BRPI0621347B1

BRPI0621347B1 - composição farmacêutica para aumentar a produção de eritrócitos e para o tratamento de anemia

Info

Publication number: BRPI0621347B1
Application number: BRPI0621347A
Authority: BR
Inventors: R Macdonald Brian; John Yurkow Edward; Kenneth Weis Jeffery
Original assignee: Janssen Pharmaceutica Nv
Priority date: 2006-02-14
Filing date: 2006-02-14
Publication date: 2018-05-08
Also published as: NO341872B1; CA2642389C; NZ570124A; HK1129571A1; EA200870261A1; HK1125055A1; PT1984014E; BRPI0621347A2; AU2006338308B2; SI1984014T1; EP1984014A1; DK1984014T3; IL193268A0; JP2009526841A; CN101374540A; EA015562B1; ES2516649T3; CN101374540B; CY1115629T1; EP1984014B1

Abstract

uso de compostos de peptídeo de tpo e de composições farmacêuticas no tratamento da anemia. um método para tratamento de anemia é descrito. o método inclui a administração de um composto de peptídeo de tpo a um indivíduo. são apresentadas, também, composições farmacêuticas que incluem um composto de peptídeo de ipo e um veículo farmaceuticamente aceitável, bem como métodos de diagnóstico que empregam um composto de peptídeo de tpo identificado.

Description

(54) Título: COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA PARA AUMENTAR A PRODUÇÃO DE ERITRÓCITOS E PARA O TRATAMENTO DE ANEMIA (51) Int.CI.: A61K 38/18; A61P 7/06 (73) Titular(es): JANSSEN PHARMACEUTICA N.V.

(72) Inventor(es): EDWARD JOHN YURKOW; BRIAN R. MACDONALD; JEFFERY KENNETH WEIS

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA PARA AUMENTAR A PRODUÇÃO DE ERITRÓCITOS E PARA O TRATAMENTO DE ANEMIA.

Campo da Invenção

A presente invenção apresenta compostos de peptídeo que se ligam ao receptor de trombopoietina (c-mpl ou TPO-R) e o ativam ou agem como um agonista da trombopoietina (TPO). A invenção tem aplicações nos campos da bioquímica e da química médica e particularmente apresenta agonistas de TPO para uso no tratamento de doenças de seres humanos.

Os compostos de peptídeo da invenção podem ser usados para tratar a anemia e/ou para evitar o desenvolvimento da anemia e/ou para manter a produção normal de eritrócitos.

Antecedentes da Invenção.

O gene que codifica a TPO foi clonado e caracterizado. Vide Ku15 ter et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:11104-11108 (1994), Barley et al. Cell 77:1117-1124 (1994), Kaushansky et al. Nature 369:568-571 (1994), Wendling et al. Nature 369:571-574 (1994) e Sauvage et al. Nature 369:533-538 (1994). A TPO é uma glicoproteína com pelo menos duas formas, com massas moleculares evidentes de 25 kDa e 31 kDa, e com uma seqüência de aminoácidos N-terminal em comum. Vide Bartley et al. Cell 77:1117-1124 (1994). A TPO parece ter duas regiões distintas separadas por um potencial sítio de clivagem Arg-Arg. A região amino-terminal é altamente conservada tanto em seres humanos como em camundongos, e tem alguma homologia com a eritropoietina e com interferon-a e interferon-b. A região carboxi25 terminal mostra ampla divergência entre espécies.

Foram descritas as seqüências de DNA e as seqüências de peptídeo codificado para TPO-R humana (também conhecida como c-mpl). Vide Vigon et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5640-5644 (1992). A TPO-R é um membro da família do receptor de fator de crescimento hematopoietina, uma família caracterizada por um delineamento estrutural comum do domínio extracelular, inclusive quatro resíduos C conservados na porção N-terminal e um motivo WSXWS (SEQ. ID NO: 1) próximo à região transmembrana.

Petição 870180011047, de 09/02/2018, pág. 12/21 /?

Vide Bazan Proc. Natl. Acad. Sei. USA 87:6934-6938 (1990). A evidência de que esse receptor exerce um papel funcional na hematopoiese inclui observações de que sua expressão se restringe ao baço, à medula óssea ou ao fígado fetal em camundongos (vide Souyri et al. Cell 63:1137-1147 (1990)) e a megacariócitos, plaquetas e células CD34⁺ em seres humanos (vide Methia et al., Blood- 82:1-395.-1.401 4l993))^AIguns trabalhos -postulam -qye o receptor funciona como um homodímero, de modo similar à situação com os receptores para G-CSF e a eritropoietina.

A disponibilidade de genes clonados para TPO-R facilita a busca por agonistas desse importante receptor. A disponibilidade da proteína receptora recombinante permite o estudo da interação receptor-ligante em uma variedade de sistemas de geração aleatória e semi-aleatória de diversidade de peptídeos. Esses sistemas são descritos nas patentes U.S. n° 6.251.864, 6.083.913, 6.121.238, 5.932.546, 5.869.451, 6.506.362 e 6.465.430, bem como em Cwirla et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 87:6378-6382 (1990), estando cada um dos documentos anteriormente mencionados aqui incorporado, a título de referência.

As células morfologicamente reconhecíveis e funcionalmente capazes que circulam no sangue incluem eritrócitos, granulócitos neutrofílicos, eosinofílicos e basofílicos, linfócitos Β, T, não-B e não-T, e plaquetas. Essas células hematopoiéticas maduras derivam de e são substituídas, sob demanda, por células precursoras em divisão e morfologicamente reconhecíveis das respectivas linhagens, como eritroblastos para a série de eritrócitos, mietoblastos, promielócitos e mielócitos para a série de granulócitos, e megacariócitos para as plaquetas. As células precursoras derivam de células mais primitivas que podem ser, de forma simplista, divididas em dois subgrupos principais: células-tronco e células progenitoras (para revisão vide Broxmeyer, Η. E., 1983, Colony Assays of Hematopoietic Progenitor Cells and Correlations to Clinicai Situations, CRC Criticai Review in Oncology/Hematology 1:227-257).

As definições de células-tronco e células progenitoras são operacionais e dependem de critérios funcionais, e não morfológicos. As células3 tronco têm uma extensa capacidade de auto-renovação ou automanutenção (Lajtha, Differentiatíon, 14:23 (1979)), o que é uma necessidade, já que a ausência ou a depleção dessas células poderia resultar na completa depleção de uma ou mais linhagens celulares, eventos que levariam, em um curto intervalo de tempo, a doenças e morte. Algumas células-tronco se diferenciam confQrme a necessidade_T mas algumas células-tronco produzcm-outras células-tronco para manter a reserva dessas células. Dessa forma, além de manter seu próprio tipo, as células-tronco pluripotentes são capazes de se diferenciarem em várias sublinhagens de células progenitoras com capacidade de auto-renovação mais limitada ou inexistente. Essas células progenitoras basicamente dão origem às células precursoras morfologicamente reconhecíveis. As células progenitoras são capazes de se multiplicar e se diferenciar ao longo de um ou mais dos caminhos de diferenciação mielóide (Lajtha, Blood Cells, 5:447 (1979)).

Vários agentes infecciosos, anomalias genéticas e fatores ambientais podem causar deficiências em um ou mais tipos de célula hematopoiética. Adicionalmente, a quimioterapia e a radioterapia usadas no tratamento do câncer, bem como certos distúrbios imunológicos, podem causar pancitopenias ou combinações de anemia, neutropenia e trombocitopenia. Portanto, o aumento ou a substituição das células hematopoiéticas é frequentemente crucial para o sucesso desses tratamentos. (Para uma discussão geral sobre distúrbios hematológicos e suas causas vide, por exemplo, Hematology em Scientific American Medicine, E. Rubenstein e D. Federman, editores, Volume 2, Capítulo 5, Scientific American, New York (1996)).

A terapia atualmente disponível para muitos distúrbios hematológicos, bem como para a destruição das células hematopoiéticas endógenas causada por quimioterapia ou radioterapia é o transplante de medula óssea. Entretanto, o transplante de medula óssea é muito restrito, já que é extremamente raro encontrar doadores que sejam perfeitamente compatíveis (geneticamente idênticos), exceto nos casos de gêmeos idênticos, ou quando as células de medula óssea de um paciente em remissão são armazenadas em um estado congelado viável. Exceto nesses casos autólogos, há uma inevitável desigualdade genética em algum grau, o que traz complicações sérias e, às vezes, letais. Essas complicações têm dois aspectos. Primeiro, o paciente é, em geral, previamente submetido a incapacitação imunológica por meio de fármacos, para evitar a rejeição imunológica das células de medula óssea estranhas (reação de enxerto versus hospedeiro). Segundo, quando e se as células dc medula óssea doadas se estabelecem, elas podem atacar o paciente (doença de enxerto versus hospedeiro), que é reconhecido como estranho. Mesmo com doadores muito semelhantes de uma mesma família, essas complicações de incompatibilidade parcial são a causa de substancial mortalidade e morbidade diretamente devidas a transplante de medula óssea obtido de um indivíduo geneticamente diferente.

O sangue periférico foi também investigado como fonte de células-tronco para reconstituição hematopoiética (Nothdurtt, W., et al., 1977, Scand. J. Haematol. 19:470-481, Sarpel, S. C., et al., 1979, Exp. Hematol. 7:113-120, Ragharachar, A., et al., 1983, J. Cell. Biochem. Suppl. 7A:78, Juttner, C. A., et al., 1985, Brit. J. Haematol. 61:739-745, Abrams, R. A., et al., 1983, J. Cell. Biochem. Suppl. 7A:53, Prummer, O., et al., 1985, Exp. Hematol. 13:891-898). Em alguns estudos, foram obtidos resultados promissores em pacientes com vários tipos de leucemia (Reiffers, J., et al., 1986, Exp. Hematol. 14:312-315, Goldman, J. M., et al., 1980, Br. J, Haematol. 45:223-231, Tilly, H., et al., Jul. 19, 1986, The Lancet, pp. 154-155, vide também To, L. B. e Juttner, C. A., 1987, Brit. J. Haematol. 66: 285-288, bem como as referências ali citadas); e com linfoma (Korbling, M., et al., 1986, Blood 67:529-532). Em outros estudos usando sangue periférico, no entanto, a reconstituição não foi obtida (Hershko, C., et al., 1979, The Lancet 1:945947, Ochs, H. D., et al., 1981, Pediatr. Res. 15:601). Os estudos investigaram também o uso do transplante de células hepáticas fetais (Cain, G. R., et al., 1986, Transplantation 41:32-25, Ochs, H. D., et al., 1981, Pediatr. Res. 15:601, Paige, C. J., et al., 1981, J. Exp. Med. 153:154-165, Touraine, J. L., 1980, Excerpta Med. 514:277, Touraine, J. L., 1983, Birth Defects 19:139, vide também Good, R. A., et al., 1983, Cellular Immunol. 82:44-45 e referências ali citadas) ou do transplante de células de baço neonatais (Yunis, E. J., et al., 1974, Proc. Natl. Acad. Sei., U.S.A. 72:4100) como fontes de célulastronco para reconstituição hematopoiética. Células de timo neonatal também foram transplantadas em experimento de reconstituição imunotógica (Vickery,

A. C., et al., 1983, J. Parasitol. 69(3):478-485, Hirokawa, K., et al., 1982,

Clin. Immunol. Immunopathol. 22:297-304).

Cteramenterhá ttma grande necessidade pot métodos para- a expansão de células sanguíneas in vitro, ou por terapias que aumentem a produção de células hematopoiéticas in vivo.

A anemia, que é definida como uma redução na concentração de hemoglobina do sangue, é usualmente associada a uma redução na massa de eritrócitos circulante total. Independentemente da causa, a anemia diminui a capacidade de transporte de oxigênio do sangue e, quando grave o suficiente, causa sintomas e sinais clínicos.

Clinicamente, a anemia é caracterizada por palidez da pele e das membranas mucosas, e por manifestações de hipóxia, mais comumente fraqueza, fadiga, letargia ou tontura. A hipóxia do miocárdio pode produzir circulação hiperdinâmica com um aumento da freqüência cardíaca e do volume de bombeamento. Murmúrios no fluxo de ejeção podem se desenvolver e, se a anemia for grave o bastante, pode ocorrer insuficiência cardíaca.

As anemias são geralmente distribuídas em duas classificações: etiológica (com base na causa) e morfológica (com base nas alterações de formato e tamanho). A classificação etiológica é a mais comumente empregada.

A anemia hemolítica aloimune ocorre quando os anticorpos de um indivíduo reagem com os eritrócitos (RBC) de outro. A anemia hemolítica aloimune tipicamente ocorre após transfusões de sangue com tipo ABO incompatível e na doença hemolítica do recém-nascido. Ela pode ocorrer também após transplantes alogênicos. (Hoffbrand, A. V., em Essential Hematology, 3^â Edição, Blackwell Scientific Publications, 1993, página 90).

A administração de certos fármacos pode causar uma anemia temporária induzida por fármacos. Isso pode ocorrer por meio de três mecanismos: 1) anticorpos dirigidos contra um complexo de fármaco-membrana do eritrócito (por exemplo, penicilina ou cefalotina), 2) deposição de com» plementos via complexo de fármaco-proteína (antígeno)-anticorpo sobre a *

superfície do eritrócito (por exemplo, quinidina ou cloropropamida) ou 3) uma anemia hemolítíca auto-imune em que o papel do fármaco é desconhecido (por exemplo, metil dopa). Em cada um desses casos, a anemia só desaparece após o uso do fármaco ser dcscontinuado (com-fr metil dopa, poféirt-es anticorpos podem persistir por muitos meses). (Hoffbrand, A. V., em Essential Hematology, 3- Edição, Blackwell Scientific Publications, 1993, página 90-1).

A anemia aplástica é definida como pancítopenia (anemia, leucopenia e trombocitopenia) resultante de aplasia da medula óssea. Ela é classificada nos seguintes tipos principais: uma forma congênita (anemia de Fanconi) e uma forma adquirida sem qualquer causa óbvia (idiopática). As causas secundárias podem resultar de várias causas industriais, iatrogêni15 cas e infecciosas. A causa subjacente parece ser uma redução substancial do número de células-tronco pluripotentes hemopoiéticas e um defeito nas células-tronco restantes, ou uma reação imune contra as mesmas, que as torna incapazes de se dividir e se diferenciar o suficiente para preencher a medula óssea. (Hoffbrand, A. V., em Essential Hematology, 3- Edição,

Blackwell Scientific Publications, 1993, página 121). Foram demonstradas, em alguns casos, células T supressoras bem como imunoglobulinas que inibem a eritropoietina ou bloqueiam a diferenciação das células-tronco hemopoiéticas in vitro. (Andreoli, T. em Essentials of Medicine, W. B. Saunders, 1986, página 349).

Em Neelis et al., Blood, 90(1):58-63 (1997), descreve-se que a

TPO recombinante humana estimulou a recuperação da linhagem de eritrócitos em macacos da índia que foram expostos a um total de 5 Gy de radiação corporal (raios X de 300 kV), com regeneração de reticulócitos tendo se iniciado 10 dias mais cedo que em animais tratados com placebo. Neelis et al.

descreve também valores otimizados de hemoglobina e hematócrito, em comparação com as amostras de controle.

Basser et al., Blood, 89(9):3118-3128 (1997), descreve que a administração de PEG-rHuMGDF mais fiigastrim elevou as células progenitoras presentes no sangue periférico de pacientes expostos a carboplatina

600 mg/m² e a ctclofosfamida 1.200 mg/m².

Papayannopoulou et al., Exp. Hematol., 24(5):660-669 (1996), descreve os efeitos de EPO e TPO sobre a diferenciação in vitro da eritroKaushansky et al., J. Clin. Invest., 96(3):1683-1687 (1995), descreve que a TPO age em sinergia com EPO para expandir os progenitores eritróides. Kaushansky et al., Exp. Hematol., 24(2):265-269 (1996), descreve células progenitoras BFU-E, CFU-GM e CFU-Mk expandidas por TPO em animais mielossuprimidos.

A anemia é um problema sério, e conferiu urgência à busca por um agonista do fator de crescimento sanguíneo capaz de evitar o desenvolvimento da anemia, tratar a anemia, promover a sobrevivência de precurso15 res de RBC e/ou manter a produção normal de eritrócitos. A presente invenção fornece esse tipo de agonista.

Sumário da Invenção

A presente invenção refere-se ao uso de compostos de peptídeo com baixo peso molecular definidos para o tratamento da anemia. Os com20 postos de peptídeo com baixo peso molecular definidos têm fortes propriedades de ligação à TPO-R, podem ativar a TPO-R, potencialmente permitem efeitos colaterais reduzidos em comparação a agonistas de TPO conhecidos, e têm a capacidade de estimular, in vivo e in vitro, a produção de eritrócitos. Os compostos de peptídeo com baixo peso molecular podem estar sob várias formas, por exemplo, monômeros, dímeros e oligômeros, e/ou podem ser derivatizados com um polímero hidrofílico. Conseqüentemente, esses compostos de peptídeo são úteis para fins terapêuticos no tratamento e/ou na prevenção da anemia, bem como para fins de diagnóstico no estudo da anemia.

Os compostos de peptídeo adequados para fins terapêuticos e/ou de diagnóstico têm um IC₅₀ de cerca de 2 mM ou menos e, com mais preferência, de 2 nM ou menos, conforme determinado, por exemplo, por um teste de ligação Baf/3 (discutido abaixo) em que um IC₅o mais baixo está relacionado com uma maior afinidade de ligação a TPO-R. Para fins farmacêuticos, os compostos de peptídeo têm, de preferência, um IC₅o de não mais que cerca de 100 μΜ, com mais preferência não mais que cerca de

500 nM, com mais preferência não mais que cerca de 100 pm e, com mais

Os compostos de peptídeo adequados a fins terapêuticos e/ou de diagnóstico têm um EC₅o de cerca de 2 mM ou menos e, com mais preferência, de 2 nM ou menos, conforme determinado por técnicas bem10 conhecidas em testes bem-conhecidos, como o teste de ligação Baf/3 (discutido abaixo), em que um EC₅₀ mais baixo está relacionado com uma maior afinidade de ligação a TPO-R. Para fins farmacêuticos, os compostos de peptídeo têm, de preferência, um EC₅o de não mais que cerca de 100 μΜ, com mais preferência não mais que cerca de 500 nM, com mais preferência não mais que cerca de 100 pm e, com mais preferência, não mais que cerca de 5 pm.

O peso molecular dos compostos de peptídeo situa-se em qualquer ponto da faixa de cerca de 500 Dáltons a cerca de 8.000 Dáltons, com mais preferência de cerca de 900 Dáltons a cerca de 2.000 Dáltons. Se os compostos de peptídeo forem oligomerizados, dimerizados e/ou derivatizados com um polímero hidrofílico, conforme descrito na presente invenção, o peso molecular desse peptídeo será maior, e poderá situar-se em qualquer ponto da faixa de cerca de 1.500 Dáltons a cerca de 120.000 dáltons, com mais preferência de cerca de 3.000 Dáltons a cerca de 80.000 Dáltons e, com mais preferência, de cerca de 30.000 Dáltons a cerca de 50.000 Dáltons.

Os polímeros hidrofílicos adequados incluem, mas não se limitam a, éteres polialquílicos, por exemplo, polietileno glicol e polipropileno glicol, ácido polilático, ácido poliglicólico, polioxialcenos, álcool polivinílico, polivinil pirrolidona, celulose e derivados de celulose, dextrano e derivados de dextrano, entre outros, conforme descrito nas patentes U.S. n-^s 5.672.662 e 5.869.451, cujo conteúdo integral está aqui incorporado a título de referência.

¹6

Quando os compostos de peptídeo são derivatizados com um polímero hidrofílico, a solubilidade e a meta-vida dos mesmos em circulação são aumentadas, e imunogenicidade dos mesmos é mascarada. Com pouca ou nenhuma diminuição em sua atividade de ligação, pode-se obter as caracte5 rísticas anteriormente mencionadas. Geralmente, esses polímeros hidrofílicos têmjjm peso molecular médio na faixa de_eema de ROO nÁItnn^axafca-da 100.000 Dáltons, com mais preferência de cerca de 2.000 Dáltons a cerca de 40.000 Dáltons e, com mais preferência ainda, de cerca de 5.000 Dáltons a cerca de 20.000 Dáltons. Em modalidades preferenciais, esses polímeros hidroftlicos têm um peso molecular médio de cerca de 5.000 dáltons, 10.000 dáltons e 20.000 dáltons.

Os compostos de peptídeo da invenção podem ser derivatizados com, ou acoplados a, esses polímeros mediante o uso de qualquer dos métodos da presente invenção, demonstrados em Zallipsky, S., Bioconjugate

Chem., 6:150-165 (1995), Monfardini, C, et al., Bioconjugate Chem., 6:62-69 (1995), nas patentes U.S. n° 4.640.835, U.S. n° 4.496.689, U.S. n° 4.301.144, U.S. n° 4.670.417, U.S. n° 4.791.192 ou U.S. n° 4.179.337, ou no WO 95/34326, todas as quais estão aqui incorporadas, a título de referência, em sua totalidade.

Em uma modalidade atualmente preferencial, os compostos de peptídeo da presente invenção são derivatizados com polietileno glicol (PEG). O PEG é um polímero linear solúvel em água, à base de unidades de repetição de óxido de etileno com dois grupos hidroxila terminais. Os PEGs são classificados por seus pesos moleculares, que se situam, tipicamente, na faixa de cerca de 500 Dáltons a cerca de 40.000 Dáltons. Em uma modalidade atualmente preferencial, os PEGs empregados têm pesos moleculares na faixa de 5.000 Dáltons a cerca de 20.000 Dáltons. Os PEGs acoplados aos compostos de peptídeo da presente invenção podem ser ramificados ou não-ramificados. (Vide, por exemplo, Monfardini, C., et al., Bioconju30 gate Chem., 6:62-69 (1995)). Os PEGs estão disponíveis comercialmente junto à Nektar Therapeutics (San Cario, CA), Sigma Chemical Co. e outras empresas. Esses PEGs incluem, mas não se limitam a, monometoxipolietileno f

glicol (MePEG-OH), succinato de monometoxipolietileno glicol (MePEG-S), succinimidil succinato monometoxipolietileno glicol (MePEG-S-NHS), amina de monometoxipolietileno glicol (MePEG-NH₂), amina de monometoxipolietileno glicol (MePEG-TFtES) e carbonil de monometoxipolietileno glicol5 imidazolil (MePEG-IM).

do, por exemplo, PEG, é de preferência terminado em uma extremidade por um grupo não-reativo, como um grupo metóxi ou etóxi. Conseqüentemente, o polímero é ativado na outra extremidade por reação com um agente ativa10 dor adequado, como haletos cianúricos (por exemplo, cloreto, brometo ou fluoreto cianúrico), diimidazol, um reagente anidrido (por exemplo, um anidrido dialossuccínico, como anidrido dibromosuccínico), acil azida, éter pdiazôniobenztlico, 3-(p-diazofenóxi)-2-hidroxipropileter hidróxi propílico) e similares. O polímero ativado é, então, reagido com um composto de peptí15 deo da presente invenção para produzir um composto de peptídeo derivatizado com um polímero. Alternativamente, um grupo funcional nos compostos de peptídeo da invenção pode ser ativado para reação com o polímero, ou os dois grupos podem ser unidos em uma reação de acoplamento conjunta, com o uso de métodos conhecidos de acoplamento. Será prontamente compreendido que os compostos de peptídeo da invenção podem ser derivatizados com PEG mediante o uso de uma miríade de outros esquemas de reação conhecidos e usados pelos versados na técnica.

Quando usados para fins de diagnóstico, os compostos de peptídeo são, de preferência, marcados com um marcador detectável e, conse25 qüentemente, os compostos de peptídeo sem esse marcador servem como intermediários na preparação de compostos de peptídeo marcados.

Os compostos de peptídeo preferenciais são aqueles que têm:

(1) um peso molecular menor que cerca de 5.000 dáltons, quer sejam monômeros, dímeros ou oligômeros, e (2) uma afinidade de ligação a TPO-R conforme expressa por um IC₅o de não mais que cerca de 100 mM, em que zero ou mais das ligações [~C(O)NR--] da peptidila fo11 ram substituídas por uma ligação não-peptidila, como uma ligação -CH₂ carbamato [--CH₂ ~OC(O)NR~], uma ligação fosfonato, uma ligação -CH₂ sulfonamida [--CH₂ --S(O)₂ NR-], uma ligação uréia [~NHC(O)NH--], uma ligação -CH₂ -amina secundária, ou uma ligação de peptidila alquilada [-C(O)NR⁶ em que R⁶ é uma alquila inferior];

NRR¹, para um grupo -NRC(O)R, para um grupo ~NRC(O)OR, para um grupo -NRS(O)₂R, para um grupo -NHC(O)NHR em que R e R¹ são hidrogênio ou alquila inferior, com a condição de que R e R¹ não sejam ambos hidrogênio, para um grupo succinimida, para um grupo benziloxicarbonil-NH-- (CBZ-NH-), ou para um grupo benziloxicarbonil-NH- tendo de 1 a 3 substituintes no anel de fenila selecionados do grupo consistindo em alquila inferior, alcóxi inferior, cloro e bromo; ou peptídeos em que o carboxiterminal é derivatizado para -C(O)R², em que R² é selecionado do grupo consistindo em alcóxi inferior e -NR³ R⁴ em que R³ e R⁴ são independentemente selecionados do grupo consistindo em hidrogênio e alquila inferior.

Descobriu-se que o composto de peptídeo central pode compreender uma sequência de aminoácidos (SEQ. ID NO: 2):

X1X2X3 X₄ x₅ X₆ X₇ em que Χ_Ί é C, L, Μ, P, Q, V; X₂ é F, K, L, N, Q, R, S, T ou V; X₃é C, F, I, L, M, R, S, V ou W; X₄ é qualquer dos 20 L-aminoácidos geneticamente codificados; X₅ é A, D, E, G, K, M, Q, R, S, Τ, V ou Y; X₆ é β-(2naftiljalanina (2-Nal); e X₇ é C, G, I, K, L, Μ, N, R ou V.

Em uma modalidade preferencial, o composto de peptídeo central compreende uma seqüência de aminoácidos (SEQ. ID NO: 3):

XsGXt X₂X₃ X₄ X₅ (2-Nal) X₇ em que Xi a X₇ são conforme definido acima, e cada resíduo X₃é independentemente selecionado entre qualquer dos 20 L-aminoácidos geneticamente codificados, seus D-aminoácidos estereoisoméricos e aminoácidos não-naturais.

Em ainda outra modalidade preferencial, o composto de peptí12 deo central compreende uma seqüência de aminoácidos (SEQ. ID NO: 4):

X₉ X₈ G Xi X₂ X₃ X₄ X₅ (2-Nal) X₇ em que X₉ é A, C, E, G, I, L, Μ, P, R, Q, S, T ou V; e X_e é A, C,

D, E, K, L, Q, R, S, T ou V. Com mais preferência, X₉ é A ou I; e X₈ é D, E ou

K.

ID NO: 5):

I E G P T L R Q (2-Nal) L A A R (Sar) em que (Sar) é sarcosina.

Em outra modalidade, o composto de peptídeo é dimerizado ou oligomerizado para aumentar a afinidade e/ou a atividade do composto de peptídeo. Um composto de peptídeo particularmente preferencial é um peptídeo de 29 meros que tem 14 meros idênticos ligados por um resíduo de lisinamida. Portanto, um composto de peptídeo particularmente preferencial é (SEQ. ID NO: 6, também chamado, neste documento, de composto de TPO n° 1):

I E G P T L R Q (2-Nal) L A A R (Sar) \

K(NH₂) /

I E G P T L R Q (2-Nal) L A A R (Sar)

Um composto de peptídeo mais preferencial é uma versão pegilada do composto de TPO n° 1. A forma pegilada pode incluir um resíduo de MPEG 20.000 covalentemente ligado a cada isoleucina N-terminal. A estru25 tura molecular completa de um exemplo desse tipo de composto é detalhada abaixo:

(Este composto é chamado, neste documento, de composto de TPO pegilado n° 1). O nome químico completo do composto de TPO pegilado n° 1 é:

metoxipolietilenoglico^O-OOO-propionil-L-isoleucil-L-glutamil-glicil

-Ι_-ρΓθ1ϊΐ3-Ι_-ίΓθοηΐΙ-Ι_-!βυοΐΙ-Ι_-ΗΓ9ΪηΐΙ-Ι_-9ΐυΐ3ΓηϊηϊΙ-1_-2-η3ΐϋΐΗΐθηΐ1-ί_-ΙβυΰίΙ-Ι_-3ΐ3nil-L-alanil-L-arginil-sarcosil-Ne-ímetóxi polietileno glicol 20.000-propionil-Lί5θΙβυοιΙ-1_-9ΐυί3ΓηϊΙ-9ΐίοίΙ-Ι_-ρΐΌΐίΙ-Ι_-ΐΓ6θηΐΙ-1_-Ιβυοΐ1-Ι_-3Γ9ΪηΐΙ-Ι_-9ΐυΐΗΓηιηϊΙ-Ι_-2naítilalanil-L-leucil-L-alanil-L-alanil-L-arginil-sarcosil-Ulisinamida.

O composto de TPO pegilado n° 1 é composto de duas cadeias idênticas de peptídeos com 14 aminoácidos, ligadas por um resíduo de lisinamida e ligadas em cada N-terminal a uma cadeia de polietileno glicol (PEG) com peso molecular de aproximadamente 20.000 Dálton. O peso molecular do peptídeo original sem PEG é de 3.295 Dáltons e com duas cadei15 as de PEG é de aproximadamente 43.295 Dáltons. O composto de TPO pegilado n° 1 tem uma estrutura molecular abreviada de (MPEG-lle-Glu-GlyPro-Thr-Leu-Arg-Gln-(2-Nal)-Leu-Ala-Ala-Arg-(Sar))2-Lys-NH₂, em que (2-Nal) é p-(2-naftil)alanina, (Sar) é sarcosina e MPEG é metoxipoli(etileno glicol) (peso molecular de aproximadamente 20.000 Dáltons).

Um ou mais compostos de peptídeo e, em particular, os compostos de peptídeo pegilados, inclusive os equivalentes farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos (coletivamente chamados neste documento de compostos de peptídeo, compostos de peptídeo de TPO ou compostos de peptídeo de TPO da invenção) são úteis para a prevenção e o tratamen25 to de doenças mediadas pela TPO e, particularmente, para o tratamento f \ , . <

e/ou a prevenção da anemia. Dessa forma, a presente invenção apresenta um método para tratamento e/ou prevenção da anemia, em que um paciente que tem anemia, ou um paciente no qual se espera que a anemia se desenvolva, recebe uma dose ou uma quantidade terapeuticamente ou profilaticamente eficaz de um composto de peptídeo da presente invenção.

A -invenção -também apresenta composições farmacêuticas compreendendo um ou mais dos compostos de peptídeo aqui descritos, bem como um veículo fisiologicamente aceitável. Essas composições farmacêuticas podem estar sob uma variedade de formas, inclusive formas de dosagem oral, bem como pós e soluções inaláveis e soluções para injeção ou infusão.

Breve Descrição das Figuras

A figura 1 mostra o efeito do tratamento com o composto de TPO pegilado n° 1 sobre os teores de hemoglobina, conforme demonstrado no Exemplo 1.

A figura 2 mostra o efeito do tratamento com o composto de TPO pegilado n° 1 sobre a contagem de eritrócitos, conforme demonstrado no Exemplo 1.

A figura 3 mostra o efeito do tratamento com o composto de TPO pegilado n° 1 sobre o hematócrito, conforme demonstrado no Exemplo 1.

A figura 4 mostra o efeito do tratamento com o composto de TPO pegilado n° 1 sobre o peso corporal, conforme demonstrado no Exemplo 1.

A figura 5 mostra o efeito do tratamento com o composto de TPO pegilado n° 1 sobre os teores de hemoglobina, conforme demonstrado no Exemplo 2.

A figura 6 mostra o efeito do tratamento com o composto de TPO pegilado n° 1 sobre a contagem de eritrócitos, conforme demonstrado no Exemplo 2.

A figura 7 mostra o efeito do tratamento com o composto de

TPO pegilado n° 1 sobre o hematócrito, conforme demonstrado no Exemplo 2.

A figura 8 mostra o efeito do tratamento com o composto de

TPO pegilado n° 1 sobre o peso corporal, conforme demonstrado no Exemplo 2.

A figura 9 mostra o efeito do tratamento com o composto de TPO pegilado n° 1 sobre os teores de hemoglobina, conforme demonstrado no Exemplo 3.

A figura W-mostra o efeito -do tratamento eem o composto -de TPO pegilado n° 1 sobre a contagem de eritrócitos, conforme demonstrado no Exemplo 3.

A figura 11 mostra o efeito do tratamento com o composto de 10 TPO pegilado n° 1 sobre o hematócrito, conforme demonstrado no Exemplo 3.

A figura 12 mostra o efeito do tratamento com o composto de TPO pegilado n° 1 sobre o peso corporal, conforme demonstrado no Exemplo 3.

A figura 13 mostra o efeito do tratamento com o composto de 15 TPO pegilado n° 1 sobre o hematócrito, conforme demonstrado no Exemplo 4.

A figura 14 mostra o efeito do tratamento com o composto de TPO pegilado n° 1 sobre o peso corporal, conforme demonstrado no Exemplo 4.

A figura 15 mostra o efeito do tratamento com o composto de 20 TPO pegilado n° 1 sobre o peso corporal, conforme demonstrado no Exemplo 5.

A figura 16 mostra o que se acredita ser o mecanismo de ação antianêmico do composto de TPO pegilado n° 1.

A figura 17 mostra o que se acredita serem alguns dos efeitos 25 de linhagem do composto de TPO pegilado n° 1 sobre as células hematopoiéticas.

As figuras 18A e 18B mostram os efeitos sobre as plaquetas e o hematócrito de camundongos tratados com carboplatina, como resultado do tratamento com composto de TPO pegilado n° 1, conforme demonstrado no

Exemplo 6.

A figura 19 mostra o efeito sobre a deposição de fibrinogênio e de coágulos sangüíneos em seções de cérebro de camundongos tratados com carboplatina, como resultado do tratamento com composto de TPO pegilado n° 1 conforme demonstrado no Exempío 6.

A figura 20 mostra o efeito do composto de TPO pegiíado n° 1 sobre a ativação da TPO-R humana em células Baf/3, conforme demonstra5 do no Exemplo 7.

TPO pegiíado n° 1 que expressam TPO-R humana de modo recombinante e de maneira dose-dependente, conforme demonstrado no Exemplo 7. Descrição de Modalidades Específicas

As definições a seguir são apresentadas para ilustrar e definir o significado e o escopo dos vários termos usados para descrever a presente invenção.

O termo agonista refere-se a um ligante biologicamente ativo que se liga a seu receptor biologicamente ativo complementar, ativando este último para causar uma resposta biológica no receptor ou para acentuar a atividade biológica preexistente deste receptor.

Os termos ECm e concentração eficaz de 50% referem-se à concentração de um agonista que produz 50% da máxima resposta eficaz possível para aquele agonista.

Os termos IC₅₀ e concentração inibitória de 50% referem-se à concentração do ligante concorrente, que desloca 50% da ligação específica do agonista.

O termo equivalentes farmaceuticamente aceitáveis inclui, sem limitação, sais, sais de adição de ácido, ésteres, amidas, hidratos, metabóli25 tos, pró-fármacos e isoésteres farmaceuticamente aceitáveis. Espera-se que muitos dos equivalentes farmaceuticamente aceitáveis tenham atividade igual ou similar, in vitro ou in vivo, àquela dos compostos de peptídeo da invenção.

O termo sais farmaceuticamente aceitáveis refere-se aos sais não-tóxicos de metal alcalino, metal alcalino-terroso e amônio comumente usados na indústria farmacêutica, inclusive os sais de sódio, potássio, lítio, cálcio, magnésio, bário, amônio e zinco protamina, que são preparados por meio de métodos bem-conhecidos na técnica. O termo inclui, também, sais de adição de ácido não-tóxicos, que são geralmente preparados pela reação de compostos de peptídeo da presente invenção com um ácido orgânico ou inorgânico adequado. Os sais representativos incluem cloridrato, bromidrato, sulfato, bissulfato, acetato, oxalato, valerato, oleato, laurato, borato, benzoato, lactato, fosfato, tosilato, -cttrato; mateafó, fuma rato, socei na to; tarlarato; napsilato e similares.

O termo sal de adição de ácido farmaceuticamente aceitável refere-se àqueles sais que retêm a efetividade biológica e as propriedades das bases livres, e que não são biologicamente, ou de outro modo, indesejáveis, formados por ácidos inorgânicos como ácido clorídrico, ácido bromídrico, ácido sulfúrico, ácido nítrico, ácido fosfórico e similares, e ácidos orgânicos como ácido acético, ácido propiônico, ácido glicólico, ácido pirúvico, ácido oxálico, ácido málico, ácido malônico, ácido succínico, ácido maléico, ácido fumárico, ácido tartárico, ácido cítrico, ácido benzóico, ácido cinâmico, ácido mandélico, ácido metanossulfônico, ácido etanossulfônico, ácido p-toluenossulfônico, ácido salicílico e similares. Para obter uma descrição dos sais de adição de ácido farmaceuticamente aceitáveis como pró-fármacos, vide Bundgaard, H., acima citado.

O termo éster farmaceuticamente aceitável refere-se àqueles ésteres que retêm, na ocorrência de hidrólise da ligação éster, a efetividade biológica e as propriedades do ácido carboxílico ou do álcool, e que não são biologicamente, ou de outro modo, indesejáveis. Para obter uma descrição dos ésteres farmaceuticamente aceitáveis como pró-fármacos, vide Bundgaard, H., ed., Delineamento of Prodrugs, Elsevier Science Publishers, Amsterdam (1985). Esses ésteres são tipicamente formados a partir do ácido carboxílico correspondente e de um álcool. Geralmente, a formação de éster pode ser obtida por meio de técnicas de sintetização convencionais. (Vide, por exemplo, March Advanced Organic Chemistry, 3- Edição, John Wiley & Sons, New York (1985) página 1157, bem como as referências ali citadas, e Mark et al. Encyclopedia of Chemical Technology, John Wiley & Sons, New York (1980)). O componente de álcool do éster compreenderá, geralmente, (i) um álcool alifático C₂ -C12 que pode ou não conter uma ou mais ligações duplas, e que pode ou não conter carbonos ramificados, ou (ii) um álcool aromático ou heteroaromático C₇ -C12. Esta invenção contempla, também, 0 uso daquelas composições que são ésteres, conforme descrito na presente invenção, e são ao mesmo tempo os sais de adição de ácido farmaceuticamente aceitáveis dos mpqmns,

O termo amida farmaceuticamente aceitável refere-se àquelas amidas que retêm, na ocorrência de hidrólise da ligação amida, a efetividade biológica e as propriedades do ácido carboxílico ou da amina, e que não são biologicamente, ou de outro modo, indesejáveis. Para obter uma descrição das amidas farmaceuticamente aceitáveis como pró-fármacos, vide Bundgaard, H., ed., Delineamento of Prodrugs, Elsevier Science Publishers, Amsterdam (1985). Essas amidas são, tipicamente, formadas a partir do ácido carboxílico correspondente e de uma amina. Geralmente, a formação de amida pode ser obtida com 0 uso de técnicas de sintetização convencionais. (Vide, por exemplo, March Advanced Organic Chemistry, 3- Edição, John Wiley & Sons, New York (1985) p. 1152, e Mark et al. Encyclopedia of Chemical Technology, John Wiley & Sons, New York (1980)). Esta invenção contempla, também, 0 uso daquelas composições que são amidas, conforme descrito na presente invenção, e são ao mesmo tempo os sais de adição de ácido farmaceuticamente aceitáveis das mesmas.

O termo veículo farmaceuticamente ou terapeuticamente aceitável refere-se a um meio carreador que não interfere com a efetividade da atividade biológica dos ingredientes ativos, e que não é tóxico para o hos25 pedeiro ou o paciente.

O termo estereoisômero refere-se a um composto químico que tem peso molecular, composição química e constituição iguais aos de um outro, mas com os átomos agrupados de forma diferente. Ou seja, certas porções químicas idênticas estão em diferentes orientações no espaço e, portanto, quando puras, têm a capacidade de girar o plano de luz polarizada. No entanto, alguns estereoisômeros puros podem ter uma rotação óptica tão leve que a mesma é indetectável com os instrumentos atuais. Os compostos de peptídeo da presente invenção podem ter um ou mais átomos de carbono assimétricos e, portanto, podem incluir vários estereoisômeros. Todos os estereoisômeros estão no escopo da invenção.

O termo quantidade terapeuticamente ou farmaceuticamente 5 eficaz, conforme aplicado às composições da presente invenção, refere-se à quantidade-de- composição suficiente-para- -índtjzrrtjrrr resultado biulóyico desejado. Esse resultado pode ser o alívio dos sinais, sintomas ou causas de uma doença, ou qualquer outra alteração desejada de um sistema biológico. Na presente invenção, o resultado tipicamente envolverá um aumento na produção de eritrócitos.

Os resíduos de aminoácido em peptídeos são abreviados da seguinte forma: fenilalanina é Phe ou F; leucina é Leu ou L; isoleucina é lie ou I; metionina é Met ou M; valina é Vai ou V; serina é Ser ou S; prolina é Pro ou P; treonina é Thr ou T; alanina é Ala ou A; tirosina é Tyr ou Y;

histidina é His ou H; glutamina é Gin ou Q; asparagina é Asn ou N; lisina é Lys ou K; ácido aspártico é Asp ou D; ácido glutâmico é Glu ou E; cisteína é Cys ou C; triptofano é Trp ou W; arginina é Arg ou R; e glicina é Gly ou G. Adicionalmente, Bu é butóxi, Bzl é benzila, CHA é ciclohexilamina, Ac é acetila, Me é metila, Pen é penicilamina, Aib é ácido aminoisobutírico, Nva é norvalina, Abu é ácido aminobutírico, Thi é tienilalanina, OBn é O-benzila e hyp é hidroxiprolina.

Além dos peptídeos consistindo somente em aminoácidos de ocorrência natural, são apresentados também peptidomiméticos ou análogos de peptídeo. Os análogos de peptídeo são comumente usados na indústria farmacêutica como fármacos não-peptídeos com propriedades análogas àquelas do peptídeo modelo. Esses tipos de compostos de não-peptídeo são denominados peptídeos miméticos ou peptidomiméticos (Fauchere, J. Adv. Drug Res. 15:29 (1986), Veber e Freidinger TINS p.392 (1985), e Evans et al.,

J. Med. Chem. 30:1229 (1987), os quais estão aqui incorporados, a título de referência). Os peptídeos miméticos que são estruturalmente similares a peptídeos terapeuticamente úteis podem ser usados para produzir um efeito terapêutico ou profilático equivalente ou otimizado. Geralmente, os peptidomiméticos são estruturalmente similares a um polipeptídeo-paradígma (isto é, um polipeptídeo que tem uma atividade biológica ou farmacológica), como o peptídeo de ligação a receptor de ocorrência natural, mas têm uma ou mais ligações de peptídeo opcionalmente substituídas por uma ligação selecionada do grupo consistindo em: -CH₂ NH-, -CH₂ S-, CH₂ .--CHg ---, —(eis o trans),—CQCH₂ —CH(QI l)CH₂ ü ---~€H₂

SO-, mediante o uso de métodos conhecidos na técnica que são descritos com mais detalhes nas seguintes referências: Spatola, A. F. em Chemistry and Biochemistry of Amino Acíds, Peptides, and Proteins, B. Weinstein,

Editores, Marcei Dekker, New York, página 267 (1983), Spatola, A. F., Vega Data (março de 1983), Volume 1, Emissão 3, Peptide Backbone Modifications (análise geral), Morley, Trends Pharm Sei (1980), páginas 463-468 (análise geral), Hudson, D. et al., Int J Pept Prot Res 14:177-185 (1979) (CH₂ NH-, CH₂ CH₂ -), Spatola et al., Life Sei 38:1243-1249 (1986) (~CH₂ 15 S), Hann J. Chem. Soc Perkin Trans. I 307-314 (1982) (-CH-CH-, cis e trans), Almquist et al., J. Med. Chem. 23:1392-1398 (1980) (-COCH₂ --), Jennings-White et al., Tetrahedron Lett 23:2533 (1982) (~COCH₂ --), Szelke et al., European Appln. EP 45665 CA (1982): 97:39405 (1982) (-CH (OH)CH₂ -), Holladay et al., Tetrahedron Lett 24:4401-4404 (1983) (-C(OH)

CH₂ -), e Hruby Life Sei 31:189-199 (1982) (--CH₂ -S-), cada um dos quais está aqui incorporado a título de referência. Uma ligação não-peptídeo particularmente preferencial é -CH₂ NH-. Esses peptídeos miméticos podem ter vantagens significativas sobre modalidades de polipeptídeos, inclusive, por exemplo: produção mais econômica, maior estabilidade química, propriedades farmacológicas otimizadas (meia-vida, absorção, potência, eficácia etc.), especificidade alterada (por exemplo, um amplo espectro de atividades biológicas) e antigenicidade reduzida, entre outras,

A marcação dos peptidomiméticos geralmente envolve a ligação covalente de um ou mais marcadores, diretamente ou por meio de um espaçador (por exemplo, um grupo amida), a uma ou mais posições nãointerferentes no peptidomimético, as quais são previstas por meio de dados quantitativos sobre a atividade da estrutura e/ou modelagem molecular.

Essas posições não-interferentes geralmente são posições que não formam contatos diretos com as macromoléculas (por exemplo, moléculas da superfamília da ímunoglobulina) às quais o peptidomimético se liga para produzir o efeito terapêutico. A derivatização (por exemplo, a marcação) de peptidomiméticos não deve interferir substancialmente com a atividade hiológica ou farmacológica docojada do peptidomimético: Geralmente; ns peptidomiméticos de peptídeos que se ligam a receptores se ligam ao receptor com um alto grau de afinidade, e apresentam uma atividade biológica detectável (isto é, são agonistas ou antagonistas de uma ou mais alterações fenotípicas mediadas por receptor).

A substituição sistemática de um ou mais aminoácidos de uma seqüência consenso por um D-aminoácido do mesmo tipo (por exemplo, Dlisina no lugar de L-lisina) pode ser usada para gerar peptídeos mais estáveis. Além disso, os peptídeos constritos que compreendem uma seqüência consenso ou uma variação de sequência consenso substancialmente idêntica podem ser gerados por métodos conhecidos na técnica (Rizo e Gierasch, Ann. Rev. Biochem. 61:387 (1992), aqui incorporado a título de referência), por exemplo mediante a adição de resíduos internos de cisteína capazes de formar pontes intramoleculares de dissulfeto, as quais ciclizam o peptídeo.

O termo marcador detectável refere-se a materiais que, quando covalentemente ligados aos compostos de peptídeo da presente invenção, permitem a detecção do composto de peptídeo in vivo no paciente ao qual o composto de peptídeo foi administrado. Os marcadores detectáveis adequados são bem-conhecidos na técnica e incluem, a título de exemplo, radioisótopos, marcadores fluorescentes (por exemplo, fluoresceína) e similares. O marcador detectável específico a ser usado não é de importância crítica, e é selecionado em função da quantidade a ser empregada e em função da sua toxicidade na quantidade utilizada. A seleção do marcador em função desses fatores está no âmbito da técnica.

A ligação covalente do marcador detectável ao composto de peptídeo é obtida por métodos convencionais bem-conhecidos na técnica.

Por exemplo, quando o radioisótopo ¹²⁵l é empregado como marcador detectável, a ligação covalente do ¹²⁵l ao composto de peptídeo pode ser obtida mediante a incorporação do aminoácido tirosina ao composto de peptídeo, seguida de iodação do composto de peptídeo. Da mesma forma, o ³²P pode ser incorporado ao composto de peptídeo sob a forma de uma peptídeo usando-se química convencional.

A presente invenção apresenta compostos de peptídeo que se ligam à TPO-R e a ativam ou, de outro modo, se comportam como um agonista da TPO. Esses compostos de peptídeo incluem compostos de peptídeo líderes e compostos de peptídeo “equivalentes” ou derivados construídos de modo a terem estrutura molecular ou formato igual ou similar ao dos compostos de peptídeo líderes, mas que diferem destes em relação à suscetibilidade à hidrólise ou proteólise e/ou em relação a outras propriedades biológicas, como maior afinidade pelo receptor. A presente invenção apresenta, também, composições que compreendem uma quantidade eficaz de um agonista de TPO e, mais especificamente, um composto de peptídeo que é útil para o tratamento da anemia.

Os compostos de peptídeo da invenção podem, também, ser administrados a animais de sangue quente, inclusive seres humanos, para ativar a TPO-R in vivo. Dessa forma, a presente invenção abrange métodos para o tratamento terapêutico da anemia, os quais compreendem a administração de um composto de peptídeo da invenção em quantidades suficientes para imitar o efeito da TPO na TPO-R in vivo.

A atividade dos compostos de peptídeo da presente invenção pode ser avaliada in vitro ou in vivo, por exemplo em um dos numerosos modelos descritos em McDonald, Am. J. of Pediatric Hematology/Oncology 14:8-21 (1992), que está aqui incorporado a título de referência, ou nos testes aqui apresentados.

De acordo com uma modalidade, as composições da presente invenção são úteis para o tratamento da anemia associada a transfusões de medula óssea, radioterapia ou quimioterapia. Os compostos de peptídeo serão tipicamente administrados profilaticamente antes da quimioterapia, da radioterapia ou do transplante de medula óssea, ou após esse evento de exposição.

Consequentemente, a presente invenção apresenta, também, composições farmacêuticas que compreendem, como um ingrediente ativo, pelo menos um dos compostos de peptídeo. da invenção,-em associação com um veículo ou diluente de uso farmacêutico. Os compostos de peptídeo da presente invenção podem ser administrados por rota de administração oral, pulmonar, parenteral (injeção intramuscular, intraperitoneal, intravenosa (IV) ou subcutânea), inalação (por meio de uma formulação em pó fino), transdérmica, nasal, vaginal, retal ou sublingual, e podem ser formulados em formas de dosagem adequadas a cada via de administração. Vide, por exemplo, a Publicação de Patente PCT n^e WO 93/25221 de Bernstein et al., a Publicação de Patente PCT n^g WO 94/17784 de Pitt et al. e o Pedido de Patente Européia 613.683 de Pitt et al., cada um dos quais está aqui incorporado, a título de referência.

As formas sólidas de dosagem para administração oral incluem cápsulas, comprimidos, pílulas, pós e grânulos. Nessas formas sólidas de dosagem, o composto de peptídeo ativo é misturado com pelo menos um veículo inerte farmaceuticamente aceitável, como sacarose, lactose ou amido. Essas formas de dosagem podem também compreender, como é prática normal, substâncias adicionais além de diluentes inertes, por exemplo, agentes lubrificantes como estearato de magnésio. No caso de cápsulas, comprimidos e pílulas, as formas de dosagem podem compreender também agentes de tamponamento. Os comprimidos e pílulas podem, adicionalmente, ser preparados com revestimentos entéricos.

As formas de dosagem líquidas para administração oral incluem emulsões, soluções, suspensões e xaropes farmaceuticamente aceitáveis, sendo que os elixires contêm diluentes inertes comumente usados na técnica, como água ou solução salina. Além desses diluentes inertes, as composições podem incluir também adjuvantes, como agentes umectantes, emulsificantes e de suspensão, bem como agentes adoçantes, flavorizantes e aromatizantes.

As preparações de acordo com a presente invenção destinadas à administração parenteral incluem soluções, suspensões ou emulsões estéreis aquosas ou não-aquosas. Exemplos de solventes ou veículos não5 aquosos são propileno glicol, polietileno glicol, óleos vegetais como óleo de . oliva e oleo.de milho, gelatina-θ-ésteres orgânicos injetáveis·,- como oleato de etila. Essas formas de dosagem podem conter também adjuvantes como agentes de conservação, de molhagem, de emulsificação e de dispersão. Estes podem ser esterilizados por meio de, por exemplo, filtração através de filtro retentor de bactérias, incorporação de agentes esterilizantes às composições, irradiação das composições, ou aquecimento das composições. Os mesmos podem, também, ser fabricados usando-se água estéril, ou algum outro meio injetável estéril, imediatamente antes do uso.

As composições para administração retal ou vaginal são, de preferência, supositórios que podem conter, além da substância ativa, excipientes como manteiga de cacau ou uma cera para supositórios. As composições para administração nasal ou sublingual também são preparadas com excipientes convencionais, bem-conhecidos na técnica.

As composições da presente invenção podem ser também microencapsuladas com o uso, por exemplo, do método de Tice e Bibi (em Treatise on Controlled Drug Delivery, editor A. Kydonieus, Marcei Dekker, N.Y. (1992), páginas 315-339).

As composições contendo o composto de peptídeo podem ser administradas para tratamentos profiláticos e/ou terapêuticos. Em aplicações terapêuticas, as composições são administradas a um paciente que já sofre de uma doença, conforme descrito acima, em uma quantidade suficiente para curar ou acabar, pelo menos parcialmente, com os sintomas da doença e suas complicações. Uma quantidade adequada para obter esse efeito é definida como dose terapeuticamente eficaz. As quantidades eficazes para esse uso dependerão da gravidade da doença e do peso e estado geral do paciente.

Em aplicações profiláticas, as composições contendo os com

-S postos de peptídeo da invenção são administradas a um paciente suscetível a uma determinada doença ou, de outro modo, sob risco de contrair essa doença. Essa quantidade é definida como dose profilaticamente eficaz.

Neste uso, as quantidades precisas dependem, novamente, do estado de saúde e do peso do paciente.

As quantidades- 4a agonista TPO«Gce€sáha5--pa£a -uma terapia eficaz dependerão de muitos fatores diferentes, inclusive dos meios de administração, do sítio-alvo, do estado fisiológico do paciente e de outros fármacos administrados. Dessa forma, as dosagens para tratamento precisariam ser tituladas para otimizar a segurança e a eficácia. Tipicamente, as dosagens usadas in vitro podem ser uma orientação útil sobre as quantidades úteis para administração local destes reagentes. O teste de doses eficazes para tratamento de distúrbios específicos feito em animais fornecerá uma melhor indicação preditiva sobre a dosagem para seres humanos. Várias considerações são descritas, por exemplo, em Gilman et al. (editores), Goodman and Gilman's: The Pharmacological Basis of Therapeutics, 8² Edição, Pergamon Press (1990), e Remington's Pharmaceutical Sciences, 7^â Edição, Mack Publishing Co., Easton, Pa (1985); cada uma das quais são aqui incorporadas por referência.

Os compostos de peptídeo da presente invenção são eficazes no tratamento da anemia quando administrados em uma faixa de dosagens de cerca de 1 pg a cerca de 300 pg/kg de peso corporal por dia. A dose específica empregada depende da via de administração, bem como do julgamento do clínico envolvido, e é função de fatores como a gravidade da condição, a idade e a condição geral do paciente, e similares.

Exemplos Modelos animais

Foram observados os efeitos do composto de TPO pegilado n^e 1 sobre camundongos tratados com carboplatina. Para todos os exemplos da presente invenção, uma solução de estoque de 10 mg/mL de composto de TPO pegilado n^Q 1 foi preparada em solução salina estéril. Para misturar, o preparado foi colocado em um agitador giratório durante 15 minutos a 200 rpm. Esse método foi usado para dissolver o composto de TPO pegilado n^s 1 sem formação de espuma. O estoque foi filtrado em um filtro GV Millex (0,22 pm). As soluções de dosagem foram, então, preparadas a partir desse estoque usando-se solução salina estéril. O estoque e as soluções de dosagem foram preparados no dia do uso.

Foi observado o efeito do composto de TPO pegilado n- 1 sobre a duração e a gravidade da anemia após o tratamento dos camundongos com carboplatina, conforme determinado pelas alterações nos teores de hemoglobina, na contagem de eritrócitos e no hematócrito. Para este estudo, quantidades crescentes de composto de TPO pegilado n^s 1 foram administradas aos camundongos um dia após a dose de carboplatina, para caracterizar um possível efeito dose-dependente sobre vários parâmetros referentes a eritrócitos.

Os grupos de camundongos foram tratados com carboplatina ou com veículo (solução salina tamponada com fosfato, PBS) por administração intraperitoneal nos dias -2 e -1, conforme delineado abaixo. A dose ótima de carboplatina usada para induzir trombocitopenia na linhagem de camundongo BALB/c foi previamente determinada como sendo uma dose total fracionada de 120 mg/kg, administrada sob a forma de duas injeções diárias consecutivas (isto é, 2 x 60 mg/kg). Um dia depois da segunda dose de carboplatina, os grupos de camundongos foram tratados com composto de TPO pegilado n^e 1 ou veículo (solução salina estéril, SS, isenta de conservantes e com 0,9% de cloreto de sódio) em injeção IV (bolo), conforme delineado na Tabela 1. A dose foi administrada com base no peso (100 pL710 g de peso corporal).

Tabela 1

Grupos de tratamento:
Gp	N	Pré-tratamento (IP), Dia -2 e -1	Artigo para teste	Dose (iv) Dia 0	Coleta de sangue

T	W	Veículo (PBS)	Veículo (SS)	Simulação	5 camundongos eutanizados nos dias 5 e 11
2	20	Carboplatina	Veículo (SS)	Simulação	5 camundongos eutanizados nos dias 5, 7, 9 e 11
3	20	Carboplatina	Composto de TPO pegilado n° 1	300 pg/kg	5 camundongos eutanizados nos dias 5, 7, 9 e 11
4	20	Carboplatina	Composto de TPO pegilado n° 1	1.000 pg/kg	5 camundongos eutanizados nos dias 5, 7, 9 e 11
5	20	Carboplatina	Composto de TPO pegilado n° 1	3.000 pg/kg	5 camundongos eutanizados nos dias 5, 7, 9 e 11
Gp =	Grupo; Eut = Eutanizados

Nos dias 5, 7, 9 e 11, cinco camundongos de cada grupo de teste foram pesados e, então, eutanizados por meio de asfixia por CO₂ e ensangüinação via perfuração cardíaca. As amostras de sangue foram transferidas para microrecipientes separados contendo EDTA (tampa lilás) para avaliação hem ato lógica. Os grupos de camundongos para controle (5) foram processados nos dias 5 e 11. Os resultados são mostrados nas figuras 1 a 4. Os dados são apresentados graficamente sob a forma de média do grupo + desvio padrão.

O tratamento dos camundongos apenas com carboplatina causou uma diminuição de cerca de 20% nos teores de hemoglobina dos camundongos em torno do dia 11. Essa diminuição foi inibida pelo tratamento com todas as doses do composto de TPO pegilado n^Q 1. Pequenas diminuições na contagem de RBC e no hematócrito também foram associadas ao tratamento com carboplatina, um efeito que foi inibido pelo tratamento com composto de TPO pegilado n^s 1, porém não foi conduzida uma avaliação estatística desse efeito. Os camundongos de todos os grupos tratados apenas com carboplatina ou com carboplatina mais as várias doses de composto de TPO pegiíado n⁹ 1 apresentaram perda de peso nos dias 5, 7 e 9, em relação a medições de peso corporal feitas no dia

0. A análise das medições do peso corporal de um subconjunto de camundongos durante o período de 11 dias do estudo sugere que o tratamento com· apenas Oarboplatina causou êdiminuição--elopesecor porei observada, e que o composto de TPO pegiíado n⁹ 1 melhorou a recuperação do peso corporal perdido em todas as doses testadas.

Os camundongos tratados com apenas carboplatina começaram a exibir aparência e comportamento alterados em tomo do dia 5. Alguns dos camundongos assumiram uma posição curvada e uma aparência flácida. Muitos camundongos tinham, também, áreas anogenitais sujas. O tratamento com composto de TPO pegiíado n⁹ 1 diminuiu o aparecimento, a freqüência e a gravidade desses sinais de uma forma que pareceu ser dose15 dependente.

Exemplo 2

Foi examinada a possibilidade de que o composto de TPO pegiíado n⁹ 1 possa tornar as células-tronco hematopoiéticas da medula óssea de camundongos sensíveis aos efeitos tóxicos do tratamento com carboplatina. Para este estudo, uma dose de composto de TPO pegiíado n^s1 foi administrada aos camundongos sete dias antes da dose de carboplatina, ou imediatamente após o tratamento com carboplatina. Um grupo adicional foi tratado com composto de TPO pegiíado n^e 1 tanto antes como depois da administração de carboplatina. Foi observado, também, o efeito desses regimes de dosagem sobre os parâmetros hematológicos.

Os grupos de camundongos foram tratados com carboplatina ou com veículo (solução salina tamponada com fosfato, PBS) por administração intraperitoneal nos dias 7 e 8, conforme delineado abaixo. A dose ótima de carboplatina usada para induzir trombocitopenia na linhagem de camundongo BALB/c foi previamente determinada como sendo uma dose total fracionada de 120 mg/kg, administrada sob a forma de duas injeções diárias consecutivas (isto é, 2 x 60 mg/kg). Sete dias antes da primeira dose de carboplatina ou uma (1) hora após a segunda dose de carboplatina, grupos de camundongos foram tratados com composto de TPO pegilado n^Q1 (300 pg/kg) ou com veículo (solução salina estéril, SS, isenta de conservantes, a 0,9% de cloreto de sódio) por injeção IV (bolo), conforme delineado na Tabela 2. Um grupo adicional foi tratado com composto de carboplatina. Todas as dosagens foram determinadas com base no peso (100 pL710 g de peso corporal).

Tabela 2

Delineamento do estudo:
Gp	N	Dose (iv) Dia 0	Carboplatina (CBPL) [60 mg/kg, q2d], (ip), dias 7 e 8	Dose (iv) Dia 8 (1 h depois da 2^a dose de CBPL)	Coleta de sangue 5 camundongos eutanizados nos dias:
1	10	Veículo (*SS)	Veículo (PBS)	Veículo (*SS)	14e26
2	20	Veículo {‘SS)	Carboplatina	Veículo (*SS)	14, 18, 22 e 26
3	20	Composto de TPO pegilado n° 1 300 pg/kg	Carboplatina	Veículo (*SS)	14, 18, 22 e 26
4	20	Veículo (*SS)	Carboplatina	Composto de TPO pegilado n° 1 300 ug/kg	14,18, 22 e 26
5	20	Composto de TPO pegilado n° 1 300 pg/kg	Carboplatina	Composto de TPO pegilado n° 1 300 ug/kg	14, 18, 22 e 26

Nos dias 14, 18, 22 e 26, cinco camundongos de cada grupo de teste foram pesados e, então, eutanizados através de asfixia por CO₂ e ensangüinação via perfuração cardíaca. As amostras de sangue foram transferidas para microrecipientes separados contendo EDTA (tampa lilás) para avaliação hematológica. Os grupos de camundongos para controle (5) foram processados nos dias 14 e 26. Os resultados são mostrados nas figuras 5 a 8. Os dados são apresentados graficamente sob a forma de média do grupo + desvio padrão.

O tratamento de camundongos com apenas carboplatina causou .diminuições (aproximadamente 18%)- nes- teeres de hemoglobina, m contagem de RBC e nos hematócritos nos camundongos sobreviventes nos dias 18 e 22, em comparação com os grupos de controle. Essas diminuições foram evitadas pela administração de composto de TPO pegilado n⁹ 1 no dia

8 (1 hora após o segundo tratamento com carboplatina), sem ou com uma dose adicional de composto de TPO pegilado n⁹ 1 no dia 0, porém a administração de composto de TPO pegilado n⁹ 1 no dia 0 (apenas) não afetou as alterações induzidas por carboplatina nesses parâmetros de eritrócitos.

Todos os camundongos do grupo de controle apresentaram ganho de peso normal entre os dias 7 e 26, enquanto todos os camundongos tratados com apenas carboplatina perderam pequenas quantidades de peso corporal (em média, aproximadamente 4%) durante o mesmo período. Os camundongos de todos os grupos que foram tratados com carboplatina e vários co-tratamentos com composto de TPO pegilado n⁹ 1 mantiveram o peso corporal ou tiveram um ganho de peso normal entre os dias 7 e 26. A análise das medições de peso corporal durante o período de estudo sugere que o tratamento com carboplatina foi fator de contribuição mais importante para as diminuições de peso corporal observadas, e que o co-tratamento com composto de TPO pegilado n⁹ 1 evitou essa perda de peso, porém não foi conduzida uma análise estatística. As diferenças de peso corporal observadas entre o dia 7 (antes da dosagem com carboplatina) e o dia 26 (término do estudo) são apresentadas na figura 8.

Todos os camundongos dos grupos de controle tiveram aparência normal ao longo do período de estudo. Os camundongos tratados com apenas carboplatina começaram a ter aparência e comportamento alterados a partir do dia 12, com freqüentes sinais de curvamento e

Λ aparência descuidada. Muitos dos camundongos recebendo carbopiatina (sem ou com o tratamento por composto de TPO pegilado n^Q 1) assumiram uma posição curvada e uma aparência descuidada durante a segunda metade do período de estudo. O tratamento com o composto de TPO pegilado n^e 1 no dia 8, sem ou com tratamento adicional no dia 0, pareceu atrasar-o-imeie desses sinais, e-e-tratamento nos cfías-Q-o 8 diminuiu também a gravidade e a duração, porém não foi conduzida uma análise detalhada dos efeitos do tratamento sobre as observações sistêmicas.

Exemplo 3

Foi observado o efeito do composto de TPO pegilado n^Q 1 sobre a duração e a gravidade da anemia após regimes de dosagem nos quais o composto de TPO pegilado n^e 1 é administrado em várias vezes após o tratamento com carboplatina. Para este estudo, uma quantidade de composto de TPO pegilado n-1 foi administrada a camundongos uma (1) hora, um (1) dia ou quatro (4) dias após a dose de carboplatina.

Os grupos de camundongos foram tratados com carboplatina ou com veículo (solução salina tamponada com fosfato, PBS) por administração intraperitoneal nos dias 0 e -1, conforme delineado abaixo. A dose ótima de carboplatina usada para induzir trombocitopenia na linhagem de camun20 dongos BALB/c foi previamente determinada como sendo uma dose total fracionada de 120 mg/kg, administrada sob a forma de duas injeções diárias consecutivas (isto é, 2 x 60 mg/kg). Uma hora (dia 0), um dia (dia 1) ou quatro dias (dia 4) após a segunda dose de carboplatina, os grupos de camundongos foram tratados com composto de TPO pegilado n^Q 1 (300 pg/kg) ou com veículo (solução salina estéril, SS, isenta de conservantes, a 0,9% de cloreto de sódio) por meio de injeção IV (bolo), conforme delineado na Tabela 3. A dose foi administrada com base no peso (100 pL/10 g de peso corporal).

Tabela 3

Grupos de tratamento:
Gp	N	Pré-tratamento [2x60 mg/kg], (ip), dias -1 e 0	Artigo para teste	Dose (iv)	Coleta de sangue 5 camundongos eutanizados nos dias:
1	10	Veículo (PBS)	Veículo (SS)	Simulação	6e 12
2	20	Carboplatina	Veículo (SS)	Simulação	6, 8, 10 e 12
3	20	Carboplatina	Composto de TPO pegilado n° 1	300 pg/kg, dia 0	6,8, 10e12
4	20	Carboplatina	Composto de TPO pegilado n° 1	300 pg/kg, dia 1	6, 8, 10 e 12
5	20	Carboplatina	Composto de TPO pegilado n° 1	300 pg/kg, dia 4	6, 8, 10e12
Gp ⁼	Grupo; Eut = Eutanizados

Nos dias 6, 8, 10 e 12, cinco camundongos de cada grupo de teste foram pesados e, então, eutanizados por meio de asfixia por CO2 e ensangüinação via perfuração cardíaca. As amostras de sangue foram transferidas para microrecipientes separados contendo EDTA (tampa lilás) para avaliação hematológica. Os grupos de camundongos para controle (5) foram processados nos dias 6 e 12. Os resultados são mostrados nas figuras 9 a 12. Os dados são apresentados graficamente sob a forma de média do grupo + desvio padrão.

O tratamento de camundongos com apenas carboplatina causou diminuições dramáticas (aproximadamente 47%) nos teores de hemoglobina, na contagem de RBC e nos hematócritos dos camundongos sobreviventes (2 camundongos) em tomo do dia 12, em comparação com os grupos de controle. Essas diminuições foram evitadas pela administração de composto de TPO pegilado η^β 1 no dia 0 (1 hora após 0 tratamento com carboplatina) e no dia 1, porém a administração de composto de TPO pegilado n² 1 no dia 4 não afetou as alterações induzidas por carboplatina nesses parâmetros de eritrócitos.

Os camundongos de todos os grupos tratados apenas com carboplatina ou carboplatina mais as várias doses de composto de TPO pegilado -n² 4 -apresentafam -perda de peso ooeefíae Τθ-e 42-, em relação a medições de peso corporal coletadas no dia -1. A análise das medições de peso corporal durante o período de estudo sugere que a carboplatina foi o principal fator contribuinte para as diminuições de peso corporal observadas. A administração do composto de TPO pegilado n² 1 nos dias 0, 1 ou 4 não pareceu afetar a perda de peso associada ao tratamento com carboplatina, porém não foi conduzida nenhuma análise estatística. As diminuições de peso corporal observadas entre os dias -1 e 10 são apresentadas na figura 11.

Todos os camundongos dos grupos de controle tiveram aparência normal ao longo do período de estudo. Os camundongos tratados com apenas carboplatina começaram a ter aparência e comportamento alterados a partir do dia 2, com frequentes sinais de curvamento e aparência flácida. Muitos dos camundongos recebendo carboplatina (sem ou com o tratamento por composto de TPO pegilado n² 1) assumiram uma posição curvada e uma aparência flácida durante a segunda metade do período de estudo. Alguns desses camundongos tinham, também, áreas anogenitais sujas. Outros sinais infreqüentes incluíram aparência emaciada, pálpebras caídas e passo anormal. O tratamento com composto de TPO pegilado n²1 não pareceu ter um efeito dramático sobre o início, a freqüência ou a gravidade desses sinais, porém não foi conduzida nenhuma análise detalhada.

A prevenção da anemia induzida por carboplatina é observada quando os animais recebem doses do composto de TPO pegilado n² 1 dentro de 24 horas após a quimioterapia. Esses dados sugerem que o composto de TPO pegilado n^e 1 tem efeitos mieloprotetores que não se limitam à linhagem de megacariócitos.

Exemplo 4

Foi observado que o composto de TPO pegilado n⁹ 1 tem a capacidade de funcionar como um fator de sobrevivência para linhagens de megacariócitos e eritrócitos em camundongos tratados com carboplatina, conforme determinado pelas alterações nos parâmetros hematológicos. Em estudos anteriores, descobriu-se que doses de~ composto -de-TPQ pegilado-n² 4 tão baixas quanto 300 pg/kg evitam a anemia induzida por carboplatina. Neste estudo, o efeito de doses mais baixas do composto de TPO pegilado n⁹1 (isto é, 30, 100 e 300 pg/kg) sobre a sobrevivência das linhagens de eritrócitos foi examinada para caracterizar a resposta à dosagem para esse efeito.

Os grupos de camundongos foram tratados com carboplatina ou com veículo (solução salina tamponada com fosfato, PBS) por administração intraperitoneal nos dias 0 e -1, conforme delineado abaixo. A dose ótima de carboplatina usada para induzir trombocitopenia na linhagem de camundongo BALB/c foi previamente determinada como sendo uma dose total fracionada de 120 mg/kg, administrada sob a forma de duas injeções diárias consecutivas (isto é, 2 x 60 mg/kg). Aproximadamente uma hora depois da segunda dose de carboplatina, os grupos de camundongos foram tratados com composto de TPO pegilado n⁹ 1 ou veículo (solução salina estéril, SS, isenta de conservantes e com 0,9% de cloreto de sódio) em injeção IV (bolo) conforme delineado na Tabela 4. A dose foi administrada com base no peso (100 μLV10 g de peso corporal).

Tabela 4

Grupos tí	le tratamento:
Gp	N	Pré-tratamento (ip), Dias -1 e 0	Artigo para teste	Dose (iv) DiaO	Coleta de sangue
1	10	Veículo (PBS)	Veículo (SS)	Simulação	5 camundongos eutani- zados nos dias 6 e 12
2	15	Carboplatina	Veículo (SS)	Simulação	5 camundongos eutani- zados nos dias 6, 8 e 12
3	15	Carboplatina	Composto de TPO pegilado n° 1	30 pg/kg	5 camundongos eutani- zados nos dias 6, 8 e 12

Gru	pos d	e tratamento:
Gp	N	Pré-tratamento (ip), Dias -1 e 0	Artigo para teste	Dose (iv) Dia 0	Coleta de sangue
4	15	Carboplatina	Composto de TPO pegilado n° 1	100 pg/kg	5 camundongos eutanizados nos dias 6, 8 e 12
	Λ5--		Cui upusiu de TPO’ pegilado n° 1	-300-pW'	5 camundongos èutãní- zados nos dias 6, 8 e 12
Gp = Grupo; Eut = Eutanizados

Nos dias 6, 8 e 12, cinco camundongos de cada grupo de teste foram pesados e, então, eutanizados por meio de asfixia por CO₂ e ensangüinação via perfuração cardíaca. As amostras de sangue foram transferidas para microrecipientes separados contendo EDTA (tampa lilás) para avaliação hematológica. Os grupos de camundongos para controle (5) foram processados nos dias 6 e 12. Os resultados são mostrados nas figuras 13 e 14.

O tratamento dos camundongos com apenas carboplatina causou uma diminuição maior que 25% nos teores de hemoglobina dos camundongos em tomo do dia 12. Essa diminuição foi totalmente inibida pelo tratamento com todas as doses do composto de TPO pegilado n^s 1. O composto de TPO pegilado n^s 1 inibiu eficazmente também as diminuições na contagem de RBC e no hematócrito, que foram induzidas pelo tratamento com carboplatina.

Essencialmente todos os camundongos de todos os grupos tratados com apenas carboplatina ou com carboplatina mais as várias doses de composto de TPO pegilado n^e 1 apresentaram perda de peso nos dias 6, 8 e 12, em relação às medições de peso corporal feitas no dia -1. A análise das medições de peso corporal ao longo do período de estudo de 13 dias indica que o tratamento com apenas carboplatina causou a diminuição de peso corporal observada. O composto de TPO pegilado n^a 1 não pareceu afetar a perda ou a recuperação de peso, neste estudo.

Os camundongos tratados com apenas carboplatina começaram a ter aparência e comportamento alterados em torno do dia 4. Alguns dos camundongos assumiram uma posição curvada e uma aparência descuidada. Muitos dos camundongos tiveram, também, fezes moles. Poucos animais tinham aparência flácida e poucos apresentaram sangue nas fezes.

O tratamento com composto de TPO pegilado n⁹ 1 diminuiu o aparecimento, a freqüência e a gravidade desses sinais de uma forma que pareceu ser dosfí-dependpntp _. ......

O composto de TPO pegilado n⁹ 1 manteve a sobrevivência das linhagens de eritrócitos em camundongos tratados com carboplatina, conforme determinado pela contagem de plaquetas no sangue periférico e por outros parâmetros hematológicos. Descobriu-se que a administração de todas as doses de composto de TPO pegilado n⁹ 1 evitou completamente a anemia induzida por carboplatina no dia 12. Esses resultados sugerem um diferencial de sensibilidade/capacidade de resposta das linhagens de megacariócitos e eritrócitos aos efeitos de “manutenção da sobrevivência” do composto de TPO pegilado n⁹1.

Exemplo 5

Os grupos de camundongos foram tratados com dois ciclos do agente quimioterápico (carboplatina) com dez dias de intervalo, sendo que cada ciclo consistiu em dois dias consecutivos de carboplatina (isto é, 70 mg/kg/dia administrados nos dias -1 e 0, e nos dias 10 e 11), conforme delineado abaixo. A dose de carboplatina usada nesses estudos de sobrevivência excedeu a dose máxima tolerada para camundongos (isto é, 120 mg/kg, administrados em 2 dias consecutivos, 60 mg/kg/dia ). Uma hora após a segunda dose de carboplatina em cada ciclo (isto é, dias 0 e 11), os camundongos foram tratados com composto de TPO pegilado n^s 1 (100 pg/kg) ou veículo (solução salina estéril, SS, isenta de conservantes, a 0,9% de cloreto de sódio) por meio de injeção IV (bolo), conforme delineado abaixo. A dose foi administrada com base no peso (100 pL/10 g de peso corporal).

Delineamento do estudo:
Gp	N	Pré-tratamento (ip), dias -1 e 0 Dias 10 e 11	Artigo para teste 100 pg/kg (IV)	Dose (iv) ~1 h após a 2~ dose de CBPL para cada ciclo	Coteta de sangue / análise 5 camundongos eutanizados nos dias:
-J- -	25		Veiculo ΐ oo)	Simulação; Otãsüe ~ 11	~7;τσ;τΒ72Τβ25' ~~
2	25	Carboplatina (70 mg/kg)	Veículo (*SS)	Simulação, dias 0 e 11	7,10, 18, 21 e 28
3	25	Carboplatina (70 mg/kg)	Composto de TPO pegilado n° 1	100 ug/kg, dias 0 e 11	7, 10, 18, 21 e 28

Nos dias 7, 10, 18, 21 e 28, cinco camundongos de cada grupo de teste (25 camundongos/grupo) foram pesados e, então, eutanizados por meio de asfixia por CO₂ e ensangüinação via perfuração cardíaca. As amostras de sangue foram transferidas para microrecipientes separados contendo EDTA (tampa lilás) para avaliação hematológica. Grupos de camundongos para controle tratados apenas com os veículos foram processados da mesma forma. Os resultados são mostrados na figura 15. O tratamento de camundongos com dois ciclos de carboplatina causou o desenvolvimento de uma anemia moderada que foi observada entre os dias

10 e 21, enquanto os camundongos tratados com 2 ciclos de carboplatina e composto de TPO pegilado n^e 1 mantiveram, ao longo desse período, valores de hematócrito similares aos do grupo de controle. É interessante notar que, dos camundongos não usados para avaliação hematológica, 7 camundongos do grupo tratado com apenas carboplatina morreram entre os dias 4 e 18, enquanto que apenas 1 camundongo do grupo que recebeu terapia de combinação morreu dentro do mesmo período, com a maioria das mortes ocorrendo no período de anemia. Estes resultados sugerem que a anemia induzida por carboplatina pode contribuir para a morte de camundongos que recebem altas doses de quimioterapia, e que o composto de TPO pegilado n^s 1 pode causar o aumento da sobrevivência dos camundongos, pois evita o desenvolvimento da anemia.

Exemplo 6

Para estudos mecanísticos, os grupos de camundongos foram tratados com veículo ou com quantidades crescentes de carboplatina (isto é, 60, 70 ou 80 mg/kg) durante 2 dias consecutivos (dia -1 e dia 0).

Aproximadamente uma hora depois da segunda dose de carboplatina, os fflxipos de.camnndnngos fnram-tratados com composto de TPO pegilado-n²1 (100 pg/kg) ou veículo (solução salina estéril, SS, isenta de conservantes e com 0,9% de cloreto de sódio) em injeção IV (bolo) conforme delineado na Tabela 5.

Tabela 5

Delineamento do estudo:
Gp	N	CBPL dosada Dias -1 e 0 (ip)	Tratamento (iv), dia1, 1 h pós-CBPL	Coleta de sangue/ análise 3 camundongos eutanizados no dia;
1	3	Veículo (PBS)	Veículo (*SS)	15
2	3	Carboplatina (60 mg/kg)	Veículo (*SS)	15
3	3	Carboplatina (70 mg/kg)	Veículo (*SS)	15
4	3	Carboplatina (80 mg/kg)	Veículo (*SS)	15
5	3	Carboplatina (60 mg/kg)	Composto de TPO pegilado n° 1 (100 pg/kg)	15
6	3	Carboplatina (70 mg/kg)	Composto de TPO pegilado n° 1 (100 pg/kg)	15
7	3	Carboplatina (80 mg/kg)	Composto de TPO pegilado n° 1 (100 pg/kg)	15

No dia 15, os camundongos de todos os grupos de tratamento foram eutanizados por meio de asfixia por CO₂ e ensangüinação via perfuração cardíaca. As amostras de sangue foram transferidas para microrecipientes separados contendo EDTA (tampa lilás) para avaliação hematológica. Além disso, vários órgãos (inclusive o cérebro) dos camundongos de controle e dos camundongos tratados com 2 x 70 mg/kg de carboplatina, sem e com o co-tratamento por composto de TPO pegilado n^e

1, foram isolados e processados para exame histológico. Seções desses tecidos foram processadas imunoistoquimicamente para detecção de fibrinogênio/fibrina.

O tratamento dos camundongos com quantidades crescentes de 5 apenas carboplatina causou, no dia 15, uma queda dramática no número de plaqiiptaç rins ramundongnq qitp mcnhftram ? x 70 mg/kg, o umn diminuição dose-dependente no hematócrito (HCT) nos camundongos tratados com 60 e 70 mg/kg de carboplatina (sozinha). Essas diminuições nas contagens de plaquetas e de RBC, induzidas pela carboplatina, foram totalmente inibidas pelo tratamento com o composto de TPO pegilado n⁹1. Deve-se notar que todos os camundongos tratados com 2 x 80 mg/kg de carboplatina (sozinha) foram encontrados mortos ou foram eutanizados (agonizante) antes do término do estudo. É interessante notar que todos os camundongos tratados com 2 x 80 mg/kg de carboplatina e composto de TPO pegilado n^s 1 sobreviveram até a data marcada para o término do estudo, e não exibiam trombocitopenia ou anemia no dia 15.

A avaliação histológica dos cérebros dos camundongos de controle mostraram pequenos vasos sanguíneos que tinham aparência normal. Muitos dos vasos continham eritrócitos e exibiam um manchamento leve para fíbrinogênio. O manchamento leve, intravascular, para fibrinogênio/fibrina, é esperado nesses camundongos de controle, já que o fíbrinogênio é um componente normal do plasma. Seções de cérebro provenientes de camundongos tratados com apenas carboplatina (2 x 70 mg/kg) continham pequenos vasos sangüíneos que estavam totalmente oclusos por material com manchamento intensamente positivo para fibrinogênio/fibrina. Esses microtrombos foram frequentemente observados em seções de tecido provenientes de todos os camundongos desse grupo de dosagem. Os pequenos vasos nas seções de cérebro provenientes de camundongos tratados com carboplatina e composto de TPO pegilado n^Q 1 tinham aparência normal ou exibiam um manchamento para fíbrinogênio/ fibrina que era ligeiramente mais escuro que o do grupo de controle. Um único evento microtrombótico foi notado no grupo de dosagem inteiro.

Os resultados deste estudo indicam que eventos microtrombóticos são induzidos por quimioterapia e, como se acredita que os microtrombos contribuem para a íise mecânica dos RBCs, é provável que esses eventos vasculares contribuam para a ocorrência de anemia induzida por quimioterapia. Além disso, a capacidade do composto de TPO pegilado a^glpara evitar ei desenvolvimento dessos ovontos trombóticos-pode ser-ttm componente do mecanismo pelo qual esse agente impede o desenvolvimento da anemia induzida por quimioterapia. Por fim, os eventos microtrombóticos podem ter contribuído, ainda, para a mortalidade dos animais que receberam altas doses de quimioterapia. Portanto, a capacidade do composto de TPO pegilado n⁹ 1 de evitar o desenvolvimento desses eventos trombóticos pode ser responsável pela maior sobrevivência dos animais que receberam altas doses de quimioterapia e o agente.

As figuras 18A e 18B mostram o efeito do tratamento com o composto de TPO pegilado n⁹ 1 sobre as plaquetas e o hematócrito de camundongos tratados com carboplatina (conforme demonstrado no Exemplo 6).

A figura 19 mostra que a administração do composto de TPO pegilado n⁹ 1 reduz a deposição de fibrinogênio e de coágulos sangüíneos em seções do cérebro de camundongos tratados com carboplatina, conforme demonstrado no Exemplo 6.

Mecanismo de Ação Proposto

A figura 16 mostra o que se acredita ser o mecanismo de ação dos efeitos antianêmicos do composto de TPO pegilado n⁹ 1. Como pode ser visto na figura 16, a quimioterapia induz a danos no endotélio de pequenos vasos sangüíneos e suprime a hematopoiese. Na ausência do composto de TPO pegilado n⁹ 1, uma trombocitopenia rapidamente se desenvolve, já que as plaquetas em circulação se tornam ativadas pelo endotélio alterado e se depositam sobre as paredes dos pequenos vasos sangüíneos. As plaquetas alteradas, produzidas pela medula comprometida, contribuem para esse processo. As plaquetas ativadas induzem a deposição de fibrina dentro dos vasos danificados, e se desenvolvem trombos microangiopáticos. Esses ç·· c

trombos microangiopáticos mediam a destruição mecânica de eritrócitos, contribuindo para o desenvolvimento da anemia induzida por quimioterapia.

O co-tratamento com composto de TPO pegilado n^e 1 inibe a ocorrência de danos induzidos pela quimioterapia ao endotélio dos vasos sanguíneos, e/ou promove as qualidades antitrombóticas e pró-fibrinolíticas das plaquetas em integridade estrutural dos eritrócitos é mantida. O efeito do composto de TPO pegilado n^e 1 sobre os precursores de megacariócito presentes na medula promove a produção de plaquetas normais. A hemostase é mantida e a anemia é evitada.

A figura 17 mostra o que se acredita serem alguns dos efeitos de linhagem do composto de TPO pegilado n^s 1 sobre as células hematopoiéticas.

Exemplo 7

Teste de ligação

A atividade dos compostos de peptídeo pode ser determinada por técnicas de teste de unidades de luminescência relativa convencionais. O teste emprega, por exemplo, células de murina manipuladas para expressar estavelmente o receptor de TPO humana e um constructo de registro de luciferase acionado pelo promotor de fos. O teste pode ser feito da seguinte forma: Células Baf/3 hTPOr fos/lux privadas de soro, expressando o receptor de TPO humana, c-mpl (hTPOr) e um constructo de registro de luciferase são expostos a concentrações crescentes de rhTPO ou de composto de peptídeo durante aproximadamente 18 horas. As células são, então, incubadas em um meio contendo um substrato de luciferase, e a luminescência das células é medida com um luminômetro.

Conforme mostrado na figura 20, as células Baf/3 ativadas pelo composto de TPO pegilado n- 1 expressam a TPO-R humana recombinantemente e de forma dose-dependente. Conforme mostrado na figura 21, foi observada uma ativação mais forte da TPO-R quando as células foram estimuladas com o composto de TPO pegilado n^e 1, do que com a TPO na mesma concentração. O EC₅o do composto de TPO pegilado n^e 1 foi de cerca de 5 pM.

Embora apenas as modalidades preferenciais da invenção sejam especificamente descritas acima, deve-se compreender que são possíveis modificações e variações da invenção, sem se afastar do espírito e do escopo pretendido da invenção.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Composição farmacêutica para aumentar a produção de eritrócitos, caracterizada pelo fato de que compreende um composto de peptídeo TPO em mistura com um veículo farmaceuticamente aceitável, o dito

5 composto de peptídeo TPO é definido pela seguinte estrutura:

I E G P T L R Q (2-Nal) L A A R (Sar) (SEQ. ID NO: 5).
2. Composição farmacêutica para tratamento de anemia, caracterizada pelo fato de que compreende um composto de peptídeo TPO em mistura com um veículo farmaceuticamente aceitável, o dito composto de

10 peptídeo TPO é definido pela seguinte estrutura:

I E G P T L R Q (2-Nal) L A A R (Sar) (SEQ ID NO: 5).
3. Composição farmacêutica para aumentar a produção de eritrócitos, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o dito composto de peptídeo TPO é definido pela seguinte estrutura:

MPEG

H

O'

HN' ~H nh₂

MPEG.,

O OH

-lí^N

NH

20 em que MPEG é metoxipoli(etileno glicol) tendo um peso molecular de aproximadamente 20.000 Dáltons.
4. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que o dito composto de peptídeo TPO é determinado pela seguinte estrutura:

Petição 870180011047, de 09/02/2018, pág. 13/21

O'

MPEG.

O^ OH em que MPEG é metoxipoli(etileno glicol) tendo um peso molecular de aproximadamente 20.000 Dáltons.
5. Composição farmacêutica para aumentar a produção de eritrócitos, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o dito composto de peptídeo TPO é definido pela seguinte estrutura:

I E G P T L R Q (2-Nal) L A A R (Sar) \

K(NH2) /

I E G P T L R Q (2-Nal) L A A R (Sar)
6. Composição farmacêutica para tratamento de anemia, de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que o dito composto de peptídeo TPO é definido pela seguinte estrutura:

I E G P T L R Q (2-Nal) L A A R (Sar) \

K(NH2) /

I E G P T L R Q (2-Nal) L A A R (Sar)

Petição 870180011047, de 09/02/2018, pág. 14/21 ^_μ

O

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