BRPI0706424A2 - marcadores de calpastatin para fertilidade e longevidade - Google Patents

Abstract

MARCADORES DE CALPASTATIN PARA FERTI- LIDADE E LONGEVIDADE.A presente invenção refere-se a composições e métodos basea- dos em novos marcadores genéticos calpastatin (CAST), tais como mutações sem sentido em exon 3 que resultem em substituições G48D ou P52L (NM174003.2:c.271G>.A e 283C>T), uma substituição G/T em intron 3 (A- AFC02060381 .1 :g.21 1OG>T) e uma repetição GAAA em intron 8 (A- AFC0206038 1.1 :g . 6700[(GAAA)4]+[(GAAA)5]. Aspectos particulares proporcionam novos marcadores para fertilidade (por exemplo, taxa de gravidez de raça, DPR) e longevidade (por exemplo, vida produtiva, PL) em, por exemplo, gado leiteiro. Aspectos adicionais proporcionam novos métodos compreendendo seleção auxiliada por marcador para aperfeiçoar fertilidade e/ou longevidade em gado leiteiro. Portanto, em concretizações particulares, uma combinação de seleção genética baseada em um ou mais dos novos marcadores CAST, e altos potenciais de PTA de traços de produção de leite, proporciona traços reprodutivos aperfeiçoados em associação com traços de produção de leite alta continuada. Aspectos adicionais desgeram um domínio XL anteriormente não-reconhecidos no gene CAST humano, e, desse modo, proporciona o uso de mutantes/variantes de domínio de CAST XL como marcadores para fertilidade e longevidade humanas.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MARCADO-RES DE CALPASTATIN PARA FERTILIDADE E LONGEVIDADE".

INCORPORAÇÃO POR REFERÊNCIA

Este pedido reivindica o benefício do pedido de patente provisó-rio dos Estados Unidos N- de Série 60/756.383, depositado em 5 de janeirode 2006. Referência é feita ao pedido de patente internacionalPCT/IB2005/002983, depositado em 18 de julho de 2005, e publicado comoWO 2006/097787 em 21 de setembro de 2006.

Os pedidos precedentes, e todos os documentos desse modocitados, ou durante seu prosseguimento ("documentos citados de pedido"), etodos os documentos citados óu referenciados nos documentos citados depedido, e todos os documentos citados ou referenciados aqui ("documentoscitados aqui"), e todos os documentos citados ou referenciados nos docu-mentos aqui citados, juntos com as instruções do fabricante, descrições, es-pecificações de produto, e folhas de produto para quaisquer produtos aquimencionados, ou em qualquer documento incorporado por referência aqui,são, desse modo, incorporados aqui por referência, β podem ser emprega-dos na pratica da invenção.

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se à identificação de marcadoresgenéticos (polimorfismos de nucleotídeo simples (SNPs) e uma repetição emtandem curta (STR)) no interior de genes bovinos que codificam calpastatin("CAST"), e suas associações com traços economicamente relevantes naprodução de Leiteria. A invenção adicionalmente se refere a métodos e sis-temas, incluindo processos baseados em rede, para controlar os dados deSNP/STR e outros dados relacionados a animais específicos e rebanhos deanimais, cuidado veterinário, diagnóstico e dados de controle de qualidade, egerenciamento de criação que, baseado na genotipagem, tem fertilidadeprognosticável e traços de longevidade, condições de criação de gado, bem-estar do animal, informação de segurança de alimentação, exame dos pro-cessos existentes, e dados das locações de campo.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃOO declínio reprodutivo tem sido um desafio na indústria de Ieite-ria ao redor do mundo por várias décadas, e tem tipicamente sido responsá-vel na seleção de produção de leite aumentada [Sheldon IM1 Dobson H. Re-productive challenges facing the cattle industry at the beginning of the 21 stcentury. Reprod Suppl. 2003; 61:1-13]. Nos Estados Unidos somente, o pri-meiro serviço para taxa de concepção declinou em aproximadamente 65%em 1951 a 40% em 1996 [Butler WR. Review: effect of proten nutrition onovarian e uterine physiology in dairy cattle. J Dairy Sei. 1998; 81:2533-2539],enquanto o número de serviços por concepção aumentou de aproximada-mente 1,8 em 1970 a aproximadamente 3 em 2000 [Lucy MC. Reproductiveloss in high-producing dairy cattle: where will it end? J Dairy Sei. 2001;84:1277-1293]. Foi reportado que durante 1976 a 1978, o número médio dedias abertos (dias entre parto e a concepção subseqüente) foi 122 dias paraJerseys e 124 dias para Holsteins [Washburn SP, Silvia WJ, Brown CH, Mc-Daniel BT, McAIIister AJ. Trends in reproduetive performance in Southeas-tern Holstein e Jersey DHI herds. J Dairy Sei. 2002; 85:244-251]. Contudo,os dias abertos aumentaram para 152 dias para Jerseys e 168 dias paraHolsteins por 1997 a 1999. No Reino Unido, a taxa de concepção para pri-meiro serviço de vacas leiteiras declinou de 65,4% (1975-82) para 44,3%(1995-98) a uma taxa de aproximadamente 1% por ano [Royal MD, DarwashAO, Flint AP, Webb R, Woolliams JA, Lamming GE. Declining fertility in dairycattle: changes in traditional e endocrine parameters of fertility. Anim Sci2000; 70:487-502]. Diminuições equivalentes na taxa de concepção de pri-meiro serviço foram também observadas no gado leiteiro em Ireland [RocheJF, Mackey D, Diskin MD. Reproduetive management of postpartum cows.Anim Reprod Sci 2000; 61:703-712] e Australia [Macmillan KL, Lean IJ,Westwood CT. Os efeitos de lactação na fertilidade de vacas leiteiras. AustVet J 1996; 73:141-147]. A compreensão das causas genéticas de fertilidadereduzida é essencial para parar o declínio de fertilidade atualmente observa-do na lactação de vacas leiteiras.

Para se discutir as dificuldades de se alcançar níveis desejadosde desempenho reprodutivo nos rebanhos de ordenha de hoje, um novo tra-ço de fertilidade, a taxa de gravidez da raça (DPR), foi introduzido como umindicador de fertilidade de progenitor para seleção genética [VanRaden PM,Sanders AH, Tooker ME1 Miller RH, Norman HD1 Kuhn MT, Wiggans GR. Odesenvolvimento de uma avaliação genética nacional para fertilidade de va-ca. Dairy Sci 2004; 87:2285-2292]. A taxa de gravidez é definida como apercentagem de vacas não-grávidas que se tornam grávidas durante cadaperíodo de 21 dias. De fato, os dados para calcular a DPR são tomados apartir dos dias abertos reportados, que são calculados como data de gravi-dez menos data de parto anterior. A data de gravidez é determinada a partirda última geração reportada ou do parto subseqüente menos comprimentode gestação esperado. Para cálculo de avaliações genéticas, os dias abertossão convertidos em taxa de gravidez da raça por transformação linear detaxa de gravidez = 0,25 (233 - dias abertos). As avaliações são expressascomo capacidade de transmissão prognosticada (PTA) para DPR, e cálculossão gerados como um resultado direto de um desempenho de raças de tou-ros [VanRaden PM, Sanders AH, Tooker ME, Miller RH, Norman HD, KuhnMT, Wiggans GR. Development of a national genetic evaluation for cow ferti-lity. Dairy Sci 2004; 87:2285-2292]. Em adição, a fertilidade da vaca é umcomponente maior de vida produtiva (PL) ou longevidade. O aperfeiçoamen-to de ambas DPR e PL conduziria a produtividade e utilidade aumentadas àindústria de leiteria.

O calpastatin (CAST) é um inibidor de protease endógeno queage especificamente em duas proteases independentes de Ca2+, μ-calpain em-calpain pela ligação e formação de um complexo inativo. O CAST é am-piamente expresso em células mamíferas e tecidos, incluindo aqueles rela-cionados a reprodução. Por exemplo, o gene CAST é expresso na glândulapituitária humana [Kitahara A, Takano E, Ontsuki H, Kirihata Y, Yamagata Y,Knaagi R, Murachi T. Reversed distribution of calpains e calpastatin in hu-man pituitary gland e selective Iocalization of calpastatin in adrenocorticotro-pin-producing cells as demonstrated by immunohistochemistry. J Clin Endo-crinol Metab 1986; 63:343-348], the human placenta [Thompson VF, SaldanaS, Cong J, Luedke DM, Goll DE. The calpain system in human placenta. LifeSci 2002; 70:2493-508], the human oocyte [Ben-Aharon I, Ben-Yosef D, AmitA, Shalgi R. Expression e immunolocalization of the calpain-calpastatin sys-tem in the human oocyte. Fértil Steril 2005; 83:1807-1813], the bovine corpusluteum [Orwig KE, Bertrand JE, Or BR, Forsberg NE, Stormshak F. Involve-ment of protein kinase-C, calpains, e calpastatin in prostaglandin F2 alpha-induced oxytocin secretion from the bovine corpus Iuteum. Endocrinology1994; 134:78-83], as well as during spermatogenesis in the tests of humans[Liang ZG, O1Hern PA, Yavetz B, Yavetz H, Goldberg E. Human testis cDNAsidentified by sera from infertile patients: a molecular biological approach toimmunocontraceptive development. Reprod Fértil Dev 1994; 6:297-305; Li S,Liang ZG, Wang GY, Yavetz B, Kim ED, Goldberg E. Molecular cloning echaracterization of functional domains of a human testis-specific isoform ofcalpastatin. Biol Reprod 2000; 63:172-178 e Wei SG, Wang LF, Miao SY,Zong SD, Koide SS. Expression of the calpastatin gene segment duringspermiogenesis in human testis: an in situ hibridization study. Arch Androl1995; 34:9-12. ], mice [Li S, Goldberg Ε. A novel N-terminal domain directsmembrane Iocalization of mouse testis-specific calpastatin. Biol Reprod2000; 63:1594-1600] e rabbits [Wang LF1 Miao SY, Yan YC, Li YH, Zong C,Koide SS. Expression of a sperm protein gene during spermatogenesis inmammalian testis: an in situ hibridization study. Mol Reprod Dev 1990; 26:1-5]. Interessantemente, a proteína de CAST foi identificada como um dos an-tígenos alvos para anticorpos antiesperma encontrados em mulheres não-férteis [Koide SS, Wang L, Kamada M. Antisperm antibodies associated withinfertility: properties e encoding genes of target antigens. Proc Soc Exp BiolMed 2000; 224:123-132], In vivo, anticorpos CAST anti-BS-17 podem blo-quear a capacidade de fertilização de esperma de camundongo para fertili-zar ova pela redução significante dos números de desenvolvimento de em-briões [Koide SS, Wang L, Kamada M. Antisperm antibodies associated withinfertility: properties e encoding genes of target antigens. Proc Soc Exp BiolMed 2000; 224:123-132]. Todos estes resultados indicam que o gene CASTdesempenha um papel importante na biologia reprodutiva.

A estrutura primária da seqüência de amino-ácido de calpastatininclui quatro domínios internamente repetitivos (Domínios 1-4) e um domínionão-homólogo na extremidade amino-terminal (Domain L) [Murachi T. Calpa-in e calpastatin. Rinsho Byori 1990; 38:337-346]. Contudo, um novo domíniode peptídeo N-terminal, denominado domínio XL1 foi identificado no gado[Cong M1 Thompson VF, Goll DE, Antin PB. O promotor de gene calpastatinbovino e uma nova região N-terminal da proteína são alvos para atividade deproteína kinase dependente de cAMP. J Biol Chem 1998; 273:660-666]. Aregião "XL" contém sessenta e oito aminoácidos, mas não compartilhamhomologia com outras regiões de calpastatin ou com quaisquer proteínasconhecidas. Experimentos in vivo mostraram que a região "XL" é um subs-trato para fosforilação por proteína kinase [Cong M, Thompson VF, Goll DE,Antin PB. O promoter de gene calpastatin bovino e uma nova região N-terminal da proteína são alvos para atividade de proteína kinase dependentede cAMP. J Biol Chem 1998; 273:660-666].

Permanece vantajoso proporcionar SNPs/STRs adicionais quepodem prognosticar mais precisamente os fenótipos de fertilidade e longevi-dade de um animal, e também um método de negócio que proporciona efici-ências de produção aumentadas em gado de criação, bem como proporcio-nando acesso a vários registros dos animais, e permitem comparações comobjetivos esperados e desejados com relação a qualidade e quantidade deanimais produzidos.

A citação ou identificação de qualquer documento neste pedidonão é uma admissão que tal documento é disponível como técnica anterior apresente invenção.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se à identificação de marcadoresgenéticos (polimorfismos de nucleotídeo simples (SNPs) e uma repetição emtandem curta (STR)) no interior dos genes bovinos genes que codificam cal-pastatin ("CAST') e suas associações com traços economicamente relevan-tes na produção de leiteria.

A invenção envolve um método para subagrupamento de ani-mais de acordo com o genótipo no qual os animais de cada subgrupo têmum polimorfismo similar em um gene de CASTque pode compreender a de-terminação do genótipo de cada animal a ser subagrupado pela determina-ção da presença de um SNP/STR no gene de CAST, e segregação dos ani-mais individuais em subgrupos no qual cada animal em um subgrupo temum polimorfismo no gene de CAST.

A invenção também envolve um método para subagrupamentode animais de acordo com o genótipo no qual os animais de cada subgrupotêm um genótipo similar no gene de CASTque pode compreender determi-nação do genótipo de cada animal a ser subagrupado pela determinação dapresença de um polimorfismo de nucleotídeo simples de interesse no genede CAST, e segregação de animais individuais em subgrupos dependendose os animais têm ou não têm o(s) polimorfismo(s) de nucleotídeo simplesde interesse no gene de CAST.

O(s) polimorfismo(s) genético(s) de interesse pode(m) ser sele-cionado(s) a partir do grupo consistindo em mutações sem sentido na regiãode domínio XL1 especialmente mutações sem sentido em exon 3 que resul-tam em G48D e P52L substituições (NM_M4003.2:c.271G>A e 283C>T),uma substituição G/T em intron 3 (AAFC02060381.1 :g.2110G>T) e uma re-petição em tandem curta GAAA em intron 8 (A-AFC02060381.1 :g.6700[(GAAA)4]+[(GAAA)5]. A invenção adicionalmente serefere a um método para subagrupamento de animais de acordo com o ge-nótipo no qual os animais de cada subgrupo têm um genótipo similar no ge-ne de GASTque pode compreender determinação do genótipo de cada ani-mal a ser subagrupado pela determinação da presença de qualquer um dosSNPs/STR acima, e segregação de animais individuais em subgrupos de-pendendo se os animais têm ou não têm qualquer um dos SNPs/STR acimano gene de CAST.

A invenção também se refere a método para identificação de umanimal tendo um fenótipo desejável conforme comparado à população geralde animais daquela espécie, que pode compreender determinação da pre-sença de um of a polimorfismo de nucleotídeo simples no gene de CAST doanimal, no qual a presença do SNP/STR é indicativa de um fenótipo deseja-vel.

Em uma concretização vantajosa, o animal pode ser um bovino.

Em outra concretização vantajosa, o gene de CAST pode ser um gene deCAST bovino.

A invenção também envolve métodos auxiliados por computadore sistemas para aperfeiçoamento da eficiência de produção para criaçãotendo fertilidade e longevidade e, em particular, o genótipo dos animais con-forme ele se refere a CAST SNPs/STRs. Os métodos da invenção envolvema obtenção de uma amostra genética de cada animal em um rebanho decriação, determinação do genótipo de cada animal com relação aos traçosde qualidade específicos conforme definidos por um painel de pelo menosdois polimorfismos de polinucleotídeo simples (SNPs)/STRs, agrupamentode animais com genótipos similares, e, opcionalmente, subagrupamento adi-cional de animais baseado nos fenótipos similares. Os métodos da invençãopodem também envolver obtenção e manutenção de dados relacionados aanimais ou a rebanhos, suas condições de criação de gado, cuidado e con-dição de saúde e veterinária, história genética ou ascendência, e provisãodestes dados a outros através de sistemas que são baseado em web, conti-dos em bases de dados, ou fixados ao próprio animal, tal como por um mi-crochip implantado. Um aspecto vantajoso da presente invenção, portanto, édirecionado a um sistema de computador e métodos auxiliados por compu-tador para rastreio dos traços de qualidade para criação que possui predis-posições genéticas específicas.

A presente invenção envolve vantajosamente métodos auxilia-dos por computador e sistemas para aquisição de dados genéticos, particu-larmente dados genéticos conforme definidos pela ausência ou presença deum SNP/STR no interior do gene de CAST relacionado a traços de fertilidadee longevidade da geração de animal e associação daqueles dados com ou-tros dados sobre o animal ou seu rebanho, e manutenção daqueles dadosem modos que são acessíveis. Outro aspecto da invenção envolve um mé-todo auxiliado por computador para prognosticar qual criação de animaispossui uma diferença biológica na fertilidade e longevidade, e que pode in-cluir as etapas de usar um sistema de computador, por exemplo, a computa-dor programado compreendendo a processador, um sistema de armazena-gem de dados, um dispositivo de entrada e um dispositivo de saída, as eta-pas de: (a) admissão no computador programado através do dispositivo deentrada de dados que incluem um genótipo de um animal conforme ele serefere a qualquer um dos SNPs/STRs de CAST aqui descritos, (b) correçãofertilidade e longevidade prognosticadas pelo genótipo de CAST usando oprocessador e o sistema de armazenagem de dados, e (c) fornecimento aodispositivo de saída da fertilidade e longevidade correlacionada ao genótipode CAST, prognosticando-se, desse modo, qual criação de animais possuiuma fertilidade e longevidade particular.

Ainda outro aspecto da invenção se refere a um método de sefazer negócio para controle da criação compreendendo provisão a um usuá-rio de um sistema de computador para gerenciamento da criação compreen-dendo características físicas e genótipos correspondentes a um ou mais a-nimais, ou um meio legível de computador para gerenciamento da criaçãocompreendendo características físicas e genótipos correspondentes a umaou mais animais, ou características físicas e genótipos correspondentes aum ou mais animais, no qual a entrada característica física, crescimento oumérito de carcaça em gado bovino e o genótipo é um genótipo de CAST.

É notado que nesta descrição e particularmente nas reivindica-ções e/ou parágrafos, termos tais como "compreende", "compreendido","compreendendo" e similares podem ter o significado atribuído à lei de Pa-tente dos Estados Unidos; por exemplo, eles podem significar "inclui", "inclu-ido", "incluindo", e similares; e aqueles termos tais como "consistindo essen-cialmente em" e "consiste essencialmente em" têm os significados descritosna lei de Patente dos Estados Unidos; por exemplo, eles permitem elemen-tos não explicitamente recitados, mas excluem elementos que são encontra-dos na técnica anterior ou que afetam uma característica básica ou nova dainvenção.

Estas e outras concretizações são descritas ou são óbvias a par-tir de e envolvidas pela seguinte Descrição Detalhada.BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

A seguinte descrição detalhada, dada por meio de exemplo, masnão pretendida para limitar a invenção somente às concretizações específi-cas descritas, pode melhor ser compreendida em conjunto com os desenhosacompanhantes, em que:

A figura 1 proporciona uma anotação comparativa de ambos ge-nes CASThumano e bovino. A anotação recuperou o domínio XL na proteí-na de CAST humana, mostrando a mesma estrutura de gene encontrada nogene de CAST bovino. Os tamanhos de cada exon (humano/gado) são con-forme segue: exon 1, 30/30bp; exon 2, 63/63 bp; exon 3, 72/72 bp; exon 4,60/60 bp; exon 5, 66 bp; exon 6, 42/42 bp; exon 7, 57/57 bp; exon 8, 114/114bp; exon 9, 81/87 bp; exon 10, 69/69 bp; exon 11, 99/99 bp; exon 12, 81/81bp; exon 13, 39/39 bp; exon 14, 93/93 bp; exon 15, 87/90 bp; exon 16,102/102 bp; exon 17, 84/84 bp; exon 18, 48/48 bp; exon 19, 96/96 bp; exon20, 96/93 bp; exon 21, 102/102 bp; exon 22, 84/84 bp; exon 23, 51/51 bp;exon 24, 72/72 bp; exon 25, 99/99 bp; exon 26, 105/108 bp; exon 27, 93/93bp; exon 28, 45/48 bp; exon 29, 93/93 bp; exon 30, 72/72 bp; exon 31, 59/66bp (incluindo seqüência de não-codificação parcial), e exon 32, 198/2045 bp(seqüências 3'UTR em ambas as espécies). A 5'UTR é 148 bp em humano e128 bp de comprimento em gado. A distância de folga entre quaisquer doisexons não é proporcional ao tamanho do intron.

As figuras 2A-2E proporcionam uma seqüência de nucleotídeo(SEQ ID NO: 1) do promotor, 5'UTR (Negrito), exon 1 (Itálicos e Sublinha-dos) e seqüência parcial intron 1 do gene de CAST(AAFC02060382) bovino.Cada limite exon-intron está em caixa.

As figuras 3A-3D proporcionam vide uma seqüência de nucleotí-deo (SEQ ID NO: 2) do intron 1, exon 2 parcial (Itálicos e Sublinhados) e se-qüência parcial de intron 2 do gene de CAST(AAFC02161394) bovino. Cadalimite exon-intron está em caixa.

As figuras 4A-4C proporcionam vide uma seqüência de nucleotí-deo (SEQ ID NO: 3) do intron 2, exon 3 parcial (Itálicos e Sublinhados) e se-qüência parcial de intron 3 do gene de CAST(AAFC02179490) bovino. Cadalimite exon-intron está em caixa. Três mutações: G/A, C/T e T/G (foram colo-cadas em Negrito), que foram associadas com ambas fertilidade e longevi-dade em gado leiteiro.

As figuras 5A-5F proporcionam uma seqüência de nucleotídeo(SEQ ID NO: 4) do intron 3, exon 4 parcial (Itálicos e Sublinhados) e se-qüência parcial de intron 4 do gene de CAST(AAFC02060385) bovino. Cadalimite exon-intron está em caixa.

As figuras 6A-6E proporcionam uma seqüência de nucleotídeo(SEQ ID NO: 5) do intron 5, exons 5-16 parcial (Itálicos e Sublinhados), se-qüência de nucleotídeo parcial de introns 5 - 15 e intron 16 do gene deC/4ST(AAFC02060381) bovino. Cada limite exon-intron está em caixa. Umpolimorfismo de STR (GAAA) foi colocado em NEGRITO e associado comfertilidade e longevidade em gado leiteiro.

A figura 7 proporciona uma seqüência de nucleotídeo (SEQ IDNO: 6) do intron 16, exon 17 parcial (Itálicos e Sublinhados) e seqüênciaparcial de intron 17 do gene de CAST(AAFC02197217) bovino. Cada limiteexon-intron está em caixa.

As figuras 8A-8H proporcionam uma seqüência de nucleotídeo(SEQ ID NO: 7) do intron 17, exons 18-32 parcial (Itálicos e Sublinhados).seqüência de introns 18-31 e 3'UTR do gene de CAST(AAFC02067026)bovino. Cada limite exon-intron está em caixa.

As figuras 9A-9B proporcionam uma seqüência de nucleotídeo(SEQ ID NO: 7) e seqüência de aminoácido (SEQ ID NO: 8) da seqüência decodificação e in sílico identificação cSNP. Os SNPs potenciais estão em caixa.

As figuras 10A-10C proporcionam polimorfismos de seqüênciade nucleotídeo no gene de CAST bovino. A, duas mutações sem sentido A/Ge C/T em exon 3 (SEQ ID NOS. 10 e 11); B, a T/G substituição em intron 3(SEQ ID NOS. 12 e 13); e C, uma repetição GAAA em intron 8 (SEQ IDNOS. 14 e 15). Dois haplotipos existem na população: G-C-T-GAAAGAAAGAAAGAAA (SEQ ID NO: 16) (série superior) e A-T-G-GAAAGAAAGAAAGAAAGAAA (SEQ ID NO: 17) (série inferior).A figura 11 ilustra genotipagem de PCR-RFLP de uma substitui-ção C/T em in exon 3 de gene de CAST bovino. TT = 308 bp, CT = 135 +173 + 308 bp e CC = 135 + 173 bp, respectivamente.

A figura 12 ilustra um fluxograma da entrada de dados e a saídade resultados a partir da análise e correlação dos dados pertencentes à ge-ração, histórias veterinárias e requerimentos de desempenho de um grupode animais, tais como de um rebanho de vacas, e o fluxo interativo de dadosa partir do dispositivo auxiliado por computador para um corpo de estudantesque aprendem o uso do método da invenção.

A figura 13 ilustra os relacionamentos potenciais entre os ele-mentos de dados a serem admitidos no sistema. As setas unidirecionais in-dicam, por exemplo, que um celeiro é tipicamente pertencente a apenas umafazenda, pelo qual uma fazenda pode possuir vários celeiros. Similarmente,uma prescrição pode incluir produtos veterinários.

A figura 14A ilustra o fluxo de eventos no uso do sistema basea-do em computador portátil para entrada de dados na geração e criação deum rebanho de vacas.

A figura 14B ilustra o fluxo de eventos através das sub-rotinasrelacionadas a entrada de dados concernente ao gerenciamento da fazenda.

A figura 14C ilustra o fluxo de eventos através das sub-rotinasrelacionadas a entrada de dados concernente a dados específicos para umacompanhia.

A figura 15 ilustra um fluxograma da entrada de dados e a saídade resultados a partir da análise e a correlação dos dados pertencentes àgeração, histórias veterinárias e requerimentos de desempenho de um grupode animais.

DESCRIÇÃO DETALHADA

O gene de Calpastatin (CAST) é amplamente expresso na re-produção de tecidos/órgãos. Contudo, como este gene é relacionado à ferti-lidade, permanece largamente indeterminado. No presente estudo, os inven-tores descobriram associações significantes anteriormente não reportadasde mutações sem sentido em um domínio XL recentemente identificado degene de CAST bovino com fertilidade (taxa de gravidez de raça, DPR) e lon-gevidade (vida produtiva, PL) em gado leiteiro usando 652 progenitores deri-vados de sete antepassados. O alinhamento de ambos cDNA e seqüênciasde DNA genômico revelou três mutações sem sentido provisórias, mas duasdelas (G48D e P52L) em exon 3 (NM_174003.2:c.271G>A e 283C>T), quecorrespondem à região de domínio XL1 foram confirmadas por análise deseqüenciamento de duas reuniões de DNA e sete antepassados. Estas duasconfirmaram mutações sem sentido mais uma mutação em intron 3 (A-AFC02060381.1 :g.2110G>T), e uma repetição GAAA em intron 8 (A-AFC02060381.1 :g.6700[(GAAA)4]+[(GAAA)5] formou somente dois haploti-pos. Uma transição C/T foi então genotipada com enzima de restrição Msp\e usada para uma classificação de associação inicial e uma análise compre-ensiva final. Através da família, a análise indicou que o genótipo individualera uma fonte significante de variação (P < 0,0001) para DPR e PL, mas nãopara os traços de leite (P > 0,05). As hereditariedades realizadas foram es-timadas para serem 0,55 para DPR e 0,66 para PL, indicando que o gene decalpastatin bovino, quando utilizado em seleção auxiliada por marcador, de-ve acelerar o aperfeiçoamento de fertilidade em gado leiteiro.

Aspectos particulares proporcionam quarto novos polimorfismosincluindo duas mutações sem sentido que formam dois haplotipos em umnovo domínio N-terminal do gene bovino de calpastatin gene mostram asso-ciações significantes com fertilidade e longevidade em gado leiteiro.

Em aspectos específicos, duas mutações na região "XL" do genebovino de CASTforam identificadas, que conduzem a mudanças de aminoá-cido (G48D e P52L) em ambas as posições. A genotipagem dos marcadoresem 652 animais de sete famílias de progenitor descreveu uma forte associa-ção com DPR e PL em gado leiteiro. Os resultados atuais indicam que for-mas diferentes de gene de CAST podem estar envolvidas em trajetórias dife-rentes de várias células/tecidos por expressão de um efeito pleiotrófico emfunções diferentes.

Aspectos particulares proporcionam novos marcadores para fer-tilidade (por exemplo, taxa de gravidez da raça, DPR) e longevidade (porexemplo, vida produtiva, PL) em, por exemplo, gado leiteiro.

Aspectos adicionais proporcionam novos métodos compreen-dendo seleção auxiliada por marcador para aperfeiçoar fertilidade e/ou lon-gevidade em gado leiteiro. Em concretizações particulares, uma combinaçãode seleção genética baseada em um ou mais dos novos marcadores deCAST, e altos potenciais de PTA (capacidade de transmissão prognosticada)em traços de produção de leite, proporciona traços reprodutivos aperfeiçoa-dos em associação com traços de produção de leite altos continuados.

Aspectos adicionais descrevem um domínio XL anteriormentenão-reconhecido no gene humano de CAST, e, desse modo, proporciona ouso de mutantes/variantes de domínio XL de CAST humano como marcado-res de fertilidade e longevidade humana.

A prática da presente invenção empregará, a menos que de ou-tro modo indicado, técnicas convencionais de biologia molecular, microbiolo-gia, tecnologia de DNA recombinante, e imunologia, que estão dentro dosconhecimentos de um técnico no assunto. Tais técnicas são explanadas to-talmente na literatura. Ver, por exemplo, Sambrook et al. (2001) MolecularCloning: A Laboratory Manual, 3rd ed., Cold Spring Harbor Press; DNA Clo-ning, Vols. I e Il (D. N. Glover ed. 1985); Oligonucleotide Synthesis (M. J.Gait ed. 1984); Acid nucleic Hybridization (B. D. Hames & S. J. Higgins eds.1984); Animal Cell Culture (R. K. Freshney ed. 1986); Immobilized Cells eEnzymes (IRL press, 1986); Perbal, B., A Practical Guide to Molecular Clo-ning (1984); the series, Methods In Enzymology (S. Colowick e N. Kaplaneds., Academic Press, Inc.); e Handbook of Experimental Immunology, Vols.I-IV (D. M. Weir e C. C. Blackwell eds., 1986, Blackwell Scientific Publicati-ons).

Antes de se descrever a presente invenção em detalhes, é paraser compreendido que esta invenção não é limitada a DNA particular, se-qüências de polipeptídeo ou parâmetros de processo, como tais, podem va-riar. É também para ser compreendido que a terminologia aqui usada é paraa proposta de descrever concretizações articulares da invenção somente, enão é pretendida para ser limitante.A menos que de outro modo definido, todos os termos técnicos ecientíficos aqui usados têm o mesmo significado conforme comumente com-preendido por um técnico no assunto ao qual a invenção pertence. Emboraum número de métodos e materiais similares ou equivalentes àqueles des-critos aqui possam ser usados na prática da presente invenção, os materiaise métodos preferidos são aqui descritos.

Na descrição da presente invenção, os seguintes termos serãoempregados e são pretendidos para serem definidos conforme indicado a-baixo.

O termo "vaca" ou "gado" é usado geralmente para se referir aum animal de origem bovina de qualquer idade. Termos permutáveis incluem"bovino", "bezerro", "touro novo", "touro", "novilho", e similares. Ele tambéminclui um animal individual em todos os estágios de desenvolvimento, inclu-indo estágios embriônicos e fetais. Os animais conforme referidos aqui po-dem também incluir indivíduos ou grupos de indivíduos que ocorreram deoutra produção de alimento diferente, tal como, mas não limitado a, animaistransgênicos para a produção de biofarmacêuticos incluindo anticorpos eoutras proteínas, ou produtos de proteína.

Pelo termo "complementaridade" ou "complementar" é significa-tivo, para a proposta do relatório descritivo ou reivindicações, um númerosuficiente no oligonucleotídeo de pares bases complementares em sua se-qüência para interagir especificamente (hibridiza) com uma seqüência deácido nucléico alvo do polimorfismo de gene a ser amplificado ou detectado.Conforme conhecido àqueles técnicos no assunto, um grau muito alto decomplementaridade é necessário para especificidade e sensibilidade envol-vendo hibridização, embora não seja necessário ser 100%. Desse modo, porexemplo, um oligonucleotídeo que é idêntico na seqüência de nucleotídeo aum oligonucleotídeo aqui descrito, exceto para uma mudança ou substituiçãobase, pode funcionar equivalentemente aos oligonucleotídeos descritos. Um"DNA complementa" ou "gene de cDNA" inclui genes recombinantes sinteti-zados por transcrição reversa de RNA mensageiro ("mRNA").

Uma "reação mediada por polimerase cíclica" se refere a umareação biomédica na qual uma molécula gabarito ou uma população de mo-léculas gabaritos é periodicamente e repetidamente para criar uma moléculagabarito complementar, ou moléculas gabaritos complementares, aumen-tando, desse modo, o número das moléculas gabaritos com o tempo.

Pelo termo "porção detectável" é significativo, para a proposta dorelatório descritivo e reivindicações, uma molécula de etiqueta (isotópica ounão-isotópica) que é incorporada indiretamente ou diretamente em um oligo-nucleotídeo, no qual a molécula de etiqueta facilita a detecção do oligonu-cleotídeo no qual ela é incorporada, por exemplo, quando o oligonucleotídeoé hibridizado às seqüências polimórficas de gene amplificadas. Desse modo,"porção detectável" é usada sinonimamente como "molécula de etiqueta". Asíntese de oligonucleotídeos pode ser acompanhada por qualquer um devários métodos conhecidos àqueles técnicos no assunto. As moléculas deetiqueta, conhecidas àqueles técnicos no assunto como sendo úteis paradetecção, incluem moléculas quimioluminescentes, fluorescentes ou Iumi-nescentes. Várias moléculas fluorescentes são conhecidas na técnica quesão adequadas para uso para etiquetar um ácido nucléico para o método dapresente invenção. O protocolo para tal incorporação pode variar dependen-do da molécula fluorescente usada. Tais protocolos são conhecidos na téc-nica para a respectiva molécula fluorescente.

"Amplificação de DNA", conforme aqui usado, se refere a qual-quer processo que aumente o número de cópias de uma seqüência de DNAespecífica por amplificação enzimática da seqüência de ácido nucléico. Umavariedade de processos é conhecida. Um dos mais comumente usado é umprocesso de reação de cadeia de polimerase (PCR) de Mullis conforme des-crito nas Patentes dos Estados Unidos N2s 4,683,195 e 4,683,202. Métodos,dispositivos e reagentes conforme descritos nas Patentes dos Estados Uni-dos Nos 6,951,726; 6,927,024; 6,924,127; 6,893,863; 6,887,664; 6,881,5596,855,522; 6,855,521; 6,849,430; 6,849,404; 6,846,631; 6,844,158;6,844,155; 6,818,437; 6,818,402; 6,794,177; 6,794,133 6,790,952;6,783,940; 6,773,901; 6,770,440; 6,767,724; 6,750,022; 6,744,789;6,733,999; 6,733,972; 6,703,236; 6,699,713; 6,699,277; 6,664,080;6,664,064 6,664,044 RE38,352 6,650,719 6,645,758 6,645,720 6,642,000 6,638,716 6,632,653 6,617,107 6,613,560 6,610,487 6,596,492 6,586,250 6,586,233 6,569,678 6,569,627 6,566,103 6,566,067 6,566,052 6,558,929 6,558,909 6,551,783 6,544,782 6,537,752 6,524,830 6,518,020 6,514,750 6,514,706 6,503,750 6,503,705 6,493,640 6,492,114 6,485,907 6,485,903 6,482,588 6,475,729 6,468,743 6,465,638 6,465,637 6,465,171 6,448,014 6,432,646 6,428,987 6,426,215 6,423,499 6,410,223 6,403,341 6,399,320 6,395,518 6,391,559 6,383,755 6,379,932 6,372,484 6,368,834 6,365,375 6,358,680 6,355,422 6,348,336 6,346,384 6,319,673 6,316,195 6,316,192 6,312,930 6,309,840 6,309,837 6,303,343 6,300,073 6,300,072 6,287,781 6,284,455 6,277,605 6,270,977 6,270,966 6,268,153 6,268,143 D445,907 6,261,431 6,258,570 6,258,567 6,258,537 6,258,529 6,251,607 6,248,567 6,235,468 6,232,079 6,225,093 6,221,595 D441,091 6,218,153 6,207,425 6,183,999; 6,183,963; 6,180,372; 6,180,349 6,174,670 6,153,412 6,146,834 6,143,496 6,140,613 6,140,110 6,103,468 6,087,097 6,072,369 6,068,974 6,063,563 6,048,688 6,046,039 6,037,129 6,033,854 6,031,960 6,017,699 6,015,664 6,015,534 6,004,747 6,001,612 6,001,572 5,985,619 5,976,842 5,972,602 5,968,730 5,958,686 5,955,274 5,952,200 5,936,968 5,909,468 5,905,732 5,888,740 5,883,924 5,876,978 5,876,977 5,874,221 5,869,318 5,863,772 5,863,731 5,861,251 5,861,245 5,858,725 5,858,718 5,856,086 5,853,991 5,849,497 5,837,468 5,830,663 5,827,695 5,827,661 5,827,657 5,824,516 5,824,479 5,817,797 5,814,489 5,814,453 5,811,296; 5,804,383; 5,800,997; 5,780,271 5,780,222 5,776,686 5,774,497 5,766,889 5,759,822 5,750,347 5,747,251 5,741,656 5,716,784 5,712,125 5,712,090 5,710,381 5,705,627 5,702,884 5,693,467 5,691,146 5,681,741 5,674,717 5,665,572 5,665,539 5,656,493 5,656,461 5,654,144 5,652,102 5,650,268 5,643,765 5,639,871 5,639,611 5,639,606 5,631,128 5,629,178 5,627,054 5,618,703 5,618,702 5,614,388 5,610,0175,602,756 5,599,674 5,589,333 5,585,238 5,576,197 5,565,340;5,565,339 5,556,774 5,556,773 5,538,871 5,527,898 5,527,5105,514,568 5,512,463 5,512,462 5,501,947 5,494,795 5,491,2255,487,993 5,487,985 5,484,699 5,476,774 5,475,610 5,447,8395,437,975 5,436,144 5,426,026 5,420,009 5,411,876 5,393,6575,389,512 5,364,790 5,364,758 5,340,728 5,283,171 5,279,9525,254,469 5,241,363 5,232,829 5,231,015 5,229,297 5,224,7785,219,727 5,213,961 5,198,337 5,187,060 5,142,033 5,091,3105,082,780 5,066,584; 5,023,171 e 5 008,182, podem também ser emprega- dos na prática da presente invenção. PCR envolve o uso de um DNA polime-rase termoestável, seqüências conhecidas de prímeres, e ciclos de aqueci-mento, que separam o ácido deoxirribonucléico (DNA) de replicação, trança-dos e amplificam exponencialmente um gene de interesse. Qualquer tipo dePCR1 tais como PCR quantitativa, RT-PCR, PCR de partida quente, LAPCR,PCR multiplex, PCR "touchdown" PCR, etc., podem ser usados. Vantajosa-mente, PCR de tempo real é usada. Em geral, o processo de amplificaçãode PCR envolve uma reação de cadeia enzimática cíclica para preparaçãode quantidades exponenciais de uma seqüência de ácido nucléico específi-ca. Ela requer uma pequena quantidade de uma seqüência para iniciar areação de cadeia e prímeres de oligonucleotídeo que hibridizarão para a se-qüência. Na PCR, os prímeres são recozidos para desnaturar ácido nucléico,seguido por extensão com um agente de indução (enzima), e nucleotídeos.Isto resulta em produtos de extensão recentemente sintetizados. Desde queestas seqüências recentemente sintetizadas tornam-se gabaritos para osprímeres, ciclos repetidos de desnaturação, recozimento de prímer e exten-são resultam em acúmulo exponencial da seqüência específica sendo ampli-ficada. O produto de extensão da reação de cadeia será um ácido nucléicodistinto dúplex com um terminal correspondendo às extremidades dos príme-res empregados.

Pelos termos "amplificar enzimaticamente" ou "amplificar", é sig-nificativo, para a proposta do relatório descritivo e reivindicações, amplifica-ção de DNA, isto, um processo pelo qual seqüências de ácido nucléico sãoamplificadas em número. Existem vários meios para amplificar enzimatica-mente seqüências de ácido nucléico. Atualmente o método mais comumenteusado é a reação de cadeia de polimerase (PCR). Outros métodos de ampli-ficação incluem LCR (reação de cadeia de ligase) que utiliza Iigase de DNA,e uma sonda consistindo em duas metades de um segmento de DNA que écomplementar à seqüência do DNA a ser amplificada, enzima QB replicase eum gabarito de seqüência de ácido ribonucléico (RNA) fixado a uma sondacomplementar ao DNA a ser copiado que é usado para produzir um gabaritode DNA para produção exponencial de RNA complementar; amplificação dedeslocamento de trançado (SDA); amplificação de replicase Q3 (QBRA);replicação auto-sustentada (3SR); e NASBA (amplificação baseada em se-qüência de ácido nucléico), que podem ser realizadas em RNA ou DNA con-forme a seqüência de ácido nucléico a ser amplificada.

Um "fragmento" de uma molécula, tal como uma proteína ou áci-do nucléico é significativo se referir a qualquer porção do aminoácido ou se-qüência genética de nucleotídeo.

Conforme aqui usado, o termo "genoma" se refere a todo o ma-terial genético nos cromossomos de um organismo particular. Sua dimensãoé geralmente dada como seu número total de pares bases. Dentro do geno-ma, o termo "gene" se refere a uma sequíssima ordenada de nucleotídeoslocalizada em uma posição particular em um cromossomo particular que co-difica um produto funcional específico (por exemplo, uma proteína ou molé-cula de RNA). Em geral, características genéticas animais, conforme defini-das pela seqüência de nucleotídeo de seu genoma, são conhecidas comoseu "genótipo," enquanto os traços físicos do animal são descritos como seu"fenótipo".

Por "heterozigoto" ou "polimorfismo heterozigoto" é significativoque os dois alelos de uma célula diplóide ou organismo em um dado localsão diferentes, isto é, que eles têm um nucleotídeo diferente trocado pelomenos nucleotídeo no mesmo lugar em suas seqüências.

Por "homozigoto" ou "polimorfismo homozigoto" é significativoque os dois alelos de uma célula diplóide ou organismo em um dado localsão idênticos, isto é, que eles têm o mesmo nucleotídeo para troca de nu-cleotídeo no mesmo lugar em suas seqüências.

Por "hibridização" ou "hibridizar", conforme aqui usado, é signifi-cativo à formação de pares base A-T e C-G entre a seqüência de nucleotí-deo de um fragmento de um segmento de um polinucleotídeo e uma se-qüência de nucleotídeo complementar de um oligonucleotídeo. Por comple-mentar é significativo que no local de cada A, C, G ou T (ou U em um ribo-nucleotídeo) na seqüência de fragmento, a oligosseqüência de nucleotídeotem um T, G, C ou A, respectivamente. O fragmento/oligonucleotídeo hibridi-zado é denominado um "dúplex".

Um "complexo de hibridização", tal como em um ensaio interca-lado, significa um complexo de moléculas de ácido nucléico incluindo pelomenos o ácido nucléico alvo e um sonda de sensor. Pode-se também incluiruma sonda de âncora.

Conforme aqui usado, o termo "locus" ou "loci" se refere ao localde um gene em um cromossomo. Pares de genes, conhecidos como "ale-los", controlam o traço hereditário produzido por um lócus de gene. Cadacombinação particular do animal de alelos é referida como seu "genótipo".Onde ambos alelos são idênticos, o indivíduo é referido para ser referidocomo sendo homozigoto para o traço controlado por este par de gene; ondeos alelos são diferentes, o indivíduo é referido como sendo heterozigoto parao traço.

Uma "temperatura de fusão" é significativa à temperatura na qualdúpleces hibridizados dehibridizam e retornam para seu estado trançadosimples. Do mesmo modo, hibridização não ocorrerá no primeiro local entredois oligonucleotídeos, ou, aqui, um oligonucleotídeo e um fragmento, emtemperaturas acima da temperatura de fusão do dúplex resultante. É atual-mente vantajoso que a diferença nas temperaturas de ponto de fusão dedúpleces de oligonucleotídeo-fragmento desta invenção seja de cerca de1°C a cerca de 10°C de modo a ser prontamente detectável.

Conforme aqui usado, o termo "molécula de ácido nucléico" épretendido para incluir moléculas de DNA (por exemplo, cDNA ou DNA ge-nômico), moléculas de RNA (por exemplo, mRNA), análogos do DNA ouRNA gerados usando-se análogos de nucleotídeo, e derivados, fragmentos ehomólogos destes. A molécula de ácido nucléico pode ser de trançado sim-ples ou de trançado duplo, mas a molécula pode ser de trançado simples oude trançado dupla, mas vantajosamente é DNA de trançado duplo. "DNA" serefere à forma polimérica de deoxirribonucleotídeos (adenina, guanina, timi-na, ou citosina) em sua forma de ou trançada simples, ou uma espiral detrançado duplo. Este termo se refere somente à estrutura primária e secun-dária da molécula, e não se limita a quaisquer formas terciárias particulares.

Desse modo, este termo inclui DNA de trançado duplo encontrado, entreoutros, em moléculas de DNA lineares (por exemplo, fragmentos de restri-ção), vírus, plasmídeos, e cromossomos. Na discussão da estrutura de mo-léculas de DNA de trançado duplo, seqüências podem ser descritas aqui deacordo com a convenção normal de dar somente a seqüência na direção 5' a3' ao longo do trançado não-transcrito de DNA (isto é, o trançado tendo umaseqüência homóloga para o mRNA). Uma molécula de ácido nucléico "isola-da" é separada de outras moléculas de ácido nucléico que estão presentesna fonte natural do ácido nucléico.

Um "nucleosídeo" se refere a uma base ligada a um açúcar. Abase pode ser adenina (A), guanina (G) (ou seu substituto, inosina (I)), cito-sina (C), ou timina (T) (ou seu substituto, uracil (U)). O açúcar pode ser ribo-se (o açúcar de um nucleotídeo natural no RNA) ou 2-deoxirribose (o açúcarde um nucleotídeo natural em DNA). Um "nucleotídeo" se refere a um nucle-osídeo ligado a um grupo fosfato simples.

Conforme aqui usado, o termo "oligonucleotídeo" se refere auma série de resíduos de nucleotídeo ligados, cujo oligonucleotídeo tem umnúmero suficiente de bases de nucleotídeo a serem usadas em uma reaçãode PCR. Uma oligosseqüência curta de nucleotídeo pode ser baseada em,ou designada de, uma seqüência genômica ou de cDNA, e é usada paraamplificar, confirmar, ou descrever a presença de um DNA ou RNA idêntico,similar ou complementar em uma célula ou tecido particular. Os oligonucleo-tídeos podem ser quimicamente sintetizados, e podem ser usados comoprímeres ou sondas. O oligonucleotídeo significa qualquer nucleotídeo demais do que 3 bases de comprimento usadas para facilitar a detecção ouidentificação de um ácido nucléico alvo, incluindo sondas e prímeres.

Uma "polimerase" é uma enzima que catalisa a adição seqüen-ciai de unidades monoméricas a uma cadeia polimérica, ou liga duas oumais unidades monoméricas para iniciar uma cadeia polimérica. A "polime-rase" operará pela adição de unidades monoméricas cuja identidade é de-terminada por, e que é complementar a uma molécula gabarito de uma se-qüência específica. Por exemplo, DNA polimerases, tais como DNA pol 1 eTaq polimerase adicionam deoxirribonucleotídeos à extremidade 3' de umacadeia de polinucleotídeo em uma maneira dependente do gabarito, sinteti-zando, desse modo, um ácido nucléico que é complementar à molécula ga-barito. Polimerases podem ser usadas, ou para entender um prímer umavez, ou repetitivamente, ou para amplificar um polinucleotídeo por prímerrepetitiva de dois trançados complementares usando dois prímeres. Uma"polimerase termoestável" se refere a uma enzima de DNA ou RNA polime-rase que pode suportar temperaturas extremamente altas, tais como aquelasque se aproximam de 100QC. Freqüentemente, polimerases termoestáveissão derivadas de organismos que vivem em temperaturas extremas, taiscomo Thermus aquaticus. Exemplos de polimerases termoestáveis incluemTaq, Tth, Pfu, Vent, "deep vent", UITma, e variações e derivados destes.

Um "polinucleotídeo" se refere a uma cadeia linear de nucleotí-deos conetada por uma ligação de fosfodiéster entre o grupo 3'-hidroxil deum nucleosídeo no grupo 5'-hidroxil de um segundo nucleosídeo que, porsua vez, é ligada através de seu grupo 3'-hidroxil ao grupo 5'-hidroxil de umterceiro nucleosídeo e assim por diante, para formar um polímero compre-endido de nucleosídeos ligados por um suporte de fosfodiéster. Um "polinu-cleotídeo modificado" se refere a um polinucleotídeo em que um ou maisnucleotídeos naturais foram parcialmente, substancialmente ou completa-mente substituídos com nucleotídeos modificados.

Um "prímer" é um oligonucleotídeo, a seqüência de pelo menosa porção do qual é complementar a um segmento de um DNA gabarito que épara ser amplificado ou replicado. Tipicamente prímeres são usados na rea-lização da reação de cadeia de polimerase (PCR). Um prímer hibridiza com(ou "é recozido") ao DNA gabarito, e é usado pela enzima de polimerasecomo o ponto de partida para o processo de replicação/amplificação. Osprímeres aqui são selecionados para serem "substancialmente" complemen-tares a trançados diferentes de uma seqüência de DNA alvo particular. Istosignifica que os prímeres devem ser suficientemente complementares parahibridizarem com seus respectivos trançados. Portanto, a seqüência de prí-mer não necessita refletir a seqüência exata do gabarito. Por exemplo, umfragmento de nucleotídeo não-complementar pode ser fixado à extremidade5' do prímer, com o restante da seqüência de prímer sendo complementar aotrançado. Alternativamente, bases não-complementares ou seqüências maislongas podem ser interespersadas no prímer, provido que a seqüência deprímer tem complementaridade suficiente com a seqüência do trançado parahibridizar com este e, desse modo, formar o gabarito para a síntese do pro-duto de extensão.

"Sondas" se referem às seqüências de ácido nucléico de nucleo-tídeos de comprimento variáveis, usadas na detecção de seqüências de áci-do nucléico idênticas, similares, ou complementares por hibridização. Umaoligosseqüência de nucleotídeo usada como uma sonda de detecção podeser etiquetada com uma porção detectável.

Os seguintes são exemplos não-limitativos de polinucleotídeos:um gene ou fragmento de gene, exons, introns, mRNA, tRNA, rRNA, ribozi-mas, cDNA, polinucleotídeos recombinantes, polinucleotídeos ramificados,plasmídeos, vetores, DNA isolado de qualquer seqüência, RNA isolado dequalquer seqüência, sondas de ácido nucléico e prímeres. Um polinucleotí-deo pode compreender nucleotídeos modificados, tais como nucleotídeosmetilatados e análogos de nucleotídeo, uracil, outros açúcares, e grupos deligação, tais como fluororibose e tiolato, e ramificações de nucleotídeo. Aseqüência de nucleotídeos pode ser adicionalmente modificada após polime-rização, tal como por conjugação, com um componente de etiquetação. Ou-tros tipos de modificações incluídos nesta definição são coberturas, substitu-ição de um ou mais nucleotídeos que ocorrem naturalmente com um análo-go, e introdução de meios para fixação do polinucleotídeo às proteínas, íonsmetálicos, componentes de etiquetação, outros polinucleotídeos ou suportesólido.

Um polinucleotídeo ou polipeptídeo "isolado" é um que é subs-tancialmente puro de materiais com o qual ele está associado em seu ambi-ente nativo. Por substancialmente livre, é significativo pelo menos 50%, pelomenos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, e vantajosamente pelo me-nos 70%, pelo menos 75%, mais vantajosamente pelo menos 80%, pelomenos 85%, ainda mais vantajosamente pelo menos 90%, pelo menos 91%,pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelomenos 96%, pelo menos 97%, mais vantajosamente pelo menos 98%, pelomenos 99%, pelo menos 99,5%, pelo menos 99,9% livre destes materiais.

Uma molécula de ácido nucléico "isolada" é uma molécula deácido nucléico separada e distinta a partir de todo organismo com o qual amolécula é encontrada na natureza; ou uma molécula de ácido nucléico des-tituída, no todo ou em parte, de seqüências normalmente associadas comela na natureza; ou uma seqüência, conforme ela existe na natureza, mastendo seqüências heterólogas (conforme definido abaixo) em associaçãocom esta.

O termo "polinucleotídeo que codifica uma proteína", conformeaqui usado, se refere a um fragmento de DNA ou molécula de DNA isoladaque codifica uma proteína, ou o trançado complementar a esta; mas, RNAnão é excluído, conforme é compreendido na técnica que timidina (T) emuma seqüência de DNA é considerada igual à uracil (U) em uma seqüênciade RNA. Desse modo, seqüências de RNA para uso na invenção, por exem-plo, para uso em vetores de RNA, podem ser derivadas de seqüências deDNA1 por timidina (T) na seqüência de DNA sendo considerada igual à uracil(U) nas seqüências de RNA.

Uma "seqüência de codificação" de DNA, ou uma "seqüência denucleotídeo que codifica" uma proteína particular, é uma seqüência de DNAque é transcrita e transladada em um polipeptídeo in vitro ou in vivo quandocolocado sob o controle de elementos regulatórios apropriados. Os limites daseqüência de codificação são determinados por um códon de partida no tér-mino 5' (amino) e um códon de parada de translação no término 3' (carbóxi).Uma seqüência de codificação pode incluir, mas é limitada a, seqüênciasprocarióticas, cDNA de mRNA eucariótico, seqüências de DNA genômico deDNA eucariótico (por exemplo, mamífero), e ainda seqüências de DNA sinté-ticas. Uma seqüência de terminação de transcrição estará usualmente loca-lizada 3' à seqüência de codificação.

"Homologia" se refere à percentagem de identidade entre doispolinucleotídeos ou duas porções de polipeptídeo. Dois DNAs, ou duas se-qüências de polipeptídeo são "substancialmente homólogas" umas as outrasquando as seqüências exibem pelo menos cerca de 80%, 81%, 82%, 83%,84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, preferivelmente pelo menos cerca de90%, 91%, 92%, 93%, 94%, e mais preferivelmente pelo menos cerca de95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5%, 99,9% de identidade de seqüência so-bre um comprimento definido das moléculas. Conforme aqui usado, subs-tancialmente homólogo também se refere às seqüências que mostram iden-tidade completa (100% de identidade de seqüência) ao DNA especificado ouseqüência de polipeptídeo.

Homologia pode ser determinada por hibridização de polinucleo-tídeos sob condições que formam dúpleces estáveis entre regiões homólo-gas, seguido por digestão com nuclease (s) específica(s) de trançado sim-ples, e determinação de tamanho dos fragmentos digeridos. As seqüênciasde DNA que são substancialmente homolólogas podem ser identificadas emum experimento de hibridização no Sul sob, por exemplo, condições estrin-gentes, conforme definido para aquele sistema particular. A definição decondições de hibridização apropriadas está dentro do conhecimento do téc-nico no assunto. Ver, por exemplo, Sambrook et al. supra; DNA Cloning, su-pra; Acid nucleic Hibridization, supra.

Dois fragmentos de ácido nucléico são considerados ser "seleti-vamente hibridizáveis" a um polinucleotídeo se eles são capazes de se hibri-dizarem especificamente a um ácido nucléico, ou uma variante deste, ouespecificamente acelerando uma reação de cadeia de polimerase: (i) sobhibridização típica e condições de lavagem, conforme descrito, por exemplo,em Sambrook et al. supra e Acid nucleic Hibridização, supra, (ii) usando-secondições de lavagem de estringência reduzida que permitem ao menoscerca de 25-30% desequiparações de par base, por exemplo: 2x SSC, 0,1%de SDS, temperatura ambiente duas vezes, 30 minutos cada; em seguida 2xSSC, 0,1% de SDS, 37°C uma vez, 30 minutos; em seguida 2 χ SSC tempe-ratura ambiente duas vezes, 10 minutos cada, ou (iii) seleção de prímerespara uso em reações de cadeia de polimerase típicas (PCR) sob condiçõespadrão (descrito por exemplo, em Saiki, et al. (1988) Science 239:487-491).

O termo "capaz de hibridizar sob condições estringentes", con-forme aqui usado, se refere a recozimento de um primeiro ácido nucléico aum segundo ácido nucléico sob condições estringentes, conforme definidoabaixo. Condições de hibridização estringentes tipicamente permitem a hi-bridização de moléculas de ácido nucléico tendo pelo menos 70% de identi-dade de seqüência de ácido nucléico com a molécula de ácido nucléico sen-do usada como uma sonda na reação de hibridização. Por exemplo, o pri-meiro ácido nucléico pode ser uma amostra teste ou sonda, e o segundoácido nucléico pode ser o trançado de sentido ou de anti-sentido de um áci-do nucléico, ou um fragmento deste. A hibridização dos primeiro e segundoácidos nucléicos pode ser conduzida sob condições estringentes, por exem-plo, alta temperatura e/ou baixo teor de sal, que tende a desfavorecer a hi-bridização de seqüências dissimilares de nucleotídeos. Alternativamente, ahibridização dos primeiro e segundo ácidos nucléicos pode ser conduzidasob condições de estringência reduzidas, por exemplo, baixa temperaturae/ou alto teor de sal, que tende a favorecer a hibridização de seqüênciasdissimilares de nucleotídeos. Condições de hibridização de baixa estringên-cia podem ser seguidas por condições de alta estringência, ou condições deestringência de meio intermediário para aumentar a seletividade da ligaçãodos primeiro e segundo ácidos nucléicos. As condições de hibridização po-dem adicionalmente incluir reagentes, tais como, mas não limitados a, dime-til sulfóxido (DMSO) ou formamida para desfavorecer ainda adicionalmente ahibridização de seqüências dissimilares de nucleotídeos. Um protocolo dehibridização adequado pode, por exemplo, envolver hibridização em 6 χ SSC(no qual 1 χ SSC compreende citrato de sódio 0,015 M e cloreto de sódio0,15 M), a 65° Celsius em uma solução aquosa, seguido por lavagem com 1χ SSC a 65° C. Fórmulas para calcular hibridização apropriada e condiçõesde lavagem para alcançar hibridização permitindo 30% ou menos de dese-quiparação entre duas moléculas de ácido nucléico são descritas, por exem-plo, em Meinkoth et al. (1984) Anal. Biochem. 138: 267-284; o conteúdo doqual sendo aqui incorporado por referência em sua totalidade. Os protocolospara técnicas de hibridização são bem-conhecidos àqueles técnicos no as-sunto, e manuais de biologia molecular padrão podem ser consultados paraselecionar um protocolo de hibridização adequado sem experimentação in-devida. Ver, por exemplo, Sambrook et al. (2001) Molecular Cloning: A Labo-ratory Manual, 3rd ed., Cold Spring Harbor Press, os conteúdos do qual sen-do aqui incorporados por referência em sua totalidade.

Tipicamente, condições estringentes serão aquelas em que aconcentração de sal é menor do que cerca de 1,5 M de íon sódio, tipicamen-te cerca de 0,01 a 1,0 M de concentração de íon Na (ou outros sais) de cer-ca de pH 7,0 a cerca de pH 8,3, e a temperatura é pelo menos cerca de 30°Celsius para sondas curtas (por exemplo, 10 a 50 nucleotídeos), e pelo me-nos cerca de 60° C para sondas longas (por exemplo, maiores do que 50nucleotídeos). Condições estringentes podem também ser alcançadas com aadição de agentes de desestabilização tal como formamida. Condições debaixa estringência adequadas incluem hibridização com uma solução tam-pão de 30 a 35% de formamida, 1 M NaCI, 1% de SDS (sódio dodecil sulfa-to) a 37° Celsius, e uma lavagem em 1-2 χ SSC a 50 a 55° Celsius. Condi-ções de estringência moderadas exemplares incluem hibridização em 40 a45% de formamida, 1 M NaCI, 1 % de SDS a 37° Celsius, e uma lavagem em0,5-1 χ SSC a 55 to 60° Celsius. Condições de estringência altas exemplaresincluem hibridização em 50% de formamida, 1 M NaCI, 1% de SDS a 37°Celsius, e uma lavagem em 0,1 χ SSC a 60 a 65° Celsius.

Os métodos e materiais da invenção podem ser usados maisgeralmente para avaliar uma amostra de DNA de um animal, geneticamentetipo um animal individual, e detectar diferenças genéticas em animais. Emparticular, uma amostra de DNA genômico de um animal pode ser avaliadapor referência a um ou mais controles para determinar se um SNP, ou grupode SNPs, em um gene, está presente. Qualquer método para determinaçãodo genótipo pode ser usado para determinação do genótipo na presente in-venção. Tais métodos incluem, mas não estão limitados a, seqüenciamentode amplimer, seqüenciamento de DNA, espectroscopia de fluorescência,análise de hibridização baseada em transferência de energia de ressonânciade fluorescência (ou "FRET"), classificação de alta produção, espectroscopiade massa, análise de microsatélite, hibridização de ácido nucléico, reação decadeia de polimerase (PCR), análise de RFLP, e cromatografia de dimensão(por exemplo, cromatografia capilar ou de gel), todos dos quais são bem-conhecidos a um técnico no assunto. Em particular, métodos para determi-nação de polimorfismos de nucleotídeo, particularmente polimorfismo de nu-cleotídeo simples, são descritos nas Patentes dos Estados Unidos N—6,514,700; 6,503,710; 6,468,742; 6,448,407; 6,410,231; 6,383,756;6,358,679; 6,322,980; 6,316,230; e 6,287,766, e revisados por Chen e Sulli-van, Pharmacogenomics J 2003;3(2):77-96, as revelações dos quais sendoincorporadas por referência em sua totalidade. Dados genotípicos úteis nosmétodos da invenção e métodos para a identificação e seleção de traços deanimal são baseados na presença de SNPs.

Um "fragmento de restrição" se refere a um fragmento de umpolinucleotídeo gerado por uma endonuclease de restrição (um enzima quecliva ligações de fosfodiéster dentro de uma cadeia de polinucleotídeo) quecliva DNA em resposta a um local de reconhecimento no DNA. O local dereconhecimento (local de restrição) consiste em uma seqüência específicade nucleotídeos tipicamente cerca de 4-8 nucleotídeos de comprimento.

A "polimorfismo de nucleotídeo simples" ou "SNP" se refere auma variação na seqüência de nucleotídeo de um polinucleotídeo que diferede outro polinucleotídeo por uma diferença simples de nucleotídeo. Por e-xemplo, sem limitação, a troca de um A por um C, G ou T na seqüência totalde polinucleotídeo constitui um SNP. É possível ter-se mais do que um SNPem um polinucleotídeo particular. Por exemplo, em uma posição em um poli-nucleotídeo,.um C pode ser trocado por um T1 em outra posição, um G podeser trocado por um A, e assim por diante. Quando se refere à SNPs, o poli-nucleotídeo é mais freqüentemente DNA.

Conforme aqui usado, um "gabarito" se refere a um trançado depolinucleotídeo alvo, por exemplo, sem limitação, um trançado de DNA queocorre naturalmente não-modificado, que uma polimerase usa como ummeio de reconhecer qual nucleotídeo deve em seguida se incorporar em umtrançado em crescimento para polimerizar o complemento do trançado queocorre naturalmente. Tal trançado de DNA pode ser de trançado simples, oupode ser parte de um gabarito de DNA de trançado duplo. Nas aplicações dapresente invenção que requer ciclos repetidos de polimerização, por exem-plo, a reação de cadeia de polimerase (PCR), o próprio trançado do gabaritopode se tornar modificado pela incorporação de nucleotídeos modificados,servindo ainda como um gabarito para uma polimerase para sintetizar poli-nucleotídeos adicionais.

Uma "reação termocíclica" é uma reação de etapa múltipla naqual pelo menos duas etapas são efetuadas pela mudança da temperaturada reação.

Uma "variação" é uma diferença na seqüência de nucleotídeoentre polinucleotídeos relacionados. A diferença pode ser a retirada de umou mais nucleotídeos a partir da seqüência de um polinucleotídeo compara-da à seqüência de um polinucleotídeo relacionado, a adição de um ou maisnucleotídeos ou a substituição de um nucleotídeo por outro. Os termos "mu-tação," "polimorfismo" e "variação" são usados aqui permutavelmente. Con-forme aqui usado, o termo "variação" no singular é para ser construído paraincluir variações múltiplas; isto é, duas ou mais adições, retiradas e/ou subs-tituições de nucleotídeo no mesmo polinucleotídeo. Uma "mutação de ponto"se refere a uma substituição simples de um nucleotídeo por outro.

Conforme aqui usado, os termos "traços", "traços de qualidade"ou "características físicas" ou "fenótipos" se referem a propriedades vantajo-sas do animal resultante das genéticas. Traços de qualidade incluem, masnão estão limitados a, a capacidade genética do animal de metabolizar efici-entemente energia, produzir carne ou leite, acumular gordura intramuscular.As características físicas incluem, mas não estão limitadas a, carnes marmo-readas, macias ou magras. Os termos podem ser usados permutavelmente.

Um "sistema de computador" se refere a meios de hardware,meios de software e meios de armazenagem de dados usados para compilaros dados da presente invenção. Os meios mínimos de hardware de sistemasbaseados em computador da invenção podem compreender uma unidade deprocessamento central (CPU), meios de entrada, meios de saída, e meios dearmazenagem de dados. Desejavelmente, um monitor é provido para visua-lizar os dados da estrutura. Os meios de armazenagem de dados podem serRAM ou outros meios para acessar meios legíveis de computador. Exemplosde tais sistemas são estações de operação de microcomputador disponíveisde Silicon Graphics Incorporated e Sun Microsystems running Unix based,Linux, Windows NT, XP, ou sistemas de operação IBM OS/2.

"Meios de leitura de computador" se referem a quaisquer meiosque podem ser lidos e acessados diretamente por um computador, e inclu-em, mas não é limitado a: meios de armazenagem magnética tais como dis-cos flexíveis, meios de armazenagem rígidos e fitas magnéticas; meios dearmazenagem óticos, tais como discos óticos ou CD-ROM; meios de arma-zenagem elétricos, tais como RAM e ROM; e híbridos destas categorias, taiscomo meios magnéticos/óticos. Pela provisão de meios de leitura de compu-tador, os dados compilados em um animal particular podem ser rotineira-mente acessados por um usuário, por exemplo, um operador de alimento.

O termo "módulo de análise de dados" é definido aqui para inclu-ir qualquer pessoa ou máquina, que operam individualmente ou juntos, queanalisam a amostra e determinam à informação genética contida nos mes-mos. O termo pode incluir uma pessoa ou máquina dentro de um ajuste delaboratório.

Conforme aqui usado, o termo "módulo de coleta de dados" serefere a qualquer pessoa, objeto ou sistema que obtém uma amostra de te-cido de um animal ou embrião. Por exemplo, e sem limitação, o termo podedefinir, individualmente ou coletivamente, a pessoa ou máquina em contatofísico com o animal conforme a amostra é tomada, os recipientes que man-têm as amostras de tecido, o acondicionamento usado para transporte dasamostras, e similares. Vantajosamente, o coletor de dados é uma pessoa.Mais vantajosamente, o coletor de dados é um fazendeiro, um criador ou umveterinário.

O termo "interface de rede" é definido aqui para incluir qualquerpessoa ou sistema de computador capaz de acessar dados, depositar da-dos, combinar dados, analisar dados, pesquisar dados, transmitir dados, ouarmazenar dados. O termo é amplamente definido para ser uma pessoa queanalisa os dados, os sistemas de hardware e software eletrônicos usados naanálise, às bases de dados que armazenam a análise de dados, e quaisquermeios de armazenagem capazes de armazenar os dados. Exemplos não-limitativos de interfaces de rede incluem pessoas, equipamento automáticode laboratório, computadores e redes de computador, dispositivos de arma-zenagem de dados, tais como, mas não limitados a, discos, acionamentosrígidos ou chips de memória.

O termo "história de procriação", conforme aqui usado, se referea um registro da vida de um animal ou grupo de animais incluindo, mas nãolimitado a, a localização, geração, período de alojamento, bem como históriagenética dos animais, incluindo ascendentes e descentes destes, genótipo,fenótipo, história transgênica, se relevante, e similares.

O termo "condições de criação de gado", conforme aqui usado,se refere aos parâmetros relacionados à manutenção de animais incluindo,mas não limitado a, temperatura do abrigo ou do alojamento, mortalidadesemanal de um rebanho, consumo de água, consumo de alimento, taxa deventilação e qualidade, condição do feno, e similares.

O termo "história veterinária", conforme aqui usado, se refere adados de vacinação de um animal ou grupo de animais, incluindo, mas nãolimitado a, tipo(s) de vacina, número(s) de série da batelada de vacina, doseadministrada, antígeno alvo, método de administração da vacina ao(s) ani-mal(is) recipiente(s), número de animais vacinados, idade dos animais e dovacinador. Os dados relacionados a uma resposta sorológica ou imunológicainduzida pela vacina podem também ser incluídos. "História veterinária",conforme aqui usado, é também pretendida para incluir as histórias da medi-cação do(s) animal(is) alvo(s) incluindo, mas não limitado a, fármaco e/ouantibióticos administrados aos animais incluindo tipo de medicação adminis-trada, quantidade e taxas de dose, por quem e quando administrada, porqual rota, por exemplo, oral, subcutânea, e similares, e a resposta à medica-ção, incluindo efeitos colaterais desejados e indesejáveis desta.

O termo "dados diagnósticos", conforme aqui usado, se refere adados relacionados à saúde do(s) animal(is) diferentes dos dados de deta-lhamento da história de vacinação ou medicação do(s) animal(is). Por exem-plo, os dados diagnósticos podem ser um registro das infecções experimen-tadas pelo(s) animal(is), e a resposta destes às medicações providas paratratar tais medicações. Dados sorológicos incluindo anticorpo ou composiçãode proteína do soro, ou outros biofluidos, podem também ser dados diagnós-ticos úteis para admissão nos métodos da invenção. Dados cirúrgicos per-tencentes ao(s) animal(is) podem ser incluídos, tais como o tipo de manipu-lação cirúrgica, resultado da cirurgia e complicações que ocorrem do proce-dimento cirúrgico. "Dados diagnósticos" podem também incluir medições deparâmetros tais como peso, morbidez, e outras características notadas porum serviço de veterinária, tais como a condição da pele, patas, etc.

O termo "dados de bem-estar", conforme aqui usado, se refereao acúmulo coletivo de dados pertencentes a um animal ou grupo de ani-mais incluindo, mas não limitado a, uma história de procriação, um históriaveterinária, um perfil de bem-estar, dados diagnósticos, dados de controle dequalidade, ou qualquer combinação destes.

O termo "perfil de bem-estar", conforme aqui usado, se refere aparâmetros, tais como peso, densidade da carne, níveis de abarrotamentonos invólucros de procriação ou criação, comportamento psicológico do ani-mal, taxa de crescimento e qualidade, e similares.

O termo "controle de qualidade", conforme aqui usado, se refereàs características desejadas do(s) animal(is). Por animais não-domésticostais como gado e ovelha, por exemplo, tais parâmetros incluem qualidade domúsculo e densidade, teor de gordura, maciez da carne, produção de leite equalidade, capacidade de procriação, e similares.

O termo "parâmetros de desempenho", conforme aqui usado, serefere fatores tais como produção de carne, produção de procriação, formade leiteria, qualidade da carne, taxa de gravidez de raça (isto é, fertilidade),vida produtiva (isto é, longevidade), e similares, que podem ser as metasdesejadas para a procriação e criação do(s) animal(is). Parâmetros de de-sempenho podem ser, ou gerados dos próprios animais, ou aqueles parâme-tros desejados por um cliente, ou o mercado.

O termo "dados nutricionais", conforme aqui usado, se refere àcomposição, quantidade e freqüência de distribuição de alimento, incluindoágua, providos ao(s) animal(is).

O termo "segurança de alimento", conforme aqui usado, se refe-re à qualidade da carne de um animal de criação, incluindo, mas não limita-do a, tempo de preparação, lugar e maneira, armazenagem do produto ali-mentício, rota de transporte, registros de inspeção, textura, cor, sabor, odor,teor bacterial, teor parasítico, e similares.

Será aparente àqueles técnicos no assunto que os dados rela-cionados à saúde e manutenção dos animais podem ser variavelmente a-grupados, dependendo da fonte ou intenção do coletor de dados, e qualquerum agrupamento aqui não é, portanto, pretendido para ser limitante.

A menos que de outro modo definido, todos os termos técnicos ecientíficos aqui usados têm o mesmo significado conforme comumente com-preendido por um técnico no assunto de biologia molecular. Embora méto-dos e materiais similares ou equivalentes àqueles aqui descritos possam serusados na prática ou teste da presente invenção, métodos e materiais ade-quados são aqui descritos.

Em uma concretização na qual o gene de interesse é CAST bo-vino, a seqüência de nucleotídeo de CAST bovino pode ser selecionada de,mas não é limitada a, a seqüência correspondente aos N9S de Acesso noGenBank AAFC02060382 (SEQ ID NO: 1), AAFC02161394 (SEQ ID NO: 2),AAFC02179490 (SEQ ID NO: 3), AAFC02060385 (SEQ ID NO: 4), A-AFC02060381 (SEQ ID NO: 5), AAFC02197217 (SEQ ID NO: 6), A-AFC02067026 (SEQ ID NO: 7), ou um fragmento desta, um uma região dogenoma bovino genoma que compreende esta seqüência.

A presente invenção, portanto, proporciona ácidos nucléicos iso-lados que podem especificamente hibridizar para a seqüência de nucleotí-deo que pode ser selecionada de, mas não é limitada a, a seqüência corres-pondente aos N- de Acesso no GenBank AAFC02060382 (SEQ ID NO: 1),AAFC02161394 (SEQ ID NO: 2), AAFC02179490 (SEQ ID NO: 3), A-AFC02060385 (SEQ ID NO: 4), AAFC02060381 (SEQ ID NO: 5), A-AFC02197217 (SEQ ID NO: 6), AAFC02067026 (SEQ ID NO: 7), ou o com-plemento desta, e que compreende o local polimórfico correspondente.

O(s) polimorfismo(s) de nucleotídeo simples de interesse po-de(m) ser selecionado(s) a partir do grupo consistindo em mutações semsentido na região de domínio XL1 especialmente mutações sem sentido emexon 3 que resultam em substituições G48D e P52L(NM_174003.2:c.277G>/4 e 283C>T), uma substituição G/T em intron 3 (A-AFC02060381.1 :g.2110G>T) e uma repetição GAAA em intron 8 (A-AFC02060381.1 :g.6700[(GAAA)4]+[(GAAA)5].

O SNP/STR vantajoso na presente invenção está associado comcertos traços economicamente valiosos e hereditários relacionados à fertili-dade e longevidade nos bovinos. Portanto, é um objetivo da presente inven-ção determinar o genótipo de um dado animal de interesse conforme defini-do pelo SNP/STR de local de CAST de acordo com a presente invenção. Étambém contemplado que o genótipo do(s) animal(is) pode ser definido porSNPs/STRs adicionais dentro do gene de CAST ou dentro de outros genesidentificados com traços desejáveis ou outras características, e, em particu-lar, por um painel ou painéis de SNPs/STRs.

Existem muitos métodos conhecidos na técnica para determina-ção da seqüência de DNA em uma amostra, e para identificação se uma da-da amostra de DNA contém um SNP/STR particular. Qualquer técnica co-nhecida na técnica pode ser usada no desempenho dos métodos da presen-te invenção.

Os métodos da presente invenção permitem que animais comcertos traços hereditários economicamente valiosos a serem identificadosbaseados na presença de SNPs/STRs em seus genomas, e, particularmen-te, com mutações sem sentido em exon 3 do gene de CAST. Os métodosadicionalmente permitem, pelos métodos auxiliados por computador da in-venção, correlacionar os traços associados ao SNP/STR com outros dadospertinentes à capacidade bem feita e produtiva dos animais, ou grupo deanimais.

Para determinar o genótipo de um dado animal de acordo comos métodos da presente invenção, é necessário obter-se uma amostra deDNA genômico daquele animal. Tipicamente, esta amostra de DNA genômi-co será obtida de uma amostra de tecido ou células tomadas daquele ani-mal. Uma amostra de tecido ou célula pode ser tomada de um animal aqualquer momento no tempo de vida de um animal, mas antes de que a i-dentidade de carcaça seja perdida. A amostra de tecido pode compreenderpelo menos, incluindo raízes, couro, osso, hastes de coleta bucais, sangue,saliva, leite, sêmen, embriões, músculo, ou quaisquer órgãos internos. Nosmétodos da presente invenção, a fonte da amostra de tecido, e, desse mo-do, também a fonte da amostra teste de ácido nucléico, não é crítica. Porexemplo, o ácido nucléico teste pode ser obtido de células no interior de umfluido corpóreo do animal, ou de células que constituem um tecido de corpodo animal. O fluido corpóreo particular do qual as células são obtidas não étambém crítico a presente invenção. Por exemplo, o fluido corpóreo pode serselecionado a partir do grupo consistindo em sangue, ascites, fluido pleural efluido espinhal. Além disso, o tecido de corpo particular do qual células sãoobtidas não é também crítico a presente invenção. Por exemplo, o tecido decorpo pode ser selecionado a partir do grupo consistindo em pele, tecidoendometrial, uterino e cervical. Ambos os tecidos normal e tumoral podemser usados.

Tipicamente, a amostra de tecido é marcada com um número deidentificação, ou outro índice que se relaciona a amostra ao animal individualdo qual a amostra foi tomada. A identidade da amostra vantajosamente per-manece constante através de todos os métodos e sistemas da invenção,garantindo, desse modo, a integridade e continuidade da amostra duranteextração e análise. Alternativamente, o índice pode ser mudado em um mo-do regular que assegura que os dados, e quaisquer outros dados associa-dos, podem estar relacionados de volta ao animal do qual os dados foramobtidos.

A quantidade/tamanho de amostra requerida é conhecido àque-les técnicos no assunto, e, por exemplo, pode ser determinada pelas etapassubseqüentes usadas no método e sistema da invenção, e nos métodos es-pecíficos de análise usados. Idealmente, o tamanho/volume da amostra detecido recuperada deve ser tão consistente quanto possível dentro do tipo deamostra e da espécie de animal. Por exemplo, para gado, exemplos não-limitativos de tamanhos/métodos de amostra incluem carne não-gordurosa:0,0002 gm-10,0 gm; puro: 0,0004 gm-10,0 gm; raízes de pelo: pelo menosum e vantajosamente mais do que cinco; hastes de coleta bucais: 15 a 20segundos de esfrega com pressão modesta na área entre lábio externo egoma usando-se, por exemplo, uma escova de citologia; osso: 0,0002 gm-10,0 gm; sangue: 30 μΙ a 50 ml.

Geralmente, a amostra de tecido é colocada em um recipienteque é etiquetado usando-se um sistema de numeração suportando um códi-go correspondente ao animal, por exemplo, a etiqueta de orelha do animal.Conseqüentemente, o genótipo de um animal particular é facilmente deter-minável em todos os tempos. O dispositivo de amostragem e/ou recipientepode ser suprido ao fazendeiro, um matadouro ou varejista. O dispositivo deamostragem vantajosamente toma uma amostra consistente e reprodutívelde animais individuais, enquanto simultaneamente evita qualquer contami-nação cruzada de tecido. Conseqüentemente, o tamanho e volume de teci-dos de amostra derivados de animais individuais seriam consistentes.

O DNA pode ser isolado a partir do tecido/células por técnicasconhecidas àqueles técnicos no assunto (ver, por exemplo, Patente dos Es-tados Unidos N- 6.548.256 e 5.989.431; Hirota et al. (1989) Jinrui IdengakuZasshi. 34: 217-23 e John et al. (1991) Acid nucleics Res. 19:408, as revela-ções das quais sendo aqui incorporadas por referência em suas totalidades).Por exemplo, DNA de alto peso molecular pode ser purificado de células outecido usando-se extração de proteinase K e precipitação de etanol. O DNA1contudo, pode ser extraído de uma espécime de animal usando-se quais-quer outros métodos conhecidos na técnica.

Em uma concretização, a presença ou ausência do SNP/STR dequalquer dos genes da presente invenção pode ser determinada pelo se-qüenciamento da região da amostra de DNA genômico que se estende so-bre o local polimórfico. Muitos métodos de seqüenciamento de DNA genômi-co são conhecidos na técnica, e qualquer método pode ser usado, ver, porexemplo, Sambrook et al. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual,3rd ed., Cold Spring Harbor Press. Por exemplo, conforme descrito abaixo,um fragmento de DNA que se estendendo sobre a locação do SNP/STR deinteresse pode ser amplificado usando-se a reação de cadeia de polimerase.A região amplificada de forma de DNA pode, em seguida, ser seqüenciadausando-se qualquer método conhecido na técnica, por exemplo, usando-seum seqüenciador automático de ácido nucléico. A detecção de um dadoSNP/STR pode, em seguida, ser realizada usando-se hibridização de son-das, e ou usando-se métodos de amplificação baseados em PCR. Tais mé-todos são descritos em maiores detalhes abaixo.

Os métodos da presente invenção podem usar oligonucleotídeosúteis como prímeres para amplificar seqüências específicas de ácido nucléi-co do gene de CAST1 vantajosamente da região envolvendo um SNP/STRde CAST. Tais fragmentos devem ser de comprimento suficiente para capa-citar recozimento específico ou hibridização para a amostra de ácido nucléi-co. As seqüências tipicamente serão cerca de 8 a cerca de 44 nucleotídeosde comprimento. Seqüências mais longas, por exemplo, de cerca de 14 acerca de 50, podem ser vantajosas para certas concretização. O desenho deprímeres é bem-conhecido do técnico no assunto.

As moléculas de ácido nucléico da invenção incluem moléculasde ácido nucléico tendo pelo menos 70% de identidade ou homologia ou si-milaridade com um gene de CAST, ou sondas ou prímeres derivados destes,tais como pelo menos 75% de identidade ou homologia ou similaridade, pre-ferivelmente pelo menos 80% de identidade ou homologia ou similaridade,mais preferivelmente pelo menos 85% de identidade ou homologia ou simila-ridade, tais como pelo menos 90% de identidade ou homologia ou similari-dade, mais preferivelmente pelo menos 95% de identidade ou homologia ousimilaridade, tais como pelo menos 97% de identidade ou homologia ou simi-laridade. A similaridade, homologia ou identidade da seqüência de nucleotí-deo pode ser determinada usando-se o programa "Align" de Myers e Miller,("Optimal Alignments in Linear Space", CABIOS 4, 11-17, 1988) e disponívelem NCBI. Alternativamente ou adicionalmente, os termos "similaridade" ou"identidade" ou "homologia", por exemplo, com relação a uma seqüência denucleotídeo, são pretendidos para indicarem uma medida quantitativa dehomologia entre duas seqüências. A percentagem de similaridade de se-qüência pode ser calculada como (Nre^ - Ndif)*OOiNref, no qual Nt^ é o núme-ro total de resíduos não-idênticos nas duas seqüências quando alinhadas, eno qual Nref é o número de resíduos em uma das seqüências. Conseqüen-temente, a seqüência de DNA AGTCAGTC terá uma similaridade de se-qüência de 75% com a seqüência AATCAATC (Nref = 8; Nd^2). Alternativa-mente ou adicionalmente, "similaridade" com relação a seqüências se refereao número de posições com nucleotídeos idênticos divididos pelo número denucleotídeos na mais curta das duas seqüências nas quais alinhamento dasduas seqüências pode ser determinado de acordo com o algoritmo de Wilbure Lipman (Wilbur e Lipman, 1983 PNAS USA 80:726), por exemplo, usando-se um tamanho de janela de 20 nucleotídeos, um comprimento de palavrade 4 nucleotídeos, e uma penalidade de folga de 4, e análise auxiliada porcomputador e interpretação dos dados de seqüência, incluindo alinhamento,podem ser convenientemente realizados usando-se programas comercial-mente disponíveis (por exemplo, Intelligenetics® Suite, Intelligenetics Inc.CA). Quando seqüências de RNA são referidas para serem similares, outerem um grau de identidade de seqüência com seqüências de DNA, timidi-na (T) na seqüência de DNA é considerada igual à uracil (U) na seqüênciade RNA.

Uma sonda ou prímer pode ser qualquer extensão de pelo me-nos 8, preferivelmente pelo menos 10, mais preferivelmente pelo menos 12,13, 14, ou 15, tais como pelo menos 20, por exemplo, pelo menos 23 ou 25,por exemplo, pelo menos 27, ou 30 nucleotídeos em um gene de CAST quesão únicos a um gene de CAST. Como para PCR ou prímeres ou sondas dehibridização e comprimentos ótimos destes, referência é também feita a Ka-jimura et al., GATA 7(4):71-79 (1990).

As seqüências de RNA dentro do escopo da invenção são deri-vadas a partir das seqüências de DNA, por timidina (T) na seqüência deDNA sendo considerada igual à uracil (U) nas seqüências de RNA.

Os oligonucleotídeos podem ser produzidos por um processo deprodução convencional para oligonucleotídeos gerais. Eles podem ser pro-duzidos, por exemplo, por um processo de síntese química, ou por um pro-cesso microbial que faz uso de um vetor de plasmídeo, um vetor de fago, ousimilares. Adicionalmente, é adequado usar-se um sintetizador de ácido nu-cléico.

Para etiquetar um oligonucleotídeo com o corante fluorescente,um dos métodos de etiquetagem convencionalmente conhecido pode serusado (Tyagi & Kramer (1996) Nature Biotechnology 14: 303-308; Schofieldet al. (1997) Appl. e Environ. Microbiol. 63: 1143-1147; Proudnikov & Mirza-bekov (1996) Nucl. Acids Res. 24: 4532-4535). Alternativamente, o oligonu-cleotídeo pode ser etiquetado com uma radioetiqueta, por exemplo, 3H, 125I,35S, 14C1 32P, etc. Métodos de etiquetamento bem-conhecidos são descritos,por exemplo, em Sambrook et al. (2001) Molecular Cloning: A LaboratoryManual, 3rd ed., Cold Spring Harbor Press. A etiqueta é acoplada diretamen-te ou indiretamente a um componente do oligonucleotídeo de acordo commétodos bem-conhecidos na técnica. Cromatografia de fase reversa ou simi-lares usadas para proporcionar uma sonda de ácido nucléico para uso napresente invenção podem purificar o oligonucleotídeo sintetizado etiquetadocom um marcador. Uma forma de sonda vantajosa é uma etiquetada comum corante fluorescente na extremidade 3'- ou 5'- e contendo G ou C como abase na extremidade etiquetada. Se a extremidade 5'- é etiquetada e a ex-tremidade 3'- não é etiquetada, o grupo OH no átomo de C na posição 3'- daextremidade 3'-, ribose ou deoxirribose podem ser modificadas com um gru-po fosfato ou similares, embora nenhuma limitação seja imposta neste parti-cular.

Durante a hibridização do ácido nucléico alvo com as sondas,condições estringentes podem ser utilizadas, vantajosamente junto com ou-tras condições que afetam a estringência, para auxiliar na hibridização. Adetecção por rompimento diferencial é particularmente vantajosa para redu-zir ou eliminar hibridização de escorregamento entre sondas e alvo, e parapromover hibridização mais efetiva. Em ainda outro aspecto, condições deestringência podem ser variadas durante a determinação de estabilidadecomplexa de hibridização de modo a determinar precisamente e rapidamen-te se um SNP está presente na seqüência alvo.

Um método de determinação do genótipo no local de gene poli-mórfico envolve obtenção de uma amostra de ácido nucléico, hibridização daamostra de ácido nucléico com uma sonda, e rompimento da hibridizaçãopara determinar o nível de energia de rompimento requerida no qual a sondatem uma energia de rompimento diferente para um alelo, conforme compa-rado a outro alelo. Em um exemplo, pode ser uma energia de rompimentomais baixa, por exemplo, temperatura de fusão, para o alelo que propicia umresíduo de citosina em um local polimórfico, e uma energia requerida maisalta para um alelo com um resíduo diferente naquele local polimórfico. Istopode ser alcançado onde a sonda tem 100% de homologia com um alelo(uma sonda perfeitamente equiparada), mas tem um desequiparação sim-ples com o alelo alternativo. Desde que a sonda perfeitamente equiparada éligada mais vedantemente ao DNA alvo do que a sonda desequiparada, elarequer mais energia para fazer com que a sonda hibridizada se disassocie.

Em uma etapa adicional do método acima, uma segunda sonda("âncora") pode ser usada. Geralmente, a sonda âncora não é específicapara qualquer alelo, mas hibridiza indiferente de qual nucleotídeo está pre-sente no local polimórfico. A sonda âncora não afeta a energia de rompimen-to requerida para disassociar o complexo de hibridização, mas, ao invés,contém uma etiqueta complementar para se usar com a primeira sonda("sensor").

A estabilidade de hibridização pode ser influenciada por nume-rosos fatores, incluindo termorregulação, regulação química, bem como con-trole de estringência eletrônico, ou sozinho ou em combinação com outrosfatores listados. Através do uso de condições de estringência, em qualquerou ambas da etapa de hibridização alvo ou a etapa de estringência de oligo-nucleotídeo de sensor, completação rápida do processo pode ser alcançada.Isto é desejável para alcançar hibridização corretamente indexada do DNAalvo para alcançar número máximo de moléculas em um local de teste comum complexo de hibridização preciso. Por meio de exemplo, com o uso deestringência, a etapa de hibridização inicial pode ser completada em dezminutos ou menos, mais vantajosamente cinco minutos ou menos, e maisvantajosamente dois minutos ou menos. Além de tudo, o processo analíticopode ser completado em menos do que metade de uma hora.

Em um modo, o complexo de hibridização é etiquetado, e a eta-pa de determinação da quantidade de hibridização inclui detecção das quan-tidades de complexo de hibridização etiquetado nos locais de teste. O dispo-sitivo de detecção e método podem incluir, mas não estão limitados a, ima-gem ótica, imagem eletrônica, imagem com câmera CCD, imagem ótica in-tegrada, e espectrometria de massa. Adicionalmente, a quantidade de sondaetiquetada ou não-etiquetada ligada ao alvo pode ser quantificada. Tal quan-tificação pode incluir análise estatística. A porção etiquetada do complexopode ser o alvo, o estabilizador, a sonda, ou o complexo de hibridização "intoto". A etiquetação pode ser por etiquetação fluorescente selecionada a par-tir do grupo de, mas não limitado a, Cy3, Cy5, Bodipy Texas Red, Bodipy FarRed, Lucifer Yellow, Bodipy 630/650-X, Bodipy R6G-X e 5-CR 6G. Etiqueta-ção colormétrica, etiquetação bioluminescente, e/ou etiquetação quimiolumi-nescente, podem adicionalmente efetuar etiquetação. A etiquetação adicio-nalmente pode incluir transferência de energia entre moléculas no complexode hibridização por análise de perturbação, extinção, transporte de elétronentre moléculas doadoras e receptoras, a última da qual podendo ser facili-tada por complexos de hibridização de equiparação de trançado duplo. Op-cionalmente, se o complexo de hibridização é não-etiquetado, detecção po-de ser acompanhada pela medição de condutância diferencial entre DNA detrançado duplo e de trançado não-duplo. Adicionalmente, detecção diretapode ser alcançada por interferometria ótica baseada em silício poroso, oupor espectrometria de massa. Usando-se espectrometria de massa, nenhu-ma etiqueta fluorescente ou outra etiqueta é necessária. Preferivelmentedetecção é obtida por níveis extremamente altos de resolução de massa al-cançada por medição direta, por exemplo, por tempo de vôo (TOF), ou porionização de pulverização de elétron (ESI). Onde espectrometria de massa écontemplada, sondas tendo uma seqüência de ácido nucléico de 50 basesou menos são vantajosas.

A etiqueta pode ser amplificada, e pode incluir, por exemplo,DNA ramificado ou dendrítico. Se o DNA alvo é purificado, ele pode ser não-amplificado ou amplificado. Adicionalmente, se o alvo purificado é amplifica-do, e a amplificação é um método exponencial, ele pode ser, por exemplo,DNA amplificado por, ou DNA amplificado por amplificação de deslocamentode trançado (SDA). Métodos lineares de amplificação de DNS, tais comocírculo de rolamento, "runoff" transcricional, podem também ser usados.

Onde é desejado amplificar um fragmento de DNA que compre-ende um SNP/STR de acordo com a presente invenção, os prímeres de a-vanço e reverso podem ter extensões contíguas de cerca de 8, 9, 10, 11, 12,13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, ou qual-quer outro comprimento até e incluindo cerca de 50 nucleotídeos de com-primento. As seqüências as quais os prímeres de avanço e reverso recozemestão vantajosamente localizados em qualquer lado da posição particular denucleotídeo que é substituída no SNP/STR a ser amplificado.

Uma etiqueta destacável pode ser incorporada em um ácido nu-cléico durante pelo menos um ciclo de uma reação de amplificação. Meiosespectroscópicos, fotoquímicos, bioquímicos, imunoquímicos, elétricos, óti-cos ou químicos podem detectar tais etiquetas. Etiquetas úteis na presenteinvenção incluem corantes fluorescentes (por exemplo, isotiocianato de fluo-resceína, Texas red, rodamina, e similares), radioetiquetas (por exemplo, 3H,125I, 35S, 14C, 32P, etc.), enzimas (por exemplo, horseradish peroxidase, fosfa-tase alcalina, etc.), etiquetas colorimétricas, tais como ouro coloidal ou gotasde vidro ou plástico coloridas (por exemplo, poliestireno, polipropileno, látex,etc.). A etiqueta é acoplada diretamente ou indiretamente a um componentedo ensaio de acordo com métodos bem-conhecidos na técnica. Conformeindicado acima, uma ampla variedade de etiquetas são usadas, com a esco-lha de etiqueta dependendo da sensibilidade requerida, facilidade de conju-gação com o composto, requerimentos de estabilidade, instrumentação dis-ponível, e provisões dispostas. Etiquetas não-radioativas são freqüentemen-te fixadas por meios indiretos. Polimerases podem também incorporar nu-cleotídeos fluorescentes durante síntese de ácidos nucléicos.

Os reagentes que permitem o seqüenciamento de produtos dereação podem ser utilizados aqui. Por exemplo, nucleotídeos de terminaçãode cadeia freqüentemente serão incorporados em um produto de reação du-rante um ou mais ciclos de uma reação. Kits comerciais contendo os reagen-tes mais tipicamente usados para estes métodos de seqüenciamento deDNA são disponíveis e amplamente usados. Métodos de digestão de exonu-clease de PCR para seqüenciamento de DNA podem também ser usados.Muitos métodos de seqüenciamento de DNA genômico são conhecidos natécnica, e qualquer tal método pode ser usado, ver, por exemplo, Sambrooket al. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed., Cold SpringHarbor Press. Por exemplo, conforme descrito abaixo, um fragmento deDNA se estendendo na locação do SNP de interesse pode ser amplificadousando-se a reação de cadeia de polimerase ou alguma outra reação deamplificação mediada por polimerase cíclica. A região amplificada de DNApode, em seguida, ser seqüenciada usando-se qualquer método conhecidona técnica. Vantajosamente, o seqüenciamento de ácido nucléico é por mé-todos automáticos (revistos por Meldrum, (2000) Genome Res. 10: 1288-303, a revelação do qual sendo incorporado por referência em sua totalida-de), por exemplo, usando-se um Beckman CEQ 8000 Genetic Analysis Sys-tem (Beckman Coulter Instruments, Inc.)· Métodos para seqüenciamento deácidos nucléicos incluem, mas não estão limitados a, seqüenciamento deDNA fluorescente automático (ver, por exemplo, Watts & MacBeath, (2001)Methods Mol Biol. 167: 153-70 e MacBeath et al. (2001) Methods Mol Biol.167:119-52), eletrophorese capillar (ver, por exemplo, Bosserhoff et al.(2000) Comb Chem High Throughput Screen. 3: 455-66), chips de seqüenci-amento de DNA (ver, por exemplo, Jain, (2000) Pharmacogenomics. 1: 289-307), espectrometria de massa (ver, por exemplo, Yates, (2000) Trends Ge-net. 16: 5-8), piroseqüenciamento (ver, por exemplo, Ronaghi, (2001) Ge-nome Res. 11: 3-11), eletroforese de gel de camada ultra fina (ver, por e-xemplo, Guttman & Ronai, (2000) Electrophoresis. 21: 3952-64), as descri-ções dos quais são, desse modo, incorporadas por referência em suas tota-lidades. O seqüenciamento pode também ser feito por uma companhia co-mercial. Exemplos de tais companhias incluem, mas não estão limitados a, aUniversity of Geórgia Molecular Genetics Instrumentation Facility (Athens,Geórgia) ou SeqWright DNA Technologies Services (Houston, Texas).

Uma sonda específica de SNP/STR pode também ser usada nadetecção do SNP/STR em seqüências de ácido nucléico amplificadas espe-cíficas do gene alvo, tais como os produtos de PCR amplificados geradosusando-se os prímeres descritos acima. Em certas concretizações, estassondas de SNP/STR específicas consistem em fragmentos de oligonucleotí-deo. Vantajosamente, os fragmentos são de comprimento suficiente paraproporcionar hibridização específica para a amostra de ácido nucléico. O usode uma sonda de hibridização de entre 10 e 50 nucleotídeos de comprimen-to permite a formação de uma molécula dúplex que é ambos estável e sele-tiva. As moléculas tendo seqüências complementares sobre extensões maio-res do que 12 bases de comprimento são geralmente vantajosas, de modo aaumentar estabilidade e seletividade do híbrido, e, desse modo, aperfeiçoara qualidade e grau de moléculas híbridas particulares obtidas. Geralmentese preferirá designar moléculas de ácido nucléico tendo extensões de 16 a24 nucleotídeos, ou ainda mais longas, onde desejado. Uma região de nu-cleotídeo de etiqueta pode ser incluída, como na extremidade 5' do prímerque pode proporcionar um local ao qual um prímer de seqüenciamento deoligonucleotídeo pode hibridizar para facilitar o seqüenciamento de amostrasmúltiplas de PCR.

A seqüência de sonda deve se estender sobre a posição de nu-cleotídeo particular que pode ser substituída no SNP particular a ser detec-tado. Vantajosamente, duas ou mais "sondas específicas de alelo" diferentespodem ser usadas para análise de um SNP, uma primeira sonda específicade alelo para detecção de um alelo, e uma segunda sonda específica de ale-Io para a detecção do alelo alternativo.

Será compreendido que esta invenção não é limitada aos príme-res particulares e sondas aqui descritas, e é pretendido envolver pelo menosseqüências de ácido nucléicos que são hibridizáveis à seqüência de nucleo-tídeo aqui descrita, o complemento ou um fragmento desta, ou são análogasde seqüência funcional destas seqüências. É também contemplado que umtraço particular de um animal pode ser determinado pelo uso de um painelde SNPs/STRs associado com este traço. Vários traços economicamenterelevantes podem ser caracterizados pela presença ou ausência de um oumais SNPs/STRs, e por uma pluralidade de SNPs/STRs em genes diferen-tes. Um ou mais painéis de SNPs/STRs podem ser usados nos métodos dainvenção para definir o perfil fenotípico do animal abjeto.

Homólogos (isto é, ácidos nucléicos derivados de outras espé-cies), ou outras seqüências relacionadas (por exemplo, paralogs) podem serobtidos sob condições de hibridização padrão ou estringente com toda ouuma porção da seqüência particular como uma sonda usando-se métodosbem-conhecidos na técnica para hibridização e clonagem de ácido nucléico.

Os marcadores genéticos, sondas destes, métodos, e kits dainvenção são também úteis em um programa de procriação para selecionarprocriação daqueles animais tendo fenótipos desejáveis para vários traçoseconomicamente importantes, tais como fertilidade (taxa de gravidez de ra-ça) e longevidade (vida produtiva). Seleção contínua e procriação de ani-mais, tais como criação, que são pelo menos heterozigotos e vantajosamen-te homozigotos para alelos desejáveis dos locais polimórficos de gene deCAST associados com traços economicamente relevantes de crescimento,entrada de alimentação, eficiência e/ou mérito de carcaça, e reprodução elongevidade, conduziriam a uma geração, linha ou população tendo númerosmais altos de descendência, com traços economicamente relevantes decrescimento, entrada de alimentação, eficiência e mérito de carcaça, e re-produção e longevidade. Desse modo, os SNPs/STRs de CAST da presenteinvenção podem ser usados como uma seleção de uma ferramenta de seleção.

Fenótipos desejáveis incluem, mas não estão limitados a, entra-da de alimentação, taxa de crescimento, peso corpóreo, mérito de carcaça ecomposição, e reprodução e longevidade, e produção de leite. Traços espe-cíficos de carcaça com fenótipos desejáveis incluem, mas não estão limita-dos a, calor individual de carcaça (valor de carc adicional, $), ganho diáriomédio (ADG, Ib/d), espessura de gordura posterior (BFAT, polegada), pesovivo calculado (Ps Viv Cale, Ib), grau de produção calculado (cYG), dias naalimentação (DOF, d), percentagem de adubo (DP, %), entrada de matériaseca (DMI, Ib), entrada de matéria seca por dia na alimentação (DMI porDOF, Ib/d), peso de carcaça quente (HCW, Ib), valor do peso de carcaçaquente (valor de HCW, $), teor de gordura intramuscular (IMF%, %),classificação de aparência marmórea (MBS, 10 a 99), classificação deaparência marmórea dividida pelos dias na alimentação (MBS/DOF), grau dequalidade, menor do que ou igual para selecionar versus maior do que ouigual a escolha (QG, < Se vs, > Ch), área de "ribeye" (REA, pol2), área de"ribeye" por cem peso de HCW (REA/cwt HCW, pol2/100 Ib de peso decarcaça quente (HCW) e profundidade de gorfura sbeutânea (SFD).

Um aspecto da presente invenção proporciona agrupamento deanimais e métodos para gerenciamento de produção de criação compreen-dendo agrupar animais da criação tal como gado de acordo com o genótipoconforme definido por painéis de SNPs/STRs, cada painel compreendendopelo menos um SNP/STR, um ou mais dos quais estão no gene de CASTdapresente invenção. Outros SNPs que podem ser incluídos nos painéis deSNPs incluem, mas não estão limitados a, SNPs encontrados no gene deGHR, gene de FABP4, gene de ghrelin, gene de leptin, gene de NPY gene,gene de TFAM1 gene de CRH1 gene de UASMS1, gene de UASMS2, genede UASMS3 e/ou o gene de UCP3. Os métodos de seleção genética e agru-pamento da presente invenção podem ser usados em conjunto com outrosmétodos de agrupamento fenotípico convencional, tal como agrupamento deanimais por características visíveis tais como peso, tamanho da estrutura,traços de geração, e similares. Os métodos da presente invenção proporcio-nam produção de gado tendo traços hereditários aperfeiçoados, e podem serusados para otimizar o desempenho de rebanhos de criação em áreas taiscomo fertilidade, longevidade, procriação, entrada de alimentação, qualidadede carcaça/carne e produção de leite. A presente invenção proporciona mé-todos de classificação de criação para determinar aqueles mais prováveis dedesenvolver uma condição corpórea desejada pela identificação da presençaou ausência de um ou mais polimorfismos de gene correlacionados com fer-tilidade e longevidade.

Conforme descrito acima, e nos Exemplos, existem vários traçosfenotípicos com o s quais os SNPs/STRs da presente invenção podem estarassociados. Cada um dos traços fenotípicos e genéticos podem ser testadosusando-se os métodos descritos nos Exemplos, ou usando-se quaisquermétodos conhecidos adequados na técnica. Usando-se os métodos da in-venção, um fazendeiro, ou operador de "feedlot", ou similares, podem agru-par gado de acordo com cada propensidade genética do animal para umtraço desejado tais como taxa de crescimento, entrada de alimentação oucomportamento de alimentação, conforme determinado pelo genótipo deSNP/STR. O gado é testado para determinar homozigosidade ou heterozi-gosidade com relação aos alelos de SNP/STR de um ou mais genes de mo-do que eles podem ser agrupados tal que cada pequeno cercado para ani-mal contém gado com genótipos similares. Cada cercado de animais é entãoalimentado e, de outro modo, mantido em uma maneira e por um tempo de-terminado pelo operador de "feedlot", e, em seguida, submetido à matança.

Os dados genotípicos individuais derivados de um painel ou pai-néis de SNPs/STRs para cada animal ou um rebanho de animais podem serregistrados e associados com vários outros dados do animal, por exemplo,informação de saúde, ascendência, condições de criação de gado, históriade vacinação, registros de rebanho, dados subseqüentes de segurança dealimentação, e similares. Tal informação pode ser enviada para uma agênciagovernamental para proporcionar traçabilidade de um animal ou produto decarne, ou pode servir como a base para informação de procriação, alimenta-ção e comercialização. Uma vez que o dado tenha sido ou não associadocom outro dado, o dado é armazenado em uma base de dados accessível,tal como, mas não limitada a, uma base de dados de computador ou um mi-crochip implantado no animal. Os métodos da invenção podem proporcionaruma análise dos dados de entrada que podem ser comparados com parâme-tros desejados pelo operador. Estes parâmetros incluem, mas não estão li-mitados a, tais metas de procriação, gerenciamento de produção de leiteria,níveis de vacinação de um rebanho. Se o desempenho ou propriedades dosanimais se desviam das metas desejadas, os métodos baseados em compu-tador podem disparar um alerta para permitir que o operador ajuste as dosesde vacinação, medicações, alimentação, etc., conseqüentemente.

Os resultados da análise proporcionam dados que são associa-dos com o animal individual ou ao rebanho, no todo ou em parte, dos quais aamostra foi tomada. Os dados são então mantidos em uma base de dadosacessível, e podem ou não podem estar associados com outros dados da-quele indivíduo particular individual, ou de outros animais.

Os dados obtidos de animais individuais podem ser armazena-dos em uma base de dados que pode estar integrada ou associada com,e/ou equiparada a outras bases de dados. A base de dados, junto com osdados associados, permite informação sobre o animal individual a ser co-nhecido através de todo estágio da vida do animal, isto é, da concepção aoconsumo do produto animal.

Os dados acumulados e a combinação dos dados genéticos comoutros tipos de dados do animal proporcionam acesso à informação sobre aascendência, identificação de rebanho, informação de saúde, incluindo vaci-nações, exposição a doenças, localização de "feedlot", dieta, e mudanças deproprietário. Informação, tais como datas e resultados de diagnóstico, outestes de rotina, são facilmente armazenados e alcançáveis. Tal informaçãoseria especialmente valiosa para companhias, particularmente aquelas queprocuram linhas de procriação superiores.

Cada animal pode ser provido com um identificador único. O a-nimal pode ser etiquetado, como programas de rastreio tradicionais, ou terimplante de chips de computador proporcionando dados armazenados oulegíveis, ou provido com qualquer outro método de identificação que associao animal com seu identificador único.

A base de dados contendo os resultados de genótipo baseadosem SNP/STR para cada animal, ou os dados para cada animal, podem estarassociados ou ligados a outras bases de dados contendo dados, por exem-plo, que podem ser proveitosos na seleção de traços para agrupamento ousubagrupamento de um animal. Por exemplo, e não para limitação, os dadospertencentes a animais tendo protocolos de vacinação ou medicação parti-culares, podem opcionalmente serem adicionalmente ligados com dadospertencentes a animais tendo alimento de certas fontes de alimento. A capa-cidade de refinar um grupo de animais é limitada somente pelos traços pro-curados, e pelas bases de dados contendo informação relacionada àquelestraços.

As bases de dados que podem ser utilmente associadas com osmétodos da invenção incluem, mas não estão limitadas a, dados científicosespecíficos ou gerais. Os dados específicos incluem, mas não estão Iimita-dos a, linhas de procriação, progenitores, e similares, outros genótipos deanimais, incluindo se ou não outros animais específicos possuem genes es-pecíficos, incluindo elementos genéticos transgênicos, locação de animaisque compartilham características genéticas similares ou idênticas, e simila-res. Dados gerais incluem, mas não estão limitados a, dados científicos, taiscomo aqueles genes que codificam para características de qualidade especí-ficas, dados de associação de procriação, dados de alimentação, tendênciasà procriação, e similares.Um método da presente invenção inclui a provisão do proprietá-rio do animal ou cliente com equipamento de coleta de amostra, tais comohastes de coleta e etiquetas úteis para coleta de amostras das quais dadosgenéticos podem ser obtidos. Vantajosamente, o acondicionamento é codifi-cado com uma etiqueta de código de barras. As etiquetas são codificadascom o mesmo índice de identificação, vantajosamente com uma equiparaçãoda etiqueta de código de barras. Opcionalmente, o acondicionamento con-tém meios para enviar as etiquetas para um laboratório de análise. O acon-dicionamento opcional é também codificado com índice de identificação,vantajosamente com uma etiqueta de código de barras.

O método opcionalmente inclui um sistema no qual uma conta-gem de base de dados é estabelecida sob ordenação do equipamento deamostragem. Um identificador de contagem de base de dados correspondeao índice de identificação das etiquetas e do acondicionamento. Após carre-gamento do equipamento de amostragem na execução da ordem, os índicesde identificação são registrados em uma base de dados. Vantajosamente, oidentificador é uma etiqueta de código de barras que é escaneada quandoas etiquetas são enviadas. Quando as etiquetas são retornadas para a facili-dade de teste, o identificador é novamente registrado e equiparado à infor-mação anteriormente registrada na base de dados sob carregamento dofrasco para o cliente. Uma vez que a genotipagem é completada, a informa-ção é registrada na base de dados, e codificada com o identificador único.Os resultados dos testes são providos ao cliente ou proprietário do animal.

Os dados armazenados na base de dados do genótipo podemser integrados com, ou comparados a outros dados ou base de dados para aproposta de identificação de animais baseada nas propensidades genéticas.Outros dados ou base de dados incluem, mas não estão limitados a, aquelescontendo informação relacionada a teste de DNA baseado em SNP, vacina-ção, programa de précondicionamento Sure Health, estro, e resultados degravidez, níveis de hormônio, segurança de alimentação/contaminação, con-tagens de célula somática, ocorrência de mastite, resultados de teste de di-agnóstico, níveis de proteína de leite, gordura de leite, estado de vacina, re-gistros de saúde, níveis de mineral, níveis de traço de mineral, desempenhodo rebanho, e similares.

A presente invenção, portanto, envolve métodos auxiliados porcomputador para rastreio das histórias de procriação ou veterinária de ani-mais da criação envolvendo o uso de um sistema baseado em computadorcompreendendo um computador programado compreendendo um processa-dor, um sistema de armazenagem de dados, um dispositivo de entrada e umdispositivo de saída, e compreendendo as etapas de gerar um perfil de umanimal da criação por admissão no computador programado através do dis-positivo de entrada de dados de genótipo do animal, no qual o genótipo podeser definido por um painel de pelo menos dois polimorfismos de nucleotídeosimples que prognostica pelo menos um traço físico do animal, admissão nocomputador programado através do dispositivo de entrada de dados de bem-estar do animal, correlação dos dados de bem-estar admitidos com o perfilfenotípico do animal usando-se o processador e o sistema de armazenagemde dados, e fornecimento de um perfil do animal ou grupo de animais ao dis-positivo de saída.

As bases de dados e a análise destes estarão acessíveis aquem acessar. O aceso pode ser provido através de direitos a acesso, oupor subscrição a partes específicas dos dados. Por exemplo, a base de da-dos pode ser acessada pelos proprietários do animal, o local de teste, a en-tidade que proporciona a amostra ao local de teste, pessoal de "feedlot", eveterinários. Os dados podem ser providos em qualquer forma, tais comopor acesso a uma website, fax, e-mail, correspondência de correio, telefoneautomático, ou outros métodos para comunicação. Estes dados podem tam-bém ser codificados em um dispositivo de armazenagem portátil, tal comoum microchip, que pode ser implantado no animal. Vantajosamente, a infor-mação pode ser lida e nova informação adicionada sem remoção do micro-chip do animal.

A presente invenção compreende sistemas para realização dosmétodos aqui descritos. Tais sistemas compreendem dispositivos, tais comocomputadores, conexões de internet, servidores, e dispositivos de armaze-nagem de dados. A presente invenção também proporciona um método detransmissão de dados compreendendo transmissão de informação de taismétodos aqui descritos ou etapas destes, por exemplo, via telecomunicação,telefone, vídeo-conferência, comunicação de massa, por exemplo, apresen-tação, tal como uma apresentação de computador (por exemplo, POWER-POINT), internet, e-mail, comunicação com documento, tais como progra-mas de computador (por exemplo, WORD), e similares.

Os sistemas da presente invenção podem compreender um mó-dulo de coleta de dados, que inclui um coletor de dados para coletar dadosde um animal ou embrião, e transmitir os dados para um módulo de análisede dados, uma interface de rede para recebimento de dados a partir do mó-dulo de análise de dados, e, opcionalmente, adicionalmente adaptados paracombinar dados múltiplos de um ou mais animais individuais, e para transmi-tir os dados via uma rede para outros locais, ou para um dispositivo de ar-mazenagem.

Mais particularmente, os sistemas da presente invenção com-preendem um módulo de coleta de dados, um módulo de análise de dados,uma interface de rede para recebimento de dados a partir do módulo de aná-lise de dados, e, opcionalmente, adicionalmente adaptados para combinardados múltiplos de um ou mais animais individuais, e para transmitir os da-dos via uma rede para outros locais, e/ou um dispositivo de armazenamento.Por exemplo, os dados coletados pelo módulo de coleta de dados conduzema uma determinação da ausência ou presença de um SNP de um gene noanimal ou embrião, e, por exemplo, tal dado é transmitido quando o regimede alimentação do animal é planejado.

Em uma concretização onde o dado é implantado em um micro-chip em um animal particular, o fazendeiro pode otimizar a eficiência de ge-renciamento do rebanho porque o fazendeiro é capaz de identificar as pre-disposições genéticas de um animal individual, bem como tratamentos pas-sados, presentes e futuros (por exemplo, vacinações e visitas veterinárias).A invenção, portanto, também proporciona acesso a outras bases de dados,por exemplo, dados de rebanho relacionados a testes genéticos e dadosrealizados por outros, por ligações de dados a outros locais. Portanto, osdados de outras bases de dados podem ser transmitidos para a base de da-dos central da presente invenção, via uma interface de rede para recebimen-to de dados a partir do módulo de análise de dados das outras bases de da-dos.

A invenção se refere a um sistema de computador e a um meiolegível de computador para compilação de dados em um animal, o sistemacontendo dado admitidos neste animal, tais como, mas não limitados a, his-tórias de vacinação e medicação, teste de DNA, teste de tiroglobulina, leptin, MMI (Meta Morphix Inc.), diagnose de encefalopatia espongiforme (BSE),vacinação de brucelose, vacinação de FMD (doença de alimentação e boca),vacinação de BVD (diarréia viral de bovino), programa de précondicionamen-to de Sure Health, estro e resultados de gravidez, tuberculose, níveis dehormônio, segurança de alimentação/contaminação, contagens de célulasomática, ocorrência de mastite, resultados de teste de diagnóstico, níveisde proteína de leite, gordura de leite, estado de vacina, registros de saúde,níveis de mineral, níveis de traço de mineral, desempenho do rebanho, esimilares. Os dados do animal podem também incluir tratamentos anteriores,bem como tratamento provido sugerido dependendo do tratamento providoque depende da predisposição genética deste animal para uma doença par-ticular.

A invenção também proporciona um método auxiliado por com-putador para aperfeiçoar a produção de animal compreendendo o uso de umsistema de computador, por exemplo, um computador programado compre-endendo um processador, um sistema de armazenagem de dados, um dis-positivo de entrada e um dispositivo de saída, as etapas de admissão nocomputador programado através do dispositivo de entrada de dados com-preendendo dados diagnósticos de procriação, veterinários, de medicação, esimilares de um animal, correlação de uma característica física prognostica-da pelo genótipo usando-se o processador e o sistema de armazenagem dedados, fornecimento ao dispositivo de saída da característica física correla-cionada ao genótipo, e alimentação do animal com uma dieta baseada nacaracterística física, aperfeiçoando, desse modo, a produção da criação.

A invenção adicionalmente proporciona um método auxiliado porcomputador para otimizar a eficiência de "feedlots" para criação compreen-dendo o uso de um sistema de computador, por exemplo, um computadorprogramado compreendendo um processador, um sistema de armazenagemde dados, um dispositivo de entrada e um dispositivo de saída, e as etapasde admissão no computador programado através do dispositivo de entradade dados compreendendo uma história de procriação e veterinária de umanimal, correlação das histórias de procriação e veterinária usando-se o pro-cessador e o sistema de armazenagem de dados, fornecimento ao dispositi-vo de saída da característica física correlacionada ao genótipo, e alimenta-ção do animal com uma dieta baseada na característica física, otimizando,desse modo, a eficiência de "feedlots" na criação.

A invenção adicionalmente compreende métodos de se fazernegócio pela provisão de acesso a tal meio legível de computador, e/ou sis-tema de computadores, e/ou dados coletados de animais aos usuários; porexemplo, o meio e/ou dados de seqüência podem ser acessíveis a um usuá-rio, por exemplo, em uma base de subscrição, via a Internet, ou uma comu-nicação global/rede de computador; ou, o sistema de computador pode serdisponível a um usuário, em uma base de subscrição.

Em uma concretização, a invenção proporciona um sistema decomputador para gerenciamento da criação compreendendo característicasfísicas e bases de dados correspondentes a um ou mais animais. Em outraconcretização, a invenção proporciona um meio legível de computador paragerenciamento da criação compreendendo características físicas e históriasveterinárias correspondentes a um ou mais animais. A invenção adicional-mente proporciona métodos de se fazer negócio para gerenciamento da cri-ação compreendendo provisão a um usuário de um sistema de computadore meios descritos acima, ou características físicas e histórias veterinárias aum ou mais animais. A invenção adicionalmente envolve métodos de trans-mitir informação obtida em qualquer método ou etapa deste aqui descrita, ouqualquer informação aqui descrita, por exemplo, via telecomunicações, tele-fone, comunicação de massas, meio de massa, apresentações, internet, e-mail, etc.

A invenção adicionalmente envolve kits úteis para classificaçãode ácido nucléico isolado de um ou mais indivíduos bovinos para variaçãoalélica de qualquer um dos genes de fator de transcrição mitocondriais, e,em particular, para qualquer dos SNPs aqui descritos, no qual os kits podemcompreender pelo menos um oligonucleotídeo que se hibridiza seletivamen-te a um ácido nucléico compreendendo qualquer um dos um ou mais dosquais são seqüências de CAST aqui descritas, e instruções para uso do oli-gonucleotídeo para detectar variação no nucleotídeo correspondente aoSNP do ácido nucléico isolado.

Uma concretização deste aspecto da invenção proporciona umoligonucleotídeo que se hibridiza especificamente à molécula de ácido nu-cléico isolada deste aspecto da invenção, e no qual o oligonucleotídeo sehibridiza a uma porção da molécula de ácido nucléico isolada compreenden-do qualquer um dos locais polimórficos nas seqüências de CAST aqui des-critas.

Outra concretização da invenção é um oligonucleotídeo que sehibridiza especificamente sob condições de estrigência altas para qualquerum dos locais polimórficos do gene de CAST, no qual o oligonucleotídeo es-tá entre cerca de 18 nucleotídeos e cerca de 50 nucleotídeos.

Em outra concretização da invenção, o oligonucleotídeo com-preende um nucleotídeo central que se hibridiza especificamente com umlocal de polimorfismo de gene de CAST da porção da molécula de ácido nu-cléico.

Outro aspecto da invenção é um método de identificação de umpolimorfismo de CAST em uma amostra de ácido nucléico compreendendoisolar uma molécula de ácido nucléico que codifica CAST, ou um fragmentodesta, e determinação do nucleotídeo no local polimórfico.

Outro aspecto da invenção é um método de classificação de ga-do para determinar aqueles bovinos mais provavelmente que exibem umadiferença biológica na fertilidade e longevidade compreendendo as etapasde obter uma amostra de material genético de um bovino; e ensaio da pre-sença de um genótipo no bovino que é associado com fertilidade e longevi-dade, o genótipo caracterizado por um polimorfismo no gene bovino deCAST.

Em outras concretizações deste aspecto da invenção, a etapade ensaio é selecionada a partir do grupo consistindo em: análise de poli-morfismo de comprimento de fragmento de restrição (RFLP), mini-seqüenciamento, análise de heterodúplex MALD-TOF, polimorfismo confor-macional de trançado simples (SSCP), eletroforese de gel de gradiente dedesnaturação (DGGE) e eletroforese de gel de gradiente de temperatura(TGGE).

Em várias concretizações da invenção, o método pode adicio-nalmente compreender a etapa de amplificar a região do gene de CAST ouuma porção deste que contém o polimorfismo. Em outras concretizações dainvenção, a amplificação pode incluir a etapa de selecionar o prímer de se-qüência avançada e reversa capaz de amplificar a região do gene de CAST.

Outro aspecto da invenção é um método auxiliado por computa-dor para prognosticar quais animais da criação possuem um diferença bioló-gica na fertilidade e longevidade compreendendo: o uso de um sistema decomputador, por exemplo, um computador programado compreendendo umprocessador, um sistema de armazenagem de dados, um dispositivo de en-trada e um dispositivo de saída, as etapas de: (a) admissão no computadorprogramado através do dispositivo de entrada de dados data compreenden-do um genótipo de CAST de um animal, (b) correlação da fertilidade e Ion-gevidade prognosticada pelo genótipo de CAST usando-se o processador eo sistema de armazenagem de dados e (c) fornecimento ao dispositivo desaída da fertilidade e longevidade correlacionada ao genótipo de CAST,prognosticando, desse modo, quais animais da criação possuem uma fertili-dade e longevidade particular.

Ainda outro aspecto da invenção é um método de se fazer negó-cio para controle da criação compreendendo provisão a um usuário de umsistema de computador para controle da criação compreendendo caracterís-ticas físicas e genótipos correspondentes a um ou mais animais ou um meiolegível de computador para controle da criação compreendendo característi-cas físicas e genótipos correspondentes a um ou mais animais ou caracterís-ticas físicas e genótipos correspondentes a um ou mais animais.

A invenção será agora adicionalmente descrita por meio dos se-guintes Exemplos não-limitativos.

EXEMPLOS

Exemplo 1

Materiais e Métodos

Animais e preparação de DNA

Amostras de sêmen de 652 progenitores que tinham procriadovários números de raças, mais sete antepassados, foram doadas pelo repo-sitório de DNA de touro de Leiteria, Maryland, para análise. Os progenitoresPTAs para seis traços foram obtidos a partir das avaliações de lista de pro-genitor do Laboratório de Programas de Aperfeiçoamento do Departamentode Agricultura Animal dos Estados Unidos para todos os touros Holstein(http://aipl.arsusda.gov/). Os traços analisados incluíam taxa de gravidez deraça (DPR), vida produtiva (PL), produção de proteína (PY), produção deleite (MY), produção de gordura (FY), classificação de célula somática (SCS)e mérito de rede em dólares (NM). O PTA médio, desvio padrão e faixa devariação para cada um destes traços em nossa população amostrada maishereditariedade total para cada traço estão listados na Tabela 1. O DNA apartir do esperma foi extraído usando-se uma extração de clorofórmio fenol eprotocolo de purificação anteriormente descrito [Ashwell MS, Heyen DW,Sonstegard TS, Van Tassell CP, Da Y, VanRaden PM, Ron M, Weller Jl,Lewin HA. A detecção de local de traço quantitativo que afeta a produção deleite, saúde, e traços reprodutivos no gado Holstein. J. Dairy Sci 2004;87:468-475].57

Tabela 1

Parâmetros fenotípicos e genéticos de traços quantitativos em sete famíliasde progenitor

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Detecção de Mutação in Silico e Desenho de Prímer

Uma seqüência de cDNA do gene bovino de calpastatin(NM_174003) consistindo no novo domínio XL foi usada como uma referên-cia para pesquisar as seqüências de DNA genômico do mesmo gene contraa base de dados de seqüenciamento de genoma bovino(http://www.hgsc.bcm.tmc.edu/projects/bovino/). Um total de sete contigsgenômicos (figuras 1 -8) foram recuperados e o alinhamento de ambos cDNAe seqüências de DNA genômico descrever 11 polimorfismos potenciais denucleotídeo simples (SNPs) na região de codificação (figura 9). Entre eles,três SNPs provisórios resultariam em mudanças de aminoácido na seqüên-cia de proteína, incluindo dois localizados em exon 3 putativo e um em exon8 putativo do gene bovino gene. A nova seqüência de DNA do domínio XLse estende nos exons 1 - 3 e exon parcial 4. Dois pares de prímer foram de-signados para cobrir ambos exons polimórficos parciais baseados nas se-qüências de DNA genômico. Para assegurar que cada região de exon foicompletamente amplificada e seqüenciada, pelo menos 100 bp de seqüên-cias de flanqueamento foram incluídas nos produtos. As seqüências de inici-ador para amplificação do produto de exon 3 foram: avançada, 5'-AAA TTTGCG GTT GAC CAC ACT GTT A-3 (SEQ ID NO: 18) e reversa, 5'-TGT TATGCC TGT TGC TTT GTA CCT C-3' (SEQ ID NO: 19) (número de aceso noGenBank: AAFC02179490). As seqüências de iniciador para amplificação doexon 8 tentativo total foram: avançado, 5'-GAT TCT TGC TGA ATT TGGAGG GAA G-3' (SEQ ID NO: 20) e reversa, 5'-GGG GTC TCA AAG AGTTGG ATA CGA T-3' (SEQ ID NO: 21) (número de acesso no GenBank: A-AFC02060381).

Validação de Mutação e Detecção por Seqüenciamento de DNA Reunido

O DNA de animais exibindo fenótipos extremos foi reunido paravalidar as mutações putativas descritas acima detectar novos polomorfismosem ambos os produtos que incluem exon 3 e exon 8 do gene bovino deCAST mais suas seqüências de intron de flanqueamento. Para alcançar osfenótipos relacionados de fertilidade, os animais foram classificados por PTApara DPR. Duas amostras de DNA reunidas foram formadas, utilizando os60 animais de topo com as PTA1S mais altas para DPR e os 60 animais comas PTA's mais baixas para DPR. AS reações de PCR foram realizadas u-sando-se 25 ng de DNA genômico bovino como gabarito em um volume finalde 10 μΙ_ contendo 12,5 ng de cada prímer, 200 μΜ de dNTPs, 1,5-3 mMde MgCI2, 50 mM de KCI, 20 de mM Tris-HCI e 0,2U de polimerase PlatinumTaq (Invitrogen, Carlsbad, CA). Condições de PCR de "touchdown" foramefetuadas conforme segue: 95°C por 10 minutos; 8 ciclos de 94°C por 30segundos, 710C por 30 segundos e 72°C 30 segundos, seguido por 37 ciclosde 94°C por 30 segundos, 63°C por 30 segundos e 72°C por 30 segundosmais 1 ciclo a 72°C por 5 minutos, e, em seguida uma retenção estendida a4°C até uso. Os produtos de PCR foram examinados por eletroforese atra-vés de um gel agrose 1,5% com tampão 1X TBE de modo a determinar aqualidade e quantidade de seqüenciamento de DNA. O seqüenciamento foirealizado em um seqüenciador ABI 3730 no Laboratório para Biotecnologia eBioanálise (Washington State University) usando-se um protocolo padrão.

Os polimorfismos de nucleotídeo foram identificados por comparação de pa-drões de seqüência entre estas reuniões de DNA.

Detecção de Halotipo por Seqüenciamento Individual de Antepassado e Ge-notipagem de Marcador

As seqüências de DNA reunidas de ambos os produtos revela-ram polimorfismos genéticos na população de progenitores de Ieiteria deri-vados de sete antepassados. Para determinar halotipos potenciais entre es-tas mutações no gene bovino de CAST1 os produtos de PCR a partir dossete antepassados foram amplificados e submetidos à seqüenciamento indi-vidualmente. Um total de quatro polimorfismos incluindo três SNPs e umarepetição em tandem simples foram observados, mas eles formaram somen-te dois haplotipos entre estes sete antepassados. Uma substituição C/T foi,portanto, escolhida para genotipagem conforme pode ser descrito usando-seuma aproximação de PCR-RFLP (polimorfismo de comprimento de fragmen-to de restrição). Os amplicons de PCR que continham a região de exon 3 eseqüência de intron de flanqueamento foram digeridos a 37°C por três horascom 2U de Mspl (New England Biolabs, Beverly, MA, USA). A visualizaçãode digestão de enzima e classificação de genótipo dos indivíduos foramconduzidas por eletroforese em um gel agrose 2% contendo brometo de eti-dium.

Análise de Associação de Gene de CAST com Fertilidade e longevidade emgado leiteiro

Três etapas foram empregadas para investigar a associação dogene bovino de calpastatin com DPR e PL em nossa população amostrada.A primeira etapa foi para genotipar o marcador em 60 amostras altas e 60amostras baixas de DPR. Teste exato de Fisher foi usado para examinar asdiferenças em freqüências de alelo por classificação de associação inicialentre estes dois grupos de animais. Na segunda etapa, o mesmo marcadorfoi genotipado na progenia a partir da família de progenitor com PTA maisalta para DPR e a família de progenitor com a PTA mais baixa para DPR.Teste exato de Fisher foi usado para examinar diferenças em freqüências dealelo para validar associações iniciais identificadas na primeira etapa. A últi-ma etapa foi analisar compreensivamente os dados de todos os indivíduospara os traços de fertilidade de of DPR e PL, os traços de produção de pro-dução de leite, proteína, gordura de leite, e mérito total de valor de rede paratodos os traços combinados. A associação entre as PTA1S dos traços anteri-ormente descritas e o genótipo do filhote, CC, CT e TT foi examinado, usan-do-se a função de modelo misturada de SAS (Versão 9.1 Carey NC). O efei-to da família de progenitor foi também incluído no modelo como um efeitofixo e genótipo de filhote como um efeito aleatório:

y.jk =M + sl+gJ+eijk

onde yijk é a PTA de traços examinados; μ é o valor médio total do traço; Sié o efeito da família de progenitor (j' = l,2,...,7)e gjé o efeito genotípico dofilhote {j = CC,CT,7T). eijk é o efeito residual correspondente a yiJk e foiassumido para ser normalmente distribuído. O efeito de interação entre famí-lia de progenitor e genótipo do filhote foi também incluído inicialmente nomodelo, mas foi excluído no modelo final porque ele não foi significante. Omodelo residual foi pesado por 1/r na análise, onde r é confiança para PTA.O nível de significância do modelo foi ajustado em P< 0,05. Seguindo umteste F significante, meios individuais para os genótipos diferentes foramcomparados usando-se comparações de par pré-planejadas usando-se afunção pdiff de SAS (Versão 9.1, Carey NC).

Re-anotação Comparativa do Gene Humano de CAST

A base de dados do GenBank atual revelou que a proteína deCAST humana, mesmo em sua isoforma mais alonga somente consistia emum domínio L N-terminal e quatro domínios de inibição de calpain repetitivos(domínios 1-4), necessitando, desse modo, do domínio XL que foi detectadona proteína de CAST bovino. Para validar adicionalmente esta observação, ogene de CAST humano foi re-anotado usando-se um processo de três eta-pas conforme segue: 1) pesquisar BLAST contra as bases de dados"est_humano" no GenBank usando-se uma seqüência de cDNA de compri-mento total do gene de CAST bovino como uma referência para recuperartodos os ESTs humanos (etiquetas de seqüência expressas) que são ortólo-gos à seqüência especifica de domínio XL do gene bovino; 2) montar osESTs humanos recentemente pesquisados com a seqüência de cDNA iso-forma mais longa atual para formar uma seqüência de cDNA de comprimen-to total do gene humano; e 3) alinhar a seqüência de cDNA recentementeanotada e seqüências de DNA genômico para determinar a organização ge-nômica completa do gene de CAST humano.

Resultados

Organização Genômica e Polimorfismos Funcionais no Gene de CAST Bovi-no

Uma pesquisa BLAST usando-se a seqüência de cDNA do genebovino de CAST(NM_174003) recuperou sete contigs genômicos com umaseqüência total de of 116,129 bp de uma montagem de seqüência de geno-ma bovino 6X (http://www.hgsc.bcm.tmc.edu/projects/bovino/) (figuras 2 - 9).O alinhamento de ambos cDNA e seqüência de DNA genômico indicou queo gene bovino de CAST continha pelo menos 32 exons e 31 introns (figura1). Contudo, exons 1 - 31 estão codificando exons com seqüência de codifi-cação variando de 30 bp (exon 1) a 114 bp (exon 8) de comprimento. Exon31 também continha 12 bp da seqüência não-traduzida 3' e exon 32 nãopossuía seqüência de codificação no todo. Entre os 31 introns, vinte e cincotinham seqüências intrônicas completas. Intron 23 era o menor intron comuma seqüência de 173 bp, enquanto o intron 4 podia ser o intron maior nogene com mais do que 22 kb de seqüência (figura 1). O domínio XL da pro-teína se estendia dos exons 1 - 3 e parte do exon 4; o domínio L correspon-de parte de exon 4, exons 5 -9 e parte de exon 10; domínio 1 parte fIanque-ada de exon 10 e exons 11-15; domínio 2 estendido de 16 - 20 e parte deexon 21; domínio 3 foi codificado por parte de exon 21, exons 22 - 25 e partede exon 26; e domínio 4 incluiu parte de exon 26, exons 27 - 30 e parte deexon 31, respectivamente (figura 1). Uma pesquisa de cDNA contra a basede dados de DNA genômico bovino indicou que somente uma cópia do genede calpastatin existia no genoma bovino.

O alinhamento da seqüência de cDNA com a seqüência de DNAgenômico do gene bovino de CAST também revelou 11 SNPs putativos naregião de codificação; incluindo quatro transições G/A, três transições C/T,duas transversões T/A, uma substituição G/T e uma substituição CA (figura9). Contudo, somente três cSNPs foram verificados alterar a seqüência deaminoácido da proteína de CAST bovino: G48D, P52L e I128K. Os SNP1Sremanescentes eram mutações inativas. As substituições G48D e P52L fo-ram localizadas no exon 3, correspondendo ao domínio XL. A I128L foi loca-lizada no exon 8 que codifica para o domínio L. Todos os três SNPs de codi-ficação de sem sentido alteraram a segunda base no códon, conduzindo amudanças no aminoácido. As seqüências do DNA alto/baixo reunido e seteantepassados individuais confirmaram os SNPs de G48D e P52L SNP1S nodomínio XL (figura 10A), mas não a substituição I128K no domínio L. Comoambos os produtos de PCR continham seqüência intrônicas parciais, umasubstituição G/T foi detectada em intron 3 (figura 10B) e uma repetição tetra-nucleotídeo GAAA em intron 8, perto da região de junção de exon-intron. Arepetição GAAA apareceu em formas bi-alélicas: quantro repetições em umalelo e 5 repetições em outro (figura 10C). Entre estes quatro polimorfismos,somente dois haplotipos existem nos sete antepassados. O haplotipo 1 foiG-C-T-GAAAGAAAGAAAGAAA (SEQ ID NO: 16), e o haplotipo 2 foi A-T-G-GAAAGAAAGAAAGAAAGAAA (SEQ ID NO: 17), respectivamente (figura10).

Comparações Alta-baixa Individuais e de Família para Estabelecimento deAssociações Iniciais

Conforme indicado acima, somente dois haplotipos existem en-tre os sete antepassados examinados; desse modo, a genotipagem de umdos haplotipos foi suficiente. De três SNPs identificados nos produtos de e-xon 3, a transição C/T, que alterou o aminoácido na posição 52 de uma pró-Iinha para uma Ieucina resultou no ganho/perda de um local de corte de en-zima de restrição para Mspl. Um fragmento de 308 bp foi amplificado para aregião, que continha somente um local de corte para a enzima de restrição.Portanto, digestão com Mspl produziu três faixas de 135 bp, 173 bp e 308bp, respectivamente (figura 11). Animais homozigotos para o alelo C têm umlocal de Mspl, e após digestão completa exibiu duas faixas de 135 bp e 173bp. Animais homozigotos para o alelo T perderam este local de Mspl queresultou em uma faixa de 308 bp após a reação de digestão. Animais hete-rozigotos mostraram três faixas após digestão de Mspl (figura 11).

A transição C/T foi então genotipada no topo e no fundo de 60indivíduos co valores de DPR mais altos. Entre os 60 indivíduos de topo, onúmero de genótipos de TT, CT e CC foi 24 (40%), 22 (36,7%) e 14 (23,3%),respectivamente. Contudo, dos 60 indivíduos de fundo, os genótipos de TTcontaram 65% (39/60), enquanto somente três indivíduos (5%) mostraramgenótipo de CC e 18 animais (30%) eram heterozigotos (Tabela 2). A análiseChi-square revelou uma associação entre DPR e seqüência de genótipo en-tre os grupos de topo e de fundo (χ2 = 11,10, P < 0,01). Esta associação en-tre polimorfismos de CAST bovino e DPR foi adicionalmente confirmada pelagenotipagem deste marcador em toda progenia de uma família de progenitorde DPR alta e baixa. Esta análise suportou a análise inicial e revelou umaassociação altamente significante entre DPR e genótipo (χ2 = 92,91; P <0,0001; Tabela 2). Os testes exatos de Fisher de diferenças em seqüênciasde alelo foram também altamente significantes entre os grupos de topo e defundo (Fisher's ρ = 0,000146), bem como entre a progenia de famílias altas ebaixas (Fisher's ρ = 0,000000) (Tabela 2).Tabela 2

Análise de Associação Inicial do Polimorfismo de CAST Bovino com DPR emGado Leiteiro

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Associações Significantes de Gene de CAST com Fertilidade e Longevidadeem Gado Leiteiro

Inicialmente, um total de 659 filhotes de sete famílias de progeni-tores foi genotipado para esta transição C/T no gene de CAST bovino. Apósverificação do genótipo baseada na análise da árvore genealógica, sete a-nimais foram removidos a partir do conjunto de dados devido a genótiposirregulares. Os 652 animais remanescentes incluíam 62 animais homozigo-tos CC1 378 animais homozigotos TT e 212 animais heterozigotos CT. Asfreqüências de alelo C e alelo T na população foram 0,26 e 0,74, respecti-vãmente. Através da análise de família para três genótipos de CC, CT e TTindicou que o genótipo individual era uma fonte significante de variação (P <0,0001) quando se examina DPR e PL, mas não era uma fonte significantede variação quando se examina os traços de produção de leite (P > 0,05)(Tabela 3).

Nos valores de DPR1 gado com genótipo homozigoto(CAST:c.283CC) tinha um adicional de 0,82 e 0,57 de unidades de PTA(3,28 e 2,28 dias abertos equivalentes) comparado aos animais homozigotosCAST:c.283TT e animais heterozigotos CAST:c.283CT (P<0,05) (Tabela 1).A longevidade PTA foi 1,22 unidades maior entre CAST:c.283CC e animaisTT e 0,89 diferente entre CAST:c.283CC e animais CT (P < 0,05). O aperfei-çoamento de ambos DPR e longevidade em animais CAST:c.283CC condu-ziu a um aumento do valor econômico por $67,86 e $51,14 por vaca compa-rado aos homozigotos TT e heterozigotos CT (P < 0,05) (Tabela 3). Os efei-tos aditivo (a) e de dominância (d) de substituição C para T e suas unidadesno desvio padrão (SD) são também listados na Tabela 3.

Tabela 3

Associações do Gene Bovino de CAST(NM_174003.2:c.283C>T) com Tra-ços Reprodutivos e Produtivos em Gado Leiteiro1

<table>table see original document page 65</column></row><table>1Subscritos diferentes indicam uma diferença significante de P < ,05 dentrode cada série.

2Efeito aditivo.

3SD = Desvio Padrão.

4Efeito de dominância.

A genotipagem de sete antepassados indicou que eram um an-tepassado CC1 dois antepassados CT e quatro antepassados TT. O genótipodo antepassado foi mostrado ser uma fonte significante de variação paraambos DPR e PL (P < 0,0001). Quando se examina DPR, o valor de PTAmédio para a progenia do antepassado CC foi 1,50 (0,61 vs -0,89) e 0,94unidades (0,60 vs -0,34) mais alta do que para a progenia de antepassadosde TT e CT, respectivamente (P < 0,05). Os valores de PL PTA foram 0,62, -0,51 e -1,24 na progenia de famílias de antepassado CC, CT e TT, e foramsignificantemente diferentes entre quaisquer dois grupos de família de ante-passado (P < 0,05). Considera-se as diferenças entre a progenia de ante-passados CC e TT como diferenciais de seleção, e as diferenças entre indi-víduos de CC e TT das famílias cruzadas como resposta de seleção, as he-reditariedades compreendidas foram estimadas para serem 0,55 (0,82/1,50)para DPR e 0,66 (1,22/1,86) para PL, respectivamente.Existência do Domínio XL em Gene de CAST Humano

A pesquisa BLAST contra a base de dados de "est_humano" emNCBI usando-se a seqüência de cDNA do gene bovino deCAST(NM_174003) identificou dois ESTs humanos (BP2044772 eBU5644868) que mostraram similaridade de seqüência alta para a seqüên-cia de domínio XL do gene bovino de CAST. A montagem destas duas se-qüências EST com a forma mais longa atual do gene humano deCAST(NM_001750) gerou uma seqüência de consenso de 2,876 bp, incluin-do seqüência de codificação 151 bp 5'UTR, 2,331 bp e seqüências 394 bp3'UTR (figura 1). Além de tudo, a proteína CAST humana recentementetransladada é 10 aminoácidos mais curta do que a seqüência de proteínaCAST bovina, mas ambas têm o mesmo numero de aminoácidos (68 amino-ácidos) no domínio XL. A similaridade do domínio XL entre o gene de CASThumano e bovino foi 85% na seqüência de nucleotídeo e 77% na seqüênciade aminoácido.

O alinhamento da seqüência de cDNA humano recentementemontada com a seqüência de DNA genômico revelou que o gene humano deCAST mais longo continha 32 exons e 31 introns (figura 1). Similar ao genebovino de CAST, exons 1 - 31 estão codificando exons com seqüência decodificação variando de 30 bp (exon 1) a 114 bp (exon 8) de comprimento.Exon 31 também continha 23 bp de seqüência não-traduzida 3' e exon 32compreende a seqüência 3'UTR remanescente. Comparado ao gene bovinode CAST, o gene humano tinha seqüência de codificação mais curtas emexons 9, 15, 26, 28 e 31 por 6, 3, 3, 3 e 18 bp, respectivamente. Contudo,exon 20 de gene humano de CAST tinha uma seqüência de codificação maislonga 3 bp do que aquele observado no gado. No gene humano de CAST,intron 23 foi também o menor intron com uma seqüência de 89 bp, enquantointron 3 foi o intron maior no gene com cerca de 27 kb de seqüência (figura1)·

Discussão

Foi reportado que o gene de calpastatin é expresso em tecidosreprodutivos múltiplos, incluindo, mas não limitados a, testículo, ovário, úte-ro, pituitária, glândula mamária, células de germe e a glândula da próstata[Kitahara A, Takano E, Ontsuki H, Kirihata Y, Yamagata Y, Knaagi R, Mura-chi T. Reversed distribution of calpains e calpastatin in human pituitary glande selective Iocalization of calpastatin in adrenocorticotropin-producing célulasas demonstrated by immunohistochemistry. J Clin Endocrinol Metab 1986;63:343-348; Thompson VF, Saldana S, Cong J, Luedke DM1 Goll DE. Thecalpain system in human placenta. Life Sci 2002; 70:2493-508; Ben-AharonI, Ben-Yosef D, Amit A, Shalgi R. Expression e immunolocalization of thecalpain-calpastatin system in the human oocyte. Fértil Steril 2005; 83:1807-1813; Orwig KE, Bertrand JE, Ou BR, Forsberg NE, Stormshak F. Involve-ment of protein kinase-C, calpains, e calpastatin in prostaglandin F2 alpha-induced oxytocin secretion from the bovine corpus luteum. Endocrinology1994; 134:78-83; Liang ZG, O1Hern PA, Yavetz B, Yavetz H, Goldberg E.Human testis cDNAs identified by sera from infertile patients: a molecularbiological approach to immunocontraceptive development. Reprod Fértil Dev1994; 6:297-305; Li S, Liang ZG, Wang GY1 Yavetz B, Kim ED1 Goldberg E.Molecular cloning e characterization of functional domains of a human testis-specific isoform of calpastatin. Biol Reprod 2000; 63:172-178; Li S1 Liang ZG,Wang GY, Yavetz B, Kim ED1 Goldberg E. Molecular cloning e characteriza-tion of functional domains of a human testis-specific isoform of calpastatin.Biol Reprod 2000; 63:172-178; Li S, Goldberg Ε. A novel N-termoinal domaindirects membrane Iocalization of mouse testis-specific calpastatin. Biol Re-prod 2000; 63:1594-1600 e Wang LF, Miao SY, Yan YC, Li YH1 Zong C, Koi-de SS. Expression of a sperm protein gene during spermatogenesis inmammalian testis: an in situ hibridization study. Mol Reprod Dev 1990; 26:1-5]. A strong association was found between the calpastatin e fertility in thepresent study. Foi também observado que animais com o genótipo desejávelpara fertilidade não exibe um nível diminuído de produção de leite: animaiscom valore de PTA mais altos para DPR exibem traços de produção de leitesimilares como animais com os genótipos menos férteis (Tabela 3). Esta éuma situação ótima, visto que foi inicialmente pensado que a seleção da fer-tilidade resultaria em uma perda de produção de leite, ou vice versa. Portan-to, o envolvimento do gene de calpastatin em trajetórias fisiológicas e/ou bi-oquímicas diferentes que conduziu a várias funções deve ser adicionalmenteavaliado.

Efeitos Pleiotrópicos do Gene de CAST Gene

Existe evidência que a atividade de calpastatin posterior à morteé altamente relacionada à maciez da carne em espécies diferentes [Kooh-maraie M, Whipple G, Kretchmar DH, Crouse JD, Mersmann HJ. Postmor-tem proteolysis in Iongissimus muscle from beef, lamb, e pork carcasses. JAnim Sci 1991; 69:617-624], várias estudos foram realizados para pesquisarpolimorfismos genéticos em calpastatin como uma fonte de marcadores ge-néticos que podem influenciar a maciez da carne. Por exemplo, Schenkel ecolegas (dados não-publicados) identificaram uma substituição G/C em in-tron 4 do gene bovino de CAST que foi associada com força de cisalhamen-to (Ρ = 0,024) em gado bovino. Em porcos, Ciobanu e outros [Ciobanu DC1Bastiaansen JW, Lonergan SM, Thomsen H, Dekkers JC, Plastow GS, Ro-thscnild MF. Novos alelos em gene de calpastatin estão associados com tra-ços de qualidade de carne em porcos. J Anim Sci 2004; 82:2829-2839] re-portou que um haplotipo de CAST estava significantemente associada comforça de cisalhamento inferior de Wamer-Bratzler, perda de cozimento e su-culência mais alta. No presente estudo, os resultados demonstram clara-mente que mutações funcionais da região de CAST bovino de domínio XLforam associadas com fertilidade e longevidade em gado leiteiro Holstein. Ohaplotipo G-C-T-GAAAGAAAGAAAGAAA (SEQ ID NO: 16) é mais desejáveldo que o haplotipo A-T-G-GAAAGAAAGAAAGAAAGAAA (SEQ ID NO: 17)pelo aumento dos valores de PTA de 0,82 unidades em DPR e 1,22 unida-des em PL (Tabela 3). Estes dados indicam que o gene de CAST desempe-nha um papel pleiotrópico em trajetórias fisiológicas diferentes e envolvidasem funções diferentes. Em adição, o presente estudo reportou duas muta-ções de sem sentido no gene bovino de CAST, que estão localizadas na re-gião recentemente identificada de domínio XL. O impacto potencial destehaplotipo de CAST benéfico para DPR e PL na qualidade da carne garanteinvestigação adicionalmente.

Benefícios do Gene de CAST para Seleção Auxiliada por MarcadorDeclínios reprodutivos em vacas leiteiras foram largamente res-ponsabilizados pela seleção intensiva de traços de leite. Por exemplo, base-ado na regressão linear de valores de procriação para dias abertos nos valo-res de procriação para 3,7% de FCM (leite com gordura corrigida), Abdallahe McDanieI [Abdallah JM, McDanieI BT. Parâmetros genéticos e tendênciasde leite, gordura, dias abertos, e peso corpóreo após parto nos rebanhosexperimentais na Carolina do Norte. J Dairy Sci 2000; 83:1364-1370] esti-mou que para cada aumento de 1000 kg nos valores de procriação para3,7% de FCM, os valores de procriação para dias abertos aumentou por 8dias. Na Espanha, a produção de leite por vaca aumentou de 7800 kg em1991 para 10.200 kg em 2000. Contudo, cada aumento de 1000 kg em umaprodução de leite média foi acompanhado por uma diminuição de 3,2% a 6%na taxa de gravidez, 4,4% a 7,6% na ciclicidade, e um aumento de 4,6% e8% na incidência de ovários inativos [Lopez-Gatius F. Está a fertilidade de-clinando no gado leiteiro? Um estudo retrospectivo no noroeste da Espanha.Theriogenology 2003; 60:89-99]. Correlações genéticas negativas foramtambém reportadas entre produção de leite e outros traços reprodutivos, taiscomo intervalo de parto e primeiras taxas de concepção de serviço [PryceJE1 Veerkamp RF. A incorporação de índices de fertilidade nos programasde aperfeiçoamento genético. Na fertilidade na produção alta de vacas leitei-ras, British Society of Animal Science Occas 2003; 26:237-249]. Os resulta-dos a partir do presente estudo sugerem que a seleção de alelo/haplotipobenéfico no gene bovino de CAST não resultaria necessariamente em umadiminuição nos traços de produção de leite em vacas leiteiras. Portanto, an-tecipou-se que uma combinação de seleção genética baseada no marcadorde CAST potenciais de PTA altos de traços de produção de leite aperfeiçoa-is rá os traços reprodutivos, enquanto permite traços de produção de leite con-tinuados altos. Em adição, se os genes de CAST foram aplicados nos pro-gramas de seleção auxiliados por marcador, a hereditariedade de DPR podiaser dramaticamente aumentada. Comparado à hereditariedade estimada de0,04 para DPR e 0,085 para PL (Tabela 1), o uso do gene de calpastatin naseleção auxiliada por marcador aceleraria, desse modo, o aperfeiçoamentode fertilidade em gado leiteiro, que declinou por várias décadas. A freqüênciabaixa do alelo/haplotipo desejável (0,26) na população de Ieiteria atual estu-dada foi consistente com a baixa fertilidade exibida nesta população, indi-cando que a seleção auxiliada por marcador é urgentemente necessária.Gene de CAST e Infertilidade Humana

A infertilidade é um dos problemas de saúde sociais e econômi-cos mais importantes em seres humanos. Por exemplo, embora a populaçãomundial tenha aumentado notavelmente e é projetada para alcançar novebilhões até 2050, é estimado que 50 - 80 milhões de casais no mundo per-manecerão sem filhos devido à infertilidade [Montoya JM1 Bernal A, BorreroC. Diagnostics in assisted human reproduction Reprod Biomed Online 2002;5:198-210]. No presente estudo, re-anotação de gene humano de CAST re-velou que o gene humano também tem o domínio XL como o gene bovinogene. Como a proteína de CAST foi identificada como um dos antígenos al-vos para anticorpos de antiesperma encontrados em mulheres não-férteis[Koide SS, Wang L, Kamada M. Os anticorpos antiesperma associados cominfertilidade: propriedades e codificação de genes de antígenos alvos. ProcSoc Exp Biol Med 2000; 224:123-132], seu envolvimento na reprodução hu-mana necessário a ser adicionalmente explorado.

Exemplo 2

A figura 12 mostra um fluxograma da entrada de dados e da saí-da de dados de resultados da análise, e correlação dos dados pertencentesà histórias de procriação e veterinária e requerimentos de desempenho deum grupo de animais, tais como de bovinos. O fluxograma ilustrado na figura7 adicionalmente indica o fluxo interativo de dados a partir do dispositivo au-xiliado por computador para um corpo de estudantes aprendendo o uso dométodo da invenção, e a correlação de tais dados interativos para apresen-tar uma saída como um gráfico indicando o progresso da classe. O fluxo-grama adicionalmente indica modificações do método da invenção de acordocom a informação recebida dos estudantes para avançar o processo de en-sinamento ou otimizar o método para satisfazer as necessidades dos estu-dantes.

A figura 13 ilustra relacionamentos potenciais entre os elemen-tos de dados a serem admitidos no sistema. Setas unidirecionais indicam,por exemplo, que um celeiro é tipicamente possuído por somente uma fa-zenda, pelo qual uma fazenda pode possuir vários celeiros. Similarmente,uma prescrição pode incluir produtos veterinários.

A figura 14A ilustra o fluxo de eventos no uso do sistema portátilbaseado em computador para entrada de dados na procriação e criação deum rebanho de vacas. A figura 14B ilustra o fluxo de eventos através de sub-rotinas relacionadas aos dados de entrada concernentes ao gerenciamentoda fazenda. A figura 14C ilustra o fluxo de eventos através das sub-rotinasrelacionadas à entrada de dados concernentes a dados específicos parauma companhia.A figura 15 ilustra um fluxograma da entrada de dados e a saídade resultados a partir da análise e da correlação dos dados pertencentes àshistórias de procriação e veterinária, e requerimentos de desempenho de umgrupo de animais.

A invenção é adicionalmente descrita pelos seguintes parágrafos

numerados:

1. Um método para subagrupamento de animais de acordo como genótipo no qual os animais de cada subgrupo tem um polimorfismo simi-lar em um gene de calpastatinfCAST") compreendendo:

(a) determinação do genótipo de cada animal a ser subagrupadopela determinação da presença de SNPs/STRs no gene de CAST, e

(b) segregação de animais individuais em subgrupos no qualcada animal em um subgrupo tem um polimorfismo similar no gene deCAST.

2. Um método for subagrupamento de animais de acordo com ogenótipo no qual os animais de cada subgrupo tem um genótipo similar nogene de CAST compreendendo:

(a) determinação do genótipo de cada animal a ser subagrupadopela determinação da presença de SNPs/STRs de interesse no gene deCAST,

(b) segregação de animais individuais em subgrupos dependen-do se os têm ou não têm o(s) polimorfismo(s) de nucleotídeo sim-ples/repetições em tandem curtas de interesse no gene de CAST.

3. O método dos parágrafos 1 ou 2, no qual os SNPs/STRs deinteresse são selecionados a partir do grupo consistindo em mutações desem sentido in exon 3 que resultam em substituições G48D ou P52L(NM_174003.2:c.271 G>A e substituições 283C>T), uma substituição G/T emintron 3 (AAFC02060381.1:g.2110G>T) e uma repetição GAAA em intron 8(AAFC02060381.1 :g.6700[(GAAA)4]+[(GAAA)5].

4. Um método para subagrupamento de animais de acordo como genótipo no qual os animais de cada subgrupo tem um genótipo similar nogene de CAST compreendendo:(a)determinação do genótipo de cada animal a ser subagrupadopela determinação da presença de mutações em sentido em exon 3 que re-sultam em substituições G48D ou P52L (NM_174003.2:c.271G>A e283C>T), uma substituição G/T em intron 3 (AAFC02060381.1 :g.2110G>T) euma repetição GAAA em intron 8 (A-AFC02060381.1 :g.6700[(GAAA)4]+[(GAAA)5], e

(b)segregação de animais individuais em subgrupos dependen-do se os animais têm ou não têm mutações sem sentido em exon 3 que re-sultam em substituições G48D ou P52L (NM_174003.2:c.271G>A e283C>T), uma substituição G/T em intron 3 (AAFC02060381.1:g.2110G>T) euma repetição GAAA em intron 8 (A-AFC02060381.1 :g.6700[(GAAA)4]+[(GAAA)5] no gene de CAST.

5.Um método para identificação de um animal tendo um fenóti-po desejável conforme comparado à população geral de animais daquelaespécie, compreendendo a determinação da presença de um SNP/STR nogene de CAST do animal, no qual o polimorfismo é selecionado a partir dogrupo consistindo em mutações sem sentido em exon 3 que resultam emsubstituições G48D ou P52L (NM_174003.2:c.271G>A e 283C>T), umasubstituição G/T em intron 3 (AAFC02060381.1:g.2110G>T) e uma repetiçãoGAAA em intron 8 (AAFC02060381.1:g.6700[(GAAA)4]+[(GAAA)5] no poli-morfismo de nucleotídeo simples/repetição em tandem curta de gene deCAST é indicativa de um fenótipo desejável.

6.O método do parágrafo 5, no qual o fenótipo desejável é taxade gravidez de raça (DPR), vida produtiva (PL), produção de proteína (PY)1

produção de leite (MY)1 produção de gordura (FY), classificação de célulasomática (SCS) e mérito de rede em dólares (NM), ou qualquer combinaçãodestes.

7.O método do parágrafo 5 ou 6, no qual o fenótipo desejável éfertilidade, longevidade e mérito de rede econômico adicionais, ou qualquercombinação destes.

8.O método de qualquer um dos parágrafos 1 a 7 no qual o a-nimal é um bovino.9. O método de qualquer um dos parágrafos 1 a 8 no qual o ge-ne de CAST é um gene CAST bovino.

10. Um método interativo auxiliado por computador para rastreioda criação de bovinos de criação compreendendo o uso de um sistema decomputador compreendendo um computador programado compreendendoum processador, um sistema de armazenagem de dados, um dispositivo deentrada, um dispositivo de saída, e um dispositivo interativo, as etapas de:(a) admissão no computador programado através do dispositivo de entradade dados compreendendo uma história de procriação de um bovino ou reba-nho de bovinos, (b) admissão no computador programado através do dispo-sitivo de entrada de dados compreendendo uma história veterinária de umbovino ou rebanho de bovinos, (c) correlação dos dados veterinários com ahistória de procriação do bovino ou rebanho de bovinos usando-se o proces-sador e o sistema de armazenagem de dados, e (d) fornecimento ao disposi-tivo de saída da história de procriação e a história veterinária do bovino ourebanho de bovinos.

11. 0 método de acordo com o parágrafo 10, no qual o sistemade computador é um sistema interativo pelo qual modificações na saída dométodo auxiliado por computador pode estar correlacionado de acordo coma entrada a partir do dispositivo interativo.

12. O método de acordo com o parágrafo 10 ou 11, compreen-dendo adicionalmente as etapas de admissão no computador programadode dados dados diagnósticos relacionados a saúde da vaca ou rebanho devacas; e correlação dos dados diagnósticos para as histórias de procriação eveterinária da vaca ou rebanho de vacas.

13. O método de acordo com qualquer um dos parágrafos 10 a12, no qual os dados veterinários compreendem um registro de vacinaçãopara uma vaca ou rebanho de vacas.

14. O método de acordo com qualquer um dos parágrafos 10 a13 no qual os dados de saúde são selecionados a partir do grupo consistin-do em dados de condição de criação, história do rebanho, e dados de segu-rança de alimentação.15. O método de acordo com qualquer um dos parágrafos 10 a

14, compreendendo adicionalmente pelo menos uma etapa adicional sele-cionada a partir do grupo consistindo em admissão no computador progra-mado de dados relacionados ao controle de qualidade do bovino ou rebanhode bovinos, e correlação do controle de qualidade de dados às histórias deprocriação e veterinária da vaca ou rebanho de vacas, admissão no compu-tador programado de parâmetros de desempenho da vaca ou rebanho devacas; e correlação dos parâmetros requeridos de desempenho do bovinoou rebanho de bovinos a um requerimento de desempenho específico de umcliente, correlação dos dados de vacina aos parâmetros de desempenho dobovino ou rebanho de bovinos, correlação do rebanho aos parâmetros dedesempenho do bovino ou rebanho de bovinos, correlação dos dados desegurança de alimentação aos parâmetros de desempenho do bovino ourebanho de bovinos, correlação dos dados de condição de raça aos parâme-tros de desempenho do bovino ou rebanho de bovinos, admissão no compu-tador programado de dados relacionados aos dados nutricionais do bovinoou rebanho de bovinos; e correlação dos dados nutricionais aos parâmetrosde desempenho do bovino ou rebanho de bovinos, e alerta às mudançasindesejáveis nos parâmetros de desempenho do bovino ou rebanho de bovi-nos.

16. O método de acordo com qualquer um dos parágrafos 10 a15, compreendendo adicionalmente as etapas de admissão no computadorprogramado através do dispositivo de entrada de dados compreendendo umgenótipo de um bovino; correlação de uma característica física prognostica-da pelo genótipo usando-se o processador e o sistema de armazenagem dedados; e fornecimento ao dispositivo de saída da característica física corre-lacionada ao genótipo para um bovino ou população de bovinos, e alimenta-ção do(s) animal(is) de uma dieta baseada na característica física, aperfei-çoando, desse modo, a produção de bovino.

17. O método auxiliado por computador de acordo com qualquerum dos parágrafos 10 a 16 para otimizar a eficiência de "feedlots" para cria-ção de gado compreendendo fornecimento ao dispositivo de saída da histó-ria de procriação e veterinária do bovino ou rebanho de bovinos, e alimenta-ção do(s) animal(is) com uma dieta baseada em suas histórias de procriaçãoe veterinária, otimizando, desse modo, a eficiência de "feedlots" para o bovi-no ou rebanho de bovinos.

18. Um método de transmissão de dados compreendendotransmissão de informação de tais métodos de acordo com qualquer um dosparágrafos 10 a 16, selecionados a partir do grupo consistindo em telecomu-nicação, telefone, vídeo-conferência, comunicação de massa, uma apresen-tação, uma apresentação por computador, uma apresentação em PowerPo-int®, internet, e-mail, e comunicação com documento.

19. Um sistema interativo de computador de acordo com qual-quer um dos parágrafos 10 a 16 para rastreamento de histórias de procria-ção e bem-estar of vacas compreendendo dados de procriação e veteriná-rios correspondentes a um bovino ou rebanho de bovinos, e no qual o siste-ma de computador é configurado para permitir o operador deste mudar osdados com o dispositivo ou uma base de dados remota.

20. O sistema interativo de computador de acordo com o pará-grafo 19, no qual os dispositivos de entrada e de saída são um assistentedigital pessoal ou um computador de bolso.

21. Um método de se fazer negócio para rastreamento de histó-rias de procriação e bem-estar de criação compreendendo dados de procria-ção e veterinários correspondentes a um ou mais animais da criação com-preendendo provisão a um usuário do sistema de computador do parágrafo 19.

22. Um método de se fazer negócio para rastreamento de histó-rias de procriação e bem-estar da criação compreendendo dados de procria-ção e veterinários correspondentes a um ou mais animais da criação com-preendendo provisão a um usuário do sistema de computador do parágrafo 20.

23. O método de se fazer negócio de acordo com o parágrafo21, compreendendo adicionalmente a provisão do proprietário do animal oucliente com equipamento de coleta de amostra, tais como as hastes de cole-ta e etiquetas úteis para coleta de amostras das quais os dados genéticospodem ser obtidos, e no qual as etiquetas são opcionalmente acondiciona-das em um recipiente que é codificado com índices de identificação.

24. O método de se fazer negócio de acordo com qualquer dosparágrafos 10 a 16, no qual o sistema de computador compreende adicio-nalmente uma pluralidade de dispositivo interativos, e no qual o métodocompreende adicionalmente as etapas de recebimento de dados a partir dosdispositivos interativos, compilação dos dados, fornecimento dos dados paraindicar a resposta de um estudante ou classe de estudantes a uma questãorelacionada à operação do método auxiliado por computador, e opcional-mente modificação da operação do método auxiliado por computador de a-cordo com a indicação da resposta.

25. O método de qualquer um dos parágrafos 8 a 24 no qual osdados compreendem a presença ou ausência de um ou mais de um polimor-fismo(s) de nucleotídeo simples/STR de interesse no gene de CAST.

26. O método do parágrafo 25 no qual o polimorfismo(s) de nu-cleotídeo simples/repetições em tandem curtas de interesse é selecionado apartir do grupo consistindo em mutações sem sentido em exon 3 que resul-tam em substituições G48D ou P52L (NM_174003.2:c.271G>A e 283C>T),uma substituição GyT em intron 3 (AAFC02060381.1:g.2110G>T) e uma re-petição GAAA em intron 8 (AAFC02060381.1:g.6700[(GAAA)4]+[(GAAA)5]do gene de CAST.

27. Um método para o diagnóstico ou monitoramento de fertili-dade e/ou longevidade em um indivíduo, compreendendo: obtenção de umaamostra biológica a partir de um indivíduo; e determinação, usando-se umensaio adequado, a presença ou ausência na amostra de um ou mais mar-cadores de CAST de domínio XL, conforme descrito aqui.

28. O método de acordo com a reivindicação 27, no qual o indi-víduo é bovino.

29. Um método para seleção auxiliado por marcador para aper-feiçoar a fertilidade e/ou longevidade, compreendendo classificação, comoparte de um esquema de seleção, baseada em um ou mais marcadores deCAST de domínio XL1 conforme descrito aqui, para aumentar seleção parafertilidade e/ou longevidade.

30. O método de acordo com a reivindicação 29, no qual a sele-ção é para aumentar a fertilidade e/ou longevidade de bovino.

31. O método de acordo com a reivindicação 29, compreenden-do adicionalmente seleção genética baseada em alto potencial de PTA deum ou mais traços de produção de leite, para proporcionar fertilidade e/oulongevidade aperfeiçoadas, em associação com alta produção de leite.

32. O método de acordo com a reivindicação 31, no qual a sele-ção é para aumentar a fertilidade e/ou longevidade de bovino, em associa-ção com alta produção de leite.

Tendo-se, desse modo, descrito em detalhes concretizações preferidas dapresente invenção, é para ser compreendido que a invenção definida pelosparágrafos acima não é para estar limitada a detalhes particulares colocadosna descrição acima, visto que muitas variações aparentes desta são possí-veis sem fugir do espírito ou escopo da presente invenção.

Claims (19)

1. Método para identificação de um animal tendo fertilidade, lon-gevidade e produção de leite desejáveis, ou uma combinação dos mesmos,conforme comparado à população geral desta espécie, compreendendo de-terminar a presença de polimorfismos de nucleotídeo simples/repetições emtandem curtas em um gene calpastatin("CAST") gene na presença de umpolimorfismo de nucleotídeo simples/repetição em tandem curta no geneCAST do animal, no qual o polimorfismo de nucleotídeo simples/repetiçãoem tandem curta é indicativo de fertilidade, longevidade e produção de leitedesejáveis, ou uma combinação dos mesmos.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, compreendendoadicionalmente subgrupos de animais de acordo com o genótipo, no qual osanimais de cada subgrupo têm um polimorfismo/repetição em tandem curtasimilar in no gene CAST, referido método compreendendo:(a) determinar o genótipo de cada animal a ser subagrupadopela determinação da presença de um polimorfismo de nucleotídeo sim-ples/repetição em tandem curta no gene CAST gene, e(b) segregar animais individuais em subgrupos dependendo seos animais têm, ou mão têm, os polimorfismos de nucleotídeo sim-pies/repetições em tandem curtas de interesse no gene CAST.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1, no qual o(s) poli-morfismo(s) de nucleotídeo simples/repetições em tandem curtas de interes-se é/são selecionado(s) a partir do grupo consistindo em mutações sem sen-tido em exon 3 que resultam em substituições G48D ou P52L(NM_174003.2:c.271G>A e 283C>T), uma substituição G/T em intron 3 (A-AFC02060381.1:g.2110G>T) e uma repetição GAAA em intron 8 (A-AFC02060381.1 :g.6700[(GAAA)4]+[(GAAA)5] no gene CAST.

4. Método, de acordo com a reivindicação 1, no qual o animal éum bovino.

5. Método, de acordo com a reivindicação 1, no qual o gene deCAST é um gene CAST bovino.

6. Método interativo auxiliado por computador para rastrear acriação de bovinos de criação compreendendo o uso de um sistema decomputador compreendendo um computador programado compreendendoum processador, um sistema de armazenagem de dados, um dispositivo deentrada, um dispositivo de saída, e um dispositivo interativo, as etapas de:(a) admissão no computador programado através do dispositivo de entradade dados compreendendo uma história de procriação de um bovino ou reba-nho de bovinos e um genótipo de um bovino; correlação de uma característi-ca física prognosticada pelo genótipo usando o processador e o sistema dearmazenagem de dados, (b) admissão no computador programado atravésdo dispositivo de entrada de dados compreendendo a história veterinária debovino ou rebanho de bovinos, (c) correlação dos dados veterinários com ahistória de procriação do bovino ou rebanho de bovinos usando o processa-dor e o sistema de armazenagem de dados, e (d) fornecimento ao dispositi-vo de saída da história de procriação, a história veterinária do bovino ou re-banho de bovinos, e as característica física correlacionadas ao genótipo pa-ra um bovino ou população de bovinos,no qual a característica física é taxa de gravidez da raça (DPR)desejável, vida produtiva (PL), produção de proteína (PY), produção de leite(MY), produção de gordura (FY), classificação de célula somática (SCS) emérito de rede em dólares (NM), ou uma combinação destes, conformecomparado à população de bovinos, e o genótipo é um polimorfismo de nu-cleotídeo simples/repetição em tandem curta em um gene CAST.

7. Método, de acordo com a reivindicação 6, no qual o sistemade computador é um sistema interativo pelo qual modificações na admissãodo método auxiliado por computador podem estar correlacionadas de acordocom a entrada a partir do dispositivo interativo.

8. Método, de acordo com a reivindicação 6, compreendendoadicionalmente as etapas de admissão no computador programado de da-dos diagnósticos relacionados à saúde da vaca e rebanho de vacas; e corre-lação dos dados diagnósticos às histórias de procriação e veterinária da va-ca ou rebanho de vacas.

9. Método, de acordo com a reivindicação 6, no qual os dadosveterinários compreendem um registro de vacinação para uma vaca ou re-banho de vacas.

10. Método, de acordo com a reivindicação 6, no qual os dadosde saúde são selecionados a partir do grupo consistindo em dados de condi-ção de criação de gado, história do rebanho, e dados de segurança de ali-mentação.

11. Método, de acordo com a reivindicação 6, compreendendoadicionalmente pelo menos uma etapa adicional selecionada a partir do gru-po consistindo em admissão no computador programado de dados relacio-nados ao controle de qualidade do bovino ou rebanho de bovinos, e correla-cionando os dados de controle de qualidade às histórias de procriação e ve-terinária da vaca ou rebanho de vacas, admissão no computador programa-do de parâmetros de desempenho da vaca ou rebanho de vacas; e correla-cionando-se os parâmetros de desempenho requeridos do bovino ou reba-nho de bovinos a um requerimento de desempenho específico de um cliente,e correlacionando-se os dados de vacina aos parâmetros de desempenhodo bovino ou rebanho de bovinos, correlacionando-se o rebanho aos parâ-metros de desempenho do bovino ou rebanho de bovinos, correlacionando-se os dados de segurança de alimentação aos parâmetros de desempenhodo bovino ou rebanho de bovinos, correlacionando-se os dados de condiçãode criação de gado aos parâmetros de desempenho do bovino ou rebanhode bovinos, admissão no computador programado de dados relacionadosaos dados nutricionais do bovino ou rebanho de bovinos; e correlacionando-se os dados nutricionais aos parâmetros de desempenho do bovino ou reba-nho de bovinos, e alertando-se às mudanças indesejáveis nos parâmetrosde desempenho do bovino ou rebanho de bovinos.

12. Método, de acordo com a reivindicação 6, no qual o(s) poli-morfismo(s) de nucleotídeo simples/repetições em tandem curtas de interes-se é(são) selecionado(s) a partir do grupo consistindo em mutações semsentido em exon 3 que resultam em substituições G48D ou P52L(NM_174003.2:c.271 G>A e 283C>T), uma substituição G/T em intron 3 (A-AFC02060381.1 :g.2110G>T) e uma repetição GAAA em intron 8 (A-AFC02060381.1 :g.6700[(GAAA)4]+[(GAAA)5] no gene CAST.

13. Método de transmissão de dados compreendendo transmis-são de informação de tais métodos de acordo com a reivindicação 6, sele-cionada a partir do grupo consistindo em telecomunicação, telefone, vídeo-conferência, comunicação de massa, a apresentação, uma apresentação decomputador, uma apresentação com PowerPoint®, internet, e-mail, e comu-nicação com documento.

14. Sistema de computador interativo, como definido na reivindi-cação 6, para rastreamento de histórias de procriação e bem-estar de vacascompreendendo dados de procriação e veterinários correspondentes a umbovino ou rebanho de bovinos, e no qual o sistema de computador é configu-rado para permitir ao operador destes trocar os dados com o dispositivo ouuma base de dados remota.

15. Sistema de computador interativo, de acordo com a reivindi-cação 14, no qual os dispositivos de admissão e descarga são um auxiliardigital pessoal ou um computador de bolso.

16. Método de se fazer negócio para rastreamento de históriasde procriação e bem-estar de criação compreendendo dados de procriação eveterinários correspondentes a um ou mais animais da criação compreen-dendo proporcionar a um usuário o sistema de computador como definido nareivindicação 14.

17. Método de se fazer negócio para rastreamento de históriasde procriação e bem-estar de criação compreendendo dados de procriação eveterinários correspondentes a um ou mais animais da criação compreen-dendo proporcionar a um usuário o sistema de computador como definido nareivindicação 14.

18. Método de e fazer negócio de acordo com a reivindicação-16, compreendendo adicionalmente proporcionar ao proprietário do animalou cliente equipamento de coleta de amostra, tais como hastes de coleta eetiquetas úteis para coleta de amostras das quais dados genéticos podemser obtidos, e no qual as etiquetas são opcionalmente acondicionadas emum recipiente que é codificado com índice de identificação.

19. Método de se fazer negócio de acordo com a reivindicação-16, no qual o sistema de computador compreende adicionalmente uma plu-ralidade de dispositivos interativos, e no qual o método compreende adicio-nalmente as etapas de receber dados a partir dos dispositivos interativos,compilar os dados, fornecimento dos dados para indicar a resposta de umestudante ou classe de estudantes a uma questão relacionada à operaçãodo método auxiliado por computador, e opcionalmente modificar a operaçãodo método auxiliado por computador de acordo com a indicação da resposta.