BRPI0705630A2 - configuração lipossomal funcional e processo de obtenção de configuração lipossomal funcional - Google Patents
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Abstract
CONFIGURAçãO LIPOSSOMAL FUNCIONAL E PROCESSO DE OBTENçãO DE CONFIGURAçãO LIPOSSOMAL FUNCIONAL A invenção apresenta um produto para terapia e vacinação, constituído de uma configuração lipossomal funcional contendo polinucleotídeos complexados preferencialmente na superfície externa de lipossomas do tipo DRVs, e o seu processo de produção. Essa configuração lipossomal funcionalcontendo polinucleotídeos possui propriedades de mucoadesão que permite a administração através de vias não invasivas como a via nasal, e é capaz de carrear eficientemente os polinucleotídeos até o interior das células, liberando- os no citoplasma. Essas propriedades potencializam maior eficiência de ação in vivo dos polinucleotídeos carreados, redução da concentração e freqúência de doses, e, no caso da vacinação produz proteção contra a doença específica
Description
Relatório Descritivo da Patente de Invenção para CONFIGURACAOLIPOSSOMAL FUNCIONAL E PROCESSO DE OBTENÇÃO DE CONFIGURAÇÃOLIPOSSOMAL FUNCIONAL"
A presente invenção se refere ao produto funcional bem como ao processo deobtenção de uma composição Iipossomal carreadora de polinucleotídeos para terapia evacinação. Essa configuração Iipossomal incorporando polinucleotídeos é mais eficaztanto em relação aos polinucleotídeos livres quanto carreados em outras configuraçõeslipossomais. É também economicamente viável, passível de uso clínico e veterináriopelas várias vias de administração, é estável quando estocada sob refrigeração e a suaprodução permite o aumento de escala para aplicação no setor industrial.
Descrição do estado da técnica
Lipossomas ou vesículas de fosfolipídios são agregados Iamelares de bicamadaslipídicas, alternadas por um ou mais domínios aquosos internos, formando partículasaproximadamente esféricas com diâmetros da ordem de nanômetros a dezenas de micra.Esses agregados são capazes de incorporar ou encapsular na sua matriz compostoscarregados ou neutros de diferentes naturezas tais como hidrofílicos, que se posicionamnos domínios aquosos internos, lipofílicos nas bicamadas e anfifílicos entre ambos osdomínios. As Iamelas atuam como membranas que protegem os compostos carreadosdas agressões do meio ao qual estão expostos e promovem a sua liberação sustentada.
Alguns ativos quando expostos ao oxigênio do ar, à luz, ao calor ou à ação de meiosbiológicos, estão sujeitos à oxidação e/ou decomposição ou desnaturação, perdendo suaatividade. A incorporação e/ou encapsulação desses ativos em Iipossomas contorna aslimitações de estabilidade físico-química e biológica.
A proteção do meio biológico e a liberação sustentada dos bioativos carreados emIipossomas aumentam a sua eficiência de ação e permitem que a dose e a freqüência deadministração sejam reduzidos. Em conseqüência disso, há também redução natoxicidade e efeitos colaterais dos bioativos em comparação às suas formas livres.Adicionalmente, a proteção também é necessária para que seja possível acomercialização e utilização segura desses produtos.
Os Iipossomas pertencem à classe das nano e microcápsulas que têm sidoaplicadas com sucesso para a incorporação e/ou encapsulação de compostos ativos denaturezas diversas, tais como aromas, enzimas, produtos cosméticos e fármacos, dentreoutros. Em geral os Iipossomas são biodegradáveis, atóxicos e não imunogênicos.A incorporação refere-se à dispersão do composto ativo em toda a matriz de nanoou micropartículas (interior e superfície) e a encapsulação ao seu confinamento somenteno interior da estrutura. Nano ou microcápsulas referem-se à partículas com diâmetros nafaixa de nanômetros (10 9m) ou micrômetros (10 6m), respectivamente, e que possuemdois domínios distintos compostos de pelo menos um núcleo aquoso envolvido por umamatriz de material estrutural tal como lipídios, polímeros, etc. e suas blendas. Oscompostos ativos podem estar interiorizados (encapsulados no(s) núcleo(s) aquoso (s) ouincorporados na matriz estrutural) ou localizados na superfície e/ ou nas regiões maisexternas das nano ou microcápsulas. A configuração Iipossomal é definida peloposicionamento dos compostos ativos na sua matriz estrutural. Polinucleotídeos sãocadeias de nucleotídeos que em dupla fita constituem os ácidos nucléicos DNA (ácidodesoxirribonucléico) e RNA (ácido ribonucléico).
Comparados à outros sistemas de liberação sustentada tais como géis e matrizespoliméricas, os Iipossomas permitem uma melhor interação com células por mimetizá-lasem estrutura e composição. Dependendo da composição, os Iipossomas podem tambématuar como carreadores funcionais direcionando os compostos para órgãos alvos e/ouespaços intracelulares específicos, exercendo função co-adjuvante. No caso dos ácidosnucléicos RNA e DNA os alvos específicos são o citoplasma e o núcleo respectivamente.
O transporte efetivo de DNA para o interior das células só foi atingido com a suaassociação a lipídios catiônicos em mecanismo denominado lipofecção (FELGNER, P.L.;GADEK, T.R.; HOLM1 M.; ROMAN, R.; CHAM1 H.W.; WENZ, M.; NORTHROP, J.P.;RINGOLD, G.M.; DANIELSEN, M. Proceedings of the National Academy of Sciences ofthe United States of America, v. 84, p. 7413-7417, 1987). Nesse contexto, lipídioscatiônicos foram usados para carrear o DNA por meio de simples complexaçãoeletrostática e facilitar o seu transporte para o interior das células, por possuírem cargaoposta. Esse fato deu início a várias frentes de pesquisa, focando aspectos tais como odesenvolvimento de novos lipídios catiônicos e o desenvolvimento de vacinas gênicas.Dentre os documentos que descrevem esses desenvolvimentos pode-se citar: (LASIC,D.D., Boca Raton^FloridaiCRC Press1 1997). Os primeiros estudos foram feitos com olipídio catiônico estearilamina, porém não prosseguiram devido à sua toxicidade(FRANLEY, R; PAPAHADJOPOULOS, D., Current topics in microbiology andimmunology, v. 96, pp. 171-191, 1981). Atualmente vários outros lipídios catiônicossintéticos de menor toxicidade têm sido usados, dentre os quais os mais conhecidoscomo carreadores de ácidos nucléicos são os sais quaternários de amônio tais como obrometo de dimetildioctadecil amônio (DDAB), 1,2-dioleoi! -3-trimetilamônio-propano(DOTAP) e o 1,2-diacil-3dimetilamônio-propano (DOTAP) (LASIC, D.D., Boca Raton-Florida:CRC Press, 1997).
No processo de transporte para o interior das células, os polinucleotídeosassociados à Iipossomas catiônicos são inicialmente internalizados preferencialmenteatravés do mecanismo de endocitose. Em uma segunda etapa é necessário que ospolinucleotídeos sejam liberados da membrana endossomal para o citoplasma,possivelmente por ruptura da membrana que se desestabiliza devido à interações entreos lipídios catiônicos e suas moléculas aniônicas (WATTIAUX, R.; JADOT, M.;WARNIER-PIRROTTE, M.T.; WATTIAUX-DE CONINCK, S., FEBS Letters, v. 417, p.199-202, 1997; ZHOU, X., HUANG, L., Biochimica et Biophysica Acta, v. 1189, p. 195-203, 1994). A desestabilização da membrana endossomal resulta em um "flip-flop" deseus lipídios aniônicos, predominantemente presentes na monocamada que interfaceia ocitoplasma. Os lipídios aniônicos difundem-se para o complexo lipídiocatiônico/nucleotídeo e formam com os lipídios catiônicos pares de íons com carganeutra, deslocando os nucleotídeos e liberando-os para o citoplasma (XU, Y.; SZOKA,F.C.J., Biochemistry, v. 35, p. 5616-5623, 1996). Dentro desse mecanismo, a presençade fosfatidoletanolaminas (PEs), também designadas como "helpers", intensificam oprocesso de liberação por possuírem características fusogênicas, que facilitam adesestabilização da membrana endossomal (FELGNER, J.H.; KUMAR, R.; SRIDHAR,C.N.; WHEELER, C.J.; TSAI, Y.J.; BORDER, R.; MARTIN, M.; FELGNER, P.L., Journal ofBiological Chemistry, v. 269, p. 2550-2561, 1994; ZABNER, J.; FASBENDER, A.J.;MONINGER, T.; POELLINGER, K.A.; WELSH1 M., Journal of Biological Chemistry, v.270, p. 18997-19007, 1995; FARHOOD, H.; SERBINA, N.; HUANG, L., Biochimica etBiophysica Acta, v.1235, p.289-295, 1995).
Porém, a fusão dos lipídios associados ao DNA com a membrana endossomalprovocada pelas PEs não ocorre diretamente com a membrana citoplasmática, sendonecessária a etapa inicial da endocitose (WROBEL, I.; COLLINS, D., Biochimica etBiophysica Acta, v. 1235, p. 296-304, 1995)= Por essa razão as PEs são tambémdesignadas na literatura como co-lipídios em relação aos lipídios catiônicos.
Dentre as PEs, a ação fusogênica do 1,2 dioleoil- sn-glicero-3-fosfo etanolamina(DOPE) é mais conhecida. A importância do DOPE nos estudos de potencialização daliberação dos nucleotídeos "in vitro" com lipídios catiônicos, deve-se à sua capacidade depassar para a fase hexagonal Hllj facilitando a desestabilização da membranaendossomal e promovendo a liberação dos polinucleotídeos no citoplasma através datroca de lipídios similares do endossoma com a membrana Iipossomal conforme ilustradopara o DNA na Figura 1. O DNA liberado deve ainda ser internalizado no núcleo paradefinir a expressão gênica de proteínas. O RNA realiza suas funções no própriocitoplasma celular.
A maioria dos trabalhos da literatura foca a simples complexação eletrostática doDNA com sistemas lipídicos binários compostos por Iipfdios catiônicos e lipídios "helper"como reportados nos documentos US5552157, US7105574, W00024428,W0200045849-A2.
Vários kits para transfecção de DNA "in vitro", constituídos de lipídios catiônicosem sistemas binários com PEs são disponíveis comercialmente. Exemplos típicos são:"Lipofectin" (DOTMA/DOPE), "Lipofectamine" (DOSPA/DOPE) e "Lipofectace"(DODAB/DOPE), nos quais DOTMA é o cloreto de dioleoxi propil trimetil amônio eDOSPA é o Iipfdio 2,3 Dioleoiloxi-N-[(esperminacarboxamino)etil]-N,N-dimetil-1-propanaminio e DODAB é o brometo de dioctadecil dimetilamônio. Essas estruturasbinárias compostas de lipídios catiônicos e DOPE são denominadas de Iipoplexos(WASAN, E. K.; HARVIE P.; EDWARDS, K.; KARLSSON, G.; BALLY1 M. B., Biochimicaet Biophysica Acta, v.1461, p. 27-46, 1999). No entanto, existem vários trabalhos naliteratura que as denominam de Iipossomas simplesmente por apresentarem bicamadaslipídicas.
Um parâmetro muito importante para caracterização da complexação eletrostáticaentre polinucleotídeos e lipídios catiônicos, é a razão molar entre cargas (R+/-)estabelecida por (RÀDLER, J.O.; KOLTOVER, I.; JAMIELSON, A.; SALDITT, T.;SAFINYA, C.R., Langmuir, v.14, p. 4272-4283, 1998). Esse parâmetro relaciona onúmero de moles de cargas positivas, provenientes das cabeças polares carregadaspositivamente dos lipídios catiônicos, e o número de moles de cargas negativas dosgrupamentos fosfato presentes no esqueleto da molécula dos polinucleotídeos.
Em geral, a geometria molecular dos anfifílicos catiônicos e do DOPE, por si sónão favorece a agregação em bicamadas Iamelares nas condições fisiológicas. Osagregados formados são instáveis, havendo co-existência entre as fases Iamelares ehexagonai (RÀDLER, J.O.; KOLTOVER, I.; SALDITT, T.; SAFINYA, C.R., Science, v.275, p. 810-814, 1997), com o DNA intercalado nas estruturas (Figura 2). A associaçãode lipídios catiônicos e DOPE com fosfolipídios estruturais tais como fosfatidilcolinas(PCs), é imprescindível para a formação de lipossomas, os quais são constituídos debicamadas regulares ou Iamelas que se agregam intercalando domínios aquosos egerando partículas coloidais aproximadamente esféricas.Avaliações de vários fosfolipídios como carreadores de DNA na respostaimunológica "in vivo", reportadas na literatura (TOMLINSON, E.; ROLLAND, A.P., Journalof Controlled Release, v. 39, p. 357-372, 1996; FARHOOD, H.; SERBINA, N.; HUANG, L.,Biochimica et Biophysiea Aeta1 v.1235, p.289-295, 1995; FELGNER, J.H.; KUMAR, R.;SRIDHAR, C.N.; WHEELER, C.J.; TSAI, Y.J.; BORDER, R.; MARTIN, M.; FELGNER,P.L., Journal of Biologieal Chemistry, v. 269, p. 2550-2561, 1994; WROBEL, I.; COLLINS,D., Bioehimiea et Biophysiea Acta, v. 1235, p. 296-304, 1995), revelaram que a presençade DOPE ou PC/PE como fosfolipídios neutros é importante para a potencialização daresposta imunológica. No entanto, a associação com PCs de elevada temperatura detransição de fases (Tc) como é o caso da distearoilfosfatidileolina (DSPC), diminui aeficiência transfecção, por tornar a bicamada mais rígida (menos fluida), reduzindo a suainteração com a membrana endossomal. A existência de uma correlação direta entrefluidez da bicamada e atividade de transfecção foi estudada por (DUZGUNES, N.;GOLDSTEIN, J.A.; FRIEND, D.S.; FELGNER, P.L. Biochemistry, v. 28, p. 9179-9184,1989). Portanto, as PCs devem ter temperatura de transição de fases baixa, tal como afosfatidilcolina natural de ovo (EPC), para que na temperatura corpórea os lipídios damembrana Iipossomal estejam no estado líquido cristalino, conferindo-lhe a fluideznecessária para facilitar a ação do DOPE e DOTAP no transporte dos polinucleotídeospara o interior das células.
Do exposto pode-se concluir que formulações Iipossomais estáveis, capazes detransportar polinucleotídeos para o interior das células devem formar sistemas ternárioscontendo componentes lipídicos funcionais:
(i) Lipídios estruturais, que garantem a agregação Iipossomal das bicamadas. Umrepresentante típico desta categoria, com baixa Tc é a L-a-Fosfatidilcolina de ovo (EPC)de origem natural, composta por uma mistura de fosfolipídios com ácidos graxosvariados, de cadeias saturadas nas proporções 16:0 (34%) e 18:0 (11%) e insaturadas de16:1 (2%), 18:1 (32%), 18:2 (18%), 20:4 (3%), onde as maiores proporções são do ácidograxo saturado com 16 átomos de carbono (16:0) e mono-insaturado com 18 átomos decarbono (18:1).
(ii) Lipídios com característica catiônica para complexação com os nucleotídeos,tais como o monocatiônico 1,2-dioleoil-3-trimetilamônio-propano (DOTAP).
(iii) Lipídios "helpers" ou co-lipídios, tal como o 1,2-dioleoil-sn-glycero-3-fosfoetanolamina (DOPE).Os sistemas ternários de estrutura Iipossomal contendo polinucleotídeos podemser preparados por simples incubação para complexação eletrostática, semelhante aosistemas binários, porém a internalização dos polinucleotídios na estrutura Iipossomal édificultada pelo seu tamanho molecular. Lipossomas com alta eficiência de encapsulaçãode DNA1 entre 88 e 97%, foram desenvolvidas por (PERRIE, Y.; GREGORIADIS, G.,Biochimica et Biophysica Acta, v. 1475, p. 125-132, 2000), através do método dadesidratação-rehidratação (KIRBY, C.; GREGORIADIS, G., Biotechnology, v. 2, p. 979-984, 1984), Nesse método, Iipossomas previamente preparados (hidratados), foramdesidratados através de liofilização e em seguida rehidratados. Durante a rehidratação oslipossomas se fundem formando novas estruturas lipossomais, chamadas de DRVs("dehydrated-rehydrated vesicles"). Nessa estapa, o DNA que foi juntamente liofilizado,intercala-se nos domínios aquosos entre as Iamelas da estrutura DRV, formando umaconfiguração Iipossomal com o DNA encapsulado, designada pela abreviaçãoDRV(DNA). A utilização de DNA radiomarcado demonstrou a sua localização nosespaços interlamelares de Iipossomas com diâmetro de aproximadamente 1 pm.
Esses trabalhos reportam ainda que os níveis de encapsulação do DNA naconfiguração DRV(DNA) não foram influenciados pelas quantidades de lipídios catiônicoe neutro. Porém, o aumento da proporção de lipídio catiônico, resultou em Iipossomas demenor diâmetro, devido à repulsão mútua das superfícies carregadas, desfavorecendo afusão durante o processo de desidratação-hidratação. A configuração DRV(DNA),composta pelos lipídios EPC/DOPE/DOTAP encapsulando o plasmídeo pRc/CMV HBS,que codifica a expressão de antígeno para hepatite B, apresentou melhor respostaimunológica, quando comparado ao DNA nu (PERRIE, Y.; FREDERIK, P.M.;GREGORIADIS, G. Li., Vaccine, v. 19, p. 3301-3310, 2001). A composição molar ótimade EPC/DOPE/DOTAP foi 16:8:4 , para 10 pg de DNA, em 2 mL de formulaçãolipossomal com razão molar de cargas foi (R+/- 20), gerando uma dosagem de 5 pg depDNA para cada 100 pL de solução lipossomal. Os resultados foram obtidos através daimunização de camundongos Bab/c pela rota intramuscular entre 2 e 4 aplicações. Aeficiência de ação do DNA encapsulado foi atribuída à proteção exercida pelos lipídiossobre o DNA encapsulado, preservando-o da degradação das nucleases e do ataque demoléculas aniônicas que poderiam agir competitivamente deslocando o DNA dasuperfície dos Iipossomas ou dos Iipoplexos (GREGORIADIS, G.; SAFFIE, R.; HART,S.L., Journal of Drug Targeting, v. 3, p. 469-475, 1996; PERRIE, Y.; GREGORIADIS, G.Biochimica et Biophysica Acta, v. 1475, p. 125-132, 2000). Esses trabalhos deram origemao documento W09810748 e a desenvolvimentos subseqüentes envolvendo aadministração de Iipossomas catiônicos pela via oral, encapsulando DNA na configuraçãoDRV(DNA) (US7008791).
Uma configuração Iipossomal alternativa, designada como DRV-DNA, foi obtidaatravés da complexação do DNA com Iipossomas DRVs vazias, produzindo partículascom diâmetros que variaram entre 4-20 μηι (PERRIE, Y.; GREGORIADIS, G. Biochimicaet Biophysica Acta, v. 1475, p. 125-132, 2000). Porém, o elevado tamanho, 4μιη oumaiores, e a heterogeneidade dos Iipossomas na configuração DRV-DNA, levaram osautores a descartá-los das suas pesquisas.
Como visto, os trabalhos desenvolvidos compreendem a produção de estruturasIipfdicas binárias (IipopIexos) e ternária (Iipossomas) encapsulando DNA e RNA.
Estruturas Iipossomais do tipo DRVs encapsularam DNA com alta eficiência produzindoconfiguração Iipossomal do tipo DRV(DNA) com diâmetro da ordem de Ιμηι, cujatransfecção foi caracterizada "in vivo". Os trabalhos descritos, no entanto, deixam adesejar quanto à produção e aos efeitos biológicos da configuração Iipossomal DRV-DNAde tamanho reduzido (1-2 μιη). Além disso as DRVs contendo DNA em ambas asconfigurações DRV(DNA) ou DRV-DNA, foram produzidas somente com razão de cargasentre lipídio catiônico e DNA, (R+/-), igual a 20 ou maior. Os efeitos profilático e/outerapêutico dessas configurações não foram investigados com redução da dose emrelação ao DNA nu, nem em função da via de administração. Medicamentos à base depolinucleotídios possuem benefícios reconhecidos para a saúde humana e alto valoragregado. Portanto, o aumento da sua eficiência de ação se torna necessário.
A referida invenção tem como objetivo a apresentação de uma configuraçãoIipossomal funcional DRV-DNA incorporando polinucleotídeos que fornece maior eficáciade ação tanto em relação aos polinucleotídeos livres quanto carreados em outrasconfigurações Iipossomais até então conhecidas e utilizadas na administração de ácidosnucléicos. A invenção também apresenta um método de obtenção desta configuraçãoIipossomal que, através do emprego de parâmetros específicos, possibilita a formaçãode uma configuração Iipossomal DRV-DNA apresentando tamanho reduzido e baixapolidispersidade, fatores importantes quando da utilização destas configurações emvacinas gênicas.
Breve Descrição da Invenção:
A presente invenção descreve uma configuração Iipossomal funcionalincorporando polinucleotídeo bem como um processo de produção dessa configuração.
A configuração Iipossomal a que se refere essa invenção compreende:(a) um sistema ternário de lipídios composto por lipídio catiônico, lipídio estruturale lipídio coadjuvante e,
(b) um polinucleotídeo.
A invenção se refere, ainda, a um processo para a obtenção da configuraçãoIipossomal funcional compreendendo as seguintes etapas:
a) obtenção de Iipossomas Iamelares a partir de uma mistura contendo lipídiocatiônico, lipídio estrutural e lipídio coadjuvante.
b) liofilização ou secagem dos Iipossomas vazios
c) obtenção de vesículas desidratadas-rehidratadas (DRVs)
d) complexação de um polinucleotídeo com as DRVs através da mistura deDRVs com polinucleotídeos na proporção de 1,1 a 50 moles de cargas positivas doslipídeos catiônicos para 1 mol de carga negativa do polinucleotídeo.
A invenção em questão também se refere a processos de obtenção deconfiguração Iipossomal funcional que incluam o processo descrito nesta invenção e acomposições farmacêuticas contendo configuração Iipossomal como àquela descrita nainvenção.
A invenção se refere, ainda a uma configuração Iipossomal definida na invençãoobtida de acordo com processo definido na invenção.
Breve Descrição das Figuras
A seguir, faz-se referência às Figuras que acompanham este relatório descritivo,para melhor entendimento e ilustração do mesmo, onde se vê:
A Figura 1 ilustra o mecanismo de liberação do DNA do complexo DNA/lipossomacatiônico ETAPA 1: Endocitose do complexo Iipossoma catiônico/DNA. ETAPA 2: "Flip-flop" dos lipídios aniônicos presentes na membrana endossomal desestabilizam oendossoma. ETAPA 3: Formação de pares iônicos neutros entre lipídios catiônicos eaniônicos. ETAPA 4: Difusão do DNA para o citoplasma (Adaptado de Xu & Szoka, 1996).
A Figura 2 ilustra o equilíbrio entre as fases Iamelar Lai0 e hexagonal inversa HMCdos Iipoplexos (Adaptado de Rádler, 1997).
A Figura 3 ilustra comparativamente as etapas para a preparação da configuraçãoDRV-DNA em comparação com a configuração DRV(DNA) e a configuração binária delipoplexo. Os Iipossomas multilamelares foram produzidos por hidratação de um filmeseco de lipídios; a redução e homogeneização de tamanhos feita por extrusão; asecagem dos Iipossomas feita por liofilização. Para a configuração DRV(DNA) o DNA foiIiofilizado juntamente com as DRVs vazias , posteriormente rehidratadas. Para aconfiguração DRV-DNA as DRVs vazias foram primeiro rehidratadas e depoiscomplexadas com o DNA. Para os Iipoplexos a complexação foi feita após a obtençãodos agregados lipídicos (lipossomas multilamelares).
A Figura 4 mostra a microscopia eletrônica de transmissão de lipossomas do tipoDRV vazios (PC/DOPE/DOTAP 50:25:25% molar em solução salina). As barras indicam
A) 1000 nm, B) 100nm.
A Figura 5 mostra a microscopia eletrônica de transmissão de lipossomas do tipoDRV complexados com DNA1 configuração DRV-DNA, em razão de cargas (R+/.) 10(PC/DOPE/DOTAP 50:25:25% molar em solução salina). As barras indicam A) 400 nm,
B) 200nm, C) 200 nm, D) 40 nm.
A Figura 6 mostra a microscopia eletrônica de transmissão de lipossomas do tipoDRV encapsulando DNA, configuração DRV(DNA) em razão de cargas (R+/.) 10(PC/DOPE/DOTAP 50:25:25% molar em solução salina). As barras indicam A) 1000 nm,B) 200nm, C) 100 nm, D) 100 nm.
A Figura 7 mostra microscopia eletrônica de transmissão de agregados lipídicos,composição binária (DOPE/DOTAP 50:50% molar em solução salina). Barras indicam A)400 nm, B) 100nm.
A Figura 8 mostra microscopia eletrônica de transmissão de Iipoplexos(agregados lipídicos complexados com DNA em razão de cargas R+/. 10 ) (DOPE/DOTAP50:50% molar em solução salina). As barras indicam A) 400 nm, B) 200nm, C) 200 nm, D) 40 nm.
A Figura 9 mostra a distribuição de tamanhos dos lipossomas catiônicoscompostos por PC/DOPE/DOTAP (50/25/25% molar) nas várias etapas deprocessamento para formação das estruturas DRVs. A) Após a hidratação do filme secocom água padrão para injeção. B) Lipossomas extrudados em membranas depolicarbonato de poro com diâmetro nominal de 100 nm. C) Lipossomas vaziosproduzidos pelo método DRV em solução salina (NaCI 0,9%). D) Lipossomas produzidospelo método DRV encapsulando DNA, configuração DRV(DNA) a uma razão de cargas10. em solução salina (NaCI 0,9%). Cada gráfico apresenta a distribuição de tamanhosde três amostras independentes. E) Lipossomas vazios produzidos pelo método DRV ecomplexados com DNA, configuração DRV-DNA, a uma razão de cargas 10, em soluçãosalina (NaCI 0,9%).
A Figura 10 mostra eletroforese em gel de agarose para avaliação da integridadedo plasmídeo pVAX-hsp65 em estruturas lipídicas do tipo DRV(DNA)1 DRV-DNA eIipoplexos em razão de cargas (R+/.) 10 em solução salina (NaCI 0,9%). O plasmídeo foiseparado de cada preparação lipídicas através da adição de solvente orgânico(clorofórmio/metanol 9:1 v/v), purificado com etanol e digerido com enzima de restriçãoBam Hl. Plasmídeos padrão e extraído foram submetidos a eletroforese em gel deagarose 0,8%. Cada linha representa: M) Marcador de 1Kb; 1) DNA separado delipoplexos; DNA separado de 2) DRV-DNA, 3) DRV(DNA) 4) DNA padrão.
A Figura 11 mostra a eletroforese em gel de agarose para várias estruturaslipídicas catiônicas obtidas em solução salina (NaCI 0,9%) e complexadas com DNAdurante 10 minutos à temperatura ambiente, em várias razões de cargas (R+/-): A)Complexos Lipossomas extrudados-DNA (LEs-DNA) compostos por PC/DOPE/DOTAP50/25/25% (molar). Cada linha representa: 1) DNA (pVAXhsp65); 2) R+/. 0,5; 3) R+/-1,0; 4)R+/-1,5; 5) R+/. 2,0; 6) R+/. 2,5; 7) R+/. 3,0; 8) R+/- 3,5; 9) R+/. 4,0; 10) R+/. 4,5. B) Lipoplexos(Agregados lipídicos-DNA compostos por DOPE/DOTAP 50/50% (molar). Cada linharepresenta: 1) DNA (pVAXhsp65); 2) R+/. 0,5; 3) R+/. 1,0; 4) R+/. 1,5; 5) R+/. 2,0; 6) R+/- 2,5;7) R+/. 3,0; 8) R+/- 3,5; 9) R+/- 4,0; 10) R+/. 4,5. C) DRV-DNA (Lipossomas DRV-DNA)compostos por PC/DOPE/DOTAP 50/25/25% (molar). Cada linha representa: 1) DNA(pVAXhsp65); 2) R+/. 0,5; 3) R+/. 1,0; 4) R+/. 1,5; 5) R+/. 2,0; 6) R+/- 2,5; 7) R+/. 3,0; 8) R+/-3,5; 9) R+/. 4,0; 10) R+/. 4,5.comparativamente as eletroforeses com a razão de cargas,(R+/-), mínima para a complexação de todo o DNA o DNA plasmideal pVax hsp65 emlipossomas extrudados (LEs) (A), lipoplexos (B) e DRVs (C).
A Figura 12 mostra o termograma comparativo entre as várias estruturas lipídicas.
As composições lipídicas são: (i) DRV vazio, PC/DOPE/DOTAP 50/25/25 % molar. (ii)DRV(DNA) e DRV-DNA, PC/DOPE/DOTAP 50/25/25 % molar, R+/. 10..(iii) Agregadolipídico, DOPE/DOTAP 50/50 % molar, R+/. 10. (iv) Lipoplexo, DOPE/DOTAP 50/50%molar, R+/- 10. Taxa de aquecimento de 10°C/minuto.acessibilidade de sondafluorescente ao DNA plasmideal pVax hsp65 incorporado na configuração DRV-DNA emcomparação com os lipoplexos e DNA nu.
A Figura 13 mostra os perfis de decaimento de intensidade de fluorescência dasonda PicoGreen (% do inicial - referente ao DNA livre) em função de R+/. para asestruturas DRV-DNA (-b-XEPC/DOPE/DOTAP, 50:25:25 % molar) e Lipoplexos (-·-)(DOPE/DOTAP, 50:50 % molar) para complexações realizadas em várias razões decarga, em água ultra pura (Milli-Q). As amostras foram excitadas em comprimento deonda de 480 nm .os espectros de calorimetria exploratória de varredura da configuraçãoDRV-DNA em comparação com os espectros das configurações de mesma composiçãocontendo do DNA encapsulado DRV(DNA) e Iipoplexos .
A Figura 14 mostra o perfil de variação da distribuição de tamanhos e diâmetrohidrodinâmico das estruturas lipídicas ao longo da estocagem sob refrigeração. A) DRVvazio; B) DRV encapsulando DNA [ DRV(DNA) ]; C) DRV complexando DNA [ DRV-DNAD) Agregados lipídicos; E) Lipoplexos.
A Figura 15 mostra o ensaio de citotoxicidade in vitro em macrófagos J774através do emprego de metodologia baseada na redução do Brometo de tiazolil - (3-[4,5-Dimetiltiazol-2-il]-2,5-difeniltetrazólio - Sal de tetrazólio MTT para as diferentesconstruções lipídicas vazias, contendo o plasmídeo pVAX-hsp 65 ou contendo somente ovetor comercial pVAX comparativamente os níveis de toxicidade das formulaçõeslipídicas de mesma composição incorporando o DNA plasmideal pVax hsp65 nasdiferentes configurações.
A Figura 16 mostra a detecção da mensagem para hsp65 in vitro utilizando o RT-PCR. Macrófagos da linhagem J774 foram transfectados com as diferentes formulaçõesIipossomais durante 72 horas e extraído o seu RNA total. A presença de mensagemnessas células foi detectada por RT-PCR utilizando-se os prímers específicos parahsp65. A qualidade do cDNA utilizado foi checada pela ampliação da D-actina. Aamplificação das amostras tratadas com DNase I está indentificada por DNAse (-), o queindica se ainda há ou não DNA nessas amostras tratadas. Após a reação de PCR1 asamostras foram submetidas a eletroforese em gel de agarose (1 %) e as bandasvisualizadas por coloração com brometo de etídio. pb: pares de bases
A Figura 17 mostra a comparação entre a recuperação de bacilos viáveis dopulmão de animais vacinados com diferentes doses, configurações e rotas e desafiadoscom M. tuberculosis (Mtb). Camundongos BALB/c foram imunizados com uma dose de50 μg de DNA Hsp65 ou 2 doses de 50 μg de DNA Hsp65 por via intramuscular, ou comuma dose de 25 μg de DNA Hsp65 por instilação intranasal. Grupos controles foramadministrados com o vetor veiculado ou não, ou com o iipossoma vazio. Após 30 dias daadministração, os camundongos foram desafiados com 105 bacilos de M. tuberculosispela via intratraqueal. Trinta dias após o desafio, os animais foram mortos e os seuspulmões extraídos para a recuperação das unidades formadoras de colônia. Osresultados são representados em Iog10 ± desvio padrão do CFU/g de cada grupo. Adiferença estatística foi considerada significante quando *p<0,05 em relação ao Mtb.Descrição Detalhada da Invenção
A invenção apresenta um produto para terapia e vacinação, constituído de umaconfiguração Iipossomal funcional contendo polinucleotídeos complexadospreferencialmente na superfície externa de Iipossomas do tipo DRVs, e o seu processode produção. Essa configuração Iipossomal funcional contendo polinucleotídeos possuipropriedades de mucoadesão que permite a administração através de vias não invasivascomo a via nasal, e é capaz de carrear eficientemente os polinucleotídeos até o interiordas células, liberando-os no citoplasma. Essas propriedades potencializam maioreficiência de ação in vivo dos polinucleotídeos carreados, redução da concentração efreqüência de doses, e, no caso da vacinação produz proteção contra a doençaespecífica.A presente invenção se refere a uma configuração Iipossomal carreadora depolinucleotídeos bem como ao processo de obtenção dessa configuração Iipossomalcarreadora de polinucleotídeos para terapia e vacinação. A presente invenção trata depolinucleotídeos com atividade profilática e/ou terapêutica, incorporados em carreador denatureza Iipossomal formando uma configuração funcional, biologicamente mais estávelem relação aos polinucleotídeos livres e com maior eficácia de ação tanto em relação aospolinucleotídeos livres quanto carreados em outras configurações lipossomais. OsIipossomas presentes na configuração da presente invenção contém lipídios comfuncionalidades estrutural, de incorporação do DNA e atração eletrostática com asuperfície das células e de intensificação da liberação do DNA no citoplasma celular.
Estes Iipossomas são preparados pelo método da desidratação e rehidratação sobcondições específicas definidas na invenção, na qual obtém-se inicialmente osIipossomas pré-formados, sendo então desidratados através da liofilização e em seguidarehidratados em condições controladas. Os polinucleotídeos são associados aosIipossomas localizando-se preferencialmente na sua superfície, através de umacomplexação eletrostática em condições de agitação e temperatura rigorosamentecontrolados de modo a gerar partículas com tamanhos da ordem de nanômetros até 1-2micrômetros e baixa polidispersidade. Nesta formulação denominada DRV-DNA, todos ospolinucleotídeos encontram-se complexados ao sistema Iipossomal em uma razão molarespecífica de cargas entre o nucleotídeo e o lipídio catiônico. Essa configuração épassível de uso clínico e veterinário, pelas várias vias de administração, é estável quandoestocada sob refrigeração e a sua produção permite o aumento de escala para aplicaçãono setor industrial.
A configuração Iipossomal da presente invenção garante uma maior eficiência deinternalização do DNA ou polinucleotídeos nas células, resultando em maior eficiência deação de formulação Iipossomal com muito menor dose, produzindo os efeitos profiláticose terapêuticos. Além disso essa configuração Iipossomal não é citotóxica mesmo a altasconcentrações, possui alta capacidade de carreamento de polinucleotídeos e éconstituída de partículas de tamanhos da ordem de nanômetros até 1-2 micrômetros combaixa polidispersidade e propriedades mucoadesivas, de modo a poderem seradministradas por via mucosal não invasiva como a via nasal. Além disso, a configuraçãoda presente invenção é reprodutível e é economicamente viável para produção industrial.
Uma construção plasmidial de atividade profilática e terapêutica comprovada, quandocarreada nessas partículas é capaz de produzir efeito profilático e terapêutico.Atualmente, a entrega de polinucleotídeos no interior de células a partir de umaestrutura lipídica é realizada em muitos casos com o emprego de agregados lipídicos,lipoplexos, sistemas binários que possuem somente dois lipídios funcionais em suaestrutura (lipídio catiônico, que permite complexação eletrostática com o nucleotídeo eentrada no interior das células e co-lipídio, facilitador de liberação do nucleotídeo nointerior celular). Estas estruturas, existentes no mercado, são na maioria das vezesinstáveis, formam simultaneamente duas estruturas organizadas nas fases hexagonalinversa e Iamelar conferindo maior instabilidade nas formulações, e dependendo daconcentração são também citotóxicas, o que limita o carreamento de maior quantidade deDNA. Geralmente são usadas para ensaios "in vitro". Portanto não há formulações devacinas gênicas ou terapias gênicas no mercado que atuem eficientemente in vivo esejam estáveis e reprodutíveis de modo a permitir a comercialização segura.
Nos últimos 10 anos, um lipídio de ação estrutural foi adicionado à formulaçãobinária, constituindo um sistema ternário de natureza lipossomai. O método de produçãopromove uma distribuição uniforme do nucleotídeo ao longo da estrutura lipossomai, poisos polinucleotídeos são encapsulados nos Iipossomas pelo método convencional dadesidratação rehidratação. No entanto, formulações desse tipo ainda não se encontramcomercializadas. Configurações Iipossomais como a da presente invenção, nãocitotóxica, com alta capacidade de carreamento e com tamanho de partículas da ordemde nanômetros até 2 micrômetros não são encontradas nem na literatura nem nomercado.
A configuração lipossomai da presente invenção apresenta diâmetro máximo de 2micrômetros e compreende:
(a) um sistema ternário de lipídios composto por lipídio catiônico, lipídio estruturale lipídio coadjuvante e,
(b) um polinucleotídeo.
O sistema ternário de lipídios da configuração lipossomai da invençãocompreende a proporção molar de 20% a 30% de lipídio catiônico, 40% a 60% de lipídioestrutural e 20% a 30% de lipídio coadjuvante. Preferencialmente, o sistema ternário delipídios da configuração lipossomai da invenção compreende a proporção molar de 25%de lipídio catiônico, 50% lipídio estrutural e 25% de lipídio coadjuvante.
O lipídio catiônico presente na configuração lipossomai da invenção é selecionadodentre 1,2-Dimyristoyl-3-Trimethylammonium-Propane; 1,2-Dipalmitoyl-3-Trimethylammonium-Propane; 1,2-Distearoyl-3-Trimethylammonium-Propane; 1,2-Dioleoyl-3-Trimethylammonium-Propane; 1,2-Diacyl-3-Dimethylammonium-Propane; DC-CholesterolHCI; Dimethyldioctadecylammonium Bromide; 1,2-Dilauroyl-sn-Glycero-3-Ethylphosphocholine; 1,2-Dimyristoyl-sn-Glycero-3-Ethylphosphocholine; 1,2-Dipalmitoyl-sn-Glycero-3-Ethylphosphocholine; 1,2-Distearoyl-sn-Glycero-3-Ethylphosphocholine; 1,2-Dioleoyl-sn-Glycero-3-Ethylphosphocholine; 1 -Palmitoyl-2-Oleoyl-sn-Glycero-3-
Ethylphosphocholine; 2,3-dioleyloxy-N-[2(sperminecarboxamido)ethyl]-N,Ndimethyl-1-propanaminium trifluoroacetate; N-[1 -(2,3-dioleyloxy)propyl]-n,n,n-trimethylammoniumchloride e 1,2-Dioleoyl-sn-Glycero-3-[Phospho-L-Serine]. Preferencialmente, o lipídiocatiônico presente na configuração Iipossomal da invenção é o 1,2-Dioleoyl-3-Trimethylammonium-Propane.
O lipídio estrutural é selecionado dentre lipídios sintéticos com cadeias de ácidosgraxos assimétricas, lipídios sintéticos com cadeias de ácidos graxos simétricassaturadas, lipídios sintéticos com cadeias de ácidos graxos simétricas insaturadas elipídios naturais. O lipídio sintético com cadeias de ácidos graxos assimétricas éselecionado dentre 1-Myristoyl-2-Palmitoyl-sn-Glycero-3-Phosphocholine; 1-Myristoyl-2-Stearoyl-sn-Glycero-3-Phosphocholine; 1-Palmitoyl-2-Myristoyl-sn-Glycero-3-Phosphocholine; 1 -Palmitoyl-2-Stearoyl-sn-Glycero-3-Phosphocholine; 1 -Palmítoyl-2-Oleoyl-sn-Glycero-3-Phosphocholine; 1-Palmitoyl-2-Linoleoyl-sn-Glycero-3-
Phosphocholine; 1 -Palmitoyl-2-Arachidonoyl-sn-Glycero-3-Phosphocholine; 1 -Palmitoyl-2-Docosahexaenoyl-sn-Glycero-3-Phosphocholine; 1 -Stearoyl-2-Myristoyl-sn-Glycero-3-Phosphocholine; 1 -Stearoyl-2-Palmitoyl-sn-Glycero-3-Phosphocholine; 1 -Stearoyl-2-Oleoyl-sn-Glycero-3-Phosphocholine; 1-Stearoyl-2-Linoleoyl-sn-Glycero-3-
Phosphocholine; 1 -Stearoyl-2-Arachidonyl-sn-Glycero-3-Phosphocholine; 1 -Stearoyl-2-Docosahexaenoyl-sn-Glycero-3-Phosphocholine; 1-Oleoyl-2-Myristoyl-sn-Glycero-3-Phosphocholine; 1-Oleoyl-2-Palmitoyl-sn-Glycero-3-Phosphocholine; 1-Oleoyl-2-Stearoyl-sn-Glycero-3-Phosphocholine. O lipídio sintético com cadeias de ácidos graxos simétricassaturadas é selecionado dentre 1,2-Diacyl-sn-Glycero-3-Phosphocoline onde os gruposacyl possuem número de carbonos variando entre C3 a C24. O lipídio sintético comcadeias de ácidos graxos simétricas insaturadas é selecionado dentre 1,2-Diacyl-sn-Glycero-3-Phosphocoline onde os grupos acyl possuem número decarbonos:insaturações variando entre C14:1 a C24:1, C18:2 a C18:3, C20:4 ou C22:6. Olipídio natural é selecionado dentre fosfatidilcolina de soja ou fosfatidilcolina de ovo.
Preferencialmente, o lipídio natural é a fosfatidilcolina de ovo.
O lipídio coadjuvante da configuração Iipossomal da invenção é selecionadodentre colesterol e L-alpha-Dioleoyl Phosphatidylethanolamine. Preferencialmente, olipídio coadjuvante da configuração Iipossomal da invenção é o L-alpha-DioleoylPhosphatidylethanolamine.
O polinucleotídeo presente na configuração Iipossomal da presente invençãocorresponde a uma estrutura de DNA e/ou RNA.
A invenção também se refere a um processo de obtenção de configuraçãoIipossomal funcional compreendendo as seguintes etapas e parâmetros:
a) obtenção de Iipossomas Iamelares a partir de uma mistura contendo lipídiocatiônico, lipídio estrutural e lipídio coadjuvante.
b) liofilização ou secagem dos Iipossomas vazios
c) obtenção de vesículas desidratadas-rehidratadas (DRVs)
d) complexação de um polinucleotídeo com as DRVs através da mistura deDRVs com polinucleotídeos na proporção de 1,1 a 50 moles de cargaspositivas dos lipídeos catiônicos para 1 mol de carga negativa dopolinucleotídeo.
A obtenção de Iipossomas multilamelares ocorre através de hidratação de umamistura de lipídios. A hidratação da mistura de lipídios pode ocorrer, inicialmente, atravésda solubilização de lipídios em solvente orgânico, sendo, preferencialmente utilizado oclorofórmio como solvente orgânico. Promove-se, então, a evaporação do solventeorgânico para, em seguida, adicionar-se água sob agitação intensa, favorecendo, assim,a formação de Iipossomas hidratados multilamelares. Pode-se, alternativamente, hidrataruma mistura de lipídios através da adição direta de lipídios (em pó) em água sobagitação, sob condições controladas de temperatura e agitação com a utilização de umhomogeneizador de alta pressão para dispersar os lipídios em meio aquoso. A mistura delipídios que é hidratada de acordo com procedimento descrito anteriormente, compreendelipídio catiônico, lipídio estrutural e lipídio coadjuvante.
O lipídio catiônico presente na mistura de lipídios que é hidratada é selecionadodentre 1,2-Dimyristoyl-3-Trimethylammonium-Propane; 1,2-Dipalmitoyl-3-Trimethylammonium-Propane; 1,2-Distearoyl-3-Trimethylammonium-Propane; 1,2-Dioleoyl-3-Trimethylammonium-Propane; 1,2-Diacyl-3-Dimethylammonium-Propane; DC-CholesterolHCI; Dimethyldioctadecylammonium Bromide; 1,2-Dilauroyl-sn-Glycero-3-Ethylphosphocholine; 1,2-Dimyristoyl-sn-Glycero-3-Ethylphosphocholine; 1,2-Dipalmitoyl-sn-Glycero-3-Ethylphosphocholine; 1,2-Distearoyl-sn-Glycero-3-Ethylphosphocholine; 1,2-Dioleoyl-sn-Glycero-3-Ethylphosphocholine; 1-Palmitoyl-2-Oleoyl-SA?-Glycero-3-Ethylphosphocholine; 2,3-dioleyloxy-N-[2(sperminecarboxamido)ethyl]-N,Ndimethyl-1-propanaminium trifluoroacetate; N-[1 -(2,3-dioleyloxy)propyl]-n,n,n-trimethylammoniumchloride e 1,2-Dioleoyl-sn-Glycero-3-[Phospho-L-Serine]. Preferencialmente, o Iipfdiocatiônico presente na configuração Iipossomal da invenção é o 1,2-Dioleoyl-3-Trimethylammonium-Propane.
O Iipfdio estrutural presente na mistura de lipídios que é hidratada é selecionadodentre lipídios sintéticos com cadeias de ácidos graxos assimétricas, lipídios sintéticoscom cadeias de ácidos graxos simétricas saturadas, lipídios sintéticos com cadeias deácidos graxos simétricas insaturadas e lipídios naturais. O lipídio sintético com cadeias deácidos graxos assimétricas é selecionado dentre 1-Myristoyl-2-Palmitoyl-sn-Glycero-3-Phosphocholine; 1 -Myristoyl-2-Stearoyl-sn-Glycero-3-Phosphocholine; 1 -Palmitoyl-2-Myristoyl-sn-Glycero-3-Phosphocholine; 1-Palmitoyl-2-Stearoyl-SA?-Glycero-3-
Phosphocholine; 1 -Palmitoyl-2-Oleoyl-sn-Glycero-3-Phosphocholine; 1 -Palmitoyl-2-Linoleoyl-sn-Glycero-3-Phosphocholine; 1-Palmitoyl-2-Arachidonoyl-sn-Glycero-3-Phosphocholine; 1-Palmitoyl-2-Docosahexaenoyl-sn-Glycero-3-Phosphocholine; 1-Stearoyl-2-Myristoyl-sn-Glycero-3-Phosphocholine; 1-Stearoyl-2-Palmitoyl-s/>Glycero-3-Phosphocholine; 1 -Stearoyl-2-Oleoyl-sn-Glycero-3-Phosphocholine; 1 -Stearoyl-2-Linoleoyl-sn-Glycero-3-Phosphocholine; 1-Stearoyl-2-Arachidonyl-s/>Glycero-3-
Phosphocholine; 1 -Stearoyl-2-Docosahexaenoyl-sn-Glycero-3-Phosphocholine; 1 -OIeoyI-2-Myristoyl-sn-Glycero-3-Phosphocholine; 1 -Oleoyl-2-Palmitoyl-sn-Glycero-3-
Phosphocholine; 1-Oleoyl-2-Stearoyl-sn-Glycero-3-Phosphocholine. O lipídio sintéticocom cadeias de ácidos graxos simétricas saturadas é selecionado dentre 1,2-Diacyl-sn-Glycero-3-Phosphocoline onde os grupos acyl possuem número de carbonos variandoentre C3 a C24- O lipídio sintético com cadeias de ácidos graxos simétricas insaturadas éselecionado dentre 1,2-Diacyl-sn-Glycero-3-Phosphocoline onde os grupos acyl possuemnúmero de carbonos:insaturações variando entre C14:1 a C24:1, C18:2 a C18:3, C20:4ou C22:6. O lipídio natural é selecionado dentre fosfatidilcolina de soja ou fosfatidilcolinade ovo. Preferencialmente, o lipídio natural é a fosfatidilcolina de ovo.
O lipídio coadjuvante presente na mistura de lipídios que é hidratada éselecionado dentre colesterol e L-alpha-Dioleoyl Phosphatidylethanolamine.Preferencialmente, o lipídio coadjuvante presente namistura é o L-alpha-DioleoylPhosphatidylethanolamine.
O processo de obtenção de configuração Iipossomal funcional da presenteinvenção pode compreender, ainda, uma etapa de redução e homogeneização dosIipossomas após a obtenção dos mesmos na etapa a. A redução de tamanho dosIipossomas ocorre através de etapa de extrusão, na qual os Iipossomas devematravessar membranas de policarbonato sobrepostas, com diâmetro nominal de 100 nm,sob pressão de nitrogênio em diversas passagens. Nessas condições ocorre a reduçãodo tamanho destas partículas.
A redução de tamanhos não se torna necessária quando os lipídios sãohidratados através da adição direta dos lipídios (em pó) em água sob agitação, sobcondições controladas de temperatura e agitação, ou com a utilização de umhomogeneizador de alta pressão para dispersar os lipídios em meio aquoso.
A obtenção de vesículas desidratadas-rehidratadas (DRVs) na etapa c ocorreatravés de hidratação dos Iipossomas vazios obtidos na etapa b sob agitação etemperatura de O0C a 12 °C. Preferencialmente, a temperatura de hidratação dosIipossomas vazios é de 2°C a 5°C.
Na etapa d de obtenção da configuração Iipossomal funcional da invenção, aconcentração de lipídios (DRVs) a serem complexados com polinucleotídeo é de 0,02Ma 0,2M. Preferencialmente, a concentração de lipídios a serem complexados compolinucleotídeo é de 0,05M a 0,1 M. Ainda na etapa d, a mistura de DRVs compolinucleotídeos ocorre, preferencilamente, na proporção 5 a 15 moles de cargaspositivas dos lipídeos catiônicos para 1 mol de carga negativa do polinucleotídeo. Aindamais preferencialmente, a mistura de DRVs com polinucleotídeos ocorre na proporção 10moles de cargas positivas dos lipídeos catiônicos para 1 mol de carga negativa dopolinucleotídeo. A mistura de DRVs com polinucleotídeos na etapa d, ocorre àtemperatura de O0C a 12°C. Preferencialmente a a mistura de DRVs compolinucleotídeos ocorre à temperatura de 2°C a 5°C.
A invenção em questão se refere, ainda, a processos de obtenção deconfiguração Iipossomal funcional que incluam o processo descrito nesta invenção e acomposições farmacêuticas contendo configuração Iipossomal como àquela descrita nainvenção.
A invenção se refere, também, a uma configuração Iipossomal definida nainvenção obtida de acordo com processo definido na invenção.
Como exemplo da funcionalidade da presente invenção e para efeitos decomparação com outras configurações lipossomais, foi criada, de acordo com processoobjetivo da presente invenção, e testada uma configuração Iipossomal funcional contendoo composto bioativo plasmideal pVax hsp65, com ação vacinai e terapêutica, constituindouma formulação atóxica, estável e reprodutível que será intitulada de DRV-DNA. Essaconstrução plasmideal, carreadora do gene Hsp65 de M. leprae, possui ação profilática eterapêutica comprovada (Lowrie1D.B.; Tascon, R.E.; Colston, M.J.; Silva, C.L., Vaccine, v.12, p. 1537-1540, 1994; Tascon, R.E.; Colston, M.J.; Ragno, S.; Stavropoulos, E.; Lowrie,D.B., Nat.Med., v.2, p. 888-892, 1996; Lowrie, D.B.; Silva, C.L.; Tascon, R.E., SpringerSeminars in Immunopathology, v. 19, p. 161-173, 1997; Bonato, V.L.D.; Lima, V.M.F.;Tascon, R.E.; Lowrie,D.B.; Silva, C.L., lnfect. Immun., v.66, p. 169-175, 1998; Lowrie,D.B.; Tascon, R.E.; Bonato, V.D.L.; Lima, V.M.F.; Faccioli, L.H.; Stavropoulos, E.;Colston, M.J.; Hewinson, R.G.; Moelling, K.; Silva, C.L., Nature, v. 400, p. 269-271, 1999).A seguir são apresentadas caracterizações que identificam propriedades físico-químicase biológicas da configuração Iipossomal funcional DRV-DNA contendo a construçãoplasmideal pVax hsp65.
O esquema da Figura 3 ilustra comparativamente as etapas para a preparação daconfiguração DRV-DNA em comparação com a configuração DRV(DNA) e a configuraçãobinária de lipoplexo. O método de preparação é simples, composto de etapas passíveisde serem escalonadas para a produção comercial. O controle rígido das condiçõesoperacionais assegura a reprodutibilidade da configuração produzida.
Na configuração Iipossomal DRV-DNA, como também nas outras configuraçõesusadas para comparação , DRV(DNA) e lipoplexo, foi usada uma razão de cargas (R+/-10), requerida para se atingir uma dosagem de DNA menor do que a anteriormentedeterminada para o DNA nu para terapia e vacinação (3 dosagens de 100μg). Asformulações lipídicas contiveram concentração total de Iipfdios 256 mM, que produziramuma concentração total de 50 μg de DNA em 100 μί de preparação lipídios.
As Figuras 4 a 8 mostram as diferenças morfológicas entre as váriasconfigurações Iipossomais incorporando DNA plasmideal, através de imagens obtidas pormicroscopia eletrônica de transmissão (METs). Assim, as Figuras 4A e B, mostram aestrutura de DRV vazia, da configuração Iipossomal funcional do tipo DRV-DNA com oDNA posicionado preferencialmente na superfície (Figuras 5A a D), em comparação comas configurações contendo do DNA encapsulado DRV(DNA) (Figuras 6A a D), agregadoslipídicos (Figuras 7A e B) e Iipoplexos (Figuras 8A a D).
Nas Figuras 4A e B que mostram as estruturas Iipossomais vazias do tipo DRVs,pode-se observar morfoiogia aproximadamente esférica, apresentando certo grau defusão e agregação, identificados peia presença de estruturas maiores e polidispersas. Oprocesso de desidratação e rehidratação (DRV) apresenta, como principal limitação, aprodução de Iipossomas de elevado diâmetro e de população heterogênea, propiciandotambém a formação de Iipossomas multilamelares (KIRBY, C.; GREGORIADIS, G.,Biotechnology, ν. 2, ρ. 979-984, 1984). A elevada polidispersidade pode ser constatada apartir da distribuição de tamanhos obtida através de espalhamento da luz ("quasi-elasticIight scattering", QLS) (Figura 9C), onde duas populações são normalmente encontradas:uma menor de cerca de 175 nm e outra maior de cerca de 932 nm. A menor populaçãopode estar relacionada às vesículas que não sofreram agregação ou fusão, enquanto asegunda população, de diâmetro maior, pode relacionar-se às estruturas coloidaismaiores provenientes de fusões ou agregações.
As estruturas DRV-DNA apresentadas nas Figuras 5 (A a D), apresentamalterações na morfologia em relação aos DRV vazios, em decorrência da encapsulaçãodo DNA na razão de cargas R+/- 10. Estruturas tubulares podem ser identificadas emregiões próximas da superfície lipossomal, sugerindo que o DNA esteja localizado nasregiões mais externas dos Iipossomas (Figuras 5B, C e D). As imagens brancas queapareceram nestas microscopias, geradas por artefatos na preparação das amostras,não comprometeram a avaliação morfológica das estruturas. Razões de cargas maiores(menores quantidades de DNA), não são suficientes para alterar a morfologia dos DRVscomo reportado por Perrie et al (2001) para Iipossomas com R+/- 20 . As diferençasestruturais observadas na Figuras 5 podem, também, ser identificadas a partir dosdiâmetros hidrodinâmicos médios e distribuição de tamanhos (Tabela 1).
TABELA 1
Estrutura Lipídica
<table>table see original document page 21</column></row><table>(i) SD: Desvio padrão para número de amostras variando entre 3 e 4.
Os tamanhos variados das estruturas são resultantes de um rearranjo específicoque ocorre após a agregação (contato) e subseqüente mistura de lipídios entre vesículas(etapa intermediária) das membranas lipòssomais, resultando na formação de uma novabicamada. Estas interações facilitam o "cross-linking" das vesículas através de pontes deDNA1 podendo levar a mudanças nas membranas Iipossomais favorecendo fusões ououtras formas de desestabilização das bicamadas, como reportado por (WASAN, E. K.;HARVIE P.; EDWARDS, K.; KARLSSON, G.; BALLY, M. B., Biochimica et BiophysicaActa, v.1461, p. 27-46, 1999).
A diferença entre as morfologias encontradas para estruturas do tipo DRV(DNA) eDRV-DNA1 Figuras 5 e 6, respectivamente, são significativas, especialmente nasuperfície externa dos lipossomas. Estruturas do tipo DRV(DNA) apresentam algumasirregularidades morfológicas (Figura 6 C), porém as estruturas DRV-DNA apresentamelevado grau de irregularidade (Figura 5 B, C e D), formando estruturas tortuosas em suasuperfície. A comparação entre estas duas estruturas sugere que DRV(DNA) apresentadistribuição do DNA mais homogênea ao longo das bicamadas lipídicas, promovida peloprocesso de encapsulação (desidratação e rehidratação controlada), enquanto DRV-DNApermite que o DNA localize-se nas superfícies mais externas. A localização mais externado DNA permite que fusões e agregações entre vesículas ocorram mais facilmente,promovendo rupturas de bicamadas, formando assim as estruturas tubulares ou tortuosasapresentadas na Figura 5 D.
METs dos agregados lipídicos são apresentados na Figura 7. Pode-se identificar apresença de estruturas esféricas (Figura 7A), porém encontram-se também estruturasresultantes de fusões e agregações. A Figura 7B revela algumas estruturas comirregularidades em sua forma, quando comparado à morfologia de lipossomas do tipoDRV vazio (Figura 4A e 4B).
Wasan, E. K.; Harvie P.; Edwards, K.; Karlsson, G.; Bally, Μ. B. Biochimica etBiophysica Acta, v.1461, p. 27-46, 1999, obteve imagens através de microscopiaeletrônica de crio-fratura em estruturas lipídicas de DODAC (dioleyldimethylammoniumchloride)/DOPE (50/50% molar) em 150 mM de NaCI e constatou a instabilidade dabicamada, podendo até visualizar que parte da estrutura organiza-se na fase hexagonalinversa (Figura 2). A identificação desta instabilidade pode justificar o polimorfismoencontrado nas estruturas DOPE/DOTAP (50/50% molar) preparadas em 154 mM deNaCI e visualizadas através das microscopias (Figura 7A e 7B).As microscopias de DRVs vazios e agregados lipídicos (Figuras 4 e 7,respectivamente) mostram que ambos os sistemas lipídicos apresentam-se altamentepolidispersos. Por outro lado, a análise de distribuição de tamanhos obtida através deespalhamento dinâmico de luz (QLS) nos mostra que estas estruturas apresentamdistribuição bimodal e também bastante polidispersa. A segunda população identificadana distribuição de tamanhos (Figura 9) pode ser provavelmente conseqüência dealgumas fusões que ocorrem, conforme apresentado nas Figuras 4A e 4B para DRVsvazias e 7A e 7B para agregados lipídicos. Esses resultados mostram que a distribuiçãoe empacotamento dos lipídios na estrutura Iipossomal depende do método depreparação.
A característica polimórfica dos Iipoplexos pode ser facilmente visualizada naFigura 8. Formas aleatórias podem ser identificadas (Figuras 8A e 8B), como tambémestruturas tubulares semelhantes às das estruturas do tipo DRV-DNA (Figura 8C e 8D).
Alterações morfológicas significativas também foram observadas por (Wasan, E.K.; Harvie P.; Edwards, K.; Karlsson, G.; Bally, M. B., Biochimica et Biophysica Acta,v.1461, p. 27-46, 1999), identificando porém que a superfície era do tipo "impressãodigital" ("finger print") para estruturas lipídicas formadas por DODAC/DOPE (50/50 %molar), porém em razão de cargas 1,6. Estruturas similares também foram encontradaspor Gustafsson et al. (1995) e Smisterová et al. (2001) em sistemas contendoDOPE/DOTAP e SAINT-2 (lipídios catiônicos derivatizados com pirimidina/DOPE 1:1),respectivamente. A presença destas "impressões digitais" foram encontradas somenteem formulações contendo DOPE.
A comparação das microscopias para DRV-DNA e Iipoplexos (Figuras 5 D e 7C)permite identificação de regiões que possuem morfologia similar às "impressões digitais"descritas. A estimativa das peridiocidades encontradas revela valores na faixa de 2,5 a5,5 nm, de mesma ordem de grandeza que o estudo anteriormente citado, indicando queo mesmo tipo de empacotamento esteja ocorrendo nas regiões identificadas. Porém, amorfologia global encontrada nos DRV-DNA e Iipoplexos não é a mesma encontrada porWasan, E. K.; Harvie P.; Edwards, K.; Karlsson, G.; Bally, Μ. B. Biochimica et BiophysicaActa, v.1461, p. 27-46, 1999, sugerindo que diferenças de parâmetros de processodurante a complexação possam alterar a morfologia dos vários tipos de complexos.
A Figura 10 apresenta a eletroforese da configuração DRV-DNA em comparaçãocom o DNA livre, mostrando a manutenção integridade do plasmídio após a preparação.
A configuração produzida, designada por DRV-DNA, possui ainda flexibilidade na razãomolar de cargas (R+/-) em função da dose de DNA requerida, respeitando a razão decargas mínima, determinada experimentalmente, para a complexação total do DNA. Essapropriedade permite que a configuração Iipossomal possa ser utilizada para outros DNAplasmideais.
A razão de cargas (R+/-) mínima para a complexação total do DNA depende daexposição do Iipfdio catiônico, e portanto caracteriza a configuração agregada. Aseletroforeses da Figura 11 mostram comparativamente a razão de cargas, (R+/-), mínimapara complexação total do DNA na configuração DRV-DNA (A), em comparação com aconfiguração contendo o DNA encapsulado [DRV(DNA)] (B) e Iipoplexos (C) Os valoresobtidos de (R+/-) são apresentados comparativamente na Tabela 2, para as váriasconfigurações de DNA associado a DRVs, incluindo ainda a configuração resultante daassociação do DNA com Iipossomas extrudados (DNA-LE) (obtidos pelo método deBangham e extrudados para homogeneização de tamanhos) e lipoplexos.
TABELA 2
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A razão de cargas 1,5 identificada para a configuração DNA-LE foi a mesmaencontrada para os agregados lipídicos formadores dos lipoplexos. Os Iipossomasextrudados, com diâmetro médio de 136 nm e distribuição unimodal, devido ao seutamanho permitem exposição de maior quantidade de cargas positivas, fazendo com querazões de carga 1,5 já promovam a incorporação total do DNA. No caso dos agregadoslipídicos, apesar do maior tamanho (396,5 e 1792,8 nm), permite também que nestarazão de cargas (R+/-1,5) todo o DNA já esteja complexado. Este comportamento mostraa instabilidade da estrutura Iipfdica contendo somente DOPE/DOTAP para complexar-secom o DNA.
Quando DRVs são utilizados para complexação com o DNA, verifica-se que arazão molar de cargas (R+/- ) necessária para promover a incorporação completa doDNA na configuração DRV-DNA é 4. Comparando este valor com o obtido para DNA-LE,que se diferencia somente no diâmetro hidrodinâmico e distribuição de tamanhos, tem-seque, para estruturas que possuem o lipídio estrutural EPC, além do tamanho, adistribuição dos lipídios na estrutura Iipossomal são fatores importantes da razão decargas para incorporação do DNA. Através microscopia eletrônica e crio-fratura, Perrie,Y.; Frederik, Ρ.Μ.; Gregoriadis1 G. Vaccine1 ν. 19, ρ. 3301-3310, 2001, teve um indicativoque as estruturas DRVs são multilamelares. Essa informação explica a razão de cargasmais elevada da configuração DRV-DNA em comparação com DRV-LE, pela presençade Iipfdio catiônico nas Iamelas mais internas dos lipossomas, dificultando o contatoinicial com o DNA e sua subseqüente complexação. Como o EPC age de modoestrutural, estabilizando a agregação lipídica em bicamadas, torna-se mais difícil para oDNA complexar-se com os Iipfdios catiônicos presentes nas camadas mais internas.
Estruturas do tipo DRV(DNA) utilizando plasmídeo semelhante (pcDNA3-hsp65)em tampão TRIS-Edta demonstraram capacidade de incorporação de DNA em razões decarga de até 3,5.
A grande diferença entre a razão de cargas utilizada nas preparações Iipfdicaspara os testes in vitro e in vivo deste exemplo (R+/- 10) e a razão na qual promove-se aincorporação completa do DNA (Tabela 2) identifica a grande flexibilidade do sistemapara ajustes de concentração de DNA para atender aos requerimentos de dose conformea aplicação.
As diferenças no empacotamento DNA/lipídios nas configurações Iipossomais enos lipoplexos, caracterizadas pela razão de cargas e observadas nas microscopias,refletem-se na carga superficial medida pela técnica do potencial zeta . Dependendo dograu de complexação, a configuração resultante apresenta carga superficial diférente. ATabela 3 mostra comparativamente a carga superficial das formulações Iipfdicas demesma composição incorporando o DNA plasmideal pvax hsp65 nas configuraçõesIipossomais (A e B) e nos lipoplexos (C).
TABELA 3
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(i) SD: Desvio padrão para 3 amostras.
(ii) Medidas utilizaram solução salina 0,9% como meio diluente
Todas as estruturas lipídicas produzidas em NaCI 0,9% são de característicacatiônica pois apresentam valores de potencial zeta (ζ) positivos. A presença do lipídioestrutural EPC nos lipossomas DRVs promove diminuição significativa do valor dopotencial zeta, devido, provavelmente, à maior internalização dos lipídios que ocorretanto pela sua agregação com o DOPE e DOTAP, quanto pela fusão após a rehidrataçãoe complexação com o DNA.
No caso dos agregados lipídicos, os lipídios catiônicos tornam-se mais expostosna superfície coloidal, comparados aos DRVs.
A presença de DNA na razão de cargas (R+/-) 10 não influencia significativamentena característica catiônica do DRVs e lipoplexos. Este fato indica que a superfície destescolóides mantém-se catiônica, com valores de densidade de carga na mesma ordem degrandeza quando o DNA é simplesmente complexado (DRV-DNA e lipoplexos) ou entãoincorporado [DRV(DNA)], sugerindo, que, juntamente com a avaliação eletroforética, queo DNA presente nestas estruturas está totalmente associado.
A técnica de calorimetria exploratória diferencial foi utilizada para avaliar ainfluência da composição Iipfdica e da presença do DNA na temperatura de transição defase das diferentes estruturas lipídicas. A preparação das amostras consistiu de umaetapa prévia de liofilização e outra de acondicionamento em dessecador, sob vácuo erefrigeração. Os termogramas p'ara as estruturas lipídicas vazias e com o DNAincorporado (Figura 12) permite a identificação das principais temperaturas de transição eos respectivos valores de entalpia, conforme apresentado na Tabela 4.
TABELA 4
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(iii) Variação de entalpia
(iv) Variação de entropiaAs estruturas do tipo DRV (Figura 12) tiveram a transição de fases ocorrendo emmaior faixa de temperatura, gerando bandas mais largas e de transição assimétricaquando comparado aos agregados lipídicos e lipoplexos, causados pela presença doEPC1 que é de origem natural e que contém uma mistura de fosfolipídeos com ácidosgraxos variados.
Os termogramas referentes aos agregados lipídicos e lipoplexos (Figura 12) quecontêm apenas DOTAP e DOPE como lipídios em sua composição, apresentam picomais definido, devido, provavelmente, à maior pureza, pois se tratam de lipídiossintéticos.
As temperaturas de transição de fases para DRV vazio e agregados lipídicosforam 12,97 e 1,22°C, respectivamente. Esta variação de temperatura de transição defases ocorre devido às diferenças de composições lipídicas encontrada em cadaestrutura, refletindo conseqüentemente em diferenças na forma de agregação de cadaestrutura.
No caso dos agregados lipídicos, a temperatura de transição de fases tem acontribuição apenas dos lipídios DOPE e DOTAP, ambos em fração molar 0,5. Nomesmo estudo realizado por KOLTOVER, I.; SALDITT, T.; RADLER, J.O.; SAFINYA,C.R. Science, v. 281, p. 78-81, 1998, formulações lipídicas nestas condições, em água,tendem a formar simultaneamente duas fases, a hexagonal inversa (H0I1) e a Iamelar(Lca). Desta forma, a temperatura de transição de fases pode estar relacionada àtransição de fase líquido cristalino para hexagonal inversa (Lca Hcn).
A presença do EPC nas estruturas DRV vazia, permite maior interaçãohidrofóbica, gerando menor nível de variação de entalpia (ΔΗ = 2010 cal/mol), enquanto,a presença somente de DOPE e DOTAP para os agregados lipídicos diminui estasinterações, contribuindo para um maior nível de variação de entalpia ((ΔΗ = 4485cal/mol). As variações de entropia ((AS) para DRV vazio e agregados lipídicos foram 7,03e 16,36 cal/mol.K, respectivamente. O maior valor de (AS para os agregados lipídicospode indicar maior desorganização desta estrutura, possivelmente pela presençaorganização lipfdica na forma hexagonal inversa. .
Para o DNA incorporado em estruturas [DRV(DNA)], o valor de Tm é 12,87°C,mantendo-se muito próximo ao valor da respectiva estrutura DRV vazia (Tm = 12,97°C).
Isto sugere que o DNA não está provocando grandes perturbações na organização dabicamada lipídica, indicando que o processo de desidratação e rehidratação, no qualocorre fusão entre as vesículas, permite boa acomodação do DNA possivelmente na faseaquosa entre as lamelas, em uma configuração do tipo sanduíche, como proposto porRÀDLER, J.O.; KOLTOVER, I.; SALDITT, T.; SAFINYA, C.R. Science, v. 275, p. 810-814,1997.
Esta avaliação também é consistente com os valores de variação de entalpia eentropia, pois estes não sofrem alterações significativas, indicando que a presença doDNA não altera significativamente as interações hidrofóbicas e o nível de organização dabicamada.
A simples complexação do DNA com DRVs vazios gera estruturas do tipo DRV-DNA. Neste caso, observa-se um aumento de Tm para 14,410C, sendo maior que arespectiva estrutura vazia (Tm = 12,97°C) e o DRV(DNA) (Tm= 12,87°C). Este mesmocomportamento de Tm também foi identificado por SUBRAMANIAN, M.; HOLOPAINEN,J. M.; PAUKKU, T.; ERIKSSON, O.; HUHTANIEM, I.; KINNUNEN, P. K.J., Biochimica etBiophysica Acta, v. 1466, p. 289-305, 2000, em estudos de caracterização de Iipossomascompostos por DMPC/BPDAB (95/5% molar), onde BPDAB refere-se a bis[2-(11-phenoxyundecanoate)ethyl]dimethylammonium bromide. Os autores identificaram quemesmo um pequeno aumento da concentração de DNA eleva a temperatura de transiçãode fases, também sugerindo que o DNA condensa o lipídio catiônico, formando domínioslipídicos ordenados que alteram Tm.
Os agregados lipídicos apresentam temperatura de transição de fases 1,22°C(Tabela 4). Quando estas estruturas são complexadas com o DNA, a temperatura detransição de fases cai para -2,410C. Isto indica que a organização no empacotamentolipfdico sofreu perturbações, diminuindo as interações de atração de van der Waals.
A acessibilidade de sonda fluorescente ao DNA caracteriza o seu posicionamentona configuração estrutural de lipídios. Os espectros de emissão de fluorescência doreagente PicoGreen após ligação com DNA dupla fita (dsDNA), DNA fita simples (ssDNA)e RNA estão ilustrados através da Figura 13, indicando a especificidade desta sonda aoDNA dupla fita. Esta sonda é específica para quantificação de DNA dupla fita (dsDNA),porém o mecanismo de ligação deste reagente ainda não é totalmente claro, ocorrendopossivelmente sua intercalação com o DNA (SINGER, V.L.; JONES, L.J.; YUE, S.T.;HAUGLAND, R.P., Analitycal Biochemistry., v. 249, p. 228-238, 1997).
Quando esta sonda é utilizada em complexos lipídio catiônico/DNA, verifica-seque ocorre um decaimento de intensidade de fluorescência, que é dependente da razãode cargas. Este decaimento é causado pela barreira criada pelo lipídio catiônico e pelaestrutura lipídica, diminuindo, desta forma, a acessibilidade da sonda ao DNA (TSAI, J.T.;FURSTOSS, K.J.; MICHNIK, T.; SLOANE, D.L. Biotechnology and Applied Biochemistry1v. 36, p. 13-20, 2002.). Curvas de intensidade de fluorescência em função da razão decargas podem ser construídas, permitindo a caracterização quanto a acessibilidade dasonda de DNA nas diferentes estruturas lipídicas. A fim de se minimizar a influência, dacomposição do meio, utilizou-se água ultrapura (MiIIi-Q) como meio reacional decomplexação.
Os perfis de decaimento de fluorescência emitida pela sonda PicoGreen nasestruturas do tipo DRV e agregado lipídico em função da razão de cargas emfluorescência (porcentagem do inicial) estão apresentados na Figuras 13. Inicialmente aintensidade de fluorescência cai e atinge um valor constante a medida que se eleva arazão de cargas. Quando maiores teores de lipídío catiônico são empregados, aquantidade de DNA livre na solução tende a desaparecer, e conseqüentemente, diminui aquantidade de DNA acessível à sonda. Valores de R+/- maiores que 4 para DRV-DNA e1,75 para Iipoplexo já mantêm a intensidade de fluorescência absoluta praticamenteconstante, indicando que razões de carga maiores não promovem mais influência,possivelmente por não haver mais DNA acessível na suspensão coloidal. Este valor defluorescência "residual" é então característico de cada tipo de estrutura lipídica, podendo,neste ponto, identificar a intensidade de fluorescência (percentagem do inicial) como aacessibilidade da sonda ao DNA. Os valores acessibilidade foram 37±8,7% e 12%, paraDRV-DNA e lipoplexo, respectivamente. Isto indica que estruturas DRV-DNA permitemmaior acesso do PicoGreen ao DNA. Por outro lado, como a complexação do DNA com oPicoGreen depende fortemente da presença da configuração em dupla fita do DNA,nesses ensaios a intensidade da fluorescência é uma função não só da quantidade deDNA, mas também da sua conformação (dupla fita ou fita única).
Apesar de não se ter realizado medida da fluorescência do lipoplexo e DRV-DNAem R+/- 10, sabe-se que o valor da intensidade de fluorescência é praticamente igual aoencontrado para R+/- 1,75 e 4, respectivamente, conforme verificado no comportamentoda Figura 13 (região do patamar). Desta forma, a acessibilidade e o comportamentodestas construções em R+/-10 é igual à identificada anteriormente.
A intensidade de fluorescência para a construção DRV(DNA) em R+/- 10(formulação utilizada para teste "in vivo") foi medida, viabilizando a identificação daacessibilidade, gerando valor de 27,6%. Esse valor é menor que o encontrado para oDRV-DNA (37%), possivelmente devido à distribuição mais uniforme existente nosDRV(DNA)S ocasionada pelo processo de desidratação e rehidratação. Esta diferençasugere que somente efeitos difusivos estejam influenciando na intercalação da sonda aoDNA1 indicando que o DRV(DNA) possui o DNA mais internalizado em sua estrutura,enquanto o DRV-DNA possui o DNA presente na região mais externa, e que aconfiguração em dupla fita é mantida. As acessibilidades da sonda ao DNA contido emcada tipo de estrutura podem ser então relacionadas, organizando-as em ordemdecrescente: DRV-DNA > DRV(DNA) > Lipoplexo. Este comportamento permite distinguiras diferenças entre os tipos de estruturas DRVs e agregados lipídicos. Os DRVspermitem maior acesso da sonda ao DNA possivelmente devido à sua maior organizaçãoem bicamada, enquanto os agregados lipídicos permitem interação molecular maisintensa, devido à menor estruturação lipídica (presença simultânea das formas Iamelar ehexagonal inversa), dificultando difusão e a intercalação da sonda ao DNA.
A avaliação da estabilidade física das estruturas lipídicas contendo DNA e dasrespectivas estruturas "vazias" foi realizada a partir do monitoramento do diâmetrohidrodinâmico das diferentes populações ao longo de 70 dias de estocagem sobrefrigeração, conforme apresentado na Figura 14.
A estrutura do tipo DRV vazio manteve-se praticamente constante ao longo de 60dias de estocagem (Figura 14A) mantendo as duas populações (200 nm e 900 nm).
Quando o DNA é encapsulado [DRV(DNA)], as duas principais populações são mantidas,embora a população de diâmetro hidrodinâmico maior tenha uma leve tendência aaumentar de tamanho (Figura 14B). Evidencia-se a presença de duas populações comdiâmetros hidrodinâmicos da mesma ordem de grandeza que as respectivas populaçõesencontradas para a estrutura vazia, porém com maior oscilação de tamanho para apopulação 2. Esta oscilação pode ser justificada pela alteração de morfologia (alteraçãode esfericidade, por exemplo) encontrada nas microscopias eletrônicas de transmissão(Figura 6) conferindo certa variação de leitura dos diâmetros no equipamento deespalhamento dinâmico de luz.
A estrutura DRV-DNA (Figura 14C), por sua vez, já apresenta uma maiortendência de agregação da maior população. A população de menor tamanho, comdiâmetro médio próximo de 400 nm manteve-se relativamente estável. A população demaior tamanho manteve-se também estável durante 30 dias com certa tendência deagregação após 60 dias de estocagem.
Embora certa variação dós diâmetro hidrodinâmicos ocorram para as estruturasdo tipo DRV, a variabilidade foi considerada aceitável, uma vez que o diâmetrohidrodinâmico máximo estabelecido pelo Centro de Pesquisas em Tuberculose é de 6 μπιpara a aplicação em vacinas.A estocagem de agregados lipídicos sob refrigeração e conseqüenteacompanhamento da distribuição de tamanhos e diâmetro hidrodinâmico pode servisualizada na Figura 14D. Neste caso, pode-se verificar a menor estabilidade destasestruturas, através da presença inicial de três populações, inclusive com agregados daordem de 12000 nm. Ao longo da estocagem, significativas alterações populacionaisocorrem, pois a partir do 15° dia de estocagem a menor população com diâmetro inicialde 100 nm desaparece e a terceira população inicia o decaimento de seu tamanho,enquanto a segunda população é a que permanece mais estável, sendo que o sistemaapresenta-se altamente polidisperso durante todo o período avaliado.
O comportamento do diâmetro hidrodinâmico das populações dos Iipoplexos estáapresentado Figura 14E. Existe uma tendência na variação do diâmetro hidrodinâmico damaior população, indicando que próximo a 15 dias de estocagem esta população assumeum tamanho mínimo por volta de 2000 nm para em seguida aumentar novamente. Alémdisso, após 35 dias de estocagem apareceram agregados que não se dispersavam comuma agitação manual, indicando que um estado irreversível de agregação estava seiniciando.
É interessante notar que todas as estruturas Iipfdicas catiônicas produziram umapopulação com diâmetro na faixa de 200 a 500 nm que se mantém relativamente estávelao longo do período de estocagem avaliado, independentemente da composição(presença ou ausência do lipídio estrutural) e método de incorporação do DNA(encapsulação ou complexação eletrostática).
As diferentes construções lipídicas foram avaliadas quanto à citotoxicidade in vitroem células de macrófagos da linhagem J774 através do emprego de metodologiabaseada na redução do Brometo de tiazolil - (3-[4,5-Dimetiltiazol-2-il]-2,5-difeniltetrazólio -Sal de tetrazólio MTT, realizado apenas pelas células vivas, a partir de métododesenvolvido por DENIZOT, F.; LANG, R. Journal of Immunological Methods, v. 89, p.271-277, 1986.
A Figura 15 apresenta as curvas de células viáveis relativas ao controle para asvárias estruturas lipídicas [DRV vazio, DRV-DNA1 DRV(DNA), agregado lipídico elipoplexo] em presença do plasmídeo pVAX-hsp 65 ou somente do vetor comercial pVAXem várias concentrações. A abscissa deste gráfico possui 2 escalas diretamenterelacionadas: a quantidade de DNA utilizada para os ensaios " in vitro", proporcional aovolume total de solução Iipfdica empregada. Estas escalas duplas são necessárias, pois aavaliação teve âmbito geral, incluindo o DNA nu (em quantidade proporcional ao utilizadonas formulações lipídicas) e formulações lipídicas contendo ou não DNA. Para estruturasdo tipo DRV ou apenas o DNA nu com dosagens de até 200 μς de DNA ou 400 μ L desolução lipídica, 70% das células ainda permanecem viáveis, enquanto agregadoslipídicos e Iipoplexos apresentam menos que 50% das células viáveis para dosagem de8,37 μg de DNA ou 17 μΙ_ de solução lipídica. Este comportamento indica elevadacitotoxicidade destas estruturas lipídicas que não contém a fosfatidilcolina natural de ovoem sua formulação. É válido ressaltar que muitos ensaios de transfecção "in vitro" sãorealizados com estas estruturas, porém as concentrações lipídicas são bastante inferioresà proposta neste trabalho.
Através da transfecção "in vitro" em macrófagos da linhagem J774 foi possívelidentificar se o plasmídeo conseguiu atingir o núcleo celular e realizou a etapa detranscrição para que a síntese do RNA mensageiro (mRNA) que contém a codificação daproteína hsp 65 possa ocorrer. O método empregado, consistiu em realizar a incubaçãodas estruturas lipídicas com as células de macrófagos, para em seguida realizar aextração do RNA total. Como é difícil a identificação do mRNA específico do hsp 65,utiliza-se uma enzima do tipo transcriptase reversa para a obtenção do cDNA (DNAcomplementar) total. Através da técnica de PCR, realizou-se a amplificação do cDNAespecífico para o hsp 65 ou β-actina (controle) para posterior identificação emeletroforese em gel de agarose. Como a β-actina é um elemento constitutivo das célulaseucarióticas, ela foi utilizada como um controle do processo.
As estruturas lipídicas contendo o plasmídeo pVAXhsp 65 ou apenas o vetorpVAX, além do plasmídeo e vetor nu, e excetuando-se agregados lipídicos e Iipoplexosdevido à sua citotoxidade, , foram avaliadas quanto a mensagem para hsp 65. Através daFigura 16, o controle para a β -actina foi positivo para todas as construções, indicandoque o processo de obtenção do mRNA é possível. A presença de mRNA para hsp65 foiidentificada apenas nas células que foram transfectadas com a estrutura DRV-DNAhsp65, sugerindo que essa construção apresenta uma eficácia maior de transfecção invitro, quando comparada com as demais formulações utilizadas. A ausência de detecçãode mensagem para a hsp65 com as demais formulações pode ser decorrente da baixaeficiência de transfecção, o que pode ser compensada por período de tempo maior decultura "in vitro" para a detecção da mensagem para a hsp65. Através da caracterizaçãodos DRV(DNA)S pode-se observar que estas estruturas são mais compactas,apresentando diâmetro médio populacional menor. Esta característica pode terinfluenciado durante o processo de transfecção, necessitando-se possivelmente detempo maior de incubação com os macrófagos para que esta estrutura permita que oDNA incorporado nas regiões mais internas seja liberado.A detecção da mensagem para hsp65 também não foi observada para ocomplexo Iipofectina e DNA nas condições recomendadas pelo fabricante. Uma dasrazões atribuídas a esse evento foi a presença de considerável quantidade de Iise celulardurante a transfecção com a formulação de Iipofectina e DNA, o que pode ter concorridopara a degradação de RNAs mensageiros. Embora seja possível obter mensagem para β-actina dessas amostras, indicando que pelo menos parte do mRNA estava em boaqualidade, mensagens em menor freqüência, como a da hsp65, podem ter sua detecçãoprejudicada nessa situação.
Curiosamente, da mesma forma que a lipofectina, também se verificou grandepresença Iise celular durante a transfecção para os macrófagos transfectados comagregados lipídicos e lipoplexos.
O efeito profilático da configuração DRV-DNA contendo a construção plasmidealpVAX-Hsp65 foi avaliado em comparação com a configuração DRV (DNA) e com o DNAnu pelas rotas intramuscular e nasal. Na análise dos resultados, a proteção foi definidacomo o abaixamento iguai ou superior a 0,5 Iog do número de unidades formadoras decolônias (CFU) nos pulmões dos animais desafiados com o M, tuberculosis, mantendo-sea integridade do parênquima pulmonar. O protocolo experimental usado para a rotaintramuscular contemplou a administração total de 300 μg de DNA em 3 doses de 100μg, e de 50 μg de DNA em dose única ou 100μg de DNA em 2 aplicações de 50 μg.
A administração nasal das configurações Iipossomais diferencia claramente asestruturas e demonstra a superioridade da configuração DRV-DNA, na proteção contra atuberculose.
A Figura 17 mostra o resultado em termos de contagem do número deunidades formadoras de colônias (CFU) nos pulmões dos animais desafiados com o M.tuberculosis quando foi aplicada somente 1 dose de 25 μg de DNA.
Claims (29)
1. Configuração lipossomal funcional caracterizada pelo fato de queapresenta diâmetro máximo de 2 micrômetros e compreende:a) um sistema ternário de lipídios composto por Iipfdio catiônico. Lipídioestrutural e lipídio coadjuvante e,b) um polinucleotídeo
2. Configuração lipossomal funcional de acordo com reivindicação 1,caracterizada pelo fato de que o sistema ternário de lipídios compreende a proporçãomolar de 20% a 30% de lipídio catiônico, 40% a 60% de lipídio estrutural e 20% a 30% delipídio coadjuvante.
3. Configuração lipossomal funcional de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1 e 2 caracterizada pelo fato de que o sistema ternário de lipídioscompreende a proporção molar de 25% de lipídio catiônico, 50% lipídio estrutural e 25%de lipídio coadjuvante.
4. Configuração lipossomal funcional de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1 a 3 caracterizada pelo fato de que o lipídio catiônico é selecionadodentre 1,2-Dimyristoyl-3-Trimethylammonium-Propane; 1,2-Dipalmitoyl-3-Trimethylammonium-Propane; 1,2-Distearoyl-3-Trimethylammonium-Propane; 1,2-Dioleoyl-3-Trimethylammoníum-Propane; 1,2-Diacyl-3-Dimethylammonium-Propane; DC-CholesterolHCI; Dimethyldioctadecylammonium Bromide; 1,2-Dilauroyl-sn-Glycero-3-Ethylphosphocholine; 1,2-Dimyristoyl-sn-Glycero-3-Ethylphosphocholine; 1,2-Dipalmitoyl-sn-Glycero-3-Ethylphosphocholine; 1,2-Distearoyl-sn-Glycero-3-Ethylphosphocholine; 1,2-Dioleoyl-sn-Glycero-3-Ethylphosphocholine; 1-Palmitoyl-2-Oleoyl-sn-Glycero-3-Ethylphosphocholine; 2,3-dioleyloxy-N-[2(sperminecarboxamido)ethyl]-N,Ndimethyl-1 -propanaminium trifluoroacetate; N-[1 -(2,3-dioleyloxy)propyl]-n,n,n-trimethylammoniumchloride e 1,2-Dioleoyl-sn-Glycero-3-[Phospho-L-Serine]
5. Configuração lipossomal funcional de acordo com reivindicação 4caracterizado pelo fato de que o lipídio catiônico é 1,2-Dioleoyl-3-Trimethylammonium-Propane.
6. Configuração lipossomal funcional de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1 a 5 caracterizada pelo fato de que o lipídio estrutural é selecionadodentre lipídios sintéticos com cadeias de ácidos graxos assimétricas, lipídios sintéticoscom cadeias de ácidos graxos simétricas saturadas, lipídios sintéticos com cadeias deácidos graxos simétricas insaturadas e lipídios naturais.
7. Configuração Iipossomal funcional de acordo com reivindicação 6caracterizado pelo fato de que o lipídio sintético com cadeias de ácidos graxosassimétricas é selecionado dentre 1-Myristoyl-2-Palmitoyl-sn-Glycero-3-Phosphocholine;-1 -Myristoyl-2-Stearoyl-sn-Glycero-3-Phosphocholine; 1 -Palmitoyl-2-Myristoyl-sn-Glycero--3-Phosphocholine; 1 -Palmitoyl-2-Stearoyl-sn-Glycero-3-Phosphocholine; 1 -Palmitoyl-2-Oleoyl-sn-Glycero-3-Phosphocholine; 1-Palmitoyl-2-Linoleoyl-sn-Glycero-3-Phosphocholine; 1 -Palmitoyl-2-Arachidonoyl-sn-Glycero-3-Phosphocholine; 1 -Palmitoyl-2-Docosahexaenoyl-sn-Glycero-3-Phosphocholine; 1-Stearoyl-2-Myristoyl-sn-Glycero-3-Phosphocholine; 1 -Stearoyl-2-Palmitoyl-s/>Glycero-3-Phosphocholine; 1 -Stearoyl-2-Oleoyl-s/>Glycero-3-Phosphocholine; 1-Stearoyl-2-Linoleoyl-sn-Glycero-3-Phosphocholine; 1 -Stearoyl-2-Arachidonyl-sn-Glycero-3-Phosphocholine; 1 -Stearoyl-2-Docosahexaenoyl-sn-Glycero-3-Phosphocholine; 1-Oleoyl-2-Myristoyl-sn-Glycero-3-Phosphochoíine; 1-Oleoyl-2-Palmitoyl-sn-Glycero-3-Phosphocholine; 1-Oleoyl-2-Stearoyl-sn-Glycero-3-Phosphocholine.
8. Configuração Iipossomal funcional de acordo com reivindicação 6caracterizado pelo fato de que o lipídio sintético com cadeias de ácidos graxos simétricassaturadas é selecionado dentre 1,2.-Diacyl-sn-Glycero-3-Phosphocoline onde os gruposacyl possuem número de carbonos variando entre C3 a C24.
9. Configuração Iipossomal funcional de acordo com reivindicação 6caracterizado pelo fato de que o lipídio sintético com cadeias de ácidos graxos simétricasinsaturadas é selecionado dentre 1,2-Diacyl-sn-Glycero-3-Phosphocoline onde os gruposacyl possuem número de carbonos:insaturações variando entre C14:1 a C24:1, C18:2 aC18:3, C20:4 ou C22:6.
10. Configuração Iipossomal funcional de acordo com reivindicação 6caracterizado pelo fato de que o lipídio natural é selecionado dentre fosfatidilcolina desoja ou fosfatidilcolina de ovo.
11. Configuração Iipossomal funcional de acordo com reivindicação 10caracterizado pelo fato de que o lipídio natural é a fosfatidilcolina de ovo.
12. Configuração Iipossomal funcional de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1 a 11 caracterizado pelo fato de que os lipídios coadjuvantes sãoselecionados dentre colesterol e L-alpha-Dioleoyl Phosphatidylethanolamine.
13. Configuração Iipossomal funcional de acordo com reivindicação 12caracterizado pelo fato de que o lipídio coadjuvante é o L-alpha-DioleoylPhosphatidylethanolamine.
14. Configuração Iipossomal funcional de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1 a 13 caracterizada pelo fato de que o polinucleotídeo corresponde a umaestrutura de DNA e/ou RNA.
15. Processo de obtenção de configuração Iipossomal funcionalcaracterizado pelo fato de que compreende as seguintes etapas:e) obtenção de Iipossomas Iamelares a partir de uma mistura contendo lipídiocatiônico, lipídio estrutural e lipídio coadjuvante.f) liofilização ou secagem dos Iipossomas vaziosg) obtenção de vesículas desidratadas-rehidratadas (DRVs)h) complexação de um polinucleotídeo com as DRVs através da mistura deDRVs com polinucleotídeos na proporção de 1,1 a 50 moles de cargaspositivas dos lipídeos catiônicos para 1 mol de carga negativa dopolinucleotídeo.
16. Processo de obtenção de configuração Iipossomal funcional de acordocom reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que a obtenção de Iipossomasmultilamelares na etapa a ocorre a partir da hidratação de uma mistura de lipídios.
17. Processo de obtenção de configuração Iipossomal funcional de acordocom reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que a mistura de lipídios compreendelipídio catiônico, lipídio estrutural e lipídio coadjuvante.
18. Processo de obtenção de configuração Iipossomal funcional de acordocom qualquer uma das reivindicações 15 a 17, caracterizado pelo fato de quecompreende, ainda, uma etapa de redução e homogeneização dos Iipossomas após aobtenção dos mesmos na etapa a.
19. Processo de obtenção de configuração Iipossomal funcional de acordocom qualquer uma das reivindicações 15 a 18 caracterizado pelo fato de que a obtençãode vesículas desidratadas-rehidratadas (DRVs) na etapa c ocorre através de hidrataçãodos Iipossomas vazios obtidos na etapa b sob agitação e temperatura de O0C a 12 0C.
20. Processo de obtenção de configuração Iipossomal funcional de acordocom reivindicação 19 caracterizado pelo fato de que a temperatura de hidratação dosIipossomas vazios é de 2°C a 5°C.
21. Processo de obtenção de configuração lipossomal funcional de acordocom qualquer uma das reivindicações 15 a 20 caracterizado pelo fato de que aconcentração de lipídios a serem complexados com polinucleotídeo é de 0,02M a 0,2M.
22. Processo de obtenção de configuração lipossomal funcional de acordocom reivindicação 21 caracterizado pelo fato de que a concentração de lipídios a seremcomplexados com polinucleotídeo é de 0,05M a 0,1 M.
23. Processo de obtenção de configuração lipossomal funcional de acordocom qualquer uma das reivindicações 15 a 22 caracterizado pelo fato de que na etapa d,a mistura de DRVs com polinucleotídeos ocorre na proporção 5 a 15 moles de cargaspositivas dos lipídeos catiônicos para 1 mol de carga negativa do polinucleotídeo.
24. Processo de obtenção de configuração lipossomal funcional de acordocom reivindicação 23 caracterizado pelo fato de que a mistura de DRVs compolinucleotídeos ocorre na proporção 10 moles de cargas positivas dos lipídeoscatiônicos para 1 mol de carga negativa do polinucleotídeo.
25. Processo de obtenção de configuração lipossomal funcional de acordocom qualquer uma das reivindicações 15 a 24 caracterizado pelo fato de que na etapa d,a mistura de DRVs com polinucleotídeos ocorre à temperatura de 0°C a 12°C.
26. Processo de obtenção de configuração lipossomal funcional de acordocom reivindicação 25 caracterizado pelo fato de que a mistura de DRVs compolinucleotídeos ocorre à temperatura de 2°C a 5°C.
27. Processo de obtenção de configuração lipossomal caracterizado pelofato de que compreende processo definido em qualquer uma das reivindicações 15 a 26.
28. Configuração lipossomal funcional conforme definida em qualquer umadas reivindicações 1 a 15 caracterizada pelo fato de que é obtida de acordo comprocesso definido em qualquer uma das reivindicações 16 a 27.
29. Composição farmacêutica caracterizada pelo fato de que compreendeconfiguração lipossomal funcionai conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 14,
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