagem oferecida pela natureza limitada da diversificação dainvenção é que outras posições de aminoácidos adicionais que não aquelasaltamente diversificadas e/ou acessíveis ao solvente também pode serdiversificadas, de acordo com a necessidade ou desejo do profissional; exemplosdestes exemplos de realização estão descritas no presente.

As posições dos aminoácidos que são acessíveis ao solvente ealtamente diversificadas, em certos exemplos de realização são aquelas nosdomínios variáveis da região CDR do anticorpo selecionados de entre o grupoconstituído por CDRL1, CDRL2, CDRL3, CDRH1, CDRH2, CDRH3, e misturasdestes. Posições de aminoácidos são cada mutante utilizando um conjunto decódons restrito que codifica um número limitado de aminoácidos, a escolha dosaminoácidos geralmente é independente dos aminoácidos que ocorremcomumente em cada posição. Em alguns exemplos de realização, quando umaposição acessível ao solvente ou altamente diversificada em uma região CDR émutada, um conjunto de códons é selecionado para codificar a partir de 2 a 10,de 2 a 8, de 2 a 6, de 2 a 4, e/ou apenas 2 aminoácidos. Em alguns exemplosde realização, quando uma posição acessível ao solvente ou altamentediversificada em uma região CDR é mutada, um conjunto de códons éselecionado para codificar a partir de 2 a 19, 2 a 15, 2 a 10, de 3 a 9, de 4 a 8,e/ou de 5 a 7 aminoácidos. Em alguns exemplos de realização, um conjuntocódon codifica pelo menos 2, mas 19 ou menos, 15 ou menos, 10 ou menos, 8ou menos, 6 ou menos, 4 ou menos aminoácidos. As seqüências de CDRtambém podem ser diversificadas, variando no comprimento. Por exemplo,para o CDRH3, regiões variantes de CDRH3 que podem ser geradas têmdiferentes comprimentos e/ou são aleatorizadas nas posições selecionadasusando um conjunto de códons restrito.

A diversidade da biblioteca dos polipeptídeos contendo variantesde CDRs é elaborada usando um conjunto de códon que codifica apenas umnúmero limitado de aminoácidos como, por exemplo, uma quantidade mínima,mas suficiente de variedade de seqüências é introduzida em um CDR. Onúmero de posições mutantes no CDR é minimizado e os aminoácidosvariantes em cada posição são concebidos de forma a incluir um númerolimitado de aminoácidos, independente dos aminoácidos considerados comode ocorrência comum nas posições nos CDRs conhecidos ou de ocorrêncianatural. Em um exemplo de realização específico, um único anticorpo, incluindopelo menos um CDR, é utilizado como anticorpo fonte. É surpreendente queuma biblioteca de domínio variável de anticorpos possuindo diversidade nasseqüências e no tamanho possa gerar utilizando um único anticorpo fontecomo modelo e atingindo uma variedade de posições específicas utilizando umnúmero limitado de substituições de aminoácidos não convencionais.

Elaboração Da Diversidade Dos Domínios Variáveis De Anticorpos

Em um aspecto da invenção, são geradas bibliotecas de altaqualidade de domínios variáveis de anticorpos. As bibliotecas têm adiversidade das seqüências restringidas das diferentes seqüências CDR, porexemplo, a diversidade dos domínios variáveis de anticorpos. As bibliotecasincluem domínios variáveis de anticorpos de alta afinidade de ligação para umou mais antígenos, incluindo, por exemplo, DR5 e HER-2 humanos. Adiversidade na biblioteca é concebida por selecionar posições de aminoacidoque são acessíveis ao solvente e altamente diversificadas, em um únicoanticorpo fonte e mutando as posições deste em, pelo menos, um CDR usandoum conjunto de códons restrito. O conjunto de códons restrito pode, em certosexemplos de realização, codificar menos de 19, 15, 10, 8, 6, 4 aminoácidos oucodificar apenas 2 aminoácidos.Um anticorpo fonte é o anticorpo 4D5 humanizado, mas osmétodos para a diversificação pode ser aplicado a outros anticorpos fonte cujaseqüência é conhecida. Um anticorpo fonte pode ser um anticorpo deocorrência natural, anticorpo sintético, anticorpos recombinante, anticorpohumanizado, anticorpo derivados de linhagem germinal, anticorpo quimérico,anticorpo maturado por afinidade ou fragmento ligante de antígeno. Osanticorpos podem ser obtidos a partir de uma variedade de espécies demamíferos, incluindo seres humanos, camundongos e ratos. Em algunsexemplos de realização, um anticorpo fonte é um anticorpo que é obtido apósuma ou mais etapas de seleção por afinidade inicial, mas antes deuma(algumas) etapa(s) de maturação por afinidade. Um anticorpo fonte podeser selecionado ou modificado para ser fornecido por alta produtividade eestabilidade quando produzido em cultura de células.

O anticorpo 4D5 é um anticorpo humanizado específico para umantígeno associado ao câncer conhecido como HER-2 (erbB2). O anticorpoinclui domínios variáveis tendo a região estrutural de consenso; algumaspoucas posições foram revertidas para a seqüência do camundongo durante oprocesso para aumentar a afinidade do anticorpo humanizado. A seqüência e aestrutura cristalina do anticorpo 4D5 humanizado estão descritas no PatenteUS 6.054.297, Carter et al, PNAS 89:4285 (1992), a estrutura cristalina éexibida em J Mol. Biol. 229:969 (1993) e on-line emhttp://www.ncbi. nlm.nih.gov/Structure/mmdb/mmdbsrv.cgi?form=6&dB=t&Dopt=s&uid=990,http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/mmdb/mmdbsrv.cgi?form=6&dB=t&Dopt=s&uid=991, ehttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/mmdb/mmdbsrv.cgi?form=6&db=t&Dopt=s&uid = 992.

Um critério para a produção de uma diversidade nos domíniosvariáveis de anticorpo é mutando os resíduos nas posições que são acessíveisao solvente (conforme definido acima). Estas posições são normalmenteencontradas nos CDRs, e são tipicamente encontradas no exterior dasproteínas. Em certos exemplos de realização, as posições acessíveis aosolvente são determinadas usando coordenadas em modelos 3-dimensionaisde um anticorpo, utilizando um programa de computador, tais como o programaInsightll (Accelrys, San Diego, Califórnia). As posições acessíveis ao solventetambém pode ser determinadas utilizando algoritmos conhecidos no estado datécnica (por exemplo, e Lee Richards, J. Mol. Biol. 55, 379 (1971) e Connolly, J.Appl. Cryst. 16, 548 (1983)). A determinação das posições acessíveis aosolvente pode ser realizada utilizando um software adequado para modelageme obtenção da informação estrutural tri-dimensional da proteína a partir de umanticorpo. O software que pode ser utilizado para esses fins inclui SYBYLBiopolymer Module software {Tripos Associates). Geralmente, em certosexemplos de realização, onde um algoritmo (programa), exija o uso de entradado parâmetro tamanho, o "tamanho" de uma sonda que é utilizada no cálculo éfixada em cerca de 1,4 Angstrom ou menor. Além disso, a determinação deregiões acessíveis ao solvente utilizando e métodos da área utilizando umsoftware para computadores pessoais foram descritos por Pacios ((1994)"ARVOMOUCONTOUR: molecular surface áreas and volumes on PersonalComputers." Comput. Chem. 18(4):377-386; e (1995). "Variations of SurfaceÁreas and Volumes in Distinct Molecular Surfaces of Biomolecules." J. Mol.Model. 1:46-53.)

Em alguns casos, a seleção dos resíduos acessíveis ao solventeé adicionalmente refinada pela escolha dos resíduos acessíveis ao solventeque formam coletivamente uma região contígua mínima, por exemplo, quandoo polipeptídeo de referência ou anticorpo fonte está na sua estrutura 3-Denovelada. Por exemplo, como mostrado na Figura 2, uma região contíguacompacta (mínima) é formada por resíduos selecionados paraCDRH1/H2/H3/L1/L2/L3 do 4D5 humanizado. Um conjunto de região contíguacompacta (mínima) pode incluir apenas um subconjunto (por exemplo, CDRs 2-5) de toda a gama de CDRs, por exemplo, CDRH1/H2/H3/L3. Resíduosacessíveis ao solvente que não contribuem para a formação de tal região epodem opcionalmente ser excluídos da diversificação. O refinamento daseleção por este critério permite ao profissional minimizar, conforme desejado,o número de resíduos a ser diversificado. Por exemplo, o resíduo 28 no H1pode opcionalmente ser excluído na diversificação uma vez que este está naextremidade da região. No entanto, este critério também pode ser utilizado,sempre que for desejado, para escolher os resíduos a serem diversificados quepodem não necessariamente ser considerado acessível ao solvente.

Por exemplo, um resíduo que não é considerado acessível aosolvente, mas forma uma região contígua na estrutura 3-D enovelada comoutros resíduos que são considerados acessíveis ao solvente talvezselecionado para diversificação. Um exemplo disto é o CDRL1-29. Seleção detais resíduos será evidente para um especialista na técnica, e a sua adequaçãotambém pode ser determinada empiricamente e de acordo com asnecessidades e desejos dos técnicos hábeis.

As posições acessíveis ao solvente identificada a partir daestrutura cristalina do anticorpo 4D5 humanizado para cada CDR são asseguintes (posição dos resíduos de acordo com Kabat):

CDRL1: 28, 30, 31,32

CDRL2: 50, 53

CDRL3: 91, 92, 93, 94, 96

CDRH1: 28, 30, 31,32, 33

CDRH2: 50, 52, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58.

Além disso, em alguns exemplos de realização, o resíduo 29 doCDRL1 também pode ser selecionado com base na sua inserção em umaregião contígua que inclua outro resíduo acessível para solvente. Todos ou umsubconjunto de posições acessível ao solvente estabelecido acima pode serdiversificado nos termos dos métodos e composições da invenção. Porexemplo, em alguns exemplos de realização, apenas as posições 50, 52, 52,53-56, e 58 são aleatorizadas no CDRH2.

Outro critério para selecionar posições a serem mutadas, são asposições que revelam variabilidade na seqüência de aminoácidos quandocomprado com as seqüências de um anticorpo conhecido e/ou natural. Umaposição altamente diversificada refere-se a uma posição de aminoácidolocalizado na região variável da cadeia leve ou pesada que possua um númerode aminoácidos diferentes do representado na posição de aminoácido dasseqüências de aminoácidos quando é comparado com o anticorpo oufragmento ligante conhecido e/ou natural. As posições altamente diversificadaspodem estar na região do CDR. As posições de CDRH3 são todasconsideradas altamente diversificadas. Em certos exemplos de realização, osresíduos de aminoácidos são altamente diversificados, se tiverem de cerca de2 a 19 (embora os números possam variar conforme descrito no presente)possíveis variações diferentes de resíduos de aminoácidos em tal posição.

Em um aspecto, a identificação de posições altamentediversificadas em anticorpos conhecidos e/ou de ocorrência natural é facilitadapelos dados fornecidos por Kabat, Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest {National Institutes of Health, Bethesda, Md, 1987 e 1991). Um bancode dados baseado na Internet localizado no endereçohttp//:www.bioinf.orq.uk.abs.structures.html oferece uma extensa coleção ealinhamentos das seqüências de cadeia leve(http//:www.biomf.orq.uk.abs.lc.align) e cadeia pesada(http//:www.bioinf.orq.uk.abs.hc.aliqn) e facilita a determinação das posiçõesaltamente diversificadas, nestas seqüências. A diversidade nas posiçõesacessível ao solvente do anticorpo 4D5 humanizado nas cadeias leves epesadas conhecidas e/ou de ocorrência natural é exibida nas Figuras 3 e 4.

Em um aspecto da invenção, os resíduos altamente diversificadose acessíveis ao solvente em pelo menos um, dois, três, quatro, cinco ou todosos CDRs selecionados do grupo constituído por CDRL1, CDRL2, CDRL3,CDRH1, CDRH2, CDRH3, e suas misturas são mutantes (isto é, aleatorizadosutilizando um conjunto de códons restrito como definido no presente). Porexemplo, uma população de polipeptídeos pode ser gerada pela diversificaçãode pelo menos, um resíduo acessível ao solvente e/ou altamente diversificadono CDRL3 e CDRH3 utilizando um conjunto de códon restrito. Desta forma, ainvenção fornece um grande número de novas seqüências de anticorposformados pela substituição, de pelo menos uma posição acessível ao solventee altamente diversificada de, pelo menos, um CDR do domínio variável doanticorpo fonte com aminoácidos codificados por um códon restrito. Porexemplo, uma variante de CDR ou domínio variável de anticorpo poderepresentar uma variante de aminoacido em uma ou mais posições dosaminoácidos 28, 30, 31, 32, 33, e/ou 34 do CDRH1; e/ou em uma ou maisposições dos aminoácidos 50, 52, 52, 53, 54, 55, 56 e/ou 58 do CDRH2; e/ouem uma ou mais posições dos aminoácidos 95-100, 100a, 100b, e 100c doCDRH3; e/ou em uma ou mais posições dos aminoácidos 28, 29, 30 e/ou 31 doCDRL1; e/ou em uma ou mais posições dos aminoácidos 50 e/ou 53 noCDRL2; e/ou em uma ou mais posições dos aminoácidos 91, 92, 93, 94, 95e/ou 96 no CDRL3. Em outro exemplo, uma variante de CDR ou domíniovariável de anticorpo pode constar de um variante de aminoacido em uma oumais posições dos aminoácidos 28, 30, 31, 32, e/ou 33 do CDRH1; e/ou emuma ou mais posições dos aminoácidos 50, 52, 53, 54, 56 e/ou 58 do CDRH2;e/ou em uma ou mais posições dos aminoácidos 95-100, 100a, 100b e 100c doCDRH3; e/ou em uma ou mais posições dos aminoácidos 28, 29, 30 e/ou 31 doCDRL1; e/ou em uma ou mais posições dos aminoácidos 50 e/ou 53 noCDRL2; e/ou em uma ou mais posições dos aminoácidos 91, 92, 93, 94 e/ou96 no CDRL3. Os aminoácidos variantes nestas posições são codificados peloconjunto de códons restrito, tal como descrito no presente.

Tal como foi discutido anteriormente, os variantes de aminoácidossão codificados por um conjunto de códons restrito. Um conjunto de códons éum conjunto de diferentes seqüências de tríades de nucleotídeos utilizadospara codificar o grupo de aminoácido variante desejado. A síntese dosoligonucleotídeos com a "degenerescência" de nucleotídeos selecionados emdeterminadas posições é bem conhecida no estado da técnica. Tais conjuntosde oligonucleotídeos com determinados conjuntos de códons podem sersintetizados usando sintetizadores de ácidos nucléicos comerciais (disponívelpor, por exemplo, Applied Biosystems, Foster City, Califórnia), ou podem serobtidos comercialmente (por exemplo, pela Life Technologies, Rockville, MD).

Por isso, um conjunto de oligonucleotídeos sintetizados tendo um conjunto decódons específico irá incluir normalmente uma variedade de oligonucleotídeoscom seqüências diferentes, as diferenças estabelecidas pelo conjunto decódons dentro da seqüência global. Oligonucleotídeos, tal como utilizado napresente invenção, têm seqüências que permitem a hibridização de um moldede um ácido nucléico do domínio variável e também pode, mas nãonecessariamente, incluir locais úteis para o uso de enzimas de restrição, porexemplo, para fins de clonagem.

Em um aspecto, o repertório restrito de aminoácidos destinados aocupar um ou mais das posições acessíveis ao solvente ou altamentediversificadas nos CDRs do anticorpo 4D5 humanizado são determinados (combase no desejo do técnico praticante, que pode ser baseadas em um númeroqualquer de critérios, incluindo aminoácidos específicos para determinadasposições desejadas, ausência de aminoácido(s) específico(s) em determinadasposições desejada, tamanho da biblioteca desejada, característica de procurados ligantes ao antígeno, etc.)

CDR3s de cadeia pesada (CDRH3s) em anticorpos conhecidostêm diversas seqüências, conformações estruturais, e comprimentos. OsCDRH3s são freqüentemente encontrados no meio da área de ligação com oantígeno e freqüentemente participam no contato com o antígeno. Aelaboração do CDRH3 pode assim ser desenvolvida separadamente do que ode outras CDRs, pois pode ser difícil prever a conformação estrutural doCDRH3 e a diversidade de aminoácido nesta região é especialmenteconhecida em diversos anticorpos. De acordo com a presente invenção, oCDRH3 é elaborado para gerar diversidades nas posições específicas dentrodo CDRH3, por exemplo, nas posições 95, 96, 97, 98, 99100, 100a, 100b, e100c (por exemplo, de acordo com a numeração de Kabat no anticorpo 4D5).

Em alguns exemplos de realização, a diversidade também é gerada pelo pelavariação do comprimento de CDRH3 usando um conjunto de códons restrito. Adiversidade do comprimento pode ser de qualquer amplitude determinadaempiricamente por estar adequada para gerar uma população de polipeptídeosque contêm grandes proporções de proteínas ligantes de antígenos. Porexemplo, os polipeptídeos compreendendo o variante CDRH3 podem sergerados com a seqüência X1-X2-X3-X4-X5-(X6)n-X7-X8-X9-DY (SEQ IS No:4), no qual, X1-X9 são aminoácidos codificados pelo conjunto de códonsrestrito, e n é de comprimentos diferentes, por exemplo, n=1-11, 5-11 ou 7-11.Outros exemplos de possíveis valores de n são: 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 e 11.

Realizações ilustrativas de oligonucleotídeos que pode ser utilizados parafornecer uma variedade no comprimento da seqüência CDRH3 incluemaqueles indicados na Figura 9A-9D, Figura 20A-L e Figura 23.

Contempla-se que a diversidade na seqüência das bibliotecascriadas pela introdução de variantes de aminoácidos, em um CDR específico,por exemplo, CDRH3, pode ser aumentada através da combinação do CDRvariante com outros CDRs que possuem variações de outras regiões doanticorpo, especificamente em outras CDRs de ambas as seqüências variáveisda cadeia leve e pesada. Também é contemplado que as seqüências de ácidosnucléicos que codificam membros deste conjunto podem ser adicionalmentediversificados pela introdução de outros aminoácidos variantes nas CDRs, deambas as seqüências variáveis da cadeia leve e pesada, através de conjuntosde códons. Desta forma, em um exemplo de realização, as seqüências CDRH3dos polipeptídeos de fusão que se ligam ao antígeno alvo podem sercombinadas com seqüências CDRL3, CDRH1 ou CDRH2 diversificadas, ouqualquer combinação de CDRs diversificadas.

Deve ser notado que, em alguns casos os resíduos da regiãoestrutural podem ser variados com relação à seqüência de um anticorpo fonteou fragmento ligante ao antígeno, por exemplo, para refletir a seqüênciaconsenso ou para melhorar a estabilidade ou exibição. Por exemplo, osresíduos da cadeia pesada na região estrutural 49, 93, 94 ou 71 podem servariados. O resíduo 93 da cadeia pesada da região estrutural podem seralanina ou serina (que é a seqüência de aminoácido de consenso humanonesta posição.). O resíduo 94 da cadeia pesada da região estrutural podem seralterados de modo a refletir a seqüência consenso da região estrutural a partirda treonina a arginina ou lisina. Outro exemplo de resíduos da região estruturalque pode ser alterado é o resíduo 71 da cadeia pesada da região estrutural,que é R em cerca de 1970 polipeptídeos, V, em cerca de 627 polipeptídeos, eA em cerca de 527 polipeptídeos, como encontrado no banco de dados deKabat. O resíduo 49 da cadeia pesada da região estrutural podem ser oualanina glicina. Além disso, opcionalmente, os 3 aminoácidos N-terminal dodomínio variável da cadeia pesada podem ser removidos. Na cadeia leve,opcionalmente, o aminoácido arginina na posição 66 pode ser modificado paraglicina. Em um exemplo de realização, o resíduo 93 na cadeia pesada daregião estrutural é alanina e o resíduo 94 é arginina.

para produzir polipeptídeos de fusão que se ligam com afinidade significativaaos ligantes potenciais. Estas construções constam de domínios dimerizáveisque quando presentes em um polipeptídeo de fusão fornece um tendênciaaumentada para dimerizar as cadeias pesadas para formar dímeros defragmentos ou porções de anticorpos Fab ou Fab'. Estes domínios dedimerização podem incluir, por exemplo, uma seqüência de dobradiça dacadeia pesada (por exemplo, uma seqüência que inclui TCPPCPAPELLG (SEQID No: 5) que podem estar presentes no polipeptídeo de fusão). Os domíniosde dimerização nos polipeptídeo de fusão de fagos trazem dois conjuntos depolipeptídeos de fusão unidos (LC/HC-proteína de fago/fragmento (tal comoplll)), permitindo assim a formação de ligações adequadas (como pontes dedissulfeto entre cadeias pesadas) entre os dois conjuntos de polipeptídeos defusão. O vetor construído contendo tal domínio de dimerização pode serutilizado para alcançar a exposição divalente do domínio variável de anticorpo,por exemplo, as diversas proteínas de fusão descritas no presente, em umfago. Em certos exemplos de realização, a afinidade intrínseca de cadafragmento de anticorpo monomérico (polipeptídeo de fusão) não ésignificativamente alterada pela fusão ao domínio de dimerização. Em certosexemplos de realização, a dimerização resulta na exibição de um fagodivalente, que fornece um aumento avidez da ligação do fago, com diminuiçãosignificativa na taxa dissociação, que pode ser determinada por métodosconhecidos no estado da técnica e como descritos no presente. Os vetorescontendo o domínio de dimerização da invenção podem ou não incluir tambémum códon de parada âmbar após o domínio de dimerização.A dimerização pode ser variada para se conseguir exibircaracterísticas diferentes. Os domínios de dimerização podem incluir umaseqüência contendo um resíduo cisteína, uma região de dobradiça de anticorpode comprimento total, como uma seqüência de dimerização tal como leucina ouseqüência zíper GCN4 ou misturas destas. As seqüências de dimerização sãoconhecidas no estado da arte, e incluem, por exemplo, a seqüência zíperGCN4 (GRMKQLEDKVEELLSKNYHLENEVARLKKLVGERG) (ID SEQ No: 3).O domínio de dimerização em certos exemplos de realização está localizado naextremidade C-terminal da seqüência do domínio variável ou constante dacadeia pesada e/ou entre a seqüência do domínio variável ou constante dacadeia pesada e em qualquer seqüência do componente da proteína dacápside viral. Um códon de parada âmbar pode também estar presente no ouno final da extremidade C-terminal do domínio de dimerização. Em um exemplode realização, onde o códon de parada âmbar está presente, o domínio dedimerização codifica pelo menos uma cisteína e uma seqüência de dimerizaçãocomo um zíper de leucina. Em outros exemplos de realização, onde o códon deparada âmbar não está presente, o domínio de dimerização pode incluir umúnico resíduo cisteína.

Os polipeptídeos da invenção também podem ser fundidos aoutros tipos de polipeptídeos, a fim de adequá-los para a exibição de variantesde polipeptídeos ou fornecer a purificação, seleção ou triagem e detecção dopolipeptídeo. Para um exemplo de realização envolvendo a exibição por fago,os polipeptídeos da invenção são fundidos em toda ou parte de uma proteínada cápside viral. Exemplos de proteínas da cápside viral incluem as proteínasplll, proteína principal da cápside pVIII, Soe, Hoc, gpD, pv1, e variantes destes.Além disso, os polipeptídeos variantes produzidos de acordo com os métodosda invenção podem opcionalmente ser fundidos a um polipeptídeo marcador ouetiquetador como, por exemplo, FLAG, poli-histidina, gD, c-myc, B-galactosidase e similares.

Métodos Para Produção De Bibliotecas De Domínios VariáveisAleatorizados

Métodos para substituir um aminoácido de escolha em um ácidonucléico modelo são bem estabelecidos no estado da técnica, alguns dos quaisestão descritos no presente. Por exemplo, as bibliotecas podem ser criadaspara atingir posições acessíveis ao solvente e/ou altamente diversificada empelo menos uma substituição de aminoácido na região variante de CDRutilizando o método Kunkel. Vide, por exemplo, Kunkel ei a/., MethodsEnzymol. (1987), 154:367-382. A produção de seqüências aleatorizadastambém está descrita abaixo nos Exemplos.

A seqüência de oligonucleotídeos inclui um ou mais dos conjuntosde códons restritos elaborados para diferentes comprimentos de CDRH3 oupara posições acessíveis ao solvente ou altamente diversificadas em um CDR.

Um conjunto de códons é um conjunto de diferentes seqüências de tríades denucleotídeos utilizados para codificar o variante de aminoácidos pretendido.Um conjunto de códons pode ser representado utilizando símbolos paradesignar um nucleotídeo específico ou misturas equimolares de nucleotídeoscomo demonstrado a seguir, de acordo com o código IUB. Tipicamente, umconjunto códons é representado por três letras maiúsculas, por exemplo, KMT,TMTe similares.

código IUB

G guaninaA adeninaT timinaC CitosinaR (A ou G)Y (C ou T)M (A ou C)

K (G ou T)

S (C ou G)

W (A ou T)

H (A ou C ou T)

B (C ou G ou T)

V (A ou C ou G)

D (A ou G ou T)

N (A ou C ou G ou T)

Por exemplo, no conjunto de códons TMT, T é o nucleotídeotimina; M podem ser A ou C. Este conjunto de códons pode apresentar várioscódons e pode codificar apenas um número limitado de aminoácidos, ou seja,serina e tirosina.

Um conjunto de oligonucleotídeos ou primer pode ser sintetizadousando métodos padrões. Um conjunto de oligonucleotídeos pode sersintetizado, por exemplo, pela síntese em fase sólida, contendo seqüênciasque representam todas as combinações possíveis de tríades nucleotídicasfornecidas pelo conjunto de códons restrito e que vai codificar o grupo restritode aminoácidos desejado. A síntese dos oligonucleotídeos com a"degenerescência" de nucleotídeos selecionados em determinadas posições ébem conhecida no estado da técnica. Tais conjuntos de oligonucleotídeos comdeterminados conjuntos de códons podem ser sintetizados usandosintetizadores de ácidos nucléicos comerciais (disponível por, por exemplo,Applied Biosystems, Foster City, Califórnia), ou podem ser obtidoscomercialmente (por exemplo, pela Life Technologies, Rockville, MD). Por isso,um conjunto de oligonucleotídeos sintetizados tendo um conjunto de códonsespecífico irá incluir normalmente uma variedade de oligonucleotídeos comseqüências diferentes, as diferenças estabelecidas pelo conjunto de códonsdentro da seqüência global. Oligonucleotídeos, tal como utilizado na presenteinvenção, têm seqüências que permitem a hibridização para um CDR (porexemplo, como os contidos em um domínio variável) de um molde de um ácidonucléico e também pode incluir locais úteis para o uso de enzimas de restrição,por exemplo, para fins de clonagem.

Em um método, as seqüências de ácidos nucléicos que codificamvariantes de aminoácidos podem ser criadas por mutagênese mediada poroligonucleotídeo de uma seqüência de ácidos nucléicos que codifica umpolipeptídeo fonte ou modelo tais como os domínios variáveis do anticorpo4D5. Esta técnica é bem conhecida no estado da técnica, como descrito porZoller et al. Nucleic Acids Res. 10:6487-6504 (1987). Resumidamente, Acodificação das seqüências de ácidos nucléicos dos aminoácidos variantes écriada pela hibridização de um conjunto de oligonucleotídeos que codifica oconjunto de códons restrito desejado a um DNA molde, no qual o molde é umaforma de plasmídeo de fita simples contendo uma seqüência molde de ácidosnucléicos da região variável. Após a hibridização, o DNA polimerase é usadopara sintetizar toda uma segunda fita complementar do molde que irá, assim,integrar o prímerúe oligonucleotídeo, e irá conter o conjunto de códons restrito,como o fornecido pelo conjunto de oligonucleotídeo. Ácidos nucléicos quecodificam outras moléculas fonte ou molde são conhecidos ou podem serfacilmente determinados.

Geralmente, oligonucleotídeos de pelo menos 25 nucleotídeos decomprimento são utilizados. Um oligonucleotídeo ótimo terá pelo menos de 12a 15 nucleotídeos que são totalmente complementares ao molde de ambos oslados do(s) nucleotídeo(s) que codifica(m) a(s) mutação(ões). Isto garante queo oligonucleotídeo irá hibridizar devidamente a molécula de DNA molde de fitasimples. Os oligonucleotídeos são facilmente sintetizados através de técnicasconhecidas no estado da técnica, como o descrito por Crea ei a/., Proc. A/aí/.Acad. Sei. USA., 75:5765 (1978).

O molde de DNA (DNA templaté) é gerado pelos vetores que sãoderivados dos vetores de bacteriófago M13 (os vetores comercialmentedisponíveis M13mp18 e M13mp19 são adequados), ou vetores que contêmuma única origem de replicação de fago de fita simples, como descrito porViera et ai., Meth. Enzymol., 153:3 (1987). Assim, o DNA que será mutadopode ser inserido em um destes vetores, a fim de gerar um molde {templaté) defita simples. A produção de molde de fita simples é descrito nas seções 4.21-4.41 de Sambrook et aí., acima.

Para alterar a seqüência do DNA nativo, o oligonucleotídeo éhibridizado por um molde de fita simples nas devidas condições de hibridação.

A enzima de polimerização do DNA, geralmente 11 DNA polimerase oufragmento Klenow da DNA polimerase I, é então adicionada para sintetizar afita complementar do molde usando o oligonucleotídeo como um primer para asíntese. Uma molécula heterodúplice é assim forma de tal forma que uma fitado DNA codifica a forma mutante do gene 1, e a outra fita (o modelo original)codifica as seqüências do gene 1 nativa, inalterada. Esta moléculaheterodúplice é então utilizada para modificar uma célula hospedeiraadequada, geralmente um procarionte tal como E. coli JM101. Após ocrescimento das células, elas são semeadas em placas de agarose eselecionadas utilizando um primer com oligonucleotídeos marcadosradioativamente com um Fosfato-32 para identificar as colônias bacterianasque contêm o DNA mutado.

O método descrito imediatamente acima pode ser modificado detal forma que seja criada uma molécula homoduplex onde ambas as fitas doplasmídeo possui mutação(ões). As modificações são as seguintes: Ooligonucleotídeo de fita simplex é anelado à fita simples do molde, tal comodescrito acima. Uma mistura de três desoxirribonucleotídeos,deoxiriboadenosina (dATP), deoxiriboguanosina (dGTP) e deoxiribotimidina(dTT), é combinada com uma modificação tiodeoxiribocitosina denominadadCTP-(aS) (que pode ser obtida pela Amersham). Essa mistura é adicionadaao complexo oligonucleotídeo-molde. Após a adição da DNA polimerase namistura, uma fita de DNA idêntica a fita molde exceto pelas bases mutantes éentão produzida. Além disso, esta nova fita de DNA irá conter dCTP-(aS) emvez de dCTP, que servirá para protegê-la da digestão com endonuclease derestrição. Após a fita molde do heterodúplice de dupla fita ser cortada com umaenzima de restrição adequada, a fita molde pode ser digerida com a nucleaseExolll ou outra nuclease adequada, passando a região que contém o(s) sítio(s)a ser(em) mutagenizado(s). A reação é, então, parada para deixar umamolécula que é apenas parcialmente fita simples. Um DNA heterodúplicecompleto de fita dupla é então formado usando a DNA polimerase, na presençade todos os quatro desoxiribonucleotídeos trifosfatos, ATP, e DNA ligase. Estamolécula heterodúplice pode então ser utilizada para modificar uma célulahospedeira apropriada.

Tal como indicado anteriormente a seqüência do conjunto deoligonucleotídeo é de comprimento suficiente para hibridizar o ácido nucleicomolde e também pode, mas não necessariamente, incluir sítios de restrição.

O molde de DNA (DNA template) pode ser gerado pelos vetores que sãoderivados dos vetores de bacteriófago M13 ou vetores que contêm uma únicaorigem de replicação de fago de fita simples, como descrito por Viera et ai,Meth. Enzymol., 153:3 (1987). Assim, o DNA que será mutado pode serinserido em um destes vetores, a fim de gerar um molde (template) de fitasimples. A produção de molde de fita simples é descrito nas seções 4.21-4.41de Sambrook et al., supra.

De acordo com outro método, uma biblioteca pode ser geradapelo fornecimento de conjuntos de oligonucleotídeos à montante e à jusante,cada conjunto com uma variedade de oligonucleotídeos com diferentesseqüências, as diferentes seqüências estabelecidas pelo conjunto de códonsreferidos fornecida no interior da seqüência de oligonucleotídeos. O conjuntode oligonucleotídeos à montante e à jusante, juntamente com uma seqüênciade ácidos nucléicos molde do domínio variável, pode ser utilizada em nareação em cadeia da polimerase para gerar uma "biblioteca" de produtos dePCR. Os produtos da PCR podem ser referidos como "cassetes de ácidosnucléicos", e eles podem ser fundidos com outras seqüências de ácidosnucléicos relacionados ou não relacionados, por exemplo, componentescomponentes da proteína da cápside viral, domínios de dimerização, utilizandotécnicas de biologia molecular estabelecidas.

A seqüência dos primers de PCR inclui um ou mais dos conjuntoscódons elaborados para as posições acessíveis ao solvente ou altamentediversificadas em uma região CDR. Como descrito acima, um conjunto códonsé um conjunto de diferentes seqüências de tríades nucleotídicas utilizadas paracodificar os aminoácidos variantes desejados.

O conjunto de oligonucleotídeos pode ser utilizado em umareação em cadeia da polimerase usando uma seqüência de ácidos nucléicosmolde da região variável para a criação de cassetes de ácidos nucléicos. Aseqüência de ácidos nucléicos molde da região variável pode ser qualquerporção da seqüência de ácidos nucléicos molde da região variável da cadeialeve ou pesada da imunoglobulina (isto é, seqüências de ácidos nucléicoscodificando aminoácidos alvos para substituição). A seqüência de ácidosnucléicos molde da região variável é uma porção de uma molécula de DNAdupla fita tendo a primeira fita de ácido nucléico e a segunda fita complementarde ácido nucléico. A seqüência de ácidos nucléicos molde da região variávelcontém pelo menos uma porção de um domínio variável e tem pelo menos umCDR. Em alguns casos, seqüência de ácidos nucléicos molde da regiãovariável contém mais de um CDR. Uma porção à montante e à jusante de umaseqüência de ácidos nucléicos molde da região variável podem serdirecionadas para a hibridação com membros de um conjunto deoligonucleotídeos à montante e um conjunto de oligonucleotídeos à jusante.

Um primeiro oligonucleotídeo de um conjunto de primer à jusantepode hibridizar a primeira fita de ácido nucléico e um segundo oligonucleotídeode um conjunto de primer à montante pode hibridizar a segunda fita de ácidonucléico. Os primers de oligonucleotídeos podem incluir um ou mais conjuntosde códons serem desenhados para hibridizar uma porção da seqüência deácido nucléico molde da região variável. O uso desses oligonucleotídeos podeintroduzir dois ou mais conjuntos de códons no produto da PCR (ou seja, oscassetes de ácidos nucléicos). O primer de oligonucleotídeo que hibridiza aseqüência de ácido nucléico molde da região variável que codifica as porçõesdo domínio variável de anticorpos inclui porções que codificam resíduos deCDR que são direcionados para a substituição de aminoácidos.

Os conjuntos de oligonucleotídeos à montante e à jusantetambém podem ser sintetizados para incluir sítios de restrição na seqüênciados oligonucleotídeos. Estes sítios de restrição podem facilitar a inserção doscassetes de ácidos nucléicos [isto é, produtos da PCR] em um vetor deexpressão tendo as seqüências adicionais do anticorpo. Em certos exemplosde realização, a sítios de restrição são projetados para facilitar a clonagem doscassetes de ácidos nucléicos sem introduzir as seqüências externas de ácidosnucléicos ou removendo o CDR original ou as seqüências da região estrutural.

Cassetes de ácidos nucléicos podem ser clonados em qualquervetor de expressão adequado de uma parte ou da totalidade da seqüência dacadeia leve ou pesada contendo a substituição do aminoácido alvo gerada. Deacordo com os métodos descritos na invenção, o cassete de ácido nucléico éclonado em um vetor que permite produção de uma parte ou da totalidade daseqüência da cadeia leve ou pesada fundida a todas ou apenas uma parte deuma proteína da cápside viral (ou seja, a criação de uma proteína de fusão) eexibida na superfície de uma partícula ou célula. Embora vários tipos devetores sejam disponíveis e podem ser utilizados para a prática destainvenção, vetores de fagomídeos são convenientes, pois eles podem serconstruídos com relativa facilidade, e pode facilmente ser amplificados. Vetoresfagomídeos geralmente contêm uma variedade de componentes, incluindopromotores, seqüências sinal, genes de seleção fenotípica, sítios de origem dereplicação, e outros componentes necessários conhecidos por aqueles hábeisno assunto.

Em outro exemplo de realização, no qual uma combinação de umaminoácido variante específico deve ser expressa, o cassete de ácido nucléicocontém uma seqüência que é capaz de codificar a totalidade ou parte dodomínio variável da cadeia pesado ou leve, e é capaz de codificar ascombinações da variante de aminoácido. Para a produção de anticorpos quecontêm estes aminoácidos variantes ou combinações de aminoácidosvariantes, como em uma biblioteca, o cassete de ácido nucléico pode serinserido em um vetor de expressão contendo a seqüência adicional deanticorpos, por exemplo, toda ou parte da região do domínio variável ouconstante da cadeia leve e pesada. Estas seqüências de anticorpos adicionaistambém podem ser fundidas a outras seqüências de ácidos nucleicos, taiscomo as seqüências que codificam os componentes das proteínas da cápsideviral e, por conseguinte, permitem a produção de uma proteína de fusão.

Vetores

Um aspecto da invenção inclui um vetor de expressão replicávelconstando de ácidos nucleicos que compreende uma seqüência que codificaum gene de fusão, no qual o gene de fusão codifica uma proteína de fusão quecompreende uma polipeptídeo contido no CDR (tal como um domínio variávelde anticorpo), ou um domínio variável ou constante de anticorpo, fundidos atotalidade ou parte de uma proteína da cápside viral. Também está incluídauma biblioteca de diversos vetores de expressão replicável que compreendeuma variedade de genes de fusão que codificam uma variedade de proteínasde fusão, incluindo uma variedade de polipeptídeos de fusão produzidos comdiversas seqüências, como descrito acima. Os vetores podem incluir umavariedade de componentes e pode ser construído de modo a permitir omovimento do domínio variável do anticorpo entre os diferentes vetores e/oufornecer a exibição das proteínas de fusão em diferentes formatos.

Exemplos de vetores incluem vetores fagos e vetores fagomídeos(que são ilustrado no presente, e descritos em maiores detalhes acima). Umvetor fago geralmente tem uma origem de replicação de fago permitindo areplicação e a formação da partícula do fago. O fago é geralmente umbacteriófago filamentoso, tais como um fago M13, fl, fd, Pf3 ou um derivadodestes, ou um fago lambdóide, tais como lambda, 21, phi80, phi81, 82, 424,434 e etc, ou um derivado destes.

Exemplos de proteínas da cápside viral incluem a proteína dainfecciosidade plll (por vezes também designada p3), proteína principal dacápside pVIII, Soe (T4), Hoc (T4), gpD (de bacteriófago lambda), proteína 6 dacápside secundária do bacteriófago (pVI) (fago filamentosp; J ImmunolMethods. Dezembro de 1999; 10, 231(l-2):39-51), variantes da proteína (P8)principal da cápside do bacteriófago M13 (Protein Sei 9 abril de 2000; (4) :647-54). A proteína de fusão pode ser exibida na superfície de um fago e sistemasde fagos adequados incluem sistemas auxiliadores de fago M13K07, M13R408,M13-VCS, e Phi X 174, pJuFo (J Virol. Agosto de 2001; 75(15):7107-13.v),híperfago (Nat Biotechnol Jan 2001;19(l):75-8). Em certos exemplos derealização, o auxiliador de fago é M13K07, e as proteínas são as proteínas dacápside do gene III do fago M13. Em certos exemplos de realização, a célulahospedeira é a E. coli, e cepas de E. coli deficientes de protease. Vetores, taiscomo o vetor fthl {Nucleic Acids Res. Maio de 2001 15; 29 (10): E50-0) podeser útil para a expressão da proteína de fusão.

O vetor de expressão pode também ter uma seqüência de sinalde secreção fundida ao DNA que codifica um polipeptídeo de fusão contendo oCDR (por exemplo, cada subunidade do anticorpo, ou fragmentos destes). Estaseqüência é tipicamente localizada imediatamente ao 5'do gene que codifica aproteína de fusão, e por isso serão transcritas na amino terminal da proteína defusão. No entanto, em certos casos, tem sido demonstrado que a seqüênciasinal está localizada em posições diferentes de 5'do gene que codifica aproteína de ser secretada. Esta seqüência alvo da proteína que se encontramassociadas por todo o interior da membrana celular bacteriana. O DNA quecodifica a seqüência de sinal pode ser obtido como um fragmento de restriçãopor endonuclease de um gene que codifica uma proteína que tem umaseqüência sinal. Seqüências sinais adequadas em procariotos podem serobtidas a partir de genes que codificam, por exemplo, LamB ou OmpF (Wonget al., Gene, 68:1931 (1983), MalE, PhoA e outros genes. Em um exemplo derealização, uma seqüência de sinal de procariótico para a prática destainvenção é a seqüência sinal da E. coli enterotoxina II termo-lábil (STII), comodescrito por Chang etal., Gene 55:189 (1987), e/ou malB.

Como indicado acima, um vetor também inclui normalmente umpromotor para direcionar a expressão do polipeptídeo de fusão.Promotoresmais comumente utilizados em vetores procarióticos incluem o sistemapromotor lac Z, promotor da fosfatase alcalina pho A (AP), o promotor debacteriófago 1PL (promotor sensível à temperatura), promotor tac, promotor detriptofano, promotor de bacteriófago T7. Para descrições gerais dospromotores, consulte a seção 17 de Sambrook et al. Supra. Embora estessejam os promotores mais comumente utilizados, outros promotoresadequados podem ser também utilizados.

O vetor pode também incluir outras seqüências de ácidosnucléicos, por exemplo, seqüências que codificam marcadores gD, epítopos dec-Myc, marcadores poli-histidina, proteínas fluorescentes (por exemplo, GFP),ou proteína beta-galactosidase que podem ser úteis na detecção ou purificaçãoda proteína de fusão expressas na superfície da célula ou fago. Seqüências deácidos nucléicos que codificam, por exemplo, uma marcador gD, fornecetambém para a seleção positiva ou negativa de células ou vírus que expressama proteína de fusão. Em alguns exemplos de realização, o marcador gD éfundido a um domínio variável de anticorpo que não é fundido a umcomponente da proteína da cápside viral. As seqüências de ácidos nucléicoscodificando, por exemplo, um marcador poli-histidina, são úteis para aidentificação de proteínas de fusão incluindo domínios variáveis de anticorpoque se ligam a um antígeno específico usando a técnica de imuno-histoquímica. Marcadores úteis para a detecção da ligação ao antígeno podemser ligados tanto a um domínio variável de anticorpo não fundido a umcomponente da proteína da cápside viral, quanto a um domínio variável deanticorpo fundido a um componente da proteína da cápside viral.

Outro componente útil dos vetores utilizados para a prática destainvenção são os genes de seleção fenotípica. Genes de seleção fenotípicaespecíficos são os genes que codificam proteínas que conferem resistência àantibióticos nas células hospedeiras. Com o objetivo de ilustrar, o gene queconfere resistência a ampicilina (ampr), e o gene de resistência a tetraciclina(tetr) são facilmente empregados para este propósito.

O vetor pode também incluir seqüências de ácidos nucléicoscontendo sítios de restrição únicos e códons de parada que podem sersuprimidos. Os sítios de restrição únicos são úteis para transportar os domíniosvariáveis de anticorpos entre os diferentes vetores e sistemas de expressão,especialmente úteis para a produção de anticorpos de comprimento total oufragmentos ligantes de antígenos em culturas de células. Os códons de paradaque podem ser suprimidos são úteis para controlar o nível de expressão daproteína de fusão e facilitar a purificação dos fragmentos solúveis deanticorpos. Por exemplo, um códon de parada âmbar pode ser lido como Glnem um hospedeiro supE para permitir a exibição por fago, em quanto umhospedeiro não-supE que é lido como um códon de parada para produzirfragmentos solúveis de anticorpos sem a fusão a uma proteína da cápside dofago. Estas seqüências sintéticas podem ser fundidas a um ou mais domíniovariável de anticorpo no vetor.

Por vezes, é benéfico o uso de sistemas de vetor que permitem acodificação de ácidos nucléicos para uma seqüência de anticorpo de interesse,por exemplo, um CDR tendo aminoácidos variantes, que pode ser facilmenteremovido do sistema de vetor e colocado em outro sistema de vetor. Porexemplo, a sítios de restrição adequados podem ser desenvolvidos em umsistema de vetor para facilitar a remoção da seqüência de ácidos nucléicos quecodifica um anticorpo ou domínio variável de anticorpo com os aminoácidosvariantes. Aas seqüências de restrição são normalmente escolhidas paraserem únicas nos vetores para facilitar a excisão e ligação no novo vetor.

Anticorpos ou domínio variável de anticorpo pode então ser expresso porvetores sem as seqüências de fusão externas, tal como as proteínas dacápside viral ou outra seqüência marcadora.

Entre os ácidos nucléicos que codificam o domínio variável ouconstante do anticorpo (gene 1) e o componente da proteína da cápside viral(gene 2), pode ser inserido um DNA que codifica um códon de parada, essecódon de terminação inclui UAG (Âmbar), SAU (Ocre) e UGA (Opala).(Microbiology, Davis et ai, Harper & Row, Nova Iorque, 1980, págs. 237, 245-47 e 374). O códon de terminação ou de parada expresso em uma célulahospedeira do tipo selvagem resulta na síntese de proteína do gene 1 sem aproteína produzida pelo gene 2 anexada. Entretanto, o crescimento em umacélula hospedeira supressora resultados na síntese de quantidades detectáveisde proteínas fundidas. Estas células hospedeiras supressoras são bemconhecidas e descritas, tais como cepa supressora de E. coli (Bullock et ai,BioTechniques 5:376-379 (1987)). Qualquer método aceitável pode serutilizado para colocar o códon de terminação no RNAm que codifica opolipeptídeo de fusão.

O códon que pode ser suprimido pode ser inserido entre oprimeiro gene que codifica um domínio variável ou constante do anticorpo, eum segundo gene que codifica pelo menos uma parte da proteína da cápsidedo fago. Alternativamente, o códon de terminação que pode ser suprimido podeser inserido de maneira adjacente ao sítio de fusão através da substituição daúltima tríade de aminoácido no domínio variável do anticorpo ou do primeiroaminoácido na proteína da cápside do fago. O códon de terminação que podeser suprimido pode estar localizado na, ou após a extremidade C-terminal deum domínio de dimerização. Quando o plasmídeo contendo o códon que podeser suprimido é cultivado em uma célula hospedeira supressora, resulta naprodução detectável de um polipeptídeo de fusão contendo o polipeptídeo e aproteína da cápside. Quando o plasmídeo é cultivado em uma célulahospedeira não-supressora, o domínio variável de anticorpo ésubstancialmente sintetizado sem a fusão da proteína da cápside do fagodevido ao terminador inserido na tríade supressora UAG, UAA ou UGA. Nascélulas não supressoras o domínio variável de anticorpo é sintetizado esecretado pela célula hospedeira, devido à ausência da fusão da proteína dacápside do fogo com outra proteína ancorada a membrana desta célulahospedeira.

Em alguns exemplos de realização, o CDR sendo diversificado(aleatorizado) pode ter um códon de parada projetado na seqüência molde(aqui referido como um "molde de parada"). Esse recurso fornece com êxitopara a detecção e seleção de seqüências diversificadas baseadas nareparação do(s) códon(s) de parada na seqüência molde devido à incorporaçãodo(s) oligonucleotídeo(s) compreendendo a(s) seqüência(s) para osaminoácidos variantes de interesse. Esta característica é ainda ilustrada nosExemplos a seguir.

O domínio variável ou constante da cadeia leve e pesada doanticorpo também pode ser fundido a uma seqüência peptídica adicional,fornecendo a interação de um ou mais polipeptídeos de fusão na superfície dapartícula viral ou célula. Estas seqüências peptídicas são aqui referidas como"domínios de dimerização". Domínios de dimerização podem incluir pelo menosuma ou mais seqüências dimerização ou, pelo menos, uma seqüência queinclui um resíduo cisteína ou ambos. Seqüências de dimerização adequadasincluem a das proteínas que possuem alfa-hélice anfipática no qual os resíduoshidrofóbicos estão regularmente espaçados e permitem a formação de umdímero pela interação dos resíduos hidrofóbicos de cada proteína; taisproteínas e porções de proteínas incluem, por exemplo, regiões de zíper deleucina. Domínios de dimerização também podem incluir um ou mais resíduosde cisteína (por exemplo, como fornecido pela inclusão de uma seqüência daregião de dobradiça do anticorpo dentro do domínio de dimerização). Osresíduos de cisteínas podem fornecer dimerização pela formação de uma oumais ligações de dissulfetos. Em um exemplo de realização, no qual o códonde parada está presente após o domínio de dimerização, o domínio dedimerização compreende, pelo menos, de um resíduo cisteína. Em algunsexemplos de realização, os domínios de dimerização estão localizados entre odomínio variável ou constante do anticorpo e os componentes da proteína dacápside viral.Em alguns casos, o vetor codifica um único anticorpo-polipeptídeode fago em uma cadeia única contendo, por exemplo, ambas as regiõesvariáveis pesada e leve fundidas a uma proteína da cápside. Nestes casos, ovetor é considerado como "monocistrônico", expressando uma transcrição sobo controle de um promotor específico. Por exemplo, um vetor pode utilizar umpromotor (tal como a fosfatase alcalina (AP) ou promotor Tac) para conduzir aexpressão de uma seqüência monocistrônica que codifica os domínios Vl e Vh,com um peptídeo ligante entre os domínios Vl e Vh. Esta seqüência cistrônicapode ser conectada a extremidade 5' de uma seqüência sinal (como, porexemplo, uma seqüência sinal de malE ou enterotoxina II termo-lábil (STII) daE. coli) e, na sua extremidade 3' a proteína da cápside viral completa ou empare desta (como, por exemplo, a proteína do bacteriófago plll). O polipeptídeode fusão codificado por um vetor deste exemplo de realização é referido como"ScFv-plH". Em alguns exemplos de realização, um vetor pode aindacompreende uma seqüência que codifica um domínio de dimerização (comoum zíper de leucina) na sua extremidade 3', entre a segunda seqüência dodomínio variável (por exemplo, Vh) e a seqüência da proteína da cápside viral.Polipeptídeos de fusão compreendendo o domínio de dimerização são capazesde dimerizar para formar um complexo de dois polipeptídeos scFv (referidos nopresente como "(ScFv)2-plll").

Em outros casos, as regiões variáveis de cadeias leves e pesadaspodem ser expressas em polipeptídeos separados, utilizando assim um vetor"bicistrônico", permitindo a expressão de transcrições separadas. Nestesvetores, um promotor adequado, tal como o promotor a Ptac ou PhoA, éutilizado para direcionar a expressão de a mensagem bicistrônica. Um primeirocístron codificando, por exemplo, um omínio variável de cadeia leve, pode serconectado a extremidade 5' de uma seqüência sinal, tal como uma seqüênciasinal de malE ou enterotoxina II termo-lábil (STII) da E. colie, na extremidade 3'uma seqüência de ácidos nucléicos que codifica uma seqüência de marcação,tal como marcador gD. Um segundo cístron, codificando, por exemplo, umdomínio variável e um domínio constante da cadeia pesada CH1, está ligadona sua extremidade 5' a uma seqüência sinal, tal como uma seqüência sinal demalE ou enterotoxina II termo-lábil (STII) da E. coli e, na extremidade 3' umaproteína da cápside viral completa ou em pare desta.

Em um exemplo de realização de um vetor que fornece umamensagem bicistrônica para a exibição de F(ab')2-plll, um promotor adequado,tal como o promotor Ptac ou PhoA (AP) promotor, conduz a expressão de umprimeiro cístron que codifica o domínio variável de cadeia leve e um domínioconstante operacionalmente ligado a extremidade 5' de uma seqüência sinal,tal como uma seqüência sinal de malE ou enterotoxina II termo-lábil (STII) daE. coli e, na extremidade 3' uma seqüência de ácidos nucléicos que codificauma seqüência de marcação, tal como marcador gD. O segundo cístroncodifica, por exemplo, um domínio variável e constante da cadeia pesadaoperacionalmente ligado na extremidade 5' a uma seqüência sinal, tal comouma seqüência sinal de malE ou enterotoxina II termo-lábil (STII) da E. coli e,na extremidade 3' tem um domínio de dimerização compreendendo a região dedobradiça da IgG e uma seqüência de zíper de leucina seguida por pelo menosuma porção de proteína da cápside viral.

Exibição de Polipeptípeos de Fusão

Polipeptídeos de fusão de um polipeptídeo contendo CDR (porexemplo, um domínio variável de anticorpo) pode ser exibido na superfície deuma célula, vírus, ou partícula de fagomídeo em uma variedade de formas.Essas formas incluem fragmentos Fv de cadeia única (scFv), fragmento F(ab) eformas polivalente destes fragmentos. Por exemplo, formas multivalentesincluem um de ScFv, Fab, ou F(ab'), denominados no presente como (ScFv)2,F(ab)2 e F(ab')2, respectivamente. As formas multivalentes de exibição sãovantajosas em alguns contextos, em parte porque eles têm mais de um sítio deligação ao antígeno que geralmente resulta na identificação de clones commenor afinidade e também permite a triagem mais eficiente de clones rarosdurante o processo de seleção.

Métodos para a exibição dos polipeptídeos de fusão quecompreendem fragmentos de anticorpos sobre a superfície do bacteriófago sãobem conhecidos no estado da técnica, por exemplo, como descrito napublicação patente número WO 92/01047 e no presente. Outras publicações depatentes WO 92/20791, WO 93/06213, WO 93/11236 e WO 93/19172,descrevem métodos e são todos incorporados ao presente pela referência.Outras publicações têm demonstrado a identificação de anticorpos comrepertórios do gene V artificialmente reorganizado contra uma variedade deantígenos exibidos na superfície de um fago (como, por exemplo, em H. R.Hoogenboom & G. Winter, J. Mol. Biol. 227 381-388 (1992); e tal comodivulgado nos documentos WO 93/06213 e WO 93/11236).

Quando um vetor é construído para exibição em um forma scFv,que inclui seqüências de ácidos nucléicos que codifica um domínio variável dacadeia leve do anticorpo e um domínio variável da cadeia pesada do anticorpo.Tipicamente, a seqüência de ácidos nucléicos que codifica um domínio variávelda cadeia pesada do anticorpo é fundida a um componente da proteína dacápside viral. Um ou ambos os domínios variáveis de anticorpo pode teraminoácidos variantes em, pelo menos, uma região de CDR. A seqüência deácido nucléico que codifica o domínio variável da cadeia leve está conectada aseqüência de ácido nucléico que codifica o domínio variável da cadeia pesadapor uma seqüência de ácido nucléico que codifica um polipeptídeo ligante. Opolipeptídeo ligante normalmente contém cerca de 5 a 15 aminoácidos.Opcionalmente, outras seqüências de codificação, por exemplo, marcadoresúteis para purificação ou detecção podem ser fundidos na extremidade 3' daseqüência de ácido nucléico que codifica o domínio variável da cadeia leve oudomínio variável da cadeia pesada ou de ambos.

Quando um vetor é montado para exibição F(ab), ele incluiseqüências de ácido nucléico que codificam domínios variáveis de anticorpo edomínios constantes de anticorpo. Um ácido nucléico que codifica um domíniovariável de cadeia leve é unido a uma seqüência de ácido nucléico que codificaum domínio contante de cadeia leve. Uma seqüência de ácido nucléico quecodifica um domínio variável de cadeia pesada de anticorpo é unida a umaseqüência de ácido nucléico que codifica um domínio CH1 contante de cadeiapesada. Tipicamente, a seqüência de ácido nucléico que codifica domíniosvariáveis e constantes de cadeia pesada são unidas a uma seqüência de ácidonucléico que codifica toda ou parte de uma proteína de envelope viral. Um ouambos domínios variáveis de cadeia leve ou pesada de anticorpo podem teraminoácidos variantes em pelo menos um CDR. Em algumas realizações, osdomínios variáveis e contantes de cadeia pesada são expressos como umafusão com pelo menos uma porção de uma proteína de envelope viral, e osdomínios variáveis e contantes de cadeia leve são expressos separadamenteda proteína de envelope viral de fusão de cadeia pesada. As cadeias leves epesadas associam-se umas com as outras, podendo ser por ligação covalenteou não-covalente. Opcionalmente, outras seqüências que codificam, porexemplo, expressão de polipepitídeo útil para purificação e detecção, podemser unidas no final 3' da seqüência de ácido nucléico que codifica o domínioconstante de cadeia leve de anticorpo ou o domínio constante de cadeiapesada de anticorpo ou ambos.

Em alguns exemplos de realização, um a molécula bivalente, porexemplo, um dímero F(ab)2 ou F(ab')2, é usado para exibir fragmentos deanticorpos com as substituições de aminoácidos variantes na superfície de umapartícula. Verificou-se que os dímeros F(ab')2 geralmente têm a mesmaafinidade como os dímeros F(ab) em um ensaio de ligação ao antígeno emfase líquida, mas a velocidade de dissociação do F(ab')2 é menor devido a umamaior avidez. Por isso, a forma bivalente (por exemplo, F(ab')2) é uma formaparticularmente útil, uma vez que pode permitir a identificação de clones commenor afinidade e permite também a triagem mais eficiente de clones rarosdurante o processo de seleção.

Introdução De Vetores Em Células Hospedeiras

Vetores construídos como descrito em conformidade com ainvenção são introduzidos em uma célula hospedeira para a amplificação e/ouexpressão. Vetores podem ser introduzidos em células hospedeiras utilizandométodos normais de modificação, incluindo eletroporação, precipitação emfosfato de cálcio e similares. Caso o vetor seja uma partícula infecciosa, talcomo um vírus, o próprio vetor fornece a entrada na célula hospedeira. Atransfecção das células hospedeiras contendo um vetor de expressãoreplicável que codifica um gene de fusão e a produção das partículas do fagode acordo com procedimentos padrões fornece partículas de fago no qual aproteína de fusão é exibida na superfície da partícula do fago.

Vetores de expressão replicáveis são introduzidos nas célulashospedeiras utilizando uma variedade de métodos. Em um exemplo derealização, vetores podem ser introduzidos em células utilizando aeletroporação, tal como descrito no documento WO/00106717. As células sãocultivadas em caldo de cultura padrão, opcionalmente por cerca de 6 a 48horas (ou até atingir uma OD6oo = 0,6 - 0,8) a cerca de 37°C, e, em seguida, ocaldo é centrifugado e o sobrenadante removido (por exemplo, pordecantação). Em alguns exemplos de realização, a purificação inicial inclui aresuspensão o pellet de célula em uma solução tampão (por exemplo, 1,0 mMde HEPES pH 7,4), seguida por uma nova centrifugação e remoção dosobrenadante. O pellet de célula resultante é resuspenso em diluente glicerol(por exemplo: 5-20% v/v) e novamente centrifugado para formar um pellet decélulas e ter o sobrenadante removido. A concentração final é obtida por célulapela resuspensão do pellet de células em água ou glicerina diluída naconcentração desejada.

Em certos exemplos de realização, a célula receptora é uma cepade E. coli competente a eletroporação da presente invenção, que é a E. colicepa SS320 (Sidhu et a/., Methods. Enzymol. (2000), 328:333-363). A cepaSS320 foi preparada por meio de cruzamentos com células MCI061 XL1-BLUEem condições suficientes para transferir episomo de fertilidade (plasmídeo F')ou XL1-BLUE em células MC1061. A cepa SS320 foi depositada com o númeroda American Type Culture Collection (ATCC), 10801 University Boulevard,Manassas EUA, em 18 de junho de 1998 e com o Número de Acesso N°98795. Qualquer episomo F' que permita a replicação no fago na cepa pode serutilizado na invenção. Episomos adequados estão disponíveis a partir dascepas depositadas junto com a ATCC ou são disponíveis comercialmente(CJ236, CSH18, FHD, JM101, JM103, JM105, JM107, JM109, JM110),KS1000, XL1-blue, 71-18 e outros).

A utilização de concentrações mais elevadas de DNA duranteeletroporação (cerca de 10X) aumenta a eficiência de modificação e a aumentaa quantidade de DNA modificado nas células hospedeiras. A utilização deelevadas concentrações de células (cerca de 10X) também aumenta aeficiência. A maior quantidade de DNA transferido produz bibliotecas maiorescom uma maior diversidade e representam um grande número de membrosúnicos de uma biblioteca combinatória. Células transformadas geralmente sãoselecionadas pelo crescimento em meio contendo antibióticos.

Seleção (Triagem) E Rastreio de Ligantes Para os Alvos de Escolha

O uso de exibição por fago para a identificação de ligantes para oantígeno alvo, com suas várias permutações e variações na metodologia, estãobem estabelecidas no estado da técnica. Uma abordagem envolve construiruma família de vetores variantes replicáveis contendo um elemento reguladorde transcrição operacionalmente ligado a um gene que codifica umpolipeptídeo de fusão, modificando as células hospedeiras adequadas, ecultivando as células transformadas para formar partículas de fagos queexibam o polipeptídeo de fusão na superfície do fago, seguido por um processoque implica na seleção ou triagem pela exposição das partículas de fagosrecombinantes com um antígeno alvo de modo a que pelo menos uma parte dapopulação de partículas liga-se ao alvo com o objetivo de aumentar eenriquecer os subconjuntos de partículas que se ligam das partículas que nãose ligam no âmbito do processo de seleção. O pool selecionado pode seramplificado pela infecção em células hospedeiras, tais como células XLI-Blue,para uma outra etapa de triagem no mesmo alvo com a mesma ou comestringência diferente. O pool de variantes é então rastreado contra o antígenoalvo para identificar novas proteínas ligantes de alta afinidade. Estas novasproteínas com alta afinidade de ligação podem ser úteis como agentesterapêuticos como agonistas ou antagonistas, e/ou como reagentes paradiagnóstico e pesquisa.

Os polipeptídeos de fusão tais como domínios variáveis deanticorpos compreendendo aminoácidos variantes podem ser expressos nasuperfície de um fago, partícula de fagomídeo ou célula e, em seguida,selecionado e/ou rastreado pela capacidade dos membros do grupo dopolipeptídeo de fusão se ligar a um antígeno alvo que é tipicamente o antígenode interesse. Os processos de seleção para os ligantes ao alvo podem tambémser incluídos selecionando em uma proteína genérica tendo afinidade para odomínio variável de anticorpo tal como a proteína L ou um marcador deanticorpo específico que se liga ao anticorpo ou fragmentos de anticorpoexibidos no fago, que podem ser utilizados para enriquecer os membros dabiblioteca que exibem fragmentos de anticorpo corretamente enovelados(polipeptídeos de fusão).

Proteínas alvo, tais como os receptores DR5 e HER-2 podem serisolados a partir de fontes naturais ou preparados pelos métodosrecombinantes por procedimentos conhecidos no estado da técnica.Seqüências de DR5 humano e murino são fornecidas na Tabela 1. A seqüênciae a preparação do HER-2 ECD foi descrita em Franklin MC. Carey KD. VajdosFF. Leahy DJ. de Vos AM. Sliwkowski MX, Insights into ErbB signaling from thestructure of the ErbB2-pertuzumab complex, Câncer Cell. 5(4):317-28, 2004. Aseqüência de aminoácidos de um domínio extracelular 23-646 da HER-2 éfornecida no Protein DataBank Record 1S78 (2004). Antígenos alvos podemincluir um número de moléculas da terapia de interesse.

Uma variedade de estratégias de seleção (triagem) por afinidadepode ser usado. Um exemplo é um método de triagem em suporte sólido outriagem em placa ou triagem com o alvo imobilizada. Outro exemplo é ométodo de ligação em solução. Para o método de triagem em suporte sólido, aproteína alvo pode ser fixada em uma matriz sólida ou semi-sólida apropriada.Tais matrizes são conhecidas no estado da técnica como, por exemplo, esferasde agarose, esferas de acrilamida, esferas de vidro, celulose, várioscopolímeros acrílicos, géis de metacrilato hidroxila, copolímeros poliacrílico epolimetacrílico, nylon, transportadores neutros e iônicos, e semelhantes. Afixação da proteína alvo à matriz pode ser realizada através dos métodosdescritos em Methods in Enzymology, vol. 44 (1976) ou por outra técnicaconhecida no estado da arte.

Após a fixação do antígeno alvo na matriz, a alvo imobilizada éexposto a biblioteca expressando os polipeptídeos de fusão em condiçõesadequadas para a ligação de pelo menos um subconjunto da partícula do fagocom o antígeno alvo imobilizado. Normalmente, as condições, incluindo o pH,força iônica, temperatura e similares irá mimetizar as condições fisiológicas.Partículas ligadas ("ligantes") ao alvo imobilizado são separadas por lavagemdas partículas que não se ligam ao alvo. As condições de lavagem podem serajustadas para resultar na remoção de todos, menos os ligantes de altaafinidade. Os ligantes podem ser dissociados do alvo imobilizado por umavariedade de métodos. Estes métodos incluem a dissociação competitivautilizando um ligante do tipo selvagem (por exemplo, excesso de antígenoalvo), alterando o pH e/ou força iônica, e outros métodos conhecidos no estadoda técnica. A seleção de ligantes envolve tipicamente a eluição de uma matrizde afinidade com um material adequado para eluição ta como ácido como HCI0,1M ou ligantes. A eluição com o aumento da concentração de ligante poderiaeluir as moléculas ligantes exibidas de afinidade aumentada.

Os ligantes podem ser isolados e em seguida re-amplificados emcélulas hospedeiras adequadas pela infecção das células com as partículasvirais que são ligantes (e auxiliadores de fago se necessário, por exemplo,quando a partícula viral é uma partícula de fagomídeo) e as célulashospedeiras são então cultivadas sob condições adequadas para aamplificação das partículas que exibem o polipeptídeo de fusão pretendido. Aspartículas de fago são coletadas e o processo de seleção é repetido uma oumais vezes, até que os ligantes do antígeno alvo estejam enriquecidos.Qualquer número de etapa de seleção ou triagem pode ser utilizado. Um dosprocessos de seleção ou triagem pode envolver o isolamento de ligantes quese ligam a uma proteína de afinidade genérica como, por exemplo, a proteína Lou um anticorpo para um polipeptídeo marcador presente no polipeptídeoexibido como, por exemplo, anticorpos para a proteína gD ou marcador poli-histidina. A contraseleção pode ser incluída em uma ou várias etapas deseleção ou triagem para isolar ligantes que também apresentam ligaçãoindesejada a um ou mais antígenos não alvo.Um aspecto da invenção envolve seleção contra bibliotecas dainvenção utilizando um novo método de seleção que é denominado "método deligação em solução". A invenção a triagem na fase de solução com muito maiseficiência do que os métodos de triagem em solução convencionais. O métodode ligação em solução pode ser utilizado para encontrar ligantes originais apartir de uma biblioteca aleatorizada ou identificando ligantes melhorados emuma biblioteca que foi designada para melhorar a afinidade de um determinadoclone ligante ou grupo de clones. O método compreende na exposição de umavariedade de polipeptídeos, tal como polipeptídeos expostos por fagos oupartículas de fagomídeos (biblioteca), com um antígeno alvo marcado oufundido com uma molécula marcadora. O marcador pode ser a biotina ououtras moléculas ligantes específicas disponíveis para este fim. A estringênciada fase de solução pode variar utilizando concentrações decrescentes deantígeno alvo marcado na primeira fase de solução. Para aumentar ainda maisa estringência, a primeira fase de ligação em solução pode ser seguida poruma segunda fase em solução com alta concentração de antígeno alvo nãomarcado após a ligação inicial com o antígeno marcado na primeira fase desolução. Normalmente, um excesso de 100 a 1000 vezes de antígeno alvo nãomarcado é usado na segunda fase (se for incluída). A duração do período deincubação da primeira fase de solução pode variar de alguns minutos a um ouduas horas ou mais para alcançar o equilíbrio. Usando um período curto detempo nesta primeira fase de ligação pode influenciar ou selecionar ligantesque têm velocidade de dissociação rápida. O período de tempo e temperaturade incubação na segunda fase pode ser modificado para aumentar oestringência. Esta fornece uma influencia de seleção para ligantes quepossuem velocidade lenta de velocidade de dissociação (off-rate) lenta ao alvo.Após a exposição de uma variedade de polipeptídeos (exibido no fago /partículas de fagomídeo) com um antígeno alvo, o fago ou partículas defagomídeo que estão ligadas aos antígenos alvos marcados são separados dosfagos que não se ligaram. A mistura da partícula-alvo na fase de solução deligantes é isolada expondo esta com a molécula alvo marcada e permitindo queestes se liguem a molécula que está ligada a molécula alvo marcada por umcurto período de tempo (por exemplo, de 2 a 5 minutos). A concentração inicialdo antígeno alvo marcado pode variar em cerca de 0,1 nM a cerca de I000 nM.

As partículas ligadas são eluídas e podem ser propagadas para a próximaetapa de triagem. Em certos exemplos de realização, várias etapas de triagemsão realizadas utilizando concentrações cada vez menores de antígeno alvomarcado a cada etapa de triagem.

Por exemplo, uma classificação ou seleção inicial utilizando cercade 100 a 250 nM de antígeno alvo marcado deve ser o suficiente para capturar umavasta gama de afinidades, embora este fator possa ser determinado empiricamentee/ou adaptado ao desejo do técnico. Na segunda etapa de seleção, cerca de 25 a100 nM de antígeno alvo marcado pode ser utilizado. Na terceira etapa de seleção,cerca de 0,1 nM a 25 nM de antígeno alvo marcado pode ser utilizado. Por exemplo,para melhorar a afinidade 100 nM de um ligante, pode ser desejável para iniciarcom 20 nM e, em seguida, aumentar progressivamente de 1 a 5 nM de antígenoalvo marcado e, então, seguido por uma concentração ainda mais baixa como cercade 0,1 nM de antígeno alvo marcado.

A solução de triagem convencional envolve o uso de esferascomo esferas revestidas de estreptoavidina, que são muito pesadas para usoe, muitas vezes, resultam em uma eficiência muito baixa a recuperação do fagoligante. A solução de triagem convencional com esferas leva um tempo muitomaior do que 2-5 minutos e é menos viável para adaptar a alta produçãoautomatizada que a invenção descreve acima.

Tal como descrito no presente, combinações de um suporte sólidoe os métodos de triagem em solução pode ser vantajosamente utilizados paraisolar ligantes com características desejadas. Após a seleção/triagem noantígeno alvo por algumas etapas, o rastreio de clones individuais a partir deum pool geralmente é realizado para identificar ligantes específicos depropriedades/ características desejadas. Em alguns exemplos de realização, oprocesso de triagem é realizado por sistemas automatizados para permitir umatriagem de alto rendimento de biblioteca candidatas.

Dois métodos principais de rastreio são descritas a seguir. Noentanto, outros métodos conhecidos no estado da técnica também podem serutilizados nos métodos da invenção. O primeiro método de rastreio inclui umensaio de ELISA em fago com o antígeno alvo imobilizado, que permite aidentificação de um clone ligante específico a partir de um clone não ligante. Aespecificidade pode ser determinada pela análise simultânea do clone empoços revestidos com o alvo e BSA ou poços revestidos com outras proteínasque não são as proteínas alvo. Este ensaio é automatizado para uma seleçãode alto rendimento.

Um exemplo de realização fornece um método de seleção paraum domínio variável de anticorpo que se liga a um antígeno alvo específico deuma biblioteca de domínio variável de anticorpos, gerando uma biblioteca devetores de expressão replicável compreendendo uma variedade depolipeptídeos; e expondo a biblioteca com um antígeno alvo e, pelo menos, umantígeno que não é o antígeno alvo em condições adequadas para a ligação; eseparando os polipeptídeo ligantes na biblioteca dos não ligantes; eidentificando os ligantes que se ligam ao antígeno alvo e os que não se ligamao antígeno que não é o antígeno alvo; e eluindo os ligantes do antígeno alvo;e amplificando os vetores de expressão replicável contendo os polipeptídeosligantes que se ligam a um antígeno específico.

O segundo ensaio de triagem é um ensaio de triagem porafinidade fornecido para separar clones que possuem alta afinidade dos clonesque possuem baixa afinidade, em uma maneira de alta produção. No ensaio,cada clone é testado com e sem a primeira incubação cm o antígeno alvo emconcentração específica, por um período de tempo (por exemplo, 30 a 60minutos) antes da aplicação nos poços previamente revestidos com antígeno(por exemplo, por 5 a 15 minutos). Depois o fago ligado é mensurado pelométodo habitual de ELISA com fago, por exemplo, utilizando anti-M13conjugados com HRP. A relação do sinal de ligação dos dois poços, um que foipré-incubado com antígeno e o outro e assim não pré-incubado com antígenoalvo é uma indicação de afinidade. A seleção da concentração do antígeno alvopara a primeira incubação depende da abrangência de afinidade de interesses.Por exemplo, se os ligantes com afinidade superior a 10 nM são desejados,então freqüentemente é utilizado 100 nM de antígeno alvo na primeiraincubação. Uma vez que os ligantes são encontrados a partir de uma etapa detriagem (seleção), estes clones podem ser rastreados com um ensaio porafinidade de rastreio para identificar os ligantes com maior afinidade.

Combinações de alguns métodos de triagem/seleção descritosacima podem ser realizadas com os métodos de rastreio. Por exemplo, em umexemplo de realização, os polipeptídeo ligantes são primeiro selecionados pelaligação ao antígeno alvo imobilizado. Os polipeptídeo ligantes que se ligam aoantígeno alvo imobilizado podem então ser amplificados e rastreados pelaligação ao antígeno alvo e pela ausência de ligação aos antígenos que não sãoos antígenos alvo. Os polipeptídeo ligantes que se ligam especificamente aoantígeno alvo são então amplificados. Estes polipeptídeos ligantes podem,então, ser selecionados por alta afinidade pela exposição com umaconcentração de antígeno alvo marcado para formar um complexo, em umafaixa de antígenos marcados de cerca de 0,1 nM a 1000 nM, os complexos sãoisolados pela exposição com um agente que se liga ao marcador sobre oantígeno alvo. Os polipeptídeos ligantes são eluídos dos antígenos alvomarcados e opcionalmente, as etapas de seleção são repetidas, utilizandosempre uma concentração menor de antígeno alvo marcado a cada etapa. Ospolipeptídeos ligantes de alta afinidade isolados utilizando este método deseleção podem então ser rastreados pela alta afinidade usando uma variedadede métodos conhecidos no estado da técnica, alguns dos quais estão descritosno presente.

Esses métodos podem localizar clones com alta afinidade, semter que realizar longos e complexos ensaios de afinidade por competição sobreum grande número de clones. O aspecto intensivo em realizar ensaioscomplexos de muitos clones é freqüentemente um obstáculo importante parase encontrar melhores clones por seleção. Este método é especialmente útil natentativa de melhoria na afinidade no qual vários ligantes com afinidadesemelhantes podem ser recuperados a partir do processo de seleção.Diferentes clones podem ter a eficiência de expressão / de exibição em fago oupartículas de fagomídeo muito diferentes. Esses clones mais altamenteexpressos apresentam melhores chances de recuperação. Isto é, a seleçãopode ser induzida pelos níveis de exibição ou expressão dos variantes. Ométodo de classificação dos ligantes em solução da invenção pode melhorar oprocesso de seleção para localizar ligantes com alta afinidade. Este método éum ensaio para se rastrear a afinidade que fornece uma vantagem significativaem termos de triagem de ligantes melhores de forma rápida e fácil.

Os anticorpos ou fragmentos ligantes de antígenos ainda podemser selecionados pela atividade funcional, por exemplo, por exemplo, atividadeagonista ou antagonista. Por exemplo, anticorpos anti-HER-2 podem serselecionados pela capacidade de inibir a fosforilação da tirosina em HER-2 e aproliferação de células cancerosas ou de induzir apoptose em célulascancerosas. Ensaios para identificar e mensurara essas atividades estãodescritas, por exemplo, no documento W098/17797.Além disso, anticorpos anti-DR5 podem ser selecionados pelacapacidade de induzir a apoptose em células cancerosas e/ou inibir a funçãodas células inflamatórias. Em outros exemplos de realização, anticorpos anti-DR5 são selecionados pela capacidade de competir com o DR5 pela ligação aoApo-2L Em outros exemplos de realização, anticorpos anti-DR5 humano sãoselecionados pela ligação ao DR5 murino e/ou DR5 de macacos cinomolgos.Ensaios para se determinar a atividade biológica podem ser realizados pormeio de métodos conhecidos no estado da técnica, como a fragmentação deDNA (vide, por exemplo, Marsters et ai, Curr. Biology, 6:1669 (1996)),inativação da caspase, ligação ao DR5 (vide, por exemplo, documento WO98/51793, publicado em 19 de Novembro de 1998. O nível de apoptose podeser mensurada através da identificação da condensação do citoplasma, perdadas micro vilosidades da membrana plasmática, segmentação do núcleo,degradação do DNA cromossômico ou perda da função mitocondrial. Estaatividade pode ser determinada e mensurada, por exemplo, por ensaios deviabilidade celular (tal como o ensaio com Alamar blue ou ensaios MTT),análise por FACS, ativação da caspase, fragmentação do DNA (vide, porexemplo, Nicoletti et ai, J. Immunoi Methods, 139: 271-279 (1991), epolimerase ribose poli-ADP, clivagem de "PARP" e ensaios conhecidos noestado da técnica.

Em um exemplo de realização, como o ensaio para a apoptoseenvolve a realização de duas vezes as diluições seriais do controle padrão e doanticorpo anti-DR5 em placas de cultura de 96 poços. O Apo-2 ligante(aminoácidos 114-281, descrito na PCT US 00/17579) é testada para efeitos decomparação. Colo-205 (20000 células - poço) com células de carcinoma decólon humano (ATCC) são semeadas em placas de 96 poços. As placas sãoincubadas a 37°C por 24 horas. AlamazBlue (Trek Diagnostic Systems, Inc.) éadicionado aos poços nas últimas 3 a 24 horas do tempo de incubação. Afluorescência é lida utilizando um fluorômetro para placas de 96 poços utilizando ocomprimento de onda para a excitação de 530 nm e de emissão a 590 nm. Osresultados são expressos como unidades de fluorescência relativa (RFU).

Após a identificação dos ligantes pela ligação ao antígeno alvo,e/ou ensaios funcionais dos ácidos nucléicos podem ser extraídas. O DNAextraído pode então ser utilizado diretamente para transformar célulashospedeiras de E. coli ou alternativamente, as seqüências de codificação podeser amplificadas, por exemplo, utilizando PCR com primers adequados, eseqüenciados por qualquer método típico seqüenciamento. O DNA de domíniosvariáveis dos ligantes pode ser digerido por enzima de restrição e, em seguida,inserido em um vetor para a expressão da proteína.

Populações compreendendo polipeptídeos tendo CDR(s) comseqüências de diversidade restrita de acordo com os métodos da invençãopodem ser utilizados para isolar ligantes contra uma variedade de alvos,incluindo aqueles listados nas Figuras 11, 15, 21A e 24A. Estes ligantes podemcompreender um ou mais CDRs variantes abrangendo diversas seqüênciasgeradas usando códons restritos. Em alguns exemplos de realização, umaCDR variante é CDRH3 compreendendo a diversidade de seqüência geradapela substituição de aminoácidos com um conjunto de códons restrito e/ouinserções de aminoácidos resultantes de CDRH3 de comprimentos variados.Oligonucleotídeos ilustrativos úteis para a geração de polipeptídeos de fusão dainvenção incluem os referidos nas Figuras 9A-D, Figuras 20A-L e Figura 23. Um oumais CDRs variantes podem ser combinados. Em alguns exemplos de realização,apenas o CDRH3 é diversificado. Em outros exemplos de realização, dois ou maisCDRs de cadeia pesada, incluindo o CDRH3, são variantes. Em outros exemplosde realização, um ou mais CDRs de cadeia pesada, excluindo o CDRH3, sãovariantes. Em alguns exemplos de realização, pelo menos um CDR de cadeiapesada e, pelo menos, um de cadeia leve são variantes, Em alguns exemplos derealização, pelo menos um, dois, três, quatro, cinco ou todos os CDRs H1, H2, H3,L1, L2 e L3 são variantes.

Em alguns casos, pode ser benéfico combinar um ou mais CDRsde diversificados de cadeia leve com os novos ligantes isolados a partir de umapopulação de polipeptídeos que inclui um ou mais CDRs de cadeia pesadadiversificados. Este processo pode ser referido como um processo etapa-2. Umexemplo de um processo etapa-2 compreende primeira a determinação deligantes (geralmente ligantes de menor afinidade) dentro de uma ou maisbibliotecas geradas pela aleatorização de um ou mais CDRs, no qual os CDRsaleatorizados, em cada biblioteca são diferentes, ou, no caso de o mesmo CDRser aleatorizado, este é aleatorizado para gerar seqüências diferentes. Ligantesde uma biblioteca de cadeia pesada podem então ser aleatorizados com umavariedade de CDR de cadeia leve, por exemplo, pela técnica de mutagênese,tal como a técnica de Kunkel, ou por clonagem (recortar e colar (por exemplo,pela ligação de diferentes seqüências de CDR juntas)) A nova biblioteca decadeia leve na cadeia pesada do ligante atual que possui apenas uma fixaçãona cadeia leve. O pool pode então ser adicionalmente classificado contra umou mais alvos para identificar ligantes que possuem uma afinidade aumentada.Ligantes (por exemplo, ligantes de baixa afinidade) obtidos a partir de umatriagem de H1/H2/H3 podem, por exemplo, serem fundidos com umadiversidade de bibliotecas de L1/L2/L3 para substituir os L1/L2/L3 originaisfixos, no qual as novas bibliotecas são então selecionadas adicionalmentecontra um alvo de interesse para se obter outro conjunto de ligantes (porexemplo, ligantes de alta afinidade). Novas seqüências de anticorpo queexibem maior afinidade de ligação podem ser identificadas por uma variedadede antígenos alvo.

Em alguns exemplos de realização, bibliotecas compreendendopolipeptídeos da invenção são submetidas a uma variedade de etapas detriagem, no qual cada etapa inclui a triagem compreende a exposição doligante obtido da etapa anterior com um(alguns) antígeno(s) alvo(s) distinto(s)do(s) antígeno(s) alvo(s) da(s) etapa(s) anterior(es). Preferencialmente, masnão necessariamente, os antígenos alvos são homólogos na seqüência, porexemplo, membros de uma família de polipeptídeos relacionadas, masdistintos, como por exemplo, mas não limitado a, citocinas (por exemplo,subtipos de interferon alfa).Produção de Bibliotecas Compreendendo Polipeptídeos Contendo CDR

Variante

Bibliotecas de polipeptídeos CDR variantes podem ser produzidaspela mutação de uma posição acessível ao solvente e/ou altamentediversificada em, pelo menos, um CDR de um domínio variável do anticorpo.

Alguns ou todos os CDRs podem ser mutados usando os métodos dainvenção. Em alguns exemplos de realização, pode ser preferível a gerardiversas bibliotecas de anticorpos pela mutação em posições de CDRH1,CDRH2 e CDRH3 para formar uma única biblioteca ou a pela mutação deposições em CDRL3 e CDRH3 para formar uma única biblioteca ou pelamutação de posições em CDRL3 e CDRH1, CDRH2 e CDRH3 para formaruma única biblioteca.

Uma biblioteca de domínio variável de anticorpos pode serproduzida, por exemplo, por mutações na posição acessível ao solvente e/oualtamente diversificada de CDRH1, CDRH2 e CDRH3. Outra biblioteca pode sergerada com mutações no CDRL1, CDRL2 e CDRL3. Estas bibliotecas tambémpodem ser usadas em conjunção com outras para gerar ligantes de afinidadesdesejadas. Por exemplo, depois de uma ou várias etapas de seleção das bibliotecasde cadeia pesada para a ligação a um antígeno alvo, uma biblioteca de cadeia levepode ser substituída na população dos ligantes de cadeia pesada por etapas deseleção adicionais para aumentar a afinidade dos ligantes.Em um exemplo de realização, uma biblioteca é criada pelasubstituição de aminoácidos originais com um conjunto limitado deaminoácidos variantes na região CDRH1, CDRH2 e/ou CDRH3 da regiãovariável da seqüência de cadeia pesada e/ou da região CDRL3 da regiãovariável da seqüência de cadeia leve. De acordo com a invenção, estabiblioteca pode incluir uma variedade de seqüências de anticorpos, no qual avariedade de seqüência é principalmente na região CDRH3 da seqüência decadeia pesada.

Em um aspecto, a biblioteca é criada no contexto da seqüência doanticorpo 4D5 humanizado, ou a seqüência de aminoácidos da regiãoestrutural do anticorpo 4D5 humanizado. Em certos exemplos de realização, abiblioteca é criada pela substituição de, pelo menos, os resíduos 28 e 30-33 deCDRH1, os resíduos 50, 52-54, 56 e 58 de CDRH2, os resíduos 95, 96, 97, 98,99, 100, 100a, 100b e 100c de CDRH3, os resíduos 91-94 e 96 de CDRL3 como conjunto de aminoácidos estabelecidos como exibido na Figura 8 para abiblioteca "YSGR-A". Em certos exemplos de realização, a biblioteca é criadapela substituição de, no mínimo, os resíduos 28 e 30-33 de CDRH1, osresíduos 50, 52-54, 56 e 58 de CDRH2, os resíduos 95, 96, 97, 98, 99, 100,100a , 100b e 100c de CDRH3, os resíduos 91-94 e 96 de CDRL3 com oconjunto de aminoácidos estabelecidos como exibido na Figura 8 para abiblioteca "YSGR-B". Em certos exemplos de realização, a biblioteca é criadapela substituição de, pelo menos, os resíduos 28 e 30-33 de CDRH1, osresíduos 50, 52-54, 56 e 58 de CDRH2, os resíduos 95, 96, 97, 98, 99, 100,100a, 100b e 100c de CDRH3, e os resíduos 91-94 e 96 de CDRL3 com oconjunto de aminoácidos estabelecidos como exibido na Figura 8 para abiblioteca "YSGR-C". Em certos exemplos de realização, a biblioteca é criadapela substituição de, pelo menos, os resíduos 28 e 30-33 de CDRH1, osresíduos 50, 52-54, 56 e 58 de CDRH2, os resíduos 95, 96, 97, 98, 99, 100,100a, 100b e 100c de CDRH3, os resíduos 91-94, 96 de CDRL3 com oconjunto de aminoácidos estabelecidos como exibido na Figura 8 para abiblioteca "YSGR-D". As posições de aminoácidos 100b e 100c podem ter umidentificador alfabético diferente dependendo do comprimento do CDRH3, masestas posições são as duas últimas posições de CDRH3 antes da posição 101.Exemplos de seqüências adequadas de oligonucleotídeos incluem, mas não selimitando a, as listadas nas Figuras 9A-D e pode ser determinado pelo técnicoespecialista no assunto, de acordo com os critérios descritos no presente.

Em certos exemplos de realização, a biblioteca é criada pelasubstituição de, pelo menos, os resíduos 28 e 30-33 de CDRH1, os resíduos50, 52, 53, 54, 56 e 58 de CDRH2, os resíduos 95-1 OOm de CDRH3, osresíduos 91-94 e 96 de CDRL3 com o conjunto de aminoácidos estabelecidoscomo exibido na Figura 19A para a biblioteca "SAH3". Em certos exemplos derealização, a biblioteca é criada pela substituição de, pelo menos, os resíduos28 e 30-33 de CDRH1, os resíduos 50, 52, 53, 54, 56 e 58 de CDRH2, osresíduos 95-1 OOm de CDRH3, os resíduos 91-94 e 96 de CDRL3 com oconjunto de aminoácidos estabelecidos como exibido na Figura 19A para abiblioteca "SCH3". Em certos exemplos de realização, a biblioteca é criada pelasubstituição de, pelo menos, os resíduos 28 e 30-33 de CDRH1, os resíduos50, 52, 53, 54, 56 e 58 de CDRH2, os resíduos 95-1 OOm de CDRH3, osresíduos 91-94 e 96 de CDRL3 com o conjunto de aminoácidos estabelecidoscomo exibido na Figura 19A para a biblioteca "SFH3". Em certos exemplos derealização, a biblioteca é criada pela substituição de, pelo menos, os resíduos28 e 30-33 de CDRH1, os resíduos 50, 52, 53, 54, 56 e 58 de CDRH2, osresíduos 95-1 OOm de CDRH3, os resíduos 91-94 e 96 de CDRL3 com oconjunto de aminoácidos estabelecidos como exibido na Figura 19A para abiblioteca "SGH3". Em certos exemplos de realização, a biblioteca é criada pelasubstituição de, pelo menos, os resíduos 28 e 30-33 de CDRH1, os resíduos50, 52, 53, 54, 56 e 58 de CDRH2, os resíduos 95-1 OOm de CDRH3, osresíduos 91-94 e 96 de CDRL3 com o conjunto de aminoácidos estabelecidoscomo exibido na Figura 19A para a biblioteca "SIH3". Em certos exemplos derealização, a biblioteca é criada pela substituição de, no pelo menos, osresíduos 28 e 30-33 de CDRH1, os resíduos 50, 52, 53, 54, 56 e 58 de CDRH2,os resíduos 95-1 OOm de CDRH3, os resíduos 91-94 e 96 de CDRL3 com oconjunto de aminoácidos estabelecidos como exibido na Figura 19A para abiblioteca "SLH3". Assim como o comprimento de CDRH3 varia, as duasúltimas posições antes da posição 101 podem ter diferentes identificadoresalfabéticos dependendo do comprimento do CDRH3, mas estas posições sãoas duas últimas posições de CDRH3 antes da posição 101. Exemplos deseqüências adequadas de oligonucleotídeos incluem, mas não se limitando a,as listadas nas Figuras 20A-20L, e pode ser determinado pelo técnicoespecialista no assunto, de acordo com os critérios descritos no presente.

Em certos exemplos de realização, a biblioteca é criada pelasubstituição de, pelo menos, os resíduos 28 e 30-33 de CDRH1, resíduos 50,52, 53, 54, 56 e 58 de CDRH2, os resíduos 95-1 OOm de CDRH3, os resíduos91-94 e 96 de CDRL3 com o conjunto de aminoácidos estabelecidos comoexibido na Figura 19B para a biblioteca "SNH3". Em certos exemplos derealização, a biblioteca é criada pela substituição de, pelo menos, os resíduos28 e 30-33 de CDRH1, os resíduos 50, 52, 53, 54, 56 e 58 de CDRH2, osresíduos 95-1 OOm de CDRH3, os resíduos 91-94 e 96 de CDRL3 com oconjunto de aminoácidos estabelecidos como exibido na Figura 19B para abiblioteca "SPH3". Em certos exemplos de realização, a biblioteca é criada pelasubstituição de, pelo menos, os resíduos 28 e 30-33 de CDRH1, os resíduos50, 52, 53, 54, 56 e 58 de CDRH2, os resíduos 95-1 OOm de CDRH3, osresíduos 91-94 e 96 de CDRL3 com o conjunto de aminoácidos estabelecidoscomo exibido na Figura 19B para a biblioteca "SRH3". Em certos exemplos derealização, a biblioteca é criada pela substituição de, pelo menos, os resíduos28 e 30-33 de CDRH1, os resíduos 50, 52, 53, 54, 56 e 58 de CDRH2, osresíduos 95-1 OOm de CDRH3, os resíduos 91-94 e 96 de CDRL3 com oconjunto de aminoácidos estabelecidos como exibido na Figura 19B para abiblioteca "STH3". Em certos exemplos de realização, a biblioteca é criada pelasubstituição de, pelo menos, os resíduos 28 e 30-33 de CDRH1, os resíduos50, 52, 53, 54, 56 e 58 de CDRH2, os resíduos 95-1 OOm de CDRH3, osresíduos 91-94 e 96 de CDRL3 com o conjunto de aminoácidos estabelecidoscomo exibido na Figura 19B para a biblioteca "SWH3". Em certos exemplos derealização, a biblioteca é criada pela substituição de, pelo menos, os resíduos28 e 30-33 de CDRH1, os resíduos 50, 52, 53, 54, 56 e 58 de CDRH2, osresíduos 95-1 OOm de CDRH3, os resíduos 91-94 e 96 de CDRL3 com oconjunto de aminoácidos estabelecidos como exibido na Figura 19B para abiblioteca "SYH3". Assim como o comprimento de CDRH3 varia, as duasúltimas posições antes da posição 101 podem ter diferentes identificadoresalfabéticos dependendo do comprimento do CDRH3, mas estas posições sãoas duas últimas posições de CDRH3 antes da posição 101. Exemplos deseqüências adequadas de oligonucleotídeos incluem, mas não se limitando a,as listadas nas Figuras 20A-20L, e pode ser determinado pelo técnicoespecialista no assunto, de acordo com os critérios descritos no presente.

Em certos exemplos de realização, a biblioteca é criada pelasubstituição de, pelo menos, os resíduos 28 e 30-33 de CDRH1, os resíduos50, 52, 53, 54, 56 e 58 de CDRH2, os resíduos 95-1 OOm de CDRH3, osresíduos 91-94 e 96 de CDRL3 com o conjunto de aminoácidos estabelecidoscomo exibido na Figura 22 para a biblioteca "SY". Em certos exemplos derealização, a biblioteca é criada pela substituição de, pelo menos, os resíduos28 e 30-33 de CDRH1, os resíduos 50, 52, 53, 54, 56 e 58 de CDRH2, osresíduos 95-1 OOm de CDRH3, os resíduos 91-94 e 96 de CDRL3 com oconjunto de a minoácidos estabelecidos como exibido na Figura 22 para abiblioteca "SW". Em certos exemplos de realização, a biblioteca é criada pelasubstituição de, pelo menos, os resíduos 28 e 30-33 de CDRH1, os resíduos50, 52, 53, 54, 56 e 58 de CDRH2, os resíduos 95-1 OOm de CDRH3, osresíduos 91-94 e 96 de CDRL3 com o conjunto de aminoácidos estabelecidoscomo exibido na Figura 22 para a biblioteca "SR". Em certos exemplos derealização, a biblioteca é criada pela substituição de, pelo menos, os resíduos28 e 30-33 de CDRH1, os resíduos 50, 52, 53, 54, 56 e 58 de CDRH2, osresíduos 95-1 OOm de CDRH3, os resíduos 91-94 e 96 de CDRL3 com oconjunto de aminoácidos estabelecidos como exibido na Figura 22 para abiblioteca "SF". Assim como o comprimento de CDRH3 varia, as duas últimasposições antes da posição 101 podem ter diferentes identificadores alfabéticosdependendo do comprimento do CDRH3, mas estas posições são as duasúltimas posições de CDRH3 antes da posição 101. Exemplos de seqüênciasadequadas de oligonucleotídeos incluem, mas não se limitando aquelaslistadas na Figura 23, e pode ser determinado pelo técnico especialista noassunto, de acordo com os critérios descritos no presente

Em certos exemplos de realização, uma biblioteca é criada pelacombinação com outras bibliotecas. Em um exemplo de realização, a biblioteca"SXH3" como utilizada no presente compreende as bibliotecas, SAH3, SCH3,SFH3, SGH3, SIH3, SLH3, SNH3, SPH3, SRH3, STH3, SWH3 e SYH3. Emoutro exemplo de realização, a biblioteca "SX-superfície" compreende asbibliotecas "SY", "SW", "SR" e "SF".

Em outro exemplo de realização, diferentes projetos de CDRH3são utilizados para isolar ligantes de alta afinidade e para isolar ligantes parauma variedade de epítopos. Para a diversidade na CDRH3, várias bibliotecaspodem ser construídas separadamente, com diferentes comprimentos do H3 e,em então combinada para a seleção de ligantes para antígenos alvo. Aamplitude de comprimentos de CDRH3 gerada nesta biblioteca pode ser de 10-21,11-21, 12-21, 13-21, 14-21, 15-21, 16-21, 17-21, 18-21, 19-21, 20-21aminoácidos, apesar de que diferentes comprimentos deste também podem sergerados. A diversidade também pode ser gerada nos CDRH1 e CDRH2, comoindicado acima. Em um exemplo de realização de uma biblioteca, a diversidadena H1 e H2 é gerada utilizando os oligonucleotídeos ilustrados nas Figuras 9A-D, L-20A e Figura 23. Outras oligonucleotídeos com variações nas seqüênciastambém podem ser usados. Oligonucleotídeos podem ser usados isoladamenteou agrupados em uma variedade de combinações dependendo da funçãoprática da necessidade e desejos do praticante. Em alguns exemplos derealização, posições aleatorizadas nos CDRs da cadeia pesada incluem aslistadas nas Figuras 8, 9, 11,15, 19, 21, 22, 23, e24.

Múltiplas bibliotecas podem ser reunidas e ordenadas usandométodos de suporte sólido e seleção em solução como descrito no presente.Estratégias de múltiplas classificações podem ser empregadas. Por exemplo,uma variação envolve a classificação no alvo ligado a fase sólida, seguido poruma triagem por um marcador que possa estar presente sobre o polipeptídeode fusão (por exemplo, marcador anti-gD) e em seguida por outra classificaçãono alvo ligado a fase sólida. Alternativamente, as bibliotecas podem serclassificadas primeiro em um alvo ligado a uma superfície sólida, os liganteseluídos são então ordenados usando uma ligação em fase líquida com adiminuição das concentrações de antígeno alvo. O uso de combinações dediferentes métodos de triagem fornece a minimização de seleção de apenasseqüências altamente expressas e fornece a seleção de um número elevadode clones de diferentes afinidades.

Dos ligantes isolados do pool de bibliotecas como descrito acima,foi descoberto que, em alguns casos, afinidade pode ser melhorada pelofornecimento de diversidade limitado, à cadeia leve. A diversidade da cadeialeve pode ser, mas não é, necessariamente, gerada através de variações nasposições 91-96 de aminoácido no CDRL3 ou em um subconjunto deste. Em umexemplo de realização, as posições aleatorizadas são aquelas listadas nasFiguras 8, 9, 11,15, 19, 21, 22, 23, e 24.

Ligantes de alta afinidade isolados a partir de bibliotecas destesexemplos de realização são facilmente produzidos em bactérias e em culturade células eucarióticas em alto rendimento. Os vetores podem ser projetadospara se remover com facilidade seqüências como, por exemplo, o marcadorgD, a seqüência do componente da proteína da cápside viral, e/ou paraacrescentar em seqüências da região constante para fornecer a produção deanticorpos de comprimento total ou fragmentos de ligação ao antígeno em altorendimento. Qualquer combinação de conjuntos de códons e CDRs podem serdiversificadas, de acordo com os métodos da invenção.

Vetores Células Hospedeiras e Métodos Recombinantes

Para a produção recombinante de um anticorpo da invenção, osácidos nucléicos que codificadores são isolados e inseridos em um vetorreplicável para a clonagem (amplificação do DNA) ou para a expressão.Codificando o DNA o anticorpo é facilmente isolado e seqüenciado utilizandoprocedimentos convencionais (por exemplo, pela utilização de sondas deoligonucleotídeos que são capazes de se ligar especificamente aos genescodificadores das cadeias leves e pesadas do anticorpo). Muitos vetores estãodisponíveis. A escolha do vetor depende em parte da célula hospedeira queserá utilizada. Células hospedeiras geralmente preferidas incluem, mas semlimitar-se a, células de origem procariótica ou euçariótica (geralmente demamíferos).

Produção De Anticorpos Utilizando Células Hospedeiras Procarióticas

Construção De Vetores

Seqüências polinucleotídicas codificadoras de polipeptídeoscomponentes do anticorpo da invenção podem ser obtidas utilizando técnicaspadrões de recombinação. As seqüências polinucleotídicas desejadas podemser isoladas e seqüenciadas de células produtoras de anticorpos, como célulasde hibridomas. Alternativamente, polinucleotídeos podem ser sintetizadosutilizando sintetizadores de polinucleotídeos ou técnicas de PCR. Uma vezobtido, as seqüências codificadoras de polipeptídeos são inseridas em umvetor recombinante capaz de replicar e expressar os polinucleotídeosheterólogos em hospedeiros procarióticos. Muitos vetores que estãodisponíveis e são conhecidos no estado da técnica podem ser utilizados paraos fins da presente invenção. A seleção de um vetor apropriado vai dependerprincipalmente do tamanho dos ácidos nucléicos a serem inseridos no vetor e acélula hospedeira específica a ser transformada com o vetor. Cada vetorcontém diversos componentes, dependendo de sua função (amplificação ouexpressão de polinucleotídeos heterólogos, ou ambos), e de suacompatibilidade coma a célula hospedeira particular na qual reside. Oscomponentes dos vetores geralmente incluem, mas não estão limitados a: umaorigem de replicação, um gene marcador de seleção, um promotor, um local deligação do ribossomo (RBS), um seqüência sinalizadora, a inserção do ácidonucléico heterólogo e uma seqüência de terminação de transcrição.

Geralmente, vetores plasmidiais recombinantes que contêmseqüências de controle e replicon que são derivadas de espécies compatíveiscom a célula hospedeira são utilizados na conexão com estas hospedeiras. Ovetor normalmente conduz como componentes da cadeia principal uma origemde local de reprodução, bem como seqüências de marcação que são capazesde fornecer seleção fenotípica em células transformadas. Por exemplo, a E.co//,é tipicamente, transformada utilizando um pBR322, um plasmídeo obtido apartir de uma espécie E. coli. pBR322 que possui os genes que conferem aresistência a ampicilina (Amp) e a tetraciclina (Tet) e, portanto, fornece meiospara a identificação de células transformadas. As pBR322, seus derivados, ououtros plasmídeos microbianos ou bacteriófagos também podem conter, ouserem modificados por, promotores, que podem ser utilizados pelo organismomicrobiano para a expressão de proteínas endógenas. Exemplos de derivadosde pBR322 utilizados para a expressão de anticorpos específicos são descritosem detalhes em Carter et al, Patente US 5.648.237.

Além disso, vetores de fagos que contêm seqüências de controlee de réplica que são compatíveis com o microorganismo hospedeiro podem serutilizados como vetores de transformação em conexão com esses hospedeiros.Bacteriófago tal como À.GEM.TM.-11, por exemplo, pode ser utilizado nafabricação de vetor recombinante que pode ser utilizado para transformarcélulas hospedeiras suscetíveis tais como a E. coli LE392.

O vetor de expressão da invenção pode incluir dois ou mais parespromotores de cístrons, codificando cada componente do polipeptídeo. Opromotor é uma seqüência de regulação não traduzida localizada à montante(5') de um cístron que modula a sua expressão. Promotores de procariotosgeralmente se enquadram em duas classes, os induzíveis e os constitutivos.Os promotores induzíveis são promotores que iniciam níveis aumentados detranscrição do cístron sob seu controle em resposta a mudanças na condiçãode cultura, por exemplo, a presença ou ausência de um nutriente ou mudançana temperatura.

Uma grande quantidade de promotores é reconhecida por umasérie de células hospedeiras potenciais. O promotor selecionado pode estaroperacionalmente ligado a um DNA cístron que codifica a cadeia leve oupesada, ao remover o promotor do DNA fonte por meio de enzimas de restriçãoe inserindo a seqüência do promotor isolado no vetor da invenção. Tanto aseqüência promotora nativa e muitos promotores heterólogos podem serutilizados para direcionar a amplificação, pois eles geralmente permitem maiortranscrição e rendimentos mais altos do gene alvo expresso, quandocomparado ao polipeptídeo promotor alvo nativo.

Os promotores apropriados para uso com hospedeirosprocarióticos incluem o promotor phoA, sistemas promotores de lactose e 8-lactamase, sistema promotor de triptofano {trp) e promotores híbridos, taiscomo o promotor tac ou trc. Entretanto, outros promotores que são funcionaisem bactérias (tais como outros promotores de fagos ou bacterianosconhecidos) também são apropriados. Suas seqüências de nucleotídeos forampublicadas, de forma a permitir que os técnicos no assunto as liguemoperacionalmente a unidades de transcrição que codificam cadeias leve epesada alvo (Siebenlist ei al, Cell, 20: 269 (1980)) utilizando ligantes ouadaptadores para fornecer quaisquer locais de restrição necessários.

Em um aspecto da invenção, cada cístron no vetor recombinantecompreende um componente da seqüência sinalizadora de secreção que levaa translocação dos polipeptídeos expressos através de uma membrana. Deforma geral, a seqüência sinalizadora pode ser um componente do vetor oupode ser uma parte do DNA do polipeptídeo alvo que é inserido no vetor. Aseqüência sinalizadora de secreção selecionada para os propósitos de acordocom a presente invenção deverá ser uma que seja reconhecida e processada(ou seja, clivada por uma peptidase sinalizadora I) pela célula hospedeira. Paracélulas hospedeiras procarióticas que não reconhecem e processam asseqüências sinalizadoras nativas para os polipeptídeos heterólogos, aseqüência sinalizadora é substituída por uma seqüência sinalizadoraprocariótica selecionada, por exemplo, a partir do grupo que consiste defosfatase alcalina, penicilinase, Ipp ou líderes de enterotoxina II estáveis aocalor (STII), LamB, PhoE, PelB, OmpA e MBP. Em um exemplo de realização,a seqüência sinalizadora utilizada em ambos os cístrons do sistema deexpressão é uma seqüência sinalizadora STII ou variante desta.Em outro aspecto, a produção de imunoglobulinas pode ocorrerno citoplasma das células hospedeiras, e assim não necessitando da presençadas seqüências sinais de secreção dentro de cada cístron. A este respeito, acadeia leve e pesada da imunoglobulina são expressas, em dobro e reunidaspara formar imunoglobulinas funcionais no citoplasma. Determinadas linhagensde células hospedeiras (por exemplo, cepas de E.Coli trxB) fornecemcondições citoplásmicas que favorecem a formação de pontes de dissulfeto,permitindo desta forma a dobradiça e reunião apropriada das subunidades dasproteínas expressas. Proba e Plukthun, Gene, 159:203(1995).

A presente invenção fornece um sistema de expressão no qualrelação quantitativa do componente de polipeptídeo expresso pode sermodulado de forma a maximizar o rendimento do anticorpo secretado edevidamente montado da invenção. Tal modulação é realizada, pelo menos emparte, pela modulação translacional simultânea das fitas para os componentesdo polipeptídeo.

Uma técnica para modular a força de tradução é descrita emSimmons et ai, Patente US 5.840.523. São utilizadas variantes da região deinício da tradução (TIR) em um cístron. Para uma dada TIR, uma série deseqüência de aminoácido ou ácido nucléico variante podem ser criadas comuma variação nas forças de tradução, fornecendo desta forma, meiosconvenientes para ajustar este fator para o nível de expressão desejado dacadeia específica. Variantes TIR podem ser geradas a partir de técnicas demutagênese convencionais que resultam em alterações nos códons que podemalterar a seqüência de aminoácido, embora alterações silenciosas naseqüência de nucleotídeo sejam preferidas. Alterações na TIR podem incluir,por exemplo, alterações no número ou espaçamento das seqüências Shine-Dalgamo, junto com alterações na seqüência sinalizadora. Um métodopreferido para a geração de seqüências sinalizadoras mutantes é a geração deum "banco de códon" no começo da seqüência de codificação que não altera aseqüência de aminoácido da seqüência de sinalizadora (ou seja, as alteraçõessão silenciosas). Esta pode ser realizada através da alteração da terceiraposição de nucleotídeo de cada códon; adicionalmente, alguns aminoácidos,tais como leucina, serina, e arginina, possuem primeira e segunda posiçõesmúltiplas que podem adicionar complexidade na produção do banco. Ditométodo de mutagênese é descrito em detalhes em Yansura et a/., (1992),METHODS: A Companion to Methods in Enzymol., 4:151-158.

Em um exemplo de realização, um conjunto de vetores é geradocom uma faixa de concentração de TIR para cada cístron presente. Esteconjunto limitado fornece uma comparação dos níveis de expressão de cada cadeiabem como o rendimento dos produtos de comprimento total sob váriascombinações de concentração de TIR. As concentrações de TIR podem serdeterminadas pela quantificação do nível de expressão de um gene relatado comodescrito em Simmons et ai, Patente US 5. 840.523. Com base na comparação daforça de tradução, TI Rs individuais desejadas são selecionadas para seremcombinadas em construções de vetores de expressão da presente invenção.

Os procariontes apropriados para este propósito incluemarquebactéria e eubactérias, tais como organismos gram-negativos ou gram-positivos. Exemplos de bactérias úteis incluem Escherichia (por exemplo, E.coli), bacilos (por exemplo, B. subtilis), Enterobactérias, espécies dePseudomonas (por exemplo, Pseudomonas aeruginosa), SalmonellaTyphimurium, Serratia marcescans, Klebsiella, Proteus, Shigella, Rhizóbia,Vitreoscilla ou Paracoccus. Em um exemplo de realização, células gram-negativas são usadas. Em um exemplo de realização, células E. coli sãousadas como hospedeiras para a invenção. Exemplos incluem cepas de E. colicepa W3110 (Bachmann, Cellular and Molecular Bioloav, vol.2 (Washington,D.C.: American Society for Microbiology, 1987), págs. 1190-1219; DepósitoATCC No. 27325) e seus derivados, incluindo as cepas 33D3 possuindo osgenótipos W3110 AfhuA (AtonA) ptr3 lac Iq lacL8 AompT A(nmpc-fepE)degP41 kanR (Patente US 5.639.635). Outras cepas e seus derivados, taiscomo E. co//'294 (ATCC 31446), E. coli B, E. coli 1776 (ATCC 31537) e E. coliRV308 (ATCC 31608) também são adequadas. Estes são exemplospreferencialmente ilustrativos do que limitadores. Métodos para a construçãode derivados de qualquer uma das bactérias acima mencionadas que possuemo genótipo definido são conhecidas no estado da técnica, por exemplo, emBass et al., Proteins, 8:309-314 (1990). Geralmente é necessário selecionar asbactérias adequadas levando em consideração a replicabilidade do repliconnas células bacterianas. Por exemplo, as espécies E. coli, Serratia ouSalmonella podem ser devidamente utilizadas como hospedeiras, quandoplasmídeos bem conhecidos, tais como os plasmídeos pBR322, pBR325,pACYC177 ou pKN410 são utilizados para a construção do replicon.

Normalmente a célula hospedeira deve secretar quantidades mínimas deenzimas proteolíticas, e adicionalmente inibidores de protease podem serincorporadas na cultura celular.

Produção de Anticorpos

As células hospedeiras são transformadas com os vetores deexpressão descritos acima e cultivadas em meios nutrientes convencionaismodificados conforme apropriado para a indução de promotores, seleção detransformadores ou amplificação dos genes que codificam as seqüênciasdesejadas.

Transformação significa a introdução de DNA em hospedeiroseucarióticos a fim de que o DNA seja replicável, quer como um elemento extra-cromossômico ou integrado ao cromossomo. Dependendo da célulahospedeira utilizada, a transformação é feita utilizando técnicas padrãoadequada para tais células. O tratamento com cálcio empregando cloreto decálcio é geralmente utilizado para células bacterianas que contêm paredecelular. Outro método de transformação emprega polietileno-glicol / DMSO.Outra técnica ainda utilizada é eletroporação.

As células procarióticas utilizadas para produzir os polipeptídeosde acordo com a presente invenção são cultivadas em meios conhecidos natécnica e são apropriadas para cultivo das células hospedeiras selecionadas.Exemplos de meios apropriados incluem caldo lúria (LB) mais os suplementosnutrientes necessários. Em realizações preferidas, os meios também contêmum agente de seleção, selecionado com base na construção do vetor deexpressão, para permitir seletivamente o crescimento de células procarióticasque contenham o vetor de expressão. A ampicilina é adicionada aos meios, porexemplo, para crescimento de células que expressam o gene resistente àampicilina.

Quaisquer suplementos necessários além de fontes de carbono,nitrogênio e fosfato inorgânico podem também ser incluídos em concentraçõesapropriadas introduzidas isoladamente ou na forma de mistura com outrosuplemento ou meio, tal como fonte de nitrogênio complexa. Opcionalmente, omeio de cultivo pode conter um ou mais agentes redutores selecionados apartir do grupo que consiste de glutationa, cisteína, cistamina, tioglicolato,ditioeritritol e ditiotreitol.

As células hospedeiras procarióticas são cultivadas sobtemperaturas apropriadas. Para crescimento da E. coli, por exemplo, atemperatura preferida varia em cerca de 20 °C a 39 °C, de maior preferênciaentre 25 °C a 37 °C, e cerca de 30 °C. O pH do meio pode ser qualquer pH queentre 5 a 9, dependendo principalmente do organismo hospedeiro. Para a E.coli, o pH é preferencialmente cerca de 6,8 a 7,4, de preferencialmente é 7,0.

Se um promotor induzível é utilizado no vetor de expressão dainvenção, a expressão da proteína é induzida em condições adequadas para aativação do promotor. Em um aspecto da invenção, promotores PhoA sãousados para controlar a transcrição de polipeptídeos. Assim, as células sãocultivadas em um meio limitante de fosfato para a indução. Em exemplo derealização, o meio limitante de fosfato é o meio C.R.A.P. (vide, por exemplo,Simmons et ai, J. Immunol. Methods. (2002), 263:133-147). Uma variedade deoutros indutores pode ser utilizada, de acordo com o vetor de construçãoutilizado, como é conhecido no estado da técnica.

Em um exemplo de realização, os polipeptídeos da presenteinvenção expressos são secretados e recuperados do periplasma das célulashospedeiras. A recuperação de proteína envolve tipicamente o rompimento domicroorganismo, geralmente por métodos como choque osmótico, sonicaçãoou lise. Após o rompimento das células, fragmentos celulares ou célulasinteiras podem ser removidas por meio de centrifugação ou filtragem. Asproteínas podem ser adicionalmente purificadas, por exemplo, porcromatografia de resina de afinidade. Alternativamente, as proteínas podem sertransportadas para o meio de cultivo e nele isoladas. As células podem serremovidas do cultivo e o sobrenadante de cultivo filtrado e concentrado parapurificação adicional do polipeptídeo produzido. Os polipeptídeos expressospodem ser adicionalmente isolados e identificados utilizando métodoscomumente conhecidos, tais como eletroforese de gel de poliacrilamida(PAGE) e teste Western Blot.

Em um aspecto da invenção, o anticorpo pode ser produzido emgrande quantidade por meio de processos de fermentação. Váriosprocedimentos de fermentação de alimentação de lotes em larga escala sãodisponíveis para a produção de proteínas recombinantes. Os fermentadores delarga escala possuem capacidade de pelo menos 1000 litros, preferencialmentede 1000 a 100.000 litros de capacidade. Estes fermentadores utilizamimpulsionadores agitadores ou outros meios apropriados para distribuiroxigênio e nutrientes, especialmente glicose (uma fonte de carbono e energiacomum). A fermentação em pequena escala refere-se geralmente afermentação em fermentador que possui capacidade volumetrica de não maisde cerca de 100 litros e pode variar de cerca de um 1 litro a 100 litros.

Em processo de fermentação, a indução da expressão deproteína é tipicamente iniciada após o crescimento das células sob condiçõesapropriadas até densidade desejada, tal como OD550 de cerca de 180 a 220 noqual as células estão no início da fase estacionaria. Uma série de indutorespode ser utilizada, de acordo com a construção de vetor empregado, como éconhecido no estado da arte e descrito acima. As células podem ser cultivadaspor períodos mais curtos antes da indução. As células são normalmenteinduzidas por cerca de 12 a 50 horas, embora possa ser utilizado um tempomaior ou menor de indução.

Para aumentar adicionalmente o rendimento de produção e aqualidade do polipeptídeo da presente invenção, várias condições defermentação podem ser transformadas. Para melhorar a montagem e doanticorpo secretado, por exemplo, vetores adicionais que superexpressamproteínas chaperonas, tais como proteínas Dsb (DsbA, DsbB, DsbC, DsbD e/ouDsbG) ou FkpA (peptidilprolil eis, trans-isomerase com atividade de chaperona),podem ser utilizados para co-transformar as células procarióticas hospedeiras.Demonstrou-se que as proteínas de chaperona facilitam a formação de dobradiça esolubilidade adequadas de proteínas heterólogas produzidas em célulashospedeiras bacterianas. Chen et al, J. Bio. Chem., 274: 19601-19605 (1999);Patentes US 6.083.715 e 6.027.888; Bothmann e Pluckthun, J. Biol. Chem., 275:17100-17105 (2000); Ramm e Pluckthun, J. Biol. Chem., 275: 17106-17113 (2000);Arie et al, Mol. Micróbio!., 39: 199-210 (2001).

Para minimizar a proteólise de proteínas heterólogas expressas(especialmente as que são proteoliticamente sensíveis) tal como em célulashospedeiras procarióticas, certas linhagens hospedeiras com deficiência paraenzimas proteolíticas podem ser utilizadas para a presente invenção.Linhagens de células hospedeiras procarióticas podem ser modificadas, porexemplo, para efetuar mutação(ões) genética(s) nos genes que codificamproteases bacterianas conhecidas, tais como Protease III, OmpT, DegP, Tsp,TonA, PhoA, Protease I, Protease Mi, Protease V, Protease VI e suascombinações. Algumas linhagens de E. Coli com deficiência de protease sãodisponíveis e descritas, por exemplo, em Joly et al, (1998) supra; Georgiou etal. Patente US 5.264.365, Georgiou et al. Patente US 5.508.192; Hara et al,Microbial Drug Resistance, 2:63-72 (1996).

Em um exemplo de realização, as cepas de E. coli deficientes deenzimas proteolíticas e transformadas em com um ou mais plasmídeos quesuperexpressam proteínas chaperonas são utilizados como célulashospedeiras no sistema de expressão da invenção.

Purificação de Anticorpo

Em um exemplo de realização, a proteína de anticorpo produzidano presente pode ser adicionalmente purificada para se obter preparações quesão consideravelmente homogêneas para ensaios e usos adicionais. Osprocedimentos a seguir são exemplos de procedimentos de purificaçãoapropriados: através de fracionamento em uma coluna de troca iônica;precipitação em etanol, HPLG de fase reversa; cromatografia em sílica ou emuma resina de troca catiônica tal como DEAE; cromatofocusação; SDS-PAGE;precipitação em sulfato de amônio; gel filtração utilizando, por exemplo,Sephadex G-75.

Em um aspecto, a proteína A imobilizada por uma fase sólida éutilizada para a purificação por imunoafinidade do anticorpo da invenção. Aproteína A é um proteína da parede celular de 41 kD do Staphylococcus áureosque se liga com alta afinidade a região Fc dos anticorpos. Lindmark, et al.(1983) J. Immunol. Meth. 62:1-13. A fase sólida para o qual a proteína A éimobilizada pode ser uma coluna que compreende uma superfície de vidroou de sílica, ou uma coluna de vidro porosa controlada ou coluna de ácidosilícico. Em algumas aplicações, a coluna é revestida com um reagente, talcomo o glicerol, possivelmente para evitar a aderência inespecífica decontaminantes.

Assim como a primeira etapa de purificação, a preparaçãoderivada da cultura celular, como descrito acima pode ser aplicada a umaproteína A imobilizada em fase sólida para permitir a ligação do anticorpoespecífico de interesse à proteína A. A fase sólida passaria então a ser lavadapara remover os contaminantes não ligados especificamente à fase sólida. Porúltimo, o anticorpo de interesse é recuperado da fase sólida por eluição.Produção de Anticorpo Utilizando Células Hospedeiras Eucarióticas

Os componentes do vetor geralmente incluem, mas sem se limitara, um ou mais dos seguintes: uma seqüência sinalizadora, uma origem dereplicação, um ou mais genes marcadores, um componente amplificador, umpromotor, e uma seqüência de terminação da transcrição.

(I) Componente De Seqüência Sinalizadora

Um vetor para uso em uma célula hospedeira eucariótica tambémpode conter uma seqüência sinalizadora ou outro polipeptídeo que possuí umsítio de clivagem específico no N-terminal da proteína ou polipeptídeo madurode interesse. A seqüência sinalizadora heteróloga selecionada geralmente éaquela que é reconhecida e processada (ou seja, clivada por uma peptidasesinalizadora) pela célula hospedeira. Em células de expressão de mamíferos,estão disponíveis as seqüências sinalizadora de mamíferos, bem como líderesde secreção viral, tais como o sinal gD da herpes simplex.

O DNA para essa região precursora é ligado em estrutura deleitura a DNA codificador do anticorpo.f II) Componente De Origem De Replicação

Geralmente, a origem do componente de replicação não énecessária para vetores de expressão em mamíferos. Por exemplo, a origemSV40 pode ser tipicamente utilizada somente porque contém o promotor inicial.

(III) Componente Genético De Seleção

Os vetores de clonagem e de expressão podem conter um genede seleção, também denominado marcador de seleção. Os genes de seleçãotípicos codificam proteínas que (a) conferem resistência a antibióticos ou outrastoxinas, tais como ampicilina, neomicina, metotrexato ou tetraciclina; (b)complementam deficiências autotróficas; ou (c) suplementam nutrientesfundamentais não-disponíveis no meio.

Um exemplo de esquema de seleção utiliza uma droga parainterromper o crescimento de uma célula hospedeira. As células que sãotransformadas com sucesso com um gene heterólogo que produz uma proteínaque confere resistência a drogas e, desta forma, sobrevivem ao regime deseleção. Exemplos de tal seleção dominante utilizam as drogas neomicina,ácido micofenólico e higromicina.

Outro exemplo de marcadores de seleção apropriados paracélulas de mamíferos são os que permitem a identificação de célulascompetentes para a absorção do ácido nucléico de anticorpo, tal como DHFR,timidina quinase, metalotioneína-l e II, preferencialmente genes metalotioneínade primatas, adenosina deaminase, ornitina decarboxilase, e etc.

Células transformadas com o gene de seleção DHFR, porexemplo, são identificadas, em primeiro lugar, através do cultivo de todos ostransformantes em um meio de cultura que contenha metotrexato (Mtx),antagonista concorrente de DHFR. Uma célula hospedeira apropriada, aoempregar-se DHFR do tipo selvagem, é a linhagem celular de ovário dehamster chinês (CHO) com deficiência na atividade de DHFR (por exemplo,ATCC CRL-9096).

Alternativamente, as células hospedeiras (particularmente,hospedeiros do tipo selvagem que contêm DHFR endógeno) transformadas ouco-transformadas com seqüências de DNA que codificam o anticorpo DHFR dotipo selvagem e outro marcador selecionável tal como aminoglicosídeo 3'-fosfotransferase (APH) podem ser selecionadas através de crescimento celularem um meio que contém um agente de seleção para o marcador selecionáveltal como antibiótico aminoglicosídico, por exemplo canamicina, neomicina ouG418. Vide a Patente US 4.965.199.

(IV) Componente Promotor

Os vetores de clonagem e de expressão normalmente contêm umpromotor que é reconhecido pelo organismo hospedeiro e é operacionalmenteligado ao ácido nucléico do polipeptídeo (por exemplo, um anticorpo). Asseqüências promotoras de eucariotos são conhecidas. São conhecidasseqüências promotoras para eucariontes. Virtualmente todos os geneseucariontes possuem uma região rica em AT localizada a cerca de 25 a 30bases a montante do sítio em que se inicia a transcrição. Outra seqüênciaencontrada a 70 até 80 bases a montante do início da transcrição de muitosgenes é uma região CNCAAT, em que N pode ser qualquer nucleotídeo. Naextremidade 3' da maioria dos genes eucariontes, encontra-se uma seqüênciaAATAAA que pode ser o sinal para adição da cauda poli-A na extremidade 3'da seqüência codificadora. Todas essas seqüências são inseridas de formaapropriada em vetores de expressão para eucariotos.

A transcrição de polipeptídeos a partir de vetores em célulashospedeiras de mamíferos é controlada, por exemplo, por promotores obtidos apartir do genoma viral, tal como, o vírus de polioma, vírus da catapora,adenovírus (tal como. Adenovírus 2), vírus de papiloma bovino, vírus desarcoma aviário, citomegalovírus, retrovírus, vírus da hepatite B e,preferencialmente, o Vírus Símio 40 (SV40), a partir de promotores demamíferos heterólogos, tais como o promotor de actina ou um promotor deimunoglobulina, de promotores de choque térmico, desde que essespromotores sejam compatíveis com os sistemas de células hospedeiras.

O promotor inicial e final do vírus SV40 são obtidosconvenientemente na forma de fragmento de restrição SV40 que tambémcontém a origem viral SV40 de replicação. O promotor inicial imediato docitomegalovírus humano é obtido convenientemente na forma de fragmento derestrição Hindlll E. Um sistema de expressão de DNA em hospedeirosmamíferos utilizando o vírus de papiloma bovino como vetor é descrito naPatente US 4.119.446. Uma modificação deste sistema é descrita na PatenteUS 4.601.978. Vide também Reyes et ai, Nature 297: 598-601 (1982) sobre aexpressão de cDNA de interferon-p humano em células de camundongos sob ocontrole de um promotor timidina quinase de vírus da herpes simplex.Alternativamente, a repetição terminal longa de vírus do sarcoma de Rous podeser utilizada como promotor.

(V) Componente Elemento Amplificador

A transcrição de um DNA codificador do polipeptídeo do anticorpode acordo com a presente invenção por eucariontes superiores éfreqüentemente aumentada através da inserção de uma seqüênciaamplificadora no vetor. Muitas seqüências amplificadoras são agoraconhecidas de genes de mamíferos (globina, elastase, albumina, a-fetoproteínae insulina). Tipicamente, entretanto, será utilizado um amplificador de um vírusde célula eucariótica. Exemplos incluem o amplificador SV40 sobre o ladoposterior da origem de replicação (bp 100-270), o amplificador promotor inicialde citomegalovírus, o amplificador de polioma sobre o lado terminal da origemde replicação e amplificadores de adenovírus. Vide também Yaniv, Nature 297:17-18 (1982) sobre elementos de promoção para a ativação de promotoreseucarióticos. O amplificador pode também sofrer splicing no vetor na posição 5'ou 3' para a seqüência codificadora de anticorpo, mas encontra-se localizado,preferencialmente, em um sítio a 5' do promotor.

(VI) Componente De Término De Transcrição

Os vetores de expressão utilizados em células hospedeiraseucariontes também irão conter seqüências necessárias para a terminação datranscrição e estabilização do mRNA. Ditas seqüências são normalmentedisponíveis a partir das regiões 5' e, ocasionalmente 3' não-traduzidas do DNAou cDNA viral ou de eucariontes. Estas regiões contêm segmentos denucleotídeos transcritos na forma de fragmentos poliadenilados na porção não-traduzida do mRNA codificador do anticorpo. Um componente de terminaçãode transcrição útil é a região de poliadenilação do hormônio de crescimentobovino. Vide o documento WO 94/11026 e o vetor de expressão nele descrito.(VII) Seleção E Transformação De Células Hospedeiras

As células hospedeiras apropriadas para clonagem ou expressãodo DNA nos vetores do presente incluem as células eucarióticas superioresdescritas neste documento, incluindo células hospedeiras de vertebrados.Propagação de células hospedeiras de vertebrados em cultura (cultura detecido) tornou-se um procedimento rotineiro. Exemplos de linhagens de célulashospedeiras de mamíferos úteis são a linhagem CV1 de rim de macacotransformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); linhagem de rim embriônicohumano (293 ou células 293 sub-clonadas para crescimento em cultura desuspensão, Graham et al., J. Gen. Virol. 36: 59 (1977)); células de rim de filhotede hamster (BHK, ATCC CCL 10); células de ovário de hamster chinês/-DHFR(CHO, Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 77: 4216 (1980)); células sertolide camundongo (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23: 243-251 (1980)); células derim de macaco (CV1 ATCC CCL 70); células de rim de macaco verde africano(VERO-76, ATCC CRL-1587); células de carcinoma cervical humano (HELA,ATCC CCL 2); células de rim canino (MDCK, ATCC CCL 34); células de fígadode buffalo rat (BRL 3A, ATCC CRL 1442); células de pulmão humano (W138,ATCC CCL 75); células de fígado humano (Hep G2, HB 8065); tumor mamáriode camundongo (MMT 060562, ATCC CCL51); células TRI (Mather et ai.,Annals N. Y. Acad. Sei. 383:44-68 (1982)); células MRC 5; células FS4;linhagem de hepatoma humano (Hep G2).

As células hospedeiras são transformadas com os vetores declonagem ou expressão descritos acima para a produção de anticorpos ecultivadas em meios nutrientes convencionais modificados conformeapropriado para a indução de promotores, seleção de transformantes ouamplificando os genes codificadores das seqüências desejadas.

(VIII) Cultivo Das Células Hospedeiras

As células hospedeiras utilizadas para a produção do anticorpo deacordo com a presente invenção podem ser cultivadas em uma série de meiosdisponíveis comercialmente, tais como meio de Ham F10 (Sigma), MeioEssencial Mínimo ((MEM), Sigma), RPMI-1640 (Sigma) e Meio EagleModificado da Dulbecco ((DMEM), Sigma) que são apropriados para o cultivodas células hospedeiras. Além disso, qualquer meio descrito em Ham et ai.,Meth. Enz. 58: 44 (1979), Barnes et ai, Anal. Biochem. 102: 255 (1980),Patentes US 4.767.704; US 4.657.866; US 4.927.762; US 4.560.655; ou US5.122.469; documentos WO 90/03430 e WO 87/00195 ou o pedido de PatenteUS 30.985 podem ser utilizados como meios de cultura para as célulashospedeiras. Qualquer destes meios pode ser suplementado conformenecessário com hormônios e/ou outros fatores do crescimento (tais comoinsulina, transferrina ou fator de crescimento epidérmico), sais (tais comocloreto de sódio, cálcio, magnésio e fosfato), tampões (tais como HEPES),nucleotídeos (tais como adenosina e timidina), antibióticos (tal como a drogaGENTAMICINA®), elementos de traço (definidos como compostos inorgânicosnormalmente presentes em concentrações finais na faixa micromolar) e glicoseou uma fonte de energia equivalente. Qualquer outro suplemento necessáriopode também ser incluído em concentrações apropriadas conhecidas dostécnicos no assunto. As condições de cultura, tais como temperatura, pH esimilares, são as utilizadas anteriormente com a célula hospedeira selecionadapara expressão e serão evidentes para os técnicos no assunto.

(IX) Purificação Do Anticorpo

Quando ao uso de técnicas recombinantes, o anticorpo pode serproduzido de forma intracelular, no espaço periplasmático ou secretadodiretamente no meio. Caso o anticorpo seja produzido de forma intracelular,como uma primeira etapa, os fragmentos particulados, sejam eles célulashospedeiras ou fragmentos lisados, são removidos, por exemplo, através decentrifugação ou ultrafiltragem. Quando o anticorpo for secretado para o meio,sobrenadantes desses sistemas de expressão são geralmente concentradosem primeiro lugar utilizando um filtro de concentração de proteínas disponívelcomercialmente, por exemplo, uma unidade de ultrafiltragem Amicon ouMillipore Pellicon. Um inibidor de protease, tal como PMSF, pode ser incluídoem qualquer das etapas acima para inibir a proteólise e antibióticos podem serincluídos para evitar o crescimento de contaminantes imprevistos.

A composição de anticorpo preparada a partir das células podeser purificada através do uso, por exemplo, de cromatografia de hidroxilapatita,eletroforese em gel, diálise e cromatografia de afinidade, com cromatografia deafinidade sendo a técnica de purificação preferida. A adequação da proteína Acomo ligante de afinidade depende da espécie e do isotipo de qualquerdomínio Fc de imunoglobulina que esteja presente no anticorpo. A Proteína Apode ser utilizada para purificar anticorpos que se baseiem em cadeiaspesadas y1, y2 ou y4 humanas (Lindmark et ai., J. Immunol. Meth. 62: 1-13(1983)). Recomenda-se Proteína G para todos os isotipos de camundongos epara y3 humano (Guss et ai, EMBO J. 5: 1567-1575 (1986)). A matriz à qual éligado o ligante de afinidade é mais freqüentemente agarose, mas outrasmatrizes são disponíveis. Matrizes mecanicamente estáveis, tais como vidro deporos controlados ou poli-(estirenodivinil)-benzeno, permitem velocidades defluxo maiores e tempos de processamento mais curtos do que os que podemser atingidos com agarose. Quando o anticorpo compreender um domínio Ch3,a resina Bakerbond ABX™ (J. T. Baker, Phillipsburg NJ, Estados Unidos) é útilpara purificação. Outras técnicas de purificação de proteínas, tais comofracionamento sobre uma coluna de troca iônica, precipitação em etanol, HPLCde Fase Reversa, cromatografia em sílica, cromatografia em heparinaSEPHAROSE™, cromatografia em uma resina de troca aniônica ou catiônica(tal como uma coluna de ácido poliaspártico), cromatofocagem, SDS-PAGE eprecipitação de sulfato de amônio também são disponíveis, dependendo doanticorpo a ser recuperado.

Após qualquer etapa(s) de purificação preliminar(es), a misturaque compreende o anticorpo de interesse e contaminantes pode ser submetidaa cromatografia de interação hidrofóbica a baixo pH utilizando uma eluiçãotamponada a um pH de cerca de 2,5 a 4,5, Em um exemplo de realizaçãoespecífico, preferencialmente realizada, a cromatografia de interaçãohidrofóbica a baixo pH é realizada sob baixas concentrações de sal (como,cerca de 0 a 0,25 M de sal).

Ensaios De Atividade

As imunoglobulinas da presente invenção podem sercaracterizadas por suas propriedades físicas/químicas e funções biológicasatravés de diversos ensaios conhecidos no estado da técnica.

Os anticorpos purificados podem ser adicionalmentecaracterizados por uma série de ensaios incluindo, mas sem limitar-se a,seqüenciamento N-terminal, análise de aminoácido, cromatografia líquida dealta pressão (HPLC) com exclusão de tamanho não-desnaturante,espectometria em massa, cromatografia de troca iônica, e digestão de papaína.

Em exemplos de realização específicos, as imunoglobulinasproduzinas no presente são analisadas pelas suas atividades biológicas. Emalgumas realizações, as imunoglobulinas da presente invenção são testadaspor sua atividade de ligação ao antígeno. Os ensaios de ligação de antígenoque são conhecidos no estado da técnica e podem ser utilizados no presenteincluem, sem se limitar a, ensaio de ligação competitivo ou direta utilizandotécnicas tais como Western blots, radioimunoensaios, ELISA (ensaioimunoabsorvente ligado por enzima), imunoensaios do tipo "sanduíche",ensaios de imunoprecipitação, imunoensaios fluorescentes, e imunoensaios deproteína A.

Os anticorpos ou fragmentos ligante de antígenos ainda podemser selecionados por suas atividades funcionais, por exemplo, atividadeagonista ou antagonista. Por exemplo, anticorpos anti-HER-2 podem serselecionados pela capacidade de inibir a fosforilação da tirosina em HER-2,inibir a proliferação de células cancerosas ou de induzir células cancerosas àapoptose. Ensaios para identificar e mesurar essas atividades são descritas,por exemplo, no documento W098/17797.

Além disso, anticorpos anti-DR5 podem ser selecionados pelacapacidade de induzir a apoptose em células cancerosas e/ou inibir a funçãodas células inflamatórias. Em outros exemplos de realização, anticorpos anti-DR5 são selecionados pela capacidade de competir com o DR5 pela ligação aoApo-2L. Em outros exemplos de realização, anticorpos anti-DR5 humano sãoselecionados pela ligação ao DR5 murino e/ou DR5 de macacos cinomolgos.Ensaios para se determinar a atividade biológica podem ser realizados pormeio de métodos conhecidos no estado da técnica, como a fragmentação deD NA (vide, por exemplo, Marsters et ai, Curr. Biology, 6:1669 (1996)),inativação da caspase, ligação ao DR5 (vide, por exemplo, documento WO98/51793, publicado em 19 de Novembro de 1998. O nível de apoptose podeser mensurada através da identificação da condensação do citoplasma, perdadas micro vilosidades da membrana plasmática, segmentação do núcleo,degradação do DNA cromossômico ou perda da função mitocondrial. Estaatividade pode ser determinada e mensurada, por exemplo, por ensaios deviabilidade celular (tal como o ensaio com Alamar blue ou ensaios MTT),análise por FACS, ativação da caspase, fragmentação do DNA (vide, porexemplo, Nicoletti et a/., J. Immunol. Methods, 139: 271-279 (1991), epolimerase ribose poli-ADP, clivagem de "PARP" e ensaios conhecidos noestado da técnica.

Em um exemplo de realização, como o ensaio para a apoptoseenvolve a realização de duas vezes as diluições seriais do controle padrão e doanticorpo anti-DR5 em placas de cultura de 96 poços. O Apo-2 ligante(aminoácidos 114-281, descrito na PCT US 00/17579) é testada para efeitos decomparação. Colo-205 (20000 células ~ poço) com células de carcinoma de cólonhumano (ATCC) são semeadas em placas de 96 poços. As placas são incubadas a37°C por 24 horas. AlamazBlue (Jrek Diagnostic Systems, Inc.) é adicionado aospoços nas últimas 3 a 24 horas do tempo de incubação. A fluorescência é lidautilizando um fluorômetro para placas de 96 poços utilizando o comprimento deonda para a excitação de 530 nm e de emissão a 590 nm. Os resultados sãoexpressos como unidades de fluorescência relativa (RFU).

Em um exemplo de realização, a invenção contempla umanticorpo modificado que possuí alguma, mas não todas as funções efetoras,que torna este anticorpo um candidato desejável para muitas aplicações noqual a meia vida do anticorpo in vivo é importante ainda que certas funçõesefetoras (como complemento e ADCC) são desnecessárias ou prejudiciais. Emcertos exemplos de realização, as atividades Fc do anticorpo são medidas paraassegurar que só as propriedades desejadas sejam mantidas. Um ensaio decitotoxicidade in vitro ou in vivo pode ser conduzido para confirmar a redução /depleção dos CDC e/ou atividades ADCC. Por exemplo, ensaios de ligaçãocom o receptor Fc (FcR) podem ser realizados a fim de garantir que o anticorponão tenha ligação ao FcyR (e portanto carece da atividade ADCC), masmantém a capacidade de ligação ao FcRn. As células primárias para amediação de ADCC, células NK, expressam unicamente FcyRIII, enquantomonócitos expressam FcyRI, FcyRII e FcyRIII. A expressão de FcR sobrecélulas hematopoiéticas é resumida na Tabela 3, pág. 464, de Ravetch e Kinet,Annu. Rev. Immunol. 9: 457-92 (1991). Um exemplo de ensaio para sedeterminar a atividade de ADCC de uma molécula de interesse, está descritona Patente US 5.500.362 ou US 5.821.337. Células efetoras úteis para essestestes incluem células mononucleares sangüíneas periféricas (PBMC) e célulasNatural Killers (NK). Alternativa ou adicionalmente, a atividade de ADCC damolécula de interesse pode ser determinada in vivo, tal como em um modeloanimal como o descrito em Clynes et ai, PNAS (USA) 95: 652-656 (1998).Ensaios de ligação de C1q também podem ser realizados para confirmar que oanticorpo é incapaz de se ligar a C1q e, portanto, carece de atividade CDC.Para determinar a ativação do complemento, pode ser realizado um ensaioCDC, conforme descrito, por exemplo, em Gazzano-Santoro et ai., J. Immunol.Methods, 202: 163 (1996). A determinação da ligação de FcRn e a depuração/meia vida in vivo também pode ser realizada utilizando métodos conhecidos noestado da técnica, por exemplo, aqueles descritos na seção Exemplos.

Anticorpos Humanizados

A invenção abrange anticorpos humanizados. Vários métodos dehumanização de anticorpos não-humanos são conhecidos no estado datécnica. Preferencialmente, um anticorpo humanizado contém um ou maisresíduos de aminoácidos nele introduzidos a partir de uma fonte que não éhumana. Esses resíduos de aminoácidos não-humanos são muitas vezesdenominados resíduos "importados", que são tipicamente retirados de umdomínio variável "importado". A humanização pode ser essencialmenterealizada seguindo-se o método de Winter et al. (Jones et ai, Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al.,Science, 239:1534-1536 (1988)), por meio de substituição de seqüências deregiões hipervariáveis pelas seqüências correspondentes de anticorpo humano.

Conseqüentemente, esses anticorpos "humanizados" são anticorposquiméricos (Patente US 4.816.567), em que substancialmente menos de umdomínio variável humano intacto tenha sido substituído pela seqüênciacorrespondente de uma espécie não-humana. Na prática, os anticorposhumanizados são tipicamente anticorpos humanos, em que alguns resíduos deregiões hipervariáveis e possivelmente alguns resíduos de FR são substituídospor resíduos de sítios análogos em anticorpos de roedores.

A seleção de domínios variáveis humanos, tanto leves quantopesados, a serem utilizados na fabricação dos anticorpos humanizados é muitoimportante para reduzir a antigenicidade. De acordo com o chamado métodode "melhor adequação" (best-fit), a seqüência do domínio variável de umanticorpo de roedor é selecionada em comparação com toda a biblioteca deseqüências de domínio variável humanas conhecida. A seqüência humana queé mais próxima da seqüência do roedor é então aceita como a região estruturalhumana (FR) para o anticorpo humanizado (Sims et al., (1993)J. Immunol.,151: 2296; Chothia et al., (1987) J. Mol. Biol., 196: 901). Outro método utilizauma região estrutural específica derivada da seqüência de consenso de todosos anticorpos humanos de um subgrupo específico de cadeias leves oupesadas. A mesma estrutura pode ser utilizada para vários anticorposhumanizados diferentes (Carter et al., (1992) Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 89:4285; Presta et ai, (1993) J. Immunol., 151: 2623).É adicionalmente importante que os anticorpos sejamhumanizados com retenção de alta afinidade para o antígeno e outraspropriedades biológicas favoráveis. Para atingir este objetivo, de acordo comum método preferido, os anticorpos humanizados são preparados por meio deum processo de análise das seqüências parentais e diversos produtoshumanizados conceituais, utilizando modelos tri-dimensionais da seqüênciaparental e humanizada. Modelos de imunoglobulina tridimensionais sãocomumente disponíveis e familiares para os técnicos no assunto. Sãodisponíveis programas de computador que ilustram e exibem prováveisestruturas de conformação tridimensional de seqüências de imunoglobulinacandidata selecionadas. A inspeção dessas exibições permite a análise dopapel provável dos resíduos no funcionamento da seqüência de imunoglobulinacandidata, ou seja, a análise dos resíduos que influenciam a capacidade daimunoglobulina candidata de ligar o seu antígeno. Desta forma, os resíduos deFR podem ser selecionados e combinados a partir das seqüências receptora eimportada, de forma que seja atingida a característica desejada do anticorpo,tal como maior afinidade para o(s) antígeno(s) desejado(s). Geralmente, osresíduos da região hipervariável são diretamente e mais substancialmenteenvolvidos na influência da ligação aos antígenos.

Anticorpos Variantes

Em um aspecto, a invenção fornece anticorpos possuemmodificações na interface dos polipeptídeos Fc que compreendem a região Fc,onde as modificações facilitam e/ou promovem a heterodimerização. Estasalterações incluem a introdução de uma protuberância em um primeiropolipeptídeo Fc e uma cavidade em um segundo polipeptídeo de Fc, onde aprotuberância é posicionada na cavidade de modo a promover o complexoentre o primeiro e segundo polipeptídeo de Fc. Métodos para produção deanticorpos com estas modificações são conhecidas no estado da técnica, porexemplo, como descrito na Patente US 5.731.168.

Em alguns exemplos, é(são) contemplada(s) modificação(ões)na(s) seqüência(s) de aminoácido(s) dos anticorpos aqui descritos. Porexemplo, pode ser desejável melhorar a afinidade de ligação e/ou outraspropriedades biológicas do anticorpo. Variantes da seqüência de aminoácidodo anticorpo são preparados pela introdução de nucleotídeos adequadosmodificando o ácido nucléico do anticorpo, ou pela síntese de peptídeo. Taisalterações incluem, por exemplo, deleção, e/ou inserção e/ou substituição, deresíduos dentro das seqüências de aminoácido do anticorpo. Qualquercombinação de deleção, inserção ou substituição podem ser feitas para sechegar a construção final, desde que o produto final tenha as característicasdesejadas. As alterações nos aminoácidos podem ser introduzidas no anticorpono momento em que seqüência é feita.

Para aumentar a meia vida do anticorpo ou polipeptídeocontendo a seqüência de aminoácido desta invenção, pode-se incorporarum epítopo de ligação de recuperação do receptor recuperado ao anticorpo(especialmente um fragmento de anticorpo), conforme descrito, porexemplo, na Patente US 5.739.277. Por exemplo, uma molécula de ácidonucléico que codifica um epítopo de ligação de recuperação do receptorpode ser ligado em uma moldura de um ácido nucléico que codifica umaseqüência de polipeptídeo da presente invenção de modo a que a proteínade fusão expressas pelas moléculas de ácido nucléico desenvolvidacontém o epítopo de ligação de recuperação do receptor e uma seqüênciado polipeptídeo da presente invenção. Da forma como utilizada nopresente, a expressão "epítopo de ligação de recuperação do receptor"designa um epítopo da região Fc de uma molécula de IgG (por exemplo,IgGi, lgG2, lgG3 ou lgG4) que é responsável pelo aumento da meia vida emsoro in vivo da molécula de IgG. Alternativamente ou adicionalmente, umaumento ou diminuição da meia vida no soro pela alteração da seqüênciade aminoácidos da região Fc de um anticorpo para gerar variantes comligações do FcRn alterados. Anticorpos com ligações FcRn alterados e/oualterações na meia vida são descritos no documento WO 00/42072 (Presta,L). WO 02/060919; Shields, R. L, et ai., (2001) JBC 276(9):6591-6604;Hinton, P. R., (2004) JBC 279(8):6213-6216). Em outro exemplo derealização, a meia vida sérica também pode ser aumentada, por exemplo,pela junção de outras seqüências polipeptídicas. Por exemplo, anticorposdesta invenção ou outro polipeptídeo contendo as seqüências deaminoácidos esta invenção pode ser anexado à albumina ou uma porçãoda albumina que se liga aos receptores FcRn ou um peptídeo que se liga aalbumina, para que se liga à albumina do soro, por exemplo, essasseqüências polipeptídicas são divulgados no documento WO01/45746. Emum exemplo de realização, o peptídeo da albumina a ser acopladocompreende a seqüência de aminoácidos DICLPRWGCLW (SEQ ID No:608). Em outro exemplo de realização, a meia-vida de um Fab de acordocom esta invenção é aumentada por estes métodos. Vide também, Dennis,M. S., ei ai, (2002) JBC 277(38):35035-35043 para seqüências de peptídeoque se ligam a albumina.

Um método útil de identificação de certos resíduos ou regiõesdo antagonista que são locais preferidos para mutagênese é denominado"mutagênese de varredura de alanina", conforme descrito por Cunningham eWells, Science, 244: 1081-1085 (1989). Aqui, um resíduo ou grupo de resíduosalvo é identificado (por exemplo, resíduos carregados, tais como arg, asp, his,lys e glu) e substituído por um aminoácido neutro ou negativamente carregado(de maior preferência alanina ou polialanina) para afetar a interação dosaminoácidos com antígeno. Esses locais de aminoácidos que demonstramsensibilidade funcional às substituições são refinados em seguida pelaintrodução de outras variantes ou variantes adicionais nos sítios de substituiçãoou para estes. Desta forma, embora o sítio para introdução de uma variação deseqüência de aminoácidos seja previamente determinado, a naturezaintrínseca da mutação não necessita ser previamente determinada. Paraanalisar o desempenho de uma mutação em um dado sítio, por exemplo,varredura de ala ou mutagênese aleatória é conduzida no códon ou região alvoe as variantes de antagonistas expressas são selecionadas para a atividadedesejada.

As inserções de seqüências de aminoácidos incluem fusõesde carbóxi e/ou amino-terminal que variam de comprimento de unsresíduos até polipeptídeos que contenham cem ou mais resíduos, bemcomo inserções intra-seqüenciais de resíduos de aminoácidos isolados oumúltiplos. Exemplos de inserções terminais incluem um antagonista comum resíduo de metionila N-terminal ou o anticorpo fundido a umpolipeptídeo citotóxico. Outras variantes de inserção da molécula deanticorpo incluem a fusão ao N- ou C-terminal do anticorpo (por exemplo,para ADEPT) de uma enzima ou um polipeptídeo que aumente a meia vidado antagonista no soro.

Outro tipo de variante é uma variante de substituição deaminoácidos. Estas variantes contêm pelo menos um resíduo deaminoácido na molécula de anticorpo substituída por um resíduo diferente.Os sítios de maior interesse para mutagênese de substituição incluem asregiões hipervariáveis, mas também são contempladas alterações de FR.Substituições conservadoras são exibidas na Tabela 2 sob o título de"substituições preferidas". Caso essas substituições resultem em mudançada atividade biológica, então mudanças mais substanciais, denominadas"exemplos de substituições" na Tabela abaixo, ou conforme descritoadicionalmente abaixo com referência a classes de aminoácidos podem serintroduzidas e os produtos são selecionados.

Tabela 2

<table>table see original document page 214</column></row><table>Modificações substanciais das propriedades biológicas doanticorpo são atingidas por meio da seleção de substituições que diferemsignificativamente no seu efeito sobre a manutenção (a) da estrutura da cadeiaprincipal de polipeptídeo na área da substituição, por exemplo, na forma defolha ou em conformação helicoidal; (b) da carga ou hidrofobicidade damolécula no sítio desejado; ou (c) do volume da cadeia lateral. Os aminoácidospodem ser agrupados de acordo com similaridades nas propriedades de suascadeias laterais (em A. L. Lehninger, in Biochemistry, segunda ed., pp. 73-75,Worth Publishers, Nova Iorque (1975)):

(1) Apolares: Ala (A), Vai (V), Leu (L), Me (I), Pro (P), Phe (F), Trp

(W), Met (M)

(2) Sem carga polar: Gly (G), Ser (S), Thr (T), Cys (C), Tyr (Y),Asn (N), Gln (Q)

(3) Ácido: Asp (D), Glu (E)

(4) Básico: Lys (K), Arg (R), His(H)

Alternativamente, os resíduos de ocorrência natural podem serdivididos em grupos com base nas propriedades comuns da cadeia lateral:

(1) Hidrofílicos: Norleucina, Met, Ala, Vai, Leu, He;

(2) Hidrofílicos neutros: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;

(3) Ácido: Asp, Glu;

(4) Básico: His, Lys, Arg;

(5) Resíduos que influenciam na orientação das cadeias: Gly, Pro;

(6) Aromático: Trp, Tyr, Phe.

Substituições não-conservadoras causarão a substituição de ummembro de uma dessas classes por outra classe. Tais resíduos substituídostambém podem ser introduzidos nos locais conservados da substituição ou,mais preferivelmente, nos locais (não-conservados) restantes.

Um tipo particularmente preferido de variante de substituiçãoenvolve a substituição de um ou mais resíduos da região hipervariável de umanticorpo parental (por exemplo, anticorpo humano e humanizado).Geralmente, a(s) variante(s) resultante(s) selecionada(s) para desenvolvimentoadicional terá(ão) propriedades biológicas modificadas (por exemplo,aprimoradas) com relação ao anticorpo parental do qual é(são) gerado(s).Resumidamente, diversos sítios de regiões hipervariáveis (por exemplo, 6 a 7sítios) sofrem mutações para gerar todas as substituições amino possíveis emcada sítio. Os anticorpos assim gerados são exibidos a partir de partículas defagos filamentosos fundidos ao gene produto do gene III de M13 com cadapartícula. As variantes exibidas por fago são, então, selecionadas de acordocom a sua atividade biológica (por exemplo, afinidade de ligação) conformedescrita na presente invenção. A fim de identificar possíveis sítios de regiõeshipervariáveis para modificação, mutagênese por varredura de alanina pode serrealizada para identificar resíduos de regiões hipervariáveis que contribuemsignificativamente para a ligação de antígenos. Alternativamente ou adicionalmente,pode ser benéfico analisar a estrutura cristalina do complexo antígeno-anticorpopara identificar pontos de contato entre o anticorpo e o antígeno. Tais resíduos decontato e resíduos vizinhos são candidatos à substituição de acordo com astécnicas realizadas no presente. Após a geração de tais variantes, o quadro devariantes é submetido à seleção conforme descrito na presente invenção e osanticorpos com propriedades superiores em um ou mais testes relevantes podemser selecionados para desenvolvimento adicional.

Moléculas de ácidos nucléicos que codificam variantes daseqüência de aminoácidos do anticorpo são preparadas por meio de uma sériede métodos conhecidos no estado da técnica. Estes métodos incluem, mas nãose limitam a, o isolamento a partir de uma fonte natural (no caso de variantesde seqüências de aminoácidos de ocorrência natural) ou preparação por meiode mutagênese mediada por oligonucleotídeo (ou sítio-dirigida), mutagênesepor PCR e cassete de mutagênese de uma variante preparada anteriormenteou uma versão não-variante do anticorpo.

Pode ser desejável introduzir uma ou mais modificações deaminoácidos em uma região Fc do anticorpo da invenção, gerando assim umaregião Fc variante. A região Fc variante humana pode compreender umaseqüência região Fc (por exemplo, região Fc da lgG1, lgG2, lgG3 ou lgG4seqüência) que inclui uma modificação de aminoácido (por exemplo, umasubstituição) em um ou mais posições de aminoácidos incluindo o de umadobradiça de cisteína.

De acordo com esta descrição e os ensinamentos no estado datécnica, é contemplado que, em alguns exemplos, um anticorpo da invençãopode constar de uma ou mais alterações em comparação com o anticorpohomólogo do tipo selvagem, por exemplo, na região Fc. Estes anticorpos,porém, mantém sensivelmente as mesmas características exigidas para autilidade terapêutica, comparativamente ao seu homólogo do tipo selvagem.Por exemplo, podem ser feitas algumas alterações na região Fc, que alteraram(isto é, ou melhoram ou diminuem) a ligação ao C1q e/ou a citotoxicidadedependente do complemento (CDC), por exemplo, como descrito nodocumento W099/51642. Vide também Duncan e Winter, Nature 322:738-40(1988); Patente US 5.648.260; Patente US. 5.624.821, e documentoW094/29351 relativas a outros exemplos de região Fc variantes.

IMUNOCONJUGADOS

A presente invenção também se refere à imunoconjugados ou aanticorpos conjugados com drogas (CAD), compreendendo um anticorpoconjugado a um agente citotóxico tal como um agente quimioterápico, droga,agente inibidor de crescimento, toxina (por exemplo, uma toxinaenzimaticamente ativa de origem bacteriana, fúngica, vegetal ou animal, oufragmentos destes) ou um isótopo radioativo (isto é, um radioconjugado).O uso anticorpos conjugados com drogas para a entrega local deagentes citotóxicos ou citostático, isto é, drogas para matar ou inibir célulastumorais no tratamento do câncer (Syrigos and Epenetos (1999) AnticancerResearch 19:605-614; Niculescu-Duvaz e Springer (1997) Adv. Drg Del. Rev.26:151-172; Patente US 4.975.278) teoricamente permitem a entrega da drogaa célula alvo de parte do tumor, e o acúmulo intracelular deste, onde aadministração sistêmica destes agentes não conjugados com drogas poderesultar em níveis inaceitáveis de toxicidade em células normais bem como emcélulas do tumor que precisam ser eliminadas (Baldwin et al., (1986) Lancetpp. (15 de Março de 1986):603-05; Thorpe, (1985) "Antibody Carriers OfCytotoxic Agents In Câncer Therapy: Uma revisão em,"Monoclonal Antibodies'84: Biológica! And Clinicai Applications, A. Pinchera et al. (ed.s), pp. 475-506).Procura-se desse modo a eficácia máxima com toxicidade mínima. Tanto osanticorpos policlonais quanto os anticorpos monoclonais foram relatados comoúteis nestas estratégias (Rowland et al., (1986) Câncer Immunol. Immunother.,21:183-87). As drogas usadas nestes métodos incluem a daunomicina,doxorubicina, metotrexate, e a vindesina (Rowland et al., (1986) Supra). Astoxinas usadas em conjugados anticorpo-toxina incluem as toxinas bacterianastais como a toxina da difteria, toxina de plantas tais como a ricina, pequenasmoléculas de toxinas tais como a geldanamicina Mandler et al (2000) Jour. ofthe Nat. Câncer Inst. 92(19): 1573-1581; Mandler et al (2000) Bioorganic & Med.Chem. Letters 10:1025-1028; Mandler et al (2002) Bioconjugate Chem. 13:786-791), maitansinóides (Patente EP 1391213; Liu et al., (1996) Proc. Natl. Acad.Sei. USA 93:8618-8623), e caliceamicina (Lode et al (1998) Câncer Res.58:2928; Hinman et al (1993) Câncer Res. 53:3336-3342). As toxinas podemrealizar seus efeitos citotóxicos e citostáticos por mecanismos incluindo aligação da tubulina, a ligação do DNA ou a inibição da topoisomerase. Algumasdrogas citotóxicas tendem a ser inativas ou mais menos ativas quandoconjugadas com anticorpos ou ligantes de proteínas receptoras.

ZEVALIN® (ibritumomab tiuxetan, Biogen/ldec) é um conjugadoanticorpo-radioisótopo composto de um anticorpo monoclonal lgG1 kappamurino dirigido contra ao antígeno CD20 encontrado na superfície de linfócitosnormais e malignos e ligado ao radioisótopo In111 ou Y90 ligado por um quelanteligante a uma tiourea (Wiseman et al (2000) Eur. Jour. Nucl. Med. 27(7):766-77;Wiseman et al (2002) Blood 99(12):4336-42; Witzig et al (2002) J. Clin. Oncol.20(10):2453-63; Witzig et al (2002) J. Clin. Oncol. 20(15):3262-69). EmboraZEVALIN tenha a atividade contra o linfoma de célula B não Hodgkin (NHL), aadministração resulta em citopenias graves e prolongadas na a maioria dospacientes. MYLOTARG™ (gemtuzumab ozogamicina, Wyeth Pharmaceuticals),um anticorpo conjugado a droga composto de um anticorpo hu CD33 ligado acaliceamicina, foi aprovado em 2000 para o tratamento da leucemia mielóideaguda por injeção (Drugs ofthe Future (2000) 25(7):686; Patente US 4970198;US 5079233; US 5585089; US 5606040; US 5693762; US 5739116; US5767285; US 5773001). Cantuzumab mertansina (Immunogen, Inc.), umconjugado anticorpo-droga composto pelo anticorpo huC242 ligado através doligante SPP a fração maitansinóide da droga, DM1 do bissulfeto, estáavançando em experimentações de fase II para o tratamento dos cânceres queexpressam CanAg como, por exemplo, pancreático, gástrico entre outros. MLN-2704 (Millennium Pharm., BZL Biologics, Immunogen Inc.), um conjugadoanticorpo-droga composto pelo anticorpo monoclonal específico para antígenode membrana anti-prostático (PSMA) ligado a fração maitansinóide da droga,DM1, está sob o desenvolvimento para o tratamento potencial de tumores depróstata. Os peptídeos da auristatina, auristatina E (AE) e amonometilauristatina (MMAE), análogos sintéticos da dolastatina, conjugadoaos anticorpos monoclonais quimérico cBR96 (específico para o carcinoma deLewis Y) e cAC10 (específico para o CD30 em malignidades hematológicas)(Doronina et al (2003) Nature Biotechnology 21(7)778-784) e estão sobdesenvolvimento terapêutico.

Os agentes quimioterápicos úteis na geração de taisimunoconjugados são descritos acima no presente. Toxinas enzimaticamenteativas e seus fragmentos que podem ser utilizados incluem cadeia A de difteria,fragmentos ativos não-ligantes da toxina de difteria, cadeia A de exotoxina (dePseudomonas aeruginosa), cadeia A rícina, cadeia A de abrina, cadeia A demodecina, alfa-sarcina, proteínas de Aleurites fordii, proteínas de diantina,proteínas de Phytolaca americana (PAPI, PAPII e PAP-S), inibidor Momordicacharantia, curcina, crotina, inibidor de Sapaonaría officinalis, gelonina,mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina e os tricotecenos. Umavariedade de radionucleotídeos está disponível para a produção de anticorposradioconjugados. Exemplos incluem Bi212, I131, In131, Y90 e Re186. Os conjugadosdo antagonista e agente citotóxico podem ser fabricados utilizando uma sériede agentes acopladores de proteínas bifuncionais, tais como propionato de N-succinimidil-3-(2-piridilditiol) (SPDP), iminotiolano (IT), derivados bifuncionaisde imidoésteres (tais como adipimidato de dimetila HCI), ésteres ativos (taiscomo suberato de dissuccinimidila), aldeídos (tais como glutaraldeído),compostos bis-azido (tais como bis-(para-azidobenzoil)-hexanodiamina),derivados bis-diazônio (tais como bis-(para-diazoniobenzoil)-etilenodiamina),diisocianatos (tais como 2,6-diisocianato de tolueno) e compostos de flúor bis-ativo (tais como 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenzeno). Pode-se preparar, porexemplo, uma imunotoxina rícina, conforme descrito em Vitetta et al., Science238: 1098 (1987). Ácido 1-isotiocianatobenzil-3-metildietilenotriaminopentaacético marcado por carbono 14 (MX-DTPA) é um exemplo deagente quelante para conjugação de radionucleotídeo ao antagonista. Vide odocumento WO 94/11026.

Conjugados de um antagonista e uma ou mais toxinas demoléculas pequenas, tais como caliqueamicina, maitansinóides, tricoteno eCC1065 e seus derivados que também apresentam atividades de toxinas, sãocontemplados no presente.

Maitansina e Maitansinóides

Em alguns exemplos de realizações, o imunoconjugadocompreende o anticorpo da invenção conjugado a uma ou mais moléculasmaitansinóides.

Maitansinóides são inibidores mitóticos que agem através dainibição da polimerização de tubulina. Maitansina foi isolada pela primeira vez apartir de Maytenus serrata (patente US 3.896.111). Descobriu-se em seguidaque determinados micróbios também produzem maitansinóides, tais comomaitansinol e ésteres C-3 de maitansinol (patente US 4.151.042). Maitansinolsintético, seus derivados e análogos são descritos, por exemplo, nas patentesUS 4.137.230, US 4.248.870, US 4.256.746, US 4.260.608, US 4.265.814, US4.294.757, US 4.307.016, US 4.308.268, US 4.308.269, US 4.309.428, US4.313.946, US 4.315.929, US 4.317.821, US 4.322.348, US 4.331.598, US4.361.650, US 4.364.866, US 4.424.219, US 4.450.254, US 4.362.663 e US4.371.533, as divulgações dos quais são expressamente incorporada aopresente pela referência.

Conjugados Anticorpo-Maitansinóide

Em uma tentativa de melhorar seu índice terapêutico, maitansinae maitansinóides têm sido conjugados com anticorpos que se ligamespecificamente a antígenos de células tumorais, imunoconjugados contendomaitansinóides e sua utilização terapêutica são divulgados, por exemplo, naPatente US 5.208.020, US 5.416.064 e Patente Européia EP 0 425 235 BI, asdivulgações dos quais são expressamente incorporada ao presente pelareferência. Liu et a/., Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 93:8618-8623 (1996)descreveu imunoconjugados compreendendo um maitansinóide designadoDM1 ligado ao anticorpo monoclonal dirigido contra C242 humano de câncercolorretal. O conjugado demonstrou-se sendo altamente citotóxico para célulasde câncer de cólon cultivadas, e mostrou uma atividade anti-tumoral em umaanálise do crescimento tumoral in vivo. Chari et ai., Câncer Research 52:127-131 (1992) descrevem imunoconjugados em que um maitansinóide foiconjugado através de uma ligação de dissulfeto ao anticorpo murino A7 ligantepara um antígeno em linhagem de células de câncer de cólon humano, ououtro anticorpo monoclonal murino TA.I que se liga ao oncogene WSR.-2lneu.A citotoxicidade do conjugado TA.I-maitansinóide foi testada in vitro sobre alinhagem de células de câncer de mama humano SK-BR-3, que expressa 3 x105 antígenos de superfície HER-2 por célula. A droga conjugada atinge umgrau de citotoxicidade semelhante à droga maitansinóide livre, o que poderiaser aumentado pelo aumento no número de moléculas de maitansinóides pormolécula de anticorpo. O conjugado A7-maitansinóide apresentaram baixacitotoxicidade sistêmica em camundongos.

Conjugados Anticorpo-maitansinóide (Imunoconjugados)

Os conjugados anticorpo-maitansinóide são preparadosquimicamente ligando um anticorpo a uma molécula de maitansinóide semdiminuir significativamente a atividade biológica do anticorpo ou da moléculamaitansinóide. Uma média de 3-4 moléculas maitansinóide conjugada por amolécula de anticorpo mostrou eficácia em amplificar a citotoxicidade emcélulas alvo sem afetar negativamente a função ou a solubilidade do anticorpo,embora mesmo uma molécula de anticorpo/toxina se esperasse amplificar acitotoxicidade sobre o uso de um anticorpo nú. Maitansinóide são bemconhecidos no estado da técnica e podem ser sintetizados por técnicasconhecidas ou isolados de fontes naturais. Maitansinóide apropriados sãodescritos, por exemplo, na patente US 5.208.020 e outras atentes epublicações não patentes referidas abaixo no presente. Os maitansinóidespreferidos são maitansinol e análogos do maitansinol modificados no anelaromático ou em outras posições da molécula do maitansinol, tais como váriosésteres do maitansinol.

Existem diversos grupos de ligação conhecidos no estado datécnica para a fabricação de conjugados de anticorpo e maitansinóide, queincluem, por exemplo, os descritos na patente US 5.208.020 ou Patente EP0.425.235 B1 e Chari ei a/., Câncer Research 52: 127-131 (1992). Os gruposde ligação incluem grupos dissulfeto, grupos tioéter, grupos de ácidos lábeis,grupos fotolábeis, grupos lábeis de peptidase ou grupos lábeis de esterase,conforme descrito nas patentes identificadas acima.

Os conjugados do anticorpo e maitansinóide podem serfabricados através da utilização de uma série de agentes acopladores protéicosbifuncionais, tais com propionato de N-succinimidil-3-(2-piridilditio) (SPDP),cicloexano-1-carboxilato de succinimidil-4-(N-maleimidometila), iminotiolano(IT), derivados bifuncionais de imidoésteres (tais como adipimidato de dimetilaHCI), ésteres ativos (tais como suberato de disuccinimidila), aldeídos (taiscomo glutaraldeído), compostos bis-azido (tais como bis-(para-azidobenzoil)-hexanodiamina), derivados de bis-diazônio (tais como bis-(para-diazoniobenzoil)-etilenodiamina), diisocianatos (tais como 2,6-diisocianato detolueno) e compostos de flúor bis-ativo (tais como 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenzeno). Em certos exemplos de realização, os agentes acopladoresincluem propionato de N-succinimidil-3-(2-piridiltio) (SPDP) (Carlsson et a/.,Biochem. J. 173: 723-737 (1978)) e pentanoato de N-succinimidil-4-(2-piridiltio)(SPP) para proporcionar a ligação de dissulfeto.

O ligante pode estar unido à molécula de maitansinóide emdiversas posições, dependendo do tipo da ligação. Uma ligação éster pode serformada, por exemplo, através da reação com um grupo hidroxila, utilizando-setécnicas convencionais de acoplamento. A reação pode ocorrer na posição C-3que possui um grupo hidroxila, na posição C-14 modificada com hidroximetila,na posição C-15 modificada com um grupo hidroxila e na posição C-20 quepossui um grupo hidroxila. Em uma realização preferida, a ligação é formadana posição C-3 do maitansinol ou um análogo do maitansinol.

Caliqueamicina

Outro imunoconjugado de interesse compreende um anticorpoconjugado a uma ou mais moléculas de caliqueamicina. A famíliacaliqueamicina de antibióticos é capaz de produzir quebras de DNA de fitadupla em concentrações sub-picomolares. Para a preparação de conjugadosda família de caliqueamicina, vide as patentes US 5.712.374, US 5.714.586,US 5.739.116, US 5.767.285, US 5.770.701, US 5.770.710, US 5.773.001 e US5.877.296 (todas da American Cyanamid Company). Análogos estruturais decaliqueamicina que podem ser utilizados incluem, mas sem limitar-se a, y-i', a-i, a3',N-acetil-yi1, PSAG e 2\ (Hinman et al., Câncer Research 53: 3336-3342 (1993),Lode et al., Câncer Research 58: 2925-2928 (1998) e as patentes US da AmericanCyanamid citadas acima). Outra droga antitumoral à qual o anticorpo pode serconjugado é QFA, que é um antifolato. Tanto caliqueamicina quanto QFA contêmsítios intracelulares de ação e não atravessam facilmente a membrana plasmática.Portanto, a absorção celular desses agentes através de internalização mediada poranticorpos aumenta grandemente seus efeitos citotóxicos

Outros Agentes Citotóxicos

Outros agentes anti-tumor que podem ser conjugados aosanticorpos da invenção incluem BCNU, streptozoicina, vincristina e 5-fluorouracil, a família do complexo LL-E33288 de agentes conhecidoscoletivamente descrito nas patentes US 5.053.394 e US 5.770.710, bem comoas esperamicinas (Patente US 5.877.296).

Toxinas enzimaticamente ativas e seus fragmentos que podemser utilizados incluem cadeia A de difteria, fragmentos ativos não-ligantes datoxina de difteria, cadeia A de exotoxina (de Pseudomonas aeruginosa), cadeiaA rícina, cadeia A de abrina, cadeia A de modeccina, alfa-sarcina, proteínas deAleurites fordii, proteínas de diantina, proteínas de Phytolaca americana (PAPI,PAPII e PAP-S), inibidor Momordica charantia, curcina, crotina, inibidor deSapaonaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicinae os tricotecenos. Vide, por exemplo, o documento WO 93/21232, publicadoem 28 de outubro de 1993.

A presente invenção contempla adicionalmente um antagonistaconjugado a um composto com atividade nucleolítica (por exemplo, ribonuclease ouuma endonuclease de DNA, tal como deoxirribonuclease; DNase).

Para a destruição seletiva do tumor, o anticorpo pode conter umátomo altamente radioativo. Uma série de isótopos radioativos é disponívelpara a produção de antagonistas radioconjugados. Exemplos incluem At211, I131,I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 e isótopos radioativos de Lu. Quando oconjugado for utilizado para diagnóstico, ele pode compreender um átomoradioativo para estudos cintilográficos, por exemplo, tc99m ou 1123, ou uma marca despin para formação de imagem através de ressonância magnética nuclear (NMR)(também conhecida como formação de imagem por ressonância magnética, MRI),tal como novamente o iodo-123, iodo-131, índio-111, flúor-19, carbono-13,nitrogênio-15, oxigênio-17, gadolínio, manganês ou ferro.

A radiomarcação ou outras podem ser incorporadas ao conjugadode formas conhecidas. O peptídeo pode ser, por exemplo, biossintetizado oupode ser sintetizado através de síntese química de aminoácidos, utilizandoprecursores de aminoácidos apropriados, envolvendo, por exemplo, flúor-19 nolugar de hidrogênio. Marcas tais como tc99m, I123, Re186, Re188 e In111 podem serligadas através de um resíduo de cisteína no peptídeo. ítrio-90 pode ser ligadoatravés de um resíduo de lisina. O método lodogen (Fraker ei a/. (1978),Biochem. Biophys. Res. Commun. 80: 49-57) pode ser utilizado para aincorporação de iodo-123. Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy(Chatal, CRC Press, 1989) descreve outros métodos em detalhes.

Os conjugados do anticorpo e agente citotóxico podem serfabricados por meio de uma série de agentes acopladores protéicosbifuncionais, tais como propionato de N-succinimidila-3-(2-piridilditio) (SPDP),cicloexano-1-carboxilato de succinimidil-4-(N-maleimidometila), iminotiolano(IT), derivados bifuncionais de imidoésteres (tais como adipimidato de dimetilaHCI), ésteres ativos (tais como suberato de di-succinimidila), aldeídos (taiscomo glutaraldeído), compostos bis-azido (tais como bis-(para-azidobenzoil)-hexanodiamina), derivados bis-diazônio (tais como bis-(para-diazoniobenzoil)-etilenodiamina), diisocianatos (tais como 2,6-diisocianato de tolueno) ecompostos de flúor bis-ativo (tais como 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenzeno). Pode-se preparar, por exemplo, uma imunotoxina rícina, conforme descrito em Vitettaet al., Science 238: 1098 (1987). Ácido 1-isotiocianatobenzil-3-metildietilenotriaminopentaacético marcado por carbono 14 (MX-DTPA) é um exemplo deagente quelante para conjugação de radionucletídeo ao anticorpo. Vide odocumento WO 94/11026. O ligante pode ser um "ligante capaz de ser clivado"que facilita a liberação da droga citotóxica na célula. Pode-se utilizar, porexemplo, um ligante de ácido lábil, ligante sensível à peptidase, ligantefotolábel, ligante de dimetila ou ligante contendo dissulfeto (Chari et al., CâncerResearch 52: 127-131 (1992); patente US 5.208.020).

Os compostos da invenção contemplam expressamente, mas nãosão limitados a, ADC preparado com reagentes reticulantes: BMPS, EMCS,GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB,SMPH, sulfo-EMCS, sulfo-GMBS, sulfo-KMUS, sulfo-MBS, sulfo-SIAB, sulfo-SMCC, sulfo-SMPB, e SVSB (succinimidil-(4-vinilsulfona)benzoato) que estãocomercialmente disponíveis (por exemplo, pela Pierce Biotechnology, Inc.,Rockford, IL, EUA). Veja páginas 467-498 de Applications Handbook andCatalog 2003-2004.

Preparação De Anticorpos Conjugados Com Drogas

Nos conjugados de anticorpos com drogas (ADC) da invenção,um anticorpo conjugado (Ab) a um ou mais frações da droga (D), por exemplo,cerca de 1 a 20 frações da droga por anticorpo, através de um ligante (L). OADC da fórmula I pode ser preparado por diversos protocolos, empregandoreações de química orgânica, circunstancias e reagentes conhecidos poraqueles hábeis na técnica, incluindo: (1) reação de um grupo nucleofílico de umanticorpo com um reagente ligante bivalente, para formar Ab-L, através de umaligação covalente, seguida pela reação com a fração de droga D; e (2) reaçãode um grupo nucleofílico de uma fração da droga com um reagente ligantebivalente, para formar D-L, através de uma ligação covalente, seguida pelareação com o grupo nucleofílico de um anticorpo.

Ab-(L-D)p

Os grupos nucleofílico nos anticorpos incluem, mas não sãolimitados: (i) grupos amino N-terminal, (ii) grupos amino da cadeia lateral, porexemplo lisina, (iii) grupos tiol da cadeia lateral, por exemplo cisteína, e (iv)hidroxila do açúcar ou grupos amino onde o anticorpo é glicosilado. Os gruposamino, tiol e hidroxila são nucleofílicos e capazes de reagir às ligações deforma covalente com os grupos eletrofílicos em frações dos ligantes ereagentes ligantes incluindo: (i) ésteres ativos tais como ésteres de NHS,ésteres de HOBt, haloformatos, e halides ácidos; (ii) Alquilas e halides benziltais como haloacetamidas; (iii) grupos dos aldeídos, das cetonas, carboxil emaleimida. Determinados anticorpos têm ligações intercadeias reduzidas, istoé, pontes de cisteína. Os anticorpos podem ser feitos reativos pela conjugaçãocom os reagentes ligantes pelo tratamento com um agente redutor, tal comoDTT (ditiotreitol). Cada ponte do cisteína dará forma assim, teoricamente, adois tióis nucleofílicos reativos. Os grupos nucleofílicos adicionais podem serintroduzidos em anticorpos pela reação das lisinas com 2-iminotiolano(reagente de Traut) tendo por resultado a conversão de uma amina em um tiol.

Os conjugados de anticorpos com drogas da invenção podemtambém ser produzidos pela modificação do anticorpo para introduzir a regiãoeletrofílicas, que podem reagir com os substituintes nucleofílicos no reagenteligante ou na droga. Os açúcares de anticorpos glicosilados podem seroxidados, por exemplo, com os reagentes de oxidação periodato, para darforma ao aldeído ou aos grupos cetona que podem reagir com o grupo aminodos ligantes reagentes ou frações das drogas. Os grupos iminas resultantes deSchiff do podem dar forma a uma ligação estável, ou podem ser reduzidos, porexemplo pelo reagente borohidrido para formar ligações amino estáveis. Emuma incorporação, a reação da porção do hidrato de carbono de um anticorpoglicosilado com a galactose oxidase ou o metaperiodato de sódio pode formargrupos carbonil (aldeído e cetona) na proteína que desta forma pode reagircom os grupos apropriados na droga (Hermanson, Bioconjugate Techniques).Em outra incorporação, as proteínas que contêm a serina N-terminal ou osresíduos do treonina podem reagir com o meta-periodato de sódio, tendo porresultado a produção de um aldeído no lugar do primeiro aminoácido(Geoghegan & Stroh, (1992) Bioconjugate Chem. 3:138-146; US 5362852). Talaldeído pode reagir com um ligante reagente ou uma fração da droganucleofílica.

Do mesmo modo, os grupos nucleofílicos em uma fração da drogaincluem, mas não são limitados a: grupos amino, tiol, hidroxila, hidrazida,oxime, hidrazina, tiosemicarbazona, carboxilato de hidrazina e gruposarilhidrazida capazes de reagir na forma de ligações covalente com os gruposeletrofílicos em frações do ligante e reagente do ligante incluindo: (i) ésteresativos, tais como, ésteres de NHS, ésteres de HOBt, haloformates e halidesácidos; (ii) Alquilas e halides benzil tais como haloacetamidas;; (iii) grupos dosaldeídos, das cetonas, carboxil e maleimida.

Alternativamente, pode ser feito uma proteína de fusãocompreendendo o anticorpo e o agente citotóxico, por exemplo, por técnicasrecombinantes ou pela síntese de peptídeo. O comprimento do DNA podecompreender as regiões respectivas que codificam as duas porções doconjugado estão adjacentes ou separadas por uma região que codifica umpeptídeo ligante que não destrua as propriedades desejadas do conjugado.

Contudo em outro exemplo de realização, o anticorpo pode serconjugado a um "receptor" (como, por exemplo, a estreptoavidina) para autilização no tumor pré direcionando o conjugado anticorpo-receptor que éadministrado ao paciente, seguido pela remoção do conjugado que não seligou ao receptor e está na circulação, pelo uso de um agente de limpeza, eentão é feita a administração de um "ligante" (por exemplo, avidina) no qual,está conjugado a um agente citotóxico (por exemplo, um radionucleotídeo).

Anticorpos Derivativos

Os anticorpos da invenção podem ainda ser modificados paraconter moléculas adicionais não-proteinácias que são conhecidos na técnica eprontamente disponíveis. Em um exemplo de realização, as moléculasadequadas para derivatização do anticorpo são polímeros hidrossolúveis.

Exemplos não limitantes de polímeros hidrossolúveis incluem, mas não selimitando a, polietilenoglicol (PEG), copolímeros de etileno-glicol/propilenoglicol,carboximetilcelulose, dextrano, álcool polivinílico, policloreto pirrolidona, poli-1,3-dioxolano, poli-1,3,6-trioxano, copolímero etileno/maleica anidrido,poliaminoácidos (homopolímeros ou copolímeros aleatórios), e dextrano ou poli(n-vinil pirrolidona) polietileno-glicol, homopolímeros de propropileno glicol, co-polímeros de oxido de prolipropileno oxido de etileno, poiiálcool polióis (porexemplo, glicerol), álcool polivinílico, e suas misturas. O polietilenoglicolpropionaldeído pode ter vantagens no processo de fabricação devido à suaestabilidade na água. O polímero pode ser de qualquer peso molecular, e podeser ramificada ou sem ramificação. O número de polímeros acoplados poranticorpo pode variar, e se mais de um polímero encontra-se anexo, ospolímeros podem ser a mesma molécula ou moléculas diferentes. Em geral, onúmero e/ou tipo de polímeros utilizado para derivatização pode serdeterminado com base em considerações, incluindo mas não limitado-se a,propriedades específicas ou funções do anticorpo de ser melhorado, se osanticorpos derivados serão utilizados no âmbito de uma terapia, etc.

Formulações Farmacêuticas

Formulações terapêuticas compreendendo o anticorpo dainvenção são preparadas são preparadas para o armazenamento através damistura de um anticorpo que tenha o grau desejado de pureza com veículos,excipientes ou estabilizantes farmaceuticamente aceitáveis opcionais(Remington's Pharmaceutical Sciences, 16a edição, Osol, A. Ed. (1980)), naforma de formulações liofilizadas, soluções aquosas ou outras formulaçõessecas. Veículos, excipientes ou estabilizantes aceitáveis são atóxicos parapacientes nas dosagens e concentrações empregadas e incluem tampões taiscomo fosfato, citrato, histidina e outros ácidos orgânicos, antioxidantes queincluem ácido ascórbico e metionina; conservantes (tais como cloreto deoctadecildimetilbenzilamônio, cloreto de hexametônio, cloreto de benzalcônio,cloreto de benzetônio; álcool fenólico, butílico ou benzílico; alquilparabenos taiscomo metil ou propilparabeno; catecòl; resorcinol; cicloexanol; 3-pentanol emeta-cresol); polipeptídeos de baixo peso molecular (menos de cerca de 10resíduos); proteínas, tais como albumina de soro, gelatina ou imunoglobulinas;polímeros hidrofílicos, tais como polivinilpirrolidona; aminoácidos, tais comoglicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina ou lisina; monossacarídeos,dissacarídeos e outros carboidratos, incluindo glicose, manose ou dextrinas;agentes quelantes tais como EDTA; açúcares, tais como sacarose, manitol,trealose ou sorbitol; contra-íons formadores de sais tais como sódio; complexosmetálicos (por exemplo, complexos protéicos de Zn); e/ou tensoativos não-iônicos, tais como TWEEN™, PLURONICS™ ou polietilenoglicol (PEG).

A formulação da presente invenção pode também conter mais deum composto ativo, conforme necessário para a indicação específica sendotratada, preferencialmente, ditos compostos apresentam atividadescomplementares que não prejudica um ao outro. Tais moléculas sãoapresentadas de forma apropriada em combinação em quantidade que sãoeficazes para o propósito pretendido.

Os ingredientes ativos podem também ser armazenados emmicrocápsulas preparadas, por exemplo, através de técnicas conservação oupolimerização interfacial, tais como microcápsulas de hidroximetilcelulose oumicrocápsulas de gelatina e de poli-(metacrilato de metila), respectivamente,em sistemas de fornecimento de drogas coloidais (por exemplo, lipossomos,microesferas de albumina, microemulsões, nanopartículas e nanocápsulas), ouem macroemulsões. Ditas técnicas são descritas em Remington'sPharmaceutical Sciences, 16a edição, Ed. Osol, A. (1980).

As formulações a serem utilizadas para administração in vivodevem ser estéreis. Por exemplo, pela filtração através das membranas defiltração estéreis.

Podem ser fabricadas preparações de liberação prolongada.Exemplos apropriados de preparações de liberação prolongada incluemmatrizes semipermeáveis de polímeros hidrofóbicos sólidos que contenham aimunoglobulina da invenção, que se encontram na forma de artigos moldados,tais como filmes ou microcápsulas. Exemplos de matrizes de liberaçãoprolongada incluem poliésteres, hidrogéis (tais como poli-(metacrilato de 2-hidroxietila) ou álcool poli-(vinílico)), poli-lactídeos (patente US 3.773.919),copolímeros de ácido L-glutâmico e L-glutamato de g etila, acetato deetilenovinila não-degradável, copolímeros degradáveis de ácido láctico e ácidoglicólico, tal como LUPRON DEPOT™ (microesferas injetáveis compostas decopolímero de ácido láctico e ácido glicólico e acetato de leuprolide) e ácidopoli-D-(-)-3-hidroxibutírico. Embora polímeros tais como etilenovinilacetato eácido láctico-ácido glicólico permitam a liberação de moléculas por mais de 100dias, certos hidrogéis liberam proteínas por períodos de tempo mais curtos.Quando anticorpos encapsulados permanecem no organismo por um longoperíodo de tempo, eles podem desnaturas ou agregar como resultado daexposição à umidade a 37°C, resultando em uma perda da atividade biológica epossíveis mudanças na imunogenicidade. Estratégias racionais podem serplanejadas para estabilização, dependendo do mecanismo envolvido. Porexemplo, se o mecanismo de agregação for descoberto para ser a formação deligação S-S intermolécula através intercadeia tio-sulfeto, a estabilização podeser alcançada por resíduos sulfidrila, liofilização de soluções ácidas, controledo teor da umidade, utilizando aditivos apropriados, e desenvolvimento decomposições matrizes de polímero específicas.

Uso

Um anticorpo da invenção pode ser utilizado, por exemplo,em invitro, ex vivo e em métodos terapêuticos in vivo. Os anticorpos da invençãopodem ser usados como um antagonista para bloquear parcial ou totalmente aatividade específica do antígeno in vitro, ex vivo e/ou in vivo. Além disso, pelomenos alguns dos anticorpos da invenção podem neutralizar a atividade doantígeno de outras espécies. Assim, os anticorpos da invenção podem serusados para inibir a atividade de um antígeno específico, por exemplo, em umacultura celular contendo os antígenos, em seres humanos ou em outrosmamíferos, em indivíduos que tenham o antígeno com o qual um anticorpo dainvenção reage cruzadamente (por exemplo, chimpanzé, babuíno, mico,cinomolgo e Rhesus, porco ou camundongo). Em um exemplo de realização, oanticorpo da invenção pode ser usado para inibir a atividade do antígenoexpondo o anticorpo com o antígeno de tal maneira que a atividade doantígeno é inibida. Em um exemplo de realização, o antígeno é uma moléculade proteína humana.

Em um exemplo de realização, um anticorpo da invenção podeser usado em um método para inibir um antígeno em um paciente que sofre deuma doença na qual a atividade do antígeno é prejudicial, compreendendo emadministrar ao paciente um anticorpo da invenção na qual a atividade doantígeno do paciente é inibida. Em um exemplo de realização, o antígeno éuma molécula de proteína humana e o paciente é um paciente humano.

Alternativamente, o paciente pode ser um mamífero que expressa o antígenocom o qual o anticorpo da invenção se liga. Adicionalmente, o paciente podeser um mamífero no qual foi introduzido o antígeno (por exemplo, aadministração do antígeno ou a expressão de um antígeno transgênico). Oanticorpo da invenção pode ser administrado a um paciente humano para finsterapêuticos. Além disso, o anticorpo da invenção pode ser administrado a ummamífero não-humano que expressa o antígeno com o qual o anticorpo se ligapor reação cruzada (por exemplo, um primata, porco ou rato) para finsveterinários ou como um modelo animal de doenças humanas. Com relação aeste último citado, esses modelos animais podem ser úteis para avaliar aeficácia terapêutica dos anticorpos da invenção (por exemplo, testes dedosagens e curso de tempo da administração).

Os anticorpos antagonistas ou capazes de bloquear da invençãoque são úteis incluem, por exemplo, mas sem se limitar a, anticorpos anti-HER-2. O anticorpo anti-HER2 da invenção pode, por exemplo, ser usado paratratar, inibir, atrasar a progressão, prevenir/atrasar a reincidência, atenuar ouprevenir doenças, afecções ou condições associadas à expressão anormale/ou atividade de uma ou mais moléculas de antígenos, incluindo mas não selimitando a tumores malignos e benignos; malignidades linfóides e nãoleucêmicas; distúrbios neuronais, gliais, astrocitais, do hipotálamo e outrosdistúrbios glandulares, macrofágicos, epiteliais, estromais e blastocélicos; edistúrbios inflamatórios e imuno relacionados.

Em um aspecto, anticorpos de bloqueio da invenção sãoespecíficos para um antígeno ligante, e inibem a atividade do antígeno,bloqueando ou interferindo com a interação ligante-receptor envolvendo oantígeno ligante, inibindo assim a via de sinalização celular e molecularcorrespondente ou outros eventos. A invenção também tem a vantagem depossuir receptores de anticorpos específicos que não necessariamenteimpedem a ligação do ligante, mas interferem com a ativação do receptor,inibindo assim a quaisquer respostas que, normalmente, seria iniciada pelaligação do ligante. Em certos exemplos de realização, a invenção tambémengloba anticorpos que preferencialmente ou exclusivamente se ligam aocomplexo ligante-receptor. Um anticorpo da invenção também pode atuar comoum agonista de um antígeno receptor específico, assim, potencializando,reforçando ou ativando parcial ou totalmente, as atividades do ligante mediadopela ativação do receptor.

Distúrbios ou condições e testes diagnósticos associados comHER-2 são descritos na Patente US 6.387.371, que é incorporada ao presentepela referência. Vide também o documento W098/17797. A administração a umpaciente de uma quantidade terapeuticamente eficaz de anticorpos anti-receptor HER-2 inibe o crescimento de células tumorais e é útil no tratamentodo câncer. Trastuzumab (Genentech, Inc.) é um anticorpo monoclonalhumanizado recombinante dirigido contra o domínio extracelular de HER-2 para otratamento de cânceres que superexpressam HER-2 / possui o gene HER-2amplificado, sobretudo no câncer de mama metastático (MBC). Esses anticorpossão úteis no tratamento de outros cânceres especialmente aqueles que expressamHER-2. O anticorpo também pode ser administrado a pacientes em associação comoutros terapêuticos, como por exemplo, paclitaxel ou Tarceva®.

Em alguns exemplos de realização, um anticorpo anti-DR5 induza apoptose em células cancerosas. Em alguns exemplos de realização, oanticorpo anti-DR5 é um agonista de DR5. Em outros exemplos de realização,o anticorpo compete com o DR5 pela ligação ao Apo-2L.

Assim como referido anteriormente, anticorpos DR5 da invençãotêm várias utilidades. Por exemplo, anticorpos DR5 agonísticos podem serempregados em métodos para tratar patologias em mamíferos como câncer oudoenças relacionadas com a imunidade. Condições imuno-relacionadasincluem artrite reumatóide, lúpus eritematoso sistêmico, esclerodermia,idiopática miopatias inflamatórias, síndrome de sjõgren, vasculite sistêmica,sarcoidose, anemia hemolítica autoimune, tireoidite, doença renal imunorelacionada, tal como, glomerulonefrite, doença desmielinizante, como aesclerose múltipla, doença autoimune da pele, tal como psoríase, doenças einfiltrados pulmonares inflamatórias, e doenças alérgicas como a asma.

O diagnóstico das várias condições patológicas em mamíferosdescritas no presente pode ser realizado pelo médico qualificado. Técnicas dediagnóstico estão disponíveis no estado da técnica as quais permitem, porexemplo, o diagnóstico ou detecção de câncer ou doenças relacionadas com aimunidade em um mamífero. Por exemplo, cânceres podem ser identificadosatravés de técnicas, incluindo mas não limitado a, palpação, análise do sangue,raio-X, NMR, e similares. Doenças imune-relacionadas podem também serfacilmente identificadas. Por exemplo, no lúpus eritematoso sistêmico, omediador central da doença é a produção de auto-anticorpos reativos aproteínas/tecidos do próprio paciente e a subseqüente geração da inflamaçãoimuno-mediada. Múltiplos órgãos e sistemas são afetados clinicamenteincluindo rim, pulmão, sistema musculoesquelético, mucocutâneo, olhos,sistema nervoso central, sistema cardiovascular, trato gastrintestinal, medulaóssea e sangue. Os médicos estão familiarizados com uma série de doençasno qual a intervenção da resposta imune e/ou inflamatória têm se beneficiado.

Em um exemplo de realização especifico um imunoconjugado quecompreende um anticorpo com um agente citotóxico é administrado aopaciente. Em alguns exemplos de realização, o imunoconjugado e/ou oantígeno ao qual este está ligado é internalizado pela célula, resultando emaumento da eficácia terapêutica do imunoconjugado na morte de células a qualse liga. Em uma realização preferida, o agente citotóxico se combina ouinterfere com o ácido nucléico em células cancerosas. Exemplos de ditosagentes citotóxicos incluindo agentes quimioterápicos citados no presente (porexemplo, matasinóides ou caliquiamicinas), isótpos radioativos ouribonucleases e endonucleases de DNA.

Os anticorpos da invenção podem ser utilizados isoladamente ouem combinação com outras composições em uma terapia. Por exemplo, umanticorpo da invenção pode ser co-administrado com outro anticorpo, agente(s)quimioterápico(s) (incluindo coquetéis de agentes quimioterápicos), outroagente(s) citotóxico(s)m, agente(s) anti-angiogênico(s), citocinas ou agente(s)inibidor(es) do crescimento. No qual o anticorpo da invenção inibe ocrescimento de um tumor, e este pode ser, se desejado, combinado com outroagente terapêutico adicional que tmbém inibe o crescimento do tumor. Porexemplo, um anticorpo da invenção pode ser combinado com um anticorpoanti-VEGF (por exemplo, AVASTIN) e/ou anticorpos anti-ErbB (por exemplo,anticorpos anti-HER-2, HERCEPTIN®), em um esquema de tratamento, porexemplo, no tratamento de uma das doenças descritas no presente, incluindocâncer colorretal, câncer de mama metastático e câncer de rim.Alternativamente, ou adicionalmente, o paciente pode receber radioterapiacombinada (por exemplo, feixe irradiação externa ou terapia com um agenteradioativo marcado, tal como um anticorpo). Essas terapias combinadasreferidas acima incluem a administração combinada (no qual dois ou mais agentesestão incluídas na mesma, ou em formulações distintas), e administração separada,e nesse caso, a administração do anticorpo da invenção pode ocorrer antes, e/ouapós a administração da terapia ou terapias adjuvantes.

O anticorpo da invenção (e agente terapêutico adjunto) é/sãoadministrado(s) por qualquer meio apropriado, que inclui parenteral,subcutâneo, intraperitoneal, intrapulmonar e intranasal e, se desejado paratratamento local, administração intralesional. As infusões parenterais incluemadministração intramuscular, intravenosa, intraarterial, intraperitoneal ousubcutânea. Além disso, o antagonista é administrado adequadamente pormeio de infusão no pulso, particularmente com doses decrescentes doantagonista. Preferencialmente, a dosagem é fornecida por meio de injeções,de maior preferência injeções intravenosas ou subcutâneas, dependendo, emparte de se a administração é rápida ou crônica.

A composição de anticorpo deve ser formulada, dosada eadministrada de uma forma consistente com as boas práticas médicas. Fatorespara consideração neste contexto incluem a disfunção particular a ser tratado,o mamífero particular a ser tratado, a condição clínica do paciente, a causa dadisfunção, o local de fornecimento do agente, o método de administração, oesquema de administração e outros fatores conhecidos pelos médicos. Oanticorpo não precisa ser, mas é opcionalmente formulado com um ou maisagente normalmente utilizado para prevenir ou tratar a disfunção em questão. Aquantidade eficaz destes outros agentes depende da quantidade do anticorpopresente na formulação, do tipo de disfunção ou tratamento, e outros fatoresdiscutidos acima. Estes são geralmente utilizados nas mesmas dosagens ecom vias de administração conforme descritas acima ou cerca de 1 a 99% dasdosagens descritas no presente.Para a prevenção ou tratamento de doença, a dosagemapropriada de anticorpo (quando utilizado isoladamente ou em combinaçãocom outros agentes tais como agentes quimioterápicos) dependerá do tipo dedoença a ser tratada, do tipo de anticorpo, da severidade e do curso dadoença, se o anticorpo é administrado para propósitos preventivos outerapêuticos, terapia anterior, histórico clínico do paciente, reação ao anticorpoe do critério do médico atendente. O anticorpo é adequadamente administradoao paciente em uma vez ou ao longo de uma série de tratamentos.

Dependendo do tipo e da severidade da doença, cerca de 1 ug/kg a 15 mg/kg(tal como 0,1 mg/kg a 10 mg/kg) de anticorpo é uma possível dose inicial paraadministração ao paciente, seja, por exemplo, por meio de uma ou maisadministrações separadas ou por meio de infusão contínua. Uma dosagemdiária típica poderá variar de cerca de 1 ug/kg a 100 mg/kg ou mais,dependendo dos fatores mencionados acima. Para administrações repetidas aolongo de vários dias ou mais, dependendo da condição, o tratamento é mantidoaté que ocorra supressão desejada de sintomas da doença. Uma dosagemexemplar do anticorpo estará na faixa de cerca de 0,05 mg/kg a 10 mg/kg.

Desta forma, uma ou mais doses de cerca de 0,5 mg/kg, 2,0 mg/kg, 4,0 mg/kgou 10 mg/kg (ou qualquer de suas combinações) podem ser administradas aopaciente. Essas doses podem ser administradas intermitentemente, tal comosemanalmente ou a cada três semanas (por exemplo, de tal forma que opaciente receba cerca de duas a cerca de vinte, tal como cerca de seis dosesdo anticorpo). Dose de ataque inicial mais alta, seguida por uma ou mais dosesmais baixas, pode ser administrada. Exemplo de regime de dosagemcompreende a administração de dose de carregamento inicial de cerca de 4mg/kg, seguida por dose de manutenção semanal de cerca de 2 mg/kg doanticorpo. Entretanto, outros regimes de dosagens podem ser úteis. Oandamento desta terapia é facilmente monitorado por meio de técnicas e testesconvencionais.

Artigos Manufaturados

Em outro aspecto da invenção, um artigo manufaturado, contendoos materiais úteis para o tratamento, prevenção e/ou diagnóstico dasdesordens acima descritas são fornecidos. O artigo manufaturado consta deum recipiente e rótulo ou uma bula sobre ou associado ao recipiente. Osrecipientes apropriados incluem, por exemplo, frascos, seringas, blisters, etc.Os recipientes podem ser feitos de uma variedade de materiais tais como ovidro ou o plástico. O recipiente guarda uma composição a qual está sozinhaou está combinada com outra composição eficaz para tratar prevenir e/oudiagnosticar a condição e que possa ter uma porta de acesso estéril (porexemplo, o recipiente pode ser um bolsa de solução intravenosa ou um frascoque possui um controlador (stopper pierceable) colocado através de umaagulha de injeção hipodérmica). Pelo menos um agente ativo na composição éum anticorpo da invenção. O rótulo ou a bula indicam que a composição é útilpara o tratamento de escolha. Adicionalmente, o artigo manufaturado podecompreender (a) um primeiro recipiente com uma composição nele contida,onde a composição compreende um anticorpo da invenção, e (b) um segundorecipiente com uma composição nele contida que compreende um agentecitotóxico ou outro agente terapêutico. O artigo manufaturado nesta realizaçãoda invenção pode ainda compreender um folheto informativo que indique queas composições podem ser usadas para tratar um caso especial.Alternativamente, ou adicionalmente, o artigo manufaturado pode aindacompreende de um segundo (ou terceiro) recipiente contendo um tampãofarmaceuticamente aceitável, como água bacteriostática para injeção (BWFI),solução salina tamponada com fosfato, solução de Ringer e solução dedextrose. Pode-se incluir ainda outros materiais desejáveis a partir de umaperspectiva comercial e de uso, que inclui outros tampões, diluentes, filtros,agulhas e seringas.

Após a invenção ter sido descrita de forma geral, a mesma serámais facilmente compreendido pela referência aos exemplos seguintes, quesão fornecidas com objetivo de ilustrar e não são destinados a limitar a invenção.

Exemplos

Exemplo I

Construção De Bibliotecas De Fab Exibidas Por Fago Com Resíduos DeCDR Enriquecido Em Tyr, Ser. Gly e Arg

Bibliotecas de Fab exibidas por fago foram construídasutilizando um vetor fagomídeo, Fab-C, que resultou na exibição demoléculas Fab bivalente dimerizadas por uma cisteína livre inserida entre oFab da cadeia pesada e o domínio C-terminal do gene-3 da proteínasecundária da cápside (P3C). Este vetor foi construído como descrito nopedido de Patente US 2005/0119455 e em Lee et a/., J. Immunol. Meth..284: 1 19-132 (2004). O vetor (ilustrado esquematicamente na figura 5)inclui os domínios variáveis do anticorpo 4D5 humanizado sob o controledo promotor Ptac IPTG-indutível. Anticorpo 4D5 humanizado temessencialmente a seqüência consenso humano da região estrutural dascadeias leves e pesadas, e regiões CDR de um anticorpo monoclonal decamundongo específico para HER-2. Métodos para a produção deanticorpos anti-HER-2 e a identidade das seqüências do domínio variávelsão fornecidos nas Patentes US 5.821.337 e US 6.054.297.

Quatro bibliotecas foram construídas: YSGR-A, YSGR-B, YSGR-C, e YSGR-D. As bibliotecas foram construídas com resíduos aleatorizados emtodas as três CDRs de cadeias pesadas e leves CDR3. Cada biblioteca foialeatorizada nas posições 91-94 e 96 de CDRL3, 28 e 30-33 de CDRH1, 50,52-54, 56 e 58 de CDRH2, e nas posições 95, 96, 97, 98, 99, 100, 100a, 100be 100c de CDRH3. O tipo e relação dos aminoácidos permitida a cada uma dasposições aleatorizadas estão ilustrados na Figura 8. Além disso, o comprimentodo CDRH3 foi variado, utilizando oligonucleotídeos que substituíram os setecódons do tipo selvagem nas posições de 95 a 100a com seis a dezessetecódons. Assim, em certos casos, o códon correspondente a posição 100a dacadeia pesada não estava presente (por exemplo, quando a mutagênese foirealizada com os oligonucleotídeos mutagênicos H3-A6 (SEQ ID No: 35), H3-B6 (SEQ ID No: 47), H3-C6 (SEQ ID No: 59) ou H3-D6 (SEQ ID No: 71), comodescrito abaixo. Vide Figura 9A-D O tipo e a relação de aminoácidos permitidasnessas posições eram as mesmas que as descritas na Figura 8 para asposições 95-100a da CDRH3.

Bibliotecas foram construídas utilizando o método de Kunkel(Kunkel, TA, Roberts, JD & Zakour, RA, Methods Enzymol. (1987), 154,367-382), com métodos anteriormente descritos (Sidhu, SS, Lowman, HB,Cunningham, BC & Wells, JA, Methods Enzymol. (2000), 328, 333-363).

Uma versão única "molde de parada" do vetor de exibição do Fab, Fab-Cfoi utilizada para gerar todas as quatro bibliotecas, como descrito noExemplo 1.

Oligonucleotídeos mutagênicos com códons dedegenerescência nas posições a serem diversificadas, foram utilizadospara simultaneamente (a) introduzir diversidades em CDR e (b) reparar doscódons de parada. As seqüências destes oligonucleotídeos mutagênicossão exibidas nas Figuras 9A-9D. Para todas as bibliotecas, diversidade foiintroduzida no CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 com oligonucleotídeos H1, H2e L3, respectivamente (SEQ ID Nos:). Para a biblioteca YSGR-A, foiintroduzida uma diversidade de CDR-H3 com uma mistura equimolar deoligonucleotídeos H3-A6, H3-A7, H3-A8, H3-A9, H3-A10, H3-A11, H3-A12,H3-A13, H3-A14, H3-A15, H3-A16, e H3-A17 (SEQ ID Nos: 35-46). Para abiblioteca YSGR-B, foi introduzida uma diversidade de CDR-H3 com umamistura equimolar de oligonucleotídeos H3-B6, H3-B7, H3-B8, H3-B9, H3-B10, H3-B11, H3-B12, H3- ' B13, H3-B14, H3-B15, H3-B16, e H3-B17 (SEQID Nos: 47-58). Para a biblioteca YSGR-C, foi introduzida uma diversidadede CDR-H3 com uma mistura equimolar de oligonucleotídeos H3-C6, H3-01, H3-C8, H3-C9, H3-C10, H3-C11, H3-C12, H3-C13, H3-C14, H3-C15,H3-C16, e H3-C17 (SEQ ID Nos: 59-70). Para a biblioteca YSGR-D, foiintroduzida uma diversidade de CDR-H3 com uma mistura equimolar deoligonucleotídeos H3-D6, H3-D7, H3-D8, H3-D9, H3-D10, H3-D11, H3-D12,H3-D13, H3-D14, H3-D15, H3-D16, e H3-D17 (SEQ ID Nos: 71-82). Cadaum dos oligonucleotídeos mutagênicos H3-A6 para H3-A17 (SEQ ID Nos:35-46), H3-B6 a H3-B17 (SEQ ID Nos: 47-58), H3-C6 a H3-C17 (SEQ IDNos: 59-70) e H3-D6 a H3-D17 (SEQ ID Nos: 71 -82) codificado umaalanina na posição 93 da cadeia pesada. Os oligonucleotídeosmutagênicos para todos os CDRs foram aleatorizados para ser incorporadosimultaneamente em uma única reação de mutagênese, assim aincorporação simultânea de todos os oligonucleotídeos mutagênicosresultou na introdução da diversidade projetada em cada posição e,reparando simultaneamente todos os códons de parada TAA. Assim, umquadro de leitura aberto foi gerado para codificar uma biblioteca Fabfundida a uma ponte de cisteína homodimerizante e P3C. Seguindo amutagênese, as quatro bibliotecas foram combinadas para criar uma únicabiblioteca, denominada biblioteca YSGR-AD.

As reações de mutagênese foram eletroporadas em E. coli SS320(Sidhu et a/., Supra). As células transformadas foram cultivadas overnight napresença de auxiliador de fago M13-K07 (New England Biolabs, Beverly, MA)para produzir partículas de fago que encapsulam o DNA de fagomídeos eexibem fragmentos de Fab em suas superfícies. A biblioteca combinadacontém mais que 3x10 membros únicos.

EXEMPLQ2

Seleção de Anticorpos Específicos a Partir de Bibliotecas YSGR-ADNaives

Fago da biblioteca YSGR-AD (descrito no Exemplo 1, acima)foram ciclizados através de etapas de seleção por ligação para enriquecerclones ligantes de DR5 ou HER-2 humanos. As seleções foram realizadasutilizando métodos de ligação descritos anteriormente (Sidhu et ai, Supra).

Uma seqüência do DR5 é exibida na Tabela 1. Um domínioextracelular do DR5 como demonstrado na Tabela 1 é utilizado na seleção porligação. De modo semelhante, uma seqüência do domínio extracelular do HER-2 humano é preparada como descrito por Franklin MC. Carey KD. Vajdos FF.Leahy DJ. de Vos AM. Sliwkowski MX, Insights into ErbB signaling from thestructure of the ErbB2-pertuzumab complex, Câncer Cell. 5(4):317-28, 2004. Aseqüência para HER-2 ECD (aminoácidos 23-646) é fornecida no ProteinDataBank Record 1S78 (2004).

Placas NUNC de 96 poços Maxisorp Immunoplates foramrevestidas overnight a 4 °C, com 5 ug/mL de proteína alvo (DR5 humano ouHER-2 humano) e bloqueadas por 2 horas com uma solução de PBT (tampãofosfato contendo adicionalmente 0,2% BSA e 0,05% de Tween 20 (Sigma)).

Após o crescimento overnight a 37 °C, os fagos foram concentrados porprecipitação com PEG/NaCI e foram ressuspendidos em PBT, como descritoanteriormente (Sidhu et ai, Supra). A solução de Fago (cerca de 1012 fago/mL)foram adicionados à placa Immunoplate revestida. Após duas horas de incubaçãopara permitir a ligação do fago, as placas foram lavadas dez vezes com PBT. Osfago ligados foram eluídos com 0,1 M de HCI por dez minutos e os eluentes foramneutralizados com 1,0 M de base Tris. Os fagos eluídos foram amplificados em E.coliXL-1-blue e utilizadas para novas etapas de seleção.As bibliotecas foram submetidas a cinco etapas de seleção contracada proteína alvo. Clones individuais de cada etapa de seleção foramcultivados em palcas de 96 poços em 500 uL de caldo de 2YT complementadocom carbenicilina e M13-K07. O sobrenadante da cultura foi utilizadadiretamente em fago ELISA (Sidhu et a/., Supra) para detectar Fabs exibidospor fago que se ligaram nas placas revestidas com a proteína alvo, mas não seligaram as placas revestidas com BSA. Ligantes específicos foram definidoscomo aqueles clones de fago que exibiram um sinal de ELISA de, no mínimo,10 vezes maior nas placas revestidas com a proteína alvo, em comparaçãocom placas revestidas com BSA. Clones individuais foram selecionados depoisde 4 e 5 eta pas de seleção para se ligarem ao DR5 humano ou HER-2humano. Os ligantes específicos foram submetidos à análise das seqüências.Os ligantes específicos foram também analisados utilizando um ensaio deafinidade ELISA spot, especificidade por ELISA, e afinidade para HER-2utilizando métodos como os descritos no presente. (Vide, Figura 11.) Tal comoindicado na Figura 10, as bibliotecas YSGR-AD produzem ligantes específicoscontra ambas as proteínas alvo.

Dos 240 clones identificados que se ligam especificamente aoHER-2 humano, 106 delas tiveram seqüências de CDR únicas (Vide, Figura11). As seqüências únicas caíram em 3 categorias: 1) 6-7 resíduo nasseqüências CDRH3; 2) oito resíduo nas seqüências CDRH3; e 3) CDR decomprimento médio nas seqüências com tirosina, serina e glicina na seqüência.

O domínio variável de cadeia pesada do anti-HER-2 demonstrouuma preferência por seqüências CDRH3 curtas (por exemplo, 6-7 aminoácidosna posições correspondentes a 95 a 100a) não incluídas na biblioteca de oligo.(Vide, Figura 12). O CDRH3 exibe um resíduo tirosina conservada naextremidade N-terminal na posição 95. A outra posição conservada éencontrada na posição 99, que é predominantemente glicina. As seqüênciasconsensos são exibidas para CDRL3: QQSYYX4PST (SEQ ID No: 587);CDRH1-.GFSIX2X3SYIH (SEQ ID No: 588); e CDRH2:

SIYPX3SGYTSYADSKVG (SEQ ID No: 589), no qual X representa umaposição de aminoácido para a qual um resíduo consenso não foi identificado eonde a posição X em cada CDR é Y ou S.

Os domínios variáveis de cadeia pesada que possuem CDRH3com oito aminoácidos tem conservado glicinas nos finais do N e C-terminais doCDRH3 (nas posições 95 e 100a). A posição 98 é também conservada comuma tirosina. A posição 99 com um CDHR3 de 8 aminoácidos demonstra umapreferência por um pequeno aminioácido tal como G, S, A, ou T. Essa posiçãoé seguida por um grande aminoácido na posição 100, tal como R, H, Y, e W.Seqüências consenso são mostradas por CDRH1:GFX1ISYSSIH (SEQ ID No590); e CDRH2.SIYPX3YGX5TX6YADSKVG (SEQ ID No 591), onde Xrepresenta uma posição de aminoácido para a qual um resíduo consenso nãofoi identificado e é Y ou S.

Análise do domínio variável da cadeia pesada de comprimentomédio (por exemplo, cerca de 12 a 14 aminoácidos) da região CDRH3 forneceuma seqüência consenso CDRH3; XEX2X3X4YYSYYX10GX12X13X14DY(SEQ ID No:592), no qual X representa uma posição de aminoácido para a qualum resíduo consenso não foi identificado e onde a posição X1 é selecionado deY, S e R, X2 é selecionado de Y e S; X3 é selecionado de G, Y e S; X4 éselecionado de G, Y e S; X4 é selecionado de Y, S, R e G; X10 é selecionadode Y, S e G, X12 é selecionado de Y, S e G; X13 é selecionado de G e A e X14é selecionado de I, F, M e L (vide, Figura 14). Como o CDRH3 forma uma alça,o consenso para o CDRH3 foi desenvolvido pela transferência da seqüênciapara alguns clones de mais de dois aminoácidos, de modo que a posição 95 daseqüência poderia se alinhar com a posição 97 da seqüência de referênciaque, neste caso, foi a seqüência do clone 52 . A seqüência de consensotambém é demonstrada para CDRH1: GFX1ISSSS1H (SEQ ID No :593); eCDRH2: X1IX2PSSGYTX6YADSKVG (SEQ ID No:594), no qual X representauma posição de aminoácido para a qual um resíduo consenso não foiidentificado e é Y ou S.

Tal como descrito na Figura 11B, vários dos clones ligados a HER-2tiveram IC5o entre 0,1 a IO nM. Na maior parte, estes ligantes de alta afinidadetinham pouca ou nenhuma reação cruzada com outros antígenos, tais como VEGF,DR5, insulina, neutravidina, hormônio do crescimento humano ou IGF-1.

Tal como indicado na Figura 10, 144 clones que expressavamFabs foram identificados por serem ligantes específicos para o DR5 humano. Aseqüência de análise identificou 18 seqüências únicas de aminoácidos desses144 clones, exibidos na Figura 15.

O IC5o de cada um destes ligantes foram determinados porcompetição em fago ELISA, seguido pela incubação em poços 96-NUNCMaxisorp Immunoplates revestido overnight a 4 °C com hDR5-ECD (5 ug/ml) ebloqueado com BSA. Fabs exibidos por Fagos foram multiplicados em E. coliXU-blue, com a adição de auxiliador de fago M13-K07. Após o crescimentoovernight a 37 °C em meio 2YT, os fagos foram concentrados por precipitaçãoem PEG/NaCI e ressuspendidos em tampão fosfato-salino tamponado (PBS),0,5% (w/v) de BSA, 0,1% (v/v) de Tween 20 (tampão PBT). Os Fagos foramdiluídos seriadamente em tampão PBT e a ligação foi mensurada paradeterminar a concentração de fago dando um sinal de saturação de - 50%.Uma concentração sub saturada fixada de fago foi pré-incubada por 2h emdiluições seriadas hDR5-ECD e, depois, transferidas para efetuar a análise dasplacas revestidas com hDR5-ECD. Após 15 min de incubação, as placas foramlavadas com PBS, 0,05% de Tween 20 e incubadas por 30 min com conjugadoperoxidase de rábano silvestre /anticorpo anti-M13 (diluição 1:5000 em tampãoPBT). As placas foram lavadas, desenvolvidas com substrato TMB, e apagadascom 1,0 M de H3PO4, e lido espectrofotometricamente a 450 nm. A afinidade deligação dos ligantes anti-hDR5

A afinidade de ligação dos ligantes anti-hDR5 foram determinadascomo valores IC50 definido como a concentração de hDR5-ECD que bloqueou50% da ligação do fago para o hDR5-ECD imobilizado.

Os clones foram analisados pela ligação ao domínio extracelulardo DR5 humano (SEQ ID No: 595). Os ligantes com o menor IC50 têmpredominantemente srina no CDRH1 e arginina no CDRH3 nas posições 96 e99. Análise do domínio variável da cadeia pesada da região CDRH3 forneceuma seqüência consenso de CDRH3: YRX3YRYGX8X9X10GSYX14X15DY(SEQ ID No:596), no qual X3 é selecionado a partir de Y, S, R, P e G; X8 éselecionado a partir de R, Y e S; X9 é selecionado a partir de G, Y e S; X10 éselecionado a partir de S, Y e R; X14 é selecionado a partir de G e A e X15 éselecionado a partir de L e F, no qual X representa uma posição de aminoácidopara a qual um resíduo consenso não foi identificado, (vide, Figura 16). Aseqüência de consenso também é demonstrada para CDRL3: QQXIX2X3SPST(SEQ ID No: 597), no qual X1, X2 e X3 são Y ou S; CDRH2:X1ISPX3X4GYTX6YADSKVG (SEQ ID No:599), no qual X representa umaposição de aminoácido para a qual um resíduo consenso não foi identificado eé X ou Y. As seqüências consenso podem ser utilizadas, nomeadamente, paraa constituição de novas bibliotecas de domínios variáveis de anticorpos. NoCDRH3, os aminoácidos nas posições 97, 100b, 100c, 100h e 100i podemcontribuir para a maior afinidade.

Os clones também foram analisados pela ligação ao DR5 murinoutilizando o teste fago ELISA por competição descrita acima. Vários clonesforam isolados a partir da biblioteca YSGR-A-D que se ligava tanto a DR5humano quanto a DR5 murino, embora a ligação a DR5 murino ter sido deafinidade muito menor, (vide Figura 17). Esta biblioteca fornecida para oisolamento de anticorpos que possam se ligar tanto a DR5 humano quanto aDR5 murino indicando que os ligantes foram identificados como únicos,comparado a um total de CDRH3 aleatório (todos os vinte aminoácidos) e auma biblioteca YS CDRH3. Modificando a diversidade de aminoácidospermitidos em cada posição, pode fornecer anticorpos que se ligam adiferentes epítopos e que possuem funções biológicas únicas. Anticorpo anti-DR5 que se ligam tanto a CDRs humanos quanto a CDRs murinos podem seligar a epítopos diferentes do que aqueles anticorpos anti-DR5 das bibliotecasanteriormente desenvolvidas.

exemplq3

Análise dos Ligantes de DR5

O sítio de ligação para ligante de Apo 2L para o DR5 humano foipreviamente mapeado e a estrutura cristalina para o sítio de ligação foideterminada (vide, Hymowitz et al, Molecular Cell 4:564 (1999); e documentoWO01/19861). A estrutura cristalina e modelos podem ser usados para mapeara ligação dos anticorpos anti-DR5.

Estudos anteriores identificaram anticorpos que se ligam a DR5humano. Esses anticorpos são designados BDF1 e YSD1. O anticorpo BDF1foi isolado de uma biblioteca em que os CDRs foram aleatorizados em todos os20 aminoácidos e possuindo as seqüências CDR: 1) seqüência CDRH1 deIGKSGIH (SEQ ID No: 600); 2); seqüência CDR2 da VAVIYPHDGNTAYA (SEQID No: 601); e 3) seqüência CDRH3 de RLALVRMWMD (SEQ ID No: 602). Oanticorpo YSD1 foi isolado de uma biblioteca na qual as posições CDR foramvariadas com tirosina e de serina e possui uma seqüência CDRH3 deYSSYYSYYYSSSSYSY (SEQ ID No: 603), O sítio de ligação destes anticorposao DR5 humano está localizado no N terminal da molécula e tem poucasobreposição com o ligante de Apo 2L, que predominantemente se encontra noC terminal (aminoácidos da alça 50s, por exemplo, aminoácidos, 50-65 eaminoácidos da alça 90s, por exemplo, aminoácidos 91 a 104 do DR5). Ummodelo demonstrando a ligação das regiões CDRH3 de cada um dessesanticorpos é mostrado na Figura 18. O CDRH3 do BDF1 e YSD1 se sobrepõe eforma um local preferencial (hot spot) de ligação para o DR5. A ligação doCDRH3 do YSD1 é mediada por tirosinas e a ligação do BFD1 é mediada pelaseqüência LAL A ligação do YSD 1 no DR5 envolve a leucina, glutamina,alanina, fenilalanina, arginina e resíduos da DR5.

Exemplo 4

Construção De Bibliotecas De Fab Exibidas Por Fago Com Resíduos DeCDRH1, H2 e L3 Enriquecido Em Ser e Ala. Cys. ESP, Gly, Ile, Leu. Asn,

Pro. Arg. Thr. Trp ou Tyr

Bibliotecas de Fab exibidas por fago foram construídas utilizandoum vetor fagomídeo, Fab-C, que resultou na exibição de moléculas Fabbivalente dimerizadas por uma cisteína livre inserida entre o Fab da cadeiapesada e o domínio C-terminal do gene-3 da proteína secundária da cápside(P3C), como descrito previamente noExemplo 1.

Doze bibliotecas foram construídas: SAH3, SCH3, SFH3, SGH3,SLH3, SNH3, SPH3, SRH3, STH3, SWH3, e SYH3. As bibliotecas foramconstruídas com resíduos aleatorizados em todas as três CDRs de cadeiaspesadas e leves CDR3. Cada biblioteca foi aleatorizada nas posições: 91-94 e96 de CDRL3, posições 28 e 30-33 da CDRH1, posiçõesõO, 52-54, 56 e 58 daCDRH2 e posições 95-100, 100a a 100m da CDRH3. O tipo e relação dosaminoácidos permitida a cada uma das posições aleatorizadas estão ilustradosnas Figuras 19A-19B. Além disso, o comprimento do CDRH3 foi variado,utilizando oligonucleotídeos que substituíram os seis códons do tipo selvagementre as posições 95 e 100 com 4 a 10 códons. O tipo e a relação deaminoácidos permitidas nessas posições eram as mesmas que as descritasnas Figuras 19A-19B para as posições 95-100 da CDRH3.Bibliotecas foram construídas utilizando o método de Kunkel (Kunkel,et. ai, Methods Enzymol. (1987), 154, 367-382), com métodos anteriormentedescritos (Sidhu, SS, et ai, Methods Enzymol. (2000), 328, 333-363). Uma versãoúnica "molde de parada" do vetor de exibição do Fab, Fab-C foi utilizada para gerartodas as quatro bibliotecas, como descrito no Exemplo 1.

Oligonucleotídeos mutagênicos com códons dedegenerescência nas posições a serem diversificadas, foram utilizadospara simultaneamente (a) introduzir diversidades em CDR e (b) reparar doscódons de parada. As seqüências destes oligonucleotídeos mutagênicossão exibidas nas Figuras 20A-20L. Para todas as bibliotecas, diversidadefoi introduzida no CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 com oligonucleotídeos H1,H2 e L3, respectivamente (SEQ ID Nos:).

Para a biblioteca SAH3, foi introduzida uma diversidade de CDR-H3 com uma mistura equimolar de oligonucleotídeos H3-SA4, H3-SA5, H3-SA6, H3-SA7, H3-SA8, H3-SA9, H3-SA10, H3-SA11, H3-SA12, H3-SA13, H3-SA14, H3-SA15, H3-SA16, e H3-SA17 (SEQ ID Nos: 621-634).

Para a biblioteca SCH3, foi introduzida uma diversidade deCDRH3 com uma mistura equimolar de oligonucleotídeos H3-SC4, H3-SC5,H3-SC6, H3-SC7, H3-SC8, H3-SC9, H3-SC10, H3-SC11, H3-SC12, H3-SC13,H3-SC14, H3-SC15, H3-SC16, e H3-SC17 (SEQ ID Nos: 635-648).

Para a biblioteca SFH3, foi introduzida uma diversidade de CDR-H3 com uma mistura equimolar de oligonucleotídeos H3-SF4, H3-SF5, H3-SF6,H3-SF7, H3-SF8, H3-SF9, H3-SF10, H3-SF11, H3-SF12, H3-SF13, H3-SF14,H3-SF15, H3-SF16, e H3-SF17 (SEQ ID Nos: 649-662).

Para a biblioteca SGH3, foi introduzida uma diversidade de CDR-H3 com uma mistura equimolar de oligonucleotídeos H3-SG4, H3-SG5, H3-SG6, H3-SG7, H3-SG8, H3-SG9, H3-SG10, H3-SG11, H3-SG12, H3-SG13,H3-SG14, H3-SG15, H3-SG16, e H3-SG17 (SEQ ID Nos: 663-676).Para a biblioteca SIH3, foi introduzida uma diversidade de CDR-H3 com uma mistura equimolar de oligonucleotídeos H3-SI4, H3-SI5, H3-SI6,H3-SI7, H3-SI8, H3-SI9, H3-SI10, H3-SI11, H3-SI12, H3-SI13, H3-SI14, H3-SI15, H3-SI16, e H3-SI17 (SEQ ID Nos: 677-690).

Para a biblioteca SLH3, foi introduzida uma diversidade de CDR-H3 com uma mistura equimolar de oligonucleotídeos H3-SL4, H3-SL5, H3-SL6,H3-SL7, H3-SL8, H3-SL9, H3-SL10, H3-SL11, H3-SL12, H3-SL13, H3-SL14,H3-SL15, H3-SL16, e H3-SL17 (SEQ ID Nos: 691-704).

Para a biblioteca SNH3, foi introduzida uma diversidade de CDR-H3 com uma mistura equimolar de oligonucleotídeos H3-SN4, H3-SN5, H3-SN6, H3-SN7, H3-SN8, H3-SN9, H3-SN10, H3-SN11, H3-SN12, H3-SN13, H3-SN14, H3-SN15, H3-SN16, e H3-SN17 (SEQ ID Nos: 705-718).

Para a biblioteca SPH3, foi introduzida uma diversidade de CDR-H3 com uma mistura equimolar de oligonucleotídeos H3-SP4, H3-SP5, H3-SP6, H3-SP7, H3-SP8, H3-SP9, H3-SP10, H3-SP11, H3-SP12, H3-SP13, H3-SP14, H3-SP15, H3-SP16, e H3-SP17 (SEQ ID Nos: 719-732).

Para a biblioteca SRH3, foi introduzida uma diversidade de CDR-H3 com uma mistura equimolar de oligonucleotídeos H3-SR4, H3-SR5, H3-SR6, H3-SR7, H3-SR8, H3-SR9, H3-SR10, H3-SR11, H3-SR12, H3-SR13, H3-SR14, H3-SR15, H3-SR16, e H3-SR17 (SEQ ID Nos: 733-746).

Para a biblioteca STH3, foi introduzida uma diversidade de CDR-H3 com uma mistura equimolar de oligonucleotídeos H3-ST4, H3-ST5, H3-ST6,H3-ST7, H3-ST8, H3-ST9, H3-ST10, H3-ST11, H3-ST12, H3-ST13, H3-ST14,H3-ST15, H3-ST16, e H3-ST17 (SEQ ID Nos: 747-760).

Para a biblioteca SWH3, foi introduzida uma diversidade de CDR-H3 com uma mistura equimolar de oligonucleotídeos H3-SW4, H3-SW5, H3-SW6, H3-SW7, H3-SW8, H3-SW9, H3-SW10, H3-SW11, H3-SW12, H3-SW13,H3-SW14, H3-SW15, H3-SW16, e H3-SW17 (SEQ ID Nos: 761-774).Para a biblioteca SYH3, foi introduzida uma diversidade de CDR-H3 com uma mistura equimolar de oligonucleotídeos H3-SY4, H3-SY5, H3-SY6, H3-SY7, H3-SY8, H3-SY9, H3-SY10, H3-SY11, H3-SY12, H3-SY13, H3-SY14, H3-SY15, H3-SY16, e H3-SY17 (SEQ ID Nos: 775-788).

Os oligonucleotídeos mutagênicos para todos os CDRs foramaleatorizados para ser incorporado simultaneamente em uma única reação demutagênese, assim a incorporação simultânea de todos os oligonucleotídeosmutagênicos resultou na introdução da diversidade projetada em cada posiçãoe, reparando simultaneamente todos os códons de parada TAA. Assim, umquadro de leitura aberto foi gerado para codificar uma biblioteca Fab fundida auma ponte de cisteína homodimerizante e P3C. Seguindo mutagênese, as vintebibliotecas foram combinadas para criar uma única biblioteca, denominadabiblioteca SXH3.

As reações de mutagênese foram eletroporadas em E. coli SS320(Sidhu et a/., Supra). As células transformadas foram cultivadas overnight napresença de auxiliador de fago M13-K07 (New England Biolabs, Beverly, MA)para produzir partículas de fago que encapsulam o DNA de fagomídeos eexibem fragmentos de Fab em suas superfícies. A biblioteca combinadacontém mais que 3 x 1010 membros únicos.

Exemplo 5

Seleção de Anticorpos Específicos a Partir de Bibliotecas SXH3 NaivesFago da biblioteca SXH3 (descrito no Exemplo 4, acima) foramciclizados através de etapas de seleção por ligação para enriquecer clonesligantes de HER-2 humano. As seleções foram realizadas utilizando métodosde ligação descritos anteriormente (Sidhu et ai, Supra).

Placas NUNC de 96 poços Maxisorp Immunoplates foramrevestidas e incubadas overnight a 4 °C, com 5 ug/mL de proteína alvo (HER-2humano) e bloqueadas por 2 horas com uma solução de PBT (tampão fosfatocontendo adicionalmente 0,2% BSA e 0,05% de Tween 20 (Sigma)). Após ocrescimento overnight a 37 °C, os fagos foram concentrados por precipitaçãocom PEG/NaCI e foram ressuspendidos em PBT, como descrito anteriormente(Sidhu et aí., Supra). A solução de Fago (cerca de 1012 fago/mL) foramadicionados à placa Immunoplate revestida. Após duas horas de incubaçãopara permitir a ligação do fago, as placas foram lavadas dez vezes com PBT.Os fago ligados foram eluídos com 0,1 M de HCI por dez minutos e os eluentesforam neutralizados com 1,0 M de base Tris. Os fagos eluídos foramamplificados em E. coli XL-1-blue e utilizadas para novas etapas de seleção.

As bibliotecas foram submetidas a seis etapas de seleção contraa proteína alvo. Clones individuais de cada etapa de seleção foram cultivadosem palcas de 96 poços em 500 uL de caldo de 2YT complementado comcarbenicilina e M13-K07. O sobrenadante da cultura foi utilizada diretamenteem fago ELISA (Sidhu et ai, Supra) para detectar Fabs exibidos por fago quese ligaram nas placas revestidas com a proteína alvo, mas não se ligaram asplacas revestidas com BSA. Ligantes específicos foram definidos como aquelesclones de fago que exibiram um sinal de ELISA de, no mínimo, 10 vezes maiornas placas revestidas com a proteína alvo, em comparação com placasrevestidas com BSA. Clones individuais foram selecionados depois de 4, 5 e 6etapas de seleção para se ligarem ao HER-2 humano. Os ligantes específicosforam submetidos à análise das seqüências. Tal como indicado na Figura 21,as bibliotecas SXH3 produzem ligantes específicos para a proteína alvo.

Dos 72 clones identificados que se ligam especificamente aoHER-2, 27 delas tiveram seqüências de CDR únicas (Vide, Figura 21A). Asseqüências únicas caíram em 3 categorias: a) seqüências CDR com posiçõesaleatorizadas limitadas a duas partes Tyr/Ser (clones Nos: B1-5 e B28); b)seqüências CDR com posições aleatorizadas limitadas a Trp/Ser (clones Nos:B6-24); e c) seqüências CDR com posições aleatorizadas limitadas a Phe/Ser(clones Nos: B25-27). Estes clones foram também altamente específicos paraHER2 e não apresentaram reatividade cruzada com as outras cinco proteínascontrole, VEGF humano, DR5 humano, insulina humana, neutravidina, IGF-1humano ou HGH (vide, Figura 21B). A concentração inibitória para cada cloneé exibida na Figura 21B.

Um teste de ELISA por fago foi utilizado para testar a capacidadede todos os clones de reagirem cruzadamente com um painel de seisantígenos diferentes do antígeno alvo. Os fagos foram produzidos em placasde 96 poços, tal como descrito e o sobrenadante foi diluído de 3 vezes emtampão PBT. O sobrenadante de fago diluído foi transferido para placasrevestidas com VEGF humano, HER2 humano, DR5 humano, insulina humana,neutravidina, IGF-1 humano, HGH ou BSA e incubados durante uma hora, sobagitação suave à temperatura ambiente. As placas foram lavadas em PBSincluindo 0,05% de Tween 20 e foram incubadas por 30 min com conjugadoperoxidase de rábano silvestre /anticorpo anti-M13 (diluição 1:5000 em tampãoPBT) (phamacia). As placas foram lavadas, desenvolvidas com substratotetrametílbenzidina (TMB) (Kirkegaard and Perry Laboratories), e apagadas com 1,0M de H3PO4. A absorbância foi determinada espectrofotometricamente a 450 nm. Aafinidade de ligação fraca foi definida como um sinal de cerca de 0,2 a 2,0, e aafinidade de ligação forte foi definida como um sinal de cerca de 2,0. Os resultadospara os clones que se ligam a HER2 são exibidos na Figura 21B. Como mostra aFigura 25, dos clones isolados da SXH3, os clones S:R exibiram uma média deligação não específica maior (OD de 0,5-0,6 a 450 nm pelo teste de ELISA),enquanto os clones S:W, S:Y, e S:F exibiram níveis baixos ou médio de ligação nãoespecífica (OD de 0-0,1 a 450 nm pelo teste de ELISA).

Um teste de competição com ELISA por fago foi utilizado paraestimar afinidade de ligação ao HER-2 de Fabs exibidos por fagos. Os fagosforam produzidos em placas de 96 poços, tal como descrito anteriormente, esobrenadante foi diluído seriadamente em tampão PBT e, em seguida,incubados em placas revestidas com HER2 por 15 minutos. As placas foramlavadas em PBS incluindo 0,05% de Tween 20 e foram incubadas durante 30minutos com conjugado peroxidase de rábano silvestre /anticorpo anti-M13(diluição 1:5000 em tampão PBT) (phamacia). As placas foram lavadas,desenvolvidas com substrato tetrametílbenzidina (TMB) (Kirkegaard and PerryLaboratories), e apagadas com 1,0 M de H3PO4. A absorbância foi determinadaespectrofotometricamente a 450 nm para determinar a concentração de fagodando um sinal de saturação de ~ 50%. Uma concentração sub saturada fixadade fago foi diluída duas vezes em tampão PBT contendo diluições seriadas emduplicatas da proteína HER-2 a partir de 250 nM de HER-2 a 0,12 nM de HER-2. As misturas foram incubadas durante uma hora, sob agitação suave àtemperatura ambiente, e foram transferidas para placas revestidas com HER2e foram então incubadas durante 15 minutos. As placas foram lavadas etratadas exatamente como descrito anteriormente. A afinidade de ligação foiestimada como valore IC50 (definido como a concentração de antígeno quebloqueou 50% da ligação de fago nos antígenos imobilizados). Os resultadossão exibidos na Figura 21B.

Exemplo 6

Construção De Bibliotecas De Fab Exibidas Por Fago Com Resíduos DeCDR Enriquecido Em Ser e Phe. Arg. Trp ou Tyr

Bibliotecas de Fab exibidas por fago foram construídas utilizandoum vetor fagomídeo, Fab-C, que resultou na exibição de moléculas Fabbivalente dimerizadas por uma cisteína livre inserida entre o Fab da cadeiapesada e o domínio C-terminal do gene-3 da proteína secundária da cápside(P3C), como descrito previamente no Exemplo 1.

Quatro bibliotecas foram construídas: SFH3, SRH3, SWH3 eSYH3. As bibliotecas foram construídas com resíduos aleatorizados em todasas três CDRs e a CDR3 da cadeia leve. Cada biblioteca foi aleatorizada nasposições: 91-94 e 96 de CDRL3, posições 28 e 30-33 da CDRH1, posiçõesõO,52-54, 56 e 58 da CDRH2 e posições 95-100, 100a a 100m da CDRH3. O tipoe relação do aminoácido permitido a cada uma das posições aleatorizada estãoilustrados na Figura 22. Além disso, o comprimento do CDRH3 foi variado,utilizando oligonucleotídeos que substituíram os seis códons do tipo selvagementre as posições 95 e 100 com 4 a 17 códons. O tipo e a relação deaminoácidos permitidas nessas posições eram as mesmas que as descritas naFigura 22 para as posições 95-100 da CDRH3.

Bibliotecas foram construídas utilizando o método de Kunkel(Kunkel, TA, Roberts, JD & Zakour, RA, Methods Enzymol. (1987), 154, 367-382), com métodos anteriormente descritos (Sidhu, SS, Lowman, HB,Cunningham, BC & Wells, JA, Methods Enzymol. (2000), 328, 333-363). Umaversão única "molde de parada" do vetor de exibição do Fab, Fab-C foi utilizadapara gerar todas as quatro bibliotecas, como descrito no Exemplo 1.

Oligonucleotídeos mutagênicos com códons de degenerescêncianas posições a serem diversificadas, foram utilizados para simultaneamente (a)introduzir diversidades em CDR e (b) reparar dos códons de parada. As seqüênciasdestes oligonucleotídeos mutagênicos são exibidas nas Figuras 20 e 23. Para todasas bibliotecas SF-superfície, diversidade foi introduzida no CDR-L3, CDR-H1 eCDR-H2 com oligonucleotídeos L3-SF, H1-SF e H2-SF, respectivamente (SEQ IDNos:) (Figura 23) e a diversidade foi introduzida noCDR-H3 com uma misturaequimolar de oligonucleotídeos H3-SF4, H3-SF5, H3-SF6, H3-SF7, H3-SFS, H3-SF9, H3-SF10, H3-SF11, H3-SF12, H3-SF13, H3-SF14, H3-SF15, H3-SF16, e H3-SF17 (SEQ ID Nos: 649-662) (Figura 20 C).

Para a biblioteca SR-superfície, a diversidade foi introduzida noCDR-L3, CDR-H1 e CDR-H2 com oligonucleotídeos L3-SR, H1-SR e H2-SR,respectivamente (SEQ ID Nos.) (Figura 23) e a diversidade foi introduzida noCDR-H3 com uma mistura equimolar de oligonucleotídeos H3-SR4, H3-SR5,H3-SR6, H3-SR7, H3-SR8, H3-SR9, H3-SR10, H3-SR11, H3-SR12, H3-SR13,H3-SR14, H3-SR15, H3-SR16, e H3-SR17 (SEQ ID Nos: 733-746) (Figura20l).

Para a biblioteca SW-superfície, a diversidade foi introduzida noCDR-L3, CDR-H1 e CDR-H2 com oligonucleotídeos L3-SW, H1-SWe H2-SW,respectivamente (SEQ ID Nos: 747-760) (Figura 23) e a diversidade foiintroduzida no CDR-H3 com uma mistura equimolar de oligonucleotídeos H3-SW4, H3-SW5, H3-SW6, H3-SW7, H3-SW8, H3-SW9, H3-SW10, H3-SW11,H3-SW12, H3-SW13, H3-SW14, H3-SW15, H3-SW16, e H3-SW17 (SEQ IDNos: 761-774) (Figura 20K).

Para a biblioteca SY-superfície, a diversidade foi introduzida noCDR-L3, CDR-H1 e CDR-H2 com oligonucleotídeos L3, H1 e H2,respectivamente (SEQ ID Nos:) (Figura 20A) e a diversidade foi introduzida noCDR-H3 com uma mistura equimolar de oligonucleotídeos H3-SY4, H3-SY5,H3-SY6, H3-SY7, H3-SY8, H3-SY9, H3-SY10, H3-SY11, H3-SY12, H3-SY13,H3-SY14, H3-SY15, H3-SY16, e H3-SY17 (SEQ ID Nos: 775-788) (Figura 20L).

Os oligonucleotídeos mutagênicos para todos os CDRs foramaleatorizados para ser incorporado simultaneamente em uma única reação demutagênese, assim a incorporação simultânea de todos os oligonucleotídeosmutagênicos resultou na introdução da diversidade projetada em cada posiçãoe, reparando simultaneamente todos os códons de parada TAA. Assim, umquadro de leitura aberto foi gerado para codificar uma biblioteca Fab fundida auma ponte de cisteína homodimerizante e P3C. Seguindo mutagênese, as vintebibliotecas foram combinadas para criar uma única biblioteca, denominadabiblioteca SX-superfície.

As reações de mutagênese foram eletroporadas em E. coli SS320(Sidhu et ai, Supra). As células transformadas foram cultivadas overnight napresença de auxiliador de fago M13-K07 (New England Biolabs, Beverly, MA)para produzir partículas de fago que encapsulam o DNA de fagomídeos eexibem fragmentos de Fab em suas superfícies. A biblioteca combinadacontém mais que 3 x 1010 membros únicos.

Exemplo 7

Seleção de Anticorpos Específicos a Partir de Bibliotecas SX- SuperfícieNaives

Fago da biblioteca SX-Superfície (descrito no Exemplo 6, acima)foram ciclizados através de etapas de seleção por ligação para enriquecerclones ligantes de HER-2 humano. As seleções foram realizadas utilizandométodos de ligação descritos anteriormente (Sidhu et ai, Supra).

Placas NUNC de 96 poços Maxisorp Immunoplates foramrevestidas e incubadas overnight a 4 °C, com 5 ug/mL de proteína alvo (HER-2humano) e bloqueadas por 2 horas com uma solução de PBT (Sigma). Após ocrescimento overnight a 37 °C, os fagos foram concentrados por precipitaçãocom PEG/NaCI e foram ressuspendidos em PBT, como descrito anteriormente(Sidhu et ai, Supra). A solução de Fago (cerca de 1012 fago/mL) foramadicionados à placa Immunoplate revestida. Após duas horas de incubaçãopara permitir a ligação do fago, as placas foram lavadas dez vezes com PBT.Os fago ligados foram eluídos com 0,1 M de HCI por dez minutos e os eluentesforam neutralizados com 1,0 M de base Tris. Os fagos eluídos foramamplificados em E. coli XL-1-blue e utilizadas para novas etapas de seleção.

As bibliotecas foram submetidas a seis etapas de seleção contraa proteína alvo. Clones individuais de cada etapa de seleção foram cultivadosem palcas de 96 poços em 500 uL de caldo de 2YT complementado comcarbenicilina e M13-K07. O sobrenadante da cultura foi utilizada diretamenteem fago ELISA (Sidhu et ai, Supra) para detectar Fabs exibidos por fago quese ligaram nas placas revestidas com a proteína alvo, mas não se ligaram asplacas revestidas com BSA. Ligantes específicos foram definidos como aquelesclones de fago que exibiram um sinal de ELISA de, no mínimo, 10 vezes maior nasplacas revestidas com a proteína alvo, em comparação com placas revestidas comBSA. Clones individuais foram selecionados depois de 4, 5 e 6 etapas de seleçãopara se ligarem ao HER-2 humano. Os ligantes específicos foram submetidos àanálise das seqüências. Tal como indicado na Figura 21, as bibliotecas SX-Superfície produzem ligantes específicos para a proteína alvo.

Dos 81 clones identificados que se ligam especificamente aoHER-2, 27 delas tiveram seqüências de CDR únicas (Vide, Figura 24A). Asseqüências únicas caíram em 2 categorias: (a) seqüências CDR com posiçõesaleatorizadas limitadas ao binário Tyr/Ser (clones Nos: G49-61); (b) seqüênciasCDR com posições aleatorizadas limitadas ao binário Trp/Ser (clones Nos: G29-48).Os clones Tyr/Ser foram altamente específicos para HER2 e não apresentaramreatividade cruzada com as outras cinco proteínas controle, VEGF humano, DR5humano, insulina humana, neutravidina, IGF-1 humano ou HGH (vide, Figura 24B).A concentração inibitória para cada clone é exibida na Figura 24B.

Um teste de ELISA por fago foi utilizado para testar a capacidadede todos os clones de reagirem cruzadamente com um painel de seisantígenos diferentes do antígeno alvo. Os fagos foram produzidos em placasde 96 poços, tal como descrito e o sobrenadante foi diluído de 3 vezes emtampão PBT. O sobrenadante de fago diluído foi transferido para placasrevestidas com VEGF humano, HER2 humano, DR5 humano, insulina humana,neutravidina, IGF-1 humano, HGH ou BSA e incubados durante uma hora, sobagitação suave à temperatura ambiente. As placas foram lavadas em PBSincluindo 0,05% de Tween 20 e foram incubadas por 30 min com conjugadoperoxidase de rábano silvestre /anticorpo anti-M13 (diluição 1:5000 em tampãoPBT) (phamacia). As placas foram lavadas, desenvolvidas com substratotetrametílbenzidina (TMB) (Kirkegaard and Perry Laboratories), e apagadascom 1,0 M de H3PO4. A absorbância foi determinada espectrofotometricamentea 450 nm. A afinidade de ligação fraca foi definida como um sinal de cerca de0,2 a 2,0 e a afinidade de ligação forte foi definida como um sinal de cerca de2,0. Os resultados para os clones SX-superfície são exibidos na Figura 24B.Como mostra a Figura 27, dos clones isolados da biblioteca SX- superfície, osclones S.Re S:W exibiram uma média de ligação não específica maior (OD de0,5-0,6 e aproximadamente OD 4,0 respectivamente a 450 nm pelo teste deELISA), enquanto os clones S:Y e S:F exibiram níveis baixos ou médio deligação não específica (OD de 0-0,1 a 450 nm pelo teste de ELISA).

Um teste de competição com ELISA por fago foi utilizado paraestimar afinidade de ligação ao HER-2 de Fabs exibidos por fagos. Os fagosforam produzidos em placas de 96 poços, tal como descrito anteriormente, esobrenadante foi diluído seriadamente em tampão PBT e, em seguida,incubados em placas revestidas com HER2 por 15 minutos. As placas foramlavadas em PBS incluindo 0,05% de Tween 20 e foram incubadas durante 30minutos com conjugado peroxidase de rábano silvestre /anticorpo anti-M13(diluição 1:5000 em tampão PBT) (phamacia). As placas foram lavadas,desenvolvidas com substrato tetrametílbenzidina (TMB) (Kirkegaard and PerryLaboratories), e apagadas com 1,0 M de H3P04. A absorbância foi determinadaespectrofotometricamente a 450 nm para determinar a concentração de fagodando um sinal de saturação de ~ 50%. Uma concentração sub saturada fixadade fago foi diluída duas vezes em tampão PBT contendo diluições seriadas emduplicatas da proteína HER-2 a partir de 250 nM de HER-2 a 0,12 nM de HER-2. As misturas foram incubadas durante uma hora, sob agitação suave àtemperatura ambiente, e foram transferidas para placas revestidas com HER2e foram então incubadas durante 15 minutos. As placas foram lavadas etratadas exatamente como descritas acima. A afinidade de ligação foi estimadacomo valore IC50 (definido como a concentração de antígeno que bloqueou50% da ligação de fago nos antígenos imobilizados). Os resultados sãoexibidos na Figura 24B.

Com base nesta análise, a análise dos clones ligantes de HER2 apartir da biblioteca SXH3 (Exemplo 6), e da biblioteca YSGR-AD (Exemplo 1),proteínas Fab solúveis de três clones (clone Nos.: 42 (YSGR-A) e B11 (SXH3)e G54 (SX-superfície)), foram purificados e submetidas ao ensaio deressonância plasmônica de superfície utilizando para a ligação ao HER2humano. Os dados de BlAcore® foram obtidos de acordo com Chen et al. J.Mol. Biol. (1999), 293(4): 865-81. Resumidamente, a afinidade de ligação dosFabs purificados para HER2 humano foram calculados a partir das constantesde associação e dissociação mensuradas utilizando o sistema ressonânciaplasmônica de superfície BlAcore ®-A100 (BIACORE, Inc., Piscataway, NJ). OHER-2 foi covalentemente acoplado a um chips de biosensores em duasconcentrações diferentes utilizando N-etil-N'-(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida (EDC) e N-hidroxisucinimida (SNS) de acordo com as instruçõesdo fornecedor (BIACORE, Inc., Piscataway, NJ). O HER-2 foi diluído com 10mM de acetato de sódio, pH 5,0, para aproximadamente 2,5 ou 5 ug/ml.Alíquotas de HER2 foram injetadas a uma velocidade de fluxo de 5 ul/minutopara atingir aproximadamente 50 a 170 unidades de resposta (RU) de proteínaacoplada. Uma solução de 1M de etanolamina é adicionada como um agentede bloqueio. Para a mediação cinética, diluições seriadas em duplicatas decada Fab foram injetados em HBT a 25 °C em uma taxa de fluxo de cerca de10 ul/min sobre cada fluxo de células. A velocidade de associação (kon) foramcalculadas utilizando uma curva de ligação utilizando o BlAcore EvaluationSoftware package (BIACORE, Inc., Piscataway, NJ) utilizando a montagemglobal e local de dois pontos e combinando os dados de ambos fluxos decélulas A constante do equilíbrio de dissociação (Kp) é calculado como arelação k0ff/kon. Os dados BlAcore ® estão resumidos nas Figura 26A e B. Oclone B1L tinha um ka de 1,9 x 106 M"1 S"1, um kdde 1,7 x 10~3 S"1 e um KD de890 nM. O Rmaxi para o experimento com o clone B1I foi de 19 RU, e Rmax2 parao experimento com o clone B1I foi de 29 RU. (Figura 26A) Clone G54 teve umka de 2,0 x 105 M"1 S"1, um kdde 2,2 x 10"3 S'1 e um KD de 11 nM. O Rmaxi parao experimento com o clone G54 foi de 21 RU e Rmax2 para o experimento com oclone G54 foi de 34 RU. (Figura 26A) O clone YSGR-A-42 teve um ka de 2,7 x106 M"1S"1, um Kd de 1,5 x 10"3 s"1, e um KD de 570 pM. O Rmaxi para oexperimento com o clone 42 foi 25 RU, e Rmax2 para o experimento com o clone42 foi 38 RU. (Figura 26 ter) O clone contendo triptofano (B1I) teve umavelocidade de kon e KD correspondentemente menor do que o clone contendotirosina (G54).

Para estudar a ligação dos anticorpos anti-HER2 ao HER2expresso em células de mamíferos, a ligação da proteína Fab purificada dosclones 42 (YSGR-A), B1I (SXH3), G54 (SX-superfície), e G37 (SX-superfície) acélulas fibroblastos NR6 que super-expressam HER2 (NR6-HER2) foi estudadapor citometria de fluxo. Um milhão de células NR6-HER2 foram incubadas com10 ug/ml de Fab durante 1 hora, seguido pela incubação com um conjugadoAlexa488-Anticorpo murino anti- IgG humano por 1 hora. Como controlenegativo, Fab ligado a células NR6 que não expressam foram estudadas.Como controle positivo, Fab 4D5 foi utilizado. Assim como demonstrado naFigura 27, os clones 42, B1I, G54, G37 se ligam especificamente ao HER2 emcélulas NR6.

Um teste de competição com ELISA foi utilizado para avaliar acompetição por ligação com Omnitarg, Herceptin e entre alguns tipos de clonesHER2 na forma de IgG (vide, Figura 28 para as seqüências CDR dos clonesrelevantes). A proteína HER2 biotinilada foi diluída serialmente de 200 nM até0,39 mM em tampão PBT e então incubada em placas revestidas comproteínas IgG purificadas por 15 minutos. As placas foram lavadas em PBSincluindo 0,05% de Tween 20 e foram incubadas durante 30 minutos comconjugado peroxidase de rábano silvestre /anticorpo anti-M13 (diluição 1:5000em tampão PBT) (phamacia). As placas foram lavadas, desenvolvidas comsubstrato tetrametílbenzidina (TMB) (Kirkegaard and Perry Laboratories), eapagadas com 1,0 M de H3PO4. A absorbância foi determinadaespectrofotometricamente a 450 nm para determinar a concentração de HER2biotinilado dando um sinal de saturação de ~ 50%. Uma concentração subsaturada fixada de proteína HER2 biotinilada foi diluída duas vezes em tampãoPBT contendo 100 mM de proteínas IgG purificadas. As misturas foramincubadas durante uma hora, sob agitação suave à temperatura ambiente, eforam transferidas para placas revestidas com proteínas IgG purificadas eforam então incubadas durante 15 minutos. As placas foram lavadas e tratadasexatamente como descritas acima. Como mostra a Figura 29, nenhum dos IgGligantes de HER2 bloqueou a ligação do HER2 biotinilado, tanto com Omnitargquanto com Herceptin. Os IgGs bloquearam a ligação entre eles em doisgrupos. Um grupo composto pelos clones B1I, G37, G54, e YSGR-A-42competiram por um mesmo epítopo e bloquearam a ligação ao HER2biotinilado, que havia sido previamente incubado com qualquer um dessesclones. Um segundo grupo composto pelos clones YSGR-A-27, B27, G43 eYSGR-D-104 competiram pelo mesmo epítopo ao HER2 e bloquearam aligação ao HER2 biotinilado. Todos os clones do grupo um possuem maiorafinidade de ligação do que os clones do grupo dois.

Todas as publicações (incluindo as patentes e os pedidos depatentes) citadas no presente são incorporadas na sua totalidade pelareferência.

Tabela 2

<table>table see original document page 263</column></row><table>EDGRDCISCKYGQDYSTHWKDLLFCLRCTRCDSGEVELSPCTTTRNTVCQCEEGTFREED

SPEMCRKCRTGCPRGMVKVGDCTPWSDIECVHKESGTKHSGEAPAVEETVTSSPGTPASP

CSLS (SEQ ID No: 595)

Polipeptídeo DR5 humanomeqrgqnapa asgarkrhgp gpreargarp glrvpktlvl vvaavlllvs aesalitqqd lapqqraapqqkrsspsegl cppghhised grdcisckyg qdysthwndl Ifclrctrcd sgevelspct ttrntvcqceegtfreedsp emcrkcrtgc prgmvkvgdc tpwsdiecvh kesgiiigvt vaavvlivav fvcksllwkkvlpylkgics ggggdpervd rssqrpgaed nvlneivsil qptqvpeqem evqepaeptgvnmlspgese hllepaeaer sqrrrllvpa negdptetlr qcfddfadlv pfdsweplmr klglmdneikvakaeaaghr dtlytmlikw vnktgrdasv htlldaletl gerlakqkie dhllssgkfm ylegnadsal s(SEQ ID No: 604)

DR5-ECD murino

GLQRPEESPSRGPCLAGQYLSEGNCKPCREGIDYTSHSNHSLDSCILCTVCKEDKWETR

CNTrTNTVCRCKPGTFEDKDSPEICQSCSNCTDGEEELTSCTPRENRKCVSKTAWASWHK

SEQ ID No: 605)

Seqüência do polipeptídeo Apo-2L

1

MetAlaMetMetGluValGInGlyGlyProSerLeuGlyGInThrCysValLeulIeValIlePheThr

ValLeuLeuGInSerLeuCys

31

ValAlaValThrTyrValTyrPheThrAsnGluLeuLysGInMetGInAspLysTyrSerLysSerGI

ylleAlaCysPheLeuLysGIu

61

AspAspSerTyrTrpAspProAsnAspGluGluSerMetAsnSerProCysTrpGInValLysTrpGlnLeuArgGInLeuVaLArgLys91

MetlleLeuArgThrSerGIuGluThrlIeSerThrValGInGluLysGInGInAsnlIeSerProLeuValArgGluArgGlyProGln

121

ArgValAlaAIaHislleThrGIyThrArgGlyArgSerAsnThrLeuSerSerProAsnSerLysAsnGluLysAlaLeuGlyArgLys

151

IleAsnSerTrpGluSerSerArgSerGIyHisSerPheLeuSerAsnLeuHisLeuArgAsnGlyGIuLeuVallleHisGluLysGly

181

PheTyrTyrlIeTyrSerGInThrTyrPheArgPheGInGluGlulleLysGluAsiiThrLysAsnAspLysGInMetValGInTyrlIe

211

TyrLysTyrThrSerTyrProAspProlleLeuLeuMetLysSerAlaArgAsnSerCysTrpSerLysAspAlaGluTyrGIyLeuTyr

241

SerlIeTyrGInGlyGlyllePheGluLeuLysGluAsnAspArgIlePheValSerValThrAsnGIuHisLeulIeAspMetAspHis

271

GluAlaSerPhePheGlyAlaPheLeuValGIy (SEQ ID No: 606)

Seqüência de aminoácidos 114-281 da Apo-2LVRERGPQRVA AHITGTRGRS NTLSSPNSKN EKALGRKINS WESSRSGHSFLSNLHLRNGE LVEHEKGFYY IYSQTYFRFQ EEIKENTKND KQMVQYIYKYTSYPDPELLM KSARNSCWSK DAEYGLYSIY QGGEFELKEN DRIFVSVTNEHLIDMDHEAS FFGAFLVG (SEQ ID No: 607).Listagem de Seqüência

<110> Sidhu, Sachdev S.Birtalan, SaraFellouse, Frederic

<120> POLIPEPTÍDEOS LIGANTES E SEUS USOS

<130> 11669.291USU1

<140> NOVO DEPÓSITO<141> 12-01-2006

<150> 60/742,185<151> 12-02-2005

<150> 60/805,553<151> 22-06-2006

<160> 1013

<170> Patentln version 3.3

<210> 1

<211> 109

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Dominio variável de cadeia leve de 4D5 sintético<400> 1

Asp lie Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Vai Gly1 5 10 15

Asp Arg Vai Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Vai Asn Thr Ala20 25 30

Vai Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Ser Leu Tyr Ser Gly Vai Pro Ser Arg Phe Ser Gly50 55 60

Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gln Pro65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Vai Glu lie Lys Arg Thr100 105

<210> 2<211> 120<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Dominio variável de cadeia pesada de 4D5 sintético<400> 2

Glu Vai Gln Leu Vai Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Gln Pro Gly Gly1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn lie Lys Asp Thr20 25 30

Tyr lie His Trp Vai Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Vai35 40 45

Ala Arg lie Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Vai50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys85 90 95

Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln100 105 110

Gly Thr Leu Vai Thr Vai Ser Ser115 120

<210> 3

<211> 35

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDRL3 Sintético<400> 3

Gly Arg Met Lys Gln Leu Glu Asp Lys Vai Glu Glu Leu Leu Ser Lys15 10 15

Asn Tyr His Leu Glu Asn Glu Vai Ala Arg Leu Lys Lys Leu Vai Gly20 25 30

Glu Arg Gly35

<210> 4

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial<220>

<223> CDRH3 Sintético<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(1)

<223> X é independentemente de Y, G, S, R, A, D, E, F, H, I, K, L,

M, N, P, Q, T, V, ou W

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (2) . . (2)

<223> X é independentemente de Y, G, S, R, A, D, E, F, H, I, K, L,M, N, P, Q, T, V, ou W

<220>

<221> MISC_FEATURE<222> (3) . . (3)

<220>

<221> MISC_FEATURE<222> (4) . . (4)

<220>

<221> MISC_FEATURE<222> (5) .. (5)

<220>

<221> MISC_FEATURE<222> (6)..(6)

<223> X é independentemente de Y, G, S, R, A, D, E, F, H, I, K, L,

M, N, P, Q, T, V, ou W

<220>

<221> MISC_FEATURE<222> (6)..(6)

<223> X é independentemente de Y, G, S, R, A, D, E, F, H, I, K, L,

M, N, P, Q, T, V, ou W, e pode ser vários comprimentos

<220>

<221> MISC_FEATURE<222> (7) . . (7)

<223> X é independentemente de Y, G, S, R, A, D, E, F, H, I, K, L,

M, N, P, Q, T, V, ou W

<220>

<221> MISC_FEATURE<222> (8) .. (8)

<223> X é independentemente de Y, G, S, R, A, D, E, F, H, I, K, L,

M, N, P, Q, T, V, ou W<220>

<221> MISC_FEATURE<222> (9)..(9)

<400> 4

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Asp Tyr1 5 10

<210> 5

<211> 12

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Seqüência de articulação de cadeia pesada sintética<400> 5

Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly15 10

<210> 6

<211> 23

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> huMAb4D5-8 LC-FR1 sintético<400> 6

Asp lie Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Vai Gly1 5 10 15

Asp Arg Vai Thr lie Thr Cys20

<210> 7

<211> 15

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> huMAb4D5 LC-FR2 sintético<400> 7

Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie Tyr1 5 10 15

<210> 8<211> 32<212> PRT<213> Artificial<220>

<223> huMAb4D5 LC-FR3 sintético<400> 8

Gly Vai Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr1 5 10 15

Leu Thr lie Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys20 25 30

<210> 9

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> huMAb4D5 LC-FR4 sintético<400> 9

Phe Gly Gln Gly Thr Lys Vai Glu lie Lys1 5 10

<210> 10

<211> 25

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> huMAb4D5-8 HC-FR1 sintético<400> 10

Glu Vai Gln Leu Vai Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Gln Pro Gly Gly1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser20 25

<210> 11

<211> 13

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> huMAb4D5 HC-FR2 sintético<400> 11

Trp Vai Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Vai1 5 10

<210> 12<211> 30

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> huMAb4D5 HC-FR3 sintético<400> 12

Arg Phe Thr lie Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln1 5 10 15

Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys20 25 30

<210> 13

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> huMAb4D5 HC-FR4 sintético<4u0> 13

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Vai Thr Vai Ser Ser1 5 10

<210> 14

<211> 23

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> huMAb4D5-8 LC-FR1 sintético<400> 14

Asp lie Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Vai Gly1 5 10 15

Asp Arg Vai Thr lie Thr Cys20

<210> 15<211> 15<212> PRT<213> Artficial

<400> 15

Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie Tyr1 5 10 15

<210> 16<211> 32<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> huMAb4D5 LC-FR3 sintético<400> 16

Gly Vai Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr1 5 10 15

Leu Thr lie Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys20 25 30

<210> 17

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> huMAb4D5 LC-FR4 sintético<400> 17

Phe Gly Gln Gly Thr Lys Vai Glu lie Lys1 5 10

<210> 18

<211> 25

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> huMAb4D5-8 HC-FR1 sintético<400> 18

Glu Vai Gln Leu Vai Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Gln Pro Gly Gly1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser20 25

<210> 19

<211> 13

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> huMAb4D5 HC-FR2 sintético<400> 19

Trp Vai Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Vai1 5 10<210> 20

<211> 30

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> huMAb4D5 HC-FR3 sintético

<400> 20

Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln1 5 10 15

Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys20 25 30

<210> 21

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> huMAb4D5 HC-FR4 sintético

<400> 21

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Vai Thr Vai Ser Ser1 5 10

<210> 22

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDRH1 sintético<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (3)..(3)

<223> X é Y ou S

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (5)..(5)

<223> X é Y ou S

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (6)..(6)

<223> X é Y ou S

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (7) . . (7)

<223> X é Y ou S<22'0>

<221> MISC_FEATURE<222> (8)..(8)

<223> X é Y ou S

<400> 22

Gly Phe Xaa lie Xaa Xaa Xaa Xaa lie His1 5 10

<210> 23

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDRH2 sintético<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1) .. (1)

<223> X é Y ou S

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (3)..(3)

<223> X é Y ou S

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (5) .. (5)

<223> X é Y ou S

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (6)..(6)

<223> X é Y ou S

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (8) . . (8)

<223> X é Y ou S

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (10) . . (10)

<223> X é Y ou S

<400> 23

Xaa lie Xaa Pro Xaa Xaa Gly Xaa Thr Xaa Tyr Ala Asp Ser Vai Lys1 5 10 15

Gly

<210> 24<211> 21

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDRH3 sintético<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(1)

<223> X é Y, G, ou S

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (2)..(2)

<223> X é Y, G, ou S

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (3)..(3)

<223> X é Y, G, ou S

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (4)..(4)

<223> X é Y, G, ou S

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (5) . . (5)

<223> X é Y, G, ou S

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (6)..(6)

<223> X é Y, G, ou S

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (7)..(7)

<223> X é Y, G, ou S, ou nenhum aminoácido<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (8)..(8)

<223> X é Y, G, ou S, ou nenhum aminoácido<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (9)..(9)

<223> X é Y, G, ou S, ou nenhum aminoácido<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (10)..(10)

<223> X é Y, G, ou S, ou nenhum aminoácido<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (11)..(11)

<223> X é Y, G, ou S, ou nenhum aminoácido<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (12) . . (12)

<223> X é Y, G, ou S, ou nenhum aminoácido<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (13)..(13)

<223> X é Y, G, ou S, ou nenhum aminoácido<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (14) . . (14)

<223> X é Y, G, ou S, ou nenhum aminoácido<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (15)..(15)

<223> X é Y, G, ou S, ou nenhum aminoácido<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (16)..(16)

<223> X é Y, G, ou S, ou nenhum aminoácido<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (17) . . (17)

<223> X é Y, G, ou S, ou nenhum aminoácido<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (18)..(18)

<223> X é G ou A

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (19)..(19)

<223> X é I, M, L, ou F

<400> 24

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa1 5 10 15

Xaa Xaa Xaa Asp Tyr20

<210> 25

<211> 9

<212> PRT<213> Artificial

<220>

<223> CDRL3 sintético<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (3)..(3)

<223> X é Y ou S

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (4)..(4)

<223> X é Y ou S

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (5)..(5)

<223> X é Y ou S

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (6)..(6)

<223> X éY ou S

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (8)..(8)

<223> X é Y ou S

<400> 25

Gln Gln Xaa Xaa Xaa Xaa Pro Xaa Thr1 5

<210> 26

<211> 21

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDRH3 sintético<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(1)

<223> X é Y, R, ou S

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (2) . . (2)

<223> X é Y, R, ou S

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (3)..(3)<table>table see original document page 278</column></row><table><220>

<221> MISC_FEATURE<222> (15)..(15)

<223> X é Y, S, ou R, ou não esta presente<220>

<221> MISC_FEATURE<222> (16)..(16)

<223> X é Y, S, ou R, ou não esta presente<220>

<221> MISC_FEATURE<222> (17)..(17)

<223> X é Y, S, ou R, ou não esta presente<220>

<221> MISC_FEATURE<222> (18)..(18)

<223> X é G ou A

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (19)..(19)

<223> X é I, M, L, ou F

<400> 26

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa1 5 10 15

Xaa Xaa Xaa Asp Tyr20

<210> 27

<211> 21

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDRH3 sintético<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(1)

<223> X é Y, G, R, ou S

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (2)..(2)

<223> X é Y, G, R, ou S

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (3)..(3)

<223> X é Y, G, R, ou S

<220><221><222><223>

<220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223>

<220><221><222><223>

MISC_FEATURE(4)..(4)

X é Y, G, R, ou S

MISC_FEATURE(5)..(5)

X é Y, G, R, ou S

MISC_FEATURE(6)..(6)

X é Y, G, R, ou S

MISC_FEATURE(7) . . (7)

X é Y, S, G, R, ou nenhum aminoácido

MISC_FEATURE(8)..(8)

X é Y, S, G, R, ou nenhum aminoácido

MISC_FEATURE(9) • • (9)

X é Y, S, G, R, ou nenhum aminoácido

MISC_FEATURE(10)..(10)

X é Y, S, G, R, ou nenhum aminoácido

MISC_FEATURE(11)••(11)

X é Y, S, G, R, ou nenhum aminoácido

MISC_FEATURE

(12) ..(12)

X é Y, S, G, R, ou nenhum aminoácido

MISC_FEATURE

(13) ..(13)

X é Y, S, G, R, ou nenhum aminoácido

MISC_FEATURE

(14) ..(14)

X é Y, S, G, R, ou nenhum aminoácido

MISC_FEATURE(15)..(15)

X é Y, S, G, R, ou nenhum aminoácido<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (16)..(16)

<223> X é Y, S, G, R, ou nenhum aminoácido<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (17)..(17)

<223> X é Y, S, G, R, ou nenhum aminoácido<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (18)..(18)

<223> X é G ou A

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (19)..(19)

<223> X é I, M, L, ou F

<400> 27

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa15 10 15

Xaa Xaa Xaa Asp Tyr20

<210> 28

<211> 21

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDRH3 sintético<220>

<221> MISC_FEATURE<222> (1)..(1)

<223> X é Y, G, S, R, A, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, T, V,

ou W

<220>

<221> MISC_FEATURE<222> (2)..(2)

<223> X é Y, G, S, R, A, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, T, V,

ou W

<220>

<221> MIS C_ FEAT URE<222> (3)..(3)

<223> X é Y, G, S, R, A, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, T, V,ou W

<220>

<221> MISC FEATURE<table>table see original document page 18</column></row><table>W, au nenhum aminoácido

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (14)..(14)

<223> X é Y, G, S, R, A, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, T, V,W, au nenhum aminoácido

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (15)..(15)

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (16)..(16)

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (17) . . (17)

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (18)..(18)

<223> X é G ou A

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (19)..(19)

<223> X é I, M, L, ou F

<400> 28

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa15 10 15

Xaa Xaa Xaa Asp Tyr20

<210> 29

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Kabat sintético consenso CDRLl<400> 29

Arg Ala Ser Gln Asp Vai Asn Thr Ala Vai Ala15 10<210> 30

<211> 7

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Kabat sintético consenso CDRL2

<400> 30

Ser Ala Ser Ser Leu Tyr Ser

<210> 31

<211> 18

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDRH3 sintético<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1) . . (1)

<223> X é R, Y, ou M

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (2)..(2)

<223> X é Y ou R

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (3)..(3)

<223> X é Y, S, R, P, ou G

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (4) .. (4)

<223> X é Y ou S

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (5) .. (5)

<223> X é Y, S, R, ou H

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (6)..(6)

<223> X é R, Y, ou S

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (7) . . (7)

<223> X é G, Y, ou S<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (8) . . (8)

<223> X é R, Y, ou S

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (9)..(9)

<223> X é G, Y, ou S

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (10)..(10)

<223> X é R, Y, ou S

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (11) . . (11)

<223> X é G, Y, ou S

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (12) . . (12)

<223> X é S, Y, R, G, ou A

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (13) . . (13)

<223> X é G ou Y

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (14) . . (14)

<223> X is either L, M, R, G, or A<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (15) . . (15)

<223> X é G, F, L, ou nenhum aminoácido<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (16)..(16)

<223> X é F ou nenhum aminoácido

<400> 31

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa1 5 10 15

Asp Tyr

<210> 32<211> 45<212> DNA<213> Artificial<220>

<223> Hl sintético

<400> 32

gcagcttctg gcttctmatt tmttmtmtmt atacactggg tgcgt 45

<210> 33

<211> 58

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> H2 sintético

<400> 33

ctggaatggg ttgcatmtat ttmtccatmt tggttmtact tmttatgccg atagcgtc 58

<210> 34

<211> 54

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> L3 sintético

<400> 34

acttattact gtcagcaatm ttmttmttmt ccatmtacgt tcggacaggg tacc 54

<210> 35

<211> 60

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> H3-A6 sintético<220>

<221> misc_feature

<222> (19)..(21)

<223> N19 a N21 são independentemente TAT, TAC, TCA, TCT, TCC,TCG,AGT, AGC, GGA, GGT, GGC, ou GGG

<220>

<221> misc_feature

<222> (22) . . (24)

<223> N22 a N24 são independentemente TAT, TAC, TCA, TCT, TCC,TCG, AGT, AGC, GGA, GGT, GGC, ou GGG

<220>

<221> misc_feature

<222> (25) .. (27)

<223> N25 a N27 são independentemente TAT, TAC, TCA, TCT, TCC,TCG, AGT, AGC, GGA, GGT, GGC, ou GGG<220>

<221> misc_feature<222> (28)..(30)

<223> N28 a N30 são independentemente TAT, TAC, TCA, TCT, TCCTCG, AGT, AGC, GGA, GGT, GGC, ou GGG

<220>

<221> misc_feature<222> (31)..(33)

<223> N31 a N33 são independentemente TAT, TAC, TCA, TCT, TCCTCG,AGT, AGC, GGA, GGT, GGC, ou GGG

<220>

<221> misc_feature<222> (34)..(36)

<223> N34 a N36 são independentemente TAT, TAC, TCA, TCT, TCCTCG,AGT, AGC, GGA, GGT, GGC, ou GGG

<400> 35

gtctattatt gtgctcgcnn nnnnnnnnnn nnnnnngstw tkgactactg gggtcaagga

<210> 36

<211> 63

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> H3-A7 sintético<220>

<221> misc_feature<222> (19)..(21)

<223> N19 a N21 são independentemente TAT, TAC, TCA, TCT, TCC,TCG, AGT, AGC, GGA, GGT, GGC, ou GGG

<220>

<221> misc_feature<222> (22)..(24)

<220>

<221> misc_feature<222> (25) . . (27)

<223> N25 a N27 são independentemente TAT, TAC, TCA, TCT, TCC;TCG, AGT, AGC, GGA, GGT, GGC, ou GGG

<220>

<221> misc_feature<222> (28)..(30)

<223> N28 a N30 são independentemente TAT, TAC, TCA, TCT, TCC,TCG, AGT, AGC, GGA, GGT, GGC, ou GGG

<220>

<221> misc_feature<222> (31)..(33)<223> N31 a N33 são independentemente TAT, TAC, TCA, TCT, TCC,TCG, AGT, AGC, GGA, GGT, GGC, ou GGG

<220>

<221> misc_feature<222> (34)..(36)

<223> N34 a N36 são independentemente TAT, TAC, TCA, TCT, TCC,TCG, AGT, AGC, GGA, GGT, GGC, ou GGG

<220>

<221> misc_feature<222> (37)..(39)

<223> N37 a N39 são independentemente TAT, TAC, TCA, TCT, TCC,TCG, AGT, AGC, GGA, GGT, GGC, ou GGG

<400> 36

gtctattatt gtgctcgcnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnng stwtkgacta ctggggtcaagga

<210> 37

<211> 66

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> H3-A8 sintético<220>

<221> misc_feature

<222> (19)..(21)

<220>

<221> misc_feature

<222> (22)..(24)

<220>

<221> misc_feature

<222> (25)..(27)

<223> N25 a N27 são independentemente TAT, TAC, TCA, TCT, TCC,TCG, AGT, AGC, GGA, GGT, GGC, ou GGG

<220>

<221> misc_feature

<222> (28)..(30)

<220>

<221> misc_feature

<222> (31)..(33)

<223> N31 a N33 são independentemente TAT, TAC, TCA, TCT, TCC,TCG, AGT, AGC, GGA, GGT, GGC, ou GGG

<220>

<221> misc_feature<222> (34)..(36)

<220>

<221> misc_feature<222> (37)..(39)

<220>

<221> misc_feature<222> (40)..(42)

<223> N40 a N42 são independentemente TAT, TAC, TCA, TCT, TCC,TCG, AGT, AGC, GGA, GGT, GGC, ou GGG

<400> 37

gtctattatt gtgctcgcnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nngstwtkga ctactggggt

caagga

<210> 38

<211> 69

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> H3-A9 sintético

<220>

<221> misc_feature<222> (19)..(21)

<220>

<221> misc_feature<222> (22) . . (24)

<220>

<221> misc_feature<222> (25) . . (27)

<220>

<221> misc_feature<222> (28)..(30)

<223> N28 a N30 são independentemente TAT, TAC, TCA, TCT, TCC,TCG. AGT, AGC, GGA, GGT, GGC, ou GGG<220>

<221> misc_feature<222> (31)..(33)

<223> N31 a N33 são independentemente TAT, TAC, TCA, TCT, TCCTCG, AGT, AGC, GGA, GGT, GGC, ou GGG

<220>

<221> misc_feature<222> (34)..(36)

<223> N34 a N36 são independentemente TAT, TAC, TCA, TCT, TCCTCG, AGT, AGC, GGA, GGT, GGC, ou GGG

<220>

<221> misc_feature<222> (37)..(39)

<223> N37 a N39 são independentemente TAT, TAC, TCA, TCT, TCCTCG, AGT, AGC, GGA, GGT, GGC, ou GGG

<220>

<221> misc_feature<222> (40) . . (42)

<223> N40 a N42 são independentemente TAT, TAC, TCA, TCT, TCCTCG, AGT, AGC, GGA, GGT, GGC, ou GGG

<220>

<221> misc_feature<222> (43) . . (45)

<223> N43 a N45 são independentemente TAT, TAC, TCA, TCT, TCCTCG, AGT, AGC, GGA, GGT, GGC, ou GGG

<400> 38

gtctattatt gtgctcgcnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnngstwt kgactactgg

ggtcaagga

<210> 39

<211> 72

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> H3-A10 sintético

<220>

<221> misc_feature<222> (19)..(21)

<223> N19 a N21 são independentemente TAT, TAC, TCA, TCT, TCCTCG, AGT, AGC, GGA, GGT, GGC, ou GGG

<220>

<221> misc_feature<222> (22)..(24)

<223> N22 a N24 são independentemente TAT, TAC, TCA, TCT, TCCTCG, AGT, AGC, GGA, GGT, GGC, ou GGG

<220><221>

misc feature<222> (25)..(27)

<220>

<221> misc_feature<222> (28)..(30)

<220>

<221> misc_feature<222> (31)..(33)

<220>

<221> misc_feature<222> (34)..(36)

<220>

<221> misc_feature<222> (37)..(39)

<220>

<221> misc_feature<222> (40) .. (42)

<220>

<221> misc_feature<222> (43).. (45)

<223> N43 a N45 são independentemente TAT, TAC, TCA, TCT, TCC,TCG, AGT, AGC, GGA, GGT, GGC, ou GGG

<220>

<221> misc_feature<222> (46)..(48)

<223> N4 6 a N48 são independentemente TAT, TAC, TCA, TCT, TCC,TCG, AGT, AGC, GGA, GGT, GGC, ou GGG

<400> 39

gtctattatt gtgctcgcnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnngs twtkgactac

tggggtcaag ga

<210> 40

<211> 75

<212> DNA

<213> Artificial

<220><223> H3-A11 sintético<220>

<221> misc_feature<222> (19)..(21)

<220>

<221> misc_feature<222> (22) . . (24)

<220>

<221> misc_feature<222> (25). . (27)

<220>

<221> misc_feature<222> (28)..(30)

<220>

<221> misc_feature<222> (31)..(33)

<220>

<221> misc_feature<222> (34)..(36)

<220>

<221> misc_feature<222> (37)..(39)

<220>

<221> misc_feature<222> (40)..(42)

<220>

<221> misc_feature<222> (43)..(45)

<220><221> misc_feature<222> (46)..(48)

<223> N46 a N48 são independentemente TAT, TAC, TCA, TCT, TCC,TCG, AGT, AGC, GGA, GGT, GGC, ou GGG

<220>

<221> misc_feature<222> (49)..(51)

<223> N49 a N51 são independentemente TAT, TAC, TCA, TCT, TCC,TCG, AGT, AGC, GGA, GGT, GGC, ou GGG

<400> 40

gtctattatt gtgctcgcnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn ngstwtkgac

tactggggtc aagga

<210> 41

<211> 78

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> H3-A12 sintético<220>

<221> misc_feature<222> (19)..(21)

<220>

<221> misc_feature<222> (22)..(24)

<220>

<221> misc_feature<222> (25).. (27)

<220>

<221> misc_feature<222> (28)..(30)

<220>

<221> misc_feature<222> (31)..(33)

<220>

<221> misc feature<222> (34)..(36)

<220>

<221> misc_feature<222> (37)..(39)

<220>

<221> misc_feature<222> (40).. (42)

<220>

<221> misc_feature<222> (43) .. (45)

<220>

<221> misc_feature<222> (46)..(48)

<220>

<221> misc_feature<222> (49)..(51)

<220>

<221> misc_feature<222> (52).. (54)

<223> N52 a N54 são independentemente TAT, TAC, TCA, TCT, TCC,TCG, AGT, AGC, GGA, GGT, GGC, ou GGG

<400> 41

gtctattatt gtgctcgcnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnngstwtk 60

gactactggg gtcaagga 78

<210> 42

<211> 81

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> H3-A13 sintético<220>

<221> misc_feature

<222> (19)..(21)<223> N19 a N21 são independentemente TAT, TAC, TCA, TCT, TCC,TCG, AGT, AGC, GGA, GGT, GGC, ou GGG

<220>

<221> misc_feature<222> (22)..(24)

<220>

<221> misc_feature<222> (25)..(27)

<220>

<221> misc_feature<222> (28)..(30)

<220>

<221> misc_feature<222> (31)..(33)

<220>

<221> misc_feature<222> (34)..(36)

<220>

<221> misc_feature<222> (37)..(39)

<220>

<221> misc_feature<222> (40)..(42)

<220>

<221> misc_feature<222> (43)..(45)

<220>

<221> misc_feature<222> (46)..(48)

<223> N46 a N48 são independentemente TAT, TAC, TCA, TCT, TCC,TCG, AGT, AGC, GGA, GGT, GGC, ou GGG<220>

<221> misc_feature<222> (49).. (51)

<220>

<221> misc_feature<222> (52) .. (54)

<220>

<221> misc_feature<222> (55).. (57)

<223> N55 a N57 são independentemente TAT, TAC, TCA, TCT, TCC,TCG, AGT, AGC, GGA, GGT, GGC, ou GGG

<400> 42

gtctattatt gtgctcgcnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnngst

wtkgactact ggggtcaagg a

<210> 43

<211> 84

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> H3-A14 sintético

<220>

<221> misc_feature<222> (19). . (21)

<220>

<221> misc_feature<222> (22)..(24)

<220>

<221> misc_feature<222> (25). . (27)

<220>

<221> misc_feature<222> (28)..(30)

<220><221> misc_feature<222> (31)..(33)

<220>

<221> misc_feature<222> (34)..(36)

<220>

<221> misc_feature<222> (37)..(39)

<220>

<221> misc_feature<222> (40)..(42)

<223> N40 a N42 são independentemente TAT, TAC, TCA, TCT, TCC,TCG,AGT, AGC, GGA, GGT, GGC, ou GGG

<220>

<221> misc_feature<222> (43)..(45)

<220>

<221> misc_feature<222> (46)..(48)

<220>

<221> misc_feature<222> (49)..(51)

<220>

<221> misc_feature<222> (52).. (54)

<220>

<221> misc_feature<222> (55) .. (57)

<220>

<221> misc_feature<222> (58)..(60)<223> N58 a N60 são independentemente TAT, TAC, TCA, TCT, TCC,TCG, AGT, AGC, GGA, GGT, GGC, ou GGG

<400> 43

gtctattatt gtgctcgcnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 60

gstwtkgact actggggtca agga 84

<210> 44

<211> 87

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> H3-A15 sintético<220>

<221> misc_feature<222> (19).. (21)

<220>

<221> misc_feature<222> (22).. (24)

<220>

<221> misc_feature<222> (25)..(27)

<220>

<221> misc_feature<222> (28).. (30)

<220>

<221> misc_feature<222> (31).. (33)

<220>

<221> misc_feature<222> (34)..(36)

<220>

<221> misc_feature<222> (37).. (39)

<220>

<221> misc_feature<222> (40).. (42)

<220>

<221> misc_feature<222> (43)..(45)

<220>

<221> misc_feature<222> (46)..(48)

<220>

<221> misc_feature<222> (49)..(51)

<220>

<221> misc_feature<222> (52)..(54)

<220>

<221> misc_feature<222> (55)..(57)

<220>

<221> misc_feature<222> (58)..(60)

<223> N58 a N60 são independentemente TAT, TAC, TCA, TCT, TCC,TCG, AGT, AGC, GGA, GGT, GGC, ou GGG

<220>

<221> misc_feature<222> (61)..(63)

<223> N61 a N63 são independentemente TAT, TAC, TCA, TCT, TCC,TCG, AGT, AGC, GGA, GGT, GGC, ou GGG

<400> 44

gtctattatt gtgctcgcnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 60nnngstwtkg actactgggg tcaagga 87

<210> 45<211> 90

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> H3-A16 sintético

<220>

<221> misc_feature<222> (19) . . (21)

<220>

<221> misc_feature<222> (22) . . (24)

<220>

<221> misc_feature<222> (25) . . (27)

<220>

<221> misc_feature<222> (28)..(30)

<220>

<221> misc_feature<222> (31)..(33)

<220>

<221> misc_feature<222> (34)..(36)

<220>

<221> misc_feature<222> (37)..(39)

<220>

<221> misc_feature<222> (40) .. (42)

<220><221> misc_feature<222> (43). . (45)

<220>

<221> misc_feature<222> (46)..(48)

<220>

<221> misc_feature<222> (49)..(51)

<220>

<221> misc_feature<222> (52) . . (54)

<220>

<221> misc_feature<222> (55).. (57)

<220>

<221> misc_feature<222> (58). . (60)

<220>

<221> misc_feature<222> (61)..(63)

<220>

<221> misc_feature<222> (64)..(66)

<223> N64 a N66 são independentemente TAT, TAC, TCA, TCT, TCC,TCG, AGT, AGC, GGA, GGT, GGC, ou GGG

<400> 45

gtctattatt gtgctcgcnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn

nnnnnngstw tkgactactg gggtcaagga

<210> 46

<211> 93

<212> DNA

<213> Artificial<220>

<223> H3-A17 sintético<220>

<221> misc_feature<222> (19). . (21)

<220>

<221> misc_feature<222> (22) .. (24)

<220>

<221> misc_feature<222> (25)..(27)

<220>

<221> misc_feature<222> (28)..(30)

<223> N28 to N30 are independently either TAT, TAC, TCA, TCT, TCC,TCG,

AGT, AGC, GGA, GGT, GGC, or GGG

<220>

<221> misc_feature<222> (31)..(33)

<220>

<221> misc_feature<222> (34)..(36)

<220>

<221> misc_feature<222> (37).. (39)

<220>

<221> misc_feature<222> (40) .. (42)

<220>

<221> misc_feature<222> (43)..(45)

<220>

<221> misc_feature<222> (46)..(48)

<220>

<221> misc_feature<222> (49)..(51)

<223> N4 9 a N51 são independentemente TAT, TAC, TCA, TCT, TCC,TCG, AGT, AGC, GGA, GGT, GGC, OU GGG

<220>

<221> misc_feature<222> (52)..(54)

<220>

<221> misc_feature<222> (55)..(57)

<220>

<221> misc_feature<222> (58)..(60)

<220>

<221> misc_feature<222> (61)..(63)

<223> N61 a N63 são independentemente either TAT, TAC, TCA, TCT,TCC, TCG, AGT, AGC, GGA, GGT, GGC, ou GGG

<220>

<221> misc_feature<222> (64)..(66)

<220>

<221> misc_feature<222> (67)..(69)

<223> N67 a N69 são independentemente TAT, TAC, TCA, TCT, TCC,TCG, AGT, AGC, GGA, GGT, GGC, ou GGG

<400> 46

gtctattatt gtgctcgcnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 60nnnnnnnnng stwtkgacta ctggggtcaa gga 93<210> 47<211> 60

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> H3-B6 sintético<220>

<221> misc_feature<222> (19)..(21)

<223> N19 a N21 são independentemente TAT, TAC, TCA, TCT, TCC,TCG, AGT, AGC, CGA, CGT, CGC, CGG, AGA, ou AGG

<220>

<221> misc_feature<222> (22) .. (24)

<223> N22 a N24 são independentemente TAT, TAC, TCA, TCT, TCC,TCG, AGT, AGC, CGA, CGT, CGC, CGG, AGA, ou AGG

<220>

<221> misc_feature<222> (25)..(27)

<223> N25 a N27 são independentemente TAT, TAC, TCA, TCT, TCC,TCG, AGT, AGC, CGA, CGT, CGC, CGG, AGA, ou AGG

<220>

<221> misc_feature<222> (28)..(30)

<220>

<221> misc_feature<222> (31)..(33)

<223> N31 a N33 são independentemente TAT, TAC, TCA, TCT, TCC,TCG, AGT, AGC, CGA, CGT, CGC, CGG, AGA, ou AGG

<220>

<221> misc_feature<222> (34)..(36)

<223> N34 a N36 são independentemente TAT, TAC, TCA, TCT, TCC,TCG, AGT, AGC, CGA, CGT, CGC, CGG, AGA, ou AGG

<400> 47

gtctattatt gtgctcgcnn nnnnnnnnnn nnnnnngstw tkgactactg gggtcaagga

<210> 48

<211> 63

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> H3-B7 sintético<220>

<221> misc feature<222> (19)..(21)

<220>

<221> misc_feature<222> (22) . . (24)

<220>

<221> misc_feature<222> (25)..(27)

<220>

<221> misc_feature<222> (28)..(30)

<223> N28 a N30 são independentemente TAT, TAC, TCA, TCT, TCC,TCG, AGT, AGC, CGA, CGT, CGC, CGG, AGA, ou AGG

<220>

<221> misc_feature<222> (31)..(33)

<220>

<221> misc_feature<222> (34)..(36)

<220>

<221> misc_feature<222> (37)..(39)

<223> N37 a N39 são independentemente TAT, TAC, TCA, TCT, TCC,TCG, AGT, AGC, CGA, CGT, CGC, CGG, AGA, ou AGG

<400> 48

gtctattatt gtgctcgcnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnng stwtkgacta ctggggtcaa 60

gga

<210> 49

<211> 66

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> H3-B8 sintético<220>

<221> misc_feature

<222> (19)..(21)

63<223> N19 a N21 são independentemente TAT, TAC, TCA, TCT, TCC,TCG, AGT, AGC, CGA, CGT, CGC, CGG, AGA, ou AGG

<220>

<221> misc_feature<222> (22) .. (24)

<220>

<221> misc_feature<222> (25)..(27)

<220>

<221> misc_feature<222> (28) . . (30)

<220>

<221> misc_feature<222> (31)..(33)

<220>

<221> misc_feature<222> (34)..(36)

<220>

<221> misc_feature<222> (37)..(39)

<220>

<221> misc_feature<222> (40). . (42)

<223> N40 a N42 são independentemente TAT, TAC, TCA, TCT, TCC,TCG, AGT, AGC, CGA, CGT, CGC, CGG, AGA, ou AGG

<400> 49

gtctattatt gtgctcgcnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nngstwtkga ctactggggt

caagga

<210> 50

<211> 69

<212> DNA

<213> Artificial

<220><223> H3-B9 sintético<220>

<221> misc_feature<222> (19)..(21)

<220>

<221> misc_feature<222> (22) .. (24)

<220>

<221> misc_feature<222> (25)..(27)

<220>

<221> misc_feature<222> (28)..(30)

<220>

<221> misc_feature<222> (31)..(33)

<220>

<221> misc_feature<222> (34)..(36)

<220>

<221> misc_feature<222> (37)..(39)

<220>

<221> misc_feature<222> (40)..(42)

<220>

<221> misc_feature<222> (43)..(45)

<223> N43 a N45 são independentemente TAT, TAC, TCA, TCT, TCC,TCG, AGT, AGC, CGA, CGT, CGC, CGG, AGA, ou AGG<400> 50

gtctattatt gtgctcgcnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnngstwt kgactactgg 60

ggtcaagga 69

<210> 51

<211> 72

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> H3-B10 sintético<220>

<221> misc_feature<222> (19)..(21)

<220>

<221> misc_feature<222> (22)..(24)

<220>

<221> misc_feature<222> (25)..(27)

<220>

<221> misc_feature<222> (28)..(30)

<220>

<221> misc_feature<222> (31)..(33)

<220>

<221> misc_feature<222> (34)..(36)

<220>

<221> misc_feature<222> (37)..(39)

<220><221> misc_feature<222> (40) . . (42)

<223> N40 a N42 são independentemente TAT, TAC, TCA, TCT, TCCTCG, AGT, AGC, CGA, CGT, CGC, CGG, AGA, ou AGG

<220>

<221> misc_feature<222> (43)..(45)

<223> N43 a N45 são independentemente TAT, TAC, TCA, TCT, TCCTCG, AGT, AGC, CGA, CGT, CGC, CGG, AGA, ou AGG

<220>

<221> misc_feature<222> (46)..(48)

<223> N46 a N48 são independentemente TAT, TAC, TCA, TCT, TCCTCG, AGT, AGC, CGA, CGT, CGC, CGG, AGA, ou AGG

<400> 51

gtctattatt gtgctcgcnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnngs twtkgactac

tggggtcaag ga

<210> 52

<211> 75

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> H3-B11 sintético<220>

<221> misc_feature<222> (19).. (21)

<220>

<221> misc_feature<222> (22) .. (24)

<220>

<221> misc_feature<222> (25)..(27)

<220>

<221> misc_feature<222> (28)..(30)

<220><221>

misc feature<222> (31). . (33)

<223> N31 a N33 são independentemente TAT, TAC, TCA, TCT, TCCTCG, AGT, AGC, CGA, CGT, CGC, CGG, AGA, ou AGG

<220>

<221> misc_feature<222> (34)..(36)

<223> N34 a N36 são independentemente TAT, TAC, TCA, TCT, TCCTCG, AGT, AGC, CGA, CGT, CGC, CGG, AGA, ou AGG

<220>

<221> misc_feature<222> (37)..(39)

<223> N37 a N39 são independentemente TAT, TAC, TCA, TCT, TCCTCG, AGT, AGC, CGA, CGT, CGC, CGG, AGA, ou AGG

<220>

<221> misc_feature<222> (40)..(42)

<220>

<221> misc_feature<222> (43) .. (45)

<220>

<221> misc_feature<222> (46)..(48)

<220>

<221> misc_feature<222> (49)..(51)

<223> N4 9 a N51 são independentemente TAT, TAC, TCA, TCT, TCCTCG, AGT, AGC, CGA, CGT, CGC, CGG, AGA, ou AGG

<400> 52

gtctattatt gtgctcgcnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn ngstwtkgac

tactggggtc aagga

<210> 53

<211> 78

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> H3-B12 sintético<220>

<221> misc_feature

<222> (19).. (21)<223> N19 a N21 são independentemente TAT, TAC, TCA, TCT, TCC,TCG, AGT, AGC, CGA, CGT, CGC, CGG, AGA, ou AGG

<220>

<221> misc_feature<222> (22) .. (24)

<220>

<221> misc_feature<222> (25) . . (27)

<220>

<221> misc_feature<222> (28)..(30)

<220>

<221> misc_feature<222> (31)..(33)

<220>

<221> misc_feature<222> (34)..(36)

<220>

<221> misc_feature<222> (37)..(39)

<220>

<221> misc_feature<222> (40).. (42)

<220>

<221> misc_feature<222> (43) . . (45)

<223> N43 a N45 são independentemente TAT, TAC, TCA, TCT, TCC,TCG, AGT, AGC, CGA, CGT, CGC, CGG, AGA, ou AGG

<220>

<221> misc_feature<222> (46)..(48)

<223> N46 a N48 são independentemente TAT, TAC, TCA, TCT, TCC,TCG, AGT, AGC, CGA, CGT, CGC, CGG, AGA, ou AGG<220>

<221> misc_feature<222> (49)..(51)

<223> N49 a N51 são independentemente TAT, TAC, TCA, TCT, TCCTCG, AGT, AGC, CGA, CGT, CGC, CGG, AGA, ou AGG

<220>

<221> misc_feature<222> (52)..(54)

<223> N52 a N54 são independentemente TAT, TAC, TCA, TCT, TCCTCG, AGT, AGC, CGA, CGT, CGC, CGG, AGA, ou AGG

<400> 53

gtctattatt gtgctcgcnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnngstwtk

gactactggg gtcaagga

<210> 54

<211> 81

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> H3-B13 sintético<220>

<221> misc_feature<222> (19)..(21)

<223> N19 a N21 são independentemente TAT, TAC, TCA, TCT, TCCTCG, AGT, AGC, CGA, CGT, CGC, CGG, AGA, ou AGG

<220>

<221> misc_feature<222> (22)..(24)

<223> N22 a N24 são independentemente TAT, TAC, TCA, TCT, TCCTCG, AGT, AGC, CGA, CGT, CGC, CGG, AGA, ou AGG

<220>

<221> misc_feature<222> (25)..(27)

<223> N25 a N27 são independentemente TAT, TAC, TCA, TCT, TCCTCG, AGT, AGC, CGA, CGT, CGC, CGG, AGA, ou AGG

<220>

<221> misc_feature<222> (28)..(30)

<223> N28 a N30 são independentemente TAT, TAC, TCA, TCT, TCCTCG, AGT, AGC, CGA, CGT, CGC, CGG, AGA, ou AGG

<220>

<221> misc_feature<222> (31)..(33)

<220><221> misc_feature<222> (34)..(36)

<220>

<221> misc_feature<222> (37)..(39)

<220>

<221> misc_feature<222> (40)..(42)

<220>

<221> misc_feature<222> (43).. (45)

<220>

<221> misc_feature<222> (46)..(48)

<223> N46 a N48 são independentemente TAT, TAC, TCA, TCT, TCC,TCG, AGT, AGC, CGA, CGT, CGC, CGG, AGA, ou AGG

<220>

<221> misc_feature<222> (49)..(51)

<223> N49 a N51 são independentemente TAT, TAC, TCA, TCT, TCC,TCG, AGT, AGC, CGA, CGT, CGC, CGG, AGA, ou AGG

<220>

<221> misc_feature<222> (52).. (54)

<223> N52 a N54 são independentemente TAT, TAC, TCA, TCT, TCC,TCG, AGT, AGC, CGA, CGT, CGC, CGG, AGA, ou AGG

<220>

<221> misc_feature<222> (55).. (57)

<223> N55 a N57 são independentemente TAT, TAC, TCA, TCT, TCC,TCG, AGT, AGC, CGA, CGT, CGC, CGG, AGA, ou AGG

<400> 54

gtctattatt gtgctcgcnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnngst

wtkgactact ggggtcaagg a

<210> 55

<211> 84

<212> DNA

<213> Artificial<220>

<223> synthetic H3-B14 sintético <220><221> misc_feature <222> (19)..(21)<223> N19 a N21 são independentemente TAT, TAC, TCA, TCT, TCC, TCG, AGT, AGC, CGA, CGT, CGC, CGG, AGA, ou AGG

<220><221> misc_feature<222> (22)..(24)<223> N22 a N24 são independentemente TAT, TAC, TCA, TCT, TCC,TCG, AGT, AGC, CGA, CGT, CGC, CGG, AGA, ou AGG

<220> <221> misc_feature<222> (25)..(27)<223> N25 a N27 são independentemente TAT, TAC, TCA, TCT, TCC,TCG, AGT, AGC, CGA, CGT, CGC, CGG, AGA, ou AGG

<220><221> misc_feature<222> (28)..(30)<223> N28 a N30 são independentemente TAT, TAC, TCA, TCT, TCC,TCG, AGT, AGC, CGA, CGT, CGC, CGG, AGA, ou AGG

<220><221> misc_feature<222> (31)..(33)<223> N31 a N33 são independentemente TAT, TAC, TCA, TCT, TCC,TCG, AGT, AGC, CGA, CGT, CGC, CGG, AGA, ou AGG

<220><221> misc_feature<222> (34)..(36)<223> N34 a N36 são independentemente TAT, TAC, TCA, TCT, TCC,TCG, AGT, AGC, CGA, CGT, CGC, CGG, AGA, ou AGG

<220><22l> misc_feature<222> (37).. (39)<223> N37 a N39 são independentemente TAT, TAC, TCA, TCT, TCC,TCG, AGT, AGC, CGA, CGT, CGC, CGG, AGA, ou AGG

<220><221> misc_feature<222> (40)..(42)<223> N40 a N42 são independentemente TAT, TAC, TCA, TCT, TCC,TCG, AGT, AGC, CGA, CGT, CGC, CGG, AGA, OU AGG

<220><221> misc_feature<222> (43)..(45)<223> N43 a N45 são independentemente TAT, TAC, TCA, TCT, TCC,TCG, AGT, AGC, CGA, CGT, CGC, CGG, AGA, ou AGG

<220>

<221> misc_feature<222> (46)..(48)

<220>

<221> misc_feature<222> (49)..(51)

<220>

<221> misc_feature<222> (52)..(54)

<220>

<221> misc_feature<222> (55)..(57)

<223> N55 a N57 são independentemente TAT, TAC, TCA, TCT, TCCTCG, AGT, AGC, CGA, CGT, CGC, CGG, AGA, ou AGG

<220>

<221> misc_feature<222> (58)..(60)

<223> N58 a N60 são independentemente TAT, TAC, TCA, TCT, TCCTCG, AGT, AGC, CGA, CGT, CGC, CGG, AGA, ou AGG

<400> 55

gtctattatt gtgctcgcnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn

gstwtkgact actggggtca agga

<210> 56

<211> 87

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> H3-B15 sintético<220>

<221> misc_feature<222> (19)..(21)

<220>

<221> misc_feature<222> (22) . . (24)

<223> N22 a N24 são independentemente TAT, TAC, TCA, TCT, TCC,TCG, AGT, AGC, CGA, CGT, CGC, CGG, AGA, ou AGG<220>

<221> misc_feature<222> (25)..(27)

<220>

<221> misc_feature<222> (28)..(30)

<220>

<221> misc_feature<222> (31).. (33)

<220>

<221> misc_feature<222> (34)..(36)

<220>

<221> misc_feature<222> (37)..(39)

<220>

<221> misc_feature<222> (40)..(42)

<220>

<221> misc_feature<222> (43)..(45)

<220>

<221> misc_feature<222> (46) .. (48)

<220>

<221> misc_feature<222> (49)..(51)

<223> N4 9 a N51 são independentemente TAT, TAC, TCA, TCT, TCC,TCG, AGT, AGC, CGA, CGT, CGC, CGG, AGA, ou AGG

<220><221>

misc feature<222> (52).. (54)

<220>

<221> misc_feature<222> (55)..(57)

<220>

<221> misc_feature<222> (58)..(60)

<223> N58 a N60 são independentemente TAT, TAC, TCA, TCT, TCC,TCG, AGT, AGC, CGA, CGT, CGC, CGG, AGA, ou AGG

<220>

<221> misc_feature<222> (61)..(63)

<223> N61 a N63 são independentemente TAT, TAC, TCA, TCT, TCC,TCG, AGT, AGC, CGA, CGT, CGC, CGG, AGA, ou AGG

<400> 56

gtctattatt gtgctcgcnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 60

nnngstwtkg actactgggg tcaagga 87

<210> 57

<211> 90

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> synthetic H3-B16<220>

<221> misc_feature

<222> (19) .. (21)

<220>

<221> misc_feature

<222> (22) . . (24)

<220>

<221> misc_feature

<222> (25) . . (27)

<220>

<221> misc_feature

<222> (28)..(30)<223> N28 a N30 são independentemente TAT, TAC, TCA, TCT, TCC,TCG, AGT, AGC, CGA, CGT, CGC, CGG, AGA, ou AGG

<220>

<221> misc_feature<222> (31)..(33)

<220>

<221> misc_feature<222> (34)..(36)

<220>

<221> misc_feature<222> (37)..(39)

<220>

<221> misc_feature<222> (40)..(42)

<220>

<221> misc_feature<222> (43)..(45)

<220>

<221> misc_feature<222> (46) .. (48)

<220>

<221> misc_feature<222> (49)..(51)

<220>

<221> misc_feature<222> (52) .. (54)

<220>

<221> misc_feature<222> (55)..(57)

<223> N55 a N57 são independentemente TAT, TAC, TCA, TCT, TCC,TCG, AGT, AGC, CGA, CGT, CGC, CGG, AGA, ou AGG<220>

<221> misc_feature<222> (58)..(60)

<220>

<221> misc_feature<222> (61)..(63)

<220>

<221> misc_feature<222> (64)..(66)

<223> N64 a N66 são independentemente TAT, TAC, TCA, TCT, TCC,TCG, AGT, AGC, CGA, CGT, CGC, CGG, AGA, ou AGG

<400> 57

gtctattatt gtgctcgcnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 60

nnnnnngstw tkgactactg gggtcaagga 90

<210> 58

<211> 93

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> H3-B17 sintético<220>

<221> misc_feature<222> (19)..(21)

<220>

<221> misc_feature<222> (22)..(24)

<220>

<221> misc_feature<222> (25).. (27)

<220>

<221> misc_feature<222> (28)..(30)

<220><221> misc_feature<222> (31)..(33)

<220>

<221> misc_feature<222> (34)..(36)

<220>

<221> misc_feature<222> (37)..(39)

<220>

<221> misc_feature<222> (40)..(42)

<220>-----------------------------------......---------------------------- - -......... —------------^------------

<221> misc_feature<222> (43) . . (45)

<220>

<221> misc_feature<222> (46) .. (48)

<220>

<221> misc_feature<222> (49)..(51)

<220>

<221> misc_feature<222> (52) . . (54)

<220>

<221> misc_feature<222> (55) .. (57)

<220>

<221> misc_feature<222> (58)..(60)<223> N58 a N60 são independentemente TAT, TAC, TCA, TCT, TCC,TCG, AGT, AGC, CGA, CGT, CGC, CGG, AGA, ou AGG

<220>

<221> misc_feature<222> (61)..(63)

<220>

<221> misc_feature<222> (64)..(66)

<220>

<221> misc_feature<222> (67)..(69)

<223> N67 a N69 são independentemente TAT, TAC, TCA, TCT, TCC,TCG, AGT, AGC, CGA, CGT, CGC, CGG, AGA, ou AGG

<400> 58

gtctattatt gtgctcgcnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 60

nnnnnnnnng stwtkgacta ctggggtcaa gga 93

<210> 59

<211> 60

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> H3-C6 sintético<220>

<221> misc_feature<222> (19)..(21)

<223> N19 a N21 são independentemente TAT, TAC, TCA, TCT, TCC,

TCG, GGA, GGT, GGC, GGG, AGT, AGC, CGA, CGT, CGC, CGG, AGA,ou AGG

<220>

<221> misc_feature<222> (22) .. (24)

<223> N22 a N24 são independentemente TAT, TAC, TCA, TCT, TCC,

TCG, GGA, GGT, GGC, GGG, AGT, AGC, CGA, CGT, CGC, CGG, AGA,ou AGG

<220>

<221> misc_feature<222> (25) . . (27)

<223> N25 a N27 são independentemente TAT, TAC, TCA, TCT, TCC,

TCG, GGA, GGT, GGC, GGG, AGT, AGC, CGA, CGT, CGC, CGG, AGA,ou AGG

<220><221> misc_feature<222> (28). . (30)

<223> N28 a N30 são independentemente TAT, TAC, TCA, TCT, TCC,

TCG, GGA, GGT, GGC, GGG, AGT, AGC, CGA, CGT, CGC, CGG, AGA,ou AGG

<220>

<221> misc_feature<222> (31)..(33)

<223> N31 a N33 são independentemente TAT, TAC, TCA, TCT, TCC,

TCG, GGA, GGT, GGC, GGG, AGT, AGC, CGA, CGT, CGC, CGG, AGA,ou AGG

<220>

<221> misc_feature<222> (34)..(36)

<223> N34 a N36 são independentemente TAT, TAC, TCA, TCT, TCC,

TCG, GGA, GGT, GGC, GGG, AGT, AGC, CGA, CGT, CGC, CGG, AGA,ou AGG

<400> 59

gtctattatt gtgctcgcnn nnnnnnnnnn nnnnnngstw tkgactactg gggtcaagga 60

<210> 60 ' - : * • *

<211> 63

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> H3-C7 sintético<220>

<221> misc_feature<222> (19)..(21)

<223> N19 a N21 são independentemente TAT, TAC, TCA, TCT, TCC,

TCG, GGA, GGT, GGC, GGG, AGT, AGC, CGA, CGT, CGC, CGG, AGA,ou AGG

<220>

<221> misc_feature<222> (22)..(24)

<223> N22 a N24 são independentemente TAT, TAC, TCA, TCT, TCC,

TCG, GGA, GGT, GGC, GGG, AGT, AGC, CGA, CGT, CGC, CGG, AGA,ou AGG

<220>

<221> misc_feature<222> (25) . . (27)

<223> N25 a N27 são independentemente TAT, TAC, TCA, TCT, TCC,

TCG, GGA, GGT, GGC, GGG, AGT, AGC, CGA, CGT, CGC, CGG, AGA,ou AGG

<220>

<221> misc_feature<222> (28)..(30)

<223> N28 a N30 são independentemente TAT, TAC, TCA, TCT, TCC,TCG, GGA, GGT, GGC, GGG, AGT, AGC, CGA, CGT, CGC, CGG, AGA,ou AGG

<220>

<221> misc_feature<222> (31) . . (33)

<223> N31 a N33 são independentemente TAT, TAC, TCA, TCT, TCC,

TCG, GGA, GGT, GGC, GGG, AGT, AGC, CGA, CGT, CGC, CGG, AGA,ou AGG

<220>

<221> misc_feature<222> (34)..(36)

<223> N34 a N36 são independentemente TAT, TAC, TCA, TCT, TCC,

TCG, GGA, GGT, GGC, GGG, AGT, AGC, CGA, CGT, CGC, CGG, AGA,ou AGG

<220>

<221> misc_feature<222> (37)..(39)

<223> N37 a N39 são independentemente TAT, TAC, TCA, TCT, TCC,

TCG, GGA, GGT, GGC, GGG, AGT, AGC, CGA, CGT, CGC, CGG, AGA,ou AGG

<400> 60

gtctattatt gtgctcgcnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnng stwtkgacta ctggggtcaa 60

gga 63

<210> 61

<211> 66

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> H3-C8 sintético<220>

<221> misc_feature<222> (19) .. (21)

<223> N19 a N21 são independentemente TAT, TAC, TCA, TCT, TCC,

TCG, GGA, GGT, GGC, GGG, AGT, AGC, CGA, CGT, CGC, CGG, AGA,ou AGG

<220>

<221> misc_feature<222> (22) . . (24)

<223> N22 a N24 são independentemente TAT, TAC, TCA, TCT, TCC,

TCG, GGA, GGT, GGC, GGG, AGT, AGC, CGA, CGT, CGC, CGG, AGA,ou AGG

<220>

<221> misc_feature<222> (25) .. (27)

<223> N25 a N27 são independentemente TAT, TAC, TCA, TCT, TCC,

TCG, GGA, GGT, GGC, GGG, AGT, AGC, CGA, CGT, CGC, CGG, AGA,ou AGG

<220>

<221> misc_feature<222> (28)..(30)

<223> N28 a N30 são independentemente TAT, TAC, TCA, TCT, TCC,

TCG, GGA, GGT, GGC, GGG, AGT, AGC, CGA, CGT, CGC, CGG, AGA,ou AGG

<220>

<221> misc_feature<222> (31)..(33)

<223> N31 a N33 são independentemente TAT, TAC, TCA, TCT, TCC,

TCG, GGA, GGT, GGC, GGG, AGT, AGC, CGA, CGT, CGC, CGG, AGA,ou AGG

<220>

<221> misc_feature<222> (34)..(36)

<223> N34 a N36 são independentemente TAT, TAC, TCA, TCT, TCC,

TCG, GGA, GGT, GGC, GGG, AGT, AGC, CGA, CGT, CGC, CGG, AGA,ou AGG

<220>

<221> misc_feature<222> (37)..(39)

<223> N37 a N39 são independentemente TAT, TAC, TCA, TCT, TCC,

TCG, GGA, GGT, GGC, GGG, AGT, AGC, CGA, CGT, CGC, CGG, AGA,ou AGG

<220>

<221> misc_feature<222> (40)..(42)

<223> N40 a N42 são independentemente TAT, TAC, TCA, TCT, TCC,

TCG, GGA, GGT, GGC, GGG, AGT, AGC, CGA, CGT, CGC, CGG, AGA,ou AGG

<400> 61

gtctattatt gtgctcgcnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nngstwtkga ctactggggt 60

caagga

<210> 62

<211> 69

<212> DNA

<213> Artificial

66

<220>

<223> H3-C9 sintético

<220>

<221> misc_feature<222> (19) .. (21)

<223> N19 a N21 são independentemente TAT, TAC, TCA, TCT, TCC,

TCG, AGT, AGC, GGA, GGT, GGC, GGG, CGA, CGT, CGC, CGG, AGA,ou AGG<220>

<221> misc_feature<222> (22) . . (24)

<223> N22 a N24 são independentemente TAT, TAC, TCA, TCT, TCC,

TCG, AGT, AGC, GGA, GGT, GGC, GGG, CGA, CGT, CGC, CGG, AGA,ou AGG

<220>

<221> misc_feature<222> (25) . . (27)

<223> N25 a N27 são independentemente TAT, TAC, TCA, TCT, TCC,

TCG, AGT, AGC, GGA, GGT, GGC, GGG, CGA, CGT, CGC, CGG, AGA,ou AGG

<220>

<221> misc_feature<222> (28)..(30)

<223> N28 a N30 são independentemente TAT, TAC, TCA, TCT, TCC,

TCG, AGT, AGC, GGA, GGT, GGC, GGG, CGA, CGT, CGC, CGG, AGA,ou AGG

<220>

<221> misc_feature

<222> (31) . . (33) ~~ ■" ~ ' * ""

<223> N31 a N33 são independentemente TAT, TAC, TCA, TCT, TCC,

TCG, AGT, AGC, GGA, GGT, GGC, GGG, CGA, CGT, CGC, CGG, AGA,

ou AGG

<220>

<221> misc_feature<222> (34)..(36)

<223> N34 a N36 são independentemente TAT, TAC, TCA, TCT, TCC,

TCG, AGT, AGC, GGA, GGT, GGC, GGG, CGA, CGT, CGC, CGG, AGA,ou AGG

<220>

<221> misc_feature<222> (37)..(39)

<223> N37 a N39 são independentemente TAT, TAC, TCA, TCT, TCC,

TCG, AGT, AGC, GGA, GGT, GGC, GGG, CGA, CGT, CGC, CGG, AGA,ou AGG

<220>

<221> misc_feature<222> (40)..(42)

<223> N40 a N42 são independentemente TAT, TAC, TCA, TCT, TCC,

TCG, AGT, AGC, GGA, GGT, GGC, GGG, CGA, CGT, CGC, CGG, AGA,ou AGG

<220>

<221> misc_feature<222> (43)..(45)

<223> N43 a N45 são independentemente TAT, TAC, TCA, TCT, TCC,

TCG, AGT, AGC, GGA, GGT, GGC, GGG, CGA, CGT, CGC, CGG, AGA,ou AGG<400> 62

gtctattatt gtgctcgcnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnngstwt kgactactgg 60

ggtcaagga 69

<210> 63

<211> 72

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> H3-C10 sintético<220>

<221> misc_feature<222> (19).. (21)

<223> N19 a N21 são independentemente TAT, TAC, TCA, TCT, TCC,

TCG, AGT, AGC, GGA, GGT, GGC, GGG, CGA, CGT, CGC, CGG, AGA,ou AGG

<220>

<221> misc_feature<222> (22) .. (24)

<223> N22 a N24 são independentemente ^TÀT," TAC, TCA, TCT, TCC,

TCG, AGT, AGC, GGA, GGT, GGC, GGG, CGA, CGT, CGC, CGG, AGA,ou AGG

<220>

<221> misc_feature<222> (25)..(27)

<223> N25 a N27 são independentemente TAT, TAC, TCA, TCT, TCC,

TCG, AGT, AGC, GGA, GGT, GGC, GGG, CGA, CGT, CGC, CGG, AGA,ou AGG

<220>

<221> misc_feature<222> (28)..(30)

<223> N28 a N30 são independentemente TAT, TAC, TCA, TCT, TCC,

TCG, AGT, AGC, GGA, GGT, GGC, GGG, CGA, CGT, CGC, CGG, AGA,ou AGG

<220>

<221> misc_feature<222> (31). . (33)

<223> N31 a N33 são independentemente TAT, TAC, TCA, TCT, TCC,

TCG, AGT, AGC, GGA, GGT, GGC, GGG, CGA, CGT, CGC, CGG, AGA,ou AGG

<220>

<221> misc_feature<222> (34)..(36)

<223> N34 a N36 são independentemente TAT, TAC, TCA, TCT, TCC,

TCG, AGT, AGC, GGA, GGT, GGC, GGG, CGA, CGT, CGC, CGG, AGA,ou AGG

<220><221> misc_feature<222> (37) .. (39)

<223> N37 a N39 são independentemente TAT, TAC, TCA, TCT, TCC,

TCG, AGT, AGC, GGA, GGT, GGC, GGG, CGA, CGT, CGC, CGG, AGA,ou AGG

<220>

<221> misc_feature<222> (40) .. (42)

<223> N40 a N42 são independentemente TAT, TAC, TCA, TCT, TCC,

TCG, AGT, AGC, GGA, GGT, GGC, GGG, CGA, CGT, CGC, CGG, AGA,ou AGG

<220>

<221> misc_feature<222> (43) . . (45)

<223> N43 a N45 são independentemente TAT, TAC, TCA, TCT, TCC,

TCG, AGT, AGC, GGA, GGT, GGC, GGG, CGA, CGT, CGC, CGG, AGA,ou AGG

<220>

<221> misc_feature

<222> (46).. (48)

<223> N4 6 a N48 são independentemente TAT, TAC, TCA, TCT, TCC,

TCG, AGT, AGC, GGA, GGT, GGC, GGG, CGA, CGT, CGC, CGG, AGA,

ou AGG

<400> 63

gtctattatt gtgctcgcnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnngs twtkgactac 60

tggggtcaag ga 72

<210> 64

<211> 75

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> H3-C11 sintético<220>

<221> misc_feature<222> (19)..(21)

<223> N19 a N21 são independentemente TAT, TAC, TCA, TCT, TCC,

TCG, AGT, AGC, GGA, GGT, GGC, GGG, CGA, CGT, CGC, CGG, AGA,ou AGG

<220>

<221> misc_feature<222> (22) . . (24)

<223> N22 a N24 são independentemente TAT, TAC, TCA, TCT, TCC,

TCG, AGT, AGC, GGA, GGT, GGC, GGG, CGA, CGT, CGC, CGG, AGA,ou AGG

<220><221>

misc feature<222> (25) .. (27)

<223> N25 a N27 são independentemente TAT, TAC, TCA, TCT, TCC,

TCG, AGT, AGC, GGA, GGT, GGC, GGG, CGA, CGT, CGC, CGG, AGA,ou AGG

<220>

<221> misc_feature<222> (28). . (30)

<223> N28 a N30 são independentemente TAT, TAC, TCA, TCT, TCC,

TCG, AGT, AGC, GGA, GGT, GGC, GGG, CGA, CGT, CGC, CGG, AGA,ou AGG

<220>

<221> misc_feature<222> (31).. (33)

<223> N31 a N33 são independentemente TAT, TAC, TCA, TCT, TCC,

TCG, AGT, AGC, GGA, GGT, GGC, GGG, CGA, CGT, CGC, CGG, AGA,ou AGG

<220>

<221> misc_feature<222> (34)..(36)

<2_23>_ N34 a N36 são independentemente TAT, TAC, TCA, TCTJTOÇ, _TCG, AGT, AGC, GGA, GGT, GGC, GGG, CGA, CGT, CGC, CGG, AGA,ou AGG

<220>

<221> misc_feature<222> (37)..(39)

<223> N37 a N39 são independentemente TAT, TAC, TCA, TCT, TCC,

TCG, AGT, AGC, GGA, GGT, GGC, GGG, CGA, CGT, CGC, CGG, AGA,ou AGG

<220>

<221> misc_feature<222> (40)..(42)

<223> N40 a N42 são independentemente TAT, TAC, TCA, TCT, TCC,

TCG, AGT, AGC, GGA, GGT, GGC, GGG, CGA, CGT, CGC, CGG, AGA,ou AGG

<220>

<221> misc_feature<222> (43)..(45)

<223> N43 a N45 são independentemente TAT, TAC, TCA, TCT, TCC,

TCG, AGT, AGC, GGA, GGT, GGC, GGG, CGA, CGT, CGC, CGG, AGA,ou AGG

<220>

<221> misc_feature<222> (46)..(48)

<223> N46 a N48 são independentemente TAT, TAC, TCA, TCT, TCC,

TCG, AGT, AGC, GGA, GGT, GGC, GGG, CGA, CGT, CGC, CGG, AGA,ou AGG

<220><221>

misc feature<222> (49)..(51)

<223> N49 a N51 são independentemente TAT, TAC, TCA, TCT, TCC,

TCG, AGT, AGC, GGA, GGT, GGC, GGG, CGA, CGT, CGC, CGG, AGA,ou AGG

<400> 64

gtctattatt gtgctcgcnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn ngstwtkgac 60

tactggggtc aagga 75

<210> 65

<211> 78

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> H3-C12 sintético<220>

<221> misc_feature

<222> (19)..(21)

<223> N19 a N21 são independentemente TAT, TAC, TCA, TCT, TCC,

TCG, AGT, AGC, GGA, GGT, GGC, GGG, CGA, CGT, CGC, CGG, AGA,

<220>

<221> misc_feature<222> (22) . . (24)

<223> N22 a N24 são independentemente TAT, TAC, TCA, TCT, TCC,

TCG, AGT, AGC, GGA, GGT, GGC, GGG, CGA, CGT, CGC, CGG, AGA,ou AGG

<220>

<221> misc_feature<222> (25) . . (27)

<223> N25 a N27 são independentemente TAT, TAC, TCA, TCT, TCC,

TCG, AGT, AGC, GGA, GGT, GGC, GGG, CGA, CGT, CGC, CGG, AGA,ou AGG

<220>

<221> misc_feature

<222> (28)..(30) ___

<223> N28 a N30 são independentemente TAT, TAC, TCA, TCT, TCC,

TCG, AGT, AGC, GGA, GGT, GGC, GGG, CGA, CGT, CGC, CGG, AGA,ou AGG

<220>

<221> misc_feature<222> (31)..(33)

<223> N31 a N33 são independentemente TAT, TAC, TCA, TCT, TCC,

TCG, AGT, AGC, GGA, GGT, GGC, GGG, CGA, CGT, CGC, CGG, AGA,ou AGG

<220>

<221> misc_feature<222> (34)..(36)<223> N34 a N36 são independentemente TAT, TAC, TCA, TCT, TCC,

TCG, AGT, AGC, GGA, GGT, GGC, GGG, CGA, CGT, CGC, CGG, AGA,ou AGG

<220>

<221> misc_feature<222> (37)..(39)

<223> N37 a N39 são independentemente TAT, TAC, TCA, TCT, TCC,

TCG, AGT, AGC, GGA, GGT, GGC, GGG, CGA, CGT, CGC, CGG, AGA,ou AGG

<220>

<221> misc_feature<222> (40)..(42)

<223> N40 a N42 são independentemente TAT, TAC, TCA, TCT, TCC,

TCG, AGT, AGC, GGA, GGT, GGC, GGG, CGA, CGT, CGC, CGG, AGA,ou AGG

<220>

<221> misc_feature<222> (43)..(45)

<223> N43 a N45 são independentemente TAT, TAC, TCA, TCT, TCC,

TCG, AGT, AGC, GGA, GGT, GGC, GGG, CGA, CGT, CGC, CGG, AGA,

~™ ou' AGG ' '" ~" " '

<220>

<221> misc_feature<222> (46)..(48)

<223> N46 a N48 são independentemente TAT, TAC, TCA, TCT, TCC,

TCG, AGT, AGC, GGA, GGT, GGC, GGG, CGA, CGT, CGC, CGG, AGA,ou AGG

<220>

<221> misc_feature<222> (49)..(51)

<223> N49 a N51 são independentemente TAT, TAC, TCA, TCT, TCC,

TCG, AGT, AGC, GGA, GGT, GGC, GGG, CGA, CGT, CGC, CGG, AGA,ou AGG

<220>

<221> misc_feature

<222> (52) . . (54)

<223> N52 a N54 são independentemente TAT, TAC, TCA, TCT, TCC,

TCG, AGT, AGC, GGA, GGT, GGC, GGG, CGA, CGT, CGC, CGG, AGA,

ou AGG

<400> 65

gtctattatt gtgctcgcnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnngstwtk 60

gactactggg gtcaagga 78

<210> 66

<211> 81

<212> DNA

<213> Artificial

<220><223> H3-C13 sintético<220>

<221> misc_feature<222> (19)..(21)

<223> N19 a N21 são independentemente TAT, TAC, TCA, TCT, TCC,

TCG, AGT, AGC, GGA, GGT, GGC, GGG, CGA, CGT, CGC, CGG. AGAou AGG

<220>

<221> misc_feature<222> (22) . . (24)

<223> N22 a N24 são independentemente TAT, TAC, TCA, TCT, TCC,

TCG, AGT, AGC, GGA, GGT, GGC, GGG, CGA, CGT, CGC, CGG. AGAou AGG

<220>

<221> misc_feature<222> (25) .. (27)

<223> N19 a N21 são independentemente TAT, TAC, TCA, TCT, TCC,

TCG, AGT, AGC, GGA, GGT, GGC, GGG, CGA, CGT, CGC, CGG. AGA,ou AGG

<220>

<221> misc_feature<222> (28)..(30)

<223> N28 a N30 são independentemente TAT, TAC, TCA, TCT, TCC,

TCG, AGT, AGC, GGA, GGT, GGC, GGG, CGA, CGT, CGC, CGG. AGA,ou AGG

<220>

<221> misc_feature<222> (31)..(33)

<223> N31 a N33 são independentemente TAT, TAC, TCA, TCT, TCC,

TCG, AGT, AGC, GGA, GGT, GGC, GGG, CGA, CGT, CGC, CGG. AGA,ou AGG

<220>

<221> misc_feature<222> (34)..(36)

<223> N34 a N36 são independentemente TAT, TAC, TCA, TCT, TCC,

TCG,-AGT, AGC, GGA, GGT, GGC, GGG, CGA, CGT, CGC, CGG. AGA^ou AGG

<220>

<221> misc_feature<222> (37)..(39)

<223> N37 a N39 são independentemente TAT, TAC, TCA, TCT, TCC,

TCG, AGT, AGC, GGA, GGT, GGC, GGG, CGA, CGT, CGC, CGG. AGA,ou AGG

<220>

<221> misc_feature<222> (40)..(42)

<223> N40 a N42 são independentemente TAT, TAC, TCA, TCT, TCC,

TCG, AGT, AGC, GGA, GGT, GGC, GGG, CGA, CGT, CGC, CGG. AGA,ou AGG

<220>

<221> misc_feature<222> (43)..(45)

<223> N43 a N45 são independentemente TAT, TAC, TCA, TCT, TCC,

TCG, AGT, AGC, GGA, GGT, GGC, GGG, CGA, CGT, CGC, CGG. AG A,ou AGG

<220>

<221> misc_feature<222> (46)..(48)

<223> N46 a N48 são independentemente TAT, TAC, TCA, TCT, TCC,

TCG, AGT, AGC, GGA, GGT, GGC, GGG, CGA, CGT, CGC, CGG. AGA,ou AGG

<220>

<221> misc_feature<222> (49)..(51)

<223> N4 9 a N51 são independentemente TAT, TAC, TCA, TCT, TCC,

TCG, AGT, AGC, GGA, GGT, GGC, GGG, CGA, CGT, CGC, CGG. AGA,ou AGG

<220>

<221> misc_feature<222> (52) . . (54)

<223> N52 a N54 são independentemente TAT, TAC, TCA, TCT, TCC,

TCG, AGT, AGC, GGA, GGT, GGC, GGG, CGA, CGT, CGC, CGG. AGA,ou AGG

<220>

<221> misc_feature<222> (55)..(57)

<223> N55 a N57 são independentemente TAT, TAC, TCA, TCT, TCC,

TCG, AGT, AGC, GGA, GGT, GGC, GGG, CGA, CGT, CGC, CGG. AGA,ou AGG

<400> 66

gtctattatt gtgctcgcnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnngst 60wtkgactact ggggtcaagg a 81

<210> 67

<211> 84

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> H3-C14 sintético<220>

<221> misc_feature<222> (19)..(21)

<223> N19 a N21 são independentemente TAT, TAC, TCA, TCT, TCC,

TCG, AGT, AGC, GGA, GGT, GGC, GGG, CGA, CGT, CGC, CGG. AGA,ou AGG<220>

<221> misc_feature<222> (22) . . (24)

<223> N22 a N24 são independentemente TAT, TAC, TCA, TCT, TCC,

TCG, AGT, AGC, GGA, GGT, GGC, GGG, CG A, CGT, CGC, CGG. AGA,ou AGG

<220>

<221> misc_feature<222> (25)..(27)

<223> N25 a N27 são independentemente TAT, TAC, TCA, TCT, TCC,

TCG, AGT, AGC, GGA, GGT, GGC, GGG, CGA, CGT, CGC, CGG. AGA,ou AGG

<220>

<221> misc_feature<222> (28)..(30)

<223> N28 a N30 são independentemente TAT, TAC, TCA, TCT, TCC,

TCG, AGT, AGC, GGA, GGT, GGC, GGG, CGA, CGT, CGC, CGG. AGA,ou AGG

<220>

<221> misc_feature

<222> (31) . . (33)

<223> N31 a N33 são independentemente TAT, TAC, TCA, TCT, TCC,

TCG, AGT, AGC, GGA, GGT, GGC, GGG, CGA, CGT, CGC, CGG. AGA,ou AGG

<220>

<221> misc_feature<222> (34)..(36)

<223> N34 a N36 são independentemente TAT, TAC, TCA, TCT, TCC,

TCG, AGT, AGC, GGA, GGT, GGC, GGG, CGA, CGT, CGC, CGG. AGA,ou AGG

<220>

<221> misc_feature<222> (37)..(39)

<223> N37 a N39 são independentemente TAT, TAC, TCA, TCT, TCC,

TCG, AGT, AGC, GGA, GGT, GGC, GGG, CGA, CGT, CGC, CGG. AGA,ou AGG

<220>

<221> misc_feature<222> (40).. (42)

<223> N40 a N42 são independentemente TAT, TAC, TCA, TCT, TCC,

TCG, AGT, AGC, GGA, GGT, GGC, GGG, CGA, CGT, CGC, CGG. AGA,ou AGG

<220>

<221> misc_feature<222> (43)..(45)

<223> N43 a N45 são independentemente TAT, TAC, TCA, TCT, TCC,

TCG, AGT, AGC, GGA, GGT, GGC, GGG, CGA, CGT, CGC, CGG. AGA,ou AGG<220>

<221> misc_feature<222> (46)..(48)

<223> N46 a N48 são independentemente TAT, TAC, TCA, TCT, TCC,

TCG, AGT, AGC, GGA, GGT, GGC, GGG, CGA, CGT, CGC, CGG. AG A,ou AGG

<220>

<221> misc_feature<222> (49)..(51)

<223> N4 9 a N51 são independentemente TAT, TAC, TCA, TCT, TCC,

TCG, AGT, AGC, GGA, GGT, GGC, GGG, CGA, CGT, CGC, CGG. AGA,ou AGG

<220>

<221> misc_feature<222> (52) . . (54)

<223> N52 a N54 são independentemente TAT, TAC, TCA, TCT, TCC,

TCG, AGT, AGC, GGA, GGT, GGC, GGG, CGA, CGT, CGC, CGG. AGA,ou AGG

<220>

<221> misc_feature<222> (55) .. (57)

<223> N55 a N57 são independentemente TAT, TAC, TCA, TCT, TCC,

TCG, AGT, AGC, GGA, GGT, GGC, GGG, CGA, CGT, CGC, CGG. AGA,ou AGG

<220>

<221> misc_feature<222> (58)..(60)

<223> N58 a N60 são independentemente TAT, TAC, TCA, TCT, TCC,

TCG, AGT, AGC, GGA, GGT, GGC, GGG, CGA, CGT, CGC, CGG. AGA,ou AGG

<400> 67

gtctattatt gtgctcgcnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 60

gstwtkgact actggggtca agga 84

<210> 68

<211> 87

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> H3-C15 sintético<220>

<221> misc_feature<222> (19)..(21)

<223> N19 a N21 são independentemente TAT, TAC, TCA, TCT, TCC,

TCG, AGT, AGC, GGA, GGT, GGC, GGG, CGA, CGT, CGC, CGG. AGA,ou AGG

<220>misc_feature(22). . (24)

N22 a N24 são independentemente TAT, TAC, TCA, TCT, TCC,TCG, AGT, AGC, GGA, GGT, GGC, GGG, CG A, CGT, CGC, CGG. AGA,ou AGG

misc_feature(25)..(27)

N25 a N27 são independentemente TAT, TAC, TCA, TCT, TCC,TCG, AGT, AGC, GGA, GGT, GGC, GGG, CGA, CGT, CGC, CGG. AGA,ou AGG

mi sc_feature(28).. (30)

N28 a N30 são independentemente TAT, TAC, TCA, TCT, TCC,TCG, AGT, AGC, GGA, GGT, GGC, GGG, CGA, CGT, CGC, CGG. AGA,ou AGG

misc_feature

(31).._(33_)<223> N31 a N33 são independentemente TAT," TAC," TCA," TCT," TCC,"

TCG, AGT, AGC, GGA, GGT, GGC, GGG, CGA, CGT, CGC, CGG. AGA,ou AGG

<220>

<221> misc_feature<222> (34)..(36)

<223> N34 a N36 são independentemente TAT, TAC, TCA, TCT, TCC,

TCG, AGT, AGC, GGA, GGT, GGC, GGG, CGA, CGT, CGC, CGG. AGA,ou AGG

<220>

<221> misc_feature<222> (37)..(39)

<223> N37 a N39 são independentemente TAT, TAC, TCA, TCT, TCC,

TCG, AGT, AGC, GGA, GGT, GGC, GGG, CGA, CGT, CGC, CGG. AGA,ou AGG

<220>

<221> misc_feature<222> (40) . . (42)

<223> N40 a N42 são independentemente TAT, TAC, TCA, TCT, TCC,

TCG, AGT, AGC, GGA, GGT, GGC, GGG, CGA, CGT, CGC, CGG. AGA,ou AGG

<220>

<221> misc_feature<222> (43) . . (45)

<223> N43 a N45 são independentemente TAT, TAC, TCA, TCT, TCC,

TCG, AGT, AGC, GGA, GGT, GGC, GGG, CGA, CGT, CGC, CGG. AGA,ou AGG

<220>

<221><222><223>

<220><221><222><223>

<220><221><222><221> misc_feature<222> (46)..(48)

<223> N46 a N48 são independentemente TAT, TAC, TCA, TCT, TCC,

TCG, AGT, AGC, GGA, GGT, GGC, GGG, CGA, CGT, CGC, CGG. AGA,ou AGG

<220>

<221> misc_feature<222> (49)..(51)

<223> N49 a N51 são independentemente TAT, TAC, TCA, TCT, TCC,

TCG, AGT, AGC, GGA, GGT, GGC, GGG, CGA, CGT, CGC, CGG. AGA,ou AGG

<220>

<221> misc_feature<222> (52).. (54)

<223> N52 a N54 são independentemente TAT, TAC, TCA, TCT, TCC,

TCG, AGT, AGC, GGA, GGT, GGC, GGG, CGA, CGT, CGC, CGG. AGA,ou AGG

<220>

<221> misc_feature

<222> (55)..(57)

<223> N55 â N57~"sãcTindependentêmêntê" "TAT, TAC, TCA,"" TCT, "TCC,

TCG, AGT, AGC, GGA, GGT, GGC, GGG, CGA, CGT, CGC, CGG. AGA,

ou AGG

<220>

<221> misc_feature<222> (58)..(60)

<223> N58 a N60 são independentemente TAT, TAC, TCA, TCT, TCC,

TCG, AGT, AGC, GGA, GGT, GGC, GGG, CGA, CGT, CGC, CGG. AGA,ou AGG

<220>

<221> misc_feature<222> (61)..(63)

<223> N61 a N63 são independentemente TAT, TAC, TCA, TCT, TCC,

TCG, AGT, AGC, GGA, GGT, GGC, GGG, CGA, CGT, CGC, CGG. AGA,ou AGG

<400> 68

<210> 69

<211> 90

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> H3-C16 sintético

<220>

<221> misc feature<222> (19)..(21)

<223> N19 a N21 são independentemente TAT, TAC, TCA, TCT, TCC,

TCG, AGT, AGC, GGA, GGT, GGC, GGG, CGA, CGT, CGC, CGG. AGAou AGG

<220>

<221> misc_feature<222> (22) . . (24)

<223> N22 a N24 são independentemente TAT, TAC, TCA, TCT, TCC,

TCG, AGT, AGC, GGA, GGT, GGC, GGG, CGA, CGT, CGC, CGG. AGAou AGG

<220>

<221> misc_feature<222> (25) . . (27)

<223> N25 a N27 são independentemente TAT, TAC, TCA, TCT, TCC,

TCG, AGT, AGC, GGA, GGT, GGC, GGG, CGA, CGT, CGC, CGG. AGA,ou AGG

<220>

<221> misc_feature<222> (28)..(30)

<223> N28_ a N30 são independentemente TAT, TAC, TCA, TCT, _TCC,

TCG, AGT, AGC, GGA, GGT, GGC, GGG, CGA, CGT, CGC, CGG. AGA,ou AGG

<220>

<221> misc_feature<222> (31)..(33)

<223> N31 a N33 são independentemente TAT, TAC, TCA, TCT, TCC,

TCG, AGT, AGC, GGA, GGT, GGC, GGG, CGA, CGT, CGC, CGG. AGA,ou AGG

<220>

<221> misc_feature<222> (34)..(36)

<223> N34 a N36 são independentemente TAT, TAC, TCA, TCT, TCC,

TCG, AGT, AGC, GGA, GGT, GGC, GGG, CGA, CGT, CGC, CGG. AGA,ou AGG

<220>

<221> misc_feature<222> (37)..(39)

<223> N37 a N39 são independentemente TAT, TAC, TCA, TCT, TCC,

TCG, AGT, AGC, GGA, GGT, GGC, GGG, CGA, CGT, CGC, CGG. AGA,ou AGG

<220>

<221> misc_feature<222> (40)..(42)

<223> N40 a N42 são independentemente TAT, TAC, TCA, TCT, TCC,

TCG, AGT, AGC, GGA, GGT, GGC, GGG, CGA, CGT, CGC, CGG. AGA,ou AGG

<220>

<221> misc feature<222> (43)..(45)

<223> N43 a N45 são independentemente TAT, TAC, TCA, TCT, TCC,

TCG, AGT, AGC, GGA, GGT, GGC, GGG, CGA, CGT, CGC, CGG. AGA,ou AGG

<220>

<221> misc_feature<222> (46) . . (48)

<223> N46 a N48 são independentemente TAT, TAC, TCA, TCT, TCC,

TCG, AGT, AGC, GGA, GGT, GGC, GGG, CGA, CGT, CGC, CGG. AGA,ou AGG

<220>

<221> misc_feature<222> (49)..(51)

<223> N49 a N51 são independentemente TAT, TAC, TCA, TCT, TCC,

TCG, AGT, AGC, GGA, GGT, GGC, GGG, CGA, CGT, CGC, CGG. AGA,ou AGG

<220>

<221> misc_feature<222> (52)..(54)

<223> N52 a N5j4 são independentemente TAT, TAC, TCA, TCT, TCC,

TCG, AGT, AGC, GGA, GGT, GGC, GGG, CGA, CGT, CGC, CGG. AGÁ,ou AGG

<220>

<221> misc_feature<222> (55)..(57)

<223> N55 a N57 são independentemente TAT, TAC, TCA, TCT, TCC,

TCG, AGT, AGC, GGA, GGT, GGC, GGG, CGA, CGT, CGC, CGG. AGA,ou AGG

<220>

<221> misc_feature<222> (58)..(60)

<223> N58 a N60 são independentemente TAT, TAC, TCA, TCT, TCC,

TCG, AGT, AGC, GGA, GGT, GGC, GGG, CGA, CGT, CGC, CGG. AGA,ou AGG

<220>

<221> misc_feature

<222> (61)..(63)

<223> N61 a N63 são independentemente TAT, TAC, TCA, TCT, TCC,

TCG, AGT, AGC, GGA, GGT, GGC, GGG, CGA, CGT, CGC, CGG. AGA,ou AGG

<220>

<221> misc_feature<222> (64)..(66)

<223> N64 a N66 são independentemente TAT, TAC, TCA, TCT, TCC,

TCG, AGT, AGC, GGA, GGT, GGC, GGG, CGA, CGT, CGC, CGG. AGA,ou AGG

<400> 69

gtctattatt gtgctcgcnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 60nnnnnngstw tkgactactg gggtcaagga 9

<210> 70

<211> 93

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> H3-C17 sintético<220>

<221> misc_feature<222> (19)..(21)

<223> N19 a N21 são independentemente TAT, TAC, TCA, TCT, TCC,

TCG, AGT, AGC, GGA, GGT, GGC, GGG, CGA, CGT, CGC, CGG. AG A,ou AGG

<220>

<221> misc_feature<222> (22) .. (24)

<223> N21 a N24 são independentemente TAT, TAC, TCA, TCT, TCC,

TCG, AGT, AGC, GGA, GGT, GGC, GGG, CGA, CGT, CGC, CGG. AGA,ou AGG

<220>

<221> misc_feature<222> (25)..(27)

<223> N25 a N27 são independentemente TAT, TAC, TCA, TCT, TCC,

TCG, AGT, AGC, GGA, GGT, GGC, GGG, CGA, CGT, CGC, CGG. AGA,ou AGG

<220>

<221> misc_feature<222> (28)..(30)

<223> N28 a N30 são independentemente TAT, TAC, TCA, TCT, TCC,

TCG, AGT, AGC, GGA, GGT, GGC, GGG, CGA, CGT, CGC, CGG. AGA,ou AGG

<220>

<221> misc_feature<222> (31). . (33)

<223> N31 a N33 são independentemente TAT, TAC, TCA, TCT, TCC,_______

TCG, AGT, AGC, GGA, GGT, GGC, GGG, CGA, CGT, CGC, CGG. AGA,ou AGG

<220>

<221> misc_feature<222> (34)..(36)

<223> N34 a N36 são independentemente TAT, TAC, TCA, TCT, TCC,

TCG, AGT, AGC, GGA, GGT, GGC, GGG, CGA, CGT, CGC, CGG. AGA,ou AGG

<220>

<221> misc_feature<222> (37)..(39)

<223> N37 a N39 são independentemente TAT, TAC, TCA, TCT, TCC,TCG, AGT, AGC, GGA, GGT, GGC, GGG, CG A, CGT, CGC, CGG. AGA,ou AGG

<220>

<221> misc_feature<222> (40)..(42)

<223> N40 a N42 são independentemente TAT, TAC, TCA, TCT, TCC,

TCG, AGT, AGC, GGA, GGT, GGC, GGG, CGA, CGT, CGC, CGG. AGA,ou AGG

<220>

<221> misc_feature<222> (43)..(45)

<223> N43 a N45 são independentemente TAT, TAC, TCA, TCT, TCC,

TCG, AGT, AGC, GGA, GGT, GGC, GGG, CGA, CGT, CGC, CGG. AGA,ou AGG

<220>

<221> misc_feature<222> (46) .. (48)

<223> N46 a N48 são independentemente TAT, TAC, TCA, TCT, TCC,

TCG, AGT, AGC, GGA, GGT, GGC, GGG, CGA, CGT, CGC, CGG. AGA,ou AGG

<220>

<221> misc_feature<222> (49) .. (51)

<223> N49 a N51 são independentemente TAT, TAC, TCA, TCT, TCC,

TCG, AGT, AGC, GGA, GGT, GGC, GGG, CGA, CGT, CGC, CGG. AGA,ou AGG

<220>

<221> misc_feature<222> (52) . . (54)

<223> N52 a N54 são independentemente TAT, TAC, TCA, TCT, TCC,

TCG, AGT, AGC, GGA, GGT, GGC, GGG, CGA, CGT, CGC, CGG. AGA,Ou AGG

<220>

<221> misc_feature<222> (55)..(57)

<223>_N55._a N57 são independentemente TAT, TAC, TCA, TCT, TCC,

TCG, AGT, AGC, GGA, GGT, GGC, GGG, CGA, CGT, CGC, CGG- AGA,ou AGG

<220>

<221> misc_feature<222> (58)..(60)

<223> N58 a N60 são independentemente TAT, TAC, TCA, TCT, TCC,

TCG, AGT, AGC, GGA, GGT, GGC, GGG, CGA, CGT, CGC, CGG. AGA,ou AGG

<220>

<221> misc_feature<222> (61)..(63)

<223> N61 a N63 são independentemente TAT, TAC, TCA, TCT, TCC,TCG, AGT, AGC, GGA, GGT, GGC, GGG, CGA, CGT, CGC, CGG. AGA,ou AGG

<220>

<221> misc_feature<222> (64)..(66)

<223> N64 a N66 são independentemente TAT, TAC, TCA, TCT, TCC,

TCG, AGT, AGC, GGA, GGT, GGC, GGG, CGA, CGT, CGC, CGG. AGA,ou AGG

<220>

<221> misc_feature<222> (67)..(69)

<223> N67 a N69 são independentemente TAT, TAC, TCA, TCT, TCC,

TCG, AGT, AGC, GGA, GGT, GGC, GGG, CGA, CGT, CGC, CGG. AGA,ou AGG

<400> 70

gtctattatt gtgctcgcnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 60

nnnnnnnnng stwtkgacta ctggggtcaa gga 93

<210> 71

<211> 60

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> H3-C6 sintético<220>

<221> misc_feature

<222> (19)..(36)

<223> N19 a N36 é qualquer combinação de A, T, C, ou G, excetoTGT, TGC, TGA, TAA, TAG

<400> 71

gtctattatt gtgctcgcnn nnnnnnnnnn nnnnnngstw tkgactactg gggtcaagga 60

<210> 72

<211> 63

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> H3-C7 sintético<220>

<221> misc_feature

<222> (19)..(39)

<223> N19 a N39 é qualquer combinação de A, T, C, ou G, excetoTGT, TGC, TGA, TAA, TAG

<400> 72

gtctattatt gtgctcgcnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnng stwtkgacta ctggggtcaagga 63

<210> 73

<211> 66

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> H3-C8 sintético<220>

<221> misc_feature

<222> (19)..(42)

<223> N19 a N42 é qualquer combinação de A, T, C, ou G, excetoTGT, TGC, TGA, TAA, TAG

<400> 73

gtctattatt gtgctcgcnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nngstwtkga ctactggggt 60

caagga 66

<210> 74

<211> 69

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> H3-C9 sintético

<220>

<221> misc_feature<222> (19)..(45)

<223> N19 a N45 é qualquer combinação de A, T, C, ou G, excetoTGT, TGC, TGA, TAA, TAG

<400> 74

gtctattatt gtgctcgcnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnngstwt kgactactgg 60

ggtcaagga 69

<210> 75

<211> 72

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> H3-C10 sintético<220>

<221> misc_feature

<222> (19).. (48)

<223> N19 a N48 é qualquer combinação de A, T, C, ou G, excetoTGT, TGC, TGA, TAA, TAG

<400> 75

gtctattatt gtgctcgcnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnngs twtkgactac 60tggggtcaag ga 72

<210> 76

<211> 75

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> synthetic H3-C11<220>

<221> misc_feature

<222> (19)..(51)

<223> N19 a N51 é qualquer combinação de A, T, C, ou G, excetoTGT, TGC, TGA, TAA, TAG

<400> 76

gtctattatt gtgctcgcnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn ngstwtkgac 60tactggggtc aagga 75<210> 77

<211> 78

<212> "DNA

<213> Artificial

<220>

<223> H3-C12 sintético

<220>

<221> misc_feature<222> (19)..(54)

<223> N19 a N54 é qualquer combinação de A, T, C, ou G, excetoTGT, TGC, TGA, TAA, TAG

<400> 77

gtctattatt gtgctcgcnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnngstwtk

gactactggg gtcaagga

<210> 78

<211> 81

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> H3-C13 sintético

<220>

<221> misc_feature<222> (19) .. (57)

<223> N19 a N57 é qualquer combinação de A, T, C, ou G, excetoTGT, TGC, TGA, TAA, TAG

<400>

78gtctattatt gtgctcgcnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnngst 60

wtkgactact ggggtcaagg a 81

<210> 79

<211> 84

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> H3-C14 sintético<220>

<221> misc_feature

<222> (19)..(60)

<223> N19 a N60 é qualquer combinação de A, T, C, ou G, excetoTGT, TGC, TGA, TAA, TAG

<400> 79

gtctattatt gtgctcgcnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 60gstwtkgact actggggtca agga 84

<210> 80

<211> 87

<212> DNA

<213> Artificial

<220> -----------------—

<223> H3-C15 sintético

<220>

<221> misc_feature<222> (19)..(63)

<223> N19 a N63 é qualquer combinação de A, T, C, ou G, excetoTGT, TGC, TGA, TAA, TAG

<400> 80

gtctattatt gtgctcgcnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 60

nnngstwtkg actactgggg tcaagga 87

<210> 81

<211> 90

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> synthetic H3-C16<220>

<221> misc_feature

<222> (19)..(66)

<223> N19 a N66 é qualquer combinação de A, T, C, ou G, excetoTGT, TGC, TGA, TAA, TAG<400> 81

gtctattatt gtgctcgcnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 60

nnnnnngstw tkgactactg gggtcaagga

<210> 82

<211> 93

<212> DNA

<213> Artificial

90

<220>

<223> H3-C17 sintético<220>

<221> misc_feature

<222> (19)..(69)

<223> N19 a N69 é qualquer combinação de A, T, C, ou G, excetoTGT, TGC, TGA, TAA, TAG

<400> 82

gtctattatt gtgctcgcnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 60

. nnnnnnnnng stwtkgacta ctg.gggtcaa gga ........._ 93

<210> 83

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 1CDRL3 ligante de HER2 sintético<400> 83

Gln Gln Ser Tyr Tyr Ser Pro Ser Thr1 5

<210> 84

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 3CDRL3 ligante de HER2 sintético

<400> 84

Gln Gln Ser Ser Tyr Tyr Pro Ser Thr1 5

<210> 85

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial

<220><223> Artificial clone 3CDRL3 ligante de HER2 sintético

<400> 85

Gln Gln Ser Ser Tyr Tyr Pro Ser Thr1 5

<210> 86

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 4CDRL3 ligante de HER2 sintético

<400> 86

Gln Gln Ser Tyr Tyr Ser Pro Ser Thr1 5

<210> 87

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial"<220>

<223> Artificial clone 5CDRL3 ligante de HER2 sintético

<400> 87

Gln Gln Ser Tyr Tyr Tyr Pro Ser Thr1 5

<210> 88

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 6CDRL3 ligante de HER2 sintético

<400> 88

Gln Gln Ser Tyr Tyr Ser Pro Ser Thr1 5

<210> 89

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 7CDRL3 ligante de HER2 sintético

<400> 89

Gln Gln Ser Tyr Tyr Tyr Pro Ser Thr1 5<210> 90

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 8CDRL3 ligante de HER2 sintético

<400> 90

Gln Gln Tyr Tyr Tyr Tyr Pro Tyr Thr1 5

<210> 91

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 9CDRL3 ligante de HER2 sintético

<400> 91

GÍn"Gln Tyr Tyr Tyr Ser Pro Ser Thr1 5

<210> 92

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 10CDRL3 ligante de HER2 sintético

<400> 92

Gln Gln Ser Tyr Tyr Tyr Pro Tyr Thr1 5

<210> 93

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 11CDRL3 ligante de HER2 sintético

<400> 93

Gln Gln Ser Ser Tyr Ser Pro Tyr Thr1 5

<210> 94

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial<220>

<223> Artificial clone 12CDRL3 ligante de HER2 sintético

<400> 94

Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro Thr1 5

<210> 95

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 13CDRL3 ligante de HER2 sintético

<400> 95

Gln Gln Tyr Ser Tyr Tyr Pro Tyr Thr

<210> 96

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 14CDRL3 ligante de HER2 sintético

<400> 96

Gln Gln Tyr Ser Tyr Tyr Pro Ser Thr1 5

<210> 97

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 15CDRL3 ligante de HER2 sintético

<400> 97

Gln Gln Tyr Ser Tyr Tyr Pro Tyr Thr

<210> 98

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 16CDRL3 ligante de HER2 sintético

<400>

98Gln Gln Ser Ser Tyr Ser Pro Ser Thr1 5

<210> 99

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 17CDRL3 ligante de HER2 sintético

<400> 99

Gln Gln Tyr Ser Tyr Tyr Pro Tyr Thr1 5

<210> 100

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 18CDRL3 ligante de HER2 sintético

<400> 100

Gln Gln Tyr Ser Tyr Tyr Pro Ser Thr1 5

<210> 101

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 19CDRL3 ligante de HER2 sintético

<400> 101

Gln Gln Tyr Ser Tyr Tyr Pro Tyr Thr1 5

<210> 102

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 20CDRL3 ligante de HER2 sintético

<400> 102

Gln Gln Tyr Ser Tyr Tyr Pro Tyr Thr1 5

<210> 103<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 21CDRL3 ligante de HER2 sintético

<400> 103

Gln Gln Tyr Ser Tyr Tyr Pro Tyr Thr1 5

<210> 104

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 22CDRL3 ligante de HER2 sintético

<400> 104

Gln Gln Tyr Ser Tyr Tyr Pro Tyr Thr

15 ~ "

<210> 105

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> A-rtrf iclal-Tclane-"23CDRL-3- ligante dc HER2 sintético

<400> 105

Gln Gln Tyr Ser Tyr Tyr Pro Tyr Thr1 5

<210> 106

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 24CDRL3 ligante de HER2 sintético

<400> 106

Gln Gln Tyr Ser Tyr Tyr Pro Tyr Thr1 5

<210> 107

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial

<220><223> Artificial clone 25CDRL3 ligante de HER2 sintético

<400> 107

Gln Gln Tyr Ser Tyr Tyr Pro Ser Thr1 5

<210> 108

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 26CDRL3 ligante de HER2 sintético

<400> 108

Gln Gln Tyr Ser Tyr Tyr Pro Ser Thr1 5

<210> 109

<211> 9

<212> PRT <213> Artificiai

<220>

<223> Artificial clone 27CDRL3 ligante de HER2 sintético

<400> 109

Gln Gln Tyr Ser Tyr Tyr Pro Tyr Thr

1 5

<210> 110

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 28CDRL3 ligante de HER2 sintético

<400> 110

Gln Gln Tyr Ser Tyr Tyr Pro Tyr Thr1 5

<210> 111

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 29CDRL3 ligante de HER2 sintético

<400> 111

Gln Gln Ser Ser Tyr Ser Pro Ser Thr1 5<210> 112

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 30CDRL3 ligante de HER2 sintético

<400> 112

Gln Gln Ser Ser Tyr Tyr Pro Tyr Thr

<210> 113

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 31CDRL3 ligante de HER2 sintético

<400> 113

Gln Gln"Ser Tyr Tyr Tyr ProSer Thr

<210> 114

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 32CDRL3 ligante de HER2 sintético

<400> 114

Gln Gln Ser Ser Tyr Tyr Pro Tyr Thr

<210> 115

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 33CDRL3 ligante de HER2 sintético

<400> 115

Gln Gln Ser Phe Ser Ser Pro Tyr Thr1 5

<210> 116

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial<220>

<223> Artificial clone 34CDRL3 ligante de HER2 sintético

<400> 116

Gln Gln Ser Tyr Ser Ser Pro Tyr Thr1 5

<210> 117

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 35CDRL3 ligante de HER2 sintético

<400> 117

Gln Gln Ser Tyr Ser Tyr Pro Ser Thr1 5

<210> 118

<211> 9 <212> "PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 36CDRL3 ligante de HER2 sintético

<400> 118

Gln Gln Ser Phe Ser Tyr Pro Tyr Thr "1 5

<210> 119

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 37CDRL3 ligante de HER2 sintético

<400> 119

Gln Gln Ser Tyr Ser Ser Pro Tyr Thr1 5

<210> 120

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 38CDRL3 ligante de HER2 sintético

<400> 120Gln Gln Ser Tyr Ser Ser Pro Ser Thr1 5

<210> 121

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 39CDRL3 ligante de HER2 sintético

<400> 121

Gln Gln Ser Tyr Ser Tyr Pro Sèr Thr1 5

<210> 122

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<22.3> . Artificial clone 40CDRL3 ligante de HER2 sintético

<400> 122

Gln Gln Ser Tyr Ser Ser Pró Tyr Thr1 5

<210> 123

<211> 9

<212> PRT ~ -

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 41CDRL3 ligante de HER2 sintético

<400> 123

Gln Gln Ser Tyr Ser Ser Pro Ser Thr1 5

<210> 124

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 42CDRL3 ligante de HER2 sintético

<400> 124

Gln Gln Ser Tyr Ser Ser Pro Ser Thr1 5

<210> 125<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 43CDRL3 ligante de HER2 sintético

<400> 125

Gln Gln Ser Phe Ser Ser Pro Ser Thr1 5

<210> 126

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 44CDRL3 ligante de HER2 sintético

<400> 126

^ Gln Gln Ser Ser Ser Ser Pro Tyr Thr

<210> 127

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> ArtTficiar clõrie 45CDRL3 ligante dê HER2 sintético

<400> 127

Gln Gln Ser Tyr Ser Ser Pro Tyr Thr1 5

<210> 128

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 46CDRL3 ligante de HER2 sintético

<400> 128

Gln Gln Ser Ser Ser Ser Pro Tyr Thr1 5

<210> 129

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial

<220><223> Artificial clone 4 7CDRL3 ligante de HER2 sintético

<400> 129

Gln Gln Ser Tyr Ser Ser 1 5 Pro Ser Thr

<210> <211> <212> <213> 130 9 PRT Artificial

<220> <223> Artificial clone 48CDRL3 ligante de HER2 sintético

<400> 130

Gln Gln Ser Ser Ser Tyr 1 5 Pro Tyr Thr

<210> <211> <212> 131 9 PRT

<213> "ArtíficiáT"

<220> <223> Artificial clone 4 9CDRL3 ligante de HER2 sintético

<400> 131

Gln Gln Ser Tyr Ser Tyr 1 5 ' Pro Ser Thr .... ......

<210> <211> <212> <213> 132 9 PRT Artificial

<220> <223> Artificial clone 50CDRL3 ligante de HER2 sintético

<400> 132

Gln Gln Ser Ser Ser Ser 1 5 Pro Tyr Thr

<210> <211> <212> <213> 133 9 PRT Artificial

<220> <223> Artificial clone 51CDRL3 ligante de HER2 sintético

<400> 133

Gln Gln Ser Ser Ser Tyr Pro Tyr Thr1 5<210> 134

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 52CDRL3 ligante de HER2 sintético

<400> 134

Gln Gln Ser Ser Ser Tyr Pro Ser Thr1 5

<210> 135

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 53CDRL3 ligante de HER2 sintético

<400> 135

Gln Gln Ser Tyr Ser Ser Pro Ser Thr "1 5

<210> 136

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 54CDRL3 ligante de HER2 sintético

<400> 136

Gln Gln Ser Ser Ser Ser Pro Tyr Thr1 5

<210> 137

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 55CDRL3 ligante de HER2 sintético

<400> 137

Gln Gln Ser Ser Ser Tyr Pro Ser Thr1 5

<210> 138

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial<220>

<223> Artificial clone 56CDRL3 ligante de HER2 sintético

<400> 138

Gln Gln Ser Ser Tyr Tyr Pro Ser Thr1 5

<210> 139

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 57CDRL3 ligante de HER2 sintético

<400> 139

Gln Gln Ser Ser Phe Ser Pro Tyr Thr1 5

<210> 140

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 58CDRL3 ligante de HER2 sintético

<400> 140

Gln Gln Ser Sér Ser Tyr Pro Tyr Thr1 5

<210> 141

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 59CDRL3 ligante de HER2 sintético

<400> 141

Gln Gln Ser Ser Ser Tyr Pro Ser Thr1 5

<210> 142

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 60CDRL3 ligante de HER2 sintético

<400> 142Gln Gln Ser Ser Ser Ser Pro Tyr Thr1 5

<210> 143

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 61CDRL3 ligante de HER2 sintético<400> 143

Gln Gln Ser Tyr Ser Ser Pro Tyr Thr1 5

<210> 144

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<-2-2-3>—A-r-ti-fÍG-ia-1— clone—6.2-CDRL3--ligan-te-de. HER2 sintético<400> 144

Gln Gln Ser Tyr Ser Ser Pro Ser Thr1 5

<210> 145

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 63CDRL3 ligante de HER2 sintético<400> 145

Gln Gln Ser Tyr Ser Ser Pro Ser Thr1 5

<210> 146

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 64CDRL3 ligante de HER2 sintético<400> 146

Gln Gln Ser Ser Ser Tyr Pro Tyr Thr1 5

<210> 147<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 65CDRL3 ligante de HER2 sintético

<400> 147

Gln Gln Ser Phe Ser Ser Pro Tyr Thr1 5

<210> 148

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 66CDRL3 ligante de HER2 sintético

<400> 148

Gln Gln Ser Tyr Ser Tyr Pro Ser Thr

1 5

<210> 149

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 67CDRL3 ligante de HER2 sintético

<400> 149

Gln Gln Ser Tyr Ser Ser Pro Tyr Thr1 5

<210> 150

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 68CDRL3 ligante de HER2 sintético

<400> 150

Gln Gln Tyr Tyr Ser Ser Pro Tyr Thr1 5

<210> 151

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial

<220><223> Artificial clone 69CDRL3 ligante de HER2 sintético

<400> 151

Gln Gln Ser Ser Ser Tyr Pro Ser Thr1 5

<210> 152

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 70CDRL3 ligante de HER2 sintético

<400> 152

Gln Gln Tyr Tyr Ser Ser Pro Ser Thr1 5

<210> 153

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 71CDRL3 ligante de HER2 sintético

<400> 153

Gln Gln Ser Ser Tyr Tyr Pro Ser Thr1 5

<210> 154

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 72CDRL3 ligante de HER2 sintético

<400> 154

Gln Gln Ser Ser Phe Tyr Pro Ser Thr1 5

<210> 155

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 73CDRL3 ligante de HER2 sintético

<400> 155

Gln Gln Ser Ser Tyr Ser Pro Tyr Thr1 5<210> 156

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 74CDRL3 ligante de HER2 sintético

<400> 156

Gln Gln Ser Ser Ser Tyr Pro Ser Thr1 5

<210> 157

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 75CDRL3 ligante de HER2 sintético

<400> 157

Gln Gln Ser Ser Ser Ser Pro Ser Thr1 5

<210> 158

<211> 9 ^

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 76CDRL3 ligante de HER2 sintético

<400> 158

Gln Gln Tyr Tyr Tyr Tyr Pro Tyr Thr1 5

<210> 159

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 77CDRL3 ligante de HER2 sintético

<400> 159

Gln Gln Ser Ser Tyr Ser Pro Tyr Thr1 5

<210> 160

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial<220>

<223> Artificial clone 78CDRL3 ligante de HER2 sintético

<400> 160

Gln Gln Ser Ser Tyr Ser Pro Tyr Thr1 5

<210> 161

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 79CDRL3 ligante de HER2 sintético

<400> 161

Gln Gln Ser Ser Tyr Ser Pro Tyr Thr1 5

<210> 162

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 80CDRL3 ligante de HER2 sintético

<400> 162

Gln Gln Tyr Tyr Ser Ser Pro Tyr Thr1 5

<210> 163

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 81CDRL3 ligante de HER2 sintético

<400> 163

Gln Gln Ser Tyr Ser Tyr Pro Ser Thr1 5

<210> 164

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 82CDRL3 ligante de HER2 sintético

<400> 164Gln Gln Tyr Ser Tyr Tyr Pro Ser Thr1 5

<210> 165

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 83CDRL3 ligante de HER2 sintético

<400> 165

Gln Gln Ser Ser Tyr Ser Pro Tyr Thr1 5

<210> 166

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 84CDRL3 ligante de HER2 sintético

<400> 166

Gln Gln Ser Ser Tyr Ser Pro Tyr Thr1 5

<210> 167

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 85CDRL3 ligante de HER2 sintético

<400> 167

Gln Gln Ser Ser Tyr Ser Pro Tyr Thr1 5

<210> 168

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 86CDRL3 ligante de HER2 sintético

<400> 168

Gln Gln Ser Ser Tyr Ser Pro Tyr Thr1 5

<210> 169<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 87CDRL3 ligante de HER2 sintético

<400> 169

Gln Gln Tyr Ser Tyr Tyr Pro Ser Thr1 5

<210> 170

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 88CDRL3 ligante de HER2 sintético

<400> 170

Gln Gln Ser Ser Ser Ser Pro Tyr Thr1 5

<210> 171

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 89CDRL3 ligante de HER2 sintético

<400> 171

Gln Gln Ser Ser Tyr Ser Pro Tyr Thr1 5

<210> 172

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 90CDRL3 ligante de HER2 sintético

<400> 172

Gln Gln Ser Ser Tyr Ser Pro Tyr Thr1 5

<210> 173

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial

<220><223> Artificial clone 91CDRL3 ligante de HER2 sintético

<400> 173

Gln Gln Ser Ser Ser Ser Pro Tyr Thr1 5

<210> 174

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 92CDRL3 ligante de HER2 sintético

<400> 174

Gln Gln Tyr Tyr Ser Ser Pro Tyr Thr1 5

<210> 175

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 93CDRL3 ligante de HER2 sintético

<400> 175

Gln Gln Ser Ser Ser Ser Pro Tyr Thr1 5

<210> 176

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 94CDRL3 ligante de HER2 sintético

<400> 176

Gln Gln Ser Ser Tyr Tyr Pro Tyr Thr1 5

<210> 177

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 95CDRL3 ligante de HER2 sintético

<400> 177

Gln Gln Ser Tyr Tyr Tyr Pro Tyr Thr1 5<210> 178

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 96CDRL3 ligante de HER2 sintético

<400> 178

Gln Gln Tyr Tyr Tyr Ser Pro Ser Thr1 5

<210> 179

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 97CDRL3 ligante de HER2 sintético

<400> 179

Gln Gln Tyr Ser Tyr Tyr Pro Tyr Thr1 5

<210> 180

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 98CDRL3 ligante de HER2 sintético

<400> 180

Gln Gln Tyr Ser Tyr Tyr Pro Tyr Thr1 5

<210> 181

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 99CDRL3 ligante de HER2 sintético

<400> 181

Gln Gln Tyr Ser Tyr Tyr Pro Tyr Thr1 5

<210> 182

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial<220>

<223> Artificial clone 100CDRL3 ligante de HER2 sintético

<400> 182

Gln Gln Ser Ser Tyr Tyr Pro Tyr Thr1 5

<210> 183

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 101CDRL3 ligante de HER2 sintético

<400> 183

Gln Gln Tyr Ser Tyr Tyr Pro Tyr Thr1 5

<210> 184

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 102CDRL3 ligante de HER2 sintético

<400> 184

Gln Gln Tyr Ser Tyr Tyr Pro Tyr Thr1 5

<210> 185

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 103CDRL3 ligante de HER2 sintético

<400> 185

Gln Gln Tyr Ser Tyr Tyr Pro Ser Thr1 5

<210> 186

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 104CDRL3 ligante de HER2 sintético

<400>

186Gln Gln Tyr Ser Ser Ser Pro Ser Thr1 5

<210> 187

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 105CDRL3 ligante de HER2 sintético<400> 187

Gln Gln Tyr Ser Ser Ser Pro Tyr Thr1 5

<210> 188

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 106CDRL3 ligante de HER2 sintético<400> 188

Gln Gln Ser Tyr Ser Ser Pro Ser Thr1 5

<210> 189

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 1CDRL3 ligante de HER2 sintético<400> 189

Gly Phe Ser lie Ser Ser Ser Tyr lie His15 10

<210> 190

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 2CDRL3 ligante de HER2 sintético<400> 190

Gly Phe Ser lie Tyr Ser Ser Tyr lie His15 10

<210> 191<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 3CDRL3 ligante de HER2 sintético<400> 191

Gly Phe Ser lie Ser Ser Ser Tyr lie His1 5 10

<210> 192

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 4CDRL3 ligante de HER2 sintético<400> 192

Gly Phe Tyr lie . Ser . Tyr Ser Tyr lie His1 5 10

<210> 193

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 5CDRL3 ligante de HER2 sintético<400> 193

Gly Phe Tyr lie Ser Ser Ser Tyr lie His15 10

<210> 194

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 6CDRL3 ligante de HER2 sintético<400> 194

Gly Phe Ser lie Ser Tyr Ser Tyr lie His 1 5 10

<210> 195

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial<220>

<223> Artificial clone 7CDRL3 ligante de HER2 sintético<400> 195

Gly Phe Ser lie Tyr Tyr Ser Tyr lie His15 10

<210> 196

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 8CDRL3 ligante de HER2 sintético<400> 196

Gly Phe Ser lie Tyr Ser Ser Tyr lie His15 10

<210> 197

<211> 10. __________________________........_______________............- -............- ------

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 9CDRL3 ligante de HER2 sintético<400> 197

Gly Phe Ser lie Ser Tyr Ser Tyr lie His15 10

<210> 198

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 10CDRL3 ligante de HER2 sintético<400> 198

Gly Phe Ser lie Tyr Ser Ser Tyr lie His15 10

<210> 199

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 11CDRL3 ligante de HER2 sintético

<400> 199Gly Phe Ser Ile Tyr Ser Ser Ser Ile His15 10

<210> 200

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 12CDRL3 ligante de HER2 sintético<400> 200

Gly Phe Ser Ile Ser Ser Tyr Ser Ile His15 10

<210> 201

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 13CDRL3 ligante de HER2 sintético.<400> 201

Gly Phe Ser Ile Ser Ser Ser Ser Ile His15 10

<210> 202

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 14CDRL3 ligante de HER2 sintético<400> 202

Gly Phe Tyr Ile Ser Ser Ser Ser Ile His15 10

<210> 203

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 15CDRL3 ligante de HER2 sintético<400> 203

Gly Phe Ser Ile Ser Ser Ser Ser Ile His15 10

<210> 204<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 16CDRL3 ligante de HER2 sintético<400> 204

Gly Phe Tyr lie Ser Ser Tyr Ser lie His1 5 10

<210> 205

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 17CDRL3 ligante de HER2 sintético<400> 205

Gly Phe Tyr lie Ser Tyr Ser Ser lie His1 5 10

<210> 206

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 18CDRL3 ligante de HER2 sintético<400> 206

Gly Phe Ser lie Ser Tyr Ser Ser lie His1 5 10

<210> 207

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 19CDRL3 ligante de HER2 sintético<400> 207

Gly Phe Tyr lie Ser Ser Tyr Ser lie His1 5 10

<210> 208

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial

<220><223> Artificial clone 20CDRL3 ligante de HER2 sintético<400> 208

Gly Phe Ser lie Ser Tyr Ser Ser lie His15 10

<210> 209

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 21CDRL3 ligante de HER2 sintético<400> 209

Gly Phe Tyr lie Ser Tyr Ser Ser lie His15 10

<210> 210

<211> 10

<212> PRT . .. .

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 22CDRL3 ligante de HER2 sintético<400> 210

Gly Phe Ser lie Ser Tyr Ser Ser lie His15 10

<210> 211

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 23CDRL3 ligante de HER2 sintético<400> 211

Gly Phe Ser lie Ser Tyr Ser Ser lie His15 10

<210> 212

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 24CDRL3 ligante de HER2 sintético<400> 212Gly Phe Ser lie Ser Tyr Ser Ser lie His1 5 10

<210> 213

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 25CDRL3 ligante de HER2 sintético<400> 213

Gly Phe Ser lie Ser Tyr Ser Ser lie His15 10

<210> 214

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

_<223> Ar-tificial -clone^-2£CDRL3-..ligante. de HER2 sintético_

<400> 214

Gly Phe Tyr lie Ser Tyr Ser Ser lie His15 10

<210> 215

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 27CDRL3 ligante de HER2 sintético<400> 215

Gly Phe Ser lie Ser Tyr Ser Ser lie His15 10

<210> 216

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 28CDRL3 ligante de HER2 sintético<400> 216

Gly Phe Ser lie Ser Tyr Ser Ser lie His15 10

<210> 217<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 29CDRL3 ligante de HER2 sintético<400> 217

Gly Phe Ser lie Tyr Ser Ser Ser lie His1 5 10

<210> 218

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 30CDRL3 ligante de HER2 sintético<400> 218

Gly Phe Ser lie Ser Tyr Ser Ser Lie His

1 5 10

<210> 219

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 31CDRL3 ligante de HER2 sintético<400> 219

Gly Phe Ser lie Ser Tyr Ser Ser lie His1 5 10

<210> 220

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 32CDRL3 ligante de HER2 sintético<400> 220

Gly Phe Ser lie Ser Ser Ser Ser lie His1 5 10

<210> 221

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial

<220><223> synthetic HER2 binding clone 33 CDRH1

<400> 221

Gly Phe Ser Ile Ser Ser Tyr Tyr Ile His1 5 10

<210> 222

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 34CDRL3 ligante de HER2 sintético

<400> 222

Gly Phe Tyr Ile Ser Ser Ser Ser Ile His1 5 10

<210> 223

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 35CDRL3 ligante de HER2 sintético

<400> 223

Gly Phe Tyr Ile Ser Ser Ser Ser Ile His1 5 10

<210> 224

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 36CDRL3 ligante de HER2 sintético<400> 224

Gly Phe Ser Ile Ser Ser Ser Ser Ile His1 5 10

<210> 225

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 37CDRL3 ligante de HER2 sintético<400> 225Gly Phe Tyr Ile Ser Ser Tyr Ser Ile His1 5 10

<210> 226

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 38CDRL3 ligante de HER2 sintético<400> 226

Gly Phe Tyr Ile Ser Ser Ser Ser Ile His1 5 10

<210> 227

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Ariificial clone 39CDRL3 ligante de HER2. sintético

<400> 227

Gly Phe Ser Ile Ser Ser Ser Ser Ile His1 5 10 <210> 228

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 40CDRL3 ligante de HER2 sintético<400> 228

Gly Phe Tyr Ile Ser Ser Ser Ser Ile His1 5 10

<210> 229

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 41CDRL3 ligante de HER2 sintético<400> 229

Gly Phe Ser Ile Ser Ser Ser Ser Ile His1 5 10

<210> 230<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 42CDRL3 ligante de HER2 sintético<400> 230

Gly Phe Tyr lie Ser Ser Ser Ser lie His1 5 10

<210> 231

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 43CDRL3 ligante de HER2 sintético<400> 231

Gly Phe Ser lie Ser Ser Ser Ser Tle His15 10

<210> 232

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 44CDRL3 ligante de HER2 sintético<400> 232

Gly Phe Ser lie Ser Ser Ser Ser lie His15 10

<210> 233

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 45CDRL3 ligante de HER2 sintético<400> 233

Gly Phe Tyr lie Ser Ser Ser Ser lie His1 5 10

<210> 234

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial

<220><223> Artificial clone 46CDRL3 ligante de HER2 sintético

<400> 234

Gly Phe Tyr lie Ser Ser Tyr Ser lie His1 5 10

<210> 235

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 47CDRL3 ligante de HER2 sintético<400> 235

Gly Phe Ser lie Ser Ser Tyr Ser lie His1 5 10

<210> 236

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 48CDRL3 ligante de HER2 sintético<400> 236

Gly Phe Tyr lie Ser Ser Tyr Tyr lie His1 5 10

<210> 237

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 49CDRL3 ligante de HER2 sintético<400> 237

Gly Phe Ser lie Ser Ser Tyr Ser lie His1 5 10

<210> 238

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 50CDRL3 ligante de HER2 sintético<400> 238Gly Phe Tyr Ile Ser Ser Ser Ser Ile His1 5 10

<210> 239

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 51CDRL3 ligante de HER2 sintético<400> 239

Gly Phe Ser Ile Ser Ser Ser Ser Ile His1 5 • 10

<210> 240

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<-2-2-3>—A^ti-fHL-eia-1—^i©ne^-2-G4DR-L3-,l-igan-te-de-H-ER2_sinté-tico<400> 240

Gly Phe Tyr Ile Ser Ser Ser Ser Ile His1 5 10

<210> 241

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 53CDRL3 ligante de HER2 sintético<400> 241

Gly Phe Tyr Ile Ser Ser Ser Ser Ile His15 10

<210> 242

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 54CDRL3 ligante de HER2 sintético<400> 242

Gly Phe Tyr Ile Ser Ser Ser Ser Ile His15 10

<210> 243<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 55CDRL3 ligante de HER2 sintético

<400> 243

Gly Phe Ser lie Ser Ser Ser Ser lie His1 5 10

<210> 244

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 56CDRL3 ligante de HER2 sintético<400> 244

Gly Phe Ser IIe Ser Ser Ser Ser Ile His

1 5 10

<210> 245

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 57CDRL3 ligante de HER2 sintético<400> 245

Gly Phe Tyr lie Ser Ser Ser Ser lie His1 5 10

<210> 246

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 58CDRL3 ligante de HER2 sintético<400> 246

Gly Phe Tyr lie Ser Ser Ser Ser lie His1 5 10

<210> 247

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial

<220><223> Artificial clone 59CDRL3 ligante de HER2 sintético<400> 247

Gly Phe Tyr lie Ser Ser Tyr Ser lie His1 5 10

<210> 248

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 60DRL3 ligante de HER2 sintético<400> 248

Gly Phe Tyr lie Ser Ser Ser Ser lie His15 10

<210> 249<211> 10

<2l2->— PRT<2l3> " Artificial"

<220>

<223> Artificial clone 61CDRL3 ligante de HER2 sintético<400> 249

Gly Phe Tyr lie Ser Ser Ser Ser lie His15 10

<210> 250

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 62CDRL3 ligante de HER2 sintético<400> 250

Gly Phe Tyr lie Ser Ser Ser Ser lie His15 10

<210> 251

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 63CDRL3 ligante de HER2 sintético

<400> 251Gly Phe Tyr Ile Ser Ser Ser Ser Ile His15 10

<210> 252

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 64CDRL3 ligante de HER2 sintético<400> 252

Gly Phe Tyr Ile Ser Ser Tyr Ser Ile His1 5 10

<210> 253

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223J>_Artificial

<400> 253

Gly Phe Tyr Ile Ser Ser Ser Tyr Ile His15 10

<210> 254

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 66CDRL3 ligante de HER2 sintético<400> 254

Gly Phe Tyr Ile Ser Ser Ser Ser Ile His15 10

<210> 255

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 67CDRL3 ligante de HER2 sintético<400> 255

Gly Phe Tyr Ile Ser Ser Tyr Ser Ile His15 10

<210> 256<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 68CDRL3 ligante de HER2 sintético<400> 256

Gly Phe Ser lie Tyr Tyr Ser Ser lie His15 10

<210> 257

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 69CDRL3 ligante de HER2 sintético<400> 257

1 510

<210> 258

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 70CDRL3 ligante de HER2 sintético<400> 258

Gly Phe Tyr lie Ser Ser Ser Ser lie His15 10

<210> 259

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 71CDRL3 ligante de HER2 sintético<400> 259

Gly Phe Tyr lie Ser Ser Tyr Ser lie His15 10

<210> 260

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial

<220><223> Artificial clone 72CDRL3 ligante de HER2 sintético<400> 260

Gly Phe Tyr lie Ser Tyr Tyr Ser lie His1 5 10

<210> 261

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 73CDRL3 ligante de HER2 sintético<400> 261

Gly Phe Tyr lie Ser Tyr Tyr Ser lie His1 5 10

<210> 262<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 74CDRL3 ligante de HER2 sintético<400> 262

Gly Phe Tyr lie Ser Ser Ser Ser lie His1 5 10

<210> 263

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 75CDRL3 ligante de HER2 sintético<400> 263

Gly Phe Tyr lie Ser Ser Ser Ser lie His1 5 10

<210> 264

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 76CDRL3 ligante de HER2 sintético

<400> 264Gly Phe Tyr Ile Ser Ser Ser Ser Ile His1 5 10

<210> 265

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 77CDRL3 ligante de HER2 sintético<400> 265

Gly Phe Tyr Ile Ser Ser Ser Ser Ile His15 10

<210> 266

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<400> 266

Gly Phe Tyr Ile Ser Ser Ser Ser Ile His15 10

<210> 267

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 79CDRL3 ligante de HER2 sintético<400> 267

Gly Phe Ser Ile Ser Ser Ser Ser Ile His15 10

<210> 268

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 80CDRL3 ligante de HER2 sintético<400> 268

Gly Phe Ser Ile Tyr Tyr Ser Ser Ile His15 10

<210> 269<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 81CDRL3 ligante de HER2 sintético<400> 269

Gly Phe Tyr lie Ser Ser Ser Tyr lie His1 5 10

<210> 270

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 82CDRL3 ligante de HER2 sintético<400> 270

Gly Phe Tyr lie Ser Ser Ser Ser lie His1 5 10

<210> 271

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 83CDRL3 ligante de HER2 sintético<400> 271

Gly Phe Tyr lie Ser Ser Ser Ser lie His1 5 10

<210> 272

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 84CDRL3 ligante de HER2 sintético<400> 272

Gly Phe Ser lie Ser Ser Ser Ser lie His1 5 10

<210> 273

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial

<220><223> Artificial clone 85CDRL3 ligante de HER2 sintético<400> 273

Gly Phe Ser lie Ser Ser Ser Ser lie His1 5 10

<210> 274

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 86CDRL3 ligante de HER2 sintético<400> 274

Gly Phe Ser lie Ser Tyr Ser Ser lie His1 5 10

<210> 275

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 87CDRL3 ligante de HER2 sintético<400> 275

Gly Phe Tyr lie Ser Tyr Ser Ser lie His1 5 10

<210> 276

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 88CDRL3 ligante de HER2 sintético<400> 276

Gly Phe Tyr lie Ser Ser Ser Ser lie His1 5 10

<210> 277

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 89CDRL3 ligante de HER2 sintético<400> 277Gly Phe Ser Ile Ser Ser Ser Ser Ile His1 5 10

<210> 278

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 90CDRL3 ligante de HER2 sintético<400> 278

Gly Phe Tyr Ile Ser Ser Ser Ser Ile His1 5 10

<210> 279

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 91CDRL3 ligante de HER2 sintético<400> 279

Gly Phe Ser Ile Ser Ser Ser Ser Ile His1 5 10

<210> 280

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 92CDRL3 ligante de HER2 sintético<400> 280

Gly Phe Tyr Ile Ser Ser Ser Ser Ile His1 5 10

<210> 281

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 93CDRL3 ligante de HER2 sintético<400> 281

Gly Phe Tyr Ile Ser Ser Ser Ser Ile His1 5 10

<210> 282<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 94CDRL3 ligante de HER2 sintético

<400> 282

Gly Phe Ser lie Ser Ser Ser Tyr lie His1 5 10

<210> 283

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 95CDRL3 ligante de HER2 sintético<400> 283

Gly Phe Phe lie Ser Tyr Tyr Tyr lie His1 5 10

<210> 284

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 96CDRL3 ligante de HER2 sintético<400> 284

Gly Phe Ser lie Tyr Ser Ser Tyr lie His1 5 10

<210> 285

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 97CDRL3 ligante de HER2 sintético<400> 285

Gly Phe Tyr lie Ser Tyr Ser Ser lie His1 5 10

<210> 286

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial

<220><223> Artificial clone 98CDRL3 ligante de HER2 sintético<400> 286

Gly Phe Tyr lie Tyr Ser Tyr Ser lie His1 5 10

<210> 287

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 99CDRL3 ligante de HER2 sintético<400> 287

Gly Phe Tyr lie Ser Tyr Ser Ser lie His1 5 10

<210> 288

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 100CDRL3 ligante de HER2 sintético<400> 288

Gly Phe Ser lie Ser Tyr Ser Ser lie His1 5 10

<210> 289

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 101CDRL3 ligante de HER2 sintético<400> 289

Gly Phe Ser lie Ser Tyr Ser Ser lie His1 5 10

<210> 290

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 102CDRL3 ligante de HER2 sintético<400> 290Gly Phe Tyr Ile Ser Tyr Ser Ser Ile His1 5 10

<210> 291

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 103CDRL3 ligante de HER2 sintético<400> 291

Gly Phe Ser Ile Ser Tyr Ser Ser Ile His1 5 10

<210> 292

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 104CDRL3 ligante de HER2 sintético<400> 292

Gly Phe Ser Ile Ser Tyr Ser Tyr Ile His1 5 10

<210> 293

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 105CDRL3 ligante de HER2 sintético<400> 293

Gly Phe Ser Ile Ser Tyr Ser Tyr Ile His1 5 10

<210> 294

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 106CDRL3 ligante de HER2 sintético<400> 294

Gly Phe Tyr Ile Ser Tyr Ser Tyr Ile His1 5 10

<210> 295<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 1CDHR2 ligante de HER2 sintético<400> 295

Ser lie Tyr Pro Tyr Ser Gly Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Vai Lys1 5 10 15

Gly

<210> 296

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 2CDHR2 ligante de HER2 sintético<400> 296

Ser lie Tyr Pro Tyr Ser Gly Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Vai Lys1 5 10 15

Gly

<210> 297

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 3CDHR2 ligante de HER2 sintético<400> 297

Ser lie Tyr Pro Tyr Ser Gly Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Vai Lys1 5 10 15

Gly

<210> 298

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 4CDHR2 ligante de HER2 sintético<400> 298

Ser lie Tyr Pro Tyr Ser Gly Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Vai Lys1 5 10 15Gly

<210> 299

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 5CDHR2 ligante de HER2 sintético

<400> 299

Ser lie Tyr Pro Tyr Ser Gly Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Vai Lys1 5 10 15

Gly

<210> 300

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 6CDHR2 ligante de HER2 sintético

<400> 300

Ser lie Tyr Pro Ser Ser Gly Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Vai Lys1 5 10 15

Gly

<210> 301

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 7CDHR2 ligante de HER2 sintético

<400> 301

Ser lie Tyr Pro Ser Ser Gly Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Vai Lys1 5 10 15

Gly

<210> 302

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 8CDHR2 ligante de HER2 sintético

<400> 302Ser lie Tyr Pro Ser Ser Gly Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Vai Lys15 10 15

Gly

<210> 303

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 9CDHR2 ligante de HER2 sintético<400> 303

Ser lie Tyr Pro Tyr Ser Gly Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Vai Lys1 5 10 15

Gly

<210> 304

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 10CDHR2 ligante de HER2 sintético<400> 304

Ser lie Tyr Pro Tyr Ser Gly Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Vai Lys1 5 10 15

Gly

<210> 305

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 11CDHR2 ligante de HER2 sintético<400> 305

Ser lie Tyr Pro Ser Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Vai Lys1 5 10 15

Gly

<210> 306

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<220><223> Artificial clone 12CDHR2 ligante de HER2 sintético<400> 306

Ser lie Tyr Pro Tyr Ser Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Vai Lys1 5 10 15

Gly

<210> 307

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 13CDHR2 ligante de HER2 sintético<400> 307

Ser lie Tyr Pro Tyr Tyr Gly Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Vai Lys1 5 10 15

Gly

<210> 308

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 14CDHR2 ligante de HER2 sintético<400> 308

Ser lie Tyr Pro Tyr Tyr Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Vai Lys1 5 10 15

Gly

<210> 309

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 15CDHR2 ligante de HER2 sintético<400> 309

Ser lie Tyr Pro Tyr Tyr Gly Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Vai Lys1 5 10 15

Gly

<210> 310<211> 17<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 16CDHR2 ligante de HER2 sintético

<400> 310

Ser lie Tyr Pro Ser Tyr Gly Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Vai Lys1 5 10 15

Gly

<210> 311

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 17CDHR2 ligante de HER2 sintético

<400> 311

Ser lie Tyr Pro Tyr Tyr Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Vai Lys1 5 10 15

Gly

<210> 312

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 18CDHR2 ligante de HER2 sintético

<400> 312

Ser lie Tyr Pro Tyr Tyr Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Vai Lys1 5 10 15

Gly

<210> 313

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 19CDHR2 ligante de HER2 sintético

<400> 313

Ser lie Tyr Pro Tyr Tyr Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Vai Lys1 5 10 15Gly

<210> 314

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 20CDHR2 ligante de HER2 sintético<400> 314

Ser lie Tyr Pro Tyr Tyr Gly Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Vai Lys1 5 10 15

Gly

<210> 315

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 21CDHR2 ligante de HER2 sintético<400> 315

Ser lie Tyr Pro Tyr Tyr Gly Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Vai Lys1 5 10 15

Gly

<210> 316

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 22CDHR2 ligante de HER2 sintético<400> 316

Ser lie Tyr Pro Tyr Tyr Gly Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Vai Lys1 5 10 15

Gly

<210> 317

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 23CDHR2 ligante de HER2 sintético<400> 317Ser lie Tyr Pro Ser Tyr

Gly Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Vai Lys10 15

Gly

<210> 318

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial

<400> 318

24CDHR2 ligante de HER2 sintético

Ser lie Tyr Pro Tyr Tyr

Gly Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Vai Lys

10 15

Gly

<210> 319

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial

<400> 319

25CDHR2 ligante de HER2 sintético

Ser lie Tyr Pro Tyr Tyr

Gly Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Vai Lys10 15

Gly

<210> 320

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial

<400> 320

2 6CDHR2 ligante de HER2 sintético

Ser lie Tyr Pro Tyr Tyr1 5

Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Vai Lys10 15

Gly

<210> 321

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<220><223> Artificial clone 27CDHR2 ligante de HER2 sintético<400> 321

Ser lie Tyr Pro Tyr Tyr Gly Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Vai Lys1 5 10 15

Gly

<210> 322

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 28CDHR2 ligante de HER2 sintético<400> 322

Ser lie Tyr Pro Ser Tyr Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Vai Lys1 5 10 15

Gly

<210> 323

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 29CDHR2 ligante de HER2 sintético<400> 323

Tyr lie Tyr Pro Ser Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Vai Lys1 5 10 15

Gly

<210> 324

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 30CDHR2 ligante de HER2 sintético<400> 324

Ser lie Ser Pro Tyr Tyr Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Vai Lys1 5 10 15

Gly

<210> 325<211> 17<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 31CDHR2 ligante de HER2 sintético<400> 325

Ser lie Ser Pro Tyr Ser Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Vai Lys1 5 10 15

Gly

<210> 326

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 32CDHR2 ligante de HER2 sintético<400> 326

Ser lie Ser Pro Tyr Ser Gly Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Vai Lys1 5 10 15

Gly

<210> 327

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 33CDHR2 ligante de HER2 sintético<400> 327

Tyr lie Ser Pro Ser Ser Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Vai Lys1 5 10 15

Gly

<210> 328

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 34CDHR2 ligante de HER2 sintético<400> 328

Ser lie Tyr Pro Ser Ser Gly Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Vai Lys1 5 10 15Gly

<210> <211> <212> <213> 329 17 PRT Artificial

<220> <223> Artificial clone

<400> 329

Ser lie Tyr Pro Ser Ser 1 5 Gly

<210> <211> <212> <213> 330 17 PRT Artificial

<220> <223> Artificial clone

<400> 330

Ser lie Ser Pro Ser Ser 1 5 Gly

<210> <211> <212> <213> 331 17 PRT Artificial

<220> <223> Artificial clone

<400> 331

Ser lie Tyr Pro Ser Ser 1 5 Gly

<210> <211> <212> <213> 332 17 PRT Artificial

<220> <223> Artificial clone

35CDHR2 ligante de HER2 sintético

Gly Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Vai Lys10 15

36CDHR2 ligante de HER2 sintético

Gly Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Vai Lys10 15

37CDHR2 ligante de HER2 sintético

Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Vai Lys10 15

38CDHR2 ligante de HER2 sintético

<400>

332Ser lie Tyr Pro Ser Ser Gly Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Vai Lys1 5 10 15

Gly

<210> 333

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 39CDHR2 ligante de HER2 sintético<400> 333

Ser lie Tyr Pro Ser Ser Gly Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Vai Lys1 5 10 15

Gly

<210> 334

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 40CDHR2 ligante de HER2 sintético<400> 334

Tyr lie Tyr Pro Ser Ser Gly Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Vai Lys1 5 10 15

Gly

<210> 335

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 41CDHR2 ligante de HER2 sintético<400> 335

Ser lie Tyr Pro Ser Ser Gly Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Vai Lys1 5 10 15

Gly

<210> 336

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<220><223> Artificial clone 42CDHR2 ligante de HER2 sintético<400> 336

Tyr lie Tyr Pro Ser Ser Gly Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Vai Lys1 5 10 15

Gly

<210> 337

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 43CDHR2 ligante de HER2 sintético<400> 337

Tyr lie Ser Pro Tyr Ser Gly Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Vai Lys1 5 10 15

Gly

<210> 338

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificiai

<220>

<223> Artificial clone 44CDHR2 ligante de HER2 sintético<400> 338

Ser lie Tyr Pro Ser Ser Gly Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Vai Lys1 5 10 15

Gly

<210> 339

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 45CDHR2 ligante de HER2 sintético<400> 339

Ser lie Tyr Pro Ser Ser Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Vai Lys1 5 10 15

Gly<210> 340

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 46CDHR2 ligante de HER2 sintético<400> 340

Tyr lie Ser Pro Ser Ser Gly Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Vai Lys1 5 10 15

Gly

<210> 341

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 47CDHR2 ligante de HER2 sintético

<400> 341

Ser lie Tyr Pro Ser Ser Gly Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Vai Lys1 5 10 15

Gly

<210> 342

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 48CDHR2 ligante de HER2 sintético

<400> 342

Ser lie Ser Pro Ser Ser Gly Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Vai Lys1 5 10 15

Gly

<210> 343

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 49CDHR2 ligante de HER2 sintético

<400> 343Ser lie Tyr Pro Ser Ser

1 5

Gly

<210> 344

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial

<400> 344

Gly Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Vai Lys10 15

50CDHR2 ligante de HER2 sintético

Ser lie Tyr Pro Ser Ser

Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Vai Lys10 15

Gly

<210> 345

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial

<400> 345

51CDHR2 ligante de HER2 sintético

Tyr lie Tyr Pro Ser Ser

Gly Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Vai Lys10 15

Gly

<210> 346

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial

<400> 346

52CDHR2 ligante de HER2 sintético

Ser lie Tyr Pro Ser Tyr1 5

Gly Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Vai Lys10 15

Gly

<210> 347

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<220><223> Artificial clone 53CDHR2 ligante de HER2 sintético<400> 347

Tyr lie Tyr Pro Ser Ser Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Vai Lys1 5 10 15

Gly

<210> 348

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 54CDHR2 ligante de HER2 sintético<400> 348

Ser lie Tyr Pro Ser Ser Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Vai Lys1 5 10 15

Gly

<210> 349

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 55CDHR2 ligante de HER2 sintético<400> 349

Ser lie Tyr Pro Ser Ser Gly Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Vai Lys1 5 10 15

Gly

<210> 350

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 56CDHR2 ligante de HER2 sintético<400> 350

Ser lie Tyr Pro Ser Ser Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Vai Lys1 5 10 15

Gly

<210> 351<211> 17<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 57CDHR2 ligante de HER2 sintético<400> 351

Ser lie Ser Pro Ser Ser Gly Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Vai Lys1 5 10 15

Gly

<210> 352

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 58CDHR2 ligante de HER2 sintético

<400> 352

Tyr lie Tyr Pro Ser Ser Gly Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Vai Lys1 5 10 15

Gly

<210> 353

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 59CDHR2 ligante de HER2 sintético

<400> 353

Ser lie Tyr Pro Ser Ser Gly Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Vai Lys1 5 10 15

Gly

<210> 354

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 60CDHR2 ligante de HER2 sintético

<400> 354

Tyr lie Ser Pro Ser Ser Gly Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Vai Lys1 5 10 15Gly

<210> 355

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 61CDHR2 ligante de HER2 sintético<400> 355

Ser lie Tyr Pro Ser Ser Gly Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Vai Lys1 5 10 15

Gly

<210> 356

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 62CDHR2 ligante de HER2 sintético<400> 356

Tyr lie Tyr Pro Ser Ser Gly Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Vai Lys1 5 10 15

Gly

<210> 357

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 63CDHR2 ligante de HER2 sintético<400> 357

Tyr lie Tyr Pro Ser Ser Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Vai Lys1 5 10 15

Gly

<210> 358

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 64CDHR2 ligante de HER2 sintético<400> 358Ser lie Tyr Pro Ser Ser

1 5

Gly

<210> 359

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone

<400> 359

Ser lie : Ser Pro Ser Ser

Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Vai Lys10 15

65CDHR2 ligante de HER2 sintético

Gly Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Vai Lys10 15

Gly

<210> 360

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial

<400> 360

66CDHR2 ligante de HER2 sintético

Ser lie Tyr Pro Ser Ser

Gly Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Vai Lys10 15

Gly

<210> 361

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial

<400> 361

67CDHR2 ligante de HER2 sintético

Tyr lie Ser Pro Ser Ser1 5

Gly Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Vai Lys10 15

Gly

<210> 362

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<220><223> Artificial clone 68CDHR2 ligante de HER2 sintético<400> 362

Ser lie Ser Pro Tyr Ser Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Vai Lys1 5 10 15

Gly

<210> 363

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 69CDHR2 ligante de HER2 sintético<400> 363

Tyr lie Tyr Pro Ser Ser Gly Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Vai Lys1 5 10 15

Gly

<210> 364

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 70CDHR2 ligante de HER2 sintético<400> 364

Ser lie Tyr Pro Tyr Ser Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Vai Lys1 5 10 15

Gly

<210> 365

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 71CDHR2 ligante de HER2 sintético<400> 365

Ser lie Ser Pro Tyr Ser Gly Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Vai Lys1 5 10 15

Gly

<210> 366<211> 17<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 72CDHR2 ligante de HER2 sintético<400> 366

Ser lie Ser Pro Ser Ser Gly Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Vai Lys1 5 10 15

Gly

<210> 367

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 73CDHR2 ligante de HER2 sintético

<400> 367

Ser lie Ser Pro Tyr Ser Gly Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Vai Lys1 5 10 15

Gly

<210> 368

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 74CDHR2 ligante de HER2 sintético

<400> 368

Ser lie Tyr Pro Ser Ser Gly Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Vai Lys1 5 10 15

Gly

<210> 369

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 75CDHR2 ligante de HER2 sintético

<400> 369

Ser lie Tyr Pro Tyr Tyr Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Vai Lys1 5 10 15Gly

<210> 370

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 76CDHR2 ligante de HER2 sintético<400> 370

Tyr lie Tyr Pro Ser Ser Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Vai Lys1 5 10 15

Gly

<210> 371

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 77CDHR2 ligante de HER2 sintético<400> 371

Tyr lie Ser Pro Ser Ser Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Vai Lys1 5 10 15

Gly

<210> 372

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 78CDHR2 ligante de HER2 sintético<400> 372

Ser lie Ser Pro Ser Ser Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Vai Lys15 10 15

Gly

<210> 373

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 79CDHR2 ligante de HER2 sintético<400> 373Ser lie Ser Pro Ser Ser Gly Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Vai Lys1 5 10 15

Gly

<210> 374

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 80CDHR2 ligante de HER2 sintético<400> 374

Ser lie Tyr Pro Tyr Ser Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Vai Lys1 5 10 15

Gly

<210> 375

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 81CDHR2 ligante de HER2 sintético<400> 375

Tyr lie Ser Pro Ser Ser Gly Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Vai Lys1 5 10 15

Gly

<210> 376

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 82CDHR2 ligante de HER2 sintético<400> 376

Tyr lie Ser Pro Ser Ser Gly Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Vai Lys1 5 10 15

Gly

<210> 377

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<220><223> Artificial clone 83CDHR2 ligante de HER2 sintético<400> 377

Ser Ile Ser Pro Ser Ser Gly Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Vai Lys1 5 10 15

Gly

<210> 378

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 84CDHR2 ligante de HER2 sintético<400> 378

Tyr Ile Ser Pro Tyr Ser Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Vai Lys1 5 10 15

Gly

<210> 379

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 85CDHR2 ligante de HER2 sintético<400> 379

Tyr Ile Ser Pro Tyr Ser Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Vai Lys1 5 10 15

Gly

<210> 380

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 86CDHR2 ligante de HER2 sintético<400> 380

Tyr Ile Tyr Pro Tyr Ser Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Vai Lys1 5 10 15

Gly

<210> 381<211> 17<212> <213> PRT Artificial

<220> <223> Artificial clone

<400> 381

Ser lie Ser Pro Ser Tyr 1 5 Gly

<210> <211> <212> <213> 382 17 PRT Artificial

<220> <223> Artificial clone

<400> 382

Ser lie Ser Pro Ser Tyr 1 5 Gly

<210> <211> <212> <213> 383 17 PRT Artificial

<220> <223> Artificial clone

<400> 383

Ser lie Tyr Pro Tyr Ser 1 5 Gly

<210> <211> <212> <213> 384 17 PRT Artificial

<220> <223> Artificial clone

<400> 384

87CDHR2 ligante de HER2 sintético

Gly Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Vai Lys10 15

88CDHR2 ligante de HER2 sintético

Gly Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Vai Lys10 15

8 9CDHR2 ligante de HER2 sintético

Gly Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Vai Lys10 15

90CDHR2 ligante de HER2 sintético

Ser lie Ser Pro Tyr Ser Gly Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Vai Lys15 10 15Gly

<210> 385

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 91CDHR2 ligante de HER2 sintético<400> 385

Tyr lie Tyr Pro Tyr Ser Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Vai Lys1 5 10 15

Gly

<210> 386

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 92CDHR2 ligante de HER2 sintético<400> 386

Tyr lie Ser Pro Ser Ser Gly Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Vai Lys1 5 10 15

Gly

<210> 387

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 93CDHR2 ligante de HER2 sintético<400> 387

Tyr lie Ser Pro Ser Ser Gly Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Vai Lys1 5 10 15

Gly

<210> 388

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 94CDHR2 ligante de HER2 sintético<400> 388Tyr lie Ser Pro Ser Tyr Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Vai Lys1 5 10 15

Gly

<210> 389

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 95CDHR2 ligante de HER2 sintético<400> 389

Ser lie Ser Pro Ser Ser Gly Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Vai Lys1 5 10 15

Gly

<210> 390

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 96CDHR2 ligante de HER2 sintético<400> 390

Ser lie Tyr Pro Tyr Ser Gly Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Vai Lys1 5 10 15

Gly

<210> 391

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 97CDHR2 ligante de HER2 sintético<400> 391

Ser lie Tyr Pro Tyr Tyr Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Vai Lys1 5 10 15

Gly

<210> 392

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<220><223> Artificial clone 98CDHR2 ligante de HER2 sintético<400> 392

Ser lie Tyr Pro Tyr Tyr Gly Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Vai Lys1 5 10 15

Gly

<210> 393

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 99CDHR2 ligante de HER2 sintético<400> 393

Ser lie Tyr Pro Tyr Tyr Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Vai Lys1 5 10 15

Gly

<210> 394

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 100CDHR2 ligante de HER2 sintético<400> 394

Ser lie Tyr Pro Tyr Tyr Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Vai Lys1 5 10 15

Gly

<210> 395

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 101CDHR2 ligante de HER2 sintético<400> 395

Ser lie Tyr Pro Ser Tyr Gly Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Vai Lys1 5 10 15

Gly

<210> 396<211> 17<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 102CDHR2 ligante de HER2 sintético<400> 396

Ser lie Tyr Pro Tyr Tyr Gly Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Vai Lys1 5 10 15

Gly

<210> 397

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 103CDHR2 ligante de HER2 sintético<400> 397

Ser lie Tyr Pro Tyr Tyr Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Vai Lys1 5 10 15

Gly

<210> 398

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 104CDHR2 ligante de HER2 sintético<400> 398

Ser lie Tyr Pro Ser Ser Gly Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Vai Lys1 5 10 15

Gly

<210> 399

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 105CDHR2 ligante de HER2 sintético<400> 399

Ser lie Tyr Pro Ser Ser Gly Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Vai Lys1 5 10 15Gly

<210> 400

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 106CDHR2 ligante de HER2 sintético

<400> 400

Ser lie Tyr Pro Ser Ser Gly Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Vai Lys1 5 10 15

Gly

<210> 401

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 106CDHR2 ligante de HER2 sintético

<400> 401

Tyr Tyr Ser Ser Gly Phe Asp Tyr1 5

<210> 402

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 1CDHR3 ligante de HER2 sintético

<400> 402

Tyr Tyr Gly Tyr Gly Met Asp Tyr1 5

<210> 403

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 3CDHR3 ligante de HER2 sintético

<400> 403

Tyr Tyr Gly Tyr Gly Leu Asp Tyr1 5<210> 404

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 4CDHR3 ligante de HER2 sintético

<400> 404

Tyr Tyr Gly Tyr Gly Phe Asp Tyr

<210> 405

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 5CDHR3 ligante de HER2 sintético

<400> 405

Tyr Tyr Gly Ser Gly Phe Asp Tyr

<210> 406

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 6CDHR3 ligante de HER2 sintético

<400> 406

Tyr Tyr Gly Gly Ala Phe Asp Tyr

<210> 407

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 7CDHR3 ligante de HER2 sintético

<400> 407

Tyr Tyr Gly Arg Gly Ala Met Asp Tyr1 5

<210> 408

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial<220>

<223> Artificial clone 8CDHR3 ligante de HER2 sintético<400> 408

Tyr Ser Tyr Ser Gly Ala Leu Asp Tyr1 5

<210> 409

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 9CDHR3 ligante de HER2 sintético<400> 409

Tyr Arg Tyr Tyr Gly Ala Leu Asp Tyr1 5

<210> 410

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 10CDHR3 ligante de HER2 sintético<400> 410

Tyr Arg Tyr Gly Gly Ala Met Asp Tyr1 5

<210> 411

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 11CDHR3 ligante de HER2 sintético<400> 411

Tyr Tyr Gly Gly Tyr Tyr Gly Met Asp Tyr1 5 10

<210> 412

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 12CDHR3 ligante de HER2 sintético<400> 412

Tyr Ser Tyr Tyr Tyr Tyr Ala Leu Asp Tyr1 5 10

<210> 413

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 13CDHR3 ligante de HER2 sintético<400> 413

Ser Ser Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Tyr1 5 10

<210> 414

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 14CDHR3 ligante de HER2 sintético<400> 414

Ser Ser Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Phe Asp Tyr1 5 10

<210> 415

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 15CDHR3 ligante de HER2 sintético<400> 415

Ser Ser Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Leu Asp Tyr1 5 10

<210> 416

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 16CDHR3 ligante de HER2 sintético<400> 416

Ser Gly Gly Tyr Ser Arg Gly lie Asp Tyr1 5 10<210> 417

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 17CDHR3 ligante de HER2 sintético<400> 417

Gly Tyr Ser Tyr Ser Arg Gly lie Asp Tyr1 5 10

<210> 418

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 18CDHR3 ligante de HER2 sintético<400> 418

Gly Tyr Ser Tyr Ser Arg Gly Met Asp Tyr1 5 10

<210> 419

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 19CDHR3 ligante de HER2 sintético<400> 419

Gly Ser Ser Tyr Ser Tyr Gly Met Asp Tyr1 5 10

<210> 420

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 20CDHR3 ligante de HER2 sintético<400> 420

Gly Ser Gly Tyr Gly Tyr Gly Met Asp Tyr1 5 10

<210> 421

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial<220>

<223> Artificial clone 21CDHR3 ligante de HER2 sintético<400> 421

Gly Ser Gly Tyr Gly Tyr Gly lie Asp Tyr1 5 10

<210> 422

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 22CDHR3 ligante de HER2 sintético<400> 422

Gly Arg Arg Tyr Ser Arg Gly lie Asp Tyr1 5 10

<210> 423

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 23CDHR3 ligante de HER2 sintético<400> 423

Gly Gly Ser Tyr Gly Tyr Gly Met Asp Tyr1 5 10

<210> 424

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 24CDHR3 ligante de HER2 sintético<400> 424

Gly Gly Ser Tyr Gly Tyr Gly Met Asp Tyr1 5 10

<210> 425

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 25CDHR3 ligante de HER2 sintético<400> 425Gly Gly Arg Tyr Gly Tyr Gly Leu Asp Tyr1 5 10

<210> 426

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 26CDHR3 ligante de HER2 sintético<400> 426

Gly Gly Arg Tyr Gly Arg Gly lie Asp Tyr1 5 10

<210> 427

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 27CDHR3 ligante de HER2 sintético<400> 427

Gly Gly Gly Tyr Gly Tyr Gly lie Asp Tyr1 5 10

<210> 428

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 28CDHR3 ligante de HER2 sintético<400> 428

Gly Gly Gly Tyr Gly Tyr Gly lie Asp Tyr1 5 10

<210> 429

<211> 12

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 29CDHR3 ligante de HER2 sintético<400> 429

Tyr Tyr Tyr Ser Gly Gly Ser Tyr Gly Met Asp Tyr1 5 10

<210> 430<211> 12

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 30CDHR3 ligante de HER2 sintético<400> 430

Ser Tyr Ser Ser Tyr Tyr Ser Ser Gly Met Asp Tyr1 5 10

<210> 431

<211> 12

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 31CDHR3 ligante de HER2 sintético<400> 431

Arg Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Ser Ala Phe Asp Tyr1 5 10

<210> 432

<211> 14

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 32CDHR3 ligante de HER2 sintético<400> 432

Tyr Tyr Tyr Tyr Ser Tyr Tyr Ser Gly Gly Ala lie Asp Tyr1 5 10

<210> 433

<211> 14

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 33CDHR3 ligante de HER2 sintético<400> 433

Ser Tyr Tyr Tyr Ser Tyr Tyr Ser Gly Tyr Gly Met Asp Tyr1 5 10

<210> 434

<211> 14

<212> PRT

<213> Artificial

<220><223> Artificial clone 34CDHR3 ligante de HER2 sintético<400> 434

Ser Tyr Tyr Tyr Ser Tyr Tyr Ser Gly Tyr Gly Leu Asp Tyr1 5 10

<210> 435

<211> 14

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 35CDHR3 ligante de HER2 sintético<400> 435

Ser Tyr Tyr Tyr Ser Tyr Tyr Tyr Gly Tyr Gly Met Asp Tyr1 5 10

<210> 436

<211> 14

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 36CDHR3 ligante de HER2 sintético<400> 436

Ser Tyr Tyr Gly Ser Tyr Tyr Tyr Gly Tyr Gly Phe Asp Tyr1 5 10

<210> 437

<211> 14

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 37CDHR3 ligante de HER2 sintético<400> 437

Ser Ser Tyr Tyr Gly Tyr Tyr Ser Gly Tyr Gly lie Asp Tyr1 5 10

<210> 438

<211> 14

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 38CDHR3 ligante de HER2 sintético<400> 438Ser Ser Tyr Tyr Ser Tyr Tyr Ser Gly Tyr Gly Leu Asp Tyr1 5 10

<210> 439

<211> 14

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 39CDHR3 ligante de HER2 sintético<400> 439

Gly Tyr Tyr Tyr Ser Tyr Tyr Tyr Gly Tyr Gly Met Asp Tyr1 5 10

<210> 440

<211> 14

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 40CDHR3 ligante de HER2 sintético<400> 440

Gly Tyr Tyr Tyr Ser Tyr Tyr Tyr Gly Ser Ala Met Asp Tyr1 5 10

<210> 441

<211> 14

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 41CDHR3 ligante de HER2 sintético<400> 441

Gly Tyr Tyr Tyr Ser Tyr Tyr Ser Gly Tyr Gly Met Asp Tyr1 5 10

<210> 442

<211> 14

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 42CDHR3 ligante de HER2 sintético<400> 442

Gly Tyr Tyr Tyr Ser Tyr Tyr Ser Gly Tyr Ala Leu Asp Tyr1 5 10

<210> 443<211> 14

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 43CDHR3 ligante de HER2 sintético<400> 443

Gly Tyr Tyr Tyr Ser Tyr Tyr Ser Gly Tyr Ala lie Asp Tyr1 5 10

<210> 444

<211> 14

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 44CDHR3 ligante de HER2 sintético<400> 444

Gly Tyr Tyr Tyr Ser Tyr Tyr Ser Gly Tyr Ala Met Asp Tyr1 5 10

<210> 445

<211> 14

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 45CDHR3 ligante de HER2 sintético<400> 445

Gly Tyr Tyr Tyr Ser Tyr Tyr Ser Gly Tyr Gly lie Asp Tyr1 5 10

<210> 446

<211> 14

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 46CDHR3 ligante de HER2 sintético<400> 446

Gly Tyr Tyr Tyr Ser Tyr Tyr Ser Gly Tyr Gly Leu Asp Tyr1 5 10

<210> 447

<211> 14

<212> PRT

<213> Artificial

<220><223> Artificial clone 47CDHR3 ligante de HER2 sintético

<400> 447

Gly Tyr Tyr Tyr Ser Tyr Tyr Ser Gly Tyr Gly Met Asp Tyr1 5 10

<210> 448

<211> 14

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 48CDHR3 ligante de HER2 sintético<400> 448

Gly Tyr Tyr Tyr Ser Tyr Tyr Ser Gly Ser Gly Leu Asp Tyr1 5 10

<210> 449

<211> 14

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 49CDHR3 ligante de HER2 sintético<400> 449

Gly Tyr Tyr Tyr Ser Tyr Tyr Gly Gly Tyr Gly Met Asp Tyr1 5 10

<210> 450

<211> 14

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 50CDHR3 ligante de HER2 sintético<400> 450

Gly Tyr Tyr Tyr Ser Tyr Tyr Gly Gly Tyr Gly lie Asp Tyr1 5 10

<210> 451

<211> 14

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 51CDHR3 ligante de HER2 sintético<400> 451Gly Tyr Tyr Tyr Ser Tyr Tyr Gly Gly Tyr Gly Met Asp Tyr1 5 10

<210> 452

<211> 14

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 52CDHR3 ligante de HER2 sintético<400> 452

Gly Tyr Tyr Tyr Ser Tyr Tyr Gly Gly Tyr Gly Met Asp Tyr1 5 10

<210> 453

<211> 14

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 53CDHR3 ligante de HER2 sintético<400> 453

Gly Tyr Tyr Tyr Ser Tyr Tyr Gly Gly Tyr Gly Met Asp Tyr1 5 10

<210> 454

<211> 14

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 54CDHR3 ligante de HER2 sintético<400> 454

Gly Tyr Tyr Tyr Ser Tyr Tyr Gly Gly Tyr Gly Leu Asp Tyr1 5 10

<210> 455

<211> 14

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 55CDHR3 ligante de HER2 sintético<400> 455

Gly Tyr Tyr Tyr Ser Tyr Tyr Gly Gly Tyr Gly Met Asp Tyr1 5 10

<210> 456<211> 14

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 56CDHR3 ligante de HER2 sintético<400> 456

Gly Tyr Tyr Tyr Ser Tyr Tyr Gly Gly Tyr Gly Met Asp Tyr1 5 10

<210> 457

<211> 14

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 57CDHR3 ligante de HER2 sintético<400> 457

Gly Tyr Tyr Tyr Gly Tyr Tyr Ser Gly Tyr Gly lie Asp Tyr1 5 10

<210> 458

<211> 14

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 58CDHR3 ligante de HER2 sintético<400> 458

Gly Ser Tyr Tyr Ser Tyr Tyr Ser Gly Tyr Gly Met Asp Tyr1 5 10

<210> 459

<211> 14

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 59CDHR3 ligante de HER2 sintético<400> 459

Gly Ser Tyr Tyr Ser Tyr Tyr Ser Gly Tyr Ala lie Asp Tyr1 5 10

<210> 460

<211> 14

<212> PRT

<213> Artificial

<220><223> Artificial clone 60CDHR3 ligante de HER2 sintético<400> 460

Gly Ser Tyr Tyr Ser Tyr Tyr Ser Gly Tyr Ala Phe Asp Tyr1 5 10

<210> 461

<211> 14

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 61CDHR3 ligante de HER2 sintético<400> 461

Gly Ser Tyr Tyr Ser Tyr Tyr Ser Gly Ser Gly lie Asp Tyr1 5 10

<210> 462

<211> 14

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 62CDHR3 ligante de HER2 sintético<400> 462

Gly Ser Tyr Tyr Gly Tyr Tyr Tyr Gly Ser Ala lie Asp Tyr1 5 10

<210> 463

<211> 14

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 63CDHR3 ligante de HER2 sintético<400> 463

Gly Ser Tyr Tyr Gly Tyr Tyr Tyr Gly Ser Gly Met Asp Tyr1 5 10

<210> 464

<211> 14

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 64CDHR3 ligante de HER2 sintético<400> 464Gly Ser Tyr Tyr Gly Tyr Tyr Ser Gly Ser Gly Met Asp Tyr1 5 10

<210> 465

<211> 14

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 65CDHR3 ligante de HER2 sintético<400> 465

Gly Ser Gly Tyr Ser Tyr Tyr Gly Gly Tyr Gly Leu Asp Tyr1 5 10

<210> 466

<211> 14

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 66CDHR3 ligante de HER2 sintético<400> 466

Gly Ser Tyr Ser Gly Tyr Tyr Tyr Gly Tyr Gly Leu Asp Tyr1 5 10

<210> 467

<211> 14

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 67CDHR3 ligante de HER2 sintético<400> 467

Gly Arg Tyr Ser Gly Tyr Tyr Gly Gly Tyr Gly Met Asp Tyr1 5 10

<210> 468

<211> 15

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 68CDHR3 ligante de HER2 sintético<400> 468

Tyr Tyr Tyr Ser Ser Gly Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Ala Phe Asp Tyr1 5 10 15

<210> 469<211> 15

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 69CDHR3 ligante de HER2 sintético<400> 469

Tyr Ser Tyr Ser Tyr Tyr Gly Tyr Tyr Gly Ser Gly Met Asp Tyr1 5 10 15 <210> 470

<211> 15

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 70CDHR3 ligante de HER2 sintético<400> 470

Tyr Arg Ser Tyr Tyr Ser Tyr Arg Tyr Gly Tyr Gly Met Asp Tyr1 5 10 15

<210> 471

<211> 15

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 71CDHR3 ligante de HER2 sintético<400> 471

Tyr Gly Tyr Tyr Tyr Ser Tyr Tyr Gly Gly Ser Gly Leu Asp Tyr1 5 10 15

<210> 472

<211> 15

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 72CDHR3 ligante de HER2 sintético<400> 472

Tyr Gly Tyr Tyr Tyr Ser Tyr Tyr Gly Gly Ser Gly Leu Asp Tyr1 5 10 15

<210> 473

<211> 15

<212> PRT

<213> Artificial

<220><223> Artificial clone 73CDHR3 ligante de HER2 sintético<400> 473

Tyr Gly Tyr Ser Tyr Ser Tyr Ser Ser Gly Ser Ala Leu Asp Tyr1 5 10 15

<210> 474

<211> 15

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 74CDHR3 ligante de HER2 sintético<400> 474

Ser Tyr Tyr Tyr Gly Gly Tyr Tyr Ser Gly Tyr Gly Met Asp Tyr1 5 10 15

<210> 475

<211> 15

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 75CDHR3 ligante de HER2 sintético<400> 475

Arg Arg Ser Tyr Tyr Ser Tyr Arg Tyr Ser Tyr Gly Leu Asp Tyr1 5 10 15

<210> 476

<211> 15

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 76CDHR3 ligante de HER2 sintético<400> 476

Arg Arg Ser Tyr Tyr Ser Tyr Ser Arg Ser Tyr Ala Met Asp Tyr1 5 10 15

<210> 477

<211> 16

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 77CDHR3 ligante de HER2 sintético<400> 477Tyr Tyr Tyr Gly Tyr Tyr Ser Tyr Tyr Ser Gly Tyr Gly Leu Asp Tyr1 5 10 15

<210> 478

<211> 16

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 78CDHR3 ligante de HER2 sintético<400> 478

Tyr Tyr Tyr Gly Tyr Tyr Ser Tyr Tyr Gly Gly Ser Gly Leu Asp Tyr1 5 10 15

<210> 479

<211> 16

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 79CDHR3 ligante de HER2 sintético<400> 479

Tyr Tyr Tyr Gly Tyr Tyr Ser Tyr Tyr Gly Gly Ser Ala Met Asp Tyr1 5 10 15

<210> 480

<211> 16

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 80CDHR3 ligante de HER2 sintético<400> 480

Tyr Tyr Tyr Ser Gly Gly Ser Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Ala Phe Asp Tyr1 5 10 15

<210> 481

<211> 16

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 81CDHR3 ligante de HER2 sintético<400> 481

Tyr Tyr Tyr Ser Tyr Tyr Ser Tyr Tyr Ser Tyr Gly Gly lie Asp Tyr1 5 10 15

<210> 482<211> 16

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 82CDHR3 ligante de HER2 sintético<400> 482

Tyr Tyr Ser Ser Tyr Tyr Ser Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Gly Met Asp Tyr1 5 10 15

<210> 483

<211> 16

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 83CDHR3 ligante de HER2 sintético<400> 483

Tyr Ser Tyr Tyr Tyr Tyr Ser Tyr Tyr Tyr Gly Ser Ala Met Asp Tyr1 5 10 15

<210> 484

<211> 16

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 84CDHR3 ligante de HER2 sintético<400> 484

Tyr Ser Tyr Tyr Tyr Tyr Ser Tyr Tyr Ser Gly Tyr Gly Phe Asp Tyr1 5 10 15

<210> 485

<211> 16

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 85CDHR3 ligante de HER2 sintético<400> 485

Tyr Ser Tyr Tyr Tyr Tyr Ser Tyr Tyr Ser Gly Tyr Gly Phe Asp Tyr1 5 10 15

<210> 486

<211> 16

<212> PRT

<213> Artificial

<220><223> Artificial clone 86CDHR3 ligante de HER2 sintético<400> 486

Tyr Ser Tyr Tyr Tyr Tyr Ser Tyr Tyr Gly Gly Ser Ala Phe Asp Tyr1 5 10 15

<210> 487

<211> 16

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 87CDHR3 ligante de HER2 sintético<400> 487

Tyr Ser Tyr Tyr Tyr Tyr Ser Tyr Tyr Gly Gly Ser Gly Met Asp Tyr1 5 10 15

<210> 488

<211> 16

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 88CDHR3 ligante de HER2 sintético<400> 488

Tyr Ser Tyr Tyr Tyr Tyr Ser Tyr Tyr Gly Gly Ser Gly Leu Asp Tyr1 5 10 15

<210> 489

<211> 16

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 89CDHR3 ligante de HER2 sintético<400> 489

Tyr Ser Tyr Ser Tyr Tyr Gly Tyr Tyr Tyr Gly Ser Gly Leu Asp Tyr1 5 10 15

<210> 490

<211> 16

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 90CDHR3 ligante de HER2 sintético<400> 490Tyr Ser Ser Tyr Tyr Tyr

Ser Tyr Tyr Ser Gly Ser Gly Leu Asp Tyr10 15

<210> 491

<211> 16

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial

<400> 491

91CDHR3 ligante de HER2 sintético

Ser Ser Tyr Tyr Tyr Tyr

Ser Tyr Tyr Gly Gly Ser Gly lie Asp Tyr10 15

<210> 4 92

<211> 16

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial

<400> 492

92CDHR3 ligante de HER2 sintético

Arg Ser Tyr Tyr Tyr Tyr

Ser Tyr Tyr Tyr Ser Arg Ala Met Asp Tyr10 15

<210> 493

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial

<400> 493

93CDHR3 ligante de HER2 sintético

Ser Tyr Ser Ser Tyr Tyr

Ser Tyr Tyr Ser Ser Tyr Gly Gly Met Asp10 15

Tyr

<210> 494

<211> 21

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial

<400> 494

94CDHR3 ligante de HER2 sintético

Tyr Arg Tyr Tyr Tyr Ser Arg Tyr Gly Tyr Arg Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr15 10 15Arg Ala Leu Asp Tyr20

<210> 495<211> 8<212> PRT<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 95CDHR3 ligante de HER2 sintético<400> 495

Arg Tyr Ser Ser Gly Met Asp Tyr1 5

<210> 496

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 96CDHR3 ligante de HER2 sintético<400> 496

Tyr Ser His Ser Gly Ala Phe Asp Tyr1 5

<210> 497

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 97CDHR3 ligante de HER2 sintético<400> 497

Gly Tyr Ser Tyr Gly His Gly lie Asp Tyr15 10

<210> 498

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 98CDHR3 ligante de HER2 sintético<400> 498

Gly Ser Ser Phe Gly Arg Gly Phe Asp Tyr15 10

<210> 499<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 99CDHR3 ligante de HER2 sintético<400> 499

Gly Ser Ser Tyr Ser Trp Gly Leu Asp Tyr15 10

<210> 500

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 100CDHR3 ligante de HER2 sintético<400> 500

Gly Ser Arg Tyr Ser His Gly Met Asp Tyr15 10

<210> 501

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 101CDHR3 ligante de HER2 sintético<400> 501

Gly Ala Ser Tyr Gly Tyr Gly Met Asp Tyr15 10

<210> 502

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 102CDHR3 ligante de HER2 sintético<400> 502

Gly Met Ser Tyr Gly Tyr Gly Met Asp Tyr15 10

<210> 503

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial

<220><223> Artificial clone 103CDHR3 ligante de HER2 sintético<400> 503

Gly Gly Arg Tyr Asn His Gly Leu Asp Tyr15 10

<210> 504

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 104CDHR3 ligante de HER2 sintético<400> 504

Glu Tyr Tyr Gln Gly Tyr Gly Pro Tyr Arg Ser Thr Tyr Gly Leu Asp15 10 15

Tyr

<210> 505

<211> 19

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 105CDHR3 ligante de HER2 sintético<400> 505

Ser Ser Trp Ser Ser Arg Gly Vai Ser Tyr Ser Arg Thr Ala Gly Gly15 10 15

Met Asp Tyr

<210> 506

<211> 20

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial clone 106CDHR3 ligante de HER2 sintético<400> 506

Glu Gly Tyr Tyr Ser Vai Ser Gly Ser Tyr Ser Tyr Ser Thr Arg Gly15 10 15

Gly Pro Asp Tyr20

<210> 507<211> 9<212> PRT<213> Artificial<220>

<223> Clone 1CDRL3 ligante de DR5 sintético

<400> 507

Gln Gln Tyr Ser Ser Tyr Pro Ser Thr1 5

<210> 508

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Clone 2CDRL3 ligante de DR5 sintético

<400> 508

Gln Gln Tyr Ser Ser Tyr Pro Ser Thr1 5

<210> 509

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Clone 3CDRL3 ligante de DR5 sintético

<400> 509

Gln Gln Tyr Tyr Tyr Tyr Pro Ser Thr1 5

<210> 510

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Clone 4CDRL3 ligante de DR5 sintético

<400> 510

Gln Gln Tyr Ser Ser Tyr Pro Ser Thr1 5

<210> 511

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Clone 5CDRL3 ligante de DR5 sintético<400> 511

Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro Thr1 5

<210> 512

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Clone 6CDRL3 ligante de DR5 sintético

<400> 512

Gln Gln Tyr Tyr Ser Ser Pro Ser Thr1 5

<210> 513

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Clone 7CDRL3 ligante de DR5 sintético

<400> 513

Gln Gln Tyr Ser Tyr Ser Pro Ser Thr1 5

<210> 514

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Clone 8CDRL3 ligante de DR5 sintético

<400> 514

Gln Gln Tyr Tyr Tyr Ser Pro Ser Thr1 5

<210> 515

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Clone 9CDRL3 ligante de DR5 sintético

<400> 515

Gln Gln Tyr Ser Ser Ser Pro Ser Thr1 5<210> 516

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Clone 10CDRL3 ligante de DR5 sintético

<400> 516

Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro Thr1 5

<210> 517

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Clone 11CDRL3 ligante de DR5 sintético

<400> 517

Gln Gln Tyr Tyr Ser Ser Pro Ser Thr1 5

<210> 518

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Clone 12CDRL3 ligante de DR5 sintético

<400> 518

Gln Gln Tyr Tyr Ser Ser Pro Tyr Thr1 5

<210> 519

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Clone 13CDRL3 ligante de DR5 sintético

<400> 519

Gln Gln Tyr Tyr Ser Ser Pro Ser Thr1 5

<210> 520

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial<220>

<223> Clone 14CDRL3 ligante de DR5 sintético

<400> 520

Gln Gln Tyr Ser Ser Ser Pro Ser Thr1 5

<210> 521

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Clone 15CDRL3 ligante de DR5 sintético

<400> 521

Gln Gln Ser Ser Tyr Ser Pro Ser Thr1 5

<210> 522

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Clone 16CDRL3 ligante de DR5 sintético

<400> 522

Gln Gln Tyr Tyr Ser Ser Pro Ser Thr1 5

<210> 523

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Clone 17CDRL3 ligante de DR5 sintético

<400> 523

Gln Gln Tyr Tyr Ser Ser Pro Ser Thr1 5

<210> 524

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Clone 1CDRH1 ligante de DR5 sintético

<400> 524Gly Phe Ser lie Tyr Ser Tyr

1 5

<210> <211> <212> <213> 525 10 PRT Artificial

<220> <223> Clone 2CDRH1 ligante

<400> 525

Gly Phe Ser lie Tyr 1 5 Ser Ser

<210> <211> <212> <213> 526 10 PRT Artificial

<220> <223> Clone 3CDRH1 ligante

<400> 526

Gly Phe Tyr lie Tyr 1 5 Ser Tyr

<210> <211> <212> <213> 527 10 PRT Artificial

<220> <223> Clone 4CDRH1 ligante

<400> 527

Ser lie His10

de DR5 sintético

Ser lie His10

de DR5 sintético

Ser lie His10

de DR5 sintético

Gly Phe Ser lie Tyr Ser Ser

Ser lie His10

<210> 528

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Clone 5CDRH1

<400> 528

ligante de DR5 sintético

Gly Phe Ser lie Tyr Ser Ser1 5

Ser lie His10

<210> 529<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Clone 6CDRH1 ligante de DR5 sintético<400> 529

Gly Phe Tyr lie Ser Tyr Ser Ser lie His15 10

<210> 530

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Clone 7CDRH1 ligante de DR5 sintético<400> 530

Gly Phe Ser lie Ser Ser Ser Ser lie His15 10

<210> 531

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Clone 8CDRH1 ligante de DR5 sintético<400> 531

Gly Phe Tyr lie Ser Ser Ser Ser lie His15 10

<210> 532

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Clone 9CDRH1 ligante de DR5 sintético<400> 532

Gly Phe Ser lie Ser Ser Ser Ser lie His15 10

<210> 533

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial

<220><223> Clone 10CDRH1 ligante de DR5 sintético<400> 533

Gly Phe Tyr lie Tyr Ser Ser Ser lie His15 10

<210> 534

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Clone 11CDRH1 ligante de DR5 sintético<400> 534

Gly Phe Ser lie Ser Ser Ser Ser lie His15 10

<210> 535

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Clone 12CDRH1 ligante de DR5 sintético<400> 535

Gly Phe Ser lie Ser Ser Ser Ser lie His15 10

<210> 536

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Clone 13CDRH1 ligante de DR5 sintético<400> 536

Gly Phe Ser lie Ser Ser Ser Ser lie His15 10

<210> 537

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Clone 14CDRH1 ligante de DR5 sintético

<400> 537Gly Phe Tyr Ile Ser Ser Ser Tyr Ile His15 10

<210> 538

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Clone 15CDRH1 ligante de DR5 sintético<400> 538

Gly Phe Tyr Ile Tyr Ser Ser Ser Ile His15 10

<210> 539

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Clone 16CDRH1 ligante de DR5 sintético<400> 539

Gly Phe Tyr Ile Tyr Ser Ser Ser Ile His15 10

<210> 540

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Clone 17CDRH1 ligante de DR5 sintético<400> 540

Gly Phe Tyr Ile Ser Ser Ser Ser Ile His15 10

<210> 541

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Clone 18CDRH1 ligante de DR5 sintético<400> 541

Ser Ile Ser Pro Tyr Tyr Gly Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Vai Lys15 10 15

Gly<210> 542

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Clone 2CDRH2 ligante de DR5 sintético<400> 542

Ser lie Tyr Pro Tyr Ser Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Vai Lys1 5 10 15

Gly

<210> 543

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Clone 3CDRH2 ligante de DR5 sintético<400> 543

Ser lie Ser Pro Tyr Tyr Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Vai Lys1 5 10 15

Gly

<210> 544

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Clone 4CDRH2 ligante de DR5 sintético<400> 544

Tyr lie Ser Pro Ser Tyr Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Vai Lys1 5 10 15

Gly

<210> 545

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Clone 5CDRH2 ligante de DR5 sintético<400> 545

Ser lie Ser Pro Tyr Ser Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Vai Lys1 5 10 15Gly

<210> 546

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Clone 6CDRH2 ligante de DR5 sintético<400> 546

Tyr lie Ser Pro Tyr Ser Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Vai Lys1 5 10 15

Gly

<210> 547

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Clone 7CDRH2 ligante de DR5 sintético<400> 547

Ser lie Ser Pro Ser Tyr Gly Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Vai Lys1 5 10 15

Gly

<210> 548

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Clone 8CDRH2 ligante de DR5 sintético<400> 548

Ser lie Ser Pro Ser Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Vai Lys1 5 10 15

Gly

<210> 549

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Clone 9CDRH2 ligante de DR5 sintético<400> 549Ser lie Ser Pro Tyr Tyr Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Vai Lys1 5 10 15

Gly

<210> 550

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Clone 10CDRH2 ligante de DR5 sintético<400> 550

Ser lie Ser Pro Ser Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Vai Lys1 5 10 15

Gly

<210> 551

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Clone 11CDRH2 ligante de DR5 sintético<400> 551

Tyr lie Ser Pro Tyr Ser Gly Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Vai Lys1 5 10 15

Gly

<210> 552

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Clone 12CDRH2 ligante de DR5 sintético<400> 552

Tyr lie Tyr Pro Tyr Ser Gly Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Vai Lys1 5 10 15

Gly

<210> 553

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<220><223> Clone 13CDRH2 ligante de DR5 sintético<400> 553

Ser lie Ser Pro Ser Ser Gly Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Vai Lys1 5 10 15

Gly

<210> 554

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Clone 14CDRH2 ligante de DR5 sintético<400> 554

Ser lie Ser Pro Ser Tyr Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Vai Lys1 5 10 15

Gly

<210> 555

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Clone 15CDRH2 ligante de DR5 sintético<400> 555

Ser lie Ser Pro Ser Ser Gly Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Vai Lys1 5 10 15

Gly

<210> 556

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Clone 16CDRH2 ligante de DR5 sintético<400> 556

Tyr lie Ser Pro Tyr Tyr Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Vai Lys1 5 10 15

Gly

<210> 557<211> 17<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Clone 17CDRH2 ligante de DR5 sintético<400> 557

Tyr lie Ser Pro Ser Tyr Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Vai Lys1 5 10 15

Gly

<210> 558

<211> 16

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Clone 1CDRH3 ligante de DR5 sintético<400> 558

Arg Tyr Tyr Ser Tyr Arg Ser Tyr Ser Tyr Tyr Ser Gly Leu Asp Tyr1 5 10 15

<210> 559

<211> 16

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Clone 2CDRH3 ligante de DR5 sintético<400> 559

Arg Tyr Tyr Ser Ser Ser Tyr Arg Ser Ser Ser Tyr Gly Met Asp Tyr1 5 10 15

<210> 560

<211> 16

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Clone 3CDRH3 ligante de DR5 sintético<400> 560

Tyr Tyr Tyr Ser Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Ser Tyr Tyr Gly Leu Asp Tyr1 5 10 15

<210> 561

<211> 18

<212> PRT

<213> Artificial<220>

<223> Clone 4CDRH3 ligante de DR5 sintético<400> 561

Arg Arg Tyr Ser Arg Tyr Tyr Arg Tyr Ser Ser Arg Tyr Arg Gly Phe1 5 10 15

Asp Tyr

<210> 562

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Clone 5CDRH3 ligante de DR5 sintético<400> 562

Tyr Arg Ser Tyr Arg Tyr Gly Tyr Tyr Arg Gly Gly Tyr Gly Phe Asp1 5 10 15

Tyr

<210> 563

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Clone 6CDRH3 ligante de DR5 sintético<400> 563

Tyr Arg Ser Tyr Arg Tyr Gly Tyr Tyr Arg Gly Ser Tyr Ala Leu Asp1 5 10 15

Tyr

<210> 564

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Clone 7CDRH3 ligante de DR5 sintético<400> 564

Tyr Arg Ser Tyr Arg Tyr Gly Ser Tyr Arg Gly Ser Tyr Gly Phe Asp1 5 10 15

Tyr

<210> 565<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Clone 8CDRH3 ligante de DR5 sintético<400> 565

Tyr Arg Ser Tyr Arg Tyr Gly Ser Tyr Tyr Gly Ser Tyr Gly Phe Asp1 5 10 15

Tyr

<210> 566

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Clone 9CDRH3 ligante de DR5 sintético<400> 566

Tyr Arg Arg Tyr Tyr Tyr Gly Tyr Tyr Tyr Gly Gly Tyr Gly Phe Asp1 5 10 15

Tyr

<210> 567

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Clone 10CDRH3 ligante de DR5 sintético<400> 567

Tyr Arg Arg Tyr Arg Tyr Gly Tyr Tyr Ser Gly Gly Tyr Gly Phe Asp1 5 10 15

Tyr

<210> 568

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Clone 11CDRH3 ligante de DR5 sintético<400> 568

Tyr Arg Arg Tyr Arg Tyr Gly Ser Tyr Tyr Ser Gly Tyr Ala Phe Asp1 5 10 15Tyr

<210> 569

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Clone 12CDRH3 ligante de DR5 sintético<400> 569

Tyr Arg Arg Tyr Arg Tyr Gly Tyr Ser Tyr Gly Ser Tyr Gly Phe Asp1 5 10 15

Tyr

<210> 570

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Clone 13CDRH3 ligante de DR5 sintético<400> 570

Tyr Arg Gly Tyr Arg Tyr Gly Tyr Tyr Arg Gly Gly Tyr Ala Phe Asp1 5 10 15

Tyr

<210> 571

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Clone 14CDRH3 ligante de DR5 sintético<400> 571

Arg Arg Tyr Tyr Arg Tyr Gly Tyr Ser Arg Gly Ser Tyr Gly Leu Asp1 5 10 15

Tyr

<210> 572

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Clone 15CDRH3 ligante de DR5 sintético<400> 572Arg Arg Ser Tyr Arg Tyr Gly Ser Tyr Arg Gly Ser Tyr Ala Phe Asp

1 5 10 15

Tyr

<210> 573

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Clone 16CDRH3 ligante de DR5 sintético

<400> 573

Arg Arg Pro Tyr Arg Tyr Gly Arg Ser Arg Gly Tyr Tyr Ala Phe Asp

1 5 10 15

Tyr

<210> 574

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Clone 17CDRH3 ligante de DR5 sintético

<400> 574

Met Arg Arg Tyr His Tyr Gly Arg Tyr Ser Gly Ala Tyr Gly Leu Asp

1 5 10 15

Tyr

<210> 575

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDRH3 sintético<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(1)

<223> X é R ou Y

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (10)..(10)

<223> X é Y ou R

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (14) . . (14)<223> X é R ou Y<400> 575

Xaa Arg Ser Tyr Arg Tyr Gly Ser Tyr Xaa Gly Ser Tyr Xaa Phe Asp1 5 10 15

Tyr

<210> 576

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDRH1 sintético<400> 576

Gly Phe Tyr lie Ser Ser Ser Ser lie His1 5 10

<210> 577

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDRH2 sintético<400> 577

Ser lie Ser Pro Ser Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Vai Lys1 5 10 15

Gly

<210> 578

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDRH3 sintético<400> 578

Tyr Arg Ser Tyr Arg Tyr Gly Ser Tyr Tyr Gly Ser Tyr Gly Phe Asp1 5 10 15

Tyr

<210> 579

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial<220>

<223> CDRH1 sintético

<400> 579

Gly Phe Tyr Ile Tyr Ser Ser Ser Ile His1 5 10

<210> 580

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDRH2 sintético

<400> 580

Ser Ile Ser Pro Ser Ser Gly Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Vai Lys1 5 10 15

Gly

<210> 581

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDRH3 sintético

<400> 581

Arg Arg Ser Tyr Arg Tyr Gly Ser Tyr Arg Gly Ser Tyr Ala Phe Asp15 10 15

Tyr

<210> 582

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDRH3 sintético<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(1)

<223> X é R ou Y

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (2)..(2)

<223> X é R, S, ou Y<220><221> MISC_FEATURE

<222> (3) .. (3)

<223> X é S, G, Y, ou H

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (4)..(4)

<223> X é S, G, Y, ou R

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (5)..(5)

<223> X é G ou A

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (6)..(6)

<223> X é F, M, L, ou A

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (7) .. (7)

<223> X é F, M, L,

<400> 582

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa1 5

<210> 583

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial

ou nenhum aminoácido

Xaa Xaa Asp Tyr

<220>

<223> CDRH3 sintético<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(1)

<223> X é G, S, ou Y

<220>

<221> MI SC_FEATURE

<222> (2)..(2)

<223> X é Y, S, G, R, A, ou M

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (3)..(3)

<223> X é G, R, S, ou Y

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (4) .. (4)

<223> X é F, G, ou Y<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (5)..(5)

<223> X é G, N, S, ou Y

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (6)..(6)

<223> X é H, R, W, ou Y

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (7)..(7)

<223> X é A ou G

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (8) . . (8)

<223> X é F, I, L, ou M

<400> 583

Xaa_Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Asp Tyr

1 5 10

<210> 584

<211> 21

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDRH3 sintético<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(1)

<223> X é Y, S, R, G, ou E

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (2) .. (2)

<223> X é Y, S, R, ou G

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (3)..(3)

<223> X é S, Y, G, ou W

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (4) . . (4)

<223> X é S, Y, G, ou W

<220><221><222>

MISC_FEATURE(5) . . (5)<223> X é G, Y, ou S<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (6)..(6)

<223> X é G, Y, S, R, ou V

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (7)..(7)

<223> X é S, Y, G, ou R

<220>

<221> MISC_FEATURE<222> (8) .. (8)

<223> X é Y, S, G, R, P, ou V

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (9)..(9)

<223> X é G, A, R, S, ou Y

<220>

<221> MISC_FEATURÊ

<222> (10)..(10)

<223> X é M, F, G, Y, S, ou R

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (11)..(11)

<223> X é A, G, R, S, Y, ou nenhum aminoácido

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (12) . . (12)

<223> X é A, F, G, I, L, M, R, S, T, Y, ou nenhum aminoácido

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (13)..(13)

<223> X é A, F, G, L, M, S, T, Y, ou nenhum aminoácido<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (14) . . (14)

<223> X é L, M, F, I, G, Y, A, T, ou nenhum aminoácido<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (15)..(15)

<223> X é M, L, Y, G, R, ou nenhum aminoácido<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (16)..(16)

<223> X é G, Y, ou nenhum aminoácido<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (17).. (17)

<223> X é G, R, M, ou nenhum aminoácido<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (18) .. (18)

<223> X é A, P, ou nenhum aminoácido<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (19)..(19)

<223> X é L ou nenhum aminoácido

<400> 584

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa15 10 15

Xaa Xaa Xaa Asp Tyr20

<210> 585

<211> 6

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Seqüência upstream de iniciação de transcrição sintética<220>

<221> misc_feature

<222> (2)..(2)

<223> N não pode ser qualquer nucleotideo

<400> 585

cncaat 6

<210> 586

<211> 6

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Sinal sintético

<400> 586

aataaa 6

<210> 587

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial

<220><223> CDRL3 sintético<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (6)..(6)

<223> X é Y ou S

<400> 587

Gln Gln Ser Tyr Tyr Xaa Pro Ser Thr

<210> 588

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDRH1 sintético<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (5)..(5)

<223> X é independentemente Y ou S<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (6)..(6)

<223> X é independentemente Y ou S

<400> 588

Gly Phe Ser Ile Xaa Xaa Ser Tyr Ile His1 5 10 <210> 589

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> synthetic CDRH2<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (5)..(5)

<223> X é independentemente Y ou S

<400> 589

Ser Ile Tyr Pro Xaa Ser Gly Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Lys Vai1 5 10 15

Gly

<210> 590<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDRH1 sintético<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (3)..(3)

<223> X is either Y or S

<400> 590

Gly Phe Xaa Ile Ser Tyr Ser Ser Ile His1 5 10

<210> 591

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDRH2 sintético<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (5)..(5)

<223> X é independentemente Y ou S<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (8) . . (8)

<223> X é independentemente Y ou S<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (10)..(10)

<223> X é independentemente Y ou S

<400> 591

Ser Ile Tyr Pro Xaa Tyr Gly Xaa Thr Xaa Tyr Ala Asp Ser Lys Vai15 10 15

Gly

<210> 592

<211> 16

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDRH3 sintético<220><221> MISC_FEATURE

<222> (1) . . (1)

<223> X é Y, S, ou R

<220>

<221> MISC_FEATURE<222> (2)..(2)

<223> X é Y ou S

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (3)..(3)

<223> X é G, Y, ou S

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (4) . . (4)

<223> X é Y, S, R, ou G

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (10) . . (10)

<223> X é Y, S, ou G

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (12) . . (12)

<223> X é Y, S, G, ou R

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (13) . . (13)

<223> X é G ou A

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (14) . . (14)

<223> X é M, I, F, ou L

<400> 592

Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Tyr Ser Tyr1 5

<210> 593

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDRH2 sintético<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (3) . . (3)

<223> X é Y ou S

Tyr Xaa Gly Xaa Xaa Xaa Asp Tyr10 15<400> 593

Gly Phe Xaa Ile Ser Ser Ser Ser Ile His1 5 10

<210> 594

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDRH2 sintético<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1) . . (1)

<223> X é independentemente Y ou S<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (3) . . (3)

<223> X é independentemente Y ou S<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (10)..(10)

<223> X é independentemente Y ou S

<400> 594

Xaa Ile Xaa Pro Ser Ser Gly Tyr Thr Xaa Tyr Ala Asp Ser Lys Vai15 10 15

Gly

<210> 595

<211> 184

<212> PRT

<213> homo

<400> 595

sapiens

Met Ser Ala Leu Leu Ile Leu Ala Leu Vai Gly Ala Ala Vai Ala Asp15 10 15

Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Leu Ser Ala Leu Ile Thr Gln Gln Asp20 25 30

Leu Ala Pro Gln Gln Arg Vai Ala Pro Gln Gln Lys Arg Ser Ser Pro35 40- 45

Ser Glu Gly Leu Cys Pro Pro Gly His His Ile Ser Glu Asp Gly Arg50 55 60

Asp Cys Ile Ser Cys Lys Tyr Gly Gln Asp Tyr Ser Thr His Trp Asn65 70 75 80 -Asp Leu Leu Phe Cys Leu Arg Cys Thr Arg Cys Asp Ser Gly Glu Vai85 90 95

Glu Leu Ser Pro Cys Thr Thr Thr Arg Asn Thr Vai Cys Gln Cys Glu100 105 110

Glu Gly Thr Phe Arg Glu Glu Asp Ser Pro Glu Met Cys Arg Lys Cys115 120 125

Arg Thr Gly Cys Pro Arg Gly Met Vai Lys Vai Gly Asp Cys Thr Pro130 135 140

Trp Ser Asp lie Glu Cys Vai His Lys Glu Ser Gly Thr Lys His Ser145 150 155 160

Gly Glu Ala Pro Ala Vai Glu Glu Thr Vai Thr Ser Ser Pro Gly Thr165 170 175

Pro Ala Ser Pro Cys Ser Leu Ser180

<210> 596<211> 17<212> PRT<213> Artificial

<220>

<223> CDRH3 sintético<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (3)..(3)

<223> X é Y, S, R, P, ou G

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (8) . . (8)

<223> X é R, Y, ou S

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (9)..(9)

<223> X é G, Y, ou S

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (10)..(10)

<223> X é S, Y, ou R

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (14) . . (14)

<223> X é G ou A

<220>

<221> MISC FEATURE<222> (15)..(15)

<223> X é L ou F

<400> 596

Tyr Arg Xaa Tyr Arg Tyr Gly Xaa Xaa Xaa Gly Ser Tyr Xaa Xaa Asp1 5 10 15

Tyr

<210> 597

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDRL3 sintético<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (3)..(3)

<223> X é independentemente Y ou S<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (4)..(4)

<223> X é independentemente Y ou S<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (5)..(5)

<223> X é independentemente Y ou S

<400> 597

Gln Gln Xaa Xaa Xaa Ser Pro Ser Thr1 5

<210> 598

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDRH1 sintético<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (3)..(3)

<223> X é independentemente Y ou S<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (5)..(5)

<223> X é independentemente Y ou S

<400> 598Gly Phe Xaa Ile Xaa Ser Ser Ser Ile His1 5 10

<210> 599

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDRH2 sintético<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(1)

<223> X é independentemente Y ou S<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (5)..(5)

<223> X é independentemente Y ou S<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (6)..(6)

<223> X é independentemente Y ou S<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (10)..(10)

<223> X é independentemente Y ou S

<400> 599

Xaa Ile Ser Pro Xaa Xaa Gly Tyr Thr Xaa Tyr Ala Asp Ser Lys Vai15 10 15

Gly

<210> 600

<211> 7

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> BDF1 CDRH1 sintético

<400> 600

Ile Gly Lys Ser Gly Ile His1 5

<210> 601

<211> 14

<212> PRT

<213> Artificial

<220><223> BDF1 CDRH2 sintético<400> 601

Vai Ala Vai Ile Tyr Pro His Asp Gly Asn Thr Ala Tyr Ala1 5 10

<210> 602

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> BDF1 CDRH3 sintético<400> 602

Arg Leu Ala Leu Vai Arg Met Trp Met Asp1 5 10

<210> 603

<211> 16

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDRH3 sintético

<400> 603

Tyi Stbt Ser Tyr Tyr Ser

1 5

<210> 604

<211> 411

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 604

10 15

Met Glu Gln Arg Gly Gln Asn Ala Pro Ala Ala Ser Gly Ala Arg Lys15 10 15

Arg His Gly Pro Gly Pro Arg Glu Ala Arg Gly Ala Arg Pro Gly Leu20 25 30

Arg Vai Pro Lys Thr Leu Vai Leu Vai Vai Ala Ala Vai Leu Leu Leu

35 40 45

Vai Ser Ala Glu Ser Ala Leu Ile Thr Gln Gln Asp Leu Ala Pro Gln

50 55 60

Gln Arg Ala Ala Pro Gln Gln Lys Arg Ser Ser Pro Ser Glu Gly Leu65 70 75 80

Cys Pro Pro Gly His His Ile Ser Glu Asp Gly Arg Asp Cys Ile Ser85 90 95Cys Lys Tyr Gly Gln Asp Tyr Ser100

Cys Leu Arg Cys Thr Arg Cys Asp

115 120

Thr His Trp Asn Asp Leu Leu Phe105 110

Ser Gly Glu Vai Glu Leu Ser Pro125

Cys Thr Thr Thr Arg Asn Thr Vai Cys Gln Cys Glu Glu Gly Thr Phe130 135 140

Arg Glu Glu Asp Ser Pro Glu Met Cys Arg Lys Cys Arg Thr Gly Cys145 150 155 160

Pro Arg Gly Met Vai Lys Vai Gly Asp Cys Thr Pro Trp Ser Asp lie165 170 175

Glu Cys Vai His Lys Glu Ser Gly lie lie lie Gly Vai Thr Vai Ala180 185 190

Ala Vai Vai Leu lie Vai Ala Vai Phe Vai Cys Lys Ser Leu Leu Trp195 200 205

Lys Lys Vai Leu Pro Tyr. Leu Lys Gly lie Cys Ser Gly Gly Gly Gly210 215 220

Asp Pro Glu Arg Vai Asp Arg Ser Ser Gln Arg Pro Gly Ala Glu Asp225 230 235 240

Asn Vai Leu Asn Glu lie Vai Ser lie Leu Gln Pro Thr Gln Vai Pro245 250 255

Glu Gln Glu Met Glu Vai Gln Glu Pro Ala Glu Pro Thr Gly Vai Asn260 265 270

Met Leu Ser Pro Gly Glu Ser Glu His Leu Leu Glu Pro Ala Glu Ala275 280 285

Glu Arg Ser Gln Arg Arg Arg Leu Leu Vai Pro Ala Asn Glu Gly Asp290 295 300

Pro Thr Glu Thr Leu Arg Gln Cys Phe Asp Asp Phe Ala Asp Leu Vai305 310 315 320

Pro Phe Asp Ser Trp Glu Pro Leu Met Arg Lys Leu Gly Leu Met Asp325 330 335

Asn Glu lie Lys Vai Ala Lys Ala Glu Ala Ala Gly His Arg Asp Thr340 345 350

Leu Tyr Thr Met Leu lie Lys Trp Vai Asn Lys Thr Gly Arg Asp Ala355 360 365

Ser Vai His Thr Leu Leu Asp Ala Leu Glu Thr Leu Gly Glu Arg Leu370 375 380

Ala Lys Gln Lys lie Glu Asp His Leu Leu Ser Ser Gly Lys Phe Met385 390 395 400Tyr Leu Glu Gly Asn Ala Asp Ser Ala Leu Ser405 410

<210> 605<211> 120<212> PRT<213> Mus musculus

<400> 605

Gly Leu Gln Arg Pro Glu Glu Ser Pro Ser Arg Gly Pro Cys Leu Ala1 5 10 15

Gly Gln Tyr Leu 20 Ser Glu Gly Asn Cys 25 Lys Pro Cys Arg Glu 30 Gly lie

Asp Tyr Thr 35 Ser His Ser Asn His 40 Ser Leu Asp Ser Cys 45 lie Leu Cys

Thr Vai 50 Cys Lys Glu Asp Lys 55 Vai Vai Glu Thr Arg 60 Cys Asn lie Thr

.Thr Asn 65 Thr Vai Cys Arg 70 Cys Lys Pro Gly Thr 75 Phe Glu Asp Lys Asp 80

Ser Pro Glu lie Cys 85 Gln Ser Cys Ser Asn 90 Cys Thr Asp Gly Glu 95 Glu

Glu Leu Thr Ser 100 Cys Thr Pro Arg Glu 105 Asn Arg Lys Cys Vai 110 Ser Lys

Thr Ala Trp 115 Ala Ser Trp His Lys 120

<210> <211> <212> <213> 606 281 PRT Homo sapiens

<400> 606

Met Ala 1 Met Met Glu 5 Vai Gln Gly Gly Pro 10 Ser Leu Gly Gln Thr 15 Cys

Vai Leu lie Vai 20 lie Phe Thr Vai Leu 25 Leu Gln Ser Leu Cys 30 Vai Ala

Vai Thr Tyr 35 Vai Tyr Phe Thr Asn 40 Glu Leu Lys Gln Met 45 Gln Asp Lys

Tyr Ser Lys Ser Gly lie Ala Cys Phe Leu Lys Glu Asp Asp Ser Tyr

50 55 60

Trp Asp Pro Asn Asp Glu Glu Ser Met Asn Ser Pro Cys Trp Gln Vai65 70 75 80Lys Trp Gln Leu Arg Gln Leu Vai Arg Lys Met lie Leu Arg Thr Ser85 90 95

Glu Glu Thr lie Ser Thr Vai Gln Glu Lys Gln Gln Asn lie Ser Pro100 105 110

Leu Vai Arg Glu Arg Gly Pro Gln Arg Vai Ala Ala His lie Thr Gly115 120 125

Thr Arg Gly Arg Ser Asn Thr Leu Ser Ser Pro Asn Ser Lys Asn Glu130 135 140

Lys Ala Leu Gly Arg Lys lie Asn Ser Trp Glu Ser Ser Arg Ser Gly145 150 155 160

His Ser Phe Leu Ser Asn Leu His Leu Arg Asn Gly Glu Leu Vai lie165 170 175

His Glu Lys Gly Phe Tyr Tyr lie Tyr Ser Gln Thr Tyr Phe Arg Phe180 185 190

Gln Glu Glu lie Lys Glu Asn Thr Lys Asn Asp Lys Gln Met Vai Gln195 200 205

Tyr lie Tyr Lys Tyr Thr Ser Tyr Pro Asp Pro lie Leu Leu Met Lys210 215 220

Ser Ala Arg Asn Ser Cys Trp Ser Lys Asp Ala Glu Tyr Gly Leu Tyr225 230 235 240

Ser —HL- e—T yr-<3in— Giy-G-l-y—lie—P he-Si-u—Le u—Lys—G-lu—Asn—Asp—Arg—íie-245 250 255

Phe Vai Ser Vai Thr Asn Glu His Leu lie Asp Met Asp His Glu Ala260 265 270

Ser Phe Phe Gly Ala Phe Leu Vai Gly275 280

<210> 607

<211> 168

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Apo-2L sintético

<400> 607

Vai Arg Glu Arg Gly Pro Gln Arg Vai Ala Ala His lie Thr Gly Thr1 5 10 15

Arg Gly Arg Ser Asn Thr Leu Ser Ser Pro Asn Ser Lys Asn Glu Lys20 25 30

Ala Leu Gly Arg Lys lie Asn Ser Trp Glu Ser Ser Arg Ser Gly His35 40 45Ser Phe Leu Ser Asn Leu50

Glu Lys Gly Phe Tyr Tyr65 70

Glu Glu lie Lys Glu Asn85

lie Tyr Lys Tyr Thr Ser100

Ala Arg Asn Ser Cys Trp115

lie Tyr Gln Gly Gly lie130

Vai Ser Vai Thr Asn Glu145 150

Phe Phe Gly Ala Phe Leu165

<210> 608<211> 6<212> PRT<213> Artificial

<220>

«2-2-3>—GBR-H-3—s-i-n-fcéti-eo

<220>

<221> MISC_FEATURE<222> (1)..(3)<223> X são quaisquer aminoácido, exceto cistéina

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (4) .. (4)

<223> X é qualquer aminoácido e pode variar em comprimento<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (5)..(6)

<223> X são quaisquer aminoácido, exceto cistéina

<400> 608

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa1 5

<210> 609

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial

His Leu Arg Asn Gly Glu Leu Vai lie His55 60

lie Tyr Ser Gln Thr Tyr Phe Arg Phe Gln75 80

Thr Lys Asn Asp Lys Gln Met Vai Gln Tyr90 95

Tyr Pro Asp Pro lie Leu Leu Met Lys Ser105 110

Ser Lys Asp Ala Glu Tyr Gly Leu Tyr Ser120 125

Phe Glu Leu Lys Glu Asn Asp Arg lie Phe135 140

His Leu lie Asp Met Asp His Glu Ala Ser

155 160

Vai Gly<220>

<223> CDRL3 sintético<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1) . . (5)

<223> X é S ou qualquer um de Y, W, R, ou F<220>

<221> misc_feature

<222> (6)..(6)

<223> Xaa pode ser qualquer aminoácido que ocorre naturalmente<220>

<221> misc_feature

<222> (8) .. (8)

<223> Xaa pode ser qualquer aminoácido que ocorre naturalmente

<400> 609

Gln Gln Xaa Xaa Xaa Xaa Pro Xaa Thr

<210> 610

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDRL3 sintético

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(5)

<223> X são quaisquer aminoácido, exceto cistéina<220>

<221> misc_feature

<222> (6)..(6)

<223> Xaa pode ser qualquer aminoácido que ocorre naturalmente<220>

<221> misc_feature

<222> (8)..(8)

<223> Xaa pode ser qualquer aminoácido que ocorre naturalmente

<400> 610

Gln Gln Xaa Xaa Xaa Xaa Pro Xaa Thr1 5

<210> 611

<211> 19

<212> PRT

<213> Artificial

<220><223> CDRH3 sintético<220>

<221> MISC_FEATURE<222> (1)..(17)

<223> X é S ou qualquer um de A, C, F, G, I, L, W, P, R, T, W, ouY, ou não esta presente

<220>

<221> MISC_FEATURE<222> (18)..(18)

<223> X é G ou A, ou não esta presente<220>

<221> MISC_FEATURE<222> (19)..(19)

<223> X é F, L, I, ou M, ou não esta presente<400> 611

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa15 10 15

Xaa Xaa Xaa

<210> 612

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDRH1 sintético<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (3) . . (3)

<223> X é S ou qualquer um do Y, W, R, ou F<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (5)..(8)

<223> X é S ou qualquer um do Y, W, R, ou F

<400> 612

Gly Phe Xaa lie Xaa Xaa Xaa Xaa lie His

1 5 10

<210> 613

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDRH2 sintético<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(1)

<223> X é S ou qualquer um de Y, W, R, ou F<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (3) . . (3)

<223> X é S ou qualquer um de Y, W, R, ou F<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (5)..(6)

<223> X é S ou qualquer um de Y, W, R, ou F<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (8)..(8)

<223> X is S and one of Y, W, R, or F<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (10) . . (10)......

<223> X é S ou qualquer um de of Y, W, R, õu F

<400> 613

Xaa Ile Xaa Pro Xaa Xaa Gly Xaa Thr Xaa Tyr Ala Asp Ser Vai Lys15 10 15

Gly

<210> 614

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDRH1 sintético<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1) . . (5)

<223> X é qualquer aminoácido, exceto cistéina<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (6)..(8)

<223> Xaa pode ser qualquer aminoácido que ocorre naturalmente

<400> 614

Gly Phe Xaa Ile Xaa Xaa Xaa Xaa Ile His15 10

<210> 615<211> <212> <213> 17 PRT Artificial

<220> <223> CDRH2 sintético

<220> <221> <222> <223> MISC FEATURE (D • • (D X é qualquer aminoácido, exceto cistéina

<220> <221> <222> <223> MISC FEATURE (3)..(3) X é qualquer aminoácido, exceto cistéina

<220> <221> <222> .<2.23>- MISC FEATURE (5) . . (6) . X. .é._q.ual.q.u.er. aminoácido.,.. exceto -cis-téina

<220> <221> <222> <223> MI SC FEATURE (8) . . (8) X é qualquer aminoácido, exceto cistéina

<220> <221> <222> <2-23> - MISC FEATURE (10)..(10) X é qualquer aminoácido, exceto cistéina

<400> 615

Xaa lie Xaa Pro Xaa Xaa Gly Xaa 1 5 Thr Xaa 10 Tyr Ala Asp Ser

Gly <210> <211> <212> <213> 616 10 PRT Artificial

<220> <223> CDRH3 sintético

<220> <221> <222> <223> MI SC FEATURE (D . . (5) X é qualquer aminoácido, exceto cistéina

<220> <221> <222> <223> MISC FEATURE (6)..(6) X é qualquer aminoácido, exceto cistéina, e pode

15comprimento

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (7) .. (8)

<223> X é qualquer aminoácido, exceto cistéina

<400> 616

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Asp Tyr15 10

<210> 617

<211> 21

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDRH3 sintético

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(1)

<223> X é Y, S, G, R, ou E

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (2)..(2)

<223> X é Y, S, G, R, M, ou A

<220> -

<221> MISC_FEATURE

<222> (3)..(3)

<223> X é Y, S, G, R, W, ou H<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (4)..(4)

<223> X é Y, S, G, R, F, ou Q<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (5)..(5)

<223> X é G, Y, N, A, ou S

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (6)..(6)

<223> X é F, M, L, A, R, G, H, W, V, Y, ou S<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (7)..(7)

<223> X é M, L, G, A, R, F, Y, or S, ou não esta presente<220><221> MISC_FEATURE<222> (8)..(8)

<223> X é M, L, F, I, R, G, P, V, Y, ou S, ou não esta presente

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (9) .. (9)

<223> X é G, Y, R, ou S, ou não esta presente

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (10) . . (10)

<223> X é M, F, G, Y, R, ou S, ou não esta presente

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (11)..(11)

<223> X é A, G, Y, R, ou S, ou não esta presente

<220>

<221> MISC FEATURE

<222> (12) . . (12)

<223> X é T, M,_F_/._A./....G.,_R.,_-T.^_Y-,_o.u_-S-,_jQlu.,não_e.s±.a_prjas„ent.e

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (13) . . (13)

<223> X é F, M, L, G, A, T, Y, ou S, ou não esta presente

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (14) . . (14)

<223> X é L, F, M, I, G, A, T, ou Y, ou não esta presente

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (15)..(15)

<223> X é M, Y, G, L, ou R, ou não esta presente

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (16)..(16)

<223> X é Y ou G, ou não esta presente<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (17) . . (17)

<223> X é R, M, ou G, ou não esta presente

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (18) . . (18)

<223> X é G ou A

<220><221>

MISC FEATURE<222> (19)..(19)

<223> X é F, M, L, ou I

<400> 617

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa1 5 10 15

Xaa Xaa Xaa Asp Tyr20

<210> 618<211> 48<212> DNA<213> Artificial

<220>

<223> oligonucleotideos sintéticos<400> 618

gcagcttctg gcttctmtat ttmttmttmt tmtatacact gggtgcgt 48.

<210> 619

<211> 60

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> oligonucleotideos sintéticos<400> 619 - .........

ctggaatggg ttgcatmtat ttmtccatmt tmtggttmta cttmttatgc cgatagcgtc 60

<210> 620

<211> 54

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> oligonucleotideos sintéticos<400> 620

acttattact gtcagcaatm ttmttmttmt ccatmtacgt tcggacaggg tacc 54

<210> 621

<211> 54

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> oligonucleotideos sintéticos<400> 621

gtctattatt gtgctcgckc tkctkctkct gstwtkgact actggggtca agga 54

<210> 622<211> 57

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> oligonucleotídeos sintéticos

<400> 622

gtctattatt gtgctcgckc tkctkctkct kctgstwtkg actactgggg tcaagga

<210> 623

<211> 60

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> oligonucleotídeos sintéticos

<400> 623

gtctattatt gtgctcgckc tkctkctkct kctkctgstw tkgactactg gggtcaagga

<210> 624

<211> 63

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> oligonucleotídeos sintéticos

<400> 624

gtctattatt gtgctcgckc tkctkctkct kctkctkctg stwtkgacta ctggggtcaa

gga

<210> 625

<211> 66

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> oligonucleotídeos

<400> 625

gtctattatt gtgctcgckc tkctkctkct kctkctkctk ctgstwtkga ctactggggt

caagga

<210> 626

<211> 69

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> oligonucleotídeos sintéticos

<400> 626gtctattatt gtgctcgckc tkctkctkct kctkctkctk ctkctgstwt kgactactgg 60

ggtcaagga 69

<210> 627

<211> 72

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> oligonucleotídeos sintéticos<400> 627

gtctattatt gtgctcgckc tkctkctkct kctkctkctk ctkctkctgs twtkgactac 60

tggggtcaag ga 72

<210> 628<211> 75<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> oligonucleotideos sintéticos

<400> 628

gtctattatt gtgctcgckc tkctkctkct kctkctkctk ctkctkctkc tgstwtkgac 60

tactggggtc aagga 75

<210> 629

<211> 78

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> oligonucleotideos sintéticos<400> 629

gtctattatt gtgctcgckc tkctkctkct kctkctkctk ctkctkctkc tkctgstwtk 60

gactactggg gtcaagga 78

<210> 630

<211> 81

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> oligonucleotideos sintéticos<400> 630

gtctattatt gtgctcgckc tkctkctkct kctkctkctk ctkctkctkc tkctkctgst 60

wtkgactact ggggtcaagg a

81<210> 631

<211> 84

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> oligonucleotideos sintéticos<400> 631

gtctattatt gtgctcgckc tkctkctkct kctkctkctk ctkctkctkc tkctkctkct 60

gstwtkgact actggggtca agga 84

<210> 632

<211> 87

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> oligonucleotideos sintéticos<400> 632

gtctattatt gtgctcgckc tkctkctkct kctkctkctk ctkctkctkc tkctkctkct 60

kctgstwtkg actactgggg tcaagga 87

<210> 633

<211> 90

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> oligonucleotideos sintéticos<400> 633

gtctattatt gtgctcgckc tkctkctkct kctkctkctk ctkctkctkc tkctkctkct 60

kctkctgstw tkgactactg gggtcaagga

<210> 634

<211> 93

<212> DNA

<213> Artificial

90

<220>

<223> oligonucleotideos sintéticos<400> 634

gtctattatt gtgctcgckc tkctkctkct kctkctkctk ctkctkctkc tkctkctkct 60

kctkctkctg stwtkgacta ctggggtcaa gga 93

<210> 635

<211> 54

<212> DNA

<213> Artificialgga

<210> 639

<211> 66

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> oligonucleotideos

<400> 639

54

<220>

<223> oligonucleotideos sintéticos<400> 635

gtctattatt gtgctcgcts ctsctsctsc gstwtkgact actggggtca agga

<210> 636

<211> 57

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> oligonucleotideos sintéticos<400> 636

gtctattatt gtgctcgcts ctsctsctsc tscgstwtkg actactgggg tcaagga 57

<210> 637

<211> 60

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> oligonucleotideos sintéticos

<400> 637

- gtctattatt gtgctcgcts ctsctsctsc tsctscgstw tkgactactg gggtcaagga 60

<210> 638

<211> 63

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> oligonucleotideos sintéticos<400> 638

gtctattatt gtgctcgcts ctsctsctsc tsctsctscg stwtkgacta ctggggtcaa 60

63

gtctattatt gtgctcgcts ctsctsctsc tsctsctsct scgstwtkga ctactggggt 60

caagga

66

<210> 640<211> 69<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> oligonucleotideos sintéticos<400> 640

gtctattatt gtgctcgcts ctsctsctsc tsctsctsct sctscgstwt kgactactgg 60

ggtcaagga 69

<210> 641

<211> 72

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> oligonucleotideos sintéticos<400> 641

gtctattatt.-gtgctcgcts- -ctsctsctsc.tsctsctsct sctsctscg.s._twtkg.actac.....6.0

tggggtcaag ga 72

<210> 642

<211> 75

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223>- oligonucleotideos sintéticos<400> 642

gtctattatt gtgctcgcts ctsctsctsc tsctsctsct sctsctscts cgstwtkgac 60

tactggggtc aagga 75

<210> 643

<211> 78

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> oligonucleotideos sintéticos<400> 643

gtctattatt gtgctcgcts ctsctsctsc tsctsctsct sctsctscts ctscgstwtk 60

gactactggg gtcaagga 78

<210> 644

<211> 81

<212> DNA

<213> Artificial

<220><223> oligonucleotideos sintéticos<400> 644

gtctattatt gtgctcgcts ctsctsctsc tsctsctsct sctsctscts ctsctscgst 60

wtkgactact ggggtcaagg a 81

<210> 645

<211> 84

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> oligonucleotideos sintéticos<400> 645

gtctattatt gtgctcgcts ctsctsctsc tsctsctsct sctsctscts ctsctsctsc 60

gstwtkgact actggggtca agga 84

<210> 646 <211> 87

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> oligonucleotideos sintéticos<400> 646

gtctattatt gtgctcgcts ctsctsctsc tsctsctsct sctsctscts ctsctsctsc 60

tscgstwtkg actactgggg tcaagga87

<210> 647<211> 90<212> DNA<213> Artificial

<220>

<223> oligonucleotideos sintéticos<400> 647

gtctattatt gtgctcgcts ctsctsctsc tsctsctsct sctsctscts ctsctsctsc 60

tsctscgstw tkgactactg gggtcaagga

<210> 648

<211> 93

<212> DNA

<213> Artificial

90

<220>

<223> oligonucleotideos sintéticos

<400> 648gtctattatt gtgctcgcts ctsctsctsc tsctsctsct sctsctscts ctsctsctsc 60

tsctsctscg stwtkgacta ctggggtcaa gga 93

<210> 649

<211> 54

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> oligonucleotideos sintéticos<400> 649

gtctattatt gtgctcgcty ctyctyctyc gstwtkgact actggggtca agga 54

<210> 650<211> 57<212> DNA<213> Artificial

<220>

<223> oligonucleotideos sintéticos

<400> 650

gtctattatt gtgctcgcty ctyctyctyc tycgstwtkg actactgggg tcaagga 57

<210> 651

<211> 60

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> oligonucleotideos sintéticos<400> 651

gtctattatt gtgctcgcty ctyctyctyc tyctycgstw tkgactactg gggtcaagga 60

<210> 652

<211> 63

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> oligonucleotideos sintéticos<400> 652

gtctattatt gtgctcgcty ctyctyctyc tyctyctycg stwtkgacta ctggggtcaa 60

gga

<210> 653

<211> 66

<212> DNA

<213> Artificial

63

<220><223> oligonucleotideos sintéticos<400> 653

gtctattatt gtgctcgcty ctyctyctyc tyctyctyct ycgstwtkga ctactggggt 60

caagga 66

<210> 654

<211> 69

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> oligonucleotideos sintéticos<400> 654

gtctattatt gtgctcgcty ctyctyctyc tyctyctyct yctycgstwt kgactactgg 60

ggtcaagga 69

<210> 655

<211> 72

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> oligonucleotideos sintéticos<400> 655

gtctattatt gtgctcgcty ctyctyctyc tyctyctyct yctyctycgs twtkgactac 60

tggggtcaag ga 72

<210> 656

<211> 75

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> oligonucleotideos sintéticos<400> 656

gtctattatt gtgctcgcty ctyctyctyc tyctyctyct yctyctycty cgstwtkgac 60

tactggggtc aagga 75

<210> 657

<211> 78

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> oligonucleotideos sintéticos

<400> 657

gtctattatt gtgctcgcty ctyctyctyc tyctyctyct yctyctycty ctycgstwtk

60gactactggg gtcaagga

<210> 658

<211> 81

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> oligonucleotideos sintéticos<400> 658

gtctattatt gtgctcgcty ctyctyctyc tyctyctyct yctyctycty ctyctycgst 60

wtkgactact ggggtcaagg a 81

<210> 659<211> 84<212> DNA<213> Artificial

<220> <223> oligonucleotideos sintéticos

<400> 659

gtctattatt gtgctcgcty ctyctyctyc tyctyctyct yctyctycty ctyctyctyc 60

gstwtkgact actggggtca agga 84

<210> 660

<211> 87

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> oligonucleotideos sintéticos<400> 660

gtctattatt gtgctcgcty ctyctyctyc tyctyctyct yctyctycty ctyctyctyc 60

tycgstwtkg actactgggg tcaagga 87

<210> 661

<211> 90

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> oligonucleotideos sintéticos<400> 661

gtctattatt gtgctcgcty ctyctyctyc tyctyctyct yctyctycty ctyctyctyc 60

tyctycgstw tkgactactg gggtcaagga

<210> 662<211> 93

90<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> oligonucleotideos sintéticos<400> 662

gtctattatt gtgctcgcty ctyctyctyc tyctyctyct yctyctycty ctyctyctyc 60tyctyctycg stwtkgacta ctggggtcaa gga 93

<210> 663

<211> 54

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> oligonucleotideos sintéticos

<400> 663

gtctattatt gtgctcgcrg- crgcrgcrgc gstwtkgact <210> 664

<211> 57

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> oligonucleotideos sintéticos

<400> 664

gtctattatt gtgctcgcrg crgcrgcrgc rgcgstwtkg <210> 665

<211> 60

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> oligonucleotideos sintéticos

<400> 665

gtctattatt gtgctcgcrg crgcrgcrgc rgcrgcgstw <210> 666

<211> 63

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> oligonucleotideos sintéticos

<400> 666

.54

57

gtctattatt gtgctcgcrg crgcrgcrgc rgcrgcrgcg stwtkgacta ctggggtcaa 60

gga

63<210> 667

<211> 66

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> oligonucleotideos sintéticos

<400> 667

gtctattatt gtgctcgcrg crgcrgcrgc rgcrgcrgcr gcgstwtkga ctactggggt 60

caagga 66

<210> 668

<211> 69

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> oligonucleotideos sintéticos

<400> 668

gtctattatt gtgctcgcrg crgcrgcrgc rgcrgcrgcr gcrgcgstwt kgactactgg 60

ggtcaagga 69

<210> 669

<211> 72

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> oligonucleotideos sintéticos<400> 669

gtctattatt gtgctcgcrg crgcrgcrgc rgcrgcrgcr gcrgcrgcgs twtkgactac 60

tggggtcaag ga 72

<210> 670

<211> 75

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> oligonucleotideos sintéticos<400> 670

gtctattatt gtgctcgcrg crgcrgcrgc rgcrgcrgcr gcrgcrgcrg cgstwtkgac 60

tactggggtc aagga 75

<210> 671

<211> 78

<212> DNA

<213> Artificial<220>

<223> oligonucleotídeos sintéticos<400> 671

gtctattatt gtgctcgcrg crgcrgcrgc rgcrgcrgcr gcrgcrgcrg crgcgstwtk 60

gactactggg gtcaagga 78

<210> 672

<211> 81

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> oligonucleotideos sintéticos<400> 672

gtctattatt gtgctcgcrg crgcrgcrgc rgcrgcrgcr gcrgcrgcrg crgcrgcgst 60wtkgactact ggggtcaagg a 81

<210> 673

<211> 84

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> oligonucleotideos sintéticos<400> 673

gtctattatt gtgctcgcrg crgcrgcrgc rgcrgcrgcr gcrgcrgcrg crgcrgcrgc 60

gstwtkgact actggggtca agga 84

<210> 674

<211> 87

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> oligonucleotideos sintéticos<400> 674

gtctattatt gtgctcgcrg crgcrgcrgc rgcrgcrgcr gcrgcrgcrg crgcrgcrgc 60

rgcgstwtkg actactgggg tcaagga 87

<210> 675

<211> 90

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> oligonucleotideos sintéticos<400> 675gtctattatt gtgctcgcrg crgcrgcrgc rgcrgcrgcr gcrgcrgcrg crgcrgcrgc 60

rgcrgcgstw tkgactactg gggtcaagga 90

<210> 676

<211> 93

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> oligonucleotideos sintéticos<400> 676

gtctattatt gtgctcgcrg crgcrgcrgc rgcrgcrgcr gcrgcrgcrg crgcrgcrgc 60

rgcrgcrgcg stwtkgacta ctggggtcaa gga 93

<210> 677

<211> 54

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> oligonucleotideos sintéticos

<400> 677

gtctattatt gtgctcgcak cakcakcakc gstwtkgact actggggtca agga 54

<210> 678

<211> 57

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> oligonucleotideos sintéticos

<400> 678

gtctattatt gtgctcgcak cakcakcakc akcgstwtkg actactgggg tcaagga 57

<210> 679

<211> 60

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> oligonucleotideos sintéticos<400> 679

gtctattatt gtgctcgcak cakcakcakc akcakcgstw tkgactactg gggtcaagga 60

<210> 680

<211> 63

<212> DNA

<213> Artificial

<220><223> oligonucleotideos sintéticos

<400> 680

gtctattatt gtgctcgcak cakcakcakc akcakcakcg stwtkgacta ctggggtcaa 60

gga 63

<210> 681

<211> 66

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> oligonucleotideos sintéticos

<400> 681

gtctattatt gtgctcgcak cakcakcakc akcakcakca kcgstwtkga ctactggggt 60

caagga 66

<210> 682 <211> 69

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> oligonucleotideos sintéticos

<400> 682

gtctattatt gtgctcgcak cakcakcakc akcakcakca kcakcgstwt kgactactgg 60ggtcaagga " ~ " ' ~~" ' 69

<210> 683

<211> 72

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> oligonucleotideos sintéticos

<400> 683

gtctattatt gtgctcgcak cakcakcakc akcakcakca kcakcakcgs twtkgactac 60

tggggtcaag ga 72

<210> 684

<211> 75

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> oligonucleotideos sintéticos

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gtctattatt gtgctcgcak cakcakcakc akcakcakca kcakcakcak cgstwtkgac 60tactggggtc aagga 75

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<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> oligonucleotideos sintéticos

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gtctattatt gtgctcgcak cakcakcakcgactactggg gtcaagga

akcakcakca kcakcakcak cakcgstwtk 60

78

<210> 686

<211> 81

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> oligonucleotideos sintéticos

<400> 686

gtctattatt gtgctcgcak cakcakcakcwtkgactact ggggtcaagg a

akcakcakca kcakcakcak cakcakcgst 60

81

<210> 687<211> 84<212> DNA<213> " Artificial"

<220>

<223> oligonucleotideos sintéticos

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gtctattatt gtgctcgcak cakcakcakcgstwtkgact actggggtca agga

akcakcakca kcakcakcak cakcakcakc 60

84

<210> 688

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<212> DNA

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<220>

<223> oligonucleotideos sintéticos

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gtctattatt gtgctcgcak cakcakcakcakcgstwtkg actactgggg tcaagga

akcakcakca kcakcakcak cakcakcakc 60

87

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<213> Artificial

<220>

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gtctattatt gtgctcgcak cakcakcakc akcakcakca kcakcakcak cakcakcakc 60

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90

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gtctattatt gtgctcgcak cakcakcakc akcakcakca kcakcakcak cakcakcakc 60

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<212> DNA

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<220>

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<213> Artificial

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<213> Artificial

<220>

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63

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<212> DNA

<213> Artificial

<220>

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gtctattatt gtgctcgcty atyatyatya tyatyatyat yagstwtkga ctactggggt 60

66

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<213> Artificial

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<212> DNA

<213> Artificial

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tggggtcaag ga 72

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<212> DNA

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<212> DNA

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<220>

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<212> DNA

<213> Artificial

<220>

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gtctattatt gtgctcgcty atyatyatya tyatyatyat yatyatyaty atyatyagst 60

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<213> Artificial

<220>

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gtctattatt gtgctcgcty atyatyatya tyatyatyat yatyatyaty atyatyatya 60

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<212> DNA

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<220>

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<212> DNA

<213> Artificial

<220>

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gtctattatt gtgctcgcty atyatyatya tyatyatyat yatyatyaty atyatyatya 60

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<212> DNA

<213> Artificial

90

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<212> DNA

<213> Artificial

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<213> Artificial

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<213> Artificial

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<213> Artificial

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<212> DNA

<213> Artificial

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<212> DNA

<213> Artificial

<220>

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gtctattatt gtgctcgcar carcarcarc arcarcarca rcarcarcgs twtkgactac 60tggggtcaag ga 72

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<213> Artificial

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<220>

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<223> oligonucleotideos sintéticos<400> 7Í4

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<212> DNA

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<220>

<223> oligonucleotideos sintéticos<400> 715

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<220>

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<212> DNA

<213> Artificial

<220>

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gtctattatt gtgctcgcar carcarcarc arcarcarca rcarcarcar carcarcarc 60

arcarcgstw tkgactactg gggtcaagga 90

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<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> oligonucleotideos sintéticos

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gtctattatt gtgctcgcar carcarcarc arcarcarca rcarcarcar carcarcarc 60

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<212> DNA

<213> Artificial

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<213> Artificial

<220>

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<212> DNA

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<212> DNA

<213> Artificial

<220>

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gga

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<212> DNA

<213> Artificial

<220>

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<212> DNA

<213> Artificial

<220>

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gtctattatt gtgctcgcyc tyctyctyct yctyctycty ctyctgstwt kgactactggggtcaagga

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tggggtcaag ga 72

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<212> DNA

<213> Artificial

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gtctattatt gtgctcgcyc tyctyctyct yctyctycty ctyctyctyc tgstwtkgac 60

tactggggtc aagga 75

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<211> 78

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> oligonucleotideos sintéticos

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gtctattatt gtgctcgcyc tyctyctyct yctyctycty ctyctyctyc tyctgstwtk 60

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<212> DNA

<213> Artificial

<220>

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<213> Artificial

<220>

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<212> DNA

<213> Artificial

<220>

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<212> DNA

<213> Artificial

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<223> oligonucleotideos sintéticos<400> 731

gtctattatt gtgctcgcyc tyctyctyct yctyctycty ctyctyctyc tyctyctyct 60yctyctgstw tkgactactg gggtcaagga 90

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<213> Artificial

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<212> DNA

<213> Artificial

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<223> oligonucleotideos sintéticos<400> 733

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<213> Artificial

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<212> DNA

<213> Artificial

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<212> DNA

<213> Artificial

<220>

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gtctattatt gtgctcgcmg cmgcmgcmgc mgcmgcmgcg stwtkgacta ctggggtcaa 60

gga

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<212> DNA

<213> Artificial

<220>

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63

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caagga 66

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<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> oligonucleotideos sintéticos

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<212> DNA

<213> Artificial

<220>

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mgcmgcmgcm gcmgcmgcgs twtkgactac 60

72

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<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> oligonucleotídeos sintéticos

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<220>

<223> oligonucleotídeos sintéticos

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<213> Artificial

<220>

<223> oligonucleotídeos sintéticos

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<212> DNA

<213> Artificial

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mgcgstwtkg actactgggg tcaagga 87

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<212> DNA

<213> Artificial

<220>

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<212> DNA

<213> Artificial

90

<220>

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<212> DNA

<213> Artificial<220>

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<212> DNA

<213> Artificial

<220>

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<213> Artificial

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<212> DNA

<213> Artificial

<220>

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gtctattatt gtgctcgcas cascascasc ascascascg stwtkgacta ctggggtcaa 60

63

gga

<210> 751

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<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> oligonucleotideos

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<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> oligonucleotideos sintéticos<400> 752

gtctattatt gtgctcgcas cascascasc ascascasca scascgstwt kgactactgg 60

ggtcaagga 69

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<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> oligonucleotideos sintéticos<400> 753

gtctattatt gtgctcgcas cascascasc ascascasca scascascgs twtkgactac 60

tggggtcaag ga ^2

<210> 754

<211> 75

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> oligonucleotideos sintéticos<400> 754

gtctattatt gtgctcgcas cascascasc ascascasca scascascas cgstwtkgac 60

tactggggtc aagga 75

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<212> DNA

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<212> DNA

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<212> DNA

<213> Artificial

<220>

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gtctattatt gtgctcgcas cascascasc ascascasca scascascas cascascasc 60

gstwtkgact actggggtca agga 84

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<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> oligonucleotideos sintéticos<400> 758

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<212> DNA

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ascascgstw tkgactactg gggtcaagga

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<212> DNA

<213> Artificial

90

<220>

<223> oligonucleotideos sintéticos

<400> 760

gtctattatt gtgctcgcas cascascasc ascascasca scascascas cascascasc 60ascascascg stwtkgacta ctggggtcaa gga 93

<210> 761

<211> 54

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> oligonucleotideos sintéticos

<400> 761

gtctattatt gtgctcgcts gtsgtsgtsg gstwtkgact actggggtca agga 54

<210> 762

<211> 57

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> oligonucleotideos sintéticos

<400> 762

gtctattatt gtgctcgcts gtsgtsgtsg tsggstwtkg actactgggg tcaagga 57

<210> 763

<211> 60

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> oligonucleotideos sintéticos

<400> 763

gtctattatt gtgctcgcts gtsgtsgtsg tsgtsggstw tkgactactg gggtcaagga 60

<210> 764

<211> 63

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> oligonucleotideos sintéticos

<400> 764

gtctattatt gtgctcgcts gtsgtsgtsg tsgtsgtsgg stwtkgacta ctggggtcaa 60

gga 63

<210> 765

<211> 66

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> oligonucleotideos sintéticos

<400> 765256

gtctattatt gtgctcgcts gtsgtsgtsg tsgtsgtsgt sggstwtkga ctactggggt 60

caagga 66

<210> 766

<211> 69

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> oligonucleotideos sintéticos<400> 766

gtctattatt gtgctcgcts gtsgtsgtsg tsgtsgtsgt sgtsggstwt kgactactgg 60

ggtcaagga 69

<210> 767

<211> 72

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> oligonucleotideos sintéticos<400> 767

gtctattatt gtgctcgcts gtsgtsgtsg tsgtsgtsgt sgtsgtsggs twtkgactac 60

tggggtcaag ga 72

<210> 768

<211> 75

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> oligonucleotideos sintéticos<400> 768

gtctattatt gtgctcgcts gtsgtsgtsg tsgtsgtsgt sgtsgtsgts ggstwtkgac 60

tactggggtc aagga 75

<210> 769

<211> 78

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> oligonucleotideos sintéticos<400> 769

gtctattatt gtgctcgcts gtsgtsgtsg tsgtsgtsgt sgtsgtsgts gtsggstwtk 60gactactggg gtcaagga 78<210> 770

<211> 81

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> oligonucleotideos sintéticos<400> 770

gtctattatt gtgctcgcts gtsgtsgtsg tsgtsgtsgt sgtsgtsgts gtsgtsggst 60

wtkgactact ggggtcaagg a 81

<210> 771

<211> 84

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> oligonucleotideos sintéticos<400> 771

gtctattatt gtgctcgcts gtsgtsgtsg tsgtsgtsgt sgtsgtsgts gtsgtsgtsg 60

gstwtkgact actggggtca agga 84

<210> 772

<211> 87

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> oligonucleotideos sintéticos<400> 772

gtctattatt gtgctcgcts gtsgtsgtsg tsgtsgtsgt sgtsgtsgts gtsgtsgtsg 60

tsggstwtkg actactgggg tcaagga 87

<210> 773

<211> 90

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> oligonucleotideos sintéticos<400> 773

gtctattatt gtgctcgcts gtsgtsgtsg tsgtsgtsgt sgtsgtsgts gtsgtsgtsg 60

tsgtsggstw tkgactactg gggtcaagga

<210> 774

<211> 93

<212> DNA

<213> Artificial

90<220>

<223> oligonucleotideos sintéticos<400> 774

gtctattatt gtgctcgcts gtsgtsgtsg tsgtsgtsgt sgtsgtsgts gtsgtsgtsg 60

tsgtsgtsgg stwtkgacta ctggggtcaa gga 93

<210> 775

<211> 54

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> oligonucleotideos sintéticos<400> 775

. gtctattatt gtgctcgctm ttmttmttmt gstwtkgact actggggtca agga 54

<210> 776

<211> 57

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> oligonucleotideos sintéticos<400> 776

gtctattatt gtgctcgctm ttmttmttmt tmtgstwtkg actactgggg tcaagga 57

<210> 777

<211> 60

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> synthetic oligonucleotides<400> 777

gtctattatt gtgctcgctm ttmttmttmt tmttmtgstw tkgactactg gggtcaagga 60

<210> 778

<211> 63

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> oligonucleotideos sintéticos<400> 778

gtctattatt gtgctcgctm ttmttmttmt tmttmttmtg stwtkgacta ctggggtcaa 60gga 63

<210><211>

77966<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> oligonucleotideos sintéticos<400> 779

gtctattatt gtgctcgctm ttmttmttmt tmttmttmtt mtgstwtkga ctactggggt 60

caagga 66

<210> 780

<211> 69

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> oligonucleotideos sintéticos<400> 780

gtctattatt gtgctcgctm ttmttmttmt tmttmttmtt mttmtgstwt kgactactgg 60

ggtcaagga 69

<210> 781

<211> 72

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> oligonucleotideos sintéticos<400> 781

gtctattatt gtgctcgctm ttmttmttmt tmttmttmtt mttmttmtgs twtkgactac 60

tggggtcaag ga 72

<210> 782

<211> 75

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> oligonucleotideos sintéticos<400> 782

gtctattatt gtgctcgctm ttmttmttmt tmttmttmtt mttmttmttm tgstwtkgac 60

tactggggtc aagga 75

<210> 783

<211> 78

<212> DNA

<213> Artificial

<220><223> oligonucleotideos sintéticos<400> 783

gtctattatt gtgctcgctm ttmttmttmt tmttmttmtt mttmttmttm ttmtgstwtk 60

gactactggg gtcaagga 78

<210> 784

<211> 81

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> oligonucleotideos sintéticos<400> 784

gtctattatt gtgctcgctm ttmttmttmt tmttmttmtt mttmttmttm ttmttmtgst 60

wtkgactact ggggtcaagg a 81

<210> 785

<211> 84

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> oligonucleotideos sintéticos<400> 785

gtctattatt gtgctcgctm ttmttmttmt tmttmttmtt mttmttmttm ttmttmttmt 60

gstwtkgact actggggtca agga 84

<210> 786

<211> 87

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> oligonucleotideos sintéticos<400> 786

gtctattatt gtgctcgctm ttmttmttmt tmttmttmtt mttmttmttm ttmttmttmt 60

tmtgstwtkg actactgggg tcaagga 87

<210> 787

<211> 90

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> oligonucleotideos sintéticos

<400> 787

gtctattatt gtgctcgctm ttmttmttmt tmttmttmtt mttmttmttm ttmttmttmt

60tmttmtgstw tkgactactg gggtcaagga

<210> 788

<211> 93

<212> DNA

<213> Artificial

90

<220>

<223> oligonucleotideos sintéticos<400> 788

gtctattatt gtgctcgctm ttmttmttmt tmttmttmtt mttmttmttm ttmttmttmt 60

tmttmttmtg stwtkgacta ctggggtcaa gga 93

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<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

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Gln Gln Ser Tyr Tyr Ser Pro Ser Thr1 5

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<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDRL3 sintético<400> 790

Gln Gln Ser Tyr Tyr Ser Pro Ser Thr1 5

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<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDRL3 sintético<400> 791

Gln Gln Ser Tyr Tyr Tyr Pro Ser Thr1 5

<210> 792<211> 9<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDRL3 sintético<400> 792

Gln Gln Ser Tyr Tyr Ser Pro Ser Thr

<210> 793

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDRL3 sintético

<400> 793

Gln Gln Ser Tyr Tyr Ser Pro Ser Thr

<210> 794

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDRL3 sintético

<400> 794

Gln Gln Tyr Tyr Tyr Ser Pro Ser Thr

<210> 795

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDRL3 sintético

<400> 795

Gln Gln Ser Tyr Tyr Tyr Pro Ser Thr1 5

<210> 796

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial

<220><223> CDRL3 sintético

<400> 796

Gln Gln Ser Tyr Tyr Tyr Pro Ser Thr1 5

<210> 797

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDRL3 sintético

<400> 797

Gln Gln Ser Tyr Tyr Ser Pro Ser Thr1 5

<210> 798

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDRL3 sintético

<400> 798

Gln Gln Ser Tyr Tyr Ser Pro Ser Thr1 5

<210> 799

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDRL3 sintético

<400> 799

Gln Gln Ser Tyr Tyr Tyr Pro Ser Thr1 5

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<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDRL3 sintético

<400> 800Gln Gln Tyr Tyr Tyr Ser Pro Ser Thr

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<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDRL3 sintético

<400> 801

Gln Gln Ser Tyr Tyr Tyr Pro Ser Thr

<210> 802

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDRL3 sintético<400> 802

Gln Gln Tyr Tyr Tyr Tyr Pro Tyr Thr

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<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDRL3 sintético

<400> 803

Gln Gln Ser Tyr Tyr Ser Pro Ser Thr

<210> 804

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDRL3 sintético

<400> 804

Gln Gln Tyr Tyr Tyr Tyr Pro Ser Thr1 5

<210> 805<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDRL3 sintético

<400> 805

Gln Gln Ser Tyr Tyr Tyr Pro Ser Thr1 5

<210> 806

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDRL3 sintético

<400> 806

Gln Gln Tyr Tyr Tyr Ser Pro Ser Thr1 5

<210> 807

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDRL3 sintético

<400> 807

Gln Gln Ser Tyr Tyr Ser Pro Ser Thr1 5

<210> 808

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDRL3 sintético

<400> 808

Gln Gln Tyr Tyr Tyr Ser Pro Ser Thr1 5

<210> 809

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial

<220><223> CDRL3 sintético

<400> 809

Gln Gln Ser Tyr Tyr Tyr Pro Ser Thr1 5

<210> 810

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDRL3 sintético

<400> 810

Gln Gln Ser Tyr Tyr Ser Pro Ser Thr1 5

<210> 811

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDRL3 sintético

<400> 811

Gln Gln Ser Tyr Tyr Ser Pro Ser Thr1 5

<210> 812

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDRL3 sintético

<400> 812

Gln Gln Tyr Ser Tyr Tyr Pro Tyr Thr1 5

<210> 813

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDRL3 sintético

<400> 813Gln Gln Tyr Ser Ser Tyr Pro Tyr Thr

<210> 814

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDRL3 sintético

<400> 814

Gln Gln Tyr Ser Tyr Tyr Pro Tyr Thr

<210> 815

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDRL3 sintético

<400> 815

Gln Gln Ser Tyr Ser Ser Pro Tyr Thr

<210> 816

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDRH1 sintético

<400> 816

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<210> 817

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDRH1 sintético

<400> 817

Gly Phe Tyr lie Ser Ser Ser Tyr lie His15 10

<210> 818<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDRH1 sintético

<400> 818

Gly Phe Ser lie Ser Ser Ser Tyr lie His1 5 10

<210> 819

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDRH1 sintético

<400> 819

Gly Phe Ser lie Ser Tyr Ser Tyr lie His1 5 10

<210> 820

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDRH1 sintético<400> 820

Gly Phe Ser lie Ser Ser Ser Tyr lie His15 10

<210> 821

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDRH1 sintético<400> 821

Gly Phe Ser lie Tyr Ser Ser Tyr lie His15 10

<210> 822

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial<220>

<223> CDRH1 sintético<400> 822

Gly Phe Ser lie Ser Tyr Ser Tyr lie His1 5 10

<210> 823

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDRH1 sintético<400> 823

Gly Phe Ser lie Ser Ser Ser Tyr lie His

10

<210> 824

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDRHl sintético

<400> 824

Gly Phe Ser lie Tyr Tyr Ser Tyr lie His1 5 10

<210> 825

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDRHl sintético<400> 825

Gly Phe Ser lie Tyr Tyr Ser Tyr lie His1 5 10

<210> 826

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDRHl sintético

<400> 826Gly Phe Ser lie Tyr Ser Ser Tyr lie

His10

<210> 827

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDRH1 sintético

<400> 827

Gly Phe Ser lie Ser Tyr Ser Tyr lie

His10

<210> 828

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDRH1 sintético

<400> 828

Gly Phe Ser lie Tyr Tyr Ser Tyr lie

His10

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<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDRH1 sintético

<400> 829

Gly Phe Ser lie Tyr Tyr Ser Tyr lie

His10

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<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDRH1 sintético

<400> 830

Gly Phe Ser lie Ser Ser Ser Tyr lie His15 10

<210> 831<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDRH1 sintético

<400> 831

Gly Phe Ser lie Ser Tyr Ser Tyr lie His1 5 10

<210> 832

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDRH1 sintético

<400> 832

Gly Phe Tyr lie Tyr Ser Ser Tyr lie His15 10

<210> 833

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDRH1 sintético<400> 833

Gly Phe Ser lie Ser Ser Ser Tyr lie His1 5 10

<210> 834

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDRH1 sintético<400> 834

Gly Phe Ser lie Ser Ser Ser Tyr lie His15 10

<210> 835

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial<220>

<223> CDRH1 sintético<400> 835

Gly Phe Ser lie Tyr Ser Ser Tyr lie His1 5 10

<210> 836

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDRH1 sintético<400> 836

Gly Phe Ser lie Ser Ser Ser Tyr lie His1 5 10

<210> 837

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

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Gly Phe Tyr lie Ser Tyr Ser Tyr lie His1 5 10

<210> 838

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDRH1 sintético<400> 838

Gly Phe Ser lie Ser Tyr Ser Tyr lie His15 10

<210> 839

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDRH1 sintético<400> 839Gly Phe Ser Ile Ser Tyr Ser Ser Ile His1 5 10

<210> 840

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDRH1 sintético

<400> 840

Gly Phe Ser Ile Ser Tyr Ser Ser Ile His1 5 10

<210> 841

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDRH1 sintético

<400> 841

Gly Phe Ser Ile Ser Tyr Ser Ser Ile His1 5 10

<210> 842

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDRH1 sintético

<400> 842

Gly Phe Ser Ile Ser Ser Ser Ser Ile His15 10

<210> 843

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDRH2 sintético

<400> 843

Ser Ile Tyr Pro Tyr Ser Gly Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Vai Lys15 10 15

Gly<210> 844

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDRH2 sintético

<400> 844

Ser Ile Tyr Pro Tyr Ser Gly Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Vai Lys1 5 10 15

Gly

<210> 845

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDRH2 sintético

<400> 845

Ser Ile Tyr Pro Tyr Ser Gly Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Vai Lys1 5 10 15

Gly

<210> 846

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDRH2 sintético

<400> 846

Ser Ile Tyr Pro Tyr Ser Gly Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Vai Lys1 5 10 15

Gly

<210> 847

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDRH2 sintético

<400> 847Ser lie Tyr Pro Tyr Ser Gly Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Vai Lys

1 5

Gly

<210> 848

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDRH2 sintético

<400> 848

Ser lie Tyr Pro Tyr Ser Gly Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Vai Lys1 5 10 15

Gly

<210> 849

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDRH2 sintético

<400> 849

Ser lie Tyr Pro Ser Ser Gly Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Vai Lys1 5 10 15

Gly

<210> 850

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDRH2 sintético

<400> 850

Ser lie Tyr Pro Tyr Ser Gly Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Vai Lys1 5 10 15

Gly

<210> 851

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Gly

<210> 852

<211> 17

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<213> Artificial

<220>

<223> CDRH2 sintético

<400> 852

Ser Ile Tyr Pro Ser Ser Gly Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Vai Lys1 5 10 15

Gly

<210> 853

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDRH2 sintético

<400> 853

Ser Ile Tyr Pro Tyr Ser Gly Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Vai Lys15 10 15

Gly

<210> 854

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<212> PRT

<213> Artificial

<220>

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Gly

<210> 855<211> 17<212> PRT

<213> Artificial

<220>

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Gly

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Gly

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Gly

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Gly

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Gly

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Gly

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Gly

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Gly

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Gly

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Gly

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Tyr lie Ser Pro Ser Ser Gly Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Vai Lys1 5 10 15

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<213> Artificial

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<213> Artificial

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<212> PRT

<213> Artificial

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Tyr Tyr Ser Ser Gly Phe Asp Tyr

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<213> Artificial

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<213> Artificial

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<213> Artificial

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<213> Artificial

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<223> CDRH3 sintético

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<213> Artificial

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<213> Artificial

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<213> Artificial

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<213> Artificial

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Trp Trp Ser Ser Ala Phe Asp Tyr1 5

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<212> PRT

<213> Artificial

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<212> PRT

<213> Artificial

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<212> PRT

<213> Artificial

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<213> Artificial

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<213> Artificial

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<400> 892

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<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDRH3 sintético

<400> 893

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<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDRH3 sintético

<400> 894

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<213> Artificial

<220>

<223> CDRH3 sintético

<400> 895

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<213> Artificial

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<213> Artificial

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<213> Artificial

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<400> 898

Gln Gln Ser Trp Trp Trp Pro Ser Thr1 5

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<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDRL3 sintético

<400> 899

Gln Gln Ser Trp Trp Ser Pro Ser Thr1 5

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<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial

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<400> 900

Gln Gln Trp Trp Trp Trp Pro Trp Thr1 5

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<211> 9

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<213> Artificial

<220>

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Gln Gln Trp Trp Trp Trp Pro Ser Thr1 5

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<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDRL3 sintético

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Gln Gln Ser Trp Trp Trp Pro Ser Thr1 5

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<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDRL3 sintético

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Gln Gln Trp Trp Trp Trp Pro Ser Thr1 5

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<212> PRT

<213> Artificial

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<223> CDRL3 sintético

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<213> Artificial

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Gln Gln Trp Trp Trp Trp Pro Ser Thr1 5

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<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDRL3 sintético

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<212> PRT

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Gln Gln Trp Ser Ser Trp Pro Ser Thr1 5

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<212> PRT

<213> Artificial

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Gln Gln Ser Ser Ser Ser Pro Ser Thr1 5

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<213> Artificial

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<213> Artificial

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<212> PRT

<213> Artificial

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<213> Artificial

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<223> CDRL3 sintético

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<213> Artificial

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Gln Gln Ser Tyr Tyr Ser Pro Ser Thr1 5

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<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDRL3 sintético

<400> 920

Gln Gln Ser Ser Ser Ser Pro Ser Thr1 5

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<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDRL3 sintético

<400> 921

Gln Gln Ser Tyr Ser Tyr Pro Tyr Thr1 5

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<212> PRT

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<213> Artificial

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<212> PRT

<213> Artificial

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<213> Artificial

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<212> PRT

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<212> PRT

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<212> PRT

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<220>

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<212> PRT

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<220>

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<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDRHl sintético

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His10

<210> 931

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

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His10

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<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

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Gly Phe Ser lie Trp Trp Ser Trp lie

His10

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<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDRH1 sintético

<400> 933

Gly Phe Ser lie Trp Trp Ser Trp lie

His10

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<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDRH1 sintético

<400> 934

Gly Phe Trp lie Trp Ser Ser Ser lie His15 10

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<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDRH1 sintético

<400> 935

Gly Phe Trp lie Trp Ser Ser Ser lie His15 10

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<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

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<212> PRT

<213> Artificial

<220>

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Gly Phe Ser lie Ser Ser Ser Ser lie His15 10

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<212> PRT

<213> Artificial

<220>

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Gly Phe Trp lie Trp Ser Ser Ser lie His15 10

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<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial

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Gly Phe Ser lie Trp Ser Ser Ser lie His1 5 10

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<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

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Gly Phe Ser lie Tyr Ser Tyr Tyr lie His1 5 10

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<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

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Gly Phe Tyr lie Ser Tyr Ser Tyr lie His15 10

<210> 942

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

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<210> 943

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDRH1 sintético

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<212> PRT

<213> Artificial

<220>

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<400> 944

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<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDRHl sintético

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<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDRHl sintético

<400> 946

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<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDRHl sintético

<400> 947

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<212> PRT

<213> Artificial

<220>

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<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

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<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDRHl sintético<400> 950

Gly Phe Ser lie Tyr Tyr Ser Ser lie His15 10

<210> 951

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDRH2 sintético<400> 951

Ser lie Ser Pro Ser Ser Gly Trp Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Vai Lys15 10 15

Gly

<210> 952

<211> 17

<212> PRT<213> Artificial<220>

<223> CDRH2 sintético<400> 952

Ser lie Ser Pro Ser Ser Gly Trp Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Vai Lys1 5 10 15

Gly

<210> 953

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDRH2 sintético

<400> 953

Ser lie Tyr Pro Ser Ser Gly Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Vai Lys1 5 10 15

Gly

<210> 954

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDRH2 sintético

<400> 954

Ser lie Ser Pro Ser Ser Gly Trp Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Vai Lys1 5 10 15

Gly

<210> 955

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDRH2 sintético

<400> 955

Ser lie Ser Pro Ser Ser Gly Trp Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Vai Lys1 5 10 15

Gly95617PRT

Artificial<220>

<223> CDRH2 sintético<400> 956

Ser lie Ser Pro Ser Ser Gly Trp Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Vai Lys15 10 15

Gly

<210> 957

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDRH2 sintético<400> 957

Ser lie Trp Pro Ser Ser Gly Trp Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Vai Lys15 10 15

Gly

<210> 958

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDRH2 sintético<400> 958

Ser lie Ser Pro Ser Ser Gly Trp Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Vai Lys15 10 15

Gly

<210> 959

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDRH2 sintético<400> 959

<210><211><212><213>

Ser lie Ser Pro Ser Ser Gly Trp Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Vai Lys15 10 15Gly

<210> 960

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDRH2 sintético<400> 960

Ser lie Ser Pro Ser Ser Gly Trp Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Vai Lys1 5 10 15

Gly

<210> 961

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDRH2 sintético

<400> 961

Trp lie Ser Pro Ser Ser Gly Ser Thr Trp Tyr Ala Asp Ser Vai Lys1 5 10 15

Gly

<210> 962

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDRH2 sintético<400> 962

Trp lie Ser Pro Ser Ser Gly Ser Thr Trp Tyr Ala Asp Ser Vai Lys15 10 15

Gly

<210> 963

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDRH2 sintético

<400> 963Trp lie Trp Pro Ser Ser Gly Trp Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Vai Lys15 10 15

Gly

<210> 964

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDRH2 sintético<400> 964

Trp lie Ser Pro Ser Trp Gly Ser Thr Trp Tyr Ala Asp Ser Vai Lys1 5 10 15

Gly

<210> 965

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDRH2 sintético<400> 965

Trp lie Ser Pro Ser Ser Gly Ser Thr Trp Tyr Ala Asp Ser Vai Lys15 10 15

Gly

<210> 966

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDRH2 sintético

<400> 966

Trp lie Ser Pro Ser Ser Gly Ser Thr Trp Tyr Ala Asp Ser Vai Lys15 10 15

Gly

<210> 967

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<220><223> CDRH2 sintético<400> 967

Ser lie Tyr Pro Ser Ser Gly Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Vai Lys1 5 10 15

Gly

<210> 968

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDRH2 sintético

<400> 968

Ser lie Tyr Pro Tyr Ser Gly Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Vai Lys15 10 15

Gly

<210> 969

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<-2-2-3>—sin^é-tieG-——-

<400> 969

Ser lie Tyr Pro Tyr Ser Gly Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Vai Lys15 10 15

Gly

<210> 970

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDRH2 sintético

<400> 970

Ser lie Tyr Pro Tyr Ser Gly Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Vai Lys15 10 15

Gly

<210> 971<211> 17<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDRH2 sintético<400> 971

Ser lie Tyr Pro Tyr Ser Gly Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Vai Lys1 5 10 15

Gly

<210> 972

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDRH2 sintético<400> 972

Ser lie Tyr Pro Tyr Ser Gly Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Vai Lys15 10 15

Gly

<210> 973<211> 17

<-2-l-2->-PRT----------------

<213> Artificial

<220>

<223> CDRH2 sintético<400> 973

Ser lie Tyr Pro Tyr Ser Gly Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Vai Lys15 10 15

Gly

<210> 974

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDRH2 sintético<400> 974

Ser lie Ser Pro Tyr Ser Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Vai Lys15 10 15Gly

<210> 975

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDRH2 sintético

<400> 975

Tyr lie Ser Pro Ser Ser Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Vai Lys1 5 10 15

Gly

<210> 976

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDRH2 sintético

<400> 976

Ser lie Tyr Pro Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Vai Lys1 5 10 15

Giy

<210> 977

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDRH2 sintético<400> 977

Ser lie Tyr Pro Ser Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Vai Lys1 5 10 15

Gly

<210> 978

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDRH3 sintético<400> 978Trp Trp Ser Ser Ala lie Asp Tyr

<210> 979

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDRH3 sintético

<400> 979

Trp Trp Ser Ser Ala Leu Asp Tyr

<210> 980

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDRH3 sintético

<400> 980

Trp Trp Ser Ser Ala Leu Asp Tyr

<210> 981

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDRH3 sintético

<400> 981

Trp Trp Ser Ser Gly Met Asp Tyr

<210> 982

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDRH3 sintético

<400> 982

Trp Trp Ser Ser Ala Leu Asp Tyr1 5

<210> 983<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDRH3 sintético<400> 983

Trp Trp Ser Ser Ala Phe Asp Tyr

<210> 984

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDRH3 sintético

<400> 984

Trp Trp Ser Ser Ala Leu Asp Tyr

<210> 985

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDRH3 sintético

<400> 985

Trp Ser Ser Ser Ala Phe Asp Tyr

<210> 986

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDRH3 sintético

<400> 986

Trp Trp Ser Ser Ala Met Asp Tyr1 5

<210> 987

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial

<220><223> CDRH3 sintético<400> 987

Trp Ser Ser Trp Gly Leu Asp Tyr1 5

<210> 988

<211> 12

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDRH3 sintético<400> 988

Ser Ser Trp Ser Ser Trp Ser Ser Ala Leu Asp Tyr1 5 10

<210> 989

<211> 12

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDRH3 sintético<400> 989

Ser Ser Trp Ser Ser Trp Ser Ser Ala Leu Asp Tyr15 10

<210> 990

<211> 12

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDRH3 sintético<400> 990

Ser Ser Ser Ser Ser Trp Trp Ser Ala lie Asp Tyr15 10

<210> 991

<211> 12

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDRH3 sintético<400> 991Ser Ser Trp Ser Ser Trp Ser Trp Ala Leu Asp Tyr1 5 10

<210> 992

<211> 12

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDRH3 sintético<400> 992

Ser Ser Trp Ser Ser Trp Ser Ser Ala Met Asp Tyr1 5 10

<210> 993

<211> 12

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDRH3 sintético<400> 993

Ser Ser Trp Ser Ser Trp Ser Ser Ala Met Asp Tyr1 5 10

<210> 994

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDRH3 sintético<400> 994

Tyr Tyr Ser Tyr Ala Leu Asp Tyr1 5

<210> 995

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDRH3 sintético<400> 995

Tyr Tyr Ser Tyr Ala Phe Asp Tyr1 5

<210> 996<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDRH3 sintético

<400> 996

Tyr Tyr Ser Tyr Ala Phe Asp Tyr

<210> 997

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDRH3 sintético

<400> 997

Tyr Tyr Ser Ser Ala Phe Asp Tyr

<210> 998

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDRH3 sintético

<400> 998

Tyr Tyr Ser Tyr Ala Leu Asp Tyr

<210> 999

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDRH3 sintético

<400> 999

Tyr Tyr Ser Tyr Ala Phe Asp Tyr1 5

<210> 1000

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial

<220><223> CDRH3 sintético<400> 1000

Tyr Tyr Ser Tyr Ala Leu Asp Tyr1 5

<210> 1001

<211> 14

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDRH3 sintético<400> 1001

Ser Ser Tyr Ser Tyr Tyr Tyr Tyr Ser Tyr Ala Leu Asp Tyr1 5 10

<210> 1002

<211> 15

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDRH3 sintético<400> 1002

Tyr Tyr Ser Ser Tyr Tyr Ser Tyr Tyr Ser Tyr Ala Leu Asp Tyr1 5 10 15

<210> 1003

<211> 18

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDRH3 sintético<400> 1003

Tyr Tyr Ser Ser Tyr Ser Ser Ser Ser Ser Tyr Tyr Tyr Tyr Ala Phe1 5 10 15

Asp Tyr

<210> 1004

<211> 19

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDRH3 sintético<400> 1004Tyr Tyr Ser Ser Ser Ser Ser Tyr Ser Ser Ser Tyr Tyr Tyr Tyr Ala1 5 10 15

Phe Asp Tyr

<210> 1005

<211> 48

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Oligonucleotideos sintéticos<400> 1005

gcagcttctg gcttctycat ttyctyctyc tycatacact gggtgcgt 48

<210> 1006

<211> 60

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Oligonucleotideos sintéticos<400> 1006

ctggaatggg ttgcatycat ttycccatyc tycggttyca cttyctatgc cgatagcgtc 60

<210> 1007

<211> 54

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Oligonucleotideos sintéticos<400> 1007

acttattact gtcagcaaty ctyctyctyc ccatycacgt tcggacaggg tacc 54

<210> 1008

<211> 48

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Oligonucleotideos sintéticos<400> 1008

gcagcttctg gcttcmgcat tmgcmgcmgc mgcatacact gggtgcgt 48

<210> 1009

<211> 60

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Oligonucleotideos sintéticos<400> 1009

ctggaatggg ttgcamgcat tmgcccamgc mgcggtmgca ctmgctatgc cgatagcgtc 60

<210> 1010

<211> 54

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Oligonucleotideos sintéticos

<400> 1010

acttattact gtcagcaamg cmgcmgcmgc ccamgcacgt tcggacaggg tacc 54

<210> 1011

<211> 48

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Oligonucleotideos sintéticos

<400> 1011

gcàgcttctg gcttctsgat ttsgtsgtsg tsgatacact gggtgcgt 48

<210> 1012

<211> 60

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Oligonucleotideos sintéticos

<400> 1012

ctggaatggg ttgcatsgat ttsgccatsg tsgggttsga cttsgtatgc cgatagcgtc 60

<210> 1013

<211> 54

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Oligonucleotideos sintéticos

<400> 1013

acttattact gtcagcaats gtsgtsgtsg ccatsgacgt tcggacaggg tacc 54

Claims

1. POLIPEPTÍDEO, que compreende um domínio variável dacadeia pesada de imunoglobina no qual:(i) CDRH1 compreende uma seqüência de aminoácidos: G-F-X1-I-X2-X3-X4-X5-I-H (SEQ ID No: 22), no qual G é a posição 26 e X1 é a posição-28 de acordo com o sistema de numeração de Kabat; no qual, X1 éselecionado de S e Y; no qual, X2 é selecionado de Y e S; no qual, X3 éselecionado de Y e S; no qual, X4 é selecionado de Y e S; no qual, X5 éselecionado de Y e S;(ii) CDRH2 compreende uma seqüência de aminoácidos: X1-I-X2-P-X3-X4-G-X5-T-X6-Y-A-D-S-V-K-G (SEQ ID No: 23), no qual X1 é a posição-50, de acordo com o sistema de numeração de Kabat; no qual, X1 éselecionado de Y e S; no qual X2 é selecionado de Y e S; no qual, X3 éselecionado de Y e S; no qual, X4 é selecionado de Y e S; no qual, X5 éselecionado de Y e S, e no qual X6 selecionado de Y e S; e(iii) CDRH3 compreende uma seqüência de aminoácidos: X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X.14-X15-X16-D-Y (SEQ ID No ED:-31), no qual, X1 é a posição 95 de acordo com o sistema de numeração deKabat, e no qual X1 é selecionado de R, Y, M; X2 é selecionado de Y e R; X3 éselecionado de Y, S, R, P e G, X4 é selecionado de Y e S; X5 é selecionado deY, S, R e H; X6 é selecionado de R, Y e S; X7 é selecionado de G, Y e S; X8 éselecionado de R, Y e S; X9 é selecionado de G, Y e S; X10 é selecionado deR, Y e S; X11 é selecionado de G, Y e S; X12 é selecionado de S, Y, R, G e A;X13 é selecionado de G e Y; X14 é selecionado de L, M, R, G e A; e X15 éselecionado de G, F e L ou não está presente, e X16 é F ou não está presente.

2. POLIPEPTÍDEO, que compreende um domínio variável dacadeia pesada de imunoglobulina, no qual:(i) CDRH1 compreende uma seqüência de aminoácidos: G-F-X1-I-X2-X3-X4-X5-I-H (SEQ ID No: 22), no qual G é a posição 26 e X1 é a posição-28 de acordo com o sistema de numeração de Kabat; no qual X1 é selecionadode Y e S; no qual X2 é selecionado de Y e S; no qual, X3 é selecionado de Y eS; no qual, X4 é selecionado de Y e S; no qual, X5 é selecionado de Y e S;(ii) CDRH2 compreende uma seqüência de aminoácidos: X1-I-X2-P-X3-X4-G-X5-T-X6-Y-A-D-S-V-K-G (SEQ ID No: 23), no qual X1 é a posição-50, de acordo com o sistema de numeração de Kabat; no qual, X1 éselecionado de Y e S; no qual X2 é selecionado de Y e S; no qual, X3 éselecionado de Y e S; no qual, X4 é selecionado de Y e S; no qual, X5 éselecionado de Y e S, e no qual X6 selecionado de Y e S; e(iii) CDRH3 compreende uma seqüência de aminoácidos: X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17-X18-X19-D-Y(SEQ ID No ED: 24), no qual, X1 é a posição 95 de acordo com o sistema denumeração de Kabat, caracterizada pelo fato dos aminoácidos em cada umadas posições de X1-X6 serem selecionados a partir de um pool de aminoácidosnuma razão molar de 50% de Y, 25% de S, e 25% de G; caracterizada pelofato dos aminoácidos em cada uma das posições de X7-X17 seremselecionados a partir de um pool de aminoácidos numa razão molar de 50% deY, 25% de S e 25% de G, ou não estarem presentes; no qual X18 éselecionado de G e A, e no qual X19 é selecionado de I, M, L e F.

3. POLIPEPTÍDEO, que compreende um domínio variável dacadeia pesada de imunoglobulina, no qual:(i) CDRH1 compreende uma seqüência de aminoácidos: G-F-X1-I-X2-X3-X4-X5-I-H (SEQ ID No: 22), no qual G é a posição 28 e X1 é a posição-28 de acordo com o sistema de numeração de Kabat; no qual X1 é selecionadode Y e S; no qual X2 é selecionado de Y e S; no qual, X3 é selecionado de Y eS; no qual, X4 é selecionado de Y e S; no qual, X5 é selecionado de Y e S;(ii) CDRH2 compreende uma seqüência de aminoácidos: X1-I-X2-P-X3-X4-G-X5-T-X6-Y-A-D-S-V-K-G (SEQ ID No: 23), no qual, X1 é a posição-50, de acordo com o sistema de numeração de Kabat; no qual, X1 éselecionado de Y e S; no qual, X2 é selecionado de Y e S; no qual, X3 éselecionado de Y e S; no qual, X4 é selecionado de Y e S; no qual, X5 éselecionado de Y e S, e no qual, X6 selecionado de Y e S; e(iii) CDRH3 compreende uma seqüência de aminoácidos: X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17-X18-X19-D-Y(SEQ ID No ED: 26), no qual, X1 é a posição 95 de acordo com o sistema denumeração de Kabat, caracterizada pelo fato dos aminoácidos em cada umadas posições de X1-X6 serem selecionados a partir de um pool de aminoácidosnuma razão molar de 25% de Y, 50% de S, e 25% de R; caracterizada pelo fatodos aminoácidos em cada uma das posições de X7-X17 serem selecionados apartir de um pool de aminoácidos numa razão molar de 25% de Y, 50% de S e-25% de R, ou não estarem presentes; no qual, X18 é selecionado de G e A; eno qual, X19 é selecionado de I, M, L e F.

4. POLIPEPTÍDEO, que compreende um domínio variável dacadeia pesada de imunoglobulina, no qual:(i) CDRH1 compreende uma seqüência de aminoácidos: G-F-X1-I-X2-X3-X4-X5-I-H (SEQ ID No: 22), no qual G é a posição 26 e X1 é a posição-28 de acordo com o sistema de numeração de Kabat; no qual X1 é selecionadode Y e S; no qual X2 é selecionado de Y e S; no qual, X3 é selecionado de Y eS; no qual, X4 é selecionado de Y e S; no qual, X5 é selecionado de Y e S;(ii) CDRH2 compreende uma seqüência de aminoácidos: X1-I-X2-P-X3-X4-G-X5-T-X6-Y-A-D-S-V-K-G (SEQ ID No: 23), no qual, X1 é a posição-50, de acordo com o sistema de numeração de Kabat; no qual, X1 éselecionado de Y e S; no qual, X2 é selecionado de Y e S; no qual, X3 éselecionado de Y e S; no qual, X4 é selecionado de Y e S; no qual, X5 éselecionado de Y e S, e no qual, X6 selecionado de Y e S; e(iii) CDRH3 compreende uma seqüência de aminoácidos: X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17-X18-X19-D-Y(SEQ ID No ED: 27), no qual, X1 é a posição 95 de acordo com o sistema denumeração de Kabat, caracterizada pelo fato dos aminoácidos em cada umadas posições de X1-X6 serem selecionados a partir de um pool de aminoácidosnuma razão molar de 38% de Y, 25% de S, e 25% de G e 12% de R;caracterizada pelo fato dos aminoácidos em cada uma das posições de X7-X17serem selecionados a partir de um pool de aminoácidos numa razão molar de-38% de Y, 25% de S, e 25% de G e 12% de R, ou não estarem presentes; noqual, X18 é selecionado de G e A, e no qual, X19 é selecionado de I, M, L e F.

5. POLIPEPTÍDEO, que compreende um domínio variável dacadeia pesada de imunoglobulina, no qual:(i) CDRH1 compreende uma seqüência de aminoácidos: G-F-X1-I-X2-X3-X4-X5-I-H (SEQ ID No: 22), no qual, G é a posição 26 e X1 é a posição-28 de acordo com o sistema de numeração de Kabat; no qual, X1 éselecionado de Y e S; no qual, X2 é selecionado de Y e S; no qual, X3 éselecionado de Y e S; no qual, X4 é selecionado de Y e S; no qual, X5 éselecionado de Y e S;(ii) CDRH2 compreende uma seqüência de aminoácidos: X1-I-X2-P-X3-X4-G-X5-T-X6-Y-A-D-S-V-K-G (SEQ ID No: 23), no qual, X1 é a posição-50, de acordo com o sistema de numeração de Kabat; no qual, X1 éselecionado de Y e S; no qual, X2 é selecionado de Y e S; no qual, X3 éselecionado de Y e S; no qual, X4 é selecionado de Y e S; no qual, X5 éselecionado de Y e S, e no qual, X6 selecionado de Y e S; e(iii) CDRH3 compreende uma seqüência de aminoácidos: X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17-X18-X19-D-Y(SEQ ID No ED: 28), no qual, X1 é a posição 95 de acordo com o sistema denumeração de Kabat, caracterizada pelo fato dos aminoácidos em cada umadas posições de X1-X6 serem selecionados a partir de um pool de aminoácidosnuma razão molar de 20% de Y, 26% de S, 26% de G, 13% de R, 1 % de A, 1 %de D, 1% de E, 1% de F, 1% de H, 1% de I, 1% de K, 1% de L, 1% de M, 1%de N, 1% de P, 1% de Q, 1% de T, 1% de V e 1% de W; caracterizada pelo fatodos aminoácidos em cada uma das posições de X7-X17 serem selecionados apartir de um pool de aminoácidos numa razão molar de 20% de Y, 26% de S,-26% de G, 13% de R, 1% de A, 1% de D, 1% de E, 1% de F, 1% de H, 1% de I,-1% de K, 1% de L, 1% de M, 1% de N, 1% de P, 1% de Q, 1% de T, 1% de V e-1% de W, ou não estão presentes; no qual, X18 é selecionado de G e A, e noqual, X19 é selecionado de I, M, L e F.

6. POLIPEPTÍDEO, de acordo com uma das reivindicações de 1a 5, caracterizado pelo fato do CDRH1 compreender uma seqüência deaminoácidos selecionada de qualquer uma das SEQs ID Nos: 524-540 e 189-294.

7. POLIPEPTÍDEO, de acordo com uma das reivindicações de 1a 5, caracterizado pelo fato do CDRH2 compreender uma seqüência deaminoácidos selecionada de qualquer uma das SEQs ID Nos: 541-557 e 295-400.

8. POLIPEPTÍDEO, de acordo com uma das reivindicações de 1a 5, caracterizado pelo fato do CDRH3 compreender uma seqüência deaminoácidos selecionada de qualquer uma das SEQs ID Nos: 558-574 e 401-506.

9. POLIPEPTÍDEO, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato da posição do aminoácido X1 no CDRH3 é a posição 95e é este é selecionado de R e Y; X3 é a posição 97 e é S; X8 é a posição doaminoácido 100b e é S; X9 é a posição do aminoácido 100c e é Y; X10 e é aposição do aminoácido 100d e é Y ou R.

10. POLIPEPTÍDEO, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato da posição do CRDH3 possuir a seqüência deaminoácido X1-R-S-Y-R-Y-G-S-Y-X10-G-S-Y-X14-F-D-Y (SEQ ID No.: 575).

11. POLIPEPTÍDEO, de acordo com uma das reivindicaçõesde 1 a 10, caracterizado pelo fato do polipeptídeo se ligar ao DR5 humano.

12. POLIPEPTÍDEO de acordo com a reivindicação 11,caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo é um anticorpo.

13. POLIPEPTÍDEO de acordo com a reivindicação 12,caracterizado pelo fato de que o domínio variável da cadeia pesadacompreende:i) um CDRH1 contendo uma seqüência de aminoácidosGFYISSSSIH (SEQ ID No: 576);ii) um CDRH2 contendo uma seqüência de aminoácidosSISPSSGSTYYADSVKG (SEQ NO ID: 577); eiii) um CDRH3 contendo uma seqüência de aminoácidosYRSYRYGSYYGSYGFDY (SEQ NO ID: 578).

14. POLIPEPTÍDEO, de acordo com a reivindicação 12,caracterizado pelo fato de que o domínio pesado da cadeia variávelcompreende:i) um CDRH1 contendo uma seqüência de aminoácidosGFYISSSSIH (SEQ ID No: 579);ii) um CDRH2 contendo uma seqüência de aminoácidosSISPSSGYTSYADSVKG (SEQ NO ID: 580); eiii) um CDRH3 contendo uma seqüência de aminoácidosRRSYRYGSYRGSYAFDY (SEQ NO ID: 581).

15. POLIPEPTÍDEO, de acordo com uma das reivindicações de 1a 14, caracterizado pelo fato do polipeptídeo se ligar ao DR5 humano e murino.

16. POLIPEPTÍDEO, de acordo com uma das reivindicações de 1a 15 que consta adicionalmente de um domínio variável da cadeia leve, no qual:(i) CDRL3 compreende uma seqüência de aminoácidos Q-Q-X1-X2-X3-X4-P-X5-T (ID SEQ NO: 25); no qual, X1 é a posição 91 e éselecionado de Y, H e S; X2 é selecionado de Y e S; X3 é selecionado de Y, Se T; X4 é selecionado de Y, S e T, e X5 é selecionado de S, P e Y.

17. POLIPEPTÍDEO, de acordo com a reivindicação 16,caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente um CDRL1 quepossuir a seqüência de aminoácidos RASQDVNTAVA (ID SEQ NO: 29).

18. POLIPEPTÍDEO, de acordo com a reivindicação 16,caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente um CDRL2 quepossuir a seqüência de aminoácidos SASSLYS (ID SEQ NO: 30).

19. POLIPEPTÍDEO, que compreende um domínio variável dacadeia pesada de imunoglobulina, no qual:(i) CDRH1 compreende uma seqüência de aminoácidos: G-F-X1-I-X2-X3-X4-X5-I-H (SEQ ID No: 22), no qual, X1 é a posição 28 de acordo como sistema de numeração de Kabat e é selecionado de S e Y; X2 é selecionadode S e Y; X3 é selecionado de S e Y; X4 é selecionado de S e Y; X5 éselecionado de S e Y;(ii) CDRH2 compreende uma seqüência de aminoácidos: X1-I-X2-P-X3-X4-G-X5-T-X6-Y-A-D-S-V-K-G (SEQ ID No: 23), no qual, X1 é a posição-50, de acordo com o sistema de numeração de Kabat e é selecionado de S eY; X2 é selecionado de S e Y; X3 é selecionado de S e Y; X4 é selecionado deS e Y; X5 é selecionado de S e Y, e X6 selecionado de S e Y; e(iii) CDRH3 compreende uma seqüência de aminoácidos: X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7- D-Y (SEQ ID No: 582), no qual, X1 é a posição doaminoácido 95 de acordo com o sistema de numeração de Kabat e éselecionado de S e Y; X2 é selecionado de S e Y e R; X3 é selecionado de S,G, Y e H; X4 é selecionado de S, G, Y e R; X5 é selecionado de G e A; X6 éselecionado de F, M, L e A; e X7 é selecionado de F, M e L ou está ausente.

20. POLIPEPTÍDEO, de acordo com a reivindicação 19,caracterizado pelo fato do CDRH1 compreender uma seqüência deaminoácidos selecionada das SEQ ID Nos: 189-198.

21. POLIPEPTÍDEO, de acordo com a reivindicação 19,caracterizado pelo fato do CDRH2 compreender uma seqüência deaminoácidos selecionada das SEQ ID Nos: 295-304.

22. POLIPEPTÍDEO, de acordo com a reivindicação 19,caracterizado pelo fato do CDRH3 compreender uma seqüência deaminoácidos selecionada das SEQ ID Nos: 401-410.

23. POLIPEPTÍDEO, que compreende um domínio variável dacadeia pesada de imunoglobulina, no qual:(i) CDRH1 compreende uma seqüência de aminoácidos: G-F-X1-I-X2-X3-X4-X5-I-H (SEQ ID No: 22), no qual, X1 é a posição 28 de acordo como sistema de numeração de Kabat e é selecionado de S e Y; X2 é selecionadode S e Y; X3 é selecionado de S e Y; X4 é selecionado de S e Y; X5 éselecionado de S e Y;(ii) CDRH2 compreende uma seqüência de aminoácidos: X1-I-X2-P-X3-X4-G-X5-T-X6-Y-A-D-S-V-K-G (SEQ ID No: 22), no qual, X1 é a posição-50, de acordo com o sistema de numeração de Kabat e é selecionado de S eY; X2 é selecionado de S e Y; X3 é selecionado de S e Y; X4 é selecionado deS e Y; X5 é selecionado de S e Y, e(iii) CDRH3 compreende uma seqüência de aminoácidos: X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-D-Y (SEQ ID No: 583), no qual, X1 é a posição doaminoácido 95 de acordo com o sistema de numeração de Kabat e éselecionado de Y, S e G; X2 é selecionado de Y, S, G, R e A; X3 é selecionadode G, Y, S e R; X4 é selecionado de G, Y e F; X5 é selecionado de Y, S, N e G;X6 é selecionado de Y, R, H e W; e X7 é selecionado de G e A; e X8 éselecionado de F, M, L e I.

24. POLIPEPTÍDEO, de acordo com a reivindicação 23,caracterizado pelo fato do CDRH1 compreender uma seqüência deaminoácidos selecionada das SEQ ID Nos: 199-216.

25. POLIPEPTÍDEO, de acordo com a reivindicação 23,caracterizado pelo fato do CDRH2 compreender uma seqüência deaminoácidos selecionada das SEQ ID Nos: 305-322.

26. POLIPEPTÍDEO, de acordo com a reivindicação 23,caracterizado pelo fato do CDRH3 compreender uma seqüência deaminoácidos selecionada das SEQ ID Nos: 411-428.

27. POLIPEPTÍDEO, que compreende um domínio variável dacadeia pesada de imunoglobulina, no qual:(i) CDRH1 compreende uma seqüência de aminoácidos: G-F-X1-I-X2-X3-X4-X5-I-H (SEQ ID No: 22), no qual, X1 é a posição 28 de acordo como sistema de numeração de Kabat e é selecionado de S e Y; X2 é selecionadode S e Y; X3 é selecionado de S e Y; X4 é selecionado de S e Y; X5 éselecionado de S e Y;(ii) CDRH2 compreende uma seqüência de aminoácidos: X1-I-X2-P-X3-X4-G-X5-T-X6-Y-A-D-S-V-K-G (SEQ ID No: 23), no qual, X1 é a posição-50, de acordo com o sistema de numeração de Kabat e é selecionado de S eY; X2 é selecionado de S e Y; X3 é selecionado de S e Y; X4 é selecionado deS e Y; X5 é selecionado de S e Y, e(iii) CDRH3 compreende uma seqüência de aminoácidos: X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11 -X12-X13-X14-X15-X16-X17-X18-X19-D-Y(SEQ ID No: 584), no qual, X1 é a posição do aminoácido 95 é selecionado deY, S, R e G; X2 é selecionado de Y, S, R e G; X3 é selecionado de S, Y, G eW; X4 é selecionado de S, Y, G e Q; X5 é selecionado de G, Y e S; X6 éselecionado de G, Y S, R e V; X7 é selecionado de S, Y, G e R; X8 éselecionado de Y, S, G, R, P e V; X9 é selecionado de G, A,Y,S e R; X10 éselecionado de M, F, G, Y, S e R; X11 é selecionado de A, Y, S, G e R; X12 éselecionado de I, M, F, L, A, G, S, Y, R e T; X13 é selecionado de F, M, L, G,A,Y, T E S ou não está presente; X14 é selecionado de L, M, F, I, G, Y, A e T;e X15 é selecionado de M, L, Y, G e R ou não está presente; X16 éselecionado de Y e G ou não está presente; X17 é selecionado de R, M e G ounão está presente; X18 é selecionado de P e A ou não está presente; e X18 é Lou não está presente.

28. POLIPEPTÍDEO, que compreende um domínio variável dacadeia pesada de imunoglobulina, no qual:(i) CDRH1 compreende uma seqüência de aminoácidos: G-F-X1-I-X2-X3-X4-X5-I-H (SEQ ID No: 22), caracterizado pelo fato de que G é a posiçãoe X1 é a posição 28 de acordo com o sistema de numeração de Kabat; e no qualX1-X5 são aminoácidos naturalmente presentes que não a cisteína;(ii) CDRH2 compreende uma seqüência de aminoácidos: X6-I-X7-P-X8-X9-G-X10-T-X11-Y-A-D-S-V-K-G, no qual, X6 é a posição 50 deacordo com o sistema de numeração de Kabat, e no qual, X6-X11 sãoaminoácidos naturalmente presentes que não a cisteína; e(iii) CDRH3 compreende uma seqüência de aminoácidos: X12-X13-X14-X15-X16-(X17) n-X18-X19-D-Y, no qual X12 é a posição 95 de acordocom o sistema de numeração de Kabat; e no qual, n é um número adequadoque manterá a atividade funcional do domínio variável da cadeia pesada; e noqual, X12-X19 são aminoácidos naturalmente presentes que não a cisteína.

29. POLIPEPTÍDEO, de acordo com a reivindicação 28,caracterizado pelo fato de que n é um número de 1 a 12.

30. POLIPEPTÍDEO, de acordo com a reivindicação 28,caracterizado pelo fato de que X1 é selecionado de Y e S; X2 é selecionado deY e S; X3 é selecionado de Y e S; X4 é selecionado de Y e S; X5 é selecionadode Y e S; e X6 é selecionado de Y e S.

31. POLIPEPTÍDEO, de acordo com a reivindicação 28,caracterizado pelo fato de que X6 é selecionado de Y e S; X7 é selecionado deY e S; X8 é selecionado de Y e S; X9 é selecionado de Y e S; X10 éselecionado de Y e S; e X11 é selecionado de Y e S.

32. POLIPEPTÍDEO, de acordo com a reivindicação 28,caracterizado pelo fato de que os aminoácidos em cada uma das posiçõesX12-X17 são selecionados a partir de um pool de aminoácidos numa razãomolar de 50% de Y, 25% de S e 25% de G, e X18 é selecionado de G e A, eX19 é selecionado de I, M, L, e F.

33. POLIPEPTÍDEO, de acordo com a reivindicação 28,caracterizado pelo fato de que os aminoácidos em cada uma das posiçõesX12-X17 são selecionados a partir de um pool de aminoácidos numa razãomolar de 25% de Y, 50% de S e 25% de R, no qual X18 é selecionado de G eA, e X19 é selecionado de I, M, L, e F.

34. POLIPEPTÍDEO, de acordo com a reivindicação 28,caracterizado pelo fato de que os aminoácidos em cada uma das posiçõesX12-X17 são selecionados a partir de um pool de aminoácidos numa razãomolar de 38% de Y, 25% de S, 25% de G e 12% de R, no qual X18 éselecionado de G e A, e X19 é selecionado de I, M, L, e F.

35. POLIPEPTÍDEO, de acordo com a reivindicação 28,caracterizado pelo fato de que os aminoácidos em cada uma das posiçõesX12-X17 são selecionados a partir de um pool de aminoácidos numa razãomolar de 20% Y, 26% S, 26% G, 13% R, 1 % A, 1 % D, 1 % E, 1 % F, 1 % H, 1 % I,-1% K, 1% L, 1% M, 1% N, 1% P, 1% Q, 1% T, 1% V, e de 1% W; no qual, X18é selecionada de G e A; e X19 é selecionado de I, M, L, e F.

36. POLIPEPTÍDEO, de acordo com uma das reivindicaçõesde 27-35, caracterizado pelo fato do CDRH1 compreender uma seqüência deaminoácidos selecionada de qualquer uma das SEQ ID Nos: 217-294.

37. POLIPEPTÍDEO, de acordo com uma das reivindicaçõesde 27-35, caracterizado pelo fato do CDRH2 compreender uma seqüência deaminoácidos selecionada de qualquer uma das SEQ ID Nos: 323-400.

38. POLIPEPTÍDEO, de acordo com uma das reivindicaçõesde 27-35, caracterizado pelo fato do CDRH3 compreender uma seqüência deaminoácidos selecionada de qualquer uma das SEQ ID Nos: 429-506.

39. POLIPEPTÍDEO, que compreende um domínio variável dacadeia pesada de imunoglobulina, no qual:(i) CDRH1 compreende uma seqüência de aminoácidos: G-F-X1-I-X2-X3-X4-X5-I-H, caracterizado pelo fato de que G é a posição 26 e X1 éa posição 28 de acordo com o sistema de numeração de Kabat; no qual, X1 éselecionado de Y e S; no qual, X2 é selecionado de Y e S; no qual, X3 éselecionado de Y e S; no qual, X4 é selecionado de Y e S; no qual, X5 éselecionado de Y e S;(ii) CDRH2 compreende uma seqüência de aminoácidos: X1-I-X2-P-X3-X4-G-X5-T-X6-Y-A-D-S-V-K-G, caracterizado pelo fato de que X1 é aposição 50 de acordo com o sistema de numeração de Kabat ; no qual, X1 éselecionado de Y e S; no qual, X2 é selecionado de Y e S; no qual, X3 éselecionado de Y e S; no qual, X4 é selecionado de Y e S; no qual, X5 éselecionado de Y e S; e no qual, X6 selecionado de Y e S; e(iii) CDRH3 compreende uma seqüência de aminoácidos: X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17-X18-X19,caracterizado pelo fato de que X1 é a posição 95 de acordo com o sistema denumeração de Kabat, e no qual os aminoácidos em cada uma das posições deX1-X17 são selecionadas de A, C, F, G, I, L, N, P, R, T, W ou Y, ou não estãopresentes; X18 é selecionado de G e A; e X19 é selecionado de F, L, I, e M.

40. POLIPEPTÍDEO, de acordo com a reivindicação 39,caracterizado pelo fato do CDRH1 compreender uma seqüência deaminoácidos selecionada das SEQ ID Nos: 816-842.

41. POLIPEPTÍDEO, de acordo com a reivindicação 39,caracterizado pelo fato do CDRH2 compreender uma seqüência deaminoácidos selecionada das SEQ ID Nos: 843-869.

42. POLIPEPTÍDEO, de acordo com a reivindicação 39,caracterizado pelo fato do CDRH3 compreender uma seqüência deaminoácidos selecionada das SEQ ID Nos: 870-896.

43. POLIPEPTÍDEO, que compreende um domínio variável dacadeia pesada de imunoglobulina, no qual:(i) CDRH1 compreende uma seqüência de aminoácidos: G-F-X1-I-X2-X3-X4-X5-I-H, caracterizado pelo fato de que G é a posição 26 e X1 éa posição 28 de acordo com o sistema de numeração de Kabat; e no qual osaminoácidos em cada uma das posições de X1-X5 são selecionadas de S e umdentre F, L, I e M; e(ii) CDRH2 compreende uma seqüência de aminoácidos: X1-I-X2-P-X3-X4-G-X5-T-X6-Y-A-D-S-V-K-G, caracterizado pelo fato de que X1 é aposição 50 de acordo com o sistema de numeração de Kabat ; e no qual osaminoácidos em cada uma das posições de X1-X6 são selecionadas de S e umdentre F, L, I e M; e(iii) CDRH3 compreende uma seqüência de aminoácidos: X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17-X18-X19,caracterizado pelo fato de que X1 é a posição 95 de acordo com o sistema denumeração de Kabat, e os aminoácidos em cada uma das posições de X1-X19são selecionadas a partir S e um dentre Y, W, R ou F, ou não esta presente;X18 é selecionado a partir de G e A; e X19 é selecionado de F, L, I, e M.

44. POLIPEPTÍDEO, de acordo com a reivindicação 43,caracterizado pelo fato do CDRH1 compreender uma seqüência deaminoácidos selecionada das SEQ ID Nos: 924-950.

45. POLIPEPTÍDEO, de acordo com a reivindicação 43,caracterizado pelo fato do CDRH2 compreender uma seqüência deaminoácidos selecionada das SEQ ID Nos: 951-977.

46. POLIPEPTÍDEO, de acordo com a reivindicação 43,caracterizado pelo fato do CDRH3 compreender uma seqüência deaminoácidos selecionada das SEQ ID Nos: 978-1004.

47. POLIPEPTÍDEO, de acordo com uma das reivindicações de 2a 8 ou 16 a 46, caracterizado pelo fato do polipeptídeo se ligar ao HER-2 humano.

48. POLIPEPTÍDEO, de acordo com a reivindicação 47,caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo é um anticorpo.

49. POLIPEPTÍDEO, de acordo com a reivindicação 39 ou 40,caracterizado pelo fato de que o domínio variável da cadeia pesadacompreende:-i) um CDRH1 contendo uma seqüência de aminoácidosGFSIYSSYIH (SEQ ID No: 821);-ii) um CDRH2 contendo uma seqüência de aminoácidosSIYPYSGYTSYADSVKG (SEQ ID No: 848); e-iii) um CDRH3 contendo uma seqüência de aminoácidosWWSSAFDY (SEQ ID No: 875).

50. POLIPEPTÍDEO, de acordo com a reivindicação 39 ou 40,caracterizado pelo fato de que o domínio variável da cadeia pesadacompreende:-i) um CDRH1 contendo uma seqüência de aminoácidosGFSIWWSWIH (SEQ ID NO: 932);-ii) um CDRH2 contendo uma seqüência de aminoácidosSISPSSGWTSYADSVKG (SEQ ID No: 959); e-iii) um CDRH3 contendo uma seqüência de aminoácidosWWSSAMDY (SEQ ID No: 986).

51. POLIPEPTÍDEO, de acordo com a reivindicação 39 ou 40,caracterizado pelo fato de que o domínio variável da cadeia pesadacompreende:i) um CDRH1 contendo uma seqüência de aminoácidosGFSISSSYIH (SEQ ID No: 944);ii) um CDRH2 contendo uma seqüência de aminoácidosSIYPYSGYTSYADSVKG (SEQ ID No: 971); eiii) um CDRH3 contendo uma seqüência de aminoácidosYYSYALDY (SEQ ID No: 998).

52. POLIPEPTÍDEO, de acordo com a reivindicação 39 ou 40,caracterizado pelo fato de que o domínio variável da cadeia pesadacompreende:i) um CDRH1 contendo uma seqüência de aminoácidosGFYISSSSIH (SEQ ID No: 230);ii) um CDRH2 contendo uma seqüência de aminoácidosYIYPSSGYTSYADSVKG (SEQ ID No: 336); eiii) um CDRH3 contendo uma seqüência de aminoácidosGYYYSYYSGYALDY (SEQ ID No: 442).

53. POLIPEPTÍDEO, de acordo com uma das reivindicações de-19-52, que consta adicionalmente de um domínio variável da cadeia leve, no qual:(i) CDRL3 compreende uma seqüência de aminoácidos Q-Q-X1-X2-X3-X4-P-X5-T (ID SEQ NO: 25); caracterizado pelo fado de que Xt é aposição 91 de acordo com o sistema de numeração de Kabat e é selecionadode S e Y; X2 é selecionado de S, Y e F; X3 é selecionado de Y; X4 éselecionado de Y e S, e X5 é selecionado de S e Y.

54. POLIPEPTÍDEO, que compreende um domínio variável dacadeia leve possuindo uma seqüência CDRL3 onde o CDRL3 possuí aseqüência de aminoácidos Q-Q-X1-X2-X3-X4-P-X5-T (SEQ ID No: 25), em queX1 é a posição 91 de acordo com a numeração de Kabat e é selecionado de Se Y; X2 é selecionado de S, Y e F; X3 é selecionado de Y, S, F; X4 éselecionado de Y e S; X5 é selecionado de S e Y.

55. POLIPEPTÍDEO, que compreende um domínio variável dacadeia leve de imunoglobulina, onde o CDRL3 compreende uma seqüência deaminoácidos Q-Q-X1-X2-X3-X4-P-X5-T; no qual, X1 é a posição 91 de acordocom o sistema de numeração de Kabat e os aminoácidos em cada uma dasposições de X1-X5 são selecionadas de S e um dentre Y, W, R ou F.

56. POLIPEPTÍDEO, que compreende um domínio variável dacadeia leve de imunoglobulina, no qual:(i) CDRL1 compreende uma primeira seqüência consensohipervariável ou variante desta contendo uma substituição em uma ou maisposições, em comparação com a seqüência consenso hipervariávelcorrespondente;(ii) CDRL2 compreende uma segunda seqüência consensohipervariável ou variante desta contendo uma substituição em uma ou maisposições, em comparação com a seqüência consenso hipervariávelcorrespondente, e(iii) CDRL3 compreende uma seqüência de aminoácidos: Q-Q-X1-X2-X3-(X4) n-X5-X6-T, caracterizado pelo fato de que X1 é a posição 91 deacordo com o sistema de numeração de Kabat.

57. POLIPEPTÍDEO, de acordo com a reivindicação 56,caracterizado pelo fato de que X1 é a posição 91 de acordo com o sistema denumeração de Kabat e X1 é selecionado de Y e S; X2 é selecionado de Y e S;X3 é selecionado de Y e S; X4 é selecionado de Y e S; X5 é selecionado de Pe L; e X6 é selecionado de F, L, I e V.

58. POLIPEPTÍDEO de acordo com a reivindicação 56,caracterizado pelo fato de que n é um número de 1 a 3.

59. POLIPEPTÍDEO, de acordo com uma das reivindicaçõesde 54 a 58, caracterizado pelo fato do CDRL3 compreender uma seqüência deaminoácidos selecionada das SEQ ID Nos: 83-188, 789-815 e 897-923.

60. POLIPEPTÍDEO, de acordo com uma das reivindicações de-54 a 58, caracterizado pelo fato de incluir adicionalmente um CDRL1 quecompreende uma seqüência de aminoácidos RASQDVNTAVA (ID SEQ NO: 29).

61. POLIPEPTÍDEO, de acordo com uma das reivindicações-54 a 58 e reivindicações 55 ou 56, caracterizado pelo fato de incluiradicionalmente um CDRL2 que compreende uma seqüência de aminoácidosSASSLYS (SEQ ID No: 30).

62. ANTICORPO, que compreende um polipeptídeo que possuíum domínio variável da cadeia pesada de imunoglobulina, de acordo com umadas reivindicações de 1 a 53, e um polipeptídeo que possuí um domíniovariável da cadeia leve de imunoglobulina de acordo com uma dasreivindicações de 54 a 61.

63. POLIPEPTÍDEO, incluindo pelo menos dois domíniosvariáveis de anticorpo compreendendo:(a) um domínio variável da cadeia pesada do anticorpocompreendendo o polipeptídeo de uma das reivindicações de 1 a 53; e(b) um domínio variável da cadeia leve do anticorpocompreendendo o polipeptídeo de uma das reivindicações de 54 a 61.

64. POLIPEPTÍDEO, de acordo com uma das reivindicações de 1a 63, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo é um Fv de cadeia única.

65. POLIPEPTÍDEO, de acordo com uma das reivindicaçõesde 1 a 63, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo é um polipeptídeo Fab.

66. POLIPEPTÍDEO, de acordo com uma das reivindicaçõesde 1 a 58, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo é um polipeptídeocompletamente humano.

67. POLIPEPTÍDEO, de acordo com uma das reivindicaçõesde 1 a 66, que compreende adicionalmente das regiões de suporte FR1, FR2,FR3, e/ou FR4 para um polipeptídeo do domínio variável correspondente àvariante de CDRH1, CDRH2, CDRH3, e/ou CDRL3, onde as regiões de suportesão obtidas de um único polipeptídeo modelo.

68. POLIPEPTÍDEO, de acordo com a reivindicação 67,caracterizado pelo fato de que cada uma das regiões de suporte compreendeuma seqüência de aminoácidos correspondente a região de suporte dasseqüências de aminoácidos do polipeptídeo 4D5 (SEQ ID No: 1 e 2).

69. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 67,caracterizado pelo fato de que o anticorpo consta da região de suportecorrespondente a seqüência de aminoácidos da região de suporte variante doanticorpo 4D5 (SEQ ID No: 14-17 e 18-21).

70. POLIPEPTÍDEO, de acordo com uma das reivindicaçõesde 1 a 69, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo compreendeadicionalmente de um domínio de dimerização ligado a região C-terminal dopolipeptídeo do domínio variável da cadeia pesada.

71. POLIPEPTÍDEO, de acordo com a reivindicação 70,caracterizado pelo fato de que o domínio de dimerização contém um domínio comzíper de leucina ou uma seqüência que possuí pelo menos um resíduo de cisteína.

72. POLIPEPTÍDEO, de acordo com a reivindicação 70,caracterizado pelo fato de que o domínio de dimerização compreende umaregião de dobradiça de um polipeptídeo e um zíper de leucina.

73. POLIPEPTÍDEO, de acordo com a reivindicação 70,caracterizado pelo fato de que o domínio de dimerização é uma única cisteína.

74. POLIPEPTÍDEO DE FUSÃO, compreendendo umpolipeptídeo de acordo com uma das reivindicações de 1 a 73, caracterizadopelo fato de que o polipeptídeo do domínio variável está fundido a pelo menosuma porção de uma proteína da cápside viral.

75. POLIPEPTÍDEO DE FUSÃO, de acordo com areivindicação 74, caracterizado pelo fato da cápside viral ser selecionada dogrupo que compreende a proteína plll, proteína maior da cápside pVIII, Soe,Hoc, gpD, pv1, e variantes destes.

76. POLIPEPTÍDEO DE FUSÃO, de acordo com areivindicação 75, que consta adicionalmente de um domínio de dimerizaçãoentre o domínio variável e a proteína da cápside viral.

77. POLIPEPTÍDEO DE FUSÃO, de acordo com areivindicação 74, que consta adicionalmente um peptídeo marcado.

78. POLIPEPTÍDEO DE FUSÃO, de acordo com areivindicação 77, caracterizado pelo fato do peptídeo marcado ser selecionadode um grupo que consiste de gD, c-myc, poli-his, uma proteína fluorescente eB-galactosidase.

79. COMPOSIÇÃO, que contenha um polipeptídeo de uma dasreivindicações de 1 a 78 e um veículo.

80. POLINUCLEOTÍDEO, que codifica um polipeptídeo de umadas reivindicações de 1 a 78.

81. VETOR, que contenha o polinucleotídeo da reivindicação 80.

82. CÉLULA HOSPEDEIRA, que contenha o vetor dareivindicação 81.

83. MÉTODO DE PRODUÇÃO DE UM POLIPEPTÍDEO, quecompreende no cultivo da célula hospedeira da reivindicação 82 sob condiçõesadequadas para a produção de um polipeptídeo e recuperação do polipeptídeoou do fragmento de ligação ao antígeno deste.

84. BIBLIOTECA DE POLIPEPTÍDEOS, que compreende umavariedade de polipeptídeos de uma das reivindicações de 1 a 78 e na qual abiblioteca tem pelo menos 1 x 104 seqüências de domínios variáveis deanticorpos.

85. MÉTODO PARA GERAR UMA COMPOSIÇÃO, que incluíuma variedade de polipeptídeos compreendendo em:(a) produzir uma variedade de polipeptídeos que inclui:(i) CDRH1 compreende uma seqüência de aminoácidos: G-F-X1-I-X2-X3-X4-X5-I-H, caracterizado pelo fato de que G é posição 26 e X1 éposição 28 de acordo com o sistema de numeração de Kabat; no qual oaminoácido X1 é selecionado de Y e S; X2 é selecionado de Y e S; X3 éselecionado de Y e S; X4 é selecionado de Y e S; e X5 é selecionado de Y e S;(ii) CDRH2 compreende uma seqüência de aminoácidos: X1-I-X2-P-X3-X4-G-X5-T-X6-Y-A-D-S-V-K-G, caracterizado pelo fato de que X1 éposição 50 de acordo com o sistema de numeração de Kabat ; no qual oaminoácido X1 é selecionado de Y e S; X2 é selecionado de Y e S; X3 éselecionado de Y e S; X4 é selecionado de Y e S; X5 é selecionado de Y e S; eX6 é selecionado de Y e S; e(iii) CDRH3 compreende uma seqüência de aminoácidos: X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17-X18-X19,caracterizado pelo fato de que X1 é posição 95 de acordo com o sistema denumeração de Kabat, no qual os aminoácidos em cada uma das posições de XI-XI? são selecionados de S e um dentre A, C, F, G, I, L, N, P, R, T, W ou Y, ou nãoesta presente; X18 é selecionado de G e A; e X19 é selecionado de F, L, I, e M.

86. MÉTODO PARA GERAR UMA COMPOSIÇÃO, que incluiuma variedade de polipeptídeos compreendendo em:(a) produzir uma variedade de polipeptídeos que inclui:(i) CDRH1 compreende uma seqüência de aminoácidos: G-F-X1-I-X2-X3-X4-X5-I-H, caracterizado pelo fato de que G é posição 26 e X1 éposição 28 de acordo com o sistema de numeração de Kabat; no qual osaminoácidos em cada uma das posições de X1-X5 são selecionados de S e umdentre Y,W,Re F;(ii) CDRH2 compreende uma seqüência de aminoácidos: X1-I-X2-P-X3-X4-G-X5-T-X6-Y-A-D-S-V-K-G, caracterizado pelo fato de que X1 éposição 50 de acordo com o sistema de numeração de Kabat ; no qual osaminoácidos em cada uma das posições de X1-X6 são selecionados de S e umdentre Y, W, R e F; e(iii) CDRH3 compreende uma seqüência de aminoácidos: X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17-X18-X19,caracterizado pelo fato de que X1 é posição 95 de acordo com o sistema denumeração de Kabat, no qual os aminoácidos em cada uma das posições de XI-XI 9 são selecionados de S e um dentre Y, W, R e , ou não esta presente; no qualX18 é selecionado de G e A; e no qual X19 é selecionado de F, L, I, e M.

87. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 85 ou 86,caracterizado pelo fato de que o método compreende em:(b) produzir uma variedade de polipeptídeos que inclui:(i) CDKL1 compreendendo uma primeira seqüência consensohipervariável ou variante desta contendo a substituição em uma ou maisposições comparada a seqüência consenso hipervariável correspondente;(ii) CDRL2 compreendendo uma segunda seqüência consensohipervariável ou variante desta contendo a substituição em uma ou maisposições comparada a seqüência consenso hipervariável correspondente; e(iii) CDRL3 compreendendo uma seqüência de aminoácido: Q-Q-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-T, no qual X1 é posição 91 de acordo com osistema de numeração de Kabat; no qual X1 é selecionado de Y e S; no qualX2 é selecionado de Y e S; no qual X3 é selecionado de Y e S; no qual X4 éselecionado de Y e S; no qual X5 é selecionado de Y e S, ou não estápresente; no qual X6 é selecionado de Y e S, ou não está presente; no qual X7é selecionado de P e L; no qual X8 é selecionado de F, L, I, e V.

88. MÉTODO, de acordo com uma das reivindicações de 85 a-86, caracterizado pelo fato de que o método compreende em:(b) produzir uma variedade de polipeptídeos que inclui:(i) CDKL1 compreendendo uma primeira seqüência consensohipervariável ou variante desta contendo a substituição em uma ou maisposições comparada a seqüência consenso hipervariável correspondente;(ii) CDRL2 compreendendo uma segunda seqüência consensohipervariável ou variante desta contendo a substituição em uma ou maisposições comparada a seqüência consenso hipervariável correspondente; e(iii) CDRL3 compreendendo uma seqüência de aminoácido: Q-Q-X1-X2-X3-X4-P-X5-T, no qual X1 é posição 91 de acordo com o sistema denumeração de Kabat; no qual X1 é selecionado de Y e S; no qual X2 éselecionado de Y e S; no qual X3 é selecionado de Y e S; no qual X4 éselecionado de Y e S; no qual X5 é selecionado de Y e S.

89. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 85 ou 86,caracterizado pelo fato de que o método compreende em:(b) produzir uma variedade de polipeptídeos que inclui:(i) CDRL1 compreendendo uma primeira seqüência consensohipervariável ou variante desta contendo a substituição em uma ou maisposições comparada a seqüência consenso hipervariável correspondente;(ii) CDRL2 compreendendo uma segunda seqüência consensohipervariável ou variante desta contendo a substituição em uma ou maisposições comparada a seqüência consenso hipervariável correspondente; e(iii) CDRL3 compreende uma seqüência de aminoácidos: Q-Q-F-X1-I-X2-X3-X4-X5-I-H, caracterizado pelo fato de que G é posição 26 e X1 éposição 28 de acordo com o sistema de numeração de Kabat; no qual osaminoácidos em cada uma das posições de X1-X5 são selecionados de S e umdentre Y, W, R e F;

90. MÉTODO PARA GERAR UMA COMPOSIÇÃO, que incluiuma variedade de polipeptídeos que compreende em:(a) produzir uma variedade de polipeptídeos que inclui:(i) CDRH1 compreende uma seqüência de aminoácidos: G-F-X1-I-X2-X3-X4-X5-I-H, caracterizado pelo fato de que G é posição 26 e X1 éposição 28 de acordo com o sistema de numeração de Kabat; no qual oaminoácido X1 é selecionado de Y e S; X2 é selecionado de Y e S; X3 éselecionado de Y e S; X4 é selecionado de Y e S; e X5 é selecionado de Y e S;(ii) CDRH2 compreende uma seqüência de aminoácidos: X1-I-X2-P-X3-X4-G-X5-T-X6-Y-A-D-S-V-K-G, caracterizado pelo fato de que X1 éposição 50 de acordo com o sistema de numeração de Kabat ; no qual oaminoácido X1 é selecionado de Y e S; X2 é selecionado de Y e S; X3 éselecionado de Y e S; X4 é selecionado de Y e S; X5 é selecionado de Y e S; eX6 é selecionado de Y e S. e(iii) CDRH3 compreende uma seqüência de aminoácidos: X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11 -X12-X13-X14-X15-X16-X17-X18-X19-D-Y, caracterizado pelo fato de que X1 é posição 95 de acordo com o sistema denumeração de Kabat, no qual os aminoácidos em cada uma das posições deX1-X6 são selecionados de um pool de aminoácidos em uma relação molar de-50% de Y, 25% de S e 25% de G, e X18 é selecionado de G e A, e X19 éselecionado de I, M, L, e F.

91. MÉTODO PARA GERAR UMA COMPOSIÇÃO, que incluiuma variedade de polipeptídeos que compreende em:(a) produzir uma variedade de polipeptídeos que inclui:(i) CDRH1 compreende uma seqüência de aminoácidos: G-F-X1-I-X2-X3-X4-X5-I-H, caracterizado pelo fato de que G é posição 26 e X1 éposição 28 de acordo com o sistema de numeração de Kabat; no qual oaminoácido X1 é selecionado de Y e S; X2 é selecionado de Y e S; X3 éselecionado de Y e S; X4 é selecionado de Y e S; e X5 é selecionado de Y e S;(ii) CDRH2 compreende uma seqüência de aminoácidos: X1-I-X2-P-X3-X4-G-X5-T-X6-Y-A-D-S-V-K-G, caracterizado pelo fato de que X1 éposição 50 de acordo com o sistema de numeração de Kabat ; no qual oaminoácido X1 é selecionado de Y e S; X2 é selecionado de Y e S; X3 éselecionado de Y e S; X4 é selecionado de Y e S; X5 é selecionado de Y e S; eX6 é selecionado de Y e S; e(iii) CDRH3 compreende uma seqüência de aminoácidos: X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17-X18-X19-D-Y, noqual X1 é posição 95 de acordo com o sistema de numeração de Kabat,caracterizada pelo fato dos aminoácidos em cada uma das posições de X1-X6serem selecionados de um pool de aminoácidos numa razão molar de 25% deY, 50% de S, e 25% de R; no qual os aminoácidos em cada uma das posiçõesde X7-X17 serem selecionados de um pool de aminoácidos numa razão molarde 25% de Y, 50% de S e 25% de R, ou não estarem presentes; no qual X18 éselecionado de G e A, e no qual X19 é selecionado de I, M, L e F.

92. MÉTODO PARA GERAR UMA COMPOSIÇÃO, que incluiuma variedade de polipeptídeos que compreende em:(a) produzir uma variedade de polipeptídeos que inclui:(i) CDRH1 compreende uma seqüência de aminoácidos: G-F-X1-I-X2-X3-X4-X5-I-H, caracterizado pelo fato de que G é posição 26 e X1 éposição 28 de acordo com o sistema de numeração de Kabat; no qual oaminoácido X1 é selecionado de Y e S; X2 é selecionado de Y e S; X3 éselecionado de Ye S; X4é selecionado de Y eS; e X5 é selecionado de Y e S;(ii) CDRH2 compreende uma seqüência de aminoácidos: X1-I-X2-P-X3-X4-G-X5-T-X6-Y-A-D-S-V-K-G, caracterizado pelo fato de que X1 éposição 50 de acordo com o sistema de numeração de Kabat ; no qual oaminoácido X1 é selecionado de Y e S; X2 é selecionado de Y e S; X3 éselecionado de Y e S; X4 é selecionado de Y e S; X5 é selecionado de Y e S; eX6 é selecionado de Y e S. e(iii) CDRH3 compreende uma seqüência de aminoácidos: X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17-X18-X19-D-Y(SEQ ID No ED: 27), no qual X1 é posição 95 de acordo com o sistema denumeração de Kabat, caracterizada pelo fato dos aminoácidos em cada umadas posições de X1-X6 serem selecionados de um pool de aminoácidos numarazão molar de 38% de Y, 25% de S, e 25% de G e 12% de R; caracterizadapelo fato dos aminoácidos em cada uma das posições de X7-X17 seremselecionados de um pool de aminoácidos numa razão molar de 38% de Y, 25%de S, e 25% de G e 12% de R, ou não estarem presentes; no qual X18 éselecionado de G e A, e no qual X19 é selecionado de I, M, L e F.

93. MÉTODO PARA GERAR UMA COMPOSIÇÃO, que incluiuma variedade de polipeptídeos que compreende em:(a) produzir uma variedade de polipeptídeos que inclui:(i) CDRH1 compreende uma seqüência de aminoácidos: G-F-X1-I-X2-X3-X4-X5-I-H, caracterizado pelo fato de que G é posição 26 e X1 éposição 28 de acordo com o sistema de numeração de Kabat; no qual oaminoácido X1 é selecionado de Y e S; X2 é selecionado de Y e S; X3 éselecionado de Y e S; X4 é selecionado de Y e S; e X5 é selecionado de Y e S;(ii) CDRH2 compreende uma seqüência de aminoácidos: X1-I-X2-P-X3-X4-G-X5-T-X6-Y-A-D-S-V-K-G, caracterizado pelo fato de que X1 éposição 50 de acordo com o sistema de numeração de Kabat ; no qual oaminoácido X1 é selecionado de Y e S; X2 é selecionado de Y e S; X3 éselecionado de Y e S; X4 é selecionado de Y e S; X5 é selecionado de Y e S; eX6 é selecionado de Y e S. e(iii) CDRH3 compreende uma seqüência de aminoácidos: X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11 -X12-X13-X14-X15-X16-X17-X18-X19-D-Y(SEQ ID No ED: 28), no qual X1 é posição 95 de acordo com o sistema denumeração de Kabat, caracterizada pelo fato dos aminoácidos em cada umadas posições de X1-X6 serem selecionados de um pool de aminoácidos numarazão molar de 20% de Y, 26% de S, 26% de G, 13% de R, 1% de A, 1% de D,-1% de E, 1% de F, 1% de H, 1% de I, 1% de K, 1% de L, 1% de M, 1% de N,-1% de P, 1% de Q, 1% de T, 1% de V e 1% de W; caracterizada pelo fato dosaminoácidos em cada uma das posições de X7-X17 serem selecionados de umpool de aminoácidos numa razão molar de 20% de Y, 26% de S, 26% de G,-13% de R, 1% de A, 1% de D, 1% de E, 1% de F, 1% de H, 1% de I, 1% de K,-1% de L, 1% de M, 1% de N, 1% de P, 1% de Q, 1% de T, 1% de V e 1% de W,ou não estão presentes; no qual X18 é selecionado de G e A, e no qual X19 éselecionado de I, M, L e F.

94. MÉTODO, de uma das reivindicações de 90 a 93,caracterizado pelo fato de que o método consta adicionalmente:(b) da produção de uma variedade de polipeptídeos que inclui:(i) CDRL1 compreende uma primeira seqüência consensohipervariável ou variante desta contendo uma substituição em uma ou maisposições, em comparação com a seqüência consenso hipervariávelcorrespondente;(ii) CDRL2 compreende uma segunda seqüência consensohipervariável ou variante desta contendo uma substituição em uma ou maisposições, em comparação com a seqüência consenso hipervariávelcorrespondente, e(iii) CDRL3 compreende a seqüência de aminoácidos Q-Q-X1-X2-X3-X4-P-X5-T, no qual X1 é posição 91 de acordo com a numeração deKabat e é selecionado de S e Y; no qual, X2 é selecionado de S e Y; no qual,X3 é selecionado de Y e S; no qual, X4 é selecionado de Y e S; no qual, X5 éselecionado de Y e S.

95. MÉTODO, de uma das reivindicações de 87 a 89 ou 94,caracterizado pelo fato de que a primeira seqüência de consenso hipervariávelcompreende uma seqüência de consenso CDRL1 Kabat.

96. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 95, caracterizadopelo fato de que a primeira seqüência de consenso hipervariável é R-A-S-Q-D-V-N-T-A-V-A (ID SEQ NO: 29).

97. MÉTODO, de uma das reivindicações de 87 a 89 ou 94,caracterizado pelo fato de que a segunda seqüência de consenso hipervariávelcompreende uma seqüência de consenso CDRL2 Kabat.

98. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 97, caracterizadopelo fato de que a segunda seqüência de consenso hipervariável é S-A-S-S-L-Y-S (SEQ ID NO:30).

99. MÉTODO, de uma das reivindicações de 85 a 98,caracterizado pelo fato de que a variedade de polipeptídeos são codificadospor uma variedade de polinucleotídeos.

100. MÉTODO PARA A SELEÇÃO DE UM DOMÍNIOVARIÁVEL LIGANTE AO ANTÍGENO, que se liga a um antígeno alvo a partirde uma biblioteca de domínios variáveis de anticorpos, compreendendo na:(a) interação da biblioteca da reivindicação 84 com o antígeno alvo;(b) separação de um ou mais polipeptídeos que ligamespecificamente ao antígeno alvo dos polipeptídeos que não se ligamespecificamente ao antígeno alvo, recuperando um ou mais polipeptídeos quese ligam especificamente ao antígeno alvo e incubando um ou maispolipeptídeos que se ligam especificamente ao antígeno alvo em uma série desoluções que consiste em diminuir a quantidade de antígeno alvo a umaconcentração de cerca de 0,1 nM a cerca de 1000 nN, e(c)Seleção de um ou mais polipeptídeos que se ligamespecificamente ao antígeno alvo e que podem ligar-se a uma baixaconcentração de antígeno alvo ou que possuem uma afinidade de cerca de 0,1nM a 200 nM.

101. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 100,caracterizado pelo fato de que o antígeno é HER2 ou DR5.

102. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 100, caracterizadopelo fato da concentração do antígeno alvo ser cerca de 100 a 250 nM.

103. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 100, caracterizadopelo fato da concentração do antígeno alvo ser cerca de 25 a 100 nM.

104. MÉTODO PARA SELECIONAR POLIPEPTÍDEOS, que seligam a antígenos alvos de uma biblioteca de polipeptídeos, compreendendo em:(a) isolar um ou mais polipeptídeos que ligam-seespecificamente ao antígeno alvo pela interação à uma biblioteca que contenhauma variedade de polipeptídeos de uma das reivindicações de 1 a 79 com umantígeno alvo imobilizado sob condições adequadas para a ligação;(b) separar um ou mais polipeptídeos que ligam-seespecificamente ao antígeno alvo dos polipeptídeos que não se ligamespecificamente ao antígeno alvo, e recuperar um ou mais polipeptídeos quese ligam especificamente ao antígeno alvo para obter uma subpopulaçãoenriquecida para um ou mais polipeptídeos que se ligam especificamente aoantígeno alvo; e(c) opcionalmente, repetir as etapas (a) - (b) pelo menos duasvezes, cada repetição usando a subpopulação enriquecida para a um ou maispolipeptídeos que ligam especificamente ao antígeno alvo obtido a partir doúltimo ciclo de seleção.

105. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 104,compreendendo adicionalmente em:(d) incubar a subpopulação com uma concentração deantígeno alvo marcado em um intervalo de cerca de 0,1 nM a 1000 nN paraformar uma mistura, sob condições adequadas para ligação;(e) interagir a mistura com um agente imobilizado que se ligano antígeno alvo marcado;(f) detectar a um ou mais polipeptídeos que ligam-seespecificamente ao antígeno alvo marcado, e recuperar um ou maispolipeptídeos que liga-se especificamente ao antígeno alvo marcado doantígeno alvo marcado; e(g) opcionalmente, repetir as etapas de (d) a (f) por pelomenos duas vezes, cada repetição usando a subpopulação enriquecida paraum ou mais polipeptídeos que ligam-se especificamente ao antígeno alvomarcado obtido a partir do última ciclo de seleção, utilizando uma concentraçãomenor de antígeno alvo marcado do que no ciclo de seleção anterior.

106. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 105,compreendendo ainda da adição de um excesso de antígeno alvo não marcadona mistura e incubar a mistura por um período de tempo suficiente pararecuperar um ou mais polipeptídeos que se ligam especificamente ao antígenoalvo com baixa afinidade.

107. MÉTODO PARA ISOLAR UM OU MAIS POLIPEPTÍDEOS,que se ligam especificamente a um antígeno alvo com alta afinidade,compreendendo em:(a) Interagir uma biblioteca que consiste em uma variedade depolipeptídeos de uma das reivindicações de 1 a 79 com um antígeno alvo auma concentração de, pelo menos, 0,1 nM a 1000 nN para isolar um ou maispolipeptídeos que se ligam especificamente ao antígeno alvo;(b) recuperar um ou mais polipeptídeos que ligamespecificamente ao antígeno alvo a partir do antígeno alvo para obter umasubpopulação enriquecida para uma ou mais polipeptídeos que se ligamespecificamente ao antígeno alvo; e(c) opcionalmente repetir as etapas (a) e (b) por pelo menosduas vezes, cada repetição usando a subpopulação obtidos a partir da última etapade e usando uma concentração decrescente de antígeno alvo do que utilizada naetapa anterior para isolar um ou mais polipeptídeos que se ligam especificamenteao antígeno alvo em uma concentração menor de antígeno alvo.

108. MÉTODO PARA O TRATAMENTO DE CÂNCER, em ummamífero, compreendendo em administrar um polipeptídeo de uma dasreivindicações de 1 a 79 aos mamíferos.

109. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 108,caracterizado pelo fato do câncer ser selecionado de câncer de mama, câncercoloretal, câncer de pulmão de não-pequenas células, linfoma não-Hodgkin(NHL), câncer renal, câncer de próstata, câncer de fígado, câncer de cabeça epescoço, melanoma, câncer de ovário, mesotelioma e mieloma múltiplo.

110. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 108 ou 109,caracterizado pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo anti-HER2.

111. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 108 ou 109,caracterizado pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo anti-DR5.

112. MÉTODO, de acordo com uma das reivindicações de 108 a-111, caracterizado pelo fato de que o tratamento inclui a etapa adicional deadministração de um segundo agente terapêutico simultaneamente ouseqüencialmente com o anticorpo.

113. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 112, caracterizadopelo fato de que o segundo agente terapêutico é selecionado de um agenteantiangiogênico, antineoplásico, agente quimioterápico e agente citotóxico.

114. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 113, caracterizadopelo fato de que o agente antiangiogênico é um anticorpo anti-hVEGF.

115. MÉTODO PARA TRATAR, um mamífero que sofre oupossui risco de desenvolver uma doença inflamatória ou autoimune,compreendendo a etapa de tratamento do mamífero com um anticorpo de umadas reivindicações de 1 a17.

116. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 115,caracterizado pelo fato de que a doença inflamatória ou autoimune é artritereumatóide.

117. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 115 ou 116,caracterizado pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo anti-DR5.