BRPI0706526A2 - sequências de nucleotìdeos e polipeptìdeos correspondentes que conferem caracterìsticas de eficiência aperfeiçoada no uso de nitrogênio em plantas - Google Patents

Abstract

SEQUêNCIAS DE NUCLEOTIDEOS E POLIPEPTIDEOS CORRESPONDENTES QUE CONFEREM CARACTERISTICAS DE EFICIêNCIA APERFEIçOADA NO USO DE NITROGêNIO EM PLANTAS. A presente invenção refere-se a moléculas isoladas de ácido nucleico e seus polipeptídeos codificados correspondentes capazes de conferir os traços de eficiência aperfeiçoada no uso de nitrogênio em plantas. A presente invenção refere-se ainda ao uso dessas moléculas de ácido nucleico e polipeptídeos fazendo com que plantas transgênicas, células de plantas, materiais de planta ou sementes de uma planta apresentem eficiência aperfeiçoada no uso de nitrogênio, que leva a um aperfeiçoamento no tamanho da planta, crescimento vegetativo, taxa de crescimento, vigor dos brotos, e/ou biomassa que são alterados no que se refere às plantas do tipo selvagem cultivadas sob condições normais e/ou anormais de nitrogênio.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "SEQÜÊN-CIAS DE NUCLEOTÍDEOS E POLIPEPTÍDEOS CORRESPONDENTESQUE CONFEREM CARACTERÍSTICAS DE EFICIÊNCIA APERFEIÇOADANO USO DE NITROGÊNIO EM PLANTAS".

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se a moléculas de ácido nucleicoisoladas e a seus polipeptídeos codificados correspondentes capazes deaperfeiçoar a eficiência aperfeiçoada do uso de nitrogênio em plantas. Apresente invenção refere-se ainda ao uso de moléculas de ácido nucleico epolipeptídeos para formação de plantas, células de plantas, materiais deplantas ou sementes transgênicas de uma planta com eficácia aperfeiçoadano uso de nitrogênio se comparado com plantas do tipo selvagem construí-das sob condições de nitrogênio similares, normais e/ou anormais. Este pe-dido de patente reivindica prioridade para o pedido de patente U.S. n°60/778.568, arquivado em 1o de março de 2006, e ao pedido de patente U.S.N0: 60/758.831, arquivado em 13 de janeiro de 2006.

FUNDAMENTO DA INVENÇÃO

Plantas especificamente aperfeiçoadas para agricultura, horticul-tura, conversão de biomassa, e outras indústrias (p.ex. indústria do papel,plantas como fábricas para produção de proteínas ou outros compostos) po-dem ser obtidas empregando tecnologias moleculares. Como um exemplo,um grande valor agronômico pode resultar do crescimento acentuado dasplantas sob baixas condições de nitrogênio.

Nitrogênio é mais freqüentemente o nutriente mineral limitadordo crescimento para a produção de safras, e todas as safras do campo sãofundamentalmente dependentes de fontes de nitrogênio exógenas. Fertili-zantes nitrogenados, normalmente fornecidos como nitrato de amônio, nitra-to de potássio ou uréia, perfazem tipicamente 40% dos custos associados àssafras na agricultura intensiva, tais como milho e trigo. A eficiência aumenta-da do uso de nitrogênio por plantas permite a produção de maiores rendi-mentos com menores aplicações de fertilizante, permite que os rendimentosde safra existentes, a serem obtidos, sejam obtidos com inputs menores defertilizante, ou permite melhores rendimentos em solos de qualidade maispobre (Good et al. (2004) Trends Plant Sei. 9:57-605). Quantidades maioresde proteínas nas safras também podem ser produzidas com maior eficiênciade custo.

Interessantemente, sabe-se que altas concentrações de nitrogê-nio são tóxicas para plantas, especialmente no estágio de semente (Brennere Krogmeier (1989) PNAS 86:8185-8188). Aqui, concentrações anormalmen-te altas de nitrogênio criam efeitos de nitrogênio tóxicos ("queima") e/ou le-vam à inibição da germinação, reduzindo o rendimento como uma conse-quência. Isto é um problema, em particular durante a aplicação de uréia eoutros fertilizantes à base de amônia, já que segmentos de um campo deplantio podem variar amplamente quanto ao nitrogênio presente disponível,e altos níveis de amônio são tóxicos para as plantas. A maior parte das plan-tas de safra são gravemente danificadas por condições de nitrogênio eleva-das, de modo que o rendimento pode ser significantivamente reduzido.

Plantas têm uma série de meios para lidar com deficiências denutrientes de nitrogênio, tais como, baixa disponibilidade de nitrogênio. Ummecanismo importante avalia a disponibilidade de nitrogênio no solo e res-ponde concordantemente modulando a expressão genética, enquanto umsegundo mecanismo seqüestra ou armazena nitrogênio em tempos de a -bundância para ser utilizado mais tarde, Ainda, os particulares desses me-canismos, e como eles interagem para governar a eficiência do uso de nitro-gênio em um ambiente competitivo (isto é, nitrogênio baixo e/ou alto) perma-nece amplamente não esclarecido.

O mecanismo sensor de nitrogênio se baseia em uma expressãogenética regulada, e permite respostas fisiológicas e metabólicas rápidas amudanças no fornecimento de nitrogênio inorgânico no solo através do ajus-te da apreensão de nitrogênio, particionamento, remobilização e transporte,em resposta a mudanças nas condições ambientais. Níveis de nitrato agemcomo um sinal para iniciar uma série de respostas que servem para repro-gramar o metabolismo, fisiologia e desenvolvimento da planta (Redinbaughet al. (1991) Physiol. Plant. 82, 640-650.; Forde (2002) Annual Review of.Plant Biology 53, 203-224). Expressão de genes que induz nitrogênio temsido caracterizada por uma série de genes em algum detalhe. Esses incluemreductase de nitrato, reductase dé nitrito, desidrogenase 6-fosfoglucanato, etransportadores de nitrato e amônia (Redinbaugh et al. (1991) Physiol. Plant.82, 640-650; Huber et al. (1994) Plant Physiol 106, 1667-1674; Hwang et al.(1997) Plant Physiol. 113, 853-862; Redinbaugh et al. (1998) Plant Science134, 129-140; Gazzarrini et al. (1999) Plant Cell 11, 937-948; Glass et al.(2002) J. Exp. Bot. 53, 855-864; Okamoto et al. (2003) Plant Cell Physiol. 44,304-317).

Pesquisas sobre os elementos de controle que agem em eis efatores de ligação de DNA envolvidos na expressão genética regulada pornitrato focaram nos genes de nitrato reductase de tabaco e espinafre, e iden-tificaram diversos supostos elementos reguladores ( Rastogi et al. (1993)PIantJ 4, 317-326; Lin etal. (1994) Plant Physiol. 106, 477-484; Hwang etal.(1997) Plant Physiol. 113, 853-862). Um perfil transcricional da expressãogenética regulada por nitrato tem um extenso conhecimento de genes e pro-cessos regulados por disponibilidade de nitrato e também identifica uma sé-rie de genes com padrões de expressão espaciais e temporais distintos (Ce-res não publicado; Wang et al. (2000) Plant Cell 12, 1491-1510; Wang et al.(2003) Plant Physiol. 132, 556-567).

Ineficiências no uso eficiente de nitrogênio (NUE) podem ser su-peradas pelo uso de uma expressão genética regulada por nitrogênio paramodificar a resposta de enzimas limitadoras de crescimento e vias metabóli-cas que ocorrem em resposta a mudanças na disponibilidade de nitrogênio.

Retrospectos gerais desses caminhos e processos podem ser observadosem: Derlot et al. (2001) Amino Acid Transport. Em Plant Nitrogen (eds. Lea eMorot-Gaudry), págs. 167-212. Editora Springer, Berlim, Heidelberg; Glass etal. (2002) J. Exp. Bot. 53: 855-864; Krapp et al. (2002) Nitrogen and Signa-ling. Em Photosynthetic Nitrogênio Assimilation and Associated Carbon Res-piratory Metabolism (eds. Foyer e Noctor), págs. 205-225. Kluwer AcademicPublisher, Dordrecht, The Netherlands; e Touraine et al. (2001) Nitrate upta-ke and its regulation. Em Plant Nitrogen (eds. Lea e Morot-Gaudry), págs. 1-36. Editora Springer, Berlim, Heidelberg. A superação das etapas Iimitantesdo crescimento na assimilação de nitrogênio, transporte e metabolismo temo efeito de aumentar o rendimento, reduzir o teor de nitrogênio e reduzir oteor de proteína das plantas cultivadas sob condições Iimitantes de nitrogênio.

A disponibilidade é sustentabilidade de um fluxo de alimento ealimentação para pessoas e animais domésticos tem sido uma alta priorida-de através da civilização humana e se situa na origem da agricultura. Espe-cialistas e pesquisadores nos campos da ciência agronômica, agricultura,ciência das safras, horticultura, e ciência florestal, mesmo hoje em dia, estãoconstantemente tentando encontrar e produzir plantas com um maior poten-cial de crescimento para alimentar uma população mundial crescente e paragarantir um fornecimento de matérias- primas renováveis. O forte nível depesquisa nesses campos da ciência indica o nível de importância considera-do por líderes, em cada ambiente geográfico e clima ao redor do mundo, nofornecimento de fontes sustentáveis de alimento, forragem e energia.

A manipulação do desempenho da safra foi conseguida conven-cionalmente por séculos através do cultivo de plantas. O processo de cultivo,entretanto, tanto é consumidor de tempo quanto intensivo em trabalho (time-consuming e labor-intensive). Além disso, programas de cultivo apropriadosdevem ser especialmente projetados para cada espécie de planta relevante.

Por outro lado, um grande progresso foi feito no uso de aborda-gens genéticas moleculares para manipular plantas para fornecer melhoressafras. Através da introdução e expressão de moléculas recombinantes deácido nucleico em plantas, pesquisadores estão agora aptos a prover a co-munidade com espécies de plantas talhadas para crescer mais eficazmentee produzir mais produto apesar de ambientes geográficos e/ou climáticosúnicos. Essas novas abordagens têm a vantagem adicional de não estaremlimitadas a uma espécie de plantas, mas ao invés disso são aplicáveis paramúltiplas espécies de plantas diferentes (Zhang et ál. (2004) Plant Physiol.135:615; Zhang et al (2001) Pro. Nati Acad. Sei. USA 98:12832).

Apesar deste progresso, existe hoje continuamente uma grandenecessidade de processos geralmente aplicáveis que aperfeiçoam o cresci-mento de plantas florestais ou agrículas para se ajustar às necessidadesparticulares, dependendo das condições ambientais específicas. Para estafinalidade, a presente invenção é dirigida ao aperfeiçoamento da eficiênciado uso de nitrogênio para maximizar o crescimento de plantas em várias sa-fras dependendo do ambiente particular no qual a safra deve crescer, carac-terizado pela expressão de moléculas de DNA recombinantes em plantas.Essas moléculas podem ser da própria planta e podem ser simplesmenteexpressas em um nível maior ou menor, ou as moléculas podem ser de dife-rentes espécies de plantas.

RESUMO DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se, portanto, moléculas e polipeptí-deos de ácido nucleico isoladas, e ao seu uso na preparação de plantastransgênicas, células de plantas, materiais de plantas ou sementes de plan-tas contendo NUE aperfeiçoado quando comparado a plantas do tipo selva-gem cultivadas sob condições de nitrogênio similares ou idênticas, normaise/ou anormais.

A presente invenção também se refere a processos para o au-mento do potencial de crescimento em plantas devido a NUE, moléculas epolipeptídeos de ácido nucleico recombinantes usados para esses proces-sos, bem como a plantas com um potencial de crescimento aumentado devi-do a NUE aumentado. A frase "aumentando o potencial de crescimento" re-fere-se ao crescimento continuado, sob condições de nitrogênio alto ou bai-xo, melhor recuperação do solo após exposição a nitrogênio baixo ou alto, etolerância aumentada a condições variadas de nitrogênio. Um tal aumentono potencial de crescimento resulta de um aumento em NUE.

A menos que definido de outro modo, todos os termos técnicos ecientíficos usados aqui têm o mesmo significado que o compreendido nor-malmente por um indivíduo com habilidade comum na arte desta invenção.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

Figura 1. Alinhamento da seqüência de amino ácidos de homó-logos de Lead 82 (ME02507), SEQ ID NO:81. Regiões conservadas sãó en-cerradas em uma caixa. Uma seqüência de consenso é mostrada abaixo doalinhamento.

Figura 2. Alinhamento da seqüência de amino ácido de homólo-gos de Lead 92 (ME08309), SEQ ID NO: 107. Regiões conservadas estãoencerradas em uma caixa. Uma seqüência de consenso é mostrada abaixodo alinhamento.

Figura 3. Alinhamento de homólogos da seqüência de aminoácido de ME03926, SEQ ID NO: 201. Regiões conservadas estão encerra-das em uma caixa. Uma seqüência de consenso é mostrada abaixo do ali-nhamento.

Figura 4. Alinhamento da seqüência de amino ácido de homólo-gos de Lead ME07344, SEQ ID NO: 140. Regiões conservadas estão encer-radas em uma caixa. Uma seqüência de consenso é mostrada abaixo doalinhamento.

Figura 5. Alinhamento da seqüência de amino ácido de homólo-gos de Lead 93 (ME10822), SEQ ID NO: 114. Regiões conservadas estãoencerradas em uma caixa. Uma seqüência de consenso é mostrada abaixodo alinhamento.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

1. A INVENÇÃO

A invenção do presente pedido de patente pode ser descrita por,mas não necessariamente limitada a, os seguintes modos de execução dosexemplos.

A presente invenção divulga novas moléculas de ácido nucleicoisoladas, moléculas de ácido nucleico que interferem com essas moléculasde ácido nucleico, moléculas de ácido nucleico que hibridizam com essasmoléculas de ácido nucleico, e moléculas de ácido nucleico isoladas quecodificam a mesma proteína devido a degeneração do código de DNA. Mo-dos de execução adicionais do presente pedido de patente ainda incluem ospolipeptídeos codificados pelas moléculas de ácido nucleico isoladas da pre-sente invenção.

Mais particularmente, as moléculas de ácido nucleico da presen-te invenção compreendem: (a) uma seqüência de nucleotídeo que codificauma seqüência de amino ácido que é pelo menos 85% idêntica a quaisquerLeads 82, 92, 93, 98, ME07344, ME05213, ME02730 e ME24939 corres-pondendo à SEQ ID NO: 81, 105, 107, 114, 116, 201, 140, 84, 112 e 200,respectivamente, (b) uma seqüência de nucleotídeo que é complementar aquaisquer das seqüências de nucleotídeos de acordo com (a), (c) uma se-qüência de nucleotídeos de acordo com quaisquer das SEQ ID Nos. NO: 80,104, 106, 113, 115, 127, 139, 202, 203 e 204, (d) uma seqüência de nucleo-tídeos capaz de interferir com quaisquer das seqüências de nucleotídeos deacordo com (a), (e) uma seqüência de nucleotídeos capaz de formar um du-plex de ácido nucleico hibridizado com o ácido nucleico de acordo com qual-quer um dos parágrafos (a) - (e) a uma temperatura de cerca de 40°C atécerca de 48°C abaixo da temperatura de fusão do duplex de ácido nucleicohibridizado, e (f) uma seqüência de nucleotídeo que codifica quaisquer dasseqüências de amino ácido dos Leads 82, 85, 92, 93, 98, 112, ME07344,ME05213, ME02730 e ME24939, correspondendo às SEQ ID NOS: 81, 105,107, 114, 116, 201, 140, 84, 112 e 200, respectivamente.

Modos de execução adicionais da presente invenção incluemaquelas seqüências de moléculas de polipeptídeos e ácido nucleico divulga-das nas SEQ ID NOS: 80, 81, 104, 105, 106, 107, 113, 114, 115, 116, 127,128, 139, 140, 84, 112 e 200-204.

A presente invenção ainda engloba um vetor compreendendoum primeiro ácido nucleico contendo uma seqüência de nucleotídeo que co-difica uma transcrição de planta e/ou sinal de translação, e um segundo áci-do nucleico contendo uma seqüência de nucleotídeo de acordo com as mo-léculas de ácido nucleico isoladas da presente invenção. Mais particularmen-te, os primeiros e segundos ácidos nucleicos podem estar ligados operacio-nalmente. Ainda mais particularmente, ó segundo ácido nucleico pode serendógeno a um primeiro organismo, e qualquer outro ácido nucleico no vetorpode ser endógeno a um segundo organismo. Mais particularmente, o pri-meiro e segundo organismo podem ser de espécies diferentes.

Em um outro modo de execução da presente invenção, uma cé-lula hospedeira pode compreender uma molécula isolada de ácido nucleicode acordo com a presente invenção. Mais particularmente, a molécula deácido nucleico isolada da presente invenção encontrada na célula hospedei-ra da presente invenção pode ser endógena ao primeiro organismo e podeser ladeada por seqüências de nucleotídeos endógenas a um segundo or-ganismo. Ainda, o primeiro e segundo organismos podem ser espécies dife-rentes. Ainda mais particularmente, a célula hospedeira da presente inven-ção pode compreender um vetor de acordo com a presente invenção, com-preendendo ele próprio moléculas de ácido nucleico de acordo com aquelasda presente invenção.

Em um outro modo de execução da presente invenção, os poli-peptídeos isolados da presente invenção podem, adicionalmente, compre-ender seqüências de amino ácidos que são pelo menos 85% idênticas aquaisquer uma das Leads 82, 85, 92, 93, 98, 112, ME07344, ME05213,ME02730 e ME24939, correspondendo às SEQ ID NOS: 81, 105, 107, 114,116, 201, 140, 84, 112 e 200, respectivamente.

Outros modos de execução da presente invenção incluem méto-dos de introdução de um ácido nucleico isolado da presente invenção emuma célula hospedeira. Mais particularmente, uma molécula de ácido nuclei-co isolada da presente invenção pode ser contactada em uma célula hospe-deira sob condições que permitem o transporte do ácido nucleico isoladopara dentro da célula hospedeira. Ainda mais particularmente, um vetor con-forme descrito em um modo de execução anterior da presente invenção po-de ser introduzido em uma célula hospedeira pelo mesmo método.

Métodos de detecção também estão disponíveis como modos deexecução da presente invenção. Particularmente, métodos de detecção deuma molécula de ácido nucleico de acordo com a presente invenção emuma amostra. Mais particularmente, a molécula de ácido nucleico isolada deacordo com a presente invenção pode ser contactada com uma amostra sobcondições que permitem uma comparação da seqüência de nucleotídeos damolécula de ácido nucleico com uma seqüência de nucleotídeos do ácidonucleico na amostra. Os resultados de uma tal análise podem então ser con-siderados para determinar se a molécula de ácido nucleico isolada da pre-sente invenção é detectável, e portanto está presente na amostra.

Um outro modo de execução da presente invenção compreendeuma planta, célula de planta, material de planta ou sementes de plantascompreendendo uma molécula de ácido nucleico isolada e/ou vetor da pre-sente invenção. Mais particularmente, a molécula de ácido nucleico isoladada presente invenção pode ser exógena à planta, célula da planta, materialda planta ou semente da planta.

Um outro modo de execução da presente invenção inclui umaplanta regenerada a partir de uma célula de planta ou semente de acordocom a presente invenção. Mais particularmente, a planta, ou plantas deriva-das da planta, célula da planta, material da planta ou sementes de uma plan-ta da presente invenção de preferência aperfeiçoou NUE, aumentou o tama-nho (no todo ou em parte), aumentou o crescimento vegetativo, e/ou aumen-tou as características da biomassa (algumas vezes posteriormente coletiva-mente referida como biomassa aumentada) se comparado a uma planta dotipo selvagem cultivada sob condições idênticas normais e/ou anormais. A-lém disso, a planta transgênica pode compreender uma primeira molécula deácido nucleico isolada da presente invenção, que codifica uma proteína en-volvida na modulação de NUE, características de crescimento e fenótipo, euma segunda molécula de ácido nucleico isolada que codifica um promotorcapaz de induzir a expressão em plantas, onde o componente de modulaçãodo crescimento e fenótipo e o promotor estão operavelmente ligados. Maispreferentemente, o primeiro ácido nucleico isolado pode ser expresso erro-neamente na planta transgênica da presente invenção, e a planta transgêni-ca exibe características moduladas se comparado a uma planta progenitoradesprovida do polinucleotídeo, quando a planta transgênica e a planta pro-genitora são cultivadas sob condições de nitrogênio ambiental idênticasnormais e/ou anormais. Em outro modo de execução da presente invenção oNUE modulado, características de crescimento e fenótipo podem ser devidosà inativação de uma seqüência particular, usando por exemplo um RNA in-terferente.Um outro modo de execução consiste de uma planta, célula deplanta, material de planta ou semente de uma planta de acordo com a pre-sente invenção, que compreende uma molécula de ácido nucleico isolada dapresente invenção, onde a planta, ou plantas derivadas da planta, célula daplanta, material da planta ou semente de uma planta, tem as característicasmoduladas de NUE, crescimento e fenótipo, se comparado com uma plantado tipo selvagem cultivada sob condições ambientais de nitrogênio idênticasnormais e/ou anormais..

O polinucleotídeo que confere NUE, biomassa ou vigor aperfei-çoados pode ser expresso erroneamente na planta transgênica da presenteinvenção, e a planta transgênica exibe um NUE, biomassa ou vigor aumen-tados se comparado com uma planta progenitora sem o polinucleotídeo,quando a planta transgênica e a planta progenitora são cultivadas sob con-dições ambientais de nitrogênio idênticas normais /ou anormais. Em outromodo de execução da presente invenção NUE, biomassa ou vigor aperfei-çoados do fenótipo exibido sob condições ambientais de nitrogênio normaise/ou anormais podem ser devidos à inativação de uma seqüência particular,empregando por exemplo um RNA interferente.

Outro modo de execução consiste de uma planta, célula de plan-ta, material de planta ou semente de uma planta de adordo com a presenteinvenção que compreende uma molécula de ácido nucleico isolada da pre-sente invenção, onde a planta, ou plantas derivadas da planta, célula deplanta, material da planta ou semente de uma planta, tem NUE, biomassa ouvigor aumentados se comparado a uma planta do tipo selvagem cultivadasob condições ambientais de nitrogênio idênticas e/ou anormais.

Outro modo de execução da presente invenção inclui métodosde aumento de NUE, biomassa ou vigor em plantas. Mais particularmente,esses métodos compreendem a transformação de uma planta com uma mo-lécula de ácido nucleico isolada de acordo com a presente invenção. De pre-ferência, o método é um método de aumento de NUE, biomassa ou vigor naplanta transformada, onde a planta é transformada com uma molécula deácido nucleico que codifica o polipeptídeo da presente invenção.Polipeptídeos da presente invenção incluem seqüências de con-senso. As seqüências de consenso são aquelas conforme mostrado nas Fi-guras 1-5.

2. DEFINIÇÕES

Os seguintes termos são utilizados neste pedido de patente :Condições Anormais de Nitrogênio:

Níveis de nitrogênio podem variar por 10 ordens de grandeza,assim espécies de plantas variam na sua capacidade de tolerar condiçõesparticulares de nitrogênio. Espécies de plantas sensíveis a nitrogênio, inclu-sive muitas espécies agronomicamente importantes, podem ser danificadaspor condições de nitrogênio que tanto são baixas ou altas se comparadascom a faixa de nitrogênio necessária para o crescimento normal. Nas condi-ções de nitrogênio acima ou abaixo da faixa necessária para o crescimentonormal, a maior parte das espécies de plantas serão danificadas ou sofrerãopotencial de crescimento reduzido. Assim, "condições de nitrogênio anor-mais" podem ser definidas como as concentrações de nitrogênio na qualuma dada espécie de planta será adversamente afetada, conforme evidenci-ado por sintomas tais como clorofila reduzida (por exemplo, medida por ab-sorção de clorofila a/b), reduzida fotossíntese (por exemplo, medido pelafixação de C02), dano na membrana (por exemplo, medido por vazamentode eletrólito), clorose (por exemplo, via inspeção visual), perda de biomassaou rendimento de semente. Já que espécies de plantas variam na sua capa-cidade de tolerar condições anormais de nitrogênio, as condições ambientaisprecisas que causam um stress de nitrogênio não podem ser generalizadas.Entretanto, plantas que toleram nitrogênio são caracterizadas por sua capa-cidade de reter sua aparência normal ou se recuperar rapidamente de condi-ções de nitrogênio anormais. Tais plantas tolerantes a nitrogênio produzembiomassa e rendimento maior do que plantas que são não tolerantes a nitro-gênio. Diferenças na aparência física, recuperação e rendimento podem serquantificados e estatisticamente analisados usando métodos de medição eanálise bastante conhecidos.

Mudas de plantas variam consideravelmente na sua capacidadede crescer sob condições anormais de nitrogênio. Geralmente, as sementesde muitas espécies de plantas não crescerão bem em concentrações de ni-trogênio menores do que cerca de 1 ppm ou maiores do que cerca de 750ppm. Concentrações elevadas de nitrogênio de amoníaco também são ini-bodoras à germinação de sementes e ao crescimento de mudas, e podemocorrer quando fertilizante à base de amônia é usado (Brenner e Krogmeier(1989) PNAS 86:8185-8188).

Uma vez que as sementes tenham sido embebidas em água,elas se tornam muito susceptíveis a doenças, danos por água e danos quí-micos. Sementes e mudas de plantàs que são tolerantes a stress de nitrogê-nio durante a germinação podem sobreviver por períodos relativamente lon-gos, sob os quais a concentração de nitrogênio é muito alta ou muito baixapara crescimento normal. Já que espécies de plantas podem variar quanto àsua capacidade de tolerar condições anormais de nitrogênio durante a ger-minação, as condições ambientais precisas causadoras de stress por nitro-gênio durante a germinação não podem ser generalizadas. Entretanto, se-mentes e mudas de plantas que são tolerantes a nitrogênio durante a germi-nação são caracterizadas por sua capacidade de permanecer viáveis ou dese recuperar rapidamente e de condições de nitrogênio alto ou baixo. Taisplantas tolerantes a nitrogênio germinam, estabelecem-se, crescem maisrapidamente, e por fim produzem mais biomassa e rendimento do que plan-tas que não são tolerantes a nitrogênio. Diferenças na taxa de germinação,aparência, recuperação e rendimento podem ser quantificadas e estatistica-mente analisadas usando métodos de medição e análise bastante conhecidos.

Proteínas Funcionalmente Comparáveis ou Homólogos Funcionais:

Esta frase descreve um conjunto de proteínas que exercem fun-ções similares dentro de um organismo. Por definição, espera-se que a per-turbação de uma proteína individual dentro daquele conjunto (através da ex-pressão errada ou mutação, por exemplo) confira um fenótipo similar secomparado a uma perturbação de qualquer outra proteína individual. Taisproteínas tipicamente compartilham a similaridade da seqüência resultanteda atividade bioquímica. Dentro desta definição, homólogos, ortólogos, eparólogos são considerados funcionalmente comparáveis.

Proteínas funcionalmente comparáveis darão origem à mesmacaracterística em um grau similar, mas não necessariamente o mesmo. Pro-teínas tipicamente comparáveis dão origem às mesmas características ondea medição quantitativa devida a uma das comparáveis é pelo menos 20% daoutra; mais tipicamente, entre 30 a 40%; ainda mais tipicamente, entre 50-60%; ainda mais tipicamente entre 70 a 80%; ainda mais tipicamente entre90 a 100% da outra.Seqüências Hetérólogas:

"Seqüências heterólogas" são aquelas que não estão operacio-nalmente ligadas ou que não são contíguas umas às outras na natureza. Porexemplo, um promotor de milho é considerado heterólogo a uma seqüênciana região codificadora da Arabidopsis. Também um promotor de um gen co-dificador de um fator de crescimento do milho é considerado heterólogo auma seqüência codificadora do receptor de milho para o fator de crescimen-to. Seqüências reguladoras de elemento, tais como seqüências com termi-nação UTRs ou seqüências com terminação final em 3' que não se originamna natureza do mesmo gen que a seqüência codificadora, são consideradasheterólogas à referida seqüência codificadora. Elementos operativamenteligados na natureza e contíguos uns aos outros não são heterólogos um emrelação ao outro. Por outro lado, os mesmos elementos permanecem opera-cionalmente ligados mas se tornam heterólogos se outra seqüência preen-chedora é colocada entre eles. Portanto, o promotor e as seqüências codifi-cadoras de um gen de milho que expressam um transportador de amino áci-do não são heterólogos um em relação ao outro, mas o promotor e a se-qüência codificadora de um gen de milho operativamente ligado de uma no-va maneira são heterólogos.

Condições de Nitrogênio Altas:

Esta frase refere-se a concentrações totais nitrogênio que resul-tarão no retardo do crescimento ou dano de tecido devido a stress tônico ouosmótico. Concentrações de meio de crescimento de nitrogênio que levarãoa stress de nitrogênio não podem ser generalizadas. Entretanto, concentra-ções de nitrogênio que reduzem a taxa de germinação em mais do que 20%,25%, 30%, 35%, 40%, 45% ou 50% são consideradas altas e em excesso.Condições de Nitrogênio Baixas:

A frase "condições de nitrogênio baixas" refere-se a concentra-ções de nitrogênio que levam a sintomas de deficiência de nitrogênio, taiscomo cor verde pálido da folha, clorose e crescimento e vigor reduzidos. Es-sas concentrações de nitrogênio são geralmente menores do que 10 ppm denitrato em um teste de nitrato do solo. Tipicamente, condições de nitrogêniobaixas levam a uma redução de pelo menos 20%, 25%, 30%, 35%, 40%,45%, 50%, 60%, 70%, 80% ou 90% no crescimento e/ou vigor.Expressão errada:

O termo "expressão errada" refere-se a um aumento ou decrés-cimo na transcrição de uma região codificadora em uma seqüência de RNAcomplementar se comparado ao tipo selvagem. Este termo também abrangea expressão e/ou translação de um gen ou região codificadora de tal trans-crição e/ou translação para um diferente período, se comparado ao tipo sel-vagem e/ou de uma locação não natural dentro do genoma da planta, inclu-indo um gen ou região codificadora de uma espécie de planta diferente oude um organismo não-vegetal.Eficiência no Uso de Nitrogênio:

A eficiência com a qual as plantas utilizam nitrogênio inorgânicopara produzir biomassa e sementes é denominada Eficiência do Uso de Ni-trogênio (NUE). Uma série de diferentes métodos de medição de NUE, ecomponentes de NUE, são rotineiramente utilizados por cientistas. NUE éusualmente medido como a quantidade de rendimento de biomassa ou se-mente produzido por unidade de nitrogênio aplicada ao solo. NUE tambémpode ser representado como o produto de dois fatores, aumento da eficiên-cia e eficiência de utilização. A eficiência da apreensão de nitrogênio mede aeficiência com a qual a planta remove nitrogênio do solo, enquanto medidasde eficiência de utilização medem o rendimento obtido por unidade de nutri-ente absorvida por uma planta. Uma série de diferentes processos biológicosestá envolvida na definição de um NUE particular da planta e pode, inde-pendentemente, afetar processos envolvidos no aumento da eficiência e efi-ciência de utilização. Muitos desses processos são geneticamente determi-nados e podem ser aperfeiçoados por manipulação genética ou biotecnoló-gica dos genes responsáveis pela determinação desse traços.Condições de Nitrogênio Normais:

Espécies de plantas variam na sua capacidade de tolerar condi-ções de nitrogênio particulares. Espécies de plantas sensíveis a nitrogênio,incluindo muitas espécies agronomicamente importantes, podem ser danifi-cadas por condições de nitrogênio que são tanto baixas ou altas se compa-radas à faixa de nitrogênio necessária para o crescimento normal. Nas con-dições de nitrogênio acima ou abaixo da faixa necessária para o crescimentonormal, a maioria das espécies das plantas serão danificadas ou sofrerãoum potencial de crescimento reduzido. Portanto, "condições normais de ni-trogênio" pode ser definido como a concentração de nitrogênio na qual umadada espécie de planta crescerá sem dano. Já que espécies de plantas vari-am na sua capacidade de tolerar condições de nitrogênio, as condições am-bientais precisas que fornecem condições normais de nitrogênio não podemser generalizadas. Entretanto, o crescimento normal exibido por plantas into-lerantes a nitrogênio é caracterizado pela inabilidade de reter uma aparêncianormal ou de se recuperar rapidamente das condições de nitrogênio anor-mais. Tais plantas intolerantes a nitrogênio produzem baixa biomassa e ren-dem menos do que plantas que são tolerantes a nitrogênio. Diferenças naaparência física, recuperação e rendimento podem ser quantificadas e esta-tisticamente analisadas usando medição e métodos de análise bem conhecidos.

Mudas de plantas variam consideravelmente na sua capacidadede crescer sob condições anormais de nitrogênio. Geralmente, sementes demuitas espécies de plantas não crescerão bem em uma concentração denitrogênio menor do que cerca de 1 ppm ou maior do que cerca de 750 ppm.Altas concentrações de nitrogênio de amoníaco também são inibidoras paragerminação de sementes e crescimento de semente e podem ocorrer quan-do fertilizante à base de amônio é empregado (Brenner e Krogmeier (1989)PNAS 86:8185-8188).

Uma vez que as sementes tenham sido embebidas em água e-las se tornam muito susceptíveis a doença, danos por água e danos quími-cos. Sementes e mudas de plantas que são tolerante s a stress de nitrogêniodurante a germinação podem sobreviver por períodos relativamente longossob os quais a concentração de nitrogênio é muito elevada ou muito baixapara o crescimento normal. Já que espécies de plantas variam na sua capa-cidade de tolerar condições de nitrogênio durante a germinação, as condi-ções ambientais precisas que causam stress por nitrogênio durante a germi-nação não podem ser generalizadas. Entretanto, o crescimento normal as-sociado às sementes intolerantes a nitrogênio é caracterizado pela incapaci-dade de permanecer viável ou de se recuperar rapidamente das condiçõesde nitrogênio baixas ou altas. Tais sementes intolerantes a nitrogênio nãogerminam, não se tornam desenvolvidas, crescem mais lentamente, se detodo, e finalmente morrem mais rápido ou produzem menos biomassa e ren-dimento do que sementes que são tolerantes a nitrogênio. Diferenças nataxa de germinação, aparência, recuperação e rendimento podem ser quan-tificadas e estatisticamente analisadas usando métodos de medição e análi-se bem conhecidos.

Porcentagem de identidade de seqüência: O termo "identidadepercentual da seqüência" refere-se ao grau de identidade entre qualquer se-qüência de busca dada, p.ex. SEQ ID NO: 102, e uma seqüência objeto.Uma seqüência alvo tipicamente tem um comprimento que é de cerca de 80porcento a 200 porcento do comprimento da seqüência de busca p.ex., 82,85, 87, 89, 90, 93, 95, 97, 99, 100, 105, 110, 115, ou 120, 130, 140, 150,160, 170, 180, 190 ou 200 porcento do comprimento da seqüência duvidosa.Uma identidade percentual para qualquer ácido nucleico alvo ou polipeptídeorelativo a um ácido nucleico ou polipeptídeo de busca pode ser determinadacomo se segue. Uma seqüência de busca (por exemplo uma seqüência deácido nucleico ou de amino ácido) é alinhada a uma ou mais seqüências deácido nucleico ou amino ácido usando o programa de computador CIustaIW(versão 1,83, parâmetros de default), que permite alinhamentos de seqüên-cias de ácido nucleico ou de proteínas a serem èxecutados ao longo de todoa seu comprimento (alinhamento global). Chenna et ai. (2003) Nucleic Acidsfíes. 31(13):3497-500.

ClustalW calcula a melhor combinação entre uma busca e umaou mais seqüências individuais, e alinhando-as de modo que identidades,similaridades e diferenças possam ser determinadas. Lacunas de um oumais resíduos podem ser inseridas em uma seqüência de busca, uma se-qüência alvo, ou ambas, para maximizar os alinhamentos de seqüência. Pa-ra alinhamentos rápidos de seqüências de ácido nucleico em par, os seguin-tes parâmetros default são usados: tamanho da palavra: 2; tamanho de jane-la: 4; método de avaliação: porcentagem; número de diagonais de topo: 4; epenalidade de lacuna (gap penalty): 5. Para múltiplos alinhamentos de se-qüências de ácido nucleico são empregados os seguintes parâmetros: pena-lidade de abertura de lacuna: 10,0; penalidade de extensão de lacuna (gapextension penalty): 5,0; e transições de peso: sim. Para todos os alinhamen-tos rápidos em par das seqüências de proteína, são empregados os seguin-tes parâmetros: tamanho de palavra: I; tamanho de janela: 5; método deavaliação: porcentagem; número de diagonais de topo: 5: 5 penalidade delacuna: 3. Para alinhamentos múltiplos das seqüências de proteína, são em-pregados os seguintes parâmetros: matriz de peso: blosum; penalidade deabertura de lacuna (gap opening penalty): 10,0; penalidade de extensão delacuna: 0,05; lacunas hidrófilas: ligado (on); resíduos hidrófilos: Gly, Pro, Ser,Asn, Asp, Gln, Glu, Arg, e Lys; penalidades das lacunas com resíduo especí-fico: on. O resultado do CIustaIW é uma seqüência de alinhamento que refle-te o relacionamento entre as seqüências. CIustaIW pode ser executado, porexemplo, no sítio web do Baylor College of Medicine Search Launcher e nosítio web do European Bioinformatics Institute no World Wide Web (ebi.ac.uk/clustalw).

Para determinar uma identidade percentual de uma seqüênciaindividual ou uma seqüência de ácido nucleico ou de amino ácido em rela-ção a uma seqüência de busca, as seqüências são alinhadas empregando-se Clustal W, o número de pares/combinações idênticas no alinhamento édividido pelo comprimento de busca, e o resultado é multiplicado por 100.Nota-se que o valor da identidade percentual pode ser arredondado para omais próximo a decimal. Por exemplo, 78,11, 78,12, 78,13, e 78,14 são arre-dondados para baixo para 78,1, enquanto 78,15, 78,16, 78,17, 78,18, e78,19 são arredondados para cima para 78,2.Eficiência Fotosíntética:

A eficiência fotossintética, ou o transporte de elétrons através dofotosistema II, é estimada pelo relacionamento entre Fm, o sinal de fluores-cência máxima e o flúorescência variável, Fv. Aqui, uma redução no quan-tum de rendimento ótimo (Fv/Fm) indica stress e pode ser usada para moni-torar o desempenho de plantas transgênicas comparado a plantas nãotransgênicas sob baixas condições de nitrogênio.Regiões Reguladoras:

O termo "região reguladora" refere-se a seqüências de nucleotí-deos que, quando operacionalmente ligadas a uma seqüência, influenciam ainiciação da transcrição, ou a iniciação da translação, ou a terminação detranscrição da referida seqüência, e a taxa dos referidos processos, e/ou aestabilidade, e/ou a mobilidade de um produto de transcrição ou de transla-ção. Conforme empregado aqui, o termo "ligado operacionalmente" refere-seao posicionamento de uma região reguladora e à referida seqüência parapermitir a referida influência. Regiões reguladoras incluem, sem limitação,seqüências promotoras, seqüências aumentadoras, elementos de resposta,locais de reconhecimento de proteína, elementos indutíveis, seqüências Ii-gantes de proteína, regiões não transladadas 5' e 3' (UTRs), locais de parti-da transcricionais, seqüências de terminação, seqüências de poliadenilaçãoe introns. Regiões reguladoras podem ser classificadas em duas categorias,regiões promotoras e outras regiões reguladoras.Área da muda:

A área total da folha de uma muda de cerca de 2 semanas.Vigor da muda ou vigor:

Conforme empregado aqui, "vigor da muda" ou "vigor" refere-seà característica da planta onde a planta emerge do solo mais rapidamente,tem uma taxa de germinação aumentada (i.e., germina mais rapidamente),tem uma muda mais rápida e maior ou crescimento adulto e/ou germinamais rapidamente quando cultivada sob condições similares se comparadoao tipo selvagem ou controle sob condições similares. O vigor das plantasnovas tem sido comumente definido para compreender as propriedades dassementes que determinam "o potencial para emergência rápida e uniforme, edesenvolvimento de plantas novas normais sob uma ampla faixa de condi-ções de campo".

Restrinqência (rigor):

"Restringência (rigor)," conforme usado aqui é uma função docomprimento da amostra da molécula de ácido nucleico, composição da a-mostra da molécula de ácido nucleico (teor de G + C), concentração de sal,concentração de solvente orgânico e temperatura de hibridização e/ou con-dições de lavagem. A restringência é tipicamente medida pelo parâmetro Tm,que é a temperatura na qual 50% das moléculas de ácido nucleico comple-menteres no ensaio de hibridização são hibridizadas, em termos de um dife-rencial de temperatura de Tm. Elevadas condições de restringência (rigor)são aquelas fornecendo uma condição de Tm - 5°C até Tm - 10°C. Condiçõesde rigor medianas ou moderadas e restringência são aquelas que fornecemTm - 20°C até Tm - 29°C. Baixas condições de rigor são aquelas que forne-cem uma condição de Tm - 40°C a Tm - 48°C. O relacionamento entre condi-ções de hibidização e Tm (em °C) é expresso pela equação matemática:Tm = 81,5 -16,6(logi0[Na+]) + 0,41 (%G+C) - (600/N) (I)onde N é o número de nucleotídeos da amostra de moléculas de ácido nu-cleico. Esta equação trabalha bem para amostras de 14 a 70 nucleotídeosde comprimento que são idênticas à seqüência alvo. A equação abaixo, paraTm de híbridos de DNA- DNA, é útil para amostras contendo comprimentosna faixa de 50 ou maior do que 500 nucleotídeos, e para condições que in-cluem um solvente orgânico (formamida):

Tm = 81,5+16,6 Iog {[Na+]/(1+0,7[Na+])}+ 0,41(%G+C)-500/L0,63(%formamida) (II)onde L representa o número de nucleotídeos na amostra no híbrido (21). OTm da Equação Il é afetado pela natureza do híbrido: para híbridos de DNA-RNA, Tm é 10-15°C mais elevado do que o calculado; para híbridos de RNA-RNA1 Tm é 20-25°C maior. Porque a Tm diminui cerca de TC para cada 1%de decréscimo em homologia quando uma longa amostra é empregada(Frischauf et a). (1983) J. Mol Bioll 170: 827-842), condições de rigor podemser ajustadas para favorecer a detecção de genes idênticos ou membrosfamiliares correspondentes.

A Equação Il é derivada assumindo que a reação está em equi-líbrio. Portanto, hibridizações de acordo com a presente invenção são maispreferentemente executadas sob condições de excesso de amostra e permi-tindo tempo suficiente para atingir o equilíbrio. O tempo requisitado para al-cançar o equilíbrio pode ser encurtado empregando um tampão de hibridiza-ção que inclui um acelerador de hibridízação, tal como sulfato de dextranoou outro polímero de volume maior.

O rigor pode ser controlado durante a reação de hibridízação, oudepois que a hibridízação ocorreu, alterando as condições de sal e tempera-tura das soluções de lavagem. As fórmulas mostradas acima são igualmenteválidas quando empregadas para computar o rigor de uma solução de Iava-gem. Rigores preferidos da solução de lavagem situam-se dentro de amplasfaixas mencionadas acima; um rigor elevado está 5-8°C abaixo da Tm, umrigor médio ou moderado está 26-29°C abaixo da Tm e um rigor baixo está45-48°C abaixo da Tm.

Hibridizações de alto rigor envolvem tipicamente etapas de hibri-dização e de lavagem. A etapa de hibridízação pode ser executada em solu-ção aquosa de hibridízação a uma temperatura entre 63eC e 70SC, mais pre-ferentemente a uma temperatura entre 65SC e 689C, e mais preferentementea uma temperatura de 65-C. Alternativamente, a etapa de hibridízação dealto rigor pode ser executada em solução de hibridízação de formamida auma temperatura entre 409C e 469C, a uma temperatura entre 41 eC e 449C,e mais preferentemente a uma temperatura de 42eC.

Uma etapa de lavagem é executada a seguir à hibridízação, euma lavagem inicial é executada com solução de lavagem 1 a 25SC ou 37eC.Em seguida a etapa inicial, lavagens adicionais são realizadas com uma so-lução de lavagem 1 a uma temperatura entre 63SC e 709C, mais preferente-mente a uma temperatura entre 65eC e 689C, e mais preferentemente a umatemperatura de 659C. O número de etapas de lavagem adicionais pode serde 1, 2, 3, 4, 5 ou mais. O tempo de ambas as etapas de lavagem inicial eadicional pode ser de 5 minutos, 10 minutos, 15 minutos, 20 minutos, 25 mi-nutos, 30 minutos, 45 minutos, 1 hora, 1,5 horas, 2 horas ou mais.

Estão indicadas abaixo as composição de hibridização e solu-ções de lavagem e seus componentes. Uma pessoa com habilidade comumna técnica reconhecerá que essas soluções são típicas e exemplares de so-luções de hibridização de alto rigor.Solução Aquosa de Hibridização: 6X SSC ou 6X SSPE0,05% Blotto ou 5X Reagente de Denhardt100 pg/ml de DNA de esperma de salmão desnaturado0,05% SDS

Solução de Hibridização de Formamida: 50% Formamida6X SSC ou 6X SSPE

0,05% Blotto ou 5X Reagente de Denhardt100 pg/ml de DNA de esperma de salmão desnaturado0,05% SDSSolução de Lavagem 1: 2X SSC ou SSPE0,1% SDS

Solução de Lavagem 2: 0,1 X SSC ou SSPE

0,5% SDS20XSSC: 175,3 g de NaCI

88,2 g de citrato de sódioLeva ã 800 ml com H2OAjuste para o pH 7 com NaOH 10 η

Leva a 1L com H2O20XSSPE: 175,3 g NaCI

27,6 g NaH2PO4Leva a 800 ml com H2O-H2O7,4 g EDTA

Ajuste a pH 7,4 com NaOH 10 ηLeva a 1L com H2O

1X BLOTTO: 5% de leite desidratado sem gordura0,02% azida de sódio50X Reagente de Denhardt: 5 g de Ficoll

5 g de polivinilpirrolidona5 g de BSAAjuste a 500 ml com H2OSuperpiscina:

Conforme usado no contexto da presente invenção, um "super-piscina" contem uma quantidade igual de semente de 500 eventos diferen-tes, representando 100 seqüências de nucleotídeo exógenas. Um evento éuma planta carregando uma única inserção de uma seqüência exógena dis-tinta que expressa erroneamente aquela seqüência. A transformação deuma única seqüência de polinucleotídeos pode resultar em múltiplos eventosporque a seqüência pode se inserir em uma parte diferente do genoma comcada transformação.

T0: O termo "T0" refere-se à planta como um todo, tecido de ex-planta ou tecido caloso, inoculado com o meio de transformação.

Ti: O termo Ti refere-se tanto à progênie da planta T0, no casoda transformação de toda a planta, ou a muda de planta regenerada, no ca-so da transformação de explante ou tecido caloso.

T2: O termo T2 refere-se à progênie da planta Ti. A progênie T2 éo resultado da auto-fertilização ou polinização cruzada de uma planta T1.

T3: O termo T3 refere-se à progênie de segunda geração daplanta que é o resultado direto de um experimento de transformação. Progê-nie T3 é o resultado da auto-fertilização ou polinização cruzada de uma plan-ta^.

Transformação: Exemplos dos meios pelos quais isto pode serconseguido são descritos abaixo e incluema transformação mediada por A-grobacteríum (de dicotiledôneas (Needleman e Wunsch (1970) J. MoL Biol.48:443; .Pearson e Lipman (1988) Proc. NatL Acad. Sei. (USA) 85: 2444), demonocotiledôneas (Yamauchi et al. (1996) PIantMoIBioI. 30:321-9; Xu et al.(1995) Plant MoL Biol. 27:237; Yamamoto et al. (1991) Plant Cell 3:371), emétodos biolísticos (P. Tijessen, "Hybridization with Nucleic Aeid Probes" EmLaboratory Teehniques in Bioehemistry and Molecular Biology, P.C. vand derVliet, ed., c. 1993 por Elsevier, Amsterdã), eletroporação, em Plant techni-ques, e semelhantes. Uma tal planta contendo o ácido nucleico exógeno éreferida aqui como T0 para a planta transgênica primária e Ti para a primeirageração.

Condições Variadas de Nitrogênio: No contexto da presente in-venção, a frase "condições variadas de nitrogênio" refere-se às condições decrescimento nas quais a concentração de nitrogênio disponível flutua dentroe fora da faixa normal. Esta frase abrange situações nas quais a concentra-ção de nitrogênio presente é inicialmente baixa, mas aumenta para nívelnormal ou níveis altos, bem como situações onde a concentração inicial denitrogênio presente é alta, mas então cai para níveis normais ou baixos. Si-tuações envolvendo múltiplas mudanças na concentração de nitrogênio pre-sente, tais como flutuações dos níveis alto até baixo, também estão abrangi-das por esta frase. Essas mudanças da concentração de nitrogênio presentepodem ocorrer de uma maneira gradual ou brusca.

3. CARACTERÍSTICAS IMPORTANTES DOS POLINUCLEOTÍDEOS E PO-LIPEPTÍDEOS DA INVENÇÃO

As moléculas de ácido nucleico e polipeptídeos da presente in-venção são de interesse porque, quando as moléculas de ácido nucleico sãoexpressas erroneamente (i.e., quando expressas a uma locação não naturalou em uma quantidade aumentada ou reduzida relativa ao tipo selvagem),elas produzem plantas que exibem NUE aperfeiçoado se comparado a plan-tas do tipo selvagem cultivadas sob condições normais e/ou anormais denitrogênio, conforme evidenciado pelos resultados de vários experimentosdivulgados abaixo. Este traço característico pode ser empregado para explo-rar ou para maximizar produtos de planta. Por exemplo, as moléculas de á-cido nucleico e polipeptídeos da presente invenção são empregadas paraaumentar a expressão de genes que fazem com que a planta tenha um NUEmodulado, biomassa, vigor da taxa de crescimento ou do vigor das novasplantas.

Porque as seqüências e métodos divulgados aumentam a NUE,o crescimento vegetativo e a taxa de crescimento sob condições normaise/ou anormais de nitrogênio, os métodos divulgados podem ser utilizadospara aumentar a produção de biomassa. Por exemplo, plantas que crescemvegetativamente têm um aumento em NUE, resultando na produção aperfei-çoada de biomassa quando cultivadas sob condições normais e/ou anormaisde nitrogênio, se comparado com uma planta da mesma espécie, que não égeneticamente modificada, cultivada sob condições idênticas. Exemplos deaumentos na produção de biomassa incluem aumentos de pelo menos 5%,pelo menos 20%, ou mesmo pelo menos 50%, quando comparado com umaquantidade de produção de biomassa para uma planta da mesma espéciecultivada sob condições idênticas normais e/ou anormais de nitrogênio.

De preferência, plantas transformadas são avaliadas pelo fenóti-po de baixa tolerância a nitrogênio desejado por comparação das áreas deplantas novas (mudas) ou eficiência fotossintética das plantas transformadase controladas cultivadas por aproximadamente quatorze dias. Eventos trans-formados com diferenças estatisticamente significativas dos controles podemser selecionados ou monitorados.

O ciclo de vida das plantas de floração em geral pode ser dividi-do em três fases de crescimento: vegetativo, infloréscência, e floral (fase dainflorescência tardia). Na fase vegetativa, o meristema apical de rebentos(SAM) gera folhas que mais tarde assegurarão os recursos necessários paraproduzir brotos férteis. No recebimento dos sinais ambientais e desenvolvi-mentais apropriados, a planta muda para crescimento reprodutivo e o SAMentra na fase de inflorescência (I) e origina uma inflorescência com os pri-mórdios da flor. Durante esta fase o destino de SAM e as raízes secundá-rias, que surgem nas axilas das folhas, é determinado por um conjunto degenes da identidade do meristema, sendo que alguns deles evitam e algunsdeles promovem o desenvolvimento de meristemas florais. Uma vez estabe-lecida, a planta entra na última fase de inflorescência, onde os órgãos floraissão produzidos. Se os sinais ambientais e desenvolvimentais apropriados,que a planta necessita para trocar para desenvolvimento floral ou reproduti-vo, são interrompidos, a planta não será capaz de entrar no crescimento re-produtivo, porém manterá o crescimento vegetativo.

O vigor da muda é uma característica importante que pode influ-enciar enormemente o crescimento com êxito de uma planta, tal como plan-tas de safra. Condições ambientais adversas, tais como disponibilidade po-bre ou excessiva de nitrogênio, condições secas, úmidas, frias ou quentes,podem afetar o ciclo de crescimento de uma planta, e o vigor das plantasnovas (i.e. a vitalidade e força sob tais condições podem ser diferenciadasentre com êxito e com falha no crescimento da safra). O vigor da muda temsido definido freqüentemente compreendendo as propriedades das semen-tes que determinam "o potencial para emergência e desenvolvimento rápidose uniformes de plantas novas normais de sementes normais sob uma amplafaixa de desenvolvimento de sementes de plantas com vigor aumentado.".Consequentemente, seria vantajoso desenvolver sementes de plantas com vigor aumentado.

Por exemplo, um vigor das plantas novas aumentado seria van-tajoso para a produção de plantas de cereais, tais como arroz, milho, trigo,etc.. Para essas safras, o crescimento pode comumente ser retardado ouinterrompido por temperaturas ambientais ou disponibilidade de nitrogêniolimitada durante a estação de plantio. Adicionalmente, a rápida emergência ecultivo de arroz permitiria que os cultivadores iniciassem uma irrigação deinundação precoce que pode economizar água e suprimir o crescimento fra-co. Genes associados com o aumento do vigor das sementes e/ou tolerânciaa frio e/ou tolerância a nitrogênio têm sido cultivados para a produção devariedades de safras aperfeiçoadas. (Walia et al (2005) Plant Physiology139:822-835)

Os ácidos nucleicos da invenção que respondem a nitrogêniotambém regulam para baixo genes que levam a uma inibição da alimentaçãode nitrogênio e redução. Exemplos de tais genes são aqueles que codificamas proteínas 14-3-3, que reprimem reductase de nitrato (Swiedrych et al.(2002) J Agric Food Chem 50 (7):2137-41,).

Expressão anti-senso desses nas plantas transgênicas causaum aumento no teor de amino ácido e proteína na semente e/ou folhas. Taisplantas são especialmente úteis para alimentação de rebanhos. Por exem-plo, um aumento no teor de amirio ácido e/ou proteína na alfafa fornece umaumento na qualidade da forragem, e assim a uma nutrição aprimorada.

4.OS POLIPEPTÍEDOS/POLINUCLEOTÍDEOS DA INVENÇÃO

Os polinucleotídeos da presente invenção e as proteínas ex-pressas via translação desses polinucleotídeos são indicadas na Listagemdas Seqüências, especificamente SEQ ID NOS: 80-153 e 155-204. A Lista-gem de Seqüências também consiste de proteínas funcionalmente compará-veis. Polipeptídeos compostos de uma seqüência dentro e definida por umadas seqüências de consenso podem ser utilizados para os propósitos dainvenção, a saber preparar plantas transgênicas com NUE aperfeiçoado,biomassa modulada e aperfeiçoada, taxa de crescimento e/ou vigor dasplantas novas melhoradas quando cultivadas sob condições normais e/ouanormais de nitrogênio.

5. USO DOS POLIPEPTÍDEOS PARA PREPARAR PLANTAS TRANSGÊNICAS

Para empregar as seqüências da presente invenção ou umacombinação delas ou partes, e/ou mutantes, e/ou fusões, e/ou variantes dasmesmas, são preparadas construções de DNA recombinante que compre-endem as seqüências de polinucleotídeos da invenção inseridas em um ve-tor e que são apropriadas para transformação das células das plantas. Aconstrução pode ser feita empregando técnicas padrão de DNA recombinan-te (ver, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, SegundaEdição, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, Nova Iorque.) e podeser introduzida nas espécies de planta de interesse, por exemplo, por trans-formação mediada por Agrobacterium, ou por outros meios de transforma-ção, por exemplo, conforme divulgado abaixo.A estrutura principal do vetor pode ser qualquer uma daquelastipicamente usadas no campo, tal como plamídeos, vírus, cromossomas arti-ficiais, BACs, YACs, PACs e vetores tais como, por exemplo, vetores pontede bactéria - levêdo, vetores Iambda fago, vetores de fusão T-DNA e vetoresde plasmídeo (ver, Shizuya et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 89:8794-8797; Hamilton et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 93: 9975-9979;Burke et al. (1987) Science, 236:806-812; Sternberg N. et al. (1990) ProcNatl Acad Sci U S A., 87:103-7; Bradshaw et al. (1995) Nucl Acids Res, 23:4850-4856; Frischauf et al. (1983) J. Mol Biol, 170: 827-842; Huynh et al.,Glover NM (ed) DNA Cloning: A practical Approach, Vol.1 Oxford: IRL Press'(1985); Walden et al. (1990) Mol Cell Biol 1:175-194).

Tipicamente, a construção compreende um vetor contendo umamolécula de ácido nucleico da presente invenção com quaisquer seqüênciastranscricionais e/ou translacionais reguladoras tais como, por exemplo, pro-motores, UTRs, e seqüências com terminação final 3'. Vetores também po-dem incluir, por exemplo, origens de replicação, regiões de ligação de anco-ragem (SARs), marcadores, seqüências homólogas, e introns. O vetor OPtambém pode compreender um marcador de genes que confere um fenótiposelecionável em células de plantas. O marcador pode de preferência codifi-car um traço de_resistência bioçida, particularmente resistência a antibiótico,tal como resistência a, por exemplo, kanamicina, bleomicina, ou higromicina,ou resistência a herbicida, tal como resistência a, por exemplo, glifosato, clo-rosulfurona ou fosfinotricina.

Será compreendido que mais do que uma região reguladora po-de estar presente em um polinucleotídeo recombinante, p.ex., introns, au-mentadóres, regiões de ativação fluxo acima, terminadores de transcrição, eelementos indutíveis. Portanto, mais do que uma região reguladora podeestar operavelmente ligada à referida seqüência.

Para "ligar operacionalmente" uma seqüência promotora a umaseqüência, o local de início da estrutura de leitura translacional da referidaseqüência está tipicamente posicionado entre um e cerca de cinqüenta nu-cleotídeos fluxo abaixo do promotor. Um promoter pode, entretanto, ser po-sicionado cerca de 5.000 nucleotídeos fluxo acima do local de início datranslação, ou cerca de 2.000 nucleotídeos acima do local de início da trans-crição. Um promotor compreende tipicamente pelo menos um promotor denúcleo (basal). Um promotor também pode incluir pelo menos um elementode controle, tal como uma seqüência aumentadora, um elemento fluxo acimaou uma região de ativação fluxo acima (UAR). Por exemplo, um aumentadorapropriado é um elemento regulador eis (-212 a -154) da região fluxo acimado gen da sintase de octopina (oes) (Fromm et al. (1989) Thè Plant Cell1:977-984).

Um promotor basal é a seqüência mínima necessária para reunirum complexo de transcrição requisitado para o início da transcrição. Promo-tores basais freqüentemente incluem um elemento "TATA caixa" que podeestar localizado entre cerca de 15 e cerca de 35 nucleotídeos fluxo acima dolocal do início da transcrição. Promotores basais também podem incluir umelemento "CCAAT caixa" (tipicamente a seqüência CCAAT) e/ou a seqüên-cia GGGCG, que pode estar localizado entre cerca de 40 e cerca de 200nucleotídeos, tipicamente cerca de 60 até cerca de 120 nucleotídeos, fluxoacima do local de início de transcrição.

A escolha de promotores a serem incluídos depende de diversosfatores, incluindo, mas não limitados a, eficiência, selecionabilidade, indutibi-lidade, nível de expressão desejado, e expressão preferencial celular ou detecido. É uma questão de rotina para um especialista na técnica modular aexpressão de uma seqüência através de seleção apropriada e posiciona-mento de promotores e outras regiões reguladoras relativas à referida se-qüência.

Alguns promotores apropriados iniciam a transcrição somente,ou predominantemente, em certos tipos de células. Por exemplo, um promo-tor que é predominantemene ativo em um tecido reprodutivo (p.ex., fruto,óvulo, pólen, pistilos, gametofito feminino, célula do ovo, célula central, nuce-lo, suspensor, célula sinergizada, flores, tecido embriônico, saco embrioná-rio, embrião, zigoto, endosperma integumento ou revestimento de semente)podem ser empregados. Portanto, conforme empregado aqui um promotorde tipo celular ou tecido preferencial é aquele que leva a expressão prefe-rencialmente no tecido alvo, mas também pode levar a alguma expressãoem outros tipos celulares ou tecidos. Métodos para identificação e caracteri-zação de regiões promotoras em DNA genômico de plantas incluem, por e-xemplo, aqueles descritos nas seguintes referências: Jordano et al. (1989)Plant Cell 1:855-866; Bustos et al. (1989) Plant Cell 1:839-854; Green et al.(1988) EMBO J. 7:4035-4044; Meier et al. (1991) Plant Cell 3:309-316; eZhang et al. (1996) Plant Physiology 110:1069-1079.

Exemplos de várias classes de promotores são descritos abaixo.Alguns dos promotores indicados abaixo são descritos em maior detalhe nopedido de patente US Nos. de Série 60/505,689; 60/518,075; 60/544,771;60/558,869; 60/583,691; 60/619,181; 60/637,140; 10/950,321; 10/957,569;11/058,689; 11/172,703; 11/208,308; e PCT/US05/23639. Será observadoque um promotor pode encontar critérios para uma classificação baseado nasua atividade em uma espécie de planta, e ainda encontrar critérios parauma classificação diferente baseada em sua atividade em outra espécie deplanta.

Outras Regiões Reguladoras: Uma região não transladada 5'(UTR) pode estar incluída em construções de ácido nucleico descritas aqui.Uma UTR 5'é transcrita, mas não é transladada, e situa-se entre o local deinício do transcrito e o códon de iniciação da translação e pode incluir o nu-cleotídeo +1. Uma UTR 3' pode estar posicionada entre o códon de termina-ção de translação e o final do transcrito. UTRs têm funções particulares taiscomo aumento da estabilidade de mRNA ou atenuação da translação. E-xemplos de UTRs 3' incluem, mas não stão limitados a, sinais de poliadeni-lação e seqüências de transcrição, p.ex., uma seqüência de terminação dasintase de nopalina.

Vários promotores podem ser empregados para dar expressãoaos polinucleotídeos da presente invenção. Seqüências de nucleotídeo detais promotores são indicadas na SEQ ID NOS: 1-79. Algumas delas podemser promotoras de ampla expressão, outras podem ser mais preferenciais para tecidos.Um promotor pode ser considerado "de ampla expressão" quan-do ele promove transcrição em muitos, mas não necessariamente todos ostecidos de plantas ou células de plantas. Por exemplo, um promotor de am-pla expressão pode promover a transcrição de uma seqüência operacional-mente ligada em um ou mais brotos, ponta do broto (ápice), e folhas, masfracamente ou não de todo em tecidos, tais como raízes ou hastes. Comooutro exemplo, um promotor de ampla expressão pode promover a transcri-ção de uma seqüência operavelmente ligada em uma ou mais hastes, broto,ponta do broto (ápice), e folhas, mas pode promover a transcrição fraçamen-te ou não de todo em todos os tecidos tais como tecidos reprodutivos de flo-res e sementes em desenvolvimento. Exemplo não Iimitantes de promotoresde ampla expressão que podem estar incluídos nas construções de ácidonucleico fornecidas aqui incluem as p326 (SEQ ID NO: 76), YP0144 (SEQ IDNO: 55), YP0190 (SEQ ID NO: 59), p13879 (SEQ ID NO: 75), YP0050 (SEQID NO: 35), p32449 (SEQ ID NO: 77), 21876 (SEQ ID NO: 1), YP0158 (SEQID NO: 57), YP0214 (SEQ ID NO: 61), YP0380 (SEQ ID NO: 70), PT0848(SEQ ID NO: 26), e PT0633 (SEQ ID NO: 7). Exemplos adicionais incluem opromotor do vírus do mosaico da couve flor (CaMV) 35S, o promotor de sin-tase de manopine (MAS), os promotores 11 ou 2' promotores derivados de T-DNA de Agrobacterium tumefaciens, o promotor do vírus do mosaico da es-crofulária 34S, promotores de actina tais como o promotor de actina do ar-roz, e promotores de ubiquitina tais como o promotor de ubiquitina-l do mi-lho. Em alguns casos, o promotor CaMV 35S é excluído da categoria depromotores de ampla expressão.

Promotores raiz ativos induzem a transcrição em tecidos da raiz,p.ex., endoderme da raiz, epiderme da raiz, ou tecidos vasculares da raiz.Em alguns modos de execução, promotores raiz ativos são promotores pre-ferenciais de raiz, i.e;, induzem a transcrição somente ou predominantemen-te ao tecido da raiz. Promotores preferenciais de raiz incluem os YP0128(SEQ ID NO: 52), YP0275 (SEQ ID NO: 63), PT0625 (SEQ ID NO: 6),PT0660 (SEQ ID NO: 9), PT0683 (SEQ ID NO: 14), e PT0758 (SEQ ID NO:22). Outros promotores preferenciais de raiz incluem os PT0613 (SEQ IDNO: 5), PT0672 (SEQ ID NO: 11), PT0688 (SEQ ID NO: 15), e PT0837 (SEQID NO: 24), que induzem à transcrição primariamente ao tecido da raiz e emuma menor extensão em óvulos e/ou sementes. Outros exemplos de promo-tores preferenciais de raiz incluem os sub-domínios específicos do promotorCaMV 35S da raiz (Lam et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86:7890-7894), promotores específicos da raiz celular reportados por Conkling et al.(1990) Plant Physiol. 93:1203-1211, e o promotor do gen de tabaco RD2.

Em alguns modos de execução, promotores que induzem àtranscrição do endoesperma de maturação podem ser úteis. A transcrição deum promotor de maturação de endoesperma inicia, tipicamente, após a ferti-lização e ocorre primariamente no tecido do endoesperma durante o desen-volvimento da semente, e é tipicamente mais elevada durante a fase de ce-lularização. São mais apropriados os promotores que são predominantemen-te ativos na maturação do endoesperma, apesar dos promotores que tam-bém são ativos em outros tecidos poderem ser utilizados algumas vezes.Exemplos não Iimitantes de promotores da maturação do endoesperma quepodem estar incluídos nas construções de ácido nucleico fornecidas aquiincluem o promotor napin, o promotor arcelin-5, o pomotor de gen faseolina(Bustos et al. (1989) Plant Cell 1 (9):839-853), o promotor do inibidor de trip-sina da soja (Riggs et al. (1989) Plant Cell 1(6):609-621), o promotor ACP(Baerson et al. (1993) Plant Mol Biol, 22(2):255-267), o gen estearoil-ACPdesaturase (Slocombe et al. (1994) Plant Physiol 104(4): 167-176), o promo-tor da subunidade a1 de β-conglimicina (Chen et al. (1986) Proc Natl AcadSci USA 83:8560-8564), o promotor da oleosina (Hong et al. (1997) PlantMol Biol 34(3):549-555), e promotores de zeína, tais como o promotor dezeína 15 kD, o promotor de zeína 16 kD, o promotor de zeína 19 kDr, o pro-motor de zeína 22 kD e o promotor de zeína 27 kD. Também são apropria-dos o promotor Osgt-1 do gen da glutelina-1 do arroz (Zheng et al. (1993)Mol. Cell Biol. 13:5829-5842), o promotor do gen beta-amilase, e o promotordo gen da cevada hordeina. Outros promotores de maturação do endosper-ma incluem as YP0092 (SEQ ID NO: 38), PT0676 (SEQ ID NO: 12), ePT0708 (SEQ ID NO: 17.Promotores que induzem a transcrição em tecidos do ovário taiscomo a parede do óvulo e mesocarpo também podem ser úteis, p.ex., umpromotor de poligalacturonidase, o promotor de TRX da banana, e o promo-tor de actina de melão. Outros tais promotores que induzem à expressãogenética preferencialmente em óvulos são YP0007 (SEQ ID NO: 30),YP0111 (SEQ ID NO: 46), YP0092 (SEQ ID NO: 38), YP0103 (SEQ ID NO:43), YP0028 (SEQ ID NO: 33), YP0121 (SEQ ID NO: 51), YP0008 (SEQ IDNO: 31), YP0039 (SEQ ID NO: 34), YP0115 (SEQ ID NO: 47), YP0119 (SEQID NO: 49), YP0120 (SEQ ID NO: 50) e YP0374 (SEQ ID NO: 68).

Em alguns modos de realização da presente invenção, promoto-res de endosperma de saco embrionário/precoce podem ser empregadospara induzir a transcrição da seqüência de interesse em núcleos polarese/ou na célula central, ou em precursores de núcleos polares, mas não emcélulas ovo ou precursores de células ovo. Mais apropriados são os promo-tores que induzem à expressão somente ou predominantemente em núcleospolares ou precursores deles e/ou na célula central. Um padrão de transcri-ção que se extende dos núcleos polares para o desenvolvimento precoce doendosperma também pode ser observado com promotores preferenciais doendosperma de saco embrionário/precoce, apesar da transcrição diminuirtipicamente significativamente no desenvolvimento do endosperma tardiodurante e depois da fase de celularização. A expressão no zigoto ou embriãoem desenvolvimento tipicamente não está presente nos promotores do en-dosperma do saco embrionário /precoce.

Promotores que podem ser apropriados incluem aqueles deriva-dos dos seguintes genes: Arabidopsis viviparous-1 (ver, GenBank No.U93215); Arabidopsis atmycl (ver, Urao (1996) PIant Mol. Biol., 32:571-57;Conceicao (1994) Plant, 5:493-505); Arabidopsis FIE (GenBank No.AF129516); Arabidopsis MEA; Arabidopsis FIS2 (GenBank No. AF096096);e FIE 1.1 (Patente U.S. 6.906.244). Outros promotores que podem ser apro-priados incluem aqueles derivados dos seguintes genes: MAC1 (ver, Sheri-dan (1996) Genetics, 142:1009-1020); milho Cat3 (ver, GenBank No.L05934; Abler (1993) Plant Mol. Biol., 22:10131-1038). Outros promotoresincluem os seguintes: promotores de Arabidopsis: YP0039 (SEQ ID NO: 34),YP0101 (SEQ ID NO: 41), YP0102 (SEQ ID NO: 42), YP0110 (SEQ ID NO:45), YP0117 (SEQ ID NO: 48), YP0119 (SEQ ID NO: 49), YP0137 (SEQ IDNO: 53), DME, YP0285 (SEQ ID NO: 64), e YP0212 (SEQ ID NO: 60). Ou-tros promotores que podem ser úteis incluem os seguintes promotores dearroz: p530c10, pOsFIE2-2, pOsMEA, pOsYp102, e pOsYp285.

Promotores, que induzem preferencialmente a transcrição emcélulas zigóticas em seguida à fertilização, podem fornecer expressão prefe-rencial para embrião e podem ser úteis para a presente invenção. Mais a-propriados são os promotores que preferencialméhte induzem à transcriçãoem estágios embrionários precoces antes do estágio do coração, porém aexpressão no estágio tardio e maturação dos embriões também é apropria-da. Promotores preferenciais do embrião includem o promotor de proteína detransferência de lipído da cevada (LtpI) (Plant Cell Rep (2001) 20:647-654,ΥΡ0097 (SEQ ID NO: 40), YP0107 (SEQ ID NO: 44), YP0088 (SEQ ID NO:37), YP0143 (SEQ ID NO: 54), YP0156 (SEQ ID NO: 56), PT0650 (SEQ IDNO: 8), PT0695 (SEQ ID NO: 16), PT0723 (SEQ ID NO: 19), PT0838 (SEQID NO: 25), PT0879 (SEQ ID NO: 28) e PT0740 (SEQ ID NO: 20).

Promotores ativos no tecido fotossintético para induzir a transcri-ção em tecidos verdes tais como folhas e hastes são de interesse particularpara a presente invenção. Mais apropriados são os promotores que induzemà expressão somente ou predominantemente em tais tecidos. Exemplos detais promotores incluem os promotores da ribulose-1,5-bisfosfato carcaixai-lase (RbcS) tais como o promotor de RbcS da bétula do oeste (Larix Iarici-na), o promotor do pinho cab6 (Yamamoto et al. (1994) Plant Cell Physiol.35:773-778), o promotor do gen Cab-1 do trigo (Fejes et al. (1990) Plant Mol.Biol. 15:921-932), o promotor CAB-1 do espinafre (Lubberstedt et al. (1994)Plant Physiol. 104:997-1006), o promotor cabIR do arroz (Luan et al. (1992)Plant Cell 4:971-981), o promotor de piruvato ortofosfato dicinase (PPDK) domilho (Matsuoka et al. (1993) Proc Natl Acad. Sei USA 90:9586-9590), opromotor de tabaco Lhcbl *2 (Cerdan et al. (1997) Plant Mol. Biol. 33:245-255), o promotor symporter sucrose SUC2-H+ da Arabidopsis thaliana (Tru-ernit et al. (1995) Planta 196:564-570), e promotores da proteína da mem-brana tilacoidal do espinafre (psaD, psaF, psaE, PC1 FNR, atpC, atpD, cab,rbcS. Outros promotores que induzem a transcrição em hastes, folhas e te-cido verde são PT0535 (SEQ ID NO: 3), PT0668 (SEQ ID NO: 2), PT0886(SEQ ID NO: 29), PR0924 (SEQ ID NO: 78), YP0144 (SEQ ID NO: 55),YP0380 (SEQ ID NO: 70) e PT0585 (SEQ ID NO: 4).

Em alguns modos de execução da presente invenção, promoto-res induzíveis podem ser desejados. Promotores induzíveis induzem àtranscrição em resposta a estímulos externos, tais como agentes químicosou estímulos ambientais. Por exemplo, promotores induzíveis podem conferirtranscrição em resposta a hormônios, tais como ácido giberélico ou etileno,ou em resposta a luz ou estiagem. Exemplos de promotores induzíveis daestiagem são YP0380 (SEQ ID NO: 70), ΡΤ0848 (SEQ ID NO: 26), YP0381(SEQ ID NO: 71), YP0337 (SEQ ID NO: 66), YP0337 (SEQ ID NO: 66),PT0633 (SEQ ID NO: 7), YP0374 (SEQ ID NO: 68), PT0710 (SEQ ID NO:18), YP0356 (SEQ ID NO: 67), YP0385 (SEQ ID NO: 73), YP0396 (SEQ IDNO: 74), YP0384 (SEQ ID NO: 72), YP0384 (SEQ ID NO: 72), PT0688 (SEQID NO: 15), YP0286 (SEQ ID NO: 65), YP0377 (SEQ ID NO: 69), e PD1367(SEQ ID NO: 79). Exemplos de promotores induczidos por nitrogênio sãoPT0863 (SEQ ID NO: 27), PT0829 (SEQ ID NO: 23), PT0665 (SEQ ID NO:10) e PT0886 (SEQ ID NO: 29). Um exemplo de promotor induzível porsombra é PR0924 (SEQ ID NO: 78) e um exemplo de um promotor induzidopor deficiência de nitrogênio é PT0959 (SEQ ID NO: 154).

Outros Promotores: Outras classes de promotores incluem, masnão estão limitadas a promotores preferenciais de folha, preferenciais dehaste/brotos, preferenciais de calo, preferenciais de célula de guarda, taiscomo PT0678 (SEQ ID NO: 13), e promotores preferenciais de senescência.Promotores designados YP0086 (SEQ ID NO: 36), YP0188 (SEQ ID NO:58), YP0263 (SEQ ID NO: 62), PT0758 (SEQ ID NO: 22), PT0743 (SEQ IDNO: 21), PT0829 (SEQ ID NO: 23), YP01Í9 (SEQ ID NO: 49), e YP0096(SEQ ID NO: 39), descritos nos pedidos de patente acima referidos, tambémpodem ser úteis.Alternativamente, a expressão errada pode ser conseguida u-sando um sistema de dois componentes, onde o primeiro componente con-siste de uma planta transgênica compreendendo um ativador transcricionaloperacionalmente ligado a um promotor, e o segundo componente consistede uma planta transgênica que compreende uma molécula de ácido nucleicooperacionalmente ligada à seqüência de ligação alvo/região do ativadortranscricional. As duas plantas transgênicas são cruzadas e a molécula deácido nucleico da invenção é expressa na progênie da planta. Em outro mo-do de execução alternativo da presente invenção, a expressão errada podeser obtida pelo' fato de conter as seqüências do sistema de dois componen-tes transformada em uma linha de planta transgênica.

Outra alternativa consiste na inibição da expressão de uma bio-massa ou polipeptídeo modulador de vigor em uma espécie de planta deinteresse. O termo "expressão" refere-se ao processo de conversão da in-formação genética codificada em um polinucleotídeo no RNA através datranscrição do polinucleotídeo (i.e., via a ação enzimática de um RNA poli-merase), e na proteína através da translação de mRNA. "Regulagem paracima" ou "ativação" refere-se à regulagem que aumenta a produção dos pro-dutos da expressão relativo aos estados basal ou nativo, enquanto "regula-gem para baixo" ou "repressão" refere-se a regulagem que diminui a produ-ção relativa aos estados basais ou nativos.

Uma série de métodos à base de ácido nucleico, incluindo RNAanti-senso, clivagem de RNA dirigida a ribozima, e RNA interferente (RNAi)podem ser empregados para inibir a expressão da proteína em plantas. Atecnologia anti-senso é um método bem conhecido. Neste método, um seg-mento de ácido nucleico do gen endógeno é clonado e é operacionalmenteligado a um promotor de modo que o filamento de RNA anti-senso é transcri-to. O vetor recombinante é então transformado em plantas, conforme descri-to acima, e o filamento anti-senso de RNA é produzido. O segmento de áci-do nucleico não necessita ser uma seqüência inteira do gen endógeno a serreprimida, mas tipicamente será substancialmente idêntica a pelo menosuma porção do gen endógeno a ser reprimido. Geralmente, maior homologiapode ser empregada para compensar pelo uso de uma seqüência mais cur-ta. Tipicamente, uma seqüência de pelo menos 30 nucleotídeos é emprega-da (p.ex., pelo menos 40, 50, 80, 100, 200, 500 nucleotídeos ou mais).

Portanto, por exemplo, um ácido nucleico isolado fornecido aquipode ser um ácido nucleico anti-senso a um dos ácidos nucleicos anterior-mente mencionados, codificando uma biomassa moduladora de polipeptí-deo. Um ácido nucleico A que diminui o nível de uma transcrição ou de umproduto de translação, de um gen codificador de um polipeptídeô moduladorda biomassa, é transcrito em um ácido nucleico anti-senso, similar ou idênti-co à seqüência codificadora do senso, da biomassa ou polipeptídeo modula- Ldor da taxa de crescimento. Alternativamente, o produto de transcrição deum ácido nucleico isolado pode ser similar ou idêntico à seqüência codifica-dora por senso de um crescimento de um polipeptídeo modulado pela taxade crescimento de uma biomassa, mas é um RNA que é não poliadenilado,carece de uma estrutura 5' cap, ou contem um intron não dobrável.

Em um outro método, um ácido nucleico pode ser transcrito emuma ribozima, ou RNA catalítico, que afeta a expressão de um mRNA. (Ver,Patente U.S. No. 6.423.885). Ribozimas podem ser projetadas para especifi-camente fazer par virtualmente com qualquer RNA alvo e clivar a estruturaprincipal de fosfodiéster em uma localização específica, desativando assimfuncionalmente o RNA alvo. Ácidos nucleicos heterólogos podem codificarribozimas projetadas para clivar transcritos de mRNA particulares evitando,portanto, a expressão de um polipeptídeo. Ribozimas cabeça de martelo sãoúteis para destruir mRNAs particulares, apesar de poderem ser empregadasvárias ribozimas que clivam mRNA em seqüências de reconhecimento localespecíficas. Ribozimas cabeça-de-martelo clivam mRNAs em locais ditadospor regiões flanqueadoras que formam pares básicos complementares como mRNA alvo. A única exigência é que o RNA alvo contenha uma seqüênciade nucleotídeo 5'-UG-3'. A construção e produção de ribozimas cabeça demartelo (hammerhead) é conhecida na técnica. Ver, por exemplo, a PatenteU.S. 5.254.678 e WO 02/46449 e referências citadas aí. Seqüências de ribo-zimas de cabeça de martelo podem ser embebidas em um RNA estável, talcomo um RNA de transferência (tRNA), para aumentar a eficiência da cliva-gem in vivo. Perriman et al. (1995) Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 92(13):6175-6179; de Feyter e Gaudron1 Methods in Molecular Biology, Vol. 74, Capítulo43, "Expressing Ribozymes in Plants", Editado por Turner, P.C, HumanaPress Inc., Totowa, NJ. RNA endoribonucleases, tais como aquelas que o-correm naturalmente em Tetrahymena thermophila, e que foram descritasextensamente por Cech e colaboradores, podem ser úteis. Ver, por exemplo,a Patente U.S. 4.987.071.

Métodos baseados na interferência de RNA (RNAi) podem serusados. Interferência de RNA é um mecanismo celular pára regular a ex-pressão de genes e a replicação de vírus. Cogita-se que este mecanismo émediado por moléculas de RNA interferentes pequenas com duplo filamento.Uma célula responde a um tal RNA de duplo filamento destruindo mRNAendógeno contendo a mesma seqüência que o RNA de duplo filamento. Mé-todos para projetar e preparar RNAs interferentes são conhecidos daquelesespecialistas na arte, ver, p.ex., WO 99/32619 e WO 01/75164. Por exemplo,uma construção pode ser preparada que inclui uma seqüência que é trans-crita em um RNA interferente. Um tal RNA pode ser um que pode se auto-anelar, p.ex., um RNA de duplo filamento contendo uma estrutura de haste-alça (stem-loop structuré). Uma porção de um filamento da haste de umRNA de duplo filamento compreende uma seqüência que é similar ou idênti-ca à seqüência codificadora do senso do polipeptídeo de interesse, e que éde cerca de 10 nucleotídeos até cerca de 2500 nucleotídeos de comprimen-to. O comprimento da seqüência que é similar ou idêntica à seqüência codi-ficadora do senso pode ser de 10 nucleotídeos até 500 nucleotídeos, de 15nucleotídeos até 300 nucleotídeos, de 20 nucleotídeos até 100 nucleotídeos,ou de 25 nucleotídeos até 100 nucleotídeos. O outro filamento da porção dahaste de um RNA de duplo filamento compreende uma seqüência anti sensodo polipeptídeo modulador da biomassá de interesse, e pode ter um com-primento que é mais curto, o mesmo, ou maior do que o comprimento cor-respondente da seqüência senso. A porção da alça (Ioop) de um RNA deduplo filamento pode ter de 10 nucleotídeos até 5.000 nucleotídeos, p.ex., de15 nucleotídeos até 1.000 nucleotídeos, de 20 nucleotídeos até 500 nucleo-tídeos, ou de 25 nucleotídeos até 200 nucleotídeos. A porção da alça doRNA pode incluir um intron. Ver, p.ex., WO 99/53050.

Em alguns métodos à base de ácido nucleico para inibição daexpressão genética em plantas, um ácido nucleico apropriado pode ser umanálogo de ácido nucleico. Análogos de ácido nucleico podem ser modifica-dos na parcela de base, parcela de açúcar, ou estrutura principal de fosfatopara aperfeiçoar, por exemplo a estabilidade, hibridização, ou solubilidadedo ácido nucleico. Modificações na parcela da base incluem deoxiuridina pordeoxitimidina, e 5-meíi!-2'-deoxicitidina e 5-bromo-2'-deoxicitidina por deoxi-citidina. Modificaçõ· - !a parcela açúcar incluem a modificação de 2' hidroxi-Ia do açúcar ribose a formar açúcares 2'-0-metil ou 2'-0-alil. A estruturaprincipal de deoxirií fosfato pode ser modificada para produzir ácido mor-folino nucleico, nos c Ls cada parcela de base está ligada a um anel morfo-lino de seis membros ou ácidos peptideo nucleicos, nos quais a estruturaprincipal de deoxifosfato é substituída por uma estrutura principal de pseu-dopeptídeo e as quatro bases são mantidas. Ver, por exemplo, Summerton eWeller (1997) Antisense Nucleic Acid Drug Dev., 7:187-195; Hyrup et al.(1996) Bioorgan. Med. Chem., 4: 5-23. Além disso, a estrutura principal dedeoxifosfato pode ser substituída por, por exemplo, um fosforotioato ou es-trutura principal de fosforoditioato, uma fosforoamidita, ou uma estruturaprincipal de alquil fosfotriéster.

Transformação

As moléculas de ácido nucleico da presente invenção podem serintroduzidas no genoma ou a célula da planta hospedeira apropriada poruma variedade de técnicas. Essas técnicas, capazes de transformar umaampla variedade de espécies de plantas maiores, são bastante conhecidas edescritas na literatura técnica e científica (ver, p.ex., Weising et al. (1988)Ann. Rev. Genet., 22:421 e Christou (1995) Euphytica1 85:13-27).

Uma variedade de técnicas conhecidas na técnica estão dispo-níveis para a introdução de DNA em uma célula de planta hospedeira. Essastécnicas incluem a transformação de células de plantas por injeção (Newell(2000)), microinjeção (Griesbach (1987) Plant Sei. 50:69-77), eletroporaçãode DNA (Fromm et al. (1985) Proc. Nati Acad. Sei. USA 82:5824), PEG(Paszkowski et al. (1984) EMBO J. 3:2717), uso de biolísticos (Klein et al;(1987) Nature 327:773), fusão de células ou protoplastos (Willmitzer, L.(1993) Transgenic Plantas. Em: lotechnology, A Multi-Volume Comprehensi-ve treatise (H.J. Rehm, G. Reed, A. Püler, P. Stadler, eds., Vol. 2, 627-659,VCH Weinheim-Nova lorque-Basel-Cambridge), e via T-DNA usando Agro-bacterium tumefaciens (Crit. Rev. Plant. Sei. 4:1-46; Fromm et al. (1990) Bio-technology 8:833-844) ou Agrobacterium rhizogenes (Cho et al. (2000) Plan-ta 210:195-204) ou outros hospedeiros bacterianos (Brootghaerts et al.(2005) Nature 433:629-633), por exemplo.

Além disso, um número de métodos de transformação não está-veis, que são bastante conhecidos por aqueles especialistas na técnica, po-de ser desejável para a presente invenção. Tais métodos incluem, mas nãoestão limitados a, expressão transiente (Lincoln et al. (1998) Plant Mol. Biol..Rep. 16:1-4) e transfecção viral (Lacomme et al. (2001), "Genetically Engi-neered Viruses" (C.J.A. Ring e E.D. Blair, Eds). Págs. 59-99, BIOS ScientificPublishers, Ltd. Oxford, UK).

Sementes são obtidas das plantas transformadas e usadas parateste de estabilidade e herança. Generalmente, duas ou mais gerações sãocultivadas para assegurar que a característica fenotípica seja estavelmentemantida e transmitida.

Uma pessoa com conhecimento comum na técnica reconheceque depois do cassette de expressão estar estavelmente incorporado nasplantas transgênicas e confirmado que é operável, ele pode ser introduzidoem outras plantas por cruzamento sexual. Qualquer número de técnicas dealimentação padrão pode ser empregado, dependendo das espécies a se-rem cruzadas.

As moléculs de ácido nucleico da presente invenção podem serempregadas para conferir o traço de NUE aperfeiçoado, incluindo tolerânciaaperfeiçoada a condições de nitrogênio altas ou baixas. A invenção tem autilidade de aperfeiçoar características agronômicas importantes de plantasde safra, por exemplo permitindo que plantas sejam produtivamente cultiva-das com pequenas aplicações de fertilizante nitrogênio e em solo pobre emnitrogênio. Conforme notado acima, plantas transformadas que exibem umasuperexpressão dos polinucleotídeos da invenção crescem bem sob condi-ções de baixo teor de nitrogênio e exibem tolerância aumentada a váriascondições de nitrogênio. Essas requerem menos fertilizante, levando a cus-tos menores para o fazendeiro e poluição reduzida de nitrato da água dosolo.

Em aspectos relacionados ao preparo de plantas, uma etapatípica envolve a seleção ou monitoramento de plantas transformadas, porexemplo, a presença de um vetor funcional conforme evidenciado pela ex-pressão de um marcador selecionável. A seleção ou monitoramento podeser executada entre uma população de células recipientes para identificartransformantes usando genes marcadores selecionáveis, tais como genesde resistência herbicida. Métodos físicos e bioquímicos podem ser emprega-dos para identificar transformantes. Esses incluem análise Southern ou am-plificação de PCR para detecção de um polinucleotídeo; Northern blots, pro-teção de S1 RNase, extensão de primer, ou amplificação de RT-PCR paradetecção de transcritos de RNA; ensaios enzimáticos para detecção de en-zima ou atividade de ribozima para polipeptídeos e polinucleotídeos; e ele-troforese de proteína em gel, Western blots, imunoprecipitação, e imuno en-saios ligados a enzima para detectar polipeptídeos. Outras técnicas tais co-mo hibridização in situ, manchas de enzima, e imunomanchas também po-dem ser empregados para detectar a presença ou expressão de polipeptí-deos e/ou polinucleotídeos. Métodos de execução de todas as técnicas refe-renciadas são conhecidos.

Uma população de plantas transgênicas pode ser monitoradapara selecionar aqueles membros da população que têm um traço desejadoou fenótipo conferido por expressão do transgene. Por exemplo, uma popu-lação de progênie de um único evento de transformação pode ser monitora-da para aquelas plantas contendo um nível desejado de expressão de umpolipeptídeo ou ácido nucleico de modulação de NUE heterólogo. Como umaalternativa, uma população de plantas, compreendendo eventos de trans-formação independentes, pode ser monitorada para selecionar aquelas plan-tas contendo um traço desejado, tal como NUE. A seleção e/ou monitora-mento podem ser executados por uma ou mais gerações, o que pode serúltil para identificar aquelas plantas que têm uma diferença estatisticamentesignificativa em um nível de proteína se comparado com um nível corres-pondente em uma planta de controle. A seleção e/ou monitoramento tam-bém podem ser realizados em mais de uma localização geográfica. Em al-guns casos, plantas transgênicas também podem ser cultivadas e selecio-nadas sob condições que induzem um fenótipo desejado ou são por outrolado necessárias para produzir um fenótipo deseajdo em uma planta trans-gênica. Além disso, a seleção e/ou monitoramento podem ser realizadosdurante um estágio de desenvolvimento particular, no qual espera-se que ofenótipo seja exibido pela planta. A seleção e/ou monitoramento podem serexecutados para escolher aquelas plantas transgênicas que têm uma dife-rença estatisticamente significativa em NUE relativo a uma planta de contro-le que carece do transgene. Plantas transgênicas selecionadas ou monitora-das têm um fenótipo alterado se comparado a uma planta de controle cor-respondente, conforme descrito na seção "Características Importantes dosPolinucleotídeos da invenção" acima.

Geralmente, os polinucleotídeos e polipeptídeos da invençãopodem ser usados para aperfeiçoar o desempenho das plantas, quandoplantas são cultivadas sob condições de nitrogênio sub-ótimas, normais ouanormais. Por exemplo, as plantas transgênicas da invenção podem ser cul-tivadas sem dano em solos ou soluções contendo pelo menos 1, 2, 3, 4 ou 5porcento menos nitrogênio, mais preferentemente pelo menos 5, 10, 20, 30,40 ou 50 porcento menos nitrogênio, até mais preferentemente pelo menos60, 70 ou 80 porcento menos nitrogênio, e mais preferentemente pelo menos90 ou 95 porcento menos nitrogênio do que o normalmente requisitado parauma espécie/safra particular de planta, dependendo do promotor ou elemen-to de controle do promotor empregado. Similarmente, as plantas transgêni-cas da invenção podem ser cultivadas sem dano nos solos ou soluções con-tendo pelo menos 1, 2, 3, 4 ou 5 porcento mais nitrogênio, mais preferente-mente pelo menos 5, 10, 20, 30, 40 ou 50 porcento mais nitrogênio, aindamais preferentemente pelo menos 60, 70 ou 80 porcento mais nitrogênio, emais preferentemente pelo menos 90 ou 95 porcento mais nitrogênio do quenormalmente tolerado para uma espécie/safra de planta particular, depen-dendo do promotor ou do elemento de controle do promotor usado.

As moléculas de ácido nucleico da presente invenção codificamproteínas apropriadas de qualquer organismo, mas são de preferência en-contradas em plantas, fungos, bactérias ou animais.

Fenótipos de Planta Transaênica

A informação de que os polipeptídeos divulgados aqui podemmodular a eficiência do uso de nitrogênio é útil no cultivo de plantas de safra.Baseado no efeito dos polipeptídeos divulgados na eficiência do uso de ni-trogênio, pode-se pesquisar e identificar polimorfismos ligados a locais gené-ticos em tais polipeptídeos. Polimorfismos que podem ser identificados in-cluem repetições de seqüência simples (SSRs), polimorfismos de compri-mento de fragmento amplificado (AFLPs) e polimorfismos de comprimentode fragmento de restrição (RFLPs).

Se um polimorfismo é identificado, sua presença e freqüêncianas populações é analisada para determinar se é estatisticamente significa-tivamente correlacionado a um aumento na eficiência do uso de nitrogênio.Aqueles polimorfismos que estão correlacionados com um aumento na efici-ência do uso de nitrogênio podem ser incorporados em um programa de ali-mentação auxiliado por marcador para facilitar o desenvolvimento de linhasque têm um aumento desejado na eficiência do uso de nitrogênio. Tipica-mente, um polimorfismo identificado de uma tal maneira é usado com poli-morfismos em outros locais que também estão correlacionados com um au-mento desejado na eficiência do uso de nitrogênio ou outro traço desejado.

Os métodos de acordo com a presente invenção podem ser apli-cados a qualquer planta, de preferência plantas maiores, pertencendo àsclasses de Angiospermae e Gymnospermae. Plantas das subclasses dasDicotylodenae e das Monocotyledonae são particularmente apropriadas.Plantas dicotiledôneas pertencentes às ordens das Magniolales, llliciales,Laurales, Piperales Aristochiales, Nymphaeales, Ranuneulales, Papeverales,Sarraceniaceae, Trochodendrales, Hamamelidales, Eucomiales, Leitneriales,Myrícales, Fagales, Casuarínales, Caryophyilales, Batales, Poligonales,Plumbaginales, Dilleniales, Theales, Malvales, Urticales, Lecythidales, Viola-les, Salicales, Capparales, Ericales1 Diapensales, Ebenales, Primulales, Ro-sales, Fabales, Podostemales, Haloragales, Myrtales, Comaíes, Proteales,Santales, Rafflesiales, Celastrales, Euphorbiales, Rhamnales, Sapindales,Juglandalesl Geraniales, Poligalales, Umbellales, Gentianales, Polemonia-les, Lamiales, Plantaginales, Scrophulariales, Campanulales, Rubiales, Dip-sacales, e Asterales, por exemplo, também são apropriadas. Plantas mono-cotiledõneas pertencentes às ordens das Alismatales, Hydrocharitales, Na-jadales, Triuridalesl Commelinales, Eriocaulales, Restionales, Poales, Junca-les, Cyperales, Typhales, Bromeliales, Zingiberales, Arecales, Cyclanthales,Pandanales, Aralesl Lilliales, e Orehidales também podem ser úteis nos mo-dos de execução da presente invenção. Outros exemplos incluem, mas nãoestão limitadas a plantas pertencentes à classe das Gymnospermae, comoPinales, Ginkgoales, Cyeadales e Gnetales.

Os métodos da presente invenção são usados de preferênciaem plantas que são importante ou interessantes para agricultura, horticultu-ra, biomassa para bioconversão e/ou florestamento. Exemplos não-limitantesincluem, por exemplo, tabaco, colza, açúcar de beterraba, batatas, tomates,pepinos, pimentões, feijões, ervilhas, frutas cítricas, abacates, pêssegos,maçãs, peras, frutas silvestres, ameixas, melões, beringelas, algodão, soja,girassóis, rosas, poinsettia, petunia, guaiaúle, repolhos, espinafre, alfafa,alcachofras, cana-de-açúcar, mimosa, Servieea lespedera, milho, trigo, ar-roz, centeio, cevada, sorgo e gramas, tais como, gramas switch, giant reed,gramas Bermuda, gramas Johnson ou grama de turfe, painço, cânhamo,bananas, alamos, eucaliptos e coníferas. De interesse temos plantas cultiva-das para produção de energia, a denominada energia de safras, tal comoplantas de folhas amplas como alfalfa, cânhamo, alcachofra de Jerusalém egramas tais como sorgo, grama switch, grama Johnson e semelhantes. Por-tanto, os materiais é métodos descritos são úteis para a modificação dascaracterísticas dà biomassa, tais como características da biomassa de plan-tas para fonte de energia renovável. Uma biomassa de planta para fonte deenergia renovável é uma planta contendo ou produzindo material (tanto crúou processado) que compreende energia solar armazenada que pode serconvertida em combustível. Em termos gerais, tais plantas compreendemsafras dedicadas a energia, bem como, plantas agrícolas e plantas lenhosas.

Exemplos de biomassa de plantas para fonte de energia renovável incluem:grama "switchgrass", grama elefante, grama "giant chinese silver", "energy-cane", "giant reèd" (também conhecido como cana selvagem), "tall fescue",grama bermuda, sorgo, grama napier, também conhecida como grama deuganda, triticais, centeio, trigo de inverno, choupo em arbusto, chorão emarbusto, "big bluestem", grama "reed canary grass " e milho.Homólogos Abrangidos pela Invenção

É sabido na técnica que um ou mais amino ácidos em uma se-qüência podem ser substituídos por um outro(s) amino ácido (s), cuja cargae polaridade são similares àquela do amino ácido substituído, i.e. uma subs-tituição conservadora de amino ácido, resultando em uma mudança biologi-camente/funcionalmente silenciosa. Substitutos conservadores para um a-mino ácido dentro da seqüência de polipeptídeos podem ser selecionadosde membros aos quais pertence o amino ácido. Amino ácidos podem serdivididos nos seguintes quatro grupos: (1) aminoácidos ácidos (negativa-mente carregados), tais como ácido aspártico e ácido glutâmico; (2) aminoácidos básicos (positivamente carregados), tais como arginina, histidina, elisina; (3) aminoácidos polares neutros, tais como serina, treonina, tirosina,asparagina, e glutamina; e (4) amino ácidos neutros não-polares (hidrófobos)tais como glicina, alanina, leucinas, isoleucina, valina, prolina, fenilalanina,triptofano, cisteínas e metioninas.

Moléculas de ácido nucleico da presente invenção podem com-preender seqüências que diferem daquelas que codificam uma proteína ouseus fragmentos selecionados do grupo consistindo de seqüências líderes(Leads) 82, 85, 92, 93, 98, 112, ME07344, ME05213, ME02730 e ME24939,correspondendo às SEQ ID NOS: 81, 105, 107, 114, 116, 201, 140, 84, 112e 200, respectivamente, devido ao fato de que a seqüência de ácido nucleicodiferente codifica uma proteína contendo uma ou mais mudanças de aminoácidos conservadores.

Equivalentes biologicamente funcionais equivalentes dos poli-peptídeos, ou seus fragmentos, da presente invenção podem ter cerca de 10ou menos mudanças de carga de amino ácidos conservadores, mais prefe-rentemente cerca de 7 ou menos mudanças de amino ácidos conservadores,e mais preferentemente cerca de 5 ou menos mudanças de amino ácidosconservadores. Em um modo de execução preferido da presente invenção, opolipeptídeo tem entre cerca de 5 e cerca de 500 mudanças conservadoras,mais preferentemente entre 10 e cerca de 300 mudanças conservadoras, atémesmo mais preferentemente entre cerca de 25 e cerca de 150 mudançasconservadoras, e mais preferentemente entre cerca de 5 e cerca de 25 mu-danças conservadoras ou entre 1 e cerca de 5 mudanças conservadoras.

Identificação de Moléculas de Ácido Nucleico Úteis e suas Seqüências deNucleotídeos Correspondentes

As moléculas de ácido nucleico, e suas seqüências de nucleotí-deos, da presente invenção foram identificadas pelo uso de uma variedadede telas que predizem as seqüências de nucleotídeos que fornecem plantascom NUE, crescimento vegetativo, taxa de crescimento e/ou biomassa aper-feiçoados quando cultivadas sob condições de nitrogênio anormais. Uma oumais das seguintes telas foram, portanto, utilizadas para identificar as se-qüências de nucleotídeos (e amino ácidos) da presente invenção.

A presente invenção é ainda exemplificada pelos seguintes e-xemplos. Não se pretende que os exemplos limitem de qualquer modo oâmbito do presente pedido de patente e seus usos.

6. EXPERIMENTOS QUE CONFIRMAM A UTILIDADE DOS POLINUCLEO-TIDEOS E POLIPEPTÍDEOS DA INVENÇÃO

Protocolos Gerais

Transformação de Arabidopsis mediada por Agrobacterium

Plantas Arabidopsis thaliana Wassilewskija (WS) do tipo selva-gem são transformadas com clones contendo plasmídeos Ti no senso deorientação relativo ao promotor 35 S. Um vetor plasmídeo Ti útil para essasconstruções, CRS 338, gen marcador selecionável de planta fosfinotricinaacetiltransferase (PAT), preparado pela Ceres, que confere resistência her-bicida às plantas transformadas.

Dez eventos independentemente transformados são tipicamenteselecionados e avaliados por seu fenótipo qualitativo na geração de Ti.

Preparação da Mistura do solo: Mistura-se 24L de SunshineMix#5 (Sun Gro Horticultura, Ltd., Bellevue, WA) com 16L de vermiculita Therm-O-Rock (Therm-O-Rock West, Inc., Chandler, AZ) em um misturador de ci-mento para fazer uma mistura de 60:40 de solo. À mistura de solo adiciona-se 2 colheres de chá de grânulos Marathon 1% (Hummert, Earth City, MO), 3colheres de chá de OSMOCOTE® 14-14-14 (Hummert, Earth City, MO) e 1colher de chá de fertilizante Peters 20-20-20 (J.R. Peters, Inc., Allentown,PA), que são primeiro adicionados a 12,6 litros (3 galões) de água e depoisadicionados ao solo e misturados completamente. Geralmente, potes com10,16 cm (4 polegadas) de diâmetro são preenchidos com mistura de solo.Os potes são então cobertos com uma rede de nyIon de 20,32 cm2 (8 pole-gadas quadradas).

Plantio: Usando uma seringa de 60 mL, aspira-se 35 mL dá mis-tura de semente. Adiciona-se 25 gotas a cada pote. Anteparos de propaga-ção claros são colocados no topo dos potes, que são então colocados sobde pano de sombra 55% e subirrigados por adição de 2,54 cm de água (1polegada) de nível.

Manutenção da Planta: 3 a 4 dias após o plantio, tampas e pa-nos de anteparos são removidos. As plantas são regadas conforme neces-sário. Após 7-10 dias, são mantidas nos potes apenas 20 plantas, as demaissendo retiradas por fórceps. Após 2 semanas, todas as plantas são subirri-gadas com fertilizante Peters a uma taxa de 1 colher de chá de fertilizantepor 4,2 litros (1 galão) de água. Quando hastes têm cerca de 5-10 cm decomprimento, elas são cortadas entre o primeiro nó e a base da haste parainduzir hastes secundárias. A infiltração por imersão é realizada 6 até 7 diasapós o corte. A infiltração por imersão é realizada 6 até 7 dias após o corte.

Preparação de Agrobacterium: Adiciona-se a 150 mL de YEBfresco 0,1 mL cada de carbenicilina, espectinomicina e rifampicina (cadaqual a 100 mg/ml de concentração de estoque). Blocos de partida de Agro-bacterium (bloco com 96-cavidades com culturas de Agrobacterium cultiva-das em um Οϋβοο de aproximadamente 1,0) são obtidos e inoculados, umvaso de cultura por construção, por transferência de 1 mL de uma cavidadeapropriada no bloco de partida. Culturas são então incubadas com agitaçãoa 27°C. Culturas são desaceleradas após atingirem um OD6oo de aproxima-damente 1,0 (cerca de 24 horas). Adiciona-sé 200 mL de meio de infiltraçãopara resuspender pelotas de Agrobacterium. O meio de infiltração é prepa-rado por adição de 2,2 g de sais de MS1 50 g de sucrose, e 5 μΙ de 2 mg/mlde benzilaminopurina a 900 ml de água.

Infiltração por imersão: Os potes são invertidos e submergidospor 5 minutos de modo que a porção aérea da planta esteja na suspensãode Agrobacterium. Permite-se que as plantas cresçam normalmente e cole-ta-se sementes.

Monitoramento Fenotípico de Alta produção de Mutantes da Expressão erra-da T1

Sementes são uniformemente dispersas em solo saturado comágua em potes, e colocadas em um refrigerador escuro a 4°C por duas noi-tes para promover uma germinação uniforme. Os potes são então removidosdo refrigerador e cobertos com um pano de sombra 55%por 4-5 dias. Cotile-dôneas estão totalmente expandidas neste estágio. FINALE® (Sanofi Aven-tis, Paris, França) é borrifado nas plantas (3 ml FINALE® diluído em 1,2 I deágua) e repetido a cada 3-4 dias até que permaneçam somente transforman-tes.

Monitoração: Monitoração é rotineiramente executada em quatroestágios. Muda, Envólucro, Florescência, e Senescência.

o Muda - o tempo depois que as cotiledôneas emergiram, mas antesque a 3a folha verdadeira começa a se formar.

o Envólucro - tempo da emergência da 3a folha verdadeira até ime-diatamente antes da haste primária começar a se alongar,

o Florescência - tempo da emergência da primeira haste até o inícioda senescência (com a exceção de se notar o próprio tempo de florescência,a maioria das observações deveria ser feita no estágio onde aproximada-mente 50% das flores estiverem abertas).

o Senescência - o tempo seguindo a entrada da senescência (com aexcessão da "senescência retardada", a maior parte das observações deve-ria ser feita depois que a planta secou completamente). Sementes são entãocoletadas.

Monitoramento de Superpiscinas para Tolerância a Condições de Cresci-mento com Baixo Teor de Nitrato

Superpiscinas são geradas e duas mil sementes de cada umade dez superpiscinas são reunidas e testadas usando o monitoramento debaixo teor de nitrato em agar. Meio de cultivo de baixo teor de nitrato, pH5,7, é como se segue: 0,5X MS sem N (PhytoTech), 0,5% de sucrose (Sig-ma), 300 μΜ de KNO3 (Sigma), 0,5 g de hidrato de MESe (Sigma), 0,8% dePhytagar (EM Science). É empregado 45 ml de meio por placa quadrada.

Arabidopsis thaliana cv semente WS é esterilizada em 50% deClorox™ com 0,01% de Triton X-100 (v/v) por cinco minutos, lavada quatrovezes com água desionizada destilada e armazenada a 4°C no escuro por 3dias antes do uso.

A semente é colocada em placas a uma densidade de 100 se-mentes por placa. A semente do tipo selvagem é empregada como um con-trole. Placas são incubadas em uma câmara de crescimento Conviron™ a22°C com um ciclo de claro:escuro de 16:8 horas de uma combinação delâmpadas incandescentes e fluorescentes emitindo uma intensidade de luzde ~ 100 pEinsteins e 70% de umidade.

Mudas são monitoradas diariamente após 14 dias. Mudas candi-datas são maiores ou permanecem mais verdes por mais tempo relativa-mente aos controles do tipo selvagem. DNA é isolado de cada planta candi-data e sequenciado para determinar que transgene estava presente.

Ensaio de Muda com Baixo Nitrato em AqarOs meios e as sementes são preparados conforme descrito aci-ma.

As sementes de cinco eventos em linha com expressão errada,cada qual contendo o mesmo polinucleotídeo, são semeadas em duas filas,com dez sementes por fila. Cada placa contem cinco eventos, para um totalde 100 sementes. Placas de controle contendo sementes do tipo selvagemtambém são preparadas. As placas são então incubadas a 4°C por pelo me-nos dois dias.

Após muitos dias de tratamento com frio a 4°C, as placas sãoincubadás em uma câmara de crescimento Conviron™ a 22°C com um ciclode luz:escuridão de 16:8 horas de uma combinação de lâmpadas incandes-centes e fluorescentes emitindo uma intensidade de luz de ~ 100 pEinsteinse 70% de umidade.

Após 14 dias, placas são escaneadas diariamente usando umCF Imager (Technologica Ltd.) com 45 minutos de aclimatação à escuridão.O CF Imager é usado para quantificar os rendimentos de quantum ótimo dasmudas (Fv/Fm) como uma medida de saúde fotossintética (ver detalhes a-baixo). Para quantificar os tamanhos das mudas, as placas também são es-caneadas com um escaneador fotográfico de leito plano (flatbed photo scan-ner) (Epson) um dia depois de o stress de nitrogênio ser visível e o cresci-mento de mudas do tipo selvagem ser capturado. A captura da imagem éfinalizada depois que todos os tipos de plantas selvagens tiverem ficadocompletamente amareladas. No dia do escaneamento final as placas sãodescobertas e liberalmente borrifadas com Finale®(10 ml em 1,2 I (48 oz.) demeio líquido Murashige & Skoog) e devolvidas à câmara de crescimento.

Dois dias após a pulverização, as placas são colocadas em umacaixa fechada por 45 minutos para aclimatar na preparação da visualizaçãofluorescente via CF Imager. Plantas resistentes a Finale® parecem verme-lhas, enquanto plantas sensíveis parecem azuis. Depois da captura da ima-gem, atribui-se às plantas um status transgênico (resistentes) ou não-transgênico (sensível). As plantas nãò - transgênicas (i.e. segregantes não-transgênicos) servem como controles internos.A eficiência fotossintética das mudas, ou o transporte de elétronsvia um fotosistema II, é estimado pelo relacionamento entre Fm1 o sinal fluo-rescente máximo, e o sinal fluorescente variável, Fv. Aqui, a redução no ren-dimento do quantum ótimo (Fv/Fm) indica stress, e assim pode ser usadapara monitorar o desempenho das plantas transgênicas comparado a plan-tas não-transgênicas sob condições de stress. Já que uma grande quantida-de de nitrogênio é investida na manutenção no dispositivo fotossintético, de-ficiências de nitrogênio podem levar ao desmantelamento dos centros dereação e a reduções na eficiênciaa fotossintética. Consequentemente, doinício da coleção de captura de imagem até que as plantas estejam mortas,a proporção de Fv/Fm é determinada para cada muda usando o softwareFlurolmager 2 (Kevin Oxborough e John Bartington).

A área do envólucro cada planta também é analisada usando-seo software WinRHIZO (Regent Instruments) para analisar as imagens captu-radas pelo escaneador de leito plano dá Epson (Epson flatbed scanner).

Ensaio de Validação de Baixo Teor de Nitrato

Meio e sementes são preparados conforme descrito acima.Para linhas de expressão errada submetidas ao ensaio de baixoteor de nitrato acima, ambas as sementes de geração T2 e T3 para um even-to são colocadas em placas juntamente com a semente do tipo selvagem, auma densidade final de 100 sementes por placa. As placas contêm 10 se-mentes/fila e têm quatro filas de 10 sementes T2 seguido por duas filas desemente do tipo selvagem, seguido por quatro filas de sementes T3. Placassão então incubadas a 4°C por pelo menos dois dias.

Após o tratamento a frio por diversos dias a 4°C, as placas sãoincubadas em uma câmara de crescimento Conviron™ a 22°C com um ciclode luz: escuridão de 16:8 horas com uma combinação de lâmpadas incan-dencentes e fluorescentes emitindo uma intensidade de luz de ~ 100pEinsteins e 70% de umidade.

Após 14 dias, as placas são escaneadas diariamente usando umCF Imager (Technologica Ltd.) com aclimatação no escuro de 45 minutos. OCF Imager é empregado para quantificar o rendimento ótimo das mudas(Fv/Fm) como uma medida da saúde fotossintética. Para quantificar os ta-manhos das mudas, as placas também são escaneadas com um escanerfotográfico de leito plano (Epson) um dia depois do stress de nitrogênio ficarvisível e o crescimento das mudas do tipo selvagem ser interrompido. A cap-tura da imagem é finalizada depois que todas as plantas do tipo selvagemficaram completamente amareladas. No dia do escaneamento final placassão descobertas e amplamente borrifadas com Finale®(10 ml em 1,2 g (48oz.) de meio líquido de Murashige & Skoog) e retornadas à câmara de cres-cimento.

Dois dias após a pulverização, as placas são colocadas em umacaixa fechada por 45 minutos para aclimatar na preparação para visualiza-ção fluorescente via um CF Imager. Plantas resistentes a Finale® aparece-ram vermelhas enquanto plantas sensíveis apareceram azuis. Depois dacaptura da imagem, às plantas dá-se o status de plantas transgênicas (resis-tentes) ou não-transgênicas (sensíveis). As plantas não-transgênicas (i.e.segregantes não-transgênicas) servem como controles internos.

A proporção Fv/Fm é determinada para cada muda usando osoftware Flurolmager 2 (Kevin Oxborough e John Bartington).

A área do envólucro de cada planta também é analisada usan-do-se o software WinRHIZO (Regent Instruments) para analisar as imagenscapturadas pelo escaneador Epson de leito plano.

RESULTADOS:

Plantas transformadas com os genes de interesse foram monito-radas conforme descrito acima para modular as características de cresci-mento e de fenótipo. As observações incluem aquelas que se referem àplanta como um todo, bem como partes de planta, tais como as raízes e fo-lhas.Resumo

<table>table see original document page 53</column></row><table>

Todas as plantas discutidas nos Exemplos abaixo não têm dife-renças observáveis ou estatísticas das plantas do tipo selvagem, no que serefere à taxa de germinação. Sob controle do promotor 35S, o exemplo 3mostrou somente uma ligeira diferença no número de dias de florescência ea área do envólucro 7 dias pós-brotação.Exemplo 1: Resumo Lead : Lead 82 - ME02507 (SEQ ID NO: 81)

<table>table see original document page 54</column></row><table>

Expressão ectópica do Clone 154343 sob o controle do promotor35S induz os seguintes fenótipos:

Fotossíntese aumentada após quatorze dias em meios contendobaixo teor de nitrato se comparado aos controles.

ME02507 foi identificado a partir de um monitoramento de umasuperpool quanto à tolerância a condições de baixo teor de nitratos.

Superpools 2-11 e 22-31 foram monitoradas em relação às mu-das maiores ou mais verdes que os controles em meio de cultivo com baixoteor de nitrato (300 μΜ KNO3 MS). A seqüência de transgenes foi obtida pa-ra 17 mudas candidatas das Superpools 2-11. Duas seqüências das 17 can-didatas foram alinhadas com ME02507 quando analisadas usando BLAST. Aseqüência de transgenes também foi obtida para 39 mudas candidatas dasSuperpools 22-31. Oito das 39 seqüências candidatas foram alinhadas comME02507 quando analisadas usando BLAST.

Dois eventos de ME02507 mostram uma segregação de 3:1 pa-ra a resistência a Finale®.

Os eventos -11 e -13 segregaram 3:1 (R:S) para resistência aFinale® na geração T2 (dados não mostrados).

Dois eventos de ME02507 mostraram eficiência fotossintéticasignificativamente aumentada sob condições de crescimento com baixo teorde nitrato em ambas as gerações.

Sementes representando três eventos de ME02507 de cadauma das gerações T2 e T3 foram semeadas em meio de cultivo do baixo teorde nitrato (300 μΜ KNO3 MS). Dois eventos, -11 e -13, mostraram um au-mento significativo na eficiência fotossintética em ambas as gerações em ρ =0,05 quando medido empregando uma variância do teste t unilateral e as-sumindo uma variância desigual (Tabela 1 -1).

Tabela 1-1. Comparação do teste t de eficiência fotossintética de mudas entre mudas transgênicas e segregantes não-transgênicos agrupados a- pós 14 dias de crescimento em baixo teor de nitrato.

<table>table see original document page 55</column></row><table>

Análise Qualitativa das plantas Ti:

Não houve uma diferença observável na aparência física de vin-te e duas dentre as vinte e quatro plantas comparado com as do controle.

Das duas plantas remanescentes, uma do Evento -02 era grande e de flo-rescência tardia e uma do Evento -13 era verde escuro.

Análise Qualitativa e quantitativa das plantas T?:

Eventos -11 e -13 de ME02507 pareceram similares ao tipo sel-vagem até levemente verde escuro em todos os casos.

O efeito do Lead 82 em NUE foi testado por plantas em cresci-mento no solo com uma quantidade baixa de nitrogênio e medições da pro-dução de biomassa após o início da florescência. Plantas foram cultivadasem uma mistura de solo consistindo de 3:2 metromix 200: vermiculita semqualquer nitrogênio suplementar sob condições longas de luz do dia em umacâmara de cultivo Conviron™ Modelo TCR.

No estágio médio de florescência médio de desenvolvimento aárea total da folha foi medida para ME2507 Evento -11 , Evento -13 e plan-tas de controle transgênico (vetor sem o Lead 82 cDNA) e toda a muda foicolhida, secada e pesada para determinar o peso da muda seca. Os resulta-dos indicam que Lead 82 aumentou significativamente o envólucro da áreaem 45% e 57% para eventos

-11 e -13, respectivamente, comparado às plantas de controletransgênicas (significante em p<0,05 nível no teste t). A mudança no tama-nho da área do ènvólucro traduzida num aumento de 45% na produção debiomassa para o Evento -13 se comparado a plantas de controle transgêni-cas (significativo ao nível p<0,05 no teste t). Embora o evento -11 tambémtenha mostrado um aumento na biomassa, este aumento não foi estatistica-mente significativo. Os dados indicam que Lead 82 com baixa tolerância anitrato pode aumentar significativamente a eficiência no uso de nitrogênio eassim aumentar a área de produção do envólucro e produção de biomassa.

Fatores de transcrição comumente controlam a expres&ão de múltiplos ge-nes em um caminho. Por exemplo, helix básico-alça (Ioop) - helix (bHLH) efatores de transcrição Myb que pensava-se estarem envolvidos no controleda expressão de diversos genes em um caminho, tal como fluxo de carbonoatravés do ciclo TCA (Yanagisawa et al., 2004). Muitos genes Myb forammostrados regulando os genes estruturais de diversos caminhos, tal como ocaminho de antocianina (Sainz et al., 1997; Hernandez et al., 2004). Alémdisso, genes Myb também estiveram implicados na regulação da expressãogenética por nitrogênio (Todd et al., 2004).

O clone 154343 codifica um fator de transcrição Myb que confe-re um fenótipo "permanecer verde" sob condições de testes com baixo teorde nitrato. Plantas expressando contrariamente o clone 154343 tambémmostram um transporte de elétrons através de um fotosistema Il aperfeiçoa-do sob condições de crescimento com um baixo teor de nitrato se compara-do aos controles do tipo selvagem e irmãos de transgenes -menos. Plantasque expressam erroneamente o clone 154343 também mostram a eficiênciano uso de nitrogênio aperfeiçoada quando cultivadas em solo conforme evi-denciado pelo aumento na área da folha e produção de biomassa sob condi-ções fertilizantes de nitrogênio limitantes.Exemplo 2: Lead Resumo: Lead 85 - ME10738 (SEQ ID NO: 105)

<table>table see original document page 57</column></row><table>

Expressão ectópica do cloro 346992 sob o controle do promotor35S induz os seguintes fenótipos:

Fotossíntese aumentada após quatorze dias em meio contendobaixo teor de nitrato comparado aos controles..

ME10738 foi identificado a partir do monitoramente de uma su-perpool em relação à tolerância a condições de baixo teor de nitrato.

Superpools 72-81 foram monitoradas em relação às mudas queeram maiores ou mais verdes do que os controles em meio de cultivo combaixo teor de nitrato (300 μΜ de KNO3 MS). A seqüência de transgenes foiobtida para 23 mudas candidatas. Uma das 23 seqüências de mudas candi-datas se alinhou com ME10738 quando analisadas com BLAST.

Um evento de ME10738 mostra a segregação de 3:1 para resis-tência a Finale®.

Evento -03 segregou 3:1 (R:S) para resistência a Finale® na ge-ração T2 (dados não mostrados). Evento -05 segregou 1:1 (18:17; R:S) pararesistência a Finale®.Dois eventos ME10738 mostraram um aumento significativo naeficiência fotossíntética sob condições de cultivo com baixo teor de nitratoem ambas as gerações.

Sementes representando cinco eventos ME10738 de cada umadas gerações T2 e T3 foram cultivadas no ensaio com baixo teor de nitrato.Dois eventos, -03 e -05, mostraram um significativo aumento na fotossínteseem ambas as gerações em ρ = 0,05 conforme medido usando um teste t uni-lateral e assumindo uma variância desigual (Tabela 2-1).

Tabela 2-1. Comparação pelo teste t da eficiência fotossíntética das mudas de comparação do entre mudas transgênicas e segregantes não transgê- nicos agrupados após 14 dias de crescimento com baixo teor de nitrato. <table>table see original document page 58</column></row><table>

Análise Qualitativa das plantas Ti:

Não houve nenhuma diferença observável na aparência física detodos os 10 eventos, comparado com os controles.

Análise qualitativa e quantitativa das plantas T?:

[0001] Os eventos -03 e -05 de ME10738 pareceram similares ao tiposelvagem até verde levemente mais escuro em todos os exemplos.

O clone de milho 346992 codifica um polipeptídeo curto sem i-dentidade de seqüência significativa para quaisquer proteínas conhecidas.

Os mapas seqüenciais de uma seqüência genômica de milho, selecionadapor metil-filtração, indicam que ela é hipometilada e uma candidata para re-sidir em uma região expressa do genoma do milho (ZmGSStuc11-12-04.257770.1). Clones de plantas expressos erroneamente 346992 tambémmostram um transporte de elétrons no fotossistema Il aperfeiçoado sob con-dições de cultivo com baixo teor de nitrato comparado com controles do tiposelvagem e irmãos trànsgênicos menos. O polipeptídeo curto pode represen-tar um novo peptídeo que tem um papel na sinalização de nutriente. Alterna-tivamente, o cDNA pode ser derivado de um RNA codificador de não-proteína, na regulação de genes através de mecanismos à base de RNA(Marker et al. (2002) Curr Biol 12:2002-2013; Tang et al. (2005) Mol Microbi-0155:469-481).

Exemplo 3: Resumo de Lead: Lead 92 - ME08309 (SEQ ID NO: 107)

<table>table see original document page 59</column></row><table>

Expressão ectópica do Clone 560731 sob o controle do promotor35S induz aos seguintes fenótipos:

Fotossíntese aumentada após 14 dias em meio contendo baixoteor de ntiratos comparado com controles.

Envólucro e folhas do caule permanecem verdes por mais tempodo que os controles sob condições de crescimento padrão.

ME08309 foi identificado a partir da monitoração de uma super-piscina quanto a tolerância às condições de baixo teor de nitrato.

Sementes das süperpiscinas 62-71 monitoradas eram maioresou mais verdes do que as dos controles no meio de cultivo com baixo teor denitratos (300 μΜ KNO3 MS). Para as süperpiscinas 62-71, a seqüência detransgenes foi obtida para 20 mudas candidatas. Uma das 20 seqüênciascandidatas se alinhou com ME08309 quando analisada com BLAST.Dois eventos de ME08309 mostram a segregação 3:1 para resis-tência a Finale®.

Eventos -02 e -05 segregaram 3:1 (R:S) para resistência a Fina-le® na geração T2 (dados não mostrados).

Dois eventos de ME08309 mostraram eficiência fotossintéticasignificativamente aumentada sob condições de cultivo com baixo teor denitratos em ambas as gerações.

Sementes representando dois eventos de ME08309 de cadauma das gerações T2 e T3 foram cultivadas em um meio com baixo teor denitrato (300 μΜ de KNO3 MS). Dois eventos, -02 e -05, mostraram um au-mento significativo na eficiência fotossintética em ambas as gerações em ρ =0,05 conforme medido usando um teste t unilateral e assumindo uma variân-cia desigual (Tabela 3-1).

<table>table see original document page 60</column></row><table>

Folhas ME08309 permanecem verde por mais tempo do que o

controle

Ambos os eventos, -02 e -05, de ME08309 tinham envólucro efolhas de caule que permaneceram de cor verde (i.e.um fenótipo "permane-ce verde") quando comparadas aos controles. Essas plantas podem estaracumulando citoquininas que contribuiriam para o fenótipo "permanece ver-de" e igualmente iniciariam um aumento da fotossíntese no meio com baixoteor de nitrato. Alternativamente, elas podem estar acumulando significati-vamente mais nitratos durante o crescimento normal que não pode ser com-pletamente remobilizado e de modo que as folhas permanecem verdes bemna senescência.

Análise Qualitativa das plantas Ti :

Não houve nenhuma diferença observável na aparência físicadas 10 plantas Ti comparado com a dos controles.

Análise Qualitativa e quantitativa das plantas T?:

Não houve nenhuma diferença observável ou estatística entre oseventos -02 e -05 de ME08309 e plantas do tipo selvagem quanto à germi-nação ou fertilidade (conforme medido pelo número de siliqua e preenchi-mento dè"semente).

Morfologia/arquitetura geral envólucro e folhas de caule parecempermanecer mais verdes por um período de tempo mais longo do que oscontroles.

Dias para a florescência: Plantas podem ter uma florescêncialevemente mais retardade do que os controles.

A área do envólucro 7 dias após brotação: Envólucros podemser um pouco menores do que os controles.

O Clone 560731 codifica uma proteína "dedo" de um anel com128 aminoácidos da família de proteína Zinc Finger C3HC4. O anel de dedos(ring finger) é um domínio de proteína especializada do anel de zinco (zincfinger) que liga dois átomos de Zn e parece estar envolvido em interaçõesproteína-proteína. Muitas proteínas do domínio do anel desempenham umpapel no caminho da degradação da proteína e a atividade E3 de ubiquitina-proteína Iigase é cogitada como sendo uma função geral deste domínio(Lorick et al. (1999) Proc Natl Acad Soc USA 96:11364-11369). O domínioC3HC4 também está presente em alguns fatores de transcrição, sendo queele pode estar envolvido na interação ou regulação de proteína (Hakli et al.(2004)FEBS Lett 560:56-62). Já que a regulagem do turnover de proteí-na/degradação de proteína é a etapa reguladora chave em muitos processosbiológicos (Hellmann e Estelle (2002) Science 297:793-797), expressão er-rada do clone 560731 pode influenciar o turnover de proteínas que estãoenvolvidas no metabolismo de nitrogênio, conferindo assim tolerância a bai-xo teor de nitrato.

Exemplo 4: Resumo Lead: Lead 93 - ME10822 (SEQ ID NO: 114)

<table>table see original document page 62</column></row><table>

Expressão ectópica de At4g24700 sob o controle do promotor35S induz os seguintes fenótipos:

Crescimento aumentado após 14 dias de meio contendo baixoteor de nitrato comparado a controles.

ME10822 foi identificado a partir da monitoração de uma super-pool quanto à tolerância a condições de baixo teor de nitrato.

Mudas que eram maiores ou mais verdes do que os controlesforam monitoradas nas superpools 72-81 em meio de cultivo com baixo teorde nitrato. Para as superpools 72-81, a seqüência de transgenes foi obtidapara 24 mudas candidatas. Uma das 24 seqüências candidatas se alinhoucom ME10822 quando analisada com BLAST.

Dois eventos de ME10822 mostram segregação 3:1 para resis-tência a Finale®. Um evento mostra segregação 15:1 para resistência a Fina-le®.

Os eventos -01 e -03 segregaram 3:1 (R:S) para resistência aFinale® na geração T2 e no Evento -02 segregou 15:1 (dados não mostra-dos).

Três eventos ME10822 mostraram um aumento significativa-mente acentuado sob condições de baixo teor de nitrato em ambas as gera-ções.

Sementes representando três eventos de ME10822 de cadauma das gerações T2 e T3 foram semeadas conforme descrito no ensaio debaixo teor de nitrato. Ambas as gerações dos eventos -01, -02 e -03 tinhamo transgene ligado ao fenótipo de crescimento aumentado em um nível deconfiança de ρ < 0,05 (Tabela 4-1).

<table>table see original document page 63</column></row><table>Análise Qualitativa dás plantas Ti:

Não houve diferenças observáveis na aparência física das qua-tro plantas T1 se comparado aos controles.Análise qualitativa e quantitativa das plantas T?:

Os eventos -01, -02, e -03 de ME10822 tinham folhas que pare-cem levemente mais oblongas se comparadas aos controles.

At4g24700 codifica uma proteína de amino ácido 143 de funçãodesconhecida. Dados de microarray (não mostrados) indicam que esta se-qüência é positivamente regulada por luz durante o ciclo diurno. Esta se-qüência pode estar envolvida em processos fotossintéticos relacionados quepoderiam influenciar o metabolismo do nitrogênio e particionamento.

Exemplo 5: Resumo Lead: Lead 98 - ME07523 (SEQ ID NO: 116)

<table>table see original document page 64</column></row><table>

Expressão ectópica do clone 14432 sob o controle do promotor35S resulta em fotossíntese aumentada em um meio contendo um baixo tre-or de nitrato após 14 dias se comparado aos controles.

ME07523 foi identificado a partir da monitorização da tolerânciade mudas de uma superpool sob condições de baixo teor de nitrato.

Superpools 52-61 foram monitoradas para mudas que erammaiores ou mais verdes do que os controles em meio de cultivo com baixoteor de nitrato (Ceres SOP 45 - Monitoramento do baixo teor de nitrato emAgar). Para superpiscinas 52-61, seqüência de transgenes foi obtida para 23mudas candidatas. Duas seqüências das 23 candidatas acusaram BLASTpara ME07523.

Dois eventos de ME07523 mostram segregação 3:1 para resis-tência a Finale®.

Eventos -02 e -04 segregaram 3:1 (R:S) para resistência a Fina-le® na geração T2 (dados não mostrados).

Dois eventos de ME07523 mostraram eficiência fotossintéticasignificativamente aumentada sob condições de crescimento com baixo teorde nitrato em ambas as gerações.

Dois eventos de ME07523 foram semeados conforme descritono ensaio de baixo teor de nitrato em ambas as gerações T2 e T3 (ou gera-ções T3 e T4, conforme for o caso para o evento -02). Neste estudo, a efici-ência fotossintética da muda foi medida como Fv/Fm comparando plantastransgênicas dentro de um evento a segregantes não-transgênicos imersosnas piscinas na mesma placa. Dois eventos, -02 e -04, foram significativosem ambas as gerações em ρ = 0,05, usando um teste t unilateral assumindouma variância desigual (Tabela 5-1).

Tabela 5-1. Comparação teste t da eficiência fotossintética de mudas entre mudas transgênicas e segregantes não transgênicos agrupados após 14 dias de crescimento em baixo teor de nitrato.

<table>table see original document page 65</column></row><table>

Análise Qualitativa das plantas Ti:Evento -03 apareceu verde claro com uma fraca inflorescência.

Não houve nenhuma diferença na aparência física de todos os outros even-tos comparado ao tipo selvagem.

Análise Qualitativa e quantitativa das plantas T?:

Não houve nenhuma diferença observável na aparência físicados eventos -02 e -04 de ME07523 comparado aos controles.

O clone 14432 codifica um fator de transcrição de amino ácido156 id bZIP com uma função desconhecida. Fatores de transcrição bZIP sãoconhecidos para regular uma ampla variedade de processos incluindo luz esinalização de stress, maturação de sementes, desenvolvimento de flores, edefesa por patógenos (Jakoby et al. (2002) Trends Plant Sci 7:106-111). Aexpressão errada de um fator de transcrição que controla processos envol-vendo nitrogênio e ou metabolismo do carbono pode condicionar tolerânciapara ambientes com baixo teor de nitrogênio, tais como aquele observadopara o fatror de transcrição Dof 1 (Yanagisawa et al., 2004).

Exemplo 6: Resumo Lead: Lead 112 - ΜΕ03926 (SEQ ID NO: 201)

<table>table see original document page 66</column></row><table>

Expressão ectópica do Clone 150823 sob o controle do promotor35S resulta em crescimento aumentado em meio contendo baixo teor denitrato após 14 dias se comparado aos controles.

ME03926 foi identificado a partir da seleção de mudas de super-piscinas com tolerância a condições de baixo teor de nitrato.

Das superpiscinas 22-31 foram selecionadas mudas que erammaiores ou mais verdes do que os controles em meio de cresciménto combaixo teor de nitrato (Ceres SOP 45 - Seleção de baixo teor de nitrato emAgar). Para superpiscinas 22-31, foi obtida uma seqüência transgênica para40 mudas candidatas. Três das 40 seqüências de candidatas acusaramBLAST para ME03926.

Dois eventos do segregado ME03926 para uma inserção simples.

Eventos -01 e -03 segregados 3:1 (R:S) para resistência a Fina-le® na geração T2 (dados não mostrados).

Dois eventos de ME03926 mostraram um crescimento significa-tivamente aumentado sob condições de baixo teor de nitrato em ambas asgerações.

Dois eventos de ME03926 foram semeados conforme descritono Ensaio de baixo teor de nitrato com duas leves diferenças, em ambas asgerações T2 e T3. Uma diferença foi que o meio 100 μΜ de KNO3 foi usadoao invés do padrão 300 μM de KNO3. A outra diferença foi que 10 sementesforam semeadas por placa ao invés do padrão de 100 sementes. Neste es-tudo, o crescimento qualitativo das plantas foi observado. Uma grande por-ção das plantas continuou a crescer e a florescer nas placas, depois outrasplantas tiveram seu crescimento interrompido. Um teste comparativo Chi-quadrado foi executado comparando transgênicos a segregantes não-transgênicos (controles internos) com o crescimento aumentado versus fenó-tipos com crescimento interrompido, para determinar se o aumento no cres-cimento estava ligado ao transgene. Para ambos os eventos, -01 e -03, emambas as gerações, o transgene estava ligado ao fenótipo de crescimentoaumentado com um nível de confiança de ρ < 0,05 (Tabela 6-1).<table>table see original document page 68</column></row><table>

Análise Qualitativa das plantas Ti :

Não foram observadas diferenças na aparência física das quatroplantas T1 se comparado aos controles.

5 Análises Qualitativa e quantitativa das plantas T?:

Não foram observadas diferenças na aparência física do Evento-01 se comparado aos controles. O Evento -03 tinha um envólucro levemen-te menor e as folhas pareceram levemente mais alongadas se comparadoaos controles.

10 O clone 150823 codifica uma proteína família 9 de amino ácido

glicosil hidrolase 516. A conexão imediata entre glicosil hidrolases e baixatolerância a nitrogênio ainda não está clara. Será necessário um trabalhoadicional para determinar o modo de ação para este gene e seu efeito nautilização de nitrogênio.Exemplo 7: Resumo Lead : ME07344 (SEQ ID NO: 140)

<table>table see original document page 69</column></row><table>

Expressão ectópica do Clone 101255 sob o controle do promoter35S induz os seguintes fenótipos:

Eficiência aumentada da fotossíntese em solo esgotado comnitrogênio, 38 dias depois da germinação, comparado aos controles.

ME07344 foi identificada de seleções de mudas de superpoolstolerantes a condições de baixo teor de nitratos e baixo teor de amônia.

As superpools 52-61 e mais tarde 56-65 foram monitoradas paraselecionar mudas que eram mais largas, mais verdes, ou tinham uma efici-ência maior a fotossintéticos do que os controles em meio de crescimentocom baixo teor de nitrato e baixo teor de nitrato de amônia. Oito dos 72 can-didatos com tolerância a baixo teor de nitrato e um candidato com tolerânciaa baixo teor de nitrato de amônio se alinharam a ME07344 quando analisa-dos usando BLAST.

Ambos os eventos de ME07344 segregado para uma inserçãosimples.

Os eventos -02 e -03 segregaram 3:1 (R:S) para resistência aFinale® na geração T2 (dados não mostrados).

Dois eventos de ME07344 mostraram eficiência fotossintéticasignificativamente aumentada sob condições de baixo teor de nitrogênio emambas as gerações.

Dois eventos de ME07344 foram semeados em solo SunshineLP#5 em ambas as gerações T2 e T3. Neste estudo, a quarta folha verdadei-ra de cada planta foi coletada no 38° dia e analisada no CF imager por seuvalor Fv/Fm. Plantas transgênicas dentro de um evento foram comparadascom todas as plantas não-transgênicas, incluindo os segregantes não trans-gênicos e controles externos. Os eventos -02 e -03 foram significativos em ρ< 0,05, usando um teste-1 unilateral assumindo uma variância desigual (Ta-bela 7.1). _,___,

<table>table see original document page 70</column></row><table>

Análise Qualitativa da plantas Ti :

Eventos -01 e -04 foram verde escuro com envólucros de folhasalongados. O Evento -10 foi verde escuro. Os eventos remanescentes pare-ceram do tipo selvagem.

Análise Qualitativa e quantitativa das plantas T? :

Não houve nenhuma diferença observável ou estatística entre oseventos -02 e -03 de ME07344 e plantas do tipo selvagem quanto à germi-nação ou fertilidade (como medido pelo número de siliqua e o preenchimentode semente).

O clone 101255 codifica um fator de transcrição "dedo de zinco"(zinc finger) tipo CCCH de um amino ácido 359 da Arabidopsis.Conformedescrito acima, fatores de transcrição podem controlar a expressão de múlti-plos gens em caminhos e podem por fim afetar a eficiência do uso de nitro-gênio por plantas e tolerância a condições de crescimento com baixo teor denitrogênio.

Os resultados dos seguintes Exemplos 8-10 confirmam que oshomólogos dos Leads descritos acima mostram NVE aperfeiçoado quandotestados pelos ensaios descritos a cima.

Exemplo 8: ME24939 SEQ ID NO: 200 (ÁREA DA MUDA E EFICIÊNCIAFOTOSSINTÉTICA (P.E.)) - HOMÓLOGOS DE ME10822 (SEQ ID NQ:201)

<table>table see original document page 71</column></row><table>Tabela 8.2 Comparação teste t da eficiência fotossintética de mudas entremudas transgênicas e segregantes não transgênicos agrupados na mes-ma linha após 14 dias de crescimento com baixo teor de nitrato.

<table>table see original document page 72</column></row><table>Exemplo 9: ME02730 (SEQ ID NO: 112) (P.E. SOMENTE) - HOMÓLOGODE ME08309 (SEQ ID NO: 107)

Tabela 9.1 Comparação por teste T da eficiência fotossintética das mudas entre mudas transgênicas e segregantes não transgênicos agrupados atra- vés da mesma linha após 14 dias de crescimento em baixo teor de nitrato. <table>table see original document page 73</column></row><table>

Exemplo 10: ME05213 (P.E. E DADOS DA MUDA PARA UM EVENTO) SEQID NO:84- HOMÓLOGO DE ME02507 (SEQ ID NO:81)

Tabela 10.1 Comparação por teste T da eficiência fotossintética das mu- das entre mudas transgênicas e segregantes não-trasngênicos agrupados através da mesma placa após 14 dias de crescimento em baixo teor de nitrato. - <table>table see original document page 73</column></row><table><table>table see original document page 74</column></row><table>

Exemplo 11 - Determinação de Seqüências Homólogas Funcionais

As seqüências "Lead" descritas nos exemplos acima são utiliza-das para identificar homólogos funcionais das seqüências líder e, juntas comaquelas seqüências, são utilizadas para determinar uma seqüência de con-senso para um dado grupo de líderes e seqüências homólogas funcionais.

Uma seqüência indivíduo é considerada um homólogo funcionalde uma seqüência de busca se o indivíduo e as seqüências de busca codifi-cam proteínas contendo uma função e/ou atividade similar. Um processoconhecido como BLAST recíproco (Rivera et al, (1998) Proc.Natl Acad. Sei.USA 95:6239-6244) é empregado para identificar as seqüências de homólo-gos funcionais potenciais a partir de dados de base consistindo de todas asseqüências de peptídeos públicas e proprietárias disponíveis, incluindo NRda NCBI e translações de peptídeo dos clones Ceres.

Antes de iniciar um processo BLAST recíproco, uma busca es-pecífica de polipetídeo é procurada contra todos os peptídeos de suas espé-cies de fontes usando BLAST para identificar polipeptídeos contendo umaidentidade de seqüência de 80% ou maior do que polipeptídeos de busca eum comprimento de alinhamento de 85% ou maior ao longo com a seqüên-cia mais curta no alinhamento. O polipeptídeo de busca e quaisquer dos po-lipeptídeos identificados anteriormente mencionados são designados comoum cluster.

O programa BLASTP versão 2.0 da Universidade de Washingtonem Saint Louis, Missouri, EUA foi usado para determinar a identidade daseqüência BLAST e o valor Ε. O programa BLASTP versão 2.0 inclui os se-guintes parâmetros: 1) um corte de valor E a partir de 1 ,Oe-5; 2) um tamanhode palavra 5; e 3) a opção -postsw. A identidade da seqüência BLAST foicalculada baseada no alinhamento do primeiro BLAST HSP (High-scoringSegment Pairs) do homólogo funcional potencialmente identificado e/ou se-qüência ortóloga com um polipeptídeo de busca específico. O número deresíduos identicamente coincidentes no alinhamento BLAST HSP foi divididopelo comprimento HSP1 e então multiplicado por 100 para calcular a identi-dade de seqüência BLAST. O comprimento HSP tipicamente incluiu lacunas(gaps) no alinhamento, mas em alguns casos gaps podem ser excluídas.

O principal processo BLAST recíproco consiste de duas rodadasde testes de BLAST; uma busca para frente e uma busca reversa. Na etapade busca para frente, uma seqüência de polipeptídeo de busca, "polipeptí-deo A," da espécie de fonte Sa é submetido a BLAST contra todas as se-qüências de proteína de uma espécie de interesse. Os maiores acertos (Tophits) são determinados usando um corte do valor E de 10"5 e um corte deidentidade de 35%. Entre os maiores acertos, a seqüência contendo o menorvalor E é designada o melhor acerto (best hit), e considerada um homólogofuncional potencial. Qualquer outro top hit que tivesse uma seqüência deidentidade de 80% ou maior relativo ao melhor acerto ou ao polipeptídeo debusca original, também ^considerado um homólogo funcional potencial. Es-te processo é repetido para todas as espécies de interesse.

Na etapa de busca reversa, o top hit identificado na busca para afrente de todas as espécies é usado para executar uma busca BLAST contratodas as seqüências de proteína ou polipeptídeos de uma espécie de fonteSA. Um top hit da busca para a frente que retornou um polipeptídeo do gru-pamento (cluster) anteriormente mencionado como seu melhor hit, também éconsiderado um homólogo funcional potencial.

Homólogos funcionais são identificados por inspeção manualdas seuqências homólogas funcionais potenciais. Homólogos funcionais re-presentativos são mostrados nas Figuras 1-5. As Figuras representam umagrupamento de uma seqüência líder/de busca alinhada com as seqüênciasindividuais homólogas funcionais correspondentemente identificadas. As se-guências líder e suas seqüências homólogas funcionais correspondentessão alinhadas para identificar amino ácidos conservados e para determinaruma seqüência de consenso que contem um resíduo de amino ácido queocorre freqüentemente em posições particulares nas seqüências de alinha-mento, conforme mostrado nas Figura 1-5.

Cada seqüência dé consenso depois é composta das regiões oudomínios conservados identificados e numerados, com algumas das regiõessendo separadas por um ou mais resíduos de amino ácidos, representadospor um traço (-), entre regiões conservadas.

Polipeptídeos úteis da invenção, portanto, incluem cada Uma dasseqüências de homólogos líder e funcional mostradas nas Figuras 1-5, bemcomo as seqüências de consenso mostradas nas figuras. A invenção tam-bém abrange outros polipeptídeos úteis construídos à base da seqüência deconsenso e as regiões conservadas identificadas. Assim, polipeptídeos úteisincluem aqueles que compreendem uma ou mais das regiões conservadasnumeradas em cada tabela de alinhamento nas figuras 1-5, onde as regiõesconservadas podem ser separadas por traços. Polipeptídeos úteis tambémincluem aqueles que compreendem todas as regiões conservadas numera-das nas figuras 1-5, alternativamente compreendendo todas as regiões nu-meradas conservadas em uma tabela de alinhamento individual e na ordemconforme esboçado nas figuras de 1 -5. Polipeptídeos úteis também incluemaqueles que compreendem todas as regiões numeradas conservadas natabela de alinhamento e na ordem conforme esboçado nas Figuras 1-5, ondeas regiões conservadas são separadas por traços, onde cada traço entreduas regiões adjacentes conservadas é composto de amino ácidos esboça-dos na tabela de alinhamento para seqüências de homólogos líder e/ou fun-cionais na posições que definem o traço particular. Tais traços na seqüênciade consenso podem ser de um comprimento variando do comprimento domenor número de traços em uma das seqüências alinhadas até o compri-mento do maior número de traços em uma das seqüências alinhadas.

Tais polipeptídeos também podem ter um comprimento (um nú-mero total de resíduos de amino ácidos) igual ao comprimento identificadopara uma seqüência de consenso ou de um comprimento variando da se-qüência mais curta para a mais longa seqüência em qualquer família de se-qüências homólogas líder e funcionais identificadas nas Figuras 1-5.

A presente invenção ainda abrange nucleotídeos que codificamos polipeptídeos descritos acima, bem como seus complementos e incluindosuas alternativas baseado na degeneração do código genético.

A invenção sendo assim descrita, ficará claro para um especia-lista usual na técnica que várias modificações dos materiais e métodos paraa prática da invenção podem ser feitas. Tais modificações devem ser consi-deradas dentro do âmbito da invenção conforme definido pelas seguintesreivindicações.

As seguintes referência são citadas no pedido de patente. Cadauma das referências da patente e literatura periódica citadas aqui é assimexpressamente incorporada na sua totalidade por uma tal citação.

REFERÊNCIAS

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Claims (24)

1. Processo para aprimorar a eficiência no uso de nitrogênio,modular crescimento vegetativo, vigor de mudas e/ou biomassa de plantas,o referido método compreendendo a introdução em um célula de planta deum ácido nucléico isolado contendo uma seqüência de nucleotídeo selecio-nada do grupo que consiste de:(a) Uma seqüência de nucleotídeo que codifica uma seqüênciade amino ácido que é pelo menos 85% idêntica a qualquer uma das seqüên-cias Líderes (Ieads) 82, 85, 92, 93, 98, 112, ME07344, ME05213, ME02730e ME24939, SEQ ID Nos: 81, 105, 107, 114, 116, 201, 140, 84, 112 e 200,respectivamente;(b) Uma seqüência de nucleotídeos que é complementar a qual-quer uma das seqüências de nucleotídeo de acordo com o parágrafo (a);(c) Uma seqüência de nucleotídeos de acordo com qualqueruma das SEQ ID Nos: 80, 104, 106, 113, 115, 127, 139, 202, 203 e 204;(d) Uma seqüência de nucleotídeos que é um RNA interferente àseqüência de nucleotídeo de acordo com o parágrafo (a);(e) Uma seqüência de nucleotídeos capaz de formar um duplexhibridizado de ácido nucleico com o ácido nucleico de acordo com qualquerum dos parágrafos (a) - (d) a uma temperatura de aproximadamente 40 0C aaproximadamente 48 0C abaixo da temperatura de fusão do duplex hibridi-zado de ácido nucleico;(f) Uma seqüência de nucleotídeo que codifica qualquer uma dasseqüências de amino ácido identificadas como seqüências líderes (Leads)-82, 85, 92, 93, 98, 112, ME07344, ME05213, ME02730 e ME24935, corres-pondentes a SEQ ID Nos: 81, 105, 107, 114, 116, 201, 140, 84, 112 e 200,respectivamente; ou(g) Uma seqüência de nucleotídeo que codifica qualquer umadas seqüências líder, homóloga funcional ou de consenso nas figuras 1-5,onde cada planta produzida a partir da referida célula de planta apresentaeficiência aprimorada do uso de nitrogênio, tamanho de planta modulado,crescimento vegetativo modulado, vigor de muda modulado e/ou biomassamodulada conforme comparados com o nível correspondente em tecido deuma planta de controle que não compreende tal referido ácido nucleico.

2. Processo de acordo com a reivindicação 1, onde a referidaseqüência de consenso compreende uma ou mais das regiões conservadasidentificadas em qualquer uma das tabelas de alinhamento nas figuras 1 - 5.

3. Processo de acordo com a reivindicação 2, onde a referidaseqüência de consenso compreende todas as regiões conservadas identifi-cadas nas tabelas de alinhamento nas figuras 1-5.

4. Processo o de acordo com a reivindicação 3, onde a referidaseqüência de consenso òompreende todas as regiões conservadas e na or-dem identificada nas tabelas de alinhamento nas figuras 1 - 5.

5. Processo de acordo com a reivindicação 4, onde as referidasregiões conservadas são separadas por um ou mais resíduos de amino ácido.

6. Processo de acordo com a reivindicação 5, onde cada um dosreferidos um ou mais amino ácidos consistem em número e tipo com os a-mino ácidos mostrados na tabela de alinhamento para as seqüências líderè/ou homólogas funcionais nas posições correspondentes que definem alacuna (gap).

7. Processo de acordo com a reivindicação 6, onde a referidaseqüência de consenso tem um comprimento em termos de número total deamino ácidos que é igual ao comprimento identificado para uma seqüênciade consenso nas figuras 1 - 5, ou igual ao comprimento que varia da se-qüência mais curta à seqüência mais longa nas figuras 1-5.

8. Processo de acordo com a reivindicação 1, onde a referidadiferença é um aumento no nível da eficiência do uso de nitrogênio, tanahode planta, crescimento vegetativo, vigor de semente e/ou biomassa.

9. Processo de acordo com a reivindicação 1, onde o referidoácido nucleico isolado é ligado operacionalmente a uma região reguladora.

10. Processo de acordo com a reivindicação 9, onde a referidaregião reguladora é um promotor selecionado do grupo consistindo deYP0092 (SEQ ID NO: 38), PT0676 (SEQ ID NO: 12), PT0708 (SEQ ID NO:-17), ΡΤ0613 (SEQ ID NO: 5), PT0672 (SEQ ID NO: 11(, PT0678 (SEQ IDNO: 13), PY0688 (SEQ ID NO: 15), PT0837 (SEQ ID NO: 24), o promotornapin, o promotor arcelin-5, o promotor gen faseolin, o promotor de inibidortripsina de soja, o promotor ACP, o gen estearoil-ACP desaturase, a subuni--dade a' de soja do promotor β-conglicinina, o promotor oleosina, o promotor-15 kD zeína, o promotor 16 kD zeína, o promotor 19 kD zeína, o promotor 22kD zeína, o promotor 27 kD zeína, o promotor Osgt-1, o promotor de genbeta-amilase, o promotor de gen de cevada hordeína, p326 (SEQ ID NO:-76), YP0144 (SEQ ID NO: 55), YP0190 (SEQ ID NO: 59), p13879 (SEQ ID-NO: 75), YP0050 (SEQ ID NO: 35), p32449 (SEQ ID NO: 77), 21876 (SEQID NO: 1), YP0158 (SEQ ID NO: 57), YP0214 (SEQ ID NO: 61), YP0380(SEQ ID NO: 70), PT0848 (SEQ ID NO: 26), e PT0633 (SEQ ID NO:7), opromotor do vírus do mosaico da couve-flor (CaMV) 35S, o promotor da sin-tase de mannopine (MAS), os promotores 11 ou 2' derivados de T-DNA de-Agrobacterium tumefaciens, o promotor do vírus do mosaico de figwort 34S,promotores de actina tais como o promotor de actina de arroz, promotoresde ubiquitina tais como o promotor de milho ubiquitina-1, promotores de ribu-Iose-1,5-bisfosfato carcaixailase (RbcS) tais como o promotor RbcS de Larixiaricina, o promotor de pinho cab6, o promotor de gen Cab-Ide trigo, o pro--motor de espinafre CAB-1, o promotor cab1 R de arroz ,o promotor de piruva-to ortofosfato dikinase (PPDK) de milho, o promotor de tabaco Lhebl *2, umpromotor de Arabidopsis thaliana SUC2 sucrose-H+ symporter, e promotoresda proteína da membrana tilacoide de espinafre (psaD, psaF, psaE, PC,FNR, atpC, atpD, cab, rbcS, PT0535 (SEQ ID NO: 3), PT0668 (SEQ ID NO:-2), PT0886 (SEQ ID NO: 29), PR0924 (SEQ ID NO: 78), YP0144 (SEQ IDNO: 55), YP0380 (SEQ ID NO: 70) e PT0585 (SEQ ID NO: 4).

11. Célula de planta compreendendo um ácido nucleico isoladocompreendendo uma seqüência de nucleotídeos selecionada do grupo queconsiste de:(a) Uma seqüência de nucleotídeo que codifica uma seqüênciade amino ácido que é pelo menos 85% idêntica a qualquer uma das seqüên-cias Líderes (Ieads) 82, 85, 92, 93, 98, 112, ME07344, ME05213, ME02730e ΜΕ24939, correspondendo às SEQ ID Nos: 81, 105, 107, 114, 116, 201,-140, 84, 112 e 200, respectivamente;(b) Uma seqüência de nucleotídeos que é complementar a qual-quer uma das seqüências de acordo com o parágrafo (a);(c) Uma seqüência de nucleotídeos de acordo com qualqueruma das SEQ ID Nos: 80, 104, 106, 113, 115, 127, 139, 202, 203 e 204;(d) Uma seqüência de nucleotídeos que é um RNA interferente àseqüência de nucleotídeo de acordo com o parágrafo (a);(e) Uma seqüência de nucleotídeos capaz de formar um duplexhibridizado de ácido nucleico com o ácido nucleico de acordo com qualquerum dos parágrafos (a) - (d) a uma temperatura de aproximadamente 40 0C aaproximadamente 48 0C abaixo da temperatura de fusão do duplex hibridi-zado de ácido nucleico;(f) Uma seqüência de nucleotídeo que codifica qualquer uma dasseqüências de amino ácido identificadas como seqüências líderes (Leads)-82, 85, 92, 93, 98, 112, ME07344, ME05213, ΜΕ02730 e ME24935, corres-pondentes a SEQ ID Nos: 81, 105, 107, 114, 116, 201, 140, 84, 112 e 200,respectivamente, ou(g) Uma seqüência de nucleotídeos que codifica qualquer umadas seqüências líderes (lead), homólogas funcionais ou de consenso nasfiguras 1-5.

12. Planta transgênica compreendendo a célula de planta dareivindicação 11.

13. Progênie da planta de acordo com a reivindicação 12, onde areferida progênie apresenta tamanho de planta modulado, crescimento vege-tativo modulado, arquitetura de planta modulada, vigor de muda moduladoe/ou biomassa modulada conforme comparadas ao nível correspondente emtecido de uma planta de controle que não contém o referido ácido nuôlèico.

14. Progênie da planta de acordo com a reivindicação 12, onde areferida progênie apresenta eficiência de uso de nitrogênio aprimorada con-forme comparada com uma planta de controle que não contém o referidoácido nucleico.

15. Semente de uma planta transgênica de acordo com a reivin-dicação 12.

16. Tecido vegetativo de uma planta transgênica de acordo coma reivindicação 12.

17. Produto de alimentação compreendendo um tecido vegetati-vo de uma planta transgênica de acordo com a reivindicação 12.

18. Produto de alimentação animal compreendendo um tecidovegetativo de uma planta transgênica de acordo com a reivindicação 12.

19. Produto compreendendo um tecido vegetativo de uma plantatransgênica de acordo com a reivindicação 12, empregado para a conversãoem combustível ou matéria prima química.

20. Método para aprimorar a eficiência do uso de nitrogênio e/oubiomassa de uma planta, o referido método compreendendo a alteração donível de expressão na referida planta de uma molécula de ácido nucleicocompreendendo uma seqüência de nucleotídeos selecionada do grupo queconsiste de:(a) Uma seqüência de nucleotídeo que codifica uma seqüênciade amino ácido que é pelo menos 85% idêntica a qualquer uma das seqüên-cias Líderes (Ieads) 82, 85, 92, 93, 98, 112, ME07344, ME05213, ME02730e ME24939, SEQ ID Nos: 81, 105, 107, 114, 116, 201, 140, 84, 112 e 200,respectivamente;(b) Uma seqüência de nucleotídeos que é complementar a qual-quer uma das seqüências de nucleotídeo de acordo com o parágrafo (a);(c) Uma seqüência de nucleotídeos de acordo com qualqueruma das SEQ ID Nos: 80, 104, 106, 113, 115, 127, 139, 202, 203 e 204;(d) Uma seqüência de nucleotídeos que é um RNA interferente àseqüência de nucleotídeo de acordo com ò parágrafo (a);(e) Uma seqüência de nucleotídeos capaz de formar um duplexhibridizado de ácido nucleico com o ácido nucleico de acordo com qualquerum dos parágrafos (a) - (d) a uma temperatura de aproximadamente 40 0C aaproximadamente 48 0C abaixo da temperatura de fusão do duplex hibridi-zado de ácido nucleico;(f) Uma seqüência de nucleotídeo que codifica qualquer uma dasseqüências de amino ácido identificadas como seqüências líderes (Leads)-82, 85, 92, 93, 98, 112, ME07344, ME05213, ME02730 e ME24935, corres-pondentes a SEQ ID Nos: 81,105, 107, 114, 116, 201, 140, 84, 112 e 200,respectivamente; ou(g) Uma seqüência de nucleotídeo que codifica qualquer umadas seqüências líder, homóloga funcional ou de consenso nas figuras 1 - 5,onde cada planta produzida a partir da referida célula de planta apresentaeficiência aprimorada do uso de nitrogênio, tamanho de planta modulado,crescimento vegetativo modulado, vigor de muda modulado e/ou biomassamodulada conforme comparados com o nível correspondente em tecido deuma planta de controle que não compreende tal referido ácido nucleico.

21. Processo para identificar um ácido nucleico em uma amos-tra, compreendendo: o fornecimento de um ácido nucleico isolado de acordocom a reivindicação 1; a contactação do referido ácido nucleico com umaamostra sob condições que permitem uma comparação com a seqüência doácido nucleico isolado na amostra; e a análise da comparação.

22. Processo para a promoção de eficiência de uso de nitrogênioaprimorada e/ou biomassa aumentada em uma planta, compreendendo:(a) A transformação da planta com uma molécula de ácido nu-cleico compreendendo uma seqüência de nucleotídeos que codifica qualqueruma das seqüências líderes (leads), homólogas funcionais ou de consensonas figuras 1 - 5; e(b) A expressão da referida seqüência de nucleotídeos na referi-da planta transformada, onde a referida planta transformada apresenta umaeficiência de uso de nitrogênio aperfeiçoada e/ou biomassa ou vigor de mu-das aumentados conforme comparado com uma planta que não foi transfor-mada com a referida seqüência de ácido nucleico.

23. Molécula de ácido nucleico isolada compreendendo:(a) Uma seqüência de nucleotídeo que codifica uma seqüênciade amino ácido que é pelo menos 85% idêntica a qualquer uma das seqüên-cias Líderes (leads) 82, 85, 92, 93, 98, 112, ME07344, ME05213, ME02730e ΜΕ24939, correspondendo às SEQ ID Nos: 81, 105, 107, 114, 116, 201,- 140, 84, 112 e 200, respectivamente;(b) Uma seqüência de nucleotídeos que é complementar a qual-quer uma das seqüências de acordo com o parágrafo (a);(c) Uma seqüência de nucleotídeos de acordo com qualqueruma das SEQ ID Nos: 80, 104, 106, 113, 115, 127, 139, 202, 203 e 204;(d) Uma seqüência de nucleotídeos que é um RNA interferente àseqüência de nucleotídeo de acordo com o parágrafo (a);(d) Uma seqüência de nucleotídeos capaz de formar um duplexhibridizado de ácido nucleico com o ácido nucleico de acordo com qualquerum dos parágrafos (a) - (c) a uma temperatura de aproximadamente 40 0C aaproximadamente 48 0C abaixo da temperatura de fusão do duplex hibridi-zado de ácido nucleico;(f) Uma seqüência de nucleotídeo que codifica qualquer uma dasseqüências de amino ácido identificadas como seqüências líderes (Leads)- 82, 85, 92, 93, 98, 112, ME07344, ME05213, ME02730 e ME24935, corres-pondentes a SEQ ID Nos: 81, 105, 107, 114, 116, 201, 140, 84, 112 e 200,respectivamente, ou(g) Uma seqüência de nucleotídeos que codifica qualquer umadas seqüências líderes (lead), homólogas funcionais ou de consenso nasfiguras 1-5.

24. Vetor, compreendendo:(a) Um primeiro ácido nucleico contendo uma região reguladoraque codifica a transcrição e/ou sinal de translação de uma planta; e(b) Um segundo ácido nucleico contendo uma seqüência de nu-cleotídeos de acordo com qualquer uma das seqüências de nucleotídeos dareivindicação 23, onde os referidos primeiro e segundo ácidos nucléicos es-tão ligados operacionalmente.