BRPI0620755A2 - adenovìrus adipogênicos como um biomarcardor para doenças - Google Patents

Abstract

ADENOVìRUS ADIPOGêNICOS COMO UM BIO-MARCADOR PARA DOENçAS. Esta invenção refere-se à relação entre infecção com adenovíius adipogênicos, tal como adenovírus-36 (Ad-36) e as etiologias de obesidade e cânceres relacionados à obesidade e outras doenças. Adicionalmente, a invenção refere-se a testar um sujeito para estado de Ad-36 e usar o estado de Ad-36 como um marcador para a presença de câncer, para prever o risco futuro de desenvolver cânceres, tal como câncer de seio e câncer de prósta- ta, e/ou prever a agressividade e prognóstico desses cânceres.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "ADENOVÍRUS ADIPOGÊNICOS COMO UM BIOMARCADOR PARA DOENÇAS".

Referência Cruzada a Pedidos Relacionados

Este pedido refere-se e reivindica benefício sob 35 U.S.C. § 119(e) para o pedido provisório ns série 60/753,402, depositado em 27 de Dezembro de 2005, a descrição do qual é aqui incorporada em sua totalidade.

Campo da Invenção

Esta invenção refere-se à relação entre infecção com adenovírus adipogênicos, tal como, por exemplo, adenovírus-36 (Ad-36), e as etiologias de obesidade e cânceres relacionados à obesidade e outras doenças. Mais particularmente, a invenção refere-se à metodologia de prever se um sujeito é pré-disposto a desenvolver câncer de seio ou câncer de próstata. Adicio- nalmente, a invenção refere-se a testar um sujeito por estado de Ad-36 e usar o estado de Ad-36 como um marcador para a presença de câncer, para prever o risco futuro de desenvolver tal câncer, e/ou prever a agressividade e prognóstico de câncer.

Antecedentes da Invenção

Há um aumento simultâneo dramático na prevalência de obesi- dade e de certos tipos de câncer. Uma epidemia mundial de obesidade ace- lerou dramaticamente iniciando em torno de 1980. Nos Estados Unidos, a prevalência de obesidade em adultos mais do que dobrou nos últimos 20 anos de 1980 a 2000 (de 15% para 31%), enquanto que a prevalência au- mentou somente levemente nos 20 anos anteriores de 1960 a 1980 (de 13,5% para 15%). A prevalência de obesidade em crianças triplicou de apro- ximadamente 1970 a 2000. Igualmente, os cânceres de seio, próstata, colo, e fígado também aumentaram rapidamente em prevalência nos últimos a- nos.

Mudanças nos hormônios reprodutivos em obesidade foram su- geridas para executar uma função na associação de câncer de seio e de próstata (entre outros) e na agressividade desses cânceres. Entretanto, mu- danças nos hormônios reprodutivos não podem explicar cânceres tal como câncer de colo, renal, ou pancreático, que não estão sob controle hormonal. Uma outra possibilidade para a ligação entre obesidade e câncer é a função imunológica diminuída vista em indivíduos obesos. As pessoas obesas têm uma resposta de anticorpos menor à vacinação com hepatite B do que pessoas vacinadas que não são obesas. O sistema imunológico é crucial para inibir o crescimento de neoplasmas, assim não seria surpreen- dente se esse fosse o mecanismo de aumento de cânceres de muitos tipos em obesidade. Entretanto, os adenovírus são bem conhecidos para diminuir a função imunológica como uma forma de melhorar sua replicação no hos- pedeiro, incluindo hospedeiros humanos. Mais relevante, o adenovírus aviá- rio SMAM-1, que foi relatado como causador de obesidade, tem um maior impacto em diminuir a função imunológica de galinhas. Assim, há uma liga- ção direta entre um adenovírus que causa obesidade e que também prejudi- ca a função imunológica. O inventor relatou que o SMAM-1 está associado com a obesidade em seres humanos, adicionando uma ligação de adenoví- rus à obesidade humana.

Alguns serotipos de adenovírus humanos são conhecidos como sendo oncogênicos, e induzem tumores em ratos ou hamsters. Os serotipos de adenovírus são divididos por grupos. Os adenovírus de Grupo A (por e- xemplo, Ad-12, Ad-18) são altamente oncogênicos, produzindo tumores na maior partes dos animais nos 4 meses; os adenovírus de Grupo B (por e- xemplo, Ad-3, Ad-7) são fracamente oncogênicos, induzindo tumores na maior parte dos animais nos 4 a 18 meses; os vírus de Grupo D são menos oncogênicos, mas o serotipo-9 eficientemente induz tumores mamários nos 3 a 5 meses. Houve vasto trabalho em câncer induzido por adenovírus, mas até agora, não houve evidência de que os adenovírus causem câncer em seres humanos.

Se os adenovírus causam câncer em seres humanos, é provável que eles façam isso alterando a expressão de genes no hospedeiro que permitem que o crescimento desregulado de células ocorra. Muitos tais mar- cadores de tumor foram identificados. Alguns são devido a variações genéti- cas. O câncer de seio hereditário foi ligado a mutações na linha germinativa em um alelo de genes de suscetibilidade à alta penetração tal como BRCA1, BRCA2, CHEK 2, ΤΡ53 ou PTEN. É possível que as infecções por adenoví- rus facilitem o câncer nesses indivíduos geneticamente suscetíveis. Entre- tanto, os adenovírus podem contribuir para oncogênese espontânea indu- zindo a expressão de vários oncogenes ou suprimindo a expressão de ge- nes supressores de tumor do hospedeiro. Entre as alterações devido a ade- novírus que se acreditam contribuir para o câncer são mudanças na proteína quinase dependente de DNA1 proteína de ligação com ácido graxo, mTOR, p16, p53, proteína PDZ, fosfatidilinositol 3-quinase, PML, timidina quinase, e Zip quinase. Como será descrito a seguir, o gene Ad-36 E4orf1 foi mostrado como estando envolvido na produção de obesidade por um efeito direto no metabolismo do adipócito. A região E4orf1 de adenovírus-5 humanos foi mostrada como sendo um oncogene, e uma publicação recente relatou que Ad-5 produz obesidade em camundongos. Essas descobertas mostram uma ligação direta entre obesidade e câncer, com ambos sendo devido a um a- denovírus humano, e fornecem o mecanismo igualmente via um gene viral.

O consenso geral de muitos investigadores no campo de pes- quisa de câncer foi que os adenovírus não contribuem para a etiologia de câncer em seres humanos. Portanto, seria um avanço tecnológico grande demonstrar que os adenovírus adipogênicos, tal como Ad-36, estão associa- dos com cânceres relacionados à obesidade, tal como cânceres de seio e de próstata.

Sumário da Invenção

Um aspecto da invenção refere-se a um método de prever se um sujeito é pré-disposto a desenvolver uma doença relacionada a adenovírus adipogênico. A metodologia inclui obter uma amostra do sujeito e determinar se ele está infectado com o adenovírus adipogênico filtrando pela presença de anticorpos específicos ao adenovírus adipogênico na amostra e determi- nar a presença de anticorpos específicos ao adenovírus adipogênico na a· mostra. Os anticorpos podem ser específicos a um ou mais peptídeos codifi- cados pelas seqüências de ácido nucléico ID SEQ NO. 5, ID SEQ NO. 6, e ID SEQ NO. 7. Além disso, a etapa de filtração pode ser executada usando um método selecionado a partir do grupo que consiste de ensaio de neutrali- zação de soro e ELISA.

Em um aspecto adicional, os adenovírus adipogênicos podem incluir o adenovírus tipo 5, adenovírus tipo 36, e adenovírus tipo 37. Adicio- nalmente, a doença relacionada a adenovírus adipogênico pode incluir cân- cer, câncer de próstata, câncer de seio, disfunção pancreática, doença pan- creática, diabetes, doença pulmonar, disfunção do cérebro e do sistema ner- voso, e disfunção adrenal.

Em ainda um aspecto adicional, o sujeito pode ser um humano ou um animal. Além disso, a amostra pode ser uma amostra biológica, tal como fluido corporal, uma amostra de tecido, uma amostra de órgão, fezes, sangue, saliva, e qualquer combinação desses.

Um outro aspecto da invenção refere-se a um método de impedir doença relacionada a adenovírus adipogênico em um sujeito administrando uma vacina antiadenovírus adipogênico ao sujeito. A vacina antiadenovírus adipogênico pode incluir uma dose efetiva de um ingrediente ativo tal como um adenovírus tipo 36 morto, um adenovírus tipo 36 inativo, uma proteína ou seqüência de peptídeos codificando uma proteína de revestimento de ade- novírus 36 ou fragmentos dessa, uma seqüência de ácido nucléico codifi- cando uma proteína de revestimento de adenovírus 36 ou um fragmento dessa, uma proteína E1A de adenovírus tipo 36, um vírus não patogênico geneticamente modificado, e um vírus não patogênico.

Em um aspecto adicional, a vacina pode ser administrada ao sujeito de forma intranasal, oral, intravenosa, intramuscular, subcutânea e/ou peritoneal. O sujeito pode ser um humano ou um animal. A doença adipogê- nica pode incluir câncer, câncer de próstata, câncer de seio, disfunção pan- creática, doença pancreática, diabetes, doença pulmonar, disfunção do cé- rebro e do sistema nervoso, e disfunção adrenal.

Um outro aspecto da invenção refere-se a um método para de- terminar a agressividade do câncer em um sujeito. A metodologia inclui obter uma amostra do sujeito e determina se ele está infectado com o adenovírus adipogênico filtrando pela presença de anticorpos específicos ao adenovírus adipogênico na amostra e determinar a presença de anticorpos específicos ao adenovírus adipogênico na amostra tal que a presença dele se correla- cione com um câncer agressivo. Os anticorpos podem ser específicos a um ou mais peptídeos codificados pelas seqüências de ácido nucléico ID SEQ NO. 5, ID SEQ NO. 6, e ID SEQ NO. 7. Além disso, a etapa de filtração pode ser executada usando um método selecionado a partir do grupo que consiste de ensaio de neutralização de soro e ELISA.

Em um aspecto adicional, o adenovírus adipogênico pode inclui adenovírus tipo 5, adenovírus tipo 35, adenovírus tipo 37. Adicionalmente, o câncer pode incluir câncer de seio, de próstata, de útero, de ovário, de colo, de rim, de pâncreas, e de fígado.

Em ainda um aspecto adicional, o sujeito pode ser um humano ou um animal. Além disso, a amostra pode ser uma amostra biológica, tal como fluido corporal, uma amostra de tecido, uma amostra de órgão, fezes, sangue, saliva, e qualquer combinação desses.

Características, vantagens e modalidades adicionais da inven- ção podem ser apresentadas ou aparentes a partir da consideração da se- guinte descrição detalhada, desenhos e reivindicações. Além disso, entende- se que ambos o sumário anterior da invenção e a seguinte descrição deta- lhada são exemplificados e pretendem fornecer explicação adicional sem limitar o escopo da invenção como reivindicada.

Breve Descrição dos Desenhos

Os desenhos em anexo,que são incluídos para fornecer um en- tendimento adicional da invenção, são incorporados e constituem uma parte desta especificação, ilustram modalidades da invenção e juntos com a des- crição detalhada servem para explicar os princípios da invenção. Nenhuma tentativa é feita para mostrar detalhes estruturais da invenção em mais deta- lhes do que pode ser necessário para um entendimento fundamental da in- venção e várias formas nas quais ela pode ser praticada.

A figura 1 é uma coloração BODIPY de células 3T3-L1 5 dias pós-tratamento MDI'. Essa figura mostra triglicerídeos em células 3T3-L1 in- fectadas com Ad-36 versus não infectadas in vitro. As células de controle mostram uma mancha de gordura BODIPY moderada, enquanto as células infectadas com Ad-36 têm aproximadamente duas vezes a quantidade de triglicerídeos, mostrando que bioquímica do adipócito mudou.

A figura 2 é um gráfico que mostra os efeitos de infecção espon- tânea com Ad-36 em macacos rhesus alimentados à vontade. Se comparado ao período antes de um macaco se tornar infectado, uma vez que a infecção foi notada (designada T), houve um aumento constante em peso corporal que ainda estava elevando em aproximadamente 18 meses.

A figura 3 é um gráfico que mostra um aumento no peso corporal de macacos infectados com Ad-36. Se comparado a macacos não infecta- dos, macacos infectados ganharam aproximadamente quatro vezes mais peso em aproximadamente sete meses.

A figura 4 é um gráfico que mostra uma diminuição no colesterol sérico em micos infectados com Ad-36. O colesterol sérico começou a cair imediatamente depois da infecção e por aproximadamente 10 semanas. Isso é significativamente diferente do que a linha base em macacos infectados. Não há mudança em macacos não infectados.

A figura 5 é um gel que mostra a presença de DNA de Ad-36 em tecido adiposo de micos infectados usando um ensaio PCR aninhado. A fai- xa 1 é DNA de Ad-36, as faixas 2-4 não mostram DNA de Ad-36 em gordura de macacos não infectados, e as faixas 5-7 mostram a presença de DNA de Ad-36 em todos os macacos infectados.

A figura 6 é um gel que mostra DNA de Ad-36 no fígado (faixas superiores) e tecido muscular (faixas inferiores) de micos infectados usando ensaio PCR aninhado. O DNA de Ad-36 de macacos infectados é visto nas faixas 7-9 de tecido do fígado e tecido muscular e não está presente nas faixas 4-6 de macacos não infectados. A faixa 2 é Ad-36 de cultura, a faixa 3 é marcador.

A figura 7 é um gel que mostra DNA de Ad-36 em tecido cerebral e muscular de animais infectados por ensaio PCR aninhado. As faixas superiores são dè tecido cerebral de micos, as faixas inferiores são de tecido muscular. O DNA de Ad-36 de micos infectados é claramente visto nas faixas 8-9 e mais ligei- ramente na faixa 7. O DNA de Ad-36 não está presente nas faixas 4-6 de micos não infectados. A faixa 2 é controle positivo de cultura de Ad-36.

A figura 8 é um gel que mostra DNA de Ad-36 em tecido adiposo de humanos usando ensaio PCR aninhado (faixas inferiores). Esse gel mos- tra DNA de Ad-36 em tecido adiposo de micos nas faixas superiores (repeti- ção de dados na figura 5: faixas 4-6 negativo de micros sob controle, faixas 7-9 DNA de Ad-36 de micos infectados). Nas faixas inferiores, o DNA de Ad- 36 é visto em 2 das 6 amostras de tecido adiposo visceral humano obtido de cadáveres em autópsia (faixa 2 é controle positivo, faixas 6-7 são Ad-36 po- sitivo, faixas 4, 5, 8, 9 são negativas).

A figura 9 é um gráfico que mostra os efeitos de múltiplos ade- novírus humanos na gordura corporal total de galinhas. Ad-2 e Ad-31 não aumentaram a gordura corporal, mas Ad-37 teve um efeito marcado.

A figura 10 é um gráfico que mostra os efeitos de múltiplos ade- novírus humanos em gordura visceral de galinhas. Ad-2 e Ad-31 não aumen- taram a gordura corporal, mas Ad-37 teve um efeito marcado.

A figura 11 é um gráfico que mostra a ingestão de alimentos em animais expostos a múltiplos adenovírus humanos. Não houve diferenças em ingestão cumulativa de alimentos entre os grupos, ainda indivíduos infec- tados com Ad-37 se tornaram obesos, enquanto indivíduos infectados com Ad-2 ou Ad-31 não.

A figura 12 é uma tabela que mostra Ad-5 humano que produziu obesidade em camundongos. Também, a gordura corporal aumentou em quase 3 vezes.

A figura 13 é uma tabela que mostra a presença de anticorpos séricos a Ad-36 humano em pessoas de três cidades americanas. Uma mé- dia de aproximadamente 30% de pessoas obesas foi infectada com Ad-36 versus aproximadamente 11% de pessoas não obesas que não foram infec- tadas com Ad-36.

A figura 14 é um gráfico que mostra o índice de massa corporal em 502 indivíduos de três cidades americanas de acordo com o estado de infecção com Ad-36. Geralmente, o IMC foi aproximadamente 9 unidades maior em pessoas infectadas versus pessoas não infectadas (p < 0,0001). Os indivíduos infectados de ambos os grupos de obesos e não obesos eram significativamente mais pesados do que os não infectados em cada grupo.

A figura 15 é uma tabela que mostra uma comparação de pares de gêmeos discordantes para infecção com Ad-36. Dos 89 pares de gê- meos, 26 eram discordantes. Os gêmeos infectados com Ad-36 eram mais pesados e mais gordos do que seus co-gêmeos não infectados.

A figura 16 é um gel que mostra a presença de DNA de Ad-36 em tecido de câncer de próstata.

A figura 17 é um gel que mostra a presença de DNA de Ad-36 em macacos.

Descrição Detalhada da Invenção

Entende-se que a presente invenção não está limitada à meto- dologia particular, protocolos, dispositivos, aparelhos, materiais, e reagentes, etc. descritos aqui, à medida que esses podem variar. Entende-se também que a terminologia usada aqui é usada para o propósito de descrever moda- lidades particulares somente, e não pretende limitar o escopo da presente invenção. Deve-se notar que como usado aqui e nas reivindicações em ane- xo, as formas singulares "um" e "o" incluem referência plural a menos que o contexto claramente dite o contrário. Assim, por exemplo, uma referência a "uma partícula de vírus" é uma referência a uma ou mais partículas de vírus e equivalentes desses conhecidos na técnica e assim por diante.

A menos que de outra forma definido, todos os termos técnicos e científicos usados aqui têm os mesmos significados do que o usualmente entendido por um versado na técnica à qual esta invenção pertence. Os mé- todos, dispositivos e materiais preferenciais são descritos, embora quaisquer métodos e materiais similares ou equivalentes àqueles descritos aqui pos- sam ser usados na pratica ou teste da presente invenção. Todas as referên- cias citadas aqui são incorporadas por referência em sua totalidade.

Quaisquer valores numéricos citados aqui incluem todos os valo- res do valor menor ao valor maior em aumentos de uma unidade já que há uma separação de pelo menos duas unidades entre qualquer valor menor e qualquer valor maior. Como um exemplo, se é determinado que a concen- tração de um componente ou valor de uma variável de processo tal como, por exemplo, dosagem, diluição, e seus similares, é, por exemplo, de 1 a 90, especificamente 20 a 80, mais especificamente de 30 a 70, pretende-se que os valores tal como 15 a 85, 22 a 68, 43 a 51, 30 a 32, etc. sejam expressa- mente enumerados nesta especificação. Para valores que são menores do que um, uma unidade é considerada como sendo 0,0001, 0,001, 0,01 ou 0,1 como apropriado. Esses são somente exemplos do que é especificamente pretendido, e todas as combinações possíveis de valores numéricos entre o menor valor e o maior valor enumeradas são consideradas como expressa- mente determinadas nesta aplicação de uma maneira similar.

Além disso, fornece-se imediatamente abaixo uma seção "Defi- nição", onde certos termos relacionados à invenção são definidos especifi- camente para esclarecimento, mas todos da definição são consistentes com como um técnico versado entenderia esses termos. Métodos, dispositivos e materiais particulares são descritos, embora quaisquer métodos e materiais similares ou equivalentes àqueles descritos aqui possam ser usados na pra- tica ou teste da invenção.

Definição

Ad-2 é adenovírus tipo 2

Ad-5 é adenovírus tipo 5

Ad-31 é adenovírus tipo 31

Ad-36 é adenovírus tipo 36

Ad-37 é adenovírus tipo 37

IMC é índice de massa corporal

FAS é sintetase de ácido graxo

PPAR é receptores ativados por proliferador de peroxissoma

CEBP é proteína de ligação de intensificador de CCAAT

O termo "adenovírus adipogênico" como usado aqui geralmente se refere a adenovírus que são capazes de estimular um aumento na produ- ção de lipídeos em células, tecidos e/ou órgãos ligando a máquina celular em hospedeiros infectados para ligar a produção do hospedeiro de enzimas lipogênicas que então produzem excesso de ácido graxos e promovem ar- mazenamento de gordura com as células infectadas. Os adenovírus adipo- gênicos incluem sem limitação Ad-5, Ad-36 e Ad-37.

O termo "IMC" como usado aqui geralmente se refere a uma medição estatística do peso de uma pessoa em escala de acordo com a al- tura. O IMC pode ser definido como o peso corporal do indivíduo dividido pelo quadrado da altura e pode ser expresso na unidade kg/m2. O IMC pode ser usado como a ferramenta de filtração para identificar possíveis proble- mas de peso para adultos e crianças. Entretanto, de modo a determinar se o excesso de peso é um risco à saúde, um profissional de saúde pode neces- sitar executar avaliações adicionais, tal como medições de espessura da dobra de pele, avaliações de moldes, atividade física, histórico familiar, rela- ção quadril-cintura, infecção com um adenovírus adipogênico, e outras filtra- ções de saúde apropriadas. Para adultos de 20 anos de idade e mais velhos, o IMC pode ser interpretado usando categorias de estado de peso padrão que são as mesmas para todas as idades e para ambos homens e mulheres. Alternativamente, para crianças e adolescentes, a interpretação do IMC é ambos específicos da idade e do sexo. Por exemplo, um adulto tendo um (i) IMC menor do que aproximadamente 18,5 porcento pode ser considerado abaixo do peso, (ii) um IMC que está na faixa de aproximadamente 18,5 a aproximadamente 24,9 pode ser considerado um peso normal, (iii) um IMC na faixa de aproximadamente 25 a aproximadamente 29,9 pode ser conside- rado sobrepeso, e (iv) um IMC maior do que aproximadamente 30,0 pode ser considerado obeso.

O termo "relação quadril-cintura" refere-se a uma medição que pode ser usada para auxiliar a determinar obesidade. A distribuição de gor- dura é avaliada dividindo-se o tamanho da cintura pelo tamanho do quadril. Por exemplo, um indivíduo com uma cintura de aproximadamente 76,2 cm (30 polegadas) e um quadril de aproximadamente 101,6 cm (40 polegadas) teria uma relação de aproximadamente 0,75 e um indivíduo com uma cintura de aproximadamente 104,14 cm (41 polegadas) e quadril de aproximada- mente 99,06 cm (39 polegadas) teria uma relação de aproximadamente 1,05. Quanto mais alta a relação, mais alto o risco de doença cardíaca e ou- tras desordens relacionadas à obesidade.

Uma "amostra biológica" refere-se a uma amostra de tecido ou fluido de um ser humano ou animal, incluindo, mas não limitada a plasma, soro, fluido espinhal, fluido linfático, as seções externas da pele, tratos respi- ratório, intestinal e geniturinário, lágrimas, saliva, células sangüíneas, tumo- res, órgãos, tecido e amostra de constituintes de cultura de célula in vitro.

Um ácido nucléico "isolado" ou "substancialmente puro" (por e- xemplo, DNA, RNA, ou um polímero misturado), por exemplo, é um que é substancialmente separado de outros componentes celulares que natural- mente acompanham uma seqüência ou proteína animal ou humana nativa, por exemplo, ribossomos, polimerases, muitas outras seqüências e proteí- nas de genoma animal ou humano. O termo abrange uma seqüência de áci- do nucléico ou proteína que foi removida de seu ambiente natural, e inclui isolados de DNA recombinante óu clonado e análogos quimicamente sinteti- zados ou análogos biologicamente sintetizados por sistemas heterólogos.

O termo "imunogênico" geralmente refere-se a uma vacina anti- obesidade que tem a capacidade de provocar em um animal imunizado, uma resposta imune que resulta em neutralizar anticorpos contra um vírus vivo causando obesidade, que pode infectar a pessoa depois da administração da vacina.

O termo "anticorpo" refere-se a anticorpos, fragmentos de diges- tão, partes específicas e variações dessas, incluindo imitações de anticorpos ou compreendendo partes de anticorpos que imitam a estrutura e/ou função de um anticorpo ou fragmento específico ou parte desse, incluindo anticor- pos de cadeia única e fragmentos desses. A invenção abrange anticorpos e fragmentos de anticorpos capazes de se ligar a uma molécula biológica (tal como antígeno ou receptor), tal como proteína de revestimento fibroso de adenovírus, e especificamente, Ad-35, ou partes desse.

O termo "seqüência de ácido nucléico" inclui um oligonucleotí- deo, nucleotídeo, ou polinucleotídeo, e fragmentos desses, e DNA ou RNA de origem genômica ou sintética que pode ser de cadeia única ou de cadeia dupla, e representam o filamento senso ou anti-sentido, para ácido nucléico- peptídeo (PNA), ou para qualquer material tipo DNA ou tipo RNA, de origem natural ou sintética.

Fragmentos: incluem qualquer parte de um peptídeo heterólogo ou seqüência de ácido nucléico. Os fragmentos de peptídeo heterólogo re- têm pelo menos uma característica estrutural ou funcional dos polipeptídeos heterólogos do sujeito. Os fragmentos da seqüência de ácido nucléico são maiores do que aproximadamente 60 nucleotídeos de comprimento, e mais preferencialmente, incluem fragmentos que são pelo menos aproximada- mente 100 nucleotídeos, pelo menos aproximadamente 1.000 nucleotídeos, e pelo menos aproximadamente 10.000 nucleotídeos de comprimento.

Complementar ou complementaridade: como usado aqui, inclui a ligação natural de polinucleotídeos sob condições de temperatura e de sal permissivas por emparelhamento de base. Por exemplo, a seqüência "A-G- T" se liga à seqüência complementar "T-C-A".

A complementaridade entre duas moléculas de cadeia única po- de ser "parcial", na qual somente alguns dos ácidos nucléicos se ligam, ou pode ser completa quando a complementaridade total existe entre as molé- culas de cadeia única. O grau de complementaridade entre filamentos de ácido nucléico tem efeitos significativos na eficiência e resistência de hibridi- zação entre filamentos de ácido nucléico. Isso é de particular importância em reações de amplificação, que dependem da ligação entre os filamentos de ácido nucléico e o projeto e uso de moléculas.

Equivalente funcional: uma proteína ou molécula de ácido nu- cléico que possui características funcionais ou estruturais que são substan- cialmente similares a uma proteína heteróloga, polipeptídeo, enzima ou áci- do nucléico. Um equivalente funcional de uma proteína pode conter modifi- cações dependendo da necessidade de tais modificações paa o desempe- nho de uma função específica. O termo "equivalente funcional" pretende in- cluir os "fragmentos", "mutações", "híbridos", "variações", "análogos", ou "de- rivados químicos" de uma molécula.

Purificação de proteína: amplamente definida, qualquer processo pelo qual as proteínas são separadas de outros elementos ou compostos com base em carga, peso molecular, ou afinidade de ligação.

Substancialmente purificado: Como usado aqui, inclui seqüên- cias de ácido nucléico ou aminoácido que são removidas de seu ambiente natural, isoladas ou separadas, e estão pelo menos 60% livres, preferenci- almente, pelo menos 75% livre, e mais preferencialmente pelo menos 90% livre de outros componentes com os quais elas estão naturalmente associa- das.

Inibição: Como usado aqui, refere-se a uma redução no parâme- tro sendo medido, seja ele crescimento ou viabilidade de adenovírus tipo 36.

A quantidade de tal redução é medida em relação a um padrão (controle). "Redução" é definida aqui como uma diminuição de pelo menos aproxima- damente 25% em relação a controle, preferencialmente, pelo menos aproxi- madamente 50%, e mais preferencialmente, pelo menos aproximadamente 75%.

As vacinas antiadenovírus adipogênicos da invenção, onde o componente imunogênico é vírus vivo, vírus inativo, vírus morto, proteína de revestimento, segmento de proteína de revestimento compreendendo epíto- po, ou proteína de revestimento (ou segmento dessa compreendendo epíto- po) fornecida com o uso de um vírus veículo modificado geneticamente não patogênico tal como um vírus de vacina ou um vírus da varíola de aves, são preparadas usando métodos bem conhecidos na técnica. Assim, as vacinas incluirão veículos, excipientes, adjuvantes, antimicrobianos, conservantes, e seus similares como bem entendidos na técnica. Assim, em adição ao ingre- diente ativo, as vacinas terão composições adequadas, usualmente tampões aquosos, tal como salina com tamponada com fosfato ou seus similares, nas quais o ingrediente ativo será suspenso junto com, opcionalmente, qualquer um dos vários adjuvantes de estimulo do sistema imunológico usados em preparações de vacina humana, composições antimicrobianas, e outras composições para estabilizar as preparações. Todas as composições incluí- das na preparação da vacina serão adequadas para administração a seres humanos. A preparação de vacina pode ser armazenada na forma Iiofilizada e então combinada com solução logo antes da administração. Para adminis- tração oral, a preparação da vacina pode ser na forma de solução, compri- mido ou pílula opcionalmente com um revestimento entérico como entendido na técnica. A concentração de componente ativo (imunogênico ou que for- nece imunogene) em solução com a qual é administrada tipicamente estará entre aproximadamente 1 ng e aproximadamente 1 mg/ml.

As vacinas antiadenovírus adipogênico da invenção serão admi- nistradas de forma intranasal, oral, ou por injeção intravenosa, intramuscular, subcutânea ou peritoneal. A administração das vacinas da invenção é para ser feita sob a orientação de um médico.

A dosagem apropriada da vacina antiadenovírus adipogênico é feita por profissionais médicos versados na técnica e dependerá de um nú- mero de fatores incluindo a idade da pessoa que está sendo tratada, a ur- gência da imunidade protetora em desenvolvimento da pessoa, o estado do sistema imunológico da pessoa, e outros fatores conhecidos ao versado na técnica. A vacina tipicamente será administrada em várias etapas de modo a causar e manter imunidade protetora contra vírus que causam obesidade na pessoa sendo vacinada. Assim, depois da vacinação principal, haverá tipi- camente entre um e aproximadamente dez vacinações de reforço separadas por períodos entre aproximadamente 1 semana e 10 anos.

Uma única dose de uma vacina antiobesidade da invenção (na forma de solução) terá um volume entre aproximadamente 0,1 ml e 10 ml e, em qualquer forma, terá entre aproximadamente 1 ng e 10 mg de vírus adi- pogênicos mortos ou inativos, entre aproximadamente 1 ng e 10 mg de vírus não patogênicos geneticamente modificados, ou entre 1 ng e 10 mg de pro- teína de revestimento (por exemplo, proteína fibrosa) ou 6 - 30 aminoácido- peptídeo (em sua forma como modificada para ser imunogênica).

Uma vacina antiadenovírus adipogênico da invenção, onde o ingrediente ativo é ácido nucléico, será também uma preparação padrão pa- ra vacinas desse tipo. Com as vacinas desse tipo, o ácido nucléico não é o imunogene, mas é expresso in vivo depois da administração da vacina como um peptídeo ou proteína que, por sua vez, é imunogênico. As vacinas desse tipo serão administradas por técnicas conhecidas na técnica para tais vaci- nas (por exemplo, injeção intramuscular). A dosagem será também de acor- do com procedimentos conhecidos na técnica para causar e manter imuni- dade protetora contra obesidade viral no indivíduo vacinado.

Nota-se que uma vacina antiadenovírus adipogênico de acordo com a invenção pode inclui ingredientes ativos baseados em mais do que um vírus adipogênico (ou a proteína de revestimento (por exemplo, proteína fibrosa) ou segmentos epitópicos da proteína de revestimento desse).

Em ainda um outro aspecto, a invenção é um método de impedir doença relacionada a adenovírus adipogênico causada por um vírus em um ser humano suscetível a esse que compreende administrar ao ser humano uma quantidade de uma vacina antiadenovírus adipogênico da invenção que é eficaz para elevar e manter uma resposta imune protetora contra um ade- novírus adipogênico.

Esta invenção geralmente refere-se à relação entre infecção com adenovírus adipogênico humano, tal como Ad-5, Ad-36 e Ad-37, as etio- logias de obesidade, e a disfunção de células, tecidos e/ou órgãos, tal como cânceres, disfunção do pâncreas, disfunção do esqueleto e músculo cardio- vascular, disfunção pulmonar, disfunção do cérebro e do sistema nervoso, e doença e disfunção adrenal. Além disso, a invenção refere-se à utilização do estado do adenovírus adipogênico como um preditor para o estado da doen- ça, prognóstico, tratamento, e prevenção de infecção e doença.

O mecanismo principal de doença relacionada a adenovírus adi- pogênico é a produção de lipídeos em células. Os adenovírus adipogênicos são capazes de mudar a máquina celular em indivíduos infectados para ligar a produção do hospedeiro de enzimas lipogênicas. Como um resultado, as enzimas lipogênicas produzem excesso de ácidos graxos e promovem o ar- mazenamento de gordura nas células de múltiplos órgãos.

Múltiplas células do corpo são conhecidas como tendo a capaci- dade de produzir ácidos graxos em suas células. A sintetase de ácido graxo (FAS) é uma das mais importantes enzimas lipogênicas e é expressa em um número de células adultas e fetais, que sugere que esses tecidos são capa- zes de produzir ácidos graxos. Por exemplo, a FAS é expressa em células adultas tal como células epiteliais do duodeno e estomago, células hemato- poiéticas, apêndice, células de gânglio do trato alimentar, hepatócitos, mas- tócitos, vesícula seminal, células guarda-chuva da bexiga urinária, células fasciculadas da zona adrenal, adipócitos, células pituitárias anteriores, célu- las em cesto do cerebelo, neurônios corticais cerebrais, decíduas, células estromais decidualizadas do endométrio, células epiteliais da glândula apó- crina, duto e ácino do seio, próstata, e glândula sebácea, células leteína, e células alveolares Tipo II do pulmão.

Adicionalmente, a FAS é também expressa em células fetais tal como células pituitárias anteriores, condrócitos de parede traqueobronquial, endotélio de vasos sangüíneos e coração, células epiteliais do brônquio, tra- to esofagogastrointestinal, pulmão, pâncreas, próstata, tiróide, língua, tra- quéia, túbulos próximos do rim, fibroblastos, linfócitos nodais, neuroblastos na medula adrenal, timócitos, miócitos estriados da língua, células epiteliais das glândulas salivares e glândulas traqueobronquiais, células hematopoiéti- cas, heptócitos, células Lanhans de vilosidade coriônica, osteoblastos, célu- las fibroblásticas perivertebrais, células Schwann do gânglio simpático e ple- xo Auerbach1 células subcapsulares de células adrenais, adipócitos, células Leidig do testículo, mastócitos, uroepitélio do trato urinário, e células adreno- corticais de camada superior.

Enquanto os ácidos graxos são cruciais ao ambiente intracelular para muitos processos bioquímicos, o excesso de ácidos graxos nas células profundamente altera a bioquímica celular. O excesso de ácidos graxos nas células pode levar ao funcionamento anormal de um número de processos intracelulares. Por exemplo, o excesso de ácidos graxos em tecido pancreá- tico reduz a secreção de insulina, e os ácidos graxos em células canceríge- nas fornecem a fonte principal de energia para o crescimento do câncer. A- lém disso, os ácidos graxos nas células do pulmão estimulam a atração de macrófagos para a área e estão associados com asma e enfisema. Portanto, resultados adversos ocorrem quando as células são expostas em excesso a ácidos graxos.

De acordo com uma modalidade, os adenovírus adipogênicos podem ser um mecanismo pelo qual o excesso de ácidos graxos e triglicerí- deos são produzidos em células e tecidos. Estudos demonstraram que os adenovírus adipogênicos podem alterar as enzimas lipogênicas no tecido adiposo e no fígado. Por exemplo, outros estudos mostraram que a infecção com o adenovírus adipogênico, Ad-36, estimula o rápido aparecimento de fatores de diferenciação incluindo glicerol-3-fosfodeidrogenase, PPAR-gama, CEBP-alfa e beta, e lipoproteína lípase em células 3T3-L1. Como múltiplos tecidos acumulam DNA adenoviral adipogênico, o excesso de enzimas lipo- gênicas pode estar presente em todos os tecidos infectados que são capa- zes de produzir essas enzimas.

De acordo com uma outra modalidade da invenção, a infecção por adenovírus adipogênico pode ser usada para determinar a presença de um câncer relacionada à obesidade. Em uma modalidade adicional, a infec- ção por adenovírus adipogênico pode ser usada para determinar se um su- jeito é pré-disposto a desenvolver um câncer relacionado à obesidade.

A prevalência de múltiplos tipos de câncer é aumentada em pes- soas obesas. Esses cânceres incluem sem limitação, câncer de seio, de próstata, de útero, de ovário, de colo, de rim, de pâncreas e de pulmão. O câncer hepatocelular pode também estar ligado à obesidade e à síndrome metabólica. Adicionalmente, a obesidade pode estar ligada à agressividade de alguns tipos de câncer e a um prognóstico pobre. Por exemplo, a obesi- dade pode estar associada com um grau mais alto de câncer de próstata e a taxas de recorrência mais altas depois de prostatectomia radical. Também, em mulheres brancas não hispânicas, o tamanho do câncer no seio está cor- relacionado com a obesidade. Especificamente, isso é mais notável para o quartil mais alto de circunferência da cintura onde a relação de probabilida- des é 2,76.

Estudos mostraram que os ácidos graxos são o substrato para gasto de energia em células cancerígenas e que bloquear a FAS pode blo- quear o crescimento do câncer. Além disso, foi mostrado que a FAS é au- mentada em muitos cânceres relacionados à obesidade e que a FAS favore- ce o crescimento de tumor. A infecção por adenovírus adipogênico em célu- las cancerígenas pode estimular ácidos graxos em células, desse modo promovendo o crescimento do câncer fornecendo uma fonte de energia para as células cancerígenas.

A expressão de FAS foi detectada em vários tumores e associa- da com subtipo histológico, grau histopatológico e agressividade do tumor. Estudos demonstraram que FAS é altamente expressa em neoplasma hu- mano tal como cânceres de seio, de próstata, de ovário, colorretal, e endo- metrial. Foi determinado que FAS (OA-519) foi um preditor de câncer de próstata. Observou-se que a imunorreatividade OA-519 foi vista em 56 (57%) dos 99 cânceres de próstata primários examinados. Os cânceres OA-519 eram mais prováveis de progredir do que os cânceres não OA-519.

De fato, a presença de Ad-36 foi confirmada em 61% de tecidos de câncer de próstata seres humanos, e observou-se que 50% e 51% dos pacientes com câncer de seio e de próstata, respectivamente, têm anticorpos para Ad-36 em comparação a 13,8% da população normal.

Portanto, a presença de FAS em tecidos de câncer de próstata em aproximadamente o mesmo número de pacientes com câncer como foi observado estando infectados com Ad-36 em combinação com as descober- tas de que os adenovírus adipogênicos aumentam a FAS em células e que a inibição de FAS pode inibir câncer, sugere que a infecção de um adenovírus adipogênico causa ambos obesidade e câncer relacionado à obesidade em um sujeito.

De acordo com uma modalidade da invenção, a prevalência de infecção por Ad-36 pode ser estatisticamente mais alta em pacientes com câncer de seio e de próstata do que em indivíduos sem câncer. Em uma modalidade adicional, o estado de Ad-36 pode servir como um marcador para câncer de seio e de próstata. Ainda uma modalidade adicional refere-se a pacientes com câncer de seio e de próstata que têm DNA de Ad-36 em seus tecidos terão câncer mais agressivo e/ou um prognóstico mais pobre do que aqueles sem DNA de Ad-36.

De acordo com uma outra modalidade da invenção, a infecção por adenovírus adipogênico pode ser usada como um preditor para prognós- tico de doenças, prognóstico de tratamento, ou como um preditor de agres- sividade de tumor. Em carcinomas de seio, de próstata e de ovário, altos níveis de FAS são freqüentemente associados a prognóstico pobre. A asso- ciação entre expressão de FAS e tamanho do tumor ou um marcador de ati- vidade proliferativa de células de tumor pode sugerir que a FAS está relacio- nada ao crescimento e à proliferação desses tumores malignos.

Por exemplo, estudos mostraram que a sobrexpressão de FAS aumentou a hepatocarcinogênese em ratos. Outros estudos mostraram que aproximadamente 30% dos pacientes com cânceres de seio iniciais expres- saram FAS. Os pacientes com câncer de seio expressando FAS tiveram grau de tumor significativamente mais alto, maior volume de tumor, estágio clínico avançado, e escore de Gleason, um dos mais poderosos preditores. A expressão de FAS também foi estudada em neoplasia ovariana, onde foi vista estar associada com o grau de tumor histológico e à menor sobrevivên- cia. Além disso, estudos mostraram que o sobrepeso e indivíduos obesos tiveram mortalidade significativamente aumentada a partir de múltiplos tipos de câncer em seres humanos.

A FAS está associada com o câncer de colo e com sua severi- dade. Estudos mostraram que somente 2 (5%) de 43 adenomas com displa- sia de baixo grau mostraram reatividade para FAS. Entretanto, a imunocolo- ração para FAS positiva foi vista em 7 (17%) dos 40 casos de adenomas com displasia de grau moderado, em 9 (53%) dos 17 casos de adenomas com displasia de alto grau, e em 81% de adenocarcinomas (p < 0,0001).

Portanto, uma modalidade da invenção é direcionada a um teste de filtração de diagnóstico para a presença de infecção por adenovírus adi- pogênico em um sujeito. Se o sujeito testar positivo para adenovírus adipo- gênico, a expressão de FAS pode ser aumentada em células cancerígenas resultando em um câncer mais agressivo e/ou a um prognóstico mais pobre. Outra informação ligando Ad-36 e câncer é a descoberta de seqüências úni- cas de DNA de Ad-36 em cânceres relacionados à obesidade, tal como teci- do de câncer de próstata por teste de reação de cadeia de polimerase (P- CR). As seqüências únicas de DNA de proteína fibrosa com Ad-36, que são descritas na Patente U.S. anterior do cessionário N2s 6,664,050 e 6,127,113 foram detectadas em 11 das 18 amostras de tecido de câncer de próstata. Técnicas de filtração exemplificadas são descritas abaixo.

O teste para adenovírus adipogênico será útil de duas formas.

Se um sujeito com uma massa informe no seio ou próstata aumentada tiver um teste para adenovírus adipogênico positivo (testado, por exemplo, ou por um teste de soro positivo ou por um teste de tecido PCR positivo), há um risco maior de que o sujeito tenha câncer e os testes deveriam ser feitos pa- ra avaliar por câncer (por exemplo, biópsia) ao invés de "esperar com aten- ção". De forma oposta, se uma pessoa tem um teste para adenovírus adipo- gênico positivo, então o sujeito deveria ser filtrado por câncer em intervalos mais reguladores do que uma pessoa com um teste para Ad-36 negativo.

Uma vacina contra Ad-36 foi desenvolvida em coelhos usando vírus morto. O soro dos coelhos contém anticorpos que impedem o cresci- mento de Ad-36 em cultura de tecido em até 17 diluições seriais (uma dilui- ção de 1:131,072 da concentração original). Sabe-se que somente anticor- pos eficazes contra o crescimento de adenovírus são direcionados contra segmentos de proteína fibrosa dos vários adenovírus (anticorpos de neutrali- zação). Os anticorpos de Ad-36 não reagem cruzado com quaisquer outros adenovírus, então as seqüências de DNA exclusivas na proteína fibrosa de Ad-36 são responsáveis por essa especificidade. Três seqüências em prote- ína fibrosa de Ad-36 que são exclusivas a Ad-36 foram identificadas. Usando tecnologia padrão no campo, os peptídeos dessas seqüências serão usados para produzir uma vacina altamente purificada que deveria ter mínimas rea- ções alérgicas. Os peptídeos seriam ligados a adjuvantes usualmente usa- dos em vacinas para melhorar a efetividade. Essas técnicas são conhecidas por aqueles versados na técnica.

Em uma modalidade particular, uma vacina contra adenovírus adipogênico, tal como Ad-36, para prevenir câncer pode ser produzida. Co- mo os adenovírus adipogênicos estão associados com câncer, uma vacina contra adenovírus adipogênicos pode ser usada para prevenir câncer. Por exemplo, uma vacina contra Ad-36 usando seqüências exclusivas de DNA contidas na proteína fibrosa do DNA para fabricar peptídeos pode ser de- senvolvida. Essa tecnologia é conhecida por aqueles versados na técnica.

Em uma modalidade adicional, um novo conceito de seqüencia- mento do DNA de proteína fibrosa a partir de todos os adenovírus adipogê- nicos para determinar suas estruturas pode ser executado. Seguindo o se- qüenciamento, as seqüências de DNA que estão presentes em muitas ou todas as proteínas fibrosas serão identificadas usando bancos de dados de comparação de DNA usualmente usados no campo. Isso pode ser executa- do, por exemplo, empregando GenBank para identificar as seqüências ex- clusivas em DNA de proteína fibrosa com Ad-36. As seqüências de DNA de aproximadamente 30 - 75 pares de base que codificam para peptídeos de aproximadamente 10-25 aminoácidos são então selecionadas. Sabe-se que os peptídeos na parte de nó da proteína fibrosa são eficazes, então es- sas seqüências serão examinadas. Seguindo a identificação, os peptídeos podem ser acoplados com adjuvantes para produzir uma vacina que preveni- rá a infecção a partir de qualquer um dos adenovírus humanos. A utilidade de uma vacina comum para os adenovírus adipogênicos será prevenir obe- sidade, câncer, e outras doenças humanas que são devido a adenovírus adipogênicos. Por exemplo, uma porcentagem significativa de recrutas mili- tares contrai infecções por adenovírus durante treinamento básico. Também, muitas das enfermidades moderadas associadas com febre, tosse, diarréia, ou conjuntivite nos dois primeiros anos de vida são devido a adenovírus.

De acordo com uma modalidade da invenção, a infecção por adenovírus adipogênicos pode ser usada como um preditor do desenvolvi- mento de obesidade e doenças devido às complicações de obesidade e os resultados de regimes que afetam o peso corporal. As complicações de obe- sidade podem incluir, entre outros, diabetes mellitus, hipertensão, hiperlipo- proteinemia, doença cardíaca tal como doença ateroesclerótica e insuficiên- cia cardíaca congestiva, doenças pulmonares tal como apnéia do sono è asma, acidentes cardiovasculares, cânceres tal como de seio, de colo do útero, e de próstata, síndrome de bexiga irritada tal como pedras e infecção, toxemia durante a gravidez, riscos durante cirurgia, gota, diminuição da ferti- lidade, artrite degenerativa, e mortalidade antecipada.

O cessionário demonstrou que o Ad-36 humano estimula o ar- mazenamento de gordura e formação de novas células de gordura em prea- dipócitos de ratos (células 3T3-L1) (figura 1) e em preadipócitos humanos.

Adicionalmente, o cessionário demonstrou na Patente U.S Nss 6,127,113 e 6,664,050, aqui incorporadas em sua totalidade por referência, que a infec- ção por Ad-36 está associada à obesidade. Por exemplo, quatro experimen- tos foram conduzidos em galinhas, um experimento em ratos, e dois experi- mentos em macacos, todos mostrando que a infecção com Ad-36 aumentou a gordura corporal e abaixou o colesterol sérico e triglicerídeos. Mais notá- vel, a ingestão de alimentos medida em galinhas, ratos, e camundongos não foi diferente entre os animais infectados e os sob controle indicando que o gasto de energia foi diferente. O mecanismo de Ad-36 tem um efeito diferen- te em adipócitos para aumentar as enzimas lipogênicas e fatores de diferen- ciação. As células infectadas com Ad-36 exibiram aproximadamente 2 vezes mais triglicerídeos armazenados em 5 dias.

Um grande número de estudos foi também executado com os adenovírus adipogênicos, Ad-36. Os macacos rhesus que foram espontane- amente infectados com Ad-36 mostraram um ganho de peso significativo em 18 meses depois da infecção (figura 2). Os micos foram também infectados com Ad-36 e um ganho de peso quatro vezes maior foi observado em micos infectados em comparação com micos não infectados (figura 3). Além disso, a gordura corporal aumentou em aproximadamente 70% e o colesterol séri- co caiu em aproximadamente 35 mg/dl depois da infecção (figura 4). Nota- velmente, o DNA de Ad-36 foi observado em múltiplos tecidos do macaco, tal como cérebro, fígado, pulmão, músculo e tecido adipócito sete meses seguindo infecção inicial e o vírus não foi mais capaz de crescer a partir de sangue ou fezes dos macacos infectados depois de dois meses (figura S 5- 7). O DNA de Ad-36 também foi observado em tecido adipócito humano co- mo visto na figura 8.

Outros estudos demonstraram que Ad-37 causou obesidade em galinhas, mas Ad-2 e Ad-31 não (figura S 9-11). A ingestão cumulativa de alimentos não foi diferente entre os grupos estudados. Além disso, estudos demonstraram que o Ad-5 causou obesidade em ratos (figura 12). Esses estudos mostram que o estímulo de enzimas lipogênicas e obesidade não são efeitos específicos de todas as infecções por adenovírus, mas múltiplos adenovírus podem fazer isso.

Uma outra modalidade da invenção inclui o uso de adenovírus adipogênicos para prever diabetes e outras disfunções pancreáticas. Adicio- nalmente, uma outra modalidade é direcionada a uma vacina contra adeno- vírus que pode prevenir doença pancreática, incluindo alguns casos de dia- betes.

As células beta pancreáticas produzem lipídeos e o metabolismo dos lipídeos na célula beta é crucial para a regulação da secreção de insuli- na. As enzimas que estão associadas com a síntese ou oxidação de lipídeos causam uma diminuição na quantidade de insulina produzida e secretada. Estudos demonstraram que a sobrexpressão de SREBP-1 em células beta diminui a síntese de insulina. O SREBP-1 é um precursor direto de FAS e revelou-se aumentado por infecção com adenovírus in vitro e in vivo em he- patócitos. Outros estudos demonstraram que proteína de ligação com ele- mento responsivo a carboidrato (ChREBP) ligando-se a sintase de ácido graxo e genes de piruvato quinase tipo L é estimulada por glicose em células beta pancreáticas. Os níveis mais altos de proteína carnitina palmitoiltransfe- rase I (CPT I) em células beta causam uma diminuição na secreção de insu- lina em resposta à glicose. Os adenovírus adipogênicos podem causar dia- betes porque eles aumentam a obesidade e produzem resistência à insulina, mas as mudanças nas enzimas lipogênicas devido à infecção com vírus do pâncreas também podem executar essa função.

Uma modalidade adicional da invenção é para usar o estado do adenovírus adipogênico para prever doença no fígado, cirrose, e outras dis- funções no fígado. Também, uma vacina contra adenovírus pode ser usada para prevenir doenças no fígado devido a adenovírus adipogênicos.

A obesidade está associada com a doença no fígado. O espec- tro de doenças no fígado com obesidade começa com a infiltração de gordu- ra no fígado, progride para esteatohepatite (esteatohepatite não alcoólica = NASH), e uma porcentagem dimensionável de pacientes com NASH conti- nua a desenvolver cirrose criptogênica. A freqüência e a severidade da infil- tração de gordura do fígado sobe com o aumento de peso corporal e está presente na vasta maioria dos pacientes com obesidade mórbida. Foi relata- do que a obesidade está presente em aproximadamente 30% a aproxima- damente 100% dos casos de doença hepática gordurosa não alcoólica (NA- FLD). Outros estudos demonstraram que mais do que aproximadamente 95% dos indivíduos com obesidade severa teve vários graus de infiltração de gordura do fígado e aproximadamente 65% teve NASH.

Os adenovírus adipogênicos produzem níveis aumentados de enzimas lipogênicas e um acúmulo de gordura no fígado. Como notado aci- ma, a infiltração de gordura do fígado pode levar à cirrose. Há um número de causas de infiltração de gordura do fígado, e insultos adicionais ao fígado podem aumentar a chance de que cirrose ocorra. Indivíduos com fatores de risco para doença hepática ou com testes de função hepática anormais de- veriam ser testados para adenovírus adipogênico à medida que eles podem necessitar de atenção especial para prevenir a progressão de fígado gordu- roso a cirrose. Uma vacina contra adenovírus adipogênico pode reduzir ou prevenir muitos casos de fígado gorduroso e cirrose.

Ainda uma outra modalidade da invenção inclui o uso de adeno- vírus adipogênicos para prever disfunção muscular. Também, uma vacina contra adenovírus pode ser usada para prevenir disfunção muscular.

Os músculos são conhecidos por terem enzimas lipogênicas presentes e por armazenar lipídeos intracelulares. A obesidade está associ- ada com metabolismo anormal de lipídeos e acúmulo de lipídeos intramus- cular. Estudos mostraram que um gene lipogênico, estearoil-CoA desaturase 1 (SCD 1), está desregulado em músculo esqueletal de seres humanos ex- tremamente obesos. Alta gordura intramuscular está relacionada a pobre função muscular em pessoas obesas e está relacionada à resistência à insu- lina e diabetes. Outros estudos mostraram que a resistência à insulina e dia- betes tipo 2 resultam do acúmulo de lipídeos em tecidos não adequados pa- ra armazenamento de gordura, tal como músculo esqueletal e o fígado. FFAs estimularam a síntese "de novo" de ceramida e esfingosina, dois es- fingolipídeos mostrados anteriormente por inibir a ação da insulina. A inca- pacidade de transitar da gordura para a glicose como a fonte primária de combustível pode estar associada com resistência à insulina, desregulação metabólica, e risco cardiovascular. Como a Ieptina foi mostrada diminuindo em adipócitos infectados com Ad-36, essa pode produzir resistência à insuli- na.

As pessoas obesas reclamam de dor com exercícios. As razões para isso não estão claras, mas indivíduos obesos têm mais lipídeos intrace- lulares e uma menor capacidade de exercício. Os lipídeos intramusculares alteram a utilização de substrato de músculos esqueletais. Os lipídeos intra- musculares aumentados devido a adenovírus adipogênicos podem limitar a capacidade de exercício, aumentar a dor, e alterar a utilização de substrato. Isso seria particularmente importante em animais usados para desempenho ou resistência, tal como cavalos de corrida ou cachorros de corrida. Um ani- mal (ou pessoa) infectado com um adenovírus adipogênico pode não ser capaz de alcançar um bom desempenho como um não infectado, assim o teste para adenovírus adipogênico pode ser usado como um preditor de qua- lidade de desempenho.

Finalmente, o aumento de lipídeos intramusculares no músculo do coração pode alterar a função cardíaca, produzir cardiomiopatia e insufi- ciência cardíaca congestiva. Estudos mostraram que o acúmulo de excesso de ácidos graxos e triglicerídeos no músculo do coração está associado com resistência cardíaca à insulina e disfunção cardíaca.

Uma modalidade adicional da invenção está relacionada ao uso de estado de adenovírus adipogênico para prever disfunção pulmonar. Tam- bém, uma vacina contra adenovírus prevenirá disfunção pulmonar.

Sabe-se por muitos anos que a obesidade está associada com doença pulmonar tal como asma e enfisema. Os mecanismos dessa associ- ação não estão claros. Sabe-se que os pulmões produzem FAS e sintetizam lipídeos. Portanto, a descoberta de que os adenovírus adipogênicos podem causar doença no pulmão pode estar associada com a produção de FAS nos pulmões por adenovírus. Estudos indicaram que a infecção por Ad-5 duplica o número de macrófagos no pulmão de porquinhos-da-índia. A combinação de fumo e Ad-5 quadruplica o número de macrófagos. Infecções virais Iaten- tes estavam presentes em pacientes com asma e enfisema e a proteína E1A com Ad-5 nos pulmões estava correlacionada com inflamação em pacientes com asma e com enfisema.

Uma modalidade da invenção é o uso de estado de adenovírus adipogênico para prever disfunção no cérebro e no sistema nervoso. Tam- bém, uma vacina contra adenovírus pode ser usada para prevenir disfunção no cérebro e no sistema nervoso.

Os vírus adipogênicos infectam o tecido cerebral. Sabe-se que os nervos e cérebro produzem FAS. A obesidade está ligada aos resultados neurocognitivos adversos, incluindo funcionamento cognitivo reduzido e do- ença de Alzheimer. Estudos demonstraram que o IMC estava inversamente relacionado ao desempenho em todos os testes cognitivos e não houve evi- dência de uma interação IMC χ idade. Há uma prevalência aumentada de doença de Alzheimer na obesidade. Abeta-42, um tipo de amilóide que é depositado em pacientes com Alzheimer, está correlacionado com IMC. Pessoas obesas podem ter uma chance aproximadamente 74% maior de demência. Outros estudos têm demonstrado que um vetor Ad-5 que foi usa- do em terapia genética causou inflamação do cérebro. Ad-5 de ocorrência natural relatou causar obesidade e notou-se que um vetor Ad-5 que é usado para transferência de genes retém sua capacidade de estimular SREBP-1 e síntese de FAZ em hepatócitos. Conseqüentemente, esses dados suportam o conceito de que adenovírus adipogênicos podem aumentar as enzimas lipogênicas no cérebro e nervos, produzir excesso de ácido graxo e triglice- rídeos, e resultar em disfunção.

Um aspecto da invenção é que o teste para adenovírus adipo- gênico pode ser usado para prever disfunção adrenal. Também, uma vacina contra adenovírus pode ser usada para prevenir disfunção adrenal.

A obesidade é conhecida por afetar significativamente a função da glândula adrenal. Há uma secreção aumentada de aldosterona, mas sem renina, que pode estar associada com a hipertensão. Estudos demonstraram que a função adrenal não foi normal em mulheres obesas, mas diferiu com distribuição de gordura abdominal. Os hormônios adrenais usam colesterol como um substrato para a produção, e com as mudanças de adenovírus a- dipogênico em ambos ácidos graxos intracelulares e metabolismo de coles- terol, o uso de um teste para detectar adenovírus adipogênicos pode ser um preditor de disfunção adrenal.

Técnicas imunoanalíticas de filtração exemplificadas incluem sem limitação, técnicas de ensaio de neutralização de vírus padrão ou técni- cas de imunoensaio de enzima bem conhecidas na técnica. As técnicas para elevar e purificar anticorpos contra esses vírus ou fragmentos desses (por exemplo, proteína fibrosa ou fragmentos dessa), ou proteínas (ou fragmen- tos dessas) a partir desses vírus para uso nessas técnicas de imunoensaio podem ser preparadas por técnicas convencionais são bem conhecidas na técnica. Em uma modalidade específica da invenção, anticorpos imunopreci- pitarão os vírus com adenovírus ou proteínas com adenovírus a partir da solução bem como reagirão com essas proteínas em Western ou "immunob- lots" ou géis de poliacrilamida. Em uma outra modalidade específica, os an- ticorpos detectarão a presença de adenovírus ou proteínas com adenovírus em seções de tecido congeladas, usando técnicas imunocitoquímicas. Mo- dalidades específicas relacionadas a métodos para detectar adenovírus ou proteínas com adenovírus incluem ensaios imunoabsorventes ligados a en- zima (ELISA), radioimunoensaio (RIA), ensaios imunoradiométricos (IRMA) e ensaios imunoenzimáticos (EIMA), incluindo ensaios em sanduíche usando anticorpos monoclonais e/ou policlonais.

Similarmente, as técnicas de ensaio de hibridização de sonda de ácido nucléico usadas nesses métodos da invenção serão técnicas padrão (opcionalmente depois de amplificação de DNA ou RNA extraído de uma amostra de sangue, outro fluido corporal, fezes, tecido ou órgão) usando sondas de ácido nucléico (e iniciadores se a amplificação é empregada) fei- tas disponíveis pelos vírus que causam obesidade identificaram e tornaram disponível pela presente invenção. As seqüências de ácidos nucléicos carac- terísticos desses vírus podem ser determinadas por técnicas padrão uma vez que os vírus são convencionalmente isolados, e sondas e iniciadores que são específicos para os vírus e que fornecem a base para sondas de ácido nucléico e iniciadores que podem ser usados em ensaios baseados em ácido nucléico para os vírus são preparados usando técnicas convencio- nais com base nas seqüências.

Por exemplo, de modo a detectar a presença de um adenovírus predispondo um indivíduo à obesidade, uma amostra biológica tal como sangue é preparada e analisada para a presença ou ausência de proteínas com adenovírus, tal como as seqüências de proteína de revestimento fibroso com Ad-36. Os resultados desses testes e informação interpretativa são re- tornados ao profissional de saúde para comunicação ao indivíduo testado. Tal diagnóstico pode ser executado por laboratórios de diagnóstico, ou alter- nativamente, kits de diagnóstico são fabricados e vendidos aos profissionais de saúde ou indivíduos privados para autodiagnóstico.

Inicialmente, a filtração envolve amplificação das seqüências de adenovírus relevantes. Em uma modalidade específica da invenção, o méto- do de filtração envolve uma estratégia não baseada em PCR. Tais métodos de filtração incluem metodologias de amplificação de etiqueta em duas eta- pas que são bem conhecidas na técnica. Ambas as estratégias de filtração baseada em PGR e não baseada em PCR podem detectar seqüências alvo com um alto nível de sensibilidade.

Uma modalidade da invenção refere-se à amplificação alvo. A- qui, a seqüência de ácido nucléico alvo é amplificada com polimerase. Um método específico usando amplificação acionada por polimerase é a reação em cadeia da polimerase (PCR). A reação em cadeia da polimerase e outros ensaios de amplificação acionados por polimerase podem alcançar um au- mento de mais de um milhão de vezes em número de cópias através do uso de ciclos de amplificação acionada por polimerase. Uma vez amplificado, o ácido nucléico resultante pode ser seqüenciado ou usado como um substra- to para sondas de DNA. Quando as sondas são usadas para detectar a presença das seqüências alvo, a amostra biológica a ser analisada, tal como sangue ou soro, pode ser tratada, se desejado para extrair os ácidos nucléicos. A a- mostra de ácido nucléico pode ser preparada de várias formas para facilitar a detecção da seqüência alvo, por exemplo, desnaturação, digestão por res- trição, eletroforese ou "dot-blot". A região alvo do analito ácido nucléico usu- almente deve ser pelo menos parcialmente de cadeia única para formar hí- bridos com a seqüência alvo da sonda. Se a seqüência é naturalmente de cadeia única, a desnaturação não será exigida. Entretanto, se a seqüência é de cadeia dupla, a seqüência provavelmente necessitará ser desnaturada. A desnaturação pode ser executada por várias técnicas bem conhecidas na técnica.

O analito ácido nucléico e a sonda são incubados sob condições que promovem formação híbrida estável da seqüência alvo no analito. A re- gião das sondas que é usada para ligar ao analito pode ser feita completa- mente complementar à região alvo do adenovírus de interesse, e em particu- lar, à proteína de revestimento fibroso. Portanto, as condições de alta seve- ridade são desejáveis de modo a prevenir positivos falsos. Entretanto, as condições de alta severidade são usadas somente se as sondas são com- plementares às regiões do adenovírus. A severidade da hibridização é de- terminada por um número de fatores durante a hibridização e durante o pro- cedimento de lavagem, incluindo temperatura, resistência tônica, composi- ção base, comprimento da sonda, e concentração de formamida.

A detecção, se houver, do híbrido resultante é usualmente exe- cutada pelo uso de sondas rotuladas. Alternativamente, entretanto, a sonda pode não ser rotulada, mas pode ser detectável por ligação específica com um ligante que é rotulado, ou direta ou indiretamente. Os rótulos adequados, e o método para rotular as sondas e Iigantes são bem conhecidos na técni- ca, e incluem, por exemplo, rótulos radioativos que podem ser incorporados por métodos conhecidos (por exemplo, tradução exata, preparação aleatória ou kinasing), biotina, grupos fluorescentes, grupos quimiluminescentes (por exemplo, dioxetanos), enzimas, anticorpos, nanopartículas de ouro e seus similares. As variações desse esquema básico são conhecidas na técnica, e incluem aquelas variações que facilitam a separação dos híbridos a serem detectados a partir de materiais estranhos e/ou que amplificam o sinal a par- tir da porção rotulada.

Como notado acima, os ensaios de filtração baseados em PCR são também observados por esta invenção. Esse procedimento hibridiza uma sonda de ácido nucléico (ou análogo tal como uma cadeia principal de metil fosfonato substituindo o fosfodiéster normal) ao DNA alvo de baixo ní- vel. Essa sonda pode ter uma enzima ligada de forma covalente à sonda, tal que a ligação covalente não interfere com a especificidade da hibridização.

O complexo de ácido nucléico alvo conjugado com sonda de enzima pode ser então isolado do conjugado de sonda livre e um substrato é adicionado para detecção de enzima. A atividade enzimática é observada como uma mudança no desenvolvimento de cor ou saída Iuminescente resultando em um aumento em sensibilidade de aproximadamente 103 a aproximadamente 106.

As metodologias de amplificação de rótulo de duas etapas são conhecidas na técnica. Esses ensaios trabalham no princípio de que um pe- queno Iigante (tal como digioxigenina, biotina, ou seus similares) é ligado a uma sonda de ácido nucléico capaz de ligação específica da região de se- qüência de adenovírus de interesse. Em um exemplo, o pequeno Iigante li- gado à sonda de ácido nucléico é especificamente reconhecido por um con- jugado anticorpo-enzima. Em uma modalidade deste exemplo, a digioxigeni- na é ligada à sonda de ácido nucléico. A hibridização é detectada por um conjugado de anticorpo-fosfatase alcalina que se transforma em um substra- to quimiluminescente. Em um segundo exemplo, o pequeno Iigante é reco- nhecido por um segundo conjugado ligante-enzima que é capaz de especifi- camente complexação ao primeiro ligante. Uma modalidade bem conhecida desse exemplo é as interações do tipo biotina-avidina.

Observa-se também no escopo desta invenção que os ensaios de sonda de ácido nucléico desta invenção empregarão um coquetel de sondas de ácido nucléico capaz de detectar várias espécies de adenovírus. Assim, em um exemplo para detectar a presença de Ad-36, Ad-37, e/ou Ad- 5, por exemplo, em uma amostra biológica, mais do que uma sonda com- plementar das regiões alvo de interesse nos vários tipos de adenovírus pode ser empregada.

Como os versados entenderão, mais do que uma cadeia de ví- rus causando obesidade podem ser testadas para simultaneamente em um método imunológico ou ensaio baseado em ácido nucléico para teste por vírus de acordo com a invenção e kits podem ser montados para facilitar a execução dos métodos para um vírus particular ou uma pluralidade deles.

A invenção foi descrita amplamente e ilustrada em referência às modalidades representativas descritas acima. Aqueles versados na técnica reconhecerão que várias modificações podem ser feitas na presente inven- ção sem abandonar o espírito e escopo desta. Sem elaboração adicional, acredita-se que um versado na técnica, usando a descrição anterior, pode utilizar a presente invenção à sua extensão mais completa. Os seguintes exemplos são somente ilustrativos, e não Iimitantes do restante da descrição de qualquer forma.

Exemplos

Exemplo Específico 1:

Amostras de sangue de 502 humanos em populações separadas de três cidades: Madison, Wl, Naples, FL, e New York City, NY, foram medi- das para infecção com Ad-36. A definição de obesidade foi um IMC maior do que aproximadamente 30 kg/m2 e a população foi dividida em indivíduos o- besos e não obesos. A prevalência de anticorpos de Ad-36 em soro de indi- víduos obesos foi de aproximadamente 30% e em não obesos de aproxima- damente 11% (isto é, uma razão 3:1) (figura 13).

Quando os indivíduos foram divididos em anticorpo positivo ver- sus anticorpo negativo, o anticorpo positivo foi observado como sendo apro- ximadamente 9 unidades de IMC mais pesado (isto é, maior do que aproxi- madamente 22,67 kg (50 libras) (p < 0,001)) (figura 14).

Além disso, o colesterol sérico e os triglicerídeos foram menores em seres humanos com anticorpos positivos (menos do que aproximada- mente -35 mg/dl, ρ < 0,001), exatamente as mesmas reduções observadas em macacos provavelmente infectados. Não houve correlações de anticor- pos para Ad-2 ou Ad-31 com ou a composição corporal ou colesterol sérico e triglicerídeos em seres humanos, implicando em que os efeitos de Ad-36 são específicos e não são comuns a todos os adenovírus humanos.

Um segundo estudo foi executado em 28 pares de gêmeos dis- cordantes para anticorpos de Ad-36. Normalmente, os gêmeos rastreiam peso corporal e IMC intimamente, mas os gêmeos com anticorpos positivos para Ad-36 eram mais gordos do que seus co-gêmeos com anticorpos nega- tivos para Ad-36 (p < 0,04) (figura 5).

Em conclusão, essas descobertas mostram que o Ad-36 causa obesidade em animais e seres humanos. Exemplo Específico 2:

Evidência muito forte de uma associação de Ad-36 com câncer vem de estudos na Universidade de Wisconsin. O soro de 128 indivíduos com câncer de seio e 37 indivíduos com câncer de próstata foi obtido, e submetido a ensaio por anticorpos de Ad-36 usando um ensaio de neutrali- zação de soro. Observou-se que 51% dos pacientes com câncer de próstata e 50% dos pacientes com câncer de seio foram positivos para anticorpos de Ad-36. Entretanto, como as amostras eram anônimas, nenhum dado sobre obesidade, tipo ou armazenamento de câncer, ou presença de metástases foi obtida. A partir dos dados de anticorpos de Ad-36 em indivíduos obesos e não obesos, estimou-se que aproximadamente 14% da população geral teve anticorpos de Ad-36. Assim, há um aumento de quase quatro vezes na pre- valência de anticorpos de Ad-36 em ambos pacientes com câncer de seio e de próstata. Exemplo Específico 3:

O tecido de câncer de próstata de 18 pacientes foi obtido e sub- metido a ensaio para DNA de Ad-36 por ensaio de reação de cadeia de po- limerase aninhada (PCR) usando iniciadores feitos de seqüências de DNA exclusivas no genoma de proteína fibrosa com Ad-36. Onze dos 18, ou 61%, tiveram DNA de Ad-36 em tecido de câncer. A figura 16 mostra um gel PCR demonstrando a presença de DNA de Ad-36 em tecidos de câncer de prós- tata. Como notado acima, o DNA de Ad-36 em múltiplos tecidos de animais experimentais foi encontrado, particularmente em tecido adiposo usando PCR aninhado com iniciadores feitos de seqüências de DNA exclusivas no genoma de proteína fibrosa com Ad-36. A figura 17 mostra um gel PCR de DNA extraído de tecido adiposo de macacos infectados com Ad-36. Todos os três dos macacos infectados, mas nenhum dos de controle, têm DNA viral presente.

Exemplo Específico 4:

Esse exemplo mostra o uso de teste de laboratório de Ad-36 como um marcador para identificar indivíduos em risco de desenvolver cân- cer. Pessoas com câncer têm uma prevalência muito mais alta de um teste de laboratório de Ad-36 positivo do que pacientes sem câncer. Foram testa- dos 128 mulheres com câncer no seio e 37 homens com câncer de próstata e comparou-se os resultados a 502 pacientes sem câncer. Do total de 165 pacientes com câncer, 83 (50%) tiveram teste de Ad-36 positivo (50% dos pacientes com câncer no seio e 51 % dos pacientes com câncer de próstata). Baseado na prevalência de obesidade na população norte-americana, os dados dos 502 indivíduos sem câncer mostraram que 17% dos indivíduos sem câncer tiveram teste de Ad-36 positivo. Se somente aqueles indivíduos sem câncer de Wisconsin são considerados (como todos os pacientes eram de Wisconsin, essa é a melhor comparação), 14% dos indivíduos sem cân- cer tiveram um teste de Ad-36 positivo. Assim, os pacientes com câncer po- sitivos foram quase 4 vezes mais comparados aos pacientes sem câncer.

Exemplo Específico 5:

Tecido adiposo de 9 humanos em autópsia no Hospital da Uni- versidade de Wisconsin foi obtido e submetido a ensaio para DNA de Ad-36. Sete dos 9 tiveram DNA de Ad-36 no tecido adiposo. Esses dados demons- traram que o DNA de Ad-36 pode ser isolado de tecido adiposo humano e animal e, de forma mais importante, que a presença de DNA de Ad-36 em tecidos é um marcador para pós-infecção por Ad-36. Como o DNA de Ad-36 apareceu em múltiplos tecidos de animais infectados, parece claro que a viremia inicial resulta em infecção da maior parte dos tecidos do corpo. Por- tanto, como descrito na seção Métodos no Exemplo Específico 6, abaixo, os tecidos de câncer ou tecido adiposo de câncer podem ser obtidos de pacien- tes para testar pela presença de DNA de Ad-36.

Exemplo Específico 6:

As amostras são submetidas a ensaio para DNA de Ad-36 em amostras de tecido do seio e da próstata de pacientes com câncer e pacien- tes sem câncer para determinar se a prevalência de infecção com Ad-36 é maior do que pacientes com câncer. O estado de Ad-36 pode estar correla- cionado com a presença de câncer e pode estar correlacionado com estágio de câncer, presença de metástases, e prognóstico de vítimas de câncer. A vacina contra Ad-36 pode prevenir cânceres induzidos por Ad-36. Projeto Experimental:

Amostras anônimas de tecido e informação médica completa são obtidas a partir de bancos de recursos de NCI1 a Rede de Tecidos Hu- manos Cooperativa NCI (CHTN) e o Recurso de Tecidos de Câncer de Seio Cooperativo NCI (CBCTR). As amostras são ensaiadas para DNA de Ad-36 por ensaio de PCR aninhado como descrito abaixo. Alternativamente, se amostras de DNA não estão disponíveis, elas podem ser ordenadas. Se DNA não foi extraído das amostras, ele pode ser como descrito abaixo.

Para avaliar câncer de seio, as amostras de tecido de câncer de seio ou tecido adiposo próximo ao seio de 100 mulheres com câncer são comparadas a tecido de seio ou tecido adiposo de 50 mulheres passando por cirurgia de seio que não têm câncer. Como notado acima, se tecido de câncer de seio não está disponível, o tecido adiposo próximo ao seio é acei- tável. O tecido de seio real não é crucial à medida que DNA de Ad-36 apare- ce em todos os tecidos depois de infecção, então o tecido adiposo é ade- quado.

Para avaliar o câncer de próstata, amostras de câncer de prósta- ta de 100 homens são comparadas a tecido de próstata de homens passan- do por cirurgia para hipertrofia prostática benigna (BPH).

Ambos os bancos de tecido NCI têm informação da idade, esta- do de menopausa de pacientes fêmeas, altura, peso, histórico familiar de câncer de seio e de próstata, tipo e estágio de câncer, presença de metásta- ses, e em alguns casos, tempo de sobrevivência. Como câncer de seio as- sociado com obesidade é mais prevalente em mulheres pós-menopausa, indivíduos sem câncer são combinados bem como possível por idade. Pode- se esperar que pacientes com câncer de próstata de quem se obteve amos- tras estarão no grupo de mais idade (> 50 anos) porque essa é a população na qual o câncer de próstata e BPH ocorrem. Pode ser muito improvável que teremos quaisquer tecidos de pacientes pediátricos à medida que cânceres de seio e de próstata são raros neles.

Técnicas de Laboratório: Os procedimentos que serão necessá- rios para esse protocolo são publicados na literatura médica e são entendi- dos por um dos versados na técnica. Um breve sumário de cada um é dado abaixo:

Cultura de Ad-36: As preparações virais crescem em cultura de tecido como anteriormente descrito usando células de carcinoma bronquial humano A549. As células A549 são obtidas da Coleção de Cultura do Tipo Americana (ATCC, Rockville, MD). Minimum Essential Media Eagle (MEM) (Cat # M-0643, Sigma Chemicals) com aminoácidos não essenciais, sais de Earle e glutamina L são usados para crescer as células A549. Matérias de trabalho crescem em células A549 usando MEM com 10% de soro bovino fetal (FBS) e 2,9% de NaHCO3 (v/v) em pH 7,4.

Ensaio com unidades de formação de placa: Concentrações de vírus Ad-36 são determinadas usando células A549 por esse ensaio. Inician- do com 100 μl de suspensão de vírus e 900 μl de meio, diluições seriais de 10 vezes são feitas. As células A549 crescem para confluência em bandejas com 6 cavidades e 3 cavidades são usadas para cada diluição. Três cavida- des são usadas como o controle branco e não são infectadas com a suspen- são de vírus. O meio é removido de cada célula e 100 μl da suspensão de vírus diluídos serialmente são pipetados nas cavidades. As bandejas são incubadas a 37°C, mexendo gentilmente a cada 15 min. Depois de 1h de incubação, a suspensão viral das cavidades é removida e descartada. As cavidades são sobrepostas com aproximadamente 3 ml de 1% de ágar em meio por cavidade, com 1x solução antibiótica-antimicótica. As bandejas são invertidas e incubadas em 37°C por 8 dias até que placas aparecem. No dia seguinte, o número de placas formadas é contado depois da remoção do ágar. O número de placas formadas χ diluição de suspensão viral usada for- nece PFU/100 μL de inoculo usado. Isso é multiplicado por 10 para expres- sar PFU/mL.

Dose de infectividade da cultura de tecido (TCID50)(66-72): A concentração das matérias de trabalho que causam um efeito citopático (CPE) em 50% das cavidades contendo células A549 é calculada e expressa como dose de infectividade da cultura de tecido (TCID-50) unidades por ml. A TCID-50 das matérias de trabalho é determinada usando diluições seriais de 10 vezes da matéria de trabalho de vírus. A TCID-50 é calculada diluindo- se serialmente a solução de matéria de vírus e inoculando-se as células com as diluições para encontrar a recíproca da mais alta diluição de vírus que causa efeito citopático (CPE) em 50% das células inoculadas. As concentra- ções são calculadas depois que as células inoculadas com as diluições de vírus são incubadas em 37°C por 8 dias.

Ensaio de PCR aninhado: O PCR aninhado detecta DNA de Ad- 36 em amostras biológicas. Como anteriormente descrito, quatro iniciadores foram designados para regiões exclusivas do gene de proteína fibrosa de Ad-36 para uso em um ensaio de PCR aninhado para detecção de DNA vi- ral. Seqüências de iniciadores:

Iniciador dianteiro externo (5'=-GTCTGGAAAACTGAGTGTGGATA) (ID SEQ No. 1), Iniciador reverso externo (5=-ATCCAAAATCAAATGTAATAGAGT) (ID SEQ No. 2), Inieiador dianteiro interno (5=-TTAACTGGAAAAGGAATAGGTA) (ID SEQ No. 3), Inieiador reverso interno (5=-GGTGTTGTTGGTTGGCTTAGGATA) (ID SEQ No. 4).

O DNA é isolado dos tecidos de seio e próstata seres humanos usando um Kit de Tecido QIAamp (Qiagen, Valencia, CA, USA; Cat # 29304). Controles de PCR negativo são água e DNA de células A549. O controle de PCR positivo é DNA de células A549 infectadas com Ad-36. O DNA é desnaturado por 2 min em 95°C e submetido a 35 ciclos de PCR (94°C por 1 min, 55°C por 1 min, 72°C por 2 min) seguido por incubação em 72°C por 5 min. Os produtos de PCR são visualizados em um gel de 1% de agarose com um marcador de tamanho.

Este ensaio foi desenvolvido na Universidade de Wisconsin e nesse momento as condições foram otimizadas para temperatura, concen- tração de magnésio, e número de ciclos em amostras consistindo de tecidos de animal e humanos, e de células 3T3-L1. As amostras dós produtos de PCR são extraídas dos géis e são enviadas Ao Biotech Center da Universi- dade de Wisconsin para seqüenciamento para assegurar que as seqüências de DNA amplificadas eram das regiões alvo. O Biotech Center confirmou sua precisão. Esses procedimentos de controle de qualidade são repetidos para obedecer às especificações CLIA e à boa prática de laboratório. O seqüen- ciamento de DNA de duas amostras positivas de câncer de seio e de câncer de próstata e as amostras de DNA de controle positivo de A549 são execu- tadas para assegurar precisão das amplificações.

Análises estatísticas e cálculos de energia: O auxílio estatístico está disponível a partir do Departamento de Ciências Estatísticas e Pesquisa de Operações da Universidade Commonwealth da Virgínia.

Cálculos de Energia: A análise de energia foi executada usando dados preliminares na prevalência de anticorpos de Ad-36 na população ge- ral versus em pacientes com câncer em Madison, Wisconsin. Foi mostrado que 50% e 51% dos pacientes com câncer de seio e com câncer de prósta- ta, respectivamente, no Hospital da Universidade de Wisconsin tiveram anti- corpos para Ad-36. Em uma amostra de voluntários da população geral do Programa de Tratamento de Obesidade na Universidade de Wisconsin, 247 indivíduos foram avaliados, dos quais 183 eram obesos e 64 não eram obe- sos. A prevalência de anticorpos para Ad-36 foi 20% e 11%, respectivamen- te. As figuras CDC mostram que aproximadamente 31% de adultos america- nos são obesos e 69% não são obesos. Usando esses números, estimou-se que a prevalência de anticorpos para Ad-36 na população geral de Madison, Wl, era 13,8%. Assim, a prevalência de Ad-36 em pacientes com câncer é quase quatro vezes maior. Usando essas figuras, os cálculos de energia re- velaram que 32 indivíduos por grupo são necessários para alcançar uma energia de 80% no nível 0,05 para determinar uma diferença em prevalência de Ad-36 em pacientes com câncer versus pacientes sem câncer. Aproxi- madamente 50% de ambos os pacientes com câncer de seio e de próstata podem ser esperados para serem positivos a anticorpos para Ad-36 basea- dos nos dados preliminares. Entretanto, pode ser possível que a prevalência de Ad-36 possa ser inferior nas amostras em banco dos bancos de tecido NCI (ou banco de tecido de Asterand), e isso afetaria a energia significati- vamente. Portanto, 100 indivíduos com câncer e 50 indivíduos sem câncer podem ser certos de terem suficiente energia.

Análises Estatísticas: A análise de Qui-Quadrado será usada para determinar se a prevalência de DNA de Ad-36 em indivíduos com cân- cer é maior do que em indivíduos sem câncer. O número de indivíduos é relativamente pequeno para múltiplas análises de regressão e não se espera ver correlações significativas a menos que o efeito seja poderoso. Exemplo Específico 7:

EXEMPLO 8

A seqüência de cDNA do genoma de Ad-36 foi filtrada contra todas as seqüências de cDNA conhecidas e duas seqüências de base 25 e uma seqüência de base 28 foram encontradas, todas na seqüência de codi- ficação de fibra que eram exclusivas para Ad-36. Essas três seqüências são como segue:

ID SEQ NO. 5: 5'-AGTTGAAACAGCAAGAGACTCAAAG

ID SEQ NO. 6: 5'-GGTACTGGATCAAGTGCACATGGAG

ID SEQ NO. 7: 5'-TTGAAACAGCAAGAGACTCAAAGCTAAC

A seqüência 3 acima foi empregada uma sonda para Ad-36 em um ensaio de hibridização de sonda de ácido nucléico convencional de DNA isolado de quatro galinhas, duas das quais foram infectadas com o vírus e se tornaram obesas e duas das quais não foram infectadas e não eram obesas. A hibridização de DNA na sonda foi observada com somente o DNA das du- as galinhas infectadas. O ensaio envolveu detecção direta e foi por eletrofo- rese capilar usando fluorescência induzida por laser para detecção. Mais particularmente, uma matriz de poliacrilamida substituível foi empregada na separação eIetroforética e a detecção empregou um sistema duplo com rotu- lação-5' do intercalador laranja oligo e tiazol no sistema tampão.

Os versados entenderão que as sondas, e iniciadores quando a amplificação é também usada, entre aproximadamente 15 a 30 bases em comprimento são vantajosamente empregados para fornecer especificidade e sensibilidade específicas. Os métodos de amplificação usando PCR e va- riações desse podem ser empregados, como bem conhecido na técnica.

Os exemplos fornecidos acima são meramente ilustrativos e não pretendem ser uma lista exaustiva de todas as modalidades possíveis, apli- cações ou modificações da invenção. Assim, várias modificações e varia- ções dos métodos descritos e sistemas da invenção estarão aparentes à- queles versados na técnica sem abandonar o escopo e espírito da invenção. Embora a invenção tenha sido descrita em conjunto com as modalidades específicas, dever-se-ia entender que a invenção como reivindicada não de- veria ser indevidamente limitada a tais modalidades específicas. De fato, as várias modificações dos modos descritos para executar a invenção que são óbvias àqueles versados em biologia molecular ou campos relacionados pre- tendem estar no escopo das reivindicações em anexo.

As descrições de todas as referências e publicações citadas a- cima são expressamente incorporadas por referência em sua totalidade à mesma extensão como se elas fossem incorporadas por referência individu- almente.

Claims (25)

1. Método para prever se um sujeito é pré-disposto a desenvol- ver uma doença relacionada a adenovírus adipogênico, compreendendo as etapas de: obter uma amostra do sujeito; e determinar se o sujeito está infectado com o adenovírus adipo- gênico.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, onde a dita etapa de determinar se o sujeito está infectado com o adenovírus adipogênico compreende as etapas de: filtrar pela presença de anticorpos específicos ao adenovírus adipogênico na amostra; e determinar a presença de anticorpos específicos ao adenovírus adipogênico na amostra.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1, onde o adenovírus adipogênico é um ou mais vírus adipogênicos selecionados a partir do grupo que consiste de adenovírus tipo 5, adenovírus tipos 35 e adenovírus tipo 37.

4. Método, de acordo com a reivindicação 1, onde a doença re- lacionada a adenovírus adipogênico é uma doença selecionada a partir do grupo que consiste em câncer, câncer de próstata, câncer de seio, disfunção pancreática, doença pancreática, diabetes, doença pulmonar, disfunção do cérebro e do sistema nervoso, e disfunção adrenal.

5. Método, de acordo com a reivindicação 1 , onde o sujeito é um ser humano.

6. Método, de acordo com a reivindicação 1, onde o sujeito é um animal.

7. Método, de acordo com a reivindicação 2, onde os anticorpos na dita etapa de determinação são específicos a um ou mais peptídeos codi- ficados pelas seqüências de ácido nucléico selecionadas a partir do grupo que consiste de ID SEQ NO. 5; ID SEQ NO. 6 e ID SEQ NO. 7.

8. Método, de acordo com a reivindicação 2, onde a dita etapa de filtração é executada usando um método selecionado a partir do grupo que consiste de ensaio de neutralização de soro e ELISA.

9. Método, de acordo com a reivindicação 1, onde a amostra é selecionada a partir do grupo que consiste de uma amostra biológica, fluido corporal, uma amostra de tecido, uma amostra de órgão, fezes, sangue, sa- liva, e qualquer combinação desses.

10. Método de prevenir doença relacionada a adenovírus adipo- gênico em um sujeito, compreendendo: administrar uma vacina antiadenovírus adipogênico ao sujeito.

11. Método, de acordo com a reivindicação 10, onde a dita vaci- na antiadenovírus adipogênico compreende como uma dose efetiva de um ingrediente ativo compreendendo um ou mais compostos selecionados a partir de um grupo que consiste em um adenovírus tipo 36 morto, um adeno- vírus tipo 36 inativo, uma seqüência de proteína ou peptídeo codificando uma proteína de revestimento de adenovírus 36 ou fragmentos dessa, uma seqüência de ácido nucléico codificando uma proteína de revestimento de adenovírus tipo 36 ou um fragmento dessa, uma proteína E1A de adenovírus tipo 36, um vírus não patogênico geneticamente modificado, e um vírus não patogênico.

12. Método, de acordo com a reivindicação 10, onde a vacina antiadenovírus adipogênico é administrada de forma intranasal, oral, intrave- nosa, intramuscular, subcutânea e/ou peritoneal.

13. Método, de acordo com a reivindicação 10, onde o sujeito é um ser humano.

14. Método, de acordo com a reivindicação 10, onde o sujeito é um animal.

15. Método, de acordo com a reivindicação 10, onde a doença relacionada a adenovírus adipogênico é uma ou mais doenças selecionadas a partir do grupo que consiste em câncer, câncer de próstata, câncer de sei- o, disfunção pancreática, doença pancreática, diabetes, doença pulmonar, disfunção do cérebro e do sistema nervoso, e disfunção adrenal.

16. Método para prever agressividade do câncer em um sujeito tendo uma anormalidade compatível com um tumor, compreendendo as eta- pas de: obter uma amostra do sujeito; submeter a amostra a ensaio para determinar se o sujeito está infectado com um adenovírus adipogênico; e prever uma forma mais agressiva de câncer em um sujeito infec- tado com um adenovírus adipogênico em relação a um sujeito não infectado com um adenovírus adipogênico.

17. Método, de acordo com a reivindicação 16, onde a dita etapa de submeter a amostra a ensaio compreende as etapas de: filtrar pela presença de anticorpos específicos ao adenovírus adipogênico na amostra; e determinar a presença de anticorpos específicos ao adenovírus adipogênico na amostra.

18. Método, de acordo com a reivindicação 16, onde o adenoví- rus adipogênico é um ou mais vírus adipogênicos selecionados a partir do grupo que consiste em adenovírus tipo 5, adenovírus tipos 36 e adenovírus tipo 37.

19. Método, de acordo com a reivindicação 1, onde o câncer é selecionado a partir do grupo que consiste em câncer de seio, de próstata, de útero, de ovário, de colo, de rim, de pâncreas, e de pulmão.

20. Método, de acordo com a reivindicação 16, onde o sujeito é um ser humano.

21. Método, de acordo com a reivindicação 16, onde o sujeito é um animal.

22. Método, de acordo com a reivindicação 17, onde os anticor- pos na dita etapa de determinação são específicos a um ou mais peptídeos codificados pelas seqüências de ácido nucléico selecionadas a partir do gru- po que consiste de ID SEQ NO. 5; ID SEQ NO. 6 e ID SEQ NO. 7.

23. Método, de acordo com a reivindicação 17, onde a dita etapa de filtração é executada usando um método selecionado a partir do grupo que consiste em ensaio de neutralização de soro e ELISA.

24. Método, de acordo com a reivindicação 16, onde a amostra é selecionada a partir do grupo que consiste em uma amostra biológica, fluido corporal, uma amostra de tecido, uma amostra de órgão, fezes, sangue, sa- liva, e qualquer combinação desses.

25. Método, de acordo com a reivindicação 16, onde a forma mais agressiva de câncer no sujeito infectado com o adenovírus adipogênico em relação ao sujeito não infectado com adenovírus adipogênico é selecio- nada a partir do grupo que consiste em maior grau de tumor, maior volume de tumor, estágio clínico avançado, escore de Gleason aumentado, e displa- sia de maior grau.