BRPI0620639A2 - anticorpos de cadeia simples biespecìficos e composição farmacêutica compreendendo os mesmos - Google Patents

Abstract

ANTICORPOS DE CADEIA SIMPLES BIESPECìFICOS E COMPOSIçãO FARMACêUTICA COMPREENDENDO OS MESMOS. A presente invenção refere-se a anticorpos de cadeia simples biespecíficos compreendendo um primeiro domínio de ligação que liga-se imunoespecificamente com o CD3 de antígeno de células T e um segundo domínio de ligação que liga-se imunoespecificamente com o receptor de EphA2. Tais anticorpos de cadeia simples biespecificos são abrangidos pelo termo "EphA2-BiTEs". A presente invenção refere-se ainda a métodos e composições destinados ao tratamento, à prevenção e/ou ao gerenciamento de desordens associadas com a expressão e/ou a atividade anormal de EphA2. Tais desordens incluem, sem limitação, câncer, desordens de células hiperproliferativas não-cancerígenas e infecções. A invenção revela vetores que compreendem polinucleotideos codificando os EphA2-BiTEs da invenção, células de hospedeiros transformadas pelos mesmos e seus usos na produção dos referidos EphA2-BiTEs. A presente invenção também fornece composições, incluindo composições farmacêuticas, compreendendo qualquer um dos referidos EphA2-BiTEs, polinucleotídeos ou vetores, sozinhos ou em combinação com um ou mais agentes terapêuticos ou profiláticos. São ainda descritos métodos de varredura dos referidos EphA2-BiTEs e kits compreendendo qualquer uma das referidas composições e reagentes de diagnóstico.

Description

ANTICORPOS DE CADEIA SIMPLES BIESPECÍFICOS E COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA COMPREENDENDO OS MESMOS

O presente pedido reivindica o beneficio do pedido provisório U.S. Provisional Application No. 60/753.368, depositado era 21 de dezembro de 2005, que é incorporado por referência aqui em sua inteqra.

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção está relacionada a anticorpos biespecificos de cadeia simples compreendendo um primeiro domínio de "ligação que se liga imunoespecifícamente ao antígeno CD3 de célula T e um segundo domínio de ligação que se liga imunoespecificamente ao receptor EphA2. Tais anticorpos biespecificos de cadeia simples são englobados pelo termo "EphA2-BiTEs." A presente invenção está relacionada ainda a métodos e composições projetados para o tratamento, prevenção e/ou gerenciamento de desordens associadas com expressão e/ou atividade de EphA2 aberrante. Tais desordens incluem, mas. não estão limitadas a, câncer, desordens celulares hiperproliferativas não cancerosas, e infecções. A invenção está ainda relacionada a vetores compreendendo polinucleotídeos codificando os EphA2-BiTEs da invenção, células hospedeiras transformadas com esses, e seu uso na produção de ditos EphA2-BiTEs. A invenção também provê composições, incluindo composições farmacêuticas, compreendendo qualquer dos EphA2-BiTEs mencionados a seguir, polinucleotídeos ou vetores tanto sozinhos ou em combinação com um ou mais agentes profiláticos ou terapêuticos. Também descritos são métodos de rastrear para ditos EphA2-BiTEs e kits compreendendo qualquer das composições e reagentes diagnósticos mencionados a seguir.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

2.1 EphA2

EphA2 é uma tirosina quinase receptora de 130 kDa que é expressada em epitélio adulto, onde é encontrada em baixos níveis e é enriquecida em sítios de adesão célula- célula (Zantek et al., 1999, Cell Growth & Differentiation 10 (9) : 629-38; Lindberg et al., Mol. & Cell. Biol. 10:6316, 1990). É pensado que essa localização subcelular desempenha um papel na inibição de contato através da interação de EphA2 com seus ligantes (conhecidos como EphrinsAl a A5) que estão ancorados na membrana celular em células adjacentes (Eph Nomenclature Committee, 1997, Cell 90:403- 04; Cheng et al., 2002, Cytokine & Growth Factor Rev. 13:75-85). O engajamento de EphA2 com seu ligante resulta em autofosforilação de EphA2 e sua subseqüente degradação (Walker-Daniels et al., 2002, Mol. Câncer. Res. 1(1):79-87; Carles-Kinch et al., 2002, Câncer Res. 62(10) :2840-47) . Essa cascata de sinalização também inicia eventos abaixo que regulam negativamente a anexação a moléculas de adesão de matriz extracelular e, dessa forma, regulam o crescimento e migração celular (Zantek et al. , 1999, Cell Growth & Differentiation 10(9) :629-38; Miao et al., 2000, Nat. Cell Biol. 2(2):62-69; Zelinski et al., 2001, Câncer Res. 61 (5) : 2301-06).

EphA2 foi mostrado por ser sobre-expressado em um número de deferentes tipos de tumores incluindo melanoma, carcinoma celular renal, cânceres de mama, próstata, cólon, de esôfago, cervical, de pulmão, ovariano e de bexiga (Carles-Kinch et al., 2002, Câncer Res. 62 (10) :2840-47). Os níveis mais altos de expressão de EphA2 são observados nas células mais agressivas, sugerindo um papel para EphA2 na progressão da doença. Níveis altos de EphA2 também têm sido correlacionados com baixa sobrevivência para cânceres que não de células pequenas de pulmão, esôfago, cervical e ovariano (Kinch et al., 2003, Clin. Câncer Res. 9(2):613- 18; Miyazaki et al., 2003, Int. J. Câncer 103(5) 657-63; Wu et al., 2004, Gynecol. Oncol. 94(2):312-19; Thaker et al., 2004, Clin. Câncer Res. 10 (15) :5145-50). Adicionalmente, em modelos pré-clínicos, foi demonstrado que a expressão exógena de EphA2 é suficiente para render uma linha celular não tumorigênica, tumorigênica in vitro e in vivo (Zelinski et al., 2001, Câncer Res. 61(5):2301-06).

2.2 Moléculas BiTE®

Engajadores de células T biespecíficos, ou BiTEs®, são uma forma de anticorpos biespecíficos que são baseados em anticorpos de cadeia simples arranjados um atrás do outro (revisado em Wolf et al., 2005, Drug Discovery Today: in press). Eles formam uma única cadeia polipeptidica de aproximadamente 55 kDa e são secretados por células de ovário de hamster chinês (CHO) como uma mistura de monômeros e dimeros. Com uma ramificação, BiTEs® se liga à subunidade épsilon (ε) de CD3 humano, um componente protéico de complexo de transdução de sinais do receptor de células T em células T. Com uma ramificação, BiTEs® reconhecem um antigeno em células alvo. A ativação de célula T é vista apenas quando BiTEs® são apresentados a células T na superfície das células alvo.

BiTEs® limitam transientemente células T e células alvo. A ativação de células T por BiTEs® envolve a regulação positive de CD69, CD25 e várias moléculas de adesão celular, expressão de novo e liberação de citoquinas (e.g., IFN-γ, TNF-α, IL-β, IL-2, IL-4 e IL-10), regulação positive da expressão de granzima e perforina, e proliferação celular. A Iise de célula alvo redirecionada por BiTEs® é independente de especificidade de receptor de célula T, presença de MHC classe I e β2 microglobulina, e de qualquer estímulo co-estimulatório. Essa independência de sinais de células T regulares e moléculas de reconhecimento pode ser explicada pela indução através de BiTEs® de sinapses citolíticas regulares e máxima proximidade a membrana. 0 deslocamento de proteínas reguladoras negativas, tais como CD45 de sinapses induzidas por BiTE® pode aliviar a necessidade para co-estimulação. BiTEs® apresentam Iise redirecionada in vitro com células T periféricas policlonais CD8- e CD4-positivas não estimuladas previamente. Nenhuma atividade é vista com células T CD8- ou CD4-positivas. células T CD4 podem regular positivamente a expressão de granzima B e perforina quando estimuladas com BiTEs® e, dessa forma, contribuem para Iise de célula alvo mediada por CD8. In vitro, Iise redirecionada é vista em concentrações picomolares baixas, sugerindo que números muito baixos de moléculas BiTE necessitam ser ligadas a células alvo para ativar células T. Em modelos de SCID de camundongo, doses sub-pg de BiTEs® foram comprovadas por prevenir completamente o crescimento de tumor (Dreier et al., 2003, J Immunol. 170:4397-4402) e por erradicar tumores sólidos em até 200 mm3 (Schlereth et al., 2005, Câncer Res. 2005 65(7):2882-89).

BiTEs®, portanto, provêm uma oportunidade única para desenvolver terapias baseadas em anticorpos seletivas e eficazes contra EphA2 para o tratamento, prevenção e/ou gerenciamento de desordens associadas com expressão e/ou atividade aberrante de EphA2 (e.g., câncer, desordens celulares hiperproliferativas não cancerosas, e infecções).

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

A presente invenção provê engajadores de células T biespecificos (i.e., EphA2-BiTEs (em particular, EphA2- BiTEs, os quais são anticorpos biespecificos de cadeia simples)) que ligam EphA2 imunoespecificamente e antigeno CD3 de célula T, e métodos de usar o mesmo para tratar, prevenir e/ou gerenciar desordens associadas com expressão e/ou atividade aberrante de EphA2. Tais desordens incluem, por exemplo, câncer, desordens celulares hiperproliferativas não cancerosas, e infecções. Em um aspecto, os EphA2-BiTEs são mais eficientes em eliminar células que expressam EphA2 de forma aberrante do que anticorpos EphA2 específicos conhecidos na arte. Em um aspecto específico, os EphA2-BiTEs são mais eficientes em eliminar células cancerosas expressando EphA2 (em particular, células cancerosas malignas expressando EphA2) do que anticorpos EphA2 conhecidos na arte. Em outro aspecto, os EphA2-BiTEs são mais eficientes em eliminar células hiperproliferativas não cancerosas expressando EphA2 do que anticorpos EphA2 conhecidos na arte. Ainda em outro aspecto, os EphA2-BiTEs da invenção são mais eficientes em eliminar células infectadas expressando EphA2 (em particular, células infectadas com o vírus sincitial respiratório; "RSV") do que anticorpos EphA2 conhecidos na arte. Em outro aspecto, dosagens menores de EphA2-BiTEs do que anticorpos EphA2 específicos conhecidos na arte são necessários para tratar, prevenir e/ou gerenciar desordens associadas com expressão e/ou atividade aberrante de EphA2.

Os engajadores de células T biespecíficos EphA2 específicos da presente invenção compreendem um primeiro domínio de ligação que se liga imunoespecificamente ao antigeno CD3 de célula T e um segundo domínio de ligação que se liga imunoespecificamente a EphA2 (daqui em diante "EphA2-BiTEs," "moléculas EphA2-BiTE" ou "engajadores de células biespecificos de EphA2). Em um avanço, o primeiro domínio de ligação se liga imunoespecificamente a CD3. Em um avanço específico, o primeiro domínio de ligação se liga imunoespecificamente a uma ou mais de qualquer subunidade de CD3 (e.g., a subunidade gama, delta, zeta, ou eta) . Em um avanço preferencial, o primeiro domínio de ligação se liga imunoespecificamente à subunidade épsilon (ε) de CD3. Em um avanço específico, o primeiro domínio de ligação se liga imunoespecificamente à subunidade épsilon (ε) de CD3 quando dita subunidade é complexada com a subunidade delta de CD3. Em outro avanço, o domínio de ligação que se liga a CD3 é desimunizado. Em outro avanço específico, o segundo domínio de ligação se liga imunoespecificamente ao domínio extracelular de EphA2. Em um avanço preferencial, o segundo domínio de ligação dos EphA2-BiTEs, que são usados no tratamento, prevenção e/ou gerenciamento de câncer, se liga imunoespecificamente a epitopos em EphA2 que são seletivamente expostos e/ou aumentadas em células cancerosas, mas não em células não cancerosas. Em outro avanço preferencial, o segundo domínio de ligação dos EphA2-BiTEs da invenção se liga imunoespecificamente a epitopos em EphA2 que são seletivamente expostos e/ou aumentados em células hiperproliferativas não cancerosas, mas não em células não hiperproliferativas. Em outro avanço preferencial, o segundo domínio de ligação dos EphA2-BiTEs da invenção se liga imunoespecificamente a epitopos em EphA2 que são seletivamente expostos e/ou aumentados em células infectadas, mas não em células não infectadas.

Em um avanço especifico, um EphA2-BiTE da invenção compreende: (1) um primeiro domínio de ligação compreende um domínio variável pesado (VH) e um domínio variável leve (VL) de um anticorpo que se liga imunoespecif icamente ao antígeno CD3 de célula T; e (2) um segundo domínio de ligação que compreende um domínio VH e um domínio VL de um anticorpo que se liga imunoespecif icamente a EphA2. Em um avanço específico, os domínios VH e VL do primeiro domínio de ligação são ligados juntos por um ligante de força suficiente para permitir que os domínios se dobrem de forma a permitir ligação ao antígeno CD3 de célula T. Ainda para este avanço, tal ligante pode compreender, por exemplo, a seqüência GEGTSTGS (G2S) 2GGAD (SEQ ID NO.:57). Em outro avanço específico, os domínios VH e VL do segundo domínio de ligação são ligados juntos por um ligante de força suficiente para permitir que os domínios se dobrem de forma a permitir a ligação a EphA2. Ainda para este avanço, tal ligante pode compreender, por exemplo, a seqüência (G4S)3 (SEQ ID NO:59). Em outro avanço específico, o primeiro e o segundo domínios de ligação são ligados juntos por um ligante de força suficiente para permitir que os domínios se dobrem de forma a permitir a ligação ao antígeno CD3 de célula Tea EphA2. Ainda para este avanço, tal ligante pode compreender, por exemplo, a seqüência G4S (SEQ ID NO:58). Em um avanço específico, um EphA2-BiTE da invenção é anti-CD3xEA2 desimunizado (VH/VL) (SEQ ID NO:65). De acordo com o avanço no parágrafo imediatamente anterior, a ligação é covalente. Em um avanço especifico, os ligantes da invenção compreendem resíduos de serina e glicina. Os ligantes dos EphA2-BiTEs, e.g., o ligante entre os domínios VH e VL do primeiro domínio de ligação que se liga a CD3, o ligante entre os domínios VH e VL do segundo domínio de ligação que se liga a EphA2, e o ligante entre o primeiro domínio de ligação que se liga a CD3 e o segundo domínio de ligação que se liga a EphA2 podem ser de qualquer comprimento suficiente a permitir que os domínios se dobrem de forma a permitir a ligação aos antígenos CD3 e EphA2, respectivamente. Em certos avanços, os ligantes da invenção compreendem um comprimento de pelo menos 5 resíduos, pelo menos 10 resíduos, pelo menos 15 resíduos, pelo menos 20 resíduos, pelo menos 25 resíduos, pelo menos 30 resíduos ou mais. Em outros avanços, os ligantes da invenção compreendem um comprimento entre 2-4 resíduos, entre 2-4 resíduos, entre 2-6 resíduos, entre 2-8 resíduos, entre 2-10 resíduos, entre 2-12 resíduos, entre 2-14 resíduos, entre 2-16 resíduos, entre 2-18 resíduos, entre 2-20 resíduos, entre 2-22 resíduos, entre 2-24 resíduos, entre 2-26 resíduos, entre 2-28 resíduos, ou entre 2-30 resíduos. Em certos avanços, o primeiro domínio de ligação é 5' em relação ao segundo domínio de ligação. Em outros avanços, o segundo domínio de ligação é 5' em relação ao primeiro domínio de ligação. Em certos avanços, o primeiro e o segundo domínios de ligação são anticorpos de cadeia simples. Em um avanço específico, o primeiro e o Segundo domínios de ligação compreendem Fvs de cadeia simples (scFvs).

Em um avanço específico, a invenção provê um anticorpo biespecífico de cadeia simples compreendendo (a) um primeiro domínio variável de cadeia pesada e um primeiro domínio variável de cadeia leve cada de um anticorpo que liga imunoespecificamente à cadeia ε do CD3, dito primeiro domínio variável de cadeia pesada ligado covalentemente a dito primeiro domínio variável de cadeia leve por um primeiro ligante de comprimento suficiente (e.g., GEGTSTGS (G2S) 2GGAD (SEQ ID NO.:57)) de forma que dito primeiro domínio variável de cadeia pesada e dito primeiro domínio variável de cadeia leve se dobrem para formar um primeiro domínio de ligação que se liga à subunidade ε de CD3; e (b) um segundo domínio variável de cadeia pesada e um segundo domínio variável de cadeia leve de um anticorpo que liga imunoespecificamente um epitopo de EphA2 exposto na superfície da célula, dito segundo domínio variável de cadeia pesada covalentemente ligado a dito segundo domínio variável de cadeia leve por um segundo ligante de comprimento suficiente (e.g., (G4S)3 (SEQ ID NO:59)) de forma que dito segundo domínio variável de cadeia pesada e dito segundo domínio variável de cadeia leve se dobrem para formar um segundo domínio de ligação que liga dito epitopo de EphA2, caracterizado pelo fato de que dito primeiro domínio de ligação e dito segundo domínio de ligação são covalentemente ligados por um terceiro ligante de um comprimento (e.g., G4S (SEQ ID NO:58)), de forma que dito primeiro domínio de ligação e dito segundo domínio de ligação se dobrem independentemente um do outro.

Em avanços específicos, os EphA2-BiTEs da invenção compreendem qualquer dos seguintes arranjos na direção 5' a 3': (1) VHcD3-VLcD3-VHEphA2-VL-EphA2; (2) VLCD3-VHcD3-VHEphA2-VL EphA2 r (3) VLCD3-VHcD3-VLEphA2-VH- EphA2 / (4) VHCD3-VLcD3-VLEphA2- VHEphA2; (5) VHEphA2-VLEphA2-VHcd3-VLcd3; (6) VLEphA2-VHEphA2-VHCD3- VLcd3/' (7) VLEphA2-VHEphA2-VLcD3-VHcD3; ou (8) VHEphA2-VLEphA2-VLcD3- VH-CD3- Ver, e.g., FIG. 14A para uma demonstração genérica dos constructos EphA2-BiTE da invenção.

Em um avanço específico, o primeiro domínio de ligação de um EphA2-BiTE da invenção se liga à subunidade e de CD3 com uma afinidade menor do que o segundo domínio de ligação que liga EphA2. Em um avanço, a constante de dissociação (Kd) do primeiro domínio de ligação que se liga à subunidade e de CD3 está entre 0,1 x 10-12 M e 0,5 x 10-12 M, 0,1 x 10-12 Melx 10-12 M, 0,1 x 10-11 Me 0,5 x 10-11 M, 0,1 x 10-11 Melx 10"11 M, 0,1 x 10-10 M e 0,5 x 10-10 M, 0,1 x 10-10 Melx 10-10 M, 0,1 x 10"9 M e 0,5 x 10-9 M, 0, 1 x 10-9 Melx 10-9 M, 0,1 x 10-8 Me 0,5 x 10-8 M, 0,1 x 10-8 Mel x 10-8 M, 0,1 x 10-7 M e 0,5 x 10-7 M, 0,1 x 10-7 Melx 10-7 M, 1 x 10-7 M e 2 x 10-7 M, 1 x 10-7 M e 3 x 10-7 M, 1 x 10-7 M e 4 x 10-7 M, 1 x 10-7 M e 5 x 10-7 M, 1 x 10-7 M e 6 x 10-7 M, 1 x 10-7 M e 7 x 10-7 M, 1 x 10-7 M e 8 x 10-7 M, 1 x 10-7 M e 9 x 10-7 M, 1 x 10-7 M e 10 x 10-7 M, 0,1 x 10-6 Me 0,5 x 10-6 M, 0,1 x 10-6 Melx 10-6 M, 1 x 10-6 M e 2 x 10-6 M, 1 x 10-6 M e 3 x 10-6 M, 1 x 10-6 M e 4 x 10-6 M, 1 x 10-6 M e 5 χ 10-6 Μ, 1 χ 10-6 M e 6 χ 10-6 Μ, 1 χ 10-6 M e 7 χ 10-6 Μ, 1 χ 10-6 M e 8 χ 10-6 Μ, 1 χ 10-6 M e 9 χ 10-6 Μ, 1 χ 10-6 M e

10χ 10-6 Μ, 0,1 χ 10-5 Me 0,5 χ 10-5 Μ, 0,1 χ 10-5 Melx 10-5 Μ, 1 χ 10-5 M e 2 χ 10-5 Μ, 1 χ 10-5 M e 3 χ 10-5 Μ, 1 χ 10-5 M e 4 χ 10-5 Μ, 1 χ 10-5 M e 5 χ 10-5 Μ, 1 χ 10-5 M e 6 χ 10-5 Μ, 1 χ 10-5 Μ e 7 χ 10-5 Μ, 1 χ 10-5 M e 8 χ 10-5 Μ, 1 χ 10-5 M e 9 χ 10-5 Μ, 1 χ 10-5 M e 10 χ 10-5 Μ. Em um avanço especifico, a constante de dissociação do primeiro domínio que se liga à subunidade ε de CD3 é 4 χ 10-7 Μ. Em outro avanço específico, a constante de dissociação do segundo domínio que se liga a EphA2 está entre 0,1 χ 10-12 Me 0,5 χ 10-12 Μ, 0,1 χ 10-12 Melx 10-12 Μ, 0,1 χ 10-11 M e 0,5 χ 10- 11Μ, 0,1 χ 10-11 Melx 10-11 Μ, 0,1 χ 10-10 Me 0,5 χ 10-10 Μ, 0,1 χ 10-10 Melx 10-10 Μ, 0,1 χ 10-9 M e 0,5 χ 10-9 Μ, 0,1 χ 10-9 Melx 10-9 Μ, 0,1 χ 10-8 M e 0,5 χ 10-8 Μ, 0,1 χ 10-8 Melx 10-8 Μ, 0,1 χ 10-7 Me 0,5 χ 10-7 Μ, 0, 1 χ 10-7 M e 1 χ 10-7 Μ, 1 χ 10-7 M e 2 χ 10-7 Μ, 1 χ 10-7 M e 3 χ 10-7 Μ, 1 χ 10-7 M e 4 χ 10-7 Μ, 1 χ 10-7 M e 5 χ 10-7 Μ, 1 χ 10-7 M e 6 χ 10-7 Μ, 1 χ 10-7 M e 7 χ 10-7 Μ, 1 χ 10-7 M e 8 χ 10-7 Μ, 1 χ 10-7 M e 9 χ 10-7 Μ, 1 χ 10-7 M e 10 χ 10-7 Μ, 0,1 χ 10-6 M e 0,5 χ 10-6 Μ, 0,1 χ 10-6 Melx 10-6 Μ, 1 χ 10-6 M e 2 χ 10-6 Μ, 1 χ 10-6 M e 3 χ 10-6 Μ, 1 χ 10-6 M e 4 χ 10-6 Μ, 1 χ 10-6 M e 5 χ 10-6 Μ, 1 χ 10-6 M e 6 χ 10-6 Μ, 1 χ 10-6 M e 7 χ 10-6 Μ, 1 χ 10-6 M e 8 χ 10-6 Μ, 1 χ 10-6 M e 9 χ 10-6 Μ, Ix 10-6 M e 10 χ 10-6 Μ, 0,1 χ 10-5 Me 0,5 χ 10-5 Μ, 0,1 χ 10-5 Melx 10-5 Μ, 1 χ 10-5 M e 2 χ 10-5 Μ, 1 χ 10-5 M e 3 χ 10-5 Μ, 1 χ 10-5 M e 4 χ 10-5 Μ, 1 χ 10-5 M e 5 χ 10-5 Μ, 1 χ 10-5 M e 6 χ 10-5 Μ, 1 χ 10-5 M e 7 χ 10-5 Μ, 1 χ 10-5 M e 8 χ 10-5 Μ, 1 χ 10-5 M e 9 χ 10-5 Μ, 1 χ 10-5 M e 10 χ 10-5 Μ. Em um avanço especifico, a constante de dissociação do segundo domínio que se liga a EphA2 é 1,13 χ IO-7 Μ. Em outro avanço específico, um EphA2-BiTE da invenção compreende um primeiro domínio de ligação que se liga à subunidade ε de CD3 com uma K0 de 4 χ IO"7 M e um segundo domínio de ligação que se liga a EphA2 com uma K0 de 1,13 χ IO"7 Μ.

Em avanços específicos, o domínio de ligação a EphA2 de um EphA2-BiTE da invenção possui uma alta constante de afinidade e uma baixa constante de dissociação. Em um avanço alternativo, o domínio de ligação a EphA2 de um EphA2-BiTE da invenção possui uma baixa constante de afinidade e uma alta constante de dissociação. Em outro avanço, o domínio de ligação a EphA2 de um EphA2-BiTE da invenção possui uma alta constante de afinidade e uma alta constante de dissociação. Em outro avanço específico, o domínio de ligação a CD3 de um EphA2-BiTE da invenção se liga à subunidade ε de CD3 com uma menor afinidade do que o segundo domínio de ligação que liga EphA2.

Em um avanço específico, os EphA2-BiTEs da invenção se ligam primeiro a EphA2 e, então, se ligam a CD3. Em outro avanço específico, os EphA2-BiTEs da invenção provocam a lise de células alvo que expressam EphA2 como medido por testes padrão de citotoxicidade conhecidos na arte ou como descrito abaixo nas Seções 6.2.6 e 6.3. Em um avanço específico, os EphA2-BiTEs da invenção medeiam a Iise de células alvo (e.g., células cancerosas, hiperproliferativas não cancerosas ou infectadas que expressam EphA2) em pelo menos 10%, pelo menos 15%, pelo menos 20%, pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 35%, pelo menos 40%, pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 99% ou pelo menos 1,5 vez, pelo menos 2 vezes, pelo menos 2,5 vezes, pelo menos 3 vezes, pelo menos 3,5 vezes, pelo menos 4 vezes, pelo menos 4,5 vezes, pelo menos 5 vezes, pelo menos 7 vezes ou pelo menos 10 vezes relativo ao nível de expressão de EphA2 nas células normais, células de um sujeito normal, saudável e/ou uma população de células normais, saudáveis que expressem EphA2 como medido por um teste baseado em citometria de fluxo como descrito na Seção 6.0 abaixo. Ainda em outro avanço, os EphA2-BiTEs da invenção não ativam (e.g., fosforilam) EphA2 quando ligados a EphA2 como medido por um teste de imunoprecipitação/Western blot como descrito na Seção 6.0 abaixo. Em um avanço específico, menos de 20%, menos de 15%, ou menos de 5% da população de EphA2s receptores são ativados (e.g., fosforilados) quando ligados a um EphA2- BiTE da invenção.

A presente invenção provê ainda composições compreendendo os EphA2-BiTEs da invenção. Em particular, a presente invenção provê composições farmacêuticas compreendendo os EphA2-BiTEs da invenção e um ou mais carregadores farmacêuticos ou excipientes. A presente invenção provê formulações aquosas, formulações liofilizadas, géis, e implantes cirúrgicos contendo qualquer dos EphA2-BiTEs da invenção. A presente invenção também provê kits compreendendo um ou mais EphA2-BiTEs da invenção, em um ou mais recipientes, e instruções para uso de tais EphA2-BiTEs.

A presente invenção provê composições e métodos para tratar, prevenir e/ou gerenciar câncer associado com expressão de EphA2 aberrante (e.g., sobre-expressão) e/ou atividade, os métodos compreendendo administrar a um sujeito em necessidade do mesmo um EphA2-BiTE da invenção. Em um avanço específico, a presente invenção provê métodos para tratar, prevenir e/ou gerenciar câncer associado com expressão de EphA2 aberrante, os métodos compreendendo administrar a um sujeito em necessidade do mesmo uma quantidade profilaticamente ou terapeuticamente efetiva de um EphA2-BiTE da invenção.

Em um avanço, o câncer a ser tratado, prevenido e/ou gerenciado é uma célula de origem epitelial. Ainda em outro avanço, as células cancerosas do câncer de um sujeito a ser tratado, prevenido e/ou gerenciado sobre-expressam EphA2 em relação a células normais de dito sujeito, células de um sujeito normal, saudável e/ou uma população de células normais, saudáveis. Em um avanço preferencial, algum EphA2 expressado pelas células cancerosas está ligado a um ligante, tanto como resultado de menos contatos célula- célula, localização subcelular alterada, ou aumento na quantidade de EphA2 relativa ao ligante. Em um avanço preferencial, o câncer a ser tratado, prevenido e/ou gerenciado é maligno.

Os EphA2-BiTEs da invenção podem ser administrados em combinação com uma ou mais terapias para câncer. Em particular, a presente invenção provê métodos de tratar, prevenir e/ou gerenciar câncer, os métodos compreendendo administrar a um sujeito em necessidade do mesmo, uma quantidade terapeuticamente ou profilaticamente efetiva de um ou mais EphA2-BiTEs da invenção em combinação com a administração de uma quantidade terapeuticamente ou profilaticamente efetiva de uma ou mais outras terapias. Exemplos não limitantes de outras terapias incluem quimioterapias, terapias hormonais, terapias biológicas/imunoterapias, radiação e cirurgia.

Expressão aumentada de EphA2 foi vista por ser associada com infecções por certos patógenos intracelulares, em particular, RSV (ver, e.g., U.S. Appn. Ser. No. 11/259.266, preenchida em 27 de outubro de 2005, intitulada "Use of Modulators of EphA2 and EphrinAl for the Treatment and Prevention of Infections", que é aqui incorporada por referência em sua integra). Dessa forma, a invenção também provê composições e métodos projetados para o tratamento, prevenção e/ou gerenciamento de uma infecção por patógeno, incluindo, mas não limitado a, uma infecção viral, uma infecção bacteriana, uma infecção fúngica e uma infecção por protozoário (exemplos de tais patógenos são descritos em, e.g., U.S. Appn. Ser. No. 11/259.266, preenchida em 27 de outubro de 2005, intitulada "Use of Modulators of EphA2 and EphrinAl for the Treatment and Prevention of Infections", (e em particular, nos parágrafos [006], [0046], [0047], e [0057]) a qual é aqui incorporada por referência em sua integra). Em particular, a presente invenção provê métodos para tratar, prevenir e/ou gerenciar uma infecção onde a expressão de EphA2 é regulada positivamente em células infectadas (e.g., células infectadas expressando EphA2), ditos métodos compreendendo administrar a um sujeito em necessidade do mesmo uma quantidade efetiva de um ou mais EphA2-BiTEs da invenção, e opcionalmente, uma quantidade efetiva de uma terapia que não com EphA2-BiTE. Em um avanço especifico, as infecções patogênicas a serem tratadas, prevenidas e/ou gerenciada de acordo com os métodos da invenção são infecções patogênicas intracelulares. Em outro avanço especifico, a infecção patogênica a ser tratada, prevenida e/ou gerenciada de acordo com os métodos da invenção é uma infecção por RSV.

Em outro aspecto da invenção, a expressão aumentada de EphA2 foi vista por estar associada com certas desordens celulares hiperproliferativas não cancerosas tais como, por exemplo, aquelas descritas em U.S. Pat. Pub. No. US 2005- 0059592 Al, intitulada "EphA2 and Hyperproliferative Cell Disorders", a qual é aqui incorporada por referência em sua integra. Dessa forma, a invenção também provê composições e métodos projetados para o tratamento, prevenção e/ou gerenciamento de desordens celulares hiperproliferativas (exemplos não limitantes de tais desordens são descritos em, e.g., U.S. Pat. Pub. No. 2005-0059592, intitulada "EphA2 and Hyperproliferative Cell Disorders", (e em particular no parágrafo [0035]) que é aqui incorporado por referência em sua integra. Em particular, a presente invenção provê métodos para tratar, prevenir e/ou gerenciar uma desordem celular hiperproliferativa onde a expressão de EphA2 é regulada positivamente em células afetadas por tal desordem, ditos métodos compreendendo administrar a um sujeito em necessidade do mesmo uma quantidade efetiva de um ou mais EphA2-BiTEs da invenção, e opcionalmente, uma quantidade efetiva de uma terapia sem EphA2-BiTE. Em um avanço especifico, a desordem celular hiperproliferativa a ser tratada, prevenida e/ou gerenciada de acordo com os métodos da invenção são asma, COPD, fibrose pulmonar, asbestose, IPF, DIP, PIÜ, fibrose de rim, fibrose de fígado, outras fibroses, psoríase bronquial hiper- responsiva, psoríase, dermatite seborréica, fibrose cística, ou uma desordem celular hiperproliferativa de endotélio, tal como restenose, doença vascular hiperproliferativa, síndrome de Behcet, aterosclerose, degeneração macular, ou uma desordem de fibroblasto hiperproliferativa.

Os métodos e composições da invenção são úteis não apenas em pacientes com câncer não tratado, mas também são úteis no tratamento de pacientes com câncer parcialmente ou completamente refratários a atuais terapias padrão e experimentais para câncer, incluindo, mas não limitado a quimioterapias, terapias hormonais, terapias biológicas, imunoterapias, terapias de radiação e/ou cirurgia assim como para melhorar a eficácia de tais tratamentos. Dessa forma, em um avanço preferencial, a invenção provê métodos terapêuticos e profiláticos para o tratamento, prevenção e/ou gerenciamento de câncer que foi comprovado por ser ou pode ser refratário ou não responsivo a terapias que não aquelas compreendendo a administração de EphA2-BiTEs da invenção. Em um avanço especifico, um ou mais EphA2-BiTEs da invenção são administrados a um paciente refratário ou não responsivo a uma terapia não baseada em EphA2-BiTE (i.e., uma terapia que não um EphA2-BiTE) para tornar o paciente não refratário ou responsivo. Em certos avanços, a terapia a qual o paciente foi previamente refratário ou não responsivo pode ser, então, administrada com efeito terapêutico.

Os métodos e composições da invenção são úteis não apenas em pacientes não tratados com uma desordem celular hiperproliferativa não cancerosa, mas são também úteis no tratamento de tais pacientes parcialmente ou completamente refratários a terapias padrão e experimentais atuais para desordens celulares hiperproliferativas não cancerosas, incluindo, mas não limitadas a quimioterapias, terapias hormonais, terapias biológicas, imunoterapias, terapias de radiação e/ou cirurgia assim como para melhorar a eficácia de trais tratamentos. Dessa forma, em um avanço preferencial, a invenção provê métodos terapêuticos e profiláticos para o tratamento, prevenção e/ou gerenciamento de desordens celulares hiperproliferativas não cancerosas que foram vistas por ser ou podem ser refratárias ou não responsivas a terapias que não aquelas compreendendo a administração de EphA2-BiTEs da invenção. Em um avanço especifico, um ou mais EphA2-BiTEs da invenção são administrados a um paciente refratário ou não responsivo a uma terapia não baseada em EphA2-BiTE (i.e., uma terapia que não um EphA2-BiTE) para tornar o paciente não refratário ou responsivo. Em certos avanços, a terapia a qual o paciente foi previamente refratário ou não responsivo pode ser, então, administrada com efeito terapêutico.

Em outro avanço, métodos e composições da invenção são úteis não apenas em pacientes não tratados infectados com um patógeno (e.g., um vírus, bactéria, fungo ou protozoário patógeno), mas são também úteis no tratamento de pacientes parcialmente ou completamente refratários a terapias atuais padrão e experimentais para infecções, incluindo, mas não limitadas a agentes antivirais, antibacterianos, antifúngicos e/ou outros agentes antimicrobianos. Dessa maneira, em um avanço preferencial, a invenção provê métodos terapêuticos e profiláticos para o tratamento, prevenção e/ou gerenciamento de infecções que foram vistas por ser ou podem ser refratárias ou não responsivas a terapias que não aquelas compreendendo a administração de EphA2-BiTEs da invenção. Em um avanço específico, um ou mais EphA2-BiTEs da invenção são administrados a um paciente refratário ou não responsivo a uma terapia não baseada em EphA2-BiTE (i.e., uma terapia que não um EphA2- BiTE) para tornar o paciente não refratário ou responsivo. Em certos avanços, a terapia na qual o paciente foi previamente refratário ou não responsivo pode ser, então, administrada com efeito terapêutico.

Além disso, a presente invenção provê métodos de rastrear EphA2-BiTEs da invenção. Em particular, EphA2- BiTEs podem ser rastreados para ligação a EphA2, particularmente o domínio extracelular de EphA2, e o antígeno CD3 de célula T, usando técnicas imunológicas de rotina tais como, por exemplo, testes radioimuno (RIAs), testes imunossorbentes ligados a enzimas (ELISA), testes de citometria de fluxo e aqueles descritos na Seção 6 abaixo. Em um avanço, para identificar EphA2-BiTEs, EphA2-BiTEs candidatos podem ser rastreados para a habilidade de iniciar Iise redirecionada de células alvo EphA2 positivas (e.g., células cancerosas, células hiperproliferativas não cancerosas, ou células infectadas que expressam EphA2). Em outro avanço, EphA2-BiTEs candidatos podem ser rastreados para a habilidade de ter atividade antitumoral in vivo (e.g., em um modelo de xenotransplante NOD/SCID de camundongo).

A invenção também provê métodos de rastrear constructos de anticorpos biespecificos de cadeia simples que se ligam a outros receptores de Eph do tipo AeB, i.e., outros BiTEs receptores de Eph usando os métodos aqui descritos para identificar BiTEs específicos de EphA2. Ver Eph Nomenclature Committee, 1997, Cell 90(3):403-4; e Cheng et al., 2002, Cytokine & Growth Factor Rev. 13:75-85, cada qual é incorporado por referência aqui em sua integra, para uma lista dos membros da família de receptores Eph que podem ser usados como alvos para identificar outras moléculas BiTE específicas de receptor Eph.

Em outro avanço, para identificar EphA2-BiTEs que preferencialmente ligam um epitopo EphA2 exposto em células cancerosas, mas não em células não cancerosas, células hiperproliferativas não cancerosas ou em células infectadas, mas não em células não infectadas, EphA2-BiTEs podem ser também rastreados para a habilidade de ligar preferencialmente EphA2 que não está ligado a um ligante, e.g., Ephrin Al, e que não é localizado para contatos célula-célula. Em um avanço específico, a invenção provê métodos para identificar tecido afetado por uma desordem associada com expressão de EphA2 e/ou atividade aberrante, compreendendo usar um EphA2-BiTE da invenção em um teste de exclusão de epitopo (ver, e.g., Seções 6.2.4, 6.3.8 e 6.7 .2, infra). De acordo com este avanço, EphA2-BiTEs da invenção se ligam a epitopos EphA2 acessíveis ou se expõem apenas em células de tecidos afetados por uma desordem associada com expressão de EphA2 e/ou atividade aberrante (e.g., células cancerosas, não cancerosas, células hiperproliferativas ou células infectadas que expressam EphA2), e não células de tecidos normais do mesmo tipo de tecido. Qualquer método conhecido na arte para determinar a ligação/localização de anticorpos em uma célula pode ser usado para rastrear BiTEs candidatos para propriedades de ligação desejáveis. Em um avanço especifico, testes padrão conhecidos na arte, tais como microscopia de ressonância magnética nuclear (NMR), microscopia de imunofluorescência, citometria de fluxo ou testes de ressonância de plasmon de superfície são usados para determinar as características de ligação de um EphA2-BiTE em particular. Neste avanço, EphA2-BiTEs que se ligam fracamente a EphA2 quando este está ligado a seu ligante e localizado em contatos célula- célula, mas se ligam bem a EphA2 livre em uma célula, são englobados pela invenção. Em outro avanço específico, EphA2-BiTEs são selecionados para sua habilidade de competir com ligantes (e.g., Iigantes ancorados na célula ou purificados) para ligação a EphA2 usando testes baseados em células ou ELISA.

DEFINIÇÕES

Como aqui usado, o termo "aberrante" no contexto de expressão de EphA2, em certos avanços, refere-se à expressão de EphA2 que é aumentada em uma célula, e.g., uma célula cancerosa, uma célula não cancerosa hiperproliferativa, ou uma célula infectada de um sujeito, relativo ao nível de expressão de EphA2 nas células normais de dito sujeito, células de um sujeito normal, saudável e/ou uma população de células normais, saudáveis. Expressão aumentada de EphA2 refere-se a um aumento na expressão de EphA2 nas células de um sujeito com uma desordem associada com expressão aberrante de EphA2, relativa ao nível de expressão de EphA2 em células normais de dito sujeito, células de um sujeito normal, saudável e/ou uma população de células normais, saudáveis. Em um avanço especifico, o nível de expressão de EphA2 na células de um sujeito com uma desordem associada com expressão aberrante de EphA2 é aumentado em pelo menos 10%, pelo menos 15%, pelo menos 20%, pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 35%, pelo menos 40%, pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 99% ou .pelo menos 1,5 vezes, pelo menos 2 vezes, pelo menos 2,5 vezes, pelo menos 3 vezes, pelo menos 3,5 vezes, pelo menos 4 vezes, pelo menos 4,5 vezes, pelo menos 5 vezes, pelo menos 7 vezes ou pelo menos 10 vezes relativo ao nível de expressão de EphA2 nas células normais de dito sujeito, células de um sujeito normal, saudável e/ou uma população de células normais, saudáveis, como medido por teste padrão conhecido na arte ou como descrito na Seção 6.0 abaixo (e.g., um teste de citometria de fluxo). Em um avanço específico, a expressão de EphA2 é aumentada em pelo menos 10%, pelo menos 15%, pelo menos 20%, pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 35%, pelo menos 40%, pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 99% ou pelo menos 1,5 vezes, pelo menos 2 vezes, pelo menos 2,5 vezes, pelo menos 3 vezes, pelo menos 3,5 vezes, pelo menos 4 vezes, pelo menos 4,5 vezes, pelo menos 5 vezes, pelo menos 7 vezes ou pelo menos 10 vezes em uma célula cancerosa, uma célula não cancerosa hiperproliferativa, ou uma célula infectada, relativa ao nível de expressão de EphA2 nas células normais de dito sujeito, células de um sujeito normal, saudável e/ou uma população de células normais, saudáveis, como medido por teste padrão conhecido na arte ou como descrito na Seção 6.0 abaixo (e.g., um teste de citometria de fluxo). Em outro avanço, o termo "aberrante" no contexto de expressão de EphA2 refere-se à expressão de EphA2, caracterizada pelo fato de que certos epitopos de EphA2 são seletivamente expostos em uma célula cancerosa, uma célula não cancerosa hiperproliferativa, ou uma célula infectada de um sujeito, e não em células normais de dito sujeito, células de um sujeito normal, saudável e/ou uma população de células normais, saudáveis. Em outro avanço, o termo "aberrante" no contexto de expressão de EphA2 refere-se à expressão de EphA2, caracterizada pelo fato de que a localização subcelular de EphA2 é alterada em uma célula (at, e.g., sítios que não os sítios de contato célula-célula), como medido por teste padrão conhecido na arte ou por métodos descritos na Seção 6 abaixo, tais como, por exemplo, marcação por imunofluorescência.

Como aqui usado, o termo "agente" refere-se a uma molécula que possui um efeito biológico desejado. Agentes incluem, mas não estão limitados a, moléculas protéicas (e.g., peptídeos, polipeptídeos, proteínas e anticorpos (e.g., anticorpos biespecíficos de cadeia simples)), vacinas, moléculas pequenas (de menos de 1000 dáltons), compostos inorgânicos ou orgânicos, e moléculas de ácidos nucléicos (incluindo, mas não limitadas, DNA de dupla fita ou fita simples, ou RNA de dupla fita ou fita simples (e.g., anti-senso, RNAi, etc.), aptâmeros, assim como moléculas de ácidos nucléicos de hélice tripla). Agentes podem ser derivados ou obtidos de qualquer organismo conhecido (incluindo, mas não limitado a, animais (e.g., mamíferos (humanos e mamíferos não humanos)), plantas, bactérias, fungos, e protistas, ou vírus) ou de uma biblioteca de moléculas sintéticas.

Como aqui usado, o termo "análogo" no contexto de um agente protéico (e.g., a peptídeo, polipeptídeo, proteína ou anticorpo) refere-se a um agente protéico que possui uma função similar ou idêntica como um segundo protéico, mas não necessariamente compreende uma seqüência de aminoácidos similar ou idêntica ou estrutura do segundo agente protéico. Um agente protéico que possui uma seqüência de aminoácidos similar refere-se a um agente protéico que satisfaz pelo menos um dos seguintes: (a) um agente protéico tendo uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 30%, pelo menos 35%, pelo menos 40%, pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 99% idêntica à seqüência de aminoácidos de um segundo agente protéico; (b) um agente protéico codificado por uma seqüência de nucleotídeos que hibridiza sob condições estringentes a uma seqüência de nucleotídeos codificando um segundo agente protéico de pelo menos 20 resíduos de aminoácidos, pelo menos 30 resíduos de aminoácidos, pelo menos 40 resíduos de aminoácidos, pelo menos 50 resíduos de aminoácidos, pelo menos 60 resíduos de aminoácidos, pelo menos 70 resíduos de aminoácidos, pelo menos 80 resíduos de aminoácidos, pelo menos 90 resíduos de aminoácidos, pelo menos 100 resíduos de aminoácidos, pelo menos 125 resíduos de aminoácidos, ou pelo menos 150 resíduos de aminoácidos; e (c) um agente protéico codificado por uma seqüência de nucleotídeos que é menos 30%, pelo menos 35%, pelo menos 40%, pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 99% idêntica à seqüência de nucleotídeos codificando um segundo agente protéico. Um agente protéico com estrutura similar a um segundo agente protéico refere- se a um agente protéico que possui uma estrutura secundária, terciária ou quaternária similar do segundo agente protéico. A estrutura de um agente protéico pode ser determinada por métodos conhecidos daqueles especialistas na arte, incluindo, mas não limitados a, cristalografia de raio X, ressonância magnética nuclear, e microscopia eletrônica cristalográfica. Preferencialmente, um agente protéico da invenção possui atividade EphA2-BiTE.

Para determinar a identidade percentual de duas seqüências de aminoácidos ou de duas seqüências de ácidos nucléicos, as seqüências são alinhadas para propósitos de comparação ótima (e.g., espaços podem ser introduzidos na seqüência de uma primeira seqüência de aminoácidos ou de ácidos nucléicos para alinhamento ótimo com uma segunda seqüência de aminoácidos ou de ácidos nucléicos). Os resíduos de aminoácidos ou nucleotídeos nas posições de aminoácidos ou posições de nucleotídeos correspondentes são, então, comparadas. Quando uma posição na primeira seqüência é ocupada pelo mesmo resíduo de aminoácido ou nucleotídeo que a posição correspondente na segunda seqüência, então, as moléculas são idênticas naquela posição. A identidade percentual entre as duas seqüências é uma função do número de posições idênticas compartilhadas pelas seqüências (i.e., % identidade = número de posições idênticas se sobrepondo / número total de posições x 100%). Em um avanço, as duas seqüências são do mesmo tamanho.

A determinação de identidade percentual entre duas seqüências pode ser também conseguida usando um algoritmo matemático. Um exemplo preferido não limitante de um algoritmo matemático utilizado para a comparação de duas seqüências é o algoritmo de Karlin and Altschul, 1990, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 87: 2264-2268, modificado como em Karlin and Altschul, 1993, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 90: 5873-5877. Tal algoritmo é incorporado nos programas NBLAST e XBLAST de Altschul et al.f 1990, J. Mol. Biol. 215: 403. Buscas BLAST de nucleotídeos podem ser efetuadas com os parâmetros do programa NBLAST nucleotide estabelecidos em, e.g., para pontuação=100, comprimento de palavra=12 para obter seqüências de nucleotídeos homólogas a moléculas de ácidos nucléicos da presente invenção. Buscas BLAST de proteínas podem ser efetuadas com os parâmetros do programa XBLAST estabelecidos em, e.g., para pontuação=50, comprimento de palavra=3 para obter seqüências de aminoácidos homólogas a moléculas de proteínas da presente invenção. Para obter alinhamentos espaçados para propósitos de comparação, Gapped BLAST pode ser utilizado como descrito em Altschul et ai., 1997, Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402. Alternativamente, PSI-BLAST pode ser usado para efetuar uma busca iterada que detecta relações distantes entre moléculas (Jd.). Quando utilizando os programas BLAST, Gapped BLAST, e PSI-Blast, os parâmetros padrão dos respectivos programas (e.g., de XBLAST e NBLAST) podem ser usados (ver, e.g., o sítio eletrônico da NCBI). Outro exemplo preferido não limitante de um algoritmo matemático utilizado para a comparação de seqüências é o algoritmo de Myers and Miller, 1988, CABIOS 4: 11-17. Tal algoritmo é incorporado no programa ALIGN (versão 2.0) que é parte do pacote de software GCG de alinhamento de seqüências. Quando utilizando o programa ALIGN para comparar seqüências de aminoácidos, uma tabela de peso de resíduo PAM120, uma penalidade de extensão de espaço de 12, e uma penalidade de espaço de 4 podem ser usados.

A identidade percentual entre duas seqüências pode ser determinada usando técnicas similares àquelas descritas acima, com o sem espaços permitidos. Quando calculando a identidade percentual, tipicamente apenas as correspondências exatas são contadas. Como aqui usado, o termo "análogo" no contexto de um análogo não protéico refere-se a uma segunda molécula orgânica ou inorgânica que possui uma função similar ou idêntica de uma primeira molécula orgânica ou inorgânica e é estruturalmente similar à primeira molécula orgânica ou inorgânica.

Como aqui usado, os termos "anticorpo" ou "anticorpos" referem-se a moléculas que contêm um sitio de ligação de antigeno, e.g., moléculas de imunoglobulina e fragmentos imunologicamente ativos de moléculas de imunoglobulina que contêm um sitio de ligação de antigeno. Moléculas de imunoglobulina podem ser de qualquer tipo (e.g., IgG, IgE, IgM, IgD, IgA e IgY), classe (e.g., IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2) ou uma subclasse de molécula de imunoglobulina. Anticorpos incluem, mas não estão limitados a, anticorpos sintéticos, anticorpos monoclonais, anticorpos de domínio simples, anticorpos de cadeia simples, anticorpos produzidos de forma recombinante, anticorpos multiespecíficos (incluindo anticorpos biespecificos) , anticorpos humanos, anticorpos humanizados, anticorpos quiméricos, intracorpos, scFvs (e.g., incluindo monoespecífico e biespecífico, etc.), fragmentos Fab, F(ab') fragmentos, Fvs ligados a dissulfetos (sdFv), (anti- Id) anticorpos anti-idiotípicos, e fragmentos se ligando a epitopos de qualquer de acima. Em um avanço específico, um EphA2-BiTE da invenção é um anticorpo biespecifico de cadeia simples que compreende: (1) um primeiro domínio de ligação que compreende um domínio variável pesado (VH) e um domínio variável leve (VL) de um anticorpo que se liga imunoespecificamente ao antígeno CD3 de célula T; e (2) um segundo domínio de ligação que se liga imunoespecif icamente a EphA2. Em outro avanço específico, o primeiro domínio de ligação e o segundo domínio de ligação de um EphA2-BiTE da invenção compreende, cada um, uma única cadeia Fv (scFv) . O domínio variável pesado e/ou domínio variável leve do primeiro domínio de ligação de um EphA2-BiTE pode ser obtido ou derivado de qualquer tipo de anticorpo que se liga imunoespecificamente a CD3. O domínio variável pesado e/ou domínio variável leve do segundo domínio de ligação de um EphA2-BiTE pode ser obtido ou derivado de qualquer tipo de anticorpo que se liga imunoespecificamente a EphA2. Exemplos não limitantes dos tipos de anticorpos incluem anticorpos sintéticos, anticorpos monoclonais, anticorpos de domínio simples, anticorpos de cadeia simples, anticorpos produzidos de forma recombinante, anticorpos multiespecíficos (incluindo anticorpos biespecíficos), anticorpos humanos, anticorpos humanizados, anticorpos quiméricos, intracorpos, scFvs (e.g., incluindo monoespecífico e biespecifico, etc.), fragmentos Fab, F(ab'), Fvs ligados a dissulfetos (sdFv), (anti-Id) anticorpos anti-idiotípicos, e fragmentos se ligando a epitopos de qualquer de acima. Como aqui usado, o termo "domínio de ligação" refere- se a um domínio compreendendo uma estrutura tridimensional capaz de se ligar imunoespecificamente a um epitopo. Assim, em um avanço, dito domínio pode compreender o domínio VH e/ou VL de uma cadeia de anticorpo, preferencialmente pelo menos o domínio VH. Em outro avanço, o domínio de ligação pode compreender pelo menos uma região determinante de complementaridade (CDR) de uma cadeia de anticorpo reconhecendo os antígenos EphA2 e CD3, respectivamente. A respeito disso, é notado que os domínios dos domínios de ligação presentes no EphA2-BiTE da invenção podem não ser apenas derivados de anticorpos, mas também de outras proteínas de ligação de EphA2 ou CD3, tais receptores de superfície naturalmente ocorrentes ou ligantes.

Como aqui usado, os termos "desimunizado", "desimunização" ou variantes gramaticalmente relacionados desses denotam uma modificação do primeiro e/ou segundo domínio de ligação vis-à-vis um constructo original de tipo selvagem tornando dito constructo de tipo selvagem não imunogênico ou menos imunogênico em humanos. Abordagens de desimunização são bem conhecidas na arte e são descritas em, e.g., International Pub. Nos. WO 00/34317 (em em particular, pp. 1-14); WO 98/52976 (e em particular, Exemplos 1-6 nas pp. 18-38); WO 02/079415 (e em particular, pp. 2-8 e Exemplos 1-10 nas pp. 15-43); e WO 92/10755 (e em particular, pp. 6-9), cada qual é incorporada por referência aqui em sua íntegra. O termo "desimunizado" também está relacionado a constructos, que apresentam propensão a gerar epitopos de células T. De acordo com esta invenção, o termo "propensão reduzida para gerar epitopos de células T" está relacionado à remoção de epitopos de células T levando a ativação especifica de células T. Além do mais, "propensão reduzida para gerar epitopos de células T" refere-se à substituição de aminoácidos contribuindo para a formação de epitopos de células T, i.e., substituição de aminoácidos que são essenciais para a formação de um epitopo de célula T. Em outras palavras, "propensão reduzida para gerar epitopos de células T" está relacionada a imunogenicidade reduzida ou capacidade reduzida de induzir a proliferação de células T dependente de antigeno. O termo epitopo de célula T está relacionado a seqüências peptidicas curtas que podem ser liberadas durante a degradação de peptídeos, polipeptideos ou proteínas em células e subseqüentemente apresentado por moléculas do principal complexo de histocompatibilidade (MHC) para dar início à ativação de células T (ver, e.g., International Pub. No. WO 02/066514, que é incorporada por referência aqui na sua íntegra). Para peptídeos apresentados por MHC classe II, tal ativação de células T pode, então, dar início a uma resposta de anticorpo por estimulação direta de células B para produzir ditos anticorpos. "propensão reduzida para gerar epitopos de células T" e/ou "desimunização" pode ser medido por técnicas conhecidas na arte. Preferencialmente, a desimunização de proteínas pode ser testada in vitro por um teste de proliferação de célula T. Nesse teste, células mononucleares de sangue periférico (PBMCs) de doadores representando >80% de alelos HLA-DR no mundo são rastreadas para proliferação em resposta tanto a peptideos de tipo selvagem ou desimunizados. De maneira ideal, a proliferação de células é apenas detectada com o carregamento das células apresentando antigeno com peptideos de tipo selvagem. Alternativamente, a desimunização pode ser testada expressando-se tetrâmeros HLA-DR representando todos haplótipos. Esses tetrâmeros podem ser testados para ligação de peptideos ou carregados com peptideos substitutos para células apresentado antigeno em testes de proliferação. Para determinar se peptideos desimunizados são apresentados em haplótipos HLA-DR, a ligação de, e.g., peptideos rotulados por fluorescência em PBMCs pode ser medida. Adicionalmente, a desimunização pode ser confirmada determinando-se se anticorpos contra as moléculas desimunizadas foram formados após a administração em pacientes. Preferencialmente, moléculas derivadas de anticorpo são desimunizadas nas regiões ferramenta e a maioria das regiões CDR não é modificada para gerar propensão reduzida a induzis epitopos de células T, de forma que a afinidade de ligação das regiões CDR não seja afetada. Mesmo a eliminação de um epitopo de célula T resulta em imunogenicidade reduzida. Em avanços específicos, a imunogenicidade do domínio de ligação que se liga a um antigeno de interesse (e.g., CD3) é reduzida em pelo menos 10%, pelo menos 15%, pelo menos 20%, pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 35%, pelo menos 40%, pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 99% ou pelo menos 100% comparado a um polipeptideo ou proteína controle não imunizados ou fragmento desses, como medido por teste padrão descrito acima (e.g., um teste de proliferação de célula T) ou conhecido na arte. Em resumo, as abordagens discutidas acima ajudam a reduzir a imunogenicidade dos anticorpos terapêuticos biespecificos de cadeia simples (e.g., EphA2-BiTEs) aqui descritos quando eles são administrados a pacientes tendo uma desordem associada com expressão e/ou atividade aberrante de EphA2 (e.g., câncer, desordens celulares hiperproliferativas não cancerosas e infecções). Por exemplo, o primeiro domínio de ligação que se liga à subunidade épsilon de CD3 é desimunizado. Preferencialmente, o arranjo das regiões variáveis nesse domínio de ligação a CD3 é VH-VL.

Como aqui usado, o termo "derivado" no contexto de um agente protéico (e.g., proteínas, polipeptídeos, peptídeos, e anticorpos) refere-se a um agente protéico que compreende a seqüência de aminoácidos que foi alterada pela introdução de substituições, deleções, e/ou adições de resíduos de aminoácidos. 0 termo "derivado" como aqui usado também se refere a um agente protéico que foi modificado, i.e., pela anexação covalente de qualquer tipo de molécula para o agente protéico. Por exemplo, mas não por meio de limitação, um derivado de um agente protéico pode ser produzido, e.g., por glicosilação, acetilação, pegilação, fosforilação, amidação, derivação por grupos de proteção/bloqueio conhecidos, clivagem proteolitica, ligação a um ligante celular ou outra proteína, etc. Um derivado de um agente protéico pode ser também produzido por modificações químicas usando técnicas conhecidas daqueles especialistas na arte, incluindo, mas não limitado a clivagem química específica, acetilação, formilação, síntese metabólica de tunicamicina, etc. Ainda, um derivado de um agente protéico pode conter um ou mais aminoácidos não clássicos. Um derivado de um agente protéico possui uma função(Ões) idêntica(s) ao agente protéico do qual é derivado.

Como aqui usado, o termo "derivado" no contexto de um derivado não protéico refere-se a uma segunda molécula orgânica ou inorgânica que é formada baseada na estrutura de uma primeira molécula orgânica ou inorgânica. Um derivado de uma molécula orgânica inclui, mas não é limitado a, uma molécula modificada, e.g., pela adição ou deleção de uma hidroxila, grupo metil, etil, carboxil, nitril, ou amina. Uma molécula orgânica pode também, por exemplo, ser esterifiçada, alquilada e/ou fosforilada.

Como aqui usado, o termo "quantidade efetiva" refere- se à quantidade de uma terapia (e.g., um agente terapêutico ou profilático) que é suficiente para reduzir e/ou melhorar a severidade e/ou duração de uma desordem associada com expressão e/ou atividade aberrante de EphA2, ou um sintoma dessa, prevenir o avanço de dita desordem, causar a regressão de dita desordem, prevenir a recorrência, desenvolvimento, ou começo de um ou mais sintomas associados com dita desordem associada com expressão e/ou atividade aberrante de EphA2, ou intensificar ou melhorar o(s) efeito(s) profilático(s) ou terapêutico(s) de outra terapia (e.g., outro agente terapêutico ou profilático).

Como aqui usado, os termos "pessoa idosa", "idoso," ou variações desses referem-se a um ser humano de 65 anos de idade ou mais velho, preferencialmente de 70 anos de idade ou mais velho.

Como aqui usado, o termo "ligante endógeno" ou "ligante natural" refere-se a uma molécula que se liga normalmente a um receptor in vivo em particular. Por exemplo, EphrinA1 é um ligante endógeno de EphA2.

Como aqui usado, o termo "polipeptídeo EphA2" refere- se a EphA2, um análogo, derivado ou um fragmento desse, ou uma proteína de fusão compreendendo EphA2, um análogo, derivado ou um fragmento dessa. O EphA2 polipeptídeo pode ser de qualquer espécie. Em um avanço específico, o polipeptídeo EphA2 é humano. Em certos avanços, o termo "polipeptídeo EphA2" refere-se à forma madura, processada de EphA2. Em outros avanços, o termo "polipeptídeo EphA2" refere-se a uma forma imatura de EphA2. De acordo com este avanço, os anticorpos da invenção se ligam imunoespecificamente à porção da forma imatura de EphA2 que corresponde à forma madura, processada de EphA2. Em um avanço específico, o termo "polipeptídeo EphA2" refere-se ao domínio extracelular de EphA2 ou um fragmento desse. Em certos avanços, no contexto de uma célula, um EphA2-BiTE da invenção se liga ao domínio extracelular (i.e., um epitopo de EphA2 que está exposto na superfície da célula) de um EphA2.

As seqüências de nucleotídeos e/ou aminoácidos de polipeptídeos EphA2 podem ser encontradas na literatura ou bases de dados públicas, ou as seqüências de nucleotídeos e/ou aminoácidos podem ser determinadas usando técnicas de clonagem e seqüenciamento conhecidas daqueles especialistas na arte. Por exemplo, a seqüência de nucleotídeos de EphA2 humano podem ser encontradas na base de dados do GenBank (ver, e.g., números de acesso Accession Nos. BC037166, M59371 e M36395). A seqüência de aminoácidos de EphA2 humano pode ser encontrada na base de dados do GenBank (ver, e.g., números de acesso Accession Nos. AAH37166 e AAA53375). Exemplos adicionais não limitantes de seqüências de aminoácidos de EphA2 são listados na seguinte tabela.

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Como aqui usado, o termo "epitopo" refere-se a sítios ou fragmentos de um polipeptídeo ou proteína tendo atividade antigênica ou imunogênica em um animal, preferencialmente em um mamífero, e mais preferencialmente em um humano. Em avanços específicos, o termo "epitopo" refere-se a um fragmento de um polipeptídeo EphA2 ou um fragmento de um polipeptídeo CD3 tendo atividade antigênica ou imunogênica em um animal, preferencialmente em um mamífero, e mais preferencialmente em um humano. Um epitopo tendo atividade imunogênica é um sítio ou fragmento de um polipeptídeo ou proteína que evoca uma resposta de anticorpo em um animal. Em avanços específicos, um epi.topo tendo atividade imunogênica é um fragmento de um polipeptídeo EphA2 ou um fragmento de um polipeptídeo CD3 que evoca uma resposta de anticorpo em um animal. Um epitopo tendo atividade antigênica é um sítio ou fragmento de um polipeptídeo ou proteína ao qual um anticorpo se liga imunoespecificamente como determinado por qualquer método bem conhecido de um especialista na arte, por exemplo, por testes imuno, tais como testes RIAs ou ELISA. Em avanços específicos, um epitopo tendo atividade antigênica é um fragmento de um polipeptídeo EphA2 ou um fragmento de um polipeptídeo CD3 ao qual um anticorpo se liga imunoespecificamente como determinado por qualquer método bem conhecido na arte, por exemplo, por testes imuno. Epitopos antigênicos não precisam ser necessariamente imunogênicos.

Como aqui usado, o termo "fragmento" no contexto de um agente protéico refere-se a um peptídeo ou polipeptídeo compreendendo uma seqüência de aminoácidos de pelo menos 5 resíduos de aminoácidos contíguos, pelo menos 10 resíduos

de aminoácidos contíguos, pelo menos 15 resíduos de aminoácidos contíguos, pelo menos 20 resíduos de aminoácidos contíguos, pelo menos 30 resíduos de aminoácidos contíguos, pelo menos 40 resíduos de aminoácidos contíguos, pelo menos 50 resíduos de aminoácidos contíguos, pelo menos 60 resíduos de aminoácidos contíguos, pelo menos 70 resíduos de aminoácidos contíguos, pelo menos 80 resíduos de aminoácidos contíguos, pelo menos 90 resíduos de aminoácidos contíguos, pelo menos 100 resíduos de aminoácidos contíguos, pelo menos 125 resíduos de aminoácidos contíguos, pelo menos 150 resíduos de aminoácidos contíguos, pelo menos 175 resíduos de aminoácidos contíguos, pelo menos 200 resíduos de aminoácidos contíguos, ou pele > menos 250 resíduos de

amínoácídos contíguos de outro polipeptídeo ou proteína. Em um avanço específico, o termo "fragmento" no contexto de um agente protéico refere-se a um peptídeo ou polipeptídeo compreendendo uma seqüência de aminoácidos variando de 10 a 15, 10 a 20, 10 a 30, 10 a 40, 10 a 50, 10 a 60, 10 a 70, 10 a 80, 10 a 100, 10 a 125, 10 a 150, 10 a 175, 10 a 200, 10 a 250, ou 10 a 300 resíduos de aminoácidos contíguos de outro polipeptídeo ou proteína.

Em um avanço específico, um fragmento é um fragmento de EphA2, ou um anticorpo que se liga imunoespecificamente a um EphA2. Em outro avanço específico, um fragmento é um fragmento de CD3 ou um anticorpo que se liga imunoespecificamente a CD3. Em um avanço, um fragmento de uma proteína ou polipeptídeo retém pelo menos uma função da proteína ou polipeptídeo. Em outro avanço, um fragmento de um polipeptídeo ou proteína retém pelo menos duas, três, quatro ou cindo funções do polipeptídeo ou proteína. Em um avanço preferencial, um fragmento de um anticorpo que se liga imunoespecificamente a um polipeptídeo EphA2 ou fragmento desse retém a habilidade para se ligar imunoespecificamente a um polipeptídeo EphA2 ou fragmento desse. Em outro avanço preferencial, um fragmento de um anticorpo que se liga imunoespecificamente a um polipeptídeo CD3 ou fragmento desse retém a habilidade de se liga imunoespecif icamente a um polipeptídeo CD3 ou fragmento desse. Preferencialmente, fragmentos de anticorpo são fragmentos que se ligam a epitopos.

Como aqui usado, o termo "proteína de fusão" refere-se a um polipeptídeo ou proteína que compreende a seqüência de aminoácidos de um primeiro polipeptídeo ou proteína ou fragmento, análogo ou derivado desse, e a seqüência de aminoácidos de um polipeptídeo heterólogo ou proteína (i.e., um segundo polipeptídeo ou proteína ou fragmento, análogo ou derivado desse diferente do primeiro polipeptídeo ou proteína ou fragmento, análogo ou derivado desse, ou não normalmente parte do primeiro polipeptídeo ou proteína ou fragmento, análogo ou derivado desse). Em um avanço, uma proteína de fusão compreende um agente terapêutico ou profilático fusionado a uma proteína heteróloga, polipeptídeo ou peptídeo. De acordo com este avanço, a proteína heteróloga, polipeptideo ou peptideo pode ou não ser um tipo diferente de agente terapêutico ou profilático. Por exemplo, duas proteínas, polipeptídeos, ou peptídeos diferentes com atividade imunomoduladora podem ser fusionadas juntas para formar a proteína de fusão. Em um avanço preferencial, proteínas de fusão retêm ou possuem atividade melhorada relativa à atividade do polipeptideo ou proteína original antes de ser fusionada a uma proteína heteróloga, polipeptideo, ou peptideo. Em um avanço específico, uma proteína de fusão compreende um primeiro domínio de ligação que se liga ao antígeno CD3 de célula T e um segundo domínio de ligação que se liga a um antígeno de interesse (e.g., EphA2). De acordo com este avanço, uma proteína de fusão é um EphA2-BiTE.

Como aqui usado, o termo "anticorpo humanizado" refere-se a formas de anticorpos não humanos (e.g., murinos), preferencialmente anticorpos quiméricos, os quais contêm seqüência mínima derivada de imunoglobulina não humana. Para a maior parte, anticorpos humanizados são imunoglobulinas humanas (anticorpo recipiente) nos quais resíduos de região hipervariável ou de determinação de complementaridade (CDR) do recipiente são substituídos por resíduos de região hipervariável ou resíduos CDR de um anticorpo de uma espécie não humana (anticorpo de doador) tal como camundongo, rato, coelho ou primata não humano tendo a especificidade, afinidade, e capacidade desejadas. Em algumas instâncias, um ou mais resíduos de regiões ferramenta (FR) da imunoglobulina humana são substituídos por resíduos não humanos correspondentes ou outros resíduos baseado em modelagem estrutural, e.g., para melhorar a afinidade do anticorpo humanizado. Adicionalmente, anticorpos humanizados podem compreender resíduos que não são encontrados no anticorpo recipiente ou no anticorpo de doador. Essas modificações são feitas para melhor refinar a performance de anticorpo. Em geral, o anticorpo humanizado compreenderá substancialmente todos de pelo menos um, e tipicamente dois, domínios variáveis, nos quais todas das regiões hipervariáveis correspondem àquelas de uma imunoglobulina não humana e todas ou substancialmente todas das FRs são aquelas de uma seqüência de imunoglobulina humana. 0 anticorpo humanizado também compreenderá, opcionalmente, pelo menos um fragmento de uma região constante de imunoglobulina (Fc), tipicamente aquela de uma imunoglobulina humana. Para maiores detalhes em relação a métodos de humanização de embaralhamento de ferramentas, ver Dall'Acqua et al., 2005, Methods 36:43-60, Jones et al. , 1986, Nature 321:522-525; Reichmann et al., 1988, Nature 332:323-329; Presta, 1992, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596; e Queen et al. , U.S. Patent No. 5.585.089, e US Pat. Pub. No. 2005-0048617 Al, cada qual é incorporada por referência aqui em sua íntegra.

Como aqui usado, o termo "hibridiza sob condições estringentes" descreve condições para hibridização e lavagem sob as quais seqüências de nucleotídeos pelo menos 30% (preferencialmente, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98%) idênticas uma à outra tipicamente permanecem hibridizadas uma à outra. Tais condições estringentes são conhecidas daqueles especialistas na arte e podem ser encontradas em Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6.

Geralmente, condições estringentes são selecionadas para serem cerca de 5 a IO0C menores do que o ponto térmico de derretimento (Tm) para a seqüência especifica em uma determinada força iônica e pH. A Tm é a temperatura .(sob força iônica definida, pH, e concentração nucléica) na qual 50% das sondas complementares ao alvo hibridizam à seqüência alvo em equilíbrio (já que as seqüências alvo estão presentes em excesso, na Tm, 50% das sondas são ocupadas no equilíbrio). Condições estringentes serão aquelas nas quais a concentração de sais é de menos do que cerca de 1,0 M de íons de sódio, tipicamente cerca de 0,01 a 1,0 M de concentração de íons de sódio (ou outros sais) em pH 7,0 a 8,3 e a temperatura é pelo menos cerca de 30°C para sondas curtas (por exemplo, 10 a 50 nucleotídeos) e pelo menos cerca de 60°C para sondas longas (por exemplo, maiores do que 50 nucleotídeos). Condições estringentes podem ser também conseguidas com a adição de agentes desestabilizantes, por exemplo, formamida. Para hibridização seletiva ou específica, um sinal positivo é pelo menos duas vezes a base de hibridização, preferencialmente 10 vezes a base de hibridização. Em um exemplo não limitante, condições de hibridização estringentes são hibridização a 6X cloreto de sódio/citrato de sódio (SSC) a cerca de 45°C, seguido por uma ou mais lavagens em 0,1X SSC, 0,2% SDS a cerca de 68°C. Em um exemplo preferido, não limitante, condições de hibridização estringentes são hibridização em 6X SSC a cerca de 45°C, seguido por uma ou mais lavagens em 0,2X SSC, 0,1% SDS a 50-65°C (i.e., uma ou mais lavagens a 50°C, 55°C, 60°C ou 65°C). É entendido que os ácidos nucléicos da invenção não incluem moléculas de ácidos nucléicos que hibridizam. sob essas condições apenas a uma seqüência de nucleotídeos consistindo de apenas nucleotídeos A ou T.

Como aqui usado, o termo "região hipervariável" refere-se aos resíduos de aminoácidos de um anticorpo os quais são responsáveis para ligação de antígeno. A região hipervariável compreende resíduos de aminoácidos de uma "Região de Determinação de Complementaridade" ou "CDR" (i.e. resíduos 24-34 (LI), 50-56 (L2) e 89-97 (L3) no domínio variável de cadeia leve e 31-35 (Hl), 50-65 (H2) e 95-102 (H3) no domínio variável de cadeia pesada; Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)) e/ou aqueles resíduos de um "loop hipervariável" (i.e. resíduos 26-32 (LI), 50-52 (L2) e 91- 96 (L3) no domínio variável de cadeia leve e 26-32 (Hl), 53-55 (H2) e 96-101 (H3) no domínio variável de cadeia pesada; Chothia and Lesk, 1987, J. Mol. Biol. 196:901-917). Resíduos de "Região Ferramenta" ou "FR" são aqueles resíduos de domínio variável que não os resíduos de região hipervariável como aqui definido.

Como aqui usado, o termo "agente imunomodulador" refere-se a um agente que modula um sistema imunológicode um sujeito. Em particular, um agente imunomodulador é um agente que altera a habilidade de um sistema imunológicode um sujeito para responder a um ou mais antígenos estrangeiros. Em um avanço específico, um agente imunomodulador é um agente que muda um aspecto de uma resposta de sistema imunológicode um sujeito. Em um avanço preferencial da invenção, um agente imunomodulador é um agente que inibe ou reduz uma resposta de sistema imunológicode um sujeito (i.e., um agente imunossupressor).

Corne aqui usado, o termo "se liga imunoespecificamente a EphA2" e termos análogos no contexto de anticorpos anti- EphA2, EphA2-BiTEs, e domínios de ligação de EphA2-BiTEs, referem-se a agentes protéicos, incluindo anticorpos (e.g., EphA2-BiTEs os quais são anticorpos biespecíficos de cadeia simples) e os domínios de ligação de EphA2-BiTEs (e.g., scFvs de EphA2-BiTEs os quais são anticorpos biespecíficos de cadeia simples) que se ligam especificamente a um polipeptídeo EphA2, e não se ligam especificamente a polipeptídeos não EphA2. Preferencialmente, anticorpos e domínios de ligação de EphA2-BiTEs que se ligam especificamente a um polipeptídeo EphA2 não reagem com outros antígenos não relacionados. Em avanços específicos, anticorpos anti-EphA2 da invenção se ligam a um polipeptídeo EphA2 com pouca ou nenhuma reatividade cruzada com outros antígenos não relacionados, como medido por teste padrão conhecido na arte, tal como um teste ELISA. Em certos avanços, anticorpos e domínios de ligação de EphA2-BiTEs que se ligam imunoespecificamente a um polipeptídeo EphA2 podem reagir cruzadamente com antígenos relacionados (e.g., outros tipos de receptores de Eph da família A e/ou B de receptores de Eph) . Um peptídeo, polipeptídeo, proteína, anticorpo ou domínio de ligação que se liga imunoespecif icamente a um polipeptídeo EphA2 pode ser ligar a outros peptídeos, polipeptídeos, ou proteínas com menor afinidade como determinado por, e.g., testes imuno ou outros testes conhecidos na arte para detectar a afinidade de ligação. Anticorpos ou domínios de ligação que se ligam imunoespecif icamente a um polipeptídeo EphA2 podem reagir cruzadamente com antígenos relacionados. Preferencialmente, anticorpos ou fragmentos desses que se ligam imunoespecificamente a um polipeptídeo EphA2 podem ser identificados, por exemplo, por testes imuno ou outras técnicas conhecidas daqueles especialistas na arte. Um anticorpo, ou fragmento desse, se liga especificamente a um polipeptídeo EphA2 quando este se liga a um polipeptídeo EphA2 com maior afinidade do que a qualquer antígeno reativo como determinado usando técnicas experimentais, tais como testes radioimuno (RIAs) e testes imunossorbentes ligados a enzimas (ELISAs) . See, e.g., Paul, ed., 1989, Fundamental Immunology, 2nd ed., Raven Press, New York nas páginas 332-336 para uma discussão relacionada a especificidade de anticorpo. Em outro avanço, um anticorpo que se liga a um polipeptídeo EphA2, que é uma proteína de fusão, se liga imunoespecificamente ao fragmento da proteína de fusão que é um polipeptídeo EphA2. Preferencialmente, anticorpos e domínios de ligação de EphA2-BiTEs que se ligam imunoespecificamente a um polipeptídeo EphA2 modulam apenas uma atividade(s) EphA2 e não afetam significativamente outras atividades. Em um avanço específico, anticorpos e domínios de ligação de EphA2-BiTEs que se ligam imunoespecificamente a um polipeptídeo EphA2 são preferencialmente anticorpos, de cadeia simples (e.g., scFvs compreendendo um domínio VH e um domínio VL), que podem ter uma baixa taxa de Koff (e.g., K0ff menor do que 3 χ 10-2S-1).

Como aqui usado, o termo "se liga imunoespecificamente a CD3" e termos análogos referem-se a agentes protéicos que se ligam especificamente a CD3 ou a uma subunidade dessa, e não se ligam especificamente a outros antígenos. Preferencialmente, anticorpos e domínios de ligação de EphA2-BiTEs que se ligam imunoespecif icamente a CD3 não reagem cruzadamente com antígenos não relacionados.

Como aqui usado, o termo "em combinação" no contexto de administração de uma terapia refere-se ao uso de mais de uma terapia. O uso do termo "em combinação" não restringe a ordem na qual as terapias são administradas a um sujeito com uma desordem associada com expressão e/ou atividade aberrante de EphA2. Uma primeira terapia pode ser administrada antes (e.g., 1 minuto, 5 minutos, 15 minutos, 30 minutos, 45 minutos, 1 hora, 2 horas, 4 horas, 6 horas, 12 horas, 24 horas, 48 horas, 72 horas, 96 horas, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas, 6 semanas, 8 semanas, ou 12 semanas antes), concomitantemente ou concorrentemente com, ou subseqüente a (e.g., 1 minuto, 5 minutos, 15 minutos, 30 minutos, 45 minutos, 1 hora, 2 horas, 4 horas, 6 horas, 12 horas, 24 horas, 48 horas, 72 horas, 96 horas, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas, 6 semanas, 8 semanas, ou 12 semanas depois) a administração de uma segunda terapia a um sujeito. que tinha, tem, ou é susceptível a uma desordem associada com expressão e/ou atividade aberrante de EphA2. Qualquer terapia adicional pode ser administrada em qualquer ordem com as outras terapias adicionais. Em certos avanços, EphA2-BiTEs da invenção podem ser administrados em combinação com uma ou mais terapias (e.g., peptídeos que não EphA2-BiTEs atualmente administrados para tratar, prevenir e/ou gerenciar a desordem associada com expressão e/ou atividade aberrante de EphA2, tais como, por exemplo, agentes analgésicos, agentes anestésicos, antibióticos, agentes antivirais, agentes antifúngicos, agentes anti- protozoários, agentes imunomoduladores).

Como aqui usado, os termos "aumentado" ou "sobre- expressado" ou "sobre-expressão" com respeito à expressão de EphA2 refere-se a um aumento na expressão de EphA2 na células de um sujeito com uma desordem associada com expressão e/ou atividade aberrante de EphA2, relativa ao nível de expressão de EphA2 em células normais de dito sujeito, células de um sujeito normal, saudável e/ou uma população de células normais, saudáveis como medido por qualquer método conhecido na arte, incluindo mas não limitado a testes RIAs, ELISA, análise de Western Blot, citometria de fluxo, ou imunohistoquímica usando anticorpos que se ligam imunoespecificamente a EphA2. Em um avanço especifico, o nível de expressão de EphA2 na células de um sujeito com uma desordem associada com expressão e/ou atividade aberrante de EphA2 é aumentado em pelo menos 10%, pelo menos 15%, pelo menos 20%, pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 35%, pelo menos 40%, pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 99% ou pelo menos 1,5 vezes, pelo menos 2 vezes, pelo menos 2,5 vezes, pelo menos 3 vezes, pelo menos 3,5 vezes, pelo menos 4 vezes, pelo menos 4,5 vezes, pelo menos 5 vezes, pelo menos 7 vezes ou pelo menos 10 vezes relativo ao nível de expressão de EphA2 nas células normais de dito sujeito, células de um sujeito normal, saudável e/ou a população de células normais, saudáveis.

Como aqui usado, os termos "criança" ou "infantil" ou variações desses referem-se a um ser humano de menos de 24 meses de idade, preferencialmente de menos de 12 meses, de menos de 6 meses, de menos de 3 meses, de menos de 2 meses, ou de menos de 1 mês de idade. Como aqui usado, os termos "criança nascida prematuramente," ou "criança prematura", ou variações desses, referem-se a um ser humano nascido com menos de 40 semanas de tempo de gestação, preferencialmente menos de 35 semanas de tempo de gestação, quem é de menos de 6 meses de idade, preferencialmente menos de 3 meses de idade, mais preferencialmente menos de 2 meses de idade, e mais preferencialmente menos de 1 mês de idade.

Como aqui usado, o termo "isolado" no contexto de. uma molécula orgânica ou inorgânica (seja uma molécula pequena ou grande) , que não um agente protéico ou um ácido nucléico, refere-se a uma molécula orgânica ou inorgânica substancialmente livre de uma molécula orgânica ou inorgânica diferente. Preferencialmente, uma molécula orgânica ou inorgânica é 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, ou 99% livre de uma segunda molécula orgânica ou inorgânica diferente. Em um avanço preferencial, uma molécula orgânica e/ou inorgânica é isolada.

Como aqui usado, o termo "isolado" no contexto de um agente protéico (e.g., um peptideo, polipeptideo, proteína de fusão, ou anticorpo) refere-se a um agente protéico que é substancialmente livre de material celular ou proteínas contaminantes da fonte de células ou tecidos dos quais é derivado, ou substancialmente livre de precursores químicos ou outros químicos quando quimicamente sintetizado. A frase "substancialmente livre de material celular" inclui preparações de um agente protéico nas quais o agente protéico é separado de componentes celulares das células das quais é isolado ou produzido recombinantemente. Assim, um agente protéico que é substancialmente livre de material celular inclui preparações de um agente protéico tendo menos do que cerca de 30%, 20%, 10%, ou 5% (por peso seco) de proteína heteróloga, polipeptídeo, peptídeo, ou anticorpo (também referidos como uma "proteína contaminante") . Quando o agente protéico é

recombinantemente produzido, ele é também preferencialmente substancialmente livre de meio de cultura, i.e., o meio de cultura representa menos de cerca de 20%, 10%, ou 5% do volume da preparação de agente protéico. Quando o agente protéico é produzido por síntese química, ele é preferencialmente substancialmente livre de precursores químicos ou outros químicos, i.e., é separado de precursores químicos ou outros químicos que são envolvidos na síntese do agente protéico. Dessa maneira, tais preparações de um agente protéico possuem menos do que cerca de 30%, 20%, 10%, 5% (por peso seco) de precursores químicos ou compostos que não o agente protéico de interesse. Em um avanço específico, agentes protéicos aqui descritos são isolados. Em um avanço preferencial, uma molécula EphA2-BiTE da invenção é isolada.

Como aqui usado, o termo "isolado" no contexto de moléculas de ácidos nucléicos refere-se a uma molécula de ácido nucléico que é separada de outras moléculas de ácidos nucléicos que estão presentes na fonte natural da molécula de ácido nucléico. Além do mais, uma molécula de ácido nucléico "isolada", tal como uma molécula de DNAc, é preferencialmente substancialmente livre de outro material celular, ou meio de cultura quando produzida por técnicas recombinantes, ou substancialmente livre de precursores químicos ou outros químicos quando sintetizadas quimicamente. Em um avanço específico, moléculas de ácidos nucléicos são isoladas. Em um avanço preferencial, uma molécula de ácido nucléico codificando uma molécula EphA2- BiTE da invenção é isolada.

Como aqui usado, o termo "baixa tolerância" refere-se a um estado no qual o paciente sofre de efeitos colaterais da(s) terapia(s) de forma que o paciente não se beneficia da terapia e/ou não continua a terapia por causa dos efeitos adversos e/ou o dano dos efeitos colaterais superam o benefício do tratamento.

Como aqui usado, os termos "administrar", "administrando" e "administração" referem-se aos efeitos benéficos que um sujeito recebe de uma terapia, que não resulta em uma cura de uma desordem. Em certos avanços, a um sujeito é administrado uma ou mais terapias para "administrar" uma desordem associada com expressão aberrante (e.g., sobre-expressão) e/ou atividade de EphA2 (e.g., câncer, desordem celular hiperproliferativa não cancerosa ou uma infecção) de forma a prevenir a progressão ou piora da desordem (i.e., segura o progresso da doença). Como aqui usado, o termo "fenótipo celular causador de patologia" refere-se a uma função que uma célula afetada por uma desordem associada com expressão e/ou atividade aberrante de EphA2 que causa ou contribui para o estado patológico de dita desordem. Fenótipos celulares

causadores de patologia incluem, mas não estão limitados a, interação célula/célula diminuída, deposição de matriz extracelular aumentada, migração aumentada, sobrevivência celular e/ou proliferação de uma célula cancerosa aumentada, uma célula hiperproliferativa, ou uma célula infectada (e.g., uma célula epitelial) por um patógeno/agente infeccioso (e.g., bactéria, vírus, fungo ou protozoário). Um ou mais desses Fenótipos celulares causadores de patologia causam ou contribuem para sintomas em um paciente sofrendo de uma desordem associada com expressão e/ou atividade aberrante de EphA2 (e.g., câncer, uma desordem celular hiperproliferativa não cancerosa, ou uma infecção).

Como aqui usado, a frase "farmaceuticamente aceitável" significa aprovado por uma agência reguladora do governo federal ou estadual, ou listada na Farmacopedia Americana (U.S. Pharmacopeia) , Farmacopedia Européia (European Pharmacopeia), ou outras farmacopedias geralmente reconhecidas para uso em animais, e mais particularmente, em humanos.

Como aqui usado, o termo "potencializar" no contexto da administração de uma terapia a um sujeito refere-se a uma melhora na eficácia de uma terapia em sua dose comum ou aprovada.

Como aqui usado, os termos "prevenir", "prevenindo", e "prevenção" no contexto de terapias administradas a um sujeito referem-se à redução ou inibição do desenvolvimento, inicio, dispersão ou recorrência de uma desordem associada com expressão e/ou atividade aberrante de EphA2 ou um sintoma dessa em um sujeito resultando da administração de uma terapia (e.g., um agente terapêutico ou profilático), ou a administração de uma combinação de terapias (e.g., uma combinação de agentes profiláticos ou terapêuticos). Em um avanço especifico, os termos "prevenir", "prevenindo", e "prevenção" no contexto de terapias administradas a um sujeito referem-se ao aumento no tempo de recorrência ou uma diminuição na dispersão ou progressão de uma desordem associada com expressão e/ou atividade aberrante de EphA2.

Como aqui usado, o termo "agente profilático" refere- se a qualquer agente que pode prevenir o desenvolvimento, recorrência, dispersão ou inicio de uma desordem associada com expressão aberrante (e.g., sobre-expressão) e/ou atividade de EphA2 (e.g., câncer, uma desordem celular hiperproliferativa não cancerosa, ou uma infecção), ou um sintoma dessa. Em certos avanços, o termo "agente profilático" refere-se a um EphA2-BiTE. Em certos outros avanços, o termo "agente profilático" refere-se a um agente que não um EphA2-BiTE. Preferencialmente, um agente profilático é um agente que é conhecido por ser útil para ou foi ou é atualmente usado para prevenir ou impedir o inicio, desenvolvimento, recorrência, progressão e/ou dispersão de uma desordem associada com expressão aberrante (e.g., sobre-expressão) e/ou atividade de EphA2 (e.g., câncer, a desordem celular hiperproliferativa não cancerosa, ou uma infecção), ou um ou mais sintomas dessa.

Como aqui usado, uma "quantidade profilaticamente efetiva" refere-se à quantidade de uma terapia {e.g., um agente profilático) que é suficiente para resultar na prevenção do desenvolvimento, recorrência, dispersão ou inicio de uma desordem associada com expressão e/ou atividade aberrante de EphA2 (e.g., câncer, a desordem celular hiperproliferativa não cancerosa ou uma infecção), ou um sintoma dessa. Uma quantidade profilaticamente efetiva pode se referir à quantidade de uma terapia (e.g., um agente profilático) suficiente para prevenir o desenvolvimento, recorrência, dispersão ou inicio de uma desordem associada com expressão e/ou atividade aberrante de EphA2 (e.g., câncer, uma desordem celular hiperproliferativa não cancerosa ou uma infecção), ou um sintoma dessa, por exemplo, naqueles tendo sofrido previamente de tal desordem, ou aqueles que são imunocomprometidos ou imunossuprimidos, ou são geneticamente predispostos a tal desordem. Uma quantidade profilaticamente efetiva pode também referir-se à quantidade de uma terapia (e.g., um agente profilático) que provê um beneficio profilático na prevenção de uma desordem associada com expressão e/ou atividade aberrante de EphA2 (e.g., câncer, a desordem celular hiperproliferativa não cancerosa ou uma infecção), ou um sintoma dessa. Ainda, uma quantidade profilaticamente efetiva com relação a uma terapia (e.g., um agente profilático da invenção) significa quantidade da terapia (e.g., agente profilático) apenas, ou em combinação com uma ou mais outras terapias (e.g., terapias sem EphA2-BiTE atualmente administradas para prevenir a desordem associada com expressão e/ou atividade aberrante de EphA2 (e.g., câncer, a desordem celular hiperproliferativa não cancerosa ou uma infecção), agentes analgésicos, agentes anestésicos, antibióticos, ou agentes imunomoduladores) que provê um beneficio profilático na prevenção de desordem associada com expressão e/ou atividade aberrante de EphA2. Usado em conexão com uma quantidade de um EphA2-BiTE da invenção, o termo pode englobar uma quantidade que melhora a profilaxia geral ou intensifica a eficácia profilática de ou sinergia com outra terapia, (e.g., um agente profilático).

Como aqui usado, um "protocolo" inclui calendários de dosagem e regimes de dosagem.

Como aqui usado, o termo "refratário" refere-se a uma desordem associada com expressão aberrante (e.g., sobre- expressão) e/ou atividade de EphA2 (e.g., câncer, uma desordem celular hiperproliferativa não cancerosa ou uma infecção) , que é não responsiva a uma ou mais terapias (e.g., terapias atualmente disponíveis). Em certos avanços, uma desordem associada com expressão aberrante (e.g., sobre-expressão) e/ou atividade de EphA2 (e.g., câncer, uma desordem celular hiperproliferativa não cancerosa ou uma infecção) é refratária a uma terapia significa que pelo menos alguma porção significativa dos sintomas associados com dita desordem não são eliminados ou amenizados por aquela terapia. A determinação de se tal desordem é refratária pode ser feita tanto in vivo e/ou in vitro por qualquer método conhecido na arte para testar a efetividade de terapia para uma desordem associada com expressão e/ou atividade aberrante de EphA2 (e.g., câncer, uma desordem celular hiperproliferativa não cancerosa ou uma infecção).

Como aqui usado, o termo "efeitos colaterais" engloba efeitos indesejados e adversos de uma terapia (e.g., um agente terapêutico ou profilático). Efeitos adversos são sempre indesejados, mas efeitos indesejados não são necessariamente adversos. Um efeito adverso de uma terapia (e.g., um agente terapêutico ou profilático) pode ser danoso ou desconfortável ou perigoso. Exemplos de efeitos colaterais incluem, mas não estão limitados a, náusea, vômito, anorexia, câimbra abdominal, febre, dor, perda de peso corporal, desidratação, alopecia, dispnéia, insônia, tontura, mucosite, efeitos nervosos e musculares, fatiga, boca ressecada, e perda de apetite, erupções ou inchaços no local de administração, sintomas tipo gripe, tais como febre, calafrios e fatiga, problemas no trato digestivo e reações alérgicas. Efeitos indesejados adicionais experimentados por pacientes são numerosos e conhecidos na arte. Vários são descritos no Physicians' Desk Reference (61st ed., 2007) .

Como aqui usado, o termo "Fv de cadeia simples" ou "scFv" refere-se a fragmentos de anticorpo compreendendo os domínios VH e VL de um anticorpo, caracterizado pelo fato desses domínios estarem presentes em uma única cadeia polipeptídica. Geralmente, o polipeptídeo Fv compreende ainda um polipeptídeo ligante entre os domínios VH e VL, o qual permite o scFv formar a estrutura desejada para ligação a antígeno. Métodos para produzir scFvs são bem conhecidos na arte. Para uma revisão de métodos para produzir scFvs, consulte Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds. Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994) . Em um avanço específico, os EphA2-BiTEs da invenção são compreendidos de scFvs.

Como aqui usado, os termos "sujeito" e "paciente" são usados intercambiavelmente. Como aqui usado, um sujeito é um animal, preferencialmente um mamífero, tal como um mamífero não primata (e.g., vacas, porcos, cavalos, gatos, cachorros, ratos, etc.) e um primata (e.g., macaco (e.g., macaco rhesus, um macaco cinomolgus ou chimpanzé) e humano), e mais preferencialmente um humano. Em um avanço, o sujeito é um mamífero, preferencialmente um humano, com uma desordem associada com expressão e/ou atividade aberrante de EphA2. Tais desordens incluem, mas não estão limitadas a, câncer, desordens celulares hiperproliferativas não cancerosas, e infecções. Em outro avanço, o sujeito é um mamífero, preferencialmente um humano, com risco de desenvolver uma desordem associada com expressão e/ou atividade aberrante de EphA2 (e.g., um mamífero imunocomprometido ou imunossuprimido, ou um mamífero geneticamente predisposto). Em outro avanço, o sujeito não é um mamífero imunocomprometido ou imunossuprimido, preferencialmente um humano. Em outro avanço, o sujeito é um mamífero, preferencialmente um humano, com uma contagem de linfócitos que está abaixo de aproximadamente 500 células/mm3.

Como aqui usado, o termo "sinergístico" refere-se a uma combinação de terapias (e.g., agentes profiláticos ou terapêuticos) que é mais efetiva do que os efeitos aditivos de qualquer duas ou mais terapias simples (e.g., um ou mais agentes profiláticos ou terapêuticos) . Em um aspecto, um efeito sinergístico de uma combinação de terapias (e.g., uma combinação de agentes profiláticos ou terapêuticos) permite o uso de dosagens menores de uma ou mais terapias (e.g., um ou mais agentes profiláticos ou terapêuticos) e/ou gerenciamento menos freqüente de ditas terapias a um sujeito com uma desordem associada com expressão aberrante (e.g., sobre-expressão) e/ou atividade de EphA2 (e.g., câncer, uma desordem celular hiperproliferativa não cancerosa ou uma infecção). Em alguns avanços, a habilidade para utilizar dosagens menores de terapias (e.g., agentes profiláticos ou terapêuticos) e/ou para administrar ditas terapias menos freqüentemente reduz a toxicidade associada com a administração de ditas terapias a um sujeito sem reduzir a eficácia de ditas terapias na prevenção ou tratamento de uma desordem associada com expressão e/ou atividade (e.g., sobre-expressão) de EphA2 aberrante (e.g., câncer, uma desordem celular hiperproliferativa não cancerosa ou uma infecção). Em outro aspecto, um efeito sinergistico pode resultar em eficácia melhorada de terapias (e.g., agentes profiláticos ou terapêuticos) no tratamento, prevenção e/ou gerenciamento de uma desordem associada com expressão aberrante (e.g., sobre-expressão) e/ou atividade de EphA2 (e.g., câncer, uma desordem celular hiperproliferativa não cancerosa ou uma infecção). Em outro aspecto, o efeito sinergistico de uma combinação de terapias (e.g., agentes profiláticos ou terapêuticos) pode evitar ou reduzir efeitos colaterais adversos ou indesejados associados com o uso de qualquer terapia simples.

Como aqui usado, o termo "agente terapêutico" refere- se a qualquer agente que possa ser usado no tratamento e/ou gerenciamento de uma desordem associada com expressão aberrante (e.g., sobre-expressão) e/ou atividade de EphA2 (e.g., câncer, uma desordem celular hiperproliferativa não cancerosa ou uma infecção) ou um ou mais sintomas dessa. Em certos avanços, o termo "agente terapêutico" refere-se a uma molécula de EphA2-BiTE da invenção. Em certos outros avanços, o termo "agente terapêutico" refere-se a um agente que não uma molécula de EphA2-BiTE da invenção. Preferencialmente, um agente terapêutico é um agente que é conhecido por ser útil para, ou foi usado ou está sendo atualmente usado para o tratamento, prevenção e/ou gerenciamento de uma desordem associada com expressão aberrante (e.g., sobre-expressão) e/ou atividade de EphA2 (e.g., câncer, uma desordem celular hiperproliferativa não cancerosa ou uma infecção) ou um ou mais sintomas dessa.

Como aqui usado, uma "quantidade terapeuticamente efetiva" no contexto de câncer refere-se à quantidade de uma terapia sozinha, ou em combinação com outras terapias, que provenha um beneficio terapêutico no tratamento e/ou management de cânceres. Em um aspecto, uma quantidade terapeuticamente efetiva refere-se à quantidade de uma terapia suficiente para destruir, modificar, controlar ou remover tecido canceroso primário, regional ou metastático. Em outro aspecto, uma quantidade terapeuticamente efetiva refere-se à quantidade de uma terapia suficiente para reduzir os sintomas de um câncer. Em outro aspecto, uma quantidade terapeuticamente efetiva refere-se à quantidade de uma terapia suficiente para atrasar ou minimizar a dispersão de câncer. Em um avanço especifico, uma quantidade terapeuticamente efetiva de uma terapia é uma quantidade de uma terapia suficiente para inibir o crescimento ou proliferação de células cancerosas, matar células cancerosas existentes (e.g., causar regressão do câncer), e/ou prevenir a dispersão de células cancerosas para outros tecidos ou áreas (e.g., prevenir metástase) . Em outro avanço especifico, uma quantidade terapêutica de uma terapia é uma quantidade de uma terapia suficiente para inibir o crescimento de um tumor em pelo menos 5%, preferencialmente pelo menos 10%, pelo menos 15%, pelo menos 20%, pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 35%, pelo menos 40%, pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, ou pelo menos 100% como medido por método padrão conhecido na arte, ou como descrito na Seção 6.4.1 abaixo. Usado em conexão com uma quantidade de um EphA2- BiTE da invenção, o termo pode englobar uma quantidade que melhore a terapia geral, reduza ou evite efeitos indesejados, ou intensifique a eficácia terapêutica de ou sinergias com outra terapia. Em um avanço, uma quantidade terapeuticamente efetiva de uma terapia reduz ou evita efeitos indesejados, ou intensifica a eficácia terapêutica de ou sinergias com outra terapia em pelo menos 5%, preferencialmente pelo menos 10%, pelo menos 15%, pelo menos 20%, pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 35%, pelo menos 40%, pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, ou pelo menos 100% relativo a um controle (e.g., um controle negativo, tal como um fosfato salino tamponado) em um teste conhecido na arte ou descrito aqui.

Como aqui usado, uma "quantidade terapeuticamente efetiva" no contexto de uma desordem celular hiperproliferativa não cancerosa refere-se à quantidade de uma terapia sozinha, ou em combinação com outras terapias, que provenha um beneficio terapêutico no tratamento e/ou gerenciamento de dita desordem. Em um aspecto, uma quantidade terapeuticamente efetiva refere-se à quantidade de uma terapia suficiente para destruir, modificar, controlar ou remover células afetadas por uma desordem celular hiperproliferativa não cancerosa. Em outro

aspecto, uma quantidade terapeuticamente efetiva refere-se à quantidade de uma terapia suficiente para reduzir os sintomas de uma desordem celular hiperproliferativa não cancerosa. Em outro aspecto, uma quantidade terapeuticamente efetiva refere-se à quantidade de uma terapia suficiente para atrasar ou minimizar a dispersão de uma desordem celular hiperproliferativa não cancerosa. Em um avanço especifico, a quantidade terapeuticamente efetiva de uma terapia é uma quantidade de urna terapia suficiente para ihibir o crescimento ou proliferação de uma desordem celular hiperproliferativa não cancerosa, matar células hiperproliferativas não cancerosas existentes (e.g., causar a regressão da desordem). Em outro avanço especifico, uma quantidade terapeuticamente efetiva de uma terapia é uma quantidade de uma terapia suficiente para inibir o crescimento das células hiperproliferativas não cancerosas em pelo menos 5%, preferencialmente pelo menos 10%, pelo menos 15%, pelo menos 20%, pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 35%, pelo menos 40%, pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, ou pelo menos 100% como medido por um método padrão conhecido na arte. Usado em conexão com uma quantidade de um EphA2-BiTE da invenção, o termo pode englobar uma quantidade que melhore a terapia geral, reduza ou evite efeitos indesejados, ou intensifique a eficácia terapêutica de ou sinergias com outra terapia. Em um avanço, uma quantidade terapeuticamente efetiva de uma terapia reduz ou evita efeitos indesejados, ou intensifica a eficácia terapêutica de ou sinergias com outra terapia em pelo menos 5%, preferencialmente pelo menos 10%, pelo menos 15%, pelo menos 20%, pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 35%, pelo menos 40%, pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, ou pelo menos 100% relativo a um controle (e.g., um controle negativo, tal como um fosfato salino tamponado) sm um teste conhecido na arte ou descrito aqui.

Como aqui usado, uma "quantidade terapeuticamente efetiva" no contexto de uma infecção refere-se àquela quantidade de uma terapia (e.g., um agente terapêutico) suficiente para reduzir a severidade de uma infecção, reduzir a duração de uma infecção, melhorar um ou mais sintomas de uma infecção, prevenir o avanço da infecção, causar regressão da infecção, ou intensificar ou melhorar o(s) efeito(s) terapêutico(s) de outra terapia. Em certos avanços, uma quantidade terapeuticamente efetiva refere-se à quantidade de um agente terapêutico suficiente para reduzir ou inibir a replicação de um patógeno, inibir ou reduzir a infecção de uma célula por um patógeno, inibir ou reduzir a produção de proteínas patogênicas, inibir ou reduzir a liberação de um patógeno, inibir ou reduzir a dispersão de um patógeno para outros tecidos ou sujeitos, ou melhorar um ou mais sintomas associados com a infecção. Em um avanço, uma quantidade terapeuticamente efetiva de um agente terapêutico reduz a replicação ou dispersão de um patógeno em pelo menos 5%, preferencialmente pelo menos 10%, pelo menos 15%, pelo menos 20%, pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 35%, pelo menos 40%, pelo menos .45%, pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, ou pelo menos 100% relativo a um controle (e.g., um controle negativo, tal como fosfato salino tamponado) em um teste conhecido na arte ou descrito aqui. Testes que podem ser usados para medir a replicação de um patógeno, e.g., um vírus, incluem, mas não estão limitados a, testes de infectividade e transformação como descrito em, e.g., H.M. Temin and H. Rubin. 1958. Characteristics of an assay for Rous sarcoma virus and Rous sarcoma cells in tissue culture. Virology 17: 669-688; and J.W. Hartley and W.P. Rowe. 1966. Production of altered cell foci in tissue culture by defective Moloney sarcoma virus particles. Proc. Natl. Acad. Sei. 55: 780-786, cada qual é aqui incoporado por referência em sua íntegra.

Como aqui usado, o termo "terapia" refere-se a qualquer protocolo, método e/ou agente que possa ser usado no tratamento, prevenção e/ou gerenciamento de uma desordem associada com expressão aberrante (e.g., sobre-expressão) e/ou atividade de EphA2 (e.g., câncer, uma desordem celular hiperproliferativa não cancerosa ou uma infecção). Em certos avanços, os termos "terapias" e "terapia" referem-se a uma terapia biológica, terapia de apoio, e/ou outras terapias úteis no tratamento, prevenção e/ou gerenciamento de uma desordem associada com expressão aberrante (e.g., sobre-expressão) e/ou atividade de EphA2 (e.g., câncer, uma desordem celular hiperproliferativa não cancerosa ou uma infecção), ou um ou mais sintomas dessa conhecidos de um especialista na arte, tal como uma equipe médica.

Como aqui usado, os termos "tratar", "tratamento" e "tratando" no contexto de administrar uma terapia (s) a um sujeito referem-se à redução ou melhora da progressão, severidade, e/ou duração de uma desordem associada com expressão aberrante (e.g., sobre-expressão) e/ou atividade de EphA2 (e.g., câncer, uma desordem celular hiperproliferativa não cancerosa ou uma infecção), e/ou a melhora de um ou mais sintomas dessas resultando da administração de uma ou mais terapias (incluindo, mas não limitado a, a administração de um ou mais agentes profiláticos ou terapêuticos). Em avanços específicos, os termos "tratar", "tratamento" e "tratando" no contexto de administrar uma terapia(s) a um sujeito referem-se à redução ou melhora da progressão, severidade, e/ou duração de uma desordem associada com expressão aberrante (e.g., sobre-expressão) e/ou atividade de EphA2 (e.g., câncer) refere-se a uma redução em células cancerosas em pelo menos 5%, preferencialmente pelo menos 10%, pelo menos 15%, pelo menos 20%, pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 35%, pelo menos 40%, pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, ou pelo menos 100% relativo a um controle (e.g., um controle negativo, tal como fosfato salino tamponado). Em outros avanços, os termos "tratar", "tratamento" e "tratando" no contexto de administrar uma terapia(s) a um sujeito referem-se à redução ou melhora da progressão, severidade, e/ou duração de uma desordem associada com expressão aberrante (e.g., sobre-expressão) e/ou atividade de EphA2 (e.g., câncer) refere-se a nenhuma mudança em número de células cancerosas, uma redução no tempo de hospitalização, uma redução em mortalidade, ou um aumento no tempo de sobrevivência do sujeito com câncer.

DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

FIGS. 1A-1B: Seqüências dos domínios VL e VH do anticorpo EA2 anti-EphA2. As seqüências de nucleotídeos e de aminoácidos do domínio VL (SEQ ID NOS: 1 e 2, respectivamente) são mostradas em (A). As seqüências de nucleotídeos e de aminoácidos do domínio VH (SEQ ID NOS: 9 e 10, respectivamente) são mostradas em (B). As seqüências de nucleotídeo e de aminoácidos das CDRs são indicadas em negrito e estão sublinhadas. O anticorpo EA2 foi previamente descrito em U.S. Pat. Pub. No. US 2005-0152899 A1, e é aqui incorporado por referência em sua integra.

FIGS. 2A-2B: Seqüências dos domínios VL e VH do anticorpo EA5 anti-EphA2. As seqüências de nucleotideos e de aminoácidos do domínio VL (SEQ ID NOS: 17 e 18, respectivamente) são mostradas em (A). As seqüências de nucleotideos e de aminoácidos do domínio VH (SEQ ID NOS: 25 e 26, respectivamente) são mostradas em (B). As seqüências de nucleotideos e de aminoácidos das CDRs são indicadas em negrito e estão sublinhadas. O anticorpo EA5 foi previamente descrito em U.S. Pat. Pub. No. US 2005-0152899 A1, e é aqui incorporado por referência em sua íntegra.

FIGS. 3A-3B: Estrutura do DNAc de EphA2-BiTE. As inserções clonadas no vetor de expressão pEF-DHFR compreenderam, cada, um líder com um sítio Kozak 5' terminal para eficiência de tradução aumentada e uma seqüência sinal secretora (líder de Ig murino de cadeia pesada). O líder é seguido por quatro domínios variáveis de Ig, como listado acima. O peptídeo ligante na junção VL-VH ou VH-VL de anti-EphA2 possui um comprimento de 15 aminoácidos (três repetições do motivo G4S). O peptídeo ligante conectando o EphA2 com a especificidade de ligação a CD3 compreende uma repetição do motivo G4S. Diretamente adjacente ao quarto domínio está uma seqüência de C- terminal hexa-histidina (H6) para propósitos de detecção e purificação. Os sítios de enzimas de restrição indicados foram usados para clonar os constructos EphA2-BiTE no vetor de expressão.

FIGS. 4A-4B: Estrutura do vetor pEF-DHFR usado para expressar os EphA2-BiTEs em células CHO. O vetor pEF-DHFR é um vetor de 5,8 kb com a dihidrofolato redutase murina como marcador de seleção formando uma unidade de transcrição bicistrônica junta com o gene a ser expressado sob o controle do promotor EFla humano. O vetor de expressão eucarionte é um derivado do vetor de expressão pMT2PC.

FIGS. 5A-5B: Perfil de eluição de EphA2-BiTE desimunizado anti-CD3xEA2 (VH/VL) contendo frações de proteína de uma coluna de filtração em gel. Pico 1: agregados, pico 2: dímero, pico 3: monômero.

FIGS. 6A-6B: SDS PAGE e marca anti-His Western blot de frações de EphA2-BiTE desimunizado anti-CD3xEA2 purificado (VH/VL). A fração de monômero (faixa 7) continha essencialmente EphA2 BiTE puro. Nenhum EphA2-BiTE foi detectável no agregado.

FIGS. 7A-7B: Análise de ligação por citômetro de fluxo de anticorpos parentais anti-CD3 reativos a cinomolgus. PBMC de macacos cinomolgus foram usados para detectar ligação a CD3 de anticorpos parentais cCD3-1 e cCD3-2, ambos conjugados com FITC. As células foram analisadas por citometria de fluxo em um FACS-Calibur (Becton Dickinson, Heidelberg). Como mostrado aqui, ambos anticorpos apresentam ligação distinta à fração de células T de PBMC de cinomolgus.

FIG. 8. Evidência para reatividade cruzada de EA2 e EA5 com EphA2 de Rhesus. Fosforilação ativada de anticorpos EA2 e EA5 de EphA2 em células CMMT110/CL, como mostrado no Western blot.

FIG. 9. Análise de ligação por citometria de fluxo de vários constructos anti-EphA2 subsituem BiTE reagindo com CD3 macague. Apenas aqueles constructos subsituem BiTE baseados em anticorpo CD3 macaque cCD3-l apresentatam forte ligação a CD3 e EphA2. Constructos baseados em cCD3-2 apresentam apenas forte ligação a CD3; a ligação EphA2 terminou sendo quase completamente suprimida. Assim, constructos surrogate BiTE baseados em cCD3-l serão continuados para produção, purificação e análise de atividade citotóxica com células T de cinomolgus.

FIG. 10. Análise de ligação por citometria de fluxo de anticorpos parentais anti-EphA2. Foram usadas células A549 expressando EphA2 (linhagem celular de carcinoma pulmonar humano) (A), e células MDA-MB-231 (câncer de mama humano) (B). Células (200.000) foram incubadas com 10 pg/ml do respectivo anticorpo por 30 min em gelo. As células foram subseqüentemte lavadas duas vezes em PBS. A ligação do anticorpo primário foi detectada via um anticorpo Fc-gama murino especifico conjugado a ficoeritrina (Dianova, order no. 115-116-071) diluído 1:100 em 50 μΐ PBS com 2% FCS. Como controle negativo, um anticorpo irrelevante com o mesmo isotipo foi usado (linha fina). Células foram analisadas por citometria de fluxo em um FACS-Calibur (Becton Dickinson, Heidelberg) . Como mostrado na figura, mAb B322 apresentou o sinal de ligação mais forte, seguido por EA2 e EA5. As capacidades de ligação dos três anticorpos diferentes são apresentadas em uma sobreposição de histogramas (4o pico da esquerda = anticorpo B322; 3o pico da esquerda = anticorpo EA2; 2o pico da esquerda = anticorpo EA5; pico mais da esquerda controle).

FIG. 11. Análise imunohistoquímica de ligação a EA2 e EA5 para tecidos normais. (A) Nenhum anticorpo primário. ΞΑ5 demonstrou coloração de discos intercalados em tecido de coração (B), elementos musculares vasculares e estromal de múltiplos órgãos (citoplasma), epitélio de colônico (citoplasma), e miométrio uterino. Seções de tecido humano (C) não foram coradas com EA2 se comparado com um isotipo de anticorpo monoclonal 1A7 controle.

FIG. 12. Ligação biespecífica de EphA2-BiTEs em diferentes linhagens celulares como determinado por citometria de fluxo. Células A549 EphA2 positivas (linhagem celular de carcinoma pulmonar humano) e células MDA-MB-231 (linhagem celular de câncer de mama humano), assim como HP-BALL CD3 positivo (linhagem de células T humana) foram usadas. FIGS. 13Α-13Β. Potência de Iise redirecionada por cinco EphA2-BiTEs em células (A) MDA MB 231 (mama), e (B) A549 (pulmão) . O constructo BiTE desimunizado anti- CD3xEA2(VH/VL) apresentou consistentemente a maior potência em Iise redirecionada de linhagens celulares de câncer de mama e pulmão.

FIGS. 14A-14C. Seqüências do EphA2-BiTE desimunizado anti-CD3(VH-VL) χ EA2 (VH-VL) . Apresentado em (A) está uma representação de um constructo EphA2-BiTE compreendendo um primeiro dominio de ligação que se liga imunoespecificamente a CD3 e um segundo dominio de ligação que se liga imunoespecificamente a EphA2. Também representadas estão seqüências de ligação entre os domínios VKcd3-VLcd3, VLcd3-VHepha2, e VHEphA2-VLEphA2, respectivamente, na direção 5' a 3' (da esquerda para a direita). As seqüências, de aminoácido e de nucleotídeos de cada ligante são representadas por SEQ ID NOS: 27 e 28, 29 e 30, e 31 e 32, respectivamente. Apresentado em (B) está a seqüência de comprimento total da seqüência de nucleotídeos (SEQ ID NO:60) e seqüência de aminoácidos (SEQ ID NO:65) do EphA2- BiTE desimunizado anti-CD3(VH-VL) χ EA2 (VH-VL). Letras em regrito representam os sítios de restrição de enzimas EcoRI e SalIf respectivamente. Letras maiúsculas em itálico indicam a seqüência líder, e letras duplamente sublinhadas representam o códon de parada. As seqüências ligantes e de marca de Histidina estão sublinhadas. FIG. 15. A atividade citotóxica de dois grupos diferentes de EphA2 BiTE desimunizado anti-CD3xEA2(VH/VL) foi comparada com PBMCs (após a depleção de células CD16 positivas) e células T CD8+ estimuladas como células efetoras. As linhagens celulares EphA2 positivas A549 e MDA-MB231 serviram como células alvo. A razão E:T foi de 10:1; e o tempo de incubação foi de 18 horas. (A) Iise de células A549 mediada por EphA2-BiTE com PBMC; (B) Iise de células A549 mediada por EphA2-BiTE com células T CD8+ estimuladas; (C) Iise de células MDA-MB231 mediada por EphA2-BiTE com PBMC e (D) Iise de células MDA-MB231 mediada por células T CD8+ estimuladas.

FIGS. 16A-16B. Variação de atividade citotóxica de EphA2-BiTE com doador de célula efetora. EphA2-BiTE redirecionararn células T de diferentes sujeitos para mediar morte de células tumorais por EphA2+. O teste de citotoxicidade utilizou células alvo SW480 e células T CD3+ isoladas de 4 9 indivíduos humanos doadores. Para a maioria dos doadores humanos, EphA2-BiTE mediou morte de células tumorais em concentrações muito baixas. O EC50 para EphA2- BiTE esteve entre 1 e 110 ng/ml para todos os doadores de células T testados com uma mediana (barra horizontal) de 24 ng/ml. Assim, para a maioria dos doadores humanos de células T, EphA2-BiTE é uma molécula altamente potente com atividade de matar células observada em concentrações numa faixa baixa de ng/ml. FIGS. 17A-17D. Especificidade de ligação de célula alvo - proteína de fusão EphA2 solúvel compete por ligação de anti-CD3xEA2(VH/VL) desimunizado. A especificidade de ligação de alvo de BiTE desimunizado anti-CD3xEA2(VH/VL) foi testada em um teste de competição. Como mostrado na figura, a co-incubação de BiTE desimunizado anti- CD3xEA2 (VH/VL) com um excesso de peso de 10 vezes de proteína de fusão EphA2 Fc solúvel bloqueou completamente a ligação do BiTE com células A54 9 de câncer de pulmão humano. Isso mostra que a ligação de BiTE a células tumorais é mediada especificamente por reconhecimento de EphA2 alvo.

FIG. 18. Especificidade de célula alvo de EphA2-BiTE desimunizado anti-CD3xEA2 (VH/VL): morte de células positivas para antígeno. A atividade citotóxica do BiTE anti-CD3xEA2 desimunizado depende estritamente da expressão de EphA2 nas células alvo B16F10 transfectadas; células B16F10 EphA2 negativas são completamente resistentes a Iise mediada por anti-CD3xEA2 desimunizado.

FIGS. 19A-19C. Atividade citotóxica de especificidade de anti-CD3xEA2 desimunizado (VH./VL) in vitro. (A) Especificidade de lise de célula alvo. PBMC enriquecido com células T CD3+ foram incubadas com células SW4 8 0 EphA2 positivas (símbolos cheios) ou células SK-MEL-28 EphA2 negativas (símbolos abertos) na presença de diluições em série de anti-CD3xEA2 desimunizado (VH./VL) (quadrados) ou bscCDl9xCD3 (triângulos) por 42 horas a 37°C. (B e C) Anticorpos parentais para CD3 (DÍL2K) e EphA2 (EA2) inibem a lise de bscEphA2xCD3 de células tumorais EphA2 positivas. Células T CD3+ foram incubadas em 200 μl de meio de cultura com células SW480 na presença de diluições em série de anti-CD3xEA2 desimunizado (VH./VL) sozinhas (quadrados abertos), ou na presença de 10 μg (triângulo) ou 100 μg (circulo) de DÍL2K no painel B ou EA2 no painel C por 42 horas a 37°C; os resultados são apresentados como a porcentagem de células alvo lisadas. Barras de erro indicam o desvio padrão (SD) de medidas duplicadas. Notar: a magnitude de Iise se aproxima de 100% para cada curva de anti-CD3xEA2 desimunizado (VH./VL).

FIG. 20. Morte de células de carcinoma renal e células de câncer de próstata mediada por EphA2-BiTE. Testes de citotoxicidade demonstraram morte de células tumorais mediada por EphA2-BiTE de células ACHN (A), Caki 2 (B), PC3 (C), e DUl45 (D) com valores de EC50 de 3, 30, 6, e 0,8 ng/ml, respectivamente. Um controle negativo BiTE especifico para CD19 não redirecionou células T para lisar células alvo.

FIGS. 21A-21B. Efeitos de morte de EphA2-BiTE em níveis de EphA2 em células alvo. (A) Testes de citotoxicidade demonstraram morte de células tumorais mediada por EphA2-BiTE de células SW4 80 com valor de EC50 de 6 ng/ml. Um controle negativo BiTE específico para CD19 não redirecionou células T para lisar células alvo. (B) Após o término de um teste de citotoxicidade in vitro, as células alvo SW480 que vivas remanescentes foram medidas para a presença de EphA2 ou EphA2-BiTE. A média geométrica de intensidade de fluorescência de células SW480 vivas se coloriu com um isotipo controle, expressão de EphA2 (coloração B233), ou EphA2-BiTE (BiTE) foi plotado versus a dose de BiTE inserido. EphA2-BiTE redirecionou células T para primeiro matar células alvo com alta expressão de niveis de EphA2. De maneira interessante, não matar todas células alvo foram lisadas apesar de EphA2-BiTE estar ligado às células. Assim, morte de células T mediada por EphA2-BiTE da maioria de células EphA2+ alvo, apesar de um subgrupo de células EphA2+ poder ser resistente.

FIGS. 22A-22D. Caracterização de citotoxicidade de artti-CD3xEA2 desimunizado (VH./VL) in vitro. (A) Cinética de Iise redirecionada. Células T CD3+ foram incubadas com células SW480 na presença de diluições em série de anti- CD3xEA2 desimunizado (VH./VL) por 4 horas (quadrado), 18 horas (triângulo), 24 horas (triângulo invertido), ou 42 horas (losango) a 37°C. Barras de erro indicam o desvio padrão. Valores de EC50 foram estimados a partir das curvas e estão listados. (B) Influência de efetor para razão alvo em Iise redirecionada. Células T CD3+ foram incubadas com células SW480 em uma razão de 20:1 (quadrado escuro), 10:1 (triângulo escuro), 5:1 (triângulo aberto invertido), 1:1 (losango aberto), 1:2 (circulo cinza), ou 1:5 (quadrado cinza) na presença de diluições em série de anti-CD3xEA2 desimunizado (VH./VL) por 42 horas a 37 'C. Barras de erro indicam o desvio padrão. Valores de EC50 foram estimados a partir das curvas e estão listados. (C) Efeitos de sítios de ligação de receptor EphA2 disponíveis no potencial de Iise redirecionada. 0 número estimado de moléculas de EphA2 por célula para linhagem de tumor (linhagens de carcinoma humano HeyA8, SW480, A54 9 e linhagens de melanoma M14 e A375) foi plotado contra os respectivos valores de EC50 da porcentagem de células alvo lisadas de quatro experimentos separados. 0 valor de P e r2 da curva de regressão linear estão listados no gráfico. (D) Efeitos de densidade de superfície de EphA2 em Iise redirecionada. Células T CD3+ foram incubadas com as linhagens celulares HeyA8 (quadrados escuros; 107.000 receptores EphA2 por célula), M14 (círculo cinza; 2.400 receptores EphA2 por célula), e nd SKMEL-28 (quadrado aberto; receptores EphA2 estiver abaixo do limite de detecção) na presença de diluições cm série de anti-CD3xEA2 desimunizado (VH./VL) por 18 horas a 37°C. Barras de erro indicam o desvio padrão. Os valores de EC50 foram estimados a partir das curvas e estão listados.

FIG. 23. Estabilidade de EphA2-BiTE desimunizado anti-CD3xEA2 (VH/VL) em plasma humano. A estabilidade de plasma do BiTE EphA2 específico foi testada sob diferentes condições de incubação seguido por determinação de ED50 de atividade citotóxica em um teste padrão de liberação de cromo 51.

FIGS. 24A-E. Exclusão de epitopo alvo em células não transformadas por anti-CD3xEA2 desimunizado (VH/VL). Microscopia de vídeo foi empregada para visualizar o ataque de células T CD8+ contra células MCFlOA não transformadas na presença de BiTE desimunizado anti-CD3 χ EA2 (VH/VL) e um BiTE controle excluindo não epitopos. (A) MCFlOA não transformadas co-incubadas com células T CD8+ (razão E: T de 1:1) e 100 ng/ml de anti-CD3xEA2 desimunizado (VH/VL). (B) MCFlOA não transformadas co-incubadas com células T CD8+ (razão E:T de 1:1) sem BiTE. (C) MCF10A não transformadas co-incubadas com células T CD8+ (razão E:T de 1:1) e 100 ng/ml de um BiTE controle pan-carcinoma excluindo. não epitopo. (D) Linhagem de células de carcinoma pulmonar A549 co-incubada com células T CD8+ (razão de E:T de 1:1) e 100 ng/ml anti-CD3xEA2 desimunizado (VH/VL). (E) Mesma configuração como em (D). A sobreposição da figura de microscopia de transmissão e de microscopia de fluorescência na presença de iodeto de propídio e para visualisar células lisada (cinza claro).

FIG. 25. Determinação de afinidade de alvo de anti- CD3xEA2 desimunizado(VH/VL) por ressonância de plasmon de superfície. A formação e dissociação de complexos BiTE/EphA2 foi monitorada por ressonância de plasmon de superfície usando um sistema Biacore 3000. A KD é estimada em 45 nM.

FIG. 26. Grupos de teste de controle negativo para anti-tum de anti-CD3xEA2 desimunizado(VH/VL) in vivo em modelo SW480. 5x106 células SW480 sozinhas ("SW480 apenas" e "anti-CD3xEA2 desimunizado") ou misturadas com 2,5 χ 106 células T CD3+ humanas ("PBS", "BiTE não-relevante", e "add. células T i.v., PBS") foram injetadas subcutaneamente em camundongos fêmea NOD/SCID. Um grupo de camundongos recebeu 2,5 x 106 células T CD3+ injetadas intravenosamente ("add. células T, i.v., PBS"). Os camundongos foram tratados diariamente por cinco dias consecutivos com BiTE ("anti-CD3xEA2 desimunizado apenas"), PBS ("PBS"; "add. células T i.v., PBS"), ou um BiTE não relevante. O volume médio de tumor de seis camundongos/grupo é apresentado.

FIG. 27. Tratamento diário com anti-CD3xEA2 desimunizado (VH/VL) por cinco dias consecutivos induziu uma inibição dependente de dose de crescimento de tumor SW480 na presença de células T CD3+ efetoras. **Altamente significativo (p≤0,01); * significativo (p≤0,05) segundo o teste T de Student.

FIG. 28. Nenhum efeito de células T periféricos em efeito antitumoral de anti-CD3xEA2 desimunizado (VH/VL). 0 volume de tumor médio de seis camundongos/grupo é apresentado. ** Altamente significativo (p≤0,01).

FIG. 29. Seqüências de aminoácidos dos domínios VL e VH do anticorpo 233 anti-EphA2. Apresentado em (A) está a seqüência de aminoácidos do domínio VL (SEQ ID NO:33). Apresentado em (B) está a seqüência de aminoácidos do domínio VH (SEQ ID NO: 37) . As seqüências das CDRs estão no quadro. 0 anticorpo 233 foi previamente descrito na U.S. Pat. Pub. No. US 2004-0028685 Al, e é aqui incorporado por referência em sua integra.

FIG. 30. Seqüências de aminoácidos dos domínios VL e VH do anticorpo 3F2 anti-EphA2. Apresentado em (A) está a seqüência de aminoácidos do domínio VL (SEQ ID NO:41) . Apresentado em (B) está a seqüência de aminoácidos do domínio VH (SEQ ID NO:45). As seqüências das CDRs estão no quadro. O anticorpo 3F2 foi previamente descrito na U.S. Pat. Appn. Ser. No. 11/203.251, preenchida em 15 de agosto de 2005, e é aqui incorporado por referência em sua íntegra.

FIG. 31. Mapa linear de sítio de inserção 4H5 scFv no vetor de expressão MD102.

FIGS. 32A-32B. Seqüências do clone humanizado 4H5 VH- VL scFV. Apresentado em (A) está a seqüência de nucleotídeos (SEQ ID NO:67). Apresentado em (B) está a seqüência de aminoácidos (SEQ ID NO:68). As CDRs estão no quadro. O anticorpo 4H5 foi previamente descrito na U.S. Pat. Appn. Ser. No. 2005-0048617 Al, e é aqui incorporado por referência em sua íntegra.

FIG. 33A-33B. Seqüência de nucleotídeos e de aminoácidos do VH VL 2A4 scFv. Apresentado em (A) está a seqüência de nucleotídeos (SEQ ID NO:75). Apresentado em (B) está a seqüência de aminoácidos (SEQ ID NO: 76). As CDRs estão no quadro. FIGS. 34Α-34Β. Seqüência de nucleotideos e de aminoácidos do VH VL 2E7 scFv. (A) representa a seqüência de nucleotideos (SEQ ID NO:83); e (B) representa a seqüência de aminoácidos (SEQ ID NO:84).

FIGS. 35A-35B. Seqüência de nucleotideos e de aminoácidos do VH VL 12E2 scFv. (A) representa a seqüência de nucleotideos (SEQ ID NO:91); e (B) representa a seqüência de aminoácidos (SEQ ID NO:92).

FIG. 36. Titulação por ELISA de sobrenadantes de scFv de variantes combinantes de afinidade otimizada era EphA2 humano imobilizado.

FIG. 37. Alinhamento de seqüência de aminoácidos dos variantes de afinidade otimizada 2A2, 2E7 e 12E2 com o 4H5 scFv humanizado.

FIG. 38. Esta figura representa a seqüência dos primers combinatórios (LI, L2, L3, L4, L6, H6, H7, H8, H9, H10, Hll, H12, e H13) usados na otimização de afinidade de Fab 2G6 (SEQ ID NOS: 99-111, respectivamente).

FIG. 39. Alinhamento de seqüência de aminoácidos das regiões variáveis de B233 murino, 2G6 humanizado e 3F2 mAbs de afinidade otimizada providas. FIG. 40. Anticorpos EphA2 anti-humano se ligam a EphA2 de cinomolgus. Anticorpos anti-humanos purificados murinos (EA2) e humanizados (3F2 e 4H5) ligados a EphA2 humano em células SW480 de carcinoma de cólon e EphA2 de cinomolgus expressadas em células CHO transfectadas. Anticorpos ligados foram detectados por citometria de fluxo usando um anticorpo Alexafluor 488 anti-camundongo ou IgG humana (H+L). Anticorpos foram comparados com um anticorpo controle negativo não ligante (R347) . EA2, 3F2, e 4H5 ligados a EphA2 humano e de cinomolgus.

FIG. 41. Reconhecimento seletivo de célula tumoral por um subgrupo de anticorpos EphA2. Monocamadas de células mamárias epiteliais não transformadas (MCF-10A) e malignas (MDA-MB-231) foram fixadas e rotuladas com os anticorpos indicados (G5, EA5, EA2, 3F2, ou 4H5), e, então, visualizadas usando microscopia de imunofluorescência. Anticorpos excluídos (yes) ou não excluídos (no) dos sítios de contato célula-célula de células MCF-IOA são indicados. Assim, os epitopos EA5 e EA2 são seletivamente excluídos pela arquitetura normal que tipifica células epiteliais não transformadas, mas se torna acessível após transformação maligna.

FIG. 42. Seqüências de aminoácidos dos domínios VL e VH de G5. Apresentado em (A) está a seqüência de aminoácidos do domínio VL (SEQ ID NO: 49). Apresentado em (B) está a seqüência de aminoácidos do domínio VH (SEQ ID NO:53). O anticorpo G5 foi previamente descrito na U.S. Appn. Ser. No. 11/165.023, preenchida em 24 de junho de 2005, e é aqui incorporado por referência em sua integra.

FIG. 43. Comparação de potência citotóxica de quatro BiTEs EphA2 específicos feitos a partir de duas corridas de produção diferentes do anticorpo monoclonal 3F2 humanizado. Testes citotóxicos in vitro compararam a habilidade dos quatro constructos BiTE anti-EphA2 baseados em 3F2 diferentes para mediar a Iise de célula T redirecionada de células MDA-MB-231 EphA2+. A tabela lista valores de potência (i.e., EC50) valores para cada constructo purificado a partir de duas corridas de produção separadas. 0 constructo BiTE desimunizado anti-CD3x3F2 (VH/VL) apresentou consistentemente a maior potência.

FIG. 44. Comparação independente de potência citotíxca de quatro BiTEs anti-EphA2 baseados em 3F2. O teste citotóxico in vitro comparou a habilidade de quatro constructos BiTE anti-EphA2 baseados em 3F2 diferentes para mediar a Iise de célula T redirecionada de células SW480 EphA2+. O constructo BiTE desimunizado anti-CD3x3F2 (VL/VH) apresentou a maior potência.

FIG. 45. Especificidade de ligação de célula alvo de BiTES anti-EphA2 baseados em 4H5 para células expressando EphA2+ e CD3+. A especificidade de ligação a alvo dos vários constructos BiTE baseados em 4H5 foi examinada usando o teste baseado em citometria de fluxo descrito acima. Células de câncer de mama MDA MB 231 EphA2+ e células T humanas HP Ball CD3+ foram usadas como células alvo. 0 BiTE anti-CD3xEA2 desimunizado (VH/VL) foi usado como controle positivo. Como mostrado na figura, cada um dos constructos EphA2-BiTE baseados em 4H5 se ligou a células expressando ambos EphA2 e CD3.

FIG. 46. Especificidade de ligação a célula alvo dos constructos BiTE 12E2, 2E7 e 2A4 humanizados baseados em 4H5 de afinidade amadurecida. A especificidade de ligação a alvo dos vários constructos BiTE baseados em 4H5. foi examinada usando o teste baseado em citometria de fluxo descrito acima. Células de câncer de mama MDA MB 231 EphA2+ e células T humanas HP Ball CD3+ foram usadas como células alvo. Como mostrado na figura, cada um dos constructos EphA2-BiTE baseados em 4H5 se ligou a células expressando ambos EphA2 e CD3.

FIG. 47. Especificidade de ligação a célula alvo de monômeros purificados. Como mostrado na figura, os monômeros purificados dos constructos EphA2-BiTE baseados em 4H5 de afinidade amadurecida se ligou a células de câncer de mama MDA MB 231 EphA2+ e células T humanas HP Ball CD3+ alvo em uma concentração de 5 μg/ml usando o teste baseado em citometria de fluxo como descrito acima.

FIG. 48. Comparação de potência citotóxica de quatro BiTEs EphA2 específicos do anticorpo monoclonal 4H5 humanizado. Testes de citotoxicidade baseados em liberação de Cromo 51 foram efetuados para determinar a Iise de célula alvo redirecionada pelos vários constructos BiTE anti-EphA2 na presença de células T CD8+ humanas estimuladas. A linhagem de célula tumoral MDA-MB-231 EphA2 positiva foi carregada com Cromo 51 e serviu como células alvo. Os vários constructos BiTE anti-EphA2 foram titulados em uma ampla gama de concentrações. A duração do teste foi de 18 horas, e a razão efetor-alvo de 10:1. As concentrações de EphA2-BiTE requeridas para metade da Iise máxima (i.e., EC50) com diferentes grupos de produção foram estimadas usando um modelo de encaixe não linear de quatro parâmetros.

FIG. 49. Esta figura provê uma comparação direta da potência de Iise de célula alvo de células MDA-MB-231 dos vários constructos EphA2 3F2 (A) e (B) baseados em 4H5 como medido por um teste de citotoxicidade baseado em Cromo 51.

FIG. 50. Atividade de citotoxicidade induzida por EphA2-BiTEs baseados em 4H5 de afinidade amadurecida 12E4, 2E7 e 2A4. Esta figura demonstra a potência de Iise de célula alvo dos vários constructos EphA2-BiTE baseados em 4H5 (12E4, 2E7 e 2A4). As células da linha A549 de células tumorais EphA2 positivas foram carregadas com Cromo 51 e serviram como células alvo. Células T CD8+ humanas estimuladas serviram como células efetoras. Os vários constructos BiTE anti-EphA2 foram titulados por uma ampla gama de concentrações. A duração do teste foi de 18 horas, e a razão efetor-alvo de 10:1. As concentrações de EphA2- BiTE requeridas para metade da Iise máxima (i.e., EC50) com diferentes grupos de produção foram estimadas usando um modelo de encaixe não linear de quatro parâmetros.

FIG. 51. Atividade de citotoxicidade induzida por EphA2-BiTEs baseados em 4H5 de afinidade amadurecida 12E4, 2E7 e 2A4. Esta figura demonstra a potência de Iise de célula alvo dos vários constructos EphA2-BiTE baseados em 4H5 (12E4, 2E7 e 2A4) . As células das linhas A549 de células tumorais EphA2 positivas e SW480 foram carregadas com Cromo 51 e serviram como células alvo. Células T .CD8+ humanas estimuladas serviram como células efetoras. Os vários constructos BiTE anti-EphA2 foram titulados por uma ampla gama de concentrações. A duração do teste foi de 18 horas, e a razão efetor-alvo foi de 10:1. As concentrações de EphA2-BiTE requeridas para metade da Iise máxima (i.e., EC50) com diferentes grupos de produção foram estimadas usando um modelo de encaixe não linear de quatro parâmetros.

FIG. 52. Nenhuma ativação de EphA2 por EphA2-BiTEs baseados em 4H5 como medido por fosforilação de EphA2. Esta figura demonstra que nem o constructo BiTE 2A4 nem o constructo BiTE 2E7 induziram a fosforilação de EphA2 em células expressando EphA2.

FIG. 53. Eficácia in vivo de constructos EphA2-BiTE baseados em 4H5 de afinidade amadurecida. A potência in vivo dos constructos 2A4- e 2E7-BÍTE foi avaliada em camundongos NOD/SCID imunodeficientes com um modelo xenotransplantado de carcinoma de cólon humano. A linhagem celular SW480 de carcinoma de cólon humano foi selecionada para o estabelecimento de um modelo xenotransplantado humano, já que células SW480 expressam EphA2. Os resultados do estudo são apresentados aqui.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Como detalhado abaixo, a presente invenção está relacionada a anticorpos biespecificos de cadeia simples compreendendo um primeiro domínio de ligação que se liga imunoespecificamente ao antígeno CD3 de célula T e um segundo domínio de ligação que se liga imunoespecificamente ao receptor EphA2. Tais anticorpos biespecificos de cadeia simples são englobados pelo termo "EphA2-BiTEs." A presente invenção está ainda relacionada a métodos e composições projetados para o tratamento, prevenção e/ou gerenciamento de desordens associadas com expressão e/ou atividade aberrante de EphA2. Tais desordens incluem, mas não estão limitadas a, câncer, desordens celulares hiperproliferativas não cancerosas, e infecções. A invenção está ainda relacionada a vetores compreendendo polinucleotídeos codificando os EphA2-BiTEs da invenção, células hospedeiras transformadas dessa maneira, e seu uso na produção de ditos EphA2-BiTEs. A invenção também provê composições, incluindo composições farmacêuticas, compreendendo qualquer dos EphA2-BiTEs, polinucleotídeos ou vetores então mencionados tanto sozinhos ou em combinação com um ou mais agentes profiláticos ou terapêuticos. Também descritos estão métodos de rastrear para ditos EphA2-BiTEs e kits compreendendo qualquer das composições e reagentes diagnósticos então mencionados.

EphA2-BiTEs

A presente invenção provê engajadores de células T biespecificos (i.eEphA2-BiTEs (em particular, EphA2- BiTEs os quais são anticorpos biespecificos de cadeia simples)) que ligam imunoespecificamente EphA2 e o antigeno CD3 de célula T, e métodos de usar os mesmos para tratar, prevenir e/ou gerenciar desordens associadas com expressão e/ou atividade aberrante de EphA2. Tais desordens incluem, por exemplo, câncer, desordens celulares hiperproliferativas não cancerosas, e infecções. Em um aspecto, os EphA2-BiTEs são mais eficientes em eliminar células que expressam EphA2 de forma aberrante do que anticorpos EphA2 específicos conhecidos na arte. Em um aspecto específico, os EphA2-BiTEs são mais eficientes em eliminar células cancerosas expressando EphA2 (em particular, células cancerosas malignas expressando EphA2) do que anticorpos EphA2 conhecidos na arte. Em outro aspecto, os EphA2-BiTEs são mais eficientes em eliminar células hiperproliferativas não cancerosas expressando EphA2 do que anticorpos EphA2 conhecidos na arte. Ainda em outro aspecto, os EphA2-BiTEs da invenção são mais eficientes em eliminar células infectadas expressando EphA2 (em particular, células infectadas com o vírus respiratório sincitial; "RSV") do que anticorpos EphA2 conhecidos na arte. Em outro aspecto, dosagens menores de EphA2-BiTEs do que anticorpos EphA2 específicos conhecidos na arte são necessárias para tratar, prevenir e/ou gerenciar desordens associadas com expressão e/ou atividade aberrante de EphA2.

Os BiTEs EphA2 específicos da presente invenção compreendem um primeiro domínio de ligação que se liga imunoespecificamente ao antígeno CD3 de célula T e um segundo domínio de ligação que se liga imunoespecificamente a EphA2 (doravante "EphA2-BiTEs" ou "moléculas EphA2- BiTE"). Em um avanço, o primeiro domínio de ligação se liga imunoespecif icamente a CD3. Em um avanço específico, o primeiro domínio de ligação se liga imunoespecificamente a uma ou mais de qualquer subunidade de CD3 (e.g., a subunidade gama, delta, zeta, ou eta). Em um avanço preferencial, o primeiro domínio de ligação se liga imunoespecificamente à subunidade épsilon (ε) deCD3. Em um avanço específico, o primeiro domínio de ligação se liga imunoespecificamente à subunidade épsilon (ε) de CD3 quando dita subunidade é complexada com a subunidade delta de CD3. Em outro avanço, o domínio de ligação que se liga a CD3 é desimunizado. Em outro avanço específico, o segundo domínio de ligação se liga imunoespecificamente ao domínio extracelular de EphA2. Em um avanço preferencial, o segundo domínio de ligação dos EphA2-BiTEs, os quais são usados no tratamento, prevenção e/ou gerenciamento de câncer, se liga imunoespecificamente a epitopos em EphA2 que são seletivamente expostos e/ou aumentados em células cancerosas, mas não em células não cancerosas. Em outro avanço preferencial, o segundo domínio de ligação dos EphA2-BiTEs da invenção se liga imunoespecificamente a epitopos em EphA2 que são seletivamente expostos e/ou aumentados em células hiperproliferativas não cancerosas, mas não em células normais. Em outro avanço preferencial, o segundo domínio de ligação de EphA2-BiTEs se liga imunoespecificamente a epitopos em EphA2 que são seletivamente expostos e/ou aumentados em células infectadas, mas não em células não infectadas.

A presente invenção provê EphA2-BiTEs nos quais o primeiro domínio de ligação compreende um domínio variável pesado (VH) em um domínio variável leve (VL) de um anticorpo que se liga imunoespecif icamente ao antígeno CD3 de célula T e um segundo domínio de ligação que compreende um domínio VH e um domínio VL de um anticorpo que se liga imunoespecificamente a EphA2. Em um avanço específico, os domínios VH e VL do primeiro domínio de ligação são ligados juntos por um ligante de força suficiente que permite que os domínios se dobrem de forma a permitir a ligação ao antígeno CD3 de célula T. Ainda para este avanço, tal ligante pode compreender, por exemplo, a seqüência GEGTSTGS(G2S) 2GGAD (SEQ ID NO.:57). Em outro avanço específico, os domínios VH e VL do segundo domínio de ligação são ligados juntos por um ligante de força suficiente que permite que os domínios se dobrem de forma a permitir a ligação a EphA2. Ainda para este avanço, tal ligante pode compreender, por exemplo, a seqüência (G4S)3 (SEQ ID NO:59). Em outro avanço específico, o primeiro e segundo domínios de ligação são ligados juntos por um ligante de força suficiente que permite que os domínios se dobrem de forma a permitir a ligação ao antígeno CD3 de célula Tea EphA2. Ainda para este avanço, tal ligante pode compreender, por exemplo, a seqüência G4S (SEQ ID NO:58). Em um avanço específico, um EphA2-BiTE da invenção possui a seqüência de aminoácidos de (SEQ ID NO: 65) . Em um avanço específico, um EphA2-BiTE da invenção compreende um anticorpo de domínio único.

De acordo com o avanço o parágrafo precedente, a ligação é covalente. Em um avanço específico, os ligantes da invenção compreendem resíduos de serina e glicina. Os ligantes dos EphA2-BiTEs, e.g., o ligante entre os domínios VH e VL do primeiro domínio de ligação que se liga a CD3, o ligante entre os domínios VH e VL do segundo domínio de ligação que se liga a EphA2, e o ligante entre o primeiro domínio de ligação que se liga a CD3 e o segundo domínio de ligação que se liga a EphA2 pode ser de qualquer comprimento suficiente para que permita que os domínios se dobrem de forma a permitir a ligação aos antígenos CD3 e EphA2, respectivamente. Em certos avanços, os ligantes da invenção compreendem um comprimento de pelo menos 5 resíduos, pelo menos 10 resíduos, pelo menos 15 resíduos, pelo menos 20 resíduos, pelo menos 25 resíduos, pelo menos 30 resíduos ou mais. Em outros avanços, os ligantes da invenção compreendem um comprimento entre 2-4 resíduos, entre 2-4 resíduos, entre 2-6 resíduos, entre 2-8 resíduos, entre 2-10 resíduos, entre 2-12 resíduos, entre 2-14 resíduos, entre 2-16 resíduos, entre 2-18 resíduos, entre 2-20 resíduos, entre 2-22 resíduos, entre 2-24 resíduos, entre 2-26 resíduos, entre 2-28 resíduos, ou entre 2-30 resíduos. Em certos avanços, o primeiro domínio de ligação é 5' ao segundo domínio de ligação. Em outros avanços, o segundo domínio de ligação é 5' ao primeiro domínio de ligação. Em certos avanços, o primeiro e segundo domínios de ligação são anticorpos de cadeia simples. Em um avanço específico, o primeiro e segundo domínios de ligação compreendem Fvs de cadeia simples (scFvs).

Em outro avanço específico, a invenção provê um anticorpo biespecífico de cadeia simples compreendendo (a) um primeiro domínio variável de cadeia pesada e um primeiro first domínio variável de cadeia leve, cada um de um anticorpo que liga imunoespecificamente a cadeia ε de CD3, dito primeiro domínio variável de cadeia pesada ligado covalentemente a dito primeiro domínio variável de cadeia leve por um primeiro ligante de comprimento suficiente (e.g., GEGTSTGS(G2S) 2GGAD (SEQ ID NO.:57)) de forma que dito primeiro domínio variável de cadeia pesada e dito primeiro domínio variável de cadeia leve se dobrem para formar um primeiro domínio de ligação que liga a subunidade ε de CD3; e (b) um segundo domínio variável de cadeia pesada e um segundo domínio variável de cadeia leve de um anticorpo que liga imunoespecificamente um epitopo de EphA2 exposto na superfície da célula, dito segundo domínio variável de cadeia pesada covalentemente ligado a dito segundo domínio variável de cadeia leve por um segundo ligante de comprimento suficiente (e.g., (G4S)3 (SEQ ID NO:59)) de forma que dito segundo domínio variável de cadeia pesada e dito segundo domínio variável de cadeia leve se dobram para formar um segundo domínio de ligação que liga dito epitopo de EphA2, caracterizado pelo fato de dito primeiro domínio de ligação e dito segundo domínio de ligação serem covalentemente ligados por um terceiro ligante de um comprimento (e.g., G4S (SEQ ID NO:58)) de forma que dito primeiro domínio de ligação e dito segundo domínio de ligação se dobram independentemente um do outro.

Em avanços específicos, os EphA2-BiTEs da invenção compreendem qualquer dos seguintes arranjos na direção 5' a 3': (1) VHCD3-VLCD3-VHEphA2-VL-EphA2; (2) VLcd3-VHcd3-VHEphA2-VL EphA2; (3) VLCD3-VHcD3-VLEphA2-VH- EphA2; (4) VHCD3-VLCD3-VLEphA2- VHEphA2; (5) VHEphA2-VLEphA2-VHcd3-VLcd3; (6) VLEphA2-VHEphA2-VHCD3- VLcd3; (7) VLEphA2-VHEphA2-VLCD3-VHCD3; ou (8) VHEphA2-VLEphA2-VLcd3- VH-cd3. Ver, e.g., FIG. 14A para uma representação genérica dos constructos EphA2-BiTE da invenção.

Como é bem conhecido, um fragmento de anticorpo que contém um domínio completo de reconhecimento e ligação a antígeno, em certas circunstâncias pode consistir de um dímero de um domínio variável de cadeia pesada e um domínio variável de cadeia leve (VH e VL) em associação não covalente. Nessa configuração que corresponde àquela encontrada em anticorpos nativos, as três regiões de determinação de complementaridade (CDRs) de cada domínio variável interagem para definir um sítio de ligação a antigeno na superfície do dimero VH-VL. Coletivamente, as seis CDRs conferem especificidade de ligação a antigeno para o anticorpo. Regiões ferramenta (FRs) flanqueando as CDRs possuem uma estrutura terciária que é essencialmente conservada em imunoglobulinas nativas em espécies tão diversas como humanos e camundongos. Essas FRs servem para segurar as CDRs e sua orientação apropriada. Os domínios constantes não são necessários para a função de ligação, mas podem auxiliar em estabilizar a interação VH-VL. Mesmo um domínio variável simples (ou meio de um Fv compreendendo apenas três CDRs específicas para um antigeno) possui a habilidade para reconhecer e ligar antigeno com alta estabilidade conformacional (ver, e.g., Dumoulin et al., 2002, Protein Science 11:500-515). Dessa forma, dito domínio do domínio de ligação de um EphA2-BiTE da invenção podem compreender um par de domínios VH-VL tanto das mesmas ou de diferentes imunoglobulinas. A ordem dos domínios VH e VL na cadeia polipeptídica não é decisiva para a presente invenção; a invenção engloba todos os arranjos possíveis dos domínios variáveis. É importante, contudo, que os domínios VH e VL estejam arranjados de forma que o domínio de ligação a antigeno possa se dobrar corretamente para reconhecer e liga o antigeno. Em um avanço específico, os domínios do domínio de ligação a EphA2 podem ser da mesma ou de uma imunoglobulina diferente.

Dessa maneira, os EphA2-BiTEs da invenção podem compreender qualquer arranjo do domínio variável pesado e domínio variável leve de cada anticorpo (e.g., os domínios VH e VL de um anticorpo que se liga imunoespecificamente a CD3 e os domínios VH e VL de um anticorpo que se liga imunoespecificamente a outro antígeno de interesse (e.g., EphA2)), e cada domínio pode estar localizado na porção N terminal ou C terminal da molécula BiTE. Por exemplo, e não por meio de limitação, uma molécula EphA2-BiTE da invenção pode compreender os seguintes arranjos como destacado na seguinte tabela:

<table>table see original document page 97</column></row><table>

Ditos domínios de ligação discutidos acima são preferencialmente conectados por um ligante flexível, preferencialmente por um polipeptídeo ligante disposto entre ditos domínios, caracterizado pelo fato de que polipeptídeo ligante compreende aminoácidos plurais, hidrofilicos, ligados a peptideo de um comprimento suficiente para sobrepujar a distância entre a extremidade C terminal de um de ditos domínios compreendendo ditos domínios de ligação e a extremidade N terminal de outros ditos domínios compreendendo ditos domínios de ligação quando o polipeptídeo da invenção assume uma conformação adequada para se ligar quando disposto em solução aquosa. Preferencialmente, dito polipeptídeo ligante compreende uma pluralidade de resíduos de glicina, alanina e/ou serina. É ainda preferível que dito polipeptídeo ligante compreenda uma pluralidade de cópias consecutivas de uma seqüência de aminoácidos. Usualmente, o polipeptídeo ligante compreende de 1 a 15 aminoácidos, apesar de que polipeptídeos ligantes de mais de 15 aminoácidos possam também funcionar. Em certos avanços, os ligantes da invenção compreendem um comprimento de pelo menos 5 resíduos, pelo menos 10 resíduos, pelo menos 15 resíduos, pelo menos 20 resíduos, pelo menos 25 resíduos, pelo menos 30 resíduos ou mais. Em outros avanços, os ligantes da invenção compreendem um comprimento entre 2-4 resíduos, entre 2-4 resíduos, entre 2-6 resíduos, entre 2-8 resíduos, entre 2-10 resíduos, entre 2-12 resíduos, entre 2-14 resíduos, entre 2-16 resíduos, entre 2-18 resíduos, entre 2-20 resíduos, entre 2-22 resíduos, entre 2-24 resíduos, entre 2-26 resíduos, entre 2-28 resíduos, ou entre 2-30 resíduos. Exemplos de ligantes que podem ser usados de acordo com os métodos da invenção são encontrados em FIG. 3 (SEQ ID NOS.-.57-59). Em um avanço da invenção, um anticorpo ou ligante que se liga imunoespecif icamente a EphA2 pode compreender uma porção da molécula BiTE. Por exemplo, a VH e/ou VL (preferencialmente um scFV) de um anticorpo que se liga imunoespecif icamente a EphA2 pode ser fusionada a uma porção de ligação a anti-CD3, tal como aquela da molécula descrita acima, criando, assim, um anticorpo biespecifico de cadeia simples que direciona EphA2. Além dos domínios VH e/ou VL de um anticorpo EphA2, outras moléculas que ligam EphA2 podem compreender o EphA2-BiTE, por exemplo receptores ou ligantes (e.g.r uma Efrina).

Em um avanço específico, um EphA2-BiTE da invenção é um anticorpo biespecifico de cadeia simples que compreende um primeiro domínio de ligação que se liga imunoespecificamente CD3, e um segundo domínio de ligação que se liga imunoespecif icamente EphA2. Em um avanço específico, o primeiro domínio de ligação compreende ma versão desimunizada dos domínios VH e VL de um anticorpo que se liga imunoespecif icamente a CD3. Também de acordo com este avanço, o segundo domínio de ligação compreende os domínios VH e VL de EA2. Preferencialmente, o arranjo das regiões variáveis de um EphA2-BiTE da invenção é o seguinte: VH-VL no domínio de ligação CD3, e VH-VL no domínio de ligação EphA2. Também de acordo com este avanço, em um avanço específico, o segundo domínio de ligação compreende o domínio VH e/ou VL de EA2, EA3, EA4, EA5, 3F2, 4H5, 2A4, 2E7, 12E2, Eph099B-102.147, Eph099B- 208.261, Eph099B-210.248, Eph099B-233.152, Eph101.530.241, 233 ou G5.

Métodos de produzir os anticorpos, dos quais os EphA2- BiTES (em particular, os EphA2-BiTEs que são anticorpos biespecificos de cadeia simples) da invenção são derivados, são bem conhecidos na arte e podem ser encontrados, por exemplo, em US 2004-0091486 A1 (May 13, 2004), US 2004- 0028685 A1 (12 de fevereiro de 2004) e WO 99/5440 (e referências ai reveladas), cada qual é aqui incorporada por referência em sua integra. Para informações relacionadas a variantes 2A4, 2E7 e 12E2 de anticorpo agonisticos EphA2 de afinidade otimizada, ver também U.S. Provisional Appn. No.60/751.964, preenchida em 21 de dezembro de 2005, intitulada "Afinity Optimized EphA2 Agonistic Antibodies and Methods of Use Thereof," que é aqui incorporada por referência em sua integra.

EphA2 Anticorpos

Como discutido acima, a invenção engloba engajadores biespecificos de células T (i.e., EphA2-BiTEs (em particular, EphA2-BiTEs que são anticorpos biespecificos de cadeia simples) compreendendo pelo menos dois domínios de ligação específicos para os antígenos EphA2 e CD3, respectivamente. Os EphA2-BiTEs da invenção compreendem um primeiro domínio de ligação que se liga ao antígeno CD3 de célula T e um segundo domínio de ligação que se liga a um polipeptídeo EphA2 ou a um fragmento desse. Em um avanço específico, o domínio de ligação que se liga imunoespecificamente a EphA2 é um Fv de cadeia simples (scFv). Como aqui usado, o termo "Fv de cadeia simples" ou "scFv" refere-se a fragmentos de anticorpo compreendendo os domínios VH e VL de um anticorpo, caracterizado pelo fato de que esses domínios estão presentes em uma única cadeia polipeptídica. Geralmente, o polipeptídeo Fv compreende, ainda, um polipeptídeo ligante entre os domínios VH e VL que permite que o scFv forme a estrutura desejada .para ligação a antígeno. Métodos para produzir scFvs são bem conhecidos na arte. Para uma revisão de métodos para produzir scFvs, ver Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds. Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994) . Em um avanço, o domínio de ligação de um EphA2-BiTE que se liga imunoespecificamente a EphA2 é derivado de um scFV produzido a partir de qualquer anticorpo, incluindo os anticorpos EphA2 aqui descritos.

Em avanços específicos, os anticorpos EphA2 usados para gerar os EphA2-BiTEs incluem moléculas de imunoglobulina e porções imunologicamente ativas de moléculas de imunoglobulina, i.e., moléculas que contêm um domínio de ligação a antígeno que se liga imunoespecificamente a um antígeno EphA2, e.g., uma ou mais regiões de determinação de complementaridade (CDRs) de um anticorpo anti-EphA2. Os anticorpos EphA2 dos quais o domínio de ligação a EphA2 dos EphA2-BiTEs são derivados podem ser de qualquer tipo (e.g., IgG, IgE, IgM, IgD, IgA e IgY), classe (e.g., IgGi, IgG2, IgG3, IgG4, IgAi e IgA2) ou subclasse de molécula de imunoglobulina.

Em outros avanços específicos, os anticorpos EphA2 usados para gerar os EphA2-BiTEs englobados pela invenção são EA2 (ver FIG. 1), EA3, EA4, EA5 (ver FIG. 2), 3F2 (ver FIG. 30), 4H5 (ver FIG. 32), 2A4 (FIG. 33), 2E7 (FIG. 34), 12E2 (FIG. 35), Eph099B-102.147 , Eph099B-208.261, Eph099B- 210.248, Eph099B-233.152, EphlOl.530.241, 233 (FIG. 29) e G5 (FIG. 42). Ver também, e.g., U.S. Patent Pub. Nos. US 2004-0091486 Al (May 13, 2004), US 2004-0028685 Al (Feb. 12, 2004), US 2005-0059592 Al (Mar. 17, 2005), US 2005- 0048617 Al, U.S. Appn. Ser. Nos. 11/165.023, preenchida em 24 de junho de 2005 e 11/203.251, preenchida em 15 de agosto de 2005, cada qual é aqui incorporada por referência em sua íntegra. Anticorpos EA2 produtores de hibridomas (linhagem EA2.31) e EA5 (linhagem EA5.12) da invenção foram depositados com a American Type Culture Collection (ATCC, P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108) em 22 de maio de 2002, e designados os números de acesso PTA-4380 e PTA-4381, respectivamente e incorporados por referência. Eph099B- 102.147, Eph099B-208.261, e Eph099B-210.248 foram depositados com a ATCC em 7 de agosto de 2002 e designados os números de acesso (PTA-4572, PTA-4573, e PTA-4574, respectivamente). Eph099B-233.152 foi depositado com a ATCC em 12 de maio de 2003 e designado o número de acesso PTA-5194, e EphlOl. 530.241 foi depositado com a ATCC em 26 de setembro de 2002 e designado o número de acesso PTA- 4724. Todos os depósitos anteriormente mencionados foram feitos sob as condições do Tratado de Budapeste sobre Reconhecimento Internacional do Depósito de Microorganismos para Propósitos de Procedimentos de Patentes (Budapest Treaty on the International Recognition of the Deposit of Microorganisms for the Purposes of Patent Procedures), e os números de acesso e datas correspondentes aos respectivos anticorpos são aqui incorporados por referência em sua integra.

Em um avanço especifico, os anticorpos usados para criar os EphA2-BiTEs usando os métodos da invenção são versões humanas ou humanizadas dos anticorpos EphA2 mencionados anteriormente. Tais anticorpos EphA2 humanizados e métodos de produção são descritos em, e.g., U.S. Patent Appln. Publn. No. US 2005-0048617 Al, e Dall'Acqua et al., 2005, Methods 36:43-60, cada qual é aqui incorporada por referência em sua integra. Em outro avanço especifico, o anticorpo EphA2 usado para gerar um EphA2- BiTE da invenção é EA2. Ainda em outro avanço especifico, os anticorpos usados para criar um EphA2-BiTE usando os métodos da invenção são versões humanizadas com afinidade otimizada dos anticorpos mencionados anteriormente. De acordo com este avanço, o domínio de ligação que se liga imunoespecificamente a EphA2 de um EphA2-BiTE da invenção é derivado de 2A4, 2E7 e 12E2. Para informações relacionadas com variantes 2A4, 2E7 e 12E2 de anticorpos agonísticos EphA2 de afinidade otimizada, ver também U.S. Provisional Appn. No. 60/751.964, preenchida em 21 de dezembro de 2005, intitulada "Afinity Optimized EphA2 Agonistic Antibodies and Methods of Use Thereof", que é aqui incorporada por referência em sua integra.

As seqüências de alguns anticorpos EphA2 são descritas nas FIGS. 1, 2, 29, 30, 32, 33, 34, 35, 37 ou 39, ou nas publicações descrevendo as seqüências dos anticorpos EphA2 citados acima. Métodos para preparar os anticorpos EphA2 dos quais os EphA2-BiTEs da invenção são gerados estão descritos, por exemplo, em U.S. Patent Pub. Nos. US 2004- 0091486 Al (13 de maio de 2004), US 2004-0028685 Al (12 de fevereiro de 2004), US 2005-0059592' Al (17 de março de 2005), US 2005-0048617 Al, U.S. Appn. Ser. Nos. 11/165.023, preenchida em 24 de junho de 2005 e 11/203.251, preenchida em 15 de agosto de 2005, cada qual é aqui incorporada por referência em sua integra.

A presente invenção provê EphA2-BiTEs derivados de anticorpos que se ligam imunoespecificamente a um polipeptideo EphA2, caracterizado pelo fato de que ditos anticorpos podem compreender uma CDR VH tendo uma seqüência de aminoácidos de qualquer uma das CDRs VH sublinhadas, por exemplo, nas FIGS. 1, 2, 29, 30, 32, 33, 34, 35, 37 ou 39, ou nas publicações descrevendo os anticorpos EphA2 citados acima. Em particular, a invenção provê EphA2-BiTEs compreendendo um domínio de ligação que se liga imunoespecificamente a EphA2, domínio de ligação este compreende (ou alternativamente, consiste de) uma, duas, três, quatro, cinco ou mais CDRs VH tendo uma seqüência de aminoácidos de qualquer das CDRs VH listadas em, por exemplo, FIGS. 1, 2, 29, 30, 32, 33, 34, 35, 37 ou 39, ou nas publicações descrevendo as seqüências dos anticorpos EphA2 citados acima.

A presente invenção provê EphA2-BiTEs derivados de anticorpos que se ligam imunoespecificamente a um polipeptideo EphA2, caracterizado pelo fato de que ditos anticorpos podem compreender uma CDR VL tendo uma seqüência de aminoácidos de qualquer uma das CDRs VL sublinhadas, por exemplo, nas FIGS. 1, 2, 29, 30, 32, 33, 34, 35, 37 ou 39, ou nas publicações descrevendo os anticorpos EphA2 citados acima. Em particular, a invenção provê EphA2-BiTEs compreendendo um domínio de ligação que se liga imunoespecificamente a EphA2, domínio de ligação este compreende (ou alternativamente, consiste de) uma, duas, três, quatro, cinco ou mais CDRs VL tendo uma seqüência de aminoácidos de qualquer das CDRs VL listadas, por exemplo, nas FIGS. 1, 2, 29, 30, 32, 33, 34, 35, 37 ou 39, ou nas publicações descrevendo as seqüências dos anticorpos EphA2 citados acima.

A presente invenção provê EphA2-BiTEs compreendendo um domínio de ligação que se liga imunoespecificamente a EphA2, domínio de ligação este que compreende (ou alternativamente consiste de) uma CDRl VH e uma CDRl VL; uma CDRl VH uma CDR2 VL; uma CDRl VH e uma CDR3 VL; uma CDR2 VH e uma CDRl VL; CDR2 VH e CDR2 VL; uma CDR2 VH e uma CDR3 VL; uma CDR3 VH e uma CDRl VH; uma CDR3 VH e uma CDR2 VL; uma CDR3 VH e uma CDR3 VL; uma VHl CDRl, uma CDR2 VH e uma CDRl VL; uma CDRl VH, uma CDR2 VH e uma CDR2 VL; uma CDRl VH, uma CDR2 VH e uma CDR3 VL; uma CDR2 VH, uma CDR3 VH e uma CDRl VL, uma CDR2 VH, uma CDR3 VH e uma CDR2 VL; uma CDR2 VH, uma CDR2 VH e uma CDR3 VL; uma CDRl VH, uma CDRl VL e uma CDR2 VL; uma CDRl VH, uma CDRl VL e uma CDR3 VL; uma CDR2 VH, uma CDRl VL e uma CDR2 VL; uma CDR2 VH, uma CDRl VL e uma CDR3 VL; uma CDR3 VH, uma CDRl VL e uma CDR2 VL; uma CDR3 VH, uma CDRl VL e uma CDR3 VL; uma CDRl VH, uma CDR2 VH, uma CDR3 VH e uma CDRl VL; uma CDRl VH, uma CDR2 VH, uma CDR3 VH e uma CDR2 VL; uma CDRl VH, uma CDR2 VH, uma CDR3 VH e uma CDR3 VL; uma CDRl VH, uma CDR2 VH, uma CDRl VL e uma CDR2 VL; uma CDRl VH, uma CDR2 VH, uma CDRl VL e uma CDR3 VL; uma CDRl VH, uma CDR3 VH, uma CDRl VL e uma CDR2 VL; uma CDRl VH, uma CDR3 VH, uma CDRl VL e uma CDR3 VL; uma CDR2 VH, uma CDR3 VH, uma CDRl VL e uma CDR2 VL; uma CDR2 VH, uma CDR3 VH, uma CDRl VL e uma CDR3 VL; uma CDR2 VH, uma CDR3 VH, uma CDR2 VL e uma CDR3 VL; uma CDRl VH, uma CDR2 VH, uma CDR3 VH, uma CDRl VL e uma CDR2 VL; uma CDRl VH, uma CDR2 VH, uma CDR3 VH, uma CDRl VL e uma CDR3 VL; uma CDRl VH, uma CDR2 VH, uma CDRl VL, uma CDR2 VL7 e uma CDR3 VL; uma CDRl VH, uma CDR3 VH, uma CDRl VL, uma CDR2 VL, e uma CDR3 VL; uma CDR2 VH, uma CDR3 VH, uma CDRl VL, uma CDR2 VL, e uma CDR3 VL; ou qualquer combinação dessas das CDRs VH e CDRs VL descritas, por exemplo, nas FIGS. 1, 2, 29, 30, 32, 33, 34, 35, 37 ou 39, ou nas publicações descrevendo as seqüências dos anticorpos EphA2 citados acima. Em outros avanços, a invenção provê EphA2-BiTEs compreendendo um domínio de ligação que se liga imunoespecificamente a EphA2, domínio de ligação este que compreende (ou alternativamente consiste de) um domínio VH e um domínio VL de qualquer dos anticorpos EphA2 mencionados anteriormente supra, e por exemplo como descrito nas FIGS. 1, 2, 29, 30, 32, 33, 34, 35 ou 37, ou nas publicações descrevendo as seqüências dos anticorpos EphA2 citados acima. Em um avanço específico, os domínios VH e VL são de anticorpos 2A4, 2E7 e 12E2. Ver, e.g., FIGS. 33, 34, 35 e 37.

Em um avanço específico, a invenção provê EphA2-BiTEs compreendendo um domínio de ligação que se liga imunoespecificamente a EphA2, domínio de ligação este é derivado de anticorpos que se ligam imunoespecificamente a um polipeptídeo EphA2, caracterizado pelo fato de que ditos anticorpos possuem uma taxa de associação constante ou taxa kon (anticorpo (Ab) + antígeno (Ag)-Ab-Ag) de pelo menos 104 M-1S-1, pelo menos 105M-1S-1, pelo menos 1,5 X 105 M-1s-1, pelo menos 2 X 105M-1S-1, pelo menos 2,5 X 105M-1S-1, pelo menos 5 X 105 M-1s-1, pelo menos 106 M-1s-1, pelo menos 5 X 106 M-1s-1, pelo menos 107 M-1S-1, pelo menos 5 X 107 M-1s-1, ou pelo menos 108 M-1s-1, ou em uma faixa de cerca de 105 a 108 M-1s-1, e uma faixa de cerca de 1,5 X 105 M-1s-1 a 1 X 107 M-1s-1, em uma faixa de cerca de 2 X 105 a 1 X 106 M-1s-1, ou em uma faixa de cerca de 4,5 X 105 a 107 M-1s-1. Em certos avanços, um anticorpo que se liga imunoespecificamente a um polipeptídeo EphA2 possui uma kon de pelo menos 104 M-1S-1, pelo menos 2 X 10"5 M-1s-1, pelo menos 2,5 X 10"5 M-1s-1, pelo menos 5 X 10"5 M-1S-1, pelo menos 10"6 M-1S-1, pelo menos 5 X 10"6 M-1S-1, pelo menos 10"7 M-1S-1, pelo menos 5 X 10"7 M-1S-1, ou pelo menos 10"8 M-1S-1 como determinado por um teste de ressonância de plasmon de superfície.

Em outro avanço específico, a invenção provê EphA2- BiTEs compreendendo um domínio de ligação que se liga imunoespecificamente a EphA2, domínio de ligação este é derivado de anticorpos que se ligam imunoespecificamente a um polipeptídeo EphA2, caracterizado pelo fato de que ditos anticorpos possuem uma taxa kQff (anticorpo (Ab) + antígeno (Ag)->Ab-Ag) de menos de 10"3 s"1, menos de 5 X 10"3 s"1, menos de 10"4 s"1, menos de 2 χ 10"4 s"1, menos de 5 X 10~4 s"1, menos de 10"5 s"1, menos de 5 X 10"5 s"1, menos de 10"6 s"1, menos de X 10"6 s"1, menos de 10"7 s"1, menos de 5 X 10"7 s"1, menos de 10"8 s"1, menos de 5 X 10"8 s"1, menos de 10"9 s"1, menos de 5 X 10"9 s"1, ou menos de 10"10 s"1, ou em uma faixa de cerca de 10"3 to 10"10 s"1, em uma faixa de cerca de 10"4 to 10"8 s"1, ou em uma faixa de cerca de 10"5 to 10"8 s"1. Em certos avanços, um anticorpo que se liga imunoespecificamente a um polipeptídeo EphA2 possui uma koff de 10"2 s"1, ou menos de 5 X 10"3 s"1, ou menos de 10"4 s"1, como determinado por um teste de ressonância de plasmon de superfície.

Em outro avanço específico, a invenção provê EphA2- BiTEs compreendendo um domínio de ligação que se liga imunoespecificamente a EphA2, domínio de ligação é derivado de anticorpos que se ligam imunoespecificamente a um polipeptídeo EphA2, caracterizado pelo fato de que ditos anticorpos possuem uma constante de afinidade ou Ka (kon/koff) de pelo menos 102 M-1, pelo menos 5 X 102 M-1, pelo menos 103 M-1, pelo menos 5 X 103 M-1, pelo menos 104 M-1, pelo menos 5 X 104 M-1, pelo menos 105 M-1, pelo menos 5 X 105 M-1, pelo menos 106 M-1, pelo menos 5 X 106 M-1, pelo menos 107 M-1, pelo menos 5 X 107 M-1, pelo menos 108 M-1, pelo menos 5 X 108 M-1, pelo menos 109 M-1, pelo menos 5 X 109 M-1, pelo menos 1010 M-1, pelo menos 5 X 1010 M-1, pelo menos 1011 M-1, pelo menos 5 X 1011 M-1, pelo menos 1012 M-1, pelo menos 5 X 1012 M-1, pelo menos 1013 M-1, pelo menos 5 X 1013 M-1, pelo menos 1014 M-1, pelo menos 5 X 1014 M-1, pelo menos 1015 M-1, ou pelo menos 5 X 1015 M-1, ou em uma faixa de cerca de 102 a 5 X 105 M-1, em uma faixa de cerca de 104 a 1 X 1010 M-1, ou em uma faixa de cerca de 105 a 1 X 108 M-1, como determinado por um teste de ressonância de plasmon de superfície.

Em outro avanço específico, a invenção provê EphA2- BiTEs compreendendo um domín10 de ligação que se liga imunoespecificamente a EphA2, domín10 de ligação este é derivado de anticorpos que se ligam imunoespecificamente a um polipeptídeo EphA2, caracterizado pelo fato de que ditos anticorpos possuem uma constante de dissociação ou Kd (koff/kon) de menos de 10-5 M, menos de 5 X 10-5 M, menos de 10-6 M, menos de 5 X 10-6 M, menos de 10-7 M, menos de 5 X 10-7 M, menos de 10-8 M, menos de 5 X 10-8 M, menos de 10-9 M, menos de 5 X 10-9 M, menos de 10-10 M, menos de 5 X 10-10 M, menos de 10-11 M, menos de 5 X 10-11 M, menos de 10-12 M, menos de 5 X IO-12 Μ, menos de 10-13 M, menos de 5 X 10-13 M, menos de 10-14 M, menos de 5 X 10-14 M, menos de 10-15 M, ou menos de 5 X 10-15 M ou em uma faixa de cerca de 10-2 M to 5 X 10-5 M, em uma faixa de cerca de 10-6 to 10-15 M, ou em uma faixa de cerca de 10-8 to 10-14 M, como determinado por um teste de ressonância de plasmon de superfície.

Em um avanço específico, a invenção provê EphA2-BiTEs que se ligam imunoespecificamente a um polipeptídeo EphA2, 10 caracterizado pelo fato de que ditos EphA2-BiTEs possuem uma taxa de constante de associação ou taxa de kon (anticorpo (Ab) + antígeno (Ag)->Ab-Ag) de pelo menos IO4 M" 1S"1, pelo menos 105 M-1S-1, pelo menos 1,5 X IO5 M-1S"!, pelo menos 2 X IO5 M-1S"1, pelo menos 2,5 X 105 M-1S"1, pelo menos 5 X 105 M-1S-1, pelo menos 106 M-1S-1, pelo menos 5 X 106 M-1S-1, pelo menos 107 M-1S-1, pelo menos 5 X 107 M-1S-1, ou pelo menos 108 M-1S-1, ou em uma faixa de cerca de 105 a 108 M-1S-1, em uma faixa de cerca de 1,5 X 105 M-1S-1 a 1 X 107 M-1S-1, em uma faixa de cerca de 2 X 105 a 1 X 106 M-1S-1, ou em uma faixa de cerca de 4,5 X 105 a 107 M-1S-1. Em certos avanços, um EphA2-BiTE que se liga imunoespecificamente a um polipeptídeo EphA2 possui uma kon de pelo menos 104 M-1s_1, pelo menos 2 X 105 M-1S-1, pelo menos 2,5 X 105 M-1S-1, pelo menos 5 X 105 M-1S-1, pelo menos 106 M-1S-1, pelo menos 5 X 106 M-1s-1, pelo menos 107 M-1S-1, pelo menos 5 X 107 M-1S-1, ou pelo menos 108 M-1S-1 como determinado por um teste de ressonância de plasmon de superfície Em outro avanço especifico, a invenção provê EphA2- BiTEs que se ligam imunoespecificamente a um polipeptideo EphA2, caracterizado pelo fato de que ditos EphA2-BiTEs possuem uma taxa k0ff (anticorpo (Ab) + antigeno (Ag)->Ab-Ag) de menos de 10-3 s-1, menos de 5 X 10-3 s-1, menos de 10-4 s-1, menos de 2 χ 10-4 s-1, menos de 5 X 10-4 s-1, menos de 10-5 s-1, menos de 5 X 10-5 s-1, menos de 10-6 s-1, menos de 5 X 10-s-1, menos de 10-7 s-1, menos de 5 X 10-7 s-1, menos de 10-8 s-1, menos de 5 X 10-8 s-1, menos de 10-9 s-1, menos de 5 X 10-9 s-1, ou menos de 10-10 s-1, ou em uma faixa de cerca de 10-3 a 10 s-1, em uma faixa de cerca de 10-4 a 10-8 s-1, ou em uma faixa de cerca de 10-5 a 10-8 s-1. Em certos avanços, um EphA2- BiTE que se liga imunoespecif icamente a um polipeptideo EphA2 possui uma koff de 10-2 s-1, menos de 5 X 10-3 s-1, ou menos de 10-4 s-1, como determinado por um teste de ressonância de plasmon de superfície.

Em outro avanço específico, a invenção provê EphA2- BiTEs que se 'ligam imunoespecif icamente a um polipeptideo EphA2, caracterizado pelo fato de que ditos EphA2-BiTEs possuem uma constante de afinidade ou Ka (kon/koff) de pelo menos 102 M-1, pelo menos 5 X 102 M-1, pelo menos 103 M-1, pelo menos 5 X 103 M-1, pelo menos 104 M-1, pelo menos 5 X 104 M-1, pelo menos 105 M-1, pelo menos 5 X 105 M-1, pelo menos 106 M-1, pelo menos 5 X 106 M-1, pelo menos 107 M-1, pelo menos 5 X 107 M-1, pelo menos 108 M-1, pelo menos 5 X IO8 M-1, pelo menos 109 M-1, pelo menos 5 X 109 M-1, pelo menos 1010 M-1, pelo menos 5 X 1010 M-1, pelo menos 1011 M-1, pelo menos 5 X 1011 M-1, pelo menos 1012 M-1, pelo menos 5 X 1012 M- 1, pelo menos 10^13 M"1, pelo menos 5 X 10^13 M"1, pelo menos 10^14 M"1, pelo menos 5 X 10^14 M"1, pelo menos 10^15 M"1, ou pelo menos 5 X 10^15 M"1, ou em uma faixa de cerca de 10^2 a 5 X 10^5 M"1, em uma faixa de cerca de 10^4 a 1 X 10^10 M"1, ou em uma faixa de cerca de 10^5 a 1 X 10^8 M"1, como determinado por um teste de ressonância de plasmon de superfície.

Em outro avanço específico, a invenção provê EphA2- BiTEs que se ligam imunoespecificamente a um polipeptídeo EphA2, caracterizado pelo fato de que ditos EphA2-BiTEs possuem uma constante de dissociação ou Kd (k0ff/k0n) de menos de 10"5 M, menos de 5 X 10"5 M, menos de 10"6 M, menos de 5 X 10"6 M, menos de 10"7 M, menos de 5 X 10"7 M, menos de 10"8 M, menos de 5 X 10"8 M, menos de 10"9 M, menos de 5 X 10"9 M, menos de 10"10 M, menos de 5 X 10"10 M, menos de 10"11 M, menos de 5 X 10"11 M, menos de 10"12 M, menos de 5 X 10"12 M, menos de 10"13 M, menos de 5 X 10"13 M, menos de 10"14 M, menos de 5 X 10"14 M, menos de 10"15 M, ou menos de 5 X 10"15 M ou em uma faixa de cerca de 10"2 M a 5 X 10"5 M, em uma faixa de cerca de 10"6 a 10"15 M, ou em uma faixa de cerca de 10"8 a 10"14 M, como determinado por um teste de ressonância de plasmon de superfície.

Anticorpos CD3

Em avanços específicos da invenção, os EphA2-BiTEs

compreendem um domínio de ligação que se liga

imunoespecificamente a antígeno de célula T CD3. Dito

antígeno de célula T CD3 pode ser de qualquer espécie (e.g., humano). Em um avanço especifico, os EphA2-BiTEs da invenção compreendem um domínio de ligação que se liga imunoespecif icamente a uma ou mais subunidades de CD3 (e.g., a subunidade gama, delta, zeta, ou eta). Em um avanço preferencial, o primeiro domínio de ligação se liga imunoespecificamente à subunidade épsilon (ε) de CD3. Em um avanço específico, o primeiro domínio de ligação se liga imunoespecificamente à subunidade épsilon (ε) de CD3 quando dita subunidade é complexada com a subunidade delta de CD3.

Em um avanço específico, o domínio de ligação CD3 de um EphA2-BiTE da invenção é desimunizado. Abordagens de desimunização são bem conhecidas na arte e estão descritas em, e.g., International Pub. Nos. WO 00/34317 (e em particular, pp. 1-14); WO 98/52976 (e em particular,

Exemplos 1-6 nas pp. 18-38); WO 02/079415 (em particular, pp. 2-8 e Exemplos 1-10 nas pp. 15-43); e WO 92/10755 (e em particular, pp. 6-9), cada qual é aqui incorporada por referência em sua íntegra.

Em um avanço específico, o domínio de ligação que se liga imunoespecif icamente a CD3 é um Fv de cadeia simples (scFv). Como aqui usado, o termo "Fv de cadeia simples" ou "scFv" refere-se a fragmentos de anticorpos compreendendo os domínios VH e VL de um anticorpo, caracterizado pelo fato desses domínios estares presentes em uma única cadeia polipeptídica. Geralmente, o polipeptídeo Fv compreende ainda um polipeptídeo ligante entre os domínios VH e VL que permite que scFv forme a estrutura desejada para ligação a antígeno. Métodos para produzir scFvs são bem conhecidos na arte. Para uma revisão de métodos para produzir scFvs ver Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds. Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994) . Em um avanço, os EphA2-BiTEs da invenção são derivados de scFvs produzidos de qualquer dos anticorpos EphA2 descritos abaixo.

Em avanços específicos, os anticorpos CD3 usados para gerar os EphA2-BiTEs incluem moléculas de imunoglobulina e porções imunologicamente ativas de moléculas de imunoglobulina, i.e., moléculas que contêm um domínio de ligação a antígeno que se liga imunoespecif icamente a um antígeno CD3, e.g., uma ou mais regiões de determinação de complementaridade (CDRs) de um anticorpo anti- CD3. Os anticorpos CD3 dos quais o domínio de ligação a CD3 dos EphA2-BiTEs são derivados podem ser de qualquer tipo (e.g., IgG, IgE, IgM, IgD, IgA e IgY), classe (e.g., IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2) ou subclasse de moléculas de imunoglobulina. Tais anticorpos CD3 podem ser de qualquer espécie (e.g., rato, camundongo, homem, etc.).

Em um avanço específico, o domínio de ligação CD3 de um EphA2-BiTE da invenção pode ser produzido como descrito em International Publication No. WO 99/54440 (p. 3 e Figure 8), que é aqui incorporada por referência em sua íntegra. Anticorpos anti-CD3 dos quais dito domínio de ligação é derivado são também descritos, por exemplo, em Kipriyanov, 1998, Int. J. Câncer 77:763-772 (p. 763-765); Dreier et al., 2002, Int. J. Câncer 100: 690-697 (ρ. 691), cada qual é aqui incorporado por referência em sua integra.

A presente invenção provê EphA2-BiTEs derivados de anticorpos que se ligam imunoespecificamente a um polipeptideo CD3, caracterizado pelo fato de que ditos anticorpos podem compreender uma CDR VH tendo um seqüência de aminoácidos de qualquer das CDRs VH descritas, por exemplo, nas publicações descrevendo os anticorpos CD3 ou fragmentos de ligação citados acima. Em particular, a invenção provê EphA2-BiTEs compreendendo um domínio de ligação que se liga imunoespecif icamente a CD3, domínio de ligação este que compreende (ou alternativamente, consiste de) uma, duas, três, quatro, cinco ou mais CDRs VH tendo uma seqüência de aminoácidos de qualquer das CDRs VH descritas, por exemplo, nas publicações descrevendo os anticorpos CD3 ou fragmentos de ligação citados acima.

A presente invenção provê EphA2-BiTEs derivados de anticorpos que se ligam imunoespecif icamente a um polipeptideo CD3, caracterizado pelo fato de que ditos anticorpos podem compreender uma CDR VL tendo uma seqüência de aminoácidos de qualquer das CDRs VL descritas, em por exemplo, as publicações descrevendo os CD3 anticorpos ou fragmentos de ligação citados acima. Em particular, a invenção provê EphA2-BiTEs compreendendo um domínio de ligação que se liga imunoespecif icamente a CD3, domínio de ligação este que compreende (ou alternativamente, consiste de) uma, duas, três, quatro, cinco ou mais CDRs VL tendo uma seqüência de aminoácidos de qualquer das CDRs VL descritas, por exemplo, nas publicações descrevendo os anticorpos CD3 ou fragmentos de ligação citados acima.

A presente invenção provê EphA2-BiTEs compreendendo um domínio de ligação que se liga imunoespecificamente a polipeptídeo CD3, domínio de ligação este que compreende (ou alternativamente consiste de) uma CDRl VH e uma CDRl VL; uma CDRl VH e uma CDR2 VL; uma CDRl VH e uma VL CDR3 ; uma CDR2 VH e uma CDRl VL; CDR2 VH e CDR2 VL; uma CDR2 VH e uma VL CDR3; uma CDR3 VH e uma CDRl VH; uma CDR3 VH e uma CDR2 VL; uma CDR3 VH e uma VL CDR3; uma VHl CDRl, uma CDR2 VH e uma CDRl VL; uma CDRl VH, uma CDR2 VH e uma CDR2 VL; uma CDRl VH, uma CDR2 VH e uma VL CDR3; uma CDR2 VH, uma CDR3 VH e uma CDRl VL, uma CDR2 VH, uma CDR3 VH e uma CDR2 VL; uma CDR2 VH, uma CDR2 VH e uma VL CDR3; uma CDRl VH, uma CDRl VL e uma CDR2 VL; uma CDRl VH, uma CDRl VL e uma VL CDR3; uma CDR2 VH, uma CDRl VL e uma CDR2 VL; uma CDR2 VH, uma CDRl VL e uma VL CDR3; uma CDR3 VH, uma CDRl VL e uma CDR2 VL; uma CDR3 VH, uma CDRl VL e uma VL CDR3; uma CDRl VH, uma CDR2 VH, uma CDR3 VH e uma CDRl VL; uma CDRl VH, uma CDR2 VH, uma CDR3 VH e uma CDR2 VL; uma CDRl VH, uma CDR2 VH, uma CDR3 VH e uma VL CDR3; uma CDRl VH, uma CDR2 VH, uma CDRl VL e uma CDR2 VL; uma CDRl VH, uma CDR2 VH, uma CDRl VL e uma VL CDR3; uma CDRl VH, uma CDR3 VH, uma CDRl VL e uma CDR2 VL; uma CDRl VH, uma CDR3 VH, uma CDRl VL e uma VL CDR3; uma CDR2 VH, uma CDR3 VH, uma CDRl VL e uma CDR2 VL; uma CDR2 VH, uma CDR3 VH, uma CDRl VL e uma VL CDR3; uma CDR2 VH, uma CDR3 VH, uma CDR2 VL e uma VL CDR3; uma CDR1 VH, uma CDR2 VH, uma CDR3 VH, uma CDR1 VL e uma CDR2 VL; uma CDR1 VH, uma CDR2 VH, uma CDR3 VH, uma CDR1 VL e uma VL CDR3; uma CDR1 VH, uma CDR2 VH, uma CDR1 VL, uma CDR2 VL, e uma VL CDR3; uma CDR1 VH, uma CDR3 VH, uma CDR1 VL, uma CDR2 VL, e uma VL CDR3; uma CDR2 VH, uma CDR3 VH, uma CDR1 VL, uma CDR2 VL, e uma CDR3 VL; ou qualquer combinação dessas das CDRs VH e CDRs VL dos CD3 anticorpos descritos acima.

Em outros avanços, a invenção provê EphA2-BiTEs derivados de anticorpos que se ligam imunoespecificamente a CD3, caracterizado pelo fato de que ditos anticorpos podem compreender um domínio VH e um domínio VL de um anticorpo CD3 descrito acima.

Em um avanço específico, a invenção provê EphA2-BiTEs compreendendo um domínio de ligação que se liga imunoespecificamente a um polipeptídeo CD3, domínio de ligação este que é derivado de anticorpos que se ligam imunoespecif icamente a um CD3, caracterizado pelo fato de que ditos anticorpos possuem uma constante de taxa de associação ou taxa kon (anticorpo (Ab) + antígeno (Ag)->Ab- Ag) de pelo menos 104 M-1S-1, pelo menos 105 M-1s-1, pelo menos 1,5 X 105 M-1S-1, pelo menos 2 X 105 M-1S-1, pelo menos 2,5 X 105 M-1S-1, pelo menos 5 X 105 M-1S-1, pelo menos 106 M-1S-1, pelo menos 5 X 106 M-1s-1, pelo menos 107 M-1s-1, pelo menos 5 X 107 M-1s-1, ou pelo menos IO8 M-1s-1, ou em uma faixa de cerca de 105 to 108 M-1s-1, em uma faixa de cerca de 1,5 X 105 M-1s-1 a 1 X 107 M-1s-1, em uma faixa de cerca de 2 X 105 a 1 X 10"6M-1S-1, ou em uma faixa de cerca de 4,5 X 10"5 a 10"7M-1S-1. Em certos avanços, um anticorpo que se liga imunoespecificamente a um polipeptideo EphA2 possui uma kon de pelo menos 10"4 M-1s-1, pelo menos 2 X 10"5 M-1S-1, pelo menos 2,5 X 10"5M-1S-1, pelo menos 5 X 10"5M-1S-1, pelo menos 10"6M-1S- 1, pelo menos 5 X 10"6 M-1s-1, pelo menos 10"7 M-1S-1, pelo menos 5 X 10"7 M-1s-1, ou pelo menos 10"8 M-1s-1 como determinado por um teste de ressonância de plasmon de superfície.

Em outro avanço específico, a invenção provê EphA2- BiTEs compreendendo um domínio de ligação que se liga imunoespecificamente a CD3, domínio de ligação este que é derivado de anticorpos que se ligam imunoespecificamente a um polipeptideo CD3, caracterizado pelo fato de que ditos anticorpos possuem uma taxa k0ff (anticorpo (Ab) + antígeno (Ag)→Ab-Ag) de menos de 10"-3 s-1, menos de 5 X 10"-3 s-1, menos de 10"-4 s"-1, menos de 2 χ 10"-4 s"-1, menos de 5 X 10"-4 s-1, menos de 10"-5 s"-1, menos de 5 X 10"-5 s"-1, menos de 10"-6 s"-1, menos de 5 X 10"-6 s"-1, menos de 10"-7 s"-1, menos de 5 X 10"-7 s"-1, menos de 10"-8 s"-1, menos de 5 X 10"-8 s"-1, menos de 10"-9 s"-1, menos de 5 X 10"-9 s"-1, ou menos de 10"-10 s"-1, ou em uma faixa de cerca de 10"-3 a 10"-10 s"-1, em uma faixa de cerca de 10"-4 a 10"-8 s"-1, ou em uma faixa de cerca de 10"-5 a 10"-8 s"-1. Em certos avanços, um anticorpo que se liga imunoespecif icamente a um polipeptideo EphA2 possui uma koff de 10"-2 s"-1, de menos de 5 X 10"-3 s"-1, ou menos de 10"-4 s"-1, como determinado por um teste de ressonância de plasmon de superfície. Em outro avanço especifico, a invenção provê EphA2- BiTEs compreendendo um domínio de ligação que se liga imunoespecificamente a CD3, domínio de ligação este que é derivado de anticorpos que se ligam imunoespecificamente a um polipeptídeo CD3, caracterizado pelo fato de que ditos anticorpos possuem uma constante de afinidade ou Ka (kon/koff) de pelo menos 102 M-1, pelo menos 5 X 102 M-1, pelo menos 103 M-1, pelo menos 5 X 103 M-1, pelo menos 104 M-1, pelo menos 5 X 104 M-1, pelo menos 105 M-1, pelo menos 5 X 105 M-1, pelo menos 106 M-1, pelo menos 5 X 106 M-1, pelo menos 107 M-1, pelo menos 5 X 107 M-1, pelo menos 108 M-1, pelo menos 5 X 108 M-1, pelo menos 109 M-1, pelo menos 5 X 109 M-1, pelo menos 1010 M-1, pelo menos 5 X 1010 M-1, pelo menos 1011 M-1, pelo menos 5 X 1011 M-1, pelo menos 1012 M-1, pelo menos 5 X 1012 M-1, pelo menos 1013 M-1, pelo menos 5 X 1013 M-1, pelo menos 1014 M-1, pelo menos 5 X 1014 M-1, pelo menos 1015 M-1, ou pelo menos 5 X 1015 M-1, ou em uma faixa de cerca de 102 to 5 X 105 M-1, em uma faixa de cerca de 104 to 1 X 1010 M-1, ou em uma faixa de cerca de 105 to 1 X 108 M-1, como determinado por um teste de ressonância de plasmon de superfície.

Em outro avanço específico, a invenção provê EphA2- BiTEs compreendendo um domínio de ligação que se liga imunoespecificamente a CD3, domínio de ligação este que é derivado de anticorpos que se ligam imunoespecificamente a um polipeptídeo CD3, caracterizado pelo fato de que ditos anticorpos possuem uma constante de dissociação ou Kd (koff/kon) de menos de 10 M, menos de 5 X 10-5 M, menos de 10ˉ6 Μ, menos de 5 X 10ˉ6 Μ, menos de 10ˉ7 Μ, menos de 5 X 10ˉ7 M, menos de 10ˉ8 M, menos de 5 X 10ˉ8 M, menos de 10ˉ9 M, menos de 5 X 10ˉ9 M, menos de 10ˉ10 M, menos de 5 X 10ˉ10 M, menos de 10ˉ11 M, menos de 5 X 10ˉ11 M, menos de 10ˉ12 M, menos de 5 X 10ˉ12 M, menos de 10ˉ13 M, menos de 5 X 10ˉ13 M, menos de 10ˉ14 M, menos de 5 X 10ˉ14 M, menos de 10ˉ15 M, ou menos de 5 X 10ˉ15 M ou em uma faixa de cerca de 10ˉ2 M a 5 X 10ˉ5 M, em uma faixa de cerca de IO"6 a 10ˉ15 M, ou em uma faixa de cerca de 10ˉ8 a 10ˉ14 M, como determinado por um teste de ressonância de plasmon de superfície.

Em um avanço específico, a invenção provê EphA2-BiTEs que se ligam imunoespecificamente a um polipeptídeo CD3, caracterizado pelo fato de que ditos EphA2-BiTEs possuem uma constante de taxa de associação ou taxa kon (anticorpo (Ab) + antígeno (Ag)-Ab-Ag) de pelo menos 104 Mˉ1sˉ1, pelo menos 105 Mˉ1Sˉ1, pelo menos 1,5 X 105 Mˉ1sˉl, pelo menos 2 X 105Mˉ1S"ˉ1, pelo menos 2,5 X 105Mˉ1Sˉ1, pelo menos 5 X 105Mˉ1Sˉ 1, pelo menos 106 Mˉ1Sˉ1, pelo menos 5 X 106 Mˉ1Sˉ1, pelo menos 107 Mˉ1sˉ1, pelo menos 5 X 107 Mˉ1sˉ1, ou pelo menos 108 Mˉ1Sˉ1, ou em uma faixa de cerca de 105 a 108 Mˉ1sˉ1, em uma faixa de cerca de 1,5 X 105 MˉV1 a 1 X 107 Mˉ1Sˉ1, em uma faixa de cerca de 2 X 105 a 1 X 106 Mˉ1sˉ1, ou em uma faixa de cerca de 4,5 X 105 a 107Mˉ1Sˉ1. Em certos avanços, um EphA2-BiTE 25 que se liga imunoespecif icamente a um polipeptídeo EphA2 possui uma kon de pelo menos 104 Mˉ1sˉ1, pelo menos 2 X 105 Mˉ 1Sˉ1, pelo menos 2,5 X 105 M-1s-1, pelo menos 5 X 105 Mˉ1Sˉ1, pelo menos 106 Mˉ1sˉ1, pelo menos 5 X 106 Mˉ1sˉ1, pelo menos 107 Mˉ1sˉ1, pelo menos 5 X 107 Mˉ1Sˉ1, ou pelo menos 108 Mˉ1Sˉ1 como determinado por um teste de ressonância de plasmon de superfície.

Em outro avanço específico, a invenção provê EphA2- BiTEs que se ligam imunoespecificamente a um polipeptídeo CD3, caracterizado pelo fato de que ditos EphA2-BiTEs possuem uma taxa kQff (anticorpo (Ab) + antígeno (Ag)-^Ab-Ag) de menos de 10"3 s-1,menos de 5 X 10" s-, menos e 10"-4S-; menos de 2x10"1 , menos de 5 x 10"-3s"-1,menos de 10"-4s"1 menos de 5 x10"-4 menos de 10"-6s"-1, menos de 5 x 10"-6s-1, menos de 10"-7 s-1, 5x 10"-7 s-1,menos de 10"-8s"-1 menos de 5 x 10"-8 s"-1,menos de 10"-9s"-1,menos de 5 x 10"-9 s"-1 ou menos e 10"-10 ou em uma faixa de cerca de 10"13 a 10"-10 s'1, em uma faixa de cerca de 10"-4a 10"-8s"-1,ou em uma faixa de cerca de IO-5 a IO"8 s"1. Em certos avanços, um EphA2- BiTE que se liga imunoespecif icamente a um polipeptídeo EphA2 possui uma kGff de 10 s"1, menos de 5 X 10"3s"-1ou menos de 10"-4, como determinado por um teste de ressonância de plasmon de superfície.

Em outro avanço específico, a invenção provê EphA2- BiTEs que se ligam imunoespecificamente a um polipeptídeo CD3, caracterizado pelo fato de que ditos EphA2-BiTEs possuem uma constante de afinidade ou Ka (k0n/k0ff) de pelo menos 10"2M-1pelo menos 5 X10"2 M"1, pelo menos 10"3M"1, pelo menos 5 X IO3 M"1, pelo menos IO4 M"1, pelo menos 5 X 10"4M"1, pelo menos 10"5M"1, pelo menos 5 X10"5M"1, pelo menos 10"6M"1, pelo menos 5 X 10"6M'1, pelo menos10"7 M"1, pelo menos 5 X10"7 M"1, pelo menos 10"8M"1, pelo menos 5 X 10"8 M"1, pelo menos IO9 M"1, pelo menos 5 X IO9 M"1, pelo menos IO10 M"1, pelo menos 5 X IO10 M"1, pelo menos IO11 M"1, pelo menos 5 X IO11 M"1, pelo menos IO12 M"1, pelo menos 5 X IO12 M" l, pelo menos IO13 M-1, pelo menos 5 X IO13 M"1, pelo menos IO14 M"1, pelo menos 5 X IO14 M"1, pelo menos IO15 M"1, ou pelo menos 5 X IO15 M"1, ou em uma faixa de cerca de IO2 a 5 X IO5 M-1, em uma faixa de cerca de IO4 a 1 X IO10 M"1, ou em uma faixa de cerca de IO5 a 1 X IO8 M"1, como determinado por um teste de ressonância de plasmon de superfície.

Em outro avanço específico, a invenção provê EphA2- BiTEs que se ligam imunoespecificamente a um polipeptídeo CD3, caracterizado pelo fato de que ditos EphA2-BiTEs possuem uma constante de dissociação ou Kd (k0ff/k0n) de menos de IO"5 M, menos de 5 X IO-5 M, menos de IO"6 M, menos de 5 X IO"6 M, menos de IO"7 M, menos de 5 X 10~7 M, menos de IO"8 M, menos de 5 X IO"8 M7 menos de IO"9 M, menos de 5 X IO"9 M, menos de IO"10 M, menos de 5 X IO"10 M, menos de IO"11 M, menos de 5 X IO"11 M, menos de IO"12 M, menos de 5 X IO"12 M, menos de IO"13 M, menos de 5 X IO"13 M, menos de IO"14 M, menos de 5 X IO"14 M, menos de IO"15 M, ou menos de 5 X IO"15 M ou em uma faixa de cerca de IO"2 M a 5 X IO"5 M, em uma faixa de cerca de IO"6 a IO"15 M, ou em uma faixa de cerca de IO"8 a IO"14 M, como determinado por um teste de ressonância de plasmon de superfície.

Conjugados EphA2-BiTE A presente invenção está relacionada ainda a engajadores biespecificos de células T (i.e., EphA2-BiTEs (em particular, EphA2-BiTEs que são anticorpos biespecificos de cadeia simples) compreendendo pelo menos um domínio adicional, dito domínio estando ligado por ligações covalentes ou não covalentes. 0 domínio adicional pode ser de uma especificidade ou função pré-definida. Dessa maneira, a presente invenção está relacionada ao uso dos EphA2-BiTEs da invenção fusionados de forma recombinante ou quimicamente conjugados (incluindo ambas conjugações covalentes e não covalentes) a um polipeptídeo heterólogo (ou fragmento desse, preferencialmente a um polipeptídeo de pelo menos 10, pelo menos 20, pelo menos 30, pelo menos 40, pelo menos 50, pelo menos 60, pelo menos 70, pelo menos 80, pelo menos 90 ou pelo menos 100 aminoácidos) para gerar proteínas de fusão. A fusão não precisa necessariamente ser direta, mas pode ocorrer através de seqüências ligantes. Por exemplo, anticorpos podem ser usados para direcionar polipeptideos heterólogos para tipos de células em particular, tanto in vitro ou in vivo, fusionando ou conjugando os anticorpos para anticorpos específicos para receptores de superfície de célula em particular. Ver e.g., International Publication WO 93/21232; EP 439,095; Naramura et al., 1994, Immunol. Lett. 39:91-99; U.S. Patent 5.474.981; Gillies et al., 1992, PNAS 89:1428-1432; e Fell et al., 1991, J. Immunol. 146:2446-2452, que são aqui incorporados por referência em sua íntegra. A presente invenção inclui ainda composições compreendendo polipeptideos heterólogos fusionados ou conjugados a fragmentos de EphA2-BiTEs. Por exemplo, os polipeptideos heterólogos podem ser fusionados ou conjugados a um fragmento Fab, fragmento Fd, fragmento Fv, fragmento F(ab)2, ou fragmento desses. Métodos para fusionar ou conjugar polipeptideos a fragmentos de anticorpos são conhecidos na arte. Ver, e.g., U.S. Patent Nos. 5.336.603, 5.622.929, 5.359.046, 5.349.053, 5.447.851, e 5.112.946; EP 307.434; EP 367.166; International Publication Nos. WO 96/04388 e WO 91/06570; Ashkenazi et al., 1991, PNAS 88: 10535-10539; Zheng et al. , 1995, J. Immunol. 154:5590-5600; e Vil et al. , 1992, PNAS 89:11337- 11341 (ditas referências incorporadas por referência em sua integra) .

Proteínas de fusão adicionais, e.g., de qualquer dos EphA2-BiTEs mencionados anteriormente, podem ser gerados através de técnicas de embaralhamento de genes, embaralhamento de motivos, embaralhamento de éxons, e/ou embaralhamento de códons (coletivamente referidos como "embaralhamento de DNA") . Embaralhamento de DNA pode ser empregado para alterar as atividades de anticorpos da invenção (e.g., anticorpos com maiores afinidades ou menores taxas de dissociação). Ver, em geral, U.S. Patent Nos. 5.605.793; 5.811.238; 5.830.721; 5.834.252; e 5.837.458, e Patten et al., 1997, Curr. Opinion Biotechnol. 8:724-33; Harayama, 1998, Trends Biotechnol. 16:76; Hansson, et al., 1999, J. Mol. Biol. 287:265; e Lorenzo and Blasco, 1998, BioTechniques 24:308 (cada dessas patentes e publicações são aqui incorporadas por referência em sua integra). EphA2-BiTEs, ou os EphA2-BiTEs codificados, podem ser alterados sendo sujeitos a mutagênese randômica por PCR de error-prone, inserção randômica de nucleotideo ou outros métodos antes de recombinação. Um ou mais fragmentos de um polinucleotideo codificando um anticorpo ou fragmento de anticorpo, fragmentos estes que se ligam imunoespecificamente a EphA2 podem ser recombinados com um ou mais componentes, motivos, seções, partes, domínios, fragmentos, etc. de uma ou mais moléculas heterólogas.

Além do mais, os EphA2-BiTEs ou fragmentos desses podem ser fusionados a seqüências marcadores, tais como um peptídeo para facilitar a purificação. Em avanços preferidos, a seqüência de aminoácidos marcadora é um peptídeo de hexa-histidina, tal como a marca (tag) provida em um vetor pQE (QIAGEN, Inc., 9259 Eton Avenue, Chatsworth, CA, 91311), entre outras, várias das quais estão comercialmente disponíveis. Como descrito em Gentz et al., 1989, PNAS 86:821, por exemplo, hexa-histidina provê a purificação conveniente da proteína de fusão. Outras marcas peptídicas úteis para purificação incluem, mas não estão limitadas a, a marca hemaglutinina "HA", que corresponde a um epitopo derivado da proteína hemaglutinina de influenza (Wilson et al., 1984, Cell 37 :767) e a marca "flag". Em outros avanços, EphA2-BiTEs da presente invenção ou fragmentos ou variantes desses são conjugados a um agente diagnóstico ou detectável. Tais EphA2-BiTEs podem ser úteis para monitorar ou fazer um prognóstico do desenvolvimento ou progressão de um câncer como parte de um procedimento de teste clinico, tal como determinar a eficáca de uma terapia em particular. Adicionalmente, tais anticorpos podem ser úteis para monitorar ou fazer um prognóstico do desenvolvimento ou progressão de uma condição pré-cancerosa associada com células que sobre- expressam EphA2 (e.g., neoplasia prostática intraepitelial de alta graduação(PIN), fibroadenoma da doença fibrocistica de mama, ou composto de nevi) . Em um avanço, um epitopo de anticorpo EphA2 exposto é conjugado a um agente diagnóstico ou detectável. Em um avanço mais especifico, o anticorpo é um EphA2-BiTE.

Tais diagnose e detecção podem ser conseguidos combinando o anticorpo a substâncias detectáveis incluindo, mas não limitadas a várias enzimas, tais como, mas não limitado a, peroxidase de raiz forte, fosfatase alcalina, beta-galactosidase, ou acetilcolinesterase; grupos prostéticos, tais como, mas não limitados a, estreptavidina/biotina e avidina/biotina; materiais fluorescentes, tais como, mas não limitados a, umbeliferone, fluoresceina, isotiocinato de fluoresceina, rodamina, fluoresceina diclorotriazinilamina, cloreto de dansil ou ficoeritrina; materiais luminescentes, tais como, mas não limitados a, luminol; materiais bioluminescentes, tais como, mas não limitados a luciferase, luciferina, e aequorina; materiais radioativos, tais como, mas não limitados a, bismuto (213Bi), carbono (14C), cromo (51Cr), cobalto (57Co), flúor (18F), gadolinio (153Gd, 159Gd), gálio (68Ga, 67Ga), germânio (68Ge), hólmio (166Ho), índio (115In, 113In, 112In, 111In), iodo (131If 125I, 123I, 121I), lantânio (140La), lutécio (177Lu), manganês (54Mn), molibdênio (99Mo), paládio (103Pd) , fósforo (32P) , praseodímio (142Pr) , promécio (149Pm), rênio (186Re, 188Re), ródio (105Rh), rutênio (97Ru), samário (153Sm) , escândio (47Sc) , selênio (75Se) , estrôncio (85Sr), enxofre (35S), tecnécio (99Tc), titânio (201Ti), estanho (113Sn, 117Sn) , tritio (3H) , xenônio (133Xe) , itérbio (169Yb, 175Yb), ítrio (90Y), zinco (65Zn); metais emissores de pósitrons usando várias tomografias de emissão de pósitrons, e íons metálicos não radioativos paramagnéticos.

Em um avanço, a localização de um EphA2-BiTE para um tecido(s) doente(s) (e.g., um tumor) pode ser determinada detectando-se uma forma rotulada do EphA2-BiTE no tecido. Em um avanço específico, um EphA2-BiTE rotulado é detectado in vivo em um sujeito de acordo com um método compreendendo as etapas de: (a) administrar ao sujeito uma quantidade efetiva de um EphA2-BiTE rotulado, e (b) detectar o EphA2- BiTE rotulado no sujeito após um intervalo de tempo suficiente para permitir que o EphA2-BiTE se concentre em sítios no sujeito onde EphA2 é expressado. De acordo com este avanço, o EphA2-BiTE rotulado pode ser administrado ao sujeito de acordo com qualquer método adequado na arte, por exemplo, parenteralmente ou intraperitoneamente. Ainda, de acordo com este avanço, a quantidade efetiva do EphA2-BiTE rotulado é a quantidade que permite a detecção do EphA2- BiTE no sujeito. Essa quantidade irá variar de acordo com o sujeito em questão, o rótulo usado, e o método de detecção empregado. Por exemplo, é entendido na arte que o tamanho do sujeito e o sistema de imagem usado irá determinar a quantidade de EphA2-BiTE rotulado necessária para detectar o EphA2-BiTE em um sujeito usando meios de imageamento. No caso de um EphA2-BiTE radio-rotulado para um humano, a quantidade de EphA2-BiTE rotulado administrado é medido em termos de radioatividade, por exemplo a partir de cerca de 5 até 20 milicuries de 99tc. o intervalo de tempo após a administração do EphA2-BiTE rotulado que é suficiente para permitir que EphA2-BiTE rotulado se concentre em sítios no sujeito onde o EphA2 é expressado irá variar dependendo de diversos fatores, por exemplo, o tipo de rótulo usado, o modo de administração, e a parte do corpo do sujeito da qual é obtida a imagem. Em um avanço em particular, o intervalo de tempo que é suficiente é de 6 a 48 horas, 6 a 24 horas, ou 6 a 12 horas. Em outro avanço, o intervalo de tempo é de 5 a 20 dias ou 5 a 10 dias.

A presença de um EphA2-BiTE rotulado pode ser detectada no sujeito usando meios de imageamento conhecidos na arte. Em geral, os meios de imageamento empregados dependem do tipo de rótulo usado. Especialistas serão capazes de determinar os meios apropriados para detectar um rótulo em particular. Métodos e dispositivos que podem ser usados incluem, mas não estão limitados a, tomografia computadorizada (CT), varredura com escâner do corpo inteiro, tal como tomografia de emissão de posição (PET), imagem de ressonância magnética (MRI), e sonografia. Em um avanço especifico, o EphA2-BiTE é rotulado com um radioisótopo e é detectado no paciente usando um instrumento cirúrgico em resposta a radiação (Thurston et al., U.S. Patent No. 5.441.050). Em outro avanço, o EphA2- BiTE é rotulado com um composto fluorescente e é detectado no paciente usando um instrumento de escâner de resposta a fluorescência. Em outro avanço, o EphA2-BiTE é rotulado com um metal emissor de pósitrons e é detectado no paciente usando tomografia de emissão de pósitrons. Ainda em outro avanço, o EphA2-BiTE é rotulado com um rótulo paramagnético e é detectado em um paciente usando imagem de ressonância magnética (MRI).

A presente invenção engloba ainda usos de EphA2-BiTEs ou fragmentos desses conjugados a um agente terapêutico.

Um EphA2-BiTE da invenção pode ser conjugado a um componente terapêutico não macromolecular, tal como uma citotoxina, e.g., um agente citostático ou citocida, um agente terapêutico ou um ion metálico radioativo, e.g., alfa-emissores. Uma citotoxina ou agente citotóxico inclui qualquer agente que é prejudicial a células. Exemplos incluem paclitaxel, citocalasina B, gramicidina D, bromet de etidio, emetina, mitomicina, etoposida, tenoposida, vincristina, vinblastina, colchicina, doxorubicina, daunorubicina, dihidroxi antracina diona, mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D, 1-dehidrotestosterona, glicocorticóides, procaina, tetracaina, lidocaína, propranolol, puromicina, epirubicina, e ciclofosfamida e análogos ou homólogos desses. Agentes terapêuticos

incluem, mas não estão limitados a, antimetabólitos (e.g., metotrexato, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, citarabina, 5- fluorouracil decarbazina), agentes alquilantes (e.g., mecloretamina, tioepa clorambucil, melfalan, carmustina (BCNU) e lomustina (CCNU), ciclotosfamida, busulfan, dibromomanitol, estreptozotocina, mitomicina C, e cisdiclorodiamina platina (II) (DDP) cisplatina), antraciclinas (e.g., daunorubicina (anteriormente

daunomicina) e doxorubicina), antibióticos (e.g., dactinomicina (anteriormente actinomicina), bleomicina, mitramicina, e antramicina (AMC)), e agentes anti-mitóticos (e.g., vincristina e vinblastina).

Ainda, um EphA2-BiTE pode ser conjugado a um agente terapêutico ou arranjo de droga que modifica uma dada resposta biológica. Agentes terapêuticos ou arranjos de droga não devem ser contruidos como limitados a agentes terapêuticos químicos clássicos. Por exemplo, o arranjo de droga pode ser uma proteína ou polipeptídeo possuindo uma atividade biológica desejada. Tais proteínas podem

incluir, por exemplo, uma toxina tal como abrina, ricina A, exotoxina de pseudomonas, toxina de cólera, ou toxina de difteria; uma proteína, tal como fator de necrose tumoral, a-interferon, β-interferon, fator de crescimento de nervo, fator de crescimento derivado de plaqueta, ativador de tecido plasminogênico, um agente apoptótico, e.g., TNF-a, TNF-β, AIM I (ver, International Publication No. WO 97/33899), AIM II (ver, International Publication No. WO 97/34911), Fas Ligand (Takahashi et al., 1994, J. Iminunol., 6:1567), e VEGI (ver, International Publication No. WO 99/23105), um agente trombótico ou um agente anti- angiogênico, e.g., angiostatina ou endostatina; ou, um modificador de resposta biológica, tal como, por exemplo, uma linfoquina (e.g., interleucina-1 ("IL-1"), interleucina-2 ("IL-2"), interleucina -6 ("IL-6"), fator estimulador de granulócito de colônia de macrófagos ("GM- CSF"), e fator estimulador de granulócito de colônia ("G- CSF")), ou um fator de crescimento (e.g., hormônio de crescimento ("GH") ).

Além do mais, um EphA2-BiTE pode ser conjugado a componentes terapêuticos, tais como materiais radioativos ou queladores macrociclicos úteis para conjugar ions de radiometais (para exemplos de materiais radioativos, ver acima). Em certos avanços, o queladore macrociclico é ácido 1,4,7,10-tetraazaciclododecano-N,N', N' ' ,N'' - tetraacético (DOTA) que pode ser anexado ao anticorpo via um molécula ligante. Tais moléculas ligantes são comumente conhecidas na arte e descritas em Denardo et al., 1998, Clin Câncer Res. 4 :2483-90; Peterson et al., 1999, Bioconjug. Chem. 10:553; e Zimmerman et al. , 1999, Nucl. Med. Biol. 26:943-50 cada um é incorporado por referência em sua integra. Em um avanço específico, o EphA2-BiTE conjugado compreende um domínio que liga preferencialmente um epitopo de EphA2 exposto em células cancerosas, mas não em células não cancerosas, ou em células infectadas, mas não em células não infectadas (i.e., anticorpo de epitopo de EphA2 exposto), e um segundo domínoi que liga preferencialmente CD3.

Técnicas para conjugar componentes terapêuticos a anticorpos são bem conhecidas. Moieties podem ser conjugados a anticorpos por qualquer método conhecido na arte, incluindo, mas não limitado a ligação de aldeído/Schiff, ligação de sulfidril, ligação ácido-lábile, ligação de cis-aconitil, ligação de hidrazona, ligação enzimaticamente degradável (ver, em geral, Garnett, 2002, Adv. Drug Deliv. Rev. 53:171-216). Técnicas adicionais para conjugar componentes terapêuticos a anticorpos são bem conhecidas, ver, e.g., Arnon et al., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Câncer Therapy," in Monoclonal Antibodies And Câncer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery," in Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson et al. (eds.), pp. 623-53 (Mareei Dekker, Inc. 1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Câncer Therapy: A Review," in Monoclonal Antibodies λ84: Biological And ClinicaL Applications, Pinchera et al. (eds.), pp. 475-506 (1985); "Analysis, Results, And Future Prospective Of The 132/346

Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Câncer Therapy," in Monoclonal Antibodies For Câncer Detection And Therapy, Baldwin et al. (eds.), pp. 303-16 (Academic Press 1985), e Thorpe et al., 1982, Immunol. Rev. 62:119-58. Métodos para fusionar ou conjugar anticorpos a componentes polipeptidicos são conhecidos na arte. Ver, e.g., U.S. Patent Nos. 5.336.603, 5.622.929, 5.359.046, 5.349.053, 5.4 47 . 851, e 5.112.94 6; EP 307.4 34; EP 3 67.166; International Publication Nos. WO 96/04388 e WO 91/06570; Ashkenazi et al., 1991, PNAS 88: 10535-10539; Zheng et al., 1995, J. Immunol. 154:5590-5 600; e Vil et al., 1992, PNAS 89:11337- 11341. A fusão de um anticorpo a um componente não precisa ser necessariamente direta, mas pode ocorrer através de seqüências ligantes. Tais moléculas ligantes são comumente conhecidas na arte e descritas em Denardo et al., 1998, Clin Câncer Res. 4:2483-90; Peterson et al., 1999, Bioconjug. Chem. 10:553; Zimmerman et al., 1999, Nucl. Med. Biol. 26:943-50; Garnett, 2002, Adv. Drug Deliv. Rev. 53:171-216, cada qual é aqui incorporado por referência em sua integra.

EphA2-BiTEs podem ser também anexados a suportes sólidos, que são particularmente úteis para testes imuno ou purificação do antigeno alvo. Tais suportes sólidos incluem, mas não estão limitados a, vidro, celulose, poliacrilamida, náilon, polistireno, cloreto de polivinil ou polipropileno.

Polinucleotideos EphA2-BiTE da invenção A presente invenção provê as seqüências dos polinucleotideos codificando os EphA2-BiTES aqui descritos. Em um avanço especifico, os polinucleotideos da invenção que codificam os EphA2-BiTEs compreendem uma primeira seqüência de nucleotideos codificando um primeiro domínio de ligação e uma segunda seqüência de nucleotideos codificando um segundo domínio de ligação, e seqüências de nucleotideos codificando seqüências ligantes que ligam o primeiro e o segundo domínios de ligação. Ver, e.g., FIG. 3 para uma representação geral de um constructo de polinucleotídeo EphA2-BiTE. A presente invenção também provê seqüências de polinucleotideos codificando EphA2- BiTEs nos quais as seqüências de nucleotideos codificando o primeiro e/ou segundo domínio de ligação hibridiza às seqüências de nucleotideos de um ou mais domínios variáveis de um anticorpo anti-EphA2 conhecido na arte ou aqui descrito (e.g., EA2, 4H5, 2A4, 2E7 ou 12E2) e/ou um anticorpo anti-CD3 conhecido na arte ou aqui descrito.

Em um avanço, EphA2-BiTEs produzidos a partir de polinucleotideos que hibridizam a polinucleotideos codificando EphA2-BiTEs que modulam a expressão de EphA2 e/ou induzem a Iise redirecionada de células sobre- expressando EphA2 por células T em um teste bem conhecido à arte ou aqui descrito. Em outro avanço, EphA2-BiTEs usados nos métodos da invenção incluem polipeptídeos produzidos a partir de polinucleotideos que hibridizam a polinucleotideos codificando fragmentos de EphA2-BiTEs. Condições para hibridização incluem, mas não estão limitadas a, condições de hibridização estringentes, tais como hibridização a DNA ligado a filtro em 6X cloreto de sódio/citrato de sódio (SSC) a cerca de 45°C, seguido por uma ou mais lavagens em 0,2X SSC/0,1% SDS a cerca de 50- 65°C, condições altamente estringentes, tais como hibridização a DNA ligado a filtro em 6X SSC a cerca de 45°C, seguindo por uma ou mais lavagens em 0,1X SSC/0,2% SDS a cerca de 60°C, ou quaisquer outras condições de hibridização estringentes conhecidas daqueles especialistas na arte (ver, por exemplo, Ausubel, F.M. et al., eds. 1989 Current Protocols in Molecular Biology, vol. 1, Green Publishing Associates, Inc. and John Wiley and Sons, Inc., NY nas páginas 6.3.1 a 6.3.6 e 2.10.3).

Uma vez que a seqüência de nucleotideos do EphA2-BiTE usado nos métodos da invenção é determinada, a seqüência de nucleotideos pode ser manipulada usando métodos bem conhecidos na arte para a manipulação de seqüências de nucleotideos, e.g., técnicas de DNA recombinante, mutagênese sitio direcionada, PCR, etc. (ver, por exemplo, as técnicas descritas em Sambrook et al., 1990, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY e Ausubel et al. , eds., 1998, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY, que são ambos aqui incorporados por referência em sua integra), para gerar polipeptideos tendo uma seqüência de aminoácidos diferente, por exemplo para criar substituições, deleções, e/ou inserções de aminoácidos. Em avanços específicos, tais polipeptídeos possuem pelo menos 1, pelo menos 2, pelo menos 3, pelo menos 4, pelo menos 5, ou pelo menos 6 substituições, deleções, e/ou inserções de aminoácidos. Incluídas dentre possíveis substituições estão substituições conservativas, nas quais a seqüência de aminoácidos é modificada substituindo um ou mais aminoácidos com aminoácidos diferentes que possuem características químicas ou estruturas similares e/ou não alteram de modo significativo a função biológica do peptídeo.

Técnicas padrão conhecidas daqueles especialistas na arte podem ser usadas para introduzir mutações na seqüência de nucleotídeos codificando um EphA2-BiTE da invenção, incluindo, por exemplo, mutagênese sítio direcionada e mutagênese mediada por PCR que resulta em substituições de aminoácidos. Preferencialmente, os derivados incluem menos de 25 substituições de aminoácidos, menos de 20 substituições de aminoácidos, menos de 15 substituições de aminoácidos, menos de 10 substituições de aminoácidos, menos de 5 substituições de aminoácidos, menos de 4 substituições de aminoácidos, menos de 3 substituições de aminoácidos, ou menos de 2 substituições de aminoácidos relativo à molécula original. Em um avanço preferencial, os derivados possuem substituições conservativas de aminoácidos são feitos em um ou mais resíduos de aminoácidos não essenciais previstos. Uma "substituição de aminoácido conservativa" é uma na qual o resíduo de aminoácido é substituído por um resíduo de aminoácido tendo uma cadeia lateral com carga similar. Famílias de resíduos de aminoácidos tendo cadeias laterais com carga similar foram definidas na arte. Essas famílias incluem

aminoácidos com cadeias laterais básicas (e.g., lisina, arginina, histidina), cadeias laterais ácidas (e.g., ácido aspártico, ácido glutâmico), cadeias laterais polares não carregadas (e.g., asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína), cadeias laterais apolares (e.g., glicina, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptofano), cadeias laterais polares beta-ramifiçadas (e.g., treonina, valina, isoleucina) e cadeias laterais aromáticas (e.g., tirosina, fenilalanina, triptofano, histidina). Alternativamente, mutações podem ser introduzidas randomicamente junto de toda ou parte da seqüência codificadora, tais como por mutagênese de saturação, e os mutantes resultantes podem ser rastreados para atividade biológica para identificar mutantes que retém atividade. Após a mutagênese, o EphA2- BiTE codificado pode ser inserido em um vetor de expressão e expressado (e.g., em uma célula hospedeira heteróloga) e a atividade da proteína pode ser determinada como descrito abaixo.

A presente invenção também engloba o uso de anticorpos biespecíficos de cadeia simples compreendendo a seqüência de aminoácidos de qualquer dos EphA2-BiTEs aqui descritos com mutações (e.g., uma ou mais substituições de aminoácidos) nas regiões ferramenta ou variáveis do primeiro e/ou segundo domínio de ligação.

Preferencialmente, essas mutações mantêm ou intensificam a avidez e/ou afinidade dos EphA2-BiTEs para EphA2 e/ou CD3 aos quais se ligam imunoespecificamente. Técnicas padrão conhecidas daqueles especialistas na arte (e.g., testes imuno ou testes ELISA) podem ser usados para testar o grau de ligação entre um polipeptídeo EphA2-BiTE e seu parceiro de ligação.

Métodos de Produzir EphA2-BiTEs

Expressão Recombinante de um EphA2-BiTE

Os EphA2-BiTEs da invenção podem ser produzidos por qualquer método conhecido na arte ou aqui descrito, em particular, por síntese química ou preferencialmente, por técnicas de expressão recombinante descritas supra (ver, e.g., WO 99/54440, que é aqui incorporada por referência em sua íntegra). Ver também a Seção 6, infra, para exemplos detalhados de métodos para produzir EphA2-BiTEs da invenção.

Os polinucleotídeos da invenção podem ser usados sozinhos ou como parte de um vetor para expressar os polipeptídeos da invenção (e.g., EphA2-BiTEs) em células, por exemplo, em terapia gênica ou diagnose de desordens associadas com expressão aberrante (e.g., sobre-expressão) e/ou atividade de EphA2 (e.g., câncer, uma desordem celular hiperproliferativa não cancerosa ou uma infecção). Os polinucleotídeos ou vetores contendo a(s) seqüência (s) de DNA codificando qualquer dos polipeptideos da invenção é introduzido nas células que, ao contrário, produzem o polipeptideo de interesse (e.g., um EphA2-BiTE). A terapia gênica, que é baseada em introduzir genes terapêuticos em células por técnicas ex-vivo ou in-vivo, é uma das mais importantes aplicações de transferência de genes.

Dessa forma, a expressão recombinante de um EphA2-BiTE da invenção requer a construção de um vetor de expressão contendo uma seqüência de polinucleotídeos que codifica o EphA2-BiTE. Ver, e.g., FIG. 3. Os polinucleotídeos codificando os EphA2-BiTEs aqui descritos podem ser obtidos e seqüenciados por qualquer método conhecido na arte. Por exemplo, um polinucleotídeo codificando um EphA2-BiTE usando nos métodos da invenção pode ser reunido a partir de oligonucleotídeos quimicamente sintetizados {e.g., como descrito em Kutmeier et al., 1994, BioTechniques 17:242), que, resumidamente, envolve a síntese de oligonucleotídeos se sobrepondo contendo fragmentos da seqüência codificando o polipeptideo, o anelamento e ligação desses oligonucleotídeos, e, então, a amplificação dos oligonucleotídeos ligados por PCR.

Uma vez que um polinucleotídeo codificando um EphA2- BiTE da invenção tenha sido obtido, o vetor para a produção da molécula EphA2-BiTE pode ser produzido por tecnologia de DNA recombinante usando técnicas bem conhecidas na arte. Assim, métodos para preparar uma proteína expressando-se um polinucleotídeo contendo uma seqüência de nucleotídeos codificando EphA2-BiTE são aqui descritos. Métodos que são bem conhecidos daqueles especialistas na arte podem ser usados para construir vetores de expressão contendo seqüências codificadoras de EphA2-BiTE e sinais apropriados de controle de transcrição e de tradução. Esses métodos incluem, por exemplo, técnicas de DNA recombinante in vitro, técnicas sintéticas, e recombinação genética in vivo. A invenção provê, assim, vetores replicáveis compreendendo uma seqüência de nucleotídeos codificando um EphA2-BiTE da invenção, uma cadeia pesada ou leve de um anticorpo, um domínio variável de cadeia leve ou pesada de um anticorpo ou um fragmento desses, ou uma cadeia pesada ou leve de CDR, operacionalmente ligada a um promotor. Tais vetores podem incluir a seqüência de nucleotídeos codificando a região constante da molécula de anticorpo (ver, e.g., International Publication Nos. WO 86/05807 e WO 89/01036; e U.S. Patent No. 5.122.464) e o domínio variável do anticorpo podem ser clonados em tal vetor para expressão da cadeia pesada inteira, cadeia leve inteira, ou ambas cadeias pesadas e leves inteiras.

O vetor de expressão é transferido para uma célula hospedeira por técnicas convencionais e as células transfectadas são, então, cultivadas por técnicas convencionais para produzir um EphA2-BiTE da invenção. Assim, a invenção inclui células hospedeiras contendo um polinucleotídeo codificando um EphA2-BiTE da invenção, fragmentos desse (e.g., primeiro e/ou segundo domínios de ligação de um EphA2-BiTE) , operacionalmente ligados a um promotor heterólogo.

Uma variedade de sistemas de expressão hospedeiro- vetor pode ser utilizada para expressar os EphA2-BiTEs da invenção ou fragmentos desses (e.g., uma primeiro e/ou segundo domínio de ligação de um EphA2-BiTE) (ver, e.g., U.S. Patent No. 5.807.715). Tais sistemas de expressão de hospedeiro representam veículos pelos quais as seqüências codificadoras de interesse podem ser produzidas e subseqüentemente purificadas, mas também representam células que podem, quando transformadas ou transfectadas com as seqüências de nucleotídeos codificadoras apropriadas, expressam uma molécula de EphA2-BiTE da invenção in situ. Essas incluem, mas não estão limitadas a microorganismos, tais como bactérias (e.g., E. coli e B. subtilis) transformadas com DNA recombinante de bacteriofago, vetores de expressão de DNA de plasmídio ou DNA de cosmídio contendo seqüências codificadoras de EphA2- BiTE; leveduras (e.g., Saccharomyces Pichia) transformadas com vetores de expressão recombinantes de leveduras contendo seqüências codificadoras de EphA2-BiTE; sistemas de células de insetos infectados com vetores de expressão recombinantes de vírus (e.g., bacilovírus) contendo seqüências codificadoras de EphA2-BiTE; sistemas de células vegetais infectados com vetores de expressão recombinantes de vírus (e.g., vírus de mosaico de couve-flor, CaMV; vírus de mosaico de tabaco, TMV) ou transformados com vetores de expressão recombinantes de plasmídios (e.g., plasmídio Ti) contendo seqüências codificadoras de EphA2-BiTE; ou sistemas de células de mamíferos (e.g., células COS, CHO, BHK, 293, NSO, e 3T3) ancorando constructos de expressão recombinantes contendo promotores derivados do genoma de células de mamíferos (e.g., promotor de metalotioneina) ou de vírus de mamíferos (e.g., o promotor de adenovírus tardio; o promotor de vírus vaccinia 7,5K). Preferencialmente, células bacterianas, tais como Escherichia coli, e mais preferencialmente, células eucariontes, são usadas para a expressão de uma molécula de EphA2-BiTE recombinante. Por exemplo, células de

mamíferos, tais como células de ovário de hamster chinês (CHO) , em conjunto com um vetor, tal como o elemento promotor de gene inicial intermediário principal de citomegalovírus humano é um sistema de expressão efetivo para anticorpos (Foecking et al., 1986, Gene 45:101; e Cockett et al., 1990, BioTechnology 8:2). Em um avanço específico, a expressão de seqüências de nucleotídeos codificando EphA2-BiTEs é regulada por um promotor constitutivo, promotor induzido ou promotor específico de tecido. Alternativamente, os polinucleotídeos da invenção podem ser expressados em um sistema de expressão de planta transgênica, tal como, por exemplo, o sistema LEX System™ descrito em U.S. Patent No. 6.040.498, aplicação internacional publicada em 18 de fevereiro de 1999 (WO 99/07210), e aplicação internacional publicada em 7 de fevereiro de 2002 (WO 02/10414) . Outro sistema de expressão de planta transgênica que pode ser utilizado para os polinucleotídeos da invenção é a tecnologia Plantibodiesm descrita em U.S. Patent Nos. 5.202.422; 5.639.947; 5.959.177; e 6.417.429.

Em sistemas bacterianos, um número de vetores de expressão pode ser vantajosamente selecionados dependendo do uso pretendido para a molécula de EphA2-BiTE ou fragmento dessa sendo expressada. Por exemplo, quando uma grande quantidade de tal proteína deve ser produzida, para a geração de composições farmacêuticas de uma molécula de EphA2-BiTE, vetores que direcionem a expressão de níveis altos de produtos de proteína de fusão que são prontamente purificados podem ser desejados. Tais vetores incluem, mas não estão limitados a, o vetor de expressão pUR278 de E. coli (Ruther et al., 1983, EMBO 12:1791), no qual a seqüência codificadora de EphA2-BiTE pode ser ligada individualmente no vetor no quadro com a região codificadora Iac Z de forma que uma proteína de fusão seja produzida; vetores pIN (Inouye & Inouye, 1985, Nucleic Acids Res. 13:3101-3109; Van Heeke & Schuster, 1989, J. Biol. Chem. 24:5503-5509); e similares. Vetores pGEX podem ser também usados para expressar polipeptídeos estrangeiros como proteínas de fusão com glutationa 5-transferase (GST). Em geral, tais proteínas de fusão são solúveis e podem ser facilmente purificadas a partir de células lisadas pode adsorção e ligação a gotas de matriz de glutationa-agarose seguido por eluição na presença de glutationa livre. Os vetores pGEX são projetados para incluir sítios de clivagem de trombina ou protease fator Xa de forma que o produto gênico alvo clonado possa ser liberado a partir do componente de GST. Outro sistema microbiano que pode ser usado para expressar os polinucleotideos da invenção é a teconologia de Expressão Pfênex que é baseada em novas linhagens de Pseudomonas fluorescens, como descrito em Squires et al., BioProcess Int'l p. 54 dezembro de 2004; e Squires et al., Specialty Chemicals julho/agosto de 2004.

Em um sistema de inseto, virus de poliedrose nuclear de Autographa californica (AcNPV) é usado como um vetor para expressar genes estrangeiros. 0 virus cresce em células de Spodoptera frugiperda. A seqüência codificadora de EphA2-BiTE pode ser clonada individualmente em regiões não essenciais (por exemplo o gene de poliedrina) do virus e colocadas sob controle de um promotor AcNPV (por exemplo o promotor de poliedrina).

Em células hospedeiras de mamíferos, um número de sistemas de expressão baseados em vírus pode ser utilizado. Em casos onde um adenovírus é usado como vetor de expressão, a seqüência codificadora de EphA2-BiTE de interesse pode ser ligada a um complexo de controle de transcrição/tradução de adenovírus, e.g., o promotor tardio e seqüência líder triparticionada. Esse gene quimérico pode ser, então, inserido no genoma do adenovírus por recombinação in vitro ou in vivo. A inserção em uma região não essencial do genoma viral (e.g., região El ou E3) resultará em um vírus recombinante que é viável e capaz de expressar a molécula EphA2-BiTE em hospedeiros infectados (e.g., ver Logan & Shenk, 1984, PNAS 8 1:355-359). Sinais específicos de iniciação podem ser também necessários para tradução eficiente de seqüências codificadoras de EphA2- BiTE inseridas. Esses sinais incluem o códon de iniciação ATG e seqüências adjacentes. Adicionalmente, o códon de iniciação deve estar em fase com o quadro de leitura da seqüência codificadora desejadas para assegurar a tradução de toda inserção. Esses sinais exógenos de controle de tradução e códons de iniciação podem ser de uma variedade de origens, tanto naturais e sintéticos. A eficiência de expressão pode ser intensificada pela inclusão de elementos intensificadores de transcrição apropriados, terminadores de transcrição, etc. (ver, e.g., Bittner et al., 1987, Methods in Enzymol. 153:516-544).

Além disso, uma linhagem de célula hospedeira que modula a expressão das seqüências inseridas, ou modifica e processa o produto gênico da maneira específica desejada pode ser escolhida. Tais modificações (e.g., glicosilação) e processamento (e.g., clivagem) de produtos de proteína podem ser importantes para a função da proteína. Células hospedeiras diferentes possuem mecanismos característicos e específicos para processamento pós-tradução e modificação de proteínas e produtos gênicos. Linhas de células, ou sistemas hospedeiros apropriados, podem ser escolhidas para assegurar a modificação e o processamento corretos da proteína estrangeira expressada. Nesta extensão, células hospedeiras eucariontes que possuem o maquinário celular para processamento correto do transcrito primário, glicosilação, e fosforilação do produto gênico pode ser usado. Tais células hospedeiras de mamíferos incluem, mas não estão limitadas a células CHO, VERO, BHK, HeLa, COS, MDCK, 293, 3T3, W138, BT483, Hs578T, HTB2, BT20, NSl, e T47D, NSO (uma linha de células de mieloma murino que não produz endogenamente qualquer cadeia de imunoglobulina), CRL7030 e células HsS78BsT.

Para produção de alto rendimento e longo prazo de proteínas recombinantes, expressão estável é preferida. Por exemplo, linhagens celulares que expressam estavelmente a molécula EphA2-BiTE podem ser construídas. Ao invés de usar vetores de expressão que contêm origens . de replicação virais, células hospedeiras podem ser transformadas com DNA controlado por elementos de controle de expressão apropriados (e.g., promotor, intensificador, seqüências, terminadores de transcrição, sítios de poliadenilação, etc.), e um marcador selecionável. Após a introdução do DNA estrangeiro, células construídas podem ser deixadas crescenedo por 1-2 dias em um meio enriquecido e, então, são trocadas para um meio seletivo. 0 marcador selecionável no plasmídio recombinante confere resistência à seleção e permite que as células integrem estavelmente o plasmídio em seus cromossomos e cresçam para formar Ioci que, ao contrário, podem ser clonados e expandidos em linhas celulares. Este método pode ser vantajosamente usado pra construir linhas celulares que expressem a molécula de EphA2-BiTE. Tais linhas celulares construídas podem ser particularmente úteis no rastreamento e avaliação de composições que interagem diretamente ou indiretamente com a molécula de EphA2-BiTE.

Um número de sistemas de seleção pode ser usado, incluindo, mas não limitados a, timidina quinase de vírus simplex de herpes (Wigler et al., 1977, Cell 11:223), glutamina sintase, hipoxantina guanina fosforribosiltransferase (Szybalska & Szybalski, 1992, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 48:202), e adenina fosforribosiltransferase (Lowy et al., 1980, Cell 22:8-17) genes podem ser empregados em células tk-, gs-, hgprt- ou aprt-, respectivamente. Também, resistência antimetabólito pode ser usada como a base de seleção para os seguintes genes: dhfr, que confere resistência a metotrexato (Wigler et al., 1980, PNAS 77:357; 0'Hare et al., 1981, PNAS 78:1527); gpt, que confere resistência a ácido micofenólico (Mulligan & Berg, 1981, PNAS 78:2072); neo, que confere resistência à aminoglicosida G-418 (Wu and Wu, 1991, Biotherapy 3:87; Tolstoshev, 1993, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32:573; Mulligan, 1993, Science 260:926; e Morgan and Anderson, 1993, Ann. Rev. Biochem. 62: 191; May, 1993, TIB TECH 11:155-); e hygro, que confere resistência a higromicina (Santerre et al., 1984, Gene 30:147). Métodos coraumente conhecidos na arte de tecnologia de DNA recombinante podem ser rotineiramente aplicados para selecionar o clone recombinante desejado, e tais métodos são descritos, por exemplo, em Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1993); Kriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY (1990) ; e nos capítulos 12 e 13, Dracopoli et al. (eds) , Current

Protocols in Human Genetics, John Wiley & Sons, NY (1994); Colberre-Garapin et al., 1981, J. Mol. Biol. 150:1, que são aqui incorporados por referência em sua íntegra.

Os níveis de expressão de uma molécula de EphA2-BiTE podem ser aumentadas por amplificação de vetor (para uma revisão, ver Bebbington and Hentschel, The use of vetores based on gene amplif ication for the expressão of cloned genes in mammalian cells in DNA cloning, Vol.3. (Academic Press, New York, 1987)). Quando um marcador no sistema vetor expressando EphA2-BiTE é amplificável, aumentar o nível de inibidor presente na cultura de células hospedeiras irá aumentar o número de cópias do gene marcador. Já que a região amplificada é associada com o gene de EphA2-BiTE, a produção do EphA2-BiTE também irá aumentar (Crouse et al., 1983, Mol. Cell. Biol. 3:257).

A célula hospedeira por ser co-transfectada com dois vetores de expressão da invenção, o primeiro vetor codificando um primeiro domínio de ligação de um EphA2-BiTE ou um domínio pesado variável de um anticorpo (e.g., um anticorpo anti-EphA2 ou um anticorpo anti-CD3) e o segundo vetor codificando um segundo domínio de ligação de um EphA2-BiTE ou um domínio variável leve de um anticorpo (e.g., um anticorpo anti-EphA2 ou um anticorpo anti-CD3) . O primeiro e o segundo domínio de ligação do EphA2-BiTE podem ser purificados usando técnicas conhecidas na arte e os dois domínios podem ser quimicamente ligados por métodos conhecidos na arte.

A célula hospedeira pode ser transfectada com um vetor de expressão da invenção codificando um EphA2-BiTE da invenção. O vetor pode conter um único vetor qu codifica, e é capaz de expressar ambos os domínios variáveis leves de um anticorpo (e.g., anticorpo anti-EphA2 ou anticorpo anti- CD3), ou ambos primeiro e segundo domínios de ligação de um EphA2-BiTE (Proudfoot, 1986, Nature 322:52; e Kohler, 1980, PNAS 77:2197). As seqüências codificadoras para os domínios variáveis ou domínios de ligação podem compreender DNAc ou DNA genômico.

Uma vez que um EphA2-BiTE da invenção ou um domínio de ligação desse tenha sido produzido por expressão recombinante, ele pode ser purificado por qualquer método conhecido na arte para purificação de um molécula de imunoglobulina, por exemplo, por cromatografia (e.g., troca iônica, afinidade iônica, particularmente por afinidade para o antígeno específico após Proteína A, e cromatografia de coluna de medição), centrifugação, solubilidade diferencial, ou por qualquer outra técnica padrão para a purificação de proteínas. Ainda, os EphA2-BiTEs da presente invenção ou fragmentos desses podem ser fusionados para seqüências polipeptídicas heterólogas aqui descritas ou, ao contrário, conhecidas na arte para facilitar a purificação. Em um avanço especifico, is EphA2-BiTEs produzidos da invenção de forma recombinante compreendem um primeiro domínio de ligação e um segundo domínio de ligação, caracterizado pelo fato do primeiro domínio de ligação compreender um domínio VH e um domínio VL ligados juntos por um ligante de força suficiente para permitir que os domínios se dobrem de forma a permitir a ligação ao antígeno CD3 de célula T. Em outro avanço específico, o segundo domínio de ligação compreende a domínio VH e um domínio VL, e os domínios VH e VL são ligados juntos por um ligante de força suficiente para permitir que os domínios se dobrem de forma a permitir a ligação a EphA2. Em outro avanço específico, o primeiro e o segundo domínios de ligação são ligados juntos por um ligante de força suficiente para permitir que os domínios se dobrem de forma a permitir a ligação a CD3 e EphA2. Em certos avanços, o primeiro e o segundo domínio de ligação são scFvs. Em outros avanços, o domínio de ligação que se liga a CD3 é desimunizado.

Métodos Profiláticos/Terapêuticos

A presente invenção está relacionada a composições farmacêuticas e regimes profiláticos e terapêuticos projetados para tratar, prevenir e/ou gerenciar desordens associadas com a expressão e/ou atividade aberrante de EphA2 (e.g., câncer, desordens celulares hiperproliferativas não cancerosas e infecções) e um sujeito, compreendendo administrar um ou mais EphA2-BiTEs. Em um avanço específico, os EphA2-BiTEs da invenção são administrados a um sujeito para tratar, prevenir e/ou gerenciar desordens associadas com a expressão e/ou atividade aberrante de EphA2 (e.g., câncer, desordens celulares hiperproliferativas não cancerosas e infecções). Em certos avanços, os EphA2-BiTEs da invenção são administrados em combinação com uma ou mais terapias. Em certos avanços, um ou mais EphA2-BiTEs da invenção são administrados a um mamífero, preferencialmente um humano, concomitantemente com uma ou mais outras terapias. Preferencialmente, tais terapias são úteis para o tratamento de tais desordens. 0 termo "concomitantemente" não é limitado à administração de terapias exatamente ao mesmo tempo, mas sim, deve significar que os EphA2-BiTEs da invenção e outra terapia são administrados a um sujeito em uma seqüência e em um intervalo de tempo de forma que os anticorpos da invenção possam agir juntos com a outra terapia para prover um benefício aumentado em relação a se fossem administrados de outra forma. Por exemplo, cada terapia pode ser administrada ao mesmo tempo ou seqüencialmente em qualquer ordem em diferentes momentos; contudo, se não administradas ao mesmo tempo, deveriam ser administradas próximas em tempo o suficiente para prover o efeito terapêutico ou profilático desejado. Cada terapia pode ser administrada separadamente, de qualquer forma apropriada e por qualquer via adequada. Em outros avanços, os EphA2-BiTEs da invenção são administrados antes, concomitantemente ou após cirurgia. Preferencialmente, a cirurgia remove completamente tumores localizados ou reduz o tamanho de tumores grandes. Cirurgia pode ser também feita como uma medida preventiva ou para aliviar a dor.

Em vários avanços, as terapias são administradas em menos de 1 hora de ! diferença, em cerca de 1 hora de diferença, de cerca de 1 hora a cerca de 2 horas de diferença, de cerca de 2 horas a cerca de 3 horas de diferença, de cerca de 3 horas a cerca de 4 horas de diferença, de cerca de 4 horas a cerca de 5 horas de diferença, de cerca de 5 horas a cerca de 6 horas de diferença, de cerca de 6 horas a cerca de 7 horas de diferença, de cerca de 7 horas a cerca de 8 horas de diferença, de cerca de 8 horas a cerca de 9 horas de diferença, de cerca de 9 horas a cerca de 10 horas de diferença, de cerca de 10 horas a cerca de 11 horas de diferença, de cerca de 11 horas a cerca de 12 horas de diferença, não mais do que 24 horas de diferença ou não mais do que 48 horas de diferença. Em avanços preferidos, dois ou mais componentes são administrados na mesma visita do paciente.

As quantidades de dosagem e freqüências de administração aqui providas são englobadas pelos termos terapeuticamente efetivo e profilaticamente efetivo. A dosagem e freqüência irão varia, ainda, tipicamente de acordo com fatores específicos para cada paciente dependendo das terapias específicas administradas, a severidade e tipo de câncer, a via de administração, assim como idade, peso corporal, resposta, e histórico médico do paciente. Regimes adequados podem ser selecionados por um especialista na arte considerando tais fatores e seguindo, por exemplo, dosagens relatadas na literatura e recomendadas na referência Physiciansr Desk Reference (61st ed., 2007).

População de Pacientes

Pacientes com Câncer

A invenção provê métodos para tratar, prevenir e/ou gerenciar câncer administrando a um sujeito uma quantidade terapeuticamente ou profilaticamente efetiva de um ou mais EphA2-BiTEs da invenção. Em outro avanço, os EphA2-BiTEs da invenção podem ser administrados em combinação com uma ou mais outras terapias. O sujeito é um animal, preferencialmente um mamífero, tal como um não primata (e.g., vacas, porcos, cavalos, gatos, cachorros, ratos, etc.) e um primata (e.g., macaco, tal como um macaco cinomolgus e um humano). Em um avanço preferencial, o sujeito é um humano.

Exemplos específicos de cânceres que podem ser tratados pelos métodos englobados pela invenção incluem, mas não estão limitados a, cânceres que sobre-expressam EphA2. Em um avanço adicional, o câncer é de origem epitelial. Exemplos de tais cânceres são câncer de pulmão, cólon, próstata, mama, e pele. Cânceres adicionais estão litados como exemplo e não por limitação na Seção 5.4.1.2, infra. Em avanços particulares, métodos da invenção podem ser usados para tratar, prevenir e/ou gerenciar metástase de tumores primários.

Os métodos e composições da invenção compreendem a administração de um ou mais EphA2-BiTEs da invenção a sujeitos/pacientes sofrendo de ou esperados de sofrer de câncer, e.g., possuem uma predisposição genética para um tipo particular de câncer, foram expostos a agente carcerigeno, ou estão em remissão de um câncer em particular. Como aqui usado, "câncer" refere-se a cânceres primários ou metastáticos. Tais pacientes podem ou não ter sido previamente tratados para câncer. Os métodos e composições da invenção podem ser usados como qualquer linha de terapia, e.g., uma primeira, segunda, terceira, etc. linha de terapia. Incluído na invenção está também o tratamento de pacientes recebendo outras terapias para câncer e os métodos e composições da invenção podem ser usados antes que ocorram efeitos adversos ou intolerância dessas outras terapias para câncer. A invenção também engloba métodos para administrar um ou mais EphA2-BiTEs da invenção para tratar, prevenir e/ou gerenciar sintomas em pacientes refratários. Em um certo avanço, um câncer ser refratário a uma terapia significa que pelo menos alguma porção significativa das células cancerosas não são mortas ou têm sua divisão aprisionada. A determinação de se as células cancerosas são refratárias pode ser feita tanto in vivo ou in vitro por qualquer método conhecido na arte para testar a efetividades da(s) terapia(s) em células cancerosas, usando meios aceitos na arte de "refratário" em tal contexto. Em vários avanços, um câncer é refratário onde o número de células cancerosas não foi reduzido significativamente, ou aumentou. A invenção também engloba métodos para administrar um ou mais EphA2-BiTEs para prevenir o começo ou recorrência de câncer em pacientes predispostos a ter câncer.

Em avanços em particular, os EphA2-BiTEs da invenção, ou outro terapêuticos que reduze a expressão de EphA2, são administrados para reverter a resistência ou sensitividade reduzida de células cancerosas a certos terapêuticos hormonais, radiação e agentes terapêuticos químicos, dessa maneira, sensibilizando novamente as células cancerosas a um ou mais desses agentes, os quais podem ser, então, administrados (ou continuar a ser administrados) para tratar ou administrar câncer, incluindo prevenir metástases.

Em avanços alternados, a invenção provê métodos para tratar câncer de pacientes administrando-se um ou mais EphA2-BiTEs da invenção em combinação com qualquer outra terapia ou a pacientes que foram mostrados refratários a outros tratamentos, mas não a estes tratamentos. Em certos avanços, os pacientes sendo tratados pelos métodos da invenção são pacientes já sendo tratados com quimioterapia, radioterapia, terapia hormonal, ou terapia biológica/imunoterapia. Dentre esses pacientes estão pacientes refratários e aqueles com câncer apesar do tratamento com terapias para câncer existentes. Em outros avanços, os pacientes foram tratados e não possuem atividade de doença e um ou mais EphA2-BiTEs da invenção são administrados para prevenir a recorrência de câncer.

Em avanços preferidos, o tratamento existente é quimioterapia. Em avanços em particular, o tratamento existente inclui administração de quimioterapias incluindo, mas não limitado a, metotrexato, taxol, mercaptopurina, tioguanina, hidroxiuréia, citarabina, ciclofosfamida, ifosfamida, nitrosouréias, cisplatina, carboplatina, mitomicina, dacarbazina, procarbizina, etoposidas, campatecinas, bleomicina, doxorubicina, idarubicina, daunorubicina, dactinomicina, plicamicina, mitoxantrona, asparaginase, vinblastina, vincristina, vinorelbina, paclitaxel, docetaxel, etc. Dentre esses pacientes estão pacientes tratados com radioterapia, terapia hormonal e/ou terapia biológica/imunoterapia. Também entre esses pacientes estão aqueles que passaram por cirurgia para o tratamento de câncer.

Alternativamente, a invenção também engloba métodos para tratar pacientes fazendo ou que fizeram radioterapia. Entre esses estão pacientes sendo tratados ou previamente tratados com quimioterapia, terapia hormonal e/ou terapia biológica/imunoterapia. Também entre esses pacientes estão aqueles que passaram por cirurgia para o tratamento de câncer. Em outros avanços, a invenção engloba métodos para tratar pacientes fazendo ou que fizeram terapia hormonal e/ou terapia biológica/imunoterapia. Entre estes estão pacientes sendo tratados ou que foram tratados com quimioterapia e/ou radioterapia. Também entre esses pacientes estão aqueles que passaram por cirurgia para o tratamento de câncer.

Adicionalmente, a invenção também provê métodos de tratamento de câncer como uma alternativa a quimioterapia, radioterapia, terapia hormonal, e/ou terapia

biológica/imunoterapia onde a terapia foi mostrada ou pode ser muito tóxica, i.e., resulta em efeitos colaterais inaceitáveis ou insuportáveis para o sujeito sendo tratado. 0 sujeito sendo tratado com os métodos da invenção pode, opcionalmente, ser tratado com outros tratamentos para câncer, tais como cirurgia, quimioterapia, radioterapia, terapia hormonal ou terapia biológica, dependendo de qual tratamento foi visto por ser inaceitável ou insuportável.

Em outros avanços, a invenção provê a administração de um ou mais EphA2-BiTEs da invenção sem quaisquer outras terapias para câncer para o tratamento de câncer, mas a quem foi mostrado por ser refratário a tais tratamentos. Em avanços específicos, pacientes refratários a outras terapias para câncer são administrados com um ou mais EphA2-BiTEs da invenção na ausência de terapias para câncer. Em outros avanços, pacientes com uma condição pré- cancerosa associada com células que sobre-expressam EphA2 podem ser administrados EphA2-BiTEs da invenção para tratar a desordem e diminuir a probabilidade de que a desordem irá progredir para câncer maligno. Em avanços específicos, a condição pré-cancerosa é neoplasia intraepitelial prostática de alta graduação (PIN), fibroadenoma de mama, doença fibrocistica, ou composto de nevi.

Cânceres

Cânceres e desordens relatadas que podem ser tratadas, prevenidas e/ou gerenciadas por métodos e composições da presente invenção incluem, mas não estão limitadas a: leucemias, tais como, mas não limitadas a, leucemia aguda, leucemia linfocitica aguda, leucemia mielocítica aguda, tais como, leucemias mieloblásticas, promielociticas, mielomonociticas, monocíticas, e eritroleucemia e síndrome mielodisplástica; leucemias crônicas, tais como, mas não limitadas a, leucemia mielocítica crônica (granulocítica), leucemia linfocitica crônica, leucemia de células capilares; policitemia vera; linfomas, tais como, mas não limitados a síndrome de Hodgkin, linfoma não de Hodgkin; mielomas múltiplos, tais como, mas não limitados a mieloma múltiplo latente, mieloma não secretor, mieloma osteosclerótico, leucemia de células do plasma, plasmacitoma solitário e plasmacitoma extramedular; macroglobulinemia de Waldenstrõm; gamopatia monoclonal de significância indeterminada; gamopatia monoclonal benigna; doença de cadeia pesada; sarcomas de tecido ósseo e conectivo, tais como, mas não limitados a sarcoma ósseo, osteossarcoma, condrossarcoma, sarcoma de Ewing, tumor maligno de célula gigante, fibrossarcoma de osso, cordoma, sarcoma periosteal, sarcomas de tecidos moles, angiossarcoma (hemangiossarcoma), fibrossarcoma, sarcoma de Kaposi, leiomiossarcoma, lipossarcoma, linfangiossarcoma, neurilemoma, rabdomiossarcoma, sarcoma sinuvial; tumores cerebrais, tais como, mas não limitados a, glioma, astrocitoma, glioma de tronco cerebral, ependimoma, oligodendroglioma, tumor não glial, neurinoma acústico, craniofaringioma, meduloblastoma, meningioma, pineocitoma, pineoblastoma, linfoma cerebral primário; câncer de mama incluindo, mas não limitado a adenocarcinoma, carcinoma lobular (células pequenas) , carcinoma intraductal, câncer de mama medular, câncer de mama mucino, câncer de mama tubular, câncer de mama papilar, doença de Paget, e câncer de mama inflamatório; câncer adrenal, tal como, mas não limitado a, feocromocitoma e carcinoma adrenocortical; câncer de tiróide, tal como, mas não limitado a câncer de tiróide papilar ou folicular, câncer de tiróide medular e câncer de tiróide anaplástico; câncer pancreático, tal como, mas não limitado a, insulinoma, gastrinoma, glucagonoma, vipoma, tumor secretor de somatostatina, e tumor de célula carcinóide ou islet; cânceres pituitários tais como, mas não limitados a, doença de Cushing, tumor secretor de prolactina, acromegalia, e diabetes insípida; cânceres de olho, tais como, mas não limitados a, melanoma ocular, tal como melanoma de íris, melanoma coroidal, e melanoma de corpo ciliar, e retinoblastoma; cânceres vaginais, tais como, carcinoma de célula escamosa, adenocarcinoma, e melanoma; câncer de vulva, tal como carcinoma de célula escamosa, melanoma, adenocarcinoma, carcinoma de célula basal, sarcoma, e doença de Paget; cânceres cervicais, tais como, mas não limitados a, carcinoma de célula escamosa, e adenocarcinoma; cânceres uterinos, tais como, mas não limitados a, carcinoma de endométrio e sarcoma uterino; cânceres ovarianos, .tais como, mas não limitados a, carcinoma epitelial ovariano, tumor borderline, tumor de célula germinal, e tumor de estroma; cânceres de esôfago, tais como, mas não limitados a, câncer escamoso, adenocarcinoma, carcinoma adenóide cistico, carcinoma mucoepidermóide, carcinoma adenoescamoso, sarcoma, melanoma, plasmacitoma, carcinoma verrucoso, e carcinoma de célula oat (células pequenas) ; cânceres de estômago, tais como, mas não limitados a, adenocarcinoma, fungo (polipóide), ulcerante, de dispesão superficial, de dispersão difusa, linfoma maligno, lipossarcoma, fibrossarcoma, e carcinossarcoma; cânceres de cólon; cânceres retais; cânceres de fígado, tais como, mas não limitados a, carcinoma hepatocelular e hepatoblastoma; cânceres de vesícula biliar, tais como, adenocarcinoma; colangiocarcinomas, tais como, mas não limitados a, papillares, nodulares, e difusos; cânceres de pulmão, tais como, câncer de pulmão que não de célula pequena, carcinoma de célula escamosa (carcinoma epidermóide), adenocarcinoma, carcinoma de células grandes e câncer de pulmão de célula pequena; cânceres de testículo, tais como, mas não limitados a, tumor germinal, seminoma, anaplástico, clássico (típico), espermatocítico, nonseminoma, carcinoma embrional, carcinoma teratoma, coriocarcinoma (tumor de saco vitelínico) , cânceres de próstata, tais como, mas não limitados a, adenocarcinoma, leiomiossarcoma, e rabdomiossarcoma; cânceres penais; cânceres orais, tais como, mas não limitados a, carcinoma de célula escamosa; cânceres basais; cânceres de glândulas salivares, tais como, mas não limitados a, adenocarcinoma, carcinoma mucoepidermóide, e carcinoma adenocístico; cânceres de faringe, tais como, mas não limitados a, câncer de célula escamosa, e verrucoso; cânceres de pele, tais como, mas não limitados a, carcinoma de célula basal, carcinoma de célula escamosa e melanoma, melanoma de dispersão superficial, melanoma nodular, melanoma maligno lentigo, melanoma acral lentiginoso; cânceres de rim, tais como, mas não limitados a, carcinoma de célula renal, adenocarcinoma, hipernefroma, fibrossarcoma, câncer de célula transicional (pélvis renal e/ ou uterer) ; tumor de Wilms; cânceres de bexiga, tais como, mas não limitados a, carcinoma de célula transicional, câncer de célula escamosa, adenocarcinoma, carcinossarcoma. Além disso, cânceres incluem mixossarcoma, sarcoma osteogênico, endoteliossarcoma, linfangioendoteliossarcoma, mesotelioma, sinovioma, hemangioblastoma, carcinoma epitelial, cistadenocarcinoma, carcinoma bronquiogênico, carcinoma de glândula sudorípara, carcinoma de glândula sebácea, carcinoma papilar e adenocarcinomas papilares (para uma revisão de tais desordens, ver Fishraan et al., 1985, Medicine, 2d Ed., J.B. Lippincott Co., Philadelphia and Murphy et al., 1997, Informed Decisions: The Complete Book of Câncer Diagnosis, Treatment, and Recoveryr Viking Penguin, Penguin Books U.S.A., Inc., United States of America).

Dessa forma, os métodos e composições da invenção são também úteis no tratamento, prevenção e/ou gerenciamento de uma variedade de cânceres ou outras doenças proliferativas anormais, incluindo (mas não limitadas a) os seguintes: carcinoma, incluindo aquele da bexiga, mama, cólon, rim, fígado, pulmão ovário, pâncreas, estomago, cervix, tiróide e pele; incluindo carcinoma de célula escamosa; tumores hematopoiéticos de linhagem linfóide, incluindo leucemia, leucemia aguda linfocítica, leucemia aguda linfoblástica, linfoma de célula B, linfoma de célula T, linfoma de Burkitt; tumores hematopoiéticos de linhagem mielóide, incluindo leucemias mielógenas agudas e crônicas e leucemia promielocítica; tumores de origem mesenquiymal, incluindo fibrossarcoma e rabdomioscarcoma; outros tumores, incluindo melanoma, seminoma, tetratocarcinoma, neuroblastoma e glioma; tumores do sistema nervoso central e periférico, incluindo astrocitoma, neuroblastoma, glioma, e schwannomas; tumores de origem mesenquimal, incluindo fibrossarcoma, rabdomiossarcoma, e osteossarcoma; e outros tumores, incluindo melanoma, xeroderma pigmentoso, queratoactantoma, seminoma, câncer folicular de tiróide e teratocarcinoma. É ainda contemplado que cânceres causados por aberrações em apoptose também poderiam ser tratados pelos métodos e composições da invenção. Tais cânceres podem incluir, mas não são limitados a, linfomas foliculares, carcinomas com mutações p53, tumores dependentes de hormônios de mama, próstata e ovário, e de lesões pré-cancerosas, tais como polipose familiar adenomatosa, e sindromes mielodisplásticas. Em avanços específicos, mudanças na malignitude ou desproliferativas (tais como metaplasias e displasias), ou desordens celulares hiperproliferativas, são tratadas ou prevenidas na pele, pulmão, cólon, mama, próstata, bexiga, rim, pâncreas, ovário, ou útero. Em outros avanços específicos, sarcoma, melanoma, ou leucemia são tratados ou prevenidos.

Em avanços específicos, os cânceres a serem tratados, prevenidos e/ou gerenciados pelos métodos e composições da invenção são de origem epitelial. Em outros avanços, o câncer é maligno e sobre-expressa EphA2. Em um avanço específico, o câncer compreende células que expressam EphA2 de maneira aberrante. Em outros avanços, a desordem a ser tratada é uma condição pré-cancerosa associada com células que sobre-expressam EphA2. Em um avanço específico, a condição pré-cancerosa é neoplasia intraepitelial prostática de alta graduação (PIN), fibroadenoma de mama, doença fibrocística, ou composto de nevi .

Em avanços específicos, os métodos e composições da invenção são usados para o tratamento, prevenção e/ou gerenciamento de cânceres de mama, cólon, ovariano, pulmão, e próstata e câncer de pele, tal como melanoma. Tratamento de Câncer de Mama

Em avanços específicos, a pacientes com câncer de mama é administrada uma quantidade efetiva de um ou mais EphA2- BiTEs da invenção. Em outro avanço, os EphA2-BiTEs da invenção podem ser administrados em combinação com uma quantidade efetiva de um ou mais outros agentes úteis para terapia de câncer de mama incluindo, mas não limitados a: doxorubicina, epirubicina, a combinação de doxorrubicina e ciclofosfamida (AC), a combinação de ciclofosfamida, doxorubicina e 5-fluorouracil (CAF), a combinação de ciclofosfamida, epirubicina e 5-fluorouracil (CEF), herceptina, tamoxifen, a combinação de tamoxifen e quimioterapia citotóxica, taxanas (tais como docetaxel e paclitaxel). Em um avanço adicional, EphA2-BiTEs da invenção podem ser administrados com taxanas mais doxorubicina padrão e ciclofosfamida para tratamento com adjuvante de câncer de mama localizado nodo positivo.

Em um avanço específico, a pacientes com fibroadenoma pré-canceroso de mama ou doença fibrocística é administrado um EphA2-BiTE da invenção para tratar a desordem e diminuir a probabilidade de que esta irá progredir para câncer de mama maligno.

Tratamento de Câncer de Cólon Em avanços específicos, a pacientes com câncer de cólon é administrada uma quantidade efetiva de um ou mais EphA2-BiTEs da invenção. Em outro avanço, os anticorpos da invenção podem ser administrados em combinação com ima quantidade efetiva de um ou mais outros agentes úteis para terapia de câncer de cólon, incluindo, mas não limitados a: a combinação de 5-FU e leucovorina, a combinação de 5-FU e levamisola, irinotecan (CPT-11) ou a combinação de irinotecan, 5-FU e leucovorina (IFL).

Tratamento de Câncer de Próstata

Em avanços específicos, a pacientes com câncer de próstata é administrada uma quantidade efetiva de um ou mais EphA2-BiTEs da invenção. Em outro avanço, os EphA2- BiTEs da invenção podem ser administrados em combinação com uma quantidade efetiva de um ou mais outros agentes úteis para terapia de câncer de próstata incluindo, mas não limitado a: radioterapia por feixe externo, implantação intersticial de radioisótopos (i.e., I125, paládio, irídio) , leuprolida ou outros agonísticos LHRH, antiandrógenos não esteróides (flutamida, nilutamida, bicalutamida), antiandrógenos esteróides (acetato de ciproterona), a combinação de leuprolida e flutamida, estrogênios, tais como DES, clorotrianiseno, etinil estradiol, estrogênios conjugados U.S.P., DES-disfosfato, radioisótopos, tais como estrôncio-89, a combinação de radioterapia por feixe externo e estrôncio-89, terapias hormonais de segunda linha, tais como, aminoglutetimida, hidrocortisona, retirada de flutamida, progesterona, e quetoconazole, prednisona em dose baixa, ou outros regimes de quimioterapia relatados por produzir melhora subjetiva nos sintomas e redução no nível de PSA, incluindo docetaxel, paclitaxel, estramustina/docetaxel, estramustina/etoposida, estramustina/vinblastina, e estramustina/paclitaxel.

Em um avanço específico, a pacientes com neoplasia prostática intraepitelial pré-cancerosa de alta graduação (PIN) é administrado um EphA2-BiTE da invenção para tratar a desordem e diminuir a probabilidade de que isto irá progredir para câncer de próstata maligno.

Tratamento de Melanoma

Em avanços específicos, a pacientes com me lano-ma é administrada uma quantidade efetiva de um ou mais EphA2- BiTEs da invenção. Em outro avanço, os EphA2-BiTEs da invenção podem ser administrados em combinação com uma quantidade efetiva de um ou mais outros agentes úteis para terapia para câncer melanoma incluindo, mas não limitados a: dacarbazina (DTIC) , nitrosouréias, tais como, carmustina (BCNU) e lomustina (CCNU), agentes com atividade modesta de agente único, incluindo vinca alcalóides, compostos de platina, e taxanas, o regime Dartmouth (cisplatina, BCNU, e DTIC), alfa-interferon (IFN-A), e interleuquina-2 (IL-2). Em um avanço específico, uma quantidade efetiva de um ou mais EphA2-BiTEs da invenção pode ser administrada em combinação com perfusão de membro hipertérmica isolada (ILP) com melfalan (L-PAM) , com ou sem fator alfa de necrose tumoral (TNF-alfa) a pacientes com múltiplas metástases cerebrais, metástases ósseas, e compressão de medula espinhal para alcançar alivio de sintomas e algum encolhimento do tumor com radioterapia.

Em um avanço especifico, a pacientes com composto de nevi pré-canceroso é administrado um EphA2-BiTE da invenção para tratar a desordem e diminuir a probabilidade de que irá progredir para melanoma maligno.

Tratamento de Câncer de Ovário '

Em avanços específicos, a pacientes com câncer de ovário é administrada uma quantidade efetiva de um ou mais EphA2-BiTEs da invenção. Em outro avanço, os EphA2-BiTEs da invenção podem ser administrados em combinação com uma quantidade efetiva de um ou mais outros agentes úteis para terapia para câncer de ovário incluindo, mas não limitados a: radioterapia intraperitoneal, tais como terapia com P32, radioterapia abdominal e pélvica total, cisplatina, a combinação de paclitaxel (Taxol) ou docetaxel (Taxotere) e cisplatina ou carboplatina, a combinação de ciclofosfamida e cisplatina, a combinação de ciclofosfamida e carboplatina, a combinação de 5-FU e leucovorina, etoposida, doxorubicina lipossomal, gemcitabina ou topotecan. É contemplado que uma quantidade efetiva de um ou mais EphA2-BiTEs da invenção é administrada em combinação com a administração de Taxol para pacientes com doença refratária a platina. Incluído está o tratamento de pacientes com câncer de ovário refratários incluindo a administração de: ifosfamida em pacientes com doença que é refratária a platina, hexametilmelamina (HMM) como quimioterapia de recuperação após a falha dos regimes de combinação baseados em platina, e tamoxifen em pacientes com níveis detectáveis de receptor de estrogênio citoplasmático em seus tumores.

Tratamento de Cânceres de Pulmão

Em avanços específicos, a pacientes com câncer de pulmão de células pequenas é administrada uma quantidade efetiva de um ou mais EphA2-BiTEs da invenção. Em outro avanço, os EphA2-BiTEs da invenção podem ser administrados em combinação com uma quantidade efetiva de um ou mais outros agentes úteis para terapia de câncer de pulmão incluindo, mas não limitados a: radioterapia toráxica, cisplatina, vincristina, doxorubicina, e etoposida, sozinhas ou em combinação, a combinação de ciclofosfamida, doxorubicina, vincristina/etoposida, e cisplatina (CAV/EP), mitigação local com terapia de laser endobronquial, stents endobronquiais, e/ou braquiterapia.

Em outros avanços específicos, a pacientes com câncer de pulmão que não de células pequenas é administrada uma quantidade efetiva de um ou mais EphA2-BiTEs da invenção em combinação com uma quantidade efetiva de um ou mais outros agentes úteis para terapia de câncer de pulmão incluindo, mas não limitados a: radioterapia paliativa, a combinação de cisplatina, vinblastina e mitomicina, a combinação de cisplatina e vinorelbina, paclitaxel, docetaxel ou gemcitabina, a combinação de carboplatina e paclitaxel, radioterapia intersticial para lesões endobronquiais ou radiocirurgia estereotática.

Outros Agentes Profiláticos/Terapêuticos

Em alguns avanços, a terapia por administração de um ou mais EphA2-BiTEs da invenção é combinada com a administração de uma ou mais terapias, tais como, mas não limitadas a, quimioterapias, radioterapias, terapias hormonais, e/ou terapias biológicas/imunoterapias. Agentes profiláticos ou terapêuticos incluem, mas não estão limitados a, moléculas protéicas, incluindo, mas não limitadas a, peptídeos, polipeptídeos, proteínas, incluindo proteínas modificadas após a tradução, anticorpos etc.; ou moléculas pequenas (de menos de 1000 dáltons), compostos inorgânicos ou orgânicos; ou moléculas de ácidos nucléicos incluindo, mas não limitadas a, DNA de dupla-fita ou fita simples, ou RNA de dupla-fita ou fita simples, assim como moléculas de ácidos nucléicos de hélice tripla. Agentes profiláticos ou terapêuticos podem ser derivados de qualquer organismo conhecido (incluindo, mas não limitado a, animais, plantas, bactérias, fungos, e protistas, ou vírus) ou de uma biblioteca de moléculas sintéticas. Tais terapias podem ser administradas antes, concomitantemente, ou após a administração de um ou mais EphA2-BiTEs da invenção.

Em um avanço especifico, os métodos da invenção englobam a administração de um EphA2-BiTE da invenção em combinação com a administração de um ou mais agentes profiláticos/terapêuticos que são inibidores de quinases, tais como, mas não limitados a, ABL, ACK, AFK, AKT (e.g., AKT-I, AKT-2, and AKT-3), ALK, AMP-PK, ATM, Aurorai, Aurora2, bARKl, bArk2, BLK, BMX, BTK, CAK, CaM quinase, CDC2, CDK, CK, COT, C TD, DNA-PK, EGF-R, ErbB-1, ErbB-2, ErbB-3, ErbB-4, ERK (e.g., ERKl, ERK2, ERK3, ERK4, ERK5, ERK6, ERK7), ERT-PK, FAK, FGR (e.g., FGF1R, FGF2R), FLT (e.g., FLT-I, FLT-2, FLT-3, FLT-4), FRK, FYN, GSK (e.g., GSKl, GSK2, GSK3-alpha, GSK3-beta, GSK4, GSK5), quinases receptoras de proteína G combinada (GRKs), HCK, HER2, HKII, JAK (e.g., JAKl, JAK2, JAK3, JAK4), JNK (e.g., JNKl, JNK2, JNK3), KDR, KIT, receptor de IGF-1, IKK-1, IKK-2, INSR (receptor de insulina), IRAKl, IRAK2, IRK, ITK, LCK, LOK, LYN, MAPK, MAPKAPK-1, MAPKAPK-2, MEK, MET, MFPK, MHCK, MLCK, MLK3, NEU, NIK, alfa receptor de PDGF, beta receptor de PDGF, PHK, PI-3 quinase, PKA, PKB, PKC, PKG, PRK1, PYK2, p38 quinases, pl35tyk2, p34cdc2, p42cdc2, p42mapk, p44mpk, RAF, RET, RIP, RIP-2, RK, RON, RS quinase, SRC, SYK, S6K, TAKl, TEC, TIEl, TIE2, TRKA, TXK, TYK2, UL13, VEGFRl, VEGFR2, YES, YRK, ZAP-70, e todos subtipos dessas quinases (ver e.g., Hardie and Hanks (1995) The Protein Kinase Facts Book, I and II, Academic Press, San Diego, Calif.). Em avanços preferidos, um EphA2-BiTE da invenção é administrado em combinação com a administração de um ou mais agentes profiláticos/terapêuticos que são inibidores de quinases receptoras de Eph (e.g., EphA2) . Em um avanço mais preferencial, um EphA2-BiTE da invenção é administrado em combinação com a administração de um ou mais agentes profiláticos/terapêuticos que são inibidores de EphA2.

Em outro avanço especifico, os métodos da invenção englobam a administração de um EphA2-BiTE da invenção em combinação com a administração de um ou mais agentes profiláticos/terapêuticos que são inibidores de angiogênese, tais como, mas não limitados a: Angiostatina (fragmento plasminogenico); antitrombina III

antiangiogênica; Angiozyme; ABT-627; Bay 12-9566; Benefina; Bevacizumab; BMS-275291; inibidor derivado de cartilagem (CDI); CAI; fragmento complemento de CD59; CEP-7055; Col 3; Combretastatina A-4; Endostatina (fragmento de colágeno XVIII); fragmento de fibronectina; Gro-beta; Halofuginona; Heparinases; fragmento de Heparina hexassacarídea; HMV833; gonadotropina coriônica humana (hCG); IM-862; alfa/beta/gama Interferon; proteína induzida por Interferon (IP-IO); Interleuquina-12; Kringle 5 (fragmento plasminogênico) ; Marimastat; inibidores de Metaloproteinase (TIMPs); 2-Metoxeestradiol; MMI 270 (CGS 27023A); MoAb IMC- 1C11; Neovastat; NM-3; Panzera; PI-88; inibidor de ribonuclease de placenta; inibidor de Plasminogen ativador; Platelet fator-4 (PF4); Prinomastat; fragmento de Prolactina de 16kD; proteína relacionada com Proliferina (PRP); PTK 787/ZK 222594; Retinóides; Solimastat; esqualamina; SS 3304; SU 5416; SU6668; SU11248; Tetrahidrocortisol-S; tetratiomolibdato; talidomida; Trombospondina-1 (TSP-1); TNP-470; fator de crescimento beta de transformação (TGF-β); Vasculostatina; Vasostatina fragmento de calreticulina); ZD6126; ZD6474; inibidores de farnesil transferase (FTI); e bisfosfonatos.

Em outro avanço especifico, os métodos da invenção englobam a administração de um EphA2-BiTE da invenção em combinação com a administração de um ou mais agentes profiláticos/terapêuticos que são agentes anti-câncer, tais como, mas não limitados a: acivicina, aclarubicina, hidrocloreto de acodazola, acronina, adozelesina, aldesleuquina, altretamina, ambomicina, acetato de ametantrona, aminoglutetimida, amsacrina, anastrozola, antramicina, asparaginase, asperlina, azacitidina, azetepa, azotomicina, batimastat, benzodepa, bicalutamida, hidrocloreto de bisantreno, dimesilato de bisnafida, bizelesina, sulfato de bleomicina, brequinar sódio, bropirimina, busulfan, cactinomicina, calusterona, caracemida, carbetimer, carboplatina, carmustina, hidrocloreto de carubicina, carzelesina, cedefingol, chlorambucil, cirolemicina, cisplatina, cladribina, crisnatol mesilato, ciclofosfamida, citarabina, dacarbazina, dactinomicina, hidrocloreto de daunorubicina, decarbazina, decitabina, dexormaplatina, dezaguanina, dezaguanina mesilato, diaziquona, docetaxel, doxorubicina, hidrocloreto de doxorubicina, droloxifeno, droloxifeno citrato, propionato de dromostanolona, duazomicina, edatrexato, hidrocloreto de eflornitina, elsamitrucina, enloplatina, enpromato, epipropidina, hidrocloreto de epirubicina, erbulozola, hidrocloreto de esorubicina, estramustina, estramustina sódio fosfato, etanidazola, etoposida, fosfato de etoposida, etoprina, hidrocloreto de fadrozola, fazarabina, fenretinida, floxuridina, fosfato de fludarabina, fluorouracil, flurocitabina, fosquidona, sódio fostriecina, gemcitabina, hidrocloreto de gemcitabina, hidroxiuréia, hidrocloreto de idarubicina, ifosfamida, ilmofosina, interleuquina 2 (incluindo interleuquin 2 recorabinante, ou rIL2), alfa-2a interferon, alfa-2b interferon, alfa-nl interferon, alfa-n3 interferon, beta-I a interferon, gama-I b interferon, iproplatina, hidrocloreto de irinotecan, acetato de lanreotida, letrozola, acetato de leuprolida, hidrocloreto de liarozola, lometrexol sódio, lomustina, hidrocloreto de losoxantrona, masoprocol, maitansina, hidrocloreto de mecloretamina, acetato de: megestrol, acetato de melengestrol, melfalan, menogaril, mercaptopurina, metotrexato, sódio metotrexato, metoprina, meturedepa, mitindomida, mitocarcina, mitocromina, mitogilina, mitomalcina, mitomicina, mitosper, mitotano, hidrocloreto de mitoxantrona, ácido micofenólico, nitrosouréias, nocodazola, nogalamicina, ormaplatina, oxisuran, paclitaxel, pegaspargase, peliomicina, pentamustina, sulfato de peplomicina, perfosfamida, pipobroman, piposulfan, hidrocloreto de piroxantrona, plicamicina, plomestano, porfimero sódico, porfiromicina, prednimustina, hidrocloreto de procarbazina, puromicina, hidrocloreto de puromicina, pirazofurina, riboprina, rogletimida, safingol, hidrocloreto de safingol, semustina, simtrazeno, sódio esparfosato, esparsomicina, hidrocloreto de espirogermânio, espiromustina, espiroplatina, estreptonigrina, estreptozocina, sulofenur, talisomicina, sódio tecogalan, tegafur, hidrocloreto de teloxantrona, temoporfina, teniposida, teroxirona, testolactona, tiamiprina, tioguanina, tiotepa, tiazofurina, tirapazamina, toremifeno citrato, acetato de trestolona, fosfato de triciribina, trimetrexato, trimetrexato glucuronato, triptorelina, hidrocloreto de tubulozole, mostarda de uracil, uredepa, vapreotida, verteporfina, sulfato de vinblastina, sulfato de vincristina, vindesina, sulfato de vindesina, sulfato de vinepidina, sulfato de vinglicinato, sulfato de vinleurosina, vinorelbina tartrato, sulfato de vinrosidina, sulfato de vinzolidina, vorozola, zeniplatina, zinostatina, hidrocloreto de zorubicina. Outras drogas anti-câncer incluem, mas não estão limitadas a: 20-epi-1,25 dihidroxivitamina D3, 5-etiniluracil, abiraterona, aclarubicina, acilfulveno, adecipenol, adozelesina, aldesleuquina, ALL-TK antagonistas, altretamina, ambamustina, amidox, amifostina, ácido aminolevulinico, amrubicina, amsacrina, anagrelida, anastrozola, andrografolida, inibidores de angiogênese, antagonista D, antagonista G, antarelix, proteína-1 anti-dorsal morfogenética, antiandrógenos, antiestrógenos, antineoplastona, afidicolina glicinato, moduladores de gene de apoptose, reguladores de apoptose, ácido apurinico, ara- CDP-DL-PTBA, arginina deaminase, asulacrina, atamestano, atrimustina, axinastatina 1, axinastatina 2, axinastatina 3, azasetrona, azatoxina, azatirosina, derivados de bacatina III, balanol, batimastat, BCR/ABL antagonistas, benzoclorinas, benzoilstaurosporina, derivados de beta lactam, beta-aletina, betaclamicina B, ácido betulinico, inibidor de bFGF, bicalutamida, bisantreno, bisaziridinilspermina, bisnafida, bistrateno A, bizelesina, breflato, bropirimina, budotitana, butionina sulfoximina, calcipotriol, calfostin C, derivados de camptotecina, canaripox IL-2, capecitabina, carboxamida-amino-triazola, carboxiamidotriazola, CaRest M3, CARN 700, inibidor derivado de cartilagem, carzelesina, inibidores de caseina quinase (ICOS), castanospermina, cecropina B, cetrorelix, cloroquinoxalina sulfonamida, cicaprost, cis-porfirina, cladribina, análogos de clomifeno, clotrimazola, colismicina A, colismicina B, combretastatina A4, análogo de combretastatina, conagenina, crambescidina 816, crisnatol, criptoficina 8, derivados de criptoficina A, curacina A, ciclopentantraquinonas, cicloplatam, cipemicina, citarabina ocfosfato, fator citolitico, citostatina, dacliximab, decitabina, dehidrodidemnina B, deslorelina, dexametasona, dexifosfamida, dexrazoxano, dexverapamil, diaziquona, didemnina B, didox, dietilnorspermina, dihidro-5-azacitidina, dihidrotaxol, dioxamicina, difenil espiromustina, docetaxel, docosanol, dolasetron, doxifluridina, droloxifeno, dronabinol, duocarmicina SA, ebselen, ecomustina, edelfosina, edrecolomab, eflornitina, elemeno, emitefur, epirubicina, epristerida, análogo de estramustina, agonistas de estrogênio, antagonistas de estrogênio, etanidazola, fosfato de etoposida, exemestano, fadrozola, fazarabina, fenretinida, filgrastim, finasterida, flavopiridol, flezelastina, fluasterona, fludarabina, hidrocloreto de fluorodaunorunicina, forfenimex, formestano, fostriecina, fotemustina, gadolinio texafirina, nitrato de gálio, galocitabina, ganirelix, inibidores de gelatinase, gemcitabina, inibidores de glutationa, hepsulfam, heregulina, hexametileno bisacetamida, hipericina, ácido ibandrônico, idarubicina, idoxifeno, idramantpna, ilmofosina, ilomastat, imidazoacridonas, imiquimod, peptideos imunoestimulantes, inibidor de receptor de fator de crescimento-1 tipo insulina, agonistas de interferon, interferons, interleuquinas, iobenguana, iododoxorubicina, ipomeanol, iroplact, irsogladina, isobengazola, isohomohalicondrina B, itasetron, jasplaquinolida, cahalalida F, lamelarina-N triacetato, lanreotida, leinamicina, lenograstim, sulfato de lentinan, leptolstatina, Ietrozola7 fator inibidor de leucemia, leucócito alfa interferon, leuprolida+estrogênio+progesterona, leuprorelina, levamisola, liarozola, análogo de poliamina linear, peptideo disacarideo lipofilico, compostos lipofilicos de platina, lissoclinamida 7, lobaplatina, lombricina, lometrexol, lonidamina, losoxantrona, lovastatina, loxoribina, lurtotecan, texafirina de lutécio, lisofilina, peptideos liticos, maitansina, manostatina A, marimastat, masoprocol, maspina, inibidores de matrilisina, inibidores de matriz de metaloproteinase, menogaril, merbarona, meterelina, metioninase, metoclopramida, inibidor de MIF, mifepristona, miltefosina, mirimostim, RNA de dupla-fita com falta de correspondência, mitoguazona, mitolactol, análogos de mitomicina, mitonafida, saporina de fator de crescimento de mitotoxina fibroblástica, mitoxantrona, mofaroteno, molgramostim, anticorpo monoclonal, gonadotrofina coriônica humana, monofosforil lipideo A+sk de parede celular de miobacterium, mopidamol, inibidor de gene de resitência a drogas múltiplas, terapia baseada em supressor 1 de tumor múltiplo, agente anticâncer mostarda, micaperoxida B, extrato de parede celular micobacteriana, miriaporona, N-acetildinalina, benzamidas N-substituidas, nafarelina, nagrestip, naloxona+pentazocina, napavina, nafterpina, nartograstim, nedaplatina, nemorubicina, ácido neridrônico, endopeptidase neutra, nilutamida, nisamicina, moduladores de óxido nitrico, nitróxido antioxidante, nitrulina, 06-benzilguanina, octreotida, oquicenona, oligonucleotideos, onapristona, ondansetron, ondansetron, oracina, indutor de citoquina oral, ormaplatina, osaterona, oxaliplatina, oxaunomicina, paclitaxel, análogos de paclitaxel, derivados de paclitaxel, palauamina, palmitoilrizoxina, ácido pamidrônico, panaxitriol, panomifeno, parabactina, pazeliptina, pegaspargase, peldesina, pentosan sódio polissulfato, pentostatina, pentrozola, perflubron, perfosfamida, álcool perilil, fenazinomicina, fenilacetato, inibidores de fosfatase, picibanil, hidrocloreto de pilocarpina, pirarubicina, piritrexim, placetina A, placetina B, inibidor de ativador de plasminogen, complexo de platina, compostos de platina, complexo platina-triamina, sódio porfímero, porfiromicina, prednisona, propil bis-acridona, prostaglandina J2, inibidores de proteasoma, modulador imune baseado em proteína A, inibidor de proteína quinase C, inibidores de proteína quinase C, microalgal, inibidores de proteína tirosina fosfatase, inibidores de purina nucleosídeo fosforilase, purpurinas, pirazoloacridina, conjugado piridoxilado hemoglobina polioxietileno, raf antagonistas, raltitrexato, ramosetron, inibidores de ras farnesil proteína transferase, inibidores de ras, inibidor de ras- GAP, reteliptina demetilada, rênio Re 186 etidronato, rizoxina, ribozimas, RII retinamida, rogletimida, rohituquina, romurtida, roquinimex, rubiginona BI, ruboxil, safingol, saintopina, SarCNU, sarcofitol A, sargramostim, Sdi 1 mimetics, semustina, inibidor 1 derivado de senescência, oligonucleotídeos senso, inibidores de sinal de transdução, moduladores de sinal de transdução, proteína de ligação a antígeno de cadeia simples, sizofiran, sobuzoxano, borocaptato de sódio, fenilacetato de sódio, solverol, proteína de ligação de somatomedina, sonermina, ácido esparfósico, espicamicina D, espiromustina, esplenopentina, espongistatina 1, esqualamina, inibidor de células-tronco, inibidor de divisão de células-tronco, estipiamida, inibidores de estromelisina, sulfinosina, antagonista de peptídeo intestinal superativo vasoativo, suradista, suramina, swainsonina, glicosaminoglicanas sintéticas, talimustina, tamoxifen metiodida, tauromustina, taxol, tazaroteno, sódio tecogalan, tegafur, telurapirílio, inibidores de telomerase, temoporfina, temozolomida, teniposida, tetraclorodecaoxida, tetrazomina, taliblastina, talidomida, tiocoralina, tioguanina, trombopoietina, trombopoietina mimética, timalfasina, agonista de receptor de timopoietina, timotrinan, hormônio estimulador de tiróide, tin etil etiopurpurina, tirapazamina, bicloreto de titanoceno, topsentina, toremifeno, fator de célula-tronco totipotente, inibidores de tradução, tretinoina, triacetiluridina, triciribina, trimetrexato, triptorelina, tropisetron, turosterida, inibidores de tirosina quinase, tirfostinas, inibidores de UBC, ubenimex, fator de inibição de crescimento derivado de sinus urogenital, antagonistas de receptor de uroquinase, vapreotida, variolina B, sistema vetor, terapia gênica de eritrócito, velaresol, veramina, verdinas, verteporfina, vinorelbina, vinxaltina, VITAXIN®, vorozola, zanoterona, zeniplatina, zilascorb, e zinostatina estimalamer. Drogas anticâncer preferidas adicionais são 5-fluorouracil e leucovorina.

Em avanços mais particulares, a presente invenção também compreende a administração de um ou mais EphA2-BiTEs da invenção em combinação com a administração de uma ou mais terapias, tais como, mas não limitadas a, agentes anti-câncer, tais como aqueles descritos na Tabela 1, preferencialmente para o tratamento de cânceres de mama, ovário, melanoma, próstata, cólon e pulmão, como descrito acima. TABELA 1

<table>table see original document page 180</column></row><table> <table>table see original document page 181</column></row><table> <table>table see original document page 182</column></row><table> <table>table see original document page 183</column></row><table> <table>table see original document page 184</column></row><table> <table>table see original document page 185</column></row><table> <table>table see original document page 186</column></row><table>

A invenção também engloba a administração dos EphA2- BiTEs da invenção em combinação com radioterapia compreendendo o uso de raios x, raios gama e outras fontes de radiação para destruir as células cancerosas. Em avanços preferidos, o tratamento por radiação é administrado como feixe de radiação externo ou teleterapia caracterizado pelo fato de que a radiação é direcionada a partir de uma fonte remota. Em outros avanços preferidos, o tratamento por radiação é administrado como terapia interna ou braquiterapia caracterizado pelo fato de que uma fonte radioativa é colocada dentro do corpo, perto das células cancerosas ou massa tumoral.

Terapias para câncer e suas dosagens, rotas de administração e uso recomendado são conhecidas na arte e foram descritas em tal literatura como a referência Physicians' Desk Reference (61st ed., 2007).

Pacientes com Desordens celulares hiperproliferativas A presente invenção provê métodos para tratar, prevenir e/ou gerenciar a desordem celular hiperproliferativa ou um sintoma dessa, os métodos compreendendo administrar a um sujeito um ou mais EphA2- BiTE da invenção sozinho ou em combinação com terapias que não um EphA2-BiTE.O sujeito é um animal, preferencialmente um mamífero, tal como não primata (e.g., vacas, porcos, cavalos, gatos, cachorros, ratos, etc.) e um primata (e.g., macaco, tal como um macaco cinomolgus ou humano). Em um avanço preferencial, o sujeito é um humano.

Em um avanço específico, a desordem celular hiperproliferativa não é câncer. Exemplos não limitantes de desordens celulares hiperproliferativas a serem tratadas, prevenidas e/ou gerenciadas pelos métodos da invenção são descritos, e.g., in U.S. Pat. Pub. No. 2005- 0059592, intitulada "EphA2 and Hyperproliferative Cell Disorders", que é incorporada por referência aqui em sua íntegra. Dessa forma, a invenção também provê composições e métodos projetados para o tratamento, prevenção e/ou gerenciamento de desordens celulares hiperproliferativas (exemplos não limitantes de tais desordens estão descritos em, e.g., U.S. Pat. Pub. No. 2005-0059592, intitulada "EphA2 and Hyperproliferative Cell Disorders", que é incorporada por referência aqui em sua íntegra).

Em particular, a presente invenção provê métodos para tratar, prevenir e/ou gerenciar uma desordem celular hiperproliferativa onde a expressão de EphA2 é regulada positivamente em células afetadas por tal desordem, ditos métodos compreendendo administrar a um sujeito em necessidade do mesmo uma quantidade efetiva de um ou mais EphA2-BiTEs da invenção, e opcionalmente, uma quantidade efetiva de uma terapia que não um EphA2-BiTE. Em um avanço preferencial, a desordem celular hiperproliferativa a ser tratada, prevenida e/ou gerenciada de acordo com os métodos da invenção são asma, COPD, fibrose pulmonar, asbestose, IPF, DIP, UIP, fibrose renal, fibrose hepática, outras fibroses, bronquial hiper-responsivo, psoriase, derma.tite seborréica, fibrose cistica, ou uma desordem celular hiperproliferativa endotelial, tal como, restenose, doença vascular hiperproliferativa, síndrome de Behcet, aterosclerose, degeneração macular, ou uma desordem hiperproliferativa de fibroblasto.

Pacientes com Desordens Inflamatória e/ou Autoimune

A presente invenção provê métodos para tratar, administrar e/ou prevenir uma desordem inflamatória ou auto-imune ou um sintoma dessa, os métodos compreendendo administrar a um sujeito um ou mais EphA2-BiTE da invenção sozinho ou em combinação com terapias que não um EphA2- BiTE. O sujeito é preferencialmente um mamífero tal como um primata (e.g., macaco (e.g., um macaco rhesus, macaco cinomolgus ou chimpanzé) , ou humano). Em um avanço preferencial, o sujeito é um humano. Em particular, a presente invenção provê métodos para tratar, prevenir, e/ou gerenciar uma desordem inflamatória ou auto-imune onde a expressão de EphA2 é regulada positivamente em células afetadas por tal desordem, ditos métodos compreendendo administrar a um sujeito em necessidade uma quantidade efetiva de um ou mais EphA2- BiTEs da invenção, e opcionalmente, uma quantidade efetiva de uma terapia que não um EphA2-BiTE. Em avanços específicos, a desordem inflamatória ou auto-imune a ser tratada é uma desordem descrita em, e.g., International Publication No. WO 00/78815, International Publication No. WO 02/070007 Al, datada de 12 de setembro de 2002, intitulada "Methods of Preventing or Treating Inflammatory or Autoimmune Disorders by Administering Integrin AlphaV Béta3 Antagonists", International Publication No. WO 03/075957 Al, datada de 18 de setembro de 2003, intitulada "The Prevention or Treatment of Câncer Using Integrin AlphaVBeta3 Antagonists in combination with Other Agents", U.S. Patent Pub. No. US 2002/0168360 Al, datada de 14 de novembro de 2002, intitulada "Methods of Preventing or Treating Inflammatory or Autoimmune Disorders by Administering Integrin ανβ3 Antagonists in combination with Other prophylactic or therapeutic Agents", e International Publication No. WO 03/075741 A2, datada de 18 de setembro de 2003, intitulada, "Methods of Preventing or Treating Disorders by Administering an Integrin ανβ3 Antagonist in combination with an HMG-CoA Reductase Inhibitor or a Bisphosphonate", cada qual é aqui incorporada por referência em sua íntegra. De acordo com esses avanços, os EphA2-BiTEs da invenção são administrados em combinação com uma quantidade efetiva de VITAXIN® (Medlmmune, Inc., International Publication No. WO 00/78815, International Publication No. WO 02/070007 Al, datada de 12 de setembro de 2002, intitulada "Methods of Preventing or Treating Inflammatory or Autoimmune Disorders by Administering Integrin AlphaV Beta3 Antagonists", International Publication No. WO 03/075957 Al, datada de 18 de setembro de 2003, intitulada "The Prevention or Treatment of Câncer Using Integrin AlphaVBeta3 Antagonists in combination with Other Agents", U.S. Patent Pub. No. US 2002/0168360 Al, datada de 14 de novembro de 2002, intitulada "Methods of Preventing or Treating Inflammatory or Autoimmune Disorders by Administering Integrin ανβ3 Antagonists in combination with Other prophylactic or therapeutic Agents", e International Publication No. WO 03/075741 A2, datada de 18 de setembro de 2003, intitulada, "Methods of Preventing or Treating Disorders by Administering an Integrin ανβ3 Antagonist in combination with an HMG-CoA Reductase Inhibitor or a Bisphosphonate", cada qual é aqui incorporada por referência em sua integra). Em outro avanço especifico, a invenção provê métodos para tratar, prevenir e/ou gerenciar uma desordem inflamatória ou auto-imune ou um ou mais sintomas dessa, ditos métodos compreendendo administrar a um sujeito em necessidade uma quantidade efetiva de um ou mais EphA2-BiTEs da invenção em combinação com uma quantidade efetiva de siplizumab (Medlmmune, Inc., International Pub. No. WO 02/069904, que é aqui incorporada por referência em sua integra). Em outro avanço especifico, a invenção provê métodos para tratar, prevenir e/ou gerenciar uma desordem inflamatória ou auto-imune ou um ou mais sintomas dessa, ditos métodos compreendendo administrar a um sujeito em necessidade uma quantidade efetiva de um ou mais EphA2-BiTEs da invenção em combinação com uma quantidade efetiva de uma agente anti-inflamatório descrito na Seção 5.4.2.4, infra.

Pacientes com Infecções

A presente invenção provê métodos para tratar, prevenir e/ou gerenciar uma infecção (em particular, uma infecção intracelular) , ou um sintoma dessa, os métodos compreendendo administrar um ou mais EphA2-BiTE da invenção sozinhos ou em combinação com terapias que não um EphA2- BiTE. 0 sujeito é preferencialmente um mamífero, tal como não primata (e.g., vacas, porcos, cavalos, gatos, cachorros, ratos, etc.) e um primata (e.g., macaco (e.g., macaco rhesus, um macaco cinomolgus ou chimpanzé) e humano). Em um avanço preferencial, o sujeito é um humano.

Os métodos da invenção compreendem a administração de um ou mais EphA2-BiTEs da invenção a pacientes sofrendo de ou esperados por sofrer de (e.g., pacientes com uma predisposição genética para ou pacientes que sofreram previamente de) uma infecção. Tais pacientes pode ter sido previamente tratados ou estão sendo atualmente tratados para a infecção, e.g., com uma terapia sem EphA2-BiTE. Em um avanço adicional, os métodos da invenção compreendem a administração de um ou mais EphA2-BiTEs da invenção para pacientes que são imunocomprometidos ou imunossuprimidos.

Em um certo avanço, um EphA2-BiTE não é administrado a pacientes que são imunocomprometidos ou imunossuprimidos. De acordo com a invenção, um EphA2-BiTE pode ser usado como qualquer linha de terapia, incluindo, mas não limitado a, uma primeira, segunda, terceira e quarta linha de terapia.

Ainda, de acordo com a invenção, um EphA2-BiTE pode ser usado antes de ocorrer qualquer efeito adverso ou intolerância das terapias sem EphA2-BiTE. A invenção engloba métodos para administrar um ou mais EphA2-BiTEs da invenção para prevenir o começo ou recorrência de uma infecção.

Em um avanço, a invenção também provê métodos de tratamento, prevenção e/ou gerenciamento de uma infecção como alternativas para terapias atuais. Em um avanço especifico, a terapia atual foi mostrada ou pode ser muito tóxica (i.e., resulta em efeitos colaterais inaceitáveis ou insuportáveis) para o paciente. Em outro avanço, um EphA2- BiTE diminui os efeitos colaterais se comparado com a terapia atual. Em outro avanço, o paciente foi mostrado refratário a uma terapia atual. Em tais avanços, a invenção provê a administração de um ou mais EphA2-BiTEs da invenção sem quaisquer outras terapias anti-infecção. Em certos avanços, um ou mais EphA2-BiTEs da invenção podem ser administrados a um paciente em necessidade ao invés de outra terapia para tratar uma infecção. Em um avanço, a invenção prove métodos de tratar, prevenir e/ou gerenciar uma infecção ativa. Em outro avanço, a invenção provê métodos de tratar, prevenir e/ou gerenciar uma infecção latente. Em outro avanço, a invenção provê métodos de prevenir a recorrência de uma infecção aguda. Ainda em outro avanço, a invenção provê métodos de tratar, prevenir e/ou gerenciar uma infecção crônica.

A presente invenção também engloba métodos para administrar um ou mais EphA2-BiTEs da invenção para tratar, prevenir e/ou gerenciar sintomas de infecções em pacientes que são ou se tornaram refratários a terapias sem EphA2- BiTE. A determinação de ser a infecção é refratária pode ser feita in vivo ou in vitro por qualquer método conhecido na arte para testar a efetividade de uma terapia em células afetadas na infecção, particularmente células epiteliais, ou em pacientes que são ou se tornaram refratários a terapias sem EphA2-BiTE.

Infecções Virais

Expressão aumentada de EphA2 foi vista sendo associada com infecções por certos patógenos intracelulares, em particular, RSV (ver, e.g., U.S. Appn. Ser. No. 11/259.266, preenchida em 27 de outubro de 2005, intitulada "Use of Modulators of EphA2 and EphrinAl for the Treatment and Prevention of Infections", que é aqui incorporada por referência em sua integra). Dessa forma, a invenção também provê composições e métodos projetados para o tratamento, prevenção e/ou gerenciamento de uma infecção por patógeno, incluindo, mas não limitada a, uma infecção viral, tal como, por exemplo, uma infecção por RSV. Um ou mais EphA2- BiTEs da invenção e composições compreendendo ditos EphA2- BiTEs podem ser administrados a um sujeito para tratar, prevenir e/ou gerenciar uma infecção viral ou um ou mais sintomas dessa. Em um avanço preferencial, a infecção viral a ser tratada, prevenida e/ou gerenciada de acordo com os métodos da presente invenção são infecções virais intracelulares. Um ou mais EphA2-BiTEs da invenção e composições compreendendo ditos anticorpos podem ser administrados em combinação com uma ou mais outras terapias (e.g., um ou mais agentes profiláticos ou terapêuticos) que não EphA2-BiTEs da invenção a um sujeito predisposto a ou com uma infecção viral útil para o tratamento, prevenção e/ou gerenciamento de uma infecção viral. Exemplos não limitantes de tais terapias incluem os agentes descritos na Seção 5.4.2.5, infra.

Em um avanço especifico, a invenção provê métodos de tratar, prevenir e/ou gerenciar uma infecção viral ou um ou mais sintomas dessa, dito método compreendendo administrar a um sujeito em necessidade do mesmo uma quantidade efetiva de um ou mais EphA2-BiTEs da invenção. Em outro avanço, a invenção provê um método de tratar, prevenir e/ou gerenciar uma infecção viral ou um ou mais sintomas dessa, dito método compreendendo administrar a um sujeito em necessidade do mesmo uma quantidade efetiva de um ou mais EphA2-BiTEs da invenção e uma quantidade efetiva de uma ou mais terapias (e.g., um ou mais agentes profiláticos ou terapêuticos) que não EphA2-BiTEs da invenção.

Em certos avanços, uma quantidade efetiva de um ou mais EphA2-BiTEs da invenção é administrada em combinação com uma quantidade efetiva de uma ou mais terapias {e.g., um ou mais agentes profiláticos ou terapêuticos) atualmente sendo usadas, tendo sido usadas, ou são conhecidas por serem úteis no tratamento, prevenção e/ou gerenciamento de uma infecção viral ou um ou mais sintomas dessa a um sujeito em necessidade. Terapias para uma infecção viral incluem, mas não estão limitados a, agentes antivirais, tais como, aciclovir, amantadina, oseltamivir, ribaviran, palivizumab, e anamivir. Em certos avanços, uma quantidade efetiva de um ou mais EphA2-BiTEs da invenção é administrada em combinação com uma ou mais medidas de apoio a um sujeito em necessidade para tratar, prevenir e/ou gerenciar uma infecção viral ou um ou mais sintomas dessa. Exemplos não limitantes de medidas de apoio incluem umidificação do ar por um nebulizador ultra-sônico, epinefrina racêmica aerosolizada, dexametasona oral, fluidos intravenosos, entubação, redutores de febre (e.g., ibuprofen, acetometafina) , e terapia antibiótica e/ou antifúngica (i.e., para prevenir ou tratar infecções bacterianas secundárias).

Qualquer tipo de infecção viral ou condição resultante de ou associada com uma infecção viral pode ser tratada, prevenida e/ou gerenciada de acordo com os métodos da invenção, ditos métodos compreendendo administrar uma quantidade efetiva de um ou mais EphA2-BiTEs da invenção sozinhos ou em combinação com uma quantidade efetiva de outra terapia (e.g., um agente terapêutico ou profilático que não EphA2-BiTEs da invenção). Exemplos de virus que causam infecções virais incluem, mas não estão limitados a, retrovirus (e.g., virus linfotrófico de célula T humana (HTLV) tipos I e II e virus de imunodeficiência adquirida humana (HIV, e.g., HIV-I e HIV-2)), virus de herpes (e.g., virus de herpes simplex (HSV) tipos I e II, virus Epstein- Barr, HHV6-HHV8, e citomegalovirus), arenavirus (e.g., virus da febre de lassa), paramixovírus (e.g., virus de morbilivirus, virus sincicial respiratório humano, cachumba, hMPV, e pneumovirus), adenovirus, buniavirus (e.g., hantavirus) , cornavírus, filovirus (e.g., virus Ebola), flavivirus (e.g., virus da hepatite C (HCV), virus da febre amarela, e virus da encefalite japonesa), hepadnavirus (e.g., virus da hepatite B (HBV)), ortomiovirus (e.g., virus influenza A, BeCe PIV) , papovavirus (e.g., papilomavirus), picornavirus (e.g., rinovirus, enterovirus e virus da hepatite A), poxvirus, reovirus (e.g., rotavirus), togavirus (e.g., virus da rubéola), e rabdovirus (e.g., virus da raiva). Respostas biológicas a uma infecção viral incluem, mas não limitadas a, níveis elevados de anticorpos IgE, proliferação e/ou infiltração aumentada de células T, proliferação e/ou infiltração aumentada de células B, hiperplasia epitelial, e produção de mucina. Em um avanço específico, a invenção também provê métodos de tratar, prevenir e/ou gerenciar infecções virais que são associadas com ou causam o resfriado comum, faringite viral, laringite viral, viral croup, bronquite viral, influenza, doenças virais parainfluenza ("PIV") doenças (e.g., croup, bronquiolite, bronquite, pneumonia), doenças por virus sincitial respiratório ("RSV"), doenças por metapneumavirus, e doenças por adenovirus (e.g., doença respiratório febril, croup, bronquite, pneumonia) , dito método compreendendo administrar uma quantidade efetiva de um ou mais EphA2- BiTEs da invenção sozinhos ou em combinação com uma quantidade efetiva de outra terapia.

Em um avanço especifico, infecções por virus influenza, infecções por PIV, infecções por hMPV, infecções por adenovirus, e/ou infecções por RSV, ou um ou mais sintomas dessas são tratados, prevenidos e/ou gerenciados de acordo com os métodos da invenção. Em um avanço especifico, a invenção provê métodos para tratar, prevenir e/ou gerenciar uma infecção por RSV ou um ou mais sintomas dessa, ditos métodos compreendendo administrar a um sujeito em necessidade do mesmo uma quantidade efetiva de um ou mais EphA2-BiTEs da invenção sozinhos ou em combinação com um ou mais agentes antivirais, tais como, mas não limitados a, amantadina, rimantadina, oseltamivir, znamivir, ribaviran, RSV-IVIG (i.e., infusão intravenosa de globulina imune) (RESPIGAM™), e palivizumab e aqueles anticorpos descritos em U.S. Pat. Appn. Ser. Nos. 09/996.288 e 09/996.265, ambos intitulados "Methods of Administering/Dosing Anti-RSV Antibodies For Prophylaxis and Treatment", preenchidas em 28 de novembro de 2001. Em certos avanços, a infecção viral tratada, prevenida e/ou gerenciada de acordo com os métodos da invenção não é uma infecção por RSV.

Em um avanço especifico, a invenção provê métodos para tratar, prevenir e/ou gerenciar uma infecção por PIV ou um ou mais sintomas dessa, ditos métodos compreendendo administrar a um sujeito em necessidade do mesmo uma quantidade efetiva de um ou mais EphA2-BiTEs da invenção sozinhos ou em combinação com uma quantidade efetiva de um ou mais agentes antivirais, tais como, mas não limitados a, amantadina, rimantadina, oseltamivir, znamivir, ribaviran, e palivizumab. Em outro avanço especifico, a invenção provê métodos para tratar, prevenir e/ou gerenciar uma infecção por hMPV ou um ou mais sintomas dessa, ditos métodos compreendendo administrar uma quantidade efetiva de um ou mais anticorpos da invenção sozinhos ou em combinação com uma quantidade efetiva de um ou mais agentes antivirais, tais como, mas não limitados a, amantadina, rimantadina, oseltamivir, znamivir, ribaviran, e palivizumab a um sujeito em necessidade dos mesmos. Em outro avanço especifico, a invenção provê métodos para tratar, prevenir e/ou gerenciar influenza, ditos métodos compreendendo administrar uma quantidade efetiva de um ou mais EphA2-BiTEs da invenção sozinhos ou em combinação com uma quantidade efetiva de um agente antiviral, tal como, mas não limitado a, zanamivir (RELENZA®), oseltamivir (TAMIFLU®), rimantadina, e amantadina (SYMADINE®; SYMMETREL®) a um sujeito em necessidade dos mesmos.

A invenção provê métodos para prevenir o desenvolvimento de asma em um sujeito que sofre ou sofreu de uma infecção viral respiratória, ditos métodos compreendendo administrar uma quantidade efetiva de um ou mais EphA2-BiTEs da invenção sozinhos ou em combinação com uma quantidade efetiva de outra terapia. Em um avanço especifico, o sujeito é uma pessoa idosa (i.e., um humano que tem 65 anos de idade ou mais velho), um infante nascido prematuramente, um infante, ou uma criança. Em outro avanço especifico, o sujeito sofreu ou sofre de infecção por RSV. Em um avanço especifico, a infecção não é uma infecção viral respiratória. Em um avanço adicional, a infecção não uma infecção por RSV.

Em um avanço especifico, a invenção provê métodos para tratar, prevenir e/ou gerenciar uma ou mais respostas secundárias a uma infecção viral primária, ditos métodos compreendendo administrar uma quantidade efetiva de um ou mais EphA2-BiTEs da invenção sozinhos ou em combinação com uma quantidade efetiva de outras terapias (e.g., outros agentes profiláticos ou terapêuticos). Exemplos de respostas secundárias a uma infecção viral primária, particularmente uma infecção viral respiratória primária, incluem, mas não estão limitadas a, resposta tipo asma a estímulos da mucosa, resistência respiratória total elevada, susceptibilidade aumentada a infecções virais secundárias, bacterianas, por fungos e por protozoários, e desenvolvimento de tais condições, tais como, mas não limitadas a, pneumonia, croup, e bronquite febril. Em um avanço especifico, a invenção provê métodos para tratar, prevenir e/ou gerenciar uma infecção viral aguda. Em um avanço adicional, a invenção provê métodos para tratar, prevenir e/ou gerenciar uma infecção viral latente. Ainda em avanços adicionais, a invenção provê métodos para tratar, prevenir e/ou gerenciar uma infecção por HIV ou uma infecção por HBV.

Em um avanço especifico, a invenção provê métodos de tratar, prevenir e/ou gerenciar uma infecção viral ou um ou mais sintomas dessa, ditos métodos compreendendo administrar a um sujeito em necessidade do mesmo uma quantidade efetiva de um ou mais EphA2-BiTEs da invenção em combinação com uma quantidade efetiva de VITAXIN® (Medlmmune, Inc., International Publication No. WO 00/78815, International Publication No. WO 02/070007 Al, datada de 12 de setembro de 2002, intitulada "Methods of Preventing or Treating Inflammatory or Autoimmune Disorders by Administering Integrin AlphaV Beta3 Antagonists," International Publication No. WO 03/075957 Al, datada de 18 de setembro de 2003, intitulada "The Prevention or Treatment of Câncer Using Integrin AlphaVBeta3 Antagonists in combination with Other Agents," U.S. Patent Pub. No. US 2002/0168360 Al, datada de 14 de novembro de 2002, intitulada "Methods of Preventing or Treating Inflammatory or Autoimmune Disorders by Administering Integrin ανβ3 Antagonists in combination with Other prophylactic or therapeutic Agents", e International Publication No. WO 03/075741 A2, datada de 18 de setembro de 2003, intitulada, "Methods of Preventing or Treating Disorders by Administering an Integrin ανβ3 Antagonist in combination with an HMG-CoA Reductase Inhibitor or a Bisphosphonate", cada qual é aqui incorporada por referência em sua integra). Em outro avanço especifico, a invenção provê métodos para tratar, prevenir e/ou gerenciar uma infecção viral ou um ou mais sintomas dessa, ditos métodos compreendendo administrar a um sujeito em necessidade do mesmo uma quantidade efetiva de um ou mais EphA2-BiTEs da invenção em combinação com uma quantidade efetiva de siplizumab (Medlmmune, Inc., International Pub. No. WO 02/069904, que é aqui incorporada por referência em sua integra). Em outro avanço, a invenção provê métodos de tratar, prevenir e/ou gerenciar uma infecção viral ou um ou mais sintomas dessa, ditos métodos compreendendo administrar a um sujeito em necessidade do mesmo uma quantidade efetiva de um ou mais EphA2-BiTEs em combinação com uma quantidade efetiva de um ou mais anticorpos anti- IL-9, tais como aqueles descritos em U.S. Pat. Pub. No. 20050002934 (Jan. 6, 2005), que é aqui incorporada por referência em sua integra. Ainda em outro avanço, a invenção provê métodos para tratar, prevenir e/ou gerenciar uma infecção viral ou um ou mais sintomas dessa, ditos métodos compreendendo administrar a um sujeito em necessidade do mesmo uma quantidade efetiva de um ou mais EphA2-BiTEs da invenção em combinação com uma quantidade efetiva de dois ou mais dos seguintes: VITAXIN®, um anticorpo anti-IL-9 e/ou siplizumab.

Em um avanço, uma quantidade efetiva de um ou mais EphA2-BiTEs da invenção é administrada em combinação com uma quantidade efetiva de um ou mais anticorpos anti-IgE a um sujeito para tratar, prevenir e/ou gerenciar uma infecção viral ou um ou mais sintomas dessa. Em um avanço especifico, uma quantidade efetiva de um ou mais anticorpos da invenção é administrada em combinação com uma quantidade efetiva de anticorpo TNX901 anti-IgE a um sujeito para tratar, prevenir e/ou gerenciar uma infecção viral ou um ou mais sintomas dessa. Em um avanço especifico, uma quantidade efetiva de um ou mais anticorpos da invenção é administrada em combinação com uma quantidade efetiva de anticorpo rhuMAb-E25 omalizumab anti-IgE a um sujeito para tratar, prevenir e/ou gerenciar uma infecção viral ou um ou mais sintomas dessa. Em outro avanço, uma quantidade efetiva de um ou mais EphA2-BiTEs da invenção é administrada em combinação com uma quantidade efetiva de anticorpo HMK-12 anti-IgE a um sujeito para tratar, prevenir e/ou gerenciar uma infecção viral ou um ou mais sintomas dessa. Em um avanço especifico, uma quantidade efetiva de um ou mais EphA2-BiTEs da invenção é administrada em combinação com uma quantidade efetiva de anticorpo 6HD5 anti-IgE a um sujeito para tratar, prevenir e/ou gerenciar uma infecção viral ou um ou mais sintomas dessa. Em outro avanço, uma quantidade efetiva de um ou mais anticorpos da invenção é administrada em combinação com uma quantidade efetiva de anticorpo MAb Hu-901 anti-IgE a um sujeito para tratar, prevenir e/ou gerenciar uma infecção viral ou um ou mais sintomas dessa.

A invenção engloba métodos para prevenir o desenvolvimento de infecções virais, em um paciente esperado por sofrer de uma infecção viral ou em risco crescente de tal infecção, e.g., pacientes com sistemas imune suprimidos (e.g., receptor de transplante de órgãos, pacientes com AIDS, pacientes fazendo quimioterapia, os idosos, infantes nascidos prematuramente, infantes, crianças, pacientes com carcinoma do esôfago com obstrução, pacientes com fistula traqueobronquial, pacientes com doenças neurológicas (e.g., causadas por derrame, esclerose lateral amiotrófica, esclerose múltipla, e miopatias), e pacientes já sofrendo de infecção viral). Os pacientes podem ou não ter sido previamente tratados para uma infecção viral.

Os EphA2-BiTEs da invenção, composições, ou combinação terapias da invenção podem ser usados como qualquer linha de terapia, incluindo, mas não limitada a, a primeira, segunda, terceira, quarta, ou quinta linha de terapia, para tratar, prevenir e/ou gerenciar uma infecção viral ou um ou mais sintomas dessa. A invenção também inclui métodos de tratar, prevenir e/ou gerenciar uma infecção viral, ou um ou mais sintomas dessa em um paciente fazendo terapias para outras doenças ou desordens associadas com expressão aumentada de EphA2. A invenção engloba métodos de tratar, prevenir e/ou gerenciar uma infecção viral, ou um ou mais sintomas dessa em um paciente antes que quaisquer efeitos adversos ou intolerância a terapias sem EphA2-BiTEs da invenção se desenvolvam. A invenção também engloba métodos de tratar, prevenir e/ou gerenciar uma infecção viral ou um sintoma dessa em pacientes refratários. Em certos avanços, um paciente com uma infecção viral, é refratário a uma terapia quando a infecção não foi significativamente erradicada e/ou os sintomas não foram significativamente aliviados. A determinação de se um paciente é refratário pode ser feita tanto in vivo como in vitro por qualquer método conhecido na arte para testar a efetividade de um tratamento de infecções, usando meios aceitos na arte de "refratário" em tal contexto. Em vários avanços, um paciente com uma infecção viral é refratário quando a replicação viral não diminuiu ou aumentou. A invenção também engloba métodos de prevenir o começo ou recorrência de infecções virais em pacientes em risco de desenvolver tais infecções. A invenção também engloba métodos de tratar, prevenir e/ou gerenciar uma infecção viral ou um sintoma dessa em pacientes que são susceptíveis a reações adversas a terapias convencionais. A invenção engloba ainda métodos para tratar, prevenir e/ou gerenciar uma infecção viral para qual nenhuma terapia antiviral está disponível.

A invenção engloba métodos para tratar, prevenir e/ou gerenciar uma infecção viral ou um sintoma dessa em um paciente visto como refratário a terapias sem EphA2-BiTEs da invenção, mas não está mais nessas terapias. Em certos avanços, os pacientes sendo administrados ou tratados de acordo com os métodos desta invenção são pacientes já sendo tratados com antibióticos, antivirais, antifúngicos, ou outra terapia biológica/imunoterapia. Entre esses

pacientes estão pacientes refratários, pacientes que são muito jovens para terapias convencionais, e pacientes com infecções virais recorrentes apesar de administração ou tratamento com terapias existentes.

A presente invenção engloba métodos para tratar, prevenir e/ou gerenciar uma infecção viral, ou um ou mais sintomas dessa como uma alternativa para outras terapias convencionais. Em avanços específicos, o paciente sendo administrado ou tratado de acordo com os métodos da invenção é refratário a outras terapias ou é susceptível a reações adversas de tais terapias. O paciente pode ser uma pessoa com sistema imunológicosuprimido (e.g., pacientes pós-operatórios, pacientes de quimioterapia, e pacientes com doença de imunodeficiência) , uma pessoa com função renal ou hepática prejudicada, os idosos, crianças, infantes, infantes nascidos prematuramente, pessoas com desordens neuropsiquiátricas ou aqueles que tomam drogas psicotrópicas, pessoas com histórico de convulsões, ou pessoas em medicação que interagiriam negativamente com agentes convencionais usados para tratar, prevenir e/ou gerenciar uma infecção viral ou um ou mais sintomas dessa. Terapias para infecção viral e suas dosagens, rotas de administração e uso recomendado são conhecidas na arte e foram descritas em tal literatura como a referência Physicians' Desk Reference (61st ed., 2007).

Infecções bacterianas

A invenção provê um método de tratar, prevenir e/ou gerenciar uma infecção bacteriana, em particular uma infecção bacteriana intracelular, ou um ou mais sintomas dessa, dito método compreendendo administrar a um sujeito em necessidade do mesmo uma quantidade efetiva de um ou mais EphA2-BiTEs da invenção. Preferencialmente, células infectadas com as bactérias intracelulares possuem expressão aumentada de EphA2. Em outro avanço, a invenção provê um método de tratar, prevenir e/ou gerenciar uma infecção bacteriana ou um ou mais sintomas dessa, dito método compreendendo administrar a um sujeito em necessidade do mesmo uma quantidade efetiva de a um ou mais EphA2-BiTEs da invenção e uma quantidade efetiva de uma ou mais terapias (e.g., um ou mais agentes profiláticos ou terapêuticos), sem EphA2-BiTEs da invenção. Em um avanço preferencial, as infecções bacterianas a serem tratadas, prevenidas e/ou gerenciadas de acordo com os métodos da presente invenção são infecções bacterianas intracelulares.

Qualquer tipo de infecção bacteriana intracelular ou condição resultante ou associada com uma infecção bacteriana (e.g., uma infecção respiratória) pode ser tratada, prevenida e/ou gerenciada de acordo com os métodos da invenção. Exemplos de bactérias intracelulares que causam infecções incluem, mas não limitados a, Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium leprae, Salmonella enterica serovar Typhi, Brucella sp, Legionella sp, Listeria monoeytogenes, Franeisella tularensis, Riekettsia riekettsii; Riekettsia prowazekii; Riekettsia typhi; Riekettsia tsutsugamushi; Chlamydia traehomatis; Chlamydia psittaei; e Chlamydia pneumoniae. Em certos avanços, uma infecção bacteriana intracelular tratada, prevenida e/ou gerenciada de acordo com os métodos da invenção não é uma infecção bacteriana respiratória. Em outros avanços, uma infecção bacteriana intracelular tratada, prevenida e/ou gerenciada de acordo com os métodos da invenção não é uma infecção por espécies de Salmonella. Ainda em outros avanços, uma infecção bacteriana intracelular tratada, prevenida e/ou gerenciada de acordo com os métodos da invenção não é uma infecção por Salmonella dublin.

Em um avanço especifico, a invenção provê métodos para tratar, prevenir e/ou gerenciar uma infecção bacteriana intracelular ou um ou mais sintomas dessa, dito método compreendendo administrar a um sujeito em necessidade do mesmo uma quantidade efetiva de um ou mais EphA2-BiTEs da invenção. Em outro avanço, a invenção provê um método de tratar, prevenir e/ou gerenciar uma infecção bacteriana intracelular ou um ou mais sintomas dessa, dito método compreendendo administrar a um sujeito em necessidade do mesmo uma quantidade efetiva de a um ou mais EphA2-BiTEs da invenção e uma quantidade efetiva de uma ou mais terapias (e.g., agentes profiláticos ou terapêuticos), que não EphA2-BiTEs da invenção.

Em certos avanços, a invenção provê métodos para tratar, prevenir e/ou gerenciar uma infecção bacteriana ou um ou mais dos sintomas, ditos métodos compreendendo administrar a um sujeito em necessidade do mesmo um ou mais EphA2-BiTEs da invenção em combinação e quantidade efetiva de uma ou mais terapias (e.g., um ou mais agentes profiláticos ou terapêuticos), que não EphA2-BiTEs da invenção, usadas para tratar,, prevenir e/ou gerenciar infecções bacterianas. Terapias para infecções

bacterianas, particularmente, infecções bacterianas incluem, mas não estão limitadas a, agentes antibacterianos (e.g., aminoglicosidas (e.g., gentamicina, tobramicina, amicacina, netilimicina) aztreonam, celfalosporinas (e.g., cefaclor, cefadroxil, cephalexina, cefazolina), clindamicina, eritromicina, penicilina (e.g., penicilina V, penicilina cristalina G, penicilina G procaina), espectinomicina, e tetraciclina (e.g., clortetraciclina, doxiciclina, oxitetracicina)) e terapia de apoio, tal como ventilação suplementar e mecânica. Em certos avanços, um ou mais EphA2-BiTEs da invenção são administrados em combinação com uma ou mais medidas de apoio a um sujeito em necessidade das mesmas para tratar, prevenir e/ou gerenciar uma infecção bacteriana ou um ou mais sintomas dessa. Exemplos não limitantes de medidas de apoio incluem umidificação do ar por nebulizador ultra-sônico, epinefrina racêmica aerosolizada, dexametasona oral, fluidos intravenosos, entubação, redutores de febre (e.g., ibuprofen, acetometafina) , e mais preferencialmente, terapia antibiótica ou antiviral (i.e., para prevenir ou tratar infecções secundárias).

A invenção provê métodos para tratar, prevenir e/ou gerenciar uma resposta biológica a uma infecção bacteriana, tal como, mas não limitada a, níveis elevados de anticorpos IgE, proliferação, degranulação, e/ou infiltração de ma stoeitos, proliferação e/ou infiltração crescente de células B, e proliferação e/ou infiltração crescente de células T, ditos métodos compreendendo administrar a um sujeito em necessidade do mesmo uma quantidade efetiva de um ou mais EphA2-BiTEs da invenção sozinhos ou em combinação com uma quantidade efetiva de uma ou mais terapias (e.g. um agente terapêutico ou profilático) sem EphA2-BiTEs da invenção. A invenção também provê métodos de tratar, prevenir e/ou gerenciar condições respiratórias causadas por ou associadas com infecções bacterianas, tais como, mas não limitadas a, pneumonia, pneumonia de aspiração recorrente, legionelose, coqueluche, meningite, ou tuberculose, ditos métodos compreendendo administrar a um sujeito em necessidade do mesmo uma quantidade efetiva de um ou mais EphA2-BiTEs da invenção sozinhos ou em combinação com uma quantidade efetiva de outra terapia. Em um avanço especifico, os métodos da invenção são utilizados para tratar, prevenir e/ou gerenciar uma infecção bacteriana causada por Mycobacteria ou um ou mais sintomas desta, dito método compreendendo a administração para um sujeito com necessidade de uma quantidade efetiva de um ou mais EphA2-BiTEs da invenção só ou em combinação com uma quantidade efetiva de uma ou mais outras terapias (por exemplo, um ou mais agentes profiláticos ou terapêuticos) que não EphA2-BiTEs da invenção.

Em um avanço especifico, a invenção provê métodos para tratamento, prevenção e/ou gerenciamento de uma ou mais condições secundárias ou respostas a uma infecção bacteriana primária, preferencialmente uma infecção bacteriana primária, dito método compreendendo a administração a um sujeito em necessidade desta em uma quantidade efetiva de um ou mais EphA2-BiTEs da invenção só ou em combinação com uma quantidade efetiva de outras terapias (por exemplo, outros agentes profiláticos ou terapêuticos). Exemplos de condições secundárias ou respostas a uma infecção bacteriana primária, particularmente uma infecção bacteriana, inclui, mas não são limitados a, respostas do tipo asma a estimulo de mucosa, resistência total elevada, susceptibilidade a infecções secundárias virais, bacterianas, fúngicas e protozoários aumentada, e desenvolvimento de tais condições como, por exemplo, mas não limitadas a, pneumonia, crupe, e bronquite febril. Em um avanço específico, os métodos da invenção são usados para tratar, prevenir e/ou gerenciar uma infecção bacteriana, ou um ou mais sintomas desta, ditos métodos compreendendo a administração para um sujeito em necessidade de uma quantidade efetiva de um ou mais EphA2- BiTEs da invenção em combinação com uma quantidade efetiva de VITAXIN® (Medlmmune, Inc., International Publication No. WO 00/78815, International Publication No. WO 02/070007 Al, datado de 12 de setembro de 2002, intitulada ssMethods of Preventing or Treating Inflammatory or Autoimmune Disorders by Administering Integrin AlphaV Beta3 Antagonists," International Publication No. WO 03/075957 Al, datado de 18 de setembro de 2003, intitulada ssThe Prevention or Treatment of Câncer Using Integrin AlphaVBeta3 Antagonists in Combination with Other Agent s", U.S. Patent Pub. No. US 2002/0168360 Al, datado de 14 de novembro de 2002, intitulado ssMethods of Preventing or Treating Inflammatory or Autoimmune Disorders by Administering Integrin ανβ3 Antagonists in Combination with Other Prophylactic or Therapeutie Agents," e International Publieation No. WO 03/075741 A2, datada de 18 de setembro de 2003, intitulada, ssMethods of Preventing or Treating Disorders by Administering an Integrin ανβ3 Antagonist in Combination with an HMG-CoA Reduetase Inhibitor or a Bisphosphona te", cada qual incorporada aqui por referência em sua íntegra) .

Em outro avanço específico, os métodos da invenção são usados para tratar, prevenir e/ou gerenciar uma infecção bacteriana, ou um ou mais sintomas desta, ditos métodos compreendendo a administração para um sujeito em necessidade desta em uma quantidade efetiva de um ou mais EphA2-BiTEs da invenção em combinação com uma quantidade efetiva de siplizumab (Medlmmune, Inc., International Pub. No. WO 02/069904). Em outro avanço, os métodos da invenção são usados para tratar, prevenir e/ou gerenciar uma infecção bacteriana, ou um ou mais sintomas desta, ditos métodos compreendendo a administração para um sujeito em necessidade desta em uma quantidade efetiva de um ou mais EphA2-BiTEs da invenção em combinação com uma quantidade efetiva de um ou mais anticorpos anti-Il-9 (por exemplo, um dos anticorpos anti-IL-9 descritos na U.S. Pat. Pub. No. 20050002934 (6 de janeiro, 2005), o qual é incorporado aqui por referência em sua integra). Em ainda outro avanço, a invenção provê métodos para tratamento, prevenção e/ou gerenciamento de uma infecção bacteriana, ou um ou mais sintomas desta, ditos métodos compreendendo a administração para um sujeito em necessidade desta em uma quantidade efetiva de um ou mais EphA2-BiTEs da invenção em combinação com uma quantidade efetiva de dois ou mais dos seguintes: VITAXIN®, siplizumab, e/ou anticorpos anti-Il-9.

A invenção engloba métodos para prevenção do desenvolvimento de infecção bacteriana, em um paciente o qual se espera sofrer de uma infecção bacteriana ou em risco aumentado de tal infecção, por exemplo, pacientes como sistemas imunológicos suprimidos (por exemplo, recipientes de transplantes de órgãos, pacientes de AIDS, pacientes submetendo-se a quimioterapia, os mais idosos, infantes nascidos prematuramente, infantes, crianças, pacientes com carcinoma do esôfago com obstrução, pacientes com fistula traqueobrônquica, pacientes com doenças neurológicas (por exemplo, causadas por derrame, esclerose lateral amiotrófica, esclerose múltipla, e miopatias), e pacientes já sofrendo de uma infecção). Os pacientes podem ou não ter sido previamente tratados para uma infecção.

Os EphA2-BiTEs da invenção ou combinação de terapias da invenção podem ser usadas como qualquer linha de terapia, incluindo mas não limitada às primeira, segunda, terceira, quarta, ou quinta linha de terapias, para tratar, prevenir e/ou gerenciar uma infecção bacteriana, ou um ou mais sintomas desta. A invenção também inclui métodos para tratamento, prevenção e/ou gerenciamento de uma infecção bacteriana, ou um ou mais sintomas dessa em um paciente submetendo-se a terapias para outras doenças ou desordens. A invenção engloba métodos para tratamento, prevenção e/ou gerenciamento de uma infecção bacteriana, ou um ou mais sintomas desta, em um paciente antes que se desenvolva quaisquer efeitos adversos ou intolerância a outras terapias que não EphA2-BiTEs da invenção. A invenção também engloba métodos para tratamento, prevenção e/ou gerenciamento de uma infecção bacteriana ou um sintoma desta em pacientes refratários. Em certos avanços, um paciente com uma infecção bacteriana é refratário a uma terapia quando a infecção não foi significativamente erradicada e/ou os sintomas não foram significativamente aliviados. A determinação de se um paciente é refratário pode ser feita tanto in vivo ou in vitro por qualquer método conhecido na arte para ensaiar a efetividade de um tratamento de infecções, usando significados de "refratário" e tal contexto aceitos na arte. Em vários avanços, um paciente com uma infecção bacteriana é refratário quando a replicação bacteriana não é diminuída ou é aumentada. A invenção também engloba métodos de prevenção do começo ou recorrência da infecção bacteriana, em pacientes em risco de desenvolverem tal infecção. A invenção também engloba métodos para tratar, gerenciar e/ou prevenir uma infecção bacteriana, ou um sintoma desta em pacientes que são susceptíveis a reações adversas a terapias convencionais. A invenção engloba ainda métodos para tratar, prevenir, e/ou gerenciar infecções bacterianas, para as quais não há terapia antibacteriana disponível.

A invenção engloba métodos para tratar, prevenir, e/ou gerenciar infecções bacterianas, ou um sintoma desta em um paciente que se mostrou refratário a terapias outras que não EphA2-BiTEs da invenção, mas não estão mais nestas terapias. Em certos avanços, os pacientes sendo gerenciados ou tratados de acordo com os métodos desta invenção são pacientes já sendo tratados com agentes anti-inflamatórios, antibióticos,antivirais,antifúngicos,agentes antiprotozoários, ou outras terapias biológicas/imunoterapias. Entre estes pacientes estão pacientes refratários, pacientes que são muito novos para terapias convencionais, e pacientes com infecções bacterianas recorrentes apesar do gerenciamento ou tratamento com terapias existentes.

A presente invenção engloba métodos de tratar, prevenir e/ou gerenciar uma infecção bacteriana, ou um ou mais sintomas dessa como uma alternativa à outras terapias convencionais. Em avanços específicos, um paciente sendo gerenciado ou tratado de acordo com os métodos da invenção é refratário a outras terapias ou é susceptível a reações adversas destas terapias. 0 paciente pode ser uma pessoa com o sistema imunológico suprimido (por exemplo, paciente pós-operatório, pacientes de quimioterapias, e pacientes com doença de imunodeficiência) , uma pessoa com função renal ou do fígado comprometidas, os mais idosos, crianças, infantes, infantes nascidos prematuramente, pessoas com desordens neuropsiquiátricas ou aquelas que tomam drogas psicotrópicas, pessoas com histórias de convulsão, ou pessoas sob medicação que teriam interação negativa com agentes convencionais usados para tratar, prevenir e/ou gerenciar uma infecção bacteriana, ou um ou mais sintomas desta.

Terapias para infecções bacterianas e suas dosagens, rotas de administração e uso recomendado são conhecidos na arte e foram descritos em tais literaturas como a referência Physicians' Desk Reference (6Ist edition, 2007) .

Infecções Fúngicas Um ou mais EphA2-BiTEs da invenção podem ser administradas de acordo com métodos da invenção para um sujeito para tratar, prevenir e/ou gerenciar uma infecção fúngica ou um ou mais sintomas desta. Em um avanço preferido, células infectadas por fungos têm a expressão de EphA2 aumentada. Um ou mais EphA2—BiTEs da invenção podem ser também administradas a um sujeito para tratar, gerenciar, e/ou melhorar uma infecção fúngica e/ou um ou mais sintomas dessa em combinação com uma ou mais outras terapias (por exemplo, um ou mais agentes profiláticos ou terapêuticos) que não EphA2-BiTEs da invenção as quais são úteis pata o tratamento, prevenção e/ou gerenciamento de uma infecção fúngica ou um ou mais sintomas desta. Em um avanço preferido, as infecções fúngicas podem ser tratadas, prevenidas e/ou gerenciadas de acordo com os métodos da presente invenção em infecções fúngicas intracelulares.

Qualquer tipo de infecção fúngica ou condição resultando de ou associada com a infecção fúngica pode ser tratada, prevenida e/ou gerenciada de acordo com os métodos da invenção. Exemplos de fungos que causam infecções fúngicas incluem, mas não são limitados a, espécies de Absidia (por exemplo, Absidia corymbifera e Absidia ramosa) , espécies de Aspergillus, (por exemplo, Aspergillus flavus, Aspergillus fumigatus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, e Aspergillus terreus), Basidiobolus ranarum, Blastomyces dermatitidis, espécies de Candida (por exemplo, Candida albicans, Candida glabrata, Candida kerr,· Candida krusei, Candida parapsilosis, Candida pseudotropicalis, Candida quillermondii, Candida rugosa, Candida Stellatoidear e Candida tropicalis), Coccidioides immitis, espécies de Conidiobolus, Cryptococcus neoforms, espécies de Cunninghamella, dermatófitos, Histoplasma eapsulatum, Microsporum gypseum, Mueor pusillus, Paraeoceidioides brasiliensis, Pseudallescheria boydii, Rhinosporidium seeberi, Pneumoeystis earinii, espécies de Rhizopus (por exemplo, Rhizopus arrhizus, Rhizopus oryzae, e Rhizopus mierosporus) , espécies de Saccharomyees, Sporothrix sehenekii, zigomicetos, e classes como, . por exemplo, Zigomicetos, Aseomieetos, os Basidiomieetos, Deuteromieetos, e Oomieetos. Em um avanço especifico, a infecção fúngica não é uma infecção fúngica respiratória.

Em um avanço especifico, a invenção provê um método para tratar, prevenir e/ou gerenciar uma infecção fúngica ou um ou mais sintomas desta, dito método compreendendo a administração a um sujeito em necessidade desta em uma quantidade efetiva de um ou mais EphA2-BiTEs da invenção. Em outro avanço, a invenção provê um método de tratar, prevenir e /ou gerenciar uma infecção fúngica ou um ou mais sintomas desta, dito método compreendendo a administração a um sujeito em necessidade desta em uma quantidade efetiva de um ou mais EphA2-BiTEs da invenção e uma quantidade efetiva de uma ou mais outras terapias (por exemplo, um ou mais agentes profiláticos ou terapêuticos) que não os EphA2-BiTEs da invenção. Em certos avanços, uma quantidade efetiva de um ou mais anticorpos é administrada em combinação com uma quantidade efetiva de uma ou mais terapias (por exemplo, um ou mais agentes profiláticos ou terapêuticos), outras que não os EphA2-BiTEs da invenção, as quais estão correntemente sendo usadas, foram usadas, ou são conhecidas como sendo úteis no tratamento, prevenção e/ou gerenciamento de uma infecção fúngica, preferencialmente infecção fúngica, para um sujeito em necessidade desta. Terapias para infecções fúngicas incluem, mas não . são limitadas a, agentes antifúngicos como, por exemplo, drogas azóis por exemplo, miconazol, cetoconazol (NIZORAL®), acetato de caspofungina (CANCIDAS®), imidazol, triazols (por exemplo, fluconazol (DIFLUCAN®)), e itraconazol (SPORANOX®)) , polienos (por exemplo, nistatina, dispersão coloidal de anfotericina B ("ABCD") (AMPHOTEC©), anfotericina B lipossomal (AMBISONE®)), iodeto de potássio (KI) , pirimidina (por exemplo, flucitosina (ANCOBON®)), e voriconazol (VFEND®). Em certos avanços, uma quantidade efetiva de um ou mais EphA2-BiTEs da invenção são administrados em combinação com uma ou mais medidas sustentadoras a um sujeito em necessidade desta para tratar, prevenir e/ou gerenciar uma infecção fúngica ou um ou mais sintomas desta. Exemplos não limitantes de medidas sustentadoras incluem umidificação do ar por um nebulizador ultra-sônico, epinefrina racêmica aerosolizada, dexametasona oral, fluidos intravenosos, entubação, redutores de febre (por exemplo, ibuprofeno e acetometafina), e terapia antiviral ou antibacteriana (isto é, para prevenir ou tratar infecções virais ou bacterianas secundárias).

A invenção também provê métodos para tratar, prevenir e/ou gerenciar uma resposta biológica a uma infecção fúngica como, por exemplo, mas não limitado a, níveis elevados de anticorpos IgE, níveis elevados de fator de crescimento nervoso (NGF), proliferação de mastócitos, degranulação, e/ou infiltração, proliferação aumentada e/ou infiltração de células B, e proliferação aumentada .e/ou infiltração de células T, ditos métodos compreendendo a administração de uma quantidade efetiva de um ou mais EphA2-BiTEs só ou em combinação com uma ou mais outras terapias.

Em um avanço específico, a invenção provê métodos para tratar, prevenir e/ou gerenciar uma ou mais condições secundárias ou respostas a infecção fúngica primária, preferencialmente uma infecção fúngica primária, dito método compreendido da administração para um sujeito em necessidade desta em uma quantidade efetiva de um ou mais EphA2-BiTEs da invenção só ou em combinação com uma quantidade efetiva de outras terapias (por exemplo, outros agentes profiláticos ou terapêuticos). Que não os EphA2- BiTEs da invenção. Exemplos de condições secundárias ou respostas a infecções fúngicas primárias, particularmente infecções fúngica primária, mas não são limitadas a, responsividade do tipo asma a estímulo de mucosa, resistência total elevada, susceptibilidade aumentada a infecções secundárias virais, fúngicas, e fúngicas, e desenvolvimento de tais condições como, por exemplo, mas não limitadas a, pneumonia, crupe, e bronquite febril.

Em um avanço especifico, a invenção provê métodos para tratar, prevenir e/ou gerenciar uma infecção fúngica ou um ou mais sintomas desta, ditos métodos compreendendo a administração a um sujeito em necessidade desta uma quantidade efetiva de um ou mais EphA2-BiTEs da invenção em combinação com uma quantidade efetiva de VITAXIN® (Medlmmune, Inc., International Publication No. WO 00/78815, International Publication No. WO 02/070007 Al, datado de 12 de setembro de 2002, intitulado "Methods of Preventing or Treating Inflammatory or Autoimmune Disorders by Administering Integrin AlphaV Beta3 Antagonists," International Publication No. WO 03/075957 Al, datado de 18 de setembro de 2003, intitulado "The Prevention or Treatment of Câncer Using Integrin AlphaVBeta3 Antagonists in Combination with Other Agents," U.S. Patent Pub. No. US 2002/0168360 Al, datado de 14 de novembro de 2002, intitulado ysMethods of Preventing or Treating Inflammatory or Autoimmune Disorders by Administering Integrin ανβ 3 Antagonists in Combination with Other Prophylactic or Therapeutie Agent", e International Publieation No. WO 03/075741 A2, datado de 18 de setembro de 2003, intitulado, ssMethods of Preventing or Treating Disorders by Administering an Integrin ανβ3 Antagonist in Combination with an HMG-CoA Reduetase Inhibitor or a Bisphosphonate", cada qual sendo incorporada aqui por referência em sua integra) a um sujeito em necessidade desta.

Em outro avanço, a invenção provê métodos para tratar, prevenir e/ou gerenciar uma infecção fúngica ou um ou mais sintomas desta, ditos métodos compreendendo a administração a um sujeito em necessidade desta uma quantidade efetiva de um ou mais EphA2-BiTEs da invenção em combinação com uma quantidade efetiva de siplizumab (Medlmmune, Inc.,

International Pub. No. WO 02/069904) a um sujeito, em necessidade desta. Em outro avanço, a invenção provê métodos para tratar, prevenir e/ou gerenciar uma infecção fúngica ou um ou mais sintomas desta, ditos métodos compreendendo a administração a um sujeito em necessidade desta uma quantidade efetiva de um ou mais EphA2-BiTEs em combinação com uma quantidade efetiva de um ou mais anticorpos anti-IL-9 (por exemplo, um ou mais dos anticorpos anti-IL-9 descritos em U.S. Pat. Pub. No. 20050002934 (6 de janeiro, 2005)), a qual é incorporada aqui por referência em sua integra) . Em outro avanço, a invenção provê métodos para tratar, prevenir e/ou gerenciar uma infecção fúngica ou um ou mais sintomas desta, ditos métodos compreendendo a administração a um sujeito em necessidade desta uma quantidade efetiva de um ou mais EphA2-BiTEs em combinação com uma quantidade efetiva de dois ou mais do seguinte: VITAXIN®, Siplizumab e/ou anticorpos anti-IL-9. A invenção engloba métodos para prevenir o desenvolvimento de infecções fúngicas em um paciente o qual se espera sofrer de uma infecção fúngica, ou em risco aumentado de sofrer tal infecção. Tais sujeitos incluem, mas não são limitados a, pacientes com sistemas imunológicos suprimidos (por exemplo, pacientes recipientes de transplantes de órgãos, pacientes de AIDS, pacientes submetendo-se a quimioterapia, pacientes com car.cinoma do esôfago com obstrução, pacientes com fistula traqueobrônquica, pacientes com doenças neurológicas (por exemplo, causadas por derrame, esclerose lateral amiotrófica, esclerose múltipla, e miopatias), e pacientes já sofrendo de uma condição, particularmente uma infecção). Os pacientes podem ou não terem sido previamente tratados para uma infecção. Em um avanço especifico, o paciente sofre de displasia broncopulmonar, doença do coração congênita, fibrose cistica, e/ou imunodeficiência adquirida ou congênita. Em outro avanço especifico, o paciente é um infante nascido prematuramente, um infante, uma criança, um humano mais idoso, ou um humano em uma casa de grupo, casa de enfermagem, ou algum outro tipo de instituição. A invenção também engloba métodos para tratar, prevenir e/ou gerenciar uma infecção fúngica ou um ou mais sintomas dessa em pacientes que são susceptíveis a reações adversas a terapias convencionais antifúngicas para condições para as quais não há terapias disponíveis.

Os EphA2-BiTEs da invenção ou combinação de terapias da invenção podem ser usadas como qualquer linha de terapia, incluindo mais não limitadas à primeira, segunda, terceira, quarta, ou quinta linha de terapia, para tratar, prevenir e/ou gerenciar uma infecção fúngica ou um ou mais sintoma desta. A invenção também inclui métodos para tratar, prevenir e/ou gerenciar uma infecção fúngica ou um ou mais sintomas dessa em um paciente submetendo-se a terapias para outras doenças ou desordens. A invenção engloba métodos para tratar, prevenir e/ou gerenciar uma infecção fúngica ou um ou mais sintomas dessa em um paciente antes que se desenvolvam quaisquer efeitos adversos ou intolerância a terapias que não com EphA2-BiTEs da invenção. A invenção também engloba métodos para tratar, prevenir e/ou gerenciar uma infecção fúngica ou um sintoma desta em pacientes refratários. Em certos avanços, um paciente com uma infecção fúngica, é refratário à terapia quando a infecção não foi significativamente erradicada e/ou os sintomas não foram significativamente aliviados. A determinação de se um paciente é refratário pode ser feita tanto in vivo ou in vitro por qualquer método conhecido na arte para ensaiar a efetividade de um tratamento de infecções, usando significados de "refratário" em tal contexto aceitos na arte. Em vários avanços, um paciente com uma infecção fúngica, é refratário quando a replicação fúngica não foi diminuída ou foi aumentada. A invenção também engloba métodos de prevenir o começo ou recorrência de infecções fúngicas, em pacientes sob risco de desenvolver tais infecções. A invenção também engloba métodos para tratar, prevenir e/ou gerenciar uma infecção fúngica ou um sintoma desta em pacientes que são susceptíveis a reações adversas a terapias convencionais. A invenção engloba adicionalmente métodos para tratar, prevenir e/ou gerenciar infecções fúngicas, para as quais não há terapia antifúngica disponível.

A invenção engloba métodos para tratar, prevenir e/ou gerenciar uma infecção fúngica, ou um sintoma desta em um paciente que se provou refratário a terapias que não por EphA2-BiTEs da invenção mas não estão mais nestas terapias. Em certos avanços, os pacientes sendo gerenciados ou tratados de acordo com os métodos desta invenção são pacientes já sendo tratados com antibióticos, antivirais, antifúngicos, ou outra terapia/imunoterapia biológica. Entre estes pacientes estão pacientes refratários, pacientes que são muito novos para terapias convencionais, e pacientes com infecções fúngicas recorrentes apesar do gerenciamento e tratamento com terapias existentes.

A presente invenção provê métodos para tratar, prevenir e/ou gerenciar uma infecção fúngica ou um ou mais sintomas dessa como uma alternativa a outras terapias convencionais. Em avanços específicos, o paciente sendo gerenciado ou tratado de acordo com os métodos da invenção é refratário a outras terapias ou é susceptível a reações adversas de tais terapias. 0 paciente pode ser uma pessoa com um sistema imunológico suprimido (por exemplo, pacientes pós-operados, pacientes de quimioterapias, e pacientes com doença de imunodeficiência), uma pessoa com função renal ou do fígado comprometidas, os mais idosos, crianças, infantes, infantes nascidos prematuramente, pessoas com desordens neuropsiquiátricas ou aquelas que tomam drogas psicotrópicas, pessoas com histórias de convulsão, ou pessoas sob medicação que teriam interação negativa com agentes convencionais usados para tratar, prevenir e/ou gerenciar uma infecção bacteriana, ou um ou mais sintomas desta.

Terapias para infecções fúngicas e suas dosagens, rotas de administração e uso recomendado são conhecidos na arte e foram descritos em tais literaturas como a referência Physicians' Desk Reference (61st edition, 2007).

Infecções por protozoários

Um ou mais EphA2-BiTEs da invenção podem ser administrados de acordo com métodos da invenção para um sujeito para tratar, prevenir e/ou gerenciar uma infecção por protozoários ou um ou mais sintomas desta. Em um avanço preferido, células infectadas por protozoários têm expressão de EphA2 aumentada. Um ou mais EphA2-BiTEs da invenção também podem ser administrados para um sujeito para tratar, gerenciar, e/ou melhorar uma infecção por protozoários ou um ou mais sintomas dessa em combinação com uma ou mais terapias (por exemplo, um ou mais agentes profiláticos ou terapêuticos) que não EphA2-BiTEs da invenção os quais são úteis para o tratamento, prevenção e/ou gerenciamento de uma infecção fúngica ou um ou mais sintomas desta. Em um avanço preferido, as infecções por protozoários a serem tratadas, prevenidas e/ou gerenciadas de acordo com os métodos da presente invenção são infecções intracelulares por protozoários.

Qualquer tipo de infecção por protozoários ou condição resultante de ou associada a uma infecção por protozoários pode ser tratada, prevenida e/ou gerenciada de acordo com os métodos da invenção. Exemplos de protozoários que causam infecções incluem, mas não limitam-se a, Leishmania; Trypanosoma; Giardia; Trichomonas; Entamoeba; Dientamoeba; Naegleria e Acanthamoeba; Babesia; Plasmodium; Isospora; Sarcocystis; Toxoplasma; Enterocytozoon; Balantidium; e Pneumocystis.

Em um avanço especifico, a invenção provê um método para tratar, prevenir e/ou gerenciar uma infecção por protozoários ou um ou mais sintomas desta, dito método compreendendo a administração a um sujeito em necessidade desta uma quantidade efetiva de um ou mais EphA2-BiTEs da invenção. Em outro avanço, a invenção provê um método para tratar, prevenir e/ou gerenciar uma infecção por protozoários ou um ou mais sintomas desta, dito método compreendendo a administração a um sujeito em necessidade desta uma quantidade efetiva de um ou mais EphA2-BiTEs da invenção e uma quantidade efetiva de uma ou mais terapias (por exemplo, um ou mais agentes profiláticos ou terapêuticos) que não EphA2-BiTEs da invenção. Em certos avanços, uma quantidade efetiva de um ou mais EphA2-BiTEs é administrada em combinação com uma quantidade efetiva de uma ou mais terapias (por exemplo, um ou mais agentes profiláticos ou terapêuticos), que não os EphA2-BiTEs da invenção, os quais estão sendo atualmente usados, foram usados, ou são conhecidos como úteis no tratamento, prevenção e/ou gerenciamento de uma infecção por protozoários, a um sujeito em necessidade desta. Em certos avanços, uma quantidade efetiva de um ou mais EphA2- BiTEs da invenção são administradas em combinação com uma ou mais medidas sustentadoras a um sujeito em necessidade desta para tratar, prevenir e/ou gerenciar uma infecção por protozoários ou um ou mais sintomas desta. Exemplos não limitantes de medidas sustentadoras incluem umidificação do ar por um nebulizador ultra-sônico, epinefrina racêmica aerosolizada, dexametasona oral, fluidos intravenosos, entubação, redutores de febre (por exemplo, ibuprofeno e acetometafina) , e terapia antiviral ou antibacteriana (isto é, para prevenir ou tratar infecções virais ou bacterianas secundárias) .

A invenção também provê métodos para tratar, prevenir e/ou gerenciar uma resposta biológica a uma infecção por protozoários como, por exemplo, mas não limitam-se a, níveis elevados de anticorpos IgE, níveis elevados de fator de crescimento de nervo (NGF), proliferação de mastócitos, degranulação, e/ou infiltração, aumento da proliferação e/ou infiltração de células B, e aumento da proliferação e/ou infiltração de células T, ditos métodos compreendendo a administração de uma quantidade efetiva de um ou mais EphA2-BiTEs só ou em combinação com uma ou mais terapias.

Em um avanço especifico, a invenção provê métodos para tratar, prevenir e/ou gerenciar uma ou mais condições secundárias ou respostas a uma infecção primária, preferencialmente uma infecção primária por protozoários, dito método compreendendo a administração a um sujeito em necessidade desta uma quantidade efetiva de um ou mais EphA2-BiTEs da invenção só ou em combinação com uma quantidade efetiva de outras terapias (por exemplo, outros agentes profiláticos ou terapêuticos) que não EphA2-BiTEs da invenção.

Em um avanço especifico, a invenção provê métodos para tratar, prevenir e/ou gerenciar uma infecção por protozoários ou um ou mais sintomas desta, ditos métodos compreendendo a administração a um sujeito em necessidade desta uma quantidade efetiva de um ou mais EphA2-BiTEs da invenção em combinação com uma quantidade efetiva de VITAXIN® (Medlmmune, Inc., International Publication No. WO 00/78815, International Publication No. WO 02/070007 A1, datado de 12 de setembro de 2002, intitulada "Methods of Preventing or Treating Inflammatory or Autoimmune Disorders by Administering Integrin AlphaV Beta3 Antagonists", International Publication No. WO 03/075957 Al, datado de 18 de setembro de 2003, intitulada "The Prevention or Treatment of Câncer Using Integrin AlphaVBeta3 Antagonists in Combination with Other Agents," U.S. Patent Pub. No. US 2002/0168360 Al, datado de 14 de novembro de 2002, intitulada "Methods of Preventing or Treating Inflammatory or Autoimmune Disorders by Administering Integrin ανβ3 Antagonists in Combination with Other Prophylactic or Therapeutic Agent", e International Publication No. WO 03/075741 A2, datado de 18 de setembro de 2003, intitulada, ysMethods of Preventing or Treating Disorders by Administering an Integrin ανβ3 Antagonist in Combination with an HMG-CoA Reduetase Inhibitor or a Bisphosphona te", cada qual sendo incorporado aqui por referência em sua integra) a um sujeito em necessidade desta.

Em outro avanço, a invenção provê métodos para tratar, prevenir e/ou gerenciar uma infecção por protozoários ou um ou mais sintomas desta, ditos métodos compreendendo a administração a um sujeito em necessidade desta uma quantidade efetiva de um ou mais EphA2-BiTEs da invenção em combinação com uma quantidade efetiva de siplizumab (Medlmmune, Inc., International Pub. No. WO 02/069904) a um sujeito em necessidade desta. Em outro avanço, a invenção provê métodos para tratar, prevenir e/ou gerenciar uma infecção por protozoários ou um ou mais sintomas desta, ditos métodos compreendendo a administração a um sujeito em necessidade desta uma quantidade efetiva de um ou mais EphA2-BiTEs em combinação com uma quantidade efetiva de um ou mais anticorpos anti-IL-9 (por exemplo, os anticorpos anti-IL-9 descritos em U.S. Pat. Pub. No. 20050002934 (Jan. 6, 2005)), a qual é incorporada aqui por referência em sua integra). Em outro avanço, a invenção provê métodos para tratar, prevenir e/ou gerenciar uma infecção por protozoários ou um ou mais sintomas desta, ditos métodos compreendendo a administração a um sujeito em necessidade desta uma quantidade efetiva de um ou mais EphA2-BiTEs em combinação com uma quantidade efetiva de dois ou mais do seguinte: VITAXIN®, siplizumab e/ou anticorpos anti-IL-9.

A invenção engloba métodos para prevenir o desenvolvimento de infecções de protozoários em um paciente o qual se espera sofrer de uma infecção por protozoários, ou em risco aumentado de sofrer tal infecção. Tais sujeitos incluem, mas não são limitados a, pacientes com sistemas imunes suprimidos (por exemplo, pacientes recipientes de transplantes de órgãos, pacientes de AIDS, pacientes submetendo-se a quimioterapia, pacientes com câncer, pacientes com fistula traqueobrônquica, pacientes com doenças neurológicas (por exemplo, causadas por derrame, esclerose lateral amiotrófica, esclerose múltipla, e miopatias), e pacientes já sofrendo de uma condição, particularmente uma infecção. Em um avanço especifico, o paciente sofre de displasia broncopulmonar, doença do coração congênita, fibrose cistica, e/ou imunodeficiência adquirida ou congênita. Em outro avanço especifico, o paciente é um infante nascido prematuramente, um infante, uma criança, um humano mais idoso, ou um humano em um grupo residencial, casa de enfermagem, ou algum outro tipo de instituição. A invenção também engloba métodos para tratar, prevenir e/ou gerenciar uma infecção por protozoários ou um ou mais sintomas dessa em pacientes que são susceptíveis a reações adversas a terapias antiprotozoários convencionais para condições para as quais não há terapias disponíveis.

Os EphA2-BiTEs da invenção ou combinação de terapias da invenção podem ser usados em qualquer linha de terapia, incluindo mais não limitadas à primeira, segunda, terceira, quarta, ou quinta linha de terapia, para tratar, prevenir e/ou gerenciar uma infecção por protozoários ou um ou mais sintoma desta. A invenção também inclui métodos para tratar, prevenir e/ou gerenciar uma infecção por protozoários ou um ou mais sintomas dessa em um paciente submetendo-se a terapias para outras doenças ou desordens. A invenção engloba métodos para tratar, prevenir e/ou gerenciar uma infecção por protozoários, ou um ou mais sintomas dessa em um paciente antes que se desenvolvam quaisquer efeitos adversos ou intolerância a terapias outras que não EphA2-BiTEs da invenção. A invenção também engloba métodos para tratar, prevenir e/ou gerenciar uma infecção por protozoários, ou um sintoma desta em pacientes refratários. Em certos avanços, um paciente com uma infecção por protozoários, é refratário à terapia quando a infecção não foi significativamente erradicada e/ou os sintomas não foram significativamente aliviados. A determinação de se um paciente é refratário pode ser feita tanto in vivo ou in vitro por qualquer método conhecido na arte para ensaiar a efetividade de um tratamento de infecções, usando significados de "refratário" em tal contexto aceito na arte. Em vários avanços, um paciente com uma infecção por protozoários é refratário quando a replicação dos protozoários não foi diminuída ou foi aumentada. A invenção também engloba métodos de prevenir o começo ou recorrência de infecções de protozoários, em pacientes sob risco de desenvolver tais infecções. A invenção também engloba métodos para tratar, prevenir e/ou gerenciar uma infecção por protozoários ou um sintoma desta em pacientes que são susceptíveis a reações adversas a terapias convencionais. A invenção engloba ainda métodos para tratar, prevenir e/ou gerenciar infecções de protozoários, para as quais não há terapias antiprotozoários disponíveis.

A invenção engloba métodos para tratar, prevenir e/ou gerenciar uma infecção por protozoários ou um sintoma desta em um paciente que se provou refratário a terapias que não EphA2-BiTEs da invenção mas não estão mais nestas terapias. Em certos avanços, os pacientes sendo gerenciados ou tratados de acordo com os métodos desta invenção são pacientes já sendo tratados com antibióticos, antivirais, antiprotozoários, ou outra terapia/imunoterapia biológica. Entre estes pacientes estão pacientes refratários, pacientes que são muito novos para terapias convencionais, e pacientes com infecções recorrentes de protozoários apesar do gerenciamento ou tratamento com terapias existentes.

A presente invenção provê métodos para tratar, prevenir e/ou gerenciar uma infecção por protozoários ou um ou mais sintomas dessa como uma alternativa a outras terapias convencionais. Em avanços específicos, o paciente sendo gerenciado ou tratado de acordo com os métodos da invenção é refratário a outras terapias ou é susceptível a reações adversas de tais terapias. 0 paciente pode ser uma pessoa com um sistema imunológico suprimido (por exemplo, pacientes pós-operados, pacientes de quimioterapias, e pacientes com doença de imunodeficiência), uma pessoa com função renal ou do fígado comprometidas, os mais idosos, crianças, infantes, infantes nascidos prematuramente, pessoas com desordens neuropsiquiátricas ou aquelas que tomam drogas psicotrópicas, pessoas com histórias de convulsão, ou pessoas sob medicação que teriam interação negativa com agentes convencionais usados para tratar, prevenir e/ou gerenciar uma infecção fúngica ou um ou mais sintomas desta.

Terapias de infecção por protozoários e suas dosagens, rotas de administração e uso recomendado são conhecidos na arte e foram descritos em tais literaturas como a referência Physicians' Desk Reference (61st edition, 2007).

Terapias Anti-Inflamatórias

Qualquer agente anti-inflamatório, incluindo agentes úteis em terapias para desordens inflamatórias, bem bom conhecidas a um especialista na arte pode ser usado nas composições e métodos da invenção. Exemplos não limitantes de agentes anti-inflamatórios incluem drogas anti- inf lamatórias não esteroidais (NSAIDs), drogas anti- inflamatórias esteroidais, anticolinérgicos (por exemplo, sulfato de atropina, metilnitrato de atropina, e brometo de ipratrópio (ATROVENT™)), agonistas beta2 (por exemplo, abuterol (VENTOLIN™ e PROVENTIL™), bitolterol (TORNALATE™), levalbuterol (XOPONEX™) , metaproterenol (ALUPENT™), pirbuterol (MAXAIR™), terbutlaine (BRETHAIRE™ e BRETHINE™), albuterol (PROVENTIL™, REPETABS™, e VOLMAX™), formoterol (FORADIL AEROLIZER™), e salmeterol (SEREVENT™ e SEREVENT DISKUS™)), e metilxantinas (por exemplo, teofilina (UNIPHYL™, THEO-DUR™, SLO-BID™, e TEHO-42™)). Exemplos de NSAIDs incluem, mas não são limitados a, aspirina, ibuprofeno, celecoxib (CELEBREX™), diclofenaco (VOLTAREN™), etodolaco (LODINE™), fenoprofeno (NALFON™), indometacina (INDOCIN™), cetoralaco (TORADOL™), oxaprozina (DIAPROet), nabumetona (RELAFEN™), sulindaco (CLINORIL™), tolmentina (TOLECTIN™), rofecoxib (VIOXX™), naproxeno (ALEVE™, NAPROSYN™), cetoprofeno (ACTRON™) e nabumetona (RELAFEN™). Tais NSAIDs funcionam por inibir uma enzima ciclooxigenase (por exemplo, COX-I e/ou COX-2). Exemplos de drogas anti- inflamatórias esteroidais incluem, mas não são limitados a, glucocorticóides, dexametasona (DECADRON™), corticoesteróides (por exemplo, metilprednisolona (MEDROL™)), cortisona, hidrocortisona, prednisona (PREDNISONE™ e DELTASONE™), prednisolona (PRELONE™ e PEDIAPRED™), triamcinolona, azulfidina, e inibidores de eicosanóides (por exemplo, prostaglandinas, tromboxanos, e leucotrienos (por exemplo, montelucaste (SINGULAIR™), zafirlucaste (ACCOLATE™), pranlucaste (ONON™), ou zileutona (ZYFLO™)). Terapias anti-inflamatórias e suas dosagens, rotas de administração, e uso recomendado são conhecidos na arte e foram descritos em tais literaturas como a referência Physicians' Desk Reference (61st edition, 2007) .

Terapias Antivirais

Qualquer agente antiviral bem conhecido de um especialista na arte pode ser usado nas composições e nos métodos da invenção. Exemplos não limitantes de agentes antivirais incluem proteínas, polipeptideos, peptídeos, anticorpos de proteínas fusionadas, moléculas de ácidos nucléicos, moléculas orgânicas, moléculas inorgânicas, e pequenas moléculas que inibem e/ou reduzem a associação de um vírus ao seu receptor, a internalização de um vírus em uma célula, a replicação de um vírus, ou a liberação de vírus de uma célula. Em particular, agentes antivirais incluem, mas não são limitados a, análogos de nucleosídeos (por exemplo, zidovudina, aciclovir, ganciclovir, vidarabina, idoxuridina, trifluoridina, e ribavirina), foscarneto, amantadina, rimantadina, saquinavir, indinavir, ritonavir, alfa-interferons e outros interferons, e AZT.

Em avanços específicos, o agente antiviral é um agente imunomodulatório que é imunoespecífico para um antígeno viral. Como usado aqui, o termo "antígeno viral" inclui, mas não é limitado a, qualquer peptídeo, polipeptídeo e proteína viral (por exemplo, HIV gpl20, HIV nef, glicoproteina RSV F, glicoproteina RSV G, neuraminidase de virus influenza, hemaglutinina de virus influenza, HTLV tax, glicoproteina de virus herpes simplex (por exemplo, gB, gC, gD, e gE) e antigeno de superfície de hepatite B) que é capaz de eliciar uma resposta imunológica. Anticorpos úteis nesta invenção para o tratamento de uma infecção viral incluem, mas não são limitados a, anticorpos contra antígenos de vírus patogênicos, incluindo como exemplos e não por limitação: adenoviridae (por exemplo, mastadenovírus e aviadenovírus) , herpesviridae .(por exemplo, herpes simplex vírus 1, herpes simplex vírus 2, herpes simplex vírus 5, e herpes simplex vírus 6) , leviviridae (por exemplo, levivírus, fago MS2 de enterobactéria, alolevírus), poxviridae (por exemplo, chordopoxvirinae, parapoxvírus, avipoxvírus, capripoxvírus, leporiipoxvírus, suipoxvírus, molluscipoxvírus, e entomopoxvirinae) , papovaviridae (por exemplo, poliomavírus e papilomavírus) , paramyxoviridae (por exemplo, paramixovírus, paravírus influenza 1, mobilivírus (por exemplo, vírus do sarampo) , rubulavírus (por exemplo, vírus da caxumba), pneumonovirinae (por exemplo, pneumovírus, vírus sincicial respiratório humano), e metapneumovírus (por exemplo, pneumovírus aviário e metapneumovírus humano)), picornaviridae (por exemplo, enterovírus, rinovírus, hepatovírus (por exemplo, vírus da hepatite A humana, cardiovírus, e apthovírus), reoviridae (por exemplo, ortoreovírus, orbivírus, rotavírus, cipovírus, fijivírus, fitoreovírus, e orizavírus), retroviridae (por exemplo, retrovírus do tipo B de mamíferos, retrovírus do tipo C de mamíferos, retrovírus do tipo C de aves, grupo de retrovírus do tipo B, retrovírus BLV-HTLV, lentivírus (por exemplo vírus 1 da imunodeficiência humana e vírus 2 da imunodeficiência humana), spumavírus), flaviviridae (por exemplo, vírus da hepatite C), hepadnaviridae (por exemplo, vírus da hepatite Β), togaviridae (por exemplo, alfavírus (por exemplo, sindbis vírus) e rubivírus (por exemplo, vírus da rubéola) ) , rhabdoviridae (por exemplo, vesiculovírus, lissavírus, efemerovírus, citorabdovírus, e necleorabdovírus) , arenaviridae (por exemplo, arenavírus, vírus da coriomeningite linfocítica, Ippy vírus, e lassa vírus), e coronaviridae (por exemplo, coronavírus e torovírus).

Exemplos específicos de anticorpos disponíveis úteis para o tratamento de uma infecção viral incluem, mas não são limitados a, PR0542 (Progenics) o qual é um anticorpo de fusão CD4 útil para o tratamento de infecção por HIV; Ostavir (Protein Design Labs, Inc., CA) o qual é um anticorpo humano útil para o tratamento de vírus da hepatite B; e Protovir (Protein Design Labs, Inc., CA) que é um anticorpo IgGl humanizado útil para o tratamento de citomegalovírus (CMV); e palivizumab (SYNAGIS®; Medlmmune, Inc.; International Publication No. WO 02/43660) que é um anticorpo humanizado útil para o tratamento de RSV.

Em um avanço específico, os agentes antivirais usados nas composições e métodos da invenção inibem ou reduzem uma infecção por vírus, inibem ou reduzem a replicação de um vírus que causa uma infecção, ou inibem ou reduzem a disseminação de um vírus que causa uma infecção a outras células ou sujeitos. Em outro avanço específico, os agentes antivirais usados nas composições e métodos da invenção inibem ou reduzem infecção por RSV, hMPV, ou PIV, inibem ou reduzem a replicação de RSV, hMPV, ou PIV, ou inibem ou reduzem a disseminação de RSV, hMPV, ou PIV a outras células ou sujeitos. Exemplos de tais agentes e métodos de tratamento de infecções por RSV, hMPV, e/ou PIV incluem, mas não são limitados a, análogos de nucleosídeos, como, por exemplo, zidovudina, aciclovir, gangciclovir, vidarabina, idoxuridina, trifluridina, e ribavirina, assim como foscarneto, amantadina, rimantadina, saquinavir, indinavir, ritonavir, e os alfa-interferons. Ver U.S. Prov. Patent App. No. 60/398,475 registrada em 25 de julho de 2002, intitulado "Methods of Treating and Preventing RSV, HMPV, and PIV Using Anti-RSVf Anti-HMPVr and Anti-PIV Antibodies", e U.S. Patent App. No. 10/371.122 registrada em 21 de fevereiro de 2003, as quais são incorporadas aqui por referência em sua íntegra.

Em avanços específicos, a infecção viral é por RSV e o anti-antígeno viral é um anticorpo que se liga imunoespecificamente a um antígeno de RSV. Em certos avanços, o anticorpo anti-antígeno de RSV se liga imunoespecificamente a um antígeno do RSV do Grupo A de RSV. Em outros avanços, o anticorpo anti-antígeno de RSV se liga imunoespecificamente a um antígeno do RSV do Grupo B de RSV. Em outros avanços, um anticorpo se liga a um antígeno de RSV de um Grupo e reage de forma cruzada como antígeno análogo do outro Grupo. Em avanços particulares, o anticorpo anti-antigeno de RSV se liga imunoespecificamente a uma nucleoproteina de RSV, fosfoproteina de RSV, proteína de matriz do RSV, pequena proteína hidrofóbica do RSV, polimerase dependente de RNA do RSV, proteína RSV F, e/ou proteína RSV G. Em avanços adicionais específicos, o anticorpo anti-antigeno de RSV liga-se a variantes alélicos de uma nucleoproteina de RSV, uma proteína de nucleocapsídeo do RSV, uma fosf oproteina do RSV, uma proteína de matriz do RSV, uma glicoproteína de adesão do RSV, uma glicoproteína de fusão do RSV, uma proteína do nucleocapsídeo do RSV uma proteína de matriz do RSV, uma pequena proteína hidrofóbica do RSV, uma polimerase dependente de RNA do RSV, uma proteína RSV F, uma proteína RSV L, uma proteína RSV P, e/ou uma proteína RSV G.

Deve ser reconhecido que anticorpos ligam-se imunoespecificamente a um antígeno do RSV são conhecidos na arte. Por exemplo, palivizumab (SYNAGIS®) é um anticorpo monoclonal humanizado presentemente usado para a prevenção de infecção por RSV em pacientes pediátricos. Em um avanço específico, um anticorpo a ser usado com os métodos da presente invenção é palivizumab ou um fragmento ligante de anticorpo deste (por exemplo, um fragmento contendo uma ou mais regiões determinantes de complementaridade (CDRs) e preferencialmente, o domínio variável de palivizumab). A seqüência de aminoácidos de palivizumab é descrita, por exemplo, em Johnson et al., 1997, J. Infection 176:1215- 1224, e U.S. Patent No. 5,824,307 e International Application Publication No.: WO 02/43660, intitulada nMethods of Administering/Dosing Anti-RSV Antibodies for Prophylaxis and Treatment", por Young et al., as quais são incorporadas aqui por referência em sua integra.

Um ou mais anticorpos ou fragmentos ligantes de antigeno destes que se ligam imunoespecificamente a um antigeno do RSV compreendem um domínio Fc com uma afinidade maior pelo receptor FcRn do que o domínio Fc de palivizpmab também podem ser usados de acordo com a invenção. Tais anticorpos são descritos em U.S. Pat. Appn. No. 10/020,354, registrada em 12 de dezembro de 2001, que é incorporado aqui por referência em sua íntegra. Adicionalmente, um ou mais dos anticorpos anti-antígeno do RSV A4B4; P12f2 P12f4; Plld4; Ale9; A12a6; Al3c4; Al7d4; A4B4; 1X-493L1; FR H3- 3F4; M3H9; Y10H6; DG; AFFF; AFFF(I); 6H8; L1-7E5; L2-15B10; A13all; Alh5; A4B4(1);A4B4-F52S; ou A4B4L1FR-S28R podem ser usados de acordo com a invenção. Estes anticorpos são descritos em International Application Publication No. : WO 02/43660, intitulada "Methods of Administering/Dosing Anti- RSV Antibodies for Prophylaxis and Treatment", por Young et al., e US Provisional Patent Application 60/398.475 registrada em 25 de julho de 2002, intitulada "Methods of Treating and Preventing RSV, HMPV, and PIV Using Anti-RSV, Anti-HMPV, and Anti-PIV Antibodies" as quais são incorporadas aqui por referência em sua íntegra. Em certos avanços, os anticorpos anti-antigeno do RSV são os anticorpos anti-antigeno do RSV de ou são preparados pelos métodos de U.S. Application No: 09/724,531, registrada em 28 de novembro de 2000; 09/996,288, registrada em 28 de novembro de 2001; e U.S. Pat. Publication No. US2003/0091584 Al, publicada em 15 de maio de 2003, todas intituladas "Methods of Administering/Dosing Anti-RSV Antibodies for Prophylaxis and Treatment", por Young et al., os quais são incorporados aqui por referência em suas totalidades. Métodos e composições para formulações estabilizadas de anticorpos que podem ser usados nos métodos da presente invenção são descritos em U.S. Provisional Application Nos. 60/388.921, registrada em 14 de junho de 2002, e 60/388.920, registrada em 14 de junho de 2002, as quais são incorporadas aqui por referência em sua integra.

Terapias antivirais e suas dosagens, rotas de administração e uso recomendado são conhecidos na arte e foram descritos em tais literaturas como a referência Physicians' Desk Reference (61st edition, 2007). Informações adicionais sobre infecções virais respiratórias estão disponíveis em Cecil Textbook of Medicine (18th edition, 1988).

Terapias Antibacterianas

Agentes antibacterianos e terapias bem conhecidas a um especialista na arte para o tratamento, prevenção e/ou gerenciamento de infecções bacterianas podem ser usados nas composições e métodos da invenção. Exemplos não limitantes de agentes antibacterianos incluem proteínas, polipeptideos, peptídeos, proteínas de fusão, anticorpos, moléculas de ácidos nucléicos, moléculas orgânicas, moléculas inorgânicas, e pequenas moléculas que inibem ou reduzem uma infecção bacteriana, inibem ou reduzem a replicação de bactérias, ou inibem ou reduzem a disseminação de bactérias para outros sujeitos. Em particular, exemplos de agentes antibacterianos incluem, mas não são limitados a, penicilina, cefalosporina, imipenem, axtreonam, vancomicina, cicloserina, bacitracina, cloranfenicol, eritromicina, clindamicina, tetraciclina, estreptomicina, tobramicina, gentamicina, amicacina, canamicina, neomicina, spectinomicina, trimetoprim, norfloxacina, rifampina, polimixina, amfotericina B, nistatina, cetoconazol, isoniazida, metronidazol, e pentamidina.

Em um avanço preferido, o agente antibacteriano é um agente que inibe ou reduz a infecção bacteriana, inibe ou reduz a replicação de uma bactéria que causa uma infecção, ou inibe ou reduz a disseminação de uma bactéria que causa uma infecção para outros sujeitos. Em casos nos quais a infecção bacteriana é uma infecção por micoplasma (por exemplo, faringite, traqueobronquite, e pneumonia), o agente antibacteriano é preferencialmente uma tetraciclina, eritromicina, ou espectinomicina. Em casos nos quais a infecção bacteriana é tuberculose, o agente antibacteriano é preferencialmente, rifampcina, isonaizida, piranzinamida, etambutol, e estreptomicina.

Terapias antibacterianas e suas dosagens, rotas de administração e uso recomendado são conhecidas na arte e foram descritos em tais literaturas como a Physicians' Desk Reference (61st edition, 2007) . Informações adicionais sobre infecções respiratórias e terapias antibacterianas estão disponíveis em Cecil Textbook of Medicine (18th edition, 1988) .

5.4.2.7 Terapias Antifúngicas

Agentes antifúngicos e terapias bem conhecidas a um especialista na arte para tratamento, prevenção e/ou gerenciamento de uma infecção fúngica ou um ou mais sintomas dessa (por exemplo, uma infecção respiratória por fungos) podem ser usados nas composições e métodos da invenção. Exemplos não limitantes de agentes antifúngicos incluem proteínas, polipeptídeos, peptídeos, proteínas de fusão, anticorpos, moléculas de ácidos nucléicos, moléculas orgânicas, moléculas inorgânicas, e pequenas moléculas que inibem e/ou reduzem infecção fúngica, inibe e/ou reduz a replicação de fungos, ou inibe e/ou reduz a disseminação de fungos para outros sujeitos. Exemplos específicos de agentes antifúngicos incluem, mas não são limitados a, drogas azóis (por exemplo, miconazol, cetoconazol (NIZORAL®), acetato de caspofungina (CANCIDAS®), imidazol, triazóis (por exemplo, fluconazol (DIFLUCAN®) ), e itraconazol (SPORANOX®)), polieno (por exemplo, nistatina, anfotericina B (FUNGOSZONE®), complexo lipídico de anfotericina B ("ABLC") (ABELCET®), dispersão coloidal de anfotericina B ("ABCD") (AMPHOTEC®), anfotericina B lipossomal (AMBISONE®)), iodeto de potássio (Kl), pirimidinas (por exemplo, flucitosina (ANCOBON®) ), e voriconazol (VFEND®) . Ver, por exemplo, Tabela 3, infra para uma lista de agentes antifúngicos específicos e suas dosagens recomendadas.

Tabela 3. Agentes antifúngicos

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Em certos avanços, o agente antifúngico é um agente que inibe ou reduz uma infecção fúngica, inibe ou reduz a replicação de um fungo que causa uma infecção, ou inibe ou reduz a disseminação de um fungo que causa uma infecção para outros sujeitos. Em casos nos quais a infecção fúngica é Blastomyces dermatitidis, o agente antifúngico é preferencialmente itraconazol, anfotericina B, fluconazol, ou cetoconazol. Em casos nos quais a infecção fúngica é aspergiloma pulmonar, o agente antifúngico é preferencialmente anfotericina B, anfotericina B lipossomal, itraconazol, ou fluconazol. Em casos nos quais a infecção fúngica é histoplasmose, o agente antifúngico é preferencialmente anfotericina B, itraconazol, fluconazol, ou cetoconazol. Em casos nos quais a infecção fúngica é coccidioidomicose, o agente antifúngico é preferencialmente fluconazol ou anfotericina B. Em casos nos quais a infecção fúngica é criptococose, o agente antifúngico é preferencialmente anfotericina B, fluconazol, ou combinação dos dois agentes. Em casos nos quais a infecção é cromomicose, o agente antifúngico é preferencialmente itraconazol, fluconazol, ou flucitosina. Em casos nos quais a infecção fúngica é mucormicose, o agente antifúngico é preferencialmente anfotericina B ou anfotericina B lipossomal. Em casos nos quais a infecção fúngica pulmonar ou respiratória é pseudoalesqueríase, o agente antifúngico é preferencialmente itraconazol ou miconazol.

Terapias antifúngicas e suas dosagens, rotas de administração, e uso recomendado são conhecidos na arte e foram descritos em tais literaturas como, por exemplo, Dodds et al., 2000 Pharmacotherapy 20(11) 1335-1355, o Physicians' Desk Reference (61st edition, 2007) e o Merck Manual of Diagnosis and Therapy (17th edition, 1999).

Terapias Antiprotozoários

Agentes antiprotozoários e terapias bem conhecidas a um especialista na arte para tratamento, prevenção e/ou gerenciamento de uma infecção por protozoários ou um ou mais sintomas dessa (por exemplo, uma infecção respiratória associada a uma infecção por protozoários) podem ser usados nas composições e métodos da invenção. Exemplos não limitantes de agentes antiprotozoários incluem proteínas, polipeptídeos, peptídeos, proteínas de fusão, anticorpos, moléculas de ácidos nucléicos, moléculas orgânicas, moléculas inorgânicas, e pequenas moléculas que inibem e/ou reduzem uma infecção por protozoários, inibe e/ou reduz a replicação de protozoários, ou inibe e/ou reduz a disseminação de protozoários para outros sujeitos. Exemplos específicos de agentes antiprotozoários incluem, mas não são limitados a, fosfato de cloroquina (Aralen™); sulfato de quinina mais um dentre os seguintes: doxociclina, tetraciclina, ou clindamicina; atovaquone-proguanil (Malarone™); Mefloquina (Lariam™); metronidazol (Flagyl); tinidazol (Tindamax) ; 5-nitroimidazol (ornidazole), e agentes descritos em U.S. Patent No. 6,440,936.

Em certos avanços, o agente antiprotozoário é um agente que inibe ou reduz uma infecção por protozoários, inibe ou reduz a replicação de um protozoário que causa uma infecção, ou inibe ou reduz a disseminação de um protozoário que causa uma infecção em outros sujeitos. Em casos nos quais a infecção por protozoários é tricomoníase, o agente antiprotozoário é preferencialmente metronidazol (Flagyl), tinidazol (Tindamax), ou 5-nitroimidazol (ornidazole) . Em casos nos quais a infecção por protozoários é malária, o agente antiprotozoários é preferencialmente fosfato de cloroquina (Aralen™); sulfato de quinina mais uma dentre os seguintes: doxociclina, tetraciclina, ou clindamicina; gluconato de quinidina mais uma dentre os seguintes: dociciclina, tetraciclina, ou clindamicina; Fansidar™; Malarone™ (250 mg de atovaquona mais 100 mg de proguanil); ou Mefloquina (Larium™).

Terapias antiprotozoários e suas dosagens, rotas de administração, e uso recomendado são conhecidos na arte e foram descritos em tais literaturas como, por exemplo, Dodds et al., 2000 Pharmacotherapy 20 (11) 1335-1355, o Physiciansr Desk Reference (61st edition, 2007); o Merk Manual of Diagnosis and Therapy (17th edition, 1999); e publicações fornecidas pelo Center for Disease Control and Prevention (CDC; http://www.cdc.gov) (Atlanta, GA).

Atividade Biológica dos EphA2-BiTEs

Vários testes in vitro e in vivo conhecidos na arte e descritos em detalhes abaixo na Seção 6 podem ser usados para determinar a atividade biológica dos EphA2-BiTEs produzidos pelos métodos da invenção. Tais testes in vitro e in vivo permitem o for filtração e identificação dos EphA2-BiTEs com atividades biológicas desejadas como, por exemplo, especificidade de célula alvo e Iise eficiente de ditas células. Em particular, a invenção provê métodos para determinar a especificidade de célula alvo (por exemplo, a habilidade dos EphA2-BiTEs de ligarem-se imunoespecificamente a células que expressam EphA2) usando vários testes imunológicos. As características de ligação dos EphA2-BiTEs da invenção também podem ser determinadas, usando por exemplo, ressonância de plasmon de superfície para identificar as constantes de afinidade (KD, Kon e Koff) dos EphA2-BiTEs produzidos pelos métodos da invenção. A presente invenção ainda provê testes que podem ser usados para filtrar os EphA2-BiTEs com atividades biológicas específicas, como, por exemplo, a habilidade de ligar-se a células alvo (por exemplo, células tumorais que apresentam expressão aumentada de EphA2) para mediar lise in vitro usando vários testes de citotoxicidade. Tais testes podem ser usados para determinar a toxicidade e eficácia . dos EphA2-BiTEs da invenção (por exemplo, para determinar a dose letal para 50% da população de células tratadas com os EphA2-BiTEs (LD50) ) . Também fornecidos são testes que podem ser usados para determinar a habilidade dos EphA2-BiTEs da invenção para mediar a morte de células tumorais in vivo usando modelos animais.

Testes para determinar a especificidade de célula alvo

Vários testes conhecidos para um especialista na arte podem ser usados para determinar a habilidade dos EphA2- BiTEs da invenção de ligarem-se imunoespecificamente a células expressando EphA2 e CD3 (por exemplo, células que apresentam expressão aumentada de EphA2 ou células nas quais certos epitopos de EphA2 são seletivamente expostos). Tais testes incluem, por exemplo, testes de RIAs, ELISA, Western Blot, imunohistoquímica, imunofluorescência e citometria de fluxo. Por exemplo, como descrito na Seção 6.2.3 abaixo, testes baseados em citometria de fluxo podem ser usados para determinar a ligação celular biespecifica dos vários constructos EphA2-BiTE. Linhagens celulares positivas para EphA2, como, por exemplo, células A54 9 (células de carcinoma de pulmão humanas) e células MDA-MB- 231 (células de câncer da mama humanas) podem ser usadas como células alvo, e células HP-Ball positivas para CD3 (linhagem de células T humanas) podem ser usadas como células efetoras. As células podem ser misturadas juntas e incubadas com um EphA2-BiTE de interesse. Citometria de fluxo pode ser usada para determinar as intensidades de ligação para cada célula alvo positiva para EphA2.

Análises de exclusão de epitopòs podem ser conduzidas usando marcação de imunofluorescência para determinar se os EphA2-BiTEs produzidos pelos métodos da invenção retêm exclusão de epitopo como os anticorpos parentais dos quais eles são derivados. Ver Seção 6.2.4 abaixo.

Testes de ressonância de plasmon de superfície

Testes de ressonância de plasmon de superfície podem ser executados para determinar as características de ligação dos EphA2-BiTEs da invenção. As constantes de afinidade e dissociação assim como as taxas de associação e dissociação (ka, kD, kon e koff) dos EphA2-BiTEs produzidos pelos métodos da invenção podem ser identificadas usando este teste. Ver, por exemplo, 6.8.3 abaixo. Por exemplo, testes de ressonância de plasmon de superfície podem ser executados usando o Sensor Chip CM5 (Biacore AB, üppsala, Suécia) que contém uma matriz dextrana de carboximetila (CM) e um bio-sensor de ressonância de plasmon de superfície Biacore® 3000 (SPR) (Biacore AB, Uppsala, Suécia). CD3εγ é covalentemente associada à matriz dextrana de CM usando acoplamento químico por amina. Uma superfície de referência é criada por omissão do passo de acoplamento do CD3εγ. Um EphA2-Fc é capturado via uma interação de alta afinidade entre a porção Fc de EphA2Fc e a (Fc) de cabra anti-IgG humana (KPL, Inc., Gaithersburg, MD). (Fc) de cabra anti-IgG humana é associada covalentemente à ma.triz dextrana de CM usando acoplamento químico por amina. Duas superfícies específicas para (Fc) anti-IgG humana são então criadas. Uma destas superfícies é usada como uma superfície de referência enquanto a outra superfície é usada para criar uma superfície específica para Fc de EphA2. Concentrações diferentes de bscEphA2 x CD3 são então preparadas por diluição serial em HBS-EP (HEPES a 0,01 M pH 7,4, NaCl a 0,15 M, EDTA a 3 mM, surfactante P20 a 0,005%). EphA2-BiTEs são injetados de uma maneira fluxo-serial através da superfície específica para CD3εγ ou específica para EphA2 e sua superfície de referência correspondente. Dissociação de EphA2-BiTEs ligados é monitorada na presença de HBS-EP. Material ligado remanescente foi removido com 10 mM tetraborato dissódico pH 8,5, NaCl a 1 M (para superfície específica para CD3εγ) ou glicina a 10 mM pH 1,7 (para superfície específica para Fc de EphA2).

Testes de citotoxicidade Como ilustrado na Seção 6.3.1 abaixo, testes de citotoxicidade de células redirecionadas baseados em citometria de fluxo podem ser executados para determinar a atividade citotóxica de EphA2-Bite com doadores de células efetoras. Por exemplo> células mononucleares de sangue periférico humanas enriquecidas em células T CD3+ ("PBMCs") podem ser isoladas de doadores saudáveis. Células alvo, por exemplo, células expressando EphA2, são etiquetadas com um corante fluorescente de membrana como, por exemplo, (Di0C18 (3) ou "DiO"). As células são incubadas juntamente com um EphA2-BiTE de interesse e são analisadas por citometria de fluxo após a adição de iodeto de propidio (PI). A lise celular dos alvos pode então ser calculada como a porcentagem de células positivas para DiO coradas positivas para PI.

Em um avanço especifico, um EphA2-BiTE da invenção medeia a Iise de células associadas com expressão e/ou atividade aberrante de EphA2 (por exemplo, células de câncer, células hiperproliferativas não cancerosas ou células infectadas que expressam EphA2). De acordo com este avanço, tais células são reduzidas em pelo menos 10%, pelo menos 15%, pelo menos 20%, pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 35%, pelo menos 40%, pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 99% ou pelo menos 1,5 vezes, pelo menos 2 vezes, pelo menos 2,5 vezes, pelo menos 3 vezes, pelo menos 3,5 vezes, pelo menos 4 vezes, pelo menos 4,5 vezes, pelo menos 5 vezes, pelo menos 7 vezes ou pelo menos 10 vezes em relação ao nível de células normais da mesma linhagem celular ou sujeito, células de um sujeito normal, saudável e/ou uma população de células normais, saudáveis. Em outro avanço específico, os EphA2-BiTEs não medeiam a Iise de células de tecidos normais ou células normais de tecidos de um sujeito saudável ou controle.

A atividade biológica (por exemplo, anticâncer, a.nti- hiperproliferação, ou anti-atividades infectivas) das terapias usadas de acordo com a presente invenção também podem ser determinadas pelo uso de vários modelos animais experimentais para o estudo do câncer como, por exemplo, o modelo de camundongo SCID ou camundongo transgênico onde um EphA2 de camundongo é substituído pelo EphA2 de humano, camundongos nude com xenoimplantes humanos, modelos animais descritos na Seção 6 infra, ou qualquer modelo animal (incluindo hamsters, coelhos, etc.) conhecidos na arte e descritos em Relevance of Tumor Models for Anticâncer Drug Development (1999, eds. Fiebig e Burger); Contributions to Oncology (1999, Karger); The Nude Mouse in Oncology Research (1991, eds. Boven e Winograd); e Anticâncer Drug Development Guide (1997 ed. Teicher), aqui incorporados por referência em suas totalidades.

Em avanços específicos, os efeitos citotóxicos dos EphA2-BiTEs da invenção também podem ser testados in vivo com um modelo de camundongo como, por exemplo, a imunodeficiência severa combinada não diabética (NOD/SCID) modelo de camundongo usando um xenoimplante tumoral como, por exemplo, a linhagem celular SW480 de carcinoma de cólon humano. A linhagem celular SW480 pode ser selecionada para estabelecimento de um modelo de xenoimplante humano porque as células SW480 expressam EphA2. Brevemente, animais podem ser injetados com uma mistura de células alvo (por exemplo, células SW480) e efetoras (células T CD3+ humanas de doadores saudáveis) ou uma célula alvo sozinha sem células efetoras. A cinética de crescimento tumoral pode ser medida entre os dois grupos de tratamentos. Ver, por exemplo, Seção 6.4.1 abaixo.

Conformemente, a toxicidade e eficácia dos protocolos profiláticos e/ou terapêuticos da presente invenção podem ser determinados por procedimentos farmacêuticos padrão em culturas de células ou animais experimentais, por exemplo, para determinar o LD50 (a dose letal para 50% da população) e o ED50 (a dose terapeuticamente efetiva em 50% da população). Uma razão de dose entre os efeitos tóxico e terapêutico é o índice terapêutico, e ele pode ser expresso como a razão LD50/ED50. Agentes profiláticos e/ou terapêuticos que exibem altos índices terapêuticos são preferidos. Enquanto agentes profiláticos e/ou terapêuticos que exibem efeitos colaterais tóxicos podem ser usados, cuidado deve ser tomado para projetar um sistema de entrega que direcione tais agentes ao sítio do tecido afetado de modo a minimizar o dano potencial a células não infectadas e, assim, reduzir os efeitos colaterais. Exemplos específicos de métodos a atividade biológica dos EphA2- BiTEs da invenção também são fornecidos na Seção 6 dos Exemplos, infra.

Os dados obtidos de testes de cultura de células e

estudos animais podem ser usados na formulação de uma escala de dosagem dos agentes profiláticos e/ou terapêuticos para uso em humanos. A dosagem de tais agentes repousa preferencialmente dentro de uma escala de concentrações de circulação que incluem o ED50 com pouca ou nenhuma toxicidade. A dosagem pode variar dentro desta escala dependendo da forma de dosagem empre-gada e a rota de administração utilizada. Para qualquer agente usado no método da invenção, a dose terapeuticamente efetiva pode ser estimada inicialmente a partir de testes de cultura de células. A dose pode ser formulada em modelos animais para alcançar uma escala de concentração de circulação no plasma que inclui o IC50 (isto é, a concentração do componente testado que alcança a metade da inibição máxima dos sintomas) como determinado em cultura de células. Tal informação pode ser usada para determinar mais acuradamente doses úteis em humanos. Níveis no plasma podem ser medidos, por exemplo, por cromatografia líquida de alta performance.

Compostos para uso em terapias podem ser testados em sistemas de modelo animal adequados antes de testar em humanos, incluindo mais não limitadas a em ratos, camundongos, galinhas, vacas, macacos, coelhos, hamsteres, etc., por exemplo, os modelos animais descritos acima. Os compostos podem então ser usados nos testes clínicos apropriados.

Adicionalmente, quaisquer testes conhecidos daqueles especialistas na arte podem ser usados para avaliar a utilidade profilática e/ou terapêutica das terapias corobinatórias aqui descritas para tratamento ou prevenção de uma desordem associada com expressão e/ou atividade aberrante de EphA2 (por exemplo, câncer, uma desordem celular não hiperproliferativa ou uma infecção).

Composições

A presente invenção prove composições compreendendo um ou mais dos EphA2-BiTEs da invenção. As composições da invenção também incluem composições de drogas em larga escala úteis na manufatura de composições farmacêuticas (por exemplo, composições impuras ou não estéreis) e composições farmacêuticas (isto é, composições que são adequadas para administração para um sujeito ou paciente) que podem ser usadas na preparação de formas de dosagem unitárias. Tais composições compreendem a quantidade profilaticamente ou terapeuticamente efetiva de um agente profilático e/ou terapêutico descrito aqui ou uma combinação destes agentes e um carregador farmaceuticamente aceitável. Preferencialmente, composições da invenção compreendem a quantidade profilaticamente ou terapeuticamente efetiva de um ou mais EphA2-BiTEs da invenção e um carregador farmaceuticamente aceitável. Em um avanço adicional, a composição da invenção compreende ainda uma terapia adicional que não é um EphA2-BiTE.

Em um avanço especifico, o termo "farmaceuticamente aceitável" significa aprovado por uma agência regulatória de um governo federal ou estadual ou listado na U.S. Pharmacopeia ou outra farmacopéia geralmente reconhecida para o uso em animais, e mais particularmente em humanos. 0 termo "carregador" refere-se a um diluente, excipiente, ou veiculo com o qual a terapêutica é administrada. Tais carregadores farmacêuticos podem ser líquidos estéreis, como, por exemplo, água e óleos, incluindo aqueles de petróleo, origem animal, sintética ou vegetal, como, por exemplo, óleo de amendoim, óleo de soja, óleo mineral, óleo de gergelim e os semelhantes. Água é um carregador preferível quando a composição farmacêutica é administrada intravenosamente. Soluções salinas e soluções aquosas de dextrose e glicerol também podem ser empregadas como carregadores líquidos, particularmente pata soluções injetáveis. Excipientes farmacêuticos adequados incluem o amido, glicose, lactose, sacarose, gelatina, malte, arroz, farinha, giz, gel de silicone, estearato de sódio, monoestearato de glicerol, talco, cloreto de sódio, leite em pó, glicerol, propileno, glicol, água, etanol e os semelhantes. A composição, se desejada, também pode conter pequenas quantidades de agentes umedecedores ou emulsionantes, ou agentes tamponantes de pH. Estas composições podem pegar a forma de soluções, suspensões, emulsão, tabletes, pílulas, cápsulas, pós, formulações de liberação prolongada e as semelhantes.

Geralmente, os ingredientes das composições da invenção são fornecidos ou separadamente ou misturados juntos em forma de dosagem unitária, por exemplo, como um pó seco liofilizado ou concentrado livre de água em contêiner hermeticamente selado como, por exemplo, uma ampola ou sachê indicando a quantidade do agente ativo. Onde a composição é para ser administrada por infusão, ela pode ser administrada com uma garrafa de infusão contendo água ou salina estéril de grau farmacêutico. Onde a composição é administrada por injeção, uma ampola para injeção de água estéril ou salina pode ser empregada de modo que os ingredientes possam ser misturados antes da administração.

As composições da invenção podem ser formuladas como formas neutras ou salinas. Sais farmaceuticamente aceitáveis incluem aqueles formados com ânions como, por exemplo, aqueles derivados de ácidos hidroclórico, fosfórico, acético, oxálico, tartárico, etc., e aqueles formados com cátions como, por exemplo, aqueles derivados de sódio, potássio, amônia, cálcio, hidróxidos de ferro, isopropilamina, trietilamina, 2-etilamino etanol, histidina, procaína, etc.

Vários sistemas de entrega são conhecidos e podem ser usados para administrar um EphA2-BiTE da invenção ou a combinação de um EphA2-BiTE da invenção e um agente profilático ou agente terapêutico útil para tratar, prevenir e/ou gerenciar uma desordem associada com expressão aberrante (por exemplo, expressão aumentada) e/ou atividade de EphA2 (por exemplo, câncer, uma desordem celular hiperproliferativa não cancerosa, ou uma infecção), por exemplo, microparticulas, microcápsulas, células recombinantes capazes de expressar o anticorpo ou fragmento de anticorpo (ver, por exemplo, Wu e Wu, 1987, J. Biol. Chem. 262:4429-4432), construção de um ácido nucléico como parte de um vetor retroviral ou outro, etc. Métodos para administrar um agente profilático ou terapêutico da invenção incluem, mas não são limitados a, administração parenteral (por exemplo, intradermal, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa e subcutânea), epidural, e mucosal (por exemplo, intranasal, inalada, e rotas orais). Em um avanço especifico, agentes profiláticos ou terapêuticos da invenção são administrados intramuscularmente, intravenosamente, ou subcutaneamente. Os agentes profiláticos ou terapêuticos podem ser administrados por qualquer rota conveniente, por exemplo por infusão ou injeção de bolo, por absorção através das linhas epitelial oü mucocutânea (por exemplo, mucosa oral, retal e mucosa intestinal, etc.) e podem ser administrados juntos com outros agentes biologicamente ativos. Administração pode ser sistêmica ou local.

Em um avanço especifico, pode ser desejável a administração dos agentes profiláticos ou terapêuticos da invenção localmente na área em necessidade de tratamento; isto pode ser alcançado, por exemplo, e não por meio de limitação, por infusão local, por injeção, ou por meio de um implante, dito implante sendo de um material poroso, não poroso, ou gelatinoso, incluindo membranas, como, por exemplo, membranas sialásticas, ou fibras.

Em ainda outro avanço, o agente profilático ou terapêutico pode ser entregue em uma liberação controlada ou sistema de liberação prolongado. Em um avanço, uma bomba pode ser usada para alcançar liberação controlada ou prolongada (ver Langer, supra; Sefton, 1987, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:20; Buchwald et al., 1980, Surgery 88:507; Saudek et al., 1989, N. Engl. J. Med. 321:574). Em outro avanço, materiais poliméricos podem ser usados para alcançar liberação controlada ou prolongada dos EphA2-BiTEs da invenção ou fragmentos destes (ver por exemplo. Medicai Applications of Controlled Release, Langer and Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, Florida (1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen e Ball (eds.), Wiley, New York (1984); Ranger e Peppas, 1983, J. Macromol. Sei. Rev. Macromol. Chem. 23:61; ver também Levy et al., 1985, Science 228:190; During et al., 1989, Ann. Neurol. 25:351; Howard et al., 1989, J. Neurosurg. 1 1:105); U.S. Patent Nos. 5.679.377; 5.916.597; 5.912.015; 5.989.463; 5.128.326; International Publication Nos. WO 99/15154 e WO 99/20253. Exemplos de polímeros usados em formulações de liberação prolongada incluem, mas não são limitados a, poli (2-hidroxi metacrilato de etila), poli (metacrilato de metila), poli (ácido acrílico), poli (acetato de etileno-co-vinila) , poli (ácido metacrílico) , poliglicolídeos (PLG), polianidridos, poli (pirrolidona de N-vinila) , poli (álcool de vinila), poliacrilamida, poli (etileno glicol), polilactideos (PLA), poli (lactídeo-co- glicolídeos) (PLGA), e poliortoésteres. Em um avanço preferido, o polímero usado na formulação de liberação prolongada é inerte, livre de impuridades lixiviadas, estável em estoque, estéril, e biodegradável. Em ainda outro avanço, o sistema de liberação controlada ou prolongada pode ser colocado em proximidade com o alvo profilático ou terapêutico, assim requerendo apenas uma fração da dose sistêmica (ver, por exemplo, Goodson, em Medicai Applications of Controlled Releaser supra, vol. 2, pp. 115-138 (1984)).

Sistemas de liberação controlada são discutidos na revisão por Langer (1990, Science 249:1527-1533). Qualquer técnica conhecida para um especialista na arte pode ser usada para produzir formulações de liberação prolongada compreendendo um ou mais agentes terapêuticos da invenção. Ver, por exemplo, ü.S. Patent No. 4.526.938; International Publication Nos. WO 91/05548 e WO 96/20698; Ning et al., 1996, Radiotherapy & Oncology 39:179-189; Song et al. , 1995, PDA Journal of Pharmaceutical Science & Technology 50:372-397; Cleek et al., 1997, Pro. Int'l. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater. 24 :853-854; e Lam et al., 1997, Proc. IntfI. Symp. Control Rei. Bioact. Mater. 24:759-760, cada qual sendo incorporado aqui por referência em sua íntegra. Formulações

Composições farmacêuticas para uso de acordo com a presente invenção podem ser formuladas de maneira convencional usando um ou mais carregadores ou excipientes fisiologicamente aceitáveis.

Assim, os EphA2-BiTEs da invenção e seus sais e solventes fisiologicamente aceitáveis podem ser formulados para administração por inalação ou insuflação (seja pela boca ou o nariz) ou administração oral, parenteral ou mucosal (como, por exemplo, bocal, vaginal, retal, sublingual). Em um avanço preferido, administração local ou sistêmica parenteral é usada.

Para administração oral, as composições farmacêuticas podem tomar a forma de, por exemplo, tabletes ou cápsulas preparadas por meios convencionais com excipientes farmaceuticamente aceitáveis como, por exemplo, agentes ligantes (por exemplo, amido de milho pré-gelatinizado, polivinilpirrolidona ou hidroxipropil metilcelulose); enchedores (por exemplo, lactose, celulose microcristalina ou hidrogênio fosfato de cálcio); lubrificantes (por exemplo, estearato de magnésio, talco ou silica); desintegrantes (por exemplo, amido de batata ou amido glicolato de sódio); ou agentes umidificantes (por exemplo, lauril sulfato de sódio). Os tabletes podem ser recobertos por métodos bem conhecidos na arte. Preparações líquidas para administração oral podem tomar a forma de, por exemplo, soluções, xaropes ou suspensões, ou eles podem ser apresentados como um produto seco para constituição na água ou outro veiculo adequado antes do uso. Tais preparações líquidas podem ser preparadas por meios convencionais com aditivos farmaceuticamente aceitáveis como, por exemplo, agentes suspensores (por exemplo, xarope sorbitol, derivativos de celulose ou gorduras hidrogenadas comestíveis); agentes emulsionantes (por exemplo, lecitina ou acácia) ; veículos não aquosos (por exemplo, óleo de amêndoas, ésteres oleosos, álcool etílico ou óleos vegetais fracionados); e preservativos (por exemplo, metil ou propil-p-hidroxibenzoatos ou ácido sórbico). As preparações também podem conter sais tamponantes, agentes saborosos, corantes e adoçantes como apropriado.

Preparações para administração oral podem ser apropriadamente formuladas para dar a liberação controlada do composto ativo.

Para administração oral as composições podem tomar a forma de tabletes ou losangos formulados de maneira convencional.

Para administração por inalação, os agentes profiláticos ou terapêuticos para uso de acordo com a presente invenção são convenientemente entregues na forma de uma apresentação em pulverizador aerossol de pacotes pressurizados ou um nebulizador, com o uso de um propelente adequado, por exemplo, diclorodifluorometano, triclorofluorometano, diclorotetrafluoroetano, dióxido de carbono ou outro gás adequado. No caso de um aerossol pressurizado a unidade de dosagem pode ser determinada ao se providenciar que a válvula entregue uma quantidade mensurada. Cápsulas e cartuchos de, por exemplo, gelatina para uso em um inalador ou insuflador podem ser formulados contendo uma mistura de pós do composto e um pó base adequado como, por exemplo, lactose ou amido.

Os agentes profiláticos ou terapêuticos podem ser formulados para administração parenteral por injeção, por exemplo, por injeção de bolo ou infusão continua. Formulações para injeção podem ser apresentadas em forma de dosagem unitária, por exemplo, em ampolas ou em recipientes multi-dose, com um preservativo adicionado. As composições podem tomar tais formas como suspensões, soluções ou emulsões em veículos oleosos ou aquosos, e podem conter agentes formuladores como, por exemplo, agentes de suspensão, estabilizantes ou dispersores. Alternativamente, o ingrediente ativo pode ser na forma de pó para constituição com um veículo adequado, por exemplo, água estéril livre de pirógenos, antes do uso.

Os agentes profiláticos ou terapêuticos também podem ser formulados em composições retais como, por exemplo, supositórios ou ênemas de retenção, por exemplo, contendo bases de supositórios convencionais como, por exemplo, manteiga de cacau ou outros glicerídeos. Em adição às formulações descritas previamente, os agentes profiláticos ou terapêuticos também podem ser formulados como uma preparação para depósito. Tais formulações de longa atividade podem ser administradas por implantação (por exemplo, subcutaneamente ou

intramuscularmente) ou por injeção intramuscular. Assim, por exemplo, os agentes profiláticos ou terapêuticos podem ser formulados com materiais poliméricos ou hidrofóbicos adequados (por exemplo, como uma emulsão em um óleo aceitável) ou resinas de troca iônica, ou como derivativos frugalmente solúveis, por exemplo, como uma sal frugalmente solúvel.

A invenção também provê que um agente profilático ou terapêutico é empacotado em um contêiner hermeticamente selado como, por exemplo, uma ampola ou sachê indicando a quantidade. Em um avanço, o agente profilático ou terapêutico é fornecido com um pó seco liofilizado esterilizado ou concentrado livre de água em um contêiner hermeticamente selado e pode ser reconstituído, por exemplo, com água ou saline para a concentração adequada para administração para um sujeito.

Em um avanço preferido da invenção, a formulação e administração de vários agentes quimioterapêutico, biológico/imunoterapêutico e hormonal são conhecidos na arte e com freqüência descritos na referência Physicians' Desk Reference (61st edition, 2007). Por exemplo, em certos avanços específicos da invenção, o agente terapêutico da invenção pode ser formulado e fornecido como mostrado na Tabela 2.

Em outros avanços da invenção, agentes terapêuticos radioativos como, por exemplo, isótopos radioativos podem ser dados oralmente como líquidos em cápsulas ou como uma bebida. Isótopos radioativos também podem ser formulados para injeções intravenosas. 0 oncologista especialista pode determinar a formulação preferida e rota de administração.

Em certos avanços os EphA2-BiTEs da invenção, são formulados em 1 mg/ml, 5 mg/ml, 10 mg/ml, e 25 mg/ml para injeções intravenosas e em 5 mg/ml, 10 mg/ml, e 80 mg/ml para administração subcutânea repetida e injeção intramuscular.

As composições podem ser, se desejado, apresentadas em um pacote ou dispositivo distribuidor que pode conter uma ou mais formas de dosagem unitária contendo o ingrediente ativo. 0 pacote pode, por exemplo, compreender folha metálica ou plástica, como, por exemplo, um plástico bolha. 0 pacote ou dispositivo distribuidor pode ser acompanhado por instruções para administração.

Dosagem e Freqüência de Administração

A freqüência e dosagem irão variar também de acordo com fatores específicos para cada paciente dependendo das terapias especificas (por exemplo, o agente terapêutico ou profilático especifico ou agentes) administradas, a severidade da desordem, doença ou condição, rota de administração, assim como idade, corpo, peso, resposta, e o histórico médico passado do paciente. Por exemplo, a dosagem de um agente profilático ou terapêutico ou a composição da invenção que será efetiva no tratamento, prevenção, e/ou gerenciamento de uma desordem associada com expressão aberrante (por exemplo, expressão aumentada) e/ou atividade de EphA2 (por exemplo, câncer, uma desordem celular hiperproliferativa não cancerosa, ou uma infecção), ou um ou mais sintomas desta, podem ser determinados pela administração de uma composição para um modelo animal como, por exemplo, por exemplo, os modelos animais descritos aqui ou conhecidos daqueles especialistas na arte. Em adição, testes in vitro podem opcionalmente ser empregados para ajudar a identificar escalas de dosagens ótimas. Regimes adequados podem ser selecionados por um especialista na arte ao considerar tais fatores e ao seguir, por exemplo, dosagens reportadas na literatura e recomendadas na referência Physiciansr Desk Reference (61st edition, 2007).

Doses exemplares de uma pequena molécula incluem quantidades em miligramas ou microgramas da pequena molécula por quilograma do sujeito ou peso amostrai (por exemplo, em torno de 1 micrograma por quilograma até em torno de 500 miligramas por quilograma, em torno de 100 microgramas por quilograma até em torno de 5 miligramas por quilograma, ou era torno de 1 micrograma por quilograma a até 50 microgramas por quilograma). Para anticorpos, proteínas, polipeptideos, peptideos e proteínas de fusão compreendidos por uma invenção, a dosagem administrada a um paciente é tipicamente de 0,0001 mg/kg a 100 mg/kg de peso corporal de um paciente. Preferencialmente, a dosagem administrada a um paciente é entre 0, 0001 mg/kg e 20 mg/kg, 0, 0001 mg/kg e 10 mg/kg, 0, 0001 mg/kg e 5 mg/kg, 0,0001 e 2 mg/kg, 0, 0001 e 1 mg/kg, 0,0001 mg/kg e 0,75 mg/kg, 0,0001 mg/kg e 0,5 mg/kg, 0,0001 mg/kg a 0,25 mg/kg, 0, 0001 a 0,15 mg/kg, 0, 0001 a 0,10 mg/kg, 0,001 a 0,5 mg/kg, 0,01 a 0,25 mg/kg ou 0,01 a 0,10 mg/kg de peso corporal do paciente. Geralmente, anticorpos humanos têm uma meia-vida mais longa dentro do corpo humano do que anticorpos de outras espécies em função da resposta imunológica a polipeptideos estrangeiros. Assim, pequenas dosagens de anticorpos humanos e administrações menos freqüentes são freqüentemente possíveis. Ademais, dosagem e freqüência de administração dos anticorpos da invenção ou fragmentos desses podem ser reduzidos pelo aumento da absorção e penetração tissular dos anticorpos por modificação como, por exemplo, por exemplo, lipidificação.

Dosagens exemplares dos EphA2-BiTEs da invenção administrados a um paciente são tipicamente 0,01 ug a 100 mg. Uma dosagem particularmente preferida é 0,1 ug a 10 mg, mais preferencialmente, 1 ug a 100 ug, e mais preferencialmente, 3 ug a 10 ug. Em um avanço específico, a dosagem dos EphA2-BiTEs (por exemplo, anticorpos, composições, ou combinação de terapias da invenção) administrada para tratar, prevenir e/ou gerenciar uma desordem associada com expressão aberrante (por exemplo, expressão aumentada) e/ou atividade de EphA2 (por exemplo, câncer, uma desordem celular hiperproliferativa não cancerosa, ou uma infecção), ou um ou mais sintomas desta, em um paciente é 100 mg/kg ou menos, 50 mg/kg ou menos, 25 mg/kg ou menos, 10 mg/kg ou menos, 1 mg/kg ou menos, 500 pg/kg ou menos, 400 pg/kg ou menos, 300 pg/kg ou menos, 200 pg/kg ou menos, 150 pg/kg ou menos, preferencialmente 125 pg/kg ou menos, 100 pg/kg ou menos, 95 pg/kg ou menos, 90 pg/kg ou menos, 85 pg/kg ou menos, 80 pg/kg ou menos, 75 pg/kg ou menos, 70 pg/kg ou menos, 65 pg/kg ou menos, 60 pg/kg ou menos, 55 pg/kg ou menos, 50 pg/kg ou menos, 45 pg/kg ou menos, 40 pg/kg ou menos, 35 pg/kg ou menos, 30 pg/kg ou menos, 25 pg/kg ou menos, 20 pg/kg ou menos, 15 pg/kg ou menos, 10 pg/kg ou menos, 5 pg/kg ou menos, 2,5 pg/kg ou menos, 2 pg/kg ou menos, 1,5 pg/kg ou menos, 1 pg/kg ou menos, 0,5 pg/kg ou menos, ou 0,5 pg/kg ou menos do peso corporal de um paciente. Em outro avanço, a dosagem dos EphA2-BiTEs ou combinação de terapias da invenção administrados para tratar, prevenir e/ou gerenciar uma desordem associada com expressão aberrante (por exemplo, expressão aumentada) e/ou atividade de EphA2 (por exemplo, câncer, uma desordem celular hiperproliferativa não cancerosa, ou uma infecção), ou um ou mais sintomas desta, em um paciente é uma dose unitária de 0,1 mg a 20 mg, 0,1 mg a 15 mg, 0,1 mg a 12 mg, 0,1 mg a 10 mg, 0,1 mg a 8 mg, 0,1 mg a 7 mg, 0,1 mg a 5 mg, 0,1 to 2,5 mg, 0,25 mg a 20 mg, 0,25 a 15 mg, 0,25 a 12 mg, 0,25 a 10 mg, 0,25 a 8 mg, 0,25 mg a 7mg, 0,25 mg a 5 mg, 0,5 mg a 2,5 mg, 1 mg a 20 mg, 1 mg a 15 mg, 1 mg a 12 mg, 1 mg a 10 mg, 1 mg a 8 mg, 1 mg a 7 mg, 1 mg a 5 mg, ou 1 mg a 2,5 mg.

Em outros avanços, um sujeito é administrado com uma ou mais doses de uma quantidade efetiva de um ou mais EphA2-BiTEs da invenção, onde uma dose em uma quantidade efetiva alcança uma titulação sérica de pelo menos 0,1 µg/ml, pelo menos 0,5 µg/ml, pelo menos 1 µg/ml, pelo menos µg/ml, pelo menos 5 µg/ml, pelo menos 6 µg/ml, pelo menos µg/ml, pelo menos 15 µg/ml, pelo menos 20 µg/ml, pelo menos 25 µg/ml, pelo menos 50 µg/ml, pelo menos 100 µg/ml, pelo menos 125 µg/ml, pelo menos 150 µg/ml, pelo menos 175 µg/ml, pelo menos 200 µg/ml, pelo menos 225 µg/ml, pelo menos 250 µg/ml, pelo menos 275 µg/ml, pelo menos 300 µg/ml, pelo menos 325 µg/ml, pelo menos 350 µg/ml, pelo menos 375 µg/ml, ou pelo menos 400 µg/ml dos EphA2-BiTEs da invenção. Em ainda outros avanços, um sujeito é administrada uma dose de uma quantidade efetiva de um ou mais EphA2-BiTEs da invenção para alcançar uma titulação sérica de pelo menos 0,1 µg/ml, pelo menos 0,5 µg/ml, pelo menos 1 µg/ml, pelo menos, 2 µg/ml, pelo menos 5 µg/ml, pelo menos 6 µg/ml, pelo menos 10 µg/ml, pelo menos 15 µg/ml, pelo menos 20 µg/ml, pelo menos 25 µg/ml, pelo menos 50 µg/ml, pelo menos 100 µg/ml, pelo menos 125 µg/ml, pelo menos 150 μg/ml, pelo menos 175 μg/ml, pelo menos 200 μg/ml, pelo menos 225 μg/ml, pelo menos 250 μg/ml, pelo menos 275 μg/ml, pelo menos 300 μg/ml, pelo menos 325 μg/ml, pelo menos 350 μg/ml, pelo menos 375 μg/ml, ou pelo menos 400 μg/ml dos anticorpos e uma dose subseqüente de uma quantidade efetiva de um ou mais EphA2-BiTEs da invenção é administrada para manter uma titulação sérica de pelo menos 0,1 μg/ml, 0,5 μg/ml, 1 μg/ml/ pelo menos, 2 μg/ml, pelo menos 5 μg/ml, pelo menos 6 μg/ml, pelo menos 10 μg/ml, pelo menos 15 μg/ml, pelo menos 20 μg/ml, pelo menos 25 μg/ml, pelo menos 50 μg/ml, pelo menos 100 μg/ml, pelo menos 125 μg/ml, pelo menos 150 μg/ml, pelo menos 175 μg/ml, pelo menos 200 μg/ml, pelo menos 225 μg/ml, pelo menos 250 μg/ml, pelo menos 275 μg/ml, pelo menos 300 μg/ml, pelo menos 325 μg/ml, pelo menos 350 μg/ml, pelo menos 375 μg/ml, ou pelo menos 400 μg/ml. De acordo com estes avanços, um sujeito pode ser administrado com 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 ou mais doses subseqüentes.

Em um avanço especifico, a invenção provê métodos para tratar, prevenir e/ou gerenciar ma desordem associada com expressão aberrante (por exemplo, expressão aumentada) e/ou atividade de EphA2 (por exemplo, câncer, uma desordem celular hiperproliferativa não cancerosa, ou uma infecção) , ou um ou mais sintomas desta, dito método compreendendo a administração a um sujeito em necessidade desta uma dose de pelo menos 10 μg, preferencialmente pelo menos 15 μg, pelo menos 20 μg, pelo menos 25 μg, pelo menos 30 μg, pelo menos 35 μg, pelo menos 40 μg, pelo menos 45 μg, pelo menos 50 µg, pelo menos 55 µg, pelo menos 60 µg, pelo menos 65 µg/ pelo menos 70 µg, pelo menos 75 µg, pelo menos 80 µg/ pelo menos 85 µg, pelo menos 90 µg, pelo menos 95 µg, pelo menos 100 µg, pelo menos 105 µg, pelo menos 110 µg, pelo menos 115 µg, pelo menos 120 µg, pelo menos 150 µ.?, pelo menos 300 µg, pelo menos 400 µg, pelo menos 500 µg, pelo menos pelo menos 1 mg, pelo menos 5 mg, pelo menos 10 mg, pelo menos 25 mg, pelo menos 50 mg, ou pelo menos 100 mg de um ou mais EphA2-BiTEs, combinação de terapias, ou composições da invenção. Em outro avanço, a invenção provê um método para tratar, prevenir e/ou gerenciar uma desordem associada com expressão aberrante (por exemplo, expressão aumentada) e/ou atividade de EphA2 (por exemplo, câncer, uma desordem celular hiperproliferativa não cancerosa, ou uma infecção), ou um ou mais sintomas desta, ditos métodos compreendendo a administração a um sujeito em necessidade desta uma dose de pelo menos 10 µg, preferencialmente pelo menos 15 µg, pelo menos 20 µg, pelo menos 25 µg, pelo menos 30 µg, pelo menos 35 µg, pelo menos 40 µg, pelo menos 45 µg, pelo menos 50 µg, pelo menos 55 µg, pelo menos 60 µg, pelo menos 65 pg, pelo menos 70 pg, pelo menos 75 µg, pelo menos 80 µ9, pelo menos 85 µg, pelo menos 90 µg, pelo menos 95 µg, pelo menos 100 µg, pelo menos 105 µg, pêlo menos 110 µg, pelo menos 115 µg, ou pelo menos 120 µg de um ou mais EphA2-BiTEs, combinação de terapias, ou composições da invenção como uma infusão continua, uma vez a cada 3 dias, preferencialmente, uma vez a cada 4 dias, uma vez a cada 5 dias, uma vez a cada 6 dias, uma vez a cada 7 dias, uma vez a cada 8 dias, uma vez a cada 10 dias, uma vez a cada duas semanas, uma vez a cada três semanas, ou uma vez ao mês.

A presente invenção provê métodos para tratar, prevenir e/ou gerenciar uma desordem associada com expressão aberrante (por exemplo, expressão aumentada) e/ou atividade de EphA2 (por exemplo, câncer, uma desordem celular hiperproliferativa não cancerosa, ou uma infecção), ou um ou mais sintomas desta, dito método compreendendo: (a) administração a um sujeito em necessidade desta uma ou mais doses de uma quantidade profilaticamente ou terapeuticamente efetiva de um ou mais EphA2-BiTEs, combinação de terapias, ou composições da invenção; e (b) monitoramento do nivel/concentração plasmático de ditos EphA2-BiTEs administrados em dito sujeito após administração de um certo número de doses dos ditos EphA2- BiTEs. Adicionalmente, ditos certos números de doses é 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, ou 12 doses de uma quantidade profilaticamente ou terapeuticamente efetiva de um ou mais EphA2-BiTEs, composições, ou combinação de terapias da invenção. Em outro avanço, a dose é administrada como uma infusão intravascular continua.

Em um avanço especifico, a invenção provê um método para tratar, prevenir e/ou gerenciar uma desordem associada com expressão aberrante (por exemplo, expressão aumentada) e/ou atividade de EphA2 (por exemplo, câncer, uma desordem celular hiperproliferativa não cancerosa, ou uma infecção), ou um ou mais sintomas desta, dito método compreendendo: (a) administração a um sujeito em necessidade desta uma dose de pelo menos 10 pg (preferencialmente pelo menos 15 pg, pelo menos 20 μg, pelo menos 25 pg, pelo menos 30 pg, pelo menos 35 pg, pelo menos 40 pg, pelo menos 45 pg, pelo menos 50 pg, pelo menos 55 pg, pelo menos 60 pg, pelo menos 65 pg, pelo menos 70 pg, pelo menos 75 pg, pelo menos 80 pg, pelo menos 85 pg, pelo menos 90 pg, pelo menos 95 pg, ou pelo menos 100 pg) de um ou mais EphA2-BiTEs da invenção; e (b) administração de uma ou mais doses subseqüentes a dito sujeito quando o nivel plasmático dos EphA2-BiTE administrados em dito sujeito é menor do que 0,1 pg/ml, preferencialmente menor do que 0,25 pg/ml, menor do que 0,5 pg/ml, menor do que 0,75 pg/ml, ou menos do que 1 pg/ml. Em outro avanço, a invenção provê um método para tratar, prevenir e/ou gerenciar uma desordem associada com expressão aberrante (por exemplo, expressão aumentada) e/ou atividade de EphA2 (por exemplo, câncer, uma desordem celular hiperproliferativa não cancerosa, ou uma infecção), ou um ou mais sintomas desta, dito método compreendendo: (a) administração a um sujeito em necessidade desta uma ou mais doses de pelo menos 10 pg (preferencialmente pelo menos 15 pg, pelo menos 20 pg, pelo menos 25 pg, pelo menos 30 pg, pelo menos 35 pg, pelo menos 40 pg, pelo menos 45 pg, pelo menos 50 pg, pelo menos 55 pg, pelo menos 60 pg, pelo menos 65 pg, pelo menos 70 pg, pelo menos 75 pg, pelo menos 80 pg, pelo menos 85 pg, pelo menos 90 pg, pelo menos 95 pg, ou pelo menos 100 pg) de um ou mais anticorpos da invenção; (b) monitoramento do nivel plasmático dos EphA2- BiTEs da invenção administrados em dito sujeito após a administração de um certo número de doses; e (c) administração de uma dose subseqüente dos EphA2-BiTEs da invenção quando o nível plasmático do EphA2-BiTE administrado em dito sujeito é menor do que 0,1 pg/ml, preferencialmente menor do que 0,25 μg/ml, menor do que 0,5 pg/ml, menor do que 0,75 pg/ml, ou menos do que 1 μg/ml. Em um avanço, dito certo número de doses é 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, ou 12 doses de uma quantidade efetiva de um ou mais EphA2-BiTEs da invenção ou podem ser administrados como uma infusão intravascular contínua.

Terapias (por exemplo, agentes profiláticos ou terapêuticos), outras que não os EphA2-BiTEs da invenção, os quais têm sido ou estão sendo correntemente usados para tratar, prevenir e/ou gerenciar uma desordem associada com expressão aberrante (por exemplo, expressão aumentada) e/ou atividade de EphA2 (por exemplo, câncer, uma desordem celular hiperproliferativa não cancerosa, ou uma infecção) ou um ou mais sintomas dessa podem ser administrados em combinação com um ou mais EphA2-BiTEs de acordo com os métodos da invenção para tratar, prevenir e/ou gerenciar uma desordem associada com expressão aberrante (por exemplo, expressão aumentada) e/ou atividade de EphA2 (por exemplo, câncer, uma desordem celular hiperproliferativa não cancerosa, ou uma infecção) ou um ou mais sintomas desta. Preferencialmente, as dosagens dos agentes profiláticos ou terapêuticos usados em combinação de terapias da invenção são menores do que aquelas as quais foram ou estão sendo atualmente usadas para tratar, prevenir e/ou gerenciar uma desordem associada com expressão aberrante (por exemplo, expressão aumentada) e/ou atividade de EphA2 (por exemplo, câncer, uma desordem celular hiperproliferativa não cancerosa, ou uma infecção) ou um ou mais sintomas desta. As dosagens recomendadas de agentes correntemente usados para o tratamento, prevenção e/ou gerenciamento de uma desordem associada com expressão aberrante (por exemplo, expressão aumentada) e/ou atividade de EphA2 (por exemplo, câncer, uma desordem celular hiperproliferativa não cancerosa, ou uma infecção), ou um ou mais sintomas desta, podem ser obtidas de qualquer referência na arte incluindo, mas não limitam-se a, Hardman et al., eds., 2001, Goodman & Gilman's The Pharmacological Basis Of Basis Of Therapeutics, IOth ed., Mc-Graw-Hill, Nova Iorque; Physiciansf Desk Reference (61st edition, 2007), Medicai Eeonomics Co., Inc., Montvale, NJ, as quais são incorporadas aqui por referência em sua integra.

Em vários avanços, as terapias (por exemplo, agentes profiláticos ou terapêuticos) são administradas como uma infusão continua, menor do que 5 minutos entre elas, menor do que 30 minutos entre elas, 1 hora entre elas, em torno de 1 hora entre elas, em torno de 1 a em torno de 2 horas entre elas, em torno de 2 horas a em torno de 3 horas entre elas, em torno de 3 horas a em torno de 4 horas entre elas, em torno de 4 horas a em torno de 5 horas entre elas, em torno de 5 horas a em torno de 6 horas entre elas, em torno de 6 horas a em torno de 7 horas entre elas, em torno de 7 horas a em torno de 8 horas entre elas, em torno de 8 horas a em torno de 9 horas entre elas, em torno de 9 horas a em torno de 10 horas entre elas, em torno de 10 horas a em torno de 11 horas entre elas, em torno de 11 horas a em torno de 12 horas entre elas, em torno de 12 horas a 18 horas entre elas, 18 horas a 24 horas entre elas, 24 horas a 36 horas entre elas, 36 horas a 48 horas entre elas, 48 horas a 52 horas entre elas, 52 horas a 60 horas entre elas, 60 horas a 72 horas entre elas, 72 horas a 84 horas entre elas, 84 horas a 96 horas entre elas, ou 96 horas a 120 horas entre elas. Em avanços preferidos, duas ou mais terapias são administradas dentro da mesma visita ao paciente.

Em certos avanços, um ou mais anticorpos da invenção e uma ou mais outras terapias (por exemplo, agentes profiláticos ou terapêuticos) são ciclicamente administrados. Terapia cíclica envolve a administração de uma terapia primeira (por exemplo, um primeiro agente profilático ou terapêutico) por um período de tempo, seguido pela administração de uma segunda terapia (por exemplo, um segundo agente profilático ou terapêutico) por um período de tempo, opcionalmente, seguido pela administração de uma terceira terapia (por exemplo, agente profilático ou terapêutico) por um período de tempo e assim por diante, e repetindo essa administração seqüencial, isto é, o ciclo de modo a reduzir o desenvolvimento de resistência a uma das terapias, para evitar ou reduzir os efeitos colaterais de uma ou mais das terapias, e/ou para aumentar a eficácia das terapias. Em certos avanços, a administração dos mesmos EphA2- BiTEs da invenção podem ser repetidos e as administrações podem ser separadas por pelo menos 1 dia, 2 dias, 3 dias, 5 dias, 10 dias, 15 dias, 30 dias, 45 dias, 2 meses, 75 dias, 3 meses, ou pelo menos 6 meses. Em outros avanços, a administração de uma terapia (por exemplo, um agente profilático ou terapêutico) outra que não um EphA2-BiTE da invenção pode ser repetido e a administração pode ser separada por pelo menos 1 dia, 2 dias, 3 dias, 5 dias, 10 dias, 15 dias, 30 dias, 45 dias, 2 meses, 75 dias, 3 meses, ou pelo menos 6 meses.

Kits

A invenção provê um pacote farmacêutico ou kit compreendendo um ou mais recipientes preenchidos com um ou mais EphA2-BiTEs da invenção, polinucleotideos codificando ditos EphA2-BiTEs, e vetores expressando ditos polinucleotideos. Adicionalmente, um ou mais outros agentes profiláticos ou terapêuticos úteis para o tratamento de uma desordem associada com expressão aberrante (isto é, expressão aumentáda) e/ou atividade de EphA2 (por exemplo, câncer, uma desordem celular hiperproliferativa não cancerosa, ou uma infecção) também podem ser incluídos no pacote farmacêutico ou kit. A invenção também provê um pacote farmacêutico ou kit compreendendo um ou mais recipientes preenchidos com um ou mais dos ingredientes das composições farmacêuticas da invenção. Opcionalmente associadas com tal (is) recipiente (s) podem uma nota na forma prescrita por uma agência governamental regulando a manufatura, uso ou venda de produtos farmacêuticos ou biológicos, tal nota refletindo a aprovação pela agência da manufatura, uso ou venda para administração humana.

A presente invenção provê kit que podem ser usados nos métodos acima. Em um avanço, um kit compreende, em um ou mais recipientes, um ou mais EphA2-BiTEs da invenção e instruções para uso. Em outro avanço, um kit ainda compreende um ou mais outros agentes profiláticos ou terapêuticos úteis para o tratamento de uma desordem associada com expressão aberrante (isto é, expressão aumentada) e/ou atividade de EphA2 (por exemplo, câncer, uma desordem celular hiperproliferativa não cancerosa, ou uma infecção) , em um ou mais recipientes. Em um avanço especifico, o EphA2-BiTE é anti-CD3xEA2 (VH/VL) desimunizado. Em certos avanços, o outro agente profilático ou terapêutico é um quimioterapêutico. Em outros avanços, o agente profilático ou terapêutico é uma terapêutica biológica ou hormonal. Em ainda outros avanços, o agente profilático ou terapêutico é um antiviral, antifúngico, antiprotozoários, antibacteriano, ou um agente anti- autoimune.

A presente invenção ainda provê kits compreendendo qualquer das composições diagnosticas discutidas acima.

EXEMPLOS Os seguintes exemplos não limitantes demonstram a produção dos EphA2-BiTEs e sua caracterização.

GERAÇÃO DE EphA2-BiTE

Construção de Oito BiTEs Específicos para EphA2 a Partir de dois Anticorpos Monoclonais

Plasmídios com seqüências codificadoras para domínios

variáveis de dois anticorpos murinos anti-EphA2 chamados EA2 e EA5 como descrito na U.S. Pub. No. US 2004-0091486 A1 e Appln. Serial No. 11/544.322, registrada em 6 de outubro de 2006, foram utilizadas para construção de EphA2-BiTE.

Ver também FIGS. 1 e 2, respectivamente. Um anticorpo de cadeia simples anti-CD3, um derivativo desimunizado do anticorpo monoclonal murino específico para CD3s humana L2K chamado diL2K foi usado para fusão com os Anticorpos de cadeia simples EphA2 (ver Dreier et al., 2002, Int. J.

Câncer 100:690-697, o qual é incorporado aqui por referência em sua íntegra). DNAs c para oito diferentes constructos de BiTE foram gerados por fusão baseada em PCR. Constructos de BiTE tinham os seguintes arranjos de domínios (VH e VL) variáveis e posicionamento de anticorpos

de cadeia simples anti-EphA2 e anti-CD3: Constructos de BiTE Feitos

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A estrutura do DNAc de BiTE é mostrada em FIG. 3. As inserções clonadas no vetor de expressão pEF-DHFR cada qual compreendendo um lider com um sitio Kozak 5'-terminal para eficiência de tradução aumentada e uma seqüência sinal secretória (lider de cadeia pesada de Ig murina). O lider é seguido por quatro domínios Ig variáveis listados acima. O peptídeo ligante na junção Vl-Vh ou VH-VL de anti-EphA2 tem um comprimento de 15 aminoácidos (três repetições do motivo G4S; SEQ ID NO:59). O peptídeo ligante conectando o EphA2 com a especificidade de ligação a CD3 compreende uma repetição do motivo G4S (SEQ ID NO:58). Diretamente adjacente ao quarto domínio é uma seqüencia C-terminal de hexa-histidina (H6) (SEQ ID NO: 66) para propósitos de detecção e purificação. Os sítios de enzimas de restrição indicados foram usados para clonar os constructos de BiTE no vetor de expressão.

Vetores para Expressão de BiTE em Células CHO

0 vetor pEF-DHFR é um vetor de 5,8 kb com a dihidrofolato redutase murina como marcador de seleção formando uma unidade de transcrição bi-cistrônica junto com o gene a ser expresso sob o controle do promotor humano EFlα. 0 vetor eucariótico de expressão é um derivativo do vetor de expressão pMT2PC.

0 promotor EFla é seguido por um sítio de clonagem múltipla, um sítio interno de entrada ribossomal (IRES), o gene DHFR e um sinal de poliadenilação. Seqüências controle adicionais presentes no vetor são a origem de replicação bacteriana (ORI) e o gene para resistência a ampicilina (bla) . Na seguinte tabela, os vários elementos do vetor de expressão de DNAc são de expressão são sumariados.

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Uma descrição do vetor é mostrada em FIG. 4.

Linhagem Celular CHO do Recipiente

A linhagem celular CH0/dhfrˉ de ovário de hamster chinês (CHO), CRL 9096, foi comprada na American Type Culture Collection ("ATCC"; Manassas, Virgínia), e foi caracterizada por Q-One, UK. Hipoxantina e timidina t/6em 10 de ser adicionadas como suplementos ao meio de cultura porque a linhagem celular CHO/dhFr é deficiente em dihidrofolato redutase.

Expressão de BiTE em Células CHO

Após transfecção das células CHO/dhfr" com os oito vetores de expressão codificando constructos BiTE baseados em EphA2, cada conjunto celular foi cultivado em maio de soja liquido livre de nucleosídeos HyQ PF CHO (com L- Glutamine a 4,0 mM com Pluronic F - 68 a 0,1%; Cat.# SH30359.02; HyClone) para seleção de transfectantes positivos para DHFR. Subseqüentemente, o conjunto de células trnasfectadas foi sujeito a uma etapa de amplificação de gene único usando inibidor de DHFR metotrexato (MTX) em uma concentração de 20 nM como um suplemento ao meio livre de nucleosídeo. Purificação dos EphA2-BiTEs dos Sobrenadantes de Cultura

Sistema de FPLC Ãkta® (Amersham) e programa computacional Unicorn® foram usados para cromatografia. Cromatografia de afinidade de metal imobilizado ("IMAC") foi executada usando uma coluna Fractogel© (Merck) a qual foi carregada com ZnCl2 de acordo com o protocolo providenciado pelo fabricante. A coluna foi equilibrada com tampão A (tampão de fosfato de sódio a 20 mM pH 7,5, NaCl a 0,4 M) e o sobrenadante da cultura de células (500 ml) foi aplicado à coluna (10 ml) a uma taxa de fluxo de 3 ml/min. A coluna foi lavada com tampão A para remover amostra não ligada. Proteína ligadas foram eluidas usando um gradiente em duas estapas de tampão B (tampão fosfato de sódio a 2OmM pH 7,5, NaCl a 0,4 M, Imidazol a 0,5 M) de acordo com o seguinte:

Etapa 1: 10% de tampão B em 6 volumes da coluna;

Etapa 2: 100% de tampão B em 6 volumes da coluna.

Frações de proteínas eluidas pela etapa 2 foram agrupadas para purificação adicional.

Cromatografia de filtração em gel foi executada em uma coluna Sephadex 200 HiPrep (Amersham) equilibrada com PBS (Gibco) (FIG. 5) . Amostras de proteínas eluidas (a taxa de fluxo de 1 ml/min) foram sujeitas a detecção por SDS-PAGE padrão e Western Blot (FIG. 6) . Antes da purificação, a coluna foi calibrada para determinação de peso molecular (kit de marcadores de peso molecular, Sigma MW GF-200(. Concentrações de proteínas foram determinadas usando corante protéico para teste (MicroBCA, Pierce) e IgG (Biorad) como proteína padrão.

BiTE EphA2s Substitutos Reativos com CD3 de Macacos para Estudos de Toxicidade

Análises de Ligação por Citometria de Fluxo de Anticorpos Parentais Anti-CD3 reativos a Cinomolgus

Como ponto de partida para os constructos EphA2-BiTE serem testados para toxicologia em macacos cinomolgus, células mononucleares de sangue periférico ("PBMCs") de macacos cinomolgus foram usados para detectar ligação a CD3 de dois anticorpos parentais anti-CD3 reativos a cinomolgus, cCD3-l e cCD3-2, ambos conjugados com FITC. Para cada amostra 200.000 células foram incubadas com os respectivos anticorpos por 30 minutos em gelo. Subseqüentemente as células foram lavadas duas vezes com PBS. Como controle negativo um anticorpo irrelevante foi usado (linha preta) . Ligação a CD3 é representada por linhas cinzas nas sobreposições de histograma. Células foram analisadas por citometria de fluxo em um FACS-Calibur (Becton Dickinson, Heidelberg). Ambos os anticorpos mostraram ligação distinta à fração de células T dos BMC de cinomolgus. Ver FIG. 7. Moléculas Substitutas com uma Especificidade de Alvo Substituída

Os domínios variáveis dos anticorpos parentais anti- CD3 cCD3-l e cCD3-2 foram usados para construir moléculas BiTE com especificidade de alvo substituída. Anticorpos de cadeia simples em diferentes arranjos de domínios foram criados por fusão baseada em PCR. Os seguintes constructos de BiTE foram gerados ao combinar estas especificidades com uma especificidade de alvo substituta:

<table>table see original document page 287</column></row><table>

Clonagem e transfecção dos constructos substitutos foram executadas com descrito acima.

Evidência para Reatividade Cruzada· de Anticorpos Monoclonais EA2 e EA5 com EphA2 de Rhesus

O seqüenciamento de EphA2 de Rhesus da linhagem de

linhagem Rhesus CMMT110/CL (97.7% de homologia com EphA2 de humano) e seqüenciamento parcial de células de baço de cinomolgus (> 99% de homologia com EphA2 de humano) sugeriram que os anticorpos monoclonais específicos para EphA2 de humanos EA2 e EA5 podem ser capazes de reagir cruzadamente com as moléculas EphA2 de primatas não humanos. De fato, anticorpos EA2e EA5 ativaram a fosforilação de EphA2 em células CMMT110/CL (FIG. 8), e ligaram-se fracamente a EphA2 de superfícies das células CMMT110/CL como medido por citometria de fluxo (mudança no MFI versus isotipo controle de 1,2-1,8 vezes).

Construção de EA2 e EA5 BiTEs de Macacos Reativos a CD3

Plasmidios com seqüências codificadores para cadeias variáveis dos anticorpos EA2 e EA5 anti-EphA2 e anticorpos de cadeia simples específicos para CD3 de macaco cCD3-l e cCD3-2 foram construídos por fusão baseada em PCR. As seguintes 12 moléculas de BiTE foram feitas:

<table>table see original document page 288</column></row><table> <table>table see original document page 289</column></row><table>

Clonagem e transfecção dos constructos substitutos foram realizadas como descrito acima.

Análise da Ligação por Citometria de Fluxo de Vários Constructos de BiTE Substitutos Anti-EphA2 Reagindo com CD3 de Macaco

Para cada amostra 200.000 células (células T ou células tumorais EphA2+) foram incubadas com 50 pL de sobrenadante puro de cultura de células CHO transfectadas com os constructos de BiTE substitutos por 30 minutos em gelo. As células foram lavadas subseqüentemente duas vezes com PBS e constructos ligados foram detectados via seus tags de histidina c-terminais com anticorpo murino Penta His (diluido a 5pg/ml em 50 μΐ de PBS com soro fetal de bezerro a 2%; Qiagen; Ordem No. 34660) seguido por um etapa de lavagem e um anticorpo especifico para FC gama murino conjugado a ficoeritrina (Dianova, ordem número 115-116- 071), diluido 1:100 em 50 μΐ de PBS com soro fetal de bezerro a 2% (linha cinza). Como um controle negativo, sobrenadantes de cultura de células não transfectadas foi usado (linha preta). Células foram analizadas por citometria de fluxo em FACS-Calibur (Becton Dickinson, Heidelberg). Como mostrado em FIG. 9, apenas aqueles constructos de BiTE substitutos baseados em anticorpo CD3 de macaco cCD3-l mostraram forte ligação a CD3 e EphA2. Constructos baseados em cCD3-2 mostraram apenas forte ligação a CD3; a ligação a EphA2 se mostrou quase que completamente suprimida.

CARACTERIZAÇÃO DE EphA2-BiTE

Análise da Ligação por Citometria de Fluxo de Anticorpos Parentais Anti-EphA2

Uma análise por citometria de fluxo foi executada para estimar a força de ligaçãodos anticorpos monocloanis parentais anti-EphA2 B233, EA2 e EA5 (FIG. 10). Ver FIG. 3 para seqüências de domínios VL e VH do anticorpo monoclonal B233. Células A549 expressando EphA2 (linhagem de células de carcinoma pulmonar humano) e células MDA-MB-231 (câncer de mama humano) foram usadas. 200.000 células foram incubadas com 10 μg/ml do respectivo anticorpo por 30 minutos em gelo. As células foram subseqüentemente lavadas por duas vezes com PBS. A ligação do anticorpo primário foi detectada via um anticorpo específico para Fc-gama murino conjugado a ficoeritrina (Dianova, ordem número 115-116- 071) diluído em 50 μL de PBS com soro fetal de bezerro a 2%. Como controle negativo, um anticorpo irrelevante com o mesmo isotipo foi usado (linha fina). Células foram analisadas por citometria de fluxo em um FACS-Calibur (Becton Dickinson, Heidelberg).

Anticorpo monoclonal B233 mostrou o sinal de ligação mais forte seguido por EA2 e EA5. As capacidades de ligação dos três diferentes anticorpos são mostradas em uma sobreposição em histograma.

Reatividade cruzada tecidual (TCR) Anticorpos Parentais EA2 e EA5 Anti-EphA2

Seções de tecido humano congelado foram coradas com os anticorpos monoclonais reativos a EphA2 de humanos EA5 e EA2 usando métodos imunohistoquimicos para determinar se os anticorpos ligam-se especificamente a tecido normal. Brevemente, um pré-complexo de anticorpos primários e secundários foi produzido com os sítios de ligação secundários desligados bloqueados com espécies de gama globulinas apropriadas. Seções congeladas foram aderidas a 16aminas em formalina a 10% e lavadas com salina tamponada com Tris Ix (TBS) com Tween 20 a 0,01%. Peroxidases endógenas foram bloqueadas com uma solução contendo glicose oxidase (Sigma, β-D(+)-glicose (Sigma), e azida de sódio (Sigma). Um kit vetor avidina/biotina (Vector Labs) bloqueou sítios reativos a avidina/biotina. As lâminas foram então incubadas com uma solução de proteína bloqueadora consistindo de albumina sérica bovina, caseína, e soro de cabra normal. Seções 'de tecidos foram incubadas com anticorpos pré-complexados e então Vectastain ABC Elite Kit (Vector Labs), lavados com TBS lx, tratadas com DAB (Sigma), e contra-coradas com hematoxilina. Seções de tecidos foram desidratadas, cobertas com lamínula, e feitas imagens Como mostrado em FIG. 11, EA5 demonstrou marcação de discos intercalados no tecido cardíaco (FIG 11 B) elementos de músculo liso vascular e estromal de múltiplos órgãos (citoplasma), epitélio de cólon (citoplasma), e miométrio) uterino. Seções de tecidos humanos (FIG. 11 C) não foram marcadas com EA2 quando comparados com um controle isotipo anticorpo monoclonal 1A7, e como resumido pela Tabela abaixo.

<table>table see original document page 292</column></row><table> <table>table see original document page 293</column></row><table>

Neg = Negativo; 1+ - fraco; 2+ - moderado; 3+ = forte; 4+ = intenso

Células MDA 231 foram usadas com um controle positivo para este teste.

Ligação Celular Biespecifica de Constructos EphA2-BiTE

Células A549 positivas para EphA2 (linhagem de células de carcinoma pulmonar humano) e células MDA-MB-231 (câncer de mama humano), assim como HP-BALL positivas para CD3 (linhagem de células T humanas) foram usadas. 200.000 células foram incubadas com 10 ug/ml do monômero de BiTE purificado de quatro diferentes constructos de EphA2 de BiTE por 30 minutos em gelo. Células foram subseqüentemente lavadas duas vezes em PBS e constructos ligados foram detectados via seus Tag hexahistidina C-terminais com um anticorpo murino penta-His (diluído 1:20 em 50 μL de PBS com soro fetal de bezerro a 2%; Qiagen; ordem número 34660) seguido por um etapa de lavagem e um anticorpo específico para Fc-gama murino conjugado a ficoeritrina (Dianova, ordem número 115-116-071) diluído 1:100 em 50 μL de PBS com soro fetal de bezerro a 2% (linha cinza). Como um controle negativo, meio de cultura de células fresco de células CHO não trnasfectadas ao invés de sobrenadante de cultura dos transfectantes foi usado (linha preta). Células foram analisadas por citometria de fluxo em um FACS-Calibur (Becton Dickinson, Heidelberg). Ver FIG. 12.

A seguinte Tabela resume as intesidades relativas de ligação de todos os oitos constructos EphA2-BiTE gerados como determinado por citometria de fluxo.

<table>table see original document page 294</column></row><table> <table>table see original document page 295</column></row><table>

Todos os oito constructos de BiTE EA2 mostraram mais ou menos ligações fortes com suas porções anti-CD3 SCA a CD3 expressos em células HP Ball, indicando expressão e dobramento apropriados da porção anti-CD3. Todos os quatro BiTEs derivados de anticorpo monoclonal EA2 mostraram ligação a linhagens celulares de câncer de mama e pulmonar que expressam EphA2, enquanto apenas um BiTE derivado de anticorpo monoclonal EA5 reteve a atividade de ligação especifica a EphA2. Anticorpo monoclonal EA2 assim pareceu ser mais adequado para construção de BiTE do que anticorpo monoclonal EA5.

Exclusão de Epitopo por BiTE EphA2s A linhagem epitelial de mama não transformada positiva para EphA2 MCFlOA e o carcinoma de mama MDA-MB-231 foram usados em um experimento de marcação de imunofluorescência para determinar se constructos de EphA2 de BiTE (usados a 10 μg/ml) retiveram exclusão de epitopo como seus anticorpos monoclonais parentais EA2 e EA5. Os resultados da análise são resumidos na Tabela abaixo. BiTE ' desimunizado anti-CD3 EA2 (VH/VL) mostrou a exclusão de epitopo mais forte.

<table>table see original document page 296</column></row><table> Produtividade de EphA2-BiTEs Monoméricos

A produtividade de cinco BiTE EphA2s ativos foi calculada a partir da produção de monômeros de uma produção em pequena escala em garrafas roladoras. Produtividades de até 1,1 mg/l' de monômeros purificados foram obtidas (ver Tabela abaixo).

A produtividade de uma produção em média escala (2 χ reator de 10 L) de um conjunto de células CHO amplificadas (MTX a 20 nM) transfectadas com constructo de BiTE anti- CD3xEA2 desimunizado (VH/VL) foi de 1,1 mg de monômero de BiTE purificado / L de sobrenadante de cultura de células.

<table>table see original document page 297</column></row><table> <table>table see original document page 298</column></row><table>

Potência da Lise Redirecionada de Cinco Constructos EphA2-BiTE

Testes de citotoxicidade baseados em Liberação de Cromo-51 foram executados para determinar Iise celular objetiva redirecionada pelos vários constructos EphA2-BiTE na presença de células T humanas. Brevemente, PBMCs como uma fonte de células T efetoras foram obtidas por centrifugação de gradiente de densidade de Ficoll. Células NK foram depletadas das PBMC por contas magnéticas direcionadas para CD16para evitar Iise celular dependente de células T. Linhagens de células tumorais postivas para EphA2 MDA-MB231 e A549 foram carregadas com Cromo-51 e servidas como células alvo. Os vários constructos EphA2- BiTE foram titulados ao longo de uma vasta gama de concentrações. A duração do teste foi de 18 horas, e a razão efetora-para-alvo (E:A) 10:1. Ver FIG. 13.

A seguinte Tabela resume as concentrações de BiTE requeridas para metade de Iise celular redirecionada máxima (isto é, EC50) de Iise celular (isto é, EC50) de Linhagens de células alvo positivas para EphA2 MDA-MB231 e A549, respectivamente, como determinado em dois experimentos independentes. A seguinte Tabela resume as concentrações de BiTE requeridas para metade de Iise celular redirecionada máxima (isto é, EC50) de Iise celular (isto é, EC50) de Linhagens de células alvo positivas para EphA2 MDA-MB231 e A54 9, respectivamente, como determinado em dois experimentos independentes.

<table>table see original document page 299</column></row><table>

O constructo BiTE anti-CD3xEA2 (VH/VL) desimunizado consistentemente mostrou a potência mais alta em Iise redirecionada de linhagens celulares de câncer de mama e pulmonar.

Seleção de BiTE Anti-CD3xEA2 (VH/VL) Desimunizado Para

Caracterização Adicional

Uma vez' que anti-CD3xEA2 (VH/VL) desimunizado foi achado como sendo o constructo EphA2-BiTE mais potente na Lise redirecionada (valores de ED50 entre 6 e 25 ng/mL com as duas linhagens de células alvo) , e tinha a segunda melhor produtividade de monômeros (-,8-1,1 mg/mL) de todos os cinco constructos de BiTE que mostraram atividade de ligação biespecifica, ele foi selecionado para caracterização adicional. Ver FIG. 14 para as seqüências de nucleotideos e aminoácidos do constructo BiTE anti-CD3xEA2 desimunizado.

CARACTERIZAÇÃO ADICIONAL DO EphA2-BiTE "DESIMUNIZADO ANTI-CD3 χ EA2 (VH/VL)"

Variação da Atividade Citotóxica com Lote de Produção e Doador de Célula Efetora

A atividade citotóxica de dois lotes de produção diferentes do EphA2-BiTE anti-CD3xEA2 (VH/VL) desimunizado foi comparada usando PBMCs (após depleção de células positivas para CD16) e células T CD8+ estimuladas como células efetoras. As linhagens celulares positivas para EphA2 2 A549 e MDA-MB-231 serviram como células alvo. A razão E:A foi 10:1, e o tempo de incubação foi 18 horas. Ver FIG. 15.

A seguinte Tabela resume os valores de meia lise máxima (isto é, EC50) , para Iise celular objetiva redirecionada, obtidos das análises dose-resposta acima com o BiTE EphA2 de diferentes lotes de produção usando seja PBMC ou células T CD8+ estimuladas como células efetoras.

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A variação de valores de ED50 para Iise celular objetiva redirecionada foi testada para o EphA2-BiTE anti- CD3xEA2 (VH/VL) desimunizado com sete doadores de PBMC humanos (esvaziados de células NK).

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O BiTE anti-CD3xEA2 (VH/VL) desimunizado EphA2mostrou citotoxicidade consideravelmente maior com células T CD8+ estimuladas do que com PBMC depletada de células NK. Variação da atividade biológica entre dois diferentes lotes foi na faixa de 1,4 a 3,2 vezes. Variação da potência foi, entretanto, mais pronunciada com doadores de PBMC humana, onde valores de ED50 entre 1,9 e 23,9 ng/mL foram observados. Eficácia especifica por doador de células T pode ser, portanto, uma grande fonte de variação de atividade BiTE.

Testes de citotoxicidade celular redirecionada baseados em citometria de fluxo também foram executados para determinar a variação de atividade citotóxica de EphA2-BiTE com doadores de células efetoras. PBMCs enriquecidas com células T CD3+ foram usadas como células efetoras e células de carcinoma de cólon SW480 EphA2+ usadas como células alvo. Brevemente, PBMC humana

enriquecida com células T CD3+ (RosetteSep; StemCell Technologies) foram isoladas de doadores saudáveis por centrifugação de gradiente de densidade de Ficoll. Células alvo foram marcadas com corante verde fluorescente de membrana 3,3'-dioctadeciloxacarbocianina (DiOC18(3) ou "DiO"; (Molecular Probes)) por 5 minutos a 37°C. Misturas de célula efetora e alvo foram combinadas a uma razão 5:1 e transferidas a uma placa de 96 poços de fundo arredondado. Somente meio ou diluições seriadas de cada constructo BiTE foi adicionado a poços apropriados, incubados por 18 ou 42 horas a 37°C, e analisados por citometria de fluxo após adição de iodeto de propidio (PI) a uma concentração final de 1 pg/ml. Lise celular objetiva foi calculada como a porcentagem de células positivas para DiO coradas positivas para PI. Todas as incubações foram conduzidas em duplicata. Cálculos dos valores de EC50 foram conduzidos usando um modelo de ajuste não linear de quatro parâmetros.

Como mostrado em FIG. 16, EphA2-BiTE redirecionaram células T de diferentes sujeitos para mediar a morte de células tumorais EphA2+. O teste de citotoxicidade baseado em citometria de fluxo utilizou células alvo SW480 e células T CD3+ isoladas de 49 doadores humanos individuais. Para a maioria dos doadores humanos, EphA2-BiTE mediou a morte de células tumorais em concentrações bastante baixas. O EC50 para EphA2-BiTE foi entre 1 e 110 ng/mL para todos os doadores de células T testados com uma mediana (barra horizontal) de 24 ng/mL. Assim, para a maioria dos doadores de células T humanas, o EphA2-BiTE é uma molécula muito potente com atividade de matança observada em concentrações na faixa baixa de ng/mL. Especificidade de Ligação a Célula Alvo: Proteína de Fusão EphA2 Solúvel Compete pela Ligação com anti-CD3xEA2 (VH/VL) Desimunizado

A especificidade de ligação ao alvo de BiTE anti- CD3xEA2 (VH/VL) desimunizadofoi testada em um teste de competição. Neste sentido, 200.000 Células A549 positivas para EphA2 foram incubadas com 5 μg/ml do constructo BiTE baseado em EA2 tanto na presença quanto na ausência de 50 pg/mL de proteína de fusão EphA2 Fc solúvel por 30 minutos em gelo. As células foram subseqüentemente lavadas duas vezes em PBS. Ligação do constructo foi então detectada via seus Tag hexahistidina C-terminais usando uma anticorpo penta-His murino (diluído 1:20 em 50 μΐ de PBS com soro fetal de bezerro a 2%; Qiagen; ordem número 34660) seguido por um etapa de lavagem e um anticorpo específico para Fc- gama murino conjugado a ficoeritrina (Dianova, ordem número 115-116-071) diluído 1:100 em 50 μΐ de PBS com soro fetal de bezerro a 2% (linha cinza). Como controle negativo, somente os anticorpo secundário foi usado (linha preta). Células foram analisadas por citometria de fluxo em um FACS Calibur instrument (Becton Dickinson, Heidelberg).

Como mostrado em FIG. 17, co-incubação do EphA2-BiTE anti-CD3xEA2 (VH/VL) desimunizado com um excesso de peso de 10-vezes de proteína de fusão EphA2 Fc solúvel bloqueou completamente a ligação do EphA2-BiTE a Células de câncer pulmonar humano A549. Isto mostra que aligação de EphA2- BiTE a células tumorais é especificamente mediada pelo reconhecimento do alvo de EphA2.

Especificidade de Célula Alvo de EphA2-BiTE anti- CD3xEA2 (VH/VL) desimunizado: Morte de Células Positivas para Antigeno

Para assegurar a retenção da especificidade de alvo após conversão da IgG original no formato BiTE, o teste de citotoxicidade com células positivas e negativas para antigeno foi executado. Para este propósito, células B16F10 transfectadas com EphA2, uma linhagem celular de melanoma de camundongos, foi comparada com células transfectadas. Um teste padrão de liberação de cromo usando células T CD8 humanas estimuladas como efetoras a uma razão E:A de 10:1 e uma duração de teste de 18 horas foi executado com várias concentrações do constructo EphA2-BiTE. Ver FIG. 18.

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Especificidade de Iise celular objetiva foi adicionalmente substanciada por BiTE anti-CD3xEA2 desimunizado mediando a Iise de Células de carcinoma de cólon humano SW480 EphA2+ e não células de melanoma SK- MEL28 negativas para EphA2. Ver FIG. 19. Anticorpos parentais específicos para ambos EphA2 e CD3 bloquearam a Iise mediada por BiTE anti-CD3xEA2 desimunizado. Assim, a atividade citotóxica do BiTE anti-CD3xEA2 desimunizado depende estritamente da expressão de EphA2 nas células alvo; células negativas para EphA2 são completamente resistentes a Iise mediada por BiTE anti-CD3xEA2 desimunizado.

Morte de Células de Câncer Renal e de Carcinoma de

Próstata Mediada por Epha2-Bite

Testes de citotoxicidade celular redirecionada baseados em citometria de fluxo foram conduzidos usando células mononucleares de sangue periférico humano enriquecidas em células T CD3+ (PBMC) como células efetoras e linhagens celulares de carcinoma renal EphA2+ ACHN e Caki 2 e linhagens de células de próstata PC3 e DU145 como células alvo. Brevemente, PBMC humana enriquecida com células T CD3+ (RosetteSep; StemCell Technologies) foram isoladas de doadores saudáveis por centrifugação de gradiente de densidade de Ficoll. Células alvo foram marcadas com corante verde fluorescente de membrana 3,3'- dioctadeciloxacarbocianina (DiOC18(3) ou "DiO"; (Molecular Probes)) por 5 minutos a 37° C. Misturas de células efetoras e alvo foram combinadas em uma razão 5:1 e transferidas a uma placa de 96 poços de fundo arredondado. Somente meio ou diluições seriadas de cada constructo BiTE foi adicionado a poços apropriados, incubados por 42 horas a 37° C, e analisados por citometria de fluxo após adição de iodeto de propídio (PI) a uma concentração final de 1 pg/mL. Lise celular objetiva foi calculada como a porcentagem de células positivas para DiO coradas positivas para PI. Todas as incubações foram conduzidas em duplicata.

Cálculos dos valores de EC50 foram conduzidos usando um modelo de ajuste não linear de quatro parâmetros.

Como mostrado em FIG. 20, EphA2-BiTE mediou a Iise celular mediada por células T tanto em células de carcinoma renal quanto em células de câncer de próstata.

Efeitos de Matança por EphA2-BiTE Sobre Níveis de EphA2 em Células Alvo

O teste de citotoxicidade foi executado como descrito acima. Uma vez completado o teste de citotoxicidade, culturas foram colocadas no gelo e deixadas sem tratamento, ou tratadas com 10 pg/mL de isotipo controle não ligante anticorpo monoclonal de camundongo 1A7 ou um anticorpo monoclonal de camundongo anti-EphA2 humana B233 (ver Dall'Acqua et al., 2005, Methods 36:43-60, o qual é incorporado aqui por referência em sua íntegra) . Um anticorpo anti-pentahistidina conjugado a APC se ligou a EphA2-BiTE que permaneceu nas células não tratadas. Um anticorpo anti-IgG (H+L) de camundongo conjugado a APC resolveu a quantidade de isotipo ou B233 ligado a células alvo. A média geométrica da intensidade de fluorescéncia do controle isotipo, EphA2 e EphA2BiTE versus a dose fornecida de EphA2-BiTE foi representada por meio de gráfico. Ver FIG. 21.

Dependência da Citotoxicidade pelo Tempo, Razão entre Efetor e Alvo, e Sítios de Ligação do Receptor

Para explorar a cinética e 'potência de anti-CD3xEA2 (VH/VL) desimunizado, vários parâmetros de Iise celular redirecionada a tumores foram avaliados. Uma análise do curso temporal de morte de células alvo revelou que na presença de anti-CD3xEA2 (VH/VL) , a Iise foi limitada por células T CD3+ não estimuladas após 18 horas, e que a mortandade máxima (>80% de lise) ocorreu em 42 horas (FIG. 22A) . Na maior parte dos experimentos, a magnitude da lise redirecionada a células T excedeu 80% das células alvo. Como uma medida adicional de potência, a razão de células efetoras para células alvo foi investigada. Razões E:A de 1:! Até 20:1 deram atividades liticas altas similares, enquanto razões E:A de 1:2 e 1:5 ainda levaram a lise redirecionada de células tumorais SW480, ainda que em uma porcentagem reduzida (FIG. 22B) . Notavelmente, os valores de EC50 estimados permaneceram largamente constantes a despeito de variações nos tempos de incubação (FIG. 22A; 1 a 9 ng/mL) ou razão E:A (FIG. 22B; 2 a 7 ng/mL).

Células alvo tumorais, as quais expressam diferentes níveis de EphA2 em suas superfícies, foram avaliadas para determinar se havia um limite de densidade de alvos na superfície requerido para a atividade de anti-CD3xEA2 (VH/VL). A eficiência da Iise redirecionada a células T foi observada para todas as linhagens celulares expressando EphA2 (FIG. 22C), incluindo células M14, que expressaram tão pouco quanto 2.400 moléculas de EphA2 por célula (FIG. 22D) . A magnitude da Iise mediada por anti-CD3xEA2 (VH/VL) foi similar para células alvo a despeito de suas densidades de alvos na superfície (FIG. 22D). Entretanto, a densidade de EphA2 na superfície de células alvo teve sim um impacto na eficiência da Iise redirecionada. Uma tendência foi observada na qual a potência de anti-CD3xEA2 (VH/VL) aumentou a medida que o número sítios de ligação a EphA2 aumentava nas células tumorais (FIG. 22C). Juntos, estes achados sugerem que anti-CD3xEA2 (VH/VL) pode potentemente e especificamente redirecionar células T humanas não estimuladas a lisar células tumorais expressando EphA2, mesmo quando há baixos níveis de sítios de ligação disponíveis no tumor.

Estabilidade de BiTE anti-CD3xEA2 (VH/VL) desimunizado em Plasma Humano

A estabilidade em plasma do BiTE específico para EphA2 foi testada sob diferentes condições de incubação seguida pela determinação do ED50 de atividade citotóxica em um teste padrão de liberação de cromo-51. Um grupo de plasmas humanos derivados do sangue de cinco doadores saudáveis foi coletado por siringas recobertas com EDTA. Componentes celulares foram removidos por centrifugação e a fasa superior do plasma foi coletada e subseqüêntemente agrupada. BiTE anti-CD3xEA2 (VH/VL) desimunizado foi ou incubado a 37°C ou 4°C na presença ou ausência de plasma. Como controles, BiTE foi diluído imediatamente antes do teste de citotoxicidade em plasma ou meio RPMI-1640, repsectivamente. MDA-MB231 serviram como células alvo; PBMC depletados de células NK foram usadas como células efetoras. A razão efetoras:alvo (E:A) 'foi 10:1. A duração do teste foi de 18 horas. Ver FIG. 23.

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Anti-CD3xEA2 (VH/VL) desimunizado provou-se estável uma vez que nenhuma perda mojaritária de atividade citotóxica pôde ser detectada após incubação em plasma humano por 24 horas a 31° C.

Exclusão de Epitopo Alvo em Células não Transformadas por anti-CD3xEA2 (VH/VL) desimunizado

Videomicroscopia foi empregada para visualizar o ataque de células T CD8+ contra células MCFlOA não transformadas na presença de BiTE (VH/VL) desimunizado anti-CD3 χ EA2 e um BiTE controle não excludente de epitopo (ver FIG. 24). Células alvo foram semeadas para crescimento como células aderentes 24 horas antes do inicio da gravação em vídeo em placas de 4 8 poços. Diretamente antes da gravação, uma mistura de células T CD8+ e BiTE foram adicionadas aos poços de cultivo. Videomicroscopia foi gravada por 20 horas com aproximadamente uma foto por minuto. Iodeto de propídio (1 μg/ml) foi adicionado aos poços após 18 horas. Fotos individuais foram convertidas em um filme de vídeo AVI, e foram tiradas fotos de luz transmitida e fotos de luz fluorescente.

A análise videomicroscópica durante a duração do teste de 18 horas exemplificou a exclusão de epitopo por BiTE específico para EphA2. Enquanto o BiTE pan-carcinoma usado como controle positivo atacou células MCFlOA não transformadas ao longo de toda a monocamada celular intacta (FIG. 24C), o BiTE específico para EphA2 mostrou atividade de células T apenas na borda da camada de células confluente onde a exclusão de epitopo através de células vizinhas não é possível (FIG. 24A) . Na área de uma monocamada intacta, atividade de células T muito baixa foi notada, como visto na ausência de BiTE (FIG. 24B) onde células T são apenas igualmente distribuídas por sobre a monocamada. Uma monocamada de células de carcinoma A54 9, as quais não suportam exclusão de epitopos de EphA2, foi completamente destruída por células T na presença de anti- CD3xEA2 (VH/VL) desimunizado. Adição de iodeto de propídeo no fim do teste permite a visualização de células de carcinamoa mortas em grupos com células T. Tais grupos celulares intensamente corados eram presentes ao fim do teste em cada poço exceto em poços controles sem BiTE.

Constantes de ligaçãao de anti-CD3xEA2 (VH/VL) desimunizado por Alvos EphA2

A formação e dissociação de complexos BiTE/EphA2 foi monitorada por ressonância de plasmon de superfície usando um sistema Biacore 3000. Para este propósito, proteína de fusão Fc EphA2 foi imobilizada em um chip sensor com uma matriz dextrana CM5 carboximetilada. Condições ótimas de uma imobilização foram identificadas através de exploração de pH (acetato de sódio pH 4,0 a pH 5,5; tetraborato disódico pH 8,5). 0 valor de pH ótimo foi pH 4,0. Após imobilização de 1000 RU a células de fluxo 2, 5.000 RU a células de fluxo 3 e 400 RU a células de fluxo 4, grupos reativos em excesso foram desativados por etanolamina. A afinidade do BiTE anti-EphA2 a EphA2 imobilizado foi determinada pela injeção de diferentes concentrações do analito desimunizado VHVL anti-CD3xEA2 diluído em tampão HBS-EP. Para regenerar a superfície, tampão REGEN (NAOH a 50 mM; MES a 20 mM; NaCl a 1 mM pH 6,4) foi empregado.

<table>table see original document page 312</column></row><table> EFICÁCIA IN VIVO DE BITE ANTI-CD3XEA2 (VH/VL) DESIMUNIZADOESPECÍFICO PARA EPHA2

Anti-CD3xEA2 (VH/VL) desimunizado é especifico para CD3 humano e EphA2 primata e portanto não se liga a CD3 ou EphA2 de camundongo. Anti-tum do BiTE anti-CD3xEA2 (VH/VL) desimunizado EphA2 pode então apenas ser estudado em camundongos NOD/SCID com um modelo de xenotransplante de carcinoma de cólon humano.

Modelo de Xenotransplante SW480 NOD/SCID

A linhagem celular SW480 de carcinoma de cólon humano foi selecionada para o estabelecimento de um modelo de xenotransplante uma vez que células SW480 que expressam EphA2 e anti-CD3xEA2 (VH/VL) desimunizado demonstrou redirecionar a Iise de células SW480 in vitro.

5xl06 células SW480 foram misturadas com 2,5 χ IO6 células T CD3+ humanas de doadores saudáveis em um volume final de 0,2 mL de PBS resultando em uma razão E:A de 1:2. As misturas de células T efetoras/células SW480 foram injetadas subcutaneamente no flanco direito de cada camundongo NOD/SCID. Tumores SW480 crescendo

subcutaneamente foram medidos três vezes por semana com um compasso de calibração em duas dimensões perpendiculares e os volumes tumorais calculados de acordo com a fórmula: volume tumoral = [(largura2 * comprimento)/2]. 6.4.2 Projeto de Estudo

Seis animais por grupo foram tratados intravenosamente com veiculo controle de PBS, BiTE controle não relevante ou anti-CD3xEA2(VHVL) desimunizado por cinco dias consecutivos iniciando uma hora após a inoculação subcutânea de células T CD3+ e inoculação de células tumorais SW480 de acordo com a Tabela abaixo.

Animais nos grupos I e J receberam adicionalmente 2,5 x 106 células efetoras CD3+ através de injeção na veia caudal 5 minutos após a inoculação de células tumorais SW480 para estimular a presença de células T periféricas.

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In Vivo Anti-Tum de Anti-CD3xEA2 (VH/VL) desimunizado

Especificidade e Reprodutibilidade do Modelo SW480

Inoculação de células SW480 somente sem células efetoras seguida por tratamento com PBS (grupo A) ou anti- CD3xEA2 (VH/VL) desimunizado (grupo B) levou aos primeiros tumores palpáveis no dia 4 após inoculação e camundongos tiveram que ser sacrificados no dia 30 em virtude das grandes massas tumorais (>1 cm3) . Não houve diferença na cinética de crescimento tumoral entre os grupos de tratamento com PBS e anti-CD3xEA2 (VH/VL) desimunizado indicando que BiTE EphA2 não tinha efeito antitumoral na ausência de células efetoras. Ver FIG. 26.

Inoculação de misturas de tumores SW480 e células T humanas seguido por tratamento com veiculo controle PBS (grupo C) , ou BiTE controle não relevante (grupo D) ·, o qual compartilha o braço ligante CD3 com anti-CD3xEA2 (VH/VL) desimunizado mas tem uma braço alvo diferente também não afetou o crescimento tumoral demonstrando que nem o braço BiTE anti-CD3 por si só nem células T sozinhas tinham qualquer atividade antitumoral. Assim, tratamento com o BiTE controle não relevante mostrou o mesmo efeito do que o tratamento com o veiculo PBS. Ver FIG. 26.

Por fim, injeção intravenosa de células T CD3 + adicionais 5 minutos antes da inoculação de células tumorais mimetizando a presença de células T periféricas não influenciou o crescimento tumoral (grupo I). Ver FIG. 26.

Nenhuma diferença significativa no crescimento tumoral foi observado entre todas as condições controle testadas abaixo. Isto também mostra uma grande robustez e reprodutibilidade do modelo de crescimento tumoral SW480 NOD/SCID com as doses de células tumorais selecionadas. Ver FIG. 26. Inibição Dependente de Dose do Crescimento Tumoral por Anti-CD3xEA2 (VH/VL) Desimunizado

Tratamento com anti-CD3xEA2 (VH/VL) desimunizado induziu uma inibição dependente da dose do crescimento de tumores SW480 na presença de células T CD3+ efetoras.

Enquanto o tratamento com 1 pg de anti-CD3-EA2 desimunizado mostrou quase nenhum efeito sobre o crescimento tumoral, todas as outras doses testadas (5, 20 e 100 pg diários por cinco dias) causaram uma inibição significativa do crescimento tumoral. Com doses diárias de 5 pg, o volume tumoral foi significativamente menor nos dias 3-9, e significativamente menor nos dias 18, 20 e 27 comparados com o grupo de BiTE controle não relevante. 0 volume tumoral de camundongos tratados com 20 yg de anti- CD3xEA2 (VH/VL) desimunizado foi significativamente menor quando comparado àqueles de camundongos tratados com BiTE controle não relevante em todos os pontos de tempo analisados. Finalmente, tratamento com 5x 100 pg de anti- CD3xEA2 (VH/VL) desimunizado levou a diferenças altamente significativas em todos os pontos de tempo analisados e não mostrou nenhum crescimento tumoral por duas semanas após o tratamento com BiTE. Tratamento com BiTE controle não relevante mostrou o mesmo efeito que o tratamento com o veiculo PBS. Ver FIG. 27.

Nenhum Efeito de Células T Periféricas sobre o Efeito Antitumoral de Anti-CD3xEA2 (VH/VL) Desimunizado Em contraste com a situação em um modelo de xenoimplante onde nenhuma célula T humana está presente na periferia, a eficácia do anti-CD3xEA2 desimunizado pode ser influenciada por células T circulantes que podem prender a molécula na periferia e assim reduzir o direcionamento especifico para tumores de anti-CD3xEA2 (VH/VL) desimunizados. Para mimetizar este cenário, dois grupos de camundongos foram adicionalmente injetados intravenosamente com células T humanas para proporcionar uma população de células T humanas periféricas.

A administração i.v. de células T humanas adicionais não teve influência sobre a eficácia de anti-CD3xEA2 (VH/VL) desimunizado. Crescimento de tumores SW480 nos grupos F (tratamento com 20 μg de anti-CD3xEA2 (VH/VL) desimunizado/in jeção) e J (tratamento com 20 yg de anti- CD3xEA2 (VH/VL) desimunizado/injeção após injeção i.v. de 2,5xl06 células T adicionais) foi quase idêntico. Em ambos os grupos, o tratamento com anti-CD3xEA2 (VH/VL) desimunizado induziu inibição do crescimento tumoral altamente significante quando comparado com camundongos tratados com PBS ou camundongos tratados com PBS e células T circulantes adicionais. Ver FIG. 28.

GERAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE BITE ANTI-EPHA2 HUMANIZADO

A seguinte informação detalha a geração e caracterização de anticorpos humanizados anti-EphA2 usados na construção de BiTEs anti-EphA2. BiTEs candidatos foram construídos a partir de anticorpos que foram humanizados, capazes de se ligar a EphA2 de cinomolgus e humano, e não se ligavam a tecido cardíaco normal humano.

Dois anticorpos monoclonais murinos anti-EphA2, B233 (ver FIG.' 29) e EA2 (FIG. 1), foram humanizados e produz iram 3F2 (derivado de B233; FIG. 30) e 4H5 (derivado de EA2). Otimização da afinidade foi executada como descrito em detalhes abaixo, e em DallfAcqua et al., 2005, Methods 36:43-60, o qual é incorporado aqui por referência em sua íntegra.

OTIMIZAÇÃO DA AFINIDADE DE ANTICORPOS EphA2

Otimização da afinidade de 4H5

A seguinte informação detalha a otimização da afinidade do anticorpo monoclonal humanizado antiEphA2 de humano 4H5 para produzir as três variantes otimizadas por afinidade 2A4, 2E7, e 12E2. Para maiores detalhes a respeito da produção de variantes otimizadas por afinidade, e em particular, 2A4, 2E7, e 12E2, favor ver U.S. Provisional Appn. No. 60/751.964, registrada em 21 de dezembro de 2005, intitulado "Afinity Optimized Eph A2 Agonistic Antibodies and Methods of Use Thereof", a qual é incorporada aqui por referência em sua íntegra.

Reagentes Todos os reagentes químicos são de grau analítico. Enzimas de restrição e enzimas modificadoras de DNA, ligase T4 e DNA polimerase T7 foram compradas de New England Biolabs, Inc. (Beverly, MA). Oligonucleotídeos costumizados foram sintetizados por Invitrogen (Carlsbad, CA). Proteína de fusão Fc-EphA2 humana (consistindo de um ectodomínio de EphA2 de humano fusionada com a porção Fc de uma IgGl humana) foi expressa em células 293 de rim embrionário humano (HEK) e purificada por cromatografia de afinidade com proteína G usando protocolos padrão. Biotinilação de Fc-EphA2 humana foi realizada usando um conjunto de biotinilação EZ-Link Sulfo-NHS-LC de acordo com as instruções do fabricante (Pierce, Rockford, IL).

Humanização de Anticorpo Monoclonal Murino EA2 Anti- EphA2 por Tecnologia de Embaralhamento de Armação

A humanização do anticorpo monoclonal murino parental EA2 foi realizada usando a tecnologia de embaralhamento de armação como descrito em detalhes em Dall'Acqua et al., 2005, Methods 36:43-60, e em U.S. Patent Pub. No. US- 2005/0048617 Al, cada um dos quais é incorporado aqui por referência em sua íntegra. Essencialmente, regiões CDR de ambas as regiões VL de EA2 e VH de EA2 são transplantadas em bibliotecas de seqüências de armações humanas de linhagens germinativas em uma forma combinatória, criando um mosaico de variantes humanizadas que retêm a ligação a EphA2. Um tal clone humanizado, 4H5, exibiu um aumento de afinidade de aproximadamente 20 vezes quando comparado com Fab EA2 quimérico. Este clone foi escolhido como molde para maturação de afinidade e foi subseqüentemente otimizado como descrito abaixo, resultando nos variantes 2A4, 2E7 e 12E2.

Otimizaçãó da afinidade de scFv de 4H5

Construção do Molde scFv

As regiões variáveis do anticorpo monoclonal humanizado 4H5 foram clonadas com um fragmento scFv em um vetor de expressão M13 (Dall'Acqua et al., 2005, Methods 36:43-60, o qual é incorporado aqui por referência em sua integra). A região variável leve do 4H5 foi combinada com a extremidade 3'da cadeia pesada variável do 4H5 por um ligante [(Gly) 4Ser] 3, e seguido por um marcador FLAG e um marcador His na sua extremidade C-terminal (FIG. 31). Constructos foram gerados usando PCR e os seguintes primers para amplificar as regiões variáveis em reações separadas:

Medi-VH8: TTC TAT GCG GCC CAG CCG GCC CAG GTG CAG

CTG TTG SAG TCT G (5' primer para amplificar VH, S=C/G) (SEQ ID NO:120)

Medi-JH1: GGA GCC GCC GCC GCC AGA ACC ACC ACC ACC TGA GGA GAC GGT GAC CAG GGT GCC (31 primer para amplificar VH) (SEQ ID NO:121) Medi-VKl: GGC GGC GGC GGC TCC GGT GGT GGT GGT TCT GAC ATC CAG WTG ACC CAG TCT CC (5' primer para VL, W=A/T) (SEQ ID NO:122)

Medi-JK4: TGG AAT TCG GCC CCC GAG GCC ACG TTT GAT CTC CAC CTT GGT CCC (3' primer para VL) (SEQ ID NO:123), onde as seqüências sublinhadas correspondem ao ligante [Gly)4Ser]3, e letras em negrito e itálico denotam o sitio de restrição Sfi I. PCR de sobreposição foi usado para construir o fragmento scFv o qual foi então restringido por Sfi I e clonado dentro do vetor MD 102. As regiões variáveis de EA2 parental murino foram clonadas da mesma maneira para servir como um scFv controle. O constructo scFv de 4H5 foi então expresso em CJ236 para produzir uridina + ssDNA como descrito em Wu e An, 2003, Methods Mol. Biol. 207:213-234, o qual é incorporado aqui por referência em sua integra. Este scFv U+ ssDNA de 4H5 foi usado como molde para as reações mutagênicas de otimização da afinidade que seguem. As seqüências de nucleotideos e aminoácidos do scFv de 4H5 são descritas na FIG. 32.

Otimização da afinidade de scFv por Aleatorização Parcimoniosa de Cada Região CDR

Cada aminoácido de todas as 6 Regiões Determinantes de

Complementaridade (CDR) foi individualmente, aleatoriamente mutado usando duas bibliotecas separadas por aminoácido (Wu e An, 2003, Methods Mol. Biol. 207:213-234, o qual é incorporado aqui por referência em sua integra) . Codificando ou 8 aminoácidos (NSS) ou 12 aminoácidos (NWS) em cada posição de aminoácido CDR, cada primer degenerado individual foi usado em uma reação de mutagênese por hibridização simples (Wuf 2003, Methods Mol. Biol. 207:197- 212, e Dall'Acqua et. al.f 2005, Methods 36:43-60, cada um dos quais sendo incorporado aqui por referência em sua integra), e então combinado para geração de uma biblioteca de CDR correspondente. Brevemente, cada primer degenerado foi fosforilado, então usado em uma razão 10:1 com modelo de U+ DNA uridinilado de scFv de fita única de 4H5 (preparado como descrito em Wu e An, 2003, Methods Mol. Biol. 207:213-234) em uma reação de anelamento onde a temperatura foi baixada de 95° C para 55° C por 1 hora. Ligase T4 e DNA polimerase T7 foram adicionados à reação de anelamento e a reação foi incubada por 1,5 horas a 37° C. Os produtos sintetizados para cada aminoácido de cada CDR foram agrupados, entretanto as bibliotecas NSS e NWS foram mantidas segregadas e filtradas independentemente. Tipicamente, 1 pL do DNA sintetizado das bibliotecas de CDR agrupadas foram então eletroporadas em XLl-Blue para formação de placas em campo de bactérias XLl-Blue ou produção de fragmentos scFv como descrito em Wu, 2003, Methods Mol. Biol. 207:197-212.

Filtração das Bibliotecas

Filtro primário O filtro primário consistiu de um ELISA de ponto único (SPE) o qual foi realizado usando sobrenadantes contendo proteína scFv solúvel, secretada preparada a partir de 1 mL de cultura bacteriana crescida em placas de 96 poços fundos e infectada com clones M13 recombinantes individuais essencialmente como descrito em Wu, 2003, Methods Mol. Biol. 207:197-212, e DallfAcqua et. al., 2005, Methods 36:43-60. Brevemente, este ELISA de Captura envolve o recobrimento de poços individuais de um Maxisorp Immunoplate de 96 poços com aproximadamente 30 ng de um anticorpo de camundongo anti-FLAG (Sigma), bloqueando com BSA a 3%/PBS por 2 horas a 37° C e incubando com amostras (scFv solúveis secretados) por 2 horas em temperatura ambiente. 150-600 ng/poço de Fc-EphA2 de humum biotinilado foi então adicionado por 2 horas em temperatura ambiente. Isto foi seguido por incubação com conjugado de neutravidina-peroxidase de raiz forte (HRP) (Pierce, IL) por 4 0 minutos a temperatura ambiente. Atividade de HRP foi detectada com substrato de tetra metil benzidina (TMB) e a reação foi extinta com 0,2 M H2SO4. Placas foram lidas a 450 nm.

Resultados do Filtro Primário

Tipicamente, clones exibindo um sinal de OD 450 nm aproximadamente duas vezes maior do que a de scFv de 4H5 parental foi recrescido em uma escala de 15 mL, e testado novamente pelo mesmo ELISA em poços duplicados para confirmar o resultado positivo. Clones os quais repetiram foram então seqüenciados e ensaiados usando uma ELISA de atividade (ver abaixo) para estimar o aumento da multiplicação de ligação a EphA2 de humano.

Filtro Secundário

De modo a caracterizar adicionalmente as variantes de afinidade otimizadas com uma mudança previamente identificadas, um filtro secundário usando fragmentos de scFv secretados expressos de culturas bacterianas de 15 mL (ver Wu, 2003, Methods Mol. Biol. 207:197-212) foi realizado. Mais precisamente, dois ELISAS foram usados: (i) um ELISA de atividade no qual poços individuais de uma Maxisorp Immunoplate de 96 poços foram recobertos com BSA a 3%/PBS por 2 horas a 37° C. Amostras serialmente diluídas por 2 vezes foram então adicionadas e incubadas por 1 hora em temperatura ambiente. Incubação com um conjugado de anti-kappa humano feito em cabra com peroxidase de raiz forte (HRP) então se seguiu. Atividade de HRP foi detectada com substrato TMB e a reação extinta com 0,2 M de H2SO4. Placas foram lidas a 450 nm; (ii) uma quantificação de anti-scFv por ELISA, o qual foi realizado essencialmente como descrito em Wu, 2003, Methods Mol. Biol. 207:197-212. Brevemente, poços individuais de uma placa Ni NTA de 96 poços (Qiagen) incubados com amostras serialmente diluídas 2 vezes ou padrão (50-0,78 ng/mL). Incubação com um conjugado de anti-FLAG feito em camundongo com peroxidase de raiz forte (HRP) então se seguiu. Atividade de HRP foi detectada com substrato TMB e a reação extinta com 0,2 M de H2SO4. Placas foram lidas a 450 nm.

Resultados do Filtro Secundário

O filtro de ELISA secundário em duas partes descrito acima permitiu a comparação do scFv de 4H5 e os variantes otimizados para afinidade um com o outro em termos de ligação a EphA2 de humano ao normalizar suas concentrações 10 de scFv. Todos os clones variantes de scFv de mudança simples com afinidade otimizada exibiram melhor ligação a EphA2 de humano quando comparados com o scFv parental de 4H5 (dado não mostrado) .

Construção e Caracterização de Variantes Combinatórias a Partir de Clones Otimizados para Afinidade por CDR

Para projetar variantes combinatórias com melhoras adicionais em ligação, todas as mudanças de aminoácidos simples que melhoraram a ligação quando comparados ao scFv parental de 4H5 por ELIAS de atividade/quantitativo foram combinados para criar uma pequena biblioteca combinatória focada. Brevemente, primers degenerados codificando todas as mudanças de aminoácidos identificadas assim como o aminoácido parental na mesma posição foram projetados. Em uma reação de anelamento onde todos os primers foram incluídos e a síntese se seguiu (supra), uma biblioteca combinatória foi construída e filtrada como previamente descrito supra. Resultados da Filtraçâo Primária sobre EphA2

Tipicamente, clones exibindo um sinal de OD 4 50 nm aproximadamente duas vezes maior do que a de scFv parental de 4H5 foi recrescido em uma escala de 15 mL, e reensaiado por ELISA (descrito supra) em poços duplicados para confirmar o resultado positivo. Dezesseis variantes combinatórias foram então selecionadas e seqüenciadas identificando 11 combinações únicas de mudanças de aminoácido CDR assim tornando cada variante diferente uma das outras por um a três aminoácidos no nivel de sua seqüência primária.

Resultados da Filtraçâo Secundária sobre EphA2

As 11 variantes combinatórias únicas descritas acima foram analisadas por um filtro secundário como descrito acima para estimar a melhora nas afinidades de ligação das variantes combinatórias. Todas as variantes tinham afinidades significativamente melhoradas para EphA2 de humano quando comparadas a 4H5 scFv. As seqüências de nucleotideos e aminoácidos das três variantes combinatórias otimizadas para afinidade 2A4, 2E7 e 12E2 são mostradas nas FIGS. 33, 34 e 35, respectivamente. Dados para as três variantes combinatórias otimizadas para afinidade 2A4, 2E7 e 12E2 são mostrados da FIG. 36. FIG. 37 mostra o alinhamento da seqüência de aminoácidos das variantes otimizadas para afinidade 2A4 , 2E7 e 12E2 com o scFv humanizado de 4H5.

Análise de Ligação

2A4, 2E7 e 12E2 assim como scFv parental de EA2 e scFv humanizado de 4H5 foram induzidos para expressão em E. coli em um volume de cultura de IL. Os sobrenadantes contendo fragmentos de scFv solúveis, secretados, foram centrifugados para remover os restos celulares então passados por uma coluna anti-FLAG (Sigma) para purificar e isolar as proteínas variantes. As variantes otimizadas para afinidade purificadas foram analisadas por detecção de ressonância de plasmon de superfície usando um instrumento BIAcore 3000 (Pharmacia Biosensor, Uppsala, Suécia). Variantes humanizadas otimizadas para afinidade de EA2 exibiram aumento de 110-150 vezes na afinidade quando comparadas ao scFv parental anti-EphA2 de EA2. Para resultados de medida de afinidade, ver a Tabela na Seção 6.6, infra.

Otimização da afinidade de Anticorpo Murino B233 Anti-EphA2 de humano

A humanização da molécula parental de anticorpo monoclonal B233 foi realizada usando a tecnologia de embaralhamento de armação como descrito em detalhe por Dall'Acqua et al., 2005, Methods 36:43-60, o qual é incorporado aqui por referência em sua íntegra. Essencialmente, regiões CDR de ambas as regiões VL do B233 e VH do B233 foram transplantadas em bibliotecas de seqüências de armações humanas de linhagens germinativas em uma forma combinatória, criando um mosaico de variantes humanizadas que retêm a ligação a EphA2. Um tal clone humanizado, 2G6, exibiu uma perda de afinidade de aproximadamente 10 vezes quando comparado com anticorpo monoclonal B233 quimérico. Este clone foi escolhido como molde para maturação de afinidade e foi subseqüentemente otimizado como descrito abaixo, resultando na variante 3F2.

Construção e Caracterização de Variantes Combinatórias

Para projetar uma variante combinatória com ligação a EphA2 de humano melhorada, todas as mudanças de aminoácidos simples que melhoraram a ligação quando comparados ao B233 parental foram combinados para criar uma pequena biblioteca combinatória focada. Brevemente, primers degenerados (ver FIG. 38) codificando todas as mudanças de aminoácidos identificadas assim como o aminoácido parental na mesma posição foram projetados. Uma reação de anelamento foi realizada onde todos os primers foram incluídos e a síntese se seguiu, essencialmente com descrito em Dall'Acqua et al., 2005, Methods 36: 43-60 e Wu, 2003. Methods Mol. Biol. 207:197-212, os quais ambos são incorporados aqui por referência em suas totalidades. Uma biblioteca combinatória foi construída e então filtrada.

Filtração das Bibliotecas Filtro primário

O filtro primário consistiu de uma ELISA de ponto único (SPE) o qual foi realizado usando extratos de Fab periplásmicos preparados com culturas bacterianas crescidas em 1mL em placas de 96 poços fundos e infectadas com clones M13 recombinantes individuais essencialmente como descrito em Dall'Acqua et al., 2005, Methods 36: 43-60, e Wu, 2003. Methods Mol. Biol. 207:197-212. Brevemente, este ELISA de Captura envolve o recobrimento de poços individuais de um Maxisorp Immunoplate de 96 poços com aproximadamente 20 ng de um anticorpo de cabra anti-Fab de humano, bloqueando com BSA a 3%/PBS por 2 horas a 37°C e incubando com amostras (Fabs expressos no periplasma) por 2 horas em temperatura ambiente. 300 ng/poço de Fc-EphA2 de humum biotinilado foi então adicionado por 2 horas em temperatura ambiente. Isto foi seguido por incubação com conjugado de neutravidina- peroxidase de raiz forte (HRP) (Pierce, IL) por 40 minutos a temperatura ambiente. Atividade de HRP foi detectada com substrato de tetra metil benzidina (TMB) e a reação foi extinta com 0,2 M H2SO4. Placas foram lidas a 450 nm.

Resultados do Filtro Primário

Tipicamente, clones exibindo um sinal de OD 4 50 nm pelo menos duas vezes maior do que a de 2G6 parental foram recrescidos em uma escala de 15 mL, e reensaiados por ELISA em poços duplicados para confirmar o resultado positivo. Clones que repetiram foram então seqüenciados e ensaiados por uso de um ELISA de atividade (ver abaixo) para estimar as multiplicações no aumento da ligação a EphA2 de humano.

Filtro Secundário

De modo a caracterizar adicionalmente as variantes de afinidade otimizadas previamente identificadas (ver acima), um filtro secundário usando fragmentos de Fab expressos em extratos periplásmicos de culturas bacterianas de 15 mL (ver Wu, 2003, Methods Mol. Biol. 207:197-212) foi realizado. Mais precisamente, dois ELISAs foram usados: (i) um ELISA de atividade no qual poços individuais de uma Maxisorp Immunoplate de 96 poços foram recobertos com ~ 1 μg de Fc-EphA2 de humum e bloqueado com BSA a 3%/PBS por 2 horas a 31°C. Amostras serialmente diluídas por 2 vezes foram então adicionadas e incubadas por 1 hora em temperatura ambiente. Incubação com um conjugado de anti- kappa humano feito em cabra com peroxidase de raiz forte (HRP) então se seguiu. Atividade de HRP foi detectada com substrato TMB e a reação extinta com 0,2 M de H2SO4. Placas foram lidas a 450 nm; (ii) um ELISA de quantificação de anti-Fab de humano que foi realizado essencialmente como descrito em Wu, 2003, Methods Mol. Biol. 207:197-212. Brevemente, poços individuais de uma placa Biocoat de 96 poços (BD Biosciences, CA) foram incubados com amostras serialmente diluídas 2 vezes ou padrão (Fab de IgG humano, 100-1,56 ng/mL). Incubação com um conjugado de anti-kappa humano feito em cabra com peroxidase de raiz forte (HRP) então se seguiu. Atividade de HRP foi detectada com substrato TMB e a reação extinta com 0,2 M de H2SO4. Placas foram lidas a 450 nm.

Resultados do Filtro Secundário

O filtro de ELISA secundário em duas partes descrito na Seção acima permitiu a comparação do Fab de 2G6 e os variantes otimizados para afinidade um com o outro em termos de ligação a EphA2 de humano. Uma destas variantes combinatórias de Fab otimizadas para afinidade foi escolhida para análise mais extensiva (variante nomeada 3F2 daqui em diante). A seqüência de aminoácidos das regiões variáveis dos anticorpos monoclonais B233 murino, 2G6 humanizado e o 3F2 otimizado para afinidade foram alinhados na FIG. 39.

Clonagem, Expressão e Purificação das Várias Versões de Anticorpo Monoclonal B233 Humanizados e Otimizados para Afinidade em um Formato de IgGl de Humanos

As regiões variáveis de clone humanizado 2G6 com armação embaralhada e a variante humanizada 3F2 otimizada para afinidade foram amplificadas por PCR a partir de vetores fago M13 codificando as regiões V correspondentes usando DNA polimerase pfu. Eles foram então individualmente clonados em vetores de expressão de mamíferos codificando uma região intensificadora, promotora e 5' não traduzida imediatamente próxima de citomegalovirus humano maior (hCMVie) (Boshart et al., 1985, Cell 41:521-530, o qual é incorporado aqui por referência em sua integra). Neste sistema, uma cadeia γ1 de humano é secretada junto com uma cadeia κ de humano (Johnson et al., 1997, Infect. Dis. 176:1215-1224, o qual é incorporado aqui por referência em sua integra). Os diferentes constructos são expressos transientemente em células HEK 293 e colhidas 72 e 144 horas após a transfecção. As IgG1s humanas solúveis secretadas foram purificadas a partir do meio condicionado diretamente com colunas HiTrap de proteína A e proteína G com 1mL de acordo com as instruções do fabricante (APBiotech, Inc., Piscataway, NJ). IgG1s humanas purificadas (tipicamente homogeneidade > 95%, como julgado por SDS-PAGE) foram dialisadas contra salina tamponada de fosfato (PBS), instantaneamente congelada e estocada a -70° C.

Análise em Biacore

A interação das IgGs solúveis B233, 2G6, e 3F2 com Fc de EphA2 imobilizado foi monitorada por detecção por ressonância de plasmon de superfície usando um instrumento Biacore® 3000 (Pharmacia Biosensor, Uppsala, Suécia) essencialmente como escrito em W.F. Dall'Acqua et al., 2005, Methods 36 (2005) 43-60. Ver também Seção 6.6.2, infra. Medidas de afinidade de B233 quimérico, 2G6 humanizado, e 3F2 otimizado para afinidade são dados na Tabela abaixo.

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MEDIDAS DE AFINIDADE DOS EphA2-BiTEs

Os seguintes descrevem as constantes de afinidade dos EphA2-BiTEs da invenção como medidos por ressonância de plasmon de superfície.

Anti-CD3 de Humano

Medida de ressonância de plasmon de superfície usando CD3sy solúvel imobilizado é fornecido. Associação bifásica de moléculas BiTE a CD3sy previne cálculos acurados da taxa de ligação e constantes de afinidade.

Anti-CD3 χ EA2 VH/VL desimunizado 400-500 nM (est.)

Anti-EphA2 de humano

Medidas de ressonância de plasmon de superfície usando Fc de EphA2 imobilizado na superfície é fornecido: Anti-CD3 χ EA2 VH/VL desimunizado (MT) 45 nM

Anti-CD3 χ EA2 VH/VL desimunizado (Medi) 113 nM

Medidas de Afinidade (K0) de scFvs

A Tabela abaixo provê um resumo das cinéticas de ligação dos scFvs anti-EphA2 de humano. Associação de scFv monomérico anti-EphA2 a EphA2 como determinado por ligação em ressonância de plasmon de superfície. Otimização da afinidade produziu três scFvs com aumento de 20-30 vezes na afinidade (KD) a EphA2 de humano quando comparados a 4H5.

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CARACTERIZAÇÃO DE BITEs HUMANIZADOS ANTI-EPHA2 DE HUMUM

Análise da Ligação por Citometria de Fluxo DE Anticorpos Parentais Humanizados Anti-EphA2 para EphA2 Humano e de Cinomolgus Monocamadas subconfluentes de carcinoma de cólon SW480 ou células CHO transfectadas com EphA2 de Cinomolgus foram rapidamente tripsinizadas, lavadas, contadas, plaqueadas em placas de 96 poços com fundo redondo, e coradas com 10 μg/mL de um anticorpo controle negativo (R347), o anticorpo murino anti-EphA2 de humano, EA2 (Coffman 2003), ou anticorpos humanizados, 3F2 e 4H5. Células foram ressuspendidas em AlexaFluor 488 anti-camundongo ou H+L de IgG anti-humano (Invitrogen) e então analisados por citometria de fluxo usando um FACSCalibur (Becton Dickinson) . Como mostrado em FIG. 40, EA2, 3F2, e 4H5 cada se ligou a EphA2 humano e de Cinomolgus.

Propriedades da Exclusão de Epitopo de Anticorpos Parentais Humanizados Anti-EphA2

Monocamadas de células MCF-IOa ou MDA-MB-231 foram cultivadas sobre laminulas de vidro por pelo menos 24 horas a 37° C antes de serem coradas. Monocamadas de células foram fixadas em paraformaldeido a 4 % (2 minutos, 25° C) antes da incubação com anticorpo primário (clone G5 (controle negativo), EA5, EA2, 3F2, ou 4H5) por 30 minutos seguido por coloração subseqüente com anti-IgG de camundongo feito em cabra conjugado a AlexaFluor 488 ou anti-IgG de humano feito em cabra conjugado a AlexaFluor 488 (The Jackson Laboratory) . As células foram fixadas para análises por microscopia de imunofluorescência. Como mostrado em FIG. 41, 3F2 e 4H5 se ligaram a EphA2 em ambas as células epiteliais de mama não transformadas e transformadas. Assim, 3F2 e 4H5 não compartilharam a habilidade única de EA2 em se ligar a um epitopo EphA2 acessível em células malignas mas seletivamente excluídas pela arquitetura normal de células epiteliais não transformadas. As seqüências de aminoácidos dos domínios VL e VH do anticorpo G5 são mostradas na FIG. 42.

Análise da Reatividade Cruzada Tecidual

A avaliação da reatividade cruzada tecidual dos anticorpos humanizados anti-EphA2 a tecido cardíaco humano determinou que 3F2 e 4H5 não se ligaram a tecido cardíaco normal em concentrações de até 10 pg/ml.

A reatividade cruzada tecidual também foi avaliada para as variantes combinatórias de scFv 2A4, 12E2, e 2E7. Nenhuma das variantes combinatórias de scFv (2A4, 12E2, 2E7) corou tecido cardíaco normal (2 doadores) em concentrações de até 50 10 pg/ml (dados não mostrados).

Caracterização de BiTE Anti-Constructos 3F2 de EphA2

Os constructos de BiTE baseados em 3F2 produzidos são descritos na Tabela abaixo e foram adicionalmente caracterizados por testes de citotoxicidade.

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Testes de citotoxicidade baseados em liberação de Cromo-51 foram executados para determinar a Iise celular objetiva redirecionada pelos vários BiTE anti-constructos de EphA2 na presença de células T CD8+ humanas estimuladas. Células tumorais da linhagem MDA-MB-231 positivas para EphA2 foram carregadas com cromo-51 e servidas como células alvo. Os vários BiTE anti-constructos de EphA2 foram titulados ao longo de uma latga escala de concentrações. O teste durou 18 horas, e a razão efetora-paraalvo foi 10:1. Concentrações de EphA2-BiTe para metade da Iise máxima (isto é, EC 50) com diferentes lotes de produção foram estimadas usando um modelo de ajuste não linear de quatro parâmetros. Ver FIG. 43.

Testes de citotoxicidade celular redirecionada baseados em citometria de fluxo foram conduzidos como listado acima usando células mononucleares de sangue periférico humanas enriquecidas em células T CD3+ (PBMC) como células efetoras e células de carcinoma de cólon EphA2+ SW480. Ver FIG. 44.

Medida de citotoxicidade in vitro (FIGS. 43 e 44) dos quatro BiTEs de cadeia simples anti-constructos de EphA2 baseados em 3F2 (Tabela acima) sugeriram que a potência (isto é, EC50) do BiTE 3F2 não foi superior ao BiTE EA2 murino. Estes resultados estabeleceram que BiTEs humanizadas anti-EphA2 redirecionaram células T humanas para lisar células tumorais EphA2+.

Caracterização de BiTE 4H5 Anti-Constructos de EphA2

Os BiTEs anti-constructo de EphA2 4H5 produzidos são descritos na Tabela abaixo e foram adicionalmente caracterizados

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Especificidade de Ligação a Célula Alvo de BiTEs anti- EphA2 baseados em 4H5 a Células que Expressam EphA2+ e CD3 +

A especificidade de ligação ao alvo dos vários BiTEs anti-EphA2 baseados em 4H5 foi examinada usando o teste baseado em citometria de fluxo descrito acima. Células de câncer de mama EphA2+ MDA MB 231 e células T humanas CD3 + HP Ball foram usadas como células alvo. O BiTE anti-CD3xEA2 (VH/VL) desimunizado foi usado como um controle positivo. Como mostrado na FIG. 45, cada um dos constructos de EphA2- BiTE baseados em 4H5 ligou-se a células expressando ambos EphA2 e CD3.

Especificidade de Ligação a Célula Alvo dos Constructos de BiTE Humanizados Baseados em 4H5 Maturados por Afinidade 12E2, 2E7 e 2A4

A especificidade de ligação ao alvo dos vários BiTEs anti-EphA2 baseados em 4H5 foi examinada usando o teste baseado em citometria de fluxo descrito acima. Células de câncer de mama EphA2+ MDA MB 231 e células T humanas CD3 + HP Ball foram usadas como células alvo. Como mostrado em FIG. 4 6, cada um dos constructos de EphA2-BiTE baseados em 4H5 ligou-se a células expressando ambos EphA2 e CD3.

Como mostrado em FIG. 47, os monômeros purificados dos constructos de EphA2-BiTE baseados em 4H5 maturados por afinidade ligou-se a células alvo de câncer de mama EphA2+ MDA MB 231 e células T humanas CD3+ HP Ball a uma concentração de 5 μg/ml usando o teste baseado em citometria de fluxo como descrito acima.

Para determinar a habilidade dos scFv baseados em 4H5 maturados por afinidade, monocamadas de MCF-10a ou células MDA-MB-231 foram cultivadas sobre lamínulas de vidro por pelo menos 24 horas a 37°C antes de serem coradas. Monocamadas celulares foram fixadas em para formaldeido 4 % (2 minutos, 25°C) antes de incubação com anticorpo scFv primário (2A4, 2E7 ou 12E2) por 30 minutos seguido por marcação subseqüente com anti-IgG de camundongo feito em cabra conjugado a AlexaFluor 488 ou anti-IgG humana feito em cabra conjugado a AlexaFluor 488 (The Jackson Laboratory). Células foram fixadas para análise por microscopia de imunofluorescência. Os scFvs 2A4 e 12E2 ligaram-se a EphA2 tanto em células epiteliais de mama não transformadas quanto transformadas. O scFv 2E7, entretanto, compartilhou a habilidade única de EA2 em se ligar a um epitopo de EphA2 acessível em células malignas mas não seletivamente excluído pela arquitetura normal de células epiteliais não transformadas (dados não mostrados).

Comparação da Potência Citotóxica de Quatro BiTEs Específicos para EphA2 do Anticorpo Monoclonal Humanizado 4H5

Testes de citotoxicidade baseados em liberação de cromo-51 foram executados para determinar a Iise celular objetiva redirecionada pelos vários BiTE anti-constructos de EphA2 na presença de células T CD8+ humanas estimuladas. Ver FIG. 48. A linhagem de células tumorais positiva para EphA2 MDA-MD231 foi carregada com cromo-51 e servida como célula alvo. Os vários BiTE anti-constructos de EphA2 foram titulados ao longo de uma larga escala de concentrações. A duraçao do teste foi 18 horas, e a razão efetora-para-alvo 10:1. Concentrações de BiTE para EphA2 requeridas para metade da Iise máxima (isto é, EC50) com diferentes lotes de produção foram estimados usando um modelo de ajuste não- linear de quatro parâmetros. FIG. 4 9 provê uma comparação direta da potência de Iise celular dirigida dos vários constructos EphA2 baseados em 3F2 e 4H5. Os testes de citotoxicidade baseados em cromo-51 foram executados como descrito acima.

Atividade Citotóxica Induzida por BiTEs de EphA2 Baseados em 4H5 Maturados Por Afinidade 12E4, 2E7 e 2A4

As FIGS. 50 e 51 demonstram a potência de Iise celular dirigida dos vários BiTEs de EphA2 baseados em 4H5 (12E4, 2E7 e 2A4). As linhagens de células tumorais positivas para EphA2 A549 e SW480 foram carregadas com cromo-51 e servidas como células alvo. Células T CD8+ humanas estimuladas (FIG.

40) e CD3+ humanas não estimuladas (FIG. 51) serviram como células efetoras. Os vários BiTE anti-constructos de EphA2 foram titulados ao longo de uma larga escala de concentrações. A duração do teste foi de 18 horas (FIG. 50) ou 42 horas (FIG. 51), e a razão efetoras-para-allvo 10:1

(FIG. 50) ou 5:1 (FIG. 41). Concentrações de BiTE para EphA2 requeridas para metade da Iise máxima (isto é, EC50) com diferentes lotes de produção foram estimadas usando um modelo de ajuste não-linear de quatro parâmetros.

Nenhuma Ativação de EphA2 por BiTEs de EphA2 Baseados em 4H5

FIG. 52 demonstra que nem o constructo de BiTE 2A4 nem o 2E7 induziu a fosforilação de EphA2 em células expressando EphA2. Células EphA2+ SW480 e A549 foram tratadas com ou o BiTE 2A4 ou o BiTE 2E7, IgG de EA5 (controle positivo), ou R347 (controle negativo) por 15 minutos nas concentrações indicadas. Extratos celulares foram então imunoprecipitados usando o anticorpo monoclonal anti-EphA2 D7 (Upstate, Charlottesville, VA) e sondados usando o anticorpo anti-fosfotirosina 4G10 (üpstate) . Extração de amostra, imunoprecipitação e análise de western blot foram executados como detalhado previamente (Coffman K. et al., 2003, Câncer Res. 63:7907-12; e é incorporado por referência aqui em sua integra) . Para todos os experimentos, níveis de proteínas foram medidos usando testes de padrão Coomassie (Pierce, Rockford, IL), e quantidades iguais de proteína foram resolvidas por SDS- PAGE (10%) e transferidas a membranas de PVDF (Invitrogen, Carlsbad, CA).

Eficácia In Vivo dos Constructos de BiTE de EphA2 Maturados por Afinidade Baseados em 4H5

A potência in vivo dos constructos de BiTE 2A4 e 2E7 foram avaliadas em camundongos imunodeficientes NOD/SCID com um modelo de xenotransplante de cólon de carcinoma humano (descrito acima na Seção 6.4 e abaixo na Seção 6.8.7). A linhagem de carcinoma de cólon humano SW480 foi selecionada para o estabelecimento do modelo de xenotransplante uma vez que as células SW480 expressam EphA2. Projeto de Estudo

5xl06 células SW480 foram misturadas com 2,5xl06 células T CD3+ humanas do mesmo doador em um volume final de 0,2 mL de PBS resultando em uma razão E:A de 1:2. As misturas de células T efetoras/SW480 foram injetadas subcutaneamente no flanco direito de cada camundongo NOD/SCID. Tumores SW480 crescendo subcutaneamente foram medidos três vezes por semana com um compasso de calibração em duas dimensões perpendiculares e os volumes tumorais calculados de acordo com a fórmula: volume tumoral = [(largura2 * comprimento)/2]. Animais foram tratados intravenosamente com o BiTE 2A4 ou o BiTE 2E7 a uma concentração de 1, 5, 20 e 100 μg/dose, veiculo controle de PBS, ou anti-CD3xEA2 (VHVL) desimunizado a 100 μg/dose como um controle positivo por cinco dias consecutivos iniciando uma hora após a inoculação subcutânea de células T CD3+ e células tumorais SW480. Os resultados do estudo são descritos na FIG. 53.

DESCRIÇÃO ADICIONAL DOS TESTES AQUI EXECUTADOS

Linhagens Celulares e Cultura

Células CHO dhfr-, SW480, MCF-7, PC3, M14, A549, MDA- MB-231, MCFlOA, MDA-MB-468, SK-MEL-28, ACHN foram obtidas da ATCC e cultivadas de acordo com a recomendação deles. Hey8 foi um presente afável do Dr. Anil Sood, M.D. Anderson Câncer Center. Imunohistoquímica e Microscopia de Imunofluorescência

Seções de tecidos humanos congelados foram corados com o anticorpo monoclonal reativo para EphA2 de humano, EA2, para determinar se o anticorpo liga-se especificamente a tecido normal. Brevemente, um complexo de anticorpos primário e secundário foi produzido, os sítios de ligação dos secundários não ligados foram bloqueados com globulinas gama humanas. Seções congeladas foram aderidas a lâminas em formalina a 10 % e lavadas com salina tamponada com tris (TBS) Ix com Tween 20 a 0,01%. Peroxidases endógenas foram bloqueadas com uma solução contendo glicose oxidase (Sigma), β-D(+)-glicose (Sigma), e azida de sódio (Sigma). Um conjunto vetor de avidina/biotina (Vector Labs) bloqueou sítios reativos de avidina/biotina. As lâminas foram então incubadas com uma solução bloqueadora de proteínas consistindo de albumina de soro bovino, caseína, e soro de cabra normal. Seções de tecidos foram incubadas com anticorpos pré-complexados e então tratados com conjunto Vectastain ABC Elite (Vector Labs), lavados com TBS lx, tratados com DAB (Sigma), e contra-corados com hematoxilina de Mayer. Seções de tecido foram desidratadas, recobertas com lamínulas, e feitas imagens.

Análise de Ressonância de Plasmon de Superfície com Biosensor

Todos os estudos foram executados usando chip sensor CM5 (Biacore AB, Uppsala, Suécia) o qual contém uma matriz dextrana de carboximetila (CM) e um biosensor de ressonância de plasmon de superfície (SPR) Biacore® 3000 (Biacore AB, Uppsala, Suécia). 0ϋ3εγ foi covalentemente associado à matriz dextrana de CM usando acoplamento químico por amina. Uma superfície de referência foi criada por omissão do etapa de associação a CD3sy. Fc de EphA2 foi capturado via uma interação de alta afinidade entre a porção Fc de EphA2Fc e um (Fc) de cabra anti-IgG humana (KPL, Inc., Gaithersburg, MD). (Fc) de cabra anti-IgG humana foi covalentemente associada à matriz dextrana de CM usando acoplamento químico por amina. Duas superfícies específicas para (Fc) anti-IgG humana foram criadas. Uma destas superfícies foi usada como uma superfície de referência enquanto a outra superfície foi usada para criar uma superfície específica para Fc de EphA2. Concentrações diferentes de bscEphA2 χ CD3 foram preparadas por diluição serial em HBS-EP (HEPES a 0,01 M pH 7,4, NaCl a 0,15 Mf EDTA a 3 mM, surfactante P20 a 0, 005 %). BiTEs de EphA2 foram injetados de uma maneira de fluxo serial ao longo da superfície específica para CD3íy ou específica para EphA2 e sua superfície de referência correspondente. Dissociação de BiTEs de EphA2 ligados foi monitorada na presença de HBS- EP. Material ligado remanescente foi removido com tetraborato disódico a 10 mM pH 8,5, NaCl a 1 M (para superfície específica para CD3£y) ou glicina a 10 mM pH 1,7 (para superfície específica para Fc de EphA2).

Densidade de Antíqenos na Superfície Celular

O número de sítios de ligação EphA2 na superfície das células foi estimado usando Qifikit (DakoCytomation). Brevemente, monocamadas subconfluentes de células foram rapidamente tripsinizadas, lavadas, contadas, plaqueadas em placas de 96 poços com fundo redondo, e coradas com 100 μl de uma diluição serial de duas vezes de um anticorpo anti- EphA2 de humano, B233 (Coffman 2003). As células e contas de calibração conjugadas a IgG de camundongos foram resuspendidos em AlexaFluor 647 anti-IgG de camundongo H+L (Invitrogen) e então analisadas por citometria de fluxo usando um FACSCalibur (Becton Dickinson). O número de sítios de ligação na superfície foi estimado por análise de regressão não linear a partir da curva de calibração das contas.

EQUIVALENTES

Aqueles especialistas na arte reconhecerão, ou serão capazes de averiguar usando nada além de experimentação de rotina, vários equivalentes aos avanços específicos da invenção aqui descrita. Tais equivalents pretendem ser englobados pelas seguintes reivindicações.

Todas as publicações, patentes e aplicações de patentes mencionadas nesta especificação são aqui incorporadas por referência na especificação com a mesma extensão como se cada publicação, patente ou aplicação de patente individual fosse especificamente e individualmente indicadas como sendo aqui incorporada por referência. LISTAGEM DE SEQÜÊNCIAS

I) INFORMAÇÕES GERAIS:

I.a) Requerente: Medlmmune, Inc. Micromet Inc.

II) Título da Invenção: ANTICORPOS DE CADEIA SIMPLES BIESPECÍ FICOS E COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA COMPREENDENDO OS MESMOS

III) Arquivo de Referência: 10271-175-228

IV.a) Dados de Prioridade ünionista: 60/753.368

IV.b) Data de preenchimento do formulário anterior: 2005- 12-21

V)Número de Seqüências: 123 (cento e vinte e três)

VI) Programa para leitura: FastSEQ for Windows Version 4.0

2) INFORMAÇÕES GERAIS DAS SEQÜÊNCIAS:

I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 1

II.a) tamanho: 321

II.b) tipo: DNA

II.c) organismo: Seqüência Artificial

III) Característica:

III.a) Outras informações: Seqüência de Nucleotideos de Cadeia Leve Variável EA2

IV) Seqüência: SEQ ID NO. 1

gacatcaaga tgacccagtc tccatcttcc atgtatgcat ctctaggaga gagagtcact 60 atcacttgca aggcgagtca ggacattaat aactatttaa gctggttcca gcagaaacca 120 gggaaatctc ctaagaccct gatctatcgt gcaaacagat tggtagatgg ggtcccatca 180 aggttcagtg gcagtggatc tgggcaagat tattctctca ccatcagcag cctggagtat 240 gaagatatgg gaatttatta ttgtctgaaa tatgatgagt ttccgtacac gttcggaggg 300 gggaccaagc tggaaataaa a 321

I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 2

II.a) tamanho: 107

II.b) tipo: PRT

II.c) organismo: Seqüência Artificial III) Caracteristica:

III.a) Outras informações: Seqüência de Aminoácidos de Cadeia Leve Variável EA2

IV) Seqüência: SEQ ID NO. 2

Asp Ile Lys Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Met Tyr Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Asn Tyr 20 25 30 Leu Ser Trp 35 Phe Gln Gln Lys Pro 40 Gly Lys Ser Pro Lys 45 Thr Leu Ile Tyr Arg 50 Ala Asn Arg Leu Val 55 Asp Gly Val Pro Ser 60 Arg Phe Ser Gly Ser 65 Gly Ser Gly Gln Asp 70 Tyr Ser Leu Thr Ile 75 Ser Ser Leu Glu Tyr 80 Glu Asp Met Gly Ile 85 Tyr Tyr Cys Leu Lys 90 Tyr Asp Glu Phe Pro 95 Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105

I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 3

II.a) tamanho: 33 II.b) tipo: DNA

II.c) organismo: Seqüência Artificial

III) Característica:

III.a) Outras informações: Seqüência de Nucleotideos CDRl de Cadeia Leve Variável EA2

IV) Seqüência: SEQ ID NO. 3

aaggcgagtc aggacattaa taactattta age 33

I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 4 II.a) tamanho: 11 II.b) tipo: PRT

II.c) organismo: Seqüência Artificial

III) Característica:

III. a) Outras informações: Seqüência de Aminoácidos CDRl de Cadeia Leve Variável EA2

IV) Seqüência: SEQ ID NO. 4 Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Asn Tyr Leu Ser 15 10

I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 5 II.a) tamanho: 21

II.b) tipo: DNA

II.c) organismo: Seqüência Artificial

III) Característica: III.a) Outras informações: Seqüência de Nucleotideos CDR2 de Cadeia Leve Variável EA2

IV) Seqüência: SEQ ID NO. 5

cgtgcaaaca gattggtaga t 21

I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 6

II.a) tamanho: 7

II.b) tipo: PRT

II.c) organismo: Seqüência Artificial

III) Característica:

III.a) Outras informações: Seqüência de Aminoácidos CDR2 de Cadeia Leve Variável EA2

IV) Seqüência: SEQ ID NO. 6 Arg Ala Asn Arg Leu Val Asp

1 5

I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 7

II.a) tamanho: 27 II.b) tipo: DNA

II.c) organismo: Seqüência Artificial

III) Característica:

III.a) Outras informações: Seqüência de Nucleotideos CDR3 de Cadeia Leve Variável EA2

IV) Seqüência: SEQ ID NO. 7

ctgaaatatg atgagtttcc gtacacg 27

I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 8

II.a) tamanho: 9

II.b) tipo: PRT

II.c) organismo: Seqüência Artificial

III) Característica:

III.a) Outras informações: Seqüência de Aminoácidos CDR3 de Cadeia Leve Variável EA2

IV) Seqüência: SEQ ID NO. 8

Leu Lys Tyr Asp Glu Phe Pro Tyr Thr 1 5

I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 9

II.a) tamanho: 345 Il.b) tipo: DNA

II.c) organismo: Seqüência Artificial

III) Característica: III.a) Outras informações: Seqüência de Nucleotideos de Cadeia Pesada Variável EA2

IV) Seqüência: SEQ ID NO. 9

gacgtgaagc tggtggagtc tgggggaggc ttagtgaagc ctggagggtc cctgaaactc 60

tcctgtgcag cctctggatt cactttcagt agctatacca tgtcttgggt tcgccagact 120

ccggagaaga ggctggagtg ggtcgcaacc attagtagtg gtggtactta cacctactat 180

ccagacagtg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca atgccaagaa caccctgtac 240

ctgcaaatga gcagtctgaa gtctgaggac acagccatgt attactgtac aagagaagct 300

atctttactt actggggcca agggactctg gtcactgtct ctgca 345

I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 10

II.a) tamanho: 115

II.b) tipo: PRT

II.c) organismo: Seqüência Artificial

III) Característica:

III.a) Outras informações: Seqüência de Aminoácidos de Cadeia Pesada Variável EA2

IV) Seqüência: SEQ ID NO. 10

Asp Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Thr Met Ser 35 Trp Val Arg Gln Thr 40 Pro Glu Lys Arg Leu 45 Glu Trp Val Ala Thr 50 Ile Ser Ser Gly Gly 55 Thr Tyr Thr Tyr Tyr 60 Pro Asp Ser Val Lys 65 Gly Arg Phe Thr Ile 70 Ser Arg Asp Asn Ala 75 Lys Asn Thr Leu Tyr 80 Leu Gln Met Ser Ser 85 Leu Lys Ser Glu Asp 90 Thr Ala Met Tyr Tyr 95 Cys Thr Arg Glu Ala Ile Phe Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 115 100 105 110

I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 11 II.a) tamanho: 30 Il.b) tipo: DNA

II.c) organismo: Seqüência Artificial

III) Característica:

III.a) Outras informações: Seqüência de Nucleotídeos CDRl de Cadeia Pesada Variável EA2

IV) Seqüência: SEQ ID NO. 11 ggattcactt tcagtagcta taccatgtct 30

I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 12

II.a) tamanho: 10 II.b) tipo: PRT

II.c) organismo: Seqüência Artificial III) Característica:

III.a) Outras informações: Seqüência de Aminoácidos CDRl de Cadeia Pesada Variável EA2

IV) Seqüência: SEQ ID NO. 12

Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Thr Met Ser 15 10

I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 13

II.a) tamanho: 4 8 II.b) tipo: DNA

II.c) organismo: Seqüência Artificial

III) Característica:

III.a) Outras informações: Seqüência de Nucleotídeos CDR2 de Cadeia Pesada Variável EA2

IV) Seqüência: SEQ ID NO. 13

accattagta gtggtggtac ttacacctac tatccagaca gtaagggc 48

I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 14

II.a) tamanho: 17

II.b) tipo: PRT

II.c) organismo: Seqüência Artificial

III) Característica:

III.a) Outras informações: Seqüência de Aminoácidos CDR2 de Cadeia Pesada Variável EA2

IV) Seqüência: SEQ ID NO. 14

Thr Ile Ser Ser Gly Gly Thr Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys 15 10 15

Gly

I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 15 40 II.a) tamanho: 18

II.b) tipo: DNA

II.c) organismo: Seqüência Artificial

III) Característica:

III.a) Outras informações: Seqüência de Nucleotídeos CDR3 de Cadeia Pesada Variável EA2

IV) Seqüência: SEQ ID NO. 15

gaagctatct ttacttac 18

I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 16

II.a) tamanho: 6 II.b) tipo: PRT II.c) organismo: Seqüência Artificial

III) Característica:

III.a) Outras informações: Seqüência de Aminoácidos CDR3 de Cadeia Pesada Variável EA2

IV) Seqüência: SEQ ID NO. 16 Glu Ala Ile Phe Thr Tyr

1 5

I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 17

II.a) tamanho: 336

II.b) tipo: DNA

II.c) organismo: Seqüência Artificial

III) Característica:

III.a) Outras informações: Seqüência de Nucleotideos de Cadeia Leve Variável EA5.12

IV) Seqüência: SEQ ID NO. 17

gatgtkgtka tgacbcagac tccactcact ttgtcggtta ccattggaca accagcctct 60 atctcttgca agtcaagtca gagcctctta tatagtaatg gaaaaaccta tttgaattgg 120 ttgttacaga ggccaggcca gtctccaaag cgcctaatct atctggtgtc taaactggac 180 tctggagtcc ctgacaggtt cactggcagt ggatcaggaa cagattttac actgaaaatc 240 agcagagtgg aggctgagga tttgggagtt tattactgcg tgcaaggttc acattttccg 300 tggacgttcg gtggaggcac caagctggaa atcaaa 336

I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 18

II.a) tamanho: 112

II.b) tipo: PRT

II.c) organismo: Seqüência Artificial

III) Característica:

III. a) Outras informações: Seqüência de Aminoácidos de Cadeia Leve Variável EA5.12

IV) Seqüência : SEQ ID NO. 18 Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Thr Leu Ser Val Thr Ile Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser 20 Ile Ser Cys Lys Ser 25 Ser Gln Ser Leu Leu 30 Tyr Ser Asn Gly Lys 35 Thr Tyr Leu Asn Trp 40 Leu Leu Gln Arg Pro 45 Gly Gln Ser Pro Lys 50 Arg Leu Ile Tyr Leu 55 Val Ser Lys Leu Asp 60 Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Val Gln Gly 85 90 95 Ser His Phe Pro 100 Trp Thr Phe Gly Gly 105 Gly Thr Lys Leu Glu 110 Ile Lys

I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 19 II.a) tamanho: 27 II.b) tipo: DNA

II.c) organismo: Seqüência Artificial

III) Característica:

III.a) Outras informações: Seqüência de Nucleotideos CDRl de Cadeia Leve Variável EA5.12

IV) Seqüência: SEQ ID NO. 19 aagtcaagtc agagcctctt atatagt 27

I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 20

II.a) tamanho: 16

II.b) tipo: PRT

II.c) organismo: Seqüência Artificial

III) Característica:

III.a) Outras informações: Seqüência de Aminoácidos EA5.12 de Cadeia Leve Variável CDRl

IV) Seqüência: SEQ ID NO. 20

Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser Asn Gly Lys Thr Tyr Leu Asn 15 10 15

I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 21

II.a) tamanho: 21 II.b) tipo: DNA

II.c) organismo: Seqüência Artificial

III) Característica:

III.a) Outras informações: Seqüência de Nucleotideos CDR2 de Cadeia Leve Variável EA5.12 IV) Seqüência: SEQ ID NO. 21

ctggtgtcta aactggactc t 21

I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 22

II.a) tamanho: 7 II.b) tipo: PRT

II.c) organismo: Seqüência Artificial

III) Característica:

III.a) Outras informações: Seqüência de Aminoácidos CDR2 de Cadeia Leve Variável EA5.12

IV) Seqüência: SEQ ID NO. 22 Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser

1 5

I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 23 II.a) tamanho: 2 7

II.b) tipo: DNA

II.c) organismo: Seqüência Artificial

III) Característica:

III.a) Outras informações: Seqüência de Nucleotideos CDR3 de Cadeia Leve Variável EA5.12

IV) Seqüência: SEQ ID NO. 23 gtgcaaggtt cacattttcc gtggacg 27

I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 24

II.a) tamanho: 9

II.b) tipo: PRT

II.c) organismo: Seqüência Artificial

III) Característica:

III.a) Outras informações: Seqüência de Aminoácidos CDR3 de Cadeia Leve Variável EA5.12

IV) Seqüência: SEQ ID NO. 24 Val Gln Gly Ser His Phe Pro Trp Thr 1 5

I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 25

II.a) tamanho: 345 II.b) tipo: DNA

II.c) organismo: Seqüência Artificial

III) Característica:

III.a) Outras informações: Seqüência de Nucleotídeos de Cadeia Pesada Variável EA5.12

IV) Seqüência: SEQ ID NO. 25

gaggtccagc tgcagcagtc tggacctgag ctagtgaaga ctggggcttc agtgaagata 60 tcctgcaagg cttctggtta ctcattcact ggttactaca tgcactgggt caagcagagc 120 catggaaaga gccttgagtg gattggatat attagttgtt acaatggtgt tactagctac 180 aaccagaagt tcaagggcaa ggccacattt actgtagaca catcctccag cacagcctac 240 atgcagttca acagcctgac atctgaagac tctgcggtct attactgtgc aagatctcat 300 gctatggact actggggtca aggaacctca gtcaccgtct cctca 345

I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 26

II.a) tamanho: 115

II.b) tipo: PRT

II.c) organismo: Seqüência Artificial

III) Característica:

III.a) Outras informações: Seqüência de Aminoácidos - Região de Cadeia Pesada Variável EA5.12

IV) Seqüência: SEQ ID NO. 26

Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Thr Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Ile 20 Ser Cys Lys Ala Ser 25 Gly Tyr Ser Phe Thr 30 Gly Tyr Tyr Met His Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr 50 Ile Ser Cys Tyr Asn 55 Gly Val Thr Ser Tyr 60 Asn Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Phe Thr Val Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Phe Asn Ser 85 Leu Thr Ser Glu Asp 90 Ser Ala Val Tyr Tyr 95 Cys Ala Arg Ser His 100 Ala Met Asp Tyr Trp 105 Gly Gln Gly Thr Ser 110 Val Thr Val Ser Ser 115

I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 27

II.a) tamanho: 15

II.b) tipo: DNA

II.c) organismo: Seqüência Artificial

III) Característica:

III.a) Outras informações: Seqüência de Nucleotideos CDRl de Cadeia Pesada Variável EA5.12

IV) Seqüência: SEQ ID NO. 27

ggttactaca tgcac 15

I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 28 II.a) tamanho: 5 II.b) tipo: PRT

II.c) organismo: Seqüência Artificial

III) Característica:

III.a) Outras informações: Seqüência de Aminoácidos CDRl de Cadeia Pesada Variável EA5.12

IV) Seqüência: SEQ ID NO. 28 Gly Tyr Tyr Met His 1 5

I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 29

II.a) tamanho: 51

II.b) tipo: DNA

II.c) organismo: Seqüência Artificial

III) Característica:

III. a) Outras informações: Seqüência de Nucleotideos CDR2 de Cadeia Pesada Variável EA5.12

IV) Seqüência: SEQ ID NO. 29

tatattagtt gttacaatgg tgttactagc tacaaccaga agttcaaggg c

51 I. a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 30

II.a) tamanho: 17

II.b) tipo: PRT

II.c) organismo: Seqüência Artificial

III) Característica:

III.a) Outras informações: Seqüência de Aminoácidos CDR2 de Cadeia Pesada Variável EA5.12

IV) Seqüência: SEQ ID NO. 30

Tyr Ile Ser Cys Tyr Asn Gly Val Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys

15 10 15

Gly

I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 31

II.a) tamanho: 18 Il.b) tipo: DNA

II.c) organismo: Seqüência Artificial

III) Característica:

III.a) Outras informações: Seqüência de Nucleotideos CDR3 de Cadeia Pesada Variável EA5.12

IV) Seqüência: SEQ ID NO. 31

tctcatgcta tggactac 18

I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 32 II.a) tamanho: 6 II.b) tipo: PRT

II.c) organismo: Seqüência Artificial

III) Característica:

III.a) Outras informações: Seqüência de Aminoácidos CDR3 de Cadeia Pesada Variável EA5.12

IV) Seqüência: SEQ ID NO. 32 Ser His Ala Met Asp Tyr 1 5

I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 33 II.a) tamanho: 123

II.b) tipo: PRT

II.c) organismo: Seqüência Artificial

III) Característica: III.a) Outras informações: Seqüência de Aminoácidos de Cadeia Leve Variável 233 IV) Seqüência: SEQ ID NO. 33

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Asp Ile Val Leu 20 Thr Gln Ser Pro Ala 25 Thr Leu Ser Val Thr 30 Pro Gly Asp Ser Val 35 Asn Leu Ser Cys Arg 40 Ala Ser Gln Ser Ile 45 Ser Asn Asn Leu His 50 Trp Tyr Gln Gln Lys 55 Ser His Glu Ser Pro 60 Arg Leu Leu Ile Lys Tyr Val Phe Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly 65 70 75 80 Ser Gly Ser Gly Thr 85 Asp Phe Thr Leu Ser 90 Ile Asn Ser Val Glu 95 Thr Glu Asp Phe Gly 100 Met Tyr Phe Cys Gln 105 Gln Ser Asn Ser Trp 110 Pro Leu Thr Phe Gly 115 Ala Gly Thr Lys Leu 120 Glu Leu Lys

I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 34 II.a) tamanho: 11 II.b) tipo: PRT

II.c) organismo: Seqüência Artificial

III) Característica:

III.a) Outras informações: Seqüência de Aminoácidos CDRl de Cadeia Leve Variável 233

IV) Seqüência: SEQ ID NO. 34 Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Asn Leu His 15 10

I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 35 II.a) tamanho: 7

II.b) tipo: PRT

II.c) organismo: Seqüência Artificial

III) Característica:

III.a) Outras informações: Seqüência de Aminoácidos CDR2 de Cadeia Leve Variável 233

IV) Seqüência: SEQ ID NO. 35

Tyr Val Phe Gln Ser Ile Ser 1 5

I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 36

II.a) tamanho: 9 II.b) tipo: PRT

II.c) organismo: Seqüência Artificial

III) Característica:

III.a) Outras informações: Seqüência de Aminoácidos CDR3 de Cadeia Leve Variável 233 IV) Seqüência: SEQ ID NO. 36

Gln Gln Ser Asn Ser Trp Pro Leu Thr 1 5

I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 37

II.a) tamanho: 120

II.b) tipo: PRT

II.c) organismo: Seqüência Artificial

III) Característica:

III.a) Outras informações: Seqüência de Aminoácidos de Cadeia Pesada Variável 233

IV) Seqüência: SEQ ID NO. 37

Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Ser Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Ser Met Asn 35 Trp Val Arg Gln Pro 40 Pro Gly Lys Ala Leu 45 Glu Trp Leu Gly Phe 50 Ile Arg Asn Lys Ala 55 Asn Asp Tyr Thr Thr 60 Glu Tyr Ser Ala Ser 65 Val Lys Gly Arg Phe 70 Thr Ile Ser Arg Asp 75 Asn Ser Gln Ser Ile 80 Leu Tyr Leu Gln Met 85 Asn Ala Leu Arg Ala 90 Glu Asp Ser Ala Thr 95 Tyr Tyr Cys Val Arg Tyr Pro Arg Tyr His Ala Met Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Ser 115 100 Val Thr Val Ser Ser 120 105 110

I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 38

II.a) tamanho: 5

II.b) tipo: PRT

II.c) organismo: Seqüência Artificial

III) Característica:

III.a) Outras informações: Seqüência de Aminoácidos CDRl de Cadeia Pesada Variável 233

IV) Seqüência: SEQ ID NO. 38 Asp Tyr Ser Met Asn 1 5

I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 39

II.a) tamanho: 19

II.b) tipo: PRT

II.c) organismo: Seqüência Artificial

III) Característica: III.a) Outras informações: Seqüência de Aminoácidos CDR2 de Cadeia Pesada Variável 233

IV) Seqüência: SEQ ID NO. 39 Phe Ile Arg Asn Lys Ala Asn Asp Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser Ala Ser 15 10 15

Val Lys Gly

I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 40

II.a) tamanho: 9 II.b) tipo: PRT

II.c) organismo: Seqüência Artificial

III) Característica:

III. a) Outras informações: Seqüência de Aminoácidos CDR3 de Cadeia Pesada Variável 233

IV) Seqüência: SEQ ID NO. 40 Tyr Pro Arg Tyr His Ala Met Asp Ser 1 5

25 I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 41 II.a) tamanho: 107 II.b) tipo: PRT

II.c) organismo: Seqüência Artificial

III) Característica:

III.a) Outras informações: Seqüência de Aminoácidos de Cadeia Leve Variável 3F2

IV) Seqüência: SEQ ID NO. 41

Ala 1 Ile Gln Leu Thr 5 Gln Ser Pro Ser Ser 10 Leu Ser Ala Ser Val 15 Gly Asp Arg Val Thr 20 Ile Thr Cys Arg Ala 25 Ser Gln Ser Ile Ser 30 Asn Asn Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr 50 Gly Phe Gln Ser Ile 55 Ser Gly Val Pro Ser 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr 85 Tyr Tyr Cys Gln Gln 90 Ala Asn Ser Trp Pro 95 Leu Thr Phe Gly Gly 100 Gly Thr Lys Leu Glu 105 Ile Lys

I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 42

II.a) tamanho: 11 Il.b) tipo: PRT

II.c) organismo: Seqüência Artificial III) Característica:

III.a) Outras informações: Seqüência de Aminoácidos CDRl de Cadeia Leve Variável 3F2

IV) Seqüência: SEQ ID NO. 42

Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Asn Leu His 15 10

I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 43 II.a) tamanho: 7 II.b) tipo: PRT

II.c) organismo: Seqüência Artificial

III) Característica:

III.a) Outras informações: Seqüência de Aminoácidos CDR2 de Cadeia Leve Variável 3F2

IV) Seqüência: SEQ ID NO. 43

Tyr Gly Phe Gln Ser Ile Ser 1 5

I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 44

II.a) tamanho: 9

II.b) tipo: PRT

II.c) organismo: Seqüência Artificial

III) Característica:

III.a) Outras informações: Seqüência de Aminoácidos CDR3 de Cadeia Leve Variável 3F2

IV) Seqüência: SEQ ID NO. 44

Gln Gln Ala Asn Ser Trp Pro Leu Thr 1 5

I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 45

II.a) tamanho: 120

II.b) tipo: PRT

II.c) organismo: Seqüência Artificial

III) Característica:

III.a) Outras informações: Seqüência de Aminoácidos de Cadeia Pesada Variável 3F2

IV) Seqüência: SEQ ID NO. 45

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Arg Pro Gly Gly 15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Ser Asp Tyr 20 25 30

Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Phe 50 Ile Arg Asn Lys Ala 55 Asn Ala Tyr Thr Thr 60 Glu Tyr Ser Ala Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met 85 Asn Ser Leu Lys Thr 90 Glu Asp Thr Ala Val 95 Tyr Tyr Cys Thr Thr 100 Tyr Pro Arg Tyr His 105 Ala Met Asp Ser Trp 110 Gly Gln Gly Thr Met 115 Val Thr Val Ser Ser 120

I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 4 6

II.a) tamanho: 5

II.b) tipo: PRT

II.c) organismo: Seqüência Artificial

III) Característica:

III.a) Outras informações: Seqüência de Aminoácidos CDRl de Cadeia Pesada Variável 3F2

IV) Seqüência: SEQ ID NO. 46 Asp Tyr Ser Met Asn

1 5

I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 47

II.a) tamanho: 19

II.b) tipo: PRT

II.c) organismo: Seqüência Artificial

III) Característica:

III.a) Outras informações: Seqüência de Aminoácidos CDR2 de Cadeia Pesada Variável 3F2

IV) Seqüência: SEQ ID NO. 47

Phe Ile Arg Asn Lys Ala Asn Ala Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser Ala Ser

15 10 15

Val Lys Gly

I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 48

II.a) tamanho: 9

II.b) tipo: PRT

II. c) organismo: Seqüência Artificial

III) Característica:

III.a) Outras informações: Seqüência de Aminoácidos CDR3 de Cadeia Pesada Variável 3F2

IV) Seqüência: SEQ ID NO. 48 Tyr Pro Arg Tyr His Ala Met Asp Ser 1 5 I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 49

II.a) tamanho: 107

II.b) tipo: PRT

II.c) organismo: Seqüência Artificial

III) Característica:

III.a) Outras informações: Seqüência de Aminoácidos de Cadeia Leve Variável G5

IV) Seqüência: SEQ ID NO. 49

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr 20 Ile Thr Cys Arg Ala 25 Ser Gln Ser Ile Ser 30 Asn Asn Leu His Trp 35 Tyr Gln Gln Lys Pro 40 Gly Lys Ala Pro Lys 45 Leu Leu Ile Lys Tyr Val Phe Gln Ser Ile Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr 85 Tyr Tyr Cys Gln Gln 90 Ser Asn Ser Trp Pro 95 Leu Thr Phe Gly Gly 100 Gly Thr Lys Val Glu 105 Ile Lys

I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 50

II.a) tamanho: 11

II.b) tipo: PRT

II.c) organismo: Seqüência Artificial

III) Característica:

III. a) Outras informações: Seqüência de Aminoácidos CDRl de Cadeia Leve Variável G5

IV) Seqüência: SEQ ID NO. 50

Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Asn Leu His 1 5 10

I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 51

II.a) tamanho: 7 II.b) tipo: PRT

II.c) organismo: Seqüência Artificial

III) Característica:

III.a) Outras informações: Seqüência de Aminoácidos CDR2 de Cadeia Leve Variável G5

IV) Seqüência: SEQ ID NO. 51 Tyr Val Phe Gln Ser Ile Ser 1 5 I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 52

II.a) tamanho: 9 II.b) tipo: PRT

II.c) organismo: Seqüência Artificial

III) Característica:

III.a) Outras informações: Seqüência de Aminoácidos CDR3 de Cadeia Leve Variável G5

IV) Seqüência: SEQ ID NO. 52

Gln Gln Ser Asn Ser Trp Pro Leu Thr 1 5

I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 53

II.a) tamanho: 120

II.b) tipo: PRT

II.c) organismo: Seqüência Artificial

III) Característica:

III.a) Outras informações: Seqüência de Aminoácidos de Cadeia Pesada Variável G5

IV) Seqüência: SEQ ID NO. 53

Gln Met Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Val Lys Lys Pro Gly Thr 1 5 10 15 Ser Val Lys Val 20 Ser Cys Lys Ala Ser 25 Gly Phe Thr Phe Thr 30 Asp Tyr Ser Met Asn 35 Trp Val Arg Gln Ala 40 Arg Gly Gln Arg Leu 45 Glu Trp Ile Gly Phe 50 Ile Arg Asn Lys Ala 55 Asn Asp Tyr Thr Thr 60 Glu Tyr Ser Ala Ser Val Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Met Ser Thr Ser Thr 65 70 75 80 Ala Tyr Met Glu Leu 85 Ser Ser Leu Arg Ser 90 Glu Asp Thr Ala Val 95 Tyr Tyr Cys Ala Arg 100 Tyr Pro Arg Tyr His 105 Ala Met Asp Ser Trp 110 Gly Gln Gly Thr Ser 115 Val Thr Val Ser Ser 120

I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 54 II.a) tamanho: 5 II.b) tipo: PRT

II.c) organismo: Seqüência Artificial

III) Característica:

III.a) Outras informações: Seqüência de Aminoácidos CDRl de Cadeia Pesada Variável G5

IV) Seqüência: SEQ ID NO. 54 Asp Tyr Ser Met Asn 1 5

I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 55 II.a) tamanho: 19 II.b) tipo: PRT II.c) organismo: Seqüência Artificial

III) Característica: III.a) Outras informações: Seqüência de Aminoácidos CDR2 de Cadeia Pesada Variável G5

IV) Seqüência: SEQ ID NO. 55 Phe Ile Arg Asn Lys Ala Asn Asp Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser Ala Ser 1 5 10 15

Val Lys Gly

I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 56

II.a) tamanho: 9 II.b) tipo: PRT II.c) organismo: Seqüência Artificial

III) Característica:

III.a) Outras informações: Seqüência de Aminoácidos CDR3 de Cadeia Pesada Variável G5

IV) Seqüência: SEQ ID NO. 56

Tyr Pro Arg Tyr His Ala Met Asp Ser 1 5

I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 57 II.a) tamanho: 18 II.b) tipo: PRT

II.c) organismo: Seqüência Artificial

III) Característica:

III.a) Outras informações: Seqüência de aminoácidos ligante de constructo EphA2-BiTe

IV) Seqüência: SEQ ID NO. 57

Gly Glu Gly Thr Ser Thr Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 10 15

Ala Asp

I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 58 II.a) tamanho: 5 II.b) tipo: PRT II.c) organismo: Seqüência Artificial III) Característica:

III.a) Outras informações: Seqüência de aminoácidos ligante de constructo EphA2-BiTe

IV) Seqüência: SEQ ID NO. 58 Gly Gly Gly Gly Ser

1 5

I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 59

II.a) tamanho: 15 II.b) tipo: PRT

II.c) organismo: Seqüência Artificial III) Característica:

III. a) Outras informações: Seqüência de aminoácidos ligante de constructo EphA2-BiTe

IV) Seqüência: SEQ ID NO. 59

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 15 10 15

I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 60 II.a) tamanho: 1554 II.b) tipo: DNA

II.c) organismo: Seqüência Artificial

III) Característica:

III.a) Outras informações: Seqüência de Nucleotídeos anti- CD3 (VH-Vl) χ EA2 (VH-VL) desimunizada

IV) Seqüê

gaattcacca

cactccgacg

aaggtgtcct

caggcacctg

aattacgcag

gcctacatgg

tattatgatg

tcaggcgaag

attgtactga

agctgcagag

gcacccaaaa

agtggcagtg

gctgccactt

aaggtggaga

ggcttagtga

agtagctata

accattagta

atctccagag

gacacagcca

ctggtcactg

ncia: SEQ

tgggatggag tccaactggt gcaaggcttc gacagggtct acagcgtcaa aactgagcag atcattactg gtactagtac cccagtctcc ccagtcaaag gatggattta ggtctgggac attactgcca tcaaatccgg agcctggagg ccatgtcttg gtggtggtac acaatgccaa tgtattactg tctcttcctc

ID NO. 60

ctgtatcatc gcagtcaggg tggctacacc ggaatggatt gggccgcttc cctgcgttct ccttgactac tggttctggt agcaactctg tgtaagttac tgacacatcc cgactactct acagtggagt aggtggtgga gtccctgaaa ggttcgccag ttacacctac gaacaccctg tacaagagaa cggtggtggt

ctcttcttgg gctgaagtga tttactaggt ggatacatta acaatcacta gaggacactg tggggccaag ggaagtggag tctctgtctc atgaactggt aaagtggctt ctcacaatca agtaacccgc tccgacgtga ctctcctgtg actccagaga tatccagaca tacctgcaaa gctatcttta ggttctggcg

tagcaacagc aaaaacctgg acacgatgca atcctagccg cagacaaatc caacctatta gcaccacggt gttcaggtgg caggggagcg accagcagaa ctggagtccc acagcttgga tcacgttcgg agctggtgga cagcctctgg agaggctgga gtgtgaaggg tgagcagtct cttactgggg gcggcggctc

tacaggtgta ggcctcagtg ctgggtaagg tggttatact caccagcaca ctgtgcaaga caccgtctcc agcagacgac tgccaccctg gccgggcaag tgctcgcttc ggctgaagat tggcgggacc gtctggggga attcactttc gtgggtcgca ccgattcacc gaagtctgag ccaagggact cggtggtggt

60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 960 1020 1080 1140 1200 ggttctgaca tcaagatgac ccagtctcca tcttccatgt atgcatctct aggagagaga 1260 gtcactatca cttgcaaggc gagtcaggac attaataact atttaagctg gttccagcag 1320 aaaccaggga aatctcctaa gaccctgatc tatcgtgcaa acagattggt agatggggtc 1380 ccatcaaggt tcagtggcag tggatctggg caagattatt ctctcaccat cagcagcctg 1440 gagtatgaag atatgggaat ttattattgt ctgaaatatg atgagtttcc gtacacgttc 1500 ggagggggga ccaagctgga aataaaacat catcaccatc atcattaggt cgac 1554

I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 61

II. a) tamanho: 55

II.b) tipo: DNA

II.c) organismo: Seqüência Artificial

III) Característica:

III.a) Outras informações: Seqüência de nucleotídeos ligante de constructo EphA2-BiTe

IV) Seqüência: SEQ ID NO. 61

ggcgaaggta ctagtactgg ttctggtgga agtggaggtt caggtggagc agacg 55

I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 62 II.a) tamanho: 19 Il.b) tipo: DNA

II.c) organismo: Seqüência Artificial

III) Característica:

III.a) Outras informações: Seqüência de nucleotídeos ligante de constructo EphA2-BiTe

IV) Seqüência: SEQ ID NO. 62 tccggaggtg gtggatccg 19

I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 63

II.a) tamanho: 4 8

II.b) tipo: DNA

II.c) organismo: Seqüência Artificial

III) Característica:

III.a) Outras informações: Seqüência de nucleotídeos ligante de constructo EphA2-BiTe

IV) Seqüência: SEQ ID NO. 63

tccggtggtg gtggttctgg cggcggcggc tccggtggtg gtggttct 48

I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 64

II.a) tamanho: 21

II.b) tipo: DNA

II.c) organismo: Seqüência Artificial

III) Característica:

III.a) Outras informações: Seqüência de nucleotídeos ligante de constructo EphA2-BiTe IV) Seqüência: SEQ ID NO. 64

catcatcacc atcatcatta g 21

I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 65 II.a) tamanho: 492

II.b) tipo: PRT

II.c) organismo: Seqüência Artificial

III) Característica:

III.a) Outras informações: Seqüência de Aminoácidos de anti-CD3(VH-VL) χ EA2 (VH-VL) EphA2-Bite desimunizado

IV) Seqüência: SEQ ID NO. 65

Asp Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr

20 25 30

Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45

Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Thr Thr Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys 25 85 90 95

Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Glu Gly Thr Ser Thr Gly Ser Gly 115 120 125

Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ala Asp Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser 130 135 140

Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys 145 150 155 160

Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro 35 165 170 175

Gly Lys Ala Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Val Ala Ser

180 185 190

Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser 195 200 205

Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys 210 215 220

Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val 225 230 235 240

Glu Ile Lys Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Val Lys Leu Val Glu Ser 245 , 250 255

Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala

260 265 270

Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Thr Met Ser Trp Val Arg Gln 275 280 285

Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val Ala Thr Ile Ser Ser Gly Gly 290 295 300

Thr Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser 305 310 315 320

Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys 325 330 335

Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Thr Arg Glu Ala Ile Phe Thr

340 345 350

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly 355 360 365 Ser Gly 370 Gly Gly Gly Ser Gly 375 Gly Gly Gly Ser Asp 380 Ile Lys Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Met Tyr Ala Ser Leu Gly Glu Arg Val Thr Ile 385 390 395 400 Thr Cys Lys Ala Ser 405 Gln Asp Ile Asn Asn 410 Tyr Leu Ser Trp Phe 415 Gln Gln Lys Pro Gly 420 Lys Ser Pro Lys Thr 425 Leu Ile Tyr Arg Ala 430 Asn Arg Leu Val Asp 435 Gly Val Pro Ser Arg 440 Phe Ser Gly Ser Gly 445 Ser Gly Gln Asp Tyr 450 Ser Leu Thr Ile Ser 455 Ser Leu Glu Tyr Glu 460 Asp Met Gly Ile Tyr Tyr Cys Leu Lys Tyr Asp Glu Phe Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly 465 470 475 480 Thr Lys Leu Glu Ile 485 Lys His His His His 490 His His

I. a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 66 II.a) tamanho: 6 II.b) tipo: PRT II.c) organismo: Seqüência Artificial III) Característica: III.a) Outras informações: seqüência de hexa-histidina C- terminalde DNAc de EphA2-BiTe

IV) Seqüência: SEQ ID NO. 66

His His His His His His 1 5

I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 67 II.a) tamanho: 711 II.b) tipo: DNA II.c) organismo: Seqüência Artificial III) Característica: III.a) Outras informações: Seqüência de Nucleotídeos4h5 VH VL scFV

IV) Seqüência: SEQ ID NO. 67 caggtgcagc tgttggagtc

caggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc cctggacaag cgcttgagtg gatgggaacc ccagacagtg tgaagggccg attcaccatc ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac atctttactt actggggccg tggcaccctg ggcggcggcg gctccggtgg tggtggttct ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc aactatttaa gctggtacca gcagaaacct gcaaacagat tggtagatgg ggtcccagac tttaccctca caattaataa catagaatct tatgatgtgt ttccgtacac gttcggccaa

ttggtacagc agctatacca attagtagtg tccagagaca acggctgtgt gtcaccgtct gacatccagt atcacttgca ggccaggctc aggttcagtg gaggatgctg gggaccaagg

ctggggggtc tgtcttgggt gtggtactta acgccaagaa attactgtgc cctcaggtgg tgacccagtc aggcgagtca ccaggctcct gcagcgggta catattactt tggagatcaa

cctgagactc gcgacaggcc cacctactat ctcactgtat gagagaagct tggtggttct tccatcctcc ggacattaat catctatcgt tggaacagat ctgtctgaaa

60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 711 I. a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 68

II. a) tamanho: 237 II.b) tipo: PRT

II.c) organismo: Seqüência Artificial III) Característica:

III.a) Outras informações: Seqüência de Aminoácidos4H5 VH VL scFv

IV) Seqüência : SEQ ID NO. 68 Gln Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Thr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Ala Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Thr Ile Ser Ser Gly Gly Thr Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Ala Ile Phe Thr Tyr Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 115 120 125 Gly Ser Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser 130 135 140 Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn 145 150 155 160 Asn Tyr Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu 165 170 175 Leu Ile Tyr Arg Ala Asn Arg Leu Val Asp Gly Val Pro Asp Arg Phe 180 185 190 Ser Gly Ser Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Asn Ile 195 200 205 Glu Ser Glu Asp Ala Ala Tyr Tyr Phe Cys Leu Lys Tyr Asp Val Phe 210 215 220 Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

225 230 235

I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 69

II.a) tamanho: 5 II.b) tipo: PRT

II.c) organismo: Seqüência Artificial III) Característica:

III.a) Outras informações: Seqüência de Aminoácidos4H5 VH VL scFv CDRl (VH)

IV) Seqüência: SEQ ID NO. 69

Ser Tyr Thr Met Ser 1 5 I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 70

II.a) tamanho: 17

II.b) tipo: PRT

II.c) organismo: Seqüência Artificial

III) Característica:

III.a) Outras informações: Seqüência de Aminoácidos 4H5 VH VL scFv CDR2 (VH)

IV) Seqüência: SEQ ID NO. 70

Thr Ile Ser Ser Gly Gly Thr Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys 15 10 15

Gly

I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 71

II.a) tamanho: 6

II.b) tipo: PRT

II.c) organismo: Seqüência Artificial

III) Característica:

III.a) Outras informações: Seqüência de Aminoácidos 4H5 VH VL scFv CDR3 (VH)

IV) Seqüência: SEQ ID NO. 71

Glu Ala Ile Phe Thr Tyr 1 5

I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 72

II.a) tamanho: 11

II.b) tipo: PRT

II.c) organismo: Seqüência Artificial

III) Característica:

III. a) Outras informações: Seqüência de Aminoácidos 4H5 VH VL scFv CDRl (VL)

IV) Seqüência: SEQ ID NO. 72

Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Asn Tyr Leu Ser 1 5 10

I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 73

II.a) tamanho: 7

II.b) tipo: PRT

II.c) organismo: Seqüência Artificial

III) Característica:

III.a) Outras informações: Seqüência de Aminoácidos 4H5 VH VL scFv CDR2 (VL) IV) Seqüência: SEQ ID NO. 73

Arg Ala Asn Arg Leu Val Asp 1 5

I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 74

II.a) tamanho: 9 II.b) tipo: PRT

II.c) organismo: Seqüência Artificial III) Característica:

III.a) Outras informações: Seqüência de Aminoácidos 4H5 VH VL scFv CDR3 (VL)

IV) Seqüência: SEQ ID NO. 74

Leu Lys Tyr Asp Val Phe Pro Tyr Thr 1 5

I.a) Número identificador da seqüência: II.a) tamanho: 711 Il.b) tipo: DNA

II.c) organismo: Seqüência Artificial

SEQ ID No: 75

III) Característica:

III.a) Outras informações VL scFv

Seqüência de Nucleotideos 2A4 VH

IV) Seqüê

caggtgcagc

tcctgtgcag

cctggacaag

ccagacagtg

ctgcaaatga

atctttactc

ggcggcggcg

ctgtctgcat

aactatcaca

gcaaacagat

tttaccctca

ncia: SEQ

tgttggagtc

cctctggatt

cgcttgagtg

tgaagggccg

acagcctgag

actggggccg

gctccggtgg

ctgtaggaga

gctggtacca

tggtcgatgg

caattaataa

tataatgtgt ttccgtacac

ID NO. 7 tgggggaggc cacctttagc gatgggaacc attcaccatc agccgaggac tggcaccctg tggtggttct cagagtcacc gcagaaacct ggtcccagac catagaatct gttcggccaa

ttggtacagc agctatacca attagtagtc tccagagaca acggctgtgt gtcaccgtct gacatccagt atcacttgca ggccaggctc aggttcagtg gaggatgctg gggaccaagg

ctggggggtc tgtcttgggt gtggtactta acgccaagaa attactgtgc cctcaggtgg tgacccagtc aggcgagtca ccaggctcct gcagcgggta catattactt tggagatcaa

cctgagactc 60 gcgacaggcc 120 cacctactat 180 ctcactgtat 240 gagagaagct 300 tggtggttct 360 tccatcctcc 420 ggacattaat 480 catctatcgt 540 tggaacagat 600 ctgtctgaaa 660 a 711

I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 76

II.a) tamanho: 237 II.b) tipo: PRT

II.c) organismo: Seqüência Artificial

III) Característica:

III.a) Outras informações: Seqüência de Aminoácidos 2A4 VH VL scFv

IV) Seqüência: SEQ ID NO. 76

Gln Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 15 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Thr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Ala Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Thr Ile Ser Ser Arg Gly Thr Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Ala Ile Phe Thr His Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 115 120 125 Gly Ser Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser 130 135 140 Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn 145 150 155 160 Asn Tyr His Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu 165 170 175 Leu Ile Tyr Arg Ala Asn Arg Leu Val Asp Gly Val Pro Asp Arg Phe 180 185 190 Ser Gly Ser Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Asn Ile 195 200 205 Glu Ser Glu Asp Ala Ala Tyr Tyr Phe Cys Leu Lys Tyr Asn Val Phe 210 215 220 Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 225 230 235

I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 77

II.a) tamanho: 5 II.b) tipo: PRT

II.c) organismo: Seqüência Artificial

III) Característica:

III.a) Outras informações: Seqüência de Aminoácidos 2A4 VH VL scFv CDRl (VH)

IV) Seqüência: SEQ ID NO. 77

Ser Tyr Thr Met Ser 1 5

I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 78 II.a) tamanho: 17 II.b) tipo: PRT

II.c) organismo: Seqüência Artificial

III) Característica:

III.a) Outras informações: Seqüência de Aminoácidos 2A4 VH VL scFv CDR2 (VH)

IV) Seqüência: SEQ ID NO. 78 Thr Ile Ser Ser Arg Gly Thr Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys 15 10 15 Gly

I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 79 II.a) tamanho: 6 II.b) tipo: PRT

II.c) organismo: Seqüência Artificial

III) Característica:

III.a) Outras informações: Seqüência de Aminoácidos 2A4 VH VL scFv CDR3 (VH)

IV) Seqüência: SEQ ID NO. 79 Glu Ala Ile Phe Thr His 1 5

I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 80 II.a) tamanho: 11

II.b) tipo: PRT

II.c) organismo: Seqüência Artificial

III) Característica:

III.a) Outras informações: Seqüência de Aminoácidos 2A4 VH VL scFv CDRl (VL)

IV) Seqüência: SEQ ID NO. 80

Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Asn Tyr His Ser 1 5 10

I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 81

II.a) tamanho: 7 II.b) tipo: PRT

II.c) organismo: Seqüência Artificial

III) Característica:

III.a) Outras informações: Seqüência de Aminoácidos 2A4 VH VL scFv CDR2 (VL)

IV) Seqüência: SEQ ID NO. 81 Arg Ala Asn Arg Leu Val Asp

1 5

I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 82

II.a) tamanho: 9 II.b) tipo: PRT II.c) organismo: Seqüência Artificial

III) Característica: III.a) Outras informações: Seqüência de Aminoácidos 2A4 VH VL scFv CDR3 (VL)

IV) Seqüência: SEQ ID NO. 82

Leu Lys Tyr Asn Val Phe Pro Tyr Thr 1 5

I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 83

II.a) tamanho: 711

II.b) tipo: DNA

II.c) organismo: Seqüência Artificial

III) Característica:

III.a) Outras informações: Seqüência de Nucleotideos 2E7 VH VL scFv

IV) Seqüê caggtgcagc tcctgtgcag cctggacaag J-ccagacagtg ctgcaaatga atctttactc ggcggcggcg ctgtctgcat aactatggca gcaaacagat tttaccctca tataatcggt

ncia: SEQ

tgttggagtc

cctctggatt

cgcttgagtg

tgaagggccg

acagcctgag

actggggccg

gctccggtgg

ctgtaggaga

gctggtacca

tggtcgatgg

caattaataa

ttccgtacac

ID NO. 83

tgggggaggc cacctttagc gatgggaacc attcaccatc agccgaggac tggcaccctg tggtggttct cagagtcacc gcagaaacct ggtcccagac catagaatct gttcggccaa

ttggtacagc agctatacca attagtagtc tccagagaca acggctgtgt gtcaccgtct gacatccagt atcacttgca ggccaggctc aggttcagtg gaggatgctg gggaccaagg

ctggggggtc tgtcttgggt gtggtactta acgccaagaa attactgtgc cctcaggtgg tgacccagtc aggcgagtca ccaggctcct gcagcgggta catattactt tggagatcaa

cctgagactc 60 gcgacaggcc 120 cacctactat 180 ctcactgtat 240 gagagaagct 300 tggtggttct 360 tccatcctcc 420 ggacattaat 480 catctatcgt 540 tggaacagat 600 ctgtctgaaa 660 a 711

I.a) Número identificador da seqüência:

II.a) tamanho: 333 II.b) tipo: PRT

II.c) organismo: Seqüência Artificial

SEQ ID No: 84

III) Característica:

III.a) Outras informações: Seqüência de Aminoácidos 2E7 VH VL scFv

IV) Seqüência : SEQ ID NO. : 84 Gln Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Thr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Ala Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Thr Ile Ser Ser Arg Gly Thr Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Gln Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 100 105 110 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 115 120 125 Thr Met 130 Ser Trp Val Arg Gln 135 Ala Pro Gly Gln Ala 140 Leu Glu Trp Met Gly Thr Ile Ser Ser Arg Gly Thr Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val 145 150 155 160 Lys Gly Arg Phe Thr 165 Ile Ser Arg Asp Asn 170 Ala Lys Asn Ser Leu 175 Tyr Leu Gln Met Asn 180 Ser Leu Arg Ala Glu 185 Asp Thr Ala Val Tyr 190 Tyr Cys Ala Arg Glu 195 Ala Ile Phe Thr His 200 Trp Gly Arg Gly Thr 205 Leu Val Thr Val Ser 210 Ser Gly Gly Gly Gly 215 Ser Gly Gly Gly Gly 220 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser 225 230 235 240 Val Gly Asp Arg Val 245 Thr Ile Thr Cys Lys 250 Ala Ser Gln Asp Ile 255 Asn Asn Tyr Gly Ser 260 Trp Tyr Gln Gln Lys 265 Pro Gly Gln Ala Pro 270 Arg Leu Leu Ile Tyr 275 Arg Ala Asn Arg Leu 280 Val Asp Gly Val Pro 285 Asp Arg Phe Ser Gly 290 Ser Gly Tyr Gly Thr 295 Asp Phe Thr Leu Thr 300 Ile Asn Asn Ile Glu Ser Glu Asp Ala Ala Tyr Tyr Phe Cys Leu Lys Tyr Asn Arg Phe 305 310 315 320 Pro Tyr Thr Phe Gly 325 Gln Gly Thr Lys Val 330 Glu Ile Lys

I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 85 II.a) tamanho: 5 II.b) tipo: PRT

II.c) organismo: Seqüência Artificial

III) Característica:

III.a) Outras informações: Seqüência de Aminoácidos 2E7 VH VL scFv CDRl (VH)

IV) Seqüência: SEQ ID NO. 85 Ser Tyr Thr Met Ser 1 5

I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 86 II.a) tamanho: 17

II.b) tipo: PRT

II.c) organismo: Seqüência Artificial

III) Característica:

III.a) Outras informações: Seqüência de Aminoácidos 2E7 VH VL scFv CDR2 (VH)

IV) Seqüência: SEQ ID NO. 86

Thr Ile Ser Ser Arg Gly Thr Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys 1 5 10 15

Gly I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 87 II. a) tamanho: 6 II.b) tipo: PRT II.c) organismo: Seqüência Artificial

III) Característica:

III.a) Outras informações: Seqüência de Aminoácidos 2E7 VH VL scFv CDR3 (VH)

IV) Seqüência: SEQ ID NO. 87 Glu Ala Ile Phe Thr His

1 5

I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 88

II.a) tamanho: 11 II.b) tipo: PRT II.c) organismo: Seqüência Artificial

III) Característica:

III.a) Outras informações: Seqüência de Aminoácidos 2E7 VH VL scFv CDRl (VL)

IV) Seqüência: SEQ ID NO. 88

Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Asn Tyr Gly Ser 15 10

I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 89

II.a) tamanho: 7

II.b) tipo: PRT

II.c) organismo: Seqüência Artificial

III) Característica:

III.a) Outras informações: Seqüência de Aminoácidos 2E7 VH VL scFv CDR2 (VL)

IV) Seqüência: SEQ ID NO. 89 Arg Ala Asn Arg Leu Val Asp

1 5

I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 90

II.a) tamanho: 9 II.b) tipo: PRT II.c) organismo: Seqüência Artificial

III) Característica:

III.a) Outras informações: Seqüência de Aminoácidos 2E7 VH VL sCFv CDR3 (VL) IV) Seqüência: SEQ ID NO. 90 Leu Lys Tyr Asn Arg Phe Pro Tyr Thr 1 5

I.a) Número identificador da seqüência:

II.a) tamanho: 711Il.b) tipo: DNA

II.c) organismo: Seqüência Artificial

SEQ ID No: 91

III) Característica:

III.a) Outras informações: Seqüência de Nucleotideos 12E2 VH VL scFv

IV) Seqüência: SEQ

caggtgcagc tgttggagtc

tcctgtgcag cctctggatt

cctggacaag cgcttgagtg

ccagacagtg tgaagggccg

ctgcaaatga acagcctgag

atctttactt actggggccg

ggcggcggcg gctccggtgg

ctgtctgcat ctgtaggaga

aactatttaa gctggtacca

gcaaacagat tgttcgatgg

tttaccctca caattaataa

tatgatcggt ttccgtacac

ID NO. 91

tgggggaggc cacctttagc gatgggaacc attcaccatc agccgaggac tggcaccctg tggtggttct cagagtcacc gcagaaacct ggtcccagac catagaatct gttcggccaa

ttggtacagc agctatacca attagtagtc tccagagaca acggctgtgt gtcaccgtct gacatccagt atcacttgca ggccaggctc aggttcagtg gaggatgctg gggaccaagg

ctggggggtc tgtcttgggt gtggtactta acgccaagaa attactgtgc cctcaggtgg tgacccagtc aggcgagtca ccaggctcct gcagcgggta catattactt tggagatcaa

cctgagactc gcgacaggcc cacctactat ctcactgtat gagagaagct tggtggttct tccatcctcc ggacattaat catctatcgt tggaacagat ctgtctgaaa a

I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 92

II. a) tamanho: 237 II.b) tipo: PRT

II.c) organismo: Seqüência Artificial

60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 711

35 III) Característica:

III. a) Outras informações: Seqüência de Aminoácidos 12E2 VH VL scFv

IV) Seqüência : SEQ ID NO. 92 Gln Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Thr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Ala Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Thr Ile Ser Ser Arg Gly Thr Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Ala Ile Phe Thr Tyr Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 115 120 125 Gly Ser Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser 130 135 140

Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn 145 150 155 160 Asn Tyr Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu 165 170 175 Leu Ile Tyr Arg Ala Asn Arg Leu Phe Asp Gly Val Pro Asp Arg Phe 180 185 190 Ser Gly Ser Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Asn Ile 195 200 205 Glu Ser Glu Asp Ala Ala Tyr Tyr Phe Cys Leu Lys Tyr Asp Arg Phe 210 215 220 Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 225 230 235

I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 93

II.a) tamanho: 5 II.b) tipo: PRT

II.c) organismo: Seqüência Artificial

III) Característica:

III.a) Outras informações: Seqüência de Aminoácidos 12E2 VH VL scFv CDRl (VH)

IV) Seqüência: SEQ ID NO. 93

Ser Tyr Thr Met Ser 1 5

I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 94 II.a) tamanho: 17 II.b) tipo: PRT

II.c) organismo: Seqüência Artificial

III) Característica:

III.a) Outras informações: Seqüência de Aminoácidos 12E2 VH VL scFv CDR2 (VH)

IV) Seqüência: SEQ ID NO. 94

Thr Ile Ser Ser Arg Gly Thr Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys 15 10 15

Gly

I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 95

II.a) tamanho: 6 II.b) tipo: PRT

II.c) organismo: Seqüência Artificial

III) Característica:

III.a) Outras informações: Seqüência de Aminoácidos 12E2 VH VL scFv CDR3 (VH) IV) Seqüência: SEQ ID NO. 95

Glu Ala Ile Phe Thr Tyr 1 5

I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 96

II.a) tamanho: 11 II.b) tipo: PRT II.c) organismo: Seqüência Artificial

III) Característica:

III.a) Outras informações: Seqüência de Aminoácidos 12E2 VH VL scFv CDRl (VL)

IV) Seqüência: SEQ ID NO. 96

Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Asn Tyr Leu Ser 15 10

I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 97 II.a) tamanho: 7 II.b) tipo: PRT

II.c) organismo: Seqüência Artificial

III) Característica:

III.a) Outras informações: Seqüência de Aminoácidos 12E2 VH VL scFv CDR2 (VL)

IV) Seqüência: SEQ ID NO. 97

Arg Ala Asn Arg Leu Phe Asp

1 5

I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 98

II.a) tamanho: 9

II.b) tipo: PRT

II.c) organismo: Seqüência Artificial

III) Característica:

III.a) Outras informações: Seqüência de Aminoácidos 12E2 VH VL scFv CDR3 (VL)

IV) Seqüência: SEQ ID NO. 98

Leu Lys Tyr Asp Arg Phe Pro Tyr Thr 45 1 5

I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 99

II.a) tamanho: 33

II.b) tipo: DNA

II.c) organismo: Seqüência Artificial

III) Característica: III.a) Outras informações: Primer Combinatório Ll usado na otimizaçao de afinidade de Fab 2G6

IV) Seqüência: SEQ ID NO. 99

ccagtgtagg ttgttgctaa tactttggct ggc 33

I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 100

II.a) tamanho: 33

II.b) tipo: DNA

II.c) organismo: Seqüência Artificial

III) Característica:

III.a) Outras informações: Primer Combinatório L2 usado na otimizaçao de afinidade de Fab 2G6

IV) Seqüência: SEQ ID NO. 100 ccagtgtagg ttgttgtdaa tactttggct ggc 33

I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 101

II.a) tamanho: 42

II.b) tipo: DNA

II.c) organismo: Seqüência Artificial

III) Característica:

III.a) Outras informações: Primer Combinatório L3 usado na otimizaçao de afinidade de Fab 2G6

IV) Seqüência: SEQ ID NO. 101

gggaccccag agatgdactg gaagvcatac ttgatcagga gc 42

I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 102 II.a) tamanho: 42 II.b) tipo: DNA II.c) organismo: Seqüência Artificial

III) Característica:

III. a) Outras informações: Primer Combinatório L4 usado na otimizaçao de afinidade de Fab 2G6

IV) Seqüência: SEQ ID NO. 102

gggaccccag agatgdactg gaagstatac ttgatcagga gc 42

I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 103 II. a) tamanho: 35 II. b) tipo: DNA II. c) organismo: Seqüência Artificial

III) Característica: III.a) Outras informações: Primer Combinatório L5 usado na otimizaçao de afinidade de Fab 2G6

IV) Seqüência: SEQ ID NO. 103 gagcggccag ctgttggmct gttgacagta atatg 35

I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 104

II.a) tamanho: 4 6 II.b) tipo: DNA

II.c) organismo: Seqüência Artificial

III) Característica:

III.a) Outras informações: Primer Combinatório H6 usado na otimizaçao de afinidade de Fab 2G6

IV) Seqüência: SEQ ID NO. 104

gcctgtcgca cccasttcat ggagtaatcg gwaaaggtga atccag 46

I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 105 II.a) tamanho: 4 6 II.b) tipo: PRT

II.c) organismo: Seqüência Artificial

III) Característica:

III.a) Outras informações: Primer Combinatório H7 usado na otimizaçao de afinidade de Fab 2G6

IV) Seqüência: SEQ ID NO. 105 Gly Cys Cys Thr Gly Thr Cys Gly Cys Ala Cys Cys Cys Ala Gly Gly 15 10 15

Trp Cys Ala Thr Gly Gly Ala Gly Thr Ala Ala Thr Cys Gly Gly Trp

20 25 30

Ala Ala Ala Gly Gly Thr Gly Ala Ala Thr Cys Cys Ala Gly 35 40 45

I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 106

II.a) tamanho: 4 6 II.b) tipo: DNA

II.c) organismo: Seqüência Artificial

III) Característica:

III.a) Outras informações: Primer Combinatório H8 usado na otimizaçao de afinidade de Fab 2G6

IV) Seqüência: SEQ ID NO. 106

gcctgtcgca cccasttcat ggagtaatcg tcaaaggtga atccag 4 6

I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 107 II.a) tamanho: 4 6 Il.b) tipo: DNA

II.c) organismo: Seqüência Artificial

III) Característica:

III.a) Outras informações: Primer Combinatório H9 usado na otimizaçao de afinidade de Fab 2G6 IV) Seqüência: SEQ ID NO. 107 gcctgtcgca cccaggwcat ggagtaatcg tcaaaggtga atccag 46

I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 108

II.a) tamanho: 4 9

II.b) tipo: PRT

II.c) organismo: Seqüência Artificial

III) Característica:

III.a) Outras informações: Primer Combinatório HlO usado na otimizaçao de afinidade de Fab 2G6

IV) Seqüência: SEQ ID NO. 108

Gly Ala Thr Gly Cys Ala Cys Thr Gly Thr Ala Cys Thr Cys Thr Gly 1 5 10 15

Thr Thr Gly Thr Gly Thr Ala Gly Lys Cys Ala Thr Thr Ala Gly Cys

20 25 30

Thr Thr Thr Gly Thr Thr Thr Cys Thr Ala Ala Thr Ala Ala Ala Thr 35 40 45

Cys

I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 109

II.a) tamanho: 49

II.b) tipo: DNA

II.c) organismo: Seqüência Artificial

III) Característica:

III.a) Outras informações: Primer Combinatório H11 usado na otimizaçao de afinidade de Fab 2G6

IV) Seqüência: SEQ ID NO. 109 gatgcactgt actctgttgt gtaggaatta gctttgtttc taataaatc 49

I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 110

II.a) tamanho: 4 5

II.b) tipo: DNA

II.c) organismo: Seqüência Artificial

III) Característica:

III.a) Outras informações: Primer Combinatório H6 usado na otimizaçao de afinidade de Fab 2G6

IV) Seqüência: SEQ ID NO. 110

gttccttggc cccaggagtc catagcatga trcctagggt atctc 45

I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 111

II.a) tamanho: 45

II.b) tipo: DNA

II.c) organismo: Seqüência Artificial

III) Característica: III. a) Outras informações: Primer Combinatório H13 usado na otimizaçao de afinidade de Fab 2G6

IV) Seqüência: SEQ ID NO. 111 gttccttggc cccacaggtc catagcatga trcctagggt atctc 45

I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 112

II.a) tamanho: 120

II.b) tipo: PRT

II.c) organismo: Seqüência Artificial

III) Característica:

III.a) Outras informações: Seqüência de Aminoácidos de Cadeia Pesada Variável 2G6 humanizada

IV) Seqüência: SEQ ID NO. 112 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Arg Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu 20 Ser Cys Ala Ala Ser 25 Gly Phe Thr Val Ser 30 Asp Tyr Ser Met Asn 35 Trp Val Arg Gln Ala 40 Pro Gly Lys Gly Leu 45 Glu Trp Ile Gly Phe 50 Ile Arg Asn Lys Ala 55 Asn Asp Tyr Thr Thr 60 Glu Tyr Ser Ala Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met 85 Asn Ser Leu Lys Thr 90 Glu Asp Thr Ala Val 95 Tyr Tyr Cys Thr Thr 100 Tyr Pro Arg Tyr His 105 Ala Met Asp Ser Trp 110 Gly Gln Gly Thr Met 115 Val Thr Val Ser Ser 120

I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 113

II.a) tamanho: 5

II.b) tipo: PRT

II.c) organismo: Seqüência Artificial

III) Característica:

III.a) Outras informações: Seqüência de Aminoácidos CDRl de Cadeia Pesada Variável 2G6 Humanizada

IV) Seqüência: SEQ ID NO. 113

Asp Tyr Ser Met Asn 1 5

I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 114

II.a) tamanho: 19

II.b) tipo: PRT

II.c) organismo: Seqüência Artificial

III) Característica: III.a) Outras informações: Seqüência de Aminoácidos CDR2 de Cadeia Pesada Variável 2G6 humanizada

IV) Seqüência: SEQ ID NO. 114 Phe Ile Arg Asn Lys Ala Asn Asp Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser Ala Ser 15 10 15 Val Lys Gly

I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 115 II.a) tamanho: 9 II.b) tipo: PRT II.c) organismo: Seqüência Artificial

III) Característica: III.a) Outras informações: Seqüência de Aminoácidos CDR3 de Cadeia Pesada Variável 2G6 Humanizada

IV) Seqüência: SEQ ID NO. 115

Tyr Pro Arg Tyr His Ala Met Asp Ser 1 5

I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 116 II.a) tamanho: 106 II.b) tipo: PRT

II.c) organismo: Seqüência Artificial

III) Característica:

III.a) Outras informações: Seqüência de Aminoácidos de Cadeia Leve Variável 2G6 Humanizada

IV) Seqüência: SEQ ID NO. 116

Ile 1 Gln Leu Thr Gln 5 Ser Pro Ser Ser Leu 10 Ser Ala Ser Val Gly 15 Asp Arg Val Thr Ile 20 Thr Cys Arg Ala Ser 25 Gln Ser Ile Ser Asn 30 Asn Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr 35 40 45 Tyr Val 50 Phe Gln Ser Ile Ser 55 Gly Val Pro Ser Arg 60 Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu 65 70 75 80 Asp Phe Ala Thr Tyr 85 Tyr Cys Gln Gln Ser 90 Asn Ser Trp Pro Leu 95 Thr Phe Gly Gly Gly 100 Thr Lys Leu Glu Ile 105 Lys

I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 117

II.a) tamanho: 11 II.b) tipo: PRT

II.c) organismo: Seqüência Artificial III) Característica:

III.a) Outras informações: Seqüência de Aminoácidos CDRl de Cadeia Leve Variável 2G6 Humanizada

IV) Seqüência: SEQ ID NO. 117

Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Asn Leu His 1 5 10

I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 118

II.a) tamanho: 7

II.b) tipo: PRT

II.c) organismo: Seqüência Artificial

III) Característica:

III.a) Outras informações: Seqüência de Aminoácidos CDR2 de Cadeia Leve Variável 2G6 Humanizada

IV) Seqüência: SEQ ID NO. 118 Tyr Val Phe Gln Ser Ile Ser 1 5

I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 119 II.a) tamanho: 9 II.b) tipo: PRT

II.c) organismo: Seqüência Artificial

III) Característica:

III.a) Outras informações: Seqüência de Aminoácidos CDR3 de Cadeia Leve Variável 2G6 Humanizada

IV) Seqüência: SEQ ID NO. 119 Gln Gln Ser Asn Ser Trp Pro Leu Thr 1 5

I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 120

II.a) tamanho: 4 3

II.b) tipo: DNA

II.c) organismo: Seqüência Artificial

III) Característica:

III.a) Outras informações: primer Medi-VH8 5' usado para amplificar VH

IV) Seqüência: SEQ ID NO. 120

ttctatgcgg cccagccggc ccaggtgcag ctgttgsagt ctg 43

50

I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 121

II.a) tamanho: 54

II.b) tipo: DNA II.c) organismo: Seqüência Artificial

III) Característica:

III.a) Outras informações: primer Medi-JHl 3' usado para amplificar VH

IV) Seqüência: SEQ ID NO. 121 ggagccgccg ccgccagaac caccaccacc tgaggagacg gtgaccaggg tgcc 54

I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 122

II.a) tamanho: 53

II.b) tipo: DNA

II.c) organismo: Seqüência Artificial

III) Característica:

III.a) Outras informações: primer Medi-VKl 5' usado para VL

IV) Seqüência: SEQ ID NO. 122 ggcggcggcg gctccggtgg tggtggttct gacatccagw tgacccagtc tcc 53

I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 123

II.a) tamanho: 45

II.b) tipo: DNA

II.c) organismo: Seqüência Artificial

III) Característica:

III.a) Outras informações: primer Medi-JK4 3' usado para VL

IV) Seqüência: SEQ ID NO. 123 tggaattcgg cccccgaggc cacgtttgat ctccaccttg gtccc 45

Claims (33)

1. Anticorpo de cadeia simples biespecifico, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) primeiro domínio variável de cadeia pesada (domínio VH) e primeiro domínio variável de cadeia leve (domínio VL) , cada qual de um anticorpo que liga-se imunoespecificamente com o CD3, o referido primeiro domínio VH liga-se covalentemente com o referido primeiro domínio VL, por meio de um primeiro ligante de comprimento suficiente, de modo que o referido primeiro domínio VH e o referido primeiro domínio VL dobram-se para formar um primeiro domínio de ligação que liga-se com o CD3; e (b) segundo domínio VH e segundo domínio VL, de um anticorpo que liga-se imunoespecificamente com o EphA2 exposto na superfície da célula, o referido segundo domínio VH liga-se covalentemente com o referido segundo domínio VL, por meio de um segundo ligante de comprimento suficiente, de modo que o referido segundo domínio VH e o referido segundo domínio VL dobram-se para formar um segundo domínio de ligação que liga-se com o referido epítopo de EphA2; em que o referido primeiro domínio de ligação e o referido segundo domínio de ligação encontram-se covalentemente ligados por um terceiro ligante de comprimento tal que o referido primeiro domínio de ligação e o referido segundo domínio de ligação dobram-se independentemente um do outro.

2. Anticorpo de cadeia simples biespecífico de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o primeiro domínio de ligação, o qual liga-se imunoespecif icamente com o CD3, liga-se com a subunidade épsilon (ε) do CD3.

3. Anticorpo de cadeia simples biespecífico de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o primeiro domínio de ligação, específico para a subunidade ε do CD3, encontra-se localizado na parte N-terminal relacionada com o segundo domínio de ligação.

4. Anticorpo de cadeia simples biespecífico de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o primeiro domínio de ligação, específico para a subunidade ε do CD3, encontra-se localizado na parte C-terminal relacionada com o segundo domínio de ligação.

5. Anticorpo de cadeia simples biespecífico de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o primeiro domínio de ligação e o segundo domínio de ligação encontram-se dispostos na ordem VHCD3-VLcD3-VHEphA2-VLEphA2.

6. Anticorpo de cadeia simples biespecifico de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o primeiro domínio de ligação, o qual liga-se imunoespecificamente com a subunidade ε do CD3, é desimunizado.

7. Anticorpo de cadeia simples biespecifico de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que os domínios VH e/ou VL do segundo domínio de ligação são os domínios VH e/ou VL de EA2, EA3, EA4, EA5, 3F2, 4H5, 2A4, 2E7, 12E2, EphO99B-102.147, Eph099B-208.261, Eph099B- 210.248, Eph099B-233.152, EphlOl.530.241, 233 ou G5 .

8. Anticorpo de cadeia simples biespecifico de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o comprimento de seqüência dos primeiro, segundo e terceiro ligantes compreende pelo menos 5 resíduos, pelo menos 10 resíduos, pelo menos 15 resíduos, pelo menos 20 resíduos, pelo menos 25 resíduos ou pelo menos 30 resíduos.

9. Anticorpo de cadeia simples biespecifico de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o referido primeiro ligante, entre o primeiro domínio variável de cadeia pesada e o primeiro domínio variável de cadeia leve do referido primeiro domínio de ligação que liga-se com a subunidade ε do CD3, compreende a seqüência SEQ ID NO: 57.

10. Anticorpo de cadeia simples biespecifico de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o referido segundo ligante, entre o segundo domínio variável de cadeia pesada e o segundo domínio variável de cadeia leve do referido segundo domínio de ligação que liga-se com o EphA2, compreende a seqüência SEQ ID NO: 59.

11. Anticorpo de cadeia simples biespecifico de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o terceiro ligante, entre o referido primeiro domínio de ligação e o referido segundo domínio de ligação, compreende a seqüência SEQ ID NO: 58.

12. Anticorpo de cadeia simples biespecifico de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que os domínios VH e/ou VL do primeiro domínio de ligação são do anticorpo de anti-CD3 que é humanizado.

13. Anticorpo de cadeia simples biespecifico de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que os domínios VH e/ou VL do segundo domínio de ligação são do anticorpo de EphA2 que é humanizado.

14. Anticorpo de cadeia simples biespecifico de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o referido primeiro domínio de ligação liga-se com a subunidade ε do CD3, com uma afinidade menor que o referido segundo domínio de ligação que liga-se ao EphA2.

15. Anticorpo de cadeia simples biespecifico de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que a constante de dissociação do primeiro domínio de ligação, o qual liga-se com a subunidade ε do CD3, é 4 χ 10^-77 Μ.

16. Anticorpo de cadeia simples biespecifico de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que a constante de dissociação do segundo domínio de ligação, o qual liga-se com o EphA2, é 1,13 χ 10^-7 Μ.

17. Anticorpo de cadeia simples biespecifico de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que compreende a seqüência de SEQ ID NO: 65.

18. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende o anticorpo de cadeia simples biespecifico como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 17 e um veículo farmaceuticamente aceitável.

19. Método de tratamento, prevenção ou gerenciamento de câncer, em que as células cancerígenas expressam EphA2, em indivíduos que necessitem do mesmo, caracterizado pelo fato de que compreende a administração, ao referido indivíduo, de uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo de cadeia simples biespecifico como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 17 e um veículo farmaceuticamente aceitável.

20. Método de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que o referido anticorpo de cadeia simples biespecifico liga-se com o EphA2 quando expresso na célula, sem o contato de célula com célula.

21. Método de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que o referido câncer é câncer metastático.

22. Método de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que compreende a administração de uma terapia adicional anti-câncer, que não a de anticorpo de cadeia simples biespecifico.

23. Método de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que a terapia adicional anti-câncer é selecionada do grupo consistindo de quimioterapia, terapia biológica, imunoterapia, radioterapia, terapia hormonal e cirurgia.

24. Método de tratamento, prevenção ou gerenciamento de infecções em indivíduos que necessitem do mesmo, caracterizado pelo fato de que compreende a administração, ao referido indivíduo, de uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo de cadeia simples biespecifico como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 17 e um veículo farmaceuticamente aceitável.

25. Método de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de que a referida infecção é infecção por patógeno intracelular.

26. Método de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de que a referida infecção é infecção por virus sincicial respiratório (RSV).

27. Método de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de que compreende a administração de terapia adicional.

28. Método de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que a referida terapia adicional é terapia anti-viral, terapia anti-fúngica, terapia anti-bacteriana ou terapia anti-protozoário.

29. Método de tratamento, prevenção ou gerenciamento de desordens de células hiperproliferativas não-cancerigenas em indivíduos que necessitem do mesmo, caracterizado pelo fato de que compreende a administração, ao referido indivíduo, de uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo de cadeia simples biespecífico como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 17 e um veículo farmaceuticamente aceitável.

30. Método de acordo com a reivindicação 29, caracterizado pelo fato de que as referidas desordens de células hiperproliferativas não-cancerigenas são asma, COPD, fibrose pulmonar, asbestose, EPF, DIP, UIP, fibrose renal, fibrose do fígado, outras fibroses, hiper-responsividade brônquica, psoriase, dermatite seborréica, fibrose cistica, ou desordens de células endoteliais hiperproliferativas, tais como restenose, doença vascular hiperproliferativa, Sindrome de Behcet's, aterosclerose, degeneração macular, ou desordens de fibroblastos hiperproliferativas.

31. Método de acordo com a reivindicação 29, caracterizado pelo fato de que compreende a administração de terapia adicional.

32. Método de acordo com a reivindicação 31, caracterizado pelo fato de que a referida terapia adicional é terapia anti-viral ou de agente imunomodulatório.

33. Método de acordo com a reivindicação 19, 24 ou 29, caracterizado pelo fato de que o referido indivíduo é um ser humano.