BRPI0620626A2

BRPI0620626A2 - método para o aumento da capacidade de reserva de nitrogênio de plantas, do valor nutricional de forragem ou silagem, do teor de nitrogênio em uma planta ou parte de planta, construção de nucleotìdeos, método para produção de uma planta transformada e método para a determinação da expressão de zmlox em um tecido vegetal

Info

Publication number: BRPI0620626A2
Application number: BRPI0620626-3A
Authority: BR
Inventors: Kanwarpal S Dhugga; Laura M Appenzeller; Rajeev Gupta; Hari Kishan Rao Abbaraju
Original assignee: Pioneer Hi Bred Int
Priority date: 2005-12-20
Filing date: 2006-12-18
Publication date: 2011-11-16
Also published as: AR058374A1; CN101379191A; WO2007075557A9; AU2006331996A1; US20090293147A1; WO2007075557A2; WO2007075557A3; EP1963512A2; CA2634544A1; US20100100985A1; US20070157342A1

Abstract

MéTODO PARA O AUMENTO DA CAPACIDADE DE RESERVA DE NITROGêNIO DE PLANTAS, DO VALOR NUTRICIONAL DE FORRAGEM OU SILAGEM, DO TEOR DE NITROGêNIO EM UMA PLANTA OU PARTE DE PLANTA, CONSTRUçAO DE NUCLEOTIDEOS, MéTODO PARA PRODUçãO DE UMA PLANTA TRANSFORMADA E MéTODO PARA A DETERMINAçãO DA EXPRESSãO DE ZMLOX EM UM TECIDO VEGETAL A presente invenção provê métodos e composições para produzir e usar plantas transgênicas que apresentam capacidade aumentada de armazenar nitrogênio em comparação a plantas selvagens. Métodos da invenção compreendem induzir a super- expressão de proteínas vegetativas de reserva (VSPs) derivadasde monocotiledóneas em plantas, particularmente em monocotiledóneas. Em alguns avanços, pelo menos uma construção de nucleotídeos compreendendo a seqúência codificante da proteína ZmLox6, ou um fragmento ativo, ou variante desta, inserida em uma planta. Dependendo do objetivo, a construção de nucleotídeo pode opcionalmente compreender uma seqúência codificante operacionalmente ligada a um peptídeo sinal de localização vacuolar ou um peptídeo transito para plastídio de modo a direcionar a estocagem da proteína ZmLox6, ou um fragmento ativo, ou variante desta nos compartimentos vacuolar ou plastídico, respectivamente, das células nas quais a VSP é expressa. A invenção ainda fornece métodos para produzir plantas com aumentado teor de nitrogênio e/ou aumentado valor nutricional, o que é desejável para culturas comerciais, incluindo aquelas usadas para forragem, silagem, e produção de grãos. Adicionalmente, provê a presente invenção um método para produção de uma planta transformada compreendendo a transformação de uma célula de planta com uma construção de nucleotídeos, cultivo de dita célula de planta sob condições de crescimento e regeneração da planta transformada.

Description

MÉTODO PARA O AUMENTO DA CAPACIDADE DE RESERVA DE NITROGÊNIO DE PLANTAS, DO VALOR NUTRICIONAL DE FORRAGEM OU SILAGEM, DO TEOR DE NITROGÊNIO EM UMA PLANTA OU PARTE DE PLANTA, CONSTRUÇÃO DE NUCLEOTÍDEOS, MÉTODO PARA PRODUÇÃO DE UMA PLANTA TRANSFORMADA E MÉTODO PARA A DETERMINAÇÃO DA EXPRESSÃO DE ZMLOX EM UM TECIDO VEGETAL

CAMPO DA INVENÇÃO

A invenção está relacionada com a área de bioquímica e biologia molecular. Mais especificamente, esta invenção objetiva o aumento da capacidade de reserva de nitrogênio em uma planta conferida pela expressão de uma proteína de reserva vegetativa.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

A demanda global para fertilizantes nitrogenados para a produção agrícola atualmente está em cerca de 90 milhões de toneladas métricas, por ano e é projetada para aumentar para aproximadamente 240 milhões de toneladas métricas até o ano de 2050. Uma substancial quantidade de nitrogênio aplicada durante a produção de culturas é perdida através de lixiviação e desnitrificação, que não apenas aumenta o custo da produção agrícola, mas contribui para a poluição ambiental. Por exemplo, nitrato lixiviado polui o lençol freático, enquanto o escoamento superficial da água de terras agrícolas ricas em nitrogênio causa crescimento de algas em rios e deltas. O excesso de nitrogênio em águas subterrâneas (lençol freático) e o escoamento superficial da água podem causar também problemas de saúde em humanos e animais devido ao alto consumo de nitrogênio na sua forma nitrato.

Várias técnicas de produção de culturas têm sido propostas para reduzir a perda de nitrogênio dos campos de culturas. As melhores práticas agrícolas têm focado na redução da quantidade de nitrogênio liberado dos campos agrícolas através do melhoramento das técnicas de aplicação de nitrogênio, empregando sistemas de cultivo alternativos, e uso de melhores métodos de drenagem. No entanto, tais práticas têm sofrido com a pouca aceitação entre os agricultores, devido, em parte, à falta de incentivos apropriados. Embora o tratamento público de águas residuais de plantas tenha diminuído o conteúdo de nitrogênio, em parte pela conversão do nitrato em amônia, o tratamento adicional para remover o nitrato é incomum devido aos altos custos associados. Zonas úmidas naturais têm sido utilizadas para remover nutrientes a um menor custo e melhor efetividade comparada aos tratamentos de plantas convencionais, mas tais usos têm causado conseqüências biológicas não intencionais como o crescimento seletivo de algumas espécies vegetais.

Uma alternativa para os métodos descritos acima é o desenvolvimento de novas variedades de culturas que sejam mais eficientes na absorção e utilização do nitrogênio do solo. Muitas plantas são conhecidas por seqüestrar excesso de nitrogênio em suas células vegetativas através do acúmulo de uma classe de proteínas referenciadas como proteínas de reserva vegetativas (VSPs). VSPs variam no tamanho em cerca de 15 a 100 kDa, e foram identificadas a partir de outras classes de proteínas tais como fosfatases alcalinas, quitinases, lectinas e lipoxigenases. A ocorrência de VSPs tem sido relatada em uma ampla variedade de espécies de plantas perenes e anuais incluindo soja, trevo, alfafa, Medicago, Arabidopsis, canola, álamo, amora negra (Morus nigra), e pêssego. No entanto, a ocorrência de VSPs em monocotiledôneas não foram, até o momento, estabelecida.

Então, a presente invenção resolve a necessidade para aumentar a capacidade de reserva de nitrogênio de plantas, particularmente monocotiledôneas, através do aumento da expressão de VSPs derivadas de monocotiledôneas.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Métodos e composições são providos para aumentar a capacidade de reserva de nitrogênio de uma planta, particularmente dentro de células vegetativas da planta. Os métodos da invenção compreendem o aumento da expressão de proteínas de reserva vegetativas (VSPs) dentro das células de uma planta, particularmente a expressão de uma VSP derivada de monocotiledônea ou fragmento biologicamente ativo ou variante destes que tenha propriedades de proteínas VSP. Desta maneira, os métodos compreendem a introdução dentro de uma planta de interesse de pelo menos uma construção de nucleotídeo compreendendo uma seqüência de polinucleotídeo que inclui uma seqüência codificadora para uma VSP derivada de monocotiledônea ou um fragmento ativo ou variante desta, onde a seqüência codificadora é operacionalmente ligada a um promotor que dirige a expressão em uma célula vegetal. Em algumas concretizações, a VSP é a proteína lipoxigenase tipo-VSP de milho ZmLox6 descrita na SEQ ID NO: 2, e o constructo de nucleotídeo compreende a seqüência codificadora para ZmLox6 descrita entre os nucleotídeos 62-2737 da SEQ ID NO: 1 ou na SEQ ID NO: 3, uma seqüência de nucleotídeo codificando a proteína ZmLox6, ou uma seqüência de nucleotídeo codificando um fragmento biologicamente ativo ou variante da proteína ZmLoxô. Dependendo da localização subcelular desejada para seqüestro da VSP, o constructo de nucleotídeo pode opcionalmente compreender uma seqüência codificando para um sinal de endereçamento vacuolar ou peptídeo de trânsito de plastídeos para direcionar o armazenamento da VSP ou fragmento ou variante destas dentro do compartimento vacuolar ou dos plastídeos, respectivamente, das células vegetais onde a VSP ou fragmento ou variante destas é expressa. Qualquer promotor funcional pode ser usado para dirigir a expressão da VSP ou fragmento ou variante destes, com ou sem o sinal de endereçamento vacuolar ou peptídeo de trânsito de plastídeos, incluindo, mas não estando limitado a promotores constitutivos, induzíveis e tecido- específicos. Em algumas concretizações, o promotor operacionalmente ligado é um promotor expresso preferencilamente em folhas tanto que os níveis de VSP, mais particularmente ZmLox6 ou fragmento ou variante destes, são aumentados preferencialmente dentro dos tecidos foliares da planta. 0 promotor pode opcionalmente ser escolhido para prover a expressão da VSP ou fragmento ou variante destes preferencialmente em um tipo de célula, como, por exemplo, em células do mesófilo ou em células da bainha dos feixes vasculares, para minimizar o impacto do acúmulo de VSP em processos metabólicos celulares.

Através do aumento da capacidade de reserva de nitrogênio dentro das células de uma planta, a resposta geral da planta ao nitrogênio aplicado no solo pode ser aumentada, levando a melhorar a utilização de nitrogênio disponível no solo. Os métodos da invenção também contribuem para o aumento do conteúdo de nitrogênio de uma planta, particularmente dentro dos tecidos de folhas, de caules, e de sementes, o que aumenta de maneira produtiva o valor nutricional das plantas cultivadas para forragem e silagem, bem como o valor nutricional de sementes, particularmente grãos de espécies de culturas agrícolas.

Composições da invenção incluem constructos de nucleotídeo compreendendo seqüências, operacionalmente ligadas, condificadoras para sinal de endereçamento vacuolar e VSP de milho ZmLox6 ou um fragmento biologicamente ativo ou um variante destes tendo propriedades da VSP, e um promotor operacionalmente ligado. 0 promotor operacionalmente ligado pode ser qualquer promotor que dirija a expressão em uma célula vegetal, incluindo, mas não limitado a um promotor constitutivo, induzível ou tecido-específico. Adicionais provisões da presente invenção são plantas, células de plantas, tecidos de plantas, e sementes transgênicas compreendendo esses constructos de nucleotídeos. Esses constructos encontram uso nos métodos da invenção para aumentar a capacidade de reserva de nitrogênio de células vegetativas de plantas, para aumentar o conteúdo de nitrogênio de uma planta ou parte da planta, para aumentar o valor nutricional de plantas cultivadas para forragem ou silagem, e para aumentar o valor nutricional da semente.

Adicionalmente, provê a presente invenção um método para produção de uma planta transformada compreendendo a transformação de uma célula de planta com uma construção de nucleotídeos, cultivo de dita célula de planta sob condições de crescimento e regeneração da planta transformada.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

Figura 1 - mostra vetores carregando a seqüência codificante de ZmLox6 sob o controle do promotor da subunidade pequena da Rubisco (SSU). Figura IA mostra um vetor sem as seqüências codificantes do peptídeo sinal (SP) e sinal de endereçamento vacuolar (VTS) de proaleurina de Zea mays (ZM) operacionalmente ligadas. Figura IB mostra um vetor com a seqüência codificante operacionalmente ligada de SP e VTS de proaleurina de Zea mays (ZM).

Figura 2 mostra vetores carregando a seqüência codificante de ZmLox6 sob o controle do promotor da fosfoenolpiruvato carboxilase (PEPC1) de Zea mays (ZM). Figura 2A mostra um vetor sem a seqüência codificando para SP e VTS da proaleurina de Zea mays operacionalmente ligada. Figura 2B mostra um vetor com a seqüência operacionalmente ligada codificante para SP e VTS da proaleurina de Zea mays. Figura 3 mostra vetores carregando a seqüência codificante de ZmLox6 sob o controle do promotor constitutivo UBI de Zea mays (ZM) . Figura 3A mostra um vetor sem a seqüência operacionalmente ligada de SP e VTS da proaleurina de Zea mays. Figura 3B mostra um vetor com a seqüência codificante operacionalmente ligada de SP e VTS da proaleurina de Zea mays.

Figura 4 - mostra resultados de SDS-PAGE para a fração solúvel de homogeneizados de diferentes tecidos extraídos de plantas crescidas na presença de quatro diferentes níveis de nitrogênio. Três grupos de quatro colunas são mostrados, correspondendo à fração solúvel do homogeneizado da folha (grupo esquerdo), raiz (grupo do meio) e caule (grupo da direita). Dentro de cada grupo, existem quatro colunas correspondendo aos homogeneizados de plantas crescidas na presença de cada uma das concentrações: sem nitrato ("0"), nitrato 1 mM ("1"), nitrato 100 mM ("100"), ou uma combinação de amônia 50 mM e nitrato 50 mM ("50+50"). A seta no grupo da folha indica uma banda de polipeptídeo de aproximadamente ~100 kDa identificada no tecido foliar em altos níveis de exposição à nitrogênio.

Figura 5 mostra 12 diferentes seqüências de peptídeos identifiçadas após a retirada da banda de polipeptídeo de aproximadamente ~100 kDa indicada na Figura 4, digestão, e seqüenciamento dos peptídeos proteolíticos coletados. Como mostrado, esses peptídeos correspondem a vários segmentos do polipeptídeo ZmLox6 (SEQ ID NO: 2) . Figura 6 - mostra uma comparação filogenética das proteínas Lox com a ZmLox6 de milho e outras espécies de plantas.

Figura 7 - mostra um alinhamento de seqüências dos polipeptideos ZmLox6 (SEQ ID NO: 2) e ZmLoxlO (SEQ ID NO: 4) usando o vetor NTI. Regiões conservadas estão em negrito, com as correspondências exatas dos resíduos mostradas em cinza.

Figura 8 - mostra um gráfico comparando a indução da expressão do gene ZmLox6 na folha V5 de milho no estágio V5 do desenvolvimento após injúria. Indução da expressão (medida em ppm) é mostrada ao longo do tempo em 0, 3, 12 e 24 horas após injúria.

Figura 9 - mostra um gráfico comparando a indução da expressão do gene ZmLox6 no nódulo da raiz de milho no estágio V5 do desenvolvimento após injúria. A indução da expressão (medida em ppm) é mostrada ao longo do tempo em 0, 3, 12 e ·24 horas após injúria (grupo "VI"), quando comparado com controles experimentais sem injúrias(grupo "U").

Figura 10 - mostra os níveis de expressão de ZmLoxlO nas folhas de B73, ILP, e IHP.

Figura 11 - mostra a expressão e purificação da proteína ZmLox6 no vetor pET28A em células de "Rosetta" e asolubilidade da treferida proteína. Note a alto nível de expressão da proteína em -100 kDa.

Figuras 12A e 12B mostram géis de SDS (esguerda) e os Western-blots correspondentes (direita) das diferentes partes da folha, feixes vasculares e células do mesófilo derivadas da bainha foliar. Nas pistas, pode-se observar o perfil protéico de partes de folhas 3 e 4, no estágio 6 de folha, de B73; onde: 1=3B, 2=3M, 3=3T, 4=4B, 5=4M, 6=4T, 7= feixes vasculares da bainha, e 8= mesólfilo da bainha. B representa a base; Μ, o meio; e T é a ponta da lâmina foliar. Notar a expressão da proteína ZmLox6

principalmente nas células do mesófilo. O anticorpo anti- ZmLox6 foi usado na diluição de 1:500.000.

Figura 13 - Titulação do anticorpo anti-Lox6 para desenvolvimento de ensaio de ELISA. A titulação para diluição do anticorpo é dada para a proteína Lox6 onde a absorvância foi linear em diluições a partir de 1:15000 a 1:40000.

Figura 14 - Expressão da proteína Lox6 em folhas de milho. Plantas transgênicas da geração To expresando o gene ZmLox6. Múltiplos eventos transgênicos foram obtidos de 6 diferentes construções (para informação do vetor, se referir à Fig. 2). Abreviações: Ubi-Intron, promotor de ubiquitina de milho junto com uma parte de um íntron; PEPC, promotor fosfoenolpiruvato carboxilase de milho; SSU, promotor da pequena subunidade Rubisco de milho; VTS, sinal de endereçamento vacuolar da aleurina de milho. Apenas aqueles eventos que têm inserções de transgenes de cópia simples são mostrados. A figura mostra um Western blot obtido com o anticorpo anti-Lox6 em alguns dos eventos identificados com asteriscos. Resultados de Western confirmam os resultados de ELISA. A expressão média em uma linhagem não-transgênica foi 25 na escala usada no eixo Y.

Figura 15 - Remobilização de diferentes proteínas das folhas das plantas transgênicas To obtidas com o constructo gênico PEPC1-L0X6. Abreviações: Rubisco, ribulose bisfosfato carboxilase; NR, nitrato redutase; PEP-C, fosfoenolpiruvato carboxilase.

Figura 16 - Expressão de ZmLox6 nos campos cultivados com eventos Tl derivados do constructo PEPC1PRO-Lox6 (Fig. 2A). Contém remobilização de diferentes proteínas depois do florescimento em milho em eventos transgênicos expressando ZmLox6 dirigidos pelo promotor PEPCl. Para cada grupo, E indica dados associados com a linhagem controle usada para transformação. Cada barra representa dados de 128 plantas através de múltiplos eventos. Também são mostrados os níveis de expressão das proteínas PEPC, Rubisco, e nitrato redutase como quantificado por ELISA. O sufixo E permanece para os resultados da linhagem usada para transformação, que age como um controle. A folha da espiga de cada uma das 16 plantas cultivadas em campo foi amostrada em intervalos semanais através de 8 eventos começando 2 semanas antes do florescimento e terminando 4 semanas depois quando as folhas estiverem velhas. Depois da extração, as proteínas das amostras da folha foram sujeitadas à ELISA usando anticorpos contra ZmLox6, ZmPEPC, Chlamydomonas Rubisco que nós mostramos reconhecer especificamente ambas as proteínas Rubisco de milho, e nitrato redutase de milho. Os resultados de ELISA são expressos em uma escala relativa com relação ao valor máximo através de plantas transgênicas ou controle sendo 100. Os resultados claramente demonstram um nível 5 vezes mais alto da expressão da proteína Lox6 em eventos transgênicos.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

A presente invenção provê métodos e composições para aumentar a capacidade de reserva de nitrogênio de uma planta, aumentando assim o conteúdo de nitrogênio em uma planta ou parte da mesma, comparada com aquela obtida com um tipo selvagem ou planta controle. Métodos da invenção compreendem a alteração de uma planta geneticamente para expressar ou super expressar uma proteína de reserva vegetativa derivada de monocotiledônea (VSP) ou um fragmento biologicamente ativo ou variante destes. Aumentando a expressão de uma VSP derivada de monocotiledônea ou fragmento ou variante destes dentro das células de uma planta, particularmente células vegetativas, resulta em uma planta com melhor responsividade para o nitrogênio aplicado ao solo e uma melhor utilização do nitrogênio disponível no solo. Plantas cultivadas na agronomia modificadas geneticamente de acordo com os métodos revelados aqui beneficiamente aliviam problemas associados com lixiviação e desnitrificação de nitrogênio fornecido ao solo na forma de fertilizantes. Através do aumento da capacidade de reserva de nitrogênio dentro das células de uma planta, os métodos da invenção fornecem plantas com maior conteúdo de nitrogênio, particularmente dentro de folhas, caules, e sementes. Os métodos da invenção podem então ser usados para produzir plantas cultivadas para forragem e silagem com valor nutricional aumentado, e para produzir sementes, particularmente grãos, com valor nutricional aumentado.

De acordo com a presente invenção, uma VSP ou um fragmento biologicamente ativo ou um variante destes é um polipeptideo que tem propriedades VSP, i.e., um polipeptideo que serve como um reservatório para estocar o excesso de nitrogênio que pode mais tarde ser liberado e remobilizado dentro da planta para suportar o metabolismo de tecidos de plantas existentes, por exemplo, durante períodos de estresse transiente tais como deficiência hídrica e/ou nutricional, e/ou para suportar o crescimento e desenvolvimento de novos tecidos. Um polipeptideo que tem propriedades VSP é referido como um "VSP," um "polipeptideo VSP", ou uma "proteína VSP," e um polinucleotídeo que codifica um polipeptideo que tem propriedades VSP é referido com um "polinucleotídeo VSP". VSP ou polinucleotídeo VSP "derivado de monocotiledônea" destina- se a VSP ou polinucleotídeo VSP ocorrendo naturalmente dentro de espécies monocotiledôneas, ou que tenha sido derivado de um polinucleotídeo VSP ou VSP que ocorre naturalmente dentro de uma espécie de monocotiledônea, onde a derivação é através de manipulação genética de VSP ou polinucleotídeo VSP de monocotiledôneas e/ou o uso do polinucleotídeo VSP de monocotiledônea para isolar polinucleotídeos VSP codificando homólogos VSPs de outras espécies de plantas.

Em particular, Polinucleotídeos VSP derivados de monocotiledôneas para uso nos métodos da presente invenção incluem, por exemplo, a seqüência codificante do gene ZmLoxô lipoxigenase tipo VSP de milho conforme estabelecido nos nucleotídeos 62-2737 da SEQ ID NO: 1 ou na SEQ ID NO: 3, seqüências codificando a proteína ZmLox6 conforme estabelecido na SEQ ID NO: 2, e fragmentos e variantes destes como definido abaixo. Polipeptídeos VSP derivados de monocotiledôenas da presente invenção incluem, por exemplo, a proteína ZmLox6 conforme estabelecida na SEQ ID NO: 2 e fragmentos biologicamente ativos e variantes destes como definido aqui abaixo.

Conforme descrito mais plenamente na seção EXPERIMENTAL, a proteína ZmLox6 exibe as características de uma VSP, e então representa uma lipoxigenase tipo VSP. Por exemplo, a proteína ZmLoxô é induzida mediante fornecimento de altos níveis de N no meio de crescimento e é mais altamente expressa nas folhas, de maneira semelhante à VSP de soja referida como VLX-D (Tranbarger, et al., (1991) Plant Cell 3:973-988). Tendo em vista as suas propriedades VSP, ZmLox6 é referida aqui como uma VSP, e seqüências codificando ZmLox6 são consideradas polinucleotideos VSP. Embora a proteína ZmLox6 exiba propriedades VSP e seja, assim, uma lipoxigenase tipo VSP, é reconhecido que a proteína ZmLox6 ou variantes desta podem exibir outras atividades biológicas associadas com outros membros das proteínas da família lipoxigenase (veja, por exemplo, U.S. Patent No. 6,921,847; aqui incorporada por referência em sua totalidade).

De acordo com a presente invenção, "aumento da capacidade de reserva de nitrogênio" de uma planta, ou parte da planta ou célula da mesma, refere-se a um aumento na fração proteica solúvel total da planta, ou parte da planta ou célula da mesma, de pelo menos 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40% ou 50% relativo ao observado em uma planta controle ou tipo selvagem, ou parte da planta ou célula da mesma, respectivamente. Através do aumento da capacidade de reserva de nitrogênio, particularmente dentro dos tecidos foliares e caulinares, pode ser aumentado o conteúdo de nitrogênio e, consequentemente, o valor nutricional, de uma planta cultivada para forragem e silagem.

Forragem é um material de planta herbácea (incluindo gramíneas e leguminosas) ingerido por animais que pastam, enquanto silagem é fermentada, forragens de alta umidade geralmente são utilizadas para alimentar animais ruminantes. Plantas usadas na produção de silagem incluem milho, grão de sorgo (Milo), gramineas perenes (tais como grama-bermudas, capim-estrela, e hemártria (Hemarthria altíssima)), gramineas anuais (tais como sorgo forrageira, híbridos sorgo-sudão, milheto, e peguenos grãos e azevém), leguminosas (tais como alfafa, trevo violeta e outras leguminosas de inverno, e leguminosas de verão incluindo mata-pasto-preto (Indigofera hirsuta L.), trevo alyce, aeschynomene, e rizoma de amendoim perene), cana-de-açúcar, aveia, e combinações de culturas tais como grão de sorgo e soja ou aveia e ervilha.

Embora o milho seja primeiramente uma fonte de silagem para pasto de gado leiteiro, a silagem de milho é relativamente baixa em conteúdo de proteína e deve ser suplementada com alimentos de maior alto teor de proteína tais como farelo de soja. Embora a soja produza tecidos vegetais com níveis de nitrogênio mais altos do que aqueles encontrados em milho, a soja não é adequada para produção de silagem. Portanto, o desenvolvimento de monocotiledôneas com aumento da expressão de polipeptídeos VSP tais como ZmLoxô ou variantes destes ativos biologicamente, poderia melhorar o seqüestro de nitrogênio e o valor nutricional de cultivares para forragem e silagem.

De acordo com a presente invenção, "aumentar o conteúdo de nitrogênio de uma planta, ou parte da planta" usada para forragem e silagem refere-se a um aumento na % total de nitrogênio dentro da planta ou parte da mesma, medida com base no peso seco de pelo menos 1%, 2%, 5%, 10%, 20% ou 50% relativo aquele observado para planta tipo selvagem ou controle, ou parte da planta. Onde a semente é de interesse agronômico, tal como em cultivares de grãos, os métodos da invenção podem aumentar a produção da semente, e/ou aumentar o conteúdo de nitrogênio da semente, e/ou aumentar o valor nutricional da semente relativo à semente obtida de uma planta controle nativa, como o excesso de nitrogênio seqüestrado dentro de tecidos foliares e caulinares na forma da proteína ZmLox6 ou variantes da mesma podem ser remobilizados para suportar uma maior produção de sementes e sementes suficientes, particularmente quando os níveis de nitrogênio no solo são limitados para o desenvolvimento reprodutivo. De acordo com a presente invenção, "aumentar o conteúdo de nitrogênio da semente" refere-se a um aumento na % de nitrogênio dentro da semente medida com base no peso seco de pelo menos 1%, 2%, 5%, 10%, 20%, ou 50% relativo aquele observado para semente da planta tipo selvagem ou controle.

Os métodos da presente invenção compreendem aumentar a expressão em plantas de VSPs derivadas de monocotiledôneas, particularmente a expressão da lipoxigenase ZmLox6 tipo VSP de milho ou fragmento biologicamente ativo ou variante destes tendo propriedades VSP. Então, em algumas concretizações, os métodos compreendem a introdução dentro de uma planta de interesse de pelo menos um constructo de nucleotídeo compreendendo uma seqüência de nucleotídeo codificando a proteína ZmLox6, ou um fragmento biologicamente ativo, ou variante destes, operacionalmente ligado a um promotor que dirige a expressão em uma célula vegetal. 0 constructo de nucleotideo pode opcionalmente compreender uma seqüência codificante para um sinal de endereçamento vacuolar, operacionalmente ligada, ou peptideo de trânsito de plastideos a fim de direcionar a proteína ZmLox6 ou fragmento ou variante destes para dentro de um compartimento vacuolar ou compartimento plastidico, respectivamente, da célula vegetal na qual esta proteína é expressa. Em concretizações particulares, a VSP é ZmLox6 ou fragmento biologicamente ativo ou variantes deste e a planta é uma monocotiledônea tal como milho.

Qualquer promotor pode ser usado para dirigir a expressão da VSP derivada de monocotiledônea, por exemplo, a proteína ZmLox6 ou fragmento biologicamente ativo ou variante destes tendo propriedades VSP, incluindo, mas não estando limitado a, promotores descritos aqui abaixo. Então, por exemplo, em algumas concretizações, a expressão de VSP, por exemplo, a proteína ZmLox6 ou fragmento biologicamente ativo ou variante desta, é dirigida por um promotor constitutivo para expressão nas células por toda a planta na maior parte do tempo e na maior parte dos tecidos, ou um promotor induzível onde a expressão é induzida em resposta a estímulos, por exemplo, em resposta a injúrias, compostos químicos aplicados externamente, ou estresse ambiental. Em outras concretizações, a expressão de VSP, por exemplo, a proteína ZmLox6 ou fragmento biologicamente ativo ou variante desta, é dirigida por um promotor tecido-específico onde a expressão ocorre preferencialmente dentro de um tecido desejado. Em tal concretização, o promotor é especifico de folha para prover expressão preferencial dentro de células dos tecidos foliares.

Ainda em outras concretizações, o promotor é escolhido para prover expressão de VSP, por exemplo, proteína ZmLoxô ou fragmento biologicamente ativo ou variante deste, preferencialmente dentro de células de folha, por exemplo, nas células de mesófilo ou células da bainha do feixe vascular, para prover acúmulo localizado de VSP ou fragmento ou variante destes dentro dessas células do tecido foliar. Tais promotores são referenciados aqui como "promotores específicos de células do mesófilo" ou "promotores específicos de células da bainha do feixe", e incluem aqueles promotores descritos aqui. Embora tecidos foliares de plantas C3 geralmente compreendam células da bainha do feixe frouxamente organizadas, o volume de enzimas fotossintéticas e maquinaria fotossintética associada estão contidos dentro dos cloroplastos das células de mesófilo mais abundantes. Onde a expressão preferencial de VSP ou fragmento biologicamente ativo ou variantes destes é direcionada para dentro das células do mesófilo das folhas de uma planta C3, o constructo de nucleotídeo compreende a seqüência codificante para VSP de interesse ou fragmento ou variantes desta, operacionalmente ligada a um promotor específico de células de mesófilo podendo opcionalmente compreender um sinal de endereçamento vacuolar para dirigir a VSP expressa ou fragmento ou variante destes para dentro do compartimento vacuolar dessas células para minimizar o impacto nos cloroplastos e na função celular.

As diferentes divisões das funções fotossintéticas entre as células do mesófilo e as células da bainha do feixe vascular das plantas C4 apresentam diferentes oportunidades de armazenar nitrogênio que podem vantajosamente ser manipuladas para aumentar a capacidade de reserva de nitrogênio dessas plantas. Os cloroplastos menos abundantes dentro das células do mesófilo de uma planta C4 tal como milho contém pouco ou nenhuma Rubisco, que é concentrada dentro dos cloroplastos abundantes das células da bainha do feixe. Sem estar obrigado pela teoria, espera-se que o compartimento plastidial das células do mesófilo dentro das folhas de uma planta C4 pode prover um reservatório extra para armazenamento de nitrogênio na forma de VSP derivada de monocotiledônea ou fragmento ou variante desta, além daquela provida nos compartimentos citoplasmáticos e vacuolares encontrados em ambas as células do mesófilo e da bainha do feixe do tecido foliar de uma planta C4, impactando minimamente na função do cloroplasto.

É reconhecido que a expressão preferencial dentro de ambas as células de mesófilo e da bainha do feixe de uma planta C4 pode ser desejável. Isso pode ser conseguido, por exemplo, através da introdução dentro da planta, quer como um simples constructo de nucleotideo ou como múltiplos constructos de nucleotídeos, de pelo menos um polinucleotídeo compreendendo a seqüência codificante da VSP de interesse ou fragmento ou variante desta operacionalmente ligada a um promotor que dirige preferencialmente a expressão de VSP ou fragmento ou variante desta dentro das células do mesófilo, e pelo menos outro polinucleotídeo compreendendo uma seqüência codificante para a VSP de interesse ou fragmento ou variante destes operacionalmente ligados a um promotor que dirige a expressão de VSP ou fragmento ou variante destes dentro das células da bainha do feixe. Quando o VSP ou fragmento ou variante destes é expresso preferencialmente dentro das células do mesófilo e/ou das células da bainha do feixe de plantas C4, por exemplo, milho, o(s) constructo (s) de nucleotídeos pode opcionalmente compreender uma seqüência operacionalmente ligada codificando para um sinal de endereçamento vacuolar para dirigir a expressão de VSP ou fragmento ou variante destes dentro do compartimento vacuolar das células do mesófilo ou células da bainha do feixe. Quando a VSP, ou fragmento ou variante destes, é expressa preferencialmente dentro das células do mesófilo de uma planta C4, sozinha ou em combinação com a expressão preferencial nas células da bainha do feixe, o constructo de nucleotídeo para ser introduzido dentro da planta pode ser projetado de modo que o polinucleotídeo codifique um peptídeo de trânsito vacuolar operacionalmente ligado conforme referido acima, ou pode ser projetado de modo que o polinucleotídeo codifique um peptídeo de trânsito de plastídeo operacionalmente ligado, por exemplo, um peptideo de trânsito de cloroplasto, para dirigir a expressão de VSP ou fragmento ou variante destes para dentro do compartimento do plastideo das células do mesófilo.

Através do aumento de uma VSP derivada de monocotiledônea, por exemplo, a proteína ZmLox6 ou fgragmento biologicamente ativo ou variante desta, dentro de uma planta, a capacidade de reserva de nitrogênio dentro da planta pode ser aumentada, produzindo um aumento global no conteúdo total de nitrogênio na planta dentro de um ou mais tecidos de interesse. Desta maneira, os métodos da invenção encontram uso no aumento do conteúdo total de nitrogênio e no valor valor nutricional das plantas que são utilizadas para forragem e silagem, e aumentam o conteúdo total de nitrogênio e valor nutricional da semente, por exemplo, em grãos de plantas cultivadas.

Embora as seqüências codificantes de VSP derivadas de monocotiledôneas descritas aqui e fragmentos biologicamente ativos e variantes destas possam ser usadas para aumentar a capacidade de reserva de nitrogênio de qualquer planta de interesse, a seqüência codificante de ZmLox6, e fragmentos e variantes desta, encontra particular uso no aumento da capacidade de reserva de nitrogênio, conteúdo de nitrogênio nos tecidos, e valor nutricional de plantas monocotiledôneas, por exemplo milho, como essa VSP tem evoluído para funcionar dentro do ambiente celular de monocotiledôneas. Além disso, é reconhecido que o aumento da capacidade de reserva de nitrogênio de uma planta pode produtivamente prover uma utilização mais eficiente de nitrogênio do ambiente ao mesmo tempo que fornece à planta reserva de nitrogênio em excesso que pode ser mobilizada durante períodos posteriores do desenvolvimento da planta, tal como durante o desenvolvimento e preenchimento da semente, particularmente quando a planta está sujeita à estresse hídrico e/ou de nutrientes.

Os métodos da invenção englobam o uso do polinucleotídeo VSP ou proteína isolada ou substacialmente purificada, incluindo a seqüência codificante de ZmLox6 e proteína, a fim de aumentar a capacidade de reserva de nitrogênio de uma planta, para aumentar o conteúdo de nitrogênio e valor nutricional de uma planta cultivada para forragem e silagem, e para aumentar o conteúdo de nitrogênio e valor nutricional da semente, particularmente grãos de plantas cultivadas na agricultura. Um polinucleotídeo ou uma proteína "isolado(a)" ou "purificado (a)", ou porção biologicamente ativa destes, é substancialmente ou essencialmente livre de componentes que normalmente acompanham ou interagem com o polinucleotídeo ou proteína conforme encontrados em seu ambiente natural. Então, um polinucleotídeo ou uma proteína isolada ou purificada é substancialmente livre de outros materiais celulares, ou meio de cultura quando produzidos por técnicas de recombinação, ou substancialmente livre de precursores químicos ou outros elementos químicos quando sintetizados quimicamente. Otimamente, um polinucleotídeo "isolado" é livre de seqüências (seqüências codificando proteínas de maneira otimizada) que naturalmente flanqueiam o polinucleotídeo (i.e., seqüências localizadas nas extremidades 51 e 3' do polinucleotídeo) no DNA genômico do organismo do qual o polinucleotídeo é derivado. Por exemplo, em várias concretizações, o polinucleotídeo isolado pode conter menos do que cerca de 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0.5 kb ou 0.1 kb de seqüência de nucleotídeos que naturalmente flanqueiam o polinucleotídeo no DNA genômico da célula na qual o polinucleotídeo é derivado. Uma proteína que é substancialmente livre de material celular inclui preparações de proteína tendo menos do que cerca de 30%, 20%, 10%, 5% ou 1% (por peso seco) de proteínas contaminantes. Quando a proteína da invenção ou porção biologicamente ativa da mesma é produzida por recombinação, meio de cultura ótimo representa menos do que cerca de 30%, 20%, 10%, 5% ou 1% (por peso seco) de precurssores químicos ou químicos de proteínas de não- interesse.

O uso de fragmentos e variantes de polinucleotídeos VSP derivados de monocotiledôneas e de polipeptídeos codificados por estes é também englobado pela presente invenção. Dependendo do contexto, "fragmento" refere-se a uma porção do polinucleotídeo ou uma porção da seqüência de aminoácido e, conseqüentemente, proteínas por estes codificadas. Fragmentos de um polinucleotídeo podem codificar fragmentos de proteínas que conservam a atividade biológica da proteína original e por isso conferem propriedades VSP. Então, fragmentos de uma seqüência de nucleotideos podem variar de pelo menos cerca de 20 nucleotideos, cerca de 50 nucleotideos, cerca de 100 nucleotideos e até o comprimento total de um polinucleotideo codificando um polipeptideo VSP.

Um fragmento de polinucleotideo VSP que codifica uma porção biologicamente ativa de um polipeptideo VSP codificará pelo menos 15, 25, 30, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850 ou 875 aminoácidos contíguos, ou até um número total de aminoácidos presentes no comprimento total do polipeptideo VSP (por exemplo, 892 aminoácidos para o polipeptideo ZmLox6 da SEQ ID NO: 2). Uma porção de um polipeptideo VSP que pode carregar características da proteína inteira pode ser preparada através do isolamento de uma porção do polinucleotideo VSP, expressando a porção codificada do polipeptideo VSP (por exemplo, através da expressão recombinante in vitro) , e avaliando a atividade da porção codificada do polipeptideo VSP. Polinucleotideos que são fragmentos de um polinucleotideo VSP compreendem pelo menos 16, 20, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 800, 900, 1.000, 1.100, 1.200, 1.300, 1.400, 1.500, 1.600, 1.700, 1.800, 1.900, 2.000, 2.100, 2.200, 2.300, 2.400, 2.500, 2.600 ou 2.650 nucleotideos contíguos, ou até o número de nucleotideos presentes no comprimento total do polinucleotideo VSP (por exemplo, 2.909 nucleotideos contíguos para a a seqüência de nucleotideos ZmLox6 da SEQ ID NO: 1 ou 2.676 nucleotideos contíguos para a seqüência codificando ZmLox6 da SEQ ID NO: 3).

O termo "variantes" refere-se a seqüências substancialmente similares. Para polinucleotideos, um .variante compreende um polinucleotídeo tendo deleções (i.e., truncamentos) nas extremidades 5' e/ou 3'; deleções e/ou adições de um ou mais nucleotídeos em um ou mais sítios internos no polinucleotídeo nativo; e/ou substituição de um ou mais nucleotídeos em um ou mais sítios no polinucleotídeo nativo. Conforme usado aqui, um polinucleotídeo "nativo" ou polipeptídeo compreende uma seqüência de nucleotídeo ocorrendo naturalmente ou seqüência de aminoácido, respectivamente. Para polinucleotideos, variantes conservadas incluem aquelas seqüências que, por causa da degeneração do código genético, codifica uma seqüência de aminoácido de um polipeptídeo VSP, por exemplo, ZmLox6 da SEQ ID NO: 2. Variantes alélicos ocorrendo naturalmente tais como esses podem ser identificados com o uso de técnicas de biologia molecular bem conhecidas, como, por exemplo, com a reação de polimerase em cadeia (PCR) e técnicas de hibridização. Polinucleotideos variantes também incluem polinucleotideos derivados sinteticamente, tais como aqueles gerados, por exemplo, através do uso de mutagênese sítio-dirigida ou "embaralhamento(DNA shuffling)". Geralmente, variantes de um polinucleotídeo particular, por exemplo, a seqüência ZmLox6 descrita em SEQ ID NO: 1, ou a seqüência codificando ZmLox6 descrita nos nucleotídeos 62-2737 da SEQ ID NO: 1 ou na SEQ ID NO: 3, tem pelo menos cerca de 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais identidade de seqüência para aquele polinucleotideo particular como determinado pelos programas de alinhamento de seqüências e parâmetros conforme descritos em outros locais aqui.

Variantes de um polinucleotideo particular (i.e., polinucleotideo de referência) podem também ser avaliados pela comparação da porcentagem de identidade de seqüência entre um polipeptideo codificado por um polipeptideo variante e o polipeptideo codificado por um polinucleotideo de referência. Então, por exemplo, em uma concretização, a variante do polinucleotideo VSP é um polinucleotideo isolado que codifica um polipeptideo VSP tendo uma dada porcentagem de identidade para o polipeptideo ZmLox6 da SEQ ID NO: 2. A porcentagem de identidade de seqüência entre qualquer dois polipeptideos pode ser calculada usando programas de alinhamento de seqüência e parâmetros descritos em outros locais aqui. Sempre que qualquer dado par de polinucleotideos usado para praticar a invenção é avaliado através da comparação da porcentagem de identidade de seqüência compartilhada pelos dois polipeptideos que eles codificam, a porcentagem de identidade de seqüência entre os dois polipeptideos codificados é pelo menos cerca de 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade de seqüência. Proteína "variante" significa uma proteína derivada de uma proteína nativa e/ou original através da deleção (então chamada de truncamento) de um ou mais aminoácidos na extremidade N-terminal e/ou C-terminal da proteína; deleção e/ou adição de um ou mais aminoácidos em um ou mais sítios internos na proteína; ou substituição de um ou mais aminoácidos em um ou mais sítios na proteína. Proteínas variantes englobadas pela presente invenção são biologicamente ativas, desde que elas continuem possuindo as propriedades VSP desejadas conforme descritas aqui. Variantes biologicamente ativas de um polipeptídeo VSP, por exemplo, a proteína ZmLox6 apresentada na SEQ ID NO: 2, terá pelo menos cerca de 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade de seqüência para seqüência de aminoácido da proteína nativa conforme determinado pelos programas de alinhamento de seqüências e parâmetros descritos aqui em outro lugar. Uma variante biologicamente ativa de um polipeptídeo VSP, por exemplo, a proteína ZMLox6, pode diferir daquele polipeptídeo em alguns resíduos de aminoácidos como 1-15, bem como 1-10, bem como 6-10, como 5, bem como 4, 3, 2, ou ainda 1 resíduo de aminoácido.

Os polipeptídeos VSP derivados de monocotiledôneas para uso na prática da invenção podem ser alterados de várias maneiras incluindo substituições de aminoácidos, deleções, truncamentos, e inserções. Métodos para tais manipulações são geralmentes conhecidos no estado na técnica. Por exemplo, variantes de seqüências de aminoácidos e fragmentos de da proteína ZmLoxô de SEQ ID NO: 2 podem ser preparados através de mutações npolinucleotideo codificante, por exemplo, a seqüência definida nos nucleotídeos 62-2737 de SEQ ID NO: 1 ou em SEQ ID NO: 3. Métodos para mutagênese e alterações no polinucleotideo são bem conhecidos no estado da técnica. Veja, por exemplo, Kunkel (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488-492; Kunkel, et al., (1987) Methods in Enzymol. 154:367-382; U.S. Patent No. 4,873,192; Walker and Gaastra, eds. (1983) Techniques in Molecular Biology (MacMillan Publishing Company, New York) e referências aí citadas. Orientação de substituições de aminoácidos que não afetam atividade biológica da proteína de interesse pode ser encontrada no modelo de Dayhoff, et al., (1978) Atlas of Protein Sequence and Structure (Natl. Biomed. Res. Found., Washington, D.C.), aqui incorporado como referência. Substituições conservadas, tais como, troca de um aminoácido com outro tendo propriedades similares, podem ser feitas.

Os polipeptídeos VSP derivados de monocotiledôneas, por exemplo, a proteína ZMLox6, ou fragmentos biologicamente ativos e variantes destes, podem também ser alterados através da modificação do polinucleotideo codificante para expressar um polipeptídeo VSP enriquecido em aminoácidos essenciais, incluindo lisina, metionina, triptofano, treonina, fenilalanina, leucina, valina, e isoleucina em relação aos níveis médios de tais aminoácidos na proteína nativa. Em uma concretização, um polinucleotideo codificando a proteína ZMLox6, ou fragmento biologicamente ativo ou variante desta, é modificado tal que a proteína é enrriquecida para o conteúdo de lisina.

Métodos para alterar o conteúdo de aminoácido nutricional de uma proteína são conhecidos (veja, e.g., U.S. Patent No. 6,905,877, aqui incorporado como referência em sua integridade). Tais métodos, portanto, encontram uso no melhoramento do valor nutricional dos polipeptídeos VSP descritos aqui, bem como no melhoramento do valor nutricional de plantas, ou parte das mesmas, expressando tais polipeptídeos VSP nutricionalmente melhorados.

Polinucleotídeos VSP variantes e VSPs para uso nos métodos da invenção também englobam seqüências e proteínas derivadas de um procedimento mutagênico ou recombinogênicos, tais como embaralhamento de DNA (DNA shuffling). Com tal procedimento, uma ou mais diferentes seqüências codificando o polipeptídeo VSP podem ser manipuladas para criar um novo polipeptídeo VSP possuindo as propriedades desejadas. Desta maneira, bibliotecas de polinucleotídeos recombinantes são geradas de uma população de seqüências de polinucleotídeos relacionadas compreendendo regiões de seqüências que tenham identidade de seqüência substancial e possam ser homologamente recombinadas in vitro ou in vivo. Por exemplo, usando esta abordagem, motivos de seqüências codificando um domínio de interesse pode ser misturado entre a seqüência ZMLox6 de SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 3 e outros genes Lox conhecidos para obter um novo gene codificando para uma proteína VSP com uma propriedade melhorada de interesse, tal como o aumento do conteúdo de aminoácidos essenciais. Estratégias para tal embaralhamento de DNA (DNA shuffling) são conhecidas no estado da técnica. Veja, por exemplo, Stemmer (1994) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 91:10747-10751; Stemmer (1994) Nature 370:389-391; Crameri, et al.r (1997) Nature Biotech. 15:436-438; Moore, et al., (1997) J. Mol. Biol. 272:336-347; Zhang, et al., (1997) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 94:4504-4509; Crameri, et al., (1998) Nature 391:288- 291; e U.S. Patent Nos. 5,605,793 and 5,837,458.

O polinucleotídeo ZmLox6 para uso nos métodos da invenção pode ser usado para isolar seqüências VSP correspondentes de outras plantas, incluindo outras monocotiledôneas. Desta maneira, métodos tais como PCR, hibridização, e semelhantes podem ser usados para identificar tais seqüências baseando-se na sua homologia de seqüência com a seqüência ZmLox6 descrita em SEQ ID NO: 1, ou com seqüência codificando ZmLox6 descrita nos nucleotídeos 62-2470 da SEQ ID NO: 1 ou em SEQ ID NO: 3. Seqüências isoladas baseadas na sua identidade de seqüência com a seqüência de nucleotídeo completa de ZmLox6 descrita aqui ou com variantes e fragmentos destes englobados pela presente invenção. Tais seqüências incluem seqüências que são ortólogas das seqüências reveladas. "Ortólogos" destinam-se a genes derivados de um gene ancestral comum e os quais são encontrados em diferentes espécies como resultado de especiação. Genes encontrados em diferentes espécies são considerados ortólogos quando suas seqüências de nucleotideos e/ou suas seqüências de proteínas codificadas partilham pelo menos 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou maior identidade de seqüência. Funções de ortólogos são freqüentemente altamente conservadas entre as espécies. Então, polinucleotideos isolados que codificam para o polipeptídeo VSP e os quais hibridizam sob condições estringentes para a seqüência com a seqüência ZmLox6 da SEQ ID NO: 1, ou seqüência codificando a ZmLoxô descrita nos nucleotideos 62-2737 da SEQ ID NO: 1 ou em SEQ ID NO: 3, ou variantes ou fragmentos destes, podem ser usados para colocar em prática a presente invenção.

Em uma abordagem de PCR, iniciadores de oligonucleotídeos podem ser desenhados para uso em reações de PCR para amplificar seqüências de DNA correspondentes de cDNA ou DNA genômico extraído de qualquer planta de interesse. Métodos para desenhar iniciadores de PCR e clonagem de PCR são geralmente conhecidos no estado da técnica e são revelados em Sambrook, et al., (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York). Veja também, Innis, et al., eds. (1990) PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Academic Press, New York); Innis and Gelfand, eds. (1995) PCR Strategies (Academic Press, New York); e Innis and Gelfand, eds. (1999) PCR Methods Manual (Academic Press, New York). Métodos conhecidos de PCR incluem, mas não estão limitados a, métodos usando iniciadores emparelhados, iniciadores aninhados, iniciadores específicos simples, iniciadores degenerados, iniciadores gene-específicos, iniciadores vetores- específicos, iniciadores mal emparelhados, e semelhantes.

Nas técnicas de hibridização, todo ou parte de um polinucleotídeo conhecido é usado como uma sonda que hibridiza seletivamente com outros polinucleotídeos correspondentes presentes em uma população de fragmentos de DNA genômico clonados ou fragmentos de cDNA (i.e., bibliotecas genômicas ou de cDNA) de um organismo escolhido. As sondas de hibridização podem ser fragmentos de DNA genômico, fragmentos de cDNA, fragmentos de RNA, ou outros oligonucleotídeos, e podem ser marcados com um grupo detectável tal como 32P, ou outro marcador detectável. Então, por exemplo, sondas para hibridização podem ser feitas por marcação de oligonucleotídeos sintéticos baseando-se na seqüência de nucleotídeo ZmLox6 da SEQ ID NO: 1, ou na seqüência codificando ZmLox6 descrita nos nucleotídeos 62-2737 da SEQ ID NO: 1 ou na SEQ ID NO: 3. Métodos para preparação de sondas para hibridização e para construção das bibliotecas genômicas e de cDNA são geralmente conhecidas no estado da técnica e são reveladas em Sambrook, et al., (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York).

Por exemplo, o polinucleotídeo inteiro de ZmLox6 revelado na SEQ ID NO: 1, nucleotídeos 62-2737 de SEQ ID NO: 1, ou SEQ ID NO: 3, ou uma ou mais porções do mesmo, pode ser usado como uma sonda capaz de hibridizar especificamente com os polinucleotideos VSP correspondentes e RNAs mensageiros. Para alcançar hibridização especifica sob uma variedade de condições, tais sondas incluem seqüências que sejam únicas entre as seqüências de polinucleotideo VSP e sejam preferencialmente pelo menos cerca de 10 nucleotideos em comprimento, e mais preferencialmente cerca de 20 nucleotideos em comprimento. Tais sondas podem ser usadas para amplificar polinucleotideos correspondentes de uma planta escolhida através de PCR. Essa técnica pode ser usada para isolar seqüências adicionais codificando VSP de uma planta desejada ou como um ensaio de diagnóstico para detrminar a presença de seqüências codificando VSP em uma planta. Técnicas de hibridização incluem hibridização de triagem de uma biblioteca de DNA plaqueada (cada placa ou colônia; veja, por exemplo, Sambrook, et al., (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York).

Hibridização de tais seqüências pode ser feita sob condições estringentes. 0 termo "condições estringentes" ou "condições de hibridização estringentes" significa condições sob as quais uma sonda hibridizará com a sua seqüência alvo a um maior nivel detectável do que com outras seqüências (por exemplo, pelo menos 2 vezes sobre o fundo). Condições estringentes são dependentes de seqüência e serão diferentes em diferentes circunstâncias. Através do controle da estringência da hibridização e/ou condições de lavagem, seqüências alvo que sejam 100% complementares à sonda podem ser identificadas (marcação homóloga). Alternativamente, condições de estringência podem ser ajustadas para permitir alguma falha de pareamento nas seqüências para que niveis mais baixos de similaridade sejam detectados (marcação heteróloga). Geralmente, uma sonda é menor do que cerca de 1000 nucleotideos em comprimento, preferencialmente menor do que 500 nucleotideos em comprimento.

Tipicamente, condições estringentes serão aquelas nas quais a concentração de sais é menor do que cerca de 1.5 M de ion Na, tipicamente cerca de 0.01 a 1.0 M de concentração de ion Na (ou outros sais) empH 7.0 a 8.3 e a temperatura é pelo menos cerca de 30°C para sondas curtas (por exemplo, 10 a 50 nucleotideos) e pelo menos cerca de de 60°C para sondas longas (por exemplo, maior do que 50 nucleotideos). Condições estringentes podem também ser alcançadas com a adição de agentes desestabilizantes tais como formamida. Condições exemplaresde baixa estringência incluem hibridizações com uma solução tampão de 30 a 35% de formamida, 1 M NaCl, 1% SDS (dodecil sulfato de sódio) à 37°C, e uma lavagem em IX a 2X de SSC (20X SSC = 3.0 M NaCl/0.3 M citrato de trisódio) de 50 a 55°C. Condições exemplaresde estringência moderada incluem hibridizações em 40 a 45% de formamida, 1.0 M NaCl, 1% SDS a 37°C, e uma lavagem a em 0. 5X a IX SSC de 55 a 60°C. Condições exemplares de alta estringência incluem hibridizações em 50% de formamida, 1 M NaCl, 1% SDS à 37°C, e uma lavagem em 0. IX SSC de 60 a 65°C. Opcionalmente, tampões de lavagem podem compreender cerca de 0.1% a cerca de 1% SDS. A duração da hibridização é geralmente menor do cerca de 24 horas, usualmente cerca de 4 a cerca de 12 horas. A duração do tempo de lavagem será pelo menos um comprimento de tempo suficiente para alcançar o equilíbrio.

Especificidade é tipicamente a função das lavagens pós-hibridização, sendo os fatores críticos a força iônica e a temperatura da solução de lavagem final. Para híbridos DNA-DNA, a Tm pode ser aproximada da equação de Meinkoth e Wahl (1984) Anal. Biochem. 138:267-284: Tm = 81.5°C + 16.6 (log M) + 0.41 (%GC) - 0.61 (% form) - 500/L; onde M é a molaridade dos cátions monovalentes, %GC é a porcentagem de nucleotídeos guanosina e citosina no DNA, % form é a porcentagem de formamida na solução de hibridização, e L é o comprimento do híbrido em pares de base. A Tm é a temperatura (sob força iônica e pH definidos) na qual 50% de uma seqüência alvo complementar hibridiza com uma perfeita correspondência com a sonda. Tm é reduzida em cerca de 1°C para cada 1% de mal emparelhamento; então, Tm, hibridização, e/ou condições de lavagem podem ser ajustadas para hibridizar com seqüências de identidade desejada. Por exemplo, se são procuradas seqüências com identidade >90%, a Tm pode ser diminuída 10°C. Geralmente, condições de estringência são selecionadas para serem cerca de 5°C inferiores ao ponto de fusão térmico (Tm) para seqüência específica e seu complemento em uma força iônica e pH definidos. No entanto, condições de estringência severas podem utilizar uma hibridização e/ou lavagem em 1, 2, 3 ou 4°C mais baixos do que o ponto de fusão térmica (Tm); condições de estringência moderadas podem utilizar uma hibridização e/ou lavagem a 6, 7, 8, 9 ou 10°C mais baixos do que o ponto de fusão térmica (Tm) ; baixas condições de estringência podem utilizar uma hibridização e/ou lavagem a 11, 12, 13, 14, 15 ou 20°C mais baixos do que o ponto de fusão térmica (Tm). Usando a equação, composições de hibridização e lavagem, e Tm desejada, aqueles de habilidades usuais entenderão que variações na estringência de hibridização e/ou soluções de lavagem são inerentementes descritos. Se o nivel desejado de mal emparelhamento resulta em uma Tm menor do que 45°C (solução aquosa) ou 32°C (solução de formamida), é ótimo aumentar a concentração de SSC para que uma temperatura mais alta possa ser usada. Um guia extensivo para hibridização de ácidos nucleicos é encontrado em Tijssen (1993) Laboratory Techniques ín Biochemistry and Molecular Biology— Hybridization with Nucleic Acid Probes, Part I, Chapter 2 (Elsevier, New York); e Ausubel, et al., eds. (1995) Current Protocols in Molecular Biology, Chapter 2 (Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York). Ver, Sambrook, et al., (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York).

Os seguintes termos são usados para descrever a relação de seqüência entre dois ou mais polinucleotideos ou polipeptideos: (a) "seqüência referência", (b) "janela de comparação", (c) "identidade de seqüência", e, (d) "porcentagem de identidade de seqüência".

(a) Como usado aqui, "seqüência referência" é uma seqüência definida usada como uma base para comparação de seqüência. Uma seqüência referência pode ser um subconjunto ou o todo de uma seqüência especificada; por exemplo, como um segmento de um comprimento total de cDNA ou seqüência gênica, ou cDNA completo ou seqüência gênica.

(b) Como usado aqui, "janela de comparação" faz referência a um segmento especificado e contíguo de uma seqüência de polinucleotídeo, onde a seqüência de polinucleotídeo na janela de comparação pode compreender adições ou deleções (i.e., lacunas) comparados com a seqüência referência (a qual não compreende adições ou deleções) para um alinhamento ótimo dos dois polinucleotideos. Geralmente, a janela de comparação tem pelo menos 20 nucleotídeos contíguos em comprimento, e preferencialmente pode ter 30, 40, 50, 100 ou mais. Os especialistas no assunto entendem que para evitar uma alta similaridade com a seqüência referência devido à inclusão de lacunas na seqüência de polinucleotídeo uma penalidade de lacuna "gap penalty" é tipicamente introduzida e é subtraída do número de correspondências.

Métodos de alinhamento de seqüências para comparação são bem conhecidos no estado da técnica. Então, a determinação da porcentagem de identidade de seqüência entre quaisquer duas seqüências podem ser feitas usando um algoritmo matemático. Exemplos não limitantes de tais algoritmos matemáticos são os algoritmos de Myers e Miller (1988) CABIOS 4:11-17; o algoritmo de alinhamento local de Smith, et al., (1981) Adv. Appl. Math. 2:482; the global alignment algorithm of Needleman and Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443-453; o método de busca para alinhamento local de Pearson and Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sei. 85:2444-2448; o algoritmo de Karlin e Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 87:2264-2268, modificado como em Karlin e Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90:5873-5877.

Implementações computacionais desses algoritmos matemáticos podem ser utilizadas para comparação de seqüências para determinar identidade de seqüência. Tais implementações incluem, mas não estão limitadas a: CLUSTAL no programa PC/Gene (disponível de Intelligenetics, Mountain View, Califórnia); o programa ALIGN (Versão 2.0) e GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA, e TFASTA no GCG Wisconsin Genetics Software Package, Versão 10 (disponível de Accelrys Inc., 9685 Scranton Road, San Diego, Califórnia, USA) . Alinhamentos usando esses programas podem ser desempenhados usando os parâmetros padrões. 0 programa CLUSTAL está bem descrito por Higgins, et al., (1988) Gene 73:237-244 (1988); Higgins, et al., (1989) CABIOS 5:151- 153; Corpet, et al., (1988) Nucleic Acids Res. 16:10881-90; Huang, et al., (1992) CABIOS 8:155-65; e Pearson, et al., (1994) Meth. Mol. Biol. 24:307-331. O programa ALIGN é baseado no algoritmo de Myers e Miller (1988) supra. Uma tabela de resíduo de peso PAM120, uma penalidade de comprimento de lacuna (gap penalty) de 12, e uma penalidade de comprimento de lacuna "gap penalty" de 4 podem ser usadas com o programa ALIGN program quando comparar seqüências de aminoácidos. Os programas BLAST de Altschul, et al., (1990) J. Mol. Biol. 215:403 são baseados no algoritmo de Karlin e Altschul (1990) supra. Buscas de nucleotídeos no BLAST podem ser desempenhadas com o programa BLASTN, pontuação = 100, comprimento do termo "wordlength" = 12, para obter seqüências de nucleotídeos homólogas a uma seqüência de nucleotídeo codificando uma VSP para uso nos métodos da presente invenção. Buscas de proteínas no BLAST podem ser desempenhadas com o programa BLASTX, pontuação = 50, comprimento do termo "wordlength" = 3, para obter seqüências de aminoácidos homólogas a uma VSP para uso nos métodos da presente invenção. Para obter alinhamentos com lacunas para propósitos de comparação, Gapped BLAST (em BLAST 2.0) pode ser utilizado conforme descrito em Altschul, et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389. Alternativamente, PSI-BLAST (em BLAST 2.0) pode ser utilizado para desempenhar uma busca iterada que detecta relações distantes entre moléculas. Ver, Altschul, et al., (1997) supra. Quando utilizar BLAST, Gapped BLAST, PSI-BLAST, os parâmetros padrões dos respectivos programas (por ex. , BLASTN para seqüências de nucleotídeos, BLASTX para proteínas) podem ser usados. 0 software BLAST está publicamente disponível no website do NCBI. Alinhamentos podem também ser realizados manualmente por inspeção.

Salvo disposição em contrário, valores providos aqui de identidade/similaridade de seqüência referem-se a valores obtidos usando GAP versão 10 e os seguintes parâmetros: % de identidade e % de similaridade para seqüência de nucleotídeo usando peso GAP de 50 e tamanho de peso de 3, e matriz de pontuação nwsgapdna.cmp; % de identidade e % de similaridade para uma seqüência de aminoácido usando peso GAP de 8 e tamanho de peso de 2, e matriz de pontuação BLOSUM62; ou qualquer programa equivalente. O termo "programa equivalente" significa qualquer programa de comparação de seqüência que, para qualquer duas seqüências em questão, gera um alinhamento tendo resíduos de nucleotídeos ou aminoácidos idênticos pareados e uma porcentagem de identidade de seqüência idêntica quando comparada com um alinhamento correspondente gerado pelo GAP Versão 10.

GAP usa o algoritmo de Needleman e Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443-453, para achar o alinhamento de duas seqüências completas que maximiza o número de pareamento e minimiza o número de lacunas. GAP considera todos os alinhamentos possíveis e posições de lacuna e cria o alinhamento com o maior número de bases pareadas e menor número de lacunas. Ele permite a provisão de uma "penalidade de criação de lacuna" e uma "penalidade de extensão de lacuna" nas unidades de bases pareadas. GAP deve fazer um ganho no número de pareamento em penalidade de criação de lacuna para cada lacuna que ele inseriu. Se a penalidade de extensão de lacuna maior do que zero for escolhida, o GAP deve, em adição, fazer um ganho para cada lacuna inserida do comprimento da lacuna vezes a penalidade de extensão de lacuna. Os valores padrão de penalidade de criação de lacuna e de penalidade de extensão de lacuna na Versão 10 do GCG Wisconsin Genetics Software Package para seqüências de proteínas são 8 e 2, respectivamente. Para seqüências de nucleotídeos o padrão de penalidade de criação de lacuna é 50 enquanto que o padrão de penalidade de extensão de lacuna é 3. As perdas por criação de lacuna e extensão de lacuna podem ser expressas como um número inteiro selecionado do grupo de inteiros consistindo de 0 a 200. Então, por exemplo, as perdas por criação de lacuna e extensão de lacuna podem ser 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65 ou maiores.

GAP apresenta um membro da família dos melhores alinhamentos. Pode haver muitos membros desta família, mas nenhum outro membro tem melhor qualidade. GAP exibe quatro figuras de mérito para alinhamentos: Qualidade, Razão, Identidade, e Similaridade. A qualidade é a medida maximizada a fim de alinhar as seqüências. Razão é a qualidade dividida pelo número de bases no segmento mais curto. Porcentagem de identidade é a porcentagem dos símbolos que atualmente pareiam. Porcentagem de similaridade é a porcentagem dos símbolos que são similares. Símbolos que estão atravessados nas lacunas são ignorados. Uma similaridade é pontuada quando o valor da matriz de pontuação para um par de símbolos é maior ou igual a 0.50, o limiar de similaridade. A matriz de pontuação usada na Versão 10 do GCG Wisconsin Genetics Software Package é BLOSUM62 (ver, Henikoff and Henikoff (1989) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89:10915).

(c) Conforme usado aqui, "identidade de seqüência" ou "identidade" no contexto de duas seqüências de polinucleotídeos ou polipeptídeos faz referência a resíduos nas duas seqüências que são os mesmos quando alinhados para a correspondência máxima ao longo de uma janela de comparação especificada. Quando a porcentagem de identidade de seqüência é usada em referência a proteínas é reconhecido que posições nos resíduos que não são idênticas freqüentemente diferem pelas substituições conservadas de aminoácidos, onde resíduos de aminoácidos são substituídos por outros resíduos de aminoácidos com propriedades químicas similares (por exemplo, carga ou hidrofobicidade) e, portanto, não mudam as propriedades funcionais da molécula. Quando seqüências diferem nas substituições conservadas, a porcentagem de identidade de seqüência pode ser ajustada para cima para corrigir a natureza conservada da substituição. Seqüências que diferem pelas substituições conservadas são ditas ter "similaridade de seqüência" ou "similaridade". Recursos para fazer esses ajustes são bem conhecidos para os especialistas da área. Tipicamente isso envolve pontuar uma substituição conservada como parcial preferencialmente do que como um mal pareamento total, aumentando assim a porcentagem de identidade de seqüência. Então, por exemplo, onde um aminoácido idêntico é dada uma pontuação de 1 e uma substituição não conservada é dada uma pontuação de zero, uma substituição conservada é dada uma pontuação entre zero e 1. A pontuação de substituições conservadas é calculada, por exemplo, como implementada no programa PC/GENE (Intelligenetics, Mountain View, Califórnia).

(d) Como usado aqui, "porcentagem de identidade de seqüência" significa o valor determinado por comparação de duas seqüências alinhadas otimamente sobre uma janela de comparação, onde a porção da seqüência de polinucleotideo na janela de comparação pode compreender adições ou deleções (por exemplo, lacunas) quando comparadada com a seqüência referência (que não compreende adições ou deleções) para alinhamento ótimo das duas seqüências. A porcentagem é calculada pela determinação do número de posições no qual a base de ácido nucleico idêntica ou resíduo de aminoácidos ocorre em ambas as seqüências para produzir o número de posições compartilhadas, dividindo o número de posições compartilhadas pelo número total de posições na janela de comparação, e multiplicar o resultado por 100 para produzir a porcentagem de identidade de seqüência.

O uso do termo "polinucleotideo" não se limita a polinucleotídeos compreendendo DNA. Os especialistas no assunto reconhecerão que polinucleotídeos podem compreender ribonucleotídeos e combinações dos ribonucleotídeos e desoxiribonucleotideos. Tais desoxiribonucleotideos e ribonucleotídeos incluem ambas as moléculas ocorrendo naturalmente e análogos sintéticos. Então, polinucleotídeos também englobam todas as formas de seqüências incluindo, mas não limitado a, formas de cadeia simples, formas de cadeia dupla, grampos ("hairpins"), estruturas haste-e-laço ("stem-and-loop structures"), e semelhantes.

0 polinucleotídeo VSP, por exemplo, o polinucleotídeo ZmLox6 ou fragmento ou variante destes, podem ser providos em cassetes de expressão para expressão na planta de interesse. 0 cassete incluirá seqüências regulatórias 5' e 3' operacionalmente ligadas ao polinucleotídeo VSP. "operacionalmente ligado" significa uma ligação funcional entre dois ou mais elementos. Por exemplo, uma ligação operacional entre um polinucleotídeo de interesse e uma seqüência regulatória (por exemplo, um promotor) é uma ligação funcional que permite a expressão do polinucleotídeo de interesse. Elementos operacionalmente ligados podem ser contíguos ou não contíguos. Quando usado para referir a interligação de duas regiões codificantes de proteínas, o termo "operacionalmente ligado" significa que as regiões codificantes estão na mesma fase de leitura. 0 cassete pode adicionalmente conter pelo menos um gene extra para ser co-transformado dentro da planta. Alternativamente, o(s) gene(s) adicional pode ser provido em múltiplos cassetes de expressão. Tal cassete de expressão é provido com uma pluraridade de sítios de restrição e/ou sítios de recombinação para inserção do polinucleotídeo VSP para estar sob regulação transcricional das regiões regulatórias. O cassete de expressão pode adicionalmente conter outros genes, incluindo outros genes marcadores de seleção.

O cassete de expressão incluirá na direção de transcrição 5'-3' uma região de iniciação transcricional e traducional (i.e., um promotor), o polinucleotídeo VSP, por exemplo, SEQ ID NO: 1, nucleotídeos 62-2737 da SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, ou fragmento ou variante destes, e uma região de terminação transcricional e traducional (i.e., região de terminação) funcional em plantas. As regiões regulatórias (i.e., promotores, regiões regulatórias transcricionais, e regiões de terminação traducional) e/ou polinucleotídeo VSP podem ser nativas/análogas à célula hospedeira ou umas às outras. Alternativamente, as regiões regulatórias e/ou o polinucleotídeo VSP podem ser heterólogas à célula hospedeira ou umas às outras. Como usado aqui, "heterólogo" em referência à seqüência é uma seqüência originada de uma espécie estrangeira, ou, se for da mesma espécie, é substancialmente modificada de sua forma nativa na composição e/ou locus genômico através de intervenção humana deliberada. Por exemplo, um promotor operacionalmente ligado a um polinucleotídeo heterólogo é de uma espécie diferente das espécies das quais o polinucleotídeo foi derivado, ou, se da mesma/análoga espécie, uma ou ambas são substancialmente modificadas da suas formas originais e/ou locus genômicos, ou o promotor não é o promotor nativopara o polinucleotídeo operacionalmente ligado.

Enquanto puder ser ótima a expressão dos polinucleotideos VSP usando promotores heterólogos, as seqüências dos prmotores nativos também podem ser usadas. Tais constructos podem mudar os níveis de expressão do polipeptídeo codificado na planta ou na célula vegetal. Então, o fenótipo da planta ou da célula vegetal pode ser alterado.

A região de terminação pode ser nativa da região de iniciação transcricional, pode ser nativa do polinucleotídeo VSP de interesse operacionalmente ligado, pode ser nativo da planta hospedeira, ou pode ser derivada de outra origem (i.e., estrangeira ou heteróloga) ao promotor, ao polinucleotídeo VSP de interesse, à planta hospedeira, ou a qualquer combinação destes. Regiões de terminação convenientes para uso na presente invenção incluem aquelas disponíveis do plasmídeo Ti de A. tumefaciens, tais como as regiões de terminação da octopina sintase e nopalina sintase. Ver também, Guerineau, et al., (1991) Mol. Gen. Genet. 262:141-144; Proudfoot (1991) Cell 64:671-674; Sanfacon, et al., (1991) Genes Dev. 5:141-149; Mogen, et al. , (1990) Plant Cell 2:1261-1272; Munroe, et al., (1990) Gene 91:151-158; Bailas, et al., (1989) Nucleic Acids Res. 17:7 8 91-7 903; e Joshi, et al., (1987) Nucleic Aeids Res. 15:9627-9639. Em algumas concretizações da invenção, o cassete de expressão compreende uma região codificante para um sinal de endereçamento vacuolar operacionalmente ligada à região codificante para a VSP de interesse, por exemplo, ZmLox6 da SEQ ID NO: 2 ou fragmento biologicamente ativo ou variante destes. De particular interesse são os sinais de endereçamento que endereçam proteínas para os vacúolos de armazenamento de proteínas. Ver, por exemplo, Neuhaus and Rogers (1998) Plant Mol. Biol. 38:127-144, e Holwerda, et al., (1992) The Plant Cell 4:307-318, aqui incorporados pela referência. Exemplos de tais seqüências codificantes para sinais de endereçamento vacuolar são conhecidas no estado da técnica e incluem, mas não estão limitadas a, sinal de endereçamento vacuolar da proalerina do milho. Por exemplo, propeptídeos C-terminal de quitinase de tabaco e albumina 2S de abóbora têm sido utilizados com sucesso para endereçar proteínas solúveis ao vacúolo. Ver, Mistubishi, et al., (2000) Plant Cell Physiol. 41(9):993-1001; e Tamura, et al., (2003) The Plant J. 35:545-555.

Em outras concretizações, o cassete de expressão compreende uma seqüência codificante para peptídeo de trânsito de plastídeo operacionalmente ligado à seqüência codificadora para a VSP de interesse, por exemplo, ZmLoxô da SEQ ID NO: 2 ou fragmento biologicamente ativo ou variante destes, a fim de dirigir a expressão de VSP para dentro do compartimento dos plastídeos de células vegetais onde a VSP é expressa. Tais peptídeos de trânsito são conhecidos no estado da técnica. Ver, por exemplo, Von Heijne, et al., (1991) Plant Mol. Biol. Rep. 9:104-126; Clark, et al., (1989) J. Biol. Chem. 264:17544-17550; Della-Cioppa, et al., (1987) Plant Physiol. 84:965-968; Romer, et al., (1993) Biochem. Biophys. Res. Cowmun. 196:1414-1421; e Shah, et al., (1986) Science 233:478-481. Peptideos de trânsito do cloroplasto (também referidos como seqüências sinais do cloroplasto) são conhecidos no estado da técnica e incluem a pequena subunidade da ribulose-1,5- bisfosfato carboxilase (Rubisco) de cloroplasto (de Castro Silva Filho, et al., (1996) Plant Mol. Biol. 30:769-780; Schnell, et al., (1991) J. Biol. Chem. 266(5):3335-3342); 5-(enolpiruvil) shikimato-3-fosfato sintase (EPSPS) (Archer, et al., (1990) J. Bioenerg. Biomemb. 22(6):789- 810); triptofano sintase (Zhao, et al., (1995) J. Biol. Chem. 270(11):6081-6087); plastocianina (Lawrence, et al., (1997) J. Biol. Chem. 272(33):20357-20363) ; corismato sintase (Schmidt, et al., (1993) J. Biol. Chem. 268(36) :27447-27457) ; e proteína de ligação a clorofila a/b captadora de Iuz(LHBP) (Lamppa, et al., (1988) J. Biol. Chem. 263:14996-14999). Ver também Von Heijne, et al., (1991) Plant Mol. Biol. Rep. 9:104-126; Clark, et al., (1989) J. Biol. Chem. 264:17544-17550; Della-Cioppa, et al., (1987) Plant Physiol. 84:965-968; Romer, et al., (1993) Biochem. Biophys. Res. Commun. 196:1414-1421; e Shah, et al., (1986) Science 233:478-481.

Métodos são conhecidos no estado da técnica para aumentar a expressão do polipeptídeo de interesse em uma planta ou célula vegetal, por exemplo, ao inserir dentro da seqüência codificante do polipeptideo um ou dois códons ricos em G/C (tais como GCG ou GCT) imediatamente adjacente a e posterior ao códon ATG de iniciação da metionina. Onde apropriado, os polinucleotideos VSP podem ser otimizados para aumentar a expressão nas plantas transformadas. Ver, por exemplo, Campbell and Gowri (1990) Plant Physiol. 92:1- 11 para uma discussão de uso de códon preferencial ao hospedeiro. Métodos estão disponíveis na técnica para sintetizar genes preferenciais de plantas. Ver, por exemplo, U.S. Patent Nos. 5,380,831, e 5,436,391, e Murray, et al., (1989) Nucleic Acids Res. 17 : 477-498, aqui incorporados por referência. Concretizações compreendendo tais modificações também são uma caracter!stica da invenção.

Modificações adicionais de seqüência são conhecidas por reforçar a expressão gênica em uma planta hospedeira particular. Essas modificações incluem eliminação de seqüências codificando sinais de poliadenilação espúrios, sinais de sítio de processamento exon-intron, repetições tipo-transposon, e outras tais como seqüências bem caracterizadas que possam ser deletérias à expressão gênica. 0 conteúdo de G-C da seqüência pode ser ajustado para níveis médios para uma dada planta hospedeira, como calculado por referência para genes conhecidos expressos na célula hospedeira. Quando possível, a seqüência é modificada para evitar estruturas secundárias em grampo preditas de mRNA. Os cassetes de expressão podem adicionalmente conter seqüências líder 5'. Tais seqüências líder podem agir para melhorar a tradução. Líderes traducionais são conhecidos no estado da técnica e incluem: líderes de picornavirus, por exemplo, líder EMCV (região não codificante 5' do vírus Encephalomyocarditis) (Elroy-Stein, et al. , (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:612 6-6130); líderes de potivirus, por exemplo, líder TEV (Vírus Etch do tabaco) (Gallie, et al., (1995) Gene 165(2):233-238), líder MDMV (vírus do mosaico anão de milho)(Virology 154:9-20), e a proteína de ligação à cadeia pesada da imunoglobulina humana (BiP) (Macejak, et al., (1991) Nature 353:90-94); líderes não traduzidos do mRNA da proteína do capsídeo do vírus do mosaico da alfaia (AMV RNA 4) (Jobling, et al., (1987) Nature 325:622-625); líder do vírus do mosaico de tabaco (TMV) (Gallie, et al., (1989) in Molecular Biology of RNA, ed. Cech (Liss, New York), pp. 237-256); e líder do vírus mosqueado clorótico de milho (MCMV) (Loitimel, et al., (1991) Virology 81:382-385). Ver também, Della-Cioppa, et al., (1987) Plant Physiol. 84:965-968.

No preparo do cassete de expressão, os vários fragmentos de polinucleotídeos podem ser manipulados, de modo a proporcionar que as seqüências estejam na orientação adequada e, quando apropriado, na fase de leitura correta. Para este fim, adaptadores ou ligadores podem ser empregados para ligar os fragmentos ou outras manipulações podem ser envolvidos para prover sítios de restrição convenientes, remoção de material supérfluo tais como a remoção de sítios de restrição, ou semelhantes. Para este propósito, mutagênese in vitro, reparo de primer, restrição, anelamento, resubstituições, por exemplo, transições e transversões, podem estar envolvidas. Técnicas de DNA recombinante padrão e clonagem molecular usadas aqui são bem conhecidas no estado da técnica e são descritas mais completamente, por exemplo, em Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press; Plainview, New York).

Um número de promotores pode ser usado na prática desta invenção, incluindo promotores nativos da seqüência do polinucleotídeo VSP de interesse. Os promotores podem ser selecionados com base no resultado desejado. Os polinucleotídeos VSP de interesse podem ser combinados com promotores constitutivos, induzíveis, tecido-específicos, ou outros promotores para expressão em plantas.

Tais promotores constitutivos incluem, por exemplo, a parte principal do promotor Rsyn7 e outros promotores constitutivos revelados em WO 99/43838 e a patente americana No. 6,072,050; a parte principal do promotor CaMV 35S (Odell, et al. , (1985) Nature 313:810-812); promotor da actina de arroz (McElroy, et al. , (1990) Plant Cell 2:163- 171); promotor da ubiquitina (Christensen, et al., (1989) Plant Mol. Biol. 12:619-632 e Christensen, et al., (1992) Plant Mol. Biol. 18:675-689); pEMU (Last, et al., (1991) Theor. Appl. Genet. 81:581-588); MAS (Velten, et al., (1984) EMBO J. 3:2723-2730); promotor ALS (U.S. Patent No. 5,659,026), e semelhantes. Outros promotores constitutivos incluem, por exemplo, aqueles descritos nas patentes americanas Nos. 5,608,149; 5,608,144; 5,604,121; 5,569,597; 5,466,785; 5,399,680; 5,268,463; 5,608,142; e 6,177,611.

Adicionalmente, um promotor induzivel por injúria pode ser usado nas construções da invenção. Tais promotores induziveis por injúrias incluem promotores para o gene inibidor de proteinase da batata (pin II) (Ryan (1990) Ann. Rev. Phytopath. 28:425-449; Duan, et al., (1996) Nature Biotechnology 14:4 94-4 98); wunl e wun2, patente americana No. 5,428,148; winl e win2 (Stanford, et al., (1989) Mol. Gen. Genet. 215:200-208); sistemina (McGurl, et al., (1992) Science 225:1570-1573); WIPl (Rohmeier, et al., (1993) Plant Mol. Biol. 22:783-792; Eckelkamp, et al., (1993) FEBS Letters 323:73-76); gene MPI (Corderok, et al., (1994) Plant J. 6(2):141-150); e semelhantes, aqui incorporados por referência.

Promotores tecido específicos podem ser usados para memlhorar a expressão direcionada do polipeptídeo VSP dentro de um tecido vegetal particular. Promotores tecido- específicos incluem aqueles revelados em Yamamoto, et al., (1997) Plant J. 12 (2) :255-265; Kawamata, et al., (1997) Plant Cell Physiol. 38 (7) : 792-803; Hansen, et al., (1997) Mol. Gen Genet. 254(3):337-343; Russell, et al., (1997) Transgenic Res. 6(2):157-168; Rinehart, et al., (1996) Plant Physiol. 112 (3) :1331-1341; Van Camp, et al., (1996) Plant Physiol. 112(2):525-535; Canevascini, et al., (1996) Plant Physiol. 112(2):513-524; Yamamoto, et al., (1994) Plant Cell Physiol. 35 (5) : 773-778; Lam (1994) Results Probl. Cell Differ. 20:181-196; Orozco, et al., (1993) Plant Mol Biol. 23 (6) :1129-1138; Matsuoka, et al., (1993) Proc Natl. Acad. Sei. USA 90 (20) :9586-9590; e Guevara- Garcia, et al., (1993) Plant J. 4(3) : 495-505. Tais promotores podem ser modificados, se necessário, para expressão fraca.

Promotores específicos de folha são conhecidos no estado da técnica. Ver, por exemplo, Yamamoto, et al., (1997) Plant J. 12 (2) :255-265; Kwon, et al., (1994) Plant Physiol. 105:357-67; Yamamoto, et al., (1994) Plant Cell Physiol. 35 (5) :773-778; Gotor, et al., (1993) Plant J. 3:509-18; Orozco, et al. , (1993) Plant Mol. Biol. 23 (6) :1129-1138; e Matsuoka, et al., (1993) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90 (20): 9586-9590.

Em algumas concretizações, o polipeptídeo VSP, por exemplo, ZmLox6 da SEQ ID NO: 2 ou fragmento biologicamente ativo ou variante destes, é expresso preferencialmente dentro de células específicas de folhas, particularmente dentro das células do mesófilo, células da bainha do feixe, ou ambas. Promotores que fornecem expressão em células específicas do mesófilo de polinucleotídeos heterólogos operacionalmente ligados em plantas transgênicas incluem, mas não estão limitados a, promotores para fosfoenolpiruvato carboxilase (PEP carboxilase) e piruvato; genes ortofosfato diquinase (ver, por exemplo, Matsuoka and Sanada (1991) Mol. Gen. Genet. 225 (3) : 411-419; Matsuoka, et al., (1993) Proc. Natl. Acad. Sei. 90:9586-9590; Kausch, et al.r (2001) Plant Mol. Biol. 45(1):1-15; Taniguchi, et al.r (2000) Plant Cell Physiol. 41(1):42-48); promotores para genes cab-1 (ver, por exemplo, o promotor para o gene cab- ml de milho, em Shiina, et al., (1997) Plant Physiol. 115 (2) :477-483 e Bansal, et al., (1992) Proc. Natl. Acad. Sei. 89:3654-3658); e promotores para os genes da pequena subunidade de Rubisco (ver, por exemplo, os promotores para os genes rbcS de tomate e arroz, em Kyozuka, et al. (1993) Plant Physiol. 102:991-1000; e a expressão preferencial em células do mesófilo provida pelo promotor do gene da pequena subunidade de Rubisco de milho dentro de uma planta C3 transgênica (ver, por exemplo, Matsuoka and Sanada (1991) Mol. Gen. Genet. 225 (3) :411-419)) . Promotores que provêem para uma expressão preferencial em células da bainha do feixe, operacionalmente ligados a polinucleotideos heterólogos em plantas transgênicas incluem, mas não estão limitados a, promotores para os genes da pequena subunidade de Rubisco de plantas C4 (ver, por exemplo, o promotor rjbcS-m3 de milho e elementos provendo para a expressão especifica nas células da bainha do feixe, descritos em Viret, et al., (1994) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 91:8577-8581, Bansal, et al., (1992) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 8 9:3654-3658), e Schãffner and Sheen (1991) Plant Cell 3:997-1012).

Em algumas concretizações, o cassete de expressão é desenhado de tal forma que a expressão da VSP codificada, por exemplo, ZmLox6 da SEQ ID NO: 2 ou fragmento biologicamente ativo ou variante destes, é dirigida pelo promotor da pequena subunidade da Rubisco de milho (SSU) (ver, por exemplo, Figura IA; também ver número de acesso ao Genbank U09743.1). Quando introduzida dentro de uma planta C4 tal como milho, essa construção provê uma expressão preferencial da VSP codificada dentro das células da bainha do feixe dos tecidos foliares. Em outras concretizações, essa construção, além disso, compreende uma seqüência codificando para um sinal de endereçamento vacuolar, por exemplo, o sinal de endereçamento vacuolar da proaleurina de milho, operacionalmente ligado ao polinucleotideo VSP para que a VSP expressa seja dirigida para o compartimento vacuolar das células da bainha do feixe (ver, por exemplo, Figura 1B) . Peptideo sinal ZM-proaleurina (SP) e a seqüência de direcionamento vacuolar (VTS) são necessários para o processamento mediado pelo Golgi e direcionando ZmLox6 para o vacúolo.

Em algumas concretizações, o cassete de expressão é desenhado de tal forma que a expressão da VSP codificada, por exemplo, ZmLoxô da SEQ ID NO: 2 ou fragmento biologicamente ativo ou variante destes, é dirigida pelo promotor da fosfoenolpiruvato carboxilase (PEPCl) de milho (ver, por exemplo, Figura 2A; também ver número de acesso no GenBank X15642.1 (seqüência parcial)). Quando introduzida dentro de uma planta, esta construção provê para expressão preferencial da VSP codificada dentro das células do mesófilo do tecido foliar. Em outras concretizações, essa construção ainda compreende uma seqüência codificando para um sinal de endereçamento vacuolar, por exemplo, o sinal de endereçamento vacuolar da proaleurina de milho, operacionalmente ligado ao polinucleotideo VSP para que a VSP expressa seja dirigida para dentro do compartimento vacuolar da célula do mesófilo (ver, por exemplo, Figura 2B). Onde a planta é uma planta C4 tal como milho, o cassete de expressão pode alternativamente compreender uma seqüência codificando para um peptideo de trânsito de plastídeo, por exemplo, um peptideo de trânsito de cloroplasto, operacionalmente ligado ao polinucleotideo VSP para que a VSP expressa seja dirigida para dentro do compartimento plastideo da célula do mesófilo.

Em algumas concretizações, o cassete de expressão é desenhado para que a expressão da VSP codificada, por exemplo, ZmLox6 da SEQ ID NO: 2 ou fragmento biologicamente ativo ou variante destes, seja dirigida por um promotor constitutivo tal como o promotor de ubiquitina (UBI) , por exemplo, o promotor da ubiquitina de milho UBI (ver, por exemplo, Figura 3A; também ver número de acesso ao Genbank S94464). Em outras concretizações, o cassete de expressão também compreende uma seqüência codificando para um sinal de endereçamento vacuolar, por exemplo, o sinal de endereçamento vacuolar da proaleurina de milho, operacionalmente ligado ao polinucleotideo VSP para que a VSP expressa seja dirigida para dentro do compartimento vacuolar das células (ver, por exemplo, Figura 3B). O cassete de expressão pode também compreender um gene marcador seletivo para a seleção das células transformadas. Genes marcadores de seleção são utilizados para a seleção das células ou tecidos transformados. Genes marcadores incluem genes codificando genes de resistência a antibióticos, tais como aqueles codificando a neomicina fosfotransferase II (NEO) e a higromicina fosfotransferase (HPT), bem como genes conferindo resistência a compostos herbicidas, tais como glufosinato de amônio, bromoxinil, imidazolinonas, e 2,4-diclorofenoxiacetato (2,4-D). Marcadores seletivos adicionais incluem maracadores fenotipicos tais como a β-galactosidase e proteínas fluorescentes tais como a proteína fluorescente verde (GFP) (Su, et al., (2004) Biotechnol. Bioeng. 85:610-9 e Fetter, et al., (2004) Plant Cell 16:215-28), proteína ci ano fluorescente (CYP) (Bolte, et al., (2004) J. Cell Science 117:943-54 e Kato, et al., (2002) Plant Physiol 129:913-42), e a proteína amarelo fluorescente (PhiYFP™ dam Evrogen, ver, Bolte, et al., (2004) J. Cell Science 117:943-54). Para marcadores seletivos adicionais, ver geralmente, Yarranton (1992) Curr. Opin. Biotech. 3:506-511; Christopherson, et al., (1992) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89:6314-6318; Yao, et al., (1992) Cell 71:63-72; Reznikoff (1992) Mol. Microbiol. 6:2419-2422; Barkley, et al., (1980) in The Operon, pp. 177-220; Hu, et al., (1987) Cell 48:555- 566; Brown, et al., (1987) Cell 49:603-612; Figge, et al., (1988) Cell 52:713-722; Deuschle, et al., (1989) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86:5400-5404; Fuerst, et al., (1989) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 8 6:254 9-2553; Deuschle, et al., (1990) Science 248:480-483; Gossen (1993) Ph.D. Thesis, University of Heidelberg; Reines, et al., (1993) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90:1917-1921; Labow, et al., (1990) Mol. Cell. Biol. 10:3343-3356; Zambretti, et al., (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:3952-3956; Baim, et al., (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:5072-5076; Wyborski, et al., (1991) Nucleic Acids Res. 19:4 647-4 653; Hillenand-Wissman (1989) Topics Mol. Struc. Biol. 10:143-162; Degenkolb, et al., (1991) Antimicrob. Agents Chemother. 35:1591-1595; Kleinschnidt, et al., (1988) Biochemistry 27:1094-1104; Bonin (1993) Ph.D. Thesis, University of Heidelberg; Gossen, et al., (1992) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89:5547-5551; Oliva, et al., (1992) Antimicrob. Agents Chemother. 36:913- 919; Hlavka, et al., (1985) Handbook of Experimental Pharmacology, Vol. 78 (Springer-Verlag, Berlin); Gill, et al., (1988) Nature 334:721-724. Tais divulgações são aqui incorporadas por referência. A lista acima de genes marcadores de seleção não é para ser limitante. Qualquer gene marcador de seleção pode ser usado na presente invenção.

A presente invenção também provê um método para aumentar a concentração e/ou atividade de um polipeptideo VSP, por exemplo, a proteína ZmLox6 da SEQ ID NO: 2 ou fragmento biologicamente ativo ou variante destes, em uma planta. Em geral, concentração e/ou atividade é aumentada em pelo menos 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% ou 90% com relação à planta controle ou tipo selvagem, parte da planta, ou célula que tinha uma seqüência VSP da invenção introduzida. 0 aumento da concentração e/ou atividade de um polipeptideo VSP na presente invenção pode ocorrer durante e/ou subsequente ao crescimento da planta para o estágio desejado de desenvolvimento. Em concretizações especificas, polipeptideos VSP tais como a proteína ZmLox6 ou fragmento ou variante destes são aumentados em monocotiledõneas, incluindo, mas não limitado a, milho.

O nível de expressão do polipeptideo VSP pode ser medido diretamente, por exemplo, através da dosagem do nível do polipeptideo VSP na planta.

Em algumas concretizações, o polipeptideo ou polinucleotídeo VSP é introduzido dentro da célula vegetal. Conforme discutido aqui em outros locais, muitos métodos são conhecidos no estado da técnica para prover um polipeptideo para incluir em plantas, mas não estão limitados a, introdução direta do polipeptideo dentro da planta e introduzir dentro da planta (transientemente ou estavelmente) um constructo de polinucleotídeo codificando um polipeptideo tendo propriedades VSP. Subseqüentemente, uma célula vegetal tendo a seqüência da invenção introduzida é selecionada usando métodos conhecidos para os especialistas da área tais como, mas não estando limitados a, análise Southern blot, sequenciamento de DNA, análise de PCR, ou análises fenotípicas. Uma planta ou parte da planta modificada pelas concretizações antecedentes é crescida sob condições de formação de uma planta por um tempo suficiente para aumentar a concentração e/ou atividade do polipeptideo VSP, por exemplo,a proteína ZmLox6 ou fragmento ou variante destes, na planta. Condições de formação da planta são bem conhecidas no estado da técnica e são discutidas brevemente aqui e em outro lugar.

É também reconhecido que o nível do polipeptideo pode ser aumentado através do emprego de um polinucleotídeo VSP que não seja capaz de dirigir, em uma planta transformada, a expressão de uma proteína ou um RNA. Por exemplo, polinucleotídeos VSP tais como o gene ZmLox6 podem ser usados para desenhar constructos de polinucleotídeo que possam ser empregados em métodos para alterar ou mutar uma seqüência nucleotídica genômica em um organismo. Tais constructos de polinucleotídeo incluem, mas não estão limitados a, vetores RNA:DNA, vetores mutacionais RNA:DNA, vetores reparadores RNA:DNA, oligonucleotídeos mistos- duplex, oligonucleotídeos autocomplementares RNA:DNA, e oligonucleobases recombinogênicas. Tais constructos de nucleotídeos e métodos de uso são conhecidos no estado da técnica. Ver patentes americanas nos. 5,565,350; 5,731,181; 5,756,325; 5,760,012; 5,795,972; e 5,871,984; todas as quais são incorporadas aqui por referência. Ver também, WO 98/49350, WO 99/07865, WO 99/25821, e Beetham, et al., (1999) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 96:8774-8778; aqui incorporados por referência. Então, o nível e ou atividade de um polipeptideo VSP, por exemplo, a proteína ZmLox6 da SEQ ID NO: 2 ou fragmento ou variante destes, pode ser aumentado através da alteração do gene codificando o polipeptideo VSP ou seu promotor. Ver, por exemplo, Kmiec, U.S. Patent 5, 565,350; Zarling, et al., PCT/US93/03868. Então plantas mutagenizadas que carregam mutações nos genes VSP, onde as mutações aumentam a expressão do gene VSP, por exemplo, o gene ZmLox6, ou aumentam as propriedades VSP do polipeptideo VSP codificado, por exemplo, a proteína ZmLox6, são providos.

É, portanto, reconhecido que métodos da presente invenção não dependem da incorporação de um polinucleotídeo inteiro dentro do genoma, apenas que a planta ou célula da mesma esteja alterada como resultado da introdução do polinucleotídeo dentro da célula. Em uma concretização da invenção, o genoma pode ser alterado seguindo a introdução de um polinucleotídeo VSP, tal como a seqüência ZmLox6 da SEQ ID NO: 1, ou a seqüência codificando ZmLox6 descrita nos nucleotídeos 62-2737 da SEQ ID NO: 1 ou na SEQ ID NO: 3, dentro de uma célula. Por exemplo, o polinucleotídeo, ou qualquer parte do mesmo, pode incorporar dentro do genoma da planta. Alterações no genoma da presente invenção incluem, mas não estão limitadas a, adições, deleções, e substituições de nucleotídeos dentro do genoma. Enquanto os métodos da presente invenção não dependem em adições, deleções e substituições de qualquer número particular de nucleotídeos, se reconhece que tais adições, deleções e substituições compreendem pelo menos um nucleotídeo.

Consequentemente, em algumas concretizações, os métodos da invenção envolvem a introdução de um polipeptideo ou polinucleotiideo VSP dentro de uma planta. "Introdução" significa apresentar à planta o polinucleotideo ou polipeptideo VSP de tal maneira que a seqüência ganha acesso ao interior de uma célula vegetal. Os métodos da invenção não dependem de um método particular para introduzir uma seqüência dentro de uma planta, apenas que o polinucleotideo ou polipeptideo ganhe acesso ao interior de pelo menos uma célula vegetal. Métodos para introduzir polinucleotideos ou polipeptideos VSP dentro das plantas são conhecidos no estado da técnica incluindo, mas não estando limitado a, métodos de transformação estável, métodos de transformação transiente, e métodos mediados por virus.

"Transformação estável" significa que o constructo de nucleotideo introduzido dentro de uma planta se integra no genoma da planta e é capaz de ser herdado pela progênie da mesma. "Transformação transiente" significa que um polinucleotideo é introduzido dentro da planta e não se integra no genoma da planta ou um polipeptideo é introduzido dentro de uma planta.

Protocolos de transformação bem como protocolos para introduzir polipeptideos ou seqüências de polinucleotideos VSP dentro das plantas podem variar dependendo do tipo da planta ou célula vegetal escolhida para transformação. Em algumas concretizações, os métodos da presente invenção envolvem protocolos de transformação adequados para introduzir polipeptideos ou seqüência de polinucleotideos de VSP dentro de monocotiledôneas.

Métodos adequados para introduzir polipeptideos e polinucleotideos VSP dentro de células vegetais incluem microinjeção (Crossway, et al., (1986) Biotechniques 4320- 334), eletroporação (Riggs, et al., (1986) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 83:5602-5606, transformação mediada por Agrobacterium (U.S. Patent No. 5,563,055 e U.S. Patent No. 5,981,840), transferência gênica direta (Paszkowski, et al., (1984) EMBO J. 3:2717-2722), e aceleração de partículas por balística (ver, por exemplo, U.S. Patent Nos. 4,945,050; U.S. Patent No. 5,879,918; U.S. Patent No. 5,886,244; e, 5,932,782; Tomes, et al., (1995) in Plant Cell, Tissue, and Organ Culture: Fundamental Methods, ed. Gamborg and Phillips (Springer-Verlag, Berlin); McCabe, et al., (1988) Biotechnology 6:923-926); e Lecl transformation (WO 00/28058). Ver também, Weissinger, et al., (1988) Ann. Rev. Genet. 22:421-477; Sanford, et al., (1987) Partieulate Science and Technology 5:27-37 (cebola); Datta, et al., (1990) Biotechnology 8:736-740 (arroz); Klein, et al., (1988) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85:4305-4309 (milho); Klein, et al., (1988) Biotechnology 6:559-563 (milho); U.S. Patent Nos. 5,240,855; 5,322,783; and, 5,324,646; Klein, et al., (1988) Plant Physiol. 91:440-444 (milho); Fromm, et al., (1990) Biotechnology 8:833-839 (milho); Hooykaas-Van Slogteren, et al., (1984) Nature (London) 311:763-764; U.S. Patent No. 5,736,369 (cereais); Bytebier, et al., (1987) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84:5345-5349 (Liliaceae); De Wet, et al., (1985) em The Experimental Manipulation of Ovule Tissues, ed. Chapman, et al., (Longman, New York), pp. 197-209 (pólen); Kaeppler, et al., (1990) Plant Cell Reports 9:415-418 e Kaeppler, et al., (1992) Theor. Appl.

Genet. 84:560-566 (transformação mediada por fibra); D' Halluin, et al., (1992) Plant Cell 4:1495-1505 (eletroporação); Li, et al., (1993) Plant Cell Reports 12:250-255 e Christou and Ford (1995) Annals of Botany 75:407-413 (arroz); Osjoda, et al., (1996) Nature Biotechnology 14:745-750 (milho via Agrobacterium tumefaciens); todas as quais incorporadas aqui por referência.

Em concretizações especificas, o aumento da capacidade de armazenar nitrogênio, e o concomitante aumento no conteúdo de nitrogênio e/ou valor nutricional, de uma planta ou partes da mesma, comparado com uma planta controle ou tipo selvagem pode ser provido para uma planta usando uma variedade de métodos de transformação transiente. Tais métodos de transformação transiente incluem, mas não estão limitados a, introdução do polipeptideo VSP, por exemplo, a proteína ZmLox6 da SEQ ID NO: 2 ou fragmento bilogicamente ativo ou variante destes, diretamente dentro da planta ou a introdução de um transcrito dentro da planta. Tais métodos incluem, por exemplo, microinjeção ou bombardeamento de partículas. Ver, por exemplo, Crossway, et al., (1986) Mol Gen. Genet. 202:179-185; Nomura, et al., (1986) Plant Sei. 44:53-58; Hepler, et al., (1994) Proc. Natl. Acad. Sei. 91:2176-2180 e Hush, et al., (1994) The Journal of Cell Science 107:775- 784, todas as quais são incorporadas aqui por referência. Alternativamente, um polinucleotideo VSP, por exemplo, a seqüência ZmLox6 da SEQ ID NO: 1, a seqüência codificando ZmLox6 descrita nos nucleotideos 62-2737 da SEQ ID NO: 1 ou na SEQ ID NO: 3, ou fragmento ou variante destes codificando um polipeptideo VSP, pode ser transientemente transformada dentro da planta usando técnicas conhecidas no estado da técnica. Tais técnicas incluem sistemas de vetores virais e a precipitação do polinucleotideo de maneira que se opõe à subseqüente liberação do DNA. Então, a transcrição da partícula de DNA ligada pode ocorrer, mas a freqüência com a qual ela é liberada para se tornar integrada dentro do genoma é grandemente reduzida. Tais métodos incluem o uso de partículas cobertas com polietilenoimina (PEI; Sigma #P3143).

Em outras concretizações, polinucleotídeos VSP podem ser introduzidos dentro das plantas através do contato das plantas com vírus ou ácidos nucléicos virais. Geralmente, tais métodos envolvem a incorporação de um constructo de nucleotídeo dentro de uma molécula de DNA ou RNA viral. É reconhecido que um polipeptideo VSP de interesse pode ser incialmente sintetizado como parte de uma poliproteína viral, a qual mais tarde poderá ser processada por proteólise in vivo ou in vitro para produzir a proteína recombinante desejada. Além disso, é reconhecido que promotores úteis podem incluir promotores utilizados para transcrição pelas RNA polimerases viral. Métodos para introduzir polinucleotideos dentro de plantas e expressar um polipeptideo codificado dessa forma, envolvendo moléculas da DNA ou RNA viral, são conhecidos no estado da técnica. Ver, por exemplo, U.S. Patent Nos. 5,889,191; 5,889,190; 5,866,785; 5,589,367; 5,316,931 e Porta, et al., (1996) Molecular Biotechnology 5:209-221; aqui incorporados por referência.

Métodos são conhecidos no estado da técnica para selecionar a inserção de um polinucleotideo em um local especifico no genoma da planta. Em uma concretização, a inserção do polinucleotideo no local genômico desejado é alcançada usando um sistema de recombinação sítio- especifica. Ver, por exemplo, WO 99/25821, WO 99/25854, WO 99/25840, WO 99/25855, e WO 99/25853, todas as quais estão aqui incorporadas por referência. Brevemente, um polinucleotideo pode estar contido em um cassete de transferência flanqueado por dois sitios de recombinação não recombinogênicos. O cassete de transferência é introduzido dentro de uma planta tendo incorporado estavelmente dentro de seu genoma um sitio alvo que é flanqueado por dois sitios de recombinação não recombinogênicos que correspondem aos sitios do cassete de transferência. Uma recombinase apropriada é provida e o cassete de transferência é integrado no sitio alvo. O polinucleotideo de interesse é por meio disso integrado na posição especifica do cromossomo no genoma da planta. As células que têm sido transformadas podem ser crescidas em plantas de acordo com formas convencionais. Ver, por exemplo, McCormick, et al. , (1986) Plant Cell Reports 5:81-84. Essas plantas podem então ser crescidas, e também polinizadas com a mesma linhagem transformada ou diferentes linhagens, e a progênie resultante ter expressão da característica fenotípica desejada, por exemplo, capacidade de armazenamento de nitrogênio aumentada, e/ou valor nutricional aumentado, identificada. Duas ou mais gerações podem ser crescidas para assegurar que a expressão da característica fenotípica desejada é estavelmente mantida e herdada e então as sementes colhidas para assegurar expressão da característica fenotípica desejada foi alcançada. Desta forma, a presente invenção provê sementes transformadas (também referidas como "sementes transgênicas") tendo um polinucleotídeo descrito aqui, por exemplo, um cassete de expressão compreendendo a seqüência ZmLox6 da SEQ ID NO: 1, a seqüência codificando ZmLox6 descrita nos nucleotídeos 62-2737 da SEQ ID NO: 1 ou na SEQ ID NO: 3, ou fragmento ou variante destes codificando um polipeptídeo VSP, estavelmente incorporado dentro de seu genoma.

Plantas da invenção podem ser produzidas por qualquer método adequado, incluindo cruzamento. 0 cruzamento de plantas pode ser usado para introduzir caracetrísticas desejadas (por exemplo, um transgene incorporado estavelmente) dentro de uma linhagem de planta particular de interesse, e pode ser melhorada em qualquer das diferentes formas. Reprodução de linhagens começa com o cruzamento de dois genótipos, tais como uma linhagem elite de interesse e uma outra linhagem elite pura tendo uma ou mais características desejáveis (i.e., tendo estavelmente incorporada um polinucleotídeo de interesse, tendo uma atividade modulada e/ou nível do polipeptídeo de interesse, etc.) as quais complementam a linhagem de planta elite de interesse. Se os dois parentais originais não provêem todas as características desejadas, outras fontes podem ser incluídas na população de cruzamento. No método de linhagens puras, plantas superiores são auto fecundadas e selecionadas em gerações filiais sucessivas. Nas gerações filiais sucessoras as condições heterozigotas dão origem a linhagens homozigotas como um resultado de autopolinização e seleção. Tipicamente no método de reprodução de linhagem pura, cinco ou mais gerações filiais sucessivas de auto- fecundação e seleção são praticadas: Fl -> F2; F2—> F3; F3 —> F4; F4 —> F5, etc. Após uma quantidade suficiente de cruzamentos, sucessivas gerações filiais servirão para aumentar o número de sementes da linhagem desenvolvida. Em concretizações específicas, a linhagem pura compreende alelos homozigotos com cerca de 95% ou mais de seus loci.

Além de ser usado para criar uma conversão por retrocruzamento, retrocruzamento pode também ser usado na combinação com reprodução de linhagens puras para modificar uma linhagem elite de interesse e um híbrido que é feito usando a linhagem elite modificada. Conforme discutido previamente, retrocruzamento pode ser usado para transferir um ou mais traços desejados especificamente de uma linhagem, o doador parental, para uma linhagem pura chamada de parental recorrente, a qual tem todas as boas características agronômicas, mas não aquele traço ou traços desejados. No entanto, o mesmo procedimento pode ser usado para mover a progênie em direção ao genótipo do parental recorrente, mas ao mesmo tempo retém muitos componentes do parental não-recorrente pela parada do retrocruzamento no estágio anterior e procedendo com auto-fecundação e seleção. Por exemplo, um F1, tal como um híbrido comercial, é criado. Esse híbrido comercial pode ser retrocruzado com uma das suas linhagens parentais para criar um BC1 ou BC2.

Progênies são auto-fecundadas e selecionadas para que a linhagem desenvolvida novamente tenha muitos dos atributos dos parentais recorrentes e ainda diversos dos atributos desejados do parental não-recorrente. Esta abordagem intensifica o valor e os pontos fortes do parental recorrente para uso em novos híbridos e reprodutores.

Portanto, uma concretização desta invenção é um método de fazer uma conversão de retrocruzamento de uma linhagem pura de interesse compreendendo os passos de cruzar uma planta da linhagem pura de interesse com uma planta doadora compreendendo pelo menos um gene mutante ou transgene conferindo um traço desejado (por exemplo, aumento da capacidade de armazenamento de nitrogênio) , selecionando uma planta da progênie F1 compreendendo o gene mutante ou transgene conferindo o traço desejado, e retrocruzar a progênie da planta F1 selecionada para uma planta da linhagem pura de interesse. Esse método pode adicionalmente compreender o passo de obter um perfil de marcador molecular da linhagem pura de interesse e usar o perfil de marcador molecular para selecionar para uma progênie de planta com o traço desejado e o perfil de marcador molecular da linhagem pura de interesse. Da mesma maneira, esse método pode ser usado para produzir uma semente híbrida Fl adicionando um passo final de cruzar a conversão do traço desejado da linhagem pura de interesse com uma planta diferente para fazer uma semente híbrida Fl compreendendo um gene mutante ou transgene conferindo o traço desejado.

Em certas concretizações, os polinucleotídeos VSP derivados de monocotiledôneas da presente invenção podem ser montados com qualquer combinação de seqüências de polinucleotídeos de interesse a fim de criar plantas com um traço desejado. Um traço, conforme usado aqui, refere-se ao fenótipo derivado de uma seqüência particular ou grupos de seqüências. Por exemplo, os polinucleotídeos VSP da presente invenção podem ser montados com quaisquer outros polinucleotídeos codificando polipeptídeos tendo propriedades VSP, tais como fosfatase alcalina (Dewald, et al., (1992) J. Biol. Chem. 267:15958-15964), amilase (Noquet, et al., (2001) Australian J. Plant Physiol. 28:279-287), quitinase (Peumans, et al., (2002) Plant Physiol. Rockville 130:1063-1072), lectina (Van, et al., (2002) Plant Physiol. Rockville 130:757-769), outra lipoxigenase (Tranbarger, et al., (1991) Plant Cell 3:973- 988), e semelhantes. As combinações geradas podem também incluir múltiplas cópias de qualquer um dos polinucleotideos de interesse.

Os polinucleotideos da presente invenção podem também ser montados com qualquer outro gene ou combinação de genes para produzir plantas com uma variedade de combinações de traços desejados incluindo, mas não estando limitado a, traços desejáveis para alimentação animal tais como genes de óleos superiores (por exemplo, U.S. Patent No. 6,232,529); aminoácidos balanceados (por exemplo, hordotioninas (U.S. Patent Nos. 5,990,389; 5,885,801; 5,885,802; e 5,703,409); cevada com alto teor de lisina (Williamson, et al., (1987) Eur. J. Biochem. 165:99-106; e WO 98/20122) e proteínas com alto teor de metionina (Pedersen, et al., (1986) J. Biol. Chem. 261:6279; Kirihara, et al., (1988) Gene 71:359; e Musumura, et al., (1989) Plant Mol. Biol. 12:123)); digestibilidade aumentada (por exemplo, proteínas de armazenamento modificadas (U.S. Application Serial No. 10/053,410, depositada 7 de novembro de 2001); e tioredoxinas (U.S. Application Serial No. 10/005,429, depositada em 03 de dezembro de 2001)); a divulgação das quais são aqui incorporadas por referência.

Os polinucleotideos da presente invenção podem também ser montados com traços desejáveis para doenças ou resistência à herbicida (por exemplo, genes de detoxificação da fumonisina (U.S. Patent No. 5,792,931); genes de resistência à doença e de avirulência (Jones, et al., (1994) Science 266:789; Martin, et al., (1993) Science 262:1432; Mindrinos, et al. , (1994) Cell 78:1089); mutantes em acetolactato sintase (ALS) que levam à resistência à herbicida tais como o S4 e/ou mutações Hra; inibidores da glutamina sintase tais como fosfinotricina ou basta (por exemplo, gene bar); e resistência à glifosato (por exemplo, o gene EPSPS e o gene GAT; ver, por exemplo, U.S. Publication No. 20040082770 e WO 03/092360)); e traços desejáveis para processamento ou produtos processados tais como óleos superiores (por exemplo, U.S. Patent No. 6,232,529 ); óleos modificados (por exemplo, genes da desaturase de ácidos graxos (U.S. Patent No. 5,952,544; WO 94/11516)); amidos modificados (por exemplo, ADPG pirofosforilases (AGPase), amido sintases (SS), enzimas de ramificação de amido (SBE), e enzimas de desramificação de amido (SDBE)); e polímeros e bioplásticos (por exemplo, U.S. Patent No. 5.602,321; beta-cetotiolase, polihidroxibutirato sintase, e acetoacetil-CoA redutase (Schubert, et al., (1988) J. Bacteriol. 170:5837-5847) facilitam expressão dos polihidroxialcanoatos (PHAs)); as divulgações das quais são aqui incorporadas por referência. Alguém pode combinar os polinucleotídeos da presente invenção com polinucleotídeos provendo traços agronômicos tais como macho-esterelidade (por exemplo, ver U.S. Patent No. 5,583,210), força do caule, tempo de florescimento, ou traços de tecnologia de transformação tais como regulação do ciclo celular ou direcionamento de gene (por exemplo, WO 99/61619, WO 00/17364, e WO 99/25821); as revelações das quais são aqui incorporadas por referência. Essas combinações de montagem podem ser criadas por qualquer método incluindo, mas não estando limitado a, plantas de reprodução cruzada por qualquer metodologia convencional ou TopCross, ou transformação genética. Se as seqüências são montadas através da transformação genética das plantas, as seqüências de polinucleotideo de interesse podem ser combinadas a qualquer tempo e em qualquer ordem. Por exemplo, uma planta transgênica compreendendo um ou mais traços desejados pode ser usada como alvo para introduzir traços adicionais por transformação subsequente. Os traços podem ser introduzidos simultaneamente em um protocolo de co-transformação com os polinucleotideos de interesse providos por qualquer combinação dos cassetes de transformação. Por exemplo, se duas seqüências serão introduzidas, as duas seqüências podem estar contidas em cassetes de transformação separados (trans) ou contidos no mesmo cassete de expressão (eis). Expressão das seqüências pode ser dirigida pelo mesmo promotor ou por promotores diferentes. Em uma concretização, é desejável introduzir um cassete de transformação que resultará na super- expressão do polinucleotideo de interesse. Este pode ser combinado com qualquer combinação de outros cassetes de super-expressão para gerar a combinação desejada dos traços na planta. É adicionalmente reconhecido que seqüências de polinucleotideo podem ser montadas em um local desejado no genoma usando um sistema de recombinação sitio-especifico. Ver, por exemplo, WO 99/25821, WO 99/25854, WO 99/25840, WO 99/25855, e WO 99/25853, todas as quais são aqui incorporadas por referência.

Como usado aqui, o termo "planta" inclui células vegetais, protoplastos de planta, culturas de tecidos de planta a partir das quais plantas podem ser regeneradas, calos vegetais, agregados de plantas, e células vegetais que são intactas em plantas ou partes das plantas tais como embriões, pólen, óvulos, sementes, folhas, flores, ramos, frutos, grãos, espigas, cascas, caules, raízes, parte apical das raízes, anteras, e semelhantes. Grão significa a semente madura produzida por plantadores comerciais para propósitos outros do que o crescimento ou reprodução das espécies. Progênie, variantes, e mutantes das plantas regeneradas são também incluídos dentro do escopo da invenção, desde que essas partes compreendam os polinucleotídeos introduzidos. Então, a invenção compreende sementes transgênicas produzidas pelas plantas da invenção.

Uma "célula vegetal ou matéria vegetal" é algo no qual uma alteração genética, tal como transformação, tenha sido efetuada como para um gene VSP de interesse, ou é uma planta ou célula vegetal que é descendente de uma planta ou célula então alterada e a qual compreende a alteração. Um "controle" ou "planta controle" ou "célula vegetal controle" proporciona um ponto de referência para medir mudanças no fenótipo da planta em questão ou célula vegetal. Uma planta controle ou célula vegetal controle pode compreender, por exemplo: (a) uma planta ou célula tipo selvagem, i.e., do mesmo genótipo que o material inicial usado para alteração genética que resultou na célula ou matéria vegetal; (b) uma planta ou célula vegetal do mesmo genótipo que o material inicial, mas que foi transformada com um constructo nulo (i.e., com um constructo que não possui efeito conhecido no traço de interesse, tal como um constructo compreendendo um gene marcador); (c) uma planta ou célula vegetal que é um segregante não transformado entre a progênie de uma célula vegetal ou planta especifica; (d) uma planta ou célula vegetal geneticamente idêntica ã célula vegetal ou planta especifica, mas que não é exposta a condições ou estímulos que poderiam induzir a expressão do gene de interesse; ou (e) a célula vegetal ou planta específica, propriamente ditas, sob condições onde o gene VSP de interesse não é expresso.

A presente invenção pode ser usada para transformação de qualquer espécie de planta, incluindo, mas não limitado a, monocotiledôneas e dicotiledôneas. Exemplos de espécies de planta de interesse incluem, mas não estão limitadas a, milho (Zea mays), Brassica sp. (por exemplo, B. napus, B. rapa, B. juncea), particularmente aquelas espécies de Brassica úteis como fonte de óleo de semente, alfafa (Medicago sativa), arroz (Oryza sativa), centeio (Secale cereale), sorgo (Sorghum bicolor, Sorghum vulgare), milheto (por exemplo, pearl millet (Pennisetum glaucum), milheto "proso" (Panicum miliaceum), painço (Setaria italica), capim pé de galinha (Eleusine coracana) ) , girassol (Helianthus annuus), cártamo (Carthamus tinctorius), trigo (Triticum aestivum), soja (Glycine max), tabaco (Nicotiana tabacum), batata (Solanum tuberosum), amendoim (Araehis hypogaea) , algodão (Gossypium barbadense, Gossypium hirsutum), batata doce (Ipomoea batatus), mandioca (Manihot eseulenta), café (Coffea spp.), coco (Cocos nucifera) , abacaxi (Ananas comosus), árvores de citros (Citrus spp.), cacau (Theobroma cacao),chá (Camellia sinensis) , banana (Musa spp.), abacate (Persea americana), figo (Ficus casica) , goiaba (Psidium guajava), manga (Mangifera indica), azeitona (Olea europaea), mamão (Carica papaya) , cajueiro (Anacardium occidentale), macadâmia (Macadamia integrifolia) , amêndoa (Prunus amygdalus), beterraba (Beta vulgaris) , cana-de- açúcar (Saccharum spp.), aveia, cevada, vegetais, ornamentais, e coniferas.

Vegetais incluem tomates (Lycopersicon esculentum) , alface (por exemplo, Lactuca sativa) , feijão verde (Phaseolus vulgaris) , feijão lima (Phaseolus limensis) , peas (Lathyrus spp.), e membros dos gêneros Cucumis tais como pepino (C. sativus), melão (C. cantalupensis) , e melão amarelo (C. melo). Ornamentais incluem azaléia

(Rhododendron spp.), hortênsia (Macrophylla hydrangea) , hibisco (Hibiseus rosasanensis) , rosa (Rosa spp.), tulipa (Tulipa spp.), narciso (Nareissus spp.), petúnia (Petunia hybrida), cravo (Dianthus earyophyllus), poinsétia (Euphorbia puleherrima), e crisântemo. Coniferas que possam ser empregadas na prática da presente invenção inlcuem, por exemplo, pinus tais como pinheiro da América-do-Norte (Pinus taeda), Pinus elliotii, pinheiro ponderosa (Pinus ponderosa) , pinheiro americano (Pinus contorta), e pinheiro Monterey (Pinus radiata) ; pinheiro douglas (Pseudotsuga menziesii) ; cicuta do oeste (Tsuga canadensis); pinheiro branco (Picea glauca); sequóia canadense (Sequoia sempervirens); abetos verdadeiros tais como abeto prata (Abies amabilis) e abeto bálsamo (Abies balsamea); e cedros tais como cedro vermelho do oeste (Thuja plicata) e cedro amarelo do Alasca (Chamaecyparis nootkatensis) . Em concretizações especificas, plantas da presente invenção são plantas cultivadas (por exemplo, milho, alfafa, girassol, Brassica, soja, algodão, cártamo, amendoim, sorgo, trigo, milheto, tabaco, etc.).

Em outras concretizações, plantas de interesse são monocotiledôneas, por exemplo, milho (Zea mays), arroz (Oryza sativa), centeio (Secale cereale), sorgo (Sorghum bicolor, Sorghum vulgare), milheto (e.g., pearl millet (Pennisetum glaucum), milheto "proso" (Panicum miliaceum), painço (Setaria italica), capim pé de galinha (Eleusine coracana), trigo (Triticum aestivum), cana-de-açúcar (Saeeharum spp.), aveia, e cevada.

Outras plantas de interesse incluem plantas de grãos que provêem sementes de interesse, plantas de sementes oleaginosas, e plantas leguminosas. Sementes de interesse incluem semnetes de grãos, tais como milho, trigo, cevada, arroz, sorgo, etc. Plantas de sementes oleaginosas incluem algodão, soja, girassol, Brassica, milho, alfafa, palmeira, coco, etc. Plantas leguminosas incluem feijão e ervilha. Feijões incluem guar, alfarrobeira, feno grego, soja, feijões de jardim, caupi, feijão mungo, feijão lima, feijão de fava, lentilha, grão-de-bico, etc.

Os seguintes exemplos são oferecidos por motivo de ilustração e não para limitação.

EXPERIMENTOS

Plantas são conhecidas por acumular VSPs como um mecanismo para seqüestrar nitrogênio em excesso nas suas células vegetais, particularmente quando um canal reprodutivo é limitante (Staswick (1994) Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 45:303-322). As folhas das árvores deciduas reciclam seu nitrogênio antes que elas caiam no outono. 0 nitrogênio reciclado é estocado na casca na forma de VSPs. As VSPs são remobilizads quando a demanda por nitrogênio excede a quantidade disponível na célula, por exemplo, durante o desenvolvimento do canal reprodutivo ou durante o crescimento na primavera (Staswick (1994) Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 45:303-322).

VSPs, variando em tamanho de ~15 a ~100 kDa, têm sido identificadas como, uma fosfatase alcalina (Dewald, et al., (1992) J. Biol. Chem. 267:15958-15964), amilase (Noquet, et al., (2001) Australian J. Plant Physiol. 28:279-287), quitinase (Peumans, et al., (2002) Plant Physiol. 130:1063- 1072), lectina (Van, et al., (2002) Plant Physiol. 130:757- 769), ou uma lipoxigenase (Tranbarger, et al., (1991) Plant Cell 3:973-988). Sua ocorrência tem sido reportada em uma ampla variedade de espécies vegetais anuais e perenes: soja (Staswick (1988) Plant Physiol. 87:250-254; Tranbarger, et al., (1991) Plant Cell 3:973-988); Trifolium (Corre, et al., (1996) J. Exp. Botany 47:1111-1118); Medicago (alfafa) (Avice, et al., (1997) Crop Sei. 37:1187-1193; Noquet, et al., (2001) Australian J. Plant Physiol. 28:279-287); Arabidopsis (Utsugi, et al., (1998) Plant Mol. Biol. 38:565-576); canola (Rossato, et al., (2002) J. Exp. Botany 53:265-275); álamo (Lawrence, et al., (1997) Planta Heidelberg 203:237-24 4); morus (Van, et al., (2002) Plant Physiol. 130:757-7 69); e pêssego (Gomez & Faurobert (2002) J. Exp. Botany 53:2431-2439). No entanto, ocorrência de VSPs em monocotiledôneas não foi até então estabelecida (Mackown, et al., (1992) Plant Physiol. 99:14 69-1474).

Proteínas conhecidas como sendo uma VSP em algumas espécies podem também ser expressas em altos níveis em outras espécies onde elas não são normalmente expressas.

Por exemplo, a VSP de soja expressa transgenicamente acumulou a um nível de ~5% das proteínas solúveis em tabaco (Guenoune, et al., (1999) Plant Science 145:93-98; Guenoune, et al., (2002) J. Exp. Botany 53:1867-1870).

Diferentes proteínas VSP podem empregar diferentes mecanismos para sinalização intracelular. Por exemplo, VSP- alfa segue o caminho ER-Golgi para chegar ao vacúolo, visto que lipoxigenase (Lox), também conhecida como uma VLX (lipoxigenase vegetativa), segue um caminho diferente, desconhecido, para o compartimento vacuolar (Klauer and Franceschi (1997) Protoplasma 200:174-185). Diferentes proteínas VLX acumulam em compartimentos intracelular separados em soja: VLX A, B, e C acumulam no citosol; VLX D é seqüestrada no vacúolo de células da bainha do feixe e células paravenais (Fischer, et al., (1999) Plant Journal 19:543-554). As proteínas VLX acumulam mesmo sob baixas concentrações de N, contudo, sugerindo que elas desempenham um amplo papel não apenas como VSPs (Grimes, et al., (1993) Plant Physiol. 103:457-4 66).

Plantas aparentemente percebem estresse como um sinal para perda de tecido e conseqüente perda de nitrogênio. Para contar com isso, VSPs são conhecidas por acumular quando plantas são expostas à estresse hídrico e metil jasmonato, um hormônio de estresse (Mason and Mullet (1990) Plant Cell 2:569-580; Rossato, et al., (2002) J. Exp. Botany 53:1131-1141). Outros estresses, tais como injúria, danos de herbívoros, senescência, e ozônio são também conhecidos por conduzir sua acumulação (Utsugi, et al., (1998) Plant Mol. Biol. 38:565-576; Berger, et al., (2002) Physiologia Plantarum 114:85-91; Mira, et al., (2002) Planta Berlin 214:939-946).

Os presentes exemplos focam no gene lipoxigenase dentre os onze, em milho, que exibem as características de uma VSP. Resultados demonstram que a lipoxigenase de milho ZmLox6 é induzida mediante fornecimento de altos níveis de N no meio de crescimento e é mais altamente expressa nas folhas, como a VSP VLX D de soja (Tranbarger, et al., (1991) Plant Cell 3:973-988).

Exemplo 1: Iindução de proteínas através de nitrogênio no meio de crescimento

Plântulas de milho foram testadas para indução de proteínas por nitrato ou uma combinação de nitrato e amônio no meio de crescimento. Plantas de duas semanas de idade crescidas em vermiculita na casa de vegetação sem de aplicação de nitrogênio mostraram sinais de deficiência de nitrogênio como julgado pelo amarelamento das folhas. Algum amarelamento das folhas foi observado até mesmo em 1 mM de nitrato no meio de crescimento. Com a finalidade de identificar as proteínas induzidas por nitrogênio, quantidades excessivas de nitrogênio foram fornecidas no meio de crescimento para induzir expressão das proteínas associadas com qualquer nitrogênio endógeno da maquinaria de estocagem. Diante da aplicação de 100 mM de nitrato como fonte única de nitrogênio, sintomas de estresse (enrolamento das folhas) foram óbvios. Quando aplicado com 50 mM de nitrato de amônio (100 mM nitrogênio total), as plantas pareceram mais saudáveis do que em 1 mM ou 100 mM de nitrato. Tratamento com nitrato de amônio foi incluído para determinar se quaisquer proteínas diferentes foram induzidas com relação ao tratamento de nitrato sozinho. Diferentes tecidos das plantas crescidas em diferentes níveis de nitrogênio foram homogeneizados em uma solução tampão e centrifugados em 100, 000 χ g em uma ultracentrifuga. Ambos os péletes e o sobrenadante foram sujeitos à SDS-PAGE. Uma banda de polipeptídeo de -100 kDa foi fortemente induzida na fração solúvel em altos níveis de nitrogênio (ver Figura 4) . A indução foi mais forte no tecido foliar. Este polipeptídeo foi indetectável no tecido radicular. Outro polipeptídeo de ~60 kDa pareceu ser induzido no tecido do caule quando nitrato de amônio foi fornecido como fonte de nutrição.

Exemplo 2:_Processamento de proteína para análise proteômica

A banda de proteína de 98 kDa da fração proteica solúvel de folha no Exemplo 1, cujo nível de expressão aumentou com aumento da suplementação de nitrato foi retirada do gel de Tris-glicina-SDS e recortada grosseiramente. Pedaços do gel (com um volume de aproximadamente 200 μL) foram lavados em 500 μL de 100 mM de bicarbonato de amônio, então desidratados gradualmente em porcentagem crescente de acetonitrila (15%, 50%, 100%). Pedaços de gel secos foram reidratados em gelo por 1 hora em 250 pL de solução de tripsina (Roche 1418025) contendo aproximadamente 4 pg tripsina em acetonitrila 15%/100 mM de bicarbonato de amônio. Fluído não absorvido foi aspirado e guardado à 4°C. 200 μL de tampão foram adicionados, e digestão em gel procedeu por 16 h à 37°C. Pedaços de gel foram lavados em 200 μί acetonitrila 15%/100 mM de bicarbonato de amônio por 30 min à 37°C, e o fluido foi coletado e agrupado. Peptideos proteoliticos foram coletados através de lavagem dos pedaços de gel em porcentagem crescente de acetonitrila (15%, 50% e 100%), e o fluido aspirado agrupado. 0 aspirado agrupado foi secado completamente à vácuo, e o resíduo redissolvido em 20 pL de H2O contendo 0.1% de ácido fórmico. A amostra toda foi injetada dentro de uma porção de 1 μl e os peptídeos foram subseqüentemente aprisionados em uma coluna de aprisionamento polimérica. Cromatografia de fase reversa foi desempenhada usando uma coluna de sílica C18, 75 μm χ 100 mm, em uma taxa de fluxo de 200 nL/min com um gradiente acetonitrila de 3-85%. Uma repetição do experimento dependente de dados MS foi criada em um espectrômetro de massa quadrupolar de armadilha iônica LCQ clássico para adquirir um escaneamento MS total seguido por três escaneamentos MS/MS dos íons precurssores mais abundantes para duração da corrida. Os dados adquiridos foram então pesquisados usando o software Sequest para identificar informação de seqüência para fragmentos peptídicos individuais.

Doze diferentes peptídeos pertencendo ao mesmo polipeptídeo lipoxigenase (ZmLox6) foram identificados (ver Figura 5). A cobertura é de toda proteína, indicando fortemente que a proteína identificada é ZmLox6.

Além do ZmLoxô, fosfoenolpiruvato carboxilase (PEP carboxilase, ~110 kDa), piruvato ortofosfato diquinase (PPDK, Mr -120 kDa), aconitato hidratase C (ACH, Mr -116 kDa), e uma proteína putativa que foi temporariamente anotada como uma proteína de divisão celular (Mr ~ 90 kDa) foram induzidas por altas concentrações de N no meio de crescimento. Aparentemente, a proteína predita de 90 kDa foi glicosilada como se ela tivesse migrado como uma proteína > 100 kDa. As três primeiras enzimas, PEP carboxilase, PPDK e ACH, são todas enzimas C4.

Exemplo 3: Análises filogenéticas de ZmLoxe com outras proteínas

Nas análises de BLAST contra o banco de dados público, a proteína ZmLox6 mostra homologia mais alta (43% identidade, 57% similaridade) com a proteína de arroz Loxl. Sem estar sujeita à teoria, esse baixo nível de homologia sugere que ZmLox6 evoluiu independentemente para talvez realizar algumas funções espécie-específicas. Nas análises filogenéticas usando proteínas Lox de diversas outras espécies de plantas bem como de milho, verificou-se a proteína ZmLox6 como sendo mais próxima à proteína Lox de soja (ver Figura 6). A proteína Lox de soja foi previamente demonstrada como uma proteína de reserva vegetativa que se acumula nos vacúolos das células do mesófilo envolvendo as nervuras nas folhas (Tranbarger, et al., (1991) Plant Cell 3:973-988). Esses resultados sugerem que a proteína ZmLox6 pode ser também uma proteína de reserva vegetativa que pode ter uma função ortóloga para aquela da proteína Lox de soja. Exemplo 4: Proteínas induzidas por nitrogênio acumulam

mais favoravelmente nas folhas completamente expandidas

Proteínas das folhas individuais coletadas das plantas de milho com 16 dias de idade crescidas em 0.1 mM ou 50 mM NH4NO3 foram sujeitas a SDS-PAGE com a finalidade de identificar as folhas com expressão mais alta da banda de polipeptídeo de ~100 - 110 kDa. A banda de polipeptídeo de ~100 kDa foi mais abundante na folha 4, a qual estava totalmente expandida quando avaliada a partir da ausência da porção basal verde clara e da ausência de quailquer parte senescente como visto nas folhas mais velhas 1, 2 e 3. Embora não seja claro que proporção desta banda pode ser contabilizada por ZmLox6, é evidente que as proteínas nesta banda não estavam presentes em qualquer medida apreciável nas folhas mais jovens 7 e 8. Essa variação é consistente com a hipótese de que as células poderiam seqüestrar nitrogênio para uma VSP apenas quando o excesso dele estivesse disponível, um cenário semelhante ocorre nas folhas totalmente expandidas mas não nas jovens, algumas rapidamente expandidas.

Exemplo 5: Padrão de expressão de ZmLox6 estudado através do Lynx MPSS

O padrão de expressão dos genes Lox de milho em diferentes tecidos da linhagem pura A63 foi compilado do banco de dados MPSS. 0 número de bibliotecas amostradas para cada tecido foi o seguinte: meristema, 14; raiz, 33; caule, 11; folha, 35; espiga, 15; casca, 1; semente inteira, 2; embrião, 8; endosperma, 19; pericarpo, 6; cabelo, 7; pendão, 14; antera, 2; pólen, 1. Conforme mostrado na tabela 1, embora expresso em baixo nivel em um número de tecidos, ZmLox6 é mais altamente expresso no tecido foliar.

Tabela 1: Padrão de expressão dos genes Lox de milho.

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Outro gene que é altamente expresso no tecido foliar é o ZmLoxlO. No entanto, nenhum único peptideo para proteína codificada pelo ZmLoxlO foi detectada durante as análises proteômicas da banda do polipeptideo induzivel por nitrogênio do tecido foliar (ver Exemplos 1 e 2) . As massas moleculares preditas de ZmLox6 (seqüência de aminoácido mostrada em SEQ ID NO: 2) e ZmLoxlO (seqüência de aminoácido mostrada em SEQ ID NO: 4) são aproximadamente 97 e 102 kDa, respectivamente, e os dois polipeptideos compartilham apenas 34% de identidade (ver Figura 7) . As duas proteínas são suficientemente diferentes que se o ZmLoxl0 estivesse presente em um nível detectável em uma banda de polipeptideo de ~100 kDa, ele poderia ter sido pego pelas análises proteômicas. Isso sugere que ZmLoxlO não foi induzido sob as condições experimentais usadas, deixando ZmLox6 apenas como uma proteína semelhante a VSP.

Indução da expressão do gene ZmLox6 após injúria foi então estudada na folha de milho V5 e no nódulo de raiz no estágio V5 de desenvolvimento. Indução da expressão foi medida em ppm ao longo do tempo 0, 3, 12 e 24 horas após 20 injúria. Resultados mostraram que ZmLox6 foi induzido por injúria em ambos os tecidos foliares e radiculares (ver Figuras 8 e 9), uma característica exibida pelas VSPs de outras espécies de plantas (Utsugi, et al., (1998) Plant Mol. Biol. 38:565-576; Berger, et al., (2002) Physiologia 25 Plantarum 114:85-91; Mira, et al., (2002) Planta Berlin 214:939-946).

Linhagens com alto teor de proteína Illinois (IHP) e baixo teor de proteína Illinois (ILP) foram selecionadas em mais de uma centena de ciclos para proteínas com alto e baixo teor no grão, respectivamente (Uribelarrea, et al., (2004) Crop Science 44:1593-1600). Considerando que o grão IHP contém >25% de proteína, as de ILP têm <5%. A alta demanda por nitrogênio no grão de IHP é encontrada pela grande quantidade de nitrogênio em seus tecidos vegetativos já que é bem conhecido que a maioria do nitrogênio nos tecidos vegetativos é remobilizado para o grão através da maturidade. Análises MPSS dessas linhagens revelaram que ZmLox6 foi expresso em um nível muito baixo em ILP em comparação com aquele em encontrado em IHP, implicando a função desta proteína no armazenamento de nitrogênio em tecidos vegetativos (Figura 10).

Coletivamente, esses achados dão suporte os resultados descritos acima, dos estudos proteômicos e de indução por nitrogênio, sugerindo que ZmLox6 é uma VSP em milho e é altamente expresso no tecido foliar.

Exemplo 6: Expressão de ZmLox6 em E. coli

O comprimento total de ZmLox6 foi amplificado de um clone EST através de PCR para gerar um sítio de restrição de EcoRI em fase acima do ATG, e um sítio de restrição XhoI na estrutura imediatamente seguindo a seqüência codificante, para produzir um produto de 2,676 bp. Seqüências dos iniciadores da amplificação: acima, 5'- GTTACCGAATTCGCCCTTCCCGGTACCATGATG-3' (SEQ ID NO: 5) e abaixo, 5'-CGCCTCCCTCGAGAACGGTGAGGCTGTTG-3' (SEQ ID NO: 6). A banda do produto de PCR foi retirada de um gel de agarose 0.5x TBE corado com brometo de etideo, eluida usando colunas de rotação Bio-Rad1S "Freeze & Squeeze", e digerida com EcoRI+XhoI durante toda noite. O produto de PCR digerido foi purificado da mistura de reação usando uma coluna de rotação QiaQuick (Qiagen) , e concentrado por evaporação através de vácuo. O vetor de expressão pET-28a (Novagen) foi digerido durante a noite com EcoRI+XhoI, e purificado do gel, eluido, e concentrado como descrito acima. Ligação e transformação foram realizadas usando protocolos padrões como fornecidos pelos fabricantes (Rapid DNA Ligation Kit da Roche; One Shot Chemically Competent TOPlO Cells da Invitrogen). DNA plasmidial das colônias resistentes à canamicina foi analisado pela restrição EcoRI-XhoI para verificar a presença do ZmLox6 clonado.

O vetor pET-28a/ZmLox6 foi transformado dentro do hospedeiro de expressão Rosetta (DE3)pLacI (Novagen) usando protocolo padrão do fornecedor. Transformantes resistentes à canamicina e cloranfenicol foram selecionados através da expressão da proteína induzida por IPTG em 2-mL de culturas testadas. Um transformante com alta expressão foi selecionado para estudos de solubilidade. Lise celular e solubilização foram alcançadas usando o seguinte tampão de lise detergente: 50 mM fosfato sódio pH 7.7, 2% (w/v) Triton X-100, +/- 200 μg/mL lisozima. Proteína recombinante ZmLox6 foi encontrada acumulada em corpos de inclusão insolúveis, e foi apenas parcialmente liberada desta fração com 8 M de uréia. Culturas de expressão foram aumentadas para um volume de 2 L (4 x 500 mL). Células foram peletizadas e congeladas à -80°C. Péletes de células descongelados foram ressuspendidos em tampão de lise através de pipetamento, e então vortexadas vigorosamente. Lisados foram peletizados e novamente ressuspendidos em tampão de lise com lisozima. Um excesso de tampão de lise na diluição de 1:10 foi adicionado, e peletizado o lisado insolúvel. O lisado insolúvel foi ressuspendido em tampão de lise na diluição 1:10 como acima, e corpos de inclusão coletados por centrifugação. Corpos de inclusão foram lavados uma vez no tampão de lise na diluição 1:10 e repeletizados. Peletes dos corpos de inclusão purificados foram solubilizados diretamente no tampão da amostra LiDS através de pipetamento, aquecido a 100°C, e corridos em géis preparativos de acrilamida Tris-glicina 10%. Géis foram lavados extensivamente em água pura e corados muito rapidamente em Coomassie aquoso (SimplyBlue Safe Stain, Invitrogen). A proteína recombinante ZmLox6 foi analisada como contendo uma ampla banda entre 95-98 kDa (ver Figura 10; SeeBlue Plus 2 MW markers, Invitrogen). Bandas foram retiradas dos 24 géis preparativos; a proteína foi eletroeluída (Elutrap, Schleicher & Schuell) e concentrada/dessalinizada (Centriprep spin columns, 3,000 MWCO, Millipore). Recuperação total, como estimada da comparação em gel com padrões BSA corados, foi de aproximadamente 2 mg. Exentplo 7: Produção de anticorpo anti-ZmLox6 e seu uso

para estudar expressão e localização desta proteína

A proteína eletroeluida foi injetada em coelhos para originar antisoros principalmente como descrito previamente (Dhugga and Ray (1994) Eur. J. Biochem. 220:943-953) através de Biosoluções estratégicas

(www.strategicbiosolutions.com). O anticorpo então gerado reconheceu uma banda de polipeptídeo simples de ~100 kDa em manchas protéicas de extratos de folha de milho em uma diluição de anticorpo de 500,000 vezes.

Quando extratos de folhas de B73, IHP, e ILP foram marcados com este anticorpo, resultados surpreendentemente similares àqueles encontrados na análise de expressão gênica foram observados, com nível muito baixo de expressão protéica nas folhas IHP (Figuras 10 e 12A).

Para determinar a localização do tipo celular de ZmLoxõ, as bainhas foliares das mesmas folhas como usadas para fazer as análises de Western acima foram divididas entre feixes vasculares e camadas de mesófilo. Análises de Western blot usando o anticorpo anti-ZmLox6 das manchas protéicas derivadas desses tecidos revelaram que esta proteína foi expressa em células do mesófilo e não em feixes vasculares (Figura 12B).

Exemplo 8: transgênicas Embriões de milho imaturos das plantas doadoras da casa de vegetação são bombardeados com plasmideo contendo a seqüência ZmLoxô da SEQ ID NO: 1 ou a seqüência codificando ZmLox6 da SEQ ID NO: 3 operacionalmente ligada ao promotor da subunidade pequena de Rubisco de milho (SSU) (Figura 1A), promotor da fosfoenolpiruvato carboxilase de milho (PEPCl) (Figura 2A), ou promotor da ubiquitina-1 de milho (UBIl) (Figura 3A), e o gene marcador de seleção PAT (Wohlleben, et al., (1988) Gene 70:25-37), o qual confere resistência ao herbicida Bialaphos. Alternativamente, o gene marcador de seleção é provido em plasmideo separado.

O constructo mostrado na Figura IA provê para expressão preferencial da VSP codificada dentro das células da bainha do feixe dos tecidos foliares de milho. Alternativamente, este constructo compreende adicionalmente uma seqüência codificando para o sinal de endereçamento vacuolar da proaleurina de milho operacionalmente ligado ao polinucleotideo VSP (ver Figura IB de modo que a VSP expressa é direcionada para o compartimento vacuolar das células da bainha do feixe.

O constructo mostrado na Figura 2A provê para expressão diferencial da VSP codificada dentro das células do mesófilo do tecido foliar de milho. Alternativamente, este constructo compreende adicionalmente uma seqüência codificando para o sinal de endereçamento vacuolar da proaleurina de milho operacionalmente ligada ao polinucleotideo VSP (ver Figura 2B) de modo que a VSP expressa é direcionada para dentro do compartimento vacuolar das células do mesófilo, ou uma seqüência codificando para um peptideo de trânsito plastideo, por exemplo, um peptideo de trânsito do cloroplasto, operacionalmente ligado ao polinucleotideo VSP de modo que a VSP expressa é direcionada para dentro do compartimento plastideo das células do mesófilo.

O constructo mostrado na Figura 3A proporciona uma expressão constitutiva da VSP codificada. Alternativamente, esse constructo compreende adicionalmente o sinal de endereçamento vacuolar da proaleurina de milho operacionalmente ligado ao polinucleotideo VSP (Figura 3B) de modo que a VSP expressa é direcionada para dentro do compartimento vacuolar das células onde é expressa constitutivamente.

Transformação é realizada como segue. As receitas dos meios seguem adiante.

Preparação do tecido alvo

As espigas foram descascadas e as superfícies esterelizadas em alvejante Clorox 30% mais 0.5% de detergente Micro por 20 minutos, e lavadas duas vezes com água esterilizada. Os embriões imaturos são retirados e o eixo do embrião colocado virado para baixo (escutelo para cima) , 25 embriões por placa, em meio 560Y por 4 horas e então alinhados dentro de 2,5cm da da zona alvo na preparação para o bombardeamento.

0 vetor plasmidial de escolha mostrado na Figura IA, 1B, 2A, 2B, 3A ou 3B é preparado. Este DNA plasmidial é precipitado para 1.1 μm (diâmetro médio) péletes de tunsgtênio usando umprocedimento de precipitação com CaCl2 como o que segue: 100 μl de partículas de tunsgtênio preparadas em água; 10 μl (1 μg) DNA em tampão Tris EDTA (1 μg do DNA total); 100 μl CaCl2 2.5 Μ; e 10 μl de espermidina 0.1 M.

Cada reagente é adicionado seqüencialmente para a suspensão da partícula de tungstênio, enquanto mantida no vortex multitubo. A mistura final é sonicada brevemente e permitida incubar sob constante agitação vortex por 10 minutos. Depois do período de precipitação, os tubos são centrifugados brevemente, o líquido removido, lavado com 500 μl de etanol 100%, e centrifugado por 30 segundos. Novamente o liquido é removido, e 105 μl de etanol 100% é adicionado para o pélete de partícula de tungstênio final. Para o bombardeamento de partículas, as partículas tungstênio/DNA são brevemente sonicadas e 10 μl espalhadas no centro de cada macrocarregador e permitidas secar por cerca de 2 minutos antes do bombardeamento.

As placas das amostras são bombardeadas no nível #4 em uma pistola de partícula. Todas as amostras recebem um simples tiro à 650 PSI, com um total de 10 alíquotas pegas de cada tubo de preparado com partículas /DNA.

Seguindo o bombardeamento, os embriões são mantidos em meio 560Y por 2 dias, então são transferidos para o meio de seleção 560R contendo 3 mg/litro de Bialaphos, e subcultivados a cada 2 semanas. Depois de aproximadamente 10 semanas de seleção, clones de calos resistentes à seleção são transferidos para o meio 288J para iniciar e regeneração da planta. Seguindo a maturação somática do embrião (2-4 semanas), embriões somáticos bem desenvolvidos são transferidos para um meio para germinação e transferidos um quarto de cultura iluminado. Aproximadamente 7-10 dias depois, plântulas desenvolvidas são transferidas para um meio 272V livre de hormônio em tubos para 7-10 dias até as plântulas estarem bem estabelecidas. As plantas são então transferidas para insertos em compartimentos (equivalente a um pote de 2.5") contendo solo envasado e crescendo por 1 semana em uma câmara de crescimento, subseqüentemente há um crescimento adicional de 1-2 semanas na casa de vegetação, e então as plantas são transferidas para 600 potes clássicos (galão de 1.6) e crescidas até a maturidade. Plantas são monitoradas e pontuadas para um conteúdo total de nitrogênio (planta total e folha, caule, e semente).

Meio de bombardeamento (560Y) compreende 4.0 g/l de sais basais N6 (SIGMA C-1416) , 1.0 ml/l de mistura de vitaminas Eriksson's (1000X SIGMA-1511), 0.5 mg/l de tiamina HCl, 120.0 g/l de sacarose, 1.0 mg/l 2,4-D, e 2.88 g/l L-de prolina (trazida para um volume com D-I H2O seguindo ajuste para pH 5.8 com KOH) ; 2.0 g/l de Gelrite (adicionada após trazer o volume com D-I H2O); e 8.5 mg/l de nitrato de prata (adicionado após esterilizar o meio e esfriar para temperatura ambiente). Meio de seleção (560R) compreende 4.0 g/l de sais basais N6 (SIGMA C-1416), 1.0 ml/l de mistura de vitaminas Eriksson's (1000X SIGMA-1511), 0.5 mg/l de tiamina HCl, 30.0 g/l de sacarose, e 2.0 mg/l 2,4-D (trazida para volume com D-I H2O seguindo ajuste para pH 5.8 com KOH) ; 3.0 g/l de Gelrite (adiconada após trazer para o volume com D-I H2O); e 0.85 mg/l de nitrato de prata e 3.0 mg/l de bialaphos (ambos adicionados após esterilização do meio e esfriamento até a temperatura ambiente).

Meio de regeneração de planta (288J) compreende 4.3 g/l de sais MS (GIBCO 11117-074), 5.0 ml/l de solução estoque de vitaminas MS (0.100 g ácido nicotinico, 0.02 g/l de tiamina HCL, 0.10 g/l de piridoxina HCL, e 0.40 g/l de glicina trazida para volume com D-I H2O polida) (Murashige and Skoog (1962) Physiol. Plant. 15:473), 100 mg/l de mio- inositol, 0.5 mg/l de zeatina, 60 g/l de sacarose, e 1.0 ml/l de ácido abscisico 0.1 mM (trazido para volume com D-I H2O polida após ajustar para pH 5.6); 3.0 g/l de Gelrite (adicionada após trazer para volume com D-I H2O) ; e ácido indolacético 1.0 mg/l e 3.0 mg/l de bialaphos (adicionado após esterilização do meio e esfriamento para 60°C). Meio livre de hormônio (272V) compreende 4.3 g/l de sais MS (GIBCO 11117-074), 5.0 ml/l de solução estoque de vitaminas MS (0.100 g ácido nicotinico, 0.02 g/l de tiamina HCL, 0.10 g/l de piridoxina HCL, e 0.40 g/l de glicina trazida para volume com D-I H2O polida), 0.1 g/l de mio-inositol, e 40.0 g/l de sacarose (glicina trazida para volume com D-I H2O polida após ajustar pH para 5.6); e 6 g/l de bacto-agar (adicionada após trazer para volume com D-I H2O polida), esterilizada e esfriada até 60°C.

Exemplo 9: Transformação mediada por Agrobacterivm

Para transformação de milho mediada por Agrobacterium com uma seqüência de nucleotideo compreendendo a seqüência ZmLox6 descrita em SEQ ID NO: 1, a seqüência codificando ZmLox6 descrita em SEQ ID NO: 3, ou uma seqüência de nucleotideo que codifica a proteína ZmLoxê descrita em SEQ ID NO: 2, o método de Zhao é empregado (U.S. Patent No. 5,981,840, e publicação da patente via PCT W098/32326; os conteúdos das quais são aqui incorporados por referência). Brevemente, embriões imaturos são isolados de milho e os embriões são colocados em contato com uma suspensão de Agrobacteriumf onde as bactérias são capazes de transferir a seqüência de nucleotideo compreendendo a seqüência descrita em SEQ ID NO: 1, a seqüência codificando ZmLox6 descrita em SEQ ID NO: 3, ou uma seqüência de nucleotideo que codifica a proteína ZmLox6 descrita em SEQ ID NO: 2 para pelo menos uma célula de pelo menos um embrião imaturo (passo 1: passo da infecção). Neste passo os embriões imaturos são imersos em uma suspensão de Agrobacterium para o início da inoculação. Os embriões são co-cultivados por um tempo com Agrobacterium (passo 2: o passo de co- cultivo). Os embriões imaturos são cultivados em meio sólido após o passo da infecção. Após esse período de co- cultivo um passo opccional de "descanso" é contemplado. Neste passo de descanso, os embriões são incubados na presença de pelo menos um antibiótico conhecido para inibir o crescimento de Agrobacterium sem adição de um agente seletivo para plantas transformadas (passo 3: passo de descanso). Os embriões imaturos são cultivados em meio sólido com antibiótico, mas sem um agente seletivo, para eliminação da Agrobacterium e para uma fase de descanso para as células infectadas. Depois, embriões inoculados são cultivados em meio contendo agente seletivo e os calos transformados em crescimento são recuperados (passo 4: o passo da seleção). Os embriões imaturos são cultivados em meio sólido com agente de seleção resultando no crescimento seletivo das células transformadas. Os calos são então regenerados em plantas (passo 5: o passo da regeneração), e calos crescidos em meio seletivo são cultivados em meio sólido para regenerar plantas.

Exemplo 10: Transformação de embriões de soja

Condições de cultura

Culturas em suspensão embriogênicas de soja (cv. Jack) são mantidas em 35 ml de meio líquido SB196 (ver receita abaixo) em agitador rotativo, 150 rpm, 26°C com luz branca fluorescente fria em fotoperíodo de 16:8 h dia/noite na intensidade de luz de 60-85 μΕ/ιη2/3. Culturas são subcultivadas a cada 7 dias por duas semanas através de inoculação de aproximadamente 35 mg de tecido em 35 ml de liquido fresco SB196 (o intervalo de subcultivo preferido é a cada 7 dias).

Culturas em suspensão embriogênicas de soja são transformadas com os plasmídeos e fragmentos de DNA descritos nos seguintes exemplos pelo método de bombardeamento de partículas (Klein, et al., (1987) Nature, 327:70).

Iniciação da suspensão da cultura embriogênica de soja

Culturas de soja são iniciadas duas vezes a cada mês com 5-7 dias entre cada iniciação.

Vagens com sementes imaturas de plantas de soja viáveis de 45-55 dias após plantio são colhidas, removidas de seus envoltórios e colocadas dentro de uma caixa magenta esterilizada. As sementes de soja são esterilizadas através de agitação das mesmas por 15 minutos em uma solução Clorox 5% com uma gota de sabão marfim (95 ml de água destilada autoclavada mais 5 ml de Clorox e uma gota de sabão). Mistura-se bem. Sementes são lavadas usando 2 garrafas de 1 litro de água destilada estéril e aquelas menores do que 4 mm são colocadas em lâmina microscópica individual. A pequena extremidade final da semente é cortada e os cotilédones pressionados para fora da casca da semente. Cotilédones são transferidos para placas contendo meio SB1 (25-30 cotilédones por placa). Placas são embrulhadas com fita de fibra e armazenadas por 8 semanas. Após esse tempo embriões secundários são cortados e colocados em um meio liquido SB196 por 7 dias.

Preparação do DNA para bombardeamento

Cada plasmideo intacto ou um fragmento de DNA plasmidial contendo a seqüência ZmLox6 descrita em SEQ ID NO: 1, a seqüência codificando ZmLox6 descrita em SEQ ID NO: 3, ou uma seqüência de nucleotideo que codifica a proteína ZmLox6 descrita em SEQ ID NO: 2 operacionalmente ligada ao promotor de interesse e o gene marcador de seleção são usados para bombardeamento. DNA plasmidial para bombardeamento são rotineiramente preparados e purificados usando o método descrito nos protocolos da Promega™ e "Applications Guide", segunda edição (página 106). Fragmentos dos plasmídeos carregando a seqüência ZmLox6 descrita em SEQ ID NO: 1, a seqüência codificando ZmLox6 descrita em SEQ ID NO: 3, ou uma seqüência de nucleotideo que codifica a proteína ZmLox6 descrita em SEQ ID NO: 2 operacionalmente ligada ao promotor de interesse e marcadores de seleção são obtidos por isolamento em gel dos plasmídeos duplamente digeridos. Em cada caso, 100 pg de DNA plasmidial é digerido em 0.5 ml da mistura específica de enzima que seja apropriada para o plasmideo de interesse. Os fragmentos resultantes de DNA são separados por eletroforese em gel em agarose SeaPlaque GTG 1% (BioWhitaker Molecular Applications), e os fragmentos de DNA contendo a seqüência ZmLox6 descrita em SEQ ID NO: 1, a seqüência codificando ZmLox6 descrita em SEQ ID NO: 3, ou uma seqüência de nucleotideo que codifica a proteína ZmLox6 descrita em SEQ ID NO: 2 operacionalmente ligada ao promotor de interesse e o gene de marcador de seleção são cortados do gel de agarose. O DNA é purificado da agoarose usando a enzima de digestão GELase seguindo o protocolo do fabricante.

Uma alíquota de 50 μΐ de água destilada contendo 3 mg de partículas de ouro é adicionada a 5 μl de uma solução de DNA 1 pg/μl (cada plasmídeo intacto ou fragmento de DNA é preparado conforme descrito acima), 50 μl de CaCl2 2. 5M e 20 μl de espermidina 0.1 Μ. A mistura é agitada por 3 min em nível 3 de um agitador vortex e centrifugada por 10 segundos em uma microcentrífuga de bancada. Após uma lavagem com 400 μl de etanol 100% o pélete é suspendido por sonicação em 40 μl de etanol 100%. 5μl da suspensão de DNA é dispensada em cada disco flutuante do disco instrumento Biolistic PDS1000/HE. Cada alíquota de 5 μl contém aproximadamente 0.37 5 mg de ouro por bombardeamento (i.e., por disco).

Preparação do tecido e bombardeamento com DNA

Aproximadamente 150-200 mg das culturas de suspensão embriônicas de 7 dias de idade são colocadas em uma placa de petri vazia e estéril de 60 χ 15 mm e a placa coberta com filme plástico. Tecido é bombardeado com 1 ou 2 tiros por placa com uma pressão de ruptura de membrana fixada em 1100 PSI e a câmara evacuada em um vácuo de 27-28 polegadas de mercúrio. Tecido é colocado a aproximadamente 3.5 polegadas da tela de retenção/parada.

Seleção dos embriões transformados

Embriões transformados são selecionados cada um usando higromicina (quando o gene da higromicina fosfotransferase, HPT, é usado como um marcador de seleção) ou clorsulfurona (quando o gene da acetolactato sintase, ALS, é usado como marcador de seleção).

Seleção através de higromicina (HPT)

Após o bombardeamento, o tecido é colocado em um meio fresco SB196 e cultivado como descrito acima. Seis dias após o bombardeamento, o SB196 é trocado com o meio fresco SB196 contendo um agente de seleção higromicina 30 mg/L. 0 meio de seleção é renovado semanalmente. 4 a 6 semanas após a seleção, um tecido transformado verde pode ser observado crescendo de "clusters" embriogênicos necróticos não transformados. O tecido isolado verde é removido e inoculado em placas multi-poços para gerar novas culturas transformadas embriogênicas em suspensão propagadas através de clonagem. Seleção através de clorsulfurona (ALS)

Após o bombardeamento, o tecido é dividido entre 2 frascos com meio fresco SB196 e cultivados conforme descrito acima. 6 a 7 dias após o bombardeamento, o meio SB196 é substituído por meio fresco SB196 contendo agente de seleção clorsulfurona 100 ng/ml. O meio de seleção é renovado semanalmente. 4 a 6 semanas após a seleção, tecido verde transformado pode ser observado crescendo de "clusters" embriogênicos necróticos não transformados O tecido isolado verde é removido e inoculado em placas multi-poços contendo meio SB196 para gerar novas culturas transformadas embriogênicas em suspensão propagadas através de clonagem.

Regeneração de embriões somáticos de soja em plantas

Com a finalidade de obter plantas inteiras de culturas embriogênicas em suspensão, o tecido pode ser regenerado.

Maturação do embrião

Embriões são cultivados por 4-6 semanas à 26°C em meio SB196 sob fluorescência branca fria (Phillips cool white Econowatt F40/CW/RS/EW) e lâmpadas Agro (Phillips F40 Agro) (40 watt) em um fotoperíodo de 16:8 h com intensidade de luz de 90-120 yE/m2s. Após esse tempo os "clusters" são removidos para um meio de agar sólido, SB166, por 1-2 semanas. Os "clusters" são então subcultivados em meio SB103 por 3 semanas. Durante este período, embriões individuais podem ser removidos dos "clusters" e selecionados para o conteúdo de nitrogênio aumentando comparado com tipos selvagens ou controles. Deve ser notado que qualquer fenótipo detectável, resultante da expressão dos genes de interesse, deve ser selecionado neste estágio.

Dessecação do embrião e germinação

Embriões individuais maduros são dessecados colocando- os em uma placa de Petri vazia pequena (35 χ 10 mm) por aproximadamente 4-7 dias. As placas são seladas com fita de fibra (criando uma pequena câmara úmida). Embriões dessecados são plantados em meio SB71-4 onde eles foram deixados germinar sob as mesmas condições de cultura descritas acima. Plântulas germinadas são removidas do meio de germinação e lavadas minuciosamente com água e então plantadas em Redi-Earth em uma bandeja com 24-células reunidas, cobertas com uma cúpula de plástico claro. Após duas semanas a cúpula é removida e as plantas foram deixadas para se tornarem resistentes durante a próxima semana. Se as plântulas pareciam resistentes elas eram então transplantadas para um pote de 10" da Redi-Earth com até 3 plântulas por pote. Após 10 a 16 semanas, sementes maduras são colhidas, quebradas e analisadas para proteínas. Receitas dos meios

SB 196 - meio de proliferação liquido FN Lite (por litro)

<table>table see original document page 106</column></row><table>

Na2 EDTA* 3.724 g 1.862 g

FeSO4 - 7H20 2.784 g 1.392 g

* Adicionar primeiro, dissolver em frasco escuro enquanto se agita

2 MS Sulfato 100x estoque

<table>table see original document page 106</column></row><table> 3 FN Lite Halogenetos 100x estoque

CaCl2-2H20 30.0 g 15.0 g

KI 0.083 g 0.0715 g

CoC12-6H20 0.0025 g 0.00125 g

3 FN Lite Ρ,B,Mo 100x estoque

KH2PO4 18.5 g 9.25 g H3BO3 0.62 g 0.31 g

Na2Mo04-2H20 0.025 g 0.0125 g

Meio sólido SBl (por litro) compreende: 1 pacote de sais MS (Gibco/ BRL - Cat# 11117-066); 1 ml de vitaminas B5 1000X eatoque; 31.5 g de sacarose; 2 ml 2,4-D (concentração final 20 mg/L); pH 5.7; e 8 g TC agar.

Meio sólido SB 166 (por litro) compreende: 1 pacote de sais MS (Gibco/ BRL - Cat# 11117-066); 1 ml de vitaminas B5 1000X estoque; 60 g de maltose; 750 mg de MgCl2 hexahidratado; 5 g de carvão vegetal ativado; pH 5.7; e, 2 g Gelrite.

Meio sólido SB 103 (por litro) compreende: 1 pacote de sais MS (Gibco/BRL - Cat# 11117-066); 1 ml de vitaminas B5 1000X estoque; 60 g de maltose; 750 mg de MgCl2 hexahidratado; pH 5.7; e, 2 g de Gelrite. Meio sólido SB 71-4 (por litro) compreende: 1 frasco de sais Gamborg' s B5 c/ sacarose (Gibco/BRL - Cat# 21153- 036); pH 5.7; e, 5 g TC agar.

Estoque de 2,4-D é obtido pré-pronto da Phytotech cat# D 295 - cuja concentração é 1 mg/ml.

Vitaminas B5 estoque (por 100 ml) que são estocadas em alíquotas à -20°C compreendem: 10 g de mio-inositol; 100 mg de ácido nicotínico; 100 mg de piridoxina HCl; e, 1 g de tiamina. Se a solução não dissolve rapidamente o bastante, aplicar um baixo nível de aquecimento através de uma placa quente em agitação.

Estoque de clorsulfurona compreende 1 mg/ml em 0.01 N de hidróxido de amônio.

Exemplo 11: Desenvolvimento de métodos analíticos para detector ZmLoxe, nitrato redutase, PEP-carboxilase, e Riabisco altamente otimizado com a técnica de extração da proteína ZmLOX (do tecido foliar vegetal)

1. Coletar 6 discos de folhas em tubos megatitulados, congelar em nitrogênio liqüido, e colocar em uma bandeja megatitulada.

2. Adicionar 1 esfera de aço inoxidável por tubo e então adicionar 400ul de tampão de extração de proteína.

3. No instrumento Genogrinder (Geno/Grinder 2000 da BT&C/OPS Diagnostics, 672 Rt., 202-206 North Bridgewater, NJ, USA) , moer a amostra em ajuste 1 χ 700 por 30 s duas vezes. Moer outros 30 s se a amostra não estiver completamente molda.

4. Centrifugar a bandeja megatitulada a 4000 rpm por 15 min a 4°C.

5. Remover cuidadosamente o sobrenadante claro em 96 poços dispostos no formato de bandeja e congelar em nitrogênio liqüido.

6. Para determinar as concentrações da proteína, diluir 10 vezes e usar o kit de dosagem de proteína BCA™ da Pierce (Pierce Chemical Company, P.O. Box 117, Rockford, IL, USA).

Tampão de extração

Reagente concentração final quant. por L

Hepes, pH 7.5 c/KOH 50 mM 11.9 g

Glicerol 20 % (v/v) 200 ml

EDTA 1 mM 0.292 g

EGTA 1 mM 0.38 g

Triton X-100 0.1 % (v/v) 1 Oml(10% estoque)

Benzamidina 1 mM 0.12 g

Ácido 6-Aminohexanoico 1 mM 0.13 g

Adicionar 800 ml de água RO/di (para 900 mL) Ajustar pH para 7.5 com ~5.9 ml de solução KOH 4M. Trazer o volume para IL com água RO/di. Estocar o tampão preparado a 4°C. Reagente concentração final da solução estoque local de estocagem

PMSF 1 mM 0.0435 g em 250 ul (= 1 M) RT dessecador

Leupeptina 10 uM 0.00115 g em 250 ul (= 1M)10 -20°C dessecador

DTT 1 mM 0.154 g

RT= temperatura ambiente

Fazer pequenas alíquotas ~ 10 ul) e estocar a -20°C

* Adicionar estoques congelados de inibidor de protease para as alíquotas de amostras imediatamente antes da extração; veja notas.

Procedimento ELISA para detecção de ZmLox6, nitrato redutase, PEP-carboxilase, e Rubisco

1. Diluir a proteína do passo da extração em tampão 25mM Tris-Cl, pH 9.0.

2. Aliquotar 50ul da solução acima em poços de uma placa microtitulada de 96 poços.

3. Incubar a placa a 37 °C por 2h ou durante à noite à temperatura ambiente. Nenhum antígeno é adicionado aos poços controle.

4. Lavar a placa revestida com água deionizada ou destilada dispensada. Salpicar a água aderida na placa e lavar com água duas ou mais vezes, salpicando a água da placa depois de cada lavagem.

5. Encher cada poço com tampão de bloqueamento (ver abaixo) e incubar por 30 min em temperatura ambiente.

6. Repetir passo 4.

7. Adicionar 50 ul da solução de anticorpo primário diluída em tampão de bloqueamento para cada um dos poços revestidos, embrulhar a placa em material plástico, e incubar por 2 h à temperatura ambiente (diluição de Lox6 a 1:15,000). Nenhum anticorpo primário á adicionado nos poços controle.

8. Lavar a placa 3 vezes em água como no passo 4.

9. Preencher poço com tampão bloqueador e incubar por 30 min.

10. Lavar a placa 3 vezes com água como no passo 4.

11. Adicionar 50 ul de solução de anticorpo secundário (diluição 1:25,000 do anti-coelho IgG de cabra do anticorpo conjugado da fosfatase alcalina; Sigma A3687) em tampão bloqueador para cada um dos poços revestidos, placa é embrulhada em plásico, e incubada por 2h à temperatura ambiente.

12. Lavar a placa 3 vezes com água como no passo 4.

13. Preencher cada poço com tampão bloqueador e incubar por min.

14. Lavar a placa 3 vezes com água como no paso 4.

15. Adicionar 75 ul de solução de substrato para cada poço e incubar por Ih à temperatura ambiente no escuro.

16. Adicionar 25ul de solução 0.5 M NaOH para cada poço para parar a reação. Misturar e medir a absorbância à 405nm.

TBS IOX

0.5 M Tris-Cl, pH 8.0 1.5 M NaCl Tampão de bloqueamento para 1 litro de solução

100 ml TBS IOX

30 ml 0.3% Triton XlOO (10%v/m)

2.5 g BSA

870 ml H20 destilada

Substrato

Substrato fosfatase tablete de 5 mg (Sigma S0942): 1 a 5 ml de tampão.

Substrato do tampão

Dietanolamina 100 g/L

Cloreto de magnésio 102 ul de solução 4.9 M.

Timerosal (sigma T5125) 100 mg

Adicionar todos os components em 900 ml de água deionizada. Ajustar o pH para 9.8 com HCl e trazer o volume para 1 litro. Transferir para um frasco de 1L estéril e cobrir com papel alumínio e estocar a 4°C.

Otimização de análise: quantidade ótima de proteína e pH ótimo para revestir os poços: 50 μΐ de proteína 10 ug/ml em pH 9.0. Um exemplo de titulação para diluição de anticorpo é dada para a proteía Lox6 onde a absorbância foi linear em diluições de 1:15,000 a 1:40,000 na Fig. 13. Exemplo 12: Superexpressão de ZmLox6 em células de milho sob o controle de diferentes promotores

Eventos transgênicos estáveis de milho foram obtidos com 6 diferentes constructos e crescidos na casa de vegetação. Discos foliares foram coletados como descrito nos exemplos prévios inciando no florescimento e então a intervalos de 10 dias ou semanalmente. Os resultados de ELISA obtidos usando o anticorpo anti-ZmLox6 são mostrados na Figura 14. Duas principais conclusões podem ser desenhadas desses resultados: primeiro, a adição do sinal de endereçamento vacuolar entre o promotor e a fase aberta de leitura (ORF) de Lox foi detrimental à expressão desta proteína e segundo, expressão máxima foi obtida com o promotor PEPC, que é especificamente expresso nas células do mesófilo. O promotor da ubiquitina Ubi-Intron foi o segundo promotor com alta expressão e o promotor da pequena subunidade de Rubisco teve o nível mais baixo de expressão destes 3 promotores. Em média, a expressão 5-8 vezes mais alta da proteína Lox6 foi obtida com o promotor PEPC sobre o tipo selvagem.

Exemplo 13: Remobilização da proteína Lox6 acumulada depois do florescimento

Aproximadamente 80% do total de N nas plantas é acumulado via florescimento e 65% do total de N acumula no grão na maturidade. Em outras palavras, uma grande maioria do N acumulado nas células vegetativas é remobilizado para o grão em desenvolvimento. Resultados ELISA do tecido foliar coletado a partir do florescimento demonstraram claramente que a proteína Lox6 é remobilizada das folhas das plantas To transgênicas assim como as outras proteínas conhecidas são remobilizadas, i.e., PEP-carboxilase e Rubisco (Figura 15).

Exemplo 14: Acúmulo e remobilização da proteína ZmLox6 nas plantas crescudas em campo da geração T1

Sementes de oito eventos de inserção do gene em cópia simples identificadas pelo PCR genômico quantitativo derivada do uso do promoter PEPC junto com a linhagem pura controle foram crescidas no campo no verão de 2006 em tramas de duas filas. 8 plantas foram selecionadas antes do florescimento para cada fila, 16 plantas por evento ou controle. Pedaços de folhas foram coletados em intervalos semanais começando 2 semanas antes do florescimento e terminando 2 semanas após o florescimento. Quando comparada com plantas controles, a proteína Lox6 é acumulada no nível 5-vezes mais alto do que os eventos controle (Figura 16) . 0 acúmulo das outras proteínas (PEPC, Rubisco, NR) não afetou qualquer extensão apreciável. A segunda principal conclusão é que a proteína acumulada do transgenes é remobilizada tão eficientemente como as outras proteínas conhecidas, por exemplo, PEPC e Rubisco (Figura 16) . Esses resultados demonstram que a proteína Lox6 age como uma proteína de reserva vegetativa que é remobilizada para o grão em desenvolvimento como outras proteínas vegetativas.

Exemplo 15._Variantes das seqüências LOX

A. Seqüências de nucleotídeos variantes das seqüências LOX que não alteram a seqüência de aminoácido codificada

A seqüência de nucleotídeo LOX descrita em SEQ ID NO: 1 ou 3 é usada para gerar seqüências de nucleotídeo variantes tendo a seqüência de nucleotídeo da fase aberta de leitura (ORF) com cerca de 70%, 76%, 81%, 86%, 92% e 97% de identidade de seqüência de nucleotídeo quando comparada com o início da seqüência de nucleotídeo da ORF inalterada da SEQ ID NO apropriada. Essas variantes funcionais são geradas usando uma tabela de códon padrão. Enquanto a seqüência de nucleotídeo da variante é alterada, a seqüência de aminoácido codificada pela fase aberta de leitura não muda.

B. Seqüências de aminoácidos variantes de uma seqüência L0X6

Seqüências de aminoácidos variantes da seqüência L0X6 são geradas. Neste exemplo, um aminoácido é alterado. Especificamente, a fase aberta de leitura descrita em SEQ ID NO: 3, ou SEQ ID NO: 1 (de 62-2737) é revisada para determinar a alteração de aminoácido apropriada. A seleção do aminoácido para ser modificado é feita pela consulta ao alinhamento de proteína (com os outros ortólogos e outros membros da família de gene de várias espécies). Ver Figura 7 e Tabela 2. Um aminoácido é selecionado considerando aquele que não está sob alta pressão de seleção (não é altamente conservado) e que é muito facilmente substituído por um aminoácido com características químicas similares (i.e., função similar no lado da cadeia). Usando o alinhamento de proteína descrito na Figura 7, e Tabela 2, um aminoácido apropriado pode ser modificado. Uma vez que o aminoácido alvo é identificado, o procedimento delineado no Exemplo 6A é prosseguido. Variantes tendo cerca de 70%, 75%, 81%, 86%, 92% e 97% de identidade de seqüência de ácido nucleico com a SEQ ID NO: 1 ou 3 são geradas usando este método.

C. Variantes adicionais de seqüências de aminoácidos das seqüências LOX6

Neste exemplo, seqüências de proteínas artificiais são criadas tendo 82%, 87%, 92% e 97% de identidade em relação à seqüência de proteína de referência. Este último esforço requer identificar regiões conservadas e variáveis do alinhamento descrito na Figura 7 e então a aplicação judiciosa de uma tabela de substituições de aminoácido. Essas partes serão discutidas em mais detalhes abaixo.

Amplamente, a determinação de quais seqüências de aminoácidos são alteradas é feita baseada nas regiões conservadas entre a proteína L0X6 ou entre as outras proteínas LOX. Ver Figura 7. Com base no alinhamento de seqüência, as várias regiões das seqüências LOX que podem suscetilvemente ser alteradas são representadas em letras minúsculas, enquanto as regiões conservadas são representadas pelas letras maiúsculas. É reconhecido que as substituições conservadas possam ser feitas nas regiões conservadas abaixo sem alterar função. Além disso, um especialista no assunto entenderá que variantes funcionais da seqüência LOX da invenção podem ter insignificantes alterações de aminoácidos não conservados no domínio conservado.

Seqüências artificiais de proteína são então criadas diferindo da original nos intervalos de 80-85%, 85-90%, 90- 95% e 95-100% de identidade. Pontos médios desses intervalos são selecionados, com latitude liberal de mais ou menos 1%, por exemplo. As substituições de aminoácidos serão efetuadas por um *script' rotineiro denominado "Perl". A tabela de substituição é provida abaixo na Tabela 2. Tabela 2. Tabela de Substituições

<table>table see original document page 118</column></row><table>

Primeiro, qualquer aminoácido conservado na proteína que não deveria ser modificado é identificado e "marcado inapto" para isolamento da substituição. A metionina inicial naturalmente será adicionada para esta lista automaticamente. Em seguida, as modificações são feitas.

H, C, e P não são modificados em qualquer circunstância. As modificações irão ocorrer com a isoleucina, primeiro, extendendo do N-terminal ao C- terminal. Então a leucina, e assim por diante como estabelece a lista até atingir a meta desejada. Um número de substituições provisórias podem ser feitas de modo a não provocar inversão das alterações. A lista está ordenada de 1-17, e então começa com quantas mudanças de isoleucina forem necessárias antes da leucina, e assim por diante até a metionina. Claramente muitos aminoácidos, desta forma, não precisarão ser modificados. L, I e V envolverão substituição 50:50 das substituições ótimas alternadas.

As seqüências de aminoácidos variantes são escritas como resultado. O script Perl é usado para calcular a porcentagem de identidade. Usando este procedimento, variantes das seqüências LOX são geradas tendo cerca de 82%, 87%, 92% e 97% de identidade de aminoácido para a seqüência de nucleotideo ORF inalterada inicial da correspondente SEQ ID NO.

Os artigos "um" ou "uma" são usados aqui para se referir a um ou mais do que um (i.e., para pelo menos um) do objeto gramatical do artigo. A titulo de exemplo, "um elemento" significa um ou mais elementos. Todas as publicações e pedidos de patente mencionados no relatório descritivo são indicativos do nivel daqueles versados no estado da técnica para os quais essa invenção pertence. Todas as publicações e pedidos de patente são aqui incorporados por referência com a mesma extensão como se cada publicação ou pedido de patente individual fosse especificamente e individualmente indicado para ser incorporado como referência.

Embora a invenção exposta tenha sido descrita em algum detalhe como forma de ilustração e exemplo para propósitos de clareza do entendimento, certas modificações podem ser praticadas dentro do escopo das reivindicações anexadas. LISTAGEM DE SEQÜÊNCIAS

<110> Requerente: Pioneer Hi-Bred International, Inc.

<120> Titulo: MÉTODOS E COMPOSIÇÕES PARA 0 AUMENTO DA CAPACIDADE DE RESERVA DE NITROGÊNIO DE PLANTAS

<130> Referência: P1397

<150> No. do Pedido de Prioridade: 60/751,871

<151> Data de depósito do Pedido de Prioridade: 20-12-2005

<160> Quantidade de SEQ ID Nos.: 6

<170> Software: FastSEQ for Windows Version 4.0

<210> SEQ ID No: 1 <211> Comprimento: 2909 <212> Tipo: DNA <213> Organismo: Zea mays

<220> Características:

<220> Nome/Chave: CDS

<220> Localização: (62) ... (2740)

<400> Seqüência: 1

aacccacgga agcaagacaa aagctcgtgc tggacgacat ctcccctgtc gatccacgac 60 c atg atg cag cag ctc cgt cac age cag ccg age ccg tgc ctc tgc ggc 109 Met Met Gln Gln Leu Arg His Ser Gln Pro Ser Pro Cys Leu Cys Gly 15 10 15

ctg cgg gcg gea cgg cct atg ctc gcc ctc ggc gea gea gea tcc cgt 157 Leu Arg Ala Ala Arg Pro Met Leu Ala Leu Gly Ala Ala Ala Ser Arg 20 25 30

tcg cgg ccc gcc gga aaa ctg caa ccg age gtc tgc ctc ggc ctc ggc 205 Ser Arg Pro Ala Gly Lys Leu Gln Pro Ser Val Cys Leu Gly Leu Gly 35 40 45

cat gta gcc cca gcc gcg gcg aga gga cag ccc cgt ccc cgt gcc gtt 253 His Val Ala Pro Ala Ala Ala Arg Gly Gln Pro Arg Pro Arg Ala Val 50 55 60

gcc gac tcg gcg ctg gga gea tcg cct acg age gtg cat gtc gga ggc 301 Ala Asp Ser Ala Leu Gly Ala Ser Pro Thr Ser Val His Val Gly Gly 65 70 75 80

aag ctg ctg ctg cag aac ttc gcc gcc gac age cag cag cgg ctc aag 349 Lys Leu Leu Leu Gln Asn Phe Ala Ala Asp Ser Gln Gln Arg Leu Lys

85 90 95 ctc tcc ate cag ctt gtc age gcc acc gtg gcc gat ccc gac ggg cgc 397

Leu Ser Ile Gln Leu Val Ser Ala Thr Val Ala Asp Pro Asp Gly Arg 100 105 110

ggg gtg aag gcg gag gcg tcg gtg ctg gac gcc gtc gtg ggc age ggg 445

Gly Val Lys Ala Glu Ala Ser Val Leu Asp Ala Val Val Gly Ser Gly 115 120 125

gac age gag ctc gac gtg gac ctg ate tgg gac gag gcg ctg ggc gcg 493

Asp Ser Glu Leu Asp Val Asp Leu Ile Trp Asp Glu Ala Leu Gly Ala

130 135 140

ccc ggc gcg gtg gtg gtg aag aac cac tcc gac ttc ccc gtg tac ctg 541

Pro Gly Ala Val Val Val Lys Asn His Ser Asp Phe Pro Val Tyr Leu

145 150 155 160

agg ctg ctg age gtg ccg gcc ggc gtc ggc ggc gcc gac gac gag gcc 589

Arg Leu Leu Ser Val Pro Ala Gly Val Gly Gly Ala Asp Asp Glu Ala

165 170 175

gcc gcc gtc cac ttc gcc tgc aac gga tgg gtg tac ccc gtc gac aag 637

Ala Ala Val His Phe Ala Cys Asn Gly Trp Val Tyr Pro Val Asp Lys 180 185 190

cac ccg tac cgc ctc ttc ttc acc aac gac gcg tgt gtc aag gaa gaa 685

His Pro Tyr Arg Leu Phe Phe Thr Asn Asp Ala Cys Val Lys Glu Glu 195 200 205

acg ccg age gcc ctg ctc aag tac cgg gag gac gag ctc ggc gcg ctc 733

Thr Pro Ser Ala Leu Leu Lys Tyr Arg Glu Asp Glu Leu Gly Ala Leu

210 215 220

gga gac ggc gag acg acg gag cga ccg ttc cag ccg tgg gac cgc 781

Arg Gly Asp Gly Glu Thr Thr Glu Arg Pro Phe Gln Pro Trp Asp Arg

225 230 235 240

gtg tac gac tac gcg ctg tac aac gac ctg ggg aac cca gac ctg cgc 829

Val Tyr Asp Tyr Ala Leu Tyr Asn Asp Leu Gly Asn Pro Asp Leu Arg

245 250 255

cag gac ctg gcg cgc ccc gtg ctg gga gga tcc cag gag tac ccg tac 877

Gln Asp Leu Ala Arg Pro Val Leu Gly Gly Ser Gln Glu Tyr Pro Tyr 260 265 270

cct cgg cgt acc aag acc ggc cga cca gcc gcc aaa aca gat cct cgg 925

Pro Arg Arg Thr Lys Thr Gly Arg Pro Ala Ala Lys Thr Asp Pro Arg 275 280 285

tcg gag age aga gcg ccg ctg gac gaa gag ate tac gtc ccc tgc gac 973

Ser Glu Ser Arg Ala Pro Leu Asp Glu Glu Ile Tyr Val Pro Cys Asp

290 295 300

gag cgc gtc ggc ttc gcc age ate ccc gcg ccg acg ctt ccg ccg ctg 1021

Glu Arg Val Gly Phe Ala Ser Ile Pro Ala Pro Thr Leu Pro Pro Leu

305 310 315 320 ggc ggg cac ttc agg tcc ctc gcc gat gtc tac cgc ctc ttc ggc ctc 1069

Gly Gly His Phe Arg Ser Leu Ala Asp Val Tyr Arg Leu Phe Gly Leu

325 330 335

gac gac ctc ggc cgg ctc ccg gag gcc aag gcg gtc ate aac age ggc 1117

Asp Asp Leu Gly Arg Leu Pro Glu Ala Lys Ala Val Ile Asn Ser Gly 340 345 350

gcg ccg ttc ccc gtc gtg cct cag gtc att tca gtg aac ccg aca cat 1165

Ala Pro Phe Pro Val Val Pro Gln Val Ile Ser Val Asn Pro Thr His

355 360 365

tgg cgg aag gac gaa gag ttc gcg cgg cag atg ate gcc ggg gcg aac 1213

Trp Arg Lys Asp Glu Glu Phe Ala Arg Gln Met Ile Ala Gly Ala Asn 370 375 380

ccg gtg tgc ate aag cgc gtc acc aag ttc ccg ctg gcg age gag ctt 1261

Pro Val Cys Ile Lys Arg Val Thr Lys Phe Pro Leu Ala Ser Glu Leu 385 390 395 400

gac cgc ggg gtg ttc ggc gac cag gac age aag ata acc aag gac cat 1309

Asp Arg Gly Val Phe Gly Asp Gln Asp Ser Lys Ile Thr Lys Asp His

405 410 415

gtc gag aag aac atg ggc ggc atg acg gtg cag cag gcc gta gag gag 1357

Val Glu Lys Asn Met Gly Gly Met Thr Val Gln Gln Ala Val Glu Glu 420 425 430

ggg agg ctg tac gtc gtg gac cac cac gac tgg gtg atg cca tac ctg 1405

Gly Arg Leu Tyr Val Val Asp His His Asp Trp Val Met Pro Tyr Leu

435 440 445

aag cgc ate aac gag ctc cct gcg age gag gag aag gcg gag gtg tcg 1453

Lys Arg Ile Asn Glu Leu Pro Ala Ser Glu Glu Lys Ala Glu Val Ser 450 455 460

cag agg aag gtg tac gcc gcc aga acg ctc ctg ttc ctg gac ggc gag 1501

Gln Arg Lys Val Tyr Ala Ala Arg Thr Leu Leu Phe Leu Asp Gly Glu 465 470 475 480

gac tcg tcg atg ctc aga ccg ctg gcg ate gag ctc age tcg ccg cac 1549

Asp Ser Ser Met Leu Arg Pro Leu Ala Ile Glu Leu Ser Ser Pro His

485 490 495

ccg gag aag gag cag ctc ggc gcg gtc age acg gtg tac act cca ccg 1597

Pro Glu Lys Glu Gln Leu Gly Ala Val Ser Thr Val Tyr Thr Pro Pro 500 505 510

gac age ggg gac gac ggc ate acg gcc ggg agg ttc tca acc tgg gaa 1645

Asp Ser Gly Asp Asp Gly Ile Thr Ala Gly Arg Phe Ser Thr Trp Glu

515 520 525

ctg gea aag gtt tac gcc tet gcc aac gac gea gcc gag aac aac ttc 1693 Leu Ala Lys Val Tyr Ala Ser Ala Asn Asp Ala Ala Glu Asn Asn Phe 530 535 540 gtc act cac tgg ctc aac acg cac gca tcc atg gag ccg ate gtg ate 1741

Val Thr His Trp Leu Asn Thr His Ala Ser Met Glu Pro Ile Val Ile

545 550 555 560

gcg gcg aac cgg cag ctg age gtg ctg cac cca ate cac agg ctc ctc 1789

Ala Ala Asn Arg Gln Leu Ser Val Leu His Pro Ile His Arg Leu Leu

565 570 575

aag ccg cac ttc cgg aag acg ctc cac ate aac gcc gtc gca cgc cag 1837

Lys Pro His Phe Arg Lys Thr Leu His Ile Asn Ala Val Ala Arg Gln 580 585 590

ate ate gtc ggc tcg ggt gac cag agg aag gac ggc age gtc ttc cgt 1885

Ile Ile Val Gly Ser Gly Asp Gln Arg Lys Asp Gly Ser Val Phe Arg

595 600 605

ggc ata gac gag gtc acg tac ttc ccc age aag tac aac atg gag atg 1933

Gly Ile Asp Glu Val Thr Tyr Phe Pro Ser Lys Tyr Asn Met Glu Met

610 615 620

tcc tcc aag gcg tac aaa gcc tgg aac ttc acg gac ctt gct ctt ccc 1981

Ser Ser Lys Ala Tyr Lys Ala Trp Asn Phe Thr Asp Leu Ala Leu Pro

625 630 635 640

aac gat ctc ate aag aga ggt ctg gca aaa gga gat cca aag aag cca 2029

Asn Asp Leu Ile Lys Arg Gly Leu Ala Lys Gly Asp Pro Lys Lys Pro

645 650 655

gag acg gtg gag ctg gcg ata aag gac tac ccg tac gcg gtg gac ggg 2077

Glu Thr Val Glu Leu Ala Ile Lys Asp Tyr Pro Tyr Ala Val Asp Gly 660 665 670

ctc gac atg tgg gcg gcg ate aag aag tgg gtg gct gac tac tgc gcc 2125

Leu Asp Met Trp Ala Ala Ile Lys Lys Trp Val Ala Asp Tyr Cys Ala

675 680 685

ate tac tac gcc gac gac ggc gcg gtg gcg agg gac age gag ctg cag 2173

Ile Tyr Tyr Ala Asp Asp Gly Ala Val Ala Arg Asp Ser Glu Leu Gln

690 695 700

ggg tgg tgg age gag gtc agg aac gtg ggg cac ggc gac ctg gcg gac 2221

Gly Trp Trp Ser Glu Val Arg Asn Val Gly His Gly Asp Leu Ala Asp

705 710 715 720

gcg ccg tgg tgg ccg gcg atg gac tgc gtc gcc gac ctc gtg gag acc 2269

Ala Pro Trp Trp Pro Ala Met Asp Cys Val Ala Asp Leu Val Glu Thr

725 730 735

tgc gcc acc gtc gtc tgg ctg age tcg gcg tac cac gcg tcc ate age 2317 Cys Ala Thr Val Val Trp Leu Ser Ser Ala Tyr His Ala Ser Ile Ser 740 745 750 ttc ggg cag tac gac tac ctg ggc ttc gtc ccg aac ggg ccc tcc ate 2365

Phe Gly Gln Tyr Asp Tyr Leu Gly Phe Val Pro Asn Gly Pro Ser Ile 755 760 765

acc acg cgg ccg gtg ccg ggc ccg gac gcc ggg gcg gag gtc acg gag 2413

Thr Thr Arg Pro Val Pro Gly Pro Asp Ala Gly Ala Glu Val Thr Glu

770 775 780

tcg gac ttc ctg gcg age gtc acg ccg gtc acc gag gcg ctc ggc ttc 24 61

Ser Asp Phe Leu Ala Ser Val Thr Pro Val Thr Glu Ala Leu Gly Phe 785 790 795 800

atg tcc ate gcc tcg ggg ccg atg ggg ctc aag ggc acg gag gtg tac 2509

Met Ser Ile Ala Ser Gly Pro Met Gly Leu Lys Gly Thr Glu Val Tyr

805 810 815

ctg ggg cag cgc ccg gac acg gag cag tgg acg cgc gag cgg agg gcg 2557

Leu Gly Gln Arg Pro Asp Thr Glu Gln Trp Thr Arg Glu Arg Arg Ala 820 825 830

gcc gag gcg ctg gcg gag ttc cgg gcg agg ttg gag gag gtc gcg ggc 2605 Ala Glu Ala Leu Ala Glu Phe Arg Ala Arg Leu Glu Glu Val Ala Gly 835 840 845

aac ate gac agg cgg aac gcg gac cct gcg ctg aag aac cgg acg ggg 2653 Asn Ile Asp Arg Arg Asn Ala Asp Pro Ala Leu Lys Asn Arg Thr Gly

850 855 860

cag gtg gag gtg ccc tat acg ctg ctc aag ccg acg gea cag ccc gga 2701

Gln Val Glu Val Pro Tyr Thr Leu Leu Lys Pro Thr Ala Gln Pro Gly 865 870 875 880

ctg gtg ctc cgt ggc ata ccc aac age ate acc gtt tga geageagage 2750 Leu Val Leu Arg Gly Ile Pro Asn Ser Ile Thr Val *

885 890

gccgtcggca gctgtcagct gtgtacagta cagaataata aggtggtcgt gtttggcgct 2810 atctccacca cataaacgtg aaaatgtttt tttttgaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2870 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaa 2909

<210> SEQ ID No: 2 <211> Comprimento: 892 <212> Tipo: PRT <213> Organismo: Zea mays <400> Seqüência: 2

Met Met Gln Gln Leu Arg His Ser Gln Pro Ser Pro Cys Leu Cys Gly 1 5 10 15 Leu Arg Ala Ala Arg Pro Met Leu Ala Leu Gly Ala Ala Ala Ser Arg 20 25 30 Ser Arg Pro Ala Gly Lys Leu Gln Pro Ser Val Cys Leu Gly Leu Gly 35 40 45 His Val Ala Pro Ala Ala Ala Arg Gly Gln Pro Arg Pro Arg Ala Val

50 55 60 Ala Asp Ser Ala Leu Gly Ala Ser Pro Thr Ser Val His Val Gly Gly 65 70 75 80

Lys Leu Leu Leu Gln Asn Phe Ala Ala Asp Ser Gln Gln Arg Leu Lys

85 90 95

Leu Ser Ile Gln Leu Val Ser Ala Thr Val Ala Asp Pro Asp Gly Arg

100 105 110

Gly Val Lys Ala Glu Ala Ser Val Leu Asp Ala Val Val Gly Ser Gly

115 120 125

Asp Ser Glu Leu Asp Val Asp Leu Ile Trp Asp Glu Ala Leu Gly Ala

130 135 140

Pro Gly Ala Val Val Val Lys Asn His Ser Asp Phe Pro Val Tyr Leu 145 150 155 160

Arg Leu Leu Ser Val Pro Ala Gly Val Gly Gly Ala Asp Asp Glu Ala

165 170 175

Ala Ala Val His Phe Ala Cys Asn Gly Trp Val Tyr Pro Val Asp Lys

180 185 190

His Pro Tyr Arg Leu Phe Phe Thr Asn Asp Ala Cys Val Lys Glu Glu

195 200 205

Thr Pro Ser Ala Leu Leu Lys Tyr Arg Glu Asp Glu Leu Gly Ala Leu

210 215 220

Arg Gly Asp Gly Glu Thr Thr Glu Arg Pro Phe Gln Pro Trp Asp Arg 225 230 235 240

Val Tyr Asp Tyr Ala Leu Tyr Asn Asp Leu Gly Asn Pro Asp Leu Arg

245 250 255

Gln Asp Leu Ala Arg Pro Val Leu Gly Gly Ser Gln Glu Tyr Pro Tyr

260 265 270

Pro Arg Arg Thr Lys Thr Gly Arg Pro Ala Ala Lys Thr Asp Pro Arg

275 280 285

Ser Glu Ser Arg Ala Pro Leu Asp Glu Glu Ile Tyr Val Pro Cys Asp

290 295 300

Glu Arg Val Gly Phe Ala Ser Ile Pro Ala Pro Thr Léu Pro Pro Leu 305 310 315 320

Gly Gly His Phe Arg Ser Leu Ala Asp Val Tyr Arg Leu Phe Gly Leu

325 330 335

Asp Asp Leu Gly Arg Leu Pro Glu Ala Lys Ala Val Ile Asn Ser Gly

340 345 350

Ala Pro Phe Pro Val Val Pro Gln Val Ile Ser Val Asn Pro Thr His

355 360 365

Trp Arg Lys Asp Glu Glu Phe Ala Arg Gln Met Ile Ala Gly Ala Asn

370 375 380

Pro Val Cys Ile Lys Arg Val Thr Lys Phe Pro Leu Ala Ser Glu Leu 385 390 395 400

Asp Arg Gly Val Phe Gly Asp Gln Asp Ser Lys Ile Thr Lys Asp His

405 410 415

Val Glu Lys Asn Met Gly Gly Met Thr Val Gln Gln Ala Val Glu Glu

420 425 430

Gly Arg Leu Tyr Val Val Asp His His Asp Trp Val Met Pro Tyr Leu

435 440 445

Lys Arg Ile Asn Glu Leu Pro Ala Ser Glu Glu Lys Ala Glu Val Ser

450 455 460

Gln Arg Lys Val Tyr Ala Ala Arg Thr Leu Leu Phe Leu Asp Gly Glu 465 470 475 480

Asp Ser Ser Met Leu Arg Pro Leu Ala Ile Glu Leu Ser Ser Pro His

485 490 495 Pro Glu Lys Glu Gln Leu Gly Ala Val Ser Thr Val Tyr Thr Pro Pro

500 505 510

Asp Ser Gly Asp Asp Gly Ile Thr Ala Gly Arg Phe Ser Thr Trp Glu

515 520 525

Leu Ala Lys Val Tyr Ala Ser Ala Asn Asp Ala Ala Glu Asn Asn Phe

530 535 540

Val Thr His Trp Leu Asn Thr His Ala Ser Met Glu Pro Ile Val Ile 545 550 555 560

Ala Ala Asn Arg Gln Leu Ser Val Leu His Pro Ile His Arg Leu Leu

565 570 575

Lys Pro His Phe Arg Lys Thr Leu His Ile Asn Ala Val Ala Arg Gln

580 585 590

Ile Ile Val Gly Ser Gly Asp Gln Arg Lys Asp Gly Ser Val Phe Arg

595 600 605

Gly Ile Asp Glu Val Thr Tyr Phe Pro Ser Lys Tyr Asn Met Glu Met

610 615 620

Ser Ser Lys Ala Tyr Lys Ala Trp Asn Phe Thr Asp Leu Ala Leu Pro 625 630 635 640

Asn Asp Leu Ile Lys Arg Gly Leu Ala Lys Gly Asp Pro Lys Lys Pro

645 650 655

Glu Thr Val Glu Leu Ala Ile Lys Asp Tyr Pro Tyr Ala Val Asp Gly

660 665 670

Leu Asp Met Trp Ala Ala Ile Lys Lys Trp Val Ala Asp Tyr Cys Ala

675 680 685

Ile Tyr Tyr Ala Asp Asp Gly Ala Val Ala Arg Asp Ser Glu Leu Gln

690 695 700

Gly Trp Trp Ser Glu Val Arg Asn Val Gly His Gly Asp Leu Ala Asp 705 710 715 720

Ala Pro Trp Trp Pro Ala Met Asp Cys Val Ala Asp Leu Val Glu Thr

725 730 735

Cys Ala Thr Val Val Trp Leu Ser Ser Ala Tyr His Ala Ser Ile Ser

740 745 750

Phe Gly Gln Tyr Asp Tyr Leu Gly Phe Val Pro Asn Gly Pro Ser Ile

755 760 765

Thr Thr Arg Pro Val Pro Gly Pro Asp Ala Gly Ala Glu Val Thr Glu

770 775 780

Ser Asp Phe Leu Ala Ser Val Thr Pro Val Thr Glu Ala Leu Gly Phe 785 790 795 800

Met Ser Ile Ala Ser Gly Pro Met Gly Leu Lys Gly Thr Glu Val Tyr

805 810 815

Leu Gly Gln Arg Pro Asp Thr Glu Gln Trp Thr Arg Glu Arg Arg Ala

820 825 830

Ala Glu Ala Leu Ala Glu Phe Arg Ala Arg Leu Glu Glu Val Ala Gly

835 840 845

Asn Ile Asp Arg Arg Asn Ala Asp Pro Ala Leu Lys Asn Arg Thr Gly

850 855 860

Gln Val Glu Val Pro Tyr Thr Leu Leu Lys Pro Thr Ala Gln Pro Gly 865 870 875 880

Leu Val Leu Arg Gly Ile Pro Asn Ser Ile Thr Val

885 890 <210> SEQ ID No: 3 <211> Comprimento: 2676 <212> Tipo: DNA <213> Organismo: Zea mays

<400> Seqüência: 3

atgatgcagc agctccgtca cagccagccg agcccgtgcc tctgcggcct gcgggcggca 60 cggcctatgc tcgccctcgg cgcagcagca tcccgttcgc ggcccgccgg aaaactgcaa 120 ccgagcgtct gcctcggcct cggccatgta gccccagccg cggcgagagg acagccccgt 180 ccccgtgccg ttgccgactc ggcgctggga gcatcgccta cgagcgtgca tgtcggaggc 240 aagctgctgc tgcagaactt cgccgccgac agccagcagc ggctcaagct ctccatccag 300 cttgtcagcg ccaccgtggc cgatcccgac gggcgcgggg tgaaggcgga ggcgtcggtg 360 ctggacgccg tcgtgggcag cggggacagc gagctcgacg tggacctgat ctgggacgag 420 gcgctgggcg cgcccggcgc ggtggtggtg aagaaccact ccgacttccc cgtgtacctg 480 aggctgctga gcgtgccggc cggcgtcggc ggcgccgacg acgaggccgc cgccgtccac 540 ttcgcctgca acggatgggt gtaccccgtc gacaagcacc cgtaccgcct cttcttcacc 600 aacgacgcgt gtgtcaagga agaaacgccg agcgccctgc tcaagtaccg ggaggacgag 660 ctcggcgcgc tccggggaga cggcgagacg acggagcgac cgttccagcc gtgggaccgc 720 gtgtacgact acgcgctgta caacgacctg gggaacccag acctgcgcca ggacctggcg 780 cgccccgtgc tgggaggatc ccaggagtac ccgtaccctc ggcgtaccaa gaccggccga 840 ccagccgcca aaacagatcc tcggtcggag agcagagcgc cgctggacga agagatctac 900 gtcccctgcg acgagcgcgt cggcttcgcc agcatccccg cgccgacgct tccgccgctg 960 ggcgggcact tcaggtccct cgccgatgtc taccgcctct tcggcctcga cgacctcggc 1020 cggctcccgg aggccaaggc ggtcatcaac agcggcgcgc cgttccccgt cgtgcctcag 1080 gtcatttcag tgaacccgac acattggcgg aaggacgaag agttcgcgcg gcagatgatc 1140 gccggggcga acccggtgtg catcaagcgc gtcaccaagt tcccgctggc gagcgagctt 1200 gaccgcgggg tgttcggcga ccaggacagc aagataacca aggaccatgt cgagaagaac 1260 atgggcggca tgacggtgca gcaggccgta gaggagggga ggctgtacgt cgtggaccac 1320 cacgactggg tgatgccata cctgaagcgc atcaacgagc tccctgcgag cgaggagaag 1380 gcggaggtgt cgcagaggaa ggtgtacgcc gccagaacgc tcctgttcct ggacggcgag 1440 gactcgtcga tgctcagacc gctggcgatc gagctcagct cgccgcaccc ggagaaggag 1500 cagctcggcg cggtcagcac ggtgtacact ccaccggaca gcggggacga cggcatcacg 1560 gccgggaggt tctcaacctg ggaactggca aaggtttacg cctctgccaa cgacgcagcc 1620 gagaacaact tcgtcactca ctggctcaac acgcacgcat ccatggagcc gatcgtgatc 1680 gcggcgaacc ggcagctgag cgtgctgcac ccaatccaca ggctcctcaa gccgcacttc 1740 cggaagacgc tccacatcaa cgccgtcgca cgccagatca tcgtcggctc gggtgaccag 1800 aggaaggacg gcagcgtctt ccgtggcata gacgaggtca cgtacttccc cagcaagtac 1860 aacatggaga tgtcctccaa ggcgtacaaa gcctggaact tcacggacct tgctcttccc 1920 aacgatctca tcaagagagg tctggcaaaa ggagatccaa agaagccaga gacggtggag 1980 ctggcgataa aggactaccc gtacgcggtg gacgggctcg acatgtgggc ggcgatcaag 2040 aagtgggtgg ctgactactg cgccatctac tacgccgacg acggcgcggt ggcgagggac 2100 agcgagctgc aggggtggtg gagcgaggtc aggaacgtgg ggcacggcga cctggcggac 2160 gcgccgtggt ggccggcgat ggactgcgtc gccgacctcg tggagacctg cgccaccgtc 2220 gtctggctga gctcggcgta ccacgcgtcc atcagcttcg ggcagtacga ctacctgggc 2280 ttcgtcccga acgggccctc catcaccacg cggccggtgc cgggcccgga cgccggggcg 2340 gaggtcacgg agtcggactt cctggcgagc gtcacgccgg tcaccgaggc gctcggcttc 2400 atgtccatcg cctcggggcc gatggggctc aagggcacgg aggtgtacct ggggcagcgc 2460 ccggacacgg agcagtggac gcgcgagcgg agggcggccg aggcgctggc ggagttccgg 2520 gcgaggttgg aggaggtcgc gggcaacatc gacaggcgga acgcggaccc tgcgctgaag 2580 aaccggacgg ggcaggtgga ggtgccctat acgctgctca agccgacggc acagcccgga 2640 ctggtgctcc gtggcatacc caacagcatc accgtt 2676 <210> SEQ ID No: 4 <211> Comprimento: 905 <212> Tipo: PRT <213> Organismo: Zea mays

<400> Seqüência: 4

Met Met Asn Leu Asn Leu Lys Gln Pro Leu Val Leu Pro Ala His His

1 5 10 15

Ser Asn Val Val Gly Ser Arg Leu Ser Ser Ser Ser Pro Ser Ala Ala

20 25 30

Ala Ala Ser Arg Arg Thr Gly Gly Gly Val Ser Ser Arg Ser Gly Ser

35 40 45

Arg Arg His Val Arg Leu Pro Arg Ile Ser Cys Ser Ala Thr Glu Glu

50 55 60

Val Ser Gly Ala Val Ser Ser Val Thr Val Glu Arg Met Leu Thr Val 65 70 75 80

Thr Ala Ser Val Glu Ala Ser Pro Ala Ile Gly Gln Met Tyr Phe Gln

85 90 95

Arg Ala Val Asp Asp Ile Gly Asp Leu Leu Gly Lys Thr Leu Leu Leu

100 105 110

Glu Leu Val Ser Ser Glu Leu Asp Ala Lys Ser Gly Val Glu Lys Thr

115 120 125

Arg Val Thr Ala Tyr Ala His Lys Thr Leu Arg Glu Gly His Tyr Glu

130 135 140

Ala Glu Phe Lys Val Pro Ala Ser Phe Gly Pro Val Gly Ala Val Leu 145 150 155 160

Val Glu Asn Glu His His Lys Glu Val Phe Ile Lys Glu Ile Lys Leu

165 170 175

Val Thr Gly Gly Asp Ser Ser Thr Ala Val Thr Phe Asp Cys Asn Ser

180 185 190

Trp Val His Ser Lys Phe Asp Asn Pro Glu Lys Arg Ile Phe Phe Thr

195 200 205

Leu Lys Ser Tyr Leu Pro Ser Asp Thr Pro Lys Gly Leu Glu Asp Leu

210 215 220

Arg Lys Lys Asp Leu Gln Ala Leu Arg Gly Asp Gly His Gly Glu Arg 225 230 235 240

Lys Val Phe Glu Arg Val Tyr Asp Tyr Asp Val Tyr Asn Asp Leu Gly

245 250 255

Asp Pro Asp Lys Asn Pro Ala His Gln Arg Pro Val Leu Gly Gly Asn

260 265 270

Lys Gln Tyr Pro Tyr Pro Arg Arg Cys Arg Thr Gly Arg Pro Arg Thr

275 280 285

Lys Lys Asp Pro Glu Thr Glu Met Arg Glu Gly His Asn Tyr Val Pro

290 295 300

Arg Asp Glu Gln Phe Ser Glu Val Lys Gln Leu Thr Phe Gly Ala Thr 305 310 315 320

Thr Leu Arg Ser Gly Leu His Ala Leu Leu Pro Ala Leu Arg Pro Leu

325 330 335

Leu Ile Asn Lys Lys Asp Leu Arg Phe Pro His Phe Pro Ala Ile Asp

340 345 350

Asp Leu Phe Ser Asp Gly Ile Pro Leu Pro Ala Gln Thr Gly Phe Asp

355 360 365

Ala Phe Arg Thr Val Val Pro Arg Met Val Lys Leu Val Glu Asp Thr 370 375 380 Thr Asp His Val Leu Arg Phe Glu Val Pro Glu Met Ile Glu Arg Asp 385 390 395 400

Arg Phe Ser Trp Phe Lys Asp Glu Glu Phe Ala Arg Gln Thr Ile Ala

405 410 415

Gly Leu Asn Pro Leu Cys Ile Gln Leu Leu Thr Glu Phe Pro Ile Lys

420 425 430

Ser Lys Leu Asp Pro Glu Val Tyr Gly Pro Ala Glu Ser Ala Ile Thr

435 440 445

Lys Glu Ile Leu Glu Lys Gln Met Asn Gly Ala Leu Thr Val Glu Gln

450 455 460

Ala Leu Ala Ala Lys Arg Leu Phe Ile Leu Asp Tyr His Asp Val Phe 465 470 475 480

Leu Pro Tyr Val His Lys Val Arg Glu Leu Gln Asp Ala Thr Leu Tyr

485 490 495

Ala Ser Arg Thr Ile Phe Phe Leu Thr Asp Leu Gly Thr Leu Met Pro

500 505 510

Leu Ala Ile Glu Leu Thr Arg Pro Lys Ser Pro Thr Arg Pro Gln Trp

515 520 525

Lys Arg Ala Phe Thr His Gly Pro Asp Ala Thr Asp Ala Trp Leu Trp

530 535 540

Lys Leu Ala Lys Ala His Val Leu Thr His Asp Thr Gly Tyr His Gln 545 550 555 560

Leu Val Ser His Trp Leu Arg Thr His Cys Cys Val Glu Pro Tyr Ile

565 570 575

Ile Ala Ala Asn Arg Gln Leu Ser Arg Leu His Pro Val Tyr Arg Leu

580 585 590

Leu His Pro His Phe Arg Tyr Thr Met Glu Ile Asn Ala Leu Ala Arg

595 600 605

Glu Ala Leu Ile Asn Ala Asp Gly Ile Ile Glu Glu Ser Phe Trp Pro

610 615 620

Gly Lys Tyr Ala Val Glu Leu Ser Ser Val Ala Tyr Gly Ala Thr Trp 625 630 635 640

Gln Phe Asp Thr Glu Ala Leu Pro Asn Asp Leu Ile Lys Arg Gly Leu

645 650 655

Ala Val Arg Gly Glu Asp Gly Glu Leu Glu Leu Thr Ile Lys Asp Tyr

660 665 670

Pro Tyr Ala His Asp Gly Leu Leu Val Trp Asp Ser Ile Arg Gln Trp

675 680 685

Ala Ser Glu Tyr Val Asn Val Tyr Tyr Lys Ser Asp Glu Ala Val Ala

690 695 700

Ala Asp Pro Glu Leu Arg Ala Phe Trp Asp Glu Val Arg Asn Val Gly 705 710 715 720

His Gly Asp Lys Lys Asp Glu Pro Trp Trp Pro Val Leu Asp Thr Arg

725 730 735

Asp Ser Leu Val Glu Thr Leu Thr Thr Ile Met Trp Val Thr Ser Gly

740 745 750

His His Ser Ala Val Asn Phe Gly Gln Tyr His Phe Ala Gly Tyr Phe

755 760 765

Pro Asn Arg Pro Thr Thr Ile Arg Lys Asn Met Pro Val Glu Glu Gly

770 775 780

Gly Pro Gly Glu Glu Met Glu Lys Phe Leu Lys Gln Pro Glu Thr Thr 785 790 795 800

Leu Leu Asp Met Leu Pro Thr Gln Met Gln Ala Ile Lys Val Met Thr

805 810 815 Thr Leu Asp Ile 820 Leu Ser Ser His Ser 825 Pro Asp Glu Glu Tyr 830 Met Gly Glu Phe Ala 835 Glu Pro Ser Trp Leu 840 Ala Glu Pro Met Val 845 Lys Ala Ala Phe Glu 850 Lys Phe Gly Gly Arg 855 Met Lys Glu Ile Glu 860 Gly Phe Ile Asp Glu Cys Asn Asn Asn Leu Asp Leu Lys Asn Arg Cys Gly Ala Gly Ile 865 870 875 880 Val Pro Tyr Glu Leu 885 Leu Lys Pro Phe Ser 890 Lys Pro Gly Val Thr 895 Gly Arg Gly Ile Pro Ser Ser Ile Ser Ile

900 905

<210> SEQ ID No: 5 <211> Comprimento: 33 <212> Tipo: DNA

<213> Organismo: Seqüência Artificial

<220> Características:

<223> Outras informações: primer

<400> Seqüência: 5

gttaccgaat tcgcccttcc cggtaccatg atg 33

<210> SEQ ID No: 6 <211> Comprimento: 29 <212> Tipo: DNA

<213> Organismo: Seqüência Artificial

<220> Características:

<223> Outras informações: primer

<400> Seqüência: 6

cgcctccctc gagaacggtg aggctgttg

29

Claims

1. Método para o aumento da capacidade de reserva de nitrogênio de plantas, caracterizado pelo fato de que compreende introduzir, na referida planta, pelo menos um constructo de nucleotídeo compreendendo uma seqüência de nucleotideos, operacionalmente ligada a um promotor que conduz a expressão em células de planta, em que a referida seqüência de nucleotideos é selecionada do grupo consistindo de: (a) a seqüência de nucleotideos compreendendo a seqüência descrita em SEQ ID NO: 1, a seqüência dos nucleotideos 62-2737 da SEQ ID NO: 1, ou a seqüência descrita em SEQ ID NO: 3; (b) a seqüência de nucleotideos codificando a seqüência de aminoácidos descrita em SEQ ID NO: 2; (c) a seqüência de nucleotideos apresentando pelo menos 9 0% de identidade de seqüência para a seqüência descrita em SEQ ID NO: 1, a seqüência dos nucleotideos 62-2737 da SEQ ID NO: 1, ou a seqüência descrita em SEQ ID NO: 3, em que a seqüência de nucleotideos codifica um polipeptídeo apresentando propriedades de proteína vegetativa de reserva; (d) seqüência de nucleotídeos que hibridiza, sob condições severas, com o complemento da seqüência de nucleotídeos de (a) ou (b) , em que as referidas condições severas compreendem uma hibridização em formamida 50%, NaCl 1M, SDS 1%, a 37°C, e um banho em 0.1X SSC, de 60°C a 65°C, em que a referida seqüência de nucleotídeos codifica um polipeptídeo apresentando propriedades de proteína vegetativa de reserva; e (e) a seqüência de nucleotídeos codificando uma seqüência de aminoácidos que apresenta pelo menos 90% de identidade de seqüência para a seqüência descrita em SEQ ID NO: 2, em que o referido polinucleotídeo codifica um polipeptídeo apresentando propriedades de proteína vegetativa de reserva.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o referido promotor é um promotor preferencial de tecido.

3. Método de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o referido promotor preferencial de tecido é um promotor preferencial de folha.

4. Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que a referida planta é uma planta C4.

5. Método de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o referido promotor é um promotor preferencial de células mesófilas.

6. Método de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o referido constructo de nucleotídeo compreende uma seqüência codificadora, para um sinal de localização vacuolar, operacionalmente ligada à referida seqüência de nucleotídeos.

7. Método de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o referido constructo de nucleotídeo compreende uma seqüência codificadora, para um peptídeo de trânsito de plastídio, operacionalmente ligada à referida seqüência de nucleotídeos.

8. Método de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o referido promotor é um promotor preferencial de células de bainha de feixes.

9. Método de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o referido constructo de nucleotídeo compreende uma seqüência codificadora, para um sinal de localização vacuolar, operacionalmente ligada à referida seqüência de nucleotídeos.

10. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 9, caracterizado pelo fato de que a referida planta C4 é milho, sorgo ou cana-de-açúcar.

11. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o referido promotor é um promotor constitutivo.

12. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o referido promotor é um promotor induzivel.

13. Método de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o referido promotor induzivel é um promotor induzivel por injúria.

14. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3 e 11 a 13, caracterizado pelo fato de que a referida planta é uma monocotiledônea.

15. Método de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que a referida monocotiledônea é selecionada do grupo consistido de milho, trigo, arroz, cevada, sorgo, ou centeio.

16. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o referido constructo de nucleotídeo compreende uma seqüência codificadora, para um sinal de localização vacuolar, operacionalmente ligada à referida seqüência de nucleotídeos.

17. Método de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que o referido promotor é um promotor preferencial de tecido.

18. Método de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que o referido promotor preferencial de tecido é um promotor preferencial de folha.

19. Método de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que o referido promotor é um promotor constitutivo.

20. Método de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que o referido promotor é um promotor induzível.

21. Método de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que o referido promotor induzível é um promotor induzível por injúria.

22. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações -16 a 21, caracterizado pelo fato de que a referida planta é uma monocotiledônea.

23. Método de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que a referida monocotiledônea é selecionada do grupo consistido de milho, trigo, arroz, cevada, sorgo, ou centeio.

24. Método para o aumento do valor nutricional de forragem ou silagem, caracterizado pelo fato de que compreende introduzir, em plantas usadas em forragem ou silagem, pelo menos um constructo de nucleotídeo compreendendo uma seqüência de nucleotídeo operacionalmente ligada a um promotor que conduz a expressão em células de planta, em que a referida seqüência de nucleotídeos é selecionada do grupo consistindo de: a) a seqüência de nucleotídeos compreendendo a seqüência descrita em SEQ ID NO: 1, a seqüência dos nucleotídeos 62-2737 da SEQ ID NO: 1, ou a seqüência descrita em SEQ ID NO: 3; (b) a seqüência de nucleotídeos codificando a seqüência de aminoácidos descrita em SEQ ID NO: -2; (c) a seqüência de nucleotídeos apresentando pelo menos 90% de identidade de seqüência para a seqüência descrita em SEQ ID NO: 1, a seqüência dos nucleotídeos 62-2737 da SEQ ID NO: 1, ou a seqüência descrita em SEQ ID NO: 3, em que a seqüência de nucleotídeos codifica um polipeptídeo apresentando propriedades de proteína vegetativa de reserva; (d) seqüência de nucleotídeos que hibridiza, sob condições severas, com o complemento da seqüência de nucleotídeos de (a) ou (b) , em que as referidas condições severas compreendem uma hibridização em formamida 50%, NaCl 1M, SDS 1%, a 37°C, e um banho em 0. IX SSC, de 60°C a 65°C, em que a referida seqüência de nucleotídeos codifica um polipeptídeo apresentando propriedades de proteína vegetativa de reserva; e (e) a seqüência de nucleotídeos codificando uma seqüência de aminoácidos que apresenta pelo menos 90% de identidade de seqüência para a seqüência descrita em SEQ ID NO: 2, em que o referido polinucleotídeo codifica um polipeptídeo apresentando propriedades de proteína vegetativa de reserva.

25. Método de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de que a referida seqüência de nucleotídeos de (e) codifica a proteína vegetativa de reserva, a qual é enriquecida com aminoácidos essenciais.

26. Método de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que os referidos aminoácidos essenciais incluem um ou mais aminoácidos selecionados do grupo consistindo de lisina, metionina, triptofano, treonina, fenilalanina, leucina, valina, e isoleucina.

27. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações -24 a 26, caracterizado pelo fato de que o referido promotor é iam promotor preferencial de tecido.

28. Método de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que o referido promotor preferencial de tecido é um promotor preferencial de folha.

29. Método de acordo com a reivindicação 28, caracterizado pelo fato de que a referida planta é uma planta C4.

30. Método de acordo com a reivindicação 29, caracterizado pelo fato de que o referido promotor é um promotor preferencial de células mesófilas.

31. Método de acordo com a reivindicação 30, caracterizado pelo fato de que o referido constructo de nucleotideo compreende uma seqüência codificadora, para um sinal de localização vacuolar, operacionalmente ligada à referida seqüência de nucleotideos.

32. Método de acordo com a reivindicação 30, caracterizado pelo fato de que o referido constructo de nucleotideo compreende uma seqüência codificadora, para um peptídeo de trânsito de plastidio, operacionalmente ligada a referida seqüência de nucleotideos.

33. Método de acordo com a reivindicação 29, caracterizado pelo fato de que o referido promotor é um promotor preferencial de células de bainha de feixes.

34. Método de acordo com a reivindicação 33, caracterizado pelo fato de que o referido constructo de nucleotideo compreende uma seqüência codificadora, para um sinal de localização vacuolar, operacionalmente ligada à referida seqüência de nucleotídeos.

35. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações -29 a 34, caracterizado pelo fato de que a referida planta C4 é milho, sorgo ou cana-de-açúcar.

36. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações -24 a 26, caracterizado pelo fato de que o referido promotor é um promotor constitutivo.

37. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações -24 a 26, caracterizado pelo fato de que o referido promotor é um promotor induzível.

38. Método de acordo com a reivindicação 37, caracterizado pelo fato de que o referido promotor induzível é um promotor induzível por injúria.

39. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações -24 a 28 e 36 a 38, caracterizado pelo fato de que a referida planta é uma monocotiledônea.

40. Método de acordo com a reivindicação 39, caracterizado pelo fato de que a referida monocotiledônea é selecionada do grupo consistido de milho, trigo, arroz, cevada, sorgo, ou centeio.

41. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 24 a 26, caracterizado pelo fato de que o referido constructo de nucleotídeo compreende üma . seqüência codificadora, para um sinal de localização vacuolar, operacionalmente ligada à referida seqüência de nucleotideos.

42. Método de acordo com a reivindicação 41, caracterizado pelo fato de que o referido promotor é um promotor preferencial de tecido.

43. Método de acordo com a reivindicação 42, caracterizado pelo fato de que o referido promotor preferencial de tecido é um promotor preferencial de folha.

44. Método de acordo com a reivindicação 41, caracterizado pelo fato de que o referido promotor é um promotor constitutivo.

45. Método de acordo com a reivindicação 41, caracterizado pelo fato de que o referido promotor é um promotor induzivel.

46. Método de acordo com a reivindicação 45, caracterizado pelo fato de que o referido promotor induzível é um promotor induzível por injúria.

47. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações -41 a 46, caracterizado pelo fato de que a referida planta é uma monocotiledônea.

48. Método de acordo com a reivindicação 47, caracterizado pelo fato de que a referida monocotiledônea é selecionada a partir do grupo consistido de milho, trigo, arroz, cevada, sorgo, ou centeio.

49. Método para aumentar o teor de nitrogênio em uma planta ou parte de planta, caracterizado pelo fato de que compreende introduzir na referida planta pelo menos uma construção de nucleotídeo operacionalmente ligada a um promotor que dirige a expressão em uma célula vegetal, em que a referida seqüência de nucleotídeos é selecionada do grupo consistindo de: (a) seqüência de nucleotídeo compreendendo a seqüência definida em SEQ ID NO: 1, a seqüência definida entre os nucleotídeos 62-2737 de SEQ ID NO: 1, ou a seqüência definida em SEQ ID NO: 3; (b) seqüência de nucleotídeo codificando a seqüência de aminoácidos definida em SEQ ID NO: 2; (c) seqüência de nucleotídeo apresentando pelo menos 90% de identidade de seqüência com a seqüência definida em SEQ ID NO: 1, a seqüência definida entre os nucleotídeos 62-2737 de SEQ ID NO: 1, ou a seqüência definida em SEQ ID NO: 3, em que a referida seqüência de nucleotídeo codifica um polipeptídeo com propriedades de proteína vegetativa de reserva; (d) seqüência de nucleotídeo que hibridiza sob condições estringentes com o complemento das seqüência nucleotídicas de (a) ou (b), em que as referidas condições estringentes compreendem hibridização em formamida 50%, NaCl 1M, SDS 1% a 37°C, e uma lavagem em SSC O,1x a 60°C-65°C, em que a referida seqüência de nucleotídeo codifica um polipeptídeo com propriedades de proteína vegetativa de reserva; e (e) seqüência de nucleotídeo que codifica uma seqüência de aminoácidos apresentando pelo menos -90% de identidade de seqüência com a seqüência definida em SEQ ID NO: 2, em que o referido polinucleotídeo codifica um polipeptídeo com propriedades de proteína vegetativa de reserva.

50. Método de acordo com a reivindicação 49, caracterizado pelo fato de que a referida seqüência de nucleotídeo de (e) codifica uma proteína vegetativa de reserva que é enriquecida com aminoácidos essenciais.

51. Método de acordo com a reivindicação 50, caracterizado pelo fato de que os aminoácidos essenciais incluem um ou mais aminoácidos selecionados do grupo consistindo de lisina, metionina, triptofano, treonina, fenilalanina, leucina, valina, e isoleucina.

52. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações -49 a 51, caracterizado pelo fato de que a referida planta ou parte de planta é usada para forragem ou silagem.

53. Método de acordo com a reivindicação 52, caracterizado pelo fato de que a referida parte de planta usada para forragem ou silagem é selecionada a partir do grupo consistindo de folhas, caules, sementes, e qualquer combinação entre estas.

54. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações -49 a 53, caracterizado pelo fato de que o referido promotor é um promotor tecido-preferencial.

55. Método de acordo com a reivindicação 54, caracterizado pelo fato de que o referido promotor tecido-preferencial é um promotor preferencial de folha.

56. Método de acordo com a reivindicação 55, caracterizado pelo fato de que a referida planta é uma planta C4.

57. Método de acordo com a reivindicação 56, caracterizado pelo fato de que o referido promotor é um promotor preferencial de células do mesófilo.

58. Método de acordo com a reivindicação 57, caracterizado pelo fato de que a referida construção de nucleotideo compreende a seqüência codificante para um sinal de localização vacuolar operacionalmente ligado a seqüência de nucleotideo.

59. Método de acordo com a reivindicação 57, caracterizado pelo fato de que a referida construção de nucleotideo compreende uma seqüência codificante para um peptideo transito de plastídio operacionalmente ligado a referida seqüência de nucleotideo.

60. Método de acordo com a reivindicação 56, caracterizado pelo fato de que o referido promotor é um promotor preferencial para células da bainha dos feixes.

61. Método de acordo com a reivindicação 60, caracterizado pelo fato de que a referida construção de nucleotideo compreende uma seqüência codificante para um sinal de localização vacuolar operacionalmente ligada a referida seqüência de nucleotideo.

62. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações -56 a 61, caracterizado pelo fato de que a referida planta C4 é milho, sorgo, ou cana de açúcar.

63. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações -49 a 53, caracterizado pelo fato de que o referido promotor é um promotor constitutivo.

64. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações -49 a 53, caracterizado pelo fato de que o referido promotor é um promotor induzivel.

65. Método de acordo com a reivindicação 64, caracterizado pelo fato de que o referido promotor induzivel é um promotor induzivel por injúria.

66. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações -49 a 55 e de 63 a 65, caracterizado pelo fato de que a referida planta é uma monocotiledônea.

67. Método de acordo com a reivindicação 66, caracterizado pelo fato de que a referida monocotiledônea é selecionada a partir do grupo consistido de milho, trigo, arroz, cevada, sorgo, ou centeio.

68. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações -49 a 53, caracterizado pelo fato de que a referida construção de nucleotideo compreende uma seqüência codificante para um sinal de localização vacuolar operacionalmente ligado a referida seqüência de nucleotídeo.

69. Método de acordo com a reivindicação 68, caracterizado pelo fato de que o referido promotor é um promotor tecido- preferencial.

70. Método de acordo com a reivindicação 68, caracterizado pelo fato de que o referido promotor tecido-preferencial é um promotor preferencial de folha.

71. Método de acordo com a reivindicação 68, caracterizado pelo fato de que o referido promotor é um promotor constitutivo.

72. Método de acordo com a reivindicação 68, caracterizado pelo fato de que o referido promotor é um promotor induzivel.

73. Método de acordo com a reivindicação 72, caracterizado pelo fato de que o referido promotor induzivel é um promotor induzivel por injúria.

74. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 68 a 73, caracterizado pelo fato de que a referida planta é uma monocotiledônea.

75. Método de acordo com a reivindicação 74, caracterizado pelo fato de que a referida monocotiledônea é selecionada a partir do grupo consistido de milho, trigo, arroz, cevada, sorgo, ou centeio.

76. Construção de nucleotídeos, caracterizada pelo fato de que compreende uma seqüência codificante para um sinal de localização vacuolar e uma seqüência de nucleotideo codificando um polipeptídeo apresentando propriedades de proteína vegetativa de reserva, em que a referida seqüência codificante e a referida seqüência de nucleotideo são operacionalmente ligadas a um promotor que dirige a expressão em uma célula vegetal, em que a referida seqüência de nucleotideo é selecionada a partir de um grupo consistido de: (a) seqüência de nucleotideo compreendendo a seqüência definida em SEQ ID NO: 1, a seqüência definida entre os nucleotídeos 62-2737 de SEQ ID NO: 1, ou a seqüência definida em SEQ ID NO: 3; (b) seqüência de nucleotideo codificando a seqüência de aminoácidos definida em SEQ ID NO: 2; (c) seqüência de nucleotideo apresentando pelo menos -90% de identidade de seqüência com a seqüência definida em SEQ ID NO: 1, a seqüência definida entre os nucleotídeos 62-2737 de SEQ ID NO: 1, ou a seqüência definida em SEQ ID NO: 3; (d) seqüência de nucleotídeo que hibridiza sob condições estringentes com o complemento das seqüência nucleotidicas de (a) ou (b) , em que as referidas condições estringentes compreendem hibridização em formamida 50%, NaCl 1M, SDS 1% a -319C1 e uma lavagem em SSC OiIx a 60aC-652C; e (e) seqüência de nucleotídeo que codifica uma seqüência de aminoácidos apresentando pelo menos 90% de identidade de seqüência com a seqüência definida em SEQ ID NO: 2.

77. Construção de nucleotídeos de acordo com a reivindicação 76, caracterizada pelo fato de que a referida seqüência de nucleotídeo de (e) codifica uma proteína vegetativa de reserva que é enriquecida com aminoácidos essenciais.

78. Construção de nucleotídeos de acordo com a reivindicação 77, caracterizada pelo fato de que os aminoácidos essenciais incluem um ou mais aminoácidos selecionados do grupo consistindo de lisina, metionina, triptofano, treonina, fenilalanina, leucina, valina, e isoleucina.

79. Construção de nucleotídeos de acordo com qualquer uma das reivindicações 76 a 78, caracterizada pelo fato de que o referido promotor é um promotor tecido-preferencial.

80. Construção de nucleotídeos de acordo com a reivindicação 79, caracterizada pelo fato de que o referido promotor tecido-preferencial é um promotor preferencial de folha.

81. Construção de nucleotídeos de acordo com qualquer uma das reivindicações 76 a 78, caracterizada pelo fato de que o referido promotor é um promotor constitutivo.

82. Construção de nucleotídeos de acordo com qualquer uma das reivindicações 76 a 78, caracterizada pelo fato de que o referido promotor é um promotor induzível.

83. Construção de nucleotídeos de acordo com a reivindicação 82, caracterizada pelo fato de que o promotor induzível é um promotor induzível por injúria.

84. Método para a produção de uma planta transformada caracterizado pelo fato de que compreende: (a) transformar uma célula de planta com uma construção de nucleotídeos como definida em qualquer uma das reivindicações 76 a 83; (b) cultivar dita célula de planta sob condições de crescimento; e (c)regenerar a planta transformada a partir da dita célula de planta.

85. Método de acordo com a reivindicação 84, caracterizado pelo fato de que a referida planta é uma monocotiledônea.

86. Método de acordo com a reivindicação 85, caracterizado pelo fato de que a referida monocotiledônea é milho, trigo, arroz, cevada, sorgo, ou centeio.

87. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações -84 a 86, caracterizado pelo fato de que a referida construção de nucleotídeos é estaveImente incorporada ao genoma da referida planta.

88. Método para a determinação da expressão de ZmLox em um tecido vegetal, caracterizado pelo fato de que compreende: a. coletar tecido vegetal das plantas escolhidas; b. extrair a proteína vegetal usando técnica otimizada de extração alto rendimento de ZmLox; e c. analisar a referida proteína extraída por ELISA para determinar o nível de expressão de ZmLox.