BRPI0706219B1 - construção de gene, vetor, método de produção de um polipeptídeo, uso de pelo menos parte de uma cepa de astrovírus isolado designada castv-3, composição, composição para gerar uma resposta imunogênica contra depressão do crescimento em uma ave, método de teste diagnóstico para a detecção do astrovírus de galinha tipo 3 em amostras de aves, e, kit diagnóstico - Google Patents

Abstract

cepa de astrovírus isolado, sequencia de nucleotideo isolada, construção de gene, vetor, metodo de produção de um polipeptídeo codificado por uma sequencia de nucleotídeo, sequencia de polipeptideo, anticorpos policlonal e monoclonal, uso de pelo menos parte de uma cepa de astro vírus isolado designada castv-3, uma sequencia de nucleotideo, ou um polipeptídeo, vacina para imunização contra depressão do crescimento em uma ave, métodos de vacinação de uma ave contra castv-3 e de teste diagnóstico para a detecção do astrovírus de galinha tipo 3 em amostras de aves, e, kit diagnóstico. um novo astrovírus designado astrovírus de galinha tipo 3 foi isolado e caracterizado. as seqúências de nucleotídeo e seqúências de polipeptídeo de 5 destes astrovírus são providas com usos do mesmo e do astrovírus isolado em kits de teste e vacinas.

Description

“CONSTRUÇÃO DE GENE, VETOR, MÉTODO DE PRODUÇÃO DE UM POLIPEPTÍDEO, USO DE PELO MENOS PARTE DE UMA CEPA DE ASTROVÍRUS ISOLADO DESIGNADA CASTV-3, COMPOSIÇÃO, COMPOSIÇÃO PARA GERAR UMA RESPOSTA IMUNOGÊNCIA CONTRA DEPRESSÃO DO CRESCIMENTO EM UMA AVE, MÉTODO DE TESTE DIAGNÓSTICO PARA A DETECÇÃO DO ASTROVÍRUS DE GALINHA TIPO 3 EM AMOSTRAS DE AVES, E, KIT DIAGNÓSTICO” CAMPO DA INVENÇÃO

[001 ] A presente invenção refere-se a vacinas, kits de teste e métodos de detecção de um novo astrovírus, em particular astrovírus de galinha tipo 3 (CAstV-3). Infecções de frangos de corte este com este astrovírus de galinha tipo 3 são associadas com enterite e depressão de crescimento e possíveis efeitos adversos no desenvolvimento de embrião de pinto.

ANTECEDENTES

[002] Problemas de depressão de crescimento em frangos, conhecidos na indústria de produção de aves domésticas por vários termos tais como síndrome de "retardo do desenvolvimento", "raquitismo-retardo de desenvolvimento" ou "crescimento irregular", resultam em custos econômicos consideráveis para as fazendas afetadas. Tal depressão de crescimento foi associada com infecção com uma variedade de vírus incluindo rotavírus e, como ainda não caracterizados, pequenos vírus redondos, conhecidos como enterovírus como os vírus (ELV). Desde que os problemas clínicos causados por vírus específicos são mal definidos devido à falta de testes diagnósticos específicos, é difícil estimar corretamente a demanda por uma vacina para proteger contra problemas de depressão de crescimento de induzida por vírus.

[003] Infecções por vírus de galinhas podem ser transmitidas horizontalmente de vírus que pode estar contaminando o poleiro; por exemplo, com infecções entéricas, propagação fecal-oral é provável que seja comum. E também reconhecido que transmissão vertical de infecções entéricas através do embrião de galinhas parentais infectadas com vírus pode também ocorrer.

[004] Estudos anteriores (Veterinary Laboratories Agency (VLA), Weybridge), têm mostrado que um enterovírus como vírus (ELV), designado FP3, pode ser detectado no mecônio (conteúdos intestinais) de pintos mortos na casca, sugerindo que este ELV estava infectando o embrião e foi vertical mente transmitido dos país infectados [Spackman, D. Gough, R.E., Coílins,. M.S. and Lanning, D, (1984). Isolation of na enterovirus-like agente from the itieconiuni of dead in-shell chicken embryo The Veterinary Recoirh 114,216-218].

[005] Vírus de tipo enterovírus incluem picornavírus, astrovírus, calicivírus e semelhantes e vírus esféricos não envelopados pequenos que replicam no cítoplasma. Eles têm um genoma de RNA e são estáveis em pH3.Vários ELVs que são distintos antigenicamente uns dos outros foram sugeridos como causando depressão de crescimento em aves.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[006] Seguindo uma investigação virológica extensiva de pássaros doentes de lotes de aves do Reino Unido em 2004-5, os presente inventores isolaram com sucesso um agente infeccioso de pintos fracos. Caracterização desse agente sugere que este agente viral causa depressão de crescimento em frangos e possíveis efeitos adversos em embriões de pintos.

[007] De acordo com o primeiro aspecto da presente invenção provê-se uma nova cepa de astrovírus isolada designada, CAstV-3. Uma amostra desta cepa foi depositada sob o Número de Acesso CNCM 1-3541 junto ao CNCM, Institut Pasteur em 15 de Dezembro de 2005, 1008] Astrovírus são vírus esféricos pequenos que têm tipicamente uma morfologia de estrela de 5 ou 6 pontas e um genoma de RNA de filamento único, de sentido positivo de cerca de 7kb.

[009] Vários astrovírus foram previamente caracterizados em patos, perus e galinhas, entretanto, o astrovírus caracterizado pelos presentes inventores é antigenicamente distinto como demonstrado por testes de imunofluorescência indireta.

[0010] Uma região substancial (-3,3 kb) do genoma de CAstV-3 foi sequenciada. Esta região compreende parte do astrovírus ORFlb, uma RNA polimerase dependente de RNA de astrovírus, uma seqüência intergênica pequena de 24 nucleotídeos, e astrovírus ORF 2, que codifica a região de proteína de capsídeo, e a região não traduzida 3'.

[0011] De acordo com o segundo aspecto, a presente invenção provê uma seqüência nucleotídica isolada que tem pelo menos 85%, preferivelmente pelo menos 90%, preferivelmente pelo menos 93%, mais preferivelmente pelo menos 95%, mais preferivelmente pelo menos 98%, ainda mais preferivelmente pelo menos 99%, e o mais preferivelmente 100% de identidade de seqüência para (a) uma seqüência nucleotídica como especificada em qualquer uma de SEQID NOs 1 a 4, (b) uma seqüência nucleotídica que é capaz de hibridizar qualquer uma de SEQ ID NOs 1 a 4 sob condições estringentes, ou (c) um fragmento de (a) ou (b).

[0012] De modo apropriado, uma seqüência nucleotídica da invenção codifica uma seqüência de aminoácido que é capaz de gerar uma resposta imunogênica contra astrovírus de galinha tipo 3. De modo apropriado, um fragmento de uma seqüência nucleotídica de (a) ou (b) codifica uma seqüência de aminoácido que é capaz de gerar uma resposta imunogênica contra astrovírus de galinha tipo 3.

[0013] De modo apropriado, a resposta imunogênica é contra pelo menos um sítio antigênico provido por uma proteína de capsídeo de astrovírus de galinha tipo 3 (CAstV-3).

[0014] A invenção ainda provê uma construção de gene incluindo pelo menos uma seqüência nucleotídica do segundo aspecto da invenção e uma seqüência de controle, por exemplo, um promotor.

[0015] Provê-se ainda um vetor incluindo uma seqüência nucleotídica isolada de acordo com o segundo aspecto da invenção e um promotor que é ligado operativamente à referida seqüência nucleotídica. Vetores apropriados incluem vírus (por exemplo, Vírus de vacina, adenovírus, baculovírus etc), vetores de levedura, fago, cromossomos, cromossomos artificiais, DNA de plasmídeos ou cosmídeo.

[0016] De acordo com um terceiro aspecto da invenção da invenção, provê-se um método de produzir um polipeptídeo codificado por uma seqüência nucleotídica da invenção, ou fragmento da mesma, incluindo as etapas de: (a) contatar uma célula bacteriana e/ou um célula de inseto via um baculovírus e/ou uma célula de levedura e/ou um célula de planta com um vetor como descrito aqui, e (b) cultivar referida célula bacteriana e/ou uma célula de inseto e/ou uma célula de levedura e/ou uma célula de planta sob condições apropriadas para a produção de polipeptídeo ou fragmento do mesmo.

[0017] De modo apropriado, a célula bacteriana pode ser Escherichia coli.

[0018] De modo apropriado, o polipeptídeo é codificado por uma seqüência nucleotídica de qualquer uma de SEQID NOs 1 a 4.

[0019] De modo apropriado, o polipeptídeo é codificado por uma seqüência nucleotídica de astrovírus de galinha tipo 3.

[0020] A invenção ainda provê um polipeptídeo produzido substancialmente a partir do método acima. Como será entendido pelos versados na técnica, tal polipeptídeo pode ser isolado ou substancialmente purificado a partir da mistura em que é expressado.

[0021] De acordo com um quarto aspecto da presente invenção, provê-se uma seqüência de polipeptídeo codificada por qualquer seqüência nucleotídica do segundo aspecto da invenção.

[0022] De modo preferido, provê-se uma seqüência de polipeptídeo codificada por qualquer uma dentre SEQID NOs 1 a 4.

[0023] De modo apropriado, um polipeptídeo da invenção pode ser antigênico em que ele demonstra pelo menos um sítio antigênico ao qual uma resposta imune pode ser dirigida.

[0024] Polipeptídeos antigênicos derivados de CAstV-3, por exemplo uma proteína de capsídeo (SEQ ID NO 5) ou fragmentos da mesma, estão dentro do escopo da presente invenção.

[0025] De modo apropriado, provê-se um polipeptídeo que tem pelo menos 85%, preferivelmente pelo menos 90%, preferivelmente pelo menos 93%, mais preferivelmente pelo menos 95%, mais preferivelmente pelo menos 98%, ainda mais preferivelmente pelo menos 99%, e o mais preferivelmente 100% de identidade de seqüência para um polipeptídeo com aminoácidos, como especificado em SEQ ID NO: 5.

[0026] Anticorpos policlonais e monoclonais que ligam especificamente a um polipeptídeo da presente invenção estão também dentro do escopo da invenção, assim como o uso de referidos anticorpos. Como será entendido pelos versados na técnica, tais anticorpos podem ser isolados ou substancialmente purificados a partir da mistura em que eles são providos.

[0027] De acordo com o quinto aspecto da invenção provê-se (i) o uso de uma nova cepa de astrovírus isolada designada, CAstV-3 do primeiro aspecto da invenção, (ii) o uso de uma seqüência nucleotídica do segundo aspecto da invenção, ou (iii) o uso de um polipeptídeo do quarto aspecto da invenção na preparação de uma composição que é capaz de mediar uma resposta imune em uma ave.

[0028] De acordo com o sexto aspecto da invenção provê-se uma composição preparada de acordo com o quinto aspecto da invenção.

[0029] De modo apropriado, referida composição inclui pelo menos uma parte do novo astrovírus isolado do primeiro aspecto da invenção, pelo menos uma seqüência nucleotídica do segundo aspecto da invenção, ou pelo menos um polipeptídeo do quarto aspecto da invenção.

[0030] Vacinação, a indução de imunidade adaptativa, de frangos de corte é vantajosa assim como a vacinação pode ser usada para controlar a doença clínica. Pintos produzidos a partir de pais vacinados são prováveis de serem menos suscetíveis à efeitos clínicos adversos causados pelo agente infeccioso vacinados contra durante o período de crescimento precoce do frango de corte.

[0031] Assim, um sétimo aspecto da presente invenção provê uma vacina para imunização contra depressão de crescimento em uma ave onde referida vacina compreende uma composição de acordo com o sexto aspecto para induzir uma resposta imune em aves.

[0032] A presente invenção também provê um método de vacinar aves contra CAstV-3 provendo uma quantidade imunologicamente efetiva de referida vacina.

[0033] CAstV-3 isolado e/ou nucleotídeos da invenção e/ou polipeptídeos e/ou anticorpos providos pela invenção podem ser usados para a preparação de um teste diagnóstico da invenção. Tais testes podem ser usados para detectar astrovírus aviário em amostras, por exemplo tecidos, fezes e soro de aves suspeitas de estarem infectados com o vírus.

[0034] De acordo com o oitavo aspecto da presente invenção, provê-se um teste diagnóstico para a detecção de astrovírus de galinha tipo 3 em amostras de aves suspeitas de estarem infectadas com o vírus compreendendo as etapas: (i) contatar material fisiológico aviário com uma sonda onde referida sonda é selecionada dentre: (a) uma seqüência nucleotídica como especificada em qualquer uma de SEQID NOs 1 a 4, (b) uma seqüência nucleotídica que é capaz de hibridizar para qualquer uma de SEQ ID NOs 1 a 4 sob condições estringentes, (c) uma seqüência nucleotídica que tem pelo menos 85%, preferivelmente pelo menos 90%, preferivelmente pelo menos 93%, mais preferivelmente pelo menos 95%, mais preferivelmente pelo menos 98%, ainda mais preferivelmente pelo menos 99% e o mais preferivelmente 100% identidade de seqüência para uma seqüência nucleotídica, como especificada em uma de (a) a (b), (d) um fragmento de (a) (b) ou (c), (e) um polipeptídeo codificado por uma seqüência nucleotídica como especificada em qualquer um (a) a (d), ou (f) um anticorpo com especificidade de ligação para um polipeptídeo de (e), e (ii) detectar um evento de ligação bem sucedido entre a sonda e pelo menos um componente da amostra.

[0035] De modo apropriado, referida sonda pode ser selecionada dentre (a) uma seqüência nucleotídica como especificada em qualquer uma de SEQ ID NOs 1 a 4, (b) uma seqüência nucleotídica que é capaz de hibridizar a qualquer uma de SEQ ID NOs 1 a 4 sob condições estringentes, (c) um fragmento de (a) ou (b), (d) um polipeptídeo da mesma codificado por uma seqüência nucleotídica como especificada em qualquer uma (a) a (c), ou (e) um anticorpo com especificidade de ligação para um polipeptídeo de (d).

[0036] Em uma forma de realização particular, uma sonda pode ser um conjunto de iniciadores apropriado para uso em RT-PCR para amplificar uma seqüência alvo selecionada de astro vírus de galinha tipo 3.

[0037] De modo apropriado, o fragmento codifica um polipeptídeo capaz de gerar uma resposta antigênica similar àquela provida por um polipeptídeo codificado por qualquer um de seqüências nucleotídicas SEQID NO 1 a 4.

[0038] De modo apropriado, o evento de ligação é detectado usando um marcador associado com a sonda, por exemplo um marcador fluorescente, um marcador de radioisótopo ou semelhantes.

[0039] Em uma forma de realização, o teste compreende as etapas: (i) contatar material fisiológico aviário, por exemplo sangue, contendo anticorpos que ligam especificamente a pelo menos parte de astro vírus de galinha tipo 3, com pelo menos parte de astro vírus de galinha tipo 3, onde referida pelo menos parte de astro vírus de galinha tipo 3 foi preferivelmente imobilizada em uma superfície sólida, de modo que referidos anticorpos são capazes de ligar à pelo menos parte de astrovírus de galinha tipo 3, e (ii) detectar a presença de referidos anticorpos ligados.

[0040] Em ainda uma outra forma de realização, um método de teste diagnóstico pode compreender as etapas; (i) contatar uma amostra de material fisiológico aviário, por exemplo fezes contendo astrovírus aviário tipo 3, com um anticorpo que liga especificamente a pelo menos parte de astrovírus de galinha tipo 3, cujo anticorpo foi preferivelmente isolado em um substrato sólido, de modo que referido anticorpo é capaz de ligar a referido astro vírus aviário tipo 3, e (ii) detectar a presença de referido vírus ligado.

[0041] O vírus capturado pode ser detectado através do uso de anticorpo com especificidade para o vírus em forma conjugada tal como deve ser conhecido pelos versados na arte.

[0042] Em ainda uma outra forma de realização, um método de teste diagnóstico pode compreender as etapas; (i) prover material genético a partir de material fisiológico aviário, e (ii) testar material genético para detectar qualquer material genético de astro vírus de galinha tipo 3.

[0043] De modo apropriado, uma sonda pode ser uma seqüência de ácido nucleico capaz de ligar à uma seqüência nucleotídica da invenção, preferivelmente uma seqüência nucleotídica de astrovírus de galinha tipo 3, preferivelmente uma seqüência nucleotídica de qualquer uma de SEQID NOs: 1 a 4.

[0044] De modo apropriado, uma sonda pode ser um conjunto de iniciadores capaz de ligar à uma seqüência nucleotídica de astrovírus de galinha tipo 3, preferivelmente uma seqüência nucleotídica de qualquer uma de SEQ ID NOs: 1 a 4, para permitir a amplificação de uma seqüência via RT-PCR.

[0045] De acordo com um outro aspecto da presente invenção, provê-se um kit diagnóstico para uso em diagnose de astrovírus de galinha tipo 3 (CAstV- 3), que inclui uma sonda onde referida sonda é pelo menos uma dentre (a) uma seqüência como especificada em qualquer uma de SEQ ID NOs 1 a 4, (b) uma seqüência que é capaz de hibridizar a qualquer uma de SEQ ID NOs 1 a 4 sob condições estringentes, (c) uma sequência nucleotídica que tem pelo menos 85%, preferivelmente pelo menos 90%, preferivelmente pelo menos 93%, mais preferivelmente pelo menos 95%, mais preferivelmente pelo menos 98%, ainda mais preferivelmente pelo menos 99% e o mais preferivelmente 100% identidade de sequência para uma sequência nucleotídica como especificada em qualquer um de (a) ou (b), (d) um fragmento de (a), (b) ou (c), (e) um polipeptídeo da mesma codificado por uma seqüência nucleotídica como especificada em qualquer um (a) a (d), ou (f) um anticorpo com especificidade de ligação para um polipeptídeo de (e).

[0046] De modo apropriado, o fragmento codifica um polipeptídeo capaz de gerar uma resposta antigênica similar àquela provida por uin polipeptídeo codificado por qualquer uma das sequências nucleotídicas SEQ 1D NO 1 a 4.

[0047] De modo apropriado, a sonda é associada com um marcador, por exemplo um marcador fluorescente, um marcador de radioísótopo ou semelhantes.

DESCRIÇÃO DETALHADA Vírus [0048] A invenção refere-se a astrovírus de galinha isolados tipo 3 e caracterização das sequências nucleotídicas e de polipeptídeos de referidos vírus.

[0049] Comparação de identidade de aminoácidos aos pares pelos inventores de CAstV-3 com outros astrovírus aviários sugere que a homologia mais próxima que ele compartilha com conhecidos astrovírus é com CAstV-2. A identidade de aminoácido aos pares entre CAstV-3 e CAstV-2 é de 84,6%.

[0050] Com relação às seqüências nucleotídicas providas pela invenção, identidade de seqüência é determinada usando um algoritmo matemático apropriado. Implementações de computador de tais algoritmos matemáticos podem ser utilizadas para comparação de seqüências para determinar identidade de seqüência. Tais implementações incluem, mas não estão limitadas a: CLUSTAL no Programa de PC/Gene (disponível por Intelligenetics, Mountain View, Califórnia); o programa de ALIGN (Versão 2.0) e GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA, e TFASTA no Wisconsin Genetics Software Package, Versão 8 (disponível por Genetics Computer Group (GCG), 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA).

[0051] De modo apropriado, alinhamentos usando estes programas podem ser realizados usando os parâmetros padrão.

[0052] Como usado aqui, "identidade de seqüência" ou "identidade" no contexto de dois nucleotídeos ou seqüências de polipeptídeos fazem referência a uma percentagem específica de resíduos nas duas seqüências que são iguais quando alinhadas para correspondência máxima sob uma janela de comparação específica, como medido pelos algoritmos de comparação de seqüência ou por inspeção visual.

[0053] De modo apropriado, uma janela de comparação especificada é selecionada dentre uma seqüência codificando ou representando pelo menos 50, pelo menos 100, pelo menos 150, pelo menos 200, pelo menos 250, ou o mais preferivelmente todos dos aminoácidos de um polipeptídeo especificado sendo alinhado.

[0054] Quando a percentagem de identidade de seqüência é usada em referência à proteínas, será entendido pelos versados na arte que posições de resíduo que não são idênticas frequentemente diferem por substituições de aminoácido conservativas, isto é onde aminoácidos são substituídos com aminoácidos que têm propriedades químicas similares àquelas dos aminoácidos que são substituídos. A identidade de seqüência percentual pode ser ajustada para cima de modo a corrigir a natureza conservativa de uma substituição.

[0055] Hibridização refere-se a ligar, duplexar, ou hibridizar em uma molécula apenas para uma seqüência nucleotídica particular sob condições estringentes quando esta seqüência está presente em um DNA ou RNA de mistura complexa (por exemplo, celular total).

[0056] Hibridização estringente ocorre quando um ácido nucleico liga o ácido nucleico alvo com um fundo mínimo. Tipicamente, para obter uma hibridização estringente, temperaturas de cerca de 1 oC a cerca de 20 oC , mais preferivelmente 5 oC para cerca de 20 oC abaixo da TF (temperatura de fusão em que metade das moléculas dissociam-se de seus parceiros) são usadas. Entretanto, ainda é definida por força iônica e pH da solução.

[0057] Um exemplo de condições de lavagem altamente estringentes inclui 0,15 M de NaCl a 72 oC durante cerca de 15 minutos. Um exemplo de uma condição de lavagem estringente é uma lavagem 0,2X de SSC a 65 oC durante 15 minutos (ver, Sambrook e Russell, infra, para uma descrição de Tampão de SSC). Frequentemente, uma lavagem de alta severidade é precedida por uma lavagem de baixa severidade para remover o sinal de sonda de fundo. Um exemplo de uma lavagem de média severidade para um duplex de, por exemplo, mais do que 100 nucleotídeos, é IX SSC em 45 oC durante 15 minutos. Um exemplo de uma lavagem de baixa severidade para um duplex de por exemplo mais do que 100 nucleotídeos, é 4-6X SSC a 40 oC durante 15 minutos. Para sondas pequenas (por exemplo cerca de 10 a 50 nucleotídeos), condições estringentes envolvem tipicamente concentrações de sal de menos do que cerca de 1,5 M, mais preferivelmente cerca de 0,01 a 1,0 M, concentração iônica de Na (ou outros sais) a pH 7,0 a 8,3, e a temperatura é tipicamente pelo menos cerca de 30 oC e pelo menos cerca de 60 oC para sondas longas (por exemplo, > 50 nucleotídeos).

[0058] De modo apropriado, seqüências nucleotídicas da presente invenção codificam polipeptídeos antigênicos de astrovírus de galinha tipo 3.

[0059] De modo apropriado, a presente invenção provê uma seqüência nucleotídica isolada selecionada de (a) uma seqüência nucleotídica como especificada em qualquer uma de SEQID NOs 1 a 4, (b) uma seqüência nucleotídica que é capaz de hibridizar a qualquer uma de SEQ ID NOs 1 a 4 sob condições estringentes, (c) ou um fragmento de (a) ou (b).

[0060] Em formas de realização específicas, seqüências nucleotídicas da invenção consistem de qualquer uma de seqüências nucleotídicas selecionadas de SEQ ID NO 1,2, 3 e/ou 4.

[0061] De modo apropriado, as seqüências nucleotídicas da presente invenção podem ser expressadas para prover os polipeptídeos codificados.

[0062] De modo preferido, polipeptídeos da presente invenção incluem polipeptídeos codificados por uma seqüência nucleotídica selecionada de (a) uma seqüência nucleotídica como especificada em qualquer uma de SEQ ID NOs 1 a 4, (b) uma seqüência nucleotídica que é capaz de hibridizar a qualquer uma de SEQ ID NOs 1 a 4 sob condições estringentes, (c) ou um fragmento de (a) ou (b).

[0063] Fragmentos de polipeptídeo da presente invenção podem ser uma variante de qualquer um dos polipeptídeos codificados por qualquer uma de SEQ ID NOs: 1 a 4 que incluem uma ou mais truncagens, substituições, deleções ou inserções onde referidos polipeptídeos provêem uma resposta antigênica similar àquela de qualquer um dos polipeptídeos codificados por SEQ ID NOs: 1 a 4. Com vantagem, estas variações podem ser feitas para a proteína de modo a aumentar a eficácia da proteína em estimular a resposta imune ou para tomá-la mais segura para uso em uma ave.

[0064] O comprimento de tal fragmento que provê uma resposta imune compreende pelo menos 6, até 15, preferivelmente 25, e mais preferivelmente 50 aminoácidos contíguos codificados por qualquer uma de SEQ ID No 1 a SEQ ID No 4. Um fragmento antigênico pode ser gerado usando, por exemplo, deleção de C-término de qualquer uma das seqüências de polinucleotídeos de SEQ ID No 1 a SEQ ID No 4 e referidas construções de deleção de C-término podem então ser inseridas no plasmídeo de expressão procariótica ou eucariótica. A atividade antigênica dos produtos de expressão derivados dos fragmentos de polinucleotídeo podem então ser testados avaliando-se a reatividade com anti-soros de galinhas infectadas naturalmente e/ou experimentalmente usando métodos de immunoblotting.

[0065] Altemativamente, uma série de peptídeos sintéticos de sobreposições especificados pela seqüência das proteínas de CAstV-3, preferivelmente a proteína de capsídeo, podería ser gerada. Estes peptídeos podem então ser reagidos com anti-soros de galinhas infectadas naturalmente ou experimentalmente usando um método de ELISA para determinar quais peptídeos são antigênicos. Adicionalmente, peptídeos sintéticos podem ser usados para imunizar camundongos, coelhos, galinhas e os anti-soros produzidos podem ser avaliados para reatividade com CAstV-3 usando testes de imunofluorescência indireta. Desta forma, peptídeos imunogênicos podem ser identificados e anti-soros de vírus específicos podem ser ehciados. Estas últimas duas abordagens descritas são particularmente vantajosas para peptídeos pequenos que contêm epitopos lineares, contínuos.

[0066] De modo apropriado, a invenção provê um pohpeptídeo de seqüência de aminoácidos onde entre 1 a 5, 1 a 10, 1 a 15, ou 1 a 20 resíduos de aminoácido são deletados, substituídos, e/ou adicionados à seqüência de aminoácido codificada pelas seqüências nucleotídicas de qualquer uma de SEQ ID NOs: 1 a 4 e onde referidos polipeptídeos estimulam uma resposta imune (isto é têm atividade antigênica).

[00671 Em formas de realização específicas,, as sequências nucleotídicas da invenção codificam um polipeptídeo dos seguintes (a) ou (b): (a) um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácido de uma SEQ ID NO: 5 (b) uma proteína compreendendo uma sequência de aminoácido quando um ou vários resíduos de aminoácidu são deletados, substituídos, e/ou adicionados à sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 5, onde referida proteína tem uma resposta antigênica similar como SEQ ID NO: 5.

[0068] Em formas de realização particulares, as sequências nucleotídicas da invenção codificam um polipeptídeo dos seguintes (a) ou (b): (a) um polipeptídeo consistindo de uma sequência de aminoácido de uma SEQ ID NO: 5 (b) uma proteína consistindo de uma sequência de aminoácido quando um ou vários resíduos de aminoácido são deletados, substituídos, e/ou adicionados à sequência de aminoácido de SEQ ID NO 5 onde referida proteína tem uma resposta antigênica similar como SEQ ID NO: 5.

[0069] Seqiiências nucleotídicas podem ser otimizadas em eódons ou de outra maneira modificadas para aumentar a eficiência de expressão dos polipeptídeos. 100701 A invenção provê, apropriadamente, polipeptídeos consistindo de uma seqüência de aminoácido SEQ ID NO 5. 10071J Soros de anticorpo policlonal podem ser produzidos através do uso de pelo menos parte de CAstV-3 para promover resposta imune, A preparação imunizante poderia ser vírus purificado de cultura celular, peptídeos sintéticos de vírus especificados, polipeptídeos produzidos por vetores de expressão etc; Plasmídeos de expressão de DNA. Após desafio repetido, partes do soro do sangue podem ser removidas e purificadas antigenicamente. Os soros semipurificados podem adicionalmente ser purificados por cromatografia, por exemplo, uma coluna de gel de sacarídeo e tampão apropriado para separar os componentes dos soros de acordo com o peso molecular.

[0072] A invenção provê, apropriadamente, anticorpos policlonais que têm especificidade de ligação para pelo menos um polipeptídeo da invenção.

[0073] A invenção provê, apropriadamente, anticorpos policlonais que têm especificidade de ligação para (a) pelo menos um seqüência de polipeptídeo codificada por uma seqüência nucleotídica de qualquer uma de SEQID NOs 1 a 4, (b) pelo menos uma seqüência de polipeptídeos compreendendo uma seqüência de aminoácido quando um ou vários resíduos de aminoácido são deletados, substituídos, e/ou adicionados à seqüência de aminoácido codificada por qualquer uma de SEQ ID NOs 1 a 4 em que referido polipeptídeo tem uma resposta antigênica similar como um polipeptídeo codificado por qualquer uma das seqüências nucleotídicas SEQ ID NO: 1 a 4, ou (c) um fragmento do polipeptídeo de (a), (b) que tem uma resposta antigênica similar como um polipeptídeo codificado por qualquer uma das seqüências nucleotídicas SEQ ID NO: 1 a 4.

[0074] A invenção provê, apropriadamente, anticorpos policlonais que têm especificidade de ligação para (a) pelo menos uma seqüência de polipeptídeo codificada por uma seqüência nucleotídica de qualquer uma de SEQ ID Nos 1 e/ou 2 e/ou 4, (b) pelo menos um polipeptídeo compreendendo uma seqüência de aminoácido quando um ou vários resíduos de aminoácido são deletados, substituídos, e/ou adicionados à seqüência de aminoácido codificada por qualquer uma de SEQ ID Nos 1 e/ou 2 e/ou 4 em que referido polipeptídeo tem uma resposta antigênica similar como um polipeptídeo codificado por qualquer uma das seqüências nucleotídicas SEQ ID NO: 1 e/ou 2 e/ou 4, ou (c) um fragmento do polipeptídeo de (a), (b) que tem uma resposta antigênica similar como um polipeptídeo codificado por qualquer uma das seqüências nucleotídicas SEQ ID NO: 1,2 ou 4.

[0075] De modo apropriado, tal anticorpo policlonal não tem especificidade de ligação para polipeptídeos codificados por SEQ ID NO: 3.

[0076] De modo preferido, a invenção provê anticorpos policlonais que têm especificidade de ligação para (a), (b), ou (c) em que (a) é pelo menos um polipeptídeo com seqüência de aminoácido SEQ ID NO 5, (b) é pelo menos um polipeptídeo compreendendo uma seqüência de aminoácido quando um ou vários resíduos de aminoácido são deletados, substituídos, e/ou adicionados à seqüência de aminoácido de SEQ ID NO 5 em que referido polipeptídeo tem uma resposta antigênica similar como SEQ ID NO 5 (c) é um fragmento do polipeptídeo de (a), (b) ou (c) que tem uma resposta antigênica similar como SEQ ID NO 5.

[0077] Anticorpos monoclonais podem ser produzidos pela técnica de hibridoma, por exemplo, imunização de um camundongo pode ser usada para gerar anticorpos monoclonais de camundongo.

[0078] A invenção provê, apropriadamente, um anticorpo monoclonal que tem especificidade de ligação para pelo menos um polipeptídeo da invenção.

[0079] A invenção provê, apropriadamente, um anticorpo monoclonal que tem especificidade de ligação para (a) pelo menos um seqüência de polipeptídeo codificada por uma seqüência nucleotídica de qualquer uma de SEQID NOs 1 a 4, (b) pelo menos um polipeptídeo compreendendo uma seqüência de aminoácido quando um ou vários resíduos de aminoácido são deletados, substituídos, e/ou adicionados à seqüência de aminoácido codificada por qualquer uma de SEQ ID NOs 1 a 4 onde referida proteína tem uma resposta antigênica similar como um polipeptídeo codificado por qualquer uma das seqüências nucleotídicas SEQ ID NO: 1 a 4, ou (c) um fragmento do polipeptídeo de (a), (b) que tem uma resposta antigênica similar como um polipeptídeo codificado por qualquer uma das seqüências nucleotídicas SEQ ID NO: 1 a 4. A invenção provê, apropriadamente, um anticorpo monoclonal que tem especificidade de ligação para (a) pelo menos uma seqüência de polipeptídeo codificada por uma seqüência nucleotídica de qualquer uma de SEQ ID Nos 1 e/ou 2 e/ou 4, (b) pelo menos um polipeptídeo compreendendo uma seqüência de aminoácido quando um ou vários resíduos de aminoácido são deletados, substituídos, e/ou adicionados à seqüência de aminoácido codificada por qualquer uma de SEQ ID Nos 1 e/ou 2 e/ou 4 em que referido polipeptídeo tem uma resposta antigênica similar como um polipeptídeo codificado por qualquer uma das seqüências nucleotídicas SEQ ID NO: 1 e/ou 2 e/ou 4, ou (c) um fragmento do polipeptídeo de (a), (b) que tem uma resposta antigênica similar como um polipeptídeo codificado por qualquer uma das seqüências nucleotídicas SEQ ID NO: 1,2 ou 4.

[0080] De modo apropriado, tal anticorpo monoclonal não tem especificidade de ligação para polipeptídeos codificados por SEQ ID NO: 3.

[0081] De modo preferido, a invenção provê um anticorpo monoclonal que tem especificidade de ligação para (a), (b), ou (c) onde (a) é um polipeptídeo com seqüência de aminoácido SEQ ID NO 5, (b) é pelo menos um polipeptídeo compreendendo uma seqüência de aminoácido quando um ou vários resíduos de aminoácido são deletados, substituídos, e/ou adicionados à seqüência de aminoácido de SEQ ID NO 5 onde referida proteína tem uma resposta antigênica similar como SEQ ID NO 5, ou (c) é um fragmento do polipeptídeo de (a), (b) ou (c) tem uma resposta antigênica similar como SEQ ID NO 5.

[0082] Imunização para prover anticorpos monoclonais pode ser realizada, por exemplo como detalhado abaixo ou pode envolver uma combinação de mais do que um desses três métodos. 1) CAstV-3 pode ser purificado de vírus cultivado em embrião ou vírus presente em fezes de aves infectadas, por exemplo fezes de galinha, e usado para imunização. 2) Camundongos podem ser imunizados com astrovírus de galinha tipo 3 recombinante, por exemplo CAstV-3, proteína produzida por expressão de seqüência de polinucleotídeos de astrovírus de galinha tipo 3 (preferivelmente uma seqüência de polinucleotídeos codificando uma proteína de capsídeo) em células de E. coli, levedura, planta ou insetos infectados com um baculovírus recombinante. 3) Camundongos podem ser imunizados com um plasmídeo de expressão de DNA capaz de expressar seqüência de polinucleotídeos de astrovírus aviário tipo 3, por exemplo uma seqüência de polinucleotídeos de CAstV-3 incluindo pelo menos uma de SEQ ID NO 1 a 4.

[0083] Como indicado acima, estas preparações podem também ser usadas para produzir anticorpos policlonais.

[0084] A presença de anticorpos para astrovírus aviário tipo 3, por exemplo CAstV- 3 nos camundongos imunizados pode ser detectada usando um teste de imunofluorescência indireta (IIF).

[0085] Células de hibridoma podem ser preparadas dos baços removidos dos camundongos imunizados e culturas celulares clonadas podem ser selecionadas para suas capacidades para secretar anticorpos específicos de vírus usando um teste de IIF.

[0086] Anticorpos produzidos em um animal tratado com uma proteína da presente invenção podem ser isolados e usados como um teste e/ou para propósitos de teste.

[0087] Em particular a invenção provê o uso de um anticorpo que tem especificidade de ligação para polipeptídeos codificados por qualquer uma de SEQID No 1 a 4 em um teste diagnóstico.

[0088] Como será apreciado pelos versados na técnica, um "anticorpo" deve ser construído como abrangendo qualquer membro de ligação ou substância tendo um domínio de ligação com a especificidade requerida. Um anticorpo pode ser natural ou parcialmente ou completamente produzido sinteticamente. O termo também abrange qualquer polipeptídeo, proteína ou peptídeo tem um domínio de ligação que é, ou é homólogo a, um domínio de ligação de anticorpo. Estes pode ser derivados de fontes naturais, ou eles podem ser parcialmente ou completamente produzidos sinteticamente. Exemplos de anticorpos são os isotipos de imunoglobulinas e suas subclasses isotípicas e fragmentos que compreendem um domínio de ligação de antígeno tal como Fab, scFv, Fv, dAb, Fd, e diacorpos.

[0089] Uma ave pode ser uma galinha, peru, pato, codomiz, gansos, avestruz, faisão, pavão da Ásia, galinha-d'angola, pombo, cisne, galinha bantam e/ou pingüim.

Tratamento [0090] Um vírus, seqüência de ácido nucleico, proteína ou anticorpo da invenção pode ser usado para modificar o sistema imune de uma ave. Esta modulação pode ser usada para tratar uma ave.

[0091] Tratamento inclui qualquer regime que pode beneficiar uma ave. O tratamento pode ocorrer em relação a uma condição existente ou pode ser proíiiático (tratamento preventivo). Tratamento pode incluir efeitos curativos, de alívio ou profiláticos.

[0092] Tratamento pode ser provido através de qualquer via apropriada, A dose precisa irá depender de uma série de fatores, por exemplo a natureza precisa do antígeno da vacina ou o uso de adjuvantes particulares.

Vacina ou composição para mediar uma resposta imune [0093] Uma vacina ou composição para mediar uma resposta imune da presente invenção pode compreender vírus vivo, vírus vivo atenuado ou CAstV-3 inativado. De modo apropriado, uma vacina da presente invenção pode compreender derivados imunogênicos e/ou pelo menos parte de CAstV-3, incluindo, por exemplo, subunidades antigênicas, vetores aptos para expressar sequências nucleotídicas da invenção, incluindo sequências nucleotídicas de CAstV-3 ,SEQ ID NO 1 a 4, por exemplo uma vacina de DMA codificando um polipeptídeo da invenção, por exemplo uma proteína de capsídeo de CAstV-3 (SEQ ID NO 5), astrovírus de galinha tipo 3 recombinante, vacinas de peptídeo sintético, ou semelhantes.

[0094] De modo apropriado, para inativar o vírus, um agente de inativação químico padrão, tal como reagente de aldeído incluindo forma li na, acetaldeído e semelhantes, pode ser usado. Aítemativamente, irradiação (por exemplo, ultravioleta ou radiação gama) do vírus pode ser usada ou o vírus pode ser repetidamente cultivado em cultura celular de origem não aviária tal que sua capacidade para reproduzir virulcntamente é perdida.

[0095] Uma vacina da presente invenção pode ser usada em aves para imunização contra depressão de crescimento.

[0096] Derivados de polipeptídeos da presente invenção podem ser usados para mediar a resposta imune. Polipeptídeüs da invenção podem ser apropriadamente ligados a um parceiro de copulaçâo, por exemplo uma molécula efetuadora, um rótulo, um fármaco, uma toxina e/ou urn veículo ou molécula de transporte. Técnicas para copular os polipeptídeos da invenção a ambos os parceiros de copulaçâo de peptidila e não peptidila são bem conhecidos na técnica.

[0097] De modo apropriado, a vacina pode compreender um veículo farmacêutico ou diluente, por exemplo solução salina fisiológica, propileno glicol e semelhantes.

[0098] De modo apropriado, a vacina pode compreender um adjuvante, por exemplo, adjuvante incompleto de Freund. Método de vacinação [00991 A vacina pode ser distribuída oralmente, parenieralmente, intranasalmente ou intravenosamente. A dosagem de uma vacina provida irá tipicamente levar em conta a idade e/ou peso e/ou condição física da ave.

[00100] De inodo apropriado, a vacina pode ser provida em água potável, pulverizador ou como um aerossol, para vacinação em massa de aves domésticas tais como, mas não limitadas a galinhas e perus.

[00101] Em uma forma de realização, uma vacina pode ser preparada como uma vacina viva, que será administrada através de água potável ou por um pulverizador. Tal vacina pode ser não atenuada, uma vez que é provável que infecções dos pássaros reprodutores em crescimento (digamos 10 semanas e mais velhos) não resultará em efeitos patogênicos, (Infecções de pintos muito novos (por exemplo 0-3 semanas) serão provavelmente patogênicas.) [00102] Em uma segunda forma de realização, uma vacina pode ser preparada como um vírus atenuado que pode ser produzida cultivando-se os vírus em embriões ou cultura celular. Tal vacina atenuada podería também ser dada por água potável ou pulverizador. Também é possível que um vírus de CAstV-3 atenuado ou não atenuado podería ser dado por inoculação (por exemplo, via subcutânea).

[00103] Em uma terceira forma de realização, uma vacina pode ser preparada como um vírus morto ou inativado. Vírus inativado (morto) pode ser administrado por inoculação. O adjuvante usado com vírus inativado provavelmente será importante a fim de maximizar a resposta imune elicitada.

[00104] Em uma quarta forma de realização, uma vacina pode ser preparada como uma vacina de subunidade recombinante. Esta abordagem pode ser adotada, por exemplo, se vacinas vivas não forem eficazes e se vacinas inativadas forem de produção muito cara. Uma vacina de subunidade recombinante pode ser baseada em expressão de proteína de capsídeo em células de E. coli, levedura, planta ou insetos infectados por um baculovírus recombinante. Em tal forma de realização, pelo menos parte de CAstV-3 pode ser usada para preparar a vacina, por exemplo uma proteína (preferivelmente uma proteína estrutural) de CAstV-3 pode ser usada. Tal proteína pode ser produzida por metodologias de expressão de DNA recombinante ou por cultivo do vírus.

[00105] De modo apropriado, a vacina para astro vírus aviário tipo 3, por exemplo CAstV-3, pode ainda compreender antígenos de outros agentes, por exemplo outros vírus de aves, mais especificamente de galinha, como parte de uma vacina de combinação. Método de teste [00106] Em formas de realização particulares, um teste da invenção compreende as etapas: - prover uma amostra de uma ave, - levar ao contato com a amostra um anticorpo capaz de ligar especificadamente a pelo menos parte de astro vírus de galinha tipo 3 (CAstV- 3), - detectar ligação do anticorpo a CAstV-3 na amostra onde a ligação do anticorpo a astrovírus de galinha tipo 3 na amostra é indicativo da presença de CAstV-3, na ave.

[00107] De modo apropriado, o anticorpo capaz de ligar especificadamente a astrovírus de galinha tipo 3 é capaz de ligar um polipeptídeo codificado por SEQ ID NOs 1 a 4, mais preferivelmente um polipeptídeo codificado por SEQ ID NOs 1 ,2 ou 4, mais preferivelmente um polipeptídeo com uma seqüência de aminoácido SEQ ID NO 5 ou pelo menos parte do polipeptídeo de SEQ ID NO 5 que é antigênica.

[00108] Em formas de realização alternativas, um teste da invenção compreende as etapas: - levar ao contato com a amostra pelo menos parte de astrovírus de galinha tipo 3, - detectar a presença ou ausência de ligação de pelo menos parte de astrovírus de galinha tipo 3 para um anticorpo na amostra, em que a ligação de, pelo menos, parte do astrovírus de galinha tipo 3 isolado a um anticorpo é indicativa da presença de anticorpos para astrovírus de galinha tipo 3 na ave.

[00109] Em outras formas de realização alternativas, um teste da invenção compreende as etapas: (i) prover material genético, e (ii) testar o material genético para detectar qualquer material genético de astrovírus de galinha tipo 3.

[00110] De modo apropriado, o material genético é de uma ave e pode ser RNA de uma ave, por exemplo uma galinha.

[00111] De modo apropriado, o material genético pode ser tomado de penas, ovos, sangue, fezes, intestinos, e conteúdo intestinal, tecido ou semelhantes de uma ave.

[00112] Uma série de kit comerciais estão disponíveis para extrair RNA de amostras de tecido. Estes são bem conhecidos por aqueles versados na arte.

[00113] A pessoa versada estará ciente de uma faixa de método de detecção para detectar material genético em amostras.

[00114] De modo apropriado, o método envolve o uso de uma reação de PCR (RT-PCR) de transcrição reversa. Em uma forma de realização particularmente preferida o método de detecção compreende as etapas (i) prover iniciadores dianteiro e reverso para uma polimerase de ácido nucleico, cujos iniciadores são capazes de ligar especificadamente a uma seqüência de polinucleotídeos de astro vírus de galinha tipo 3; (ii) amplificar seqüência de polinucleotídeos entre os iniciadores; (iii) detectar seqüência de polinucleotídeos amplificada; em que a detecção de múltiplas cópias de seqüência de polinucleotídeos amplificada na amostra é indicativa da presença de astrovírus de galinha tipo 3 na amostra.

[00115] A base deste teste é que um produto de cDNA positivo será produzido se as duas seqüências de iniciadores pequenos acharem correspondências de seqüência exatas ou muito próximas no RNA extraído das amostras de teste.

[00116] Iniciadores dianteiro e reverso para uma polimerase de ácido nucleico apropriado para uso na invenção podem ser selecionados dentre qualquer uma das seqüências apropriadas de dentro do genoma de CAstV-3. O versado irá notar os fatores requeridos a serem levados em conta quando projetanto iniciadores apropriados por exemplo, o uso de comparações de seqüência para determinar regiões conservadas de seqüência em que os iniciadores dianteiro e reverso podem ser projetados.

[00117] De modo apropriado, os iniciadores podem ter as seqüências [00118] Dianteiro: 5' - AGC CTC AAA GTA TAA GAC GCA G-3' SEQID No 6.

[00119] Reverso: 5' - CCA TGC TAT TTC AAA GGT GGT T-3V SEQ ID NO 7.

[00120] Com vantagem usando tais iniciadores, provê-se um teste entre 10, preferivelmente 20, mais preferivelmente 30 e o mais preferivelmente 100 vezes mais sensível do que um método usando detecção por imunofluorescência indireta de antígeno viral produzido por inoculação de células primárias de fígado de embrião de pinto com amostras contendo vírus.

[00121] De modo preferido, o método de teste provê informação quantitativa sobre a quantidade de vírus presente na amostra.

[00122] Com vantagem, os iniciadores podem ser rotulados fluorescentemente e o teste compreende a nova etapa de determinar se os iniciadores foram ligados à seqüência de polinucleotídeos determinando-se as emissões fluorescentes do iniciador.

[00123] De modo apropriado, rótulos fluorescentes estão dentro do conhecimento geral comum de pessoas versadas.

[00124] De modo preferido, o método de teste da invenção é específico para astrovírus de galinha tipo 3 como depositado sob Número de Acesso CNCM 1-3541 junto ao CNCM, lnstitut Pasteur em 15 de Dezembro de 2005.

[00125] Qualquer amostra apropriada pode ser usada em um teste da presente invenção, por exemplo, uma amostra de uma ave, por exemplo de uma galinha pode ser usada e um tecido onde o vírus replica, por exemplo, intestino pode ser usado. Altemativamente, a amostra pode ser sangue ou fezes.

[00126J De modo preferido, uma amostra para diagnose pode ser selecionada dentre fezes, conteúdos intestinais ou esfregaço fecal.

[00127] De modo apropriado, quando a amostra é de fezes e/ou de conteúdos intestinais, suspensões de vírus em bruto são preparadas como 10% de homogenados em solução salina tamponada com fosfato (PBS). Estas podem ser clarificadas usando 3000g durante 30 minutos e uma alíquota (por exemplo 200 microlitros) de extrato clarificado é extraída. Com esfregaços, suspensões em l -2ml PBS podem ser feitas e clarificadas como acima antes da extração.

Kit diagnóstico [00128] Em exemplos particulares de kits de teste diagnóstico, providos pela invenção, para a detecção de astrovírus de galinha tipo 3 em amostras de aves suspeitas de estarem infectadas com o vírus, o kit de teste compreende pelo menos parle de astrovírus de galinha tipo 3. uma sequência nudeotídíca da invenção, um polipeptídeo da invenção, um anticorpo policlonal da invenção ou um anticorpo monoclonal da invenção.

[00129] Pelo menos uma parte do astrovírus de galinha tipo 3, sequência nucleotídica da invenção, polipeptídeo da invenção, anticorpo policlonal da invenção ou anticorpo monoclonal da invenção pode ser ligada a um substrato, de modo que uma amostra de teste pode ser colocada em ou lavada sobre pelo menos parte do astrovírus de galinha tipo 3, sequência nucleotídica da invenção, polipeptídeo da invenção, anticorpo policlonal da invenção ou anticorpo monoclonal da invenção.

[00130] Em exemplos específicos, um kit de teste diagnóstico da invenção para a detecção de astrovírus de galinha tipo 3 em amostras de aves suspeitos de estarem infectadas com o vírus compreende anticorpos com especificidade de ligação para pelo menos parte de astrovírus de galinha tipo 3. De modo apropriado, os anticorpos pode ser ligados a um substrato tal que uma amostra de teste pode ser colocada sobre ou lavada sobre os anticorpos ligados.

[00131] De modo apropriado, os anticorpos têm especificidade de ligação para polipeptídeos codificados por qualquer uma de SEQ ID NOs: 1 a 4. Em uma forma de realização particular os anticorpos têm uma especificidade de ligação para um polipeptídeo com uma seqüência de aminoácido SEQ ID NO: 5.

[00132] Em outro exemplo, um kit de teste diagnóstico da invenção para a detecção de astrovírus de galinha tipo 3 em amostras de aves suspeitas de estarem infectadas com o vírus compreende uma sonda de ácido nucleico capaz de hibridizar a qualquer uma de SEQ ID NOs 1 a 4.

[00133] Em exemplos particulares, provê-se uma sonda de ácido nucleico capaz de hibridizar a qualquer uma de SEQ ID NOs 1,2 ou 4.

[00134] Em uma forma de realização, uma sonda pode ser uma seqüência de ácido nucleico e a hibridização de referida sonda para uma seqüência nucleotídica na amostra pode ser detectada por hibridização em dot blot.

[00135] De modo apropriado, a sonda pode ser um conjunto de iniciador.

[00136] Quando se usa um conjunto de iniciador, referido conjunto de iniciador pode ser usado para amplificar uma seqüência selecionada através de RT- PCR se uma seqüência nucleotídica particular estiver presente em uma amostra.

[00137] Em exemplos particularmente preferidos, um conjunto de iniciador pode ser selecionado dentre: [00138] Dianteiro: 5' - AGC CTC AAA GTA TAA GAC GCA G-3' SEQ ID No 6.

[00139] Reverso: 5' - CCA TGC TAT TTC AAA GGT GGT T-3V SEQ ID NO 7.

[00140] De modo preferido, o kit de teste é específico para astrovírus de galinha tipo 3 como depositado sob Número de Acesso CNCM 1-3541 junto ao CNCM, Instituí Pasteur em 15 de Dezembro de 2005. 1001411 De modo apropriado, o vírus, sequências nucleotídícas, sequências de polipeptídeos, moduladores do sistema imune, vacinas e kits da presente invenção podem ser usados em relação a aves, mais preferivelmente quaisquer pássaros que são produzidos comercialmente, mais preferivelmente aves domésticas tais como galinhas, perus, patos, gansos, faisões, pombos, galinha-d'angola, ainda mais preferivelmente galinhas.

Definições 1001421 Como usado aqui, o termo "isolado" refere-se a uma preparação, isolamento e/ou purificação in vitro de um peptídeo, polipeptídeo, proteína, anticorpo, vírus ou molécula de ácido nucleico da invenção, de modo que não estejam associados com substâncias in vivo ou sejam substancial mente purificados a partir de substâncias in vivo. 1001431 Como usado aqui, o termo "aerossol" inclui sólido dividido finamente ou partículas líquidas que podem ser criadas usando um sistema pressurizado tal como um nebulizador, 1001441 Como usado aqui, os termos "ácido nucleico" ou "sequência nucleotídica" inclui DNA genômico, cDNA ou RNA. 1001451 A invenção descrita aqui será exemplificada agora com referência aos seguintes exemplos não limitativos e figuras. Outras formas de realização desta invenção serão evidentes para os versados na técnica tendo em vista a presente descrição* [00146] Figura 1 mostra comparação de identidade de aminoáeido aos pares de ELVs e astrovírus aviários;

[00147] Figura 2 mostra análise filogenética de sequências de astrovírus de humano, galinha e peru: e [00148] Figura 3 mostra eletroforese em gel agarose de resultados de RT-PCR obtidos com amostras de intestino de pintos de um dia, em que o produto de RT-PCR é 187bp.

Infecção frangos novos com CAstV-3 [00149] Investigações de campo experimentais e preliminares sugerem que infecções com o CastV-3 estão associadas com retardo de crescimento ou depressão de crescimento em frangos novos.

[00150] Depressão de crescimento é uma característica de estados de doença incluindo retardo no desenvolvimento em que as aves novas deixam de crescer em unia faixa esperada. Isso pode ser transiente durante dias, após o que os pássaros afetados irão crescer normal mente e "alcançar" as aves de sua ninhada não afetadas. Altemativamente, as aves podem permanecer relativamente pequenas ("raquíticas") e retardar seu desenvolvimento com relação ao resto das aves de sua ninhada não afetadas. Deste modo, o lote como um todo podería ser descrito como demonstrando "crescimento irregular".

[00151] Experimentalmente, foi demonstrado que a inoculação oral de pintos de 1 dia de idade livres de patógenos específicos (SPF) com astro vírus de galinha 3 resultou em uma depressão de 17% no crescimento durante um período de 14 dias. Mudanças histológicas foram observadas no intestino, rim e pâncreas indicando que este vírus replicou no intestino mas adicionalmente apresentou a capacidade de se espalhar além do trato intestinal. Antígeno viral foi detectado em uma vasta faixa de tecidos. É sugerido que a depressão de crescimento observada pode ter sido devido aos efeitos combinados tanto no intestino como nos outros órgãos, por exemplo pâncreas. 100152] Evidência obtida com a investigação envolvida de campo de amostras clínicas de lotes demonstrando "crescimento irregular", que mostraram que os conteúdos intestinais de algumas galinhas afetadas clinicamente contém grandes números de vírus de tipo enterovírus (ELV), incluindo CAstV-3, juntos com rota vírus e reovírus. Reconhece-se que astrovíms de galinha tipo 3 podem estar contribuindo para o problema clínico. Em adição, infecção oral de pintos de 1 dia SPF com um inóculo preparado a partir dos conteúdos intestinais de uma galinha doente de um lote demonstrando crescimento irregular resultou em aproximadamente depressão de crescimento de 30% em 5 semanas após infecção. Teste sorológico mostrou que as galinhas inoculadas se tornaram soroconvertidas para CAstV-3 e outro ELV imunologicamente distinto identificado previamente, Esta descoberta indicou que o inóculo continha CAstV-3 e sugeriu que este vírus pode estar contribuindo para o retardo do crescimento.

[00153] É provável que os efeitos patogênicos causados por infecções com vírus entéricos tais como CAstV-3 serão mais severos em galinhas mais novas e em galinhas sem anticorpos materno aos vírus infectantes.

[00154] Reconhece-se que a presença de anticorpo materno não pode prevenir infecções do trato intestinal da galinha devido à ausência de anticorpo neste sítio, mas pode prevenir ou reduzir a disseminação da infecção para além do intestino.

Infecção de embrião com CAstV-3 [00155] Evidência para transmissão pelo embrião de CAstV-3 foi observada em trabalho recente realizado pelos inventores, que demonstraram a presença de vírus em tecido de intestino preparado de pintos de um dia obtidos de vários lotes reprodutores. Teste sorológico mostrou que a maioria de lotes de aves reprodutoras apresentou soroconversão parcial para astrovírus de galinha tipo 3 quando testados em 22 semanas (pouco antes de entrarem em postura). Tomados juntos, estes resultados apoiam a consideração de que muitas aves reprodutoras tornam-se infectadas durante a postura e, que, como uma conseqüência, são capazes de transmitir CAstV-3 a seus embriões e pintos da progênie.

[00156] Inoculaçao de embriões de 6 ou 7 dias de vida com isolados de CAstV-3 incluindo FP3, causou a morte de embrião, nanismo e necrose de fígado e pele em embriões e reduziu a capacidade de eclodir. Consequentemente, no campo, as infecções com CAstV-3 tem o potencial para danificar o embrião em desenvolvimento e causar uma reduzida capacidade de eclodir.

[00157] Independente do fato de que CAstV-3 causa problemas de doença para o embrião, é provável que o vírus transmitido verticalmente irá colocar uma ameaça ao pinto recém nascido, particularmente uma vez que esses pintos não terão anticorpo maternalmente derivado para o vírus. Replicação vira! pode causar efeitos patogênicos para esses pintos infectados diretamente. Vírus excretados por esses pássaros, frequentemente nos primeiros dias, irão, por sua vez, infectar horizontalmente as aves da ninhada que terão anticorpo materno (se o ovo foi produzido por uma ave reproduiora positi va para o anticorpo, infectada previamente), ou não têm anticorpo materno (se o ovo foi produzido de uma ave reprodutora negativa para o anticorpo, não infectada). O efeito protetor de anticorpo materno é provável para conduzir à variação nos efeitos patogênicos observados e crescimento irregular dentro do lote de frangos de corte pode ser observado.

Isolamento e caracterização preliminar do agente infeccioso [00158] Usando o método de inoculação de embrião de pinto, uma série de tentativas bem sucedidas foi realizada para isolar agente infecciosos de pintos de 1 dia debilitados de lotes exibindo capacidade reduzida de eclodir e maiores proporções de pintos debilitados. O seguinte é um exemplo deste fato: [00159] Pintos debilitados de avaliação de amostra '11672" foram homogeneizados como pintos completos e inoculados em embriões de 7 dias de idade através do saco embrionário. Não foram registradas mortes dos embriões após 10 dias de incubação , mas os embriões foram menores do que os controles. Amostras de fluido alantóico dos ovos foram processadas e examinadas por EM, mas não foram vistas partículas virais. Os fígados desses embriões foram agrupados, homogeneizados e re- inoculados pela via de saco embrionário (Ia passagem) nos ovos de sete dias de idade. Com estas amostras, mortes de embriões foram registradas entre 9 e 12 dias após inoculação. Os embriões foram impedidos de crescer, comparados aos controles, e lesões brancas (áreas de necrose) foram vistas em volta das margens dos lóbulos do fígado. Nesses ovos, o fluido alantóico teve uma cor verde distinta, e ele foi coletado e armazenado (-70 oC). Exame de EM falhou em revelar qualquer evidência de partículas virais.

[00160] Fígados foram removidos dos embriões mortos, agrupados, homogeneizados e examinados por microscopia eletrônica mas não foram vistas partículas de vírus. O fígado agrupado foi inoculado novamente nos ovos de sete dias de idade (2a passagem), e todos os embriões morreram com mortes registradas a partir do dia 4 após a inoculação. Os embriões foram impedidos de crescer e como antes o fluido alantóico apresentou uma cor verde distinta. Fígados e rins foram removidos dos embriões mortos e seções de cryostat cortadas. As seções de fígado foram coloridas por imunofluorescência para vírus de bronquite infecciosa, mas nenhuma fluorescência positiva foi observada. Seções de cryostat de fígado e rim foram retidas para colorir com anti-soros adicionais em uma data posterior. As lesões necróticas brancas foram vistas nos fígados de um conjunto de amostras, e alguma parte deste material foi processada por EM de seção fina, mas não foi vista evidência de replicação viral. Fígados com lesões necróticas foram homogeneizados e receberam passagens de 2 x 7 dias em células primárias de fígado de embrião de pinto. Não foi observado qualquer CPE viral, mas as lâminas foram fixadas e armazenadas a -20 oC de modo a aguardar coloração fluorescente quando um conjugado toma-se disponível.

[00161] O material da 2o passagem foi submetido a passagem adicional em embrião de pintos como resumido abaixo. O homogenado de fígado agrupado foi novamente inoculado pelo saco embrionário, esta vez nos embriões SPF de 7 dias de vida (3a passagem). Mortes de embriões foram registradas de dia 7 a 11 após inoculação, e embriões estavam raquíticos com lesões necróticas grossas no fígado e pele. Amostras de fígado afetado foram fixadas e armazenadas para exame histopatológico e os fígados restantes dos embriões mortos foram agrupados juntos e homogeneizados. Fluidos alantóicos foram coletados separadamente e também agrupados. O fluido alantóico foi inoculado (4a passagem) por inoculação de saco embrionário nos embriões de 7 dias de idade, resultando em mortes de embriões entre 7 e 10 dias após inoculação. Fluidos alantóicos e fígados foram agrupados e usados para infectar embriões SPF de 7 dias de idade (5a passagem). Os embriões foram coletados, homogeneizados e armazenados a -70 oC. Este homogenado é referido aqui como o homogenado de embrião de Ia passagem de vírus 11672 (lp EH).

[00162] Estudos de concentração e purificação foram realizados com os homogenados derivados de passagem de 11672 em amostras em embriões.

[00163] O homogenado de embriões completos foi preparado após inoculação dos embriões com 11672 (lp EH), em uma tentativa para identificar o agente responsável para a mortalidade de embrião. Doze ovos SPF VALO de 7 dias de vida foram inoculados e embriões impedidos de crescer e AF verde coletados após incubação de 7 dias. Diferentes materiais de partida foram usados para purificação. Estes foram fluido alantóico, tubos, fígados esverdeados e embriões completos. Uma purificação similar foi usada em cada caso. Isto envolveu 3 etapas: (1) Clarificação a 3000 rpm por 20 min, (2) Ultracentrifugação em velocidade baixa a 10.000 rpm durante 30 min, (3) Ultracentrifugação em velocidade elevada a 30.000 rpm por 3-4 horas. Centrifugações a 10.000 rpm e 30.000 rpm foram realizadas em uma ultracentrífuga Beckman (rotor de ângulo fixo tipo 35).

[00164] Com as preparações de fígado e de embrião completo, uma etapa adicional foi usada. Isso envolveu colocar em suspensão novamente o grânulo em velocidade elevada, tratar ou não tratar a suspensão com o detergente dodecil sulfato de sódio (SDS) e sedimentar através de almofadas de sacarose a 25% usando um rotor oscilante Beckman de 6 x 14 ml centrifugados a 32. 000 rpm durante 3-4 horas Esta etapa foi incluída porque os grânulos em velocidade elevada eram espessos e gelatinosos e provavelmente contendo altos níveis de contaminação derivada de embrião que tomaria a visualização de partículas virais muito difícil. Todas as amostras de material obtidas das preparações acima foram negativas por EM de contraste negativo e por EM imune usando anti-soro de convalescente.

[00165] Para melhor definir se a infectividade estava concentrada em um ou mais estágios do processo de purificação, um homogenado de embriões completos com retardo do desenvolvimento, do material de passagem lp EH foi tratado usando etapas 1 ,2 e 3 acima, com material sendo coletado após cada etapa de centrifugação para inoculação nos embriões SPF de 7 dias de idade. Todas as preparações produziram ananismo ou morte durante incubação de 7 dias, indicando que a infectividade estava presente em todos os estágios do processo de purificação, incluindo o grânulo de alta velocidade. Este resultado indicou que alguns víms infecciosos permanecerem em associação com material celular em que a infectividade foi peletizada pela etapa de centrifugação a 10.000 rpm (Tabela 1). Alguns vírus infecciosos permaneceram na fração solúvel de sobrenadante de 10.000 rpm e foram peletizados em centrifugação a 30000rpm. A detecção de alguma infectividade no sobrenadante de 30000rpm sugeriu que vírus 11672 pode ser pequeno. Entretanto, usando inoculação de embrião para mostrar infectividade viral desta forma é um método relativamente bruto. Sem titular a infectividade viral é difícil avaliar quais proporções de infectividade estavam presentes em cada fração.

Tabela 1 : Padrão de mortes de embriões após inoculação de frações de centrifugacão diferencial.

[00166] 10 ovos foram inoculados com cada fração.

[00167] Frações de grânulos foram diluídas 1 :60 para chegar a um efeito de concentração [00168] Embriões permanecendo vivos no dia 12 p.i. foram mortos e examinados.

[00169] Para determinar se o agente infeccioso era sensível a clorofórmio, isto é se o agente viral foi envelopado (sensível ao tratamento com clorofórmio) ou não envelopado (resistente a clorofórmio), o homogenado de embrião de vírus 11672 (2p EH) foi tratado com clorofórmio, então inoculado nos embriões de 7 dias de idade. Morte de embrião e retardo do desenvolvimento foram registrados em ambas as preparações, tratadas e não tratadas, indicando que o agente infeccioso não foi envelopado.

[00170] O homogenado de embrião de vírus 11672 (2p EH) foi diluído de 10-1 a 10-5 e cada diluição foi inoculada nos embriões de 7 dias de idade. Retardo do crescimento e mortes de embriões foram registrados até a diluição de 10-4 (Tabela 2), Como esperado, os efeitos mais severos nos embriões, em termos de número de mortes prematuras e ananísmo, foram vistos com a maior concentração de vírus (isto é, não diluída e diluições de 10-1). Ocorreram algumas mortes em diluições de 10-2 e 10-3, e nenhuma em diluição de 10-4. Mudanças tais como ananismo e necrose de fígado em embriões ainda vivos no dia 11 após inoculação indicaram que vírus infecciosos ainda estavam presente nestas diluições. Uma titulação de infectividade estimada de doses infecciosas 104 de embrião fornece uma explicação para o insucesso até agora de ver as partículas virais por EM, uma vez que uma titulação de partícula viral de >105 ou até >106 é frequentemente declarada como sendo requerida a fim de ver partículas em EM.

Tabela 2: Padrão de mortes de embriões seguindo inoculação de doses infecciosas diferentes de vírus 11672. __________________________________ [001711 8 ovos foram inoculados para cada diluição.

[00172] Todos os ovos mortos no dia 7 apresentaram desenvolvimento retardado, hemorragia e necrose de fígado.

[00173] Embriões restantes no dia 11 foram mortos e examinados.

[00174] O efeito de infecção de embrião com vírus 11672 em capacidade de eclodir foi investigado em um novo experimento. O homogenado de embrião de vírus 11672 (2p EH) foi inoculado nos embriões de 7 dias de idade, em 3 diluições (10-3, 10-4, 10-5), com 30 embriões para cada diluição. 24 embriões foram deixados sem inocular como controle. Todos os embriões que morreram do dia 8 após inoculação foram verificados. Todos eram muito pequenos comparados aos controles, com evidência de hemorragia e necrose do fígado. Além disso, 8 ovos de cada diluição foram abertos no dia 12 após inoculação e os embriões examinados, com resultados como a seguir: diluição de 10'3: 4/8 embriões eram pequenos comparados aos controles, 3/8 apresentaram desenvolvimento muito retardado, com necrose óbvia do fígado, 1/8 era normais. diluição de IO'4: 3/8 desenvolvimento muito retardado, 2 destes com necrose de fígado; 5/8 normais. diluição de 105: 8/8 normais.

[00175] Os ovos sobrevivendo no dia 13 após inoculação foram transferidos para uma incubadora e deixados eclodir.

Tabela 3: Efeito de titulação de vírus 11672 em capacidade de eclodir [00176] Todos pintos, que eelodiram, estavam muito fracos, e levaram um tempo longo para sair do ovo.

[00177] Todas as inoculações de embriões até agora tinham usado a via do saco embrionário de inoculação, e as mortes de embriões e retardo do desenvolvimento tinham sido uma descoberta consistente, A via de inoculação na membrana clorioalantóica (CAM) foi bem sucedida em alguns estudos virais, porque, se o agente cresce na CAM ou pode ser pode ser adaptado para crescer na CAM, a maior concentração de vírus pode resultar, tomando a identificação mais fácil. Também, no passando, as seções de cryostat de CAM infectada, foram usadas para estudos de sorología usando imunofluorescência indireta. Além disso, CAMs de ovos infectados são normalmente coletadas em 4 dias após inoculação, que encurta o procedimento de isolamento {até 12 dias após a inoculação de saco embrionário). O vírus 11672 (lp EH) foi assim inoculado nas CAMs de embriões de 9 dias de vida, e coletado 4 dias depois. Focos brancos e algum espessamento de CAM foram observados, indicando crescimento viral. Áreas espessadas da CAM foram congeladas e as seções de cryostat cortadas para coloração imunofluorescente. As áreas afetadas foram excisadas, homogeneizadas e re-ínoculadas nas CAMs de embriões de 9 dias de vida. Novamente, o espessamento das CAMs ínoculadas foi evidente.. O material agora foi passado 4 vezes por inoculação de CAM, Nenhum vírus foi observado quando preparações de CAM foram examinadas por EM, sugerindo que a produção viral foi baixa.

Caracterização antigêniea de agente infeccioso [00178] 0,1 ml de homogenado de embrião completo com vírus 11672 foi ínoculado oralmente e íntramuscularmente em 12 x pintos de 1 dia SPF de 1 em um isolador. Os pássaros foram reforçados com uma segunda inoculação oral em 6 semanas de idade, então sangrados e sacrificados 2 semanas mais tarde, Não foram vistos sinais clínicos óbvios nos pássaros inoculados em todo este período. O soro dos pássaros foi coletado, agrupado e armazenado a -20 oC (Anti-soro 1), Um segundo lote de aves de 1 dia foi inoculado Íntramuscularmente e sangrado após 5 semanas. O soro foi coletado, agrupado e armazenado a -20 oC, como antes (Anti-soro 2).

[001791 O homogenado de embrião de vírus 11672 (2p EH) foi inoculado dentro das culturas celulares de fígado de embrião de pinto SPF em frascos de plástico de 25cm2. Nenhum efeito citopático de tipo viral (CPE) foi observado após incubação de 7 dias quando então as células foram raspadas do frasco, recolocadas em suspensão e re-inoculadas dentro das culturas frescas (segunda passagem). Nenhum CPE foi observado após a segunda passagem, ou após uma terceira passagem em culturas CEL, como acima.

[00180J O homogenado de embrião de vírus 11672 (2p EH) foi ínoculado com não diluído e em diluição 1/10, em culturas celulares de fígado de embrião de pinto SPF (CEL) crescendo em lâminas circulares de 13mm, e incubado a 30oC durante 48 horas. As lâminas foram então fixadas em acetona por 10 minutos, secadas ao ar e coloridas com anti-soro 1 (acima) durante 1 hora a 37 oC. Após lavagem em várias trocas de PBS, as lâminas foram novamente coloridas com um conjugado anti-galinha FITC durante 1 hora, lavadas, montadas em glicerol tamponado e examinadas sob iluminação U.V. Em ambas as diluições de inóculo, imunofluorescência positiva foi observada em células únicas. A imunofluorescência foi citoplásmica, e frequentemente granular na natureza. Este resultado mostrou que vírus passado em embrião foi capaz de sofrer replicação parcial em células CEL, mas esta replicação não resultou em CPE.

[00181] Imunofluorescência indireta (MF), realizada com Anti-soro 1, foi também bem sucedida em detectar antígeno viral em seções de cryostat de rins embriônicos e CAM de ovos infectados com vírus 11672. Isso confirmou que o espessamento/ pústulas detectados em CAMs foram associados com o vírus e também identificados como um sítio possível (isto é rim) de replicação do vírus nos embriões de pintos experimentalmente inoculados.

[00182] Teste exploratório por MF mostrou que culturas em lâmina CEL coloridas de Anti-soro 1 que foram infectadas com Vírus de FP3, um vírus como enterovírus (ELV) que foi isolado de pintos mortos na casca nos anos 80. Além disso, Anti-soro cultivado para FP3 em pesquisas anteriores (McNulty, M.S., Connor, T.J., McNeilly, F. and McFerran J.B., (1991) Biological characterization of na avian enteroviruses and anterovirus-like viroses Avian Pathology, 19, 75-87) foi mostrado para reagir por MF com culturas em lâminas CEL infectadas com vírus 11672. Testes de neutralização cruzada ainda não foram realizados.

[00183] Com base nos resultados de MF, foi concluído que vírus 11672 é um vírus como entero vírus (ELV), que é antigenicamente relacionado com o vírus FP3. Apesar de que o teste de IIF detectará vírus que compartilham um antígeno de lote comum, ele não consegue distinguir vírus de serotipos diferentes.

Caracterização de sequência nucleotfdica de vírus 11672 como novo astrovírus de galinha Estudos de sequência nucleotfdica de isolado 11672 [00184] As seguintes sequências de iniciador foram obtidas para permitir a amplificação de sequência de gene de RN A polímerase de astrovírus por RT-PCR

AstPol -1F 5V-GAYTGGACNMGNTAYGAYGGNAC.NATNCC - SEQID NO 8 AstPol -1R 5' - YTTN ACCC AC ATN CCR A A - SEQ ID NO 9 [00185] Em que Y = CouT;M = AouC;R = AouGeN = deoxinosína (I) [00186] RT-PCR de uma etapa foi efetuado usando pérolas Ready-To-GO RT-PCR de Amersham Pharmacia, [00187] Seq ID No. 1 e Seq ID No. 2 são as sequências de nucleotídeos (nt) que são específicas para o astrovírus de galinha tipo 3 (CAstV-3) (isolado 11672). Este é o 391 nt que é flanqueado pelos iniciadores degenerados projetados para amplificar seqüências de astrovírus na região de gene RNA polímerase. As seqüências de 2 clones são mostradas. Estas diferem em 4 posições de nt (99,0% de identidade de nt) [00188] A seqüência nt da região correspondente de 1 clone de isolado FP3 é também mostrada como Seq ID No. 3. Esta difere do clone 1 de vírus 11672 em 20 posições de nt (94,9% de identidade de nt).

[00189] As buscas Blast indicam que a região de nt 391 compartilha 65% de identidade de nt com astro vírus de peru tipo 1 (GenBank Número de Acesso: Y15936), 61% de identidade de nt com vírus de nefrite aviária (GenBank Número de Acesso: AB033998) e 60% de identidade de nt com astrovírus humano tipo 1 (GenBank Número de Acesso: Z25771).

[00190] As ID de seqüências de 11672 e FP3 Nos 1 , 2 e 3 acima referidas.

Seq ID No. 1 11672 Clone 1 CCTCAAAGTATAAGACGCAGGAAAACAAGGAGCTGTTTGATTGGT

ACACCAAAAACCTTTTGGAGAAGGTGATATTGTTACCTACTGGGG

AAGTGTGCCAAATAAAGCGAGGAAATCCTTCAGGGCAATTTTCTA

CCACCGTGGATAACAACATGTGCAACGTATGGTTAACCACCTTTGA

AATAGCATGGCTCCACCGCAAACAACGGGGCAGACTACCAACCCC

AGCTGAATTGCGTGAAAACGTTTGTTATATTTGCTACGGTGATGAC

AGGCTCTTATCAGTTTCGAGAGACTTTGTCATTTATGAGCCTGAAA

CTGTGGTAGCAATGT ACGCAGATGTA

Seq ID No. 2 11672 Clone 2 AAAACCCTTGTTTTGGCGCATTAGGCAGATTCGGTTTTTCTTTTTAG

CCTCAAAGTATAAGACGCAGGAAAACAAGGAGCTGTTTGATTGGT

ACACCAAAAACCTTTTGGAGAAGGTGATATTGTTACCTACTGGGG

AAGTGTGCCAAATAAAGCGAGGAAATCCTTCAGGGCAACTTTCTA

CCACCGTGGATAACAACATGTGCAACGTATGGTTAACCACCTTTGA

AATAGCATGGCTCCACCGCAAACAACGGGGCAGACTACCAACCCC

AGCTGAATTGCGTGAAAACGTTTGTTATATTTGCTACGGTGATGAC

AGGCCCTTATCAGTTTCGAGAGACTTTGTCATTTATGAGCCTGAAA

CTGTGGTAGCAATGT ACGCAGATGTA

Seq ID No. 3 FP3 Clone 1 AAAGCCCTTGTTTTGGCGTATTAGGCAGATTCGGTTTTTCTTCTTAG

CCTCAAAGTATAAGACGCAGGAAAACAAGGACCTCTTTGATTGGT

ACACCAAAAACCTCTTGGAGAAGGTGATATTGTTACCTACTGGAG

AAGTGTGCCAAATAAAGCGAGGGAATCCTTCAGGGCAATTTTCTA

CTACCGTGGATAACAACATGTGCAATGTATGGCTAACCACCTTTGA

AATAGCATGGCTTCACCGCAAACAACGGGGTAGATTACCAACCCC

AGCTGAATTGCGTGAAAATGTTTGTTATATTTGCTACGGTGATGAT

AGGCTCTTATCAGTTTCAAGAGACTTTGTCATTTATGAGCCTGACA

CTGTGGTAGCGATGTAC GCTGATGTA

[00191] Estes dados de seqüência mostram que vírus 11672 e vírus FP3 estão muito estreitamente relacionados no nível de seqüência nucleotídica e que ambos são possíveis para serem isolados das mesmas espécies de vírus. Estes dados de seqüência são compatíveis com a descoberta de que os vírus 11672 e FP3 são antigenicamente similares, como demonstrado por imunofluorescência indireta. Na base dos níveis de identidade de nucleotídeo compartilhada com outras espécies de astrovírus, as espécies de vírus, das quais 11672 e FP3 são isolados, são consideradas como sendo um novo astrovírus de galinha, que os inventores chamaram astrovírus de galinha tipo 3 (CAstV-3) [00192] Seqüência nucleotídica correspondente ao fragmento de 3,2kb na extremidade de 3' do genoma de vírus foi produzida por RT-PCR usando um iniciador dianteiro baseado em oligo dT que liga ao trato de Poly A na extremidade de 3' do genoma de astrovírus e um iniciador reverso selecionado de dentro da seqüência de fragmento de nucleotídeo 391 amplificada pela estratégia de iniciador degenerado (SEQ 1D No 1 -3). O fragmento de 3,2kb foi clonado usando o vetor pTOPO e sequenciado usando uma estratégia de "andar" iniciador começando com os iniciadores Ml3 dianteiro e reverso que são específicos para o vetor de plasmídeo. Combinando-se a seqüêtieia nucleotídica específica para o fragmento de nucleotídeo 391 de vírus 11672 com aquele determinada para o fragmento de 3;2kb resulta uma seqüência total de 3265 nucleotídeos, Esta sequência engloba 730 nucleotídeos no término 5' do ORF 1b de astrovírus, que codifica a RNA polimerase dependente de RNA de astrovírus, uma sequência intergênica pequena de 24 nucleotídeos, o ORF 2 de astrovírus completo (nucleotídeos 2217), que codifica a região de proteína de capsídeo, e a região não traduzida 3' (UTR) de 276 nucleotídeos (excluindo a cauda de Poly A).

[001931 A seqüência nucleotídica do fragmento de nucleotídeo 3265 é como a seguir:-SEQ ID No 4 AAAGCCCTTGTTTTGGCGCATTAGGCAGATTCGGTTTTTTTTTTTAG

CCTCAAAGTATAAGACGCAGGAAAACAAGGAGCTGTTTGATTGGT

AC ACC A A A A ACCTTTTG GAGAAGGTGAT ATTGTT ACCTACT GGGG A AGTGTGCC A A AT A A AGC G AGG A A ATCCTTC A G G GC A ATTTTCT A CCACCGTGGATA ACA AC ATGTGC A ACGT ATGGTTA ACC ACCTTTGA AATAGCATGGCTCCACCGCAAACAACGGGGCAGACTACCAACCCC

AGCTG A ATTG C GTG A A A AC GTTTGTTAT ATTTG CT AC GGTG ATG AC AGGCTCTT ATC AGTTTCGAG AG ACTTTGTCTTTT ATG AGCCTG A AA CTGTGGTAGC A ATGT ACGC AG ATGT ATTCGGCATGTGGGTG A AGC C AG AG A AT GTG A AGGT A AG A A AT AC ACTT AGTG GTCTCTCTTTCTG TGGT ATG AC A ATT AC A A A A A ATC AGC ATGGCCGTT ATGTTGGT ATT CCTA ATGTC A ATA A A AT ACTGTCC ACTCT ACGGTCTCCTAC A A AGC GCCTTCC A A ATGTAG A AGC ACT ATGGGGTA AGTTG AT ATC ATT AA GAATTCTGTGTGAGAATGCAGATCCCGACGTAAAGGATTACTTAG

ATAGGCAGATCAATTGCGTCGAGGAGTATGCCGCTGCTGAAGAAA

TACAGTTACCAGAAGTCGGGCCCGACTTCTTTCAGAAAATCTGGTA

GAGGGATGGACCGAAATATAGCAGCATGGCCATAAGGCTAGCGCG

CAGAAGGAGAAAACAACAAGGCGCGGACGTGGCCGTTCTCGATCT

AGGTCACGTTCTCGTTCCCGTTCTAGGAATCGTGTCAAGAAAACTG

TCACGATAGTTGAATCTAAGAAAACCCCATCTAGATCTATATTAAG

AAAAGAACTTGAAAATCATGAGAGAAGGGATAGGAGGCGTTTTAG

GAAGATTGAAAAAAAATTAAATGGCCCTAAAATACATGATCGCAT

GGCAGTCACAACTACACTTGGAGTCCTCACTGGAAATTCTGACAAT

AATTTGGAAAGGAAAATGAGAGCTCTTCTTAACCCATTGCTTTTGA

AATCTCAAAACACTGGGGCCTCAGCATCCCCACTTTCCCTTAGGGC

ATCTCAGTATTCAATGTGGAAGATACAGAAATGTGTTGTAAAATTT

GTTCCCCTAGTTGGGGCTGCTAATGTGGCAGGTAGTGTATCCTTTG

TGTCTCTGGATCAGGATGCAACCTCCTCCCAGCCTGAATCACCTGA

TACGATAAAGGCAAAGGTGCATGCAGAAGTTGCAATTGGACAAAG

ATTTAATTGGAACGTTCAATCTAGATACCTGGTCGGACCCCGTTCT

GGTTGGTGGGGCATGGATACTGGTGAGTCACCAACTGATACAGTT

GGACCAGCCCTTGACTTTTGGAATCTTTATAGAACAGTGAACACAC

TTCAAATGGCTCAACATCGCAGGCATACACTGCACCATTGTTTTCT

ATTGAAGTGTATACGGTGTATGTTTTTTCAGGTTACGAACCAAAGC

CTGCCCTGGCGACCATGACAAATTCAACTTTTGAGAGTCAGCAGG

GGGTGACCATAACAAATGGTGCTAATGGTGAACTTCTGCTCAATGT

TCCACGGCGATCGAGTCTTGCCGAAGGGCTGCGTGAAAAGGAAGT

ATTATACCGCGGCCAAAACCAAACGGGTGGTGTCGGTGAGGTACT

GTGGGCGGTGGCATCAGGAGCTGTTGAAGGAGCTGCAGAAGCGTT

GGGCCCATGGGGATGGTTACTGAGAGGTGGCTGGTGGGTGATAAA

GAAGTTGTTTGGACGGAGCGCTGAAAATGAAAGTGACGATTATGT

GATGTACTCGTCTATTGAGGATGCCAACAAAGATAGTAGGATCTA

TCAAACGGTATCCAGTGCGGTCCCTGTTCAACAAGGTCCTCTGGTT

CTCACCCAAATCTCATCCCCAAATGTTATCAAGCTGGGGGTGTTGT

GCAGGTAGGTACAACAATTGCCACTGATTACTTGCCACTATCTCAG

GCCCAGGTTCCGCTTTTAGAGAACATTCTTTACTCCAGCACTGGGC

AGCCTGTGACATCAACTAAGAGCCATACTATGAGGATCACTGGGT

TTCCAGCCTCGAAATTGGTAACATCAACGTCGTCGCAATGGTTGGG

CACTACTGATACGAGTGTCCAAGCAACAAAGTGGCTAATGTCGGA

TTATACAGACACTGGAGTGATATTTGGCTTTCCATACTCTGATGAT

TCCCCCGGGGAAACTTTTGGTAACATTGGAGTAATACACACAGCC

AAGTCGCTCATAAAAACGGTCACATCAAGGCGACAACGCGGGCTA

CGCATGTCTCCACTTGTTTCGACATTGTTACCATCAACTTCTAAGG

GACCAACCCAGATGCTTAGTTGCTTTGACACGCCTTACTATTGGAT

TAGGGTTTGTGACAATACCTGCTCAAACAAACCCACAAATGGCGC

CGTGACACAGCGCTGCAATGCTTGGGGCGTTATGGTGGTGAGCTT

AGCACACAATAAAGTCTACATCTTGGCTGGTTATCCCGATTCTCAA

ACTAGGGTACCACAACAACAACTAGTCTGGGACACTTTTGACTGG

GATGCTACATTTTCTACTGGCAGGATTTATAATACAACATGGCCAG

GACTTTATGAAGAAAGTGATGATGAAACAGATGCCGAATCTGACA

TCTCCAGTCTTTTTGACCCCGTTAATGAGGTTGAGCAGGACTTTCA

CTTCAAATGTAGTCTGAAGACATCTGACTACTTGAAGGAGGAGGC

TGATTATTGGAAAGCAAAAGCACAACAATTGCTTATGGAGAAAGC

AATGGGAAAAAATAATGACTCTCCTCCACTTGTCCGCTTTGAGAAG

GGCGGACCTGAGCAGCAAAAACAGCCTGCTAGCAGCCGCGGCCAC

GCCGAGTAGGATCGAGGGTACAGCTGCACCTTCTTCATGGAGTTTT

TATGCCATAATCAGGCTTTTCTCCATGTAAATCAAGGCACCGGGGC

CACGCCGAGCAGGAACGAGGGTACAGTGCCGGGTTGACCCCACCT

GAAAGGGGCGTCCGCCGGTGTGATAATCACCACACCGGGGCCTGG

TTTAAATCACAGATAATCACTCTGTGTGTCAATCAGGTCTTTCGGG

CGGTTTTGGAAACACTAGTTTTTAAAACCAATTTGATTTTGAATTA GATTAATTGGCAAAAAAAAAAAAAAAAAA.

[00194] O gene de proteína capsídeo tem 2217 nucleotídeos de comprimento e codifica uma região de proteína de 738 aminoácidos.

[00195] A seqüência de aminoácido da região de proteína capsídeo de 738 aminoácidos é como a seguir: SEQ ID No 5 mad kas aq kekttrrg rg rs rs rs rs rs rs rn rvkk tv ti veskktps rs i 1 rke len herrdrrrfrkiekk 1 n gp kihdrmavtulgvltgnsdnnlerkmrallnplllksqntgasasplslrasqysmwkiqkcvvkfvplvg aanvügsvsfvsldqdatssqpespdtikakvhaevaigqrfnwnvqsrylvgprsgwwgmdtgesptd t vgpal d fwn 1 y rt v ntl q tgstsqay tapl fs i e vy t vy v fs g yepkpal atmt nstfe sqqgv t i tn g an ge 111 n v p rr ss 1 aeg I r e ke v 1 y rgq nq tgg vge v 1 wa vasga vegaaeal g p wg w 11 rgg w w v i k k 1 fgr s aenesddyvmyssiedankdsriyqtvssavpvqqgplvltqisspnvnqaggvvqvgttiatdylplsqa qvpllenilysstgqpvtstkshtmritgfpasklvtstssqwlgttdtsvqatkwlmsdytdtgvifgfpysd dspgetfgnigvihtaksliktvtsrrqrglrmsplvstllpstskgptqmlscfdtpyywirvcdntcsnkpt ngavtqrcnawgvmvvslahnkvyilagypdsqtrvpqqqlvwdtfdwdatfstgriynitwpglyees ddetdaesdisslfdpvneveqdfhfkcslktsdylkeeadywkakaqqllmekamgknndspplvrfe kggpeqqkqpassrghae [00196] Conhecimento do nucleotídeo e seqüência de aminoácido prevista da região de proteína de capsídeo pode ser explorado para uma série de propósitos incluindo: 1) Uso como uma vacina de DNA, se o gene for clonado em um vetor de expressão apropriado.Taís vetores de expressão podem ser também usados para iniciar/imunizar camundongos para a geração de reagentes de anticorpo. 2) Uso para produzir produtos de proteína recombinante por sistemas de expressão procariótico (por exemplo E. coli) e eucariótico (por exemplo células de inseto infectadas com baculovírus recombinante, levedura). Tais proteínas podem ser de uso como vacinas de subunidade ou para imunizar camundongos para geração de reagentes de anticorpo. 3) Uso para gerar peptídeos específicos de proteína capsídeo para fins de imunização ou vacina. 4) Uso de sequências nucleotídicas específicas para o desenvolvimento de testes de RT-PCR específicos de astrovírus 3.

Diagnose sorológica de astro vírus de galinha tipo 3 em lotes de aves reprodutor as [001971 Amostras de soro de lotes de aves reprodutoras com idade de aproximadamente 22 semanas (pouco antes da postura) foram testadas para a presença de anticorpo para vírus 11672, um isolado de CAstV-3, por um teste de imunofluorescência indireta usando culturas de lâmina de CEL que foi infectado com vírus 11672, Soros foram filtrados em diluição de 1 :50Ü PBS e anticorpos de galinha foram detectados usando um conjugado de Ig anti-galinha de FITC. Anticorpo foi detectado em 62/ 211 pássaros (29,4%) e em amostras de 13/ 17 lotes (76,5%), Os níveis relativamente baixos de soroconversão em alguns lotes sugeriram que alguns lotes estavam experimentando infecções em curso no ponto de postura (22 semanas) e que outras infecções de pássaros reprodutores eram possíveis de ocorrer quando as aves reprodutoras estavam em postura.

Tabela 4: Resultados de sorologia para lotes de aves reprodutoras testadas em 22 semanas de idade. Lâminas CEL infectadas com vírus 11672 foram usadas em um teste de imunofluorescência indireta para detectar anticorpo específico de vírus em. soros de galinha.

Detecção de astrovírus de galinha tipo 3 em lotes exibindo crescimento irregular [00198] Conteúdos intestinais de galinha doentes de lotes mostrando "crescimento irregular" foram investigados para a presença de vírus. Isso envolveu preparar homogenados de 5- 10% em meio de cultura celular de MEM, clarificação em 3000 rpm durante 30 min, centrifugação do extrato clarificado a 10.000 rpm durante 30 min, e ultracentrifugação do sobrenadante através de uma almofada de sacarose de 30% (peso/peso) em PBS. Amostras do sobrenadante de 10.000 rpm e grânulo de sacarose recolocado em suspensão foram inoculadas nas células de CEL cultivadas em lâminas de vidro. Após lavagem, as culturas de lâminas foram incubadas por 48 horas, e então fixadas por tratamento com acetona. Lâminas fixados foram incubadas com anti-soros contra 3 ELVs imunologicamente diferentes incluindo CAstV-3. A presença de CAstV-3 infeccioso foi detectada em amostras de 1 lote de frango de corte demonstrando crescimento irregular nos dias 5, 7 e 9 após eclosão. A presença de 2 outros ELVs imunologicamente diferentes, isto é vírus de nefrite aviária (CAstV-1) e um ELV, exemplificado pelo isolado "612", foi também demonstrada. Microscopia eletrônica de contraste negativo realizada com preparações brutas ou parcialmente purificadas de conteúdos intestinais mostraram que tais amostras continham altos níveis de ELVs e rotavírus.

[00199] Um inóculo preparado a partir dos conteúdos intestinais de uma galinha doente originária de um lote exibindo crescimento irregular foi usado para infectar oralmente pintos SPF de 1 dia. Estas aves exibiram anormalidades na plumagem em cerca de 2-3 semanas e uma depressão de peso de 30% em 5 semanas de idade. Exame de microscopia eletrônica de amostras de conteúdo intestinal obtidas de pássaros mortos no dia 4, 6, 8, 10 e 15 revelaram a presença de ELVs em todos pontos de avaliação. Anti-soro recuperado de pássaros em 5 semanas de idade foram mostrados por IF indireta como contendo anticorpos para CAstV-3 e para um segundo ELV diferente. Este experimento mostrou que os conteúdos intestinais da galinha doente usados para inoculação continham CAstV-3 e sugeriu que este ELV podería estar contribuindo para depressão de crescimento.

Vacinacão [00200] Uma vacina para CAstV-3 irã provavelmente proteger contra doença e depressão de crescimento em frangos novos, e também proteger contra transmissão vertical de aves reprodutoras infectadas e possíveis efeitos ruins no embrião em desenvolvimento e pinto eclodido que o vírus vertical mente transmitido podem causar.

[00201] A vacina para administração aos pássaros reprodutores teria benefícios de saúde para o embrião em desenvolvimento e pintos novos em crescimento. A vacina também pode ser administrada aos frangos de corte em crescimento.

Detecção de vírus [00202] A presença dc vírus em amostras pode ser detectada pelo crescimento de vírus infecciosos em embriões ou cultura celular. Altemativameme, vírus (ou mais corretamente antígeno viral) podem ser detectados dentro das amostras de tecido de galinhas infectadas usando imunohistoquímica. Isto envolve coletar tecido fresco, fixação de tecido em formalina, iticrustação em parafina, o corte de muitas seções de tecido finas e o uso de anticorpos específicos para vírus (por exemplo anti-soro monoclonal ou policlonal altamente específico) para colorir o antígeno viral na seção de tecido. Os anticorpos ligados seriam detectados por um conjugado enzima-an ti corpo secundário.

[002G3J Antígeno viral pode também ser detectado em seções de tecido congelado usando anticorpos em uma forma similar.

[00204] No caso de astro vírus, que infectam o trato intestinal, vírus é excretado algumas vezes em grandes quantidades em, fezes.

[00205] A presença de antígeno viral pode ser detectada em amostras de fezes ou esfregaços usando um ELISA de detecção de antígeno. Tipicamente, isso envolve o uso de um anticorpo específico de vírus (imobilizado em uma superfície de plástico) para ligar a e "capturar" partículas virais presentes em amostras de fezes diluídas. Partículas de vírus capturadas são então reagidas com outro anti-soro específico de vírus que foi conjugado a uma enzima, tal como peroxidase de raiz forte. A presença de conjugado ligado é demonstrada adicionando o substrato de enzima e sua conversão para produto colorido.

[00206] Galinhas irão responder à infecção produzindo anticorpos para o CAstV-3. Anticorpos no soro podem ser detectados usando uma variedade de testes tais como teste de imunofluorescência indireta, neutralização de vírus ou ELISA, que é particularmente útil para a produção grande de amostras. Tipicamente um ELISA indireto envolvería imobilizar o vírus ou antígeno viral na placa de plástico de microtitulação, reação com diluições de soro para permitir a ligação dos anticorpos, reação com anticorpo de Ig anti-galinha secundário conjugado a enzima, seguido por reação com substrato de enzima. Altemativamente, um ELISA bloqueado pode ser usado. Isto envolvería demonstrar a presença de anticorpos de galinha específicos do vírus por sua capacidade para "bloquear" a reação entre antígeno viral imobilizado e um anticorpo específico de vírus (comumente um anticorpo monoclonal).

[00207] Produção de anticorpo monoclonal e caracterização podem ser realizadas e anticorpos monoclonais podem ser usados no desenvolvimento de testes diagnósticos tais como testes usados para detectar anticorpo de soro para o agente infeccioso.

[00208] Altemativamente um teste de PCR pode ser usado. Detalhes de tal teste são providos abaixo [00209] Um teste RT-PCR de protótipo foi desenvolvido em que iniciadores dianteiros (SEQ ID NO 6) e reversos (SEQ ID NO 7) foram baseados em seqüências conservadas encontradas dentro dos fragmentos de nucleotídeos 391 especificado pelos isolados de 11672 e FP3 (SEQ ID NOl -3) e amplificados pela abordagem de RT-PCR de iniciador degenerado. O teste de protótipo amplificou um produto de 187 pares de base (Figura 3) e foi verificado como sendo 10 a 100 vezes mais sensível que o método envolvendo inoculação de cultura celular seguida por imunofluorescência indireta. O teste de protótipo detectou com sucesso CAstV-3 em amostras de conteúdo intestinal obtidas de pintos de um dia de vida eclodidos de ovos de galinhas-sentinelas reprodutoras.

[00210] Neste experimento, aproximadamente 50 fêmeas jovens foram originadas de um lote com uma boa condição de saúde. Estas foram colocadas em galinheiros dentro de um lote de aves reprodutoras doentes, que estavam produzindo pintos fracos de progênie. Machos dos lotes de aves reprodutoras doentes foram engaiolados com as fêmeas. Quando as fêmeas começaram a colocar os ovos, ovos das fêmeas foram separadamente incubados, eclodidos e os pintos da progênie examinados para a presença de CAstV-3. Doze pintos de 1 dia da progênie foram investigados em intervalos semanais. Os pintos foram mortos e amostras de intestino, fígado, rim e coração foram coletadas de aves individuais.

[00211] Com cada uma das avaliações de 12 pintos, os intestinos de 6 pintos foram agrupados e processados por método de ultracentrifugação usado para detectar o ELV 11672 (acima) em conteúdos intestinais de pintos de crescimento irregular. Estas preparações foram inoculadas em células CEL cultivadas em lâminas, e, após incubação de 48 hr, as culturas inoculadas foram coloridas para presença de antígeno viral 11672 usando o teste IF indireta previamente descrito. Nenhum vírus 11672 foi detectado em qualquer uma das preparações produzidas a partir das avaliações de progênie. (Tabela 5) [00212] RNA foi extraído de alíquotas das amostras intestinais agrupadas (produzidas por ultracentrifugação) e testadas pelo teste RT-PCR de protótipo. Dentre as 13 amostras testadas, 8 foram positivas para RNA de vírus 11672. Amostras positivas foram obtidas intermitentemente de avaliações precoces (7/3/05) para algumas das avaliações tardias (31/5/05). Esses resultados indicaram que os adultos-sentinelas tinham-se tornado infectados com vírus 11672 presentes no local e que a transmissão vertical provavelmente tinha ocorrido. O perfil de detecção, em que amostras positivas foram detectadas durante um período de 12 semanas, sugeriu que propagação do vírus 11672 foi lenta ou que vírus foi transmitido das aves parentais infectadas e continuou por longos períodos. Trabalho está em curso para determinar se a detecção de CAstV-3 está associada com problemas de fraqueza ou retardo de crescimento nos pintos da progênie.

Tabela 5: Detecção de CAstV-3 em pintos da progênie obtidos de galinhas-sentinelas reorodutoras__________________________________________ iNi: mio testauo [00213] A invenção estando agora completamente descrita, será evidente para o versado na técnica que mudanças e modificações podem ser feitas sem sair do escopo das reivindicações.

REIVINDICAÇÕES

Claims (18)

1. Construção de gene, caracterizada pelo fato de compreender uma sequência de nucleotídeos isolada que codifica um polipeptídeo que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 e uma sequência de controle heteróloga.

2. Vetor, caracterizado pelo fato de compreender uma sequência de nucleotídeos isolada que codifica um polipeptídeo que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 e um promotor heterólogo que é ligado operativamente à referida sequência de nucleotídeo.

3. Método de produção de um polipeptídeo que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5, o método caracterizado pelo fato de incluir as etapas de: (a) contatar (i) uma célula bacteriana, (ii) uma célula de inseto via um baculovírus, (iii) uma célula de levedura, ou (iv) uma célula de planta com um vetor como definido na reivindicação 2, (b) cultivar a referida (i) célula bacteriana, (ii) célula de inseto, (iii) célula de levedura, ou (iv) célula de planta da etapa (a) sob condições apropriadas para a produção polipeptídiea.

4. Uso de: (i) pelo menos parte de uma cepa de astrovírus isolado designada CAstV-3 depositada na CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes) (Institute Pasteur) sob o número de acesso CNCM I-3541, (ii) uma seqüência de nucleotídeos que pode codificar um polipeptídeo que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5, ou (iii) um polipeptídeo que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5, caracterizado pelo fato de ser na preparação de uma composição que é capaz de mediar uma resposta imune em uma ave.

5. Composição, caracterizado pelo fato de compreender: (i) pelo menos parte de uma cepa de astrovírus isolado designada CAstV-3 depositada na CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes) (Institute Pasteur) sob o número de acesso CNCM I-3541, (ii) uma seqüência de nucleotídeos que pode codificar um polipeptídeo que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5, ou (iii) um polipeptídeo que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5, em que a composição adicionalmente compreende um veículo ou diluente farmacêutico.

6. Composição para gerar uma resposta imunogênica contra depressão do crescimento em uma ave, caracterizada pelo fato de que referida composição compreende: (i) pelo menos parte de uma cepa de astrovírus isolado designada CAstV-3 depositada na CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes) (Institute Pasteur) sob o número de acesso CNCM I-3541, (ii) uma seqüência de nucleotídeos que pode codificar um polipeptídeo que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5, ou (iii) um polipeptídeo que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5, e um adjuvante.

7. Método de teste diagnóstico para a detecção do astrovírus de galinha tipo 3 em uma amostra de uma ave, caracterizado pelo fato de compreender as etapas de: (i) contatar material fisiológico de aves com uma sonda em que referida sonda é selecionada dentre: (a) uma sequência de nucleotídeos capaz de codificar um polipeptídeo que compreende a sequência de aminoácidos de SEQID NO: 5, (b) polipeptídeo que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 codificado por uma sequência de nucleotídeos como especificada em (a), ou um anticorpo com especificidade de ligação para um polipeptídeo que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5, e (ii) detectar um evento de ligação de sucesso entre a sonda e pelo menos um componente da amostra.

8. Método de teste diagnóstico de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de compreender as etapas de: - contatar material fisiológico de aves com um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5, - incubar o material fisiológico de aves e o polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5, de modo que qualquer anticorpo presente na amostra que é capaz de ligar ao polipeptídeo compreendendo a SEQ ID NO:5 se liga ao polipeptídeo, e - detectar a presença de referido anticorpo ligado.

9. Método de teste diagnóstico de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de compreender as etapas de: - contatar uma amostra de material fisiológico de aves com um anticorpo que especificamente liga a um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5, - incubar o material fisiológico de aves com referido anticorpo de modo que qualquer astrovírus de galinha tipo 3 presente na amostra liga ao referido anticorpo, e - detectar a presença de referido astrovírus de galinha tipo 3 presente na amostra.

10. Kit diagnóstico para uso na diagnose de astrovírus de galinha tipo 3 (CAstV-3), caracterizado pelo fato de compreender uma sonda em que referida sonda é pelo menos uma dentre (a) uma seqüência de SEQ ID NO: 4 capaz de codificar a SEQ ID NO: 5, (b) um polipeptídeo codificado por uma seqüência de nucleotídeo como especificada em (a) compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5, ou (c) um anticorpo com especificidade de ligação para um polipeptídeo de (b).

11. Construção de gene, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a sequência de nucleotídeos isolada codifica o polipeptídeo consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5.

12. Vetor, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a sequência de nucleotídeos isolada codifica um polipeptídeo consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5.

13. Método de produção de um polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5.

14. Uso, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a sequência de nucleotídeos de (ii) codifica um polipeptídeo consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5, ou o polipeptídeo de (iii) consistindo na sequência de aminoácido da SEQ ID NO:5.

15. Composição, de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato de que a sequência de nucleotídeos de (ii) é uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo consistindo da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5, ou em que o polipeptídeo de (iii) consiste na sequência de aminoácido da SEQID NO:5.

16. Teste de diagnóstico, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que a sequência de nucleotídeos de (a) é capaz de codificar uma sequência de aminoácidos consistindo na SEQ ID NO: 5, a sequência de polipeptídeos de (b) consiste em uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 5.

17. Teste de diagnóstico, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo consiste em uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5.

18. Teste de diagnóstico, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o anticorpo se liga especificamente a um polipeptídeo consistindo na SEQ ID NO: 5.