BRPI0706481A2 - anticorpo ou seu fragmento de ligação a antìgeno, anticorpo humanizado, fragmento de ligação a antìgeno, célula hospedeira recombinante transformada ou transfectada, métodos para produzir um anticorpo, para tratar um paciente humano afligido por uma doença, para prevenir ataques asmáticos agudos em um paciente humano, e para reduzir a frequência e/ou mitigar os efeitos dos ataques asmáticos agudos em um paciente humano, composição farmacêutica, kit de partes, e, uso de um anticorpo ou seu fragmento de ligação a antìgeno - Google Patents

anticorpo ou seu fragmento de ligação a antìgeno, anticorpo humanizado, fragmento de ligação a antìgeno, célula hospedeira recombinante transformada ou transfectada, métodos para produzir um anticorpo, para tratar um paciente humano afligido por uma doença, para prevenir ataques asmáticos agudos em um paciente humano, e para reduzir a frequência e/ou mitigar os efeitos dos ataques asmáticos agudos em um paciente humano, composição farmacêutica, kit de partes, e, uso de um anticorpo ou seu fragmento de ligação a antìgeno Download PDF

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Abstract

ANTICORPO OU SEU FRAGMENTO DE LIGAçãO A ANTìGENO, ANTICORPO HUMANIZADO, FRAGMENTO DE LIGAçãO A ANTìGENO, CéLULA HOSPEDEIRA RECOMBINANTE TRANSFORMADA OU TRANSFECTADA, METODOS PARA PRODUZIR UM ANTICORPO, PARA TRATAR UM PACIENTE HUMANO AFLIGIDO POR UMA DOENçA, PARA PREVENIR ATAQUES ASMATICOS AGUDOS EM UM PACIENTE HUMANO, E PARA REDUZIR A FREQUENCIA E/OU MITIGAR OS EFEITOS DOS ATAQUES ASMATICOS AGUDOS EM UM PACIENTE HUMANO, COMPOSIçãO FARMACêUTICA, KIT DE PARTES, E, USO DE UM ANTICORPO OU SEU FRAGMENTO DE LIGAçãO A ANTìGENO A presente invenção diz respeito a imunoglobulinas, particularmente a anticorpos que especificamente se ligam à interleucina humana 13 (hIL-13). Os anticorpos da invenção podem ser usados no tratamento de uma variedade de doenças ou distúrbios responsivos à modulação da interação entre a hIL- 13 e o receptor da IL- 13 humana. Tais doenças incluem a asma severa, a dermatite atópica, COPD e várias doenças fibróticas. Composições farmacêuticas compreendendo referidos anticorpos e métodos de fabricação são também apresentadas.

Description

"ANTICORPO OU SEU FRAGMENTO DE LIGAÇÃO A ANTÍGENO,ANTICORPO HUMANIZADO, FRAGMENTO DE LIGAÇÃO AANTÍGENO, CÉLULA HOSPEDEIRA RECOMBINANTETRANSFORMADA OU TRANSFECTADA, MÉTODOS PARAPRODUZIR UM ANTICORPO, PARA TRATAR UM PACIENTEHUMANO AFLIGIDO POR UMA DOENÇA, PARA PREVENIRATAQUES ASMÁTICOS AGUDOS EM UM PACIENTE HUMANO, EPARA REDUZIR A FREQÜÊNCIA E/OU MITIGAR OS EFEITOS DOSATAQUES ASMÁTICOS AGUDOS EM UM PACIENTE HUMANO,COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, KIT DE PARTES, E, USO DE UMANTICORPO OU SEU FRAGMENTO DE LIGAÇÃO A ANTÍGENO"
Campo da Invenção
A presente invenção diz respeito a imunoglobulinas queespecificamente se ligam à interleucina 13 (IL-13) e, em particular, à IL-13humana (hIL-13). Uma forma de realização da invenção diz respeito aanticorpos que especificamente ligam a hIL-13. A presente invenção tambémdiz respeito a métodos de tratar de doenças ou distúrbios com as referidasimunoglobulinas, composições farmacêuticas compreendendo as referidasimunoglobulinas e métodos de fabricação. Outros aspectos da presenteinvenção serão evidentes do relatório descritivo a seguir.
Fundamentos da Invenção
Interleucina-13 (IL-13)
A IL-13 é uma citocina secretada de 12 kDa originalmentedescrita como uma citocina derivada das células T que inibe a produção dacitocina inflamatória. Estudos estruturais indicam que ela tem uma disposiçãode feixes helicoidais quádrupla mantida por duas ligações dissulfeto. Nãoobstante a IL-13 tenha quatro sítios potenciais de glicosilação, a análise da IL-13 nativa do pulmão de rato indicou que ela é produzida como uma moléculanão glicosilada. A expressão da IL-13 humana das células NOS e COS-7confirma esta observação (Eisenmesser et al., J. Mol. Biol. 2001 310(1): 231-241; Moy et al., J. Mol. Biol. 2001 310(1): 219-230; Cannon-Carlson et al.,Protein Expression andPurification 1998 12(2): 239-248).
A IL-13 é uma citocina pleotrópica produzida por umavariedade de tipos de células, incluindo as células Th2 ativadas, osmastócitos, basófilos, células dendríticas, ceratinócitos e células NKT. Elapode também ser produzida pelas células ThO, Thl, CD8 e células TCD45RA+. A IL-13 tem atividades imunorreguladoras que parcialmente sesobrepõem com aquelas da IL4, esta redundância podendo ser explicada peloscomponentes compartilhados nos receptores para IL4 e IL-13. Os sinais daIL-13 através do receptor de IL4 do tipo II, que é um heterodímero compostodas cadeias de IL4Ra e IL-13Ral. A IL-13Ral se liga à IL-13 com baixaafinidade (Kd = 2 a 10 nM), mas quando pareados com a IL4Ra ela se ligacom uma alta afinidade (Kd = 400 pM) e forma um receptor de IL-13funcional (o receptor humano é aqui referido como "hIL-13R") que sinaliza,resultando na ativação das vias JAK/STAT e IRS-l/IRS-2. Uma cadeia dereceptores de IL-13 adicional foi também caracterizada (IL-13Ra2), a qualliga IL-13 com alta afinidade (Kd = 250 pM). Acredita-se que a IL-13Ra2atue como um receptor isca modulando a atividade de IL-13. A IL-13 podetambém sinalizar através da cadeia de IL13Rot2 (Fichter- Feigl 2006 NatureMedicine 12: 99-106) para induzir TGFbetal e, como tal, pode contribuir paraa fibrose associada com a patologia da asma. Os receptores funcionais paraIL-13 são expressos em uma ampla faixa de células, incluindo um epitélio dasvias aéreas, o músculo liso, os mastócitos, eosinófilos, basófilos, células B,fibroblastos, monócitos e macrófagos. As células T não têm receptoresfuncionais para IL-13 [Hilton et al., PNAS 1996 93(1): 497-501; Caput et al.,J. Biol. Chem. 1996 271(28): 16921-16926; Hershey, G. K., J. Allergy Clin.Immunol. 2003 111(4): 677-690].
Tanto a IL-13 quanto a IL-4 atuam para modificar as respostasimunes e inflamatórias pela promoção da inflamação associada à alergia einflamação supressiva devida a bactérias, vírus e patógenos intracelulares. Osprincipais efeitos biológicos da IL-13 incluem: indução da proliferação decélulas B e regulação do isotipo mudando para IgE; indução da expressão deMHC e CD23 sobre as células B e monócitos; supra-regulação de VCAM-Isobre as células endoteliais; regulação da produção de quimiocina; ativaçãoda função dos mastócitos, eosinófilos e neutrófilos, bem como inibição daexpressão do gene pró-inflamatório nas populações de monócitos emacrófagos. A IL-13 não têm quaisquer efeitos proliferativos sobre as célulasT. Assim, diferente da IL4, a IL-13 não parece ser importante nadiferenciação inicial das células T CD4 nas células do tipo Th2, mas, ao invésdisso, parece ser importante na fase efetora da inflamação alérgica (McKenzieet ai, PNAS 1993 90(8): 3735-3739; Wynn, Τ. A., Annu. Rev. Immunol. 200321:425-456).
IL-13 e Asma
A asma é uma doença crônica dos pulmões, causada pelainflamação das vias aéreas inferiores e é caracterizada por problemasrespiratórios recorrentes. As vias aéreas dos pacientes são sensíveis eintumescidas ou inflamadas a certo grau todo o tempo, mesmo quando nãoexistem sintomas. A inflamação resulta no estreitamento das vias aéreas ereduz o fluxo de ar dentro e fora dos pulmões, tornando a respiração difícil elevando a chiados, constrição do peito e tosse. A asma é deflagrada pelasupersensibilidade a alérgenos (por exemplo os ácaros da poeira, os pólens, osfungos), a irritantes (por exemplo o fumo, gases, odores fortes), infecçõesrespiratórias, exercícios e tempo seco. As deflagrações irritam as vias aéreas eo revestimento das vias aéreas incham para tornarem-se ainda maisinflamados, o muco então obstrui as vias aéreas e os músculos ao redor dasvias aéreas se estreitam até que a respiração se torna difícil e estressante, e ossintomas da asma aparecem.Existe uma forte evidência dos modelos de animais e pacientescuja inflamação asmática e outras patologias são conduzidas por resposta deTh2 desreguladas aos aeroalérgenos e outros estímulos (Busse et al., Am. J.Resp. Crit. Care Med. 1995 152(1): 388-393). Em particular, a IL-13 éjulgada ser a principal citocina efetora conduzindo uma variedade derespostas celulares nos pulmões, incluindo a hiper-reatividade das vias aéreas,a eosinofilia, a metaplasia das células caliciformes e a hiper-secreção domuco.
Evidência clínica para o papel da IL-13 na asma
O gene codificando IL-13 acha-se localizado no cromossoma5q31. Esta região também contém genes codificando IL-3, IL-4, IL-5, IL-9 eGM-CSF, e tem sido ligado à asma. Variantes genéticas de IL-13 que sãoassociadas com a asma e a atopia têm sido observadas tanto nas regiõespromotoras quanto nas codificadoras (Vercelli, D., Curr. Opin. Allergy Clin.Immunol. 2002 2(5): 389-393). Dados de estudos funcionais acham-sedisponíveis quanto à variante codificadora, Q130 IL-13 (referida aqui como"Q130 IL-13"). O polimorfismo de nucleotídeo único (SNP) +2044 GaAencontrado no quarto éxon, resulta em uma substituição de uma arginina comuma glutamina na posição 130 (Q130 IL-13). Observe-se também que, naSEQ ID NO: 9, isto é equivalente à posição 110, em que o primeiro resíduode aminoácido 'G' no início da seqüência de aminoácido IL-13 humanomaduro é a posição 1. Esta variante foi observada estar associada com a asma,níveis de IgE aumentados e dermatite atópica nas populações japonesas eeuropéias. Acredita-se que Ql30 IL-13 tenha estabilidade intensificada emcomparação com IL-13 do tipo selvagem. Ela também tem afinidadelevemente menor para o receptor isca IL-13Ra2 e, consistente com estasobservações, níveis de IL-13 sérico medianos superiores são encontrados empacientes homozigotos quanto à variante Q130 IL-13 em comparação compacientes não homozigotos. Estes resultados indicam que Q130 IL-13 podeinfluenciar as concentrações locais e sistêmicas de IL-13 (Kazuhiko et al, J.Allergy Clin. Immunol 2002 109(6): 980-987).
Níveis elevados de IL-13 têm sido medidos tanto em asmáticosatópicos quanto em não atópicos. Em um estudo, os níveis médios de IL-13sérico de 50 pg/ml foram medidos em pacientes asmáticos em comparaçãocom os 8 pg/ml nos pacientes normais de controle (Lee et al, J. Asthma 200138(8): 665-671). Níveis aumentados de IL-13 foram também medidos noplasma, no fluido de lavagem brônquio-alveolar, nas amostras de biópsia dospulmões e no esputo (Berry et al, J Allergy Clin. Immunol 2004 114(5):1106-1109; Kroegel et al, Eur. Respir. J. 1996 9(5): 899-904; Huang et al, J.Immunol. 1995 155(5): 2688-2694; Humbert et al, J. Allergy Clin. Immunol.1997 99(5): 657-665).
Evidência in vivo para o envolvimento da IL-13 na asma
Vários estudos têm definido um papel efetor crítico para a IL-13 em conduzir a patologia de asma alérgica tanto aguda quanto crônica emmodelos de camundongos. O receptor da IL-13 de alta afinidade (IL-13Ra2)ou anticorpos policlonais anti-IL-13, foram usados para neutralizar abioatividade de IL-13 de camundongos nestes modelos. O bloqueio da IL-13no momento do desafio de alérgeno inibiu completamente a hiper-responsividade das vias aéreas induzida por OVA, a eosinofilia e a metaplasiadas células caliciformes. Ao contrário, a administração do anticorpo para IL-4após a sensibilização e durante a fase de desafio do alérgeno, reduziu apenasparcialmente o fenótipo da asma. Assim, embora a IL-4 e a EL-13 exógenasejam ambas capazes de induzir um fenótipo como a asma, a atividade efetorapara IL-13 parece ser superior àquela para IL-4. Estes dados sugerem umpapel principal para IL-4 na indução imune (particularmente para odesenvolvimento e recrutamento das células Th2 para as vias aéreas, eprodução de IgE), enquanto se acredita que IL-13 esteja principalmenteempenhada em vários resultados efetores, incluindo a hiper-responsividadedas vias aéreas, a super-produção de muco e a inflamação celular (Wills-Karpet al, Science 1998 282: 2258-2261; Grunig et al, Science 1998 282: 2261-2263; Taube et al, J. Immunol. 2002 169: 6482-6489; Blease at al, J.Immunol. 2001 166(8): 5219-5224).
Em experiências complementares, os níveis de IL-13 dospulmões foram elevados pela super-expressão em um camundongotransgênico ou por instilação da proteína de IL-13 dentro da traquéia decamundongos do tipo selvagem. Em ambas as colocações, característicassemelhantes à asma foram induzidas: hiper-responsividade à estimulaçãocolinérgica das vias aéreas não específica, eosinofilia pulmonar, hiperplasiadas células epiteliais, metaplasia celular do muco, fibrose sub-epitelial,obstrução das vias aéreas e cristais semelhantes a Charcot-Leyden. Alémdisso, a IL-13 foi observada ser um estimulador potente das metaloproteinasesmatrizes e das catepsina proteases nos pulmões, resultando alteraçõesenfisematosas e metaplasia mucosa. Portanto, a IL-13 pode ser umaimportante molécula efetora tanto na asma quanto nos fenótipos da doençaCOPD (Zhu et al, J. Clin. Invest. 1999 103(6): 779-788; Zheng et al, J. Clin.Invest. 2000 106(9): 1081-1093).
Estes dados indicam que a atividade da IL-13 é tantonecessária quanto suficiente para produzir vários dos aspectos principais tantoclínicos quanto patológicos da asma alérgica em modelos de animais bem aprovados.
Doença pulmonar obstrutiva crônica (COPD)
COPD é uma expressão genérica que cobre várias síndromesclínicas, incluindo enfisema e bronquite crônica. Os sintomas são similaresaos da asma e a COPD pode ser tratada com os mesmos medicamentos. ACOPD é caracterizada por uma obstrução do fluxo aéreo amplamenteirreversível. A contribuição do indivíduo no decurso da doença édesconhecida, mas pensa-se que o fumo de cigarros é a causa de 90 % doscasos. Os sintomas incluem a tosse, a bronquite crônica, falta de respiração einfecções respiratórias. Finalmente a doença levará à incapacidade severa e àmorte. A bronquite crônica é diagnosticada em pacientes com uma história detosse ou produção de esputo na maior parte dos dias durante pelo menos 3meses durante 2 anos, sem qualquer outra explanação. O enfisema pulmonar écaracterizado por uma dilatação permanente anormal dos espaços de ar e destruição das paredes alveolares.
A IL-13 pode desempenhar um papel no desenvolvimento daCOPD. Os seres humanos fumantes que desenvolvem a COPD têm muitostipos de células inflamatórias (neutrófilos, macrófagos, eosinófilos) noparênquima pulmonar. AIL-13 é uma citocina Th2 pró-inflamatória, portanto,para modelar a progressão do enfisema. Zheng et al. indicaram asuperexpressão da IL-13 no epitélio das vias respiratórias em camundongostransgênicos de IL-13. Estes animais desenvolveram a inflamação e oenfisema parenquimatosos das vias aéreas e dos pulmões. Eles tambémdesenvolveram metaplasia mucosa reminiscente da bronquite crônica (J. Clin.Invest. 2000 106(9): 1081-1093).
O polimorfismo do promotor de IL-13 (-1055 CaT) que seacha associado com a asma alérgica, também foi relatado como tendo umafreqüência aumentada nos pacientes de COPD em comparação com oscontroles saudáveis. Isto implica em um papel funcional para o polimorfismodo promotor de IL-13 no risco intensificado de desenvolver COPD (Kraan etal., Genes and Immunity 2002 3: 436-439). Além disso, um númeroaumentado de células positivas de IL-13 e IL-4 foi observado em fumantescom bronquite crônica, em comparação com fumantes assintomáticos (Miottoet al., Eur. Resp. J. 2003 22: 602-608). Entretanto, um estudo recente paraavaliar o nível de expressão de IL-13 nos pulmões de pacientes com enfisemagrave não encontrou uma associação entre os níveis de IL-13 e a doença(Boutten et al., Thorax 2004 59: 850-854).Doença alérgica incluindo dermatite atópica e rinite alérgica
A IL-13 também foi implicada nos distúrbios atópicos taiscomo a rinite atópica e a dermatite atópica. A rinite alérgica é a doençaatópica mais comum nos Estados Unidos, e estima-se afetar até 25 % dosadultos e mais do que 40 % das crianças. Existe um íntimo relacionamentoentre a rinite alérgica e a asma. Ambas as condições compartilham aimunopatologia e a fisiopatologia comuns; elas têm processos imunológicossemelhantes em que os eosinófilos e os linfócitos de Th2 no tecido nasal ebrônquico desempenham um papel. A produção excessiva das citocinas Th2,particularmente IL-4 e IL-5, é julgada ser fundamental na patogênese dadoença alérgica. A IL-13 compartilha várias características e funções efetorascom a IL-4 e isto, combinado com a superposição funcional na utilização doreceptor de IL-4 e IL-13, dos componentes de sinalização intracelular, e naorganização genética, fornece evidência constrangedora (embora indireta)para um papel da IL-13 na promoção ou manutenção da hipersensibilidadehumana imediata in vivo. Isto foi corroborado por Li et al. (Li et al. JImmunol 1998; 161: 7007), que demonstraram que os pacientes atópicos comrinite alérgica sazonal apresentaram respostas de IL-13 significativamentemais intensas em resposta à ativação dependente de Ag, porém não policlonal.
A dermatite atópica é uma doença da pele inflamatóriacomum, crônica, recidivante, altamente prurítica. A pele com a lesão depacientes da dermatite atópica é histologicamente caracterizada por uminfiltrado inflamatório de células Τ, o qual, durante as fases agudas, se achaassociado com uma predominância de expressão de IL-4, IL-5 e IL-13 (Simonet al., J Allergy Clin Immunol 2004; 114:887; Hamid et al. J Allergy ClinImmunol 1996; 98: 225). Além disso, Tazawa et al. demonstraram que omRNA de IL-13 (mas não de IL-4) é significativamente supra-regulado emlesões da pele subagudas e crônicas da pacientes com dermatite atópica(Tazawa et al., Arch Derm Res 2004: 296:459). A freqüência da IL-13expressando as células T CD4+ e CD8+ circulantes é tambémsignificativamente aumentada nestes pacientes (Aleksza et al. British JDermatol 2002; 147: 1135). Esta atividade da IL-13 aumentada é julgadaresultar nos níveis elevados de IgE sérico, desse modo contribuindo para apatogênese da dermatite atópica. Além disso, a produção aumentada da IL-13pelas células T CD4+ neonatais é um marcador útil para identificar recém-nascidos em alto risco de desenvolvimento subseqüente de doenças alérgicas,em especial a dermatite atópica (Ohshima et al. Pediatr Res 2002; 51: 195).Evidência adicional para a importância da IL-13 na etiologia da dermatiteatópica foi fornecida por Simon et al. (Simon et al., J Allergy Clin Immunol2004; 114: 887); o tratamento tópico com ungüento de tacrolimus (ummedicamento imunossupressivo que inibe as vias de sinalização intracelularpara a produção de citocina) resultou em melhoramento clínico e histológicosignificativo das lesões atópicas da pele, acompanhado por reduçõessignificativas na expressão local das citocinas Th2, incluindo a IL-13. Alémdisso, a IL-13 Ral (uma proteína da superfície celular que, junto com a IL-4Roc, forma um receptor funcional para IL-13) foi observada ser super-expressa sobre os ceratinócitos suprabasais na pele de pacientes da dermatiteatópica, e a IL-13 foi capaz de supra-regular o mRNA de IL-13 Ral in vitro(Wongpiyabovom et al., JDermatol Science 2003; 33:31).
Estes dados coletivamente indicam que as intervençõesalvejadas pela IL-13, incluindo um anticorpo monoclonal de IL-13, podemprover uma abordagem eficaz para o tratamento da doença alérgica humana.
Eosinofilia Esofágica
O acúmulo de eosinófilos no esôfago é um problema médicocomum em pacientes com diversas doenças, incluindo a doença de refluxogastroesofágica, a esofagite eosinofílica, a gastrenterite eosinofílica e asinfecções parasíticas. A eosinofilia esofágica é associada com as respostasalérgicas, e o desafio repetido dos camundongos com aeroalérgenosestabeleceu um elo entre a inflamação alérgica das vias aéreas e a eosinofiliaesofágica. As células Th2 são julgadas induzir a inflamação associada com oseosinófilos através da secreção de uma série de citocinas, incluindo a IL-4 e aIL-13, que ativam as vias inflamatórias e efetoras, tanto direta quantoindiretamente. A IL-13 parece ser particularmente importante porque ela éproduzida em altas quantidades pelas células Th2 e regula aspectos múltiplosda doença alérgica (por exemplo a produção de IgE, a superprodução demuco, o recrutamento e sobrevivência dos eosinófilos, e a hiper-reatividadedas vias aéreas. Os eosinófilos podem gerar IL-13 funcionalmente ativos apósexposição ao GM-CSF e/ou IL-5 sob condições in vitro, ex-vivo e in vivo nasrespostas inflamatórias eosinofílicas. (Schmid-Grendelmeier J Immunology,2002, 169: 1021-1027). A IL-13 liberada aos pulmões de camundongos dotipo selvagem, deficientes de STAT-6, eotaxina-1 ou IL-5, medianteadministração intratraqueal, estabeleceu que a inflamação pulmonar,deflagrada pela IL-13, é associada com o desenvolvimento da eosinofiliaesofágica (Mishra et al. Gastroenterol. 2003; 125: 1419). Tomados juntos,estes dados fornecem evidência quanto a um papel da IL-13 na eosinofiliaesofágica.
Indicações da oncologia
Outra área importante de interesse acha-se em indicar a IL-13ou os receptores da LL-13 para inibir o crescimento de certos tipos de tumores.Acredita-se que as defesas do hospedeiro mediadas pelas células T tipo 1medeiem a rejeição tumoral ótima in vivo, e o desvio para a resposta do tipoTh2 pode contribuir para bloquear a rejeição tumoral e/ou a promoção darecorrência tumoral (Kobayashi, M. et ai. J. Immunol. 1998; 160: 5869).Vários estudos em animais com o uso das linhagens celulares de tumorestransplantáveis apoiam este parecer pela demonstração de que Stat6, IL-4 eIL-13 (produzidos em parte pelas células NKT) tenham sido capazes de inibira rejeição tumoral (Terabe et al. Nat. Immunol. 2000; 1: 515; Kacha et al. J.Immunol. 2000; 165: 6024-6028; Ostrand-Rosenberg et al. J. Immunol. 2000,165: 6015).
A atividade antitumoral potente na ausência de Stat-6 foijulgada ser devida à intensificação da produção de IFNg e da atividade deCTL específica do tumor. Além disso, uma perda de células NKT foiobservada reduzir a produção de IL-13 com um aumento concomitante narecorrência tumoral, indicando que a IL-13, produzida em parte pelas célulasNKT, é importante para a imunovigilância (Terabe et al. Nat. Immunol. 2000;1: 515). Como tal, estas descobertas sugerem que os inibidores da IL-13 ou osnovos antagonistas da IL-13, incluindo mAb da IL-13, podem ser eficazescomo imunoterapêuticos do câncer pela interferência com os papéis da IL-13reguladora negativa na infra-regulação das respostas imunes às célulastumorais.
Além de reforçar as defesas antitumorais associadas ao Th tipo1, os inibidores da IL-13 podem também ser capazes de bloquear ocrescimento das células tumorais mais diretamente. Por exemplo, na leucemialinfocítica crônica das células B (B-CLL) e na doença de Hodgkin, a IL-13 oubloqueia a apoptose ou promove a proliferação das células tumorais(Chaouchi et al. Blood 1996; 87: 1022; Kapp et al. J. Exp Med. 1999; 189:1939). A B-CLL é uma doença clinicamente heterogênea que se origina doslinfócitos B que envolvem o defeito apoptótico nas células leucêmicas. A IL-13 não é julgada atuar como um fator de crescimento direto, porém protege ascélulas tumorais contra a apoptose espontânea in vitro (Chaouchi et al. Blood1996; 87: 1022; Lai et al. J. Immunol.1999; 162: 78) e pode contribuir para aB-CLL pela prevenção da morte das células neoplásticas.
A doença de Hodgkin é um tipo de linfoma que principalmenteafeta os adultos jovens e é responsável por cerca de 7.500 casos por ano nosEstados Unidos. O câncer é caracterizado pela presença de grandes célulasmultinucleadas de Hodgkin/Reed-Stemberg (H/RS). Em uma grande maioriados casos, a população de células malignas surge das células B. Váriaslinhagens celulares derivadas da doença de Hodgkin, assim como o tecido doslinfonodos dos pacientes de linfoma de Hodgkin, super-expressam a IL-13e/ou os receptores da IL-13 (Kapp et al. J. Exp Med. 1999: 189: 1939, Billardet al. Eur Cytokine Netw 1997; 8: 19; Skinnider et al Blood 2001; 97: 250;Oshima et al., Cell Immunol 2001, 211: 37). A neutralização dos mAbs anti-IL-13 ou dos antagonistas da IL-13, foram observados inibirem a proliferaçãodas células H/RS de uma maneira dependente da dose (Kapp et al J. ExpMed. 1999; 189: 1939; Oshima et al., CellImmunol 2001; 211: 37). De formasemelhante, a liberação do receptor isca IL-13Ra2 solúvel aos camundongosNOD/SCID com uma linhagem de células implantadas derivadas da doençade Hodgkin retardou o início e o crescimento tumoral, e aumentou asobrevivência, demonstrando que a neutralização da IL-13 pode suprimir ocrescimento do linfoma de Hodgkin in vitro e in vivo (Trieu et al. CâncerResearch 2004; 64: 3271). Coletivamente, estes estudos indicam que a IL-13estimula a proliferação das células H/RS em uma forma autócrina (Kapp et al.J. Exp Med. 1999; 189: 1939; Ohshima et al. Histopathology 2001; 38: 368).
A neutralização da IL-13 pode, portanto, representar umtratamento atrativo e eficaz para a doença de Hodgkin e outros cânceresassociados com as células B mediante inibição do crescimento das célulastumorais, enquanto ao mesmo tempo reforça as defesas antitumorais.
Doenças inflamatórias intestinais
Existe um papel possível para a IL-13 na patogênese dadoença inflamatória intestinal (IBD). A doença inflamatória intestinalcompreende várias doenças clinicamente classificadas como colite ulcerativa,doença de Crohn e colite indeterminada. Sua principal manifestação é ainflamação intestinal crônica devida a uma resposta imune exagerada com umdesequilíbrio na ativação dos linfócitos Thl e Th2 na mucosa intestinal. Istofoi demonstrado em modelos de animais da doença de Crohn (Bamias et al.Gastroenterol 2005; 128: 657) e da colite ulcerativa (Heller et al, Immunity2002; 17: 629). A neutralização da IL-13 pela administração de IL-13Ra2-Fcpreveniu a colite em um modelo Th2 de murino da colite ulcerativa humana(Heller et al., Immunity 2002; 17: 629). Além disso, a produção da IL-13rapidamente substitui aquela da IL-4 neste modelo, e a produção da IL-13pode ser induzida pela estimulação das células NKT5 sugerindo que o danotecidual possa resultar da atividade tóxica da IL-13 sobre as células epiteliais.Existem alguns dados humanos para apoiar estas descobertas: a freqüência deespécimes de biópsia retal positiva de IL-13 dos pacientes com coliteulcerativa foi significativamente mais elevada do que a dos pacientes decontrole inflamatório ou não inflamatório, e uma expressão de índice maiselevado de IL-4 e IL-13 foi observada na colite ulcerativa aguda do que nanão aguda (Inoue et al. Am J Gastroenterol 1999; 94: 2441). Além disso,Akido et al. caracterizaram a atividade imune nos muscularis externa dossegmentos intestinais dos pacientes da doença de Crohn, e observaram que aIL-4 e a IL-13 medeiam a hipercontratilidade das células dos músculos lisosintestinais através de uma via de STAT-6. Os autores concluíram que esta viapode contribuir para a hipercontratilidade dos músculos intestinais na doençade Crohn (Akiho et al., Am J Fysiol Gastrointest Liver Fysiol 2005; 288:619).
Assim, um mAb de IL-13, possivelmente em combinação commoléculas dirigidas em outras citocinas, pode prover uma abordagem parainterromper ou reduzir a progressão de IBDs.
Psoríase e artrite psoriásica
A psoríase é uma doença crônica da pele caracterizada porhiperproliferação dos ceratinócitos e um infiltrado celular imunológico,incluindo células T ativadas, produzindo várias citocinas que podeminfluenciar o fenótipo dos ceratinócitos epidérmicos. CDw60 é uma moléculaconduzindo carboidratos que é supra-regulada sobre a superfície dosceratinócitos psoriásicos basais e suprabasais da pele psoriásica. A IL-4 e aIL-13 secretadas das células T derivadas de lesões psoriásicas foramapresentadas como fortemente supra-regulando a expressão de CDwóO sobreos ceratinócitos (Skov et al., Am JPathol 1997; 15: 675), ao passo que IL-4/IL-13 bloqueadas pelo interferon-gama mediaram a indução de CDwóOsobre is ceratinócitos cultivados (Huang et ai., JInvest Dermatol 2001; 116:305). Assim sendo, a expressão de CDwóO sobre os ceratinócitos epidérmicospsoriázicos é julgada ser induzida, pelo menos em parte, pela IL-13 secretadapelas células T ativadas dentro da lesão. Além disso, IL-13Ral e IL-4Ra, asproteínas da superfície celular que, juntas, formam um complexo receptorpara IL-13, são diferentemente expressas nas biópsias da pele de pacientescom e sem psoríase (Cancino-Diaz et al., JInvest Dermatol 2002; 119: 1114;Wongpiyabovorn et al., J Dermatol Science 2003; 33: 31), e as experiênciasin vitro demonstraram que a IL-13 (mas não a IL-4) podem supra-regular aexpressão de IL-13Ral (Wongpiyabovorn et al., J Dermatol Science 2003,33: 31 ). Tendo em vista que a IL-13 tem um efeito sobre uma variedade detipos celulares, estes estudos sugerem que o receptor da IL-13 podedesempenhar uma parte no processo inflamatório precoce da psoríase.
A artrite psoriásica é caracterizada pela sinovite, a qual émediada pelas citocinas tanto pró-inflamatórias quanto antiinflamatórias. Opapel da IL-13 nas várias formas de artrite vem recebendo interesse crescente.Spadaro et al. observou níveis significativamente mais elevados de IL-13 nofluido sinovial de pacientes com artrite psoriásica e artrite reumatóide, do queem pacientes com osteoartrite. Além disso, os níveis de IL-13 do fluidosinovial foram significativamente mais elevados do que aqueles no soro empacientes com artrite psoriásica, e a relação de fluido sinovial/soro da IL-13foi marcadamente mais elevada no grupo de artrite psoriásica do que no grupode artrite reumatóide, o que sugeriu um possível papel para a IL-13localmente produzida nos tecidos sinoviais de pacientes com artrite psoriásica(Spadaro et al., Ann Rheum Dis 2002; 61:174).Papel potencial da IL-13 em outras condições
A doença aguda do enxerto versus hospedeiro é uma causaséria de morbidez e mortalidade que segue o transplante de célulasprimordiais e se acha diretamente relacionada com o grau deincompatibilidade do antígeno leucocitário humano (HLA) entre doador ereceptor. Jordan et al. primeiramente identificaram a IL-13 como umacitocina Th2 típica que é abundantemente produzida durante as MLRs (reaçãode linfócitos misturados; um ensaio in vitro para a seleção de sintonia fina dodoador após a tipagem inicial do HLA) não relacionadas, nãocompatibilizadas (Jordan et al. JImmunol Methods; 2002; 260: 1). O mesmogrupo, subseqüentemente, mostrou que a produção de IL-13 pelas células Tdoadores é prenunciador da doença do enxerto versus hospedeiro aguda(aGVHD) em seguida ao transplante de células primordiais doadoras nãorelacionadas (Jordan et al. Blood 2004; 103: 717). Todos os pacientes comaGVHD severa de graduação III em seguida ao transplante de célulasprimordiais, tiveram doadores que produziram respostas muito elevadas deIL-13 de pré-transplante, demonstrando um elo significativo entre os níveis deIL-13 e aGVHD e elevando a possibilidade de que a IL-13 possa serdiretamente responsável por algumas das patologias associadas com a GVHD.Conseqüentemente, uma terapia com base no bloqueio específico da IL-13pode ser útil para o tratamento da aGVHD pós-transplante de célulasprimordiais.
A nefropatia diabética é uma das principais causas de doençarenal de estágio final no mundo ocidental. Não obstante a incidência denefropatia devida ao diabete do tipo 1 esteja declinando, o diabete melito dotipo 2 é agora a causa única mais comum de insuficiência renal nos EstadosUnidos, no Japão e na Europa. Além disso, este grupo de pacientes tem umprognóstico muito fraco sobre a diálise de manutenção devido à mortalidadeextremamente elevada causada por eventos cardiòvasculares. É agoracrescentemente claro que as mudanças hemodinâmicas, metabólicas eestruturais estejam entrelaçadas, e que várias enzimas, fatores de transcrição efatores de crescimento, tenham sido identificadas, que desempenhem umpapel na patogênese desta doença. Particularmente, o TGF-β é importante nodesenvolvimento da hipertrofia renal e no acúmulo de componentes matrizesextracelulares, e é considerado a citocina principal em mediar a formação decolágeno nos rins [Cooper. Diabetologia 2001; 44: 1957; Wolf. Eur J ClinInvest 2004; 34 (12): 785]. Na nefropatia diabética experimental e humana, abioatividade do TGF-I é aumentada e a administração de anticorpos TGF-β 1a camundongos diabéticos levou ao melhoramento na função renal e acúmuloreduzido da matriz extracelular. A IL-13 foi recentemente apresentada em ummodelo de fibrose pulmonar em camundongo transgênico para mediar seusefeitos, pelo menos em parte, mediante regulação da produção e ativação doTGF-β 1 e deposição de colágeno (Lee et ai. J. Exp. Med. 2001; 194: 809; Zhuet al. J. Clin. Invest. 1999; 103: 779), por esse meio estabelecendo um elofuncional direto entre a IL-13 e o TGF-β. Conseqüentemente, um papelsemelhante para a IL-13 em regular a atividade do TGF-bl nos rinsdiabéticos, pode ser considerado e as intervenções indicadas da IL-13 podempotencialmente ter um papel no controle da nefropatia diabética.
Condições Fibróticas
A fibrose pulmonar é uma condição de cicatrização imprópriae danosa dos pulmões, levando à incapacidade e freqüentemente à morte. Aexpressão encerra uma variedade de diferentes condições com etiologias,patologias e respostas distintas ao tratamento. Em alguns casos, a causa dafibrose é identificada. As causas incluem: (1) material pró-fibrótico inalado,tal como asbestos ou silício, ou poeira de metais duros, (2) material orgânicoinalado, ao qual o paciente tenha uma resposta imunológica idiossincráticalevando à fibrose (por exemplo, os pulmões de fazendeiro), (3) medicamentostais como a nitrofurantoína, a amiodarona e o metotrexàto, (4) em associaçãocom uma doença inflamatória sistêmica, tal como a Esclerose Sistêmica ou aArtrite Reumatóide.
Entretanto, em muitos casos, nenhuma causa ou condiçãosubjacente é identificada. Muitos de tais pacientes são diagnosticados comFibrose Pulmonar Idiopática (IFP). Esta é uma condição rara relativa(prevalência 20/100 000). O diagnóstico baseia-se na ausência de uma causaidentificada combinada com certos aspectos radiológicos e patológicos,particularmente o alveolamento sobre a CT ou a biópsia pulmonar. A doençaé usualmente observada em pacientes mais idosos (> 50) e freqüentementesegue um curso implacável de debilitação pulmonar progressiva levando àmorte, com a sobrevivência mediana classificada como 2 a 5 anos. Alémdisso, os pacientes têm a experiência muitíssimo desagradável da falta derespiração que progride durante meses ou anos. Isto inicialmente restringe aatividade física, mas, na fase terminal - o que pode durar vários meses - opaciente fica sem respiração mesmo em repouso e fica outrossim dependente de oxigênio.
Presentemente não existe nenhum tratamento satisfatório paraesta doença. O tratamento corrente geralmente toma a forma decorticosteróides e imunossupressores tais como a azatioprina. No entanto, oscorticosteróides podem ser ineficazes em muitos dos pacientes e seus efeitoscolaterais podem tornar a situação pior. Existem muitos tratamentospotenciais sob pesquisa que incluem o interferon-gama, que se apresentoucomo uma tentativa para a sobrevivência melhorada em um grande estudorecente, e a perfenidona.
Existe evidência de que a IL-13 e as citocinas associadas como fenótipo de Th2 se acham envolvidas no processo da fibrose no reparotecidual (Wynn, Τ. A., Nat. Rev. Immunol. 2004 4: 583-594; Jakubzick et al.,Am. J. PathoL 2004 164(6): 1989-2001; Jakubzick et al., Immunol. Res. 200430(3): 339-349; Jakubzick et al, J. Clin. Pathol. 2004 57: 477-486). A IL-13e a IL-4 têm sido implicadas em uma variedade de condições fibróticas. Afibrose hepática induzida por Schistosoma parece ser dependemte da IL-13 eexiste evidência limitada de que a IL-13 se acha envolvida na patogênese daesclerodermia (Hasegawa et al, J. Rheumatol. 1997 24: 328-332; Riccieri etai, Clin. Rheumatol. 2003 22: 102-106).
Em termos de fibrose pulmonar, estudos in vitro têm mostradoque a IL-13 promove um fenótipo fibrogênico. Estudos de animais têmapresentado elevados níveis de expressão da IL-13 em modelos de fibroseinduzidos artificialmente, e que a fibrose pode ser reduzida pela eliminação daIL-13.
A IL-13 promove um fenótipo pró-fibrótico. Em um nívelcelular, existem vários mecanismos pelos quais a IL-13 pode promover afibrose. As vias de sinal e a importância destes vários mecanismos não seacham bem definidos.
Existe evidência de que a IL-13 atua sobre o fibroblasto tantopara promover a produção do colágeno, quanto para inibir sua decomposição,assim favorecendo um fenótipo fibrótico. Os fibroblastos da pele possuemreceptores de IL-13 (= o receptor de IL-4 do tipo II) e a exposição dosfibroblastos cultivados da pele à IL-13 leva à supra-regulação da geração docolágeno (Oriente et al., J. Farmacol. Exp. Ther. 2000 292: 988-994). A IL-4também tem um efeito semelhante, porém mais transitório. Uma linhagemcelular de fibroblastos pulmonares humanos (ICIG7) expressa o receptor daIL-4 tipo II (Jinnin et al., J. Biol. Chem 2004 279: 41783-41791). A exposiçãodestas células à IL-13 promove a secreção de uma variedade de mediadoresinflamatórios e pró-fibróticos: GM-CSF, G-CSF, integrina VCAM betai(Doucet et al, Int. Immunol. 1998 10(10): 1421-1433).
A IL-13 inibe a produção de proteínas das metaloproteinases 1e 3 da matriz induzida pela IL-la, mediante os fibroblastos da pele, o quedeve tender a reduzir a decomposição da matriz de EC (Oriente et al, J.Farmacol. Exp. Ther. 2000 292: 988-994). A IL-13 atua sinergisticamentecom o TGF-β sobre os fibroblastos humanos obtidos pela biópsia das viasaéreas da asma para promover a expressão do inibidor tecidual dametaloproteinase 1 (TIMP-1). A decomposição da matriz extracelular éefetuada pelas metaloproteínases matrizes, as quais são inibidas pelo TIMP-1.Esta ação da IL-13 deve assim tender a reduzir a degradação da matriz (Zhouet ai, Am. J. Fysiol CellFysiol 2005 288: C435-C442).
A super-expressão da IL-13 em camundongos transgênicosconduz à fibrose subepitelial, à hipertrofia das células epiteliais, à hiperplasiadas células caliciformes, à deposição de cristais (quitinase acídica demamíferos, à hiper-responsividade das vias aéreas, à fibrose intersticial, àhipertrofia celular tipo 2 e ao acúmulo de tensoativos (Zhu et al., J. Clin.InvesL 1999 103(6): 779-788).
As diferentes raças de camundongos possuem diferentessuscetibilidades à fibrose pulmonar induzida pela bleomicina. Oscamundongos C57B1/6J, que são suscetíveis, apresentam supra-regulaçãorápida da IL-13, da IL-13Ra e da IL-4 (bem como TGFβ, TNFRa e ILlRs)em resposta à bleomicina. Os camundongos BALB/c, que não são suscetíveis,não apresentam supra-regulação da IL-13.
Belperio et al (Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 2002 27: 419-427) estudaram a expressão e o papel da IL-13, IL-4 e da chemocina CC CIOem um modelo de fibrose de bleomicina de camundongo. Os níveis teciduaisdos pulmões tanto da IL-13 quanto da IL-4 aumentaram em resposta àbleomicina. Antes da neutralização da IL-13, o uso de anticorpos policlonaisanti-IL-13 reduziu significativamente a fibrose pulmonar em resposta àbleomicina, como avaliado pelos níveis de hidroxiprolina dos pulmões. Adespeito da expressão aumentada da IL-4 no mesmo modelo, a neutralizaçãoda IL-4 não teve nenhum efeito sobre a fibrose pulmonar.Em outro modelo de fibrose pulmonar aguda induzida porFITC no camundongo BALB/C, a ausência da IL-13 (em silenciados), masnão da IL-4, protegeu contra a fibrose pulmonar. Não existe nenhumaproteção adicionada de silencioso da IL-4 nos silenciosos da IL-13 (Kolodsicket al., J. Immunol. 2004 172: 4068-4076). O efeito protetor da ausência de IL-13 não é devido à diferença no recrutamento celular dentro dos pulmões: emtodos os silenciosos e BALB/c, os números totais de células recrutadas sãosemelhantes, de modo que o componente inflamatório inicial parece ser nãoafetado. O recrutamento eosinofílico é menor nos silenciosos da IL-4 e IL-13em comparação com BALB/c, mas, tendo em vista que os IL-4 -/- não foramprotegidos contra a fibrose, isto não pode explicar a diferença na fibrose.Talvez, surpreendentemente, não existisse nenhuma diferença nos níveis decitocinas entre IL-13 +/+ e -/-, incluindo para a IL10, MCP-1, interferon-gama, TGF-1. Além disso, o mesmo número de fibroblastos foi isolado dospulmões dos diferentes animais após FITC, mas nos camundongos de IL-13 -/-a produção de colágeno I é reduzida. Isto indica que a perda de IL-13 nãoestá simplesmente prevenindo a resposta inflamatória, mas, ao invés, estátendo um papel antifibrótico mais específico. Foi sugerido que a IL-13 podeexercer seu efeito fibrótico através do TGF-I (Lee et al., J. Exp. Med. 2001194: 809-821). Entretanto, neste modelo de FITC, a expressão do TGF-I nãofoi reduzida em camundongos silenciosos de IL-13.
Pode-se esperar que a interleucina-4 exerça um efeito similarao da IL-13, já que ambas atuam através do mesmo receptor. A IL-4 ésignificativamente supra-regulada nos pulmões dos camundongos com fibrosepulmonar induzida pela bleomicina (Gharaee-Kermani et al., Cytokine 200115: 138-147). Entretanto, a comparação da fibrose pulmonar induzida pelableomicina em camundongos C57BL6/J que sobre-expressam a IL-4, ossilenciosos e tipo selvagem de IL-4, Izbicki et al. {Am. J. Fysiol. Lung CellMol. Fysiol 2002 283(5): Ll 110-L1116) não encontraram evidência de que aIL-4 fosse envolvida na fibrose pulmonar. A fibrose não foi reduzida nossilenciosos de IL-4, e os camundongos super-expressando a IL-4 tiveramníveis aumentados de fibrose.
Os níveis de citocina BAL da IL-13 são significativamenteelevados em pacientes com uma variedade de formas de fibrose pulmonar,não obstante com considerável variabilidade. A expressão da IL-13 ésignificativamente supra-regulada nos macrófagos alveolares obtidos dospacientes com fibrose pulmonar.
A evidência clínica mais forte vem da pesquisa naUniversidade de Michigan. Jakubzick e colegas estudaram a expressão dosgenes de IL-13 e IL-4 e seus receptores nas biópsias cirúrgicas de pulmões depacientes com fibrose pulmonar. A expressão dos genes de IL-13 émarcadamente mais elevada nos espécimes dos pulmões de IPF afetados doque de pulmões normais ou outras condições fibróticas pulmonares. Osfibroblastos cultivados de pacientes com IPF/UIP apresentam expressãoelevada do receptor de IL-13 e de IL-4, em comparação com as biópsiasobtidas do tecido e dos fibroblastos de pacientes com pulmões normais ououtras formas de fibrose pulmonar. Em particular, os focos fibroblásticos, quesão presumivelmente o epicentro da atividade da doença, mancham emparticular intensamente quanto a estes receptores (Jakubzick et al., J.Immunol. 2003 171: 2684-2693; Jakubzick et al., Am. J. Pathol. 2003 162:1475-1486; Jakubzick et al., Am. J. Pathol. 2004 164(6): 1989-2001;Jakubzick et al., Immunol. Res. 2004 30(3): 339-349; Jakubzick et al., J. Clin.Pathol. 2004 57: 477-486).
Existe boa evidência ín vitro de que as citocinas Th2 em gerale a IL-13, em particular, promovem um fenótipo pró-fibrótico. Em pelomenos dois modelos de animais, foi observado que a fibrose quimicamenteinduzida pode ser reduzida pela eliminação da IL-13 (ou no silencioso dogene ou por anticorpos anti-IL-13). Alguma evidência indica que a IL-13 émais importante em promover a fibrose pulmonar do que a IL-4. Evidênciaclínica para o papel da IL-13 na fibrose pulmonar sugere que a IL-13 e seusreceptores sejam desregulados nos pulmões de pacientes com IPF. Um grupocrescente de dados sugere um papel importante para as terapias à base da IL-13 para o tratamento de uma variedade de condições fibróticas, incluindo afibrose hepática induzida pela esquistossomíase, e várias formas de fibrosepulmonar [por exemplo a IPF (examinada em outra parte), escleroderma].
As experiências em que a IL-4 e a IL-13 foram inibidasindependentemente identificaram a IL-13 como a citocina efetora dominanteda fibrose em vários modelos (Chiaramonte et al. J. Clin. Invest. 1999; 104:777-785; Blease et al. J. Immunol. 2001; 166: 5219; Kumar et al. Clin. Exp.Allergy 2002; 32: 1104). Na esquistossomíase, embora a resposta inflamatóriainduzida por ovos não tenha sido afetada pelo bloqueio da IL-13, a deposiçãodo colágeno decresceu em mais do que 85 % nos animais cronicamenteinfectados (Chiaramonte et al. J. Clin. Invest. 1999; 104: 777; Chiaramonte etal. Hepatology 2001; 34: 273) a despeito da produção continuada e não reduzida da IL-4.
A seqüência de aminoácidos para hIL é apresentada comoSEQ ID NO: 9 (Esta é a seqüência de proteínas maduras, isto é, nenhumaseqüência de sinal se acha presente).
Um polinucleotídeo codificando hIL-13 é apresentado na SEQID NO: 10 (Isto é, a seqüência de DNA para a seqüência de proteínasmaduras, isto é, a seqüência de sinal se acha presente).
Todas as patentes e referências de literatura apresentadasdentro do presente relatório descritivo (incluindo qualquer pedido de patentepara o qual este pedido reivindique prioridade), ficam expressa e inteiramenteincorporadas neste relatório como referência.
Recentemente, as vacinas originando respostas imunes contraIL-13 para o tratamento da asma, foram descritas (WO 02/070711). Um papelpara a IL-13 na sensibilização da pele aos alérgenos ambientais também foirecentemente descrito (Herrick et al., The Journal of Immunology, 2003, 170:2488-2495).
A presente invenção fornece um anticorpo que liga a hIL-13 einibe a ligação da hIL-13 com ambas as cadeias de hIL-13R, isto é, IL-13Rale IL-13Ra2.Sumário Da Invenção
A presente invenção, portanto, provê um anticorpo ou seufragmento de ligação a antígeno, que especificamente se liga à hIL-13 eneutraliza a atividade da hIL-13. A presente invenção fornece um anticorpoou seu fragmento de ligação a antígeno que especificamente se liga à hIL-13 ecompreende um CDRH3 que é uma variante da seqüência apresentada naSEQ ID NO: 3 ou uma variante em que um ou dois resíduos de aminoácidosdentro do referido CDHR3 da dita variante diferem do resíduo deaminoácidos na posição correspondente na SEQ ID NO: 3. Em uma forma derealização da presente invenção, estas diferenças nos resíduos de aminoácidossão substituições conservativas.
A expressão "especificamente se liga", como usada natotalidade do presente relatório descritivo em relação a anticorpos e seusfragmentos de ligação a antígeno da invenção, significa que o anticorpo seliga à hIL-13 sem nenhuma ligação, ou com ligação insignificante, a outrasproteínas humanas e, em particular, à IL-4 humana. A expressão, entretanto,não exclui o fato de que os anticorpos da invenção possam ser de reatividadecruzada com a IL-13 de cinomolgos.
O termo "neutraliza", como usado na totalidade do presenterelatório descritivo em relação aos anticorpos e seus fragmentos de ligação aantígenos da invenção, significa que a atividade biológica da IL-13 é reduzidana presença dos anticorpos e fragmentos de ligação a antígenos da presenteinvenção, em comparação com a atividade da IL-13 na ausência de taisanticorpos e seus fragmentos de ligação a antígeno. Os níveis de neutralizaçãopodem ser medidos de várias maneiras, por exemplo pelo uso dos ensaiosapresentados nos exemplos abaixo, por exemplo em um ensaio deproliferação de células TF-I que pode ser realizado, por exemplo, comodescrito nos Exemplos 3.3 a 3.5. A neutralização da IL-13 neste ensaio émedida pela avaliação da proliferação reduzida das células TF-I na presençade anticorpo neutralizante.
Se um anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno forcapaz de neutralização, então isto é indicativo da inibição da interação entrehIL-13 e seu receptor. Os anticorpos que são considerados como tendoatividade neutralizante contra a IL-13 humana devem ter uma ND5O de menosdo que 100 microgramas/ml, ou menos do que 80 microgramas/ml no ensaiode proliferação das células TF-I apresentado nos Exemplos 3.3, 3.4 ou 3.5.
Em um aspecto alternativo da presente invenção sãofornecidos anticorpos ou seus fragmentos de ligação a antígeno que possuematividade de neutralização equivalente aos anticorpos nela exemplificados,por exemplo anticorpos que conservam a atividade de neutralização de H2L1no ensaio de proliferação das células TF-I apresentado nos Exemplos 3.3, 3.4 ou 3.5.
Como aqui usado, o termo "modula" significa a inibição daligação da IL-13 a seu receptor, e/ou o bloqueio da interação entre a IL-13 eseu receptor, por esse meio desacoplando a via de sinalização hIL-13/hIL-13R. Isto pode ser a inibição e/ou o bloqueio de qualquer um, ou de ambos,dentre IL-13Ral e IL-13Rot2. O receptor de hIL-13, como usado nesterelatório descritivo, significa um ou ambos destes receptores. A inibição daligação da IL-13 a seu receptor pode ser medida de várias maneiras, porexemplo pelo uso dos ensaios apresentados nos exemplos abaixo, porexemplo um método ELISA tal como aquele descrito nos Exemplos 6.5 e 6.6.
Os anticorpos e seus fragmentos de ligação a antígeno dapresente invenção podem ser anticorpos terapêuticos e seus fragmentos deligação a antígeno, isto é, adequados para uso em terapia.
Em um aspecto, é fornecido um anticorpo ou seu fragmento deligação a antígeno, que especificamente se liga à hIL-13, e compreendem umCDRH3 contendo a seqüência apresentada na SEQ ID NO: 3.
Em uma forma de realização, o anticorpo ou fragmento deligação a antígeno da presente invenção neutraliza a IL-13 humana.
Em outra forma de realização, o anticorpo ou fragmento deligação a antígeno da presente invenção modula a ligação da IL-13 humana aseu receptor.
Em outro aspecto da presente invenção, é fornecido umanticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno que especificamente se ligaà hIL-13 e modula a interação entre hIL-13 e hIL-13R.
Em certas formas de realização, os anticorpos da invençãopelo menos inibem a interação entre hIL-13 e hIL-13R, mas podem tambémbloquear a interação entre hIL-13 e hIL-13R, dessa forma desacoplando a viade sinalização hIL-13/hIL-13R.
Em outra forma de realização, a presente invenção provê umanticorpo ou fragmento de ligação a antígeno em que CDRH3 compreende aseqüência de SEQ ID NO: 3. Em uma outra forma de realização, o anticorpoou seu fragmento de ligação a antígeno da presente invenção aindacompreendem uma ou mais das seguintes seqüências: CDRH2: SEQ ID NO:2, CDRHl: SEQ ID NO: 1, CDRLl: SEQ ID NO: 4, CDRL2: SEQ ID NO: 5e CDRL3: SEQ ID NO: 6. Em uma outra forma de realização, a presenteinvenção ainda compreende estas seqüências de CDR no contexto de umaestrutura humana, por exemplo como um anticorpo humanizado ou seufragmento.
Em outro aspecto da presente invenção, é fornecido umanticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno que especificamente se ligaà hIL-13, e compreende as seguintes CDRs:CDRHl: SEQ. ID. NO: 1CDRH2: SEQ. ID. NO: 2CDRH3: SEQ. ID. NO: 3CDRL1: SEQ. ID. NO: 4
CDRL2: SEQ. ID. NO: 5CDRL3: SEQ. ID. NO: 6
Em uma forma de realização da presente invenção, uma oumais das CDRs do anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno podemcompreender variantes das CDRs apresentadas nas seqüências listadas acima.Cada CDR variante compreenderá um ou dois resíduos de aminoácidos quedifiram do resíduo de aminoácido na posição correspondente na seqüêncialistada acima. Tais substituições nos resíduos de aminoácidos podem sersubstituições conservativas, por exemplo substituindo-se um aminoácidohidrofóbico por um aminoácido hidrofóbico alternativo, por exemplosubstituindo-se a Leucina por Valina ou Isoleucina.
Na totalidade deste relatório descritivo, os resíduos deaminoácidos nas seqüências de anticorpos são numerados de acordo com oesquema de Kabat. De forma semelhante, os termos "CDR", "CDRL1","CDRL2", "CDRL3", "CDRH 1", "CDRH2", "CDRH3" seguem o sistema denumeração de Kabat apresentado em Kabat et cd\ Sequences of proteins ofImmunological Interest NIH, 1987, com exceção de que a posição 30 dacadeia pesada é tomada como fazendo parte de uma CDR.
Como aqui empregados os termos "compreendendo" e"compreende" incorporam "consistindo em" e "consiste em".
Em outro aspecto da invenção, é fornecido um anticorpo ouseu fragmento de ligação a antígeno compreendendo um domínio VHcontendo a seqüência apresentada em SEQ ID NO: 7 e um domínio VLcontendo a seqüência apresentada em SEQ ID NO: 8.Em outro aspecto da invenção, é fornecido um domínio VHisolado de um anticorpo contendo a seqüência selecionada do grupoconsistindo nas SEQID NOs: 7, 11, 12, 13 e 14. Em uma forma de realização,o domínio VH isolado de um anticorpo consiste em, ou consisteessencialmente em, um domínio VH isolado de um anticorpo selecionado dogrupo consistindo nas SEQ ID NOs: 7, 11, 12, 13 e 14.
Em outro aspecto da invenção, é fornecido um anticorpo ouseu fragmento de ligação a antígeno, compreendendo um domínio VHselecionado do grupo consistindo nas: SEQ ID NOs: 7, 11, 12, 13 e 14.
Em outro aspecto da invenção, é fornecido um anticorpo queespecificamente se liga à hIL-13 e pelo menos inibe a interação entre hIL-13 ehIL-13R, cujo anticorpo compreende uma cadeia pesada da SEQ ID NO: 18, euma cadeia leve selecionada do grupo consistindo em: SEQ ID NOs: 22, 23 e24.
Em outro aspecto da invenção, é fornecido um anticorpo queespecificamente se liga à hIL-13 e pelo menos inibe a interação entre hIL-13 ehIL-13R, cujo anticorpo compreende uma cadeia pesada da SEQ ID NO: 19, euma cadeia leve selecionada do grupo consistindo em: SEQ ID NOs: 22, 23 e24.
Em outro aspecto da invenção, é fornecido um anticorpo queespecificamente se liga à hIL-13 e pelo menos inibe a interação entre hIL-13 ehIL-13R, cujo anticorpo compreende uma cadeia pesada da SEQ ID NO: 20, euma cadeia leve selecionada do grupo consistindo em: SEQ ID NOs: 22, 23 e24.
Em outro aspecto da invenção, é fornecido um anticorpo queespecificamente se liga à hIL-13 e pelo menos inibe a interação entre hIL-13 ehIL-13R, cujo anticorpo compreende uma cadeia pesada da SEQ ID NO: 21, euma cadeia leve selecionada do grupo consistindo em: SEQ ID NOs: 22, 23 e24.Em outro aspecto da invenção, é fornecido um anticorpo ouseu fragmento de ligação a antígeno que inibem a ligação do anticorpocompreendendo uma cadeia pesada de SEQ ID NO: 18 e uma cadeia leve deSEQ ID NO: 22,àhIL-13.
De acordo com a presente invenção, é fornecido um anticorpohumanizado, o qual compreende um domínio VH de: SEQ ID NO: lie umdomínio VL selecionado do grupo consistindo nas: SEQ ID NOs: 15, 16 e 17.
De acordo com a presente invenção, é fornecido um anticorpohumanizado, o qual compreende um domínio VH de: SEQ ID NO: 12 e umdomínio VL selecionado do grupo consistindo nas: SEQ ID NOs: 15, 16 e 17.
De acordo com a presente invenção, é fornecido um anticorpohumanizado, o qual compreende um domínio VH de: SEQ ID NO: 13 e umdomínio VL selecionado do grupo consistindo nas: SEQ ID NOs: 15, 16 e 17.
De acordo com a presente invenção, é fornecido um anticorpohumanizado, o qual compreende um domínio VH de: SEQ ID NO: 14 e umdomínio VL selecionado do grupo consistindo nas: SEQ ID NOs: 15, 16 e 17.
De acordo com a presente invenção, é fornecido um anticorpoou seu fragmento de ligação a antígeno que se liga aos peptídeos apresentadosnas SEQ ID NOs: 90, 99, 102, 103, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112 e114, porém não liga os peptídeos apresentados nas SEQ ID NOs: 100, 101,104 e 113, em que a ligação é definida como tendo uma atividade de ligaçãoequivalente aos anticorpos aqui exemplificados, por exemplo os anticorposque conservam atividade de ligação semelhante à ligação 3G4 aos peptídeosde IL-13 humanos no ensaio ELISA apresentado no Exemplo 6.4.
Em outro aspecto da invenção, é fornecido um método detratar de um paciente humano afligido com uma doença ou distúrbioresponsivo à modulação da interação entre hIL-13 e hIL13R (tal como asma,COPD, rinite alérgica, dermatite atópica), método este que compreende aetapa de administrar ao referido paciente uma quantidade terapeuticamenteeficaz do anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno, como descritoneste relatório.
O uso de um anticorpo da invenção, na fabricação de ummedicamento para o tratamento de uma doença ou distúrbio responsivo àmodulação da interação entre hIL-13 e hIL-13R, é também proporcionado.
Em um outro aspecto, a invenção fornece um método paraselecionar um anticorpo anti-IL-13 adequado para uso em terapia, métodoeste que compreende i) prover um anticorpo que especificamente se ligue àIL-13Ral, ii) determinar se o anticorpo se liga especificamente à IL-13Ra2,e selecionar um anticorpo que se ligue na etapa ii) para desenvolvimentoadicional.
Descrição Detalhada Da Invenção
Os anticorpos da presente invenção podem ser anticorposintactos ou seus fragmentos; anticorpos humanos, quiméricos ouhumanizados; e mono- ou biespecíficos.
1. EstruturasDosAnticorpos
1.1 Anticorpos Intactos
Os anticorpos intactos incluem glicoproteínasheteromultiméricas compreendendo pelo menos duas cadeias pesadas e duasleves. Com exceção da IgM, os anticorpos intactos são usualmenteglicoproteínas heterotetraméricas de aproximadamente 150 Kda, compostasde duas cadeias leves (L) idênticas e duas cadeias pesadas (H) idênticas.Tipicamente, cada cadeia leve é ligada a uma cadeia pesada por uma ligaçãodissulfeto covalente, enquanto o número de articulações dissulfeto, entre ascadeias pesadas de diferentes isotipos de imunoglobulina, varia. Cada cadeiapesada e leve também tem pontes dissulfeto entre cadeias. Cada cadeia pesadatem em uma extremidade um domínio variável (VH) seguido por váriasregiões constantes. Cada cadeia leve tem um domínio variável (VL) e umaregião constante em sua outra extremidade; a região constante da cadeia leveé alinhada com a primeira região constante da cadeia pesada e o domíniovariável de cadeia leve é alinhado com o domínio variável da cadeia pesada.As cadeias leves de anticorpos da maioria das espécies de vertebrados podemser atribuídas a um dos dois tipos denominados de Kapa e Lambda, com basena seqüência de aminoácidos da região constante. Dependendo da seqüênciade aminoácidos da região constante de suas cadeias pesadas, os anticorposhumanos podem ser atribuídos a cinco diferentes classes, IgA, IgD, IgE, IgG eIgM. IgG e IgA podem ser ainda subdivididas nas subclasses IgGl, lgG2,lgG3 e lgG4; e IgAl e IgA2. Variantes das espécies existem comcamundongos e ratos tendo pelo menos IgG2a, IgG2b. O domínio variável doanticorpo confere especificidade de ligação sobre o anticorpo, com certasregiões apresentando variabilidade específica denominadas regiõesdeterminantes da complementaridade (CDRs). As porções mais conservadasda região variável são denominadas regiões Estruturais (FR). Os domíniosvariáveis das cadeias pesadas e leves intactas compreendem, cada um, quatroFR conectadas por três CDRs. As CDRs em cada cadeia são mantidas juntasem íntima proximidade pelas regiões FR e com as CDRs da outra cadeiacontribuem para a formação do sítio de ligação a antígeno dos anticorpos. Asregiões constantes não se acham diretamente envolvidas na ligação doanticorpo ao antígeno, mas apresentam várias funções efetoras, tais como aparticipação na citotoxicidade mediada pelas células dependentes doanticorpo (ADCC), a fagocitose através da ligação ao receptor Fcy, aproporção de meia-vida/depuração através do receptor Fc neonatal (FcRn) e acitotoxicidade dependente do complemento através do componente Clq dacascata de complementos.
Em uma forma de realização, portanto, nós fornecemos umanticorpo intacto que especificamente se liga à hIL-13, anticorpo este quemodula a interação entre hIL-13 e hIL-13R, por exemplo o anticorpo inibe ainteração entre hIL-13 e seu receptor. O anticorpo intacto pode compreenderuma região constante de qualquer isotipo ou sua subclasse descritos acima.Em uma forma de realização, o anticorpo é do isotipo de IgG, particularmenteIgGl. O anticorpo pode ser de rato, camundongo, coelho, primata ou humano.Em uma forma de realização típica, o anticorpo é de primata (tal como decinomolgos, macaco do Velho Mundo ou Macaco Antropóide; ver porexemplo as WO 99/55369, WO 93/02108) ou humano.
Em outra forma de realização, é fornecido um anticorpointacto isolado compreendendo uma CDRH3 da SEQ ID NO: 3. Em outraforma de realização, é fornecido um anticorpo intacto compreendendo umaregião variável contendo CDRs das SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 5 e 6.
Em outra forma de realização, é fornecido um anticorpointacto isolado de murinos ou seu fragmento de ligação a antígenocompreendendo um domínio VH contendo a seqüência de SEQ ID NO: 7 eum domínio VL da seqüência de SEQ ID NO: 8.
1.2 AnticorposHumanos
Os anticorpos humanos podem ser produzidos por váriosmétodos conhecidos daqueles de experiência na técnica. Os anticorposhumanos podem ser produzidos pelo método de hibridomas com o uso domieloma humano ou das linhagens de células de heteromieloma decamundongos-humanas; ver Kozbor, J. Immunol 133, 3001, (1984) e Brodeur,Monoclonal Antibody Production Teehniques and Applications, pp 51-63(Mareei Dekker Inc, 1987). Métodos alternativos incluem o uso de bibliotecasde fago ou camundongos transgênicos, ambos os quais utilizam os repertóriosda região V humana [ver Winter, G., (1994), Annu. Rev. Immunol 12, 433-455, Green, L. L. (1999), J. Immunol. methods 231, 11-23).
Várias cepas de camundongos transgênicos acham-se agoradisponíveis, nas quais seus lócus de imunoglobulina de camundongo tenhamsido substituídos por segmentos de genes de imunoglobulina humana [verTomizuka, K., (2000) PNAS 97, 722-727; Fishwild, D. M. (1996) NatureBiotechnol. 14, 845-851, Mendez, Μ. J., 1997,Nature Genetics, 15, 146-156].Após ο desafio com antígenos, tais camundongos são capazes de produzir umrepertório de anticorpos humanos do qual os anticorpos de interesse podemser selecionados. De menção particular é o sistema Trimera® (ver Eren, R. etal., (1998) Immunology 93: 154-161) em que os linfócitos humanos sãotransplantados nos camundongos irradiados, o Sistema de AnticorposLinfociticos Selecionados (SLAM, ver Babcook et al., PNAS (1996) 93:7843-7848), em que os linfócitos humanos (ou de outras espécies) sãoeficazmente colocados através de um procedimento de geração de anticorposin vitro reunidos massivos, seguido por procedimento decomvulated, dediluição e de seleção limitativas e o Xenomouse II® (Abgenix Inc.). Umaabordagem alternativa acha-se disponível da Morfotek Inc. com o uso datecnologia de Morfodoma®.
A tecnologia de apresentação de fago pode ser usada paraproduzir anticorpos humanos (e seus fragmentos). Ver McCafferty; Nature,348, 552-553 (1990) e Griffiths, A. D. et al. (1994) EMBO 13: 3245-3260.De acordo com esta técnica, os genes do domínio V de anticorpos sãoclonados em matriz dentro ou de uma cobertura principal ou secundária degene proteico de um bacteriófago filamentoso, tal como Ml3 ou fd, eapresentados (usualmente com o auxílio de um fago auxiliar) comofragmentos funcionais de anticorpos sobre a superfície da partícula de fago.
As seleções com base nas propriedades funcionais doanticorpo resultam na seleção do gene codificando o anticorpo que apresentaessas propriedades. A técnica de apresentação de fago pode ser usada paraselecionar anticorpos específicos de antígenos das bibliotecas produzidas dascélulas B humanas colhidas de indivíduos afligidos com uma doença oudistúrbio descritos acima ou, alternativamente, de doadores humanos nãoimunizados (ver Marks; J. Mol. Bio. 222, 581-597, 1991). Quando se desejeque um anticorpo humano intacto compreendendo um domínio Fc, énecessário reclonar o fragmento derivado do fato apresentado em ummamífero, os vetores de expressão compreendendo as regiões constantesdesejadas e estabelecendo linhagens celulares de expressão estável.
A técnica de maturação de afinidade [Marks; Bio/technol 10,779-783 (1992)] pode ser usada para melhorar a afinidade de ligação em quea afinidade do anticorpo humano primário é melhorada por substituiçãoseqüencial das regiões V de cadeias HeL com variantes de ocorrêncianatural, e seleção com base nas afinidades de ligação melhoradas. Asvariantes desta técnica, tais como a "impressão do epítopo" acham-se agoratambém disponíveis. Ver a WO 93/06213. Ver também Waterhouse; Nucl.Acids Res 21, 2265-2266 (1993).
Assim, em outra forma de realização é fornecido um anticorpointacto humano isolado ou seu fragmento de ligação a antígeno, queespecificamente se liga à hIL-13 e modula a interação entre hIL-13 e hlL-13R, por exemplo quando ele inibe a interação entre hIL-13 e seu receptor.
Em outro aspecto, é fornecido um anticorpo intacto humanoisolado ou seu fragmento de ligação a antígeno compreendendo uma CDRH3da SEQ ID NO: 3 que especificamente se liga à hIL-13 e modula a interaçãoentre hIL3 e hIL-13R, por exemplo quando ele inibe a interação entre hIL-13e seu receptor. Em outro aspecto, é fornecido um anticorpo intacto humanoisolado ou seu fragmento de ligação a antígeno compreendendo uma regiãovariável que compreende CDRs das SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 5 e 6, comodefinido acima.
1.2 Anticorpos quiméricos e humanizados
O uso de anticorpos intactos não humanos no tratamento dedoenças ou distúrbios humanas, carrega com ele o potencial para osproblemas ora bem estabelecidos da imunogenicidade, isto é, o sistema imunedo paciente pode reconhecer o anticorpo intacto humano como não próprio emontar uma resposta neutralizadora. Isto é particularmente evidente após aadministração múltipla do anticorpo não humano a um paciente humano.Várias técnicas foram desenvolvidas através dos anos para superar estesproblemas, e geralmente envolvem reduzir a composição das seqüências deaminoácidos não humanas no anticorpo intacto, enquanto se retém afacilidade relativa na obtenção de anticorpos não humanos de um animalimunizado, por exemplo um camundongo, rato ou coelho. Duas abordagensforam usadas amplamente para se obter isto. A primeira consiste emanticorpos quiméricos, que geralmente compreendem um domínio variávelnão humano (por exemplo roedor tal como o camundongo) fundido a umaregião constante humana. Tendo em vista que o local de ligação a antígeno deum anticorpo se acha localizado dentro das regiões variáveis, o anticorpoquimérico retém sua afinidade de ligação quanto ao antígeno, mas adquire asfunções efetoras da região constante humana, e é portanto capaz de realizarfunções efetoras tais como as descritas acima. Os anticorpos quiméricos sãotipicamente produzidos com o uso de métodos de DNA recombinantes. ODNA codificando os anticorpos (por exemplo o cDNA) é isolado eseqüenciado com o uso de procedimentos convencionais (por exemplo, pelouso de sondas de oligonucleotídeos que são capazes de ligação específica aosgenes codificando as cadeias H e L do anticorpo da invenção, por exemplo oDNA codificando as SEQ ID NOs: 1, 2, 3, e, 5 e 6 descritas acima). Ascélulas de hibridomas servem como uma fonte típica de tal DNA. Uma vezisolado, o DNA é colocado dentro dos vetores de expressão, os quais sãoentão transfectados nas células hospedeiras tais como E. coli, células COS,células CHO ou células de mieloma que de outra forma não produzem aproteína de imunoglobulina para se obter a síntese do anticorpo. O DNA podeser modificado pela substituição da seqüência codificadora para as cadeiashumanas LeH, pelas regiões constantes não humanas (por exemplo, demurino) HeL correspondentes. Ver, por exemplo, Morrison; PNAS 81, 6851(1984).A segunda abordagem envolve a geração de anticorposhumanizados em que o conteúdo não humano do anticorpo é reduzido pelahumanização das regiões variáveis. Duas técnicas para a humanizaçãoobtiveram popularidade. A primeira é a humanização pelo enxerto de CDR.As CDR constroem circuitos próximos ao término N dos anticorpos em queeles formam uma superfície montada em um andaime fornecido pelas regiõesda estrutura. A especificidade de ligação a antígeno do anticorpo éprincipalmente definida pela topografia e pelas características químicas de suasuperfície de CDR. Estes aspectos são por sua vez determinados pelaconformação das CDRs individuais, pela deposição relativa das CDRs, e pelanatureza e disposição das cadeias laterais dos resíduos compreendendo asCDRs. Uma grande redução na imunogenicidade pode ser obtida por enxertoapenas das CDRs de anticorpos não humanos (por exemplo de murino)(anticorpos "doadores" sobre a estrutura humana ("estrutura aceptora" eregiões constantes [ver Jones et al. (1986) Nature 321, 522-525 e Verhoeyen,M. et al. (1988) Science 239, 1534-1536). Entretanto, o enxerto de CDR porsi pode não resultar na retenção completa das propriedades de ligação aantígeno e é observado freqüentemente que alguns resíduos da estrutura(algumas vezes referidos como "retro-mutações") do anticorpo doadornecessitam ser preservados na molécula humanizada, se a afinidadesignificativa de ligação ao antígeno tiver de ser recuperada (ver Queen, C. etal. (1989) PNAS 86, 10.029-10.033, Co, M. et al. (1991) Nature 351, 501-502). Neste caso, as regiões V humanas apresentando a maior homologia deseqüência ao anticorpo doador não humano, são escolhidas de um banco dedados a fim de prover a estrutura humana (FR). A seleção das FRs humanaspode ser feita ou do consenso humano ou de anticorpos humanos individuais.Quando necessário, resíduos chaves do anticorpo doador são substituídos naestrutura aceptora humana para preservar as conformações da CDR. Amodelagem de computador do anticorpo pode ser usada para ajudar aidentificar tais resíduos estruturalmente importantes. Ver a WO 99/48523.
Alternativamente, a humanização pode ser obtida por umprocesso de "folheamento". Uma análise estatística das regiões variáveis decadeias pesadas e leves únicas de imunoglobulina humana e murina revelouque os padrões precisos dos resíduos expostos são diferentes nos anticorposhumanos e de murinos, e a maioria das posições das superfícies individuaistem uma forte preferência por um número pequeno de diferentes resíduos [verPadlan, E. A. et al; (1991) Mol. Immunol. 28, 489-498 e Pedersen, J. T. et al(1994) J. Mol. Biol 235; 959-973). Portanto, é possível reduzir aimunogenicidade de um Fv não humano pela substituição dos resíduosexpostos em suas regiões de estrutura que difiram daqueles usualmenteencontrados nos anticorpos humanos. Tendo em vista que a antigenicidadeproteica pode ser correlacionada com a acessibilidade superficial, asubstituição dos resíduos superficiais pode ser suficiente para tornar a regiãovariável de camundongos "invisível" ao sistema imune humano (ver tambémMark, G. E. et al. (1994) em Handbook of Experimental Farmacology vol.113: The farmacology of monoclonal Antibodies, Springer-Verlag, pp 105-134). Este procedimento de humanização é referido como "folheamento"porque apenas a superfície do anticorpo é alterada, os resíduos de suportepermanecendo imperturbados.
A pessoa habilitada estará ciente de que outros métodos dehumanização de anticorpos existem e acham-se disponíveis na literatura.
Assim sendo, outra forma de realização da invenção forneceum anticorpo quimérico compreendendo um domínio variável não humano(por exemplo, de roedor) fundido a uma região constante humana (que podeser de um isotipo de IgG, por exemplo IgGl), que especificamente liga a hlL-13 e modula a interação entre hIL-13 e hIL-13R, por exemplo em que eleiniba a interação entre hIL-13 e seu receptor.
Em outra forma de realização, é fornecido um anticorpoquimérico compreendendo uma região variável não humana (por exemplo deroedor) e uma região constante humana (que pode ser de um isotipo de IgG5por exemplo IgGl), que especificamente liga hIL-13, cujo anticorpo aindacompreende uma CDRH3 da SEQ ID NO: 3. Tais anticorpos podem aindacompreender uma região constante humana do isotipo de IgG, por exemploIgGl.
Em outra forma de realização, é fornecido um anticorpoquimérico que compreende uma região variável não humana (por exemplo, deroedor) e uma região constante humana (a qual pode ser de um isotipo de IgG,por exemplo IgGl) que especificamente ligue a hIL-13 compreendendo CDRsdas SEQID NOs: 1, 2, 3, 4, 5 e 6.
Em outra forma de realização, é fornecido um anticorpoquimérico que compreende um domínio VH de SEQ ID NO: 7 e um domínioVL de SEQ ID NO: 8, e uma região constante humana de um isotipo de IgG,por exemplo IgGl, que especificamente se ligue a hIL-13 e module ainteração entre hIL-13 e hIL-13R, por exemplo em que ela iniba a interaçãoentre hIL-13 e seu receptor.
Em outra forma de realização, é fornecido um anticorpohumanizado ou seu fragmento de ligação a antígeno, que especificamente seligue à hIL-13 e module a interação entre hIL-13 e hIL-13R, por exemplo emque ele iniba a interação entre hIL-13 e seu receptor.
Em outra forma de realização, é fornecido um anticorpohumanizado ou seu fragmento de ligação a antígeno, que especificamente seligue à hIL-13 e compreenda uma CDRH3 de SEQ ID NO: 3. Tais anticorpospodem compreender uma região constante humana do isotipo de IgG, porexemplo IgGl.
Em outra forma de realização, é fornecido um anticorpohumanizado ou seu fragmento de ligação a antígeno, que especificamente seligue à hIL-13 e compreenda CDRs das SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 5 e 6. Taisanticorpos podem compreender uma região constante humana do isotipo deIgG5 por exemplo IgGl.
Em conformidade com a presente invenção, é fornecido umanticorpo humanizado que compreende um domínio VH selecionado do grupode: SEQ ID NO: 11, e um domínio VL selecionado do grupo de: SEQ IDNOs: 15, 16 e 17. Tais anticorpos podem compreender uma região constantehumana do isotipo de IgG, por exemplo IgGl.
Em conformidade com a presente invenção, é fornecido umanticorpo humanizado que compreende um domínio VH selecionado do grupode: SEQ ID NO: 12, e um domínio VL selecionado do grupo de: SEQ IDNOs: 15, 16 e 17. Tais anticorpos podem compreender uma região constantehumana do isotipo de IgG, por exemplo IgGl.
Em conformidade com a presente invenção, é fornecido umanticorpo humanizado que compreende um domínio VH selecionado do grupode: SEQ ID NO: 13, e um domínio VL selecionado do grupo de: SEQ IDNOs: 15, 16 e 17. Tais anticorpos podem compreender uma região constantehumana do isotipo de IgG, por exemplo IgGl.
Em conformidade com a presente invenção, é fornecido umanticorpo humanizado que compreende um domínio VH selecionado do grupode: SEQ ID NO: 14, e um domínio VL selecionado do grupo de: SEQ IDNOs: 15, 16 e 17. Tais anticorpos podem compreender uma região constantehumana do isotipo de IgG, por exemplo IgGl.
Em outra forma de realização, é fornecido um anticorpohumanizado que compreende um domínio VH de SEQ ID NO: lie umdomínio VL de SEQ ID NO: 15.
Em outra forma de realização, é fornecido um anticorpohumanizado que compreende um domínio VH de SEQ ID NO: 12 e umdomínio VL de SEQ ID NO: 15.
Em outra forma de realização, é fornecido um anticorpohumanizado que compreende um domínio VH de SEQ ID NO: 13 e umdomínio VL de SEQ ID NO: 15.
Em outra forma de realização, é fornecido um anticorpohumanizado que compreende um domínio VH de SEQ ID NO: 14 e umdomínio VL de SEQID NO: 15.
Em outra forma de realização, é fornecido um anticorpohumanizado que compreende um domínio VH de SEQ ID NO: 11 e umdomínio VL de SEQ ID NO: 16.
Em outra forma de realização, é fornecido um anticorpohumanizado que compreende um domínio VH de SEQ ID NO: 12 e umdomínio VL de SEQ ID NO: 16.
Em outra forma de realização, é fornecido um anticorpohumanizado que compreende um domínio VH de SEQ ID NO: 13 e umdomínio VL de SEQ ID NO: 16.
Em outra forma de realização, é fornecido um anticorpohumanizado que compreende um domínio VH de SEQ ID NO: 14 e umdomínio VL de SEQ ID NO: 16.
Em outra forma de realização, é fornecido um anticorpohumanizado que compreende um domínio VH de SEQ ID NO: lie umdomínio VL de SEQ ID NO: 17.
Em outra forma de realização, é fornecido um anticorpohumanizado que compreende um domínio VH de SEQ ID NO: 12 e umdomínio VL de SEQ ID NO: 17.
Em outra forma de realização, é fornecido um anticorpohumanizado que compreende um domínio VH de SEQ ID NO: 13 e umdomínio VL de SEQ ID NO: 17.
Em outra forma de realização, é fornecido um anticorpohumanizado que compreende um domínio VH de SEQ ID NO: 14 e umdomínio VL de SEQ ID NO: 17.Em outra forma de realização, é fornecido um anticorpohumanizado ou seu fragmento de ligação a antígeno, que especificamente seligue a hIL-13 em que referido anticorpo ou seu fragmento compreendaCDRH3 da SEQ ID NO: 3, opcionalmente ainda compreendendo uma oumais CDRs de SEQ ID NOs: 1, 2, 4, 5 e 6, em que um ou mais dos resíduosselecionados do grupo consistindo das posições 10, 30, 67, 69, 71, 73 e 93 daestrutura de cadeia pesada do aceptor humano, e um ou ambos os resíduos nasposições 76 e 98 da estrutura de cadeia leve do aceptor humano sãosubstituídos pelos resíduos correspondentes encontrados na estrutura doanticorpo doador da qual a CDRH3 é derivada (que é apresentada na SEQ IDNO: 7).
Em outra forma de realização, é fornecido um anticorpohumanizado ou seu fragmento de ligação a antígeno, que especificamente seligue a hIL-13 em que referido anticorpo ou seu fragmento compreendaCDRH3 da SEQ ID NO: 3, opcionalmente ainda compreendendo uma oumais CDRs de SEQ ID NOs: 1, 2, 4, 5 e 6, em que a estrutura de cadeiapesada humana compreende um ou mais (por exemplo todos) dos seguintesresíduos (ou sua substituição conservativa):
Posição Resíduo10 D30 I67 A69 L71 A73 K93 T
e uma estrutura de cadeia leve compreendendo qualquer um, ou ambos, dosseguintes resíduos (ou seus substitutos conservativos):76 NSerá evidente àqueles habilitados na técnica, que o termo"derivado" intenta definir não apenas a fonte no sentido de ser a origem fisicapara o material, mas também definir material que seja estruturalmenteidêntico (em termos de seqüência primária de aminoácidos) ao material, masque dela não se origine, da fonte de referência. Assim, "resíduos encontradosno anticorpo doador do qual a CDRH3 é derivada" não necessitanecessariamente ter sido purificado do anticorpo doador.
E bem reconhecido na técnica que certas substituições deaminoácidos são consideradas como sendo "conservativas". Os aminoácidos,divididos nos grupos com base nas propriedades comuns da cadeia lateral enas substituições dentro dos grupos que mantêm toda, ou substancialmentetoda, a afinidade de ligação do anticorpo da invenção ou seu fragmento deligação a antígeno, são considerados como substituições conservativas. Ver a15 Tabelai:
<table>table see original document page 42</column></row><table>
De acordo com a presente invenção, é fornecido um anticorpohumanizado compreendendo uma cadeia pesada selecionada do grupoconsistindo de: SEQ ID NOs: 18, 19, 20, 21 e uma cadeia leve selecionada dogrupo consistindo de: SEQID NOs: 22, 23, 24.
Em uma forma de realização da invenção, é fornecido umanticorpo humanizado que especificamente se liga à hIL-13 compreendendouma cadeia pesada da SEQ ID NO: 18 e uma cadeia leve da SEQ ID NO: 22.
Em uma forma de realização da invenção, é fornecido umanticorpo humanizado que especificamente se liga à hIL-13 compreendendouma cadeia pesada da SEQ ID NO: 19 e uma cadeia leve da SEQ ID NO: 22.
Em uma forma de realização da invenção, é fornecido umanticorpo humanizado que especificamente se liga à hIL-13 compreendendouma cadeia pesada da SEQ ID NO: 20 e uma cadeia leve da SEQ ID NO: 22.
Em uma forma de realização da invenção, é fornecido umanticorpo humanizado que especificamente se liga à hIL-13 compreendendouma cadeia pesada da SEQ ID NO: 21 e uma cadeia leve da SEQ ID NO: 22.
Em uma forma de realização da invenção, é fornecido umanticorpo humanizado que especificamente se liga à hIL-13 compreendendouma cadeia pesada da SEQ ID NO: 18 e uma cadeia leve da SEQ ID NO: 23.
Em uma forma de realização da invenção, é fornecido umanticorpo humanizado que especificamente se liga à hIL-13 compreendendouma cadeia pesada da SEQ ID NO: 19 e uma cadeia leve da SEQ ID NO: 23.
Em uma forma de realização da invenção, é fornecido umanticorpo humanizado que especificamente se liga à hIL-13 compreendendouma cadeia pesada da SEQID NO: 20 e uma cadeia leve da SEQID NO: 23.
Em uma forma de realização da invenção, é fornecido umanticorpo humanizado que especificamente se liga à hIL-13 compreendendouma cadeia pesada da SEQ ID NO: 21 e uma cadeia leve da SEQ ID NO: 23.
Em uma forma de realização da invenção, é fornecido umanticorpo humanizado que especificamente se liga à hIL-13 compreendendouma cadeia pesada da SEQ ID NO: 18 e uma cadeia leve da SEQ ID NO: 24.
Em uma forma de realização da invenção, é fornecido umanticorpo humanizado que especificamente se liga à hIL-13 compreendendouma cadeia pesada da SEQID NO: 19 e uma cadeia leve da SEQ ID NO: 24.
Em uma forma de realização da invenção, é fornecido umanticorpo humanizado que especificamente se liga à hIL-13 compreendendouma cadeia pesada da SEQ ID NO: 20 e uma cadeia leve da SEQ ID NO: 24.
Em uma forma de realização da invenção, é fornecido umanticorpo humanizado que especificamente se liga à hIL-13 compreendendouma cadeia pesada da SEQ ID NO: 21 e uma cadeia leve da SEQ ID NO: 24.
Em uma forma de realização da presente invenção, é fornecidauma região variável de cadeia pesada humana ou humanizada compreendendodada uma das CDRs listadas nas SEQ ID NOs: 1 a 3. Em outra forma derealização da presente invenção, é fornecida uma região variável de cadeiapesada humanizada compreendendo as CDRs listadas nas SEQ ID NOs: 1 a 3,dentro da seqüência maior de uma região variável de cadeia pesada humana.Em ainda outra forma de realização, a região variável de cadeia pesadahumanizada compreende as CDRs listadas nas SEQ ID NOs: 1 a 3 dentro deuma estrutura de anticorpo aceptora tendo mais do que 40 % de identidadenas regiões da estrutura, ou mais do que 50 %, ou mais do que 60 %, ou maisdo que 65 %, de identidade com a região variável de cadeia pesada deanticorpo doador 3G4 de murinos (SEQ ID NO: 7).
Em um aspecto da presente invenção, os anticorposcompreendem uma região variável de cadeia pesada compreendendo aseqüência de aminoácidos da SEQ ID NO: 44, ainda compreendendo váriassubstituições em uma ou mais das posições 10, 30, 67, 69, 71, 73, 93 (sistemade numeração de Kabat); em que cada resíduo de aminoácido substituído ésubstituído pelo resíduo de aminoácido na posição equivalente na SEQ IDNO: 7 (a região variável de cadeia pesada do anticorpo doador 3G4) e onúmero de substituições situa-se entre 0 e 7. Em outras formas de realização,o número de substituições é 0, ou 1, ou 2, ou 3, ou 4, ou 5, ou 6, ou 7.
Em uma forma de realização da presente invenção, é fornecidauma região variável de cadeia leve humana ou humanizada compreendendocada uma das CDRs listadas nas SEQ ID NOs: 4 a 6. Em outra forma derealização da presente invenção, é fornecida uma região variável de cadeialeve humanizada compreendendo as CDRs listadas nas SEQ ID NOs: 4 a 6dentro da seqüência maior de uma região variável de cadeia leve humana. Emainda outra forma de realização, a região variável de cadeia leve humanizadacompreende as CDRs listadas nas SEQ ID NOs: 4 a 6 dentro de uma estruturade anticorpo aceptora tendo mais do que 40 % de identidade nas regiões daestrutura, ou mais do que 50 %, ou mais do que 60 %, ou mais do que 65 %,de identidade com a região variável de cadeia pesada do anticorpo doador3G4 de murinos (SEQ ID NO: 8).
Em um aspecto da presente invenção os anticorposcompreendem uma região variável de cadeia leve contendo a seqüência deaminoácidos da SEQ ID NO: 45, ainda compreendendo várias substituiçõesem uma ou mais das posições 76, 98 (sistema de numeração de Kabat); emque cada resíduo de aminoácido substituído é substituído pelo resíduo deaminoácido na posição equivalente na SEQ ID NO: 8 (a região variável decadeia leve do anticorpo 3G4 doador) e o número de substituições situa-seentre 0 e 2. Em outras formas de realização, o número de substituições é 0 ou15 Iou 2.
1.3 Anticorpos Biespecíficos
Um anticorpo biespecífico é um anticorpo tendoespecificidades de ligação para pelo menos dois epítopos diferentes. Osmétodos de produzir tais anticorpos são conhecidos na técnica.Tradicionalmente, a produção recombinante de anticorpos biespecíficosbaseia-se na coexpressão de dois pares de imunoglobulina de cadeia H-cadeiaL, em que as duas cadeias H têm diferentes especificidades de ligação. VerMillstein et ai., Nature 305 537-539 (1983), WO 93/08829 e Traunecker et ai.EMBO, 10, 1991, 3655-3659. Por causa da classificação aleatória das cadeiasHeL, uma mistura potencial de dez diferentes estruturas de anticorpos éproduzida, da qual apenas uma tem a especificidade de ligação desejada. Umaabordagem alternativa envolve a fusão dos domínios variáveis com asespecificidades de ligação desejadas para a região constante de cadeia pesadacompreendendo pelo menos parte da região da dobradiça, as regiões CH2 eCH3. É preferível ter a região CHl contendo o sítio necessário para a ligaçãoda cadeia leve presente em pelo menos uma das fusões. O DNA codificandoestas fusões e, se desejável, a cadeia L, são introduzidos em vetores deexpressão separados e são então cotransfectados em um organismohospedeiro adequado. É possível, não obstante, introduzir as seqüênciascodificadoras para duas ou todas as três cadeias em um vetor de expressão.Em uma abordagem preferida, o anticorpo biespecífico é composto de umacadeia H com uma primeira especificidade de ligação em um braço e um parde cadeias H-L, provendo uma segunda especificidade de ligação no outrobraço, ver a WO 94/04690. Ver, também, Suresh et ai. Methods inEnzymology 121, 210, 1986.
Em uma forma de realização da invenção, é fornecido umanticorpo biespecífico em que pelo menos uma especificidade de ligação doreferido anticorpo é para hIL-13, em que referido anticorpo modula ainteração entre hIL-13 e IL-13R, por exemplo onde ele inibe a interação entrehIL-13 e seu receptor. Tais anticorpos podem ainda compreender uma regiãoconstante humana do isotipo de IgG, por exemplo IgG1. Em algumas formasde realização, o anticorpo terapêutico biespecífico tem uma primeiraespecificidade de ligação para hIL-13 e modula a interação entre hIL-13 ehIL-13R, por exemplo onde ele inibe a interação entre hIL-13 e seu receptor,e uma segunda especificidade de ligação para hIL-4 e modula a interaçãoentre hIL-4 e um receptor para hIL-4, por exemplo onde ele inibe a interaçãoentre hIL-4 e seu receptor.
Em uma forma de realização da invenção, é fornecido umanticorpo biespecífico em que pelo menos uma especificidade de ligação doreferido anticorpo é para hIL-13, em que referido anticorpo compreende umaCDRH3 de SEQ ID NO: 3. Tais anticorpos podem ainda compreender umaregião constante humana do isotipo de IgG, por exemplo IgG1.
Em uma forma de realização da invenção, é fornecido umanticorpo biespecífico em que pelo menos uma especificidade de ligação doreferido anticorpo é para hIL-13, em que o referido anticorpo compreendepelo menos CDRs de SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 5 e 6. Tais anticorpos podemainda compreender uma região constante humana do isotipo de IgG, porexemplo IgGl.
1.4 Fragmentos De Anticorpos
Em certas formas de realização da invenção, são fornecidosfragmentos de anticorpos que modulam a interação entre hIL-13 e hIL-13R,por exemplo em que os fragmentos inibem a interação entre hIL-13 e seureceptor. Tais fragmentos podem ser fragmentos de ligação a antígenosfuncionais de anticorpos intactos e/ou humanizados e/ou quiméricos, taiscomo os fragmentos Fab, Fab', F(ab')2, Fv, ScFv dos anticorpos descritosacima. Tradicionalmente, tais fragmentos são produzidos pela digestãoproteolítica dos anticorpos intactos, por exemplo pela digestão da papaína(ver, por exemplo, a WO 94/29348), mas podem ser produzidos diretamentedas células hospedeiras recombinantemente transformadas. Quanto àprodução do ScFv, ver Bird et al:, (1988) Science, 242, 423-426. Além disso,os fragmentos de anticorpos podem ser produzidos com o uso de umavariedade de técnicas de engenharia, como descrito abaixo.
Os fragmentos parecem ter menor energia de interação de suasduas cadeias, do que os fragmentos Fab. Para estabilizar a associação dosdomínios VH e VL, eles têm sido ligados com os peptídeos (Bird et al.,(1988) Science 242, 423-426, Huston et al., PNAS, 85, 5879-5883), com aspontes dissulfeto (Glockshuber et al., (1990) Biochemistry, 29, 1362-1367) eas mutações de "botão no orifício" (Zhu et al. (1997), Protein Sci., 6, 781-788). Os fragmentos ScFv podem ser produzidos por métodos bemconhecidos daqueles habilitados na técnica. Ver Whitlow et al. (1991)Methods companion Methods Enzymol, 2, 97-105 e Huston et al. (1993) Int.Rev. Immunol 10, 195-217. Os ScFv podem ser produzidos nas célulasbacterianas tais como Ε. coli, mas são mais preferivelmente produzidas nascélulas eucarióticas. Uma desvantagem dos ScFv é a monovalência doproduto, que impede uma avidez aumentada devida à ligação polivalente, esua curta meia-vida. As tentativas para superar estes problemas incluem(ScFv')2 bivalente produzido de ScFV contendo uma cisteína de terminal Cadicional mediante acoplamento químico (Adams et al. (1993) Can. Res. 53,4026-4034 e McCartney et al. (1995) Protein Eng. 8, 301-314) ou mediantedimerização espontânea específica do sítio, de ScFv contendo um resíduo decisteína de terminal C não pareado (ver Kipriyanov et al. (1995) Cell. Biofys26, 187-204). Alternativamente, o ScFv pode ser forçado a formar multímerospelo encurtamento do ligador peptídico até 3 a 12 resíduos para formar"diacorpos". Ver Holliger et al. PNAS (1993), 90, 6444-6448. A redução doligador ainda mais pode resultar em trímeros de ScFV ("triacorpos", ver Korttet al. (1997) Protein Eng, 10, 423-433) e tetrâmeros ("tetracorpos", ver LeGall et al. (1999) FEBS Lett, 453, 164-168). A construção de moléculas deScFV bivalentes pode também ser obtida por fusão genética com os motivosde dimerização proteica para formar "minianticorpòs" (ver Pack et al. (1992)Biochemistry 31, 1579-1584) e "minicorpos" (ver Hu et al. (1996), CâncerRes. 56, 3055-3061). Os tandens de ScFv-Sc-Fv [(ScFV)2] também podemser produzidos pela ligação de duas unidades de ScFv por um terceiro ligadorpeptídico, ver Kurucz et al. (1995) J. Immol. 154, 4576-4582. Diacorposbiespecíficos podem ser produzidos através da associação não covalente dedois produtos de fusão de cadeia única consistindo no domínio VH de umanticorpo conectado por um ligador curto ao domínio VL de outro anticorpo.Ver Kipriyanov et al. 1998), Int. J. Can 77, 763-772. A estabilidade de taisdiacorpos biespecíficos pode ser intensificada pela introdução de pontesdissulfeto ou mutações de "botão no orifício" como descrito acima, ou pelaformação de diacorpos de cadeia única (ScDb) em que dois fragmentos deScFc híbridos são conectados através de um ligador peptídico. VerKontermann et al (1999) J. Immunol. Methods 226 179-188. As moléculasbiespecíficas tetravalentes acham-se disponíveis, por exemplo, pela fusão deum fragmento ScFv ao domínio CH3 de uma molécula de IgG ou a umfragmento Fab através da região da dobradiça. Ver Coloma et al. (1997)Nature Biotechnol. 15, 159-163. Alternativamente, as moléculas biespecíficastetravalentes foram criadas pela fusão de diacorpos biespecíficos de cadeiaúnica (ver Alt et al, (1999) FEBSLett 454, 90-94. As moléculas biespecíficastetravalentes menores também podem ser formadas pela dimerização dequaisquer tandens ScFv-ScFv com um ligador contendo um motivo de hélice-alça-hélice (minianticorpos DiBi, ver Muller et al. (1998) FEBSLett 432, 45-49) ou uma molécula de cadeia única compreendendo quatro domíniosvariáveis de anticorpos (VH e VL) em uma orientação que previne opareamento intramolecular (diacorpo em tandem, ver Kipriyanov et al.,(1999) J. Mol. Biol. 293, 41-56). Os fragmentos F(ab')2 biespecíficos podemser criados por acoplamento química dos fragmentos Fab' ou porheterodimerização através de zíperes de leucina (ver Shalaby et al, (1992) J.Exp. Med. 175, 217-225 e Kostelny et al. (1992), J. Immunol. 148, 1547-1553). São também disponíveis domínio VH e VL isolados (Domantis plc).ver as U.S. 6.248.516, U.S. 6.291.158 e U.S. 6.172.197.
Em uma forma de realização, é fornecido um fragmento deanticorpo (por exemplo ScFv, Fab, Fab', F(ab')2 ou um fragmento deanticorpo engendrado como descrito acima, que especificamente liga a hIL emodula a interação entre hIL-13 e hIL-13R, por exemplo quando taisfragmentos inibem a interação entre hIL-13 e seu receptor. O fragmento deanticorpo pode compreender uma CDRH3 compreendendo a seqüência deSEQ ID NO: 3, opcionalmente junto com outras CDRs compreendendo umaou mais das seqüências apresentadas nas SEQ ID NOs: 1, 2, 4, 5 e 6.
Um ScFv pode ser produzido compreendendo as regiões VH eVL dos anticorpos da presente invenção. Por exemplo, um ScFv podecompreender as SEQ ID NOs: 12 e 15, ou, por exemplo, pode compreender asSEQ ID NOs: 13 e 15. Isto pode ser feito pelos polinucleotídeos de acordocom a invenção, por exemplo as seqüências apresentadas nas SEQ ID NOs:93 e 94, ou, por exemplo, pelas seqüências apresentadas nas SEQ ID NOs: 28e 31. Em uma forma de realização da invenção, é fornecido um ScFvcompreendendo uma proteína codificada pelas seqüências apresentadas nasSEQ ID NOs: 93 e 94.
1.5 Anticorpos Heteroconjugados
Os anticorpos heteroconjugados também formam uma formade realização da presente invenção. Os anticorpos heteroconjugados sãocompostos de dois anticorpos covalentemente unidos formados com o uso dequaisquer métodos de ligação cruzada conveniente. Ver, por exemplo, a U.S.4.676.980.
1.6 Outras Modificações
Acredita-se que a interação entre a região Fc de um anticorpo evários receptores de Fc (FcyR) medeie as funções efetoras do anticorpo, queincluem a citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC), a fixaçãodo complemento, a fagocitose e a meia-vida/depuração do anticorpo. Váriasmodificações à região Fc dos anticorpos da invenção podem ser realizadasdependendo da propriedade desejada. Por exemplo, as mutações específicasna região Fc para tornar um anticorpo de outra forma lítico, em não lítico, sãodetalhadas nas EP 0629 240B1 e EP 0307 434B2, ou pode-se incorporar umepítopo de ligação do receptor de salvamento no anticorpo para aumentar ameia-vida sérica. Ver a U.S. 5.739.277. Existem cinco receptores Fcyhumanos correntemente reconhecidos, os FcyR(I), FcyRIIa, FcyRIIb, FcyRIIIae FcRn neonatal. Shields et al, (2001) J. Biol. Chem 276, 6591-6604demonstraram que um conjunto comum de resíduos de IgG1 é envolvido naligação de todos os FcyRs, enquanto FcyRII e FcyRIII utilizam sítios distintosfora deste conjunto comum. Um grupo de resíduos de IgG1 reduziu a ligaçãoa todos os FcyRs quando alterados em alanina: Pro-238, Asp-265, Asp-270,Asn-297 e Pro-239. Todos se acham no domínio CH2 de IgG e aglomeradosperto da dobradiça unindo CH1 e CH2. Enquanto FcyRI utiliza apenas oconjunto comum de resíduos de IgGl para ligação, FcyRII e FcyRIIIinteragem com resíduos distintos além do conjunto comum. A alteração dealguns resíduos reduziram a ligação apenas ao FcyRII (por exemplo, Arg-292)ou FcyRIII (por exemplo, Glu-293). Algumas variantes apresentaram ligaçãomelhorada ao FcyRII ou FcyRIII, mas não afetaram a ligação a outro receptor(por exemplo, a ligação melhorada de Ser-267Ala a FcyRII, mas a ligação aFcyRIII não foi afetada). Outras variantes apresentação ligação melhorada aFcyRII ou FcyRIII com redução na ligação ao outro receptor (por exemploSer-298Ala melhorou a ligação ao FcyRIII e reduziu a ligação ao FcyRII).Quanto ao FcyRIIIa, as variantes IgGl de melhor ligação tiveramsubstituições combinadas da alanina em Ser-298, Glu-333 e Lys-334.Acredita-se que o receptor neonatal FcRn esteja envolvido tanto na depuraçãodo anticorpo quanto na transcitose através dos tecidos (ver Junghans, R. P(1997) Immunol. Res 16. 29-57 e Ghetie et al. (2000) Annu. Rev. Immunol.18, 739-766). Os resíduos de IgGl humana determinados para interagiremdiretamente com FcRn humano incluem Ile253, Ser254, Lys288, Thr307,Gln311, Asn434 e His435. As trocas em qualquer destas posições descritasneste Exemplo podem possibilitar meia-vida sérica aumentada e/oupropriedades efetoras alteradas dos anticorpos da invenção.
Outras modificações incluem as variantes de glicosilação dosanticorpos da invenção. A glicosilação dos anticorpos nas posiçõesconservadas em suas regiões constantes é conhecida como tendo um profundoefeito sobre a função dos anticorpos, particularmente o funcionamento dosefetores tais como aqueles descritos acima. Ver, por exemplo, Boyd et al.(1996), Mol. Immunol. 32, 1311-1318. As variantes de glicosilação dosanticorpos ou seus fragmentos de ligação a antígenos da presente invenção,em que um ou mais componentes de carboidrato são adicionados,substituídos, deletados ou modificados são considerados. A introdução de ummotivo de asparagina-X-serina ou asparagina-X-treonina cria um sítiopotencial para articulação enzimática dos componentes de carboidrato epodem, portanto, ser usados para manipular a glicosilação de um anticorpo.Em Raju et al. (2001) Biochemistry 40, 8868-8876 a sialilação terminal deuma imunoadesina de TNFR-IgG foi aumentada através de um processo deregalactosilação e ou resialilação, com o uso de beta-l,4-galactosiltransferasee/ou alfa-2,3-sialiltransferase. Aumentando-se a sialilação, acredita-se que seaumente a meia-vida da imunoglobulina. Os anticorpos, em comum com amaioria das glicoproteínas, são tipicamente produzidos como uma mistura deglicoformas. Esta mistura é particularmente evidente quando os anticorpossão produzidos em células eucarióticas, particularmente de mamíferos. Umavariedade de métodos foram desenvolvidos para fabricar glicoformasdefinidas. Ver Zhang et al. Science (2004), 303, 371, Sears et al., Science,(2001) 291, 2344, Wacker et al. (2002) Science, 298 1790, Davis et al. (2002)Chem.Rev. 102, 579, Hang et al. (2001) Acc. Chem. Res 34, 727. Assim, ainvenção leva em conta uma pluralidade de anticorpos (monoclonais) (osquais podem ser do isotipo de IgG, por exemplo IgGl) como aqui descrito,compreendendo um número definido (por exemplo, 7 ou menos, por exemplo5 ou menos, tal como dois ou um único) de glicoformas dos referidosanticorpos ou seus fragmentos de ligação a antígeno.
Outras formas de realização da invenção incluem anticorposda invenção ou seus fragmentos de ligação a antígeno acoplados a umpolímero não proteináceo tal como o polietileno glicol (PEG), o polipropilenoglicol ou o polioxialquileno. A conjugação das proteínas ao PEG é umatécnica estabelecida para aumentar a meia-vida das proteínas, bem comoreduzir a antigenicidade e a imunogenicidade das proteínas. O uso daPEGilação com diferentes pesos moleculares e estilos (lineares ouramificados) foi pesquisado com anticorpos intactos, bem como comfragmentos Fab'. Ver Koumenis, I. L. et al. (2000) Int. J. Farmaceut. 198: 83-95.
2. Métodos de Produção
Os anticorpos da invenção podem ser produzidos como umapopulação policlonal, mas são mais preferivelmente produzidos como umapopulação monoclonal (isto é, como uma população substancialmentehomogênea de anticorpos idênticos dirigidos contra um sítio de ligação aantígeno específico). Será naturalmente evidente àqueles versados na técnica,que uma população subentende mais do que uma entidade de anticorpos. Osanticorpos da presente invenção podem ser produzidos em organismostransgênicos, tais como cabras (Ver Pollock et al. (1999), J. Immunol.Methods 231: 147-157), galinhas (ver Morrow, K. J. J. (2000) Genet. Eng.News 20: 1-55), camundongos (ver Pollock et al.) ou plantas (ver Doran, P.M., (2000) Curr. Opinion Biotechnol. 11, 199-204, Ma J. K-C (1998), Nat.Med. 4; 601-606, Baez, J. et al., BioFarm (2000) 13: 50-54, Stoger, E. et al·,(2000) Plant Mol. Biol. 42: 583-590). Os anticorpos podem também serproduzidos pela síntese química. Entretanto, os anticorpos da invenção sãotipicamente produzidos com o uso da tecnologia de cultura de célulasrecombinantes bem conhecida daqueles habilitados na técnica. Umpolinucleotídeo codificando o anticorpo é isolado e introduzido em um vetorreplicável, tal como um plasmídeo, para outra clonagem (amplificação) ouexpressão. Um sistema de expressão útil é um sistema de glutamato sintetase(tal como o vendido pela Lonza Bilogics), particularmente quando a célulahospedeira seja CHO ou NSO (ver abaixo). O polinucleotídeo codificando oanticorpo é facilmente isolado e seqüenciado com o uso de procedimentosconvencionais (por exemplo sondas de oligonucleotídeos). Vetores quepodem ser usados incluem plasmídeo, vírus, fago, transposons,minicromossomas dos quais os plasmídeos são uma forma de realizaçãotípica. Geralmente tais vetores ainda incluem uma seqüência de sinal, origemde replicação, um ou mais genes marcadores, um elemento intensificador, umpromotor e seqüências de terminação da transcrição operavelmente ligadas aopolinucleotídeo de cadeia leve e/ou pesada, de modo a facilitar a expressão. Opolinucleotídeo codificando as cadeias leves e pesadas podem serintroduzidos em vetores separados e transfectados na mesma célulahospedeira ou, se desejável, tanto a cadeia pesada quanto a cadeia leve podemser introduzidas no mesmo vetor para transfecção na célula hospedeira.Assim, de acordo com um aspecto da presente invenção, é fornecido umprocesso de construir um vetor codificando as cadeias leves e/ou pesadas deum anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno da invenção, cujométodo compreende introduzir em um vetor um polinucleotídeo codificandoou uma cadeia leve e/ou uma cadeia pesada de um anticorpo da invenção.
Em outro aspecto da invenção, é fornecido um polinucleotídeocodificando um domínio VH murino compreendendo a seqüência apresentadacomo SEQ ID NO: 25.
Em outro aspecto da invenção, é fornecido um polinucleotídeocodificando um domínio VL murino compreendendo a seqüência apresentadacomo SEQ ID NO: 26.
Em outra forma de realização, é fornecido um polinucleotídeocodificando um domínio VH compreendendo a seqüência selecionada dogrupo consistindo das SEQ ID NOs: 27, 28, 29, 30.
Em outra forma de realização, é fornecido um polinucleotídeocodificando um domínio VL compreendendo a seqüência selecionada dogrupo consistindo das SEQ ID NOs: 31, 32, 33.
Em conformidade com a presente invenção, é fornecido umpolinucleotídeo codificando uma cadeia pesada da invenção, polinucleotídeoeste selecionado do grupo consistindo das SEQ ID NOs: 34, 35, 36, 37.
Em conformidade com a presente invenção, é fornecido umpolinucleotídeo codificando uma cadeia leve da invenção, polinucleotídeoeste selecionado do grupo consistindo das SEQ ID NOs: 38, 39, 40.
Será imediatamente evidente àqueles versados na técnica, que,por causa da redundância do código genético, os polinucleotídeos alternativosàqueles aqui apresentados (particularmente aqueles otimizados pelo códonpara expressão em uma dada célula hospedeira) acham-se tambémdisponíveis, os quais codificarão os polipeptídeos da invenção.
3.1 Seqüências de sinal
Os anticorpos da presente invenção podem ser produzidoscomo uma proteína de fusão com uma seqüência de sinal heteróloga tendo umsítio específico de clivagem no término N da proteína madura. A seqüência desinal deve ser reconhecida e processada pela célula hospedeira. Quanto àscélulas hospedeiras eucarióticas, a seqüência de sinal pode ser uma fosfatasealcalina, penicilinase, ou enterotoxina II estável no calor, condutoras. Quantoà secreção das leveduras, as seqüências de sinal podem ser uma levedurainvertase condutora, um fator condutor ou fosfatases virais condutoras. (Ver,por exemplo, a WO 90/13646. Nos sistemas celulares de mamíferos, oscondutores secretores virais tais como herpes simples gD sinal e umaseqüência de sinal de imunoglobulina nativa, acham-se disponíveis.Tipicamente a seqüência de sinal é ligada na matriz de leitura ao DNAcodificando o anticorpo da invenção.
3.2 Origem de replicação
As origens de replicação são bem conhecidas na técnica compBR322 adequado para a maioria das bactérias Gram-negativas, o plasmídeo2μ para a maioria das leveduras e várias origens virais tais como SV40,polioma, adenovírus, VSV ou BPV para a maior parte das células demamíferos. Geralmente, o componente da origem de replicação não énecessário para os vetores de expressão de mamíferos, mas o SV40 pode serusado desde que ele contenha o promotor prematuro.3.3 Marcador de seleção
Os genes de seleção típicos codificam proteínas que (a)conferem resistência aos antibióticos ou outras toxinas, por exemploampicilina, neomicina, metotrexato ou tetraciclina, ou (b) deficiênciasauxiotróficas complementares ou fornecimento de nutrientes não disponíveisnos meios complexos. O esquema de seleção pode envolver a parada docrescimento da célula hospedeira. As células que tenham sido com sucessotransformadas com os genes codificando o anticorpo da presente invenção,sobrevivem por causa, por exemplo, da resistência dos medicamentosconferida pelo marcador de seleção. Outro exemplo é o assim chamadomarcador de seleção DHFR em que os transformantes são cultivados napresença de metotrexato. Nas formas de realização típicas, as células sãocultivadas na presença de quantidades crescentes de metotrexato paraamplificar o número de cópias do gene exógeno de interesse. As células CHOsão uma linhagem celular particularmente útil para a seleção de DHFR. Umoutro exemplo é o sistema de expressão da glutamato sintetase (LonzaBiologics). Um gene de seleção adequado para uso na levedura é o gene trpl .Ver Stinchcomb et ai. Nature 282, 38, 1979.
3.4 Promotores
Promotores adequados para expressar anticorpos da invençãosão operavelmente articulados a DNA/polinucleotídeo codificando oanticorpo. Promotores para hospedeiros procarióticos incluem o promotorphoA, os sistemas de promotores beta-lactamase e lactose, a fosfatasealcalina, o triptofano e os promotores híbridos, tais como Tac. Promotoresadequados para expressão nas células de levedura incluem a 3-fosfogliceratoquinase ou outras enzimas glicolíticas, por exemplo a enolase, gliceraldeído 3fosfato desidrogenase, hexoquinase, piruvato decarboxilase,fosfofructoquinase, glicose 6 fosfato isomerase, 3-fosfoglicerato mutase eglicoquinase. Promotores de levedura indutíveis incluem a álcooldesidrogenase 2, o isocitocromo C, a fosfatase ácida, a metalotioneína e asenzimas responsáveis pelo metabolismo do nitrogênio ou a utilização demaltose/galactose. Os promotores para expressão nos sistemas celulares demamíferos incluem os promotores virais tais como polioma, epiteliomacontagioso e adenovírus (por exemplo o adenovírus 2), o vírus do papilomabovino, o vírus do sarcoma aviário, o citomegalovírus (em particular opromotor do gene prematuro imediato), retrovírus, o vírus da hepatite B,actina, o promotor do vírus do sarcoma de Rous (RSV) e o vírus símio 40prematuro ou tardio. Naturalmente, a escolha do promotor baseia-se nacompatibilidade adequada com a célula hospedeira usada para expressão. Emuma forma de realização, portanto, é fornecido um primeiro plasmídeocompreendendo um promotor de RSV e/ou SV40 e/ou CMV, DNAcodificando a região V de cadeia leve (VL) da invenção, a região kC juntocom os marcadores de seleção de resistência à neomicina e à ampicilina e umsegundo plasmídeo compreendendo um promotor de RSV ou de SV40, DNAcodificando a região de cadeia V pesada (VH) da invenção, DNA codificandoa região constante γ1, DHFR e marcadores de resistência à ampicilina.
3.5 Elemento Intensificador
Quando apropriado, por exemplo para a expressão emeucarióticos mais elevados, um elemento intensificador operavelmente ligadoao elemento promotor em um vetor, pode ser usado. Seqüênciasintensificadoras de mamíferos adequadas incluem os elementosintensificadores da globina, elastase, albumina, fetoproteína e insulina.Alternativamente, pode-se usar um elemento intensificador de um vírus decélulas eucarióticas tal como o intensificador do SV40 (em 100 a 270 pares debase), o intensificador do promotor prematuro do citomegalovírus, ointensificador do polioma, o intensificador do baculoviral ou o lócus IgG2amurino (ver a WO 04/009823). O intensificador é preferivelmente localizadono vetor em um sítio a montante do promotor.3.5.5 Sinais de poliadenilação
Nos sistemas eucarióticos, os sinais de poliadenilação sãooperavelmente ligados ao DNA/polinucleotídeo codificando o anticorpo destainvenção. Tais sinais são tipicamente colocados em 3' da matriz de leituraaberta. Nos sistemas de mamíferos, exemplos não limitativos incluem sinaisderivados dos hormônios de crescimento, fator-1 alfa de alongamento e genesvirais (por exemplo SV40) ou repetições terminais longas retrovirais. Nossistemas de levedura, exemplos não limitativos dos sinais depoliadenilação/terminação incluem aqueles derivados dos genes dafosfoglicerato quinase (PGK) e da álcool desidrogenase 1 (ADH). Nossistemas procarióticos, os sinais de poliadenilação são tipicamente nãonecessários e, ao invés, é usual empregar seqüências terminadoras mais curtase mais definidas. Naturalmente, a escolha das seqüências depoliadenilação/terminação baseia-se na compatibilidade adequada com acélula hospedeira usada para a expressão.
3.6 Células hospedeiras
Células hospedeiras adequadas para clonar ou expressarvetores codificando anticorpos da invenção, são as células procarióticas, delevedura ou eucarióticas superiores. Células procarióticas adequadas incluema eubactéria, por exemplo a Enterobacteriaceae, tal como Escherichia, porexemplo E. coli (por exemplo ATCC 31.446, 31.537, 27.325), Enterobacter,Erwinia, Klebsiella Proteus, Salmonella, por exemplo Salmonella tyfimurium,Serratia, por exemplo Serratia marcescans e Shigella, bem como Bacilli, talcomo B. subtilis e B. Iicheniformis (ver DD 266 710), Pseudomonas tal comoP. aeruginosa e Streptomyees. Das células hospedeiras de leveduras,Saccharomyees eerevisiae, sehizosaceharomyces pombe, Kluyveromyces (porexemplo ATCC 16.045, 12.424, 24.178, 56.500), yarrowia (EP 402.226),Piehia Pastoris (EP 183.070; ver também Peng et al. J. Bioteehnol. 108(2004) 185-192), Candida, Triehoderma reesia (EP 244.234), Penicillin,Tolypocladium e Aspergillus\ hospedeiros tais como A. nidulans e A. nigersão igualmente considerados.
Embora as células hospedeiras procarióticas e de levedurasejam especificamente consideradas pela invenção, preferivelmente,entretanto, as células hospedeiras da presente invenção são célulaseucarióticas superiores. Células hospedeiras eucarióticas superioresadequadas incluem as células de mamíferos, tais como COS-I (ATCC N2CRL 1650) COS-7 (ATCC CRL 1651), linhagem 293 de rins embriônicahumana, células de rins de hamster filhote (BHK) (ATCC CRL 1632),BHK570 (ATCC NO: CRL 10314), 293 (ATCC NO. CRL 1573), células deovário de hamster chinês CHO (por exemplo, CHO-K1, ATCC NO: CCL 61,linhagem de células de DHFR-CHO, tal como DG44 [ver Urlaub et ai.,(1986) Somatic Cell Mol. Genet. 12, 555-556)], particularmente aquelaslinhagens de células CHO adaptadas para cultura de suspensão, células deSertoli de camundongos, células de rins de macaco, células de rins de macacoverde africano (ATCC CRL-1587), células HELA, células de rins caninos(ATCC CCL 34), células de pulmão humano (ATCC CCL 75), células HepG2 e de mieloma ou linfoma, por exemplo NSO (ver a U.S. 5.807.715), Sp2/0,YO.
Assim, em uma forma de realização da invenção, é fornecidauma célula hospedeira estavelmente transformada compreendendo um vetorcodificando uma cadeia pesada e/ou uma cadeia leve do anticorpo ou seufragmento de ligação a antígeno, como aqui descrito. Preferivelmente, taiscélulas hospedeiras compreendem um primeiro vetor codificando a cadeialeve e um segundo vetor codificando referida cadeia pesada.
Fermentação Bacteriana
Os sistemas bacterianos são particularmente adequados para aexpressão de fragmentos de anticorpos. Tais fragmentos são localizadosintracelularmente ou dentro do periplasma. As proteínas periplasmáticasinsolúveis podem ser extraídas e reduplicadas para formar proteínas ativas deacordo com métodos conhecidos daqueles habilitados na técnica. Ver Sanchezet ai. (1999) J. Biotechnol. 72, 13-20 e Cupit, Ρ. M. et ai. (1999) Lett ApplMicrobiol, 29, 273-277.
3.7 Métodos de cultivo celular
As células hospedeiras transformadas com os vetores quecodificam os anticorpos da invenção ou seus fragmentos de ligação a antígenopodem ser cultivadas por qualquer método conhecido daqueles habilitados natécnica. As células hospedeiras podem ser cultivadas em frascos cônicos,garrafas redondas ou sistemas de fibras ocas, mas é preferível quanto àprodução em grande escala que os reatores de tanque agitado sejam usadosparticularmente para as culturas em suspensão. Preferivelmente os tanquesagitados são adaptados para aeração com o uso, por exemplo, depulverizadores, abafadores ou impulsores de baixo cisalhamento. Para ascolunas de bolhas e reatores de levantamento pneumático, a aeração diretacom bolhas de ar ou de oxigênio, pode ser usada. Quando as célulashospedeiras forem cultivadas em um meio de cultura livre de soro, épreferível que o meio seja suplementado com um agente de proteção dascélulas, tal como o F-68 plurônico, para ajudar a prevenir o dano das célulascomo resultado do processo de aeração. Dependendo das características dascélulas hospedeiras, ou microportadores podem ser usados como substratos decrescimento para as linhagens celulares dependentes de ancoragem, ou ascélulas podem ser adaptadas à cultura de suspensão (o que é típico). A culturadas células hospedeiras, particularmente as células hospedeiras deinvertebrados, pode utilizar uma variedade de modos operacionais, tais comoa massa alimentada, o processamento da massa repetido (ver Drapeau et al.(1994) eytotechnology 15: 103-109), o processo de massa prolongada ou acultura de perfusão. Embora as células hospedeiras de mamíferosrecombinantemente transformadas possam ser cultivadas em meio contendosoro, tal como o soro de bezerro fetal (FCS), é preferível que tais célulashospedeiras sejam cultivadas em meio sintético livre de soro, tal comoapresentado em Keen et al. (1995) Cytotechnology 17: 153-163, ou em meiocomercialmente disponível tal como ProCHO-CDM ou UltraCHO® (CambrexNJ, USA), suplementado, quando necessário, com uma fonte de energia talcomo a glicose e os fatores de crescimento sintéticos tais como a insulinarecombinante. A cultura livre de soro das células hospedeiras pode requererque aquelas células sejam adaptadas ao crescimento em condições livres desoro. Uma abordagem de adaptação é cultivar tais células hospedeiras emmeio contendo soro e repetidamente trocar 80 % do meio de cultura pelo meiolivre de soro de modo que as células hospedeiras se adaptem nas condiçõeslivres de soro (ver, por exemplo, Scharfenberg, K. et al. (1995) em AnimalCell technology: Developments towards the 21st century (Beuvery, E. C. etal. eds.), pp 619-623, Kluwer Academic Publishers).
Os anticorpos da invenção, secretados no meio, podem serrecuperados e purificados com o uso de uma variedade de técnicas paraprover um grau de purificação adequado para o uso pretendido. Por exemplo,o uso dos anticorpos da invenção para o tratamento de pacientes humanostipicamente determina pelo menos 95 % de pureza, mais tipicamente 98 % ou99 % ou mais de pureza (em comparação com o meio de cultura bruto). Noprimeiro caso, os resíduos celulares do meio de cultura são tipicamenteremovidos com o uso de centrifugação, seguido por uma etapa de clarificaçãodo sobrenadante com o uso de, por exemplo, microfiltração, ultrafiltraçãoe/ou filtração de profundidade. Uma variedade de outras técnicas, tais como adiálise e a eletroforese em gel, e técnicas cromatográficas tais como ahidroxiapatita (HA), a cromatografia de afinidade (opcionalmente envolvendoum sistema de rotulagem de afinidade, tal como a poli-histidina) e/ou acromatografia de interação hidrofóbica (HIC, ver a U.S. 5.429.746), acha-sedisponível. Em uma forma de realização, os anticorpos da invenção, emseguida a várias etapas de clarificação, são capturados com o uso dacromatografia de afinidade das Proteínas A ou G, seguida por outras etapas decromatografia, tais como a cromatografia de troca de íons e/ou de HA, trocade ânions ou de cátions, a cromatografia de exclusão de tamanhos e aprecipitação de sulfato de amônio. Tipicamente, várias etapas de remoçãoviral são também empregadas (por exemplo, a nanofiltração com o uso, porexemplo, de um filtro DV-20). Em seguida a estas várias etapas, umapreparação purificada (preferivelmente monoclonal) compreendendo pelomenos 75 mg/ml ou mais, por exemplo 100 mg/ml ou mais, dos anticorpos dainvenção ou seus fragmentos de ligação a antígeno, é fornecida e, portanto,constitui uma forma de realização da invenção. Adequadamente, taispreparações são substancialmente livres de formas agregadas de anticorpos dainvenção.
4. Composições farmacêuticas
As preparações de anticorpos purificadas da invenção (emparticular as preparações monoclonais) como descrito acima, podem serincorporadas nas composições farmacêuticas para utilização no tratamento dedoenças e distúrbios humanos, tais como as doenças atópicas, por exemploasma, rinite alérgica, COPD. Tipicamente tais composições compreendem umcarreador farmaceuticamente aceitável como conhecido e requerido pelaprática farmacêutica aceitável. Ver, por exemplo, Remingtons FarmaceuticalSciences, 16â edição, (1980), Mack Publishing Co. Exemplos dessescarreadores incluem o carreador esterilizado como a solução salina, a soluçãode Ringer ou a solução de dextrose, tamponadas com tampões adequados aum f dentro de uma faixa de 5 a 8. As composições farmacêuticas parainjeção (por exemplo por via intravenosa, intraperitoneal, intradérmica,subcutânea, intramuscular ou intraportal) ou infusão contínua sãoadequadamente livres de matéria particulada visível e podem compreenderentre 0,1 ng a 100 mg de anticorpo, preferivelmente entre 5 mg e 25 mg deanticorpo. Os métodos para a preparação de tais composições farmacêuticassão bem conhecidos daqueles habilitados na técnica. Em uma forma derealização, as composições farmacêuticas compreendem entre 0,1 ng a 100mg dos anticorpos da invenção na forma de dosagem unitária, opcionalmentejunto com instruções para uso. As composições farmacêuticas da invençãopodem ser liofilizadas (secadas pelo congelamento) para reconstituição antesda administração de acordo com métodos bem conhecidos ou evidentesàqueles habilitados na técnica. Quando as formas de realização da invençãocompreendam anticorpos da invenção com um isotipo de IgGl, um quelantede cobre tal como citrato (por exemplo o citrato de sódio), ou EDTA ouhistidina podem ser adicionados à composição farmacêutica para reduzir ograu de degradação dos anticorpos deste isotipo, mediada pelo cobre. Ver aEP 0612251. O tratamento anti-hIL-13 pode ser administrado oralmente, porinalação, topicamente (por exemplo pelas vias intraocular, intranasal, retaldentro dos ferimentos sobre a pele).
Doses e regimes de tratamento eficazes para se administrar oanticorpo da invenção são geralmente determinados empiricamente edependem de fatores tais como a idade, o peso e o estado de saúde dopaciente, e das doenças e distúrbios a serem tratados. Tais fatores acham-sedentro da competência do médico atendente. Orientação na seleção de dosesapropriadas pode ser encontrada, por exemplo, em Smith et ai. (1977)Antibodies in human diagnosis and therapy, Raven Press, New York, mas sesituarão, em geral, entre 1 mg e 1000 mg.
Dependendo da doença ou distúrbio a serem tratados (mas emparticular asma), as composições farmacêuticas compreendendo umaquantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo da invenção, podem serusadas de forma simultânea, separada ou seqüencial, com uma quantidadeeficaz de outro medicamento tal como agentes antiinflamatórios (por exemplocosticosteróide ou um NSAID), agentes anticolinérgicos (particularmente osantagonistas do receptor M1/M2/M3), agonistas do adrenorreceptor β2,agentes antiinfecciosos (por exemplo antibióticos, antivirais), anti-histaminas,inibidor PDE4. Exemplos de agonistas adrenorreceptores β2 incluemsalmeterol, salbutamol, formoterol, salmefamol, fenoterol, terbutalina.Agonistas adrenorreceptores β2 de longa atuação preferidos incluem aquelesdescritos nas WO 02/66422A, WO 02/270490, WO 02/076933, WO03/024439 e WO 03/072539. Corticosteróides adequados incluemmetilprednisolona, prednisolona, dexametasona, propionato de fluticasona, oéster S-fluorometílico de ácido 6a,9a-difluoro-17a-[(2-furanilcarbonil)óxi]-11β-hidróxi-16a-metil-3-oxo-androsta-l,4-dieno-17β-carbotióico, o éster S-(2-oxo-tetraidro-furano-3S-il) de ácido 6α,9α-difluoro-11 β-hidróxi-16α-metil-3-oxo-17a-propionilóxi-androsta-1,4-dieno-17β-carbotióico, os ésteresde beclometasona (por exemplo o éster 17-propionato ou o éster 17,21-dipropionato), budesonida, flunisolida, ésteres de mometasona (por exemplo oéster de fluroato), triamcinolona acetonida, rofleponida, ciclesonida (16α, 17-[[(R)-ciclo-hexilmetileno]bis(óxi)]-11β,21 -diidróxi-pregna-1,4-dieno-3,20-diona), propionato de butixocorte, RPR-106541 e ST-126. Costicosteróidespreferidos incluem o propionato de fluticasona, o éster S-fluorometílico deácido 6α,9α-difluoro-11β-hidróxi-16α-metil-17α-[[4-metil-1,3-tiazol-S-carbonil)óxi]-3-oxo-androsta-l,4-dieno-17β-carbotiόco, o éster S-fluorometílico de ácido 6α,9α-difluoro-17α-[(2-furanilcarbonil)óxi-11β-hidróxi-16α-metil-2-oxo-androsta-1,4-dieno-17β-carbotiόco, mais preferívelo éster 5-fluorometílico de éster S-fluorometílico de ácido 6α,9α-difluoro-17α-[(2-furanilcarbonil)óxi-11β-hidróxi-16α-metil-2-oxo-androsta-1,4-dieno-17β-carbotiόco.
Compostos não esteróides tendo agonismo de glicocorticóide,que podem possuir seletividade para transrepressão através da transativação, eque podem ser úteis na terapia de combinação, incluem aqueles cobertos nasseguintes patentes: WO 03/082827, WO 01/10143, WO 98/54159, WO04/005229, WO 04/009016, WO 04/009017, WO 04/018429, WO 03/104195,WO 03/082787, WO 03/082280, WO 03/059899, WO 03/101932, WO02/02565, WO 01/16128, WO 00/66590, WO 03/086294, WO 04/026248,WO 03/061651, WO 03/08277.
Agentes antiinflamatórios adequados incluem osmedicamentos antiinflamatórios não esteróides (NSAID's).
NSAID's adequados incluem o cromoglicato de sódio,nedocromil sódico, inibidores da fosfodiesterase (PDE) (por exemplo, ateofilina, os inibidores da PDE4 ou os inibidores das PDE3/PDE4misturadas), antagonistas de leucotrieno, inibidores da síntese do leucotrieno(por exemplo o montelukast), inibidores de iNOS, inibidores da triptase e daelastase, antagonistas da integrina beta-2 e agonistas ou antagonistas doreceptor da adenosina (por exemplo os agonistas da adenosina 2a),antagonistas da citocina (por exemplo os antagonistas de quimiocina, taiscomo um antagonista de CCR3) ou inibidores da síntese da citocina, ouinibidores da 5-lipoxigenase. Outros agonistas p2-adrenorreceptores incluem osalmeterol (por exemplo como o xinafosto), salbutamol (por exemplo como abase livre), formoterol (por exemplo como o fumarato), feneterol outerbutalina e seus sais. Um iNOS (inibidor indutível da óxido nítrico sintase) épreferivelmente para administração oral. Inibidores de iNOS adequadosincluem aqueles apresentados nas WO 93/13055, WO 98/30537, WO02/50021, WO 95/34534 e WO 99/62875. Inibidores de CCR3 adequadosincluem aqueles apresentados na WO 02/26722.
De particular interesse é o uso dos anticorpos da invenção, emcombinação com um inibidor da fosfodiesterase 4 (PDE4). O inibidorespecífico da PDE-4 útil neste aspecto da invenção, pode ser qualquercomposto que seja conhecido como inibidor da enzima PDE4 ou que sedescubra atue como um inibidor da PDE4, e que seja apenas inibidor daPDE4, não compostos que inibam outros membros da família da PDE, taiscomo a PDE3 e a PDE5, assim como a PDE4.
Compostos de interesse incluem o ácido c/í-4-ciano-4-(3-ciclopentilóxi-4-metoxifenil)ciclo-hexano-1 -carboxílico, o 2-carbometóxi-4-ciano-4-(3-ciclopropilmetóxi-4-difluorometóxifenil)ciclo-hexan-l-ona e o cis-[4-ciano-4-(3 -ciclopropilmetóxi-4-difluorometoxifenil)ciclo-hexan-1 -ol].
Igualmente, o ácido cw-4-ciano-4-(3-ciclopentilóxi-4-metoxifenil)ciclo-hexano-1-carboxílico, (também conhecido como cilomilast) e seus sais,ésteres, pró-medicamentos ou formas físicas, que são descritos na PatenteU.S. 5.552.438 emitida em 3 de setembro de 1996. Esta patente e oscompostos que ela descreve ficam incorporados no presente relatóriodescritivo na íntegra como referência.
AWD-12-281 da Elbion (Hofgen, N. et al. 15th EFMC IntSymp Med Chem (6 a 10 de setembro, Edinburgh) 1998, Resumo P.98;referência CAS n° 247584020-9); um derivado da 9-benziladeninadenominado NCS-613 (INSERM); D-4418 da Chiroscience e Schering-Plough; um inibidor da benzodiazepina PDE4 identificado como CI-IO18(PD-168787) e atribuído à Pfizer; um derivado do benzodioxol apresentadopela Kyowa Hakko na WO 99/16766; K-34 da Kyowa Hakko; V-11294A daNapp (Landells, L. J. et al. Eur Resp J [Annu Cong Eur Resp Soc (19 a 23 desetembro, Geneva) 1998], 12 (Supl. 28): Resumo P2393); roflumilast(referência CAS n2 162401-32-3) e uma ptalazinona (WO 99/47505, cujoconteúdo fica aqui incorporado como referência) da Byk-Gulden;Pumafentrina, (-)-p-[(4aR*, 10òS*)-9-etóxi-1,2,3,4,4a, 1 Ob-hexaidro-8-metóxi-2-metilbenzo[c][l,6]naftiridin-6-il]-N,N-diisopropilbenza-mida, que é uminibidor de PDE3/PDE4 misturados, o qual foi preparado e publicado pelaByk-Gulden, ora Altana; arofilina em desenvolvimento pela Almirall-Prodesfarma; VM554/UM565 da Vernalis; ou T-440 (Tanabe Seiyaku; Fuji,K. etal. JFarmacolExp Ther, 1998, 284(1): 162), e T2585.
Outros compostos de interesse são apresentados no pedido depatente internacional publicado WO 04/024728 (Glaxo Group Ltd), PCT/EP2003/014867 (Glaxo Group Ltd.) e PCT/EP 2004/005494 (Glaxo Group Ltd).
Agentes anticolinérgicos adequados são aqueles compostosque atuam como antagonistas nos receptores muscarínicos, em particularaqueles compostos que são antagonistas dos receptores M1 ou M3,antagonistas duais dos Mi/M3 ou M2/M3, receptores ou pan-antagonistas dosreceptores dos receptores de Mi/M2/M3. Compostos exemplares paraadministração através de inalação incluem o ipratrópio (por exemplo como obrometo CAS 22254-24-6, vendido sob a denominação de Atrovent), ooxitrópio (por exemplo como o brometo CAS 30286-75-0) e o tiotrópio (porexemplo como o brometo CAS 136310-93-5, vendido sob a denominação deSpiriva). Igualmente de interesse são o revatropato (por exemplo como obromidreto CAS 262586-79-8) e o LAS-34273, que é apresentado na WO01/04118. Compostos de exemplo para administração oral incluem apirenzepina (CAS 28797-61-7), a darifenacina (133099-04-4, ou CAS133099-07-7 para o bromidreto vendido sob a denominação de Enablex),oxibutinina (CAS 5633-20-5, vendido sob a denominação de Ditropan),terodilina (CAS 15793-40-5), tolterodina (CAS 124937-51-5, ou CAS124937-52-6 para o tartarato, vendido sob a denominação de Detrol), otilônio(por exemplo como o brometo CAS 26095-59-0, vendido sob a denominaçãode Spasmomen), cloreto de tróspio (CAS 10405-02-4) e solifenacina (CAS242478-37-1, ou CAS 242478-38-2 para o succinato, também conhecidocomo YM-905 e vendido sob a denominação de Vesicare).
Outros agentes anticolinérgicos adequados incluem oscompostos de fórmula (XXI) que são apresentados no pedido de patente U.S.60/487981:<formula>formula see original document page 68</formula>
em que a orientação preferida da cadeia alquílica articulada ao anel tropano éendo;
R31 e R32 são, independentemente, selecionados do grupoconsistindo de grupos alquila inferior de cadeia reta ou ramificada tendopreferivelmente de 1 a 6 átomos de carbono, grupos cicloalquila tendo de 5 a6 átomos de carbono, cicloalquil-alquila tendo de 6 a 10 átomos de carbono,2-tienila, 2-pifidila, fenila, fenila substituída por um grupo alquila tendo nãomais do que 4 átomos de carbono, e fenila substituída por um grupo alcóxitendo não mais do que 4 átomos de carbono;
X" representa um ânion associado com a carga positiva doátomo Ν. X" pode ser, porém sem limitar, cloreto, brometo, iodeto, sulfato,sulfonato de benzeno e sulfonato de tolueno, incluindo, por exemplo:
brometo de (3-e«Jo)-3-(2,2-di-2-tieniletenl)-8,8-dimetil-8-azoniabiciclo-[3.2.1 ]octano;
brometo de (3-e«<io)-3-(2,2-difeniletenil)-8,8-dimetil-8-azoniabiciclo[3.2.1]-octano;
4-metilbenzenossulfonato de (3-era/o)-3-(2,2-difeniletenil)-8,8-dimetil-8-azoniabiciclo [3.2.1 ] octano;
brometo de (3-e«í/o)-8,8-dimetil-3-[2-fenil-2-(2-tienil)etenil]-8-azoniabiciclo-[3.2. ljoctano; e/ou
brometo de (3-e/?do)-8,8-dimetil-3-[2-fenil-2-(2piridinil)etenil]-8-azonia-biciclo[3.2.1]octano.
Outros agentes anticolinérgicos adequados incluem oscompostos de fórmulas (XXII) ou (XXIII), que são apresentados no pedido depatente U.S. 60/511009:<formula>formula see original document page 69</formula>
em que
o átomo de H indicado se acha na posição exo;
R41- representa um ânion associado com a carga positiva doátomo de N. RI" pode ser, sem a isto ficar limitado, cloreto, brometo, iodeto,sulfato, sulfonato de benzeno e sulfonato de tolueno;
consistindo de grupos de alquila inferior de cadeia reta ou ramificada (tendopreferivelmente de 1 a 6 átomos de carbono), grupos cicloalquila (tendo de 5a 6 átomos de carbono), cicloalquil-alquila (tendo de 6 a 10 átomos decarbono), heterocicloalquila (tendo de 5 a 6 átomos de carbono) e N ou Ocomo o heteroátomo, heterocicloalquil-alquila (tendo de 6 a 10 átomos decarbono) e N ou O como o heteroátomo, arila, arila opcionalmentesubstituída, heteroarila e heteroarila opcionalmente substituída;
cicloalquila C3-C12, heterocicloalquila C3-C7, alquil Ci-C6-cicloalquila C3-C12,alquila C1 -C6-heterocicloalquila C3-C7, arila, heteroarila, alquil Ci-C6-arila,alquil CrC6-Iieteroarila, -OR45, -CH2OR45, -CH2OH, -CN, -CF3, -CH2O(CO)R46, -CO2R47, -CH2NH2, -CH2N(R47)SO2R45, -SO2N(R47)(R48)5 -CON(R47)(R48)5 -CH2N(R48)CO(R46), -CH2N(R48)SO2(R46)5CH2N(R48)CO2(R45)5-CH2N(R48)CONH(R47);
Ci-C6-cicloalquila C3-Ci2, alquila Ci-C6-heterocicloalquila C3-C7, alquil CrC6-arila, alquil C1 -C6-heteroarila;
cicloalquila C3-Ci2, heterocicloalquila C3-C7, alquil Ci-C6-cicloalquila C3-Cj2,
R42 e R43 são independentemente selecionados do grupo
R44 é selecionado do grupo consistindo de alquila Ci-C6,
R45 é selecionado do grupo consistindo de alquila Ci-C6, alquil
R46 é selecionado do grupo consistindo de alquila Ci-C6,alquila C ι -C6-heterocicloalquila C3-C7, arila, heteroarila, alquil Ci-C6-arila,alquil Ci-Có-heteroarila;
R47 e R48 são, independentemente, selecionados do grupoconsistindo de H, alquila Ci-Cô, cicloalquila C3-C12, heterocicloalquila C3-C7,alquil Ci-Có-cicloalquila C3-C12, alquil Ci-C6-heterocicloalquila C3-C7, alquilCi-C6-arila e alquil Ci-C6-heteroarila, incluindo, por exemplo:
Iodeto de (endo)-3-(2-metóxi-2,2-di-tiofen-2-il-etil)-8,8-dimetil-8-azonia- biciclo[3.2.1]octano;3-((Endo)-8-metil-8-aza-biciclo[3.2.1]oct-3-il)-2,2-difenil-propionitrila;
(Endo)-8-metil-3-(2,2,2-trifenil-etil)-8-aza-biciclo[3.2.1 ]octano;
3-((Endo)-8-metil-8-aza-biciclo[3.2.1]oct-3-il)-2,2-difenil-propionamida;
Ácido 3 -((Endo)- 8-metil-8-aza-biciclo [3.2.1 ] oct-3 -il)-2,2-difenil-propiônico;
Iodeto de (Endo)-3-(2-ciano-2,2-difenil-etil)-8,8-dimetil-8-azonia-biciclo-[3.2. l]octano;
Brometo de (Endo)-3-(2-ciano-2,2-difenil-etil)-8,8-dimetil-8-azonia-biciclo-[3.2. l]octano;
3-((Endo)-8-metil-8-aza-biciclo[3.2.1]oct-3-il)-2,2-difenil-propan-l-ol;
A-benzil-3-((endo)-8-metil-8-aza-biciclo[3.2.1]oct-3-il)-2,2-difenil-propionamida;
Iodeto de (Endo)-3-(2-carbamoil-2,2-difenil-etil)-8,8-dimetil-8-azonia-biciclo[3.2.1]octano;l-benzil-3-[3-((endo)-8-metil-8-aza-biciclo[3.2.1]oct-3-il)-2,2-difenil-propil]- uréia;
l-etil-3-[3-((endo)-8-metil-8-aza-biciclo[3.2.1]oct-3-il)-2,2-difenil-propil]-uréia;
7V-[3((endo)-8-metil-8-aza-biciclo[3.2.1]oct-3-il)-2,2-difenil-propil] acetamida;
N-[3((endo)-8-metil-8-aza-biciclo[3.2.1]oct-3-il)-2,2-difenil-propl]benzamida;
3 -((endo)-8-metil-8-aza-biciclo [3.2.1] oct-3 -il)-2,2-di-tiofen-2-il-propionitrila;
Iodeto de (endo)-3-(2-ciano-2,2-di-tiofen-2-il-etil)-8,8-dimetil-8-azonia- biciclo-[3.2.1]octano;
N-[3-((endo)-8-metil-8-aza-biciclo[3.2.1]oct-3-il)-2,2-difenil-propilj-benzeno-sulfonamida;
[3-((endo)-8-metil-8-aza-biciclo[3.2.1]oct-3-il)-2,2-difenil-propil]-uréia;
N-3-((endo)-8-metil-8-aza-biciclo[3.2.1]oct-3-il)-2,2-difenil-propil]-metano-sulfonamida; e/ou
Brometo de (endo)-3-{2,2-difenil-3-[(l-fenil-metanoil)-amino] -propil} -8,8] -dimetil- 8-azonia-biciclo[3.2.1] octano.
Compostos mais preferidos úteis na presente invençãoincluem:
Iodeto de (endo)-3-(2-metóxi-2,2-di-tiofen-2-il-etil)-8,8-dimetil-8-azonia- biciclo[3.2. l]octano;
Iodeto de (endo)-3-(2-ciano-2,2-difenil-etil)-8,8-dimetil-8-azonia-biçiclo[3.2.1 ]octano;
Brometo de (endo)-3-(2-ciano-2,2-difenil-etil)-8,8]-dimetil-8-azonia-biciclo[3.2. l]octano;
Iodeto de (endo)-3-(2-carbamoil-2,2-difenil-etil)-8,8-dimetil-8-azonia-biciclo[3.2.1]octano;
Iodeto de (endo)-3-(2-ciano-2,2-di-tiofen-2-il-etil)-8,8-dimetil-8-azonia- biciclo[3.2.1]octano; e/ou
Brometo de (endo)-3-{2,2-difenil-3-[(l-fenil-metanoil)-amino]-propil}-8,8-dimetil-8-azonia-biciclo[3.2.1]octano.Anti-histaminas adequadas (também referidas comoantagonistas do receptor Hl) incluem qualquer um ou mais dos numerososantagonistas conhecidos que inibem os receptores Hl, e são seguros para usohumano. Os antagonistas de primeira geração incluem derivados deetanolaminas, etilenodiaminas e alquilaminas, por exemplo difenil-hidramina,pirilamina, clemastina, clorofeniramina. Antagonistas de segunda geração,que são não sedativos, incluem a loratidina, desloratidina, terfenadina,astemizol, acrivastina, azelastina, levocetirizina, fexofenadina e cetirizina.
Exemplos de anti-histaminas preferidas incluem a loratidina,desloratidina, fexofenadina e cetirizina.
Outras combinações consideradas incluem o uso de anticorposda invenção em combinação com um agente anti-IL-4 (por exemplo oanticorpo anti-IL-4, tal como o pascolizumab) e/ou o agente anti-IL-5 (porexemplo, o anticorpo anti-IL-5, tal como o mepolizumab) e/ou o agente anti-IgE (por exemplo, o anticorpo anti-IgE tal como o omalizumab (Xolair®) outalizumab).
Convenientemente, uma composição farmacêutica contendoum kit de partes do anticorpo da invenção ou seu fragmento de ligação aantígeno, junto com tais outros medicamentos, opcionalmente junto cominstruções para uso, é também considerado pela presente invenção.
A invenção, além disso, considera uma composiçãofarmacêutica compreendendo uma quantidade terapeuticamente eficaz deanticorpo terapêutico monoclonal ou seu fragmento de ligação a antígeno,como aqui descrito, para uso no tratamento de doenças responsivas àmodulação da interação entre hIL-13 e hIL-13R.
De acordo com a presente invenção, é fornecida umacomposição farmacêutica compreendendo uma quantidade terapeuticamenteeficaz de um anticorpo terapêutico humanizado monoclonal, anticorpo esteque compreenda um domínio VH selecionado do grupo consistindo de: SEQID NOs: 11, 12, 13, 14, e um domínio VL selecionado do grupo consistindode: SEQ ID NO: 15, 16, 17.
De acordo com a presente invenção, é fornecida umacomposição farmacêutica compreendendo um anticorpo monoclonal quecompreende uma cadeia pesada selecionada do grupo consistindo de: SEQ IDNOs: 18, 19, 20, 21, e uma cadeia leve selecionada do grupo consistindo de:SEQ ID NOs: 22, 23, 24.
De acordo com a presente invenção, é fornecida umacomposição farmacêutica compreendendo um anticorpo monoclonal quecompreende uma cadeia pesada de SEQ ID NO: 18 e uma cadeia leve de SEQID NO: 22, e um carreador farmaceuticamente aceitável.
De acordo com a presente invenção, é fornecida umacomposição farmacêutica compreendendo um anticorpo monoclonal quecompreende (ou consiste essencialmente em) uma cadeia pesada de SEQ IDNO: 18 e uma cadeia leve de SEQ ID NO: 22, e um carreadorfarmaceuticamente aceitável.
De acordo com a presente invenção, é fornecida umacomposição farmacêutica compreendendo um carreador farmaceuticamenteaceitável e uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma populaçãomonoclonal de anticorpo, anticorpo este que compreende uma cadeia pesadade SEQ ID NO: 18 e uma cadeia leve de SEQ ID NO: 22.
De acordo com a presente invenção, é fornecida umacomposição farmacêutica compreendendo um carreador farmaceuticamenteaceitável e uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma populaçãomonoclonal de anticorpo, anticorpo este que compreende uma cadeia pesadade SEQ ID NO: 18 e uma cadeia leve de SEQ ID NO: 23.
De acordo com a presente invenção, é fornecida umacomposição farmacêutica compreendendo um carreador farmaceuticamenteaceitável e uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma populaçãomonoclonal de anticorpo, anticorpo este que compreende uma cadeia pesadade SEQ ID NO: 18 e uma cadeia leve de SEQ ID NO: 24.
De acordo com a presente invenção, é fornecida umacomposição farmacêutica compreendendo um carreador farmaceuticamenteaceitável e uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma populaçãomonoclonal de anticorpo, anticorpo este que compreende uma cadeia pesadade SEQ ID NO: 19 e uma cadeia leve de SEQ ID NO: 22.
De acordo com a presente invenção, é fornecida umacomposição farmacêutica compreendendo um carreador farmaceuticamenteaceitável e uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma populaçãomonoclonal de anticorpo, anticorpo este que compreende uma cadeia pesadade SEQ ID NO: 19 e uma cadeia leve de SEQ ID NO: 23.
De acordo com a presente invenção, é fornecida umacomposição farmacêutica compreendendo um carreador farmaceuticamenteaceitável e uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma populaçãomonoclonal de anticorpo, anticorpo este que compreende uma cadeia pesadade SEQ ID NO: 19 e uma cadeia leve de SEQ ID NO: 24.
De acordo com a presente invenção, é fornecida umacomposição farmacêutica compreendendo um carreador farmaceuticamenteaceitável e uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma populaçãomonoclonal de anticorpo, anticorpo este que compreende uma cadeia pesadade SEQ ID NO: 20 e uma cadeia leve de SEQID NO: 22.
De acordo com a presente invenção, é fornecida umacomposição farmacêutica compreendendo um carreador farmaceuticamenteaceitável e uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma populaçãomonoclonal de anticorpo, anticorpo este que compreende uma cadeia pesadade SEQ ID NO: 20 e uma cadeia leve de SEQ ID NO: 24.
De acordo com a presente invenção, é fornecida umacomposição farmacêutica compreendendo um carreador farmaceuticamenteaceitável e uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma populaçãomonoclonal de anticorpo, anticorpo este que compreende uma cadeia pesadade SEQ ID NO: 21 e uma cadeia leve de SEQ ID NO: 22.
De acordo com a presente invenção, é fornecida umacomposição farmacêutica compreendendo um carreador farmaceuticamenteaceitável e uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma populaçãomonoclonal de anticorpo, anticorpo este que compreende uma cadeia pesadade SEQ ID NO: 21 e uma cadeia leve de SEQ ID NO: 23.
De acordo com a presente invenção, é fornecida umacomposição farmacêutica compreendendo um carreador farmaceuticamenteaceitável e uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma populaçãomonoclonal de anticorpo, anticorpo este que compreende uma cadeia pesadade SEQ ID NO: 21 e uma cadeia leve de SEQ ID NO: 24.
5. Usos clínicos
Os anticorpos da invenção podem ser usados no tratamento dedoenças/distúrbios atópicos e doenças/distúrbios inflamatórios crônicos. Departicular interesse é seu uso no tratamento da asma, tal como a asmaalérgica, particularmente a asma severa (isto é, asma que não é responsiva aotratamento corrente, incluindo os corticosteróides sistemicamenteadministrados; ver Busse, W. W. et al., J Allergy Clin. Immunol 2000, 106:1033-1042), asma "difícil" (definida como o fenótipo asmático caracterizadopela falha em se obter controle a despeito das doses máximas recomendadasdos esteróides inalados prescritos; ver Barnes, P. J. (1998), Eur Respir J 12:1208-1218), asma "frágil" (define um subgrupo de pacientes com asma severainstável que mantém uma variabilidade de fluxo expiratório de amplo pico(PEF) a despeito das altas doses dos esteróides inalados; ver Ayres, J. G. et al.(1998) Thorax 58: 315-321), asma noturna, asma pré-menstrual, asmaresistente a esteróides (ver Woodcock, A. J. (1993) Eur Respir J 6: 743-747),asma dependente de esteróides (definida como asma que pode ser controladaapenas com altas doses de esteróides orais, asma de começo adulto, asmapediátrica. Os anticorpos da invenção podem ser usados para prevenir, reduzira freqüência ou mitigar os efeitos dos episódios asmáticos agudos {statusasthmaticus). Os anticorpos da invenção podem também ser usados parareduzir a dosagem requerida (ou em termos de quantidade administrada ou defreqüência da dosagem) de outros medicamentos usados no tratamento daasma. Por exemplo, os anticorpos da invenção podem ser usados para reduzira dosagem requerida para o tratamento de esteróides da asma, tal como otratamento de corticosteróides ("redução de esteróides". Outras doenças oudistúrbios que podem ser tratados com os anticorpos da invenção incluem adermatite atópica, a rinite alérgica, a doença de Crohn, a doença pulmonarobstrutiva crônica (COPD), a esofagite eosinofílica, as doenças ou distúrbiosfibróticos tais como a fibrose pulmonar idiopática, a esclerose sistêmicaprogressiva (escleroderma), a fibrose hepática, os granulomas hepáticos, aesquistossomíase, a leishmaniose, e doenças de regulação do ciclo celular, porexemplo a doença de Hodgkins, a leucemia linfocítica crônica de células B,Outras doenças ou distúrbios que podem ser tratados com os anticorpos dainvenção acham-se detalhados no Exemplo acima dos Fundamentos daInvenção.
Em uma forma de realização da invenção, é fornecido ummétodo de tratar de um paciente humano afligido com uma condição asmáticaque seja refratária ao tratamento com corticosteróides, método este quecompreende a etapa de administrar ao referido paciente uma quantidadeterapeuticamente eficaz de um anticorpo da invenção.
Em outra forma de realização, é fornecido um método deprevenir um ataque asmático agudo em um paciente humano, método este quecompreende a etapa de administrar ao referido paciente uma quantidadeterapeuticamente eficaz de um anticorpo da invenção.
Em outra forma de realização, é fornecido um método dereduzir a freqüência e/ou de mitigar os efeitos de um ataque asmático agudoem um paciente humano, método este que compreende a etapa de administrarao referido paciente uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpoda invenção.
Em outra forma de realização da invenção, é fornecido ummétodo de tender a resposta de células auxiliares T para uma resposta do tipoThl em seguida a um insulto inflamatório e/ou alérgico em um pacientehumano, método este que compreende administrar ao referido paciente umaquantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo ou seu fragmento deligação a antígeno da invenção.
Em outra forma de realização da invenção, é fornecido ummétodo de tratar de um paciente humano tendo a variante Q130hIL-13,paciente este que esteja sendo afligido por asma, tal como as asma severa,referido método compreendendo a etapa de administrar ao referido pacienteuma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo ou seu fragmento deligação a antígeno da invenção.
Embora a presente invenção tenha sido descrita principalmenteem relação ao tratamento de doenças ou distúrbios humanos, a presenteinvenção também pode ter aplicações no tratamento de doenças ou distúrbiossemelhantes em mamíferos não humanos.
A presente invenção será agora descrita por meio de exemploapenas.
Breve Descrição Dos Desenhos
FIGURA 1
ELISA de sanduíche ilustrando a ligação do anticorpo 3G4monoclonal de camundongos à IL-13 humana expressa em E. colirecombinante em concentrações crescentes.
FIGURA 2a
Ensaio de neutralização ilustrando a capacidade do anticorpo3G4 monoclonal de camundongo em aumentar as concentrações para inibir abioatividade da IL-13 humana recombinante expressa em E. coli em umensaio de proliferação de células TF-1.
FIGURA 2b
Ensaio de neutralização ilustrando a capacidade do 3G4quimérico em aumentar as concentrações para inibir a bioatividade da IL-13humana recombinante expressa em E. coli em um ensaio de proliferação decélulas TF-1.
FIGURA 3
Ensaio de neutralização ilustrando a capacidade do anticorpo3G4 monoclonal de camundongo (e 3G4 quimérico) em aumentar asconcentrações para inibir a bioatividade da IL-13 de cinomolgosrecombinante expressa em E. coli em um ensaio de proliferação de célulasTF-1. A curva rotulada 'Campath' é aquela obtida com o uso do alemtuzumabde anticorpo humanizado anti-CD52, atuando como um controle de anticorpoirrelevante nesta experiência. A linha rotulada 'anti-hIL13 poli' é aquelaobtida com o uso de uma preparação anti-IL13 policlonal neutralizante (R&DSystems, catálogo número AF-213-NA) como um controle positivo.
FIGURA 4
Ensaio de neutralização ilustrando a capacidade do anticorpo3G4 monoclonal de camundongo (e 3G4 quimérico) em concentraçõescrescentes para inibir a bioatividade da IL-13 humana expressa em mamíferos(célula CHO) em um ensaio de proliferação de células TF-1. Campath e anti-hIL13 são reagentes de controle como descrito acima.
FIGURA 5
Ensaio de neutralização ilustrando a capacidade do anticorpo3G4 monoclonal de camundongo (e 3G4 quimérico) em concentraçõescrescentes para inibir a bioatividade da IL-13 humana Q130 expressa em E.coli recombinante em um ensaio de proliferação de células TF-1. Campath eanti-hIL13 são reagentes como descrito acima.
FIGURA 6
Um ELISA de mapeamento de epítopo para determinar oepítopo de ligação para o anticorpo 3G4 monoclonal de camundongo sobre aIL-13 humana e de cinomolgos.
FIGURA 7a
Um ELISA de mapeamento de epítopo para identificar aespecificidade de ligação fina do anticorpo 3G4 monoclonal de camundongosobre a IL-13 humana.
FIGURA 7b
Um ELISA de mapeamento de epítopo para identificar aespecificidade de ligação fina do anticorpo 3G4 monoclonal de camundongosobre a IL-13 de cinomolgo.
FIGURA 8
Um ELISA de mapeamento de epítopo para determinar osresíduos de aminoácidos chaves necessários para ligação do anticorpo 3G4monoclonal de camundongo à IL-13 humana.
FIGURA 9
Um ELISA de mapeamento de epítopo para determinar osresíduos de aminoácidos chaves necessários para ligação do anticorpo 3G4monoclonal de camundongo à IL-13 humana.
FIGURA 10
ELISA de sanduíche ilustrando a ligação do anticorpomonoclonal de camundongo 3G4, H2L1, H3L1 de mAbs quiméricos ehumanizados 3G4, à IL-13 humana recombinante expressa em E. coli emconcentrações crescentes.
FIGURA 11
Ensaio de neutralização ilustrando a capacidade do anticorpomonoclonal de camundongo 3G4, H2L1, H3L1 de mAbs quiméricos ehumanizados 3G4, em concentrações crescentes para inibir a bioatividade daIL-13 humana recombinante expressa em E. coli em um ensaio deproliferação de células TF-1.
FIGURA 12
Ensaio de neutralização ilustrando a capacidade do anticorpomonoclonal de camundongo 3G4, H2L1, H3L1 de mAbs quiméricos ehumanizados 3G4, em concentrações crescentes para inibir a bioatividade daIL-13 de cinomolgo recombinante expressa em E. coli em um ensaio deproliferação de células TF-1.
FIGURA 13
Ensaio de neutralização ilustrando a capacidade do anticorpomonoclonal de camundongo 3G4, H2L1, H3L1 de mAbs quiméricos ehumanizados 3G4, em concentrações crescentes, para inibir a bioatividade daIL-13 humana (células CHO) expressa em mamífero em um ensaio deproliferação de células TF-1.
FIGURA 14
Ensaio de neutralização ilustrando a capacidade do anticorpomonoclonal de camundongo 3G4, H2L1, H3L1 de mAbs quiméricos ehumanizados 3G4, em concentrações crescentes, para inibir a bioatividade daIL-13 humana Q130 expressa em E. coli em um ensaio de proliferação decélulas TF-1.
FIGURA 15
ELISA de sanduíche demonstrando que o anticorpo 3G4monoclonal de camundongo, H2L1, H3L1 de mAbs quiméricos ehumanizados 3G4, não ligam a IL-4 humana recombinante expressa em E.coli.
FIGURA 16
ELISA de sanduíche demonstrando que o anticorpo 3G4monoclonal de camundongo, H2L1, H3L1 de mAbs quiméricos ehumanizados 3G4, não ligam a IL-5 humana recombinante expressa em E.coli.
FIGURA 17
ELISA de ligação direta demonstrando que o anticorpo 3G4monoclonal de camundongo, H2L1, H3L1 de mAbs quiméricos ehumanizados 3G4, não ligam o GM-CSF humano.
FIGURA 18
ELISA de sanduíche ilustrando a ligação do anticorpo 3G4monoclonal de camundongo, H2L1, H3L1 de mAbs quiméricos ehumanizados 3G4, à IL-13 humana nativa em concentrações crescentes.
FIGURA 19
ELISA ilustrando a capacidade do anticorpo 3G4 monoclonalde camundongo, H2L1, H3L1 de mAbs quiméricos e humanizados 3G4, emconcentrações crescentes para inibir a ligação da IL-13 humana recombinanteexpressa em E. coli à cadeia al do receptor da IL-13 humana.
FIGURA 20
ELISA ilustrando a capacidade do anticorpo 3G4 monoclonalde camundongo, H2L1, H3L1 de mAbs quiméricos e humanizados 3G4, emconcentrações crescentes para inibir a ligação da IL-13 humana recombinanteexpressa em E. coli à cadeia a2 do receptor da IL-13 humana.
Exemplos
1. Geração de anticorpos monoclonais e caracterização do anticorpo3G4 monoclonal de camundongos
Cinco camundongos SJL foram imunizados por injeçãointraperitoneal, cada uma com 2 μg de IL-13 humana recombinante derivadade E. coli (Cambridge Bioscience, Cat. n° CH-013). As células esplênicas doscamundongos foram removidas e os linfócitos B foram fundidos com ascélulas de mieloma de camundongos originadas das células P3X com o uso dePEG1500 (Boehringer) para gerar hibridomas. As linhagens individuais decélulas de hibridomas foram clonadas por diluição limitativa (E. Harlow e D.Lane). Os reservatórios contendo colônias únicas foram identificadosmicroscopicamente e os sobrenadantes foram testados quanto à atividade. Acélulas da maioria dos clones ativos foram expandidas para a criopreservação,a produção de anticorpos, etc. Inicialmente, os sobrenadantes de hibridomasforam triados quanto à atividade de ligação em relação a uma proteína de IL-13 humana rotulada det-1 recombinante expressa em E. coli (produzidalocalmente) em um formato de ensaio de sanduíche. Uma triagem secundáriadestes positivos foi completada com o uso de um método BIAcore® paradetecção quanto à ligação à proteína IL-13 humana rotulada det-1. Amostrasdestes hibridomas foram então testadas quanto à capacidade de neutralizar abioatividade da IL-13 humana recombinante expressa em E. coli (CambridgeBioscience, cat. n° CH-013) em um bioensaio de células TF-1.
Os positivos identificados do bioensaio neutralizante da IL-13humana foram subclonados por diluição limitativa para gerar linhagens decélulas monoclonais estáveis. As imunoglobulinas destes hibridomas,cultivadas em fábricas celulares sob condições livres de soro, forampurificadas com o uso de colunas de Proteína A imobilizada. Estes mAbspurificados foram então re-triados nos mesmos três sistemas de ensaio.
O anticorpo 3G4 monoclonal foi identificado como um potenteanticorpo que neutralizava a bioatividade da IL-13 humana.
O anticorpo 3G4 tem a seqüência de aminoácidos da região Vhapresentada na SEQ ID NO: 7,
O anticorpo 3G4 tem a seqüência de aminoácidos da região Vlapresentada na SEQ ID NO: 8,
Um anticorpo quimérico foi construído tomando-se as regiõesvariáveis do anticorpo monoclonal de murino 3G4 e a enxertando-as nasregiões do tipo C selvagens IgGl/k humanas. Uma seqüência de sinal humana(como mostrado na SEQ ID NO: 43) foi usada na desenvolvimento destasconstruções. Este anticorpo quimérico foi denominado 3G4C.
1.1 Ligação à IL-13 humana recombinante expressa em E. coli
IL-13 humana recombinante expressa em E. coli ligada a 3G4em um ELISA de sanduíche; o método foi realizado como descrito noExemplo 6.1 (Ver Figura 1).
1.2 Neutralização da IL-13 humana e de cinomolgos recombinanteexpressa em E. coli em um bioensaio de proliferação de células TF-I
As células TF-I proliferam em resposta à IL-13 humana e àIL-13 de cinomolgos. Um bioensaio foi desenvolvido para avaliar acapacidade de neutralização de um mAb anti-IL-13 sobre a proliferação decélulas TF-I induzidas por IL-13 humana e de cinomolgo. O método foirealizado como descrito no Exemplo 6.2.
A seqüência de aminoácidos e uma seqüência de cDNA paraIL-13 de cinomolgo (não incluindo a seqüência de sinal) é apresentada comoSEQ ID NO: 41 e SEQ ID NO: 42, respectivamente.
3G4 neutralizou a bioatividade da IL-13 humana recombinanteem um bioensaio de células TF-I (ver a Figura 2a).
3G4 neutralizou a bioatividade da IL-13 de cinomolgo menospotencialmente do que a IL-13 humana (ver a Figura 3).
Um valor de ND50 médio de 0,13 μg/ml foi calculado para aneutralização de aproximadamente 10 ng/ml de bioatividade de IL-13 humanarecombinante expressa em E. coli em um bioensaio de células TF-I peloanticorpo 3G4 monoclonal.
Um valor de ND50 de 29 μg/ml foi calculado para aneutralização de aproximadamente 10 ng/ml de bioatividade de IL-13 decinomolgos recombinante expressa em E. coli em um bioensaio de célulasTF-I pelo anticorpo 3G4 monoclonal. [O valor da ND50 (dose deneutralização) é a concentração do anticorpo monoclonal necessária parareduzir a proliferação de células TF-I em 50 %, em resposta a umaconcentração de IL-13 estabelecida].
1.3 Neutralização da IL-13 humana (célula CHO) expressa emmamíferos em um bioensaio de proliferação de células TF-I
A capacidade de neutralização do anticorpo 3G4 monoclonalpara a IL-13 humana expressa das células CHO foi avaliada em um ensaio deproliferação de células TF-I. O método foi realizado como descrito noExemplo 6.2. A IL-13 humana expressa em mamífero neutralizou 3G4 maispotencialmente do que um reagente policlonal de IL-13 anti-humanacomercialmente disponível. Um valor de ND5O de 0,31 μ^ηιΐ foi calculadopara a neutralização de -20 ng/ml de IL-13 humana expressa em mamíferosem um bioensaio de células TF-I por anticorpo 3G4 monoclonal. Ver aFigura 4.
1.4 Neutralização da variante de IL-13 humana Q130 recombinanteem um bioensaio de proliferação de células TF-I
A capacidade de neutralização do anticorpo 3G4 monoclonalpara a IL-13 humana Q130 recombinante expressa em E. coli (Peprotech, Cat.ns 200-13A) foi avaliada em um ensaio de proliferação de células TF-1. Ométodo foi realizado como descrito no Exemplo 6.2. 3G4 neutralizou a IL-13humana Q130 mais potencialmente do que um reagente policlonal de IL-13anti-humano comercialmente disponível. Um valor de ND50 de 0,025 μg/mlfoi calculado para a neutralização de -60 ng/ml de bioatividade de IL-13humana Ql30 em um bioensaio de células TF-I por anticorpo 3G4monoclonal. Ver a Figura 5.
1.5 Análise BIAcore®
A afinidade do mAb de camundongo 3G4 para a IL-13recombinante humana e de cinomolgo foi avaliada pela análise de BIAcore®(ressonância de plásmon superficial). Ver a Tabela 2.
As análises de BIAcore® foram realizadas com o uso dacaptura de IgG anticamundongo. Um anticorpo ode IgG anticamundongo foiacoplado em um fragmento CM5 pela acoplagem de amina primária deacordo com a recomendação dos fabricantes. O mAb de camundongo parental3G4 foi então capturado sobre esta superfície e a IL-13 humana ou decinomolgo passou nas concentrações definidas. A superfície foi regenerada devolta para a superfície de IgG anticamundongo com o uso de condições deeluição ácida branda, e isto não afetou significativamente a capacidade decapturar anticorpo para um evento subseqüente de ligação da IL-13. Estetrabalho foi realizado sobre a Biacore 3000 e analisado com o uso doprograma de avaliação inerente na máquina, e os dados foram analisados como uso do modelo 1:1 de ligação. Os dados quanto à ligação da IL-13 humanaforam gerados com o uso da IL-13 recombinante humana rotulada de Det-Iexpressa em E. coli, bem como o foram como um reagente da IL-13 humanarecombinante não rotulada expressa em E. coli (fornecida pela Peprotech). AIL-13 de cinomolgo recombinante expressa em E. coli foi gerada na GSK.Todos os desenvolvimentos de Biacore foram realizados em 25 graus C.
Tabela 2. Dados de biacore 3000 para a ligação do mAb parental decamundongo 3G4 à IL-13 humana e de cinomolgo
<table>table see original document page 85</column></row><table>
Quanto à IL-13 humana rotulada Det-1, os dados foramproduzidos de 2 experiências independentes com ambos os desenvolvimentosrealizados em duplicata. Os dados são apresentados como a média e desviopadrão (entre parênteses) destes resultados.
Quanto à IL-13 humana (fornecida pela Peprotech) e IL-13 decinomolgo (produzida na GSK), os dados são o resultado de uma experiênciarealizada em duplicata.
Quanto aos dados descritos acima, as duplicatas foramanalisadas juntas para dar um valor para o desenvolvimento.Estes dados indicam que o mAb de camundongo 3G4 têm umaafinidade de ligação muito elevada para a IL-13 humana, a afinidade deligação do mAb de camundongo 3G4 para a IL-13 de cinomolgo sendo menospotente na comparação.
2. HUMANIZAÇÃO DO CLONE 3G4
2.1 Análise das Seqüências
Uma comparação foi feita entre as seqüências das regiõesvariáveis de 3G4 e outras seqüência de imunoglobulina murina e humana. Istofoi feito com o uso dos programas FASTA e BLAST e por inspeção.
Os seguintes resíduos de estrutura em 3G4 foram identificadoscomo sendo potencialmente importantes no projeto de uma versão enxertadaem CDR (humanizada) do anticorpo:
Posição 3G4 VH
10 D
30 I
93 T
A posição está de acordo com o sistema de numeração deKabat et al.
Posição 3G4 VL
98 L
Uma estrutura adequada do aceptor humano para a 3G4 Vh foiidentificada: SEQ ID NO: 44
Uma estrutura adequada do aceptor humano para a 3G4 Vl foiidentificada: SEQ ID NO: 45
Na SEQ ID NO: 44, CRDHl e H2 se acham presentes eCDRH3 é representada por XXXXXXXXXX. Na SEQ ID NO: 45, CRDLl eL2 se acham presentes e CDRL3 é representada por XXXXXXXXX.
No enxerto de CDR, é típico necessitar de um ou maisresíduos da estrutura do anticorpo doador a ser incluído no lugar de seusortólogos nas estruturas aceptoras de modo a que se obtenha ligaçãosatisfatória. Além daqueles listados acima, os seguintes resíduos da estruturade murinos foram também considerados para a possível retenção em umprojeto de anticorpo humanizado:
<table>table see original document page 87</column></row><table>
4 construções de Vh humanizadas com diferentes retro- mutações foram projetadas para se obter um anticorpo humanizado com atividade satisfatória. Estas são numeradas de Hl a H4.
H1 consiste em um enxerto de CDR dos CDRs de VH 3G4 na seqüência aceptora especificada. Adicionalmente, Hl contém o resíduo murino na posição 30 (isoleucina). Isto está fora da definição de Kabat da CDT, mas dentro da definição de Hl de CDR de Chothia. Neste caso, este resíduo é considerado como sendo parte da CDR, ao invés de uma retro- mutação verdadeira da estrutura.
H2 é idêntico a Hl, porém com uma retro-mutação em que o aminoácido na posição 93 é treonina, ao invés de alanina. H3 é idêntico a H2, porém com uma retromutação adicional em que o aminoácido na posição 10 é ácido aspártico, ao invés de ácido glutâmico.Η4 é idêntico a H3, mas contém quatro retro-mutaçõesadicionais nas posições 67 (alanina no lugar de valina), 69 (leucina no lugarde metionina), 71 (alanina no lugar de arginina) e 73 (lisina no lugar detreonina).
3 construções de Vl humanizada com diferentes retro-mutações foram projetadas para se obter um anticorpo humanizado comatividade satisfatória. Estas são numeradas de Ll a L3.
Ll consiste em um enxerto de CDR das CDRs Vl de 3G4 naseqüência aceptora especificada com o uso da definição de Kabat das CDRs.
L2 é idêntica a LI, mas com uma retro-mutação onde oaminoácido na posição 98 é leucina no lugar de fenilalanina.
L3 é idêntica a L2, mas com uma retro-mutação adicional ondeo aminoácido na posição 76 é asparagina no lugar da serina.
Construção Hl de Vh humanizadaSEQ ID NO: 11
Construção H2 de Vh humanizadaSEQ ID NO: 12
Construção H3 de Vh humanizadaSEQ ID NO: 13
Construção H4 de Vh humanizadaSEQ ID NO: 14
Construção Ll de Vh humanizadaSEQ ID NO : 15
Construção L2 de Vl humanizadaSEQ ID NO: 16
Construção L3 de Vl humanizadaSEQ ID NO: 17
2.2 Humanização de 3G4
As construções de Vh e Vl humanizadas foram preparadaspela formação de novo dos oligonucleotídeos de superposição incluindo ossítios de restrição para clonagem nos vetores de expressão de mamíferos Rld eRln, bem como uma seqüência de sinal humana. Sítios Hind III e Spe I foramintroduzidos para formar o domínio Vh contendo a seqüência de sinal humana(SEQ ID NO: 43) para clonar em Rld contendo a região constante do tiposelvagem γΐ humana. Os sítios de restrição Hind III e BsiW I foramintroduzidos para formar o domínio Vl contendo a seqüência de sinal humanapara clonagem em Rln contendo a região constante capa humana. Isto éessencialmente como descrito na WO 2004/014953.
3. Expressão e caracterização dos anticorpos humanizados
As construções de Vh humanizadas (Hl, H2, H3 e H4) e duasconstruções de Vl humanizadas (LI e L2) foram preparadas nos vetores deexpressão de mamíferos Rld hCylwt e Rln hCic. As combinações deplasmídeos de cadeia pesada-cadeia leve (H1L1, H1L2, H2L1, H2L2, H3L1,H3L2, H4L1, H4L2) foram transientemente cotransfectadas dentro de célulasCHO e expressas em pequena escala para dar oito diferentes anticorposhumanizados.
Os anticorpos produzidos no sobrenadante das células CHO eas subseqüentes bateladas de anticorpos purificados, foram analisados quantoà atividade no ELISA de ligação à IL-13 humana, no bioensaio deneutralização da IL-13 humana, e ligação à IL-13 humana por BIAcore®.Todos os oito mAbs humanizados apresentaram ligação e/ou neutralização daIL-13 humana em cada um destes ensaios. H2L1 e H3L1 foram selecionadospara outra análise por causa do melhor desempenho no bioensaio deneutralização da IL-13 humana, e ligação à IL-13 humana pelo BIAcore®,enquanto oferecendo um número limitado de retromutações.
3.1 Ligação à IL-13 humana recombinante expressa em E. coli
IL-13 humana recombinante expressa em E. coli ligada a3G4C, H2L1 e H3L1 em um ELISA de sanduíche com perfis semelhantes. Ométodo foi realizado como descrito no Exemplo 6.1A. A Tabela 3 apresentavalores de ED50 médios (ver também a Figura 10). [A ED50 (dose eficaz) é aconcentração do anticorpo necessária para a meia ligação máxima à IL-13neste ELISA]
Tabela 3
<table>table see original document page 90</column></row><table>
O 3G4, 3G4C, H2L1 e H3L1 foram também mostradosinibirem a ligação da IL-13 humana às cadeias do receptor da IL-13 humana(IL13Rα1 e IL13Rα2) por ELISA. Este método foi realizado como descritonos Exemplos 6,5 e 6,6.
A Figura 19 apresenta os dados demonstrando a inibiçãoquanto à ligação à IL13Ral.
A Tabela 4 mostra os valores médios da IC5o para a inibiçãoquanto à ligação à EL13Ra2. [A IC50 é a concentração do mAb necessáriapara inibir a ligação de uma quantidade fixa de IL-13 humana à IL13Rα2 em50%].
Tabela 4
<table>table see original document page 90</column></row><table>
A Figura 19 ilustra que 3G4, 3G4, H2L1 e H3L1 inibem aligação da IL-13 humana a IL13Ral com potência semelhante.
A Figura 20 ilustra que 3G4, 3G4C, H2L1 e H3L1 inibem aligação da IL-13 humana à IL13Rα2 com potência semelhante.3.2 Ligação à IL-13 humana nativa
A linhagem de células HDLM-2 (uma linhagem celularsemelhante a Reed-Steinberg, originalmente derivada da medula óssea)produz a IL-13 humana e usa-a em uma forma autócrina para crescimento.Esta IL-13 humana nativa é secretada no sobrenadante de células HDLM-2.Esta foi usada para avaliar a ligação de 3G4, 3G4C, H2L1 e H3L1 à IL-13humana nativa com o uso de um método descrito no Exemplo 6,1B. PeloELISA, todos os quatro anticorpos ligaram-se à IL-13 humana nativa nosobrenadante de células HDLM2 com desempenho muito semelhante àqueledo mAb de 3G4 parental. Ver Figura 18.
3.3 Neutralização da IL-13 humana e de cinomolgos recombinanteexpressa em E. coli em um bioensaio de proliferação de células TF-I.
3G4, 3G4C, H2L1 e H3L1 neutralizaram a bioatividade da IL-13 humana e de cinomolgos recombinante expressa em E. coli. O método foirealizado como descrito no Exemplo 6.2A.
3G4, 3G4C, H2L1 e H3L1 neutralizaram a bioatividade da IL-13 de cinomolgos recombinante expressa em E. coli menos potencialmente doque a IL-13 humana [ND5o (dose de neutralização) é a concentração de mAbrequerida para reduzir a proliferação de células TF-I em 50 %, em resposta auma concentração estabelecida de IL-13].
Ver a Tabela 5 abaixo e as Figuras 11 e 12.
Tabela 5
<table>table see original document page 91</column></row><table>
O valor médio da ND50 para 3G4 foi de 0,049 μ§/ηι1 calculadopara a neutralização de aproximadamente 10 ng/ml de bioatividade de IL-13humana recombinante expressa em E. coli no ensaio de TF-1. Os resultadosna Tabela 5 são a média de quatro repetições separadas. O valor obtido écomparável, embora aproximadamente duas vezes menor do que o valor daND5O anteriormente obtido (ver o Exemplo 1.2).
O nível de neutralização da IL13 humana expressa em E. coliobtido para o mAb de camundongo 3G4 parental é comparável com aqueleobtido pelo 3G4 quimérico. As potências de H2L1 e H3L1 foram reduzidasem comparação tanto com mAb de camundongo 3G4 parental quanto com3G4 quimérico.
O valor médio da ND5O para 3G4 parental é de 34 μg/ml. Estefoi calculado para a neutralização de aproximadamente 10 ng/ml debioatividade da IL-13 de cinomolgos recombinante, expresso em£. coli. Estevalor foi semelhante ao valor anteriormente relatado para 3G4 parental (verExemplo 1.2). H2L1 e H3L1 também apresentaram potência semelhantecontra IL13 de cinomolgos como 3G4.
3.4 Neutralização da IL-13 humana (célula CHO) expressa emmamífero em um bioensaio de proliferação de células TF-1.
A capacidade de neutralização dos anticorpos monoclonais3G4, 3G4C, H2L1, e H3L1 para a IL-13 humana expressa das células CHO,foi avaliada em um ensaio de proliferação de células TF-I de acordo com ométodo apresentado no Exemplo 6.2A.
3G4, 3G4C, H2L1 e H3L1 neutralizaram a bioatividade da IL-13 humana expressa em CHO recombinante (ver a Tabela 6 e a Figura 13).
[ND50 (dose de neutralização) é a concentração de mAbrequerida para reduzir a proliferação de células TF-I em 50 %, em resposta auma concentração estabelecida de IL-13]
Tabela 6
<table>table see original document page 92</column></row><table>
O valor médio de ND50 para 3G4 parental foi de 0,05 μg/ml.Este foi calculado para a neutralização de -10 ng/ml de IL-13 humanaexpressa em mamíferos em um bioensaio de células TF-1. Este valor diferedaquele anteriormente obtido (ver o Exemplo 1.3). Entretanto, a quantidadede IL-13 humana usada para estimular a proliferação das células TF-I nestasexperiências, foi menor do que a anteriormente usada (10 ng/ml).
O nível de neutralização da IL13 humana expressa em CHOobtido pelo mAb de 3G4 parenteral, foi levemente melhor do que o nível para3G4C. As potências de H2L1 e H3L1 foram reduzidas em comparação tantocom o mAb de 3G4 parenteral quanto com 3G4 quimérico.3.5 neutralização da variante de IL-13 humana Q130 recombinante emum bioensaio de proliferação de células TF-I.
A capacidade de neutralização de 3G4, 3G4C, H2L1 e H3L1para a IL-13 humana Q130 recombinante expressa em E. coli foi avaliada emum ensaio de proliferação de células TF-1. O método foi realizado comodescrito no Exemplo 6.2A.
Um valor da ND50 de 0,274 μ§/πι1 foi obtido. Este difere dovalor da ND50 anteriormente obtido (ver Exemplo 1.4). Este ensaio foirepetido por várias vezes para confirmar estes valores da ND50. A qualidadeda preparação da IL-13 humana Ql30 de fonte comercial usada em ambos osconjuntos de experiências (realizada em diferentes ocasiões) podem explicaras diferenças observadas para estes 2 conjuntos de dados.
A Tabela 7 apresenta as potências de 3G4C, H2L1 e H3L1, asquais foram todas semelhantes. Ver também a Figura 14.
Tabela 7
<table>table see original document page 93</column></row><table>
3.6 Análise de BIAcore®A afinidade de 3G4C, H2L1 e H3L1 para a IL-13 humana e decinomolgos recombinante foi avaliada pela análise de BIAcore®. Ver asTabelas 8, 9 e 10.
As análises foram realizadas com o uso da captura da ProteínaA. Resumidamente, a Proteína A foi acoplada em um fragmento de CM5 poracoplamento de amina primária de acordo com as recomendações dosfabricantes. O anticorpo quimérico ou os anticorpos humanizados foram entãocapturados sobre esta superfície e a IL-13 humana e de cinomolgos atuaramem concentrações definidas. A superfície foi regenerada de volta à superfícieda Proteína A com o uso de condições de eluição ácida branda, o que nãoafetou significativamente a capacidade de capturar anticorpo para um eventosubseqüente de ligação da IL-13. O trabalho foi realizado sobre as máquinasBiacore 3000 e Biacore T100, os dados foram analisados com o uso do programade avaliação inerente nas máquinas e ajustados ao modelo de ligação 1:1. Os dadosdiferiram levemente entre as duas máquinas, embora as diferenças observadas entreas cinética quanto à ligação dos anticorpos quiméricos e humanizados à IL-13humana tenham sido semelhantes para ambas as máquinas. Os dados de ligaçãoquanto à IL-13 humana ajustaram-se bem ao modelo 1.1 para todas as construções,porém o ajuste para a ligação à IL-13 de cinomolgo foi pior, aumentando apossibilidade de que os valores reais possam ser levemente piores (por exemplo,uma diferença de 2 a 3 vezes) do que as relatados por causa de seu ajuste mais fracoe da dificuldade nas análises. Os dados foram gerados com o uso de IL-13 humanae de cinomolgos (produzida na GSK). Todos os desenvolvimentos de Biacoreforam realizados em 25 graus C.
Tabela 8. Dados da BIACORE 3000 para a ligação de anticorposquiméricos e humanizados à IL-13 humana
<table>table see original document page 94</column></row><table>Quanto ao 3G4 quimérico, os dados foram produzidos de 4experiências independentes (duas das quais foram realizadas em duplicata,com cada duplicata sendo analisada separadamente). Quanto aos mAbshumanizados H2L1 e H3L1, os dados foram produzidos de duas experiênciasindependentes realizadas em duplicata (com cada duplicata sendo analisadaseparadamente). Os dados são apresentados como a média e o desvio padrão(dentro de parênteses) destes resultados.
Tabela 9. Dados de TlOO para ligação de anticorpos quiméricos ehumanizados à IL-13 humana
<table>table see original document page 95</column></row><table>
Os dados foram produzidos de 2 experiências independentes esão apresentados como a média e desvio padrão (dentro de parênteses) destesresultados.
O anticorpo quimérico 3G4 e os H2L1 e H3L1 de mAbshumanizados se ligam com alta afinidade à IL-13 humana, e estes dados sãocomparáveis com a afinidade de ligação do mAb de camundongo 3G4parental pela IL-13 humana.
Tabela 10. Dados T100 para ligação do anticorpo quimérico Ehumanizado à IL-13 de cinomolgos
<table>table see original document page 95</column></row><table>
Os dados foram produzidos de uma experiência única. Oanticorpo quimérico e os H2L1 e H3L1 de mAbs humanizados se ligam à IL-13 de cinomolgos com uma afinidade inferior em comparação com suaafinidade de ligação quanto à IL-13 humana.
3.7 Especificidade de 3G4C, H2L1 e H3L1 para ligação à IL-13humana.
As especificidades de 3G4C, H2L1 e H3L1 quanto à IL-13humana foram avaliadas pela análise do potencial de reatividade cruzadacontra a IL-4 humana, IL-5 humana e GM-CSF humana em ELISAs deligação. Estes métodos foram realizados como descritos nas seções 6.7, 6.8 e6.9, respectivamente. Ver as Figuras 15, 16 e 17. Estes mAbs foramobservados serem específicos para ligação à IL-13, sem nenhuma reatividadecruzada quanto à IL-4 humana, IL-5 humana ou GM-CSF humana emconcentrações de mAb até 30 μ£/ηι1. As quimeras de 3G4 pareceramapresentar alguma ligação à IL-5 humana em 30 μg/ml; isto é provavelmentedevido a um erro de pipetagem, já que nenhuma observação foi feita quantoaos H2L1 e H3L1 dos mAbs humanizados em uma concentração semelhante.
4. Mapeamento do epítopo do 3G4 com o uso de peptídeosbiotinilados
Uma série de experiências de mapeamento de epítopo foirealizada para se determinar quais resíduos de aminoácidos na IL-13 foramnecessários para ligação do mAb de camundongo 3G4.
4.1. Mapeamento bruto do epítopo de ligação do mAb DE camundongo3g4 sobre a IL-13 humana e de cinomolgos
Dezesseis mer peptídeos biotinilados deslocados por 4 foramsintetizados para mapear a localização do epítopo de ligação identificado por3G4 de mAb de camundongo sobre a IL-13 humana e de cinomolgos. Ummétodo ELISA, como descrito no Exemplo 6.3, foi usado para detectar aligação do peptídeo biotinilado imobilizado ao 3G4 de mAb de camundongoparental.
Detalhes de costume dos 16-meros designados Peptídeos: 88 χ16 meros, deslocamento por 4 (fornecido pela Mimotopes, Austrália).
Formato: Peptídeos 25 e 44 = Biotina-SGSG-PEPTÍDEO-ácido
Peptídeos 2 a 24 e 27 a 43 = Biotina-SGSG-PEPTÍDEO-amida<table>table see original document page 97</column></row><table>
(* indica um valor elevado de hidrofobicidade).
Os resultados indicaram esse mAb de camundongo 3G4 ligado aos dois peptídeos apresentados abaixo (ver também a figura 6).
Peptídeo 25: DLLLHLKKLFREGRFN (SEQ ID NO: 88)
Peptídeo 44: DLLVHLKKLFREGQFN (SEQ ID. NO: 89)
O peptídeo 25 é derivado de IL-13 humana.
O peptídeo 44 é derivado de IL-13 de cinomolgos.Nota: Negrito indica diferenças de resíduos entre a IL-13humana e o ortólogo da IL-13 de cinomolgos.
4.2 Mapeamento fino do epítopo de ligação de mAb de camundongo3G4 sobre a IL-13 humana e de cinomolgos, com o uso de peptídeosbiotinilados
O epítopo de ligação mínima para 3G4 de mAb decamundongo sobre a IL-13 humana foi determinado com o uso de umpeptídeo estabelecido com base em torno da seqüência de peptídeos,QFVKDLLLHLKKLFREGRFN (SEQ ID. NO: 90). Os peptídeos foramobtidos com 1 aminoácido seqüencialmente removido ou do termino N ou doC desta seqüência de peptídeos parentais de modo a definir o epítopo precisode ligação linear para o 3g4 de mAb de camundongo. Uma abordagem similarfoi tomada para mapear a ligação à IL-13 de cinomolgos. Um método ELISA(realizado como descrito no Exemplo 6.4) foi usado para detectar a ligação dopeptídeo biotinilado imobilizado ao 3G4 de mAb de camundongo parental(Figuras 7a e 7b).
Os resultados indicam que o 3G4 de mAb de camundongoparental se liga ao epítopo de aminoácido mínimo LLHLKKLFREG (SEQID. NO: 91) na região C-terminal da IL-13 humana. Entretanto, os 2aminoácidos (D e L) localizados adjacentes à extremidade N-terminal daseqüência de peptídeos acima (na seqüência de IL-13 humana) podemtambém ser importantes para ligação, já que o sinal de ligação é intensificadoquando estes resíduos se acham presentes. De forma semelhante, os 2aminoácidos (R, FeN) localizados adjacentes à extremidade C-terminal daseqüência de peptídeos acima (na seqüência de IL-13 humana) podemtambém ser importantes para a ligação, já que o sinal de ligação é perdidoquando os resíduos R e F se acham presentes, mas o sinal de ligação érestaurado quando o resíduo N se acha presente.
Resultados semelhantes foram obtidos para a ligação do 3G4de mAb de camundongo ao conjunto de peptídeos da IL-13 de cinomolgos.
Os resultados indicam que 3G4 de mAb de camundongo parental se liga aoepítopo de aminoácido mínimo LLVHLKKLFREG (SEQ ID. NO: 98) naregião C-terminal da IL-13 de cinomolgos. Entretanto, o 1 aminoácido (D)localizado adjacente à extremidade N-terminal da seqüência de peptídeos acima(na seqüência de IL-13 de cinomolgos) também pode ser importante para aligação, já que o sinal de ligação é intensificado quando o resíduo se achapresente. De forma semelhante, os 3 aminoácidos (Q, FeN) localizadosadjacentes à extremidade C-terminal da seqüência de peptídeos acima (naseqüência de IL-13 de cinomolgos) pode também ser importante para ligação, jáque o sinal de ligação é perdido quando os resíduos Q e F se acham presentes, maso sinal de ligação é restaurado quando o resíduo N se acha presente.
4.3 Varredura da alanina do epítopo de ligação 3G4 de mAb decamundongo, usando peptídeos biotinilados.
A fim de identificar os resíduos chaves envolvidos nainteração da IL-13 humana com 3G4 de mAb de camundongo, umaabordagem de varredura de alanina foi adotada com o uso da seqüência depeptídeo parental QFVKDLLLHLKKLFREGRFN (SEQ ID. NO: 90). Paraesta análise, os peptídeos apresentados na Tabela 11 foram obtidos (AnaSpecInc.) quando um aminoácido foi seqüencialmente substituído por um resíduode alanina em cada posição de aminoácido na porção LKKLFRE (SEQ IDNO: 92) do epítopo parental de LKKLFRE (SEQ ID. NO: 92) do epítopoparental QFVKDLLLHLKKLFREGRFN (SEQ. ID. NO: 90).
Tabela 11
<table>table see original document page 99</column></row><table>Um método ELISA foi usado (semelhante àquele apresentadono Exemplo 6.4) para detectar a ligação do peptídeo biotinilado imobilizadoao 3G4 de mAb de camundongo parental (ver Figura 8).
Estes dados confirmam que os resíduos de aminoácido chavesenvolvidos na interação do 3G4 de mAb de camundongo parental com a IL-13 humana são pelo menos arginina (R) na posição 107, lisina (K) na posição103 e lisina (K) na posição 104. A numeração destes é como anteriormentedescrita na WO 2006/003407.
Como a análise acima havia varrido apenas a porçãoLKKLFRE (SEQ ID NO: 92) do epítopo de ligação mínima, um outroconjunto de peptídeos conforme apresentado na Tabela 12, foi obtido(Mimotopes) para expandir o estudo da varredura da alanina a outros resíduosde aminoácidos no epítopo de ligação mínima.
Tabela 12
<table>table see original document page 100</column></row><table>
Novamente, um método ELISA (semelhante àquele usado noExemplo 6.4) foi usado para detectar a ligação do peptídeo biotiniladoimobilizado ao 3G4 de mAb de camundongo parental. Ver a Figura 9 (nestaexperiência o peptídeo QFVKDLLLHLKKLFREGRFN (SEQ ID. NO: 90) éo controle positivo demonstrando a ligação máxima, e o peptídeoQFVKDLLLHLKKLFAEGRFN (SEQ ID NO: 104) é o controle negativodemonstrando ligação mínima).
Estes dados sugerem que o resíduo de fenilalanina (F) naposição 111 também é importante para a interação do 3G4 de mAb decamundongo parental com a IL-13 humana. A numeração deste resíduo écomo previamente descrito na WO 2006/003407.
5. Eficácia de um mAb anti-IL-13 humanizado no modelo de asma decinomolgos.
Este exemplo é profético.
O modelo de broncoconstrição pulmonar induzido Ascarissuum (A. suum) em macacos cinomolgos {Macaca fascicularis) é amplamentereconhecido como o modelo não clínico mais semelhante e relevante à asmanos seres humanos (Patterson, R. et ai. Trans. Assoc. Am. Physicians 1980 93:317-325; Patterson, R. etal. J. Lab. Clin. Med. 1983 101: 864-872).
Neste modelo, os animais tendo uma sensibilidade pulmonarinata ao A suum ficam expostos ao A. suum nebulizado para induzir umaresposta asmática. Esta resposta asmática pode ser caracterizada pela mediçãoda hiper-responsividade das vias aéreas (AHR), pela infiltração celularmedida no fluido da lavagem broncoalveolar (BAL) e pelos níveis de IgGsérico. Os métodos experimentais são semelhantes àqueles anteriormentedescritos por Mauser, P. et al. em Am. J. Resp. Crit. Care Med. 1995 204:467-472 e por Evanoff, H., et al. em Immunologic Investigation 1992 21: 39.
Este estudo utiliza 30 animais, pré-selecionados para entradaem que tenham demonstrado uma resposta broncoconstritora positiva a umadose específica de um antígeno de A. suum. A. suum é administrado na dosede resposta ótima (ORD) para cada animal. E uma dose predeterminada de A.suum que produz um aumento na Rl (resistência pulmonar) de pelo menos 40% e um decréscimo na Cdyn (complacência dinâmica) de pelo menos 35 %,por inalação em aerossol (para uma dose única administrada através de 15respirações com o uso de um nebulizador).
O estudo ocorre em duas fases. Durante a fase 1, a AHR éavaliada em resposta ao desafio da histamina intravenosa (i/v) [isto é, umadose de histamina suficiente para induzir um aumento na Rl de pelo menos 30% acima da linha de referência (PC30)] tanto antes (a avaliação da funçãopulmonar da linha de referência no primeiro dia) quanto após (no décimoprimeiro dia) a administração do antígeno de A. suum (no nono e no décimodia, quando o A. suum é administrado em uma dose predeterminada ótimapara cada animal, por inalação por aerossol).
A fase 2 é idêntica à fase 1, exceto que os animais recebemtratamento com anticorpo (ver abaixo), cada anticorpo é dado como 3 dosesde aproximadamente 30 mg/kg administradas por infusão i/v nos primeiro,quinto e nono dias.
Grupo 1 (n = 12): um mAb anti-IL-13 humanizado (30 mg/kg)
Grupo 2 (n = 12): um mAb anti-IL-13 humanizado (30 mg/kg) e
Pascolizumab (mAb anti-IL4 humanizado, 30 mg/kg)
Grupo 3 ( η = 6): tratamento de controle negativo de apenas veículo
As saídas de leitura da AHR das fases 1 e 2 são calculadaslevando-se em conta as leituras de pressão e de fluxo de ar - resistênciapulmonar (Rl) e complacência dinâmica (Cdyn) - em resposta à histamina,com o uso do sistema de mecânica pulmonar Buxco. A mudança depercentual máximo da linha de referência comparada com o pós-desafio doantígeno de A. suum [para a resistência pulmonar (Rl) e a complacênciadinâmica (Cdyn) é comparada quanto às fases 1 e 2, isto é, com ou semtratamento de anticorpos, e estes dados são usados para avaliar o fenótipo daAHR.
Além disso, as amostras BAL são colhidas nos primeiro edécimo primeiro dias nas fases 1 e 2, para medir a infiltração celular e, emparticular, a eosinofilia. As amostras de soro são também colhidas paramonitorar os níveis de IgE.
6.1 ELISA de ligação à IL-13 humana e de cinomolgos
Este ensaio descreve um ELISA que detecta a ligação de umanticorpo à IL-13 humana e de cinomolgo. Ele é um formato de ELISA desanduíche.
6.1.1 Materiais
1. Imunoplaca 1 Nunc Maxisorp F96 (Life Technologies, 4-39454A)
2. IL-13 humana (expressa em E. coli da CambridgeBiosciences, cat. n2 CH1-013).
3. IL-13 de cinomolgo (produzida pela GlaxoSmithkline)
4. Anticorpo policlonal de IL-13 anti-humana de cabra (R&DSystems, cat. n2 AF-213-NA)
5. IgG-HRP anti-humana (Sigma, Cat nfi A-6029)
6. IgG-HRP anticamundongo (Sigma, Cat η2 A-9309)
7. Tampão de carbonato/bicarbonato (Sigma; cat. n2 C-3041)
8. TBST [solução salina tamponada de Tris (6,06 g de Tris +8,06 g de NaCl + 0,2 g de KCl + H20 até 1 litro) + 0,05 % de Tween 20]
9. BSA (Sigma A-7030)
10. OPD (Sigma, Cat. ns P-9187)
11. Ácido sulfurico6.1.2 Método
l.A solução de bloqueio é de 3 % de BSA+TBST
2. A solução de lavagem é de TBST
3. Placas de ELISA 'Nunc Maxisorp' cobertas, com 50 ul deanticorpo policlonal de IL-13 anti-humana de cabra de 5 ug/ml (R&DSystems, cat. n2 AF-213-NA. Composto em uma concentração de estoque de500 ug/ml de acordo com as instruções dos fabricantes, e armazenado emalíquotas em -20°C) em tampão de carbonato/bicarbonato (Sigma; cat. n2 C-3041, composto segundo instruções dos fabricantes), cobertura com umselador de placa e incubação durante a noite em 4 °C.
4. Bloqueio com 100 ul de 3 % de BSA/TBST incubado natemperatura e pressão ambientes por 1 hora.
5. Lavar X3 em TBST (pelo menos 200 ul de solução delavagem por reservatório, por lavagem).
6. Adicionar 20 ng por reservatório (em um volume de 50 ul)de IL-13 humana (Cambridge Bioscience, cat. n2 CHl-013. Composto emuma concentração de estoque de 100 ng/ul de acordo com as instruções dosfabricantes, e armazenado em alíquotas em -20 °C) ou 20 ng por reservatóriode IL-13 de cinomolgo, em solução de bloqueio e incubar na temperaturaambiente por 1 hora.
7. Lavar X3 em TBST.
8. Adicionar 50 ul de amostra de anticorpo (titular fora parase obter os dados do título de ponto final, se necessário) em solução debloqueio, incubar na temperatura e pressão ambientes por 1 hora.
9. Lavar X3 em TBST.
10. Quanto ao anticorpo quimérico 3G4 ou anticorpohumanizado, detectar a ligação com o uso de 50 ul por reservatório de IgG-HRP anti-humana (Sigma, Cat n° A-6029) em uma diluição a 1/2000 emsolução de bloqueio por 1 hora na temperatura e pressão ambientes. Quantoao anticorpo monoclonal de camundongo 3G4, detectar a ligação usando 50 ulpor reservatório de IgG-HRP anticamundongo (Sigma, Cat n° A-9309) emuma diluição a 1/1000 em solução de bloqueio por 1 hora na temperatura epressão ambientes.
11. Lavar X3 em TBST.
12. Desenvolver com 100 ul de OPD (Sigma, Cat. na P-9187.Composto conforme as instruções dos fabricantes), interromper com 50 ul deH2SO4 3M, leitura em uma absorbância de 490 nm. O tempo dedesenvolvimento é de ~12 minutos.
6.1A ELISA de ligação da IL-13 humana
Este ensaio descreve um ELISA que detecta a ligação de umanticorpo à IL-13 humana. Ele é um formato de ELISA de sanduíche e difereapenas levemente daquele descrito no Exemplo 6.1.
6.1A1 Materiais
1. Placa de EIA de 96 reservatórios Costar (Corning Costarcat. n- 3369)
2. IL-13 humana (Peprotech cat. n° 200-13)
3. Anticorpo policlonal IL-13 anti-humana de cabra (R&DSystems, cat. n2 AF-213-NA)
4. HRP de cadeia leve capa anti-humano (Sigma, Cat n°A7164)
5. Tampão de carbonato/bicarbonato (Sigma; cat. ns C-3041)
6. TBST [solução salina tamponada de Tris (6,06 g de Tris +8,06 g de NaCl + 0,2 g de KCl + H2O até 1 litro) + 0,05 % de Tween 20]
7. BSA (Sigma A-7030)
8. OPD (Sigma, Cat. n-P-9187)
9. Ácido sulfurico
6.1A.2 Método
1. A solução de bloqueio é de 3 % de BSA+TBST
2. A solução de lavagem é de TBST
3. Placas de ELISA 'Costar EIA/RIA' cobertas, com 50 ulde anticorpo policlonal de IL-13 anti-humana de cabra de 5 ug/ml (R&DSystems, cat. ns AF-213-NA. Composto em uma concentração de estoque de500 ug/ml de acordo com as instruções dos fabricantes, e armazenado emalíquotas em -20 °C) em tampão de carbonato/bicarbonato (Sigma; cat. n° C-3041, composto segundo instruções dos fabricantes), cobertura com umselador de placa e incubação durante a noite em 4 °C.
4. Bloqueio com 100 ul de 3 % de BSA/TBST incubado natemperatura e pressão ambientes por 1 hora ou o mínimo durante a noite de 4°C.5. Lavar X2 em TBST (pelo menos 200 ul de solução delavagem por reservatório, por lavagem).
6. Adicionar 20 ng por reservatório (em um volume de 50 ul)de IL-13 humana (Peprotech cat. n2 200-13. Composto em uma concentraçãode estoque de 100 ng/ul de acordo com as instruções dos fabricantes, earmazenado em alíquotas em -20 °C) diluir em solução de bloqueio e incubarna temperatura ambiente por 1 hora.
7. Lavar X2 em TBST.
8. Adicionar 50 ul de amostra de anticorpo (titular fora parase obter os dados do título de ponto final, se necessário) em solução debloqueio, incubar na temperatura e pressão ambientes por 1 hora.
9. Lavar X2 em TBST.
10. Quanto ao anticorpo quimético 3G4 ou anticorpohumanizado, detectar a ligação com o uso de 50 ul por reservatório de HRP decadeia leve capa anti-humana (Sigma, Cat no A-7164) em uma diluição a 1/2000em solução de bloqueio por 1 hora na temperatura e pressão ambientes.
11. Lavar X2 em TB ST.
12. Desenvolver com 100 ul de OPD (Sigma, Cat. na P-9187.Composto conforme as instruções dos fabricantes), interromper com 50 ul deH2SO4 3M, leitura em uma absorbância de 490 nm.
6.1B ELISA de ligação à IL-13 humana nativa
Este ensaio descreve um ELISA que detecta a ligação de umanticorpo à IL-13 humana nativa. Ele é de um formato de ELISA de sanduíche.
6.1B.1 Materiais
1. Imunoplaca 1 Nunc Maxisorp F96 (Life Technologies, A-39454A)
2. IL-13 humana NATIVA (sobrenadante de células HDLM-2)
3. Anticorpo de IL13 anti-humano (Pharmingen, Cat. ns554570)
4. Anticorpo de IL13 anti-humana biotinilado (Pharmingen,Cat. nfi 555054)
5. Estreptavidina-HRP (Sigma cat n2 E2886)
6. Tampão de carbonato/bicarbonato (Sigma; cat. n2 C-3041)
7. RPMI + 20 % de FBS+glutamina 2 mM
8. PBST (PBS + 0,05 % de Tween 20)
9. BSA (Sigma A-7030)
10. OPD (Sigma, Cat. nfi P-9187)
11. Ácido sulfurico
6.1B.2 Método
1. A solução de bloqueio é de 1 % de BSA em PBST
2. A solução de lavagem é de PBST
3. Placas de ELISA 'Nunc Maxisorp' cobertas, com 50 ul deanticorpo quimérico ou humanizado 3G4 de 5 ug/ml (Pharmigen, cat. n2554570) diluição em tampão de carbonato/bicarbonato, cobertura com umselador de placa e incubação durante a noite em 4 °C.
4. Bloqueio com 200 ul de 1 % de BSA/PBST incubado natemperatura ambiente por 1 hora
5. Lavar com 200 ul de BSA/PBST, incubação natemperatura ambiente por 1 hora.
6. Adicionar 50 ul de IL-13 nativa presente em amostra desobrenadante de HDLM2 (separação por titulação) diluição em RPMI + 20 %de FBS + solução de glutamina a 2 mM, incubação na temperatura e pressãoambientes por 1 hora.
7. Lavar X3 em PBST.
8. Adicionar 50 ul por reservatório de 1 ug/ml de IL-13 anti-humana biotinilada (Pharmigen, Cat. n° 555054) diluição em PBST + 1 % deB SA, incubação na temperatura e pressão ambientes por 1 hora.9.Lavar X3 em PBST.
10.Adicionar 50 ul por reservatório do conjugado deestreptavidina-HRP em diluição a 1/1000, diluir em PBST + 1 % de BSA,incubar por 1 hora na temperatura ambiente.
11.Lavar X3 em TB ST.
12.Desenvolver com 100 ul de OPD (Sigma, Cat. n° P-9187.Composto conforme as instruções dos fabricantes), interromper com 50 ul porreservatório de H2SO4 3M, leitura em uma absorbância de 490 nm.6.2. Bioensaio de neutralização de IL-13 (Ensaio de proliferação decélulas TF-1)
Este é um bioensaio da IL-13 que pode ser usado paradeterminar a capacidade de neutralização de um anticorpo anti-IL-13, Ométodo descrito abaixo utiliza IL-13 recombinante humana ou de cinomolgos.A IL-13 humana expressa em mamíferos ou a variante de IL-13 humana Q130podem igualmente ser usadas neste ensaio também.
6.2.1 Materiais
1. Linhagem de células TF-I (a linhagem de células TF-Iinternamente obtida, NB, disponível na versão da ATCC)
2. Placas de cultura tecidual de 96 reservatórios (Invitrogen)
3. IL-13 humana (Cambridge Bioscience, cat. n° CHl-013)
4. Ensaio de proliferação de células não-radioativas CellTiter96 (Promega, Cat. nfi G4000)
6.2.2 Método
1. Método para medir a capacidade de um mAb de IL-13anti-humana para neutralizar a bioatividade da IL-13 recombinante humanaou de cinomolgos em um bioensaio de células TF-1.
2. Este ensaio é realizado em placas de cultura de tecidosestéreis de 96 reservatórios (Invitrogen), sob condições estéreis. Todos ostestes são realizados em triplicata.3. Pré-incubar 10 ng/ml de IL-13 humana (CambridgeBioscience, cat. n° CH1-013. Compor em uma concentração de estoque de100 ng/ul de acordo com instruções dos fabricantes, usando técnica estéril emuma coifa de cultura de tecidos de classe 2, armazenar em pequenas alíquotasem -20 °C) ou 10 ng/ml de IL-13 de cinomolgos (gerados em GSK) comvárias diluições do mAb de IL-13 anti-humana (diluído de 6 ug/ml emdiluições de 3 vezes até 0,025 ug/ml) em um volume total de 50 ul por 1 horaem 37 °C. Serão também incluídos reservatórios de controle positivo, tendoIL-13 presente, porém nenhum mAb de IL-13 anti-humana. Além disso, osreservatórios de controle negativo não terão nenhuma IL-13 e nenhum mAbde IL-13 anti-humana presente. Usar uma placa de 96 reservatórios de fundoredondo, estéril, de fraca ligação proteica, para esta pré-incubação (observarque a concentração da IL-13 e do mAb de IL-13 anti-humana será repartidaigualmente em um estágio posterior quando as células forem adicionadas).
4. Plaquear 50 ul de células TF-I em 2 χ IO5 por mililitro emuma placa de cultura tecidual de 96 reservatórios estéreis. Após 1 hora de pré-incubação, adicionar a IL-13 e a amostra de mAb de IL-13 anti-humana àscélulas. O volume do ensaio final de 100 ul, contendo várias diluições demAb de IL-13 anti-humana, IL-13 recombinante e células TF-1, é incubadoem 37 0C por -70 horas em uma incubadora de CO2 umedecida.
5. Em ~66 horas, esquadrinhar os reservatórios paraconfirmar que eles sejam estéreis e que nenhuma contaminação bacterianatenha ocorrido.
6. Adicionar 15 ul de substrato esterilizado em filtro porreservatório (Cat. n2 G4000, Promega. Composto conforme instruções dosfabricantes) pelas 4 horas de incubação finais.
7. Interromper a reação com 100 ul de solução de interrupção(fornecida no kit de MTT) para solubilizar o produto formazan azulmetabolizado. Deixar por pelo menos 2 horas, depois pipetar para cima e parabaixo para ajudar a dissolver os cristais. Alternativamente, cobrir com umselador de placas e deixar em 4 0C durante a noite, depois pipetar para cima epara baixo no dia seguinte (isto é mais fácil em termos de pipetagem).
8. Ler a absorbância da solução em cada reservatório em umaleitora de placas de 96 reservatórios em comprimento de onda de 570 nm.
9. A capacidade do mAb de IL-13 anti-humana paraneutralizar a bioatividade da IL-13 humana ou de cinomolgos, é expressacomo essa concentração do mAb da IL-13 anti-humana requerida paraneutralizar a bioatividade de uma quantidade definida de IL-13 humana ou decinomolgo (5 ng/ml) em 50 % (= ND50). Quanto menor a concentraçãorequerida, mais potente a capacidade de neutralização.
6.2.A Bioensaio de neutralização da IL-13 (Ensaio de proliferação decélulas TF-1)
Este é um bioensaio de IL-13 que pode ser usado paradeterminar a capacidade de neutralização de um anticorpo anti-IL-13. Ométodo descrito abaixo usa IL-13 recombinante humana e de cinomolgo. AIL-13 humana expressa em mamíferos ou a variante da IL-13 humana Q130igualmente podem ser usadas também neste ensaio. Observe-se que estemétodo difere apenas levemente daquele descrito no Exemplo 6.2.
6.2 .A. 1 Materiais
1. Linhagem de células TF-I (Linhagem de células TF-Iobtidas internamente, NB5 disponível na versão da ATCC)
2. Placas de cultura tecidual de 96 reservatórios (CorningCostar, cat. nfi 3596).
3. IL-13 humana (Peprotech, cat. n2 200-13)
4. IL-13 humana (expressa em células CHO) geradas emGSK.
5. Variante Q130 de IL-13 humana (Peprotech, cat. na 200-13 A)6. IL-13 de cinomolgo (gerada na GSK).
7. IL-13 anti-humana policlonal (R&D Systems AF-213-NA)
8. Placas de cultura tecidual de 96 reservatórios (Corning Costar, cat. n2 3790).
9. Ensaio de proliferação de células não radioativas CellTiter96 (Promega, Cat. n2 G4000)6.2.A.2 Método
1. Método para medir a capacidade de um mAb de IL-13anti-humana para neutralizar a bioatividade da IL-13 recombinante humana ede cinomolgo em um bioensaio de células TF-1.
2. Este ensaio é realizado em placas de cultura de tecidos de96 reservatórios estéreis (Corning Costar, cat. n2 3596), sob condiçõesestéreis. Todos os testes são realizados em triplicata.
3. Pré-incubar 10 ng/ml de IL-13 humana (Peprotech, cat. n2200-13), ou 10 ng/ml de IL13 humana expressa em CHO (gerada na GSK) ou60 ng/ml de variante Q130 de IL13 humana (Peprotech, cat. n2 200-13A), ou10 ng/ml de IL-13 de cinomolgo (gerada na GSK) compor Ab comercial emuma concentração de estoque de acordo com instruções dos fabricantescom o uso de técnica estéril em uma coifa de cultura de tecidos de classe2, armazenar em pequenas alíquotas em -20 °C. Com várias diluições domAb de IL-13 anti-humana (diluída de 6 ug/ml ou 2 ug/ml ou 189 ug/mlem diluições triplas abaixo de 0,025 ug/ml ou 0,008 ug/ml ou 0,74 ug/ml,respectivamente) em um volume total de 50 ul por 1 hora em 37 °C.Também incluídos serão os reservatórios de controle positivo, tendo IL-13 presente, porém nenhum mAb de IL-13 anti-humana. Além disso, osreservatórios de controle negativo não terão nenhuma IL-13 enenhum mAb de IL-13 anti-humana presente. Usar uma placa de 96reservatórios de fundo redondo, de baixa ligação proteica, estéril, paraesta pré-incubação (Corning Costar, cat. n2 3790). (Observe-se que aconcentração da IL-13 e do mAb de IL-13 anti-humana será dividida empartes iguais em um estágio posterior quando as células foremadicionadas).
4. Plaquear 50 ul de células TF-I a 2 χ IO5 por mililitro, emuma placa de cultura de tecidos estéril de 96 reservatórios (Corning Costar,cat. n° 3596). Após a pré-incubação de 1 hora, adicionar a IL-13 e a amostrade mAb de IL-13 anti-humana às células. O volume final do ensaio de 100 ul,contendo várias diluições de mAb da IL-13 anti-humana, IL-13 recombinantee células TF-1, é incubado em 37 0C por 3 dias em uma incubadora de CO2umedecida.
5. Esquadrinhar os reservatórios para confirmar que eles sãoestéreis e que nenhuma contaminação bacteriana tenha ocorrido.
6. Adicionar 15 ul de substrato de MTT por reservatório(Cat. n2 G4000, Promega) para as 4 horas finais de incubação.
7. Interromper a reação com 100 ul de solução de interrupção(fornecidos no kit da MTT) para solubilizar o produto formazan azulmetabolizado. Deixar por pelo menos 2 horas na temperatura ambiente,depois sacudir as placas no agitador de placas por ~30 minutos.
Alternativamente, cobrir com um selador de placas e deixar em 4 0C durante anoite, depois sacudir as placas no agitador de placas por ~30 minutos. Ler aabsorbância da solução em cada reservatório em uma leitora de placas de 96reservatórios em comprimento de onda de 570 nm.
8. A capacidade do mAb de IL-13 anti-humana paraneutralizar a bioatividade da IL-13 humana ou de cinomolgos, é expressacomo essa concentração do mAb da IL-13 anti-humana requerida paraneutralizar a bioatividade de uma quantidade definida de IL-13 humana ou decinomolgo em 50 % (= ND50). Quanto menor a concentração requerida, maispotente a capacidade de neutralização.
6.3. ELISA de mapeamento bruto do epítopoEste ensaio descreve um ELISA que detecta a ligação de 3G4de mAb de camundongo aos peptídeos de IL-13 humana ou de cinomolgos.
6.3.1 Materiais
1. Imunoplaca 1 Nunc Maxisorp F96 (Life Technologies, 4-39454A)
Tween 20)
2. Estreptavidina ImmunoPure® (Pierce, cat. n2 21125)
3. PBST (solução salina tamponada de fosfato + 0,05 % de
4. BSA (Sigma A-7030)
5. Peptídeos 16-mero de IL-13 humanos e de cinomolgos,deslocamento = 4 (pedidos por encomenda da Mimotopes)
6. Peptídeos 20-mero de controle positivo e negativo(fornecidos por encomenda da Mimotopes)
7. mAb de camundongo 3G4
8. Ab de controle (Fornecido mediante pedido de encomendada Mimotopes)
9. Ig HRP conjugado anticamundongo de coelho (DAKO,código η- P0260)
10. OPD (Sigma, Cat. η2 P-9187)
11. Ácido sulfurico 3M
6.3.2 Método
1. A solução de bloqueio é de 3% de BSA+PBST.
2. A solução de lavagem é PBST.
3. Cobrir as placas ELISA 'Nunc Maxisorp' com 100 μΐ de 5μg/ml de Estreptavidina ImmunoPure® (Pierce, cat. ne 21125 composto emuma concentração de estoque de 1 mg/ml de acordo com as instruções dosfabricantes, e armazenado em alíquotas a +4 °C) usando PBST como umdiluente. Incubar durante a noite em 37 0C para permitir que a solução seque.
4. Bloquear com 200 μΐ de 3 % de BSA/PBST. Adicionarselador de placa e incubar em temperatura e pressão ambientes por 1 hora.
5. Lavar X3 em PBST (pelo menos 200 μΐ de solução delavagem por reservatório, por lavagem).
6. Em duplicata e usando PBST como diluente, adicionar 100μl por reservatório (exceto os reservatórios de controle) de diluições de 1.000vezes de cada peptídeo (dissolvidos conforme instruções dos fabricantes em200 μΐ, 40 % de Acetonitrila, 60 % de água, depois divididos em alíquotas emdiluições de 10 vezes no mesmo solvente e armazenados em -20 °C.
7. Nos reservatórios de controle, em duplicata e com o uso dePBST como um diluente, adicionar 100 μΐ por reservatório de diluições de 10vezes dos peptídeos de controle (dissolvidos conforme instruções dosfabricantes em 1 ml, 40 % de Acetonitrila, 60 % de água, e armazenados em -20 °C). Adicionar selador de placas e incubar na temperatura e pressãoambientes por 1 hora sobre uma mesa vibratória.
8. Lavar X3 em PBST (pelo menos 200 μΐ de solução delavagem por reservatório por lavagem).
9. Adicionar 100 μΐ por reservatório (exceto os reservatóriosde controle) de 1,506 μ£/ηι1 de mAb de camundongo em PBST.
10. Adicionar 100 μΐ por reservatório aos reservatórios decontrole apenas, diluições de 4, 16 e 32 vezes do anticorpo de controle (usadocomo fornecido pelo fabricante e armazenado em -20 °C) com o uso de PBSTcomo um diluente. Adicionar selador de placas e incubas na temperatura epressão ambientes por 1 hora sobre uma mesa vibratória.
11. Lavar X3 em PBST (pelo menos 200 μΐ de solução delavagem por reservatório por lavagem).
12. Adicionar 100 μΐ por reservatório de diluição de 2.000vezes de conjugado de Ig HRP anticamundongo de coelho (DAKO, código n2P0260 como fornecido, armazenado em +4 0C) usando PBST como umdiluente. Acrescentar selador de placas e incubar na temperatura e pressãoambiente por 1 hora sobre uma mesa vibratória.
13. Lavar X3 em PBST (pelo menos 200 μΐ de solução delavagem por lavagem).
14. Desenvolver com 100 μΐ de OPD (Sigma, Cat. n° P-9187.Composto conforme instruções dos fabricantes), interrupção com 50 μΐ deH2SO4 3M, leitura em uma absorbância de 490 nm. Tempo dedesenvolvimento de —10 minutos.
6.4. ELISA de mapeamento fino de epítopo
Este ensaio descreve um ELISA que detecta a ligação de 3G4de mAb a peptídeos de IL-13 humana e de cinomolgos.
6.4.1 Materiais
1. Imunoplaca 1 Nunc Maxisorp F96 (Life Technologies, 4-39454A)
2. Estreptavidina ImmunoPure® (Pierce, cat. n° 21125)
3. PBST (solução salina tamponada de fosfato + 0,05 % deTween 20)
4. BSA (Sigma A-7030)
5. Peptídeos puros de janela parcial de IL-13 humana e decinomolgos (13-mero truncado por um aminoácido em um tempo tanto daextremidade N- quando C-terminal; (pedidos por encomenda da Mimotopes)
6. Peptídeos 16-mero de controle positivo (fornecidos porprévia encomenda da Mimotopes)
7. mAb de 3G4 (produzido interiormente)
8. Anticorpo conjugado a HRP de IgG (específico de Fc)anticamundongo de cabra (Sigma, Cat. n~ P-9187)
9. OPD (Sigma, Cat. na P-9187)
10. Acido sulfurico 3M
6.4.2 Método
1. A solução de bloqueio é de 3% de BSA+PBST.2. A solução de lavagem é PBST.
3. Cobrir as placas ELISA 'Nunc Maxisorp' com 100 μΐ de 5μ§/ιη1 de Estreptavidina ImmunoPure® (Pierce, cat. n2 21125 composto emuma concentração de estoque de 1 mg/ml de acordo com as instruções dosfabricantes, e armazenado em +4 °C). Incubar durante a noite em +37 °C.
4. Bloquear com 200 μΐ de 3 % de BSA/PBST. Adicionarselador de placas e incubar durante a noite em +4 °C.
5. Lavar X3 em PBST (pelo menos 200 μΐ de solução delavagem por reservatório, por lavagem).
6. Em duplicata e usando 3 % de BSA em PBST comodiluente, adicionar 100 μΐ por reservatório de diluições de 1.000 vezes decada peptídeo (dissolvidos conforme instruções dos fabricantes em 200 μΐ de40 % de Acetonitrila, 60 % de água, e armazenados em -20 °C). Adicionarselador de placas e incubar na temperatura ambiente por 1 hora sobre mesavibratória.
7. Lavar X3 em PBST (pelo menos 200 μΐ de solução delavagem por reservatório por lavagem).
8. Adicionar 100 μΐ por reservatório de 3 μg/ml de 3G4diluído em BSA a 3 % em PBST.
9. Lavar X3 em PBST (pelo menos 200 μΐ de solução delavagem por reservatório por lavagem).
10. Adicionar 100 μΐ por reservatório de diluição de 1.000vezes de anticorpo conjugado de Ig HRP anticamundongo de cabra (Sigma A-9309 usado como fornecido, armazenado em +4 °C) com o uso de BSA a 3 %em PBST como um diluente. Acrescentar selador de placas e incubar natemperatura ambiente por 1 hora sobre uma mesa vibratória.
11. Lavar X3 em PBST (pelo menos 200 μΐ de solução delavagem por reservatório por lavagem).
12. Desenvolver com 100 μΐ de OPD (Sigma, Cat. n° P-9187.Composto conforme instruções dos fabricantes), interromper com 50 μΐ deH2SO4 3M, ler em uma absorbância de 490 nm. O tempo de desenvolvimentoé de -10 minutos.
6.5 ELISA de ligação da IL-13 humana à cadeia IL13Ral humana
Este ELISA determina se um anticorpo pode inibir a ligaçãoda IL-13 humana à cadeia IL13 Ral humana.
6.5.1 Materiais
1. Imunoplaca 1 Nunc Maxisorp F96 (Life Technologies, 4-
39454A)
2. IL13Ra 1 -Fc humana (R&D Systems, cat. n° 146-IR)
3. IL-13 humana (produzido internamente)
4. IL-13 anti-humana biotinilada (R&D Systems, cat. n°
BAF213)
5. Streptavidina-HRP (Sigma, cat. n° E2886)
6. Tampão de Carbonato/bicarbonato (Sigma, cat. n° C-3041)
7. TBST [solução salina tamponada com Tris (6,06 g de Tris+ 8,06 g de NaCl + 0,2 g de KCl + H2O até 1 litro) + 0,05 % de Tween 20]
8. BSA (Sigma A-7030)
9. OPD (Sigma, Cat. n° P-9187)
10. Acido sulfurico
6.5.2 Método
1. A solução de bloqueio é 3 % BSA + TBST
2. A solução de lavagem é TBST
3. Cobrir as placas ELISA 'Nunc Maxisorp' com 50 ul de 5ng/ul de IL- 13Ra I-Fc humana em tampão de carbonato/bicarbonato. Cobrircom um selador de placas e incubar durante a noite em 4 °C.
4. Bloquear com 100 ul de 3 % de BSA/TBST e incubar natemperatura e pressão ambiente por 1 hora.
5. Lavar X3 TBST (pelo menos 200 ul de solução delavagem por reservatório por lavagem).
6. Em um volume total de 50 ul, pré-incubar 0,4 ng/ul de IL-13 humana com amostra de anticorpo (titulada) em solução de bloqueio por30 minutos. Adicionar a amostra pré-incubada à placa de ELISA revestidacom o receptor e incubar na temperatura ambiente por 1 hora.
7. Lavar x3 em TBST
8. Detectar qualquer IL-13 humana ligada usando 50 ul porreservatório de IL-13 anti-humana biotinilada diluída em 1 ug/ml. Incubar por1 hora na temperatura ambiente.
9. Lavar x3 em TBST
10. Adicionar 50 ul por reservatório de conjugado deestreptavidina-HRP em diluição de 1/1000. Incubarpor 1 hora na temperaturaambiente.
11. Lavar x3 em TBST
12. Desenvolver com 100 ul por reservatório de OPD (Sigma,Cat. n° P-9187. Compor conforme instruções dos fabricantes), interrompercom 50 ul por reservatório de H2SO4 3M, ler em uma absorbância de 490 nm.
6.6 ELISA ligação de IL-13 humana à cadeia IL13Ral humana
Este ELISA determina se um anticorpo pode inibir a ligaçãoda IL-13 humana à cadeia IL13Rα2 humana.
6.6.1 Materiais
1. Imunoplaca 1 Nunc Maxisorp F96 (Life Technologies, 4-39454A)
2. IL13Rα2-Fc humana (R&D Systems, cat. n° 614-IR)
3. IL-13 humana (gerada na GSK)
4. IL-13 anti-humana biotinilada (R&D Systems, cat. n°_BAF213)
5. Streptavidina-HRP
6. Tampão de Carbonato/bicarbonato (Sigma, cat. n2 C-3041)7.TBST [solução salina tamponada com Tris (6,06 g de Tris+ 8,06 g de NaCl + 0,2 g de KCl + H2O até 1 litro) + 0,05 % de Tween 20]
8.BSA (Sigma A-7030)
9.OPD (Sigma, Cat. η2 P-9187)10. Acido sulfurico
6.6.2 Método
1.A solução de bloqueio é 3 % BSA + TBST
2.A solução de lavagem é TBST
3.Cobrir as placas ELISA 'Nunc Maxisorp' com 50 ul de 5ng/ul de IL-13Roc2-Fc humana em tampão de carbonato/bicarbonato. Cobrircom um selador de placas e incubar durante a noite em 4 °C.
4.Bloquear com 100 ul de 3 % de BSA/TBST e incubar natemperatura e pressão ambiente por 1 hora.
5.Lavar X3 TBST (pelo menos 200 ul de solução delavagem por reservatório por lavagem).
6.Em um volume total de 50 ul, pré-incubar 0,01 ng/ul deIL-13 humana com amostra de anticorpo (titulada) em solução de bloqueiopor 60 minutos. Adicionar a amostra pré-incubada à placa de ELISA revestidacom o receptor e incubar na temperatura ambiente por 1 hora.
7.Lavar x3 em TBST
8.Detectar qualquer IL-13 humana ligada usando 50 ul porreservatório de IL-13 anti-humana biotinilada diluída em 0,5 ug/ml. Incubarpor 1 hora na temperatura ambiente.
9.Lavar x3 em TBST
10.Adicionar 50 ul por reservatório de conjugado deestreptavidina-HRP em diluição de 1/1000. Incubar por 1 hora na temperaturaambiente.
11.Lavar x3 em TBST
12.Desenvolver com 100 ul por reservatório de OPD (Sigma,Cat. η- Ρ-9187. Compor conforme instruções dos fabricantes), interrompercom 50 ul por reservatório de H2SO4 3M, ler em uma absorbância de 490 nm.
O tempo de desenvolvimento é de ~2 minutos.__ >
6.7 ELISA de ligação A IL-4 humana
Este ensaio descreve um ELISA que detecta a ligação de umanticorpo à IL-4 humana. Ele é de um formato de ELISA de sanduíche.
6.7.1 Materiais
12. Imunoplaca 1 Nunc Maxisorp F96 (Life Technologies, 4-39454A)
13. IL-4 humana (R&D Systems, cat. na 204IL)
14. Anticorpo policlonal de IL-4 anti-humana de cabra (R&DSystems, cat. ns AF204-NA)
15. Anticorpo de IL-4 anti-humana de rato, biotinilado (R&DSystems, cat. n2 BAF204)
16. IgG-HRP anticamundongo (Dako, Cat. n2 P0260)
17. HRP de cadeia leve capa anti-humano (Sigma A7164)
18. Estreptavidina-HRP (Sigma cat. n2 E2886)
19. Tampão de carbonato/bicarbonato (Sigma, cat. n2 C-3041)
20. TBST [solução salina tamponada de Tris (6,06 g de Tris +8,06 g de NaCl + 0,2 g de KCl + H2O até 1 litro) + 0,05 % de Tween 20]
21. BSA (Sigma A-7030)
22. OPD (Sigma, Cat. n2 P-9187)
23. Acido sulfurico
6.7.2 Método
13. A solução de bloqueio é 3 % BSA em TBST
14. A solução de lavagem é TBST
15. Cobrir as placas ELISA 'Nunc Maxisorp' com 50 ul de 5ug/ml de anticorpo policlonal de IL-4 anti-humana de cabra (R&D Systems,cat. n2 AF-204-NA. Composto em uma concentração de estoque de 500 ug/mlde acordo com as instruções dos fabricantes, e armazenado em alíquotas em~20 °C) em tampão de carbonato/bicarbonato (Sigma, cat. ns C-3041,produzido conforme instruções dos fabricantes). Cobrir com um selador deplacas e incubar durante a noite em 4 °C.
16. Bloquear com 100 ul de 3 % de BSA/TBST e incubar natemperatura e pressão ambiente (rtp) por 1 hora.
17. Lavar X3 em TBST (pelo menos 200 ul de solução delavagem por reservatório por lavagem).
18. Adicionar 1 ng/ml (em um volume de 50 ul) de IL-4humana em solução de bloqueio, e incubar na temperatura ambiente por 1hora.
19. Lavar x3 em TBST
20. Adicionar 50 ul de amostra de anticorpo (separados portitulação para se obter os dados de titulação de ponto final, se necessário) emsolução de bloqueio, incubar na temperatura e pressão ambiente por 1 hora.Como um controle positivo para ligação à IL-4 humana, usar um anticorpomonoclonal de IL-4 anti-humana biotinilada (separada por titulação).
21. Lavar x3 em TBST
22. Quanto ao anticorpo monoclonal de camundongo 3G4,detectar a ligação com o uso de 50 ul por reservatório de IgG-HRPanticamundongo (Dako, cat. η2 P0260) em uma diluição de 1/2000 emsolução de bloqueio por 1 hora na temperatura e pressão ambiente. Quanto aoanticorpo quimérico 3G4 ou anticorpo humanizado, detectar a ligação usando50 ul por reservatório de HRP de cadeia leve capa anti-humano (Sigma, Cat.nfi Sigma A7164) em uma diluição a 1/2000 em solução de bloqueio por 1hora na temperatura e pressão ambiente. Quanto ao anticorpo monoclonal deIL-4 anti-humana de rato biotinilada de controle positivo, detectar com o usode um anticorpo de conjugado de estreptavidina-HRP (Sigma cat. n° E2886)em diluição de 1/1000 na solução de bloqueio por 1 hora na temperatura epressão ambiente.
23.Lavar X3 em TBST.
24.Desenvolver com 100 ul de OPD (Sigma, Cat. n2 P-9187.Composto conforme instruções dos fabricantes), interromper com 50 ul porreservatório de H2SO4 3M, ler em uma absorbância de 490 nm.
6.8 ELISA de ligação A IL-5 humana
Este ensaio descreve um ELISA que detecta a ligação de umanticorpo à IL-5 humana; ele é um formato de ELISA de sanduíche.
6.8.1 Materiais
24.Imunoplaca 1 Nunc Maxisorp F96 (Life Technologies, 4-
39454A)
25.IL-5 humana (R&D Systems, cat. n2 205IL)
26.Anticorpo policlonal de IL-5 anti-humana (R&D Systems,cat. n2 AF-205-NA)
27.Mepolizumab de IL-5 anti-humana (na graduação químicainterna)
28.IgG-HRP anticamundongo (Dako, Cat. η2 P0260)
29.HRP de cadeia leve capa anti-humano (Sigma A7164)
30.Tampão de carbonato/bicarbonato (Sigma, cat. n2 C-3041)
31. TBST [solução salina tamponada de Tris (6,06 g de Tris +8,06 g de NaCl + 0,2 g de KCl + H2O até 1 litro) + 0,05 % de Tween 20]
32.BSA (Sigma A-7030)
33.OPD (Sigma, Cat. n2 P-9187)
34.Acido sulfurico
6.8.2 Método
25.A solução de bloqueio é 3 % BSA em TBST
26.A solução de lavagem é TPBST
27.Cobrir as placas ELISA 'Nunc Maxisorp' com 50 ul de 5ug/ml de anticorpo policlonal de IL-4 anti-humana de cabra (R&D Systems,cat. η° AF-205-NA. Composto em uma concentração de estoque de 500 ug/mlde acordo com as instruções dos fabricantes, e armazenado em alíquotas em~20 °C) em tampão de carbonato/bicarbonato (Sigma, cat. n° C-3041,produzido conforme instruções dos fabricantes). Cobrir com um selador deplacas e incubar durante a noite em 4 °C.
28. Bloquear com 100 ul de 3 % de BSA/TBST e incubar natemperatura e pressão ambiente (rtp) por 1 hora.
29. Lavar X3 em TBST (pelo menos 200 ul de solução delavagem por reservatório por lavagem).
30. Adicionar 100 ng/ml (em um volume de 50 ul) de IL-5humana (R&D Systems, cat. n° 205IL) em solução de bloqueio, e incubar natemperatura ambiente por 1 hora.
31. Lavar X3 em TBST
32. Adicionar 50 ul de amostra de anticorpo (separados portitulação para se obter os dados de titulação de ponto final, se necessário) emsolução de bloqueio, incubar na temperatura e pressão ambiente por 1 hora.Como um controle positivo para ligação à IL-5 humana, usar um anticorpoMepolizumab de IL-5 anti-humana (separada por titulação).
33. Lavar X3 em TBST.
34. Quanto ao anticorpo monoclonal de camundongo 3G4,detectar a ligação com o uso de 50 ul por reservatório de IgG-HRPanticamundongo (Dako, cat. n° P0260) em uma diluição de 1/2000 emsolução de bloqueio por 1 hora na temperatura e pressão ambiente. Quanto aoanticorpo quimérico 3G4 ou anticorpo humanizado e Mepolizumab de IL5,detectar a ligação usando 50 ul por reservatório de HRP de cadeia leve capaanti-humano (Sigma, Cat. n° Sigma A7164) em uma diluição a 1/2000 emsolução de bloqueio por 1 hora na temperatura e pressão ambiente.
35. Lavar X3 em TBST.
36. Desenvolver com 100 ul de OPD (Sigma, Cat. na P-9187.Composto conforme instruções dos fabricantes), interromper com 50 ul deH2SO4 3M, ler em uma absorbância de 490 nm.
6.9 ELISA de ligação de GM-CSF humano
Este ensaio descreve um ELISA que detecta a ligação de umanticorpo a GM-CSF humano. Ele é um formato de ELISA de ligação direta.
6.9.1 Materiais
35. Imunoplaca 1 Nunc Maxisorp F96 (Life Technologies, 4-39454A)
36. GM-CSF humana (graduação clínica interna)
37. Anticorpo monoclonal de GM-CSF anti-humana (R&DSystems, cat. η2 MAB-215)
38. IgG-HRP anticamundongo (Dako, Cat. ns P0260)
39. HRP de cadeia leve capa anti-humano (Sigma A7164)
40. Tampão de carbonato/bicarbonato (Sigma, cat. n2 C-3041)
41. PBST [PBS + 0,05 % de Tween 20)
42. BSA (Sigma A-7030)
43. OPD (Sigma, Cat. η2 P-9187)
44. Ácido sulfürico6.9.2 Método
37. A solução de bloqueio é 3 % BSA em PBST
38. A solução de lavagem é PBST
39. Cobrir as placas ELISA 'Nunc Maxisorp' com 50 ul de 2ug/ml de diluição de GM-CSF humano em PBS, cobrir com um selador deplacas e incubar durante a noite em 4 °C.
40. Bloquear com 200 ul de 3 % de BSA/PBST e incubar natemperatura e pressão ambiente (rtp) por 1 hora.
41. Lavar X3 emPBST.
42. Adicionar 50 ul de amostra de anticorpo (separar portitulação para se obter os dados do título de ponto final) em solução debloqueio, e incubar na temperatura e pressão ambiente por 1 hora. Como umcontrole positivo para ligação a IL-GM-CSF humano, usar anticorpo de GM-CSF anti-humano (R&D Systems, cat. n° MAB215) (separado por titulação).
43. Lavar X3 em PBST.
44. Quanto ao anticorpo monoclonal de camundongo anti-GMCSF, detectar a ligação usando 50 ul por reservatório de IgG-HRPanticamundongo (Dako, cat. na P0260) em uma diluição a 1/2000 emsolução de bloqueio por 1 hora na temperatura e pressão ambiente.Quanto ao anticorpo quimérico 3G4 ou anticorpo humanizado, detectar aligação usando 50 ul por reservatório de HRP de cadeia leve capa anti-humano (Sigma, Cat. n° Sigma A7164) em uma diluição a 1/2000 emsolução de bloqueio por 1 hora na temperatura e pressão ambiente.
45. Lavar X3 em PBST.
46. Desenvolver com 100 ul de OPD (Sigma, Cat. n° P-9187.Composto conforme instruções dos fabricantes), interromper com 50 ul deH2SO4 3M, ler em uma absorbância de 490 nm.
Tabela 13
<table>table see original document page 125</column></row><table><table>table see original document page 126</column></row><table>
Nota: A seqüência proteica ou de polinucleotídeo de DNA nas SEQ ID NOs: 11 a 24 e 27 a40 (inclusive) também inclui a seqüência de sinal.SEQ.I.P.NO IDYEIH
SlQ-I.D.HO 2
AIDPETGGTAYNQKFKG
SEQ.I.D.NO 3
I LLYYYiPMD Y
ssq,i.d.no 4
RASQWISDYLH
SEQ.I.D,NO 5
YASQSIS
SEQ-1-D.NO <5
QNGRSFPLT
SEQ.I.D.NO 7
QVQLQQ S GADLVH PGASV7LSCKAS GYT FIDYEI HViM KQT PVHGLEWIGAIDPETGGTAYNQKFKGKAILTADKS S S TAYMELRS LTS EDSAVY yctri LlfYYYPMDYWGQGTSVTVS S
SEQ.I.D-NQ 8
Divmtqspatlsvtpgdrvslscrasqnisdylhmyqqkshesprllikyasqsxsgipsrpsgsgsgsdftlsiüsvbpsdvgvyycqnishsfpltlgagtklelk
SEQ I. D.MO:9
GP'VPPSTALRELIEELVNITQNQKAPLCNGSMVWSI RLTAGfiYCAALESL 1NVSGCS AIEKTQRMLSGFCPHKVSAGQF SS MÍVRDTKIEVAQFVKDLLLHLKKLFREGRFff
SEQ.I.D.NOt10GGCCCTGTGCGTCCCTCTACAGCCCTCAC?<3GAGCTCATTGAGGAGCrTGGTCAACATCACCCA
gaaccagaaggctccgctctgcaatggcagcatggtatggagcatcaacctgacagctggcatgtactgtgcagccctggaatccctgatcaacgtgtcaggctgcagtgccatcgagaagacccagaggatgctgagcc^attctgcccgcacaaggtctcagcxgggcagttttccagcttgca
TGTCCGAGACACC^U^ATCGAGGTGGCCCAGTTTGTAAAGGACCTGCTC-rTAGArTTAAAGAAACTTTTTCGCGAGGGACGGTTCAACTGA
SBQ.I.D.NO 11
mgwsciilflvatatgwisqvqlvqsgaevkkpgasvkvsckasgytfidyeihwvrqapgq
GLEWMGAID PETGGTAYNQKFKGRVTMTTDTSTS TAYMELRSLRS DDT A VY YCARILL YY Y PMDYWGQGTLVTVSS
SBQ-1,P- NO 12
MGW1SC11LPLVATÁTGVHSQVQL VQSQAE VKKPGAS VKVSCXASG YTFIDYBIHWVRQAPGQGl^WMGAIDPSTGGTAYNQKFKGRVTMTTDTSTS TAYMEtAS LRSDDTAVYYCTR ILLYYYP!MDYViGQGTL1V7TVSS
SEQ.I.D.KO 13
Mgwsciilflvatatgvhsqvqlvqsgadvkkpgasvkvsckasgytfidyeihwwqapgq
GLEWMGAI DPETGGTAYNQKf KGRVTMTTDTSTSTAYMELRS LRSDDTAVY YCTRILLYYYPMDYWGQGfLVTVSS
SEQ.I.D.K0 14
Mgwsciilflvatatgvhsqvqlvqsgadvkkpgasvkvsckasgytfidyeihwvrqapgq
GLEWMGAI D PETGGTAYNQKFKGKATLTADKS TSTAYME LRSLRSDDTAVYYCTRILLYYYPMDYWGQGTLVTVSS
SEQ.I.D.WO 15
MGWSCIΪLFLVATATGVHSEIVLTQS PATLSLS PGERATLSCRASQNISDYLHWYQQKFGQA
PrijjIyyasqsisgiparfsgsgsgtoftltisslepedfawycqmghsfpSEQ.I.D.KO 17
MGWS CI IIrFLVATA TG1THSEI VlLTQS PATLSLS PGERATLS CRAS QNIS DYLHWYQQKPGQftPRLLIYYASQSI SGl PARFSGSGS GTD PTLTIMSLEPEDFAW YCQNSHS FPLTLGGGTKVEIK
SEQ.I.D-.NO 18
MGWSC11LF L VATATGVHSQVQLVQS GAEVKXPÇASVKVSCKASGYTFIDYEIHWVRQAPGQGLEWMGAIDPETGGTAYNQKFKGR VTMTTDTSTS TAYiME LRS LRSDDTAVYYCARILL YY YPM^YWGOGTLVTVSSASTKGPSVFPKAPSSKSTSGGTA^^GCLVlODYFPEFTOVSiiNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSS WTVPSSSLGTQTYIGNWKKPSOTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKP KDTL^I SRTPEVTCWTO
KPREEQ YNSTYE VVS VLTVIiHQDWLNGKEYKCKVS WKALPÃPIEKTISKA.KGQPRE PQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPBMMYKTTPPVLDSDGSKSRWQQGNVFSC S VIC^EALHNHYTQKSLS LS PGK
SBQ.I.P.HQ 19
MGW SCIILF L VATATG VMSQ VQL VQSGAE VKKPGASVKVSCKASG YTFIDYEIHV7VRQAPGQGLE WKGAIDPETGGTAYNQKFKGRVTMTTDTSTS TAYME LRS LRSDDTAVTf CTRILLYYYPTOYVIGQGTLVTVSSAST^GPSVFPLAPSSKSTSGGTAAL^CLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYS LSSWT VP S-S SLGTQT YICMVNIIKPSNTKVDKKVE PKS CDK-THTCPPC PAPELLGGPS VFLFP PKP KDTLM Ϊ SRTP E VTCWVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKT
Kpreeqymstyrwsvltvijiqdwlhgkeykckvsnkalpapiektiskakgq^repqvytl
P PSRDELTKNQVSLTCL VKG FYPSDIA VEW E SNGQ PENWYKTTPPVLDSDG S FFLYS KLTVDKSRWQQGNVFS C SVMIfEALHNHYTQKSLS L SPGK
SEQ.I.D.NO 20
MGWSCIILFLVATATGVHSQVQLVQSGADVKXPGASVKVSCKASGYTFIDYEIHí^QAPGQGLEWMGAID-PETGGTAYNQKPKGRVTM^^^
MDYWGGGTLWVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLV^
Gvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvmhkpshtkvdkkvepkscdkthtcp
PCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTL^ISPvTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHKAKTKPREEQ YN ST YR WS VLTVLHQDWLNG KEY KCKVS NKA L PA PIEKTISKAKGQPRE PQVYTLP PSRDELTXMQVS LTCLVKG FYPS DIAVEW S SMGQPEMÍYKTTPP VLDSDGSFFLYS KLTVDKSRWQQGNVFSCSVI^IHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SBQ.I.D.NO 21
MGWS CIILFLVATÂTGVHS QVQL VQS GAD VKKPG-AS VKVSCKASG YTFIDYEIHWVRQAPGQGLÉWNGAIDPETGGTAYWQKFKriRATLTÃDKSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCTRI LLYYYPMDYWG^TLVTVSSASTKGPSVFPI^PSSKSTSGGTAAIiGCLVKDYFPEPVWSWNSGALTSGVHTPPAVLQS SGL YSLSS WTVPS S SLGTQT YICNWHKP SOTKVDKKVE PKS CDKTHTCPPCPAPELLGGP SVFLFPPKPKDTLMIS RTPBVTC WVD VSHEDPE VKFlíWíVDGVBVHNAKTKPREEQYNS TYR WS VLTVLHQDWLNGKEYKC KVSNKALPAPIE KTISKAKGQPREPQVYTLPPSSDELTKNOVSLTCLVKGFyPSDIAVEWESNGOPENWYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ.I.D.NO 22
MGWSC11LFLVATATGVKSEIVLTQSpatls ls PGERATLSCRASQMlSDYLiiWYQQKPGQAPRLL γyyasqs τSGIPARFSGSGSGTDFTLTISS ls PEDFAvyYCQNGHSFPLTFGGGTKVEIkrtvaaps VFIFPPSDEQLKSGTAS wcllunfyprea KVQWKVDNALQSGKSQE SVTEQDSKDSTYS lss TLTLSKADYBKHKVYAcevthqglsS pvtks FNRGEC
SEQD.MO 33
MGWSCIILFLVATATGVKSÉlVLTQS PATLSLS PGERATLSCRASQN1SDYLHWYQQKPGQAPRLLIYYASQS ΓSGlFARFSGSGSGTDFTLTIS SLE PED FAVYYCQNGHSFPLTLGGGTKVEIKETVAAPSVFIFPPSDSGLKSGTASWCLLNiiFYPREAKVGWKVDNALOSGNSGESVTEODSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SBQ.I.D.MO 24
mgws ciilflvatatgvhseivltqs fatlsls pgeratlscrasqnisdylhwyqqkpgqapelliyyasqsisgiparfsgsgsgtd ftlt inslepedfâv^ycqnghsfpltixxkírtkveikrtvaapsvpifppsdeqlksgtasotcijj^f^^
SKDST YSLS S T LTLS KADY E KB KtZY ACEVTHQGL S S P VTKS FMRGECSEQ.I.D.NO 25
CAGGTTCAJiCTGCAGCAGTCTGGGGCTGACCTGGTGAGGCCTGGGGCTTCAGTGACGCTGTC
ctgcaaggcttcgggctacacati-tattgactatgaaatacactggatgaagcagacacctg
tgcatcgcctggajíTGGA1TGGAC-CTATTGATCC1'GAAACTGGTGGTACAGCCTATAATCAGaagttcaagggcaaggccattctgactgcagacaaatcctccxgtacagcctacatggagctccgcagcctgacatctgaggactctgccgtctattactgtacaagaattctcttatattactATCCTATGGACTACTGGGGTCAAGGGACCTCAGTCAC/ÍGTCTCCTCA
seq.i.d.no 26
GACATTGTGATGACTCAGTCTCCAGCCACCCTaTCTGTGACTCCAGGAGATAGAGTCTCTCTTTCCTGCAGGGCCAGCCAGAATATTAGCGACTACTTACACTGGTATCAACAAAAATCACATGAGTCTCCWÍGGCI^CTCATCAAATATGCTTCCCAATCCATCTCTGGGATCCCCTCCAGGTTCAGTGGCAGIXGGATCAGGGTCAGATTTCACTCTCAGTATCAACAGTGTGGAACCTGAAGATGTTGGAGTGTÃTTACTGTClfiAAATGGTCATGGAGCTGAAA
seq< i .d.kio 27
atgggctggagctgcatcatcctgttcctggtggccagcgccaccggcgtgcacagccaggtgcagctggtgcagagcggcgccgaggtga/igaagcccggcgccagcgtgaaggtgagctgca
aggccagcggctacaccttc^tdgactacgagatccactg^tgcgccaggcccccggccag
ggcctggagtggatgggcgccatcgaccccgagaccggcggcaccgcctagaaccagaagrt
caagggccgcgtgaccatgaccaccgacaccagcaccagcaccgcctacatggagctgcgca
gcctgcgcagcgacgacaccgccgtgtactactgcgcccgcatcctgctgtagtactaccccatggactactggggccagggcacactagtcacagrctcctca
seq, i. b,nq 28
atgggctggagctgcatcatcctgttcctggtggccaccgccaccggcgtgcacagccaggtgcagctggtgcagagcggcgccgaggtg.aagaagcccggcgccagcgtgaaggtgagctgca
aggccagcggctacaccttcatcgactacgagatccactgggtgcgccaggcccccggccaggggctggagtggatgggcgccatcgaccccgagaccggcggcaccgcctagaaccagaagttcaagggccgcgtgaccatgaccaccgacaccagcaccagcaccgcctacatggagctgcgcagcctgcgcagcgacgacaccgccgtgtactactgcacccgcatcctgctgtactactaccccatggactactggggccagggcacactagtcacagtctcctca
SEQ.I.D.MO 29
atgggctggagctgcatcatcctgttcctggtggccaccgccaccggcgtgcacagccaggtgcagctggtgcagagcggogccgacgtgaagaagcccggcgccagcgtgaaggtgâgctgca
aggccagcggctacaccttcatcg/dctacgagatccactgggtgcgccaggcccccgggcagggcctggagtggatgggcgccatcgaccccgagaccggcggcagcgccracaaccagaagtt
caagggccgcgtgaccatgaccaccgacaccaggaccagcaccgcctacatggagctgcgcaggctgcgcagcgacgacaccgccgtgtactactgcacccgcatgctgctgtactactaccccatggactactggggccagggcacactagtcacagtctcctca
sbq-i^d,nq 30
atgggctggagctgcatcatcgtgttcctggtggccaccgccaccggcgtgcacagccaggtgcaggtggtgcagagcggcgccgacgtgaagaagcccggcgccagcgtgaaggtgagctgcaaggccagcggctacaccttcatcgactacgagatccactgggtgcgccaggccgccggccaggggctggagtgoatgggcggcatcgaccccgagaccggcggcaccgcctacaaccagaagttcaagggccgcgccaccctgaccgccgacm^gagcaccagcaccgcctacatggagctgcgcagcctgcgcagcgacgacaccgccgtgtactactggacccgcatcgtgctgtactactaggccatggactactggggccagggcacactagtcacagtctcctcaseq.i.d.no 31
atgggctggagctgcatcatcctgttcctggtggccaccgccaccggcgtgcacagcgagatcgtgct-gacccagagccccgccaccctgagcctgagccccggcgagcgcgccaccctgagctgccgcgccagcca<macatcagcgactacctgcactggtaccagcagaagcccggccaggccccccgcct-gctgatctactacgccagccagagcatcagcggcatccccgcccgcttcagcgg
cagcggcagcggcaccgacttaicccrgaccatcagcagcctggagcccgaggacttcgccgtgtactactgccagaacggccacagcttcccccrgaccttcggcggcggcaccaaggtggagatcaag
seq.i.d.no 32
atgggctggagctgcatcatcctgttcctc-gtggccaccc-ccaccggcgtgcacagcgagatcgtgctgacccagagccccgcgaccctgagcctgagccccggcgagcgcgccaccctgagctgccgcgggagccagíacatcagcgactacctgcactggtaccagcagaagcccggccaggcc
ccccgcctgctgatctactacgccagccagagcatcagcggcatccccgcccgcttcagcggcagcggcagcggcaccgacttcaccctgaccatcaggagcctggagcccgaggacttcgccgtgtactactgccagaacgggcacagcttccccctgaccctgggcggcggcaccaaggtggag
atcaag
seq.i.d.no 33
atgggctggagctgcatcatcctgttcctggtggccaccgccaccggcgtgcacagcgagatcgtgctgacccagagccccgccaccctgagcctgagccccggcgagcgcgccaccctgagctgccgcgccaggcagaacatcagcgactacctgcactggtaccaggagaagcccggccaggccccccgcctgctgatctactacgccagccagagcatcagcggcatccccgcccgcttcagcggcagcggcagcggcaccgacttgaccctgaccatcíacagcctggagcccgaggacttcgccgtgtactactgccagaacggccacagcttccccctgaccctgggcggcggcaccaaggtggagatcaag
seq.i.d.no 34
atgggctggagctgcatcatcctgttcctggtggccaccgccaccggcgtgcacagccaggtgcagctggtgcagagcc^^cgccgaggtgaagaagcccggcgccagcgtgaaggtgagctgcaaggccagcggctacaccttcatcgactacgagatccactgggtgcgccaggcccccggccagggcctggagtggatgggcgccatcgaccccgagaccggcggcaccgcctacaaccagaagttcaagggccgcgtgaccatgaccaccgacaccagcaccagcaccgcctacatggagctgcgcagcctgcgcagcgacgacaccgccgtgtactactccgcccgcatcctgctgtactactaccccatggagtactggggccagggcacactagtcacagtctcctcagcctccaccaagggccgatcggtcttccccctggcaccgtcctccaagagcacctctgggggcácagcggccctgggctgcc
tggtcaaggactacttgcccgaa,ccg<3tgaçggtgtcgtggaactcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcgtcaggactctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcagcttgggcacccagacctiicatctgcaacgtgaatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaaga-^agttgagcccaaatcttgtgac^aaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtgagtcttcctcrtcccgccaaaacccaa
ggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtc^catgcgtggtggtcgacgtgagccacg
aagaccctgaggtcaagrtcaactggtâcgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagaca
aagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtacggtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgca
ccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctggaacaaagccctcccagccc
ccatcgagaaaaccatctccaaagccaaaggggagccccgagaaccacaggtgtacaccctg
cccccatcccgggatgaggtgaccaag/i^íccaggigagcctgacctgcctggtcaaaggctt
ctatgccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatggatgaggctctgcacaagcactacacgcagaagagcctctccgtgtctccgggtaaatga
seq.i-d.no 3s
atggggtggagctgcatcatcctgttcctggtggccaccgccaccggcgtgcacagccaggtgcagctggtgcagagcggcgccgaggtgaagaagcccggcgccagcgtgaaggtgagctgcaagggcagcgggtacaccttcatggactacgagarccactgggtgggccaggcccccggccagggcctggagtggatgggcgccatcgaccccgagaccggcggcaccgcctacaaccagaagtt
caagggccgcgtgaccatgaccaccgaçaccsígcagcagcaccgcctacatggagctgcgcagcctgcgcagcgacgacaccgccgtgtactactgcacccgcatcctgctgtactactaccccatggactactggggccagggcacactagtgacagtctcctcagcctccaccaagggcccatcggtcttgcccctggcaccctcctccaagagcaccrctgggggcacagcgggcctgggctgcc
tggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcaggcgccgtgagcagc
ggcgtgcacaccttcctggctgrcctacagtgctcaggactctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccgtccagcagcttgggcacccagacctacatctgcaacgtgaatcacaagcccagcaacacgaaggtggagaagaaagttgagccgíu^ítcttgtgacaaaactgacacatggccaccgtgccgagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaa
ggacaccctcatgatctcccggaccgctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagac cctg aggtcaagttcaactggtacg tgga cggcgtggaggtgc ataatgccaagaca
aagccgcgggag'3agcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagggtcctcaccgtcgtgcaccaggactggctgaatggcaíiggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagcccrcccagcccocatcgfògaaaaccatctc
cgcccatcccgggatgagctgacciagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaaga
ccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcacggtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaatga
seq.i,d.no 3£atgggctggagctgcatcatcctgttcctggtggccaccgccaccggcgtgcâcagccaggtgcagctggtgcagagcggcgccgacgtgaagaagcccggcgccagcgtgaaggtgagctgcaaggccagcggctaçaccttcatcgactacgagatccactgggtgcgccaggcccccggccagggcctggagtggatgggcgccatcgaccccgagaccggcggcaccgcctacaaccagaagttcaagggccgcgtgaccatgaccaccgacaccagcaccagcaccgcctacatggagcxgcgcagcctgcgcagcgacgacaccgccgtgtagtactgcacccgcatcctgctgtactactaccccatggactactggggccagggcacactagtcacagtctcctcagcctccaccaagggcccatcggtcttccccctggcaccctcctccaac-agcãcctctgggggcacagcggccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctcaggactctactccctcagcagcgtggt
gaccgtgccctccagcagcttgggcacccagacctacatctgcâacgtgaatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagaaagttgagcccajatcttgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaaggcgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgca
ccaggactggctgaatggc^ggagtacmtgtgcaaggtctccaacaaagccctcccagccc
ccatcgagaaa^ccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtagaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggcrccttcttcctctagagcaagctcaccgtggacaagagcaggrggcagcaggggaacg tctt ctcatgc tccgtgatgcatgaggctctgcacaacgactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaatga
seq.i.d.no 37
atgggctggagctgcatcatcctgttcctggtggccaccgccaccggcgtgcacagccaggt
gcagctggtgcagagcggcgcggacgtgaagaagcccggcgccagcgtgaaggtgagctgca
aggccagcggctacaccttcatcgactacgagatccactgggtgcgccaggcccccggccagggcctggagtggatgggcgccatggaccccgagaccggcggcaccgcctacaaccagaagttcaagggccgcgccaccctgaccgccgacaagagcaccagcãccgcctaciatggagctgcgcagcctgcgcagcgacgacaccgccgtgtactactgcacccgcatcctgctgtactactacccc
atggactactggggccagggcacactagtcacagtctcctcagccrccaccaagggcccatcggtcttccccctggcaccctcctccajagagcacctctgggggcacagcggccctgggctgcctggtcaaggactacttccccg^accggtgacggtgtcgtggaactcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctgaggactctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcagcttgggcacccagacctacatctgcaacgtgaatcacaagcccagcaacacga^ggtggacaagaaagttgagcccaaatcttgtoacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgâtctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagcegcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatogcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctccolGÇÇCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCC/^GGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTT
ctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcâatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcgtcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggac
aagagcaggtggcagcaggggaacgtcttgtcatggrccgxgatgcatgaggctctgcacaa
ccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaatga
seq.i.d.ho 38
atgggctggagctgcatcatcctgttcctggtggccaccgccaccggcgtgcacagcgagatcgtgctgacccagagccccgccaccctgagcctgagccccggggagcgcgccaccctgagct
GCCGCGCCAaCCAGAACATCAGCGACTACCTGCACTGGTACCAGCAGAAGCCCGGCGAGGCCCCCCGCCTGCTGATCTAC-TACGCCAGCCAGAGCATCAGCGGCATCCCCGGCCGCTTCAGCGGCAGGGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCAGCAGCCTGGAGCCCGAGGACTTCGCCGTGTACTACTGCCAGAACGGCCACAGCTTGCCCCTGACCTTCGGCGGCGGCACCAAGGTGGAGATCAAGCGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCC1GCTGAAT.AA.CTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGACA-ACGCCCTCCJi-ATCGGGTAAC-rCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGAC
agcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaâgcagactacgagaa
ACACAAAGIGTAGGCCTGCGA/ÍGTCACCCATCAC-GGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTtcaacaggggacsagtgtmg
SBQ.I.D.NO 39
ATGGGGTGGAGCTGCATCATCCTGTTCCTGGTGGCCACCGCCACCGGCGTGGACAGCGAGATCGTGCTGACCCAGAGCCCCGCCACGCTGAGCCTGAGCCCCGGCGAGCGCGCCACCCTGAGCTGCCGCGCCA-GCCAGAACATCAGCGACTACCTGCACTGGTÂCGAGCAGAAGCCCGGCCAGGCCCCCCGCCTGCTGATCTACTACGCCAGCCAGAGCATCAGCGGGATCCCCGCCCGGTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGACC/^TCAGCAGCCTGGAGCCCGAGGACTTCGCCGTGTACTACTGGCAGAACGGCCACAGCTTCCCCCTGACrCTGGGCGGCGGCACCAAGGTGGAGATCAAGCGTACGGTGGGTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAA
atctggaactgcctcigttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtgga^ggtggacaacgccctccaatcgggtjíactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgaggaaagcagactacgagaaacacaaagtctaggcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagaggttcaacaggggagagtgttag
seqti^dfnq 4.0
atgggctgg^vgctgcatcatcctgttcctggtggccaccggcaccggcgtgcacagcgagatcgtgctgacccagagccccgccaccctgagcctgagccccggcgagcgcgccaccgtgagct
gccgcgccagccagaacatcagcgactacctc-cactggtaccagcagaagcccggccaggccCCCCGCCTGCTGATCTACTACGCCAGCCAGAGCATCAGCGGCATCCCCGCCCGCTTCAGCGGCAGCGGCAGCGC-CACCGACTTCACCCTGACCATCAACAGCCTGGAGCCCGAGGACTTCGCCGTGTACTACTGCCAGAACGGCCACAGCTTGCCCCTGÃCCCIGGGCGGCGGCACCAAGGTGGAGATCAAGCGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAAGTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTG^T^CTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGACAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTmG
SEQ ■ I .D.UO;:41
S P VPPSTAL KELl EELVlfI TQNQKAPLiCNGSMVWS I NL>T:AG VYCAALES LINVSGCS Al EKTQRMLNGF C PHKVSAGQFS S LR VRDTKIEVAQ FVKDLLVHLKKLFREGQFN
SEQ.1.D.NO:42
AGCCCTGTGCCTCCCTCTACAGCCCTCAAGGAGCTCATTGAGGAGCTGGTCAACATCACCCA
gaaccagaaggccccgctctgcaatggcagcatggtgtggagcatcaacctgacagctggcg
TGTACTGTGCAGCCCTGGAATCCCTGATCMÍCGTGTCAGGCTGCAGTGCCATCGAGAAGACCCAGAGGATGCTGAACGGArTCTGCCCGCACAíiGGTCTCAGCTGGGCAGrTTTCCAGCTTGCGTGTCCGAGACACCAAAATCGAGGTGGCCCAGTTTGTAAAGGACCTGCTCGTACATTTAAAGAAACTTTTTCGCGÃGGGACAGTTCAACTGA
SEQ.I.D.NO;4 3MGWSC11 LFLVAmiTGVHS
SEQ■I.D.HO:44
SEQ♦ X . D,NO;4 5
EIVLTQSPATLS hS PGERATLSCftAS QS VS S YLAVTf QQKPGQAPRLLIYDASNRATGI PiJiFSGSGSGTDFTLTISS LBPEDFAVYYCXXXXXXXXXFQGGTKVEΪ K
SEQ,I.D.NO14 6
SGSGPSTALRSLIEELVNITSEQ.I.D.NO:4-7
SGSGIfRBLI BE LVNITQNQKSBQ * I,D.NO;4 8SGSGISELWITQNQKA.PLCSEQ.I.D.NO;4 9SGSGWl TQMQKAPI1CfiGSMS SQ. 1. D . MO: 5 QS GSGQIIQKAPLCiNG SHVWSlSBQ. I. D. NO51SGSGAPLCNGSMVWSINLTASBQ,IfD.NO i 52SGSGNGSMWSIttfLTAGMYCSBQ, X .D .NO i 5.3SGSGVWSlULTAGMYCAALESEQ.I.D.NO:54SGSGNLTAGMYCAALESLINSBQ.I.D.NO:5 5SGSGGMYC&ÃLESLINVSGCSEQ.I,D.NO:5€SGSGAALE SLINVS GCSAIESEQ ♦ I.DvNO:57SGSGSLINVSGCSAIEKTQRSEQ.I.D .NO:58SGSOVSGCSAIEKTGRK0E.SGSEQ. I. D .Μ>; 59SGSGSAIEKTQRMLSGFCPHSEQ.1.D.NO. 60SGSGRfQ-RMLSGFCPHKVSASEQ.I.D.NO:61SGSGMLSGFCPMKVSAGQFSSEQ.I.D.NO:62SGSGFCPHKVSAGQFSSLHVSEQ. I.D.NO:63SGSGKVSAGQFS SLHVRDTKSEQ.I.D.NO:64SGSGGQFSSLHVRDTKrEVASBQ.I.D.NO:65SGiSGSLHVRDTKI EVAQFVKSEQ.I.D.NO:66SGSGRDTKIEVAQFVKD LLLSBQ, I. D.NO:67SGSGIEVAQFVKDLLLHbKKSEQ.I.D.NO:68SGSGQFVKDLLLHLKKLFRS
SEQ>I .D.MOi 69SGSGDLLIiHLKKLFREGRFirSEQ. I .D.KSO: 70SGSGFSTALXELIEELVNITSEQ. I. D.NO:71S GSGLKELIEELVWITQNQKSEQ.I.D.NO:72SGS GMGSWWS INLmGVYCSEQ.I.D.NQ:73SGSGWS INtTAGVYCAAtESEQ,I.D.NO:74SGSGNLTAGVYCAALES LIN
SEQ.I.D.NO:7 5SGSGGVYCAALESLINVSGCSEQ,I.D.NO t7 6SGSGVSGCSAIEKrQRMLNGSEQ.I,DjNG:77SG SGSAIE KTQRMLNGF CPHSgQtI.D.NO:78SGSGKTQRMLNGfCPHKVSASEQ. I.D,NQ;7 9
SGS GMLNGFCPHKVSAGQPSSÉQ.1.D,M0:gQSGSGFCFHKVSAGQFSSLRVSEQ,I.P > KO:S1SGSGKVSAGQFSSL^VRDTXSBQ-I,D.KOt82
SGSGGQFS SLRVRDTKIEVASEQ. 1. D. N0_s S 3SGSGSLRVEDTKIEVAQFVKSEQ.I.D.K0:84SGSGRDTKIE VAQF VKDLWSBQ.I.D.WOtSS
SGSGiBvaqfvkdllvhlkk
SEQ.I.D,H0:86SGSGQFVKDLLVHXiKKLFRESBQ.I.D,N0;B7SGSGDLLVHLKtCLFREGQFNSEQ,ΐ,D.NO:SBDliliLHLKKLFRSGRFNSEQ.I.D, NOi89Dllvhlkklfregqfw
140
seq. i. d. isto: 90
qfvkpllmlkklfregefn
seq.i.d. wo:sl
llhlkxlfreg
seq.i.d.nq
lkklfre
seq id no, 93
caggtgcagctggxgcagagcggagccgaggtgaagaagcctggcgccagcgtcaaggtgtcctgcaaggccagcggctacaccttcatcgactacgagatccactgggtgcggcaggct
gctggacagggcctggaatggatgggcgccatcgaccccgagacaggcggcaccgcctac
aaccagaagttc^iagggccgggtcaccatgaccaccgacaccagcaccagcaccgcctat
atggaactgcggagcctgagaagcgacgãcaccgccgtgtactactgcacccggatcctgctgtactactaccccatggactactggggccagggcacactagtcãccgtgagcagc
ssq id ko. s4
gagatcgtgctgaccgagagccccgccaccctgagcctgagccctggcgagcgggccaccctgtcctgccgggggagccagaacatcagcgactacctgcactggtatcagcag,oagcccggccaggcgcccaggctgctgatciactacgccagccagtccatctccggcatccccgccaggttc^gcggcagcggctccggg^ccgacttcacgctgaccatcagctctctggaacgcgaggacttcgccgtgtattattgccaga^cggccacagcttccccctgacctttggcggcggaacaaaggtggagatcaag
sbq id mo. ss
atgggatggagctgcatcatcctcrrcctggtggccacggclaccggggrgc^tagccaggtgckgctcgtccagtctggí^êcg^
aggccagcggctataccttcatcgactacgagatccattgggtgaggcaggctcccgggcagggcctggagtggatgggcgccatcgacccagagaccggaggcacggcgtacaaccagaagttcaagggacgggtcaccatgacaaccgataccagcacctccaccgcttacatggagctgcgcagcctgagaagcgacgacaccgcggtgtactactgtacgcgcatcctgctctactactacccc
atggattactggggccagggcacactagtcacagtctcctcagcctccaccaagggcccatcggtcttgcccctggcaccctcctccaagagcacttctgggggcacagcggccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctcaggactctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctcx^aggagcttgggcacccagacctacatctgcaacgtgaatcacaagcccagc^c accaaggtggacaagaaagttgagccc AAATCTTGTGA caaaa ctc acac atgcccaccgtgcx:cãgavcctgaactcctggggggãccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagaca
aagccgcgggaggagcagtacaacagcaxgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaâgggcâgccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacggctcccgtgctggactccgacggctcgttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcâggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggta^jítga
ssq id no, 96atgggatggagctgcatcatcctc^
gcagçtcgtccagtctggggccgacgtgí-agaívgcccggagcttctgtgaaggtgtcctgcaaggccagcggctataccttcatcgactacgagatccattgggtgaggcaggctcccgggcagggcctggagtogatgggcgccatcgaccca^gaccggaggcacggcgmcaaccagaagttcaagggacgggtcaccatgacaaccgataccagcacctccaccgcttacatggagctgcgcagcctgagaagcgacgacaccgcggtgtactactgtacgcgcatcctgctctactactacccc
atggattactggggccagggcacactagtcacagtctcctcagcctccaccaagggcccatcggtcttccccctggcaccctcctccaagagcacctctgggggcacagcggccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcaggcgccctgaccagcggggtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctcaggactctactccctgagcagcgtggtgaccgtgccctccagcagcttgggcacccagacctacatctgcaacgtgaatcacaaggcca
gcaacaccmggtggacaagaaagttgag
ccgtgcccagcacctgaagtcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaa
ggacaccctcatgatcrcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacg
aagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagaca
aagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtgc-tcagcgtcctcaccgtcctgga
ccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgca/íggtctccaacaaagccctcccaggcc
ccatcgagaa/accatctccaaagccaaagggcagccccgagaagcacaggtgtacaccctgcccccatcccggg atg agct^ acc aa.g aac c aggtcag cctg acctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagca.2itgggcagccggagaacaactacaaga
ccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcgtctccctgtctccgggtaaatgaseq id IfO. 97
ATGGGATGGTCTTGTATCATCCTGTTCCTGGTGGCGACCGCCACCGGCGTGCACTCCGAGATCGTGCTGACCCAGAGTCCAGCCACCCTCAGCCrGAGCCCTGGGGAACGCGCCACCCTGTCCTGCCGGGCGAGT<^Gi^CATCTCCGACmCCTGCATTGGTACCAGCAGAAGCCCGGCCAGGCCCCTCGCCTGCTGATCTACTACGCCTCCCAC3AGCATCAGCGGAATCCCCGCGCGGTTCTCCGGAAGTGGGTCCGGAACCGACTTTACCCTGACCATCAGCTCTCTCGAGCCAGAGGACl-rCGCGGTGTACTACTGCCAGZiACGGGCATAGTTTCCCACTGACCTTCGGAGGGGGCAC^AAGGTGGAGArCAAGCGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGG AAGTGCCnrGTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCGAGAGAGGCCAAAGTAC
agtggaaggtggaca^cgccctgcaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaaca.caaagtctacgcctgcg^iagtcacc€atcagggcctgagctggcccgtcacaaagagcrtcaagaggggagagtgttag
SEQ ID KQ;93

Claims (46)

1. Anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno,caracterizado pelo fato de que especificamente se liga a hIL-13 e compreendeo CDRH3 como definido na SEQ ID NO: 3 ou nas variantes desta, em que umou dois resíduos de aminoácidos dentro do referido CDRH3 diferem dosresíduos de aminoácidos na posição correspondente na SEQ ID NO: 3.
2. Anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno de acordocom a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que neutraliza a IL-13humana.
3. Anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno de acordocom as reivindicações 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que modula a ligaçãoda IL-13 humana a seu receptor.
4. Anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno de acordocom qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que oCDRH3 compreende a seqüência de SEQ ID NO: 3.
5. Anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno de acordocom qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de queainda compreende uma ou mais das seguintes seqüências CDRH2: SEQ IDNO: 2, CDRHl: SEQ ID NO: 1, CDRLl: SEQ ID NO: 4, CDRL2: SEQ IDNO: 5 e CDRL3: SEQ ID NO: 6 ou uma variante destas, em que um ou doisresíduos de aminoácidos dentro do referido CDR diferem dos resíduos deaminoácidos na posição correspondente na SEQ ID NO.
6. Anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno de acordocom a de acordo com qualquer das reivindicações precedentes, caracterizadopelo fato de que compreende os seguintes CDRs:CDRHl: SEQ ID NO: 1CDRH2: SEQ ID NO: 2CDRH3: SEQ ID NO: 3CDRL1: SEQ ID NO: 4CDRL2: SEQ ID NO: 5CDRL3: SEQ ID NO: 6
7. Anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno,caracterizado pelo fato de que se liga aos peptídeos apresentados nas SEQ IDNOs: 90, 99, 102, 103, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112 e 114, mas nãose ligam aos peptídeos apresentados nas SEQ ID NOs: 100, 101, 104 e 113.
8. Anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno de acordocom qualquer reivindicação precedente, caracterizado pelo fato de queespecificamente se liga ao epítopo apresentado na SEQ ID NO: 91.
9. Anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno de acordocom qualquer reivindicação precedente, caracterizado pelo fato de que oanticorpo é um anticorpo intacto.
10. Anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno deacordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é umanticorpo de rato, camundongo, primata (por exemplo cinomolgos, macacosdo Velho Mundo ou Macaco Antropóide) ou ser humano.
11. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações-1 a 9, caracterizado pelo fato de que é um anticorpo humanizado ouquimérico.
12. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações-9 a 11, caracterizado pelo fato de que compreende uma região constantehumana.
13. Anticorpo de acordo com as reivindicações 9 a 12,caracterizado pelo fato de que compreende uma região constante do isotipo de IgG.
14. Anticorpo de acordo com a reivindicação 13, caracterizadopelo fato de que é IgGl, IgG2 ou IgG4.
15. Anticorpo de acordo com a reivindicação 6, caracterizadopelo fato de que compreende um domínio VH da SEQ ID NO: 7 e umdomínio VL da SEQ ID NO: 8.
16. Anticorpo humanizado de acordo com a reivindicação 6,caracterizado pelo fato de que compreende um domínio VH de SEQ ID NO: 12e um domínio VL de SEQ ID NO: 15.
17. Anticorpo humanizado de acordo com a reivindicação 6,caracterizado pelo fato de que compreende um domínio VH de SEQ ID NO: 13 e um domínio VL de SEQ ID NO: 15.
18. Anticorpo humanizado de acordo com as reivindicações 16ou 17, caracterizado pelo fato de que ainda compreende uma região constantehumana de um isotipo de IgG (por exemplo, IgGl ou IgG4).
19. Anticorpo humanizado, caracterizado pelo fato de quecompreende uma cadeia pesada de SEQ ID NO: 19 e uma cadeia leve de SEQID NO: 22.
20. Anticorpo humanizado, caracterizado pelo fato de quecompreende uma cadeia pesada de SEQ ID NO: 20 e uma cadeia leve de SEQID NO: 22.
21. Fragmento de ligação a antígeno de acordo com qualqueruma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de ser um Fab, Fab',F(ab')2, Fv, diacorpo, triacorpo, tetracorpo, minianticorpo, minicorpo, VHisolado, VL isolado.
22. Fragmento de ligação a antígeno de acordo com areivindicação 21, caracterizado pelo fato de que compreende, ou consiste deum ScFv.
23. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesla 20, caracterizado pelo fato de que compreende uma região Fc mutada, detal modo que o referido anticorpo tenha ADCC reduzido e/ou ativação docomplemento.
24. Célula hospedeira recombinante transformada outransfectada, caracterizada pelo fato de que compreende um primeiro e umsegundo vetor, referido primeiro vetor compreendendo um polinucleotídeocodificando uma cadeia pesada de um anticorpo como definido em qualquerreivindicação precedente, e referido segundo vetor compreendendo umpolinucleotídeo codificando uma cadeia leve como definida em qualquerreivindicação precedente.
25. Célula hospedeira de acordo com a reivindicação 24,caracterizada pelo fato de que é uma célula eucariótica.
26. Célula hospedeira de acordo com a reivindicação 25,caracterizada pelo fato de que é uma célula de mamífero.
27. Célula hospedeira de acordo com a reivindicação 26,caracterizada pelo fato de que é uma célula de CHO ou uma célula NSO.
28. Método para produzir um anticorpo como definido emqualquer uma das reivindicações 1 a 20 ou com a reivindicação 23,caracterizado pelo fato de que compreende a etapa de cultivar uma célulahospedeira como definida em qualquer uma das reivindicações 24 a 27, emum meio de cultura livre de soro.
29. Método de acordo com a reivindicação 28, caracterizadopelo fato de que o referido anticorpo é secretado pela referida célulahospedeira dentro do referido meio de cultura.
30. Método de acordo com a reivindicação 29, caracterizadopelo fato de que o referido anticorpo é ainda purificado até pelo menos 95 %ou mais (por exemplo 98 % ou mais) em relação ao referido meio de culturacontendo o anticorpo.
31. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de quecompreende um anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno comodefinido em qualquer uma das reivindicações 1 a 23, e um veículofarmaceuticamente aceitável.
32. Kit de partes, caracterizado pelo fato de que compreende acomposição como definida na reivindicação 31, juntamente com instruçõesquanto ao uso.
33. Método para tratar um paciente humano afligido por umadoença sendo asma, caracterizado pelo fato de que compreende a etapa deadministrar uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo oufragmento de ligação a antígeno como definido em qualquer uma dasreivindicações 1 a 23.
34. Método de acordo com a reivindicação 33, caracterizadopelo fato de que referido paciente é afligido pela asma, dentre a asma alérgica,a asma severa, asma frágil, asma noturna, asma pré-menstrual, asma esteróideresistente, asma esteróide dependente, asma induzida pela aspirina, asma decomeço adulto, asma pediátrica.
35. Método para tratar um paciente humano afligido por umadoença sendo uma condição asmática que seja refratária ao tratamento comcorticosteróides, caracterizado pelo fato de que compreende a etapa deadministrar ao referido paciente uma quantidade terapeuticamente eficaz doanticorpo ou fragmento de ligação a antígeno como definido em qualquer umadas reivindicações 1 a 23.
36. Método para prevenir ataques asmáticos agudos em umpaciente humano, caracterizado pelo fato de que compreende a etapa deadministrar ao referido paciente uma quantidade terapeuticamente eficaz deum anticorpo como definido nas reivindicações 1 a 23.
37. Método para reduzir a freqüência e/ou mitigar os efeitosdos ataques asmáticos agudos em um paciente humano, caracterizado pelofato de que compreende a etapa de administrar ao referido paciente umaquantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo como definido emqualquer uma das reivindicações 1 a 23.
38. Método para tratar um paciente humano afligido por umadoença sendo uma doença ou distúrbio, constante do grupo consistindo dedermatite atópica, rinite alérgica, doença de Crohn, COPD, doenças oudistúrbios fibróticos tais como a fibrose pulmonar idiopática, a esclerosesistêmica progressiva, a fibrose hepática, os granulomas hepáticos,esquistossomíases, leishmaniose, doenças da regulação do ciclo celular, tal adoença de Hodgkins, a leucemia linfocítica crônica de células B,caracterizado pelo fato de que compreende administrar a um paciente humanouma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo como definido emqualquer uma das reivindicações 1 a 23.
39. Uso de um anticorpo ou seu fragmento de ligação aantígeno como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 23,caracterizado pelo fato de ser na fabricação de um medicamento para otratamento de uma doença ou distúrbio selecionados do grupo consistindo de:asma alérgica, a asma severa, asma difícil, asma frágil, asma noturna, asmapré-menstrual, asma esteróide resistente, asma esteróide dependente, asmainduzida pela aspirina, asma de começo adulto, asma pediátrica, dermatiteatópica, rinite alérgica, doença de Crohn, COPD, doenças fibróticas oudistúrbios tais como a fibrose pulmonar idiopática, esclerose sistêmicaprogressiva, fibrose hepática, granulomas hepáticos, esquistossomíase,leishmaníase, doenças da regulação do ciclo celular tais como a doença deHodgkins, leucemia linfocítica crônica de células B.
40. Método para tratar um paciente humano afligido por umadoença sendo uma doença ou distúrbio selecionado do grupo consistindo deasma alérgica, a asma severa, asma difícil, asma frágil, asma noturna, asmapré-menstrual, asma esteróide resistente, asma esteróide dependente, asmainduzida pela aspirina, asma de começo adulto, asma pediátrica, dermatiteatópica, rinite alérgica, doença de Crohn, COPD, doenças fibróticas oudistúrbios tais como a fibrose pulmonar idiopática, esclerose sistêmicaprogressiva, fibrose hepática, granulomas hepáticos, esquistossomíase,leishmaníase, doenças da regulação do ciclo celular tais como a doença deHodgkins, leucemia linfocítica crônica de células B, caracterizado pelo fatode que compreende administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz deum anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 23, euma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo monoclonal anti-IL--4.
41. Método de acordo com a reivindicação 40, caracterizadopelo fato de que o anticorpo monoclonal anti-IL-4 é administrado simultânea,seqüencial ou separadamente com o anticorpo como definido em qualqueruma das reivindicações 1 a 23.
42. Método de acordo com as reivindicações 40 ou 41,caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-IL-4 é pascolizumab.
43. Uso de um anticorpo como definido em qualquer uma dasreivindicações 1 a 23, e um anticorpo monoclonal anti-IL-4, tal como opascolizumab, caracterizado pelo fato de ser na fabricação de ummedicamento para o tratamento de uma doença ou distúrbios selecionados dogrupo consistindo de: asma alérgica, a asma severa, asma difícil, asma frágil,asma noturna, asma pré-menstrual, asma esteróide resistente, asma esteróidedependente, asma induzida pela aspirina, asma de começo adulto, asmapediátrica, dermatite atópica, rinite alérgica, doença de Crohn, COPD,doenças fibróticas ou distúrbios tais como a fibrose pulmonar idiopática,esclerose sistêmica progressiva, fibrose hepática, granulomas hepáticos,esquistossomíase, leishmaníase, doenças da regulação do ciclo celular taiscomo a doença de Hodgkins, a leucemia linfocítica crônica de células B.
44. Uso de um anticorpo como definido em qualquer uma dasreivindicações 1 a 23, e um anticorpo monoclonal anti-IL-4, tal como opascolizumab, caracterizado pelo fato de ser na fabricação de um kit de partespara o tratamento de uma doença ou distúrbio selecionados do grupoconsistindo de: asma alérgica, a asma severa, asma difícil, asma frágil, asmanoturna, asma pré-menstrual, asma esteróide resistente, asma esteróidedependente, asma induzida pela aspirina, asma de começo adulto, asmapediátrica, dermatite atópica, rinite alérgica, doença de Crohn, COPD,doenças fibróticas ou distúrbios tais como a fibrose pulmonar idiopática,esclerose sistêmica progressiva, fibrose hepática, granulomas hepáticos,esquistossomíase, leishmaníase, doenças da regulação do ciclo celular taiscomo a doença de Hodgkins, a leucemia linfocítica crônica de células B.
45. Kit de partes, caracterizado pelo fato de que compreendeuma primeira composição farmacêutica contendo um anticorpo como definidoem qualquer uma das reivindicações de 1 a 23, e um veículofarmaceuticamente aceitável, e uma segunda composição farmacêuticacompreendendo um anticorpo monoclonal anti-IL-4, tal como opascolizumab, e um veículo farmaceuticamente aceitável, opcionalmentejunto com instruções para uso.
46. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de quecompreende um primeiro anticorpo como definido em qualquer uma dasreivindicações 1 a 23, e um segundo anticorpo, em que referido segundoanticorpo é um anticorpo anti-IL-4 tal como o pascolizumab e um veículofarmaceuticamente aceitável.
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