BRPI0622024A2 - genes alvo para diagnóstico especìfico para cepa de ehrlichia ruminantium e uso dos mesmos - Google Patents

Abstract

GENES ALVO PARA DIAGNóSTICO ESPECìFICO PARA CEPA DE EHRLICHIA RUMINANTIUM E USO DOS MESMOS. A presente invenção refere-se a uma combinação de genes-alvo que são úteis como marcadores genéticos para a detecção específica de cepa da Ehrlichia ruminantium. A invenção também se refere a métodos diagnósticos com a utilização da referida combinação de marcadores.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "GENES AL- VO PARA DIAGNÓSTICO ESPECÍFICO PARA CEPA DE EHRUCHIA RUMINANTIUM E USO DOS MESMOS".

A presente invenção refere-se às Rickettsiae são bactérias pato- gênicas intracelulares responsáveis por diversas doenças em seres huma- nos e em animais. As Rickettsiae são transmitidas por artrópodes, de forma mais freqüente por carrapatos, piolhos e ácaros, e ocasionam doenças im- portantes tais como o tifo epidêmico ou febre das Montanhas Rochosas. O gênero Ehrlichia compreende outras espécies patogênicas para seres hu- manos e mamíferos tais como a E.chaffensis, responsável pela erliquiose monocítica humana, E. canis o agente causador da erliquiose monocítica canina.

Outra espécie Ehrlichia ruminantium, anteriormente conhecida como Cowdria ruminantium, é o agente causador da "heartwater" ou Cow- driose uma doença economicamente importante de ruminantes domésticos. A heartwater pode ocasionar até 80% de mostalidade em animais suscetí- veis. A E. ruminantium é transmitida através dos carrapatos Amblyomma e está presente na África Sub-Sahariana e ilhas circundantes, incluindo Mada- gascar. A heartwater também está presente em várias ilhas do Caribe e está ameaçando o território Americano.

A vacinação contra a heartwater tem sido baseada há longo tempo em "infecção e tratamento". Animais novos são inoculados com san- gue que contêm os organismos virulentos, um procedimento que tem um risco elevado de reações clínicas incontroláveis e a dispersão inadvertida de parasitas e vírus indesejáveis. Uma primeira geração da vacina não-ativada contra a cowdriose com base em corpos elementares derivados a partir de cultura de células foi desenvolvida. Embora representando uma melhoria considerável e a primeira vacina contra a heartwater aceitável para uso am- plificado, o nível de proteção conferido ainda não é totalmente satisfatório.

Por certo, todos os animais desenvolvem uma reação clinica quando contes- tados a despeito da vacinação. Além disso, o gado também enfrenta a con- testação através de cepas geneticamente e anti geneticamente diversas. A diversidade da Ε. ruminantium é um problema-chave que tem sido reconhecido já há muito tempo, porém a informação não é suficiente para a formulação ótima da vacina e do diagnóstico específico. Testes de diagnóstico sorológicos da heartwater com a utilização de antígenos em bru- to a partir da bactéria total detectam reações positivas falsas devido as de- terminantes comuns do antígeno.

A diversidade da E. ruminantium foi demonstrada no nível anti- gênico através de estudos de imunização cruzada. Antígenos variáveis fo- ram identificados através de ELISA e imunoblot com a utilização de soros imunes com absorção cruzada.

A diversidade genética foi demonstrada mais tarde na ocasião do sequênciamento do gene Map 1 que mostrou um alto grau de heteroge- neidade de seqüência concentrada em três regiões hiper variáveis. O poli- formismo genômico também foi detectado com a utilização de marcadores RAPD e RFLP. Este poliformismo do DNA foi mostrado como se correlacio- nando com o poliformismo antigênico.

Os diagnósticos sorológicos e com base em ELISA foram de- senvolvidos com a utilização dos antígenos Map e GroEL (WO 99/14233). Outros peptídios para diagnóstico sorológico foram descritos (US 2002004051, US 20020132789, WO 02/066652). Embora eles tenham me- lhorado drasticamente a especificidade, eles ainda exibem a reação cruzada com E. canis e E. chaffeensis. O gene mapl considerado inicialmente como um bom marcador com relação a diversidade geográfica, foi mostrado recen- temente como não sendo restrito geograficamente. Além disso, a duração da vida dos anticorpos Mapl é bastante curta.

Os métodos de diagnóstico baseados em PCR representam os métodos de escolha para a detecção sensível e específica da Ehrlichia em ruminantes portadores clinicamente reativos ou sintomáticos, bem como em vetores. No entanto, no campo, os hospedeiros e os vetores podem estar coinfectados por vários parasitas e a diversidade de espécies e ainda com- plicada péla existência de uma diversidade extensa de intraespécies. Dessa forma, é importante prover meios e ferramentas diagnosticas que permitam não somente a identificação da E. ruminantium porém também diferencia entre as cepas diferentes.

As seqüências que permitem o diagnóstico diferencial da cepa Gardel da E. ruminantium e da cepa Welgevonden E. ruminantium já foram anteriormente descritas pelos inventores. Eles mostraram, através do se- quênciamento completo do genoma e da análise genômica comparativa que vários genes eram somente encontrados ou na cepa Gardel ou na cepa Welgevonden1 sem contraparte na outra cepa, e que diversos outros genes, embora estando presentes em ambas as cepas diferissem entre si através de uma ou de diversas mutações, tais como grandes inserções e/ou dele- ções que resultaram em uma versão de estrutura desviada e/ou truncada do gene original. Esses genes foram, por esse motivo, os alvos primários para o desenvolvimento específico de métodos diagnósticos de alvos múltiplos para diferenciar entre essas duas cepas (WO 2006/045338; Frutos et al., Journal of Bacteriology. 188: 2533-2542, 2006).

Os inventores descobriram agora que o uso de uma combinação específica de alguns dos genes objetivados descritos na (WO 2006/045338 permitiram não somente a discriminação entre as cepas Gardel e Welgevol- den, porém também de uma maneira mais geral, detectar especificamente a E. ruminantium e para descriminar entre uma ampla faixa de outras cepas de E. ruminantium que não as Gardel e Welgevolden, incluindo cepas com rela- ção as quais dados de seqüência genômica não estão disponíveis.

Um objetivo da invenção é, por esse motivo, o uso do conjunto de genes que se segue:

Erum 1, definido pela seqüência SEQ ID NO: 6

Erum2, definido pela seqüência SEQ ID NO: 3

Erum3, definido pela seqüência SEQ ID NO: 1

Erum4, definido pela seqüência SEQ ID NO: 4

Erum5, definido pela seqüência SEQ ID NO: 2

Erum6, definido pela seqüência SEQ ID NO: 5

Erum7, definido pela seqüência SEQ ID NO: 13

Erum8, definido pela seqüência SEQ ID NO: 15 Erum9, definido pela seqüência SEQ ID NO: 14

ErumIO1 definido pela seqüência SEQ ID NO: 8, como objetivos com relação a detecção específica para a cepa da E. rumi- nantium.

As seqüência de referência usadas aqui, neste pedido de paten- te para definir os genes alvo Erum de 1 a 5 e Erun 7 a 9 são aquelas identifi- cadas pela Gardel; as seqüências de referência usadas aqui, neste pedido de patente para definir os genes alvo Erum6 e ErumIO são aquelas identifi- cadas na cepa Welgevolden.

No entanto, deve ser entendido que cada um desses genes exis- te realmente sob formas alélicas diferentes, dependendo da cepa de E. ru- minantium. As formas alélicas que serão consideradas aqui, neste pedido de patente, tendo em vista a detecção específica para a cepa são de forma es- pecífica aquelas que resultam a partir de grandes inserções e/ou deleções que levam a uma desvio de estrutura ou a uma versão truncada do gene original.

Dessa forma, a invenção proporciona um método para a detec- ção específica de cepa da E. ruminantium em que o referido método com- preende determinar, para cada um dos genes Erum 1 até Erum 10 definidos acima, se o gene está presente na bactéria a ser testada, e sob qual forma alélica.

Vantajosamente, o método da invenção é executado através da realização de amplificação por PCR de todos os genes alvo de Erum 1 até Erum 10, e checando com relação a cada um dos genes, a presença de um ou mais produto ou produtos de amplificação, e o tamanho dos referidos produtos da amplificação.

Dentro do dos genes alvo Erum 1 até Erum 10, as regiões obje- tivadas de preferência são como se segue:

Para Erum 1, a região-alvo pode consistir da seqüência total SEQ ID NO: 6, ou de uma parte da mesma, de modo específico a região- alvo pode ser definida dentro da parte que se estende a partir do nucleotídeo 1 até o nucleotídeo 173 da SEQ ID NO: 6. Para Erum 2, a região-alvo pode consistir da seqüência total SEQ ID NO: 3, ou de uma parte da mesma, de modo específico a região- alvo pode ser definida dentro da parte que se estende a partir do nucleotídeo 1 até o nucleotídeo 218 da SEQ ID NO: 3.

Para Erum 3, a região-alvo pode consistir da seqüência total SEQ ID NO: 1, ou de uma parte da mesma, de modo específico a região- alvo pode ser definida dentro da parte que se estende a partir do nucleotídeo 1 até o nucleotídeo 509 da SEQ ID NO: 1.

Para Erum 4, a região-alvo pode consistir da seqüência total SEQ ID NO: 4, ou de uma parte da mesma, de modo específico a região- alvo pode ser definida dentro da parte que se estende a partir do nucleotídeo 56 até o nucleotídeo 698 da SEQ ID NO: 4.

Para Erum 5, a região-alvo pode consistir da seqüência total SEQ ID NO: 2, ou de uma parte da mesma, de modo específico a região- alvo pode ser definida dentro da parte que se estende a partir do nucleotídeo 1 até o nucleotídeo 239 da SEQ ID NO: 2.

Para Erum 6, a região-alvo pode consistir da seqüência total SEQ ID NO: 5, ou de uma parte da mesma, de modo específico a região- alvo pode ser definida dentro da parte que se estende a partir do nucleotídeo 3 até o nucleotídeo 130 da SEQ ID NO: 5.

Para a Erum 7 uma região-alvo de preferência está localizada na parte que se estende a partir do nucleotídeo 1 até o nucleotídeo 1981 da SEQ ID NO: 13, outra região-alvo de preferência está localizada dentro da parte que se estende a partir do nucleotídeo 2378 até o nucleotídio 3252 da SEQ ID NO: 13.

Para a Erum 8, uma região-alvo de preferência está localizada na parte que se estende a partir do nucleotídeo 1 até o nucleotídeo 926 da SEQ ID NO: 15, outra região-alvo de preferência está localizada dentro da parte que se estende a partir do nucleotídeo 1816 até o nucleotídio 3570 da SEQ ID NO: 15.

Para a Erum 9, uma região-alvo de preferência está localizada na parte que se estende a partir do nucleotídeo 1 até o nucleotídio 1307 da SEQ ID NO: 14, outra região-alvo de preferência está localizada dentro da parte que se estende a partir do nucleotídio 151 até o nucleotídio 1836 da SEQ ID NO: 14.

Para a Erum 10, uma região-alvo de preferência está localizada na parte que se estende a partir do nucleotídeo 1 até o nucleotídeo 598 da SEQ ID NO: 8, outra região-alvo de preferência está localizada dentro da parte que se estende a partir do nucleotídeo 792 até o nucleotídio 3522 da SEQ ID NO: 8; ainda outra região-alvo de preferência está localizada dentro da parte que se estende a partir do nucleotídio 599 até o nucleotídio 791 da SEQ ID NO: 8.

Várias técnicas para a detecção de seqüências de ácido nuclêi- co objetivadas com base na amplificação por PCR estão disponíveis na téc- nica.

Esses métodos incluem especificamente análise PCR combina- da, isto é, visualização simultânea em gel de dez reações PCR individuais, cada uma objetivando um dos genes de Erum 1 até Erum 10 definidos aci- ma. Os dez genes objetivados também podem ser analisados através de PCR múltiplas, por uma única reação de PCR que envolva a amplificação simultânea de todos os genes usando uma mistura de iniciadores e visuali- zação do padrão sobre o gel da eletroforese, ou através de reações PCR múltiplas, cada uma com relação a um sub conjunto dos genes objetivados relacionados acima.

Os exemplos não-limitativos dos iniciadores de PCR que permi- tem a execução do método da invenção são fornecidos na Tabela 2 abaixo.

Outros iniciadores de PCR adequados podem ser indicados por uma pessoa versada na técnica, com base na informação provida através da presente invenção. A título de exemplo não-ilustrativo de software de projeto de oligo- nucleotídio para a obtenção de iniciadores de PCR da invenção pode ser mencionado o Vector NTI Advance 9.0 (Invitrogene).

A invenção também compreende kits de diagnóstico para a des- criminação entre as cepas de E. ruminantium, em que os referidos kits com- preendem iniciadores de PCR para todos os genes objetivados de Erum 1 até Erum 10.

O método da invenção é útil especificamente para discriminar entre as cepas de E. ruminantium e outras cepas que não a cepa Gardel ou a cepa Welgevonden. Ele também é útil para discriminar entre a cepa Gardel e as outras cepas de E. ruminantium que não a cepa Welgevonden, ou ao inverso, entre a cepa Welgevonden e outras cepas de E. ruminantium que não a cepa Gardel. Além disso ela também permite a discriminação entre uma cepa virulenta de E. ruminantium e sua contraparte atenuada.

O método da invenção pode ser executado tanto em bactéria inteira lisada previamente ou em ácido nucléico (DMA genômico, cDNA ou mRNA) isolado a partir da referida bactéria.Ele é adequado para ser usados em diversos estágios com ciclo de vida da E. ruminantium, mais especifica- mente podem não-limitado a estágios de infecção de ruminantes domésti- cos, estágio de interação de vetor ou estágio de interação de animais em reservatório. A utilização de preferência do método da invenção inclui a de- tecção da Ehrlichia ruminantium em determinado território, a identificação da cepa específica da Ehrlichia ruminantium em um território determinado, a discriminação entre as cepas de Ehrlichia ruminantium em um determinado território ou entre regiões geográficas diferentes, a análise da movimentação das cepas no interior de uma região ou entre regiões geograficamente sepa- radas, a presença diferencial de cepas de Ehrlichia ruminantium em de a- cordo com a espécie de vetor e/ou população ou a detecção precoce e a avaliação de risco nas regiões nas quais os vetores potenciais estejam pre- sentes porém nas quais a doença não foi ainda registrada.

É exemplificada especificamente aqui a identificação das cepas da E. ruminantium com base nos padrões específicos de amplificação dos genes objetivados definidos acima.

EXEMPLO 1. CARACTERÍSTICAS GERAIS E REFÊNCIA DE SEQÜÊNCIA

Para cada cepa, o DNA purificado foi quebrado por sonicação para a geração de fragmentos de tamanhos diferentes. Depois de encher as extremidades com polimerase Klenow, os fragmentos de DNA variando a partir de 0,5 kb até 4 kb foram separados em um gel de agarose a 0,8% e coletados depois da digestão com gelase (Epicentro) de uma faixa de agaro- se cortada. Fragmentos de DNA de extremidade rombuda foram inseridos dentro de pBluescript Il KS (Stratagene) digeridos com EcoRVe desfosforila- dos. A ligação foi realizada com o kit de ligação de Fast-Link DNA (Epicen- tre) e o competente DH10B E. coli foram transformados antes do isolamento da colônia em LB-agar+ Ampicilina + Xgal +IPTG. Cerca de 15000 clones foram isolados para cada uma das cepas de E. ruminantium. O DNA plasmí- dico das cepas recombinantes de E. coli foi extraído de acordo com o méto- do de Iise alcalina e os insertos foram sequênciados em ambos os filamen- tos com a utilização de iniciadores universais M13 diretos e reversos e o kit de término ET DYEnamic (Amersham). As seqüências foram obtidas com os sequênciadores automáticos ABI 373 e ABI 377 (Applied Biosystems). Os dados foram analisados e os contigs foram montados com a utilização de pacotes de software Phred-Phrap e Consed (http://www.genome.washington.edu). As lacunas foram cheias através de sequênciamento direcionado ao iniciador. Um total de cerca de 20000 pas- sagens de seqüências em bruto foram geradas e analisadas com relação a cada uma das cepas de E. ruminantium para a geração de uma seqüência de consenso de comprimento total com uma cobertura de 6x até 7x.

A cepa Gardel da E. ruminantium e a cepa Welgevonden da E. ruminantium são cepas patogênicas virulentas causadoras de cowdriose na Ilha de Guadalupe (índias Ocidentais Francesas) e na África do Sul, respec- tivamente. O genoma das cepas Gardel e Welgevonden da E. ruminantium é disposto como um cromossomo circular de 1499920 pb e 1512977 pb, res- pectivamente. Os conteúdos G+G correspondentes com relação às cepas Gardel são de 27,51% e 27,48%. O genoma da cepa Gardel da E. ruminan- tium compreende 948 seqüências de codificação de um tamanho médio de 1018 pb que representam uma superfície total de codificação de 63% do ge- noma total. O genoma da cepa Welgevonden E. ruminantium compreende 957 genes do mesmo tamanho médio de 1018 pb. A superfície do genoma desta cepa devotada às seqüências de codificação é de 62%. Ambos os ge- nomas compreendem 36 RNA de transferência (tRNA) e 3 RNA de ribosso- mo (rRNA).

EXEMPLO 2: IDENTIFICAÇÃO DE GENES OBJETIVADOS COM RELA- ÇÃO AO DISGNOSTICO DIFERENCIAL ESPECÍFICO NAS CEPAS GAR- DEL E WELGEVONDEM DA E.RUMINANTIUM

A análise diferencial dos genomas inteiros das cepas Gardel e Welgevonden da E. ruminantium mostraram a presença de seqüências de codificação que estão presentes em somente uma das cepas e não na outra. Algumas das CDS que são únicas na cepa Gardel da E. ruminantium são encontradas somente no genoma dessa cepa e são apresentadas na Tabela 1. (Seq ID NO 1 até SEQ ID NO 5). Uma das CDS que é única na cepa Wel- gevonden da E. ruminantium e encontrada somente no genoma dessa cepa é apresentada na Tabela 1 (Seq ID NO 6). Uma vez que essas seqüências são únicas para uma ou para a outra cepa, elas representam claramente alvos para a detecção diferencial da cepa Gardel da E. ruminantium versus a cepa Welgevonden da E. ruminantium.

A análise diferencial dos genomas inteiros das cepas Gardel e Welgevonden da E. ruminantium também mostraram a presença de seqüên- cias de codificação que são afetadas por uma ou várias mutações em uma das duas cepas e para as quais um alelo de funcionalidade normal e ativa não-mutada está presente no genoma da outra cepa. As mutações produzi- ram um códon de parada que pode resultar em CDS mais curtas porém ain- da previstas dependendo do tamanho dos fragmentos restantes. Os genes truncados que resultam em uma única CDS são denominados de CDS par- ciais, enquanto que aqueles resultantes em duas ou mais CDS previstas são descritos como CDS fragmentadas. Essas seqüências de codificação são apresentadas na Tabela 1. Um de tais CDS Np genoma da cepa Gardel da E. ruminantium que é afetado por mutação e é diferente da sua contraparte de origem na cepa Welgevonden da E. ruminantium é apresentado na Tabe- la 1 (SEQ ID NO 7). Essa é uma versão truncada do gene de origem na ce- pa Welgevonden da E. ruminantium (Tabela 1, SEQ ID NO 8). O genoma da cepa Welgevonden da E. ruminantium também contem genes mudados, com relação as suas contrapartes alélicas variantes da cepa Gardel da E. rumi- nantium. Três de tais CDS que são afetadas por mutação gerando uma ver- são truncada dos genes estão apresentadas na Tabela 1 (SEQ ID NO 9 até SEQ IG NO 12). O alelo original de comprimento total dessas CDS presen- tes no genoma da cepa Gardel da E. ruminantium são mostrados na Tabela 1 (SEQ ID NO 13 até a SEQ ID NO 15). Uma série de CDS na cepa Welge- vonden da E. ruminantium (SEQ ID NO 11 e SEQ ID NO 12), cujos alelos originais de comprimento total são encontrados no genoma da cepa Gardel da E. mminantium (Tabela 1, SEQ ID NO 15) foi afetada por mutações ge- rando um desvio de estrutura.

<table>table see original document page 11</column></row><table> EXEMPLO 3: DETECÇÃO DIFERENCIAL DA CEPA GARDEL E DA CEPA WELGEVONDEN DE E. RUMINANTIUM COM BASE EM PADRÕES DE AMPLIFICACÃO POR PCR DOS GENES OBJETIVADOS.

Identificação diferencial por PCR das cepas Gardel e Welgevon- den da E. ruminantium foi conseguida com a utilização dos iniciadores des- critos na Tabela 2.

<table>table see original document page 12</column></row><table> <table>table see original document page 13</column></row><table>

O DNA é extraído a partir de corpos elementares de E. ruminan- tium, como descrito por Perez et ai (1997). As cepas de E. ruminantium são cultivadas em células BUEC como descrito acima. Os corpos elementares são purificados a partir do sobrenadante da cultura através de centrifugação diferencial e ressuspensos em 350 μl de PBS ao qual são adicionados 150 μl de tampão contendo Tris-HCl a 25 mM (pH 8,0), MgCl2 a 10 mM e 125 pg de DNase com a finalidade de remover O DNA contaminante da célula hos- pedeira. Depois da incubação durante 90 min a 37°C, a reação é parada a- través da adição de 25 mM EDTA. Os corpos elementares são lavados três vezes em água e Iisados por incubação de um dia para o outro a 55°C em uma solução de Tris-HCI a 100 mM (pH 8,0), NaCI a 150 mM, EDTA a 25 mM, 1.5% SDS e 250 μg/ml de proteinase Κ. O DNA bacteriano é extraído com fenol-clorofórmio, precipitados com etanol frio e ressuspensos em água destilada estéril. A contaminação com o DNA da célula é avaliado através de hibridização em "slot blot" com a utilização de DNA bovino marcado como uma sonda e diluições de DNA bovino (12,5 ng e 25 ng) como os controles positivos.

A amplificação de amplicons por PCR é realizada através da misturação de 250 ng de DNA de E. ruminantium, 2,5 U de Taq DNA polime- rase, de cada um de dNTP a 200 nM, cada um, iniciador de senso e antis- senso a 1 μΜ, e MgCI2 a 3 mM em um volume final de 50 μΙ. A amplificação é feita sob as seguintes condições durante 5 minutos de desnaturação a 94°C, seguido por 30 ciclos de amplificação com 2 minutos de desnaturação, 45 segundos de tempera a 45°C e uma extensão de 2 minutos a 72°C. Uma etapa extra de extensão de 10 minutos a 72°C é adicionada depois de com- pletar os 30 ciclos. Os produtos de PCR1 isto é, os amplicons são analisados por eletroforese em gel de agarose a 1 % em tampão de Tris-borato-EDTA.

Os resultados estão resumidos na Tabela 3, Figura 1 e Figura 2. Legenda da Figura 1:

1: Marcador de peso molecular (escada de 100-bp); 2: Erga com iniciadores P-Erum 1-A + P-Erum 1-B; 3: Erwe com iniciadores P-Erum 1-A + P-Erum 1- B; 4: Amostra de controle com iniciadores P-Erum 1-A + P-Erum 1-B; 5: Erga com iniciadores P-Erum 2-A + P-Erum 2-B; 6: Erwe com iniciadores P-Erum 2-A + P-Erum 2-B; 7: Amostra de controle com iniciadores P-Erum 2-A+P- Erum 2-B; 8: Erga com iniciadores P-Erum 3-A+P-Erum 3-B; 9: Erwe com iniciadores P-Erum 3-A + P-Erum 3-B; 10: Amostra de controle com iniciado- res P-Erum 3-A + P-Erum 3-B; 11: Erga com iniciadores P-Erum 4-A + P- Erum 4-B; 12: Erwe com iniciadores P-Erum 4-A + P-Erum 4-B; 13: Amostra de controle com iniciadores P-Erum 4-A + P-Erum 4-B; 14: Erga com inicia- dores P-Erum 5-A + P-Erum 5-B; 15: Erwe com iniciadores P-Erum 5-A + P- Erum 5-B; 16: Amostra de controle com iniciadores P-Erum 5-A + P-Erum 5- B; 17: Erga com iniciadores P-Erum 6-A + P-Erum 6-B; 18: Erwe com inicia- dores P-Erum 6-A + P-Erum 6-B; 19: Amostra de controle com iniciadores P- Erum 6-A + P-Erum 6-B; 20: Marcador de peso molecular (I EcoRI-Ay/ndlll). Legenda da Figura 2:

1: Marcador de peso molecular (escada de 100-bp); 2: Erga com iniciadores P-Erum 7-A + P-Erum 7-B; 3: Erwe com iniciadores P-Erum 7-A + P-Erum 7- B; 4: Amostra de controle com iniciadores P-Erum 7-A + P-Erum 7-B; 5: Erga com iniciadores P-Erum 9-A + P-Erum 9-B; 6: Erwe com iniciadores P-Erum 9-A + P-Erum 9-B; 7: Amostra de controle com iniciadores P-Erum 9- A+Perum 9-B; 8: Erga com iniciadores P-Erum 10-A+P-Erum 10: -B; 9: Erwe com iniciadores P-Erum 10-A + P-Erum 10-B; 10: Amostra de controle com iniciadores P-Erum 10-A + P-Erum 10-B; 11: Marcador de peso molecular (I EcoRI-H/ndlll); 12: Marcador de peso molecular (escada de 100-bp); 13: Er- ga com iniciadores P-Erum 8-A + P-Erum 8-B; 14: Erwe com iniciadores P- Erum 8-A + P-Erum 8-B; 15: Amostra de controle com iniciadores P-Erum 8- A + P-Erum 8-B.

Como mostrado na Tabela 3, Figura 1 e Figura 2, todos oa pares de iniciadores descritos na Tabela 3 permitiram a identificaação diferenciada e a discriminação das cepas Gardel e Welgevonden. As reações de PCR produziram os resultados esperados a partir da previsão in silico dos ampli- cons (Tabela 3). Os pares P-Erum 1-A + P-Erum 1-B, P-Erum 2-A + P-Erum 2-B, P-Erum 3-A + P-Erum 3-B, P-Erum 4-A + P-Erum 4-B, P-Erum 5-A + P- Erum 5-B, que objetivam genes únicos presentes somente na cepa Gardel geraram os amplicons únicos previstos de 172 pb 217 pb, 508 pb, 642 pb e 238 pb, respectivamente, na cepa Gardel enquanto não gerando faixas na cepa Welgevonden (Tabela 3, Figura 1). O par de iniciadores P-Erum 6-A + P-Erum 6-B que objetivaram um único gene somente presente na cepa Wel- gevonden produziram, como previsto, um único amplicon de 127 pb enquan- to não foi obtido nenhum produto de PCR na cepa Gardel (Tabela 3, Figura 1). Os pares P-Erum 7-A + P-Erum 7-B, P-Erum 8-A + P-Erum 8-B, P-Erum 9-A + P-Erum 7-B e P-Erum 10-A + P-Erum 10-B objetivando os genes torn- eados produziram produtos de PCR dos respectivos tamanhos previstos de 2791 pb 552 pb+ 1071 pb, 1361 pb e 1095 pb na cepa Gardel e 2395 pb, 492 pb, 1178 pb e 1691 pb na cepa Welgevonden, respectivamente (Tabela 3, Figura 2). Uma faixa adicional de 480 pb é observada na cepa Gardel com o par P-Erum 8-A + P-Erum 8-B. Esta faixa adicional é mais provável devido a uma única resposta de baixa especificidade ocorrendo em Erga.

Os pares de iniciadores P-1350-A + P-1350-B, P-4510-A + P- 4510-B, P-5750-A + P-5750-B e P-7420-A + P-7420-B produziram Produtos PCR do tamanho respectivo previsto de 2791, 552+1071, 1361 e 1095 na cepa Gardel e 2395, 492, 1178 e 1691 na cepa Welgevonden, respectiva- mente (Tabela 3, Figura 1 e Figura 2). Uma faixa adicional de 480 bp é ob- servada na cepa Gardel com o par P-4510-A + P-4510-B. Esta faixa adicio- nal é mais provavelmente devido a uma resposta de baixa especificidade ocorrendo na cepa Gardel.

Tabela 3. Triagem diferencial de PCR específica para a cepa Gardel e da cepa Welgevonden da E.ruminantium.

<table>table see original document page 16</column></row><table>

EXEMPLO 4: DETECÇÃO PCR DIFERENCIAL ESPECÍFICA PARA CEPA E IDENTIFICAÇÃO DAS CEPAS DE E. RUMINANTIUM DIFERENTES DA CEPA GARDEL E DA CEPA WELGEVONDEN.

Os iniciadores relacionados na Tabela 2 foram usados pata a identificação específica e a discriminação de outras cepas de E. ruminantium que não a cepa Gardel e a cepa Welgevonden. As outras cepas que não as Gardel e Welgevonden apresentadas neste exemplo são as cepas Umpala (Moçambique), Senegal (Senegal), Bankouma (Burkina Faso) , Bekuy (Bur- kina Faso), Lamba (Burkina Faso), Banan 1 (Burkina Faso) e Banan 2 (Bur- kina Faso).

Essas cepas são apresentadas aqui, neste pedido de patente para ilustrar amostras de partes diferentes da África Sub-Sahariana e do Caribe.

O DNA é extraído a partir dos corpos elementares de E. rumi- nantium e a amplificação PCR foi realizada como descrita no Exemplo 3.

Os resultados são mostrados na Tabela 4, Figura 3 e Figura 4.

Legenda da Figura 3:

A. Detecção PCR com iniciadores P-Erum 1-A + P-Erum 1-B

B. Detecção PCR com iniciadores P-Erum 3-A + P-Erum 3-B

C. Detecção PCR com iniciadores P-Erum 2-A + P-Erum 2-B

D. Detecção PCR com iniciadores P-Erum 4-A + P-Erum 4-B

E. Detecção PCR com iniciadores P-Erum 6-A + P-Erum 6-B

F. Detecção PCR com iniciadores P-Erum 5-A + P-Erum 5-B

MW1: Marcador de peso molecular (escada de DNA de 100 pb); MW2: Mar- cador de peso molecular 3: Cepa Bankouma; 4: Cepa Bekuy; 5: Cepa Lam- ba, 6: Cepa Banan 1; 7: Cepa Banan 2; NC: Controle negativo; G. Cepa Gardel; W: Cepa Welgevonden.

Legenda da Figura 4:

A. Detecção PCR com iniciadores P-Erum 7-A + P-Erum 7-B

B. Detecção PCR com iniciadores P-Erum 8-A + P-Erum 9-B

D. Detecção PCR com iniciadores P-Erum 10-A + P-Erum 10-B

MW1: Marcador de peso molecular (escada de DNA de 100 pb); MW2: Mar- cador de peso molecular (I /-//ndlll/EcoRI); 1: Cepa Bankouma; 2: Cepa Be- kuy; 3: Cepa Lamba; 4: Cepa Banan 1; 5: Cepa Banan 2; 6: Cepa Gardel atenuada (Gatt); 7: Cepa Gardel CTVM; 8: Cepa Senegal; 9: Cepa Senegal atenuada (Satt); NC: Controle negativo; G. Cepa Gardel; W: Cepa Welgevonden.

Como mostrado na Tabela 4, Figura 3 e Figura 4, o uso combi- nado de todos os pares de iniciadores descritos na Tabela 2 permitiu a iden- tificação diferencial e a discriminação das outras cepas que não as cepas Gardel e Welgevonden. Os resultados das reações PCR estão resumidos na Tabela 4. Os pares Os pares P-Erum 1-A + P-Erum 1-B1 P-Erum 2-A + P- Erum 2-B, P-Erum 3-A + P-Erum 3-B, P-Erum 4-A + P-Erum 4-B, P-Erum 5- A + P-Erum 5-B que objetivam genes únicos presentes somente na cepa Gardel e o par P-Erum 6-A + P-Erum 6-B que objetiva um gene único pre- sente somente na cepa Welgevonden todos produziram padrões diferentes de Produtos PCR dependendo da cepa (Tabela 4, Fig 3). Padrões diferentes dependentes da cepa também foram observados com a utilização dos pares P-Erum 7-A + P-Erum 7-B, P-Erum 8-A + P-Erum 8-B, P-Erum 9-A + P-Erum 7-B e P-Erum 10-A + P-Erum 10-B que objetivaram os genes truncados (Ta- bela 4, Figura 3).

É no entanto a análise total de todos os padrões de PCR produ- zidos por todos ao pares de iniciadores descritos na Tabela 2 que proporcio- na um diagnóstico específico para a cepa. As cepas Bekuy e Lamba que foram isoladas em Burkina Faso a partir das aldeias próximas de Bekuy e Lamba respectivamente, são as mais prováveis de serem dois isolados da mesma cepa. Além disso, essas cepas exibem o mesmo genótipo map-1 determinado por amplificação de PCR e o sequênciamento do gene map-1. Todas as outras cepas exibem genótipos map-1 diferentes. Isso indica tam- bém que as cepas Bekuy e Lamba são dois isolados da mesma cepa. O pa- drão total idêntico obtido a partir dessas duas cepas com todos os pares de iniciadores descritos na Tabela 2 também ainda demonstram a especificida- de de cepa do assunto desta invenção e a sua capacidade de identificar ce- pas diferentes e isolados separados da mesma cepa. Tabela 4

<table>table see original document page 19</column></row><table> EXEMPLO 5: DETECÇÃO PCR DIFERENCIAL ESPECÍFICA E IDENTIFI- CAÇÃO DE DERIVADOS ATENUADOS E DIFERENTES DAS CEPAS GARDEL E SENEGAL.

Os iniciadores relacionados na Tabela 2 também permitem a identificação específica de variantes atenuadas de cepas conhecidas de E ruminantium.

As variantes que se seguem foram testadas: - derivados atenuados da cepas Gardel e Senegal denominados Gatt (para Gardel-atenuado) e Satt (para Senegal-atenuado), respectiva- mente. A cepa Gatt foi obtida a partir da cepa virulenta Gardel através de 248 passagens sucessivas em células BUEC enquanto que a cepa Satt foi obtida a partir da cepa virulenta Senegal em seguida a 64 passagens em células BUEC. Ambas as cepas Gatt e Satt exibem um fenótipo atenuado caracterizado pela falta de virulência.

- cepa Gardel CTVM1 que é um sub conjunto da cepa Gardel mantida em um ambiente de célula diferente, e foi reportada como tendo sido submetida a mutações no operon mapl e exibindo um fenótipo diver- gente (Bekker etal., 2004).

O DNA é extraído a partir de corpos elementares de E. ruminan- tium e a amplificação por PCR executada como descrita no Exemplo 3.

Os resultados estão exibidos na Tabela 5, Figura 4, e Figura 5. Legenda da Figura 4:

A. Detecção PCR com iniciadores P-Erum 7-A + P-Erum 7-B

B. Detecção PCR com iniciadores P-Erum 8-A + P-Erum 8-B

C. Detecção PCR com iniciadores P-Erum 9-A + P-Erum 9-B

D. Detecção PCR com iniciadores P-Erum 10-A + P-Erum 10-B

MW1: Marcador de peso molecular (escada de DNA de 100pb DNA); MW2: Marcador de peso molecular (I H/ndlll/EcoRI); 1: Cepa Bankouma; 2: Cepa Bekuy; 3: Cepa Lamba; 4: Cepa Banan 1; 5: Cepa Banan 2; 6: Cepa Gardel atenuada (Gatt); 7: Cepa Gardel CTVM; 8: Cepa Senegal; 9: Cepa Senegal atenuada; NC: controle negativo; G: Cepa Gardel; W: cepa welgevonden.

Legenda da Figura 5: - A. Analise por PCR de cepas virulentas e atenuadas com os iniciadores P- Erum 1-A + P-Erum 1-B

MW1: Marcador de peso molecular (escada de DNA de 100pb DNA); MW2:

Marcador de peso molecular (I H/ndlM/EcoRI); 1: Cepa Gardel atenuada (Gatt); 2: cepa Gardel; 3: controle negativo.

- B. Analise por PCR de cepas virulentas e atenuadas com os iniciadores P- Erum 2-A + P-Erum 2-B e P-Erum 6-A + P-Erum 6-B

MW1: Marcador de peso molecular (escada de DNA de 100 pb DNA); MW2:

Marcador de peso molecular (I H/ndlll/EcoRI); Análise com P-Erum 2-A + Ρ- Erum 2-B de 1: Cepa Gardel atenuada (Gatt); 2: Cepa Gardel; 3: Controle negativo; Análise com P-Erum 6-A + P-Erum 6-B de 4: Cepa Gardel atenua- da (Gatt); 5: Cepa Gardel; 6: Cepa Welgevonden; 3: controle negativo.

- C. Analise por PCR de cepas virulentas e atenuadas com os iniciadores P- Erum 3-A + P-Erum 3-B, P-Erum 4-A + P-Erum 4-B e P-Erum 5-A + P-Erum 5-B

MW1: Marcador de peso molecular (escada de DNA de 100 pb DNA); MW2:

Marcador de peso molecular (I HindWUEcoR\)\ Análise com P-Erum 4-A + P- Erum 4-B de 1: Cepa Gardel atenuada (Gatt); 2: Cepa Gardel; 3: Controle negativo; Análise com P-Erum 5-A + P-Erum 5-B de 4: Cepa Gardel atenua- da (Gatt); 5: Cepa Gardel; 6: Controle negativo; Análise com P-Erum 3-A + P-Erum 3-B de 7: Cepa Gardel atenuada (Gatt); 8: Cepa Gardel; 9: Cepa Gardel; 10: Controle negativo.

Como mostrado na Tabela 5, Figura 4 e Figura 5 o uso combi- nado de todos os pares descritos na tabela 2 também permitiram a identifi- cação e a discriminação diferencial de variantes e derivados atenuados de cepas conhecidas. O resultado das reações de PCR foram resumidos na Tabela 5. Os padrões totais de PCR gerados na cepa Gardel e dois dos seus derivados, a cepa Gardel CTVM e a cepa Gatt atenuada mostram a presença de ligeira variação - Tabela 5, Figura 4, Figura 5. Além disso, cada cepa é caracterizada através de um padrão específico. A cepa Gatt é dife- rente da cepa virulenta Gardel de origem from pelos produtos dos pares de iniciadores P-Erum 6-A + P-Erum 6-B e P-Erum 7-A + P-Erum 7-B, enquanto que a cepa Gardel CTVM difere da cepa Gardel de origem pelo produto a partir dos iniciadores P-Erum 6-A + P-Erum 6-B. Similarmente, o par de ini- ciadores P-Erum 7-A + P-Erum 7-B permitiu a discriminação entre a cepa Gardel CTVM e a cepa Gardel atenuada cepa Gatt. Uma situação similar é observada entre a cepa virulenta de origem Senegal e o seu derivado atenu- ado Satt (Tabela 5, Figura 4). A cepa virulenta Senegal e as cepas atenua- das Satt diferem pelo produto de PCR a partir dos pares de iniciadores P- Erum 2-A + P-Erum 2-B, P-Erum 3-A + P-Erum 3-B, P-Erum 6-A + P-Erum 6- B e P-Erum 7-A + P-Erum 7-B.

Tabela 5: Identificação diferencial de cepas Gardel atenuada e cepas Sene- gal da E. ruminantium

<table>table see original document page 22</column></row><table>

EXEMPLO 6: AUSÊNCIA DE REAÇÃO CRUZADA COM OUTRAS RIC-

KETTSIAES. Para verificar a avaliação da especificidade dos iniciadores rela- cionados na Tabela 2, eles foram testados em Rickettsiales pertencebtes a outras espécies e gênero que não a E. ruminantium, isto é, Ehrlichia canis, Anaplasma platys and Anaplasma marginale.

A extração do DNA e a amplificação por PCR foram realizadas como descritas no Exemplo 3.

Os resultados estão mostrados Figuras 6, 7 e 8. Legenda da Figura 6:

- A. Detecção por PCR com a sonda EHR16S específica para Ehriichia spp. 16S rDNA

MW: Marcador de peso molecular (escada de 100-bp); 1, 2 e 3: DNA isolado a partir de amostras de sangue de cães infectados com Anaplasma platys, 4, 5 e 8; DNA isolado a partir de amostras de sangue de cães infectados com Ehrlichia canis; 6. Controle positivo Ehrlichia canis; 7: Controle negativo; 9 e 10 Controle de DNA isolado a partir de amostras de sangue de cães não- infectados.

- B. Detecção por PCR com sondas de PCR Nested específicas para Ana- plasma platys

MW: Marcador de peso molecular (escada de 100-bp); 1, 2 e 3: DNA isolado a partir de amostras de sangue de cães infectados com Anaplasma platys.

- C. Detecção por PCR com sondas de PCR Nested específicas para Ehrli- chia canis

MW: Marcador de peso molecular (escada de 100-bp); 4, 5 e 8: DNA isolado a partir de amostras de sangue de cães infectados com Ehrlichia canis; 11: DNA a partir de culturas de monócitos caninos infectadas com E. canis (so- brenadante); 12: DNA a partir de culturas de monócitos caninos infectadas com E. canis (pélete).

Legenda da Figura 7:

A. Detecção PCR com iniciadores P-Erum 1-A + P-Erum 1-B

B. Detecção PCR com iniciadores P-Erum 2-A + P-Erum 2-B

C. Detecção PCR com iniciadores P-Erum 3-A + P-Erum 3-B

D. Detecção PCR com iniciadores P-Erum 5-A + P-Erum 5-B Ε. Detecção PCR com iniciadores s P-Erum 6-A + P-Erum 6-B MW1: Marcador de peso molecular (escada de DNA de 100 pb ); MW2: Mar- cador de peso molecular (IH/ndIII/EcoRI); 1, 2 e 3: DNA isolado a partir de amostras de sangue de cães infectados com Anaplasma platys, 4, 5 e 8: DNA isolado a partir de amostras de sangue de cães infectados com Ehrli- chia canis; 9 e 10: Controle de DNA isolado a partir de amostras de sangue de cães não-infectados, 11: DNA a partir de culturas de monócitos caninos infectadas com E. canis (rSObrenadante); 12: DNA a partir de culturas de mo- nócitos caninos infectadas com E canis (pélete); Am: DNA a partir de Ana- plasma marginale; G: DNA a partir da cepa Gardel; NC: Controle negativo. Legenda da Figura 8:

A. Detecção PCR com iniciadores P-Erum 7-A + P-Erum 7-B

B. Detecção PCR com iniciadores P-Erum 8-A + P-Erum 8-B

C. Detecção PCR com iniciadores P-Erum 10-A + P-Erum 10-B

D. Deteção PCR com iniciadores P-Erum 4-A + P-Erum 4-B MW1:D Marcador de peso molecular (escada de DNA de 100 pb ); MW2: Marcador de peso molecular (I HindWUEcoR\)] 1, 2 e 3: DNA isolado a partir de amostras de sangue de cães infectados com Anaplasma platys, 4, 5 e 8: DNA isolado a partir de amostras de sangue de cães infectados com Ehrli- chia canis; 9 e 10: Controle de DNA isolado a partir der amostras de sangue de caes não-infectados, 11: DNA a partir de culturas de monocitos caninos infectadas com E. canis (sobredadante); 12: DNA a partir de culturas de mo- nocitos caninos infectadas com E. canis (pélete); Am: DNA de Anaplasma marginale; G: DNA da cepa Gardel; W: DNA da cepa Welgevonden; NC: Controle negativo.

A Figura 6 indica que as amostras usadas por certo continham DNA de A. platys e E. canis como demonstrado pelo reconhecimento das mesmas através de iniciadores específicos para 16S rDNA e iniciadores pa- ra PCR específico aninhado em cada espécie. Como mostrado na Figura 7 e na Figura 8, os pares de iniciadores descritos na Tabela 2 são estritamente específicos para E. ruminantium e não exibem reação cruzada com outras Rickettsiales relacionados uma vez que nenhum produto específico de PCR pode ser detectado em E. canis, A. platys e A. marginale (Figura 7 e Figu- ra8). Enquanto que nenhum produto de PCR é detectável em qualquer par de iniciadores que foi usado, produtos de PCR foram visíveis A. platys e E. canis. No entanto, todos esses produtos de PCR são gerados através de reações cruzadas com células de sangue canino como mostrado pela detec- ção dessas mesmas faixas em células caninas não-infectadas (Figura 7 e Figura 8). Isso demonstra que os iniciadores descritos na Tabela 2 e que objetivaram os genes objetivados descritos na Tabela 1 permitiram a identifi- cação específica de E. ruminantium e a discriminação entre as cepas de E. ruminantium mesmo quando outras Rickettsiales estão presentes.

As ferramentas providas pela invenção permitem dessa forma para ambas a detecção específica de E. ruminantium, mesmo na presença de Ricketssiales contaminantes relacionados, para a discriminação específi- ca entre uma cepa virulenta e os seus derivados atenuados para vacina. Is- so por sua vez permite a monitoração da vacinação. LISTAGEM DE SEQÜÊNCIA

<110> - CENTRE DE COOPERATION INTERNATIONALE EN RECHERCHE AGRONOMIQUE

POUR LE DEVELOPPEMENT (CIRAD)

- CENTRE NATIONAL DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE

- FRUTOS, Roger

- VACHIERY, Nathalie

- LEFRANCOIS, Thierry

- FERRAZ, Conception

- DEMAILLE, Jacques

- MARTINEZ, Dominique

<120> GENES ALVO PARA DIAGNÓSTICO ESPECÍFICO PARA CEPA DE EHRLICHIA

RUMINANTIUM E USO DOS MESMOS

<130> MJP/mad-F1367-12/WO

<160> 35

<170> PatentIn versão 3.3

<210> 1

<211> 630

<212> DNA

<213> Ehrlichia ruminantium

<400> 1

atgaaaggat ctttatctgc taaagttatt tctgaaaatc taccattagt agagatggaa

aaagcagttc ttagtcctac tgctcgtatt tttctcacta atcataagtt gggacctgtc

atggaccttg gaatttatat cttaatacat catagtaatc ttcgtttatt aacgaaggaa

aacctttatc ctgctaataa cctaagtaaa attggtaaag tggtgctttg taaacctttg

tctataggca atggcataca tacagtacat atgtacttta atgaactcga agctttaaaa

gaattcggag gattagaaaa tgctcgcttt acaacagtac gtccggactc ccccttgcat

acacatacat ctaaaaaaaa gaaatcatta tttacaaaac gttcagatac ttgctataca

ctattatgtg aggaatctta tacagatcca aataataccg aaactgatag tacagtaaaa

gcaatatcac ataatgaaga agaagaaggt gcagtaagag gagatatacc acaatatcaa

ctttccaatg ccgaagcact aggtcgtggt cttgcttttt tccatgatgt tgcaagtaat

tttgaaacat tatgcagaag ataccattaa

60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 630 60 120 180 240

gaaatgcttt caatatcaga tacagagggg ggggggggag agcttagtag aagaaaattc 300

303

<210> 2 <211> 303 <212> DNA <213> Ehrlichia ruminantium <400> 2 atggatttaa ataaactaat aaagagatta gtattttcat ttgtaatgat taattttgtt aataggtttt ttagtaatac agaaagtgaa agcttgcatt taagtgatag tttacgacat tattattatt ttctatgttt gtgccatgca gtaatggggt ttattatagt aaatacagat ggatataaca tccttgagga ttttatgttc tcagaacaaa tcgtaggtag agaaaatgca gaaatgcttt caatatcaga tacagagggg ggggggggag agcttagtag aagaaaattc tag <210> 3 <211> 270 <212> DNA <213> Ehrlichia ruminantium <400> 3 atgtatttag tctatttagt agctggtttt gtggtactat atagtaatta tcgagatata aattatgata aaaaacttgc tattctttat tctaggggag aagatgatga atataaatat gttcctagga aagagcagaa taatcaatat tattttcata taaaattgta tagtgttaag ttaaatttaa tgtcagatat tgttcaatta gatgttataa tgttaaaagg attttattat agcaatatgt ttaatgtctt tttattttaa <210> 4 <211> 828 <212> DNA <213> Ehrlichia ruminantium <400> 4 gtgtgttact taattggtaa ttttatgtta ttcaaataca atcctcaaaa tactaaagaa ttacatgatg cagctttaaa ttgtttacgt catacaagat tatatgcata tagctaccgt tgtataggac atactgaacc taatggaaca ctacatgtat tcataagtaa agataaatca aataatttgt gtttaccaaa agaagggtat tctctattct atatagaatg tagtctatct gataagagag tatctcagaa tcaggaaata agagatatga tgcaagcagt tgtccgccac aaaattaacc gccttgcttt taataaccct cacacgacac ctaccataga tgtaggcatt

60 120 180

ttaaatttaa tgtcagatat tgttcaatta gatgttataa tgttaaaagg attttattat 240

270

25

60 120 180

aataatttgt gtttaccaaa agaagggtat tctctattct atatagaatg tagtctatct 240

300 360 tatattttaa taaataaaag taaccttaat atgttaacaa aagaacatat aacacctacc 420

aacaacatgg acagtgttgg ccatatgata ttatgcaaac ctgtacgtgc agctaatggt 480

ttactctcat tagacttcct attcaatgaa gaagaagctt taaaagagct tggaggatta 540

caaaatgcag tatttacgat aatagaaact acaccaccta ttaccaaaaa atcattattc 600

agaagacatt cactgggtta ttcacaacta tcagaagaac atagtaaacc tgaaacaatt 660

accagtagta ctattacaga gagtataaca agagaagaag cacaatcaag taaacaagag 720

gaaggattag aaacacatca gctttccacc aatgtagtaa cacatggtat caattattta 780

actaatgtct cacttgcttt tgaacagcta tgtacaaaat atcattaa 828

<210> 5

<211> 225

<212> DNA

<213> Ehrlichia ruminantium

<400> 5

ttgtacatagtatgtcttta tataaaagta agaattgatg attctactga tgttattact 60

tataactctaaaaaaaatat gtgtaaatta caattaactc agaaaaagaa tagatcattt 120

atatatttggttaacagata ctatcataaa tcagaatata ggcttaccac actttcagtt 180

caatcttatagcaaattaga gcaactttat aacaatatcc agtaa 225

<210> 6

<211> 186

<212> DNA

<213> Ehrlichia ruminantium

<400> 6

atgagtcacagttttattga gtttaaacaa atcaattatt acgatattaa cgcaatatat 60

acaatatcatttgtaacaca tatcaataat tttataccaa aatataagag aaaaattatt 120

ataactctgcttaatacact aattaacaat attacttctt gtgattttga gtgtaataaa 180 caatga 186

<210> 7

<211> 3522

<212> DNA

<213> Ehrlichia ruminantium

<400> 7

atgaatgagataatcctata cacagcagtg tcgctgtttt ttatatgtgt ttactatgtt 60 ctgcttgtgg ttaggtttgt atgttatgtg ttggacatat cagataatta tacaaaaagt gaaaagtacg aaatggacac tttatctgga taccataatg atagtgatga tataggtcat accaaaatgg atcaggtaac acatcaagtt gcgatagaag gtcaccaagt tatggataag catactgaaa ctactataaa aacaagtctt aaggataaat ctgtagagaa aaaagtagta aagagagatg tttttgtaag tgctagtatt ttatctagtt ctgtattaga aaaaccagat acaggtagta ctaaggataa atctgtagag agaataaatg aaaaaaagag agatgttttt aaaagtgatc aagttaaatt atctggttct gttactgata caggttgtgc aggtagtact tctgaaggta ctgctataag agatgaaaag acttttaatc ttcaaagtgg taatgtaaaa ttaggtaaaa tagaggattc agttttatct aataagcctg ttatatgtgt tggaaaagaa ttggttaata ctgttgaaga tagttcaaga ttaatgttag attttgacag aaatggtaat gtgcctagtt tctatcctga taatgttata gatcttcctc aatcagaaga tcaactttat gatgtgactg aaaatagtgt aagtgtatat caagctaaac agaatgaaga tactaaacag gcggctgcgc atagtcaata tgatgtgact ttggttcctg atgatataaa acaagctaaa atagctacag gttctacaac cgcggctgcg gttagtgtat atcagagtga cttagtttct gatactaagc agggtgcttt tatagctaca tatgatatga ctgaaaatag cgtaagtgta aaacaatcta aacagcatga agatactaag tctgctaagt tagatattgt tgatgtagtt

ttgagtgtta tgaagtataa gtcaaaggaa 120

agggttactt attgtagtca gagtgaatat 180

aaagatggta ttgaatttct aaaatcagtt 240

gttttaaaat caaaatctac tgtttcatct 300

cctggcgttc aaactataga acacgatagt 360

gaaaatgctg gtgttggtgt tcactatagt 420

agttttaaat ctgatgttat ggttgatact 480

cctgaaaata ctataagaat aaatgaaaaa 540

caaactgata taaaaagtaa tcaagttaaa 600

gagaaaagtg atgttactga tacagcgtgt 660

gaaaaagtag tacctgaagg tgatactata 720

gtaagtgcta gtgctcaaac tggtgatatg 780

agattagaaa aactagatga gagaaaggat 840

aaggacaaat ctgtagagaa aaaagtagta 900

gagagtagtg ttgctagaag tgttggtgtt 960

gatgataaag taaaactatc aggtgtagat 1020

gcttctagtt gtgaaactac tgttaaggat 1080

agtacgtttc aattagcttc aagtttggat 1140

aatactcgtg gtttaagtga aacttgttct 1200

cctgtatacg aagaggcaac tagtaagtta 1260

tatcacacta aagaaaaaca ttgtggtgtt 1320

tcatgtatta ctaatgtgca tagtcaatat 1380

ccgcgtgatt tggttcctga tgatataaaa 1440

ggtgctttta tagctacagg ttctacaacc 1500

gaaaatagcg taagtgtatg tcagagtgat 1560

cagagtgaag atactaaaca gggtgctttt 1620

catagtcaat atgatgtgac tgaaaatagt 1680

gataatataa aacaagctaa acagaatgaa 1740

ggttctacaa ccgcggctgc gcatagtcaa 1800

tgtcagagtg acttagttcc tgatggtgta 1860

cagggtgctt ttatagttac aggttctgta 1920

agtttagggg aaaaacgtga tattgatgaa 1980 aaagttgtta agtcatcagg ttgtactact gctgattcag ttagtaatcc tgtaggtatg 2040

gataaagttc aatattgtgt acctgactta gagatgagag taaaaatgga tcttgtagaa 2100

gatcaccata atatggctag tatggaaaaa tgttatcctg atagagaagt tgttgagcaa 2160

ttaagtaatg ttactacttg tttggttagt actccagtaa ttgaacatag agttcatagt 2220

gttgagtctg ttgcagagtt acaagtaaaa ataggtcctt tagatgaggg aaaatgtaaa 2280

gacagtgtgg taaggagctc atcatttact agtgatacat gtttaaaaga tacaggtgca 2340

acaatgactg tagaagaata tggtaataaa cctagtacag gtctttgtgc tagtaggggt 2400

gatgatagtg tttcttctat gattggtata ggttcgtatt ttatagataa gatgatttgt 2460

gatattgata ctactgtgca gcttaataat acattttcta ctttagaaaa aagaaaaaac 2520

tgttttatag ataatattaa aaaaaataat gaaaaaatat ttagtaacct tgttaatatt 2580

atggatttaa taaaagaaac ggtaggtatt caattttttg atactaaaag tacagatgat 2640

atatccaggt atgtaatgga acaatctagt ggtgtttatg atgatgttat gtcacaaatg 2700

cttatccaag atgaaaaata tttatttaag gtctttaaac atattattcc ggtttttgct 2760

aaaatattct ttaacaatga tcctatatct tcaatggaat ggaaattagt agatgaattg 2820

ttctctatga gaagggcagt cttacaagat aatgtgtatt ttcaaaggat attttattgt 2880

atagtgtgtg catgtgaaaa aactgcaggt acaataaaga aaattcagtc gttatctaaa 2940

cagtgtgatg aaatacgaga aaagattaaa aagtgtaatc taaggcaagg aaagaagaaa 3000

agtgcattgt cgaaatttac agatcatttt agtgaaaaaa aggaagacct gttgtgttta 3060

ttagataaaa tagaaaaaga actgaattta actaagcaag tttacactaa tcttatagca 3120

gaaaaagagg cgttattaac aggagatgtt gcttatataa gatattttgt atcacgtatt 3180

gtttttgata gttggaaatt tgatgataag gctaaacagg ttgtcaaaaa tataaagaac 3240

ctagcaccat atgtgttatg tgatgtgttg tatgaagaag aaaaaaaata tctaggtttg 3300

gtgaagtgta ttgtttgtga gtacacggtt ttttataaag atatagataa ttttttacct 3360

atagttcaac aatatcatga tcgacgacaa tctagaagtg ctgcagccca aaaattttat 3420

gatcaggaaa ttgatggtgt tcttcctatg gatactttag aaggtgtagg ggatcttgta 3480

gctatggaat taggacaaaa cagtaaatgt aatgcacatt aa 3522 <210> 8 <211> 4122 <212> DNA <213> Ehrlichia ruminantium <400> 8

atgaatgaga taatcctata cacagcagta tcactgtttt ttatatgtat ttactatgtt 60 ctgcttgtgg ctaggtttgt gtgttatgtg ttggatatat cggataatga tacaaaaagt gaatatggaa agtacgagat ggaaacttta tcagtttacc atagtgatag tgatgatgta tcatctacca aaatggatca ggtaacacat gataatgtag aaggtcaaca agttatggtt aatcatactg aaactattat aaaaacaagt actaaggata aatctataga ggaaaaagta gaaaaaaaga gagatgtttt tgtaagtgct gttagattat ctggttctag attagagaaa gcgtgtacag gtagtactaa ggataaatct actataagaa taaatgaaaa aaagagagat atgaaaagta atcaagttag attatctggt gatgttactg atacagcgtg tacaggtagt gtacctgaag gtgatactat aagaataaat agtgctcaaa ctggtgatat gaaaagtgat aaaccagatg agaaaaggga tgttactgat tctgtagagg aaaaagtagt acctgaaggt gatgtttttg taagtgctag tgctcaaact tctggttcta gattagagaa accagatgag ggtaatacta aggataaatc tgtagaggaa ataaatgaaa aaaagagaga tgtttttgta agtaatcaag ttaaattatc tggttctaga actgatacag gttgtacggg taatactaag gaaggtactg ctataagaga tgaaaaggag tttaatcttc aaagtggtaa tgtaaaagat ggtaaaatag aggattcagt tttatctgct aagcctgtta tatgtgttgg aaaagaaagt gttaatgctg ttgaagatag ttcaagaaat atgttagatt ttgacagaaa tggtaatcct cctagtttct atcctgataa tgttatatat cttcctcaat cagaagatca actttattca

ttaagtatta tgaagtataa gtcaagagaa 120 agggttactt attgtagtca gagtgagtat 180 tctggaaaag atggtattga atttctaaaa 240 ggtgatgttt taaaatcaaa atctactgtc 300 caaatttctg acgttcaaac tatagaacgc 360 aaggaaaatg ctggtgttgg tgttcactat 420 cttagtttta aatctgatgt tatggttgat 480 gtacctgaag gtgatactat aagaataaat 540 agtgctcaaa ctgatatgaa aagtaatcaa 600 ccagatgaga gaagggatgt tactgataca 660 gtagaggaaa aagtagtacc tgaaggtgat 720 gtttttgtaa gtgctagtgc tcaaactgat 780 tctagattag agaaaccaga tgagaaaagg 840 actaaggata aatctataga ggaaaaagta 900 gaaaaaaaga gagatgtttt tgtaagtgct 960

cacattaaat tatctggttc tagattagag 1020

acagcgtgta caggtagtac taaggataaa 1080

gatactataa gaataaatga aaaaaagaga 1140

ggtgatatga aaagtgatca cattaaatta 1200

agaagggatg ttactgatac aggttgtacg 1260

aaagtagtac ctgaaggtga tactataaga 1320

agtgctagtg ctcaaactgg tgatatgaaa 1380

ttagaaaaac tagatgagag aaaggatgtt 14 40

gataaatctg tagagaaaaa agtagtatct 1500

agtagtgttg ctagaagtgt tgatgctact 1560

gataaagtaa aactatcagg tgtagattta 1620

tctagttgtg aaactactgt taaggataat 1680

acgtttcaat tagcttcaag tttggatttg 1740

acttgtggtt taagtgaaac ttgttcttta 1800

gtatacgaag aggcaactag taagttagtg 1860

cacactaaag aaaaacattg tggtgttgat 1920

tgtattacta atgtgcatag tcaatatgat 1980 gtgactgaaa atagtgtaag tgtatatccg gctaaacaga atgaagatac taaacagggt gctgcgcata gtcaatatga tgtgactgaa gttcctgatg atataaaaca agctaaacag gctacaggtt ctacaaccgc ggctgcgcat agtgtatatc agagtgactt agttcctgat actaagcagg gtgcttttat agctacaggt gatatgactg aaaatagcgt aagtgtatgt caagctaaac agaatgaaga tactaagcag gctaagttag atattgttga tgtagttaat gttgttaagt catcaggttg tactactgct aaagttcaat attgtgtacc tgacttagag cactataata tggctagtat ggaaaaatgt agtaatgtta ctacttgttt ggttagtagt gagtctgttg cagagttaca agtaaaaata agtgtggtaa tgagctcatc atttactagt atgactgtag aagaatatgg taataaacct

gatagtgttt cttctatgat tggtatgggt attgatacta ctgtgcagct taataataca tttatagatg atattaaaaa aaataatgaa gatttaataa aagaaacggt aggtattcaa tccaggtatg taatggaaca atctagtggt atccaagatg aaaaatattt atttaaggtc

atattcttta acaatgatcc tatatcttca tctatgagaa gggcagtctt acaagataat gtgtgtgcat gtgaaaaaac tgcaggtgca tgtgatgaaa tacgagaaaa gattaaaaag gcattgtcga aatttacaga tcattttagt gataaaatag aaaaagaact gaatttaact aaagaggcgt tattaacagg agatgttgct tttgatagtt ggaaatttga tgataaggct gcaccatatg tgttacgtga tgtgttgtat

cgtgatttgg ttcctgatga tataaaacaa 2040 gcttttatag ctacaggttc tacaaccgcg 2100

aatagcgtaa gtgtatgtca gagtgactta 2160

aatgaagata ctaaacaggg tgcttttata 2220

agtcaatatg atgtgactga aaatagtgtt 2280

gatataaaac aagctaaaca gaatgaagat 2340

tctgcaaccg cggctgcgca tagtcaatat 2400

cagagtgatt tggttcctga tgatataaaa 24 60

ggtgctttta tagttacagg ttctgtatct 2520

ttaggggaaa aacgtgatat tgatgaaaaa 2580

gattcagtta gtaatcctgt aggtatggat 2 640

aggagagtga aaatggatct tgtagaagat 2700

tatcctgata gagaagttgt tgagcaatta 2760

ccagtaattg agcatagagt tcatagtgtt 2820

ggtcctttag atgagggaaa atgtagagac 2880

gatacatgtt taaaagatac aggtgcaaca 2940

agtacaggtc tttgtgctag taggggtgat 3000

tcgtatttta tagataagat gatttgtgat 3060

ttttctactt tagaaaaaag aaaaaaacat 3120

aaaatattta gtaaccttgt taatattatg 3180

ttttttgata ctaaaagtac agatgatata 3240

gtttatgatg atgttatgtc acaaatgctt 3300

tttaaacata ttattccggt ttttgctaaa 3360

atggaatgga aattagtaga tgaattgttc 3420

gtgtattttc aaaggatatt ttattgtata 3480

ataaagaaaa ttcagtcatt atctaaacag 3540

tgtaatctaa ggcaaggaaa gaagaaaagt 3600

gaaaaaaagg aagacctgtt gtgtttatta 3660

aagcaagttt acactaatct tatagcagaa 3720

tatataagat attttgtatc acgtattgtt 3780

aaacaagtta tcaaaaatat aaagaaccta 3840

gaagaggaaa aaaaatatct aggtttggtg 3900 aagtgtattg tttgtgagta cacggttttt tataaagata tagatgattt tttacctgcg 3960

gttcaagaat atcataatcg acgacaatct agaagtgctg cagcccgaaa attttatgat 4020

caggaaattg atggtattct tcttcctatg gatactttag aagatgtagg ggatcttgta 4080

gctatggaat taggacagaa cagtaaatgt aatgcacatt aa 4122

<210> 9

<211> 2856

<212> DNA

<213> Ehrlichia ruminantium

<400> 9

ttgcataaaa tcatgcttac atcacttaaa actacagtta ctgataataa actaagatct 60

agtattatta atggatctag tgttaatttt tttaaaaaag gcaacattat tttttctgta 120

tattatacaa gaaataatgt taatggatat gatgtaatat gtgagattca acatggtgct 180

tctatttatt atatgaaaat taatgatcat gcaattattg atcgtcggac aacaaattat 240

ccaccagaga tgttatttgt aaagaatagt aatgatgatt tgatatttat tgttattcct 300

gaagaaagta aaggtcgtaa agctttagtt atcaaaatat ataagataaa ttataatcct 360

aatgtgtctt tatccaaatt acatgactta caattaatta gttgcaataa ctatctcaaa 420

gaagaagtga aatatcctat tattttacat caggatacgg gtggtaggat tgttgttatt 480

gcaagagtag ataatgacta tcgaggtgat gttacagata gattgtatgt gatgtggcaa 540

ttgagatatc ataataatag atttgaaatt ataggtttaa gtaatgggta taggcaattt 600

aatgctgcct atttatttaa gcattctggt tatattaatc gtggtaaatg tcatgataga 660

ctaattgtta aattaggatc ggatagtttt ataaattttc tttatgttgg gaaacatatt 720

tctagagatt acaatttttt ttctagtata tatgatttat ctataaatta taatatgcat 780

cttgatccag aagaatgttt ggtgggttct ttttatggtt gtaatgctag tagtggtagg 840

aaatataata ttcctaatag ctgtattcat gttattgata tttttcgtga tgatgggaat 900

gtatatatag catatattgg tactgtattt aatagtacat ttaagaataa aaagcagttg 960

gttattgttt atactatggg tgatgaacaa tcgcctgtgt atgattttat gcagattaca 1020

gaagatatta gtgccatata tataaattct actgaaaata ttttagcaat aacgactatg 1080

ggaagtgatt atcttgtaaa atatgagatt tcaaaattac agttaaaatt agggattgtt 1140

gatcatgttg atgttataaa aattccacgt aatgtagtga aaaatattgc taattttaca 1200

tatgttgttg atacagtttt agggtttgat agtgttgaac atattaatat tcgtaatgta 1260

ttagctacaa aatcaactgt taatgataaa gtatctcagt tttttttaaa tattagagaa 1320

atggaatttg gtgatttatt taagagttgg agtggtgaat ataatgactt gttaataggt 1380 tatactatgc ctgctagtta tggtgtaaat actgtttcag gtaatgcagg ttttgtagag gtatttaaga ttacagataa cttaattaat gcacatgtga cattgcaatc aaaattatca aatagatcag ataattctgt aagtgaaagt agtgatgatt tgtttaaaag tacggctagt aagcctacta tccacgtaac gcatgttaca gttgtgaggc atataaatcc taaaacggat tcaatactga ctaatagaag cgatggtgta gcttttggtt atgtaataaa gcctactcgc tcaccatatg gtaaagaggt tgtgaggcat acaagttcaa taccaagatc agtactgact gctagtccta ttaatcatgc ttttggttat ttaggtgata ctgatgtttc aaagcaagtg actcctacag taagatcagt attagtaggt gatagtgttg gacatgaaca agatttgggt aaactaatga gtgataatgt atccaacaat ataaaacata agatattagg tagaaaagta tctggtgtta atattcgcaa taaaagtaca caagaggcta ataatatgaa tgttacattg tataatggta gtttattaaa tagtaattct aaagtagtaa ttgcagtaat atctagtata aaatgtataa agtggtattt agcaaagttg ggatttgtga tttttaattt ggatagtatt aaaggtacca catctcgaat agagagtcta <210> 10 <211> 1659

<212> DNA

<213> Ehrlichia ruminantium

<400> 10

atgttattca aacccggttt acccatttcc atacgtgagt tgaatagagc gtcagaaata

tatactacag aatatttaag cgatgttata 1440

aagttcatat caactagtaa aatgggtgat 1500

tatactagtg taaaccctac taatcatatg 1560

gatggtgagg gtattacaga gcgtgcgggt 1620

ttagctacag gattggttct tactagtaaa 1680

cctattaatc atgcttttgg ttatgtaata 1740

ttgcaaccga agtcaccata tggtaaagag 1800

aattctatac atacaagttc aataccaaga 1860

tttaaaagta cagctagtcc tattaatcat 1920

catgtaacgc atgttacatt gcaaccgaag 1980

ataaatccta aaacggataa ttctatacat 2040

agtaaaagct atgatgtatt taaaagtacg 2100

atgaaacctg ctagttctgt tgtagtgcca 2160

gaaagtgtta gtaatgttcc agtacatctt 2220

gatgcgtatc atgtatctgg cagtgaaaaa 2280

catggtgatg ttagtactga tgttgtattg 2340

attagtaggc atgtgaataa ttctttagct 2400

aagtataata taaggcgtag tactgttaga 24 60

gtgagtacaa gatatacatc tcatggcata 2520

tttaatccta cacagcataa tattagtagt 2580

gcttttaata ctgaaagttc tgttgattat 2640

ctgcttatct ttttattatt aggtggattt 2700

aatagaagaa ggatgtctaa taatgaacag 27 60

caaagtagtg tttctggtgt gcaagtgaca 2820

ttctag 2856

aagattacag aatctctgca tagatcagtt 60

catgttaata cgtgtcattg tataggagct 120 acaataaata aaaaaactct taatatctgc gttgataata agccaggtaa tcggtgtact 180

ccagtaggaa catctttatt tcgtatggaa tgtattatac ccgctcctgt aataaataat 240

ccacgtaata tatctttaca aaagttgaca caagtattgt ctagtccttt tttaataaca 300

ctagaaccac ttaaggttga tgcatatttt attgtaccag aggaagaatt aaagaatttc 360

atagatttag taaaaccttt atctagtatg ccacgtgaag gacttttacc tatttataat 420

attggtaaat tcggaacatt ttccttatgt aggccaaaaa gtataggtaa tagagatgta 480

aggcatgatg taccatttga cgaattcaaa gctttaaata ttttaggagg tctagaggat 540

tctatttttt ttaaaacacc ctcatcaatc cctgatatca caaaacgtaa tacaaaacaa 600

agcatagcag atagtaaaca acaaaaagtt gtagtaactg gtaaggaaat tcaacacaaa 660

atacaacata taaaaaaaat gttttctaga gtttctacta cacaatgttc accttcaagt 720

acaccagtca gtgctcaaat gacacataat atagaagaaa aaacagcaag tagtccgcaa 780

aagccagcta tccaaaaggt tatagtaact agcaaacaac ctcgtaaaga agaaatacaa 840

tttatatata caaagtttcc tgaggctcca gaagaacatt catcttcaaa tcaaacacaa 900

gagacaacaa gcaagcattt agaacagcat ctatcaaaaa gtatagtagg tggtgcgcca 960

cttatacaaa aaggtacagt agatcctcaa caagttgtca gaccaaaaac atttgcatct 1020

agtccttttt ataaagaatc gacacttcca actacaaaat atccatcttc aaatcaaaca 1080

caagaaacag caagcaagca tttagaacag catccatcaa aaattacaca aaaaggtaca 1140

ataaaccttc aacaagttgt tagaccaaaa acacaatttt catctagtcc tttttataaa 1200

gaacaggtac ttccaaatat aaaacatcca tcttcaaatc aaagacaaga gacagcaaac 1260

aagcatttag aacagcgtac attaaaaaaa agtacactag gtagcatgcc gccatctata 1320

caaaaaggta caatagatcc tcaacaagtt gttaggccaa aaacacaatc tgcatctagt 1380

cctttttaca aagaatcgac acttccaact acaaaacatc aaatgttaag tgttatagaa 1440

gaatcgacaa atagtagtgt accaattaat acattaagtt ctgaagaaat accacggttt 1500

ttcagtgtag attattttag tagttataaa gtattgtacg atacttacaa agaatcttat 1560

aaagttgata ctttaccaac agcacctctc gtcccatcat gtcaacttga agatgatgta 1620

tttgttgaaa atagtaatcc ccatgtatct ttgaattaa 1659

<210> 11 <211> 873 <212> DNA <213> Ehrlichia ruminantium <400> 11

atgccactta ctttcgatct atatgcacat gaaaaaagat taaatcttct tctatgcaat 60 gctataaatt ccgctgctaa tctagttaat gaaatagata tatcttgtgt aggatatact 120

gatgaaaccg gtaaattagt ggcttttatt gaccctaaca ttccactaaa cttattccct 180

attcctcaaa atctatcctt atttcgtata agtggtacta taccaattac cattataaca 240

aattctaatt ctcaagaatt atctaaagag tttgttttca cagaaggtga aataaatagt 300

ggccttgtta agtgtgaaat gtattgttta gtaggtaatg aaaatcttga tgattttact 360

gaaatatgta gtaatcctaa aataggatat gaaaatttaa taaaaatttc caataatatt 420

tacacacaat tatttacaga agatatatta aaatttccta ttaacataga acatgctcta 480

tcaaatatag caaatttaaa tgcagaatat atatatgcat ctgatctagt aaggaaagaa 540

aaacttaagc agcttaaaga aagaaatgat gatttatgta atgcaatatg ccatgcatgt 600

aatgaggaga atgtaacttc tgtaaaatgc ataggacata ctcctgacag taatcaactc 660

acagttcata ttaaatgtcc agaaagcctt ttacctatac ctcaaagtaa ctctctattt 720

cttgtcgaga tgagtatatt acctaatgtt atagggggca atcaaatatt atcctctact 780

tttgaattaa cagaaagtga atgtaaaaaa ggtgctctca attgtacaat gtactgttta 840

gttagtaagg agaaacttaa aaaattttac tga 873

<210> 12

<211> 1740

<212> DNA

<213> Ehrlichia ruminantium

<400> 12

atggctatac cacacactat tatagcaaat aatgccatat tatcttctac ttttaaagta 60

gtaaaaaatg atcttggtat tgatagtgat tatattttat gcactgcata ctgtctagta 120

actaagcata atcttcaaga ttttactaat gaagtgtcat cggatgatgt aatagatgat 180

actacacaac aaaaacgtca aaaatttaaa aatatcatta aattatgttc tgtaaaatgt 240

gtaacattac atacacaaga aatgttatca ttaaacatta gtgaagaaga actaatcaac 300

gatatagggt tatgtaatgc aactttcaaa tatttaagta atctgcatca agaaaagatt 360

gatatactta gacaagcaaa taataaatta tgtcgtgaaa tatgtcttaa acttaataaa 420

catcaaacaa actatataag atgtatagga aatactgttg ataatcaatt aatagttacc 480

actcagtgtc cacgagatct tcttcctttt cctaaaaatc aatctttatt cattataagg 540

ataaatatac cacctaacat tatattacac agtaaaatac taaataatac atttaaatta 600

acaaaaagtg aaaaagaaga ttattacatt aaatgtgata tgtattgcct agtatatgaa 660

gaagatatta agagttttat tgatgtatgt gatgatttag ataagccata tattgaagag 720

ttaattcaac attgttctgt aaaatgtata aaattgtata cacaagaaat gttatcatta 780 aacattagtg aagaagaact aatcaacgat gttgaaagta gacagataat tgaatcagta gcaaataaac tcctatgcag aattttgcct ctcatcaaaa agatacgttg tataggtaat tatcctccta gtatattctc aaaggaacac ttaatacgaa gtaggatgtt aactgaagtt cataatctaa gtgatgaaga aatgtcgagt gtagataatc aaaacattaa tctatttaag gatgttgtaa ttacatgtga tgtaagatat ttcccattta atgaggcaag tgtattaaaa aatgaacaag actttaaagc attagttagt tcttcatcag cagtatcaac tgaagaagaa cagagtttaa aatcaagatt atcacaaata tctaatacag tatcaagtga agatgatata gaagcaagac gtttaaaatt agcaaaatta ggtatgttgt ctgatcaaga agtttcacat <210> 13

<211> 3252

<212> DNA

<213> Ehrlichia ruminantium

<400> 13

ttgcataaaa ttatgcctac atcacttaaa agtattattg atggatctag tgttaatttt tattatacaa gaaataatgt tgatggatat tctatttatt atatgaaaat taatgatcat ccaccagaga tgttatttgt aaagaatagt gaagaaagta aaggtagtaa agctttagtt aatgtgtctt tatcccaatt acatgattta gaagaagtga aatatcctgt tattttacat gcaagagtag ataatgacta tcgaggtgat ttgagatatc ataatagtag atttgaaatt aatgctgcct acttatttaa gcattctggt

atagggttat gtaatgcaga gtttaaatat 840

ctagacacat ttgagtatat cgaaatacaa 900

acactttgtg ctttatataa aaaagatttt 960

actatagatc ctgaacaagg attaacaatt 1020

ttaccaactg ccaaaggtac atctttattt 1080

atattaagta ctcctgaact agtgaatgta 1140

aagtatttat tatgtgatat atattgccta 1200

aatctttgta caaagacaag acagttttct 1260

attaggatat atacaaaaga tgctagaaaa 1320

caattaggaa atataaaagg aaaatatctc 1380

tctggacttt atactaaatc agcaagtgaa 1440

tcaattatac aacaagaact ccatgtaaaa 1500

agaaaacaac taacacctga ttcttcatca 1560

gatacaccag cagaaattaa aagaaaaaga 1620

caacaagaag aatcacaaac aacaggaata 1680

cataaatctc aaagtaaaga tttagattag 1740

accatagtta ctgatagtaa actaagatct 60

tttaaaaaag gtaacattat tttttctgta 120

gatgtaatat gtgagattca acatggtgct 180

gcaattattg atcgtcgggc aacgaattat 240

aatgatgatt tgatatttat tgttattcct 300

atcaaaatat ataagataaa ttataatcct 360

caattaatta gttgcaataa ctatctcaaa 420

caggatacgg ttggtaggat tgttgttatt 480

gttacagata gattgtatgt gatgtggcaa 540

ataggtttaa gtaatgggta tagacgattt 600

tatattaatc gtggaaaatg tcatgataga 660 ctaattgtta aattaggatc ggatagtttt tctagagatt acaatttttt ttctagtata cttaatccag aagaatgttt ggtgggttct agatataata ttcctaatag ctgcattcat gtatatatag catatattgg tactgtattt gttattgttt atactatggg tgatgaacaa gaagatatta gtgccatata tataaattct ggaagtgatt atcttgtaaa atatgagatt gatcatgttg atgttataaa aattccacgt tatgttgttg atacaatttt agggtttgat ttagctacaa aatcaactgt taattataag atggaatttg gtgatttatt taagagttgg tatactatgc ctgctagtta tggtgtaaat actgtttcag gtaatgcagg ttttgtagag gtatttaaga ttacagataa cttaattaat gcacatatga cattgcaatc aaaattgtca aataaatcag ataattctgt aagtgaaagt aatgatgatt tgtttaaaag tacagctagt aagcctactc gccatgtaac gcatgtaaca gttgtgaggc atatgaatcc taaaacggat tcagtactga ctagtagaag cgatgatgta gcttttggtt atgtaataaa gcctactcgc ttaccatatg ataaagaggt tgtgaggcat acaagttcaa taccaagatc agtactgact gctagtccta ttaatcatgc ttttggttat gtaacattgg aatcgaagtt accatatgat acggataatt ctatacatac aagttcaata gatgtattga aaagtacagc tagtcctatt actcactatg taacgcatgt aacattggaa aggcatatga atcctaaaac ggataattct ctgactagta aaagcgatga tgtattgaaa ggttatatga aacctgctag ttctattgta

ataaattttc tttatgttgg gaaacatatt 720

tatgatttat ctataaatta taatatgcat 780

ttttatggtt gtaatgctag tagtggtagg 840

gttattgata tttttcgtga tgatgggaat 900

aatagtacat ttaagaataa aaagcagttg 960

tcgcatgtgt atgattttat gcagattaca 1020

actgaaaata ttttagcaat aacgactatg 1080

tcaaaattac agttaaaatt agggattgtt 1140

aatgtagtga aaaatattgc taattttaca 1200

agtgttgaac atattaatat tcgtaatgta 1260

gtatctcagt tttttttaaa tattagagaa 1320

agtggtgaat ataatgactt gttaataggt 1380

tatactacag aatatttaag cgatgttata 1440

aagttcatat caactagtaa aatgggtgat 1500

tatactagtg taaaccctac taatcatatg 1560

gatggtgagg gtattacaga gcgtgcgggt 1620

ttagctacag gattggttct tactagtaaa 1680

cctattaatc atgcttttgg ttatgtaata 1740

ttggaatcga agtcaccata tggtaaagag 1800

aattctatac atacaagttc aataccaaga 1860

ttgaaaagta cagctagtcc tattaatcat 1920

catgtaacgc atgtaacatt ggaatcgaag 1980

atgagtccta aaacggataa ttctatacat 2040

agtaaaagcg atgatgtatt gaaaagtaca 2100

gtaataaagc ctactcgcca tgtaacgcat 2160

aaagaggttg tgaggcatat gagtcctaaa 2220

ccaagatcag tactgactag tagaagcgat 2280

aatcatgctt ttggttatgt aataaagcct 2340

tcgaagtcac catatggtaa agaggttgtg 2400

atacatacaa gttcaatacc aagatcagta 2460

agtacagcta gtcctattaa tgatgctttt 2520

gtatcattag gtgatactga tgtttcaaag 2580 caagtgaaaa gtgttagtaa tgttccagta gtaggtgatg cgtatcatgt atctggtagt ttgggtcatg gtgatgttag taccgatgtt aacaatatta gtaggcatgt aaatgattct aaaataaagt ataatataag gcgtagtact agtacagtga gtacaagata tacatctcat acattgttta atcctacaca gcataatatt aattctgctt ttaatactga aagttctgtt agtatactgc ttatcttttt attattaggt aagttgaata gaagaaggat gtctaataat agtattcaaa gtagtgtttc tggtgtgcaa agtctattct ag

<210> 14

<211> 1836

<212> DNA

<213> Ehrlichia ruminantium

<400> 14

atgttattca aacccggttc acccgttgcc atatatgagt tgaatagagt accagaaata acaataggta caaaacttga tatctggatt gtaggaacat ctttatttct tatggaatgt cgtaatatat ctttacaaaa gttgacacaa ccacttaagg ctgatgtata ttttattgta acagtatccc ctttatgtag tatgggactt aaattcggag cattttgcgt atgtaggcca ctatttgatg aatacaaagc tttaagggtt aaaacaccct tatcaacctc taataccaca aatagagaac aaaaatttgt agtaactggt aaacatctac ataaaatatt ttctagatct ccagtcaata ctaaaacaca acataatata ccaaatatcc aaaaggttat agtaactagc atatgtacaa agtttcctga ggctccaaaa

tatcttactc ctacagtaag atcagtatta 2640

gaaaaagata gtattggaca tgaacaagat 2700

gtattgaaac taatgagtga taatgtatca 2760

ttagctataa aacataagat attaggtaaa 2820

gttagatctg ctgttaatat tcgcaataaa 2880

ggcatacaag aggctaataa tatgaatgtt 2940

agtagttata atggtagttt attaaatagt 3000

gattataaag tagtaattgc agtaatatct 3060

ggatttaaat gtataaagtg gtatttagca 3120

gaacagggat ttgtgatttt taatttggat 3180

gtgacagaag gtaccacatc tcgaatagag 3240

3252

aagattacag aatctctgca taaatcagtt 60

catcttaata catgtcattg tataggagct 120

gataataagt caggtcatcg gtgtactcca 180

attataccca ctgctgtaat aaatcatcca 240

gtattgtcta gtcgcttttc aagaacacaa 300

tcagaggaag aattcgagaa tttcagaagt 360

aatgaacttt tacctgttta taatattggt 420

aaaagtatag gtaatagagg tgtagatgta 480

ttaggaggtc tagaggattc taattttttt 540

aaacgtaata caaaacaaag cacagcaaat 600

aagaaaattc aaagcaaaat acaaagtata 660

tctactacac aatgttcacc tttaagtaca 720

gaagaaaaaa cagcaagtag tacgcaagaa 780

aatcaaccta atagagaaaa aacacaactt 840

tatccatctt taaatcaaag acaagagaca 900 ggaggcaagt atttagaaca gcgtctatca aaaagtacag cagatagtac gccatttaca 960

caaaaaggta caacagattc tcaacaagtt gttagaccaa aaacacaatt tgcatctagt 1020

cctttttatt tttatcaaga acagccactt ttaactacaa aacattcatc ttcaaatcaa 1080

agacaagaga caggaggcaa gtatttagaa cagcgcctat caaaaagtac agcagatagt 1140

acgccattta cacaaaaagg tacaacagat tctcaacaag ttgttagacc aaaaacacaa 1200

tttgcatcta gtccttttta tttttatcaa gaacagccac ttttaactac aaaacattca 1260

tcttcaaatc aaagacaaga gacaggaggc aagtatttag aacagcgcct atcaaaaagt 1320

acagcagata gtacgccatt tacacaaaaa ggtacaacag attctcaaca agttgttaga 1380

ccaaaaacat ttgcatctag ttctttttat aaagaatcgg cacttgcaat tacaaagcat 1440

ccatcttcaa atcaaagaca agaggcaaca aacaagcatt tagaacagcg tccatcaaca 1500

aaaagtacag tagatcctca acaagttgtt aggccaaaaa cacaatctgc atctagtcgt 1560

gtttataaag aacagggact tccaactaca aaacataaaa tattaagtgc tataaaagaa 1620

tctacagata gtagtacatc agttaataca ttaagttctg aagaagattt acggttttta 1680

aatgtagatt attctagtag ttgtgaaata ttatacgata ctttcagaga atcttataga 1740

gttagtgctt taccaacatc acctctcatc ccatcacatc aacttgaaga tgatgtattt 1800

gttgaagatg gttatcctcg tgcatcttat ctttga 1836 <210> 15 <211> 3570 <212> DNA

<213> Ehrlichia ruminantium

<400> 15

atgccactta cttttgatct atatgcatat gaaagaaaat taaattttct tctatgcaat 60

gctgtaaatt ctaatcctaa gttagttaat gtaataaatg tagtttgtgt aggatatact 120

gatgaaaata atcagttatt acttgctact gactacaaca ttccaccaga attacaccct 180

attcctagaa atcaatcctt atttcgtata aatgctaata taaaaactag cattataaca 240

aattctttta gattatctca agagtttgct ttaacacaag aggagctaaa taatggtaat 300

gttaagtgtg aaatgtattg tttagtaggt aatgaaaatc ttgatgattt tactaaaata 360

tgtagtaagc ataaagtaag atataaaaat ctaacaacaa tttccaagaa tatttacaca 420

caattattta cagcagatat attaaaattt cctattaaca tagaacatgc tctatcaaat 480

atagcaaatt taaatgcaca atatatatat gcatctgatc taataaatga atctgatcta 540

ataaatgcgt ctgatctaat aaatgcgtct gatctaataa aagaagaaaa aattaagaat 600

attagaggaa gtactagtat attatatgat gcaatatgca gtacatatgc aactaatgat 660 taccatgtac tttctgtaaa atgcatagga cacactcaat gtccagagaa ccttttacct tgtgttgata tatcaccaga tatcataaca ttaacagaaa gtgaaagtaa acaaagtact gatgaacaac ttggaagttt tactcataaa caagatatta ttcaattttg ttctgtaata tcattacaaa ttagcgaaga agagctaata agaaatttta gtgatctacg taaggaaaaa ctatgtagtg caatatgcag tatatatgca tgcataggat atactcataa taatcaacaa cttttaccta tacctcaaag taactctcta atcataacaa ataataaaaa attatcctct caaagtactc tcaagtgtgc aatgtactgt actcataaat gtgatattac aaataataaa tctgtaatat gtataacact caatacagaa gagctaataa atagtgtagg aataggtgat caggaaaaat ttaataaaat acagcaaaca tcacctgaag aaaataaaat aattgatata aaattagtag ttcatactga atgtccacta ttattttcta tactgatggc tataccatac cctgctttta aagtagtaaa aaatgatctt gcatactgtc tagtaactaa gcatgatctt ggtgcaatag gtgatagtat acaacaaaaa tgttctgtaa aatgtgtaac attacataca aaagaactaa tcaacgatat agggttatgt catcaagaaa agattgatct acttaaacaa aataaactta ggaaacataa aacacaatat aaattagtag ttaccactca gtgtccacga ttattcatta taaggataaa tatatcacct aatacattta aattaacaac aagtgaaaga tgcctagtat atgaagaaaa tattaagagt ccatatattg aagagttaat tcaatattgt tatactcata ataatcgaca actcatagtt 720 atacctcaaa gtaactctct atttattgta 780 aataatgaaa atttatcctc tacttttgaa 840 atcaattgtg caatgtactg tttagttaat 900 tgtaatacta caaataataa accaaagctt 960 tgtataacac tcaatacaga aagaatatca 1020 aatagtgtag gaataggtga tgtaacattc 1080 cttaagaaaa tacagcaaat aaagaatgaa 1140 gctaataact accatgtact ttctgtaaaa 1200 ctcatagttc acactcaatg tccagacagc 1260 tttattgtaa atgttgatgt atcaccagat 1320 acttttgcat taacagaaag tgaaagtaag 1380 ttagttaatg atgaacaact tgaaagtttt 1440 ccaaggcttc aagatattat tcaattttgt 1500 agaatgttat cattacaaat tagcgaagaa 1560 gtaacattca aaaattttag tgatctacgt 1620 aataatgaac tatgtagtgc aatatgcatt 1680 aaatgcgtag gacacactac cgctaagaat 1740 gctcttcttc ctacacctca aggtgattca 1800 gctattatag caaataatgc catattatct 1860 ggtattaata gtaattatat tttatgcact 1920 caagatttta ctaatgaagt gtcatcggat 1980 cgtcaaaaat ttgaaagtat cattaaatta 2040 caagaaatac tgtcattaaa tattagtcaa 2100 aatgcaactt tcaaatattt aagtaatctg 2160 gtaaataata aattatgtcg tgaaatatgt 2220 ataagatgta taggaaatac tgttaatact 2280 gatcttcttc cttttcctaa aggtcaatct 2340 aacattatat tacacagtaa aacactacgt 2400 tcagatcatc acattaaatg tgatatgtat 2460 tttattgatg tatgtgatga tccaaataag 2520 tctgtaaaat gtataaaatt gtatacacaa 2580 gaaatgttat cattaaacat tagtgaagaa gcagaattta aatatgttga aagtaaacat tatatcgaaa tacaagcaaa taaactccta tataaaaaag attttctcat caaaaagata caaggattaa caatttatcc ttctagtata ggtacatctt tatttttaat acgaactagg gaactagtga atgtacatat tctaaatgat gatatatatt gcctagtaga tgagaaaaac gcaagaaatc tttcagatat gataattaca aaagattcta aaagatttcc atttgatgaa gacggaagat atctcgacga aggagatttt aaatcatcaa gtaagtcttc atcaacaata gggacccata taaaacgtag tttaagatca cctgagtctt catcatctgc tacattctca cttcaagaaa gaagacaaaa aagacgtgca caaacaacaa aaagtaaaac aggaataggt cataaatctc aaagtaaaga tttagattag <210> 16 <211> 21 <212> DNA

<213> Ehrlichia ruminantium

<4 00> 16

atgagtcaca gttttattga g <210> 17

<211> 21

<212> DNA

<213> Ehrlichia ruminantium

<400> 17

cactcaaaat cacaagaagt a

<210> 18

<211> 25

<212> DNA

caactaatca acgatatagg gttatgtaat 2640

ataattgaat cagtattgga cgcatttaat 2700

tgcggaattt tgcctacact ttgtgcttta 27 60

cgttgtatag gtaatactat agatcctgaa 2820

tacccaaagg aattcttacc aactgcccaa 2880

atattaactg aagttatatt aagtactcct 2940

gaagaaatgt tgaataagta tttattatgt 3000

cttagaatat ttaagaatct ttgtacaaaa 3060

tgtggtgtaa agtatgttag gatacataca 3120

gcaaaggtat taaaacactt aggaggtata 3180

gacaaattac ttagttctgg actttatacc 3240

tcgactgaag aagaatcaag tacacaagaa 3300

acattattaa aaataagaaa acaaatagga 3360

agtggagatg agttagattc agaagacgaa 3420

agattagcaa gactacaaca tgaagaatca 34 80

ggtatcttgt ctgatcaaga agtttcacat 3540

3570

21

21 <213> Ehrlichia ruminantium

<400> 18

atgtatttag tctatttagt agctg

<210> 19

<211> 23

<212> DNA

<213> Ehrlichia ruminantium

<400> 19

ataacatcta attgaacaat ate

<210> 20

<211> 20

<212> DNA

<213> Ehrlichia ruminantium

<400> 20

atgaaaggat ctttatctgc

<210> 21

<211> 20

<212> DNA

<213> Ehrliehia ruminantium

<400> 21

ccttcttett cttcattatg

<210> 22

<211> 19

<212> DNA

<213> Ehrlichia ruminantium

<400> 22

aagaattaca tgatgcagc

<210> 23

<211> 22

<212> DNA

<213> Ehrlichia ruminantium

<400> 23 tcttctcttg ttatactctc tg

<210> 24

<211> 23

<212> DNA

<213> Ehrlichia ruminantium

<400> 24

atggatttaa ataaactaat aaa

<210> 25

<211> 19

<212> DNA

<213> Ehrlichia ruminantium

<400> 25

gcattttctc tacctacga

<210> 26

<211> 26

<212> DNA

<213> Ehrlichia ruminantium

<400> 26

gtacatagta tgtctttata taaaag

<210> 27

<211> 23

<212> DNA

<213> Ehrlichia ruminantium

<400> 27

ccaaatatat aaatgatcta ttc

<210> 28

<211> 25

<212> DNA

<213> Ehrlichia ruminantium

<400> 28

tccaccagag atgttatttg taaag

<210> 29 <211> 25

<212> DNA

<213> Ehrlichia ruminantium

<400> 29

caacagaact ttcagtatta aaagc

<210> 30

<211> 25

<212> DNA

<213> Ehrlichia ruminantium

<400> 30

gttaagtgtg aaatgtattg tttag

<210> 31

<211> 25

<212> DNA

<213> Ehrlichia ruminantium

<400> 31

cactttctgt taattcaaaa gtaga

<210> 32

<211> 25

<212> DNA

<213> Ehrlichia ruminantium

<400> 32

gtaggccaaa aagtataggt aatag

<210> 33

<211> 25

<212> DNA

<213> Ehrliehia ruminantium

<400> 33

caacaaatac ateatcttea agttg

<210> 34

<211> 25

<212> DNA <213> Ehrlichia ruminantium

<400> 34

agggttactt attgtagtca gagtg <210> 35

<211> 25

<212> DNA

<213> Ehrlichia ruminantium

<400> 35

cctcttcgta tacaggatta ccatt

Claims (3)

1. Uso dos seguintes conjuntos de genes alvo Eruml, definido pela seqüência SEQ ID NO: 6 Erum2, definido pela seqüência SEQ ID NO: 3 Erum3, definido pela seqüência SEQ ID NO: 1 Erum4, definido pela seqüência SEQ ID NO: 4 Erumõ, definido pela seqüência SEQ ID NO: 2 Erum6, definido pela seqüência SEQ ID NO: 5 Erum7, definido pela seqüência SEQ ID NO: 13 Erum8, definido pela seqüência SEQ ID NO: 15 Erum9, definido pela seqüência SEQ ID NO: 14 Eruml0, definido pela seqüência SEQ ID NO: 8, para a detecção específica para cepa de Ehrlichia ruminantium.

2. Método para a detecção específica para cepa de Ehrlichia ru- minantium, em que o referido método compreende detectar, para cada um dos genes de Erum 1 até Erum 10, quando um alelo do referido gene esteja presente na bactéria a ser testada, e determinando a forma do referido alelo.

3. Método de acordo com a reivindicação 2, que compreende a execução de amplificação por PCR de todos os genes-alvo de Erum 1 até Erum 10, e verificando, com relação a cada um desses genes, a presença de um ou mais produtos da amplificação, e o tamanho dos referidos produ- tos da amplificação.