BRPI0621280A2 - polipeptìdeo tendo atividade esterase e esterase recombinante e seus usos - Google Patents
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Abstract
POLIPEPTìDEO TENDO ATIVIDADE ESTERASE E ESTERASE RECOMBINANTE E SEUS USOS. Polipeptídeo e proteína recombinante que têm atividade de esterase que exibem a sequência de aminoácidos de Id. de Seq. N<0>. 1 e o uso desses.
Description
POLIPEPTÍDEO TENDO ATIVIDADE ESTERASE E ESTERASE RECOMBINANTE E SEUS USOS
A invenção relaciona-se a um novo polipeptídeo que tem atividade de esterase, especialmente que tem atividade de 2-alquil-5-halopent-4-enocarboxil esterase, e a uma proteína recombinante enzimaticamente ativa que tem atividade de esterase e ao uso dessa para a resolução de racematos de misturas de enantiômero de éster 2-alquil-5- halopent-4-enocarboxílico.
Ácidos 2-alquil-5-halopent-4-enocarboxílicos e seus ésteres enantiomericamente enriquecidos são intermediários valiosos para a preparação de fármacos, como, por exemplo, de 11 a - amino - gama - hidroxi - omegaari lalcanocarboxamidas, que têm propriedades de inibição de renina e podem ser usados como agentes anti-hipertensivos em preparações farmacêuticas.
Esterases são geralmente empregadas na resolução de racematos e assimetrização.
No entanto, apenas muito poucas esterases adequadas para a preparação de compostos quirais são comercialmente disponíveis.
O uso de extratos de esterase de fígado de porco é conhecido na escala preparatória. Esterase de fígado de porco (PLE) foi isolada há muito tempo a partir de fontes naturais e sua atividade também é conhecida por um longo (Simonds, J.P. (1919) Amer. J. Physiol. 48, 141; Bamann, E. e cols. (1934) Hoppe-Seyler Z. 229, 15; Falconer J.S. and Taylor, D.B. (1946) Biochem. J. 40, 831-834).
Vários estudos também já foram realizados para caracterizar PLE (Heymann, E. and Junge, W. (1979) Eur. J. Biochem. 95, 509-518; Lehner, R. and Verger, Τ. (1997) Biochemistry 36, 1861-1868).
Também foi possível mostrar, por exemplo em WO 01/09079, que extratos de esterase de fígado de porco podem hidrolisar seletivamente o enantiômero (R) de metil 5- cloro-2-(1-metiletil)-4-pentenoato.
No entanto, o uso de tais extratos de esterase de fontes naturais, como fígado de porco, está associado com desvantagens.
Em primeiro lugar, as qualidades dos diferentes lotes variam e assim torna difícil otimizar os processos industriais. Em segundo lugar, o uso de recursos animais na manufatura de produtos farmacêuticos é indesejável porque nem sempre se pode evitar a presença de vírus e príons.
Por essas razões há uma necessidade de produzir esterases recombinantes de fígado de porco de qualidade padronizada em microorganismos.
A clonagem de genes de esterase supostos é descrita, por exemplo, em FEBS Lett. (1991), 293, 37-41. A primeira expressão funcional de uma enzima de esterase ativa de fígado de porco foi descrita pela primeira vez em WO 02/48322. WO 2004/055177 descreve a preparação de esterases recombinantes adicionais por mutagênese direcionada a sítio da esterase recombinante de fígado de porco de Id. de Seq.
Nº . 1 (rPLE) - de WO 02/48322. Como é evidente a partir da descrição de WO 2004/055177 e do artigo de autoria dos mesmos inventores em "Protein Engineering", 16, 1139-1145, 2003, as modificações da seqüência de rPLE de WO 02/48322 foram escolhidas de modo que é obtida uma esterase recombinante de intestino de porco (PICE) revelada em David e cols., (1998) Eur. J. Biochem. 257, 142-148.
A resolução de éster 2-alquil-5-halopent-4- enocarboxíIico racêmico não é descrita que qualquer desses artigos.
No entanto, embora não se consiga satisfazer a necessidade por esterases que tenham a atividade estereo- seletiva desejada por ésteres 2-alquil-5-halopent-4- enocarboxílicos e que possam ser facilmente preparadas biotecnologicamente, é um objetivo da presente invenção o fornecimento de uma nova esterase recombinante correspondente.
Em uma tentativa de isolar e de clonar o gene descrito em FEBS Lett. (1991), 293, 37-41 e WO 02/48322 para esterase de fígado de porco (PLE) conhecida como cDNA iniciando a partir de mRNA de fígado de porco, uma segunda nova seqüência de esterase foi encontrada além da seqüência PLE conhecida. Após a expressão das duas seqüências, em que as proteínas ou esterases correspondentes, ou seja a rPLE conhecida e uma nova, esterase recombinante "alternativa" (rAPLE), foi preparada, contatou-se que, inesperadamente, apenas a rAPLE é capaz de resolução seletiva de ésteres 2- alquil-5-halopent-4-enocarboxílicos racêmicos.
Foi assim possível atingir o objetivo da presente invenção por um novo polipeptídeo que tenha atividade de esterase e uma nova esterase recombinante (rAPLE) , cuja seqüência de aminoácidos seja diferente em 21 de um total de 54 8 aminoácidos da seqüência de PLE conhecida.
A nova rAPLE difere na seqüência de aminoácidos também da carboxilesterase intestinal de porco (PICE) conhecida em 12 de um total de 54 8 aminoácidos. Entretanto, PICE é encontrada no trato intestinal do porco.
A presente invenção, portanto, relaciona-se a um polipeptídeo que tem atividade de esterase, que compreende a seqüência de aminoácidos de Id. de Seq. N°. 1.
A presente invenção também se relaciona a uma nova proteína recombinante que tem atividade de esterase, que compreende a seqüência de aminoácidos de Id. de Seq. N°. 1.
O polipeptídeo e a rAPLE recombinante da invenção têm a capacidade de resolução estereo-seletiva de ésteres 2- alquil-5-halopent-4-enocarboxílicos racêmicos de fórmula
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em que R é um radical Ci-C6-alquil, Ri é Cx-C4-alquila e
X é cloro, bromo ou iodo.
O polipeptídeo da invenção que tem atividade de esterase, e a nova esterase recombinante rAPLE diferem, como acima determinado, em 21 de um total de 548 aminoácidos da seqüência conhecida revelada em FEBS Lett. (1991), 293, 37-41 e em 12 de um total de 548 aminoácidos da proteína conhecida PICE revelada em David e cols., (1998) Eur. J. Biochem. 257, 142-148.
A seqüência da proteína da nova rAPLE da invenção difere nas seguintes posições de aminoácidos da seqüência conhecida da proteína PLE:
APLE Posição
PLE
Glu 73 Asp
Ile 75 Val
Gly 76 Val Gly 77 Glu Leu 80 Thr Arg 87 Gly Ile 92 Thr Pro 93 Leu Val 129 Leu Ser 133 Pro Thr 134 Met Leu 138 Val Ala 139 Val Phe 234 Leu Ala 236 Val Gly 237 Ala Phe 286 Leu Ala 287 Thr Leu 290 Phe Pro 294 Gla Thr 302 Pro
A proteína da invenção e a nova rAPLE recombinante podem estar na forma de uma seqüência modificada como mostrado em Id. de Seq. N°: 1, que pode ser obtida, por exemplo por modificações comuns como, por exemplo, troca, deleção ou anexação de aminoácido(s) na seqüência no terminal N ou C, como, por exemplo, GluAlaGluAla de uma seqüência de sinal de fator, ou por fusão a outras proteínas.
A invenção também inclui muteínas que têm modificações em uma seqüência de proteína da enzima da invenção que tem a atividade adequada, em particular em ésteres 2-alquil-5- halopent-4-enocarboxílicos. Muteínas podem ser obtidas, por exemplo, por modificações do DNA que codifica para a enzima da invenção, por técnicas conhecidas de mutagênese (mutagênese aleatória, mutagênese direcionada a sítio, de evolução direcionada, de embaralhamento de gene etc.) de modo que o DNA codifica para uma enzima que difere pelo menos em um aminoácido da enzima da invenção, e subseqüente expressão do DNA modificado em uma célula hospedeira adequada. A invenção também inclui, portanto, seqüências de DNA modificadas como mostrado em Id. de Seq. N°: 1, obtidas pelas mutações, deleções, extensões, fusões acima descritas, e que codificam para enzimas que têm a atividade de esterase desejada.
Atividade de esterase, especialmente atividade de 2- alquil-5-halopent-4-enocarboxilesterase, é aqui definida como a capacidade de resolução de racematos de ésteres 2- alquil-5-halopent-4-enocarboxílicos de fórmula (I).
O polipeptídeo da invenção e a rAPLE recombinante podem ser preparados como abaixo descrito:
Primeiramente, mRNA é isolado de fígado de porco com o uso de um kit adequado, e então o cDNA é gerado por transcrição reversa com base no extrato de mRNA.
Subseqüentemente, iniciadores específicos de PCR com base na seqüência do gene de esterase de fígado de porco conhecido de GenBank No. de acesso X63323 (Matsushima e cols., 1991) são preparados, seguido por amplificação e clonagem. Esses iniciadores específicos são:
Iniciador 1: 5'-CAGAATTCA.TGGCTATCGGGCAGCCAGCCTCGC-3' Iniciador 2: 5' -CCGGAATTCAGCCTCCCCTTCACAGCTCAG-3'
Essa parte dos iniciadores que compreende as seqüências de nucleotídeos adequadas que codificam para a proteína PLE e que é obrigatoriamente presente nos iniciadores está em negrito.
A outra parte da seqüência dos iniciadores compreende por exemplo informação para sítios de clivagem para endonucleases de restrição (em itálico) ou elementos de seqüência que são importantes para expressão. Essa parte pode variar na preparação da rAPLE da invenção.
A amplificação então ocorre com iniciadores 1 e 2 por métodos de PCR de técnica prévia.
O produto de PCR é subseqüentemente usado para preparar construções de expressão por métodos de técnica prévia para expressão heteróloga da proteína rAPLE codificada em organismos hospedeiros adequados. Isso preferivelmente torna o produto de PCR sendo inicialmente clonado em vetores de plasmideo adequados.
Os plasmídeos recombinantes obtidos desse modo são então transformados em um hospedeiro adequado, por exemplo, Escherichia coli. Inserções de vários clones resultantes são então seqüenciadas.
Inesperadamente, foram identificados 2 grupos de clones recombinantes com diferentes seqüências, um sendo 100% idêntico à seqüência esperada para PLE de acordo com Matsushima e cols., (1991) FEBS Lett. 293, 37-41, e uma nova seqüência de nucleotídeos como mostrado em Id. de Seq. N°. 2 (seqüência de APLE) que lidera após expressão à seqüência de aminoácidos de Id. de Seq. N°. 1 da invenção.
A presente invenção também se relaciona a uma seqüência de ácidos nucleicos ou nucleotídeos que codifica para o polipeptídeo da invenção e a esterase recombinante rAPLE.
Por exemplo, tal ácido nucleico tem a seqüência de nucleotídeos mostrada em Id. de Seq. N°. 2.
A invenção também se relaciona a seqüências de nucleotídeos que incluem a seqüência de nucleotídeos que codifica para o polipeptídeo da invenção e a esterase recombinante rAPLE, ou compreende a seqüência de nucleotídeos mostrada em Id. de Seq. N°. 2.
Uma possibilidade adicional é a preparação de oligonucleotideos adequados que correspondem às seqüências de ácidos nucleicos de acordo com a presente invenção que codificam para a esterase da invenção por técnicas sintéticas, por exemplo, com o uso de sintetizadores automáticos de DNA.
A preparação puramente sintética das seqüências de ácidos nucleicos que codificam para a esterase da invenção é particularmente vantajosa para uso na produção de fármacos ou outros intermediários, porque as enzimas são assim obtidas de fontes animais.
A expressão das duas seqüências encontradas (seqüências PLE e APLE) então ocorre.
A esterase conhecida de fígado de porco (PLE, Swiss- Prot ID Q29550) compreende uma seqüência de sinal N- terminal e um sinal de retenção ER C-terminal, os quatro últimos aminoácidos HAEL.
Para expressar a PLE conhecida e a nova APLE, vetores em que as seqüências são introduzidas em sistemas de expressão adequados são construídos. Essas construções de expressão são então transformadas em células hospedeiras adequadas.
Células hospedeiras adequadas são, por exemplo, microorganismos, linhas de células animais e plantas.
Microorganismos tanto procarióticos quanto eucarióticos podem ser empregados. Hospedeiros procarióticos preferidos (bactérias) são Escherichia coli, e cepas do gênero Bacillus (por exemplo, B.subtilis, B. licheniformis, B.amyloliguefaeiens), Pseudomonas (por exemplo, P. fluorescens, P.putida), ou Streptomyces (por exemplo, S.lividans, S. tendae) . Microorganismos eucarióticos são preferidos e fungos são particularmente preferidos. Exemplos desses são Saccharomyees eerevisiae, Piehia pastoris, Kluyveromyces laetis or Aspergillus sp. .
A expressão pode ser secretora ou intracelular e tanto indutível quanto constitutiva.
Para expressão bacteriana uma escolha de sinais específicos para espécie pode ser obtida, como cepas comercialmente disponíveis e vetores para expressão de proteína (por exemplo, fornecidas por companhias como Invitrogen, Novagen, New England Biolabs), que permitem a expressão indutível ou constitutiva, localização intracelular e secretora da proteína alvo; em adição, tecnologia para permitir ou promover a dobra correta das proteínas para resultar em proteína solúvel e ativa pode ser aplicada.
As proteínas são preferivelmente expressas em uma maneira secretora, em cujo caso, vetores em que as seqüências de PLE e APLE são ligadas de modo N-terminal a uma seqüência de sinal de fator de S. eerevisiae são preferivelmente construídas.
É também possível preparar construções em que o tetrapeptídeo C-terminal HAEL, que serve como sinal de retenção ER como descrito, por exemplo, em Hardwick e cols., (1990) EMBO J. 9, 623-630, é adicionalmente deletado.
Uma expressão também preferida é a expressão indutível de construções com ou sem sinal de retenção ER. Inesperadamente, as construções que têm o sinal de retenção ER também podem ser expressas e levam a uma rAPLE que é capaz de resolução seletiva de ésteres 2-alquil-5- halopent-4-enocarboxílicos racêmicos.
A seqüência de aminoácidos da nova esterase rAPLE que é derivada da seqüência de nucleotídeos do gene de APLE é mostrada em Id. de Seq. N°: 1.
É possível constatar, inesperadamente, que o novo polipeptídeo ou a proteína rAPLE é capaz, em contraste a rPLE conhecida, em cada caso obtida por expressão dos segmentos de DNA que codificam para APLE e PLE, respectivamente, por exemplo, em células de P. pastoris, realizar a resolução de ésteres 2-alquil-5-halopent-4- enocarboxílicos racêmicos de forma estereo-seletiva.
A invenção, portanto, também se relaciona ao uso do polipeptídeo que tem atividade de esterase e da esterase recombinante (rAPLE) da invenção, que tem pelo menos 80% de identidade à seqüência mostrada em Id. de Seq. N°: 1, para resolução de racematos de ésteres 2-alquil-5-halopent-4- enocarboxílicos de fórmula (I)
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em que R é um radical C1-C6-alquil, R1 é C1-C4-alquila e X é cloro, bromo ou iodo.
O polipeptídeo que tem atividade de esterase e a esterase recombinante (rAPLE) da invenção têm, preferivelmente, pelo menos 90%, particularmente preferivelmente pelo menos 98%, de identidade à seqüência da proteína mostrada em Id. de Seq. N°: 1. É também possível empregar polipeptídeo que tem uma atividade de esterase ou a esterase recombinante (rAPLE) da invenção com seqüências de DNA modificadas mostradas em Id. de Seq. N°:1, obtidas por modificações comuns como, por exemplo, mutações, deleções, extensões, fusões, que codificam para enzimas que têm a atividade de esterase desejada.
Com vista a isso, ácidos 2-alquil-5-halopent-4- enocarboxílico enantiomericamente enriquecidos ou seus ésteres de fórmula (II)
<formula>formula see original document page 12</formula>
em que R é um radical C1-C6-alquil, A é igual a H, R1, em que Ri pode ser C1-C4-alquila, ou R2, em que R2 é um grupo alquil, mas não é igual a R1, e X é cloro, bromo ou iodo, são obtidos por uma mistura enantiomérica de um éster 2-alquil-5-halopent-4-enocarboxílico de fórmula (I)
<formula>formula see original document page 12</formula>
Em que R, R1 e X são como acima definidos, sendo convertidos por meio do polipeptídeo da invenção ou da rAPLE da invenção na presença de água ou um álcool de fórmula R2OH, em que R2 é um grupo alquila que não é igual a R1, como nucleófilo, e
a) o éster 2-alquil-5-halopent-4-enocarboxílico enantiomericamente enriquecido remanescente de fórmula (II) com A igual a R1 sendo isolado ou
b) se um álcool for empregado como nucleófilo, o éster 2-alquil-5-halopent-4-enocarboxíIico
enantiomericamente enriquecido resultante de fórmula (II) com A igual a R2 sendo isolado, ou
c) se água for empregada como nucleófilo, o ácido 2- alquil-5-halopent-4-enocarboxílico resultante de fórmula (II) com A igual a H sendo isolado.
R na fórmula (II) é um radical C1-C6-alquila como, por exemplo, metil, etil, n- e i-propil, η-, i- e t-butil, pentil e hexil.
Radicais C1-C4-alquila são preferidos e o radical i- propil é particularmente preferido.
A é H, R1, em que Ri é um rad1cal C1-C4-alquila, pref erivelmente um radical Ci-C2-alquila e particularmente pref erivelmente um radical metil, ou R2, em que R2 é um 15 radical alquila que não é igual a R1. R2 [e particularmente pref erivelmente um radical C1-C6-alquila.
X é cloro, bromo ou iodo, preferivelmente cloro.
Compostos enantiomericamente enriquecidos significam aqueles que exibem um excesso enantiomérico (ee) de >80%, pref erivelmente de >90% e particularmente pref erivelmente de >97%.
A enzima da invenção pode ser usada em qualquer forma. Por exemplo, como dispersão, como solução, imobilizada, como enzima bruta, como enzima que foi obtida de sua fonte por uma combinação de métodos de purificação conhecidos, como células inteiras (em que imobilizadas e/ou permeabilizadas adequadas) que têm a atividade enzimática desejada (naturalmente ou através de modificações genéticas) ou em um lisado de tais células.
A temperatura da reação para a conversão da invenção é normalmente entre 0 e 90°C, preferivelmente entre 10 e 60°C. O pH da solução de reação é entre 4 e 11, preferivelmente entre 6 e9.
A escolha do solvente depende do nucleófilo empregado.
Se, por exemplo, água é o nucleófilo, solventes que podem ser empregados são água, uma mistura de água com um solvente miscível em água, por exemplo, com um álcool como, por exemplo, metanol, etanol, isopropanol, t-butanol etc., dioxano, tetrahidrofurano, acetona or dimetil sulfóxido ou um sistema de duas fases de água e de um solvente imiscível em água, por exemplo, um composto aromático como, por exemplo, tolueno, xileno etc., um alcano como, por exemplo, hexano, heptano, ciclohexano etc., éter como, por exemplo, éter diisopropílico, éter metil t-butílico etc. Se o nucleófilo é um álcool, o solvente preferivelmente empregado é o álcool R2OH em que R2 é um grupo alquila que não é, no entanto, igual a R1. Entretanto, também é possível usar misturas do álcool com um solvente orgânico como, por exemplo, tetrahidrofurano, heptano, tolueno, hexano, CH3CN, éter metil t-butílico etc.
Depois de ocorrer a resolução do racemato enzimaticamente catalisada, o produto final desejado é isolado. Esse pode ser o éster 2-alquil-5-halopent-4- enocarboxílico enantiomericamente enriquecido remanescente de fórmula (II) com A igual a R1, ou se água é o nucleófilo o ácido 2-alquil-5- halopent-4-enocarboxíIico enantiomericamente enriquecido de fórmula (II) com A igual a H que se formou, ou se o álcool é o nucleófilo o éster 2- alquil-5- halopent-4-enocarboxíIico enantiomericamente enriquecido de fórmula (II) com A igual a R2. A isolação pode ocorrer, por exemplo, por métodos convencionais como, por exemplo, extração, cristalização, cromatografia em coluna, destilação etc.
O método da invenção resulta nos ácidos ou ésteres correspondentes de fórmula (I) nos campos teóricos de até 98% de rendimento e com um e.e. de até >99%. Exemplo 1: Isolação de mRNA e geração de cDNA
0,7 g de fígado de um porco recém abatido, obtido de um abatedor local, foi congelado em nitrogênio líquido e homogeneizado com um pilão, e o mRNA liberado foi isolado ou extraído com o uso do kit de extração de mRNA Fast Track 2.0 (Invitrogen, Carlsbad, Calif., USA) de acordo com as instruções pelo fabricante (manual do kit Fast Track 2.0; versão J; 082301; 25-0099). A extração gerou uma quantidade total de 12,9 μg de mRNA.
0,26 μg desse mRNA foi então usado como modelo para geração de cDNA com o uso do sistema de síntese SuperScript III First-Strand para RT-PCR de acordo com as instruções do fabricante.
Exemplo 2: Amplificação e clonagem de fragmentos de cDNA a partir de fígado de porco
Iniciadores específicos com base na seqüência do gene de esterase de fígado de porco de GenBank No. de acesso X63323 (Matsushima e cols., 1991) foram preparados:
Iniciador 1: 51-CAGAATTCATGGCTATCGGGCAGCCAGCCTCGC-3 1 (Id. de Seq. N0: 3)
Iniciador 2: 5 1 -CCGGAATTCAGCCTCCCCTTCACAGCTCAG -3' (Id. de Seq. N0: 4)
Bases homólogas à seqüência conhecida de PLE estão em negrito. As seqüências de reconhecimento para as endonucleases de restrição estão em itálico para destaque.
A amplificação ocorre em uma mistura de 50 μl com 1 U de wPhusion DNA polymerase" (Finnzymes, Espoo, Finland) , com 500 ng de cDNA como modelo, 20 μπιοί cada de iniciador 1 e 2, 5 μl de uma mistura de dNTP (2 mM cada) , todos em tampão IxPhusion HF de acordo com o manual de "Phusion High-Fidelity DNA Polymerase" (Finnzymes), iniciando com uma etapa de desnaturação de 30 segundos a 98°C, seguida por 30 ciclos (10 segundos 98°C, 20 segundos 68°C, 1 minuto 72°C) para amplificação e uma incubação final a 70°C por 8 minutos para preparar produtos completos.
Esse PCR resultou em um fragmento de DNA com um tamanho de 1,8 kb (encontrado por eletroforese de gel de agarose).
Esse produto de PCR foi então purificado com o uso do
kit Qiaquick (Qiagen, Hilden, Germany) de acordo com o manual incluído.
Cerca de 0,1 μg do produto de PCR purificado foi cortado com a endonuclease de restrição EcoRI e clonado nos vetores de plasmídeo pHILZ e pHIL-D2 via os sítios de clivagem EcoRI.
Os vetores foram então transformados em células eletrocompetentes TOPlO preparadas de acordo com "Current Protocols in Molecular Biology" (protocolos atuais em biologia molecular).
Inserções de vários clones resultantes foram seqüenciadas com o uso do kit "Dye Deoxy Terminator Cycle Sequencing" (Applied Biosystems Inc., Forster City, Calif., USA). Duas seqüênciasforam identificadas através disso, uma que corresponde 100% à seqüência esperada publicada por Matsushima e cols., (1991) FEBS Lett. 293, 3 7-41, e a outra seqüência que corresponde a Id. de Seq. N° : 2 .
Exemplo 3: Introdução da seqüência de sinal de fator α e variações da extremidade C-terminal.
Para permitir a expressão secretora da proteína PLE conhecida e da proteína rAPLE da invenção, vetores em que a seqüência de PLE e APLE foi conectada de modo N-terminal à seqüência de início de fator α do vetor de clonagem pPICZ α (Invitrogen) foram construídos. Em adição, as construções em que o tetrapeptídeo C-terminal HAEL foi deletado foram preparadas.
PCR I: 0 par de iniciador EcoRIalf al/alfaPLE2 foi usado para amplificar a seqüência de sinal de fator α do vetor de clonagem pPICZ α (Invitrogen) . A PCR foi realizada em uma mistura de 50 μl (2 ng de modelo, 0,5 μΜ de cada iniciador, 0,2 mM dNTPs, 1 U de "Phusion DNA polymerase" (Finnzymes) todos em tampão IxPhusion HF de acordo com o manual "Phusion High-Fidelity DNA Polymerase" (Finnzymes)).
Desnaturação a 95 0C por 3 minutos foi seguida por amplificação em 30 ciclos (30 segundos 95°C, 30 segundos 57°C, 15 segundos 72°C) e uma etapa final a 72°C por 7 minutos.
PCR II: as seqüências de PLE e APLE foram amplificadas de plasmídeos pHILZ com o uso do par de iniciador PLEalfal/EcoRIPLE+ER2 ou o par de iniciador PLEalfal/EcoRIPLE2 (deleção do tetrapeptídeo C-terminal HAEL).
Essas PCRs foram novamente realizadas em misturas de 50 μl (2 ng de modelo, 0,5 μΜ de cada iniciador, 0,2 mM dNTPs, 1 U de "Phusion DNA polymerase" (Finnzymes) todos em tampão 1xPhusion HF de acordo com the manual "Phusion High- Fidelity DNA Polymerase" (Finnzymes)).
Uma desnaturação a 95°C por 3 minutos foi seguida por amplificação em 30 ciclos (30 segundos 95°C, 30 segundos 57°C, 15 segundos 72°C) e uma etapa final a 72°C por 7 minutos.
PCR III: 3 μl de todos os produtos de PCR I e PCR II foram usados para combine esses dois produtos por PCR sem iniciador.
A extensão foi realizada em uma mistura de 45 μl com 0,2 mM dNTPs, 1 U da "Phusion DNA polymerase" (Finnzymes) todos em tampão IxPhusion HF.
A mistura de reação foi aquecida a 95°C por 3 minutos e então 10 ciclos com 30 segundos a 95°C e 45 segundos a 72 °C foram realizados. Para amplificar esses produtos de extensão de sobreposição, 5 μΐ de mistura de iniciador (3 μl de água, 1 μl de 5 AM EcoRlalphal iniciador e 1 μl de 5 μΜ de iniciador EcoRIPLE + ER2 ou iniciador EcoRIPLE2) foram adicionados. Os produtos foram amplificados com 20 ciclos de PCR (30 segundos 95°C, 30 segundos 57°C, 1 minuto 72°C) e uma interrupção de temperatura a 72°C por 7 minutos.
Seqüências de Iniciador:
EcoRIaIpha1: 5'-TCTTCGAAGAATTCACGATGAGATTTCCTTCAATTTTTACTGC-3'
(Id. de Seq. N°: 5)
alphaPLE2:5'GAGGCTGGCTGCCCAGCTTCAGCCTCTCTTTTCTCG-3'
(Id. de Seq. N°: 6)
PLEaIpha1: 5'-AGAGAGGCTGAAGCTGGGCAGCCAGCCTCGCCG-3'
(Id. de Seq. N°: 7)
EcoRIPLE+ER2: 5'-ATGGTACCGAATTCTCACAGCTCAGCATGCTTTATCTTG-3' (Id. de Seq. N°: 8)
EcoRIPLE2: δ'-ATGGTACCGAA7TCTCACTTTATCTTGGGTGGCTTCTTTG-3' (Id. de Seq. N°: 9)
Regiões com homologia ao modelo em negrito, seqüências de reconhecimento para endonucleases de restrição em itálico.
Exemplo 4: Construção de construções de expressão para a expressão heteróloga de esterases de fígado de porco em Pichia pastoris
Os produtos de PCR de extensão de sobreposição do exemplo 3 foram purificados com o uso do kit Qiaquick kit (Qiagen, Hilden, Germany) de acordo com o manual incluído. Cerca de 0,1 μg dos produtos purificados de PCR foi cortado com a endonuclease de restrição EcoRI e clonado via o sítio de clivagem EcoRI no vetor de plasmídeo pGAPZ A (Invitrogen).
A orientação correta da inserção em relação aos promotores foi checada com a ajuda de clivagens de controle, por exemplo, com NcoI.
Em cada caso, um clone com inserção corretamente orientada foi selecionado, seqüenciado e preservado.
Os plasmídeos correspondentes foram nomeados como se segue: Plasmídeos que continham a seqüência conhecida de PLE como revelado em Matsushima e cols. , (1991) FEES Lett. 293, 37-41, foram chamados pGAPZ A PLE-ER (o tetrapeptídeo HAEL foi deletado) e pGAPZ A PLE+ER (tetrapeptídeo HAEL ainda presente).
Plasmídeos derivados das novas seqüência de APLE foram chamados pGAPZ A APLE-ER (o tetrapeptídeo HAEL foi deletado) e pGAPZ A APLE-ER (tetrapeptídeo HAEL ainda presente).
Exemplo 5: Expressão constitutiva de esterases de fígado de porco em Pichia pastoris
Os plasmídeos pGAPZ A PLE-ER, pGAPZ A PLE+ER, pGAPZ A APLE-ER e pGAPZ A APLE+ER foram transformados em P. pastoris X-33. A transformação ocorreu de acordo com as instruções do protocolo de kit para a Expressão de Picchia de Invitrogen. Os transformantes foram selecionados em placas YPD (1% extrato de levedura, 2% peptona, 2% D- glicose, 2% agar) que continha 100 mg/l zeocina. 52 clones resistentes a zeocina foram raspados em placas YPD com 100 mg/l zeocina e preservados em 15% glicerol. Exemplo 6: análise qualitativa da atividade de esterase
Transformantes de P. pastoris foram cultivados em placas YPD com 100 mg/l zeocina a 30°C por 48 h. As células foram retiradas em filtros Whatman 541 de 70 mm0 e secas ao ar. Os filtros foram incubados com uma solução de 6 mg de α-naftil acetato (Sigma, dissolvido em 500 μΐ de acetona), 2,5 mg de o-dianisidina tetrazotizada (Fast Blue Salt BN, Sigma, dissolvido em 125 μΐ de água) e 5 ml de 0,1 M tampão de fosfato de potássio, pH 7, para visualizar a atividade de esterase por uma reação de cor.
As atividades foram detectadas em todos os transformantes que tiveram integrados um dos 4 plasmídeos pGAPZ A PLE-ER, pGAPZ A PLE+ER, pGAPZ A APLE-ER e pGAPZ A APLE+ER. Isso prova a expressão de proteínas funcionais que têm atividade de esterase. Como uma checagem, um clone com vetor vazio integrado foi também testado da mesma maneira. Nesse caso, nenhuma atividade significativa de esterase foi visível no período de reação comparável. Exemplo 7: atividade estereo-seletiva de esterase em relação a metil 5-cloro-2-(1-metiletil)-4-pentenoato
Transformantes de P. pastoris como descrito no exemplo 6 foram cultivados em placas YPD com 100 mg/l zeocina a 30°C por 4 8 h. As células foram retiradas em filtros Whatman 541 de 70 mm0 e secas ao ar. Os filtros foram incubados com uma solução de substrato A (100 μl de metil 5-cloro-2-(1-metiletil)-4-pentenoato racêmico, 200 μl de 0,1 M tampão de fosfato de potássio, pH 8; 150 μl de 10 mg/ml fenol vermelho; 450 μl de DMSO; 650 μl de H2O) pi com solução de substrato B (idêntico a solução A mas que emprega metil (2S,4E)-5-cloro-2-(1-metiletil)-4-pentenoato em vez do racemato).
Devido à atividade específica de esterase sobre os substratos, a liberação do ácido em hidrólise do substrato do éster resulta em uma diminuição de pH que por sua vez leva a uma mudança na cor do indicador de fenol vermelho para amarelo.
Constatou-se a partir disso que transformantes que contêm o plasmídeo pGAPZ A APLE-ER geram sinais (coloração amarela ao redor da colônia) após incubação por 3 a 4 horas se eles forem testados em solução de substrato A, enquanto nenhuma conversão significativa pode ser encontrada com solução de substrato B (figura 1).
Transformantes obtidos com os plasmídeos pGAPZ A PLE- ER ou pGAPZ A PLE+ER não mostraram reação como soluções de substrato A ou B sob as mesmas condições.
Isso mostrou que a rAPLE recombinante tem uma especificidade de substrato diferente de rPLE recombinante e que a hidrólise de metil 5-cloro-2-(1-metiletil)-4- pentenoato com o uso de rAPLE ocorre estereo-seletivamente para o enantiômero (R).
Exemplo 8: eletroforese de gel de poliacrylamida SDS
10 μl de um tampão de amostra 2x SDS (125 mM Tris-HCl, pH 6,8; 4% SDS, 20% glicerol, 5% (3-mercaptoetanol, 0,05% bromofenol azul) foram adicionados a 10 μl de esterase de fígado de porco comercialmente disponível ou 10 μl dos sobrenadantes concentrados 60 vezes (Centricon Ultrafiltrations-Spin Columns, de Sartorius) das culturas de P. pastoris (72 h a 100 rpm e 28°C em 250 ml de meio YPD em frascos de 2 Litros de Erlenmeyer com septos) que continham o plasmídeo pGAPZ A APLE-ER ou um plasmídeo vazio pGAPZ A (cepa de controle).
Depois de as amostras serem aquecidas a 95°C por 5 minutos, as proteínas foram separadas em um gel de poliacrilamida a 12,5% (4% stacking gel) e coradas com Azul Coomassie Brilliant R250 para detecção. A SDS-PAGE mostra uma banda de proteína com o tamanho esperado para rAPLE (-60 kDa) na cepa de levedura tendo o plasmídeo pGAPZ A APLE, mas não na cepa de controle (figura 2). A esterase de fígado de porco comercialmente disponível que também foi analisada para comparação mostrou duas bandas de proteína na mesma faixa de tamanho (seta na figura 2).
Exemplo 9: expressão induzida de esterases de fígado de porco com o promotor AOXl
Os plasmídeos pGAPZ A PLE-ER, pGAPZ A PLE+ER, pGAPZ A APLE-ER e pGAPZ A APLE+ER foram cortados com a endonuclease de restrição XhoI, e os fragmentos respectivos codificando para proteínas APLE e PLE, com ou sem sinal de retenção ER, foram clonados por meio do sítio de clivagem XhoI no vetor pPIC9 (Invitrogen).
A orientação correta dos fragmentos em relação ao promotor AOXl foi checada com a ajuda de cortes de controle com a endonuclease de restrição NcoI. Os vetores que têm o promotor AOXl foram denominados, em analogia aos plasmídeos denominados no exemplo 4, pPIC9 PLE-ER, pPIC9 PLE+ER, pPIC9 APLE-ER e pPIC9 APLE+ER, linearizados com SalI e transformados em P. pastoris KM71.
A transformação e seleção para prototrofia His ocorreram de acordo com as instruções do kit de expressão de Pichia de Invitrogen. Os transformantes selecionados e a cepa KM71 foram cultivados em meio completo de acordo com o kit de expressão de Pichia de Invitrogen de um dia para o outro e induzidos com 1% metanol por 48 horas. As culturas resultantes foram analisadas por meio do ensaio qualitativo pH-shift descrito no exemplo 7, testando 2 μΐ das culturas nas misturas em cada caso. Expressão sob o controle do promotor indutível AOXl levou a atividades enzimáticas de rAPLE muito maiores, em comparação com a situação descrita para expressão constitutiva no exemplo 7, em relação a metil 5-cloro-2-(1-metiletil)- 4-pentenoato racêmico. A mudança da cor do fenol vermelho (vermelho para amarelo) foi detectável após apenas alguns minutos (figura 3) . Inesperadamente, a atividade de rAPLE foi independente da presença do sinal de retenção ER HAEL no C terminal, ou seja, até mesmo células que expressaram rAPLE com sinal de retenção ER mostraram atividade. Em contraste, cepas de levedura para produção de rPLE não tiveram atividade em relação a metil 5-cloro-2- (1-metiletil)-4-pentenoato racêmico. LISTAGEM DE SEQUENCIA
<110> DSM Fine Chemicals Áustria Nfg GmbH & Go KG
<120> P0LIPEPTÍDE0 TEM» ATIVIDADE ESTERASE E ESTERASE REGCMBINANTE E SEUS USOS
<130> O.Z.1302a
<160> 9
<170> PatentIn em versão 3.3
<210> 1
<211> 548
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223 > rAPLE
<400> 1
Gly Gln Pro Ala Ser Pro Pro Val Val Asp Thr Ala Gln Gly Arg Val 1 5 10 15
Leu Gly Lys Tyr Val Ser Leu Glu Gly Leu Ala Gln Pro Val Ala Val 20 25 30
Phe Leu Gly Val Pro Phe Ala Lys Pro Pro Leu Gly Ser Leu Arg Phe 35 40 45
Ala Pro Pro Gln Pro Ala Glu Pro Trp Ser Phe Val Lys Asn Ttir Thr 50 55 60
Ser Tyr Pro Pro Met Cys Cys Gln Glu Pro Ile Gly Gly Gln Met Leu 65 70 75 80
Ser Asp Leu Phe Thr Asn Arg Lys Glu Arg Leu Ile Pro Glu Phe Ser 85 90 95
Glu Asp Cys Leu Tyr Leu Asn Ile Tyr Thr Pro Ala Asp Leu Thr Lys 100 105 110
Arg Gly Arg Leu Pro Val Met Val Trp Ile His Gly Gly Gly Leu Val 115 120 125
Val Gly Gly Ala Ser Thr Tyr Asp Gly Leu Ala Leu Ala Ala His Glu 130
135
140
Asn Val Val Val Val Ala Ile Gln Tyr Arg Leu Gly Ile Trp Gly Phe 145 150 155 160
Phe Ser Thr Gly Asp Glu His Ser Arg Gly Asn Trp Gly His Leu Asp 165 170 175
Gln Val Ala Ala Leu His Trp Val Gln Glu Asn Ile Ala Asn Phe Gly 180 185 190
Gly Asp Pro Gly Ser Val Thr Ile Phe Gly Glu Ser Ala Gly Gly Glu 195 200 205
Ser Val Ser Val Leu Val Leu Ser Pro Leu Ala Lys Asn Leu Phe His 210 215 220
Arg Ala Ile Ser Glu Ser Gly Val Ala Phe Ihr Ala Gly Leu Val Arg 225 230 - 235 240
Lys Asp Met Lys Ala Ala Ala Lys Gln Ile Ala Val Leu Ala Gly Cys 245 250 255
Lys Thr Thr Thr Ser Ala Val Phe Val His Cys Leu Arg Gln Lys Ser 260 265 270
Glu Asp Glu Leu Leu Asp Leu Thr Leu Lys Met Lys Phe Phe Ala Leu 275 280 285
Asp Leu His Gly Asp Pro Arg Glu Ser His Pro Phe Leu Thr Thr Val 290 295 300
Val Asp Gly Val Leu Leu Pro Lys Met Pro Glu Glu Ile Leu Ala Glu 305 310 315 320
Lys Asp Phe Asn Thr Val Pro Tyr Ile Val Gly Ile Asn Lys Gln Glu 325 330 335
Phe Gly Trp Leu Leu Pro Thr Met Met Gly Phe Pro Leu Ser Glu Gly 340 345 350
Lys Leu Asp Gln Lys Thr Ala Thr Ser Leu Leu Trp Lys Ser Tyr Pro 355 360 365
Ile Ala Asn Ile Pro Glu Glu Leu Thr Pro Val Ala Thr Asp Lys Tyr 370 375 380
Leu Gly Gly Thr Asp Asp Pro Val Lys Lys Lys Asp Leu Phe Leu Asp 385 390 395 400
Leu Met Gly Asp Val Val Phe Gly Val Pro Ser Val Thr Val Ala Arg 405 410 415
Gln His Arg Asp Ala Gly Ala Pro Thr Tyr Met Tyr Glu Phe Gln Tyr 420 425 430
Arg Pro Ser Phe Ser Ser Asp Lys Lys Pro Lys Thr Val Ile Gly Asp 435 440 445
His Gly Asp Glu Ile Phe Ser Val Phe Gly Phe Pro Leu Leu Lys Gly 450 455 460
Asp Ala Pro Glu Glu Glu Val Ser Leu Ser Lys Ihr Val Met Lys Phe 465 470 475 480
Trp Ala Asn Phe Ala Arg Ser Gly Asn Pro Asn Gly Glu Gly Leu Pro 485 490 495
His Trp Pro Met Tyr Asp Gln Glu Glu Gly Tyr Leu Gln Ile Gly Val 500 505 510
Asn Thr Gln Ala Ala Lys Arg Leu Lys Gly Glu Glu Val Ala Phe Ttp 515 520 525
Asn Asp Leu Leu Ser Lys Glu Ala Ala Lys Lys Pro Pro Lys Ile Lys 530 535 540 His Ala Glu Leu 545
<210> 2
<211> 1647
<212> DNA
<213> Artificial <220>
<223> rAPLE <400> 2
gggcagccag cctcgccgcc tgttgtggac actgcccagg gccgagtcct ggggaagtac 60
gtcagcttag aaggcctggc acagccggtg gccgtcttcc tgggagtccc ttttgccaag 120
ccccctctcg gatccttgag gtttgctccg ccgcagcctg cagaaccatg gagcttcgtg 180
aagaacacca cctcctaccc tcccatgtgc tgccaagagc caattggggg acagatgctc 240
tcagatctat ttaccaacag aaaggagagg ctcattccgg agttttctga agactgtctc 300
tacctaaata tttacacccc tgctgacctg acaaagaggg gcagactgcc ggtgatggtg 360
tggatccacg gaggaggtct ggtggtgggc ggggcttcca cctatgatgg actggccctc 420
gctgcgcatg aaaacgtggt ggtggtggcc atccagtacc gcctgggcat ctggggattc 480
ttcagcacag gggacgaaca cagccggggc aactggggtc acttggacca ggtggccgca 540
ctgcactggg tccaggagaa catcgccaac tttggaggcg acccaggctc tgtgaccatc 600
tttggagagt cagcaggagg ggaaagtgtc tctgttctgg tgttgtctcc cttggccaag 660
aacctcttcc accgggccat ctctgagagt ggcgtggcct tcactgctgg cctggtcagg 720
aaggacatga aggctgcagc taagcaaatt gctgtccttg ctgggtgtaa aaccaccacc 780
tcggctgtct ttgttcactg cctgcgccag aagtcggagg acgagctctt ggacttaacg 840
ctgaagatga aatttttcgc tcttgatttg catggagacc ccagagagag ccatcccttc 900
ctgaccactg tggtggatgg agtgctgctg cccaagatgc ctgaagagat tctggctgaa 960
aaggatttca acactgtccc ctacatcgtg ggaatcaaca agcaagagtt tggctggctt 1020
ctgccaacga tgatgggctt ccccctctct gaaggcaagc tggaccagaa gacggccacg 1080
tcactcctgt ggaagtccta ccccatcgct aacatccctg aggaactgac tccagtggcc 1140
actgacaagt atttgggggg gacagacgac cccgtcaaaa agaaagacct gttcctggac 1200
ttgatggggg atgtggtgtt tggtgtccca tctgtgacgg tggcccgtca acacagagat 1260
gcaggagccc ccacctacat gtatgagttt cagtatcgcc caagcttctc atcggacaag 1320
aaacccaaga cggtgatcgg ggaccacggg gatgagatct tctccgtctt tggttttcca 1380
Ctgttaaaag gcgatgcccc agaagaggag gtcagtctca gcaagacggt gatgaaattc 1440
tgggccaact ttgctcgcag tgggaacccc aatggggagg ggctgcccca ttggccgatg 1500
tacgaccagg aagaagggta ccttcagatc ggcgtcaaca cccaggcagc caagaggctg 1560 aaaggtgaag aagtggcctt ctggaacgat ctcctgtcca aggaggcagc aaagaagcca 1620 cccaagataa agcatgctga gctgtga 1647
<210> 3
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> iniciador
<400> 3
cagaattcat ggctatcggg cagccagcct cgc 33
<210> 4
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> iniciador
<400> 4
ccggaattca gcctcccctt cacagctcag 30
<210> 5
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223 > iniciador
<400> 5
tcttcgaaga attcacgatg agatttcctt caatttttac tgc 43
<210> 6
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> iniciador
<400> 6
gaggctggct gcccagcttc agcctctctt ttctcg 36
<210> 7 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial <220>
<223> iniciador <400> 7
agagaggctg aagctgggca gccagcctcg ccg 33
<210> 8
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223 > iniciador
<400> 8
atggtaccga attctcacag ctcagcatgc tttatcttg 39
<210> 9
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> iniciador
<400> 9
atggtaccga attctcactt tatcttgggt ggcttctttg 40
Claims (8)
1. Polipeptídeo ou proteína recombinante caracterizado pelo fato de ter atividade de esterase e exibir uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 98% idêntica à seqüência de aminoácidos de Id. de Seq. N°. 1.
2. Polipeptídeo ou proteína recombinante caracterizado pelo fato de exibir pelo menos 98% de identidade ã seqüência de aminoácidos mostrada na Id. de Seq. N°. Ie tem atividade para resolução de racemato de ésteres 2-alquil-5-halopent-4-enocarboxílicos de fórmula <formula>formula see original document page 30</formula> em que R é um radical Ci-C6-alquila, R1 é Ci-C4-alquila e X é cloro, bromo ou iodo.
3. Polipeptídeo ou proteína recombinante possuindo atividade de esterase,. de acordo com a reivindicação 1 ou -2, caracterizado pelo fato de que exibe uma seqüência de aminoácidos modificada por uma modificação selecionada do grupo que consiste em mutação, deleção, inserção, extensão e fusão.
4. Seqüência de nucleotídeos caracterizada pelo fato de codificar um polipeptídeo ou proteína recombinante de qualquer uma das reivindicações 1, 2 ou 3.
5. Seqüência de nucleotídeos caracterizada pelo fato de compreender a seqüência mostrada na Id. de Seq. N°. 2.
6. Seqüência de nucleotídeos caracterizada pelo fato de ser obtenível por isolação de mRNA de um organismo seguido por amplificação de um fragmento de ácido nucleico com o uso de um primeiro iniciador que compreende a seqüência de nucleotídeos GGGCAGCCAGCCTCGC e um segundo iniciador que compreende a seqüência de nucleotídeos GGGCAGCCAGCCTCGC.
7. Uso de um polipeptídeo ou a proteína recombinante de qualquer uma das reivindicações 1, 2 ou 3 caracterizado pelo fato de ser para a resolução racêmica de ésteres 2- alquil-5-halopent-4-enocarboxílicos de fórmula (!) <formula>formula see original document page 31</formula> em que R é um radical Ci-C6-alquila, Ri é Ci-C4-alquila e X é cloro, bromo ou iodo.
8. Método para a preparação de ácidos 2-alquil-5- halopent-4-enocarboxílico enantiomericamente enriquecidos <formula>formula see original document page 31</formula> em que R é um radical Ci-C6-alquila, A é igual a H, Ri, em que Ri pode ser Ci-C4-alquila, ou R2, em que R2 é um grupo alquila, mas não é igual a Rif e X é cloro, bromo ou iodo, caracterizado pelo fato de que compreende uma mistura de enantiômeros de um éster 2-alquil-5-halopent-4- enocarboxíIico de fórmula (I) <formula>formula see original document page 31</formula> em que R, Rl e X são como acima definido, sendo convertidos por meio de um polipeptídeo ou uma esterase recombinante de qualquer uma das reivindicações 1, 2 ou 3 na presença de água ou um álcool de fórmula R2OH, em que R2 é um grupo alquila que não é igual a Ri, como nucleófilo, e a) ou o éster 2-alquil-5-halopent-4-enocarboxílico enantiomericamente enriquecido remanescente de fórmula (II) com A igual a Ri sendo isolado ou b) se um álcool for empregado como nucleófilo, o éster 2-alquil-5-halopent-4-enocarboxílico enantiomericamente enriquecido resultante de fórmula (II) com A igual a R2 sendo isolado, ou c) se água for empregada como nucleófilo, o ácido 2- alquil-5-halopent-4-enocarboxílico resultante de fórmula (II) com A igual a H sendo isolado.
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