BRPI0620949A2 - utilização de um extrato insaponificável de polpa vegetal no tratamento do envelhecimento cutáneo - Google Patents

Abstract

UTILIZAçãO DE UM EXTRATO INSAPONIFICáVEL DE POLPA VEGETAL NO TRATAMENTO DO ENVELHECIMENTO CUTáNEO. A presente invenção refere-se a utilização de um extrato insaponificável de polpa vegetal no tratamento do envelhecimento cutâneo. O domínio da presente invenção refere-se à utilização de um extrato insaponificável de polpa vegetal para a preparação de um produto cosmético, farmacêutico ou nutracêutico destinado a tratar e/ou a prevenir as alterações cutâneas associadas ao envelhecimento.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "UTILIZAÇAO DE UM EXTRATO INSAPONIFICÁVEL DE POLPA VEGETAL NO TRA- TAMENTO DO ENVELHECIMENTO CUTÂNEO".

A presente invenção refere-se à utilização de um extrato insapo- nificável de polpa vegetal para a preparação de um produto cosmético, far- macêutico ou nutracêutico destinado a tratar as alterações cutâneas associ- adas ao envelhecimento.

O envelhecimento é um fenômeno inevitável, lentamente evoluti- vo e irreversível acarretando modificações anatômicas e histológicas res- ponsáveis por anomalias funcionais dos órgãos. Os primeiros sinais visíveis se manifestam no nível do tecido cutâneo por alterações da textura, da cor, da transparência e pelo aparecimento de rugas. Essas manifestações po- dem ser potencializadas por fatores extrínsecos como o sol, o tabaco...

A importância dos radicais livres oxigenados (RLO) nos proces- sos implicados no envelhecimento é retida como uma das teorias maiores.

No nível cutâneo, os RLO sob atmosfera descritos como os me- diadores precoces de patologias inflamatórias e do envelhecimento (Kress M. et al. Pain, 1995; 62:87 - 94)

No decorrer do envelhecimento, todas as estruturas da pele se modificam. Mas as alterações fundamentais predominam na derme e são fibroblastos e a matriz extracelular que são os principais alvos e os principais atores. Os fibroblastos são capazes de entrarem em senescência. Em con- seqüência, seu número diminui, sua função é diminuída e seu fenótipo é modificado. Eles participam então ativamente da degradação da matriz ex- tracelular dérmica. Além disso, quando da senescência, os fibroblastos per- dem sua reatividade e vêem sua regulagem modulada. Com efeito, é admiti- do que o envelhecimento está associado a uma redução, até mesmo uma perda da resposta ao estresse ambiental, e, dessa forma, a um aparecimen- to de doenças infecciosas, auto-imunes e de cânceres (Gardner I.D. Ver. Infect. Dis. 1980; 2: 801-10).

O aparecimento das rugas é um dos sinais mais precoces do envelhecimento. Ele constitui, para certas pessoas, um verdadeiro problema em suas relações com o exterior. Assim, hoje em dia, numerosos produtos cosméticos, visando ao tratamento do envelhecimento cutâneo são coloca- dos à disposição do público. Principalmente, essas especialidades são à base de extratos vegetais.

A argania, conhecida na nomenclatura botânica internacional sob a denominação de Argania spinosa (L.) Skels, foi notadamente valoriza- da pela indústria cosmética e, mais particularmente, a semente da amêndoa.

A argania é uma árvore atarracada de 6 a 10 metros de altura, cujo suporte lembra aquele da oliveira.

O suporte da coroa folicular é um pouco variável, podendo ser reto ou ramificado.

Os ramos, muito espinhosos, portam pequenas folhas Ianceola- das, alternadas, estreitas, curtas (aproximadamente 2 cm), freqüentemente agrupadas em fascículos.

A folhagem da Argania é geralmente persistente, mas acontece que, em período de grande seca, ela se torna murcha.

As flores, de coloração amarelo esverdeado, hermafroditas (etaminas e pistilhos sobre a mesma flor) e pentâmeros (cinco pétalas, cinco sépalas...) são agrupadas em inflorescências de tipo glomérula. Elas desa- brocham de maio a junho.

A argania frutifica desde os 5 anos. O fruto é um bago séssio amarelo e oval de 4 a 5 centímetros de comprimento. Ele é formado de um pericarpo carnudo (também denominado polpa), contendo uma espécie de "falso núcleo" muito duro de cor marrom. Esse elemento é constituído, na realidade, de 2 a 3 grãos achatados soldados entre si e contendo, cada um, uma amêndoa oleaginosa. As aplicações as mais valorizadas têm por ori- gem a amêndoa do grão. Esta fornece um óleo, depois em uma segunda etapa um resíduo sólido.

O óleo oriundo dos grãos constituiu o objeto de várias patentes de invenção: obtenção do óleo por solvente (FR 2 553 788), o óleo de arga- nia enriquecido em insaponificável (FR 2 724 663).

Substâncias diferentes do óleo foram também patenteadas. É o caso de peptídeos oriundos dos resíduos sólidos de grãos obtidos após ex- tração do óleo: associação do óleo e dos peptídeos de resíduos sólidos para o tratamento de alterações ligadas ao envelhecimento cutâneo (FR 2 756 183). A folha de argania, as proteínas, e as saponinas de resíduos sólidos constituíram também o objeto de patentes da invenção: EP 1 213 025 se refere aos extratos de folhas, EP 1 213 024 trata das proteínas de resíduos sólidos e EP 1 430 900 das saponinas de resíduos sólidos.

As polpas de frutos da Argania constituíram o objeto mais recen- temente do pedido de patente W02005/039610.

O fruto da Argania é uma falsa drupa. Ele é portanto constituído de um pericarpo carnudo, denominado polpa (55 a 75% do fruto) e de um núcleo provido de uma concha muito dura contendo 1 a 3 amêndoas. Destas é extraído o óleo.

A polpa da fruta constituiu o objeto de estudos químicos. Ela é constituída de glucídeos, cuja celulose, a glicose, a frutose e sacarose (Charrouf Z. Guillaume D., Ethnoeconomical, ethnomedical, and phytoche- mical study of Argania spinosa (L.) Skeels., Journal of Ethnopharmacology, 1999, 67, 1, 7-14 - Sandret F.G., Estudos preliminares dos glucídeos e do látex da polpa da fruta de argan (argania espinhosa): variação no decorrer da maturação, Boletim da Sociedade de Química Biológica, 1957, 39, 5-6, 619-631). Os lipídeos aí estão também presentes. Seu teor é de 6%. Na fra- ção insaponificável desses lipídeos foram identificados 5 álcoois triterpênicos = eritrodiol, luteol, α e β-amirina, betulinaldeído e 2 esteróis - α espinosterol e escotenol (Charrouf Z., Fkih-Tetouani S., Charrouf M., Mouchel B., Triter- penos e esteróis extraídos da polpa de argania espinhosa, plantas medici- nais e fitoterapia, 1991, 25, 2-3, 112-117).

O pedido de patente W02005/039610 se refere, de maneira ge- ral, à utilização de composição à base de polpas de frutas de argania para a preparação de produtos cosméticos. O extrato das polpas de frutas foi mais ou menos purificado. Com efeito, os inventores testaram o extrato em dife- rentes etapas do processo. Assim, é preferencialmente a utilização de um extrato de polpas de frutas obtido em conseqüência de uma extração ao he- xano que é descrito (página 15). Depois em conseqüência de uma clássica etapa de saponificação conhecida do versado, os autores testaram a fração insaponificável assim coletada. Enfim, os autores consideraram também uma etapa de fracionamento do insaponificável por cromatografia, tomando- se o cuidado de afastar o composto triterpênico eritrodiol.

Esse raciocínio foi orientado verdadeiramente pelos resultados obtidos notadamente pelo fato do eritrodiol sozinho estar presente como tó- xico (exemplo 1) a uma dose mais fraca que a fração triterpênica, tal como definida no documento: fração A desprovida de eritrodiol (página 38). Além disso, o eritrodiol sozinho apresenta apenas um benefício medíocre face aos UVA e UVB (exemplos 3 e 4), em relação a essa fração triterpênica. O ensi- namento geral desse documento se refere portanto à utilização da fração triterpênica de um extrato de polpa de frutas de argania para a preparação de produtos cosméticos e preferencialmente no tratamento das peles agre- didas pelos UVA e UVB via o estímulo do metabolismo dos fibroblastos. Mais especificamente, esse documento ensina que essa fração triterpênica, tal como descrita em W02005/039610 será tanto mais ativa quanto mais fraca a quantidade de eritrodiol.

De maneira surpreendente e inesperada, os autores da presente invenção colocaram em evidência um efeito de inibição da senescência dos fibroblastos de cascas maduras com um extrato insaponificável de polpas de frutas de argania rica em eritrodiol; esse extrato sendo capaz de ser obtido por uma extração acetônica seguida de uma etapa clássica de saponificação. Todavia, pode-se racionalmente pensar que os benefícios da presente inven- ção possam ser estendidos a qualquer extrato insaponificável de polpa vege- tal, apresentando uma fração triterpênica, cuja composição em seus compos- tos majoritários é próxima daquela oriunda das polpas de frutas de argania.

A presente invenção se refere à utilização de um extrato insapo- nificável de polpa vegetal, compreendendo uma fração triterpênica, caracte- rizado pelo fato de essa fração triterpênica compreender o eritrodiol, a a- amirina, da β-amirina e do lupeol, para a preparação de um produto cosmé- tico, farmacêutico ou nutracêutico destinado a prevenir e/ou tratar alterações cutâneas associadas ao envelhecimento cutâneo. De forma preferencial, esse extrato é obtido por uma extração acetônica seguida de uma etapa clássica de saponificação.

Esse extrato insaponificável, esse extrato insaponificável inicial, pode ser solubilizado em um excipiente para facilitar sua formulação.

Preferencialmente, esse extrato é obtido a partir de um vegetal escolhido na família das sapotaceae; e ainda mais preferencialmente esse extrato é obtido a partir de polpas de frutas de argania.

Uma vantagem da extração acetônica reside no fato de ser pos- sível se livrar do látex, que representa a maior parte da fração lipídica, e as- sim ser mais concentrado em substâncias insaponificáveis na fração lipídica.

A composição do insaponificável, segundo a presente invenção, se diferencia ao mesmo tempo qualitativa e quantitativamente daquela des- crita preferencialmente no pedido de patente WO2005/039610.

Os extratos, segundo a presente invenção, são caracterizados pelo teor em substâncias triterpênicas. Estas podem ser analisadas por cro- matografia em fase gasosa, segundo um método apropriado clássico que permite identificar a β-amirina, o eritrodiol. Ao contrário, a α-amirina e o Iu- peol não são separados por esse método, essas moléculas podem então ser dosadas comumente.

Vantajosamente, a fração triterpênica desse extrato é composta de eritrodiol, cuja fração mássica está compreendida entre aproximadamente 7% e aproximadamente 40% do insaponificável inicial, de β-amirina, cuja fração mássica está compreendida entre aproximadamente 5% e aproxima- damente 30% do insaponificável inicial, da α-amirina e de lupeol, cuja soma dessas duas frações mássicas está compreendida entre aproximadamente 10% e aproximadamente 50% do insaponificável inicial.

De forma vantajosa, essa fração mássica de eritrodiol está com- preendida entre aproximadamente 10% e aproximadamente 20% do insapo- nificável inicial; e de forma ainda mais vantajosa é igual a aproximadamente 15% do insaponificável inicial.

De forma vantajosa, essa fração de β-amirina está compreendi- da entre aproximadamente 7% e aproximadamente 20% do insaponificável inicial; e de forma ainda mais vantajosa e também a aproximadamente 10% do insaponificável inicial.

De forma vantajosa, a soma dessas frações mássicas de α - amirina e de Iupeol está compreendida entre aproximadamente 15% e apro- ximadamente 30% do insaponificável inicial; e de forma ainda mais vantajo- sa é igual a aproximadamente 20% do insaponificável inicial.

Os teores nessas diferentes moléculas dependem das condições de extração. Esses valores serão menos importantes no produto cosmético, farmacêutico ou nutracêutico em função do(s) excipiente(s) que serão acres- centados ao insaponificável inicial.

Um ponto notável da presente invenção é a contribuição impor- tante do eritrodiol nas propriedades antienvelhecimento do extrato insaponi- ficável, segundo a presente invenção. Os RLO exercendo um papel impor- tante no processo de envelhecimento cutâneo, o efeito anti-radicalar (anti- RLO) do eritrodiol foi avaliado em comparação como insaponificável de pol- pas de frutos de argania, segundo a presente invenção.

Os danos criados pelos RLO no meio das células se traduzem pela alteração dos componentes lipídicos da membrana plásmica (lipoperoxi- dação), das proteínas (desnaturação e degradação) e do material genético ou DNA (mutações). Os testes realizados in vitro referiram-se à determinação:

- da eficácia de proteção pelo eritrodiol e pelo extrato insaponifi- cável contra a oxidação de lipídeos membranários (exemplo 3); e

- do poder protetor do eritrodiol e de outras moléculas triterpêni- cas (lupeol, α e β-amirina) face à alteração do DNA genômico (exemplo 4).

Esses testes permitiram colocar em evidência que o eritrodiol é uma molécu- la que possui um potencial antioxidante importante.

Em um modo particular de realização da presente invenção, a extração pode ser realizada conforme a seguir: as polpas de Argania secas são moídas, depois extraídas com a acetona. Pode-se também utilizar uma mistura acetona-água. A extração é feita sob agitação ou de forma estática, em uma proporção planta/solvente podendo variar de Vz a 1/20, a temperatu- ras que variam da temperatura ambiente à temperatura de ebulição do sol- vente e em uma duração que pode ir de 30 minutos a 24 horas.

Uma vez extraído, o resíduo sólido de planta é separado da so- lução extrativa por filtragem ou centrifugação. A solução pode ser mais ou menos concentrada até a obtenção de um extrato seco. Neste caso, a maté- ria seca pode ser solubilizada em um álcool para permitir a saponificação.

À solução, é acrescentado um hidróxido metálico, em particular a soda ou a potassa com concentrações que variam de 0,1 a 10 Ν. A saponi- ficação é feita a temperaturas que variam da temperatura ambiente à ebuli- ção, sob agitação e em uma duração que varia de 15 minutos a 48 horas segundo a temperatura.

A purificação é feita por uma extração líquido/líquido. Acrescen- ta-se então ao meio de hidrólise um solvente não miscível que pode ser á- gua saturada ou não em sais [NaCI, (NH4)SO4] e ajustada com pH que vari- am de 3 a 9. Esse solvente pode ser um éter oxido, um éster, um alcano, um hidrocarboneto halogenado, ou uma mistura desses solventes. Uma, duas ou três extrações líquidos/líquidos sucessivas são realizadas. As fases orgânicas são reunidas, depois lavadas com água saturada ou não me sais e com pH que variam de 3 a 9. Essa fase de lavagem pode ser repetida várias vezes.

Após purificação, as fases orgânicas são tratadas de forma a eliminar o solvente. Esse tratamento pode ser efetuado por evaporação, con- trolando a pressão. A etapa de evaporação pode levar a um produto de con- sistência lipídica mais ou menos cerosa, o insaponificável inicial.

Pode-se acrescentar um excipiente que pode ser uma cera ani- mal (abelha, por exemplo) ou vegetal (cera de Carnaúba, de Candellila ou de Jojoba), um óleo vegetal (milho, cartamo, sésamo, argan...) a glicerina, pro- dutos de origemn sintética como o óleo de vaselina, os polióis (como propi- leno glicol, o butileno glicol, o glicerol...) triglicerídeos esterificados (como o migliol 812, o mititol 318, o neobee MJ), os polímeros oxipropilenados de fórmula H (OCH2-CHCH3)n OH ou os polímeros oxietilenados de fórmula H (O CH2-CH2)n OH, os diésteres de álcool graxo de comprimento variável, de C1 a C40- As proporções da insaponibilidade inicial de polpas de frutas de Arganier e do excipiente podem variar de 1/99 a 99/1.

De forma vantajosa, a presente invenção permite uma valoriza- ção das polpas de frutas no tratamento antienvelhecimento, a um custo ra- zoável. O extrato insaponificável é utilizado sem etapa de purificação suple- mentar, que é muito onerosa. A composição, de acordo com a presente in- venção pode, portanto, ser obtida com o auxílio de um processo que faz inter- vir etapas clássicas de extração e de saponificação conhecidas do versado.

A utilização de um extrato insaponificável de polpa vegetal, se- gundo a presente invenção permite prevenir e/ou tratar as alterações cutâ- neas que se manifestam por alterações de textura, de cor, da transparência da pele e pelo aparecimento das rugas.

Em um modo de realização particular da invenção, as alterações cutâneas são consecutivas a uma redução ou uma perda de resposta ao estresse ambiental, notadamente causado pelo sol ou pelo tabaco.

Em um outro modo de realização particular da invenção, as alte- rações cutâneas são consecutivas a uma redução ou uma perda de inducti- bilidade das proteínas HSP72. As proteínas HSP para "Heat Shock Protein" são expressas constitutivamente em numerosas células e possuem funções indispensáveis na manutenção das proteínas, daí seu nome de proteínas "chaperona". Com efeito, elas inibem a agregação das proteínas desnatura- das, impedem associações não apropriadas de proteínas e elas são implica- das no transporte intracelular e na manutenção sob a forma inativa de certas proteínas (Morris S.D. Clin. Exp. Dermatol. 2002; 27: 220-224). As HSPs exercem também um papel essencial na resposta ao estresse e notadamen- te nos processos de proteção celulares que colocam em jogo a resposta a- daptativa (Maytin E.V. J. Invest. Dermatol. 1995; 104: 448-55).

De forma inesperada, a utilização de um extrato segundo a pre- sente invenção permite restaurar a indução das proteínas HSP72 nos fibro- blastos senescentes.

No âmbito da presente invenção, o produto cosmético, farmacêu- tico ou nutracêutico, contendo um extrato, de acordo com a invenção, é admi- nistrado por via oral ou por via tópica, e preferencialmente por via tópica. Para uma administração por via tópica, a forma galênica é esco- lhida no grupo que compreende os cremes, os géis, as pomadas e os sprays.

Vantajosamente, a forma oral é escolhida dentre o grupo que compreende comprimidos, cápsulas e pós para suspensões ingeríveis.

De forma vantajosa, a quantidade desse extrato no produto cosmético final está compreendida entre aproximadamente 0,001% e apro- ximadamente 50%, preferencialmente entre aproximadamente 0,01% e a- proximadamente 10%; e ainda mais precipitado formado entre aproximada- mente 0,1 % e aproximadamente 2% em peso do peso total da preparação.

A preparação pode, além disso, conter outros ativos bem- conhecidos do versado para o tratamento e/ou a prevenção das alterações cutâneas associadas ao envelhecimento cutâneo. Vantajosamente, essa preparação contém outras substâncias oriundas da argania conhecidas por sua ação "antiidade", tais como o óleo obtido a partir da amêndoa e do grão e os peptídeos de resíduos sólidos, por exemplo.

O exemplo abaixo de uma composição, de acordo com a inven- ção, é dado a título indicativo e não limitativo. As percentagens são dadas em peso em relação ao peso total da composição.

EXEMPLO 1: cuidado anti-relaxamento rosto

- Extrato insaponificável de polpa de frutos da argania 0,1 a 2%

- Óleo de argania enriquecida 1 a 5%

- Peptídeos de argania 0,1 a 1%

- Derivado de vitamina E 0,1 a 0,5%

- Éster glicérico de vitamina F 0,1 a 0,5%

- Palmitato vitamina A 0,1 a 1%

- Estearato metil glicose 1 a 5%

- Triglicerídeos cáprico caprílico 2 a 8%

- Parafina líquida 5 a 12%

- Perfume qs

- Água purificada q.s.p. 100 g

Os exemplos seguintes ilustram a presente invenção.s em toda- via limitar-lhe o alcance.

EXEMPLO 2: processo de obtenção de um extrato insaponificável de polpas de frutos de argania

1 tonelada de polpas de fruta de Argania secas é moída, depois extraída em um reator por 5 toneladas de acetona. A extração é feita sob agitação durante uma hora ao refluxo. Uma vez resfriada, a solução é recu- perada por filtragem, depois concentrada sob vácuo até à obtenção de um extrato oleoso sem solvente. Esse resíduo é retomado em 500 I de etanol a 95% v/v. São acrescentados aí 100 I de lixívia de soda 10 N e leva-se ao refluxo sob agitação durante uma hora.

Após resfriamento, a solução hidrolisada é colocada em um decan- tador, são aí acrescentados 500 I de heptano e 300 I de água. A extração líqui- do/líquido é feita com precaução. Após decantação, recupera-se a fase orgâni- ca. Repetem-se duas extrações novas com 500 I de heptano. As 3 fases hep- tânicas são agrupadas e lavadas 3 vezes com 500 I de água cada vez. As fases orgânicas lavadas têm os solventes retirados. Recupera-se assim uma pasta em consistência de cera. Esse extrato, que corresponde ao insaponificável ini- cial, é dosado para seu teor em Substancias triterpênicas. Ele contém 10% de β amirina, 15% em eritrodiol e 20% da mistura lupeol-α amirina.

EXEMPLO 3: análise do efeito anti-radicalar do reitrodiol - análise da peroxi- dação lipídica

1) Introdução

A membrana plásmica constitui o principal e o primeiro alvo das RLO e, sendo rica em lipídeos, ela é o local de uma peroxidação aumentada (Girotti A. W. J. Free Radie. Biol. Med. 1985; 1: 87-95). Os peróxidos gera- dos no decorrer dessa oxidação lipídica são também muito reagentes e ca- pazes de degradar o material protéico e genômico.

Para avaliar a alteração membranária, os autores da invenção mediram a peroxidação lipídica por uma dosagem in vitro dos complexos entre os produtos de oxidação lipídica e o ácido tiobarbitúrico. Esses com- plexos são denominados TBARS (para Thiobarbituric Acid ReaCTIVE Subs- tances)e dão o nome ao teste: Teste das TBARS. A fim de mimar um estresse oxidativo químico, tratou-se a linha- gem de fibroblastos, L929, por um complexo composto de peróxido de hi- drogênio (H2O2) e de ferro (Fe2+/ Fe3+) reconstituindo assim a reação de Fenton, fonte de RLO e mais particularmente de radical hidroxila (OH0) (Vessey D.A et al J. Invest. Dermatol. 1992; 99: 859-63): H2O2 + Fe2+ -> OH0 + OH- + Fe3+.

2) Metodologia

Produtos testados:

Os produtos foram avaliados sobre a linhagem de fibroblastos murins L929. As células são pré-tratadas com as diferentes concentrações de produtos (Tabela I) durante 16 horas e são em seguida estimuladas com o complexo H2O2- Fe2+/ Fe3+ durante uma hora. O lote LK0304 de extrato insaponificável dê polpas de frutas de argania foi preparado, segundo o e- xemplo 2.

Tabela I: apresentação das soluções testadas

<table>table see original document page 12</column></row><table>

(*Molécula de referência anti-radicalar)

A peroxidação dos lipídeos membranários foi analisada, medin- do-se as TBARS (segundo Morlière P. et al Biochim. Biphys. Acta 1991; 1084:261 -268).

Princípio do teste:

em meio ácido, a 95°C, formam-se complexos, anotados TBARS para Thio Barbituric Acid Reactive Substance, entre os produtos de oxidação lipídicas (malondialdeído ou MDA) e o ácido tiobarbitúricxo (TBA) que podem ser dosados em fluorescência em relação a uma faixa de aferição com o MDA. A dosagem das TBARS é então expressa em pmol/µg de proteínas. As proteínas e TBARS são dosados no meio intracelular.

. Cálculo da percentagem de proteção das membranas celula- res:

A partir do cálculo das TBARS em pmol/pg proteínas, a eficácia protetora dos diferentes produtos contra a oxidação dos lipídeos membraná- rios foi calculado conforme a seguir.

<formula>formula see original document page 13</formula>

3) Resultados - Discussão Após um tratamento de 16 horas com os diversos produtos a tes- tar, o modelo de estresse radicalar utilizado nessa experiência (reação de Fen- ton) induz uma peroxidação lipídica importante nos fibroblastos L929. Essa descarga maciça de radical hidroxila OH0 gera, portanto, um estresse oxidativo no nível celular e notadamente no nível das membranas. Todavia, nesse tipo de reação oxidativa, os produtos oriundos da peroxidação lipídica são internaliza- dos nas células e as TBARS são então dosadas no meio intracelular.

Os resultados obtidos são apresentados na tabela Il abaixo.

Tabela II: análise da peroxidação lipídica <table>table see original document page 13</column></row><table> A vitamina Ε, constituindo a molécula de referência anti- radicalar, diminui a peroxidação lipídica induzida pelo complexo H2O2- Fe2+/Fe3+, e protege muito eficazmente as membranas celulares (56% apro- ximadamente).

O extrato insaponificável de polpas de frutos da argania prepa- rado segundo o exemplo 2 apresenta uma atividade anti-radicalar às con- centrações de 1 e 3 µg/ml (30 e 37% de proteção das membranas lipídicas, respectivamente).

O eritrodiol, molécula contida na fração triterpênica do extrato insaponificável, apresenta uma boa atividade antioxidante com um efeito dependente da dose. O eritrodiol é ativo desde 0,3 µg/ ml (33% de prote- ção). O efeito anti-radicalar do eritrodiol a 3 µg/ml é muito importante e com- parável à Vitamina E.

4) Conclusão

O modelo in vitro apresentado nesse estudo reflete as conse- qüências devido a um estresse oxidativo maior sobre o principal alvo celular que é a membrana plásmica. Assim, a dosagem da peroxidação lipídica constitui um bom marcador do estresse oxidativo e permite a avaliação da ação antioxidante, face ao radical hidroxila, de princípios ativos no nível da membrana celular.

A vitamina E, molécula antioxidante, permite a validação desse modelo.

Nessas condições experimentais, foi observado que o extrato segundo a presente invenção contendo o eritrodiol, assim como o próprio eritrodiol possuem um potencial antoxidante importante.

EXEMPLO 4: análise do efeito anti-radicalar do eritrodiol - análise do alcance genômico

1) Introdução

O DNA é um alvo dos RLO que induzem a modificação de bases (oxidação, nitretação, desaminação: Guetens G. et al Clin. Lab. Sei. 2002; 39: 331 - 457), a formação de rupturas de filamentos (locais abásicos ou β-eliminação) e de pontagem DNA-proteínas ou DNA-hidroperóxidos. A alte- ração do material genômico induz uma cascata de reações celulares (blo- queio garfo de replicação, ativação de proteínas chaves, parada no ciclo ce- lular) que chegam à indução dos mecanismos de reparo. As bases modifica- das por um estresse oxidativo são assim tomadas em carga majoritariamen- te pelo sistema de reparo das bases ou BER para Base excision Repair (Fri- edberg E.C. et al DNA repair and mutagenesis, ASMPress; Washington DC 1995). Esse sistema age rápida e eficazmente segundo três etapas-chaves:

1 - reconhecimento da base alterada;

2 - incisão e excisão da lesão;

3 - nova síntese da breche.

Os RLO podem ser produzidos em quantidade tal que os siste- mas de defesa e de reparo celulares podem ser saturados. Se os efetuado- res da apoptose forem ativados, a célula danificada morrerá. Mas, no caso em que as lesões no DNA forem mal reparadas, poderá haver geração de mutações deletérias que são então implicadas na etapa de iniciação da car- cionogênese. É por isso que a incidência biológica de um estresse oxidativo (mortalidade ou mutagênese) acondiciona acontecimentos a mais longo pra- zo, como o envelhecimento e o câncer.

Numerosos estudos demonstraram a forte correlação entre o enve- lhecimento e o acúmulo progressivo e irreversível de danos oxidativos no nível das macromoléculas celulares. Vários grupos de pesquisa mostraram que, roe- dor, as taxas de 8-oxoGuanina, medidas em diferentes tecidos, tais como a pe- le, aumentam com a idade (Tahara S. et al Mech. Ageing Dev. 2001; 122: 415 - 426). Os trabalhos de Mecocci P. et al (Free Radie. Biol. Med. 1999; 26: 303-8) sobre o músculo esquelético no homem, mostram que lesões oxidantes sobre o DNA ou sobre os lipídeos se acumulam com a idade. A mesma equipe mostrou também que nos indivíduos atingidos pelo Mal de Alzheimer, as taxas de bases oxidadas no DNA dos linfócitos e as taxas de antioxidantes no plasma são sig- nificativamente mais altos e mais baixos respectivamente, do que no indivíduos sadios (Mecocci P. et al Arch. Neurol. 202; 59 : 794-8).

2) Objetivo

Após o exemplo 3, e a fim de controlar a atividade anti-radicalar do eritrodiol sobre um outro modelo, os autores da invenção analisaram seu poder protetor face à alteração do DNA genômico induzida por um estresse oxidativo, em comparação como extrato insaponificável de polpas de frutas de argania e de outras moléculas triterpênicas contidas também nesse extrato.

Eles escolheram gerar lesões no DNA por um estresse H2O2 e analisar indiretamente os danos assim formados, analisando a reação de reparo. Para isso, um kit denominado teste 3D para DNA Damage Detection foi utilizado. Esse teste bioquímico mima in vitro a reação de reparo por ex- cisão (Salles B. et al Anal. Biochem. 1995; 232: 37-42 e Salles B. et al Bio- chemie 1999; 81: 53-58). O teste 3D tem por base o reparo das lesões do DNA por meio de extrato celulares humanos purificados. No decorrer da eta- pa de reparo, um marcador é incorporado ao DNA e essa incorporação, re- flexo quantitativo do número de lesões reparadas, é em seguida revelada por quimiluminescência.

3) Metodologia

. Produtos testados

Os produtos foram avaliados sobre a linhagem de fibroblastos mu- rinos L929. As células são pré-tratadas com os produtos (Tabela III) durante 16 horas e são em seguida estimuladas com H2O2 peróxido de hidrogênio 3% - Ref. GIFRER - Laboratoire Gifrer Barbezat) a 10O μΜ, durante 30 minutos.

Tabela III: apresentação das soluções testadas

<table>table see original document page 16</column></row><table> .Teste 3D:

O princípio é o seguinte: Após dano do DNA genômico (trata- mento oxidativo), as células são lisadas. O Iisado é depositado sobre uma microplaca coatada com a polilisina:

1. Adsorção do DNA

2. Incubação do DNA com um extrato protéico (enriquecida em enzimas de reparo) e um pool de nucleotídeos dos quais um nucleotídeo é marcado na biotina (dUTP-Biotine) - Reparo das lesões e incorporação no DNA dos nucleotídeos marcados "dUTP-Biotina".

3. Incubação com um complexo enzimático "Avidine-Peroxidase"

- reconhecimento pela avidina das dUTP - Biotina incorporados.

4. Adição de um substrato de peroxidase Iuminescente e quanti- ficação do sinal emitido proporcional ao número de lesões reparadas.

O protocolo de realização do teste é seguido segundo as instru- ções do fornecedor do Kit (Teste 3D Solyscel - referência: SFRIDN13 - AES laboratório). No fim da reação, a placa é lida em um luminômetro (MITHRAS LB940 - BERTHOLD).

.Cálculo da percentagem de proteção do DNA:

O relatório abaixo permite calcular, para cada concentração de produto testado, a percentagem contra a indução sobre o DNA por um es- tresse oxidativo (a Intensidade de Luminescência - ou IL - expressa a quan- tidade de lesões do DNA).

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4) Resultados e conclusão.

Os resultados obtidos no exemplo 3 mostrarem que o eritrodiol apresenta a atividade anti-radicalar a mais forte com 3 Mg/ml (6,78 μΜ). É por isso que os autores escolheram testar todos os tripterpenos (lupeol, a- amirina, β-amirina e eritrodiol) e o extrato insaponificável de polpas de frutos de argania com 3 pg/ml sobre o teste 3D "DNA Damage Detection". Esse extrato insaponificável foi obtido segundo o processo do exemplo 2.

Os resultados obtidos são apresentados na tabela IV abaixo. Os valores indicados nessa tabela são as percentagens de inibição (ou % de proteção) das lesões no DNA em conseqüência de um estresse oxidativo exógeno, em relação às células "prova basal"(100%) e às células "estressa- do H2O2" (0%).

Tabela IV: protecao do DNA pelo Eritrodiol

<table>table see original document page 18</column></row><table>

O tratamento por H2O2 induz uma forte proporção de oxidação no nível da Guanina com formação em particular de 8-oxo-7,8-dihidro-2'- desoxiguanosina (8-OxoGuanina) (Dizdaroglu M. et al Arch. Biochem. Bio- phys. 1991; 285: 238-390). O teste 3D mostra um elevado aumento de Iumi- nescência após tratamento com H2O2, refletindo uma forte atividade de reparo e, por conseguinte, uma taxa considerável de bases danificadas sobre o DNA.

O extrato insaponificável de polpas de frutos de argania protege eficazmente o DNA face ao estresse oxidativo.

O eritrodiol, molécula contida nesse extrato insaponificável, com 3 μg/ml apresenta uma atividade oxidante muito boa com 99% de proteção do DNA face à formação de lesões oxidativas.

Comparando-se as moléculas triterpênicas com concentração molar equivalente (aproximadamente 7 μΜ), é o eritrodiol que é o mais ativo.

Exemplo 5: Modelo de estudo in vitro do efeito do extrato insaponificável, segundo a invenção sobre a indução das proteínas HSP72.

1) Bibliografia

Diferentes trabalhos mostraram a perda de inductibilidade das proteínas HSP72, quando do envelhecimento. Em pacientes idosos, a indu- ção da proteína HSP72 pelo calor é reduzida de forma muito considerável no nível cutâneo (Muramatsu T. et al. Br. J. Dermatol, 1996; 134: 1035-1038). Por outro lado, Gustmann-Conrad A et al. (exp. Cell. Res. 1998; 241: 404- 413) mostraram que a indução da proteína HSP72 por um estresse térmico é significativamente diminuída em fibroblastos oriundos da pele de indivíduos idosos em relação àqueles de indivíduos jovens. Nesse mesmo estudo, foi mostrado que o nível de indução de HSP72 é também reduzido em fibroblas- tos (oriundos de pelo jovem) ou em linhagens de fibroblastos (IMR-90) tor- nados senescentes durante divisões celulares.

Um primeiro estresse moderado basta para induzir in vitro as proteínas HSPs, a fim de que elas protejam a célula face aos novos estres- ses (Morris S. D. et al. J. Clin. Invest. 1996; 97: 706-12). A HSP72 é uma proteína majoritária da família das HSP70, expressa nos queratinócitos e nos fibroblastos cutâneos e indutível por numerosos agentes estressantes (calor, UV...) (Trautinger F. et al. J. Invest. Dermatol. 1993; 101: 334-38; Charveron M. et al. Cell. Biol. Toxicol. 1995; 11:161 -65).

2) Protocolo experimental

Os autores da presente invenção escolheram analisar o nível de indução, por um estresse térmico, das proteínas HSP72 em fibroblastos IMR-90 (linhagem fibroblástica), quando da senescência e isto a fim de ava- liar as propriedades "antiidade" de um extrato de polpas de fruto de argania preparado segundo o exemplo 2, seja contendo 10% de β amirina, 15% de eritrodiol e 20% da mistura Iupeol - a-amirina.

Em uma primeira etapa, os autores colocaram e validaram um modelo de envelhecimento celular, induzindo a senescência dos fibroblastos por um estresse oxidativo.

- Modelo de senescência induzida:

Os fibroblastos se dividem até um estado crítico que se chama senescência replicativa e que se assimila a um envelhecimento celular. Mas a senescência pode também ser induzida notadamente por um estresse oxi- dativo, trata-se da "Stress-lnduced Premature Senescence ou SIPS" (Du- mont et al Free Radie. Biol. Med. 2000; 28: 361-373).

Modelo utilizado: A indução da senescência na linhagem de fi- broblastos IMR-90 jovens foi colocado em evidência, tratando as células 2 horas com H2O2. 72 horas após esse estresse, as células IMR-90 são se- nescentes.

Em uma segunda etapa, mostraram a diminuição do nível de indução das HSP72 em conseqüência de um estresse térmico, em fibroblas- tos senescentes comparados a fibroblastos jovens. Finalmente, eles avalia- ram as propriedades de um extrato de polpas de fruto de argania preparado segundo o exemplo 2, seja contendo 10% de β amirina, 15% de eritrodiol e 20% da mistura Iupeol - α amirina sobre esse modelo de senescência.

3) Resultados

A invenção será melhor compreendida e as finalidades, vanta- gens e características desta aparecerão mais claramente da descrição que se segue e que é feita com referência aos desenhos anexados, nos quais:

- a figura 1 apresenta a análise da taxa de indução das HSP72 nos fibroblastos IMR-90 no nível transcripcional e traduccional;

- a figura 2 apresenta a análise por Westerm Blot da taxa de pro- teínas HSP72 nas células IMR-90 tratadas com diferentes concentrações do extrato de polpas de fruto de argania, segundo a invenção;

- a figura 3 apresenta a análise semiquantitativa da taxa de indu- ção das proteínas HSP72 (normalizada pelo nível de expressão da β-acti/ia)

nos fibroblastos IMR-90 senescentes pré-tratados com diferentes concentra- ções de extratos de polpas de fruto de argania, segundo a invenção.

- Análise da indução das HSP72 por um estresse térmico no de- correr da senescência dos fibroblastos IMR-90:

as células cultivadas a 37°C são incubadas durante uma hora a 45°C e são em seguida incubadas a 37°C durante duas horas (análise de mRNA) ou durante 4 horas (análise das proteínas). * Expressão da proteína (Western Blot)

As proteínas intracelulares, extraídas dos fibroblastos, foram a- nalisadas pela técnica do Western Blot, utilizando um anticorpo anti-HSP72 (Anticorpo monoclonal, CHEMICON) e um sistema de revelação indireta em luminescência. A membrana é analisada e a intensidade das faixas é quanti- ficada por densiometria (Logiciel ImageMaster TotaILab AMERSHAM). O nível de expressão de HSP72 é normalizado por aquele de uma proteína expressa de forma constitutiva, a β-actina.

A figura 1A apresenta a análise semiquantitativa por Western Blot da taxa de indução das proteínas HSP72 nos IMR-90 jovens (□) e IMR- 90 senescentes (■) (senescência induzida por H2O2). Assim, a figura 1A mostra claramente que a taxa de proteínas HSP72 é induzida por um estres- se térmico em fibroblastos IMR-90 jovens. Essa indução de HSP72 é diminu- ída em fibroblastos IMR-90 senescentes.

* Expressão dos mRNA (PCR em tempo real)

Os autores analisaram a expressão HSP72 no nível transcrip- cional, quantificando-se os mRNA pela técnica de PCR em tempo real.

O nível de expressão do gene de interesse HSP72 é calculado nas amostras tratadas por um estresse térmico e as amostras provas. O nível de expressão do gene HSP72 é em seguida normalizado, utilizando três genes de referência [β-actina, GAPDH (Human Glyceraldehide-3-phosphate deshydro- genase) e YWHAZ (Tyrosine-3-monooxigenase, tryptophane-5-monooxigenase activation protein zeta polypeptide)], cuja expressão é constitutiva.

Enfim, fixando-se o nível de expressão nas amostras provas em 1, então é possível determinar o fator de indução do gene HSP72.

A figura 1B apresenta a análise quantitativa por PCR em tempo real da taxa de indução dos mRNA HSP72 nos IMR-90 jovens (□) e IMR-90 senescentes (■) (senescência induzida por H2O2). A figura 1B mostra clara- mente que a indução dos mRNA HSP72 é também diminuída, quando da senescência induzida dos fibroblastos IMR-90.

- Análise da eficácia do extrato de polpas de frutos de argania:

Os autores da invenção utilizaram o modelo de senescência in- duzida ou SIPS (Stress Induced Premature Senescence) com a linhagem fibroblástica IMR-90 para avaliar o extrato de polpas de fruto de argania pre- parado segundo o exemplo 2.

As células foram incubadas com o extrato de polpas de fruto de argania às concentrações de 1 e 3 pg/ml durante 24 horas. Depois elas so- freram o estresse oxidativo induzindo a senescência.

Todos os tratamentos foram comparados a um lote de células IMR-90 "jovens" e um lote de células "senescentes" (senescência induzida) não pré-tratadas pelo extrato de polpas de frutos de argania.

TresHias (72 horas), após o estresse oxidativo, as HSP72 foram induzidas pelo calor. Finalmente, os ARN e as proteínas HSP72 foram anali- sadas por PCR em tempo real e Western Blot, respectivamente.

A figura 2 apresenta a análise por Western Blot da taxa de prote- ínas HSP72 nas células IMR-90 tratadas com o extrato insaponificável pre- parado segundo o exemplo 2. As menções "T" e "ST" significam respectiva- mente "prova" e "estresse térmico". As análises A, B, C e D se referem res- pectivamente a fibroblastos IMR-90 jovens, fibroblastos IMR-90 senescentes (senescência induzida por H2O2), fibroblastos IMR-90 senescentes são incu- bados com o extrato insaponificável com 1 Mg/ml e enfim fibroblastos IMR-90 senescentes incubados com o extrato insaponificável com 3 pg/ml.

A figura 3 apresenta a análise semiquantitativa da taxa de indu- ção das proteínas HSP72 (normalizada pelo nível de expressão da -actina) nos fibroblastos IMR-90 senescentes pré-trados com o extrato insaponificá- vel com 1 pg/ml (C) e com 3 Mg/ml (D). Estão também representadas as ta- xas de indução das proteínas HSP72 nos fibroblastos IMR-90 jovens (A) e nos fibroblastos IMR-90 senescentes (B) (senescência induzida por H2O2).

Essas figuras 2 e 3 mostram que não há mais indução das prote- ínas HSP72 nos fibroblastos IMR-90 tornados senescentes, mas que o ex- trato de polpas de frutos de argania, às concentrações de 1 e 3 pg/ml, res- taura a indução das HSP72 pelo estresse térmico.

Enfim, a tabela V abaixo dá o fator de indução (após normaliza- ção) dos ARN HSP72 em fibroblastos senescentes pré-tratados com diferen- tes concentrações de extrato de polpas de frutos de argania. Tabela V: fator de indução

<table>table see original document page 23</column></row><table>

Essa tabela confirma os resultados obtidos no nível transcripcio- nal e mostra a restauração quase total da indução dos mRNA HSP72 pelo extrato de polpas de fruto de argania. É na concentração de 3 Mg/ml que es- se extrato é mais ativo.

4) Conclusão

As proteínas HSP72 são proteínas indutíveis por numerosos es- tresses (calor...) e são muito implicadas nos processos de resposta adapta- tiva. É reconhecido que a inductibilidade das proteínas HSP72, no nível cu- tâneo e em outros tecidos, diminui com a idade e notadamente quando da senescência celular. Além disso, é admitido que o envelhecimento é associ- ado a uma redução da resposta ao estresse ambiental acarretando patologi- as ligadas à idade.

A partir de um modelo de senescência induzida em fibroblastos em cultura, os autores avaliaram a capacidade do extrato de polpas de fruto de argania a modular a diminuição de indução das HSP72 pelo calor.

O exemplo dos resultados confirma, por um lado, que há uma forte diminuição da indução das HSP72 (por um extresse térmico) em fibro- blastos senescentes èm comparação com fibroblastos jovens. Por outro la- do, esses trabalhos mostram que o extrato de polpas de fruto de argania restaura a indução das proteínas de HSP72 nos fibroblastos senescentes. Nesse modelo de estudo in vitro, a extração de polpas de fruto de argania limita as conseqüências biológicas da senescência celular e, portanto, apre- senta propriedades antienvelhecimento.

Claims (13)

1. Utilização de extrato insaponificável de polpa vegetal compre- endendo uma fração triterpênica, caracterizado pelo fato de essa fração tri- terpênica compreender eritrodiol, a α-amirina, a β-amirina e o lupeol, para a preparação de um produto cosmético, farmacêutico ou nutracêutico destina- do a prevenir e/ou tratar alterações cutâneas associadas ao envelhecimento cutâneo, a quantidade de eritrodiol estando compreendida entre 7% e 40% do extrato insaponificável.

2. Utilização, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de a fração mássica de β-amirina estar compreendida entre 5 e -30% do extrato insaponificável.

3. Utilização, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de a sòma das frações mássicas de α-amirina e de lupeol estar compreendida entre 10% e 50% do extrato insaponificável.

4. Utilização, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de a quantidade desse extrato no produto cosmético final estar compreendida entre 0,001% e 50%, preferencialmente entre 0,01% e 10%, e ainda mais preferencialmente entre 0,1 e 2% em peso total da preparação.

5. Utilização, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de esse extrato ser obtido a partir de um vegetal escolhido na famí- lia botânica das Sapotaceae.

6. Utilização, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de esse extrato ser obtido a partir de polpas de frutos de argania.

7. Utilização, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de as alterações cutâneas se manifestarem por alterações de textu- ra de cor, da transparência da pele e pelo aparecimento de rugas.

8. Utilização, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de as alterações cutâneas serem consecutivas a uma redução ou a uma perda de resposta ao estresse ambiental.

9. Utilização, de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo fato de o estresse ambiental ser causado pelo sol, pelo tabaco.

10. Utilização, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de as alterações cutâneas serem consecutivas a uma redução ou uma perda de inductibilidade das proteínas HSP72.

11. Utilização, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de o produto cosmético, farmacêutico ou nutracêutico, estar sob a forma oral ou tópica, preferencialmente por via tópica.

12. Utilização, de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pelo fato de a forma tópica ser escolhida dentre o grupo que compreende cremes, géis, pomadas e sprays.

13. Utilização, de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pelo fato de a forma oral ser escolhida dentre o grupo que compreende comprimidos, cápsulas e pós para suspensões ingeríveis.