BRPI0620586A2 - formulação farmacêutica aquosa para administração intranasal e uso de uma formulação farmacêutica aquosa para elaborar um medicamento - Google Patents

Abstract

FORMULAçãO FARMACEUTICA AQUOSA PAPA ADMINISTRAçãO INTPANASAL E USO DE UMA FORMULAçãO FARMACêUTICA AQUOSA PARAELABORAR UM MEDICAMENTO A presente invenção refere-se a uma formulação farmacêutica que contém uma mistura de uma quantidade farmaceuticamente activa de péptido que regulà glucose (GRP) e intensificadores, onda formulação farmacêutica é empregue no tratamento de um síndrome metabólico.

Description

FORMULAÇÃO FARMACÊUTICA AQUOSA PARA ADMINISTRAÇÃO INTRANASAL E USO DE UMA FORMULAÇÃO FARMACÊUTICA AQUOSA PARA ELABORAR UM MEDICAMENTO

HISTÓRICO DA INVENÇÃO

Os peptídeos reguladores de glucose ("GRP") são uma classe de peptídeos que têm potencial terapêutico não tratamento de diabetes mellitus insulino-dependente (DMID), diabetes gestacional ou diabetes mellitus não insulino- dependente (DMNID) , não tratamento de obesidade, e não tratamento de dislipidemia. Ver Patente E.U.A N° 6 506 725, OU. S Patent Application Publication N0 20030036504A1; Patente Européia N0 EP1083 924B1; International Patent Application Publication N0 WO 98/30231A1; e International Patent Application N0 WO 00/73331A2. Estes GRPs incluem ou peptídeo semelhante ao glucagom (GLP), por exemplo ou GLP-1; as exendinas, especialmente a exendina-β / também conhecida como exenatide; e peptídeos damilina e análogos damilina, tc ycomo pramlintide. Não entanto, até à data estes GRP apenas foram administrados em humanos através de injecção.

Uma grande desvantagem de administração de medicamentos através de injecção é que é muitas vezes necessário pessoal formado para administrar a droga.Adicionalmente, ou pessoal formado é colocado numa posição de risco quando administra uma drogàtravés de injecção. Para medicamentos auto-administrados, muitos pacientes estão relutantes ou incapazes de darem injecções a se próprios numcom base regular. A injecção está também associada riscos aumentados de infecção. Outras desvantagens de injecção de medicamentos incluem variabilidade dois resultados entregues entre indivíduos, assim como intensidade e duração imprevisível de áção do medicamento.

A administração oral está disponível como alternativa; não entanto, alguns agentes terapêuticos mostram uma biodisponibilidade muito baixa e um atraso considerável paràctuarem quando administrados por esta via devido a um metabolismo hepático de primeira passagem e degradação não tracto gastrointestinal. Logo, há uma necessidade de desenvolver modos de administração parnosGRP diferentes de injecção e/ou administração oral.

A administração através da mucosa de compostos terapêuticos oferece certas vantagens em relação à injecção e outros modos de administração, por exemplo conveniência e eficácia de entrega, assim como a redução ou eliminação dois problemas de compatibilidade e efeitos secundários inerentes à entrega. Não entanto, a entregàtravés da mucosa de agentes biologicamente ativos está limitada pelas funções de barreira mucosa e outros factores. As células epiteliais compõem a barreira mucosa e fornecnum interface crucial entre ou meio externo e os tecidos da mucosa e submucosa e compartimentos extracelulares. Uma das funções mais importantes das células epiteliais da mucosa é determinar e regular a permeabilidade da mucosa. Neste contexto, as células epiteliais criam barreiras de permeabilidade selectiva entre diferentes compartimentos fisiológicos. A permeabilidade selectiva é ou resultado de um transporte regulado de moléculas através do citoplasma (ou caminho transcelular) e a permeabilidade regulada dois espaços entre as células (ou caminho paracelular).

Sabe-se que as junções intercelulares entre células epiteliais estão envolvidas tanto na manutenção como na regulação de função de barreira epitelial, e adesão célula- célula. As junções estreitas (TJ) das células epiteliais e endoteliais são particularmente importantes paràs junções célula-célula que regulam a permeabilidade do caminho paracelular, e também dividem superfície celular em compartimentos apicais e basolaterais. As junções estreitas formam contactos circunferenciais intercelulares contínuos entre as células epiteliais e criam uma barreira regulada para ou movimento paracelular de água, solutos, e células imunitárias. Fornecem também um segundo tipo de barreira que contribui para polaridade celular limitando a troca de lípidos membranares entre os domínios de membranàpical e basolateral.

Não contexto de entrega de medicamento, a capacidadee dois fármacos permearem as camadas de células epiteliais das superfícies da mucosa, assistência de agentes daumento de entrega, parece estar relacionada com um número de factores, incluindo tamanho molecular, solubilidade lipídica, e ionização. Em geral, as moléculas pequenas, menores que cerca de 300-1000 daltons, são muitas vezes capazes de penetrar as barreiras da mucosa. Não entanto, à medida que ou tamanho molecular aumenta, a permeabilidade decresce rapidamente. A entrega transdérmica do fármaco permite a permeação de moléculas maiores através das camadas celulares epiteliais de pele. A administração transdérmica, como um adesivo dérmico, é outra via de entregàlternativa paro fármacos macromoleculares maiores. Não entanto, a entrega transdérmica poderá aindàpresentar mais limitações de tamanho do que a injecção. Por estas razões, a administração de fármacos por via da mucosa e epidérmica requer tipicamente maiores quantidades de fármaco do que a administração por injecção. Outros compostos terapêuticos, incluindo fármacos de moléculas maiores, são muitas vezes refractários à entregàtravés da mucosa. Adição à fraca permeabilidade intrínseca, os grandes fármacos macromoleculares são muitas vezes sujeitos a difusão limitada, assim como degradação enzimática não lúmen e celular e clearance rápido nos locais da mucosa. Logo, de formà entregar estas moléculas maiores em quantidades terapeuticamente eficazes, são necessários agentes potenciadores de permeação celular paràjudar à sua passagem através destas superfícies da mucosa e dérmicas e para circulação sistêmica onde podagir rapidamente no tecidoalvo.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

FIGURA 1: Decréscimo na concentração de glucose sangulneàpós administração IN de GLP-I comparada à Exenatide (SQ) e controlo Salino (IN) (corrigido para glucose endógena) em ratos.

Resposta insulínicàpós administração intranasal de GLP-I em ratos.

FIGURA 3: Esvaziamento Gástrico após administração intranasal de GLP-I em ratos.

FIGURA 4: Farmacocinética potenciada parà Exendine- 4 administrada IN com potenciadores 2X, IN com potenciadores 2X + gelatina, e IN com potenciadores IX + gelatina comparada com controlo IN e IV em coelhos

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Um aspecto da presente invenção inclui a utilidade terapêutica de formulações farmacêuticas parà entrega de GRP, análogos do GRP, fragmentos do GRP, e derivados funcionais do GRP na superfície epitelial para utilização não tratamento de doenças humanas incluindo a obesidade e a diabetes.

A presente invenção preenche necessidades prementes e satisfaz objectivos e vantagens adicionais fornecendo novos e eficazes métodos, utilizações e composições para entrega trans-epitelial, especialmente trans-mucosal, de GRP tais como GLP e análogos do GLP, amilina e análogos damilina, e exendines e análogos do exendine, para tratar a diabetes mellitus insulino-dependente (DMID), diabetes gestacional ou diabetes mellitus não insulino-dependente (DMNID), dislipidemia, hiperglicemia, obesidade, induzir a saciedade num indivíduo, e promover a perda de peso num indivíduo. Nas materializações exemplificativas, os métodos e composições de entrega potenciados da presente invenção fornecnuma entrega terapeuticamente eficaz do agonista do GRP através de uma camada de células biológicas para prevenção ou tratamento de obesidade e desordens alimentares em mamíferos. Num aspecto da invenção, são fornecidas formulações farmacêuticas adequadas para administração epitelial que contém uma quantidade de um GRP terapeuticamente eficaz e um ou mais agentes potenciadores de entrega epitelial como descrito doravante, cujas formulações são eficazes num método de entrega epitelial da invenção para prevenir a instalação ou progressão de obesidade ou desordens alimentares num mamífero. A entrega trans-epitelial de uma quantidade terapeuticamente eficaz dagonista do GRP e um ou mais agentes potenciadores de entrega epitelial resulta em níveis terapêuticos elevados do agonista do GRP não indivíduo.

Os métodos e composições de entrega potenciada da presente invenção fornecnuma entrega terapeuticamente eficaz de um GRP para prevenção ou tratamento de uma variedade de doenças e condições em mamíferos. OU GRP pode ser administrado através de uma variedade de vias epiteliais, por exemplo pondo ou GRP em contacto com ou epitélio da mucosa nasal, um epitélio da mucosa bronquial ou nasal, a superfície oral bucal e uma pequena superfície da mucosa intestinal ou uma superfície epidérmica. Nas materializações exemplificativas, os métodos e composições estão dirigidos para ou formulados para entrega intranasal (por exemplo entrega na mucosa nasal ou entrega na mucosa intranasal).

Estas composições e métodos podem envolver formulação combinatória ou coordenar a administração de um ou mais GRPs com um ou mais agentes potenciadores de entrega epitelial. Entre os agentes de potenciamento de entrega epitelial a serem escolhidos para alcançar estas formulações e métodos estão (A) agentes de solubilização; (B) agentes modificadores de carga; (C) agentes de controlo do pH; (D) inibidores de degradamento enzimático; (E) agentes de limpeza do muco ou mucolíticos; (F) agentes ciliostáticos; (G) agentes de potenciamento de entrada na membrana (por exemplo, (i) um surfactante, (ii) um sal biliar, (iii) um aditivo fosfolipídio ou ácido gordo, micélio, lipossoma, ou transportador misturado, (iv) um álcool, (v) uma enamina; (vi) um composto doador de óxido nítricô, (vii) uma moléculànfipática de cadeia longa, (viii) um pequeno potenciador de penetração hidrofóbico; (ix) um derivado do sódio ou ácido salicílico; (x) um ester de glicerol ou ácido acetoacético (xi) um derivado de ciclodextrina ou beta- ciclodextrina, (xii) um ácido gordo de cadeia média, (xiii) um agente quelante, (xiv) um aminoácido ou um seu sal, (xv) um N-acetilaminoácido ou um seu sal, (xvi) um degradante enzimático para um composto da membrana seleccionado, (xvii) um inibidor de síntese dois ácidos gordos, (xviii) um inibidor de síntese do colesterol; ou (xix) qualquer combinação dois agentes de potenciação de penetração membranar de (i)-(xviii); (H) agentes moduladores de fisiologia de junção epitelial, tais como estimulantes do óxido nítricô (NÃO), e derivados do óxido nítrico; (I) agentes vasodilatadores; (J) agentes selectivos de potenciação do transporte; e (K) veículos de entrega estabilizantes, transportadores, apoios ou espécies formuladores de complexos com as quais ou(s) GRP(s) seja/m efetivamente combinado(s), associado(s), contido(s), encapsulado(s) ou ligado(s) para estabilizar ou agente ativo para entrega epitelial potenciada.

Em várias materializações da invenção, um GRP é combinado com um, dois, três, quatro ou mais agentes potenciadores de entrega epitelial descritos em (A) - (K), em cima. Estes agentes potenciadores de entrega epitelial podem ser misturados, sozinhos ou em conjunto, ao GRP, ou de outra forma combinados numa formulação farmaceuticamente aceitável ou veículo de entrega. A formulação de um GRP com um ou mais agentes potenciadores de entrega epitelial dacordo com os ensinamentos seguintes (incluindo opcionalmente qualquer combinação de dois ou mais agentes potenciadores de entrega epitelial seleccionados de entre (A) - (K) em cima) proporciona uma biodisponibilidadaumentada do peptídeo de ligação regulador de glucose após a entrega do mesmo numa superfície epitelial de um mamífero. Adicionalmente à adição de agentes potenciadores de entrega epitelial à formulação, a modificação do GRP, como através dadição de um grupo hidrofóbico pode ser utilizada para tornar eficaz a biodisponibilidade do peptídeo.

Logo, a presente invenção é um método do seupressão do apetite, promovendo a perda de peso, diminuindo a ingestão dalimento, ou tratando a obesidade e/ou a diabetes num mamífero consistindo nàdministração trans-epitelial de um formulação contendo um GRP.

A presente invenção proporcionàlém disso a utilização de um GRP parà produção de medicamentos para administração trans-epitelial de um GRP paro tratamento de hiperglicemia, diabetes mellitus, síndrome metabólico, dislipidemia, supressão do apetite, promoção de perda de peso, diminuição de ingestão dalimentos, ou tratamento de obesidade num mamífero.

Uma dose de GRP eficaz na mucosa dentro não âmbito das formulações farmacêuticas da presente invenção contém, por exemplo, entre cerca de 0,001 pmol a cerca de 100 pmol por kg de peso corporal, entre cerca de 0,01 pmol a cerca de 10 pmol por kg de peso corporal, ou entre cerca de 0,1 pmol a cerca de 5 pmol por kg de peso corporal. Em posteriores materializações exemplificativas a dosagem de GRP é entre cerca de 0,5 pmol a cerca de 1 pmol por kg de peso corporal. Numa materialização preferencial uma dose intranasal irá variar entre 0,1 - 100 yg/kg, ou cerca de 7 - 7000 yg, mais preferencialmente 0,5 - 30 yg/kg ou 35 a 2100 yg. Doses mais específicas do GRP intranasal incluem 20 yg, 50 yg, 100 yg, 150 yg, 200 yg a 400 yg, 500 yg, 800 a 1000 yg e 1200 a 1800 yg. As formulações farmacêuticas da presente invenção podem ser administradas uma ou mais vezes por dia, ou 3 vezes por semana ou uma vez por semana entre uma semana e pelo menos 96 semanas ou mesmo durante toda vida do paciente ou indivíduo. Nalgumas materializações, as formulações farmacêuticas da invenção são administradas uma ou mais vezes por dia, duas vezes ao dia, quatro vezes ao dia, seis vezes ao dia, ou oito vezes ao dia.

Os agentes potenciadores de entrega epitelial são empregues para potenciar a entrega do GRP na ou através de camada celular, incluindo a superfície da mucosa nasal. Paro fármacos absorvidos passivamente, a contribuição relativa dois caminhos paracelulares e transcelulares para ou transporte do fármaco depende do pKa, coeficiente de partição, raio molecular e carga do fármaco, ou pH do ambiente luminal não qual ou fármaco é entregue, e a área do seuperfície absorvente. OU agente potenciador de entrega epitelial da presente invenção poderá ser um agente de controlo do pH. OU pH de formulação farmacêutica da presente invenção é um factor que afectà absorção do GRP através dois caminhos paracelulares e transcelulares para ou transporte do fármaco. Numa materialização, a formulação farmacêutica da presente invenção tem ou pH ajustado entre 2 e 8. Numa posterior materialização, a formulação farmacêutica da presente invenção tem ou pH ajustado entre cerca de 3 a 6.

Numa posterior materialização, a formulação farmacêutica da presente invenção tem ou pH ajustado entre cerca de 3,5 a 5,5. Geralmente, ou Ph é 4,5 ± 0,5.

Como mencionado em cima, a presente invenção proporciona métodos melhorados e composições parà entrega epitelial de GRP a mamíferos paro tratamento ou prevenção de uma variedade de doenças e condições. Exemplos de mamíferos paro tratamento e profilaxia dacordo com os métodos da invenção incluem, mas não estão limitados a, primatas humanos e não humanos, espécies de gado vivo, tais como cavalos, gado, ovelhas e cabras, e espécies de investigação e domésticas, incluindo cães, gatos, ratos, ratazanas, porcos de Guiné e coelhos.

De forma proporcionar um melhor entendimento da presente invenção, são fornecidas as seguintes definições:

Peptídeos similares ao Glucagom (GLP)

Incluídos na invenção estão análogos, fragmentos, miméticos, e derivados funcionais de proteínas e peptídeos do GLP. As incretinas são hormonas derivadas de saliva que estimulam a secreção de insulina em resposta ingestão de nutrientes (num processo dependente de glucose). Duas incretinas que ocorrem naturalmente incluem ou peptídeo insulinotrópico dependente de glucose (GIP) e ou peptídeo-1 semelhante ao glucagom (GLP-1). OU GLP-I é libertado a partir das células presentes na saliva em respostào alimento. OU GLP-1 liga-se aos receptores GLP-1 nas células beta do pâncreas, estimulando a libertação de insulina. OU GLP-1[7- 36]NH2, também conhecido como proglucagom[78-107] e mais comummente como "GLP-1", num efeito insulinotrópico, estimulando a secreção de insulina; ou GLP-1 também inibe a secreção do glucagom [Orskov, et para ou., Diabetes 42:658- 61, 1993; D'Alessio, et para ou., J. Clin. Invest. 97:133-38, 1996] . Está reportado que ou GLP-1 inibe ou esvaziamento gástrico [Williams B., et para ou., J. Clin. Encocrinol Meta. 81: (1) : 327-32, 1996; Wettergren Α., et para ou., Dig. Dis. Sei. 38:(4):665-73, 1993], e a secreção de ácido gástrico. [Schjoldager B.T., et para ou., Dig. Dis. Sei. 34{ 5): 703-8, 1989; OU1Halloran D. J., et para ou., J. Endocrinol.

126(1) : 169-73, 1990; Wettergren A., et para ou., Dig. Dis. Sei. 38: (4) : 665-73, 1993]. OU GLP-I [7-37], que num resíduo adicional de glicina na sua extremidade carboxi, também estimulà secreção de insulina em humanos [Orskov, et para ou., Diabetes 42:658-61, 1993]. Um receptor transmembranar adenilato-ciclasse de proteína G que se acreditava ser responsável pelo efeito insulinotrópico do GLP-I foi reportado com tendo sido clonado de uma linha de células beta [Thorens, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89:8641-45, 1992] .

Uma grande limitação do GLP-I para terapêutica é a sua rápida degradação pela ubíqua enzima dipeptidil peptidase-IV (DPP-IV). Os inibidores de DPP-IV (LAF237; MK- 0431) têm sido usados para melhorar a duração dactividadee endógena do GLP-I. A OU.S. Food and Drug Administration (FDA) aprovou ou JANUVIA™ (fosfato de sitagliptina) , Merck & Co., Inc., um inibidor oral de DPP-IV disponível nos Estados Unidos para ou tratamento de diabetes tipo 2. Um método para ou tratamento de doenças metabólicas em mamíferos consistindo na co-administração de um composto capaz de se ligar a um local de ligação secundário de DPP-IV e enzimas semelhantes a DPP-IV e pelo menos um agente anti-diabético foi descrito na Patente E.OU.A N0 20060234940.

Os miméticos de incretina são uma classe de fármacos que imitam as ações antidiabéticas ou redutoras de glucose das hormonas de incretina humanas geradas naturalmente como ou GLP-I. As ações dois miméticos de incretina incluem estimular a capacidadee do corpo para produzir insulina em resposta níveis elevados de glucose não sangue, inibir a libertação de hormona glucagon, abrandar a absorção dois nutrientes parà corrente sangüínea, abrandar a taxa de esvaziamento gástrico, promover a saciedade e reduzir ou aporte dalimentos. Os miméticos de incretina foram desenvolvidos para utilização não tratamento de diabetes tipo 2 e inclunos seguintes: derivados do GLP-I (Liraglutide e CJC-1131) e ou Exenatide. CJC-1131 (ConjuChem, Montreal, Canadá) tnum ligador reagente que permite a ligação covalente à albumina do soro resultando num aumento de resistência à degradação de DPP-IV. OU Liraglutide (Novo Nordisk, Copenhaga, Dinamarca) é um derivado do GLP-I concebido para ultrapassar os efeitos de degradação de DPP-IV através dacilação com uma cadeia de ácidos gordos. A estrutura do Liraglutide é mostrada na WHO Drug Information, Vol. 17, N°2 (2003).

A invenção inclui modificações dois GRPs por anexação de um grupo hidrofóbico, como ácidos gordos, ao peptídeo. Mais exemplos de derivados modificados do GLP-I com propriedades farmacocinéticas desejáveis são descritos em Knudsen et para ou., J. Med. Chem. 43:1664-1669, 2000, e são doravante incorporados como referência. Estes compostos GLP-I foram derivados com ácidos gordos de forma estender a suàcção facilitando a ligação à albumina do soro. Os seguintes peptídeos parentes e substituições acil foram descritos: K8R26,34-GLP-1(7-37) (K8: γ-Glu-C16); K18R26,34-GLP-1(7-37) (K18: γ-G1U-C16; K23R26,34-GLP-1(7-37) (K23: Y-Glu-C16); R34-GLP-1(7- 37) (K26: γ-Glu-C16); K27R26,34-GLP-1(7-37) (Κ27: γ-Glu-C16); R26-GLP-1 (7-37) (Κ34: γ -Glu-C16); K36R26'34-GLP-1(7-37) (Κ36: γ -Glu-C16); R26,34-GLP-1(7-38) (Κ38: γ -Glu-C16); GLP-I (7-37) (K26,34: bis-C16-diácido); GLP-1(7-37) (K26,34: bis- γ -Glu- C16); GLP-1 (7-37) (K26,34: bis- γ -Glu-C14; GLP-1(7-37) (K26,34: bis-C12-diacid) ; R34- GLP-l(7-37) (K26: C16-diácido); R34 GLP- 1(7-37) (K26: C14 -diácido) ; R34- GLP-1 (7-37) (Κ26: γ -Glu-C18); R34- GLP-1(7-37) (Κ26: γ -GlU-C14); R34- GLP-1(7-37) (Κ26: γ - Glu-C12) ; desamino-H7R34-GLP-I (7-37) (Κ26: γ -Glu-C16) ; R34- GLP-I (7-37) (Κ26: GABA-Cl6) ; R34-GLP-I (7-37) (Κ26: p-Ala-C16); R34-GLP-I (7-37) (Κ26: Iso-Nip-C16) ; desamino-H7R26-GLP-1 (7-37) (Κ34: γ -G1U-C16) ; desamino-H7R26-GLP-1 (7 - 3 7 ) (Κ34: C8); desamino-H7R26-GLP-1 (7-37) (Κ34: γ -Glu-C8); K36'34-GLP-1 (7-36) (Κ36: C20-diacid) ; K36'34-GLP-1 (7-36) (Κ36: C16-dÍácido) ; K36'34- GLP-I (7-36) (Κ36: γ -Glu-C18); R26'34-GLP-1 (7 - 3 8 ) (Κ38: C16- diácido) ; R26l34-GLP-I (7-38) (Κ38: C12-diácído) ; R26'34-GLP-1 (7- 38) (Κ38: γ -Glu- C18 ) ; R26'34-GLP-1 (7 - 3 8 ) (Κ38: e-Glu-C14); C8R26l34-GLP-I (7-38) (Κ38: γ -G1U-C16); E37R26'34-GLP-1 ( 7 - 3 8) (Κ38: γ -Glu-Cl 6 ) ; E37C8R26'34-GLP-1 ( 7 - 3 8 ) (Κ38: γ -G1U-C16); e E37C8R26'34-GLP-1 (7-38) (Κ38: γ -Glu-C18).

A sequênciàminoácido do GLP-I é dada i.a. por Schmidt, et para ou., Diabetologia 28:704-707, 1985. OU GLP- 1 humano é um resíduo peptídeo do aminoácido 3 7 originado a partir do pré-proglucagon ou qual é sintetizado, i.a. nas células L não íleo distai, não pâncreas e não cérebro. OU processamento de pré-proglucagom em GLP-1 (7-36) amido, GLP- 1(7-37) e GLP-2 ocorre principalmente nas células L. Emboras interessantes proppriedades farmacológicas do GLP-I (7-37) e análogos do mesmo tenham atraído muitàtenção nos anos mais recentes, apenas pouco é conhecido sobre a estrutura destas moléculas. A estrutura secundária do GLP-I nas micelas foi descrita por Thorton, et para ou., Biochemistry 33:3532-3539, 1994), mas em solução normal, ou GLP-I é considerado uma molécula muito flexível.

OU GLP-I e análogos do GLP-I e fragmentos do mesmo são úteis i.a. não tratamento de diabetes Tipo 1 e Tipo 2 e de obesidadee. Os análogos do GLP-1, fragmentos do GLP-I e derivados funcionais do GLP-1 como descrito em Holst, J. , Expert Opin. Emerg. Drugs 9 (1) : 155-161, 2004; Rolin, R., et para ou., Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 283: E745- E752, 2002; Deacon, C., Diabetes 53:2181-2187, 2004; Perry, T., et para ou., Trends Pharmacol. Sei. 24(7):377-383, 2003; Holz, G., et para ou., Curr. Med. Chem. 10(22):2471- 2481, 2 003; Naslund, E., et para ou., Regul. Pept. 106:89-95, 2002; nas aplicações para patente WO 87/06941; WO 90/11296;

WO 91/11457; nas patentes EP 0708179-A2 e EP 0699686-A2 são incorporados doravante como referência na sua totalidade:

A WO 87/06941 descreve os fragmentos do GLP-1, incluindo ou GLP-I(7-37), e derivados funcionais do mesmo e ou seu uso como agente insulinotrópico.

A WO 90/11296 descreve os fragmentos do GLP-1, incluindo ou GLP-1(7-36), e derivados funcionais do mesmo que têm umàctividadee insulinotrópicà qual excedàctividadee insulinotrópica do GLP-1(1-36) ou GLP-1(1-37) e ou seu uso como agentes insulinotrópicos.

A WO 91/11457 descreve os análogos dois peptídeos ativos do GLP-1 7-34, 7-35, 7-36, e 7-37 os quais podem também ser úteis como partes do GLP-1.

A EP 0708179-A2 (Eli Lilly & Co.) descreve os análogos do GLP-1 e derivados que inclunum grupo imidazol terminal N e opcionalmente um grupo acil C6 -C10 não ramificado anexado ao resíduo lisina na posição 37.

A EP 0699686-A2 (Eli Lilly & Co.) descreve algums fragmentos de terminal N truncados do GLP-1 que estão reportados como sendo biologicamente ativos.

A sequênciàminoácido do GLP-1 (1-37) é: HDEFERHAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG (SEQ ID N° : 1).

A sequênciàminoácido do GLP-1(7-37) é:

HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG (SEQ ID N°: 2).

A sequênciàminoácido do GLP-1 (7-36) é:

HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGR (SEQ ID N°: 3).

A sequênciàminoácido do GLP-1 (7-34) é: HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVK (SEQ ID N°: 4).

A sequênciàminoácido do GLP-1 (9-36) é: EGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGR (SEQ ID N°: 5).

Os análogos do GLP-1 listados em baixo tem resistênciàumentada à DPP-IV.

A sequênciàminoácido do análogo do GLP-1, GG é: HGEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGR (SEQ ID N° : 6).

A sequênciàminoácido do análogo do GLP-1, GG1 é: HGEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRPSS (SEQ ID N° : 7).

A sequênciàminoácido do análogo do GLP-1, GG2 é: HGEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRPSSGAP (SEQ ID N° : 8).

A sequênciàminoácido do análogo do GLP-1, GG3 é: HGEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRPSSGAPPPS (SEQ ID N°: 9).

A sequênciàminoácido do análogo do GLP-1, GLP-1 ET é: HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGGPSSGAPPPS (SEQ ID N° : 10).

A sequênciàminoácido do análogo sintético do GLP-1, NN2211 é: HAEGTFTSDVSSYLEGQAAK*EFIAWL VRGRG (SEQ ID N°: 11) onde K* na posição 26 de cadeia do aminoácido é modificado por acilação para gerar uma cadeia lateral hexadecanol (i.e., K-N-ε-(N-α-hexadecanol).

A sequênciàminoácido do análogo sintético do GLP-1, CJC-1131 é: HA*EGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRK* (SEQ ID N°: 12) onda* na posição 8 de cadeia do aminoácido é uma D-alanina substituída por uma L-alanina e ou K* na posição 3 7 de cadeia do aminoácido tnum ligador [2- [2- [2- maleimidopropionamido (etoxi) etoxi] acetamida não seu grupo amino e.

A sequênciàminoácido do análogo sintético do GLP-1, LY315902 é:

des- HAEGTFTSDVSSYLEGQAAREFIAWLVK*GRG (SEQ ID N°: 13) onde ou resíduo de histidina não terminal N (des-H) não contém um grupo amino e ou K* na posição 34 é modificado por acilação para gerar uma cadeia lateral octanol (i.e., K- (octoanoyl)). Dacordo cora a presente invenção ou GLP-I também inclui bases livres, sais dadição ácida ou sais metálicos, tais como sais sódicos ou potássicos dois peptideos, e peptídeos GLP-I que foram modificados por processos como àmidação, glicosilação, acilação, sulfação, fosforilação, acetilação, ciclização e outros métodos de modificação covalente bem conhecidos.

Exendinas e Agonistas de Exendina

Incluídos dentro da invenção estão análogos, fragmentos e derivados funcionais de peptídeos e proteínas exendina. As exendinas são peptídeos que foram primeiro isolados a partir de secreções salivares do monstro de Gila, um lagarto encontrado não Arizona, e do Lagarto-de-Contas- Mexicano. A Exendina-3 está presente nas secreções salivares do Heloderma horridum, e exendina-4 está presente nas secreções salivares do Heloderma seuspectum [Eng, J., et para ou., J. Biol. Chem. 265:20259-62, 1990; Eng., J., et para ou., J. Biol. Chem. 267:7402-05, 1992]. As exendinas têm alguma semelhança nas seqüências com vários membros de família do peptídeo semelhante ao glucagom, com a maior homologia, 53%, na hormona incretina GLP-1[7 - 36]NH.2 [Goke, et para ou., J. Biol. Chem. 268:19650-55, 1993].

OU nome genérico parà exendina-4 sintética é exenatida [WH0 Drug Information, Vol. 18, N°. 1, 2004]. Exenatida é uma Exendina-4 sintética. A exenatida reproduz os efeitos do GLP-I, mas é mais potente devido à sua resistência à degradação de DPP-IV. BYETTA® é a versão comercialmente disponível de exenatida (Amylin & Lilly). A FDA nos E.OU.Aprovou a injecção de BYETTA (Exenatida) como terapiàdjuntiva à diabetes tipo 2 sempré que ou tratamento com raetformina oral e/ou sulfonilureias não sejadequado para alcançar ou controlo glicémico. Adicionalmente ao controlo glicémico melhorado, os indivíduos dois estudos a usarem exenatida experimentaram também perda de peso.

A presente invenção está dirigida novos métodos paro tratamento de diabetes e condições que seriam beneficiadas pela redução de glucose plasmática ou atraso e/ou abrandamento do esvaziamento gástrico ou inibição de ingestão dalimento consistindo nàdministração intranasaç de uma exendina, um análogo de exendina, um agonista de exendina, uma exendina modificadar, um análogo modificado de exendina ou um agonista modificado de exendina, ou quaisquer combinações dois mesmos, com por exemplo:

Exendina-3:

His Ser Asp Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser (SEQ ID N0 : 14) , ou, exendina-4 (exendina-4 sintética (exenatida)):

His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser onda serina do Terminal C é amidada (SEQ ID N°: 15),

ou fragmentos insulinotrópicos de exendina-4:

Exendina-4 (1-31) His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro (SEQ ID N°: 16); e.sup.31 Exendina-4 (1-31 ) His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Tyr (SEQ ID N°: 17), ou fragamentos inibidores de exendina-4:

Exendina-4 (9-39) Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser (SEQ ID N0: 18),

ou outros agonistas de exendina préferidos : exendina-4 (1-30) His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly ( SEQ ID N°: 19), exendina-4 (1-30) amida His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly-NH. sub. 2 (SEQ ID N°: 20), exendina-4 (1-28) amide His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn-NH.sub.2 (SEQ ID N°: 21), .sup.14 Leu, .sup.25 Phe exendina-4 amida His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Leu Glu Glu Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Phe Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser-NH.sub.2 (SEQ ID N° : 22), .sup.14 Leu, .sup.25 Phe exendina-4 (1-28) amida His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Leu Glu Glu Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Phe Leu Lys Asn-NH.sub.2 (SEQ ID N°: 23), e .sup.14 Leu, .sup.22 Ala, .sup.25 Phe exendina-4 (1-28) amida His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Leu Glu Glu Glu Ala Val Arg Leu Ala Ile Glu Phe Leu Lys Asn-NH.sub.2 (SEQ ID Nº: 24).

ou seqüências incorporadas por referência que tenham sido descritas nas Patentes E.OU.A n° 5 424 286; Patente E.OU.A Nº 6 506 724/ Patente E.OU.A Nº 6 528 486/ Patente E.OU.A Nº 6 593 295; Patente E.OU.A Nº 6 872 700; Patente E.OU.A Nº 6 902 744; Patente E.OU.A Nº 6 924 264; e Patente E.OU.A Nº 6 956 026,

ou outros compostos que se liguem efetivamente ao receptor não qual a exendina exerce as suas ações que são benéficas não tratamento de diabetes e condições que seriam beneficiadas pela redução de glucose plasmática ou atraso e/ou abrandamento do esvaziamento gástrico ou inibição de ingestão dalimentos. A utilização de exendina-3 e exendina-4 como agentes insulinotrópicos para ou tratamento de diabetes mellitus e prévenção de hiperglicemia foi descrita na Patente E.OU.A Nº 5 424 286. As exendinas mostraram também ser úteis na modulação dois níveis de triglicéridos e não tratamento de dislipidemia.

Logo a invenção fornece peptldeos ou fragmentos de peptídeos, fabricados sinteticamente ou purificados a partir de fontes naturais, os quais incorporam àctividadee biológica das exendinas ou fragmentos das mesmas, como descrito pela presente especificação.

Dacordo com a presente invenção as exendinas também inclunas bases livres, sais dadição ácida ou sais metálicos, tais como sais sódicos ou potássicos dois peptldeos, e peptídeos de enxedina que foram modificados por processos tais como amidação, glicosilação, acilação, sulfação, fosforilação, acetilação, ciclização e outros métodos de modificação covalente bem conhecidos.

Logo, dacordo com a presente invenção, os peptídeos acima mencionados são incorporados em formulações adequadas para entrega transepitelial, especialmente entrega intranasal e dérmica.

Membranas Biológicas

"Membrana biológica" define-se como ou material membranar presente dentro de um organismo vivo, préf erencialmente um animal, mais préf erencialmente um humano, que separa uma área do organismo de outra. Em muitas instâncias, a membrana biológica separa ou organismo dois suas limites exteriores ou ambiente. Exemplos não limitativos incluem membranas da mucosa e de pele não ser humano.

Agentes Potenciadores de Entrega Epitelial

"Agentes potenciadores de entrega epitelial" são definidos como químicos ou outros excipientes que, quando adicionados a uma formulação contendo água, sais e/o ''buffers'' comuns e GRP (a formulação de controlo) produznuma formulação que produz um aumento significativo não transporte do GRP através de uma membrana biológica como medido pela concentração máxima do sangue, soro, ou fluido espinal cerebral (Cmax) ou pela áreàbaixo de curva, AUCi num gráfico de concentração verseus tempo. As membranas biológicas epiteliais poderão incluir as superfícies nasal, oral, intestinal, bucal, broncopulmonar, vaginal, rectal, e dérmica. Os agentes potenciadores de entrega trans-epitelial são algumas vezes denominados transportadores. Agentes Potenciadores de Entrega Mucosal

"Agentes potenciadores de entrega mucosal" são definidos como químicos ou outros excipientes que, quando adicionados a uma formulação contendo água, sais e/ou wbuffers'' comuns e GRP (a formulação de controlo) produznuma formulação que produz um aumento significativo não transporte do GRP através de uma mucosa como medido pela concentração máxima do sangue, soro, ou fluido espinal cerebral (Cmax) ou pela áreàbaixo de curva, AUC, num gráfico de concentração verseus tempo. As membranas biológicas epiteliais poderão incluir as superfícies mucosais nasal, oral, intestinal, bucal, broncopulmonar, vaginal, rectal e de facto inclui todas as membranas secretoras de muco que revestem todas as cavidades corporais ou passagens que comunicam com ou exterior. Os agentes potenciadores de entrega mucosal são por vezes denominados transportadores. Formulação livre de endotixina

"Formulação livre de endotoxina" signifca uma formulação que contém um GRP e um ou mais agentes potenciadores de entrega epitelial que é substancialmente livre de endotoxinas e/ou substâncias pirogénicas relacionadas. As endotoxinas incluem toxinas que estão confinadas dentro de um microorganismo e são libertadas apenas quando os micro-organismos são partidos ou morrem. As substâncias pirogénicas incluem substâncias indutoras de febre, termoestáveis (glicoproteínas) da membrana exterior de bactéria e outros organismos. Ambas as substâncias podem causar febre, hipotensão e choque se administradas em humanos. Podruzir formulações livres de endotoxinas pode requerer equipamento especial, peritos, e pode ser significamtivamente mais dispendioso do que fazer formulações que não estejam livres de endotoxinase. Devido a administração intravenosa de GLP ou amilina simultaneamente com infusão de endotoxina em roedores ter mostrado prevenir a hipotensão e mesmo morte associada com a administração de endotoxina sozinha (Patente E.OU.A N0 4 839 343), não seria necessário esperar a produção de formulações sem endotoxinas destes agentes para administração não parental (não injectada).

Administração Não infundida

"Administração não infundida", significa qualquer método de administração que não envolva uma injecção directamente numàrtéria ou veia, um método que força ou acciona (tipicamente um fluido), em algo e especialmente para introduzir numa parte do corpo por meio de umàgulha, seringa ou outros métodos invasivos. A administração não infundida inclui injecção subcutânea, injecção intramuscular, injecção intraperitoneal e os métodos sem injecção de administração numa membrana biológica. Métodos e Composições de administração

Os métodos e composições melhoradas para administração epitelial de GRP a sujeitos mamíferos, optimiza programas de dosificação de GRP. A presente invenção proporciona administração epitelial de GRP formulado com um ou mais agentes que intensificam a administração epitelial, onda libertação de dose de GRP é substancialmente normalizada e/ou controlada por um período de administração efetivo de intervalos de libertação de GRP desde aproximadamente 0.1 até 2.0 horas; 0.4 até 1.5 horas; 0.7 até 1.5 horas; ou 0.8 até 1.0 horas; depois de administração epitelial. A libertação controlada de GRP tentada, pode ser facilitada por administração repetida de GRP exógeno utilizando métodos e composições da presente invenção. Composições e Métodos de Libertação Prolongada

As composições e métodos melhorados para administração epitelial de GRP a sujeitos mamíferos, optimiznosprogramas de dosificação de GRP. A presente invenção proporcionàdministração epitelial melhorada (por exemplo, nasal) de uma formulação que contém GRP em combinação com um ou mais agentes que intensificam a administração epitelial e um agente ou agentes que intensificam a libertação prolongada. Agentes que intensificam a administração epitelial da presente invenção, proporcionam um aumento efetivo nãdministração, por exemplo, um aumento na concentração máxima de plasma (Craax) para melhorar àctividade terapêutica de GRP epitelialmente administrada. Um segundo factor que afectà actividade terapêutica de GRP no plasma do sangue e a SNC é a tempo de residência (RT). Os agentes que intensificam a libertação prolongada, em combinação com agentes que intensificam a administração intranasal, incrementam a Cmax e incrementam ou tempo de residência (RT) de GRP. Os veículos de administração polimérica e outros agentes e métodos da presente invenção que proporcionam formulações que intensificam a libertação prolongada, por exemplo, descreve-se aqui polietileno glicol (PEG). A presente invenção proporciona um método de administração melhorado de GRP e forma de dosificação para ou tratamento de sintomas relacionados com obesidade, diabetes, hiperglicemia, síndrome metabólico, síndrome coronário, cancro do cólon, cancro de exendina, cancro de mama, enfarte do miocárdio, promoção de neurogénese, supressão do apetite, promoção de perda de peso, e redução de absorção dalimentos em sujeitos mamíferos. Dentro das formulações de administração epitelial e métodos da invenção, a GRP é freqüentemente combinado ou coordenadamente administrado com um portador ou veículo adequado para administração epitelial. Como se usàqui, a termo "portador", significa material de enchimento, diluente ou encapsulante sólido ou líquido f armaceuticamente aceitável. Um portador líquido que contém água pode conter aditivos farmaceuticamente aceitáveis tais como agentes acidificantes, agentes alcalinizantes, conservantes antimicrobianos, antioxidantes, agentes amortecedores, agentes quelantes, agentes formadores de complexo, agentes solubilizantes, humidificadores, solventes, agentes que incrementam a viscosidade e/ou suspensão, agentes de tonicidade, agentes humidificadores ou outros materiais biocompatíveis. Uma tabela de ingredientes listados pelas categorias anteriores se pode encontrar em OU.S. Pharmacopeia National Formulary, 1857-1859, 1990. Alguns exemplos dos materiais os quais podem servir como portadores farmaceuticamente aceitáveis são açúcares, tais como lactose, glucose e sacarose; amidos tais como amido de milho e amido de papa; celulose e seus derivados tais como carboximetilcelulose de sódio, etilcelulose e acetato de celulose; gomàdragante em pó; malta; gelatina; talco; excipientes tais como manteiga de cacau e supositórios de cera; óleos tais como óleo de maní, óleo de semilla dalgodão, óleo de cártamo, óleo de sésamo, óleo dazeitona, óleo de milho e óleo de soja; glicóis tais como propilenoglicol ; polióis tais como glicerina, sorbitol, manitol e polietileno glicol; ésteres tais como oleato de etilo e laurato de etilo; agar; agentes amortecedores tais como hidróxido de magnésio e hidróxido dalumínio; ácido algínico; água livre de pirógeno; salina isotónica; solução de Ringer, álcool etílico e soluções amortecedoras de fosfato, assim como também outras substâncias compatíveis não tóxicas usadas em formulações farmacêuticas. Agentes humidificadores, emulsificadores e lubrificantes tais como lauril sulfato de sódio e estearato de magnésio, assim como também agentes colorantes, agentes de libertação, agentes de revestimento, adoçantes, agentes saborizantes e perfumantes, conservantes e antioxidantes, podem também estar presentes nas composições, em conformidade com os desejos do formulador. Exemplos dantioxidantes farmaceuticamente aceitáveis incluem, antioxidantes solúveis em água tais como ácido ascórbico, cloridrato de cisteína, bissulfito de sódio, metabissulfito de sódio, sulfito de sódio e similares; antioxidantes solúveis em água tais como ascorbil palmitato, hidroxianisol butilado (BHA), hidroxitolueno butilado (BHT), lecitina, propil gaiato, alfa- tocoferol e similares; e agentes quelantes metálicos tais como ácido cítrico, ácido etilendiamina tetraacético (EDTA), sorbitol, ácido tartárico, ácido fosfórico e similares. A quantidade de ingrediente ativo que pode ser combinada com os materiais portadores para produzir uma forma de dosificação, variará dependendo do modo particular de administração.

Dentro das composições de administração epitelial e métodos da invenção, vários agentes que intensificam a administração são empregues, os quais melhoram a administração de GRP em ou através de uma capa celular. Neste sentido, a administração de GRP através do epitélio, pode ocorrer "intracelularmente" ou "paracelularmente" . A magnitudee na qual estas trajectórias contribuem para ou fluxo total e biodisponibilidade do GRP, depende do ambiente da membrana biológica, das propriedades psico-químicas do agente ativo, e das propriedades do epitélio. OU transporte paracelular englobàpenas difusão passiva, enquanto ou transporte transcelular pode ocorrer por processos passivos, facilitados ou ativos. Em geral, os solutos polares, passivamente transportados, hidrofílicos, se difundem através de rota paracelular, enquanto mais solutos lipofilicos usam a rota transcelular. A absorção e biodisponibilidade (por exemplo, como se reflecte por um coeficiente de permeabilidade ou ensaio fisiológico), para solutos diversos, passivamente e activamente absorvidos, podem ser facilmente avaliada em termos de componentes de administração tanto paracelular como transcelular, por qualquer GRP seleccionado dentro da invenção. Paro fármacos passivamente absorvidos, a contribuição relativa de trajectórias paracelulares e intracelulares para ou transporte do fármaco, depende do coeficiente de partição, pKa, raio molecular e carga do fármaco, a pH do ambiente luminal na qual ou fármaco é administrado, e a área do seuperfície de absorção. A rota paracelular representa uma fração relativamente pequena de área do seuperfície acessível do epitélio mucosal nasal. Em termos gerais, reportou-se que As membranas celulares ocupam uma área do seuperfície mucosa que é mil vezes maior que a área ocupada pelos espaços paracelulares. Deste modo, a áreàcessível mais pequena, e a tamanho e discriminação com base de carga contra permeação macromolecular poderia sugerir que a rota paracelular poderia ser uma rota em geral menos favorável que a administração transcelular para ou transporte de fármaco. De maneira surpreendente, os métodos e composições da invenção proporcionam transporte significativamente melhorado de bioterapêuticos em e através do epitélio mucosal através a rota paracelular. Por isso, os métodos e composições da invenção dirigem ambas rotas paracelular e transcelular, alternativamente ou dentro de um método ou composição única.

Como se usàqui, agentes que intensificam a administração epitelial incluem agentes os quais melhoram a libertação ou solubilidade (por exemplo, de um veículo de administração de formulação), taxa de difusão, capacidadee e sincronização de penetração, absorção, tempo de residência, estabilidade, vida média efetiva, níveis de concentração prolongados ou máximos, separação e outras características de administração epitelial desejadas (por exemplo, medidas na sítio de administração, ou num sítio objectivo seleccionado da actividade tal como a corrente sangüínea ou a sistema nervoso central) de GRP ou outros compostos biologicamente ativos. A intensificação da administração epitelial pode deste modo, ocorrer por qualquer de uma variedade de mecanismos, por exemplo, aumentando a difusão, transporte, persistência ou estabilidade de GRP, aumentando a fluidez da membrana, modulando a capacidadee ou ação de cálcio e outros iões que regulam a permeação intracelular ou paracelular, solubilização de componentes da membrana (por exemplo, lípidos) , mudança de níveis do seulfhidrilo de proteína e não proteína em tecidos mucosais, incrementar a fluxo do águàtravés de capa celular, modular a fisiologia de união epitelial, reduzir a viscosidade do muco que passa epitélio mucosa, reduzir As taxas de separação mucociliares e outros mecanismos.

Como se usàqui, uma "quantidade efetiva de GRP", contempla administração efetivo de GRP a um sítio dirigido paràctividade de fármaco no sujeito que pode envolver uma variedade de rotas de administração ou transferência. Por exemplo, um agente ativo dado pode encontrar a sua formàtravés de separações entre células da mucosa e alcançar uma parede vascular adjacente, enquanto por outra rotà agente pode, ainda que seja passivamente ou activamente, ser tomado em células mucosais paràctuar dentro das células ou ser descarregadas ou transportadas fora das células para alcançar um sítio objectivo secundário, tal como a circulação sistêmica. Os métodos e composições da invenção podem promover a deslocação de agentes ativos ao largo de uma ou mais rotas alternativas, ou podem actuar directamente sobre ou tecido mucosal ou tecido vascular próximo para promover a absorção ou penetração dos agentes ativos. A promoção de absorção ou penetração neste contexto, não está limitada estes mecanismos.

Como se usàqui, "concentração máxima (Cmax) de GRP num plasma do sangue", "concentração de área sob a curva (AUC) de GRP num plasma do sangue", "tempo a concentração máxima de plasma (tmax) de GRP num sangue de plasma", são parâmetros farmacocinéticos conhecidos por um perito na técnica. Laursen, et para ou., Eur. J. Endocrinology 135:309- 315, 1996. A "concentração contra curva de tempo", medida de concentração de GRP num soro do sangue de um sujeito contra tempo depois de administração de uma dosificação de GRP para ou sujeito ainda que seja por rotas de administração intranasal, intramuscular, subcutânea ou outra parental. A "Cmax" é a concentração máxima de GRP no soro do sangue de um sujeito depois de uma dosificação única de GRP para ou sujeito. "Tmax" é a tempo para alcançar a concentração máxima de GRP num soro do sangue de um sujeito depois de administração de uma dosificação única de GRP para ou sujeito.

Como se usàqui, "concentração de área sob a curva de tempo (AUC) de GRP num plasma do sangue", se calcula em conformidade com a regra trapezoidal linear e com adição das áreas residuais. Uma redução de 23% ou um aumento de 30% entre duas doses poderia ser detectada com uma probabilidade de 90% (erro β tipo II = 10%) . A "taxa de administração" ou "taxa de absorção", é estimada por comparação do tempo (tmax) para alcançar a concentração máxima (Cmax) . Tanto Cmax como tmax, são analisadas usando métodos não paramétricos. As comparações das farmacocinéticas das administrações de GRP intramusculares, subcutâneas, intravenosas e intranasais, se realizaram por análise de variação (ANOVA). Para comparações em forma de par, se usa um procedimento seqüencial Bonferroni-Holmes paràvaliar a significância. A relação de resposta de dose entre As três dose nasais é estimada por análise de regressão. P <0.05 é considerado significante. Os resultados dão-se como valores médios +/- SEM.

Enquanto ou mecanismo de promoção de absorção pode variar com diferentes agentes da invenção que intensificam a administração epitelial, agentes úteis neste contexto não afectarão substancialmente de maneiràdversà tecido e serão seleccionados em conformidade com As características físico- químicas do GRP particular ou outro agente de intensificação de administração ou ativo. Neste contexto, agentes que intensificam a administração que incrementam a penetração ou permeabilidade de tecidos mucosais, freqüentemente resultaram nalgumàlteração de barreira de permeabilidade protectora da mucosa. Para tais agentes que intensificam a administração para ser de valor dentro da invenção, se deseja em geral, que qualquer mudança significante na permeabilidade da membrana biológica seja reversível dentro de uma estrutura de tempo adequada duração desejada de administração de fármaco. Além disso, não deve haver toxicidade cumulativa, substancial, nem alguma mudança eliminadora permanente induzida nas propriedades de barreira da membrana biológica com uso de termo largo.

Dentro de certos aspectos da invenção, os agentes que promovem a absorção para administração coordenada ou formulação combinatorial com GRP da invenção, se seleccionam de moléculas hidrofílicas pequenas, que incluem mas não se limitam a, dimetil sulfóxido (DMSO); dimetilformamida, etanol, propilenoglicol, e 2-pirrolidonas. Alternativamente, moléculas anfipáticas de cadeia longa, por exemplo, deacilmetilsulfóxido, azona, laurilsulfato de sódio, ácido oleico e sais biliares, podem ser empregues para melhorar a penetração da membrana biológica do GRP. Aspectos adicionais, são empregues tensioativos (por exemplo, polisorbatos) como compostos adjuntos, agentes de processamento, ou aditivos de formulação para melhorar a administração trans-epitelial do GRP. Agentes tais como DMSO, polietileno glicol, e etanol, podem se apresentam em concentrações suficientemente altas nàmbiente de administração (por exemplo, por pré- administração ou incorporação numa formulação terapêutica), entrar na fase aquosa da mucosa e alterar suas propriedades solubilizantes, e com isso, melhorar a divisão do GRP do veículo na membrana biológica.

Agentes que intensificam a administração epitelial adicional que são empregues dentro de administração coordenada e métodos de processamento e formulações combinatoriais da invenção incluem, mas não se limitam a, micélios misturados, enaminas; doadores de óxido nítrico (por exemplo, S-nitroso-N-acetil-DL-penicilamina, NORl, N0R4, os quais são preferencialmente co-administrados com um depurador de NO tal como carboxi-PITO ou diclofenac sódico); salicilato de sódio; ésteres de glicerol de ácido acetoacético (por exemplo, gliceril-1,3-diacetoacetato ou 1/2- isopropilidenglicerina-3-acetoacetato); e outros agentes que promovem a libertação-difusão ou intra ou trans-penetração epitelial que são fisiologicamente compatíveis para administração epitelial. Outros agentes que promovem a absorção, se seleccionam de uma variedade de portadores, bases e excipientes que melhoram a administração epitelial, estabilidade, actividade ou penetração trans-epitelial do GRP. Estes incluem, entre outras coisas, ciclodextrinas e derivados de β-ciclodextrinas (por exemplo, 2-hidroxipropil- β-ciclodextrina e heptakis (2, 6-di-OU-metil-p-ciclodextrina) . Estes compostos, opcionalmente conjugados com um ou mais dos ingredientes ativos e Além disso, opcionalmente formulado numcom base oleaginosa, melhora biodisponibilidade nas formulações epiteliais da invenção. Agentes que melhoram a absorção adicional após, adaptados para administração epitelial incluem ácidos gordos de cadeia média, que incluem mono e diglicéridos (por exemplo, extractos de caprato sódico de óleo de coco, Capmul) , e triglicéridos (por exemplo, amilodextrina, Estaram 299, Migliol 810) .

As composições terapêuticas epiteliais e profiláticas da presente invenção, podem ser suplementadas com qualquer agente que promove a penetração, que facilita absorção, difusão ou penetração de GRP através das barreiras da membrana biológica. OU promotor de penetração pode ser qualquer promotor que é farmaceuticamente aceitável. Deste modo, nos aspectos mais detalhados das composições da invenção, se proporciona que incorporem ou mais agentes que promovem a penetração, seleccionados de salicilato de sódio e derivados de ácido salicílico (acetil salicilato, salicilato de colina, salicilamida, etc.); aminoácidos e sais dos mesmos (por exemplo, ácidos monoaminocarboxílicos tais como glicina, alanina, fenilalanina, prolina, hidroxiprolina, etc.; hidroxiaminoácidos tais como serina; aminoácidos acídicos tais como ácido aspártico, ácido glutámico, etc.; e aminoácidos básicos tais como lisina etc. -inclusiva do seuas sais de metais álcalis ou metais alcalino térreos) ; e N- acetilaminoácidos (N-acetilalanina, N-acetilfenilalanina, N- acetilserina, N-acetilglicina, N-acetillisina, ácido N- acetilglutámico, N-acetilprolina, N-acetilhidroxiprolina, etc.) e seus sais (sais de metais álcalis e metais alcalino térreos). Também proporcionados como agentes que promovem a penetração com os métodos e composições da invenção, estão substâncias as quais são em geral usadas como emulsionantes (por exemplo, oleil fosfato de sódio, lauril fosfato de sódio, laurilsulfato de sódio, miristil sulfato de sódio, polioxietilenalquil éteres, polioxietilenalquil ésteres, etc.), ácido capróico, ácido láctico, ácido málico e ácido cítrico e sais de metais álcalis do mesmo, ácidos pirrilidincarboxílico, ésteres de ácido alquilpirrolidoncarboxilico, N-alquilpirrolidonas, ésteres dacil prolina e similares.

Dentro de vários aspectos da invenção, se proporcionam formulações e métodos de administração mucosal nasal melhorados, que permitem a administração de GRP e outros agentes terapêuticos dentro da invenção através das barreiras da membrana biológica entre a administração e sítios objectivo seleccionado. Certas formulações são especificamente adaptadas para uma célula, tecido ou órgão objectivo seleccionado, ou após um estado de doença particular. Em certos aspectos, formulações e métodos proporcionados por endo ou transcitosis eficiente, selectiva de GRP especificamente dirigido junto com uma trajectória intracelular ou intercelular definida. Tipicamente, a GRP é eficientemente carregada níveis de concentração efetivos num portador ou outro veículo de administração, e é administrado e mantido numa forma estabilizada, por exemplo, na mucosa nasal e/ou durante a passagem através de compartimentos intracelulares e membranas a um sítio objectivo remoto de ação de fármaco (por exemplo, a corrente do sangue ou um tecido definido, órgão ou compartimento extracelular). OU GRP pode ser proporcionado num veículo de administração ou de outro modo modificado (por exemplo, na forma de um profármaco), onda libertação ou activação do GRP é activada por um estímulo fisiológico (por exemplo, mudança de pH, enzimas lisossomais, etc.). Freqüentemente, a GRP é farmacologicamente inativo até que alcança ou seu sítio objectivo por actividade. Em muitos casos, a GRP e outros componentes de formulação são não tóxicos e não imunogénicos. Neste contexto, portadores e outros componentes de formulação são em geral seleccionados por ou seu capacidadee para ser rapidamente degradados e excretados sob condições fisiológicas. Para ou mesmo tempo, As formulações são química e fisicamente estáveis em forma de dosificação paràrmazenamento efetivo.

Peptídeos e Análogos de Proteína e Miméticos

Incluídos dentro de definição de peptídeos e proteínas biologicamente ativos para uso dentro da invenção, estão peptídeos sintéticos, terapeuticamente ou profilaticamente ativos (contendo de dois ou mais aminoácidos covalentemente ligados), proteínas, peptídeos ou fragmentos de proteínas, peptídeos ou análogos de proteínas e derivados quimicamente modificados ou sais de peptídeos ou proteínas ativos. Umàmpla variedade danálogos e miméticos úteis de GRP estão contemplados para uso dentro da invenção, e podem ser produzidos e testados pela suàctividade biológica em conformidade com métodos conhecidos. Freqüentemente, os peptídeos ou proteínas de GRP ou outros peptídeos ou proteínas biologicamente ativos para uso dentro da invenção, são muteínas que são facilmente obteníveis por substituição, adição ou supressão parcial de aminoácidos dentro de um peptídeo ou seqüência de proteína que se origina naturalmente ou nativa (por exemplo, mutante que se origina naturalmente, de tipo nativo, ou variante alélica). Adicionalmente, os fragmentos biologicamente ativos de peptídeos ou proteínas estão incluídos. Tais derivados e fragmentos mutantes retêm substancialmente actividade biológica desejada do peptídeo ou proteínas nativas. No caso de peptídeos ou proteínas que têm cadeias de carboidratos, as variantes biologicamente activas marcadas por alterações nestas espécies de carboidratos, também estão incluídas dentro da invenção.

Como se usàqui, "substituição de aminoácido conservativo", refere-se a capacidadee de intercâmbio geral de resíduos de aminoácido que têm cadeias laterais similares.

Por exemplo, um grupo comummente intermutável de aminoácidos que têm cadeias laterais alifáticas é alanina, valina, leucina e isoleucina; um grupo de aminoácidos que têm cadeias laterais hidroxilo alifáticas é serina e treonina; um grupo de aminoácidos que têm cadeias laterais que contém amida, é asparagina e glutamina; um grupo de aminoácidos que têm cadeias laterais aromáticas é fenilalanina, tirosina e triptofano; um grupo de aminoácidos que têm cadeias laterais básicas é lisina, arginina, histidina; e um grupo de aminoácidos que têm cadeias laterais que contém enxofre é cisteína e metionina. Exemplos do seubstituições conservativas incluem a substituição de um resíduo não polar (hidrofóbico) tal como isoleucina, valina, leucina ou metionina por outro. Do mesmo modo, a presente invenção contempla substituição de um resíduo polar (hidrofílico) tal como entre arginina e lisina, entre glutamina e asparagina e entre treonina e serina. Adicionalmente, a substituição de um resíduo básico tal como lisina, arginina ou histidina por outro ou a substituição de um resíduo acídico tal como ácido aspártico ou ácido glutámico por outro, também se contempla. Grupos do seubstituição de aminoácidos conservativos exemplares são: valina-leucina-isoleucina, fenilalanina- tirosina, lisina-arginina, alanina-valina e asparagina- glutamina. Alinhando um peptídeo ou proteínànáloga optimamente com um peptídeo ou proteína nativa correspondente, e usando ensaios adequados, por exemplo, proteína dadesão ou ensaio de ligação de receptor, para determinar umàctividade biológica seleccionada, se pode identificar facilmente, análogos de proteína e peptídeo operáveis para uso dentro dos métodos e composições da invenção. Análogos de proteínas e peptideos operáveis são tipicamente especificamente inmunoreagentes com anticorpos originados para ou peptídeo ou proteína nativa correspondente.

Um procedimento para estabilizar formulações de proteínas sólidas da invenção, é incrementar a estabilidade física de proteína liofilizada, por exemplo, purificada. Isto inibirá agregação através interações hidrofóbicas, assim como também através trajectórias covalentes que podem incrementar conforme as proteínas se desprendem. As formulações estabilizantes neste contexto, freqüentemente incluem formulações com base de polímeros, por exemplo, um sistema de formulação/administração de hidrogel biodegradável. Como se notou anteriormente, ou papel crítico da água na estrutura de proteína, função e estabilidade, é bem conhecido. Tipicamente, as proteínas são relativamente estáveis no estado sólido com volume de água removido. Não obstante, As formulações de proteína terapêutica sólida podem chegar a ser hidratadas depois do armazenamento a humidades elevadas ou durante a administração de uma composição ou dispositivo de libertação prolongada. A estabilidade de proteínas em geral cai com ou aumento de hidratação. A água pode também desempenhar um papel significante nàgregação de proteína sólida, por exemplo, aumentando a flexibilidadee de proteína que resulta em acessibilidade aumentada de grupos reagentes, proporcionamdo uma fase móvel para reagentes, e servindo como um reagente em vários processos eliminatórios tais como beta- eliminação e hidrólise.

As preparações de proteína que contém entre aproximadamente 6% até 28% de água, são as mais instáveis. Por desobediência deste nível, a mobilidade de ligações de água e porções internas de proteína são substituídas. Arriba deste nível, a mobilidade do água e porções de proteínàlcançam aquelas de hidratação completa. Até um ponto, a susceptibilidade aumentadãté à agregação de fase sólida com hidratação aumentada, foi observada em vários sistemas. Não obstante, com conteúdo de água superior, se observa menos agregação devido ao efeito de diluição.

Em conformidade com estes princípios, um método efetivo para estabilizar peptídeos e proteínas contràgregação destado sólido para administração mucosal, é controlar com conteúdo de água numa formulação sólida e manter àctividade da água na formulação a níveis óptimos. Este nível depende da natureza da proteína, mas em geral, as proteínas mantidas por de sob da sua cobertura de água "monocapa", mostraram estabilidade destado sólido superior.

Se proporciona uma variedade daditivos, diluentes, bases e veículos de administração dentro da invenção, que controlam efetivamente com conteúdo de água para melhorar a estabilidade de proteína. Estes reagentes e materiais portadores efetivos como agentes anti-agregação neste sentido incluem, por exemplo, polímeros de várias funcionalidades, tais como polietileno glicol, dextran, dimetilaminoetil dextran e carboximetilcelulose, os quais incrementam significativamente a estabilidade e reduzem agregação de fase sólida de peptídeos e proteínas misturados junto com estes ou ligados a estes. Nalguns casos, àctividade ou estabilidade física das proteínas também pode ser melhorada por vários aditivos a soluções aquosas do peptídeo ou fármacos de proteína. Por exemplo, aditivos tais como polióis (que incluem açúcares), aminoácidos, proteínas tais como colagénio e gelatina e vários sais, podem ser usados.

Certos aditivos, em particular açúcares e outros polióis, também conferem estabilidade física significante a proteínas Iiofilizadas, por exemplo, secas. Estes aditivos também podem ser usados dentro da invenção para proteger as proteínas contra agregação não apenas durante a Iiofilização, se não também durante ou armazenamento no estado seco. Por exemplo, sacarose e Ficoll 70 (um polímero com unidades de sacarose) , exibem protecção significante contra peptídeo ou agregação de proteína durante a incubação da fase sólida sob várias condições. Estes aditivos também podem melhorar a estabilidade de proteínas sólidas incrustadas com matrizes poliméricas.

Após aditivos adicionais, por exemplo, sacarose, estabilizarem proteínas contra agregação em estado sólido nas atmosferas húmidas a temperaturas elevadas, como pode ocorrer em certas formulações de libertação prolongada da invenção. Proteínas tais como gelatina e colagénio, também servem como agentes estabilizantes ou de volume para reduzir a desnaturalização e agregação de proteínas instáveis neste contexto. Estes aditivos podem ser incorporados em processos de fusão polimérica e composições dentro da invenção. Por exemplo, micropartículas de polipeptido podem ser preparadas liofilizando simplesmente ou atomizando por secagem numa solução que contém vários aditivos estabilizantes descritos anteriormente. A libertação prolongada de peptldeos e proteínas não agregados pode e com isso, obter-se sobre um período prolongado de tempo.

Vários componentes e métodos preparativos adicionais, assim como também aditivos de formulação específicos, se proporcionam aqui, os quais proporcionam formulações para administração epitelial de peptídeos e proteínas dagregação propensas, onde ou peptídeo ou proteína é estabilizado numa forma substancialmente pura, não agregada usando um agente de solubilização. Num intervalo, componentes e aditivos estão contemplados para uso dentro destes métodos e formulações. Exemplares destes agentes de solubilização são ciclodextrinas (CDs), As quais ligam selectivamente cadeias laterais hidrofóbicas de polipeptidos.

Estas CD encontraram-se por ligar em pares hidrofóbicos de proteínas numa maneira que inibe significativamente agregação. Esta inibição é selectiva com respeito tanto a CD como à proteína envolvida. Tal inibição selectiva dagregação de proteína proporciona vantagens adicionais dentro dos métodos de administração intranasal e composições da invenção. Agentes adicionais para uso neste contexto incluem, dímeros, trímeros e tetrámeros de CD com geometrias variantes controladas pelos conectores que especificamente bloqueiam agregação de peptídeos e proteínas.

Após agentes de solubilização e métodos para incorporação dentro da invenção envolverem, ou uso de peptídeos e miméticos peptídicos para bloquear selectivamente as interações de proteína-proteína. Num aspecto, a ligação específica de cadeias laterais hidrofóbicas reportada para multímeros de CD, estende-se a proteínas através do uso de peptídeos e miméticos peptídicos que bloqueiam similarmente àgregação de proteína. Um amplo intervalo de métodos adequados e agentes danti-agregação estão disponíveis para incorporação dentro das composições e processos da invenção.

Modificação da Carga e Agentes de Controlo de pH e Métodos

Para melhorar as características de transporte de agentes biologicamente ativos (que incluem GRP, outros peptídeos e proteínas ativos, e fármacos moleculares pequenos e macromoleculares) para administração melhoradàtravés das barreiras da membrana biológica hidrofóbica, a invenção também proporciona técnicas e reagentes para modificação da carga de agentes biologicamente ativos seleccionados ou agentes que intensificam a administração descritos neste documento. Neste sentido, as permeabilidades relativas de macromoléculas estão em geral, relacionadas com os seus coeficientes de divisão. OU grau de ionização das moléculas, ou qual é dependente do pKa da molécula e ou pH na superfície da membrana biológica, também afectam a permeabilidade das moléculas. A permeação e divisão dos agentes biologicamente ativos, que incluem GRP e análogos da invenção, para administração epitelial, pode ser facilitada por alteração da carga ou dispersão de carga do agente ativo ou agente permeabilizante, ou qual se consegue por exemplo, por alteração de grupos funcionais carregados, modificando ou pH do veículo de administração ou solução na qual ou agente ativo é administrado, ou por administração coordenada de um reagente que altera o pH ou carga com agente ativo.

Consistente com estes ensinamentos gerais, administração epitelial de espécies macromoleculares carregadas, que incluem GRP e outros peptídeos e proteínas biologicamente activas, dentro dos métodos e composições da invenção, é substancialmente melhorada quando ou agente ativo é administrado na superfície epitelial num estado de carga eléctrica substancialmente não ionizada ou neutra.

Certos GRP e outros componentes de proteínas e peptídeos biologicamente ativos de formulação epitelial para uso dentro da invenção, serão modificados na carga para proporcionar um aumento na densidade da carga positiva do peptídeo ou proteína. Estas modificações se estendem também a cationização de conjugados de peptídeo e proteína, portadores e outras formas de administração descritas aqui. A cationização oferece um meio conveniente paràlterar a biodistribuição e propriedades de transporte de proteínas e macromoléculas dentro da invenção. A cationização é empreendida de uma maneira que substancialmente preserva actividade biológica do agente ativo e limitnosefeitos laterais potencialmente adversos, que incluem ou dano e toxicidade dos tecidos.

Um "amortecedor" é em geral, usado para manter ou pH de uma solução num valor aproximadamente constante. Um amortecedor mantém ou pH de uma solução, ou após, quando quantidades menores de ácido forte ou base forte são agregados à solução, prevenindo ou neutralizando as trocas de carga em concentrações de iões de hidrogênio e hidróxido. Um amortecedor em geral, consiste de um ácido débil e ou seu sal adequado (ou umcom base débil e ou seu sal adequado). OU sal adequado para um ácido débil contém os mesmos iões negativos como se apresentam no ácido débil (ver, Lagowski, Macmillan Encyclopedia of Chemistry, Vol. 1, Simon & Schuster, New York, 1997, p. 273-4). A equação Henderson-Hasselbach, pH = pKa + loglO [A-] / [HA], é usada para descrever um amortecedor, e baseia-se na equação padrão para dissociação ácido débil, HA == H+ + A-. Exemplos de fontes damortecedor comummente usadas incluem as seguintes: glutamato, acetato, citrato, glicina, histidina, arginina, lisina, metionina, lactato, formiato, glicolato, tartrato e misturas dos mesmos.

A "capacidadee amortecedora", significa a quantidade de ácido ou base que pode ser agregada a uma solução amortecedora antes que ocorra uma mudança de pH signif icante. Se o pH cai dentro do intervalo de pK-1 e pK+1 do ácido débil, a capacidadee amortecedora é apreciável, mas fora deste intervalo, cai a tal magnitudee que é de pouco valor. Por isso, um sistema dado apenas tnumàcção amortecedora útil num intervalo de uma unidade de pH em qualquer lado do pK do ácido débil (ou base débil) (ver Dawson, Data for Biochemical Research, Third Edition, Oxford Science Publications, 1986, p. 419). Em geral, elegem-se concentrações adequadas de maneira que ou pH da solução seja próximo do pKa do ácido débil (ou base débil) (ver Lide, CRC Handbook of Chemistry and Physicsl 86th Edition, Taylor & Francis Group, 2005-2006, p. 2-41). Além disso, soluções de ácidos e bases fortes não são normalmente classificadas como soluções amortecedoras, e não exibem capacidadeamortecedora entre os valores de pH 2.4 a 11.6.

Agentes Inibidores de Enzima Degradativa e Métodos

Outro excipiente que pode ser incluído numa preparação trans-epitelial é um inibidor de enzima degradativa. Complexos inibidores de polímero-enzima mucoadesivos exemplares que são empregues dentro das formulações de administração epitelial e métodos da invenção incluem, mas não se limitam a: Carboximetilcelulose- pepstatina (com actividadanti-pepsina); poli(ácido acrílico)- inibidor Bowman-Birk (anti-quimiotripsina); poli(ácido acrílico) -quimiostatina (anti-quimiotripsina); poli (ácido acrílico)-elastatinal (anti-elastase) ; Carboximetilcelulose- elastatinal (anti-elastase) ; Policarbof ilo-elastatinal (anti- elastase) ; Quitosan-antipaína(anti-tripsina) ; poli(ácido acrílico)-bacitrina (anti-aminopeptidase N) ; Quitosan-EDTA (anti-aminopeptidase N, anti-carboxipeptidase A) ; Quitosan- EDTA-antipaí na (anti-tripsina, antiquimiotripsina, anti- elastase) . Como se descreve em mais detalhe adicional, certas modalidades da invenção incorporaram opcionalmente um novo derivado de quitosano ou forma química modificada de quitosano. Um novo derivado para uso dentro da invenção denota-se como polímero β- [1—>4] -2-guanidino-2-desoxi-D- glucose (poli-GuD).

Qualquer inibidor que inibe àctividade de uma enzima para proteger os agentes biologicamente ativos, pode ser utilmente empregue nas composições e métodos da invenção. Os inibidores enzimáticos úteis parà protecção de proteínas e peptídeos biologicamente ativos incluem, por exemplo, inibidores de dipeptidil aminopeptidase (DPP) IV, inibidor de tripsina de soja, inibidor de tripsina exendina, inibidor de quimiotripsina e inibidor de tripsina e quimiotripsina isolado de tubérculos de papa (solanum tuberosum L). Uma combinação ou misturas de inibidores pode ser empregue.

Inibidores adicionais de enzimas proteolíticas para uso dentro da invenção incluem, enzima ovomucoide, gabaxato mesilato, alfa 1-antitripsina, aprotinina, amastatina, bestatina, puromicina, bacitracina, leupepsina, alfa2- macroglobulina, pepstatina e inibidor de tripsina de ovo branco ou soja. Estes e outros inibidores podem ser usados solos ou em combinação. Os inibidores podem ser incorporados em ou unidos a um portador, por exemplo, um polímero hidrofílico, revestido na superfície de forma dosificada a qual está em contacto com a mucosa nasal, ou incorporado na fase superficial do seuperfície, em combinação com agente biologicamente ativo numa formulação separadamente administrada (por exemplo, pré-administrada) (por exemplo, pastilhas orais).

A quantidade do inibidor, por exemplo, de inibidor enzimático proteolítico que é opcionalmente incorporada nas composições da invenção, variará dependendo de (a) As propriedades do inibidor específico, (b) a número de grupos funcionais presentes na molécula (a qual pode se pode fazer reagir para introduzir insaturação etilénica necessária para copolimerização com monómeros que formam hidrogel), e (c) ou número de grupos lectina, tais como glicósidos, os quais estão presentes na molécula inibidora. Também podem depender do agente terapêutico específico que é proposto para ser administrado. Falando de maneira geral, uma quantidade útil de um inibidor enzimático é de aproximadamente 0.1 mg/ml até aproximadamente 50 mg/ml, freqüentemente, de aproximadamente 0.2 mg/ml até aproximadamente 25 mg/ml, e mais comummente, de aproximadamente 0.5 mg/ml até 5 mg/ml de formulação (isto é, uma formulação inibidora da protease separada ou formulação combinada com ou inibidor e agente biologicamente ativo).

No caso da inibição da tripsina, podem ser seleccionados inibidores adequados como por exemplo, aprotinina, BBI, inibidor de tripsina de soja, ovomucóide de frango, ovoinibidor de frango, inibidor de tripsina exendina humana, mesilato camostat, inibidores flavonóides, antipaína, leupeptina, p-aminobenzamidina, AEBSF, TLCK (tosilisina clorometilcetona) , APMSF, DFP, PMSF e derivados de poli (acrilato). No caso da inibição da quimiotripsina, inibidores adequados podem ser seleccionados de entre por exemplo, aprotinina, BBI, inibidor de tripsina de soja, quimioestatina, benciloxicarbonil-Pro-Phe-CHO, FK-448, ovoinibidor de frango, complexos de ácidos bifenilborónicos daçúcar, DFP, PMSF7 β-fenilpropionato, e derivados de poli (acrilato) . No caso de inibição de elastase, os inibidores adequados podem ser seleccionados de por exemplo, elastinal, metoxisuccinil-Ala-Ala-Pro-Val-clorometilcetona (MPCMK), BBI, inibidor de tripsina de soja, ovoinibidor de frango, DFP e PMSF.

Inibidores enzimáticos adicionais para uso dentro da invenção, se seleccionam de um amplo intervalo de inibidores não de proteína que variam não seu grau de potência e toxicidade. Como se descreve em mais detalhe em baixo, a imobilização destes agentes adjuntos em matrizes ou outros veículos de administração, ou desenvolvimento danálogos quimicamente modificados, pode ser facilmente implementada para reduzir ou após eliminar os efeitos tóxicos, quando estes se encontram. Entre este amploo grupo de inibidores de enzima candidatos para uso dentro da invenção, estão inibidores organofosforosos, tais como diisopropilfluorofosfato (DFP) e fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF), os quais são inibidores irreversíveis, potentes de serina protease (por exemplo, tripsina e quimiotripsina). A inibição adicional dacetilcolinesterase por estes compostos, torna-os altamente tóxicos em ajustes de administração não controlados. Outro inibidor candidato, fluoruro de 4-(2-aminoetil)- bencensulfonilo (AEBSF), tem actividade inibidora comparável com DFP e PMSF, mas é marcadamente menos tóxico. OU Cloridrato fluoruro de (4-aminofenil)-metansulfonilo (APMSF), é outro inibidor potente de tripsina, mas é tóxico em ajustes não controlados. Contrariamente a estes inibidores, metansulfonato 1,2,3,4-tetrahidro-l-naftanoato de 4-(4- isopropilpiperadinocarbonil)fenilo (FK-448), é uma substância tóxica baixa, que representa um inibidor específico e potente de quimiotripsina. Representantes adicionais deste grupo sem proteína de candidatos inibidores, e que também exibem riscos tóxicos, são mesilato de camostat (metan-sulfonato de N,N'- dimetil carbamoilmetil-p-(p'-guanidino- benzoiloxi)fenilacetato).

Também outros tipos de agentes inibidores da enzima para uso dentro dos métodos e composições da invenção são, aminoácidos e aminoácidos modificados que interferem com a degradação enzimática de compostos terapêuticos específicos. Para uso neste contexto, aminoácidos e aminoácidos modificados, são substancialmente não tóxicos e podem ser produzidos a baixo custo. Não obstante, devido ao seu tamanho molecular baixo e boa solubilidade, são facilmente diluídos e absorvidos em ambientes mucosais. Não obstante, sob condições apropriadas, os aminoácidos podem actuar como inibidores competitivos, reversíveis de enzimas protease. Certos aminoácidos modificados podem exibir umàctividade inibdora muito mais forte. Um aminoácido modificado desejado neste contexto, conhece-se como um inibidor de "estado de transição". Actividade inibidora forte destes compostos baseia-se na sua semelhança estrutural com um substrato na sua geometria destado de transição, enquanto são em geral, seleccionados por ter uma afinidade muito superior para ou local ativo de uma enzima que se substitui a se mesma. Os inibidores destado de transição são inibidores competitivos, reversíveis. Exemplos deste tipo de inibidor são derivados de ácido α-aminoborónico, tais como boro- leucina, boro-valina e boro-alanina. A átomo de boro nestes derivados pode formar um ion boronato tetrahédrico que se asemeja para ou estado de transición de peptídeos durante ou seu hidrólise por aminopeptidasas. Estes derivados de aminoácido são inibidores reversibles e potentes daminopeptidasas e se reporta que a boro-leucina é mais de 100 vezes mais efetivo na inibição enzimática que a bestatina e mais de 1000 vezes mais efetivo que puromicina. Outro aminoácido modificado parà qual reportou-se que umàctividade inhibitoria de protease forte, é N-acetilcisteína, a qual inhibe àctividade enzimática daminopeptidasa N. Este agente adjunto exibe propriedades mucolíticas que podem ser empregues dentro dos métodos e composições da invenção, para reduzir os efeitos de barreira de difusão do muco.

Todavia outros inibidores enzimáticos úteis para uso dentro dos métodos de administração coordenada e formulações combinatoriais da invenção, podem ser seleccionados de peptídeos e inibidores enzimáticos peptídicos modificados. Um representante importante desta classe de inibidores é a dodecapéptido cíclico, bacitracina, obtenidos de Bacillus licheniformis. Além disso destes tipos de peptídeos, certos peptídeos e tripeptídeos exibem actividade inibidora não específica, débil, até algumas proteases. Por analogia com aminoácidos, ou seu actividade inhibitoria pode ser melhorada por modificações químicas. Por exemplo, análogos de dipéptido de ácido fosfírico também são inibidores de "transição-estado", com umàctividade inhibitoria forte até aminopeptidasas. Han sido según se informa, usados para estabilizar leucina encefalina nasalmente administrada. Outro exemplo de um análogo de transição-estado, é a pepstatina de pentapéptido modificado, a qual é um inibidor muito potente de pepsina. Análise estrutural de pepstatina, testando a actividade inibidora de vários análogos sintéticos, de amostras características de função-estrutura principais de molécula responsável da actividade inibitória. Outro tipo especial de peptídeo modificado inclui inibidores com uma função de aldeído terminalmente localizada na sua estrutura. Por exemplo, a seqüência benciloxicarbonil-Pro-Phe-CHO, a qual cobre completamente os requisitos de especificidade primária e secundária conhecidos de quimiotripsina, foi encontrada por ser um inibidor reversível potente desta proteinase alvo. As estruturas químicas de inibidores adicionais com uma função aldeído terminalmente localizado, por exemplo, antipaína, leupeptina, quimiostatina e elastatinal, também são conhecidos na técnica, como são as estruturas de outros inibidores peptídicos modificados, reversíveis, conhecidos, tais como fosforamidon, betatina, puromicina e amastatina.

Devido à sua massa molecular comparavelmente alta, inibidores de protease de polipéptido, são mais receptivos que os compostos mais pequenos a administração concentrada em matrizes que transportam fármaco. Agentes adicionais para inibição de protease dentro das formulações e métodos da invenção, envolvem o uso de agentes formadores de complexos. Estes agentes medeiam a inibição enzimática evitando o ambiente intranasal (ou composição preparativa ou terapêutica), de catiões divalentes, os quais são co-factores para muitas proteases. Por exemplo, os agentes que formam complexos EDTA e DTPA, como agentes adjuntos combinatorialmente formulados ou coordenadamente administrados, em concentração adecuada, serán suficiente para inhibir As proteases seleccionadas para e com isso, melhorar a administração intranasal de agentes biologicamente ativos em conformidade com a invenção. Representativos adicionais desta classe de agentes inibidores são EGTA, 1,10- fenantrolina e hidroxiquinolina. Além disso, devido à sua propensão para quelar catiões divalentes, estes e outros agentes que formam complexos são empregues dentro da invenção como agentes que promovem a absorção, directos.

Como se nota em detalhe noutra parte aqui, também se contempla usar vários polímeros, particularmente polímeros mucoadesivos, como agentes que inibem a enzima dentro da administração coordenada, métodos e composições de multi- processamento e/ou formulação combinatorial da invenção. Por exemplo, derivados de poli(acrilato), tais como poli(ácido acrílico) e policarbófilo, podem afectar a actividade de várias proteases, que incluem tripsina, quimiotripsina. 0 efeito inibidor destes polímeros também se pode basear na formação de complexos de catiões divalentes tais como Ca2+ e Zn2+. Contempla-se além disso, que estes polímeros podem servir como padrões ou associados conjugados para agentes inibidores enzimáticos adicionais, como descreve-se anteriormente. Por exemplo, um conjugado quitosan-EDTA, foi desenvolvido e é empregue dentro da invenção, que exibe um efeito inibidor forte até à actividade enzimática de proteases dependentes do zinco. As propriedades mucoadesivas de polímeros depois de união covalente de outros inibidores enzimáticos neste contexto, não se espera seja substancialmente comprometida, nem a utilidade geral de tais polímeros como um veículo de administração para agentes biologicamente ativos dentro da invenção, se espera que seja diminuída. Pelo contrário, a distância reduzida entre a veículo de administração e a superfície mucosal proporcionada pelo mecanismo mucoadesivo minimizará o metabolismo pré- sistémico do agente ativo, enquanto os inibidores de enzima covalentemente unidos permanecerão concentrados no sítio de administração do fármaco, minimizando os efeitos de diluição indesejados de inibidores, assim como também efeitos tóxicos e outros colaterais causados e com isso. Desta maneira, a quantidade efetiva de um inibidor de enzima coordenadamente administrado, pode ser reducida a exclusção de efeitos de diluição.

Complexos inibidores de polímero-enzima mucoadesivos que são empregues dentro das formulações mucosais e métodos da invenção incluem, mas não se limitam a:

Carboximetilcelulose-pepstatina (com actividade anti- pepsina); poli(ácido acrílico)-inibidor Bowman-Birk (anti- quimiotripsina) ; poli(ácido acrílico)-quimiostatina (anti- quimiotripsina) ; poli(ácido acrílico)-elastatinal(anti- elastase) ; Carboximetilcelulose-elastatinal (anti-elastase) ; Policarbofilo-elastatinal(anti-elastase) ; Quitosan- antipaína (anti-tripsina) ; poli (ácido acrílico)-bacitrina (anti-aminopeptidasa N) ; Quitosan-EDTA (anti-aminopeptidase N, anti-carboxipeptidasà) ; Quitosan-EDTA-antipaína (anti- tripsina, antiquimiotripsina, anti-elastase) .

Agentes Separadores de Muco e Mucolítico e Métodos

A administração efetiva de agentes bioterapêuticos através da administração intranasal deve ter em conta a taxa de transporte de fármaco reducida através do revestimento mucoso protector da mucosa nasal, além da perda de fármaco devido a ligação a glicoproteínas de capa da mucosa. O muco normal é uma substância semelhante a um gel, viscoelástica que consiste de água, electrólitos, mucinas, macromoléculas e células epiteliais deslocadas. Serve principalmente como uma cobertura citoprotectora e lubrificante para os tecidos mucosais subjacentes. O muco é secretado por células secretoras aleatoreamente distribuídas localizadas no epitélio nasal e em outros epitélios mucosais. A unidade estrutural do muco é a mucina. Esta glicoproteína é principalmente responsável pela natureza viscoelástica do muco, ainda que outras macromoléculas também possam contribuir para esta propiedade. Nas mucosas das vias respiratórias, tais macromoléculas podem produzir localmente IgA, IgM, IgE, lisozima e broncotransferrina secretoras, as quais também desempenham um papel importante no mecanismo de defesa hospedeiro.

Os métodos de administração coordenados da presente invenção, incorporam opcionalmente agentes de separação de muco ou mucolíticos, os quais servem para degradar; muco delgado ou transparente das superfícies mucosais intranasais para facilitar a absorção de agentes bioterapêuticos intranasalmente administrados. Dentro destes métodos, um agente de separação de muco ou mucolítico, é coordenadamente administrado como um composto adjunto para melhorar a administração intranasal do agente biologicamente ativo.

Alternativamente, uma quantidade efetiva de agente de separação de muco ou mucolí tico, se incorpora como um agente de processamento dentro de um método de processamento múltiplo da invenção, ou como um aditivo dentro de uma formulação combinatorial da invenção, para proporcionar uma formulação melhorada que melhora a administração intranasal de compostos bioterapêuticos reduzindo os efeitos de barreira de muco intranasal.

Uma variedade de agentes de separação de muco ou mucolíticos estão disponíveis para incorporação dentro dos métodos e composições da invenção. Baseados nos seus mecanismos de ação, os agentes de separação de muco e mucolíticos podem freqüentemente, ser classificados nos seguintes grupos: proteases (por exemplo, pronase, papaína), que desdobram o núcleo da proteína de glicoproteínas mucinas; compostos sulfhidrilo que dividen as ligações de disulfuro de mucoproteína; e detergentes (por exemplo, Triton X-IOO, Tween 20), que rompem ligações não covalentes dentro do muco. Compostos adicionais neste contexto incluem, mas não se limitam a, sais biliares e tensioativos, por exemplo, desoxicolato de sódio, taurodesoxicolato de sódio, glicolato sódico e lisofosfatidilcolina.

A efetividade de sais biliares que causam rompimento estrutural do muco, é da ordem de desoxicolato > taurocolato > glicolato. Outros agentes efetivos que reduzem a viscosidade do muco ou adesão para melhorar a administração intranasal em conformidade com os métodos da invenção incluem, por exemplo, ácidos gordos de cadeia curta e agentes mucolíticos que trabalham por quelação, tais como peptídeos N-acilcolágeno, ácidos biliares e saponinas (a última funciona em parte, quelando Ca2+ e/ou Mg2+, os quais desempenham um papel importante em manter a estrutura da capa mucosa).

Agentes mucolíticos adicionais para uso dentro dos métodos e composições da invenção incluem, N-acetil-L- cisteína (ACS), um agente mucolítico potente que reduz tanto a viscosidade como aderência do muco broncopulmonar e é reportado por incrementar modestamente a biodisponibilidade nasal de hormona de crescimento humano em ratazanas anestesiadas (desde 7.5 até 12.2%). Estes e outros agentes que separam o muco ou mucolíticos, são contactados com a mucosa nasal, tipicamente num intervalo de concentração desde aproximadamente 0.2 até 20 mM, coordenadamente com a administração do agente biologicamente ativo, para reduzir a viscosidade polar e/ou elasticidade do muco intranasal.

Todavia outros agentes de separação de muco ou mucolíticos podem ser seleccionados de um intervalo de enzimas glicosidases, as quais são capazes de desdobrar ligações glicosídicas dentro de glicoproteína do muco. As a- amilase e β-amilases, são representativas desta classe de enzimas, ainda que o seu efeito mucolitico possa ser limitado. Pelo contrário, as glicosidases bacterianas permitem a estes microorganismos permear as capas mucosas dos seus hospedeiros.

Para uso combinatorial com a maioria dos agentes biologicamente ativos dentro da invenção, que incluem peptídeos e proteínas terapêuticas, detergentes não ionogénicos são em geral, também empregues como agentes de separação de muco ou mucolíticos. Estes agentes tipicamente não modificaram ou deterioraram substancialmente a actividade de polipeptídeos terapêuticos.

Agentes que Intensificam a Viscosidade

Os agentes do seuspensão ou que intensificam a viscosidade, podem afectar a taxa de libertação de um fármaco a partir da formulação e absorção de dosificação. Como resultado, podem ser usados intensificadores de viscosidade para modificar a permeação de alguns peptídeos de regulação de glucose. Alguns exemplos de materiais os quais podem servir como agentes que intensificam a viscosidade farmacêuticamente aceitáveis são, metilcelulose (MC) ; hidroxipropilmetilcelulose (HPMC) ; carboximetilcelulose (CMC); celulose; gelatina; amido; amido beta; poloxámeros; plurónicos; CMC sódico; sorbitol; acacia; povidona; carbopol; policarbófilo; quitosan; microesferas de quitosan; microesferas dalginato; glutamato de quitosan; resina amberlite; hialuronano; etil celulose; maltodextrina DE; amido de milho de forma seca em tambor (DDWM) ; microesferas de amido degadráveis (DSM); desoxiglicolato (GDC); hidroxietilcelulose (HEC); hidroxipropilcelulose (HPC); celulose microcristalina (MCC); ácido polimetacrílico e polietilenoglicol; ciclodextrina do seulfobutiléter B; bioesferas dalmidón eldexómero reticulado; taurodihidrofusidato sódico (STDHF); cloreto de N-trimetil quitosan (TMC); microesferas dalmidón degradadas; resina amberlite; nanopartículas de quitosan; crospovidona seca por aspersão; microesferas de dextran secas por aspersão; celulose microcristalina seca por aspersão; e microesferas de amido eldexómero reticuladas.

Agentes Ciliostáticos e Métodos

Devido à capacidadee de autolimpeza de certos tecidos mucosais (por exemplo, tecido mucosal nasal), a separação mucociliar, é necessária como uma função protectora (por exemplo, para remover pó, alérgenos e bactérias), que foi considerada em geral, que esta função não deve ser substancialmente deteriorada por medicações mucosais. O transporte mucociliar na tracto respiratório é um mecanismo de defesa particularmente importante contra infeções. Para conseguir esta unção, o golpe ciliar nas passagens das vias respiratórias e nasais move uma capa de muco junto à mucosa para remover as partículas e microorganismos inalados.

Agentes ciliostáticos encontram uso dentro dos métodos e composições da invenção, para aumentar o tempo de residência de GRP mucosalmente administrados (por exemplo, intranasalmente), análogos e miméticos e outros agentes biologicamente ativos descritos aqui. Em particular, a administração destes agentes com os métodos e composições da invenção, é significativamente melhorada em certos aspectos por administração coordenada ou formulação combinatorial de um ou mais agentes ciliostáticos que funcionam para inibir reversivelmente a actividade das células mucosais, para proporcionar um aumento reversível, temporal no tempo de residência dos agentes ativos mucosalmente administrados. Para uso dentro destes aspectos da invenção, os factores ciliostáticos mencionados anteriormente, ainda que sejam específicos ou indirectos na sua actividade, são todos candidatos para emprego exclusivo como agentes ciliostáticos em quantidadees apropriadas (dependendo de concentração,, duração e modo de administração), de maneira tal que proporcionam uma redução temporal (isto é, reversível) ou cessação da separação mucociliar a um sítio mucosal de administração para melhorar a administração de GRP, análogos e miméticos, e outros agentes biologicamente ativos descritos neste documento, sem efeitos colaterais adversos inaceitáveis.

Vários factores ciliostáticos bacterianos isolados e caracterizados na literatura, podem ser empregues dentro das modalidades da invenção. Os factores ciliostáticos da bactéria Pseudomonas aeuroginosa, incluem um derivado de fenazina, um composto pio (2-alquil-4-hidroxiquinolinas), e um ramnolípido (também conhecido como uma hemolisina). O composto pio produz ciliostase a concentrações de 50 μg/ml e sem lesões ultraestruturais óbvias. O derivado fenazina também inibe a mobilidade ciliar mas causa algum rompimento da membrana ainda a concentrações substancialmente maiores que 400 μg/ml. A exposição limitada de explantes traqueais para o ramnolípido, resulta em ciliostase, a qual está associada com membranas ciliares alteradas. Mais exposição extensiva a ramnolípidos está associada com a remoção de ramas dineínas daxonemas.

Agentes Ativos do seuperfície e Métodos

Dentro dos aspectos mais detalhados da invenção, um ou mais agentes de penetração da membrana podem ser empregues dentro de um método de administração epitelial ou formulação da invenção, para melhorar a administração epitelial de GRP, análogos e miméticos e outros agentes biologicamente ativos descritos aqui. Os agentes que intensificam a penetração da membrana biológica neste contexto, podem ser seleccionados de: (i) um tensoativo, (ii) uma sal biliar, (iii) um aditivo de fosfolípido, micélios misturados, liposomas, ou portador, (iv) um álcool, (v) uma enamina, (vi) um composto donador NO, (vii) uma molécula anfipática de cadeia longa, (viii) um intensificador de penetração hidrofóbico pequeno; (ix) derivado de ácido salicilico ou sódio; (x) um éster de glicerol de ácido acetoacético (xi) um derivado de ciclodextrina ou beta-ciclodextrina, (xii) um ácido gordo de cadeia média, (xiii) um agente quelante, (xiv) um aminoácido ou sal do mesmo, (xv) um N-acetilaminoácido ou sal do mesmo, (xvi) uma enzima degradativa; um componente da membrana seleccionado, (xvii) um inibidor de síntese de ácido gordo, (xviii) um inibidor de síntese de colesterol; ou (xiv) qualquer combinação dos agentes que intensificam a penetração da membrana mencionados em (i)-(xviii)) .

Certos agentes ativos do seuperfície (tensoativos), são facilmente incorporados dentro das formulações de administração epitelial e métodos da invenção como agentes que intensificam a absorção epitelial. Estes agentes, os quais podem ser coordenadamente administrados ou combinatorialmente formulados com GRP, análogos e miméticos, e outros agentes biologicamente ativos descritos aqui, podem ser seleccionados de um amplo leque de tensoativos conhecidos. Os tensoativos, os quais em geral caiem em três classes: (1) polioxietilen éteres não iónicos; (2) sais biliares tais como glicolato sódico (SGC) e desoxicolato (DOC) ; e (3) derivados de ácido fucsídico tais como taurodihidrofusidato sódico (STDHF) . Os mecanismos de ação destas várias classes de agentes ativos do seuperfície tipicamente incluem solubilização do agente biologicamente ativo. Para proteínas e peptídeos os quais freqüentemente formam agregados, as propriedades activãs do seuperfície destes promotores de absorção podem permitir interações com proteínas, de maneira tal que unidades mais pequenas tais como monómeros revestidos de tensoativo, podem ser mais facilmente mantidos em solução. Exemplos de outros agentes ativos do seuperfície são didecanoil L-α-fosfatidilcolina (DDPC), polisorbato 80 e polisorbato 20. Estes monómeros são presumivelmente unidades mais transportáveis que os agregados. Um segundo mecanismo potencial é a protecção de peptídeo ou proteína a partir da degradação proteolítica por proteases em ambiente mucosal. Tanto os sais biliares como alguns derivados de ácido fucsídico segundo se reporta, inibem a degradação proteolítica de proteínas por homogeneizados nasais a concentrações menores que ou equivalentes àquelas requeridas para melhorar a absorção de proteína. Esta inibição de protease pode ser especialmente importante para peptídeos com vidas médias biológicas curtas.

Degradação de Enzimas e Inibidores de Síntese de Ácido Gordo e Colesterol

Em aspectos relacionados com a invenção, GRP, análogos e miméticos, e outros agentes biologicamente ativos para administração da membrana biológica, são formulados ou coordenadamente administrados com um agente que intensifica a penetração, seleccionado de uma enzima de degradação, ou um agente estimulador metabólico ou inibidor de síntese de ácidos gordos, esteróis ou outros componentes de barreira epitelial seleccionados, Patente E.U.A N° 6 190 894. Por exemplo, enzimas degradativas tais como fosfolipase, hialuronidase, neuraminidase e condroquitinase, podem ser empregues para melhorar a penetração mucosal de GRP, análogos e miméticos, e outros agentes biologicamente ativos sem causar dano irreversível à barreira mucosal. Numa modalidade, a condroquitinase é empregue dentro dum método ou composição como se proporciona aqui, para alterar a glicoproteína ou constituintes glicolípidos de permeabilidade de barreira da mucosa, e com isso, intensificando a absorção mucosal de GRP, análogos e miméticos, e outros agentes biologicamente ativos descritos aqui.

Com respeito a inibidores de síntese de constituintes da barreira mucosal, se nota que os ácidos gordos livres contam por 20-25% de lípidos epiteliais por peso. Dois enzimas que limitam a proporção na biosínteses de ácidos gordos livres são acetil CoA carboxilase é sintetase de ácido gordo. Através de uma série de etapas, os ácidos gordos livres são metabolizados em fosfolípidos. Deste modo, os inibidores de síntese de ácido gordo livre e metabolismo para uso com os métodos e composições da invenção incluem, mas não se limitam a, inibidores da acetil-CoA carboxilase tal como ácido 5-tetradeciloxi-2-furancarboxílico (TOFA); inibidores de sintetase de ácido gordo; inibidores de fosfolipase tais como gomisina, ácido 2-(p-amilcinamil)amino- 4-clorobenzóico, bromuro de bromofenacilo, monoaluro, ácido 7,7-dimetil- 5,8-eicosadienóico, nicergolina, cefarantina, nicardipina, quercetina, AMP dibutiril-cíclico, R-24571, N- oleoiletanolamina, N-(7-nitro-2,1, 3-benzoxadiazol-4- il)fosfostidil serina, ciclosporina, anestésicos tópicos, que incluem dibucaína, prenilamina, retinóides, como ácidos trans e 13-cis-retinoico, W-7, trif luoperazina, R-24571 (calmidazolio) , l-hexadocil-3-trifluoroetil glicero-sn-2- fosfomentol (MJ33); bloqueadores do canal de cálcio que incluem nicardipina, verapamil, diltiazem, nifedipina, e nimodipina; antimaláricos que incluem quinacrina, mepacrina, cloroquina e hidroxicloroquina; beta bloqueadores que incluem propanalol e labetalol; antagonistas de calmodulina; EGTA; timersol; glucocorticoesteróides que incluem dexametasona e prednisolona; e agentes anti-inflamatórios não esteróides que incluem indometacina e naproxeno.

Esteróides livres, principalmente colesterol, contam por 20-25% dos lipidos epiteliais em peso. A enzima que limita a taxa na biosinteses de colesterol é a reductase de 3-hidroxi-3-metilglutarilo (HMG) CoA. Inibidores de síntese de colesterol para uso dentro dos métodos e composições da invenção incluem, mas não se limitam a, inibidores competitivos de reductase CoA (HMG) , tal como sinvastatina, lovastatina, fluindostatina (fluvastatina) , pravastatina, mevastatina, assim como também outros inibidores de reductase CoA HMG, tais como oleato de colesterol, sulfato de colesterol e fosfato, e esteróis oxigenados, tais como colesterol 25-OH-- e 26-OH--; inibidores de sintetase escualeno; inibidores de epoxidasa escualeno; inibidores de reductase DELTA 7 ou DELTA24, tais como 2 2,25-diazacolesterol, 20 , 25-diazacolestenol, AY9944, e triparanol.

Cada um dos inibidores da síntese de ácido gordo ou inibidores de síntese desterol, podem ser coordenadamente administrados ou combinatorialmente formulados com um ou mais GRP, análogos e miméticos, e outros agentes biologicamente ativos descritos aqui, para conseguir penetração epitelial melhorada dos agentes ativos. Um intervalo de concentração efetivo para o inibidor desterol numa formulação terapêutica ou adjunta para administração mucosal é em geral, desde aproximadamente 0.0001% até aproximadamente 20% em peso do total, mais tipicamente desde aproximadamente 0.01% até aproximadamente 5%.

Agentes Doadores de Óxido Nítrico e Métodos

Dentro de outros aspectos relacionados com a invenção, um doador de óxido nítrico (NO) se selecciona como um agente que intensifica a penetração da membrana biológica para melhorar a administração epitelial de um ou mais GRP, análogos e miméticos e outros agentes biologicamente ativos descritos aqui. Vários doadores de NO conhecem-se na arte e são empregues em concentrações efetivas dentro dos métodos e formulações da invenção. Doadores NO exemplares incluem, mas não se limitam a, nitroglicerina, nitroprúsido, N0C5 [3- (2- hidroxi-1- (metil-etil) -2-nitrosohidrazino) -1-propanamina], NOC12 [N-etil-2- (1-etil-hidroxi-2-nitrosohidrazino) - etanamina] , SNAP [S-nitroso-N-acetil-DL-penicilamina], NORl e N0R4. Dentro dos métodos e composições da invenção, uma quantidade efetiva de um doador NO seleccionado é coordenadamente administrada ou combinatorialmente formulada com um ou mais GRP, análogos e miméticos, e/ou outros agentes biologicamente ativos descritos aqui, em ou através do epitélio.

Agentes para Modular a Estrutura de União Epitelial e/ou Fisiologia

A presente invenção proporciona composições farmacêuticas que contêm um ou mais GRP, análogos ou miméticos, e/ou outros agentes biologicamente ativos em combinação com agentes que intensificam a administração epitelial descritos aqui formulados numa preparação farmacêutica para a administração epitelial.

O agente permeabilizante reversivelmente intensifica o transporte paracelular epitelial mucosal, tipicamente modulando a estrutura de união epitelial e/ou fisiologia numa superfície epitelial mucosal no sujeito. Este efeito engloba tipicamente a inibição pelo agente permeabilizante de ligação homotípico ou heterotípico entre as proteínas adesivas da membrana epitelial de células epiteliais vizinhas. As proteínas alvo para este bloqueio de ligação homotípico ou heterotípico podem ser seleccionadas de várias moléculas de adesão de união relacionadas (JAMs), ocludinas, ou claudinas. Exemplos destas são anticorpos, fragmentos de anticorpo ou anticorpos de cadeia única que se ligam nos domínios extracelulares destas proteínas.

Nas modalidades detalhadas adicionais, a invenção proporciona peptídeos permeabilizantes e análogos peptídicos e miméticos para melhorar o transporte paracelular epitelial mucosal. Os peptídeos sujeito e análogos peptídicos e miméticos, tipicamente funcionam dentro das composições e métodos da invenção modulando a estrutura de união epitelial e/ou fisiologia num sujeito animal. Em certas modalidades, os peptídeos e análogos peptídicos e miméticos inibem efetivamente a ligação homotípico e/ou heterotípico de uma proteína adesiva da membrana epitelial, seleccionada de uma molécula de adesão de união (JAM), ocludina, ou claudina.

Um de tais agentes que têm sido extensivamente estudados é a toxina bacterial da Vibrio cholerae conhecida como a "toxina zonula occludens" (ZOT). Esta toxina medeia a permeabilidada mucosal intestinal aumentada e causa sintomas de doença que incluem diarréia em sujeitos infectados. Fasano, et para ou, Proc. Nat. Acad. Sci., OU.S.A. 8:5242- 5246, 1991. Quando se testa na mucosa ileal de coelho, a ZOT incrementa a permeabilidade intestinal modulando a estrutura de uniões herméticas intercelulares. Mais recentemente, verificou-se que a ZOT é capaz de abrir reversivelmente uniões herméticas na mucosa intestinal. Também reportou-se que que a ZOT é capaz de abrir reversivelmente uniões herméticas na mucosa nasal. Patente Estadounidense Não. 5,908,825.

Dentro dos métodos e composições da invenção, ZOT, assim como também vários análogos e miméticos de ZOT que funcionam como agonistas e antagonistas da actividade ZOT, são empregues para intensificar a administração nasal de agentes biologicamente ativos - aumentando a absorção paracelular em e através da mucosa nasal. Neste contexto, ZOT tipicamente actua causando uma reorganização estrutural de uniões herméticas marcadas por localização alterada de proteína de união ZO1. Dentro destes aspectos da invenção, ZOT é coordenadamente administrado ou combinatorialmente formulado com o agente biologicamente ativo numa quantidade efetiva para proporcionar absorção significativamente melhorada do agente ativo, aumentando reversivelmente a permeabilidade da mucosa nasal sem efeitos colaterais substanciais adversos.

Agentes Vasodilatadores e Métodos

Após outra classe de agentes que promovem a absorção que mostram utilidade benéfica dentro da administração coordenada e métodos de formulação combinatorial e composições da invenção estão, compostos vasoativos, mais especificamente vasodilatadores. Estes compostos funcionam dentro da invenção para modular a estrutura e fisiologia da vasculatura submucosal, aumentando a taxa de transporte de GRP, análogos e miméticos e outros agentes biologicamente ativos ou através do epitélio e/ou tecidos alvo específicos ou compartimentos (por exemplo, o sistema nervoso central ou circulatório sistêmico).

Agentes vasodilatadores para uso dentro da invenção, tipicamente causam relaxamento dos vasos sangüíneos submucosais devido a um decréscimo no cálcio citoplasmático, um aumento no oxido nítrico (NO) ou inibindo a síntese da cadeia longa de miosina. Em geral, dividem-se em 9 classes; antagonistas do cálcio, abridores do canal do potássio, inibidores ACE, antagonistas do receptor da angiotensina-II, antagonistas do receptor α-adrenérgico e imidazol; agonistas β1-adrenérgicos, inibidores da fosfodiesterase, e icosanóides e doadores de NO.

Devido às diferenças químicas, as propriedades farmacocinéticas dos antagonistas do cálcio são similares. A absorção na circulação sistêmica é alta, e estes agentes por isso, submetem-se a um metabolismo considerável de primeira passagem pelo fígado, resultando em variação individual na farmacocinética. Excepto pelos fármacos mais novos do tipo dihidropiridina (amlodipina, felodipina, isradipina, nilvadipina, nisoldipina e nitrendipina), a vida média dos antagonistas do cálcio é curta. Por isso, manter uma concentração de fármaco efetiva para muitos destes, pode requerer administração por dosagem múltipla, ou formulações de libertação controlada, como se descreve noutra parte aqui. 0 tratamento com abridor do canal de potássio minoxidil, pode também ser limitado em maneira e nível de administração devido a efeitos colaterais potenciais adversos.

Inibidores do ACE previnem a conversão da angiotensina-I em angiotensina-II, e são mais efetivos quando a produção de renina aumenta. Dado que o ACE é idêntico à cinase-II, a qual inactiva o vasodilatador endógeno potente, bradiquinina, a inibição do ACE causa uma redução na degradação de bradiquinina. Os inibidores ACE proporcionam a vantagem agregada de efeitos cardioprotectores e cardioreparadores, prevenindo e invertendo a fibrose cardíaca e hipertrofia ventricular em modelos animais. A trajectória de eliminação predominante da maioria dos inibidores ACE é através excreção renal. Portanto, a deterioração renal está associada à eliminação reduzida e uma redução de dosificação de 25 a 50% é recomendada em pacientes com deterioração renal moderada a severa.

Com respeito a doadores NO, estes compostos são particularmente úteis dentro da invenção pelos seus efeitos adicionais na permeabilidada mucosal. Além disso dos doadores NO notados anteriormente, complexos de NO com nucleófilos chamados NO/nucleófilos, ou NONOatos, espontaneamente e não enzimáticamente libertam NO quando se dissolvem em solução aquosa de pH fisiológico. Pelo contrário, os nitro vasodilatadores tais como nitroglicerina, requerem actividade enzimática específica para libertação de NO. Os NONOatos libertam NO com uma estequiometria definida e a taxas previsíveis variando desde <3 minutos para dietilamina/NO até aproximadamente 20 horas para dietilentriamina/NO (DETANO) .

Com certos métodos e composições da invenção, um agente vasodilatador seleccionado é coordenadamente administrado (por exemplo, sistémicamente ou intranasalmente, simultaneamente ou em associação temporal combinatorialmente efetiva) ou combinatorialmente formulado com um ou mais GRP, análogos e miméticos e outros agentes biologicamente ativos numa quantidade efetiva para intensificar a absorção da mucosa dos agentes ativos para alcançar um tecido alvo ou compartimento no sujeito (por exemplo o fígado, veia portal hepática, tecido ou fluido do CNS, ou plasma do sangue) .

Agentes Selectivos que Intensificam o Transporte e Métodos

As composições e métodos de administração da invenção, opcionalmente incorporam um agente que intensifica o transporte selectivo, que facilita o transporte de um ou mais agentes biologicamente ativos. Estes agentes que intensificam o transporte podem ser empregues numa formulação combinatorial ou protocolo de administração coordenado com um ou mais dos GRP, análogos e miméticos descritos aqui, para administrar coordenadamente um ou mais agentes biologicamente ativos adicionais através das barreiras de transporte da membrana biológica, para melhorar a administração epitelial dos agentes ativos para alcançar um tecido objetivo ou compartimento na sujeito (por exemplo, o epitélio mucosal, fígado, tecido ou fluido CNS ou plasma do sangue) . Alternativamente, os agentes que intensificam o transporte podem ser empregues num protocolo de administração coordenada ou formulação combinatorial para intensificar directamente a administração epitelial de um ou mais dos GRP, análogos e miméticos, com ou sem administração intensificado de um agente biologicamente ativo adicional.

Agentes que intensificam o transporte selectivo para uso dentro deste aspecto da invenção incluem, mas não se limitam a, glicósidos, moléculas que contém açúcar, e agentes de ligação tais como agentes de ligação de lectina, os quais são conhecidos por interactuar especificamente com os componentes do transporte de barreira epitelial. Por exemplo, ligandos "bioadesivos específicos, incluem várias lectinas de plantas e bacterianas, as quais se ligam às porções de açúcar do seuperfície celular por interações mediadas por um receptor, podem ser empregues como portadores ou mediadores de transporte conjugados para melhorar a administração nasal, por exemplo, mucosal de agentes biologicamente ativos dentro da invenção. Certos ligandos bioadesivos para uso dentro da invenção, mediarán a transmisión de senales biológicas a células epiteliais objetivo que activan a absorção selectiva do ligando adesivo por processos de transporte celular especializado (endocitose a transcitose). Estes mediadores de transporte podem portanto, ser empregues como um "sistema portador" para estimular ou dirigir a absorção selectiva de um ou mais GRP, análogos e miméticos e outros agentes biologicamente ativos em e/ou através do epitélio mucosal.

Estes e outros agentes que intensificam o transporte selectivo, intensificam significativamente a administração epitelial de biofármacos macromoleculares (particularmente peptídeos, proteínas, oligonucleótidos e vectores de polinucleótido) com a invenção. As lectinas são proteínas de planta que se ligam a açúcares específicos encontrados na superfície de glicoproteínas e glicolípidos de células eucarióticas. As soluções concentradas de lecitinas têm um efeito "mucoatrativo" e vários estudos têm demonstrado endocitose mediada por um receptor rápido (RME) de lectinas e conjugados de lectinas (por exemplo, concavalinà conjugada com partículas de ouro coloidal) através das superfícies mucosais. Estudos adicionais têm reportado que os mecanismos de absorção para lectinas, podem ser utilizados para dirigir o fármaco intestinal in vivo. Em certos destes estudos, as nanopartícuias de poliestireno (50 0 nm) , foram covalentemente acopladas a lectina de tomate e os rendimentos reportados melhoram a absorção sistêmica depois da administração oral a ratazanas.

Além disso as lectinas de plantas, os factores de invasão e adesão microbiana proporcionam uma fonte rica de candidatos para uso como portadores de transporte adesivo/selectivo dentro dos métodos de administração mucosal e composições da invenção. Dois componentes são necessários para os processos de aderência bacteriana, uma "adesina" bacteriana (aderência ou factor de colonização) e um receptor na superfície e célula hospedeira. As bactérias que causan infecciones mucosais necesitan penetrar a capa mucosãntes de unir As mesmas à superfície epitelial. Esta união é usualmente mediada por fibrinas bacterianas ou estruturas do pilus, ainda outros componentes do seuperfície celular também podem tomar parte na processo. As bactérias aderentes colonizam o epitélio mucosal por multiplicação e iniciação de uma série de reações bioquímicas dentro de célula alvo através dos mecanismos de transdução de sinal (com ou sem ajuda de toxinas). Associados com estes mecanismos invasivos, uma ampla diversidade de proteínas bioadesivas (por exemplo, invasiva, internalina), produzidas originalmente por várias bactérias e virus, conhecem-se. Estas permitem a união extracelular de tais microorganismos com uma selectividade impressionante para espécies hospedeiras e após tecidos particulares alvo. Os sinais transmitidos por tais interações de receptor-ligando, activam o transporte de microorganismos viventes, intactos em, e eventualmente através das células epiteliais por processos endo e transcitóticos. Tais fenômenos que se originan naturalmente, podem ser endurecidos (por exemplo, formando complexos de agentes biologicamente ativos tais como GRP com uma adesina) , em conformidade com os ensinamentos aqui descritos para administração melhorada de compostos biologicamente ativos em ou através de uma membrana biológica e/ou a outros sítios alvo designados para ação do fármaco.

Várias toxinas de plantas e bacterianas que se ligam às superfícies epiteliais numa maneira similar a lectina, específica, também são empregues dentro dos métodos e composições da invenção. Por exemplo, a toxina difteria (DT) entra nas células hospedeiras rapidamente por RME. Do mesmo modo, a subunidade B da toxina lábil para o calor de E. coli, liga-se no limite da cúpula das células epiteliais intestinais numa maneira similar à lectina, altamente específica. A absorção desta toxina e transcitose para o lado basolateral dos enterócitos, foi reportada in vivo ou in vitro. Outros investigadores expressaram o domínio da transmembrana da toxina da dif teria em E. coli como uma proteína de fusão de ligação a maltose e acoplada quimicamente à poli-L-lisina de alto peso molecular. 0 complexo resultante é empregue com êxito para mediar a internalização de um gene repórter in vitro. Além disso destes exemplos, a Staphylococcus aureus produz uma série de proteínas (por exemplo, enterotoxina estafilococal A (SEJA), SEB, toxina 1 de síndrome de apoplexia tóxica (TSST-I), a qual actua tanto como superantígenos e toxinas. Estudos que referem a estas proteínas têm reportado transcitose facilitada dependente de dose de SEB e TSST-I em células Caco-2. A hemaglutinina viral contém outro tipo de agente de transporte para facilitar a administração mucosal de agentes biologicamente ativos dentro dos métodos e composições da invenção. A etapa inicial em muitas infecções virais é a ligação de proteínas do seuperfície (hemaglutininas) a células mucosais. Estas proteínas de ligação foram identificadas por muitos virus, que incluem rotavirus, virus de varicela zoster, virus do bosque Semliki, adenovirus, e reovirus. Estas e outras hemaglutininas exemplares se podem empregar numa formulação combinatorial (por exemplo, uma mistura ou formulação de conjugado) ou protocolo de administração coordenada com um ou mais dos GRP, análogos e miméticos descritos aqui, para intensificar coordenadamente a administração mucosal de um ou mais agentes biologicamente ativos adicionais. Alternativamente, as hemaglutininas virais podem ser empregues numa formulação combinatorial ou protocolo de administração coordenada para intensificar directamente a administração mucosal de um ou mais GRP, análogos e miméticos, com ou sem administração intensificada de um agente biologicamente ativo adicional.

Uma variedade de factores que medeiam ou transporte, selectivos, também estão disponíveis para uso dentro da invenção. As células do mamífero desenvolveram uma classficação de mecanismos para facilitar a internalização do seubstratos específicos e dirigidos a estes compartimentos definidos. Colectivamente, este processo de deformações da membrana é chamado "endocitose" e compreende a fagocitose, pinocitose, endocitose mediada por um receptor (RME mediada por clatrina), e potocitose (RME mediada não por clatrina). A RME é um processo biológico celular altamente específico pelo qual, como o seu nome implica, vários ligandos se ligam aos receptores do seuperfície celular e são subseqüentemente internalizados e traficados dentro da célula. Em muitas células, os processos de endocitose são activados assim que a superfície da membrana completa é internalizada e substituída em menos de meia hora. Duas classes de receptores são propostos baseados na sua orientação na membrana celular; no terminal amino dos receptores Tipo I, está localizado no lado extracelular da membrana, enquanto os receptores Tipo II, têm este mesmo extremo de proteína no contorno intracelular.

Todavia outras modalidades da invenção utilizam transferrina como um portador ou estimulante de RME de agentes biologicamente ativos epitelialmente administrados. A transferrina, uma glicoproteína de transporte de ião de 8 0 kDa, é eficientemente tomada em células por RME. Os receptores de transferina encontram-se na superfície da maoria das células proliferantes, em números elevados em eritroblastos e em muitas classes de tumores. A transcitose de transferrina (Tf) e a conjugação de transferrina, segundo se reporta, são intensificadas na presença de Brefeldinà (BFA), um metabolito fúngico. Noutros estudos, ou tratamento de BFA foi reportado por incrementar rapidamente a endocitose apical tanto da resina como HRP em células MDCK. Deste modo, BFA e outros agentes que estimulam ou transporte mediado por um receptor, podem ser empregues com os métodos da invenção como formulados combinatorialmente (por exemplo, conjugados) e/ou agentes coordenadamente administrados para melhorar ou transporte mediado por um receptor de agentes biologicamente ativos, que incluem, GRP, análogos e miméticos.

Métodos e Veículos de Entrega Polimérica

Dentro de certos aspectos da invenção, ou GRP, análogos e miméticos, outros agentes biologicamente ativos aqui descritos e os agentes potenciadores da entrega como descritos acima, são, individualmente ou combinados, incorporados dentro de uma formulação administrada epitelialmente (por exemplo nasalmente) que inclui um polímero biocompatível a funcionar como transportador ou base. Tais transportadores de polímeros incluem pós poliméricos, matrizes ou veículos de entrega de microparticulas, entre outras formas de polímeros. OU polímero pode ser de origem vegetal, animal ou sintética. Muitas vezes ou polímero é cruzado. Adicionalmente, nestes sistemas de entrega ou GRP, análogo ou mimético, pode ser funcionalizado de forma que possa ser ligado covalentemente ao polímero e tornado inseparável do polímero por simples ishing. Em outras materializações, ou polímero é modificado quimicamente com um inibidor enzimático ou outros agentes que possam degradar ou inactivar ou(s) agente(s) biologicamente ativo(s) e/ou agente(s) potenciador(é) da entrega. Em certas formulações, ou polímero é parcial ou completamente insolúvel em água mas solúvel num polímero da água, por exemplo, um hidrogel. Os polímeros úteis neste aspecto da invenção são desejavelmente interativos com a água e/ou hidrofílicos por natureza para absorver quantidades significativas de água, e estes muitas vezes formam hidrogeles quando colocados em contacto com a água ou meios aquosos por um período de tempo suficiente para alcançar ou equilíbrio com a água. Em materializações mais detalhadas, ou polímero é um hidrogel que, quando colocado em contacto com água em excesso, absorve pelo menos duas vezes ou seu peso em água em equilíbrio quando exposto a água à temperatur ambiente. Patente E.U.A N0 6 004 583.

Os sistemas de entrega de fármacos baseados em polímeros biodegradáveis são preferidos em muitas aplicações biomédicas porque estes sistemas são quebrados ou por hidrólise ou por reação enzimática em moléculas não tóxicas. A taxa de degradação é controlada manipulando a composição da matriz do polímero biodegradável. Estes tipos de sistemas pode por isso ser empregues em certas situações para libertação a longo prazo de agentes biologicamente ativos. Os polímeros biodegradáveis como ou ácido poliglicóligo (PGA), ácido poliláctico (PLA), e ácido poli(D,L- ácido láctico-co- ácido glicólico) (PLGA), receberam atenção considerável como possíveis transportadores para entrega do fármaco, uma vez que os produtos de degradação destes polímeros têm baixa toxicidade. Durante a normal função metabólica do corpo estes polímeros degradam-se em dióxido de carbono e água. Estes polímeros exibiram também excelente biocompatibilidade.

Para prolongar a actividade biológica do GRP, análogos e mimética, e outros agentes biologicamente ativos aqui indicados, assim como agentes potenciadores da entrega opcionais, estes agentes podem ser incorporados em matrizes poliméricas, por exemplo, poliortoésteres, polianidridos, ou poliésteres. Isto acarreta actividade e libertação sustentada do(s) agente(s) ativo(s), por exemplo, como determinado pela degradação da matriz polimérica. Embora a encapsulação de moléculas bioterapêuticas dentro de polímeros sintéticos possa estabilizá-os durante o armazenamento e entrega, o maior obstáculo da tecnologia de libertação baseada em polímeros é a perda da actividade das moléculas terapêuticas durante os processos de formulação que muitas vezes envolvem calor, sonicação ou solventes orgânicos.

Os polímeros promotores da absorção contemplados para utilização com a invenção podem derivados e versões química ou fisicamente modificadas dos tipos de polímeros expostos, além de outros polímeros sintéticos ou de origem natural, gomas, resinas, e de outros agentes, bem como misturas desses uns com os outros materiais ou outros polímeros, desde que as alterações, modificações ou misturas não afectem negativamente as propriedades desejadas, tais como a absorção da água, formação de hidrogel, e / ou estabilidade química para aplicação útil.De uma forma mais detalhadnosaspectos da invenção, polímeros tais como nylon, acrylan e outros polímeros sintéticos normalmente hidrofóbicos podem ser suficientemente modificados por reação para se tornarem solúveis em água e / ou de forma estável géis em meio aquoso.

Os polímeros promotores da absorção da invenção podem incluir ou grupo de polímeros de homo-e copolímeros baseados em várias combinações dos seguintes monómeros de vinilo: ácido acrílico e metacrílico, acrilamida, metacrilamida, hidrooxietilacrilato ou metacrilato, vinilpirrolidonas, bem como álcool polivinílico e os seus co - E terpolímeros, polivinilacetato, e os seus co-terpolímeros com os acimas listados monómeros e). Muito úteis são os copolímeros do ácido acrilamido-2-2-metil-propanosufónico (AMPS®) dos acima listados monómeros com monómeros funcionais co-polimerizáveis, tais como acril ou metacrilamidàcrilato ou metacrilato ésteres ondos grupos éster ou são derivados de cadeia ramificada alquil, aril tendo até quatro anéis aromáticos que possam conter substituintes alquilo de 1 a 6 carbonos; esteróides, sulfatos, fosfatos ou monómeros catiónicos tais como N, N-dimetilaminoalquil (métodos) acrilamida, dimetilaminoaquil (métodos) acrilato, (métodos) cloreto dacriloxialquilltrimetilamónio, (métodos) cloreto dacriloxialquildimetillbenzil damónio.

Os polímeros promotores de absorção adicional para utilização no âmbito são aqueles classificados como dextrans, dextrins e, a partir da classe de materiais classificados como gomas e resinas naturais, ou a partir da classe de polímeros naturais como processado colágeno, quitina, quitosana, pullalan, zooglan , alginatos e alginatos modificados como "Kelcoloid" (um polipropilenoglicol modificado alginato), gomas gellan gengivas, como "Kelocogel", gomas Xanathan, como "Keltrol", estastin, alfa hidroxibutirato e seus copolímeros, ácido hialurônico e seus derivados, e ácido poliláctico ácido glicólico.

Uma classe muito útil de polímeros aplicáveis no âmbito da invenção instantânea são ácidos carboxílicos olefinicamente insaturados contendo pelo menos uma ligação olefínica dupla carbono-carbono activada, e, pelo menos, um grupo carboxilo; isto é, um grupo funcional ou ácido facilmente convertido num ácido contendo uma ligação dupla olefínica que funciona prontamente na polimerização por causa da sua presença na molécula monómero, quer no alfa-beta posição no que diz respeito a um grupo carboxilo, ou como parte de um agrupamento terminal de metileno. Os ácidos olefinicamente insaturados desta classe incluem materiais tais como ou próprio ácido acrílico, ácido alfa cianoacrílico, ácido beta metilacrílico (ácido crotónico), ácido alfa fenilacrílico, ácido betacrilóxipropiónico, ácido cinâmico, ácido p-cloro cinâmico, Carboximetilcelulose 1- fenil-4-butadieno-1, 3, Ácido itacónico,ácido citracónico, ácido mesacónic, ácido glutacónico, ácido aconítico, ácido maleico, ácido fumárico, e tricarboxietileno. Tal como aqui utilizadas, ou termo "ácidos carboxílicos" inclui os ácidos policarboxílicos e os anidridos de ácido, como anidrido maleico, onde ou grupo anidrido é formado pela iminação de uma molécula de água dos dois grupos carboxilo localizados na mesma molécula de ácido carboxílico.

Os acrilatos representativos úteis como agentes promotores da absorção no âmbito da invenção incluem metil acrilato, Acrilato de etilo, propilo acrilato, acrilato isopropílico, butilo acrilato, acrilato isobutílico, metacrilato de metilo, etacrilato de metilo, etilo metacrilato, octil acrilato, heptil acrilato, octil metacrilato,metacrilato isopropílico,2-etilhexil metacrilato, nonil acrilato, hexil acrilato, n-hexilo metacrilato, e similares. Esteres alquil acrilico superiores são decil acrilato, isodecil metacrilato, lauril acrilato, estearil acrilato, behenil acrilato e melissil acrilato e versões metacrilato do mesmo. As misturas de dois ou três ou mais ésteres de cadeia longa podem ser polimerizadas com sucesso com um dos monómeros carboxílicos. Outros co- monómeros incluem as olefinas, incluindo alfa olefinas, vinil éteres, ésteres de vinilo, e suas misturas.

Outros monómeros vinilideno, incluindo os nitrilos acrílicos, podem também ser usados como agentes promotores da absorção no âmbito dos métodos e composições da invenção para reforçar a difusão e a absorção de um ou mais GRP, análogos e miméticos, e outro(s) agente(s) biologicamente ativo(s), inclusive para reforçar a entrega do(s) agente (s) ativo(s) para um tecido alvo ou num compartimento do indivíduo (por exemplo, ou fígado, veia portal hepática, tecidos ou fluidos CNS, ou plasma sangüíneo) . Os nitrilos alfa beta- olenif icamente insaturados úteis são preferencialmente nitrilos mono-olenificamente insaturados contendo de 3 a 10 átomos de carbono, tais como acrilonitrila, metacrilonitrila, e similares. Os preferidos são acrilonitrilo e metacrilonitrilo. Amidas acrílicas contendo de 3 a 35 átomos de carbono incluindo amidas insaturadas mono-olefinicamente também podem ser utilizadas. As amidas representativas incluem acrilamida, metacrilamida, Nt-butil acrilamida, N- ciclohexil acrilamida, alquil amidas superiores, onde ou grupo alquilo no nitrogênio contém de 8 a 32 átomos de carbono, amidas acrílica incluindo n-alquilol amidas de ácidos alfa carboxílicos beta-olenificamente insaturados, incluindo aqueles que têm de 4 a 10 átomos de carbono, tais como N-metilol acrilamida, N-propanol acrilamida, N-metilol metacrilamida, N-metilol maleimida, ésteres do ácido N- metilol maleâmico, N-metilol-p-vinil benzamida, e similares.

Materiais de promotores de absorção ainda mais úteis são as alf a-olef inas contendo de 2 a 18 átomos de carbono, mais preferencialmente a partir de 2 a 8 átomos de carbono; dienes contendo de 4 a 10 átomos de carbono; vinil ésteres e alilo ésteres tais como ou acetato de vinilo; vinil aromáticos tais como estireno, metil estireno e cloro- estireno; vinil e alilo éteres e cetonas tais como vinil e éter metil vinil cetona; cloroacrilatos; cianoalquil acrilatos como alfa-cianometil acrilato, e os alfa-, beta e gama-cianopropil; alcoxiacrilatos como metoxi etil acrilato; haloacrilatos como cloroetil acrilato; halogenetos vinil e cloreto de vinilo, cloreto vinilideno e similares; divinilos, diacrilatos e outros monómeros polifuncionais, tais como divinyl éter, diacrilato dietilenoglicol, etileno glicol dimetacrilato, metileno-bis-acrilamida, alilpentaeritritol, e similares; e bis(beta-haloalquil) alquenil fosfonatos como bis (beta-cloroetil) vinil fosfonato e similares como são conhecidos por aqueles competentes na tecnologia. Copolímeros onde ou monómero contendo carboximetilcelulose é um componente menor, e os outros monómeros vinilideno presentes como principais componentes são facilmente preparados de cordo com os métodos aqui divulgados.

Quando são aplicados hidrogéis como agentes promotores da absorção no âmbito da invenção, estes podem ser compostos de copolímeros sintéticos a partir do grupo de ácidos acrílico e metacrílico, acrilamida, metacrilamida, hidroxietilacrilato (HEA) ou metacrilato (HEMA) , e vinilpirrolidonas que interagem com a água e são solúveis . Exemplos ilustrativos específicos de polímeros úteis, especialmente para entrega de peptídeos ou proteínas, são os seguintes tipos de polímeros: (met) acrilamida e 0,1 a 99 WT. % , ácido (met)acrílico; (met)acrilamidas e peso 0,1-75% wt. , cloreto (met)acriloxietil trimetilamónio; (met)acrilamida e 0,1 75% wt. (met)acrilamida; ácido acrílico e peso 0.1-75% alquil (met)acrilatos ; (met)acrilamida e 0.1-75 wt.

AMPS.RTM%. (marca registrada da Lubrizol Corp); (met) acrilamida e de 0 a 30% peso alquil (met) acrilamidas e peso 0.1-75% AMPS.RTM.; (met)acrilamida e 0.1-99 WT. HEMA%; (met) acrilamida e 0,1 a 75% HEMA peso e de 0,1 a 99% ácido (met)acrílico; e de ácido (met)acrílico 0.1-99 peso% HEMA; 50% vinil éter e 50% mole danidrido maleico; (met)acrilamida e 0,1% a 75 peso cloreto de (met) acriloxialqui dimetil benzi lamónio; (met) acrilamida e 0,1 a 99% peso vinil pirrolidona; (met)acrilamida e 50% vinil pirrolidona peso e peso 0.1-99.9% ácido (met)acrílico; ácido (met)acrílico e de 0,1 a 75% AMPS. RTM peso. 0.1-75% e peso alquil (met)acrilamida. Nos exemplos acima, alquil significa C1 a C30, de preferência C1 a C22, linear e ramificada e C4 a C16 cíclica; onde (met) é utilizado, isso significa que os monómeros com e sem ou grupo metil estão incluídos. Outros polímeros de hidrogel solúvel muito úteis, mas são versões de poli (vinil pirrolidona) amido, carboximetil celulose e álcool polivinílico.

Materiais adicionais de hidrogel polimérico úteis no âmbito da invenção incluem (poli)hidroxialquil (met)acrilato: hidrogéis aniónicos e catiónicos: complexos poli(eletrólito); álcoois polivinílicos, com um resíduo de acetato baixo: mistura solúvel de ágar e carboximetil celulose : uma composição solúvel que inclua metil celulose misturada com um agar crosslinked; co-polímero solúvel em água produzido por uma dispersão de um copolímero finamente dividido danidrido maleico com estireno, etileno, propileno, ou isobutileno; um polímero solúvel em água de N-vinil lactâmicos; sais de sódio solúveis de carboximetilcelulose; e similares.

Outros polímeros de retenção e absorventes de fluido, gelificáveis empregues para formar o hidrogel hidrofílico para a administração mucosal de agentes biologicamente ativos dentro da invenção incluem pectina; polissacáridos tais como agar, acácia, karaya, tragacanto, e guar e suas versões reticuladas; polímeros de ácido acrílico, copolímeros e derivados de sais, poliacrilamida; polímeros de anidrido indol maleico expansíveis em água; copolímeros de enxerto de milho; polímeros e copolímeros de tipo acrilato com capacidadee de absorção de água de aproximadamente 2 até 400 vezes o seu peso original; diésteres de poliglucano; uma mistura de poli(vinilalcohol) reticulado e poli(N-vinil-2- pirrolidona); geles de copolímero de bloqueio de polibutilen- polietileno; goma de carob; geles de poliéster; geles de poliureia; geles de poliéter,- geles de poliamida; geles de poliimida; geles de polipéptido; geles de poliaminoácido; geles policelulósicos; polímeros dacrilato anidrido maleico- indeno reticulados; e polisacáridos.

Polímeros de hidrogel sintético para uso dentro da invenção podem fazer-se por uma combinação infinita de vários monómeros em várias proporções. O hidrogel pode ser reticulado e em geral, possui a capacidadee para reter e absorver fluido e expandir-se ou inchar para um estado de equilíbrio ampliado. Os hidrogeles tipicamente incham ou expandem depois da administração à superfície mucosal nasal, absorvendo aproximadamente 2-5, 5-10, 10-50 até 50-100 ou mais vezes o dobro do seu peso dágua. O grau óptimo de expansibilidade para um hidrogel será determinado por diferentes agentes biologicamente ativos, dependendo de tais factores como peso molecular, tamanho, solubilidade e características de difusão do agente ativo transportado ou preso ou encapsulado dentro do polímero, e o espaçamento específico e movimento de cadeia cooperativa associado com cada polímero individual.

Os polímeros hidrofílicos empregues com a invenção são solúveis em água mas expansíveis em água. Tais polímeros expansíveis em água são como tipicamente se refere a hidrogeles ou geles. Tais geles podem ser convenientemente produzidos a partir de polímero solúvel em água pelo processo de reticulação dos polímeros por um agente de reticulação adequado. Não obstante, os hidrogeles estáveis podem também ser formados a partir de polímeros específicos sob condições definidas de pH, temperatura e/ou concentração iónica, e conformidade com os métodos conhecidos na arte. Tipicamente, os polímeros são reticulados, isto é, reticulados na magnitude de que os polímeros possuem boas propriedades hidrofílicas, têm integridade física melhorada (comparada com polímeros não reticulados do mesmo ou similar tipo) e exibem capacidade melhorada para reter dentro da rede de gel tanto o agente biologicamente ativo de interesse como os compostos adicionais para coadministração junto com estes, tais como citocina ou inibidor de enzima, assim como retêm a capacidade para libertar os agentes ativos, no tempo e local adequados.

Em geral, os polímeros de hidrogel para uso com a invenção são reticulados com uma reticulação di-funcional na quantidade desde 0.01 até 25% em peso, baseado no peso dos monómeros que formam o copolímero, e mais preferivelmente, desde 0.1 até 20 por cento em peso e mais freqüentemente desde 0.1 até 15 por cento em peso do agente reticulante. Outra quantidade útil de um agente de reticulação é 0.1 a 10 por cento em peso. Agentes de reticulação multifuncional tri, tetra ou superiores, podem também ser empregues. Quando tais reagentes são utilizados, quantidades inferiores podem ser requeridas para conseguir a densidade de reticulação equivalente, isto é, o grau de reticulação ou propriedades de rede que são suficientes para conter efetivamente os agentes biologicamente ativos.

Os reticulantes podem ser ligações covalentes, iónicas ou hidrogênio com o polímero que possui a capacidade para expandir-se na presença de fluidos que contém água. Tais reticuladores e reações de reticulação são conhecidas por aqueles peritos na técnica e em muitos casos, são dependentes do sistema polimérico. Deste modo, uma rede reticulada pode ser formada por copolimerização de radical livre de monómeros insaturados. Os hidrogeles poliméricos também podem ser formados reticulando polímeros preformados fazendo reagir grupos funcionais encontrados nos polímeros, tais como álcoois, ácidos, aminas com tais grupos como glioxal, formaldeído ou glutaraldeído, bis anidridos e similares.

Os polímeros também podem ser reticulados com qualquer polieno, por exemplo, decadieno ou trivinilciclohexano; acrilamidas tais como N,N-metilen- bis(acrilamida) ; acrilatos polifuncionales tais como trimetilolpropantriacrilato; ou monómero de vinilideno polifuncional que contém pelo menos, 2 grupos terminais CH2 <, que incluem por exemplo, copolímeros de divinilbenzeno, divinilnaftleno, alilo e similares. Em certas modalidades, os monómeros de reticulação para uso na preparação dos copolímeros são polialquenilpoliéteres que têm mais de um agrupamento de alqueniléter por molécula, o qual pode opcionalmente, possuir grupos alquenilo nos quais uma ligação dupla olefínica está presente unida a um agrupamento de metileno terminal (por exemplo, feito pela eterificação de um álcool polihídríco que contém pelo menos 2 átomos de carbono e ao menos 2 grupos hidroxilo). Os compostos desta classe podem ser produzidos fazendo reagir um haluro de alquenilo, tal como cloreto dalilo ou bromuro dalilo, com uma solução aquosa fortemente alcalina de um ou mais ãlcoois polihídricos. O produto pode ser uma mistura complexa de poliéteres com números variantes de grupos éter. A eficiencia do agente de reticulação de poliéter incrementa com o número de grupos potencialmente polimerizáveis na molécula. Tipicamente, poliéteres que contêm um promedio de dois ou mais agrupamentos de alqueniléter por molécula, são usados. Outros monómeros de reticulação incluem por exemplo, compostos de dialil ésteres, dimetalil éteres, alil ou metalil acrilatos e acrilamidas, tetravinilsilano, polialquenilmetanos, diacrilatos e dimetacrilatos, divinilo, tais como compostos de divinilbenceno, polialilfosfato, dialiloxi e ésteres de fosfito e similares. Agentes típicos são alil pentaeritritol, alilsacarose, teimetilolpropan triacrilato, 1,6-hexandiol diacrilato, trimetilolpropandialil éter, pentaeritritol triacrilato, tetrametilen dimetacrilato, etilendiacrilato, etilendimetacrilato, trietilenglicol dimetacrilato e similares. Alilpentaeritritol, trimetilolpropan dialiléter e alil sacarose, proporcionam polímeros adequados. Quando o agente de reticulação está presente, as misturaspoliméricas usualmente contêm entre aproximadamente 0.01 até 20 por cento em peso, por exemplo, 1%, 5%, ou 10% ou mais em peso do monómero de reticulação basado no total do monómero de ácido carboxílico, mais outros monómeros.

Em aspectos mais detalhados da invenção, a administração epitelial de GRP, análogos e miméticos e outros agentes biologicamente ativos descritos aqui, é intensificado reteniendo os agentes ativos em veículo ou portador enzimáticamente ou fisiologicamente protector de libertação lenta, por exemplo, um hidrogel que cobre o agente ativo da ação das enzimas degradativas. Em certas modalidades, o agente ativo está unido por meios químicos ao portador ou veículo, o qual também pode ser misturado ou unido agentes adicionais tais como inibidores de enzima, citocinas, etc. 0 agente ativo pode alternativamente, ser imobilizado através de trampas físicas suficientes dentro do portador ou veículo, por exemplo, uma matriz polimérica.

Os polímeros tais como os hidrogeles empregues com a invenção, podem incorporar agentes ligado funcionais tais como glicósidos quimicamente incorporados no polímero para intensificar a biodisponibilidade intranasal de agentes ativos formulados junto com estes. Exemplos de tais glicósidos são glucósidos, fructósidos, galactósidos, arabinósidos, manósidos e seus derivados alquilos sustituidos e glicósidos naturais tais como arbutina, florizina, amigdalina, digitonina, saponina e indicamo. Existem várias formas nas quais um glicósido típico se pode unir a um polímero. Por exemplo, o hidrogênio dos grupos hidroxilo de um glicósido ou outro carbohidrato similar pode ser substituído pelo grupo alquilo a partir de um polímero de hidrogel para formar um éter. Também, os grupos hidroxilo dos glicósidos podem fazer-se reagir para esterificar os grupos carboxilo de um hidrogel polimérico para formar ésteres poliméricos in si tu. Outro procedimento é empregar condensação de acetobromoglucose com colest-5-em-3beta-ol num copolímero de ácido maleico. N-poliacrilamidas sustituidas podem ser sintetizadas pela reação de polímeros activados com omega-aminoalquilglicósidos; (1) (espaçador de carbohidrato) (n)-poliacrilamida, "pseudopolisacãridos"; (2) (espaçador de carbohidrato)(n)-fosfatidiletanolamina(m)- poliacrilamida, neoglicolípidos, derivados de fosfatidiletanolamina; (3) (espaçador de carbohidrato) (n) - biotina(m)-poliacrilamida. Estes derivados biotinilados podem unir-se a lectinas na superfície mucosal para facilitar a absorção dos agentes biologicamente ativos por exemplo, um GRP encapsulado em polímero.

Dentro dos aspectos mais detalhados da invenção, um ou mais GRP, análogos e miméticos, e/ou outros agentes biologicamente ativos, descritos aqui, opcionalmente incluem agentes ativos secundários tais como, inibidores de proteases, citocinas, moduladores adicionais de fisiologia da união intercelular, etc., são modificados e unidos a uma matriz ou portador polimérico. Por exemplo, isto pode ser realizado ligando quimicamente um agente de peptídeo ou proteína ativo e modificando agentes opcionais com uma rede polimérica reticulada. Também é possível modificar quimicamente o polímero separadamente com um agente interativo tal como uma molécula que contém glicosidal. Em certos aspectos, os agentes biologicamente ativos e agentes secundários ativos opcionais, podem ser funcionalizados, isto é, em donde um grupo reagente adequado é identificado ou é quimicamente agregado nos agentes ativos. Mais muitas vezes, se agrega um grupo polimerizável etilénico, e o agente ativo funcionalizado é então copolimerizado com monómeros e um agente de reticulação usando um método de polimerização padrão tal como solução de polimerização (usualmente em água), emulsão, suspensão ou polimerização de dispersão. Muitas vezes, o agente funcionalizante se proporciona com uma concentração suficientemente alta de grupos funcionais ou polimerizáveis para asegurar que vários sitios nos agentes ativos são funcionalizados. Por exemplo, num polipéptido que compreende 16 sitios amina, é geralmente desejado, funcionalizar ao menos, 2, 4, 5, 6 e até 8 ou mais dos sitios.

Depois da funcionalização, os agentes ativos funcionalizados é/são misturados com monómeros e um agente de reticulação que comprendem reagentes a partir dos quais se forma o polímero de interesse. A polimerização é então induzida neste meio para criar um polímero que contém os agentes ativos unidos. 0 polímero é então combinado com água ou outros solventes adequados e de outro modo, purificados para remover impurezas rastro sem reagir e, se é necessário, triturar ou romper por meios físicos tais como por agitação, forçando através de uma malha, ultrasonicação u outros meios adequados, a um tamanho de partícula desejado. O solvente usualmente água, é então removido numa maneira tal para não se desnaturalizar ou de outro modo degradar os agentes ativos. Um método desejado é liofilização (secagem por congelamento) , mas outros métodos estão disponíveis e podem ser usados (por exemplo, secagem por vácuo, secagem por ar, secagem por aspersão, etc.).

Para introducir grupos polimerizáveis em peptídeos, proteínas e outros agentes ativos com a invenção, é possível fazer reagir grupos reagentes amino, hidroxilo, tiol e outros disponíveis, com grupos insaturados que contêm electrófilos. Por exemplo, grupos N-hidroxi succinimidilo que contêm monómeros insaturados, carbonatos ativos, tais como p-nitrofenil carbonato, triclorofenil carbonatos, trêsilato, oxicarbonilimidazoles, epóxido, isocianatos e aldeídos, e carboximetilazidas insaturadas e ortopiridil- disulfuro insaturado, pertencem a esta categoria de reagentes. Exemplos ilustrativos de reagentes insaturados são alil glicidil éter, cloreto dalilo, bromuro dalilo, yoduro dalilo, cloreto dacriloilo, isocianato dalilo, cloreto dalilsulfonilo, anídrido maleico, copolímeros danídrido maleico e alil éter e similares.

Todos os derivados ativos de lisina, excepto aldeído, podem em geral, reagir com outros aminoácidos tais como grupos imidazol de histidina e grupos hidroxilo de tirosina e os grupos tiol de cistina se o ambiente local intensifica a nucleofilicidade destes grupos. Os reagentes funcionalizantes que contêm aldeldo são específicos a lisina. Estes tipos de reações com grupos disponíveis de lisinasf cisteínas, tirosinas, foram extensivamente documentados na literatura e são conhecidos por aqueles peritos na técnica.

No caso de agentes biologicamente ativos que contêm grupos amina, é conviente fazer reagir tais grupos com um cloreto daciloilo, tal como cloreto dacriloilo, para introduzir o grupo acrílico polimerizável no agente que se faz reagir. Depois durante a preparação do polímero, tal como durante a reticulação do copolímero dacrilamida e ácido acrílico, o agente ativo funcionalizado, através dos grupos acrílicos, é unido ao polímero e chega a unir-se a este.

Em aspectos adicionais da invenção, agentes biologicamente ativos que incluem peptídeos, proteínas, nucleósidos e outras moléculas as quais são bioactivas in vivo, são de conjugação estabilizada unindo covalentemente um ou mais agentes ativos a um polímero que incorpora como uma parte integral do mesmo, tanto uma porção hidrofílica, por exemplo, um polialquilenoglicol linear, uma porção lipofílica (ver por exemplo, patente E.U.A No. 5,681,811). Num aspecto, um agente biologicamente ativo é covalentemente acoplado com um polímero que compreende (i) uma porção de polialquilenoglicol linear, e (ii) uma porção lipofílica, onde o agente ativo, porção de polialquilenoglicol linear, e a porção lipofílica, são conformacionalmente tornados relativos entre si, de maneira tal que o agente terapêutico ativo em uma resistência in vivo intensificada a degradação enzimática (isto é, relativa à sua estabilidade sob condições similares numa forma não conjugada desprovida do polímero acoplado a este). Em outro aspecto, a formulação de conjugação estabilizada numa conformação tri-dimensional que compreende o agente biologicamente ativo acoplado com um complexo de polisorbato que compreende (i) uma porção de polialquilenglicol linear, e (ii) uma porção lipofílica, onde o agente ativo, a porção polialquilenglicol linear e a porção lipofílica, estão conformacionalmente tornadas relativas entre si, de maneira tal que (a) a porção lipof ílica é exteriormente disponível na conformação tri- dimensional, e (b) o agente ativo na composição numa resistência in vivo intensificada para degradação enzimática.

Num aspecto adicional relacionado, se proporciona um complexo conjugado de ligando múltiplo, o qual compreende um agente biologicamente ativo acoplado covalentemente com uma porção de estrutura de triglicérido através de um grupo espaçador de polialquilenglicol unido a um átomo de carbono da porção de estrutura de triglicérido, e ao menos uma porção de ácido gordo covalentemente unida seja directamente a um átomo de carbono da porção de estrutura de triglicérido ou covalentemente unida através de uma porção espaçadora de polialquilenoglicol (ver por exemplo, Patente E.U.A No. 5,681,811). Em tais complexos de agentes terapêuticos conjugados de ligandos múltiplos, os átomos de carbono alfa e beta da porção bioactiva de triglicéridos, podem ter partes de ácido gordo unidas unindo covalentemente seja directamente a esta, ou indirectamente unindo covalentemente a esta através de partes espaçadoras de polialquilenglicol.

Alternativamente, uma porção de ácido gordo pode ser covalentemente unida seja directamente ou através de uma porção espaçadora de polialquilenoglicol nos carbonos alfa e alfa' da porção de estrutura de triglicérido, com o agente terapêutico bioativo siendo covalentemente acoplado com o gama-carbono da porção de estrutura de triglicérido, seja directamente covalentemente unido a este ou indirectamente unido a este através de uma porção espaçadora de polialquileno. Se reconhecerá que uma ampla variedade de formas estruturais, composicionais e conformacionais são possíveis, para o complexo de agente terapêutico conjugado de ligando múltiplo que compreenda porção de estrutura de triglicérido, dentro do campo da invenção. Além disso, se nota que em tal complexo de agente terapêutico de ligando múltiplo, os agentes biologicamente ativos podem ser vantajosamente covalentemente acoplados com a porção de estrutura modificada de triglicérido através de grupos espaçadores alquilo, ou alternativamente, outros grupos espaçadores aceitáveis dentro do campo da invenção. Como se usa em tal contexto, a aceitabilidade do grupo espaçador refere-se a características de aceitabilidade específicas da aplicação de uso final, estérico e composicional.

Em alguns aspectos adicionais da invenção, se proporciona um complexo de conjugação estabilizada, o qual compreende um complexo de polisorbato que compreende uma porção de polisorbato que inclui uma estrutura de triglicérido que tem covalentemente acoplado nos átomos de carbono alfa, alfa' e beta do mesmo, grupos funcionalizantes que incluem, (i) um grupo de ácido gordo; e (ii) um grupo de polietilenoglicol que tem um agente biologicamente ativo ou porção covalentemente unida a este, por exemplo, unida a uma funcionalidade adequada do grupo polietilenoglicol. Tal ligação covalente pode ser seja directo, por exemplo, a uma funcionalidade hidroxi terminal do grupo de polietilenoglicol, ou alternativamente, a ligação covalente pode ser directa, por exemplo, tapando reactivamente o término hidroxi do grupo polietilenoglicol com um grupo espaçador de funcionalidade carboxi terminal, de maneira que o grupo polietilenoglicol tapado resultante, tem uma funcionalidade carboxi terminal na qual o agente biologicamente ativo ou porção, pode ser covalentemente unido.

Em aspectos ainda adicionais da invenção, se proporciona um complexo estável, aquosamente solúvel, de conjugação estabilizada, o qual compreende um ou mais GRP, análogos e miméticos, e/ou outros agentes biologicamente ativos descritos aqui, covalentemente acoplados a uma porção glicolípida modificada com polietilenoglicol (PEG) fisiologicamente compatível. Em tal complexo, os agentes biologicamente ativos podem ser covalentemente acoplados à porção glicolípida modificada com PEG fisiologicamente compatível por uma ligação covalente lábil num grupo de aminoácido livre do agente ativo, onde a ligação covalente lábil é separável in vivo por hidrólise bioquímica e/ou proteólise. A porção glicolípida modificada com PEG fisiologicamente compatível, pode comprender vantajosamente um polímero de polisorbato, por exemplo, um grupo de éster de ácidos gordos que compreendem polímero de polisorbato, seleccionado do grupo que consiste de monopalmitato, dipalmitato, monolaurato, dilaurato, trilaurato, monoleato, dioleato, trioleato, monoestearato, diestearato e triestearato. Em tal complexo, a porção glicolípida modificada com PEG fisiologicamente compatível, pode comprender adequadamente um polímero seleccionado do grupo que consiste de polietilenglicoléteres de ácidos gordos e polietilenglicolésteres de ácidos gordos, onde os ácidos gordos por exemplo, compreendem um ácido gordo seleccionado do grupo que consiste de ácidos láurico, palmítico, oleico e esteárico.

Armazenamento de Material

Em certos aspectos da invenção, as formulações combinatoriais e/ou métodos da administração coordenados aqui, incorporam uma quantidade efetiva de peptídeos e proteínas os quais podem aderir-se a vidro carregado, com ele, reduzindo a concentração efetiva no contentor. Os contentores assinalados por exemplo, contentores de vidro assinalados, são usados para armazenar o produto acabado para reduzir a absorção do polipéptido ou proteína num contentor de vidro.

Em aspectos ainda adicionais da invenção, um kit para o tratamento de um sujeito mamífero compreende uma composição farmacêutica estável de um ou mais compostos GRP formulados para administração mucosal ao sujeito mamífero, onde a composição é eficaz para aliviar um ou mais sintomas de diabetes, obesidade, cancro, hiperglicemia, dislipidemia, síndrome metabólico, síndrome coronário, enfarte do miocárdio, ou transtorno neurológico no dito sujeito sem efeitos secundários adversos inaceitáveis. O kit além disso compreende um frasco reagente farmacêutico para conter um ou mais compostos GRP. 0 frasco reagente farmacêutico está composto de polímero de grau farmacêutico, vidro ou outro material adequado. 0 frasco de reagente farmacêutico é, por exemplo, um frasco de vidro assinalado. 0 kit além disso compreende uma abertura para administração da composição numa superfície mucosal nasal do sujeito. A abertura de administração está composta por um polímero de grau farmacêutico, vidro ou outro material adequado. A abertura de administração é, por exemplo, um vidro assinalado.

Uma técnica de sinalização combina uma técnica de limpeza especial para as superfícies a ser sinalizadas com um processo de silanização a baixa pressão. O silano está na fase gasosa e a uma temperatura intensificada das superfícies a ser silanizadas. 0 método proporciona superfícies reprodutíveis com capas de silano estáveis, homogêneas e funcionais que têm características de uma monocapa. As superfícies silanizadas previnem a ligação ao vidro de polipeptídeos ou agentes que intensificam a administração mucosal da presente invenção.

O procedimiento é útil para preparar frascos reagentes farmacêuticos sinalizados para reter composições GRP da presente invenção. As bandejas de vidro são limpas enxaguando com água bi-destilada (ddH20) antes de usar. A bandeja de silano é então enxaguada com EtOH a 95%, e a bandeja de acetona é enxaguada com acetona. Os frascos de reagente farmacêutico são sonicados em acetona por 10 minutos. Depois da sonicação em acetona, os frascos de reagentes são enxaguados em bandeja de ddH20 ao menos, duas vezes. Os frascos reagentes são sonicados em 0. IM de NaOH por 10 minutos. Assim como os frascos reagentes são sonicados em NaOH, a solução de silanação efectua-se de baixo de um capucho. (Solução de silano: 800 ml de 95% de etanol; 96 L de ácido glacial acético; 25 ml de glicidoxipropiltrimetoxi silano). Depois da sonicação de NaOH, os frascos de reagente são enxaguados em bandeja de ddH20 ao menos dos vezes. Os frascos de reagente são sonicados em solução de silano por 3 a 5 minutos. Os frascos de reagente são enxaguados em bandeja de EtOH a 100%. Os frascos de reagente são secos com gás N2 prepurifiçado e armazenados num forno a IOO0C pelo menos 2 horas antes de usar.

Veículos de Administração Bioadesivo e Métodos

Em certos aspectos da invenção, as formulações combinatoriais e/ou métodos da administração coordenada aqui incorporam uma quantidade efetiva de um adesivo não tóxico como um composto ou portador adjunto, para melhorar a administração epitelial de um ou mais agentes biologicamente ativos. Os agentes bioadesivos neste contexto, exibem adesão geral ou específica a um ou mais componentes ou superfícies da membrana biológica alvo.

O bioadesivo mantém um gradiente de concentração desejado do agente biologicamente ativo em ou através da mucosa para assegurar a penetração de moléculas grandes (por exemplo, peptídeo e proteínas) em ou através do epitélio.

Tipicamente, o emprego de um bioadesivo dentro dos métodos e composições da invenção, proporciona um aumento de duas a cinco vezes, muitas vezes de cinco a dez vezes em permeabilidade para peptídeos e proteínas em ou através do epitelio. Este melhoramento da permeação epitelial muitas vezes, permite a administração transmucosal efetiva de macromoléculas grandes, por exemplo, ã porção basal do epitelio nasal ou nos compartimentos extracelulares adjacentes ou um plasma do sangue ou tecido de CNS ou fluido.

Esta administração melhorada proporciona efetividade mormente melhorada para a administração de peptídeos, proteínas bioactivas e outras especies terapêuticas macromoleculares. Estes resultados dependerão em parte, da hidrof ilicidade do composto, com ele, se conseguirá maior penetração com especies hidrofílicas comparadas com compostos insolúveis em água. Além destes efeitos, o emprego de bioadesivos para melhorar a persistência do fármaco à superfície da membrana biológica, pode provocar um mecanismo reservatório para a administração de fármaco prolongado, e com ele, os compostos não penetram apenas através da membrana biológica, como também se difundem novamente até à superfície uma vez que o material na superfície se esgote.

Descreve-se uma variedade de bioadesivos adequados na técnica para administração oral, nas Patentes E.U.A N0s 3,972,995; 4,259,314; 4,680,323; 4,740,365; 4,573,996; 4,292,299; 4,715,369; 4,876,092; 4,855,142; 4,250,163; 4,226,848; 4,948,580; Republicação de Patente Estadounidense N0 33,093, a qual encontra uso dentro dos novos métodos e composiçõe da invenção. 0 potencial de vários polímeros bioadesivos como uma plataforma de administração nasal, por exemplo mucosal, com os métodos e composições da invenção, pode ser facilmente avaliado determinando a sua capacidade para reter e libertar GRP, assim como também por sua capacidade para interagir com as superfícies mucosais depois da incorporação do agente ativo aí. Além disso, métodos bem conhecidos serão aplicados para determinar a biocompatibilidade de polímeros seleccionados com o tecido no sítio da administração mucosal. Quando a mucosa alvo estiver coberta pelo muco (isto é, na ausência de tratamento mucolítico ou separação do muco), pode servir como uma ligação de conexão ao epitelio mucosal subjacente. Portanto, o térmo "bioadesivo" como se usa aqui, também cobre os compostos mucoadesivos úteis para melhorar a administração mucosal de agentes biologicamente ativos dentro da invenção.

Não obstante, o contacto adesivo ao tecido mucosal mediado através da adesão a uma capa de gel mucosa, pode ser limitado por união incompleta ou temporal entre a capa do muco e o tecido subyacente, particularmente em superfícies nasais em donde ocurre a separação rápida do muco. Neste sentido, as glicoproteínas de mucina são continuamente secretadas e, inmediatamente depois, são liberadas de células ou glândulas, formando um gel viscoelástico. A superfície luminal da capa de gel adherente, não obstante, é continuamente erosionada por ação mecânica, enzimática e/ou ciliar. Em donde tais actividades são mais prominentes ou em donde são desejados tempos dadhesión prolongados, os métodos da administração coordinados e métodos de formulação combinatorias da invenção, podem além disso, incorporar métodos mucolíticos e/ou ciliostáticos ou agentes como se descreve aqui anteriormente.

Tipicamente, os polímeros mucoadesivos para uso dentro da invenção são macromoléculas naturais ou sintéticas as quais se aderem às superfícies de tecido mucosal húmedo por mecanismos complexos, mas não específicos. Além disso destes polímeros mucoadesivos, a invenção também proporciona métodos e composições que incorporam bioadesivos que se aderem directamente a uma superfície celular, em lugar do muco, por meio de interações específicas que incluem, mediadas pelo receptor. Um exemplo de bioadesivos que funcionam em esta maneira específica, é o grupo de compostos conhecidos como lectinas. Estas são glicoproteínas com uma capacidade para reconocer especificamente e ligar-se a moléculas de açúcar, por exemplo, glicoproteínas ou glicolípidos, os quais formam parte das membranas de células epiteliais intranasais e podem ser considerados como "receptores de lectina".

Em certas aspectos da invenção, materiais bioadesivos para intensificar a administração intranasal de agentes biologicamente ativos compreendem, uma matriz de um polímero hidrofílico, por exemplo, solúvel em água ou expansível, ou uma mistura de polímeros que podem adherirse a uma superfície mucosa húmida. Estes adesivos podem ser formulados como ungüentos, hidrogeles (ver anteriormente), películas gástricas, e outras formas de aplicação. Muitas vezes, estes adesivos têm o agente biologicamente ativo misturado junto com este para efectuar libertação lenta ou administração local do agente ativo. Alguns são formulados com ingredientes adicionais para facilitar a penetração do agente ativo através da mucosa nasal, por exemplo, no sistema circulatório do indivíduo.

Vários polímeros, tanto naturais como sintéticos, mostram ligação significante ao muco e/ou superfícies epiteliais mucosais baixo condições fisiológicas. A fuerza desta interacción pode ser facilmente medida por desprendimiento mecânico ou testes de corte. Quando se aplica a uma superfície mucosal húmida, muitos materiais secos espontaneamente se adherirán, ao menos ligeiramente. Depois de tal contacto inicial, alguns materiais hidrofílicos começam a atrair água por absorção, expansão ou forças capilares e se esta água é absorvida do substrato subjacente ou da interface de polímero-tecido, a adesão pode ser suficiente para conseguir a meta de melhorar a absorção da mucosa por agentes biologicamente ativos. Tal "adesão por hidratação", pode ser quase forte, mas as formulações adaptadas para empregar este mecanismo, devem considerar expansão, a qual continua conforme a dosagem se transforma num muscílago hidratado. Isto é projectado para muitos hidrocoloides úteis com a invenção, especialmente alguns derivados de celulose, os quais são em geral, no adesivos quando se aplican no estado pré-hidratado. Não obstante, os sistemas de administração de fármaco bioadesivos para administração epitelial são efetivos dentro da invenção, quando tais materiais são aplicados na forma de um pó seco polimérico, microesfera, ou forma de administração tipo película.

Outros polímeros se aderem às superfícies epiteliais no solamente quando são aplicados em seco, sino também em estado completamente hidratado, e na presença de quantidades em exceso dágua. A seleção de um mucoadesivo deste modo, requer consideração devido às condições fisiológicas assim como também fisicoquímicas, sob as quais o contacto com o tecido será formado e mantido. Em particular, a quantidade de água ou humidade, usualmente presente no sítio propuesto de adesão, e o pH prevalente, são conhecidas por afectar amplamente a intensidade de ligação mucoadesiva de diferentes polímeros.

Vários sistemas de administração de fármaco bioadesivo polimérico foram fabricados e estudados nos últimos 20 anos, nem sempre com êxito. Uma variedade de tais portadores são, não obstante, actualmente usados em aplicações clínicas que encapsulam usos dentais, ortopédicos, oftalmológicos e cirúrgicos. Por exemplo, hidrogeles de base acrílica, foram usados extensivamente por dispositivos bioadesivos. Os hidrogeles de base acrílica, são bem estudiados para bioadesão devido a sua flexibilidade e características no abrasivas no estado particularmente expandidlo, o qual reduz abrasão que causa danos nos tecidos em contacto. Além disso, su alta permeabilidad no estado hinchado permite ao monómero sem reagir, cadeias poliméricas no reticuladas e ao iniciador, ser enxaguados da matriz depois da polimerização, o qual é uma característica importante para selección de materiais bioadesivos para uso com a invenção. Dispositivos poliméricos de base acrílica exibem intensidad de ligação adesivo muy fuerte. Para administração epitelial controlado de fármacos de peptídeo e proteína, os métodos e composições da invenção, opcionalmente incluem uso de portadores, por exemplo, veículos de administração polimérico, que funcionam em parte, para proteger o agente biologicamente ativo do rompimento proteolítico, assim como ao mesmo tempo, proporcionam penetração intensificada do peptídeo ou proteína em ou através da mucosa nasal. Neste contexto, os polímeros bioadesivos têm demonstrado potencial considerable para intensificar a administração de fármaco oral. Como um exemplo, a biodisponibilidade de 9-desglicinamida, 8- arginina vasopresina (DGAVP), intraduodenalmente administrada à ratazanas, junto com 1% (p/p) de dispersão salina do derivado de poli(ácido acrílico) mucoadesivo policarbof ilo, é 3-5 vezes aumentada comparada com uma solução aquosa do fármaco de peptídeo neste polímero. Os polímeros mucoadesivos do tipo poli(ácido acrílico) , são potentes inibidores de algumas proteases intestinais. 0 mecanismo de inibição da enzima é explicado pela forte afinidade desta classe de polímeros por catiões divalentes, tais como cálcio ou zinco, os quais são cofactores essenciais de metaloproteinases, tais como tripsina e quimiotripsina. A privação das proteases dos seus cofactores por poli(ácido acrílico), é reportada por induzir mudanças estruturais irreversíveis das proteínas enzimáticas, as quais são acompanhadas por uma perda da actividade enzimática. Ao mesmo tempo, outros polímeros mucoadesivos (por exemplo, alguns derivados de celulose e quitosan) , podem não inibir as enzimas proteolíticas sob certas condições. Contrariamente a outros inibidores enzimáticos contemplados para uso dentro da invenção (por exemplo, aprotinina; bestatina), os quais são moléculas relativamente pequenas, a absorção transnasal de polímeros inibidores é provavelmente mínima em vista do tamanho destas moléculas, e com ele, eliminam os efeitos secundários adversos possíveis. Deste modo, os polímeros mucoadesivos, particularmente do tipo poli(ácido acrílico), podem servir tanto como um adesivo que promove a adesão como um agente protector de enzima para intensificar a administração controlada de peptídeo e fármacos de proteína, especialmente quando são considerados interesses de segurança.

Além da proteção contra a degradação enzimática, bioadesivos e outros agentes que promoved a absorção, não poliméricos e poliméricos para uso com a invenção, podem incrementar diretamante a permeabilidade epitelial agentes biologicamente ativos. Para facilitar o transporte de moléculas hidrofílicas e grandes, tais como peptídeos e proteínas, através da barreira epitelial nasal, polímeros mucoadesivos e outros agentes, foram postulados para proporcionar efeitos de permeação intensificados mais além do que se considera pelo tempo de residência pré-mucosal prolongado do sistema de administração. 0 curso de tempo das concentrações de plasma de fármaco segundo se informa, sugere que as microesferas bioadesivas causam um aumento agudo, mas temporal, de permeabilidade da insulina através da mucosa nasal. Outros polímeros mucoadesivos para uso com a invenção, por exemplo, quitosan, segundo se informa, intensificam a permeabilidade de certos epitélios mucosais quando são aplicados como uma solução aquosa ou gel. Outro polímero mucoadesivo reportado por afectar directamente a permeabilidade epitelial é o ácido hialurônico e derivados de éster do mesmo. Um agente bioadesivo particularmente útil com a administração coordenada e/ou métodos de formulação combinatorial e composições da invenção é quitosan, assim como também os seus análogos e derivados. O quitosan é um polímero não tóxico, biocompatível e biodegradável que é amplamente usado para aplicações médicas e farmacêuticas devido às suas propriedades favoráveis de baixa toxicidade e boa compatibilidade. É um poliaminosacárido natural preparado de quitina por N-desacilação com álcali. Como se usa dentro dos métodos e composições da invenção, o quitosan incrementa a retenção de GRP, análogos e miméticos e outros agentes biologicamente ativos descritos aqui, num sítio mucosal de aplicação. Este modo da administração também pode melhorar o acatamento e aceitação do paciente. Como se proporciona além disso aqui, os métodos e composições da invenção opcionalmente incluirão um novo derivado de quitosan ou forma quimicamente modificada de quitosan. Um dos tais novos derivados para uso com a invenção, se denota como um polímero β- [1—>4]-2-guanidino-2-desoxi-D-glucose (poli-GuD) . O quitosan é o produto N-desacilado de quitina, um polímero que se origina naturalmente que foi usado extensivamente para preparar microesferas para formulações orais e intranasais. O polímero de quitosan também foi proposto como um portador solúvel para administração de fármaco parenteral. Dentro de um aspecto da invenção, a ou- metilisourea é usada para converter uma amina quitosan na sua porção de guanidino. O composto guanidino é preparado, por exemplo, pela reação entre soluções quase normais de quitosan e ou-metilisourea de pH acima de 8.0.

Compostos adicionais classificados como agentes bioadesivos para uso com a presente invenção, atuam mediando interações específicas, tipicamente clasifiçadas como "interações de ligando-receptor", entre as estruturas complementares do composto bioadesivo e um componente da superfície epitelial mucosal. Muitos exemplos naturais ilustram esta forma de bioadesão de ligação específica, como se exemplifica por interações de lectina-açúcar. As lectinas são (glico)proteínas de origem não imune, as quais se ligam a polissacáridos ou glicoconjugados.

Varias lectinas de plantas foram investigadas como agentes farmacêuticos que promovem a absorção possíveis. Uma lectina de planta, hemaglutinina de Phaseolus vulgaris (PHA), exibe alta biodisponibilidade oral de mais de 10% depois da alimentação em ratazanas. A lectina de tomate Lycopersicon esculentum) (TL), parece segura por vários modos da administração.

Em resumo, os agentes bioadesivos mencionados anteriormente, são empregues nas formulações combinatoriais e métodos da administração coordenada da presente invenção, os quais opcionalmente incorporam uma quantidade efetiva e formam um agente bioadesivo para prolongar a persistência ou de outro modo aumentam a absorção epitelial de um ou mais GRP, análogos e miméticos, e outros agentes biologicamente ativos. Os agentes bioadesivos podem ser coordenadamente administrados como compostos adjuntos ou como aditivos dentro das formulações combinatoriais da invenção. Em certas modalidades, o agente bioativo atua como um "pegamento farmacêutico", assim como em outras modalidades, a administração adjunta ou formulação combinatorial do agente bioadesivo serve para intensificar o contacto do agente biologicamente ativo com a mucosa nasal, em alguns casos promovendo as interações específicas ligando-receptor com "receptores" de células epiteliais e em outros aumentando a permeabilidade epitelial para incrementar significativamente o gradiente de concentração do fármaco medido num sítio alvo de administração (por exemplo, fígado, plasma do sangue, ou tecido do CNS ou fluido). Alguns agentes bioadesivos adicionais para uso com a invenção, atuam como inibidores de enzima (por exemplo protease), para melhorar a estabilidade de agentes bioterapêuticos mucosalmente administrados, administrados coordenadamente ou em formulação combinatorial com o agente bioadesivo.

Lipossomas e Veículos de Administração Micelar

Os métodos da administração coordenada e formulações combinatoriais da presente invenção, opcionalmente incorporam portadores com base de ácidos gordos ou lípidos efetivos, agentes de processamento, ou veículos de administração, para proporcionar formulações melhoradas para a administração epitelial de GRP, análogos e miméticos e outros agentes biologicamente ativos. Por exemplo, uma variedade de formulações e métodos são proporcionados para a administração mucosal, o qual compreende um ou mais destes agentes ativos, tais como peptídeo ou proteína, misturados ou encapsulados por, ou coordenadamente administrados com um lipossoma, portador micelar misturado ou emulsão, para melhorar a estabilidade química e física e incrementar a vida média dos agentes biologicamente ativos (por exemplo, reduzindo a susceptibilidade a proteólise, modificação química e/ou desnaturalização) depois da administração mucosal.

Dentro de certos aspectos da invenção, os sistemas de administração especializados para agentes biologicamente ativos, compreendem vesículas lipidas pequenas conhecidas como lipossomas. Estas são tipicamente elaboradas de moléculas lipidas neutras, biodegradáveis, não tóxicas e não imunogênicas, e podem eficientemente, prender ou ligar moléculas de fármacos, que incluem peptídeos e proteínas, em ou sobre as suas membranas. A capacidade atractiva de lipossomas como um sistema de administração de peptídeo e proteína dentro da invenção, é aumentada pelo feito de que as proteínas encapsuladas podem permanecer no seu ambiente aquoso preferido dentro das vesículas, assim como a membrana liposomal as protege contra a proteólise e outros fatores desestabilizantes. No entanto ainda nem todos os métodos de preparação de lipossomas conhecidos são efetuáveis na encapsulação de peptídeos e proteínas devido às suas propriedades físicas e químicas únicas, vários métodos permitem a encapsulação destas macromoléculas sem desativação substancial.

Uma variedade de métodos estão disponíveis para preparar lipossomas para uso com a invenção, Patentes E.U.A N°s 4,235,871, 4,501,728, e 4,837,028. Para uso com a administração de lipossoma, o agente biologicamente ativo é tipicamente preso dentro do liposoma, vesícula lípida ou está unido ao exterior da vesícula.

Como os lipossomas, ácidos gordos de cadeia longa insaturados, os quais também têm actividade intensificada para absorção mucosal, podem formar vesículas com estruturas similares a bicapas (assim chamadas "ufassomas"). Estas podem ser formadas por exemplo, usando ácido oleico para prender peptídeos e proteínas biologicamente ativos para administração intranasal por exemplo, mucosal com a invenção.

Outros sistemas de administração para uso com a invenção, combinan o uso de polímeros e liposomas para aliar as propriedades vantajosas de ambos veículos tais como encapsulação, dentro da fibrina de polímero natural. Além disso, a libertação de compostos bioterapêuticos deste sistema de administração é controlável do uso de reticulação covalente e adição de agentes antifibrinolíticos ao polímero de fibrina.

Os sistemas de administração mais simplificados para uso dentro da invenção, incluem o uso de lípidos catiónicos como veículos ou portadores de administração, os quais podem ser efetivamente empregues para proporcionar uma interação electrostática entre o portador lípido e tais agentes biologicamente ativos carregados como proteínas e ácidos nucleicos polianiônicos. Isto permite o empacotamento eficiente dos fármacos numa forma adequada para administração mucosal e/ou subsequente administração a compartimentos sistêmicos.

Os veículos de administração adicional para uso com a invenção incluem, ácidos gordos de cadeia média e longa, assim como também micelos misturados de tensoativos com ácidos gordos. A maioria dos lípidos que se originam naturalmente na forma de ésteres, têm implicações importantes com respeito ao seu próprio transporte através das superfícies mucosais. Os ácidos gordos livres e seus monoglicêridos os quais têm grupos polares unidos, foram demonstrados na forma de micelos misturados para actuar na barreira intestinal, como intensificadores da penetração. Esta descoberta de função modificante de barreira de ácidos gordos livres (ácidos carboxílicos com uma longitude de cadeia que varia desde 12 até 2 0 átomos de carbono) e seus derivados polares, tem investigação extensiva estimulada sobre aplicação destes agentes como intensificadores da absorção mucosal.

Para uso com os métodos da invenção, os ácidos gordos de cadeia longa, especialmente lípidos fusogênicos (ácidos gordos insaturados e monoglicéridos tais como ácido oleico, ácido linoleico, ácido linoleico, monooleína, etc.), proporcionam portadores úteis para intensificar a administração mucosal de GRP, análogos e miméticos e outros agentes biologicamente ativos descritos aqui. Os ácidos gordos de cadeia média (C6 a C12) e monoglicéridos, também foram mostrados por ter actividade intensificante na absorção de fármaco intestinal, e podem ser adaptados para uso com as formulações de administração mucosal e métodos da invenção. Além disso, os sais sódicos de ácidos gordos de cadeia longa e média, são veículos de administração efetivos e agentes que intensificam a absorção para administração epitelial de agentes biologicamente ativos com a invenção.

Deste modo, podem ser empregues ácidos gordos em formas solúveis de sais sódicas ou pela adição de tensoativos não tóxicos, por exemplo, óleo de ricino hidrogenado polioxietilado, taurocolato sódico, etc. Outras preparações micelares misturadas e ácido gordo que são empregues com a invenção incluem, mas não se limitam a, caprilato de Na (C8), caprato de Na (CIO) , laurato de Na (C12) , u oleato de Na(C18), opcionalmente combinada com sais biliares, tais como glicocolato e taurocolato.

Peguilação

Métodos adicionais e composições proporcionadas com a invenção envolvem modificação química de peptídeos e proteínas biologicamente activas por união covalente de materiais poliméricos,por exemplo, dextranos, polivinilpirrolidonas, glicopeptídeos, polietilenoglicol e poliaminoácidos. Os peptídeos e proteínas conjugados resultantes, retêm as suas actividades biológicas e solubilidade para administração epitelial. Em modalidades alternas, GRP, análogos e miméticos e outros peptídeos e proteínas biologicamente ativos, são conjugados a polímeros de polialquilenóxido, particularmente polietilenglicõis (PEG). Patente E.U.AN0. 4,179,337.

Os polímeros PEG amino-reagentes para uso com a invenção incluem, SC-PEG com massas moleculares de 2 000, 5000, 10000, 12000, e 20 000; U-PEG-10000; NHS-PEG-3400- biotin; T-PEG-5000; T-PEG-12000; e TPC-PEG-5000. A PEGilação de peptídeos e proteínas biologicamente ativos se pode conseguir por modificação de sítios carboxilo (por exemplo, grupos de ácido aspártico ou ácido glutámico além do terminalo carboxilo) . Foi descrita a utilidade da PEG- hidrazida em modificação selectiva de grupos carboxilo de proteína activada por carbodiimida sob condições acídicas. Alternativamente, a modificação PEG bifuncional de peptídeos e proteínas biologicamente activas, pode ser empregue. Em alguns procedimentos, os resíduos de aminoácido carregados, que incluem lisina, ácido aspártico e ácido glutámico, têm uma tendência marcada para ser acessíveis ao solvente em superfícies de proteínas.

Outras Modificações Estabilizantes de Agentes Ativos Além da PEGilação, agentes biologicamente ativos tais como peptídeos e proteínas para uso com a invenção, podem ser modificados para melhorar a vida média de circulação protegendo o agente ativo via conjugação a outros compostos estabilizantes ou protectores conhecidos, por exemplo, pela criação de proteínas de fusão com um peptídeo, ativo, proteína, análogo ou mimético, ligado a uma ou mais proteínas portadoras, tais como uma ou mais cadeias de imunoglobulina.

Formulação, Preparação, Fabricação e Administração

As formulações de administração epitelial da presente invenção compreendem GRP, análogos e miméticos, tipicamente combinados junto com um ou mais portadores farmaceuticamente aceitáveis e, opcionalmente, outros ingredientes terapêuticos. Os portadores devem ser "farmaceuticamente aceitáveis", no sentido de ser compatíveis com os outros ingredientes da formulação e não provocar um efeito eliminador inaceitável no sujeito. Tais portadores são descritos aqui anteriormente ou são de outro modo, bem conhecidos por aqueles peritos na técnica de farmacologia. De maneira desejável, a formulação não deve incluir substâncias tais como enzimas ou agentes oxidantes com os quais o agente biologicamente ativo a ser administrado se conhece por ser incompatível. As formulações podem ser preparadas por quaisquer dos métodos bem conhecidos na técnica de farmácia.

Com as composições e métodos da invenção, o GRP, análogos e miméticos e outros agentes biologicamente ativos descritos aqui, podem ser administrados a sujeitos por uma variedade de modos da administração mucosais, que incluem, administração oral, rectal, vaginal, intranasal, intrapulmonar, ou transdérmica, ou por administração tópica nos olhos, ouvidos, pele ou outras superfícies mucosais. As composições e métodos da invenção também incluem modos da administração dérmicos. Opcionalmente, GRP, análogos e miméticos e outros agentes biologicamente ativos descritos aqui, podem ser coordenadamente e adjuntivamente administrados por vias no mucosais, que incluem emplastros dérmicos, preparações tópicas aplicadas à pele, vias intramuscular, subcutânea, intravenosa, intra-atrial, intra- articular, intraperitoneal ou parenteral. Em outras modalidades alternativas, os agentes biologicamente ativos podem ser administrados ex vivo por exposição directa a células, tecidos ou órgãos que se originam de um sujeito mamífero, por exemplo, como um componente de uma formulação de tratamento de órgão ou tecido ex vivo, que contém o agente biologicamente ativo num portador líquido ou sólido adequado.

As composições em conformidade com a presente invenção, são muitas vezes administradas numa solução aquosa como um atomizador pulmonar ou nasal e podem ser dispensadas em forma de aspersão por uma variedade de métodos conhecidos por aqueles peritos na técnica. Sistemas preferidos para dispensar líquidos como um atomizador nasal descrevem-se na Patente E.U.A N0 4,511,069. As formulações podem ser apresentadas em contentores de dose múltiplos, por exemplo, no sistema de dispensa selada descrito na Patente E.U.A N0 4,511,069. As formas de administração em aerossol adicionais podem incluir, por exemplo, nebulizadores de ar comprimido, de jacto e eléctricos, nos quais a administração do agente biologicamente ativo dissolvido ou suspenso num solvente farmacêutico, por exemplo, água, etanol ou uma mistura dos mesmos.

As soluções atomizadoras pulmonares e nasais da presente invenção, tipicamente compreendem o fármaco ou fármaco a ser administrado, opcionalmente formulado com um agente ativo da superfície, tal como um tensoativo no iónico (por exemplo, polisorbato 80), e um ou mais amortecedores. Em algumas modalidades da presente invenção, a solução atomizadora nasal além disso compreende um propulsor. O pH da solução atomizadora nasal é opcionalmente entre aproximadamente pH 2.0 e 8, pref erivelmente 4.5 + 0.5. Os amortecedores adequados para uso com estas composições são como se descrevem anteriormente ou de outro modo, conhecidos na técnica. Outros componentes podem ser agregados para melhorar ou manter a estabilidade química, que incluem conservantes, tensoativos, dispersantes ou gases. Os conservantes adequados incluem, mas não se limitam a, fenol, metilparabeno, parabeno, m-cresol, tiomersal, clorobutanol, cloreto de benzalcónio, benzoato de sódio, etanol, feniletil éter, álcool benzílico e similares. Tensoativos adequados incluem, mas não se limitam a, ácido oleico, trioletato de sorbitan, polisorbatos, lecitina, fosfatidil colinas e vários diglicéridos e fosfolípidos de cadeia longa.

Dispersantes adequados incluem mas não se limitam a, ácido etilendiaminatetraacético e similares. Os gases adequados incluem mas não se limitam a, nitrógeno, hélio, clorofluorocarbonos (CFC), hidrofluorocarbonos (HFC), dióxido de carbono, ar e similares.

Com modalidades alternas, as formulações mucosais são administradas como formulações em pó seco que compreendem o agente biologicamente ativo numa forma seca, usualmente liofilizada de um tamanho de partícula adequado, ou com um intervalo de tamanho de partícula adequado. Os tamanhos de partícula mínimos adequados para deposição com as pasagens pulmonares ou nasais, são muitas vezes, de aproximadamente 0.5 μ de massa mediana equivalente ao diâmetro aerodinâmico (MMEAD), comumente aproximadamente 1 μ MMEAD, e mais tipicamente aproximadamente 2 μ MMEAD. 0 tamanho de partícula máximo adequado para deposição com os passagens nasais é muitas vezes aproximadamente 10 μ MMEAD, comumente aproximadamente 8 μ MMEAD, e mais tipicamente aproximadamente 4 μ MMEAD. Os pós intranasalmente respiráveis com estes tamanhos de partícula, podem ser produzidos por uma variedade de técnicas convencionais, tais como movido por pulverização, secagem por aspersão, precipitação de solvente, condensação de fluido supercrítico e similares. Estes pós secos de MMEAD adequado podem ser administrados a um paciente via um inalador em pó seco convencional (DPI); o qual depende da respiração do paciente, da inalação pulmonar ou nasal, para dispersar o pó numa quantidade aerossolizada. Alternativamente, o pó seco pode ser administrado via dispositivos asistidos por ar que usam uma fonte de energia externa para dispersar o pó numa quantidade aerosolizada, por exemplo, uma bomba de pistão.

Os dispositivos em pó seco, tipicamente requerem uma massa em pó no intervalo desde aproximadamente 1 mg até 20 mg, para produzir uma dose aerosolizada única ("nube"). Se a dose desejada ou requerida do agente biologicamente ativo é inferior que esta quantidade, o agente ativo em pó tipicamente se combinará com um pó em volume seco farmacêutico para proporcionar a massa em pó total requerida. Os pós secos volumosos preferidos incluem, sacarose, lactose, dextrose, manitol, glicina, trehalose, albumina do soro humano (HSA) e amido. Outros pós secos volumosos adequados incluem, celobiose, dextranos, maltotriose, pectina, citrato de sódio, ascorbato de sódio e similares.

Para formular composições para administração epitelial com a presente invenção, o agente biologicamente ativo pode ser combinado com vários aditivos farmacêuticamente aceitáveis, assim como também como uma base ou portador para dispersão dos agentes ativos. Aditivos desejados incluem, mas não se limitam a, agentes de controlo de pH, tais como arginina, hidróxido de sódio, glicina, ácido clorídrico, ácido cítrico, ácido acético, etc. Além disso, anestésicos locais (por exemplo, álcool benzílico), agentes isotonizantes (por exemplo, cloreto de sódio, manitol, sorbitol) , inibidores da absorção (por exemplo, Tween 80) , agentes intensificadores da solubilidade (por exemplo, ciclodextrinas e derivados dos mesmos), estabilizadores (por exemplo, albumina do soro) e agentes de redução (por exemplo, glutationa) , podem ser incluidos. Quando a composição para administração epitelial é um líquido, a tonicidade da formulação, medida com referência à tonicidade de 0.9% (p/v) da solução salina fisiológica tomada como unidade, é tipicamente ajustada um valor no qual não se induzirá dano de tecido irreversível substancial na mucosa nasal, ao sítio da administração. Em geral, a tonicidade da solução é ajustada a um valor de aproximadamente 1/3 a 3, mais tipicamente 1/2 a 2, e muito mais vezes 3/4 a 1.7.

O agente biologicamente ativo pode ser dispersado numa base ou veículo, o qual pode compreender um composto hidrofílico que tem uma capacidade para dispersar o agente ativo e qualquer dos aditivos desejados. Esta base pode ser seleccionada de um amplo intervalo de portadores adequados, que incluem mas não se limitam a, copolímeros de ácidos policarboxílicos ou sais dos mesmos, anídridos carboxílicos (por exemplo, anidrido maleico) com outros monómeros (por exemplo, metil(met)acrilato, ácido acrílico, etc.), polímeros vinílico hidrofóbico tais como polivinilacetato, álcool polivinílico, polivinilpirrolidona, derivados de celulose tais como hidroximetilcelulose, hidroxipropilcelulose, etc., e polímeros natural tais como quitosan, colágeno, algunato de sódio, gelatina, ácido hialurônico e sais metálicos não tóxicos dos mesmos. Muitas vezes, um polímero biodegradável se selecciona como uma base ou portador, por exemplo, ácido poliláctico, copolímero poli(ácido láctico-ácido glicólico), ácido polihidroxibutírico, copolímeros de poli(ácido hidroxibutírico-ácido glicólico) e misturas dos mesmos. Alternativamente ou adicionalmente, ésteres de ácidos gordos sintéticos tais como ésteres de ácidos gordos de poliglicerina, éteres de ácido gordo de sacarose, etc., podem ser empregues como portadores. Os polímeros hidrofílicos e outros portadores podem ser usados sozinhos ou em combinação, e a integridade estrutural melhorada, podem ser imputados ao portador por cristalização parcial, ligação iónica, reticulação e similares. 0 portador pode ser proporcionado numa variedade de formas, que incluem, soluções viscosas ou fluidos, geles, pastas, pós, microesferas e películas para aplicação directa na mucosa nasal. 0 uso de um portador seleccionado neste contexto, pode resultar em promoção da absorção do agente biologicamente ativo.

0 agente biologicamente ativo pode ser combinado com base ou portador em conformidade com uma variedade de métodos, e a libertação do agente ativo pode ser por difusão, desintegração do portador ou formulação associada de canais de água. Em algumas circunstâncias, o agente ativo é dispersado em microcápsulas (microesferas) ou nanocápsulas (nanoes feras) preparadas de um polímero adequado, por exemplo, 2-cianoacrilato de isobutilo e dispersado num meio de dispersão biocompatível aplicado à mucosa nasal, o qual proporciona administração prolongada e actividade biológica sobre um tempo prolongado.

Para melhorar além disso a administração, epitelial de agentes farmacêuticos com a invenção, formulações que compreendem o agente ativo também podem conter um composto de baixo peso molecular hidrofílico como uma base ou excipiente. Tais compostos de baixo peso molecular hidrofílicos proporcionam um meio de passagem através do qual um agente ativo solúvel em água, tal como um peptídeo ou proteína fisiologicamente ativo, pode difundir-se através da base à superfície corporal onde o agente ativo é absorvido. O composto hidrofílico de baixo peso molecular, opcionalmente absorve humidade da mucosa ou atmosfera da administração e dissove o peptídeo ativo solúvel em água. O peso molecular do composto hidrofílico de baixo peso molecular é em geral, não mais de 10000 e preferivelmente não mais de 3000. 0 composto hidrofílico de baixo peso molecular exemplar inclui, os compostos de poliol, tais como oligo, di e monosacáridos tais como sacarose, manitol, sorbitol, lactose, L-arabinose, D-eritrosa, D-ribosa, D- xilosa, D-manosa, trehalosa, D-galactose, lactulosa, celobiosa, gentibiosa, glicerina e polietilenoglicol. Outros exemplos de compostos hidrofílicos de baixo peso molecular empregues como portadores dentro da invenção incluem, N- metilpirrolidona, e alcoholes (por exemplo, oligonivilalcohol, etanol, etilenglicol, propilenglicol, etc.). Estes compostos hidrofílicos de baixo peso molecular podem ser usados solos ou em combinação entre sí ou com outros componentes ativos ou inativos da formulação intranasal.

As composições da invenção podem alternativamente conter como portadores farmaceuticamente aceitáveis, substâncias requeridas a condições fisiológicas aproximadas, tais como agentes amortecedores e que ajustam o pH, agentes que ajustam a tonicidade, agentes humidificadores e similares, por exemplo, acetato de sódio, lactato de sódio, cloreto de sódio, cloreto de potássio, cloreto de cálcio, monolaurato de sorbitán, oleato de trietanolamina, etc. Para composições sólidas, os portadores não tóxicos convencionais farmacêuticamente aceitáveis podem ser usados, os quais incluem por exemplo, grados farmacêuticos de manitol, lactose, almidón, estearato de magnésio, sacarina de sódio, talco, celulose, glucose, sacarose, carbonato de magnésio e similares. As composições terapêuticas para administrar o agente biologicamente ativo podem também ser formuladas como uma solução, microemulsão ou outra estrutura ordem adequada para alta concentração de ingredientes ativos. O portador pode ser um solvente ou meio de dispersão que contém por exemplo, água, etanol, poliol (por exemplo, glicerol, propilenglicol, e polietilenoglicol líquido e similares), e misturas adequadas dos mesmos. A fluidez adequada para soluções se pode manter por exemplo, pelo uso de um revestimento tal como lecitina, pelo mantenimiento de um tamanho de partícula desejado no caso de formulações dispersíveis, e pelo uso de tensoativos. Em muitos casos, será desejável incluir agentes isotónicos por exemplo, açúcares, polialcoholes tais como manitol, sorbitol ou cloreto de sódio na composição. A absorção prolongada do agente biologicamente ativo pode ser levada aproximadamente incluindo na composição um agente, o qual retarda a absorção, por exemplo, sais de monoesterato e gelatina.

Em certas modalidades da invenção, o agente biologicamente ativo administrado é uma formulação de libertação com o tempo, por exemplo, numa composição a qual inclui um polímero de libertação lenta. O agente ativo pode ser preparado com portadores que protegerão contra a libertação rápida, por exemplo, um veículo de libertação controlada tal como polímero, sistema de administração microencapsulado ou gel bioadesivo. A administração prolongada do agente ativo, em varias composições da invenção, pode ser levada aproximadamente incluindo na composição, agentes que retardam a absorção, por exemplo, hidrogeles de monoesterato de alumínio e gelatina.

Quando as formulações de libertação controlada do agente biologicamente ativo são desejadas, os aglutinantes de libertação controlada adequados para uso de conformidade com a invenção incluem, qualquer material de libertação controlada biocompatível o qual é inserido no agente ativo e o qual é capaz de incorporar o agente biologicamente ativo.

Numerosos tais materiais conhecem-se na técnica. Os aglutinantes de libertação controlada úteis são materiais que são metabolizados lentamente sob condições fisiológicas depois da sua administração intranasal (por exemplo, na superfície mucosal nasal, ou na presença de fluidos corporais depois da administração transmucosal). Os aglutinantes adequados incluem mas não se limitam a polímeros biocompatíveis e copolímeros previamente usados na técnica em formulações de libertação prolongada. Tais compostos biocompatíveis são não tóxicos e inertes a tecidos circundantes, e não activan efeitos secundários adversos significantes tais como irritação nasal, resposta inmune, inflamação ou similares. São metabolizados em produtos metabólicos que são também biocompatíveis e facilmente eliminados do corpo.

Materiais poliméricos exemplares para uso neste contexto incluem, mas não se limitam a, matrizes poliméricas derivadas de poliésteres copoliméricos e homopoliméricos que têm ligações éster hidrolizáveis. Um número destes conhecem-se na técnica por ser biodegradáveis e conduzir a produtos de degradação que não têm toxicidad ou têm baixa. Polímeros exemplares incluem ácidos poliglicólicos (PGA) e ácidos polilácticos (PLA), poli(DL- ácido láctico-co-ácido glicólico) (DLPLA) , poli (D-ácido láctico-ácido coglicólico)(D PLGA) e poli(L-ácido láctico- co-ácido glicólico) (L PLGA) . Outros polímeros biodegradáveis ou bioerosíveis úteis incluem mas não se limitam a, tais polímeros como poli(épsilon-caprolactona), poli(épsilon- aprolactona-CO-ácido láctico) , poli (a-aprolactona-CO-ácido glicólico), poli(beta-ácido hidroxi butírico), poli(alquil- 2-cianoacrilato), hidrogeles tais como poli(hidroxietil metacrilato), poliamidas, poli(amino ácidos) (isto é, L- leucina, ácido glutámico, ácido L-aspártico e similares), poli(éster urea), poli(2-hidroxietil DL-aspartamida), polímeros de poliacetal, poliortoésteres, policarbonato, polimaleamidas, polisacáridos e copolímeros dos mesmos. Muitos métodos para preparar tais formulações são em geral, conhecidos por aqueles peritos na técnica. Outras formulações úteis incluem composições de libertação controlada, por exemplo, microcápsulas, Patentes E.U.A. Nos. 4,652,441 e 4,917,893, copolímeros de ácido láctico-ácido glicólico empregues na elaboração de microcápsulas e outras formulações, Patentes E.U.A. Nos. 4,677,191 e 4,728,721, e composições de libertação prolongada para peptídeos solúveis em água, Patente Estadounidense No. 4,675,189.

O processo de fabricação de produto atomizador nasal em geral, inclui a preparação de um diluente para atomizador nasal GRP, o qual inclui 85% de água mais os componentes da formulação atomizadora nasal sem GRP. O pH do diluente é então medido e ajustado ao pH da formulação desejada com hidróxido de sódio ou ácido clorídrico se é necessário. A água é usada para conseguir o volume alvo final do diluente. O atomizador nasal GRP é preparado pela transferência não aséptica de ~85% do volume alvo final do diluente a uma garrafa tapada com rosca. Uma quantidade adequada de GRP agrega-se e mistura-se que se dissolve completamente. O pH é medido e ajustado ao pH de formulação desejada com hidróxido de sódio ou ácido clorídrico, se é necessário. Uma quantidade suficiente de diluente se agrega para alcançar o volume alvo final. As garrafas tapadas com rosca são cheias e fixas com tampas. A descrição anterior do processo de fabricação representa um método usado para preparar os lotes clínicos iniciais do produto de fármaco. Este método pode ser modificado durante o processo de desenvolvimento para optimizar o processo de fabricação.

O GRP actualmente comercializado requer condições de fabricação estéreis para cumprimento com as regulações da FDA. A administração parenteral que inclui GRP para injeção ou infusão, requer um processo de fabricação estéril (aséptico). As Boas Prácticas de Fabricação Actual (GMP) para fabricação de fármaco estéril incluem padrões para características de construção e esboço (21 C.F.R. § 211.42 (Abril 1, 2005)); padrões para avaliar e aprovar ou rejeitar componentes, recipientes de produto de fármaco e tampas (§ 211.84)); padrões para o controlo de contaminação microbiolõgica (§ 211.113); e outros requisitos de teste especiais (§ 211.167). Produtos no parenterales (no asépticos), tais como o produto intranasal da invenção, não requerem estas condiicones de fabricação estéril especializadas. Como se pode apreciar facilmente, os requisitos para um processo de fabricação estéril são substancialmente superiores e correspondentemente mais dispendiosos que aqueles requeridos para um processo de fabricação de produto não estéril. Estes custos incluem custos de capitalização muito maiores para instalações, assim como também custos de fabricação elevados: instalações adicionais para fabricação estéril incluem, divisões adicionais e ventilação; custos adicionais associados com a fabricação estéril incluem recursos humanos maiores, controlo de qualidade extensivo e garantia de qualidade, e apoio administrativo. Como um resultado, os custos de fabricação de um produto GRP, tal como aquele da invenção, são suficientemente menores que aqueles de um produto GRP parenteralmente administrado. A presente invenção satisfaz a necessidade de um processo de fabricação não estéril para GRP. A invenção inclui um produto de fármaco GRP livre de conservante. Tal formulação não contém um conservante. Na ausência de um excipiente antimicrobiano, a formulação poderia ser cheia sob condições estéreis num dispositivo atomizador nasal livre de conservante, ou incorporado numa preparação de penso dérmico. 0 dispositivo poderia ser capaz de administrar uma dose efetiva sem permitir contaminação da formulação dentro do sistema de administração. Tal produto de fármaco de GRP poderia permitir a dosagem múltipla do mesmo contenedor, com ello, reduzindo grandemente o custo de artigos relativos a um produto de fármaco de uso único. Vantagens de uma formulação de GRP livre de conservante de uso múltipla, são estabilidade melhorada, meios alternativos para prevenção da microbiana, e redução no custo de artigos que permitem ao produto ser mais viável para comercialização.

As soluções estéreis podem ser preparadas incorporando o composto ativo na quantidade requerida num solvente adequado com uma ou outra combinação de ingredientes enumerados anteriormente, conforme se requer, seguido por esterilização filtrada. Em geral, as dispersões são preparadas incorporando o composto ativo num veiculo estéril que contém um meio de dispersão básico e os outros ingredientes requeridos destes enumerados anteriormente. No caso de pós estéreis, os métodos de preparação incluem secagem a vácuo e secagem por congelamiento, o qual proporciona um pó do ingrediente ativo mais qualquer ingrediente adicional desejado de uma solução previamente filtrada estéril do mesmo. A prevenção da ação de microorganismos pode ser realizada por vários agentes antibacterianos e antifúngicos, por exemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, timerosal e similares.

A administração na pele e mucosal, em conformidade com a invenção, permite auto-administração seletiva para o tratamento por pacientes, sempre que suficiente segurança se coloque para controlar e monitorizar as dosagens e efeitos secundários. A administração na pele e mucosal também supera certas desvantagens de outras formas da administração, tais como injeções, que são dolorosas e expõem o paciente a infeções possíveis e podem apresentar problemas de biodisponibilidade de fármaco. Para administração pulmonar e nasal, os sistemas para dispensa controlada de aerossol de líquidos terapêuticos como um atomizador, são bem conhecidos. Numa modalidade, doze medidas de agente ativo são administradas por meio de uma válvula de bomba mecânica especialmente construída, Patente E.U.A No. 4,511,069. Em outra modalidade, o agente inativo é administrado por tecnologia de emplastro dérmico.

Dosagem

Para fins de tratamento e prof ilácticos, os agentes biologicamente ativos descritos aqui, podem ser administrados nos sujeitos numa administração de bolo único, via administração continua (por exemplo, administração transdérmica, mucosal ou intravenosa continua) , sobre um período de tempo prolongado ou num protocolo da administração repetida (por exemplo, por um protocolo de administração repetido a cada hora, diariamente ou semanalmente). Neste contexto, uma dosagem terapeuticamente efetiva de GRP pode incluir dose repetidas dentro de um regime de tratamento ou profilaxia prolongada que proporcionará resultados clinicamente significantes para aliviar um ou mais sintomas ou condições detectáveis associadas com uma doença ou condição alvo, como se expõe anteriormente. A determinação das dosagens efetivas neste contexto, baseia-se tipicamente em estudos de modelos animais seguido por ensaios clínicos humanos e se guia determinando as dosagens efetivas e protocolos da administração que reduzem significativamente a incidência ou severidade de sintomas ou condições de doença alvo no sujeito. Os modelos adequados neste sentido incluem, por exemplo, sujeitos de modelos animais murino, ratazana, porcino, felino, primata não humano e outros aceites, conhecidos na técnica. Alternativamente, as dosagens efetivas podem ser determinadas usando modelos in vitro (por exemplo, ensaios histopatológicos e imunológicos). Usando tais modelos, apenas cálculos e ajustes ordinários são tipicamente requeridos para determinar uma concentração adequada e dose para administrar uma quantidade terapeuticamente efetiva dos agentes biologicamente ativos (por exemplo, quantidades que são intranasalmente efetivas, transdermicamente efetivas, intravenosamente efetivas ou intramuscularmente efetivas para provocar uma resposta desejada).

Numa modalidade alternativa, a invenção proporciona composições e métodos para administração intranasal de GRP, onde os compostos GRP é/são administrados repetidamente através de um regime de dosagem efetivo intranasal que involucra, administrações múltiplas do GRP ao sujeito durante um programa diário ou semanal para manter um nível terapeuticamente efetivo elevado e pulsátil reduzido de GRP durante um período de dosagem prolongado. As composições e métodos proporcionam compostos GRP que são auto-administrados pelo sujeito numa formulação nasal entre uma e seis vezes diariamente para manter um nível terapeuticamente efetivo elevado e pulsátil reduzido de GRP durante um período de dosagem extendido de 8 horas a 24 horas.

Kits

A presente invenção inclui kits, embalagens e unidades de contentores múltiplos que contêm as composições farmacêuticas descritas anteriormente, ingredientes ativos, e/ou meios para administrar os mesmos, para uso na prevenção e tratamento de doenças e outras condições em sujeitos mamíferos. Brevemente, estes kits incluem um contentor ou formulação que contém um ou mais GRP, análogos ou miméticos, e/ou outros agentes biologicamente ativos em combinação com agentes que intensificam a administração epitelial descritos aqui, formulados numa preparação farmacêutica para administração epitelial.

As formulações intranasais da presente invenção, podem ser administradas usando qualquer garrafa ou seringa atomizadora ou por instilação. Um exemplo de garrafa atomizadora nasal é a "Nasal Spray Pump w/ Safety Clip, Pfeiffer SAP # 60548, a qual administra uma dose de 0.1 ml por pulverização e tem uma longitude de tubo profundo de 36.05 cm. Pode ser adquirida â Pfeiffer of America of Princeton, NJ.

Administração Nasal em Aerossol de um GRP

Descobriuse que os GRP podem ser administrados intranasalmente usando um atomizador nasal ou aerossol. Isto é surpreendente visto que muitas proteínas e peptídeos foram mostrados por serem portados ou desnaturalizados devido às forças mecânicas geradas pelo acionador na produção do atomizador ou aerossol. Nesta área, são empregues as seguintes definições:

1. Aerossol- Um produto que é engarrafado sob pressão e contém ingredientes terapeuticamente ativos que são liberados depois da ativação de um sistema de válvula apropriado.

2. Aerossol medido- Uma forma de dosagem pressurizada que contém de válvulas de dose medidas, as quais permitem a administração de uma quantidade uniforme de atomizador depois de cada activação.

3 . Aerossol em pó- Um produto que é engarrafado sob pressão e contém ingredientes terapeuticamente ativos na forma de um pó, no qual são liberados depois da activação de um sistema de válvula adequado.

4. Aerossol atomizado- Um produto em aerossol que utiliza gás comprimido com o propulsor para proporcionar a força necessária para expulsar o produto como uma atomização húmida; é em geral, aplicável a soluções de agentes químicos em solventes aquosos.

5. Atomizador - Um líquido minuciosamente dividido como por um vapor de pulverização ou ar. Os produtos de fármaco atomizadores nasais contêm ingredientes terapeuticamente ativos dissolvidos ou suspensos em soluções ou misturas de excipientes em dispensadores não pressurizados.

6. Atomizador medido - Uma forma de dosagem não presurizada que consiste de válvulas que permitem a dispensa de uma quantidade especificada de atomizador depois de cada activação.

7. Atomizador de suspensão- Uma preparação líquida que contém partículas sólidas dispersas num veículo líquido e na forma de gotitas em curso ou como sólidos finamente divididos.

A caracterização dinâmica do fluido do atomizador em aerossol se emite por bomba atomizadora nasal medida como um dispositivo de administração de fármaco ("DDD"). A caracterização de aspersão é uma parte integral das admisiones regulatorias necesarias pela administração de alimentos e Fármacos ("FDA"), para aprovação de investigação desenvolvimento, garantia de qualidade e procedimietos de teste destabilidade para nuevas e existentes bombas de aspersão nasais. Através da caracterização da geometria atomizadora, encontrou-se o melhor indicador do desempenho total das bombas atomizadoras nasais. Em particular, medições do ângulo de divergencia atomizador (geometria de coluna de água) , conforme saem do dispositivo; elipticidade em seção transversal do atomizador, uniformidade distribuição de partícula/gotita (padrão atomizador); e o tempo de evolução do desenvolvimento do atomizador, encontrou-se por ser as quantidades de desempenho mais representativas na caracterização de bombas atomizadoras nasais. Durante a garantia de qualidade e testes de estabilidade, a geometria da pulverização e medições do padrão atomizador são identificadores cave para verificar a consistência e conformidade com o critério de dados aprovado para as bombas atomizadoras nasais.

Definições

Altura de pulverização- a medição da ponta do acionador ao ponto no qual o ângulo do pulverização chega a ser não linear devido ao rompimento do fluxo linear.

Baseados numa examinação visual de imagens digitais, e estabelecer um ponto de medição de amplitude que é consistente com um ponto de medição mais longe do padrão atomizador, uma altura de 30 mm é definida para este estudo.

Eixo Principal - a corda mais longa que pode ser extraída do padrão atomizador ajustado que cruza o COMw em unidades base (mm).

Eixo menor - a corda mais curta que pode ser extraída com o padrão atomizador que cruza o COMw em unidades base (mm).

Relação de Elipticidade - a relação do eixo principal ao eixo menor, preferivelmente entre 0.1 e 1.5, e mais preferivelmente entre 1.0 e 1.3 D10 - o diâmetro da gotita pela qual, 10% do volume total de líquidos da amostra consiste de gotitas de um diâmetro menor (μm) .

D50 - o diâmetro da gotita pela qual, 50% do volume total de líquidos da amostra consiste de gotitas de um diâmetro mais pequeno (μm) , também conhecida como o diâmetro mediano de massa.

D90 - o diâmetro da gotita pela qual, 90% do volume total de líquidos da amostra consiste de gotitas de um diâmetro mais pequeno (μm) .

Trajeto - medição da amplitude da distribuição. O menor valor, distribuição mais estreita. O trajeto é calculado como

<formula>formula see original document page 117</formula>

% RSD - percentagem de desvio padrão relativa, a desvio padrão dividido pela média das séries e multiplicada por 100, também conhecida como % de CV.

Volume - o volume do líquido ou pó descarregado do veículo de administração com cada equação, preferivelmente entre 0.01 ml e aproximadamente 2.5 ml e mais preferivelmente, entre 0.02 ml e 0.25 ml.

EXEMPLOS

A descrição anterior geralmente descreve a presente invenção, a qual é além disso exemplificada pelos seguintes exemplos. Estes exemplos descrevem unicamente para fins de ilustração, e não se planeiam para limitar o alcance da invenção. A pesar de se terem empregue termos e valores específicos neste documento, tais termos e valores também se entenderam como exemplos e não limitante do alcance da invenção.

EXEMPLO 1 Materiais e Equipamento Usados

0 presente exemplo ilustra os reagentes, equipamento e a fonte de cada um usado nos subsequentes Exemplos da presente solicitude. A Tabela 1 ilustra os reagentes da amostra usados nos Exemplos subsequentes.

Tabela 1

Reagentes da amostra GLP-1

<table>table see original document page 118</column></row><table>

A tabela 2 ilustra fonte dos componentes do Sistema MatTek EpiAirway™ que se descrevem em maior detalhe no Exemplo 2 da presente aplicação.

Tabela 2

Componentes do Sistema do Modelo de Célula Epitelial in vivo

<table>table see original document page 118</column></row><table>

A Tabela 3 ilustra a fonte e componentes do sistema de ensaio LDH descrito em maior detalhe no Exemplo 2 da presente aplicação.

Tabela 3

Componentes do Ensaio LDH (Citotoxicidade) e MTT (Viabilidade celular). <table>table see original document page 119</column></row><table>

A tabela 4 ilustra os instrumentos e outras

administrações de laboratório relacionadas e fontes de cada um usado neste documento. Tabela 4

Instrumentos e Outros administrações Relacionadas

<table>table see original document page 119</column></row><table>

EXEMPLO 2

Cinética de Permeação in vitro de Formulações Farmacêuticas do Peptídeo-1 (GLP-I) similar a Glucagon

O presente exemplo mostra as formulações farmacêuticas exemplares da presente invenção, as quais contêm os excipientes DDPC, EDTA e Μ-β-DC sozinhos ou em combinação, permeação GLP-I intensificada através de uma monocapa de célula epitelial. A tabela 5 ilustra as formulações selecionadas no Sistema de Modelo EpiAirway por ensaio de resistência transepitelial (TEER), ensaio de viabilidade celular (MTT), ensaio de morte celular de lactato deshidrogenase (LHD) e ensaio de permeação de tecido para determinar que formulação logra o maior grau de permeação de tecido GLP-I e redução TEER assim como não resulta em toxicidade celular significante.

As amostras por triplicado de cada formulação e controlos avaliaram-se usando as inserções da membrana da célula epitelial traqueal/bronquial do modelo in vitro do Sistema EpiAirway por MatTek Corp. (Ashland, MA), catalogo # Air-100. 0 sistema EpiAirway™ desenvolveu-se por MatTek Corp. (Ashland, MA) como um modelo do recubrimiento do epitelio pseudoestratifiçado do tracto respiratório. As células fazem-se crescer em cultivos de célula de fundo redondo da membrana porosa inseridos numa interface ar- líquido, a qual resulta em diferenciação das células a uma morfologia altamente polarizada. A superfície apical é ciliada com uma ultraestrutura microvelosa e a mucosidade procedente do epitelio (a presença de mucina confirmou-se por inmunomanchado). As inserções têm um diâmetro de 0.875 cm, proporcionam um área da superfície de 0.6 cm2. As células se colocaram em placas nas inserções na fábrica aproximadamente três semanas antes do embarque.

Receberam-se membranas de cultivo EpiAirway™ um dia antes que os experimentos tenha início. Enviaram-se por Meio de Eagle Modificado por Dulbecco livre de hidrocortisona e livre de fenol vermelho (DMEM). Cada inserção de tecido se colocou numa cavidade de uma placa de 6 cavidades que contêm 0.9 ml de DMEM livre do soro. As membranas depois cultivam-se por 24 horas a 37°C/C02 a 5% para permitir aos tecidos equilibrarem-se. Este meio com base de DMEM é livre do soro mas suplementado com factor de crescimento epidérmico e outros factores. 0 meio é sempre testado para níveis endõgenos de qualquer citocina ou factor de crescimento o qual é considerado para administração intranasal, mas está livre de todos os factores e citocinas estudadas na data excepto insulina. 0 volume é suficiente para proporcionar contacto com os fundos das unidades e suas posturas, mas a superfície apical do epitelio se deseja manter em contacto directo com o ar. Se usam pinças estéreis nesta etapa e em todas as etapas subsequentes que envolvam a transferencia de unidades a cavidades que contêm líquido para assegurar que não ficam presos entre os fundos das unidades e o meio.

0 sistema de modelo EpiAirway™ se usou para avaliar efeito de cada GLP-I que contém a formulação em TEER, viabilidade celular (ensaio MTT) , citotoxicidade (ensaio LDH) e permeação. Estes ensaios se descrevem abaixo em detalhe.

Resistência Eléctrica Transepitelial (TEER)

Leram-se as medições TEER usando uma Câmara de Medição de Resistencia do Tecido conectada a um Voltímetro Epitelial com o eletrodo guia, ambos de World Precision Instrumentos. Primero o TEER antecedente se leyó para cada inserto no dia que inicia o experimento. Depois de se ter lido o TEERf colocou-se 1 ml de meio fresco no fundo de cada cavidade numa placa de 6 cavidades. As inserções drenaram-se em papel absorvente e colocaram-se em novas cavidades com meio fresco, assim como se mantêm os insertos numerados para correlacionarse com as medições de TEER antecedente. Se agregaron 100 ul de formulação experimental a cada inserto. Os insertos se colocaron num incubador da agitação a 100 rmp e 37°C por 1 hora.

Os electrodos e um cetro branco do cultivo de tecido se equilibrarão por ao menos 2 0 minutos em meio fresco com a energia antes de verificar a calibração A resistencia à antecedente se midió com 1.5 ml de meio na câmara de tecido Endohm e 3 00 μl de meio num inserto Millicell-CM blanco. 0 electrodo superior se ajusto de forma que se sumerge no meio mas no hace contacto com a superfície superior da membrana do inserto. A resistencia antecedente do inserto blanco é 5-20 ohms. Para cada determinação TEER, se agregarão 300 μl do meio ao inserto seguido por uma incubação por 20 minutos a temperatura ambiente antes de coloca-lo na câmara Endohm para Ieer o TEER. A resistencia se expresó como (resistencia medida-blanco) χ 0.6 cm2. Todos os valores TEER se reportarão como uma função da área da superfície do tecido.

TEER calculado como:

TEER = (RI -Rb) XA

em donde RI é a resistencia do inserto com uma membrana, RI é a resistencia do inserto blanco, e A é o área da membrana (0.6 cm2). Uma diminuição no valor TEER em relação ao valor controlo (controlo = aproximadamente 100 ohms-cm2; normalizado a 100) indica uma diminuição em resistencia da membrana celular e um aumento em permeabilidad da célula epitelial mucosal. Depois de 1 horà incubação se completo, os insertos do tecido se removieron do incubador. Se colocaron 200 μl de meio fresco em cada cavidad de uma placa de 24 cavidades e os insertos do tecido se transfirieron à placa de 24 cavidades. Se agregaron suavemente 200 μl de meio fresco a cada inserto de tecido. Nuevamente se midió TEER para cada inserto.

Depois que os insertos do cultivo de tecido se transf irieron da placa de 6 cavidades à placa de 2 cavidades, o meio basal se subdividió em três partes e se almacenaron em tubos eppendorf. Todas as três subdivisiones se colocaron a -80°C até o uso.

Ensaio de Lactato Deshidrogenasa (LDH)

A quantidade de muerte celular se sometió a ensaio midiendo a libertação de LDH das células usando um Kit dê Ensaio de Citotoxicidad CytoTox 96, de Promega Corp. Realizaram-se as amostras por triplicado para cada inserto de cultivo de tecido no estudo. Se cargaron 50 μΐ do meio colectado (almacenado a 4°C) em triplicado numa placa de 96 cavidades. Recientemente, se usó o meio livre de célula como um blanco. Se agregaron 50 μΐ de solução do seus trato (12 ml de amortecedor de Ensaio agregado a uma garrafa reciente da Mistura do Sustrato, hecha de conformidade com o kit) a cada cavidad e as placas se incubaron por 3 0 minutos a temperaturàmbiente na oscuridad. Depois da incubação, se agregaron 50 μΐ de solução de detención a cada cavidad e as placas se leyeron num lector de placa de densidad óptica μQuant a 4 90 nm usando o software KCJr.

Ensaio MTT

A viabilidade celular de cada inserto de cultivo de tecido se probõ por ensaio MTT. A viabilidade celular se valoro usando o ensaio MTT (Kit MatTek, MTT-100) . Este kit mida recuperación e transformación de sal de tetrazolio ou tinte de formazan. O concentrado de MTT se descongelo e diluyõ com o meio a uma proporción de 2 ml de MTT: 8 ml do meio. O concentrado de MTT diluido se pipeteo (3 00 μl) numa placa de 24 cavidades. Os insertos do tecido se secaron suavemente, se colocaron nas cavidades da placa, e se incubaron por três horas na oscuridad a 37°C. Depois da incubação, cada inserto se removió da placa, suavemente manchados e se colocaron numa placa de 24 cavidades por extracción. Os insertos do cultivo celular depois se sumergieron e 2.0 ml da solução extractante por cavidad (para completamente cubrir amostra). A placa de extracción se cubrió e se selló para reducir a evaporación do extractante. Depois de uma incubação durante a noche a temperaturàmbiente na oscuridad, o líquido dentro de cada inserto se decanto nuevamente na cavidad da qual se tomó, e os insertos se desecharon. A solução extractante (50 μl) de cada cavidad se pipeteo por triplicado em placas de microtitulador de 96 cavidades, junto com os blancos extraídos e se diluyó com àdición de 15 0 μΐ de solução extractante fresca. A densidad óptica das amostras se midió a 550 nm num lector de placa de densidad óptica pQuant usando o software KCJr.

Ensaio de Permeação de Tecido

A quantidade de GLP-I (7-36) que pasa da superfície apical à superfície basolateral da monocapa de célula epitelial EpiAirway™ representa o grau de permeação GLP-1. A quantidade de proteína GLP-I encontrada na superfície basolateral das células cultivadas se miden peloISA. O kit ELISA amida (7-36) GLP-I se adquirió de Linco Research, (St. Charles, MI) . 0 ensaio ELISA realizou- se de conformidade com o protocolo do fabricante. As amostras colectadas se diluyeron com amortecedor de ensaio proporcionado com o kit. Realizaram-se varias rondas de selección in vitro. Se calculo o percentagem de permeação diluyendo a quantidade medida de GLP-I encontrado no lado basolateral das células como se midió peloISA pela quantidade total de material de partida GLP-I que se agregou ao lado apical das células multiplicadas por 100. Primero, realizou-se um esboço do estudo do experimento (DOE) usando diferentes quantidades de excipientes EDTA, Μ-β-CD e DDPC. O resumo dos resultados se proporciona na Tabela 5. Todas as formulações que contêm um ou mais excipientes mostram melhoramiento em permeação sobre o controlo sem excipientes (#3) .

Tabela 5:

Estudo de Permeação in vitro de GLP-I

<table>table see original document page 124</column></row><table> <table>table see original document page 125</column></row><table>

As formulações farmacêuticas intranasais testadas

em estudos TEER in vitro adicional, MTTf LDH e % de permeação se mostram na Tabela 6. Os resultados de TEER, MTT, LDH e permeação para estas formulações se resumo na Tabela 7.

Tabela 6:

Formulações GLP-I Testadas in vitro

<table>table see original document page 125</column></row><table> <table>table see original document page 126</column></row><table>

Tabela 7

Resumo de Resultados GLP-I in vitro

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Uma diminuição medida em valor relativo TEER para

o controlo indica uma diminuição em resistencia da membrana celular ou noutras palabras o pasaje de especies iónicas do lado apical ao basolateral da monocapa epitelial. Os dados presentados na Tabela 7 indicam que todas as formulações intensif icadoras significativamente reducen TEER comparadas às formulações controlo.

O ensaio MTT mida viabilidade celular assim como o ensaio LDH mida citotoxicidad. Os ensaios se usam em combinação para determinar o efeito de formulações farmacêuticas em célula "saludable". Os resultados MTT e LDH ambos são expresados como porcentajes. Se calculo o percentagem MTT dividiendo o valor de MTT medido para cada formulação pelo valor MTT da formulação controlo multiplicado por 100. Assim, o controlo positivo MTT é 100% e sirve como a comparação de línecom base para todas as outras formulações. Um valor MTT abaixo do 80% representa um efeito negativo em viabilidade celular. Similarmente, se calculo o percentagem LDH dividiendo o valor LDH para cada formulação pelo valor LDH da formulação controlo multiplicado por 100. Assim, o controlo positivo LDH é 100% e sirve como a comparação de línecom base para todas as outras formulações. Os resultados do ensaio MTT indica que todas mas uma formulação (#12 na Tabela 7) no reduz a viabilidade celular abaixo do 8 0%. Estes dados são além disso reportados pelo ensaio de citotoxicidad LDH amostra que uma maioria das formulações no amostras níveis significantes de citotoxicidad.

A permeação do tecido GLP-I é expresada como % de permeação uma vez incrementa sobre a formulação controlo (amostra #13). As vezes incrementadas sobre o controlo para o excipiente que contêm formulações intensificadores de permeação GLP-I de aproximadamente 74 vezes até 341 vezes sobre o controlo. Estes dados indicam que a inclusión dos excipientes DDPC, EDTA e Μ-β-CD significativamente melhora permeação de GLP-I através da monocapa de célula epitelial. Da tabela 7, as formulações #1,#2, #6 e #12 resultam em >200 vezes melhoramiento do % de permeação sobre o controlo sem excipiente (#13 na Tabela 17).

Em resumo, os dados in vitro indicam que a formulação farmacêutica ejemplar da presente invenção compreende 2 mg/ml de GLP, 10 mg/ml de EDTA e 10 mM de amortecedor Citrato (amostra #6 na Tabela 6) , exhibiendo permeação GLP-I maior intensificada e cualidades reducidas de TEER assim como têm um efeito negativo mínimo em viabilidade celular. Assim, esta formulação representa um candidato ideal para a administração de GLP-I através de uma superfície mucosal, por exempla administração de fármaco intranasal (IN), no tratamento de doenças humanas que incluem obesidade e diabetes.

EXEMPLO 3

Comparação de Cinética de Permeação in vitro de Peptídeo-1 similar a Glucagon (GLP-I) Farmacêutico

0 presente exemplo deamostra que a cinética de permeação in vitro de formulações farmacêuticas GLP-I são sensibles à forma EDTA usada nas formulação. A tabela 8 abaixo ilustra formação seleccionada no Sistema do Modelo EpiAirway in vitro por resistencia transepitelial (ensaio TEER), biodisponibilidade celular (ensaio MTT), lactato deshidrogenasa (ensaio LDH; muerte celular) e permeação de tecido. Todas as amostras contêm 2 mg/ml de GLP-I excepto as amostras #9 e #19 as cales sirven como controlos. Cada formulação se realizan a um volume total de 0.5 ml e se evalúa por triplicado (n = 3) . Cadãmostra se evalúo de conformidade com os protocolos descritos em detalhe abaixo no Exemplo 2. <table>table see original document page 129</column></row><table> <table>table see original document page 130</column></row><table>

Abreviaturas:

Μ-β-CD = metil-beta-ciclodextrina, EDTA = edetato de di-sódio, DDPC = L-α-fosfatidilcolina didecanoil, CB = clorobutanol, Mg EDTA = sal de magnésio de di-sódio EDTA; Zn EDTA = sal de zinc de di-sódio EDTA; MTT = ensaio MTT; LDH = ensaio LDH; TEER = resistencia transepitelial.

Resultados

Se amostra o efeito de formulações farmacêuticas que compreendem agentes para melhorar a administração intranasal, por exemplo, os excipientes DDPC, EDTA e Μ-β-CD em Membrana Celular EpiAirway™ (capa celular epitelial da mucosa). Os resultados de cinética de permeação se resumo abaixo na Tabela 9 e representan medições tomadas numa hora depois que as células se incubaron com as formulações mostradas na Tabela 8.

Tabela 9

Resultados de cinética de permeação para Formulações GLP-1 que contêm Sais EDTA diferentes

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Os dados precedentes indicaron que varias formas de sais EDTA podem ser usadas em formulações farmacêuticas para manipular as cinéticas de permeação do fármaco.

EXEMPLO 4

Estabilidade do GLP-I

OU presente exemplo demonstra que os pequenos excipientes da molécula, por exemplo M-D-CD, EDTA e DDPC, não promovem a estabilidade física do GLP-I na formulação farmacêutica. No exemplo imediato, a estabilidade do GLP-I foi avaliada com as duas formulações descritas em baixo na Tabela. OU propósito do exemplo imediato foi determinar se ou aquecimento do GLP-I provoca degradação proteica. Tabela 10

Formulações destabilidade do GLP-I

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Foi efectuada uma experiência de calorimetria de rastreamento diferencial (DSC) com um novo rastreamento nàmostra #1 da Tabela 10; amostra foi rastreada de 5 DC a 100 DC a uma taxa de rastreamento de 60DC/hora. Os dados foram colocados em gráfico como Cp (cal/DC ) v. temperatura (DC ). Um pico de transição águado é observado perto dos 35 DC no primeiro rastreio de calor. OU ruído depois da transição e grande diminuição na capacidadee daquecimento entre 80 e 90DC sugerem a formação dagregados. Observou-se que a solução estava ligeiramente nebulosàpõs os rastreios, suportando a formação de um precipitado. OU pico de transição é muito mais estreito do que ou esperado para ou desdobramento de um peptídeo, ou que poderá ser resultado dagregação imediatamente após ou desdobramento do peptídeo. Estes dados indicam que ou GLP-I começa desnaturar e/ou formàgregados na formulação a, ou perto dos 3 5DC.

Foi efectuada uma experiência DSC com novo rastreamento nàmostra #2; àmostra foi rastreada de 5 a 100DC a uma taxa de rastreamento de 600C/hora. Os dados foram colocados em gráfico como Cp (cal/DC) vs. temperatura (DC ) . Foi observado um pico muito amplo perto dos 4 6DC no primeiro rastreio. A grande diminuição na capacidadee daquecimento entre os 80 e 90DC poderá dever-se à formação dagregados. No entanto, a solução não pareceu nebulosa seguir aos rastreios sugerindo agregados muito pequenos. Estes dados indicam que ou GLP-I começa desnaturar e/ou formàgregados na formulação a, ou perto dos 4 6DC.Estes dados indicam que àdição de excipientes como descrito na Tabela 10 em cima à formulação GLP-I não aumenta sua estabilidade física.

EXEMPLO 5

Avaliação Farmacocinética (PK) da administração Intranasal e Intravenosa de um Peptideo-I Semelhante ao Glucagon (GLP-I) em Formulações Farmacêuticas Seleccionadas em Coelhos OU presente exemplo demonstra que a biodisponibilidade do

GLP-I através de administração intranasal é significativamente aumentada pela inclusão de um inibidor da dipeptidil peptidase-IV (DPP-IV), por exemplo Lis(4-nitro-Z)- pirrolidida, na formulação farmacêutica.

Foi efectuado um estudo farmacocinético (PK) em coelhos paràvaliar as propriedades farmacocinéticas do plasma do GLP- 1 com várias formulações administradas através de entrega intranasal (IN) versus infusão intravenosa (IV). A concepção global do estudo é apresentada em baixo na Tabela 11. As formulações de 1 a 4 representam as formulações IN enquanto a formulação 5 representa formulação infusionada por IV.

Tabela 11

Concepção Global do Estudo para Avaliação Farmacocinética <table>table see original document page 133</column></row><table>

Neste estudo, foram usados coelhos Brancos da Nova Zelândia (Hra: (NZW) SPF) como cobaias paràvaliar a farmacocinética do plasma do GLP-I por administração intranasal e infusão intravenosa. Os coelhos foram escolhidos como cobaias animais para este estudo devido ao perfil farmacocinético derivado de um fármaco administrado aos coelhos que tem grandes semelhanças com ou perfil PK para ou mesmo fármaco nos humanos.

Foram avaliadas quatro formulações intranasais e uma formulação intravenosa de GLP-1 no estudo. A composição do veículo para cada formulação é fornecida na Tabela 12. As formulações intranasais e intravenosas de GLP-1 foram fabricadas para preparação final e teste.

Para cada uma das soluções de dosagem, os componentes foram fornecidos em duas partes, Parte A e Parte B (ver Tabela 12). A formulação final para cada um dos grupos intranasais (Grupos 1 a 4) foi criada misturando volumes iguais da Parte A (1 mL) e da Parte B (1 mL). Para ou grupo intravenoso (Grupo 5), foram misturados 1,5 mL da Parte A e 3,5 mL da Parte B. As soluções de dosagem finais para todos os grupos foram usadas até 6 horas após a preparação. Tabela 12

Composição do Veículo para Formulações de GLP-1 1 a 5

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A concentração de GLP-I foi constante entre as quatro formulações intranasais. A concentração de citrato e ou pH foram também consistentes entre as quatro formulações. A concentração de EDTA foi consistente paras formulações 1,3 e 4. A formulação 2 continha PON159, um modulador de junção estreita que foi mostrado previamente que aumenta entrega de peptídeos através de uma camada de células epiteliais, mas não continha EDTA. A formulação 5 continha citrato, EDTA, e cloreto de sódio, cada qual na concentração apropriada para administração intravenosa; além disso a concentração de GLP-I foi diminuída para para fornecer uma dose total de GLP-I que fosse 10% da dose intranasal.

OU lis (4-nitro-Z)-pirrolidida é um inibidor específico da dipeptil aminopept idade (DPP) IV, a enzima principal responsável pelo metabolismo do GLP-I (fragmento aminoácido 7-36) num metabolito inativo (fragamento aminoácido 9-36). Paràvaliação neste estudo, as concentrações de Lis(4-nitro- Z)-pirrolidida variaram para cada um dos grupos de dose intranasal com a excepção da concentração igual entre a Formulação 1 e Formulação 2. A dose total de Lis(4-nitro-Z)- pirrolidida foi aproximadamente 0,04 mMoles/kg parnosgrupos 1 e 2 (grupos intranasais) e para ou grupo 5 (grupo intravenoso).Método de Ensaio do GLP-I

Foram testadas amostras do estudo, padrões, e amostras do controlo de qualidade com um Kit ELISA (Linco Research Inc. Catalog # EGLP-3 5K) Glucagon Like Peptide-I (Active). Cadàmostra foi analisada em duplicado.

Este ensaio é baseado na captura do GLP-I ativo (fragmentos 7-36 e 7-36amida) por um anticorpo monoclonal (específico da região terminal N) imobilizado nas cavidades de uma placa de microtiteração 96 cavidades, e detecção através de um segundo anticorpo anti GLP 1 etiquetado alcalino fosfatase. Após lavagem, é adicionado metil umbeliferil fosfato a cada cavidade, ou qual na presença da fosfatase alcalina forma ou produto fluorescente umbeliferona. A quantidade de fluorescência gerada é directamente proporcional à concentração do GLP-I ativo numàmostra desconhecida, e isto foi derivado por interpolação a partir de uma curva de referência usando padrões de referência de concentrações conhecidas de GLP-I ativo.

Devido à semelhança das espécies entre ou GLP-I humano e do coelho, antecipou-se que ou ensaio iria detectar GLP-I endógeno ativo (isto é, coelho). Os níveis endogénos do GLP-I do coelho são medidos no tempo 0. OU fragmenton GLP-1 9-36 não foi detectado pelo ensaio, independentemente da fonte.

Avaliação Farmacocinética

Os cálculos farmacocinéticos foram efectuados usando software WinNonlin (Pharsight Corporation, Versão 4.0, Mountain View, CA) e um modelo não compartimental de administração extravascular. Os parâmetros paràvaliação estão descritos na Tabela 13.

Tabela 13

Parâmetros Farmacocinéticos

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Análise dos Parâmetros Farmacocinéticos

Os dados farmacocinéticos médios do GLP parnosgrupos intranasal e intravenoso são fornecidos na Tabela 14. As concentrações pré-dosagem (linha de base) do GLP-1 endógeno no soro ou plasma estava geralmente abaixo dos 10 pg/mL. Paràlgumas amostras, as limitações no volume damostra precludiram análises repetidas para obter resultados definitivos. Foi reportado um valor de <4 pg/mL para estas amostras. Para calcular os valores médios do grupo e parà avaliação farmacocinética, os dados foram corrigidos na linha de base quando adequado. Os resultados denotados por <NUMBER foram definidos a "<NUMBER/2"; com estàbordagnum valor de <4 pg/mL foi definido a 2 pg/mL.

Os valores pós-dosagem individuais do plasmànimal para ou GLP-1 excederam ou valor de base de 10 pg/mL. No ponto de tempo final após infusão intravenosa (90 minutos) as concentrações plasmáticas de GLP-1 estava no ou perto dos valores de linha de base indicamdo que as fases de infusão e eliminação foram captadas pela enquandramento temporal dàmostragem para ou estudo. Após a instilação intranasal, vários animais tinham concentrações plasmáticas de GLP-1 que excediam os níveis da linha de referência. ÀUCinf foi determinada para estimar ou perfil de exposição total para ou GLP-1.

Tabela 14

Parâmetros Farmacocinéticos Médios para GLP-1 no Plasma de Coelhos Macho Após Instilação Intranasal (Grupos 1-4) e Intravenosa (Grupo 5)

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Formulação 1/Grupo 1

As concentrações pico de GLP-1 (Tmax) ocorreram entre os 5 e 20 minutos (média do grupo de 11 minutos) após administração da dose. A média Cmax do grupo foi de 844,9 pg/mL. As concentrações plasmáticas permaneceram acima da linha de referência 90 minutos após a dose, indicamdo que a eliminação não estava completa nestàltura. Isto é reflectido nàUCiast média de 20792,7 min*pg/mL e AUCinf de 32415,9 min*pg/mL. A semi-vida terminal média (ti/2) estimou-se ser de 55,5 minutos.

Formulação 2/Grupo 2

A Cmax média do grupo 2 se estimo ser 424.0 pg/ml. A Tmax medis se estimo ser 43 minutos; não obstante, existe considerable variabilidad inter-animal para este parâmetro. O examen das concentrações contra perfil de tempo para estes animais indica uma fase da absorção (aumentada) e eliminação (diminuição). ÀUCúitima do grupo 2 é 17,069.8 min*pg/ml. Uma 11/2 no deve ser estimada devido a umàusência de uma fase de eliminação clara em dos animais dentro do grupo. Não obstante, em base nosdados colectados parnosanimais restantes no grupo, a tx/2 média é 66.8 minutos. ÀUCinf média (três animais nos quais Kel deve ser determinado) é 33,324.4 min*pg/ml.

Formulação 3/Grupo 3

A Cmax, Tm3X / 11/2 e AUCúltima média do grupo 3 são 283.9 pg/ml, 25 minutos, 39.3 minutos, e 9331.5 min*pg/ml, respectivamente. Um Kel exacto, e assim ti/2 no pode ser terminada porque um animal no grupo têm uma maior que o valor esperado em 60 minutos. Assim, este valor não se inclui na ti/2 média do grupo de 3 9.3 minutos e AUCinf meio do grupo de 13,232.7 min*pg/ml. Formulação 4/Grupo 4

A Cmax média para o grupo 4 se estimo ser 154.5 pg/ml. A Tmax média do grupo é 47 minutos, não obstante, dos animais, têm sus maiores concentrações de plasma medidas de GLP-I a 90 minutos. Snum Kel de fase de eliminação aparente (e ti/2) e AUCinf no deve ser determinado para estes animais. A 11/2 média e AUCinf parnosoutros três animais se estiman ser 22.4 minutos e 5734.4 min*pg/ml, respectivamente. Formulação 5/Grupo 5 Durante o procedimiento de infusão, um animal do grupo 5 experimenta uma falia mecânica com o aparato de bombeo, o qual resultó em ~100 μΐ adicionais ser suministrados entre os 5 e 10 minutos pontos de tempo. Isto se refleja no valor de concentração de 10 minutos de >5000 pg/ml. Como as condições exactas parà infusão ou deben ser determinadas, os dados para este animal não se incluem na avaliação de farmacocinética para o grupo 5.

A Cmax média parà infusão intravenosa de 10 minutos é 3183.6 pg/ml. Três animais têm uma Tmax a 5 minutos e um animal tnuma Tmax a 10 minutos; aindàs concentrações de GLP-I são geralmente similares nos pontos de tempo de 5 e 10 minutos para todos os quatro animais. Uma t,x/2 terminal para o grupo se estimo ser 3 0.9 minutos. ÀUCúitima média de 28,883.2 min*pg/ml captura maioria do perfil de exposição, como àUCinf é únicamente ligeiramente maior, 2 9,14 9.5 min*pg/ml.

O examen da concentração Iog contra perfil de tempo entre 10 minutos (fin da infusão) e 20 minutos, sugiere uma eliminação bifásica de GLP-I. A fase α mais rápida de um perfil bifásico é geralmente associada com distribuição e eliminação extravascular, assim como a fase β é mais lenta, se considera representar a eliminação terminal. O cálculo da relação de eliminação durante esta estrutura de tempo indica um ti/2 inicial de 2 minutos ou menos. Esta ti/2 inicial deve ser consistente com conseguir um estado estable aparente na última mitad do periodo de infusão de 10 minutos.

Biodisponibilidade

Se calculo a biodisponibilidade de GLP-I depois da administração intranasal usando AUCúitima ou AUCinf; estes estimados se proporcionam na Tabela 15. Nos grupos 1, 3 e 4 a concentração do inibidor Lys(4-nitro-Z)-pirrolidino na formulação é 0 mM, 15 mM ou 25 mM respectivamente. Nàusência do inibidor, a biodisponibilidade de GLP-I é aproximadamente 2% assim como àdición de 15 mM de Lys (4-nitro-Z) -pirrolidido na formulação (Grupo 3) incrementa biodisponibilidade de GLP-I até aproximadamente 3% até 5%. A biodisponibilidade de GLP-I é além disso aumentada de aproximadamente 7% até 11% em adición de 25 mM de Lys (4-nitro-Z)-pirrolidido na formulação (Grupo 1).

0 polipéptido PN159 se ha mostrado por incrementar a biodisponibilidade de peptídeos comparado a excipientes de molécula pequena. Quando se teste, a formulação 2 (Grupo 2) que contém PN159 e 25 mM de Lys(4-nitro-Z)-pirrolidido tnuma biodisponibilidade GLP-1 aproximada de 6 até 11%, o qual é equivalente à biodisponibilidade observada para GLP-I na presença de 25 mM de Lys(4-nitro-Z)-pirrolidido sem PN159. O PNl 5 9 tem o mesmo efeito como 10 mM de EDTA em IN d biodisponibilidade de GLP-1

Tabela 15

Biodisponibilidade de GLP-I em Coelhos Administrados com 75 ug/kg via Instilação Intranasal (7.5 yg/kg de Dose Intravenosa para Cálculo; Grupo 5)

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a Biodisponibilidade = [Dose (Grupo 5) χ AUCXXX (Grupo X) } / [Dose (Grupo Χ) χ AUCXXX (Grupo 5)] χ 100.

A vida média terminal para GLP-1 é aproximadamente 3 0 minutos em coelho e mais longa que o anticipado em base nosreportes publicados que mostram uma vida média terminal de 10 minutos ou menos para ratazana ou humano (Parkes, D. et ao., " Pharmacokinetic Actions of Exendin-4 in the rat: Comparasion with Glucagon-Iike Peptide-1", Drug Development Research 53:260-267, 2001; Deacon C., Therapeutics Strategies Based on Glueagon-Iike Peptide-1, Perspectives in Diabetes 53:2181-2189, 2004. A ti/2 para coelho é consistente entre cada um dos grupos e animais, e assim se reporto dentro do estudo.

O cálculo de ti/2 terminal é dependente na porção da concentração Iog contrà curva de tempo usado para determinación do traslape (ver definición de Kel na Tabela 13). Para o estimado descrito anteriormente, o programa de modelaje se deja para escoger o melhor ajuste parà estimación de Kel. A selección manual parà curva dajustamiento de 10 minutos (fin da infusão) até 90 minutos que indica uma vida média terminal no intervalo de 10 até 12 minutos (dados no mostrados).

A separação proporciona um segundo meio paràvaliar a disposición de um fármaco depois da administração. A separação pode ser considerada como a capacidade intrínseca do corpo ou sus órgãos para remover um fármaco da sangue (Basic Ckinical Pharmacokinetics, 2da ed. , Applied Therapeutics, Inc. Vancouver, Washington). Não obstante, neste caso, GLP-I pode permanecer na sangue, mas se considera removido para fins de avaliação de separação. A razón para isto é que GLP-I existe em dos diferentes estados: um estado ativo que consiste de um fragmento de peptídeo representado por aminoácidos 7-36 e um estado inativo, um resultado de metabolismo, que consiste de um fragmento de peptídeo representado por aminoácidos 9-36. Na conversión para o estado inativo, o GLP-I se considera efetivamente eliminado do corpo. Como o ensaio usado neste documento para detectar GLP-I é específico parà formàctiva de GLP-I (7-36), a presença da formàctiva de GLP-I na sangue no interfiere com a avaliação da separação de GLP-I. Parnosgrupos intranasais, o valor de separação superior (CL-F) se nota para o Grupo 4 com uma média do grupo de 15,160.0 ml/min/kg. 0 valor meio para o grupo 3 é 6977.0 ml/min/kg. A separação é similar parnosGrupos 2 e 1, 2716.0 ml/min/kg e 3032.8 ml/min/kg, respectivamente. Como se espera, a separação estimada para cada grupo é inversamente proporcional à exposição sistêmica.

Os valores de separação para grupos intranasais também se ajustam para biodisponibilidade de GLP-I. A separação ajustada para Grupos 4 e 3 são 758 0 ml/min/kg e 1395 ml/min/kg, respectivamente. Os valores de separação parnosgrupos 1 e 2, (-11% de biodisponibilidade para cada um) se determinaron ser 275 ml/min/kg e 247 ml/min/kg, respectivamente. A separação ajustada parnosGrupos 1 e 3 são similares à separação estimada de 259.8 ml/min/kg para o grupo de dose intravenosa (Grupo 5).

A dose total de Lys-(4-nitro-Z)-pirrolidido é aproximadamente 0.004 mMoles/kg por Grupos 1, 2 e 5. Os níveis do sangue de Lys(4-nitro-Z)-pirrolidido não se determinaron neste estudo, como tal a biodisponibilidade depois da administração intranasal no é conhecida. A presença de Lys(4-nitro-Z)-pirrolidido na formulação nasal têm o potencial para proteger o GLP-I ativo, a partir do metabolismo dentro da mucosa nasal, e se asume que a biodisponibilidade razonable, dentro da circulação sistêmica. A protección do metabolismo pela mucosa nasal é consistente com uma Cmax maior para GLP-I quando Lys(4-nitro- Z)-pirrolidido está presente na formulação. Não obstante, como ambos fragmentos de GLP-I são susceptíveis a cruza ou a circulação, um ensaio para GLP-I total (fragmento de aminoácido 7-36 e 9-36) será requerido para confirmar se uma percentagem maior é GLP-I ativo.

A proteção do metabolismo dentro do sangue é indicada pela semelhança de valores de separação para GLP-I entre o grupo intravenoso (Grupo 5) e os grupos intranasais com a concentração maior do inibidor (Grupos 1 e 2) .

Resumo

Estes dados mostram o a descoberta surpreendente e inesperada que a administração de formulações farmacêuticas intranasais de GLP-I com o inibidor DPP IV Lys(4-nitro-Z)- pirrolidido resulta em biodisponibilidade GLP-I aumentada. Além disso, a biodisponibilidade GLP-I é dependente da concentração do inibidor na formulação. Na ausência do inibidor, a biodisponibilidade de GLP-I é aproximadamente 2%. A inclusão de Lys(4-nitro-Z)-pirrolidido a 15 mM aumenta, a biodisponibilidade GLP-I aproximadamente 5%, e com 25 mM Lys (4-nitro-Z)-pirrolidido, a biodisponibilidade para GLP-I é aproximadamente 11%. O potencial para inibição local (tecido nasal) e sistêmica do metabolismo de GLP-I é indicado pelos dados obtidos.

A formulação com PN15 9, além disso a 25 mM de Lys (4-nitro-Z)-pirrolidido, também é investigada para avaliar o potencial para maior biodisponibilidade com este modulador de ligação forte. Sob as condições deste estudo, o efeito de PN15 9 na biodisponibilidade de GLP-I não é maior que o efeito de EDTA na formulação.

EXEMPLO 6

Formulações de GLP-I em Estabilidade de Uso e Venda

Estabilidade "em uso" define-se como aqueles estudos que guardam uma formulação armazenada dentro de um frasco fixado com um acionador e atomizado em conformidade com o regime terapêutico apropriado (neste caso, três vezes ao dia (TID) ) , e se colocam em temperaturas de armazenamento específicas. Frascos com acionadores são inicialmente cheios, mas não são cheios entre atomizações posteriores. A cebação define-se como atomização até que uma atomização completa seja visualmente aparente, depois actuando uma ou mais vezes antes da dosagem. Os frascos são armazenados a 30°C/65% de humidade relativa (HR) todas as vezes e são atomizados dentro de 10 minutos depois de removê-los da câmara para cada dosagem. Os frascos são accionados três vezes ou uma vez ao dia, dependendo do regime seleccionado para cada estudo. 0 tempo entre cada atomização é ao menos 1 hora e anotaram-se as observações visuais/físicas.

Realizaram-se estudos em uso TID/30°C. As formulações usadas neste estudo contêm 5 mg/ml de GLP-1, 10 mg/ml de EDTA, 10 mM de amortecedor de Citrato (pH 3.5), e sem conservante. Os frascos foram cheios, fechados e accionados por TID, e foram armazenados a 30°C/65% de HR por 10 dias. A recuperação e pureza em uso de GLP-I depois de 7 dias de TID de atomização se mostram na Tabela 16 e 17. A recuperação do peptídeo em uso é maior de 95 ± 2.2% por até 7 dias. A pureza do peptídeo total em uso é 98 ± 2.1% depois de 10 dias TID/30°C/65% HR.

Tabela 16

Recuperação em uso de GLP-I depois de TID/3 0°C/65% de HR

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* % da exigência da etiqueta

% of T=0

* Valores estimados

Tabela 17 Pureza do GLP-I Em Utilização Após TID/30°C/65% RH

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Estudos destabilidade "em venda" definem-se como aqueles estudos que guardam a formulação armazenada dentro de um frasco fechado (isto é, tapado), colocado em armazenamento específico e condições de temperatura acelerada (isto é, 5°C, 25°C, 40°C e/ou 50°C) por períodos especificados de tempo. Realizaram-se estudos destabilidade em venda em formulações que têm resultados positivos das rondas de selecção in vitro. Elaboraram-se formulações e armazenaram-se a 5°C, 25°C - e 35°C. A tabela 18 mostra as formulações que se testaram. Os resultados das formulações #5 e #6 (que contêm GLP-1 e EDTA) mostram que depois de 56 dias de armazenamento a recuperação de GLP-1 é 100% a 5°C, e >97% a 25°C e >90% a 35°C.

Tabela 18

Resumo das Formulações Testadas para Estabilidade "em venda"

<table>table see original document page 145</column></row><table> <table>table see original document page 146</column></row><table>

Realizou-se um ensaio destabilidade em venda no mesmo lote de formulação feito para o estudo em uso (5 mg/ml de GLP-1, 10 mg/ml de EDTA, 10 mM de amortecedor de Citrato (pH 3.5) e sem conservante) . A formulação armazenou-se a 5°C. Os resultados destabilidade em venda se mostram abaixo nas Tabelas 19 até 20.

Tabela 19

Estabilidade em venda, Recuperação do GLP-I em Armazenamento a 5°C

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Tabela 20

Estabilidade em venda, Pureza de GLP-1 em Armazenamento a 5°C

<table>table see original document page 146</column></row><table>

EXEMPLO 7

Farmacodinâmica in vivo de Formulações GLP-I Intranasais

Três estudos comparam as ações de farmacodinâmica (PD) de GLP-I (7-36)amida e exendin-4 sintético (exanatida) em glucose sangüínea depois da administração intranasal (IN) de GLP-I na presença ou ausência do inibidor DPP-V ou injeção subcutânea (SQ) de exenatida. Os estudos realizaram- se no modelo de ratazana ZDF da teste de tolerância à glucose oral (OGTT) usada em estudos em humano.

Avaliaram-se as ações de f armacodinâmica monitorizando os níveis de glucose sangüínea e insulina no sangue. Determinou-se a concentração de glucose na sangue usando um analizador Synchron CX 4 e Kit de Reagente de Glucose apropriado (Beckman Coultér, Brea, CA USA). Determinaram-se os parâmetros de farmacocinética usando o software WinNonlin (Pharsight Corporation, Versión 5.01, Mountain View, CA). Determinou-se a concentração de insulina na sangue pelo ISA.

Determinou-se uma concentração de acetaminofeno em sangue usando um analizador Synchron CX4 e Kit de Reagente de acetominofeno (Beckman Coulter, Brea, CA USA). Usou-se acetaminofeno como um marcador de esvaziamento gástrico porque o acetaminofeno geralmente tem absorção insignificante no estômago. 0 tempo de concentração do pico (Tmax) e concentrações do pico (Cmax) depois da administração da dose reflecte o tempo no qual ocorre o esvaziamento gástrico, e o perfil de esvaziamento gástrico (por exemplo, absorção na circulação sistêmica depois da libertação do estômago) reflete a duração do esvaziamento. O AUC reflecte a exposição total. 0 acetaminofeno administra-se no Estudo 2 e Estudo 3 para monitorizar o esvaziamento gástrico.

Estudo 1

0 esboço do estudo completo para avaliação de valores de glucose em sangue e insulina no Estudo se resume na Tabela 21.

Tabela 21

Estudo 1: Esboço do Estudo de Farmacodinâmica (PD) e Designações de Grupo para Determinação de Glucose Sangüínea e Insulina 147/176

Grupo N0 danimais* Tratamento ro > ω CO o T3 ro "D ^ σ> ω > D) z 3 a> (Λ o Q SsI Dose relativào OGTT 1 5 Salina IN 250 0 -10 minutos 2 5 GLP1 F1 IN 250 5000 -10 minutos 3 5 GLP1 F1 IN 250 5000 +20 minutos 4 5 GLP1 F2 IN 250 5000 -10 minutos 5 5 GLP1 F2 IN 250 5000 +20 minutos 6 5 GLP1 F3 IN 250 5000 -10 minutos 7 5 GLP1 F3 IN 250 5000 +20 minutos 8 5 Exenatida SQ 3.0 5 -10 minutos <table>table see original document page 148</column></row><table>

*Ratos ZDF Macho

Formulações para ratazanas tratadas com GLP-I no Estudo 1 são Fl = 10 mg/ml de EDTA, 10 mM de amortecedor de Citrato (pH 3.5) SEM INIBIDOR; F2 = 10 mg/ml de EDTA, 10 mM de amortecedor de Citrato (pH 3.5) e 25 mM de H-Lys(4nitro- Z)pirrolidido (o inibidor está disponível comercialmente de Bachem)); e F3 = 10 mg/ml de EDTA, 10 mM de amortecedor de Citrato (pH 3.5) e 25 mM de L-prolina-boroprolina (Pro- boropro sintetizou-se com base na informação de Solicitação de Patente 2004/0229829 Al, Bachovchin, Willia, W. et ao.).

Os resultados PD para o estudo 1 se mostram na Tabela 22. 0 AUC(0-150) de glucose para ratazanas tratadas com formulações GLP-I (p/ e p/ou inibidor DPP-IV) é -15% inferior que exanatida em ratazanas tratadas com placebo. No estudo 1, a glucose se proporciona a 2 g/kg, assim como em estudos subsequentes a glucose se proporciona a 1 g/kg. Como um resultado, no Estudo 1, a redução de glucose observada é relativamente inferior que os outros estudos (por exemplo, AUC(0-150) de 0-16%) porque a provocação de glucose é maior. Para o estudo 1, o acetaminofeno não se dosifica para monitorizar o esvaziamento gástrico.

Tabela 22 Estudo 1: % de Redução Calculada em AUC de Glucose para GLP- 1 comparada à Placebo e Exenatida

<table>table see original document page 149</column></row><table>

Não existe diferença na glucose sangüínea entre as formulações GLP-I quando se administra +2 0 minutos depois da dose de glucose oral. Existe diferença no perfil de glucose sangüínea entre as formulações de GLP-I com inibidor (F2 e F3) contra sem inibidor (Fl) quando se administra antes da dose, -10 minutos. Ambas formulações que contêm um inibidor DPP-IV (F2 e F3) resultam num atraso em Cmax (de 45 até aproximadamente 12 0 minutos) . Níveis significantes de GLP-I atrasam o esvaziamento gástrico; o estudo de coelho PK mostrou um % de BA 5 vezes maior para a formulação de GLP-I que contêm inibidor DPP-IV que sneste. No estudo 2, se agregou acetaminofeno a uma formulação que contém um inibidor DPP-IV para comparar esvaziamento gástrico numa formulação GLP-I sem inibidor.

Os dados de medições de insulina e glucose para o Placebo a -10 minutos, Fl de GLP-I (sem inibidores) a -10 minutos e Fl de GLP-I (sem inibidores a +20 minutos mostram um aumento de insulina maior com Fl de GLP-I quando se administra seja entre -10 e +20 minutos em relação ao placebo.

Estudo 2

Submeteram-se a ensaio as ações PD de GLP-I (amida 7-36) na presença ou ausência do inibidor DPP-IV em glucose sangüínea depois da instilação intranasal (GLP-1) num modelo de ratazana do OGTT no Estudo 2. O esboço do estudo completo para avaliação de glucose sangüínea e valores de insulina se resumo na Tabela 23. 0 estudo 2 de OGTT se condes como uma dose de lg/kg do bolo de uma solução de glucose administrada por sonda oral. Se co-administrou acetaminofeno, a uma dose de 100 mg/kg dentro da solução de glucose. Para fins de registro do tempo o OGTT designou-se como 0 minutos em tempo.

Tabela 23

Estudo 2: Esboço OGTT de Farmacodinâmica e Designações de Grupo para Determinação de Glucose Sangüínea e Insulina

<table>table see original document page 150</column></row><table>

* Ratazana ZDF

As formulações usadas no Estudo 2 incluem: Fl = 10 mg/ml de EDTA, 10 mM de amortecedor de citrato (pH 3.5) SEM INIBIDOR; F3 = 10 mg/ml de EDTA, 10 mM de amortecedor de citrato (pH 3.5) e 25 mM de L-prolina-boroprolina. A glucose sangüínea avaliou-se nos seguintes pontos de tempo: pré-OGTT e 5, 10, 15, 30, 45, 60, 75, 90, 120, 180 e 240 minutos pós-OGTT. Calculou-se a insulina sangüínea nos seguintes pontos de tempo: pré-OGTT e 15, 30, 60, 120 e 240 minutos pós-OGTT. Avaliaram-se os níveis do sangue APAP nos seguintes pontos de tempo: pré-OGTT e 5, 10, 15, 30, 45, 60, 75, 90, 120 e 180 minutos pós-OGTT. Os resultados do Estudo 2 mostram que existe uma redução em AUC de glucose (com base correcta) comparada ao controlo, especialmente para formulações sem inibidor (Fl) . Ambas as formulações (F1 e F3) com e sem inibidor aumentam a insulina depois da dosagem. A dose a IN de 100 ug/ml de GLP-I mostrou que na presença do inibidor, atrasou-se o esvaziamento gástrico. Aumentando a dose de GLP-I a IN também o esvaziamento gástrico é afectado sem a presença do inibidor. Quando o esvaziamento gástrico é atrasado devido a altas doses ou à presença do inibidor, a absorção de glucose atrasa-se. A tabela 24 mostra a diferença AUC de glucose para grupos de tratamento comparados ao Placebo. Tabela 24

Resumo de Diferenças em AUC de Glucose

<table>table see original document page 151</column></row><table>

Estudo 3

No estudo 3, submeteram-se a ensaio as ações de farmacodinâmica (PD) de GLP-I (amida 7-36) sem inibidor e exenatida em glucose sangüínea depois de instilação intranasal (GLP-1 ou salina) ou injeção subcutânea de exenatida num modelo de ratazana do OGTT. No estudo 3, se usou uma formulação de GLP-I que não tem inibidores DPP-IV (Fl = 10 mg/ml de EDTA, 10 mM de amortecedor de citrato (pH 3.5) SEM INIBIDOR). A meta principal do Estudo 3 é comparar Fl GLP-I (IN) a exenatida (SQ) . Avaliou-se PD monitorizando o nível de glucose sangüínea e insulina no sangue.

Administrou-se acetaminofeno para monitorizar o esvaziamento gástrico (do Estudo 2) . No Estudo 3 o OGTT conduziu-se usando uma dose de 1 g/kg do bolo de uma solução de glucose administrada por sonda oral. Quando é relevante, o acetaminofeno a uma dose de 100 mg/kg, coadministrou-se dentro da solução de glucose.

Para fins de registo do tempo, o OGTT designou-se como 0 minutos de tempo. 0 registo do tempo para a administração da dose de tratamento é relativo ao OGTT. A dose do tratamento única se administra a -10 minutos. Se conduz a dosagem das vezes, com a primeira dose a -10 minutos e a segunda dose a +35 minutos. Portanto, a administração para dose por salina, GLP-I ou exenatida ocorre a -10 minutos, +3 5 minutos ou -10 e +3 5 minutos, em relação ao OGTT.

Recolheu-se sangue para análises de farmacodinâmica, que incluem cálculos AUCO-24 0 e Cmax. Avaliou-se a glucose sangüínea nos seguintes pontos de tempo: pré-OGTT e pós-OGTT (5, 15, 30, 45, 60, 75, 90, 120, 180 e 240 minutos) . Avaliou-se a insulina sangüínea pré-OGTT e pós-OGTT (5, 15, 30, 45, 60, 75, 90, 120 e 180 minutos) . Avaliaram-se os níveis sangüíneos de acetaminofeno pré-OGTT e pós-OGTT (15, 30, 45, 60, 75, 90, 120 e 180 minutos) . O esboço total para a avaliação do Estudo 3 de valores de glucose sangüínea e insulina resumiu-se na Tabela 25. O esboço total para avaliação do esvaziamento gástrico resume- se na Tabela 26.

Tabela 25

Estudo 3: Esboço de Estudo de Farmacodinâmica e Designaçõe de Grupo para Determinações de Glucose Sangüínea e Insulina

<table>table see original document page 152</column></row><table> <table>table see original document page 153</column></row><table>

* Ratazanas ZDF Macho

Tabela 26

Estudo 3: Esboço do Estudo de Farmacodinâmica e Designaçõe de Grupo para Avaliações de Esvaziamento Gástrico

<table>table see original document page 153</column></row><table>

* Ratazanas ZDF Macho

Os resultados do Estudo 3 mostram redução dramática (-60%) da AUC0-24o de glucose sangüínea correcta depois da dosagem GLP-I intranasal comparado a administração Salina ou SQ de Exenatida. Se mostram valores AUC0-240 e Cmax na Tabela 27. A mudança na concentração de glucose corrigida para glucose endógena se mostra na Figura 1.

Estes resultados de farmacodinâmica mostram a descoberta surpreendente e inesperada de que a administração intranasal de formulações farmacêuticas de GLP-I resulta numa concentração de glucose diminuída na sangue.

Tabela 27

Dados de Farmacodinâmica para Parâmetros da Farmacocinética de Glucose Sangüínea Depois da Administração de GLP-1, Exenatida e Salina em Ratazanas Determinados em Teste de Tolerância de Glucose Oral

<table>table see original document page 153</column></row><table>

Os dados de insulina média do grupo para grupos do tratamento GLP-I e placebo do Estudo 3 se mostram na Figura 2. Os níveis de insulina em ratazanas tratadas com salina (placebo) mostram uma diminuição ligera depois do OGTT. Com uma dose única de 100 pg/kg de GLP-I a -10 minutos, existe um aumento marcado em níveis de insulina no sangue em resposta a um OGTT. A administração de GLP-I a -10 minutos e +35 minutos resulta num aumento repentino de insulina inmediatamente depois de cada dose. Este padrão indica que o GLP-I é responsável pela libertação de insulina em resposta a glucose sangüínea elevada.

Os dados de acetaminofeno médios do grupo para os grupos de tratamento GLP-I e placebo (com desvio padrão para o grupo placebo) mostram-se na figura 3. No estudo 3, a determinação de exposição total (AUC) indicada é menos de 3% de diferença na quantidade total de acetaminofeno absorvido na circulação sistêmica entre os três grupos de tratamento. Os valores AUC são 6804 pg*min/kg, 6672 pg*min/kg e 6951 pg*min/kg para o controlo de salina (placebo), grupos 100 pg/kg de GLP-I e 1000 pg/kg GLP-If respectivamente. Não obstante, o perfil de absorção é diferente. Em ratazanas tratadas com placebo, a Tmax para o acetaminof eno é 3 0 minutos pós-dose; com uma Cmax média do grupo de 78 pg/ml com um desvio padrão de ± 21 pg/ml. Uma Cmax ligeiramente inferior, 66 ± 21 pg/ml se notou a 3 0 minutos depois da dose para o grupo 100 pg/kg GLP-1; não obstante, as concentrações de acetaminofeno entre este grupo e o grupo controlo são similares para mais pontos de tempo avaliados. A Cmax para o acetaminof eno é menor, 4 5 ± 3 0 ug/ml, no grupo 1000 pg/ml GLP-1. Além disso, a Tmax parece originar-se entre 3 0 e 90 minutos depois da dose, e os níveis sangüíneos de acetaminofeno são marcadamente maiores nos últimos pontos de tempo. Os resultados para o grupo 1000 pg/kg GLP-I são consistentes com um atraso no esvaziamento gástrico e um perfil mais prolongado para esvaziamento gástrico depois de uma dose alta de GLP-I.

Os resultados do Estudo 3 mostram que o GLP-I sem inibidor diminui significativamente a glucose e que a dose pode ser administrada antes ou depois da comida. A formulação de GLP-I a IN diminui AUC de glucose assim como a dosagem de Exenatida SQ em ratazanas ZDF enquanto se esta fôr 0.6 ou 3 ug/kg não o faz.

Resumo de Resultados PD

Estes resultados de farmacodinâmica mostram a descoberta surpreendente e inesperada de que a administração intranasal de formulações farmacêuticas de GLP-I resulta numa concentração de glucose diminuída na sangue. Além disso, o padrão de concentração de insulina no sangue indica que GLP-I é o factor responsável para a libertação de insulina em resposta à glucose sangüínea elevada. Os resultados para o estudo de acetaminofeno são consistentes com um atraso no esvaziamento gástrico e um perfil mais prolongado para esvaziamento gástrico a dose altas de GLP-I numa ausência do inibidor D00-IV. Uma dose inferior de GLP- 1, a qual também é efetiva em glucose sangüínea inferior, não tem impacto no esvaziamento gástrico. A diminuição da concentração de glucose na sangue, especialmente através de níveis de insulina elevados é um tratamento efetivo para Diabetes tipo II. Além disso, o atraso no esvaziamento gástrico pode aumentar a saciedade e promover a perda de peso. Estes dados apoiam a eficácia da formulação intranasal GLP-I descrita nestes ensaios para uso no tratamento de transtornos metabólicos tais como obesidade e diabetes.

EXEMPLO 8

Formulações Transmucosales Sintéticas de Exendin-4 com Intensificadores

Testou-se uma variedade de excipientes para optimização in vitro de formulações de exenatida. Geraram-se formulações de exenatida transmucosal combinando exenatida e excipientes (que incluem intensificadores, solubilizadores, tensoativos, queladores, estabilizadores, amortecedores, tonificadores e conservantes).

Realizaram-se rondas múltiplas de selecção de formulação e dividiram-se me duas séries, A e B. As séries A focam-se na troca das concentrações do excipiente de solubilizadores (Me-p-CD) , tensoativos (DDPC), queladores (EDTA) e estabilizadores (gelatina). Também se testaram amortecedores tais como amortecedor de citrato, amortecedor de tartrato e glutamato (MSG) . Series B selecciona excipientes alternativos pelo seu potencial para intensificar a permeação de exenatida. Testaram-se várias concentrações de intensif icadores de permeação potencial que incluem ciclodextrinas, glicósidos, ácidos gordos, fosfatidilcolinas, compostos GRAS, PN15 9, gelatina e outras. Além da seleccção de intensif icadores de permeação potencial, também se seleccionaram variadas concentrações de amortecedor (amortecedor de citrato, amortecedor de tartrato) e excipientes tonificadores/estabilizadores (manitol, NaCl) . Testaram-se conservantes tais como benzoato de sódio (NaBz) e cloreto de benzalcónio (BAK) . A tabela 28 lista os excipientes testados na selecção in vitro. Fora das formulações únicas 372 que se testaram, onze formulações se recomendam para uso em estudos PK de coelho in vivo pré- clínicos, ver Tabela 29.

Tabela 28

Excipientes Testados em Optimizaçãon de Formulação de

Exenatida in vitro

<table>table see original document page 156</column></row><table> <table>table see original document page 157</column></row><table> <table>table see original document page 158</column></row><table>

Tabela 29

Formulações de Exenatida Transmucosal Recomendada para Estudos Pré-clínicos

<table>table see original document page 158</column></row><table> <table>table see original document page 159</column></row><table>

EXEMPLO 9

Formulação de Exenatida Transcumosal que Induz Abertura de Uniões Fortes in vitro

Realizaram-se ensaios TER, LDH, MTT e permeação in vitro para formulações de exenatida como se descreve nos protocolos no Exemplo 2 anterior.

Para todas as formulações de exenatida que contêm intensif icadores, se reduz TER de aproximadamente 350-700 ohms χ cm2 até aproximadamente 5-20 ohms χ cm2 depois de sessenta (60) minutos do periodo de incubação. Todas as formulações de exenatida, com a excepção de controlos, contêm EDTA. Como um quelador de cálcio, conhece-se o EDTA para abrir uniões fortes por cálcio depurador. Num ambiente estático similar ao sistema de cultivo de tecido in vitro que se usa neste documento, a remoção de cálcio da solução conduz para abrir uniões fortes significantes. Não se observou redução nem TER no controlo de glutamato mais exenatida (MSG) que contêm unicamente exenatida em amortecedor de glutamato com cloreto de sódio como um tonificador. 0 controlo de glutamato mais exenatida indica que a abertura de uniões fortes não é uma característica inerente da mesma exenatida. 0 TER de insertos depois de sessenta (60) minutos exposto ao controlo de glutamato é similar nosdos insertos expostos ao meio por sessenta (60) minutos. O controlo X triton é o TER mais baixo possível, o qual resulta da eliminação da barreira celular como se espera.

Para verificar que a redução de TER pelas formulações de exenatida resultou de modulação de uniões fortes pelos intensificadores e não por morte celular, realizaram-se ensaios LDH e MTT usando a mesma linha celular, MatTek Corp., como se usa nos ensaios TER. As formulações de exenatida não mostram um aumento significante em citotoxicidade como se méde por % de LDH. As formulações de exenatido têm menos do 2 0% de perda de LDH. Similarmente, o meio de controlo não mostra citotoxicidade. Em contraste, o grupo tratado com controlo Triton X mostrou significante toxicidade, como se esperava. Valorizou-se a viabilidade celular usando o ensaio MTT (MTT-100, kit MatTek). As formulações de exenatida não mostram um aumento significante em toxicidade como se mediu para a % de MTT com a excepção de três formulações, JW-239-126-14, JW-239-126-19, e JW-239- 126-24, as quais têm perto dos 50% de MTT. Por outra parte, as formulações de exenatida mostram maior viabilidade que 80% de MTT. Similarmente, o meio de controlo não mostra citotoxicidade. Em contraste, o grupo tratado com controlo Triton X mostrou significante toxicidade como se esperava. Os resultados do estudo de permeação se mostram na Tabela 30.

Tabela 30

Formulações de Exenatida Transmucosal a partir de Estudos Prévios

<table>table see original document page 160</column></row><table> Os resultados de permeação para as formulações mostradas 300 até 830 vezes incrementados em permeação em relação a uma formulação controlo que contém unicamente 3 mg/ml de exenatida e glutamato monosódico. As formulações dosificadas a metade do volumem mostrado a 1400 e 2200 vezes de aumento em permeação comparado ao controlo.

EXEMPLO 10

Resultados de PK em Coelho para Formulações de Exenatida Transmucosal

Se mostram formulações de Exendin-4 para testes in vivo na Tabela 31.

Tabela 31

Formulações de Exenatida Transmucosal a partir de Estudos Prévios

<table>table see original document page 161</column></row><table>

Realizou-se um estudo PK de exendin-4 em coelhos que comparam resultados PK para exendin-4 administrado por IV e IN. As formulações IN incluem controlo IN (sem intensificadores), intensificador IN IX + gelatina, intensif icador IIN 2X e intensif icador IN 2X + gelatina (formulações mostrada na Tabela 31). Os resultados do estudo PK se mostram na Tabela 32 e Figura 4.

Tabela 32

Resultados de Farmacocinética para Exendin-4 em Coelhos

<table>table see original document page 162</column></row><table>

Os resultados PK mostram que IN 2X intesif e IN 2X intensif + gel são as melhores formulações de exendin-4 desenvolvidas, testadas no estudo de coelho. Tanto IN 2X intensif como IN 2X intensif+gel resultam em valores PK maiores que os controlos IV ou IN.

EXEMPLO 11

Formulações de Exenatida Transmucosal Alternativas

Desenvolveram-se formulações de exendin-4 alternativas para administração transmucosal para testar o seguinte: 1) estabilidade de armazenamento aumentada, 2) biodisponibilidade aumentada de exendin-4 e 3) efeito de farmacodinâmica aumentada determinado medindo níveis de insulina e glucose.

Prepararam-se modificações de formulações exendin- 4 previamente testadas para remover DDPC e gelatina completamente mas numa formulação. Usou-se "0EF" para referência a formulações que contêm 80 mg/ml de Me-b-CD e 5 mg/ml de EDTA (sem DDPC ou gelatina) em 10 mM de amortecedor de acetato. Uma segunda mudança nas formulações previamente testadas é a adição de arginina ou algumas das formulações.

As formulações OEF descrevem-se na Tabela 33. Tabela 33

Formulações de Exenatida Transmucosal para Estudos de Permeação in vitro

<table>table see original document page 163</column></row><table>

Abreviaturas: DDPC = didecanoil L-a-fosfatidilcolina, EDTA =

Edetato di-hidrato de sódio, Me-p-DC = metil-p-ciclodextrina aleatória.

Percentagem de Permeação

Estudos de permeação in vitro mostraram que as formulações OEF (sem DDPC e gelatina) intensificando a permeação de exendin-4 a uma extensão maior que as formulações de exendin-4 previamente testadas (ver formulações previamente testadas na Tabela 31) assim como se proporciona viabilidade celular comparável ou melhor. Os resultados de permeação que comparam as formulações se mostram na Tabela 34.

Tabela 34 Resultados de Permeação in vitro para Formulações de Exendin-4 depois de 90 Minutos

<table>table see original document page 164</column></row><table>

Estudo de Farmacocinetica

Um estudo de farmacocinética (PK) in vivo em coelhos demonstrou que as formulações "OEF + arg" e "2x intensif + gel, arg" quando se administra intranasalmente produz biodisponibilidade intensificada de exendin-4, comparável a ou superada pelas formulações previamente testadas. O pico médio da concentração de plasma exendin-4 é maior que a formulação OEF + arg. A tabela 35 mostra uma comparação dos parâmetros PK médios (Tmax, AUC, t1/2 e Kel) para as formulações testadas. O coeficiente de variação para cada parâmetro PK se mostram na Tabela 36, e a biodisponibilidade absoluta (%F) para cada formulação intranasal se mostra na Tabela 37.

Tabela 35

Parâmetros PK meios para Formulações de Exendin-4

<table>table see original document page 164</column></row><table>

Tabela 36 % de Coeficiente Meio de Variacao

<table>table see original document page 164</column></row><table> <table>table see original document page 165</column></row><table>

Tabela 37

Biodisponibilidade Absoluta (%F) usando AUCúitimo

<table>table see original document page 165</column></row><table>

Resultados para o estudo PK mostram que OEF + arg têm % de biodisponibilidade maior (16.6%). Outras das formulações intranasais, 2x intensif e 2x intensif + gel, também têm biodisponibilidade significativamente intensificada comparado ao controlo IN (12.6% e 11.5%, respectivamente).

Estudos de Farmacodinâmica

Um estudo in vivo em coelhos proporcionou parâmetros f armacodinâmicos (PD) que mostram que as formulações "OEF + arg" e "2x intensif + gel, arg" quando se administra intranasalmente produz respostas de insulina e glucose, comparáveis ou maiores que as formulações previamente descritas (ver Tabela 31) . A tabela 38 inclui parâmetros PD para níveis de insulina médios (Tmax, Cmax e AUC) e a Tabela 3 9 mostra-nos níveis de glucose médios (Tmax e Cmin). Surpreendentemente, a formulação "2x intensif + gel, arg" provoca resposta PD maior aún ainda no resulta no aumento maior em biodisponibilidade de exendin-4 no estudo PK.

Tabela 38 Parâmetros PD para Níveis de Insulina Depois da Dosagem de Formulações em Coelhos

<table>table see original document page 166</column></row><table>

Tabela 39

Parâmetros para Níveis de Glucose Depois da Dosagem de Formulações em Coelho

<table>table see original document page 166</column></row><table>

Estabilidade

Estudos destabilidade acelerada mostram que as variantes de formulação "OEF" proporcionam estabilidade intensificada para exendin-4 em relação à formulação "2x intensif+gel" . A estabilidade das formulações "OEF" é comparável à de BYETTA® comercialmente disponível. Depois de quatro (4) semanas a 40°C, a pureza das formulações "OEF" é 85.6 - 86.0%, assim como a pureza de "2x intensif + gel" é 83.7%. Depois de quatro (4) semanas a 50°C, a pureza das formulações "OEF" é similar a BYETTA ® (72.2-72.9% contra 72.9) assim como a formulação "2x intensif + gel" precipitou. Não se observou precipitação nas formulações simples.

Em resumo, os estudos destabilidade acelerada demonstraram que o amortecedor de acetato proporciona estabilidade física aumentada para formulações de exendin-4 em relação ao amortecedor de tartrato. Observou-se menos precipitação em formulações amortecidas de acetato que em formulações amortiguadas de tartrato. Geralmente, os amortecedores de mono-ionogénico (acetato, arginina, lactato) proporcionam melhor estabilidade que os amortecedores poli-ionogénicos (tartrato, citrato). O intervalo de pH 4.7-5.5 proporciona melhor estabilidade química para exendin-4 comparada pH ≤ 4.25. A arginina proporciona estabilidade química ligeiramente melhorada. Além disso a metionina e o ácido aspártico diminuem a estabilidade química de exendin-4. A osmolalidade óptima para estabilidade química de exendin-4 é 200-250 mOsm/kg de H2O.

Adicionalmente, os estudos destabilidade acelerada indicam que as variantes da formulação "OEF" proporcionam estabilidade intensificada para exendin-4 em relação à formulação "2x intensif+gel". A estabilidade das formulações "OEF" é comparável à de BYETTA® comercialmente disponível. A 40 °C, depois de quatro semanas, a pureza das formulações "OEF" é 85.8-86.0% assim como a pureza de "2x intensif +gel" é 83.7. Mais dramaticamente, a 50°C, depois de quatro semanas, a pureza das formulações "OEF" é comparável a BYETTA® (72.2-72.9% contra 72.9%) assim como a formulação "2x intensif + gel" precipitou.

Ainda não testados neste estudo, adverte-se que os intensificadores de viscosidade se podem agregar às formulações. Também se podem incluir conservantes nas formulações, os quais podem incluir, mas não se limitam a, cloreto de benzalcónio, metil e propil parabenos e/ou clorobutanol. Exemplos de outros conservantes previamente testados, os quais podem ser incluídos nas formulações para promover efetividade antimicrobiana incluindo as seguintes combinações: 0.033% de metilparabeno + 0.017% de Propilparabeno; 0.18% de metilparabeno + 0.02% de Propilparabeno; 0.10% até 0.50% de clorobutanol; 0.10% até 0.25% de clorobutanol + 0.033% de metilparabeno + 0.017% de Propi lparabeno; 0.10% até 0.25% de clorobutanol + 0.18% de Metilparabeno + 0.02% de Propi lparabeno; 0.5% de álcool benzílico; 0.5% de álcool benzílico + 0.033% de metilparabeno + 0.017% propi lparabeno; 0.5% de álcool benzílico + 0.18% de metilparabeno + 0.02% de Propilparabeno; 0.5% de feniletanol + 0.1 até 0.25% de clorobutanol; 0.5% de feniletanol + 0.033% de Metilparabeno + 0.017% de Propilparabeno; 0.5% de feniletanol + 0.18% de Metilparabeno + 0.02% de Propi lparabeno; 5 mg/ml de EDTA; 0.01-0.1% de cloreto de benzalcónio; 7 mg/ml de etano; 5 mg/ml de álcool benzílico + 2.5 mg/ml de álcool feniletílico.

Podem usar-se concentrações variáveis de exenatida para conseguir uma dose desejada, por exemplo as concentrações de 0.5 mg/ml até 6 mg/ml. As formulações "OEF" e "OE F + arg" podem proporcionar estabilidade e biodisponibilidade melhorada para outros GRP, que incluem, mas não se limitam a, outros análogos de GLP-1.

Numa formulação de exendin-4 para administração transmucosal com vida médiàumentada, identificam-se custos diminuídos de gastos e biodisponibilidade aumentada partir dos melhoramentos OEF à formulação. A vida médiàumentada significa que o produto comercial durará mais tempo, os que permite que menos produtos expirem e reduzindo a sua fabricação. Biodisponibilidade aumentada significa eficácia e utilidade terapêutica potencialmente aumentada do produto do fármaco. Também pode significar um poupança em custos reduzindo a quantidade de PI (exendin-4, GLP-1) requerida parà eficácia do produto do fármaco. A remoção de DDPC permite potencialmente maior facilidade nàprovação do produto pela FDA visto que o DDPC é um excipiente novo. Também diminui o tempo requerido para fabricação do produto. Além disso, o DDPC é um excipiente caro e se a eliminação reduz significativamente o custo de gastos associados com a produção do fármaco. A eliminação de gelatina resulta numa diminuição no tempo requerido parà fabricação do produto e também diminui o custo de fabricação com a eliminação de um excipiente.

A invenção também inclui formulações GRP livres de conservante. Tais formulações não contêm um conservante. Nàusência de um excipiente antimicrobiano, a formulação foi cheia sob condições estéreis num dispositivo de administração livre de conservante. Uma formulação de exenatida livre de conservante pode incluir formulações tais como aquelas mostradas nas Tabelas 40 e 41. As concentrações de exenatida podem variar de 2-12 mg/ml.

Tabela 40

Formulação Livre de Conservante para "2x Intensificadores + gelatina"

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Tabela 41

Formulação livre de Conservante para "lx intensificadores + Gelatina"

<table>table see original document page 169</column></row><table> <table>table see original document page 170</column></row><table>

Outras modalidades podem variar nos níveis de componentes intensif icadores de permeação tais como os seguintes: Me-β-CD (20 - 80 mg/ml), DDPC (0-2 mg/ml), EDTA (2 - 10 mg/ml), amortecedor de tartrato (0 - 30 mM), gelatina, e cloreto de sódio. Outras modalidades podem conter uma formulação diferente: Me-p-CD (80 mg/ml), EDTA (5 mg/ml), arginina (2.8 ou 10 mM) e/ou amortecedor de acetato (10 mM), e cloreto de sódio com um pH de 4.9 - 5.6. As concentrações destes excipientes podem variar. As formulações podem além disso conter um intensificador de viscosidade tal como gelatina, hidroximetilcelulose, carboximetilcelulose ou carbopol. Podem usar-se concentrações variadas de exenatida para conseguir uma dose desejada. As concentrações podem variar de 0.5 mg/ml até 25 mg/ml, por exemplo.

EXEMPLO 12

Estudo de Farmacodinâmica (PD) em Dose Unica de Administração Intranasal de Proteínas Que regulam a Glucose (GRPs) num Modelo de Ratazana do Teste de Tolerância à

Glucose (OGTT)

Testaram-se as ações de farmacodinâmica do GLP-I (amida 7-36) e exendin-4 e glucose sangüínea depois da instilação intranasal num modelo de ratazana de teste de tolerância de glucose oral (OGTT). Avaliaram-se duas formulações de exendin-4 e usou-se uma formulação única de GLP-I. A formulação GLP-I (em base a EDTA) (#2) contém GLP-I (amida 7-36) e os seguintes ingredientes: 10 mg/mL de EDTA di -sodio; 10 mM citrate buffer, pH 3.5. As formulaçoes de exendin-4 (com base de EDTA) (#2, #3, #4, and #5) continham exendin-4 e os seguintes ingredientes: 10 mg/mL de EDTA di- sódio e 10 mM de amortecedor de arginina, pH 4.0. As formulações de exendin-4 (em base a PDF) (#6 e #7) contêm exendin-4 e os seguintes ingredientes: 45 mg/ml de Me-p-Cd, 1 mg/ml de DDPC, 1 mg/ml de EDTA de di-sódio, 100 mM de sorbitol, 25 mM de lactose, 5mg/ml de CB, e 10 mM de amortecedor de arginina, pH 4.0. Um resumo das formulações testadas se mostra na Tabela 42. 0 esboço de estudo e designações de grupo se mostram na Tabela 43 . Tabela 42

Formulações usadas paràvaliar Dosagem Intranasal de Exendin- 4 e GLP-I

<table>table see original document page 171</column></row><table>

Abreviaturas: Me-p-CD=metil-beta-ciclodextrina, EDTA edetato de di-sódio, DDPC=L-a-fosfatidilcolina didecanoil, e CB=Clorobutanol. Tabela 43

Esboço do Estudo e Designações de Grupo

<table>table see original document page 172</column></row><table>

Avaliaram-se farmacodinâmicas monitorizando níveis de glucose sangüínea e insulina na sangue; co-administrou-se acetaminofeno com glucose para monitorizar o esvaziamento gástrico. 0 estudo inclui um tratamento de dose única em ratazanas ZDF de aproximadamente 11 semanas de idade (5 ratazanas por grupo de tratamento) . Conduziu-se o OGTT como uma dose de 1 g/kg de bolo de uma solução de glucose administrada por sonda oral. Administrou-se acetaminofeno, a uma dose de 100 mg/kg. Para fins de registro do tempo o OGTT designou-se como tempo = 0 minutos. A administração de dose para salina, GLP-I ou exendin-4 é a -10 minutos em relação ao OGTT. Avaliou-se a glucose sangüínea nos seguintes pontos de tempo: pré-OGTT (duas vezes) e 5, 15, 30, 45, 60, 75, 90, 120, 180 e 240 minutos pós-OGTT. Avaliou-se a insulina em sangue nos seguintes pontos de tempo: pré-OGTT e 15, 30, 45, 60, 75, 90, 120, e 180 minutos pós-OGTT. Avaliou-se o nível do sangue APAP nos seguintes pontos de tempo: pré-OGTT e 15, 30, 45, 60, 75, 90, 120, e 180 minutos pós-OGTT.

Resultados de Farmacodinâmica

A tabela 44 mostra resultados de farmacodinâmica do nível de glucose. Níveis de pico (Cmax) para glucose são 70% de controlo em animais administrados com GLP-1; similarmente o AUC para glucose para estrutura de tempo de 0 até 60 (AUCo-eo) minutos pós-OGTT é 70% do controlo. A administração de Exendin-4 tem efeitos mínimos em Cmax (que varia de 86% até 99% do controlo) ou AUC0-So (que varia de 91% até 103% do controlo) . Não existe uma clara resposta à dose para exendin-4.

Tabela 44

10 Resultados de Farmacodinâmica em Nível de Glucose para GRPs: GLP-I e Exendin-4

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A tabela 4 5 mostrnosresultados de farmacodinâmica do nível de glucose depois da correcção para glucose endógena. Níveis de pico (Cmax) para glucose são 51% de controlo em animais administrados com GLP-I; similarmente o AUC para glucose para estrutura de tempo de 0 até 60 (AUC0-6o) minutos pós-OGTT é 46% de controlo, e AUC0-240 (0 até 240 minutos pós-OGTT) é 88% de controlo. A administração de exendin-4 nas formulações com base de EDTA ou com base de PDF tem efeitos moderados em Cmax (que varia de 73% até 87% do controlo) ou AUC0-6o (que varia de 91% até 103% de controlo). Não se notou efeito mínimo paràUC0-24o, que varia de 77% até 125% de controlo.

Tabela 4 5

Resultados de Farmacodinâmica do Nível de Glucose (Corrigidos para Glucose Endógena) para GRPs: GLP-I e

Exendin-4.

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Os resultados da resposta insulina (corrigidos para insulina endógena) mostram que os níveis de insulina pós- OGTT em animais de controlo são similares ou ligeiramente inferiores, comparados a valores pós-dose. A administração nasal de GLP-1 a 100 ug/kg está associada com até 2 vezes aumentada em insulina de 5 até 4 5 minutos pós -OGTT. Os níveis de insulina depois da dosagem de exendin-4 a 2, 10 e 20 pg/kg (formulação com base de EDTA) demonstraram que um aumento dependente da dose em insulina com níveis de pico são aproximadamente 0.7 vezes, 1.5 vezes e 4 vezes, respectivamente, abaixo dos valores de pré-dose para cada grupo. A resposta se limita aproximadamente 4 5 minutos pós- OGTT. Depois da administração nasal de exendin-4 na formulação com base de PDF a 2 ou 10 pg/kg dose, níveis de pico de insulina são 1.5 vezes ou 2.7 vezes, respectivamente, abaixo da pré-dose. A resposta se limita aproximadamente 45 minutos pós-OGTT.

Resultados do Esvaziamento Gástrico

A tabela 46 mostrnosresultados de acetaminofeno (esvaziamento gástrico). Em controlos, o pico de níveis de acetaminof eno (Cmax) de 73 ng/ml ocoreu 30 minutos põs-dose (Tmax).

Em animais administrados com GLP-1, notou-se uma Cmax ligeiramente inferior (66 ng/ml) ; no entanto, Tmax é maior o que sugere um atraso no esvaziamento gástrico neste nível de dose. A administração de exendin-4 na formulação abase de EDTÀ 2 ou 10 ug/kg ou formulações com base de PDR a 2 ug/kg é similar ao controlo para Tmax (30 até 4 5 minutos) e Cmax (aproximadamente 70 até 73 ng/ml) . A administração de exedin-4 na formação com base de EDTÀ 2 0 yg/kg ou formulações com base de PDF a 10 μg/kg demonstrou uma diminuição em Cmax (aproximadamente 51 até 54 ng/ml) e ao menos parà 20 pg/kg (formulação com base de EDTA) um perfil de exposição ligeiramente prolongado. Os resultados sugerem que o esvaziamento gástrico é impactado a estes níveis de dose.

Tabela 46

Resumo de Resultados de acetaminofeno GRP (Esvaziamento Gástrico)

<table>table see original document page 175</column></row><table> <table>table see original document page 176</column></row><table>

Resumo

Com base nos efeitos farmacológicos do GLP-I e exendin-4 com respeito a estimulação dependente da glucose de insulina libertada, as formulações intranasais. com base de EDTA e com base de PDF efetivamente administração o fármaco ativo nosobjetivos sistêmicos. A estimulação parà insulina libertada é dependente da dose.

Mostrou-se a modulação de níveis do pico (Cmax) ou exposição (AUC) para glucose sangüínea em animais administrados com GLP-I ou exendin-4, comparado com controlos. A estimulação de libertação de insulina e modulação do esvaziamento gástrico, por GLP-I e exendin-4 são bases farmacológicas similares para modulação do perfil da glucose sangüínea depois de uma carga de glucose oral.

A inibição do esvaziamento gástrico é umàcção farmacológica conhecida de GLP-I e exendin-4. A mudança em tempo parà concentração do piso (Tmax) ou concentração do pico (Cmax) paràcetaminofeno é consistente com a farmacologia induzida por GLP-I e exendin-4. Estes dados apoiam a eficácia das formulações de GLP-I e exendin-4 descritas nestes ensaios para uso no tratamento de transtornos metabólicos tais como obesidade e diabetes.

Ainda que invenção precedente tenha sido descrita em detalhe por meio de exemplos para fins de clareza de entendimento, será aparente ao técnico que certas mudanças e modificações são compreendidas pela descrição e podem ser practiçadas sem experimentação indevida do alcance das reivindicações anexas, as quais estão apresentadas por meio de ilustração, sem limitação.

Claims (17)

1. FORMULAÇÃO FARMACÊUTICA AQUOSA PARA ADMINISTRAÇÃO INTRANASAL, caracterizada por conter uma quantidade terapeuticamente efetiva de exendina-4 ou um análogo agonista da exendina-4, um agente de solubilização que intensifica a permeação, um quelante catiônico que intensifica a permeação, um amortecedor e opcionalmente um agente intensificador da viscosidade que intensifica a permeação, onde a. o agente de solubilização seleciona-se pelo menos a partir de um dos grupos que consistem de hidroxipropil-β-ciclodextrina, sulfobutiléter-β- ciclodextrina, dimetil-β-ciclodextrina, metil-β-ciclodextrina e Cremophor o, e b. o intensificador de^yiscosidade seleciona-se pelo menos um a partir do grupo quV insiste de gelatina, metilcelulose e hidroxipropilmâfei-icelu;Lose, e onde c. a formulação proporciona pelo menos 5% de permeação de exendina-4 em um ensaio de permeação de tecido in vifcro, tem uma viscosidade até 150 cps, tem um pH de 2 até 8 e é estável pelo menos duas semanas a 5°C.

2. FORMULAÇÃO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o agente de solubilização é metil-β-ciclodextrina.

3. FORMULAÇÃO, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a metil-β-ciclodextrina está presente numa concentração até 90 mg/ml.

4. FORMULAÇÃO, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que a metil-β-ciclodextrina está presente a 80 mg/ml.

5. FORMULAÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 até 4, caracterizado pelo fato de que se seleciona pelo menos um quelante do grupo que consiste de ácido etileno diamina tetracético e ácido etilenoglicol tetracético.

6. FORMULAÇÃO, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o quelante está presente em uma concentração até 10 mg/ml.

7. FORMULAÇÃO, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o quelante está presente a 5 mg/ml.

8. FORMULAÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 até 7, caracterizado pelo fato de que a concentração do agente de solubilização é 80 mg/ml e a concentração do quelante é 5 mg/ml.

9. FORMULAÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 até 8, caracterizado pelo fato de que o amortecedor é um amortecedor mono-ionogénico.

10. FORMULAÇÃO, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que se seleciona pelo menos um amortecedor mono-ionogénico do grupo que consiste de acetato, arginina e lactato.

11. FORMULAÇÃO, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o amortecedor mono-ionogénico é arginina.

12. FORMULAÇÃO, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que a arginina está presente em uma concentração maior ou igual a 2,8 mM.

13. FORMULAÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 até 12, caracterizado pelo fato de que o pH vai de 4,7 até 5,5.

14. FORMULAÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 até 13, caracterizado pelo fato de que o conservante não estar presente.

15. FORMULAÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 até 14, caracterizado pelo fato de que a viscosidade é de 1,5 até 10 cps.

16. FORMULAÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 até 15, caracterizado pelo fato de que a formulação é estável pelo menos por 4 semanas a 5°C.

17 . USO DE UMA FORMULAÇÃO FARMACÊUTICA AQUOSA PARA ELABORAR UM MEDICAMENTO, caracterizado pelo fato do medicamento ser administrado de forma intranasal a um sujeito para tratar uma doença metabólica seleccionada do grupo que consiste na hiperglicemia, diabetes mellitus insulino- dependente, diabetes gestacional, diabetes mellitus não insulino-dependente, obesidade ou dislipidemia para tratar condições beneficiadas suprimindo o apetite, aumentar a saciedade, promover a perda de peso, diminuir a ingestão de alimento, diminuir a velocidade do esvaziamento gástrico, reduzir a glucose no plasma ou promover a secreção de insulina.