BRPI0620697A2 - anticorpos isolados, molécula de ácido nucléico, vetor, célula hopedeira, linhagem celular, método para a produção de um anticorpo, composição, métodos para identificar a presença de poliubiquitina, para tratar uma doença, para determinar a presença de uma poliubiquitina, para separar as proteìnas poliubiquitinadas, para determinar a função e/ou atividade da poliubiquitina em uma célula e para determinar a função e/ou atividade da poliubiquitina em uma amostra e fragmento de ligação ao antìgeno - Google Patents

Abstract

ANTICORPOS ISOLADOS, MOLéCULA DE áCIDO NUCLéICO, VETOR, CéLULA HOPEDEIRA, LINHAGEM CELULAR, MéTODO PARA A PRODUçãO DE UM ANTICORPO, COMPOSIçãO, MéTODOS PARA IDENTIFICAR A PRESENçA DE POLIUBIQUITINA, PARA TRATAR UMA DOENçA, PARA DETERMINAR A PRESENçA DE UMA POLIUBIQUITINA, PARA SEPARAR AS PROTEìNAS POLIUBIQUITINADAS, PARA DETERMINAR A FUNçãO E/OU ATIVIDADE DA POLIUBIQUITINA EM UMA CéLULA E PARA DETERMINAR A FUNçãO EIOU ATIVIDADE DA POLIUBIQUITINA EM UMA AMOSTRA E FRAGMENTO DE LIGAçãO AO ANTìGENO. A presente invenção refere-se a anticorpos monoclonais anti-poliubiquitina, e os métodos para a utilização dos anticorpos.

Description

"ANTICORPOS ISOLADOS, MOLÉCULA DE ÁCIDO NUCLÉICO, VETOR, CÉLULA HOPEDEIRA, LINHAGEM CELULAR, MÉTODO PARA A PRODUÇÃO DE UM ANTICORPO, COMPOSIÇÃO, MÉTODOS PARA IDENTIFICARA PRESENÇA DE POLIUBIQUITINA, PARA TRATAR UMA DOENÇA, PARA DETERMINAR A PRESENÇA DE UMA POLIUBIQUITINA, PARA SEPARAR AS PROTEÍNAS POLIUBIQUITINADAS, PARA DETERMINAR A FUNÇÃO E/OU ATIVIDADE DA POLIUBIQUITINA EM UMA CÉLULA E PARA DETERMINAR A FUNÇÃO E/OU ATIVIDADE DA POLIUBIQUITINA EM UMA AMOSTRA E FRAGMENTO DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO"

Campo da Invenção

A presente invenção relaciona-se ao campo de anticorpos anti- poliubiquitina, e mais especificamente aos anticorpos anti-poliubiquitina que não se ligam especificamente à monoubiquitina e capaz de discriminar as poliubiquitina com diferentes ligações isopeptídicas.

Antecedentes da Invenção

A ubiquitina é uma pequena proteína que tem um papel importante na regulação de grande variedade de vias de sinalização celulares. A mais conhecida destas é o papel da proteína ubiquitina na degradação, onde a ligação covalente da ubiquitina a uma proteína alvo permite que a proteína alvo seja reconhecida e destruída pelo proteassoma 26S (vide Wilkinson, Semin. Cell Desen. Biol. 11 (3):141-148 (2000)). A regulação da proteína quinase de diversas vias de sinalização tem sido também correlacionada com a ubiquitinização (vide, Sun e Chen1 Curr. Opin. Cell Biol. 16:119-126 (2004)). Por exemplo, a fosforilação da IkB em quinase de I^B permite ubiquitinização da IkB e sua posterior degradação pelo proteassoma 26S; pelo fato de IkB ser um inibidor do NF-κΒ, a degradação do IkB ativa o NF-κΒ (Ghosh e Karin1 Cell 109 (Suppl.): S81-S96 (2002); Palombella et ai, Qell 78: 773-785 (1994)). A ubiquitinização também medeia à reparação do DNA (vide Sun e Chen1 Curr. Opin. Cell Biol. 16:119-126 (2004)). Após o DNA estar danificado, a monoubiquitinização do antígeno nuclear de proliferação celular (PCNA) ativa a polimerase tolerante aos danos que são capazes de sintetizar DNA apesar de lesões no DNA (Stelter e Ulrich, Nature 425: 188-191 (2003). Outros processos fisiológicos na qual a ubiquitinização é conhecida por estar envolvida incluem a divisão celular, o crescimento celular, a movimentação celular, e a apoptose/morte celular (Johnson, Nat Cell Biol. 4: E295-E298 (2002); Pickart, Mol. Cell. 8 : 499-504 (2001)).

A ligação covalente da ubiquitina, uma proteína de 76 aminoácidos, a uma proteína alvo é um processo enzimático três etapas (Pickart, Annu. Rev. Biochem. 70: 503-533 (2001)). Primeiro, a enzima ativadora de ubiquitina E1 forma um tioéster ubiquitina-E1 em uma reação dependente de ATP. A ubiquitina é transferida di tioéster ubiquitina-E1 a um membro da família da enzima conjugadora de ubiquitina (E2) na segunda etapa. Na terceira etapa, com o apoio de uma proteína ubiquitina-ligase (E3), uma ligação isopeptídicas é formada entre o terminal carboxilo da ubiquitina e o grupo ε-amino de um resíduo de Iisina na proteína alvo. Enzimas denominadas deubiquitinases removem as moléculas de ubiquitina das proteínas alvo (Guterman e Glickman, Curr. Prot. Pep. Sei. 5: 201-210 (2004)). Destacando o papel da ubiquitina como uma importante molécula reguladora, o genoma humano contém várias proteínas envolvidas na ubiquitinização ou deubiquitinização: pelo menos 40 E2s diferentes, 500 E3s diferentes, e 80 deubiquitinases diferentes foram identificados até agora (Wong et al. Drug. Discov. Today 8:746-754 (2003)).

A ubiquitina contém sete resíduos de Iisina (Lys6, Lys22, Lys27, Lys33, Lys29, Lys48, e Lys63), e, portanto, a própria ubiquitina pode servir como uma proteína alvo para ubiquitinização (Peng et al., Λ/aí. BiotechnoL 21: 921-926 ( 2003); Pickart e Fushman, Curr. Opin. Chem. Biol. 8:610-616 (2004)). A molécula produzida mediante a ubiquitinização de uma proteína ubiquitina é denominada de molécula de poliubiquitina, e pode incluir duas ou mais moléculas de ubiquitina. A ubiquitinização da ubiquitina pode teoricamente ocorrer em qualquer um dos sete resíduos de lisina (Peng et al., Nat. Biotechnol 21: 921-926 (2003)), a fim de que existem diferentes espécies de poliubiquitina tendo diferentes ligação isopeptídica a diferentes resíduos lisina na ubiquitina. É possível que uma única molécula poliubiquitina com mais de duas moléculas de ubiquitina pode ter mais de um tipo de ligação à lisina. Estudos têm demonstrado que a enzima E2 influencia o tipo de ligação de lisina criada entre uma e outra molécula ubiquitina (Tenno et al., Genes to Cells 9: 865-875 (2004); Deng et al. (2000); Hofmann e Pickart (2001)). A poliubiquitina e a ubiquitina existem tanto como moléculas livres como com moléculas com ligações covalentes a uma proteína alvo.

Tal como a ubiquitina, o envolvimento da poliubiquitina tem sido encontrado em muitos processos celulares, incluindo o tráfico intracelular, a endocitose, a expressão /silenciamento gênico, a proteólise, a ativação da quinase, e a tradução e reparo do DNA (Hoege et al., Nature 419:135-141 (2002); Spence et al., Mol. Cell. Biol. 15:1265-1273 (1995); Hofmann e Pickart, Cell 96: 645-653 (1999)). A poliubiquitina e a poliubiquitinização podem ter funções fisiológicas contundentemente diferentes do que a monoubiquitina e monoubiquitinização na mesma via de sinalização. Por exemplo, considerando que monoubiquitinização do PCNA após danificar o DNA resulta na ativação da DNA polimerase sujeita a erro, a poliubiquitinização do PCNA no resíduo idêntico ao observado na monoubiquitinização resulta na ativação da reparação de DNA livre de erros (Stelter e Ulrich, Nature 425: 188-191 (2003); Hoege et al., Nature 419:135-141 (2002); Spence et al., Mol Cell. Biol. 15:1265-1273 (1995); e Hofmann e Pickart, Cell 96: 645-653 (1999)).

Mesmo as poliubiquitinas tendo diferentes ligações de lisina parecem desempenhar diversas funções fisiológicas. As duas poliubiquitinas mais estudadas são as poliubiquitinas ligadas a Lys48 e ligadas a Lys63, e estudos estruturais das duas sugere que as diferentes poliubiquitinas ligada a lisina podem adotar conformações evidentemente diferentes, permitindo assim diversas interações com parceiros de ligação selecionados (Tenno et ai, Genes to Cells 9:865-875 (2004)). A modificação covalente da poliubiquitina- Lys48 normalmente ligada à proteína alvo marca a degradação proteolítica, embora haja indícios de que a poliubiquitina ligada a Lys48 pode também regular algumas proteínas por uma maneira não-proteolítica (Chau et ai, Science 243: 1576-1583 (1989 ); Finley et ai, Moi Celi Biol. 14: 5501-5509

(1994); Flick et ai, Nat. Celi Biol. 6:634-641 (2004)). A poliubiquitina ligada a Lys63, em contrapartida, tem sido associada a uma variedade de vias de sinalização intracelular não proteolítica, incluindo a reparação do DNA (células de levedura manifestando a ubiquitina K63R são deficientes no reparo de DNA), ativação da quinase, a tradução e o tráfico intracelular (Pickart e Fushman, Curr. Opin. Chem. Biol. 8: 610-616 (2004); Hicke e Dunn, Annu Rev. Cell Dev. Biol. 19: 141-172 (2003); Spece et al., Moi CeIIBioi 15: 1265 -1,273

(1995); Ulrich, Eukaryot. Cell 1: 1-10 (2002); Spence et al., Cell 102: 67-76 (2000); Seibenhener et al., Mol. Cell. Biol. 24 (18) : 8055-8068 (2004)). Em um exemplo específico, a sinfilina-1 é normalmente associada com a poliubiquitina ligada a K63 por Parkin, em uma maneira independente do proteassoma, mas a sinfilina-1 alternativamente pode ser orientada para a destruição pela ubiquitinização da poliubiquitina ligada a K48 (Lim et ai, J. Neurosci. 25 (8): 2002-9 (2005)). Uma análise de pacientes com a doença de Parkinson mostra que a poliubiquitinização K63 da sinfilina-1 pode estar envolvida na formação de inclusões do tipo corpo Lewy associada a essa doença (Lim et ai, J. Neurosci. 25 (8): 2002-9 (2005)).

Outras poliubiquitinas ligadas a Iisina não foram estudadas extensivamente, em grande parte, devido à dificuldade de se fazer a distinção entre elas. Estudos têm, até agora, se baseado em células mutagenizadas expressando ubiquitinas no qual uma ou mais Iisinas tenham sido removidas, em poliubiquitinas sintetizadas enzimaticamente de ligações específicas, ou por técnicas, tais como, a espectrometria de massa para distinguir entre um tipo de poliubiquitina. Cada uma dessas metodologias é imprópria ou de difícil manejo para a análise do comportamento fisiológico normal de poliubiquitinas especialmente ligadas à lisina. Embora existam anticorpos que são específicos para a poliubiquitina em oposição à monoubiquitina (Fujimoro et ai, FEBS Lett. 349: 173-180 (1994)), não existem até agora anticorpos que possam distinguir entre as poliubiquitinas de diferentes ligações de lisina.

Como seria de se esperar, dado o seu importante papel em uma variedade de processos celulares, a ubiquitina e a poliubiquitina também têm sido implicadas em muitas doenças vide (Argiles, Ubiquitin and Disease, R. G.

Landes (1998)). A não regulação da ubiquitina é observada no desperdício muscular (Mitch e Goldberg, New EngL J. Med. 335: 1897-905 (1996); Bodine et ai., Science 294: 1704-1708 (2001)). Diversas doenças genéticas têm sido relacionadas com a atividade aberrante da ubiquitina, incluindo a fibrose cística (Ward et ai, Celi 83:121-127 (1995)), síndrome de Angelman (Kishino et ai,

Nature Genet. 15:70-73 ( 1997)), e síndrome de Liddle (Staub et ai, EMBO J. 16:6325-6336 (1997)). A ubiquitina desempenha também um papel nas respostas imunes e inflamatórias, como por exemplo, a ubiquitina extracelular tem sido encontrada por agir como uma espécie de citocina, inibindo o TNF-a em resposta à endotoxina em células mononucleares do sangue periférico e regulando a hiporeação causada pela endotoxina (Majetschak et aí., Biood 101 : 1882-1890 (2003); Ciechanover, EMBO J 17: 7151-7160 (1998)). Além disso, tanto ubiquitina quanto a poliubiquitina foram encontradas no soro humano, com níveis mais elevados de ambas as moléculas observadas no soro de pacientes com doenças parasitárias e alérgicas (Takada et al Clin. Chem. 43: 1188-1195 (1997)).

A não regulação de diversas vias de sinalização mediadas pela ubiquitina também estão envolvidas no câncer (Spataro et al, Br. J. Câncer 77:448-55 (1998); Beckmann et al, Hum. Mutat. 25:507-12 (2005)) . Por exemplo, mutações na ubiquitina-ligase heterodimérica BRCA1-BARD1 estão correlacionadas com câncer de mama (Hashizume et al, J. Biol. Chem. 276: 14537-40 (2001)), mutações que perturbam a capacidade da Myc de ser degradada pelo via da ubiquitina ativa o potencial oncogênico da c-Myc (Salghetti et al., EMBO J. 18: 717-726 (1999)), e a v-Jun transformada é incapaz de ser ubiquitinada e degradada como a sua correspondente não- oncogênica, c - Jun, dando assim, origem ao crescimento descontrolado (Ciechanover, EMBO J. 17: 7151-7160 (1998); Trier et al, Cell 78: 787-798 (1994)).

A ubiquitina e a poliubiquitina têm sido estudadas particularmente no âmbito das doenças neurológicas (Chung et al., TINS 24(11 Suppl.) S7-S14 (2001)). As inclusões, corpos e emaranhados neurofibrilares que se acumulam na doença de Huntington1 ataxia espinocerebelosa, encefalopatias relacionadas com priões, doença de Pick, doença do corpo de Lewy, doença de Parkinson e doença de Alzheimer coram imuno-positivamente para mono e/ou poliubiquitina (Rodrigues Alves et al, Trends Neurosci. 21: 516-520 (1998); Cammarata et al, Neurosci Lett. 156: 96-98 (1993); Kalchman et al, J. Biol. Chem. 271: 19385 -94 (1996); Holmberg et al., Human Mol. Genet. 7: 913- 918 (1998); Yedidia et al, EMBO J. 20: 5383-91 (2001); Mori et al, Science 235: 1641-44 (1987); Leigh et al, Acta Neuropathol. (Berl.) 79: 61-72 (1989); e Kuzuhara et al., Acta Neuropathologica 75: 345-353 (1988)). Várias formas da doença de Parkinson têm sido associadas a mutações no hidrolase carboxilo- terminal do gene L1(UCH-L1) da ubiquitina, uma deubiquitinase (Leroy et al, Nature 395: 451-452 (1998)), enquanto outras formas de Parkinson têm sido associadas a mutações inativadoras em Parkin, uma Iigase proteína- ubiquitina dependente de E2 conhecido por interagir com a enzima conjugadora de ubiquitina UbcH7 e por ubiquitinar a sinfilina-1 (Shimura et ai, Nature Genet. 25: 302-305 (2000), Zhang et ai, Proc. Nati Acad. Sei. 97: 13354-13359 (2000); Lim et ai, J. Neurosci. 25 (8): 2002-9 (2005)). Ambos os tipos de mutações resultam em um tratamento proteolítico aberrante e a agregação inadequada de proteínas (vide McNaught et al., Nature Rev. Neurosci. 2: 589- 594 (2001)). As mutações de UCH-L1 também foram encontrados por segregar com a doença de Huntington (Naze et ai, Neurosci. Lett. 328: 1:1-4 (2002)). Uma forma da ubiquitina mutante tem sido identificada no cérebro dos doentes com Alzheimer que é eficientemente incorporada as cadeias de poliubiquitina, mas uma vez formada é refratária a deubiquitinização, conduzindo potencialmente a inibição dominante do sistema de processamento proteolítico celular normal (Lam et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 97: 9902-9906 (2000)).

Está claro que seria benéfico não só apenas ter composições e métodos que permitam distinguir entre as poliubiquitinas de diferentes ligações de lisina, mas também ter as composições e os métodos que são eficazes na marcação e modulação das vias mediadas pela ubiquitina e poliubiquitina. A invenção fornecida no presente relaciona-se a essas composições e métodos.

Todas as referências citadas neste documento, incluindo os pedidos de patentes e publicações, são incorporadas ao presente pela referência na sua totalidade.

Descrição da Invenção

A invenção fornece novos anticorpos capazes de ligar a e/ou regular a atividade biológica associada à poliubiquitina.

Em um exemplo de realização, um anticorpo isolado que se liga especificamente a poliubiquitina é fornecido, no qual os anticorpos não se ligam especificamente a monoubiquitina. Em um exemplo de realização, é fornecido um anticorpo específico que liga especificamente a uma primeira poliubiquitina compreendendo uma primeira ligação de lisina, onde os anticorpos não se ligam especificamente a uma segunda ρ oliubiquitina que compreende uma segunda ligação de lisina, e onde a primeira ligação de lisina difere da segunda ligação de lisina. Em um aspecto, o anticorpo adicionalmente se liga a poliubiquitina ligada à lisina-6, poliubiquitina ligada à lisina-11, poliubiquitina ligada à lisina-27, poliubiquitina ligada a lisina-27, poliubiquitina ligada à Iisina- 29, poliubiquitina ligada à lisina-33, poliubiquitina ligada à lisina-48 ou poliubiquitina ligada à lisina-63.

Em um exemplo de realização, é fornecido um anticorpo isolado que se liga especificamente a uma primeira poliubiquitina ligada a K48, no qual, os anticorpos não se ligam especificamente a uma segunda poliubiquitina compreendendo outra forma de poliubiquitina ligada a lisina (ou seja, que não é a poliubiquitina ligada a K48). Em um exemplo de realização, a segunda poliubiquitina está ligada a poliubiquitina-K63.

Em um exemplo de realização, é fornecido um anticorpo isolado que se liga especificamente a uma primeira poliubiquitina ligada a K63, no qual, os anticorpos não se ligam especificamente a uma segunda poliubiquitina compreendendo outra forma de poliubiquitina ligada a lisina (ou seja, que não é a poliubiquitina ligada a K63). Em um exemplo de realização, a segunda poliubiquitina está ligada à poliubiquitina-K48.

Em um exemplo de realização, é fornecido um anticorpo isolado que se liga especificamente tanto em uma primeira poliubiquitina compreendendo uma primeira ligação de lisina quanto em uma segunda poliubiquitina compreendendo uma segunda ligação de lisina, onde a primeira ligação de lisina difere da segunda ligação de lisina, no qual os anticorpos não se ligam especificamente à monoubiquitina, e no qual o anticorpo se liga a segunda poliubiquitina com uma afinidade de ligação substancialmente reduzida quando comparada com a afinidade de ligação do anticorpo para a primeira poliubiquitina.

Em um exemplo de realização, é fornecido um anticorpo isolado que se liga especificamente a poliubiquitina ligada à lisina-48, no qual os anticorpos não se ligam especificamente à monoubiquitina. Em um exemplo de realização, o anticorpo ainda inclui pelo menos uma seqüência hipervariável (HVR) selecionada a partir da seqüência HVR-H1, HVR-H2, HVR-H3 e HVR-L3 de uma das SEQ ID Nos: 1-25, 151-175, 265-279, 392-459 e 695-704; SEQ ID Nos: 27-51, 177-201, 281-295, 461-528 e 706-715; SEQ ID Nos: 53-77, 203- 227, 297-311, 530-597 e 717-726; e SEQ ID Nos: 313-327 e 728-737, respectivamente. Em um exemplo de realização, o anticorpo inclui adicionalmente de pelo menos uma seqüência selecionada de HVR-H1, HVR- H2, HVR-H3, no qual, HVR-H1 compreende a seqüência de aminoácidos abe d e f g h i j (SEQ ID No: 825), no qual, o aminoácido é glicina; o aminoácido b é fenilalanina; o aminoácido c é asparagina; o aminoácido d é um aminoácido selecionado entre valina, fenilalanina, Ieucina e isoleucina; o aminoácido e é selecionado entre serina e tirosina; o aminoácido f é tirosina; o aminoácido g é um aminoácido selecionado entre serina e tirosina; o aminoácido h é selecionado entre serina e tirosina; o aminoácido i é selecionado entre isoleucina e metionina e o aminoácido j é histidina; no qual, HVR-H2 compreende a seqüência de aminoácidos klmnopqrstuvwxyza' (SEQ ID No: 826), no qual, o aminoácido k é serina; o aminoácido I é isoleucina; o aminoácido m é selecionado entre serina e tirosina; o aminoácido η é selecionado entre prolina e serina; o aminoácido o é tirosina; o aminoácido p é tirosina; o aminoácido q é selecionado entre serina e glicina; o aminoácido r é selecionado entre serina e tirosina; o aminoácido s é treonina, o aminoácido t é selecionado entre serina e tirosina; o aminoácido u é tirosina; o aminoácido v é alanina; o aminoácido w é ácido aspártico; o aminoácido χ é serina; o aminoácido y é valina; o aminoácido ζ é lisina, o aminoácido a' é glicina; e no qual, HVR-H3 compreende a seqüência de aminoácidos b' c' d' e' f 'g' h' i' j' k' Γ, no qual o aminoácido b' é selecionada entre ácido glutâmico, serina, glicina e tirosina ; o aminoácido c' é selecionado entre glicina, tirosina, serina e asparagina; o aminoácido d' é selecionada entre tirosina, serina, lisina, fenilalanina e ácido glutâmico; o aminoácido e' é selecionado entre serina, tirosina, glicina e triptofano; o aminoácido f é selecionado entre glutamina, tirosina, serina e glicina; o aminoácido g' é selecionado entre glicina, serina, tirosina, metionina e alanina; o aminoácido h' é selecionado entre glicina, alanina, prolina e isoleucina; o aminoácido i' é selecionado entre fenilalanina, isoleucina, metionina, alanina e leucina, ou não está presente; o aminoácido j' é fenilalanina ou não está presente; o aminoácido k' é ácido aspártico e o aminoácido Γ é tirosina. Em um exemplo de realização, o anticorpo adicionalmente compreende das seqüências HVR-H1, HVR-H2 e HVR-H3 correspondentes a aquelas estabelecidas para os clones apu01, apu02, apu03, apu04, apu05, apu06, apu07, apu08, apu09, apu10, apu11, apu12, apu13, apu14 ou apu15 nas figuras 10A e 10B.

Em um exemplo de realização, o anticorpo ainda inclui pelo menos uma seqüência selecionada a partir da seqüência HVR-H1, HVR-H2, HVR-H3, no qual, HVR-H1 compreende a seqüência de aminoácidos a b c d e f g h i j (SEQ ID No: 827), no qual, o aminoácido a é glicina; o aminoácido b é fenilalanina; o aminoácido c é asparagina; o aminoácido d é isoleucina, o aminoácido e é selecionado entre serina e fenilalanina; o aminoácido f é tirosina; o aminoácido g é selecionado entre serina e glicina; o aminoácido h é selecionado a partir de serina e glicina; o aminoácido i é selecionado entre a isoleucina e metionina, e o aminoácido j é histidina; no qual, HVR-H2 compreende seqüência de aminoácidos klmnopqrstuvwxyza' (SEQ ID No: 828), no qual, o aminoácido k é serina; o aminoácido I é isoleucina; o aminoácido m é tirosina; o aminoácido η é serina; o aminoácido o é tirosina; o aminoácido ρ é tirosina; o aminoácido q é serina; o aminoácido r é tirosina; o aminoácido s é treonina, o aminoácido t é serina; o aminoácido u é tirosina; o aminoácido ν é alanina; o aminoácido w é ácido aspártico; o aminoácido χ é serina; o aminoácido y é valina; o aminoácido ζ é Iisina e o aminoácido a' é glicina; e no qual, HVR-H3 compreende seqüência de aminoácidos b 'c' d 'e' f 'g' h T j 'k' (SEQ ID No: 829), no qual, o aminoácido b' é selecionado entre serina e glicina; o aminoácido c' é tirosina; o aminoácido d' é serina; o aminoácido e' é selecionado entre tirosina e triptofano, o aminoácido f é selecionado entre serina, tirosina, arginina, fenilalanina e histidina; o aminoácido g1 é selecionado entre ácido glutâmico, serina, leucina, fenilalanina, metionina, asparagina, e valina; o aminoácido h1 é selecionado entre alanina e glicina; o aminoácido i' é selecionado entre leucina, metionina, fenilalanina e isoleucina; o aminoácido j' é ácido aspártico e o aminoácido k' é tirosina. Um exemplo de realização, o anticorpo adicionalmente compreende das seqüências HVR-H1, HVR-H2 e HVR-H3 correspondente as seqüências estabelecidas para os clones apu2.01, apu2.02, apu2.03, apu2.04, apu2.05, apu2.06, apu2.07, apu2.08, apu2.09 ou apu2.10 na figura 16A.

Em um exemplo de realização, o anticorpo ainda compreende uma seqüência HVR-L3 compreendendo da seqüência de aminoácidos m 'η' o "p* q 'r' s' t 'u' v' w' (SEQ ID No: 830), no qual, o aminoácido m' é glutamina; o aminoácido n' é glutamina; o aminoácido o' é selecionado entre serina e tirosina; o aminoácido p' é selecionado entre serina e tirosina; o aminoácido q' é selecionado entre serina e tirosina; o aminoácido r' é selecionado entre serina e tirosina; o aminoácido s' é selecionado entre serina e tirosina; o aminoácido t' selecionado entre leucina, serina, prolina e tirosina; o aminoácido u' é prolina ou não está presente; o aminoácido v' é selecionado entre fenilalanina, isoleucina, valina e leucina, e o aminoácido w' é treonina. Um exemplo de realização, o anticorpo adicionalmente compreende da seqüência HVR-L1 da SEQ ID No: 79, uma seqüência HVR-L2 da SEQ ID No: 80, e uma seqüência HVR-L3 correspondente à seqüência HVR-L3 estabelecida para clones apu01, Apu02, apu03, apu04, apu05, apu06, apu07, apu08, apu09, apu10, apu11, apu12, apu13, apu14 ou apu15 na figura 10C. Um exemplo de realização, o anticorpo adicionalmente compreende da seqüência HVR-L3 compreendendo a seqüência de aminoácidos Q-Q-S-S-Y-S-S-L-I-T (SEQ ID No: 728). Um exemplo de realização, o anticorpo adicionalmente compreende da seqüência HVR-L1 da SEQ ID No: 79, uma seqüência HVR-L2 da SEQ ID No: 80, e uma seqüência HVR-L3 correspondente à seqüência HVR-L3 estabelecida para clones apu2.01, Apu2.02, apu2.03, apu2.04, apu2.05, apu2.06, apu2.07, apu2.08, apu2.09, ou apu2.10 na Figura 16b.

Em um exemplo de realização, é fornecido um anticorpo isolado que se liga especificamente a poliubiquitina ligada à lisina-48, no qual o anticorpo não se liga especificamente à monoubiquitina e, no qual, o anticorpo compreende uma seqüência HVR-H1 da SEQ ID No: 269, uma seqüência HVR-H2 da SEQ ID No: 285, uma seqüência HVR-H3 da SEQ ID No: 301, uma seqüência HVR-L1 da SEQ ID No: 79, uma seqüência HVR-L2 da SEQ ID No: 80 e uma seqüência HVR-L3 da SEQ ID No: 317. Em um exemplo de realização, é fornecido um anticorpo isolado que se liga especificamente a poliubiquitina ligada à lisina-48, no qual o anticorpo não se liga especificamente à monoubiquitina e, no qual, o anticorpo compreende uma seqüência HVR-H1 da SEQ ID No: 701, uma seqüência HVR-H2 da SEQ ID No: 712, uma seqüência HVR-H3 da SEQ ID No; 723, uma seqüência HVR-L1 da SEQ ID No: 79, uma seqüência HVR-L2 da SEQ ID No: 80 e uma seqüência HVR-L3 da SEQ ID No: 734. Em um exemplo de realização, é fornecido um anticorpo isolado que se liga especificamente a poliubiquitina ligada à lisina-48, no qual o anticorpo não se liga especificamente à monoubiquitina e, no qual, o anticorpo contém uma seqüência HVR-H1 da ID SEQ No: 701, uma seqüência HVR-H2 da SEQ ID No: 712, uma seqüência HVR-H3 da SEQ ID No: 723, uma seqüência HVR-L1 da SEQ ID No: 79, uma seqüência HVR-L2 da SEQ ID No: 80, e de uma seqüência HVR-L3 da SEQ ID No: 734.

Em um exemplo de realização, é fornecido um anticorpo isolado que se liga especificamente a poliubiquitina ligada à lisina-63, no qual os anticorpos não se ligam especificamente à monoubiquitina. Em um exemplo de realização, o anticorpo ainda inclui pelo menos uma seqüência hipervariável (HVR) selecionada a partir das seqüências HVR-H1, HVR-H2, HVR-H3 e HVR- L3 de uma das SEQ ID Nos: 81-89, 229-239, 329-336, 599-629 e 739-748; NOS SEQ ID: 91-99, 241-251, 338-345, 631-661 e 750-759; SEQ ID Nos: 101- 109, 253-263, 347-354, 663-693 e 761-770; e SEQ ID Nos: 356-363 e 772-781, respectivamente. Em um exemplo de realização, o anticorpo inclui adicionalmente de pelo menos uma seqüência selecionada de HVR-H1, HVR- H2, HVR-H3, no qual, HVR-H1 compreende a seqüência de aminoácidos abe d e f g h i j (SEQ ID No: 831), no qual, o aminoácido a é glicina; o aminoácido b é fenilalanina; o aminoácido c é asparagina; o aminoácido d é selecionado entre valina, isoleucina e fenilalanina, o aminoácido e é selecionado entre serina e tirosina; o aminoácido f é selecionado entre serina e tirosina; o aminoácido g é selecionado entre serina e tirosina; o aminoácido h é selecionado entre serina e tirosina; o aminoácido i é selecionado entre isoleucina e metionina, e o aminoácido j é histidina; no qual HVR-H2 compreende seqüência de aminoácidos klmnopqrstu vwxyza' (SEQ ID No: 832), no qual, o aminoácido k é selecionado entre serina e tirosina; o aminoácido I é isoleucina; o aminoácido m é selecionado entre serina e tirosina; o aminoácido η é selecionado entre prolina e serina; o aminoácido é selecionado entre serina e tirosina; o aminoácido ρ é selecionado entre serina e tirosina; o aminoácido q é selecionado entre serina e glicina; o aminoácido r é selecionado entre serina e tirosina; o aminoácido s é treonina, o aminoácido t é selecionado entre serina e tirosina; o aminoácido u é tirosina; o aminoácido ν é alanina; o aminoácido w é ácido aspártico; o aminoácido χ é serina; o 5 aminoácido y é valina; o aminoácido z é lisina e o aminoácido a' é glicina; e no qual, HVR-H3 compreende a seqüência de aminoácidos b' c' d' e' f 'g' h' i' j' k' l' m' n' o' p' q' r' s' t' u' v', onde, o aminoácido b' é selecionado entre de serina, ácido glutâmico, glicina, e triptofano; o aminoácido c' é selecionado entre de glicina, tirosina, isoleucina, glutamina e serina; o aminoácido d' é selecionado entre de tirosina, metionina, glicina e isoleucina, o aminoácido e é selecionado entre tirosina, arginina, fenilalanina, triptofano, alanina e prolina; o aminoácido f é selecionado entre tirosina, triptofano, serina e glicina; o aminoácido g 'é selecionado entre de glutamina, tirosina, serina, fenilalanina e valina; o aminoácido h' é selecionado entre de glicina, treonina, triptofano, Iisina e prolina; o aminoácido i' é selecionado entre de tirosina, alanina, triptofano, ácido glutâmico, prolina e serina; o aminoácido j' é selecionado entre triptofano, isoleucina, tirosina e alanina; o aminoácido k' é selecionado entre triptofano, tirosina, glicina, ácido aspártico ou não está presente; o aminoácido Γ é selecionado entre tirosina, serina, fenilalanina e triptofano ou não está presente; o aminoácido m' é selecionado entre tirosina, ácido aspártico, serina ou não está presente; o aminoácido n' é selecionado entre tirosina e alanina ou não está presente; o aminoácido o' é selecionado entre treonina, serina, valina, glicina e tirosina ou não está presente; o aminoácido p' é selecionado entre glicina, ácido aspártico, serina, metionina e tirosina ou não está presente; o aminoácido q' é selecionado entre tirosina, alanina e glicina ou não está presente; o aminoácido r 'é selecionado entre tirosina, Ieucina e glicina ou não está presente; o aminoácido s' é glicina ou não está presente; o aminoácido t1 é selecionado entre metionina e Ieucina ou não está presente; o aminoácido u' é ácido aspártico, e o aminoácido v' é tirosina. Em um exemplo de realização, o anticorpo adicionalmente compreende das seqüências HVR- H1, HVR-H2 e HVR-H3 correspondentes a aquelas estabelecidas para os clones apu17, apu18, apu19, apu20, apu21, apu22, apu23 e apu24 nas figuras 11Ae 11B.

Em um exemplo de realização, o anticorpo ainda inclui pelo menos uma seqüência selecionada a partir da seqüência HVR-H1, HVR-H2, HVR-H3, no qual, HVR-H1 compreende a seqüência de aminoácidos a b c d e f g h i j (SEQ ID No: 833), no qual, o aminoácido a é glicina; o aminoácido b é fenilalanina; o aminoácido c é asparagina; o aminoácido d é selecionado entre isoleucina, valina e leucina, o aminoácido e é selecionado entre serina, Iisina e valina; o aminoácido f é selecionado entre serina, triptofano, glicina e treonina; o aminoácido g é selecionado entre serina, asparagina e glicina; o aminoácido h é selecionado entre tirosina, isoleucina, leucina e fenilalanina; o aminoácido i é selecionado entre isoleucina e metionina e o aminoácido j é histidina; no qual, HVR-H2 compreende seqüência de aminoácidos klmnopq rstuvwxyza' (SEQ ID No: 834), no qual, o aminoácido k é selecionado entre tirosina, fenilalanina, ácido aspártico, histidina e alanina; o aminoácido I é isoleucina; o aminoácido m é selecionado entre serina, alanina e glutamina; o aminoácido η é prolina; o aminoácido o é tirosina; o aminoácido ρ é selecionado entre leucina, tirosina e fenilalanina; o aminoácido q é selecionado entre serina e glicina; o aminoácido r é selecionado entre serina, treonina e triptofano ; o aminoácido s é treonina, o aminoácido t é selecionado entre serina, asparagina, Iisina e isoleucina; o aminoácido u é tirosina; o aminoácido ν é alanina; o aminoácido w é ácido aspártico; o aminoácido χ é serina; o aminoácido y é valina; o aminoácido ζ é lisina; e o aminoácido a' é glicina; e no qual, HVR-H3 compreende seqüência de aminoácidos b' c' d' e' f g' h' i' j' k' l' (SEQ ID No: 908), no qual, o aminoácido b' é ácido glutâmico; o aminoácido c' é tirosina; o aminoácido d' é tirosina; o aminoácido e' é arginina, o aminoácido f é triptofano, o aminoácido g1 é tirosina; o aminoácido h' é treonina; o aminoácido i' é alanina; o aminoácido j' é isoleucina; o aminoácido k' é ácido aspártico; e o aminoácido Γ é tirosina. Um exemplo de realização, o anticorpo compreende as seqüências HVR-H1, HVR-H2 e HVR-H3 correspondente as seqüências estabelecidas para os clones apu2.11, apu2.12, apu2.13, apu2.14, apu2.15, apu2.16 , Apu2.17, apu2.18, apu2.19, e apu2.20 na figura 17A.

Em um exemplo de realização, o anticorpo compreende pelo menos uma seqüência selecionada a partir da seqüência HVR-H1, HVR-H2, HVR-H3, no qual, HVR-H1 compreende a seqüência de aminoácidos a b c d e f g h i j (SEQ ID No: 835), no qual, o aminoácido a é glicina; o aminoácido b é fenilalanina; o aminoácido c é asparagina; o aminoácido d é selecionado entre isoleucina, valina e leucina, o aminoácido e é selecionado entre Iisina e metionina; o aminoácido f é selecionado entre treonina, metionina , asparagina, arginina e isoleucina; o aminoácido g é selecionado entre glicina, valina e fenilalanina; o aminoácido h é selecionado entre tirosina, isoleucina, leucina e fenilalanina; o aminoácido i é selecionado entre isoleucina e metionina; e o aminoácido j é histidina; no qual, HVR-H2 compreende seqüência de aminoácidos k l m n o p q r s t u v w x y z a' b' (SEQ ID No: 836), no qual, o aminoácido k é alanina; o aminoácido I é tirosina; o aminoácido m é isoleucina; o aminoácido n é selecionado entre serina, isoleucina e treonina; o aminoácido o é prolina; o aminoácido ρ é tirosina; o aminoácido q é selecionado entre leucina, tirosina, ácido aspártico, serina e triptofano; o aminoácido r é glicina, o aminoácido s é selecionado entre triptofano, valina, serina, asparagina, arginina e tirosina; o aminoácido t é treonina, o aminoácido u é selecionado entre arginina , asparagina, valina, treonina, serina e lisina, o aminoácido v é tirosina, o aminoácido w é alanina; o aminoácido x é ácido aspártico; o aminoácido y é serina; o aminoácido z é valina; o aminoácido a' é lisina; e o aminoácido b' é glicina; e no qual, HVR-H3 compreende seqüência de aminoácidos c' d' e' f g' h' i' j' k' Γ m' n' o' (SEQ ID No: 837), no qual, onde o aminoácido c' é serina; o aminoácido d' é arginina, o aminoácidos e' é ácido glutâmico; o aminoácido f é tirosina; o aminoácido g' é tirosina; o aminoácido h' é arginina, o aminoácido i' é triptofano; o aminoácido j' é tirosina; o aminoácido k' é treonina; o aminoácido Γ é alanina; o aminoácido m' é isoleucina; o aminoácido n' é ácido aspártico; e o aminoácido o' é tirosina. Em um exemplo de realização, o anticorpo compreende as seqüências HVR-H1, HVR-H2 e HVR-H3 correspondente as seqüências estabelecidas para os clones apu3.01, apu3.02, apu3.03, apu3.04, apu3.05, apu3.06, Apu3.07, apu3.08, apu3.09, apu3.10, e apu3,11 nas Figuras 23a e 23b.

Em um exemplo de realização, o anticorpo compreende uma seqüência HVR-L3 que incluí a seqüência de aminoácidos w' x' y' ζ'Α B C D E F G, na qual, o aminoácido w 'é glutamina; o aminoácido x1 é glutamina; o aminoácido y 'é selecionado entre serina e tirosina; o aminoácido z' é selecionado entre serina e tirosina; o aminoácido A é selecionado entre serina e tirosina; o aminoácido B é selecionado entre serina e tirosina; o aminoácido C é selecionado entre prolina, serina e leucina; o aminoácido D é selecionado entre serina, prolina e tirosina, ou não está presente; o aminoácido E é selecionado entre leucina e fenilalanina, ou não está presente; o aminoácido F é selecionado entre fenilalanina, valina, treonina, e isoleucina; e o aminoácido G é selecionado entre arginina, treonina, e fenilalanina. Em um exemplo de realização, o anticorpo compreende uma seqüência HVR-L1 da SEQ ID No: 79, uma seqüência HVR-L2 da SEQ ID No: 80, e uma seqüência HVR-L3 correspondente à seqüência HVR-L3 estabelecidas para os clones apu17, apu18, apu19, apu20, apu21, apu22, apu23 e apu24 na figura 11C. Em um exemplo de realização, o anticorpo compreende uma seqüência HVR-L3 compreendendo consistindo da seqüência de aminoácidos Q-Q-Y-S-S-Y-S-S-L- F-T (SEQ ID No: 772). Em um exemplo de realização, o anticorpo compreende uma seqüência HVR-L1 da SEQ ID No: 79, uma seqüência HVR-L2 da SEQ ID No: 80, e de uma seqüência HVR-L3 correspondente à seqüência HVR-L3 estabelecida para clones apu2.11, apu2.12, apu2.13, apu2.14, apu2.15, apu2.16, apu2.17, apu2.18, apu2.19, e apu2.20 na figura 17B. Em um exemplo de realização, o anticorpo compreende uma seqüência HVR-L1 da SEQ ID No: 79, uma seqüência HVR-L2 da SEQ ID No: 80, e de uma seqüência HVR-L3 correspondente à seqüência HVR-L3 da SEQ ID No: 777 .

Em um exemplo de realização, é fornecido um anticorpo isolado que se liga especificamente a poliubiquitina ligada à lisina-63, no qual o anticorpo não se liga especificamente à monoubiquitina e, no qual, o anticorpo compreende uma seqüência HVR-H1 da SEQ ID No: 330, uma seqüência HVR-H2 da SEQ ID No: 339, uma seqüência HVR-H3 da SEQ ID No: 348, uma seqüência HVR-L1 da SEQ ID No: 79, uma seqüência HVR-L2 da SEQ ID No:

80 e uma seqüência HVR-L3 da SEQ ID No: 357. Em um exemplo de realização, é fornecido um anticorpo isolado que se liga especificamente a poliubiquitina ligada à lisina-63, no qual o anticorpo não se liga especificamente à monoubiquitina e, no qual, o anticorpo compreende uma seqüência HVR-H1 da SEQ ID No: 739, uma seqüência HVR-H2 da SEQ ID No: 750, uma seqüência HVR-H3 da SEQ ID No: 761, uma seqüência HVR-L1 da SEQ ID No: 79, uma seqüência HVR-L2 da SEQ ID No: 80 e uma seqüência HVR-L3 da SEQ ID No: 357. Em um exemplo de realização, é fornecido um anticorpo isolado que se liga especificamente a poliubiquitina ligada à lisina-63, no qual o anticorpo não se liga especificamente à monoubiquitina e, no qual, o anticorpo compreende uma seqüência HVR-H1 da SEQ ID No: 739, uma seqüência HVR-H2 da SEQ ID No: 750, uma seqüência HVR-H3 da SEQ ID No: 761; e uma seqüência HVR-L1 da SEQ ID No: 79, uma seqüência HVR-L2 da SEQ ID No: 80 e uma seqüência HVR-L3 da SEQ ID No: 772. Em um exemplo de realização, é fornecido um anticorpo isolado que se liga especificamente a poliubiquitina ligada à lisina-63, no qual o anticorpo não se liga especificamente à monoubiquitina e, no qual, o anticorpo compreende uma seqüência HVR-H1 da SEQ ID No: 740, uma seqüência HVR-H2 da SEQ ID No: 751, uma seqüência HVR-H3 da SEQ ID No: 762; e uma seqüência HVR-L1 da SEQ ID No: 79, uma seqüência HVR-L2 da SEQ ID No: 80 e uma seqüência HVR-L3 da SEQ ID No: 773. Em um exemplo de realização, é fornecido um anticorpo isolado que se liga especificamente a poliubiquitina ligada à lisina-63, no qual o anticorpo não se liga especificamente à monoubiquitina e, no qual, o anticorpo compreende uma seqüência HVR-H1 da SEQ ID No: 744, uma seqüência HVR-H2 da SEQ ID No: 755, uma seqüência HVR-H3 da SEQ ID No: 766; e uma seqüência HVR-L1 da SEQ ID No: 79, uma seqüência HVR-L2 da SEQ ID No: 80 e uma seqüência HVR-L3 da SEQ ID No: 777. Em um exemplo de realização, é fornecido um anticorpo isolado que se liga especificamente a poliubiquitina ligada à lisina-63, no qual o anticorpo não se liga especificamente à monoubiquitina e, no qual, o anticorpo compreende uma seqüência HVR-H1 da SEQ ID No: 795, uma seqüência HVR-H2 da SEQ ID No: 807, uma seqüência HVR-H3 da SEQ ID No: 819; e uma seqüência HVR-L1 da SEQ ID No: 79, uma seqüência HVR-L2 da SEQ ID No: 80 e uma seqüência HVR-L3 da SEQ ID No: 777.

Em um aspecto da invenção, é fornecido um anticorpo isolado que se liga ao mesmo determinante antigênico na poliubiquitina como qualquer anticorpo acima mencionado, onde os anticorpos não se ligam especificamente a monoubiquitina. Em um aspecto, é fornecido um anticorpo isolado que compete com qualquer um dos anticorpos mencionados anteriormente para se ligar a poliubiquitina, onde os anticorpos não se ligam especificamente a monoubiquitina.

Em um aspecto, qualquer dos anticorpos acima mencionados liga- se especificamente a uma proteína poliubiquitinada. Em um aspecto, o anticorpo adicionalmente inibe a degradação da proteína poliubiquitinada. Em um aspecto, o anticorpo adicionalmente modula, pelo menos, uma via de sinalização mediada pela poliubiquitina. Em um aspecto, o anticorpo adicionalmente inibe, pelo menos, uma via de sinalização mediada pela poliubiquitina. Em um aspecto, o anticorpo adicionalmente estimula, pelo menos, uma via de sinalização mediada pela poliubiquitina.

Em um aspecto, é fornecida uma molécula de ácido nucléico que codifica um anticorpo da invenção. Em um aspecto, é fornecido um vetor que contém os ácidos nucléicos. Em um aspecto, é fornecida uma célula hospedeira, que contém o vetor. Em um aspecto, é fornecida uma linha de células capaz de produzir um anticorpo da invenção. Em um aspecto, é fornecido um método de produzir um anticorpo da invenção, compreendendo uma cultura células hospedeiras que possuem uma molécula de ácido nucléico que codifica os anticorpos sob condições em que o anticorpo é produzido. Em um aspecto, é fornecida uma composição que compreende uma quantidade eficaz de anticorpo da invenção e de um veículo farmaceuticamente aceitável.

Em um aspecto, é fornecido um método para identificar a presença de poliubiquitina ou proteína poliubiquitinada em uma amostra, consistindo na exposição da amostra com pelo menos um anticorpo da invenção. Em um aspecto, é fornecido um método para o tratamento de uma doença ou condição associada com a não regulação da poliubiquitina em um paciente, o método consiste em administrar ao paciente uma quantidade eficaz de, pelo menos, um anticorpo da invenção. Em um aspecto, o paciente é um paciente mamífero. Em um aspecto, o paciente é humano. Em um aspecto, a doença a ser tratada é selecionada entre o câncer, distúrbios muscular, doenças genéticas relacionadas a via da ubiquitina, doenças inflamatórias/autoimunes e doenças neurológicas. Em um aspecto, a doença é selecionada de carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma, leucemia, distrofia muscular, esclerose múltipla, esclerose lateral amiotrófica, fibrose cística, síndrome de Angelman, síndrome de Liddle1 doença de Alzheimer1 mal de Parkinson1 doença de Pick e doença de Paget.

Em um aspecto, é fornecido um método para determinar a presença de uma poliubiquitina ou proteína poliubiquitinada em uma amostra suspeita de conter poliubiquitina ou proteína poliubiquitinada, que consiste na exposição da amostra a pelo menos um anticorpo da invenção, e determinando a ligação de pelo menos um anticorpo à poliubiquitina ou proteína poliubiquitinada na amostra.

Em um aspecto, é fornecido um método para separar as proteínas poliubiquitinadas das proteínas não poliubiquitinadas em uma amostra, consistindo na exposição da amostra à pelo menos um anticorpo da invenção.

Em um aspecto, é fornecido um método para determinar a função e/ou atividade da poliubiquitina em uma célula, consistindo na exposição da célula ao anticorpo da invenção, e determinando o efeito da dita etapa de exposição na célula.

Em um aspecto, é fornecido um método para determinar a função e/ou atividade da poliubiquitina em uma amostra, consistindo na exposição da amostra ao anticorpo da invenção, e determinando o efeito da dita etapa de exposição na amostra.

Em outro exemplo de realização, é fornecido um anticorpo isolado que se liga especificamente a uma lisina-63 ligada à poliubiquitina, de modo que o anticorpo se liga a um epítopo na lisina-63 ligada a poliubiquitina. Em um aspecto, o epítopo inclui resíduos tanto na primeira subunidade da ubiquitina quanto em uma segunda subunidade da ubiquitina de uma lisina-63 ligada a poliubiquitina. Em outro aspecto tal, o epítopo inclui, pelo menos, um resíduo em uma primeira subunidade de ubiquitina selecionado de Glu-18, Pro-19, Ser- 20, Asp-21, Thr-55, Leu-56, Ser-57, Asp-58 , Asn-60, lle-61 e Gln-62. Em outro aspecto tal, o epítopo inclui, pelo menos, um resíduo em uma segunda subunidade da ubiquitina selecionado de Leu-8, Thr-9, Glu-34, Gly-35, lle-36, Pro-37, Asp-39, Gln-40 , Leu-71, Arg-72, Leu-73, Arg-74 e Gly-75. Em outro aspecto, o epítopo inclui, pelo menos, um resíduo em uma primeira subunidade de ubiquitina selecionado de Glu-18, Pro-19, Ser-20, Asp-21, Thr-55, Leu-56, Ser-57, Asp-58 , Asn-60, lle-61 e Gln-62, e, pelo menos, um resíduo em uma segunda subunidade da ubiquitina selecionada a partir de Leu-8, Thr-9, Glu-34, Gly-35, lle-36, Pro-37, Asp-39, Gln-40, Leu-71, Arg-72, Leu-73, Arg-74 e Gly-75.

Em um exemplo de realização, é fornecido um anticorpo isolado que se liga especificamente a uma primeira poliubiquitina constando de pelo menos uma ligação isopeptídica a um primeiro resíduo Iisina na primeira posição do aminoácido de uma molécula ubiquitina, no qual, os anticorpos não se ligam especificamente a uma segunda poliubiquitina constando de pelo menos uma ligação isopeptídica ligado a um segundo resíduo Iisina na segunda posição do aminoácido de uma molécula ubiquitina, e no qual a primeira e a segunda posições diferem o aminoácido. Um anticorpo da invenção pode estar de diversas formas. Por exemplo, um anticorpo da invenção pode ser um anticorpo quimérico, um anticorpo humanizado ou um anticorpo humano. Em um exemplo de realização, um anticorpo da invenção não é um anticorpo humano, por exemplo, não é um anticorpo produzido em um xenomouse (por exemplo, como descrito em W096/33735). Um anticorpo da invenção pode ser completo ou um fragmento do mesmo (por exemplo, um fragmento contendo o componente de ligação ao antígeno). Em outro exemplo de realização, a invenção fornece um fragmento de ligação ao antígeno de um dos anticorpos acima descritos.

Breve Descrição das Figuras

A Figura 1 exibe a estrutura primária da ubiquitina e a visualização esquemática de certas ligações isopeptídica da poliubiquitina. A Figura 1a exibe a seqüência de aminoácidos da ubiquitina humana (SEQ ID No: 377), com os resíduos de Iisina indicados em negrito, com texto sublinhado. A figura 1b é uma representação esquemática da ligação formada entre a lisina-48 ou lisina-63 de uma primeira molécula de ubiquitina e o resíduo de glicina do C-terminal de uma segunda molécula ubiquitina.

As Figuras 2A-2C exibem a seqüência em alça da cadeia pesada HVR de moléculas de anticorpos anti-poliubiquitina que reconhecem especificamente poliubiquitinas Iigantes de K48, tal como descrito no Exemplo 1(A). O designador "48" indica que a molécula de anticorpo reconhece especificamente a ubiquitina ligada a K48. O designador "ambos" indica que a molécula de anticorpo reconhece ambas as ubiquitinas ligada a K48 e K63. O designador "todos" indica que a molécula de anticorpo reconhece tanto a ubiquitina ligada a K48 quanto a ubiquitina ligada a K63, bem como a monoubiquitina. O designador "n.p." indica que alguns clones não tiveram um aminoácido na posição indicada. As figuras exibem as seqüências HVR de cadeia pesada, H1, H2 e H3. As posições dos aminoácidos são numeradas de acordo com o sistema de numeração de Kabat como descrito abaixo.

As Figuras 3A-3b exibem a seqüência em alça da cadeia pesada HVR de moléculas de anticorpos anti-poliubiquitina que reconhecem especificamente poliubiquitinas Iigantes de K63, tal como descrito no Exemplo 1(A). O designador "63" indica que a molécula de anticorpo reconhece especificamente a ubiquitina ligada a K63. O designador "ambos" indica que a molécula de anticorpo reconhece ambas ubiquitinas ligada a K63 e a K48. O designador "todos" indica que a molécula de anticorpo reconhece tanto a ubiquitina ligada a K63 quanto a ubiquitina ligada a K48, bem como a monoubiquitina. O designador "n.p." indica que alguns clones não tiveram um aminoácido na posição indicada. As figuras exibem as seqüências HVR de cadeia pesada, H1, H2 e H3. As posições dos aminoácidos são numeradas de acordo com o sistema de numeração de Kabat como descrito abaixo.

As Figuras 4A e 4B e a Figura 5 representam exemplarmente seqüência da estrutura de consenso humano aceptora para uso na prática da presente invenção com identificadores da seqüência do seguinte modo: Estrutura de Consenso Variável Pesada (VH) (Figuras 4A ε 4B)

Estrutura de consenso VH Humano subgrupo I menos CDRs Kabat (SEQ ID No: 111, 839, 858 e 877)

Estrutura de consenso VH Humano subgrupo I menos regiões hipervariáveis prolongadas (SEQ ID No: 112-114, 840-842, 859-861 e 878-880).

Estrutura de consenso VH Humano subgrupo Il menos CDRs Kabat (SEQ ID No:115, 843, 862 e 881).

Estrutura de consenso VH Humano subgrupo Il menos regiões hipervariáveis prolongadas (SEQ ID No: 116-118, 844-846, 863-865 e 882- 884).

Estrutura de consenso VH Humano subgrupo Ill menos CDRs Kabat (SEQ ID No: 119, 847, 866 e 885)

Estrutura de consenso VH Humano menos regiões hipervariáveis prolongadas (SEQ ID No: 120-122, 848-850, 867-869 e 886-888)

Estrutura aceptora VH Humano menos CDRs Kabat (SEQ ID No: 123, 851, 870 e 889).

Estrutura aceptora VH Humano menos regiões hipervariáveis prolongadas (SEQ ID No: 124-125, 852-853, 871-872 e 890-891).

Estrutura aceptora 2 VH Humano menos CDRs Kabat (SEQ ID No: 126, 854, 873, e 892).

Estrutura aceptora 2 VH Humano menos regiões hipervariáveis prolongadas (SEQ ID No: 127-129, 855-857, 874-876 e 893-895). Estrutura de Consenso Variável Leve (VL) (Figura 5)

Estrutura de consenso subgrupo I VL Humano kappa (SEQ ID No: 130, 896, 900 e 904)

Estrutura de consenso subgrupo Il VL Humano kappa (SEQ ID No: 131, 897, 901, e 905).

Estrutura de consenso subgrupo Ill VL Humano kappa (SEQ ID No: 132, 898, 902, e 906)

Estrutura de consenso subgrupo IV VL Humano kappa (SEQ ID No: 133, 899, 903, e 907)

A Figura 6 descreve as seqüências da região de estrutura das cadeias leve e pesadas da huMAb4D5-8. Os números em sobrescrito / negrito indicam as posições de aminoácido de acordo com Kabat.

A Figura 7 descreve as seqüências modificadas/variantes da região de estrutura das cadeias leve e pesadas da huMAb4D5-8. Os números em sobrescrito / negrito indicam as posições de aminoácido de acordo com Kabat.

As Figuras 8A-8C exibem as seqüências da alça de cadeia pesada HVR de moléculas de anticorpos anti-poliubiquitina que reconhecem especificamente poliubiquitinas ligadas a K48, tal como descrito no Exemplo 1A. Os números mostram as seqüências de cadeia pesada HVR, H1, H2 e H3. O designador "n.p." indica que alguns clones não tiveram um aminoácido na posição indicada. As posições de aminoácido são numeradas de acordo com o sistema de numeração Kabat como descrito abaixo.

As Figuras 9A-9B exibem as seqüências da alça de cadeia pesada HVR de moléculas de anticorpos anti-poliubiquitina que reconhecem especificamente poliubiquitinas ligadas a K63, tal como descrito no Exemplo 1A. Os números mostram as seqüências de cadeia pesada HVR, H1, H2 e H3. O designador "n.p." indica que alguns clones não tiveram um aminoácido na posição indicada. As posições de aminoácido são numeradas de acordo com o sistema de numeração Kabat como descrito abaixo.

As Figuras 10A-10C exibem as seqüências da alça de cadeia leve e cadeia pesada HVR de moléculas de anticorpos anti-poliubiquitina apu01- apu15 que reconhecem especificamente poliubiquitinas ligadas a K48 e que foram reconhecidos por um anticorpo específico para pentahistidina, tal como descrito no Exemplo 1(B). A figura exibe as seqüências da cadeia pesada HVR1 H1, H2 e H3, e as seqüências da cadeia leve HVR1 L3. O designador "n.p." indica que alguns clones não tiveram um aminoácido na posição indicada. As posições de aminoácido são numeradas de acordo com o sistema de numeração Kabat como descrito abaixo.

As Figuras 11A-11C exibem as seqüências da alça de cadeia leve e cadeia pesada HVR de moléculas de anticorpos anti-poliubiquitina apu17- apu24 que reconhecem especificamente poliubiquitinas ligadas a K63 e que foram reconhecidos por um anticorpo específico para pentahistidina, tal como descrito no Exemplo 1(B). A figura exibe as seqüências da cadeia pesada HVR1 H1, H2 e H3, e as seqüências da cadeia leve HVR1 L3. O designador "n.p." indica que alguns clones não tiveram um aminoácido na posição indicada. As posições de aminoácido são numeradas de acordo com o sistema de numeração Kabat como descrito abaixo.

A Figura 12 ilustra as interações de ligação entre as diferentes concentrações de anti-poliubiquitina Fab apu09 e poliubiquitina ligada a K48 e K63observadas utilizando a análise BIACORE®, como descrito no Exemplo 1(C).

As Figuras 13A-13b ilustram as interações de ligação entre as diferentes concentrações de anti-poliubiquitina Fab apu18 e poliubiquitina ligada a K48 e K63observadas utilizando a análise BIACORE®, como descrito no Exemplo 1(C). As figuras 14A-14F exibem as seqüências em alça da cadeia pesada HVR da segunda geração de moléculas de anticorpo anti-poliubiquitina com base na seqüência de Fab apu05, que reconhecem especificamente a poliubiquitina ligada a K48, tal como descrito no Exemplo 2. As figuras exibem as seqüências da cadeia pesada HVR1 H1, H2 e H3. O designador "n.p." indica que alguns clones não tiveram um aminoácido na posição indicada. As posições de aminoácido são numeradas de acordo com o sistema de numeração Kabat como descrito abaixo. O texto sombreado indica que a seqüência é idêntica à seqüência de aminoácidos correspondente a seqüência HVR da Fab apu05. O texto em negrito indica que os anticorpos demonstram uma forte ligação ao fago no ensaio de ELISA descrito no Exemplo 2.

As figuras 15A-15F exibem as seqüências em alça da cadeia pesada HVR da segunda geração de moléculas de anticorpo anti-poliubiquitina com base na seqüência de Fab apu05, que reconhecem especificamente a poliubiquitina ligada a K63, tal como descrito no Exemplo 2. As figuras exibem as seqüências da cadeia pesada HVR1 H1, H2 e H3. O designador "n.p." indica que alguns clones não tiveram um aminoácido na posição indicada. As posições de aminoácido são numeradas de acordo com o sistema de numeração Kabat como descrito abaixo. O texto sombreado indica que a seqüência é idêntica à seqüência de aminoácidos correspondente a seqüência HVR da Fab apu05. O texto em negrito indica que os anticorpos demonstram uma forte ligação ao fago no ensaio de ELISA descrito no Exemplo 2.

As Figuras 16A e 16B exibem as seqüências de aminoácidos das moléculas de Fab da região hipervariável de cadeia pesada derivadas da molécula mutada apu05 que reconheceu especificamente a poliubiquitina ligada a K48 (apu2.01-apu2.10) e que foram reconhecidos por um anticorpo específico para pentahistidina, como descrito no Exemplo 2. A figura exibe as seqüências da cadeia pesada HVR1 H1, H2 e H3, e a seqüência HVR de cadeia leve, L3. O designador "n.p." indica que alguns clones não tiveram um aminoácido na posição indicada. As posições de aminoácido são numeradas de acordo com o sistema de numeração Kabat como descrito abaixo. O texto sombreado indica que a seqüência é idêntica à seqüência de aminoácidos correspondente a seqüência HVR da Fab apu05.

As Figuras 17A e 17B exibem as seqüências de aminoácidos das moléculas de Fab da região hipervariável de cadeia pesada derivadas da molécula mutada apu18 que reconheceu especificamente a poliubiquitina ligada a K63 (apu2.11-apu2.20) e que foram reconhecidos por um anticorpo específico para pentahistidina, como descrito no Exemplo 2. A figura exibe as seqüências da cadeia pesada HVR1 H1, H2 e H3, e a seqüência HVR de cadeia leve, L3. O designador "n.p." indica que alguns clones não tiveram um aminoácido na posição indicada. As posições de aminoácido são numeradas de acordo com o sistema de numeração Kabat como descrito abaixo. O texto sombreado indica que a seqüência é idêntica á seqüência de aminoácidos correspondente a seqüência HVR da Fab apu18.

A Figura 18 exibe os resultados do teste de fago por ELISA descrito no Exemplo 2 na qual foi avaliada a ligação de cada um dos Fabs de segunda geração apu2.01-2,20 para a poliubiquitina ligada a K48, poliubiquitina ligada a K63, monoubiquitina e albumina bovina.

As Figura 19A e 19B exibem os resultados dos experimentos Western blotting descrito no Exemplo 1. A Figura 19A exibe a ligação dos Fabs produzidos pelos clones de apu01 a apu15 para imobilizar a tetraubiquitina ligada a K48. A Figura 19B exibe a ausência de ligação dos Fabs produzidos pelos clones de apu18 a apu24 para imobilizar a poliubiquitina ligada a K63.

As Figura 20A e 20B exibem os resultados dos experimentos Western blotting descrito no Exemplo 1. A Figura 20A exibe a ligação das apu2.01- apu2.10 para imobilizar a tetraubiquitina ligada a K48 e a ausência de ligação para imobilizar a diubiquitina ligada a K63. A Figura 20B exibe a ausência de ligação das apu2.11 a apu2.20 para imobilizar a tetraubiquitina ligada a K63 e a ausência de ligação para imobilizar a diubiquitina ligada a K48.

As Figuras 21A e 21B exibem o Western blot a partir de experimentos de imunoprecipitação a fim de detectar a o estado de ubiquitinação da RIP, como descrito no Exemplo 3. O blot na figura 21A inclui amostras que foram imunoprecipitadas com IgG apu2.16 para capturar as proteínas de poliubiquitina ligadas a K63. O blot na figura 21B inclui amostras que foram imunoprecipitadas com IgG apu2.07 para capturar as proteínas de poliubiquitina ligadas a K48. Ambos os Blots foram marcadas com um anticorpo anti-RIP.

A Figura 22 exibe os resultados do teste de fago por ELISA descrito no Exemplo 4 na qual foi avaliada a ligação de cada um dos Fabs de terceira geração apu3.01-apu3,12 para a poliubiquitina ligada a K48, poliubiquitina ligada a K63, monoubiquitina e albumina bovina.

As Figuras 23A e 23B exibem as seqüências d cadeia pesada hipervariável de clones derivados da apu2.16 mutada que reconhece especificamente a poliubiquitina ligada a K63 (apu3.01-apu3.12), como descrito no exemplo 4. A figura exibe as seqüências da cadeia pesada HVR, H1, H2 e H3. O designador "n.p." indica que alguns clones não tiveram um aminoácido na posição indicada. As posições de aminoácido são numeradas de acordo com o sistema de numeração Kabat como descrito abaixo. O texto sombreado indica que a seqüência é idêntica à seqüência de aminoácidos correspondente a seqüência HVR da apu2.16.

As Figuras 24A e 24B representam os resultados do experimentos de Western Blotting descrito no Exemplo 4. Figura 24A exibe a ligação da IgG apu2.07 IgG para imobilizada a heptaubiquitina com ligação tripla a K48 e a ausência de ligação com a heptaubiquitina com ligação tripla a K63 ou monoubiquitina. A Figura 24B exibe a ligação da IgG apu3.07 IgG para imobilizar a heptaubiquitina com ligação tripla a K63, e a ausência de ligação com a heptaubiquitina com ligação tripla a K48 ou monoubiquitina. A Figura 24C exibe a ligação dependente de concentração da IgG apu2.07 para imobilizar a tetraubiquitina ligada a K48 e a ausência de ligação par imobilizar a tetraubiquitina ligada a K63. A figura 24D exibe a ligação dependente de concentração da IgG apu3.07 para imobilizar a tetraubiquitina ligada a K63 e a ausência de ligação par imobilizar a tetraubiquitina ligada a K48.

Figura 25 representa os resultados de um experimento de Western Blotting descrito no Exemplo 4. A figura exibe a ligação do anticorpo policlonal anti-ubiquitina apu2.07 IgG1 e apu3.07 IgG para imobilizar Iisados a partir de células 293T tratadas (+) ou não tratadas (-) com VELCADE®.

As Figuras 26A-26C exibem as interações entre um Fab - poliubiquitina ligada a K63 específico da invenção e poliubiquitina ligada a K63 conforme determinado pela análise cristalográfica. A Figura 26A demonstra o complexo formado entre a poliubiquitina ligada a K63 específica e o Fab da apu2.16 e uma diubiquitina ligada a K63. A apu2.16 é exibida no "diagrama de fita tridimensional" na parte inferior da figura enquanto a diubiquitina ligada a K63 é apresentada na forma globular no topo da figura. A Figura 26 ilustra a superfície da biubiquitina ligada a K63, com os resíduos no âmbito de 4,5 A do fab em cor cinza escuro e de resíduos de interesse marcados. A Figura 26C exibe a superfície da apu2.16, com os resíduos no âmbito de 4,5 A do dímero da ubiquitina ligada a K63 colorido em cinza escuro. Os CDRs estão marcados. Modos de Execução para a Realização da Invenção

Técnicas Usuais

A prática da presente invenção empregará, salvo quando indicado de outra forma, técnicas convencionais de biologia molecular (incluindo técnicas recombinantes), microbiologia, biologia celular, bioquímica e imunologia que estão dentro das competências aqueles hábeis na técnica. Tais técnicas são totalmente elucidadas na literatura, tais como, em " Molecular Cloning: A Laboratory Manual ", terceira edição (Sambrook et ai, 2001); " Oligonucleotide Synthesis " (M.J. Gait, ed.,1984); "Animal Cell Culture" (RI Freshney, ed., 1987); "Methods in Enzymology" (Academic Press, Inc.); "Current Protocols in Molecular Biology"(FM. Ausubel et ai, Eds., 1987, e atualizações periódicas); " PCR: The Polymerase Chain Reaction ", (Mullis et a/., Ed., 1994); ltPCR 2: A Practical Approach" (M.J. MacPherson, B.D. Hames e G.R. Taylor ed. (1995)); Harlow e Lane, eds. (1988) Antibodies, A Laboratory Manual; "A Practieal Guide to Molecular Cloning" (Perbal V. Bernard, 1988) e "Phage display: A Laboratory Manuat' (Barbas et al., 2001).

Definições

Da forma como utilizado no presente, os termos "ubiquitina" e "monoubiquitina" são usados indiferentemente, e são definidos como qualquer espécies nativas do Homem e ubiquitina sintética substancialmente semelhante a uma proteína de 76 aminoácidos que tenha pelo menos um resíduo de Iisina no aminoácido 6, aminoácidos 22, aminoácidos 27, aminoácidos 29, aminoácidos 33, aminoácidos 48, e/ou aminoácidos 63.

Da forma como utilizado no presente, o termo "poliubiquitina" é definido todas espécies de cadeias da ubiquitina nativas do Homem e sintéticas de diferentes classes de ligações poliméricas de ubiquitina, incluindo mas não se limitando a, poliubiquitina ligada a K6, poliubiquitina ligada a K22, poliubiquitina ligada a K27, poliubiquitina ligada a K29, poliubiquitina ligada a K33, poliubiquitina ligada a K48e poliubiquitina ligada a K63. As poliubiquitinas podem ser de qualquer comprimento, e inclui, pelo menos, duas moléculas ubiquitina. As poliubiquitinas são distinguidas peãs repetições tandem que são expressas originalmente como uma única proteína.

Da forma como utilizado no presente, os termos "poliubiquitina ligada a K*" e "poliubiquitina ligada a Lys*" são intercambiáveis, e se referem a uma molécula de poliubiquitina que compreende de pelo menos uma ligação isopeptídica entre os grupamentos C-terminal de uma molécula de ubiquitina e uma Iisina na posição * em outra molécula de ubiquitina. Por exemplo, uma "poliubiquitina ligada a K63" é usada intercambiavelmente com "poliubiquitina ligada a Lys63", e ambos os termos referem-se a uma molécula de poliubiquitina que compreende de uma ligação isopeptídica entre o C-terminal de uma das frações de ubiquitina na molécula e a Iisina na posição 63 na outra fração de ubiquitina na molécula.

Da forma como utilizado no presente, uma afirmação de que uma primeira ligação de Iisina "difere" da segunda ligação de Iisina indica que a primeira ligação de uma das molécula de ubiquitina envolve um resíduo diferente de Iisina (por exemplo, K6, K22, K27, K29, K33 , K48 e/ou K63) da segunda ligação de entre a outra molécula de ubiquitina.

Da forma como utilizado no presente, o termo "via da ubiquitina" refere-se a um percurso bioquímico na célula ou in vivo reconstituído, que inclui a ubiquitina e/ou poliubiquitina.

Um anticorpo "isolado" é aquele que tenha sido identificado, separado e/ou recuperado a partir de um componente do seu ambiente natural. Os componentes contaminantes do seu ambiente natural são materiais que poderiam interferir em usos diagnóstico ou terapêutico para o anticorpo e podem incluir enzimas, hormônios e outros solutos proteináceos ou não- proteináceos. Em exemplos de realizações preferidas, o anticorpo será purificado (1) até mais de 95% em peso de anticorpo, conforme determinado através do método Lowry e, de maior preferência, mais de 99% em peso; (2) até grau suficiente para a obtenção de pelo menos 15 resíduos de seqüência de aminoácidos interna ou N-terminal, através do uso de um seqüenciador de copo de fiação (spinning cup); ou (3) até a homogeneidade através de SDS- PAGE sob condições redutoras ou não-redutoras utilizando azul de Coomassie ou, preferencialmente, coloração de prata. Anticorpo isolado inclui o anticorpo in situ em células recombinantes, desde que pelo menos um componente do ambiente natural do anticorpo não esteja presente. Normalmente, entretanto, o anticorpo isolado é preparado através de pelo menos uma etapa de purificação.

Da forma como utilizado no presente, os termos "anticorpos anti- ubiquitina" e "anticorpos anti-monoubiquitina" são utilizados indiferentemente, e referem-se a um anticorpo que é capaz de ligar especificamente à uma molécula de ubiquitina.

Da forma como utilizado no presente, o termo "anticorpo anti- poliubiquitina" refere-se a um anticorpo que é capaz de ligar especificamente à uma molécula de poliubiquitina.

Da forma como utilizado no presente, o termo "anticorpos anti- poliubiquitina ligada a K48" refere-se a um anticorpo que é capaz de se ligar especificamente a uma molécula de anticorpos anti-poliubiquitina ligada a K48.

Da forma como utilizado no presente, o termo "anticorpos anti- poliubiquitina ligada a K63" refere-se a um anticorpo que é capaz de se ligar especificamente a uma molécula de anticorpos anti-poliubiquitina ligada a K63.

As frases "substancialmente semelhante", "substancialmente o mesmo", "equivalentes" ou "substancialmente equivalentes", como utilizadas no presente, denota um grau de semelhança suficientemente elevado entre dois valores numéricos (por exemplo, associada a uma molécula e o outro associada a uma referência/ molécula de comparação) de tal forma que um técnico hábil no assunto iria considerar a diferença entre os dois valores como de pouca ou nenhuma significância biológica e/ou estatística no contexto da característica biológica mensurada pelos ditos valores (por exemplo, valores Kd, efeitos anti-viral, etc.) A diferença entre os dois valores é, por exemplo, inferiores a 50%, menor que 40%, inferiores a 30%, menores que 20% e/ou inferiores a 10% em função do valor de referência/ da molécula de comparação.

A frase "substancialmente reduzida" ou "substancialmente diferente", como aqui utilizada, denota um nível suficientemente elevado de diferença entre os dois valores numéricos (geralmente um associado a uma molécula e o outro associado a um valor de referência/ molécula de comparação) de tal forma que um técnico hábil no assunto iria considerar a diferença entre os dois valores como sendo de significância estatística no contexto da característica biológica mensurada pelos ditos valores (por exemplo, valores Kd). A diferença entre os dois valores é dito como, por exemplo, superior a 10%, maior do que 20%, maior do que 30%, maior do que 40%, e/ou superior a 50% em função do valor de a referência/ molécula de comparação.

"Afinidade de ligação" refere-se, no geral, à força da soma total de interações não-covalentes entre um sítio de ligação isolado de uma molécula (tal como anticorpo) e seu parceiro de ligação (tal como, um antígeno). A "afinidade de ligação" menos que indicado de outro modo, refere-se a afinidade de ligação intrínseca que reflete uma interação de 1:1 entre os membros do par ligante (por exemplo, anticorpo e antígeno) A afinidade da molécula X para seu parceiro Y pode geralmente ser representada pela constante de dissociação (Kd). A afinidade pode ser medida através de métodos conhecidos no estado da técnica, incluindo os métodos descritos na presente invenção. Anticorpos de baixa afinidade ligam de forma fraca o antígeno e tendem a dissociar rapidamente, enquanto os anticorpos de alta afinidade ligam o antígeno de forma mais forte e permanecem ligados por mais tempo. Uma variedade de métodos para mensurar a afinidade de ligação são conhecidos no estado da técnica, no qual qualquer um deles podem ser utilizados para as propostas da presente invenção. Exemplos de realização especificamente ilustrativos estão descritos a seguir.

Em um exemplo de realização, o "Kd" ou " valor de Kd " de acordo com a presente invenção é medida por um teste de ligação radiomarcado antígeno (RAI) realizado com a versão Fab de um anticorpo de interesse e os seus antígenos como descrito pelo seguinte ensaio. A solução da afinidade de ligação dos Fabs pelos antígenos é medido pelo equilíbrio do Fab com uma mínima concentração de antígeno marcado com I1251 na presença de uma titulação seriada de antígeno não marcado e, em seguida, capturando os antígenos ligados com uma placa com anticorpos anti-Fab (Chen, et al., (1999) J. Mol Biol 293:865-881). Para estabelecer as condições para o ensaio, placas de microtitulação (Dynex) são revestidas durante a noite com 5 pg/ml de anticorpo anti-Fab (Cappel Labs), em 50 mM de carbonato de sódio (pH 9.6) e, subseqüente, bloqueio com albumina bovina 2% (p/v) em PBS por duas a cinco horas à temperatura ambiente (cerca de 23 °C). Em uma placa não-adsorvente (Nunc # 269620), antígenos 100 pM ou 26 pM [I125] são misturadas em uma série de diluições Fab de interesse (por exemplo, consistente com a avaliação de anticorpos anti-VEGF, Fab-12, em Presta et al., (1997) Câncer Res. 57:4593-4599). A Fab de interesse é, em seguida, incubada overnight; no entanto, a incubação pode continuar por um período mais longo (por exemplo, 65 horas) para se assegurar de que o equilíbrio é atingido. Posteriormente, as misturas são transferidas para a incubação na placa de captura à temperatura ambiente (por exemplo, por uma hora). A solução é então retirada e a placa é lavada oito vezes com 0,1% de Tween-20, em PBS. Quando as placas estão secas, 150 μ l/poço de cintilante (MicroScint-20; Packard) é adicionado, e as placas são contados em um contador Topcount gamma (Packard) durante dez minutos. As concentrações de cada Fab que tiverem resultados igual ou inferior a 20% de ligação máxima são escolhidos para serem utilizados em ensaios de ligação competitiva. De acordo com outro exemplo de realização ou Kd ou valor de Kd é mensurado pelo ensaio de ressonância plasmônica de superfície utilizando o BIAcoreTM-2000 ou um BIAcoreTM-3000 (BlAcore, Inc., Piscataway1 NJ) a 25 0C com antígeno CM5 em chips at ~ 10 Unidades de Resposta (RU). Resumidamente, chips de biosensores de destrano carboximetilados (CM5, BIAcore Inc.) são ativados com cloridrato de N-etil-N'- (3-dimetilaminopropil)-carbodiimida (CED) e N-hidroxisucinimida (SNS) de acordo com as instruções do fornecedor. O antígeno é diluído com 10 mM de acetato de sódio, pH 4,8, para 5 pg/ml (~ 0,2 μΜ) antes de injetar a uma velocidade de fluxo de 5 μΙ/minuto para atingir aproximadamente 10 unidades de resposta (RU) de proteína acoplada. Após a injeção do antígeno, etanolamina 1M é adicionada para bloquear grupos não reacionados. Para a mediação cinética, diluições seriadas em duplicatas de Fab (0,78 nM e 500 nM) são injetados em PBS com 0,05% de Tween-20 (PBST) a 25 0C em uma txa de fluxo de cerca de 25 μΙ/min. A velocidade de associação (kon) e a velocidade de dissociação (k0ff) são calculadas utilizando um modelo de ligação simples um- para-um de Langmuir (BlAcore Evaluation Software version 3.2) pela montagem simultânea de sensogramas de associação e dissociação. A constante de dissociação em equilíbrio (Kd) é calculado como a relação k0ff/k0n. Vide, por exemplo, Chen1 Y., et al., (1999) J. Mol Biol 293:865-881. Se a medida for superior a 106 M"1 s"1 pelo ensaio de ressonância plasmônica acima, e depois, a medida pode ser determinada por uma técnica de inibição (quenching) de fluorescência que mede o aumento ou a diminuição das emissões de intensidade de fluorescência (excitação= 295 nm; Emissão = 340 nm, banda de passagem=16 nm) a 25 0C de 20 nM de um anticorpo anti- antígeno (Na Forma Fab) em PBS, pH 7,2, na presença de concentrações crescentes do antígeno mensurado em espectrômetro, tal como um espectrofotômetro equipado com válvula stop-flow (Aviv Instruments) ou um espectrofotômetro SLM-Aminco série 8000 (ThermoSpectronic), com agitador de cuveta.

Um "valor" ou "velocidade de associação" ou "kon", de acordo com esta invenção também pode ser determinada utilizando o mesmo ensaio de ressonância plasmônica descrito acima usando um BIAcoreTM-2000 ou BIAcoreTM-3000 (BIAcore Inc., Piscataway, NJ) a 25°C com um chipde antígeno CM5 a ~ 10 unidades de resposta (RU). Resumidamente, chips de biosensores de destrano carboximetilados (CM5, BIAcore Inc.) são ativados com cloridrato de N-etil-N'-(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida (CED) e N- hidroxisucinimida (SNS) de acordo com as instruções do fornecedor. O antígeno é diluído com 10 mM de acetato de sódio, pH 4,8, para 5 pg/ml (~ 0,2 μΜ) antes de injetar a uma velocidade de fluxo de 5 μl/minuto para atingir aproximadamente 10 unidades de resposta (RU) de proteína acoplada. Para a mediação cinética, diluições seriadas em duplicatas de Fab (0,78 nM e 500 nM) são injetados em PBS com 0,05% de Tween-20 (PBST) a 25°C em uma velocidade de fluxo de cerca de 25 μl/min. A velocidade de associação (kon) e a velocidade de dissociação (k0ff) são calculadas utilizando um modelo de ligação simples um-para-um de Langmuir (BIAcore Evaluation Software version 3.2) pela montagem simultânea de sensogramas de associação e dissociação. A constante de dissociação em equilíbrio (Kd) é calculado como a relação k0ff/k0n. Vide, por exemplo, Chen, Y., et al., (1999) J. Mol Biol 293:865-881. Se a medida for superior a 106 M1 s"1 pelo ensaio de ressonância plasmônica acima, e depois, a medida pode ser determinada por uma técnica de inibição (quenching) de fluorescência que mede o aumento ou a diminuição das emissões de intensidade de fluorescência (excitação= 295 nm; Emissão = 340 nm, banda de passagem=16 nm) a 25°C de 20 nM de um anticorpo anti- antígeno (Na Forma Fab) em PBS, pH 7,2, na presença de concentrações crescentes do antígeno mensurado em espectrômetro, tal como um espectrofotômetro equipado com válvula stop-flow (Aviv Instruments) ou um espectrofotômetro SLM-Aminco série 8000 (ThermoSpectronic), com agitador de cuveta.

O termo "vetor", da forma utilizada na presente invenção, refere- se a uma molécula de ácido nucléico capaz de transportar outro ácido nucléico ao qual ele está ligado. Um tipo de vetor é um "plasmídeo", que se refere a uma alça de DNA de fita dupla circular na qual segmentos de DNA adicionais podem ser ligados. Outro tipo de vetor é um vetor fago. Outro tipo de vetor é um vetor viral, em que segmentos de DNA adicionais podem ser ligados no genoma viral. Determinados vetores são capazes de replicação autônoma na célula hospedeira na qual eles estão introduzidos (por exemplo, vetores bacterianos que possuem uma origem de replicação bacteriana e vetores de mamífero epissomais). Outros vetores (por exemplo, vetores de mamíferos não-epissomais) podem ser integrados no genoma de uma célula hospedeira mediante a introdução na célula hospedeira, e são replicados desta forma ao longo do genoma hospedeiro. Adicionalmente, determinados vetores são capazes de expressão direta dos genes aos quais eles são operacionalmente ligados. Ditos vetores são denominados no presente como "vetores de expressão recombinantes" (ou simplesmente, "vetores recombinantes"). No geral, vetores de expressão úteis nas técnicas de DNA recombinante estão freqüentemente na forma de plasmídeos. Na presente invenção, "plasmídeo" e "vetor" podem ser utilizados de forma intercambiável, uma vez que o plasmídeo é a forma de vetor mais utilizada.

"Polinucleotídeo," ou "ácido nucléico," utilizados de forma intercambiável no presente, refere-se a polímeros de nucleotídeos de qualquer comprimento, e incluem DNA e RNA. Os nucleotídeos podem ser deoxiribonucleotídeos, ribonucleotídeos, nucleotídeos ou bases modificadas, e/ou seus análogos, ou qualquer substrato que pode ser incorporado em um polímero pela DNA ou RNA polimerase ou por uma reação sintética. Um polinucleotídeo pode compreender nucleotídeos modificados, tais como nucleotídeos metilados e seus análogos. Se presente, uma modificação na estrutura do nucleotídeo pode ser transmitida antes ou após o conjunto do polímero. A seqüência de nucleotídeos pode ser interrompida por componentes não-nucleotídeos. Um polinucleotídeo pode ser adicionalmente modificado após a síntese, tal como por conjugação com uma marca. Outros tipos de modificações incluem, por exemplo, "caps", substituição de um ou mais nucleotídeos de ocorrência natural com um análogo, modificações internucleotídeo tais como, por exemplo, as com ligações não-carregadas (por exemplo, metil fosfonatos, fosfotriésteres, fosfoamidatos, carbamatos, etc.) e ligações carregadas (tal como fosforotioatos, fosforoditioatos, etc.), aquelas que contém unidades pendentes, tais como, por exemplo, proteínas (por exemplo, nucleases, toxinas, anticorpos, peptídeos de sinal, ply-L-lisina, etc.), as com intercalantes (tal como acridina, psoraleno, etc.), as que contém quelantes (tais como, metais, metais radioativos, bóro, metais oxidativos, etc.), as que contém alquilantes, as com ligações modificadas (tal como ácidos nucléicos alfa anoméricos, etc.), bem como formas não modificadas de polinucleotídeos. Adicionalmente, qualquer dos grupos hidroxilas geralmente presentes nos açúcares pode ser substituído, por exemplo, por grupos fosfonatos, grupos fosfatos, protegidos por grupos protetores padrão, ou ativados para preparar ligações adicionais a nucleotídeos adicionais, ou podem ser conjugados para suportes sólidos ou semi-sólidos. O terminal OH 5' e 3' pode ser fosforilado ou substituído com unidades de grupos de proteção orgânicos ou aminas de 1 a 20 átomos de carbono. Outras hidroxilas podem ainda ser derivadas para grupos protetores. Os polinucleotídeos podem ainda conter formas análogas de açúcares ribose ou deoxiribose são geralmente conhecidos na técnica, incluindo, por exemplo, 2'-0-metil-, 2-O-alil, 2-fluoro- ou 2'-azido-ribose, análogos de açúcar carboxílico, açúcares a-anoméricos, açúcares epiméricos tais como arabinose, xiloses ou lixoses, açúcares piranose, açúcares furanose, sedoheptuloses, análogos acíclicos, e análogos de nucleosídeos abásicos tais como metil-ribosídeo. Uma ou mais das ligações fosfodiéster podem ser substituídas por grupos de ligação alternativos. Ditos grupos de ligação alternativos incluem, mas sem limitar-se a, realizações em que fosfato é substituído por P(O)SCtioato"), P(S)S ("ditioato"), "(0)NR2 ("amidato"), P(O)R1 P(O)OU', CO ou CH2 ("formacetal"), em que cada R ou R' é independentemente H ou alquil substituído ou não-substituído (1-20 C.) contendo opcionalmente uma ligação éter (-0-), arila, alquenila, cicloalquila, cicloalquenila, ou araldila. Nem todas as ligações no polinucleotídeo precisam ser idênticas. A descrição anterior aplica-se a todos os polinucleotídeos descritos no presente, incluindo RNA e DNA.

"Oligonucleotídeo," da forma utilizada no presente, refere-se geralmente a polinucleotídeos geralmente sintéticos, curtos e de fita simples que apresentam, no geral mas não necessariamente, menos de cerca de 200 nucleotídeos de comprimento. Os termos "oligonucleotídeo" e "polinucleotídeo" não são mutuamente exclusivos. A descrição acima para polinucleotídeos é igualmente e completamente aplicável a oligonucleotídeos.

"Anticorpos" (Abs) e "imunoglobulinas" (Igs) são glicoproteínas que possuem as mesmas características estruturais. Embora anticorpos exibem uma especificidade de ligação a um antígeno específico, as imunoglobulinas incluem anticorpos e moléculas similares a anticorpo que geralmente não tem especificidade ao antígeno. Polipeptídeos deste último tipo são, por exemplo, produzidos em baixos níveis pelo sistema linfático e em altos níveis no mieloma.

O termo "anticorpo" e "imunoglobulina" são utilizados de forma intercambiável no sentido mais amplo e inclui anticorpos monoclonais (tais como anticorpos monoclonais intactos ou de comprimento total), anticorpos policlonais, anticorpos multiespecíficos (tais como anticorpos multiespecíficos a ponto de exibir a atividade biológica desejada), e pode ainda incluir determinados fragmentos de anticorpos (conforme descrito em maior detalhe abaixo). Um anticorpo pode ser quimérico, humano, humanizado e/ou maturado por afinidade.

A "região variável"ou "domínio variável" de um anticorpo refere-se ao domínio amino-terminal da cadeia leve ou pesada do anticorpo. Esses domínios são geralmente as partes mais variáveis de um anticorpo, e contém o local de ligação ao antígeno.

O termo "variável" é utilizado no presente para descrever certas porções dos domínios variáveis que diferem de seqüência entre os anticorpos e são utilizadas na ligação e especificidade de cada anticorpo específico para o seu antígeno específico. Entretanto, a variabilidade normalmente não é distribuída regularmente ao longo dos domínios variáveis de anticorpos. Ela é tipicamente concentrada em três segmentos denominados regiões determinantes de complementaridade (CDRs) ou regiões hipervariáveis, tanto nos domínios variáveis de cadeia leve como de cadeia pesada. As porções mais altamente conservadas dos domínios variáveis são denominadas estruturas (FR). Cada um dos domínios variáveis de cadeia leve e pesada nativos compreende 4 regiões FR, que adotam em grande parte configuração de folha-β, conectadas por 3 CDRs, que formam alças (loops) que conectam e, em alguns casos, fazem parte da estrutura de folha-β. As CDRs em cada cadeia são mantidas juntas em boa proximidade pelas regiões FR e, com as CDRs da outra cadeia, contribuem para a formação do sítio de ligação de antígenos de anticorpos (vide Kabat, E. A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institutes of Health, Bethesda MD, Estados Unidos (1987)). Os domínios constantes não estão envolvidos diretamente na ligação de um anticorpo a um antígeno, mas exibem várias funções efetoras, tais como a participação do anticorpo em toxicidade celular dependente de anticorpos.

A digestão de anticorpos por papaína produz dois fragmentos de ligação de antígenos idênticos, denominados fragmentos "Fab", cada qual com um único sítio de ligação de antígenos, e um fragmento "Fc" residual, cujo nome reflete a sua capacidade de rápida cristalização. O tratamento com pepsina gera um fragmento F(ab')2 que contém dois sítios de ligação de antígenos e ainda é capaz de reticular antígeno.

"Fv" é o menor fragmento de anticorpo, que contém um sítio completo de reconhecimento e de ligação de antígenos. Esta região consiste em um dímero de um domínio variável de cadeia pesada e em um de cadeia leve em forte associação não-covalente. Em uma única cadeia de Fv1 um domínio variável da cadeia pesada e da cadeia leve pode ser covalentemente ligado por um peptídeo ligante flexível de tal forma que a cadeias leves e pesadas podem se associar em uma estrutura "dimérica" análoga à de uma cadeia de dois Fv. É nesta configuração que as três regiões hipervariáveis de cada domínio variável interagem para definir um sítio de ligação de antígenos sobre a superfície do dímero VH-VL. Coletivamente, as seis regiões hipervariáveis (CDRs) conferem especificidade de ligação de antígenos ao anticorpo. Entretanto, mesmo um domínio variável isolado (ou a metade de um Fv que compreende apenas três regiões hipervariáveis específicas para um antígeno) possui a capacidade de reconhecer e se ligar ao antígeno, embora em afinidade mais baixa que o sítio de ligação completo.

O fragmento Fab também contém o domínio constante da cadeia leve e o primeiro domínio constante (CH1) da cadeia pesada. Os fragmentos Fab' diferem dos fragmentos Fab pela adição de alguns resíduos no carbóxi- terminal do domínio CH1 de cadeia pesada, que inclui uma ou mais cisteínas da região de articulação do anticorpo. Fab'-SH é a denominação do presente para Fab', em que o(s) resíduo(s) de cisteína dos domínios constantes contém pelo menos um grupo tiol livre. Os fragmentos de anticorpos F(ab')2 foram originalmente produzidos na forma de pares de fragmentos de Fab' que contêm cisteínas de articulação entre tais fragmentos. Outros acoplamentos químicos de fragmentos de anticorpos também são conhecidos.

As "cadeias leves" de anticorpos (imunoglobulinas) de qualquer espécie de vertebrado podem ser atribuídas a um dentre dois tipos claramente distintos, denominados kappa (κ) e Iambda (λ), com base nas seqüências de aminoácidos dos seus domínios constantes.

Dependendo da seqüência de aminoácidos do domínio constante das suas cadeias pesadas, anticorpos podem ser atribuídos a classes diferentes. Existem cinco classes principais de anticorpos intactos: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, e várias delas podem ser adicionalmente divididas em subclasses (isoformas), por exemplo, IgGi, lgG2, lgG3, IgG4, IgAi, e IgA2. Os domínios constantes de cadeia pesada que correspondem às classes diferentes de anticorpos são denominados α, δ, ε, γ, e μ, respectivamente. As estruturas de subunidades e configurações tridimensionais de diferentes classes de imunoglobulinas são bem conhecidas e descritas, geralmente, por exemplo, em Abbas et a/., 2000, Cellular and Moi Immunology, 4th ed. Um anticorpo pode ser parte de uma grande molécula de fusão, formada por associação covalente ou não-covalente do anticorpo com uma ou mais outras proteínas ou peptídeo.

Os termos "anticorpo de comprimento total", "anticorpo intacto" e "anticorpo inteiro" são utilizados no presente de forma intercambiável, para designar um anticorpo na sua forma substancialmente intacta, e não fragmentos de anticorpos tal como definidos abaixo. Os termos particularmente referem-se a um anticorpo com cadeias pesadas que contenha regiões Fc.

"Fragmentos de anticorpos" compreendem uma porção de anticorpo intacto, onde a porção mantém pelo menos um, e como a maior parte ou a totalidade, das funções normalmente associadas a porção que quando presentes em um anticorpo intacto. Em um outro exemplo de realização, um fragmento de anticorpo, por exemplo um que compreende a região Fc, retém pelo menos uma das funções biológicas normalmente associadas com a região Fc quando presente em um anticorpo intacto, tal como ligação de FcRn, modulação da meia vida do anticorpo, função ADCC e/ou ligação de complemento. Em um exemplo de realização, um fragmento de anticorpo é um anticorpo monovalente que tem uma meia vida in vivo substancialmente semelhante a um anticorpo intacto. Por exemplo, esse anticorpo pode compreender o braço de ligação ao antígeno ligado a uma seqüência Fc capaz de conferir estabilidade in vivo ao fragmento.

A expressão "anticorpo monoclonal", da forma como utilizada no presente, indica o caráter do anticorpo como não sendo uma mistura de anticorpos. Tal anticorpo monoclonal inclui tipicamente um anticorpo que conste de uma seqüência de polipeptídeo que se liga a um alvo, em que a seqüência do polipeptídeo de ligação ao alvo foi obtida por um processo que inclua a seleção de uma seqüência de polipeptídeo de ligação ao alvo único dentre uma variedade de seqüências de polipeptídeos. Por exemplo, o processo de seleção pode ser a seleção de um clone original de uma variedade de clones, como um pool de clones de hibridoma, clones de fagos ou clones de DNA recombinante. Deve-se compreender que a seqüência de ligação selecionada pode adicionalmente ser alterada, por exemplo, para melhorar a afinidade ao alvo, para humanizar a seqüência de ligação ao alvo, para melhorar sua produção na cultura de células, para reduzir a imunogenicidade in vivo, para criar um anticorpo multiespecífico e etc. e que um anticorpo que contenha a seqüência de ligação ao alvo alterada é também um anticorpo monoclonal desta invenção. Ao contrário das preparações de anticorpos (policlonais) que incluem tipicamente diferentes anticorpos direcionados contra diferentes determinantes (epítopos), cada anticorpo monoclonal é direcionado contra um único determinante sobre o antígeno. Além da sua especificidade, os anticorpos monoclonais são vantajosos por serem sintetizados por culturas de hibridoma e não são contaminados por outras imunoglobulinas.

O adjetivo "monoclonal" indica o caráter do anticorpo como sendo obtido a partir de uma população de anticorpos substancialmente homogênea e não deve ser considerado como requerendo a produção do anticorpo por qualquer método específico. Por exemplo, os anticorpos monoclonais a serem utilizados de acordo com a presente invenção podem ser preparados por uma variedade de técnicas, incluindo, por exemplo, o método de hibridoma (Por exemplo, Kohler et al, Nature, 256:495 (1975); Harlow et al, Antibodirs: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2a Ed. 1988); Hammerling et al, em: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681, (Elsevier, 1981)), métodos de DNA recombinante (vide, por exemplo, Patente US 4.816.567), tecnologia de bibliotecas de fagos (vide, por exemplo, Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991); Marks et al, J. Mol. Biol, 222:581-597 (1991); Sidhu et al, J. Mol. Biol 338(2):299-310 (2004); Lee et al, J.Mol.Biol.34Q(5): 1013-1093 (2004); Fellouse, Proc. Nat. Acad. Sei. USA 101 (34): 12467-12472 (2004); e Lee et al J. Immunol. Methods 284(1-2):119- 132 (2004), e tecnologias para a produção de anticorpos humano ou humano- Iike em animais que possuem partes ou todo o Ioci ou genes que codificam as seqüências de imunoglobulinas humanas (vide, por exemplo, os documentos WO 1998/24893; WO 1996/34096; WO 1996/33735; WO 1991/10741; Jakobovits et al, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 90:2551 (1993); Jakobovits et al, Nature, 362:255-258 (1993); Bruggemann et al, Year in Immuno., 7:33 (1993); Patente US 5.545.806; US 5.569.825; US 5.591.669 (Todas da GenPharm); Patente US 5.545.807; DocumentoWO 1997/17852; Patente US 5.545.807; US 5.545.806; US 5.569.825; US 5.625.126; US 5.633.425; e US 5.661.016; Marks et al, Bio/Technology, 10: 779-783 (1992); Lonberg et al, Nature, 368: 856-859 (1994); Morrison1 Nature, 368: 812-813 (1994); Fishwild et al, Nature Biotechnology, 14: 845-851 (1996); Neuberger1 Nature Biotechnology, 14: 826 (1996); e Lonberg e Huszar1 lntern. Rev. Immunol1 13: 65-93 (1995)).

Os anticorpos monoclonais do presente incluem especificamente anticorpos "quiméricos", nos quais uma porção da cadeia leve e/ou pesada é idêntica ou homóloga a seqüências correspondentes em anticorpos derivados de uma espécie específica, ou pertencente a uma classe ou subclasse específica de anticorpos, enquanto o restante da(s) cadeia(s) é idêntica ou homóloga as seqüências correspondentes em anticorpos derivados de outras espécies ou pertencentes à outra classe ou subclasse de anticorpos, bem como fragmentos de tais anticorpos, desde que exibam a atividade biológica desejada (US 4.816.567; Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 81:6851- 6855(1984)).

As formas "humanizadas" de anticorpos não-humanos (por exemplo, murinos) são anticorpos quiméricos que contêm uma seqüência mínima derivada de imunoglobulina não-humana. Na maior parte, os anticorpos humanizados são imunoglobulinas humanas (anticorpo receptor), nas quais os resíduos de uma região hipervariável do receptor são substituídos por resíduos de uma região hipervariável de uma espécie não-humana (anticorpo doador), tal como camundongo, rato, coelho ou primata não-humano que possui a especificidade, afinidade e/ou capacidade desejadas. Em alguns casos, os resíduos da região estrutural (FR) da imunoglobulina humana são substituídos por resíduos não-humanos correspondentes. Além disso, os anticorpos humanizados podem compreender resíduos que não são encontrados no anticorpo receptor ou no anticorpo doador. Estas modificações são feitas para refinar ainda mais o desempenho do anticorpo. Geralmente, o anticorpo humanizado compreenderá substancialmente todos dentre pelo menos um e, tipicamente, dois domínios variáveis, em que todas ou substancialmente todas as alças hipervariáveis correspondem aos de uma imunoglobulina não-humana e todas ou substancialmente todas as FRs são as de uma seqüência de imunoglobulina humana. O anticorpo humanizado também compreenderá, opcionalmente, pelo menos uma porção da região constante (Fc) da imunoglobulina, tipicamente a de uma imunoglobulina humana. Para detalhes adicionais, vide Jones et ai, Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et ai, Nature 332:323-329 (1988); e Presta, Curr. Op. Struct Biol. 2:593-596 (1992). Vide também os seguintes artigos de revisão e referências aqui citadas: Vaswani e Hamilton, Ann. Allergy, Asthma & Immunol. 1:105-115 (1998); Harris, Biochem. Soe. Transactions 23:1035-1038 (1995); Hurle e Gross, Curr. Op. Biotech. 5:428-433 (1994).

A expressão "região hipervariável" "HRV" ou "HV", quando utilizada no presente, refere-se a regiões do domínio variável do anticorpo que são hipervariáveis na seqüência e/ou forma de alças estruturalmente definidas. Geralmente, anticorpos contêm seis regiões hipervariáveis; três na VH (VH1, VH2, VH3) E três na VL (L1, L2, L3). Um número de delineamento da região hipervariável é utilizada uso e englobadas neste documento. A região determinante de complementaridade de Kabat (CDR) é baseada na viabilidade da seqüência e a mais comumente utilizada (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)). Chothia refere-se a localização das alças estruturais (Chothia e Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)). A regiões hipervariáveis AbM representam um acordo entre os CDRs de Kabat e alças estruturais de Chothia, e são utilizados pelo programa Oxford MoIeeuIarjS AbM antibody modeling. O "contacto" de regiões hipervariáveis é baseado em uma análise das estruturas cristais complexas disponíveis. Os resíduos de cada uma destas regiões hipervariáveis são descritas a seguir.

Alça Kabat AbM Chothia Contato

L1 L24-L34 L24-L34 L26-L32 L30-L36 L2 L50-L56 L50-L56 L50-L52 L46-L55 L3 L89-L97 L89-L97 L91-L96 L89-L96 Η1 H31-H35B H26-H35B H26-H32 H30-H35B

(Numeração de Kabat)

Η1 H31-H35 H26-H35 H26-H32 H30-H35

(Numeração de Chothia)

H2 H50-H65 H50-H58 H53-H55 H47-H58

H3 H95-H102 H95-H102 H96-H101 H93-H101

Regiões hipervariáveis podem compreender "regiões hipervariáveis alongadas" do seguinte modo: 24-36 e 24-34 (L1), 46-56 e 50-56 (L2) ou 89-97 e 89-96 (L3), na VL e 26-35 (H1), 50-65 e 49-65 (H2) e 93-102, 94-102, ou 95-102 (H3) na VH. O resíduos do domínio variável são numeradas de acordo com a Kabat et al., Supra, para cada uma dessas definições.

"Estrutura" ou resíduos "FR" são aqueles resíduos de domínio variável esceto os resíduos de região hipervariável como definidos no presente.

A expressão "numeração dos resíduos em do domínio variável como em Kabat" ou "numeração da posição dos aminoácidos como em Kabat", e variantes dos mesmos, referem-se ao sistema de numeração utilizado para o domínio variável da cadeia pesada ou cadeia leve da compilação dos anticorpos em Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed. National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), Usando este sistema de numeração, a seqüência de aminoácido linear real linear pode conter menos ou mais aminoácidos, o que corresponde a uma redução ou inserção em um domínio variável FR ou HVR. Por exemplo, um domínio variável de cadeia pesada pode incluir um único aminoácido inserido (resíduo 52A, de acordo com Kabat) após o resíduo 52 da H2 e inserido resíduos (por exemplo, resíduos 82a, 82b, 82c, etc, de acordo com Kabat etc), após o resíduo 82 FR da cadeia pesada. A numeração de Kabat dos resíduos pode ser determinada para um dado anticorpo pelo alinhamento nas regiões de homologia da seqüência do anticorpo com uma seqüência numerada de Kabat "padrão".

Fragmentos de anticorpos "Fv de cadeia única" ou "scFv" compreendem os domínios VH e VL de anticorpo, em que esses domínios estão presentes em uma única cadeia de polipeptídeos. Preferencialmente, o polipeptídeo Fv compreende adicionalmente um Iigante de polipeptídeo entre os domínios VH e VL que permite que o scFv forme a estrutura desejada para ligação de antígenos. Para uma análise de scFv, vide Pluckthun em The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg e Moore eds., Springer-Verlag, Nova Iorque, Estados Unidos, págs. 269-315 (1994).

O termo "diacorpos" designa pequenos fragmentos de anticorpos com dois sítios de ligação de antígenos, que compreendem um domínio variável de cadeia pesada (VH) conectado a um domínio variável de cadeia leve (VL) na mesma cadeia de polipeptídeo (VH-VL). Utilizando um Iigante que é curto demais para permitir o pareamento entre os dois domínios sobre a mesma cadeia, os domínios são obrigados a parear-se com os domínios complementares de outra cadeia e criar dois sítios de ligação de antígenos. Os diacorpos são descritos de maneira mais completa, por exemplo, na patente EP 404.097 e no documento WO 93/11161 e Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 90:6444-6448 (1993).

Um "anticorpo humano" é um anticorpo que possui uma seqüência de aminoácido correspondente a de um anticorpo produzido por um humano e/ou foi produzido através do uso de qualquer das técnicas para a produção de anticorpos descritas no presente. A presente definição exclui, especificamente, um anticorpo humanizado que compreende resíduos de ligação de antígeno não-humanos.

Um anticorpo "maturado por afinidade" é um anticorpo que possui uma ou mais alterações em um ou mais HVRs do mesmo que resulta em melhora na afinidade de ligação do anticorpo ao antígeno, comparado ao anticorpo parental que não possui dita alteração(s). Em u exemplo de realização os anticorpos maturados por afinidades preferidos irão possuir afinidades nanomolares ou ainda picomolares ao antígeno alvo. Anticorpos maturados por afinidade são produzidos por procedimentos conhecidos. Vide, por exemplo, Marks, et al., 1992, Biotechnology 10:779-783 que descreve maturação por afinidade através da mistura (shuffling) do domínio VL e VH. Mutagênese aleatória de CDR e/ou resíduos de estrutura é descrita, por exemplo, em: Barbas, et al., 1994, Proc. Nat. Acad. Sei, USA 91:3809-3813; Shier et al., 1995, Gene 169:147-155; Yelton et al., 1995, J. Immunol. 155:1994-2004; Jackson et al., 1995, J. Immunol. 154(7):3310-9; e Hawkins et al., 1992, J. Mol. Bioi 226:889-896.

Um anticorpo "antagonista" ou um anticorpo de "bloqueio" é aquele que inibe ou reduz a atividade biológica do antígeno ao qual se liga. Certos anticorpos de bloqueio preferidos ou anticorpos antagonistas inibem de forma substancial ou completa a atividade biológica do antígeno.

Um "anticorpo agonista", como utilizado no presente, é um anticorpo que mimetiza pelo menos uma das atividades funcionais de um polipeptídeo de interesse.

Um "distúrbio" é qualquer condição que seria beneficiada pelo tratamento com um anticorpo da invenção. Isto inclui doenças agudas e crônicas ou doenças incluindo condições patologias que predispõem o mamífero para o distúrbio em questão. Exemplos, mas não se limitando a, de doenças a ser tratadas no presente incluem, câncer, distúrbios muscular, doenças genéticas relacionadas a via da ubiquitina, doenças inflamatórias/autoimunes e doenças neurológicas e outras doenças ligadas com a via da ubiquitina.

Os termos "distúrbio da proliferação celular" e "desordem proliferativa" referem-se a distúrbios que estão associados com algum grau de proliferação de células anormais. Em exemplo de realização, a deserdem proliferativa é o câncer.

"Tumor", como é utilizado no presente, refere-se ao crescimento e multiplicação de todas as células neoplásicas, quer sejam malignas ou benignas, e todas as células e tecidos pré-cancerosos e cancerosos. Os termos "câncer", "cancerosos", "distúrbio da proliferação celular", "desordem proliferativa" e "tumor" não são mutuamente exclusivos como referido no presente.

O termo "câncer" e "canceroso" refere-se a ou descreve a condição fisiológica em mamíferos que é tipicamente caracterizada pelo crescimento/proliferação celular não regulada. Exemplos de câncer incluem, mas sem limitar-se a, carcinoma, linfoma (por exemplo, Iinfoma de Hodking e linfoma não-Hodking), blastoma, sarcoma, e leucemia. Exemplos mais particulares de ditos cânceres incluem câncer de células escamosas, câncer do pulmão de células pequenas, câncer do pulmão de células não-pequenas, adenocarcinoma do pulmão, carcinoma escamoso do pulmão, câncer do peritôneo, câncer hepatocelular, câncer gastrointestinal, câncer pancreático, glioblastoma, câncer cervical, câncer do ovário, câncer do fígado, câncer da bexiga, hepatoma, câncer de mama, câncer do cólon, câncer colorectal, carcinoma endometrial ou uterino, carcinoma de glândulas salivares, câncer dos rins, câncer do fígado, câncer de próstata, câncer vulval, câncer da tireóide, carcinoma hepático, e vários tipos câncer de câncer da cabeça e pescoço.

O termo "distúrbio muscular" refere-se ou descreve a condição fisiológica nos animais que possuem músculos, geralmente, é caracterizado pela deterioração ou enfraquecimento da musculatura esquelética ou musculatura lisa na qual tal função é significativamente reduzida comparada ao músculo normal. Exemplos de distúrbios musculares incluem, mas sem Iimitar- se a, distrofia muscular, esclerose múltipla, esclerose lateral amiotrófica, síndrome de Isaac; síndrome da pessoa rígida; paralisia periódica familiar, miopatia, miotonia, rabdomiólise, atrofia muscular e vários tipos de fraqueza e rigidez muscular.

O termo "doença genética relacionada com a via da ubiquitina" refere-se o descreve um distúrbio genético que é tipicamente caracterizado por, ou contribuí para, o funcionamento aberrante da via da ubiquitina. Exemplos de doenças genéticas relacionada com a via da ubiquitina incluem, mas sem limitar-se a, fibrose cística, síndrome de Angelman, e síndrome de Liddle.

As expressões "transtorno neurológico" ou "doença neurológica" referem-se ou descrevem uma doença ou transtorno do sistema nervoso central e/ou periférico em mamíferos que, geralmente, é caracterizada pela deterioração do tecido nervoso ou deterioração da comunicação entre as células do tecido nervoso. Exemplos de alterações neurológicas incluem, mas sem limitar-se a, doenças neuro-degenerativas (incluindo, mas sem limitar-se a, doença do corpo de Lewy, síndrome pós-poliomelite, Síndrome de Shy- Draeger, atrofia olivopontocerebelar, doença de Parkinson, atrofia de múltiplos sistemas, degeneração de Striatonigral, tauopatias (incluindo, mas limitando-se a, Doença de Alzheimer e paralisia supranuclear), doenças priónicas (incluindo mas limitando-se a, encefalopatia espongiforme bovina, tremor epizoótico dos ovinos (scrapie), a doença de Creutzfeldt-Jakob, síndrome de kuru, doença de Gerstmann-Straussler-Scheinker, doença de desperdício crônica e insônia familiar fatal), paralisia bulbar, doença do neurônio motor e distúrbios do sistema nervoso heterodegenerativo (incluindo mas limitando-se a, doença de Canavan, doença de Huntington, Iipofuscinose ceróide neuronal, doença de Alexander1 Síndrome de Tourette, Síndrome de Menkes Kinky1 síndrome de Cockayne1 Síndrome Halervorden-Spatz1 doença de Lafora1 síndrome de Rett1 degeneração hepatolenticular, síndrome de Lesch-Nyhan e síndrome de Unverrieht-Lundborg), demência (incluindo mas não limitando-se a, doença de Pick e ataxia espinocerebelar).

Os termos "distúrbio inflamatório" e "distúrbio imune" referem-se ou descrever distúrbios causados por mecanismos imunológicos aberrantes e/ou sinalização aberrantes das citocinas. Exemplos de desordens inflamatórias e imunes incluem, mas sem limitar-se a, doenças auto-imunes, síndromes de deficiência imunológica e hipersensibilidade. Uma "doença auto- imune" como designado no presente é uma doença não maligna ou decorrente da desordem e dirigida contra o próprio tecido do indivíduo. As doenças auto- imunes no presente excluem especificamente doenças malignas ou condições cancerosas, excluindo especialmente linfoma de células B, leucemia linfoblástica aguda (ALL), leucemia linfocítica crônica (LLC), Tricoleucemia miéloblastica crônica e leucemia. São exemplos de doenças auto-imunes, mas sem limitar-se a, respostas inflamatórias, tais como doenças inflamatórias da pele incluindo psoríase e dermatite (por exemplo, dermatite atópica); esclerodermia e esclerose sistêmica; reações associadas com a doença inflamatória intestinal (tais como a doença de Crohn e a colite ulcerosa ); Síndrome de angústia respiratória (incluindo síndrome de angústia respiratória adulta; SDRA), dermatite, meningite, encefalite; uveíte; colite; glomerulonefrite; condições alérgicas, tais como eczema e asma e outras condições que envolvem infiltração de células T e respostas inflamatórias crônicas; aterosclerose; leucócitos aderência deficiência; artrite reumatóide, lúpus eritematoso sistêmico (LES) (incluindo mas não limitando-se a nefrite lúpica, lúpus cutâneo), diabetes mellitus (por exemplo, diabetes mellitus tipo I ou diabetes mellitus insulino dependente); esclerose múltipla; síndrome de Reynaud; tireoidite autoimune; tireoidite de Hashimoto; encefalomielite alérgica; Síndrome de Sjõgren; casos de diabetes juvenil; e respostas imunes e agudas associada com hipersensibilidade tardia mediada por citocinas e linfócitos T tipicamente encontradas na tuberculose, sarcoidose, polimiosite, granulomatose e vasculites; anemia perniciosa (doença de Addison); doenças envolvendo a diapedese de leucócitos; distúrbio inflamatório do sistema nervoso central (SNC); síndrome da lesão de múltiplos órgãos; anemia hemolítica (incluindo mas não limitando-se a crioglobulinemia ou anemia Coombs positiva); miastenia gravis; doenças mediadas pelo complexo antígeno-anticorpo; doença da síndrome glomerular anti-membrana; síndrome antifosfolipídica; neurite alérgica; Doença de Grave; Síndrome de Lambert- Eaton; penfigóide bolhoso; pênfigo; poliendocrinopatias auto-imunes; doença de Reiter; síndrome da pessoa rígida (Síndrome Stiff-Man); doença de Behcet; arterite de células gigantes; nefrite por complexos imunes; nefropatia por IgA1 polineuropatias por IgM; púrpura trombocitopênica auto-imune (ITP) ou trombocitopênia auto-imune, etc.

Exemplos de síndromes de deficiência imunológica incluem, mas sem limitar-se a, ataxia telangiectasia, síndrome aderência de leucócitos, linfopenia, disgamaglobulinemia, infecções por HIV ou deltaretrovirus, imunodeficiência variável comum, imunodeficiência combinada grave, disfunção Fagócito bactericida, agamaglobulinemia, síndrome de DiGeorge, síndrome de Wiskott - Aldrich. Exemplos de hipersensibilidade incluem, mas sem limitar-se a, alergias, asma, dermatite, urticária, anafilaxia, síndrome de Wissler e púrpura trombocitopênica.

Como usado no presente, "tratamento" refere-se à intervenção clínica em uma tentativa de alterar o curso natural do indivíduo ou da célula que estão sendo tratados, e pode ser executado para a profilaxia ou durante a patologia clínica. Os efeitos desejáveis do tratamento incluem impedir a ocorrência ou o retorno da doença, alívio dos sintomas, diminuição de qualquer conseqüência patológica direta ou indireta da doença, prevenindo ou diminuindo a inflamação e/ou o dano ao órgão, diminuindo a velocidade de progressão da doença, melhorando o estado da doença ou melhorando o prognóstico. Em algumas incorporações, os anticorpos da invenção são usados para retardar o desenvolvimento de uma doença ou desordem.

Um "indivíduo" é um vertebrado. Em certos exemplos de realização, vertebrado é um mamífero. Mamíferos incluem, mas sem limitar-se a, animais (tais como vacas), animais esportivos, animais de estimação (tais como gatos, cães e cavalos), primatas, camundongos e ratos. Em certos exemplos de realização, os vertebrados são seres humanos.

"Mamífero", para os propósitos de tratamento, refere-se a qualquer animal classificado como mamífero, incluindo seres humanos, animais domésticos e de criação e animais de zoológico, esportivos ou de estimação, tais como cães, cavalos, gatos, vacas etc. Preferencialmente, o mamífero é humano.

Uma "quantidade eficaz" refere-se a uma quantidade eficaz, em dosagens e por os períodos de tempo necessários para conseguir o resultado terapêutico ou profilático desejado.

Uma "quantidade terapeuticamente eficaz" de uma substância e/ou molécula da invenção, que pode variar de acordo com fatores tais como, o estado, idade, sexo e o peso do individual, e habilidade da substância e/ou molécula, agonista ou antagonista de eliciar uma resposta desejada no indivíduo. Uma quantidade terapeuticamente eficaz é também uma em que todos os efeitos tóxicos ou prejudiciais da substância e/ou molécula, agonista ou antagonista são compensados pelos efeitos terapeuticamente benéficos. Uma "quantidade profilaticamente eficaz" refere-se a uma quantidade eficaz, em dosagens e por os períodos de tempo necessários, para se conseguir o resultado profilático desejado. Tipicamente, mas não necessariamente, desde que a dose profilática é usada nos pacientes antes da doença ou em um estágio mais precoce da doença, a quantidade profilaticamente eficaz será menor do que a quantidade terapeuticamente eficaz.

A expressão "agente citotóxico", da forma utilizada no presente, indica uma substância que inibe ou evita o funcionamento das células e/ou causa destruição das células. A expressão destina-se a incluir isótopos radioativos (tais como At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32 e isótopos radioativos de Lu), agentes quimioterápicos, por exemplo, metotrexato, adriamicina, alcalóides vinca (vincristina, vinblastina, etoposida), doxorubicina, melfalan, mitomicina C, clorambucil, daunorubicina ou outros agentes intercalantes, enzimas e fragmentos destes como, por exemplo, ezimas nucleotídeas, antibióticos e toxinas como, por exemplo, pequenas moléculas de toxina ou toxinas ezimáticamente ativas de origem bacteriana, fúngica, vegetal ou animal, incluindo fragmentos ou variantes destes, e vários agentes anti-câncer ou anti-tumor descritos abaixo. Outros agentes citotóxicos estão descritos abaixo. Um agente tumoricida causa destruição das células tumorais.

Um "agente quimioterápico" é um composto químico útil no tratamento de condições como o câncer. Exemplos de agentes quimioterápicos incluem agentes alquilantes, tais como tiotepa e ciclofosfamida (Cytoxan®); sulfonatos de alquila, tais como busulfan, improsulfan e piposulfan; aziridinas, tais como benzodopa, carboquona, meturedopa e uredopa; etilenoiminas e metilamelaminas, incluindo altretamina, trietilenomelamina, trietilenofosforamida, trietilenotiofosforamida e trimetilolomelamina; acetogeninas (especialmente bulatacin e bulatacinona); delta-9- tetrahidrocanabinol (dronabinol, MARINOL®); beta-lapacone; lapacol; colcicines; ácido betulinico; camptotecina (incluindo o análogo sintético topotecan (HYCAMTIN®)), CPT-11 (irinotecan, CAMPTOSAR®), acetlcamptotecina, scopolectina e 9-(aminocamptotecina); briostatina; calistatina; CC-1065 (incluindo seus análogos sintéticos adozelesina, carzelesina e bizelesina); podofilotoxina; ácido podofilinico; teniposida; (criptoficinas particularmente a criptoficina 1 e criptoficina 8); dolastatina; duocarmicina (incluindo o análogo sintético, KW-2189 e CB1-TM1); eleuterobina; pancratistatina; sarcodictiina; espongistatina; mostardas de nitrogênio, tais como clorambucil, clornafazina, colofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, cloridrato oxido de mecloretamina, melfalan, novembiquin, fenesterina, prednimustina, trofosfamida, mostarda de uracila; nitrossuréias, tais como carmustina, clorozotocin, fotemustina, lomustina, nimustina, ranimustina; antibióticos, tais como os antibióticos de enedina (por exemplo, caliqueamicin, especialmente caliqueamicin gamai I e caliquemicin omegaM; vide, por exemplo, Agnew, Chem. Intl. Ed. Engl., 33: 183-186 (1994); dinemicina, incluindo dinemicina A; esperamicina; bem como neocarzinostatina cromóforo e cromóforos antibióticos de enedina cromoproteína relacionadas), aclacinomisinas, actinomicina, autramicina, azaserina, bleomicinas, cactinomicin, carabicina, carminomicina, carzinofilina, cromomicinas, dactinomicina, daunorrubicina, detorubicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, doxorrubicina doxorubicina (incluindo ADRIAMYCIN®, morfolino-doxorubicina, cianomorfolino-doxorubicina, 2-pirrolino-doxorubicina e desoxidoxorubicina), epirubicina, esorubicina, idarubicina, marcelomicina, mitomicinas como, por exemplo mitomicina C, ácido micofenólico, nogalamicina, olivomicinas, peplomicina, potfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorrubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorubicina; antimetabólitos, tais como metotrexato, gemcitabina (GEMZAR®), tegafur (UFTORAL®), capecitabina (XELODA®), uma epotilona e 5-fluorouracil (5-FU); análogos de ácido fólico, tais como denopterin, metotrexato, pteropterin, trimetrexato; análogos de purina, tais como fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina; análogos de pirimidina, tais como ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, dideoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina, 5-FU; andrógenos, tais como calusterona, propionato de dromostanolona, epitiostanol, mepitiostano, testolactona; anti-adrenais, tais como aminoglutetimida, mitotano, trilostano; reabastecedor de ácido fólico, tal como ácido frolínico; aceglatona; aldofosfamido glicosídeo; ácido aminolevulínico; amsacrina; bestrabucil; bisantreno; edatraxato; defofamina; demecolcina; diaziquona; elfornitina; acetato de eliptínio; epotilona; etoglucídeo; nitrato de gálio; hidroxiuréia; lentinan; lonidamina; maitansinóides, tais como maitansina e ansamitocinas; mitoguazona; mitoxantrona; mopidamol; nitacrina; pentostatina; fenamet; pirarubicina; ácido podofilínico; 2-etilidrazida; procarbazina; PSK(B) complexo polissacarídico (JHS Natural Products, Eugene1 OR); razoxano; rizoxin; sizofiran; espirogermânio; ácido tenuazônico; triaziquona; 2,2',2"-triclorotrietilamina; tricotecenos (especialmente toxina T-2, verracurin A, roridin A e anguidina); uretano; vindesina (ELDISINE®, FILDESIN®); dacarbazina; manomustina; mitobronitol; mitolactol; pipobroman; gacitosina; arabinosida ("Ara-C"); ciclofosfamida; tiotepa; taxóides, tais como, paclitaxel TAXOL® (Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.), formulção de nanopartículas de paclitaxel construídas em albumina ABRAXANETM (American Pharmaceutical Partners1 Schaumberg, Illinois), e doxetaxel TAXOTERE® (Rhône-Poulenc Rorer, Antony, France); clorambucil (GEMZAR®); gencitabina; 6-tioguanina (VELBAN®); mercaptopurina; metotrexato; análogos de platina tais como cisplatina e carboplatina; vinblastina; platina; etoposida (VP-16); ifosfamida; mitoxantrona; vincristina (ONCOVIN®); oxaliplatin; leucovovin; vinorelbine (NAVELBINE®); novantrona; edatrexato; daunomicina; aminopterina; ibandronato; inibidor de topoisomerase RFS 2000; difluorometilornitina (DMFO); ácido retinóico; capecitabina (XELODA®); e os sais, ácidos ou derivados farmacêuticamente aceitáveis de quaisquer dos acima; bem como combinações de dois ou mais dos agentes descritos acima como, por exemplo CHOP, uma abreviação para a terapia combinada de ciclofosfamidas, doxorubicina, vincristina, e prednisolona, e FOLFOX, uma abreviação para o regime de tratamento com oxaliplatina (ELOXATINTM) combinada com 5-FU e leucovovina.

São incluídos também nesta definição os agentes anti-hormonais que agem para regular, reduzir, obstruir, ou inibir os efeitos dos hormônios que podem promover o crescimento do câncer, e são freqüentemente forma de tratamento sistêmica, ou de todo o corpo. Podem ser os próprios hormônios. Os exemplos incluem antiestrógenos e os moduladores seletivos do receptor do estrógeno (SERMs), incluindo, por exemplo, tamoxifen (incluindo o tamoxifeno NOLVADEX®), raloxifeno (EVISTA®), droloxifeno, 4- hidroxitamoxifeno, trioxifeno, keoxifeno, LY117018, onapristona, e toremifeno (FARESTON®); anti-progesteronas; reguladores supressores de receptor de estrógeno (ERDs); agentes que funcionam para suprimir o s ovários, por exemplo, hormônio agonista liberador de hormônio luteinizante (LHRH) tais como o acetato de leuprolida (LUPRON® e ELIGARD®), acetato de goserelina, acetato de buserelina e tripterelina; outros anti-andrógenos tais como a flutamida, nilutamida e a bicalutamida; e inibidores da aromatase que inibem enzima aromatase, que regula a produção do estrógeno nas glândulas adrenais como, por exemplo, 4(5)-imidazoles, aminoglutetimida, acetato de megestrol (MEGASE®), exemestane (AROMASIN®), formestanie, fadrozole, vorozole (RIVISOR®), letrozole (FEMARA®), e anastrozole (ARIMIDEX®). Além disso, tal definição de agentes quimioterápicos inclui bisfosfonatos tais como o clodronato (por exemplo, o BONEFOS® ou o OSTAC®), etidronato (DIDROCAL®), NE-58095, ácido zoledrônico / zoledronate (ZOMETA®), alendronato (FOSAMAX®), pamidronato (AREDIA®), tiludronato (SKELID®) ou risedronato (ACTONEL®); bem como a troxacitabina (um 1,3-dioxolane análogo nucleosídeo da citosina); os oligonucleotídeos antisense, particularmente aqueles que inibem a expressão dos genes da via de sinalização, implicando na proliferação aberrante da célula como, por exemplo, PKC-alfa, Raf, H-Ras e o receptor do fator de crescimento epidermal (EGF-R); vacinas tais como vacina THERATOPE® e vacinas de terapia gênica, por exemplo, vacina ALLOVECTIN®, vacina LEUVECTIN® e vacina VAXID®; inibidor da topoisomerase 1 (por exemplo, LURTOTECAN®); rmRH (por exemplo, ABARELIX®); ditosilato do Iapatinib (um ErbB-2 e um EGFR molécula pequena inibidoras da quinase também conhecida como GW572016); e os sais, ácidos ou derivados farmaceuticamente aceitáveis de quaisquer dos acima.

Métodos E Composições da Invenção

A presente invenção fornece anticorpos que se ligam especificamente a poliubiquitina, mas não a monoubiquitina. Mais especificamente, são fornecidos anticorpos capazes de se ligar especificamente em uma poliubiquitina compreendendo uma primeira ligação de lisina, mas não a uma poliubiquitina compreendendo uma segunda e diferente ligação de lisina.

Em um aspecto, a invenção fornece um anticorpo que consta de uma região HVR-H1 que compreende a seqüência de pelo menos uma das SEQ ID Nos: 1-25, 81-89, 151-175, 229-239, 265-279, 329-336, 392-459, 599- 629, 695-704, 739-748, e 789-799. Em um aspecto, a invenção fornece um anticorpo que compreende uma região de consenso HVR-H1 selecionada das SEQ ID Nos: 26, 90, 176, 240, 280, 337, 460, 630, 705, 749 e 800. Em um aspecto, a invenção fornece um anticorpo que consta de uma região HVR-H2 que compreende a seqüência de pelo menos uma das SEQ ID Nos: 27-51, 91- 99, 177-201, 241-251, 281-295, 338-345, 461-528, 631-661, 706-715, 750-759 e 801-811. Em um aspecto, a invenção fornece um anticorpo que compreende uma região de consenso HVR-H2 selecionada das SEQ ID Nos: 52, 100, 202, 252, 296, 346, 529, 662, 716, 760 e 812. Em um aspecto, a invenção fornece um anticorpo que consta de uma região HVR-H3 que compreende a seqüência de pelo menos uma das SEQ ID Nos: 53-77, 101-109, 203-227, 253-263, 297- 311, 347-354, 530-597, 663-693, 717-726, 761-770 e 813-823. Em um aspecto, a invenção fornece um anticorpo que compreende uma região de consenso HVR-H3 selecionada das SEQ ID Nos: SEQ ID Nos: 78, 110, 228, 264, 312, 355, 598, 694, 727, 771 e 824.

Em um aspecto, a invenção fornece um anticorpo que consta de uma região HVR-H1 que compreende a seqüência de pelo menos uma das SEQ ID Nos: 1-26, 81-90, 151-176, 229-240, 265-280, 329-337, 392-460, 599- 630, 695-705, 739-749 e 789-800 e um anticorpo que consta de uma região HVR-H2 que compreende a seqüência de pelo menos uma das SEQ ID Nos: 27-52, 91-100, 177-202, 241-252, 281-296, 338-346, 461-529, 631-662, 706- 716, 750-760 e 801-812. Em um aspecto, a invenção fornece um anticorpo que consta de uma região HVR-H1 que compreende a seqüência de pelo menos uma das SEQ ID Nos: 1-26, 81-90, 151-176, 229-240, 265-280, 329- 337, 392-460, 599-630, 695-705, 739-749 e 789-800, e um anticorpo que consta de uma região HVR-H3 que compreende a seqüência de pelo menos uma das SEQ ID Nos: 53-78, 101-110, 203-228, 253-264, 297-312, 347-355, 530-598, 663-694, 717-727, 761-771 e 813-824. Em um aspecto, a invenção fornece um anticorpo que consta de uma região HVR-H2 que compreende a seqüência de pelo menos uma das SEQ ID Nos: 27-52, 91-100, 177-202, 241- 252, 281-296, 338-346, 461-529, 631-662, 706-716, 750-760 e 801-812 e um anticorpo que consta de uma região HVR-H3 que compreende a seqüência de pelo menos uma das SEQ ID Nos: 53-78, 101-110, 203-228, 253-264, 297-312, 347-355, 530-598, 663-694, 717-727, 761-771 e 813-824.

Em um aspecto, a invenção fornece um anticorpo que consta de uma região HVR-L3 que compreende a seqüência de pelo menos uma das SEQ ID Nos: 313-327, 356-363, 728-737 e 772-781. Em um aspecto, a invenção fornece um anticorpo que compreende uma região de consenso HVR- L3 selecionada das SEQ ID Nos: 328, 364, 738 e 782. Em um aspecto, a invenção fornece um anticorpo que consta de uma região HVR-L3 que compreende a seqüência de pelo menos uma das SEQ ID Nos: 313-328, 356- 364, 728-738 e 772-782, adicionalmente um anticorpo compreende de pelo menos uma seqüência HVR-H1, HVR-H2 ou HVR-H3 selecionada da SEQ ID Nos: 1-26, 81-90, 151-176, 229-240, 265-280, 329-337, 392-460, 599-630, 695- 705, 739-749 e 789-800; SEQ ID Nos: 27-52, 91-100, 177-202, 241-252, 281- 296, 338-346, 461-529, 631-662, 706-716, 750-760 e 801-812; e SEQ ID Nos: 53-78, 101-110, 203-228, 253-264, 297-312, 347-355, 530-598, 663-694, 717- 727, 761-771 e 813-824, respectivamente.

Em um aspecto, a invenção fornece um anticorpo incluindo pelo menos um, pelo menos dois, pelo menos três, quatro ou todas as seguintes:

(i) uma seqüência HVR-H1 incluindo pelo menos uma seqüência SEQ ID Nos: 1-26, 81-90, 151-176, 229-240, 265-280, 329-337, 392-460, 599- 630, 695-705, 739-749 e 789-800;

(ii) uma seqüência HVR-H2 incluindo pelo menos uma seqüência SEQ ID Nos: 27-52, 91-100, 177-202, 241-252, 281-296, 338-346, 461-529, 631-662, 706-716, 750-760 e 801-812;

(iii) uma seqüência HVR-H3 incluindo pelo menos uma seqüência SEQ ID Nos: 53-78, 101-110, 203-228, 253-264, 297-312, 347-355, 530-598, 663-694, 717-727, 761-771 e 813-824;

(iv) uma seqüência HVR-L3 incluindo pelo menos uma seqüência SEQ ID Nos: 313-328, 356-364, 728-738 e 772-782. Em um aspecto, a invenção fornece um anticorpo específico que liga-se a poliubiquitina ligada a K48 com alta afinidade, mas que liga-se a poliubiquitina ligada a K63 a uma afinidade substancialmente reduzida, incluindo pelo menos um, pelo menos dois, pelo menos três, quatro ou todas das seguintes:

(i) uma seqüência HVR-H1 incluindo pelo menos uma seqüência SEQ ID Nos: 1-26, 151-176, 265-280, 392-460 e 695-705;

(ii) uma seqüência HVR-H2 incluindo pelo menos uma seqüência SEQ ID Nos: 27-52, 177-202, 281-296, 461-529 e 706-716;

(iii) uma seqüência HVR-H3 incluindo pelo menos uma seqüência SEQ ID Nos: 53-78, 203-228, 297-312, 530-598 e 717-727; e

(iv) uma seqüência HVR-L3 incluindo pelo menos uma seqüência SEQ ID Nos: 313-328 e 728-738.

Em um aspecto, a invenção fornece um anticorpo específico que se liga a poliubiquitina ligada a K63 com alta afinidade, mas que se liga a poliubiquitina ligada a K48 a uma afinidade substancialmente reduzida, incluindo pelo menos um, pelo menos dois, pelo menos três, quatro ou todas das seguintes:

(i) uma seqüência HVR-H1 incluindo pelo menos uma seqüência SEQ ID Nos: 81-90, 229-240, 329-337, 599-630, 739-749 e 789-800;

(ii) uma seqüência HVR-H2 incluindo pelo menos uma seqüência SEQ ID Nos: 91-100, 241-252, 338-346, 631-662, 750-760 e 801-812;

(iii) uma seqüência HVR-H3 incluindo pelo menos uma seqüência de SEQ ID Nos: 101-110, 253-264, 347-355, 663-694, 761-771 e 813-824;

(iv) uma seqüência HVR-L3 incluindo pelo menos uma seqüência SEQ ID Nos: 356-364 e 772-782.

As seqüências de aminoácidos SEQ ID Nos: 1-78, 81-106-149, 151-364, 392-782, 789-824 estão numerados com relação ao HVR individual (ou seja, H1, H2, H3, L3), como indicado nas figuras 2, 3, 8, 9, 10, 11, 14, 15, 16, 17, e 22, sendo a numeração coerente com o sistema de numeração de Kabat como descrito abaixo. Em um exemplo de realização, um anticorpo da invenção compreende uma, duas, três, ou todas as seqüências acima de HVR (i)-(iv), e HVR-L1 e/ou HVR-L2 que compreende uma seqüência consenso de Kabat (por exemplo, SEQ ID No: 79 (HVR-L1) e 80 (HVR-L2)).

Em um aspecto, a invenção fornece anticorpos que compreendem as seqüências HVR de cadeia pesada como representado nas figuras 2, 3, 8, 9, 10, 11, 14, 15, 16, 17, e 22. Em um exemplo de realização, os anticorpos constam ainda das seqüências HVR de cadeia leve como representado nas figuras 10, 11, 16 e 17.

Em algumas realizações os anticorpos da invenção constam de um domínio variável do anticorpo humanizado 4D5 (huMAb4D5-8) (HERCEPTIN Genentech, Inc., CA, EUA.) (também referido na Patente US 6.407.213 e Lee, et a/., J. Mol. Biol. (2004), 340(5): 1073-93), conforme ilustrado na SEQ NO ID: 783 a seguir.

1 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arq Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tvr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tvr Thr Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 107 (SEQ ID No: 783) (os resíduos HVR estão sublinhados)

Em um exemplo de realização, a seqüência do domínio variável da cadeia leve do huMAb4D5-8 é modificada em uma ou mais das posições 28, 30, 31, 53, 66 e 91 (Asp, Asn, Thr, Esp, Arg e His, como indicado em negrito/itálico acima, respectivamente). Em um exemplo de realização, a seqüência do huMAb4D5-8 modificado compreende de uma Ser na posição 28, uma Ser na posição 30, uma Ser na posição 31, uma Ser na posição 53, uma Gly na posição 66 e/ou uma Ser na posição 91. Correspondentemente, em um exemplo de realização, um anticorpo da invenção compreende de um domínio variável da cadeia leve compreendendo a seqüência ilustrada na SEQ ID No: 784 a baixo:

1 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arq Ala Ser Gln SerVaI SerSer Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Ser Leu Tvr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln SerTvr Thr Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 107 (SEQ ID NO: 784) (os resíduos HVR estão sublinhados).

Os resíduos substituídos no huMAb4D5-8 estão acima indicados em negrito/itálico.

Os anticorpos da invenção podem compreender qualquer seqüência da região de estrutura de domínio variável, desde a atividade de ligação a poliubiquitina incluindo uma ligação específica com a Iisina seja substancialmente mantida. Por exemplo, em algumas realizações, os anticorpos da invenção compreendem uma seqüência consenso humano da estrutura de cadeia pesada subgrupo III. Em um exemplo de realização destes anticorpos, a seqüência consenso da estrutura contém substituições nas posições 71, 73 e/ou 78. Em alguns exemplos de realização destes anticorpos, a posição 71 é um A, 73 um T e/ou 78 é A. Em um exemplo de realização, esses anticorpos incluem as seqüências de estrutura do domínio variável de cadeia pesada do huMAb4D5-8 (HERCEPTIN ®, Genentech, Inc., CA, EUA.) (também referido na Patente US N0S 6.407.213 e 5.821.337, e Lee et ai, J. Mol. Biol. (2004), 340(5): 1073-93). Em um exemplo de realização, esses anticorpos compreendem da seqüência consenso da região de estrutura da cadeia leve Ικ. Em um exemplo de realização, esses anticorpos compreendem de pelo menos uma, duas ou todas as seqüências da estrutura HVR de cadeia leve SEQ ID Nos: 79, 80, 313-328, 356-364, 728-738, e 772-78. Em um exemplo de realização, esses anticorpos compreende das seqüências HVR de cadeia leve do anticorpo huMAb4D5-8, como descrito nas Patentes US Nos 6.407.213 e 5.821.337). Em um exemplo de realização, esses anticorpos compreende das seqüências HVR de cadeia leve do anticorpo huMAb4D5-8 (SEQ ID Nos: 783 e 784) (HERCEPTIN Genentech, Inc., CA1 EUA) ( também referida No patente US Nos 6.407.213 e 5.821.337, e Lee et ai, J. Moi Bioi (2004),340(5): 1073-93).

Em um exemplo de realização, um anticorpo da invenção consta de um domínio variável de cadeia pesada, onde a seqüência da região de estrutura compreende da seqüência de pelo menos uma das SEQ ID Nos: 111- 129, 138-141, 146-149 e 839-895, e as seqüências HVR H1, H2, H3 são selecionadas a partir de pelo menos uma das SEQ ID Nos: 1-26, 81-90, 151- 176, 229-240, 265-280, 329-337, 392-460, 599-630, 695-705, 739-749 e 789- 800; 27-52, 91-100, 177-202, 241-252, 281-296, 338-346, 461-529, 631-662, 706-716, 750 -760 e 801-812; e 53-78, 101-110, 203-228, 253-264, 297-312, 347-355, 530-598, 663-694, 717-727, 761-771 e 813-824, respectivamente. Em um exemplo de realização, consta de um domínio variável de cadeia leve, onde a seqüência da região de estrutura compreende da seqüência de pelo menos uma das SEQ ID Nos: 130-133, 134-137, 142-145, 896-907 e, a seqüência HVR-L1 é a SEQ ID No: 79, a seqüência HVR-L2 é a SEQ ID No: 80, e a seqüência HVR-L3 é selecionada a de pelo menos uma das SEQ ID Nos: 313- 328, 356-364, 728-738 e 772-782.

Em um exemplo de realização, um anticorpo da invenção consta de um domínio variável de cadeia pesada, onde a seqüência da região de estrutura compreende da seqüência de pelo menos uma das SEQ ID Nos: 111- 129 e 839-895; e as seqüências HVR H1, H2, H3 são selecionadas a partir de pelo menos uma das SEQ ID Nos: 1 27 e 53 respectivamente (clone 48-1). Da mesma forma, em outros exemplos de realização, anticorpos de cada um dos clones de 48-2 a 48-118, 63-1 a 63-51, Fabs apu01 até apu24, Fabs apu2.01 até apu2.20, e clones apu3.01 até 3.11 compreendem um domínio variável de cadeia pesada, onde a seqüência da região de estrutura inclui pelo menos uma das seqüências SEQ ID No: 111-129 e 839-895, e as seqüências HVR-H1, HVR-H2 e HVR-H3 são as seqüências especificamente numeradas para cada clone ou Fab nas figuras 2, 3, 8-11, 14-17 e 22. Em um exemplo de realização, o anticorpo da invenção compreende um domínio variável de cadeia leve, onde a seqüência da região de estrutura inclui pelo menos uma das seqüências SEQ ID Nos: 130-133 e 896-907, e as seqüências HVR L1, L2 e L3 são SEQ ID Nos: 79, 80, e 313, respectivamente (Fab apu01). Da mesma forma, em outros exemplos de realização, anticorpos de cada um dos Fabs de apu01 até apu24 e Fabs apu2.01 até apu2.20 constam de um domínio variável da cadeia leve, no qual a seqüência da região de estrutura inclui pelo menos uma das seqüências SEQ ID Nos: 130-133 e 896-907, e as seqüência HVR-L1 é a SEQ ID No: 79, a HVR-L2 é SEQ ID No: 80, e as seqüências HVR-L3 são as seqüências especificamente enumeradas para cada Fab nas figuras 10, 11C, 16B e 17B.

Em um exemplo de realização, um anticorpo da invenção contém um domínio variável de cadeia pesada, no qual, a seqüência da região de estrutura compreende da seqüência de pelo menos uma das SEQ ID Nos: 138- 141, e as seqüências HVR H1, H2, H3 são selecionadas a partir de pelo menos uma das SEQ ID Nos:1, 27 , E 53, respectivamente (clone 48-1). Da mesma forma, em outros exemplos de realização, anticorpos de cada um dos clones de 48-2 até 48-118, 63-1 até 63-51, Fabs apu01 até apu24, Fabs apu2.01 até apu2.20, e clones apu3.01-3,11 compreendem um domínio variável de cadeia pesada, onde a seqüência da região de estrutura inclui pelo menos uma das seqüências SEQ ID No: 138-141, e as seqüências HVR-H1, HVR-H2 e HVR-H3 são as seqüências especificamente numeradas para cada clone ou Fab nas figuras 2, 3, 8-11, 14-17, e 22. Em um exemplo de realização, o anticorpo da invenção compreende um domínio variável de cadeia leve, onde a seqüência da região de estrutura inclui pelo menos uma das seqüências SEQ ID Nos: 134-137, e as seqüências HVR L1, L2 e L3 são SEQ ID Nos: 79, 80, e 313, respectivamente (Fab apu01). Da mesma forma, em outros exemplos de realização, anticorpos de cada um dos Fabs de apu01 até apu24 e Fabs apu2.01 até apu2.20 constam de um domínio variável da cadeia leve, no qual a seqüência da região de estrutura inclui pelo menos uma das seqüências SEQ ID Nos: 134-137, e as seqüência HVR-L1 é a SEQ ID No: 79, a HVR-L2 é SEQ ID No: 80, e as seqüências HVR-L3 são as seqüências especificamente enumeradas para cada Fab nas figuras 10, 11C, 16B e 17B.

Em um exemplo de realização, um anticorpo da invenção contém um domínio variável de cadeia pesada, no qual, a seqüência da região de estrutura compreende da seqüência de pelo menos uma das SEQ ID Nos: 146- 149, e as seqüências HVR H1, H2, H3 são selecionadas a partir de pelo menos uma das SEQ ID Nos:1, 27 , E 53, respectivamente (clone 48-1). Da mesma forma, em outros exemplos de realização, anticorpos de cada um dos clones de 48-2 até 48-118, 63-1 até 63-51, Fabs apu01 até apu24, Fabs apu2.01 até apu2.20, e clones apu3.01-3,11 compreendem um domínio variável de cadeia pesada, onde a seqüência da região de estrutura inclui pelo menos uma das seqüências SEQ ID No: 146-149, e as seqüências HVR-H1, HVR-H2 e HVR-H3 são as seqüências especificamente numeradas para cada clone ou Fab nas figuras 2, 3, 8-11, 14-17, e 22. Em um exemplo de realização, o anticorpo da invenção compreende um domínio variável de cadeia leve, onde a seqüência da região de estrutura inclui pelo menos uma das seqüências SEQ ID Nos: 142-145, e as seqüências HVR L1, L2 e L3 são SEQ ID Nos: 79, 80, e 313, respectivamente (Fab apu01). Da mesma forma, em outros exemplos de realização, anticorpos de cada um dos Fabs de apu01 até apu24 e Fabs apu2.01 até apu2.20 constam de um domínio variável da cadeia leve, no qual a seqüência da região de estrutura inclui pelo menos uma das seqüências SEQ ID Nos: 142-145, e as seqüência HVR-L1 é a SEQ ID No: 79, a HVR-L2 é SEQ ID No: 80, e as seqüências HVR-L3 são as seqüências especificamente enumeradas para cada Fab nas figuras 10, 11C, 16B e 17B.

Em um exemplo de realização, um anticorpo da invenção é maturado por afinidade para se obter uma afinidade de ligação ao alvo desejado. Em um exemplo, um anticorpo maturado por afinidade da invenção que se liga especificamente a poliubiquitina ligada a K48 com alta afinidade, e se liga a poliubiquitina ligada a K63 com uma afinidade substancialmente reduzida, contém uma substituição nos aminoácidos do HVR-H1 nas posições 29, 30, 33 e 34. Em outro exemplo, um anticorpo maturado por afinidade da invenção que se liga especificamente a poliubiquitina ligada a K48 com alta afinidade, e se liga a poliubiquitina ligada a K63 com uma afinidade substancialmente reduzida, contém uma substituição nos aminoácidos do HVR- H2 nas posições 52 e 52b. Em outro exemplo, um anticorpo maturado por afinidade da invenção que se liga especificamente a poliubiquitina ligada a K48 com alta afinidade, e se liga a poliubiquitina ligada a K63 com uma afinidade substancialmente reduzida, contém uma substituição nos aminoácidos do HVR- H3 nas posições 99, 100, 100a, e 100b. Em outro exemplo, um anticorpo maturado por afinidade da invenção que se liga especificamente a poliubiquitina ligada a K48 com alta afinidade, e se liga a poliubiquitina ligada a K63 com uma afinidade substancialmente reduzida, contém uma substituição nos aminoácidos do HVR-L3 nas posições 91 e 96. Em outro exemplo, um anticorpo maturado por afinidade da invenção que se liga especificamente a poliubiquitina ligada a K63 com alta afinidade, e se liga a poliubiquitina ligada a K48 com uma afinidade substancialmente reduzida, contém uma substituição nos aminoácidos do HVR-H1 nas posições 29 e 34. Em outro exemplo, um anticorpo maturado por afinidade da invenção que se liga especificamente a poliubiquitina ligada a K63 com alta afinidade, e se liga a poliubiquitina ligada a K48 com uma afinidade substancialmente reduzida, contém uma substituição nos aminoácidos do HVR-H2 nas posições 50, 52, 52a, 53-56 e 58. Em outro exemplo, um anticorpo maturado por afinidade da invenção que se liga especificamente a poliubiquitina ligada a K63 com alta afinidade, e se liga a poliubiquitina ligada a K48 com uma afinidade substancialmente reduzida, contém uma substituição nos aminoácidos do HVR-H3 nas posições 95-100, 100a, 100b e 100c. Em outro exemplo, um anticorpo maturado por afinidade da invenção que se liga especificamente a poliubiquitina ligada a K63 com alta afinidade, e se liga a poliubiquitina ligada a K48 com uma afinidade substancialmente reduzida, contém uma substituição nos aminoácidos do HVR- L3 nas posições 91-95, 95a e 95b.

Em outro exemplo, um anticorpo maturado por afinidade da invenção que se liga especificamente a poliubiquitina ligada a K63 com alta afinidade, e se liga a poliubiquitina ligada a K48 com uma afinidade substancialmente reduzida, contém uma substituição nos aminoácidos do HVR- H1 nas posições 29-34. Em outro exemplo, um anticorpo maturado por afinidade da invenção que se liga especificamente a poliubiquitina ligada a K63 com alta afinidade, e se liga a poliubiquitina ligada a K48 com uma afinidade substancialmente reduzida, contém uma substituição nos aminoácidos do HVR- H2 nas posições 50, 52, 54, 56 e 58. Em outro exemplo, um anticorpo maturado por afinidade da invenção que se liga especificamente a poliubiquitina ligada a K63 com alta afinidade, e se liga a poliubiquitina ligada a K48 com uma afinidade substancialmente reduzida, contém uma substituição nos aminoácidos do HVR-H3 nas posições 95-100, 100a, 100b e 100c.

Em um exemplo de realização, um anticorpo da invenção compreende um domínio variável de cadeia pesada compreendendo as seqüências SEQ ID Nos: 265, 281 e 297. Em um exemplo de realização, um anticorpo da invenção compreende um domínio variável de cadeia leve compreendendo as seqüências SEQ ID Nos: 79, 80 e 313 e também compreende um domínio variável de cadeia pesada compreendendo as seqüências SEQ ID Nos: 265, 281 e 297. Em um exemplo de realização, um anticorpo da invenção compreende um domínio variável de cadeia leve compreendendo as seqüências SEQ ID Nos: 79, 80 e 313. Em outro exemplo de realização, um anticorpo da invenção que corresponde a um determinado clone número que possuí um domínio variável de cadeia pesada que compreende das seqüências HVR-H1, HVR-H2 e HVR-H3 conforme estabelecido nas figuras 2, 3, 8, 9, 10 , 11, 14-17 e 22 para o número de clone.

Em outros exemplos de realização, um anticorpo da invenção que corresponde a um número de clone específico possuía um domínio variável de cadeia leve que compreende uma seqüência HVR-L1 da SEQ ID No: 79, uma seqüência HVR-L2 da SEQ ID No: 80, e uma seqüência HVR - L3, tal como estabelecido nas figuras 10, 11, 16e 17 para o número do clone.

Em um aspecto, a invenção fornece um anticorpo que compete com um dos anticorpos acima mencionados para se ligar a poliubiquitina. Em um aspecto, a invenção fornece um anticorpo que se liga ao mesmo determinante antigênico na poliubiquitina como um dos anticorpos acima mencionados.

Tal como demonstrado no presente, os anticorpos da invenção ligam-se especificamente a uma poliubiquitina isolada que possuí uma ligação de Iisina específica. Tal como demonstrado no presente, os anticorpos da invenção também ligam-se especificamente a uma poliubiquitina que possuí uma ligação específica de Iisina quando a poliubiquitina está acoplada a uma proteína heteróloga (vide, por exemplo, os exemplos 3 e 4).

São fornecidas composições que compreendem de pelo menos um anticorpo anti-poliubiquitina ou, pelo menos, uma seqüência de polinucleotídeo que codifica um anticorpo anti-poliubiquitina. Em certos exemplos de realização, uma composição pode ser uma composição farmacêutica. Tal como utilizado no presente, composições compreendem um ou mais anticorpos que se ligam a uma ou mais poliubiquitina e/ou uma ou mais seqüências de polinucleotídeos codificadoras de um ou mais anticorpos que se ligam a uma ou mais poliubiquitina. Estas composições podem adicionalmente incluir veículos e excipientes farmaceuticamente aceitáveis, incluindo tampões, que são bem conhecidos no estado da técnica.

Anticorpos isolados e polinucleotídeos são também fornecidos. Em certos exemplos de realização, os anticorpos isolados e polinucleotídeos são consideravelmente puros.

Em um exemplo de realização, o anticorpo anti-poliubiquitina é monoclonal. Em outro exemplo de realização, são fornecidos fragmentos de anticorpos anti-poliubiquitina (por exemplo, fragmentos Fab1 Fab1-SH e F(ab')2). Estes fragmentos de anticorpos podem ser criados utilizando as técnicas tradicionais, tais como, digestão enzimática, ou podem ser gerados por técnicas de recombinação. Tais fragmentos de anticorpos podem ser fragmentos de anticorpos quiméricos, humanizados, humanos. Estes fragmentos são úteis para os propósitos diagnósticos e terapêuticos definidos a seguir.

PRODUCAO DE ANTICORPOS ANTI-POLIUBIQUITINA UTILIZANDO BIBLIOTECA DE

EXIBICAO POR FAGO

Uma variedade de métodos é conhecida no estado da arte para a geração de bibliotecas de exibição por fago a partir do qual um anticorpo de interesse pode ser obtida. Um método de produção de anticorpos de interesse é pelo uso de uma biblioteca de anticorpo por fago, tal como descrito em Lee et ai, J. Mol. Bioi (2004), 340 (5): 1073-93.

Os anticorpos anti-poliubiquitina da invenção pode ser produzidos utilizando bibliotecas combinatórias para selecionar clones sintéticos com a desejada atividade ou atividades. Em princípio, os clones sintéticos de anticorpos são selecionados pela triagem de bibliotecas de fago contendo fagos que exibem vários fragmentos da região variável de anticorpos (Fv) fundidos na proteína da cápside do fago. Essas bibliotecas de fago são testadas por cromatografia de afinidade contra o antígeno desejado. Clones expressando fragmentos Fv capazes de se ligar ao antígeno desejado são absorvidos pelo antígeno e, assim, separados dos clones que não se ligam na biblioteca. Os clones que se ligam são então eluídos do antígeno e podem ainda ser enriquecidos por ciclos adicionais de adsorção/eluição de antígenos.

Qualquer um dos anticorpos anti-poliubiquitina da invenção pode ser obtido pela concepção de um procedimento de seleção adequado para selecionar o clone do fago de interesse seguido pela construção de um anticorpo anti- poliubiquitina de comprimento total usando as seqüências Fv a partir do clone de fago de interesse e a seqüência adequada da região constante (FC) descrita em Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, quinta edição, NIH Publication 91-3242, Bethesda MD (1991), vols. 1-3.

O domínio de ligação ao antígeno de um anticorpo é formado a partir de duas regiões variáveis (V) de cerca de 110 aminoácidos, de cada cadeia leve (VL) e cadeia pesado (VH), ambos apresentam três alças hipervariáveis ou Regiões de Determinação de Complementaridade (CDRs).

Os domínios variáveis podem ser exibidos funcionalmente em fago, quer como fragmentos Fv de cadeia única (scFv), na qual VH e VL são covalentemente ligados através de um peptídeos curto e flexível, ou como fragmentos Fab, que são fundidos para cada domínio constante e interagem não-covalentemente, tal como descrito em Winter et ai, Ann. Rev. Immunol., 12:433-455 (1994). Como utilizado no presente, clones de fago que codificam scFv e clones de fago que codificam Fab são coletivamente referidas como "clones de fagos Fv" ou "clones Fv".

Repertórios de genes VH e VL podem ser clonados separadamente por reação em cadeia da polimerase (PCR) e recombinados aleatoriamente em bibliotecas de fago, que podem ser pesquisada por ligação ao antígeno dos clones, tal como descrito em Winter et al., Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455 (1994). Bibliotecas de fontes imunizadas fornecem anticorpos de alta afinidade para o imunogeno sem a necessidade de construir hibridomas. Alternativamente, os repertórios naive podem ser clonados para proporcionar uma única fonte de anticorpos humanos a uma vasta gama de antígenos não próprios e também sem qualquer imunização, como descrito por Griffiths et al., EMBO J, 12: 725-734 (1993) . Por último, bibliotecas naive também podem ser feitas sinteticamente clonando segmentos desarranjados do gene-V de células tronco utilizando prímers de PCR contendo uma seqüência aleatória para codificar as regiões CDR3 altamente variáveis e para realizar um rearranjo in vitro, como descrito por Hoogenboom e Winter, J. Moi Biol., 227: 381-388 (1992).

Fagos filamentosos são utilizados para exibir fragmentos de anticorpo pela fusão com a proteína menor da cápside plll. Os fragmentos de anticorpos podem ser visualizados como fragmentos Fv de cadeia única, na qual os domínios VH e VL estão ligados na mesma cadeia polipeptídicas por um polipeptídeo espaçador flexível, por exemplo, como descrito por Marks et al., J. Moi Biol., 222: 581-597 (1991), ou como fragmentos Fab, na qual, uma cadeia está fundida na plll e a outra é secretada no periplasma da célula bacteriana hospedeira onde montagem de uma estrutura protéica cápside-Fab, é exibida na superfície do fago pela deslocação de algumas das proteínas da cápside tipo selvagem, por exemplo, como descrito em Hoogenboom et ai, Nuci Acids Res., 19: 4133-4137 (1991).

Em geral, os ácidos nucléicos que codificam genes de fragmentos de anticorpo são obtidos a partir de células imunitárias colhidas de seres humanos ou animais. Se uma biblioteca induzida a favor de clones de anti- poliubiquitina é desejada, o indivíduo é imunizado com poliubiquitina para gerar uma resposta imunitária, e as células esplênicas e/ou células B circulantes ou outros linfócitos do sangue periférico (PBLs) são recuperadas para a construção da biblioteca. Em um exemplo de realização, uma biblioteca de gene de anticorpo humano é induzida a favor de clones anti-poliubiquitina humana é obtida gerando uma resposta ao anticorpo anti-poliubiquitina humano em ratos transgênicos portador de um gene funcional de imunoglobulina humana (e com ausência de um sistema de produção de anticorpo endógena) assim, a imunização com poliubiquitina dá origem a células B que produzem anticorpos humanos contra poliubiquitina. A geração de ratos transgênicos que produzem anticorpos humanos está descrito na Seção (III) (b) a seguir.

Enriquecimento suplementar para a população de células reativas anti-poliubiquitina pode ser obtido utilizando um processo de seleção para se isolar células B que expressam anticorpos na membrana que se ligam especificamente à poliubiquitina, por exemplo, a separação de células utilizando a cromatografia por afinidade ou adsorção de células com poliubiquitina marcada com fluorocromo seguido pelo uso de um classificador de células fluorescentes ativadas (FACS).

Alternativamente, a utilização de células esplênicas e/ou células B ou outras PBLs de um doador não imunizado proporciona uma melhor representação das possíveis repertórios de anticorpos, e também permite a construção de uma biblioteca de anticorpo utilizando qualquer animal (humano ou não-humanos) na qual a poliubiquitina não é antigênica. Para bibliotecas incorporando a construção de genes de anticorpos in vitro, células tronco são colhidas a partir do indivíduo para fornecer ácidos nucléicos que codificam frações de gene de anticorpos desarranjados. As células imunes de interesse podem ser obtidas a partir de uma variedade de espécies animais, tais como humanos, camundongos, ratos, lagomorfos, luprinos, caninos, felinos, suínos, bovinos, eqüinos e espécies aviárias, etc.

Ácidos nucléicos que codificam segmentos de gene do anticorpo variável (incluindo os segmentos VH e VL) são recuperados das células de interesse e amplificados. No caso de bibliotecas de genes de VH e VL rearranjados, o DNA desejado pode ser obtido isolando o DNA genômico ou RNAm de linfócitos seguido pela reação em cadeia da polimerase (PCR) com primers correspondentes a 5 'e 3' dos genes VH e VL rearranjados como descrito em Orlandi et ai, Proc. Natl. Acad. Sei. (USA), 86:3833-3837 (1989), tornando assim diverso o repertório de genes V para a expressão. Os genes V podem ser amplificados a partir do cDNA e DNA genômico, com a volta dos primers ao final 5' do exon que codifica o domínio V maduro e transmitir primers baseados no segmento-J, tal como descrito em Orlandi et al. (1989) e em Ward et al., Nature, 341: 544-546 (1989). No entanto, para a amplificação de cDNA, os primers anti-sense também podem ser baseados no exon líder como descrito em Jones et al., Biotechnol., 9:88-89 (1991), e com primer sense dentro da região constante, tal como descrito em Sastry et al ., Proc. Nati Acad. Sei. (USA), 86:5728-5732 (1989). Para maximizar a complementaridade, um enfraquecimento pode ser incorporado aos primers, tal como descrito em Orlandi et ai (1989) ou Sastry et al. (1989). Em certos exemplos de realização, a diversidade da biblioteca é maximizada por PCR usando primers voltados para cada gene da família V, a fim de completar todos os arranjos VH e VL disponíveis presentes na amostra de ácido nucléico das células imunitárias, por exemplo, como descrito no método de Marks et al., J. Moi Biol., 222: 581-597 (1991) ou conforme descrito no método de Orum et aí., Nucleic Acids Res., 21: 4491-4498 (1993). Para a clonagem do DNA amplificado em vetores de expressão, raros sítios restrição pode ser introduzida dentro de um primer de PCR como um marcador em uma extremidade, tal como descrito em Orlandi et al. (1989), ou por uma amplificação por PCR adicional com um primer marcado como descrito em Clackson et ai, Nature, 352: 624-628 (1991).

Repertórios de genes V sintéticos rearranjados podem ser obtidos in vitro a partir de segmentos de genes V. A maior parte dos segmentos de genes humanos VH foram clonados e seqüenciados (descrito em Tomlinson et al., J. Mol. Biol., 227: 776-798 (1992)), e mapeados (descrito em Matsuda et al., Nature Genet., 3: 88-94 (1993); estes segmentos clonados (incluindo todas as principais conformações da alça H1 e H2) podem ser usados para gerar diversos repertórios de gene VH com prímers de PCR codificando alças H3 de diversas ordem e comprimento, tal como descrito em Hoogenboom e Winter, J. Mol. Biol., 227: 381-388 (1992). Repertórios de VH também podem ser feitos com toda a diversidade da seqüência centrada em uma alça longa H3 de um único comprimento, tal como descrito em Barbas et aí., Proc. Nati Acad. Sei. USA, 89:4457-4461 (1992). Segmentos Vk e Vλ humanos foram clonados e seqüenciados (descrito em Williams e Winters, Eur. J. Immunol., 23: 1456-1461 (1993)) e podem ser usados para fazer repertórios sintéticos de cadeia leves. Repertórios sintéticos de gene V, com base em VH e VL, e comprimento H3 e L3, irá codificar anticorpos de considerável diversidade estrutural. Após a amplificação do DNA do gene codificador de V, segmentos germinal do gene V podem ser reorganizados, in vitro, de acordo com os métodos de Hoogenboom e Winter, J. Moi Biol., 227: 381-388 (1992).

Repertórios de fragmentos de anticorpos podem ser construídos pela combinação de repertórios de genes VH e VL em conjunto de várias maneiras. Cada repertório pode ser criado em diferentes vetores, e os vetores podem ser recombinados in vitro, por exemplo, como descrito em Hogrefe et ai, Gene, 128:119-126 (1993), ou in vivo por infecção combinatória, por exemplo, o sistema IoxP descrito em Waterhouse et ai., Nucl. Acids Res., 21: 2265-2266 (1993). A abordagem da recombinação in vivo explora a natureza das duas cadeias do fragmento Fab de ultrapassar o limite no tamanho da biblioteca impostas pela eficiência de transformação da E. coli. Repertórios VL e VH naives são clonados separadamente, um em um fagomídeo e o outro em um vetor fago. As duas bibliotecas são então combinadas pela infecção do fago na bactéria contendo o fagomídeo de modo que cada célula contenha uma combinação diferente e o tamanho da biblioteca é limitada apenas pelo número de células presentes (cerca de 1012 clones). Ambos os vetores contêm sinais de recombinação in vivo de modo que os genes VH e VL são recombinados em uma única replicação e são co-encapsuladas nos viriões de fagos. Estas bibliotecas enormes oferecem um grandes números de diversos anticorpos de boa afinidade (Kd"1 de cerca de 10"8 M).

Alternativamente, os repertórios podem ser clonados seqüencialmente no mesmo vetor, por exemplo, tal como descrito em Barbas et ai, Proc. Nati. Acad. Sei. USA, 88:7978-7982 (1991), montadas em conjunto por PCR e, em seguida, clonadas, por exemplo, como descrito por Clackson et ai., Nature, 352: 624-628 (1991). A montagem do PCR também pode ser usada para unir os DNAs de VH e VL com o DNA que codifica um peptídeo espaçador flexível para formar um Fv de cadeia única (scFv). Ainda em outra técnica, "montagem de PCR na célula" é usada para combinar os genes VH e VL dentro de linfócitos por PCR e, em seguida, clonar os repertórios de genes ligados, tal como descrito por Embleton et ai, Nucl. Acids Res., 20: 3831-3837 (1992). A triagem das bibliotecas pode ser obtida por qualquer técnica conhecida no estado da arte. Por exemplo, a poliubiquitina pode ser utilizada para o revestimento de poços de placas de adsorção, ser expressas em células hospedeiras colocada em placas de adsorção ou utilizadas na triagem de células, ou conjugadas a uma biotina para capturar esferas revestidas de estreptoavidina, ou utilizado em qualquer outro método conhecido para expor as bibliotecas de exibição por fago.

As amostras da biblioteca de fagos são expostas à poliubiquitina imobilizada em condições adequadas para a ligação de pelo menos uma porção das partículas do fago com o adsorvente. Normalmente, as condições, incluindo pH, força iônica, temperatura e similares são selecionados para simular condições fisiológicas. Os fagos ligados à fase sólida são lavados e, em seguida, eluídos em ácido, por exemplo, como descrito em Barbas et ai, Proc. Nati Acad. Sci USA, 88: 7978-7982 (1991), ou por alcalino, por exemplo, como descrito em Marks et ai, J. Mol. Bioi, 222: 581-597 (1991), ou por competição com o antígeno poliubiquitina, por exemplo, em um processo semelhante ao método de competição por antígeno de Clackson et ai, Nature, 352: 624-628 (1991). Os fagos podem ser enriquecido de 20-1000 vezes em um único ciclo de seleção. Além disso, os fagos enriquecidos podem ser cultivados em culturas bacterianas sujeitas a novos ciclos de seleção.

A eficiência da seleção depende de vários fatores, incluindo a cinética de dissociação durante a lavagem, e se múltiplos fragmentos de anticorpo em um único fago pode se acoplar simultaneamente com o antígeno. Anticorpos com rápida dissociação cinética (e fraca afinidade de ligação) podem ser retidos pelo uso de lavagens curtas, exibindo fagos multivalentes e uma baixa densidade de revestimento de antígenos em fase sólida. A elevada densidade não apenas estabiliza o fago através de interações polivalentes, mas favorece a re-ligação do fago dissociado. A seleção de anticorpos com dissociação cinética lenta (e boa afinidade de ligação) pode ser promovida através da utilização de lavagens longas e exibição de fagos monovalentes, tal como descrito em Bass et al., Proteins, 8: 309-314 (1990) e no documento WO 92/09690, e uma baixa densidade de revestimento de antígenos, tal como descrito em Marks et al., Biotechnol., 10:779-783 (1992).

É possível selecionar entre anticorpos de fagos de diferentes afinidades, mesmo com afinidades que diferem ligeiramente, para poliubiquitina. No entanto, mutações aleatórias de um anticorpo selecionado (por exemplo, as realizadas em algumas das técnicas de maturação por afinidade) é susceptível a originar muitos mutantes, mais ligantes ao antígeno, e alguns com maior afinidade. Com a limitação da poliubiquitina, raros fagos de alta afinidade fago poderiam competir. Para manter a maior afinidade de todos os mutantes, os fagos podem ser incubados com excesso de poliubiquitina biotinilada, mas com uma concentração de poliubiquitina biotinilada de molaridade menor do que a constante molar de afinidade ao alvo para a poliubiquitina. Fagos de alta afinidade de ligação podem então ser capturados por esferas paramagnéticas revestidas de estreptoavidina. Tal "equilíbrio de captura" permite que os anticorpos sejam selecionados de acordo com as suas afinidades de ligação, com sensibilidade que permita o isolamento de clones mutantes com uma afinidade de algo em torno de duas vezes maior que a afinidade de um grande excesso de fagos com menor afinidade. As condições utilizadas para a lavagem de ligados a fase sólida também podem ser manipuladas para distinguir com base da dissociação cinética.

Os clones de anti-poliubiquitina atividade pode ser selecionado ativamente. Em um exemplo de realização, a invenção fornece anticorpos anti- poliubiquitina que bloqueiam a ligação entre um ligante de poliubiquitina e uma poliubiquitina, mas não bloqueia a ligação entre um ligante de poliubiquitina e uma segunda proteína. Clones Fv correspondentes a esses anticorpos anti- poliubiquitina podem ser selecionados: (1) isolando clones anti poliubiquitina a partir da biblioteca de fagos com descrito na sessão B (I) (2) acima e, opcionalmente, amplificando as populações de clones de fagos isolados pelo crescimento em uma bactéria hospedeira adequada; (2) selecionando a poliubiquitina e uma segunda proteína contra a proteína que bloqueia e a proteína que não bloqueia a atividade que respectivamente, é desejada; (3) adsorvendo o clone de fago anti-poliubiquitina para a poliubiquitina imobilizada; (4) utilizando um excesso da segunda proteína para eluir qualquer clone indesejável que reconheça a ligação de poliubiquitina determinante que se sobrepõem ou é partilhada com o determinante de ligação da segunda proteína, e (5) eluindo os clones que continuam a ser absorvidos no passo seguinte (4). Opcionalmente, os clones com as propriedades de bloqueio ou não bloqueio desejada ainda podem ser enriquecidos repetindo os procedimentos de seleção descritos no presente por uma ou mais vezes.

O DNA codificador dos clones Fv é facilmente isolado e seqüenciado utilizando procedimentos convencionais (utilizando, por exemplo, sondas de oligonucleotídeos que sejam capazes de ligar-se especificamente a genes codificadores das cadeias pesada e leve de interesse a aprtir do hibridoma ou modelo de DNA do fago). Uma vez isolado, o DNA pode ser colocado em vetores de expressão, que são transfectados em seguida para células hospedeiras, tais como células de E. coli, células COS de símios, células de Ovário de Hamster Chinês (CHO) ou células de mieloma que, de outra forma, não produzem proteína imunoglobulina, para obter a síntese de anticorpos monoclonais nas células hospedeiras recombinantes. Os artigos de análise sobre a expressão recombinante em bactérias de DNA que codifiquem o anticorpo incluem Skerra et al., Curr. Opinion in Immunol., 5: 256-262 (1993) e Plückthun, Immunol. Revs., 130: 151-188 (1992).

O DNA codificador dos clones Fv da invenção pode ser combinado com seqüências de DNA conhecidas codificadoras das regiões constantes de cadeia pesada e/ou leve (por exemplo, as seqüências adequadas de DNA podem ser obtidas a partir de Kabat et al., Supra) para formar clones que codificam as cadeias pesadas/leves de comprimento total ou parcial. Será apreciado se as regiões constante de qualquer isotipo possa ser utilizada para este fim, incluindo as regiões constantes de IgG1 IgM, IgA1 IgD1 IgE1 e que tais regiões constantes possam ser obtidas a partir de qualquer espécie animal ou humana. Um clone Fv derivado do DNA de um domínio variável de um animal (como o humano) e, em seguida, fundido em um DNA de uma região constante de outra espécie animal para formar seqüência(s) "hibrida(s)", o comprimento completo da cadeia pesada e/ou leve está incluído na definição de anticorpo "quimérico" e "híbrido" como utilizado no presente. Em um exemplo de realização, um clone Fv derivado do DNA humano variável é fundido à seqüência de DNA da região constante humana para formar unria(s) seqüência(s) de codificação(ões) totalmente humana, de comprimento da cadeia pesada e/ou leve completa ou parcial.

Os anticorpos produzidos por bibliotecas naives (tanto naturais quanto sintéticas) podem ser de afinidade moderada (Kd"1 de cerca de 106 a 107 M"1), mas a afinidade por maturação também pode ser mimetizada in vitro e re-selecionada pela construção de bibliotecas secundárias, tal como descrito em Winter et aí. (1994), supra. Por exemplo, a mutação pode ser introduzida de forma aleatória, in vitro, utilizando uma polimerase propensa ao erro (descrito em Leung et al, Technique, 1: 11-15 (1989)) no método de Hawkins et al., J. Moi. Bioi., 226: 889-896 (1992) ou no método de Gram et al., Proc. Nati Acad. Sei. USA, 89: 3576-3580 (1992). Adicionalmente, a afinidade maturação pode ser realizada por uma mutação aleatória em um ou mais CDRs, por exemplo, utilizando primers de PCR que levam a seqüência aleatória abrangendo todo o CDR de interesse, selecionados em cada clone Fv e selecionando clones de maior afinidade. O documento WO 9607754 (publicado em 14 de Março de 1996) descreve um método para induzir a mutagênese em uma região determinante de complementaridade de uma cadeia leve de imunoglobulina para criara uma biblioteca de genes de cadeia leve. Outro método eficaz é recombinar os domínios VH ou VL selecionados por exibição de fagos com repertórios de ocorrência natural de variantes do domínio V não imunizados obtidos a partir de doadores e selecionados para maior afinidade em vários ciclos de reorganização da cadeia, tal como descrito em Marks et ai, Biotechnoi, 10 : 779-783 (1992). Esta técnica permite a produção de anticorpos e fragmentos de anticorpos com afinidades na faixa de 10"9 M.

Outros Métodos de Produção de Anticorpos Anti-Poliubiquitina

Outros métodos de gerar e avaliar a afinidade de anticorpos são bem conhecidas na estado da técnica, por exemplo, em Kohler et ai, Nature 256: 495 (1975); Patente US 4.816.567; Goding, Monoclonal Antibodies:

Principies and Practice, Págs.. 59-103 (Academic Press, 1986; Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Produetion Teehniques and Applications, pp. 51-63 (Mareei Dekker Inc., Nova Iorque, 1987; Munson et ai, Anal. Biochem., 107:220 (1980) e Engels et ai, Agnew. Chem. Int. Ed. Engi, 28: 716-734 (1989); Abrahmsen et al., EMBO J., 4: 3901 (1985); Methods in Enzymology, vol. 44 (1976); Morrison et al., Proe. Natl. Aead. Sei. USA, 81: 6851-6855 (1984).

Métodos Gerais Em geral, a invenção fornece anticorpos anti-poliubiquitina que sejam úteis no tratamento de distúrbios mediados pela poliubiquitina no qual um bloqueio parcial ou total de uma ou mais atividades da poliubiquitina é desejada. Em um exemplo de realização, os anticorpos anti-poliubiquitina da invenção são utilizados para o tratamento do câncer. Em outro exemplo de realização, os anticorpos anti-poliubiquitina fornecidos pelo presente são utilizados para tratar distúrbios musculares, como os acima indicados. Em outro exemplo de realização, os anticorpos anti-poliubiquitina fornecidas pelo presente são utilizados para tratar distúrbios neurológicos, tais como os acima indicados. Em outro exemplo de realização, os anticorpos anti-poliubiquitina fornecidas pelo presente são utilizados para tratar doenças genéticas. Em outro exemplo de realização, os anticorpos anti-poliubiquitina aqui fornecidos são utilizados para tratar doenças autoimunes/inflamatórias.

As propriedades únicas dos anticorpos anti-poliubiquitina da invenção faz destes particularmente úteis na distinção entre as diferentes formas de ligações de lisinas da poliubiquitina em um sistema celular sem recorrer à manipulação genética excessivamente trabalhosa e dispendiosa ou a métodos biofísicos tais como espectrometria de massa. Os anticorpos anti- poliubiquitina da invenção podem ser usados para caracterizar a(s) função(ões) e atividades específicas das poliubiquitinas ligadas a lisina de maneira in vitro e in vivo. Os anticorpos anti-poliubiquitina da invenção também pode ser utilizados para determinar o papel específico das poliubiquitinas ligadas à lisina no desenvolvimento e na patogênese das doenças. Os anticorpos anti- poliubiquitina da invenção podem ainda ser utilizados para tratar doenças nas quais uma ou mais poliubiquitinas ligadas à lisina específicas estão reguladas ou funcionando de maneira aberrante, sem interferir com a atividade normal das poliubiquitinas para a qual o anticorpo anti-poliubiquitina não é específico.

Em outro aspecto, os anticorpos anti-poliubiquitina da invenção são úteis como reagentes para detecção e isolamento da poliubiquitina de ligações de lisina específicas, tais como a detecção de poliubiquitina em diversos tipos de células e tecidos, incluindo a determinação da densidade e distribuição da poliubiquitina nas populações de células, e em um determinado tipo celular, e de seleção de células com base na presença ou quantidade de poliubiquitina. Ainda em outro aspecto, os anticorpos anti-poliubiquitina do presente são úteis para o desenvolvimento de antagonistas de poliubiquitina que bloqueiam a atividade de padrões semelhantes aos dos anticorpos da presente invenção. Por exemplo, um anticorpo anti-poliubiquitina ligada à K48 da invenção pode ser usado para determinar e identificar outros anticorpos que possuí a mesma característica de ligação ou capacidade de bloquear as vias de sinalização mediada pela poliubiquitina ligada à K63. Do mesmo modo, um anticorpo anti-poliubiquitina ligada à K63 da invenção pode ser usado para determinar e identificar outros anticorpos que possuí a mesma característica de ligação ou capacidade de bloquear as vias de sinalização mediada pela poliubiquitina ligada à K63.

Como um exemplo adicional, os anticorpos anti-poliubiquitina da invenção podem ser utilizados para identificar outros anticorpos anti- poliubiquitina que se ligam de forma considerável ao(s) mesmo(s) determinante(s) antigênico(s) da poliubiquitina como os anticorpos exemplificado η presente, incluindo epítopos lineares e conformacionais.

Os anticorpos anti-poliubiquitina da invenção podem ser utilizados em ensaios baseados nas vias de sinalização fisiológicas em que a poliubiquitina está envolvida para selecionar antagonista de pequena molécula da poliubiquitina com uma ou mais ligações específicas de Iisina que desempenhará efeitos farmacológicos semelhantes ao bloqueio da ligação de uma ou mais parceiros de ligação da poliubiquitina com uma ou mais ligações de lisina. Por exemplo, a poliubiquitina ligada à K48 é conhecida por estar envolvida na degradação segmentada proteassomal de certas proteínas (vide, por exemplo, Chau et al., Science. 243: 1576-1583 (1989); Finley et al., Mol. Ceti Biol. 14: 5501-5509 (1994); Flick et al., Nat. Cell. Biol. 6:634-641 (2004)); assim anticorpos anti-poliubiquitina ligada à K48 podem ser utilizados na triagem para identificar pequenas moléculas antagonistas da degradação proteasomal mediada pela poliubiquitina ligada à K48 pela comparação da atividade de uma ou mais pequenas moléculas antagonistas potenciais para a atividade do anticorpo anti-poliubiquitina ligada à K48. Da mesma forma, em outro exemplo, a poliubiquitina ligada à K63 é conhecida por estar envolvida na reparação do DNA (vide, por exemplo, Pickart e Fushman, Curr. Opin. Chem. Biol. 8:610-616 (2004)), e, assim, a atividade dos anticorpos anti-poliubiquitina ligada à K63 para antagonizar uma via de reparo de DNA pode ser comparada com a atividade de uma ou mais pequenas moléculas antagonistas de poliubiquitina ligada à K63 potenciais da reparação de DNA nesta mesma via. Da mesma forma, em outro exemplo, a poliubiquitina ligada à K63 é conhecida por estar envolvida na formação de corpos de Lewy na doença de Parkinson (vide, por exemplo, Lim et al., J. Neurosci. 25 (8):2002-9 (2005)), e, assim, a atividade do anticorpo anti-poliubiquitina ligada à K63 em antagonizar a formação de corpos de Lewy podem ser comparadas com a atividade de uma ou mais pequenas moléculas antagonistas de poliubiquitina ligada à K63 em antagonizar a formação de corpos de Lewy.

A produção de anticorpos candidatos pode ser feita utilizando técnicas conhecidas no estado da arte, incluindo os métodos aqui descritos, tais como a técnica de hibridoma e a seleção de bibliotecas de moléculas ligantes exibidas por fagos. Estes métodos são bem estabelecidos no estado da arte.

Resumidamente, os anticorpos anti-poliubiquitina da invenção podem ser produzidos utilizando bibliotecas combinatórias para a seleção de clones de anticorpos sintéticos com a desejada atividade de ligação. Em princípio, os clones de anticorpos sintéticos são selecionados pela triagem de bibliotecas de fagos contendo fagos que exibem vários fragmentos da região variável (Fv) de anticorpos fundidos na cápside do fago. Essas bibliotecas são submetidas à cromatografia por afinidade contra o antígeno desejado. Clones que expressam fragmentos Fv capazes de se ligar ao antígeno desejado são adsorvidos pelo antígeno e, assim, separados dos clones não Iigantes na biblioteca. Os clones Iigantes são então eluídos do antígeno, e podem ainda ser enriquecidos por ciclos adicionais de adsorção/eluição ao antígeno.

Qualquer dos anticorpos anti-poliubiquitina da invenção pode ser obtido pela concepção de um processo adequado de triagem com antígeno para selecionar o fago clone de interesse seguido pela construção de um anticorpo anti- poliubiquitina de comprimento total usando as seqüências Fv a partir do fago clone de interesse adequada as seqüências da região constante (Fc) descritas em Kabat et ai, Sequences of Proteins of Immunological Interest, quinta edição, National Institutes of Health, Bethesda, MD, (1991), vols. 1-3. Vide também, o documento WO 03/102157, e as referências aí citadas.

Em um exemplo de realização, os anticorpos anti-poliubiquitina da invenção são monoclonais. Também se encontram dentro do escopo da presente invenção fragmentos de anticorpos, tais como fragmentos Fab, Fab ', Fab'-SH e F(ab')2, e variantes destes, dos anticorpos anti-poliubiquitina previsto no presente. Estes fragmentos de anticorpos podem ser criados por métodos tradicionais como, por exemplo, pela digestão enzimática, ou podem ser gerados por técnicas recombinantes. Esses fragmentos de anticorpos podem ser fragmentos de anticorpos quiméricos, humanos ou humanizados. Esses fragmentos de anticorpos são úteis para os propósitos experimentais, diagnósticos e terapêuticos aqui definidos.

Os anticorpos monoclonais podem ser obtidos a partir de uma população de anticorpos substancialmente homogêneos, isto é, os anticorpos individuais que compreendem a população são idênticos, exceto por possíveis mutações de ocorrência natural que podem estar presentes em quantidades menores. O adjetivo "monoclonal" indica o caráter do anticorpo como não sendo uma mistura de anticorpos parecidos. Os anticorpos monoclonais anti-poliubiquitina da invenção podem ser produzidos por uma variedade de métodos conhecidos no estado da técnica, incluindo o primeiro método de hibridoma descrito por Kohler et al., Nature, 256:495 (1975), ou, alternativamente, podem ser produzidos por métodos de DNA recombinante (por exemplo,Patente US 4.816.567).

Vetores, Células Hospedeiras ε Métodos Recombinantes

Para a produção recombinante de um anticorpo da invenção, os ácidos nucléicos que codificadores são isolados e inseridos em um vetor replicável para a clonagem (amplificação do DNA) ou para a expressão. Codificando o DNA o anticorpo é facilmente isolado e seqüenciado utilizando procedimentos convencionais (por exemplo, pela utilização de sondas de oligonucleotídeos que são capazes de se ligar especificamente aos genes codificadores das cadeias leves e pesadas do anticorpo). Muitos vetores estão disponíveis. A escolha do vetor depende em parte da célula hospedeira que será utilizada. Células hospedeiras incluem, mas sem limitar-se a, células de origem procariótica ou eucariótica (geralmente de mamíferos). Será apreciado que regiões constante de qualquer isotipo possam ser utilizados para este fim, incluindo as regiões constantes de IgG, IgM, IgA, IgD e IgE, e que tais regiões constantes possam ser obtidas a partir de humano ou qualquer espécie animal.

Produção de Anticorpos Utilizando Células Hospedeiras Procarióticas Construção de Vetor

Seqüências polinucleotídicas codificadoras de polipeptídeos componentes do anticorpo da invenção podem ser obtidas utilizando técnicas padrões de recombinação. As seqüências polinucleotídicas desejadas podem ser isoladas e seqüenciadas de células produtoras de anticorpos, como células de hibridomas. Alternativamente, polinucleotídeos podem ser sintetizados utilizando sintetizadores de polinucleotídeos ou técnicas de PCR. Uma vez obtido, as seqüências codificadoras de polipeptídeos são inseridas em um vetor recombinante capaz de replicar e expressar os polinucleotídeos heterólogos em hospedeiros procarióticos. Muitos vetores que estão disponíveis e são conhecidos no estado da técnica podem ser utilizados para os fins da presente invenção. A seleção de um vetor apropriado vai depender principalmente do tamanho dos ácidos nucléicos a serem inseridos no vetor e a célula hospedeira específica a ser transformada com o vetor. Cada vetor contém diversos componentes, dependendo de sua função (amplificação ou expressão de polinucleotídeos heterólogos, ou ambos), e de sua compatibilidade coma a célula hospedeira particular na qual reside. Os componentes dos vetores geralmente incluem, mas não estão limitados a: uma origem de replicação, um gene marcador de seleção, um promotor, um local de ligação do ribossomo (RBS), um seqüência sinalizadora, a inserção do ácido nucléico heterólogo e uma seqüência de terminação de transcrição.

Geralmente, vetores recombinantes que contêm seqüências de controle e de réplica que são derivadas de espécies compatíveis com a célula hospedeira são utilizados na conecção com estas hospedeiras. O vetor normalmente conduz como componentes da cadeia principal uma origem de local de reprodução, bem como seqüências de marcação que são capazes de fornecer seleção fenotípica em células transformadas. Por exemplo, a E. co//',é tipicamente, transformada utilizando um pBR322, um plasmídeo obtido a partir de uma espécie E. coli. pBR322 que possui os genes que conferem a resistência a ampicilina (Amp) e a tetraciclina (Tet) e, portanto, fornece meios para a identificação de células transformadas. As pBR322, seus derivados, ou outros plasmídeos microbianos ou bacteriófagos também pode conter, ou serem modificados por, promotores, que pode ser utilizados pelo organismo microbiano para a expressão de proteínas endógenas. Exemplos de derivados de pBR322 utilizados para a expressão de anticorpos específicos são descritos em detalhes em Carter et al, Patente US 5.648.237. Além disso, vetores de fagos que contêm seqüências de controle e de réplica que são compatíveis com o microorganismo hospedeiro podem ser utilizados como vetores de transformação em conexão com esses hospedeiros. Bacteriófago tal como XGEM.TM.-11, por exemplo, pode ser utilizado na fabricação de vetor recombinante que pode ser utilizado para transformar células hospedeiras suscetíveis tais como a E. coli LE392.

O vetor de expressão da invenção pode incluir dois ou mais pares promotores de cístrons, codificando cada componente do polipeptídeo. O promotor é uma seqüência de regulação não traduzida localizada à montante (5') de um cístron que modula a sua expressão. Promotores de procariotos geralmente se enquadram em duas classes, os induzíveis e os constitutivos. Os promotores induzíveis são promotores que iniciam níveis aumentados de transcrição do cístron sob seu controle em resposta a mudanças na condição de cultura, por exemplo, a presença ou ausência de um nutriente ou de uma mudança na temperatura.

Uma grande quantidade de promotores é reconhecida por uma série de células hospedeiras potenciais. O promotor selecionado pode estar operavelmente ligado a um DNA cístron que codifica a cadeia leve ou pesada, ao remover o promotor do DNA fonte por meio de enzimas de restrição e inserindo a seqüência do promotor isolado no vetor da invenção. Tanto a seqüência promotora nativa e muitos promotores heterólogos podem ser utilizados para dirigir, pois eles geralmente permitem maior transcrição e rendimentos mais altos de gene alvo expresso em comparação ao promotor nativo.

Os promotores apropriados para uso com hospedeiros procarióticos incluem o promotor phoA, sistemas promotores de Iactose e β- lactamase, sistema promotor de triptofano (trp) e promotores híbridos, tais como o promotor tac ou trc. Entretanto, outros promotores que são funcionais em bactérias (tais como outros promotores de fagos ou bacterianos conhecidos) também são apropriados. Suas seqüências de nucleotídeos foram publicadas, de forma a permitir que os técnicos no assunto as liguem operativamente a unidades de transcrição que codificam cadeias leve e pesada alvo (Siebenlist et al, Cell, 20: 269 (1980)) utilizando Iigantes ou adaptadores para fornecer quaisquer locais de restrição necessários.

Em um aspecto da invenção, cada cístron no vetor recombinante compreende um componente da seqüência sinalizadora de secreção que leva a translocação dos polipeptídeos expressos através de uma membrana. De forma geral, a seqüência sinalizadora pode ser um componente do vetor ou pode ser uma parte do DNA do polipeptídeo alvo que é inserido no vetor. A seqüência sinalizadora de secreção selecionada para os propósitos de acordo com a presente invenção deverá ser uma que seja reconhecida e processada (ou seja, clivada por uma peptidase sinalizadora I) pela célula hospedeira. Para células hospedeiras procarióticas que não reconhecem e processam as seqüências sinalizadora nativas para os polipeptídeos heterólogos, a seqüência sinalizadora é substituída por uma seqüência sinalizadora procariótica selecionada, por exemplo, a partir do grupo que consiste de fosfatase alcalina, penicilinase, Ipp ou líderes de enterotoxina II estáveis ao calor (STII), LamB, PhoE, PeIB, OmpA e MBP. Em um exemplo de realização, a seqüência sinalizadora utilizada em ambas os cístrons do sistema de expressão é uma seqüência sinalizadora STII ou variante desta.

Em uma realização, a produção de imunoglobulinas pode ocorrer no citoplasma das células hospedeiras, e assim não necessitando da presença das seqüências sinais de secreção dentro de cada cístron. A este respeito, a cadeia leve e pesada da imunoglobulina são expressas, em dobro e reunidas para formar imunoglobulinas funcionais no citoplasma. Determinadas linhagens de células hospedeiras (por exemplo, linhagens de E.Coli trxB) fornecem condições citoplásmicas que favorecem a formação de pontes de dissulfeto, permitindo desta forma a dobradiça e reunião apropriada das subunidades das proteínas expressas. (Proba e Plukthun, Gene, 159:203(1995)).

Os anticorpos da invenção também podem ser produzidos através de um sistema em na qual a relação quantitativa do componente de polipeptideo expresso pode ser modulado de forma a maximizar o rendimento do anticorpo secretado e devidamente montada da invenção. Essa modulação é realizada, pelo menos em parte, pela modulação translacional das fitas simultaneamente paro os componentes do polipeptideo.

Uma técnica para modular a força de tradução é descrita em

Simmons et ai, Patente US 5.840.523. São utilizadas variantes da região de início da tradução (TIR) em um cístron. Para uma dada TIR1 uma série de seqüência de aminoácido ou ácido nucléico variante podem ser criadas com uma variação nas forças de tradução, fornecendo desta forma meios convenientes para ajustar este fator para o nível de expressão desejado da cadeia específica. Variantes TIR podem ser geradas a partir de técnicas de mutagênese convencionais que resultam em alterações nos códons que podem alterar a seqüência de aminoácido, embora alterações silenciosas na seqüência de nucleotídeo sejam preferidas. Alterações na TIR podem incluir, por exemplo, alterações no número ou espaçamento das seqüências Shine- Dalgamo1 junto com alterações na seqüência sinalizadora. Um método preferido para a geração de seqüências sinalizadoras mutantes é a geração de um "banco de códon" no começo da seqüência de codificação que não altera a seqüência de aminoácido da seqüência de sinalizadora (ou seja, as alterações são silenciosas). Esta pode ser realizada através da alteração da terceira posição de nucleotídeo de cada códon; adicionalmente, alguns aminoácidos, tais como leucina, serina, e arginina, possuem primeira e segunda posições múltiplas que podem adicionar complexidade na produção do banco. Dito método de mutagênese é descrito em detalhes em Yansura et ai, (1992), METHODS: A Companion to Methods in Enzymol., 4:151-158.

Em um exemplo de realização, um conjunto de vetores é gerado com uma faixa de concentração de TIR para cada cístron presente. Este conjunto limitado fornece uma comparação dos níveis de expressão de cada cadeia bem como o rendimento dos produtos de comprimento total sob várias combinações de concentração de TIR. As concentrações de TIR podem ser determinadas pela quantificação do nível de expressão de um gene relatado como descrito em Simmons et ai, Patente US 5. 840.523. Com base na comparação da força de tradução, TIRs individuais desejadas são selecionadas para serem combinadas em construções de vetores de expressão da presente invenção.

Os procariontes apropriados para este propósito incluem arquebactéria e eubactérias, tais como organismos gram-negativos ou gram- positivos. Exemplos de bactérias úteis incluem Escherichia (por exemplo, E. coli), bacilos (por exemplo, B. subtilis), Enterobactérías, espécies de Pseudomonas (por exemplo, Pseudomonas aeruginosa), Salmonella Typhimurium, Serratia marcescans, Klebsiella, Proteus, Shigella, Rhizóbia, Vitreoscilla ou Paracoccus. Em um exemplo de realização, células gram- negativas são usadas. Em um exemplo de realização, células E. coli são usadas como hospedeiras para a invenção. Exemplos incluem cepas de E. coli cepa W3110 (Bachmann, Cellular and Molecular Bioloav, vol. 2 (Washington, D.C.: American Society for Microbiology, 1987), págs. 1190-1219; Depósito ATCC No. 27325) e seus derivados, incluindo as cepas 33D3 possuindo os genótipos W3110 Δ fhuA (Δ to η A) ptr3 Iac Iq lacL8 Δ ompT Δ (nmpc-fepE) degP41 kanR (Patente US 5.639.635). Outras cepas e seus derivados, tais como E. coli 294 (ATCC 31446), E. coli Β, E. coli 1776 (ATCC 31537) e E. coli RV308 (ATCC 31608) também são adequadas. Estes são exemplos preferencialmente ilustrativos do que limitadores. Métodos para a construção de derivados de qualquer uma das bactérias acima mencionadas que possuem o genótipo definido são conhecidas no estado da técnica, por exemplo, em Bass et al, Proteins, 8:309-314 (1990). Geralmente é necessário selecionar as bactérias adequadas levando em consideração a replicabilidade do replicon nas células bacterianas. Por exemplo, as espécies E. coli, Serratia ou Salmoriella podem ser devidamente utilizadas como hospedeiras, quando plasmídeos bem conhecidos, tais como os plasmídeos pBR322, pBR325, pACYC177 ou pKN410 são utilizados para a construção do replicon. Normalmente a célula hospedeira deve secretar quantidades mínimas de enzimas proteolíticas, e adicionalmente inibidores da protease podem ser incorporadas na cultura celular.

Produção de Anticorpos

As células hospedeiras são transformadas com os vetores de expressão descritos acima e cultivadas em meios nutrientes convencionais modificados conforme apropriado para a indução de promotores, seleção de transformadores ou amplificação dos genes que codificam as seqüências desejadas.

Transformação significa a introdução de DNA em hospedeiros eucarióticos a fim de que o DNA seja replicável, quer como um elemento extracromossomico ou integrado ao cromossomo. Dependendo da célula hospedeira utilizada, a transformação é feita utilizando técnicas padrão adequada para tais células. O tratamento com cálcio empregando cloreto de cálcio é geralmente utilizado para células bacterianas que contêm parede celular. Outro método de transformação emprega polietileno-glicol / DMSO. Outra técnica ainda utilizada é eletroporação.

As células procarióticas utilizadas para produzir os polipeptídeos de acordo com a presente invenção são cultivadas em meios conhecidos na técnica e são apropriadas para cultivo das células hospedeiras selecionadas. Exemplos de meios apropriados incluem caldo Iuria (LB) mais os suplementos nutrientes necessários. Em realizações preferidas, os meios também contêm um agente de seleção, selecionado com base na construção do vetor de expressão, para permitir seletivamente o crescimento de células procarióticas que contenham o vetor de expressão. A ampicilina é adicionada aos meios, por exemplo, para crescimento de células que expressam o gene resistente à ampicilina.

Quaisquer suplementos necessários além de fontes de carbono, nitrogênio e fosfato inorgânico podem também ser incluídos em concentrações apropriadas introduzidas isoladamente ou na forma de mistura com outro suplemento ou meio, tal como fonte de nitrogênio complexa. Opcionalmente, o meio de cultivo pode conter um ou mais agentes redutores selecionados a partir do grupo que consiste de glutationa, cisteína, cistamina, tioglicolato, ditioeritritol e ditiotreitol.

As células hospedeiras procarióticas são cultivadas sob temperaturas apropriadas. Para crescimento da E. coli, por exemplo, a temperatura preferida varia em cerca de 20 0C a 39°C, de maior preferência entre 25°C a 37°C, e cerca de 30°C. O pH do meio pode ser qualquer pH que entre 5 a 9, dependendo principalmente do organismo hospedeiro. Para a E. coli, o pH é preferencialmente cerca de 6,8 a 7,4, de preferencialmente é 7,0.

Se um promotor induzível é utilizado no vetor de expressão da invenção, a expressão da proteína é induzida em condições adequadas para a ativação do promotor. Em um aspecto da invenção, promotores PhoA são usados para controlar a transcrição de polipeptídeos. Assim, as células são cultivadas em um meio Iimitante de fosfato para a indução. Em exemplo de realização, o meio Iimitante de fosfato é o meio C.R.A.P. (vide, por exemplo, Simmons et ai, J. Immunol. Methods. (2002), 263:133-147). Uma variedade de outros indutores pode ser utilizada, de acordo com o vetor de construção utilizado, como é conhecido no estado da técnica.

Em um exemplo de realização, os polipeptídeos da presente invenção expressos são segregados e recuperados do periplasma das células hospedeiras. A recuperação de proteína envolve tipicamente o rompimento do microorganismo, geralmente por meios tais como choque osmótico, sonicação ou lise. Após o rompimento das células, fragmentos celulares ou células inteiras podem ser removidas por meio de centrifugação ou filtragem. As proteínas podem ser adicionalmente purificadas, por exemplo, por cromatografia de resina de afinidade. Alternativamente, as proteínas podem ser transportadas para o meio de cultivo e nele isoladas. As células podem ser removidas do cultivo e o sobrenadante de cultivo filtrado e concentrado para purificação adicional do polipeptídeo produzido. Os polipeptídeos expressos podem ser adicionalmente isolados e identificados utilizando métodos comumente conhecidos, tais como eletroforese de gel de poliacrilamida (PAGE) e teste Western Blot.

Em um aspecto da invenção, o anticorpo pode ser produzido em grande quantidade por meio de processos de fermentação. Vários procedimentos de fermentação de alimentação de lotes em larga escala são disponíveis para a produção de proteínas recombinantes. As fermentações em larga escala possuem capacidade de pelo menos 1000 litros, preferencialmente de 1000 a 100.000 litros de capacidade. Estes fermentadores utilizam impulsionadores agitadores ou outros meios apropriados para distribuir oxigênio e nutrientes, especialmente glicose (uma fonte de carbono e energia comum). A fermentação em pequena escala refere-se geralmente a fermentação em fermentador que possui capacidade volumétrica de não mais de cerca de 100 litros e pode variar de cerca de um 1 litro a 100 litros.

Em processo de fermentação, a indução da expressão de proteína é tipicamente iniciada após o crescimento das células sob condições apropriadas até densidade desejada, tal como OD550 de cerca de 180 a 220 no qual as células estão no início da fase estacionária. Uma série de indutores pode ser utilizada, de acordo com a construção de vetor empregado, como é conhecido no estado da arte e descrito acima. As células podem ser cultivadas por períodos mais curtos antes da indução. As células são normalmente induzidas por cerca de 12 a 50 horas, embora possa ser utilizado um tempo maior ou menor de indução.

Para aumentar adicionalmente o rendimento de produção e a qualidade do polipeptídeo da presente invenção, várias condições de fermentação podem ser modificadas. Para melhorar a montagem e do anticorpo secretado, por exemplo, vetores adicionais que superexpressam proteínas chaperonas, tais como proteínas Dsb (DsbA, DsbB, DsbC, DsbD e/ou DsbG) ou FkpA (peptidilprolil eis, trans-isomerase com atividade de chaperona), podem ser utilizados para co-transformar as células procarióticas hospedeiras. Demonstrou-se que as proteínas de chaperona facilitam a formação de dobradiça e solubilidade adequadas de proteínas heterólogas produzidas em células hospedeiras bacterianas. Chen et al, J. Bio. Chem., 274: 19601-19605 (1999); Patentes US 6.083.715 e 6.027.888; Bothmann e Pluckthun, J. Biol. Chem., 275: 17100-17105 (2000); Ramm e Pluckthun, J. Biol. Chem., 275: 17106-17113 (2000); Arie et al, Mol. Microbiol., 39: 199-210 (2001).

Para minimizar a proteólise de proteínas heterólogas expressas (especialmente as que são proteoliticamente sensíveis) tal como em células hospedeiras procarióticas, certas linhagens hospedeiras com deficiência para enzimas proteolíticas podem ser utilizadas para a presente invenção. Linhagens de células hospedeiras procarióticas podem ser modificadas, por exemplo, para efetuar mutação(ões) genética(s) nos genes que codificam proteases bacterianas conhecidas, tais como Protease III1 OmpT1 DegP1 Tsp1 TonA1 PhoA1 Protease I1 Protease Mi1 Protease V1 Protease Vl e suas combinações. Algumas linhagens de E. Coli com deficiência de protease são disponíveis e descritas, por exemplo, em Joly et al, (1998) supra; Georgiou et al. Patente US 5.264.365, Georgiou et al. Patente US 5.508.192; Hara et al, Microbial Drug Resistance, 2:63-72 (1996).

Em um exemplo de realização, as cepas de E. coli deficientes de enzimas proteolíticas e transformadas em com um ou mais plasmídeos que superexpressam proteínas chaperonas são utilizados como células hospedeiras no sistema de expressão da invenção.

Purificação de Anticorpo

Em exemplo de realização, A proteína de anticorpo produzida no presente pode ser adicionalmente purificada para se obter preparações que são consideravelmente homogenia para os ensaios e usos. Podem ser empregados métodos padrões de purificação de proteínas conhecidos no estado de técnica. Os procedimentos a seguir são exemplos de procedimentos de purificação apropriados: através de fracionamento em uma coluna de troca iônica; precipitação em etanol, HPLC de fase reversa; cromatografia em sílica ou em uma resina de troca catiônica tal como DEAE; cromatofocusação; SDS- PAGE; precipitação em sulfato de amônio; gel filtração utilizando, por exemplo, Sephadex G-75.

Em um aspecto, a proteína A imobilizada por uma fase sólida é utilizada para a purificação por imunoafinidade do anticorpo da invenção. A proteína A é um proteína da parede celular de 41 kD do Staphylococcus aureas que se liga com alta afinidade a região Fc dos anticorpos. Lindmark, et al. (1983) J. Immunol. Meth. 62:1-13. A fase sólida para o qual a proteína A é imobilizada pode ser uma coluna que compreende uma superfície de vidro ou de sílica, ou uma coluna de vidro porosa controlada ou coluna de ácido silícico. Em algumas aplicações, a coluna é revestida com um reagente, tal como o glicerol, possivelmente para evitar a aderência inespecífica de contaminantes.

Tal como a primeira etapa de purificação, a preparação derivada da cultura celular, como descrito acima pode ser aplicado a uma fase sólida de proteína A imobilizada para permitir a ligação do anticorpo específico de interesse à proteína A. A fase sólida passaria então a ser lavada para remover os contaminantes não ligados especificamente à fase sólida. Por último, o anticorpo de interesse é recuperado da fase sólida por eluição.

PRODUCAO DE ANTICORPO UTILIZANDO CELLULAS HOSPEDEIRAS EUCARIOTICAS

Os componentes do vetor geralmente incluem, mas sem se limitar a, um ou mais dos seguintes: uma seqüência sinalizadora, uma origem de replicação, um ou mais genes marcadores, um componente amplificador, um promotor, e uma seqüência de terminação da transcrição.

(I) Componente de Seqüência Sinalizadora

Um vetor para uso em uma célula hospedeira eucarióticas também pode conter uma seqüência sinalizadora ou outro polipeptídeo que possuí um sítio de clivagem específico no N-terminal da proteína ou polipeptídeo maduro de interesse. A seqüência sinalizadora heteróloga selecionada geralmente é aquela que é reconhecida e processada (ou seja, clivada por uma peptidase sinalizadora) pela célula hospedeira. Em células de expressão de mamíferos, estão disponíveis as seqüências sinalizadora de mamíferos, bem como líderes de secreção viral, tais como o sinal gD da herpes simplex.

O DNA para essa região precursora é ligado em estrutura de leitura a DNA codificador do anticorpo.

(II) COMPETENTE DE ORIGEM DE REPLICACAO

Geralmente, a origem do componente de replicação não é necessária para vetores de expressão em mamíferos. Por exemplo, a origem SV40 pode ser tipicamente utilizada somente porque contém o promotor inicial.

(HI) Componente Genético de Seleção Os vetores de clonagem e de expressão podem conter um gene de seleção, também denominado marcador de seleção. Os genes de seleção típicos codificam proteínas que (a) conferem resistência a antibióticos ou outras toxinas, tais como ampicilina, neomicina, metotrexato ou tetraciclina; (b) complementam deficiências autotróficas; ou (c) fornecem nutrientes fundamentais não-disponíveis no meio.

Um exemplo de esquema de seleção utiliza uma droga para interromper o crescimento de uma célula hospedeira. As células que são transformadas com sucesso com um gene heterólogo que produz uma proteína que confere resistência a drogas e, desta forma, sobrevivem ao regime de seleção. Exemplos de tal seleção dominante utilizam as drogas neomicina, ácido micofenólico e higromicina.

Outro exemplo de marcadores de seleção apropriados para células de mamíferos são os que permitem a identificação de células competentes para a absorção do ácido nucléico de anticorpo, tal como DHFR, timidina quinase, metalotioneína-l e II, preferencialmente genes metalotioneína de primatas, adenosina deaminase, ornitina decarboxilase, e etc.

Células transformadas com o gene de seleção DHFR, por exemplo, são identificadas, em primeiro lugar, através do cultivo de todos os transformantes em um meio de cultura que contenha metotrexato (Mtx), antagonista concorrente de DHFR. Uma célula hospedeira apropriada, ao empregar-se DHFR do tipo selvagem, é a linhagem celular de ovário de hamster chinês (CHO) com deficiência na atividade de DHFR (por exemplo, ATCC CRL-9096).

Alternativamente, as células hospedeiras (particularmente, hospedeiros do tipo selvagem que contêm DHFR endógeno) transformadas ou co-transformadas com seqüências de DNA que codificam o anticorpo anti-DR4, proteína DHFR do tipo selvagem e outro marcador selecionável tal como aminoglicosídeo 3'-fosfotransferase (APH) podem ser selecionadas através de crescimento celular em um meio que contém um agente de seleção para o marcador selecionável tal como antibiótico aminoglicosídico, por exemplo canamicina, neomicina ou G418. Vide a Patente US 4.965.199.

(IV) Componente Promotor

Os vetores de clonagem e de expressão normalmente contêm um promotor que é reconhecido pelo organismo hospedeiro e é operacionalmente ligado ao ácido nucléico do polipeptídeo (por exemplo, um anticorpo). As seqüências promotoras de eucariotos são conhecidas. São conhecidas seqüências promotoras para eucariontes. Virtualmente todos os genes eucariontes possuem uma região rica em AT localizada a cerca de 25 a 30 bases a montante do sítio em que se inicia a transcrição. Outra seqüência encontrada a 70 até 80 bases a montante do início da transcrição de muitos genes é uma região CNCAAT, em que N pode ser qualquer nucleotídeo. Na extremidade 3' da maioria dos genes eucariontes, encontra-se uma seqüência AATAAA que pode ser o sinal para adição da cauda poli A à extremidade 3' da seqüência codificadora. Todas essas seqüências são inseridas de forma apropriada em vetores de expressão eucarióticos.

A transcrição de polipeptídeos a partir de vetores em células hospedeiras de mamíferos é controlada, por exemplo, por promotores obtidos a partir dos genoma viral tais como vírus de polioma, vírus da catapora, adenovírus (tal como Adenovírus 2), vírus de papiloma bovino, vírus de sarcoma aviário, citomegalovírus, retrovírus, vírus da hepatite B e, de maior preferência, Vírus Símio 40 (SV40), a partir de promotores de mamíferos heterólogos, tais como o promotor de actina ou um promotor de imunoglobulina, de promotores de choque térmico, desde que esses promotores sejam compatíveis com os sistemas de células hospedeiras.

O promotor inicial e final do vírus SV40 são obtidos convenientemente na forma de fragmento de restrição SV40 que também contém a origem viral SV40 de replicação. O promotor inicial imediato do citomegalovírus humano é obtido convenientemente na forma de fragmento de restrição Hindlll E. Um sistema de expressão de DNA em hospedeiros mamíferos utilizando o vírus de papiloma bovino como vetor é descrito na Patente US 4.119.446. Uma modificação deste sistema é descrita na Patente US 4.601.978. Vide também Reyes et ai, Nature 297: 598-601 (1982) sobre a expressão de cDNA de interferon-β humano em células de camundongos sob o controle de um promotor timidina quinase de vírus da herpes simplex. Alternativamente, a repetição terminal longa de vírus do sarcoma de Rous pode ser utilizada como promotor.

(V) Componente Elemento Aiviplificador

A transcrição de um DNA codificador do polipeptídeo do anticorpo de acordo com a presente invenção por eucariontes superiores é freqüentemente aumentada através da inserção de uma seqüência amplificadora no vetor. Muitas seqüências amplificadoras são agora conhecidas de genes de mamíferos (globina, elastase, albumina, a-fetoproteína e insulina). Tipicamente, entretanto, será utilizado um amplificador de um vírus de célula eucariótica. Exemplos incluem o amplificador SV40 sobre o lado posterior da origem de replicação (bp 100-270), o amplificador promotor inicial de citomegalovírus, o amplificador de polioma sobre o lado terminal da origem de replicação e amplificadores de adenovírus. Vide também Yaniv, Nature 297: 17-18 (1982) sobre elementos de promoção para a ativação de promotores eucarióticos. O amplificador pode também sofrer splicing no vetor na posição 5' ou 3' para a seqüência codificadora de anticorpo, mas encontra-se localizado, preferencialmente, em um sítio a 5' do promotor. (VI) Componente de Término de Transcrição

Os vetores de expressão utilizados em células hospedeiras eucariontes também irão conter seqüências necessárias para a terminação da transcrição e estabilização do mRNA. Ditas seqüências são normalmente disponíveis a partir das regiões 5' não-traduzidas, ocasionalmente 3', dos DNAs ou cDNAs virais ou eucariontes. Estas regiões contêm segmentos de nucleotídeos transcritos na forma de fragmentos poliadenilados na porção não- traduzida do mRNA codificador do anticorpo. Um componente de terminação de transcrição útil é a região de poliadenilação do hormônio de crescimento bovino. Vide o documento WO 94/11026 e o vetor de expressão nele descrito.

(VII) Seleção ε Transformação de Células Hospedeiras

As células hospedeiras apropriadas para clonagem ou expressão do DNA nos vetores do presente incluem as células eucarióticas superiores descritas neste documento, incluindo células hospedeiras de vertebrados.

Propagação de células hospedeiras de vertebrados em cultura (cultura de tecido) tornou-se um procedimento rotineiro. Exemplos de linhagens de células hospedeiras de mamíferos úteis são a linhagem CV1 de rim de macaco transformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); linhagem de rim embriônico humano (293 ou células 293 sub-clonadas para crescimento em cultura de suspensão, Graham et ai, J. Gen. Virol. 36: 59 (1977)); células de rim de filhote de hamster (BHK, ATCC CCL 10); células de ovário de hamster chinês/-DHFR (CHO, Urlaub et ai, Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 77: 4216 (1980)); células sertoli de camundongo (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23: 243-251 (1980)); células de rim de macaco (CV1 ATCC CCL 70); células de rim de macaco verde africano (VERO-76, ATCC CRL-1587); células de carcinoma cervical humano (HELA, ATCC CCL 2); células de rim canino (MDCK, ATCC CCL 34); células de fígado de buffalo rat (BRL 3A, ATCC CRL 1442); células de pulmão humano (W138, ATCC CCL 75); células de fígado humano (Hep G2, HB 8065); tumor mamário de camundongo (MMT 060562, ATCC CCL51); células TRI (Mather et al., Annals Ν. Y. Acad. Sei. 383:44-68 (1982)); células MRC 5; células FS4; linhagem de hepatoma humano (Hep G2).

As células hospedeiras são transformadas com os vetores de clonagem ou expressão descritos acima para a produção de anticorpos e cultivadas em meios nutrientes convencionais modificados conforme apropriado para a indução de promotores, seleção de transformantes ou amplificando os genes codificadores das seqüências desejadas.

(VIII) Cultivo das Células Hospedeiras

As células hospedeiras utilizadas para a produção do anticorpo de acordo com a presente invenção podem ser cultivadas em uma série de meios disponíveis comercialmente, tais como Ham's F10 (Sigma), Meio Essencial Mínimo ((MEM), Sigma), RPMI-1640 (Sigma) e Meio Eagle Modificado da Dulbecco ((DMEM), Sigma) que são apropriados para o cultivo das células hospedeiras. Além disso, qualquer meio descrito em Ham et al., Meth. Enz. 58: 44 (1979), Barnes et al., Anal. Biochem. 102: 255 (1980), Patentes US 4.767.704; US 4.657.866; US 4.927.762; US 4.560.655; ou US 5.122.469; documentos WO 90/03430 e WO 87/00195 ou o pedido de Patente US US 30.985 podem ser utilizados como meios de cultura para as células hospedeiras. Qualquer destes meios pode ser suplementado conforme necessário com hormônios e/ou outros fatores do crescimento (tais como insulina, transferrina ou fator de crescimento epidérmico), sais (tais como cloreto de sódio, cálcio, magnésio e fosfato), tampões (tais como HEPES), nucleotídeos (tais como adenosina e timidina), antibióticos (tais como droga Gentamycin®), elementos de traço (definidos como compostos inorgânicos normalmente presentes em concentrações finais na faixa micromolar) e glicose ou uma fonte de energia equivalente. Qualquer outro suplemento necessário pode também ser incluído em concentrações apropriadas conhecidas dos técnicos no assunto. As condições de cultura, tais como temperatura, pH e similares, são as utilizadas anteriormente com a célula hospedeira selecionada para expressão e serão evidentes para os técnicos no assunto.

(IX) Purificação do Anticorpo

A partir do uso de técnicas recombinantes, o anticorpo pode ser produzido de forma intracelular, no espaço periplasmático ou secretado diretamente no meio. Caso o anticorpo seja produzido de forma intracelular, como uma primeira etapa, os fragmentos particulados, sejam eles células hospedeiras ou fragmentos lisados, são removidos, por exemplo, através de centrifugação ou ultrafiltragem. Quando o anticorpo for secretado para o meio, sobrenadantes desses sistemas de expressão são geralmente concentrados em primeiro lugar utilizando um filtro de concentração de proteínas disponível comercialmente, por exemplo, uma unidade de ultrafiltragem Amicon ou Millipore Pellicon. Um inibidor de protease, tal como PMSF, pode ser incluído em qualquer das etapas acima para inibir a proteólise e antibióticos podem ser incluídos para evitar o crescimento de contaminantes imprevistos.

A composição de anticorpo preparada a partir das células pode ser purificada através do uso, por exemplo, de cromatografia de hidroxilapatita, eletroforese em gel, diálise e cromatografia de afinidade, com cromatografia de afinidade sendo a técnica de purificação preferida. A adequação da proteína A como ligante de afinidade depende da espécie e do isotipo de qualquer domínio Fc de imunoglobulina que esteja presente no anticorpo. A Proteína A pode ser utilizada para purificar anticorpos que se baseiem em cadeias pesadas γ1, γ2 ou γ4 humanas (Lindmark et al, J. Immunol. Meth. 62: 1-13 (1983)). Recomenda-se Proteína G para todos os isotipos de camundongos e para γ3 humano (Guss et al., EMBO J. 5: 1567-1575 (1986)). A matriz à qual é ligado o ligante de afinidade é mais freqüentemente agarose, mas outras matrizes são disponíveis. Matrizes mecanicamente estáveis, tais como vidro de poros controlados ou poli-(estirenodivinil)-benzeno, permitem velocidades de fluxo maiores e tempos de processamento mais curtos do que os que podem ser atingidos com agarose. Quando o anticorpo compreender um domínio Ch3, a resina Bakerbond ABX® (J. T. Baker1 Phillipsburg NJ1 Estados Unidos) é útil para purificação. Outras técnicas de purificação de proteínas, tais como fracionamento sobre uma coluna de troca iônica, precipitação em etanol, HPLC de Fase Reversa, cromatografia em sílica, cromatografia em heparina SEPHAROSE™, cromatografia em uma resina de troca aniônica ou catiônica (tal como uma coluna de ácido poliaspártico), cromatofocagem, SDS-PAGE e precipitação de sulfato de amônio também são disponíveis, dependendo do anticorpo a ser recuperado.

Após qualquer etapa(s) de purificação preliminar, a mistura que compreende o anticorpo de interesse e contaminantes pode ser submetida a cromatografia de interação hidrofóbica a baixo pH utilizando uma eluição tamponada a um pH de cerca de 2,5 a 4,5, preferencialmente realizada sob baixas concentrações de sal (tal como, de cerca de 0 a 0,25 M de sal).

Deve ser notado que, em geral, técnicas e metodologias para a preparação de anticorpos para uso na presente invenção, ensaio e utilização clínica estão bem estabelecidas no estado da técnica, coerente com o que foi exposto acima e/ou considerado adequado, para os técnicos no assunto para o anticorpo específico de interesse.

Ensaios de Atividade

As imunoglobulinas da presente invenção podem ser caracterizadas por suas propriedades físicas/químicas e funções biológicas através de diversos ensaios conhecidos no estado da técnica.

Os anticorpos purificados podem ser adicionalmente caracterizados por uma série de ensaios incluindo, mas sem limitar-se a, seqüenciamento N-terminal, análise de aminoácido, cromatografia líquida de alta pressão (HPLC) com exclusão de tamanho não-desnaturante, espectometria em massa, cromatografia de troca iônica, e digestão de papaína.

Quando necessário, os anticorpos são analisados por suas atividade biológicas. Em algumas realizações, as imunoglobulinas da presente invenção são testadas para sua atividade de ligação a antígeno. Os ensaios de ligação de antígeno que são conhecidos no estado da técnica e podem ser utilizados no presente incluem, sem se limitar a, ensaio de ligação competitivo ou direta utilizando técnicas tais como western blots, radioimunoensaios, ELISA (ensaio imunoabsorvente ligado por enzima), imunoensaios do tipo "sanduíche", ensaios de imunoprecipitação, imunoensaios fluorescentes, e imunoensaios de proteína A.

Em um exemplo de realização, a invenção contempla um anticorpo modificado que possuí alguma, mas não todas as funções efetoras, que torna este anticorpo um candidato desejável para muitas aplicações no qual a meia vida do anticorpo in vivo é importante ainda que certas funções efetoras (como complemento e ADCC) são desnecessárias ou prejudiciais. Em certos exemplos de realização, as atividades Fc do anticorpo são medidas para assegurar que só as propriedades desejadas sejam mantidas. Um ensaio de citotoxicidade in vitro ou in vivo pode ser conduzido para confirmar a redução / depleção dos CDC e/ou atividades ADCC. Por exemplo, ensaios de ligação com o receptor Fc (FcR) podem ser realizados a fim de garantir que o anticorpo não tenha ligação ao FcyR (e portanto carece da atividade ADCC), mas mantém a capacidade de ligação ao FcRn. As células primárias para a mediação de ADCC, células NK, expressam unicamente FcyRIII, enquanto monócitos expressam FcyRI, FcyRII e FcyRIII. A expressão de FcR sobre células hematopoiéticas é resumida na Tabela 3, pág. 464, de Ravetch e Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9: 457-92 (1991). Um exemplo de ensaio para se determinar a atividade de ADCC de uma molécula de interesse, está descrito na Patente US 5.500.362 ou US 5.821.337. Células efetoras úteis para esses testes incluem células mononucleares sangüíneas periféricas (PBMC) e células Natural Killers (NK). Alternativa ou adicionalmente, a atividade de ADCC da molécula de interesse pode ser determinada in vivo, tal como em um modelo animal como o descrito em Clynes et al., PNAS (USA) 95: 652-656 (1998).

Ensaios de ligação de C1q também podem ser realizados para confirmar que o anticorpo é incapaz de se ligar a C1q e, portanto, carece de atividade CDC. Para determinar a ativação do complemento, pode ser realizado um ensaio CDC, conforme descrito, por exemplo, em Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods, 202: 163 (1996). A determinação da ligação de FcRn e a depuração/ meia vida in vivo também pode ser realizada utilizando métodos conhecidos no estado da técnica.

Fragmentos de Anticorpos

A presente invenção abrange fragmentos anticorpos. Em determinadas circunstâncias há uma vantagem maior de se usar fragmentos de anticorpos ao invés de anticorpos. O menor tamanho dos fragmentos permite rápida difusão, e pode conduzir melhor acesso aos tumores sólidos.

Foram desenvolvidas diversas técnicas para a produção de fragmentos de anticorpos. Tradicionalmente, estes fragmentos foram derivados por meio de digestão proteolítica de anticorpos intactos (vide por exemplo, Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24: 107-117 (1992); e Brennan et ai, Science 229: 81 (1985)). Entretanto, esses fragmentos podem ser agora produzidos diretamente por células hospedeiras recombinantes. Os fragmentos Fab, Fv e ScFv podem ser expressos diretamente de E. coli e assim permitindo a produção de grandes quantidades destes fragmentos. Os fragmentos de anticorpos podem ser isolados, por exemplo, a partir das bibliotecas de fagos de anticorpos discutidas acima. Alternativamente, fragmentos Fab'-SH podem ser recuperados diretamente de Ε. coli e acoplados quimicamente para formar fragmentos F(ab')2 (Carter et ai, Bio/Technology 10:163-167 (1992)). De acordo com outra abordagem, fragmentos F(ab')2 podem ser isolados diretamente a partir da cultura de células hospedeiras recombinantes. Fragmentos Fab e F(ab')2 com maior meia-vida in vivo que compreendem resíduos de epítopos de ligação de receptores recuperados são descritos na patente US 5.869.046. Outras técnicas para a produção de fragmentos de anticorpos serão evidentes para os técnicos no assunto. Em outras realizações, o anticorpo selecionado é um fragmento Fv de cadeia única (scFv). Vide documento WO 93/16185; as patentes US 5.571.894; e US 5.587.458. Fv e sFv são as únicas espécies com sítios de combinação intactos que são desprovidas de regiões constantes; por isso, elas são apropriadas para ligação não-especifica reduzida durante a utilização in vivo. Proteínas de fusão sFv podem ser construídas para gerar a fusão de uma proteína efetora no amino ou carbóxi terminal de um sFv. Vide Antibody Engineering, ed. Borrebaeck, supra. O fragmento de anticorpo pode também ser um "anticorpo linear", conforme descrito, por exemplo, na patente US 5.641.870. Ditos fragmentos de anticorpos lineares podem ser monoespecíficos ou biespecíficos.

Anticorpos Humanizados

A invenção abrange anticorpos humanizados. Vários métodos de humanização de anticorpos não-humanos são conhecidos no estado da técnica. Preferencialmente, um anticorpo humanizado contém um ou mais resíduos de aminoácidos nele introduzidos a partir de uma fonte que não é humana. Esses resíduos de aminoácidos não-humanos são muitas vezes denominados resíduos "importados", que são tipicamente retirados de um domínio variável "importado". A humanização pode ser essencialmente realizada seguindo-se o método de Winter et ai. (Jones et ai., Nature, 321:522- 525 (1986); Riechmann et ai., Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen et ai., Science, 239:1534-1536 (1988)), por meio de substituição de seqüências de regiões hipervariáveis pelas seqüências correspondentes de anticorpo humano. Conseqüentemente, esses anticorpos "humanizados" são anticorpos quiméricos (Patente US 4.816.567), em que substancialmente menos de um domínio variável humano intacto tenha sido substituído pela seqüência correspondente de uma espécie não-humana. Na prática, os anticorpos humanizados são tipicamente anticorpos humanos, em que alguns resíduos de regiões hipervariáveis e possivelmente alguns resíduos de FR são substituídos por resíduos de sítios análogos em anticorpos de roedores.

A seleção de domínios variáveis humanos, tanto leves quanto pesados, a serem utilizados na fabricação dos anticorpos humanizados é muito importante para reduzir a antigenicidade. De acordo com o chamado método de "melhor adequação" (best-fit), a seqüência do domínio variável de um anticorpo de roedor é selecionada em comparação com toda a biblioteca de seqüências de domínio variável humanas conhecida. A seqüência humana que é mais próxima da seqüência do roedor é então aceita como a região de estrutura humana (FR) para o anticorpo humanizado (Sims et ai, J. Immunol., 151: 2296 (1993); Chothia et al., J. Moi Biol., 196: 901 (1987)). Outro método utiliza uma região estrutural específica derivada da seqüência de consenso de todos os anticorpos humanos de um subgrupo específico de cadeias leves ou pesadas. A mesma estrutura pode ser utilizada para vários anticorpos humanizados diferentes (Carter et al., Proc. Nati Acad. Sci. USA, 89: 4285 (1992); Presta et ai, J. Immunol., 151: 2623 (1993)).

É adicionalmente importante que os anticorpos sejam humanizados com retenção de alta afinidade para o antígeno e outras propriedades biológicas favoráveis. Para atingir este objetivo, de acordo com um método preferido, os anticorpos humanizados são preparados por meio de um processo de análise das seqüências parentais e diversos produtos humanizados conceituais, utilizando modelos tridimensionais das seqüências parental e humanizada. Modelos de imunoglobulina tridimensionais são comumente disponíveis e familiares para os técnicos no assunto. São disponíveis programas de computador que ilustram e exibem prováveis estruturas de conformação tridimensional de seqüências de imunoglobulina candidata selecionadas. A inspeção dessas exibições permite a análise do papel provável dos resíduos no funcionamento da seqüência de imunoglobulina candidata, ou seja, a análise dos resíduos que influenciam a capacidade da imunoglobulina candidata de ligar o seu antígeno. Desta forma, os resíduos de FR podem ser selecionados e combinados a partir das seqüências receptora e importada, de forma que seja atingida a característica desejada do anticorpo, tal como maior afinidade para o(s) antígeno(s) desejado(s). Geralmente, os resíduos da região hipervariável são diretamente e mais substancialmente envolvidos na influência da ligação de antígenos.

Anticorpos Humanos

Anticorpos anti-poliubiquitina humana da invenção pode ser construída através de uma combinação clone Fv da seqüência do domínio variável selecionados a partir de uma biblioteca de exposição de fagos de origem humana com as seqüências do domínio constante conhecidas, como descrito acima. Alternativamente , os anticorpos monoclonais humanos podem ser preparados através do método de hibridoma. Linhagens celulares de mieloma humano e heteromieloma humano/de camundongos para a produção de anticorpos monoclonais humanos foram descritas, por exemplo, por Kozbor, J. Immunol. 133, 3001 (1984), e Brodeur et ai, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, págs. 51-63 (Mareei Dekker, Inc., Nova Iorque, Estados Unidos, 1987) e Boerner ET AL., J. Immunol., 147, 86 (1991).

É agora possível produzir animais transgênicos (por exemplo, camundongos) que são capazes, mediante imunização, de produzir um repertório de anticorpos humanos na ausência de produção de imunoglobulina endógena. Descreveu-se, por exemplo, que a deleção homozigótica do gene da região de ligação de cadeia pesada de anticorpos (Jh) em camundongos quiméricos e mutantes de linhagem germinativa resulta na inibição completa da produção de anticorpos endógenos. A transferência do conjunto de genes de imunoglobulina da linhagem germinativa humana nesses camundongos com mutação da linhagem germinativa resultará na produção de anticorpos humanos mediante desafio de antígenos. Vide, por exemplo, Jakobovits et ai, Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 90, 2551-255 (1993); Jakobovits et ai, Nature, 362: 255-258 (1993), Bruggermann et ai, Year in Immunol., 7: 33 (1993). A alteração de genes pode também ser utilizada para derivar anticorpos humanos de anticorpos de roedores, em que o anticorpo humano possui afinidades e especificidades similares ao anticorpo de roedor inicial. De acordo com este método, que também é denominado "impressão de epítopos", o gene de domínio V de cadeia leve ou pesada de anticorpos de roedores obtido através da técnica de exibição de fagos é substituído com um repertório de genes de domínio V humanos, criando quimeras de roedores-humanos. A seleção sobre antígeno resulta no isolamento de variável humana capaz de restaurar um sítio de ligação de antígenos funcional, ou seja, o epítopo governa (imprime) a escolha do parceiro. Quando o processo for repetido, a fim de substituir o domínio V de roedor remanescente, é obtido um anticorpo humano (vide documento WO 93/06213, publicado em 1 de abril de 1993). Ao contrário da humanização tradicional de anticorpos de roedores através de enxerto de CDR1 esta técnica fornece anticorpos completamente humanos, que não possuem resíduos de CDR ou FR de origem não humana.

Anticorpos Biespecíficos

Os anticorpos biespecíficos são anticorpos monoclonais, que possuem especificidades de ligação para pelo menos dois antígenos diferentes. Em exemplos de realização os anticorpos biespecíficos são anticorpos humanos ou humanizados. Em certos exemplos de realização, uma das especificidades de ligação é com poliubiquitina que possuí uma ligação na lisina específica, o outro é para qualquer outro antígeno. Em exemplo de realização, o anticorpo biespecífico pode se ligar a duas poliubiquitinas diferentes que possuem duas ligações na Iisina diferentes. A nticorpos biespecíficos podem ser preparados como anticorpos de comprimento total ou fragmentos de anticorpo (por exemplo, anticorpo F(ab')2 biespecífico).

Os métodos de fabricação de anticorpos biespecíficos são conhecidos na técnica. Tradicionalmente, a produção recombinante de anticorpos biespecíficos é baseada na co-expressão de dois pares de cadeia leve e cadeia pesada de imunoglobulina, em que as duas cadeias pesadas possuem especificidades diferentes (Milstein e Cuello, Nature, 305: 537-539 (1983)). Devido à seleção aleatória de cadeias leve e pesada de imunoglobulina, esses hibridomas (quadromas) produzem uma mistura potencial de 10 moléculas de anticorpos diferentes, das quais apenas uma possui a estrutura biespecífica correta. A purificação da molécula correta, que normalmente é realizada através de etapas de cromatografia de afinidade, é um tanto problemática e os rendimentos de produto são baixos. Procedimentos similares são descritos no documento WO 93/08829 publicado em 13 de maio de 1993 e em Traunecker et ai, EMBO J. 10, 3655-2659 (1991).

De acordo com uma abordagem diferente, domínios variáveis de anticorpos com as especificidades de ligação desejadas (sítios de combinação de antígeno e anticorpo) são fundidos à seqüências de domínios constantes de imunoglobulina. A fusão ocorre preferencialmente com um domínio constante de cadeia pesada de imunoglobulina, que compreende pelo menos parte das regiões de articulação, Ch2 e Ch3. Prefere-se ter a primeira região constante de cadeia pesada (CH1) contendo o sítio necessário para ligação de cadeia leve presente em pelo menos uma das fusões. Os DNAs que codificam as fusões de cadeia pesada de imunoglobulina e, se desejado, a cadeia leve de imunoglobulina, são inseridos em vetores de expressão separados e são co- transfectados em um organismo hospedeiro apropriado. Isso proporciona grande flexibilidade no ajuste das proporções mútuas dos 3 fragmentos de polipeptídeos em realizações quando razões desiguais das três cadeias de polipeptídeos utilizadas na construção fornecem os rendimentos ideais. É possível, entretanto, inserir as seqüências de codificação para 2 ou todas as 3 cadeias de polipeptídeos em um vetor de expressão quando a expressão de pelo menos duas cadeias de polipeptídeos em razões iguais resultar em altos rendimentos ou quando as razões não foram de significância específica.

Em uma realização preferida da presente abordagem, os anticorpos biespecíficos são compostos de uma cadeia pesada de imunoglobulina híbrida com uma primeira especificidade de ligação em um braço, e um par de cadeias leve e pesada de imunoglobulina híbrida (que fornece uma segunda especificidade de ligação) no outro braço. Descobriu-se que essa estrutura assimétrica facilita a separação do composto biespecífico desejado de combinações de cadeia de imunoglobulina indesejadas, pois a presença de uma cadeia leve de imunoglobulina em apenas metade da molécula biespecífica fornece forma fácil de separação. Esta abordagem é descrita no documento WO 94/04690. Para mais detalhes de produção de anticorpos biespecíficos vide, por exemplo, Suresh et ai, Methods in Enzymology, 121:210 (1986).

De acordo com outra abordagem, a interface entre um par de moléculas de anticorpos pode ser construída de forma a maximizar o percentual de heterodímeros que é recuperado da cultura celular recombinante. A interface preferida compreende pelo menos uma parte do domínio Ch3 de um domínio constante de anticorpo. Neste método, uma ou mais cadeias laterais de aminoácidos pequenos da superfície intermediária da primeira molécula de anticorpo são substituídas com cadeias laterais maiores (tais como tirosina ou triptofano). "Cavidades" compensatórias de tamanho idêntico ou similar à(s) cadeia(s) lateral(is) grande(s) são criadas sobre a interface da segunda molécula de anticorpo, por meio da substituição de grandes cadeias laterais de aminoácidos com cadeias menores (tais como alanina ou treonina). Isso proporciona um mecanismo de aumento do rendimento do heterodímero sobre outros produtos finais indesejados, tais como homodímeros.

Os anticorpos biespecíficos incluem anticorpos reticulados ou "heteroconjugados". Um dos anticorpos no heteroconjugado pode ser acoplado, por exemplo, a avidina e o outro a biotina. Esses anticorpos foram propostos, por exemplo, para dirigir células do sistema imune a células indesejadas (Patente US 4.676.980) e para o tratamento de infecções por HIV (documentos WO 91/00360, WO 92/200373 e Patente EP 03.089). Anticorpos heteroconjugados podem ser fabricados utilizando qualquer método reticulante conveniente. Agentes reticulantes apropriados são bem conhecidos na técnica e são descritos na Patente US 4.676.980 juntamente com uma série de técnicas reticulantes.

As técnicas de geração de anticorpos biespecíficos a partir de fragmentos de anticorpos também foram descritas na literatura. Anticorpos biespecíficos podem ser preparados, por exemplo, utilizando ligações químicas. Brennan et ai, Science, 229: 81 (1985) descrevem um procedimento em que anticorpos intactos são proteoliticamente clivados para gerar fragmentos F(ab')2. Estes fragmentos são reduzidos na presença do agente arsenito de sódio formador de complexo de ditiol para estabilizar ditióis vizinhos e evitar a formação de dissulfeto intermolecular. Os fragmentos Fab' gerados são então convertidos em derivados de tionitrobenzoato (TNB). Um dos derivados de Fab1-TNB é então novamente convertido em Fab'-tiol por meio de redução com mercaptoetilamina e é misturado com uma quantidade eqüimolar do outro derivado de Fab1-TNB para formar o anticorpo biespecífico. Os anticorpos biespecíficos produzidos podem ser utilizados como agentes para a imobilização seletiva de enzimas.

Progressos recentes possibilitaram a recuperação direta dos fragmentos Fab1-SH de E. coli, que podem ser acoplados quimicamente para formar anticorpos biespecíficos. Shalaby et al., J. Exp. Med., 175: 217-225 (1992) descrevem a produção de uma molécula F(ab')2 de anticorpo biespecífico totalmente humanizado. Cada fragmento Fab' foi segregado separadamente de E. coli e submetido a acoplamento químico dirigido in vitro para formar o anticorpo biespecífico. O anticorpo biespecífico assim formado foi capaz de ligar-se a células que superexpressam o receptor de ErbB2 e células T humanas normais, bem como iniciar a atividade lítica de linfócitos citotóxicos humanos contra alvos de tumor de mama humano.

Diversas técnicas de fabricação e isolamento de fragmentos de anticorpos biespecíficos diretamente a partir de cultura celular recombinante também foram descritas. Anticorpos biespecíficos foram produzidos, por exemplo, utilizando zíppers de leucina. Kostelny et al., J. Immunol., 148(5): 1547-1553 (1992). Os peptídeos de zípper de leucina das proteínas Fos e Jun foram ligados às porções Fab' de dois anticorpos diferentes por meio de fusão gênica. Os homodímeros de anticorpos foram reduzidos na região de articulação para formar monômeros e, em seguida, novamente oxidados para formar os heterodímeros de anticorpos. Este método pode também ser utilizado para a produção de homodímeros de anticorpos. A tecnologia de "diacorpo" descrita por Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 90: 6444-6448 (1993) forneceu um mecanismo alternativo para a fabricação de fragmentos de anticorpos biespecíficos. Os fragmentos compreendem um domínio variável de cadeia pesada (VH) conectado a um domínio variável de cadeia leve (VL) por um Iigante que é curto demais para permitir o emparelhamento entre os dois domínios sobre a mesma cadeia. Conseqüentemente, os domínios VH e VL de um fragmento são forçados a emparelhar-se com os domínios VL e VH complementares de outro fragmento, de maneira a formar dois sítios de ligação de antígenos. Outra estratégia de fabricação de fragmentos de anticorpos biespecíficos utilizando dímeros Fv de cadeia simples (sFv) também foi relatada. Vide Gruberef al., J. Immunol., 152: 5368 (1994).

São contemplados anticorpos com mais de duas valências. Podem ser preparados, por exemplo, anticorpos triespecíficos. Tutt et al., J. Immunol. 147: 60 (1991).

Anticorpos Multivalentes

Um anticorpo multivalente pode ser internalizado (e/ou catabolizado) mais rapidamente que um anticorpo bivalente por uma célula que expresse um antígeno ao qual os anticorpos se ligam. Os anticorpos de acordo com a presente invenção podem ser anticorpos multivalentes (que são diferentes dos da classe IgM) com três ou mais sítios de ligação de antígenos (por exemplo, anticorpos tetravalentes), que podem ser facilmente produzidos através da expressão recombinante de ácido nucléico que codifica cadeias de polipeptídeo do anticorpo. O anticorpo multivalente pode compreender um domínio de dimerização e 3 ou mais sítios de ligação de antígeno. O domínio de dimerização preferido compreende (ou consiste de) uma região Fc ou uma região de articulação. Nessas condições, o anticorpo compreenderá uma região Fc e três ou mais sítios de ligação de antígenos amino-terminais para a região Fe. O anticorpo multivalente preferido do presente compreende (ou consiste de) 3 a cerca de 8, mas preferencialmente, 4 sítios de ligação de antígenos. O anticorpo multivalente compreende pelo menos uma cadeia polipeptídica (e, preferencialmente, duas cadeias polipeptídicas), em que a(s) cadeia(s) polipeptídica(s) compreende(m) 2 ou mais domínios variáveis. A(s) cadeia(s) polipeptídica(s) pode(m) compreender, por exemplo, VD1-(X1)n-VD2- (X2)n-Fc, em que VD1 é um primeiro domínio variável, VD2 é um segundo domínio variável, Fc é uma cadeia polipeptídica de uma região Fc, X1 e X2 representam um aminoácido ou polipeptídeo e η é 0 ou 1. A(s) cadeia(s) polipeptídica(s) pode(m) compreender, por exemplo: cadeia VH-CH1-ligação flexível-VH-CH1-região Fc; ou cadeia VH-CH1-VH-CH1-região Fe. O anticorpo multivalente da presente invenção compreende adicionalmente de pelo menos 2 (preferencialmente 4) polipeptídeos de domínio variável de cadeia leve. O anticorpo multivalente da presente invenção pode compreender, por exemplo, cerca de 2 a cerca de 8 polipeptídeos de domínio variável de cadeia leve. Os polipeptídeos de domínio variável de cadeia leve, contemplados na presente invenção, compreendem um domínio variável de cadeia leve e, opcionalmente, um domínio CL.

Anticorpos Variantes

Em alguns exemplos, é(são) contemplada(s) modificação(ões) na(s) seqüência(s) de aminoácido(s) dos anticorpos aqui descritos. Por exemplo, pode ser desejável melhorar a afinidade de ligação e/ou outras propriedades biológicas do anticorpo. Variantes da seqüência de aminoácido do anticorpo são preparados pela introdução de nucleotídeos adequados modificando o ácido nucléico do anticorpo, ou pela síntese de peptídeo. Tais alterações incluem, por exemplo, supressão, e/ou inserção e/ou substituição, de resíduos dentro das seqüências de aminoácido do anticorpo. Qualquer combinação de deleção, inserção ou substituição podem ser feitas para se chegar a construção final, desde que o produto final tenha as características desejadas. As alterações nos aminoácidos podem ser introduzidas no anticorpo no momento em que seqüência é feita.

Um método útil de identificação de certos resíduos ou regiões do antagonista que são locais preferidos para mutagênese é denominado "mutagênese de varredura de alanina", conforme descrito por Cunningham e Wells, Science, 244: 1081-1085 (1989). Aqui, um resíduo ou grupo de resíduos alvo é identificado (por exemplo, resíduos carregados, tais como arg, asp, his, Iys e glu) e substituído por um aminoácido neutro ou negativamente carregado (de maior preferência alanina ou polialanina) para afetar a interação dos aminoácidos com antígeno. Esses locais de aminoácidos que demonstram sensibilidade funcional às substituições são refinados em seguida pela introdução de outras variantes ou variantes adicionais nos sítios de substituição ou para estes. Desta forma, embora o sítio para introdução de uma variação de seqüência de aminoácidos seja previamente determinado, a natureza intrínseca da mutação não necessita ser previamente determinada. Para analisar o desempenho de uma mutação em um dado sítio, por exemplo, varredura de ala ou mutagênese aleatória é conduzida no códon ou região alvo e as variantes de antagonistas expressas são selecionadas para a atividade desejada.

As inserções de seqüências de aminoácidos incluem fusões de carbóxi e/ou amino-terminal que variam de comprimento de um resíduo até polipeptídeos que contenham cem ou mais resíduos, bem como inserções intra-seqüenciais de resíduos de aminoácidos isolados ou múltiplos. Exemplos de inserções terminais incluem um antagonista com um resíduo de metionila N- terminal ou o anticorpo fundido a um polipeptídeo citotóxico. Outras variantes de inserção da molécula de anticorpo incluem a fusão ao N- ou C-terminal do anticorpo (por exemplo, para ADEPT) de uma enzima ou um polipeptídeo que aumente a meia vida do antagonista no soro.

Outro tipo de variante é uma variante de substituição de aminoácidos. Estas variantes contêm pelo menos um resíduo de aminoácido na molécula de anticorpo substituída por um resíduo diferente. Os sítios de maior interesse para mutagênese de substituição incluem as regiões hipervariáveis, mas também são contempladas alterações de FR. Substituições conservadoras são exibidas na Tabela A sob o título de "substituições preferidas". Caso essas substituições resultem em mudança da atividade biológica, então mudanças mais substanciais, denominadas "exemplos de substituições" na Tabela A, ou conforme descrito adicionalmente abaixo com referência a classes de aminoácidos podem ser introduzidas e os produtos são selecionados.

Tabela a

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Modificações substanciais das propriedades biológicas do anticorpo são atingidas por meio da seleção de substituições que diferem significativamente no seu efeito sobre a manutenção (a) da estrutura da cadeia principal de polipeptídeo na área da substituição, por exemplo, na forma de folha ou em conformação helicoidal; (b) da carga ou hidrofobicidade da molécula no sítio desejado; ou (c) do volume da cadeia lateral. Os aminoácidos podem ser agrupados de acordo com similaridades nas propriedades de suas cadeias laterais (em A. L. Lehninger, in Biochemistry, segunda ed., pp. 73-75, Worth Publishers, Nova Iorque (1975)):

(1) Apolares: Ala (A), Val (V), Leu (L)1 Ile (I), Pro (P), Phe (F)1 Trp (W), Met (M)

(2) Sem caraga polar: Gly (G)1 Ser (S), Thr (T), Cys (C), Tyr (Y), Asn (N), Gln (Q)

(3) Ácido: Asp (D), Glu (E)

(4) Básico: Lys (K), Arg (R), His(H)

Alternativamente, os resíduos de ocorrência natural podem ser divididos em grupos com base nas propriedades comuns da cadeia lateral:

(1) Hidrofílicos: Norleucina, Met, Ala, Vai, Leu, lie;

(2) Hidrofílicos neutros: Cys1 Ser, Thr, Asn, Gln; (3) Ácido: Asp1 Glu;

(4) Básico: His1 Lys1 Arg;

(5) Resíduos que influenciam na orientação das cadeias: Gly, Pro;

(6) Aromático: Trp1 Tyr1 Phe.

Substituições não-conservadoras causarão a substituição de um membro de uma dessas classes por outra classe. Tais resíduos substituídos também podem ser introduzidos nos locais conservados da substituição ou, mais preferivelmente, nos locais (não-conservados) restantes.

Um tipo particularmente preferido de variante de substituição envolve a substituição de um ou mais resíduos da região hipervariável de um anticorpo parental (por exemplo, anticorpo humano e humanizado). Geralmente, a(s) variante(s) resultante(s) selecionada(s) para desenvolvimento adicional terá(ão) propriedades biológicas modificadas (por exemplo, aprimoradas) com relação ao anticorpo parental do qual é(são) gerado(s). Resumidamente, diversos sítios de regiões hipervariáveis (por exemplo, 6 a 7 sítios) sofrem mutações para gerar todas as substituições amino possíveis em cada sítio. Os anticorpos assim gerados são exibidos a partir de partículas de fagos filamentosos fundidos a pelo menos uma parte da proteína da cápside do fago (por exemplo, o produto do gene Ill de M13). As variantes exibidas por fago são, então, selecionadas de acordo com a sua atividade biológica (por exemplo, afinidade de ligação) conforme descrita na presente invenção. A fim de identificar possíveis sítios de regiões hipervariáveis para modificação, mutagênese por varredura de alanina pode ser realizada para identificar resíduos de regiões hipervariáveis que contribuem significativamente para a ligação de antígenos. Alternativamente ou adicionalmente, pode ser benéfico analisar a estrutura cristalina do complexo antígeno-anticorpo para identificar pontos de contato entre o anticorpo e o antígeno. Tais resíduos de contato e resíduos vizinhos são candidatos à substituição de acordo com as técnicas conhecidas no estado da arte. Após a geração de tais variantes, o quadro de variantes é submetido à seleção conforme descrito na presente invenção e os anticorpos com propriedades superiores em um ou mais testes relevantes podem ser selecionados para desenvolvimento adicional.

Moléculas de ácidos nucléicos que codificam variantes da seqüência de aminoácidos do anticorpo são preparadas por meio de uma série de métodos conhecidos no estado da técnica. Estes métodos incluem, mas não se limitam a, o isolamento a partir de uma fonte natural (no caso de variantes de seqüências de aminoácidos de ocorrência natural) ou preparação por meio de mutagênese mediada por oligonucleotídeo (ou sítio-dirigida), mutagênese por PCR e cassete de mutagênese de uma variante preparada anteriormente ou uma versão não-variante do anticorpo.

Pode ser desejável introduzir uma ou mais modificações de aminoácidos em uma região Fc do anticorpo da invenção, gerando assim uma região Fc variante. A região Fc variante humana pode compreender uma seqüência região Fc (por exemplo, região Fc da IgGI, lgG2, lgG3 ou lgG4 seqüência) que inclui uma modificação de aminoácido (por exemplo, uma substituição) em um ou mais posições de aminoácidos incluindo o de uma dobradiça de cisteína.

Variantes de polipeptídeos com seqüências de aminoácidos da região Fc alteradas e capacidade de ligação de C1q aumentada ou reduzida são descritas na patente US 6.194.551 B1 e no documento WO 99/51642. O conteúdo de ditas publicações é incorporado especificamente ao presente como referência. Vide também Idusogie et al., J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000).

De acordo com esta descrição e os ensinamentos no estado da técnica, é contemplado que, em alguns exemplos, um anticorpo da invenção pode constar de uma ou mais alterações em comparação com o anticorpo homólogo do tipo selvagem, por exemplo, na região Fc. Estes anticorpos, porém, mantém sensivelmente as mesmas características exigidas para a utilidade terapêutica, comparativamente ao seu homólogo do tipo selvagem. Por exemplo, podem ser feitas algumas alterações na região Fc, que alteraram (isto é, ou melhoram ou diminuem) a ligação ao C1q e/ou a citotoxicidade dependente do complemento (CDC), por exemplo, como descrito no documento W099/51642. Vide também Duncan e Winter, Nature 322:738-40 (1988); Patente US 5648260; Patente US. 5624821, e documento W094/29351 relativas a outros exemplos de região Fc variantes.

Em um aspecto, a invenção fornece anticorpos possuem modificações na interface dos polipeptídeos Fc que compreendem a região Fc, onde as modificações facilitam e/ou promovem a heterodimerização. Estas alterações incluem a introdução de uma protuberância em um primeiro polipeptídeo Fc e uma cavidade em um segundo polipeptídeo de Fc, onde a protuberância é posicionada na cavidade de modo a promover o complexo entre o primeiro e segundo polipeptídeo de Fe. Métodos para produção de anticorpos com estas modificações são conhecidas no estado da técnica, por exemplo, como descrito na Patente US 5.731.168.

Imunoconjugados

Em outro aspecto, A invenção também fornece imunoconjugados ou a anticorpos conjugados com drogas (CAD), compreendendo um anticorpo conjugado a um agente citotóxico tal como um agente quimioterápico, droga, agente inibidor de crescimento, toxina (por exemplo, uma toxina enzimaticamente ativa de origem bacteriana, fungíca, vegetal ou animal, ou fragmentos destes) ou um isótopo radioativo (isto é, um radioconjugado).

O uso anticorpos conjugados com drogas para a entrega local de agentes citotóxicos ou citostático, isto é, drogas para matar ou inibir células tumorais no tratamento do câncer (Syrigos and Epenetos (1999) Anticancer Research 19:605-614; Niculescu-Duvaz e Springer (1997) Adv. Drg Del. Rev. 26:151-172; U.S. patent 4,975,278) teoricamente permitem a entrega da droga a célula alvo de parte do tumor, e a acumulação intracelular deste, onde a administração sistêmica destes agentes não conjugados com drogas pode resultar em níveis inaceitáveis de toxicidade às células normais bem como as células do tumor que precisam ser eliminadas (Baldwin et al., (1986) Lancet pp. (15 de Março de 1986):603-05; Thorpe, (1985) "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Câncer Therapy: Uma revisão em,"Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinicai Applications, A. Pinchera et al. (ed.s), pp. 475-506). É procurado desse modo a eficácia máxima com toxicidade mínima. Tanto os anticorpos policlonais quanto os anticorpos monoclonais foram relatados como úteis nestas estratégias (Rowland et al., (1986) Supra). As drogas usadas nestes métodos incluem a daunomicina, doxorubicina, metotrexate, e a vindesina (Rowland et al., (1986) Supra). As toxinas usadas em conjugados anticorpo-toxina incluem as toxinas bacterianas tais como a toxina da difcteria, toxina de plantas tais como a ricina, pequenas moléculas de toxinas tais como a geldanamicina Mandler et al (2000) Jour. of the Nat. Câncer Inst. 92(19): 1573-1581; Mandler et al (2000) Bioorganic & Med. Chem. Letters 10:1025-1028; Mandler et al (2002) Bioconjugate Chem. 13:786-791), maitansinóides (Patente EP 1391213; Liu et ai., (1996) Proc. Nati Acad. Sei. USA 93:8618-8623), e caliceamicina (Lode et al (1998) Câncer Res. 58:2928; Hinman et al (1993) Câncer Res. 53:3336-3342). As toxinas podem realizar seus efeitos citotóxicos e citostáticos por mecanismos incluindo a ligação da tubulina, a ligação do DNA ou a inibição da topoisomerase. Algumas drogas citotóxicas tendem a ser inativas ou mais menos ativas quando conjugadas com anticorpos ou Iigantes de proteínas receptoras.

ZEVALIN® (ibritumomab tiuxetan, Biogen/ldec) é um conjugado anticorpo-radioisótopo composto de um anticorpo monoclonal IgGI kappa murino dirigido contra ao antígeno CD20 encontrado na superfície de linfócitos normais e malignizados e ligado ao radioisótopo In111 ou Y90 ligado por um tiourea ligada a um quelante (Wiseman et al (2000) Eur. Jour. Nucl. Med. 27(7):766-77; Wiseman et al (2002) Blood 99(12):4336-42; Witzig et al (2002) J. Clin. Oncol. 20(10):2453-63; Witzig et al (2002) J. Clin. Oncol. 20(15):3262-69). Embora ZEVALIN tenha a atividade contra o Iinfoma de célula B não Hodgkin (NHL), a administração resulta em citopenias graves e prolongadas na a maioria dos pacientes. MYLOTARG™ (gemtuzumab ozogamicina, Wyeth Pharmaceuticals), um anticorpo conjugado a droga composto de um anticorpo hu CD33 ligado a caliceamicina, foi aprovado em 2000 para o tratamento da leucemia mielóide aguda por injeção (Drugs of the Future (2000) 25(7):686; Patente US 4970198; US 5079233; US 5585089; US 5606040; US 5693762; US 5739116; US 5767285; US 5773001. ZEVALIND (ibritumomab tiuxetan, Biogen/ldec) é um conjugado anticorpo-radioisótopo composto de um anticorpo monoclonal IgGI kappa murino dirigido contra ao antígeno CD20 encontrado na superfície de linfócitos normais e malignizados e ligado ao radioisótopo In111 ou Y90 ligado por um tiourea ligada a um quelante (Wiseman et al (2000) Eur. Jour. Nucl. Med. 27(7):766-77; Wiseman et al (2002) Blood 99(12):4336- 42; Witzig et al (2002) J. Clin. Oncol. 20(10):2453-63; Witzig et al (2002) J. Clin. Oncol. 20(15):3262-69). Embora ZEVALIN tenha a atividade contra o Iinfoma de célula B não Hodgkin (NHL), a administração resulta em citopenias graves e prolongadas na a maioria dos pacientes. MYLOTARG™ (gemtuzumab ozogamicina, Wyeth Pharmaceuticals), um anticorpo conjugado a droga composto de um anticorpo hu CD33 ligado a caliceamicina, foi aprovado em 2000 para o tratamento da leucemia mielóide aguda por injeção (Drugs of the Future (2000) 25(7):686; Patente US 4970198; US 5079233; US 5585089; US 5606040; US 5693762; US 5739116; US 5767285; US 5773001. Cantuzumab mertansina (Immunogen, Inc.), um conjugado anticorpo-droga composto pelo anticorpo huC242 ligado através do Iigante SPP a fração maitansinóide da droga, DM1 do bissulfeto, está avançando em experimentações de fase Il para o tratamento dos cânceres que expressam CanAg como, por exemplo, pancreático, gástrico entre outros. MLN-2704 (Millennium Pharm., BZL Biologics, Immunogen Inc.), um conjugado anticorpo-droga composto pelo anticorpo monoclonal específico para antígeno de membrana anti-prostático (PSMA) ligado a fração maitansinóide da droga, DM1, está sob o desenvolvimento para o tratamento potencial de tumores de próstata. Os peptídeos da auristatina, auristatina E (AE) e a monometilauristatina (MMAE), análogos sintéticos da dolastatina, conjugado aos anticorpos monoclonais quimérico cBR96 (específico para o carcinoma de Lewis Y) e cAC10 (específico para o CD30 em malignidades hematológicas) (Doronina et al (2003) Nature Biotechnology 21(7):778-784) e estão sob desenvolvimento terapêutico.

Os agentes quimioterápicos úteis na geração de tais imunoconjugados foram descritos acima. Toxinas enzimaticamente ativas e seus fragmentos que podem ser utilizados incluem cadeia A de difteria, fragmentos ativos não-ligantes da toxina de difteria, cadeia A de exotoxina (de Pseudomonas aeruginosa), cadeia A rícina, cadeia A de abrina, cadeia A de modeccina, alfa-sarcina, proteínas de Aleurites fordii, proteínas de diantina, proteínas de Phytolaca americana (PAPI, PAPII e PAP-S), inibidor Momordica charantia, curcina, crotina, inibidor de Sapaonaria offícinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina e os tricotecenos. Vide, por exemplo, o documento WO 93/21232 publicado em 28 de outubro de 1993. Uma variedade de radionucleotídeos está disponível para a produção de anticorpos radioconjugados. Exemplos incluem Bi212, I1311 In131, Y90 e Re186. Os conjugados do antagonista e agente citotóxico podem ser fabricados utilizando uma série de agentes acopladores de proteínas bifuncionais, tais como propionato de N-succinimidil-3-(2-piridilditiol) (SPDP)1 iminotiolano (IT)1 derivados bifuncionais de imidoésteres (tais como adipimidato de dimetila HCI), ésteres ativos (tais como suberato de dissuccinimidila), aldeídos (tais como glutaraldeído), compostos bis-azido (tais como bis-(para-azidobenzoil)- hexanodiamina), derivados bis-diazônio (tais como bis-(para-diazoniobenzoil)- etilenodiamina), diisocianatos (tais como 2,6-diisocianato de tolueno) e compostos de flúor bis-ativo (tais como 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenzeno). Pode- se preparar, por exemplo, uma imunotoxina rícina, conforme descrito em Vitetta et ai, Science 238: 1098 (1987). Ácido 1-isotiocianatobenzil-3-metildietileno triaminopentaacético marcado por carbono 14 (MX-DTPA) é um exemplo de agente quelante para conjugação de radionucleotídeo ao antagonista. Vide o documento WO 94/11026.

Conjugados de um antagonista e uma ou mais toxinas de moléculas pequenas, tais como caliqueamicina, maitansinóides, tricoteno e CC1065 e seus derivados que também apresentam atividades de toxinas, são contemplados no presente.

Maitansina ε Maitansinóides Em alguns exemplos de realizações, o imunoconjugado compreende o anticorpo da invenção conjugado a uma ou mais moléculas maitansinóides.

Maitansinóides são inibidores mitóticos que agem através da inibição da polimerização de tubulina. Maitansina foi isolada pela primeira vez a partir de Maytenus serrata (patente US 3.896.111). Descobriu-se em seguida que determinados micróbios também produzem maitansinóides, tais como maitansinol e ésteres C-3 de maitansinol (patente US 4.151.042). Maitansinol sintético, seus derivados e análogos são descritos, por exemplo, nas patentes US 4.137.230, US 4.248.870, US 4.256.746, US 4.260.608, US 4.265.814, US 4.294.757, US 4.307.016, US 4.308.268, US 4.308.269, US 4.309.428, US 4.313.946, US 4.315.929, US 4.317.821, US 4.322.348, US 4.331.598, US 4.361.650, US 4.364.866, US 4.424.219, US 4.450.254, US 4.362.663 e US 4.371.533.

Frações da droga dos maitansinóides são frações atrativas da droga em conjugados droga-anticorpo porque são: (i) relativamente acessíveis para serem preparadas pela modificação por fermentação ou modificação química, derivada de produtos da fermentação, (ii) por serem receptivos à derivatização com os grupos funcionais apropriados para a conjugação através de ligações não dissulfeto aos anticorpos, (iii) o estáveis no plasma, e (iv) eficazes contra uma variedade de linhagens de células tumorais.

Realizações exemplares de moléculas de drogas maitansinóides incluem: DM1; DM3 e DM4. Imunoconjugados contendo maitansinóides e seus usos terapêuticos são descritos, por exemplo, nas patentes US 5.208.020, US 5.416.064 e patente EP 0 425 235 B1, cujos conteúdos são expressamente incorporados ao presente como referência. Liu et ai, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 93: 8618-8623 (1993), descreveram imunoconjugados que compreendem um maitansinóide denominado DM1 ligado ao anticorpo monoclonal C242 dirigido a câncer colo-retal humano. Concluiu-se que o conjugado é altamente citotóxico com relação a células cancerígenas do cólon cultivadas e exibiu atividade antitumoral em teste de crescimento tumoral in vivo. Chari et ai, Câncer Research 52: 127-131 (1992) descrevem imunoconjugados em que um maitansinóide foi conjugado por meio de uma ligação dissulfeto ao anticorpo A7 murino que se liga a um antígeno sobre linhagens de células cancerígenas de cólon humano ou a outro anticorpo TA-1 monoclonal murino que liga o oncogene HER-2/neu. A citotoxicidade do conjugado TA.1- maitansinóide foi testado in vitro em células da linhagem humana SK-BR-3 de câncer de mama, que expressa 3 χ 10^5 antígenos de superfície HER-2 por célula. O conjugado da droga conseguiu um grau de citotoxicidade similar a droga maitansinóide livre, que poderia ser aumentada pelo aumento no número de moléculas maitansinóide por a molécula de anticorpo. Os conjugados A7- maitansinóide demonstrou baixa citotoxicidade sistêmica nos camundongos.

Os conjugados anticorpo-maitansinóide são preparados quimicamente ligando um anticoro a uma molécula de maitansinóide sem diminuir significativamente a atividade biológica do anticorpo ou da molécula maitansinóide. Vide, por exemplo, a Patente US 5.208.020 (a divulgação do qual é expressamente incorporada a este pela referência). Uma média de 3-4 moléculas maitansinóide conjugada por a molécula de anticorpo mostrou eficácia em amplificar a citotoxicidade em células alvo sem afetar negativamente a função ou a solubilidade do anticorpo, embora mesmo uma molécula de anticorpo/toxina se esperasse amplificar a citotoxicidade sobre o uso de um anticorpo nú. Maitansinóide são bem conhecidos no estado da técnica e podem ser sintetizados por técnicas conhecidas ou isolados de fontes naturais. Maitansinóide apropriados são descritos, por exemplo, na patente US 5.208.020 e outras atentes e publicações não patentes referidas abaixo no presente. Os maitansinóides preferidos são maitansinol e análogos do maitansinol modificados no anel aromático ou em outras posições da molécula do maitansinol, tais como vários ésteres do maitansinol.

Existem diversos grupos de ligação conhecidos no estado da técnica para a fabricação de conjugados de anticorpo e maitansinóide, que incluem, por exemplo, os descritos na patente US 5.208.020 ou EP 0.425.235 B1 e Chari etal., CancerResearch 52: 127-131 (1992) e pedido de Patente US 10/960.602, arquivado em 8 de outubro de 2004, a divulgação do qual é expressamente incorporada a este pela referência. Conjugados anticorpo- maitansinóide contendo o componente Iigante SMCC pode ser preparado conforme divulgado no pedido de Patente US 10/960602, arquivados em 8 de outubro de 2004. Os grupos de ligação incluem grupos dissulfeto, grupos tioéter, grupos de ácidos lábeis, grupos fotolábeis, grupos lábeis de peptidase ou grupos lábeis de esterase, conforme descrito nas patentes identificadas acima. Grupos de ligação adicionais estão descritos e exemplificados no presente.

Os conjugados do anticorpo e maitansinóide podem ser fabricados através da utilização de uma série de agentes acopladores protéicos bifuncionais, tais com propionato de N-succinimidil-3-(2-piridilditio) (SPDP)1 cicloexano-1-carboxilato de succinimidil-4-(N-maleimidometila) (SMCC)1 iminotiolano (IT)1 derivados bifuncionais de imidoésteres (tais como adipimidato de dimetila HCI), ésteres ativos (tais como suberato de disuccinimidila), aldeídos (tais como glutaraldeído), compostos bis-azido (tais como bis-(para- azidobenzoil)-hexanodiamina), derivados de bis-diazônio (tais como bis-(para- diazoniobenzoil)-etilenodiamina), diisocianatos (tais como 2,6-diisocianato de tolueno) e compostos de flúor bis-ativo (tais como 1,5-difluoro-2,4- dinitrobenzeno). Os agentes acopladores particularmente preferidos incluem propionato de N-succiηimidil-3-(2-piridiltio) (SPDP) (Carlsson et ai, Biochem. J. 173: 723-737 (1978)) e pentanoato de N-succinimidil-4-(2-piridiltio) (SPP) para proporcionar ligação dissulfeto.

O ligante pode estar unido à molécula de maitansinóide em diversas posições, dependendo do tipo da ligação. Uma ligação éster pode ser formada, por exemplo, através da reação com um grupo hidroxila, utilizando-se técnicas convencionais de acoplamento. A reação pode ocorrer na posição C-3 que possui um grupo hidroxila, na posição C-14 modificada com hidroximetila, na posição C-15 modificada com um grupo hidroxila e na posição C-20 que possui um grupo hidroxila. Em uma realização preferida, a ligação é formada na posição C-3 de maitansinol ou um análogo do mesmo.

Auristatina ε Dolostatina Em alguns exemplo de realização, o imunoconjugado compreende um anticorpo da invenção conjugado com dolastatinas ou peptídicos análogos da dolastatinas e derivados e auristatinas (Patentes US 5.635.483; 5.780.588). Dolastatinas e auristatinas mostraram interferir com a dinâmica do microtúbulo, hidrólise da GTP e divisão nuclear e celular (Woyke et al (2001) Antimicrob. Agents and Chemother. 45(12):3580-3584) e possuem atividade anti-câncer (Patente US 5663149) e antifúngica (Pettit et al (1998) Antimicrob. Agents Chemother. 42:2961-2965). A fração da droga dolastatina ou auristatina podem ser unidas covalentemente a um anticorpo através do (amino) N-terminal ou do C (carboxila) terminal da fração peptídica da droga (WO 02/088172).

Incorporações exemplares da auristatina incluem a ligação do N- terminal da fração DE e DF da droga monometilauristatina, divulgados em "Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands", Ser. US No. 10/983,340, arquivado em 5 de novembro de 2004, a divulgação do qual é expressamente incorporada pela referência em sua totalidade.

Incorporações exemplares da auristatina incluem MMAE e MMAF. Incorporações adicionais constam de Iigantes MMAE ou MMAF e vários componentes (descrito mais adiante neste documento) incluindo Ab-MC-VC- PAB-MMAF1 Ab-MC-VC-PAB-MMAE, Ab-MC-MMAE e Ab-MC-MMAF.

Tipicamente, frações da droga baseadas em peptídeo podem ser preparadas formando uma ligação de peptídeos entre dois ou mais aminoácidos e/ou fragmentos de peptídeos. Tais ligações de peptídeos podem ser preparados, por exemplo, de acordo com o método de síntese de fase líquida (vide, E. Schrõder e K. Lübke, "The Peptides", volume 1, págs 76-136, 1965, Academic Press) que é bem conhecido no campo da química de peptídeos.

As moléculas das drogas auristatina/dolastatina podem ser preparadas de acordo com os métodos da Patente US 5.635.483; Patente US 5.780.588; Pettit et al (1989) J. Am. Chem. Soe. 111:5463-5465; Pettit et al (1998) Anti-Cancer Drug Design 13:243-277; Pettit, GR1 et al. Syntesis, 1996, 719-725; e Pettit ef al (1996) J. Chem. Soe. Perkin Trans. 1 5:859-863. Vide também Doronina (2003) Nat Biotechnol 21 (7):778-784; "Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands", US Nº 10/983340, arquivado em 5 de Novembro de 2004, incorporado ao presente pela referência na sua totalidade (divulgado, por exemplo, Iigantes e métodos de preparação de compostos monometilvalina como MMAE e MMAF conjugado aos ligantes).

CALIQUEAMICINA

Em outro exemplo de realização, o imunoconjugado compreende um anticorpo da invenção conjugado a uma ou mais moléculas de caliqueamicina. A família caliqueamicina de antibióticos é capaz de produzir quebras de DNA de fita dupla em concentrações sub-picomolares. Para a preparação de conjugados da família de caliqueamicina, vide as patentes US 5.712.374, US 5.714.586, US 5.739.116, US 5.767.285, US 5.770.701, US 5.770.710, US 5.773.001 e US 5.877.296 (todas da American Cyanamid Company). Análogos estruturais de caliqueamicina que podem ser utilizados incluem, mas sem limitar-se a, γΛ c^', c^', N-acetil-γΛ PSAG e θ'ι (Hinman et al., Câncer Research 53: 3336-3342 (1993), Lode et al., Câncer Research 58: 2925-2928 (1998) e as patentes US da American Cyanamid citadas acima). Outra droga antitumoral à qual o anticorpo pode ser conjugado é QFA, que é um antifolato. Tanto caliqueamicina quanto QFA contêm sítios intracelulares de ação e não atravessam facilmente a membrana plasmática. Portanto, a absorção celular desses agentes através de internalização mediada por anticorpos aumenta grandemente seus efeitos citotóxicos.

OUTROS AGENTES CITOTOXICOS

Outros agentes antitumor que podem ser conjugados aos anticorpos da invenção incluem BCNU, streptozoicina, vincristina e 5- fluorouracil, a família do complexo LL-E33288 de agentes conhecidos coletivamente descrito nas patentes US 5.053.394 e US 5.770.710, bem como as esperamicinas (Patente US 5.877.296).

Toxinas enzimaticamente ativas e seus fragmentos que podem ser utilizados incluem cadeia A de difteria, fragmentos ativos não-ligantes da toxina de difteria, cadeia A de exotoxina (de Pseudomonas aeruginosa), cadeia A rícina, cadeia A de abrina, cadeia A de modeccina, alfa-sarcina, proteínas de Aleurites fordii, proteínas de diantina, proteínas de Phytolaca americana (PAPI, PAPII e PAP-S), inibidor Momordica charantia, curcina, crotina, inibidor de Sapaonaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina e os tricotecenos. Vide, por exemplo, o documento WO 93/21232, publicado em 28 de outubro de 1993.

A presente invenção contempla adicionalmente um antagonista conjugado a um composto com atividade nucleolítica (por exemplo, ribonuclease ou uma endonuclease de DNA1 tal como deoxirribonuclease; DNase).

Para a destruição seletiva do tumor, o anticoro pode conter um átomo altamente radioativo. Uma série de isótopos radioativos é disponível para a produção de antagonistas radioconjugados. Exemplos incluem At211, I1311 I125, Y901 Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 e isótopos radioativos de Lu. Quando o conjugado for utilizado para diagnóstico, ele pode compreender um átomo radioativo para estudos cintigráficos, por exemplo, tc99m ou 1123, ou uma marca de centrifugação para formação de imagem através de ressonância magnética nuclear (NMR) (também conhecida como formação de imagem por ressonância magnética, MRI), tal como novamente iodo-123, iodo-131, índio- 111, flúor-19, carbono-13, nitrogênio-15, oxigênio-17, gadolínio, manganês ou ferro.

A radiomarcação ou outras podem ser incorporadas ao conjugado de formas conhecidas. O peptídeo pode ser, por exemplo, biossintetizado ou pode ser sintetizado através de síntese química de aminoácidos, utilizando precursores de aminoácidos apropriados, envolvendo, por exemplo, flúor-19 no lugar de hidrogênio. Marcas tais como tc99m, I123, Re186, Re188 e In111 podem ser ligadas através de um resíduo de cisteína no peptídeo. ítrio-90 pode ser ligado através de um resíduo de lisina. O método Iodogen (Fraker et al. (1978), Biochem. Biophys. Res. Commun. 80: 49-57) pode ser utilizado para a incorporação de iodo-123. Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy (Chatal, CRC Press, 1989) descreve outros métodos em detalhes.

Os conjugados do anticorpo e agente citotóxico podem ser fabricados por meio de uma série de agentes acopladores protéicos bifuncionais, tais como propionato de N-succinimidila-3-(2-piridi!ditio) (SPDP)1 cicloexano-1-carboxilato de succinimidil-4-(N-maleimidometila) (SMCC), iminotiolano (IT), derivados bifuncionais de imidoésteres (tais como adipimidato de dimetila HCI), ésteres ativos (tais como suberato de di-succinimidila), aldeídos (tais como glutaraldeído), compostos bis-azido (tais como bis-(para- azidobenzoil)-hexanodiamina), derivados bis-diazônio (tais como bis-(para- diazoniobenzoil)-etilenodiamina), diisocianatos (tais como 2,6-diisocianato de tolueno) e compostos de flúor bis-ativo (tais como 1,5-difluoro-2,4- dinitrobenzeno). Pode-se preparar, por exemplo, uma imunotoxina rícina, conforme descrito em Vitetta et al., Science 238: 1098 (1987). Ácido 1- isotiocianatobenzil-3-metildietileno triaminopentaacético marcado por carbono 14 (MX-DTPA) é um exemplo de agente quelante para conjugação de radionucletídeo ao anticorpo. Vide o documento WO 94/11026. O Iigante pode ser um "ligante capaz de ser clivado" que facilita a liberação da droga citotóxica na célula. Pode-se utilizar, por exemplo, um ligante de ácido lábil, ligante sensível à peptidase, ligante fotolábel, ligante de dimetila ou ligante contendo dissulfeto (Chari et al., Câncer Research 52: 127-131 (1992); patente US 5.208.020).

Os compostos da invenção contemplam expressamente, mas não são limitados a, ADC preparado com reagentes reticulantes: BMPS, EMCS, GMBS, HBVS1 LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, sulfo-EMCS, sulfo-GMBS, sulfo-KMUS, sulfo-MBS, sulfo-SIAB, sulfo- SMCC, sulfo-SMPB, e SVSB (succinimidil-(4-vinilsulfona)benzoato) que estão comercialmente disponíveis (por exemplo, pela Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL., EUA). Veja páginas 467-498, Applications Handbook and Catalog 2003-2004.

Preparação de Anticorpos Conjugados com Drogas Nos conjugados de anticorpos com drogas (ADC) da invenção, um anticorpo conjugado (Ab) a um ou mais frações da droga (D), por exemplo, cerca de 1 a 20 frações da droga por anticorpo, através de um ligante (L). O ADC da fórmula I pode ser preparado por diversos protocolos, empregando reações de química orgânica, circunstancias e reagentes conhecidos por hábeis na técnica, incluindo: (1) reação de um grupo nucleofílico de um anticorpo com um reagente ligante bivalente a forma Ab-L, através de uma ligação covalente, seguida pela reação com a fração de droga D; e (2) reação de um grupo nucleofílico de uma fração da droga com um reagente ligante bivalente, a forma D-L, através de uma ligação covalente, seguida pela reação com o grupo nucleofílico de um anticorpo. Métodos adicionais para preparação de ADC estão descritos no presente.

Ab-(L-D)p

O ligante pode ser composto por um ou mais componentes ligante. Exemplos componentes de ligantes incluem 6-maleimidocaproil ("CM"), maleimidopropanoil ("MP"), valina-citrulina ("val-cit"), alanina-fenilalanina ("Ala- phe"), p-aminobenziloxicarbonil ("PAB"), N-Succinimidil 4-(2-piridiltio) pentanoato ("SPP"), N-Succinimidol 4-(N-maleimidometil) ciclohexano-1 carboxilato ("SMCC"), e Succinimidil N-(4-iodo-acetil) aminobenzoato ("SIAB"). Componentes de Iigantes adicionais são conhecidos na arte e alguns estão descritos neste documento. Vide também "Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands", US N0 10/983340, arquivado em 5 de Novembro de 2004, o conteúdo do qual é aqui incorporado pela referência na sua totalidade.

Em alguns exemplos de realização, o ligante pode compreender de resíduos de aminoácidos. Exemplos de componentes aminoácidos Iigantes incluem dipeptídeos, tripeptídeos, tetrapeptídeos ou pentapeptídeos. Exemplos de dipeptídeos incluem: valine-citrulina (vc ou val-cit), alanina-fenilalanina (af ou ala-phe). Exemplos de tripeptídeos incluem: glicina-valina-citrulina (gly-val- cit) e glicina-glicina- glicina (gly-gly-gly). Resíduos de aminoácidos que incluam um componente Iigante de aminoácido incluem aqueles que ocorrem naturalmente, assim como aminoácidos pequenos e aminoácidos análogos que não ocorrem naturalmente, tais como citrulina. Componentes ligantes de aminoácidos podem ser concebidos e otimizados em sua seletividade para a clivagem enzimática por uma enzima específica, por exemplo, uma protease associada a tumor, catepsina B, C, D, ou plasmina.

Exemplos de estruturas de componente s Iigantes são mostrados abaixo (onde a linha ondulada indica os sítios de ligação covalente a outros componentes da ADC):

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Exemplos de componentes Iigantes e abreviações adicionais incluem (onde o anticorpo (AB) e Iigantes são representados, e ρ é cerca de 1 a 8):

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Os grupos nucleofílico nos anticorpos incluem, mas não são limitados: (i) grupos amino N-terminal, (ii) grupos amino da cadeia lateral, por exemplo lisina, (iii) grupos tiol da cadeia lateral, por exemplo cisteína, e (iv) hidroxila do açúcar ou grupos amino onde o anticorpo é glicosilado. Os grupos amino, tiol e hidroxila são nucleofílicos e capazes de reagir às ligações de forma covalente com os grupos eletrofílicos em frações dos Iigantes e reagentes Iigantes incluindo: (i) ésteres ativos tais como ésteres de NHS1 ésteres de HOBt1 haloformatos, e halides ácidos; (ii) Alquilas e halides benzil tais como haloacetamidas; (iii) grupos dos aldeídos, das cetonas, carboxil e maleimida. Determinados anticorpos têm ligações intercadeias reduzidas, isto é, pontes do cisteina. Os anticorpos podem ser feitos reativos pela cojugação com os reagentes Iigantes pelo tratamento com um agente redutor, tal como DTT (ditiotreitol). Cada ponte do cisteina dará forma assim, teoricamente, a dois tióis nucleofílicos reativos. Os grupos nucleofílicos adicionais podem ser introduzidos em anticorpos pela reação das Iisinas com 2-iminotiolano (reagente de Traut) tendo por resultado a conversão de uma amina em um tiol. Grupos reativos de tiol podem ser introduzidos no anticorpo (ou fragmento deste) pela introdução de um, dois, três, quatro, ou mais resíduos de cisteina (por exemplo, preparando anticorpos mutantes compreendendo um ou mais resíduos de aminoácidos não-nativos).

Os conjugados de anticorpos com drogas da invenção podem também ser produzidos pela modificação do anticorpo para introduzir a região eletrofílicas, que podem reagir com os substituintes nucleofílicos no reagente ligante ou na droga. Os açúcares de anticorpos glicosilados podem ser oxidados, por exemplo, com os reagentes de oxidação periodato, para dar forma ao aldeído ou aos grupos cetona que podem reagir com o grupo amino dos ligantes reagentes ou frações das drogas. Os grupos iminas resultantes de Schiff do podem dar forma a uma ligação estável, ou podem ser reduzidos, por exemplo, pelo reagente borohidrido para formar ligações amino estáveis. Em um exemplo de realização, a reação da porção do hidrato de carbono de um anticorpo glicosilado com a galactose oxidase ou o metaperiodato de sódio pode formar grupos carbonil (aldeído e cetona) na proteína que desta forma pode reagir com os grupos apropriados na droga (Hermanson1 Bioconjugate Techniques). Em outro exemplo de realização, as proteínas que contêm a serina N-terminal ou os resíduos do treonina podem reagir com o meta- periodato de sódio, tendo por resultado a produção de um aldeído no lugar do primeiro aminoácido (Geoghegan & Stroh, (1992) Bioconjugate Chem. 3:138- 146; Patente US 5362852). Tal aldeído pode reagir com um Iigante reagente ou uma fração da droga nucleofílica.

Do mesmo modo, os grupos nucleofílicos em uma fração da droga incluem, mas não são limitados a: grupos amino, tiol, hidroxila, hidrazida, oxime, hidrazina, tiosemicarbazona, carboxilato de hidrazina e grupos arilhidrazida capazes de reagir na forma de ligações covalente com os grupos electrofílicos em frações do Iigante e reagente do Iigante incluindo: (i) ésteres ativos, tais como, ésteres de NHS, ésteres de HOBt1 haloformates e halides ácidos; (ii) Alquilas e halides benzil tais como haloacetamidas;; (iii) grupos dos aldeídos, das cetonas, carboxil e maleimida.

Alternativamente, uma fusão protéica compreendendo do anticorpo e do agente citotóxico pode ser feita, por exemplo, por técnicas ou pela síntese de peptídeo recombinante. O comprimento do DNA pode compreender as regiões respectivas que codificam as duas parcelas do conjugado adjacente ou separada por uma região que codifica um peptídeo ligante que não destrua as propriedades desejadas do conjugado.

Em um outro exemplo de realização, o anticorpo pode estar conjugado a um "receptor" (como por exemplo a estreptoavidina) para a utilização no tumor pré alvo em que o conjugado anticorpo- receptor é administrado ao paciente, seguido pela remoção de conjugado não ligado da circulação usando um agente de limpeza e então a administração de um "ligante" (por exemplo, avidina) que é conjugado a um agente citotóxico (por exemplo, um radionucleotídeo). Um anticorpo (Ab)-MC-MMAE pode ser preparado pela conjugação de qualquer um dos anticorpos aqui fornecido com MC-MMAE como se segue. O anticorpo, dissolvido em 500 mM de borato de sódio e 500 mM de cloreto de sódio em pH 8,0 é tratado com um excesso de 100 mM ditiotreitol (DTT). Após incubação a 37 0C durante cerca de 30 minutos, o tampão é trocado por eluição sobre a resina Sephadex G25 e eluída por PBS com 1 mM de DTPA. O valor de tiol/Ab é verificado determinando a redução da concentração do anticorpo pela absorbância a 280 nm da solução e da concentração tiol pela reação com DTNB (Aldrich, Milwaukee, Wl) determinada no comprimento de onde de 412 nm. O anticorpo reduzido dissolvido em PBS é refrigerado em gelo. O reagente da droga ligante, auristatina E maleimidocaproil-monometílico (MMAE), ou seja, MC-MMAE, dissolvido em DMSO, é diluído em acetonitrilo e água a uma concentração conhecida, e adicionada ao anticorpo refrigerado 2H9 reduzido em PBS. Após cerca de uma hora, um excesso de maleimida é adicionada para parar a reação e fechar qualquer grupo tiol que não tenha reagido com o anticorpo. A mistura da reação é concentrada por ultrafiltração centrífuga e o 2H9-MC-MMAE é purificado e desalinizado por eluição na resina G25 em PBS, filtrado através de filtros de 0,2 milímetros em condições estéreis, e congelado para armazenamento.

O anticorpo-MC-MMAF pode ser preparado pela conjugação de qualquer um dos anticorpos aqui fornecida com MC-MMAF seguindo o protocolo fornecido para a preparação do Ab-MC-MMAE.

O anticorpo-MC-val-cit-PAB-MMAE é preparado pela conjugação de qualquer um dos anticorpos aqui fornecida com MC-val-cit-PAB-MMAE seguindo o protocolo fornecido para a preparação do Ab-MC-MMAE.

O anticorpo -SMCC-DM1 é preparado pela conjugação de qualquer um dos anticorpos aqui fornecido com o SMCC-DM1 da seguinte forma. O anticorpo é purificado com o derivado (Succinimidil 4-(N- maleimidometil) ciclohexano-1-carboxilato (SMCC, Pierce Biotechnology, Inc) para introduzir o Iigante SMCC. Especificamente, anticorpo é tratada a 20 mg/ml em 50 mM de fosfato de potássio/ 50 mM de cloreto de sódio/ 2 mM de EDTA, em pH 6,5 com equivalente molar 7,5 de SMCC (20 mM em DMSO1 6,7 mg/ml). Depois de agitar durante 2 horas sob argônio em temperatura ambiente, a reação é filtrada através de uma coluna Sephadex G25 balanceada com 50mM de fosfato de potássio/ 50 mM de cloreto de sódio/ 2 mM de EDTA, em pH 6,5. As frações contendo o anticorpo são agrupadas e dosadas.

O anticorpo-SMCC preparado da seguinte maneira é diluído em 50mM de fosfato de potássio/ 50 mM de cloreto de sódio/ 2 mM de EDTA, em pH 6,5, para uma concentração final de cerca de 10 mg/ml, e reagido com uma solução de 10 mM de DM1 em dimetilacetamida. A reação é agitada à temperatura ambiente, sob argônio por 16,5 horas. A mistura da reação de conjugação é filtrada através de uma coluna de filtração em gel Sephadex G25 (1,5 x 4,9 cm) com 1 x PBS em pH 6,5. A relação de droga DM1 para anticorpos (p) pode ser de cerca de 2 a 5, mensurada pela absorbância a 252 nm e a 280 nm.

O Ab-SPP-DMI é preparado pela conjugação de qualquer um dos anticorpos aqui fornecido com SPP-DM1 da seguinte forma: O anticorpo derivado é purificado com N-succinimidil-4-(2-pyridiltio) pentanoato para introduzir grupos ditiopiridil. O anticorpo (376,0 mg, 8 mg/ml) em 44,7 ml de tampão fosfato de potássio 50 mM (pH 6.5) contendo NaCI (50 mM) e EDTA (1 mM) é tratado com SPP (5,3 equivalente molar em 2,3 ml de etanol). Após incubação de 90 minutos, sob argônio em temperatura ambiente, a mistura da reação é filtrada através de uma coluna de gel Sephadex G25 balanceada com 35 mm de citrato de sódio, 154 mM NaCl, 2 mM de tampão EDTA. O frações contendo o anticorpo foram reunidas e mensuradas. O grau de modificação do anticorpo é determinado tal como descrito acima.

O anticorpo-SPP-Py (cerca de 10 μmoles de grupos 2-tiopiridina liberáveis) é diluído em 35 mM de tampão citrato de sódio, pH 6,5, para uma concentração final de cerca de 2,5 mg/ml. DM1 (1,7 equivalentes, 17 μmoles) em 3,0 mM dimetilacetamida (DMA, 3% v/v na mistura final da reação) é então adicionado à solução do anticorpo. A reação procede à temperatura ambiente, sob argônio por cerca de 20 horas. A reação é carregado em uma coluna de filtração em gel Sephacryl S300 (5,0 cm χ 90,0 cm, 1,77 L) balanceada com 35 mM de citrato de sódio, NaCI 154 mM, pH 6,5. A velocidade de fluxo pode ser de cerca de 5,0 ml/min e 65 fracções (20,0 ml cada) são recolhidos. O número de moléculas da droga DM1 ligadas à molécula de anticorpo (p') é determinada pela medição da absorbância a 252 nm e 280 nm, e pode ser de cerca de 2 a 4 moléculas da droga DM1 por moléculas de anticorpo 2H9.

O anticorpo-BMPEO-DM1 é preparado pela conjugação de qualquer um dos anticorpos aqui fornecido com BMPEO-DM1 da seguinte forma. O anticorpo é modificado pelo reagente bis-maleimido BM(PEO)4 (Pierce Chemical), deixando um grupo maleimido não reagido sobre a superfície do anticorpo. Este pode ser obtido pela dissolução de BM(PEO)4, em uma mistura de 50% de etanol/água a uma concentração de 10 mM e acrescentando um excesso molar dez vezes superior a uma solução contendo os anticorpos em tampão fosfato na concentração de aproximadamente 1,6 mg/ml ( 10 micromolar) e permitindo reagir durante 1 hora para formar um ligante do anticorpo intermediário, de 2H9-BMPEO. O excesso de BM(PEO)4 é removido por filtração em gel (coluna HiTrap1 Pharmacia), em 30 mM de citrato, pH 6 com 150 mM de tampão NaCI. Um excesso molar 10 vezes superior de DM1 é dissolvido em dimetil acetamida (DMA) e acrescentado ao 2H9-BMPEO. Dimetil Formamida (CPO) também pode ser utilizado para dissolver o agrupamento reagente da droga. A mistura da reação permanece reagindo overnight em seguida é filtrado ou sofre diálise em gel em PBS para remover o DM1 que não reagiu. A filtração em colunas de gel em PBS S200 é utilizada para remover alto peso molecular agregados, e fornecer o 2H9-BMPEO-DM1 purificado.

Anticorpos Derivativos

Os anticorpos da invenção podem ainda ser modificados para conter moléculas adicionais não-proteinácias que são conhecidos na técnica e prontamente disponíveis. Em um exemplo de realização, as moléculas adequadas para derivatização do anticorpo são polímeros hidrossolúveis. Exemplos não Iimitantes de polímeros hidrossolúveis incluem, mas não se limitando a, polietilenoglicol (PEG)1 copolímeros de etileno-glicol/propilenoglicol, carboximetilcelulose, dextrano, álcool polivinílico, policloreto pirrolidona, poli-1, 3-dioxolano, poli-1,3,6-trioxano, copolímero etileno/maleica anidrido, poliaminoácidos (homopolímeros ou copolímeros aleatórios), e dextrano ou poli (n-vinil pirrolidona) polietileno-glicol, homopolímeros de propropileno glicol, co- polímeros de óxido de prolipropileno oxido de etileno, poliálcool polióis (por exemplo, glicerol), álcool polivinílico, e suas misturas. O polietilenoglicol propionaldeído pode ter vantagens no processo de fabricação devido à sua estabilidade na água. O polímero pode ser de qualquer peso molecular, e pode ser ramificada ou sem ramificação. O número de polímeros acoplados por anticorpo pode variar, e se mais de um polímero encontra-se anexo, os polímeros podem ser a mesma molécula ou moléculas diferentes. Em geral, o número e/ou tipo de polímeros utilizado para derivatização pode ser determinado com base em considerações, incluindo mas não limitado-se a, propriedades específicas ou funções do anticorpo de ser melhorado, se os anticorpos derivados serão utilizados no âmbito de uma terapia, etc.

Em outro exemplo de realização, são fornecidos conjugados de anticorpo e grupamento não-proteinácio que podem ser seletivamente aquecida por exposição à radiação. Em um exemplo de realização, o grupamento não-proteinácio é uma nanotubo de carbono (Kam et aí., Proc. Natl. Acad. Sei. 102: 11600-11605 (2005)). A radiação pode ser de qualquer comprimento de onda, e inclui, mas não se limita a, comprimento de ondas que não prejudicam células normais, mas que aquece o grupamento não- proteinácio a uma temperatura no qual as células próximas ao conjugado anticorpo-agrupamento não-proteinácio são mortas.

Formulações Farmacêuticas

Formulações terapêuticas compreendendo o anticorpo da invenção são preparadas são preparadas para o armazenamento através da mistura de um anticorpo que tenha o grau desejado de pureza com veículos, excipientes ou estabilizantes farmaceuticamente aceitáveis opcionais (Remington's Pharmaceutical Sciences, 16a edição, Osol, A. Ed. (1980)), na forma de formulações liofilizadas, soluções aquosas ou outras formulações secas. Veículos, excipientes ou estabilizantes aceitáveis são atóxicos para pacientes nas dosagens e concentrações empregadas e incluem tampões tais como fosfato, citrato e outros ácidos orgânicos, antioxidantes que incluem ácido ascórbico e metionina; conservantes (tais como cloreto de octadecildimetilbenzilamônio, cloreto de hexametônio, cloreto de benzalcônio, cloreto de benzetônio; álcool fenólico, butílico ou benzílico; alquilparabenos tais como metil ou propilparabeno; catecol; resorcinol; cicloexanol; 3-pentanol e meta-cresol); polipeptídeos de baixo peso molecular (menos de cerca de 10 resíduos); proteínas, tais como albumina de soro, gelatina ou imunoglobulinas; polímeros hidrofílicos, tais como polivinilpirrolidona; aminoácidos, tais como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina ou lisina; monossacarídeos, dissacarídeos e outros carboidratos, incluindo glicose, manose ou dextrinas; agentes quelantes tais como EDTA; açúcares, tais como sacarose, manitol, trealose ou sorbitol; contra-íons formadores de sais tais como sódio; complexos metálicos (por exemplo, complexos protéicos de Zn); e/ou tensoativos não- iônicos, tais como TWEEN®, PLURONICS® ou polietilenoglicol (PEG).

A formulação da presente invenção pode também conter mais de 5 um composto ativo, conforme necessário para a indicação específica sendo tratada, preferencialmente, ditos compostos apresentam atividades complementares que não prejudica um ao outro. Tais moléculas são apresentadas de forma apropriada em combinação em quantidade que são eficazes para o propósito pretendido.

Os ingredientes ativos podem também ser armazenados em microcápsulas preparadas, por exemplo, através de técnicas conservação ou polimerização interfacial, tais como microcápsulas de hidroximetilcelulose ou microcápsulas de gelatina e de poli-(metacrilato de metila), respectivamente, em sistemas de fornecimento de drogas coloidais (por exemplo, lipossomos, microesferas de albumina, microemulsões, nanopartículas e nanocápsulas), ou em macroemulsões. Ditas técnicas são descritas em Remington's Pharmaceutical Sciences, 16a edição, Osol, A. Ed. (1980).

As formulações a serem utilizadas para administração in vivo deve ser estéril. O que é seguido por filtração através das membranas de filtração.

Podem ser fabricadas preparações de liberação prolongada. Exemplos apropriados de preparações de liberação prolongada incluem matrizes semipermeáveis de polímeros hidrofóbicos sólidos que contenham o anticorpo, que se encontram na forma de artigos moldados, tais como filmes ou microcápsulas. Exemplos de matrizes de liberação prolongada incluem poliésteres, hidrogéis (tais como poli-(metacrilato de 2-hidroxietila) ou álcool poli-(vinílico)), poli-lactídeos (patente US 3.773.919), copolímeros de ácido L- glutâmico e L-glutamato de g etila, acetato de etilenovinila não-degradável, copolímeros degradáveis de ácido láctico e ácido glicólico, tal como LUPRON DEPOT® (microesferas injetáveis compostas de copolímero de ácido láctico e ácido glicólico e acetato de leuprolide) e ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutírico. Embora polímeros tais como etilenovinilacetato e ácido láctico-ácido glicólico permitam a liberação de moléculas por mais de 100 dias, certos hidrogéis liberam proteínas por períodos de tempo mais curtos. Quando anticorpos encapsulados permanecem no organismo por um longo período de tempo, eles podem desnaturas ou agregar como resultado da exposição à umidade a 37°C, resultando em uma perda da atividade biológica e possíveis mudanças na imunogenicidade. Estratégias racionais podem ser planejadas para estabilização, dependendo do mecanismo envolvido. Por exemplo, se o mecanismo de agregação for descoberto para ser a formação de ligação S-S intermolécula através intercadeia tio-sulfeto, a estabilização pode ser alcançada por resíduos sulfidrila, liofilização de soluções ácidas, controle do teor da umidade, utilizando aditivos apropriados, e desenvolvimento de composições matrizes de polímero específicas.

Uso

Um anticorpo da invenção pode ser utilizado, por exemplo,em in vitro, ex vivo e em métodos terapêuticos in vivo. Os anticorpos da invenção podem ser usados como um antagonista para bloquear parcial ou totalmente a atividade específica do antígeno in vitro, ex vivo e/ou in vivo. Além disso, pelo menos alguns dos anticorpos da invenção podem neutralizar a atividade do antígeno de outras espécies. Assim, os anticorpos da invenção podem ser usados para inibir a atividade de um antígeno específico, por exemplo, em uma cultura celular contendo os antígenos, em seres humanos ou em outros mamíferos, em indivíduos que tenham o antígeno com o qual um anticorpo da invenção reage cruzadamente (por exemplo, chimpanzé, babuíno, mico, cinomolgo e Rhesus, porco ou camundongo). Em um exemplo de realização, o anticorpo da invenção pode ser usado para inibir a atividade do antígeno expondo o anticorpo com o antígeno de tal maneira que a atividade do antígeno é inibida. Em um exemplo de realização, o antígeno é uma molécula de proteína humana.

Em um exemplo de realização, um anticorpo da invenção pode ser usado em um método para inibir um antígeno em um paciente que sofre de uma doença na qual a atividade do antígeno é prejudicial, compreendendo em administrar ao paciente um anticorpo da invenção na qual a atividade do antígeno do paciente é inibida. Em um exemplo de realização, o antígeno é uma molécula de proteína humana e o paciente é um paciente humano. Alternativamente, o paciente pode ser um mamífero que expressa o antígeno com o qual o anticorpo da invenção se liga. Adicionalmente, o paciente pode ser um mamífero no qual foi introduzido o antígeno (por exemplo, a administração do antígeno ou a expressão de um antígeno transgênico). O anticorpo da invenção pode ser administrado a um paciente humano para fins terapêuticos. Além disso, o anticorpo da invenção pode ser administrado a um mamífero não-humano que expressa o antígeno com o qual o anticorpo se liga por reação cruzada (por exemplo, um primata, porco ou rato) para fins veterinários ou como um modelo animal de doenças humanas. Com relação a este último citado, esses modelos animais podem ser úteis para avaliar a eficácia terapêutica dos anticorpos da invenção (por exemplo, testes de dosagens e curso de tempo da administração). Os anticorpos da invenção pode ser usado para tratar, inibir, atrasar a progressão, prevenir/atrasar a reincidência, atenuar ou prevenir doenças, afecções ou condições associadas à expressão anormal e/ou atividade das poliubiquitinas e proteínas poliubiquitinadas, incluindo, mas não se limitado a: câncer, doenças musculares, doenças genéticas relacionadas com a via da ubiquitina, desordens imunes/inflamatórias, distúrbios neurológicos, e outras doenças ligadas a via da ubiquitina.

Em um aspecto, um anticorpo de bloqueio da invenção é específico para uma poliubiquitina que possuí uma ligação específica de lisina, e inibe a atividade normal pelo bloqueio da poliubiquitina ou interferindo na interação entre a poliubiquitina que possuí uma ligação específica de lisina e uma proteína que interage com a poliubiquitina, inibindo assim a via de sinalização correspondente e de outros associados a eventos moleculares ou celulares.

Em um exemplo de realização especifico um imunoconjugado que compreende um anticorpo com um agente citotóxico é administrado ao paciente. Em alguns exemplos de realização, o imunoconjugado e/ou o antígeno ao qual este está ligado é internalizado pela célula, resultando em aumento da eficácia terapêutica do imunoconjugado na morte de células a qual se liga. Em uma realização preferida, o agente citotóxico se combina ou interfere com o ácido nucléico em células cancerosas. Exemplos de ditos agentes citotóxicos incluindo agentes quimioterápicos citados no presente (por exemplo, matasinóides ou caliquiamicinas), isótpos radioativos ou ribonucleases e endonucleases de DNA.

Os anticorpos da invenção podem ser utilizados isoladamente ou em combinação com outras composições em uma terapia. Por exemplo, um anticorpo da invenção pode ser co-administrado com outro anticorpo, e/ou agentes adjuvantes / agentes terapêuticos (por exemplo, esteróides). Por exemplo, um anticorpo da invenção pode ser combinado com um anti- inflamatório e/ou anti-séptico, em um esquema de tratamento, por exemplo, no tratamento de uma das doenças descritas no presente, incluindo, câncer, doenças musculares, doenças genéticas relacionadas com a via da ubiquitina, desordens imunes/inflamatórias, distúrbios neurológicos e outras doenças ligadas a via da ubiquitina. Esta terapia combinada referida acima inclui a administração combinada (onde dois ou mais agentes estão incluídos na mesmo ou em formulações distintas), administração separada, e nesse caso, a administração do anticorpo da invenção pode ocorrer antes, e/ou após a administração da terapia ou terapias adjuntas.

O anticorpo da invenção (e agente terapêutico adjunto) podem ser administrado por qualquer meio apropriado, que inclui parenteral, subcutâneo, intraperitoneal, intrapulmonar e intranasal e, se desejado para tratamento local, administração intralesional. As infusões parenterais incluem administração intramuscular, intravenosa, intraarterial, intraperitoneal ou subcutânea. Além disso, o antagonista é administrado adequadamente por meio de infusão no pulso, particularmente com doses decrescentes do antagonista. Preferencialmente, a dosagem é fornecida por meio de injeções, de maior preferência injeções intravenosas ou subcutâneas, dependendo, em parte de se a administração é rápida ou crônica.

A localização do alvo de ligação do anticorpo da invenção pode ser tomado em consideração na elaboração e administração do anticorpo. Quando o alvo de ligação é uma molécula intracelular, certas realizações a invenção oferece um anticorpo ou fragmento de ligação do mesmo a ser introduzido na célula onde está localizado alvo de ligação. Em um exemplo de realização, o anticorpo da invenção pode ser expresso intracelularmente como um "intracorpo". O termo "intracorpo" da forma como utilizado no presente, refere-se a um anticorpo ou porção de ligação ao antígeno deste que é expresso intracelularmente e é capaz de se ligar seletivamente à molécula- alvo, como descrito em Marasco, GeneTherapy 4:11-15(1997 ); Kontermann, Methods 34:163-170 (2004); Patentes US 6.004.940 e US 6.329.173; Pedido de Patente US 2003/0104402, e Documento W02003/077945. A expressão intracelular de uma intracorpo é efetuada através da introdução de um ácido nucléico que codifica o anticorpo ou porção de ligação do antígeno deste (que não possua o líder seqüência do tipo selvagem e sinais secretores normalmente associados com o gene que codifica anticorpo ou porção de ligação do antígeno deste) em uma célula alvo. Qualquer método padrão para a introdução de ácidos nucléicos em uma célula pode ser utilizado, incluindo, mas não se limitando a, microinjecção, injeção balística, eletroporação, precipitação em fosfato de cálcio, lipossomos, transfecções retrovirais, adenoviral, vírus adeno-associados que transportam vetores e vacinas com os ácidos nucléicos de interesse. Um ou mais ácidos nucléicos que codificam na totalidade ou em parte um anticorpo anti-poliubiquitina da invenção pode ser entregue a uma célula-alvo, de tal forma que um ou mais intracorpos são expressos e são capazes de se ligar intracelularmente a uma poliubiquitina e modular uma ou mais via celular mediada pela poliubiquitina.

Em outro exemplo de realização, a internalização de anticorpos é fornecida. Os anticorpos podem possuir algumas características que aumentam a entrega de anticorpos nas células, ou podem ser modificados para possuírem essas características. As técnicas para se alcançar este objetivo são conhecidas no estado da arte. Por exemplo, cationização de um anticorpo é conhecida por facilitar a sua utilização em células (vide, por exemplo, Patente US 6.703.019). Lipofecções ou Iipossomas também podem ser utilizadas para entregar os anticorpos nas células. Quando fragmentos de anticorpos são utilizados, é geralmente vantajoso o menor fragmento de anticorpos inibitório que se liga especificamente ao domínio de ligação da proteína alvo. Por exemplo, baseado nas seqüências de regiões variáveis de um anticorpo, moléculas de peptídeo que retém a capacidade de se ligar à seqüência de proteína alvo podem ser designadas. Ditos peptídeos podem ser sintetizados quimicamente e/ou produzidos a partir da tecnologia de DNA recombinante. Vide, por exemplo, Marasco et ai, Proc. Nati Acad. Sei. USA, 90: 7889-7893 (1993). Entrada de um polipeptídeo modulador na célula alvo pode ser reforçada por métodos conhecidos. Por exemplo, algumas seqüências, como os derivados do proteína Tat do HIV ou da Antennapedia homeodomain são capazes de orientar a eficiente absorção de proteínas heterólogas em toda a membrana celular. Vide, por exemplo, Chen et ai, Proc. Nati Acad. Sei. USA. (1999), 96:4325-4329.

Quando o alvo de ligação está localizado no cérebro, certas realizações da invenção prevê que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno atravessa a barreira hematoencefálica. Certas doenças neuro- degenerativas estão associadas com um aumento na permeabilidade da barreira hematoencefálica, de tal forma que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno pode facilmente ser introduzido no cérebro. Quando a barreira hematoencefálica permanece intacta, vários abordagens bem conhecidas no estado da técnica existem para o transporte de moléculas, incluindo mas não se limitado a, métodos físicos, métodos a à base de lipídios, e métodos de receptores à base de canal.

Métodos físicos para o transporte do anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno em toda a barreira hematoencefálica incluem, mas não se limita a, contornar a barreira hematoencefálica, inteiramente, ou através da criação de aberturas na barreira hematoencefálica. Métodos de evasão que incluem, mas não se limitam a, injeção direta no cérebro (vide, por exemplo, Papanastassiou et al. GeneTherapy, 9: 398-406 (2002)), perfusão intersticial / entrega por convecção realçada (vide, por exemplo, Bobo et al., Proc. Nati Acad. Sei. USA. 91:2076-2080 (1994)), e um implante de um dispositivo de entrega no cérebro (vide, por exemplo, Gill et ai, Nature Med. 9:589-595 ( 2003); e Gliadel Wafers™, Guildford Farmacêutica).

Métodos de criação de aberturas na barreira hematoencefálica incluem, mas não se limitam a, ultra-som (vide, por exemplo, Patente Publicada 2002/0038086), pressão osmótica (por exemplo, através da administração de manitol hipertônico (Neuwelt, EA, Implication of the Blood-Brain Barrier and its Manipulation, Vol 1 e 2, Plenum Press, Nova Iorque (1989)), permeabilização, por exemplo, por bradicinina ou permeabilizante A-7 (vide, por exemplo, Patentes US 5.112.596, US 5.268.164, US 5.506.206 e Us 5.686.416), E transfecções de neurônios que transpõe a barreira hematoencefálica com vetores contendo genes que codificam o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno (vide, por exemplo, Patente Publicada 2003/0083299).

Métodos baseados em lipídeos para o transporte do anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno por toda a barreira hematoencefálica incluem, mas não se limitam a, englobar o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno em Iipossomas que estão atreladas ao anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno que se ligam aos receptores sobre a endotélio vascular da barreira hematoencefálica (vide, por exemplo, Pedido e Patente US 20020025313), e o revestimento do anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno em partículas lipoproteína de baixa densidade (vide, por exemplo, Pedido de Patente US 20040204354) ou apo-lipoproteína E (vide, por exemplo, Pedido de Patente US 20040131692).

Os métodos baseados em receptores e canais de transporte do anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno por toda a barreira hematoencefálica incluem, mas não estão limitados a, utilização de bloqueadores glicocorticóide para aumentar a permeabilidade da barreira hematoencefálica (vide, por exemplo, pedidos de Patentes US 2002/0065259, US 2003/0162695, US 2005/0124533); ativando canais de potássio (vide, por exemplo, pedido de Patente US 2005/0089473), Dragas inibidoras de transportadores ABC (vide, por exemplo, pedido de Patente US 2003/0073713); anticorpos com um revestimento de transferrina que modulam a atividade de um ou mais receptores de transferrina (vide, por exemplo, pedido de Patente US 2003/0129186), e anticorpos cationizantes (vide, por exemplo, Patente US 5.004.697).

A composição de anticorpo deve ser formulada, dosada e administrada de uma forma consistente com as boas práticas médicas. Fatores para consideração neste contexto incluem a disfunção particular a ser tratada, o mamífero particular a ser tratado, a condição clínica do paciente, a cousa da disfunção, o sítio de fornecimento do agente, o método de administração, a sincronização de administração e outros fatores conhecidos. O anticorpo não precisa ser, mas é opcionalmente formulado com um ou mais agente normalmente utilizados para prevenir ou tratar a disfunção em questão. A quantidade eficaz destes outros agentes depende da quantidade do anticorpo presente na formulação, do tipo de disfunção ou tratamento, e outros fatores discutidos acima. Estes são geralmente utilizados nas mesmas dosagens e com vias de administração conforme descritas acima ou cerca de 1 a 99% das dosagens descritas no presente.

Para a prevenção ou tratamento de doença, a dosagem apropriada de anticorpo (quando utilizado isoladamente ou em combinação com outros agentes tais como agentes quimioterapêuticos, conforme indicado acima) dependerá do tipo de doença a ser tratado, do tipo de antagonista, da severidade e do curso da doença, se o antagonista é administrado para propósitos preventivos ou terapêuticos, terapia anterior, histórico clínico do paciente e reação ao antagonista e do critério do médico atendente. O anticorpo é adequadamente administrado ao paciente em uma vez ou ao longo de uma série de tratamentos. Dependendo do tipo e da severidade da doença, cerca de 1 Mg/kg a 15 mg/kg (tal como 0,1 mg/kg a 10 mg/kg) de anticorpo é uma possível dose inicial para administração ao paciente, seja, por exemplo, por meio de uma ou mais administrações separadas ou por meio de infusão contínua. Uma dosagem diária típica poderá variar de cerca de 1 pg/kg a 100 mg/kg ou mais, dependendo dos fatores mencionados acima. Para administrações repetidas ao longo de vários dias ou mais, dependendo da condição, o tratamento é mantido até que ocorra supressão desejada de sintomas da doença. A dosagem preferida do anticorpo estará na faixa de cerca de 0,05 mg/kg a cerca de 10 mg/kg. Desta forma, uma ou mais doses de cerca de 0,5 mg/kg, 2,0 mg/kg, 4,0 mg/kg ou 10 mg/kg (ou qualquer de suas combinações) podem ser administradas ao paciente. Essas doses podem ser administradas intermitentemente, tal como semanalmente ou a cada três semanas (por exemplo, de tal forma que o paciente receba cerca de duas a cerca de vinte, tal como cerca de seis doses do anticorpo). Dose de ataque inicial mais alta, seguida por uma ou mais doses mais baixas, pode ser administrada. Exemplo de regime de dosagem compreende a administração de dose de carregamento inicial de cerca de 4 mg/kg, seguida por dose de manutenção semanal de cerca de 2 mg/kg do anticorpo. Entretanto, outros regimes de dosagens podem ser úteis. O andamento desta terapia é facilmente monitorado por meio de técnicas e testes convencionais.

Artigos Manufatuirados Em outro aspecto da invenção, um artigo manufaturado, contendo os materiais úteis para o tratamento, prevenção e/ou diagnóstico das desordens acima descritas são fornecidos. O artigo manufaturado consta de um recipiente e rótulo ou uma bula sobre ou associado ao recipiente. Os recipientes apropriados incluem, por exemplo, frascos, seringas, blisters, etc. Os recipientes podem ser feitos de uma variedade de materiais tais como o vidro ou o plástico. O recipiente guarda uma composição a qual está sozinha ou está combinada com outra composição eficaz para tratar prevenir e/ou diagnosticar a condição e que possa ter uma porta de acesso estéril (por exemplo, o recipiente pode ser um bolsa de solução intravenosa ou um frasco que possui um controlador (stopper pierceablé) colocado através de uma agulha de injeção hipodérmica). Pelo menos um agente ativo na composição é um anticorpo da invenção. O rótulo ou a bula indicam que a composição é útil para o tratamento de escolha. Adicionalmente, o artigo manufaturado pode compreender (a) um primeiro recipiente com uma composição nele contida, onde a composição compreende um anticorpo da invenção, e (b) um segundo recipiente com uma composição nele contida que compreende um agente citotóxico ou outro agente terapêutico. O artigo manufaturado nesta realização da invenção pode ainda compreender um folheto informativo que indique que as composições podem ser usadas para tratar um caso especial. Alternativamente, ou adicionalmente, o artigo manufaturado pode ainda compreende de um segundo (ou terceiro) recipiente contendo um tampão farmaceuticamente aceitável, como água bacteriostática para injeção (BWFI), solução salina tamponada com fosfato, solução de Ringer e solução de dextrose. Pode-se incluir ainda outros materiais desejáveis a partir de uma perspectiva comercial e de uso, que inclui outros tampões, diluentes, filtros, agulhas e seringas.

O que se segue são exemplos de métodos e composições da invenção. Entende-se que vários outros exemplos de realização podem ser praticados, dada a descrição geral fornecido acima.

Exemplos

Exemplo 1

Isolamento E Caracterização De Primeira Geração de Anticorpos Anti- Poliubiquitina

A) Seleção da Biblioteca

O Fago de bibliotecas de anticorpos naives foi submetido à seleção de ligação contra peptídeos sintéticos imobilizados, incluindo uma ligação de peptídeo que mimetiza quer a poliubiquitina ligada a K48 ou poliubiquitina ligada a K63. Não foi observado o enriquecimento após seis ciclos de seleção. Os peptídeos sintéticos foram alongados, e as bibliotecas de anticorpos naives foram novamente rastreadas. Mais uma vez, não foi observado o enriquecimento após seis ciclos de seleção por ligação.

Fago a partir da biblioteca de anticorpo naive YS-B foi submetido a quatro ciclos de seleção de ligação contra cadeias da poliubiquitina tendo diferentes ligações isopeptídicas conhecidas. A biblioteca de anticorpo YS-B contém aminoácidos randomizados em todas as três cadeias pesadas CDRs e cadeias leves CDR3 (vide Pedido de Patente US 2005-0106667), e baseia-se em um anticorpo humanizado 4D5.

A cadeia de poliubiquitina ligada a K48 ou K63 de comprimento total sintetizada enzimaticamente de 3 a 7 unidades de comprimento (Boston Biochem) foram imobilizadas em placas de 96 poços Maxisorp Immunoplates (NUNC). As placas foram revestidas overnight com 5 pg/ml de poliubiquitina ligada a K48 ou K63 em 50 mM de tampão carbonato, pH 9,6. As placas revestidas foram lavadas com tampão fosfato (PBS) e bloqueadas, com albumina bovina (BSA) ou caseína, em uma concentração de 0,2% em PBS. As placas foram posteriormente lavadas com PBS contendo 0,05% de Tween- 20 (PBST) a 25 °C. Cada poço foi incubado com 100 μL de 102 fago/ml em tampão de triagem (BSA ou caseína, 0,2% em PBST) por 2 horas à temperatura ambiente. Cada poço foi lavado por oito vezes em PBST para remover material que não se ligou ao fago. Os fagos foram eluídos em incubação com 0,1 M HCI por 10 minutos, e o eluente foi neutralizado com 2M de base Tris. Os fagos eluídos foram propagados em Escherichia coli XL1-blue (Stratagene), com a adição do auxiliador de fago M13-K07 (New England Biolabs).

Os fagos amplificados foram utilizados para ciclos adicionais de seleção contra o mesmo alvo que foi usado no ciclo anterior. Para dois a quatro ciclos de seleção, 10 pg/ml de ubiquitina foi incluída na seleção como um tampão de contraseleção. Três e quatro ciclos também foram classificados com e sem contraseleção adicional: ambas com 10 Mg/ml de poliubiquitina ligada a K63 para a seleção de poliubiquitina ligada a K48 ou 10 pg/ml de poliubiquitina ligada a K48 para a seleção de poliubiquitina ligada a K63.

Para aqueles clones onde os ciclos de seleção de dois a quatro faltava a contraseleção com poliubiquitina, clones individuais foram cultivados em placas de 96 poços em 400 μΙ de caldo 2YT complementado com carbenicilina e auxiliador de fago M13-K07. O sobrenadante destas culturas foi utilizado no teste de ELISA de alto rendimento de fago para selecionar clones que se ligam a poliubiquitina ligada a K48, poliubiquitina ligada K63, ubiquitina e BSA. Todos os clones foram submetidos a análise da seqüência de DNA. Uma parte da cadeia pesada que inclui a HVR foi seqüenciada, permitindo a análise das regiões hipervariáveis da cadeia pesada. As regiões hipervariáveis da cadeia pesada para os clones que reconhecem a poliubiquitina ligada a K48 ou ambas as poliubiquitinas ligada a K48 ou ligada a K63 são exibidas nas Figuras 2A-C. As regiões hipervariáveis da cadeia pesada dos clones que reconhecem a poliubiquitina ligada a K63 ou ambas as poliubiquitinas ligadas a K48 e ligada a K63 são exibidas nas Figuras 3A e 3B. A cedia leve HVR de cada clone não foi seqüenciada, mas com base na natureza da biblioteca YS- B, esperava-se que as seqüências HVR-L1 e HVR-L2 fossem invariantes, enquanto espera-se que a seqüência HVR-L3 seja específica do clone. A seqüência HVR-L1 é RASQSVSSAVA (SEQ ID No: 79) e a seqüência HVR-L2 é SASSLYS (SEQ ID No: 80), de acordo com a concepção da biblioteca. Todos os clones possuíam a mesma seqüência de estrutura da cadeia pesada e da cadeia leve (vide Figura 6).

Um conjunto diferente de clones incluídos contraseleção com 10 pg/ml de poliubiquitina de uma ligação de Iisina diferente (quer seja, poliubiquitina ligada a K48 ou que seja poliubiquitina ligada a K63) no ciclo de seleção de dois a quatro. 10 μΙ de fago eluído do quarto ciclo de seleção foi utilizado para infectar uma cultura de E. coli CJ236 por 20 minutos, que então, cresceram overnight em ágar sólido contendo carbenicilina. 15 mililitros de caldo 2YT suplementado com carbenicilina e cloranfenicol foi acrescentado à placa de ressuspender as células CJ236 contendo o fagomídeo. O auxiliador de fago M13-K07 foi adicionado. Após a incubação de uma hora a 37 0C sob agitação, 2,5 ml da suspensão foi adicionada a 250 ml de caldo 2YT suplementado com carbenicilina e kanamicina. A suspensão ficou crescendo durante a noite.

Os fagos foram colhidos por precipitação em polietileno-glicol e o DNA Kunkel foi isolado usando um kit spin M13 (Qiagen). Um micrograma de molde (template) de Kunkel foi utilizado para a mutagênese de Kunkel (vide, Kunkel, Proc. NatL Acad. Sei. USA. 82:488(1985)) com o oligonucleótido F1560-2 (TCTTGTGACAAAACTCACCATCACCATCACCATCACTAGGGCGGTGGCTC TGGTTCCGGTGATTTT) (SEQ ID No: 150). A reação de mutagênese foi transformada em E. coli XL1-blue e cultivadas overnight em ágar sólido suplementado com carbenicilina. Clones individuais foram então colhidos e crescidos com descrito acima e selecionados contra poliubiquitina ligada a K48 e a K63, BSA e anticorpos anti-pentaHis (Qiagen), em um ELISA para fago, tal como descrito acima. Clones identificados por serem específicos para poliubiquitina ligada a K48 o para poliubiquitina ligada a K63 foram submetidas a análise da seqüência de DNA. As seqüências de aminoácidos das regiões hipervariáveis HVR-H1, HVR-H2 e HVR-H3 são exibidas nas Figuras 8A-C (específico para a poliubiquitina ligada a K48) e 9A e 9B (específico para poliubiquitina ligada a K63). A cadeia leva HVR para cada clone não foi seqüenciado, mas com base na natureza da biblioteca YS-B, esperava-se que as seqüências HVR-L1 e HVR-L2 fossem invariantes, enquanto espera-se que a seqüência HVR-L3 seja específica do clone. A seqüência HVR-L1 é RASQSVSSAVA (SEQ ID No: 79) e a seqüência HVR-L2 é SASSLYS (SEQ ID No: 80), de acordo com a concepção da biblioteca. Todos os clones possuíam a mesma seqüência de estrutura da cadeia pesada e da cadeia leve (vide Figura 6).

(B) Produção de Fab

Para a produção de Fab, o sobrenadantes de fago exclusivo de clones positivos para o a pentahistidina foram usados para infectar a E. coli FF34B8, uma linhagem celular em que o epissomo F' foi acrescentado à cepa 34B8 por meio de cruzamentos com a cepa XL1 e cultivada nos meios sólidos seletivos. Células infectadas foram semeadas em ágar solido suplementado com carbenicilina e crescidas durante a noite. Colônias únicas de FF34B8 contendo o fagomídeo foram colhidas a partir das placas que cresceu ovemight a 37°C em meio LB suplementado com carbenicilina. Estas culturas foram então utilizadas para inocular 500 ml de meio CRAP completo (3,57 g (NH4)2SO4, 0,71 g de citrato de sódio*2H20, 1,07 g de KCI, 5,36 g de extrato de leveduras (certificadas), 5,36 g de Hycase SF (Sheffield), pH ajustado para 7,3 pela adição de KOH e volume ajustado para 872 ml com água ultra-pura, autoclavada, resfriada para 55°C, ao qual foi adicionado (por L) 110 mL de 1M MOPS pH 7,3, 11 mL de glicose 50% e 7 mL de 1 M MgSO4) contendo carbenicilina, e cresceu por 24 horas a 30 0C sob agitação. As células foram colhidas por centrifugação e o sedimento de células foram armazenados a -20 °C. Os Fabs foram purificados pela resuspenção de cada sedimento de célula em 35 ml de tampão de lavagem gelado (PBS + 150 mM NaCI) contendo 0,2 mg/ml Iisozima e 0,3 U/ de Dnase I. O sedimento de células resuspensos foi transferido para tubos de centrifugação de 50 ml e agitados rapidamente a 25 °C por 45 minutos. Os aglomerados foram centrifugados e Iisado foi carregado em colunas de 1 ml de proteína G-sepharose pré-balanceada com tampão a 4 °C. As colunas foram lavadas com 50 ml de tampão de lavagem frio, eluído com 3 ml de ácido acético 0,1 M1 e neutralizado com 150 μΙ de 2M de base Tris. Os Fabs eluídos foram passados para tampão PBS e concentrados utilizando um filtro centrífuga Centriprep 10 (Millipore). A concentração de Fab resultante foi determinada espectrofotometricamente (1 OD2Sonm = 1.55mg/mL).

Os Fabs concentrados foram armazenados a 4°C.

Cada Fab foi incluído em um ensaio de proteína por ELISA, tal como descrito acima, para determinar a sua afinidade relativa para a poliubiquitina ligada a K48 e poliubiquitina ligada a K63, e para confirmar que a Fab não foi reativa com uma monoubiquitina ou BSA. As Fabs apu01-15 apresentaram uma maior especificidade para a poliubiquitina ligada a K48 do que para a poliubiquitina ligada a K63. As Fabs apu17-apu24 demonstraram maior especificidade para a poliubiquitina ligada a K63 do que para a poliubiquitina ligada a K48 no teste ELISA. A apu16 não foi produzida como uma Fab.

Todas as Fabs foram submetidas a análise da seqüência de DNA. As seqüências de aminoácidos das regiões hipervariáveis HVR-H1, HVR-H2, HVR-H3, e HVR-L3 para cada Fab que se liga especificamente a poliubiquitina ligada a K48 são exibidas nas Figuras 10A-C. As seqüências de aminoácidos das regiões hipervariáveis HVR-H1, HVR-H2, HVR-H3, e HVR-L3 para cada Fab que se liga especificamente a poliubiquitina ligada a K63 são exibidas nas Figuras 11A-C. A seqüência de estrutura da cadeia pesada e da cadeia leve para cada Fab é exibida na Figura 6. As duas primeiras regiões hipervariáveis da cadeia leve, HVR-L1 e HVR-L2, eram idênticas para cada clone, de acordo com a concepção da biblioteca (vide, SEQ ID No: 79 e 80, acima). (C) Análise da afinidade de Fabs Isolados.

A afinidade dos Fabs selecionados (vide sessão (B), acima) para a ubiquitina e suas formas ligadas a Iisina foram determinadas pelo ensaio de ressonância plasmônica de superfície utilizando o BIACORE ® 3000 usando um sistema (Biacore). Cerca de 100 unidades de ressonância ubiquitina, diubiquitina ligada a K48 ou ligada a K63, poliubiquitina ligada a K48 ou ligada a K63 (comprimentos de cadeia de 3 a 7) foram imobilizadas em diferentes fluxos de células chips CM5 utilizando o protocolo de acoplamento de amina fornecido pelo fabricante. Em cada experimento, o fluxo célula 1 foi ativada e a etanolamina bloqueada sem imobilizar as proteínas, para ser utilizado como subtração de referência. Diluições seriadas de proteínas Fab (1.6-100 nM) de cada uma das apu01 a apu24 foram injetadas (50 μl total a um débito de 25 μl/hora) durante cada fluxo de células. O sinal para cada fluxo de células foi registrada e sinal de referência foi subtraído. Seguida por um período de dissociação (5 minutos), a superfície do chip foi regenerada com 13 μl de HCl 20 mM. Exemplos de curva de ligação para a apu09 e apu18 são exibidas nas Figuras 12 e 13. A apu09 liga-se a poliubiquitina ligada a K48, mas não a poliubiquitina ligada a K63, como é exibido pela Figura 12. A Figura 13A mostra a curva de ligação da apu18 para a poliubiquitina ligada a K48. Enquanto algumas ligações são observadas, estas são substancialmente inferiores à ligação observada para a poliubiquitina ligada a K63 (Figura 13B). Análises similares foram realizadas para cada Fab.

As constantes cinéticas e constantes de ligação foram simultaneamente calculadas por regressão não linear usando o software fornecido pelo fabricante, e estão indicadas na Tabela Β. O designador "NB" na Tabela B indica que não foi detectado ligação para a interação indicada. O designador "nd" na Tabela B indica que nenhum dado foi mensurado para a para a interação indicada. Os resultados mostram que as constantes cinéticas de um Fab específico para se ligar a diubiquitina são muito semelhantes aquelas para a poliubiquitina. Assim, as Fabs parecem reconhecer uma ligação isopeptídica particular entre duas moléculas de ubiquitina. Tabela B

CONSTANTES CINETICAS DOS FABS ANTI-POLIUBIQUITINA, AVALIADO PELA ANALISE DE BIACORE ®

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* Uma segunda análise de Biacore da Apu18 confirmou a constante cinética

anteriormente obtida para a interação da diubiquitina ligada a K63.

(D) Western Blot

A tetraubiquitina (ligada a K48 ou a K63 conforme o caso) e a diubiquitina (ligada a K48 o a K63) (Boston Biochem) foram separadas em gel de poliacrilamida e transferidas por eletroblotting para membranas de nitrocelulose. Sítios de ligação não específicos sobre as membranas foram bloqueadas incubando as membranas overnight a 4°C em 0,5% de reagente de bloqueio Qiagen (Qiagen). As membranas bloqueadas foram colocadas em um aparelho miniblotter. Clones dos Fabs (1 pg/ml) foram aplicados a uma série de seções da membrana em 0,5% de reagente de bloqueio Qiagen (Qiagen). Após o período de uma hora de incubação, as membranas foram lavadas. Anticorpos anti-ubiquitina ligados à membrana foram revelados utilizando um conjugado anticorpo anti-penta-histidina HRP (Qiagen), de acordo com as instruções do fabricante.

Fabs específicos para poliubiquitina ligada a K48 produzidos a partir de clones apu01 a apu15 especificamente ligados a tetraubiquitina ligada a K48 imobilizada em nitrocelulose (vide, Figura 19B). Fabs específicos não ligados a poliubiquitina ligada a K63 produzida a partir de clones apu17 a apu24 foram observadas na poliubiquitina ligada a K63 imobilizada em membrana de nitrocelulose (vide figura 19A).

Segunda geração de bibliotecas Fab exibição foram construídos a partir da phagemids a codificação previamente identificados clones apu05 (seletiva para a poliubiquitina ligada a K48) e apu18 (seletiva para a poliubiquitina ligada a K63) (vide Figuras 10 e 11). O fago desses clones foram usados para infectar células CJ236 para preparar molde (template) Kunkel de DNA. Esses moldes (templates) foram posteriormente mutagenizados para inserir códons de parada, e templates contendo códons de parada foram utilizados na construção da biblioteca da seguinte forma.

Exemplo 2

Isolamento ε Caracterização de Segunda Geração Anticorpos Anti- Poliubiquitina

A segunda geração de bibliotecas para exibição de Fab foram construídas a partir de fagomídeos que codificam os clones previamente identificados apu05 (seletivo para a poliubiquitina ligada a K48) e apu18 (seletivo para a poliubiquitina ligada a K63) (Vide Figuras 10 e 11). O Fago desses clones foi usado para infectar células CJ236 para preparar moldes Kunkel de DNA. Esses moldes foram posteriormente mutagenizados para inserir códons parar de parada, e parar moldes contendo estes foram utilizados na construção das bibliotecas da seguinte forma.

O Fab apu05 foi mutagenizado de acordo com dois esquemas diferentes para criar duas biblioteca derivada de apu05. Na primeira biblioteca, apenas o HVR-H3 foi mutagenizado. O HVR-H3 foi primeiro modificado para incluir um códon de parada no molde Kunkel, seguido de uma mutagênese utilizando quatro oligonucleotídeos mutagênicos. O oligonucleotídeo que codifica o códon de parada em todos os casos foi CGTCTATTATTGTGCTCGCTAATAAGACTACTGGGGTCAAGG (SEQ ID No: 365). Os três primeiros oligonucleotídeos mutagênicos eram três permutações da mesma seqüência desejada, na qual foi fixado um resíduo de tirosina e cada resíduo de tirosina remanescente foi randomizado utilizando um conjunto de códons NNS (onde N corresponde a G1 C1 A ou T, e S corresponde a G ou C); o aminoácido na posição 100b foi selecionado do grupo de fenilalanina, metionina, leucina, isoleucina e; o aminoácido na 100a posição foi selecionada dos aminoácidos glicina e alanina; os aminoácidos restantes foram levemente randomizado. Uma randomização leve, neste contexto indica que determinadas posições nucleotídicas foram 70% do tempo ocupadas pela base indicada e 10% do tempo ocupada por uma das outras três bases. Para aqueles oligonucleotídeos seguintes, tal randomização foi incluída em uma base particular, a presença da randomização leve é indicada pela presença de um número em na posição da base. O número "5" indica que a base adenina está presente em 70% do tempo naquela posição, enquanto que as bases guanina, citosina e timina estão presentes em 10% do tempo. Do mesmo modo, o número "6" refere-se à guanina, "7" a citosina, e "8" a timina, onde em cada caso, cada uma das outras três bases está presente em apenas 10% do tempo. As três primeiras seqüências de oligonucleotídeos mutagênicas são: CGTCTATTATTGTGCTCGC567TAC567NNSNNS567GST WTSGACTACTGGGGTCAAGG (SEQ ID No: 367), CGTCTATTATTGTG CTCGC567N NS567TACNNS567 GSTWTSGACTACTGGG GTCAAGG (SEQ ID No: 368), e CGTCTATTATTGTGCTCGC567 NNS567NNSTAC567GSTWTSGA CTACTGGGGTCAAGG (SEQ ID No: 369). A quarta seqüência de oligonucleotídeo mutagênico incluiu a randomização da tirosina nas posições 96, 98, e 99 utilizando o conjunto de códons NNS; seleção do aminoácido na posição 100b a partir de fenilalanina, metionina, leucina, isoleucina, e a seleção do aminoácido na posição 100a a partir de glicina e alanina, randomização leve em todas as outras posições, de acordo com a nomenclatura de randomização leve descrita acima. A seqüência do quarto oligonucleotídeo foi CGTCTATTATTGTGCTCGC567NNS567NNSNNS567GSTWTSGACTACTGG GGTCAAGG (SEQ NO ID: 370).

Na segunda biblioteca apu05, HVR-H1, HVR-H2, HVR-H3 e HVR- L3 foram mutagenizados. O HVR-H1 foi modificado de tal forma que as serinas nas posições 30 e 33 foram randomizadas utilizando um conjunto de códons NNS (onde N corresponde ao G1 C1 A ou T e S corresponde ao G ou C); o aminoácido na posição 29 foi selecionado a partir dos aminoácidos fenilalanina, leucina, isoleucina e valina; e o aminoácido na posição 34 foi selecionado a partir de isoleucina e metionina. Os oligonucleotídeos utilizados para mutagênese da apu05 HVR-H1 foram GCAGCTTCTGGCTTCAACTAATAACACTGGGTGCGTCAGG (SEQ ID No: 371) e GCAGCTTCTGGCTTCAACNTCNNSTACTCTNNSATSCACTGGGTGC GTCAGG (SEQ ID No: 372). O HVR-H2 foi modificado de tal forma que a tirosina na posição 52 foi randomizada utilizando um conjunto de códons NNS definidos e o aminoácido na posição 52 foi selecionada a partir de prolina e serina. Os oligonucleotídeos utilizados para mutagênese do HVR-H2 foram GGCCTGGAATGGGTTGCATAATAATATGCCGATAGCGTCAAGG (SEQ ID No: 373) e GGCCTGGAATGGGTTG CATCTATCNNSYCTTACTACTCTTA CACCTCTTATGCCGATAGCGTCAAGG (SEQ ID No: 374). O HVR-H3 foi modificado de tal forma que a tirosina na posição 99 e os serina na posição 100 foram randomizadas utilizando o conjunto de códons NNS; o aminoácido na posição 100a foi selecionado a partir de glicina e alanina; e o aminoácido na posição 100b foi selecionado a partir de fenilalanina, metionina, leucina e isoleucina. Os oligonucleotídeos utilizados para a mutagênese do HVR-H3 foram CGTCTATTATTGTGCTCGCTAATAAGACTACTGGGGTCAAGG (SEQ ID NO: 365) e CGTCTATTATTGTGCTCGCTCTTA CTCTTACNNSNNS GSTWTSGACTACTGGG GTCA AGG (SEQ ID No: 375). O HVR-L3 foi modificado em que a posição S91 foi randomizada de acordo com o conjunto de códons NNS e a posição I96 foi selecionada a partir de fenilalanina, isoleucina e valina. Os oligonucleotídeos utilizados para mutagênese de HVR- L3 foi CGCAACTTATTACTGTCAGCAATAATAAACGTTCGGACAGGGTACC (SEQ ID No: 376) e CGCAACTTATTACTGTC AGCAANNSTCTTAC TCTTCTCTGDT TACGTTCGGACAGGGTACC (SEQ ID No: 378).

Seis diferentes bibliotecas derivadas de apu18 foram feitas por seis esquemas diferentes de mutagênese da apu18. Na primeira biblioteca, apenas o HVR-H3 foi mutagenizado. O HVR-H3 foi primeiro modificado para incluir um códon de parada no molde Kunkel1 seguido por uma metodologia de mutagênese utilizando sete oligonucleotídeos mutagênicos. O oligonucleotídeo que codifica o códon de parada em todos os casos foi CGTCTATTATTGTGCTCGCTAATAAGACTACTGGGGTCAAGG (SEQ ID No: 366). Os primeiros seis oligonucleotídeos mutagênicos foram seis permutações da mesma seqüência desejada, na qual dois resíduos de tirosina ou triptofano foram fixados e cada resíduo remanescente tirosina e triptofano foi randomizado utilizando o conjunto de códons NNS (onde N corresponde a G, C, A ou T e S corresponde a G ou C); o aminoácido na posição 100c foi selecionado a partir de fenilalanina, metionina, leucina, isoleucina e; o aminoácido na posição 100b foi selecionado a partir de glicina e alanina; os aminoácidos restantes foram randomizados de acordo com a randomização leve na qual a nomenclatura está acima descrita. As seis primeiras seqüências de oligonucleotídeos mutagênicos foram: CGTCTATTATTGT GCTCGC65 5TACTAC565N NSNNS57 7GSTWTSGACTACTGGGGTCAAGG (SEQ ID No: 379), CGTC TATTATTGTG CTCGC655NNSNNS565TGGT AC577GSTWT SGACTACTGGGGT CAAGG (SEQ ID No: 380), CGTCTA TTATTGTGCTCG C655TACBBS565NNSTAC577GSTWTSGACTACTGGGGTCAAGG (SEQ ID No: 381), CGTCTA TTATTGTGCTCGC65 5NNSTAC565TGGNNS577G STWTSGACTACTGGGGTCAAGG (SEQ ID No: 382), CGTCTATTATTGTGCT CGC655TACNNS565TGGNNS577GSTWTSGACTACTGGGGTCAAGG (SEQ ID No: 383), e CGTCTATTAT TGTGCTCGC655NNS TAC565NNSTA C577GSTWTSGAC TACTGGGG TCAAGG (SEQ ID No: 384). O sétimo oligonucleotídeo mutagênico incluiu a randomização de tirosinas nas posições 96, 97, e 100 e do triptofano na posição 99 utilizando um conjunto de códons NNS; seleção do aminoácido na posição 100b a partir de fenilalanina, metionina, leucina, isoleucina, e a seleção do aminoácido na posição 100a a partir de glicina e alanina, randomização leve em todas as outras posições, de acordo com a nomenclatura de randomização leve descrita acima. A seqüência do sétimo oligonucleotídeo foi CGTCTATT ATTGTGCTCGC655 NNSNNS565N NSNNS577GSTWTSGACTACTGGGGTCAAGG (SEQ ID No: 385).

Na segunda biblioteca apu18, apenas HVR-H2 foi mutagenizado. O HVR-H2 foi primeiro modificado para incluir um códon de parada no molde Kunkel, seguido de uma mutagênese utilizando quatro oligonucleotídeos mutagênicos. O oligonucleotídeo que codifica o códon de parada em todos os casos foi GGCCTGGAATGGGTTGCATAATAATATGCCGATAGCGTCAAGG (SEQ ID No: 373). Os três primeiros oligonucleotídeos mutagênicos eram três permutações da mesma seqüência desejada, na qual foi fixado um resíduo de tirosina e o resíduo de serina restante na posição 52 foram randomizado utilizando um conjunto de códons NNS (onde N corresponde a G, C, A ou T, e S corresponde a G ou C); o aminoácido na posição 52 foi selecionado a partir de prolina e serina; o aminoácido na posição 55 foi selecionado a partir de glicina e serina; a isoleucina na posição 51 e treonina na posição 57 foram fixadas, e os aminoácidos restantes foram levemente randomizados de acordo com a nomenclatura de randomização leve descrita acima. A seqüência dos três primeiros oligonucleotídeos mutagênicos foram:

GGCCTGGAATGGGTTGCATACATCNNSYCTNNSNNSRGC567ACC567TAT GCCGATAGCGTCAAGG (SEQ ID No: 386), GGCCTGGA ATGGGTTGCANNSATC NNSYCTTACNNSRGC56 7ACC567TA TGCCG ATAGCGTCAAGG (SEQ ID No: 387), e GGCCTGGAATGGGTTG CANNSATCNNSYCTNNSTACRGC 567ACC567TATGCCGATAGCGTCAAGG (SEQ ID No: 388). O quarto oligonucleotídeo mutagênico incluiu a randomização de tirosinas nas posições 50, 53, e 54 utilizando um conjunto de códons NNS; seleção do aminoácido 52 a partir de fenilanina e serina; seleção do aminoácido na posição 55 a partir de glicina e serina; que fixa os resíduos de isoleucina e treonina, nas posições 51 e 57 respectivamente; randomização leve em todas as outras posições, de acordo com a nomenclatura de randomização leve descrita acima. A seqüência do quarto oligonucleotídeo foi: GGCCTGGAATGGGTTGCANNSATCNNSYCTNNSNNSRGC567ACC567TAT GCCGATAGCGTCAAGG (SEQ NO ID: 389).

Na terceira biblioteca apu18, HVR-H2 e HVR-H3 foram mutagenizados. HVR-H2 foi modificado de maneira idêntica as modificações feitas ao HVR-H2 na segunda biblioteca apu18, utilizando os mesmos quatro oligonucleotídeos mutagênicos. O HVR-H3 foi modificado de maneira idêntica as modificações feitas ao HVR-H3 na primeira biblioteca apu18, utilizando os mesmos seis primeiros oligonucleotídeos mutagênicos.

Na quarta biblioteca apu18, o HVR-H3 e o HVR-L3 foram mutagenizados. HVR-H3 foi modificado de maneira idêntica as modificações feitas ao HVR-H3 na primeira biblioteca apu18, utilizando os mesmos seis oligonucleotídeos mutagênicos. O HVR-L3 foi primeiro modificado para incluir um códon de parada no molde Kunkel, seguido por uma metodologia de mutagênese utilizando um oligonucleotídeo mutagênico. Dentro do HVR-L3, as tirosinas nas posições 91 e 94 e a serina na posição 95 foram randomizadas utilizando um conjunto de códons NNS; a leucina na posição 52 foi selecionada a partir de fenilalanina, isoleucina e valina; e as serinas nas posições 92, 93 e 95 foram levemente randomizadas, de acordo com a nomenclatura de randomização leve descrita acima. Os oligonucleotídeos utilizados para a mutagênese da HVR-L3 foram CGCAACTTATT ACTGTCAGCAATAATAAACGTTCGGACAGGGTACC (SEQ NO ID: 376) e CGCAACTTATTACTGTCAGCAANNS567567NNS567NNSCTGDTTACGTTCG GACAGGGTACC (SEQ ID No: 390).

Na quinta biblioteca apu18, HVR-H12 e HVR-H1 foram mutagenizados. O HVR-H2 foi modificado de maneira idêntica as modificações feitas ao HVR-H2 na segunda biblioteca apu18, utilizando os mesmos quatro oligonucleotídeos mutagênicos. O HVR-H1 foi modificado para incluir um códon de parada; a serina na posição 30 e a tirosina na posição 33 foram randomizadas utilizando um conjunto de códons NNS; o aminoácido na posição 29 foi selecionado a partir de fenilalanina, leucina, isoleucina, valina e; o aminoácido na posição 34 foi selecionado a partir de isoleucina e metionina, e os aminoácidos nas posições 31 e 32 foram levemente randomizados de acordo com a nomenclatura de randomização leve descrita acima. Os oligonucleotídeos utilizados para a mutagênese da HVR-H1 foram: GCAGCTTCTGGCTTCAACTAATAACACTGGGTGCGTCAGG (SEQ ID NO: 371) and GCAGCTTCTGGCTT CAACNTCNNS567567NNSATS CACTGGGTGCGTCAGG (SEQ ID No: 391).

Na sexta biblioteca apu18, HVR-H1, HVR-H2 e HVR-L3 foram mutagenizadas. O HVR-H1 foi modificado de maneira idêntica as modificações feitas ao HVR-H1, na quinta biblioteca apu18, utilizando os mesmos oligonucleotídeos mutagênicos. HVR-H2 foi modificado de maneira idêntica as modificações feitas ao HVR-H2 na segunda biblioteca apu18, utilizando os mesmos quatro oligonucleotídeos mutagênicos. HVR-L3 foi modificado de maneira idêntica as modificações feitas ao HVR-L3 na quarta biblioteca apu18, utilizando os mesmos oligonucleotídeos mutagênicos.

As reações de mutagênese de cada uma das duas bibliotecas derivadas de apu5 e cada uma das seis bibliotecas derivadas de apu18 foram transformadas em E. coli XL-1 eletrocompetentes por eletroporação. Foi permitido que as células se recuperassem por 30 minutos a 37 0C sob agitação em meio SOC. Vinte microlitros meio SOC contendo célula foi reservado para determinar o número de transformantes, e o restante foi então transferido para 500 ml de meio 2YT contendo carbenicilina e 1010 de auxiliador de fago M13K07 por mililitro. Após 45 minutos a 37 0C sob agitação, o caldo foi suplementado com canamicina e foi incubada para o crescimento overnight a 37 0C sob agitação. O número de transformantes para cada biblioteca foi >109 Os fagos foram coletados e concentrados a partir do caldo por centrifugação e precipitação em PEG e, posteriormente, utilizado nos ciclos de seleção.

A poliubiquitina ligada a K48 e a poliubiquitina ligada a K63 foram imobilizadas em diferentes placas Maxisorp (NUNC), como descrito acima no Exemplo 1 (A). Cada biblioteca foi classificada separadamente contra o seu respectivo alvo (poliubiquitina ligada a K48 para as duas bibliotecas derivadas de apu05, e poliubiquitina ligada a K63 para as seis bibliotecas derivadas de apu18) para uma ciclo com a adição de 3 μΜ de monoubiquitina no tampão de seleção. Os fagos eluídos foram amplificados e agrupados (dois grupos, uma para cada poliubiquitina ligada a lisina-alvo) para novos ciclos de seleção.

Ciclos de seleção subseqüentes foram selecionados da fase de solução. O pool de fagos foi incubado com cadeias de poliubiquitinas biotiniladas (Sulfo-NHS-biotina, Pierce) por uma a duas horas em temperatura ambiente em tampão para seleção em solução (PBST com 0,5% de Superblock (Pierce)). A mistura foi diluída de cinco a dez vezes em tampão para a seleção em solução e acrescentou-se a placas com poços revestidos de neutravidina para uma breve captação (5 minutos) de poliubiquitina biotinilada. A reação contendo as cadeias de poliubiquitina não biotinilada serviu como um controle para monitorar fundo da ligação do fago. As placas foram lavadas com PBST e eluídas com 0,1 M de HCI por 10 minutos.

A estringência foi modulada de três maneiras: pela concentração de poliubiquitina biotinilada; por meio da adição de excesso de poliubiquitina não biotinilada para competir por ligação antes de concorrer para a captura em poços revestidos com neutravidina, e com a duração da competição. Para cada ciclo de triagem, monoubiquitina e poliubiquitina da outra ligação foi adicionada a uma concentração de 30 pg/ml no tampão de seleção durante a primeira etapa incubação. O primeiro ciclo da seleção em solução empregou 20 nM de poliubiquitina biotinilada incubadas com fago durante uma hora à temperatura ambiente. A mistura foi então diluída dez vezes em tampão para seleção em solução, e capturada usando poços revestidos com neutravidina por cinco minutos. Para o segundo ciclo o fago foi balanceado com 20 nM de poliubiquitina biotinilada, tal como no ciclo 1, mas foi diluído dez vezes no tampão para seleção em solução contendo 30 Mg/ml de poliubiquitina não biotinilada (ligada a K48 para a seleção de K48, ligada a K63 para a seleção de K63) por quinze minutos para seleção da velocidade de dissociação, e capturada usando poços revestidos com neutravidina. O terceiro ciclo da seleção em solução foi similar ao descrito para o segundo ciclo, mas incluiu adicionalmente 5 nM de poliubiquitina biotinilada e 30 minutos de seleção da velocidade de dissociação. Após um ciclo de triagem em placa e três ciclos de seleção em solução, cada clone selecionado a partir da segunda geração foi cultivado em placas de 96 poços como descrito anterioromente. Clones individuais foram selecionados por ELISA de fago e seqüenciados.

Após o primeiro ciclo de seleção em solução, foi observado um enriquecido em até 40 vezes para as bibliotecas baseadas em apu05 e um enriquecimento em até 7 vezes para as bibliotecas baseadas em apu18 (vide quadro C). Um enriquecimento adicional de 11 vezes foi obtido em clones específicos para K48 e um enriquecimento adicional de 3 vezes em clones específicos para K63 após a segunda seleção (classificação de afinidade e classificação da velocidade de dissociação) (vide Tabela C). A terceira seleção (classificação de afinidade e classificação da velocidade de dissociação) resultou em um enriquecimento de 18 vezes para os clones específicos de K48 e 4 vezes para os clones específicos de K63 (vide Tabela C).

Tabela C:

Resultados da Seleção em Solução da Segunda Geração da Biblioteca de Anticorpo Anti- Poliubiquitina

<table>table see original document page 175</column></row><table>

Sessenta e oito clones únicos que se ligavam especificamente à poliubiquitina ligada a K48 foram identificados; esses clones foram submetidos a análise de seqüência de DNA. As seqüências HVR-H1, HVR-H2 e HVR-H3 desses clones são exibidas nas Figuras 14A-F. Trinta e um clones únicos que se ligavam especificamente à poliubiquitina ligada a K63 foram identificados; esses clones foram submetidos à análise de seqüência de DNA. As seqüências HVR- H1, HVR-H2 e HVR-H3 desses clones são exibidas nas Figuras 15A-F. A cadeia leve HVR para cada clone específico das poliubiquitinas ligada a K48 e ligada a K63 não foram seqüenciados, mas, como a apu05 e apu18, espera-se que as seqüências de HVR-L1 e HVR-L2 sejam invariantes, enquanto a seqüência esperada da HVR-L3 é específica de cada clone. A seqüência HVR-L1 é RASQSVSSAVA (SEQ ID No: 79) e a seqüência HVR-L2 é SASSLYS (SEQ ID No: 80), de acordo com a concepção da biblioteca. Todos os clones possuíam a mesma seqüência de estrutura da cadeia pesada e da cadeia leve (vide Figura 6).

Os vinte clones com a maior ligação observada (dez específicos para poliubiquitina ligada a K48 e dez específicos para poliubiquitina ligada a K63) foram produzidos como Fabs1 tal como descrito no Exemplo 1. Os Fabs apu2.01 até apu2.20 foram submetidos a análise da seqüência de DNA. As seqüências HVR-H1, HVR-H2, HVR-H3, e HVR-L3 desses clones são exibidas nas Figuras 16A e B (Fabs específicos para K48) e 17A e B (Fabs específicos para K63).

Fabs de apu2.01 até apu2.20 foram incluídos em um teste de proteínas por ELISA para determinar sua relativa afinidades à poliubiquitina ligada a K48 e poliubiquitina ligada a K63, e para confirmar se as Fabs não foram reativas à monoubiquitina ou ao BSA (vide Figura 18). Cada clone apu2.11 e 2.12 demonstraram uma afinidade cerca de 300 vezes maior para a poliubiquitina ligada a K63 do que para a poliubiquitina ligada a K48 nesse ensaio. A Apu2.20 e 2,16 tinham um diferença menor, mas ainda assim acentuadas (cerca de 30 e 10 vezes maior, respectivamente) na afinidade de ligação da poliubiquitina ligada a K63 em comparação com a poliubiquitina ligada a K48. Não foi detectada ligação pelos clones apu2.01 e apu2.10 para a poliubiquitina ou diubiquitina ligada a K63.

Cada Fab foi também analisada pelo BIAcore como descrito anteriormente no Exemplo 1 (C). As constantes cinéticas e constantes de ligação obtidas são exibidas na Tabela D. A expressão "NB" na Tabela D indica que não foi detectada ligação para a interação indicada.

Tabela D

Constantes Cinéticas De Fabs Anti-Poliubiquitina, Avaliado Pela Análise De BIAcore

<table>table see original document page 177</column></row><table> Várias dos Fabs baseados em apu05 tinha Kds menor que a do Fab que corresponde a apu05 para a diubiquitina ligada a K48, representando uma ligação mais estreita com a poliubiquitina. Cada uma das Fabs apu2.11- 2,20 se ligaram não apenas à poliubiquitina ligada a K63, mas também, em menor extensão a, diubiquitina ligada a K48. Embora apenas apu2.13 tivesse uma Kd menor do que apu18, sua Kd para a poliubiquitina ligada a K48 foi maior do que a de apu18. Cada uma das apu2.11, apu2.12, apu2.16 e apu2.20 tiveram melhores relações de Kd para a poliubiquitina ligada a K63do que relações de Kd para poliubiquitina ligada a K48 do que apu18. A constante cinética observada para a ligação dos Fabs baseados em apu18 para a poliubiquitina ligada a K63 foi semelhante ao observado para a diubiquitina ligada a K63.

A capacidade de cada Fab se ligar especificamente a poliubiquitina imobilizada em uma membrana de nitrocelulose foi também avaliada por Western Blot como descrito anteriormente no Exemplo 1 (D). Foram imobilizados para membrana de nitrocelulose a tetraubiquitina contendo ligações à K48 ou K63, diubiquitina contendo uma ligação a Iisina oposta a ligação da tetraubiquitina (por exemplo, diubiquitina ligada a K63 quando foi utilizada a tetraubiquitina ligada a K48, ou diubiquitina ligada a K48 quando foi utilizada a tetraubiquitina ligada a K63), e monoubiquitina, e Fabs apu2.01-2,20 foram avaliados pela sua capacidade de reconhecer todos as três moléculas imobilizada (Figuras 20A e 20B). Nenhum Fab reconheceu especificamente a monoubiquitina. Cada apu2.01-apu2.10 reconheceu especificamente a tetraubiquitina ligada a K48 imobilizada, mas não reconhecemos a diubiquitina ligada a K63 imobilizada (vide Figura 20A). Várias outras bandas apareceram no blot que representam espécies contaminantes de tri-, penta-, e octaubiquitina na preparação da tetraubiquitina ligada a K48. Cada apu2.11- apu2.20 reconheceu especificamente a tetraubiquitina ligada a K63 imobilizada e não reconheceu a diubiquitina ligada a K48 imobilizada (vide Figura 20B).

Exemplo 3

Ligação de Anticorpos Anti-Poliubiquitina a Proteínas Endogenamente Poliubiquitinadas

Os experimentos anteriores demonstraram que a atividade da Proteína de Interação com o Receptor (RIP), um mediador essencial de 140 kD do complexo de sinalização do receptor de TNF-1 proximal (TNFR1), é modulada pela poliubiquitinação (Wertz et ai, Nature 430: 694-699 (2004 )). Quando a RIP é poliubiquitinada com a cadeia da poliubiquitina ligada a K63, a sinalização através da TNFR1 é facilitada. Removendo a cadeia da poliubiquitina ligada a K63 do RIP pelo N-terminal de ubiquitinação da A20 e a substituição com a cadeia de poliubiquitina ligada a K48 pela função ubiquitina ligase C terminal da A20 inativa RIP e marca esta para a degradação proteasomal. Esse mecanismo foi elucidado usando linhagens de células que expressam ubiquitina mutante capaz de formar apenas poliubiquitinas ligada a K48 ou ligada a K63.

Foi avaliada a capacidade das duas proteínas ligantes anti- poliubiquitina ligada a K48 e anti-poliubiquitina ligada a K63 da invenção de reconhecer especificamente as diferente formas de RIP poliubiquitinadas que existem nas células HeLa S3 em diferentes pontos de tempo após o tratamento com TNF. Quatro litros de células HeLa S3 em aproximadamente 1,5 x 106 células/mL fora m tratadas com 21 μΜ de MG-132. Imediatamente após o tratamento, um litro de células foi removido da cultura principal, colhida por centrifugação, lavado com 200 mL PBS1 e recentrifugada. Esta amostra foi usada como tempo zero. Os três litros restantes de cultura celular foram tratados com 100 ng/mL de TNF. Um litro de células foi removido, colhido, lavado com 200 ml de PBS1 e recentrifugado a cada 5, 15, e 25 minutos após o tratamento com TNF. As células de cada ponto de tempo foram Iisadas em 30 ml de solução de Iise IP (LB) (20 mM de Tris pH 7,5, 150 mM de NaCI1 1% de Triton x-100, 1 mM de EDTA, 25 μΜ de MG-132, 10 mM de NEM, 30 μ L de cada coquetel inibidor de fosfatase 1 e 2 (Sigma), e 1 comprimido inibidor da protease completa (Roche)) e incubadas com rotação a 4 0C durante 20-60 minutos.

Cada Iisado foi transferido para um tubo de 50 mL de centrifugação e sedimentado duas vezes por cinco minutos a 10000 χ g. A concentração das proteínas do Iisado de cada ponto de tempo foi estimada. Cada lisado (30 mL para cada ponto de tempo com as concentrações da proteína normalizada) foi incubado por 1.25-1.5 horas com 1 ml de esferas de Proteína A/G desbloqueado a 4°C. As esferas e resto foram separadas do lisado por centrifugação a 2000 rpm por 5 minutos. A amostra foi colhida a partir de cada Iisado direto para a análise por Western Blot, e o volume restante foi congelado a -80°C.

Quatro amostras de 16 ml de cada Iisado foram empregadas. Para cada amostra foi acrescentado 25 mM de MG-132 e 20 μL de NEM. Duas amostras foram combinadas com cada 2,4 μg/mL de um anticorpo anti-TNFR1. Duas outras amostras foram combinadas com 2,4 pg/mL de um anticorpo controle (anti-myc). Todas as amostras foram incubadas por duas horas a 4 0C em rotação, seguida pela adição de 150 μL de uma suspensão espessa 50% de esferas de proteína A desbloqueada. As amostras foram incubadas a 4 0C por mais 5 horas com rotação. As amostras foram sedimentadas por centrifugação, e as esferas foram lavadas uma vez com 15 mL de LB1 duas vezes com 10 mL de LB contendo 1 M de NaCI, e duas vezes com 10 mL de LB. As esferas foram lavadas ressuspendidas em 1,25 ml de LB e transferidas para tubos de microcentrifugação. Cada amostra foi aspirado de tal maneira que o tubo continha um volume total de 950 pL, e 360 mg de uréia sólida foi adicionado a cada amostra para uma concentração final de cada amostra de 6Μ de uréia. As amostras foram incubadas durante 15 minutos à temperatura ambiente sob suave agitação. As esferas de cada amostra foram sedimentadas por centrifugação. Uma parte de cada um sobrenadante foi reservado para a análise de Western Blot, e o sobrenadante restante de cada amostra (cerca de 1 ml por amostra) foi diluída com 10 ml de tampão de diluição de dissociação (1% Triton-XIOO1 0,5% deoxicolato, 120 mM de NaCI1 50 mM de HEPES pH 7,2, e coquetel inibidor da protease completa(Roche)).

Cada amostra foi dividida em duas porções de cinco mL. Uma porção foi tratada com 2,5 pg de apu2.16 que havia sido reformulada da forma Fab para a forma IgG, e os outros foram tratados com 2,5 pg de apu2.07 que havia sido reformulada da forma Fab para a forma de IgG. Para ambas as amostras foram adicionadas 50 μL de esferas de proteína A, e as amostras foram incubadas durante 5 horas a 4°C. As esferas de proteína A foram sedimentadas e lavadas três vezes em TNFR1 LB, depois de ter sido transferido para tubos de microcentrífuga durante a lavagem processo. Amostra tampão foi adicionado em todas as amostras, e cada amostra (incluindo as amostras previamente reservado para Western Blot análise) foi reduzida em 10% e execute tris / Gly 1,5 mm 10-bem Novex ® géis (Invitrogen). Depois de correr, as proteínas no gel foram transferidas para membranas Invitrolon™ PVDF (Invitrogen) de acordo com as instruções do fabricante. As membranas foram bloqueadas com 5% e PBS-T e sondadas com um anticorpo monoclonal anti-RIP (Becton Dickinson) durante a noite em temperatura ambiente. Os blots foram então lavados, e sondados com o anticorpo secundário camundongo anti-cabra conjugado com HRP (Cappel), lavados, expostos ao reagente para ativar a quimiluminescência, e expostos ao filme. Os resultados são exibidos nas Figuras 21A e 21 Β. A Figura 21A exibe o blot contendo as amostras primeiro imunoprecipitadas com TNFR1 ou anti-myc e, em seguida, imunoprecipitadas com apu2.16 IgG (seletiva para a poliubiquitina ligada a K63). Assim como indicado na figura 21A, a RIP não é visível em ambas as amostras anti-myc controle ou amostra no tempo zero. O banda RIP foi mais forte na amostra do ponto de tempo 5 minutos e, depois, diminuiu significativamente na amostra de 15 minutos e 25minutos. A Figura 21B exibe o blot contendo as amostras primeiro imunoprecipitadas com TNFR1 ou anti-myc e, em seguida, imunoprecipitadas com apu2.07 IgG (seletiva para poliubiquitina ligada a K48). Assim como indicado na figura 21B, não foi observada RIP em ambas as amostras anti-myc controle ou amostra no tempo zero. Os níveis de RIP neste blot aumentaram ao longo do tempo, e ficaram mais fortes na amostra do ponto de tempo 25 minutos. Estes dados se correlacionam com os achados anteriores que mediante sinalização através da TNFR1, a RIP é primeiro poliubiquitinada ligada a K63, e posteriormente desubiquitinada e poliubiquitinada ligada a K48 pela A20. Assim, os anticorpos da invenção foram capazes de se ligar especificamente e discriminar entre um polipeptídeo poliubiquitinado ligado a K63 e um polipeptídeo poliubiquitinado ligado a K48 que foram poliubiquitinado nas células. .

Exemplo 4

Isolamento ε Caracterização de Terceira Geração de Anticorpos Anti- Poliubiquitina

A terceira geração de bibliotecas para a exibição de Fab foram construídas a partir do fagomídeo que codifica o clone previamente identificado apu2.16 (seletivo para a poliubiquitina ligada a K63) (vide, Exemplo 2 e Figuras 17A e 17B). Fago do qual o clone foi usado para infectar células CJ236 a preparar um molde Kunkel de DNA. Esse molde foi posteriormente mutagenizado para inserir códons de parada, e moldes contendo os códons de parada foram utilizados na construção da biblioteca da seguinte forma.

O Fab apu05 foi mutagenizado de acordo com três esquemas diferentes para criar duas biblioteca diferentes derivada de apu2.16. Na primeira biblioteca, o HVR-H1 e HVR-H2 foi mutagenizado. O HVR-H1 foi primeiro modificado para incluir um códon de parada no molde Kunkel1 seguido de uma mutagênese utilizando um oligonucleotídeo mutagênico. A seqüência do oligonucleotídeo que codifica o códon de parada foi: GCAGCTTCTGGCTTCAACTAATAACACTGGGTGCGTCAGG (SEQ ID No: 371). O oligonucleotídeo mutagênico permitiu a isoleucina mutada na posição 29 ser selecionada de fenilalanina, leucina, isoleucina e valina; a isoleucina na posição 34 ser selecionada de metionina e isoleucina utilizando um conjunto de códons NNS (onde N corresponde a G1 C, A ou T1 e S corresponde a G ou C); e a leve randomização dos aminoácidos K30, T31, G32 e L33. Uma randomização Ieve1 neste contexto indica que determinadas posições nucleotídicas foram 70% do tempo ocupadas pela base indicada e 10% do tempo ocupada por uma das outras três bases. Para aqueles oligonucleotídeos seguintes, tal randomização foi incluída em uma base particular, a presença da randomização leve é indicada pela presença de um número na posição da base. O número "5" indica que a base adenina está presente em 70% do tempo naquela posição, enquanto que as bases guanina, citosina e timina estão presentes em 10% do tempo. Do mesmo modo, o número "6" refere-se à guanina, "7" a citosina, e "8" a timina, onde em cada caso, cada uma das outras três bases está presente em apenas 10% do tempo. As seqüência de oligonucleotídeoutilizados na mutagênese da apu3.16 da HVR-H1 foi: GCAGCTTCTGGCTTCAACNTC556577668788ATSCACTGGGTGCGTCAGG (SEQ ID No: 785).

O HVR-H2 também foi modificado para incluir um códon de parada no molde Kunkel, seguido de uma mutagênese utilizando um oligonucleotídeo mutagênico. A seqüência do oligonucleotídeo que codifica o códon de parada em todos os casos foi: GGCCTGGAATGGGTTGCATAATAATATGCCGATAGCGTCAAGG (SEQ ID No: 373). Os três primeiros oligonucleotídeos mutagênicos eram duas permutações da primeira seqüência desejada, e uma segunda seqüência desejada. A primeira seqüência desejada incluía um resíduo de tirosina fixa e resíduo de tirosina randomizado nas posições 50 e 54 utilizando um conjunto de códon NNS (descrito acima); resíduos fixos nas posições 51 (isoleucina), 52 (prolina), 53 (tirosina), 55 (glicina) e 57 (treonina); e randomização leve nas posições S52, S56, S58 e (de acordo com o esquema descrito acima de randomização leve). A segunda seqüência desejada incluiu: resíduos fixos nas posições 51 (isoleucina), 52 (prolina), 53 (tirosina), 55 (glicina) e 57 (treonina); e randomização pesada das tirosinas nas posições 50 e 54 utilizando um conjunto de mistura de códons NNS (descrito acima), e randomização leve nas posições S52, S56, S58 e (de acordo com o esquema descrito acima de randomização leve) Os oligonucleotídeos utilizados para mutagênese apu2.16 HVR-H2 foram GGCCTGGA ATGGGTTGCANNSATC567 CCGTACTACGGT567ACC567TATGCCGATAGCGTCAAGG (SEQ ID No: 786), GGCCTGGAA TGGGTTGCATACATC567CCGTACNNSGGT567 ACC567 TATGCCGATAGC GTCAAGG (SEQ ID No: 787), e GGCCTGGAATGGGTTGCANNS ATC567CCGTACNN SGGT567ACC567TAT GCCGATAGCGTCAAGG (SEQ ID No: 788).

Na segunda biblioteca apu2.16, HVR-H2 e HVR-H3 foram mutagenizados. HVR-H2 foi mutagenizado de maneira idêntica as modificações feitas ao HVR-H2 da primeira biblioteca apu2.16, utilizando o mesmo oligonucleotídeo contendo o códon de parada e o mesmo oligonucleotídeo mutagênicos. O HVR-H3 foi modificado de maneira idêntica as modificações 25 feitas ao HVR-H3 na primeira biblioteca apu18 (descrita no exemplo 2), utilizando o mesmo oligonucleotídeo contendo o códon de parada e utilizando os mesmos seis primeiros oligonucleotídeos mutagênicos.

Na terceira biblioteca apu2.16, HVR-H1 e HVR-H3 foram mutagenizados. HVR-H1 foi mutagenizado de maneira idêntica as modificações feitas ao HVR-H2 da primeira biblioteca apu2.16, utilizando o mesmo oligonucleotídeo contendo o códon de parada e o mesmo oligonucleotídeo mutagênicos. O HVR-H3 foi modificado de maneira idêntica as modificações feitas ao HVR-H3 na primeira biblioteca apu18 (descrita no exemplo 2), utilizando o mesmo oligonucleotídeo contendo o códon de parada e utilizando os mesmos seis primeiros oligonucleotídeos mutagênicos.

As reações de mutagênese de cada uma das duas bibliotecas derivadas de apu2.16 foram transformados em E. coli XL-1 eletrocompetente por eletroporação. Foi permitido que as células se recuperassem por 30 minutos a 37 °C sob agitação em meio SOC. Vinte microlitros meio SOC contendo célula foi reservado para determinar o número de transformantes, e o restante foi então transferido para 500 ml de meio 2YT contendo carbenicilina e 1010 de auxiliador de fago M13K07 por mililitro. Após 45 minutos a 37 0C sob agitação, o caldo foi suplementado com canamicina e foi incubada para o crescimento ovemight a 37 °C sob agitação. O número de transformantes para cada biblioteca foi >109. Os fagos foram coletados e concentrados a partir do caldo por centrifugação e precipitação em PEG e, posteriormente, utilizado nos ciclos de seleção.

As três terceiras gerações da biblioteca foram classificadas separadamente cada uma contra a poliubiquitina ligada a K63 imobilizada sobre placas Maxisorp (NUNC), como descrito acima no Exemplo 1 (A). A estringência foi modulada de três maneiras: pela concentração de poliubiquitina biotinilada; por meio da adição de excesso de poliubiquitina não biotinilada para competir por ligação antes de concorrer para a captura em poços revestidos com neutravidina, e pela duração da competição. Para cada ciclo de seleção em solução, incluiu 3 μΜ de monoubiquitina e 30 pg/ml de poliubiquitina ligada a K48 no tampão para seleção em solução durante a primeira etapa incubação. Os fagos eluídos foram amplificados e agrupados para novos ciclos de triagem. Ciclos de seleção subseqüentes foram selecionados a partir da seleção em solução. O primeiro ciclo da seleção em solução incluiu 100 nM de poliubiquitinas biotiniladas (Sulfo-NHS-biotina, Pierce) incubadas no concentrado de fago por uma hora em temperatura ambiente. A solução foi então diluída 10 vezes em solução tampão para seleção em solução (PBST com 0,5% de Superblock (Pierce)); e capturada utilizando placas com poços revestidos de neutravidina por cinco minutos. A reação contendo as cadeias de poliubiquitina não biotinilada serviu como um controle para monitorar o fundo da ligação do fago. As placas foram lavados com PBST e eluídas com 0,1 M de HCI por 10 minutos. Para o segundo ciclo de seleção em solução, o fago foi balanceado com 30 nM de poliubiquitina biotinilada, como no ciclo um, mas foi diluído dez vezes no tampão para seleção em solução contendo 30 pg/mL de poliubiquitina não biotinilada (ligada a K63) por cinco minutos para selecionar a velocidade de dissociação seguida pela captação nos poços revestidos por neutravidina.

Após o primeiro ciclo de solução de seleção, o enriquecimento de 6,5 vezes foi observado para as bibliotecas combinadas baseado no apu2.16 (vide. Tabela E). Um enriquecimento adicional de 10 vezes foi obtido após a segunda seleção em solução para a velocidade de dissociação lenta (veja a Tabela E).

Tabela E

Resultados da Seleção em Solução da Terceira Geração de Biblioteca de Anticorpo Anti-Poliubiquitina

<table>table see original document page 186</column></row><table> Após um ciclo de seleção em placa e dois ciclos de seleção em solução, os clones únicos selecionados a partir da terceira geração foram cultivados em placas de 96 poços e rastreado por ELISA para fago, tal como descrito acima no Exemplo 2. Setenta e dois clones foram identificados por seqüenciamento. Desses clones, doze demonstraram maior grau de especificidade para a poliubiquitina ligada a K63 no teste ELISA para fago (Figura 22). Destes doze foram designados apu3.01-3,12, e os suas seqüências HVR-H1, HVR-H2 e HVR-H3 aparecem nas Figuras 23A e 23B. A cadeia leve HVR de cada clone específico para poliubiquitina ligada a K63 não foram seqüenciados, mas espera-se que as seqüências HVR-L1 e HVR- L2 fossem invariantes, enquanto espera-se que a seqüência de HVR-L3 seja idêntica à esperada para apu2 16. A seqüência HVR-L1 é RASQSVSSAVA (SEQ ID No: 79) e a seqüência HVR-L2 é SASSLYS (SEQ ID No: 80), de acordo com a concepção da biblioteca. Todos os clones possuíam a mesma seqüência de estrutura da cadeia pesada e da cadeia leve (vide Figura 6).

Apu2.07 (ver Exemplo 2 e Figuras 16a e 16b)) e apu3.07 (ver acima e as figuras 23A e 23 B) foram expressas em ambas as células CHO e 293 como IgGs humanas. As construções de expressão foram feitas pela mutagênese de Kunkel de vetores de expressão apropriados para mamífero PRK codificando as cadeias leves e pesadas da IgG humana (Gorman et al., DNA Prot. Eng. Tech. 2:3-10 (1990)).As IgGs foram purificadas por cromatografia de afinidade utilizando metodologias padrões.

A capacidade de cada IgG se ligar especificamente a poliubiquitina imobilizada de ligação apropriada para um membrana de nitrocelulose foi avaliada por Western Blot. Poliubiquitina e monoubiquitina ligada a K48 ou ligada a K63 (Boston Biochem) correram em gel de 4-20% Tris- glicina poliacrilamida (Invitrogen). O conteúdo dos géis foram transferidos para a nitrocelulose por electroblotting. Os sítios de ligação não específicos sobre a membrana de nitrocelulose foram bloqueados durante 1 hora, com 5% de leite em pó desnatado sem gordura dissolvido em tampão Tris-salina contendo 0,1% Tween-20 (TBST). Os anticorpos específicos para K48 ou específicos para K63 foram então adicionados ao blot em uma concentração de 2 pg/mL (apu2.07 IgG) ou 1 pg/ml (apu3.07 IgG) e incubadas durante uma hora para permitir a ligação. Como um controle positivo, um blot foi incubado com anticorpos anti- ubiquitina de coelho (Sigma). Os blots foram lavados em TBST e a ligação dos anticorpos foi detectado por anticorpos cabra anti-lg Fc (ICN) humano conjugados com peroxidase ou anti- Ig de coelho conjugado com peroxidase (Amersham) diluído 1:10000 em TBST contendo 5% de leite em pó sem gordura. Depois de uma hora, os blots foram lavados em TBST e desenvolvida utilizando o reagente Super Signal West Dura (Pierce) para revelar a peroxidase. Os resultados são exibidos nas Figuras 24A-24D.

Como esperado, o apu2.07 IgG reconheceu especificamente a tetraubquitina ligada a K48 e a tri-heptaubiquitina ligada a K48 imobilizadas (Figura 24A), mas não se ligou a nenhuma amostra de poliubiquitina ligada a K63 imobilizada. Do mesmo modo, a apu3.07 IgG reconheceu especificamente a a tetraubquitina ligada a K63 e a tri-heptaubiquitina ligada a K63 imobilizadas (Figura 24B), mas não se ligou a nenhuma amostra de poliubiquitina ligada a K48 imobilizada. Nem mesmo a ligação da IgG a monoubiquitina imobilizada. Para avaliar a sensibilidade de cada IgG, uma análise adicional por Western Blot foi realizada com variadas concentrações de tetraubiquitina ligada a K48 e ligada a K63 imobilizada (25-1000 ng/banda) (Figuras 24C e 24D). Na apu2.07 IgG foi detectado algo em torno de 50 ng ligada a tetraubiquitina ligada a K48 imobilizada, e novamente não se ligou especificamente a tetraubiquitina ligada a K63 imobilizada (Figura 24C). Na apu3.07 IgG foi detectado algo em torno de 50 ng ligada a tetraubiquitina ligada a K63 imobilizada, e novamente não se ligou especificamente a tetraubiquitina ligada a K 48 imobilizada (Figura 24D). Em ambos os casos, o aumento da quantidade de tetraubiquitina imobilizada resultou no aumento de ligação observado.

Para determinar se as IgGs foram capazes de detectar proteínas endogenamente poliubiquitinadas, Iisados de prot eínas foram preparadas a partir da linhagem de células embrionárias de rins humana 293T tratados com ou sem 20 μΜ de inibidor de proteosoma Velcade ® (bortezomib) durante quatro horas. Os Iisados foram redissolvidos por SDS-PAGE em gel de Tris- glicina poliacrilamida 4-20% (Invitrogen), e o Western blottingio\ realizado como descrito acima. Os resultados são exibidos na Figura 25. Anticorpos policlonais anti-ubiquitina (Sigma) detectou um grande número de proteínas de alto peso molecular (faixas à esquerda), tanto na presença quanto na ausência do tratamento com VELCADE®. O apu2.07 IgG ligado a inúmeras proteínas de pesos moleculares variados (faixas à direita), e as ligações observadas foram mais pesadas para os Iisados imobilizados tratados com VELCADE do que para os Iisados imobilizado não tratados. Foi observado uma ligação total significativamente menor com a apu3.07 IgG (faixas ao centro), que era esperada para se ligar a proteínas poliubiquitinas ligadas a K63, e não houve nenhuma diferença aparente entre a ligação nas faixas tratadas e não tratadas com VELCADE. Sabe-se que a poliubiquitinação ligada a K48 marca a proteína para a degradação proteolítica intracelular (Chau et ai, Science 243: 1576- 1583 (1989); Finley et ai, Moi Celi Biol. 14: 5501-5509 (1994); Flick et al., Nat. Celi Biol. 6:634-641 (2004)). Assim, uma explicação para os resultados da apu2.07 IgG foi que quando o processamento proteolítico foi impedido, um aumento na quantidade de proteínas poliubiquitinadas ligadas a K48 permaneceram no lisado, resultando em um aumento de ligação pela apu2.07 IgG sobre as amostras não tratadas. A poliubiquitinação ligada a K63 não é conhecida por marcar a proteína para a degradação proteolítica intracelular (Pickart e Fushman, Curr. Opin. Chem. Biol. 8: 610-616 (2004); Hicke e Dunn, Annu. Reν. Cell Dev. Biol. 19: 141 -172 (2003); Spece et ai, Moi CeIIBioi 15: 1265-1273 (1995); Ulrich1 Eukaryot. Cell 1: 1-10 (2002); Spence et al., Cell 102: 67-76 (2000); Seibenhener et al., Mol. Celi Bioi 24 (18): 8055-8068 (2004)). Assim, uma explicação para o resultado da apu3,07 IgG foi que a inibição do proteassoma não resultou em um acúmulo de proteínas poliubiquitinadas ligadas a K63.

Exemplo 5

Análise Estrutural do Ligante Fab à Anti-Poliubiquitina Ligada a K63

Para compreender melhor a interação entre o Fab anti- poliubiquitina ligada a K63, o Fab apu2.16 anti-poliubiquitina ligada a K63 foi co-cristalizado com a diubiquitina ligada a K63. Cristais foram cultivadas em suspensões de gotas utilizando 1 pL de uma solução apu2.16 (15 mg/ml em 10 mM Tris, 75mM de NaCI pH 8,0) e 1 pL de uma solução (0,1 M de LiCI, 0,1 M de Tris pH 8,2, 1 M de citrato ). Para cada gota foi adicionado 0,5 pL de 0,1 M de cloreto cúprico, e cada gota era semeada em listras. Grupos de cristais cresceram ao longo de vários dias e puderam ser manipulado para se obter um único, cristal de difração. A estrutura foi determinada por substituição molecular. Os dados originais foram coletados em 100K e foram tratados com HKL2000. Cristais pertencentes ao grupo de espaço C2 com dimensões da célula a = 177,7 A, b - 94,9 A, c = 97,9 Aep = 107, com dois complexos na unidade assimétrica. A estrutura foi resolvida pela substituição molecular usando o programa Phaser e as coordenadas de uma variante do fragmento Fab 4D5 humanizado 4D5 (PDB para 4D5: PBD código 1FVE). O modelo de construção foi realizada no programa Coot e a estrutura foi aperfeiçoado com Refmac5. A resolução da estrutura é de 3,1 A. O complexo foi aperfeiçoado para um R de 24,5% e um Rfree de 30,4%.

A interação entre apu2.16 e diubiquitina ligada a K63 é exibida nas figuras 26A-26C. O epítopo estrutural é uma combinação de resíduos que enterrar pelo menos 25% da sua superfície acessível solvente mediante a ligação de fab e/ou têm mais de átomo com 4,5 A tanto da cadeia pesada quanto da leve de fab. A cadeia de ubiquitina que doa K63 é a cadeia A, e a cadeia de ubiquitina que doa o C-terminal é a cadeia B. Os resíduos da cadeia leve de Fab pertencem a cadeia L, e os resíduos da cadeia pesada de Fab pertencem a cadeia Η. O número das cadeias precede o número de resíduos na tabela abaixo, e os resíduos de fab são numerados seqüencialmente.

Tabela F

Resíduos Localizado na Interface de Ligação Entre a Diubiquitina Ligada a K63 e Apu2.16

<table>table see original document page 191</column></row><table> <table>table see original document page 192</column></row><table>

Assim como demonstrado na Tabela F, e como indicado na Figura 26 em cinza escuro, havia onze resíduos na cadeia A da diubiquitina ligada a K63 e treze resíduos na cadeia B da diubiquitina ligada a K63 que estavam localizados no interior da apu2.16 em 4,5 A quando se ligou a apu2.16. Assim como demonstrado na Tabela F1 e como indicado na figura 26C, em cinza escuro, havia oito resíduos na cadeia leve de apu2.16 e quatorze resíduos na cadeia pesada de apu2.16 que estavam localizados no intervalo de 3,5 A da diubiquitina ligada a K63 quando ligadas a molécula. Com base nestes dados, resíduos susceptíveis a mediar a interação entre os dois na diubiquitina ligada a K63 incluí Glu-18, Ser-20, Leu-57 e Asp-58 na cadeia A e Pro-37, Arg-74 e Gly-75 na cadeia B. Interessantemente, os anticorpos não interagem intimamente com a Gly-76 ligada a K63 mas ao contrario a especificidade deriva via superfície do complexo da di-ubiquitina adjacentes à ligação. Listagem de Seqüências

<110> GENENTECH, INC.

<120> MÉTODOS E COMPOSIÇÕES PARA MARCAR POLIUBIQUITINA

<130> P2260R1-PCT

<140> <141>

<150> 60/751,081 <151> 2005-12-15

<150> 60/793,980 <151> 2006-04-21

<160> 908

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 1

Gly Phe Asn Leu Ser Tyr Ser Ser Met His 1 5 10

<210> 2 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 2

Gly Phe Asn Val Ser Tyr Ser Ser Ile His 1 5 10

<210> 3 <211> 10 <212> PRT <213> Seqüência Artificial <220> <223> Descrição da Seqüência

Peptideo Sintético

<400> 3 Gly Phe Asn Ile Tyr Tyr Ser Ser Ile His 1 5 10

<210> 4 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial Peptideo Sintético

<400> 4

Gly Phe Asn Ile Ser Tyr Tyr Tyr Ile His 1 5 10

<210> 5 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial Peptideo Sintético

<400> 5

Gly Phe Asn Val Ser Tyr Tyr Tyr Met His 1 5 10

<210> 6 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial Peptideo Sintético

<400> 6

Gly Phe Asn Phe Tyr Ser Ser Tyr Met His 1 5 10

<210> 7 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial Peptideo Sintético

<400> 7

Gly Phe Asn Leu Tyr Tyr Ser Tyr Met His 1 5 10

<210> 8 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 8

Gly Phe Asn Val Tyr Tyr Ser Ser Ile His 1 5 10

<210> 9 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 9

Gly Phe Asn Ile Ser Tyr Ser Tyr Met His 1 5 10

<210> 10 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 10

Gly Phe Asn Val Tyr Tyr Ser Ser Ile His 1 5 10

<210> 11 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 11

Gly Phe Asn Val Ser Tyr Ser Tyr Met His 1 5 10

<210> 12 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial

<220> <223> Descrição da Seqüência Artificial Peptideo Sintético

<400> 12

Gly Phe Asn Leu Tyr Tyr Ser Tyr Met His 1 5 10

<210> 13 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial Peptideo Sintético

<400> 13

Gly Phe Asn Val Tyr Tyr Ser Ser Ile His 1 5 10

<210> 14 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial Peptideo Sintético

<400> 14

Gly Phe Asn Ile Ser Tyr Ser Ser Met His 15 10

<210> 15 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial Peptideo Sintético

<400> 15

Gly Phe Asn Val Ser Tyr Ser Ser Ile His 1 5 10

<210> 16 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial Peptideo Sintético

<400> 16 Gly Phe Asn Phe Tyr Tyr Tyr Tyr Ile His 1 5 10

<210> 17 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial Peptideo Sintético

<400> 17

Gly Phe Asn Val Ser Ser Tyr Ser Ile His 1 5 10

<210> 18 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial Peptideo Sintético

<400> 18

Gly Phe Asn Val Ser Ser Tyr Ser Met His 1 5 10

<210> 19 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial Peptideo Sintético

<400> 19

Gly Phe Asn Leu Ser Tyr Tyr Ser Ile His 1 5 10

<210> 20 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial Peptideo Sintético

<400> 20

Gly Phe Asn Leu Ser Tyr Tyr Ser Ile His 1 5 10

<210> 21 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial Peptideo Sintético

<400> 21

Gly Phe Asn Val Ser Tyr Ser Tyr Met His 1 5 10

<210> 22 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial Peptideo Sintético

<400> 22

Gly Phe Asn Val Ser Tyr Tyr Ser Ile His 15 10

<210> 23 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial Peptideo Sintético

<400> 23

Gly Phe Asn Leu Ser Tyr Ser Ser Ile His 15 10

<210> 24 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial Peptideo Sintético

<400> 24

Gly Phe Asn Val Ser Tyr Ser Ser Ile His 15 10

<210> 25 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220> <223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 25

Gly Phe Asn Leu Ser Tyr Ser Ser Met His 1 5 10

<210> 26 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<220>

<221> MOD_RES

<222> (4)..(4)

<223> Leu, Vai, Ile ou Phe

<220>

<221> MOD_RES <222> (5)..(8) <223> Ser ou Tyr

<220>

<221> MOD_RES <222> (9)..(9) <223> Met ou Ile

<400> 26

Gly Phe Asn Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa His 1 5 10

<210> 27 <211> 17 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 27

Ser Ile Tyr Pro Tyr Tyr Ser Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15

Gly

<210> 28 <211> 17 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220> <223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 28

Ser Ile Ser Pro Tyr Tyr Gly Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15

Gly

<210> 29 <211> 17 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 29

Ser Ile Tyr Ser Tyr Tyr Ser Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15

Gly

<210> 30 <211> 17 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 30

Ser Ile Ser Ser Tyr Tyr Gly Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15

Gly

<210> 31 <211> 17 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptídeo Sintético

<400> 31

Ser Ile Ser Ser Tyr Tyr Gly Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15

Gly

<210> 32 <211> 17 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 32

Ser Ile Ser Pro Tyr Tyr Gly Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15

Gly

<210> 33 <211> 17 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 33

Ser Ile Ser Ser Tyr Tyr Ser Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15

Gly

<210> 34 <211> 17 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 34

Ser Ile Tyr Pro Tyr Tyr Gly Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15

Gly

<210> <211> <212> <213>

<220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

35 17 PRT

Seqüência Artificial

<400> 35

Ser Ile Ser Ser Tyr Tyr Ser Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly

<210> 36 <211> 17 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 36

Ser Ile Ser Pro Tyr Tyr Ser Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15

Gly

<210> 37 <211> 17 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 37

Ser Ile Ser Pro Tyr Tyr Ser Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15

Gly

<210> 38 <211> 17 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 38

Ser Ile Ser Pro Tyr Tyr Ser Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15

Gly

<210> 39 <211> 17 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético <400> 39

Ser Ile Ser Pro Tyr Tyr Ser Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys 15 10 15

Gly

<210> 40 <211> 17 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 40

Ser Ile Tyr Ser Tyr Tyr Ser Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys 15 10 15

Gly

<210> 41 <211> 17 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 41

Ser Ile Tyr Ser Tyr Tyr Ser Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys 15 10 15

Gly

<210> 42 <211> 17 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 42

Ser Ile Ser Pro Tyr Tyr Ser Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys 15 10 15

Gly

<210> 43 <211> 17 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 43

Ser Ile Ser Ser Ser Tyr Ser Ser Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15

Gly

<210> 44 <211> 17 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 44

Ser Ile Tyr Ser Ser Ser Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15

Gly

<210> 45 <211> 17 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 45

Ser Ile Tyr Ser Ser Tyr Ser Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15

Gly

<210> 46 <211> 17 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 46

Ser Ile Tyr Pro Tyr Tyr Gly Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15

Gly

<210> 47 <211> 17 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 47

Ser Ile Ser Ser Tyr Tyr Ser Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys 15 10 15

Gly

<210> 48 <211> 17 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 48

Ser Ile Tyr Pro Tyr Tyr Ser Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys 15 10 15

Gly

<210> 49 <211> 17 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 49

Ser Ile Tyr Pro Tyr Tyr Gly Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15

Gly

<210> 50 <211> 17 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 50

Ser Ile Tyr Pro Tyr Tyr Ser Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys 15 10 15 Gly

<210> 51 <211> 17 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 51

Ser Ile Tyr Pro Tyr Tyr Ser Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15

Gly

<210> 52 <211> 17 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<220>

<221> M0D_RES <222> (3)..(3) <223> Tyr ou Ser

<220>

<221> MOD_RES <222> (4) . . (4) <223> Pro ou Ser

<220>

<221> MOD_RES <222> (5)..(6) <223> Tyr ou Ser

<220>

<221> MOD_RES <222> (7)..(7) <223> Ser ou Gly

<220>

<221> MOD_RES <222> (8)..(8) <223> Tyr ou Ser

<220>

<221> MOD_RES <222> (10)..(10) <223> Ser ou Tyr <400> 52

Ser Ile Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Thr Xaa Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15

Gly

<210> 53 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 53

Gly Tyr Glu Gly Gly Met Ala Met Asp Tyr 1 5 10

<210> 54 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 54

Asp Gly Tyr Ala Met Asp Ala Leu Asp Tyr 1 5 10

<210> 55 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 55

Leu Tyr His Asn Thr Leu Gly Met Asp Tyr 1 5 10

<210> 56 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 56

Pro Tyr Ser Tyr Ser Glu Ala Met Asp Tyr 1 5 10 <210> 57 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 57

Glu Tyr Tyr Met Tyr Asp Ala Leu Asp Tyr 1 5 10

<210> 58 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 58

Asp Tyr Tyr Tyr Ile Ser Ala Ile Asp Tyr 1 5 10

<210> 59 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 59

Ser Tyr Ser Tyr Ser Ser Ala Leu Asp Tyr 1 5 10

<210> 60 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 60

Gly Tyr Lys Tyr Trp Ser Ala Phe Asp Tyr 1 5 10

<210> 61 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 61

Ser Tyr Ser Ser Tyr Ser Ala Ile Asp Tyr 1 5 10

<210> 62 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 62

Glu Gly Tyr Ser Gln Gly Gly Phe Asp Tyr 1 5 10

<210> 63 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 63

Ser Tyr Gly Tyr Tyr Val Ala Phe Asp Tyr 1 5 10

<210> 64 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 64

Asp Tyr Lys Phe Gly Tyr Ala Ile Asp Tyr 1 5 10

<210> 65 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético <400> 65

Glu Gly Tyr Ser Gln Gly Gly Phe Asp Tyr 15 10

<210> 66 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 66

Ser Tyr Ser Tyr Tyr Ser Ala Met Asp Tyr 15 10

<210> 67 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 67

Gly Tyr Met Trp Tyr Gly Gly Ile Asp Tyr 15 10

<210> 68 <211> 11 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 68

Glu Tyr Tyr Ser Tyr Leu Gly Ala Ile Asp Tyr 15 10

<210> 69 <211> 21 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 69

His Thr Lys Tyr Val Tyr Leu Tyr Thr Tyr Trp Glu Asp Ser Met Asp 15 10 15 Tyr Gly Leu Asp Tyr 20

<210> 70 <211> 21 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 70

Ser Ser Ile Ser Glu Trp Tyr Gly Ser Trp Tyr Tyr Phe Trp Glu Ser 15 10 15

Ser Gly Ile Asp Tyr 20

<210> 71 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 71

Glu Ser Tyr Trp Ser Tyr Ala Met Asp Tyr 1 5 10

<210> 72 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 72

Ser Tyr Ser Tyr Ser Tyr Gly Ile Asp Tyr 15 10

<210> 73 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 73 Ser Tyr Ser Tyr Tyr Ser Ala Ile Asp Tyr 15 10

<210> 74 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 74

Ser Tyr Ser Tyr Ser Tyr Gly Leu Asp Tyr 15 10

<210> 75 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 75

Gly Tyr Ile His Trp Glu Ala Leu Asp Tyr 15 10

<210> 76 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 76

Ser Tyr Ser Tyr Ser Ser Gly Leu Asp Tyr 15 10

<210> 77 <211> 10 < 212 > PRT

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 77

Ser Tyr Ser Tyr Ser Tyr Gly Met Asp Tyr 15 10

<210> 78 <211> 21 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<220>

<221> MOD_RES <222> (1) .. (1)

<223> Gly, Asp, Leu, Pro, Glu, Ser ou His

<220>

<221> MOD_RES

<222> (2)..(2)

<223> Tyr, Gly, Thr ou Ser

<220>

<221> MOD_RES <222> (3)..(3)

<223> Glu, Tyr, His, Ser, Lys, Gly, Met ou Ile <220>

<221> MOD_RES <222> (4) . . (4)

<223> Gly, Ala, Asn, Tyr, Met, Ser, Phe, Trp ou His <220>

<221> MOD_RES <222> (5) .. (5)

<223> Gly, Met, Thr, Ser, Tyr, He, Trp, Gln, Val ou Glu <220>

<221> MOD_RES <222> (6)..(6)

<223> Met, Asp, Leu, Glu, Ser, Gly, Vai, Tyr ou Trp

<220>

<221> MOD_RES

<222> (7) .. (7)

<223> Ala, Gly, Leu ou Tyr

<220>

<221> MOD_RES <222> (8) . . (8)

<223> Met, Leu, lie, Phe, Ala, Tyr ou Gly <220>

<221> MOD_RES <222> (9)..(9)

<223> lie, Thr, Ser ou não presente

<220>

<221> MOD_RES <222> (10)..(11) <223> Tyr, Trp ou não presente <220>

<221> MOD_RES

<222> (12) .. (12)

<223> Glu, Tyr ou não presente

<220>

<221> MOD_RES

<222> (13)..(13)

<223> Asp, Phe ou não presente

<220>

<221> MOD_RES

<222> (14) . . (14)

<223> Ser, Trp ou não presente

<220>

<221> MOD_RES

<222> (15)..(15)

<223> Met, Glu ou não presente

<220>

<221> MOD_RES

<222> (16)..(16)

<223> Asp, Ser ou não presente

<220>

<221> MOD_RES

<222> (17) . . (17)

<223> Tyr, Ser ou não presente

<220>

<221> MOD_RES <222> (18)..(18)

<223> Este resíduo pode ou não estar presente

<220>

<221> MOD_RES

<222> (19)..(19)

<223> Leu, Ile ou não presente

<400> 78

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 15 10 15

Xaa Gly Xaa Asp Tyr 20

<210> 79 <211> 11 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético <400> 79

Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ala Val Ala 1 5 10

<210> 80 <211> 7 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 80

Ser Ala Ser Ser Leu Tyr Ser 1 5

<210> 81 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 81

Gly Phe Asn Ile Ser Ser Ser Tyr Ile His 1 5 10

<210> 82 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 82

Gly Phe Asn Phe Ser Tyr Ser Tyr Ile His 1 5 10

<210> 83 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 83

Gly Phe Asn Leu Ser Tyr Tyr Tyr Ile His 1 5 10 <210> 84 <211> 10 <212> PRT <213> Seqüência Artificial

<220> <223> Descrição da Seqüência Peptideo Sintético

<400> 84

Gly Phe Asn Phe Tyr Ser Ser Tyr Ile His 1 5 10

<210> 85 <211> 10 <212> PRT <213> Seqüência Artificial

<220> <223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 85

Gly Phe Asn Phe Tyr Ser Ser Ser Ile His 1 5 10

<210> 86 <211> 10 <212> PRT <213> Seqüência Artificial <220> <223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 86

Gly Phe Asn Ile Ser Ser Ser Ser Ile His 1 5 10

<210> 87 <211> 10 <212> PRT <213> Seqüência Artificial

<220> <223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 87

Gly Phe Asn Phe Tyr Tyr Ser Ser Ile His 1 5 10

<210> 88 <211> 10 <212> PRT <213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 88

Gly Phe Asn Phe Ser Tyr Ser Ser Ile His 1 5 10

<210> 89 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 89

Gly Phe Asn Val Ser Ser Tyr Ser Ile His 1 5 10

<210> 90 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<220>

<221> M0D_RES

<222> (4) . . (4)

<223> lie, Phe, Leu ou Val

<220>

<221> MOD_RES <222> (5)..(8) <223> Ser ou Tyr

<400> 90

Gly Phe Asn Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ile His 1 5 10

<210> 91 <211> 17 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 91

Tyr Ile Ser Pro Tyr Tyr Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly

<210> 92

<211> 17

<212> PRT

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 92

Ser Ile Ser Ser Ser Tyr Gly Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15

Gly

<210> 93

<211> 17

<212> PRT

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 93

Ser Ile Ser Ser Tyr Tyr Gly Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15

Gly

<210> 94

<211> 17

<212> PRT

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 94

Ser Ile Ser Ser Ser Tyr Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15

Gly

<210> 95

<211> 17

<212> PRT

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético <400> 95

Ser Ile Ser Ser Tyr Tyr Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15

Gly

<210> 96 <211> 17 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptídeo Sintético

<400> 96

Ser Ile Ser Pro Ser Tyr Ser Ser Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15

Gly

<210> 97 <211> 17 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 97

Ser Ile Tyr Ser Ser Tyr Gly Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15

Gly

<210> 98 <211> 17 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 98

Ser Ile Tyr Ser Ser Tyr Ser Ser Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys 15 10 15

Gly

<210> 99 <211> 17 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 99

Ser Ile Tyr Pro Ser Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15

Gly

<210> 100 <211> 17 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<220>

<221> M0D_RES <222> (1)..(1) <223> Tyr ou Ser

<220>

<221> M0D_RES <222> (3)..(3) <223> Ser ou Tyr

<220>

<221> M0D_RES <222> (4) . . (4) <223> Pro ou Ser

<220>

<221> M0D_RES <222> (5)..(6) <223> Tyr ou Ser

<220>

<221> M0D_RES <222> (7) . . (7) <223> Gly ou Ser

<220>

<221> M0D_RES <222> (8)..(8) <223> Ser ou Tyr

<220>

<221> M0D_RES <222> (10)..(10) <223> Ser ou Tyr

<400> 100 Xaa Ile Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Thr Xaa Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15

Gly

<210> 101 <211> 11 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 101

Glu Tyr Tyr Arg Trp Tyr Thr Ala Ile Asp Tyr 1 5 10

<210> 102 <211> 11 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 102

Glu Lys Met Tyr Tyr Ser Tyr Gly Phe Asp Tyr 1 5 10

<210> 103 <211> 11 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 103

Glu Ser Tyr Ser Ile His Phe Gly Phe Asp Tyr 1 5 10

<210> 104 <211> 16 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 104

Met Tyr Tyr Ser Tyr Tyr Trp Arg Pro Tyr Gly Asn Ala Ile Asp Tyr 1 5 10 15 <210> 105 <211> 19 <212> PRT <213> Seqüência Artificial <220> <223> Descrição da Seqüência

Peptideo Sintético

<400> 105

Gly Ser Ile Pro Ser Tyr Trp Ser Ala Asp Trp Tyr Tyr Tyr Tyr Gly 1 5 10 15

Leu Asp Tyr

<210> 106 <211> 14 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 106

Tyr Lys Tyr Asn Tyr Tyr Tyr Phe Glu Ser Gly Met Asp Tyr 1 5 10

<210> 107 <211> 17 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 107

Glu Tyr Tyr Trp Trp Tyr Lys Glu Ala Trp Tyr Ser Ala Gly Met Asp 1 5 10 15

Tyr

<210> 108 <211> 19 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 108

Gly Ile Met Phe Ser Ser Trp Trp Trp Tyr Tyr Asp Tyr Ser Asp Ala 1 5 10 15 Leu Asp Tyr

<210> 109 <211> 21 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 109

Ser Gly Tyr Tyr Tyr Gln Gly Tyr Trp Trp Tyr Tyr Tyr Thr Gly Tyr 1 5 10 15

Tyr Gly Met Asp Tyr 20

<210> 110 <211> 21 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<220>

<221> M0D_RES <222> (1)..(1)

<223> Glu, Met, Gly, Tyr ou Ser <220>

<221> M0D_RES <222> (2)..(2)

<223> Tyr, Lys, Ser, Ile ou Gly

<220>

<221> M0D_RES

<222> (3)..(3)

<223> Tyr, Met ou Ile

<220>

<221> M0D_RES <222> (4)..(4)

<223> Arg, Tyr, Ser, Pro, Asn, Trp ou Phe

<220>

<221> M0D_RES

<222> (5)..(5)

<223> Trp, Tyr, Ile ou Ser

<220>

<221> M0D_RES <222> (6)..(6) <223> Tyr, Ser, His ou Gln <220>

<221> MOD_RES <222> (7)..(7)

<223> Thr, Tyr, Phe, Trp, Lys ou Gly <220>

<221> MOD_RES <222> (8) . . (8)

<223> Ala, Gly, Arg, Ser, Phe, Glu, Trp ou Tyr <220>

<221> MOD_RES <222> (9)..(9)

<223> lie, Phe, Pro, Ala, Glu ou Trp

<220>

<221> MOD_RES <222> (10)..(10)

<223> Tyr, Asp, Ser, Trp ou não presente <220>

<221> MOD_RES <222> (11)..(11)

<223> Gly, Trp, Tyr ou não presente <220>

<221> MOD_RES <222> (12) .. (12)

<223> Asn, Tyr, Met, Ser, Asp ou não presente <220>

<221> MOD_RES

<222> (13)..(13)

<223> Ala, Tyr ou não presente

<220>

<221> MOD_RES <222> (14) . . (14) <223> lie, Tyr, Gly,

<220>

<221> MOD_RES <222> (15)..(15) <223> Tyr, Met, Asp,

Ser, Thr ou não presente

Gly ou não presente

<220>

<221> MOD_RES <222> (16)..(16)

<223> Gly, Ala, Tyr ou não presente <220>

<221> MOD_RES

<222> (17) . . (17)

<223> Leu, Tyr ou não presente

<220> <221> MOD_RES <222> (18) . . (18)

<223> Este resíduo pode ou não estar presente <220>

<221> MOD_RES <222> (19)..(19)

<223> Este resíduo pode ou não estar presente <400> 110

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15

Xaa Gly Met Asp Tyr 20

<210> 111 <211> 30 <212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 111

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 15 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr 20 25 30

<210> 112 <211> 25 <212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 112

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser 20 25

<210> 113 <211> 25 <212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 113

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser 20 25

<210> 114 <211> 25 <212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 114

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser 20 25

<210> 115 <211> 30 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 115

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Val Ser 20 25 30

<210> 116 <211> 25 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 116

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly 1 5

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val 20

<210> 117 <211> 25 <212> PRT

<213> Homo sapiens

Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 10 15

Ser 25

<400> 117

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 15 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser 20 25

<210> 118 <211> 25 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 118

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly 1 5

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val 20

Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 10 15

Ser 25

<210> 119 <211> 30 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 119

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser 20 25 30

<210> 120 <211> 25 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 120

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser 20 25

<210> 121 <211> 25 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 121

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly 1 5

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala 20

<210> 122 <211> 25 <212> PRT

<213> Homo sapiens

Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 10 15

Ser 25

<400> 122

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser 20 25

<210> 123 <211> 30 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 123

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 15 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys 20 25 30

<210> 124 <211> 25 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 124

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly 1 5

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala 20

<210> 125 <211> 25 <212> PRT

<213> Homo sapiens

Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 10 15

Ser 25

<400> 125

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly 1 5

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala 20

<210> 126 <211> 30 <212> PRT

<213> Homo sapiens

Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 10 15

Ser 25

<400> 126

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys 20 25 30

<210> 127 <211> 25 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 127

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser 20 25

<210> 128 <211> 25 <212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 128

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser 20 25

<210> 129 <211> 25 <212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 129

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser 20 25

<210> 130 <211> 23 <212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 130

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys 20

<210> 131 <211> 23 <212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 131

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 15 10 15

Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys 20

<210> 132 <211> 23 <212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 132

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 15 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys 20

<210> 133 <211> 23 <212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 133

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys 20

<210> 134 <211> 23 <212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 134

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys 20

<210> 135 <211> 15 <212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 135

Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr 15 10 15

<210> 136 <211> 32 <212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 136

Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr 15 10 15

Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys 20 25 30

<210> 137 <211> 10 <212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 137

Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 15 10

<210> 138 <211> 25 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 138

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser 20 25

<210> 139 <211> 13 <212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 139

Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 15 10

<210> 140 <211> 30 <212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 140

Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln 15 10 15

Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 20 25 30

<210> 141 <211> 11 <212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 141

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 15 10

<210> 142 <211> 23 <212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 142

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys 20

<210> 143 <211> 15 <212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 143

Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr 15 10 15

<210> 144 <211> 32 <212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 144

Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 15 10 15

Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys 20 25 30

<210> 145 <211> 10 <212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 145

Phe Arg Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 15 10

<210> 146 <211> 25 <212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 146

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser 20 25

<210> 147 <211> 13 <212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 147

Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 15 10

<210> 148 <211> 30 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 148

Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln 15 10 15 Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 20 25 30

<210> 149 <211> 11 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 149

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 1 5 10

<210> 150 <211> 66 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Oligonucleotideo Sintético

<400> 150

tcttgtgaca aaactcacca tcaccatcac catcactagg gcggtggctc tggttccggt 60

gatttt 66

<210> 151 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 151

Gly Phe Asn Val Tyr Tyr Ser Ser Ile His 1 5 10

<210> 152 <211> 10 <212> PRT <213> Seqüência

Artificial

<220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 152

Gly Phe Asn Val Ser Tyr Ser Tyr Met His 1 5 10

<210> 153 <211> 10 <212> PRT <213> Seqüência

Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 153

Gly Phe Asn Phe Ser Tyr Tyr Ser Met His 1 5 10

<210> 154 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 154

Gly Phe Asn Leu Ser Tyr Tyr Ser Ile His 1 5 10

<210> 155 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 155

Gly Phe Asn Ile Ser Tyr Ser Ser Met His 1 5 10

<210> 156 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 156

Gly Phe Asn Val Tyr Tyr Ser Ser Ile His 1 5 10

<210> 157 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético <400> 157

Gly Phe Asn Leu Ser Tyr Ser Tyr Ile His 1 5 10

<210> 158 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 158

Gly Phe Asn Phe Tyr Tyr Tyr Tyr Ile His 1 5 10

<210> 159 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 159

Gly Phe Asn Leu Ser Tyr Ser Ser Ile His 1 5 10

<210> 160 <211> 10 <212> PRT <213> Seqüência

Artificial

<220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 160

Gly Phe Asn Val Ser Tyr Ser Ser Ile His 1 5 10

<210> 161 <211> 10 <212> PRT <213> Seqüência

Artificial

<220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 161

Gly Phe Asn Val Ser Tyr Ser Ser Ile His 15 10 <210> 162 <211> 10 <212> PRT <213> Seqüência

Artificial

<220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 162

Gly Phe Asn Val Tyr Tyr Ser Ser Ile His 1 5 10

<210> 163 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<4 00> 163

Gly Phe Asn Val Ser Tyr Tyr Tyr Ile His 15 10

<210> 164 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 164

Gly Phe Asn Leu Ser Tyr Ser Ser Ile His 1 5 10

<210> 165 <211> 10 <212> PRT <213> Seqüência

Artificial

<220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 165

Gly Phe Asn Ile Ser Tyr Ser Tyr Met His 15 10

<210> 166 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 166

Gly Phe Asn Leu Tyr Tyr Ser Tyr Met His 1 5 10

<210> 167 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 167

Gly Phe Asn Val Ser Tyr Tyr Tyr Met His 1 5 10

<210> 168 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 168

Gly Phe Asn Ile Ser Tyr Ser Tyr Met His 1 5 10

<210> 169 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 169

Gly Phe Asn Ile Ser Tyr Ser Ser Ile His 1 5 10

<210> 170 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético <400> 170

Gly Phe Asn Val Ser Tyr Ser Ser Met His 1 5 10

<210> 171 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 171

Gly Phe Asn Leu Ser Tyr Tyr Ser Ile His 1 5 10

<210> 172 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 172

Gly Phe Asn Val Ser Tyr Tyr Ser Ile His 1 5 10

<210> 173 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 173

Gly Phe Asn Ile Ser Tyr Ser Ser Ile His 1 5 10

<210> 174 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 174

Gly Phe Asn Phe Ser Tyr Tyr Ser Ile His 1 5 10 <210> 175 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 175

Gly Phe Asn Leu Ser Tyr Ser Ser Met His 1 5 10

<210> 176 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<220>

<221> M0D_RES

<222> (4)..(4)

<223> Vai, Phe, Leu ou Ile

<220>

<221> M0D_RES <222> (5) .. (5) <223> Tyr ou Ser

<220>

<221> H0D_RES <222> (7) . . (8) <223> Ser ou Tyr

<220>

<221> M0D_RES <222> (9). . (9) <223> Ile ou Met

<400> 176

Gly Phe Asn Xaa Xaa Tyr Xaa Xaa Xaa His 15 10

<210> 177 <211> 17 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 177 Ser Ile Ser Pro Tyr Tyr Ser Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys 15 10 15

Gly

<210> 178 <211> 17 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 178

Ser Ile Ser Ser Tyr Tyr Ser Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys 15 10 15

Gly

<210> 179 <211> 17 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 179

Ser Ile Tyr Pro Tyr Tyr Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 15 10 15

Gly

<210> 180 <211> 17 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial

<220> <223>

<400> 180

Ser Ile Tyr Pro Tyr Tyr Gly Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys 15 10 15

Gly

<210> 181 <211> 17 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial

<220> <223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 181

Ser Ile Tyr Ser Tyr Tyr Ser Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15

Gly

<210> 182 <211> 17 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 182

Ser Ile Tyr Pro Tyr Tyr Gly Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15

Gly

<210> 183 <211> 17 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 183

Ser Ile Ser Ser Tyr Tyr Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15

Gly

<210> 184 <211> 17 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 184

Ser Ile Ser Pro Tyr Tyr Ser Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15

Gly

<210> 185 <211> 17 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 185

Ser Ile Tyr Pro Tyr Tyr Ser Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15

Gly

<210> 186 <211> 17 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 186

Ser Ile Tyr Pro Tyr Tyr Ser Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys 15 10 15

Gly

<210> 187 <211> 17 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 187

Ser Ile Tyr Ser Tyr Tyr Ser Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys 15 10 15

Gly

<210> 188 <211> 17 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<4 00> 188

Ser Ile Tyr Pro Tyr Tyr Gly Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys 15 10 15

Gly <210> 189 <211> 17 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 189

Ser Ile Ser Ser Tyr Tyr Gly Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15

Gly

<210> 190 <211> 17 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 190

Ser Ile Tyr Ser Tyr Tyr Gly Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15

Gly

<210> 191 <211> 17 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 191

Ser Ile Ser Pro Tyr Tyr Gly Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15

Gly

<210> 192 <211> 17 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 192 Ser Ile Ser Ser Tyr Tyr Ser Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15

Gly

<210> 193 <211> 17 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 193

Ser Ile Ser Ser Tyr Tyr Ser Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15

Gly

<210> 194 <211> 17 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 194

Ser Ile Ser Ser Tyr Tyr Ser Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys 15 10 15

Gly

<210> 195 <211> 17 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 195

Ser Ile Ser Ser Ser Tyr Ser Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 15 10 15

Gly

<210> 196 <211> 17 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 196

Ser Ile Ser Pro Tyr Tyr Gly Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15

Gly

<210> 197 <211> 17 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 197

Ser Ile Tyr Ser Ser Tyr Ser Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15

Gly

<210> 198 <211> 17 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 198

Ser Ile Tyr Pro Tyr Tyr Ser Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15

Gly

<210> 199 <211> 17 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 199

Ser Ile Tyr Pro Tyr Tyr Ser Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15

Gly

<210> 200 <211> 17 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 200

Ser Ile Tyr Pro Tyr Tyr Ser Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15

Gly

<210> 201 <211> 17 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 201

Ser Ile Tyr Pro Tyr Tyr Ser Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys 15 10 15

Gly

<210> 202 <211> 17 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: peptideo Sintético

<220>

<221> M0D_RES <222> (3)..(3) <223> Ser ou Tyr

<220>

<221> M0D_RES <222> (4)..(4) <223> Pro ou Ser

<220>

<221> M0D_RES <222> (5)..(5) <223> Tyr ou Ser

<220>

<221> M0D_RES <222> (7)..(7) <223> Ser ou Gly <220>

<221> MOD_RES <222> (8)..(8) <223> Tyr ou Ser

<220>

<221> MOD_RES <222> (10)..(10) <223> Ser ou Tyr

<400> 202

Ser Ile Xaa Xaa Xaa Tyr Xaa Xaa Thr Xaa Tyr Ala Asp Ser Val Lys 15 10 15

Gly

<210> 203 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 203

Glu Gly Tyr Ser Gln Gly Gly Phe Asp Tyr 15 10

<210> 204 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 204

Ser Tyr Ser Tyr Tyr Ser Ala Ile Asp Tyr 15 10

<210> 205 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 205

Ser Tyr Ser Tyr Ser Tyr Gly Met Asp Tyr 15 10

<210> 206 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 206

Ser Tyr Ser Tyr Ser Tyr Gly Ile Asp Tyr 1 5 10

<210> 207 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 207

Ser Tyr Ser Tyr Tyr Ser Ala Met Asp Tyr 1 5 10

<210> 208 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 208

Gly Tyr Lys Tyr Trp Ser Ala Phe Asp Tyr 1 5 10

<210> 209 <211> 11 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 209

Glu Ser Phe Tyr Tyr Ser Pro Ala Phe Asp Tyr 1 5 10

<210> 210 <211> 11 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 210

Glu Tyr Tyr Ser Tyr Leu Gly Ala Ile Asp Tyr 1 5 10

<210> 211 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 211

Gly Tyr Glu Gly Gly Met Ala Met Asp Tyr 15 10

<210> 212 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 212

Ser Tyr Ser Tyr Ser Ser Gly Leu Asp Tyr 15 10

<210> 213 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 213

Gly Tyr Met Trp Tyr Gly Gly Ile Asp Tyr 15 10

<210> 214 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<220> <221> MOD_RES

<222> (5)..(5)

<223> Aminoácido variável

<400> 214

Asp Cys Tyr Tyr Xaa Ala Ala Phe Asp Tyr 1 5 10

<210> 215 <211> 9 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 215

Glu Asn Tyr Trp Trp Ala Ile Asp Tyr 1 5

<210> 216 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 216

Ser Tyr Ser Tyr Tyr Ser Ala Phe Asp Tyr 15 10

<210> 217 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 217

Asp Tyr Tyr Phe Phe Ser Ala Ile Asp Tyr 15 10

<210> 218 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético <400> 218

Ser Tyr Ser Tyr Ser Ser Ala Leu Asp Tyr 1 5 10

<210> 219 <211> 11 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 219

Glu Gly Tyr Ile Ser Gly Asp Ala Ile Asp Tyr 1 5 10

<210> 220 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 220

Ser Tyr Ser Ser Tyr Ser Ala Ile Asp Tyr 1 5 10

<210> 221 <211> 11 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 221

Gly Tyr Phe Glu Gly Trp Tyr Gly Leu Asp Tyr 1 5 10

<210> 222 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 222

Glu Tyr Ser Tyr Tyr Gly Gly Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 223 <211> 10 <212> PRT <213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 223

Glu Ser Tyr Trp Ser Tyr Ala Met Asp Tyr 1 5 10

<210> 224 <211> 10 <212> PRT <213> Seqüência Artificial

<220> <223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 224

Ser Tyr Ser Tyr Ser Tyr Gly Leu Asp Tyr 1 5 10

<210> 225 <211> 10 <212> PRT <213> Seqüência Artificial

<220> <223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 225

Tyr Tyr Ser Tyr Ser Ser Gly Leu Asp Tyr 1 5 10

<210> 226 <211> 10 <212> PRT <213> Seqüência Artificial

<220> <223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 226

Ser Tyr Ser Tyr Ser Tyr Gly Leu Asp Tyr 1 5 10

<210> 227 <211> 10 <212> PRT <213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 227

Ser Tyr Ser Tyr Ser Tyr Gly Met Asp Tyr 1 5 10

<210> 228 <211> 11 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<220>

<221> M0D_RES <222> (1)..(1)

<223> Glu, Ser, Gly, Asp ou Tyr <220>

<221> MOD_RES <222> (2) . . (2)

<223> Gly, Tyr, Ser, Cys ou Asn <220>

<221> MOD_RES <222> (3)..(3)

<223> Tyr, Ser, Lys, Phe, Glu ou Met <220>

<221> MOD_RES <222> (4) . . (4)

<223> Ser, Tyr, Gly, Trp, Phe, Ile ou Glu <220>

<221> MOD_RES

<222> (5)..(5)

<223> Aminoácido variável

<220>

<221> MOD_RES <222> (6)..(6)

<223> Gly, Ser, Tyr, Leu, Met, Gly, Ala ou Trp <220>

<221> MOD_RES <222> (7)..(7)

<223> Gly, Ala, Pro, He, Asp ou Tyr <220>

<221> MOD_RES <222> (8)..(8)

<223> Phe, lie, Met, Ala, Leu, Gly ou não presente <220>

<221> MOD_RES <222> (9)..(9)

<223> Phe, lie, Leu ou não presente

<400> 228

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Asp Tyr 15 10

<210> 229 <211> 10 <212> PRT <213> Seqüência

Artificial

<220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 229

Gly Phe Asn Ile Ser Ser Ser Tyr Ile His 15 10

<210> 230 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 230

Gly Phe Asn Val Ser Ser Tyr Ser Ile His 15 10

<210> 231 <211> 10 <212> PRT <213> Seqüência

Artificial

<220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 231

Gly Phe Asn Phe Ser Tyr Ser Ser Ile His 15 10

<210> 232 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético <400> 232

Gly Phe Asn Phe Tyr Ser Ser Ser Ile His 1 5 10

<210> 233 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 233

Gly Phe Asn Phe Tyr Tyr Ser Ser Ile His 1 5 10

<210> 234 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 234

Gly Phe Asn Val Tyr Tyr Ser Ser Ile His 1 5 10

<210> 235 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 235

Gly Phe Asn Phe Tyr Tyr Ser Tyr Ile His 1 5 10

<210> 236 <211> 10 <212> PRT <213> Seqüê

Artificial

<220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 236

Gly Phe Asn Val Ser Ser Ser Tyr Ile His 1 5 10

<210> 237 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 237

Gly Phe Asn Phe Tyr Tyr Ser Ser Ile His 1 5 10

<210> 238 <211> 10 <212> PRT <213> Seqüência

Artificial

<220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 238

Gly Phe Asn Phe Tyr Ser Ser Tyr Met His 1 5 10

<210> 239 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 239

Gly Phe Asn Val Ser Ser Tyr Ser Ile His 1 5 10

<210> 240 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<220>

<221> M0D_RES

<222> (4) . . (4)

<223> He, Val ou Phe

<220>

<221> M0D_RES <222> (5) . . (8) <223> Ser ou Tyr <220>

<221> MOD_RES <222> (9)..(9) <223> Ile ou Met

<400> 240

Gly Phe Asn Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa His 1 5 10

<210> 241 <211> 17 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 241

Tyr Ile Ser Pro Tyr Tyr Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15

Gly

<210> 242 <211> 17 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 242

Ser Ile Tyr Pro Ser Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 15 10 15

Gly

<210> 243 <211> 17 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 243

Ser Ile Tyr Ser Ser Tyr Ser Ser Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15

Gly

<210> 244 <211> 17 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 244

Ser Ile Ser Ser Tyr Tyr Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15

Gly

<210> 245 <211> 17 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 245

Ser Ile Tyr Ser Ser Tyr Gly Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15

Gly

<210> 246 <211> 17 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 246

Ser Ile Ser Pro Ser Tyr Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15

Gly

<210> 247 <211> 17 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 247

Tyr Ile Ser Pro Ser Tyr Ser Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 248 <211> 17 <212> PRT <213> Seqüência Artificial <220> <223> Descrição da Seqüência

Peptideo Sintético

<400> 248

Ser Ile Ser Ser Ser Tyr Ser Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15

Gly

<210> <211> <212> <213>

<220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 249

Ser Ile Tyr Ser Ser Tyr Ser Ser Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys 15 10 15

Gly

<210> 250 <211> 17 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 250

Tyr Ile Ser Ser Tyr Ser Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15

Gly

<210> 251 <211> 17 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

249

17

PRT

Seqüência Artificial <400> 251

Ser Ile Tyr Pro Ser Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15

Gly

<210> 252 <211> 17 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<220>

<221> M0D_RES <222> (1)..(1) <223> Tyr ou Ser

<220>

<221> MOD_RES <222> (3)..(3) <223> Ser ou Tyr

<220>

<221> MOD_RES <222> (4)..(4) <223> Pro ou Ser

<220>

<221> MOD_RES <222> (5)..(6) <223> Tyr ou Ser

<220>

<221> MOD_RES <222> (7)..(7) <223> Gly ou Ser

<220>

<221> MOD_RES <222> (8)..(8) <223> Ser ou Tyr

<220>

<221> MOD_RES <222> (10)..(10) <223> Ser ou Tyr

<400> 252

Xaa Ile Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Thr Xaa Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15

Gly

<210> 253 <211> 11 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 253

Glu Tyr Tyr Arg Trp Tyr Thr Ala Ile Asp Tyr 15 10

<210> 254 <211> 21 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 254

Ser Gly Tyr Tyr Tyr Gln Gly Tyr Trp Trp Tyr Tyr Tyr Thr Gly Tyr 15 10 15

Tyr Gly Met Asp Tyr 20

<210> 255 <211> 19 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 255

Gly Ile Met Phe Ser Ser Trp Trp Trp Tyr Tyr Asp Tyr Ser Asp Ala 15 10 15

Leu Asp Tyr

<210> 256 <211> 19 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 256

Gly Ser Ile Pro Ser Tyr Trp Ser Ala Asp Trp Tyr Tyr Tyr Tyr Gly 15 10 15 70

Leu Asp Tyr

<210> 257 <211> 17 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 257

Glu Tyr Tyr Trp Trp Tyr Lys Glu Ala Trp Tyr Ser Ala Gly Met Asp 1 5 10 15

Tyr

<210> 258 <211> 21

<212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 258

Trp Gln Gly Tyr Gly Phe Lys Tyr Tyr Trp Ser Tyr Tyr Val Ser Tyr 1 5 10 15

Gly Gly Leu Asp Tyr 20

<210> 259 <211> 14 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 259

Ser Tyr Ser Tyr Tyr Tyr Tyr Ser Ser Tyr Gly Phe Asp Tyr 1 5 10

<210> 260 <211> 13 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 260 Glu Ser Tyr Ala Gly Val Pro Pro Tyr Gly Phe Asp Tyr 1 5 10

<210> 261 <211> 19 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 261

Gly Ile Met Phe Ser Ser Trp Trp Trp Tyr Tyr Asp Tyr Ser Asp Ala 15 10 15

Leu Asp Tyr

<210> 262 <211> 19 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 262

Gly Ile Met Phe Ser Ser Trp Trp Trp Tyr Tyr Asp Tyr Ser Asp Ala 15 10 15

Leu Asp Tyr

<210> 263 <211> 17 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 263

Glu Tyr Tyr Trp Trp Tyr Lys Glu Ala Trp Tyr Ser Ala Gly Met Asp 15 10 15

Tyr

<210> 264 <211> 21 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético <220>

<221> MOD_RES

<222> (1)..(1)

<223> Glu, Ser, Gly ou Trp

<220>

<221> MOD_RES <222> (2)..(2)

<223> Tyr, Gly, He, Ser ou Gln <220>

<221> MOD_RES <222> (3)..(3)

<223> Tyr, Met, He, Gly ou Ser <220>

<221> MOD_RES <222> (4) . . (4)

<223> Arg, Tyr, Phe, Pro ou Trp <220>

<221> MOD_RES

<222> (5)..(5)

<223> Trp, Tyr, Ser ou Gly

<220>

<221> MOD_RES <222> (6)..(6)

<223> Tyr, Gln, Ser, Phe ou Val <220>

<221> MOD_RES <222> (7) . . (7)

<223> Thr, Gly, Trp, Lys, Tyr ou Pro <220>

<221> MOD_RES <222> (8)..(8)

<223> Ala, Tyr, Trp, Ser, Glu ou Pro <220>

<221> MOD_RES <222> (9)..(9)

<223> lie, Trp, Ala, Tyr ou Ser <220>

<221> MOD_RES

<222> (10) .. (10)

<223> Trp, Tyr, Asp ou Gly

<220>

<221> MOD_RES

<222> (11) .. (11)

<223> Tyr, Trp, Ser, Gly ou Phe

<220> <221> MOD_RES <222> (12)..(12)

<223> Tyr, Asp, Ser, Phe ou não presente <220>

<221> MOD_RES

<222> (13)..(13)

<223> Tyr, Ala ou não presente

<220>

<221> MOD_RES <222> (14) .. (14) <223> Thr, Ser, Tyr,

<220>

<221> MOD_RES <222> (15)..(15) <223> Gly, Asp, Tyr,

Gly, Val ou não presente

Met, Ser ou não presente

<220>

<221> MOD_RES <222> (16)..(16)

<223> Tyr, Ala, Gly ou não presente <220>

<221> MOD_RES <222> (17)..(17)

<223> Tyr, Leu, Gly ou não presente <220>

<221> MOD_RES <222> (18)..(18)

<223> Este resíduo pode ou não estar presente <220>

<221> MOD_RES

<222> (19)..(19)

<223> Met, Leu ou não presente

<400> 264

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 15 10 15

Xaa Gly Xaa Asp Tyr 20

<210> 265 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 265 Gly Phe Asn Val Tyr Tyr Ser Ser Ile His 1 5 10

<210> 266 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 266

Gly Phe Asn Val Ser Tyr Ser Tyr Met His 15 10

<210> 267 <211> 10 <212> PRT <213> Seqüência

Artificial

<220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 267

Gly Phe Asn Phe Ser Tyr Tyr Ser Met His 15 10

<210> 268 <211> 10 <212> PRT <213> Seqüência

Artificial

<220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 268

Gly Phe Asn Leu Ser Tyr Tyr Ser Ile His 15 10

<210> 269 <211> 10 <212> PRT <213> Seqüê

Artificial

<220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 269

Gly Phe Asn Ile Ser Tyr Ser Ser Met His 15 10

<210> 270 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 270

Gly Phe Asn Val Tyr Tyr Ser Ser Ile His 15 10

<210> 271 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 271

Gly Phe Asn Leu Ser Tyr Ser Tyr Ile His 15 10

<210> 272 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 272

Gly Phe Asn Leu Ser Tyr Ser Ser Met His 15 10

<210> 273 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 273

Gly Phe Asn Val Ser Tyr Ser Ser Ile His 15 10

<210> 274 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial

<220> <223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 274

Gly Phe Asn Val Ser Tyr Ser Ser Ile His 1 5 10

<210> 275 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 275

Gly Phe Asn Val Ser Tyr Tyr Tyr Ile His 1 5 10

<210> 276 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 276

Gly Phe Asn Leu Tyr Tyr Ser Tyr Met His 1 5 10

<210> 277 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 277

Gly Phe Asn Val Ser Tyr Tyr Ser Ile His 1 5 10

<210> 278 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 278 Gly Phe Asn Ile Ser Tyr Ser Ser Ile His 15 10

<210> 279 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 279

Gly Phe Asn Phe Ser Tyr Tyr Ser Ile His 15 10

<210> 280 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<220>

<221> M0D_RES

<222> (4)..(4)

<223> Vai, Phe, Leu ou Ile

<220>

<221> M0D_RES <222> (5) . . (5) <223> Tyr ou Ser

<220>

<221> M0D_RES <222> (7) . . (8) <223> Ser ou Tyr

<220>

<221> M0D_RES <222> (9)..(9) <223> Ile ou Met

<400> 280

Gly Phe Asn Xaa Xaa Tyr Xaa Xaa Xaa His 15 10

<210> 281 <211> 17 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial

<220> <223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 281

Ser Ile Ser Pro Tyr Tyr Ser Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys 15 10 15

Gly

<210> 282 <211> 17 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 282

Ser Ile Ser Ser Tyr Tyr Ser Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys 15 10 15

Gly

<210> 283 <211> 17 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 283

Ser Ile Tyr Pro Tyr Tyr Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 15 10 15

Gly

<210> 284 <211> 17 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 284

Ser Ile Tyr Pro Tyr Tyr Gly Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys 15 10 15

Gly

<210> 285 <211> 17 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 285

Ser Ile Tyr Ser Tyr Tyr Ser Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys 15 10 15

Gly

<210> 286 <211> 17 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 286

Ser Ile Tyr Pro Tyr Tyr Gly Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys 15 10 15

Gly

<210> 287 <211> 17 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 287

Ser Ile Ser Ser Tyr Tyr Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys 15 10 15

Gly

<210> 288 <211> 17 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 288

Ser Ile Tyr Pro Tyr Tyr Ser Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys 15 10 15 Gly <210> 289 <211> 17 <212> PRT <213> Seqüência Artificial <220> <223> Descrição da Seqüência

Peptideo Sintético <400> 289

Ser Ile Tyr Pro Tyr Tyr Ser Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys 15 10 15

Gly

<210> 290 <211> 17 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 290

Ser Ile Tyr Ser Tyr Tyr Ser Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys 15 10 15

Gly

<210> 291 <211> 17 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 291

Ser Ile Ser Ser Tyr Tyr Gly Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys 15 10 15

Gly

<210> 292 <211> 17 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético <400> 292

Ser Ile Ser Ser Tyr Tyr Ser Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys 15 10 15

Gly

<210> 293 <211> 17 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 293

Ser Ile Tyr Pro Tyr Tyr Ser Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys 15 10 15

Gly

<210> 294 <211> 17 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 294

Ser Ile Tyr Pro Tyr Tyr Ser Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys 15 10 15

Gly

<210> 295 <211> 17 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 295

Ser Ile Tyr Pro Tyr Tyr Ser Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 15 10 15

Gly

<210> 296 <211> 17 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<220>

<221> MOD_RES <222> (3)..(3) <223> Ser ou Tyr

<220>

<221> MOD_RES <222> (4)..(4) <223> Pro ou Ser

<220>

<221> MOD_RES <222> (7)..(7) <223> Ser ou Gly

<220>

<221> MOD_RES <222> (8) . . (8) <223> Tyr ou Ser

<220>

<221> MOD_RES <222> (10)..(10) <223> Ser ou Tyr

<400> 296

Ser Ile Xaa Xaa Tyr Tyr Xaa Xaa Thr Xaa Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15

Gly

<210> 297 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 297

Glu Gly Tyr Ser Gln Gly Gly Phe Asp Tyr 1 5 10

<210> 298 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético <400> 298

Ser Tyr Ser Tyr Tyr Ser Ala Ile Asp Tyr 1 5 10

<210> 299 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 299

Ser Tyr Ser Tyr Ser Tyr Gly Met Asp Tyr 1 5 10

<210> 300 <211> 10 <212> PRT <213> Seqüência

Artificial

<220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 300

Ser Tyr Ser Tyr Ser Tyr Gly Ile Asp Tyr 1 5 10

<210> 301 <211> 10 <212> PRT <213> Seqüência

Artificial

<220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 301

Ser Tyr Ser Tyr Tyr Ser Ala Met Asp Tyr 1 5 10

<210> 302 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 302

Gly Tyr Lys Tyr Trp Ser Ala Phe Asp Tyr 1 5 10

<210> 303 <211> 11 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 303

Glu Ser Phe Tyr Tyr Ser Pro Ala Phe Asp Tyr 1 5 10

<210> 304 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 304

Gly Tyr Glu Gly Gly Met Ala Met Asp Tyr 15 10

<210> 305 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 305

Ser Tyr Ser Tyr Ser Ser Gly Leu Asp Tyr 1 5 10

<210> 306 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 306

Gly Tyr Met Trp Tyr Gly Gly Ile Asp Tyr 1 5 10

<210> 307 <211> 9 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial

<220> <223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 307

Glu Asn Tyr Trp Trp Ala Ile Asp Tyr 1 5

<210> 308 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 308

Ser Tyr Ser Tyr Ser Ser Ala Leu Asp Tyr 15 10

<210> 309 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 309

Ser Tyr Ser Tyr Ser Tyr Gly Leu Asp Tyr 15 10

<210> 310 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 310

Tyr Tyr Ser Tyr Ser Ser Gly Leu Asp Tyr 15 10

<210> 311 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 311 Ser Tyr Ser Tyr Ser Tyr Gly Leu Asp Tyr 1 5 10

<210> 312 <211> 11 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<220>

<221> M0D_RES <222> (1)..(1) <223> Glu, Ser, Gly ou Tyr

<220>

<221> M0D_RES <222> (2)..(2) <223> Gly, Tyr, Ser ou Asn

<220>

<221> M0D_RES <222> (3)..(3) <223> Tyr, Ser, Lys, Phe ou Glu

<220>

<221> MOD_RES <222> (4)..(4) <223> Ser, Tyr, Gly ou Trp

<220>

<221> MOD_RES <222> (5)..(5) <223> Gln, Tyr, Ser ou Gly

<220>

<221> MOD_RES <222> (6)..(6) <223> Gly, Ser, Tyr, Met ou Ala

<220>

<221> MOD_RES <222> (7) .. (7) <223> Gly, Ala, Pro ou Ile

<220>

<221> MOD_RES <222> (8) .. (8)

<223> Phe, lie, Met, Ala, Leu ou não presente <220>

<221> MOD_RES <222> (9)..(9)

<223> Este resíduo pode ou não estar presente <400> 312

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Phe Asp Tyr 1 5 10

<210> 313 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 313

Gln Gln Ser Ser Tyr Ser Ser Leu Phe Thr 1 5 10

<210> 314 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 314

Gln Gln Ser Ser Tyr Ser Ser Leu Phe Thr 1 5 10

<210> 315 <211> 11 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 315

Gln Gln Tyr Ser Ser Tyr Ser Ser Pro Ile Thr 1 5 10

<210> 316 <211> 11 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 316

Gln Gln Tyr Ser Ser Tyr Tyr Ser Pro Val Thr 1 5 10 <210> 317 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 317

Gln Gln Ser Ser Tyr Ser Ser Leu Ile Thr 1 5 10

<210> 318 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 318

Gln Gln Ser Ser Tyr Ser Ser Leu Val Thr 1 5 10

<210> 319 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 319

Gln Gln Ser Tyr Tyr Tyr Ser Leu Phe Thr 1 5 10

<210> 320 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 320

Gln Gln Ser Ser Tyr Ser Ser Leu Val Thr 1 5 10

<210> 321 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 321

Gln Gln Ser Ser Tyr Ser Ser Leu Phe Thr 15 10

<210> 322 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 322

Gln Gln Tyr Ser Tyr Ser Ser Leu Phe Thr 15 10

<210> 323 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 323

Gln Gln Ser Tyr Tyr Tyr Tyr Pro Ile Thr 15 10

<210> 324 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 324

Gln Gln Ser Ser Tyr Ser Ser Leu Val Thr 15 10

<210> 325 <211> 11 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético <400> 325

Gln Gln Tyr Ser Ser Ser Tyr Tyr Pro Phe Thr 15 10

<210> 326 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 326

Gln Gln Ser Ser Tyr Ser Ser Leu Leu Thr 15 10

<210> 327 <211> 11 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 327

Gln Gln Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Pro Ile Thr 15 10

<210> 328 <211> 11 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<220>

<221> M0D_RES <222> (3)..(7) <223> Ser ou Tyr

<220>

<221> M0D_RES

<222> (8)..(8)

<223> Leu, Ser, Pro ou Tyr

<220>

<221> M0D_RES <222> (9)..(9)

<223> Este resíduo pode ou não estar presente <220>

<221> MOD RES <222> (10)..(10)

<223> Phe, He, Val ou Leu

<400> 328

Gln Gln Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Pro Xaa Thr 1 5 10

<210> 329 <211> 10 <212> PRT <213> Seqüência

Artificial

<220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 329

Gly Phe Asn Val Ser Ser Tyr Ser Ile His 1 5 10

<210> 330 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 330

Gly Phe Asn Ile Ser Ser Ser Tyr Ile His 1 5 10

<210> 331 <211> 10 <212> PRT <213> Seqüência

Artificial

<220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 331

Gly Phe Asn Phe Ser Tyr Ser Ser Ile His 1 5 10

<210> 332 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial Peptideo Sintético

<400> 332 Gly Phe Asn Val Tyr Tyr Ser Ser Ile His 1 5 10

<210> 333 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 333

Gly Phe Asn Phe Tyr Tyr Ser Ser Ile His 1 5 10

<210> 334 <211> 10 <212> PRT <213> Seqüência

Artificial

<220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 334

Gly Phe Asn Val Ser Ser Ser Tyr Ile His 1 5 10

<210> 335 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 335

Gly Phe Asn Phe Tyr Ser Ser Tyr Met His 1 5 10

<210> 336 <211> 10 <212> PRT <213> Seqüência

Artificial

<220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 336

Gly Phe Asn Phe Tyr Ser Ser Ser Ile His 1 5 10

<210> 337 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<220>

<221> M0D_RES

<222> (4)..(4)

<223> Vai, Ile ou Phe

<220>

<221> M0D_RES <222> (5)..(8) <223> Ser ou Tyr

<220>

<221> MOD_RES <222> (9)..(9) <223> Ile ou Met

<400> 337

Gly Phe Asn Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa His 15 10

<210> 338 <211> 17 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 338

Ser Ile Tyr Pro Ser Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 15 10 15

Gly

<210> 339 <211> 17 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 339

Tyr Ile Ser Pro Tyr Tyr Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys 15 10 15

Gly <210> 340 <211> 17 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 340

Ser Ile Tyr Ser Ser Tyr Ser Ser Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15

Gly

<210> 341 <211> 17 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 341

Ser Ile Ser Pro Ser Tyr Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15

Gly

<210> 342 <211> 17 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 342

Ser Ile Tyr Ser Ser Tyr Gly Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15

Gly

<210> 343 <211> 17 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 343 Ser Ile Ser Ser Ser Tyr Ser Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15

Gly

<210> 344 <211> 17 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 344

Tyr Ile Ser Ser Tyr Ser Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15

Gly

<210> 345 <211> 17 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 345

Ser Ile Ser Ser Tyr Tyr Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15

Gly

<210> 346 <211> 17 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<220>

<221> M0D_RES <222> (1) . . (1) <223> Ser ou Tyr

<220>

<221> M0D_RES <222> (3)..(3) <223> Tyr ou Ser

<220>

<221> MOD RES <222> (4)..(4) <223> Pro ou Ser

<220>

<221> MOD_RES <222> (5)..(6) <223> Ser ou Tyr

<220>

<221> MOD_RES <222> (7)..(7) <223> Gly ou Ser

<220>

<221> MOD_RES <222> (8) . . (8) <223> Ser ou Tyr

<220>

<221> MOD_RES <222> (10)..(10) <223> Tyr ou Ser

<400> 346

Xaa Ile Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Thr Xaa Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15

Gly

<210> 347 <211> 21 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 347

Ser Gly Tyr Tyr Tyr Gln Gly Tyr Trp Trp Tyr Tyr Tyr Thr Gly Tyr 1 5 10 15

Tyr Gly Met Asp Tyr 20

<210> 348 <211> 11 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 348 Glu Tyr Tyr Arg Trp Tyr Thr Ala Ile Asp Tyr 1 5 10

<210> 349 <211> 19 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 349

Gly Ile Met Phe Ser Ser Trp Trp Trp Tyr Tyr Asp Tyr Ser Asp Ala 1 5 10 15

Leu Asp Tyr

<210> 350 <211> 21 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 350

Trp Gln Gly Tyr Gly Phe Lys Tyr Tyr Trp Ser Tyr Tyr Val Ser Tyr 1 5 10 15

Gly Gly Leu Asp Tyr 20

<210> 351 <211> 17 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 351

Glu Tyr Tyr Trp Trp Tyr Lys Glu Ala Trp Tyr Ser Ala Gly Met Asp 1 5 10 15

Tyr

<210> 352 <211> 13 <212> PRT <213> Seqüência

Artificial

<220> <223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 352

Glu Ser Tyr Ala Gly Val Pro Pro Tyr Gly Phe Asp Tyr 15 10

<210> 353 <211> 19 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 353

Gly Ile Met Phe Ser Ser Trp Trp Trp Tyr Tyr Asp Tyr Ser Asp Ala 15 10 15

Leu Asp Tyr

<210> 354 <211> 19 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 354

Gly Ser Ile Pro Ser Tyr Trp Ser Ala Asp Trp Tyr Tyr Tyr Tyr Gly 15 10 15

Leu Asp Tyr

<210> 355 <211> 21 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<220>

<221> M0D_RES <222> (1) .. (1) <223> Ser, Glu, Gly ou Trp

<220>

<221> M0D_RES <222> (2) . . (2)

<223> Gly, Tyr, He, Gln ou Ser <220> <221> MOD_RES <222> (3)..(3) <223> Tyr, Met, Gly ou Ile

<220> <221> MOD_RES <222> (4)..(4) <223> Tyr, Arg, Phe, Trp, Ala ou Pro

<220> <221> MOD_RES <222> (5)..(5) <223> Tyr, Trp, Ser ou Gly

<220> <221> MOD_RES <222> (6)..(6) <223> Gln, Tyr, Ser, Phe ou Val

<220> <221> MOD_RES <222> (7)..(7) <223> Gly, Thr, Trp, Lys ou Pro

<220> <221> MOD_RES <222> (8)..(8) <223> Tyr, Ala, Trp, Glu, Pro ou Ser

<220> <221> MOD_RES <222> (9)..(9) <223> Trp, He, Tyr ou Ala

<220> <221> MOD_RES <222> (10)..(10) <223> Trp, Tyr, Gly, Asp ou não presente

<220> <221> MOD_RES <222> (11)..(11) <223> Tyr, Ser, Phe, Trp ou não presente

<220> <221> MOD_RES <222> (12)..(12) <223> Tyr, Asp, Ser ou não presente

<220> <221> MOD_RES <222> (13)..(13) <223> Tyr, Ala ou não presente

<220> <221> MOD_RES <222> (14) . . (14)

<223> Thr, Ser, Vai, Gly, Tyr ou não presente <220>

<221> MOD_RES <222> (15)..(15)

<223> Gly, Asp, Ser, Met, Tyr ou não presente

<220>

<221> MOD_RES <222> (16)..(16)

<223> Tyr, Ala, Gly ou não presente <220>

<221> MOD_RES <222> (17) . . (17)

<223> Tyr, Leu, Gly ou não presente <220>

<221> MOD_RES <222> (18) . . (18)

<223> Este resíduo pode ou não estar presente <220>

<221> MOD_RES

<222> (19) . . (19)

<223> Met, Leu ou naõ presente

<400> 355

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 15 10 15

Xaa Gly Xaa Asp Tyr 20

<210> 356 <211> 9 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptídeo Sintético

<400> 356

Gln Gln Tyr Ser Tyr Tyr Pro Phe Arg 1 5

<210> 357 <211> 11 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptídeo Sintético <400> 357

Gln Gln Tyr Ser Ser Tyr Ser Ser Leu Phe Thr 1 5 10

<210> 358 <211> 9 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 358

Gln Gln Tyr Ser Ser Ser Leu Val Thr 1 5

<210> 359 <211> 11 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 359

Gln Gln Tyr Ser Ser Ser Ser Pro Phe Thr Phe 15 10

<210> 360 <211> 9 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 360

Gln Gln Ser Ser Tyr Ser Pro Ile Thr 1 5

<210> 361 <211> 11 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 361

Gln Gln Tyr Ser Tyr Ser Ser Tyr Leu Ile Thr 1 5 10 <210> 362 <211> 9 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 362

Gln Gln Ser Tyr Tyr Ser Pro Phe Thr 1 5

<210> 363 <211> 9 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 363

Gln Gln Tyr Tyr Ser Ser Leu Val Thr 1 5

<210> 364 <211> 11 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<220>

<221> MOD_RES <222> (3)..(6) <223> Tyr ou Ser

<220>

<221> MOD_RES

<222> (7)..(7)

<223> Pro, Ser ou Leu

<220>

<221> MOD_RES <222> (8)..(8)

<223> Ser, Pro, Tyr ou não presente <220>

<221> MOD_RES <222> (9)..(9)

<223> Leu, Phe ou não presente

<220> <221> MOD_RES

<222> (10)..(10)

<223> Phe, Vai, Thr ou Ile

<220>

<221> MOD_RES <222> (11) .. (11) <223> Arg, Thr ou Phe

<400> 364

Gln Gln Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10

<210> 365 <211> 42 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Oligonucleotideo Sintético

<400> 365

cgtctattat tgtgctcgct aataagacta ctggggtcaa

<210> 366 <211> 42 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Oligonucleotideo Sintético

<400> 366

cgtctattat tgtgctcgct aataagacta ctggggtcaa

<210> 367 <211> 60 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Oligonucleotideo Sintético

<220>

<221> base modificada <222> (20) .. (22) <223> a, c, g ou t

<220>

<221> base modificada <222> (26)..(30) <223> a, c, g ou t <220>

<221> base modificada <222> (32)..(33) <223> a, c, g ou t

<220>

<221> base modificada <222> (35)..(37) <223> a, c, g ou t

<220>

<223> Ver relatório descritivo como depositado para descrição detalhada de substituições e realizações preferidas

<400> 367

cgtctattat tgtgctcgcn nntacnnnnn snnsnnngst wtsgactact ggggtcaagg 60

<210> 368 <211> 60 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Oligonucleotideo Sintético

<220>

<221> base modificada <222> (20)..(24) <223> a, c, g ou t

<220>

<221> base modificada <222> (26)..(28) <223> a, c, g ou t

<220>

<221> base modificada <222> (32)..(33) <223> a, c, g ou t

<220>

<221> base modificada <222> (35)..(37) <223> a, c, g ou t

<220>

<223> Ver relatório descritivo como depositado para descrição detalhada de substituições e realizações preferidas

<400> 368

cgtctattat tgtgctcgcn nnnnsnnnta cnnsnnngst wtsgactact ggggtcaagg 60

<210> 369 <211> 60 <212> DNA <213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Oligonucleotideo Sintético

<220>

<221> base modificada <222> (20)..(24) <223> a, c, g ou t

<220>

<221> base modificada <222> (26)..(30) <223> a, c, g ou t

<220>

<221> base modificada <222> (35) .. (37) <223> a, c, g ou t

<220>

<223> Ver relatório descritivo como depositado para descrição detalhada de substituições e realizações preferidas

<400> 369

cgtctattat tgtgctcgcn nnnnsnnnnn stacnnngst wtsgactact ggggtcaagg

<210> 370 <211> 60 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Oligonucleotideo Sintético

<220>

<221> base modificada <222> (20)..(24) <223> a, c, g ou t

<220>

<221> base modificada <222> (26)..(30) <223> a, c, g ou t

<220>

<221> base modificada <222> (32)..(33) <223> a, c, g ou t

<220>

<221> base modificada <222> (35)..(37) <223> a, c, g ou t <220>

<223> Ver relatório descritivo como depositado para descrição detalhada de substituições e realizações preferidas

<400> 370

cgtctattat tgtgctcgcn nnnnsnnnnn snnsnnngst wtsgactact ggggtcaagg 60

<210> 371 <211> 40 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Oligonucleotideo Sintético

<400> 371

gcagcttctg gcttcaacta ataacactgg gtgcgtcagg 40

<210> 372 <211> 52 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Oligonucleotideo Sintético

<220>

<221> base modificada <222> (19)..(19) <223> a, c, g ou t

<220>

<221> base modificada <222> (22)..(23) <223> a, c, g ou t

<220>

<221> base modificada <222> (31) .. (32) <223> a, c, g ou t

<400> 372

gcagcttctg gcttcaacnt cnnstactct nnsatscact gggtgcgtca gg 52

<210> 373 <211> 43 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Oligonucleotideo Sintético

<400> 373 ggcctggaat gggttgcata ataatatgcc gatagcgtca agg 43

<210> 374 <211> 67 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Oligonucleotideo Sintético

<220>

<221> base modificada <222> (25)..(26) <223> a, c, g ou t

<400> 374

ggcctggaat gggttgcatc tatcnnsyct tactactctt acacctctta tgccgatagc 60 gtcaagg 67

<210> 375 <211> 60 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Oligonucleotideo Sintético

<220>

<221> base modificada <222> (32)..(33) <223> a, c, g ou t

<220>

<221> base modificada <222> (35) .. (36) <223> a, c, g ou t

<400> 375

cgtctattat tgtgctcgct cttactctta cnnsnnsgst wtsgactact ggggtcaagg 60

<210> 376 <211> 46 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Oligonucleotideo Sintético

<400> 376

cgcaacttat tactgtcagc aataataaac gttcggacag ggtacc 46

<210> 377 <211> 76 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 377 Met Gln Ile 1

Val Glu Pro

Lys Glu Gly 35

Gln Leu Glu 50

Ser Thr Leu 65

<210> 378 <211> 61 <212> DNA <213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Oligonucleotideo Sintético

<220>

<221> base modificada <222> (23)..(24) <223> a, c, g ou t

<400> 378

cgcaacttat tactgtcagc aannstctta ctcttctctg dttacgttcg gacagggtac c

Phe Val Lys Thr Leu Thr 5

Ser Asp Thr Ile Glu Asn 20 25

Ile Pro Pro Asp Gln Gln 40

Asp Gly Arg Thr Leu Ser 55

His Leu Val Leu Arg Leu 70

Gly Lys Thr Ile Thr Leu Glu 10 15

Val Lys Ala Lys Ile Gln Asp 30

Arg Leu Ile Phe Ala Gly Lys 45

Asp Tyr Asn Ile Gln Lys Glu 60

Arg Gly Gly 75

<210> 379 <211> 63 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Oligonucleotideo Sintético

<220>

<221> base modificada <222> (20)..(22) <223> a, c, g ou t

<220>

<221> base modificada <222> (29)..(33) <223> a, c, g ou t <220>

<221> base modificada <222> (35)..(36) <223> a, c, g ou t

<220>

<221> base modificada <222> (38)..(40) <223> a, c, g ou t

<220>

<223> Ver relatório descritivo como depositado para descrição detalhada de substituições e realizações preferidas

<400> 379

cgtctattat tgtgctcgcn nntactacnn nnnsnnsnnn gstwtsgact actggggtca 60

agg 63

<210> 380 <211> 63 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Oligonucleotideo Sintético

<220>

<221> base modificada <222> (20)..(24) <223> a, c, g ou t

<220>

<221> base modificada <222> (26)..(27) <223> a, c, g ou t

<220>

<221> base modificada <222> (29)..(31) <223> a, c, g ou t

<220>

<221> base modificada <222> (38)..(40) <223> a, c, g ou t

<220>

<223> Ver relatório descritivo como depositado para descrição detalhada de substituições e realizações preferidas

<400> 380

cgtctattat tgtgctcgcn nnnnsnnsnn ntggtacnnn gstwtsgact actggggtca 60 agg 63

<210> 381 <211> 63 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Oligonucleotideo Sintético

<220>

<221> base modificada <222> (20) .. (22) <223> a, c, g ou t

<220>

<221> base modificada <222> (29)..(33) <223> a, c, g ou t

<220>

<221> base modificada <222> (38)..(40) <223> a, c, g ou t

<220>

<223> Ver relatório descritivo como depositado para descrição detalhada de substituições e realizações preferidas

<400> 381

cgtctattat tgtgctcgcn nntacbbsnn nnnstacnnn gstwtsgact actggggtca 60

agg 63

<210> 382 <211> 63 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Oligonucleotideo Sintético

<220>

<221> base modificada <222> (20) .. (24) <223> a, c, g ou t

<220>

<221> base modificada <222> (29)..(31) <223> a, c, g ou t

<220>

<221> base modificada <222> (35)..(36) <223> a, c, g ou t <220>

<221> base modificada <222> (38)..(40) <223> a, c, g ou t

<220>

<223> Ver relatório descritivo como depositado para descrição detalhada de substituições e realizações preferidas

<400> 382

cgtctattat tgtgctcgcn nnnnstacnn ntggnnsnnn gstwtsgact actggggtca 60

agg 63

<210> 383 <211> 63 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Oligonucleotideo Sintético

<220>

<221> base modificada <222> (20)..(22) <223> a, c, g ou t

<220>

<221> base modificada <222> (26)..(27) <223> a, c, g ou t

<220>

<221> base modificada <222> (29)..(31) <223> a, c, g ou t

<220>

<221> base modificada <222> (35)..(36) <223> a, c, g ou t

<220>

<221> base modificada <222> (38)..(40) <223> a, c, g ou t

<220>

<223> Ver relatório descritivo como depositado para descrição detalhada de substituições e realizações preferidas

<400> 383

cgtctattat tgtgctcgcn nntacnnsnn ntggnnsnnn gstwtsgact actggggtca 60 agg 63

<210> 384 <211> 63 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Oligonucleotideo Sintético

<220>

<221> base modificada <222> (20)..(24) <223> a, c, g ou t

<220>

<221> base modificada <222> (29)..(33) <223> a, c, g ou t

<220>

<221> base modificada <222> (38)..(40) <223> a, c, g ou t

<220>

<223> Ver relatório descritivo como depositado para descrição detalhada de substituições e realizações preferidas

<400> 384

cgtctattat tgtgctcgcn nnnnstacnn nnnstacnnn gstwtsgact actggggtca 60

agg 63

<210> 385 <211> 63 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Oligonucleotideo Sintético

<220>

<221> base modificada <222> (20)..(24) <223> a, c, g ou t

<220>

<221> base modificada <222> (26)..(27) <223> a, c, g ou t

<220>

<221> base modificada <222> (29)..(33) <223> a, c, g ou t <220>

<221> base modificada <222> (35)..(36) <223> a, c, g ou t

<220>

<221> base modificada <222> (38)..(40) <223> a, c, g ou t

<220>

<223> Ver relatório descritivo como depositado para descrição detalhada de substituições e realizações preferidas

<400> 385

cgtctattat tgtgctcgcn nnnnsnnsnn nnnsnnsnnn gstwtsgact actggggtca 60

agg 63

<210> 386 <211> 67 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Oligonucleotideo Sintético

<220>

<221> base modificada <222> (25)..(26) <223> a, c, g ou t

<220>

<221> base modificada <222> (31)..(32) <223> a, c, g ou t

<220>

<221> base modificada <222> (34) .. (35) <223> a, c, g ou t

<220>

<221> base modificada <222> (40) . . (42) <223> a, c, g ou t

<220>

<221> base modificada <222> (46)..(48) <223> a, c, g ou t

<220> <223> Ver relatório descritivo como depositado para descrição detalhada de substituições e realizações preferidas

<400> 386

ggcctggaat gggttgcata catcnnsyct nnsnnsrgcn nnaccnnnta tgccgatagc 60

gtcaagg 67

<210> 387 <211> 67 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Oligonucleotideo Sintético

<220>

<221> base modificada <222> (19)..(20) <223> a, c, g ou t

<220>

<221> base modificada <222> (25) . . (26) <223> a, c, g ou t

<220>

<221> base modificada <222> (34)..(35) <223> a, c, g ou t

<220>

<221> base modificada <222> (40) . . (42) <223> a, c, g ou t

<220>

<221> base modificada <222> (46)..(48) <223> a, c, g ou t

<220>

<223> Ver relatório descritivo como depositado para descrição detalhada de substituições e realizações preferidas

<400> 387

ggcctggaat gggttgcann satcnnsyct tacnnsrgcn nnaccnnnta tgccgatagc 60

gtcaagg 67

<210> 388 <211> 67 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Oligonucleotideo Sintético

<220>

<221> base modificada <222> (19)..(20) <223> a, c, g ou t

<220>

<221> base modificada <222> (25)..(26) <223> a, c, g ou t

<220>

<221> base modificada <222> (31)..(32) <223> a, c, g ou t

<220>

<221> base modificada <222> (40)..(42) <223> a, c, g ou t

<220>

<221> base modificada <222> (46)..(48) <223> a, c, g ou t

<220>

<223> Ver relatório descritivo como depositado para descrição detalhada de substituições e realizações preferidas

<400> 388

ggcctggaat gggttgcann satcnnsyct nnstacrgcn nnaccnnnta tgccgatagc 60

gtcaagg 67

<210> 389 <211> 67 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Oligonucleotideo Sintético

<220>

<221> base modificada <222> (19)..(20) <223> a, c, g ou t

<220>

<221> base modificada <222> (25)..(26) <223> a, c, g ou t <220>

<221> base modificada <222> (31)..(32) <223> a, c, g ou t

<220>

<221> base modificada <222> (34)..(35) <223> a, c, g ou t

<220>

<221> base modificada <222> (40)..(42) <223> a, c, g ou t

<220>

<221> base modificada <222> (46)..(48) <223> a, c, g ou t

<220>

<223> Ver relatório descritivo como depositado para descrição detalhada de substituições e realizações preferidas

<400> 389

ggcctggaat gggttgcann satcnnsyct nnsnnsrgcn nnaccnnnta tgccgatagc 60

gtcaagg 67

<210> 390 <211> 64 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Oligonucleotideo Sintético

<220>

<221> base modificada <222> (23)..(24) <223> a, c, g ou t

<220>

<221> base modificada <222> (26)..(33) <223> a, c, g ou t

<220>

<221> base modificada <222> (35)..(39) <223> a, c, g ou t

<220>

<223> Ver relatório descritivo como depositado para descrição detalhada de substituições e realizações preferidas <400> 390

cgcaacttat tactgtcagc aannsnnnnn nnnsnnnnns ctgdttacgt tcggacaggg 60

tacc 64

<210> 391 <211> 52 <212> DNA <213> Seqüência Artificial

<220> <223> Descrição da Seqüência Artificial: Oligonucleotideo Sintético

<220>

<221> base modificada <222> (19)..(19) <223> a, c, g ou t

<220> <221> base modificada <222> (22)..(23) <223> a, c, g ou t

<220> <221> base modificada <222> (25)..(32) <223> a, c, g ou t

<220> <223> Ver relatório descritivo como depositado para descrição detalhada de substituições e realizações preferidas

<400> 391

gcagcttctg gcttcaacnt cnnsnnnnnn nnsatscact gggtgcgtca gg 52

<210> 392 <211> 10 <212> PRT <213> Seqüência Artificial

<220> <223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 392

Gly Phe Asn Ile Ser Tyr Ser Ser Met His 1 5 10

<210> 393 <211> 10 <212> PRT <213> Seqüência Artificial

<220> <223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 393

Gly Phe Asn Ile Ser Tyr Ser Ser Met His 1 5 10

<210> 394 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 394

Gly Phe Asn Ile Ser Tyr Ser Ser Met His 1 5 10

<210> 395 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 395

Gly Phe Asn Ile Ser Tyr Ser Ser Met His 1 5 10

<210> 396 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 396

Gly Phe Asn Ile Gly Tyr Ser Phe Met His 1 5 10

<210> 397 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 397 Gly Phe Asn Val Asp Tyr Ser Tyr Met His 1 5 10

<210> 398 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 398

Gly Phe Asn Val Asp Tyr Ser Tyr Met His 1 5 10

<210> 399 <211> 10 <212> PRT <213> Seqüência

Artificial

<220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 399

Gly Phe Asn Phe Ser Tyr Ser Phe Met His 1 5 10

<210> 400 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 400

Gly Phe Asn Ile Val Tyr Ser Phe Met His 1 5 10

<210> 401 <211> 10 <212> PRT <213> Seqüência

Artificial

<220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 401

Gly Phe Asn Ile Ile Tyr Ser Phe Met His 1 5 10

<210> 402 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 402

Gly Phe Asn Ile Val Tyr Ser Phe Ile His 1 5 10

<210> 403 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 403

Gly Phe Asn Leu Ser Tyr Ser Phe Met His 1 5 10

<210> 404 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 404

Gly Phe Asn Val Asp Tyr Ser Phe Met His 1 5 10

<210> 405 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 405

Gly Phe Asn Val Ile Tyr Ser Phe Met His 1 5 10

<210> 406 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 406

Gly Phe Asn Val Ala Tyr Ser Leu Met His 15 10

<210> 407 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 407

Gly Phe Asn Ile Ser Tyr Ser Trp Met His 15 10

<210> 408 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 408

Gly Phe Asn Leu Asp Tyr Ser Phe Met His 15 10

<210> 409 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 409

Gly Phe Asn Phe Leu Tyr Ser Gly Ile His 15 10

<210> 410 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético <400> 410

Gly Phe Asn Ile Ser Tyr Ser Ser Met His 1 5 10

<210> 411 <211> 10 <212> PRT <213> Seqüência

Artificial

<220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 411

Gly Phe Asn Ile Ser Tyr Ser Ser Met His 1 5 10

<210> 412 <211> 10 <212> PRT <213> Seqüência

Artificial

<220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 412

Gly Phe Asn Ile Ser Tyr Ser Ser Met His 1 5 10

<210> 413 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 413

Gly Phe Asn Ile Ser Tyr Ser Ser Met His 1 5 10

<210> 414 <211> 10 <212> PRT <213> Seqüência

Artificial

<220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 414

Gly Phe Asn Ile Ser Tyr Ser Ser Met His 1 5 10 <210> 415 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 415

Gly Phe Asn Ile Leu Tyr Ser Gly Ile His 15 10

<210> 416 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 416

Gly Phe Asn Ile Ser Tyr Ser Ser Met His 15 10

<210> 417 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 417

Gly Phe Asn Ile Ser Tyr Ser Ser Met His 15 10

<210> 418 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 418

Gly Phe Asn Ile Ser Tyr Ser Ser Met His 15 10

<210> 419 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 419

Gly Phe Asn Ile Ser Tyr Ser Ser Met His 1 5 10

<210> 420 <211> 10 <212> PRT <213> Seqüência

Artificial

<220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 420

Gly Phe Asn Ile Ser Tyr Ser Ser Met His 1 5 10

<210> 421 <211> 10 <212> PRT <213> Seqüência

Artificial

<220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 421

Gly Phe Asn Ile Ser Tyr Ser Ser Met His 15 10

<210> 422 <211> 10 <212> PRT <213> Seqüência

Artificial

<220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 422

Gly Phe Asn Ile Ser Tyr Ser Ser Met His 1 5 10

<210> 423 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético <400> 423

Gly Phe Asn Ile Ser Tyr Ser Ser Met His 1 5 10

<210> 424 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 424

Gly Phe Asn Ile Ser Tyr Ser Ser Met His 1 5 10

<210> 425 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 425

Gly Phe Asn Ile Ser Tyr Ser Ser Met His 1 5 10

<210> 426 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 426

Gly Phe Asn Ile Ser Tyr Ser Ser Met His 1 5 10

<210> 427 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 427

Gly Phe Asn Ile Phe Tyr Ser Gly Ile His 1 5 10 <210> 428 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 428

Gly Phe Asn Ile Ser Tyr Ser Ser Met His 15 10

<210> 429 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 429

Gly Phe Asn Ile Ser Tyr Ser Ser Met His 15 10

<210> 430 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 430

Gly Phe Asn Ile Ser Tyr Ser Ser Met His 15 10

<210> 431 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 431

Gly Phe Asn Ile Ser Tyr Ser Ser Met His 15 10

<210> 432 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 432

Gly Phe Asn Ile Ser Tyr Ser Ser Met His 15 10

<210> 433 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 433

Gly Phe Asn Ile Ser Tyr Ser Ser Met His 15 10

<210> 434 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 434

Gly Phe Asn Ile Ser Tyr Ser Ser Met His 15 10

<210> 435 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 435

Gly Phe Asn Ile Ser Tyr Ser Ser Met His 15 10

<210> 436 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético <400> 436

Gly Phe Asn Ile Ser Tyr Ser Ser Met His 15 10

<210> 437 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 437

Gly Phe Asn Ile Ser Tyr Ser Ser Met His 15 10

<210> 438 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 438

Gly Phe Asn Ile Ser Tyr Ser Ser Met His 15 10

<210> 439 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 439

Gly Phe Asn Ile Ser Tyr Ser Ser Met His 15 10

<210> 440 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 440

Gly Phe Asn Ile Ser Tyr Ser Ser Met His 15 10 <210> 441 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 441

Gly Phe Asn Ile Ser Tyr Ser Ser Met His 15 10

<210> 442 <211> 10 <212> PRT <213> Seqüência

Artificial

<220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 442

Gly Phe Asn Ile Ser Tyr Ser Ser Met His 15 10

<210> 443 <211> 10 <212> PRT <213> Seqüência

Artificial

<220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 443

Gly Phe Asn Ile Ser Tyr Ser Ser Met His 15 10

<210> 444 <211> 10 <212> PRT <213> Seqüência

Artificial

<220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 444

Gly Phe Asn Ile Ser Tyr Ser Ser Met His 15 10

<210> 445 <211> 10 <212> PRT <213> Seqüê

Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 445

Gly Phe Asn Ile Ser Tyr Ser Ser Met His 1 5 10

<210> 446 <211> 10 <212> PRT <213> Seqüência

Artificial

<220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 446

Gly Phe Asn Ile Ser Tyr Ser Ser Met His 1 5 10

<210> 447 <211> 10 <212> PRT <213> Seqüência

Artificial

<220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 447

Gly Phe Asn Ile Ser Tyr Ser Ser Met His 1 5 10

<210> 448 <211> 10 <212> PRT <213> Seqüência

Artificial

<220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 448

Gly Phe Asn Ile Ser Tyr Ser Ser Met His 1 5 10

<210> 449 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético <400> 449

Gly Phe Asn Ile Ser Tyr Ser Ser Met His 15 10

<210> 450 <211> 10 <212> PRT <213> Seqüência

Artificial

<220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 450

Gly Phe Asn Ile Ser Tyr Ser Ser Met His 1 5 10

<210> 451 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 451

Gly Phe Asn Ile Ser Tyr Ser Ser Met His 15 10

<210> 452 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 452

Gly Phe Asn Ile Ser Tyr Ser Ser Met His 15 10

<210> 453 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 453

Gly Phe Asn Leu Ser Tyr Ser Gly Met His 15 10 <210> 454 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 454

Gly Phe Asn Leu Leu Tyr Ser Gly Met His 1 5 10

<210> 455 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 455

Gly Phe Asn Val Ala Tyr Ser Gly Ile His 1 5 10

<210> 456 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 456

Gly Phe Asn Val Asp Tyr Ser Gly Met His 1 5 10

<210> 457 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 457

Gly Phe Asn Val Asp Tyr Ser Gly Met His 1 5 10

<210> 458 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 458

Gly Phe Asn Val Ser Tyr Ser Ser Ile His 1 5 10

<210> 459 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 459

Gly Phe Asn Val Val Tyr Ser Gly Ile His 1 5 10

<210> 460 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<220>

<221> M0D_RES

<222> (4) . . (4)

<223> He, Valf Phe ou Leu

<220>

<221> MOD_RES <222> (5) .. (5)

<223> Ser, Gly, Asp, Vai, lie, Leu, Phe ou Ala <220>

<221> MOD_RES <222> (8) .. (8)

<223> Ser, Phe, Tyr, Leu, Trp ou Gly

<220>

<221> MOD_RES <222> (9)..(9) <223> Met ou Ile

<400> 460

Gly Phe Asn Xaa Xaa Tyr Ser Xaa Xaa His 1 5 10

<210> 461 <211> 17 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 461

Ser Ile Tyr Ser Tyr Tyr Ser Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys 15 10 15

Gly

<210> 462 <211> 17 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 462

Ser Ile Tyr Ser Tyr Tyr Ser Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys 15 10 15

Gly

<210> 463 <211> 17 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 463

Ser Ile Tyr Ser Tyr Tyr Ser Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys 15 10 15

Gly

<210> 464 <211> 17 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 464

Ser Ile Tyr Ser Tyr Tyr Ser Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys 15 10 15 Gly <210> 465 <211> 17 <212> PRT <213> Seqüência Artificial <220> <223> Descrição da Seqüência

Peptideo Sintético

<400> 465

Ser Ile Ala Ser Tyr Tyr Ser Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys 15 10 15

Gly

<210> 466 <211> 17 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 466

Ser Ile Ala Pro Tyr Tyr Ser Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys 15 10 15

Gly

<210> 467 <211> 17 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 467

Ser Ile Ala Pro Tyr Tyr Ser Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys 15 10 15

Gly

<210> 468 <211> 17 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético <400> 468

Ser Ile Ser Ser Tyr Tyr Ser Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys 15 10 15

Gly

<210> 469 <211> 17 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 469

Ser Ile Ser Pro Tyr Tyr Ser Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys 15 10 15

Gly

<210> 470 <211> 17 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 470

Ser Ile Ser Ser Tyr Tyr Ser Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys 15 10 15

Gly

<210> 471 <211> 17 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 471

Ser Ile Ser Ser Tyr Tyr Ser Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys 15 10 15

Gly

<210> 472

<211> 17

<212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 472

Ser Ile Ser Ser Tyr Tyr Ser Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys 15 10 15

Gly

<210> 473 <211> 17 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 473

Ser Ile Ser Ser Tyr Tyr Ser Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys 15 10 15

Gly

<210> 474 <211> 17 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 474

Ser Ile Ser Ser Tyr Tyr Ser Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys 15 10 15

Gly

<210> 475 <211> 17 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 475

Ser Ile Ser Ser Tyr Tyr Ser Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys 15 10 15

Gly

<210> 476 <211> 17 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 476

Ser Ile Thr Ser Tyr Tyr Ser Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys 15 10 15

Gly

<210> 477 <211> 17 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 477

Ser Ile Thr Pro Tyr Tyr Ser Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys 15 10 15

Gly

<210> 478 <211> 17 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 478

Ser Ile Tyr Ser Tyr Tyr Ser Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys 15 10 15

Gly

<210> 479 <211> 17 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 479

Ser Ile Tyr Ser Tyr Tyr Ser Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys 15 10 15 Gly

<210> 480

<211> 17

<212> PRT

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 480

Ser Ile Tyr Ser Tyr Tyr Ser Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15

Gly

<210> 481

<211> 17

<212> PRT

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 481

Ser Ile Tyr Ser Tyr Tyr Ser Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15

Gly

<210> 482

<211> 17

<212> PRT

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 482

Ser Ile Tyr Ser Tyr Tyr Ser Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15

Gly

<210> 483

<211> 17

<212> PRT

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético <400> 483

Ser Ile Tyr Pro Tyr Tyr Ser Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15

Gly

<210> 484 <211> 17 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 484

Ser Ile Tyr Ser Tyr Tyr Ser Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15

Gly

<210> 485 <211> 17 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 485

Ser Ile Tyr Ser Tyr Tyr Ser Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15

Gly

<210> 486 <211> 17 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 486

Ser Ile Tyr Ser Tyr Tyr Ser Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15

Gly

<210> 487 <211> 17 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial

<220> <223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 487

Ser Ile Tyr Ser Tyr Tyr Ser Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15

Gly

<210> 488 <211> 17 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 488

Ser Ile Tyr Ser Tyr Tyr Ser Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15

Gly

<210> 489 <211> 17 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 489

Ser Ile Tyr Ser Tyr Tyr Ser Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15

Gly

<210> 490 <211> 17 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 490

Ser Ile Tyr Ser Tyr Tyr Ser Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15

Gly

<210> 491 <211> 17 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 491

Ser Ile Tyr Ser Tyr Tyr Ser Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys 15 10 15

Gly

<210> 492 <211> 17 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 492

Ser Ile Tyr Ser Tyr Tyr Ser Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys 15 10 15

Gly

<210> 493 <211> 17 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 493

Ser Ile Tyr Ser Tyr Tyr Ser Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys 15 10 15

Gly

<210> 494 <211> 17 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 494

Ser Ile Tyr Ser Tyr Tyr Ser Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys 15 10 15 Gly <210> 495 <211> 17 <212> PRT <213> Seqüência Artificial <220> <223> Descrição da Seqüência

Peptideo Sintético

<400> 495

Ser Ile Tyr Ser Tyr Tyr Ser Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys 15 10 15

Gly

<210> 496 <211> 17 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 496

Ser Ile Tyr Ser Tyr Tyr Ser Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys 15 10 15

Gly

<210> 497 <211> 17 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 497

Ser Ile Tyr Ser Tyr Tyr Ser Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys 15 10 15

Gly

<210> 498 <211> 17 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético <400> 498

Ser Ile Tyr Ser Tyr Tyr Ser Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys 15 10 15

Gly

<210> 499 <211> 17 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 499

Ser Ile Tyr Ser Tyr Tyr Ser Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys 15 10 15

Gly

<210> 500 <211> 17 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 500

Ser Ile Tyr Ser Tyr Tyr Ser Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys 15 10 15

Gly

<210> 501 <211> 17 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 501

Ser Ile Tyr Ser Tyr Tyr Ser Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys 15 10 15

Gly

<210> 502 <211> 17 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial

<220> <223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 502

Ser Ile Tyr Ser Tyr Tyr Ser Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys 15 10 15

Gly

<210> 503 <211> 17 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 503

Ser Ile Tyr Ser Tyr Tyr Ser Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys 15 10 15

Gly

<210> 504 <211> 17 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 504

Ser Ile Tyr Ser Tyr Tyr Ser Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys 15 10 15

Gly

<210> 505 <211> 17 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 505

Ser Ile Tyr Ser Tyr Tyr Ser Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys 15 10 15

Gly

<210> 506 <211> 17 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 506

Ser Ile Tyr Ser Tyr Tyr Ser Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15

Gly

<210> 507 <211> 17 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 507

Ser Ile Tyr Ser Tyr Tyr Ser Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15

Gly

<210> 508 <211> 17 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 508

Ser Ile Tyr Ser Tyr Tyr Ser Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15

Gly

<210> 509 <211> 17 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 509

Ser Ile Tyr Pro Tyr Tyr Ser Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly

<210> 510 <211> 17 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 510

Ser Ile Tyr Ser Tyr Tyr Ser Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys 15 10 15

Gly

<210> 511 <211> 17 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 511

Ser Ile Tyr Ser Tyr Tyr Ser Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys 15 10 15

Gly

<210> 512 <211> 17 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 512

Ser Ile Tyr Ser Tyr Tyr Ser Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys 15 10 15

Gly

<210> 513 <211> 17 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético <400> 513

Ser Ile Tyr Ser Tyr Tyr Ser Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys 15 10 15

Gly

<210> 514 <211> 17 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 514

Ser Ile Tyr Ser Tyr Tyr Ser Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys 15 10 15

Gly

<210> 515 <211> 17 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 515

Ser Ile Tyr Ser Tyr Tyr Ser Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys 15 10 15

Gly

<210> 516 <211> 17 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 516

Ser Ile Tyr Ser Tyr Tyr Ser Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys 15 10 15

Gly

<210> 517 <211> 17 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial

<220> <223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 517

Ser Ile Tyr Ser Tyr Tyr Ser Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15

Gly

<210> 518 <211> 17 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 518

Ser Ile Tyr Ser Tyr Tyr Ser Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15

Gly

<210> 519 <211> 17 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 519

Ser Ile Tyr Ser Tyr Tyr Ser Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15

Gly

<210> 520 <211> 17 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 520

Ser Ile Tyr Ser Tyr Tyr Ser Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15

Gly

<210> 521 <211> 17 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 521

Ser Ile Tyr Ser Tyr Tyr Ser Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15

Gly

<210> 522 <211> 17 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 522

Ser Ile Tyr Ser Tyr Tyr Ser Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15

Gly

<210> 523 <211> 17 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 523

Ser Ile Tyr Ser Tyr Tyr Ser Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15

Gly

<210> 524 <211> 17 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 524

Ser Ile Tyr Ser Tyr Tyr Ser Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly

<210> 525 <211> 17 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 525

Ser Ile Tyr Ser Tyr Tyr Ser Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys 15 10 15

Gly

<210> 526 <211> 17 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 526

Ser Ile Tyr Ser Tyr Tyr Thr Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys 15 10 15

Gly

<210> 527 <211> 17 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 527

Ser Ile Tyr Ser Tyr Tyr Ser Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys 15 10 15

Gly

<210> 528 <211> 17 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético <400> 528

Ser Ile Tyr Ser Tyr Tyr Ser Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys 15 10 15

Gly

<210> 529 <211> 17 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<220>

<221> M0D_RES

<222> (3)..(3)

<223> Tyr, Ala, Ser ou Thr

<220>

<221> M0D_RES <222> (4) . . (4) <223> Ser ou Pro

<220>

<221> MOD_RES <222> (7)..(7) <223> Ser ou Thr

<400> 529

Ser Ile Xaa Xaa Tyr Tyr Xaa Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys 15 10 15

Gly

<210> 530 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 530

Ser Tyr Asn Asn Thr Thr Ser Ile Asp Tyr 15 10

<210> 531 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial

<220> <223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 531

Gly Tyr Ser Trp Tyr Asn Ala Met Asp Tyr 15 10

<210> 532 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 532

Gly Tyr Ser Trp Phe Asn Ala Ile Asp Tyr 15 10

<210> 533 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 533

Gly Tyr Tyr Trp Phe Asp Ala Met Asp Tyr 15 10

<210> 534 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 534

Ser Tyr Ser Tyr Tyr Ser Ala Met Asp Tyr 15 10

<210> 535 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 535 Ser Tyr Ser Tyr Arg Glu Thr Met Asp Tyr 15 10

<210> 536 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 536

Ser Tyr Ser Tyr Arg Glu Thr Met Asp Tyr 15 10

<210> 537 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 537

Ser Tyr Ser Tyr Tyr Ser Ala Met Asp Tyr 15 10

<210> 538 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 538

Ser Tyr Ser Tyr Tyr Ser Ala Met Asp Tyr 15 10

<210> 539 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 539

Ser Tyr Ser Tyr Tyr Ser Ala Met Asp Tyr 15 10

<210> 540 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 540

Ser Tyr Ser Tyr Tyr Ser Ala Met Asp Tyr 1 5 10

<210> 541 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 541

Ser Tyr Ser Tyr Tyr Ser Ala Met Asp Tyr 1 5 10

<210> 542 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 542

Ser Tyr Ser Tyr Tyr Ser Ala Met Asp Tyr 1 5 10

<210> 543 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 543

Ser Tyr Ser Tyr Tyr Ser Ala Met Asp Tyr 1 5 10

<210> 544 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptídeo Sintético

<400> 544

Ser Tyr Ser Tyr Tyr Ser Ala Met Asp Tyr 15 10

<210> 545 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 545

Ser Tyr Ser Tyr Tyr Ser Ala Met Asp Tyr 15 10

<210> 546 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 546

Ser Tyr Ser Tyr Tyr Ser Ala Met Asp Tyr 15 10

<210> 547 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 547

Ser Tyr Ser Tyr Tyr Ser Ala Met Asp Tyr 15 10

<210> 548 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético <400> 548

Ser Tyr Ser Tyr Tyr Ser Ala Met Asp Tyr 1 5 10

<210> 549 <211> 10 <212> PRT <213> Seqüência Artificial

<220> <223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 549

Ser Tyr Ser Tyr Ser Phe Gly Met Asp Tyr 1 5 10

<210> 550 <211> 10 <212> PRT <213> Seqüência Artificial

<220> <223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 550

Ser Tyr Ser Tyr Phe Met Gly Met Asp Tyr 1 5 10

<210> 551 <211> 10 <212> PRT <213> Seqüência Artificial

<220> <223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 551

Ser Tyr Ser Tyr His Val Ala Phe Asp Tyr 1 5 10

<210> 552 <211> 10 <212> PRT <213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 552

Ser Tyr Ser Tyr Tyr Ser Ala Met Asp Tyr 1 5 10 <210> 553 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 553

Ser Tyr Ser Tyr Tyr Ser Ala Met Asp Tyr 15 10

<210> 554 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 554

Ser Tyr Ser Tyr His Leu Ala Phe Asp Tyr 15 10

<210> 555 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 555

Ser Tyr Ser Tyr Ser Leu Ala Phe Asp Tyr 15 10

<210> 556 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 556

Ser Tyr Ser Tyr Tyr Ile Ala Met Asp Tyr 15 10

<210> 557 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 557

Ser Tyr Ser Tyr Tyr Met Gly Met Asp Tyr 15 10

<210> 558 <211> 10 <212> PRT <213> Seqüência

Artificial

<220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 558

Ser Tyr Ser Tyr Ser Met Gly Met Asp Tyr 15 10

<210> 559 <211> 10 <212> PRT <213> Seqüência

Artificial

<220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 559

Ser Tyr Ser Tyr His Val Ala Met Asp Tyr 15 10

<210> 560 <211> 10 <212> PRT <213> Seqüência

Artificial

<220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 560

Ser Tyr Ser Tyr His Met Gly Met Asp Tyr 15 10

<210> 561 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético <400> 561

Ser Tyr Ser Tyr His Leu Gly Met Asp Tyr 1 5 10

<210> 562 <211> 10 <212> PRT <213> Seqüência

Artificial

<220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 562

Ser Tyr Ser Tyr Tyr Gln Gly Phe Asp Tyr 1 5 10

<210> 563 <211> 10 <212> PRT <213> Seqüência

Artificial

<220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 563

Ser Tyr Ser Tyr Ser Met Gly Met Asp Tyr 1 5 10

<210> 564 <211> 10 <212> PRT <213> Seqüência

Artificial

<220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 564

Ser Tyr Ser Tyr Phe Leu Ala Met Asp Tyr 1 5 10

<210> 565 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 565

Ser Tyr Ser Tyr Tyr Ser Ala Met Asp Tyr 1 5 10 161

<210> 566 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 566

Ser Tyr Ser Tyr Ser Glu Ala Leu Asp Tyr 15 10

<210> 567 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 567

Ser Tyr Ser Tyr Ser Leu Gly Met Asp Tyr 15 10

<210> 568 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 568

Ser Tyr Ser Tyr Tyr Ser Ala Met Asp Tyr 15 10

<210> 569 <211> 10 <212> PRT <213> Seqüê

Artificial

<220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 569

Ser Tyr Ser Tyr Phe Met Gly Met Asp Tyr 1 5 10

<210> 570 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 570

Ser Tyr Ser Tyr Phe Leu Ala Met Asp Tyr 15 10

<210> 571 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 571

Ser Tyr Ser Tyr Phe Leu Ala Met Asp Tyr 15 10

<210> 572 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 572

Ser Tyr Ser Tyr Tyr Leu Ala Met Asp Tyr 15 10

<210> 573 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 573

Ser Tyr Ser Tyr Phe Ile Gly Met Asp Tyr 15 10

<210> 574 <211> 10 <212> PRT <213> Seqüência

Artificial

<220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético <400> 574

Ser Tyr Ser Tyr His Leu Gly Met Asp Tyr 1 5 10

<210> 575 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 575

Ser Tyr Ser Tyr Thr Glu Ala Phe Asp Tyr 1 5 10

<210> 576 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 576

Ser Tyr Ser Tyr Tyr Ser Ala Met Asp Tyr 1 5 10

<210> 577 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 577

Ser Tyr Ser Tyr Thr Tyr Gly Leu Asp Tyr 1 5 10

<210> 578 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 578

Ser Tyr Ser Tyr Tyr Ser Ala Met Asp Tyr 1 5 10 <210> 579

<211> 10

<212> PRT

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 579

Ser Tyr Ser Tyr Ser Leu Gly Met Asp Tyr 1 5 10

<210> 580

<211> 10

<212> PRT

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 580

Ser Tyr Ser Tyr Trp Val Gly Met Asp Tyr 1 5 10

<210> 581

<211> 10

<212> PRT

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 581

Ser Tyr Ser Tyr Thr Leu Ala Met Asp Tyr 1 5 10

<210> 582

<211> 10

<212> PRT

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 582

Ser Tyr Ser Tyr Thr Met Gly Leu Asp Tyr 1 5 10

<210> 583

<211> 10

<212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 583

Ser Tyr Ser Tyr Phe Leu Gly Met Asp Tyr 1 5 10

<210> 584 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 584

Ser Tyr Ser Tyr His Met Gly Phe Asp Tyr 1 5 10

<210> 585 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 585

Ser Tyr Ser Tyr Ser Leu Gly Met Asp Tyr 1 5 10

<210> 586 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 586

Ser Tyr Ser Tyr Tyr Glu Ala Phe Asp Tyr 1 5 10

<210> 587 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético <400> 587

Ser Tyr Ser Tyr Arg Met Ala Phe Asp Tyr 15 10

<210> 588 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 588

Ser Tyr Ser Tyr His Ile Ala Phe Asp Tyr 15 10

<210> 589 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 589

Ser Tyr Ser Tyr Ser Val Gly Met Asp Tyr 15 10

<210> 590 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 590

Ser Tyr Ser Tyr Thr Leu Gly Met Asp Tyr 1 5 10

<210> 591 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 591

Ser Tyr Ser Tyr Tyr Ser Ala Met Asp Tyr 15 10 <210> 592 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 592

Ser Tyr Ser Tyr Tyr Ser Ala Met Asp Tyr 1 5 10

<210> 593 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 593

Ser Tyr Ser Tyr Tyr Ser Ala Met Asp Tyr 15 10

<210> 594 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 594

Ser Tyr Ser Tyr Tyr Ser Ala Met Asp Tyr 15 10

<210> 595 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 595

Ser Tyr Ser Tyr Tyr Ser Ala Met Asp Tyr 15 10

<210> 596 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 596

Ser Tyr Ser Tyr Tyr Ser Ala Met Asp Tyr 1 5 10

<210> 597 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 597

Ser Tyr Ser Tyr Tyr Ser Ala Met Asp Tyr 1 5 10

<210> 598 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<220>

<221> M0D_RES <222> (1)..(1) <223> Ser ou Gly

<220>

<221> M0D_RES

<222> (3). . (3)

<223> Ser, Asn ou Tyr

<220>

<221> M0D_RES

<222> (4) . . (4)

<223> Tyr, Asn ou Trp

<220>

<221> M0D_RES <222> (5) .. (5)

<223> Thr, Tyr, Phe, Arg, Ser, His ou Trp <220>

<221> M0D_RES <222> (6)..(6)

<223> Thr, Asn, Asp, Ser, Glu, Phe, Met, Vai, Leu, Ile ou Tyr

<220> <221> MOD RES <222> (7) . '· (7) <223> Ser, Ala, Thr ou Gly <220> <221> MOD RES <222> (8) . (8) <223> He, Met, Phe ou Leu <400> 598

Xaa Tyr Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Asp Tyr 15 10

<210> 599 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 599

Gly Phe Asn Ile Ser Ser Ser Tyr Ile His 15 10

<210> 600 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 600

Gly Phe Asn Ile Ser Ser Ser Tyr Ile His 1 5 10

<210> 601 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 601

Gly Phe Asn Ile Ser Ser Ser Tyr Ile His 15 10

<210> 602 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 602

Gly Phe Asn Ile Ser Ser Ser Tyr Ile His 15 10

<210> 603 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 603

Gly Phe Asn Ile Ser Ser Ser Tyr Ile His 15 10

<210> 604 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 604

Gly Phe Asn Ile Ser Ser Ser Tyr Ile His 15 10

<210> 605 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 605

Gly Phe Asn Ile Ser Ser Ser Tyr Ile His 15 10

<210> 606 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético <400> 606

Gly Phe Asn Ile Ser Ser Ser Tyr Ile His 15 10

<210> 607 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 607

Gly Phe Asn Ile Ser Ser Ser Tyr Ile His 15 10

<210> 608 <211> 10 <212> PRT <213> Seqüência

Artificial

<220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 608

Gly Phe Asn Ile Ser Ser Ser Tyr Ile His 15 10

<210> 609 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 609

Gly Phe Asn Ile Ser Ser Ser Tyr Ile His 15 10

<210> 610 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 610

Gly Phe Asn Ile Ser Ser Ser Tyr Ile His 15 10 <210> 611 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 611

Gly Phe Asn Ile Ser Ser Ser Tyr Ile His 1 5 10

<210> 612 <211> 10 <212> PRT <213> Seqüência

Artificial

<220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 612

Gly Phe Asn Ile Ser Ser Ser Tyr Ile His 1 5 10

<210> 613 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 613

Gly Phe Asn Phe Ser Ser Ser Tyr Ile His 1 5 10

<210> 614 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 614

Gly Phe Asn Ile Lys Gly Ser Leu Ile His 1 5 10

<210> 615 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 615

Gly Phe Asn Ile Lys Gly Ser Ile Met His 15 10

<210> 616 <211> 10 <212> PRT <213> Seqüência

Artificial

<220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 616

Gly Phe Asn Ile Lys Ser Ser Ile Met His 15 10

<210> 617 <211> 10 <212> PRT <213> Seqüência

Artificial

<220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 617

Gly Phe Asn Ile Ser Ser Ser Tyr Ile His 15 10

<210> 618 <211> 10 <212> PRT <213> Seqüência

Artificial

<220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 618

Gly Phe Asn Ile Ser Ser Ser Tyr Ile His 15 10

<210> 619 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: peptideo Sintético <400> 619

Gly Phe Asn Ile Ser Ser Ser Tyr Ile His 15 10

<210> 620 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 620

Gly Phe Asn Ile Ser Ser Ser Tyr Ile His 15 10

<210> 621 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 621

Gly Phe Asn Ile Ser Ser Ser Tyr Ile His 15 10

<210> 622 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 622

Gly Phe Asn Ile Ser Ser Ser Tyr Ile His 15 10

<210> 623 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 623

Gly Phe Asn Ile Ser Ser Ser Tyr Ile His 15 10 <210> 624 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 624

Gly Phe Asn Ile Ser Ser Ser Tyr Ile His 1 5 10

<210> 625 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 625

Gly Phe Asn Leu Ala Ser Ser Phe Met His 1 5 10

<210> 626 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 626

Gly Phe Asn Leu Val Ser Ser Leu Met His 1 5 10

<210> 627 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 627

Gly Phe Asn Val Lys Thr Gly Leu Ile His 1 5 10

<210> 628 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 628

Gly Phe Asn Val Lys Trp Asn Tyr Ile His 15 10

<210> 629 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 629

Gly Phe Asn Val Val Ser Ser Phe Ile His 15 10

<210> 630 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<220>

<221> M0D_RES <222> (4)..(4) <223> He, Phe,

<220>

<221> M0D_RES <222> (5)..(5) <223> Ser, Lys,

<220>

<221> M0D_RES <222> (6)..(6) <223> Ser, Gly,

<220>

<221> M0D_RES <222> (7) . . (7) <223> Ser, Gly ou Asn

<220>

<221> M0D_RES <222> (8)..(8) <223> Tyr, Leu, Ile ou Phe

Leu ou Val

Ala ou Val

Thr ou Trp

<220> <221> MOD_RES <222> (9)..(9) <223> Ile ou Met

<400> 630

Gly Phe Asn Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa His 15 10

<210> 631 <211> 17 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 631

Ala Ile Ala Pro Tyr Leu Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys 15 10 15

Gly

<210> 632 <211> 17 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 632

Ala Ile Pro Pro Phe Tyr Gly Trp Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys 15 10 15

Gly

<210> 633 <211> 17 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 633

Ala Ile Gln Pro Tyr Phe Gly Trp Thr Ile Tyr Ala Asp Ser Val Lys 15 10 15

Gly

<210> 634 <211> 17 <212> PRT <213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 634

Ala Ile Ser Pro Tyr Leu Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15

Gly

<210> 635 <211> 17 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 635

Asp Ile Ala Pro Tyr Leu Gly Thr Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15

Gly

<210> 636 <211> 17 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 636

Asp Ile Ser Pro Trp Tyr Gly Gly Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15

Gly

<210> 637 <211> 17 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 637

Asp Ile Ser Ser Tyr Thr Gly Ser Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15

Gly <210> 638 <211> 17 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 638

Phe Ile Gln Pro Tyr Tyr Gly Ser Thr Ile Tyr Ala Asp Ser Val Lys 15 10 15

Gly

<210> 639 <211> 17 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 639

Phe Ile Ser Pro Tyr Leu Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys 15 10 15

Gly

<210> 640 <211> 17 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 640

Gly Ile Thr Pro Tyr Leu Gly Trp Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys 15 10 15

Gly

<210> 641 <211> 17 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 641 His Ile Ser Pro Tyr Leu Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15

Gly

<210> 642 <211> 17 <212> PRT <213> Seqüência Artificial

<220> <223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 642

Ile Ile Ser Pro Tyr Leu Gly Ser Thr Gly Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15

Gly

<210> 643 <211> 17 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 643

Ser Ile Thr Pro Tyr Tyr Gly Trp Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15

Gly

<210> 644 <211> 17 <212> PRT <213> Seqüência Artificial

<220> <223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 644

Trp Ile Ser Pro Tyr Leu Gly Arg Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15

Gly

<210> 645 <211> 17 <212> PRT <213> Seqüência Artificial

<220> <223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 645

Tyr Ile Ser Pro Tyr Tyr Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys 15 10 15

Gly

<210> 646 <211> 17 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 646

Tyr Ile Ser Pro Tyr Tyr Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys 15 10 15

Gly

<210> 647 <211> 17 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 647

Tyr Ile Ser Pro Tyr Tyr Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys 15 10 15

Gly

<210> 648 <211> 17 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 648

Tyr Ile Ser Pro Tyr Tyr Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys 15 10 15

Gly

<210> 649 <211> 17 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 649

Tyr Ile Gly Pro Phe Thr Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15

Gly

<210> 650 <211> 17 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 650

Tyr Ile Ser Pro Phe Leu Ser Thr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15

Gly

<210> 651 <211> 17 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 651

Tyr Ile Ser Pro Tyr Tyr Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15

Gly

<210> 652 <211> 17 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 652

Tyr Ile Ser Pro Tyr Ser Gly Ser Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly

<210> 653 <211> 17 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 653

Tyr Ile Ser Pro Tyr Tyr Ser Ser Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys 15 10 15

Gly

<210> 654 <211> 17 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 654

Tyr Ile Ser Pro Tyr Leu Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys 15 10 15

Gly

<210> 655 <211> 17 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 655

Tyr Ile Ser Pro Tyr Leu Ser Ser Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys 15 10 15

Gly

<210> 656 <211> 17 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético <400> 656

Tyr Ile Ser Pro Tyr Tyr Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15

Gly

<210> 657 <211> 17 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 657

Tyr Ile Ser Pro Tyr Tyr Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15

Gly

<210> 658 <211> 17 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 658

Tyr Ile Ser Pro Tyr Tyr Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15

Gly

<210> 659 <211> 17 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 659

Tyr Ile Ser Pro Tyr Tyr Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15

Gly

<210> 660 <211> 17 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial

<220> <223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 660

Tyr Ile Ser Pro Tyr Tyr Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15

Gly

<210> 661 <211> 17 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 661

Tyr Ile Ser Pro Tyr Tyr Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15

Gly

<210> 662 <211> 17 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<220>

<221> M0D_RES <222> (1) . . (1)

<223> Ala, Asp, Phe, Gly, His, lie, Ser, Trp ou Tyr <220>

<221> M0D_RES <222> (3)..(3)

<223> Ala, Pro, Gln, Ser, Thr ou Gly <220>

<221> M0D_RES <222> (4) . . (4) <223> Pro ou Ser

<220>

<221> M0D_RES <222> (5)..(5) <223> Tyr ou Phe

<220>

<221> MOD_RES <222> (6)..(6)

<223> Leu, Tyr, Phe ou Thr

<220>

<221> MOD_RES

<222> (7)..(7)

<223> Gly ou Ser

<220>

<221> MOD_RES

<222> (8)..(8)

<223> Ser, Trp, Thr, Gly ou Arg

<220>

<221> MOD_RES

<222> (10)..(10)

<223> Ser, He, Lys, Asp, Asn, Gly ou Arg

<400> 662

Xaa Ile Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Thr Xaa Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15

Gly

<210> 663

<211> 11

<212> PRT

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 663

Glu Tyr Tyr Arg Trp Tyr Thr Ala Ile Asp Tyr 1 5 10

<210> 664

<211> 11

<212> PRT

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 664

Glu Tyr Tyr Arg Trp Tyr Thr Ala Ile Asp Tyr 1 5 10

<210> 665

<211> 11

<212> PRT

<213> Seqüência Artificial

<220> <223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 665

Glu Tyr Tyr Arg Trp Tyr Thr Ala Ile Asp Tyr 1 5 10

<210> 666 <211> 11 <212> PRT <213> Seqüência Artificial

<220> <223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 666

Glu Tyr Tyr Arg Trp Tyr Thr Ala Ile Asp Tyr 1 5 10

<210> 667 <211> 11 <212> PRT <213> Seqüência Artificial

<220> <223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 667

Glu Tyr Tyr Arg Trp Tyr Thr Ala Ile Asp Tyr 1 5 10

<210> 668 <211> 11 <212> PRT <213> Seqüência Artificial

<220> <223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 668

Glu Tyr Tyr Arg Trp Tyr Thr Ala Ile Asp Tyr 1 5 10

<210> 669 <211> 11 <212> PRT <213> Seqüência Artificial

<220> <223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 669 Glu Tyr Tyr Arg Trp Tyr Thr Ala Ile Asp Tyr 1 5 10

<210> 670 <211> 11 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 670

Glu Tyr Tyr Arg Trp Tyr Thr Ala Ile Asp Tyr 1 5 10

<210> 671 <211> 11 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 671

Glu Tyr Tyr Arg Trp Tyr Thr Ala Ile Asp Tyr 1 5 10

<210> 672 <211> 11 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 672

Glu Tyr Tyr Arg Trp Tyr Thr Ala Ile Asp Tyr 1 5 10

<210> 673 <211> 11 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 673

Glu Tyr Tyr Arg Trp Tyr Thr Ala Ile Asp Tyr 1 5 10

<210> 674 <211> 11 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 674

Glu Tyr Tyr Arg Trp Tyr Thr Ala Ile Asp Tyr 15 10

<210> 675 <211> 11 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 675

Glu Tyr Tyr Arg Trp Tyr Thr Ala Ile Asp Tyr 15 10

<210> 676 <211> 11 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 676

Glu Tyr Tyr Arg Trp Tyr Thr Ala Ile Asp Tyr 15 10

<210> 677 <211> 11 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 677

Glu Tyr Tyr Arg Trp Tyr Thr Ala Ile Asp Tyr 15 10

<210> 678 <211> 11 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 678

Glu Tyr Tyr Arg Trp Tyr Thr Ala Ile Asp Tyr 15 10

<210> 679 <211> 11 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 679

Glu Tyr Tyr Arg Trp Tyr Thr Ala Ile Asp Tyr 15 10

<210> 680 <211> 11 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 680

Glu Tyr Tyr Arg Trp Tyr Thr Ala Ile Asp Tyr 15 10

<210> 681 <211> 11 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 681

Glu Tyr Tyr Arg Trp Tyr Thr Ala Ile Asp Tyr 15 10

<210> 682 <211> 11 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético <400> 682

Glu Tyr Tyr Arg Trp Tyr Thr Ala Ile Asp Tyr

15 10

<210> 683

<211> 11

<212> PRT

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial:

Peptideo Sintético

<400> 683

Glu Tyr Tyr Arg Trp Tyr Thr Ala Ile Asp Tyr

15 10

<210> 684

<211> 11

<212> PRT

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial:

Peptideo Sintético

<400> 684

Glu Tyr Tyr Arg Trp Tyr Thr Ala Ile Asp Tyr

15 10

<210> 685

<211> 11

<212> PRT

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial:

Peptideo Sintético

<400> 685

Glu Tyr Tyr Arg Trp Tyr Thr Ala Ile Asp Tyr

15 10

<210> 686

<211> 11

<212> PRT

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial:

Peptideo Sintético

<400> 686

Glu Tyr Tyr Arg Trp Tyr Thr Ala Ile Asp Tyr

15 10 <210> 687 <211> 11 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 687

Glu Tyr Tyr Arg Trp Tyr Thr Ala Ile Asp Tyr 15 10

<210> 688 <211> 11 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 688

Glu Tyr Tyr Arg Trp Tyr Thr Ala Ile Asp Tyr 15 10

<210> 689 <211> 11 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 689

Glu Tyr Tyr Arg Trp Tyr Thr Ala Ile Asp Tyr 15 10

<210> 690 <211> 11 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 690

Glu Tyr Tyr Arg Trp Tyr Thr Ala Ile Asp Tyr 15 10

<210> 691 <211> 11 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 691

Glu Tyr Tyr Arg Trp Tyr Thr Ala Ile Asp Tyr 1 5 10

<210> 692 <211> 11 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 692

Glu Tyr Tyr Arg Trp Tyr Thr Ala Ile Asp Tyr 1 5 10

<210> 693 <211> 11 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 693

Glu Tyr Tyr Arg Trp Tyr Thr Ala Ile Asp Tyr 1 5 10

<210> 694 <211> 11 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 694

Glu Tyr Tyr Arg Trp Tyr Thr Ala Ile Asp Tyr 1 5 10

<210> 695 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético <400> 695

Gly Phe Asn Ile Ser Tyr Ser Ser Met His 15 10

<210> 696 <211> 10 <212> PRT <213> Seqüência

Artificial

<220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 696

Gly Phe Asn Ile Phe Tyr Gly Gly Ile His 15 10

<210> 697 <211> 10 <212> PRT <213> Seqüência

Artificial

<220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 697

Gly Phe Asn Ile Ser Tyr Ser Ser Met His 15 10

<210> 698 <211> 10 <212> PRT <213> Seqüência

Artificial

<220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 698

Gly Phe Asn Ile Ser Tyr Ser Ser Met His 15 10

<210> 699 <211> 10

<212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 699

Gly Phe Asn Ile Ser Tyr Ser Ser Met His 15 10 <210> 700 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 700

Gly Phe Asn Ile Ser Tyr Ser Ser Met His 15 10

<210> 701 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 701

Gly Phe Asn Ile Ser Tyr Ser Ser Met His 15 10

<210> 702 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 702

Gly Phe Asn Ile Ser Tyr Ser Ser Met His 15 10

<210> 703 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 703

Gly Phe Asn Ile Ser Tyr Ser Ser Met His 15 10

<210> 704 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 704

Gly Phe Asn Ile Ser Tyr Ser Ser Met His 15 10

<210> 705 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<220>

<221> M0D_RES <222> (5)..(5) <223> Ser ou Phe

<220>

<221> M0D_RES <222> (7)..(8) <223> Ser ou Gly

<220>

<221> M0D_RES <222> (9)..(9) <223> Met ou Ile

<400> 705

Gly Phe Asn Ile Xaa Tyr Xaa Xaa Xaa His 15 10

<210> 706 <211> 17 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 706

Ser Ile Tyr Ser Tyr Tyr Ser Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys 15 10 15

Gly

<210> 707 <211> 17 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 707

Ser Ile Tyr Ser Tyr Tyr Ser Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15

Gly

<210> 708 <211> 17 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 708

Ser Ile Tyr Ser Tyr Tyr Ser Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15

Gly

<210> 709 <211> 17 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 709

Ser Ile Tyr Ser Tyr Tyr Ser Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15

Gly

<210> 710 <211> 17 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 710

Ser Ile Tyr Ser Tyr Tyr Ser Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15

Gly

<210> 711 <211> 17 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 711

Ser Ile Tyr Ser Tyr Tyr Ser Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15

Gly

<210> 712 <211> 17 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 712

Ser Ile Tyr Ser Tyr Tyr Ser Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys 15 10 15

Gly

<210> 713 <211> 17 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 713

Ser Ile Tyr Ser Tyr Tyr Ser Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys 15 10 15

Gly

<210> 714 <211> 17 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 714

Ser Ile Tyr Ser Tyr Tyr Ser Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys 15 10 15 Gly <210> 715 <211> 17 <212> PRT <213> Seqüência Artificial <220> <223> Descrição da Seqüência

Peptideo Sintético

<400> 715

Ser Ile Tyr Ser Tyr Tyr Ser Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys 15 10 15

Gly

<210> 716 <211> 17 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 716

Ser Ile Tyr Ser Tyr Tyr Ser Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys 15 10 15

Gly

<210> 717 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 717

Ser Tyr Ser Tyr Ser Glu Ala Leu Asp Tyr 15 10

<210> 718 <211> 11 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 718 Ser Tyr Ser Tyr Tyr Ser Ala Met Asp Val Tyr 15 10

<210> 719 <211> 11 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 719

Ser Tyr Ser Tyr Ser Leu Ala Phe Asp Val Tyr 15 10

<210> 720 <211> 11 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 720

Ser Tyr Ser Tyr Ser Phe Gly Met Asp Val Tyr 15 10

<210> 721 <211> 11 <212> PRT <213> Seqüência

Artificial

<220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 721

Ser Tyr Ser Tyr Arg Met Ala Phe Asp Val Tyr 1 5 10

<210> 722 <211> 11 <212> PRT <213> Seqüência

Artificial

<220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 722

Gly Tyr Ser Trp Phe Asn Ala Ile Asp Val Tyr 15 10

<210> 723 <211> 11 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 723

Ser Tyr Ser Tyr His Leu Gly Met Asp Val Tyr 15 10

<210> 724 <211> 11 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 724

Ser Tyr Ser Tyr Ser Val Gly Met Asp Val Tyr 15 10

<210> 725 <211> 11 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 725

Ser Tyr Ser Tyr His Val Ala Phe Asp Val Tyr 15 10

<210> 726 <211> 11 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 726

Ser Tyr Ser Tyr Phe Leu Ala Met Asp Val Tyr 15 10

<210> 727 <211> 11 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<220>

<221> M0D_RES <222> (1)..(1) <223> Ser ou Gly

<220>

<221> M0D_RES <222> (4)..(4) <223> Tyr ou Trp

<220>

<221> M0D_RES <222> (5) . . (5)

<223> Ser, Tyr, Arg, Phe ou His

<220>

<221> M0D_RES <222> (6)..(6)

<223> Glu, Ser, Leu, Phe, Met, Asn ou Val

<220>

<221> M0D_RES <222> (7).. (7) <223> Ala ou Gly

<220>

<221> M0D_RES

<222> (8) . . (8)

<223> Leu, Met, Phe ou Ile

<400> 727

Xaa Tyr Ser Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Asp Val Tyr 15 10

<210> 728 <211> 10 <212> PRT <213> Seqüência

Artificial

<220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 728

Gln Gln Ser Ser Tyr Ser Ser Leu Ile Thr 15 10

<210> 729 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 729

Gln Gln Ser Ser Tyr Ser Ser Leu Ile Thr 1 5 10

<210> 730 <211> 10 <212> PRT <213> Seqüência

Artificial

<220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 730

Gln Gln Ser Ser Tyr Ser Ser Leu Ile Thr 1 5 10

<210> 731 <211> 10 <212> PRT <213> Seqüência

Artificial

<220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 731

Gln Gln Ser Ser Tyr Ser Ser Leu Ile Thr 1 5 10

<210> 732 <211> 10 <212> PRT <213> Seqüência

Artificial

<220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 732

Gln Gln Ser Ser Tyr Ser Ser Leu Ile Thr 15 10

<210> 733 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético <400> 733

Gln Gln Ser Ser Tyr Ser Ser Leu Ile Thr 1 5 10

<210> 734 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 734

Gln Gln Ser Ser Tyr Ser Ser Leu Ile Thr 15 10

<210> 735 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 735

Gln Gln Ser Ser Tyr Ser Ser Leu Ile Thr 15 10

<210> 736 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 736

Gln Gln Ser Ser Tyr Ser Ser Leu Ile Thr 15 10

<210> 737 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 737

Gln Gln Ser Ser Tyr Ser Ser Leu Ile Thr 15 10 <210> 738 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 738

Gln Gln Ser Ser Tyr Ser Ser Leu Ile Thr 1 5 10

<210> 739 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 739

Gly Phe Asn Ile Ser Ser Ser Tyr Ile His 1 5 10

<210> 740 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 740

Gly Phe Asn Ile Ser Ser Ser Tyr Ile His 1 5 10

<210> 741 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 741

Gly Phe Asn Val Lys Trp Asn Tyr Ile His 1 5 10

<210> 742 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 742

Gly Phe Asn Ile Ser Ser Ser Tyr Ile His 15 10

<210> 743 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 743

Gly Phe Asn Ile Lys Gly Ser Ile Met His 15 10

<210> 744 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 744

Gly Phe Asn Val Lys Thr Gly Leu Ile His 15 10

<210> 745 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 745

Gly Phe Asn Ile Ser Ser Ser Tyr Ile His 15 10

<210> 746 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético <400> 746

Gly Phe Asn Leu Val Ser Ser Leu Met His 1 5 10

<210> 747 <211> 10 <212> PRT <213> Seqüência

Artificial

<220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 747

Gly Phe Asn Val Val Ser Ser Phe Ile His 1 5 10

<210> 748 <211> 10 <212> PRT <213> Seqüência

Artificial

<220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 748

Gly Phe Asn Ile Ser Ser Ser Tyr Ile His 15 10

<210> 749 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<220>

<221> M0D_RES

<222> (4) .. (4)

<223> He, Val ou Leu

<220>

<221> M0D_RES

<222> (5)..(5)

<223> Ser, Lys ou Val

<220>

<221> M0D_RES

<222> (6)..(6)

<223> Ser, Trp, Gly ou Thr

<220>

<221> MOD RES <222> (7) . . (7) <223> Ser, Asn ou Gly

<220>

<221> MOD_RES

<222> (8) .. (8)

<223> Tyr, He, Leu ou Phe

<220>

<221> MOD_RES <222> (9)..(9) <223> Ile ou Met

<400> 749

Gly Phe Asn Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa His 15 10

<210> 750 <211> 17 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 750

Tyr Ile Ser Pro Tyr Leu Ser Ser Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys 15 10 15

Gly

<210> 751 <211> 17 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 751

Phe Ile Ser Pro Tyr Leu Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys 15 10 15

Gly

<210> 752 <211> 17 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético <400> 752

Tyr Ile Ser Pro Tyr Tyr Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys 15 10 15

Gly

<210> 753 <211> 17 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 753

Asp Ile Ala Pro Tyr Leu Gly Thr Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Val Lys 15 10 15

Gly

<210> 754 <211> 17 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 754

Tyr Ile Ser Pro Tyr Tyr Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys 15 10 15

Gly

<210> 755 <211> 17 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 755

Tyr Ile Ser Pro Tyr Tyr Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys 15 10 15

Gly

<210> 756 <211> 17 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 756

His Ile Ser Pro Tyr Leu Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys 15 10 15

Gly

<210> 757 <211> 17 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 757

Tyr Ile Ser Pro Tyr Tyr Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys 15 10 15

Gly <210> 758 <211> 17 <212> PRT <213> Seqüência Artificial <220> <223> Descrição da Seqüência

Peptideo Sintético

<400> 758

Tyr Ile Ser Pro Tyr Tyr Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys 15 10 15

Gly

<210> 759 <211> 17 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 759

Ala Ile Gln Pro Tyr Phe Gly Trp Thr Ile Tyr Ala Asp Ser Val Lys 15 10 15

Gly <210> 760 <211> 17 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<220>

<221> M0D_RES <222> (1) . . (1)

<223> Tyr, Phe, Asp, His ou Ala <220>

<221> MOD_RES

<222> (3)..(3)

<223> Ser, Ala ou Gln

<220>

<221> MOD_RES <222> (6)..(6) <223> Leu, Tyr ou Phe

<220>

<221> MOD_RES <222> (7)..(7) <223> Ser ou Gly

<220>

<221> MOD_RES

<222> (8) . . (8)

<223> Ser, Thr ou Trp

<220>

<221> MOD_RES

<222> (10)..(10)

<223> Ser, Asn, Lys ou Ile

<400> 760

Xaa Ile Xaa Pro Tyr Xaa Xaa Xaa Thr Xaa Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15

Gly

<210> 761 <211> 11 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 761

Glu Tyr Tyr Arg Trp Tyr Thr Ala Ile Asp Tyr 1 5 10 <210> 762 <211> 11 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 762

Glu Tyr Tyr Arg Trp Tyr Thr Ala Ile Asp Tyr 1 5 10

<210> 763 <211> 11 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 763

Glu Tyr Tyr Arg Trp Tyr Thr Ala Ile Asp Tyr 1 5 10

<210> 764 <211> 11 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 764

Glu Tyr Tyr Arg Trp Tyr Thr Ala Ile Asp Tyr 1 5 10

<210> 765 <211> 11 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 765

Glu Tyr Tyr Arg Trp Tyr Thr Ala Ile Asp Tyr 1 5 10

<210> 766 <211> 11 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 766

Glu Tyr Tyr Arg Trp Tyr Thr Ala Ile Asp Tyr 15 10

<210> 767 <211> 11 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 767

Glu Tyr Tyr Arg Trp Tyr Thr Ala Ile Asp Tyr 15 10

<210> 768 <211> 11 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 768

Glu Tyr Tyr Arg Trp Tyr Thr Ala Ile Asp Tyr 15 10

<210> 769 <211> 11 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 769

Glu Tyr Tyr Arg Trp Tyr Thr Ala Ile Asp Tyr 15 10

<210> 770 <211> 11 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético <400> 770

Glu Tyr Tyr Arg Trp Tyr Thr Ala Ile Asp Tyr 1 5 10

<210> 771 <211> 11 <212> PRT <213> Seqüência

Artificial

<220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 771

Glu Tyr Tyr Arg Trp Tyr Thr Ala Ile Asp Tyr 1 5 10

<210> 772 <211> 11 <212> PRT <213> Seqüência

Artificial

<220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 772

Gln Gln Tyr Ser Ser Tyr Ser Ser Leu Phe Thr 1 5 10

<210> 773 <211> 11 <212> PRT <213> Seqüência

Artificial

<220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 773

Gln Gln Tyr Ser Ser Tyr Ser Ser Leu Phe Thr 1 5 10

<210> 774 <211> 11 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 774

Gln Gln Tyr Ser Ser Tyr Ser Ser Leu Phe Thr 1 5 10 <210> 775 <211> 11 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 775

Gln Gln Tyr Ser Ser Tyr Ser Ser Leu Phe Thr 1 5 10

<210> 776 <211> 11 <212> PRT <213> Seqüência

Artificial

<220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 776

Gln Gln Tyr Ser Ser Tyr Ser Ser Leu Phe Thr 1 5 10

<210> 777 <211> 11 <212> PRT <213> Seqüência

Artificial

<220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 777

Gln Gln Tyr Ser Ser Tyr Ser Ser Leu Phe Thr 1 5 10

<210> 778 <211> 11 <212> PRT <213> Seqüência

Artificial

<220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 778

Gln Gln Tyr Ser Ser Tyr Ser Ser Leu Phe Thr 1 5 10

<210> 779 <211> 11 <212> PRT <213> Seqüê

Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 779

Gln Gln Tyr Ser Ser Tyr Ser Ser Leu Phe Thr 15 10

<210> 780 <211> 11 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 780

Gln Gln Tyr Ser Ser Tyr Ser Ser Leu Phe Thr 15 10

<210> 781 <211> 11 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 781

Gln Gln Tyr Ser Ser Tyr Ser Ser Leu Phe Thr 15 10

<210> 782 <211> 11 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 782

Gln Gln Tyr Ser Ser Tyr Ser Ser Leu Phe Thr 15 10

<210> 783 <211> 107 <212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 783

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala 20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro 85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105

<210> 784 <211> 107 <212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 784

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ala 20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Ser Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Thr Thr Pro Pro 85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105

<210> 785 <211> 52 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Oligonucleotideo Sintético

<220>

<221> base modificada <222> (19)..(19) <223> a, c, g, ou t

<220>

<221> base modificada <222> (22)..(33) <223> a, c, g, ou t

<220>

<223> Ver relatório descritivo como depositado para descrição detalhada de substituições e realizações preferidas

<400> 785

gcagcttctg gcttcaacnt cnnnnnnnnn nnnatscact gggtgcgtca gg 52

<210> 786 <211> 67 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Oligonucleotideo Sintético

<220>

<221> base modificada <222> (19)..(20) <223> a, c, g, ou t

<220>

<221> base modificada <222> (25)..(27) <223> a, c, g, ou t

<220>

<221> base modificada <222> (40)..(42) <223> a, c, g, ou t

<220>

<221> base modificada <222> (46) .. (48) <223> a, c, g, ou t

<220>

<223> Ver relatório descritivo como depositado para descrição detalhada de substituições e realizações preferidas

<400> 786

ggcctggaat gggttgcann satcnnnccg tactacggtn nnaccnnnta tgccgatagc 60

gtcaagg 67

<210> 787 <211> 67 <212> DNA <213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Oligonucleotideo Sintético

<220>

<221> base modificada <222> (25)..(27) <223> a, c, g, ou t

<220>

<221> base modificada <222> (34)..(35) <223> a, c, g, ou t

<220>

<221> base modificada <222> (40)..(42) <223> a, c, g, ou t

<220>

<221> base modificada <222> (46)..(48) <223> a, c, g, ou t

<220>

<223> Ver relatório descritivo como depositado para descrição detalhada de substituições e realizações preferidas

<400> 787

ggcctggaat gggttgcata catcnnnccg tacnnsggtn nnaccnnnta tgccgatagc60

gtcaagg 67

<210> 788 <211> 67 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Oligonucleotideo Sintético

<220>

<221> base modificada <222> (19)..(20) <223> a, c, g, ou t

<220>

<221> base modificada <222> (25) .. (27) <223> a, c, g, ou t

<220>

<221> base modificada <222> (34)..(35) <223> a, c, g, ou t

<220>

<221> base modificada <222> (40)..(42) <223> a, c, g, ou t

<220>

<221> base modificada <222> (46) .. (48) <223> a, c, g, ou t

<220>

<223> Ver relatório descritivo como depositado para descrição detalhada de substituições e realizações preferidas

<400> 788

ggcctggaat gggttgcann satcnnnccg tacnnsggtn nnaccnnnta tgccgatagc60

gtcaagg 67

<210> 789 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 789

Gly Phe Asn Val Lys Thr Gly Phe Met His 1 5 10

<210> 790 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 790

Gly Phe Asn Val Lys Thr Gly Phe Ile His 1 5 10

<210> 791 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético <400> 791

Gly Phe Asn Ile Lys Met Val Phe Met His 15 10

<210> 792 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 792

Gly Phe Asn Val Lys Asn Phe Ile Ile His 15 10

<210> 793 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 793

Gly Phe Asn Val Lys Thr Gly Phe Met His 15 10

<210> 794 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 794

Gly Phe Asn Val Lys Arg Gly Phe Met His 15 10

<210> 795 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 795

Gly Phe Asn Leu Lys Thr Gly Phe Ile His 15 10 <210> 796 <211> 10 <212> PRT <213> Seqüência Artificial <220> <223> Descrição da Seqüência

Peptideo Sintético <400> 796

Gly Phe Asn Val Lys Thr Gly Tyr Met His 15 10

<210> 797 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 797

Gly Phe Asn Val Lys Thr Gly Leu Ile His 15 10

<210> 798 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 798

Gly Phe Asn Val Met Ile Gly Ile Ile His 15 10

<210> 799 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 799

Gly Phe Asn Ile Lys Thr Gly Phe Met His 15 10

<210> 800

<211> 10

<212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<220>

<221> MOD_RES

<222> (4)..(4)

<223> Val, Ile ou Leu

<220>

<221> MOD_RES <222> (5)..(5) <223> Lys ou Met

<220>

<221> MOD_RES

<222> (6)..(6)

<223> Thr, Met, Asn, Arg ou Ile

<220>

<221> MOD_RES

<222> (7)..(7)

<223> Gly, Val ou Phe

<220>

<221> MOD_RES

<222> (8)..(8)

<223> Phe, He, Tyr ou Leu

<220>

<221> MOD_RES <222> (9)..(9) <223> Met ou Ile

<400> 800

Gly Phe Asn Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa His 15 10

<210> 801 <211> 17 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 801

Tyr Ile Ser Pro Tyr Tyr Gly Trp Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val Lys 15 10 15

Gly

<210> 802 <211> 17 <212> PRT <213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 802

Tyr Ile Ser Pro Tyr Leu Gly Val Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val Lys 15 10 15

Gly

<210> 803 <211> 17 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 803

Tyr Ile Ser Pro Tyr Asp Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys 15 10 15

Gly

<210> 804 <211> 17 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 804

Tyr Ile Ile Pro Tyr Ser Gly Asn Thr Val Tyr Ala Asp Ser Val Lys 15 10 15

Gly

<210> 805 <211> 17 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 805

Tyr Ile Ser Pro Tyr Ser Gly Arg Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val Lys 15 10 15

Gly <210> 806 <211> 17 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 806

Tyr Ile Ser Pro Tyr Leu Gly Ser Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val Lys 15 10 15

Gly

<210> 807 <211> 17 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 807

Tyr Ile Ser Pro Tyr Trp Gly Ser Thr Thr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 15 10 15

Gly

<210> 808 <211> 17 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 808

Tyr Ile Ser Pro Tyr Tyr Gly Ser Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val Lys 15 10 15

Gly

<210> 809 <211> 17 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 809 Tyr Ile Ser Pro Tyr Phe Gly Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15

Gly

<210> 810 <211> 17 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 810

Tyr Ile Ile Pro Tyr Ser Gly Ser Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15

Gly

<210> 811 <211> 17 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 811

Tyr Ile Thr Pro Tyr Trp Gly Ser Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15

Gly

<210> 812 <211> 17 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<220>

<221> M0D_RES

<222> (3)..(3)

<223> Ser, Ile ou Thr

<220>

<221> M0D_RES <222> (6)..(6)

<223> Tyr, Leu, Asp, Ser ou Trp <220>

<221> MOD RES <222> (8)..(8)

<223> Trp, Vai, Ser, Asn, Arg ou Tyr <220>

<221> MOD_RES <222> (10)..(10)

<223> Arg, Asn, Vai, Thr, Ser ou Lys

<400> 812

Tyr IIe Xaa Pro Tyr Xaa Gly Xaa Thr Xaa Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15

Gly

<210> 813 <211> 11 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 813

Glu Tyr Tyr Arg Trp Tyr Thr Ala Ile Asp Tyr 1 5 10

<210> 814 <211> 11 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 814

Glu Tyr Tyr Arg Trp Tyr Thr Ala Ile Asp Tyr 1 5 10

<210> 815 <211> 11 <212> PRT

<220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 815

Glu Tyr Tyr Arg Trp Tyr Thr Ala Ile Asp Tyr 1 5 10

<210> 816 <211> 11 <212> PRT <213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 816

Glu Tyr Tyr Arg Trp Tyr Thr Ala Ile Asp Tyr 15 10

<210> 817 <211> 11 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 817

Glu Tyr Tyr Arg Trp Tyr Thr Ala Ile Asp Tyr 15 10

<210> 818 <211> 11 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 818

Glu Tyr Tyr Arg Trp Tyr Thr Ala Ile Asp Tyr 15 10

<210> 819 <211> 11 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 819

Glu Tyr Tyr Arg Trp Tyr Thr Ala Ile Asp Tyr 15 10

<210> 820

<211> 11

<212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético <400> 820

Glu Tyr Tyr Arg Trp Tyr Thr Ala Ile Asp Tyr 1 5 10

<210> 821 <211> 11 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 821

Glu Tyr Tyr Arg Trp Tyr Thr Ala Ile Asp Tyr 1 5 10

<210> 822 <211> 11 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 822

Glu Tyr Tyr Arg Trp Tyr Thr Ala Ile Asp Tyr 1 5 10

<210> 823 <211> 11 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 823

Glu Tyr Tyr Arg Trp Tyr Thr Ala Ile Asp Tyr 1 5 10

<210> 824 <211> 11 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 824

Glu Tyr Tyr Arg Trp Tyr Thr Ala Ile Asp Tyr 15 10 <210> 825 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<220>

<221> MOD_RES

<222> (4) . . (4)

<223> Vai, Phe, Leu ou Ile

<220>

<221> M0D_RES <222> (5)..(5) <223> Ser ou Tyr

<220>

<221> M0D_RES <222> (7)..(8) <223> Ser ou Tyr

<220>

<221> M0D_RES <222> (9)..(9) <223> Ile ou Met

<400> 825

Gly Phe Asn Xaa Xaa Tyr Xaa Xaa Xaa His 15 10

<210> 826 <211> 17 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<220>

<221> M0D_RES <222> (3)..(3) <223> Ser ou Tyr

<220>

<221> M0D_RES

<222> (4) . . (4)

<223> Pro ou Ser

<220>

<221> M0D_RES <222> (7) . . (7) <223> Ser ou Gly <220>

<221> MOD_RES <222> (8) .. (8) <223> Ser ou Tyr

<220>

<221> MOD_RES <222> (10)..(10) <223> Ser ou Tyr

<400> 826

Ser Ile Xaa Xaa Tyr Tyr Xaa Xaa Thr Xaa Tyr Ala Asp Ser Val Lys 15 10 15

Gly

<210> 827 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptídeo Sintético

<220>

<221> MOD_RES <222> (5)..(5) <223> Ser ou Phe

<220>

<221> MOD_RES <222> (7) .. (8) <223> Ser ou Gly

<220>

<221> MOD_RES <222> (9)..(9) <223> Ile ou Met

<400> 827

Gly Phe Asn Ile Xaa Tyr Xaa Xaa Xaa His 15 10

<210> 828 <211> 17 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 828

Ser Ile Tyr Ser Tyr Tyr Ser Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly

<210> 829 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<220>

<221> M0D_RES <222> (1)..(1) <223> Ser ou Gly

<220>

<221> M0D_RES <222> (4)..(4) <223> Tyr ou Trp

<220>

<221> M0D_RES <222> (5)..(5)

<223> Ser, Tyr, Arg, Phe ou His

<220>

<221> M0D_RES <222> (6)..(6)

<223> Glu, Ser, Leu, Phe, Met, Asn ou Val

<220>

<221> M0D_RES <222> (7)..(7) <223> Ala ou Gly

<220>

<221> M0D_RES

<222> (8)..(8)

<223> Leu, Met, Phe ou Ile

<400> 829

Xaa Tyr Ser Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Asp Tyr 15 10

<210> 830 <211> 11 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<220>

<221> MOD RES <222> (3)..(7) <223> Ser ou Tyr

<220>

<221> MOD_RES

<222> (8)..(8)

<223> Leu, Ser, Pro ou Tyr

<220>

<221> MOD_RES <222> (9)..(9)

<223> Este resíduo pode ou não estar presente <220>

<221> MOD_RES

<222> (10)..(10)

<223> Phe, He, Val ou Leu

<400> 830

Gln Gln Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Pro Xaa Thr 1 5 10

<210> 831 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<220>

<221> M0D_RES

<222> (4)..(4)

<223> Vai, Ile ou Phe

<220>

<221> M0D_RES <222> (5)..(8) <223> Ser ou Tyr

<220>

<221> M0D_RES <222> (9)..(9) <223> Ile ou Met

<400> 831

Gly Phe Asn Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa His 1 5 10

<210> 832

<211> 17

<212> PRT

<213> Seqüência Artificial

<220> <223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<220>

<221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> Ser ou Tyr

<220>

<221> MOD_RES <222> (3)..(3) <223> Ser ou Tyr

<220>

<221> MOD_RES <222> (4)..(4) <223> Pro ou Ser

<220>

<221> MOD_RES <222> (5)..(6) <223> Ser ou Tyr

<220>

<221> MOD_RES <222> (7)..(7) <223> Ser ou Gly

<220>

<221> MOD_RES <222> (8) .. (8) <223> Ser ou Tyr

<220>

<221> MOD_RES <222> (10)..(10) <223> Ser ou Tyr

<400> 832

Xaa Ile Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Thr Xaa Tyr Ala Asp Ser Val Lys 15 10 15

Gly

<210> 833 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<220>

<221> M0D_RES <222> (4)..(4) <223> He, Val ou Leu <220>

<221> MOD_RES <222> (5)..(5) <223> Ser, Lys ou Val

<220>

<221> MOD_RES

<222> (6)..(6)

<223> Ser, Trp, Gly ou Thr

<220>

<221> MOD_RES

<222> (7) . . (7)

<223> Ser, Asn ou Gly

<220>

<221> MOD_RES

<222> (8)..(8)

<223> Tyr, He, Leu ou Phe

<220>

<221> MOD_RES <222> (9)..(9) <223> Ile ou Met

<400> 833

Gly Phe Asn Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa His 15 10

<210> 834 <211> 17 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<220>

<221> M0D_RES <222> (1)..(1)

<223> Tyr, Phe, Asp, His ou Ala

<220>

<221> MOD_RES

<222> (3)..(3)

<223> Ser, Ala ou Gln

<220>

<221> MOD_RES <222> (6)..(6) <223> Leu, Tyr ou Phe

<220> <221> MOD_RES <222> (7)..(7) <223> Ser ou Gly

<220>

<221> MOD_RES <222> (8)..(8) <223> Ser, Thr ou Trp

<220>

<221> MOD_RES

<222> (10)..(10)

<223> Ser, Asn, Lys ou Ile

<400> 834

Xaa Ile Xaa Pro Tyr Xaa Xaa Xaa Thr Xaa Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15

Gly

<210> 835 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<220>

<221> M0D_RES

<222> (4)..(4)

<223> He, Val ou Leu

<220>

<221> M0D_RES <222> (5)..(5) <223> Lys ou Met

<220>

<221> M0D_RES <222> (6)..(6)

<223> Thr, Met, Asn, Arg ou Ile <220>

<221> M0D_RES

<222> (7)..(7)

<223> Gly, Val ou Phe

<220>

<221> M0D_RES

<222> (8) .. (8)

<223> Tyr, lie, Leu ou Phe

<220>

<221> MOD RES <222> (9)..(9) <223> Ile ou Met

<400> 835

Gly Phe Asn Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa His 1 5 10

<210> 836 <211> 18 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<220>

<221> M0D_RES

<222> (4) . . (4)

<223> Ser, Ile ou Thr

<220>

<221> MOD_RES <222> (7) . . (7)

<223> Leu, Tyr, Asp, Ser ou Trp <220>

<221> MOD_RES <222> (9)..(9)

<223> Trp, Vai, Ser, Asn, Arg ou Tyr <220>

<221> MOD_RES <222> (11)..(11)

<223> Arg, Asp, Vai, Thr, Ser ou Lys <400> 836

Ala Tyr Ile Xaa Pro Tyr Xaa Gly Xaa Thr Xaa Tyr Ala Asp Ser Val 1 5 10 15

Lys Gly

<210> 837 <211> 13 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 837

Ser Arg Glu Tyr Tyr Arg Trp Tyr Thr Ala Ile Asp Tyr 1 5 10

<210> 838 <211> 18 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<220>

<221> MOD_RES <222> (2)..(2)

<223> Tyr, Phe, Asp, His ou Ala <220>

<221> MOD_RES

<222> (4)..(4)

<223> Ser, Ala ou Gln

<220>

<221> MOD_RES

<222> (7)..(7)

<223> Leu, Tyr and Phe

<220>

<221> MOD_RES <222> (8)..(8) <223> Ser ou Gly

<220>

<221> MOD_RES

<222> (9)..(9)

<223> Ser, Thr ou Trp

<220>

<221> MOD_RES

<222> (11)..(11)

<223> Ser, Asn, Lys ou Ile

<400> 838

Ala Xaa Ile Xaa Pro Tyr Xaa Xaa Xaa Thr Xaa Tyr Ala Asp Ser Val 15 10 15

Lys Gly

<210> 839 <211> 14 <212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 839

Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly 15 10

<210> 840 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 840

Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 15 10

<210> 841 <211> 13 <212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 841

Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 1 5 10

<210> 842 <211> 13 <212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 842

Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 1 5 10

<210> 843 <211> 14 <212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 843

Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly 1 5 10

<210> 844 <211> 13 <212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 844

Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 15 10

<210> 845 <211> 13 <212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 845

Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 15 10

<210> 846 <211> 13 <212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 846

Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 1 5 10

<210> 847 <211> 14 <212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 847

Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser 1 5 10

<210> 848 <211> 13 <212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 848

Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 1 5 10

<210> 849 <211> 13 <212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 849

Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 1 5 10

<210> 850 <211> 13 <212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 850

Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 1 5 10

<210> 851 <211> 14 <212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 851

Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser 1 5 10

<210> 852 <211> 13 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 852 Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 15 10

<210> 853 <211> 13 <212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 853

Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 15 10

<210> 854 <211> 14 <212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 854

Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser 15 10

<210> 855 <211> 13 <212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 855

Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 15 10

<210> 856 <211> 13 <212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 856

Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 15 10

<210> 857 <211> 13 <212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 857

Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 15 10

<210> 858 <211> 32 <212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 858

Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu 15 10 15 Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg 20 25 30

<210> 859 <211> 32 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 859

Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu 1 5 10 15

Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg 20 25 30

<210> 860 <211> 31 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 860

Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu 15 10 15

Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 20 25 30

<210> 861 <211> 30 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 861

Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu 15 10 15

Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 20 25 30

<210> 862 <211> 32 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 862

Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Lys 15 10 15

Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg 20 25 30

<210> 863 <211> 32 <212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 863

Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Lys 15 10 15

Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg 20 25 30

<210> 864 <211> 31 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 864

Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Lys 15 10 15

Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 20 25 30

<210> 865 <211> 30 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 865

Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Lys 15 10 15

Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 20 25 30

<210> 866 <211> 32 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 866

Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln 15 10 15

Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg 20 25 30

<210> 867 <211> 32 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 867

Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln 15 10 15

Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg 20 25 30

<210> 868 <211> 31 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 868

Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln 15 10 15

Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 20 25 30

<210> 869 <211> 30 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 869

Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln 15 10 15

Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 20 25 30

<210> 870 <211> 32 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 870

Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln 15 10 15

Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ser Arg 20 25 30

<210> 871 <211> 32 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 871

Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln 15 10 15

Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ser Arg 20 25 30

<210> 872 <211> 31 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 872

Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln 15 10 15 Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ser 20 25 30

<210> 873 <211> 32 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 873

Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln 1 5 10 15

Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg 20 25 30

<210> 874 <211> 32 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 874

Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln 1 5 10 15

Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg 20 25 30

<210> 875 <211> 31 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 875

Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln 1 5 10 15

Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 20 25 30

<210> 876 <211> 30 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 876

Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln 1 5 10 15

Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 20 25 30

<210> 877 <211> 11 <212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 877

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 1 5 10

<210> 878 <211> 11 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 878

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 1 5 10

<210> 879 <211> 11 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 879

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 1 5 10

<210> 880 <211> 11 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 880

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 1 5 10

<210> 881 <211> 11 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 881

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 1 5 10

<210> 882 <211> 11 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 882

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 1 5 10

<210> 883 <211> 11 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 883 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 15 10

<210> 884 <211> 11 <212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 884

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 15 10

<210> 885 <211> 11 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 885

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 15 10

<210> 886 <211> 11 <212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 886

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 15 10

<210> 887 <211> 11 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 887

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 15 10

<210> 888 <211> 11 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 888

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 15 10

<210> 889 <211> 11 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 889

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 15 10 <210> 890 <211> 11 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 890

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 1 5 10

<210> 891 <211> 11 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 891

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 1 5 10

<210> 892 <211> 11 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 892

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 1 5 10

<210> 893 <211> 11 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 893

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 1 5 10

<210> 894 <211> 11 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 894

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 1 5 10

<210> 895 <211> 11 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 895

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 1 5 10

<210> 896 <211> 15 <212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 896

Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr 15 10 15

<210> 897 <211> 15 <212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 897

Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr 15 10 15

<210> 898 <211> 15 <212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 898

Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr 15 10 15

<210> 899 <211> 15 <212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 899

Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr 15 10 15

<210> 900 <211> 32 <212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 900

Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 15 10 15

Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys 20 25 30

<210> 901 <211> 32 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 901

Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 15 10 15 Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys 20 25 30

<210> 902 <211> 32 <212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 902

Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 1 5 10 15

Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys 20 25 30

<210> 903 <211> 32 <212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 903

Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 1 5 10 15

Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys 20 25 30

<210> 904 <211> 10 <212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 904

Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 1 5 10

<210> 905 <211> 10 <212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 905

Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 1 5 10

<210> 906 <211> 10 <212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 906

Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 1 5 10

<210> 907 <211> 10 <212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 907

Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 15 10

<210> 908 <211> 11 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo Sintético

<400> 908

Glu Tyr Tyr Arg Trp Tyr Thr Ala Ile Asp Tyr 15 10

Claims (67)

1. ANTICORPO ISOLADO, que se liga especificamente a uma primeira poliubiquitina compreendendo uma primeira ligação de lisina, caracterizado pelo fato de que o anticorpo não se liga especificamente a uma segunda poliubiquitina compreendendo uma segunda ligação de lisina, e no qual a primeira ligação na lisina difere da segunda ligação na lisina.

2. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato do anticorpo se ligar especificamente com a poliubiquitina ligada a lisina 6, com a poliubiquitina ligada a lisina 11, com a poliubiquitina ligada a lisina 27, com a poliubiquitina ligada a lisina 29, com a poliubiquitina ligada a lisina 33, com a poliubiquitina ligada a lisina 48 ou com a poliubiquitina ligada a lisina 63.

3. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a primeira poliubiquitina está ligada a lisina 48.

4. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que a segunda poliubiquitina está ligada a lisina 63.

5. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a primeira poliubiquitina está ligada a lisina 63.

6. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que a segunda poliubiquitina está ligada a lisina 48.

7. ANTICORPO ISOLADO, que se liga especificamente tanto à primeira poliubiquitina, que compreende uma primeira ligação de lisina, quanto a uma segunda poliubiquitina que compreende uma segunda ligação de lisina, caracterizado pelo fato de que o anticorpo não se liga especificamente com a monoubiquitina, e o anticorpo se liga a segunda poliubiquitina com uma afinidade de ligação substancialmente menor quando comparada com a afinidade de ligação para a primeira poliubiquitina.

8. ANTICORPO ISOLADO, que se liga especificamente a poliubiquitina ligada a Iisina 48, caracterizado pelo fato do anticorpo não se ligar especificamente a monoubiquitina.

9. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende de pelo menos uma seqüência hipervariável (HVR) selecionada a partir de HVR-H1, HVR-H2, HVR- H3 e HVR-L3 de qualquer uma das SEQ ID No: 1-25, 151-175, 265-279, 392- -459 e 695-704; SEQ ID No: 27-51, 177-201, 281-295, 461-528 e 706-715; SEQ ID No: 53-77, 203-227, 297-311, 530-597 e 717-726; e SEQ ID No: 313-327 e -728-737, respectivamente.

10. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 8, compreendendo de pelo menos uma seqüência selecionada a partir de HVR- H1, HVR-H2, HVR-H3, caracterizado pelo fato de que o HVR-H1 compreende seqüência de aminoácidos abcdefghij (SEQ ID No: 825), no qual, o aminoácido é glicina; o aminoácido b é fenilalanina; o aminoácido c é asparagina; o aminoácido d é um aminoácido selecionado entre valina, fenilalanina, Ieucina e isoleucina; o aminoácido e é selecionado entre serina e tirosina; o aminoácido f é tirosina; o aminoácido g é um aminoácido selecionado entre serina e tirosina; o aminoácido h é selecionado entre serina e tirosina; o aminoácido i é selecionado entre isoleucina e metionina e o aminoácido j é histidina; no qual, HVR-H2 compreende a seqüência de aminoácidos klmnopqrstuvwxyza' (SEQ ID No: 826), no qual, o aminoácido k é serina; o aminoácido I é isoleucina; o aminoácido m é selecionado entre serina e tirosina; o aminoácido η é selecionado entre prolina e serina; o aminoácido o é tirosina; o aminoácido ρ é tirosina; o aminoácido q é selecionado entre serina e glicina; o aminoácido r é selecionado entre serina e tirosina; o aminoácido s é treonina, o aminoácido t é selecionado entre serina e tirosina; o aminoácido u é tirosina; o aminoácido ν é alanina; o aminoácido w é ácido aspártico; o aminoácido χ é serina; o aminoácido y é valina; o aminoácido ζ é lisina, o aminoácido a' é glicina, e no qual, HVR-H3 compreende a seqüência de aminoácidos b' c' d" e' f 'g' h' i' j' k' Γ, no qual o aminoácido b' é selecionada entre ácido glutâmico, serina, glicina e tirosina ; o aminoácido c' é selecionado entre glicina, tirosina, serina e asparagina; o aminoácido d' é selecionado entre tirosina, serina, lisina, fenilalanina e ácido glutâmico; o aminoácido e' é selecionado entre serina, tirosina, glicina e triptofano; o aminoácido f é selecionado entre glutamina, tirosina, serina e glicina; o aminoácido g' é selecionado entre glicina, serina, tirosina, metionina e alanina; o aminoácido h' é selecionado entre glicina, alanina, prolina e isoleucina; o aminoácido i' é selecionado entre fenilalanina, isoleucina, metionina, alanina e leucina, ou não está presente; o aminoácido j' é fenilalanina ou não está presente; o aminoácido k' é ácido aspártico e o aminoácido I1 é tirosina.

11. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 8, compreendendo de pelo menos uma seqüência selecionada a partir de HVR- H1, HVR-H2, HVR-H3, caracterizado pelo fato de que o HVR-H1 compreende a seqüência de aminoácidos abcdefghij (SEQ ID No: 827), no qual, o aminoácido a é glicina; o aminoácido b é fenilalanina; o aminoácido c é asparagina; o aminoácido d é isoleucina, o aminoácido e é selecionado entre serina e fenilalanina; o aminoácido f é tirosina; o aminoácido g é selecionado entre serina e glicina; o aminoácido h é selecionado a partir de serina e glicina; o aminoácido i é selecionado entre a isoleucina e metionina, e o aminoácido j é histidina; ; no qual, HVR-H2 compreende seqüência de aminoácidos k I m η o ρ qrstuvwxyza' (SEQ ID No: 828), no qual, o aminoácido k é serina; o aminoácido I é isoleucina; o aminoácido m é tirosina; o aminoácido η é serina; o aminoácido o é tirosina; o aminoácido ρ é tirosina; o aminoácido q é serina; o aminoácido r é tirosina; o aminoácido s é treonina, o aminoácido t é serina; o aminoácido u é tirosina; o aminoácido ν é alanina; o aminoácido w é ácido aspártico; o aminoácido χ é serina; o aminoácido y é valina; o aminoácido ζ é lisina e o aminoácido a' é glicina; e no qual, HVR-H3 compreende seqüência de aminoácidos b 'c' d 'e' f 'g' h T j 'k' (SEQ ID No: 829), no qual, o aminoácido b' é selecionado entre serina e glicina; o aminoácido c' é tirosina; o aminoácido d' é serina; o aminoácido e' é selecionado entre tirosina e triptofano, o aminoácido f é selecionado entre serina, tirosina, arginina, fenilalanina e histidina; o aminoácido g1 é selecionado entre ácido glutâmico, serina, leucina, fenilalanina, metionina, asparagina, e valina; o aminoácido h' é selecionado entre alanina e glicina; o aminoácido i1 é selecionado entre leucina, metionina, fenilalanina e isoleucina; o aminoácido j' é ácido aspártico e o aminoácido k' é tirosina.

12. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende de uma seqüência HVR-L3 que compreende a seqüência de aminoácidos m1 η' o 'p' q 'r' s' t 'u' v' w' (SEQ ID No: 830), no qual, o aminoácido m' é glutamina; o aminoácido n' é glutamina; o aminoácido o' é selecionado entre serina e tirosina; o aminoácido p' é selecionado entre serina e tirosina; o aminoácido q' é selecionado entre serina e tirosina; o aminoácido r' é selecionado entre serina e tirosina; o aminoácido s' é selecionado entre serina e tirosina; o aminoácido t' selecionado entre leucina, serina, prolina e tirosina; o aminoácido u' é prolina ou não está presente; o aminoácido v' é selecionado entre fenilalanina, isoleucina, valina e leucina, e o aminoácido w' é treonina.

13. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 8, compreendendo uma seqüência HVR-L3 que compreende a seqüência de aminoácidos SEQ ID No: 728.

14. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 10, compreendendo das seqüências HVR-H1, HVR-H2, HVR-H3, correspondentes a aquelas estabelecidas para os clones apu01, apu02, apu03, apu04, apu05, apu06, apu07, apu08, apu09, apu10, apu11, apu12, apu13, apu14 ou apu15 nas figuras 10A e 10B.

15. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 11, compreendendo das seqüências HVR-H1, HVR-H2, HVR-H3, correspondentes a aquelas estabelecidas para os clones apu2.01, apu2.02, apu2.03, apu2.04, apu2.05, apu2.06, apu2.07, apu2.08, apu2.09 ou apu2.10 na figura 16A.

16. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de compreender uma seqüência HVR-L1 da SEQ ID No: 79, e uma seqüência HVR-L2 da SEQ ID No: 80, e uma seqüência HVR-L3 correspondente à seqüência HVR-L3 estabelecida para clones apu01, Apu02, apu03, apu04, apu05, apu06, apu07, apu08, apu09, apu10, apu11, apu12, apu13, apu14 ou apu15 na figura 10C.

17. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de compreender uma seqüência HVR-L1 da SEQ ID No: 79, e uma seqüência HVR-L2 da SEQ ID No: 80, e uma seqüência HVR-L3 correspondente à seqüência HVR-L3 estabelecida para clones apu2.01, Apu2.02, apu2.03, apu2.04, apu2.05, apu2.06, apu2.07, apu2.08, apu2.09, ou apu2.10 na Figura 16b.

18. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de compreender uma seqüência HVR-H1 da SEQ ID No: 269, uma seqüência HVR-H2 da SEQ ID No: 285, uma seqüência HVR-H3 da SEQ ID No: 301, uma seqüência HVR-L1 da SEQ ID No: 79, uma seqüência HVR-L2 da SEQ ID No: 80 e uma seqüência HVR-L3 da SEQ ID No: 317.

19. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de compreender uma seqüência HVR-H1 da SEQ ID No: 701, uma seqüência HVR-H2 da SEQ ID No: 712, uma seqüência HVR-H3 da SEQ ID No; 723, uma seqüência HVR-L1 da SEQ ID No: 79, uma seqüência HVR-L2 da SEQ ID No: 80 e uma seqüência HVR-L3 da SEQ ID No: 734.

20. ANTICORPO ISOLADO, que se liga especificamente a poliubiquitina ligada a Iisina 63, em que o anticorpo não se liga especificamente à monoubiquitina.

21. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende de pelo menos uma seqüência hipervariável (HVR) selecionada a partir de HVR-H1, HVR-H2, HVR- H3 e HVR-L3 de qualquer uma das SEQ ID No 81-89, 229-239, 329-336, 599- -629 e 739-748; NOS SEQ ID: 91-99, 241-251, 338-345, 631-661 e 750-759; SEQ ID Nos: 101-109, 253-263, 347-354, 663-693 e 761-770; e SEQ ID Nos: -356-363 e 772-781, respectivamente.

22. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 20, compreendendo de pelo menos uma seqüência selecionada a partir de HVR- H1, HVR-H2, HVR-H3, caracterizado pelo fato de que o HVR-H1 compreende a seqüência de aminoácidos abcdefghij (SEQ ID No: 831), no qual, o aminoácido a é glicina; o aminoácido b é fenilalanina; o aminoácido c é asparagina; o aminoácido d é selecionado entre valina, isoleucina e fenilalanina, o aminoácido e é selecionado entre serina e tirosina; o aminoácido f é selecionado entre serina e tirosina; o aminoácido g é selecionado entre serina e tirosina; o aminoácido h é selecionado entre serina e tirosina; o aminoácido i é selecionado entre isoleucina e metionina, e o aminoácido j é histidina; ; no qual HVR-H2 compreende seqüência de aminoácidos k I m η o ρ qrstuvwxyza' (SEQ ID No: 832), no qual, o aminoácido k é selecionado entre serina e tirosina; o aminoácido I é isoleucina; o aminoácido m é selecionado entre serina e tirosina; o aminoácido η é selecionado entre prolina e serina; o aminoácido é selecionado entre serina e tirosina; o aminoácido ρ é selecionado entre serina e tirosina; o aminoácido q é selecionado entre serina e glicina; o aminoácido r é selecionado entre serina e tirosina; o aminoácido s é treonina, o aminoácido t é selecionado entre serina e tirosina; o aminoácido u é tirosina; o aminoácido ν é alanina; o aminoácido w é ácido aspártico; o aminoácido χ é serina; o aminoácido y é valina; o aminoácido ζ é Iisina e o aminoácido a' é glicina; e no qual, HVR-H3 compreende a seqüência de aminoácidos b' c' d' e' f 'g' h' i' j' k' l' m' n' o' p' q' r' s' t' u' v', onde, o aminoácido b' é selecionado entre de serina, ácido glutâmico, glicina, e triptofano; o aminoácido c' é selecionado entre de glicina, tirosina, isoleucina, glutamina e serina; o aminoácido d' é selecionado entre de tirosina, metionina, glicina e isoleucina, o aminoácido e é selecionado entre tirosina, arginina, fenilalanina, triptofano, alanina e prolina; o aminoácido f é selecionado entre tirosina, triptofano, serina e glicina; o aminoácido g 'é selecionado entre de glutamina, tirosina, serina, fenilalanina e valina; o aminoácido h' é selecionado entre de glicina, treonina, triptofano, Iisina e prolina; o aminoácido i1 é selecionado entre de tirosina, alanina, triptofano, ácido glutâmico, prolina e serina ; o aminoácido j' é selecionado entre triptofano, isoleucina, tirosina e alanina; o aminoácido k' é selecionado entre triptofano, tirosina, glicina, ácido aspártico ou não está presente; o aminoácido I' é selecionado entre tirosina, serina, fenilalanina e triptofano ou não está presente; o aminoácido m' é selecionado entre tirosina, ácido aspártico, serina ou não está presente; o aminoácido n1 é selecionado entre tirosina e alanina ou não está presente; o aminoácido o' é selecionado entre treonina, serina, valina, glicina e tirosina ou não está presente; o aminoácido p' é selecionado entre glicina, ácido aspártico, serina, metionina e tirosina ou não está presente, o aminoácido q' é selecionado entre tirosina, alanina e glicina ou não está presente; o aminoácido r 'é selecionado entre tirosina, leucina e glicina ou não está presente; o aminoácido s' é glicina ou não está presente; o aminoácido t' é selecionado entre metionina e leucina ou não está presente; o aminoácido u' é ácido aspártico, e o aminoácido v' é tirosina.

23. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 20, compreendendo de pelo menos uma seqüência selecionada a partir de HVR- H1, HVR-H2, HVR-H3, caracterizado pelo fato de que o HVR-H1 compreende a seqüência de aminoácidos abcdefghij (SEQ ID No: 833), no qual, o aminoácido a é glicina; o aminoácido b é fenilalanina; o aminoácido c é asparagina; o aminoácido d é selecionado entre isoleucina, valina e leucina, o aminoácido e é selecionado entre serina, Iisina e valina; o aminoácido f é selecionado entre serina, triptofano, glicina e treonina; o aminoácido g é selecionado entre serina, asparagina e glicina; o aminoácido h é selecionado entre tirosina, isoleucina, leucina e fenilalanina; o aminoácido i é selecionado entre isoleucina e metionina e o aminoácido j é histidina; no qual, HVR-H2 compreende seqüência de aminoácidos klmnopqrstuvwxyza' (SEQ ID No: 834), no qual, o aminoácido k é selecionado entre tirosina, fenilalanina, ácido aspártico, histidina e alanina; o aminoácido I é isoleucina; o aminoácido m é selecionado entre serina, alanina e glutamina; o aminoácido η é prolina; o aminoácido o é tirosina; o aminoácido ρ é selecionado entre leucina, tirosina e fenilalanina; o aminoácido q é selecionado entre serina e glicina; o aminoácido ré selecionado entre serina, treonina e triptofano; o aminoácido s é treonina, o aminoácido t é selecionado entre serina, asparagina, Iisina e isoleucina; o aminoácido u é tirosina; o aminoácido ν é alanina; o aminoácido w é ácido aspártico; o aminoácido χ é serina; o aminoácido y é valina; o aminoácido ζ é lisina; e o aminoácido a' é glicina; e no qual, HVR-H3 compreende seqüência de aminoácidos c' d* e' f g' h' i' j' k' I' m' n' o' (SEQ ID No: 837), no qual, onde o aminoácido c1 é serina; o aminoácido d' é arginina, o aminoácido e1 é ácido glutâmico; o aminoácido f é tirosina; o aminoácido g' é tirosina; o aminoácido h' é arginina, o aminoácido i' é triptofano; o aminoácido j' é tirosina; o aminoácido k' é treonina; o aminoácido Γ é alanina; o aminoácido m" é isoleucina; o aminoácido n1 é ácido aspártico; e o aminoácido o' é tirosina.

24. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende de uma seqüência HVR-L3 que compreende a seqüência de aminoácidos w' x1 y' ζ'Α B C D E F G, na qual, o aminoácido w 'é glutamina; o aminoácido x' é glutamina; o aminoácido y 'é selecionado entre serina e tirosina; o aminoácido z" é selecionado entre serina e tirosina; o aminoácido A é selecionado entre serina e tirosina; o aminoácido B é selecionado entre serina e tirosina; o aminoácido C é selecionado entre prolina, serina e leucina; o aminoácido D é selecionado entre serina, prolina e tirosina, ou não está presente; o aminoácido E é selecionado entre leucina e fenilalanina, ou não está presente; o aminoácido F é selecionado entre fenilalanina, valina, treonina, e isoleucina; e o aminoácido G é selecionado entre arginina, treonina, e fenilalanina.

25. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 20, compreendendo uma seqüência HVR-L3 que compreende da seqüência de aminoácidos QQYSSYSSLFT (SEQ ID No: 772).

26. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 22, compreendendo das seqüências HVR-H1, HVR-H2, HVR-H3, correspondentes a aquelas estabelecidas para os clones apu17, apu18, apu19, apu20, apu21, apu22, apu23 e apu24 nas figuras 11A e 11B.

27. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 23, compreendendo das seqüências HVR-H1, HVR-H2, HVR-H3, correspondentes a aquelas estabelecidas para os clones apu2.11, apu2.12, apu2.13, apu2.14, apu2.15, apu2.16 , Apu2.17, apu2.18, apu2.19, e apu2.20 na figura 17A.

28. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de compreender uma seqüência HVR-L1 da SEQ ID No: 79, e uma seqüência HVR-L2 da SEQ ID No: 80, e uma seqüência HVR-L3 correspondente à seqüência HVR-L3 estabelecida para clones apu17, apu18, apul9, apu20, apu21, apu22, apu23 e apu24 na figura 11C.

29. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de compreender uma seqüência HVR-L1 da SEQ ID No: 79, e uma seqüência HVR-L2 da SEQ ID No: 80, e uma seqüência HVR-L3 correspondente à seqüência HVR-L3 estabelecida para clones apu2.11, apu2.12, apu2.13, apu2.14, apu2.15, apu2.16, apu2.17, apu2.18, apu2.19, e apu2.20 na figura 17B.

30. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de compreender uma seqüência HVR-H1 da SEQ ID No: 330, uma seqüência HVR-H2 da SEQ ID No: 339, uma seqüência HVR-H3 da SEQ ID No: 348, uma seqüência HVR-L1 da SEQ ID No: 79, uma seqüência HVR-L2 da SEQ ID No: 80 e uma seqüência HVR-L3 da SEQ ID No: 357.

31. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de compreender uma seqüência HVR-H1 da SEQ ID No: 739, uma seqüência HVR-H2 da SEQ ID No: 750, uma seqüência HVR-H3 da SEQ ID No: 761, uma seqüência HVR-L1 da SEQ ID No: 79, uma seqüência HVR-L2 da SEQ ID No: 80 e uma seqüência HVR-L3 da SEQ ID No: 772.

32. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de compreender uma seqüência HVR-H1 da SEQ ID No: 740, uma seqüência HVR-H2 da SEQ ID No: 751, uma seqüência HVR-H3 da SEQ ID No: 762, uma seqüência HVR-L1 da SEQ ID No: 79, uma seqüência HVR-L2 da SEQ ID No: 80 e uma seqüência HVR-L3 da SEQ ID No: 773.

33. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 20, compreendendo de pelo menos uma seqüência selecionada a partir de HVR- H1, HVR-H2, HVR-H3, caracterizado pelo fato de que o HVR-H1 compreende a seqüência de aminoácidos abcdefghij (SEQ ID No: 835), no qual, o aminoácido a é glicina; o aminoácido b é fenilalanina; o aminoácido c é asparagina; o aminoácido d é selecionado entre isoleucina, valina e leucina, o aminoácido e é selecionado entre Iisina e metionina; o aminoácido f é selecionado entre treonina, metionina, asparagina, arginina e isoleucina; o aminoácido g é selecionado entre glicina, valina e fenilalanina; o aminoácido h é selecionado entre tirosina, isoleucina, leucina e fenilalanina; o aminoácido i é selecionado entre isoleucina e metionina; e o aminoácido j é histidina; no qual, HVR-H2 compreende seqüência de aminoácidos klmnopqrstuvwxyza' b' (SEQ ID No: 836), no qual, o aminoácido k é alanina; o aminoácido I é tirosina; o aminoácido m é isoleucina; o aminoácido η é selecionado entre serina, isoleucina e treonina; o aminoácido o é prolina; o aminoácido ρ é tirosina; o aminoácido q é selecionado entre leucina, tirosina, ácido aspártico, serina e triptofano; o aminoácido r é glicina, o aminoácido s é selecionado entre triptofano, valina, serina, asparagina, arginina e tirosina; o aminoácido t é treonina, o aminoácido u é selecionado entre arginina , asparagina, valina, treonina, serina e lisina, o aminoácido ν é tirosina, o aminoácido w é alanina; o aminoácido χ é ácido aspártico; o aminoácido y é serina; o aminoácido ζ é valina; o aminoácido a' é lisina; e o aminoácido b' é glicina; e no qual, HVR-H3 compreende seqüência de aminoácidos c' d' e' f g' h' i' j' k' Γ m' n' o' (SEQ ID No: 837), no qual, onde o aminoácido c' é serina; o aminoácido d' é arginina, o aminoácidos e' é ácido glutâmico; o aminoácido f é tirosina; o aminoácido g' é tirosina; o aminoácido h' é arginina, o aminoácido i' é triptofano; o aminoácido j' é tirosina; o aminoácido k' é treonina; o aminoácido Γ é alanina; o aminoácido m' é isoleucina; o aminoácido n' é ácido aspártico; e o aminoácido o' é tirosina.

34. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 33, compreendendo das seqüências HVR-H1, HVR-H2, HVR-H3, correspondentes a aquelas estabelecidas para os clones apu3.01, apu3.02, apu3.03, apu3.04, apu3.05, apu3.06, Apu3.07, apu3.08, apu3.09, apu3.10, e apu3,11 nas Figuras 23A e 23B.

35. ANTICORPO, de acordo com uma das reivindicações 33 ou 34, caracterizado pelo fato de compreender uma seqüência HVR-L1 da SEQ ID No: 79, uma seqüência HVR-L2 da SEQ ID No: 80 e uma seqüência HVR-L3 da SEQ ID No: 777.

36. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de compreender uma seqüência HVR-H1 da SEQ ID No: 744, uma seqüência HVR-H2 da SEQ ID No: 755, uma seqüência HVR-H3 da SEQ ID No: 766, uma seqüência HVR-L1 da SEQ ID No: 79, uma seqüência HVR-L2 da SEQ ID No: 80 e uma seqüência HVR-L3 da SEQ ID No: 777.

37. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de compreender uma seqüência HVR-H1 da SEQ ID No: 79, uma seqüência HVR-H2 da SEQ ID No: 807, uma seqüência HVR-H3 da SEQ ID No: 819, uma seqüência HVR-L1 da SEQ ID No: 79, uma seqüência HVR-L2 da SEQ ID No: 80 e uma seqüência HVR-L3 da SEQ ID No: 777.

38. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de compreender uma seqüência HVR-H1 da SEQ ID No: 701, uma seqüência HVR-H2 da SEQ ID No: 712, uma seqüência HVR-H3 da SEQ ID No: 723, uma seqüência HVR-L1 da SEQ ID No: 79, uma seqüência HVR-L2 da SEQ ID No: 80 e uma seqüência HVR-L3 da SEQ ID No: 734.

39. ANTICORPO ISOLADO que se liga ao mesmo determinante antigênico na poliubiquitina, de acordo com de uma das reivindicações de 1 a 38, caracterizado pelo fato do anticorpo não se ligar especificamente a monoubiquitina.

40. ANTICORPO ISOLADO que compete para se ligara a poliubiquitina, com os anticorpos de qualquer uma das reivindicações de 1 a -38, caracterizado pelo fato do anticorpo não se ligar especificamente a monoubiquitina.

41. ANTICORPO, de acordo com uma das reivindicações de 1 a 38, caracterizado pelo fato do anticorpo não se ligar especificamente a monoubiquitina.

42. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 41, caracterizado pelo fato de que o anticorpo inibe a degradação de proteínas poliubiquitinadas.

43. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 41, caracterizado pelo fato de que o anticorpo modula pelo menos uma via de sinalização mediada pela poliubiquitina.

44. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 41, caracterizado pelo fato de que o anticorpo inibe pelo menos uma via de sinalização mediada pela poliubiquitina

45. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 41, caracterizado pelo fato de que o anticorpo estimula pelo menos uma via de sinalização mediada pela poliubiquitina.

46. MOLÉCULA DE ÁCIDO NUCLÉICO, que codifica o anticorpo de uma das reivindicações de 1 a 38.

47. VETOR, que possuí o ácido nucléico da reivindicação 46.

48. CÉLULA HOPEDEIRA, que compreende o vetor da reivindicação 47.

49. LINHAGEM CELULAR, capaz de produzir os anticorpos anticorpo de uma das reivindicações de 1 a 38.

50. MÉTODO PARA A PRODUÇÃO DE UM ANTICORPO, de acordo com uma das reivindicações de 1 a 38, compreendendo uma cultura célula hospedeira, que possuí uma molécula de ácidos nucléicos que codifica os anticorpos sob condições nas quais o anticorpo é produzido.

51. COMPOSIÇÃO, na qual consta uma quantidade eficaz de anticorpo conforme descrito em uma das reivindicações de 1 a 38 e um veículo farmaceuticamente aceitável.

52. MÉTODO PARA IDENTIFICAR A PRESENÇA DE POLIUBIQUITINA, ou proteína poliubiquitinada em uma amostra, compreendendo da exposição da amostra a pelo menos um anticorpo descrito em uma das reivindicações de 1 a 38.

53. MÉTODO PARA TRATAR UMA DOENÇA, ou condição patológica, associada à não regulação da poliubiquitina em um paciente, em que o método compreende em administração ao paciente uma quantidade eficaz de pelos menos um anticorpo descrito em uma das reivindicações de 1 a -38.

54. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 53, caracterizado pelo fato do paciente ser um paciente mamífero.

55. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 54, caracterizado pelo fato do paciente ser humano.

56. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 53, caracterizado pelo fato da doença ser câncer, desordem muscular, doença genética relacionada com a via da ubiquitina, doença imune/inflamatória e doença neurológica.

57. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 56, caracterizado pelo fato da doença ser selecionada de carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma, leucemia, distrofia muscular, esclerose múltipla, esclerose lateral amiotrófica, fibrose cística, síndrome de Angelman, síndrome de Liddle, doença de Alzheimer, mal de Parkinson, doença de Pick e doença de Paget.

58. MÉTODO PARA DETERMINAR A PRESENÇA DE UMA POLIUBIQUITINA, ou proteína poliubiquitinada em uma amostra suspeita de conter poliubiquitina ou proteína poliubiquitinada, que consiste na exposição da amostra a pelo menos um anticorpo da invenção, e determinando a ligação de pelo menos um anticorpo descrito em uma das reivindicações de 1 a 38 e determinar a ligação de pelo menos um anticorpo à poliubiquitina ou proteína poliubiquitinada na amostra.

59. MÉTODO PARA SEPARAR AS PROTEÍNAS POLIUBIQUITINADAS, das proteínas não poliubiquitinadas em uma amostra, que consiste na exposição da amostra a pelo menos um anticorpo descrito em uma das reivindicações de 1 a 38.

60. MÉTODO PARA DETERMINAR A FUNÇÃO E/OU ATIVIDADE DA POLIUBIQUITINA EM UMA CÉLULA, compreendendo a exposição da célula a pelo menos um anticorpo descrito em uma das reivindicações de 1 a 38, e determinando o efeito da etapa mencionada de exposição na célula.

61. MÉTODO PARA DETERMINAR A FUNÇÃO E/OU ATIVIDADE DA POLIUBIQUITINA EM UMA AMOSTRA, consistindo na exposição da amostra a pelo menos um anticorpo descrito em uma das reivindicações de 1 a 38, e determinando o efeito da etapa mencionada de exposição na amostra. Um anticorpo isolado que se liga especificamente a uma primeira poliubiquitina compreendendo pelo menos uma ligação isopeptídica no primeiro resíduo de Iisina na primeira posição de aminoácido de uma molécula ubiquitina, caracterizado pelo fato do anticorpo não se ligar especificamente a uma segunda poliubiquitina compreendendo de pelo menos uma ligação isopeptídica no segundo resíduo de Iisina na segunda posição do aminoácido de outra molécula de ubiquitina, e no qual o primeiro e o segundo tem posições de aminoácido diferentes.

62. ANTICORPO ISOLADO, de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que o anticorpo se liga especificamente a um epítopo na poliubiquitina ligada a Iisina 63.

63. ANTICORPO ISOLADO, de acordo com a reivindicação 62, caracterizado pelo fato de que o epítopo inclui resíduos na primeira e segunda subunidade da ubiquitina da poliubiquitina ligada a Iisina 63.

64. ANTICORPO ISOLADO, de acordo com a reivindicação 63, caracterizado pelo fato de que o epítopo inclui pelo menos um resíduo na primeira subunidade selecionado de Glu-18, Pro-19, Ser-20, Asp-21, Thr-55, Leu-56, Ser-57, Asp-58, Asn-60, lle-61 e Gln-62.

65. ANTICORPO ISOLADO, de acordo com a reivindicação 63, caracterizado pelo fato de que o epítopo inclui pelo menos um resíduo na primeira subunidade selecionado de Leu-8, Thr-9, Glu-34, Gly-35, IIe-36, Pro- -37, Asp-39, Gln-40 , Leu-71, Arg-72, Leu-73, Arg-74 e Gly-75.

66. ANTICORPO ISOLADO, de acordo com a reivindicação 63, caracterizado pelo fato de que o epítopo inclui pelo menos um resíduo na primeira subunidade selecionado de Glu-18, Pro-19, Ser-20, Asp-21, Thr-55, Leu-56, Ser-57, Asp-58 , Asn-60, lle-61 e Gln-62, e, pelo menos, um resíduo em uma segunda subunidade da ubiquitina selecionado a partir de Leu-8, Thr- -9, Glu-34, Gly-35, lle-36, Pro-37, Asp-39, Gln-40, Leu-71, Arg-72, Leu-73, Arg- -74 e Gly-75.

67. FRAGMENTO DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO, do anticorpo de uma das reivindicações de 1 a 38 ou 62 a 66.