BRPI0621988A2 - metarhizium anisopliae var. dcjhyium e seus usos - Google Patents

Abstract

METARHIZIUM ANISOPLIAE VAR, DCJHYIUM E SEUS USOS. Esta invenção descreve um Metarhizium anisoplise isolado (M. anisopliase var. dcjhyium), o qual é referido como Metarhizium anisoplise Lj01. Ele é identificado como uma nova variante de Metarhizium anisopliae, por análise biológica molecular, morfológia, fisiológica e bioquímica (CCTC Nº M206077, número de acesso do GenBank: Nº DQ288247). Também são descritos os bio-inseticidas produzidos por M. anisopliae var. dcjhyium (Metarhizium anisopliae Lj01) e esta variante para exterminar pragas, tais como térmites.

Description

"METARHIZIUM ANISOPLIAE VAR. DCJHYIOM E SEUS USOS"

Campo Técnico da Invenção

Esta invenção refere-se a bio-pesticidas e, particularmente, refere-se a Metarhizium anisopliae var. dcjhyium LjOl (número de depósito CCTCC: M206077) e aos bio-pesticidas que compreendem a dita linhagem e ao método para usá-los no extermínio de insetos.

Antecedentes da Invenção

A térmite individual é pequena, mas pode ser uma das principais pragas do mundo, podendo aumentar a ameaça e os danos em quase todos campos de economia, sendo particularmente severo para., construções -residenciais, represas-,- -reservatórios, florestas e pomares, e equipamentos e instalações de comunicação, etc. Ao redor do mundo, com exceção da Antártica, existem térmites em todos os continentes. Eles se alastraram por quase 50% das áreas de terra. Especialmente nas áreas tropicais e subtropicais, os danos causados pelas térmites são mais sérios e severos. Até agora, na China, da Província de Taiwan até o sudeste do Tibet, das ilhas do Mar do Sul da China até a província de Liaoning, com exceção das províncias de Heilongjiang, Jilin, do Interior da Mongólia, Ningxia, Qinghai e Xinjiang, as térmites estão presentes em 25 províncias, municipalidades, ou regiões autônomas, que representam quase 40% da área nacional total. Estima-se que as perdas da economia nacional causadas por térmites é de aproximadamente 2 a 2,5 bilhões de yuan por ano. Este número é particularmente alto na área ao sul do Rio Yangtze. Enquanto isso, é difícil calcular diretamente, com dados estatísticos econômicos, os danos causados por térmites a relíquias culturais, represas e reservatórios. 0 controle das térmites compreende principalmente controle químico e controle biológico. Usar processos químicos tradicionais no controle de térmites pode trazer uma série de problemas ambientais. Por exemplo, os processos químicos tradicionais podem contaminar ou mesmo destruir o ambiente ecológico. Depois da aplicação de um processo químico tradicional, as térmites podem voltar. Além disso, os processos químicos tradicionais também podem matar os predadores nativos das térmites (tais como pássaros, aranhas, formigas, o falcão de mosquito, etc.). O uso a longo prazo de pesticidas químicos em altas doses faz as térmites gerarem uma resistência ao inseticida químico aplicado. Nesta situação, o uso não só não pode controlar efetivamente as térmites, como também pode resultar em três problemas inextricáveis: [1] Os humanos e o gado podem ser envenenados por causa da contaminação ambiental e da crescente toxicidade residual; [2] A perda de controle aumentará por causa da crescente concentração de dosagem e do desenvolvimento de novos pesticidas; [3] As lesões aos predadores nativos e a destruição do equilíbrio ecológico podem causar um aumento ou explosão da praga, que resultará em um círculo vicioso na natureza. Estes três problemas inextricáveis são referidos internacionalmente como "3R" (Resíduo, Resistência e Ressurgimento). Comparado com os pesticidas químicos, os inseticidas microbianos usados para controle de térmites têm o seguinte mérito: [1] não é fácil para as térmites gerarem resistência; [2] são inofensivos aos vertebrados e humanos por causa da alta especificidade; [3] possuem capacidades de natureza epidêmica; [4] sem contaminação ambiental; [5] podem proteger os predadores nativos da praga. Atualmente, os inseticidas microbianos usados para controle biológico de térmites no mundo são, principalmente, Beauveria e Metarhizium anisopliae, e particularmente Metarhizium anisopliae.

Metarhizium anisopliae pertence ao gênero dos fungos imperfeitos, subphylum metarhizium anisopliae. O Metarhizium anisopliae reproduzir-se-á em grande quantidade nas hemocélulas depois da germinação de esporo e invadirá a parede do corpo do inseto, matando assim o inseto. Os conidióforos de Metarhizium anisopliae aderem à superfície do corpo do hospedeiro.

A germinação de esporo gera hifas, que invadem a superfície do corpo, secretam uma variedade de enzimas, tais como quitinase, enzima proteolítica, lipase, etc. e assim destroem a superfície do corpo e invadem o interior do corpo do inseto. As hifas gerarão hifas vegetativas in vivo, que podem ramificar-se continuamente. Ao mesmo tempo, uma série de "toxinas de peptídeos da cricóide seis" (destruxina Α-E) podem ser geradas durante o processo de crescimento. Infundir a destruxina no inseto causa imediatamente paralisia e relaxamento muscular do inseto. Além disso, as membranas das células, o cito-esqueleto, a morfologia do núcleo das células, e o equilíbrio de Ca2+ do inseto também serão destruídos. Por outro lado, as hifas invasoras se reproduzem e se difundem in vivo e formam uma estrutura de rede que pode invadir vários tecidos e órgãos das térmites e, assim, podem destruir o corpo das térmites.

0 pedido de patente chinês n° de série 93117629.8, intitulado "0 Controle Biológico de Térmites", descreve o uso de fungos (Gloeophyllum trabeum) para incitar as térmites ao contato com Metarhizium anisopliae (M. anisopliae ATCC 62176), e assim matar as térmites. Porém, o Metarhizium anisopliae usado (M. anisopliae ATCC 62176) tem efeito repelente para as térmites. Então, é necessário usar fungos (Gloeophyllum trabeum) para contornar o efeito repelente.

Stimac (patente U.S. 4.925.663 (1990)) demonstrou que Beauveria bassiana pode ser usado para controlar Solenopsis. A mistura de arroz, micélio e esporos pode ser engolida pela Solenopsis, ou pode ser movida para o ninho.

Stimac et al. (patente U.S. 5.683.689) demonstraram que os conidióforos de Beauveria bassiana crescidos em arroz podem ser usados para controlar baratas, formigas carpinteiras e formigas-faraó.

Sugiura, et al. [patente U.S. 5.728.573 (1998)] demonstraram que os esporos dormentes dos fungos germinantes e fungos parasitários de insetos, tais como brucellosis, Beauveria bassiana, Beauveria bassiana multi-formato, Metarhizium anisopliae e fungos sinensis Verticillium de cera, podem ser usados para matar insetos, tais como térmites, baratas, formigas, piolhos de madeira, bichos-de-conta, grandes centopéias, e centopéias com carapaça.

A Milner et al. (1997) foi concedida a patente U.S. 5.595.746 relativa ao controle de térmites. Nesta patente, foram descritos esporos de Metarhizium anisopliae. Milner et al. alegam que esporos de Metarhizium anisopliae podem ser usados como um repelente de térmites em áreas não infestadas pela praga, ou podem ser usados em um método de controle de térmites em áreas infestadas.

Já no início de 1965, a comunidade internacional empreendeu muita pesquisa sobre o uso de Beauveria bassiana e Metarhizium anisopliae para controle de térmites (Culliney, T.W. Grace, J.K. 2000, "Prospectos para o controle biológico de térmites subterrâneas, com referência especial a Coptotermes formosanus", Buli. Entomol. Res. 90, 9-21. Grace, J.K. 1997. "Estratégias de controle biológico para supressão de térmites", J. Agric. Entomol. 14, 281-289). Foi confirmado que estes dois fungos têm um bom efeito no controle de térmites em laboratório, mas o efeito é muito pobre na natureza (Hãnel, H., Watson, J.A.L. 1983. "Testes preliminares em campo sobre ou de Metarhizium anisopliae para o controle de Nasutitermes exitiosus", Buli. Entomol. Res. 73, 305-313. Milner, R.J. 2003, "Aplicação de agentes de controle biológico em térmites construtoras de montículos - experimentos com Metarhizium na Austrália", Sociobiology 41, 419-428). Uma das razões principais do resultado pobre em campo é a grande repelência das térmites a Beauveria bassiana e Metarhizium anisopliae; em segundo lugar, eles têm baixa toxicidade. A terceira razão é a remoção e isolamento do indivíduo doente ou morto da comunidade de térmites (Rath, A.C., 2000, "O uso de fungos entomopatogênicos para controle de térmites", Biocontrol Sei. Technol. 10, 563-581).

Um produto comercial compreendendo M. anisopliae como pesticida biológico para controle de térmites foi registrado nos Estados Unidos em 1994, mas logo foi retirado do mercado devido à falta de toxicidade e baixa efetividade nos testes de campo.

Em 1997, o Escritório de Patentes dos Estados Unidos concedeu uma patente que usava M. anisopliae como pesticida biológico para controle de térmites (Milner et al. , patente U.S. 5.595.746, 1997). Porém, esta patente também enfrentava a baixa toxicidade e o problema da alta repelência (Wang, C.L., Powell, J.E., .2004, "Iscas de celulose melhoram a efetividade de Metarhizium anisopliae como um controle microbiano de térmites", Biological Control, 30, 523-529). Então, há lima necessidade urgente por um pesticida biológico eficaz com alta toxicidade e repelência mais baixa para as térmites, para controlar o crescente problema das térmites e outras pragas nocivas.

Sumário da Invenção

A menos que sejam definidos de outro modo, todos os termos técnicos e científicos aqui usados têm o mesmo significado comumente entendido por aqueles com capacidades comuns na área, à qual esta invenção pertence. Embora métodos e materiais semelhantes ou equivalentes àqueles aqui descritos possam ser usados na prática ou teste da presente invenção, os materiais e métodos adequados são descritos abaixo. Todas as publicações, pedidos de patente patentes e outrasreferências aqui mencionadas estão incorporadas como referência na sua totalidade. Em caso de conflito, o presente relatório descritivo, incluindo as definições, prevalecerá. Além do mais, os materiais, métodos, e exemplos são apenas ilustrativos e não pretendem ser limitativos.

Os inventores descobriram que o Metarhizium anisopliae var. dcjhyium LjOl (número de depósito CCTCC M206077) é eficiente para controlar e matar insetos peçonhentos e tem boas propriedades entomopatogênicas, especialmente para as térmites Reticulitermes, Coptotermes, Odontotermes, por exemplo, Coptotermes formosanus Shiraki, Reticulitermes chinensis Snyder, Odontotermes formosanus Shiraki. Metarhizium anisopliae var. dcjhyium LjOl é uma nova linhagem variante de Metarhizium anisopliae que pode ser cultivada em um meio de baixo custo. Os esporos gerados por Metarhizium anisopliae var. dcjhyium LjOl podem ser usados para preparar pesticidas biológicos.

Metarhizium anisopliae var. dcjhyium que Lj01 foi depositado no Centro para Coleção de Cultura de Tipos da China (CCTCC - nChina Center for Type Culture Collection") com o n° de depósito CCTCC M206077. 0 Centro para Coleção de Cultura de Tipos da China fica situado na Universidade de Wuhan. O Metarhizium anisopliae var. dcjhyium LjOl depositado comprovou estar vivo.

De acordo com a descoberta da presente invenção, tim propósito desta invenção é isolar uma variante fúngica com alta toxicidade e baixa repelência ou não-repelência para insetos peçonhentos, a partir do ambiente natural.

Outro propósito desta invenção é prover inseticidas biológicos com capacidade efetiva para matar insetos tanto em laboratório como na natureza.

Ainda, um outro propósito desta invenção é isolar uma variante fúngica com alta toxicidade e baixa repelência ou não-repelência para térmites, a partir do ambiente natural.

Ainda outro propósito desta invenção é prover inseticidas biológicos com capacidade efetiva para matar Reticulitermes chinensis Snyder e seu ninho, tanto em laboratório como na natureza.

Mais -um -propósito -desta -invenção é prover inseticidas biológicos com capacidade efetiva para matar Coptotermes formosanus Shiraki e seu ninho, tanto em laboratório como no meio selvagem (natureza).

Um outro propósito desta invenção é prover inseticidas biológicos com capacidade efetiva para matar Odontotermes formosanus Shiraki e seu ninho, tanto em laboratório como no meio selvagem (natureza) .

Ainda um outro propósito da presente invenção é prover um método para matar pragas, tais como térmites, etc.

Breve Descrição Dos Desenhos

A figura 1 é uma fotografia de microscópio por esquadrinhamento de elétrons, mostrando que os esporos de M. anisopliae var. dcjhyium LjOl se distribuem nos agrupamentos de esporos em um arranjo do tipo "cerca";

A figura 2 é uma fotografia de microscópio por esquadrinhamento de elétrons, mostrando os agrupamentos de esporos de M. anisopliae var. dcjhyium LjOl em um meio PDA;

A figura 3 é uma fotografia de microscópio por esquadrinhamento de elétrons, mostrando micélios de M. anisopliae var. dcjhyium LjOl que cresceu em térmites;

A figura 4 é uma fotografia de microscópio por esquadrinhamento de elétrons, mostrando agrupamentos de esporos de M. anisopliae var. dcjhyium LjOl que cresceram na cabeça de térmites; A figura 5 é o padrão de eletroforese de isoenzima esterase de M. anisopliae var. dcjhyium LJOl (CCTCC M206077). Rota 1 = AB027337, Rota 2 = AB099941, Rota 3 = AF280631, Rota 4 = AB099510, Rota 5 = CCTCC M206077;

A figura 6 mostra que parte da seqüência de Ribossomo 18S r DNA reflete as diferentes posições (em negrito) entre M. anisopliae var. dcjhyium LjOl (CCTCC M206077) e várias outras variantes (tais como AB099510, AB099941, AF280631, e AB027337);

A figura 7 mostra a análise de árvore Filogenética de M. anisopliae var. dcjhyium LjOl (CCTCC M206077) baseado em Ribossomo 18S r DNA (método UPGMA do programa MEGA ver. 3.0);

A figura 8 é um desenho esquemático de um kit de inseticida para térmites;

A figura 9 é um desenho esquemático de outro kit de inseticida para térmites, com projeto diferente;

A figura 10 mostra o efeito da dose de M. anisopliae var. dcjhyium LjOl (CCTCC M206077) em térmites.

Outras características e vantagens da presente invenção ficarão evidentes a partir da descrição detalhada e reivindicações a seguir, em combinação com as figuras.

Descrição Detalhada da Invenção

Os inventores do presente pedido isolaram uma nova linhagem de fungos inseticidas, a partir do corpo de térmites mortas no ninho localizado na cidade de Wuhan, província de Hubei, campo de Luojia Hill da Universidade de Wuhan, e produziram suas culturas puras.

Em uma forma de incorporação da presente invenção, M. anisopliae var. dcjhyium LjOl (CCTCC M206077) foi isolado e cultivado para prover uma cultura substancialmente homogênea, que é patogênica para insetos peçonhentos.

Isolamento, identificação e cultivo de Metarhizium anisopliae var. dcjhyium LjOl:

1. Isolamento e cultivo de Metarhizium anisopliae var. dcjhyium Lj01: Os inventores isolaram com sucesso um novo fungo inseticida e produziram suas culturas puras a partir dos corpos mortos de térmites encontrados no ninho localizado no campo de Luojia Hill na cidade de Wuhan, Província de Hubei, Universidade de Wuhan. O fungo isolado foi cultivado no meio PDA sólido melhorado (200g de batata, 20g de açúcar, 10 g de peptona, 20g de ágar, 1.000 ml de água, a 121 °C°C, esterilizados sob 1 atmosfera por 1 h) , sob uma temperatura constante de 28°C.

Nenhum trabalho criativo é necessário para que um especialista na área selecione outros meios adequados para Metarhizium anisopliae var. dcjhyium Lj01.

2. Identificação de Metarhizium anisopliae var. dcjhyinm Lj01.

1) Comparação de Toxicidade de Metarhizium anisopliae var. dcjhyium Lj01

Linhagens de amostra: Cinco variantes de Metarhizium anisopliae (CCTCC M206077, AB099510, AB099941, AF280631 e AB027337) foram cultivadas em um meio PDA melhorado durante 10 dias sob temperatura constante de 28°C. Os esporos foram diluídos a 3 χ 10"7 - 3 χ 10"8 esporos/ml, usando 0,05% de Tween-80.

Térmites de amostra: O. formosanus Shiraki

Um pedaço de papel de filtro foi colocado no fundo de uma proveta e umedecido com bolas de algodão. 50 O. formosanus Shiraki foram postos na proveta. Então, no grupo de teste, 1 ml de 3 χ 10"7 - 3 χ 10"8 esporos/ml de Metarhizium anisopliae var. dcjhyium Lj01 foi colocado na proveta e no controle, foi introduzido 1 ml de Tween-80 a 0,05%. Cada teste foi repetido 5 vezes. Os resultados são mostrados na Tabela 1 a seguir:

Tabela 1 - Comparação tóxica de Metarhizium

anisopliae var. dcjhyium (CCTCC M206077) versus O. formosanus Shiraki

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Os resultados. mostram- que, quando—Metar-hi-z-ium anisopliae var. dcjhyium LjOl (CCTCC M206077) com a concentração de 3 χ IO8 esporos/ml é usado, a mortalidade de O. formosanus Shiraki no terceiro dia foi de 100%. Porém, quando tratado pelas outras quatro variantes de Metarhizium anisopliae (AB099510, AB099941, AF280631 e AB027337), sob a mesma concentração, a mortalidade de O. formosanus Shiraki foi de menos de 10% no terceiro dia, podendo demorar 12-15 dias para alcançar 100% de mortalidade. Então, comparando com as outras variantes de Metarhizium anisopliae, Metarhizium anisopliae var. dcjhyium LjOl (CCTCC M206077) apresenta a toxicidade mais forte para O. formosanus Shiraki.

2) Depois de três dias da inoculação de

Metarhizium anisopliae var. dcjhyium LjOl (CCTCC M206077), foi gerado um grande número de colônias brancas, que eram vilosas ou floculares. Depois de 9 dias de inoculação, foram gerados esporos verdes e então eles se tornaram pretos. As colônias brancas e esporos apresentaram simultaneamente baixa taxa de crescimento. Observados com microscópico óptico, os esporos tinham um formato cilíndrico alongado. 0 microscópio por esquadrinhamento de elétron mostrou que os esporos cilíndricos crescem em agrupamentos e organizam-se na forma de uma pãliçada (figs. 1-2). Para as térmites inoculadas com culturas, cresceram micélio e esporos no corpo das térmites mortas e os esporos cilíndricos alongados ficaram dispostos em agrupamentos no corpo das térmites mortas (figs. 3-4).

3) Análise de isoenzima esterase de Metarhizium anisopliae var. dcjhyium LjOl

5 variantes de Metarhizium anisopliae (CCTCC M206077, ABO99510, AB099941, AF280631 e AB027337) foram inoculadas em 100 ml de um meio esterilizado (10 g de açúcar, 2,5 g de peptona, 5 g de extrato de fermento, 1.000 ml de água), cultivadas com agitação a 180 rpm a 28°C por 60 h, filtradas para obter micélio. Foi adicionado 1 ml de 0,1 M de TBE (Tris-H3BD4-EDTA) , extraído para 1 g de micélio, a mistura foi congelada a -20°C por 24 h, então foi raspada e centrifugada (4.000 rpm, 20 minutos)

para .obter, o sobrenadante e- o —sobrenadan-te - f o-i- armazenado em refrigerador. Foi feita eletroforese de painel plano vertical com gel de poliacrilamida (3% de gel concentrado, 7% de gel separado, tamponante de eletrodo Tris-Gly, pH 8,9; 50 ml de amostra, usando- se bromofenol azul como indicador de eletroforese, com reguladores: 120 V 0,5 h, 175 V 2,5 h) . Depois do tingimento com sal B azul rápido, o resultado desta eletroforese é mostrado na figura 5. Como visto na figura 5, todas as 5 variantes de Metarhizium anisopliae apresentam espectro de isoenzima esterase (a isoenzima é o produto da sub-expressão de gene, que pode ser usado como um indicador bioquímico na genética; a isoenzima esterase pode ser usada para conduzir análises para relação de fungos e localização de gene). Comparado com às outras 4 variantes de Metarhizium anisopliae (AB099510, AB099941, AF280631 e AB027337), Metarhizium anisopliae var. dcjhyium LjOl (CCTCC M206077) apresenta um espectro distinto de isoenzima esterase. Em outras palavras, o espectro de Metarhizium anisopliae var. dcjhyium LjOl apresenta 3 Ioci (os valores de Rf são 0,4490, 0,5198 e 0,8367 respectivamente), enquanto os espectros das outras quatro variantes apresentam 6 Ioci e elas compartilham apenas um locus comum (Rf = 0,4490).

4) O DNA genômico de Metarhizium anisopliae var. dcjhyium LjOl é extraído. 18S rDNA é amplificado usando polimerase de Taq DNA e iniciadores (primers): 5'-CCAATGCCCTTCGGGGCTCA-31 e 5'-CCACCTCTCTGGGCCAGTCC-3'. 50 μΐ de sistema reativo PCR contêm: 10 χ 5 μl de tamponante, 3 μL de MgCl2 a 25 mmol/L, 5 μL de dNTP a 2 mmol/L, 2,5 μL de iniciador (primer) R a 10 μmol/L, 2,5 uL de iniciador (primer) L a 10 μmol/L, 0,5 μL de Taq E a 5 uL, 26,5 μL de H2O dd, e 5 μL de modelo de DNA (-10 ng) . Na primeira vez, a desnaturalização é conduzida a 94°C por 3 min, em uma outra vez, a desnaturalização é conduzida a 94°C por 1 min. Recoze-se a 55°C por 1 min, amplifica-se a 72°C por 1 min, e repete-se 35 vezes. Na última vez, a fase de amplificação é conduzida a 72°C durante 10 min. Subseqüentemente, os produtos de amplificação de 18S rDNA são clonados e seqüenciados (1.400 bp). Usando a seqüência de 18S rDNA altamente conservativa de Metarhizium anisopliae var. dcjhyi um Lj01 (CCTCC M206077) que entra no GenBank (banco de genes) para conduzir o alinhamento de BLAST (Basic Local Alignment Search Tool - "Ferramenta Básica de Procura de Alinhamento Local"), o resultado mostra que a seqüência de Metarhizium anisopliae var. dcjhyium Lj01 (CCTCC M206077) é 99% idêntica àquelas das outras quatro variantes de Metarhizium anisopliae (AB099510, AB099941, AF280631 e AB027337). O alinhamento da seqüência de 18S rDNA mostra que a diferença entre Metarhizium anisopliae var. dcjhyium Lj01 e as outras quatro variantes reside na substituição de 26 pares base: quatro g—»c, dois c—>g, cinco t—>a (transferência) e quatro g—>a, dois a—>g, um g—»t, um t—»g, três a—»c e quatro t—>c (transversão; fig. 6) .

5) A seqüência de 18S rDNA de Metarhizium anisopliae var. dcjhyium Lj01 (CCTCC M206077) é analisada usando o Programa de BLAST do NCBI (National Coalition Building Institute), e então usando o método de UPGMA (Unweighted Pair-Grouping Method by Mathematical Average - "Método de agrupamento por médias aritméticas") do programa MEGA ver. 3.0, para fazer a comparação de árvore filogenética (fig. 7). Metarhizium anisopliae var. dcjhyium Lj01 (CCTCC M206077) forma um monofiletismo com as outras quatro variantes de Metarhizium anisopliae (AB099510, AB099941, AF280631 e AB027337), que são 99% idênticos entre si e constituem as espécies de Metarhizium anisopliae.

Outra forma de incorporação desta invenção refere-se a um pesticida biológico compreendendo Metarhizium anisopliae var. dcjhyium Lj01. Todos os fungos, esporos, conídios, e micélios de Metarhizium anisopliae var. dcjhyium que LjOl, podem ser usados como ingredientes ativos do pesticida biológico. Os preferidos são os fungos, esporos e conidios de Metarhizium anisopliae var.· dcjhyium LjOl. Os mais preferidos são os seus esporos, que possuem boa estabilidade para armazenamento, transporte e uso.

Os ingredientes ativos do pesticida biológico da presente invenção podem ser qualquer um ou todos os fungos, esporos, conídios, e micélios de Metarhizium anisopliae var. dcjhyium Lj01. 0 pesticida biológico da presente invenção possui menor repelência, se houver, ou nenhuma repelência, para insetos peçonhentos,—particularmente para térmites

Ainda em outra forma de incorporação da presente. invenção, o pesticida biológico é um agente exterminador de térmites que compreende os fungos, esporos, conídios, micélios, ou qualquer mistura relacionada, de Metarhizium anisopliae var. dcjhyium Lj01, como o ingrediente ativo, preferivelmente, compreendendo os seus fungos e esporos e, mais preferivelmente, compreendendo os esporos. O agente exterminador de térmites possui pequena ou mesmo nenhuma fobotaxia para térmites. 0 agente exterminador de térmites da presente invenção é eficiente para matar várias térmites, por exemplo, mas não se limitando a: Coptotermes formosanus Shiraki, Reticulitermes chinensis Snyder, Odontotermes formosanus Shiraki, Macrotermes barneyi Light, Cryptotermes domesticus Haviland, Kalotermes flavicollis Fabr., Cryptotermes brevis Walker, Reticulitermes santonensis Feytaud, Heterotermes indicola Wasmann, Reticulitermes flavipes Kollar, Reticulitermes Hesperus Banks, Zootermopsis angusticollis Hagen, Nasutitermes moratus Silvestri, Coptotermes curvignathus Holmgren, Incisitermes minor Hagen, Reticulitermes virginicus Banks, Macrotermes michaelseni Sjostedt, Macrotermes bellicosus Smeathman, etc.

Os bio-pesticidas da presente invenção são eficazes para insetos. Em particular, os fungos, esporos, conídios, micélios e culturas de Metarhizium anisopliae var. dcjhyium LjOl ou qualquer mistura relacionada possuem forte atividade etiológica para insetos. Sem limitações por qualquer mecanismo, o Metarhizium anisopliae var. dcjhyium LjOl da presente invenção é um fungo parasitário de vários insetos. O Metarhizium anisopliae var. dcjhyium LjOl possui toxicidade de contato e toxicidade estomacal, que podem ser induzidas nos insetos por meio do ato de comer ou pelo contato de superfície. Os fungos reproduzem-se no inseto e esgotam a nutrição, penetram mecanicamente na praga liberam toxinas e propagam-se na população da praga, para matar as pragas.

Modo de Infecção: Metarhizium anisopliae var. dcjhyium LjOl prende-se inicialmente à epiderme do hospedeiro. Uma vez crescendo, Metarhizium anisopliae var. dcjhyium LjOl infectará o hospedeiro produzido hifas infecciosas e, assim, matara o hospedeiro. Durante este processo, Metarhizium anisopliae var. dcjhyium LjOl forma uma estrutura especial, tal como apressório, etc., e, ao mesmo tempo, excreta várias enzimas relativas, tais como quitinase, protease, lipase, etc., destrói a epiderme e infecta o corpo do hospedeiro. Além disso, Metarhizium anisopliae var. dcjhyium LjOl produz hifas, que podem ramificar-se continuamente.

Os apressórios são os conídios presos à pele do hospedeiro, que podem formar o tubo germinativo depois da germinação. 0 tubo germinativo tem boas propriedades direcionais para a epiderme. Uma série de estruturas precisas de reconhecimento, tais como apressórios, cavilhas de penetração e hifas de infecção, são necessárias para penetrar a epiderme do inseto. Estas estruturas focalizam efetivamente as capacidades físicas (mecânicas) e de dissolução dos fungos sobre uma pequena faixa da pele, o que pode ajudar a infectar o inseto. Os apressórios contêm um grande número de mitocôndrios, complexos de Golgi, retículos e ribossomos endoplásmicos e são extremamente eficientes na síntese e excreção de hidrolase.

Enzimas: A epiderme das térmites é feita principalmente de proteína, quitina e lipídios, em que os componentes principais são proteínas e microfibras de quitina, que são os locais iniciais da invasão do Metarhizium anisopliae var. dcjhyium LjOl. Uma estratégia do Metarhizium anisopliae para degradar a epiderme é produzir várias enzimas extracelulares. A epiderme da térmite é degradada pela enzima correspondente (a enzima degradante de proteína, quitina e lipídio), produzida pelas hifas durante a invasão, e, assim, torna mais fácil invasões adicionais. Ao mesmo tempo, esta degradação provê nutrientes para os micélios, para o seu posterior crescimento.

Síntese de toxina e propagação de micélios: Com base na visão atual, as toxinas fúngicas funcionam interferindo no sistema imunológico das células do hospedeiro. Metarhizium anisopliae pode produzir uma série de "toxinas de peptídeos da cricóide seis" (destruxina) durante o crescimento. Uma vez injetadas em térmites, estas toxinas imediatamente causam paralisia e relaxamento dos -músculos, - danos-- nas—membranas das células, no cito-esqueleto, no formato do karyon (núcleo), no equilíbrio de Ca2+, etc.. Ao mesmo tempo, os micélios que invadiram o inseto reproduzir-se-ão na térmite e propagar-se-ão para formar uma estrutura de rede, que invade todos os tecidos ou órgãos da térmite e assim destrói a térmite inteira.

Com exceção das características acima mencionadas, M. anisopliae var. dcjhyium que LjOl possui, além disso, as seguintes vantagens: [1] forte toxicidade; [2] pequena repelência para térmites; [3] outras vantagens, tais como matar rapidamente e controlar eficazmente as térmites. M. anisopliae var. dcjhyium LjOl pode adaptar-se às condições de vida (nutrição, temperatura, umidade, concentração de CO2, etc.) nos ninhos das térmites e tem a capacidade de infectar as térmites e, finalmente, infectar e matar cada térmite individualmente, para alcançar o propósito da exterminação da colônia inteira de térmites em iam tempo muito curto (30-50 dias).

Outra forma de incorporação desta invenção refere-se a um pesticida biológico compreendendo Metarhizium anisopliae var. dcjhyium LjOl ou esporos, conídios, micélios, ou qualquer mistura relacionada. Além disso, este pesticida compreende, além disso, feromônios de inseto.

O feromônio de trilha da térmite refere-se a substâncias químicas excretadas pela térmite para inter- relacionamentos e transferência de informações na colônia de térmites. O feromônio é necessário quando a térmite defende-se, aninha-se, procura comida e para identificação do indivíduo, etc. O análogo de feromônio refere-se à substância química que é obtida (tal como sintetizada) a partir de outras fontes, exceto térmites, e possui atividades semelhantes àquelas do feromônio de trilha da térmite. Há muitas vantagens no uso de análogos de feromônio para incitar e controlar térmites, tais como alta eficiência, inocuidade, nenhuma poluição e nenhuma lesão no inseto. Logo, os análogos de feromônio possuem iam prospecto de amplas aplicações. A térmite vive aproximadamente a 2 - 5 m de profundidade. A síntese de feromônio termítico artificial ajuda a função do Metarhizium anisopliae var. dcjhyium LjOl no controle de térmites. Completou- se asíntese química de (Ζ, Z-) -3 , 6-codlemona-1, que é o análoga de feromônio de trilha do Odontotermes formosanus Shiraki.

Com a presença de amida de lítio, usando álcool propiólico e pentano de bromo como matéria-prima, é obtido álcool de 2-octina-l. 0 resultado leva à bromização com a presença de tribromida de fósforo. Depois da bromização, os produtos reagem com álcool de 3-butina-l na presença de catalisador, tal como íon cuproso e brometil magnésio, para produzir álcool de 3,6- dodecadiína diína. Finalmente, a cis-hidrogenação selecionada é feita por meio de catalisador de Lindlar com rendimento de 42%. 0 produto final é um tipo de óleo incolor com pureza GC de 94,3%. Este procedimento de síntese é mostrado a seguir: <formula>formula see original document page 17</formula>

As bio-atividades dos feromônios de térmite sintetizados artificialmente foram testadas pelo Número-Y e teste de Student. Os resultados mostram que sob concentração ótima, nenhuma diferença significativa é encontrada na resposta de Odontotermes formosanus Shiraki, tanto para qualquer extrato de feromônio natural como ao feromônio sintetizado. Logo, a (Z,Z)- 3,6-Codlemona-l sintetizada possui atividades desejáveis.

Outra forma de incorporação da presente invenção refere-se a bio-pesticidas compreendendo Metarhizium anisOpliae var. dcjhyium Lj01, feromônio de inseto e opcionalmente, isca de inseto.

A isca de inseto usada nos bio-pesticidas da presente invenção inclui vários atrativos alimentares, compreendendo, mas não se limitando a farinha de milho, pólen de pinho, bagaço, samambaia ou similar, sacarose, proteína, fermento, melaço, pó de pinho podre, pó de paulownia podre, pó de fungo preto, glutamato de sódio, L-leucina, aspartato, vitamina B, dextrina, caramelo, etc.. Dentre esses, farinha de milho, pólen de pinho, bagaço, pó de fungo preto e sacarose são mais eficazes. Atrativos alimentares podem ser usados como um complemento para o efeito do feromônio de trilha. Um especialista da área pode selecionar a isca adequada, de acordo com a condição específica.

Os bio-pesticidas da presente invenção compreendem, além disso, vários adjuvantes, tais como preenchedores diversos, incluindo, mas não se limitando a serragem de pinho, proteína natural de animais ou plantas, amido, dextrina, açúcar em pó, lactose, celulose microcristalina, amido solúvel, sal inorgânico, manitol, etc.. Dentre esses, serragem de pinho, celulose microcristalina e proteína natural animal ou vegetal são mais eficazes. 0 especialista na área pode selecionar o preenchedor adequado, de acordo com a condição específica.

Além disso, outros adjuvantes satisfatórios usados nos bio pesticidas da presente invenção incluem vários ligantes, incluindo, mas não se limitando a pó de fibra, lecitina ou amido de milho, borra de amido, carboximetilcelulose de sódio (CMC-Na), hidroxipropil celulose (HPC), metil celulose (MC) , Etocel (EC), hidroxipropil metilcelulose (HPMC), gelatina, polivinil pirrolidona (PVP) etc.. Dentre esses, carboximetilcelulose de sódio, lecitina e amido de milho são mais eficientes. 0 especialista na área pode selecionar o preenchedor adequado, de acordo com a condição específica.

Verificou-se por meio de um teste de virulência em laboratório e um teste de controle de térmites em campo que os pesticidas para térmites da presente invenção, compreendendo M. anisopliae var. dcjhyium LjOl como ingrediente ativo, feromônio de inseto como atrativo, complementados com atrativo alimentar, podem ser usados no controle biológico de todos as térmites, com bom efeito de controle e morte das espécies de térmites.

Por exemplo, as térmites que podem ser mortas pelos pesticidas da presente invenção incluem, mas não se limitam a Coptotermes formosanus Shiraki, Reticulitermes chinensis Snyder, Odontotermes formosanus Shiraki, Macrotermes barneyi Light, Cryptotermes domesticus Haviland, Kalotermes flavicollis Fabr., Cryptotermes brevis Walker, Reticulitermes santonensis Feytaud, Heterotermes indicola Wasmann, Retieulitermes flavipes Kollar, Retieulitermes hesperus Banks, Zootermopsis angustieollis Hagen, Nasutitermes moratus Silvestri, Coptotermes eurvignathus Holmgren, Incisitermes minor Hagen, Reticulitermes virginicus Aterra, Macrotermes michaelseni Sjostedt, Macrotermes bellicosus Smeathman, etc..

Surpreendentemente, os bio-pesticidas da presente invenção também possuem forte patogenicidade a muitas outras espécies de pragas. Por exemplo, exceto por diferentes tipos de térmites, os bio-pesticidas da presente invenção também podem ser usados no controle biológico de outras pragas, tais como: Solenopsis invicta, formigas carpinteiras, formigas-faraó, gafanhotos, dendrolimus e baratas.

Estas pragas serão controladas e mortas empregando-se os bio-pesticidas da presente invenção, próximo do seu ninho ou do.

Ainda, em outra forma de incorporação da presente invenção, os bio-pesticidas da presente invenção, compreendendo M. anisopliae var. dcjhyium LjOl como ingrediente ativo, podem ser usados em várias formulações.

As formulações comuns de bio-pesticidas compreendendo M. anisopliae var. dcjhyium LjOl incluem, mas não se limitam a pó, suspensão em óleo, projétil (kit anti-inseto), microcápsulas, névoa de base oleosa, pó liberado por iam foguete, um agente protetor de ultravioleta, suspensão em água, nano- agentes, etc.. Dentre esses, o projétil (kit anti-inseto), o pó liberado por foguete e o pó são mais eficientes. O especialista na área pode selecionar a formulação adequada, de acordo com a condição específica.

1) Pó: Pó de esporos será produzido através de adsorção dos esporos de M. anisopliae var. dcjhyium LjOl por um carreador satisfatório.

2) Suspensão em óleo: A suspensão em óleo pode ser produzida suspendendo-se esporos de M. anisopliae var. dcjhyium LjOl em óleo mineral e adicionando-se uma quantidade adequada de potenciador (MgCl2, MgSO4 e Na2CO3).

3) Projétil (kit anti-inseto): 0 projétil pode ser produzido usando esporos de M. anisopliae var. dcjhyium LjOl como ingrediente ativo, feromônio de inseto como atrativo, uma quantidade de atrativo alimentar, um preenchedor e um ligante. O kit anti-inseto pode ser produzido colocando-se o projétil produzido em um dispositivo adequado.

4) Microcápsulas: A formulação de microcápsula refere-se a uma esfera com o tamanho de várias centenas de micrômetros, onde os esporos de M. anisopliae var. dcjhyium LjOl são encapsulados na microcápsula (tal como amido, sal inorgânico, etc.). A taxa de liberação do medicamento pode ser controlada alterando-se a espessura das microcápsulas e o tamanho de poro.

5) Névoa de base oleosa: Estando suspensos em óleo diesel N0 0 e atomizados por uma máquina para fazer névoa, do tipo de impulsão ("bomba de flit", por exemplo), os esporos de M. anisopliae var. dcjhyium LjOl ainda mantém sua toxicidade e atividade depois de borrifados- pelo—bi-cs—de aspersão e, assim, podem matar o Dendrolimus diretamente.

6) Pó liberado por foguete: Depois de formulado, 600 g ± 50 g de esporos de M. anisopliae var. dcjhyium LjOl foram inseridos na ogiva do foguete, o qual sobe no ar e explode, para dispersar o pó de esporos sobre o estrato alvo.

7) Agente protetor de ultravioleta: A adição de lignina e uma solução de sacarose, em pó de esporos de M. anisopliae var. dcjhyium Lj 01, pode proteger o pó da luz ultravioleta (a radiação ultravioleta do sol é o fator principal que reduz o efeito do pó de esporos de M. anisopliae var. dcjhyium Lj01), e estender a vida útil do pó.

8) Suspensão em água: Pó de esporos de M. anisopliae var. dcjhyium LjOl foi adicionado a Tween-80 a 0,05% para produzir a suspensão em água.

9) Nano-agente: O nano-agente pode ser produzido adicionando-se pó de esporos de M. anisopliae var. dcjhyium LjOl a um carreador adequado (tal como amido, sal mineral etc.), por meio de tecnologia nanométrica.

Outra forma de incorporação da presente invenção provê um método para controlar e matar pragas usando os bio- pesticidas da presente invenção, compreendendo esporos de M. anisopliae var. dcjhyium LjOl.

Os métodos usando os bio-pesticidas compreendendo esporos de M. anisopliae var. dcjhyium LjOl incluem, mas não se limitam a borrifamento, morte pelo kit, perfusão direta no formigueiro, atomização usando máquina para fazer névoa do tipo de impulsão ("bomba de flit", por exemplo), ou pulverização por meio de avião ou foguete, etc..

A presente invenção também provê um dispositivo conveniente que é útil para térmites em recinto fechado ou ao ar livre. Este dispositivo é mostrado na fig. 8. Este dispositivo é um tipo de kit tendo construção monolítica, conforme mostrado na fig. 8. É basicamente um cilindro longo com uma extremidade terminal de ponta aguda, apta para ser embutida no subsolo, e outra extremidade terminal que não tem ponta aguda e está internamente vazia, para portar os bio-pesticidas da presente invenção. Por- outro -Iador-a—extremidade terminal ; de ponta- ag-ada também pode ser projetada para ter uma parte oca, para os bio- pesticidas da presente invenção. A região indicada com a letra "R" na fig. 8, pode conter, por exemplo, M. anisopliae var. dcjhyium LjOl a 3 .x IO8 esporos/ml, 0,2 ~ 10 ng de feromônios, atrativo alimentar, um preenchedor, e um ligante de comida.

Em outra forma de incorporação da presente invenção, conforme mostrado na fig. 9, o kit anti-inseto compreende duas partes. Uma possui a extremidade terminal de ponta aguda e a outra não. A parte não aguda está internamente vazia. Então, é fácil transportar os bio-pesticidas da presente invenção. As ditas parte de ponta aguda e parte não-aguda são ligadas uma à outra por meio de um aparato de encaixe. Se o kit for usado em recinto fechado, somente a parte não-aguda é necessária. A parte não-aguda pode compreender adicionalmente algum dispositivo auxiliar, tal como uma pasta dupla para fazer a parte aderir ao local selecionado. Se o kit for usado ao ar livre, ambas as partes do kit serão fixadas juntas pelo dispositivo de encaixe e convenientemente embutidas no subsolo.

O especialista na área avaliará que a presente invenção contém várias modificações ou alterações, sem fugir do espírito da invenção. Essas modificações e alternações estão dentro do escopo limitado pelas reivindicações deste pedido.

Conforme mencionado acima, os bio-pesticidas da presente invenção também podem matar gafanhotos, dendrolimus e baratas, etc.. Especialmente para os gafanhotos e dendrolimus, os bio-pesticidas serão mais efetivos se forem pulverizados por um avião ou foguete.

Os seguintes exemplos descreverão mais detalhadamente a presente invenção. Porém, nenhum deles será limitativo do escopo da presente invenção, a qual será definida pelas reivindicações apensas.

EXEMPLOS

Exemplo 1:

Linhagens de amostra: Metarhizium anisopliae var. dcjhyium Lj01 foi cultivado no meio de PDA melhorado (200 g de batata, 20 g de açúcar, 10 g de peptona, 20 g de ágar, 1.000 ml de água a 121°C, esterilizado sob 1 atmosfera durante 30 min) durante 10 dias, sob uma temperatura constante de 28 °C. Os esporos foram diluídos a 3 χ 10^7 - 3 χ 10^8 esporos/ml usando Tween- 80 a 0,05%.

Amostra de térmites: O. formosanus Shiraki

Feromônio testado: Análogos de feromônio de trilha, sintetizados artificialmente, de O. formosanus Shiraki (Z,Z)-3,6-codlemona-l (DDE-OH), com a concentração de 0,2-10 ng/ml; um pedaço de papel de filtro foi colocado no fundo de uma proveta e umedecido com bolas de algodão. 100 térmites de amostra, DDE-OH, esporos de Metarhizium anisopliae var. dcjhyium Lj01, e Tween-80 a 0,05% foram misturados juntos e a concentração final de análogos de feromônio foi de 0,2 - 100 ng/ml. 1 ml de Metarhizium anisopliae var. dcjhyium LjOl a 3 χ 10^7 - 3 χ 10^8 esporos/ml (com DDE-OH) foi colocado na proveta, no controle, e 1 ml de Tween-80 a 0,05% foi colocado no grupo de controle. Cada teste foi repetido 5 vezes. Os resultados são mostrados na Tabela 2:

Tabela 2: Comparação tóxica de Metarhizium anisopliae var. dcjhyium Lj01 versus O. formosanus Shiraki

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1) Teste de toxicidade em laboratório O resultados mostram que DDE-OH na concentração de 6 ng/ml possui o melhor efeito atrativo para O. formosanus Shiraki. Quando Metarhizium anisopliae var. dcjhyium LjOl estava na concentração de 3 χ 10^8 esporos/ml, o melhor efeito mortal foi alcançado. Quando DDE-OH estava na concentração de 6 ng/ml e Metarhizium anisopliae var. dcjhyium LjOl estava na concentração de 3 χ IO8 esporos/ml, a mortalidade de O. formosanus Shiraki no primeiro dia alcançou 63,7% e no segundo dia alcançou 100%.

2) Teste de toxicidade ao ar livre

Foram selecionados 3 formigueiros de O. formosanus Shiraki no campo e foi embutido o kit anti-inseto da presente invenção ao redor de cada formigueiro, ou a cada 1-2 m no caminho das térmites. Cada kit continha Metarhizium anisopliae var. dcjhyium LjOl a 3 χ IO8 esporos/ml, 6 ng de feromônio DDE-OH, atrativo alimentar, preenchimento e ligante de comida. Depois de seis semanas, todas as térmites nos 3 formigueiros estavam mortas. Este resultado mostra que o feromônio DDE-OH e atrativo alimentar cooperam entre si para incitar os ergates de O. formosanus Shiraki a saírem ..para. ..comer. Estes ergates retomam—-eom—esporos de Metarhizium anisopliae var. dcjhyium LjOl na sua superfície ou boca. Então, os esporos de Metarhizium anisopliae var. dcjhyium LjOl são levados para dentro e então crescem até preencher o formigueiro inteiro. Como resultado, os esporos de Metarhizium anisopliae var. dcjhyium LjOl matam todas as térmites no formigueiro através de inter-infecção entre as térmites individualmente.

Exemplo 2;

Dosagem efetiva de Metarhizium anisopliae var. dcjhyium LjOl para matar térmites.

Linhagens de amostra: Metarhizium anisopliae var. dcjhyium LjOl foi cultivado no meio de PDA melhorado durante 10 dias, sob uma temperatura constante de 28 °C. Os esporos foram diluídos a 3 χ IO2 - 3 χ IO13 esporos/ml usando Tween-80 a 0,05%.

Amostra de térmites: O. formosanus Shiraki, Coptotermes formosanus Shiraki e Reticulitermes chinensis Snyder.

Havia 12 provetas de vidro para cada tipo de térmites. Um pedaço de papel de filtro foi posto no fundo da proveta e umedecido com bolas de algodão. 100 térmites de amostra foram colocadas na proveta e adicionadas a 1 ml de suspensão com a concentração de 3 χ IO2 - 3 χ IO13 esporos/ml, respectivamente. Cada teste foi repetido 3 vezes. O tempo requerido para que metade das térmites morresse foi registrado. Os resultados são mostrados na Tabela 3: Tabela 3: Efeito da dosagem de Metarhizium anisopliae var. dcjhyium LjOl em térmites

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A fig. 10 reflete o efeito da dosagem de Metarhizium anisopliae var. dcjhyium LjOl em térmites. Como visto na fig. 10, 3 χ 10^8 esporos/ml é a concentração ótima de Metarhizium anisopliae var. dcjhyium LjOl para a morte das térmites.

Exemplo 3:

Linhagens de amostra: Metarhizium anisopliae var. dcjhyium LjOl foi cultivado no meio de PDA melhorado durante 10 dias, sob uma temperatura constante de 28°C. Os esporos foram diluídos a 3 χ 10^7 - 3 χ 10^8 esporos/ml usando Tween-80 a 0,05%.

Amostra de térmites: Coptotermes formosanus Shiraki.

1) Teste de toxicidade em laboratório

15 provetas de vidro foram usadas no teste. Um pedaço de papel de filtro foi colocado no fundo da proveta e umedecido com bolas de algodão. 100 térmites de amostra foram postas na proveta e adicionadas a 1 ml de suspensão com a concentração de 3 χ 10^7 - 3 χ 10^8 esporos/ml, respectivamente. Para o grupo de controle, foi adicionado 1 ml de Tween-80 a 0,05%. Cada teste foi repetido 5 vezes. Os resultados são mostrados na Tabela 4:

Tabela 4: Resultado do teste de toxicidade de Metarhizium anisopliae var. dcjhyium LjOl versus Coptotermes formosanus Shiraki

<table>table see original document page 25</column></row><table> <table>table see original document page 26</column></row><table>

Os resultados mostram que Metarhizium anisopliae var. dcjhyium Lj01 com a concentração de 3 χ 10"8 esporos/ml possui excelente efeito mortal para Coptotermes formosanus Shiraki.

2) Teste de toxicidade ao ar livre

Foram selecionados 3 formigueiros de C. formosanus no campo, cavando-se um buraco nos formigueiros. Em cada formigueiro, foram injetados 100 ml de uma suspensão de esporos de Metarhizium anisopliae var. dcjhyium Lj01 a 3 χ 10"8 esporos/ml e então o formigueiro foi recuperado. Depois de 4-6 semanas, desenterrando-se os formigueiros, foi constatado que o formigueiro inteiro estava preenchido com as hifas do Metarhizium anisopliae var. dcjhyium Lj01. Por causa da formação de esporos, todas as térmites no formigueiro estavam mortas.

Exemplo 4;

Linhagens de amostra: Metarhizium anisopliae var. dcjhyium Lj01 foi cultivado no meio de PDA melhorado durante 10 dias, sob uma temperatura constante de 28 °C. Os esporos foram diluídos a 3 χ 10"7 - 3 χ 10"8 esporos/ml usando Tween-80 a 0,05%.

Amostra de térmites: Reticulitermes chinensis Snyder

1) Teste de toxicidade em laboratório provetas de vidro foram usadas no teste. Um pedaço de papel de filtro foi colocado no fundo de cada proveta e umedecido com bolas de algodão. 100 térmites de amostra foram postas na proveta e adicionadas a 1 ml de suspensão com a concentração de 3 χ 10"7 - 3 χ 10"8 esporos/ml, respectivamente. Para o grupo de controle, foi adicionado 1 ml de Tween-80 a 0,05%. Cada teste foi repetido 5 vezes. Os resultados são mostrados na Tabela 5:

Tabela 5: Resultado do teste de toxicidade de

Metarhizium anisopliae var. dcjhyium Lj01 versus Reticulitermes chinensis Snyder

Tratamento

Mortalidade de térmites (%) <table>table see original document page 27</column></row><table>

Os resultados mostram que Metarhizium anisopliae var. dcjhyium Lj01 com a concentração de 3 χ 10^8 esporos/ml possui excelente efeito mortal para Reticulitermes chinensis Snyder.

2) Teste de toxicidade ao ar livre

Foram selecionados 3 formigueiros de Reticulitermes chinensis Snyder no campo, cavando-se um buraco nos formigueiros. Em cada formigueiro, foram injetados 100 ml de uma suspensão de esporos de Metarhizium anisopliae var. dcjhyium Lj01 a 3 x 10^8 esporos/ml, e então o formigueiro foi recuperado. Depois de 4-6 semanas, desenterrando-se os formigueiros, foi constatado que o formigueiro inteiro estava preenchido com as hifas do Metarhizium anisopliae var. dcjhyium Lj01. Por causa da formação de esporos, todas as térmites no formigueiro foram mortas.

Exemplo 5:

Linhagens de amostra: Metarhizium anisopliae var. dcjhyium Lj01 foi cultivado no meio de PDA melhorado durante 10 dias, sob uma temperatura constante de 28 °C. Os esporos foram diluídos a 3 χ 10^7 - 3 χ 10^8 esporos/ml usando Tween-80 a 0,05%.

Amostra de térmites: Cryptotermes domesticus Haviland

1) Teste de toxicidade em laboratório

15 provetas de vidro foram usadas no teste. Um pedaço de papel de filtro foi colocado no fundo de cada proveta e umedecido com bolas de algodão. 100 térmites de amostra foram postas na proveta e adicionadas a 1 ml de suspensão com a concentração de 3 χ 10^7 - 3 χ 10^8 esporos/ml, respectivamente. Para o grupo de controle, foi adicionado 1 ml de Tween-80 a 0,05%. Cada teste foi repetido 5 vezes. Os resultados são mostrados na Tabela 6:

Tabela 6: Resultado do teste de toxicidade de Metarhizium anisopliae var. dcjhyium Lj01 versus Cryptotermes domesticus Haviland

Tratamento

Mortalidade de térmites (%) <table>table see original document page 28</column></row><table>

Os resultados mostram que Metarhizium anisopliae var. dcjhyium LjOl com a concentração de 3 χ IO8 esporos/ml possui excelente efeito mortal para Cryptotermes domesticus Haviland.

2) Teste de toxicidade ao ar livre

Foram selecionados 3 formigueiros de Reticulitermes chinensis Snyder no campo, cavando-se um buraco nos formigueiros. Em cada formigueiro, foram injetados 100 ml de uma suspensão de esporos de Metarhizium anisopliae var. dcjhyium LjOl a 3 χ 10^8 esporos/ml e então o formigueiro foi recuperado. Depois de 6 semanas, desenterrando-se os formigueiros, foi constatado que o formigueiro inteiro estava preenchido com as hifas do Metarhizium anisopliae var. dcjhyium Lj01. Por causa da formação de esporos, todas as térmites no formigueiro foram mortas.

Exemplo 6:

Efeito do controle de Metarhizium anisopliae var. dcjhyium LjOl em Coptotermes formosanus Shiraki

Linhagens de amostra: Metarhizium anisopliae var. dcjhyium LjOl com a concentração de 3 χ IO8 esporos/ml.

Amostra de térmites: Coptotermes formosanus Shiraki

Uma casa que foi usada durante dez anos foi atacada por Coptotermes formosanus Shiraki. O Coptotermes formosanus Shiraki podia ser encontrado no guarda-roupa, no chão de madeira, na porta de madeira e no teto da casa. O pesquisador posicionou de 6 a 8 kits no guarda-roupa, no chão de madeira, na porta de madeira e no teto da dita casa. Esses kits compreendiam esporos de Metarhizium anisopliae var. dcjhyium LjOl a 3 χ 10^8 esporos/ml, atrativo alimentar, preenchedor, ligante de comida, etc.. Depois de um mês, todas as térmites na casa estavam mortas. 30 Pode ser observado que os corpos mortos dessas térmites estavam cobertos pelas hifas ou esporos de Metarhizium anisopliae var. dcjhyium Lj01.

Exemplo 7: Teste de toxicidade de Metarhizium anisopliae var. dcjhyium LjOl versus Cryptotermes havilandi Holmgren

Linhagens de amostra: Metarhizium anisopliae var. dcjhyium LjOl foi cultivado no meio de PDA melhorado durante 10 dias, sob uma temperatura constante de 28 °C. Os esporos foram diluídos a 3 χ 10^7 - 3 χ 10^8 esporos/ml usando Tween-80 a 0,05%.

Amostra de térmites: Cryptotermes havilandi Holmgren

15 provetas de vidro foram usadas no teste. Um pedaço de papel de filtro foi colocado no fundo de cada proveta e umedecido com bolas de algodão. 50 térmites de amostra foram postas na proveta e adicionadas a 1 ml de suspensão com a concentração de 3 χ 10^7 - 3 χ 10^8-esporos/ml-, -respectivamente. Para o grupo de controle, foi adicionado 1 ml de Tween-80 a 0,05%. Cada teste foi repetido 5 vezes. Os resultados são mostrados na Tabela 7:

Tabela 7: Resultado do teste de toxicidade de

Metarhizium anisopliae var. dcjhyium LjOl versus Cryptotermes havilandi Holmgren

<table>table see original document page 29</column></row><table>

Os resultados mostram que Metarhizium anisopliae var. dcjhyium LjOl possui excelente efeito mortal para Cryptotermes havilandi Holmgren.

Exemplo 8:

Teste de toxicidade de Metarhizium anisopliae var. dcjhyium LjOl. versus Nasutitermes moratus Silvestri Linhagens de amostra: Metarhizium anisopliae var. dcjhyium LjOl foi cultivado no meio de PDA melhorado durante 10 dias, sob uma temperatura constante de 28 °C. Os esporos foram diluídos a 3 χ 10^7 - 3 χ 10^8 esporos/ml usando Tween-80 a 0,05%.

Amostra de térmites: Nasutitermes moratus Silvestri 15 provetas de vidro foram usadas no teste. Um pedaço de papel de filtro foi colocado no fundo de cada proveta e umedecido com bolas de algodão. 100 térmites de amostra foram postas na proveta e adicionadas a 1 ml de suspensão com a concentração de 3 χ 10^8 esporos/ml, respectivamente. Para o grupo de controle, foi adicionado 1 ml de Tween-80 a 0,05%. Cada teste foi repetido 3 vezes. Os resultados são mostrados na Tabela 8:

Tabela 8: Resultado do teste de toxicidade de Metarhizium anisopliae var. dcjhyium Lj01 versus Nasutitermes moratus Silvestri

<table>table see original document page 30</column></row><table>

Os resultados mostram que Metarhizium anisopliae var. dcjhyium Lj01 possui excelente efeito mortal para Nasutitermes moratus Silvestri.

Exemplo 9:

Teste de toxicidade de Metarhizium anisopliae var. dcjhyium Lj01 versus Reticulitermes flavipes Kollar Linhagens de amostra: Metarhizium anisopliae var. dcjhyium LjOl foi cultivado no meio de PDA melhorado durante 10 dias, sob uma temperatura constante de 28 °C. Os esporos foram diluídos-a 3 x 10^7 3 x 10^8 esporos/ml usando Tween-80 a 0,05%.

Amostra de térmites: Reticulitermes flavipes Kollar

15 provetas de vidro foram usadas no teste. Um pedaço de papel de filtro foi colocado no fundo de cada proveta e umedecido com bolas de algodão. 50 térmites de amostra foram postas na proveta e adicionadas a 1 ml de suspensão com a concentração de 3 χ 10^7 - 3 χ 10^8 esporos/ml, respectivamente. Para o grupo de controle, foi adicionado 1 ml de Tween-80 a 0,05%. Cada teste foi repetido 3 vezes. Os resultados são mostrados na Tabela 9:

Tabela 9: Resultado do teste de toxicidade de Metarhizium anisopliae var. dcjhyium Lj01 versus Reticulitermes flavipes Kollar <table>table see original document page 31</column></row><table>

Os resultados mostram que Metarhizium anisopliae var. dcjhyium LjOl possui excelente efeito mortal para Reticulitermes flavipes Kollar.

Exemplo 10:

Teste de toxicidade de Metarhizium anisopliae var. dcjhyium LjOl versus Solenopsis invicta

Em latim, "Solenopsis invicta" significa "formiga Invendverir"; "qué~ ãtaca principalmente humanos ou outros animais e é difícil de ser impedida. A Solenopsis invicta sempre age em uma população grande. Ao iniciar um ataque, a Solenopsis invicta ataca repetidamente o mesmo alvo. Algumas manchas vermelhas, como uma bolha, aparecem nas áreas atacadas do corpo do alvo e a sensação é a de uma queimadura. Nos E.U.A. , a Solenopsis invicta causa a perda de mais de 1 bilhão de libras a cada ano. Desde os anos 1930, 84 pessoas foram mortas pela Solenopsis invicta no sul dos E.U.A. . A Solenopsis invicta também é encontrada no sul da China, e ameaça seriamente a segurança das pessoas e do gado.

Linhagens de amostra: Metarhizium anisopliae var. dcjhyium,Lj 01 foi cultivado no meio de PDA melhorado durante 10 dias, sob uma temperatura constante de 28 °C. Os esporos foram diluídos a 3 χ IO8 esporos/ml usando Tween-80 a 0,05%.

Amostra de térmites: Solenopsis invicta 4 formigueiros de Solenopsis invicta foram selecionados no sul de China (tal como em Shenzhen) , o que induziu a perseguição provocada da Solenopsis invicta, sendo removidos com pá para 4 tanques de plástico, respectivamente. Cada tanque continha um formigueiro compreendendo aproximadamente 18-20 milhares de Solenopsis invicta. A cada tanque, foram adicionados 200 ml de uma suspensão de esporos de Metarhizium anisopliae var. dcjhyium LjOl a 3 χ IO8 esporos/ml. Os tanques estavam cobertos por uma tela de arame compacta para impedir que as Solenopsis invicta escapassem do tanque. Um tanque plástico menor foi adotado para conduzir o teste de controle, no qual somente foram colocadas as Solenopsis invicta e a terra do formigueiro, sem qualquer suspensão de esporos de Metarhizium anisopliae var. dcjhyium LjOl. 200 ml de Tween-80 a 0,05% esterilizado foram adicionados como controle. O tanque também estava coberto por uma tela de arame compacta. Os grupos de teste e o grupo de controle foram cultivados sob temperatura ambiente (25 °C).

Resultado: Foi observado que, a partir do sexto dia, algumas Solenopsis invicta nos grupos de teste estavam mortas e as hifas ou esporos de Metarhizium anisopliae var. dcjhyium LjOl começavam a aparecer na terra; no nono dia, um grande número de Solenopsis invicta nos grupos de teste estavam mortas e as hifas ou esporos de Metarhizium anisopliae --var. - dcjhyium - cresciam abundantemente nos tanques de teste; e no décimo-terceiro dia, todas as Solenopsis invicta nos grupos de teste estavam mortas. Porém, todas as Solenopsis invicta no grupo de controle ainda estavam vivas. Então, Metarhizium anisopliae var. dcjhyium LjOl possui excelente efeito mortal para Solenopsis invicta.

Exemplo 11

Teste de toxicidade de Metarhizi um anisopliae var. dcjhyium LjOl versus gafanhotos

Linhagens de amostra: Metarhizium anisopliae var. dcjhyium LjOl foi cultivado no meio de PDA melhorado durante 10 dias, sob uma temperatura constante de 28 °C. Os esporos foram diluídos a 3 χ 10^7 - 3 χ 10^8 esporos/ml usando Tween-80 a 0,05%.

Amostra de praga: gafanhotos

9 tanques de plástico foram usados no teste. Um pedaço de papel de filtro foi colocado no fundo de cada tanque e umedecido com bolas de algodão. 30 gafanhotos foram postos no 30 tanque e adicionados a 10 ml de suspensão de esporos com a concentração de 3 χ 10^7 - 3 χ 10^8 esporos/ml, respectivamente. Para o grupo de controle, foram adicionados 10 ml de Tween-80 a 0,05%. Cada teste foi repetido 3 vezes. Os resultados são mostrados na Tabela 10:

Tabela 10: Resultado do teste de toxicidade de

Metarhizium anisopliae var. dcjhyium LjOl versus gafanhotos

<table>table see original document page 32</column></row><table> <table>table see original document page 33</column></row><table>

Os resultados mostram que Metarhizium anisopliae var. dcjhyium Lj01 possui excelente efeito mortal para gafanhotos. Tratados com 10 ml de Metarhizium anisopliae var. dcjhyium Lj01 a 3 χ 10"8 esporos/ml, a mortalidade dos gafanhotos no nono dia foi de 77,4%, e no décimo-segundo dia foi de 100%.

Exemplo 12

Teste de toxicidade de Metarhizium anisopliae var. dcjhyium Lj01 versus dendrolimus

Linhagens de amostra: Metarhizium anisopliae var. dcjhyium Lj01 foi cultivado no meio de PDA melhorado durante 10 dias, sob uma temperatura constante de 28°C. Os esporos foram diluídos a 3 χ 10"7 - 3 χ 10"8 esporos/ml usando Tween-80 a 0,05%.

Amostra de praga: dendrolimus

6 tanques de plástico foram usados no teste. Alguns ramos frescos de pinho foram colocados no fundo de cada tanque. 30 dendrolimus foram postos no tanque e adicionados a 10 ml de suspensão de esporos com a concentração de 3 χ 10"8 esporos/ml, respectivamente. Para o grupo de controle, foram borrifados 10 ml de Tween-80 a 0,05% nos ramos de pinho. Cada teste foi repetido 3 vezes. Os resultados- são mostrados na Tabela 11:

Tabela 11: Resultado do teste de toxicidade de

Metarhizium anisopliae var. dcjhyium LjOl versus dendrolimus

<table>table see original document page 33</column></row><table>

Os resultados mostram que Metarhizium anisopliae var. dcjhyium Lj01 possui excelente efeito mortal para dendrolimus. Depois de tratados com 10 ml de suspensão de esporos a 3 χ 10"8 esporos/ml, a mortalidade dos dendrolimus alcançou 94,6%. Exemplo 13:

Teste de toxicidade de Metarhizium anisopliae var. ãcjhyium LjOl versus Blattella germanica

Linhagens de amostra: Metarhizium anisopliae var. dcjhyium LjOl foi cultivado no meio de PDA melhorado durante 10 dias, sob uma temperatura constante de 28 0C. Os esporos foram diluídos a 3 χ IO7 - 3 χ IO8 esporos/ml usando Tween-80 a 0,05%.

Amostra de praga: Blattella germanica 6 pequenos barris (com tampa para aeração) foram selecionados para conduzir o teste. Ao fundo de cada barril, iam pedaço de papel de filtro foi colocado, umedecido com bolas de algodão. Foram colocados em cada barril 30 baratas (Blattella g.ermanica) e 2 pedaços de-batata--fresca sem pele. Para os--grupos- de teste, foram adicionados por gotejamento 10 ml de suspensão de esporos de Metarhizium anisopliae var. dcjhyium LjOl com a concentração de 3 χ IO8 esporos/ml, e aos grupos de controle, foram adicionados por gotejamento 10 ml de Tween-80 a 0,05%. Cada teste foi repetido 3 vezes. Observada a intervalos regulares, a mortalidade de baratas é mostrada na Tabela 12:

Tabela 12: Resultado do teste de toxicidade de Metarhizium anisopliae var. dcjhyium LjOl versus baratas

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Como visto pelo resultado, M. anisopliae var. dcjhyium LjOl possui bom efeito mortal para Blattella germanica e, assim, pode ser usado no controle biológico de baratas.

Embora a invenção tenha sido descrita detalhadamente, pretende-se que a descrição acima ilustre e não limite o escopo da invenção, o qual está definido pelo escopo das reivindicações anexas. Outros aspectos, vantagens e modificações estão dentro do escopo das reivindicações a seguir. Os especialistas na área compreendem que podem ser feitas várias mudanças nas formas e nos detalhes da invenção, sem fugir do escopo da invenção englobado pelas reivindicações anexas. Enquanto isso, invenções não-descritas, que podem ser antecipadas por este pedido, também estão dentro do escopo deste pedido. 0 depositante permanece no direito de reivindicá-las no futuro.

Claims (22)

1. nmetarhizium anisopliae var. dcjhyium", caracterizado pelo fato de compreender Metarhizium anisopliae var. dcjhyium LjOl isolado, substancialmente homogêneo, compreendendo as características do número de depósito do CCTCC M206077.

2. nMETARHiziUM anisopliae", de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o Metarhizium anisopliae var. dcjhyium LjOl é um fungo entomopatogênico.

3. nMETARHiziUM anisopliae". de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o Metarhizium anisopliae var. dcjhyium LjOl é entomopatogênico para Reticulitermes chinensis Snyder.

4. nMETARHiziUM-ANXSOPLiAE", .-de acordo com -ar reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o Metarhizium anisopliae var. dcjhyium LjOl é entomopatogênico para Coptotermes formosanus Shiraki.

5. nmetarhizium anisopliae", de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o Metarhizium anisopliae var. dcjhyium LjOl é entomopatogênico para Odontotermes formosanus Shiraki.

6. nmetarhizium anisopliae", de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o Metarhizium anisopliae var. dcjhyium LjOl é entomopatogênico para um dos insetos selecionados do grupo que consiste em Macrotermes barneyi Light, Cryptotermes domesticus Haviland, Kalotermes flavicollis Fabr., Cryptotermes brevis Walker, Reticulitermes santonensis Feytaud, Heterotermes indicola Wasmann, Reticulitermes flavipes Kollar, Reticulitermes hesperus Banks, Zootermopsis angusticollis Hagen, Nasutitermes moratus Silvestri, Solenopsis invicta, formigas carpinteiras, formigas-faraó, gafanhotos, dendrolimus, baratas.

7 . nmetarhizium anisopliae", de acordo COItl a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de compreender uma quantidade de M. anisopliae var. dcjhyium LjOl eficiente para matar insetos, onde o M. anisopliae var. dcjhyium LjOl é isolado do seu hábitat natural e é cultivado, o M. anisopliae var. dcjhyium LjOl tendo número de depósito do CCTCC M206077.

8. "METARHIZIUM ANISOPLIAE", de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de compreender uma quantidade de M. anisopliae var. dcjhyium LjOl eficaz para matar insetos, em que o M. anisopliae var. dcjhyium LjOl é um fungo entomopatogênico.

9. "METARHIZIUM ANISOPLIAE", de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de compreender uma quantidade de M. anisopliae var. dcjhyium LjOl eficiente para matar insetos, em que o M. anisopliae var. dcjhyium LjOl é entomopatogênico para Reticulitermes chinensis Snyder.

10. "METARHIZIUM ANISOPLIAE", de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de compreender uma quantidade de M. anisopliae var. dcjhiym Ljo1 eficiente para matar insetos, em que o M. anisopliae var. dcjhyium LjOl é entomopatogênico para Coptotermes formosanus Shiraki.

11. "METARHIZIUM ANISOPLIAE",de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de compreender uma quantidade de M. anisopliae var. dcjhyium LjOl eficiente para matar insetos, em que o M. anisopliae var. dcjhyium LjOl é entomopatogênico para Odontotermes formosanus Shiraki.

12. "METARHIZIUM ANISOPLIAE",de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de compreender uma quantidade de M. anisopliae var. dcjhyium LjOl eficiente para matar insetos, onde o Metarhizium anisopliae var. dcjhyium LjOl é entomopatogênico para um dos insetos selecionados do grupo que consiste em Macrotermes barneyi Light, Cryptotermes domesticus Haviland, Kalotermes flavicollis Fabr., Cryptotermes brevis Walker, Reticulitermes santonensis Feytaud, Heterotermes indicola Wasmann, Reticulitermes flavipes Kollar, Reticulitermes hesperus Banks, Zootermopsis angusticollis Hagen, Nasutitermes moratus Silvestri, Solenopsis invicta, formigas carpinteiras, formigas- faraó, gafanhotos, dendrolimus, baratas.

13. "METARHIZIUM ANISOPLIAE", de acordo com as reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ou 12, caracterizado pelo fato de compreender bio-pesticidas compreendendo uma quantidade de M. anisopliae var. dcjhyium LjOl eficiente para matar insetos.

14. "Metarhizium anlsopllae", de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que nos bio- pesticidas, o dito M. anisopliae var. dcjhyium LjOl pode estar na forma de fungos, esporos, micélios, ou qualquer combinação relacionada.

15. "METARHiziUM ANISOPLIAE", de acordo com as reivindicações 13 ou 14, caracterizado pelo fato de que os bio- pesticidas compreendem adicionalmente feromônios de inseto.

16. "METARHiziUM anisopliae", de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que os bio-pesticidas compreendem adicionalmente um atrativo alimentar para insetos.

17. "METARHiziUM anisopliae", de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo-fato-de-que os bio-pesticidas compreendem adicionalmente um adjuvante.

18. "Metarhizium anisopliae var. dcjhyium E SEUS USOS", de acordo com a reivindicação 13, caracterizados pelo fato de compreenderem um método para matar insetos, em que os ditos insetos são: Coptotermes formosanus Shiraki, Reticulitermes chinensis Snyder, Odontotermes formosanus Shiraki, Macrotermes barneyi Light, Cryptotermes domesticus Haviland, Kalotermes flavicollis Fabr., Cryptotermes brevis Walker, Reticulitermes santonensis Feytaud, Heterotermes indicola Wasmann, Reticulitermes flavipes Kollar, Reticulitermes hesperus Aterra, Zootermopsis angusticollis Hagen, Nasutitermes moratus Silvestri, Solenopsis invicta, formigas carpinteiras, formigas-faraó, gafanhotos, dendrolimus, e baratas, em que o método compreende o uso, nos hábitats dos insetos, de bio-pesticidas compreendendo uma quantidade de M. anisopliae var. dcjhyium Lj01 eficiente para matar insetos.

19. "Metarhizium anisopliae var. dcjhyium E SEUS USOS", de acordo com a reivindicação 18, caracterizados pelo fato de que, no método para matar insetos, o dito M. anisopliae var. dcjhyium Lj01 pode estar na forma de fungos, esporos, micélios, ou qualquer combinação relacionada.

20. "Metarhizium anisopliae var. dcjhyium E SEUS USOS", caracterizados pelo fato de compreenderem o uso de M. anisopliae var. dcjhyium LjOl (número de depósito: CCTCC M206077) na fabricação de um agente para matar insetos.

21. "metarhizium anisopliae var. dcjhyium e seus usos", caracterizados pelo fato de compreenderem um dispositivo para matar insetos, tendo substancialmente um formato de cilindro alongado, em que o dito dispositivo em formato de cilindro alongado compreende: uma extremidade terminal de ponta aguda, onde a dita extremidade terminal de ponta substancialmente aguda é cuneiforme; lima extremidade terminal de ponta não-aguda, onde a dita extremidade terminal não-aguda tem uma parte oca.

22. "MetarhiziuM anisopliae var. dcjiixiuz seus usos", de acordo com a reivindicação 21, caracterizados pelo fato de que, no dispositivo para matar insetos, a dita parte oca compreende os bio-pesticidas de qualquer uma das reivindicações 13 a 17.