BRPI0705968A2 - peptìdeos recombinantes miméticos e motivos protéicos de antìgenos do vìrus da dengue e suas aplicações diagnósticas e terapêuticas - Google Patents

Abstract

PEPTìDEOS RECOMBINANTES MIMéTICOS E MOTIVOS PROTéICOS DE ANTIGENOS DO VìRUS DA DENGUE E SUAS APLICAçõES DIAGNóSTICAS E TERAPEUTICAS. A presente invenção refere-se ao uso da técnica de Phage Display para a seleção, caracterização e utilização de novos peptídeos recombinantes e motivos protéicos, que mimetizam regiões antigênicas da poliproteina dos quatro tipos do vírus da dengue, determinando epítopos funcionais das proteínas virais, através de anticorpos policlonais obtidos de galinhas imunizadas com proteínas totais de dengue (IgY). Os peptídeos foram especificamente imunorreativos com o soro de individuos infectados com o vírus da dengue e podem ser potencialmente usados em imunodiagnósticos e em composições vacinais para o controle da infecção viral.

Description

"PEPTÍDEOS RECOMBINANTES MIMÉTICOS E MOTIVOS PROTÉICOS DE ANTÍGENOS DO VÍRUS DA DENGUE E SUAS APLICAÇÕES DIAGNOSTICAS E TERAPÊUTICAS"

A presente invenção refere-se à seleção, caracterização e utilização de peptídeos recombinantes e motivos protéicos que mimetizam regiões antigênicas da poliproteína dos quatro tipos do vírus da dengue. Os peptídeos foram especificamente imunorreativos com o soro de indivíduos infectados com o vírus da dengue e podem ser potencialmente usados em imunodiagnósticos e em composições vacinais para o controle da infecção viral.

A dengue é hoje a mais importante arbovirose que afeta o homem e constitui um sério problema de saúde pública no mundo, especialmente nos países de clima tropical, onde as condições do meio ambiente favorecem o desenvolvimento e a proliferação do Aedes aegypti, principal transmissor da doença (Marques GRAM et al. Arquivos do Instituto Biológico, 71:462-465, 2004). Durante as duas últimas décadas, a incidência da infecção pela dengue tem crescido consideravelmente em áreas endêmicas, particularmente na região das Américas, onde o vírus da dengue tem mostrado uma característica de hiperendemicidade como resultado da circulação de múltiplos sorotipos em muitos países do continente (de Simone TS et al. Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene, 98:553-562, 2003). De acordo com a Organização Mundial da Saúde (OMS, em inglês World Health Organization, who), dois quintos da população mundial corre o risco de ser infectada pela doença, e mais de cem países foram atingidos por epidemias de dengue ou dengue hemorrágica. A OMS estima que, anualmente, ocorrem mais de 50 milhões de casos de contágio de dengue e dengue hemorrágica, dos quais meio milhão de são hospitalizados, com cerca de 20 mil mortes (www.who.int).

O vírus da dengue é esférico com uma superfície relativamente lisa, exceto nas regiões em que as moléculas de glicoproteína se associam. Apresenta um diâmetro de aproximadamente 500 A, e um capsídeo icosaédrico coberto por um envelope lipídico. O RNA desse vírus é de cadeia simples, com aproximadamente 10.700 nucleotídeos. O genoma tem 11 Kb e codifica 10 proteínas, sendo 3 proteínas estruturais (Capsídeo C, Membrana M e Envelope E), onde as duas últimas estão na superfície do vírus, e 7 proteínas não estruturais (NS1, NS2a, NS2b, NS3, NS4a, NS4b, NS5) (Guzmán MG et al.

The Lancet Infectious Diseases, 2:33-42, 2002 e Kuhn RJ et al. Cell, 108: 717-725, 2002). Durante a replicação do vírus, a cadeia senso positiva do RNA genômico viral é traduzida como uma poliproteína na ordem 5'-C-prM(M)-E-NS1-NS2a-NS2b-NS3-NS4a-NS4b-NS5-3', sendo que a prM representa a proteína precursora de membrana (Wu CF et al. Journal of Virological Methods, 114:45-54,2003).

Foram descritos quatro sorotipos antigenicamente semelhantes designados dengue vírus tipo 1 (DENV-1), dengue vírus tipo 2 (DENV-2), dengue vírus tipo 3 (DENV-3) e dengue vírus tipo 4 (DENV-4), segundo Ligon (Ligon BL. Seminars in Pediatric Infectious Diseases 15:60-65, 2004).

O processo infeccioso desencadeado pelo vírus da dengue possui um amplo quadro clínico, podendo variar desde uma simples infecção inaparente (assintomática), até quadros mais graves, nos quais se verificam hemorragias, abrupto aumento da permeabilidade vascular e desenvolvimento de choque hipovolêmico. A doença se manifesta clinicamente sob duas formas: dengue clássica (DC), também descrita como febre da dengue (FD) e a dengue hemorrágica (DH) ou febre hemorrágica da dengue (FHD) (Lee MS et al. J. Mierobiol Immunol Infeet., 39:121-9, 2006).

Uma infecção primária com qualquer um dos quatro sorotipos do vírus da dengue, tipicamente, resulta em alguma doença assintomática ou então na febre da dengue. Estudos epidemiológicos sugerem que indivíduos que foram infectados uma segunda vez com um diferente sorotipo, o risco de desenvolver a febre da dengue hemorrágica é significantemente maior (Simmons CP etal. Journal of Virology, 79:5665-5675, 2005).

As características clínicas do dengue freqüentemente dependem da idade do paciente. Os Iactentes e as crianças pequenas podem sofrer de febre não diferenciada com erupção maculopapular. As crianças maiores e os adultos têm uma síndrome de febre benigna ou a doença clássica incapacitante com início abrupto e febre alta, cefaléia severa, dor retro-orbital, dores musculares e articulares. A taxa de mortalidade de casos é extremamente baixa. Muitas epidemias de dengue são acompanhadas por complicações que envolvem sangramento, tais como epistaxe, sangramento gengival, sangramento gastrointestinal, hematúria e hipermenorrea. Em alguns casos, um sangramento singularmente severo pode levar o paciente a óbito (Guzmán MG et al. The Lancet Infectious Diseases, 2:33-42, 2002).

Os casos típicos de Dengue Hemorrágico são caracterizados por quatro manifestações clínicas principais: febre alta, fenômenos hemorrágicos, hepatomegalia e, freqüentemente, insuficiência circulatória (Guzmán MG et al. The Lancet Infectious Diseases, 2:33-42, 2002). As autópsias de casos de dengue hemorrágica, em ordem de freqüência, constatam-se hemorragias na pele e nos tecidos subcutâneos, nas mucosas do trato gastrointestinal, e no coração e fígado. De maneira geral, é pouco freqüente a ocorrência de hemorragias subaracnoidais ou cerebrais. O volume hemorrágico, entretanto, não é excessivo (WHO. Dengue haemorrhagic fever: diagnosis, treatment, prevention and control. 2nd edition. Geneva: World Health Organization, 1997).

Os quatro vírus da dengue são capazes de produzir casos de FDH, sendo que DENV-2 e DENV-3 são mais freqüentemente associados à severa doença (Guzmán MG et al. The Laneet Infeetious Diseases, 2:33-42, 2002).

Os métodos comumente usados para confirmar a infecção pela dengue, envolvem o isolamento do vírus, a detecção do antígeno ou RNA do vírus no plasma ou soro ou tecidos, e a presença de anticorpos vírus- específicos no soro e outros fluidos.

Recentemente, várias técnicas têm sido desenvolvidas para um diagnóstico laboratorial rápido do vírus da dengue: a amplificação para um aumento na taxa de vírus isolado; o método de citometria de fluxo para uma rápida detecção de vírus; detecção de ácido nucléico viral por PCR-NESTED, RT-PCR, por sequenciamento baseado na amplificação de ácido nucléico e por PCR em tempo real; detecção de antígenos virais livres, imunoglobulinas M (IgM) ou G (IgG) reativas ao vírus da dengue por ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay); e diferenciação de infecção primária da secundária por ELISA (Kao CL et al. Journal of Microbiology, Immunology and Infection, 38:5-16, 2005).

Sabendo que muitas doenças infecciosas, como a dengue, carecem de diagnósticos mais confiáveis, rápidos e precisos, as seguintes patentes foram desenvolvidas com aplicações de novas modalidades diagnosticas, permitindo tanto a detecção qualitativa quanto quantitativa do vírus in vitro: W02005014627 (Phage display), US2006099573 (ELISA anti IgE), US2002155435 (RT-PCR), W00179546 (RT-PCR), US6197568 (interação do vírus com células alvo).

A patente W09909414 consiste no uso de polipeptídeos, contendo entre 2 e 8 aminoácidos, derivados de proteínas de diferentes sorotipos de flavivírus, em particular do vírus da dengue, no intuito de diagnosticar a infecção causada pelo vírus pelo método de ELISA e DotBIot. A presente patente apresenta o uso da metodologia de Phage Display para seleção de peptídeos contendo 7 resíduos de aminoácidos, derivados de proteínas de diferentes sorotipos do vírus da dengue, caracterizada por um eficiente método de seleção, confirmada por bioinformática.

Na presente invenção são identificados e caracterizados novos peptídeos recombinantes e miméticos da poliproteína do vírus da dengue altamente imunorreativos para a detecção de anticorpos anti-dengue para os diversos tipos virais, e que reconhecem tanto a resposta à IgM quanto à IgG.

Os quatro sorotipos do vírus do dengue têm antígenos muito similares, mas são suficientemente diferentes para provocar proteção parcial contra os outros, após infecção por um deles. Uma infecção natural com o vírus da dengue induz uma imunidade protetora somente ao mesmo sorotipo (homóloga), e uma proteção por curto período de tempo (meses) contra um outro sorotipo (Rothman AL. The Journal of Clinical Investigation, 113:946-951, 2004). Após um período de incubação de 4-6 dias (mínimo de três, máximo de dez), o vírus está presente no sangue dos pacientes durante a fase aguda da doença (WHO. Dengue haemorrhagic fever: diagnosis, treatment, prevention and control. 2nd edition. Geneva: http://www.who.int/csr /resources/publications/denque/024-33.pdf. World Health Organization, 1997).

Uma vacina efetiva precisa proteger contra todos os quatro sorotipos da dengue, ou seja, ser tetravalente (Rothman AL. The Journal of Clinicai Investigation, 113:946-951, 2004). Além disso, precisa ser segura para uso humano, e ser economicamente viável (Halstead SB et al. The Lance,t 360:1243-1245, 2002). Para esse objetivo uma série de técnicas vêem sendo estudadas, incluindo vacinas com vírus atenuados e vírus recombinantes, vacinas de subunidades recombinantes, e vacinas de DNA (OMS. Vaccine, 23:2689-2695, 2005). As vacinas tetravalentes contendo vírus vivos atenuados parecem ser as mais adequadas para prevenir a doença, devido à possibilidade de proteção para todos os sorotipos e por longos períodos de tempo. Já as vacinas vivas têm a vantagem de estimular tanto a imunidade humoral (altos títulos de anticorpos neutralizantes), como a resposta celular (Bricks LF. Pediatria (São Paulo) 26:268-281, 2004).

De acordo com a patente W09718311, a vacina polivalente contra os flavivírus, e particularmente o vírus da dengue, compreende peptídeos recombinantes emitidos de cada sorotipo, as quais a extremidade carboxilada é substituída por um peptídeo contendo de 2 a 8 histidinas, triptofanos e cisteínas. A presente invenção propõe o uso de novos peptídeos recombinantes, que funcionam como epítopos antigênicos e que são alvos potenciais para geração de resposta imune aos diversos tipos do vírus da dengue, compreendendo seqüências que reconhecem motivos protéicos comuns da poliproteína da dengue existentes nos quatro tipos virais.

Outras patentes têm utilizado também partículas recombinantes de proteínas purificadas no intuito de fornecer proteção a indivíduos suscetíveis, tais como: US2004022811 (proteína M/pM de DENV-2 expressa em baculovírus, com intuito protetor em camundongos), EP1159968 (vacinas que contenham linhagens atenuadas do vírus da dengue), W09915692 (uso de epítopos antigênicos para finalidades vacinais), US2004077022 (fusão de domínios Fc com peptídeos biologicamente ativos) e W09718311 (uso de peptídeos recombinantes emitidos de cada sorotipo).

Também com o intuito de desenvolver uma vacina capaz de produzir imunidade protetora, a patente W09963095 propõe o uso de uma vacina contra flavivírus cujo agente ativo seja o ácido nucléico, enquanto a patente US6254873 utiliza vírus da dengue inativados, que não apresentam infectividade, no entanto possuem a imunogenicidade preservada.

A metodologia de Phage Display, ou exposição de biomoléculas em fagos, foi desenvolvida por Smith (Smith GP. Science, 228:1315-1317, 1985), ao conseguir a expressão da enzima de restrição EcoRI através da fusão com a proteína três (plll) do capsídeo do fago. Phage display permite a seleção de peptídeos e proteínas, incluindo anticorpos, com alta afinidade e especificidade para vários alvos. A vantagem crucial dessa tecnologia está na ligação direta que existe entre o fenótipo experimental e o genótipo encapsulado, mostrando a evolução dos ligantes selecionados até moléculas otimizadas (Azzazy HM et al. Clinical biochemistry, 35:425-445, 2002).

Bacteriófagos, ou simplesmente fagos, são vírus que infectam uma variedade de bactérias Gram-negativas usando o pilus sexual como receptor. As partículas de fagos filamentosos (linhagens M13, f1 e fd) que infectam E. coli via pilus F, consiste em uma fita simples de DNA que é envolta em uma cápsula protéica (Russel M. Filamentous phage assembly. Molecular Microbiology, 5:1607-1613, 1991). O bacteriófago é composto por cinco proteínas estruturais, presentes no capsídeo: plll, pVI, pVII, pVIII e pIX. A proteína pVIII forma o corpo cilíndrico do capsídeo. Nas extremidades desse capsídeo encontram-se de três a cinco cópias das demais proteínas estruturais. A extremidade distai contém as proteínas pVII e pIX, enquanto que a proximal é composta pelas proteínas codificadas pelo gene 3 (plll) e pela própria pVI. A incorporação de proteínas exógenas na superfície dos fagos filamentosos faz-se fusionando esses peptídeos às proteínas estruturais das partículas virais. As duas principais proteínas utilizadas para esse fim são a proteína pVII e a plll. (Brigido MM et al. Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento, 26:44-51, 2002).

Phage display tem provado ser uma técnica muito poderosa na obtenção de bibliotecas contendo milhões ou até mesmo bilhões de diferentes peptídeos ou proteínas. A metodologia de bibliotecas mais amplamente utilizada é baseada no uso de fagos filamentosos (Smith GP. Science, 228:1315-1317, 1985).

As seqüências de DNA de interesse são inseridas em uma localização no genoma de bacteriófagos filamentosos, de modo que a proteína codificada é expressa na superfície do fago filamentoso como um produto de fusão a uma das proteínas da superfície do fago (Azzazy HM et al. Clinicai biochemistry, 35:425-445, 2002). O peptídeo ou proteína expresso na superfície do fago possibilita a seleção de seqüências baseada na afinidade de ligação para uma molécula alvo por um processo de seleção in vitro denominado biopanning (Parmley S et al. Gene, 73:305-318, 1988).

Apesar da técnica de Phage Display ter sido primeiramente introduzida há aproximadamente 15 anos, as aplicações e desenvolvimento desta tecnologia estão apenas começando a ser exploradas. Essa exploração da tecnologia de Phage Display irá levar à produção de uma enorme gama de ligantes, incluindo anticorpos recombinantes e peptídeos, com especificidades pré-definidas. Além disso, tecnologias emergentes baseadas em Phage Display irão beneficiar diagnósticos através da produção de moléculas impossíveis de se obter por métodos tradicionais. Especificamente, anticorpos recombinantes contra antígenos tóxicos ou seqüências conservadas e carboidratos podem ser isolados (Soderlind E et al. Nature Biotechnology, 18:852-856, 2000).

Durante os últimos 10 anos, exposição de anticorpos em fagos tem se transformado em uma técnica bem aceita e, num pequeno espaço de tempo tem gerado moléculas de altíssima qualidade. Anticorpos derivados por Phage Display têm provado sua segurança e eficácia em testes clínicos. Processos de seleção adaptados à essa técnica, em combinação com anticorpos de fácil montagem, abrem amplamente as portas para desenvolvimento sofisticado de anticorpos como medicamentos. Em adição, estes anticorpos selecionados por Phage Display oferecem maiores vantagens em termos de velocidade e rendimento para pesquisa e identificação/validação de alvos. Phage Display já é parte de uma moderna forma de descoberta de novas drogas (Kretzschmar T et al. Current Opinion in Biotechnology, 13:598-602, 2002).

As patentes US7083945, US2006068421, US2005202512, GB2408332 , US2003104604, EP1452599, US2006035223 utilizam a técnica de Phage Display com o intuito de expressar polipeptídeos recombinantes com afinidade para o ligante, além de propor metodologias que tornam a técnica mais eficiente.

A utilização de imunoglobulina de galinha (IgY) para pesquisas proteômicas foi denominada IgY technology por Zhang (Zhang WW. Drug Discovery Today, 8:364-371, 2003), tendo como fontes dos anticorpos o soro e os ovos (Gassmann M et al. FASEB J., 4:2528-2532, 1990). Segundo Lemamy (Lemamy GJ. International Journal of Câncer; 80:896-902, 1999), aves têm capacidade de produzir anticorpos com alto título e grande persistência da resposta imune para proteínas de bactérias e mamíferos. Além disso, os anticorpos produzidos em galinhas possuem vantagens bioquímicas como resistência a pH extremo (Lee et al. J Biochem Mol Biol, 35:488-493, 2002), resistência à temperatura elevada (Jensenius et al. J. Immunol Methods, 46:63-68, 1988), grande afinidade (Ikemori et al. Poult Sei, 72:2361-2365, 1993) e avidez (Stuart et al. Anal Biochem, 173:142-150, 1988), motivo pela qual, têm sido usadas eficientemente em análises imunológicas (Schade et al. ALTEX, 13:5-9, 1996), como exemplificado pelos processos patentários abaixo.

A patente JP8188599 propõe um método de separação de anticorpos IgY de maneira que esses reajam especificamente a um antígeno imune. Algumas patentes se referem ao uso de IgY imunologicamente reativos à doença de Alzheimer (GR1005016), à prevenção de infecção intestinal por Escherichia coli (US2004086513) e infecção ginecológica por bactérias patogênicas (N1454901), contra doenças venéreas (CN1485343), dentre outras. Além destas, a patente W02006093080 refere-se ao uso combinado de IgY e Phage Display, com o intuito de produzir anticorpos divalentes de galinha.

Na busca de uma metodologia rápida, eficiente e capaz de fornecer um diagnóstico da infecção pelo vírus da dengue, bem como uma vacina preventiva e/ou terapêutica, a presente invenção propõe o uso da técnica de Phage Display para a identificação e seleção de peptídeos específicos com o vírus da dengue, determinando epítopos funcionais das proteínas virais, através de anticorpos policlonais obtidos de galinhas imunizadas com proteínas totais de dengue (IgY).

A invenção poderá ser melhor compreendida através da seguinte descrição detalhada mediante os exemplos para os resultados experimentais obtidos, apresentados nas Tabelas 1 a 5. Os procedimentos experimentais envolvidos estão detalhados no final desse relatório descritivo. A metodologia empregada para a seleção, caracterização e utilização de peptídeos recombinantes e motivos protéicos que mimetizam regiões antigênicas de poliproteínas foi aplicada aos quatro tipos do vírus da dengue, podendo ser aplicada a outros tipos de flavivirus de maneira eficiente.

Exemplo 1:

Este exemplo se refere à seleção e a caracterização dos peptídeos recombinantes miméticos e motivos protéicos, objetos da presente invenção. Diversos parâmetros podem ser utilizados para indicar o sucesso da seleção de cada peptídeo, como pode ser visualizado na Tabela 1. Esses mesmos parâmetros foram anteriormente utilizados por Rodi e colaboradores (Rodi DJ etal. Journal of Molecular Biology, 322: 1039-1052, 2002).

A Tabela 1 apresenta a identidade das seqüências de aminoácidos selecionadas, bem como as suas respectivas freqüências observadas (FO); freqüências esperadas (FE), que corresponde à probabilidade da seqüência randômica; amplificação dos peptídeos decorrentes do processo de seleção em relação à freqüência esperada dos peptídeos na biblioteca original; grau de informação de cada peptídeo (I(M)), que é dado por -In (probabilidade de seqüência randômica); e o número provável de clones independentes dentro da biblioteca (λ). Quanto maior o grau de informação, mais efetiva foi a seleção do peptídeo, consequentemente, mais raro ele é na biblioteca.

Foram obtidos 16 clones com seqüências distintas (Seq. ID N— 1 a 16), sendo que estes apresentaram suas respectivas seqüências invertidas (Seq. ID N— 17 a 32). Por exemplo, a Seq. ID N2 1 tem a seqüência inversa Seq. ID N- 17, a Seq. ID N- 2 possui a seqüência inversa Seq. ID N2 18, a assim sucessivamente, como apresentado da Tabela 2. O peptídeo Seq. ID N2 3 e o seu inverso Seq. ID N2 19 foi o mais freqüente na seleção e o quarto com o maior índice de informação, tornando-se um dos principais mimotopos selecionados, especialmente quando se considera o número de clones independentes previstos na biblioteca com esta mesma seqüência, ou seja, neste caso espera-se somente um único clone. Por outro lado, o peptídeo com o maior índice de informação foi o Seq. ID N2 6 e o seu inverso Seq. ID N2 22, o qual apresenta o principal motivo protéico Seq. ID N2 36. Peptídeos que exibem alto grau de informação são menos prováveis de ocorrer ao acaso do que aqueles que possuem baixo nível de informação (Rodi DJ et al. Journal of Molecular Bioiogy, 322: 1039-1052, 2002).

Os aminoácidos arginina (Arg) e cisteína (Cys) nas seqüências de peptídeos randômicos atuam na secreção de Proteína Ill e podem interferir na infectividade dos fagos. Conseqüentemente, clones com peptídeos contendo estes aminoácidos podem ser menos freqüentes durante a seleção (Noren KA et al. Methods, 23:169-178, 2001). De acordo com os resultados obtidos, apenas um peptídeo apresenta Cys (representado por Seq. ID N2 16), enquanto que 22 possuem Arg (representado pelas Seq. ID N— 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31), demonstrando não só sua importância nos motivos protéicos, quanto a sua baixa interferência na freqüência de peptídeos com este aminoácido. Observou-se, ainda, que houve um grande enriquecimento de todos os peptídeos selecionados em relação às suas freqüências esperadas na biblioteca de fagos, sugerindo que os fagos são específicos para dengue. Tabela 1

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A Tabela 3 demonstra os peptídeos obtidos no processo de seleção alinhados pelo programa Blast com as seqüências completas das proteínas específicas para Dengue, depositadas no GeneBank e o acesso à essas seqüências, bem como os motivos que são similares a tais peptídeos. Também foram incluídos os motivos que apresentam uma seqüência de aminoácidos muito curta (3 aminoácidos) com atividade. As seqüências apresentam similaridades com proteínas relacionadas à dengue sendo encontradas em proteínas de todos os tipos virais. Em virtude da representação conservada em determinadas regiões ao longo dos peptídeos, os motivos poderiam representar importantes epítopos contínuos ou descontínuos dos antígenos (Cortese R et al. Current Opinion in Biotechnology, 6:73-80, 1995 e Yang WJ et al.. Journal of Immunological Methods, 276:175-183, 2003). Além disso, também podem ser visualizados na Tabela 3 os índices ELISA (IE) das seqüências, que comprovam a alta reatividade dos clones ao antígeno viral.

Tabela 2

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Observando os resultados apresentados na Tabela 3, nota-se a similaridade de alguns clones com poliproteínas de DENV, os quais foram apresentados na seguinte ordem: os peptídeos e seus reversos (dados pelas Seq. ID N° 1 a 16 e Seq. ID N° 17 a 32, respectivamente) e os motivos protéicos (entre parênteses), sendo que:

- apresentam similaridades com DENV-1 os peptídeos e os respectivos motivos protéicos Seq. ID N° 1 (Trp Lys Lys), Seq. ID N° 7 (Seq. ID N° 39), Seq. ID N° 9 (Seq. ID N° 67 e Seq. ID N° 68), Seq. ID N° 11 (Seq. ID N° 47, Seq. ID N° 70, Seq. ID N° 72), Seq. ID N° 12 (Seq. ID N° 73), Seq. ID N° 14 (Seq. ID N° 51 e Seq. ID N° 73), Seq. ID N0 17 (Trp Lys Lys), Seq. ID N0 25 (Seq. ID N0 67 e Seq. ID N0 68), Seq. ID N0 27 (Seq. ID N0 70) e Seq. ID N0 30 (Seq. ID N0 73);

- apresentam similaridades com DENV-2 os peptídeos e os respectivos motivos protéicos Seq. ID N° 1 (Seq. ID N° 53), Seq. ID N° 2 (Seq. ID N° 57), Seq. ID N° 4 (Seq. ID N° 36), Seq. ID N° 6 (Seq. ID N° 64), Seq. ID N° 8 (Seq. ID N° 66), Seq. ID N° 10 (Seq. ID N° 47), Seq. ID N° 11 (Seq. ID N° 47, Seq. ID N° 48 e Seq. ID N° 72), Seq. ID N° 12 (Seq. ID N° 49), Seq. ID N0 17 (Seq. ID N0 53), Seq. ID N0 18 (Seq. ID N0 57), Seq. ID N0 22 (Seq. ID N0 63 e Seq. ID N0 64), Seq. ID N0 24 (Seq. ID N0 66);

- apresentam similaridades com DENV-3 os peptídeos e seus respectivos motivos protéicos Seq. ID N° 1 (Seq. ID N° 55 e Seq. ID N° 56), Seq. ID N° 2 (Seq. ID N° 58), Seq. ID N° 3 (Seq. ID N° 35), Seq. ID N° 5 (Seq. ID N° 62), Seq. ID N° 7 (Seq. ID N° 38, Seq. ID N° 65 e Pro Asn Met), Seq. ID N° 9 (Seq. ID N° 43 e Seq. ID N° 44), Seq. ID N° 11 (Seq. ID N° 47 e Seq. ID N° 73), Seq. ID N° 12 (Seq. ID N° 49), Seq. ID N° 13 (Seq. ID N° 50), Seq. ID N0 17 (Seq. ID N0 55 e Seq. ID N0 56), Seq. ID N0 18 (Seq. ID N0 58), Seq. ID N0 21 (Seq. ID N0 62), Seq. ID N0 23 (Seq. ID N0 65 e Pro Asn Met);

- apresentam similaridades com DENV-4 os motivos e seus respectivos motivos protéicos, Seq. ID N° 9 (Seq. ID N° 67), Seq. ID N° 11 (Seq. ID N° 48, Seq. ID N° 71 e Seq. ID N° 72), Seq. ID N° 14 (Seq. ID N° 51), Seq. ID N0 25 (Seq. ID N0 67), Seq. ID N0 27 (Seq. ID N0 71).

Essas poliproteínas são codificadas pelo genoma do vírus e são processadas em 10 polipeptídeos, sendo 3 estruturais e 7 não estruturais, conforme descrito anteriormente. Também foi observado que os peptídeos e seus respectivos motivos apresentaram similaridade com precursores da DENV:

- apresentam similaridades com o precursor de poliproteína para DENV-4 os peptídeos e seus correspondentes motivos (entre parêntese): Seq. ID N° 1 (seqüência muito curta Trp Lys Lys), Seq. ID N- 5 (Seq. ID N° 37), Seq. ID N° 6 (Seq. ID N° 37), Seq. ID N° 7 (Seq. ID N° 37), Seq. ID N° 8 (Seq. ID N° 37), Seq. ID N° 9 (Seq. ID N° 67), Seq. ID N° 10 (Seq. ID N° 47), Seq. ID N° 11 (Seq. ID N° 48, Seq. ID N° 71, Seq. ID N° 72), Seq. ID N° 12 (Seq. ID N° 49) e Seq. ID N° 14 (Seq. ID N° 51), Seq. ID N° 17 (Trp Lys Lys ), Seq. ID N° 25 (Seq. ID N° 67), Seq. ID N° 27 (Seq. ID N° 71);

- apresentam similaridades com o precursor de poliproteína para DENV-1 os peptídeos e seus correspondentes motivos, representados pelas seqüências Seq. ID N° 1 (seqüência muito curta de aminoácidos Trp Lys Lys) e Seq. ID N° 12 (Seq. ID N° 73), Seq. ID N° 28 (Seq. ID N0 73).

Todas as proteínas do vírus derivam de uma poliproteína precursora de grande tamanho, por processamento proteolítico co-traducional e pós- traducional (Tibaire Montes, M. Revista de Ia Sociedad Venezolana de Microbiologia, 21:39-45, 2001), daí a importância dos peptídeos serem similares a esta poliproteína.

Os clones que apresentam similaridade com proteínas do envelope (E) de diferentes tipos virais são: Seq. ID N° 11 (Seq. ID N° 47), para glicoproteína do envelope do DENV-1; Seq. ID N° 8 (Seq. ID N° 41), para proteína do envelope do DENV-2; e Seq. ID N° 2 (Seq. ID N° 34), Seq. ID N° 4 (Seq. ID N° 60) e Seq. ID N° 7 (Seq. ID N° 38), Seq. ID N0 18 (Seq. ID N0 58), Seq. ID N0 20 (Seq. ID N0 60) para proteína do envelope do DENV-3. Esta proteína (E) possui 53 kDa, e contêm importantes determinantes antigênicos (Alisson SL et al. Journal of Virology, 75:4268-4275, 2001) e por este motivo serem utilizadas para o desenvolvimento de uma vacina para o controle da Dengue.

Analisando os dados da Tabela 3, conclui-se que os peptídeos estão compartilhando similaridades antigênicas entre os motivos e entre as proteínas. Tabela 3

<table>table see original document page 16</column></row><table> Continuação da Tabela 3

<table>table see original document page 17</column></row><table> Continuação da Tabela 3

<table>table see original document page 18</column></row><table>

Devido ao fato dos peptídeos (Seq. ID N- 1 a 32) compartilharem similaridades antigênicas entre os motivos e entre as proteínas, é muito importante avaliar a viabilidade de produção de uma vacina utilizando tais compostos. Thullier e colaboradores (Thullier P et al. Journal of General Virology, 82:1885-1892, 2001), usando um anticorpo monoclonal que neutraliza todos os sorotipos do dengue, ligante à glicoproteína do envelope, identificaram o clone Trp Ser Leu Phe Leu Asn His Ala Glu similar à seqüência da proteína. Segundo os autores, este é um segmento crítico para a infectividade de todos os quatro sorotipos. Interessante observar que essa seqüência crítica possui algumas similaridades em relação aos peptídeos selecionados, descritos nesta invenção, que se alinharam com a proteína do envelope, especificamente considerando os motivos Leu Val ou Leu Asn.

A proteína NS1 tem identidade com os peptídeos Seq. ID N- 9 (Seq. ID N2 67) e Seq. ID N0 25 (Seq. ID N0 68) de DENV-1; Seq. ID N2 6 (Seq. ID N2 63), Seq. ID N2 8 (Seq. ID N2 42) e Seq. ID N0 22 (Seq. ID N0 63) de DENV-2; e Seq. ID N2 11 (Seq. ID N2 48 ) de DENV-4. A proteína NS1, com 40 KDa, possui atividade na maturação viral e é encontrada na superfície, ligada à membrana da célula infectada, podendo também ser secretada. Essa proteína tem capacidade imunizante, sendo que os anticorpos atuam como mediadores de fenômenos de citotoxidade por linfócitos, através de seus receptores para a porção Fc de imunoglobulinas (Figueiredo, LTM. Vacinas contra o dengue. Simpósio: Virologia Médica I, 32: 21-25, 1999). Além disso, Wu e colaboradores (Wu HC et al. Journal of Clinicai Microbiology, 39:977-982, 2001) usando um anticorpo monoclonal sorotipo-específico de DENV-1, identificaram um epítopo (célula B) de peptídeo randômico expresso em fago, com motivo consenso His Tyr Trp, que mimetiza a seqüência His Lys Tyr Ser Trp Lys da proteína NS1 do mesmo tipo viral. Em outro trabalho, os mesmos autores (Wu HC et al. Journal of General Virology, 84:2771-2779, 2003), usando a mesma metodologia com enfoque em DENV-2, confirmaram que o motivo His Arg Leu foi crucial para a ligação peptídeo-anticorpo. Um fato importante foi este motivo apresentar identidade parcial às seqüências lineares Arg Leu observadas nos diversos clones selecionados nesta invenção, indicando haver uma alta especificidade com as proteínas virais. O peptídeo Seq. ID N2' 12 apresenta similaridade com a proteína NS2a de DENV-4 apresentando o motivo Seq. ID N2 49. Já os clones Seq. ID N2 5, Seq. ID N2 9 e Seq. ID N0 21 através dos motivos Seq. ID N2 62, Seq. ID N2 43 e Seq. ID N0 62 apresentam similaridades com a proteína NS2b de DENV-3, e as seqüências Seq. ID N2 11, Seq. ID N2 14 através dos motivos Seq. ID N2 71 e Seq. ID N2 51, apresentam similaridades com a proteína NS2b de DENV-4. Ambas são proteínas pouco conhecidas sob o ponto de vista imunológico na Dengue, sugerindo mais pesquisas envolvendo estas proteínas.

Os peptídeos Seq. ID N2 5, Seq. ID N2 9, Seq. ID N2 13, Seq. ID N0 21, Seq. ID N0 25 e Seq. ID N0 29 apresentam similaridades com a proteína NS3 de DENV-3 através do motivo Seq. ID N2 61, e o peptídeo Seq. ID N2 10 apresenta similaridade com a proteína NS3 de DENV-1 e DENV-2 através do motivo Seq. ID N2 47. Esta proteína, com 69 kDa, é uma enzima bifuncional, nucleotídea, trifosfatase/helicase viral. A proteína NS3 que se apresenta em contato com a superfície celular ou que é secretada possui capacidade imunizante. A presença de NS3 estimula a destruição das células infectadas por linfócitos T citóxicos (Figueiredo, LTM. Simpósio: Virologia Médica I, 32: 21-25, 1999).

O peptídeo Seq. ID N2 1 apresenta similaridade com a proteína NS5 pelos motivos com as seqüências muito curtas de aminoácidos Trp Lys Lys (DENV-1 e DENV-4), Seq. ID N2 33 e Ile Asn Trp (DENV-2); o peptídeo Seq. ID N2 17 apresenta similaridade com a proteína NS5 de DENV-1 e DENV-4 pelo motivo com seqüência muito curta de aminoácidos Trp Lys Lys, e com DENV-1 pelo motivo Ile Asn Trp; já o peptídeo Seq. ID N0 23 possui similaridade com NS5 de DENV-3 pelo motivo de seqüência muito curta de aminoácidos Pro Asn Met. A proteína NS5 é a maior das dez proteínas e a mais conservada, com 104 kDa. É uma proteína que possui domínios que contêm atividade enzimática que são cruciais para o ciclo replicativo do vírus (Chão DY et al. Virology Journal, 72:1-10, 2005). A similaridade deste peptídeo à proteína NS5 justifica a ocorrência de reatividade cruzada dos demais peptídeos aos múltiplos sorotipos virais (Rothman AL. Clin. Invest., 113:946-951, 2004).

Os peptídeos Seq. ID N2 6, Seq. ID N2 8, Seq. ID N2 9, Seq. ID N2 11, similares a NS1; e Seq. ID N2 5, Seq. ID N2 9, Seq. ID N2 10, Seq e ID N2 13, similares a NS3, se tornam importantes alvos vacinais, por serem altamente imunogênicas e importantes alvos de anticorpos contra a dengue.

Os peptídeos miméticos Seq. ID N2 15 e Seq. ID N2 16 bem como suas respectivas seqüências invertidas Seq. ID N2 31 e Seq. ID Ns 32 não apresentam motivos protéicos similares (motivo pelo qual não foram citados na Tabela 3).

Exemplo 2:

Esse exemplo se refere à confirmação da especificidade dos peptídeos e motivos protéicos objetos da presente invenção.

A Tabela 4 apresenta seqüências com similaridades à proteínas de comunidades biológicas conhecidas. Sendo que Sl refere-se aos sítio de identificação, AT à amplitude taxonômica e P à probabilidade de ocorrência randômica dos peptídeos. Dos 16 peptídeos selecionados (Seq. ID N— 1 a 16), apenas seis seqüências apresentaram similaridades com proteínas de comunidades biológicas e com probabilidades de ocorrência ao acaso muito baixa, sugerindo que os fagos foram selecionados especificamente para os sítios alvos.

Os peptídeos Seq. ID N2 3 e ID N2 19, Seq. ID N2 4 e Seq. ID N2 20 apresentam similaridades com o sítio de fosforilação da proteína kinase C de vírus eucarióticos, através dos sítios de identificação Ser Ala Lys e Thr Tyr Lys, respectivamente, sendo Ser ou Thr o sítio de fosforilação. A proteína kinase C, está envolvida em processos celulares incluindo secreção, exocitose, expressão gênica, modulação da condução iônica, proliferação celular e regulação negativa de receptores extracelulares (Kapczinski F et al. Revista Brasileira de Psiquiatria 26:17-21, 2004). In vivo, a proteína Kinase C exibe uma preferência pela fosforilação de resíduos de serina ou de treonina, encontrados próximos a um resíduo básico C-terminal (Kishimoto A et al. Journal of Biological Chemistry, 260:12492-12499, 1985). A presença de resíduos básicos adicionais ao N ou C-terminal do aminoácido alvo, aumenta a velocidade da reação de fosforilação.

Os peptídeos Seq. ID N°1 e Seq. ID N°17, Seq. ID N°9 e Seq. ID N°25, Seq. ID N°12 e Seq. ID N°28 apresentaram similaridades com o sítio de N-glicosilação dos vírus eucarióticos, através dos sítios de identificação Asn Ile Ser Ser, Asn Ala Ser Thr e Asn Tyr Thr Ser, respectivamente, sendo Asn o sítio de glicosilação. A N-glicosilação é uma das principais modificações pós- traducionais, sendo responsável por alterações na conformação, estabilidade e conseqüentemente, na funcionalidade de proteínas em eucariotos (Maia IG et al. Genetics and molecular biology, 24: 231-234, 2001).

A presença de domínios conhecidos de vírus eucarióticos sugere que os peptídeos selecionados possuem similaridade com o vírus da dengue e podem estar associados ao processo de modulação do vírus no hospedeiro.

Tabela 4

<table>table see original document page 22</column></row><table>

A Tabela 5 refere-se ao teste ELISA da imunorreatividade dos fagos contra soros de pacientes previamente tipados com os tipos DENV-1 e DENV- 3, tanto para IgG quanto para IgM. Os resultados demonstram que os peptídeos não foram específicos para qualquer um dos dois tipos virais, bem como para os tipos de imunoglobulinas. Todos os resultados de índices ELISA foram significativos, embora com perfis diferenciados entre os fagos.

Os peptídeos recombinantes foram superiores em imunorreatividade em relação aos índice ELISA (IE) obtidos com as proteínas totais da dengue.

Estes resultados corroboram os testes ELISA prévios com IgY e culturas, bem como com os resultados de bioinformática.

Tabela 5

<table>table see original document page 23</column></row><table> Todos os resultados combinados tornam os 16 peptídeos selecionados e suas respectivas seqüências reversas (Seq. ID N- 1 a 32) como potenciais alvos vacinais, assim bem como prováveis biomarcadores para ensaios diagnósticos, uma vez que estes apresentaram alta especificidade às proteínas de dengue de todos os tipos virais.

As principais vantagens deste invento são:

- uso da resposta humoral em galinhas para caracterização de antígenos da dengue;

- seleção de peptídeos especificamente imunorreativos para a detecção de anticorpos anti-dengue para todos os tipos virais;

- uso destes peptídeos em procedimento de imunodiagnósticos;

- uso destes peptídeos em composições vacinais para o controle da infecção viral.

A presente invenção é de grande importância, uma vez que as infecções causadas pelo vírus da dengue representam um importante problema de saúde pública no mundo, especialmente em países tropicais como o Brasil, onde o clima e os hábitos urbanos oferecem condições ótimas para o desenvolvimento e proliferação de seu mosquito transmissor, o Aedes aegypti.

A dengue tornou-se endêmica no país desde meados da década passada, ocasionando repetidas epidemias em muitas cidades, registrando-se, inclusive, a ocorrência da temida forma hemorrágica. A Organização Mundial da Saúde (OMS) estima que entre 50 a 100 milhões de pessoas se infectem anualmente, em mais de 100 países, de todos os continentes, exceto a Europa. Cerca de 550 mil doentes necessitam de hospitalização e 20 mil morrem em conseqüência da dengue.

Neste cenário, a necessidade de peptídeos protéicos no diagnóstico e na terapêutica da dengue, aponta para um grande avanço na investigação clínica da doença. Assim, políticas de saúde voltadas para a detecção e além de um eficaz tratamento vacinai devem ser priorizadas.

A invenção poderá ser melhor compreendida por meio da descrição detalhada, em consonância com as Figuras em anexo, onde: A FIGURA 1 apresenta um histograma referente à reatividade em teste ELISA das imunoglobulinas Y1 geradas após quatro imunizações com proteínas totais do vírus da dengue tipo 3 (DENV-3), testadas contra proteínas totais de culturas dos tipos DENV-1, DENV-2 e DENV-3, onde (a) corresponde a IgY imune e (b) corresponde a IgY controle.

A FIGURA 2 apresenta a estrutura tri-dimensional do capsídeo viral do tipo DENV-2 para comprovação de alinhamentos em epítopos conformacionais. Há indicação de alguns aminoácidos, onde (N) é uma aspargina ou Ans; (R) é uma arginina ou Arg; (V) é uma valina ou Val e (L) é uma Ieucina ou Leu.

Segundo a FIGURA 1, confirmou-se a falta de especificidade desta quanto aos tipos virais da dengue, no entanto verificou-se uma alta sensibilidade ao vírus da dengue. De acordo com a FIGURA 2, como os motivos seq. ID N- 75 e Leu Arg Asn não se alinharam na estrutura linear da proteína do capsídeo, a busca de motivos foi feita diretamente na estrutura terciária da proteína, por superposição, pelo programa Cn3D.

Epítopos podem ser classificados como conformacionais (seqüências descontínuas) ou não conformacionais (seqüências lineares). Epítopos lineares são curtos estiramentos da estrutura da proteína primária, composta de resíduos contínuos de aminoácidos da seqüência primária. Epítopos conformacionais consistem em muitos resíduos de aminoácidos, discretos na seqüência primária, que montam determinantes antigênicos na forma da estrutura terciária das proteínas (Barlow DJ et al. Nature, 322:747-748, 1986).

Seqüências consenso geralmente não mostram nenhuma similaridade com a seqüência do antígeno natural (Felici F et al. Gene, 128:21-27, 1993). Nesse caso, epítopos podem mimetizar epítopos naturais (mimotopos) ou epítopos conformacionais. Isto justifica o fato dos prováveis motivos não terem sido encontrados na seqüência linear da proteína do capsídeo. A proteína C de DENV-2 é um dímero simétrico com quatro hélices dispostas em dois pares antiparalelos (Jones CT et al. Journal of Virology, 7:7143-7149, 2003). Cada dímero possui uma das seqüências alvo analisadas.

Pode-se observar que ambos os motivos estão localizados na porção mais externa da molécula, propiciando um maior contato de superfície, portanto tornando-se uma região candidata para a localização de epítopos.

Para melhor compreensão dos exemplos utlizados, segue abaixo uma descrição detalhada dos procedimentos experimentais adotados.

Foram utilizados no processo de imunização, antígenos inativados do sorotipo DENV-3, produzidos em cérebros de camundongos e extraídos pelo método sucrose-acetona. O esquema de imunização foi o descrito por Barbas e colaboradores (Barbas CF et al. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, p.8.4-8.7, 2001), com algumas modificações. Foram realizadas seis aplicações intramusculares de proteínas virais totais emulsionadas em adjuvante, sendo que a quantidade de proteína foi de 200,0 μg na primeira imunização, seguida por imunizações subseqüentes de 100,0 pg, com intervalos de 15 dias. Foram imunizadas duas galinhas e outras duas mantidas como controle.

Após 3 meses coletou-se o sangue, e o título de anticorpos específicos foi monitorado por testes ELISA.

A purificação de IgY foi realizada com o uso da coluna HiTrap IgY Purification HP, 5 mL (Amersham Biosciences). A bomba peristáltica foi preenchida com tampão de eluição (Na2HPO4 20 mM, pH 7.5), e então conectada à coluna. A coluna foi lavada com 5 volumes (25,0 mL) de cada tampão: ligação (Na2HPO4 20 mM, K2SO4 0,5 M, pH 7.5), eluição e limpeza (Na2HPO4 20 mM, 30% volume/volume de isopropanol, pH 7,5). Em seguida a coluna foi equilibrada com 5 volumes de tampão de ligação, e foi injetada amostra (6,0 mL de soro). A coluna foi lavada com 10 volumes da mesma (50,0 mL) de tampão de ligação. As IgY foram então eluídas com 10 volumes da coluna de tampão de eluição, sendo coletadas amostras de 1,0 mL que foram quantificadas no espectrofotômetro à 280 nm. A coluna foi regenerada com 8 volumes (40,0 mL) de tampão de limpeza, e reequilibrada com 5 volumes de tampão de ligação. À medida que as amostras eram filtradas na coluna de purificação, as leituras ópticas (OD 280nm) das alíquotas eram obtidas.

Para diálise das amostras obtidas foi utilizada uma membrana de celulose Fisherbrand® (regenerated cellulose-DYALYSIS tubing). As amostras do soro purificado foram colocadas em tubos de diálise (tubos 1 a 8), concentradas em sacarose por 1 hora a 4°C e em seguida dialisadas em PBS (Solução tampão fosfato salina: NaCI 137 mM, KCI 2,7 mM, Na2HPO4 12 mM, KH2PO4 1,2 mM, pH 7.4) por 12 horas a 4°C. As amostras foram quantificadas no espectrofotômetro à 280nm.

Após a obtenção do anticorpo purificado, foi necessário confirmar a especificidade das IgY em relação aos demais tipos virais. Foi sensibilizada uma placa de alta afinidade (NUNC) com 20 pg/mL de proteínas totais de cada tipo viral, diluídos em 100,0 pL/poço de tampão carbonato (NaHC03 60 mM, pH 9,6) e incubada por 12 horas, sob agitação, à 4°C. Após 3 lavagens com PBS-T 0,05% (PBS + 0,05% volume/volume de Tween 20), foram adicionados 250,0 pL de tampão de bloqueio (PBS-T 0,05% - BSA 3%), sendo a placa incubada por 1 hora à temperatura ambiente. A placa foi então lavada por mais 3 vezes e adicionados 100,0 pL de solução contendo soro das galinhas imunizadas na concentração de 1:600, mais 50,0 pL de bloqueio (um clone em cada poço). Após a incubação por 1 hora à 37°C, realizou-se mais 6 lavagens. Foi adicionado o anticorpo Anti-IgY conjugado marcado com peroxidase (Amersham Biosciences, 1:5000) diluído em solução de bloqueio, com incubação por 1 hora à 37°C. Em seguida, a placa foi lavada por mais 6 vezes, e então revelada com 100,0 pL/poço de uma solução contendo OPD (O- Phenylenediamine dihydrochrloide - Sigma Chemical), H2O2, e tampão citrato (0,1 Μ). A reação foi interrompida pela adição de 10,0 pL de H2SO4 4 M. A leitura da absorbância foi feita em leitor Multiscan Plus versão 2.03, com filtro 492nm.

Para a seleção dos peptídeos (expressos na proteína Ill do capsídeo de fagos filamentosos), reativos com os anticorpos acima descritos, utilizou-se uma biblioteca randômica de peptídeos de 7 aminoácidos (Ph.D -7 mer - New England Biolabs).

Foi adsorvido no poço de uma placa de microtitulação de 96 poços (Maxisorp - NUNC) 150,0 μΙ_ de IgY purificada em coluna específica para IgY (100 μg/mL em NaHCO3 0,1 M, pH 8,6) e incubada overnight a 4°C em um recipiente contendo papel toalha umidificado. A placa foi bloqueada com 150,0 μlde um tampão de bloqueio (NaHCO3 0.1 M, pH 8,6, 5 mg/mL BSA) por 1h sob agitação a 4°C, e lavada seis vezes com TBST (TBS (Tris-HCI 50 mM pH 7,5, NaCI 150 mM, água, 0,1% volume/volume de Tween 20). Foram acrescentados na placa 10,0 μΐ_ da biblioteca de peptídeos diluída em 100,0 μΙ_ de TBST, e a placa foi mantida sob agitação por 1 hora à temperatura ambiente. Fagos não Iigantes foram removidos pela lavagem da placa por dez vezes com TBST. Os fagos Iigantes foram eluídos com 100,0 μΐ_ do tampão de eluição (glicina-HCI 0,2 M, pH 2,2, contendo 1 mg/mL BSA) por 10 min à temperatura ambiente e imediatamente neutralizados com 15,0 μΙ_ do tampão de neutralização (Tris-HCI 1 M, pH 8,0). Alíquotas dos fagos eluídos foram utilizadas para a determinação do título.

Uma pequena amostra deste eluato (10,0 μΙ_) foi titulada e o tratante foi utilizado para reamplificação, realizada em 20,0 mL de cultura de E. coli (ER2537) em fase inicial de crescimento (OD600≤0,3), contendo tetraciclina, incubando-se a cultura por 4-5 horas em agitador com temperatura a 37°C, antes do procedimento de precipitação dos fagos e posterior titulação.

A partir do terceiro ciclo, dois processos de seleção separados foram realizados, sendo um positivo (contra antígenos totais de DENV-3) e outro negativo (contra proteínas totais de células de cérebro de camundongo não infectadas). Importante enfatizar que na seleção negativa o sobrenadante que era mantido para o próximo ciclo de seleção, excluindo-se assim fagos Iigantes inespecíficos.

A cultura foi transferida para um tubo Oakridge (Hitachi, 50 mL) e centrifugada (10 min, 10.000 rpm). As células residuais foram descartadas e o sobrenadante transferido para um tubo limpo e recentrifugado. Foi pipetado 80% do sobrenadante para um tubo esterilizado onde foi adicionado 20% do volume de PEG/NaCl (20% peso/volume de Polietileno glicol-8000, NaCl 2,5M, água), e a mistura permaneceu em repouso por 12 horas a 4°C.

No dia seguinte, a precipitação foi centrifugada 15 minutos a 10.000 rpm à 4°C. O sobrenadante foi descartado e o tubo foi centrifugado brevemente, para que o sobrenadante residual pudesse ser removido. O precipitado foi ressuspendido em 1,0 mL de TBS, transferido para um microtubo e centrifugado por 5 minutos, 10.000 rpm à 4°C para precipitar os resíduos celulares. O sobrenadante foi transferido para um novo microtubo para a adição de PEG/NaCl (1/6 do volume). A mistura foi incubada em gelo por 1 hora e então centrifugada (10 min, 14.000 rpm, 4°C). O sobrenadante foi descartado, e a centrifugação foi repetida para remoção de sobrenadante residual. O precipitado foi ressuspendido em 200,0 uL de TBS, obtendo-se então o eluato amplificado, pronto para a titulação.

Os fagos reamplificados a partir do primeiro ciclo de seleção foram utilizados em um segundo ciclo e assim subseqüentemente, por um total de quatro ciclos, sendo que a partir do segundo ciclo a estringência do tampão de lavagem foi aumentada de 0,1% para 0,5% de Tween-20 em todas as lavagens.

Para todas as titulações foram utilizados 10,0 uL dos fagos, diluídos em 90,0 pL de meio de cultura LB. As diluições (10~1 a 10~4, para eluato não amplificado e de 10"8 a 10"11, para fagos amplificados) foram incubadas com 200,0 pL de E. coli (ER2738) em fase de crescimento inicial por 5 minutos e plaqueadas em meio LB contendo IPTG (0,5 mM) e X-gal (40 pg/mL), juntamente com 3,0 mL de Agarose Top (10 g de Bacto-Triptona, 5g de extrato de levedura, 5g de NaCI, 1 g de MgCI2. 6H20 / litro).

Após a incubação em estufa por toda a noite à 37°C, as colônias azuis foram contadas para a obtenção dos títulos de entrada e saída para todos os ciclos de seleção (número de colônias azuis χ fator de diluição).

As colônias que apresentaram coloração azul, demonstrando a quebra do substrato X-Gal e a expressão do gene da β-galactosidase dos fagos pelas bactérias ER2738, foram reamplificadas separadamente em placas Deepwell para o armazenamento dos clones selecionados. Para isso, cada colônia isolada obtida do 4o ciclo não amplificado foi dispensada em um poço da Deepwell contendo 1,0 mL de meio de cultura com E. coli em fase de crescimento inicial. A placa foi incubada por 12 horas à 37°C, sob agitação. A placa Deepwell foi centrifugada por 60 minutos a 3.700 rpm, para a retirada do sobrenadante da cultura. Seu conteúdo foi transferido para uma outra placa Deepwell e então foi adicionado 1/6 do volume de PEG/NaCI (20% de polietileno glicol-8000, NaCl 2,5 M) incubando-a por 12 horas à 4°C. A placa foi centrifugada por 1 hora a 3.700 rpm, o sobrenadante descartado, e o precipitado suspenso em 200,0 μL de PBS.

Testes de ELISA foram realizados para determinar a reatividade dos peptídeos recombinantes (expressos nos fagos selecionados), contra os anticorpos presentes no soro das galinhas imunizadas com proteínas virais totais da dengue do tipo 3.

Foi sensibilizada uma placa de alta afinidade (NUNC) com 1 pg/poço do anticorpo policlonal purificado IgY anti-dengue diluído em 100,0 pL/poço de tampão carbonato (NaHCO3 60 mM, pH 9,6) e incubada por 12 horas, sob agitação, à 4°C. Após 3 lavagens com PBS-T 0,05% (PBS + 0,05% volume/volume de Tween 20), foram adicionados 250,0 μL de tampão de bloqueio (PBS-T 0,05% - BSA 3%), sendo a placa incubada por 1 hora à temperatura ambiente. A placa foi então lavada por mais 3 vezes e adicionados 100,0 μL de solução contendo 50,0 μL do fago mais 50,0 μL de bloqueio (um clone em cada poço). Após a incubação por 1 hora à 37°C, realizou-se mais 6 lavagens. Para a detecção, utilizou-se o anticorpo conjugado anti-M13 marcado com peroxidase (1:500) diluído em solução de bloqueio, com incubação por 1 hora à 37°C. Em seguida, a placa foi lavada por mais 6 vezes, e então revelada com 100,0 pL/poço de uma solução contendo OPD (O- Phenylenediamine dihydrochrloide - Sigma Chemical), H2O2, e tampão citrato (0,1 Μ). A reação foi interrompida pela adição de 10,0 pL de H2SO4 4 M. A leitura da absorbância foi feita em leitor Multiscan Plus (Thermo Plate) versão 2.03, com filtro 492nm.

Para a obtenção de DNA dos fagos, 10,0 μί dos fagos purificados em placa Deepwell foram adicionados a 1,0 mL de cultura de ER2738 em fase 5 de crescimento inicial em tubos FALCON de 15 mL, onde permaneceram sob agitação vigorosa por 6 horas à 37°C. Após o crescimento, as culturas foram transferidas para microtubos para a sedimentação das bactérias que foram centrifugadas por 10 minutos a 4.000 rpm. 500,0 μL do sobrenadante foram transferidos para outro tubo, e acrescidos a este, 200,0 μl de PEG-NaCI, incubando o tubo em seguida à temperatura ambiente por 10 minutos. Após centrifugar por 10 minutos a 14.000 rpm, foi descartado o sobrenadante, e o precipitado foi ressuspenso com em 100,0 μL de Tampão Iodeto (Tris-HCI 10 mM, EDTA 1 mM, Nal 4 M), e então foi adicionados 250,0 μL de etanol absoluto, incubando o tubo por 10-20 minutos à temperatura ambiente. O tubo 15 foi centrifugado por 10 minutos a 14.000 rpm, descartando o sobrenadante, e em seguida, foi lavado o precipitado com 500,0 μL de etanol 70%, centrifugando mais uma vez por 10 minutos a 14.000 rpm. O sobrenadante foi desprezado e o precipitado suspenso em 20,0 μl de água ultra pura estéril.

O seqüenciamento foi realizado utilizando o Kit Big Dye Terminator 20 (Amersham Biosciences) e um seqüenciador automático MegaBace 1000 (.Amersham Biosciences. Para a reação do seqüenciamento, foi utilizado o primer - 96 M13 - (5'-HoCCCTCATAGTTAGCGTAACG -3'- Amersham Biosciences), que amplifica a região dos aminoácidos codificantes dos peptídeos randômicos fusionados nos fagos M13 recombinantes.

A análise das seqüências de DNA provenientes do seqüenciador automático foram processadas em software do próprio equipamento (Sequence Analyser, BASE CALLER, Cimarron 3.12, Phred 15). Logo após esta pré-análise, as seqüências dos vetores foram retiradas e somente aqueles insertos com 16 resíduos perfeitos foram então traduzidas.

As seqüências de DNA geradas pelo seqüenciamento foram analisadas utilizando-se programas de bioinformática disponíveis on-line: - a tradução das seqüências de aminoácidos obtidas no seqüenciamento se deu pelo programa DNA2PR07 (http://relic.bio.anl.gov/dna2pro7.aspx);

- o cálculo da freqüência e da medida de informação de cada um dos peptídeos dentro da biblioteca original de fagos foi feito pelo programa INFO (https://relic.bio.anl.gov/info.aspx);

- os motivos protéicos gerados foram analisados quanto às homologias com proteínas de dengue depositadas no "GENBANK" pelo programa BLAST - Basic Local Alignment Search Tool (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST);

- para encontrar os padrões protéicos e a linhagem taxonômica referindo-se às famílias de proteínas e domínios comuns em espécies, gêneros ou táxons a qual os peptídeos pertencem, foi utilizado o programa PROSCAN (PROSITE SCAN). Este programa examina os peptídeos contra o PROSITE, um banco de dados de famílias de proteínas e domínios que consiste de locais biologicamente significantes, padrões e perfis que ajudam a identificar confiantemente a família conhecida da proteína, caso exista uma (http://npsa-

pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_prosite.html).

Para confirmar a especificidade dos clones obtidos, realizou-se o teste ELISA com soro de 2 pacientes contaminados individualmente com DENV-1 e DENV-3. Esses soros foram previamente tipados por PCR. Como controle negativo foi utilizado um poço sem fago e sem soro, e os controle positivos foram os antígenos totais das culturas específicas para os tipos DENV-1, -2, e -3.

Foram feitos 4 testes ELISA, sendo que em 2 foram utilizados soros humanos com DENV-1, e nos outros 2, soros humanos com DENV-3. Em ambos tipos virais, foi aplicado anticorpo anti-lgG em uma das placas, conjugado com peroxidase e na outra, anticorpo anti-lgM, também conjugado com peroxidase. No controle negativo utilizado, não foram colocados os fagos e o soro testado. A sensibilização das placas foi feita com fagos, na concentração de 5x109 partículas virais e também com proteínas totais de DENV-1 e DENV-3, na concentração de 20 Mg/mL, ambos diluídos em bicarbonato de sódio. Esta foi incubada por 12 horas, sob agitação, à 4°C.

Após 3 lavagens com PBS-T 0,05% (PBS + 0,05% volume/volume de Tween 20), foram adicionados 250 μL de tampão de bloqueio (PBS-T 0,05% - BSA 3%), sendo a placa incubada por 1 hora à temperatura ambiente. As placas foram então lavadas por mais 3 vezes e foram adicionados soros de pacientes infectados com DENV-1 e DENV-3. Nas placas em que seriam aplicados anti-lgG, conjugado com peroxidase, a concentração do soro foi de 1:500, e nas placas em que seriam aplicados anti-lgM, conjugado com peroxidase, a concentração do soro foi de 1:50. Após a incubação por 1 hora à 37°C, realizou-se mais 6 lavagens. Foram adicionados os anticorpos Anti-IgG e Anti-IgM conjugados, marcados com peroxidase (Amersham Biosciences, 1:5000) diluídos em solução de bloqueio, com incubação por 1 hora à 37°C. Em seguida, a placa foi lavada por mais 6 vezes, e então revelada com 100 uL/poço de uma solução contendo OPD (O- Phenylenediamine dihydrochrloide - Sigma Chemical), H2O2, e tampão citrato (0,1M). A reação foi interrompida pela adição de 10 μL de H2So4 4 Μ. A leitura da absorbância foi feita em leitor Multiscan Plus (Thermo Plate) versão 2.03, com filtro 492nm. LISTAGEM DE SEQÜÊNCIAS BIOLÓGICAS

(1) Informações gerais do Pedido de Patente

(1) Dados do Requerente:

a) Nome: Universidade Federal de Uberlândia

b) Endereço: Av. João Naves de Ávila, 2121 - Bloco 5L, Bairro Santa Mônica, CEP: 38400-902, Uberlândia - MG.

(ii) Título da invenção: "PEPTÍDEOS RECOMBINANTES MIMÉTICOS E MOTIVOS PROTÉICOS DE ANTÍGENOS DO VÍRUS DA DENGUE E SUAS APLICAÇÕES DIAGNOSTICAS E TERAPÊUTICAS"

(iii) Número de seqüências constantes do pedido: 75 (setenta e cinco)

(iv) Formato para leitura no computador: Microsoft Word; Windows XP; computador tipo PC.

(2) Informações gerais das seqüências Características das moléculas seqüenciadas:

a) Tipo: PROTEÍNA

b) Nome da Proteína: Poliproteína do Vírus da Dengue: DENV-1, DENV-2, DENV-3 e DENV-4.

c) Identidade das Seqüências: Seq. ID N- 1 a Seq ID N- 74.

d) Fonte original das moléculas: GenBank (www.ncbi.nlm.nih.gov/GenBank/)

3- Informações para Seq. ID N2 1

Características da seqüência:

a) Tamanho: 7 aminoácidos

b) Tipo: aminoácido

c) Topologia: linear

Descrição da seqüência: Seq. ID N2 1:

Lys Leu Trp Asn Ile Ser Ser 1 5 7

3- Informações para Seq. ID N2 2

Características da seqüência: a) Tamanho: 7 aminoácidos

b) Tipo: aminoácido

c) Topologia: linear Descrição da seqüência: Seq. ID N- 2:

Lys Leu Phe Asn Ala Asn Pro 1 5 7

3- Informações para Seq. ID N- 3

Características da seqüência:

a) Tamanho: 7 aminoácidos

b) Tipo: aminoácido

c) Topologia: linear Descrição da seqüência: Seq. ID N2 3: Tyr Glx Asx Ser Ala Lys Thr 1 5 7

3- Informações para Seq. ID Ns 4

a Características da seqüência:

a) Tamanho: 7 aminoácidos

b) Tipo: aminoácido

c) Topologia: linear

Descrição da seqüência: Seq. ID N- 4:

Thr Tyr Lys Leu Pro Pro Pro 1 5 7

3- Informações para Seq. ID N2 5

Características da seqüência:

a) Tamanho: 7 aminoácidos

b) Tipo: aminoácido

c) Topologia: linear Descrição da seqüência: Seq. ID N2 5:

Val Leu Arg Asn Ala Pro Pro 1 5 7

3- Informações para Seq. ID N2 6 Características da seqüência:

a) Tamanho: 7 aminoácidos

b) Tipo: aminoácido

c) Topologia: linear Descrição da seqüência: Seq. ID N- 6:

Val Leu Arg Asn Val His Asn 1 5 7

3- Informações para Seq. ID N- 7

Características da seqüência:

a) Tamanho: 7 aminoácidos

b) Tipo: aminoácido

c) Topologia: linear Descrição da seqüência: Seq. ID N2 7:

Val Leu Arg Asn Met Asn Pro 1 5 7

3- Informações para Seq. ID N- 8

Características da seqüência:

a) Tamanho: 7 aminoácidos

b) Tipo: aminoácido

c) Topologia: linear Descrição da seqüência: Seq. ID N2 8:

Val Leu Arg Asn Ser Pro Thr 1 5 7

3- Informações para Seq. ID N2 9

Características da seqüência:

a) Tamanho: 7 aminoácidos

b) Tipo: aminoácido

c) Topologia: linear Descrição da seqüência: Seq. ID N2 9:

Leu Leu Arg Asn Ala Ser Thr 1 5 7 3- Informações para Seq. ID N° 10 Características da seqüência:

a) Tamanho: 7 aminoácidos

b) Tipo: aminoácido

c) Topologia: linear

Descrição da seqüência: Seq. ID N°10 Met Leu Arg Asn Leu Pro Pro 1 5 7

3- Informações para Seq. ID N2 11 Características da seqüência:

a) Tamanho: 7 aminoácidos

b) Tipo: aminoácido

c) Topologia: linear Descrição da seqüência: Seq. ID N° 11

Ala Leu Arg Asn Leu Gly Pro 1 5 7

3- Informações para Seq. ID N° 12 Características da seqüência:

a) Tamanho: 7 aminoácidos

b) Tipo: aminoácido

c) Topologia: linear Descrição da seqüência: Seq. ID N2 12 Ala Leu Arg Asn Tyr Thr Ser 1 5 7

3-Informações para Seq. ID N° 13 Características da seqüência:

a) Tamanho: 7 aminoácidos

b) Tipo: aminoácido

c) Topologia: linear

Descrição da seqüência: Seq. ID N° 13 Glx Leu Arg Asn Ala Pro Pro 1 5 7

3- Informações para Seq. ID N2 14 Características da seqüência:

a) Tamanho: 7 aminoácidos

b) Tipo: aminoácido

c) Topologia: linear Descrição da seqüência: Seq. ID N- 14:

Gly Leu Glx Ser Leu Ser Arg 1 5 7

3- Informações para Seq. ID N-

Características da seqüência:

a) Tamanho: 7 aminoácidos

b) Tipo: aminoácido 15 c) Topologia: linear

Descrição da seqüência: Seq. ID N° 15:

Asn Leu Arg Asn Val His Trp 1 5 7

3- Informações para Seq. ID N°16

Características da seqüência:

a) Tamanho: 7 aminoácidos

b) Tipo: aminoácido

c) Topologia: linear Descrição da seqüência: Seq. ID N2 16:

His Cys Glx Leu Ala Lys Cys 1 5 7

3- Informações para Seq. ID N2 17 Características da seqüência:

a) Tamanho: 7 aminoácidos

b) Tipo: aminoácido

c) Topologia: linear Descrição da seqüência: Seq. ID N- 17:

Ser Ser Ile Asn Trp Leu Lys 1 5 7

3- Informações para Seq. ID N° 18

Características da seqüência:

a) Tamanho: 7 aminoácidos

b) Tipo: aminoácido

c) Topologia: linear Descrição da seqüência: Seq. ID N° 18:

Pro Asn Ala Asn Phe Leu Lys 1 5 7

3- Informações para Seq. ID N° 19 Características da seqüência:

a) Tamanho: 7 aminoácidos

b) Tipo: aminoácido

c) Topologia: linear Descrição da seqüência: Seq. ID N° 19: Thr Lys Ala Ser Asx Glx Tyr 1 5 7

3- Informações para Seq. ID N° 20

Características da seqüência:

a) Tamanho: 7 aminoácidos

b) Tipo: aminoácido

c) Topologia: linear

Descrição da seqüência: Seq. ID N° 20:

Pro Pro Pro Leu Lys Tyr Thr 1 5 7

3- Informações para Seq. ID N° 21 Características da seqüência:

a) Tamanho: 7 aminoácidos

b) Tipo: aminoácido c) Topologia: linear Descrição da seqüência: Seq. ID N2 21: Pro Pro Ala Asn Arg Leu Val 1 5 7

3- Informações para Seq. ID N2 22

Características da seqüência:

a) Tamanho: 7 aminoácidos

b) Tipo: aminoácido

c) Topologia: linear

Descrição da seqüência: Seq. ID N- 22:

Asn His Val Asn Arg Leu Val 1 5 7

3- Informações para Seq. ID N2 23 Características da seqüência:

a) Tamanho: 7 aminoácidos

b) Tipo: aminoácido

c) Topologia: linear Descrição da seqüência: Seq. ID N2 23:

Pro Asn Met Asn Arg Leu Val 1 5 7

3- Informações para Seq. ID N2 24 Características da seqüência:

a) Tamanho: 7 aminoácidos

b) Tipo: aminoácido

c) Topologia: linear

Descrição da seqüência: Seq. ID N° 24: Thr Pro Ser Asn Arg Leu Val 1 5 7

3- Informações para Seq. ID N° 25

Características da seqüência:

a) Tamanho: 7 aminoácidos b) Tipo: aminoácido

c) Topologia: linear Descrição da seqüência: Seq. ID N° 25:

Thr Ser Ala Asn Arg Leu Leu 1 5 7

3- Informações para Seq. ID N° 26 Características da seqüência:

a) Tamanho: 7 aminoácidos

b) Tipo: aminoácido

c) Topologia: linear

Descrição da seqüência: Seq. ID N° 26: Pro Pro Leu Asn Arg Leu Met 1 5 7

3- Informações para Seq. ID N- 27

Características da seqüência:

a) Tamanho: 7 aminoácidos

b) Tipo: aminoácido

c) Topologia: linear Descrição da seqüência: Seq. ID N° 27:

Pro Gly Leu Asn Arg Leu Ala 1 5 7

3- Informações para Seq. ID N° 28 Características da seqüência:

a) Tamanho: 7 aminoácidos

b) Tipo: aminoácido

c) Topologia: linear Descrição da seqüência: Seq. ID N° 28: Ser Thr Tyr Asn Arg Leu Ala 1 5 7

3- Informações para Seq. ID N° 29 Características da seqüência: a) Tamanho: 7 aminoácidos

b) Tipo: aminoácido

c) Topologia: linear Descrição da seqüência: Seq. ID N° 29:

Pro Pro Ala Asn Arg Leu Glx 1 5 7

3- Informações para Seq. ID N° 30 Características da seqüência:

a) Tamanho: 7 aminoácidos

b) Tipo: aminoácido

c) Topologia: linear Descrição da seqüência: Seq. ID N° 30: Arg Ser Leu Ser Glx Leu Gly 1 5 7

3- Informações para Seq. ID N° 31

Características da seqüência:

a) Tamanho: 7 aminoácidos

b) Tipo: aminoácido

c) Topologia: linear

Descrição da seqüência: Seq. ID N° 31:

Trp His Val Asn Arg Leu Asn 1 5 7

3- Informações para Seq. ID N° 32 Características da seqüência:

a) Tamanho: 7 aminoácidos

b) Tipo: aminoácido

c) Topologia: linear Descrição da seqüência: Seq. ID N° 32:

Cys Lys Ala Leu Glx Cys His 1 5 7

3- Informações para Seq. ID N° 33 Características da seqüência:

a) Tamanho: 5 aminoácidos

b) Tipo: aminoácido

c) Topologia: linear

Descrição da seqüência: Seq. ID N- 33:

Trp Xaa Xaa Ser Ser 1 5

3- Informações para Seq. ID N° 34 Características da seqüência:

a) Tamanho: 6 aminoácidos

b) Tipo: aminoácido

c) Topologia: linear Descrição da seqüência: Seq. ID N- 34:

Leu Phe Xaa Ala Asn Pro 1 5 6

3- Informações para Seq. ID N°

Características da seqüência:

a) Tamanho: 4 aminoácidos

b) Tipo: aminoácido

c) Topologia: linear

Descrição da seqüência: Seq. ID N° 35: Asx Ser Ala Lys 1 4

3- Informações para Seq. ID N° 36

Características da seqüência:

a) Tamanho: aminoácidos

b) Tipo: aminoácido

c) Topologia: linear Descrição da seqüência: Seq. ID N° 36:

Tyr Lys Xaa Pro Pro 1 5 3- Informações para Seq. ID N° 37 Características da seqüência:

a) Tamanho: 4 aminoácidos

b) Tipo: aminoácido

c) Topologia: linear

Descrição da seqüência: Seq. ID N° 37:

Val Leu Arg Asn 1 4

3- Informações para Seq. ID N° 38

Características da seqüência:

a) Tamanho: 4 aminoácidos

b) Tipo: aminoácido

c) Topologia: linear Descrição da seqüência: Seq. ID N° 38:

Leu Arg Xaa Met 1 4

3- Informações para Seq. ID N° 39 Características da seqüência:

a) Tamanho: 6 aminoácidos

b) Tipo: aminoácido

c) Topologia: linear Descrição da seqüência: Seq. ID N° 39: Val Leu Xaa Xaa Met Asn 1 5 6

3- Informações para Seq. ID N° 40 Características da seqüência:

a) Tamanho: 6 aminoácidos

b) Tipo: aminoácido

c) Topologia: linear

Descrição da seqüência: Seq. ID N- 40: Val Leu Xaa Xaa Pro Thr 1 5 6

3- Informações para Seq. ID N° 41 Características da seqüência:

a) Tamanho: 5 aminoácidos

b) Tipo: aminoácido

c) Topologia: linear Descrição da seqüência: Seq. ID N-41:

Arg Asn Xaa Pro Thr 1 5

3- Informações para Seq. ID N° 42 Características da seqüência:

a) Tamanho: 6 aminoácidos

b) Tipo: aminoácido

c) Topologia: linear

b. Descrição da seqüência: Seq. ID N- 42 Leu Arg Xaa Xaa Pro Thr 1 5 6

3- Informações para Seq. ID N° 43 Características da seqüência:

a) Tamanho: 4 aminoácidos

b) Tipo: aminoácido

c) Topologia: linear Descrição da seqüência: Seq. ID N° 43:

Leu Leu Arg Asn 1 4

3- Informações para Seq. ID N2 44 Características da seqüência:

a) Tamanho: 5 aminoácidos

b) Tipo: aminoácido

c) Topologia: linear Descrição da seqüência: Seq. ID N° 44: Leu Arg Xaa Ala Ser 1 5

3- Informações para Seq. ID N° 45

Características da seqüência:

a) Tamanho: 4 aminoácidos

b) Tipo: aminoácido

c) Topologia: linear Descrição da seqüência: Seq. ID N° 45:

Asn Leu Pro Pro 1 4

3- Informações para Seq. ID N° 46 Características da seqüência:

a) Tamanho: 5 aminoácidos

b) Tipo: aminoácido

c) Topologia: linear Descrição da seqüência: Seq. ID N° 46: Leü Arg Xaa Leu Pro 1 5

3- Informações para Seq. ID N° 47 Características da seqüência:

a) Tamanho: 5 aminoácidos

b) Tipo: aminoácido

c) Topologia: linear

Descrição da seqüência: Seq. ID N° 47:

Ala Leu Xaa Asn Leu 1 5

3- Informações para Seq. ID N° 48 Características da seqüência:

a) Tamanho: 5 aminoácidos

b) Tipo: aminoácido c) Topologia: linear Descrição da seqüência: Seq. ID N2 48: Leu Arg Xaa Leu Gly 1 5

3- Informações para Seq. ID N° 49 Características da seqüência:

a) Tamanho: aminoácidos

b) Tipo: aminoácido

c) Topologia: linear Descrição da seqüência: Seq. ID N2 49:

Leu Arg Xaa Thr Ser 1 5

3- Informações para Seq. ID N° 50 Características da seqüência:

a) Tamanho: 5 aminoácidos

b) Tipo: aminoácido

c) Topologia: linear Descrição da seqüência: Seq. ID N° 50:

Glx Leu Xaa Asn Ala 1 5

3- Informações para Seq. ID N° 51 Características da seqüência:

a) Tamanho: 5 aminoácidos

b) Tipo: aminoácido

c) Topologia: linear Descrição da seqüência: Seq. ID N° 51:

Gly Leu Xaa Ser Leu 1 5

3- Informações para Seq. ID N° 52 Características da seqüência:

a) Tamanho: 5 aminoácidos b) Tipo: aminoácido

c) Topologia: linear Descrição da seqüência: Seq. ID N-52:

Glx Leu Xaa Ala Lys 5 1 5

3- Informações para Seq. ID N- 53 Características da seqüência:

a) Tamanho: 4 aminoácidos

b) Tipo: aminoácido

c) Topologia: linear

Descrição da seqüência: Seq. ID N° 53: Asn Trp Leu Lys 1 4

3- Informações para Seq. ID N- 54

Características da seqüência:

a) Tamanho: 6 aminoácidos

b) Tipo: aminoácido

c) Topologia: linear Descrição da seqüência: Seq. ID N° 54:

20 Ser Xaa Ile Xaa Trp Leu 1 5 6

3- Informações para Seq. ID N° 55 Características da seqüência:

a) Tamanho: 4 aminoácidos

b) Tipo: aminoácido

c) Topologia: linear Descrição da seqüência: Seq. ID N° 55: Ser Ser Ile Asn 1 4

3- Informações para Seq. ID N° 56 Características da seqüência: a) Tamanho: 6 aminoácidos

b) Tipo: aminoácido

c) Topologia: linear Descrição da seqüência: Seq. ID N2 56:

5 Asn Ile Asn Xaa Leu Lys 15 6

3- Informações para Seq. ID N° 57 Características da seqüência:

a) Tamanho: 4 aminoácidos

b) Tipo: aminoácido

c) Topologia: linear Descrição da seqüência: Seq. ID N° 57: Asn Phe Leu Lys 1 4

3- Informações para Seq. ID N- 58

Características da seqüência:

a) Tamanho: 7 aminoácidos

b) Tipo: aminoácido

c) Topologia: linear

Descrição da seqüência: Seq. ID N° 58:

Asn Ala Xaa Phe Xaa Leu Lys 1 5 7

3- Informações para Seq. ID N2 59 Características da seqüência:

a) Tamanho: 4 aminoácidos

b) Tipo: aminoácido

c) Topologia: linear Descrição da seqüência: Seq. ID N2 59:

Thr Lys Ala Ser 301 4

3- Informações para Seq. ID N2 60 Características da seqüência:

a) Tamanho: 4 aminoácidos

b) Tipo: aminoácido

c) Topologia: linear Descrição da seqüência: Seq. ID N- 60

Leu Lys Tyr Thr 1 4

3- Informações para Seq. ID N2 61 Características da seqüência:

a) Tamanho: 4 aminoácidos

b) Tipo: aminoácido

c) Topologia: linear Descrição da seqüência: Seq. ID N- 61

Ala Asn Arg Lys 1 4

3- Informações para Seq. ID N2 62 Características da seqüência:

a) Tamanho: 6 aminoácidos

b) Tipo: aminoácido

c) Topologia: linear Descrição da seqüência: Seq. ID N- 62

Pro Ala Xaa Xaa Lys Val 1 5 6

3- Informações para Seq. ID N- 63 Características da seqüência:

a) Tamanho: 7 aminoácidos

b) Tipo: aminoácido

c) Topologia: linear Descrição da seqüência: Seq. ID N- 63

Asn Xaa Val Asn Xaa Lys Val 1 5 7 3- Informações para Seq. ID N- 64 Características da seqüência:

a) Tamanho: 6 aminoácidos

b) Tipo: aminoácido 5 c) Topologia: linear

Descrição da seqüência: Seq. ID N- 64: His Val Xaa Xaa Lys Val 1 5 6

3- Informações para Seq. ID N2 65

Características da seqüência:

a) Tamanho: 6 aminoácidos

b) Tipo: aminoácido

c) Topologia: linear Descrição da seqüência: Seq. ID N- 65:

Pro Asn Met Xaa Arg Lys 1 5 6

3- Informações para Seq. ID N2 66 Características da seqüência:

a) Tamanho: 6 aminoácidos

b) Tipo: aminoácido

c) Topologia: linear Descrição da seqüência: Seq. ID N2 66: Pro Ser Xaa Xaa Lys Val 1 5 6

3- Informações para Seq. ID N2 67

Características da seqüência:

a) Tamanho: 4 aminoácidos

b) Tipo: aminoácido

c) Topologia: linear

Descrição da seqüência: Seq. ID N2 67: Thr Ser Ala Asn 1 4

3- Informações para Seq. ID N° 68 Características da seqüência:

a) Tamanho: 5 aminoácidos

b) Tipo: aminoácido

c) Topologia: linear Descrição da seqüência: Seq. ID N° 68

Ser Ala Xaa Arg Lys 1 5

3- Informações para Seq. ID N° 69 Características da seqüência:

a) Tamanho: 5 aminoácidos

b) Tipo: aminoácido

c) Topologia: linear Descrição da seqüência: Seq. ID N° 69

Pro Pro Xaa Asn Arg 1 5

3- Informações para Seq. ID N° 70 Características da seqüência:

a) Tamanho: 4 aminoácidos

b) Tipo: aminoácido

c) Topologia: linear Descrição da seqüência: Seq. ID N° 70

Pro Gly Lys Asn 1 4

3- Informações para Seq. ID N° 71 Características da seqüência:

a) Tamanho: 5 aminoácidos

b) Tipo: aminoácido

c) Topologia: linear Descrição da seqüência: Seq. ID N° 71:

Gly Lys Xaa Lys Ala 1 5

3- Informações para Seq. ID N° 72 Características da seqüência:

a) Tamanho: 7 aminoácidos

b) Tipo: aminoácido

c) Topologia: linear Descrição da seqüência: Seq. ID N- 72:

Pro Gly Xaa Xaa Xaa Lys Ala 1 5 7

3- Informações para Seq. ID N° 73 Características da seqüência:

a) Tamanho: 7 aminoácidos

b) Tipo: aminoácido

c) Topologia: linear Descrição da seqüência: Seq. ID N- 73

Ser Thr Xaa Xaa Xaa Lys Ala 1 5 7

3- Informações para Seq. ID Ne 74 Características da seqüência:

a) Tamanho: 6 aminoácidos

b) Tipo: aminoácido

c) Topologia: linear Descrição da seqüência: Seq. ID N2 74

Ser Lys Xaa Xaa Lys Gly 1 5 6

3- Informações para Seq. ID N° 75 Características da seqüência:

a) Tamanho: 4 aminoácidos

b) Tipo: aminoácido c) Topologia: linear Descrição da seqüência: Seq. ID N2 75:

Val Xaa Arg Asn 1 4

Claims (8)

1. Peptídeos recombinantes miméticos de antígenos do vírus da dengue e suas seqüências reversas, caracterizadas por compreender as seqüências Seq ID N- 1 a Seq ID N° 32.

2. Motivos protéicos de antígenos do vírus da dengue, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadas por compreender as seqüências Seq ID N° 33 a Seq ID N° 75, incluindo os motivos protéicos de três aminoácidos: Trp Lys Lys, Ile Asn Trp e Pro Asn Met.

3. Peptídeos, suas seqüências reversas e motivos protéicos de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizadas por serem usadas como sondas para detecção in vitro da presença de anticorpos circulantes ou outras moléculas ligantes contra flavivirus, preferencialmente o vírus da dengue.

4. Peptídeos, suas seqüências reversas e motivos protéicos sintéticos ou recombinantes de acordo com uma das reivindicações 1 a 3, utilizados em processos de imunodiagnóstico in vitro como sondas para detectar a presença de moléculas ligantes, como os anticorpos circulantes, que reajam contra o vírus da dengue, caracterizados pela detecção por ensaios imunológicos, como por exemplo testes imunoenzimáticos (tais como ELISA, Western Blot, imunofluorescência, imunohistoquímica, EIA e outros), testes por imunoaglutinação, sensores eletroquímicos, ou de qualquer outra forma de detecção relacionada direta ou indiretamente em amostras de fluídos corporais, como saliva, urina, sangue, preferencialmente sangue.

5. Uso dos peptídeos, suas seqüências reversas e motivos protéicos conforme a reivindicação 1 ou 2, caracterizados por serem na preparação de uma composição vacinai, para estimular o sistema imune humano ou animal como processo terapêutico vacinai contra flavivirus, principalmente o vírus da dengue.

6.

Composição vacinai conforme a reivindicação 5, caracterizados pelo fato de compreender um ou mais compostos descritos pelas seqüências Seq ID N° 1 a Seq ID N° 75, preferencialmente os relacionados a Seq ID N° 11,

Seq ID Ns 47, Seq ID N2 8, Seq ID N2 41, Seq ID N2 2, Seq ID N2 34 Seq ID N2 58, Seq ID N2 4, Seq ID N2 60, Seq ID N2 7, Seq ID N2 38 Seq ID N2 18, Seq ID N2 20, Seq ID N2 60.