BRPI0706494A2 - processamento de slpi pela quimase - Google Patents

Abstract

PROCESSAMENTO DE SLPI PELA QUIMASE. A presente invenção refere-se à quimase humana que cliva o SLPI humano em um local específico e que esta clivagem pode ser usada como indicador de atividade da quimase. A presente invenção fornece métodos para diagnosticar doenças associadas à quimase ou avaliar a eficiência do tratamento de uma doença associada à quimase em um ser humano objeto do estudo através da medição do processamento do SLPI, bem como através de outros métodos e composições relacionados.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para"PROCESSAMENTO DE SLPI PELA QUIMASE".

Referência Cruzada a Pedidos Relacionados

Este pedido reivindica a prioridade para o pedido ns 60/758.400depositado em 12 de janeiro de 2006, cujo conteúdo integral está aquiincorporado a título de referência.

Campo da Invenção

A presente invenção refere-se a métodos para análise deatividade da quimase. Em particular, a invenção refere-se ao diagnóstico deuma doença associada à quimase ou à avaliação da eficiência do tratamentode uma doença associada à quimase em um ser humano objeto do estudomediante a medição do processamento do inibidor de protease liberada porleucócitos(SLPI - Secretory Leukocyte Protease Inhibitor).

Antecedentes da Invenção

O inibidor de protease liberada por leucócitos (SLPI - SecretoryLeukocyte Protease Inhibitor) foi descoberto como um inibidor 11.7 kD paraelastase e catepsina G (Thompson et al., Proc Natl Acad Sci U S A 1986;83:6692-6). O SLPI é expresso por mastócitos (Westin et al., Biol Chem1999; 380:489-93) e está presente na mucosa das vias aéreas superiores(Fryksmark et al., Ann Otol Rhinol Laryngol 1982; 91:268-71) e no escarro(Kramps et al., J Histochem Cytochem 1981; 29:712-9). Altas quantidadesde SLPI foram medidas no nariz (Lee et al., Am Rev Respir Dis 1993;147:710-6), traquéia e brônquios (Kramps et al., Am Rev Respir Dis 1984;129:959-63; Mooren et al., J Histochem Cytochem 1982; 30:1130-4), seiomaxilar (Fryksmark et al., supra) e células caliciformes do epitélio dobronquíolo (Willems et al., Am Rev Respir Dis 1989; 139:1244-50).

Estudos de cristalografia do inibidor de SLPI mostraram que amolécula é um membro da família dos similares às proteínas do soro de leiteácido (Grutter et al., Embo J 1988; 7:345-51). Estas proteínas têm doisdomínios com quatro ligações de dissulfeto. As quatro ligações de dissulfetoe a estrutura helicoidal de cada domínio fazem do SLPI uma proteína muitoestável. Foi descoberto que as proteínas de mastócito bovino (Grutter supra)e ovino (Pemberton et al., Biochim Biophys Acta 1998; 1379:29-34) clivamSLPI em Leu72-Met73.

Outros têm mostrado um peso molecular mais baixo do produtoprocessado de SLPI mas não têm caracterizado a enzima responsável poresta clivagem (Ota et al., Hum Reprod 2002; 17:2517-22) O SLPI foi descritocomo o inibidor mais eficaz da quimase (Walter et al., Arch Biochem Biophys1996; 327:81-8; and Fink et al., Biol Chem Hoppe Seyler 1986; 367:567-71).

A quimase é uma serina proteinase quimotríptica que pertence àfamília das peptidases S1. Ela é expressa em mastócitos e em leucócitos dapele e dos pulmões e acredita-se que ela atua na degradação da matrizextracelular, na regulação da secreção da glândula submucosal e nageração de peptídeos vasoativos. Ela tem uma atividade máximaimediatamente após sua liberação na matriz extracelular depois dosmastócitos terem sido ativados (Takai et al., FEBS Lett 467: 141-144, 2000).

Existem duas formas de quimase em mamíferos, α e β, que diferem emespécie e têm funções diferentes. Em seres humanos e em babuínos,apenas a α-quimase é encontrada, enquanto cachorros, ratos ecamundongos têm ambas as quimases a- e β (DeINtaIia et al., Curr OpinCardiol 2003 17: 374-379).

Embora as funções patológicas e fisiológicas exatas da quimaseainda não tenham sido determinadas, a quimase tem sido conectada avazamentos microvasculares, ao acúmulo de neutrófilos, ao estímulo dasecreção de muco, à modulação de citoquinas etc. Um potente inibidorseletivo de quimase pode ser indicado em doenças mediadas por mastócitoscomo asma, inflamação pulmonar e doenças pulmonares obstrutivascrônicas (COPD). Uma vez que a quimase pode desempenhar um papel nageração da parede angiotensina Il cardíaca e vascular, um inibidor daquimase pode ser potencialmente usado como tratamento anti-hipertensivopara inflamação e lesão da parede vascular (ateroesclerose ou reestenose),bem como para hipertrofia cardíaca. A quimase está na mira das terapias dedoenças cardiovasculares (Doggrell et al., Can J Physiol Pharmacol.

Fevereiro de 2005;83(2): 123-30). Além disso, a quimase tem também sidoproposta para desempenhar um papel crítico em doenças como artritereumatóide (Kobayashi et al., Jpn J Pharmacol. setembro de 2002; 90(1 ):7-11), nefropatia diabética (Huang et al., J Am Soc Nephrol. julho de2003;14(7): 1738-47) e doenças inflamatórias (Muto et al., Idrugs., 12, 2002,1141-50).

Portanto, os compostos preparados para inibir a atividadebiológica da quimase podem oferecer benefício terapêutico em inúmerasáreas de doenças. Foram desenvolvidos inibidores seletivos da quimase,que incluem o TY-51076, SUN-C8257, o BCEAB, o NK320 e o TEI-E548(consulte Doggrell et al acima). Resultados promissores foram obtidos comeste inibidor da quimase em modelos de infarto do miocárdio, decardiomiopatia e de taquicardia e insuficiência cardíaca induzida comanimais. Para facilitar o teste do inibidor da quimase em seres humanos,bem como o estudo da atividade da quimase em geral em seres humanos,existe a necessidade de desenvolver um biomarcador para essa atividade da- quimase em seres humanos.

Sumário da Invenção

Descobriu-se recentemente que a quimase humana cliva o SLPIhumano em um local específico e que esta clivagem pode ser usada comoindicador de atividade da quimase. Esta clivagem é específica para quimasequando testada em uma série de proteases conhecidas por interagir com oSLPI, incluindo triptase, catepsina G, elastase e proteinase 3.

Em um aspecto geral, a presente invenção fornece um métodopara detectar uma doença associada à quimase em um ser humano objetodo estudo, compreendendo as etapas de: a) obter uma amostra biológica doser humano objeto do estudo, b) medir o nível de clivagem de SLPI humanopela quimase humana na amostra biológica e c) comparar o nível medido naetapa b) com uma amostra de controle do nível de clivagem de SLPIhumano pela quimase humana em um ser humano saudável, sendo que umelevado nível de clivagem de SLPI humano pela quimase humanacomparado com a dita amostra de controle indica que o ser humano objetodo estudo tem uma doença associada à quimase ou tem um alto risco decontrair uma doença associada à quimase

Em um outro aspecto, a presente invenção fornece um métodopara avaliar a eficácia de um tratamento para doenças associadas àquimase em um paciente humano, compreendendo as etapas de: a) obteruma amostra biológica do paciente humano, b) medir o nível de clivagem deSLPI humano pela quimase humana na amostra biológica e c) comparar onível medido na etapa b) com uma amostra de controle do nível de clivagemde SLPI humano pela quimase humana do paciente antes do tratamento,sendo que um nível menor de clivagem de SLPI humano pela quimase humana comparado com a dita amostra de controle indica que o tratamentoda doença associada à quimase no dito paciente é eficaz.

A presente invenção fornece também um método para medir aatividade biológica da quimase humana, compreendendo as etapas de: a)colocar a quimase humana em contato com um SLPI humano em umamistura de teste, b) incubar a mistura de teste em uma condição na qual aquimase humana cliva o SLPI humano e c) medir o nível de clivagem deSLPI humano pela quimase humana na mistura de teste.

A presente invenção fornece adicionalmente um método paraidentificar um composto que diminui a atividade biológica da quimasehumana compreendendo as etapas de: a) colocar um composto de teste emcontato com uma quimase humana e um SLPI humano em uma mistura deteste, b) incubar a mistura de teste em uma condição na qual a quimasehumana cliva o SLPI humano, c) medir o nível de clivagem de SLPI humanopela quimase humana na mistura de teste e d) comparar o nível detectadoda etapa c) com o nível detectado na amostra de controle, sendo que ocomposto de teste é omitido da mistura de teste.

Além disso, a presente invenção fornece também kitsrelacionados aos métodos da presente invenção.

Outro aspecto da presente invenção é um método paraclassificar um paciente que tem uma probabilidade maior de responder a umtratamento envolvendo um inibidor da quimase, compreendendo as etapasde: a) obter uma amostra biológica do paciente, b) medir o nível de clivagemdo SLPI humano pela quimase humana na amostra biológica e c) compararo nível medido na etapa b) com uma amostra de controle do nível declivagem do SLPI humano pela quimase humana em um ser humanosaudável, sendo que um nível elevado de clivagem do SLPI humano pelaquimase humana comparado com o dito controle indica que o paciente temuma probabilidade maior de responder a um tratamento envolvendo uminibidor da quimase.

Outro aspectos, características e vantagens da invenção ficarãoaparentes a partir da descrição que se segue, incluindo a descriçãodetalhada da invenção e suas modalidades preferenciais e as reivindicaçõesanexas.

Descrição das Figuras

A figura 1 mostra a digestão de SLPI humano recombinante(rSLPI) pela quimase humana. As amostras em cada faixa são: 1 - proteínatamanho padrão (BechMark, Invitrogen), 2 - SLPI, 0 h, 3 - quimase + SLPI,20 min, 4 - quimase + SLPI, 140 min, 5 - quimase + SLPI, 4 h, 6 - quimase+ SLPI, 21 h, 7 -SLPI, 21 h, 8 - quimase 21 h, 9 - 1 ug de quimase, 10 -proteína tamanho padrão (Mark-12, Invitrogen).

A figura 2 mostra que inibidores de quimase conhecidosdiminuíram a clivagem do rSLPI pela quimase. Os números 0, 8, 80 e 800indicam a quantidade de inibidor da quimase presente na mistura de teste naunidade de pmols.

A figura 3 mostra que a quimase foi capaz de clivar o SLPIpresente na amostra de saliva humana, e que o inibidor de quimase reduziua clivagem.

A figura 4 compara o nível de clivagem de SLPI nas amostras desaliva de um ser humano saudável e de um paciente portador de umadoença associada à quimase.

A figura 5 mostra que um aumento de cSLPI se correlacionacom um aumento de sintomas alérgicos. As razões entre cSLPI e SLPI totalem lavagens nasais foram determinadas pela análise western obtidas deindivíduos 0,75 hora e 0,5 hora antes do desafio antigênico e 0,5 hora e 7horas depois do desafio antigênico (figura 5b). Os pacientes foramclassificados de acordo com a intensidade dos sintomas (nível Lebel) nosmesmos pontos do tempo (figura 5a).

A figura 6 mostra que amostras de escarro de um asmáticocontêm maiores porcentagens de cSLPI/SLPI total que as amostras deescarro de um indivíduo normal e se correlacionam com níveis de quimasedestes indivíduos. Foram tomadas amostras de escarro tanto de pacientesnormais quanto de pacientes asmáticos. Tanto as razões entre cSLPI e SLPIquanto os níveis de quimase foram determinados pela análise western. Osvalores foram determinados por análise de densitometria.

Descrição Detalhada

Todas as publicações citadas da presente invenção estão aquiincorporadas, por referência. A menos que definido de outro modo, todos ostermos técnicos e científicos usados na presente invenção têm o significadocomumente dado pelo versado na técnica relacionada à presente invenção.

Para uso na presente invenção, os termos "compreendendo","contendo", "tendo" e "incluindo" são usados em seu sentido amplo e não-limitador.

As seguintes são abreviações que às vezes são usadas nesterelatório descritivo:

bp = par de basescDNA = DNA complementarCOPD = doença pulmonar obstrutiva crônica

ELISA = teste imunoenzimático ("enzyme-linked immunoabsorbent assay")kb = kilobase - 1.000 pares de bases

PAGE = eletroforese em gel de poliacrilamida ("polyacrylamide gelelectrophoresis")

PCR = reação em cadeia da polimerase ("polymerase chain reaction")SDS = dodecil sulfato de sódio ("sodium dodecyl sulfate")SLPI = inibidor de protease liberada por leucócitos ("Secretory LeukocyteProtease Inhibitor")

Para uso na presente invenção, o termo "atividade biológica daquimase" refere-se a uma atividade exercida pela quimase comodeterminada in vivo ou in vitro, de acordo com técnicas padrão. Atividadesbiológicas exemplificadoras da quimase, incluem, mas não se limitam a, suacapacidade de converter angiotensina I em peptídeo vasoativo angiotensinaII, de converter seletivamente endotelina-grande 1 em peptídeo endotelina 1com 31 aminoácidos de comprimento, de degradar a matriz extracelular, declivar fatores de célula-tronco para produzir um produto bioativo solúvel, deprocessar procolagenase, citoquinas inflamatórias e outros peptídeosbioativos, incluindo SLPI etc.

A expressão "amostra biológica", para uso na presenteinvenção, refere-se a uma amostra contendo ou consistindo em matéria outecido celular, como células ou fluidos biológicos isolados de um objeto deestudo. Um "objeto de estudo" pode ser um mamífero, como um rato, umcamundongo, um macaco ou um ser humano, que foi objeto de tratamento,observação ou experimento. Exemplos de amostra biológica incluem, porexemplo, escarro, sangue, células do sangue (por exemplo, leucócitos),fluido amniótico, plasma, esperma, saliva, medula óssea, amostras debiópsia de tecidos ou agulha fina, urina, fluido peritoneal, fluido pleural eculturas de células. As amostras biológicas podem incluir também seções detecidos como seções congeladas coletadas para fins histológicos. Umaamostra biológica de teste é a amostra biológica que foi objeto de análise,monitoramento ou observação. Uma amostra biológica de controle pode serde controle positivo ou negativo para a amostra biológica de teste.

Freqüentemente, a amostra biológica de controle contém os mesmos tiposde tecido, células e/ou fluidos biológicos de interesse que os da amostrabiológica de teste. Em modalidades particulares, a amostra biológica é uma"amostra clínica", que é uma amostra derivada de um paciente humano.

Uma "célula" refere-se ao menos uma célula ou a umapluralidade de células adequadas à sensibilidade do método de detecção. Acélula pode estar presente em uma cultura de células. A célula pode estarpresente também em seu ambiente natural, como um tecido ou um fluidobiológico. As células adequadas para a presente invenção podem serbactérias, mas são de preferência eucarióticas, e são, com a máximapreferência, células de mamíferos.

A expressão "quimase humana", para uso na presente invenção,refere-se à quimase que foi originalmente isolada de um ser humano.

Quimase é uma serina proteinase quimotríptica que pertence à família daspeptidases S1. Os sinônimos de quimase incluem protease de mastócito I,protease de músculos esqueletais, proteinase quimotríptica da pele,proteinase serina mastócito, quimase e protease de músculos esqueletais. Aclivagem preferencial para uma quimase é: Phe-|-Xaa > Tyr-|-Xaa > Trp-|-Xaa > Leu-|-Xaa. Uma "quimase humana" exemplificadora tem a seqüênciade aminoácidos da SEQ ID ne1, a qual é mostrada em GenBank proteína ID:NP_001827. Uma "quimase humana" para uso na presente invenção incluios polimorfismos estruturais e funcionais da quimase humana mostrada inSEQ ID ns 1. "Polimorfismo" refere-se a um conjunto de variantes genéticasem um Iocus genético particular entre os indivíduos de uma população.

A expressão "doença associada à quimase" ou um "distúrbioassociado à quimase" como usada na presente invenção refere-se a umadoença ou distúrbio associado à atividade excessiva ou expressão excessivada quimase, ou a uma doença ou distúrbio que pode ser tratado ouamenizado pelo decréscimo da atividade biológica da quimase ou pelodecréscimo da quantidade de quimase em um objeto de estudo, e àsmanifestações ou condições sub-clínicas que acompanham tal doença oudistúrbio no objeto de estudo. "Doenças associadas à quimase"exemplificadoras incluem, mas não se limitam a, asma, rinite alérgica,fibrose, hipertensão, hipertrofia cardíaca, insuficiência cardíaca, artritereumatóide, nefropatia diabética, doença pulmonar obstrutiva crônica(COPD) e doenças inflamatórias.

Um "SLPI humano" para uso na presente invenção refere-se aum inibidor da protease liberada por leucócitos que foi originalmente isoladode um humano. Os sinônimos de SLPI incluem ALP, MPI, ALK1, BLPI,HUSI, WAP4, WFDC4 e HUSI-I. O SLPI protege os tecidos epiteliais contraas proteases de serina. Ele é encontrado em várias secreções incluindoplasma seminal, muco cervical e secreções brônquicas, e tem afinidade comtripsina, elastase de leucócito e catepsina G. Seu efeito inibitório contribuipara a resposta imunológica pela proteção das superfícies epiteliais contra oataque de enzimas proteolíticas endógenas; acredita-se também que aproteína tem uma atividade antibiótica de amplo espectro. Um "SLPIhumano" exemplificador tem a seqüência de aminoácidos da SEQ ID nQ 2, aqual é a porção madura da proteína mostrada no ID de proteína GenBank:NP_003055. A expressão "SLPI humano", para uso na presente invenção,inclui os polimorfismos estruturais e funcionais do SLPI humano mostrado naSEQ ID n- 2.

O "nível de clivagem do SLPI humano pela quimase humana"refere-se ao grau ou à quantidade de clivagem ou proteólise do SLPIhumano pela quimase humana. Para uso na presente invenção, o "nível declivagem do SLPI humano pela quimase humana" pode ser medido como arazão entre o fragmento de SLPI humano resultante da clivagem porquimase e o SLPI de comprimento total presente na amostra biológica deteste ou na mistura de teste.

O "fragmento de SLPI humano resultante da clivagem porquimase" refere-se à porção do SLPI humano que é produzida pelaproteólise ou clivagem do SLPI por uma quimase. Foi descoberto nestainvenção que uma quimase humana cliva um SLPI humano entre Leu72 eMet73, onde o número 72 ou 73 refere-se à posição do resíduo deaminoácido a partir da extremidade amino-términal do SLPI humano. Dessaforma, um "fragmento de SLPI humano resultante da clivagem por quimase"exemplificador pode ser Serl -Leu72 ou Met 73 - ala fragmento da SEQ IDne 2, que consistem nas seqüências de aminoácidos da SEQ ID n93 ou SEQID n-4, respectivamente. Um "fragmento de SLPI humano resultante daclivagem por quimase", para uso na presente invenção, inclui ospolimorfismos estruturais e funcionais do fragmento de SLPI humanomostrado na SEQ IDng 3 ou na SEQ ID nQ 4.

A expressão "seqüência de nucleotídeos" refere-se à disposiçãode resíduos de desoxirribonucleotídeos ou de ribonucleotídeos em umpolímero na forma de filamento único ou de filamento duplo. As seqüênciasde ácido nucléico podem ser compostas de nucleotídeos naturais dasseguintes bases: timidina, adenina, citosina, guanina e uracila,abreviadamente T, A, C, G e U, respectivamente, e/ou análogos sintéticosdos nucleotídeos naturais.

Uma molécula de ácido nucléico "isolada" é uma molécula que ésubstancialmente separada de pelo menos uma das outras moléculas deácido nucléico presentes na fonte natural do ácido nucléico, ou ésubstancialmente isenta de pelo menos um dos precursores químicos ououtras substâncias químicas quando a molécula de ácido nucléico ésintetizada quimicamente. Uma molécula de ácido nucléico "isolada" podeser também, por exemplo, uma molécula de ácido nucléico que ésubstancialmente isenta de pelo menos uma das seqüências denucleotídeos que naturalmente flanqueiam a molécula de ácido nucléico emsuas extremidades a 1,5 m (51) e 0,9 m (31) no DNA genômico do organismodo qual o ácido nucléico é derivado. Uma molécula de ácido nucléico é"substancialmente separada de" ou "substancialmente isenta de" outrasmoléculas de ácido nucléico ou outras substâncias químicas naspreparações da molécula de ácido nucléico quando há menos que cerca de30%, 20%, 10% ou 5% (em peso a seco) das outras moléculas de ácidonucléico ou das outras substâncias químicas (também chamada na presenteinvenção de "molécula de ácido nucléico contaminante" ou de "contaminantequímico").

As moléculas isoladas de ácido nucléico incluem, mas não selimitam a, moléculas separadas de ácido nucléico (por exemplo, cDNA oufragmentos de DNA genômico produzido por PCR ou por tratamento deendonuclease de restrição ) independentes de outras seqüências, bem comomoléculas de ácido nucléico que são incorporadas em um vetor, umplasmídeo auto-replicante, um vírus (por exemplo, um retrovírus, adenovírus,ou vírus de herpes), ou em um DNA genômico de uma procariota oueucariota. Além disso, uma molécula de ácido nucléico isolado pode incluiruma molécula de ácido nucléico que faz parte de uma molécula de ácidonucléico híbrida ou de fusão. Uma molécula de ácido nucléico isolada podeser uma seqüência de ácido nucléico que é: (i) amplificada in vitro, porexemplo, por reação em cadeia da polimerase (PCR), (ii) sintetizada, porexemplo, por síntese química, (iii) recombinantemente produzida porclonagem ou (iv) purificada, como por clivagem e separação eletroforética oucromatográfica.

O termo "oligonucleotídeo" ou "oligo" refere-se a uma seqüênciade DNA ou RNA de filamento único com comprimento relativamente curto,por exemplo, com menos de 100 resíduos. Em muitos métodos, osoligonucleotídeos de cerca de 16 a 25 nucleotídeos em comprimento sãoúteis, embora os oligonucleotídeos de comprimento maior que cerca de 25nucleotídeos possam às vezes ser usados. Alguns oligonucleotídeos podemser usados como "preparadores" (primers) para a síntese de filamentos deácido nucléico complementares. Por exemplo, preparadores de DNA podemhibridizar as seqüências de ácido nucléico para preparar a síntese de umfilamento de DNA complementar em reações usando polimerases de DNA.

Os oligonucleotídeos são úteis também para a hibridização em váriosmétodos de detecção de ácido nucléico, por exemplo, em northern blottingou hibridização in situ.

Os termos "polipeptídeo", "proteína" e "peptídeo" são usados napresente invenção de forma intercambiável para referir-se a cadeias deaminoácidos nas quais os resíduos de aminoácidos são ligados por ligaçõesde peptídeo ou ligações de peptídeo modificados. As cadeias deaminoácidos podem ser de qualquer comprimento maior que doisaminoácidos. Exceto se especificado de outro modo, os termos"polipeptídeo", "proteína" e "peptídeo" abrangem também várias formasmodificadas dos mesmos. Tais formas modificadas podem ser de ocorrêncianatural ou quimicamente modificadas. Exemplos de formas modificadasincluem, mas não se limitam a, formas glicosiladas, formas fosforiladas,formas miristoiladas, formas palmitoiladas, formas ribosiladas, formasacetiladas, formas ubiquitinadas, etc. As modificações incluem também areticulação intramolecular e a ligação covalente a várias porções comolipídios, flavina, biotina, polietileno glicol ou derivados dessas substânciasetc. Além disso, as modificações podem incluir também ciclização,ramificação e reticulação. Adicionalmente, outros aminoácidos além dosvinte aminoácidos convencionais codificados pelo códons de genes podemser incluídos no polipeptídeo.

Uma "proteína isolada" é urna proteína substancialmenteseparada de pelo menos uma das outras proteínas presentes na fontenatural da proteína, ou é substancialmente isenta de pelo menos um dosprecursores químicos ou outras substâncias químicas se a proteína forquimicamente sintetizada. A proteína é "substancialmente separada de" ou"substancialmente isenta de" outra(s) proteína(s) ou outra(s) substância(s)química(s) na preparação da proteína quando há menos que cerca de 30%,20%, 10% ou 5% (em peso a seco) de outra(s) proteína(s) ou de outra(s)substância(s) química(s) (também chamadas na presente invenção de"proteínas contaminantes " ou de "substâncias químicas contaminantes").

As proteínas isoladas podem ter várias formas físicas diferentes.A proteína isolada pode existir como um polipeptídeo nascente decomprimento total ou não processado, como um polipeptídeo processadoparcialmente ou como uma combinação de polipeptídeos processados. Opolipeptídeo nascente de comprimento total pode ser modificado pós-translacionalmente por eventos específicos de clivagem proteolítica queresultam na formação de fragmentos do polipeptídeo nascente decomprimento total.

Um fragmento, ou uma associação física de fragmentos, podeter atividade biológica associada ao polipeptídeo de comprimento total;entretanto, o grau de atividade biológica associado a fragmentos individuaispode variar.

Um polipeptídeo isolado pode ser um polipeptídeo que não temocorrência natural. Por exemplo, um "polipeptídeo isolado" pode ser um"polipeptídeo híbrido". Um "polipeptídeo isolado" pode também ser umpolipeptídeo derivado de um polipeptídeo de ocorrência natural por adições,remoções ou substituições de aminoácidos. Um polipeptídeo isolado podetambém ser um "polipeptídeo purificado" que é usado na presente invençãopara significar um polipeptídeo específico em uma preparaçãosubstancialmente homogênea e substancialmente isenta de outroscomponentes celulares, outros polipeptídeos, materiais virais ou meio decultura, ou, quando o polipeptídeo é quimicamente sintetizado, precursoresquímicos ou subprodutos associados à síntese química. Um "polipeptídeopurificado" pode ser obtido a partir de células hospedeiras naturais ourecombinantes por técnicas padrão de purificação, ou por síntese química,como será aparente para os versados na técnica.

Os termos "proteína híbrida, "polipeptídeo híbrido", "peptídeohíbrido", "proteína de fusão", "polipeptídeo de fusão" e "peptídeo de fusão"são usados na presente invenção de forma intercambiável para significar umpolipeptídeo que não tem ocorrência natural ou um polipeptídeo isolado quetem uma molécula de polipeptídeo específica covalentemente ligada a umaou mais moléculas diferentes de polipeptídeo que não se ligam naturalmenteao polipeptídeo específico. Dessa forma, a "proteína híbrida" pode ser duasproteínas de ocorrência natural, ou fragmentos da mesma, ligadas uma àoutra por uma ligação covalente. Uma "proteína híbrida" pode também seruma proteína formada pela ligação covalente de dois polipeptídeos artificiais.

Tipicamente, mas não necessariamente, as duas ou mais moléculas depolipeptídeo são ligadas ou "fundidas" por uma ligação peptídica formandouma cadeia não-ramificada de polipeptídeos. O termo "fragmento deproteína", para uso na presente invenção, significa um polipeptídeo querepresenta uma porção de uma proteína.

"Recombinante" refere-se a um ácido nucléico, uma proteínacodificada por um ácido nucléico, uma célula ou uma partícula viral, que foimodificada usando-se técnicas de biologia molecular para algo diferente deseu estado natural. Por exemplo, células recombinantes podem conter umaseqüência de nucleotídeos que não é encontrada na forma nativa (não-recombinante) da célula ou que pode expressar genes nativos que são deoutro modo anormais, pouco expressos, ou não expressos de modo algum.

As célula recombinantes podem também conter genes encontrados na formanativa da célula, sendo que tais genes são modificados e reintroduzidos nacélula por meios artificiais. O termo abrange também células que contémuma ácido nucléico endógeno que foi modificado sem a remoção do ácidonucléico da célula; tais modificações incluem aquelas obtidas, por exemplo,por reposição do gene e mutação sítio-específica.

Uma "célula hospedeira recombinante" é uma célula na qual foiintroduzida uma seqüência de DNA recombinante. A seqüência de DNArecombinante pode ser introduzida na célula hospedeira por qualquermétodo adequado, incluindo, por exemplo, eletroporação, precipitação defosfato de cálcio, microinjeção, transformação, biobalística e infecção viral. ODNA recombinante pode ou não estar integrado (ligado covalentemente) noDNA cromossômico que forma o genoma da célula. Por exemplo, o DNArecombinante pode ser mantido em um elemento epissomal, como umplasmídeo. Alternativamente, com respeito a uma célula transformada outransfectada de forma estável, o DNA recombinante se integra nocromossomo dé tal forma que é herdado pelas células filhas através dereplicação cromossômica. Esta estabilidade é demonstrada pela capacidadeda célula transformada ou transfectada de forma estável de estabelecerlinhagens de células ou clones que compreendem a população de célulasfilhas contendo o DNA exógeno. A célula hospedeira recombinante pode serprocariótica ou eucariótica, incluindo bactérias como E. coli, células fúngicascomo levedura, células de mamíferos como linhagens de células de origemhumana, de bovinos, de porcos, de macacos ou de roedores e células deinsetos como linhagens celulares derivadas de drosófilas e de bichos-da-seda. É adicionalmente entendido que o termo "célula hospedeirarecombinante" refere-se não somente à célula do objeto de estudo particular,mas também à progênie ou potencial progênie de tal célula. Uma vez quecertas modificações podem ocorrer em gerações sucessivas devido amutações ou influências ambientais, tal progênie pode não ser, de fato,idêntica à célula mãe, mas ainda assim são incluídas no escopo do termopara uso na presente invenção.

"Seqüência" significa a ordem linear na qual os monômerosocorrem em um polímero, por exemplo, a ordem de aminoácidos em umpolipeptídeo ou a ordem de nucleotídeos em um polinucleotídeo.

"Identidade ou similaridade de seqüência", conforme conhecidona técnica, é a relação entre duas ou mais seqüências de polipeptídeos ouduas ou mais seqüências de polinucleotídeos, conforme determinado ao secomparar às seqüências. Para uso na presente invenção, "identidade", nocontexto da relação entre duas ou mais seqüências de polipeptídeos ouduas ou mais seqüências de polinucleotídeos, refere-se à porcentagem denucleotídeos ou resíduos de aminoácidos, respectivamente, que são iguaisquando as seqüências são otimamente alinhadas e analisadas. Para fins decomparação entre uma seqüência pesquisada e, por exemplo, a seqüênciade aminoácidos da SEQ ID n9 2, a seqüência pesquisada é otimamentealinhada com a SEQ ID n- 2 e o melhor alinhamento local ao longo docomprimento total da SEQ ID n2 2 é obtido.

A análise pode ser feita manualmente ou usando-se umalgoritmo de comparação de seqüências. Na comparação de seqüências,uma seqüência age tipicamente como uma seqüência de referência, com aqual a seqüência pesquisada é comparada. Quando se usa um algoritmo decomparação de seqüências, as seqüências de teste e de referência sãoinseridas em um computador, as coordenadas de subseqüências sãodeterminadas, se necessário, e os parâmetros do programa do algoritmo deseqüência são determinados.

O alinhamento mais eficiente de seqüências de comparaçãopode ser feito, por exemplo, com o uso do algoritmo de alinhamento porhomologia de Needleman & Wunsch, J Mol. Biol., 48:443 (1970). O softwareque faz a análise de Needleman& Wunsch está publicamente disponível nosite do Instituto Pasteur (França): http://bioweb.pasteur.fr/seqanal/interfaces/needle.html. O programa NEEDLE usa o algoritmo de alinhamentoglobal Needleman-Wunsch para encontrar o melhor alinhamento possível(incluindo buracos) de duas seqüências considerando seus comprimentostotais. A identidade é calculada junto com a porcentagem de filamentosidênticos entre as duas seqüências na região de alinhamento reportada,incluindo eventuais buracos no comprimento. Os scores de similaridade sãotambém apresentados, sendo que a similaridade é calculada como aporcentagem de filamentos idênticos entre as duas seqüências na região dealinhamento reportada, incluindo os buracos. As comparações padrão usama matriz EBLOSUM62 para seqüências de proteína e a matriz EDNAFULLpara seqüências de nucleotídeos. A penalidade de buracos corresponde aospontos removidos quando um buraco é criado; o parâmetro padrão usando apenalidade de buraco é 10,0. Para ampliação de buraco, a penalidade éadicionada à penalidade padrão de buraco para cada base ou resíduo noburaco; o parâmetro padrão é 0,5.

A hibridização pode também ser usada como um teste paraindicar que dois polinucleotídeos são substancialmente idênticos. Ospolinucleotídeos que compartilham um alto grau de identidade irão hibridizarentre si em condições severas de hibridização. A expressão "condiçõesseveras de hibridização" tem o significado conhecido na técnica, conformedescrito em Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual,Second Edition, Cold Spring HarborLaboratory, Cold Spring Harbor, NewYork, EUA (1989). Uma condição severa de hibridização exemplificadoracompreende a hibridização em 6x cloreto de sódio ou citrato de sódio (SSC)a cerca de 45 °C, seguida de uma ou mais lavagens em 0.2x SSC e 0,1% deSDS em 50 a 65 °C, dependendo do comprimento sobre o qual ospolinucleotídeos hibridizantes compartilham complementaridade.

"Vetor" refere-se à molécula de ácido nucléico na qual um ácidonucléico heterólogo pode ser ou é inserido. Alguns vetores podem serintroduzidos em uma célula hospedeira, permitindo a replicação de tal vetorou a expressão da proteína que é codificada pelo vetor ou constructo. Osvetores tipicamente têm marcadores selecionáveis, por exemplo, genes quecodificam proteínas para determinar a resistência a medicamentos, asorigens de seqüências de replicação e múltiplos locais de clonagem quepermitem a inserção de uma seqüência de heterólogos. Os vetores sãotipicamente baseados em plasmídios e são designados pelo ρ minúsculoseguido por uma combinação de letras e/ou números. Os plasmídios departida descritos na presente invenção estão comercialmente disponíveis,publicamente disponíveis de forma irrestrita ou podem ser construídos apartir de plasmídios disponíveis pela aplicação de procedimentos conhecidosna técnica. Muitos plasmídios e outras clonagens e vetores de expressãoque podem ser usados de acordo com a presente invenção são bem-conhecidos e prontamente disponíveis para aqueles versados na técnica.Além disto, os versados na técnica podem construir prontamente qualquernúmero de outros plasmídios adequados ao uso na invenção. Aspropriedades, a construção e o uso de tais plasmídios, bem como de outrosvetores da presente invenção será prontamente aparente para aquelesversados na técnica através da presente descrição.

Na prática da presente invenção, são usadas muitas técnicasconvencionais de biologia molecular, microbiologia e DNA recombinante.Estas técnicas são bem-conhecidas e explicadas em, por exemplo, CurrentProtocols in Molecular Biology, Vols. I, Il e III, F.M. Ausubel, ed.(1997) eSambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold SpringHarbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (2001).

A presente invenção apresenta um método geral para medir aatividade biológica de uma quimase humana através da medição do nível declivagem de SLPI humano pela quimase humana.

Em um aspecto geral, a presente invenção fornece um métodopara detectar uma doença associada à quimase em um ser humano atravésda medição do nível de clivagem do SLPI humano pela quimase humana emuma amostra biológica. Um ser humano portador de uma doença associadaà quimase pode ter uma quimase hiperativa ou um nível elevado dequimase. Dessa forma, a amostra biológica coletada de tal ser humano podeconter mais clivagem de SLPI por quimase no local específico Leu72-Met73do que a de um ser humano saudável.

Qualquer tipo de amostra biológica pode ser usada na invenção.

Em modalidades particulares, a amostra biológica pode ser saliva, escarro,exudato nasal, fluido epitelial ou fluidos de lavagem. A amostra biológicapode ser obtida do ser humano objeto do estudo de formas conhecidas peloversado na técnica. A amostra biológica de controle contém o mesmo tipo detecido, de célula e/ou de fluidos biológicos de interesse da amostra biológicade teste e pode ser obtido de um ser humano saudável ou de umapopulação de seres humanos saudáveis que não foram diagnosticados comnenhuma doença associada à quimase.

Tanto o nível de SLPI humano de comprimento total quanto onível de fragmentos de SLPI resultante da clivagem por quimase podem sermedidos na amostra biológica e usados para quantificar o nível de clivagemdo SLPI humano pela quimase humana. O nível de SLPI humano decomprimento total e o nível de fragmentos de SLPI resultante da clivagempor quimase em uma amostra biológica podem ser medidos por quaisquermeios conhecidos dos versados na técnica para a quantificação deproteínas.

Em uma modalidade, o SLPI ou fragmento de SLPI podem serisolados ou purificados da amostra biológica e a quantidade do mesmodeterminada. O SLPI ou fragmento de SLPI pode ser prontamente separadodo resto da amostra biológica pelo uso de métodos conhecidos na técnica,por exemplo, métodos de separação baseados no tamanho, como gelfiltração. Adicionalmente, após a redução da amostra, o SLPI ou o fragmentode SLPI da amostra pode ser separado em um gel, como gel depoliacrilamida, e subseqüentemente ser submetido a imunoblot usando-seum anticorpo imunorreativo com o complexo da proteína.

Alternativamente, o nível de SLPI ou de fragmentos de SLPIpode ser determinado em uma amostra biológica sem separação, isolamentoou purificação. Para este propósito, é preferencial que um anticorposeletivamente imunorreativo com o SLPI ou com o fragmento de SLPI sejausado em um imunoensaio. Por exemplo, podem ser usados métodosimunocitoquímicos. Outras técnicas bem-conhecidas baseadas emanticorpos podem ser usadas, inclusive, por exemplo, teste imunoenzimático(ELISA - enzyme-linked immunosorbent assay), radioimunoensaio (RIA -radioimmunoassay), teste imunorradiométrico (IRMA - immunoradiometricassays), imunoensaio fluorescente, imunoensaio de proteína A e testeimunoenzimático (EMA - immunoenzymatic assays). Consulte, por exemplo,as patentes US números 4.376.Í10 e 4.486.530, ambas as quais estão aquiincorporadas a título de referência.

O nível de clivagem do SLPI humano pela quimase humana éentão calculado como a razão entre o fragmento do SLPI humano resultanteda clivagem da quimase e o SLPI de comprimento total presente na amostrabiológica de teste ou na mistura de teste. Um nível elevado de clivagem doSLPI humano pela quimase humana na amostra de teste comparado com aamostra de controle indica que o ser humano objeto do estudo tem umadoença associada à quimase ou tem um risco elevado de desenvolver umadoença associada à quimase.

Em um outro aspecto geral, a presente invenção fornece ummétodo para avaliar a eficácia de um tratamento para doenças associadas àquimase em um paciente humano mediante a medição do nível de clivagemdo SLPI humano pela quimase humana antes, durante ou depois dotratamento. Um tratamento eficaz para doenças associadas à quimasediminuiria a atividade biológica da quimase ou diminuiria a quantidade dequimase no paciente humano. Então, um nível menor de clivagem de SLPIhumano no local específico Leu72-Met73 pela quimase seria observado emuma amostra biológica coletada de tal paciente humano depois dotratamento eficaz. Como controle, amostras biológicas com o mesmo tipo detecidos, células e/ou fluidos biológicos de interesse podem ser obtidas domesmo paciente humano antes do tratamento. Um nível menor de clivagemde SLPI humano pela quimase humana na amostra de teste comparado como da amostra de controle indica que o tratamento para a doença associada àquimase no dito paciente é eficaz.

Os métodos da invenção compreendem adicionalmente a etapade analisar outros biomarcadores, outros fenótipos ou outras mudançasfisiológicas associadas com a doença relacionada à quimase. Por exemplo,na asma, foi recentemente reportado que o nível de VEGF (fator decrescimento endotelial vascular) e o índice de permeabilidade vascular nasvias aéreas estava inversamente correlacionado com o grau de obstruçãodas vias aéreas e com a hiper-reatividade das vias aéreas com a metacolinaem asmáticos (Kanazawa et al., Clin Exp Allergy. novembro de 2005;35(11): 1432-6). Em particular, foi descoberto que os níveis de VEGF emescarro induzido e no índice de permeabilidade vascular das vias aéreas foisignificativamente mais alto em asmáticos sem colite ulcerativa (UC -ulcerative colitis) e em asmáticos com UC do que nos controles normais oupaciente com UC {ld.). Assim, em um método da presente invenção paradiagnosticar uma condição asmática ou um método da presente invençãopara avaliar a eficácia do tratamento para uma condição asmática, o métodocompreende adicionalmente a etapa de analisar o nível de VEGF expressono escarro induzido do ser humano objeto do estudo.

Doença pulmonar obstrutiva crônica (COPD) é uma doençainflamatória dos pulmões associada com limitações progressivas do fluxo dear que não é totalmente reversível. As DPOCs incluem bronquite obstrutivacrônica e enfisema, comumente associados com o uso do fumo. Embora aetiologia exata da COPD seja desconhecida, a literatura médica sugere queem alguns casos, a COPD pode representar uma progressão patológica deasma crônica muito severa. Portanto, as terapias atuais disponíveis para otratamento de COPD são principalmente aquelas destinadas a reduzir ainflamação das vias aéreas e dos pulmões associada à asma. Terapiasatuais incluem corticoesteróides e bronco dilatadores administradosoralmente ou por inalação como os agonistas p2-adrenérgicos e osantagonistas colinérgicos. Portanto, se pode antecipar que uma nova terapiapara asma seria também uma provável terapia para COPD Para ver análisessobre as DPOCs, consulte: de Bôer, W. I. Perspectives for cytokineantagonist therapy in COPD. Drug Discovery Today, 10(2):93, 2005; eBarnes, P.J. New Treatments for COPD Nature Reviews- Drug Discovery, 1:437, 2002. Como na asma, o aspecto inflamatório da COPD pode sercaracterizado por uma resposta inflamatória que inclui um influxo deleucócitos, como neutrófilos e macrófagos, nos pulmões e nas vias aéreas.

Este influxo é um dos principais sintomas da inflamação das vias aéreas edos pulmões associada com a asma e com a COPD. Dessa forma, em ummétodo da presente invenção para diagnosticar uma condição de COPD ouum método da presente invenção para avaliar a eficácia de um tratamentode uma condição de COPD, o método compreende, ainda, a etapa de mediro influxo de leucócitos nos pulmões e vias aéreas.

As citoquinas são mediadores inflamatórios chave na asma e naCOPD. As citoquinas pró-inflamatórias incluem, entre outros, a interleucina(IL - interleukin )-1, o fator de necrose tumoral (TNF - tumor necrosis factor)-α e o fator quimiotáctico derivado de macrófagos (MCP - macrophagechemotactic factor)-1. Os agentes terapêuticos para o tratamento da asma eda COPD tendem a reduzir os níveis destas citoquinas pró-inflamatórias.

Dessa forma, em um método da presente invenção para diagnosticar umacondição de asma ou de COPD ou um método da presente invenção paraavaliar a eficácia do tratamento para uma condição de asma ou de COPD, ométodo compreende, ainda, a etapa de medição do nível de citoquinas noobjetodeestudo.

Outro aspecto da presente invenção é um método declassificação de pacientes que têm uma probabilidade maior de responderao tratamento para inibição da quimase, que compreende a etapa demedição do nível de clivagem de SLPI em tais pacientes. Um paciente comum nível maior de clivagem de SLPI provavelmente tem quimase hiperativa,e assim provavelmente responderá mais facilmente à terapia de inibidor dequimase. Por exemplo, a asma pode ser gerada por atividades relacionadasà constrição (aplicação de dilatadores bronquiais) e/ou relacionadas aconstrução das vias aéreas (produção excessiva de muco). Ainda não foideterminado se os mastócitos e a quimase liberada por eles estãoenvolvidos em uma ou em ambas as características patofisiológicasaberrantes da asma. Portanto, a asma poderia ser o resultado demecanismos dependentes da quimase e/ou independentes da quimase. Sobeste ponto de vista, a clivagem específica de SLPI por quimase pode serusada para associar ou validar ou estratificar populações asmáticasdependentes de quimase e populações asmáticas independentes dequimase para aumentar a eficácia dos inibidores de quimase.A presente invenção fornece adicionalmente um método paraidentificar um composto que diminui a atividade biológica da quimasehumana, compreendendo as etapas de: a) colocar um composto de teste emcontato com uma quimase humana e um SLPI humano em uma mistura deteste, b) incubar a mistura de teste em uma condição na qual a quimasehumana cliva o SLPI humano, c) medir o nível de fragmentos de SLPIhumano resultantes da clivagem por quimase na mistura de teste e d)comparar a quantidade detectada na etapa c) com a quantidade detectadana amostra de controle, sendo que o composto de teste é omitido da misturadeteste.

Os métodos de identificação do composto podem serexecutados usando-se formatos convencionais de laboratório ou em ensaiosadaptados para altas velocidades. O termo "alta velocidade" refere-se a umprojeto de ensaio que permite fácil triagem de múltiplas amostrassimultaneamente e/ou em rápida sucessão, e pode incluir manipulaçãorobótica. Outra característica desejada para ensaios de alta velocidade é umdesign de teste otimizado para reduzir uso de regentes ou para minimizar onúmero de manipulações para obter a análise desejada. Exemplos deformatos de teste incluem placas de 96 ou de 384 cavidades, gotículas emsuspensão e chips de microcanais de microlaboratório ("lab on a chip")usados para o manuseio de experimentos com líquidos. É bem-conhecidopelos versados na técnica que, à medida que a miniaturização de moldesplásticos e dispositivos de manuseio de líquidos se torna mais avançada, ouà medida que são desenvolvidos dispositivos de ensaio cada vez melhores,um número cada vez maior de amostras poderão ser processadas usando-se o design da presente invenção.

Quaisquer compostos de teste podem ser analisados nos testesde triagem da presente invenção para selecionar moduladores do complexode proteínas da invenção. O termo "identificar" composto abrange: (a)escolher compostos para serem moduladores de quimase dentre um grupoanteriormente desconhecido e (b) testar compostos que são conhecidos porserem capazes de ligar ou modular as funções e as atividades da quimase.Ambos os tipos de compostos são geralmente chamados, na presenteinvenção, de "compostos de teste" ou "compostos candidatos". Oscompostos candidatos abrangem numerosas classes químicas, incluindo,mas não se limitando a, pequenos compostos orgânicos ou inorgânicos,moléculas naturais ou sintéticas, como anticorpos, proteínas ou fragmentosdas mesmas, nucleotídeo anti-senso, RNA interferente (iRNA) e ribozimas, ederivados, substâncias miméticas e análogos dos mesmos. De preferência,eles são pequenos compostos orgânicos, isto é, têm peso molecular nãosuperior a 10.000 dáltons, com mais preferência menor que 5.000 dáltons.

De preferência, os compostos de teste são fornecidos em formato debiblioteca conhecidos na técnica, por exemplo, em bibliotecas quimicamentesintetizadas (consulte, geralmente, Gordan et aí. J. Med. Chem., 37:1385-1401 (1994)), bibliotecas recombinantemente expressas (por exemplo,bibliotecas de apresentação de fago) e bibliotecas baseadas emtransferência in vitro (por exemplo, bibliotecas de apresentação deribossoma).

Os compostos candidatos compreendem grupos químicosfuncionais necessários para interações estruturais com polipeptídeos etipicamente incluem ao menos um grupo amina, carbonila, hdroxila oucarboxila, de preferência ao menos dois grupos químicos funcionais e commais preferência ao menos três dos grupos químicos funcionais. Oscompostos candidatos podem compreender carbono cíclico ou estruturasheterocíclicas e/ou aromáticas ou estruturas poliaromáticas substituídas comum ou mais dos grupos funcionais acima identificados. Os compostoscandidatos podem ser também bio-moleculares como peptídeos, sacarídeos,ácidos graxos, esteróis, isoprenóides, purinas, pirimidinas, derivados ouanálogos estruturais dos mesmos, ou combinações dos mesmos e similares.

Se o composto for um ácido nucléico, o composto tipicamente é umamolécula de DNA ou RNA, embora ácidos nucléicos modificados comligações artificiais ou subunidades sejam também contemplados.

Os compostos candidatos são obtidos a partir de uma amplavariedade de fontes, inclusive bibliotecas de compostos sintéticos ounaturais. Por exemplo, numerosos meios estão disponíveis para síntesealeatória e direcionada de uma ampla variedade de compostos orgânicos ede biomoléculas, inclusive expressão de oligonucleotídeos aleatórios,bibliotecas combinatórias de orgânicos sintéticos, bibliotecas de peptídeosaleatórios de apresentação de fago e similares. Os compostos candidatospodem também ser obtidos pelo uso de quaisquer das numerosasabordagens em métodos das bibliotecas combinatórias conhecidos natécnica, inclusive bibliotecas biológicas, bibliotecas espacialmenteendereçáveis de fase sólida paralela ou solução fase, biblioteca sintética demétodos que exige desconvolução; o método de biblioteca "one-bead one-compound" e biblioteca de métodos sintéticos que usam seleção decromatografia de afinidade (Lam (1997) Anticancer Drug Des. 12:145).

Alternativamente, bibliotecas de compostos naturais sob a forma debactérias, de fungos e de extratos de plantas e animais estão disponíveis ousão prontamente produzidas. Adicionalmente, bibliotecas e compostosnaturais e sinteticamente produzidos podem ser prontamente modificadasatravés de meios convencionais químicos, físicos e bioquímicos.

Além disto, agentes farmacológicos conhecidos podem estarsujeitos a modificações químicas direcionadas ou aleatórias como acilação,alquilação, esterificação, amidação etc. para produzir análogos estruturaisdos agentes. Os compostos candidatos podem ser selecionadosaleatoriamente ou podem ser baseados em compostos existentes que seligam à e/ou modulam a função da atividade da quimase. Portanto, umafonte de agentes candidatos é uma ou mais bibliotecas de moléculas à basede um ou mais compostos que aumentam ou diminuem a atividade daquimase, e cuja estrutura é mudada em uma ou mais posições da moléculapara conter mais ou menos porções químicas ou porções químicasdiferentes. As alterações estruturais feitas nas moléculas durante a criaçãode bibliotecas de ativadores ou inibidores análogos podem ser dirigidas,aleatórias, ou uma combinação de substituições e/ou adições dirigidas ealeatórias. O versado na técnica de preparação de bibliotecas combinatóriaspode prontamente preparar tais bibliotecas baseadas nos compostosexistentes.

Uma variedade de outros reagentes pode, também, ser incluídana mistura. Estes incluem reagentes como sais, tampões, proteínas neutras(por exemplo, albumina), detergentes etc. que podem ser usados parafacilitar a ligação proteína-proteína e/ou proteína-ácido nucléico. Talreagente pode também reduzir interações não-específicas ou secundáriasdos componentes da reação. Outros reagentes que aumentam a eficiênciado teste como inibidores de nuclease, agentes microbicidas e similarespodem também ser usados.

Exemplos de métodos para a síntese de bibliotecas molecularespodem ser encontrados na técnica, por exemplo em: Zuckermann et al.(1994). J Med. Chem. 37:2678. As bibliotecas de compostos podem serapresentadas em solução (por exemplo, Houghten (1992) Biotechniques13:412-421), ou em cápsulas (Lam (1991) Nature 354:82-84), chips (Fodor(1993) Nature 364:555-556), bactérias (patente U.S. n9 5.223.409), esporos(patente U.S. nQ 5.571,698), plasmídios (Cull et al. (1992) Proc. NatL Acad.Sei. USA 89:1865-1869) ou fagos (consulte por exemplo, Scott and Smith(1990) Science 249:3 86-390).

A capacidade dos compostos selecionados para diminuir aatividade biológica da quimase na clivagem de um SLPI em um localespecífico Leu72-Met73 pode ser testada. Durante o teste, o composto deteste pode ser adicionado à quimase antes, depois ou simultaneamente como SLPI que serve como substrato para a atividade de protease do SLPI.

Geralmente, é feito um teste de controle no qual a triagem acima éconduzida na ausência do composto de teste. O resultado deste teste decontrole é então comparado com o resultado obtido na presença docomposto de teste.

A quimase ou o SLPI da triagem podem ser isolados ou não-isolados. Em uma modalidade, quimase ou SLPI substancialmentepurificados podem ser usados na triagem. Será aparente aos versados natécnica que quaisquer métodos de expressão recombinante podem serusados na presente invenção para expressão e purificação de SLPI ouquimase. As moléculas de ácido nucléico exemplifiçadoras que podem serusadas na presente invenção incluem moléculas de ácido nucléico quecodificam a quimase humana ou SLPI.

Tipicamente, os ácidos nucléicos, de preferência sob a forma deDNA, são incorporados em um vetor para formar vetores de expressãocapazes de dirigir a produção de membro(s) da proteína interagente depoisde introduzidos na célula hospedeira. Muitos tipos de vetores podem serusados na presente invenção. Os métodos para a construção de um vetor deexpressão, para os propósitos desta invenção, devem ser aparentes aosversados na técnica informados da presente descrição. (Consulte,geralmente, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 2, Ed. Ausubel1 etal., Greene Publish. Assoc. & Wiley lnterscience, Ch. 13, 1988; Glover, DNACloning, Vol. II, IRL Press, Wash., D.C., Ch. 3, 1986; Bitter1 et al., emMethods in Enzymology 153:516-544 (1987); The Molecular Biology of theYeast Saccharomyces, Eds. Strathern et al., Cold Spring Harbor Press, Vols.I e II, 1982; e Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, ColdSpring Harbor Press, 1989.)

Geralmente, os vetores de expressão incluem um cassete deexpressão que tem um promotor conectado de forma funcional a um DNAque codifica um membro de proteína interagente. O promotor pode ser umpromotor nativo, isto é, o promotor encontrado em células de ocorrêncianatural e responsável pela expressão do membro de proteína interagentenas células. Alternativamente, o cassete de expressão pode ser quimérico,isto é, tem um promotor heterólogo que não é o promotor nativo responsávelpela expressão do membro de proteína interagente em células de ocorrêncianatural. O vetor de expressão pode incluir, também, uma fonte de replicaçãode DNA para a replicação dos vetores nas células hospedeiras. Depreferência, os vetores de expressão incluem também uma fonte dereplicação para a amplificação dos vetores em, por exemplo, E. coli, emarcadores de seleção para selecionar e manter apenas as célulashospedeiras que abrigam os vetores de expressão.

O vetor de expressão assim construído pode ser introduzido nacélula hospedeira por quaisquer métodos conhecidos na técnica, porexemplo, por transformação direta de DNA, microinjeção, eletroporação,infecção viral, lipofecção, arma genética e similares. A expressão daproteína de interesse pode ser temporária ou estável. O vetor de expressãopode ser mantido na célula hospedeira em um estado extracromossômico,isto é, como um plasmídeo ou vírus auto replicante. Alternativamente, ovetor de expressão pode ser integrado no cromossomo das célulashospedeiras por técnicas convencionais como seleção de linhagem decélulas estavéis ou recombinação sítio-específica. Em linhagens de célulasestáveis, ao menos a porção do cassete de expressão do vetor deexpressão é integrada a um cromossomo das células hospedeiras.

A construção do vetor pode ser feita de forma que ele sejaadequado para expressão em várias células hospedeiras, incluindo, mas nãose limitando a, bactérias, células de levedura, células de plantas, células deinsetos, e células de mamíferos e de seres humanos. Métodos para prepararvetores de expressão para diferentes células hospedeira deverão serconhecidos dos versados na técnica.

Homólogos e fragmentos de quimase ou SLPI podem tambémser facilmente expressos com o uso dos métodos de recombinação descritosacima. Por exemplo, para expressar um fragmento de proteína, o fragmentode DNA incorporado no vetor de expressão pode ser selecionado de formaque ele codifique apenas o fragmento de proteína. Da mesma forma, umaproteína híbrida específica pode ser expressa usando-se um DNArecombinante para a codificação da proteína híbrida. De modo similar, umaproteína homóloga pode ser expressa a partir de uma seqüência de DNAcodificando a proteína homóloga. A seqüência de DNA de codificaçãohomóloga pode ser obtida pela manipulação da seqüência nativa decodificação de proteína usando-se técnicas de DNA recombinante. Para estafinalidade, a mutagênese sítio-dirigida ou aleatória pode ser feita com o usode técnicas de conhecimento geral na técnica. Para fazer derivadosprotéicos, por exemplo, a seqüência de aminoácidos de um elementoprotéico interativo pode ser alterada de formas predeterminadas pormutagênese sítio-dirigida de DNA para criar ou remover sequêniciasconsenso.

Em outra modalidade, a quimase ou o SLPI envolvidos napresente invenção podem estar presentes em uma amostra biológica, comosaliva, escarro, corrimento nasal, fluidos de lavagem etc. A quimase ou oSLPI podem também estar associados à célula ou estarem presentes noIisato celular.

O método da presente invenção compreende, ainda, a etapa detestar a atividade da quimase no composto, em um ou mais testes. Oscompostos podem ser submetidos a outros testes para determinar as outrasatividades da quimase, incluindo, mas não se limitando a, sua capacidade deconverter angiotensina I no peptídeo vasoativo angiotensina II, paraconverter seletivamente endotelina-grande 1 na endotelina 1 de peptídeocom comprimento de 31 aminoácidos, para degradar a matriz extracelular eclivar o fator de célula-tronco para produzir um produto bioativo solúvel paraprocessar procolagenase, citoquinas inflamatórias e outros peptídeosbioativos etc. Em uma modalidade particular, os compostos podem seradicionalmente testados com um teste de inibição de enzima envolvendouma quimase e um substrato cromogênico (consulte, por exemplo, Garavillaet al., The J. Bio.Chem.2005, 280:18001-18007).

O método da presente invenção compreende, ainda, a etapa detestar os compostos em um modelo animal para determinar os seus efeitossobre as doenças associadas à quimase. Por exemplo, um modelo bemaceito de inflamação das vias aéreas é o modelo asmático de ovelhasinduzido por antígenos do Ascaris suum. Após a administração de umcomposto de teste ao modelo de ovelhas, a redução do influxo de neutrófilose macrófagos indicaria, ao versado na técnica, que o composto é útil para otratamento de inflamação das vias aéreas e dos pulmões com asma e comdoença pulmonar obstrutiva crônica (COPD). Outro modelo de inflamaçãodas vias aéreas é a neutrofilia das vias aéreas induzida por lipolissacarídeo(LPS) em ratos, no qual, após a introdução do LPS nos pulmões, ocorre uminfluxo de leucócitos no fluido de lavagem broncoalveolar. Após aadministração do composto de teste ao rato, a reversão da inflamação dasvias aéreas induzida por lipolissacarídeo e a diminuição da quantidade deneutrófilos inidicaria ao versado na técnica que o composto é útil para otratamento de asma e de COPD. Um outro modelo de asma e COPD é omodelo da peritonite aguda induzida por glicogênio em ratos. Após aadministração de um composto de teste ao rato, a redução dos níveis decitoquinas pró-inflamatórias que incluem, entre outras, IL-1, TNF-α e MCP-1,no ascite e no plasma de ratos tratados com glicogênio demonstraria que ocomposto de teste é útil para o tratamento de asma e COPD.

Exemplo 1

- SLPI humano recombinante clivado de quimase humana em um localespecífico

Embora a clivagem de SLPI humano por proteases demastócitos bovinos (Grutter et al., Embo J 1988; 7:345-51) e ovino(Pemberton et al., Biochim Biophys Acta 1998; 1379:29-34) tenha sidoreportada por investigadores, não foi reportada nenhuma clivagem de SLPIpor quimase humana. Este exemplo investigou a capacidade da quimasehumana para clivar SLPI humano recombinate (rSLPI).

O SLPI humano recombinate e o anticorpo policlonal anti-SLPIde cabra foram obtidos de sistemas R&D (Minneapolis, MN, EUA). Oanticorpo anti-SLPI de coelho foi obtido da Abcam (Cambridge, MA, EUA). Aquimase e a triptase humanas foram obtidas da Cortex Biochem (SanLeandro, CA, EUA). A catepsina Gea elastase foram adquiridas daBiodesign International (Saco, ME, EUA) e a proteinase 3 foi adquirida daFitzgerald Industries International (Concord, MA, EUA). Exceto ondeindicado em contrário, reagentes similares foram usados também nos outrosexemplos incluídos na presente invenção.

O SLPI humano recombinate foi incubado com quimase humana(razão molar de 40:1) em Tris-HCI a 0,1 M, pH 8,0, NaCI a 0,5 M a 37 °C. Asamostras foram coletadas após vários pontos no tempo. Amostras reduzidasforam separadas em uma SDS-PAGE de 4 a 12 % (NuPAGE, Invitrogen) (2ug de rSLPI por cavidade) e marcadas com Coomassie.A figura 1 mostra que a clivagem do SLPI humano recombinatefoi observada depois que o rSLPI foi incubado com quimase humana porcerca de 20 minutos. Mesmo com uma quantidade de rSLPI 10 vezes maiorque a de quimase, a maior parte das proteínas de rSLPI foi clivada (dadosnão mostrados). O SLPI humano de comprimento total foi clivado em doisfragmentos. Análises por espectrometria de massa indicaram que aquantidade de cerca de 11,7 kD de SLPI humano de comprimento total foiclivada em dois segmentos de tamanho aproximado de 7,9 kD e 3,8 kD.

Para determinar o local exato da clivagem, foi executado umseqüenciamento N-terminal nas bandas de comprimento total (figura 1,banda A) e nas bandas clivadas (figura 1, bandas B e C). A análise doseqüenciamento indicou que a clivagem do SLPI humano recombinate porquimase humana ocorreu em Leu72-Met73. Os resultados mostraram que oSLPI, um inibidor conhecido da quimase (Fink et al., Biol Chem HoppeSeyler 1986; 367:567-71), atuou também como um substrato da quimase.Este fato é consistente com a atividade das proteases de mastócitos bovinose ovinos na clivagem do SLPI humano (Grutter et al., supra, e Pemberton etal., supra).

Um painel das proteases incluindo elastase, catepsina G,triptase e proteinase 3 foi testado para determinar a sua capacidade de clivaro SLPI humano recombinate usando a análise LC/MS. Sabe-se que estasprotease são inibidas pelo SLPI. Uma quantidade de 1 pg de SLPI humanorecombinate foi incubada por 5 horas com 50 ng de uma protease de teste.

As amostras foram, então, diluídas em 50 mM de uma solução tampão deNH4HCO3 até cerca de 0,1 pg de proteína / μί. A cromatografia líquida foifeita em um equipamento Agilent 1100 LC/MSD. A amostra diluída (10 pL)foi injetada em uma coluna Zorbax SB300 5u C8, C18 (150 χ 2,1 mm) a umataxa de 0,2 mL/min. As proteínas da amostra foram eluídas usando-se umgradiente de 30 minutos de 15% a 60% de solvente B em solvente A, sendoque o solvente A é: (0,1% de ácido fórmico + 0,02% de TFA)/ H2O e osolvente B é: (0,1% de ácido fórmico + 0,02% de TFA)/ACN. O rSLPI clivadofoi detectado em um tempo de retenção de 10,7 minutos, enquanto que oSLPI intacto foi detectado em 12,2 minutos. O espectrômetro de massaAgilent 1100 MSD SL foi interfaceado com um sistema 1100 HPLC atravésde uma fonte de ionização por eletrospray. O software Chemstation versão10.02 foi usado para o controle do sistema e para aquisição de dados.

Com o uso do espectrofotômetro, o rSLPI nativo foi isolado edetectado no tamanho esperado de 11,708 dáltons. Após a incubação comquimase, um segundo pico foi obtido por cromatografia líquida. O segundopico tinha 18 unidades de massa adicionais, o que é consistente com aadição de água à molécula de rSLPI quebrada ou clivada. Portanto, apresença do segundo pico indicou que a quimase realmente clivou o rSLPI,conforme foi observado nas análises SDS-PAGΕ. A incubação do rSLPI comas outras proteases do painel não produziu o segundo pico, indicando queas proteases testadas não clivaram o rSLPI. A redução das amostras derSLPI na presença das proteases resultou na clivagem da proteína de SLPI,indicando que as outras proteínas clivaram a forma reduzida de rSLPI.

- A incapacidade das outras proteases de clivar o SLPI éconsistente com os estudos de Vogelmeier et ai., que mostraram que nãohouve nenhuma clivagem de SLPI por elastase e catepsinas G (J Clin Invest1991;87:482-8).

Exemplo 2

Inibidores da quimase diminuíram a clivagem do rSLPI humano por quimasehumana

Este exemplo mostra o efeito dos inibidores da quimase naclivagem do SLPI humano pela quimase humana. Dois inibidores daquimase foram testados em várias concentrações: inibidor de quimase A,ácido [2-(3-{metil-[1-(naftaleno-2-carbonila)-piperidina-4-il]-carbamoíla}-naftalen-2-il)-1-naftaleno-1-il-2-oxo-etil]-fosfônico), que foi descrito emUS20030195172, e o inibidor de quimase B, ácido {(5-cloro-benzo[b]tiofeno-3-il)-[2-(3-cloro-5-fluoro-fenil)-vinilcarbamoil]-metil}-metil-fosfínico, que foidescrito em US20050176769.

O SLPI humano recombinate (80 pmols) foi incubado comquimase humana (80 pmols) na presença ou ausência de inibidor daquimase por 30 minutos a 37 0C em tris tampão (pH 7,5) a 1 M ou em PBS(solução salina tamponada com fostato). Foi feita uma análise Western paraquantificar o rSLPI e o produto de clivagem maior do SLPI (cerca de 7,9 kD)em análise por espectrometria de massa). As amostras foram desnaturadase reduzidas com um volume igual de solução tampão contendo SDS e beta-.

Cada amostra foi aplicada a um gel poliacrilamida com gradiente de 4 a 20%a um gel de poliacrilamida a 15%. As amostras foram submetidas aeletroforese e transferidas para uma membrana de PVDF (PierceBiotechnology, Rockford, IL, EUA). As manchas foram bloqueadas com 5%de leite / PBS-tween (PBS/0,4% tween-20) por 1 hora à temperaturaambiente. As manchas foram incubadas de um dia para o outro a 4 0C noanticorpo primário (anti-SLPI de cabra a 1:1000 ou anti-SLPI de coelho a1:2000) diluído na solução de bloqueio. Após três lavagens com PBS-tweena mancha foi incubada por 1 hora à temperatura ambiente com o anticorposecundário (HRP de cabra anticoelho ou HRP de coelho anticabra) diluído àrazão de 1:2500 em solução de bloqueio. As manchas foram lavadas 6vezes com PBS-tween e incubadas por 1 minuto à temperatura ambientecom reagentes quimioluminescentes Wester Lightning (Perkin Elmer,Boston, MA, EUA) e reveladas em Biomax Light Film (Eastman Kodak,Rochester, NY, EUA) em câmara escura. Um densitômetro, FluorChem®8000, Advanced Fluorescence, Chemiluminescence and Visible ImagingSystem da Alpha Innotech (San Leandro, CA, EUA), foi usado para medir asdensidades relativas à quantidade do rSLPI e à quantidade do produto declivagem maior de SLPI no filme revelado.

A porcentagem de clivagem de SLPI foi calculada com afórmula: 100 χ (densidade do produto de maior clivagem de SLPI /(densidade do rSLPI + densidade do produto de maior clivagem de SLPI)).

A figura 2 mostra os efeitos do inibidor da quimase na clivagemdo SLPI por quimase. A quantidade de inibição estava diretamenterelacionada com a quantidade de inibidor da quimase adicionado. Este fatosugeriu que este teste é útil para determinar a eficácia dos compostosinibidores da quimase.Exemplo 3

SLPI humano clivado por quimase humana em uma amostra clínica

Este exemplo ilustra um teste ex vivo para determinar a clivagemdo SLPI com uma amostra clínica facilmente acessível de saliva humana.

Dez μί de saliva humana foram incubados com quimase (4pg/0,1 U/5 μΜ) e/ou inibidor da quimase (100 μΜ) com volume aumentadopara 30 μί com PBS, (solução salina tamponada com fostato) por 30minutos a 37 °C. Para as amostras não-digeridas de saliva, 10 μί de salivaforam diluídos em 20 μί de PBS. Conforme descrito no Exemplo 2, foi feitauma análise Western para determinar a quantidade de SLPI e a quantidadedo produto de maior clivagem do SLPI, a partir dos quais a porcentagem declivagem de SLPI foi calculada.

A figura 3 mostra que a quimase exógena clivou o SLPI daamostra de saliva, da mesma forma que clivou o rSLPI. Ela mostra tambémo efeito de um inibidor da quimase na capacidade da quimase de clivar oSLPI. O inibidor da quimase, ácido {(5-cloro-benzo[b]tiofeno-3-il)-[2-(3,4-difluorofenil)-vinilcarbamoil]-metil}-metil-fosfínico, foi descrito emUS20050176769. O inibidor causou diminuição na atividade da quimase einibiu a clivagem do SLPI presente na saliva (figura 3). Estes resultadosindicaram que a atividade da quimase bem como a eficiência dos inibidoresda quimase podem ser monitoradas por amostras de saliva.

De forma consistente com os resultados do Exemplo 1, dentre opainel de proteases testadas, a clivagem de SLPI em saliva foi exclusiva daquimase. O produto de maior clivagem do SLPI não foi observado quando asamostras de saliva foram incubadas com catepsina G, triptase e proteinase3. Uma ligeira digestão do SLPI foi observada depois que a saliva foiincubada com elastase. Entretanto, a quantidade de produtos resultantes dadigestão, um par de bandas 11 kD e 10.5 kD após a análise de SDS-PAGE),foi diferente da dos produtos da clivagem resultante da digestão porquimase.

Exemplo 4

Processamento de SLPI com biomarcador de doenças associadas àquimase

A clivagem de SLPI foi medida em amostras de saliva humanaobtidas de pacientes normais e de pacientes com alergia, um distúrbioassociado à hiperatividade da quimase.

Foram obtidas amostras de saliva dos seres humanos objetos doestudo: um deles reclamando de uma condição alérgica induzida porexposição a camundongos (alergia) e o outro não apresentando nenhumaindisposição respiratória (normal). As amostras foram congeladas earmazenadas a -80 °C. As amostras foram descongeladas em gelo esubmetidas a vortex. 10 pL de saliva foram diluídos com 15pL de PBS(solução salina tamponada com fosfato). Conforme descrito no Exemplo 2,foi feita uma análise Western para determinar a quantidade de SLPI e aquantidade do produto de maior clivagem do SLPI, a partir dos quais aporcentagem de clivagem de SLPI foi calculada.

A figura 4 mostra as diferenças entre os níveis de clivagem deSLPI das amostras de saliva de indivíduos normais e de pacientes comalergia. Uma porcentagem mais alta de clivagem de SLPI foi observada naamostra de saliva do indivíduo com alergia, indicando que o processamentode SLPI pode ser usado como um biomarcador para doenças associadas àquimase.

Exemplo 5

A metodologia a seguir foi empregada para investigar oscomponentes solúveis (mediadores e citoquinas) da inflamação das viasaéreas superiores no nariz na linha de base e em resposta a um alérgenorelevante em indivíduos com rinite alérgica.

Materiais

1 pipeta (>10 cc) ou seringa de 10 cc

Solução estéril de lavagem nasal: NaCI a 0,9%, 10 mL para 1narina, preaquecido a 37 0C

Dispositivo de preaquecimento

Lenços de papel

Funil (40 mm)Seringas(IOcc)

Recipientes plásticos

Espéculo nasal

Spray nasal de xilometazolina a 0,1 % no gelo

Método

(Modificado da técnica validada por De Graaf-In 't Veld C, et al; Clin ExpAllergy 1995;25:966-73)

1. Uma solução estéril de NaCI a 0,9% é aquecida até 37 °C.

2. A acessibilidade do nariz é verificada com um espéculo nasale luz suficiente.

3. O indivíduo estende seu pescoço a aproximadamente 30°enquanto sentado. Injetar dez (10) cc de uma solução morna de NaCI a 0,9% em uma narina com uma pipeta ou seringa. Instruir o indivíduo para nãoengolir nem respirar durante o procedimento.

4. Depois de 10 segundos, pedir ao indivíduo para inclinar-sedelicadamente e expelir o líquido de lavagem do nariz em um funil(conectado a uma seringa de 10 cc).

5. Pré-desafio: fazer um total de 4 lavagens nasais para eliminaros detritos.

6. Para testar a reprodutibilidade do teste com o dia 1 do estudo,analisar o primeiro fluido de lavagem no dia 2 (pré-desafio); após a primeiralavagem nasal no dia 2, aspergir uma rajada de xilometazolina a 0,1 % emcada narina 10 minutos antes dos outros 3 procedimento NAL (não permitirque o indivíduo assoe o nariz).

7. Alguns minutos depois, fazer (e descartar) a segunda e aterceira lavagens nasais.

8. Armazenar o fluido da quarta lavagem em um recipienteplástico, no gelo, até o momento do processamento.

9. Processar todos os NALs dentro de um período de 1 hora eaté o momento do processamento armazenado no gelo.

Os resultados são mostrados na figura 5. A figura 5 mostra queum aumento de cSLPI se correlaciona com um aumento de sintomasalérgicos. As razões entre cSLPI e SLPI total em lavagens nasais foramdeterminadas pela análise western obtidas de indivíduos 0,75 hora e 0,5hora antes do desafio antigênico e 0,5 hora e 7 horas depois do desafioantigênico (figura 5b). Os pacientes foram classificados de acordo com aintensidade dos sintomas (escore Lebel) nos mesmos pontos do tempo(figura 5a).

Exemplo 6

O escarro dos indivíduos foi coletado de acordo com asrecomendações da European Respiratory Society (ERS) e com protocolosque envolvem a inalação de soluções salinas hipertônicas ou isotônicas. Ocatarro de indivíduos com nível baixo a moderado de asma foi induzido comsolução salina hipertônica que foi aerossolizada e inalada por 3 a 4 períodosde 5 minutos. Em indivíduos com nível mais severo de asma, foi usado umprotocolo ERS modificado, começando a inalação com solução salina normale evoluindo mais lentamente para solução salina hipertônica apenas se nãohouver queda significativa no FEV-i.

Os resultados são mostrados na figura 6. A figura 6 mostra queas amostras de catarro de indivíduos asmáticos contêm uma porcentagemmaior de cSLPI/SLPI total do que a das amostras de indivíduos normais eque se correlaciona com os níveis de quimase desses indivíduos. Foramtomadas amostras de escarro tanto de pacientes normais quanto depacientes asmáticos. Tanto as razões entre cSLPI e SLPI quanto os níveisde quimase foram determinados por análise western. Os valores foramdeterminados por análise de densitometria.LISTAGEM DE SEQUENCIAS

<110> Dohnson and Johnson Pharmaceutical Research & Development,L.L.C.

<120> "PROCESSAMENTO DE SLPI PELA QUIMASE"

<1B0> PRD-<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 247

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 1

Met Leu Leu Leu Pro Leu Pro Leu Leu Leu Phe Leu Leu Cys Ser Arg15 10 15

Ala Glu Ala Gly Glu Ile Ile Gly Gly Thr Glu Cys Lys Pro His ser20 25 30

Arg Pro Tyr Met Ala Tyr Leu Glu Ile Val Thr ser Asn Gly Pro Ser35 40 45

Lys Phe Cys Gly Gly Phe Leu Ile Arg Arg Asn Phe Val Leu Thr Ala50 55 60

Ala His Cys Ala Gly Arg Ser lie Thr Val Thr Leu Gly Ala His Asn65 70 75 80

Ile Thr Glu Glu Glu Asp Thr Trp Gln Lys Leu Glu Val Ile Lys Gln85 90 95

Phe Arg His Pro Lys Tyr Asn Thr Ser Thr Leu His His Asp lie Met100 105 110

Leu Leu Lys Leu Lys Glu Lvs Ala Ser Leu Thr Leu Ala vai Gly Thr115 * 120 125

Leu Pro Phe Pro Ser Gln Phe Asn Phe vai Pro Pro Gly Arg Met Cys130 135 140

Arg vai Ala Gly Trp Gly Arg Thr Gly vai Leu Lys Pro Gly Ser Asp145 150 155 160

Thr Leu Gln Glu vai Lys Leu Arg Leu Met Asp Pro Gln Ala Cys Ser165 170 175His Phe Arg Asp Phe Asp His Asn Leu Gln Leu Cys vai Gly Asn Pro180 185 190

Arg Lys Thr Lys Ser Ala Phe Lys Gly Asp ser Gly Gly Pro Leu Leu195 200 205

Cys Ala Gly vai Ala Gln Gly Ile Val Ser Tyr Gly Arg Ser Asp Ala210 215 220

Lys Pro Pro Ala vai Phe Thr Arg Ile Ser His Tyr Arg Pro Trp Ile225 230 235 240

Asn Gln Ile Leu Gln Ala Asn245

<210> 2

<211> 107

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 2

ser Gly Lys Ser Phe Lys Ala Gly Val Cys Pro Pro Lys Lys Ser Ala1 5 10 15

Gln cys Leu Arg Tyr Lys Lys Pro Glu Cys Gln Ser Asp Trp Gln Cys20 25 30

Pro Gly Lys Lys Arg Cys Cys Pro Asp Thr cys Gly Ile Lys Cys Leu35 40 45

Asp Pro Val Asp Thr Pro Asn Pro Thr Arg Arg Lys Pro Gly Lys Cys50 55 60

pro Val Thr Tyr Gly Gln Cys Leu Met Leu Asn Pro Pro Asn Phe Cys65 70 75 80

Glu Met Asp Gly Gln cys Lys Arg Asp Leu Lys Cys Cys Met Gly Met85 90 95

Cys Gly Lys Ser Cys vai Ser Pro Val Lys Ala100 105

<210> 3

<211> 72

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 3Ser Gly Lys Ser Phe Lys Ala Gly vai Cys Pro Pro Lys Lys Ser Ala1 5 10 15

Gln Cys Leu Arg Tyr Lys Lys Pro Glu Cys Gln Ser Asp Trp Gln Cys20 25 BO

Pro Gly Lys Lys Arg Cys Cys Pro Asp Thr Cys Gly Ile Lys Cys Leu35 40 45

Asp Pro vai Asp Thr Pro Asn Pro Thr Arg Arg Lys Pro Gly Lys Cys50 55 60

Pro Val Thr Tyr Gly Gln Cys Leu65 70

<210> 4

<211> 35

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 4

Met Leu Asn Pro Pro Asn Phe Cys Glu Met Asp Gly Gln Cys Lys Arg15 10 15

Asp Leu Lys Cys Cys Met Gly Met Cys Gly Lys Ser Cys vai Ser Pro20 25 30

Val Lys Ala35

Claims (37)

1. Método para a detecção de doenças associadas à qui-mase em seres humanos objetos de estudo, compreendendo as eta-pas de:a. obter uma amostra biológica do ser humano objeto doestudo;b. medir o nível de clivagem do inibidor humano de protea-se liberada por leucócitos (SLPI - secretory Ieucocyte protease inhibi-tor) pela quimase humana na amostra biológica; ec. comparar o nível medido na etapa b) com uma amostrade controle do nível de clivagem do SLPI humano pela quimase hu-mana de um ser humano saudável, sendo que um nível elevado declivagem de SLPI humano por quimase humana comparado com adita amostra de controle indica que o ser humano objeto do estudotem uma doença associada à quimase ou tem um risco elevado deadquirir uma doença associada à quimase.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a a-mostra biológica é saliva.

3. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a do-ença associada à quimase é selecionado do grupo que consiste emasma, rinite alérgica, fibrose, hipertensão, hipertrofia cardíaca, insufi-ciência cardíaca, artrite reumatóide, nefropatia diabética, fibrose císti-ca, doença pulmonar obstrutiva crônica (COPD) e doenças inflamatórias.

4. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o nívelde clivagem do SLPI humano pela quimase humana é medido como arazão entre um fragmento do SLPI humano resultante de clivagem daquimase e o comprimento total do SLPI presente na amostra biológica.

5. Método de acordo com a reivindicação 4, em que o frag-mento de SLPI humano resultante da clivagem da quimase consisteessencialmente na seqüência de aminoácidos da SEQ ID n- 3.

6. Método de acordo com a reivindicação 4, em que o frag-mento de SLPI humano resultante da clivagem da quimase consisteessencialmente na seqüência de aminoácidos da SEQ ID nQ 4.

7. Método de acordo com a reivindicação 4, em que o SLPIhumano de comprimento total consiste essencialmente na seqüênciade aminoácidos da SEQ ID nQ 2.

8. Método para avaliar a eficácia do tratamento de uma do-ença associada à quimase em um paciente humano, compreendendoas etapas de:a. obter uma amostra biológica do paciente humanob. medir o nível de clivagem do inibidor humano de protea-se liberada por leucócitos (SLPI - secretory Ieucocyte protease inhibi-tor) pela quimase humana na amostra biológica; ec. comparar o nível medido na etapa b) com uma amostrade controle do nível de clivagem do SLPI humano pela quimase hu-mana no paciente humano antes do tratamento, sendo que um nívelmenor de clivagem do SLPI humano pela quimase humana em rela-ção ao dito controle indica que o tratamento da doença associada àquimase no dito paciente é eficaz.

9. Método de acordo com a reivindicação 8, em que a a-mostra biológica é saliva.

10. Método de acordo com a reivindicação 8, em que a do-ença associada à quimase é selecionado do grupo que consiste emasma, rinite alérgica, fibrose, hipertensão, hipertrofia cardíaca, insufi-ciência cardíaca, artrite reumatóide, nefropatia diabética, fibrose císti-ca, doença pulmonar obstrutiva crônica (COPD) e doenças inflamató-rias.

11. Método de acordo com a reivindicação 8, em que o ní-vel de clivagem do SLPI humano pela quimase humana é medido co-mo a razão entre um fragmento do SLPI humano resultante de cliva-gem da quimase e o comprimento total do SLPI presente na amostrabiológica.

12. Método de acordo com a reivindicação 11, em que ofragmento de SLPI humano resultante da clivagem da quimase consis-te essencialmente na seqüência de aminoácidos da SEQ ID ns 3.

13. Método de acordo com a reivindicação 11, em que ofragmento de SLPI humano resultante da clivagem da quimase consis-te essencialmente na seqüência de aminoácidos da SEQ ID n9 4.

14. Método de acordo com a reivindicação 11, em que oSLPI humano de comprimento total consiste essencialmente na se-qüência de aminoácidos da SEQ ID nQ 2.

15. Método de acordo com a reivindicação 8, em que o tra-tamento de uma doença associada à quimase em um paciente huma-no envolve um composto que diminui a atividade biológica da quimase.

16. Método para medir a atividade biológica da quimasehumana, compreendendo as etapas de:a. colocar a quimase humana em contato com um SLPIhumano em uma mistura de teste;b. submeter a mistura de teste a incubação sob condiçõestais que a quimase humana faça a clivagem do SLPI humano; ec. medir o nível de clivagem do SLPI humano pela quimasehumana na mistura de teste.

17. Método de acordo com a reivindicação 16, em que aquimase humana compreende a seqüência de aminoácidos da SEQID n2 1.

18. Método de acordo com a reivindicação 16, em que oSLPI humano compreende a seqüência de aminoácidos da SEQ ID n° 2.

19. Método de acordo com a reivindicação 16, em que onível de clivagem do SLPI humano pela quimase humana é medidocomo a razão entre um fragmento do SLPI humano resultante de cli-vagem da quimase e o comprimento total do SLPI presente na amos-tra biológica.

20. Método de acordo com a reivindicação 19, em que ofragmento de SLPI humano resultante da clivagem da quimase consis-te essencialmente na seqüência de aminoácidos da SEQ ID nQ 3.

21. Método de acordo com a reivindicação 19, em que ofragmento de SLPI humano resultante da clivagem da quimase consis-te essencialmente na seqüência de aminoácidos da SEQ ID ns 4.

22. Método de acordo com a reivindicação 16, em que odito SLPI humano é isolado.

23. Método de acordo com a reivindicação 16, em que odito SLPI humano está em uma amostra biológica.

24. Método de acordo com a reivindicação 16, em que adita quimase humana é isolada.

25. Método de acordo com a reivindicação 16, em que adita quimase humana está em uma amostra biológica.

26. Método para identificar um composto que diminui a ati-vidade biológica da quimase humana caracterizado por compreenderas etapas de:a. colocar um composto de teste em contato com a quima-se humana e com um SLPI humano em uma mistura de teste;b. submeter a mistura de teste a incubação sob condiçõestais que a quimase humana faça a clivagem do SLPI humano;c. medir o nível de clivagem do SLPI humano pela quimasehumana na mistura de teste; ed. comparar o nível detectado na etapa c) com o nível deuma amostra de controle, sendo que o composto de teste é omitido damistura de teste.

27. Método de acordo com a reivindicação 26, em que aquimase humana compreende a seqüência de aminoácidos da SEQID ne 1.

28. Método de acordo com a reivindicação 26, em que oSLPI humano compreende a seqüência de aminoácidos da SEQ ID n-2.

29. Método de acordo com a reivindicação 26, em que onível de clivagem do SLPI humano pela quimase humana é medidocomo a razão entre um fragmento do SLPI humano resultante de cli-vagem da quimase e o comprimento total do SLPI presente na amos-tra biológica.

30. Método de acordo com a reivindicação 29, em que ofragmento de SLPI humano resultante da clivagem da quimase consis-te essencialmente na seqüência de aminoácidos da SEQ ID nQ 3.

31. Método de acordo com a reivindicação 29, em que ofragmento de SLPI humano resultante da clivagem da quimase consis-te essencialmente na seqüência de aminoácidos da SEQ ID ns 4.

32. Método de acordo com a reivindicação 26, em que odito SLPI humano é isolado.

33. Método de acordo com a reivindicação 26, em que odito SLPI humano está em uma amostra biológica.

34. Método de acordo com a reivindicação 26, em que adita quimase humana é isolada.

35. Método de acordo com a reivindicação 26, em que adita quimase humana está em uma amostra biológica.

36. Kit, compreendendo:a. um anticorpo que se liga especificamente a um fragmen-to do SLPI que consiste essencialmente na seqüência de aminoácidosda SEQ ID n9 3 ou da SEQ ID n9 4; eb. uma instrução para correlacionar o nível medido do ditofragmento de SLPI com a atividade biológica da quimase humana.

37. Método para classificar um paciente que tem uma pro-babilidade maior de responder a um tratamento que envolve um inibi-dor da quimase, caracterizado por compreender as etapas de:a. obter uma amostra biológica do paciente;b. medir o nível de clivagem do inibidor humano de protea-se liberada por leucócitos (SLPI - secretory Ieucocyte protease inhibi-tor) pela quimase humana na amostra biológica; ec. comparar o nível medido na etapa b) com uma amostrade controle do nível de clivagem do SLPI humano pela quimase hu-mana de um ser humano saudável, em que um nível elevado de cliva-gem de SLPI humano por quimase humana comparado com a ditaamostra de controle indica que o paciente tem uma probabilidademaior de responder a um tratamento que envolve um inibidor da qui-mase.