BRPI0621562A2

BRPI0621562A2 - mÉtodo para rÁpido isolamento de rna e um kit deste

Info

Publication number: BRPI0621562A2
Application number: BRPI0621562-9A
Authority: BR
Inventors: Ghwana; Sanjay; Singh; Kashmir; Raizada; Jyoti; Rani; Arti; Bhardwaj; Pradeep; Kumar
Original assignee: Council Of Scientific & Industrial Research
Priority date: 2006-03-30
Filing date: 2006-07-31
Publication date: 2013-01-08
Also published as: EP2004822A1; US20110184162A1; AU2006341291B2; AU2006341291A1; CN101437941A; WO2007113614A1; CN101437941B; EP2004822B1

Abstract

MÉTODO PARA RAPIDO ISOLAMENTO DE RNA E UM KIT DESTE. A presente invenção se relaciona à um método para rápido isolamento de RNA. Mais particularmente, ela se refere à um método para isolamento de RNA usando sistema de duas soluções. A presente invenção também se refere à um kit de isolamento de RNA.

Description

"MÉTODO PARA RÁPIDO ISOLAMENTO DE RNA E UM KIT DESTE"

Campo da invenção

A presente invenção relaciona-se a um método para rápido isolamento do RNA. Mais particularmente, relaciona-se à um método para o isolamento do RNA usando o sistema de duas soluções. A presente invenção igualmente relaciona-se a um kit de isolamento do RNA. Fundamentos e arte prévia da invenção

Uma pesquisa extensiva foi empreendida no campo da biologia molecular para facilitar a explicação de mecanismos de base da expressão genética, transdução de sinal, regulamento genético e análise transcriptômica. Isto envolve uma gama inteira de técnicas como reação em cadeia por polimerase via transcriptase reversa (a seguir denominada por RT-PCR), hibridização, construção de bibliotecas de cDNA e tradução in vitro. O RNA substancialmente puro e não degradado é um requisito fundamental para todas as técnicas acima mencionadas. Diversas composições e procedimentos para o isolamento do RNA foram

descritos conforme abaixo mencionado:

Protocolos Atuais em Biologia Molecular (Ausubel, F.M., Brent, R., Kingston1 R.E., Moore, D.D., Seidman, J.G., Smith, J.A. e Struhl, K. Eds, 1994. John Wiley & Sons, Inc. EUA) descreveram um protocolo do isolamento do RNA, que envolve a Iise celular e a remoção da proteína pelo fenol/SDS, seguido pela precipitação seletiva do RNA usando o cloreto de lítio. Em resumo, o tecido é triturado em nitrogênio líquido usando um socador e pilão farmacêutico seguido por transferência ao triturador buffer (Tris 0.18 M, LiCI 0.09 M EDTA 4.5 mM e SDS1%, pH 8.2) contendo fenol saturado com a solução de Tris 0.2 M, LiCI 0.1 M e EDTA 5 mM (pH 8.2) em uma proporção de 3: 1. Após a homogeneização em um polytron, as proteínas são removidas da fase aquosa por diversas re-extrações com fenol e clorofórmio saturados. A fase aquosa assim obtida é precipitada diversas vezes com LiCI 8 M. Por causa das etapas repetidas da precipitação, o procedimento torna-se demorado, cansativo e caro.

Cox, R.A. (em Métodos em Enzimologia 1968, Grosmann, L. e Moldave, Eds.

Vol.12 5 B, pp. 120-129, Academic Press, Orlando, FL), descreveram o método do isolamento do RNA usando hidrocloreto de guanidina. O hidrocloreto de guanidina é um inibidor forte das ribonucleases. Entretanto, o procedimento é demorado. Os sais da guanidina empregados para o isolamento do RNA são extremamente venenosos. Além disso, diversos tecidos de planta são recalcitrantes à extração em sais de guanidina. Tênue ou nenhum RNA é obtido de determinados tecidos pela extração em guanidina [R.C. Bugos, V.L. Chiang, X-H. Zhang, E.R. Campbell, G.K. Podila, W.H. Campbell. Isolamento do RNA dos tecidos de planta recalcitrantes à extração em guanidina, Biotechniques 19 (1995) 734-737], Chirgwin, J.M., Przybyla, A.E., Macdonald, R.J., & Rutter, 1979) Bioquímica

18: 5294-5299) descreveram um método para o isolamento do RNA usando um forte desnaturante tiocianato de guanidina, no qual ambos cátion e anion são agentes caotrópicos poderosos. Neste método, o tecido é homogeneizado em uma solução que contém tiocianato de guanidina (4M), N-Laurilsarcosina de sódio (0.5%), citrato de sódio, pH 7.0 (25mM) e o beta-mercaptoetanol (0.1 Μ). O sobrenadante é acidificado com 1M de ácido acético e o RNA é precipitado com um volume de 0.75 de álcool absoluto a - 20°C. Etapas adicionais envolvem a dissolução do grânulo do RNA obtido após a centrifugação em solução de cloreto de guanidina (7.5M), tamponada com citrato de sódio pH 7 contendo 5mM de ditiotreitol. A re-precipitação é feita em ácido acético e em etanol por 3-4h a - 20°C. Uma outra etapa de dissolução e de re-precipitação é incluída para o isolamento do RNA. A modificação deste procedimento inclui separar o RNA da homogeneização pela ultra- centrifugação com gradiente de cloreto do césio. Este método igualmente usa o sal tóxico da guanidina e é muito demorado.

Wallace, D.M. (em Métodos naO Enzimologia, 152:33 - 41; 1987) descreveu

extrações de RNA dos tecidos biológicos baseadas em fenol. Usando um buffer morno de fenol saturado, a fase aquosa obtida foi re-extraída com álcool clorofórmio- isoamil e buffer de fenol saturado. A re-extração é repetida e o RNA é precipitado com etanol incubado durante a noite. O procedimento consome tempo porque exige procedimentos noturnos de precipitação. Além disso, não há nenhuma proteção ao RNA das RNases na fase aquosa.

Patente 4,843,155 dos E.U.A e Chomczynski, P. e Sacchi, N. (1987) Anal. Biochem. 162:156 - 159 descreveram um procedimento para o isolamento simultâneo do RNA, do DNA e da proteína. Isto é denominado igualmente como o método ácido/guanidina/fenol/clorofórmio (doravante designado por AGPC). Neste procedimento, o tecido é homogeneizado em um solvente que consiste em 4 M de tiocianato de guanidina, 25 mM de citrato de sódio, pH 7; sarkosyl 0.5%, 2- mercaptoetanol 0.1 Μ. A fase da separação é feita pela adição de fenol saturado com água e 0.2 M de acetato de sódio, pH 4.0, e mistura de álcool clorofórmio- isoamil (49:1) pela mistura e pela centrifugação vigorosas. O RNA compartimentaliza-se à fase aquosa visto que o DNA e as proteínas estão presentes na fase orgânica e na interfase. A precipitação é feita pela adição de volume igual de isopropanol, o grânulo resultante do RNA é dissolvido na solução da homogeneização e precipitado com 1 volume de isopropanol em -20°C por 1 hora. A lavagem é feita em etanol a 70% e o grânulo do RNA é dissolvido em SDS 0.5%. Este procedimento exige pelo menos 4 horas para o isolamento do RNA.

O método desenvolvido por Chomczynski1 P. e por Sacchi, N. (1987) Anal. Biochem. 162:156 - incluindo a modificação do método do tiocianato de guanidina de Chirgwin, J.M., Przybyla, A.E., Macdonald1 R.J., & Rutter1 (1979), Bioquímica 18:5294-5299, usando o tiocianato de guanidina/fenol/clorofórmio em um pH ácido é rápido, mas este método de AGPC rende geralmente quantidades muito elevadas da contaminação genômica do DNA.

Siebert, P.D. e Chenchik, A. (1993) Nucl. Acid. Res. 21 (8): 2019-2020 fizeram modificações simples do método AGPC pela adição de uma etapa seletiva da precipitação do RNA. Isto incluiu a adição de um terço do volume de etanol a 95% seguindo a Iise do tiocianato de guanidina. A etapa da precipitação do isopropanol foi reduzida igualmente de 1h para 30 min. A contaminação do DNA foi reduzida significativamente. Mas ainda o método exigiu 3-4h para o isolamento do RNA e não é apropriado para os tecidos resistentes aos sais da guanidina. A Patente 5,945,515, Estados Unidos por Chomczynski, P. (1999) divulgou a

solução para o isolamento simultâneo do RNA, do DNA e das proteínas. A solução consistiu no tiocianato de guanidina em 40-60% de fenol, glicerol como o solubilizador do fenol e um buffer para manter o pH solvente em aproximadamente 4. A mistura é uma mistura homogênea (monofásica). A fase de separação é efetuada pela adição de clorofórmio em 10% que resulta na divisão do RNA na fase aquosa. As proteínas e o DNA são concentrados na fase orgânica ou na interfase. A precipitação do RNA é realizada pela adição de volume igual de isopropanol à fase aquosa. O grânulo do RNA é obtido pela centrifugação que é lavado com etanol a 70% e seco. A presença da concentração muito elevada (2-5M) de sais da guanidina torna a solução extremamente perigosa à saúde. Além disso, os tecidos recalcitrantes aos sais da guanidina não rendem nenhum RNA.

A Patente 5,777,099 dos E.U.A por Mehra, M. (1998) descreve um método para a separação do RNA de amostras líquidas de origem biológica, pelo contato com uma solução bifásica onde a fase superior é fenol e a fase inferior é a fase aquosa que contem o sal de guanidina, um buffer e uréia. A separação da fase aquosa é efetuada pela adição de solvente insolúvel em água, tal como o clorofórmio. O RNA é recuperado da fase aquosa resultante. A presença de sais de guanidina torna a solução extremamente perigosa à saúde. Além disso, os tecidos recalcitrantes aos sais da guanidina não rendem nenhum RNA. Pat. E.U.A n°. 5,010,183, por Macfarlane, D.E. (1991) descreve a capacidade

catiônica dos surfactantes à Iise celular e da precipitação simultânea do RNA e do DNA da solução. Este método difere fundamentalmente daqueles descritos acima, pois que na sua primeira etapa rende o RNA insolúvel, visto que nos métodos acima descritos a primeira etapa é solubilizar o RNA. Neste método, uma solução de 2% do surfactante de cloreto de benzildimetil-n-hexadecilamônio junto com 40% de uréia e outros aditivos são adicionados a uma suspensão celular e a mistura é centrifugada. O grânulo é re-suspenso em etanol, do qual o RNA e o DNA são precipitados pela adição de um sal. Nas tentativas de aplicar este método ao sangue, o inventor ele mesmo achou que o uso do último surfactante e de outros surfactantes disponíveis no mercado resultam numa precipitação ineficaz do RNA e à Iise incompleta das células sangüíneas.

A patente n°. 5,300,635 dos E.U.A por Macfarlane, D.E. (1994) divulga um método novo para isolar os ácidos nucléicos das amostras biológicas, mais particularmente o sangue, usando-se surfactantes selecionados de amina quaternária. A amina quaternária selecionada é produzida com a reação de um hidróxido quaternário de amina e de um ácido do grupo fosfórico, sulfúrico, fórmico, acético, propiônico, oxálico, malônico, succínico e cítrico. A amina quaternária é um aciltrimetil amônio ou um acilbenzildimetilamônio, onde o grupo acil contém 12, 14, 16 ou 18 carbonos. Este método emprega a solução de 4 M de isotiocianato de guanidina para a dissociação de ácidos nucléicos do complexo quaternário da amina do ácido nucléico que é completamente perigoso. Além disso, o método é em grande parte apropriado para o isolamento do RNA do sangue e do tecido animal, visto que nenhuma experiência foi conduzida no tecido de planta.

Feramisco, J.R., Helfman, D.M., Smart, J.E., Burridge, K., e Thomas, G.P. (em Clonagem Molecular (Maniatis, T., Fritsch, E.F., e Sambrook, J., Eds. (1982), PP. 194- 195, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY) relatam um outro procedimento de isolamento do RNA em amostras contendo RNA homogeneizado em uma solução de 4 M de tiocianato de guanidina, sódio Iauril sarcosina a 20%, e 2-mercaptoetanol. Seguindo a homogeneização, um volume igual de fenol aquecido (60°C) e acetato do sódio pH 5.2 são adicionados à homogeneização. Em seguida, uma quantidade igual de clorofórmio é adicionada, e a mistura é refrigerada e centrifugada. A fase aquosa é decantada e re-extraída diversas vezes com uma solução de fenol/clorofórmio a fim de maximizar o rendimento. O procedimento exige um técnico hábil e leva de quatro à cinco horas para terminar e igualmente emprega o tiocianato de guanidina que é completamente perigoso.

Patente Estados Unidos n°. 20040019196 por Bair, R J Jr., Heath, E M., Meehan, H, Paulsen, K E, Wages, J M. Jr (2004) descrevem um método para o isolamento do RNA do sangue, células mamárias, tecido de planta, bactérias e fungos. Inicialmente, 200 μ1_ de solução de liga/lise (LiCI 4, Triton X-100 5% , DGME 5% (dietilenoglicolmonoetileter), 10 mM EDTA, 10 mM de TECP (Tris( carboxietil) fosfina), tungstato de sódio 1% em 100 mM de TRIZMA no pH 8.8) foram adicionados para cada 30 mg, de amostra de tecido em um tubo. O tecido foi homogeneizado em um roto-estator em velocidade baixa e depois a velocidade foi aumentada por um minuto adicional para completar a homogeneização. Após a homogeneização, o 200 μ!_ de Iisado homogeneizado foi adicionado a um sistema de purificação (Gentra). Dependendo do tecido e da extensão da homogeneização, a purificação pegou partículas ínfimas enquanto permitiu que a maior parte do volume pertinente de Iise contendo o RNA fosse lavado através do filtro. Após a centrifugação na purificação, o Iisado limpo no fundo do tubo foi centrifugado momentaneamente. Então, o volume inteiro do Iisado limpo (aproximadamente 200 μΙ_) foi introduzido com pipeta na coluna da purificação que continha uma membrana de fibra de vidro de borosilicato (membrana de fibra de vidro de Whatman D) dentro de uma cesta e colocado dentro de um tubo de microcentrífuga de 2 ml. O tubo microcentrífuga foi girado então em velocidade máxima em uma microcentrífuga por 1 minuto. O tubo microcentrífuga foi virado em 180 graus na microcentrifugadora e centrifugado por 2 minutos adicionais. Após a centrifugação do Iisado e subseqüente ligação do RNA à superfície da membrana do borosilicato, 200 pL da Solução I de Lavagem (LiCI 5 M e etanol 55%) foi adicionada ao material da coluna e girado em velocidade máxima em uma microcentrífuga por 1 minuto. A cesta contendo a membrana foi então transferida para um tubo novo microcentrífuga e 200 μ da Solução Il de Lavagem (5 mM EDTA, etanol 70% em 100 mM de Tris-HCI no pH 7.6) foi adicionada ao material da coluna e girado em velocidade máxima em uma microcentrífuga por 1 minuto. A adição de Solução Il de Lavagem e os passos da centrifugação foram repetidos uma vez. Para eluir o RNA da base sólida, a cesta contendo a membrana foi transferida a um tubo novo microcentrífuga e 50 pL de água DEPC-tratada foi adicionado ao material da coluna e girado em velocidade máxima por 1 minuto. A patente não fornece nenhuma experiência /data do isolamento do RNA dos tecidos de planta que são geralmente muito difíceis devido à presença de polissacárideos e de outro material de contaminação. O uso do cloreto de lítio, e de outros acessórios neste método, são muito caros.

Patente Estados Unidos n°. 5,973,137 por Heath, E M. (1999) descreve um método para o isolamento do RNA de sangue humano, tecidos de animais e plantas, cultura de células, fluidos corporais, fermento e bactérias por inteiro. O inventor usou de um "Reagente de Lise Celular" que inclui um detergente aniônico (sais, por exemplo, sódio, potássio, e sais do lítio, dodecil sulfato assim como o N-Iauril sarcosina; 1.8-2.2% peso/volume) dissolvido na água tamponada com citrato de sódio e ácido cítrico em uma concentração de 66-70 mM e 130-134 rnM, respectivamente. Além do detergente aniônico e do buffer, o reagente inclui um agente quelante tal como o etilenodiaminatetraacetato (EDTA) como um reagente preferido em uma quantidade eficaz para reduzir a atividade do DNase. O segundo reagente, referido aqui como um "Reagente de Precipitação com Proteína-DNA", inclui um sal do sódio ou do potássio tal como o cloreto de sódio, o acetato do sódio, o cloreto de potássio e o acetato de potássio em uma concentração relativamente elevada de sal (3.8-4.2 M) dissolvido em água. O inventor usou o detergente aniônico tal como o dodecil sulfato de sódio como o inibidor das RNases. A RNases é o principal problema nos tecidos, particularmente em tecidos velhos e estressados. Os detergentes aniônicos são inibidores suaves de RNases (Wallace, D.M., em Métodos na Enzimologia, 152:33 - 41; 1987; refira-se à 7a. linha da parte superior na página 37) e aqui não seria apropriado para os tecidos com RNases elevada. Em segundo lugar, uma concentração muito elevada de sal (3.8 a 4.2 M) usada no método causaria a agregação não específica do RNA conduzindo à perda de, particularmente uma espécie menor do RNA (Wallace, D.M., em Métodos na Enzimologia, 152:33 - 41; 1987; refira-se ao último parágrafo do final da página 36).

Os inconvenientes na patente anterior são: Os métodos usam sais do guanidina (hidrocloreto de guanidina e tiocianato de

guanidina) como um componente principal. O hidrocloreto de guanidina é extremamente perigoso e avaliado como prejudicial pelo CHIP (Informações Químicas sobre Danos e Embalagem do Reino Unido) e tóxico pelo HCS (Padrões de Comnicação de Dano dos E.U.A.). Proporção Oral LD50 = 475 mg/kg. Os tecidos recalcitrantes aos sais da guanidina não rendem RNA ou o

rendimento é demasiado pobre para permitir qualquer uso adicional.

Os reagentes disponíveis no mercado são muito caros.

Os procedimentos baseados em hidrocloreto não guanídico são muito longos.

As soluções/protocolos que não envolvem o uso de sais de guanidina não são apropriados para tecidos com RNases elevadas e igualmente não conduziriam à perda da espécie do RNA devido à concentração elevada de sal usada para inibir a atividade da RNase.

Alguns dos métodos usam o cloreto de césio para o isolamento do RNA na ultracentrifuga, que é um instrumento muito caro. Também, pessoas capazes são necessárias para operar a ultracentrifuga, tomando todas as precauções de segurança, assim, o procedimento torna-se muito caro e demorado. Objetivos da invenção

O objetivo principal da presente invenção é fornecer um método para o isolamento rápido do RNA. Um outro objetivo da presente invenção é fornecer um método para o isolamento do RNA usando o sistema de duas soluções.

Além disso, um outro objetivo da presente invenção é fornecer um custo - eficaz, menos perigoso, no sistema de duas soluções para o isolamento rápido do RNA.

Contudo um outro objetivo da presente invenção é fornecer um kit de

isolamento do RNA de duas soluções apropriado para as aplicações empregadas em biologia molecular incluindo a síntese de um DNA complementar (cDNA) usando o RNA como um substrato e executar a hibridização , reação da polimerase em cadeia, clonagem de genes, preparação de ensaios e a construção de uma biblioteca de cDNA.

Breve descrição das figuras:

A Figura 1 representa a comparação do RNA total isolado dos tecidos diferentes de várias espécies usando os métodos diferentes de isolamento do RNA, onde P1G1T e R significam, para o presente método, HCI-guanidina, métodos de Trizol e de RNeasy, respectivamente.

A Figura 2 representa o RNA total isolado da folha e da raiz de Arabidopsis thaliana cv.col-0. A representa o RNA isolado da folha e B representa o RNA isolado da raiz.

A Figura 3 representa a isolamento total do RNA da folha de Arabidopsis thaliana cv. col-0 usando quantidades diferentes de solução na fase da separação. A, B, C, e D contêm o 200, 400, 600 e 800 μι. da solução Il respectivamente.

A Figura 4 representa o RNA total isolado Solanum tuberosum, de Capsicum annum,das folhas e raízes de Rheum, e Picrorhiza. A é o RNA do tubérculo Solanum, B é o RNA do fruto do Capsicum, C é o RNA das folhas do Rheum, D é o RNA das folhas de Picrorhiza e E é o RNA das raizes de Picrorhiza. A Figura 5 representa o RNA total isolado do botão de flor vegetativo e da terceira folha do chá. M representa o marcador do RNA; A, o RNA isolado do botão de flor vegetativo; Β, o RNA isolado da terceira folha.

A Figura 6 representa a amplificação baseada do RT-PCR do RNA de Arabidopsis thaliana cv. Col-O1 usando actina primária. M representa o marcador de 100 bp; C representa a reação do controle sem gabarito; A representa a amplificação com o cDNA de Arabidopsis.

A Figura 7 representa a amplificação baseada do RT-PCR do RNA do Rheum usando actina primaria. A Figura 8 representa a amplificação baseada do RT-PCR do RNA de

Arabidopsis thaliana cv. Col-O usando WRKY primário . M representa o marcador de 100 bp. A representa a reação do controle com o gabarito e B mostra uma amplificação de 500 pares de bases.

A Figura 9 representa a amplificação baseada do RT-PCR do RNA do Rheum com os WRKY primários específicos. Onde M é o marcador 100 bp, A é reação do controle sem gabarito e B é produto da amplificação de 700 pares de bases.

A Figura 10 representa a amplificação baseada do RT-PCR do RNA do botão de flor vegetativo e da terceira folha de chá com DFR primários específicos. Onde M é o marcador de 100 pares de bases, A é a amplificação do botão de flor vegetativo e B é a amplificação da terceira folha.

A Figura 11 representa a hibridização com o RNA do botão de flor do chá (A) e da terceira folha (B) usando 950 pares de bases com fragmento DFR como instrumento. Resumo da invenção:

A presente invenção trata de um método de custo efetivo e menos perigoso para o isolamento rápido do RNA usando o sistema de duas soluções. Igualmente fornece um kit de isolamento rápido do RNA. Ele fornece o RNA de uma escala de tecidos que podem ser utilizados para várias aplicações tais como RT-PCR, hibridizações, etc. Descrição detalhada da invenção:

Conformemente, a presente invenção fornece um método para o isolamento rápido do RNA, onde dito método compreende as etapas de:

a) triturar o tecido em nitrogênio líquido para fazê-lo um pó fino;

b) adicionar de 1 a 2 ml da solução I na amostra pulverizada obtida da etapa (a) seguido de homogeneização para fazê-la um pó fino;

c) adicionar de 600 a 800 μΙ da solução Il na amostra pulverizada obtida da etapa (b);

d) adicionar de 150 a 200 μΙ de clorofórmio à solução acima mencionada obtida da etapa (c) seguido de centrifugação e mantida em temperatura ambiente por 10

minutos para separar a camada;

e) transferir a camada superior obtida da etapa (d) para o tubo;

f) adicionar isopropanol na camada acima obtida da etapa (e) na proporção de 5:3 a 5:4 seguido de centrifugação e manter em temperatura ambiente por 10 min.;

g) centrifugar a solução obtida da etapa (f) de 5 a 10 minutos aproximadamente em 4°C para ter o grânulo desejado de RNA;

h) lavar os grânulos resultantes do RNA obtidos da etapa (g) com etanol a 70% seguido pela secagem do ar;

i) dissolver o grânulo lavado obtido da etapa (h) em uma quantidade apropriada de água tratada DEPC [dietilpirocarbonato],

Incorporando à presente invenção o mencionado tecido é selecionado de um grupo que consiste do grupo dos tubérculos de Solanum tuberosum, frutos de Capsicum annum, folhas de Rheum, folhas e raízes de Picrorhiza kurroa, folhas e raízes de Arabidopsis thaliana.

Em uma outra incorporação à presente invenção, a mencionada solução I compreende fenol saturado e pH 6.0-6.8, detergente aniônico, sal de acetato e um quelante onde a proporção do ingrediente individual está na escala de 10: 0.003: 0.02: 1.0 a 10: 0.03: 0.08: 2.0 respectivamente.

Em outra incorporação adicional à presente invenção, o fenol saturado usado é preferivelmente de um pH menor que 7.

Em outra incorporação à presente invenção, o detergente aniônico usado é

selecionado do grupo de um sal dodecil- sulfato ou N-Lauril Sarcosina.

Ainda outra incorporação à presente invenção, o detergente aniônico é usado em uma quantidade de aproximadamente 0.3-1% peso/volume, mais preferencialmente aproximadamente 0.5-0.6% p/v.

Ainda em outra incorporação à presente invenção, o sal do acetato usado é

selecionado do grupo de sódio ou potássio.

Em outra incorporação à presente invenção, o sal do acetato usado está em uma concentração de 0.2-0.8 M.

Em outra incorporação à presente invenção, o agente quelante usado é

selecionado do grupo do dissódio e do dipotássio do ácido etileno diamino tetraacético.

Em outra incorporação à presente invenção, a solução Il compreende dietilpirocarbonato em água deionizada que tem uma condutividade de 17-18.2 mega-ohms.

Ainda em outra incorporação à presente invenção, o dietilpirocarbonato usado está em uma concentração de aproximadamente 0.1% volume/volume.

Ainda em outra incorporação à presente invenção, o RNA isolado é testado para aplicações relacionadas à biologia molecular. Além disso, a presente invenção igualmente fornece um kit de isolamento rápido do RNA que compreende: a) solução I

b) solução II;

c) instruções para usar as soluções.

A presente invenção fornece um custo efetivo, menos perigoso, sistema de duas soluções para o isolamento rápido do RNA que inclui a solução I que compreende o buffer de fenol saturado (pH menor que 7), o SDS (0.1-1%), o EDTA (10-20mM), o acetato do sódio (0.3-0.8M), e a solução Il que compreende DEPC (0.001 -0.1%), água deionizada tratada. O sistema da solução pode ser usado para isolar o RNA de diversos tecidos. O tempo exigido no processo inteiro de isolamento do RNA é menor do que uma hora e fornece o RNA puro e de alta qualidade.

A melhor quantidade da solução Il foi padronizada usando as folhas de Arabidopsis thaliana (um modelo de sistema de planta em biologia). O procedimento desenvolvido foi empregado para um padrão de plantas onde os tubérculos incluídos de Solanum tuberosum (rico em carboidratos), frutos de Capsicum annum, folhas de Rheum (recalcitrante à guanidina contendo as soluções), as folhas e as raízes de Picrorhiza kurroa , as folhas e as raízes de Arabidopsis thaliana, e botões de flor vegetativos e a terceira folha de Camellia sinensis (polifenol elevado contendo o tecido). Os dados comparativos do rendimento do RNA isolado usando o protocolo atual e o outro protocolo são dados na tabela 1. Tabela 1 Dados comparativos do rendimento do RNA isolado

Material Planta Produção μΙ_ /10mg tecido Presente invenção Método baseado no hidrocloreto de guanidina (Logemann et al., 1987) Trizol (Fornecido pela Sigma e Invitogen, ambos tendo fenol e sal de guanidina) RNeasy (Qiagene, GmbH) Método sem fenol Rheum 174 Nil Nil 5.5 Folha de Arabidopsis 153 60 133.3 32.64 Raiz de Arabidopsis 46 30 15 30.1 Folha de RNAebia 152 Nil 49.1 17.9 Botões de Caragana (controle) 81 25 65 28.5 Botões de Caragana (crescendo sob a neve em habitat nativo) 107 28 102 22.2 Botões de chá 215 150 Nil 59.5 Folhas de chá 164 30 Nil 30 Folha de Picrorhiza 58 40 15.21 18.04 Raiz de Picrorhiza 93 54 16.96 9.84

São dados os seguintes exemplos para ilustração da presente invenção e não

devem ser interpretados para limitar o escopo da presente invenção. EXEMPLO 1

Preparação da solução para o isolamento do RNA

Para preparar a solução I, o fenol foi saturado com buffer Tris-(hidroximetil)- aminometano num pH de 6.7±0.2. Depois disso, foi adicionado 0.3-1% de dodecil sulfato de sódio, 0.2-0.8M de acetato de sódio e 10-20mM de EDTA A solução Il foi preparada separada onde foi adicionado 0.1% DEPC (concentração final) à água deionizada que tem uma condutividade de 17-18.2 mega-ohms. A solução foi esterilizada após deixada durante a noite. EXEMPLO 2

Para isolar o RNA total, o seguinte protocolo é aplicado:

Isolamento do RNA usando o procedimento de base do hidrocloreto de guanidina: (Singh, O., Kumar, S. e Singh, P. 2003. Um método rápido para isolar o RNA do trigo e de outras sementes ricas em carboidratos. 21:93 a-93f, Relatório de Biologia Molecularde Plantas)

1. Tecido (1 g) foi triturado em nitrogênio líquido em pó fino. O pó foi transferido para um novo pilão contendo 5 ml de buffer GH [8 M de hidrocloreto de guanidina, mM de ácido etileno diamino tetraacético (EDTA), 20 mM e MÊS (ácido 2-[N-

morfolino] etanosulfônico), beta mercaptoetanol, 200 mM; pH 7.0] e foi mais triturado.

2. O resultado homogêneo foi transferido a um tubo Oak Ridge que contem o volume igual de PCI (fenol: clorofórmio: álcool isoamil).

3. As fases foram emulsionadas por turbilhonamemto e separadas por centrifugação em 10.000 RPM para 20 min.( 7°C).

4. A fase aquosa superior foi transferida a um tubo limpo Oak Ridge e extraída com volume igual de Cl.

5. A fase aquosa superior resultante foi transferida a um tubo Corex e o RNA foi precipitado adicionando 0.2 volumes a 1 M de ácido acético e 0.7 volumes de etanol

refrigerado.

6. Os tubos foram mantidos - em 72°C por 3 h.

7. A precipitação foi granulada seguida pela rotação em 10.000 RPM por 10 mim em 4°C. O grânulo foi extremamente lavado usando 5 ml de 3M de acetato de sódio (pH 5.2) seguido pela lavagem final com o etanol refrigerado a 70%.

8. O grânulo foi seco e dissolvido num volume mínimo de ADW DEPC-tratado. Isolamento do RNA usando o Reagente TRIzol:

1. O tecido (100 mg) foi triturado em nitrogênio líquido e reduzido a pó fino.

2. Adicionado 1 ml do reagente TRIzoI e depois adicionalmente reduzido a pó usando o pilão e socador.

3. ncubadas as amostras homogeneizadas por 5 min de 15 a 30°C. Adicionado

0.2.ml de clorofórmio por ml do reagente TRizol. Os tubos foram agitados vigorosamente por 15 segundos e incubados de 15 a 30°C por 2 a 3 min.

4. Amostras centrifugadas em 12.000 X g por 15 min a 4°C.

5. Transferida a fase aquosa a um tubo limpo.

6. O RNA foi precipitado da fase aquosa misturando com álcool isopropil Adicionado 0.5 ml de álcool isopropílico por 1 ml do reagente TRIzoI usado para a homogeneização inicial.

7. Incubadas as amostras de 15 a 30°C por 10 min

8. Centrifugadas as amostras em 12.000 X g por 10 min a 4°C.

9. Removido o sobrenadante. Lavado o grânulo do RNA com etanol 75% e seco. 10. RNA dissolvido em 30-50 μΙ de água livre de RNase. Mini Protocolo RNeasy para a isolamento do RNA de Planta: (QIAGEN):

1. O tecido (100 mg.) foi triturado sob nitrogênio líquido usando pilão e socador e reduzido a pó fino. Transferido o pó do tecido a um tubo de 2 ml. Não permita que a

amostra seja congelada.

2. Adicionado 450 μΙ de buffer RLC (contendo hidrocloreto de guanidina) ao máximo de 100 mg. de pó do tecido. Centrifugado vigorosamente. Assegure-se de que 10 μΙ β-ΜΕ sejam adicionados a 1 ml do buffer RLC antes de usar.

3. Aplicado Iisado à coluna de rotação do aparelho QIAshredder situado em 2 ml no tubo coletor, e centrifugado por 2 min na velocidade máxima. Uma fração do fluxo foi transferida do QIAshredder a um tubo novo sem alterar os restos do grânulo de células no tubo coletor.

4. Adicionado 0.5 volumes de etanol ao Iisado limpo e bem misturado com pipeta.

5. Aplicada amostra, incluindo qualquer precipitação, que puder ter dado forma, na mini coluna do RNeasy num tubo coletor de 2 ml. Centrifugado por 15 seg. em 10.000 RPM.

6. Adicionado 700 μΙ buffer RW na coluna RNeasy, e centrifugado por 15 seg. a 10.000 RPM à lavagem. Rejeitados os fluidos através do tubo coletor. 7. Transferida a coluna RNeasy a um novo tubo coletor de 2 ml. Adicionado 500 μΙ de buffer RPE à coluna RNeasy e centrifugado por 15 seg a 10.000 RPM.

8. Adicionado 500 μΙ de buffer RPE à coluna RNeasy, e centrifugado por 2 min. em velocidade máxima para secar a membrana RNeasy.

9. Colocada a coluna RNeasy em um novo tubo coletor de 2 ml, e rejeitada a coleta anterior no tubo com filtro. Centrifugado na velocidade máxima por 1 min.

10. Transferida a coluna R.Neasy a um novo tubo coletor de 1.5 ml, e adicionado 50 μΙ de água livre de RNase diretamente na membrana de RNeasy. Centrifugado por 1 minuto em 10.000 RPM para eluir o RNA.

Isolamento do RNA usando o presente protocolo: a. Folhas de Arabidopsis thaliana (100 mg) foram trituradas em nitrogênio líquido usando pilão e socador para fazer o pó fino.

b. Adicionado 2 ml da solução I.

c. Homogeneizado para fazer um pó fino no pilão.

d. Adicionado 800 μΙ da Solução Il

e. Amostra transferida para os tubos eppendorf de 2.0 ml. f. Adicionado 200 μΙ de clorofórmio.

g. Turbilhado e deixado em temperatura ambiente por 10 minutos.

h. Centrifugado por 10 minutos em temperatura ambiente

i. Fase aquosa superior transferida a um tubo novo eppendorf de 2.0 ml. j. Adicionado 0.6 volumes de isopropanol

k. Turbilhado e deixado em temperatura ambiente por 10 minutos. I. Centrifugado por cinco minutos a 4°C.

m. O grânulo resultante do RNA foi lavado com etanol 70%, seco e dissolvido em uma quantidade apropriada de água tratada DEPC. O RNA foi determinado pela varredura da absorbância entre 220 a 320 nm; a pureza foi determinada calculando a relação da absorbância medida em 260 e em 280 nm. Um valor > 1.8 em 260/280 nm foi considerado ideal com a finalidade da presente investigação. A fórmula usada para calcular a concentração e o rendimento do RNA foi como segue:

Concentração do RNA (pg /ml) = A26O (Absorbância em 260nm) X 40 X rendimento total do fator da diluição (pg) = Concentração X Volume da amostra RNA estocada. A qualidade do RNA isolado foi analisada em agarose gel 1.2% contendo formaldeído. Para verificar a integridade do RNA1 5-6 pg de RNA em 4.5 μΙ de água tratada esterilizada DEPC foi diluído com 15.5 μΙ de solução M1 (2 μΙ de 5X buffer MOPS, 3.5 μΙ de formaldeído e 10 μΙ do formamida [5X buffer MOPS: 300 mM de acetato do sódio, 10 mM de MOPS (ácido 3-[N-morfolino] propanosulfônico), 0.5 mM de ácido etileno diamina tetraacetato [EDTA] e incubado por 15 minutos a 65 graus C. O RNA foi carregado em agarose-gel 1.2% formaldeído após ter adicionado 2 μΙ do buffer gel formadeido [glicerol 50%, 1 mM EDTA (pH 8.0), 0.25% de bromofenolazul, 0.25% de xileno-cianol FF] e eIetroforizado a 72 volts 1 X no buffer MOPS (60mM de acetato do sódio, 2 mM de MOPS e 0.1 mM de EDTA), conforme descrito por Sambrook, J., Fritsch, E.F., Maniatis, T., (1989) (em Clonagem Molecular: Um manual de laboratório, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview1 NY). Usando 100 mg de folhas, foi obtido 153 pg de RNA (Tabela 2). A Figura 2 mostra que o RNA isolado estava intacto porque revelou faixas intactas. Tabela 2

Rendimento do RNA de diferentes tecidos

Material Planta Rendimento do RNA (lug/100 mg tecido) Folhas de Arabidopsis 153 Raízes de Arabidopsis 46 Folhas de Picrorhiza 58 Raízes de Picrorhiza 93 Folhas de Rheum 174 3a. Folha de Chá 164 Botões de Flores de Chá 215 Botões de flores de Caragana (Controle) 81 Botões de Flores de Caragana (sob stress) 107 Folha de RNAebia 152 Raiz de RNAebia 136 Fruto de Capsicum 49 Tubérculo Solanum 29

Os dados comparativos do rendimento do RNA isolado usando o protocolo atual e outro o protocolo mencionados no exemplo 2, são mostrados na tabela 1. EXEMPLO 3

A quantidade da solução Il adicionada ao homogenado foi variada para estudar seu efeito na quantidade e na qualidade do RNA. As folhas de Arabidopsis thaliana foram usadas como material inicial e o protocolo foi seguido essencialmente conforme descrito salvo que 200 μΙ, 400 μΙ, 600 μΙ, e 800 μΙ da solução Il foram adicionados ao homogenado. É evidente da tabela 2, e da figura 3 que 800 μΙ da solução Il rende os melhores resultados. Tabela 3

Efeito de diferentes volumes de solução Il no rendimento do RNA.

Volume da Solution Il Rendimento do RNA (jjg/100 mg tecido) 200 μΙ 39.8 400 μΙ 112.6 600 μΙ 116 800 μΙ 134

EXEMPLO 4

A solução desenvolvida foi usada para isolar o RNA de diversas espécies de plantas. As amostras usadas eram tubérculos de Solanum tuberosum (ricos em carboidrato) (Figura 4-A), de frutos de Capsicum annum (Figura 4-B), folhas de Rheum (recalcitrante à guanidina contendo soluções) (Figura 3-C), folhas de Picrorhiza (Figura 4-D) e raízes (figura 4-E), folhas de Arabidopsis e raízes (figura 2), e de Cameliia sinensis, os botões de flor vegetativos (chá) e a terceira folha (ricos em polifenóis) (Figura 5). Os procedimentos usados para o isolamento, a quantidade e a avaliação de qualidade do RNA são os mesmos descritos no exemplo 2. Dependendo do tecido usado, o rendimento pode ser tão elevado quanto 215 pg/100 mg de tecido. A tabela 1 descreve o rendimento obtido de diferentes tecidos. EXEMPLO 5

Para avaliar a conformidade do RNA às aplicações concernentes, uma reação em cadeia da polimerase (PCR) via transcripta reversa (RT) foi executada usando o RNA das raízes e galhos de Arabidopsis, e folhas de Rheum. O RNA total (2 pg) foi digerido com DNase I (Cat. No. 18068-0 15, Invitrogen, EUA), polimerase via transcripta reversa com sobrescrito Il (Cat. No. 18064-022, Invitrogen, EUA) para sintetizar o cDNA usando o oligo primer dT (Cat. No. 18418-012, Invitrogen, EUA). Em ambas as reações acima, as instruções do fabricante foram seguidas. Para a amplificação do PCR, os primers oligonucleotideos específicos ao beta actina foram usados para amplificar este DNA durante 35 ciclos, onde um ciclo foi definido como 94 graus C por 30 segundos, 52 graus C por 1 minuto, e 72 graus por 1 minuto. A composição da mistura de reação foi como segue:

Reagentes Quantidade em μΙ Buffer PCR 10X (20 mM Tris-HCI, pH 8.4, 50 mM KCL, 1.5 mM MgC12) 2.5 Deoxi-Nucleotideo Trifosfato (dNTPs) 10Mm 0.5 Primer Ativo (2/vM) 2.5 Primer Reverso (2μΜ) 2.5 cDNA (como o exemplo 5) 1 Polimerase Taq DNA (5υ/μΙ_) 0.2 Água destilada estéril 15.8 Total 25

O DNA amplificado foi eletroforizado através da agarose gel 1.5%. Uma faixa de 500 pares de base foi amplificada, amplificação do cDNA de Arabidopsis (Figura 6) e Rheum (Figura 7).

Usando o cDNA sintetizado de Arabidopsis e o RNA do Rheum um outro PCR foi realizado com primers oligonucleotíeos específicos para o fator da transcrição wrky. Os parâmetros de ciclagem para que os primers wrky amplifiquem o DNA para 35 ciclos foram 94 graus C por 30 segundos, 48 graus C por 45 segundos e 72 graus por 1 minuto. Os produtos amplificados foram visualizados no gel agarose 1.5% .Os produtos da amplificação de 500 pares de base (Figura n°. 8) e de 700 pares de base (Figura n°. 9) foram obtidos de Arabidopsis e Rheum, respectivamente. A seqüência confirmou-os como sendo fragmentos wrky.

O DNA complementar foi igualmente sintetizado usando o RNA isolado dos botões de flor do chá e da terceira folha essencialmente conforme descrito neste estudo. Para a amplificação do PCR, os primers oligonucleotídeos específicos para a reductase de 4-diidroflavonol - (DFR) foram usados para a amplificação durante 35 ciclos, onde os parâmetros cíclicos foram definidos como 94 graus C por 30 seg, 52 graus C por 40 seg, e 72 graus por 2 minutos. O DNA amplificado foi eletroforizado através de agarose gel 1.5% em 80 volts por 2 horas. Como é evidente na Figura 10, uma faixa de 950 pares de base foi amplificada e a seqüência adicional confirmada como sendo fragmento de DFR.

Assim, as experiências mostraram explicitamente que o RNA isolado é apropriado para a análise de RT-PCR, uma aplicação concernente. EXEMPLO 6

Para avaliar melhor a conformidade do RNA para aplicações concernentes, o borrão foi executado usando o RNA do botão de flor e a terceira folha do chá usando a amplificação do produto dos 950 pares de base conforme obtido no exemplo 5 como um estudo. Após ter visualizado os produtos amplificados em agarose gel 1.5%. A faixa foi extirpada do gel e o DNA eluido usando o Kit Gel Extração QIAEX Il da M/s Qiagen, Alemanha, seguindo as instruções do fabricante. O fragmento purificado foi radioinduzido com dATP a- [32P] (4000 Ci/mmole) usando o Kit HotPrime (M/s GenHunter Corporation, Nashville, EUA). Os radionucleotideos não registrados foram removidos usando o kit de remoção de nucleotídeos QIAquick (QIAGEN, Alemanha). O estudo foi radioinduzido para experimentos de hibridização.

Para o borrão, 15 pg do RNA foi eletroforizado em gel agarose formaldeido 1.0%, como descrito no Exemplo 2. Depois da eletroforese, o gel foi lavado duas vezes com água esterilizada tratada DEPC por 15 minutos cada com agitação. O gel foi lavado então duas vezes com 10 X SSPE (10 X SSPE: 1.5 M de cloreto de sódio, 115 mM de NaH2PO4, 10 mM de EDTA) por 20 minutos cada, com agitação. A membrana de nylon foi molhada em água DEPC e embebida então em 10 X SSPE por 5 minutos com leve agitação. O RNA foi então borrado no vácuo (usando uma pressão de 40 mbar) na membrana de nylon usando água tratada DEPC 10X SSPE como meio de transferência. A transferência foi realizada por 4 horas. A pressão foi aumentada a 70 mbar por 15 minutos antes de remover o gel do vácuo. A posição do marcador do RNA foi marcada na superfície de nylon sob uma fonte luminosa UV. A membrana foi seca e aquecida em 80 graus C por duas horas. Depois de uma breve secagem em 5X SSPE, a membrana foi embebida na solução de prehibridização (formamida 50%, 0.75 M NaCI1 fosfato de sódio 50 mM, pH 7.4, 0.5 mM EDTA, 0.1% Ficoll-400 ,0.1% albumina de soro bovino, 0.1% polivinilpirolidona , 0.1% SDS solução e 150 pg de DNA de esperma de salmão recentemente fervido) por cinco horas.

O estudo radioinduzido foi desnaturado pelo fervimento por 10 minutos seguido pela adição à solução de prehibridização. A hibridação foi realizada por 16 horas. A solução foi removida e a membrana foi lavada duas vezes com 1X SSC (20X SSC; 3 M de acetato de sódio e 0.3 M de acetato de sódio diidratado, pH 7.0) contendo 0.1% SDS em temperatura ambiente por 15 minutos cada. A lavagem final foi feita a 60 graus C (usando SSC pré-aquecido 0.25X contendo 0.1% SDS) por 15 minutos. A membrana foi envolvida no envoltório impermeável e radiografada por 48 horas. A Figura 11 mostra que o estudo deu um sinal. Este resultado adicional confirmou que o RNA isolado é apropriado para aplicações concernentes. Vantagens:

As vantagens principais da presente invenção são:

1. A presente invenção fornece a boa qualidade do RNA.

2. A boa qualidade e a quantidade de RNA podem ser isoladas usando o presente protocolo.

3. Este método pode ser aplicado para vários sistemas de tecido.

4. A invenção atual fornece o método rápido e custo efetivo para o isolamento do RNA

5. A invenção é apropriada para os tecidos recalcitrantes aos sais da guanidina.

Claims

1. "SISTEMA DE ISOLAMENTO DO RNA", caracterizado por compreender a solução I e solução II, onde dita solução I compreende o fenol saturado de pH 6.0- 6.8, detergente aniônico, sal acetato e um quelato onde a proporção do ingrediente individual está na escala de 10:0.003: 0.02: 1.0 a 0.03:0.08:2.0 respectivamente e a solução Il compreende dietilpirocarbonato em água deionizada que tem uma condutividade de 17-18.2 megaohms.

2. "SOLUÇÃO", reivindicada de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fenol ser saturado com o Tris-(hidroximetil) - buffer (Tris) aminometano.

3. "SOLUÇÃO", reivindicada de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo detergente aniônico usado ser selecionado do grupo de um sal de dodecil sulfato de sódio ou de um N-Iauroil sarcosina.

4. "SOLUÇÃO", reivindicada de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo sal acetato usado ser selecionado do grupo de sódio ou de potássio.

5. "SOLUÇÃO", reivindicada de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo agente quelante usado ser selecionado do grupo de dissódio e do ácido dipotássico de diamina etileno tetraacético.

6. "SOLUÇÃO", reivindicada de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo dietilpirocarbonato usado estar em uma concentração de aproximadamente 0.1% volume/volume.

7. "MÉTODO PARA RÁPIDO ISOLAMENTO DO RNA", caracterizado pelo método mencionado compreender as etapas de: a) triturar o tecido de planta em nitrogênio líquido para fazê-la um pó fino; b) adicionar a solução I na amostra pulverizada obtida da etapa (a) na proporção que varia de 1:10 a 1:50 seguido de homogeneização para fazê-la um pó fino; c) adicionar a solução Il na amostra pulverizada obtida da etapa (b); onde a concentração da solução I para a solução Il usado está na proporção que varia de 5:3 ao 5:2; d) adicionar clorofórmio à solução acima mencionada obtida da etapa (c) seguido de centrifugação e mantido em temperatura ambiente por 10 minutos para separar a camada; e) transferir a camada superior obtida da etapa (d) para o tubo; f) adicionar o isopropanol na camada acima obtida da etapa (e) na proporção de 5:3 a 5:4 seguido de centrifugação e mantendo em temperatura ambiente por 10 minutos; g) centrifugar a solução obtida da etapa (f) de 5 a 10 minutos aproximadamente em 4°C para ter o grânulo desejado de RNA; h) lavar os grânulos resultantes do RNA obtidos da etapa (g) com álcool etílico a 70% seguido pela secagem do ar; i) dissolver o grânulo lavado obtido da etapa (h) em uma quantidade apropriada de água tratada DEPC [dietilpirocarbonato],

8. "MÉTODO PARA RÁPIDO ISOLAMENTO DO RNA", reivindicado de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo tecido mencionado ser selecionado do grupo que consiste dos tubérculos de Solanum tuberosum, frutos de Capsicum annum, folhas de Rheum, folhas e raízes de Picrorhiza kurroa, folhas e raízes de Arabidopsis thaliana.

9. "KIT RÁPIDO DE ISOLAMENTO DO RNA", caracterizado por compreender: a) a solução I conforme reivindicada na reivindicação 1; b) a solução Il conforme reivindicada na reivindicação 1; c) instruções para usar as soluções.

10. "MÉTODO PARA RÁPIDO ISOLAMENTO DO RNA E DE UM KIT DELE", caracterizado por, serem como substancialmente aqui descritos em referência aos exemplos e aos desenhos que acompanham esta especificação.