BRPI0621906A2 - molécula de dna que codifica um polipeptìdeo de histidina quinase mutante e seu uso relacionado, polipeptìdeo de histidina quinase mutante,bem como método de produção de uma planta geneticamente modificada - Google Patents

Abstract

<B>MOLéCULA DE DNA QUE CODIFICA UM POLIPEPTìDEO DE HISTIDINA QUINASE MUTANTE E SEU USO RELACIONADO, POLIPEPTìDEO DE HISTIDINA QUINASE MUTANTE, BEM COMO MéTODO DE PRODUçãO DE UMA PLANTA GENETICAMENTE MODIFICADA<D>. A presente invenção refere-se à formação de nódulos radiculares fixadores de nitrogênio em leguminosas que é induzida pela captação de moléculas sinalizadoras de oligossacarídeo de lipoquitina secretadas por bactérias Rhizobium compatíveis, que desencadeiam uma via simbiótíca comum. A presente invenção provê um mutante de formação espontânea de nódulo (snf2), no qual a formação de nódulos simbióticos é espontânea, levando ao desenvolvimento nodular na ausência bem como na presença de bactérias Rhizobium e/ou sinais rizobiais exógenos. A invenção ainda provê uma sequência de DNA isolada que codifica uma histidina quinase mutante independente de citocinina, cuja atividade resulta neste fenótipo dominante de 'ganho de função' da formação espontânea de nódulo. Além disso, mostra-se que o gene snf2 confere um fenótipo caracterizado pela organogênese regulada de nódulos espontâneos em plantas que têm um contexto genético de nodulação deficiente. Um gene da invenção, que confere este fenótipo de nodulação espontânea, tem utilidade para transferência e estabelecimento da capacidade de fixação de nitrogênio em plantas não-noduladas, e por meio disso reduz a dependência de fertilizantes nitrogenados das culturas de plantas não-noduladas.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MOLÉCULADE DNA QUE CODIFICA UM POLIPEPTÍDEO DE HISTIDINA QUINASEMUTANTE E SEU USO RELACIONADO, POLIPEPTÍDEO DE HISTIDINAQUINASE MUTANTE, BEM COMO MÉTODO DE PRODUÇÃO DE UMAPLANTA GENETICAMENTE MODIFICADA".

Antecedentes da Invenção

O crescimento das culturas agrícolas é geralmente limitado peladisponibilidade de nitrogênio, e pelo menos 50% da demanda global é supri-da pela aplicação de fertilizantes sintéticos na forma de amônia, nitrato ouuréia. Contudo, há uma necessidade crescente de explorar uma das fontesnaturais de nitrogênio mais importantes para agricultura, ou seja, a fixaçãobiológica de nitrogênio.

A fonte primária de fixação biológica de nitrogênio são Rhizobi-um ou Rhizobia spp e a actinobactéria Frankia spp, que são um pequenogrupo de procariotos que produz nitrogenases e forma associações endos-simbióticas com plantas conferindo a capacidade de fixar nitrogênio. Emboramuitas plantas possam associar-se com bactérias fixadoras de nitrogênio,somente algumas plantas, todas membros do Ciado Rosídea I, formam umaassociação endossimbiótica com a Rhizobia spp e Frankia spp, que são asúnicas em que a maior parte do nitrogênio é transferida e assimilada pelaplanta hospedeira. As plantas da família Leguminosae, que inclui soja, feijão,ervilha, amendoim, grão-de-bico, feijão-caupi, lentilha, guandu, alfafa e trevo,são os membros agronomicamente mais importantes deste pequeno grupode plantas fixadoras de nitrogênio. A fixação biológica de nitrogênio atravésda associação endossimbiótica reduz a necessidade de fertilizantes nitroge-nados caros na cultura de Ieguminosas e é uma importante característica daagricultura sustentável. As Ieguminosas também podem utilizar o nitrogêniodisponível no solo, tal que quando os níveis de nitrato do solo são altos, aformação de nódulo é suprimida e a planta substitui o metabolismo de nitro-gênio por crescimento em nitrato (Wopereis et ai, 2000).

A simbiose Rhizobium-\egurr\\nosa inclui a interação de uma sé-rie de genes de planta e bacterianos em um processo complexo que leva àiniciação e desenvolvimento de nódulos radiculares. A organogênese dosnódulos é desencadeada pelo microssimbionte rizobial, mas a planta Iegu-minosa hospedeira codifica o programa de desenvolvimento responsável porconstruir os tecidos do nódulo e por regular o processo. O baixo peso mole-cular dos oligossacarídeos de Iipoquitina (fatores Nod), sintetizados e secre-tados pelo Rizóbio, são as principais moléculas sinalizadoras que desenca-deiam este processo. O principal fator Nod secretado pelo Mesorhizobiumloti, microssimbionte do Lotus, é uma N-acetilglicosamina pentamérica queporta um ácido cis-vacênico e um grupo carbamoíla no resíduo terminal nãoreduzido junto a uma 4-O-acetilfucose no resíduo terminal reduzido. A cap-tação do fator Nod no Lotus é mediada pelas quinases receptoras NFR1 eNFR5 (Radutoiu et ai., 2003 Nature 425: 585-592; Madsen et ai., 2003 Natu-re 425: 637-640), que em conjunto com um gene da quinase receptora LRR,SymRK, comunicam-se com uma via comum de transdução de sinal, com-partilhada com a simbiose micorrizal (Oldroyd e Downie, 2004 Moi. Celi Bio-Iogy 5: 566-576). Essa via comum é codificada por sete genes, SymRK, Cas-tor, Pollux, Nup133, CCaMK [Sym15], Sym6 e Sym24. A análise de mutantestem mostrado que receptor (es) NFR1/NFR5, SymRK que codifica a proteínaquinase LRR, canal(is) de cátion CASTOR/POLLUX e nucleoporina133 sãonecessários para a variação de cálcio, uma das mais precoces respostas fisio-lógicas detectáveis nos pelos radiculares expostos ao fator Nod purificado.

Para estabelecer a simbiose, o Rizóbio tem acesso a células in-dividuais da planta por endocitose onde são instalados em simbiossomasrodeados por uma membrana peribacterioide. Em Lotus, a infecção ocorreatravés de um filamento de infecção que leva as bactérias através dos pelosradiculares no córtex radicular e as distribui às células, que se tornam infec-tadas com o simbiossoma que contém células fixadoras de nitrogênio. Emresposta às bactérias introduzidas, os pelos radiculares se deformam e enro-lam, montando uma pequena bolsa que provê um sítio para recepção dofilamento de infecção (Geurts et ai, 2005 Curr. Opinion Plant Biol., 8: 346-352). Os filamentos de infecção são estruturas derivadas das plantas, origi-nados da invaginação da membrana plasmática, acompanhada pela deposi-ção externa de material da parede celular. Frente ao progresso interno dofilamento intracelular, células corticais radiculares desdiferenciam e reentramno ciclo celular para iniciar o primórdio de nódulo. Mais tarde, no processo, aformação padrão e a diferenciação celular especificam tipos de tecido e célu-Ia inclusive as células infectadas que endocitaram os Rizóbios. No nódulomaduro funcional, os feixes vasculares periféricos estão conectados à vas-culatura radicular e os principais tipos de tecidos/célula podem ser distingui-dos (Pawlowski e Bisseling, 1996, Plant Cell 8: 1899-1913).

A análise de um grupo de mutantes de nodulação, inclusive al-guns que falham em mostrar oscilações de cálcio em resposta aos sinais dofator Nod, revelou que além da falta de nodulação, esses mutantes são in-capazes de formar endossimbioses com fungos micorrizais arbusculares.Isso implica que uma via comum de transdução de sinal simbiótica é com-partilhada por dois tipos de relações endossimbióticas, ou seja, simbiose denódulo radicular, que é basicamente restrita à família das leguminosas, efungos micorrizais arbusculares, que é comum à maioria das espécies deplantas terrestres. Isto sugere que possa haver alguns genes-chave dosquais as leguminosas dispõem para empregar na nodulação, e que estãofaltando em cultura de plantas tais como cereais. A identificação desses ge-nes-chave, que codificam funções que são indispensáveis para o estabele-cimento de um sistema de fixação de nitrogênio em leguminosas, e suatransferência e expressão em plantas não-noduladas, tem sido por muitotempo um objetivo de melhoradores moleculares de plantas. Isto poderia terum impacto agronômico significante no cultivo de cereais como arroz, onde aprodução de duas colheitas por ano pode necessitar de fertilização com até400 kg de nitrogênio por hectare.

A simbiose de nódulo radicular depende de uma interação bem-sucedida entre a planta hospedeira e o seu simbionte cognato que inclui aetapa do reconhecimento do fator nod pela planta hospedeira. A identifica-ção de genes que regulam a nodulação em Leguminosas forneceria ferra-mentas para otimizar e modificar este processo em benefício da agricultura.

Em resumo, há uma necessidade de melhorar a capacidade deformação de nódulos e as propriedades de fixação de nitrogênio nas culturasde leguminosas, bem como transferir essa via para a cultura não-noduladapara suprir as necessidades nutricionais de uma população global crescente,minimizando o uso futuro de fertilizantes nitrogenados e o seu impacto am-biental negativo associado.

Sumário da Invenção

Uma primeira modalidade da invenção é uma molécula de DNAque codifica um polipeptídeo de histidina quinase mutante compreendendouma seqüência de aminoácidos selecionada entre: SEQ ID NO: 6, 9, 12, 14-20, em que o resíduo de aminoácido correspondente a Xaa é selecionadoentre isoleucina, serina, treonina, valina, metionina, alanina, fenilalanina, ti-rosina, triptofano, arginina, lisina, glicina, histidina, aspartato, asparagina,glutamato, glutamina, prolina e cisteína,

um ortólogo de (a) e um truncamento de (a) ou (b), capaz de in-duzir formação espontânea de nódulo em uma planta.

Uma segunda modalidade da invenção é um polipeptídeo dehistidina quinase mutante composto de uma seqüência de aminoácidos se-lecionada entre: (a) SEQ ID NO: 6, 9, 12, 14-20, em que o resíduo de ami-noácido correspondente a Xaa é selecionado entre isoleucina, serina, treoni-na, valina, metionina, alanina, fenilalanina, tirosina, triptofano, arginina, lisi-na, glicina, histidina, aspartato, asparagina, glutamato, glutamina, prolina ecisteína; (b) uma variante alélica de (a) independente de citocinina; (c) umortólogo de (a) independente de citocinina; e (d) um truncamento de (a), (b)ou (c).

Uma modalidade adicional da invenção é uma planta genetica-mente modificada caracterizada por ter uma seqüência de nucleotídeos quecodifica um polipeptídeo compreendendo um mutante de histidina quinaseconsistindo em uma seqüência de aminoácidos selecionada entre: (a) SEQID NO: 6, 9, 12, 14-20, em que o resíduo de aminoácido correspondente aXaa é selecionado entre isoleucina, serina, treonina, valina, metionina, alani-na, fenilalanina, tirosina, triptofano, arginina, lisina, glicina, histidina, asparta-to, asparagina, glutamato, glutamina, prolina e cisteína; (b) uma variante alé-lica de (a) independente de citocinina; (c) um ortólogo de (a) independentede citocinina; e (d) um truncamento de (a), (b) ou (c), em que a dita planta écapaz da formação espontânea de nódulo.

A invenção é ainda direcionada ao uso de uma molécula de áci-do nucleico que codifica uma histidina quinase mutante consistindo em umaseqüência de aminoácidos selecionada entre: (a) SEQ ID NO: 7, 8, 9, 10, 11,15, 26 e 27, em que o resíduo de aminoácido correspondente a Xaa é sele-cionado entre isoleucina, serina, treonina, valina, metionina, alanina, fenila-lanina, tirosina, triptofano, arginina, lisina, glicina, histidina, aspartato, aspa-ragina, glutamato, glutamina, prolina e cisteína; (b) um ortólogo de (a); e (c)um truncamento de (a) ou (b), como um transgene para produzir a plantageneticamente modificada da invenção, capaz de nodulação espontânea deacordo com suas várias modalidades.

A invenção é ainda direcionada a um método de produção deuma planta geneticamente modificada de acordo com a invenção nas suasvárias modalidades, caracterizada pela introdução de um cassete de genecompreendendo a dita seqüência de nucleotídeos que codifica o dito poli-peptídeo e selecionando uma planta transgênica e sua progênie que expres-sa o dito polipeptídeo.

A invenção ainda inclui uma planta geneticamente modificadaproduzida de acordo com um processo de mutagênese de DNA e seleção deuma planta capaz de formação espontânea de nódulo, ou por um método detransformação com um transgene que codifica uma histidina quinase mutan-te da invenção.

A invenção ainda inclui uma semente ou uma cultura obtida daplanta geneticamente modificada da invenção. Além disso, a invenção é di-recionada ao uso de uma planta geneticamente modificada de acordo com ainvenção em um programa de melhoramento, e uma planta selecionada noprograma de melhoramento compreendendo uma seqüência de nucleotídeosque codifica um polipeptídeo compreendendo uma histidina quinase mutanteconsistindo em uma seqüência de aminoácidos selecionada entre: (a) SEQID NO: 6, 9, 12, 14-20 em que o resíduo de aminoácido correspondente aXaa é selecionado entre isoleucina, serina, treonina, valina, metionina, alani-na, fenilalanina, tirosina, triptofano, arginina, lisina, glicina, histidina, asparta-to, asparagina, glutamato, glutamina, prolina e cisteína; (b) uma variante alé-lica de (a) independente de citocinina; (c) um ortólogo de (a) independentede citocinina, e (d) um truncamento de (a), (b) ou (c), em que a dita planta écapaz de formação espontânea de nódulo.

Breve Descrição dos Desenhos

Figura 1. Caracterização fenotípica do mutante snf2.

(A) rizóbios do tipo selvagem induziram o nódulo radicular (B)nódulo radicular espontâneo na raiz snf2 5 semanas após a germinação. Ascabeças de seta indicam nódulos. Secção transversal do (C) tipo selvagem e(D) da raiz snf2 no tempo zero e (E) tipo selvagem e (F) raiz snf2 após 6 diasde crescimento no meio B5 sem hormônio. A cabeça de seta indica célulasse dividindo no periciclo. As setas indicam células do xilema. (G) e (H) cres-cimento do calo a partir de hipocótilos do tipo selvagem e snf2 em diferentesconcentrações de auxina e citocinina. Os calos foram fotografados depois de21 dias de crescimento a 26°C. (I) e (J) segmentos radiculares do tipo selva-gem e snf2 incubados por três semanas em meio sem hormônio. Barras deescala: (C); (D); (E); (F) 50 pm.

Figura 2. Clonagem baseada no mapa do gene Lhkl

A: Figura do cromossomo IV de Lotus japonicus com mapa ge-nético estendido da região abaixo do snf2 (Iocus Lhk1), compreendendo 6clones de BAC/TAC (sublinhado em negrito). As linhas verticais indicam mi-crossatélites ou marcadores de polimorfismo de nucleotídeo único. O núme-ro das plantas recombinantes obtidas por um marcador de microssatélite(TM) é indicado em negrito abaixo do marcador.

Β: A estrutura éxon-íntron do gene Lhk1, onde os 11 éxons deLhkl são indicados por caixas abertas. A transição CDT no éxon 4 do alelomutante snf2 (indicado com uma cabeça de seta preta) codifica um polipep-tídeo mutante LHK1 que compreende uma substituição de F266 para L266.

Figura 3. Transformação do alelo snf2 no tipo selvagem nas raí-zes cabeludas leva à organogênese controlada e fenótipo de nodulação es-pòntânea.

Plantas Lotus japonicus do tipo selvagem foram transformadascom Agrobacterium rhizogenes portando o gene snf2. Nódulos espontâneosnas raízes cabeludas estão identificados por cabeças de seta brancas. A raizprincipal está identificada por uma seta branca.

Figura 4. Estrutura da proteína LHK1 de Lotus.

(A) Representação esquemática dos domínios da proteínaLHK1. (B) A seqüência de aminoácidos de LHK1 arranjada em domínios pro-teicos. O domínio extracelular do receptor predito é dado em itálico e o do-mínio CHASE dentro do domínio extracelular do receptor está sublinhado; odomínio histidina quinase é dado em negrito e sublinhado; o domínio ATPa-se His Quinase é dado em negrito; e o domínio do receptor está em negrito eitálico. O asterisco no domínio CHASE marca a posição da substituição doaminoácido no alelo snf2.

Figura 5. Ensaios in vivo de sinalização de citocinina mediadapelo receptor.

(A) Ensaio em placa da atividade de β-galactosidase expressapor um gene repórter cpsr.iacZ em E. coli. Uma cepa de E. coli SRC122 queporta o repórter de cpsr.iacZ, transformada com um construto de plasmídeocompreendendo o DNAc de snf2 ou o DNAc do tipo selvagem, foi cultivadaem placas na ausência de citocinina ou em presença de quatro citocininasdiferentes. A cor azul mostra a conversão do substrato X-Gal pela β-galactosidase.

(B) Indução da atividade de β-galactosidase pela citocinina emculturas líquidas de SRC122 cpsr.iacZ transformada com o DNAc de snf2 oucom DNAc do tipo selvagem. T-z: Trans-zeatina.

(C) Modelo de trabalho do papel funcional de Lhkl na nodula-ção. O reconhecimento de um fator Nod rizobial corretamente adornado peloNFR1 e NFR5 induz transdução de sinal através da via comum, incluindovariação de cálcio e a interpretação da variação de cálcio pela proteínaCCaMK. Um aumento localizado na biossíntese de citocinina captado peloreceptor LHK1 leva então à desdiferenciação celular e ativação do ciclo celu-lar. snf2 está constitutivamente ativo mas ainda necessita dos genes Nin eSym35 para a organogênese do nódulo.

Figura 6. Efeito do tratamento com fito-hormônio no crescimentode calo em explantes de raiz.

O crescimento de calo no ecotipo Gifu do L. japonicus do tiposelvagem (A) e (B) fragmentos de raiz snf2 em diferentes concentrações deauxina e citocinina. Os calos foram fotografados após 21 dias de crescimen-to a 26°C.

Figure 7. Expressão do gene Lhkl em órgãos e Lhk1, Lrr5 e ninem resposta à citocinina.

(A) Expressão de Lhkl em órgãos diferentes. (B) Expressão dogene Lrr5 em explantes de raiz do tipo selvagem e snf2 incubados em placade ágar-ágar B5 com ou sem 0,5 pg/ml de BAP durante 10 dias. (C), (D), (E)Expressão dos genes Lrr5, Lhkl e Nin, em raízes intactas do tipo selvageme snf2 em resposta à citocinina. (F) Expressão do gene Nin em explantes deraiz do tipo selvagem e snf2 incubados em placas de ágar-ágar B5 com ousem 0,5 pg/ml de BAP durante 10 dias.

Figura 8: Efeito da citocinina no comprimento do broto e da raizde L. japonicus do tipo selvagem e no mutante snf2-2.

Plantas foram cultivadas em % de B&D contendo diferentes con-centrações de BAP. O comprimento do broto e da raiz foi medido após 3 se-manas de crescimento. (A) comprimento do broto (B) comprimento da raiz.

Figure 9. Fenótipo de nodulação de snf2 e do duplo mutantesnf2 har1 na ausência dos rizóbios.

(A) snf2 mutante e (B) duplo mutante snf2 har1 5 semanas apósa germinação.

Descrição Detalhada da Invenção

A presente invenção provê um gene isolado que codifica um po-lipeptídeo mutante, cuja expressão em plantas confere um fenótipo de nodu-lação espontânea. Mais especificamente o gene foi isolado de mutantes denodulação espontânea snf2 do Lotus japonicus que desenvolvem nódulossem rizóbios brancos na ausência do microssimbionte M. loti, enquanto asplantas Lotus do tipo selvagem somente são noduladas depois da induçãocom os seus cognatos fatores nod ou simbionte rizobial (figura 1a, b). Análi-ses histológicas detalhadas de secções de nódulos demonstram que os nó-dulos espontâneos snf2 são nódulos genuínos com uma ontogenia e fisiolo-gia semelhantes aos nódulos rizobiais induzidos. Assim, os nódulos radicula-res espontâneos formados em mutantes snf2 originam-se de células corti-cais e têm uma vasculatura periférica característica de nódulos do tipo sel-vagem, embora eles sejam desprovidos de filamentos de infecção e rizóbios.O alelo snf2 é monogênico dominante e a inoculação de mutantes snf2 como M. Ioti resulta no desenvolvimento de nódulos radiculares normais fixado-res de nitrogênio compatível com a presença de uma mutação de ganho defunção neste alelo.

O alelo snf2 localiza-se no cromossomo 4 em uma posição a-proximadamente a 1 cM do fim do braço longo (figura 2). O gene, corres-pondente ao alelo snf2, codifica uma forma mutante de uma Lotus histidinaquinase (LHK1) que é um homólogo dos genes Arabidopsis histidina quinase(AHK) que codificam as proteínas receptoras de citocinina. Uma comparaçãodo gene Lotus histidina quinase do tipo selvagem (LhkI) [SEQ ID NO:1] como gene correspondente do alelo snf2 [SEQ ID NO:4] revela uma transição denucleotídeo único (C para T) na seqüência de codificação do alelo snf2 queresulta na substituição de uma Ieucina conservada [L266 em Lhk1\ SEQ IDNO:3] por uma fenilalanina (F266 no alelo snf2 do Lhk1\ SEQ ID NO:6) nopolipeptídeo codificado. A invenção ainda provê DNAcs isolados correspon-dentes ao transcrito do gene Lhkl do tipo selvagem [SEQ ID NO:2] e ao ale-lo snf2 [SEQ ID NO:5]. O alinhamento das seqüências genômicas do Lhkl eseqüências de DNAc ou o respectivo gene do alelo snf2 e seqüências deDNAc, define uma estrutura primária de Lhkl e o seu alelo snf2 como com-posto de 11 éxons (figura 2).

A invenção ainda provê a proteína receptora de citocinina(LHK1) isolada, do tipo selvagem e mutante, codificada, respectivamente,pelo gene Lhkl e seu alelo snf, compreendendo 993 aminoácidos com umamassa predita de 110 kD (figura 4). Ambas as proteínas compreendem doissegmentos transmembrana no N-terminal, localizados entre os aminoácidos37 e 57 e entre os aminoácidos 328 e 357. Localizado entre esses segmen-tos estão os motivos característicos de ciclases/histidina quinases associa-das ao domínio sensorial extracelular (CHASE). Este domínio extracelularpredito é seguido por uma histidina quinase intracelular putativa entre os a -minoácidos 379 e 693 e um domínio receptor entre os aminoácidos 852 e985. Esses domínios são característicos de sistemas reguladores de doiscomponentes que funcionam por uma fosforrealocação. A fenilalanina 266no alelo snf2, substituída pela Ieucina 266, está localizada em um domínioconservado compartilhado entre os domínios extracelulares CHASE de re-ceptores histidina quinase (figura 4). As propriedades funcionais da histidinaquinase (proteína receptora de citocinina) codificada pelo alelo snf2 incluema atividade independente de citocinina, tal que o alelo snf2, em contrastecom alelo do tipo selvagem Lhkl pode induzir a nodulação na ausência desinalização de citocinina.

Assim sendo, a presente invenção provê uma proteína histidinaquinase mutante isolada (proteína mutante receptora de citocinina) capaz deinduzir a nodulação espontânea quando expressa em uma planta, em que oresíduo de aminoácido correspondente a L266 na histidina quinase LHK1 dotipo selvagem codificado pelo gene Lhkl do Lotus japonicus é substituídopor um aminoácido selecionado entre isoleucina, serina, treonina, valina,metionina, alanina, fenilalanina, tirosina, triptofano, arginina, lisina, glicina,histidina, aspartato, asparagina, glutamato, glutamina, prolina e cisteína. Al-ternativamente, o resíduo de aminoácido correspondente à L266 na histidinaquinase LHK1 do tipo selvagem (Xaa) é conservativamente substituído comum aminoácido selecionado entre fenilalanina, tirosina, triptofano, histidinaou prolina. O dito último grupo pode ser aumentado para incluir qualquer dos3 grupos seguintes de aminoácidos (arginina, lisina, aspartato, glutamato) ou(asparagina, glutamina, serina, treonina) ou (cisteína, metionina, isoleucina,valina, glicina, alanina). Essa histidina quinase mutante da invenção incluihomólogos de várias plantas nos quais o resíduo de aminoácido correspon-dente a L266 na histidina quinase LHK1 do tipo selvagem (com base no ali-nhamento como mostrado na Tabela 2) é deletado ou substituído com qual-quer outro aminoácido diferente de leucina. Mais especificamente, a inven-ção inclui os homólogos de histidina quinase mutante do Lotus japonicus(forma mutante de Lhk1; SEQ ID NO:6,15), M. truncatula (forma mutante deABE94286; SEQ ID N0:16), Arabidopsis (forma mutante de BAB33311; SEQID NO:9,17), arroz (forma mutante de XP_469566; SEQ ID N0:18), milho(forma mutante de BAE80688; SEQ ID NO:12,19) e Cucurbita maxima (for-ma mutante de CAF31355.1; O SEQ ID N0:14,20) ou ortólogos ou variantesalélicas das mesmas, em que Xaa é qualquer outro aminoácido diferente deleucina. Em uma modalidade, a histidina quinase mutante é aquela na qualXaa é selecionada a partir do grupo da fenilalanina, tirosina, triptofano, histi-dina ou prolina, ou alternativamente Xaa é fenilalanina. O ortólogo ou varian-te alélica da histidina quinase mutante da invenção compartilha uma porcen-tagem de identidade com a seqüência da dita histidina quinase mutante, se-lecionada do grupo composto de pelo menos 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, e98 por cento, ou truncamento desses, em que a dita quinase tem todas aspropriedades funcionais da histidina quinase mutante da invenção, tal quequando expressa em uma planta da invenção ela confere a capacidade deformar nódulos espontâneos. Em uma modalidade adicional o alelo ortólo-go/variante é uma histidina quinase mutante que é uma proteína receptorade citocinina que é independente citocinina.

Esta substituição única de aminoácido ou deleção codificadapelo alelo mutante snf2 do gene Lhk1 ou o seu homólogo é suficiente paraconferir um fenótipo de nodulação espontânea nas raízes das plantas trans-formadas do tipo selvagem que expressam um transgene compreendendo ogene correspondente ao alelo snf mutante (Tabela 1 e figura 3). O alelo snf2atua como um gene dominante de ganho de função, visto que a nodulaçãoespontânea é vista em um contexto genético do tipo selvagem, e está au-sente em plantas transformadas com gene Lhk1 do tipo selvagem. Portanto,a expressão de uma única cópia da histidina quinase mutante da invençãoem uma planta, como no caso de uma planta heterozigota é suficiente paraconferir o fenótipo snf2 de nodulação espontânea.A presente invenção ainda provê uma molécula de DNA que co-difica a dita histidina quinase mutante homóloga (em que Xaa é Phe) do Lo-tus japonicus (SEQ ID NO:4,5), M. truncatula (forma mutante da AcessãoAC141922.19; SEQ ID NO:7), Arabidopsis (forma mutante de AB049935.1;SEQ ID NO:8), arroz (forma mutante de NT_079916.2; SEQ ID NO: 10), mi-lho (forma mutante de AB206392.1; SEQ ID NO:11) e Cucurbita maxima(forma mutante de AJ628045.1; SEQ ID NO:13), ou fragmentos desses quecodificam uma histidina quinase mutante funcional inteira ou truncada capazde causar nodulação espontânea quando expressa em uma planta.

De acordo com a presente invenção, a seqüência de DNA quecodifica a proteína histidina quinase mutante da invenção está operavelmen-te ligada a uma seqüência de DNA promotora capaz de dirigir a expressãoda dita histidina quinase em uma planta, e a uma seqüência terminadora 3'.O promotor pode ser um promotor que dirige a expressão da dita histidinaquinase em tecidos radiculares de uma planta e/ou em células destinadas atornar-se o primórdio do nódulo e desenvolver-se em nódulos. Os exemplosconvenientes de um promotor e um terminador incluem o promotor e a se-qüência terminadora correspondente ao gene Lhkl do tipo selvagem. Em umamodalidade da invenção, o promotor usado para dirigir a expressão da histidi-k·· 20 na quinase mutante é um regulado (por exemplo, promotor de tecido ou espe-cífico do tipo celular) que inclui o promotor nativo do gene Lhkl ou o seu ho-mólogo como definido na presente invenção. Um exemplo de um promotorconstitutivo heterólogo inclui o promotor do 35SCaMV (Acc. No: V00141,J02048). Um transgene (cassete de gene) compreendendo uma seqüência deDNA que codifica uma histidina quinase mutante da invenção operavelmentefundida a uma seqüência promotora e opcionalmente a uma seqüência termi-nadora pode ser construído por técnicas de DNA recombinante.

De acordo com a presente invenção, um transgene compreen-dendo uma seqüência de DNA que codifica a histidina quinase mutante podeser usado para gerar uma planta que expressa a histidina quinase mutanteda invenção. O transgene pode estar integrado de maneira estável no ge-noma de uma planta hospedeira por técnicas de transformação bem-conhecidas pelo versado na técnica. Além disso, os vetores binários e méto-dos baseados em Agrobacterium tumefaciens para a integração estável dostransgenes em todas as principais plantas de cereal são conhecidos, comodescrito por exemplo para arroz (Hiei et al., 1994, The Plant J. 6; 271-282), emilho (Yuji et al., 1996, Nature Biotech. 14: 745-750). Uma seqüência deDNA que codifica uma histidina quinase mutante também pode ser introduzi-da em outra planta pelo cruzamento com uma planta geneticamente modifi-cada que expressa a histidina quinase mutante da invenção.

A planta geneticamente modificada da invenção, se gerada pormutagênese, transformação com um transgene da invenção, ou introduçãodo dito transgene, pode ser usada em um programa de melhoramento, paraselecionar as plantas com a capacidade de fixar nitrogênio, ou capacidadede fixação de nitrogênio aumentada, que herdaram o gene que codifica ahistidina quinase mutante. A invenção assim inclui uma planta geneticamen-te modificada, produzida pela transformação de uma planta natural, que écapaz de nodulação espontânea. A expressão de um gene que codifica umahistidina quinase mutante em uma planta fixadora de nitrogênio, como ummembro da Leguminoseae (tal como soja, feijão, ervilha, amendoim, grão-de-bico, feijão-caupi, lentilha, guandu, alfafa e trevo), tem utilidade particu-larmente com respeito ao aumento da capacidade fixadora de nitrogênio dadita planta sob uma ou mais condições ambientais de crescimento. A ex-pressão de um gene que codifica uma histidina quinase mutante em umacultura que não fixa naturalmente o nitrogênio, como uma planta dicotiledô-nea ou uma planta monocotiledônea inclusive um membro dos cereais (co-mo trigo, centeio, aveia, cevada, sorgo, painço, milho, grama Poaceae e ar-roz), tem particularmente a utilidade com respeito à concessão de habilidadede fixar nitrogênio. As plantas, bem como a progênie da planta, selecionadasem tal programa de melhoramento podem ser cultivadas com o objetivo dacolheita de uma cultura, onde o cultivo pode ser as partes vegetativas daplanta, por exemplo folha, tronco ou tubérculo, ou partes reprodutivas, inclu-sive flores, semente, grãos, espiga ou fruto.

Os exemplos dados abaixo servem para ilustrar várias modali-dades da invenção e as suas respectivas características. Eles demonstramque uma planta, por exemplo o Lotus, que é homozigoto ou heterozigoto pa-ra um gene que codifica o polipeptídeo de histidina quinase mutante da in-venção, forma nódulos espontâneos que podem ser infectados por bactériassimbióticas fixadoras de nitrogênio, por exemplo, o M. loti, e que são capa-zes de fixar o nitrogênio e dar suporte ao crescimento da planta sob condi-ções com nitrogênio limitado. A formação de nódulos fixadores de nitrogêniodepois da inoculação com bactérias fixadoras de nitrogênio na dita plantanodulada espontaneamente não é dependente da produção do fator nod pe-las bactérias infectantes ou captação do fator nod pela planta infectada. Issoindica que somente um subconjunto de genes relacionados à nodulação énecessário para a fixação de nitrogênio ocorrer em um planta nodulada es-pontaneamente que expressa uma histidina quinase mutante depois da ino-culação com uma bactéria rizóbio. As propriedades únicas da histidina qui-nase mutante da invenção podem ser exploradas para aumentar a fixaçãode nitrogênio nas plantas fixadoras de nitrogênio existentes, bem como noestabelecimento de fixação de nitrogênio em plantas não-noduladas.Exemplo 1. Clonagem posicionai e identificação do gene mutante snf-2 emLotus japonicus

Mutantes de Lotus (snf2-1 e snf2-2) têm um fenótipo de nodula-ção espontânea, originado de uma triagem das sementes de Lotus japonicusdo ecotipo Gifu com EMS. O gene mutante snf-2 em Lotus japonicus, que dáorigem à nodulação espontânea, foi localizado no braço longo do cromosso-mo IV, a aproximadamente 1 cM do final, em um Iocus denominado Lhk1.

A posição do gene snf2 foi determinada pelo mapeamento finousando marcadores de microssatélite (marcadores TM) e marcadores poli-mórficos de nucleotídeo único desenvolvidos em clones BAC ou TAC anco-rados ao mapa genético da região Lhk1. O mapeamento foi realizado emuma população F2 estabelecida de um híbrido dos ecotipos de Lotus japoni-eus, Miyakojima e MG 20. O mapa fino foi usado para construir um "contig"físico de TAC/BAC compreendendo seis clones de BAC/TAC de MG20 queforam reunidos para cobrir a região Lhk1 flanqueando entre os dois marca-dores TM1146 e TM0069 (Figure 2). Uma vez que snf2 é uma mutação do-minante, plantas F2 do tipo selvagem, e não as plantas mutantes, forammarcadas para mapeamento dos alvos. A genotipagem de 853 plantas dotipo selvagem que não desenvolveram nódulos radiculares espontaneamen-te foi usada para identificar marcadores que delimitam o Iocus corresponden-te à mutação snf2 a uma região de 120 kb. Quinze genes foram preditosdentro desta região, um dos quais foi predito para codificar um receptor decitocinina. A seqüência dos alelos tanto do tipo selvagem [SEQ ID NO:1]quanto do mutante snf2 [SEQ ID NO:4] deste gene candidato foi determina-da, a qual revelou uma substituição do nucleotídeo C para T em ambos osalelos snf2. O gene de tipo selvagem foi denominado gene histidina quinasede Lotus (LhkI) que codifica um polipeptídeo LHK1 [SEQ ID NO:3]. A transi-ção de nucleotídeo único (C para T) em uma seqüência do éxon do alelomutante snf2 codifica um polipeptídeo que tem uma fenilalanina (F266 emSEQ ID NO:6) em substituição da Ieucina conservada (L266 em SEQ IDNO:3) no polipeptídeo codificado pelo gene de tipo selvagem, e identificasnf2 como um alelo de um gene histidina quinase de Lotus (Lhk1).Exemplo 2. Clonagem e identificação do DNAc de Lhkl correspondente aotranscrito de tipo selvagem do gene Lhkl em Lotus japonicus

Um DNAc inteiro de Lhkl (3568 pb) foi isolado de uma biblioteca□ ZAPII de DNAc preparada a partir de RNAm isolado de M. Ioti inoculadanas raízes de Lotus japonicus. O DNAc de Lhkl foi sequenciado [SEQ IDNO:2], no qual o sítio de início de transcrição foi determinado estando situa-do a pelo menos 137 nucleotídeos a montante do códon de iniciação e a se-quência de codificação foi seguida por uma região 3' não traduzida de apro-ximadamente 445 nucleotídeos. O alinhamento das seqüências genômicas ede DNAc definiu uma estrutura primária de Lhkl composta de 11 éxons (Fi-gura 2B). A seqüência de nucleotídeos do alelo mutante snf2 do DNAc doLhkl é indicada SEQ ID NO:5.

Exemplo 3: Expressão do alelo snf2 em raízes de Lotus de tipo selvagemconfere um fenótipo de nodulação espontânea.

A expressão transgênica do alelo snf2 de tipo selvagem ou mu-tante em raízes de Lotus foi realizada para confirmar in planta a base genéti-ca do fenótipo de nodulação espontânea. Um fragmento genômico de 12,7kb do clone de BAC 1K18 foi usado para clonar o gene Lhkl de tipo selva-gem incluindo uma região promotora de 2,2 kb, e o seu alelo Snf2 compre-endendo a transição CGT, que então foram subclonados no plasmídeoplV10. Os construtos foram integrados em A. rhizogenes da cepa AR12 pelocruzamento triparental. A transformação foi realizada como descrito porStougaard (1995) Method Mol Biology 49: Plant Gene Transfer and Expres-sion Protocols, p. 49-63, e incluída a transformação com um vetor de contro-le vazio. Nodulação radicular, registrada na ausência da indução rizobial, sófoi detectada em raízes transformadas com o alelo snf2, enquanto o geneLhkl de tipo selvagem falhou em conferir a nodulação espontânea em raízesde tipo selvagem (Tabela 1, figura 3).

Tabela 1

Indução de nódulos espontâneos em raízes cabeludas de tipo selvagemtransformadas com o gene Lhkl de tipo selvagem ou seu alelode ganho de função snf2

<table>table see original document page 17</column></row><table>

* Raízes transgênicas foram registradas na ausência de M. loti.

A capacidade do alelo snf2 conferir nodulação espontânea emraízes transformadas que têm o contexto genético de tipo selvagem servepara confirmar a natureza dominante do alelo snf2. Além disso, é surpreen-dentemente mostrado que a histidina quinase independente de citocinina(snf2), quando sob controle de um promotor regulado, por exemplo, promo-tor do gene Lhk1, confere a organogênese controlada de nódulos radicula-res, em contraste com a proliferação celular descontrolada levando ao de-senvolvimento de nódulos volumosos. A formação controlada de nódulosespontâneos, capazes de infecção e fixação de nitrogênio em plantas trans-formadas com o alelo snf2, aumenta sua capacidade fixadora de nitrogêniodurante o cultivo. Uma vez que a única diferença estrutural entre o geneLhkl de tipo selvagem e o alelo snf2 está situada em uma mutação pontualque codifica uma substituição única de aminoácido, esses dados demons-tram que a nodulação espontânea é o resultado de uma substituição L/F266em um polipeptídeo LHK1.

Exemplo 3: Lotus LHK1 é um membro da família de receptor de citocinina.

A observação do clone de DNAc do Lhkl revela uma fase aber-ta de leitura de 2979 nucleotídeos que é predita para codificar uma proteínareceptora de citocinina (LHK1) consistindo em 993 aminoácidos com umamassa predita de 110 kD (figura 4). No término N1 dois segmentos trans-membrana estão localizados entre os aminoácidos 37 e 57 e entre os ami-noácidos 328 e 357. Localizado entre esses segmentos estão os motivoscaracterísticos das ciclases/histidina quinases associadas ao domínio senso-rial extracelular (CHASE). Este domínio extracelular predito é seguido poruma histidina quinase intracelular putativa entre os aminoácidos 379 e 693 eum domínio receptor entre os aminoácidos 852 e 985. Esses domínios sãocaracterísticos de sistemas reguladores de dois componentes que funcionampor uma fosforrealocação. A análise comparativa define a proteína Lotus LHK1 como ummembro da família de receptor de citocinina que inclui proteínas de Medica-go truncatula, Arabidopsis, arroz e milho (tabela 2). A proteína Lotus LHK1compartilha uma identidade de seqüência de aminoácidos de 83%, 68%,58% e 49%, respectivamente, com as proteínas homólogas de M. truncatula(ABE94286), Arabidopsis (BAB33311), arroz (XP_469566) e milho(BAD01584). Dentre os três receptores de citocinina Arabidopsis, LHK1 é omais semelhante a AHK4/(Cre1) que é importante para o desenvolvimentoradicular normal e apresenta uma função na captação da citocinina fornecidaexternamente (Mahonen et ai. (2000), Genes Dev. 4: 2938). A Ieucina 266substituída por uma fenilalanina 266 no alelo snf2 está localizada em ummotivo conservado compartilhado entre os domínios CHASE extracelularesdos receptores de histidina quinase (figura 4).Tabela 2

<table>table see original document page 19</column></row><table>Tabela 2

<table>table see original document page 20</column></row><table>Tabela 2 - continuacao

<table>table see original document page 21</column></row><table>Exemplo 4. Atividade independente de Citocinina

O fenótipo de nodulação espontânea conferido pelo alelo snf2 émostrado ser devido a uma função independente de citocinina do receptorde citocinina LHK1 mutante codificado por este alelo, que é caracterizadopor uma substituição L/F266 no domínio CHASE (figura 4). A atividade invivo dos receptores de citocinina Lotus LHK1 de tipo selvagem e mutante e asua resposta à citocinina foi demonstrada por meio de um ensaio de fosfor-realocação de dois componentes desenvolvido em E. coli (Suzuki et ai,(2001) Plant Cell Physioi 42: 107). Neste ensaio a indução de citocinina po-de ser determinada sem interferência de níveis de citocinina endógena, pe-netração de citocinina e vias metabólicas interferentes presentes em plantas.A fosforrealocação explorada neste ensaio está normalmente envolvida naregulação da síntese de polissacarídeo extracelular bacteriano através daativação do operon cps em resposta a um sensor (RcsC)1 o qual tem umaestrutura de domínio semelhante aos receptores de citocinina de planta. Aexpressão funcional de um receptor de citocinina em uma cepa de E. coli desensor RcsC deletado permite a captação de citocinina ser lida como ativi-dade de β-galactosidase pela a expressão de uma fusão cps::lacZ.

Consequentemente, os DNAcs Lhkl correspondentes ao alelode tipo selvagem e snf2, foram clonados no vetor de expressão plN-111 etransformados na cepa de sensor negativo SRC122 (ARcsC) abrigando ogene de cps::lacZ. Os transformantes foram cultivados durante a noite emLuria-ágar-ágar líquido e então colocados em placas LB1 suplementadascom e sem t-zeatina, quinetina, BAP (200 μΜ) cada um e tidiazuron (50 μΜ).Os meios LB foram ainda suplementados com X-Gal (5-bromo-4-cloro-3-indolil-p-D-galactosidase), um substrato para β-galactosidase. Após 40 horasde incubação à temperatura ambiente (25°C), as placas foram fotografadas.A cepa de E. coli (SRC122) foi tomada como um controle negativo. A ex-pressão do alelo snf2 (receptor de citocinina LHK1 mutante) é vista por indu-zir a atividade de β-galactosidase na ausência de citocinina (figura 5A). Aocontrário, a LHK1 de tipo selvagem induziu a atividade de β-galactosidase deuma maneira dependente de citocinina (figura 5A). O nível de atividade de β-galactosidase induzida pela expressão dos alelos de tipo selvagem e snf2 foiquantitativamente determinado nos transformantes depois do crescimentodurante a noite a 37°C em meio LB de acordo com o protocolo seguinte. Asculturas durante a noite foram diluídas 1:1000 em 50 ml de LB e, além disso,cultivadas durante 24 horas a 37°C. Depois do período de incubação, 1 mlda cultura foi centrifugado por 10 minutos a 13000 rpm. A DOeoo da culturarestante foi medida. O pélete foi ressuspenso em 1 ml de NaCl 0,85 %. 200μl da suspensão foram ajustados para 1 ml com o tampão Z (Guarentee(1983) Methods Enzymol., 101: 183). Duas gotas de SDS 0,1 % e 1 gota declorofórmio foram adicionadas. As amostras foram agitadas em vórtex e co-locadas em repouso a 30°C por 5 minutos. 200 μΙ de o-Nitrofenil-p-D-galactopiranosídeo ONPG (4 mg/ml) foram então adicionados à amostra,que foi ainda incubada a 30°C. Quando as amostras obtiverem uma cor a-marela apropriada (correspondente a DO420 = 0,300-0,600), a reação é para-da pela adição de 500 μl de Na2CO31 Μ. O tempo de parada foi registrado. ADO420 foi medida dentro de 1 hora por espectrofotometria. A atividade de β-galactosidase foi calculada como se segue: Unidades Relativas =(D0420*1000) / (D06oo*min*ml) (Guarentee, (1983) acima).

Como mostrado na figura 5B, a expressão do alelo snf2 deLHK1 em células de E. coli induziu um nível três vezes maior da atividade deβ-galactosidase do que o controle, células de E. coli não transformadas ecélulas que expressam a LHK1 de tipo selvagem. A adição de citocinina re-sulta em uma indução de duas vezes da atividade de β-galactosidase emcélulas que expressam LHK1 enquanto células que expressam o alelo snf2respondem apenas com um aumento marginal na atividade. Esses resulta-dos demonstram que LHK1 é um receptor de citocinina, enquanto o receptormutante codificado pelo alelo snf2 é constitutivamente ativo, cuja atividade écomparável com a atividade induzida pela citocinina do receptor selvagem.Embora não pretenda ser vinculado pela teoria, é proposto que o domínioextracelular CHASE, que normalmente liga a citocinina para ativar a quinase(Kakimoto, (2001) Plant Cell Physiol. 42: 677; Anantharaman e Aravind,(2001) Trends Biochem Sei. 26: 579; Pas et al., (2004), FEBS Lett. 576: 287)é trancado em uma conformação ativa no receptor mutante (snf2). Essaspropriedades da LHK1 mutante explicariam tanto natureza genética domi-nante do alelo snf2 como os resultados do ensaio de fosforrealocação.

Exemplo 5. Impacto do alelo snf2 na regulação do crescimento e da diferen-ciação celular

A conversão espontânea das células corticais da raiz em nódulosradiculares iniciais vista em mutantes snf2 é provavelmente devido à atividadeconstitutiva em uma ou mais etapas da via que controla a diferenciação celu-lar. A realização de cultura de tecido in vitro de células snf2 provê um meio deavaliar o impacto global do alelo snf2 em processos de diferenciação celulare/ou interferência com respostas normais a fito-hormônios. Assim sendo, hi-pocótilo e explantes de raiz (Figura 1 e 6) de 10 dias de idade de plantas detipo selvagem e snf2 (cultivados em >2 de meio salino B5) foram cultivados em36 proporções de ácido naftaleno acético (NAA) e 6-benzilaminopurina (BAP)durante três semanas. A faixa de concentrações de citocinina e auxina em-pregadas inclui níveis normalmente usados para a mais eficiente cultura invitro de explantes de tipo selvagem. Os explantes foram movidos para ummeio novo toda semana. Explantes representativos de cada combinação hor-monal foram arranjados em uma placa de Petri e fotografados.

Como mostrado na figura 1G, H e na figura 6, há pouca dife-rença observável no crescimento do calo em hipocótilo ou em explantes deraiz de plantas com alelos de tipo selvagem e snf2. Geralmente, a resposta àdose hormonal é semelhante. Somente em altas concentrações de auxina (2pg/ml NAA), explantes snf2 sobreviveram ligeiramente melhor do que explan-tes de tipo selvagem. De modo inverso, em acréscimo de citocinina (BAP) naausência de auxina, explantes snf2 desenvolveram menos calo do que os detipo selvagem. Quando cultivado em placas de cultura de tecido sem qualquerfito-hormônio, o calo verde cresceu a partir do final dos segmentos basais daraiz snf2, de uma maneira similar a uma resposta de tecido induzida pelacitocinina, e claramente diferente de segmentos de raiz de tipo selvagem(figura 11 e J). A cossegregação deste fenótipo do calo verde e do alelo snf2mostram que essa formação não induzida de calo radicular foi causada peloganho de função do receptor de citocinina codificado pelo alelo snf2.

A microscopia em secções finas de raízes de tipo selvagem esnf2 (figura1 C,D e E,F) mostra pelo menos uma camada extra de célula devasos do xilema de raízes snf2. Depois de 6 dias da incubação em meio semhormônio, camadas adicionais de célula do periciclo originadas de divisõespericlinais foram observadas em conjunto com um aumento no número decélulas da vasculatura da raiz snf2 enquanto nenhuma modificação foi ob-servada em raízes de tipo selvagem (figura 1E, F).

Exemplo 6. Expressão do gene Lhkl em órgãos e dos genes Lhk1, Lrrb eNin em plantas Lotus de tipo selvagem e snf2 em resposta à citocinina

Os níveis no estado de equilíbrio dos transcritos Lhkl e ARR fo-ram determinados em raízes e outros órgãos da planta pela análise por RT-PCR quantitativa de acordo com o protocolo seguinte.

Sementes de tipo selvagem e snf2 foram esterilizadas superfici-almente e germinadas como descrito anteriormente (Handberg, e Stougaard1(1992) Plant J. 2: 487). As plantas foram cultivadas por um período de 16hno claro/8h no escuro a 21 °C. O RNA total foi isolado de raízes, nódulos,folhas, flores e vagens de L. japonicus de tipo selvagem inoculado. O RNAmfoi extraído de raízes de plantas de tipo selvagem e snf2 cultivadas durante2 semanas em V* de B&D (Broughton e Dilworth, (1971) Biochem. J. 125:1075) suplementado com 0,5 μΜ de nitrato de potássio. As raízes foram tra-tadas com 10 μΜ de BAP em três pontos de tempo, 30 minutos, 3 horas e 8horas. As raízes não-tratadas foram tomadas como controle. RNAm tambémfoi extraído de segmentos de raiz de tipo selvagem e plantas snf2 cultivadasdurante 10 dias em meio salino B5 sem hormônio e meio salino B5 suple-mentado com 0,5 pg/ml de BAP. O kit Dynabeads mRNA direct (Invitrogen)foi usado para a extração de RNAm.

DNAc fita simples foi preparado usando transcriptase reversa(Fermentas). PCR quantitativa foi realizada em um Liqht Cvcler (Roche Mo-lecular Biochemicals) usando um Fast Start DNA master SYBR qreen kit(Roche) para amplificar os transcritos alvo a partir de 5 μΙ de DNAc diluído.Quatro genes constitutivos (Czechowski et aí., (2005) Genoma analysis 139:5) foram usados para determinar a expressão relativa dos genes alvo (vejaabaixo). Para cada tratamento, as razões relativas normalizadas dos genesalvo e os quatro genes constitutivos independentes foram calculadas usandoo Software de Quantificação Relativa da Roche (Quant). A média geométrica (Vandesompele et ai, (2002) Genome Biology 3:1) das razões da expressãorelativa para as três replicatas técnicas e biológicas e os intervalos de confi-ança correspondentes a 95% foram calculados como descrito anteriormente(Radutoiu et ai, (2003) Nature 425: 585).

Os seguintes pares de iniciadores foram usados para a PCR

quantitativa:

Seqüências dos iniciadores do gene constitutivo independente:

1. PP24-TC9878-homólogo de AT1G13320-proteína fosfata-

se 2A

5'-GTAAATGCGTCTAAAGATAGGGTCC-3' 5'-ACTAGACTGTAGTGCTTGAGAGGC-3'

2. UBC-CB828248 homólogo de AT5G25760- enzima conju-gadora de ubiquitina

5'-ATGTG CATTTTAAGAC AGGG-3'5'-GAACGTAGAAGATTGCCTGAA-3' 3. TB2C-BI418560- cadeia beta da tubulina

5'-GCTCACCACCCCAAGCTTTGG-3'5'-TGTCAATGGAGCAAACCCAACC-3'4. ATP-AW719841-ATP sintase-

Si-Aacaccactctcgatcatttctctg-S'

5'-CAATGTCGCCAAGGCCCATGGTG-3'

Seqüências de iniciadores do gene alvo:Lhkl

5'-AATTTGGTGAACCGAAGGGTCGCCG-3'5'-TCGACGAGTGGCCTCAAACCCATCC-3' a/e/o snf2 de Lhkl

Snf2LC3 Fwd: 5'-AGAGGTCTTAAAGCCATTGTG-3'Snf2LC6Rev: 5-TATCAGGCTGAAATAATGCCG-3'Nin-AJ239041.

5'-AGGAGCCCAAGTGAGTGCTA-3'

5-GCCATCAAGGTATATGACGAG-3'

ARR5-CB827384-homólogo de AT3G48100-ARR5

5'-TCTTGACTCGAATTGATAGGTGC-3'

5'-GATAGAGATGGCCTGCAACTACTG-3'

A análise do transcrito mostra Lhkl a ser expresso em níveismais altos em raízes, nódulos e folhas, mas os transcritos estiveram presen-tes em todos os órgãos testados (figura 7A).

Modificações induzidas pela citocinina em processos celularesem plantas são acompanhadas pela expressão aumentada de genes regula-dores de resposta (ARR) que pertencem à classe Tipo-A (Hutchison e Kie-ber, (2002) The plant Cell 14: 47). Dez genes que codificam ARRs em Arabi-dopsis e os seus transcritos foram encontrados em todos os tecidos adultos.Os genes ARR Tipo-A são transcricionalmente induzidos pela citocinina eARR4 e ARR5 são genes de resposta primária rapidamente induzidos. Umavez que a proteína receptora mutante codificada pelo alelo snf2 mostrou ati-vidade constitutiva no sistema de teste em E. coli, a ativação de um LotusARR5 homólogo (denominado Lrr5) foi determinado em raízes snf2 e de tiposelvagem (figura 7). Um nível duas vezes maior do transcrito Lrr5 foi encon-trado em explantes de raiz de mutantes snf2 incubados no meio B5 semhormônio em comparação com explantes de tipo selvagem, enquanto a adi-ção de citocinina [BAP] ao meio B5 aumentou duas a três vezes o nível detranscrito Lrr5 em ambos os explantes, snf2 e de tipo selvagem (figura 7B).O tratamento direto das raízes com citocinina também aumentou o nível detranscrito Lrr5 em raízes snf2 e de tipo selvagem, mas nesse experimento,uma diferença na expressão entre raízes snf2 não-tratadas e de tipo selva-gem não foi encontrada (figura 7C).

Os transcritos do gene Lhkl também são vistos aumentandorapidamente em resposta ao tratamento com citocinina no tipo selvagem emutantes snf2 (figura 7D), que é compatível com a inducibilidade da citocini-na de seu homólogo em Arabidopsis (gene AHK4). O gene Nin em Lotus,que é necessário para a iniciação do nódulo primordial (Figura 5C), é tam-bém transcricionalmente super-regulado pela citocinina (figura 7E), mas osníveis do transcrito em raízes snf2 não-tratadas e tratadas não foram signifi-cativamente diferentes daqueles de raízes de tipo selvagem. A expressãoectópica de Nin em explantes mutantes de raiz snf2 incubados em meio B5sem hormônio não foi detectada (Fig. 2F).

Em Arabidopsis, a via de resposta ARR é dessensibilizada de-pois da exposição prolongada à citocinina (Rashotte et al., (2003), PlantPhysiol. 132: 1998), que pode explicar a relativamente pequena ou a falta desuper-regulação de Lrr5 e Nin em raízes de mutante snf2.

Exemplo 7. O hábito de crescimento da planta Lotus Snf2 é sensível à cito-cinina

Embora as modificações transcricionais na planta Lotus snf2 se-jam limitadas, o crescimento da planta foi visto ser fortemente afetado pelaaplicação de citocinina fornecida externamente. Assim sendo, as plantas detipo selvagem e snf2 foram cultivadas em 1/2 de salina B5 com e sem aumen-to das concentrações de BAP durante 3 semanas. O comprimento do broto eda raiz de pelo menos 60 plantas de cada tratamento foram medidos. Deacordo com a atividade constitutiva do receptor de citocinina mutante codifi-cado pelo alelo snf2, o crescimento do broto e da raiz da planta snf2 foramhipersensíveis à citocinina em comparação ao de tipo selvagem (figura 8).Exemplo 8.O fenótipo de raiz snf2 cosseqreqado com a mutação snf2

As raízes da plantas snf2, cultivada em 1/2 de meio salino B5sem hormônio, são caracterizados pelo aumento da divisão celular no perici-cio e tecido vascular (figura 1 D,F). Este padrão de crescimento, que leva aum fenótipo de raiz inchada, é atribuído à expressão do alelo snf2. Para con-firmar que o fenótipo de raiz inchada de fato co-segrega com o fenótipo denodulação espontânea, o alelo mutante snf2-2 foi retrocruzada com o ecoti-po Gifu de tipo selvagem e as plantas F2 [50] foram cultivadas em !4 demeio B&D durante tempo suficiente para permitir o registro do fenótipo denodulação espontânea (~5 semanas). As raízes das plantas noduladas enão-noduladas foram cultivadas durante 3 semanas em meio sem hormônio,e então registradas para a presença e a ausência de inchaço radicular. Asplantas de tipo selvagem e snf2 foram tomadas como controles. Somente asraízes das plantas F2 que desenvolveram nódulos espontâneos mostraram oinchaço dos segmentos radiculares que foi comparável ao inchaço dos seg-mentos da raiz snf2. Isto indica que a expressão da proteína Lhkl indepen-dente de citocinina mutante nas plantas Lotus confere à raiz e ao broto snf2o fenótipo de crescimento e o fenótipo de nodulação espontânea.

Exemplo 9. snf2 e a sinalização de citocinina atuam a jusante na via detransdução de sinal induzida pelo do fator Nod.

O fenótipo dos mutantes snf2 sugere que a sinalização de cito-cinina seja parte de, ou atue a jusante, da via de transdução de sinal induzi-da pelo fator Nod (figura 5C). Para testar esta hipótese, o construto do genesnf2 foi transformado nas plantas mutantes que transportam mutações emgenes que constituem a via comum de transdução de sinal compartilhadacom fungos micorrizais ou nas plantas mutantes defeituosas em genes amontante ou a jusante.

Assim sendo, sete L. japonicus único e duplo mutantes de nodu-lação foram transformados usando Agrobacterium rhizogenes que transpor-tam o construto mutante do gene snf2 ou um vetor vazio como descrito ante-riormente (Stougaard, 1995 acima). Todos os mutantes exceto sy/r?35 foramgenotipados por sequenciamento dos produtos de PCR que cobrem a muta-ção usando os seguintes iniciadores:

nfr1

Nfr1-1 Msel CAPSfw(56) 5'-

CGCTGGTTTACCCATAAACGTGTTC-3'

Nfr1-1 Msel CApsrv(SS)Sl-GGGCAAATGCATTTGTGCTGAG-S'nfr5

K2fwB 5'-CCAGCTAGGTGATAGCTACG-3'K2revC 5'-CCAGAAGATGAATGCTGCTTT-3'

S5R rev5 (64) 5'-GGTATTAGAACGCCCCCTGG-3'

symRK (tipo selvagem)symRK fw1 5'-CTGAGTTTGGACCCCTTTTG-3'symRK revi 5'-ACGCCCTTATGAAAATGTGG-3'symRK (gene mutante)

Lore2 5' LTR fora P 5-GGAGCTCTGATACCAATGTTAGG-3'cac41.5F 5'-CGGCAATAGAGCGCTGGAGAGTTG-3'ccamk

LTsymI5 (60) fw 5-TATGACACAGATAGATCAGGG-3'LTsymI5 (60) rev 5'-GAGAGCGGCTCAATGAATGT-3'nin

Resc 5'-CTCAGAGCACGCTTCTTGGA-3 futuros'Resc rev 5'-ATCATGTGTGCAATCCATGATG-3'har1

#3fw2 - 5'-CCTGAAATGCCTATTCGTTGAG-3'#3rev2 5'-CACAGCTTCTTCTGCATGCG-3'snfl

Ca2fwd Si-Tggcttgcatccaaacggc-S'

Ca3-3rev 5-ACTATTGTTGTCTCACTTTAGTG-3'snf2

C3fwd 5'-TGGGATAATTGGTTGCTTGACA-3'C3Brev 5-TGACAATGTGAGTTCCAGCAG-3'A raízes cabeludas transgênicas foram então monitoradas paranodulação espontânea na ausência do rizóbio.

Tabela 3

Nodulação espontânea em plantas Lotus não-nodulada mutantes

transformadas com o gene snf2.

<table>table see original document page 30</column></row><table>As raízes cabeludas de mutantes transformados foram registradas na au-sência da Μ. Ioti. As raízes das plantas mutantes controle transformadascom um vetor vazio não desenvolveram nódulos espontâneos.

A nodulação espontânea observada em nfr1-1, nfr5-2 e nfr1-1nfr5-2 receptor de fator Nod, único e duplo mutantes perdendo a reposta ele-trofisiológica precoce ao fator Nod (Radutoiu et ai, (2003) acima; Madsen etai, (2003) acima), demonstra que Lhkl funciona a jusante da captação desinalização do fator Nod. As vias comuns mutantes symRK desprovidas derápida oscilação citoplasmática de Ca2+ (Stracke et ai, (2002) Nature, 417:959; Niwa et ai, (2001) Mol Plant Microbe Internet. 14: 848) e os ccamk mu-tantes sugerem ser incapazes de interpretar a rápida oscilação citoplasmáti-ca de Ca2+ (Tirichine et ai, (2006) Nature 441: 1153), também desenvolvemnódulos radiculares espontâneos em raízes transgênicas transformadas como construto do gene snf2. Nos mutantes nin e sym35 que são suprimidosantes da iniciação da divisão celular induzida através da via comum, nenhumnódulo espontâneo foi observado em raízes transgênicas, mostrando que acaptação da sinalização de citocinina atua a montante do início da divisãocelular, ou funciona em uma via paralela (figura 5C). Evidências adicionaisde um papel central da citocinina e da captação de citocinina na via detransdução de sinal induzida pelo fator Nod amplificada através de uma viacomum vêm do efeito aditivo das mutações snf1-1 e snf2 em duplo mutan-tes. Os mutantes snf1-1 sintetizam uma proteína CCaMK defeituosa em au-tofosforilação (Tirichine et ai, (2006) acima) e desenvolvem uma média desete nódulos espontâneos. Mutantes snf2 desenvolvem uma média de trêsnódulos espontâneos, enquanto snf1-1 snf2 duplo mutantes excedem ambose desenvolvem aproximadamente dezessete nódulos espontâneos. A con-versão de células corticais em células tronco de nódulo ou o subsequentedesenvolvimento de órgão parecem, por isso, rigidamente controlados. Essateoria foi testada pelo cruzamento do alelo snf2 em um contexto genético dehipernodulação har1-1 (Krusell et ai, (2002) Nature 420: 422). Na ausênciado rizóbio, snf2 har1-1 duplo mutantes homozigotos desenvolveram umamédia de quatorze nódulos espontâneos, enquanto os mutantes snf2 desen-volveram uma média de três, e har1-1 nenhum (figura 9). Esses resultadosindicam que somente algumas poucas células se desdiferenciaram ou quesomente poucas células desdiferenciadas sustentam as divisões celularesdurante o processo de iniciação do nódulo snf2. A autorregulação controladapelo broto do número de nódulos radiculares (Krusell et al., (2002) Nature420: 422) está assim atuando a jusante da sinalização de citocinina e a cito-cinina induziu a ativação das células iniciadoras do nódulo radicular (figura5C). Os dados claramente demonstram que a sinalização de citocinina é ne-cessária e suficiente para a desdiferenciação e a proliferação celular levandoà formação de nódulo radicular e que este processo de desenvolvimentopode ser provocado independentemente da citocinina pela expressão doalelo snf2 dominante. Surpreendentemente, o fenótipo conferido pela ex-pressão do alelo snf2, expresso sob controle de um promotor regulado (porexemplo, promotor do gene Lhk1) é caracterizado pela organogênese con-trolada de nódulos radiculares, em vez de proliferação celular descontrolada,independente da citocinina.

Exemplo 10. Kit de detecção para distinguir o alelo mutante snf2 do alelo detipo selvagem que codifica a histidina quinase LKH1

Um kit para a detecção do alelo mutante snf2 útil para o rastre-amento de genótipos alvo compreende pelo menos:

Dois grupos alternativos de dCAPS (seqüência polimórfica am-plificada clivada derivada) iniciadores são providos para a detecção do tiposelvagem versus a mutação:

Grupo um:

Snf2 Xmnl/Asp700 dCAPS fw(74)

5'-CACCAAAATTGCTTGGTTACCAGCAAGTTGACCGA

Snf2 Xmnl/Asp700 dCAPS rv (69) 5'-CCCTTCATGTGGCCCTTACCCAAC

Os iniciadores são convenientes para o uso em um teste PCRrealizado com DNA genômico como molde, onde a amplificação é realizadaa 60°C com 30 segundos de alongamento e 35-40 ciclos. O produto de 225pb é clivado pela Xmnl/Asp700 no mutante, e não é clivado no tipo selva-gem. Os produtos de PCR clivados podem ser identificados depois de suaseparação em gel de agarose a 1 %.

Grupo dois:

Snf2 Rsal dCAPS fw (72)

5'-GATCCTTTGATGTTGAGTCCCTTGTGGAGAATGTA Snf2 Rsal dCAPS rv (62)5'-

CTGAAACTCAGAAAATGTACTACAAC

Os iniciadores são convenientes para o uso em um teste PCRrealizada com DNA genômico como molde, onde a amplificação é realizadaa 48°C com 30 segundos de alongamento e 35-40 ciclos. O produto de pb éclivado por bu Rsal no tipo selvagem, mas não é clivado no mutante.

Os produtos de PCR clivados podem ser identificados depois desua separação em gel de agarose a 1%.

Exemplo 11. Iniciadores de amplificação para clonagem da seqüência decodificação do DNAc do snf2 .

Os iniciadores para amplificar a seqüência de codificação dapartida para parada (DNAc) são:

Snf2 DNAc fw ATGGGTCTTGGGTTCAAGATGCA

Snf2 DNAc rev TCATGAGTCTGAAGCAGGCTTGG

A PCR foi realizada com o anelamento a 58°C e tempo de alon-gamento de 3 minutos e 20 segundos por 25 ciclos com o clone de DNAccomo molde.LISTAGEM DE SEQÜÊNCIA

<110> Aarhus universitet, LedelsessekretariatetTiri chine, Leila

<120> MOLÉCULA DE DNA QUE CODIFICA UM POLIPEPTÍDEO DE HISTIDINA QUI-

NASE MUTANTE E SEU USO RELACIONADO, POLIPEPTÍDEO DE HISTIDINAQUINASE MUTANTE, BEM COMO MÉTODO DE PRODUÇÃO DE UMA PLANTA GE-NETICAMENTE MODIFICADA

<130> P80600597DK00

<160> 20

<170> Patentln version 3.2

<210> 1

<211> 12738

<212> DNA

<213> Lotus japonicus

<220>

<221> promoter

<222> (1)..(2359)

<223> promoter + 5' UTR of transcript<220>

<221> exon

<222> (2360)..(2704)

<223> start of CDS in Ist exon<220>

<221> Intron

<222> (2705)..(3024)

<220>

<221> exon

<222> (3025)..(3258)<220>

<221> Intron

<222> (3259)..(3390)<220><221> exon

<222> (3391)..(3560)

<220>

<221> Intron

<222> (3561)..(3834)<220>

<221> exon

<222> (3835)..(4053)<220>

<221> Intron

<222> (4054)..(4145)<220>

<221> exon

<222> (4146)..(4332)<220>

<221> Intron

<222> (4333)..(4420)

<220>

<221> exon

<222> (4421)..(4472)<220>

<221> Intron

<222> (4473)..(4586)<220>

<221> exon

<222> (4587)..(4816)<220>

<221> Intron

<222> (4817)..(5037) <220>

<221> exon

<222> (5038)..(5136)<220>

<221> Intron<222> (5137)..(5308)<220><221> exon

<222> (5309)..(6024)<220>

<221> Intron<222> (6025)..(7042)<220>

<221> exon<222> (7043)..(7513)<220>

<221> Intron<222> (7514)..(8306)<220>

<221> exon<222> (8307)..(8564)<220><221> Intron

<222> (8565)..(12738)

<223> 3"UTR + 3 prime of transcript

<400> 1

cccgggattg ttcatatccc catgtgtgtg tttggtttgg acacaagcaa gcttgccaca 60gtggtgttta caactcattc tgaattatat atatatatat atatatataa ctaatctcta 120tcaataattt agttagtttt atgggataat atgattcccg tcaaattagc ttgtaggtta 180aaaatccata tttatataat aaattagact tatctaaatc acttaagtaa atatgatgta 240aaatcacaat agcttaggta gtttaacaat gttttatcat gaatttaaaa aaaattagtt 300gtttcaaaat attattggac caaataagca aagaggagct aatccaatta taaacagcac 360atctttataa ttgttttcta ctcgatctaa tattggttcc ttctttcctt gagaaaaaaa 420gggttaaaaa tgcgatttgt tttgtaaaat taatttgtga cattaacaag agaaaactct 480acttttttaa tttttaagaa gttacttaaa tatagaaaga aagaagttac ttaaatatga 540aacttgtcta accaaagtca accgatcaaa gcgtttggtt agcaaagaga acttaaaaaa 600

ataactaaat taactgtttg aacagtgatg taacagagaa atagaatggc ttacatatgg 660

attatggagt taatggaagg cacactagtt ttagttcacg gcaacaagac agaattatcc 720

tcctatattt taggaggttt tcttatttat ttttaatgta agacgtgtat ccttcttttg 780

aggtaataat gttcgagctt gaaacattca cattatagtg tgactaattg cttaatatga 840

atcaagcatg taccacttga aacactcact catcgtttat aatataatta ctttatagta 900

ctataaagta tgtaattatt ttctcctttt taagtatctc aatcattttt ttgacccaaa 960

tattatttta gagaagaaac atgtcttaag accaatacat caacatatat ggagagtagt 1020

ttgacaacct ctcatgagct ttctaaagcc aaacaaatgt actcacataa aaaaattaaa 1080

aatttacagc aagtgagtta taaagagtga ttaataaatg ttgaataacg atggagggta 1140

gttatgaaat tccataaata aagcaaagga tgtttatggc aattgacatg ggaataagat 1200

ccgcgcgttg tcgccgtgtc ataatcgctc agatttgtga tagcgagaga tttccattct 1260

tttcctcttt tttcgaacga acgaacgaac gaacacagta gcagctgtat taggattcag 1320

attgcatgat acattgatat tgatattgat attgatattg atattgttgt gggtcaagtc 1380

tctactctac tatccaaagt aagcatatat atagagagag agagagagct tgggactagg 1440

gaggatatta gcttatgtga ctgtgaagtt gaagggagac aagagcgtat ctggcaaaat 1500

cctcaaaata aaatactagt actagtacag agaaaagaga ctaagagaga gagtgctgct 1560

gcacatcaag acccattgtg atttgtgatt tgtgatttgt gatttgtgat ttgtgagtga 1620

gttcattgta caggtattat tgtttgttgt ttctctcctc aaccaccctc taaagtctaa 1680

tctaactcat tgggctctgt gcttagctgg ttgtgttttg tgtatggtga attagggggt 1740

caatctctgg ttttcatcat tattatatta tatatgggaa taccgtgctc tcttctttgt 1800

ccttcaccaa aactagtttc acgcctacac aacatgatta gagcctcttc atttttttaa 1860

tctcatcctt taagtgtatt tctatttcta ttggctattg ggacaagggg aaggtggtgc 1920

ttcttaggaa cttgagctgt tttccatctt ttgagaccca tgctttgtct ctctcatttt 1980

taattctggg tctctttctt ctcttgtcct gattttttaa atgtgcttct tttttgcttc 2040

ttacaaccac cctctaaacc attcatcatg cttggtttgc ttttgcttct cctttcacag 2100

gtttcaatca cgcaaaacaa tgctgcaatg atgctgtact tggagtttct tctgtgaccc 2160

cttttttcct tccttcaaca atcaacccac cagagaaaag tgtctcagat tttgagacta 2220

ctttcaactt tcaaaacaaa gtggatggga tcttcatctt atataaccac acatcaatca 2280

tttgtgctac ttctccaatt ttctttagag atgaaatgaa gagctaagca gacaagacaa 2340

gtttatttgt ttgttgctg atg ggt ctt ggg ttc aag atg cag cag age cac 2392

Met Gly Leu Gly Phe Lys Met Gln Gln Ser His1 5 10

cac cct gtg gct ttg aag tta cat gag caa gct ggg age cag aga aag 2440His Pro vai Ala Leu Lys Leu His Glu Gln Ala Gly Ser Gln Arg Lys15 20 25

ttc act ttc att cag aac ttc aga aac tgg ttt cta ccc ctt ctg ttt 2488Phe Thr Phe Ile Gln Asn Phe Arg Asn Trp Phe Leu Pro Leu Leu Phe

30 35 40

gta tgg ttc att gtt atg gct gea ttt ggt gcc tgc ate tac cat aaa 2536vai Trp Phe Ile vai Met Ala Ala Phe Gly Ala Cys Ile Tyr His Lys45 50 55

atg gat gct gaa act aaa gtc aga agg aaa gag gtg ctg ggt age ctc 2584Met Asp Ala Glu Thr Lys vai Arg Arg Lys Glu Val Leu Gly Ser Leu60 65 70 75

tgt gat caa agg gct aga atg cta caa gac caa ttc agt gtc agt gtc 2632Cys Asp Gln Arg Ala Arg Met Leu Gln Asp Gln Phe ser Val ser Val

80 85 90

aac cat gtc cat gcc ctt gcc ate ctt gtt tca acc ttc cat tac tac 2680Asn His Val His Ala Leu Ala Ile Leu vai Ser Thr Phe His Tyr Tyr95 100 105

aga aat act tca gcc att gac cag gtttgtgctt gattttcctt tccttgaagc 2734Arg Asn Thr ser Ala Ile Asp Gln110 115

attttttagt tggaggctca atttcttttt ctgatttgat tctggcctta aaaattagaa 2794tcaattgtag aaggatttcc aaacatgccc attttggaaa ttggtgcatc tgatagtatc 2854atgtttagat cagtttcttt ttcctcagaa ttgattttgg gcttaaaatc aattgtggaa 2914ggatattcat tagtaatttg gatattgttg catcatatgg ttctatctag ttacatcatt 2974tttttccact ctgattgcat gtatctttct cctgttcttt tccctatcag gaa acc 3030

Glu Thr

ttt gea gaa tac acg gcc agg aca gea ttt gaa cgg cca tta atg agt 3078Phe Ala Glu Tyr Thr Ala Arg Thr Ala Phe Glu Arg Pro Leu Met Ser120 125 130999 9*9 9cc tat gca cag aga gtg gtt cac tca gag aga gaa aga ttt 3126Gly Val Ala Tyr Ala Gln Arg Val Val His Ser Glu Arg Glu Arg Phe

135 140 145

gag aag caa cat ggg tgg gtt ata aag aca atg gaa aga gtg cct tca 3174Glu Lys Gln His Gly Trp vai Ile Lys Thr Met Glu Arg Val Pro Ser150 155 160 165

ggg gtt agg gat gag tat gca gca gtg ata ttt gca cag gaa act gtc 3222Gly Val Arg Asp Glu Tyr Ala Ala vai Ile Phe Ala Gln Glu Thr Val170 175 180

tct tac ctt gaa tct att gat atg atg tct ggg gag gtaaatgtca 3268

Ser Tyr Leu Glu Ser Ile Asp Met Met Ser Gly Glu

185 190

acacttgtga attaattgta aaactcagaa gctactcaga gaagctcttc cccagaattg 3328gttctgcctt tagaataaat tgtacatgga tttgaccaca ttttctcatt tgcatgatgc 3388ag gag gac cga gag aac att ttg agg gct aga gcc act ggg aaa gct 3435Glu Asp Arg Glu Asn Ile Leu Arg Ala Arg Ala Thr Gly Lys Ala195 200 205

gtt ctg act age cct ttc aga ctg ctg gat tct cat cat ctt ggc gtg 3483vai Leu Thr Ser Pro Phe Arg Leu Leu Asp Ser His His Leu Gly Val210 215 220

gtt cta aca ttt cct gtt tat aaa tct aag ctc cct cca gag cca acg 3531Val Leu Thr Phe Pro Val Tyr Lys Ser Lys Leu Pro Pro Glu Pro Thr225 230 235 240

acg gaa gag gtc att aaa gcc ata gca gg gtatgtcctc atttcacttt 3580

Thr Glu Glu vai lie Lys Ala Ile Ala Gly

245

tcttgccaaa accagacttc tatttggttg tgtttccgta ggctatgact gatatgtagt 3640ttcaactcag ttagactata atataaaccc ttcatgtggc ccttacccaa cagcttaagc 3700ttttgggata attggttgct tgacaaactc cttccgtaga aaacttggtt agctttggtt 3760ctatgtgggc tttatgtttt ccctgagctt atgtaatagc atgatgtgtt taatgtactt 3820tttaatggaa acag a tat att gga gga tcc ttt gat gtt gag tcc ctt gtg 3871Tyr lie Gly Gly Ser Phe Asp Val Glu Ser Leu Val255 260

gag aat tta ctt ggt caa ctt gct ggt aac caa gca att ttg gtg aag 3919Glu Asn Leu Leu Gly Gln Leu Ala Gly Asn Gln Ala Ile Leu Val Lys265 270 275

gta tat gat ata aca aac tct age gac ccc cta ate atg tat ggc age 3967Val Tyr Asp Ile Thr Asn Ser Ser Asp Pro Leu Ile Met Tyr Gly Ser

280 285 290

caa tat gaa gag ggt gat atg tct ctt gtc cat gaa agt aag ctt gat 4015Gln Tyr Glu Glu Gly Asp Met Ser Leu vai His Glu Ser Lys Leu Asp295 300 305 310

ttt gga gat cca tac agg aaa cat cac atg ate tgt ag gtgggtgctt 4063Phe Gly Asp Pro Tyr Arg Lys His His Met Ile Cys Arg315 320

ctagttattg ttgtagtaca ttttctgagt ttcagtggtt tatcaattat cagcagattc 4123ttatgatcaa tttttttaac ag a tat cac caa cag gca cca aca aat tgg 4173

Tyr His Gln Gln Ala Pro Thr Asn Trp325 330

ata gca tat acc acg gca ttc cta ttc ttt gtg att ctt tgt tta gtg 4221Ile Ala Tyr Thr Thr Ala Phe Leu Phe Phe Val Ile Leu Cys Leu vai335 340 345

ggt tac att tta tat gct gct gga act cac att gtc aag gta gaa gat 4269Gly Tyr Ile Leu Tyr Ala Ala Gly Thr His Ile Val Lys Val Glu Asp

350 355 360

gat tac aat gca atg cag gat tta aaa gtc aaa gca gaa gca gct gat 4317Asp Tyr Asn Ala Met Gln Asp Leu Lys Val Lys Ala Glu Ala Ala Asp365 370 375 380

att gcc aag tca cag gtacttttca tgacatgtta gcactgttcg ttatttcctt 4372Ile Ala Lys Ser Gln385

gaattgcata ctgatcacta gaaactgaaa atttgttatt aatgtcag ttt cta gct 4429Phe Leu Alaacc gtc tct cat gaa att aga act ccc atg aat gga att tta g 4472

Thr Val Ser His Glu Ile Arg Thr Pro Met Asn Gly Ile Leu

390 395 400

gtaactttaa gattctctct cgttctcttt ccactgaaaa gcaacacatg ctttcattcc 4532atacctgata ctttcccatt agtgatgcta tcgttaaact ccttgtcact gtag ga 4588Gly

atg ctt ggt ctg ctt tta cgc aca gaa ttg agt tca aca caa aga gac 4636Met Leu Gly Leu Leu Leu Arg Thr Glu Leu Ser Ser Thr Gln Arg Asp 405 410 415

tat gct cag act gct caa gca tgt ggg aag gca cta ata gca tta ata 4684Tyr Ala Gln Thr Ala Gln Ala Cys Gly Lys Ala Leu Ile Ala Leu lie420 425 430 435

aat gag gtg ctt gac cga gct aaa att gaa gca ggc aaa tta gag cta 4732Asn Glu Val Leu Asp Arg Ala Lys Ile Glu Ala Gly Lys Leu Glu Leu

440 445 450

gaa gca gtt cca ttt gac ctt cgt tcc ata ctt gac gat gtc ctt tct 4780Glu Ala Val Pro Phe Asp Leu Arg Ser Ile Leu Asp Asp vai Leu Ser455 460 465

ctt ttt tct gag aag tca aga cac aaa ggc tta gag gtacgtttag 4826

Leu Phe Ser Glu Lys Ser Arg His Lys Gly Leu Glu

470 475

tcattgctaa atctgttgtg aagtcctgta caagtggcgt aatttcatag tcctatttcc 4886ttttcttcaa ttgatgatct tatttcatat tcctctcgtg tttctctctt tctatgttgc 4946catgtcgttg ggcggtgatg ttcctactct gatcccaaat tcctgatgtg caattattcc 5006gacttggact tcaatggttt gggaagtata g ctg gca gtg ttt gtt tct gac 5058

Leu Ala vai Phe Val Ser Asp480 485

aaa gtt ccg gat ata gtt atg ggc gat cct ggg cga ttc aga caa ata 5106Lys Val Pro Asp Ile vai Met Gly Asp Pro Gly Arg Phe Arg Gln lie490 495 500

gtg aca aat ctt gtt gga aac tct gtt aag gttagtggaa ttttcaaact 5156Val Thr Asn Leu Val Gly Asn Ser Val Lys

505 510

ttatttgcct aatgttgtgt gcaagttgtg tgttggaaat gcgtcctttt aacgttataa 5216aatcgtacaa gttcgtattc tccattgtat acaataactt attagcaaag tacttgttga 5276tatcattact gattaacttt aatatcttgc ag ttc act gag cga ggt cat ata 5329

Phe Thr Glu Arg Gly His Ile515

ttt gtt aaa gtc cat tta gct gaa aaa aga cag tgc aca atg aat gga 5377Phe Val Lys Val His Leu Ala Glu Lys Arg Gln Cys Thr Met Asn Gly520 525 530 535

aaa tgt gag act ttt cta aat gga ggc tgt gat gat gtt ttg cat gta 5425Lys Cys Glu Thr Phe Leu Asn Gly Gly Cys Asp Asp vai Leu His vai

540 545 550

tct ggc agt tat aat ttg aaa acc ctt agt gga tat gaa gcc gct gat 5473Ser Gly Ser Tyr Asn Leu Lys Thr Leu Ser Gly Tyr Glu Ala Ala Asp555 560 565

gaa cgg aac age tgg gat aat ttt aag cat cat att gct gac gaa gaa 5521Glu Arg Asn Ser Trp Asp Asn Phe Lys His His Ile Ala Asp Glu Glu570 575 580

ttt ttc ttt gat gct tcg gtt aaa aag ttg gcc tct agt gaa tct tat 5569Phe Phe Phe Asp Ala Ser Val Lys Lys Leu Ala Ser Ser Glu Ser Tyr

585 590 595

gag caa gtc acc ttg atg gtc age gtg gag gac act gga att ggg att 5617Glu Gln vai Thr Leu Met Val Ser Val Glu Asp Thr Gly lie Gly Ile600 605 610 615

tct ttc tct gcc caa gat agt att ttc atg cct ttt gtg cag gct gac 5665Ser Phe Ser Ala Gln Asp Ser Ile Phe Met Pro Phe Val Gln Ala Asp

620 625 630

age tca acc tct cga aac tat ggg ggt acc ggg ate ggc ttg agt ate 5713ser ser Thr ser Arg Asn Tyr Gly Gly Thr Gly Ile Gly Leu ser lie635 640 645

agt aag tgc ttg gtt gaa ctg atg ggc ggt cag ata aac ttc ata age 5761Ser Lys Cys Leu vai Glu Leu Met Gly Gly Gln Ile Asn Phe Ile Ser

650 655 660

cga ccc cag gtc ggg age acg ttt tca ttc act gea gat ttc gga aca 5809Arg Pro Gln Val Gly Ser Thr Phe ser Phe Thr Ala Asp Phe Gly Thr 665 670 675

ttt aag aaa aac tca aca act gac atg aag aaa ctt aac ttt gaa gat 5857Phe Lys Lys Asn Ser Thr Thr Asp Met Lys Lys Leu Asn Phe Glu Asp680 685 690 695

cta cct tet agt ttt aga ggt ctt aaa gcc att gtg gtt gat gga aaa 5905Leu Pro Ser Ser Phe Arg Gly Leu Lys Ala Ile Val Val Asp Gly Lys

700 705 710

cct gtt aga gct gea gtg act aga tac cat ttg aag aga cta ggg ata 5953Pro Val Arg Ala Ala vai Thr Arg Tyr His Leu Lys Arg Leu Gly Ile715 720 725

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480 485 490

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Lys Leu His Glu Gln Ala Gly Ser Gln Arg Lys Phe Thr Phe Ile Gln20 25 30

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35 40 45

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115 120 125

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195 200 205

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245 250 255

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290 295 300

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325 330 335

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370 375 380

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405 410 415

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450 455 460

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580 585 590

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660 665 670

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805 810 815

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915 920 925

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245

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510 515 520

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Lys Pro Ala Ser Asp Ser990

acttttgatt gagaaacatt tagtgttagc atgtttggat caacttctcc cagcatcaat 3209tctgaaactc agaagctact catagaagct tctagccaga attgattttg gcttcagaag 3269ctactaatgg ttttatgtag agagcaaaag ttggtttcca agatatgcga ggatccatga 3329tgatacacac gtctgaagtg ateattteta accagttgaa gtttcactcg acgtgatttg 3389aatccaagta aatgcatacc acataattat ccatccccat cttgtgtaca gattctccca 3449agggataaga aaatttatgt aaattcaatt tttttctttt gcatctcaat acttccctgt 3509tagaactttt tccctatgat tatttccact tttcattttc aattatattt tttgtaaaa 3568<210> 6<211> 993<212> PRT

<213> Lotus japonicus<400> 6

Met Gly Leu Gly Phe Lys Met Gln Gln ser His His Pro vai Ala Leu1 5 10 15

Lys Leu His Glu Gln Ala Gly Ser Gln Arg Lys Phe Thr Phe Ile Gln

20 25 30

Asn Phe Arg Asn Trp Phe Leu Pro Leu Leu Phe vai Trp Phe Il e vai 35 40 45

Met Ala Ala Phe Gly Ala Cys Ile Tyr His Lys Met Asp Ala Glu Thr50 55 60Lys Val Arg Arg Lys Glu Val Leu Gly Ser Leu Cys Asp Gln Arg Ala65 70 75 80

Arg Met Leu Gln Asp Gln Phe Ser Val Ser Val Asn His Val His Ala85 90 95

Leu Ala Ile Leu Val Ser Thr Phe His Tyr Tyr Arg Asn Thr ser Ala100 105 110

Ile Asp Gln Glu Thr Phe Ala Glu Tyr Thr Ala Arg Thr Ala Phe Glu

115 120 125

Arg Pro Leu Met Ser Gly Val Ala Tyr Ala Gln Arg Val Val His Ser130 135 140

Glu Arg Glu Arg Phe Glu Lys Gln His Gly Trp vai Ile Lys Thr Met145 150 155 160

Glu Arg Val Pro Ser Gly vai Arg Asp Glu Tyr Ala Ala Val Ile Phe165 170 175

Ala Gln Glu Thr vai ser Tyr Leu Glu Ser Ile Asp Met Met Ser Gly180 185 190

Glu Glu Asp Arg Glu Asn Ile Leu Arg Ala Arg Ala Thr Gly Lys Ala

195 200 205

Val Leu Thr Ser Pro Phe Arg Leu Leu Asp Ser His His Leu Gly Val210 215 220

Val Leu Thr Phe Pro vai Tyr Lys Ser Lys Leu Pro Pro Glu Pro Thr225 230 235 240

Thr Glu Glu vai Ile Lys Ala Ile Ala Gly Tyr Ile Gly Gly Ser Phe245 250 255

Asp vai Glu Ser Leu vai Glu Asn Leu Phe Gly Gln Leu Ala Gly Asn260 265 270

Gln Ala Ile Leu Val Lys Val Tyr Asp Ile Thr Asn Ser Ser Asp Pro

275 280 285

Leu Ile Met Tyr Gly Ser Gln Tyr Glu Glu Gly Asp Met Ser Leu Val290 295 300

His Glu Ser Lys Leu Asp Phe Gly Asp Pro Tyr Arg Lys His His Met305 310 315 320Ile Cys Arg Tyr His Gln Gln Ala Pro Thr Asn Trp Ile Ala Tyr Thr

325 330 335

Thr Ala Phe Leu Phe Phe Val lie Leu Cys Leu Val Gly Tyr Ile Leu340 345 350

Tyr Ala Ala Gly Thr His Ile vai Lys Val Glu Asp Asp Tyr Asn Ala355 360 365

Met Gln Asp Leu Lys Val Lys Ala Glu Ala Ala Asp Ile Ala Lys Ser

370 375 380

Gln Phe Leu Ala Thr vai Ser His Glu Ile Arg Thr Pro Met Asn Gly 385 390 395 400

lie Leu Gly Met Leu Gly Leu Leu Leu Arg Thr Glu Leu Ser Ser Thr

405 410 415

Gln Arg Asp Tyr Ala Gln Thr Ala Gln Ala Cys Gly Lys Ala Leu Ile420 425 430

Ala Leu Ile Asn Glu Val Leu Asp Arg Ala Lys Ile Glu Ala Gly Lys435 440 445

Leu Glu Leu Glu Ala Val Pro Phe Asp Leu Arg Ser Ile Leu Asp Asp

450 455 460

vai Leu Ser Leu Phe Ser Glu Lys Ser Arg His Lys Gly Leu Glu Leu 465 470 475 480

Ala Val Phe vai Ser Asp Lys vai Pro Asp Ile Val Met Gly Asp Pro

485 490 495

Gly Arg Phe Arg Gln Ile Val Thr Asn Leu Val Gly Asn Ser Val Lys500 505 510

Phe Thr Glu Arg Gly His Ile Phe Val Lys Val His Leu Ala Glu Lys515 520 525

Arg Gln Cys Thr Met Asn Gly Lys Cys Glu Thr Phe Leu Asn Gly Gly

530 535 540

Cys Asp Asp vai Leu His vai Ser Gly Ser Tyr Asn Leu Lys Thr Leu 545 550 555 560

Ser Gly Tyr Glu Ala Ala Asp Glu Arg Asn Ser Trp Asp Asn Phe Lys565 570 575His His Ile Ala Asp Glu Glu Phe Phe Phe Asp Ala Ser Val Lys Lys

580 585 590

Leu Ala Ser Ser Glu Ser Tyr Glu Gln Val Thr Leu Met Val Ser Val595 600 605

Glu Asp Thr Gly lie Gly Ile Ser Phe Ser Ala Gln Asp Ser Ile Phe610 615 620

Met Pro Phe Val Gln Ala Asp Ser Ser Thr Ser Arg Asn Tyr Gly Gly625 630 635 640

Thr Gly Ile Gly Leu Ser Ile Ser Lys Cys Leu Val Glu Leu Met Gly 645 650 655

Gly Gln Ile Asn Phe Ile Ser Arg Pro Gln vai Gly Ser Thr Phe Ser

660 665 670

Phe Thr Ala Asp Phe Gly Thr Phe Lys Lys Asn Ser Thr Thr Asp Met675 680 685

Lys Lys Leu Asn Phe Glu Asp Leu Pro Ser Ser Phe Arg Gly Leu Lys690 695 700

Ala Ile vai vai Asp Gly Lys Pro Val Arg Ala Ala vai Thr Arg Tyr705 710 715 720

His Leu Lys Arg Leu Gly Ile Gln Ala Lys vai Ala Ile Ser Ile Asn 725 730 735

Lys Ala Val Ser Leu Cys Gly Lys Asn Gly Ser Leu Thr Ser Ala Leu

740 745 750

Phe Gln Pro Asp Ile Ile Phe Val Glu Lys Asp Ser Trp Val Ser Gly755 760 765

Glu Asp Gly Gly Ile Phe Asn Ala Phe Lys Met Pro Gln Met Ile Leu770 775 780

Leu Ala Thr Asn Ile Cys Asn Ala Glu Phe Asp Lys Ala Lys Ala Ala785 790 795 800

Gly Phe Ser Asp Thr Val Ile Met Lys Pro Leu Arg Ala Ser Met Leu 805 810 815

Ala Ala Cys Leu Gln Gln Val Phe Gly Thr Gly Lys Thr Arg Gln Phe820 825 830Gly Lys Asp Met Ser Asn Gly Ser Ser Val Arg Ser Leu Leu Cys Gly

835 840 845

Lys Lys Ile Leu Val Val Asp Asp Asn Leu vai Asn Arg Arg Val Ala850 855 860

Ala Gly Ala Leu Lys Asn Phe Gly Ala Asp vai Lys Cys Ala Ala Ser865 870 875 880

Gly Lys Ala Ala Leu Glu Met Leu Gln Tyr Pro His Asp Phe Asp Ala

885 890 895

Cys Phe Met Asp Ile Gln Met Pro Glu Met Asp Gly Phe Glu Ala Thr900 905 910

Arg Arg Ile Arg Met Met Glu Arg Glu Ala Ser Glu Gln Leu Lys Ser

915 920 925

Glu Ser Gly Glu Glu Asn Gly Lys Lys Ser Glu Phe His Met Pro Ile930 935 940

Leu Ala Met Thr Ala Asp Val Ile His Ala Thr Tyr Asp Lys Cys Leu945 950 955 960

Asn Cys Gly Met Asp Gly Tyr Val Ser Lys Pro Phe Glu Glu Glu Asn

965 970 975

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Ser

<210> 7

<211> 4743

<212> DNA

<213> Medicago truncatula<220>

<221> exon

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<221> Intron

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<400> 7

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1 5 10 15

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50 55 60

act aaa gtg aga agg aaa gag gtt ttg ggt agt ctt tgt gat caa agg 240Thr Lys Val Arg Arg Lys Glu Val Leu Gly Ser Leu Cys Asp Gln Arg65 70 75 80

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85 90 95

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Ala Ile Asp Gln115

aaaaatactc aatctttgtt gtgtttttga acctttatgt atcctctgat gattatttga 448tgatttccct tcag gaa act ttt gca gaa tat acg gct agg acc gct ttc 498Glu Thr Phe Ala Glu Tyr Thr Ala Arg Thr Ala Phe120 125

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180 185 190

gga gag gtaaagaacg acacttgtga accattccac cgcttgtttt tttttttttt 746

Gly Glu

tttttggtgg tggattactt ttattactac aatttctcat ttttgcaatg cag gag 802

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gat cga gag aac ata atg aga gct aga gct act ggg aaa gct gtt ctg 850Asp Arg Glu Asn Ile Met Arg Ala Arg Ala Thr Gly Lys Ala Val Leu

200 205 210

act age cct ttt agg ttg ttg ggt tct cat cat ctc ggt gtg gtt tta 898Thr Ser Pro Phe Arg Leu Leu Gly Ser His His Leu Gly Val Val Leu 215 220 225

aca ttt cct gtt tac aaa tct aag ctc cct ccc aac cca aca aca gaa 946Thr Phe Pro vai Tyr Lys Ser Lys Leu Pro Pro Asn Pro Thr Thr Glu

230 235 240

gag ctc att aaa gcg acc gea gg gtatatgctt atttcactaa ttgtcagctt 999Glu Leu Ile Lys Ala Thr Ala Gly245 250

tttgttttta gaatcttttt tcttatgttt catattagta attagaggat gaaggttgtg 1059tttagtataa aaattttagg tacattatta gcattttatt aagcagcagt taatctgtca 1119atgccactat tagtgttatc gacacaactt ctatcattga gttgaagaaa actgtttctg 1179ttacaaggct tgtatttggt tatattttgt tgtaagcatt tcaatagaac atgtgattaa 1239tgaacttttt aattggaggc ag a tat gtt gga gga tcc ttt gat gtg gag 1289

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265 270 275

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280 285 290

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310 315 320

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350 355 360

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ggcatatttc gatatttcct ttgattacgc aacaataact aatactgaaa tttttgtttt 1851tgtcag ttt cta gct act gtc tct cat gaa att aga aca cct atg aat 1899Phe Leu Ala Thr Val Ser His Glu Ile Arg Thr Pro Met Asn390 395 400

ggc att tta g gtaactgcaa aattctctct ctctttgcct aacatgtaac 1949Gly Ile Leu

atatgctttc atagctttca cttgctcatt aataatgtta tcacaaaaca aaactctgta 2009tgattgtag ga atg ctt ggt ctg ctt cta cgc acg gaa ttg aac tca act 2059Gly Met Leu Gly Leu Leu Leu Arg Thr Glu Leu Asn Ser Thr405 410 415

caa cgg gac tat gct cag act gct caa gca tgt ggg aag gct ctg ata 2107Gln Arg Asp Tyr Ala Gln Thr Ala Gln Ala Cys Gly Lys Ala Leu Ile420 425 430

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495 500 505

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665 670 675

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695 700 705

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730 735 740

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755 760 765

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865 870 875 880

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885 890 895

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900 905 910

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915

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35 40 45

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50 55 60

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65 70 75

tcg ggg ttg atg ggt ttt gcg aag atg cag cag cag caa cag ctt 350Ser Gly Leu Met Gly Phe Ala Lys Met Gln Gln Gln Gln Gln Leu80 85 90

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115 120 125

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130 135 140

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145 150 155

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370 375 380

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450 455 460

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480 485 490

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595 600 605

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625 630 635

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915 920 925

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<210> 9<211> 1080<212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana<400> 9

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20 25 30

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85 90 95

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115 120 125

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165 170 175

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195 200 205

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245 250 255

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275 280 285

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340 345 350

Glu Asn Leu Phe Gly Gln Leu Ala Gly Asn Gln Ala Ile Val Val His 355 360 365

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370 375 380

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405 410 415

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420 425 430

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450 455 460

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485 490 495

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500 505 510

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530 535 540

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565 570 575

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595 600 605

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755 760 765

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Leu Gly Ala Leu Ala Leu Gly vai Phe Leu His Ser Tyr Phe Arg His

50 55 60

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85 90 95

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115 120 125

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260 265 270

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370 375 380

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405 410 415

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450 455 460

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485 490 495

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530 535 540

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660 665 670

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820 825 830

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915 920 925

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965 970 975

Glu Glu Lys Gln Leu Phe Gln Ala Leu Gln Lys Phe Leu Asp Pro Gly 980 985 990

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<213> Cucurbita maxima<220>

<221> CDS<222> (1)..(2946)25 <220>

<221> 3'UTR<222> (2947)..(3318)<400> 13

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275 280 285

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325 330 335

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<210> 14<211> 981<212> PRT

<213> Cucurbita maxima<400> 14

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35 40 45

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85 90 95

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115 120 125

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165 170 175

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Glu Ala Thr Ala Gly Tyr Val Gly Gly Ala Phe Asp vai Glu Ser Leu245 250 255

Val Glu Asn Leu Phe Gly Gln Leu Ala Gly Asn Gln Ala Ile Leu Val

260 265 270

Asn Val Tyr Asp vai Thr Asn ser ser Asp Leu Leu Val Met Tyr Gly275 280 285

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290 295 300

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325 330 335

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340 345 350

His Ile vai Lys Val Glu Asp Asp Phe His Glu Met Gln vai Leu Lys355 360 365

Val Arg Ala Glu Ala Ala Asp vai Ala Lys Ser Gln Phe Leu Ala Thr

370 375 380

Val Ser His Glu Ile Arg Thr Pro Met Asn Gly Ile Leu Gly Met Leu385 390 395 400

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405 410 415

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450 455 460

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485 490 495

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515 520 525

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Gln Ser Asn Ala Ala Ser Asn Asn ser Ala Val Thr Asn Lys Gly Cys580 585 590

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660 665 670

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675 680 685

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770 775 780

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850 855 860

Gly Ala Leu Lys Lys Phe Gly Ala Asp vai Glu Cys Ala Asp Ser Gly865 870 875 880

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885 890 895

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Arg lie Arg Thr Met Glu Val Glu Ala Asn Lys Gly Gly Leu Ser Ala915 920 925

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930 935 940

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965 970 975

Phe Phe Lys Lys Pro980

<210> 15<211> 993<212> PRT<213> Lotus corniculatus<220>

<221> Mutation<222> (266)..(266)<223> X: is Xaa (any anrino acid other than Leu)<220>

<221> misc_feature<222> (266)..(266)

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Lys Phe Asp Leu Cys Leu Met Asp Ile Gln Met Pro Glu Met Asp Gly915 920 925

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Gln Ala Asp Asp ser Glu Ser Gly Ser Glu Ile Ala Ala Lys Thr Ala945 950 955 960

Lys Trp His Leu Pro Ile Leu Ala Met Thr Ala Asp Val Ile Gln Ala 965 970 975

Thr His Glu Glu Cys Thr Lys Cys Gly Met Asp Gly Tyr vai Ser Lys

980 985 990

Pro Phe Glu Glu Lys Gln Leu Phe Gln Ala vai Gln Lys Phe Leu Gly995 1000 1005

Pro Cys vai Ser Ser1010

<210> 19<211> 995<212> PRT<213> Zea mays<220>

<221> Mutation<222> (267)..(267)

<223> X= Xaa (any amino acid other than Leu)<220>

<221> misc_feature<222> (267)..(267)<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid<400> 19

Met Gly Val Gly Gly Gly Gly Gly Gly Glu Ala Ala Ala Val Ser Ala1 5 10 15

Pro Ala Pro Ala Glu Glu Ala Gly Lys Asp Ala Glu Asp Gly Gly Gly20 25 30

Trp Thr Leu Lys Ala Lys Leu Ile Ala Val Ala Val Leu Val Trp Val

35 40 45

Leu Gly Ala Leu Ala Leu Gly Val Phe Leu His Ser Tyr Phe Arg His50 55 60

Ala Ala Leu Arg Lys Ala Glu Glu Gly Leu Val Ser Met Cys Glu Glu65 70 75 80

Arg Ala Arg Met Leu Gln Asp Gln Phe Ala vai Ser Val Asn His Val85 90 95

His Ala Leu Ala Ile Leu Val Ala Thr Phe His Tyr Glu Lys Arg Pro100 105 110

Pro Ala Leu Asp Gln Asn Thr Phe Ala Asp Tyr Thr Ala Arg Thr Ser

115 120 125

Phe Glu Arg Pro Leu Leu ser Gly vai Ala Tyr Ala Gln Arg Val Val130 135 140

His Gly Asp Arg Glu Ser Phe Glu Arg Gln Gln Gly Trp Ile Ile Lys145 150 155 160

Thr Met Lys His Glu Pro Ser Pro Val Gln Asp Glu Tyr Ala Pro Val165 170 175

vai Tyr Ser Gln Glu Thr vai Ser Tyr Ile Glu Gly Leu Asp Met Met180 185 190

Ser Gly Glu Glu Asp Arg Glu Asn Ile Leu Arg Ser Arg Ala Ser Gly

195 200 205

Lys Ala Val Leu Thr Arg Pro Phe Arg Leu Met Ser Asn His Leu Gly210 215 220

vai vai Leu Thr Phe Pro vai Tyr His Val Asp Leu Ser Ser Asp Ala225 230 235 240Lys Glu Glu Asp Arg Val Ala Ala Thr Ala Gly Tyr Leu Gly Gly Ser245 250 255

Phe Asp Val Glu Ser Leu vai Glu Asn Leu Xaa Arg Gln Leu Ala Gly260 265 270

Asn Gln Glu Leu Val Val Asn vai Tyr Asp Val Thr Asn Ser Ser Asn275 280 285

Pro Leu Val Met Tyr Gly Ser Glu vai Ser Leu Gly Asn Pro Ser Pro

290 295 300

Ser His Ile Cys Met Leu Asp Phe Gly Asp Pro Phe Arg Lys His His305 310 315 320

Met Val Cys Arg Tyr Arg Asn Lys Pro Gln Leu Pro Trp Ser Ala Ile325 330 335

Ser Ser Ser Ser Gly Val Phe Val Ile Cys Met Leu Val Gly Tyr Ile340 345 350

Val Gly Ala Ala Trp Ser Arg Tyr Asp Asn Val Lys Glu Asp Cys Arg355 360 365

Lys Met Glu Glu Leu Lys Lys Gln Ala Glu Ala Ala Asp Val Ala Lys370 375 380

Ser Gln Phe Leu Ala Thr Val Ser His Glu Ile Arg Thr Pro Met Asn385 390 395 400

Gly Val Leu Gly Met Leu Asp Met Leu Leu Asp Thr Asp Leu Thr Ser405 410 415

Thr Gln Arg Asp Phe Ala Gln Thr Ala Gln Val Cys Gly Lys Ala Leu420 425 430

Ile Ser Leu Ile Asn Glu vai Leu Asp Arg Ala Lys Ile Glu Ala Gly435 440 445

Lys Leu Asp Leu Glu Ser Val Pro Phe Asp Leu Arg Ser Ile Leu Asp450 455 460

Asp Val Ile Ser Leu Phe Ser ser Lys ser Arg Glu Lys Gly Ile Glu465 470 475 480

Leu Ala Val Tyr vai Ser Glu Arg Val Pro Glu Leu Leu Leu Gly Asp485 490 495Pro Gly Arg Phe Arg Gln Ile Ile Thr Asn Leu vai Gly Asn Ser Ile

500 505 510

Lys Phe Thr Glu Arg Gly His Ile Phe Val Gln Val His Leu Ala Asp515 520 525

His Ser Asn Leu Ala Thr Glu Ser Lys Val Glu Ser Val Ala Asn Gly530 535 540

Met Asn Gly His Lys Asp Glu Lys Thr Ala vai Ala Thr Ser Val Ser545 550 555 560

Leu Asn Thr Leu Ser Gly Phe Glu Ala Ala Asp Ser Arg Asn Ser Trp565 570 575

Glu Asn Phe Lys Leu Leu Leu Ser Tyr Glu Lys Asn Glu Met Pro Tyr

580 585 590

Glu Ser Val Ser Asp Lys vai Thr Leu Val Val Ser Val Glu Asp Thr595 600 605

Gly Ile Gly Ile Pro Leu Asp Ala Gln Ala Lys vai Phe Thr Pro Phe610 615 620

Met Gln Ala Asp Ser Ser Thr Ser Arg Thr Tyr Gly Gly Thr Gly Ile625 630 635 640

Gly Leu Ser Ile Ser Lys Cys Leu vai Glu Leu Met Gly Gly Gln Ile645 650 655

Asn Phe vai Ser Arg Pro His vai Gly Ser Thr Phe Thr Phe Thr Ala

660 665 670

Ala Leu Gln Arg Cys Asp Arg Ser Ala Ile Gly Asp Ser Lys Pro Val675 680 685

Met Leu His Pro Leu Pro Ser Ser Phe Lys Gly Leu Ser Ala Leu Leu690 695 700

Val Asp Arg Arg Pro Val Arg Ala Thr vai Thr Lys Tyr His Leu Gln705 710 715 720

Arg Leu Gly Ile Ala Cys Asp vai vai Ala Thr Ile Glu Leu Ala Leu725 730 735

Gly Val Leu Ser Gly Arg Asn Gly Ser Ser Leu Thr Ser Thr Lys Gln740 745 750Pro Cys Met Leu Leu Ile Glu Ser Asp Ser Trp Gly Phe Lys Ile Asp

755 760 765

Val Pro Leu Arg Ser Arg Leu Leu Glu Met Lys Gln Asn Gly Pro Pro770 775 780

Gly Leu Pro Lys Thr Ile Leu Leu Ala Ala Ala Glu Ser Gly Lys Leu785 790 795 800

Lys Ala His Tyr Ala Val Asp Ser Val Ile Thr Lys Pro Leu Lys Ala

805 810 815

Ser Gly Leu Ala Ala Cys Leu Phe Gln Thr Leu Gly Ile Thr Gln Ser820 825 830

Ser Asn Glu Arg Arg Asp Asn Ser Gly Ser Leu His Gly Leu Leu Leu

835 840 845

Gly Lys Asn Ile Leu Val vai Asp Asp Asn Lys Val Asn Leu Arg Val850 855 860

Ala Ala Gly Thr Leu Lys Lys Phe Gly Ala Lys vai Glu Cys Val Glu865 870 875 880

Ser Gly Lys Asp Ala Leu Ala Ser Leu Gln Val Pro His Lys Phe His

885 890 895

Leu Cys Leu Met Asp Ile Gln Met Pro Glu Met Asp Gly Phe Glu Ala900 905 910

Thr Lys Gln lie Arg Ala Met Glu Ala Lys Ala Asn Glu Gln Ala Val

915 920 925

Ala Cys Asp Asp Ser Asp Thr Asp Gly Ala Thr Arg Ala Ala Arg Trp930 935 940

His Leu Pro vai Leu Ala Met Thr Ala Asp vai Ile Gln Ala Thr His945 950 955 960

Glu Glu Cys Thr Lys Tyr Gly Met Asp Gly Tyr Val Thr Lys Pro Phe

965 970 975

Glu Glu Lys Gln Leu Phe Gln Ala Leu Gln Lys Phe Leu Asp Pro Gly980 985 990

Met Ser Ser995<210> 20

<211> 981

<212> PRT

<213> Cucurbita maxima

<220>

<221> Mutation

<222> (261)..(261)

<223> X= Xaa (any amino acid other than Leu)

<220>

<221> misc_feature

<222> (261)..(261)

<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid

<400> 20

Met Gln Val Ser Asp Asn Ser Val Gly Leu Lys Trp Asn Glu Gln Met1 5 10 15

Gly Thr Thr Lys Lys Gly Tyr Thr Phe vai Gln Ala Asn Arg Ala Trp20 25 30

Leu Arg Lys Tyr Leu Leu Phe Trp Ile Met Gly Met Ala Phe Ile Ser35 40 45

Met Leu lie Tyr Asn Gly Met Asp Ala Asp Ile Lys vai Arg Arg Asn50 55 60

Glu Val Leu Gly Ser Met Cys Glu Gln Arg Ala Arg Met Leu Gln Asp65 70 75 80

Gln Phe Asn Val Ser vai Asn His Val His Ala Leu Ala Val Leu Val85 90 95

Ser Thr Phe His Tyr Phe Lys Asn Pro Ser Ala Ile Asp Gln Glu Thr100 105 110

Phe Ala Glu Tyr Thr Ala Arg Thr Ala Phe Glu Arg Pro Leu Leu Ser115 120 125

Gly Val Ala Tyr Ala Gln Arg vai Ile His Ser Glu Arg Asp Ile Phe130 135 140

Glu Lys Gln His Gly Trp Met Ile Arg Thr Met Glu Lys Glu Pro Ser145 150 155 160

Pro Asp Arg Asp Glu Tyr Ala Pro Val Ile Phe Ser Gln Glu Thr vai

165 170 175

Ser Tyr Ile Glu Ser Leu Asp Met Met Ser Gly Glu Glu Asp Arg Glu180 185 190

Asn Ile Leu Arg Ala Arg Ala Thr Gly Lys Ala vai Leu Thr Arg Pro

195 200 205

Phe Arg Leu Leu Gly Ser His His Leu Gly vai vai Leu Thr Phe Pro210 215 220

Val Tyr Lys Phe Lys Leu Pro Ser Ile Pro Thr Glu Glu Glu Arg Ile225 230 235 240

Glu Ala Thr Ala Gly Tyr Val Gly Gly Ala Phe Asp vai Glu Ser Leu

245 250 255

Val Glu Asn Leu Xaa Gly Gln Leu Ala Gly Asn Gln Ala Ile Leu Val260 265 270

Asn vai Tyr Asp vai Thr Asn Ser Ser Asp Leu Leu vai Met Tyr Gly

275 280 285

His Gln Tyr Gln Asp Gly Asp Leu ser Leu ser His Glu Ser Ser Leu290 295 300

Asp Phe Gly Asp Pro Phe Arg Lys His Leu Met Ile Cys Arg Tyr Gln305 310 315 320

Gln Arg Ala Pro Thr ser Trp Thr Ala Leu Thr Thr Ala Phe Leu Phe

325 330 335

Phe Val Ile Gly Leu Leu Val Gly Tyr Ile Leu Tyr Gly Ala Ala Thr340 345 350

His Ile Val Lys Val Glu Asp Asp Phe His Glu Met Gln Val Leu Lys

355 360 365

vai Arg Ala Glu Ala Ala Asp Val Ala Lys Ser Gln Phe Leu Ala Thr370 375 380

val Ser His Glu lie Arg Thr Pro Met Asn Gly lie Leu Gly Met Leu385 390 395 400

Ala Leu Leu Leu Asp Thr Asp Leu Ser Ser Thr Gln Lys Asp Tyr Ala405 410 415

Gln Thr Ala Gln Ala Cys Gly Lys Ala Leu Ile Ala Leu Ile Asn Glu420 425 430

Val Leu Asp Arg Ala Lys Ile Glu Ala Gly Lys Leu Glu Leu Glu Ala435 440 445

vai Pro Phe Asp Ile Arg Ser Ile Leu Asp Asp Val Leu ser Leu Phe450 455 460

Ser Glu Lys Ser Arg Gln Lys Gly Leu Glu Leu Ala vai Phe vai Ser465 470 475 480

Asp Lys Val Pro Glu Ile Val Ile Gly Asp Pro Gly Arg Phe Arg Gln485 490 495

Ile Ile Thr Asn Leu Val Gly Asn Ser Val Lys Phe Thr Glu Arg Gly500 505 510

His lie Phe Val Lys Val His Leu Ala Glu Asn Ser Lys Val Ser Met515 520 525

Asp Ser Glu Tyr vai Asn Gly Ile Ser Asp Ser Gly Leu Phe vai Leu530 535 540

Asp Gly Arg Glu Phe Gln Thr Leu Ser Gly Arg Glu Ala Ala Asp Asp545 550 555 560

Gln Asn ser Trp Asp Asn Phe Lys His Leu Ile Ala Asp Asp Asn Phe565 570 575

Gln Ser Asn Ala Ala Ser Asn Asn Ser Ala Val Thr Asn Lys Gly Cys580 585 590

Asp His vai Thr Leu Met vai Ser Val Glu Asp Thr Gly Ile Gly Ile595 600 605

Leu Leu His Ala Gln Asn Arg vai Phe Thr Pro Phe Met Gln Ala Asp610 615 620

Ser Ser Thr Ser Arg Asn Tyr Gly Gly Thr Gly Ile Gly Leu Ser Ile625 630 635 640

Ser Lys Cys Leu Val Glu Leu Met Gly Gly Gln Ile Asn Phe Ile Ser645 650 655

Arg Pro Gln Ile Gly Ser Thr Phe Ser Phe Thr Ala Val Phe Gly Lys660 665 670

Cys Lys Lys Asn Ser Met Asn Asp Met Lys Lys Pro Asn Ser Glu Glu

675 680 685

Leu Pro Pro Ser Phe Arg Gly Met Lys Ala Ile vai vai Asp Ser Lys5 690 695 700

His Val Arg Ala Ser Val Thr Arg Tyr His Leu Lys Arg Leu Gly Ile705 710 715 720

Ile vai Glu Val Thr Asn Ser Ile Asn Met Ala Ala Ser Leu Phe Arg725 7B0 735

10 Glu Asn Gly Ser Thr Leu Pro Arg Asn Thr Ile Leu Pro Asp Met Ile740 745 750

Leu vai Glu Lys Asp Ile Leu Asn Ser Asp Glu Glu Cys Gly Ile Ile

755 760 765

His His Leu Asn Trp Lys Pro Asn Gly Ser Ser Val Lys Phe Pro Lys15 770 775 780

Leu Ile Leu Leu Ala Thr Asn Ile Ala Thr Ala Glu Leu Asp Lys Ala785 790 795 800

Arg Ala Ala Gly Phe Ala Asp Thr vai Ile Met Lys Pro Leu Arg Ala805 810 815

20 Thr Met Val Ala Ala Cys Leu Gln Gln vai Leu Gly Val Lys Asn Gln820 825 830

Arg Arg Pro Asn Gly Ser Ala Phe Leu Gln Ser Leu Leu Cys Gly Lys

835 840 845

Arg Ile Leu Ile Val Asp Asp Asn Arg vai Asn Arg Arg vai Ala Ala25 850 855 860

Gly Ala Leu Lys Lys Phe Gly Ala Asp vai Glu Cys Ala Asp Ser Gly865 870 875 880

Lys Ser Ala Leu Lys Leu Leu Gln Leu Pro His Asn Phe Asp Ala Cys885 890 895

30 Phe Met Asp Ile Gln Met Pro Glu Met Asp Gly Phe Glu Ala Thr Arg900 905 910

Arg Ile Arg Thr Met Glu Val Glu Ala Asn Lys Gly Gly Leu Ser Ala915 920

Thr Glu Gly Lys Arg Pro Ile Pro

930 935

Ile His Ala Thr Tyr Glu Glu Cys945 950

vai Ser Lys Pro Phe Glu Glu Glu965

Phe Phe Lys Lys Pro980

925

Ile Leu Ala Met Thr Ala Asp vai940

Leu Lys Cys Gly Met Asn Gly Tyr955 960

Asn Leu Tyr Lys Glu Val Ala Arg970 975

Claims (15)

1. Molécula de DNA que codifica um polipeptídeo de histidinaquinase mutante, caracterizada pelo fato de que compreende uma seqüên-cia de aminoácidos selecionada entre:a. SEQ ID NO: 6, 15 e 16, em que o resíduo de aminoácido 266[Phe] na SEQ ID NO: 6 e 266 [Xaa] na SEQ ID NO: 15 e resíduo 267 [Xaa]na SEQ ID NO: 16 é selecionado entre isoleucina, serina, treonina, valina,metionina, alanina, fenilalanina, tirosina, triptofano, arginina, lisina, glicina,histidina, aspartato, asparagina, glutamato, glutamina, prolina e cisteína,b. um truncamento de (a),em que o referido peptídeo é capaz de induzir formação espontânea quandoexpressa em uma planta.

2. Polipeptídeo de histidina quinase mutante, caracterizado pelofato de ser codificado pela molécula de DNA tal como definida na reivindicação 1.

3. Planta geneticamente modificada, caracterizada por ter umaseqüência de nucleotídeo que codifica um polipeptídeo de histidina quinasemutante que compreende uma seqüência de aminoácidos selecionada entre:a. SEQ ID NO: 6, 15 e 16, em que o resíduo de aminoácido 266[Phe]na SEQ ID NO: 6 e resíduo 266 [Xaa]na SEQ ID NO: 15 e resíduo 267[Xaa] na SEQ ID NO: 16 é selecionado entre isoleucina, serina, treonina,valina, metionina, alanina, fenilalanina, tirosina, triptofano, arginina, lisina,glicina, histidina, aspartato, asparagina, glutamato, glutamina, prolina e ciste-ína,b. um truncamento de (a),em que a dita planta é capaz de formação espontânea de nódulo.

4. Planta geneticamente modificada de acordo com a reivindi-cação 3, caracterizada pelo fato de que o polipeptídeo de histidina quinasemutante é codificado por uma molécula de ácido nucleico tendo uma se-quência de ácido nucleico selecionada do grupo: SEQ ID NO: 4, 5, e 7, ou aseqüência codificante dessas.

5. Uso de uma molécula de DNA que codifica um polipeptídeode histidina quinase mutante, caracterizado pelo fato de ser capaz de induzirformação de nódulo espontânea quando expressa em uma planta consistin-do em uma seqüência de aminoácido selecionado entre:а. SEQ ID NO: 6, 15 e 16, em que o resíduo de aminoácido 266[Phe]na SEQ ID NO: 6 e resíduo 266 [Xaa]na SEQ ID NO: 15 e resíduo 267[Xaa] na SEQ ID NO: 16 é selecionado entre isoleucina, serina, treonina,valina, metionina, alanina, fenilalanina, tirosina, triptofano, arginina, lisina,glicina, histidina, aspartato, asparagina, glutamato, glutamina, prolina e ciste-ína, eb. um truncamento de (a),como um transgene para produzir a planta geneticamente modificada comodefinida na reivindicação 5.

6. Planta geneticamente modificada como definida na reivindi-cação 3 ou 4, caracterizada pelo fato de que compreende adicionalmenteuma seqüência de nucleotídeos homóloga ou heteróloga do promotor opera-velmente ligada à seqüência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo.

7. Planta geneticamente modificada de acordo com a reivindi-cação 6, caracterizada pelo fato de que o dito promotor é um promotor regu-lado.

8. Planta geneticamente modificada de acordo com qualqueruma das reivindicações 3, 4, 6 ou 7, caracterizada pelo fato de que a ditaplanta é uma planta monocotiledônea ou dicotiledônea.

9. Planta geneticamente modificada de acordo com a reivindi-cação 8, caracterizada pelo fato de que a dita planta é selecionada entrearroz, cevada, milho, aveia, centeio, sorgo, trigo e grama Poaceae.

10. Planta geneticamente modificada de acordo com qualqueruma das reivindicações 3, 4, 6 a 9, obtenível por um processo de mutagê-nese de DNA e seleção de uma planta capaz de formação espontânea denódulo, caracterizada pelo fato de ter uma seqüência de nucleotídeo quecodifica um polipeptídeo de histidina quinase mutante, compreendendo umaseqüência de aminoácido selecionada entre:a. SEQ ID NO: 6, 15 e 16, em que o resíduo de aminoácido 266[Phe]na SEQ ID NO: 6 e resíduo 266 [Xaa]na SEQ ID NO: 15 e resíduo 267[Xaa] na SEQ ID NO: 16 é selecionado entre isoleucina, serina, treonina,valina, metionina, alanina, fenilalanina, tirosina, triptofano, arginina, lisina,glicina, histidina, aspartato, asparagina, glutamato, glutamina, prolina e cisteína, eb. um truncamento de (a)

11. Método de produção de uma planta geneticamente modifi-cada tal como definida em qualquer uma das reivindicações 3, 4, 6 a 9, ca-racterizado pelo fato de que a introdução de cassete de gene compreen-dendo a dita seqüência de nucleotídeos que codifica o dito polipeptídeo eselecionando uma planta transgênica e a sua progênie que expressa o ditopolipeptídeo.

12. Método de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pe-lo fato de que o cassete de gene é introduzido em uma planta pela trans-formação ou é sujeito à "introgress" na planta por cruzamento sexual com aplanta transgênica compreendendo o dito cassete de gene.

13. Planta geneticamente modificada produzida de acordo como método como definido na reivindicação 11 ou 12, caracterizada pelo fatode ter uma seqüência de nucleotídeo que codifica um polipeptídeo de histi-dina quinase mutante, compreendendo uma seqüência de aminoácido sele-cionada entre:a. SEQ ID NO: 6, 15 e 16, em que o resíduo de aminoácido 266[Phe]na SEQ ID NO: 6 e resíduo 266 [Xaa]na SEQ ID NO: 15 e resíduo 267[Xaa] na SEQ ID NO: 16 é selecionado entre isoleucina, serina, treonina,valina, metionina, alanina, fenilalanina, tirosina, triptofano, arginina, lisina,glicina, histidina, aspartato, asparagina, glutamato, glutamina, prolina e ciste-ína, eb. um truncamento de (a)em que o referido peptídeo é capaz de induzir formação espontânea quandoexpressa em uma planta.

14. Semente da planta geneticamente modificada tal como defi-nida em qualquer uma das reivindicações 3, 4, 6 a 10 e 13, caracterizadapelo fato de ter uma seqüência de nucleotídeo que codifica um polipeptídeode histidina quinase mutante, compreendendo uma seqüência de amino-ácido selecionada entre:a. SEQ ID NO: 6, 15 e 16, em que o resíduo de aminoácido 266[Phe]na SEQ ID NO: 6 e resíduo 266 [Xaa]na SEQ ID NO: 15 e resíduo 267[Xaa] na SEQ ID NO: 16 é selecionado entre isoleucina, serina, treonina,valina, metionina, alanina, fenilalanina, tirosina, triptofano, arginina, lisina,glicina, histidina, aspartato, asparagina, glutamato, glutamina, prolina e ciste-rna, eb. um truncamento de (a)em que o referido polipeptídeo é capaz de induzir formação de nódulo es-pontânea quando expressa em uma planta.

15. Plantação, caracterizada pelo fato de que compreende umaplanta geneticamente modificada tal como definida em qualquer uma dasreivindicações 3, 4, 6 a 10 e 13.