BRPI0706868A2 - anticorpo isolado, molécula de ácido nucléico, vetor, célula hospedeira, linhagem celular, método para a produção de anticorpo, composição, método para determinar a presença de um polipeptìdeo relt, método para tratar uma doença ou condição patológica causada agravada ou prolongada pelo ifn-alfa, método para tratar uma doença ou condição patológica associada com o ifn-alfa, métodos para aumentar a proporção de células dendrìticas plasmocitóides (pdc), métodos para diminuir a proporção de células dendrìticas plasmocitóides, métodos para aumentar a produção de ifn-alfa, métodos para diminuir a produção de ifn-alfa e métodos para diagnosticar uma doença ou condição relacionada com nìveis anormais de ifn-alfa - Google Patents

anticorpo isolado, molécula de ácido nucléico, vetor, célula hospedeira, linhagem celular, método para a produção de anticorpo, composição, método para determinar a presença de um polipeptìdeo relt, método para tratar uma doença ou condição patológica causada agravada ou prolongada pelo ifn-alfa, método para tratar uma doença ou condição patológica associada com o ifn-alfa, métodos para aumentar a proporção de células dendrìticas plasmocitóides (pdc), métodos para diminuir a proporção de células dendrìticas plasmocitóides, métodos para aumentar a produção de ifn-alfa, métodos para diminuir a produção de ifn-alfa e métodos para diagnosticar uma doença ou condição relacionada com nìveis anormais de ifn-alfa Download PDF

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Kayagaki Nobuhiko
Wu Yan
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Abstract

ANTICORPO ISOLADO, MOLéCULA DE áCIDO NUCLéICO, VETOR, CELULA HOSPEDEIRA, LINHAGEM CELULAR, MéTODO PARA A PRODUçãO DE ANTICORPO, COMPOSIçãO, MéTODO PARA DETERMINAR A PRESENçA DE UM POLIPEPTìDEO RELT, MéTODO PARA TRATAR UMA DOENçA OU CONDIçãO PATOLOGICA CAUSADA AGRAVADA OU PROLONGADA PELO IFN-<244>, MéTODO PARA TRATAR UMA DOENçA OU CONDIçãO PATOLõGICA ASSOCIADA COM O IFN-<244>, MéTODOS PARA AUMENTAR A PROPORçãO DE CELULAS DENDRìTICAS PLASMOCITOIDES (pDC), MéTODOS PARA DIMINUIR A PROPORçãO DE CéLULAS DENDRITICAS PLASMOCITõIDES, MéTODOS PARA AUMENTAR A PRODUçãO DE IFN-a, MéTODOS PARA DIMINUIR A PRODUçãO DE IFN-a E MéTODO PARA DIAGNOSTICAR UMA DOENçA OU CONDIçãO RELACIONADA COM NìVEIS ANORMAIS DE IFN-<244>" São fornecidos anticorpos anti-RELT monoclonais e os métodos para a utilização dos anticorpos. Também são fornecidos métodos para a utilização de polipeptideos RELT e ácidos nucléicos, na modulação do desenvolvimento de células imunitárias e na modulação da produção de citocina.

Description

"ANTICORPO ISOLADO, MOLÉCULA DE ÁCIDO NUCLÉICO, VETOR,CÉLULA HOSPEDEIRA, LINHAGEM CELULAR, MÉTODO PARA APRODUÇÃO DE ANTICORPO, COMPOSIÇÃO, MÉTODO PARADETERMINAR A PRESENÇA DE UM POLIPEPTÍDEO RELT, MÉTODOPARA TRATAR UMA DOENÇA OU CONDIÇÃO PATOLÓGICA CAUSADAAGRAVADA OU PROLONGADA PELO IFN-α, MÉTODO PARA TRATARUMA DOENÇA OU CONDIÇÃO PATOLÓGICA ASSOCIADA COM O IFN-a,
MÉTODOS PARA AUMENTAR A PROPORÇÃO DE CÉLULASDENDRÍTICAS PLASMOCITÓIDES (pDC), MÉTODOS PARA DIMINUIR APROPORÇÃO DE CÉLULAS DENDRÍTICAS PLASMOCITÓIDES, MÉTODOSPARA AUMENTAR A PRODUÇÃO DE IFN-a, MÉTODOS PARA DIMINUIR APRODUÇÃO DE IFN-a E MÉTODO PARA DIAGNOSTICAR UMA DOENÇAOU CONDIÇÃO RELACIONADA COM NÍVEIS ANORMAIS DE IFN-a"
Campo da Invenção
A presente invenção está relacionada ao campo de métodos queutilizam polipeptídeos e ácidos nucléicos RELT na modulação dodesenvolvimento de células do sistema imune e modulação na produção decitocina. Esta invenção também se refere ao campo de anticorpos anti-RELT, emais particularmente a anticorpos anti-RELT que são agonistas da produção decitocina de células que expressam RELT.
Antecedentes da Invenção
Interferons do tipo I (IFNs) são citocinas que possuem efeitospleiotrópicos em uma série de tipos celulares. IFNs são mais conhecidas porsuas atividades antivirais, mas também possuem funções regulatórias docrescimento celular, imunomoduladoras, antibacterianas e anti protozoários(van den Broek et ai, lmmunol. Rev. 148: 5-18 (1995); Pfeffer et a/., CâncerRes. 58: 2489-99 (1998)). Interferons do tipo I incluem interferon-α (IFN-a) einterferon-β (IFN-β).Células dendríticas plasmocitóides (pDCs) CD11c+B220+CD11b-CD45RB+ de murinos, também conhecidas como células produtoras de IFN(IPCs)1 exibem uma morfologia plasmocitóide distintiva e são produtorasrobustas de IFN do tipo I quando expostas a oligodeoxinucleotídeos CpG nãometilados ou a uma faixa ampla de vírus de DNA ou RNA (Colonna et al., Nat.Immunol. 5: 1219-26 (2004); Hochrein et ai, Hum. Immunoi 63: 1103-10(2002); Nakano etal., J. Exp. Med. 194: 1171-8 (2001); Diebold etal., Science303: 1529-31 (2004); Dalod et al., J. Exp. Med. 195: 517-28 (2002); Asselin-Paturel et al., Nat. Immunol. 2: 1144-50 (2001); e Lund etal., J. Exp. Med. 198:513-20 (2003)). Esta produção de IFN é dependente de receptores análogos atoll 7 e 9, e adaptador a jusante (downstream) MyD88 (Diebold et al., Science303: 1529-31 (2004); Lund etal., J. Exp. Med. 198: 513-20 (2003); Krug etal.,Immunity 21: 107-19 (2004); Hemmi et al., J. Immunol. 170: 3059-64 (2003)).Em camundongo infectado com determinados vírus, tais como citomegalovírusde murino (MCMV), pDCs são as principais, e provavelmente únicas fontes deIFN-α (Dalod etal., J. Exp. Med. 195: 517-28 (2002); Asselin-Paturel etal., Nat.Immunol. 2: 1144-50 (2001)). O desenvolvimento e cooperação de pDCs eCD11c+B220~DCs (cDCs) convencionais, um subconjunto distinto de célulasapresentadoras de antígeno "profissionais" que ativam células T nativasantígeno-específicas (Colonna et al., Nat. Immunol. 5: 1219-26 (2004);Banchereau et al., Nature 392: 245-52 (1998)), são críticos para a geração derespostas imunes apropriadas para um dado patógeno. pDC tem sido tambémrelacionada com o desempenho de um papel crucial no desenvolvimento epatofisiologia de doenças autoimunes, tais como o lúpus (vide, por exemplo,Ronnblom, J. Exp. Med. 194: F59 (2001)), em disfunções imunes tais comorinite alérgica e asma, (Jahnsen et al., J. Immunol. 165: 4062-4068 (2000);Matsuda et al., Am. J. Resp. Crit. Care Med. 166: 1050-1054 (2002)), e emcâncer (tal como câncer de ovário, conforme descrito por Zou et al., Nat. Med.7:1339-1346 (2001)), e síndromes mielodisplásicas (MDS), conforme descritopor Ma et al., Leukemia 18(9): 1451-1456 (2004).
Tanto as células progenitoras linfóides comuns (CLP) quanto ascélulas progenitoras mielóides comuns (CMP) na medula óssea murina podemdesenvolver populações cDC e pDC (Shigematsu et al., Immunity 21: 43-53),enquanto um subconjunto de classe II" CD1 Ic+MHC no sangue periférico temsido identificado como a população que contém os precursores imediatos paraos subconjuntos pDC e cDC (dei Hoyo et al., Nature 415: 1043-7 (2002)).
Estudos de combinação gênica em camundongos identificaram diversasmoléculas de sinalização intracelular e fatores de transcrição que regulam odesenvolvimento de cDCs; fator regulatório de IFN (IRF) 2, IRF4, lkaros, ReIB1TRAF6, e PU.1 são, cada um, essenciais para o desenvolvimento de cDC(Ardavin et al., Nat. Rev. Immunol. 3: 582-90 (2003)). Consideravelmentemenos é conhecido sobre o desenvolvimento de pDC. Um camundongo quecarece da proteína de ligação da seqüência consenso IRF8/IFN (ICSBP) exibedefeitos no desenvolvimento de pDC, mas células mielóides e odesenvolvimento de cDC também são debilitados nestes camundongos(Tsujimura et al., J. Immunol. 170: 1131-5 (2003)). A diferenciação deprogenitores em pDCs e cDCs é estimulada em camundongos ou na cultura demedula óssea por Iigantes de tirosina quinases 3 relacionados a fms (FLT3L)(Vollstedt et al., J. Exp. Med. 197: 575-84 (2003); Gilliet et ai, J. Exp. Med. 195:953-8 (2002)).
Determinados receptores TNF e seus Iigantes foram identificadoscomo mediadores importantes da ativação e atividade de células dendríticas(Anderson et al., Nature 390: 175-179 (1997). A superfamília de receptoresTNF (TNFRSF) compreende pelo menos 29 membros, a maioria dos quais sãoproteínas de membrana integral do tipo I. Estes receptores possuem domíniosextracelulares ricos em cisteína, conservados (CRDs)1 que são pseudorepetidos, tipicamente contendo seis resíduos de cisteína ligados por trêspontes dissulfeto. Membros da TNFRSF promovem um conjunto de resultadosbiológicos quando engajados por seus Iigantes cognatos, incluindosobrevivência celular, morte celular, proliferação, e diferenciação (Locksley etai, Cell 104: 487-501 (2001); Bodmer et ai, Trends Biochem. Sei. 27: 19-26(2002)).
Dentro destas TNFRSF, existem diversos receptores órfãos cujosligantes específicos têm ainda que ser identificados, incluindo ReceptorExpresso em Tecidos Linfóides (RELT)/TNFRSF19L (Sica et ai, Blood 97:2702-7 (2001)). RELT é uma proteína de superfície celular do tipo I com doisCRDs. Quando expressa ectopicamente, RELT ativa NF-κΒ (id.), um fator detranscrição essencial para a expressão de genes necessários para a imunidadeinata e adquirida (Bonizzi et al., Trends Immunol. 25: 280-8 (2004)). Aexpressão do mRNA de RELT parece amplamente relacionada a tecidoslinfóides, tais como o baço e Iinfonodos (Sica et al., Blood 97: 2702-7 (2001)).O entendimento do papel de RELT na função e regulação de células imunespode fornecer novos desenvolvimentos para o tratamento de doenças imunes.
Todas as referencias citadas no presente, incluindo documentosde patentes e publicações, são integralmente incorporadas ao presente comoreferência.
Descrição Resumida da Invenção
Métodos que utilizam polipeptídeos de ácidos nucléicos RELT namodulação do desenvolvimento de determinadas células imunes, e modulaçãona produção de citocina de determinadas células imunes são fornecidos. Novosanticorpos capazes de ligar e/ou regular atividades biológicas associadas comRELT, são também fornecidos.
Em uma realização, um anticorpo isolado que se ligaespecificamente a RELT é fornecido. Em uma realização, um anticorpo isoladoé fornecido, que compreende pelo menos uma seqüência hipervariável (HVR)selecionada de HVR-H1, HVR-H2, e HVR-H3, de qualquer uma das seqüênciasSEQ ID NOs: 42-49, 51-58, e 60-67, respectivamente. Em um aspecto, oanticorpo isolado se liga particularmente a RELT. Em outro aspecto, oanticorpo isolado compreende adicionalmente uma seqüência hipervariável decadeia leve selecionada da SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 2. Em outro aspecto,o anticorpo se liga especificamente a RELT humano. Em outro aspecto, oanticorpo inibe a ligação de RELT a pelo menos um Iigante de RELT. Em outroaspecto, o anticorpo é um antagonista de RELT. Em outro aspecto, o anticorpoinibe pelo menos uma via de sinalização mediada por RELT. Em um aspectoadicional, o anticorpo estimula a produção de NF-κΒ a partir de uma célula queexpressa RELT. Ainda em outro aspecto, o anticorpo é um agonista de RELT.Em mais um aspecto, o anticorpo estimula pelo menos uma via de sinalizaçãomediada por RELT.
Em outra realização, um anticorpo isolado é fornecido, quecompreende pelo menos uma seqüência selecionada de HVR-H1, HVR-H2,HVR-H3, em que HVR-H1 compreende a seqüência de aminoácido a b c d e f gh i j, em que o aminoácido a é glicina; o aminoácido b é fenilalanina; oaminoácido c é treonina; o aminoácido d é isoleucina; o aminoácido e éselecionado entre treonina, serina, e asparagina; o aminoácido f é selecionadode asparagina, glicina, serina, e ácido aspártico; o aminoácido g á selecionadode treonina, serina, e asparagina; o aminoácido h é selecionado de triptofano,tirosina, e serina; o aminoácido i é isoleucina; e o aminoácido j é histidina; emque HVR-H2 compreende a seqüência de aminoácido klmnopqrstuvwxy z a' b', em que o aminoácido k é selecionado de glicina e alanina; oaminoácido I é selecionado de fenilalanina, arginina, triptofano, glicina,asparagina, e tirosina; o aminoácido m é isoleucina; o aminoácido η éselecionado de serina, tirosina, treonina, e asparagina; o aminoácido o éprolina; o aminoácido ρ é selecionado de serina, asparagina, tirosina, e alanina;o aminoácido q é selecionado de glicina, asparagina, ácido aspártico, e serina;o aminoácido r é glicina; o aminoácido s é selecionado de tirosina, asparagina,ácido aspártico e serina; o aminoácido t é treonina; o aminoácido u éselecionado de asparagina, tirosina, e ácido aspártico; o aminoácido ν étirosina; o aminoácido w é alanina; o aminoácido χ á ácido aspártico; oaminoácido y é serina; o aminoácido ζ é valina; o aminoácido a' é lisina; e oaminoácido b' é glicina; em que HVR-H3 compreende a seqüência deaminoácido c' d' e' f g' h' i' j' k' I' m' n' o' p' q' r' s' t' u' v\ em que o aminoácidoc' é selecionado de arginina e lisina; o aminoácido d' é selecionado defenilalanina, triptofano, serina, glicina, leucina, e ácido aspártico; o aminoácidoe' é selecionado de leucina, ácido aspártico, alanina, serina, e arginina; oaminoácido f é selecionado de serina, tirosina, glicina, triptofano, e histidina; oaminoácido g' é selecionado de ácido aspártico, isoleucina, leucina, alanina,triptofano, e valina; o aminoácido h' é selecionado de glicina, ácido aspártico,asparagina, triptofano, alanina, treonina, e histidina; o aminoácido i' éselecionado de alanina, glicina, metionina, triptofano, ácido aspártico, e ácidoglutâmico; o aminoácido j' é selecionado de tirosina, triptofano, asparagina,valina, glicina, e ácido glutâmico; o aminoácido k' é selecionado de alanina,valina, glicina, histidina, ácido glutâmico, e arginina; o aminoácido Γ éselecionado de arginina, tirosina, valina, fenilalanina, e glicina; o aminoácido m'é selecionado de ácido aspártico, treonina, metionina, ácido glutâmico, tirosina,e arginina; o aminoácido n' é selecionado de tirosina, serina, ácido glutâmico,alanina, ácido aspártico, e prolina, ou não está presente; o aminoácido o' éselecionado de alanina, tirosina, metionina, triptofano, e valina, ou não estápresente; o aminoácido p' é selecionado de metionina, alanina, valina, e glicina,ou não está presente, o aminoácido q' é selecionado de arginina, valina,metionina, e ácido aspártico, ou não está presente; r' é selecionado de tirosinae metionina, ou não está presente; s' é valina ou não está presente; t' émetionina, ou não está presente; u' é ácido aspártico, ev'é tirosina. Em umaspecto, o anticorpo isolado se liga especificamente a RELT. Em um aspecto, oanticorpo isolado compreende adicionalmente uma seqüência hipervariável decadeia leve selecionada de SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 2. Em outro aspecto,o anticorpo especificamente se liga a RELT humano. Em outro aspecto, oanticorpo inibe a ligação de RELT a pelo menos um Iigante de RELT. Em outroaspecto, o anticorpo é um antagonista de RELT. Em outro aspecto, o anticorpoinibe pelo menos uma via de sinalização mediada por RELT. Em outro aspecto,o anticorpo estimula a produção de NF-κΒ de uma célula que expressa RELT.Em outro aspecto, o anticorpo é um agonista de RELT. Em outro aspecto, oanticorpo estimula pelo menos uma via de sinalização mediada por RELT.
Em outra realização, é fornecido um anticorpo isoladocompreendendo as seqüências HVR-H1, HVR-H2, e HVR-H3 quecorrespondem àquelas descritas para os clones C21, C10, E5/E7, F4, F5, H7,H9, e H11, nas figuras 5A e 5B. Em um aspecto, o anticorpo isolado se ligaespecificamente a RELT. Em outro aspecto, o anticorpo isolado compreendeadicionalmente uma seqüência hipervariável de cadeia leve selecionada deSEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 2. Em outro aspecto, o anticorpo se ligaespecificamente a RELT humano. Em outro aspecto, o anticorpo inibe a ligaçãode RELT a pelo menos um Iigante de RELT. Em outro aspecto, o anticorpo éum antagonista de RELT. Em outro aspecto, o anticorpo inibe pelo menos umavia de sinalização mediada por RELT. Em outro aspecto, o anticorpo estimula aprodução de NF-κΒ de uma célula que expressa RELT. Em outro aspecto, oanticorpo á um agonista de RELT. Em outro aspecto, o anticorpo estimula pelomenos uma via de sinalização mediada por RELT.
Em outra realização, é fornecido um anticorpo isolado quecompreende uma seqüência HVR-H1 de SEQ ID NO: 49, uma seqüência HVR-I Η2 de SEQ ID NO: 58, e uma seqüência HVR-H3 de SEQ ID NO: 67. Em umaspecto, o anticorpo isolado compreende adicionalmente uma seqüênciahipervariável de cadeia leve selecionada da SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 2. Emum aspecto, o anticorpo se liga especificamente a RELT humano. Em outroaspecto, o anticorpo inibe a ligação de RELT a pelo menos um Iigante deRELT. Em outro aspecto, o anticorpo é um antagonista de RELT. Em outroaspecto, o anticorpo inibi pelo menos uma via de sinalização mediada porRELT. Em outro aspecto, o anticorpo estimula a produção de NF-κΒ a partir deuma célula que expressa RELT. Em outro aspecto, o anticorpo é um agonistade RELT. Em outro aspecto, o anticorpo estimula pelo menos uma via desinalização mediada por RELT.
Em outro aspecto, é fornecido um anticorpo isolado que se liga aomesmo antigênico determinante em RELT, como qualquer um dos anticorposdescritos acima. Em uma realização, é fornecido um anticorpo isolado quecompete com qualquer um dos anticorpos descritos acima, para ligação aRELT.
Um anticorpo de acordo com a presente invenção pode estar emqualquer número de formas. Por exemplo, o anticorpo de acordo com apresente invenção pode ser um anticorpo quimérico, um anticorpo humanizado,ou um anticorpo humano. Em uma realização, um anticorpo de acordo com apresente invenção não é um anticorpo humano, por exemplo, ele não é umanticorpo produzido em um xenocamundongo (conforme descrito emW096/33735). Um anticorpo de acordo com a presente invenção pode ser decomprimento total ou um fragmento deste (por exemplo, um fragmentocompreende um componente de ligação de antígeno).
Em um aspecto, é fornecida ainda a molécula de ácido nucléicoque codifica um anticorpo da presente invenção. Em um aspecto, é fornecidoum vetor que compreende o ácido nucléico. Em um aspecto, é fornecida umacélula hospedeira que compreende o vetor. Em um aspecto, é fornecida umalinhagem celular capaz de produzir um anticorpo de acordo com a presenteinvenção. Em um aspecto, é fornecido um método de produção de umanticorpo de acordo com a presente invenção, que compreende o cultivo deuma célula hospedeira contendo uma molécula de ácido nucléico que codifica oanticorpo, sob condições em que o anticorpo seja produzido. Em um aspecto, éfornecida uma composição que compreende uma quantidade eficaz de umanticorpo de acordo com a presente invenção e um veículo farmaceuticamenteaceitável.
Em outra realização, é fornecido um método de determinação dapresença de um polipeptídeo RELT em uma amostra suspeita de conter opolipeptídeo RELT, que compreende a exposição da amostra a pelo menos umanticorpo de acordo com a presente invenção, e a determinação de ligação depelo menos um anticorpo ao polipeptídeo RELT na amostra.
Em outra realização, é fornecido um método de tratamento deuma doença ou condição causada por IFN-α, exacerbada ou prolongada, emum paciente, que compreende a administração ao paciente de uma quantidadeeficaz de pelo menos um anticorpo de acordo com a presente invenção. Emuma realização, a doença ou condição é causada por níveis reduzidos de IFN-a, exacerbado ou prolongado, em um paciente, com relação aos níveis de IFN-α na ausência da doença ou condição. Em um aspecto, a doença ou condiçãoé causada por aumento dos níveis de IFN-α, exacerbado ou prolongado, nopaciente, com relação aos níveis de IFN-α na ausência da doença ou condição.Em outra realização, é fornecido um método para o tratamento de uma doençaou condição associada com IFN-α em um paciente, que compreende aadministração ao paciente de uma quantidade eficaz de uma forma solúvel de RELT.
Em um aspecto, o paciente é um paciente mamífero. Em outroaspecto, o paciente é humano. Em outro aspecto, a doença ou condição éselecionada a partir de pelo menos uma entre: disfunção na proliferaçãocelular, infecção, disfunção inflamatória/imune, e uma disfunção relacionada ainterferon. Em outro aspecto, a doença inflamatória/imune é selecionada delúpus, asma, e rinite alérgica. Em outro aspecto, a infecção é selecionada deuma infecção microbiana, uma infecção viral e uma infecção fúngica. Em outrarealização, a disfunção na proliferação celular é selecionada entre a síndromemielodisplásica (MDS) e câncer.
Em outra realização, é fornecido um método para aumentar aproporção de células dendríticas plasmacitóide (pDC) produzidas a partir decélulas CD1 Ic+MHC II", relativas a células dendríticas convencionais (cDC),que compreende a inibição da expressão de RELT nas células CD1 Ic+MHC II".
EM outra realização, é fornecido um método para aumentar a proporção decélulas dendríticas plasmacitóide (pDC) produzidas a partir de célulasCD1 Ic+MHC II", com relação à células dendríticas convencionais (cDC), quecompreende a inibição da atividade de RELT nas células CD1 Ic+MHC II". Emum aspecto, a inibição da expressão ou atividade de RELT compreende obloqueio de RELT nas células CD1 Ic+MHC II". Em outro aspecto, a inibição daexpressão ou atividade de RELT compreende a administração para célulasCD1 Ic+MHC II", de um oligonucleotídeo antisense a RELT. Em outro aspecto, ainibição da expressão ou atividade de RELT compreende a administração àscélulas CD1 Ic+MHC II" de um anticorpo que inibe a ligação de RELT ao seuIigante normal. EM outro aspecto, a inibição da expressão ou atividade deRELT é realizada in vivo. Em outro aspecto, a inibição da expressão ouatividade de RELT é realizada in vitro.
Em outra realização, é fornecido um método de redução daproporção de células dendríticas plasmocitóides produzidas por célulasCD1 Ic+MHCII", com relação a células dendríticas convencionais, quecompreende o estimulo da expressão de RELT em células CD1 Ic+MHCII". Emoutro aspecto, é fornecido um método de redução da proporção de célulasdendríticas plasmocitóide produzidas a partir de células CD1 Ic+MHCM", comrelação à células dendríticas convencionais, que compreende o estímulo daatividade de RELT em células CD1 Ic+MHCII". Em um aspecto, o estímulo daexpressão ou atividade de RELT compreende a administração de um anticorpoque agoniza RELT à células CD1 Ic+MHCII".
Em outra realização, é fornecido um método para aumentar aprodução de IFN-α em um mamífero, que compreende a inibição da expressãode RELT no mamífero. Em outra realização, é fornecido um método deaumentar a produção de IFN-α em um mamífero, que compreende a inibiçãoda atividade RELT no mamífero.
Em outra realização, é fornecido um método de redução naprodução de IFN-α em mamíferos, que compreende o estímulo da expressãode RELT em células CD1 Ic+MHCH" de mamíferos. Em outra realização, éfornecido um método de redução na produção de IFN-α em mamíferos, quecompreende o estímulo da atividade de RELT em células CD1 Ic+MHCII' demamíferos.
Em outra realização, é fornecido um método para o diagnostic deuma doença ou condição relacionada à níveis anormais de IFN-α em ummamífero, que compreende a detecção da quantidade de RELT expressa nomamífero. Em um aspecto, a condição ou doença é selecionada a partir depelo menos uma disfunção na proliferação celular, uma infecção, umadisfunção inflamatória/imune e uma disfunção relacionada a interferon.
Breve Descrição das Figuras
As figuras 1A e 1B e 2 ilustram exemplos de seqüências deestrutura consenso humanas aceptoras para uso na prática da presenteinvenção com identificador de seqüência conforme segue:Estruturas Consenso Variáveis Pesadas (VH) (Figuras 1A ε 1B)
Estrutura de consenso humana VH subgrupo I menos KabatCDRs (SEQ ID NOs: 3, 73, 74, 75)
Estrutura de consenso humana VH subgrupo I menos regiõeshipervariáveis estendidas (SEQ ID NOs: 4-6, 76-78, 79-81, e 82-84)
Estrutura de consenso humana VH subgrupo Il menos KabatCDRs (SEQ ID NO: 7, 85, 86, 87)
Estrutura de consenso humana VH subgrupo Il menos regiõeshipervariáveis estendidas (SEQ ID NOs: 8-10, 88-90, 91-93, 94-96)
Estrutura de consenso humana VH subgrupo Ill menos KabatCDRs (SEQ ID NO: 11, 97, 98, 99)
Estrutura de consenso humana VH subgrupo Ill menos regiõeshipervariáveis estendidas (SEQ ID NOs: 12-14, 100-102, 103-105, 106-108)
Estrutura aceptora humana VH menos Kabat CDRs (SEQ ID NO:15,109,110,111)
Estrutura aceptora humana VH menos regiões hipervariáveisestendidas (SEQ ID NOs: 16-17, 112-114, 115-117)
Estrutura 2 aceptora humana VH menos Kabat CDRs (SEQ IDNO: 18, 118, 119, 120)
Estrutura 2 aceptora humana VH menos regiões hipervariáveisestendidas (SEQ ID NOs: 19-21, 121-123, 124-126, 127-129)
Estruturas de Consenso Variáveis Leves (VL) (Figura 2)
Estrutura de consenso humana VL kappa subgrupo I (SEQ ID NO:22,130,131,132)
Estrutura de consenso humana VL kappa subgrupo Il (SEQ IDNO: 23, 133, 134, 135)
Estrutura de consenso humana VL kappa subgrupo Ill (SEQ IDNO: 24, 136, 137, 138)Estrutura de consenso humana VL kappa subgrupo IV (SEQ IDNO: 25, 139, 140, 141)
A figura 3 ilustra seqüências de regiões de estrutura dehuMAb4D5-8 de cadeias leve e pesada. Os números sobrescritos/negritoindicam posições de aminoácidos de acordo com Kabat.
A figura 4 ilustra seqüências de regiões de estruturamodificadas/variantes de huMAb4D5-8 de cadeias leve e pesada. Os númerossobrescritos/negrito indicam posições de aminoácidos de acordo com Kabat.
As figuras 5A e 5B mostram seqüências de alça (Ioop) HVR decadeia pesada de moléculas de anticorpo anti-RELT, conforme descritas noexemplo 1(A). As figuras mostram as seqüências HVR de cadeia pesada, H1,H2, e H3. As posições de aminoácidos são numeradas de acordo com osistema de numeração Kabat, conforme descrito abaixo.
A figura 6 exibe os resultados da análise FACS da ligação deanticorpos anti-RELT à células de rim de hamster recém nascido (BHK), quenão expressam ("BHK") ou que expressam ("mRELT/BHK") RELT decamundongo na superfície celular, conforme descrito no exemplo 1(b)(1).
A figura 7 exibe os resultados da análise FACS de ligação dosanticorpos anti-RELT a esplenócitos que não expressam ("-/-") ou expressam("+/+")RELT de camundongo na superfície celular, conforme descrito noexemplo 1 (b)(1).
A figura 8 ilustra o grau de ativação de ativação NF-κΒ nas célulastransfectadas com relt-xedar e tratadas com diversos anticorpos anti-RELT,conforme descrito no exemplo 1(b)(2).
A figura 9 ilustra as interações de ligação entre diversasconcentrações do anticorpo anti-RELT H11 e RELT de camundongoobservadas durante a análise BlAcore® de alta resolução, conforme descrito noexemplo 1(b)(4).A figura 10 ilustra a análise FACS que demonstra que o anticorpoanti-RELT H11 se liga especificamente a RELT humano, expresso nasuperfície de 293 células, conforme descrito no exemplo 1(b)(5).
A figura 11 ilustra os resultados da análise FACS da ligação doanticorpo anti-RELT H11 a diferentes populações de células T, mostrando quecada uma das populações de células T expressa RELT na superfície celular,conforme descrito no exemplo 2.
A figura 12 ilustra os resultados da análise FACS da ligação doanticorpo anti-RELT H11 a diferentes populações de células B, exibindo quenenhuma das populações de célula B foram ligadas pelo anticorpo H11,conforme descrito no exemplo2.
A figura 13 ilustra os resultados da análise FACS de ligação doanticorpo anti-RELT H11 a esplenócitos, exibindo que células T e macrófagosexpressam RELT na superfície celular, conforme descrito no exemplo 2.
A figura 14A-C ilustra a geração de camundongos deficientes emRELT1 conforme descrito pelo exemplo 3(a). A figura 14A exibe o cassete deseleção PGK-neo flanqueado por sítios IoxP que foi utilizado para substituir oséxons Il a V de RELT de camundongo (codificando os aminoácidos 17-209). Afigura 14B ilustra a análise de Southern Blot do DNA genômico de relt+/+,relt+/-, e relt-/- de camundongos, conforme descrito pelo exemplo 3(a). A figura14C exibe os resultados de uma análise por citometria de fluxo para aexpressão de RELT de superfície em células T de camundongos relt+/+ ("WT")e relt-/-. A curva mais a direita (negrito), em ambos os gráficos, representa amarcação pelo anticorpo controle, enquanto a curva mais a esquerdarepresenta a marcação por mAb H11 específico a RELT.
As figuras 15A-15D ilustram os resultados de experimentosdesignados para determinar se RELT é necessário para o desenvolvimento decélulas Τ, B e NK normais em camundongo, conforme descrito pelo exemplo3(b). A figura 15A ilustra os resultados da análise de citometria de fluxo decélulas do baço de camundongos do tipo selvagem e relt-A com 10 semanasde idade. Os valores representam a derivação média ± padrão de 10camundongos de cada genótipo. As células T foram identificadas como célulasque foram CD3+lgM"B220"DX5". Células B foram identificadas como célulasque foram CD3"lgM+B220+DX5". Células NK foram identificadas como célulasque foram CD3"lgM"B220"DX5+. A figura 15B ilustra a expressão de RELT emcélulas Τ, B e NK identificadas como na figura 15A. A curva mais a direita(negrito) em cada gráfico representa a coloração pelo controle mAb, enquantoa curva mais a esquerda representa a coloraçãok pelo mAb H11 específico aRELT. A figura 15C ilustra uma análise de citometria de fluxo de camundongoscom timócitos do tipo selvagem ("WT") e relt-A. O percentual de célulaspositivas em cada quadrante é exibido, e são representativos de cincocamundongos de cada genótipo. A figura 15D são gráficos que ilustram osresultados de ensaios de incorporação de [3H]-timidina em células T purificadasde camundongos do tipo selvagem e relt-A expostos tanto ao anticorpo anti-CD3 sozinho (painel direito) ou aos anticorpos anti-CD3 e anti-CD28,demonstrando que RELT não é essencial para a proliferação de células T.
As figuras 16A-16G ilustram os resultados de experimentos para adeterminação do efeito de bloqueio de relt em camundongos ou produção desubtipo de anticorpo por estes camundongos mediante desafio com umimunógeno, conforme descrito no exemplo 3(c).
As figuras 17A-D ilustram os resultados de experimentos para adeterminação dos efeitos da anulação de RELT em populações de célulasdendríticas em camundongos, conforme descrito pelo exemplo 3(d). A figura17A exibe os resultados da análise de citometria de fluxo para subconjuntos decélulas dendríticas do baço em camundongos do tipo selvagem e relt-A com 10semanas de idade. Os gráficos representam a coloração com CD11c de célulasdo baço totais (painéis da direita) ou coradas com CD11b e B220 após gatingde forma eletrônica para selecionar células CD11c+ (painéis da esquerda). Osresultados foram representativos de 10 camundongos de cada genótipo. Afigura 17B ilustra o desvio médio ± padrão para pDCs (CD11c+B220+CD11b~) ecDCs (CD11 c+B220~CD11 b+) em cada grupo de 10 camundongos, ambos nostermos de número celular total e porcentagem. A figura 17C ilustra osresultados da análise de citometria de fluxo para expressão de RELT em pDCse cDCs. A curve mais a direita (negrito) em cada gráfico representa ligaçãopelo controle mAb, enquanto a curva mais a esquerda representa ligação peloanticorpo anti-RELT H11. A figura 17D ilustra os resultados da análise decitometria de fluxo da ligação do anticorpo anti-CD45RB, l-A, CD80, ou CD86para células CD11c+B220+ de camundongos do tipo selvagem (curva mais adireita) ou relt-A (curva em negrito mais a esquerda). O histograma sólidoilustra a ligação para um anticorpo controle.
As figuras 18A e 18B ilustra os resultados dos experimentos parase determinar os efeitos do da interrupção de RELT na população celularprogenitora CD11c+MHC II" pDC, conforme descrito no exemplo 3(e). A figura18A ilustra os resultados da análise de citometria de fluxo do sangue periféricode camundongos do tipo selvagem e relt-A com 10 semanas de idade. Odesvio médio ± porcentagem padrão de células CD1 Ic+I-A" em 10camundongos de cada genótipo é exibido. A figura 18b ilustra os resultados daanálise de citometria de fluxo para a expressão de RELT na superfície celularde células precursoras MHC II" DC. A curva mais a direita (negrito) representaa ligação de um anticorpo controle, enquanto a curva mais a direita representaa ligação pelo anticorpo anti-RELT H11.
A figura 19 ilustra os resultados de experimentos da determinaçãoda produção de IFN-α por populações celulares relt-/- e do tipo selvagem,conforme descrito no exemplo 4. A figura 19 exibe a produção de IFN-α poresplenócitos (painel direito) ou pDCs e cDCs purificados (painel esquerdo)obtidos a partir de camundongos do tipo selvagem e relt-/- de 10 semanas deidade, cultivados com a dose indicada de CpG-ODN por 24 horas. Os valoresrepresentam o desvio médio ± padrão de sete camundongos de cada genótipo.
A figura 20 ilustra os resultados de experimentos que determinamo impacto da deleção de RELT em células derivadas da medula óssea,conforme descrito no exemplo 5. Camundongos irradiados de forma letal dotipo selvagem e relt-/- receberam injeção intravenosa com medula óssea dotipo selvagem e relt-/-. Após oito semanas, células do baço e do sangue decamundongos quiméricos foram analisadas a partir de citometria de fluxo. Osdados representam a porcentagem média ± o desvio padrão de pDCsesplênicas (CD11 c+B220+CD11 b") e células precursoras de MHC II" DC dosangue periférico (CD1 Ic+I-A") de sete camundongos de cada genótipo.
Modos de Realização da Invenção
Técnicas Gerais
A prática da presente invenção empregará, a menos que indicadode outra forma, técnicas convencionais de biologia molecular (incluindotécnicas recombinantes), microbiologia, biologia celular, bioquímica, eimunologia, que pertencem ao estado da técnica. As ditas técnicas sãoexplicadas detalhadamente na literatura, tal como, "Molecular Cloning: ALaboratory Manual", Terceira edição (Sambrook et al., 2001); "OligonucleotideSynthesis" (M. J. Gait, ed., 1984); "Animal Cell Culture" (R. I. Freshney, ed.,1987); "Methods in Enzymology" (Academic Press, Inc.); "Current Protocols inMolecular Biology" (F. M. Ausubel et al., eds., 1987, e publicações emperiódicos); "PCR: The Polymerase Chain Reaction", (Mullis et al., ed., 1994);PCR 2: A Practical Approach (M. J. MacPherson1 B. D. Hames and G.R. Tayloreds. (1995)); Harlow and Lane, eds. (1988) Antibodies, A Laboratory Manual;"A Practical Guide to Molecular Cloning" (Perbal Bernard V., 1988); e "PhageDisplay: A Laboratory Manual" (Barbas etal., 2001).
Definições
Da forma utilizada no presente, os termos "Receptor expresso emtecidos linfóides" e "RELT" são definidos como todas as espécies depolipeptídeos de RELT, sintéticos e naturais, incluindo, mas sem se limitar, opolipeptídeo RELT de comprimento total, a forma madura de RELT em que aseqüência sinal foi removida, e formas solúveis do polipeptídeo RELT.
Um anticorpo "isolado" é aquele que foi identificado e separadoe/ou recuperado de um componente de seu ambiente natural. Componentescontaminantes de seu ambiente natural são materiais que podem interferir napesquisa, diagnóstico ou usos terapêuticos para o anticorpo, e podem incluirenzimas, hormônios, e outros solutos proteináceos e não-proteináceos. Emuma realização, o anticorpo será purificado (1) até mais de 95% em peso deanticorpo, conforme determinado, por exemplo, pelo método de Lowry, e emalgumas realizações, mais de 99% em peso, (2) a um grau suficiente para seobter pelo menos 15 resíduos de seqüência N-terminal ou de aminoácidosinterna, a partir do uso, por exemplo, de um seqüenciador de copo rotatório(spinning cup sequenafor), ou (3) até homogeneidade por SDS-PAGE sobcondições redutoras ou não-redutoras, utilizando, por exemplo, Coomassieblue ou coloração de prata. O anticorpo isolado inclui o anticorpo in situ emcélulas recombinantes, desde que pelo menos um componente do ambientenatural do anticorpo não esteja presente. Geralmente, entretanto, o anticorpoisolado será preparado por pelo menos uma etapa de purificação.
Da forma utilizada no presente, o termo "anticorpo anti-RELT"refere-se a um anticorpo que é capaz de se ligar especialmente a RELT.
A expressão "substancialmente similar," "substancialmente omesmo", "equivalente", ou "substancialmente equivalente", da forma utilizadano presente, refere-se a um grau suficientemente alto de similaridade entredois valores numéricos (por exemplo, um valor associado com a molécula e ooutro valor associado com a molécula referência/comparativa), de forma queum técnico no assunto consideraria a diferença entre os dois valores para ternenhuma ou pouca significância estatística e/ou biológica no contexto dacaracterística biológica mensurada pelos mencionados valores (tal como,valores Kd). A diferença entre os ditos valores, por exemplo, é menos de cercade 50%, menos de cerca de 40%, menos de cerca de 30%, menos de cerca de20% e/ou menos de cerca de 10%, como uma função do valor para a moléculade referência/comparativa.
A expressão "substancialmente reduzida" ou "substancialmentediferente", da forma utilizada no presente, refere-se a um grau suficientementealto de diferença entre dois valores numéricos (geralmente um associado comuma molécula e o outro associado com uma molécula dereferência/comparativa), de forma que o técnico no assunto consideraria adiferença entre os dois valores a ser de significância estatística dentro docontexto das características biológicas mensuradas pelos ditos valores (talcomo valores Kd). A diferença entre os ditos dois valores, por exemplo, é maiorque cerca de 10%, maior que cerca de 20%, maior que cerca de 30%, maiorque cerca de 40%, e/ou maior que cerca de 50% como uma função do valorpara a molécula de referência/comparativa.
"Afinidade de ligação", geralmente, refere-se a força da soma totalde interações não-covalentes entre um sítio de ligação específico de umamolécula (tal como um anticorpo) e seu parceiro de ligação (tal como umantígeno). A menos que indicado de outra forma, conforme utilizado nopresente, "afinidade de ligação" refere-se à afinidade de ligação intrínseca quereflete uma interação de 1:1 entre membros de um par de ligação (porexemplo, anticorpo e antígeno). A afinidade de uma molécula X para seuparceiro Y pode, geralmente, ser representada pela constante de dissociação(Kd). A afinidade pode ser mensurada por métodos comuns conhecidos noestado da técnica, incluindo os métodos aqui descritos. Anticorpos de baixaafinidade geralmente ligam o antígeno de forma lenta e tendem a se dissociardos mesmos rapidamente, enquanto anticorpos de alta afinidade geralmenteligam-se ao antígeno mais rapidamente e tendem a permanecer ligados porlongo tempo. Uma série de métodos de mensuração da afinidade de ligação éconhecida na técnica, qualquer dos quais pode ser utilizado para os propósitosda presente invenção. Realizações ilustrativas específicas são descritas aseguir.
Em uma realização, o "valor Kd" ou "Kd", de acordo com apresente invenção, é mensurado por um ensaio de ligação de antígenoradiomarcado (RIA) realizado com a versão Fab do anticorpo de interesse eseu antígeno, conforme descrito pelo ensaio a seguir. A afinidade de ligação dasolução de Fabs para o antígeno é mensurada através do equilíbrio de Fabcom uma concentração mínima de antígeno marcado com (125I)1 na presençade uma série de titulação de antígeno não-marcado, capturando assimantígeno ligado com uma placa revestida de anticorpo anti-Fab (Chen, et ai,(1999) J. Mol Biol 293:865-881). Para estabelecer as condições do ensaio,placas de microtítulo (Dynex) são revestidas durante a noite com 5 pg/ml de umanticorpo anti-Fab de captura (capturing) (Cappel Labs) em 50 mM decarbonato de sódio (pH 9,6), e, subseqüentemente, bloqueado com 2% (p/v) dealbumina de soro bovino em PBS por duas a cinco horas a temperaturaambiente (aproximadamente 23°C). Em uma placa não-adsovente (Nunc#269620), 100 pM ou 26 pM de antígeno marcado com [125I] são misturadoscom as diluições em série de um Fab de interesse (por exemplo, consistentecom a avaliação de um anticorpo anti-VEGF, Fab-12, em Presta et ai, (1997)Câncer Res. 57:4593-4599). O Fab de interesse é então incubado durante anoite; entretanto, a incubação pode continuar por um longo período (tal como,65 horas) para assegurar que o equilíbrio seja alcançado. A seguir, as misturassão transferidas para a placa de captura, para incubação a temperaturaambiente (por exemplo, por uma hora). A solução é então removida e a placalavada oito vezes com 0,1% de Tween-20 em PBS. Quando as placas sãolavadas, 150 μl/cavidade de cintilante (scintillant) (MicroScint-20; Packard) sãoadicionados, e as placas são contadas em um contador Topcount gamirid(Packard) por dez minutos. As concentrações de cada Fab que dá menos ouigual a 20% da ligação máxima são escolhidas para uso em ensaios de ligaçãocompetitivo. De acordo com outra realização, o Kd ou valor Kd é mensuradopelo uso do ensaio de ressonância plasmônica de superfície, utilizando umBIAcoreTM -2000 ou um BIAcoreTM_3ooo (BlAcore, Inc., Piscataway, NJ) a25°C, com antígeno CM5 chips imobilizado a -10 unidades de resposta (RU).Em resumo, chips biosensores de dextran carboximetilado (CM5, BIAcore Inc.)são ativados com /V-etil-Λ/- (3-dimetilaminopropil)-carbodiimida hidrocloreto(EDC) e A/-hidroxisuccinimida (NHS) de acordo com as instruções dofabricante. O antígeno é diluído com 10 mM de acetato de sódio, pH 4,8, a 5Mg/ml (-0.2 μΜ) antes da injeção a uma velocidade de fluxo de 5 μΙ/minuto,para alcançar aproximadamente 10 unidades de resposta (RU) de proteínaacoplada. Após as injeções de antígeno, é injetado 1 M de etanolamina parabloquear os grupos não-reagidos. Para mensurações cinéticas, diluições emsérie de Fab1 duas vezes, (0.78 nM a 500 nM) são injetadas em PBS com0,05% de Tween 20 (PBST) a 25°C a uma velocidade de fluxo deaproximadamente 25 μΙ/min. A velocidade de associação (kon) e velocidade dedissociação (k0ff) são calculadas pelo uso de um modelo de ligação Langmuirsimples, um a um (BlAcore Evaluation Software version 3.2) ajustando deforma simultânea os sensogramas de associação e dissociação. A constantedo equilíbrio de dissociação (Kd) é calculada como a razão de k0ff/k0n Vide,por exemplo, Chen, Y., et ai, (1999) J. Mol Biol 293:865-881. Se a velocidadede associação excederlO® M-1 s-1 pelo ensaio de ressonância plasmônica desuprfície acima, então a velocidade de associação pode ser determinada pelouso de uma técnica de apagamento fluorescente que mede o aumento ouredução na intensidade de emissão de fluorescência (excitação = 295 nm;emissão = 340 nm, passe de banda de 16 nm) a 25°C de um anticorpo anti-antígeno 20 nM (forma Fab) em PBS, pH 7,2, na presença de concentraçõescrescentes de antígeno, conforme medido em um espectrômetro, tal como umespectrofotômetro equipado com um bloqueador de fluxo (Aviv Instruments) ouum espectrofotômetro 8000-series SLM-Aminco (ThermoSpectronic) com umacuveta de agitação.
Uma "velocidade de associação" ou "kon", de acordo com apresente invenção, pode também ser determinada com a mesma técnica deressonância plasmônica de superfície descrita acima, utilizando umBIAcore™-2000 ou um BIAcore™-3000 (BlAcore, Inc., Piscataway, NJ) a25°C com um chip CM5 de antígeno imobilizado a ~10 unidades de resposta(RU). Em resumo, chips biosensores de dextran carboximetilados (CM5,BIAcore Inc.) são ativados com /V-etil-A/- (3-dimetilaminopropil)-carbodiimidahidrocloreto (EDC) e A/-hidroxisuccinimida (NHS), de acordo com as instruçõesdo fabricante. O antígeno é diluído com 10 mM de acetato de sódio, pH 4,8, a 5pg/ml (-0.2 μΜ) antes da injeção a uma velocidade de fluxo de 5 μΙ/minuto,para alcançar aproximadamente 10 unidades de resposta (RU) de proteínaacoplada. Após a injeção de antígeno, 1M de etanolamina é injetado parabloquear grupos não-reagidos. Para mensurações cinéticas, diluições em sériede Fab, duas vezes (0,78 nM a 500 nM), são injetadas em PBS com 0,05% deTween 20 (PBST) a 25°C a uma velocidade de fluxo de aproximadamente 25μΙ/min. A velocidade de associação (kon) e velocidade de dissociação (k0ff) sãocalculadas pelo uso de um modelo de ligação Langmuir simples, um a um(BlAcore Evaluation Software version 3.2), através de ajuste simultâneo dosensograma de associação e dissociação. O equilíbrio da constante dedissociação (Kd) foi calculado como as velocidades k0ff/k0n Vide, porexemplo, Chen, Y., et ai, (1999) J. Mol Biol 293:865-881. Entretanto, se avelocidade de associação exceder 106 M"1 s-1 pelo ensaio de ressonânciaplasmônica de superfície acima, então a velocidade de associação pode serdeterminada pelo uso de uma técnica de apagamento fluorescente que mede oaumento ou redução na intensidade de emissão de fluorescência (excitação =295 nm; emissão = 340 nm, passe de banda 16 nm) a 25°C de um anticorpoanti-antígeno 20 nM (forma Fab) em PBS, pH 7,2, na presença deconcentrações crescentes de antígeno, conforme mensurado em umespectrômetro, tal como um espectrofotômetro equipado com um bloqueadorde fluxo (Aviv Instruments) ou um espectrofotômetro 8000-series SLM-Aminco(ThermoSpectronic), com uma cuveta de agitação.
O termo "vetor", da forma utilizada no presente, refere-se a umamolécula de ácido nucléico capaz de transportar outro ácido nucléico ao qualele foi ligado. Um tipo de vetor é um "plasmídeo", que se refere a uma alça(Ioop) de DNA de fita dupla circular, ao qual segmentos de DNA adicionaispodem ser ligados. Outro tipo de vetor é um vetor fago. Outro tipo de vetor éum vetor viral, em que segmentos de DNA adicionais podem ser ligados nogenoma viral. Determinados vetores são capazes de realizar replicaçãoautônoma na célula hospedeira a qual foram introduzidos (por exemplo, vetoresbacterianos que possuem uma origem bacteriana de replicação e vetoresmamíferos epissomais). Outros vetores (por exemplo, vetores mamíferos não-epissomais) podem ser integrados no genoma de uma célula hospedeiramediante a introdução na célula hospedeira, sendo, desta forma, replicadojunto com o genoma hospedeiro. Adicionalmente, determinados vetores sãocapazes de direcionar a expressão de genes aos quais são operacionalmenteligados. Estes vetores são denominados, no presente, como "vetores deexpressão recombinantes" (ou simplesmente, "vetores recombinantes"). Nogeral, os vetores de expressão para uso em técnicas de DNA recombinantesão freqüentemente presentes na forma de plasmídeos. De acordo com opresente relatório, "plasmídeo" e "vetor" podem ser utilizados de formaintercambiável, como o plasmídeo é a forma mais comum de vetor utilizada.
"Polinucleotídeo" ou "ácido nucléico", como utilizados de formaintercambiável no presente, referem-se a polímeros de nucleotídeos dequalquer comprimento, e incluem DNA e RNA. Os nucleotídeos podem serdeoxiribonucleotídeos, ribonucleotídeos, nucleotídeos modificados ou bases,e/ou seus análogos, ou qualquer substrato que pode ser incorporado em umpolímero pela DNA ou RNA polimerase, ou por uma reação sintética. Umpolinucleotídeo pode compreender nucleotídeos modificados, tais comonucleotídeos metilados e seus análogos. Se presente, a modificação àestrutura de nucleotídeo pode ser realizada antes ou após a formação dopolímero. A seqüência de nucleotídeos pode ser interrompida por componentesque não nucleotídeos. Um polinucleotídeo pode adicionalmente ser modificadoapós a síntese, tal como por conjugação com uma marcação. Outros tipos demodificações incluem, por exemplo, "caps", substituição de um ou mais dosnucleotídeos de ocorrência natural por um análogo, modificaçõesinternucleotídeos, como por exemplo, aquelas com ligações não-carregadas(por exemplo, metil fosfonatos, fosfotriésteres, fosfoamidatos, carbamatos,etc.), e com ligações carregadas (tal como, fosforotioatos, fosforoditioatas,etc.), aqueles que contêm unidades pendentes, tal como, por exemplo,proteínas (como nucleases, toxinas, anticorpos, peptídeos sinais, ply-L-lisina,etc.), aqueles com intercalantes (por exemplo, acridina, psoralen, etc.), os quecontêm quelantes (tal como, metais, metais radioativos, boro, metaisoxidativos, etc.), os que contêm alquilantes, aqueles com ligações modificadas(tal como, ácidos nucléicos alfa anoméricos, etc.), bem como formas não-modificadas dos polinucleotídeos. Adicionalmente, qualquer um dos gruposhidroxila necessariamente presentes nos açúcares pode ser substituído, porexemplo, por grupos fosfonatos, grupos fosfatos, protegidos por grupos deproteção padrão, ou ativados para preparar ligações adicionais à nucleotídeosadicionais, ou pode ser conjugado à suportes sólidos ou semi-sólidos. Oterminal 5' e 3' OH pode ser fosforilado ou substituído com unidades aminas oude grupos de encapsulação orgânicos dei a 20 átomos de carbono. Outrashidroxilas podem também ser substituídas por grupos de proteção padrões. Ospolinucleotídeos podem também conter formas análogas de açúcares ribose oudeoxiribose que são geralmente conhecidos na técnica, incluindo, por exemplo,2'-0-metil-, 2'-0-alil, 2'-fluoro- ou 2'-azido-ribose, análogos de açúcarescarbocíclicos, açúcares α-anoméricos, açúcares epiméricos, tais como xilosesou lixoses, açúcares piranose, açúcares furanose, sedoheptuloses, análogosacíclicos e análogos de nucleosídeo básicos, tais como metil ribosídeo. Uma oumais ligações fosfodiéster pode ser substituída por grupos de ligaçãoalternativos. Estes grupos de ligação alternativos incluem, mas sem se limitar,realizações em que o fosfato é substituído por P(O)S ("tioata"), P(S)S("ditioata"), (O)NR2 ("amidata"), P(O)R1 P(O)OR', CO ou CH2 ("formacetal"), emque cada R ou R' é independentemente H ou alquil (1-20 C) substituído ou não-substituído, contendo opcionalmente uma ligação éter (-0-), aril, alquenil,cicloalquil, cicloalquenil ou araldil. Nem todas as ligações presentes nopolinucleotídeo precisam ser identificadas. A descrição acima se aplica a todosos polinucleotídeos referenciados no presente, incluindo RNA e DNA.
"Oligonucleotídeo", da forma utilizada no presente, geralmenterefere-se a uma seqüência curta, geralmente de fita simples, geralmentepolinucleotídeos sintéticos que possuem, em geral, mas não necessariamente,menos de cerca de 200 nucleotídeos de comprimento. Os termos"oligonucleotídeo" e "polinucleotídeo" não são mutuamente exclusivos. Adescrição acima para polinucleotídeos é igualmente e completamente aplicávelpara oligonucleotídeos.
"Anticorpos" (Abs) e "imunoglobulinas" (Igs) são glicoproteínasque possuem as mesmas características estruturais. Enquanto os anticorposexibem uma especificidade de ligação a um antígeno específico, asimunoglobulinas incluem anticorpos e moléculas similares a anticorpos quegeralmente não possuem a especificidade a um antígeno. Polipeptídeos doultimo tipo são, por exemplo, produzidos a baixos níveis pelo sistema linfóide ea altos níveis por mielomas.
Os termos "anticorpo" e "imunoglobulina" são utilizados de formaintercambiável no sentido mais amplo, e incluem anticorpos monoclonais (talcomo, anticorpos monoclonais intactos ou de comprimento total), anticorpospoliclonais, monovalentes, multivalentes, anticorpos multiespecíficos (taiscomo, anticorpos biespecíficos, desde que eles exibam a atividade biológicadesejada), e podem também incluir certos fragmentos de anticorpos (conformedescrito em maiores detalhes no presente). Um anticorpo pode ser quimérico,humano, humanizado e/ou com afinidade maturada.
A "região variável" ou "domínio variável" de um anticorpo refere-seaos domínios de aminoácidos de cadeia pesada ou leve do anticorpo. Estesdomínios são geralmente as partes mais variáveis de um anticorpo, e contêmos sítios de ligação de antígenos.
O termo "variável" refere-se ao fato de que determinadas porçõesdos domínios variáveis diferem em grande parte na seqüência do anticorpo, esão utilizadas na ligação e especificidade de cada anticorpo específico paraseu antígeno particular. Entretanto, a variabilidade não é distribuída pelosdomínios variáveis dos anticorpos. Ela é concentrada em três segmentosdenominados regiões determinantes de complementaridade (CDRs) ou regiõeshipervariáveis, ambas nos domínios variáveis de cadeia pesada e cadeia leve.As porções mais amplamente conservadas dos domínios variáveis sãodenominadas regiões de estrutura (FR). Os domínios variáveis de cadeiaspesadas e leves nativas compreendem, cada um, quatro regiões FR1amplamente adotando uma configuração de folha beta, conectadas por trêsCDRs1 que formam alças (Ioops) de conexão, e em alguns casos, formandoparte da estrutura de folha beta. As CDRs em cada cadeia são mantidas unidasem boa proximidade através das regiões FR e, com as CDRs de outrascadeias, contribuem para a formação do sítio de ligação de antígeno dosanticorpos (vide Kabat et aí., Sequences of Proteins of Immunological Interest,quinta edição, National Institute of Health, Bethesda, MD (1991)). Os domíniosconstantes não estão envolvidos diretamente na ligação de um anticorpo a umantígeno, mas exibem diversos efeitos funcionais, tais como participação doanticorpo na toxicidade celular dependente de anticorpo.
A digestão com papaína dos anticorpos produz dois fragmentosde ligação de antígeno idênticos, denominados fragmentos "Fab", cada um comum sítios de ligação de antígeno único, e um fragmento "Fc" residual, cujonome reflete sua habilidade de cristalizar rapidamente. O tratamento compepsina gera um fragmento F(ab')2 que possui dois sítios de ligação deantígeno, e ainda é capaz de reticular um antígeno.
"Fv" é o fragmento mínimo de anticorpo que contém um sítio deligação e de reconhecimento de antígeno. Em uma espécie de Fv de duascadeias, esta região consiste de um dímero de um domínio variável de cadeialeve e pesado na extremidade, através de associação não-covalente. Em umaespécie Fv de cadeia simples, um domínio variável de cadeia leve e umdomínio variável de cadeia pesada podem ser covalentemente ligados atravésde um peptídeo Iigante flexível, de forma que as cadeias pesada e leve podemse associar em uma estrutura "dimérica" análoga à estrutura em uma espéciede Fv de duas cadeias. É nesta configuração que as três CDRs de cadadomínio variável interage para definir um sítio de ligação de antígeno nasuperfície do dímero VH-VL. Coletivamente, as seis CDRs conferemespecificidade de ligação de antígeno ao anticorpo. Entretanto, mesmo umdomínio variável simples (ou metade de um Fv que compreende apenas trêsCDRs específicas para um antígeno), possui a capacidade de reconhecer eligar antígeno, por meio de uma afinidade mais baixa do que o sítio de ligaçãointeiro.
O fragmento Fab também contém o domínio constante de cadeialeve e o primeiro domínio constante (CH1) de cadeia pesada. Os fragmentosFab' diferem dos fragmentos Fab pela adição de alguns resíduos no carbóxiterminal do domínio CH1 de cadeia pesada, incluindo uma ou mais cisteínas daregião de articulação do antígeno. Fab'-SH é a designação da presenteinvenção para Fab' em que o(s) resíduo(s) de cisteína do domínio constantesustenta(m) um grupo tiol livre. Fragmentos de anticorpos F(ab')2 originalmenteforam produzidos como pares de fragmentos Fab' que possuem cisteínas dearticulação entre eles. Outros acoplamentos químicos de fragmentos deanticorpos são também conhecidos.
As "cadeias leve" de anticorpos (imunoglobulinas), de qualquerespécie de vertebrado, podem ser determinadas para um de dois tiposclaramente distintos, denominados kappa (κ) e Iambda (λ), com base nasseqüências de aminoácidos de seus domínios constantes.
Dependendo das seqüências de aminoácidos dos domíniosconstantes de suas cadeias pesadas, os anticorpos (imunoglobulinas) podemser determinados para diferentes classes. Existem cinco classes principais deimunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, e várias destas podem seradicionalmente divididas em subclasses (isotipos), tal como, IgG1, IgG2, IgG3,IgG4l IgA1, e IgA2 . Os domínios constantes de cadeia pesada, quecorrespondem às diferentes classes de imunoglobulinas são denominadas α, δ,ε, γ, e μ, respectivamente. As estruturas da subunidade e configuraçõestridimensionais de classes diferentes de imunoglobulinas são bem conhecidase descritas geralmente em, por exemplo, Abbas et al. Cellular and Mol.Immunology1 4th ed. (2000). Um anticorpo pode ser parte de uma molécula defusão maior, formada por associação covalente ou não-covalente do anticorpocom uma ou mais outras proteínas ou peptídeos.
Os termos "anticorpo de comprimento total", "anticorpo intacto" e"anticorpo completo" são utilizados no presente de forma intercambiável, parareferir-se a um anticorpo em sua forma substancialmente intacta, nãofragmentos de anticorpos como descritos acima. Os termos particularmentereferem-se a um anticorpo com cadeias pesadas que contêm regiões Fc.
"Fragmentos de anticorpos" compreendem apenas uma porção deum anticorpo intacto, em que a porção retém pelo menos uma, e quanto maismelhora, das funções normalmente associadas com aquela porção quandopresente em um anticorpo intacto. Em uma realização, um fragmento deanticorpo compreende um sítio de ligação de antígeno do anticorpo intacto e,desta forma, retém a capacidade de ligar antígeno. Em outra realização, umfragmento de anticorpo, por exemplo um que compreende a região Fc1 retémpelo menos uma das funções biológicas normalmente associadas com a regiãoFc quando presente em um anticorpo intacto, tal como ligação de FcRn,modulação da meia vida do anticorpo, função ADCC e ligação decomplemento. Em uma realização, um fragmento de anticorpo é um anticorpomonovalente que possui uma meia vida in vivo substancialmente similar a umanticorpo intacto. Por exemplo, tal como um fragmento de anticorpo podecompreender, no braço de ligação de antígeno ligado a uma seqüência Fccapaz de conferir estabilidade in vivo para o fragmento.
O termo "anticorpo monoclonal", da forma utilizada no presente,refere-se a um anticorpo obtido a partir de uma população de anticorposhomogêneos substancialmente homólogos, tal como, os anticorpos individuaisque compreendem a população são idênticos, exceto por possíveis mutaçõesde ocorrência natural que podem estar presentes em quantidades menores.Desta forma, o indicativo "monoclonal" refere-se o caráter do anticorpo comonão sendo uma mistura de anticorpos distintos. Este anticorpo monoclonaltipicamente inclui um anticorpo que compreende uma seqüência depolipeptídeo que liga um alvo, em que a seqüência de polipeptídeo de ligaçãoalvo foi obtida por um processo que inclui a seleção de uma única seqüênciapeptídica de ligação alvo a partir de uma série de seqüências de polipeptídeos.Por exemplo, o processo de seleção pode ser a seleção de um único clone deuma série de clones, tal como um pool de clones de hibridoma, clones de fagoou clones de DNA recombinante. Deve-se compreender que a seqüência deligação alvo selecionada pode ser adicionalmente alterada, por exemplo, paraaprimorar a afinidade ao alvo, para humanizar a seqüência de ligação alvo,para aprimorar sua produção na cultura celular, para reduzir suaimunogenicidade in vivo, para criar um anticorpo multiespecífico, etc., e que umanticorpo que compreende a seqüência de ligação alvo alterada é também umanticorpo monoclonal da invenção. Em contraste a um anticorpo policlonal,preparações que incluem tipicamente diferentes anticorpos, direcionados adiferentes determinantes (epítopos), cada anticorpo monoclonal de umapreparação de anticorpo monoclonal, é direcionado a um único determinanteem um antígeno. Além de sua especificidade, as preparações de anticorpomonoclonal são vantajosas por serem tipicamente livre de contaminação poroutras imunoglobulinas. O termo "monoclonal" indica o caráter do anticorpocomo sendo obtido de uma população substancialmente homóloga deanticorpos, e não é para ser compreendida como requerendo a produção dequalquer anticorpo por um método específico. Por exemplo, os anticorposmonoclonais a serem utilizados de acordo com a presente invenção, pode serproduzidos por uma série de técnicas, incluindo, por exemplo, o método dehibridoma (Kohler et al., Nature, 256: 495 (1975); Harlow et al., Antibodies: ALaboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988);Hammerling et al., em: Monoclonal Antibodies e T-Cell hybridomas 563-681(Elsevier, N.Y., 1981)), métodos de DNA recombinante (vide, U.S. 4.816.567),tecnologias de exibição por fago (vide Clackson et al., Nature, 352: 624-628(1991); Marks et ai, J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1992); Sidhu etal., J. Mol. Biol.338(2): 299-310 (2004); Lee et al., J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093 (2004);Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 101(34): 12467-12472 (2004); e Lee etal.,J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132(2004)), e tecnologias para a produçãode anticorpos humanos ou similares a humanos, em animais que possuempartes de Ioci ou genes da imunoglobulina humana, codificando seqüências deimunoglobulina humana (vide, W098/24893; W096/34096; W096/33735;W091/10741; Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90: 2551 (1993);Jakobovits et al., Nature 362: 255-258 (1993); Bruggemann et al., Year inImmunol. 7:33 (1993); U.S. 5.545.807; 5.545.806; 5.569.825; 5.625.126;5.633.425; 5.661.016; Marks et al., Bio.Technology 10: 779-783 (1992);Lonberg et al., Nature 368: 856-859 (1994); Morrison, Nature 368: 812-813(1994); Fishwild et al., Nature Biotechnol. 14: 845-851 (1996); Neuberger,Nature Biotechnol. 14: 826 (1996) e Lonberg e Huszar, lntern. Rev. Immunol.13: 65-93(1995).
Os anticorpos monoclonais da presente invenção incluemespecificamente anticorpos "quiméricos" nos quais uma porção da cadeia levee/ou pesada é idêntica ou homóloga a seqüências correspondentes emanticorpos derivados de uma espécie especifica, ou pertencendo a uma classeou subclasse de anticorpo específica, enquanto o restante da cadeia é idênticoou homólogo a seqüências correspondentes em anticorpos derivados de outrasespécies, ou pertencendo a outra classe ou subclasse de anticorpo, bem comofragmentos destes anticorpos, desde que eles exibam a atividade biológicadesejada (U.S. 4.816.567; e Morrison et ai, Proc. Natl. Acad. Sei. USA81:6851-6855 (1984)).
Formas "humanizadas" de anticorpos não-humanos (tal como,murino) são anticorpos quiméricos que contém uma seqüência mínimaderivada de uma imunoglobulina não humana. Em uma realização, umanticorpo humanizado é uma imunoglobulina humana (anticorpo receptor) emque resíduos de uma região hipervaríável do receptor foram substituídos porresíduos de uma região hipervaríável de uma espécie não-humana (anticorpodoador) tal como rato, coelho ou primata não-humano, que possuem aespecificidade, afinidade e/ou capacidade desejadas. Em algumas realizações,resíduos de região de estrutura (FR) da imunoglobulina humana sãosubstituídos por resíduos não-humanos correspondentes. Adicionalmente,anticorpos humanizados podem compreender resíduos que não sãoencontrados no anticorpo receptor ou no anticorpo doador. Estas modificaçõessão produzidas para refinar a habilidade do anticorpo. Em geral, o anticorpohumanizado compreenderá substancialmente todos de pelo menos um, etipicamente dois, domínios variáveis, em que todas ou substancialmente todasdas alças (Ioops) hipervariáveis correspondem aos de uma imunoglobulinanão-humana e todos ou substancialmente todos FRs são de uma seqüência deimunoglobulina humana. O anticorpo humanizado poderá tambémcompreender, opcionalmente, pelo menos uma porção de uma regiãoconstante de imunoglobulina (Fc), tipicamente aquela de uma imunoglobulinahumana. Para maiores detalhes, vide Jones et ai, Nature 321:522-525 (1986);Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); e Presta, Curr. Op. Struct. Biol.2:593-596 (1992). Vide também os seguintes artigos de revisão e referênciascitadas nos mesmos: Vaswani e Hamilton, Ann. Allergy, Asthma & Immunol.1:105-115 (1998); Harris, Biochem. Soe. Transactions 23:1035-1038 (1995);Hurle e Gross, Curr. Op. Biotech. 5:428-433 (1994).
O termo "região hipervariável", ΉVR" ou "HV", quando utilizadono presente, refere-se às regiões de um domínio variável de anticorpo que sãohipervariáveis na seqüência e/ou forma estruturalmente definidas por alças(loops). Geralmente, os anticorpos compreendem seis regiões hipervariáveis;três na VH (H1, H2, H3), e três na VL (L1, L2, L3). Uma série de delimitaçõesde região hipervariável é utilizada e englobada pela presente invenção. Asregiões determinantes de complementaridade Kabat (CDRs) são baseadas navariabilidade da seqüência e são as mais comumente utilizadas (Kabat et ai,Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service,National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)). As siglas "HC" e "LC"precedendo o termo "CDR" refere-se, respectivamente, a uma CDR de umacadeia pesada e uma cadeia leve. Chothia refere-se no lugar dos locais dasalças (Ioops) estruturais (Chothia e Lesk J. Moi Biol. 196:901-917 (1987)). Asregiões hipervariáveis AbM representam um acordo entre os CDRs Kabat ealças (Ioops) estruturais Chothia, e são utilizadas pelo software de modulaçãode anticorpo AbM de Oxford Molecular (Oxford MoIecuIarjS AbM antibodymodeling software). As regiões hipervariáveis de "contato" são baseadas naanálise das estruturas de cristais complexas disponíveis. Os resíduos de cadauma das regiões hipervariáveis são particularmente descritas a seguir.
Alça Kabat AbM Chothia Contato
L1 L24-L34 L24-L34 L26-L32 L30-L36
L2 L50-L56 L50-L56 L50-L52 L46-L55
L3 L89-L97 L89-L97 L91-L96 L89-L96
Η1 H31-H35B H26-H35B H26-H32 H30-H35B
(Numeração Kabat)
Η1 H31-H35 H26-H35 H26-H32 H30-H35(Numeração Chothia)
H2 H50-H65 H50-H58 H53-H55 H47-H58
H3 H95-H102 H95-H102 H96-H101 H93-H101
As regiões hipervariáveis podem compreender "regiõeshipervariáveis estendidas" como segue: 24-36 ou 24-34 (L1), 46-56 ou 50-56(L2) e 89-97 ou 89-96 (L3) no VL e 26-35 (H1), 50-65 ou 49-65 (H2) e 93-102,94-102, ou 95-102 (H3) no VH. Os resíduos de domínio variáveis sãonumerados de acordo com Kabat et aí., acima, para cada uma destasdefinições.
Resíduos "de estrutura" ou "FR" são os resíduos do domíniovariável diferentes dos resíduos de região hipervariável definidos no presente.
O termo "numeração do resíduo de domínio variável como emKabat" ou "numeração da posição de aminoácido como em Kabat," e suasvariações, refere-se ao sistema de numeração utilizado para domínios variáveisde cadeia pesada ou domínios variáveis de cadeia leve da compilação dosanticorpos em Kabat et ai, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5thEd. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991).Utilizando este sistema de numeração, a seqüência de aminoácido linear atualpode conter menos aminoácidos, ou aminoácidos adicionais que correspondema um encurtamento de, ou inserção em, um FR ou HVR do domínio variável.Por exemplo, um domínio variável de cadeia pesada pode incluir uma únicainserção de aminoácido (resíduo 52a, de acordo com Kabat) após o resíduo 52de H2 e resíduos inseridos (tal como resíduos 82a, 82b, e 82c, etc. de acordocom Kabat) após o resíduo 82 FR de cadeia pesada. A numeração Kabat deresíduos pode ser determinada para um dado anticorpo através do alinhamentonas regiões de homologia da seqüência do anticorpo com um "padrão" Kabatde seqüência numerada.
Fragmentos de anticorpo "Fv de cadeia única" ou"scFv"compreendem os domínios VH e VL do anticorpo, em que estesdomínios estão presentes em uma única cadeia de polipeptídeo. Geralmente, opolipeptídeo scFv compreende adicionalmente um polipeptídeo Iigante entre osdomínios VH e VL1 que permitem que o scFv forma a estrutura desejada paraligação do antígeno. Para uma revisão de scFv vide Pluckthun, em ThePharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg e Moore eds.,Springer-Verlag, Nova Iorque, págs. 269-315 (1994).
O termo "diacorpos" refere-se a pequenos fragmentos deanticorpos com dois sítios de ligação de antígeno, que compreendem umdomínio variável de cadeia pesada (VH) conectado a um domínio variável decadeia leve (VL) na mesma cadeia de polipeptídeo (VH-VL). Por meio do usode um Iigante que é muito curto para permitir o pareamento entre os doisdomínios na mesma cadeia, os domínios são forçados à parear com osdomínios complementares de outra cadeia, e criar dois sítios de ligação deantígeno. Diacorpos são descritos mais particularmente em, por exemplo, EP404.097; WO 93/1161; e Hollinger et al., Proc. Nati Acad. Sei. USA 90: 6444-6448 (1993).
Um "anticorpo humano" é um anticorpo que possui umaseqüência de aminoácido que corresponde a seqüência de um anticorpoproduzido por um humano e/ou foi produzido pelo uso de qualquer técnica paraa produção de anticorpos humanos descrita no presente. A definição de umanticorpo humano especificamente exclui um anticorpo humanizado quecompreende resíduos de ligação de antígeno não-humanos.
Um anticorpo "de afinidade maturada" é aquele com uma ou maisalterações em um ou mais HVRs do mesmo, que resulta em um aprimoramentona afinidade do anticorpo para o antígeno, comparado a um anticorpo parentalque não possui estas alterações. Em uma realização, um anticorpo deafinidade maturada possui afinidades nanomolares, ou mesmo picomolarespara o antígeno alvo. Anticorpos de afinidade maturada são produzidos atravésde procedimentos bem conhecidos no estado da técnica. Marks et al.Bio/Technology 10:779-783 (1992) descrevem a maturação da afinidade pormeio de mistura dos domínios VH e VL. Mutagênese aleatória de resíduosCDR e/ou de estrutura é descrita por: Barbas et al. Proc Nat. Acad. Sei. USA91:3809-3813 (1994); Schier et al. Gene 169:147-155 (1995); Yelton et al. J.Immunol. 155:1994-2004 (1995); Jackson et al., J. Immunol. 154(7):3310-9(1995); e Hawkins et al, J. Mol. Bioi 226:889-896 (1992).
Um anticorpo de "bloqueio" ou "antagonista" é aquele que inibe oureduz a atividade biológica do antígeno ao qual se liga. Determinadosanticorpos de bloqueio ou anticorpos antagonistas inibem substancialmente oucompletamente a atividade biológica do antígeno.
Um anticorpo "agonista", da forma utilizada no presente, é umanticorpo que imita pelo menos uma das atividades funcionais de umpolipeptídeo de interesse.
Uma "disfunção" é qualquer condição que seria beneficiada pelotratamento com um anticorpo da invenção. Esta definição inclui uma disfunçãoou doença crônica ou aguda, incluindo as condições patológicas que predispõeo mamífero à disfunção em questão. Exemplos não-limitativos de disfunções aserem tratadas no presente incluem infecção, disfunções de proliferaçãocelular, disfunções inflamatórias/imunes (incluindo, mas sem se limitar,disfunções autoimunes), e outras disfunções relacionadas a interferon.
O termo "infecção" refere-se a doenças causadas por um ou maisorganismos diferentes que invadem ou impedem a fisiologia normal domamífero que possui a infecção. Exemplos de infecção incluem, mas sem selimitar a, infecções virais, infecções bacterianas, infecções parasíticas (tal comoinfecções causadas por vermes e nemátodes) e infecções fúngicas.
Os termos "disfunção de proliferação celular" e "disfunçãoproliferativa" refere-se a disfunções associadas a algum grau anormal deproliferação celular. Em uma realização, a disfunção de proliferação celular écâncer. O termo "câncer" e "canceroso" refere-se a ou descreve a condiçãofisiológica em mamíferos que é tipicamente caracterizada porcrescimento/proliferação celular desregulado e, por exemplo, formação detumor. Exemplos de câncer incluem, mas sem se limitar a, carcinoma, Iinfoma(tal como Iinfoma de Hodgkin e não de Hodgkin), blastoma, sarcoma, eleucemia. Mais particularmente, exemplos destes cânceres incluem câncer decélulas escamosas, câncer de células pequenas do pulmão, câncer de célulasnão pequenas do pulmão, adenocarcinoma do pulmão, carcinoma escamosodo pulmão, câncer do peritônio, câncer hepatocelular, câncer gastrointestinal,câncer pancreático, glioblastoma, câncer cervical, câncer do ovário, câncer dofígado, câncer da bexiga, hepatoma, câncer de mama, câncer do colo, câncercolo retal, carcinoma endometrial ou uterino, carcinoma das glândulascelulares, câncer do rim, câncer do fígado, câncer da próstata, câncer vulval,câncer da tireóide, carcinoma hepático, leucemia e outras disfunçõeslinfoproliferativas, e vários tipos de câncer de cabeça e pescoço. Disfunções naproliferação celular também incluem, mas sem se limitar, disfunções pré-leucêmicas, tais como síndromes mielodisplásicas (MDS).
"Tumor," da forma utilizada no presente, refere-se a todo ocrescimento ou proliferação celular neoplásico, sendo maligno ou benigno, etodos os tecidos e células cancerosos e pré-cancerosos. Os termos"cancerosos", "câncer", "disfunção de proliferação celular", "disfunçãoproliferativa", e "tumor" não são mutuamente exclusivos, conforme descritos nopresente.
O termo "disfunção relacionada a interferon" refere-se a oudescreve uma disfunção que é tipicamente caracterizada por ou contribui para,quantidades ou atividades aberrantes de um ou mais interferons. Exemplos dedisfunções relacionadas a interferem incluem, mas sem se limitar
Os termos "disfunção inflamatória" e "disfunção imune" referem-sea, ou descreve, disfunções causadas por mecanismos imunológicos aberrantese/ou sinalização de citocina aberrante (tal como sinalização aberrante deinterferon). Exemplos de disfunções imunes e inflamatórias incluem, mas semse limitar a, doenças autoimunes, síndromes de deficiências imunológicas ehipersensibilidades. Uma "doença autoimune" de acordo com o presente, éuma doença ou disfunção não-maligna que se desenvolve para, e édirecionada contra o próprio tecido de um indivíduo. As doenças autoimunes deacordo com a presente invenção exclui, especificamente, doenças oucondições malignas e cancerosas, excluindo particularmente Iinfoma de célulaB, leucemia linfoblástica aguda (ALL), leucemia linfocítica crônica (CLL),leucemia de células capilares e leucemia mieloblástica crônica. Exemplos dedoenças e disfunções autoimunes incluem, mas sem se limitar, respostasinflamatórias, tais como doenças inflamatórias de pele, incluindo psoríase edermatite (tal como dermatite atópica); escleroderma e esclerose sistêmica;respostas associadas a doença inflamatória dos ossos (tal como doença deCrohn e colite ulcerativa); síndrome de disfunção respiratória (incluindosíndrome de disfunção respiratória adulta; ARDS); dermatite; meningite;encefalite; uveite; colite; glomerulonefrite; condições alérgicas, tal comoeezema e asma, e outras condições que envolvem a infiltração de células T erespostas inflamatórias crônicas; aterosclerose; deficiência na adesão deleucócitos; artrite reumatóide; lúpus eritematoso sistêmico (SLE) (incluindo,mas sem se limitar, lúpus nefrite, lúpus cutâneo); diabetes mellitus (tal comodiabetes mellitus do tipo I ou dependente de insulina); esclerose múltipla;síndrome de Reynaud; tireoidite autoimune; tireoidite de Hashimoto;encefalomielite alérgica; síndrome de Sjogren; diabetes juvenil; e respostasimunes associadas com hipersensibilidade aguda ou tardia mediada porcitocinas e linfócitos Τ, tipicamente encontradas em tuberculose, sarcoidose,polimiosite, granulomatose e vasculite; anemia perniciosa (doença de Addison);doenças que envolvem diapedese de leucócitos; disfunção inflamatória dosistema nervoso central (CNS); síndrome da injúria de múltiplos órgãos;
anemia hemolítica (incluindo, mas sem se limitar, anemia positiva de Coombsou crioglobinemia) ; miastenia grave; doenças mediadas por complexos deantígeno-anticorpo; doença de membrana com base anti-glomerular; síndromeantifosfolipídeos; neurite alérgica; doença de Graves; síndrome miastênica deLambert-Eaton; penfigóide bolhoso; pênfigo; poliendocrinopatia autoimmune;doença de Reiter; síndrome de "stiff-man"\ doença de Behcet; atrite de célulasgigantes; nefrite de complexo imune; nefropatia de IgA; polineuropatia de IgM;púrpura trombocitopênica imune (ITP) ou trombocitopenia autoimune, etc.
Exemplos de síndromes de deficiência imunológica incluem, massem se limitar, ataxia telangiectasia, síndrome da deficiência na adesão de15 leucócitos, linfopenia, disgamaglobulinemia, infecções por HIV oudeltaretrovírus, imunodeficiência variável comum, imunodeficiência combinadasevera, disfunção bactericida fagocitária, agamaglobulinemia, síndrome deDiGeorge e síndrome de Wiskott-Aldrich. Exemplos de hipersensibilidadeincluem, mas sem se limitar, alergias, asmas, dermatite, urticária, anafilaxia,síndrome de Wissler e púrpura trombocitopênica.
Da forma utilizada no presente, "tratamento" refere-se aintervenções clínicas em uma tentativa de alterar o curso natural do indivíduoou célula que está sendo tratado, e pode ser realizado tanto para profilaxiaquanto durante o desenvolvimento da patologia clínica. Os efeitos desejáveisdo tratamento incluem a prevenção da ocorrência ou decorrência da doença,alívio dos sintomas, diminuição de qualquer conseqüência patológica direta ouindireta da doença, prevenção ou redução de inflamação e/ou dano ao tecidoe/ou órgão, redução da taxa de progressão da doença, melhoria ou alívio doestado doentio, e remissão ou prognose melhorada. Em algumas realizações,os anticorpos da presente invenção são utilizados para retardar odesenvolvimento de uma doença ou disfunção.
Um "indivíduo" é um vertebrado. Em algumas realizações, overtebrado é um mamífero. Mamíferos incluem, mas sem se limitar, animais defazenda (tais como vacas), animais de esportes, animais de estimação (taiscomo gatos, cachorros e cavalos), primatas, camundongos e ratos. Emalgumas realizações, o vertebrado é humano.
"Mamífero" para os propósitos do tratamento, refere-se a qualqueranimal classificado como um mamífero, incluindo os humanos, animaisdomésticos e de fazenda, e animais de zoológico, esporte e animais deestimação, tais como cachorro, cavalos, gatos, vacas, etc. Em algumasrealizações, o mamífero é humano.
Uma "quantidade eficaz" refere-se a uma quantidade eficaz, emdosagens e por período de tempo necessário, para alcançar o resultadoprofilático ou terapêutico desejado.
Uma "quantidade terapeuticamente eficaz" de umasubstancia/molécula da invenção pode variar de acordo com fatores tais comoestado doentio, idade, sexo e peso do indivíduo, e a capacidade dasubstância/molécula, para desenvolver uma resposta desejada no indivíduo.Uma quantidade terapeuticamente eficaz é também aquela em que qualquerefeito tóxico ou prejudicial da substância são superados pelos efeitosterapeuticamente benéficos. Uma "quantidade profilaticamente eficaz" refere-sea uma quantidade eficaz, a dosagens e por períodos de tempo necessários,para alcançar o resultado profilático desejado. Tipicamente, mas nãonecessariamente, uma vez que uma dose profilática é utilizada em sujeitosantes ou no início do estágio inicial da doença, a quantidade profilaticamenteeficaz seria menor que a quantidade terapeuticamente eficaz.O termo "agente citotóxico", da forma utilizada no presente,refere-se a uma substância que inibe ou previne a função das células e/oucausam destruição das células. O termo é entendido como incluindo isótoposradioativos (tal como, At211, I131, I1251 Y901 Re186, Re188, Sm153, Bi212, P321 Pb212 eisótopos radioativos de Lu), agentes quimioterápicos (tais como, metotrexato,adriamicina, alcalóides de vinca (vincristina, vinblastina, etoposídeo),doxorubicina, melfalan, mitomicina C, clorambucil, daunorubicina ou outrosagentes intercalantes, enzimas e fragmentos dos mesmos, tais como enzimasnucleolíticas, antibióticos, e toxinas, tais com toxinas de moléculas pequenas,ou toxinas enzimaticamente ativas de bactérias, fungos, plantas ou animais,incluindo fragmentos e/ou variantes deste, e os vários agentes anti-tumores ouanti-cancerígenos , descritos abaixo. Outros agentes citotóxicos são descritosabaixo. Um agente tumoricida causa a destruição de células tumorais.
Um "agente quimioterápico" é um composto químico útil notratamento de câncer. Exemplos de agentes quimioterápicos incluem agentesalquilantes, tais como tiotepa e CYTOXAN® ciclosfosfamida; alquil sulfonatostais como busulfan, improsulfan e piposulfan; aziridinas tais como benzodopa,carboquona, meturedopa, e uredopa; etileniminas e metilamelaminas incluindoaltretamina, trietilenomelamina, trietilenofosforamida, trietilenetiofosforamida etrimetilolomelamina; acetogeninas (especialmente bulatacina e bulatacinona);delta-9-tetrahidrocanabinol (dronabinol, MARINOL®); beta-lapacona; lapacol;colchicinas; ácido betulínico; camptotecina (incluindo o análogo sintéticotopotecan (HYCAMTIN®), CPT-11 (irinotecan, CAMPTOSAR®),acetilcamptotecina, escopolectina, e 9-aminocamptotecina); briostatina;calistatina; CC-1065 (incluindo seus análogos sintéticos adozelesin, carzelesine bizelesin); podofilotoxina; ácido podofilínico; teniposídeo; criptoficinas(particularmente criptoficina 1 e criptoficina 8); dolastatina; duocarmicina(incluindo os análogos sintéticos KW-2189 e CB1-TM1); eleuterobina;pancratistatina; sarcodictina; espongistatina; mostardas de nitrogênio tais comoclorambucila, clornafazina, colofosfàmida, estramustina, ifosfamida,mecloretamina, hidrocloreto oxido de mecloretamina, melfalan, novembicina,fenesterina, prednimustina, trofosfamida, mostarda de uracila; nitrouréias taiscomo carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina, eranimnustina; antibióticos tais como antibióticos de enedina (tais como,caliceamicina, especialmente caliceamicina gamall e caliceamicina ômega Il(vide, Agnew, Chem Intl. Ed. Engl., 33: 183-186 (1994)); dinemicina, incluindodinemicina A; esperamicina; bem como cromóforo de neocarzinostatina ecromóforos antibióticos de enedina cromoproteína relacionados),aclacinomisinas, actinomicina, autramicina, azaserina, bleomicinas,cactinomicina, carabicina, carminomicina, carzinofilina, cromomicinas,dactinomicina, daunorubicina, detorubicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina,ADRIAMYCIN® doxorubicina (incluindo morfolino-doxorubicina, cianomorfolino-doxorubicina, 2-pirrolino-doxorubicina e deoxidoxorubicina), epirubicina,esorubicina, idarubicina, marcelomicina, mitomicinas tais como mitomicina C,ácido micofenólico, nogalamicina, olivomicinas, peplomicina, potfiromicina,puromicina, quelamicina, rodorubicina, estreptonigrina, estreptozocina,tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorubicina; anti-metabólitos tais comometotrexato e 5-fluorouracila (5-FU); análogos de ácido fólico, tais comdenopterina, metotrexato, pteropterina, trimetrexato; análogos de Purina, taiscomo fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina; análogos depirimidina tais como ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina,dideoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina; andrógenos tais comocalusterona, propionato de dromostanolona, epitiostanol, mepitiostano,testolactona; anti- adrenais tais como aminoglutetimida, mitotano, trilostano;ácido fólico reabastecedor, tais como ácido frolínico; aceglatona; aldofosfamidaglicosideo; ácido aminolevulínico; eniluracila; amsacrina; bestrabucila;bisantreno; edatraxato; defofamina; demecolcina; diaziquona; elfornitina;acetato de eliptínio; epotilona; etoglucídeo; nitrato de gálio; hidroxiuréia;lentinan; lonidainina; maitansinóides tais como maitansina e ansamitocinas;mitoguazona; mitoxantrona; mopidanmol; nitraerina; pentostatina; fenamet;
pirarubicina; losoxantrona; 2-eti Ihidrazid a; procarbazina; complexopolisacarídico PSK® (JHS Natural Products, Eugene1 OR); razoxano; rizoxina;sizofiran; espirogermânio; ácido tenuazónico; triaziquona; 2,2',2"-triclorotrietilamina; tricotecenos (especialmente toxina T-2, verracurina A,roridina A e anguidina); uretano; vindesina (ELDISINE®, FILDESIN®);dacarbazina; manomustina; mitobronitol; mitolactol; pipobroman; gacitosina;arabinosídeo ("Ara-C"); tiotepa; taxóides, tais como, TAXOL® paclitaxel(Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.), ABRAXANETM livre decromóforo, formulações de nanopartículas de paclitaxel produzidas comalbumina (American Pharmaceutical Partners, Schaumberg1 Illinois), eTAXOTERE® doxetaxel (Rhône-Poulenc Rorer, Antony1 France); cloranbucila;gemcitabina (GEMZAR®); 6-tioguanina; mercaptopurina; metotrexato; análogosde platino, tais como cisplatina e carboplatina; vinblastina (VELBAN®); platínio;etoposídeo (VP-16); ifosfamida; mitoxantrona; vincristina (ONCOVIN®);oxaliplatina; leucovovina; vinorelbina (NAVELBINE®); novantrona; edatrexato;daunomicina; aminopterina; ibandronato; inibidor de topoisomerase RFS 2000;difluorometilornitina (DMFO); retinóides tais como ácido retinóico; capecitabina(XELODA®); sais farmaceuticamente aceitáveis, ácidos ou derivados destescompostos acima, bem como as combinações de dois ou mais destes, tal comoCHOP, uma abreviação para uma terapia combinada de ciclofosfamida,doxorubicina, vincristina, e prednisolona, e FOLFOX, uma abreviação para umtratamento com oxaliplatina (ELOXATINTM) combinada com 5-FU eleucovovina.
Também incluídos nesta definição estão agentes anti-hormonaisI que atuam para regular, reduzir, bloquear, ou inibir os efeitos dos hormôniosque podem promover o crescimento do câncer, e são freqüentementeapresentados na forma de tratamento sistêmico ou do corpo inteiro. Elespodem ser hormônios em si. Exemplos incluem anti-estrogênios e moduladoresde receptor de estrogênio seletivos (SERMs), inlcuindo, por exemplo, tamoxifen(inlcuindo NOLVADEX® tamoxifen), EVISTA® raloxifeno, droloxifeno, 4-hidroxitamoxifen, trioxifeno, keoxifeno, LY117018, onapristona, e FARESTON®toremifeno; anti-progesteronas; reguladores negativos de receptores deestrogênio (ERDs); agentes que funcionam para suprimir ou parar os ovários,por exemplo, agonistas de hormônios de liberação de hormônios Ieutinizante(LHRH) tais como LUPRON® e ELIGARD® acetato de leuprolida, acetato degoserelina, acetato de buserelina e tripterelina; outros anti-andrógenos, taiscomo flutamida, nilutamida e bicalutamida; e inibidores de aromatase, queinibem as enzimas aromatase, que regulam a produção de estrogênio nasglândulas adrenais, tais como, por exemplo, 4(5)-imidazol, aminoglutetimida,MEGASE® acetato de megestrol, AROMASIN® exemestano, formestania,fadrozol, RIVISOR® vorozol, FEMARA® letrozol, e ARIMIDEX® anastrozol.Adicionalmente, esta definição de agentes quimioterápicos inclui bisfosfonatos,tais como clodronato (por exemplo, BONEFOS® ou OSTAC®), DIDROCAL®etidronato, NE-58095, ZOMETA® ácido zoledrônico / zoledronato, FOSAMAX®alendronato, AREDIA® pamidronato, SKELID® tiludronato, ou ACTONEL®risedronato; bem como troxacitabina (análogo de 1,3-dioxolano nucleosídeo);oligonucleotídeos antisense, particularmente aqueles que inibem a expressãode genes nas vias de sinalização implicam na proliferação celular desregulada ,tais como, por exemplo, alfa-PKC, Raf1 H-Ras1 e receptores do fator decrescimento epidérmico (EGF-R); vacinas, tais como vacina THERATOPE® evacinas de terapia gênica, por exemplo, vacina ALLOVECTIN®, vacinaLEUVECTIN®, e vacina VAXID®; LURTOTECAN® inibidor de topoisomerase I;ABARELIX® rmRH; ditosilato de Iapatinib (inibidor de molécula pequena detirosina quinase dupla ErbB-2 e EGFR também conhecidos como GW572016);e sais, ácidos ou derivados farmaceuticamente aceitáveis de qualquer um doscompostos descritos acima.
Composições ε Métodos de Produção das Mesmas
A presente invenção fornece anticorpos que ligamespecificamente a RELT. Em um aspecto, a invenção fornece um anticorpo quecompreende uma região HVR-H1 que compreende a seqüência de pelo menosuma das SEQ ID NOs: 42-49. EM um aspecto, a presente invenção fornece umanticorpo que compreende uma região HVR-H2 que compreende a seqüênciade pelo menos uma das SEQ ID NOs: 51-58. Em um aspecto, a presenteinvenção fornece um anticorpo que compreende a região HVR-H3 que contéma seqüência de pelo menos uma das SEQ ID NOs: 60-67.
Em um aspecto, a presente invenção fornece um anticorpo quecompreende uma região HVR-H1 que contém a seqüência de pelo menos umadas SEQ ID NOs: 42-49, e uma região HVR-H2 que contém uma seqüência depelo menos uma das SEQ ID NOs: 51-58. Em um aspecto, a presente invençãofornece um anticorpo que compreende uma região HVR-H3 que contém aseqüência de pelo menos uma das SEQ ID NOs: 60-67. Em um aspecto, apresente invenção fornece um anticorpo que compreende uma região HVR-H1que contém a seqüência de pelo menos uma das SEQ ID NOs: 42-49, e umaregião HVR-H3 que contém a seqüência de pelo menos uma das SEQ ID NOs:60-67. Em um aspecto, a presente invenção fornece um anticorpo quecompreende uma região HVR-H2 que contém a seqüência de pelo menos umadas SEQ ID NO: 51-58, e uma região HVR-H3 que contém a seqüência de pelomenos uma das SEQ ID NOs: 60-67.
Em um aspecto, a presente invenção fornece um anticorpo quecompreende pelo menos uma, pelo menos duas ou pelo menos três dasseqüencias a seguir:
(i) Uma seqüência HVR-H1 que compreende pelo menos uma dasSEQ ID NOs: 42-49;
(ii) Uma seqüência HVR-H2 que compreende pelo menos umadas SEQ ID NOs: 51-58;
(iii) Uma seqüência HVR-H3 que compreende pelo menos umadas SEQ ID NOs: 60-67.
As seqüências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 42-49, 51-58, e60-67 são numeradas com relação a HVR individuas (tal como, H1, H2, H3),conforme indicado nas figuras 5A e 5B, a numeração sendo consistente com osistema de numeração Kabat, conforme descrito abaixo. Em um aspecto, umanticorpo da presente invenção compreende um, dois ou três das seqüênciasHVR de (i)-(iii) acima, e uma região hipervariável de cadeia leve conformeilustrado na SEQ ID NO: 1 ou 2.
Em um aspecto, a presente invenção fornece anticorpos quecompreendem seqüências HVR de cadeia pesada conforme ilustrado nasFiguras 5A e 5B. Em uma realização, os anticorpos compreendemadicionalmente seqüências HVR de cadeia leve, conforme ilustrado na SEQ IDNOs: 1 ou 2.
Algumas realizações de anticorpos de acordo com a presenteinvenção compreendem um domínio variável de cadeia leve do anticorpo 4D5humanizado (huMAb4D5-8) (HERCEPTIN®, Genentech, Inc., South SanFrancisco, CA, USA) (também referenciado em US 6.407.213 e Lee et al., J.Mol. Biol. (2004), 340(5): 1073-93), conforme ilustrado na SEQ ID NO: 1 abaixo.1 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg ValThr Ile Thr Cys Arq Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln GlnLys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tvr Ser GlyVal Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile SerSer Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tvr Thr Thr ProPro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 107 (SEQ ID NO: 1) (osresíduos HVR são sublinhados)
Em uma realização, a seqüência do domínio variável de cadeialeve de huMAb4D5-8 é modificada em uma ou mais posições 30, 66 e 91 (Asn,Arg e His conforme indicado em negrito/itálico acima, respectivamente). Emuma realização, a seqüência de huMAb4D5-8 modificada compreende Ser naposição 30, Gly na posição 66 e/ou Ser na posição 91. Conseqüentemente, emuma realização, um anticorpo de acordo com a presente invenção compreendeum domínio variável de cadeia leve que contém a seqüência ilustrada na SEQID NO: 2 abaixo:
1 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg ValThr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val SerThr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln LysPro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tvr Ser Gly ValPro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser SerLeu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tvr Thr Thr Pro ProThr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 107 (SEQ ID NO: 2) (os resíduosHVR são sublinhados)
Os resíduos substituídos com relação ao huMAb4D5-8 sãoindicados em negrito/itálico acima.
Os anticorpos de acordo com a presente invenção podemcompreender qualquer seqüência de domínio variável de estrutura apropriada,desde que a atividade de ligação a RELT seja substancialmente mantida. Porexemplo, em algumas realizações, os anticorpos de acordo com a presenteinvenção compreendem uma seqüência de consenso de estrutura com cadeiapesada, do subgrupo Ill humana. Em uma realização destes anticorpos, aseqüência consenso de estrutura compreende uma substituição na posição 71,73 e/ou 78. Em algumas realizações destes anticorpos, a posição 71 é A, 73 éT e/ou 78 é A. Em uma realização, estes anticorpos compreendem seqüênciasde estrutura de domínio variável de cadeia pesada de huMAb4D5-8(HERCEPTIN®, Genentech, Inc., South San Francisco, CA, USA) (tambémreferenciado em US 6.407.213 e US 5.821.337, e Lee et a/., J. Mol. Biol.(2004), 340(5): 1073-93). Em algumas realizações, estes anticorposcompreendem adicionalmente uma seqüência consenso de estrutura de cadeialeve Dl humana. Em uma realização, estes anticorpos compreendemseqüências HVR de cadeia leve de huMAb4D5-8, conforme descritas na US6.407.213 e US 5.821.337.) Em uma realização, estes anticorposcompreendem seqüências de domínio variável de cadeia leve de huMAb4D5-8(SEQ ID NO: 1 e 2) (HERCEPTIN®, Genentech, Inc., South San Francisco, CA,USA) (também referenciado na US 6.407.213 e US 5.821.337, e Lee et a/., J.Mol. Biol. (2004), 340(5): 1073-93).
Em uma realização, um anticorpo de acordo com a presenteinvenção compreende um domínio variável de cadeia pesada, em que aseqüência de estrutura compreende a seqüência de pelo menos uma das SEQID NOs: 3-21, 30-33, 38-41, e 73-129, e as seqüências HVR H1, H2 e H3 sãoselecionadas de pelo menos uma das SEQ ID NOs: 42-50, 51-59, e 60-68,respectivamente. Em uma realização, o anticorpo de acordo com a presenteinvenção compreende um domínio variável de cadeia leve, em que a seqüênciade estrutura compreende a seqüência de pelo menos uma das SEQ ID NOs:22-25, 26-29, 34-37, e 130-141, e a região hipervariável é selecionada da SEQID NOs: 1 e 2.
Em uma realização, um anticorpo de acordo com a presenteinvenção compreende um domínio variável de cadeia pesada, em que aseqüência de estrutura compreende pelo menos uma seqüência das SEQ IDNOs: 3-21 e 73-129, e as seqüências HVR Η1, H2 e H3 são de SEQ ID NO: 49,58, e 67, respectivamente (clone H11). De forma similar, em outras realizações,os anticorpos de cada um dos clones C21, C10, E5/E7, F4, F5, H7, e H9compreendem um domínio variável de cadeia pesada, em que a seqüência deestrutura compreende pelo menos uma das seqüências de SEQ ID NOs: 3-21 e73-129, e as seqüências HVR-H1, HVR-H2, e HVR-H3 são as seqüências quesão especificamente numeradas para cada clone ou Fab nas figuras 5A e 5B.
Em uma realização, um anticorpo de acordo com a presenteinvenção possui a afinidade maturada para obter a afinidade de ligação alvodesejada.
Em um aspecto, a presente invenção fornece um anticorpo quecompete com qualquer um dos anticorpos descritos acima, com relação àligação a RELT. Em um aspecto, a presente invenção fornece um anticorpoque se liga ao mesmo determinante antigênico em RELT com relação aosanticorpos mencionados acima.
São fornecidas composições que compreendem pelo menos umanticorpo anti-RELT ou pelo menos um polinucleotídeo que compreendeseqüências que codificam um anticorpo anti-RELT. Em algumas realizações,uma composição pode ser uma composição farmacêutica. Da forma utilizadano presente, as composições compreendem um ou mais anticorpos que seligam a RELT e/ou um ou mais polinucleotídeos que compreendem seqüênciasque codificam um ou mais anticorpos que se ligam a RELT. Estas composiçõespodem compreender adicionalmente veículos apropriados, tais comoexcipientes farmaceuticamente aceitáveis, incluindo tampões, que são bemconhecidos no estado da técnica.
Também são fornecidos anticorpos e polinucleotídeos isolados.Em algumas realizações, os anticorpos e polinucleotídeos isolados sãosubstancialmente puros.
Em uma realização, anticorpos anti-RELT são monoclonais. Emoutra realização, são fornecidos fragmentos de anticorpos anti-RELT (tais comoI fragmentos Fab1 Fab'-SH e F(ab')2). Estes fragmentos de anticorpos podemser criados por meio tradicionais, tais como digestão enzimática, ou podem sergerados por técnicas recombinantes. Estes anticorpos podem ser quiméricos,humanizados ou humanos. Estes fragmentos são úteis para os fins dediagnóstico e terapêutico ilustrados abaixo.
Geração de Anticorpos Anti-RELT Utilizando uma Biblioteca de Exibiçãopor Fago
Uma série de métodos é conhecida no estado da técnica para ageração de bibliotecas de exibição por fago, a partir dos quais um anticorpo deinteresse pode ser obtido. Um método de geração dos anticorpos de interesseé por meio do uso de uma biblioteca de anticorpo de fago, conforme descritaem Lee et ai, J. Mol. Biol. (2004), 340(5): 1073-93.
Os anticorpos anti-RELT de acordo com a presente invençãopodem ser produzidos pelo uso de bibliotecas combinatórias, para a seleção declones de anticorpos sintéticos com a atividade ou atividades desejadas.Primeiramente, clones de anticorpos sintéticos são selecionados por meio deseleção de bibliotecas de fago contendo o fago que exibe vários fragmentos daregião variável do anticorpo (Fv), fundidos à proteína de revestimento do fago.Estas bibliotecas de fago são desafiadas por cromatografia de afinidade contrao antígeno desejado. Clones que expressam fragmentos Fv capazes de se ligarao antígeno desejado, são adsorvidos para o antígeno e, desta forma,separados por meio de clones não de ligação presentes na biblioteca. Osclones de ligação são então eluídos do antígeno, e podem ser adicionalmenteenriquecidos por ciclos adicionais de adsorção/eluição de antígeno. Qualquerum dos anticorpos anti-RELT de acordo com a presente invenção podem serobtidos através do desenvolvimento de um procedimento de seleção deantígeno apropriado para selecionar o clone fago de interesse, seguido pelaconstrução de um clone de anticorpo anti-RELT de comprimento total utilizandoseqüências Fv do clone fago de interesse, e seqüências da região constante(Fc) apropriada descritas em Kabat et ai, S equences of Proteins ofImmunological Interest, quinta edição, NIH Publication 91-3242, Bethesda MD(1991), vols. 1-3.
O domínio de ligação de antígeno de um anticorpo é formado porduas regiões variáveis (V) de cerca de 110 aminoácidos, selecionados, cadaum, de cadeias leve (VL) e pesada (VH), que apresentam, ambos, três alçashipervariáveis ou regiões determinantes de complementaridade (CDRs). Osdomínios variáveis podem ser exibidos funcionalmente no fago, tanto comofragmentos Fv de cadeia simples (scFv), em que VH e VL são covalentementeligados por meio de um peptídeo flexível e curto, quanto como fragmentos Fab,em que são, cada um, fundidos a um domínio constante, e interagem de formanão-covalente, conforme descrito em Winter et ai, Ann. Rev. Immunoi, 12:433-455 (1994). Da forma utilizada no presente, clones fagos que codificamscFv e clones fagos que codificam Fab são coletivamente referenciados como"clones fagos Fv" ou "clones Fv".
Repertórios de genes VH e VL podem ser clonadosseparadamente por meio de reação em cadeia de polimerase (PCR) erecombinados de forma aleatória em bibliotecas de fagos, que podem então serlocalizados como clones de ligação de antígeno, conforme descrito em Winteret ai, Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455 (1994). Bibliotecas de fontesimunizadas fornecem anticorpos de alta afinidade para o imunógeno, sem anecessidade de construção de hibridomas. Alternativamente, o repertório inicial(naive) pode ser clonado para fornecer uma única fonte de anticorposhumanos, para uma faixa ampla de antígenos não-próprios (non-self) etambém próprios (self), sem qualquer imunização, conforme descrito porGriffiths et ai, EMBO J, 12: 725-734 (1993). Finalmente, bibliotecas iniciais{naive) podem também ser produzidas sinteticamente por meio de clonagem desegmentos de gene V não rearranjados de células tronco, e utilizando primersde PCR que contém seqüência aleatória para codificar as regiões CDR3altamente variáveis e para realizar o rearranjo in vitro, conforme descrito porHoogenboom e Winter, J. Mol. Biol., 227: 381-388 (1992).
Fago filamentoso é utilizado para exibir fragmentos de anticorpospela fusão à proteína plll menor de revestimento. Os fragmentos de anticorpospodem ser exibidos como fragmentos Fv de cadeia simples, em que osdomínios VH e VL são conectados na mesma cadeia polipeptídica por umespaçador de polipeptídeo flexível, tal como descrito por Marks et al., J. Mol.Biol:, 222: 581-597 (1991), ou como fragmentos Fab, em que uma cadeia éfundida a plll e a outra é secretada no periplasma de células hospedeirasbacterianas, onde ocorre a junção de uma estrutura de proteína derevestimento-Fab exibida na superfície do fago através da exibição de algumasproteínas de revestimento do tipo selvagem, conforme descrito emHoogenboom et al., Nuci Acids Res., 19: 4133-4137 (1991).
Em geral, ácidos nucléicos que codificam fragmento gênico doanticorpo são obtidos a partir de células imunes coletadas de humanos eanimais. Se uma biblioteca influenciada a favor de clones anti-RELT, sedesejado, o sujeito é imunizado com RELT para gerar uma resposta aoanticorpo, e células do baço e/ou células B circundante ou outros linfócitos dosangue periférico (PBLs) são recuperadas da construção da biblioteca. Emuma realização, uma biblioteca de fragmento de gene de anticorpo humano,influenciada a favor de clones anti-RELT humano é obtida pela geração derespostas de anticorpos anti-RELT humano em camundongos transgênicos quecontêm um arranjo gênico de imunoglobulina humana funcional (e carecem deum sistema de produção de anticorpo endógeno funcional), tal que aimunização a RELT leva células B à produção de anticorpos humanos contraRELT. A geração de camundongos transgênicos que produzem anticorposhumanos é descrita na seção (lll)(b) abaixo.
Enriquecimento adicional para populações de células reativasanti-RELT pode ser obtido pelo uso de um procedimento de seleçãoapropriado, para isolar células B que expressam anticorpo de ligação demembrana específica de RELT, tal como pela separação celular comcromatografia por afinidade de RELT ou adsorção de células para RELTmarcado com fluorocromo, seguida pela seleção de célula ativada por fluxo(FACS).
Alternativamente, o uso de células do baço e/ou células B ououtras PBLs de um doador não-imunizado fornece uma melhor representaçãodo repertório de anticorpo possível, e também permite a construção de umabiblioteca de anticorpo pelo uso de qualquer espécie animal (humana ou não-humana) em que RELT não é antigênico. Para bibliotecas que incorporamconstrução gênica de anticorpo in vitro, células tronco são coletadas do sujeitopara fornecer ácidos nucléicos que codificam segmentos gênicos de anticorponão rearranjados. As células imunes de interesse podem ser obtidas de umasérie de espécies animais, tal como humano, camundongo, rato, lagomorfos,luprinos, caninos, felinos, porcos, bovinos e espécies de aves.
Ácidos nucléicos que codificam segmentos gênicos variáveis deanticorpos (incluindo segmentos VH e VL) são recuperados de células deinteresse e amplificados. No caso de bibliotecas gênicas VH e VL rearranjadas,o DNA desejado pode ser obtido pelo isolamento de DNA genômico ou mRNAde linfócitos, seguido pela reação em cadeia de polimerase (PCR) com primersque reconhecem as extremidades 5' e 3' de genes VH e VL rearranjados ,conforme descrito em Orlandi et a/., Proc. Natl. Acad. Sei. (USA), 86: 3833-3837 (1989), produzindo, desta forma, repertories diversos de gene V paraexpressão. Os genes V podem ser amplificados de cDNA e DNA genômico,com primers reversos na extremidade 5' do éxon que codifica o domínio Vmaduro, e primers diretos com base no segmento J, conforme descrito emOrlandi et ai (1989) and in Ward et al., Nature, 341: 544-546 (1989).Entretanto, para a amplificação de cDNA, primers reversos podem também serbaseados no éxon líder, conforme descrito por Jones et ai, Biotechnoi, 9: 88-89 (1991), e primers diretos na região constante, conforme descrito em Sastryet ai, Proc. Nati Acad. Sei. (USA), 86: 5728-5732 (1989). Para maximizar acomplementaridade, degeneração pode ser incorporada nos primers, conformedescrito em Orlandi et ai. (1989) ou Sastry et ai. (1989). Em algumasrealizações, a diversidade da biblioteca é maximizada pelo uso de primers dePCR alvos para cada família de gene V, para amplificar todos os arranjos VH eVL disponíveis presentes na amostra de ácido nucléico de células imunes,conforme descrito no método de Marks et ai., J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991),ou conforme descrito no método de Orum et ai., Nucieic Acids Res., 21: 4491-4498 (1993). Para a clonagem do DNA amplificado em vetores de expressão,sítios de restrição raros podem ser introduzidos no primer de PCR como umamarca em uma extremidade, conforme descrito em Orlandi et ai. (1989), oupela amplificação por PCR adicional com um primer marcado, conformedescrito em Clackson et ai, Nature, 352: 624-628 (1991).
Repertórios de genes V rearranjados sinteticamente podem serderivados in vitro de segmentos de gene V. A maior parte dos segmentos degene VH humanos pode ser clonada e seqüenciada (relatada em Tomlinson etai., J. Mol. Biol., 227: 776-798 (1992)), e mapeada (relatado em Matsuda et ai,Nature Genet., 3: 88-94 (1993); estes segmentos clonados (incluindo todas asconformações principais da alça H1 e H2) podem ser utilizados para gerardiversos repertórios de gene VH com primers de PCR que codificam alças H3de diversas seqüências e comprimentos, conforme descrito em Hoogenboom eWinter, J. Moi Bioi, 227: 381-388 (1992). Repertórios de VH podem tambémser produzidos com toda a diversidade de seqüência, focada em uma alça H3longa de um único comprimento , conforme descrito em Barbas et ai, Proc.Nati Acad. Sei. USA, 89: 4457-4461 (1992). Segmentos Vk e VA humanosforam clonados e seqüenciados (descrito em Williams e Winter1 Eur. J.Immunol., 23: 1456-1461 (1993)) e podem ser utilizados para produzirrepertórios de cadeia leve sintéticos. Os repertórios de gene V sintéticos , combase na faixa de vezes de VH e VL1 e comprimento de L3 e H3, codificarãoanticorpos de diversidade estrutural considerável. Seguindo a amplificação dosDNAs que codificam o gene V, segmentos de gene V de linhagem germinativapodem ser rearranjados in vitro de acordo com métodos de Hoogenboom eWinter, J. Moi Bioi, 227: 381-388 (1992).
Repertórios de fragmentos de anticorpo podem ser construídospela combinação de repertórios de gene VH e VL juntos em diversas formas.Cada repertório pode ser criado em diferentes vetores, e vetores recombinadosin vitro, por exemplo, conforme descrito em Hogrefe et ai, Gene, 128: 119-126(1993), ou in vivo por infecção combinatória, por exemplo, o sistema IoxPdescrito em Waterhouse et al., Nuci Acids Res., 21: 2265-2266 (1993). Ométodo de recombinação in vivo explora a natureza de cadeia dupla defragmentos Fab para superar o limite no tamanho de biblioteca imposto pelaeficiência de transformação em E. coli. Repertórios VH e VL iniciais (naive) sãoclonados de forma separada, um em um fagomídeo e o outro em um vetor defago. As duas bibliotecas são então combinadas por infecção de fago debactéria contendo fagomídeo, de forma que cada célula contém umacombinação diferente, e o tamanho da biblioteca é limitado apenas pelonúmero de células presente (cerca de1012 clones). Ambos os vetores contêmsinais de recombinação in vivo, de forma que os genes VH e VL sejamrecombinados em um único replicon, e são co-embalados em vírion de fago.Estas diversas bibliotecas fornecem um grande número de anticorpos diversosde boa afinidade (Kd"1 de cerca de 10"8 M).Alternativamente, os repertórios podem ser clonados de formaseqüencial no mesmo vetor, tal como descrito em Barbas et ai, Proc. Natl.Acad. Sei. USA, 88: 7978-7982 (1991), ou unidos por PCR e então clonados,conforme descrito em Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991). A junçãopor PCR pode também ser utilizada para unir DNAs VH e VL com DNA quecodifica um espaçador peptídico flexível para formar repertórios de Fv decadeia simples (scFv). Em ainda outra técnica, "junção por PCR em célula" (incell PCR assembly) é utilizada para combinar genes VH e VL nos linfócitos porPCR e então os repertórios dos genes ligados são clonados, conforme descritoem Embleton et al., Nuci Acids Res., 20: 3831-3837 (1992).
A seleção das bibliotecas pode ser realizada por qualquer técnicaconhecida no estado da técnica. Por exemplo, RELT pode ser utilizado pararevestir as paredes das placas de adsorção, expresso em células hospedeirasfixadas a placas de adsorção ou utilizado na seleção celular, ou conjugado abiotina para captura com esferas revestidas com estreptavidina, ou utilizado emqualquer outro método conhecido no estado da técnica para selecionar(panning) bibliotecas de exibição por fago.
As amostras de biblioteca de fago são colocadas em contatoRELT imobilizado sob condições apropriadas para a ligação de pelo menosuma porção das partículas de fago com o adsorvente. Normalmente, ascondições, incluindo pH, força iônica, temperatura e similares, sãoselecionadas de forma a imitar condições fisiológicas. Os fagos ligados à fasesólida são lavados e então eluídos por ácido, tal com descrito em Barbas et ai,Proc. Natl. Acad. Sci USA, 88: 7978-7982 (1991), ou por álcali, conformedescrito em Marks et ai, J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991), ou por competiçãode antígeno de RELT, por exemplo, em um procedimento similar ao método decompetição de antígeno de Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991). Fagospodem ser enriquecidos de 20-1.000 vezes em um único ciclo de seleção.Ainda, os fagos enriquecidos podem ser crescidos em culturas bacterianas esubmetidos a ciclos adicionais de seleção.
A eficiência de seleção depende de diversos fatores, inlcuindo ascinéticas de dissociação durante a lavagem, e se múltiplos fragmentos deanticorpos em um único fago podem se engajar simultaneamente com oantígeno. Anticorpos com rápida dissociação cinética (e fraca afinidade deligação), podem ser retidos pelo uso de lavagens curtas, exibição por fagomultivalente e alta densidade de revestimento de antígeno na fase sólida. Aalta densidade não apenas estabiliza o fago por meio de interaçõesmultivalente, mas favorece a nova ligação do fago que foi dissociado. Aseleção de anticorpos com cinéticas de dissociação lentas (e boa afinidade deligação) pode ser promovida pelo uso de longas lavagens e exibição por fagomonovalente, conforme descrito em Bass et al., Proteins, 8: 309-314 (1990) eno documento WO 92/09690, e uma baixa densidade de revestimento deantígeno, conforme descrito em Marks et al., Biotechnol., 10: 779-783 (1992).
É possível selecionar entre anticorpos de fago de diferentesafinidades para RELT1 mesmo com afinidades que diferem levemente.Entretanto, mutação aleatória de um anticorpo selecionado (por exemplo,conforme realizado em algumas das técnicas de maturação da afinidadedescritas acima) é comum de gerar diversos mutantes, a maioria ligando aoantígeno, e poucos com alta afinidade. Com RELT limitado, fagos de altaafinidade raros podem estar fora da competição (competed out). Para retertodos os mutantes de alta afinidade, fagos podem ser incubados com excessode RELT biotinilado, mas com o RELT biotinilado a uma concentração demolaridade mais baixa que a constante de afinidade molar alvo para RELT. Osfagos de ligação de alta afinidade podem então ser capturados por esferasparamagnéticas revestidas com estreptavidina. Esta "captura de equilíbrio"permite que os anticorpos sejam selecionados de acordo com suas afinidadesde ligação, com uma sensibilidade que permite o isolamento de clonesmutantes com uma afinidade tão pequena quanto duas vezes maior de umgrande excesso de fagos com afinidade mais baixa. As condições utilizadas nalavagem de fagos ligados a uma fase sólida podem também ser manipuladaspara discriminar com base nas cinéticas de dissociação.
Clones anti-RELT podem ser selecionados pela atividade. Emuma realização, a presente invenção fornece anticorpos anti-RELT queaumentam a produção de pDC com relação a cDC, quando administrado invivo ou quando adicionado in vitro à culturas celulares precursoras de MHC ΙΓDC. Em outra realização, a presente invenção fornece anticorpos anti-RELTque aumentam as concentrações séricas de IFN-α quando administrados invivo, ou que aumentam a secreção de IFN-α quando adicionados in vitro aculturas de células precursoras de MHC II" DC. Clones Fv que correspondemaos ditos anticorpos anti-RELT podem ser selecionados por (1) isolamento declones anti-RELT de uma biblioteca de fago, conforme descrito na seção B(l)(2)acima, e opcionalmente a amplificação da população de clones de fago isoladapor meio do crescimento da população em um hospedeiro bacterianoapropriado; (2) seleção de RELT e uma segunda proteína contra os quais sãodesejados atividades de bloqueio e não-bloqueio, respectivamente; (3)adsorção dos clones de fago anti-RELT para imobilizar RELT; (4) uso de umexcesso da segunda proteína para eluir quaisquer clones indesejados quereconheçam determinantes de ligação de RELT que sobrepõe ou compartilhamdeterminantes de ligação da segunda proteína; e (5) eluição dos clones quepermaneceram adsorvidos após a etapa (4). Opcionalmente, os clones com aspropriedades de bloqueio/não-bloqueio desejadas podem ser adicionalmenteenriquecidos por meio da repetição dos procedimentos de seleção descritosuma ou mais vezes no presente.
O DNA que codifica os clones Fv da invenção são facilmenteisolados e seqüenciados pelo uso de procedimentos convencionais (porexemplo, pelo uso de primers de oligonucleotídeos desejados para amplificarespecificamente as regiões codificantes da cadeia leve e pesada de interesse apartir de um modelo de DNA de hibridoma ou fago). Uma vez isolado, o DNApode ser colocado em vetores de expressão, que são então transfectados emcélulas hospedeiras, tais como células E. coli, células COS de símios, célulasdo ovário de hamster chinês (CHO), ou células de mieloma que não produzemde outra forma proteína de imunoglobulina, para obter a síntese dos anticorposmonoclonais desejados nas células hospedeiras recombinantes. Artigos derevisão de expressão recombinante em bactérias de DNA que codificaanticorpo incluem Skerra et ai, Curr. Opinion in Immunol., 5: 256 (1993) ePluckthun, Immunol. Revs1 130: 151 (1992).
O DNA que codifica os clones Fv de acordo com a presenteinvenção pode ser combinado com seqüências de DNA conhecidas quecodificam regiões constantes de cadeia leve e/ou pesada (por exemplo, asseqüências de DNA apropriadas podem ser obtidas a partir de Kabat et ai,acima), para formar clones que codificam cadeias leve e/ou pesada, de formaparcial ou integral. Aprecia-se que regiões constantes de qualquer isotipopossa ser utilizada para este propósito, incluindo regiões constantes de IgG,IgM, IgA, IgD1 e IgE, e que estas regiões constantes possam ser obtidas apartir de qualquer espécie animal ou humana. Um clone Fv derivado do DNAde domínio variável de uma espécie animal (tal como humana) e então fundidoao DNA da região constante de outras espécies animais para formarseqüências de codificação para "híbrido", cadeia leve e/ou cadeia pesada decomprimento total é incluída na definição de anticorpo "quimérico" e "híbrido",conforme utilizado no presente. Em uma realização, um clone Fv derivado deDNA variável humano é fundido a DNA de região constante humano paraformar seqüências de codificação para todos os humanos, cadeias leve e/oupesada de comprimento total ou parcial.
Os anticorpos produzidos por bibliotecas iniciais (naive) (tantonaturais quanto sintéticos) podem ser de afinidade moderada (Kd"1 de cerca de106 a 107 M"1), mas maturação da afinidade pode também ser imitada in vitropela construção e nove seleção de bibliotecas secundárias, conforme descritoem Winter et al. (1994), acima. Por exemplo, uma mutação pode serintroduzida de forma aleatória in vitro pelo uso de polimerase passível de erro(descrito em Leung et al., Technique, 1: 11-15 (1989)) no método de Hawkinset al., J. Moi Biol., 226: 889-896 (1992) ou no método de Gram et al., Proc.Λ/aí/. Acad. Sci USA, 89: 3576-3580 (1992). Adicionalmente, a maturação daafinidade pode ser realizada por mutação aleatória de uma ou mais CDRs, porexemplo, pelo uso de PCR com primers que carregam seqüências aleatórias,transportando um CDR de interesse, nos clones Fv individuais selecionados eseleção para clones de afinidade mais alta. O documento WO 9607754(publicado em 14 de março de 1996) descreveu um método para indução damutagênese em uma região determinante de complementaridade de umacadeia leve de imunoglobulina para criar uma biblioteca de genes de cadeialeve. Outra realização eficaz é recombinar os domínios VH ou VL selecionadospela exibição por fago com repertórios de variantes de domínio V de ocorrêncianatural, obtidos a partir de doadores não-imunizados, e seleção para altaafinidade em diversos ciclos de reorganização da cadeia, conforme descrito emMarks et al., Biotechnol., 10: 779-783 (1992). Esta técnica permite a produçãode anticorpos e fragmentos de anticorpos com afinidade na faixa de 10"9 M.
Outros Métodos de Geração de Anticorpos Anti-RELT
Outros métodos de geração e determinação da afinidade deanticorpos são bem conhecidos no estado da técnica e são descritos, porexemplo, em Kohler et al., Nature 256: 495 (1975); US 4.816.567; Goding,Monoclonal Antibodies: Principies and Practice, pp. 59-103 (Academic Press,1986; Kozbor1 J. Immunol., 133:3001 (1984); Brodeur et al., MonoclonalAntibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Mareei Dekker,Inc., NewYork, 1987; Munson et ai, Anal. Biochem., 107:220 (1980); Engels etai, Agnew. Chem. Int. Ed. Engi, 28: 716-734 (1989); Abrahmsen et al., EMBOJ., 4: 3901 (1985); Methods in Enzymology, vol. 44 (1976); Morrison et ai,Proc. Nati Acad. Sei. USA, 81: 6851-6855 (1984).
Métodos Gerais
No geral, a presente invenção fornece anticorpos anti-RELT quesão úteis para o tratamento de disfunções mediadas por RELT1 em que obloqueio total ou parcial de uma ou mais atividades de RELT é desejado. Emuma realização, os anticorpos anti-RELT da presente invenção são utilizadospara tratar disfunções de proliferação celular. Em outra realização, osanticorpos anti-RELT fornecidos no presente são utilizados para tratar umainfecção. Em outra realização, os anticorpos anti-RELT fornecidos no presentesão utilizados para tratar disfunções imunes, tais como as disfunções indicadasacima. Em outra realização, os anticorpos anti-RELT fornecidos na presenteinvenção são utilizados para tratar disfunções inflamatórias, tais como aquelasindicadas acima. Em outra realização, os anticorpos anti-RELT fornecidos nopresente são utilizados para tratar outras disfunções relacionadas a interferon.
Conforme exibido no presente, RELT é um regulador negativopara células dendríticas plasmocitóides ("pDC") CD11+B220+CD11b~CD45RB\mas não para células dendríticas ("cDC") CD11c+B220" convencionais. Destaforma, os anticorpos anti-RELT de acordo com a presente invenção podemtanto antagonizar o funcionamento normal de RELT (aumentando desta formaa produção de pDC que secreta IFB-α a partir de células precursoras), quantopode agonizar o funcionamento normal de RELT (reduzindo, desta forma, aprodução de pDC que secreta IFN-α a partir de células precursoras),dependendo do epítopo ligado pelo anticorpo. Anticorpos anti-RELT quebloqueiam a ligação de RELT a um ou mais de seus Iigantes naturais sãoantagonísticos da atividade de RELT. Anticorpos anti-RELT que estabilizam ouaumentam a ligação de RELT a um ou mais de seus Iigantes naturais (ou seja,bloqueando a ligação de RELT a um ou mais dos supressores de RELT ouprevenindo a degradação de RELT sem interferir na habilidade de RELT deligar o seu Iigante natural), são agonísticos da atividade de RELT. Tnato osanticorpos agonistas quanto os antagonistas sã contemplado pela presenteinvenção e, desta forma, são fornecidos métodos de aumentar (antagonista) oureduzir (agonista) os níveis relativos de pDC e IFN-α, in vitro e in vivo com osanticorpos anti-RELT de acordo com a presente invenção.
Em um aspecto, os anticorpos anti-RELT de acordo com apresente invenção são úteis como reagentes para a detecção e isolamento deRELT, tais como a detecção de RELT em diversos tipos celulares e tecidos,incluindo a determinação da densidade e distribuição de RELT em populaçõescelulares e em uma dada célula, e a seleção celular com base na presença ouquantidade de RELT.
Em ainda outro aspecto, os anticorpos anti-RELT antagonistas dapresente invenção são úteis para o desenvolvimento de antagonistas de RELTcom padrões de atividade de bloqueio similares aos padrões dos anticorpos dapresente invenção. Por exemplo, anticorpos anti-RELT antagonistas de acordocom a presente invenção podem ser utilizados para identificar outros anticorposque possuem as mesmas características e/ou capacidades de ligação de RELTde bloqueio das vias mediadas por RELT. Como exemplo adicional, anticorposantagonistas anti-RELT de acordo com a presente invenção podem serutilizados para identificar outros anticorpos anti-RELT que ligamsubstancialmente os mesmos determinantes antigênicos de RELT, como osanticorpos exemplificados no presente, incluindo epítopos lineares econformacionais.Os anticorpos anti-RELT de acordo com a presente invençãopodem ser utilizados em ensaios com base nas vias fisiológicas em que RELTestá envolvido, para selecionar antagonistas de moléculas pequenas paraRELT1 que exibirão efeitos farmacológicos similares no bloqueio da ligação deum ou mais parceiros de ligação para RELT. Conforme ilustrado no presente, adeleção de relt em camundongos resultou em um aumento na população depDC que secreta IFN-α e, desta forma, um aumento geral nos níveis séricos deIFN-α nestes camundongos. Desta forma, anticorpos anti-RELT de bloqueiopodem se reutilizados para identificar antagonistas de molécula pequena parasupressão do desenvolvimento de pDC mediada por RELT. Por exemplo, aatividade de um ou mais antagonistas de molécula pequena potenciais podeser comparada com a atividade dos anticorpos anti-RELT antagonistas nasupressão do desenvolvimento de pDC a partir de células precursoras de MHCII" DC.
Da forma ilustrada na presente invenção, a quebra de relt emcamundongos resulta em um aumento na quantidade de pDC produzido a partirde células CD1 Ic+MHC II", com relação à cDC. Desta forma, em outrarealização, a presente invenção fornece um método para modular a proporçãode pDC versus cDC produzidas a partir de células CD1 Ic+MHC II", por meio dainibição da expressão e/ou atividade de RELT nas células CD1 Ic+MHC II". Emum aspecto, a expressão e/ou atividade de RELT é inibida pela quebra de relt.
Em outro aspecto, a expressão e/ou atividade de RELT é inibida pelaadministração de um oligonucleotídeo antisense para DNA ou RNA de RELT.
Em outro aspecto, a expressão e/ou atividade de RELT é inibida pelaadministração de um ou mais anticorpos antagonistas de RELT. Em umaspecto, a expressão e/ou atividade de RELT é inibida pela administração deum ou mais anticorpos de acordo com a presente invenção. Em outro aspecto,a expressão e/ou atividade de RELT é inibida pela administração de anticorpoΗ11. Em outro aspecto, a expressão e/ou atividade de RELT é inibida in vitro.Em outro aspecto, a expressão e/ou atividade de RELT é inibida in vivo.
De forma similar, a presente invenção fornece um método para aredução da proporção de pDC produzida a partir de células CD1 Ic+MHC II",com relação à células cDC, que compreende o estímulo da expressão e/ouatividade de RELT nas células CD1 Ic+MHC II". Em um aspecto, a expressãoe/ou atividade de RELT é estimulada pela administração de um ou maisanticorpos agonistas de RELT. Em outro aspecto, a expressão e/ou atividadede RELT é estimulada in vivo. Em outro aspecto, a expressão e/ou atividade deRELT é estimulada in vitro.
IFN-α é conhecido por ser produzido inicialmente por pDC, e,conforme exibido no presente, níveis de IFN-α sistêmicos in vivo são, emprimeiro lugar, atribuídos à produção de IFN-α por pDC. Assim, a presenteinvenção fornece métodos para aumentar a produção de IFN-α a partir dainibição da expressão e/ou atividade de RELT. Em um aspecto, a expressãoe/ou atividade de RELT é inibida pela quebra de relt. Em outro aspecto, aexpressão e/ou atividade de RELT é inibida pela administração de umoligonucleotídeo antisense ao DNA ou RNA de RELT. Em outro aspecto, aexpressão e/ou atividade de RELT é inibida pela administração de um ou maisanticorpos antagonistas de RELT. Em um aspecto adicional, a expressão e/ouatividade de RELT é inibida pela administração de um ou mais anticorpos deacordo com a presente invenção. Em outro aspecto, a expressão e/ou atividadede RELT é inibida pela administração do anticorpo H11. Em ainda outroaspecto da invenção, a expressão e/ou atividade de RELT é inibida in vitro. Emoutro aspecto, a expressão e/ou atividade de RELT é inibida in vivo.
De forma similar, a presente invenção fornece métodos para aredução na produção de IFN-α por meio do estímulo da expressão e/ouatividade de RELT. EM um aspecto, a expressão e/ou atividade de RELT éestimulada pela administração de um ou mais anticorpos agonistas de RELT.Em outro aspecto, a expressão e/ou atividade de RELT é estimulada in vivo.
Em um aspecto adicional, a expressão e/ou atividade de RELT é estimulada invitro.
A geração de anticorpos candidatos pode ser alcançada pelo usode técnicas rotineiras do estado da técnica, inlcuindo as técnicas descritas nopresente, tais como a técnica de hibridoma e seleção de bibliotecas de exibiçãopor fago de moléculas ligantes. Estes métodos são bem conhecidos eestabelecidos no estado da técnica.
Em resumo, anticorpos anti-RELT de acordo com a presenteinvenção podem ser produzidos pelo uso de bibliotecas combinatórias para aseleção de clones de anticorpos sintéticos com a ou as atividades desejadas.
Em princípio, clones de anticorpos sintéticos são selecionados por meio deseleção de bibliotecas de fago que contêm fogos que exibem diversosfragmentos da região variável do anticorpo (Fv) fundidos à proteína derevestimento do fago. Estas bibliotecas de fago são desafiados porcromatografia de afinidade contra o antígeno desejado. Clones que expressamfragmentos Fab capazes de ligarem o antígeno desejado são adsorvidos para oantígeno, e, desta forma, separados dos clones que não apresentam ligação nabiblioteca. Os clones de ligação são então eluídos a partir de um antígeno, epodem ser adicionalmente enriquecidos por ciclos adicionais deadsorção/eluição de antígeno. Qualquer um dos anticorpos anti-RELT deacordo com a presente invenção podem ser obtidos pelo desenvolvimento deum procedimento de seleção de antígeno apropriado, para selecionar o clonede fago de interesse, seguido pela construção de um clone de anticorpo anti-RELT de comprimento total utilizando as seqüências Fv do clone de fago deinteresse e seqüências de região constante (Fc) apropriadas descritas emKabat et ai, Sequences of Proteins of Immunological Interest, quinta edição,publicação NIH 91-3242, Bethesda MD (1991), vols. 1-3. Vide também odocumento PCT Pub. W003/102157, e referências ali citadas.
Em uma realização, anticorpos anti-RELT de acordo com apresente invenção são monoclonais. Ainda englobados pelo escopo dapresente invenção estão fragmentos de anticorpos, tais como fragmentos Fab,Fab', Fab1-SH e F(ab')2, e variações destes, de anticorpos anti-RELT fornecidosno presente. Estes fragmentos de anticorpos podem ser criados por meiostradicionais, tais como digestão enzimática, ou podem ser gerados por técnicasrecombinantes. Os ditos fragmentos de anticorpos podem ser quiméricos,humanos ou humanizados. Os ditos fragmentos são úteis para os propósitosexperimentais, diagnósticos e terapêuticos descritos no presente.
Anticorpos monoclonais podem ser obtidos de uma população deanticorpos substancialmente homogêneos, ou seja, os anticorpos individuaisque compreendem a população são idênticos, exceto por possíveis mutaçõesde ocorrência natural que podem estar presentes em quantidades pequenas.Assim, o termo "monoclonal" indica o caráter do anticorpo como não sendouma mistura de anticorpos distintos.
Os anticorpos monoclonais anti-RELT de acordo com a presenteinvenção podem ser produzidos pelo uso de uma série de métodos conhecidosno estado da técnica, incluindo o método de hibridoma primeiramente descritopor Kohler et ai, Nature, 256:495 (1975), ou alternativamente eles podem serproduzidos por métodos de DNA recombinantes (tal como na US 4.816.567).
Vetores. Células Hospedeiras ε Métodos Recombinantes
Para a produção recombinante de um anticorpo da invenção, osácidos nucléicos que codificam o anticorpo são isolados e inseridos em umvetor replicável para a clonagem (amplificação do DNA) ou para a expressão.
O DNA que codifica o anticorpo é facilmente isolado e seqüenciado utilizandoprocedimentos convencionais (por exemplo, pela utilização de sondas deoligonucleotídeos que são capazes de se ligar especificamente aos genescodificadores das cadeias leves e pesadas do anticorpo). Muitos vetores estãodisponíveis. A escolha do vetor depende, em parte, da célula hospedeira queserá utilizada. Células hospedeiras incluem, mas sem limitar-se a, células deorigem procariótica ou eucariótica (geralmente de mamíferos). Será apreciadoque regiões constante de qualquer isotipo possam ser utilizados para este fim,incluindo as regiões constantes de IgG1 IgM, IgA, IgD e IgE, e que tais regiõesconstantes possam ser obtidas a partir de humano ou qualquer espécie animal.
Produção de Anticorpos Utilizando Células Hospedeiras ProcarióticasConstrução De Vetores
Seqüências polinucleotídicas codificadoras de componentespolipeptídicos do anticorpo da invenção podem ser obtidas utilizando técnicaspadrões de recombinação. As seqüências polinucleotídicas desejadas podemser isoladas e seqüenciadas de células produtoras de anticorpos, como célulasde hibridomas. Alternativamente, polinucleotídeos podem ser sintetizadosutilizando sintetizadores de nucleotídeos ou técnicas de PCR. Uma vez obtidas,as seqüências codificadoras de polipeptídeos são inseridas em um vetorrecombinante capaz de replicar e expressar os polinucleotídeos heterólogosem hospedeiros procarióticos. Muitos vetores que estão disponíveis e sãoconhecidos no estado da técnica podem ser utilizados para os fins da presenteinvenção. A seleção de um vetor apropriado vai depender principalmente dotamanho dos ácidos nucléicos a serem inseridos no vetor e a célula hospedeiraespecífica a ser transformada com o vetor. Cada vetor contém diversoscomponentes, dependendo de sua função (amplificação ou expressão depolinucleotídeos heterólogos, ou ambos), e de sua compatibilidade com acélula hospedeira particular na qual reside. Os componentes dos vetoresgeralmente incluem, mas não estão limitados a: uma origem de replicação, umgene marcador de seleção, um promotor, um sítio de ligação do ribossomoI (RBS), uma seqüência sinal, a inserção do ácido nucléico heterólogo e umaseqüência de terminação de transcrição.
Geralmente, vetores plasmidiais que contêm seqüências decontrole e replicon que são derivadas de espécies compatíveis com a célulahospedeira, são utilizados na conexão com estas hospedeiras. O vetornormalmente conduz um sítio de replicação, bem como seqüências demarcação que são capazes de fornecer seleção fenotípica em célulastransformadas. Por exemplo, a E. coli é tipicamente transformada utilizando umpBR322, um plasmídeo obtido a partir de uma espécie E. coli. pBR322 possuios genes que conferem a resistência a ampicilina (Amp) e a tetraciclina (Tet) e,portanto, fornece meios fáceis para a identificação de células transformadas.
As pBR322, seus derivados, ou outros piasmíaeos microbianos oubacteriófagos também podem conter, ou serem modificados por, promotoresque podem ser utilizados pelo organismo microbiano para a expressão deproteínas endógenas. Exemplos de derivados de pBR322 utilizados para aexpressão de anticorpos específicos são descritos em detalhes em Carter et al,Patente US 5.648.237.
Além disso, vetores de fagos que contêm seqüências de controlee replicon que são compatíveis com o microorganismo hospedeiro podem serutilizados como vetores de transformação em conexão com esses hospedeiros.Bacteriófago tal como λΘΕΜ.ΤΜ.-ΙΙ, por exemplo, pode ser utilizado nafabricação de um vetor recombinante que pode ser utilizado para transformarcélulas hospedeiras suscetíveis tais como a E. coli LE392.
O vetor de expressão da invenção pode compreender dois oumais pares promotores de cístrons, codificando cada componente dopolipeptídeo. O promotor é uma seqüência de regulação não traduzidalocalizada à montante (5') de um cístron, que modula a sua expressão.Promotores de procariotos geralmente se enquadram em duas classes, osinduzíveis e os constitutivos. Os promotores induzíveis são promotores queiniciam níveis aumentados de transcrição do cístron sob seu controle, emresposta a mudanças na condição de cultura, por exemplo, a presença ouausência de um nutriente ou de uma mudança na temperatura.
Uma grande quantidade de promotores reconhecida por umasérie de células hospedeiras potenciais é bem conhecida. O promotorselecionado pode estar operacionalmente ligado a um DNA cístron que codificaa cadeia leve ou pesada, ao remover o promotor do DNA fonte por meio dedigestão com enzimas de restrição, e inserindo a seqüência do promotorisolado no vetor da invenção. Tanto a seqüência promotora nativa quantomuitos promotores heterólogos podem ser utilizados para direcionar aamplificação e/ou expressão dos genes alvos. Em algumas realizações,promotores heterólogos são utilizados, pois eles geralmente permitem maiortranscrição e rendimentos mais altos do gene alvo expresso, quandocomparado com o promotor do polipeptídeo alvo nativo.
Os promotores apropriados para uso com hospedeirosprocarióticos incluem o promotor phoA, sistemas promotores de Iactose e β-galactamase, sistema promotor de triptofano (trp) e promotores híbridos, taiscomo o promotor tac ou trc. Entretanto, outros promotores que são funcionaisem bactérias (tais como outros promotores de fagos ou bacterianosconhecidos) também são apropriados. Suas seqüências de nucleotídeos forampublicadas, de forma a permitir que os técnicos no assunto as liguemoperacionalmente a cistrons que codificam cadeias leve e pesada alvo(Siebenlist et al, Cellt 20: 269 (1980)), utilizando Iigantes ou adaptadores parafornecer quaisquer sítios de restrição necessários.
Em um aspecto da invenção, cada cístron no vetor recombinantecompreende um componente da seqüência sinal de secreção que leva atranslocação dos polipeptídeos expressos através de uma membrana. Deforma geral, a seqüência sinal pode ser um componente do vetor ou pode seruma parte do DNA do polipeptídeo alvo que é inserido no vetor. A seqüênciasinal selecionada para os propósitos de acordo com a presente invençãodeverá ser uma que seja reconhecida e processada (ou seja, clivada por umapeptidase sinal) pela célula hospedeira. Para células hospedeiras procarióticasque não reconhecem e processam as seqüências sinal nativas para ospolipeptídeos heterólogos, a seqüência sinal é substituída por uma seqüênciasinal procariótica selecionada, por exemplo, a partir do grupo que consiste defosfatase alcalina, penicilinase, Ipp ou líderes de enterotoxina Il estáveis aocalor (STII), LamB, PhoE, PeIB, OmpA e MBP. Em uma realização dainvenção, a seqüência sinal utilizada em ambos os cístrons do sistema deexpressão é uma seqüência sinal STII ou variante desta.
Em outro aspecto, a produção de imunoglobulinas de acordo coma invenção pode ocorrer no citoplasma das células hospedeiras, e assim, nãonecessitam da presença das seqüências sinais de secreção dentro de cadacístron. A este respeito, as cadeias leve e pesada da imunoglobulina sãoexpressas, dobradas e reunidas para formar imunoglobulinas funcionais nocitoplasma. Determinadas linhagens hospedeiras (por exemplo, linhagens deE.Coli trxB) fornecem condições citoplásmicas que favorecem a formação depontes de dissulfeto, permitindo desta forma a dobra e união apropriada dassubunidades das proteínas expressas. (Proba e Plukthun, Gene, 159:203(1995)).
Os anticorpos de acordo com a presente invenção podemtambém ser produzidos pelo uso de um sistema de expressão em que a taxaquantitativa dos componentes de polipeptídeos expressos pode ser modulada afim de maximizar o rendimento de anticorpos secretados e apropriadamentereunidos de acordo com a presente invenção. A dita modulação é realizadapelo menos em parte pela modulação simultânea das forças de tradução paraos componentes do polipeptídeo.
Uma técnica para a modulação das forças de tradução estádescrita em Simmons et al., U.S. Pat. No. 5.840.523. A dita técnica utilizavariantes da região de início da tradução (TIR) em um cístron. Para uma dadaTIR, uma série de variantes de seqüências de aminoácidos e ácidos nucléicospode ser criada com uma faixa de forças de tradução, fornecendo, desta forma,meios convenientes para ajustar este fator para o nível de expressão desejadoda cadeia específica. Variantes de TIR podem ser geradas por técnicas demutagênese convencionais que resultam em alterações de códon que podemalterar a seqüência de aminoácido. Em algumas realizações, alterações naseqüência de nucleotídeos são silenciosas. Alterações na TIR pode incluir, porexemplo, alterações no número ou espaçamento de seqüências Shine-Dalgarno, junto com alterações na seqüência sinal. Um método para a geraçãode seqüências sinais mutadas é a geração de um "banco de códon" no começode uma seqüência codificadora que não altera a seqüência de aminoácido daseqüência sinal (por exemplo, as alterações são silenciosas). Esta realizaçãopode ser realizada por alteração da posição do terceiro nucleotídeo de cadacódon; adicionalmente, alguns aminoácidos tais como leucina, serina, earginina possuem primeira e segunda posições múltiplas que podem adicionarcomplexidade na produção do banco. Este método de mutagênese é descritoem Yansura et al. (1992) METHODS: A Companion to Methods in Enzymol.4:151-158.
Em uma realização, um conjunto de vetores é gerado com umafaixa de forçar TIR para cada cístron do presente. Este conjunto limitadofornece uma comparação dos níveis de expressão de cada cadeia, bem comoo rendimento dos produtos de anticorpo desejados sob várias combinações deforças TIR. Forças TIR podem ser determinadas por quantificação do nível deexpressão de um gene repórter conforme descrito em detalhes em Simmons etal. U.S. Pat. No. 5. 840.523. Com base na comparação da força de tradução,os TIRs individuais desejados são selecionados para ser combinado naconstrução de vetor de expressão da presente invenção.
As células hospedeiras procariontes apropriados para aexpressão dos anticorpos da presente invenção incluem arquebactéria eeubactérias, tais como organismos gram-negativos ou gram-positivos.
Exemplos de bactérias úteis incluem Escherichia (por exemplo, E. coli), bacilos(por exemplo, B. subtilis), Enterobactérias, espécies de Pseudomonas (porexemplo, P. aeruginosa), Salmonella typhimurium, Serratia marcescans,Klebsiella, Proteus, Shigella, Rhizóbia, Vitreoscilla ou Paracoccus. Em umexemplo de realização, células gram-negativas são usadas. Em um exemplo derealização, células E. coli são usadas como hospedeiras para a invenção.
Exemplos de linhagens de E. coli incluem a linhagem W3110 (Bachmann,Cellular and Molecular BíoIoqv, vol. 2 (Washington, D.C.: American Society forMicrobiology, 1987), págs. 1190-1219; Depósito ATCC No. 27325) e seusderivados, incluindo as linhagens 33D3 possuindo os genótipos W3110 Δ fhuA(Δ tonA) ptr3 Iac Iq lacL8 Δ ompT Δ (nmpc-fepE) degP41 kanR (Patente US5.639.635). Outras linha e seus genes derivados, tais como E. coli 294 (ATCC31446), E. coli Β, E coli 1776 (ATCC 31537) e E. coli RV308 (ATCC 31608)também são adequadas. Estes são exemplos preferencialmente ilustrativos doque limitadores. Métodos para a construção de derivados de qualquer uma dasbactérias acima mencionadas que possuem o genótipo definido sãoconhecidas no estado da técnica, por exemplo, em Bass et ai, Proteins, 8:309-314 (1990). Geralmente é necessário selecionar as bactérias adequadaslevando em consideração a replicabilidade do replicon nas células bacterianas.
Por exemplo, as espécies E. coli, Serratia ou Salmonella podem serdevidamente utilizadas como hospedeiras, quando plasmídeos bemconhecidos, tais como os plasmídeos pBR322, pBR325, pACYC177 oupKN410 são utilizados para a construção do replicon. Normalmente a célulahospedeira deve secretar quantidades mínimas de enzimas proteolíticas, eadicionalmente inibidores da protease podem ser incorporadas na culturacelular.
Produção de Anticorpos
As células hospedeiras são transformadas com os vetores deexpressão descritos acima e cultivadas em meios nutrientes convencionaismodificados conforme apropriado para a indução de promotores, seleção detransformantes ou amplificação dos genes que codificam as seqüênciasdesejadas.
Transformação significa a introdução de DNA em hospedeiroseucarióticos a fim de que o DNA seja replicável, quer como um elemento extra-cromossômico ou integrado ao cromossomo. Dependendo da célulahospedeira utilizada, a transformação é feita utilizando técnicas padrãoadequada para tais células. O tratamento com cálcio empregando cloreto decálcio é geralmente utilizado para células bacterianas que contêm paredecelular. Outro método de transformação emprega polietileno-glicol / DMSO.Outra técnica ainda utilizada é eletroporação.
As células procarióticas utilizadas para produzir os polipeptídeosde acordo com a presente invenção são cultivadas em meios conhecidos natécnica e são apropriadas para cultivo das células hospedeiras selecionadas.Exemplos de meios apropriados incluem caldo Iuria (LB) mais os suplementosnutrientes necessários. Em algumas realizações preferidas, os meios tambémcontêm um agente de seleção, selecionado com base na construção do vetorde expressão, para permitir seletivamente o crescimento de célulasprocarióticas que contenham o vetor de expressão. A ampicilina é adicionadaaos meios, por exemplo, para crescimento de células que expressam o generesistente à ampicilina.Quaisquer suplementos necessários além de fontes de carbono,nitrogênio e fosfato inorgânico podem também ser incluídos em concentraçõesapropriadas, introduzidas isoladamente ou na forma de uma mistura com outrosuplemento ou meio, tal como uma fonte de nitrogênio complexa.
Opcionalmente, o meio de cultivo pode conter um ou mais agentes redutoresselecionados a partir do grupo que consiste de glutationa, cisteína, cistamina,tioglicolato, ditioeritritol e ditiotreitol.
As células hospedeiras procarióticas são cultivadas sobtemperaturas apropriadas. Para crescimento da E. coli, por exemplo, ocrescimento ocorre a uma faixa de temperatura que inclui, mas sem se limitar,cerca de 20 0C a 39 °C, de maior preferência, entre 25 0C a 37 0C1 e cerca de30 °C. O pH do meio pode ser qualquer pH que esteja entre 5 a 9, dependendoprincipalmente do organismo hospedeiro. Para a E. coli, o pH épreferencialmente cerca de 6,8 a 7,4, de preferencialmente é 7,0.
Se um promotor induzível é utilizado no vetor de expressão dainvenção, a expressão da proteína é induzida em condições adequadas para aativação do promotor. Em um aspecto da invenção, promotores PhoA sãousados para controlar a transcrição de polipeptídeos. Assim, as célulashospedeiras transformadas são cultivadas em um meio Iimitante de fosfatopara a indução. Em um exemplo de realização, o meio Iimitante de fosfato é omeio C.R.A.P. (vide, por exemplo, Simmons et al., J. Immunol. Methods.(2002), 263:133-147). Uma variedade de outros indutores pode ser utilizada, deacordo com a construção do vetor utilizado, como é conhecido no estado datécnica.
Em um exemplo de realização, os polipeptídeos expressos dapresente invenção são secretados e recuperados do periplasma das célulashospedeiras. A recuperação de proteína envolve tipicamente o rompimento domicroorganismo, geralmente por meios tais como choque osmótico, sonicaçãoou lise. Após o rompimento das células, fragmentos celulares ou célulasinteiras podem ser removidas por meio de centrifugação ou filtragem. As! proteínas podem ser adicionalmente purificadas, por exemplo, porcromatografia de resina de afinidade. Alternativamente, as proteínas podem sertransportadas no meio de cultivo, e nele isoladas. As células podem serremovidas do cultivo e o sobrenadante de cultivo filtrado e concentrado parapurificação adicional das proteínas produzidas. Os polipeptídeos expressospodem ser adicionalmente isolados e identificados utilizando métodoscomumente conhecidos, tais como eletroforese de gel de poliacrilamida(PAGE) e teste Western Blot.
Em um aspecto da invenção, o anticorpo pode ser produzido emgrande quantidade por meio de processos de fermentação. Váriosprocedimentos de fermentação de alimentação de lotes em larga escala sãodisponíveis para a produção de proteínas recombinantes. As fermentações emlarga escala possuem capacidade de pelo menos 1000 litros, preferencialmentede cerca de 1000 a 100.000 litros de capacidade. Estes fermentadores utilizamimpulsionadores agitadores para distribuir oxigênio e nutrientes, especialmenteglicose (uma fonte de carbono e energia comum). A fermentação em pequenaescala refere-se geralmente a fermentação em fermentador que possui umacapacidade volumétrica de não mais que cerca de 100 litros, e pode variar decerca de um 1 litro a 100 litros.
No processo de fermentação, a indução da expressão de proteínaé tipicamente iniciada após o crescimento das células sob condiçõesapropriadas até densidade desejada, tal como OD550 de cerca de 180 a 220, noqual as células estão no início da fase estacionária. Uma série de indutorespode ser utilizada, de acordo com a construção de vetor empregado, como éconhecido no estado da arte e descrito acima. As células podem ser cultivadaspor períodos mais curtos antes da indução. As células são normalmenteinduzidas por cerca de 12 a 50 horas, embora um tempo maior ou menor deindução possa ser utilizado,
Para aumentar o rendimento de produção e a qualidade dopolipeptídeo da presente invenção, várias condições de fermentação podemser modificadas. Para melhorar a união e dobra apropriadas do anticorposecretado, por exemplo, vetores adicionais que superexpressam proteínaschaperonas, tais como proteínas Dsb (DsbA, DsbBl DsbC, DsbD e/ou DsbG)ou FkpA (peptidilprolil eis, trans-isomerase com atividade de chaperona),podem ser utilizados para co-transformar as células procarióticas hospedeiras.Demonstrou-se que as proteínas de chaperona facilitam a formação de dobrase solubilidade adequadas de proteínas heterólogas produzidas em célulashospedeiras bacterianas. Chen et al, J. Bio. Chem., 274: 19601-19605 (1999);Patentes US 6.083.715 e 6.027.888; Bothmann e Pluckthun, J. Biol. Chem.,275: 17100-17105 (2000); Ramm e Pluckthun, J. Biol. Chem., 275: 17106-17113 (2000); Arie et al, Moi Microbiol., 39: 199-210 (2001).
Para minimizar a proteólise de proteínas heterólogas expressas(especialmente as que são proteoliticamente sensíveis), certas linhagenshospedeiras com deficiência para enzimas proteolíticas podem ser utilizadaspara a presente invenção. Por exemplo, linhagens de células hospedeiraspodem ser modificadas para efetuar mutação(ões) genética(s) nos genes quecodificam proteases bacterianas conhecidas, tais como Protease III, OmpT,DegP1 Tsp, Protease I, Protease Mi, Protease V, Protease Vl e suascombinações. Algumas linhagens de E. Coli com deficiência de protease sãodisponíveis e descritas, por exemplo, em Joly et al, (1998) supra; Georgiou etal. Patente US 5.264.365, Georgiou et al. Patente US 5.508.192; Hara et al,Microbial Drug Resistance, 2:63-72 (1996).
Em um exemplo de realização, as linhagens de E. coli deficientesde enzimas proteolíticas e transformadas com um ou mais plasmídeos queI superexpressam proteínas chaperonas, são utilizadas como célulashospedeiras no sistema de expressão da invenção.
Purificação de Anticorpo
Em uma realização, a proteína de anticorpo produzida nopresente é adicionalmente purificada para obter preparações que sãosubstancialmente homogêneas para ensaios e usos adicionais. Podem serempregados métodos padrões de purificação de proteínas conhecidos noestado de técnica. Os procedimentos a seguir são exemplos de procedimentosde purificação apropriados: através de fracionamento em uma coluna de trocaiônica ou imunoafinidade; precipitação em etanol, HPLC de fase reversa;cromatografia em sílica ou em uma resina de troca catiônica, tal como DEAE;cromatofocusação; SDS-PAGE; precipitação em sulfato de amônio; gel filtraçãoutilizando, por exemplo, Sephadex G-75.
Em um aspecto, a proteína A imobilizada em uma fase sólida éutilizada para a purificação por imunoafinidade dos produtos do anticorpo dainvenção. A proteína A é um proteína da parede celular de 41 kD doStaphylococcus aureas que se liga com alta afinidade a região Fc dosanticorpos. Lindmark1 et ai (1983) J. Immunol. Meth. 62:1-13. A fase sólidapara o qual a proteína A é imobilizada pode ser uma coluna que compreendeuma superfície de vidro ou de sílica, ou uma coluna de vidro porosa controladaou coluna de ácido silícico. Em algumas aplicações, a coluna é revestida comum reagente, tal como o glicerol, possivelmente para evitar a aderênciainespecífica de contaminantes.
Tal como a primeira etapa de purificação, a preparação derivadada cultura celular, como descrito acima, pode ser aplicada a uma fase sólida deproteína A imobilizada para permitir a ligação do anticorpo específico deinteresse, para proteína A. A fase sólida passaria então a ser lavada pararemover os contaminantes não ligados especificamente à fase sólida. Porúltimo, o anticorpo de interesse é recuperado da fase sólida por eluição.
Produção de Anticorpos Utilizando Células Hospedeiras Eucarióticas
Os componentes do vetor geralmente incluem, mas sem se limitara, uma ou mais dos seguintes: uma seqüência sinal, uma origem de repiicação,um ou mais genes marcadores, um componente amplificador, um promotor, euma seqüência de terminação da transcrição.
(I) Componente de Seqüência Sinal
Um vetor para uso em uma célula hospedeira eucarióticastambém pode conter uma seqüência sinal ou outro polipeptídeo que possuí umsítio de clivagem específico no N-terminal da proteína madura ou polipeptídeode interesse. A seqüência sinal heteróloga selecionada geralmente é aquelaque é reconhecida e processada (ou seja, clivada por uma peptidase sinal) pelacélula hospedeira. Em expressão em células de mamíferos, estão disponíveisas seqüências sinais de mamíferos, bem como líderes de secreção viral, taiscomo o sinal gD da herpes simplex.
O DNA para essa região precursora é ligado na estrutura deleitura ao DNA codificador do anticorpo.
(II) Origem de ReplicacãoGeralmente, a origem do componente de repiicação não énecessária para vetores de expressão em mamíferos. Por exemplo, a origemSV40 pode ser tipicamente utilizada somente porque contém o promotor inicial.
(III) Componente Genético de Seleção
Os vetores de clonagem e de expressão podem conter um genede seleção, também denominado marcador de seleção. Os genes de seleçãotípicos codificam proteínas que (a) conferem resistência a antibióticos ou outrastoxinas, tais como ampicilina, neomicina, metotrexato ou tetraciclina; (b)complementam deficiências autotróficas, quando relevante; ou (c) fornecemnutrientes fundamentais não-disponíveis no meio.Um exemplo de esquema de seleção utiliza uma droga parainterromper o crescimento de uma célula hospedeira. As células que sãotransformadas com sucesso com um gene heterólogo que produz uma proteínaque confere resistência a drogas e, desta forma, sobrevivem ao regime deseleção. Exemplos de tal seleção dominante utilizam as drogas neomicina,ácido micofenólico e higromicina.
Outro exemplo de marcadores de seleção apropriados paracélulas de mamíferos são os que permitem a identificação de célulascompetentes para a absorção do ácido nucléico de anticorpo, tal como DHFR1timidina quinase, metalotioneína-l e Il (preferencialmente genes metalotioneínade primatas), adenosina deaminase, ornitina decarboxilase, e etc.
Células transformadas com o gene de seleção DHFR1 porexemplo, podem ser identificadas, em primeiro lugar, através do cultivo detodos os transformantes em um meio de cultura que contenha metotrexato(Mtx), concorrente antagonista de DHFR. É utilizada uma célula hospedeiraapropriada que possuí DHFR do tipo selvagem, que é a linhagem celular deovário de hamster chinês (CHO) com deficiência na atividade de DHFR (porexemplo, ATCC CRL-9096).
Alternativamente, as células hospedeiras (particularmente,células hospedeiras do tipo selvagem que contêm DHFR endógeno)transformadas ou co-transformadas com seqüências de DNA que codificamum anticorpo, a proteína DHFR do tipo selvagem e outro marcadorselecionável tal como aminoglicosídeo 3'-fosfotransferase (APH) podem serselecionadas através de crescimento celular em um meio que contém umagente de seleção para o marcador selecionável, tal como um antibióticoaminoglicosídico, por exemplo, canamicina, neomicina ou G418. Vide aPatente US 4.965.199.
(IV) Componente PromotorOs vetores de clonagem e de expressão normalmente contêm umpromotor que é reconhecido pelo organismo hospedeiro, e é operacionalmenteligado ao ácido nucléico que codifica um polipeptídeo de interesse (porexemplo, um anticorpo). As seqüências promotoras de eucariotos sãoconhecidas. São conhecidas seqüências promotoras para eucariontes.
Virtualmente todos os genes eucariontes possuem uma região rica em ATlocalizada a cerca de 25 a 30 bases a montante do sítio em que se inicia atranscrição. Outra seqüência encontrada a 70 até 80 bases a montante doinício da transcrição de muitos genes é uma região CNCAAT, em que N podeser qualquer nucleotídeo. Na extremidade 3' da maioria dos genes eucariontes,encontra-se uma seqüência AATAAA que pode ser o sinal para adição dacauda poli A na extremidade 3' da seqüência codificadora. Todas essasseqüências são inseridas de forma apropriada em vetores de expressãoeucarióticos.
A transcrição de polipeptídeos do anticorpo a partir de vetores emcélulas hospedeiras de mamíferos pode ser controlada, por exemplo, porpromotores obtidos a partir do genoma viral, tal como vírus de polioma, vírus dacatapora, adenovírus (tal como Adenovírus 2), vírus de papiloma bovino, vírusde sarcoma aviário, citomegalovírus, retrovírus, vírus da hepatite B e, de maiorpreferência, Vírus Símio 40 (SV40), a partir de promotores de mamíferosheterólogos, tais como o promotor de actina ou um promotor deimunoglobulina, de promotores de choque térmico, desde que essespromotores sejam compatíveis com os sistemas de células hospedeiras.
O promotor inicial e final do vírus SV40 são obtidosconvenientemente na forma de fragmento de restrição SV40 que tambémcontém a origem viral SV40 de replicação. O promotor inicial imediato docitomegalovírus humano é obtido convenientemente na forma de fragmento derestrição Hindlll E. Um sistema de expressão de DNA em hospedeirosmamíferos utilizando o vírus de papiloma bovino como vetor é descrito naPatente US 4.119.446. Uma modificação deste sistema é descrita na PatenteUS 4.601.978. Vide também Reyes et al., Nature 297:598-601 (1982) em:expression of human β-interferon cDNA in mouse cells under the control of athymidine kinase promoter from herpes simplex virus. Alternativamente, arepetição terminal longa de vírus do sarcoma de Rous pode ser utilizada comopromotor.
(V) Componente de Elemento Amplificador
A transcrição de um DNA codificador do polipeptídeo do anticorpode acordo com a presente invenção por eucariontes superiores éfreqüentemente aumentada através da inserção de uma seqüênciaamplificadora no vetor. Muitas seqüências amplificadoras são agoraconhecidas de genes de mamíferos (globina, elastase, albumina, a-fetoproteínae insulina). Tipicamente, entretanto, será utilizado um amplificador de um vírusde célula eucariótica. Exemplos incluem o amplificador SV40 sobre o ladoposterior da origem de replicação (bp 100-270), o amplificador promotor inicialde citomegalovírus, o amplificador de polioma sobre o lado terminal da origemde replicação e amplificadores de adenovírus. Vide também Yaniv, Nature 297:17-18 (1982) sobre elementos de promoção para a ativação de promotoreseucarióticos. O amplificador pode também sofrer splicing no vetor na posição 5'ou 3' para a seqüência codificadora de polipeptídeo de anticorpo, masencontra-se localizado, preferencialmente, em um sítio 5' do promotor.
(VI) Componente de Término de Transcrição
Os vetores de expressão utilizados em células hospedeiraseucariontes também irão conter seqüências necessárias para a terminação datranscrição e estabilização do mRNA. Ditas seqüências são normalmentedisponíveis a partir das regiões 5' não-traduzidas, ocasionalmente 3', dosDNAs ou cDNAs virais ou eucariontes. Estas regiões contêm segmentos denucleotídeos transcritos na forma de fragmentos poliadenilados na porçãonão-traduzida do mRNA codificador do anticorpo. Um componente determinação de transcrição útil é a região de poliadenilação do hormônio decrescimento bovino. Vide o documento WO 94/11026 e o vetor de expressãonele descrito.
(VII) Seleção ε Transformação de Células Hospedeiras
As células hospedeiras apropriadas para clonagem ou expressãodo DNA nos vetores do presente incluem as células eucarióticas superioresdescritas neste documento, incluindo células hospedeiras de vertebrados. Apropagação de células de vertebrados em cultura (cultura de tecido) tornou-seum procedimento rotineiro. Exemplos de linhagens de células hospedeiras demamíferos úteis são: a linhagem CV1 de rim de macaco transformada porSV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); linhagem de rim embriônica humana (293 oucélulas 293 sub-clonadas para crescimento em cultura de suspensão, Grahamet ai, J. Gen. Viroi 36: 59 (1977)); células de rim de filhote de hamster (BHK,ATCC CCL 10); células de ovário de hamster chinês/-DHFR (CHO, Urlaub etai, Proc. Nati Acad. Sei. USA. 77: 4216 (1980)); células de sertoli decamundongo (TM4, Mather1 Biol. Reprod. 23: 243-251 (1980)); células de rimde macaco (CV1 ATCC CCL 70); células de rim de macaco verde africano(VERO-76, ATCC CRL-1587); células de carcinoma cervical humano (HELA,ATCC CCL 2); células de rim canino (MDCK, ATCC CCL 34); células de fígadode rato buffalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442); células de pulmão humano (W138,ATCC CCL 75); células de fígado humano (Hep G2, HB 8065); tumor mamáriode camundongo (MMT 060562, ATCC CCL51); células TRI (Mather et ai,Annals Ν. Y. Acad. Sei. 383:44-68 (1982)); células MRC 5; células FS4;linhagem de hepatoma humano (Hep G2).
As células hospedeiras são transformadas com os vetores declonagem ou expressão descritos acima para a produção de anticorpos ecultivadas em meios nutrientes convencionais modificados conformeapropriado para a indução de promotores, seleção de transformantes ouamplificação dos genes codificadores das seqüências desejadas.
(VIII) Cultivo das Células Hospedeiras
As células hospedeiras utilizadas para a produção do anticorpo deacordo com a presente invenção podem ser cultivadas em uma série de meios.Meios de cultura disponíveis comercialmente como, por exemplo, meio de HamF10 (Sigma), Meio Essencial Mínimo ((MEM), Sigma), RPMI-1640 (Sigma) eMeio Eagle Modificado da Dulbecco ((DMEM), Sigma) que são apropriadospara o cultivo das células hospedeiras. Além disso, qualquer meio descrito emHam et al., Meth. Enz. 58: 44 (1979), Barnes et ai, Anal. Biochem. 102: 255(1980), Patentes US 4.767.704; US 4.657.866; US 4.927.762; US 4.560.655;ou US 5.122.469; documentos WO 90/03430 e WO 87/00195 ou o pedido dePatente US US 30.985 podem ser utilizados como meios de cultura para ascélulas hospedeiras. Qualquer um destes meios pode ser suplementadoconforme necessário com hormônios e/ou outros fatores do crescimento (taiscomo insulina, transferrina ou fator de crescimento epidérmico), sais (como,cloreto de sódio, cálcio, magnésio e fosfato), tampões (tais como HEPES),nucleotídeos (tais como adenosina e timidina), antibióticos (tais como drogaGENTAMYCIN™), traços de elementos (definidos como compostos inorgânicosnormalmente presentes em concentrações finais na faixa micromolares) eglicose ou uma fonte de energia equivalente. Qualquer outro suplementonecessário pode também ser incluído em concentrações apropriadasconhecidas dos técnicos no assunto. As condições de cultura como, atemperatura, pH e similares, são as utilizadas anteriormente com a célulahospedeira selecionada para expressão e serão evidentes para os técnicos noassunto.
(IX) Purificação do AnticorpoA partir do uso de técnicas recombinantes, o anticorpo pode serproduzido de forma intracelular ou secretado diretamente no meio. Caso oanticorpo seja produzido de forma intracelular, como uma primeira etapa, osfragmentos particulados, sejam eles células hospedeiras ou fragmentoslisados, são removidos, por exemplo, através de centrifugação ouultrafiltragem. Quando o anticorpo for secretado para o meio, sobrenadantesdesses sistemas de expressão são geralmente concentrados em primeiro lugarutilizando um filtro de concentração de proteínas disponível comercialmente,por exemplo, uma unidade de ultrafiltragem Amicon ou Millipore Pellicon. Uminibidor de protease, tal como PMSF, pode ser incluído em qualquer das etapasacima para inibir a proteólise e antibióticos podem ser incluídos para evitar ocrescimento de contaminantes imprevistos.
A composição de anticorpo preparada a partir das células podeser purificada através do uso, por exemplo, de cromatografia de hidroxilapatita,eletroforese em gel, diálise e cromatografia de afinidade, sendo a cromatografiapor afinidade a técnica de purificação preferida. A adequação da proteína Acomo Iigante de afinidade depende da espécie e do isotipo de qualquerdomínio Fc de imunoglobulina que esteja presente no anticorpo. A Proteína Apode ser utilizada para purificar anticorpos que se baseiem em cadeiaspesadas γ1, γ2 ou γ4 humanas (Lindmark et ai, J. Immunol. Meth. 62: 1-13(1983)). Recomenda-se Proteína G para todos os isotipos de camundongos epara γ3 humano (Guss et ai, EMBO J. 5: 1567-1575 (1986)). A matriz ao qual oIigante de afinidade é anexado é freqüentemente a agarose, mas outrasmatrizes são disponíveis. Matrizes mecanicamente estáveis, tais como vidro deporos controlados ou poli-(estirenodivinil)-benzeno, permitem velocidades defluxo maiores e tempos de processamento mais curtos do que os que podemser atingidos com agarose. Quando o anticorpo constar de um domínio Ch3, aresina Bakerbond ABX® (J. T. Baker, Phillipsburg NJ, Estados Unidos) é útilpara a purificação. Outras técnicas de purificação de proteínas, tais comofracionamento sobre uma coluna de troca iônica, precipitação em etanol, HPLCde Fase Reversa, cromatografia em sílica, cromatografia em heparinaSEPHAROSE™, cromatografia em uma resina de troca aniônica ou catiônica(tal como uma coluna de ácido poliaspártico), cromatofocagem, SDS-PAGE eprecipitação de sulfato de amônio também são disponíveis, dependendo doanticorpo a ser recuperado.
Após qualquer (quaisquer) etapa(s) de purificação preliminar, amistura que compreende o anticorpo de interesse e contaminantes pode sersubmetida a cromatografia de interação hidrofóbica de baixo pH utilizando umaeluição tamponada em um pH de cerca de 2,5 a 4,5, preferencialmenterealizada sob baixas concentrações de sal (tal como, de cerca de 0 a 0,25 M desal).
Deve ser notado que, em geral, técnicas e metodologias para apreparação de anticorpos para uso na presente invenção, ensaio e utilizaçãoclínica estão bem estabelecidas no estado da técnica, coerente com o que foiexposto acima e/ou considerado adequado, para os técnicos no assunto para oanticorpo específico de interesse.
Ensaios de Atividade
Os anticorpos da invenção podem ser caracterizados por suaspropriedades físicas/químicas e funções biológicas através de diversos ensaiosconhecidos no estado da técnica.
Os anticorpos purificados podem ser adicionalmentecaracterizados por uma série de ensaios incluindo, mas sem limitar-se a,seqüenciamento N-terminal, análise de aminoácido, cromatografia líquida dealta pressão (HPLC) com exclusão de tamanho não-desnaturante,espectometria em massa, cromatografia de troca iônica, e digestão pelapapaína.Quando necessário, os anticorpos são analisados por suaatividade biológica. Em algumas realizações, os anticorpos da invenção sãotestados pela sua atividade de ligação ao antígeno. Os ensaios de ligação aoantígeno que são conhecidos no estado da técnica e podem ser utilizados nopresente incluem, sem se limitar a, ensaio de ligação competitivo ou diretautilizando técnicas como western blot, radioimunoensaios, ELISA (ensaioimunoabsorvente ligado por enzima), imunoensaios do tipo "sanduíche",ensaios de imunoprecipitação, imunoensaios fluorescentes, e imunoensaios deproteína A.
Em um exemplo de realização, a invenção contempla umanticorpo modificado que possuí alguma, mas não todas as funções efetoras,que torna este anticorpo um candidato desejável para muitas aplicações noqual a meia vida do anticorpo in vivo é importante ainda que certas funçõesefetoras (como complemento e ADCC) são desnecessárias ou prejudiciais. Emcertos exemplos de realização, as atividades Fc do anticorpo são medidas paraassegurar que só as propriedades desejadas sejam mantidas. Um ensaio decitotoxicidade in vitro ou in vivo pode ser conduzido para confirmar a redução /depleção dos CDC e/ou atividades ADCC. Por exemplo, ensaios de ligaçãocom o receptor Fc (FcR) podem ser realizados a fim de garantir que o anticorponão tenha ligação ao FcyR (e portanto carece da atividade ADCC), masmantém a capacidade de ligação ao FcRn. As células primárias para amediação de ADCC, células NK1 expressam unicamente FcyRIIIj enquantomonócitos expressam FcyRI, FcyRII e FcyRIII. A expressão de FcR sobrecélulas hematopoiéticas é resumida na Tabela 3, pág. 464, de Ravetch e Kinet,Annu. Rev. Immunol. 9: 457-92 (1991). Um exemplo de ensaio para sedeterminar a atividade de ADCC de uma molécula de interesse, está descritona Patente US 5.500.362 ou US 5.821.337. Células efetoras úteis para essestestes incluem células mononucleares sangüíneas periféricas (PBMC) e célulasNatural Killers (ΝΚ). Alternativa ou adicionalmente, a atividade de ADCC damolécula de interesse pode ser determinada in vivo, tal como em um modeloanimal como o descrito em Clynes et al., PNAS (USA) 95: 652-656 (1998).Ensaios de ligação de C1q também podem ser realizados para confirmar que oanticorpo é incapaz de se ligar a C1q e, portanto, carece de atividade CDC.Para determinar a ativação do complemento, pode ser realizado um ensaioCDC1 conforme descrito, por exemplo, em Gazzano-Santoro et ai, J. Immunol.Methods, 202: 163 (1996). A determinação da ligação de FcRn e a depuração/meia vida in vivo também pode ser realizada utilizando métodos conhecidos noestado da técnica.
Fragmentos de Anticorpos
A presente invenção abrange fragmentos anticorpos. Emdeterminadas circunstâncias há uma vantagem maior de se usar fragmentos deanticorpos ao invés de anticorpos. O menor tamanho dos fragmentos permiterápida difusão, e pode conduzir melhor acesso aos tumores sólidos.
Foram desenvolvidas diversas técnicas para a produção defragmentos de anticorpos. Tradicionalmente, estes fragmentos foram derivadospor meio de digestão proteolítica de anticorpos intactos (vide por exemplo,Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24: 107-117(1992); e Brennan et ai, Science 229: 81 (1985)). Entretanto, esses fragmentospodem ser agora produzidos diretamente por células hospedeirasrecombinantes. Os fragmentos Fab1 Fv e ScFv podem ser expressosdiretamente de E. coli e assim permitindo a produção de grandes quantidadesdestes fragmentos. Os fragmentos de anticorpos podem ser isolados, porexemplo, a partir das bibliotecas de fagos de anticorpos discutidas acima.Alternativamente, fragmentos Fab'-SH podem ser recuperados diretamente deE. coli e acoplados quimicamente para formar fragmentos F(ab')2 (Carter et ai,Bio/Technology 10:163-167 (1992)). De acordo com outra abordagem,fragmentos F(ab')2 podem ser isolados diretamente a partir da cultura decélulas hospedeiras recombinantes. Fragmentos Fab e F(ab')2 com maior meia-vida in vivo que compreendem resíduos de epítopos de ligação de receptoresrecuperados são descritos na patente US 5.869.046. Outras técnicas para aprodução de fragmentos de anticorpos serão evidentes para os técnicos noassunto. Em outras realizações, o anticorpo selecionado é um fragmento Fv decadeia única (scFv). Vide documento WO 93/16185; as patentes US 5.571.894;e US 5.587.458. Fv e sFv são as únicas espécies com sítios de combinaçãointactos que são desprovidas de regiões constantes; por isso, elas sãoapropriadas para reduzir ligações não-especificas durante a utilização in vivo.
Proteínas de fusão sFv podem ser construídas para gerar a fusão de umaproteína efetora no amino ou carbóxi terminal de um sFv. Vide AntibodyEngineering, ed. Borrebaeck, supra. O fragmento de anticorpo pode tambémser um "anticorpo linear", conforme descrito, por exemplo, na patente US5.641.870. Ditos fragmentos de anticorpos lineares podem ser monoespecíficosou biespecíficos.
Anticorpos Humanizados
A invenção abrange anticorpos humanizados. Vários métodos dehumanização de anticorpos não-humanos são conhecidos no estado datécnica. Preferencialmente, um anticorpo humanizado contém um ou maisresíduos de aminoácidos nele introduzidos a partir de uma fonte que não éhumana. Esses resíduos de aminoácidos não-humanos são muitas vezesdenominados resíduos "importados", que são tipicamente retirados de umdomínio variável "importado". A humanização pode ser essencialmenterealizada seguindo-se o método de Winter e colaboradores (Jones et ai.,Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et ai, Nature, 332:323-327 (1988);Verhoeyen et ai., Science, 239:1534-1536 (1988)), por meio de substituição deseqüências de regiões hipervariáveis pelas seqüências correspondentes deanticorpo humano. Conseqüentemente, esses anticorpos "humanizados" sãoanticorpos quiméricos (Patente US 4.816.567), em que substancialmentemenos de um domínio variável humano intacto tenha sido substituído pelaseqüência correspondente de uma espécie não-humana. Na prática, osanticorpos humanizados são tipicamente anticorpos humanos, em que algunsresíduos de regiões hipervariáveis e possivelmente alguns resíduos de FR sãosubstituídos por resíduos de sítios análogos em anticorpos de roedores.
A seleção de domínios variáveis humanos, tanto leves quantopesados, a serem utilizados na fabricação dos anticorpos humanizados é muitoimportante para reduzir a antigenicidade. De acordo com o chamado métodode "melhor adequação" (best-fit), a seqüência do domínio variável de umanticorpo de roedor é selecionada em comparação com toda a biblioteca deseqüências de domínio variável humanas conhecida. A seqüência humana queé mais próxima da seqüência do roedor é então aceita como a região deestrutura humana (FR) para o anticorpo humanizado (Sims et ai, (1993) J.Immunol., 151: 2296; Chothia et ai, (1987) J. Moi Biol., 196: 901). Outrométodo utiliza uma região estrutural específica derivada da seqüência deconsenso de todos os anticorpos humanos de um subgrupo específico decadeias leves ou pesadas. A mesma estrutura pode ser utilizada para váriosanticorpos humanizados diferentes (Carter et ai, (1992) Proc. Natl. Acad. Sei.USA, 89: 4285; Presta et ai, (1993) J. Immunoi, 151: 2623).
É adicionalmente importante que os anticorpos sejamhumanizados com retenção de alta afinidade para o antígeno e outraspropriedades biológicas favoráveis. Para atingir este objetivo, de acordo comum método preferido, os anticorpos humanizados são preparados por meio deum processo de análise das seqüências parentais e diversos produtoshumanizados conceituais, utilizando modelos tridimensionais das seqüênciasparental e humanizada. Modelos de imunoglobulina tridimensionais sãocomumente disponíveis e familiares para os técnicos no assunto. Sãodisponíveis programas de computador que ilustram e exibem prováveisestruturas de conformação tridimensional de seqüências de imunoglobulinacandidata selecionadas. A inspeção dessas exibições permite a análise dopapel provável dos resíduos no funcionamento da seqüência de imunoglobulinacandidata, ou seja, a análise dos resíduos que influenciam a capacidade daimunoglobulina candidata de ligar o seu antígeno. Desta forma, os resíduos deFR podem ser selecionados e combinados a partir das seqüências receptora eimportada, de forma que seja atingida a característica desejada do anticorpo,tal como maior afinidade para o(s) antígeno(s) desejado(s). Geralmente, osresíduos da região hipervariável são diretamente e mais substancialmenteenvolvidos na influência da ligação de antígenos.
Anticorpos Humanos
Anticorpos anti-RELT da invenção podem ser construídos pelacombinação da seqüência do domínio variável do clone Fv selecionado a partirde uma biblioteca de exposição por fagos com as seqüências conhecidas dodomínio constante humano, como descrito acima. Alternativamente, osanticorpos monoclonais humanos podem ser preparados através do método dehibridoma. Linhagens celulares de mieloma humano e heteromielomahumano/de camundongos para a produção de anticorpos monoclonaishumanos foram descritas, por exemplo, por Kozbor1 J. Immunol. 133, 3001(1984), e Brodeur et ai, Monoclonal Antibody Production Techniques andApplications, págs. 51-63 (Mareei Dekker, Inc., Nova Iorque, Estados Unidos,1987) e Boerner et ai, J. Immunol., 147: 86 (1991).
É agora possível produzir animais transgênicos (por exemplo,camundongos) que são capazes, mediante imunização, de produzir umrepertório de anticorpos humanos na ausência de produção de imunoglobulinaendógena. Descreveu-se, por exemplo, que a deleção homozigótica do geneda região de ligação de cadeia pesada de anticorpos (Jh) em camundongosquiméricos e mutantes de linhagem germinativa resulta na inibição completa daprodução de anticorpos endógenos. A transferência do conjunto de genes deimunoglobulina da linhagem germinativa humana nesses camundongos commutação da linhagem germinativa resultará na produção de anticorposhumanos mediante desafio de antígenos. Vide, por exemplo, Jakobovits et ai,Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 90, 2551-255 (1993); Jakobovits et ai, Nature, 362:255-258 (1993), Bruggermann et ai, Yearin Immunoi, 7: 33 (1993).
É agora possível produzir animais transgênicos (por exemplo,camundongos) que são capazes, mediante imunização, de produzir umrepertório de anticorpos humanos na ausência de produção de imunoglobulinaendógena. Descreveu-se, por exemplo, que a deleção homozigótica do geneda região de ligação de cadeia pesada de anticorpos (Jh) em camundongosquiméricos e mutantes de linhagem germinativa resulta na inibição completa daprodução de anticorpos endógenos. A transferência do conjunto de genes deimunoglobulina da linhagem germinativa humana nesses camundongos commutação da linhagem germinativa resultará na produção de anticorposhumanos mediante desafio de antígenos. Vide, por exemplo, Jakobovits et al.,Proc. Nati Acad. Sei. USA. 90, 2551-255 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362:255-258 (1993), Bruggermann et ai, Year in Immunoi, 7: 33 (1993). Aalteração de genes pode também ser utilizada para derivar anticorpos humanosde anticorpos de roedores, em que o anticorpo humano possui afinidades eespecificidades similares ao anticorpo de roedor inicial. De acordo com estemétodo, que também é denominado "impressão de epítopos", os dominósvariáveis da cadeia leve e pesada de fragmentos de anticorpos não humanosobtidos através da técnica de exibição de fagos como descrito acima ésubstituído com um repertório de genes de domínio V humanos, criando scFvou Fab quimérico cadeia não-humana/cadeia humana. A seleção com antígenoresulta no isolamento do scFv ou Fab quimérico cadeia não-humana/cadeiahumana capaz de restaurar um sítio de ligação do antígeno destruído após aremoção da cadeia não-humana correspondente na exibição do clone noprimeiro fago, ou seja, o epítopo governa (imprime) a escolha da cadeiahumana parceira. Quando o processo for repetido, a fim de substituir a cadeianão-humana remanescente, um anticorpo humano é obtido (vide documentoWO 93/06213, publicado em 1 de abril de 1993). Ao contrário da humanizaçãotradicional de anticorpos não humanos através de enxerto de CDR, estatécnica fornece anticorpos completamente humanos, que não possuemresíduos de CDR ou FR de origem não humana.
Anticorpos Biespecíficos
Os anticorpos biespecíficos são anticorpos monoclonais, quepossuem especificidades de ligação para pelo menos dois antígenosdiferentes. Em exemplos de realização os anticorpos biespecíficos sãoanticorpos humanos ou humanizados. Em certos exemplos de realização, umadas especificidades de ligação é para RELT e a outra é para qualquer outroantígeno. Anticorpos biespecíficos podem ser preparados como anticorpos decomprimento total ou fragmentos de anticorpo (por exemplo, anticorpo F(ab')2biespecífico).
Os métodos de fabricação de anticorpos biespecíficos sãoconhecidos na técnica. Tradicionalmente, a produção recombinante deanticorpos biespecíficos é baseada na co-expressão de dois pares de cadeialeve e cadeia pesada de imunoglobulina, em que as duas cadeias pesadaspossuem especificidades diferentes (Milstein e Cuello, Nature, 305: 537-539(1983)). Devido à seleção aleatória de cadeias leve e pesada deimunoglobulina, esses hibridomas (quadromas) produzem uma misturapotencial de 10 moléculas de anticorpos diferentes, das quais apenas umapossui a estrutura biespecífica correta. A purificação da molécula correta, quenormalmente é realizada através de etapas de cromatografia de afinidade, éum tanto problemática e os rendimentos de produto são baixos. Procedimentossimilares são descritos no documento WO 93/08829 publicado em 13 de maiode 1993 e em Traunecker et ai, EMBO J. 10, 3655-2659 (1991).
De acordo com uma abordagem diferente, domínios variáveis deanticorpos com as especificidades de ligação desejadas (sítios de combinaçãode antígeno e anticorpo) são fundidos a seqüências de domínios constantes deimunoglobulina. A fusão ocorre preferencialmente com um domínio constantede cadeia pesada de imunoglobulina, que compreende pelo menos parte dasregiões de articulação, CH2 e CH3. Prefere-se ter a primeira região constante decadeia pesada (CH1) contendo o sítio necessário para ligação de cadeia levepresente em pelo menos uma das fusões. Os DNAs que codificam as fusõesde cadeia pesada de imunoglobulina e, se desejado, a cadeia leve deimunoglobulina, são inseridos em vetores de expressão separados e são co-transfectados em um organismo hospedeiro apropriado. Isso proporcionagrande flexibilidade no ajuste das proporções mútuas dos 3 fragmentos depolipeptídeos em realizações quando razões desiguais das três cadeias depolipeptídeos utilizadas na construção fornecem os rendimentos ideais. Épossível, entretanto, inserir as seqüências de codificação para 2 ou todas as 3cadeias de polipeptídeos em um vetor de expressão quando a expressão depelo menos duas cadeias de polipeptídeos em razões iguais resultar em altosrendimentos ou quando os valores não foram de significância específica.
Em uma realização preferida da presente abordagem, osanticorpos biespecíficos são compostos de uma cadeia pesada deimunoglobulina híbrida com uma primeira especificidade de ligação em umbraço, e um par de cadeias leve e pesada de imunoglobulina híbrida (quefornece uma segunda especificidade de ligação) no outro braço. Descobriu-seque essa estrutura assimétrica facilita a separação do composto biespecíficodesejado de combinações de cadeia de imunoglobulina indesejadas, pois apresença de uma cadeia leve de imunoglobulina em apenas metade damolécula biespecífica fornece forma fácil de separação. Esta abordagem édescrita no documento WO 94/04690. Para mais detalhes de produção deanticorpos biespecíficos vide, por exemplo, Suresh et al., Methods inEnzymology, 121:210 (1986).
De acordo com outra abordagem, a interface entre um par demoléculas de anticorpos pode ser construída de forma a maximizar opercentual de heterodímeros que é recuperado da cultura celular recombinante.A interface preferida compreende pelo menos uma parte do domínio CH3 de umdomínio constante de anticorpo. Neste método, uma ou mais cadeias lateraisde aminoácidos pequenos da superfície intermediária da primeira molécula deanticorpo são substituídas com cadeias laterais maiores (tais como tirosina outriptofano). "Cavidades" compensatórias de tamanho idêntico ou similar à(s)cadeia(s) lateral(is) grande(s) são criadas sobre a interface da segundamolécula de anticorpo, por meio da substituição de grandes cadeias laterais deaminoácidos com cadeias menores (tais como alanina ou treonina). Issoproporciona um mecanismo de aumento do rendimento do heterodímero sobreoutros produtos finais indesejados, tais como homodímeros.
Os anticorpos biespecíficos incluem anticorpos reticulados ou"heteroconjugados". Um dos anticorpos no heteroconjugado pode ser acoplado,por exemplo, a avidina e o outro a biotina. Esses anticorpos foram propostos,por exemplo, para dirigir células do sistema imune a células indesejadas(Patente US 4.676.980) e para o tratamento de infecções por HIV (documentosWO 91/00360, WO 92/200373 e Patente EP 03.089). Anticorposheteroconjugados podem ser fabricados utilizando qualquer método reticulanteconveniente. Agentes reticulantes apropriados são bem conhecidos na técnicae são descritos na Patente US 4.676.980 juntamente com uma série detécnicas reticulantes.
Técnicas para produção de anticorpos biespecíficos a partir defragmentos de anticorpos também foram descritas na literatura. Anticorposbiespecíficos podem ser preparados, por exemplo, utilizando ligaçõesquímicas. Brennan et ai, Science, 229: 81 (1985) descrevem um procedimentoem que anticorpos intactos são proteoliticamente clivados para gerarfragmentos F(ab')2. Estes fragmentos são reduzidos na presença do agentearsenito de sódio formador de complexo de ditiol para estabilizar ditióis vizinhose evitar a formação de dissulfeto intermolecular. Os fragmentos Fab' geradossão então convertidos em derivados de tionitrobenzoato (TNB). Um dosderivados de Fab'-TNB é então novamente convertido em Fab'-tiol por meio deredução com mercaptoetilamina e é misturado com uma quantidade eqüimolardo outro derivado de Fab1-TNB para formar o anticorpo biespecífico. Osanticorpos biespecíficos produzidos podem ser utilizados como agentes para aimobilização seletiva de enzimas.
Progressos recentes possibilitaram a recuperação direta dosfragmentos Fab'-SH de E. coli, que podem ser acoplados quimicamente paraformar anticorpos biespecíficos. Shalaby et aí., J. Exp. Med., 175: 217-225(1992) descrevem a produção de uma molécula F(ab')2 de anticorpobiespecífico totalmente humanizado. Cada fragmento Fab' foi segregadoseparadamente de E. coli e submetido a acoplamento químico dirigido in vitropara formar o anticorpo biespecífico. O anticorpo biespecífico assim formado foicapaz de ligar-se a células que superexpressam o receptor HER2 e células Thumanas normais, bem como iniciar a atividade lítica de linfócitos citotóxicoshumanos contra alvos de tumor de mama humano.
Diversas técnicas de fabricação e isolamento de fragmentos deanticorpos biespecíficos diretamente a partir de cultura celular recombinantetambém foram descritas. Anticorpos biespecíficos foram produzidos, porexemplo, utilizando zíppers de leucina. Kostelny et ai, J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992). Os peptídeos de zípper de leucina das proteínas Fos e Junforam ligados às porções Fab' de dois anticorpos diferentes por meio de fusãogênica. Os homodímeros de anticorpos foram reduzidos na região dearticulação para formar monômeros e, em seguida, novamente oxidados paraformar os heterodímeros de anticorpos. Este método pode também ser utilizadopara a produção de homodímeros de anticorpos. A tecnologia de "diacorpo"descrita por Hollinger et ai, Proc. Nati Acad. Sei. USA, 90: 6444-6448 (1993)forneceu um mecanismo alternativo para a fabricação de fragmentos deanticorpos biespecíficos. Os fragmentos compreendem um domínio variável decadeia pesada (VH) conectado a um domínio variável de cadeia leve (VL) porum Iigante que é curto demais para permitir o emparelhamento entre os doisdomínios sobre a mesma cadeia. Conseqüentemente, os domínios VH e VL deum fragmento são forçados a emparelhar-se com os domínios VL e VHcomplementares de outro fragmento, de maneira a formar dois sítios de ligaçãode antígenos. Outra estratégia de fabricação de fragmentos de anticorposbiespecíficos utilizando dímeros Fv de cadeia simples (sFv) também foirelatada. Vide Gruber et ai, J. Immunol., 152: 5368 (1994).
São contemplados anticorpos com mais de duas valências.Podem ser preparados, por exemplo, anticorpos triespecíficos. Tutt et ai, J.Immunol. 147: 60 (1991).
Anticorpos Multivalentes
Um anticorpo multivalente pode ser internalizado (e/oucatabolizado) mais rapidamente que um anticorpo bivalente por uma célula queexpresse um antígeno ao qual os anticorpos se ligam. Os anticorpos de acordocom a presente invenção podem ser anticorpos multivalentes (que sãodiferentes dos da classe IgM) com três ou mais sítios de ligação de antígenos(por exemplo, anticorpos tetravalentes), que podem ser facilmente produzidosatravés da expressão recombinante de ácido nucléico que codifica cadeias depolipeptídeo do anticorpo. O anticorpo multivalente pode compreender umdomínio de dimerização e 3 ou mais sítios de ligação de antígeno. O domíniode dimerização preferido compreende (ou consiste de) uma região Fc ou umaregião de articulação. Nessas condições, o anticorpo compreenderá umaregião Fc e três ou mais sítios de ligação de antígenos amino-terminais para aregião Fe. O anticorpo multivalente preferido do presente compreende (ouconsiste de) 3 a cerca de 8, mas preferencialmente, 4 sítios de ligação deantígenos. O anticorpo multivalente compreende pelo menos uma cadeiapolipeptídica (por exemplo, duas cadeias polipeptídicas), em que a(s) cadeia(s)polipeptídica(s) compreende(m) 2 ou mais domínios variáveis. A(s) cadeia(s)polipeptídica(s) pode(m) compreender, por exemplo, VD1-(X1)n-VD2-(X2)n-Fc,em que VD1 é um primeiro domínio variável, VD2 é um segundo domíniovariável, Fc é uma cadeia polipeptídica de uma região Fe, X1 e X2 representamum aminoácido ou polipeptídeo e η é 0 ou 1. A(s) cadeia(s) polipeptídica(s)pode(m) compreender, por exemplo: cadeia VH-CH1-ligação flexível-VH-CH1-região Fc; ou cadeia VH-CH1-VH-CH1-região Fe. O anticorpo multivalente dapresente invenção compreende adicionalmente de pelo menos 2(preferencialmente 4) polipeptídeos de domínio variável de cadeia leve. Oanticorpo multivalente da presente invenção pode compreender, por exemplo,cerca de 2 a cerca de 8 polipeptídeos de domínio variável de cadeia leve. Ospolipeptídeos de domínio variável de cadeia leve, contemplados na presenteinvenção, compreendem um domínio variável de cadeia leve e, opcionalmente,um domínio CL.
Anticorpos Variantes
Em alguns exemplos, é(são) contemplada(s) modificação(ões)na(s) seqüência(s) de aminoácido(s) dos anticorpos aqui descritos. Porexemplo, pode ser desejável melhorar a afinidade de ligação e/ou outraspropriedades biológicas do anticorpo. Variantes da seqüência de aminoácidodo anticorpo são preparados pela introdução de nucleotídeos adequadosmodificando o ácido nucléico do anticorpo, ou pela síntese de peptídeo. Taisalterações incluem, por exemplo, supressão, e/ou inserção e/ou substituição,de resíduos dentro das seqüências de aminoácido do anticorpo. Qualquercombinação de deleção, inserção ou substituição podem ser feitas para sechegar a construção final, desde que o produto final tenha as característicasdesejadas. As alterações nos aminoácidos podem ser introduzidas no anticorpono momento em que seqüência é feita.
Um método útil de identificação de certos resíduos ou regiões doantagonista que são locais preferidos para mutagênese é denominado"mutagênese de varredura de alanina", conforme descrito por Cunningham eWells, Science, 244: 1081-1085 (1989). Aqui, um resíduo ou grupo de resíduosalvo é identificado (por exemplo, resíduos carregados, tais como arg, asp, his,Iys e glu) e substituído por um aminoácido neutro ou negativamente carregado(de maior preferência alanina ou polialanina) para afetar a interação dosaminoácidos com antígeno. Esses locais de aminoácidos que demonstramsensibilidade funcional às substituições são refinados em seguida pelaintrodução de outras variantes ou variantes adicionais nos sítios de substituiçãoou para estes. Desta forma, embora o sítio para introdução de uma variação deseqüência de aminoácidos seja previamente determinado, a naturezaintrínseca da mutação não necessita ser previamente determinada. Paraanalisar o desempenho de uma mutação em um dado sítio, por exemplo,varredura de ala ou mutagênese aleatória é conduzida no códon ou região alvoe as variantes de antagonistas expressas são selecionadas para a atividadedesejada.
As inserções de seqüências de aminoácidos incluem fusões decarbóxi e/ou amino-terminal que variam de comprimento de um resíduo atécarbóxi e/ou amino-terminal que variam de comprimento de um resíduo atépolipeptídeos que contenham cem ou mais resíduos, bem como inserçõesintra-seqüenciais de resíduos de aminoácidos isolados ou múltiplos. Exemplosde inserções terminais incluem um antagonista com um resíduo de metionila N-terminal ou o anticorpo fundido a um polipeptídeo citotóxico. Outras variantesde inserção da molécula de anticorpo incluem a fusão ao N- ou C-terminal doanticorpo (por exemplo, para ADEPT) de uma enzima ou um polipeptídeo queaumente a meia vida do antagonista no soro.
Outro tipo de variante é uma variante de substituição deaminoácidos. Estas variantes contêm pelo menos um resíduo de aminoácidona molécula de anticorpo substituída por um resíduo diferente. Os sítios demaior interesse para mutagênese de substituição incluem as regiõeshipervariáveis, mas também são contempladas alterações de FR. Substituiçõesconservadoras são exibidas na Tabela A sob o título de "substituiçõespreferidas". Caso essas substituições resultem em mudança da atividadebiológica, então mudanças mais substanciais, denominadas "exemplos desubstituições" na Tabela A, ou conforme descrito adicionalmente abaixo comreferência a classes de aminoácidos podem ser introduzidas e os produtos sãoselecionados.
Tabela A
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Modificações substanciais das propriedades biológicas doanticorpo são atingidas por meio da seleção de substituições que diferemsignificativamente no seu efeito sobre a manutenção (a) da estrutura da cadeiaprincipal de polipeptídeo na área da substituição, por exemplo, na forma defolha ou em conformação helicoidal; (b) da carga ou hidrofobicidade damolécula no sítio desejado; ou (c) do volume da cadeia lateral. Os aminoácidospodem ser agrupados de acordo com similaridades nas propriedades de suascadeias laterais (em A. L. Lehninger1 in Biochemistry, segunda Ed., pp. 73-75,Worth Publishers, Nova Iorque (1975)):
(1) Apolares: Ala (A), Val (V), Leu (L)1 Ile (I), Pro (P), Phe (F)1 Trp
(W), Met (M)
(2) Sem caraga polar: Gly (G)1 Ser (S)1 Thr (T)1 Cys (C)1 Tyr (Y)1Asn (N)1 Gln (Q)
(3) Ácido: Asp (D)1 Glu (E)
(4) Básico: Lys (K)1 Arg (R)1 His(H)
Alternativamente, os resíduos de ocorrência natural podem serdivididos em grupos com base nas propriedades comuns da cadeia lateral:
(1) Hidrofílicos: Norleucina, Met, Ala, Vai, Leu, lie;
(2) Hidrofílicos neutros: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;
(3) Ácido: Asp, Glu;
(4) Básico: His, Lys, Arg;
(5) Resíduos que influenciam na orientação das cadeias: Gly, Pro;
(6) Aromático: Trp, Tyr, Phe.
Substituições não-conservadoras causarão a substituição de ummembro de uma dessas classes por outra classe. Tais resíduos substituídostambém podem ser introduzidos nos locais conservados da substituição ou,mais preferivelmente, nos locais (não-conservados) restantes.
Um tipo particularmente preferido de variante de substituiçãoenvolve a substituição de um ou mais resíduos da região hipervariável de umanticorpo parental (por exemplo, anticorpo humano e humanizado).Geralmente, a(s) variante(s) resultante(s) selecionada(s) para desenvolvimentoadicional terá(ão) propriedades biológicas modificadas (por exemplo,aprimoradas) com relação ao anticorpo parental do qual é(são) gerado(s).Resumidamente, diversos sítios de regiões hipervariáveis (por exemplo, 6 a 7sítios) sofrem mutações para gerar todas as substituições amino possíveis emcada sítio. Os anticorpos assim gerados são exibidos a partir de partículas defagos filamentosos fundidos a pelo menos uma parte da proteína da cápside dofago (por exemplo, o produto do gene Ill de M13). As variantes exibidas porfago são, então, selecionadas de acordo com a sua atividade biológica (porexemplo, afinidade de ligação) conforme descrita na presente invenção. A fimde identificar possíveis sítios de regiões hipervariáveis para modificação,mutagênese por varredura (por exemplo, varredura de alanina) pode serrealizada para identificar resíduos de regiões hipervariáveis que contribuemsignificativamente para a ligação de antígenos. Alternativamente ouadicionalmente, pode ser benéfico analisar a estrutura cristalina do complexoantígeno-anticorpo para identificar pontos de contato entre o anticorpo e oantígeno. Tais resíduos de contato e resíduos vizinhos são candidatos àsubstituição de acordo com as técnicas conhecidas no estado da arte. Após ageração de tais variantes, o quadro de variantes é submetido à seleçãoconforme descrito na presente invenção e os anticorpos com propriedadessuperiores em um ou mais testes relevantes podem ser selecionados paradesenvolvimento adicional.
Moléculas de ácidos nucléicos que codificam variantes daseqüência de aminoácidos do anticorpo são preparadas por meio de uma sériede métodos conhecidos no estado da técnica. Estes métodos incluem, mas nãose limitam a, o isolamento a partir de uma fonte natural (no caso de variantesde seqüências de aminoácidos de ocorrência natural) ou preparação por meiode mutagênese mediada por oligonucleotídeo (ou sítio-dirigida), mutagênesepor PCR e cassete de mutagênese de uma variante preparada anteriormenteou uma versão não-variante do anticorpo.
Pode ser desejável introduzir uma ou mais modificações deaminoácidos em uma região Fc do anticorpo da invenção, gerando assim umaregião Fc variante. A região Fc variante humana pode compreender umaseqüência região Fc (por exemplo, região Fc da IgGI, lgG2, lgG3 ou lgG4seqüência) que inclui uma modificação de aminoácido (por exemplo, umasubstituição) em um ou mais posições de aminoácidos incluindo o de umadobradiça de cisteína.
De acordo com esta descrição e os ensinamentos no estado datécnica, é contemplado que, em alguns exemplos, um anticorpo da invençãopode constar de uma ou mais alterações em comparação com o anticorpohomólogo do tipo selvagem, por exemplo, na região Fc. Estes anticorpos,porém, mantém sensivelmente as mesmas características exigidas para autilidade terapêutica, comparativamente ao seu homólogo do tipo selvagem.Por exemplo, podem ser feitas algumas alterações na região Fc1 que alteraram(isto é, ou melhoram ou diminuem) a ligação ao C1q e/ou a citotoxicidadedependente do complemento (CDC)1 por exemplo, como descrito nodocumento W099/51642. Vide também Duncan e Winter, Nature 322:738-40(1988); Patente US 5648260; Patente US. 5624821, e documento W094/29351relativas a outros exemplos de região Fc variantes.
Em um aspecto, a invenção fornece anticorpos possuemmodificações na interface dos polipeptídeos Fc que compreendem a região Fc1onde as modificações facilitam e/ou promovem a heterodimerização. Estasalterações incluem a introdução de uma protuberância em um primeiropolipeptídeo Fc e uma cavidade em um segundo polipeptídeo de Fc, onde aprotuberância é posicionada na cavidade de modo a promover o complexoentre o primeiro e segundo polipeptídeo de Fc. Métodos para produção deanticorpos com estas modificações são conhecidas no estado da técnica, porexemplo, como descrito na Patente US 5.731.168.
Imunoconjugados
Em outro aspecto, A invenção também fornece imunoconjugadosou a anticorpos conjugados com drogas (ADC), compreendendo um anticorpoconjugado a um agente citotóxico tal como um agente quimioterápico, droga,agente inibidor de crescimento, toxina (por exemplo, uma toxinaenzimaticamente ativa de origem bacteriana, fúngica, vegetal ou animal, oufragmentos destes) ou um isótopo radioativo (isto é, um radioconjugado).
O uso anticorpos conjugados com drogas para a entrega local deagentes citotóxicos ou citostático, isto é, drogas para matar ou inibir célulastumorais no tratamento do câncer (Syrigos e Epenetos (1999) AnticancerResearch 19:605-614; Niculescu-Duvaz e Springer (1997) Adv. Drg Del. Rev.26:151-172 e Patente US 4.975.278) teoricamente permitem a entrega dadroga a célula alvo de parte do tumor, e o acúmulo intracelular desta, onde aadministração sistêmica destes agentes não conjugados com drogas poderesultar em níveis inaceitáveis de toxicidade às células normais bem como ascélulas do tumor que precisam ser eliminadas (Baldwin et ai, (1986) Lancetpp. (15 de Março de 1986):603-05; Thorpe, (1985) "Antibody Carriers OfCytotoxic Agents In Câncer Therapy: Uma revisão em,"Monoclonal Antibodies'84: Biological And Clinicai Applications, A. Pinchera et aí. (ed.s), pp. 475-506).Procura-se deste modo a eficácia máxima com toxicidade mínima. Tanto osanticorpos policlonais quanto os anticorpos monoclonais foram relatados comoúteis nestas estratégias (Rowland et ai, (1986) Supra). As drogas usadasnestes métodos incluem a daunomicina, doxorubicina, metotrexate, e avindesina (Rowland et ai, (1986) Supra). As toxinas usadas em conjugadosanticorpo-toxina incluem as toxinas bacterianas tais como a toxina da difteria,toxina de plantas tais como a ricina, pequenas moléculas de toxinas tais comoa geldanamicina Mandler et al (2000) Jour. of the Nat Câncer Inst.92(19):1573-1581; Mandler et al (2000) Bioorganic & Med. Chem. Letters10:1025-1028; Mandler et al (2002) Bioconjugate Chem. 13:786-791),maitansinóides (Patente EP 1391213; Liu et ai, (1996) Proc. Nati Acad. Sei.USA 93:8618-8623), e caliceamicina (Lode et al (1998) Câncer Res. 58:2928;Hinman et al (1993) Câncer Res. 53:3336-3342). As toxinas podem realizarseus efeitos citotóxicos e citostáticos por mecanismos incluindo a ligação datubulina, a ligação do DNA ou a inibição da topoisomerase. Algumas drogascitotóxicas tendem a ser inativas ou mais menos ativas quando conjugadascom anticorpos ou Iigantes de proteínas receptorasZEVALIN® (ibritumomab tiuxetan, Biogen/ldec) é um conjugadoanticorpo-radioisótopo composto de um anticorpo monoclonal IgGI kappamurino dirigido contra ao antígeno CD20 encontrado na superfície de linfócitosnormais e malignizados e ligado ao radioisótopo In111 ou Y90 ligado por umtiourea ligada a um quelante (Wiseman et al (2000) Eur. Jour. Nuci Med.27(7):766-77; Wiseman et al (2002) Blood 99(12):4336-42; Witzig et al (2002) J.Clin. Oncol. 20(10):2453-63; Witzig et al (2002) J. Clin. Oncol. 20(15):3262-69).Embora ZEVALIN tenha a atividade contra o Iinfoma de célula B não Hodgkin(NHL), a administração resulta em citopenia grave e prolongada na a maioriados pacientes. MYLOTARG™ (gemtuzumab ozogamicina, WyethPharmaceuticals), um anticorpo conjugado a droga composto de um anticorpohu CD33 ligado a caliceamicina, foi aprovado em 2000 para o tratamento daleucemia mielóide aguda por injeção (Drugs of the Future (2000) 25(7):686;Patente US 4970198; US 5079233; US 5585089; US 5606040; US 5693762;US 5739116; US 5767285; US 5773001. Cantuzumab mertansina (Immunogen,Inc.), um conjugado anticorpo-droga composto pelo anticorpo huC242 ligadoatravés do Iigante SPP a fração maitansinóide da droga, DM1 do bissulfeto,está avançando em experimentações de fase Il para o tratamento dos cânceresque expressam CanAg como, por exemplo, pancreático, gástrico entre outros.MLN-2704 (Millennium Pharm., BZL Biologics, Immunogen Inc.), um conjugadoanticorpo-droga composto pelo anticorpo monoclonal específico para antígenode membrana anti-prostático (PSMA) ligado a fração maitansinóide da droga,DM1, está sob o desenvolvimento para o tratamento potencial de tumores depróstata. Os peptídeos da auristatina, auristatina E (AE) e amonometilauristatina (ΜΜΑΕ), análogos sintéticos da dolastatina, conjugadoaos anticorpos monoclonais quimérico cBR96 (específico para o carcinoma deLewis Y) e cAC10 (específico para o CD30 em malignidades hematológicas)(Doronina et al (2003) Nature Biotechnology 21(7):778-784) e estão sobdesenvolvimento terapêutico.
Os agentes quimioterápicos úteis na geração de taisimunoconjugados foram descritos acima. Toxinas enzimaticamente ativas eseus fragmentos que podem ser utilizados incluem cadeia A de difteria,fragmentos ativos não-ligantes da toxina de difteria, cadeia A de exotoxina (dePseudomonas aeruginosa), cadeia A rícina, cadeia A de abrina, cadeia A demodeccina, alfa-sarcina, proteínas de Aleurites fordii, proteínas de diantina,proteínas de Phytolaca americana (PAPI, PAPII e PAP-S), inibidor Momordicacharantia, curcina, crotina, inibidor de Sapaonaria officinalis, gelonina,mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina e os tricotecenos. Vide, porexemplo, o documento WO 93/21232 publicado em 28 de outubro de 1993.
Uma variedade de radionucleotídeos está disponível para a produção deanticorpos radioconjugados. Exemplos incluem Bi212, I131, In131, Y90 e Re186. Osconjugados do antagonista e agente citotóxico podem ser fabricados utilizandouma série de agentes acopladores de proteínas bifuncionais, tais comopropionato de N-succinimidil-3-(2-piridilditiol) (SPDP)1 iminotiolano (IT)1derivados bifuncionais de imidoésteres (tais como adipimidato de dimetila HCI),ésteres ativos (tais como suberato de dissuccinimidila), aldeídos (tais comoglutaraldeído), compostos bis-azido (tais como bis-(para-azidobenzoil)-hexanodiamina), derivados bis-diazônio (tais como bis-(para-diazoniobenzoil)-etilenodiamina), diisocianatos (tais como 2,6-diisocianato de tolueno) ecompostos de flúor bis-ativo (tais como 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenzeno). Pode-se preparar, por exemplo, uma imunotoxina rícina, conforme descrito em Vitettaet al., Science 238: 1098 (1987). Ácido 1-isotiocianatobenzil-3-metildietilenotriaminopentaacético marcado por carbono 14 (MX-DTPA) é um exemplo deagente quelante para conjugação de radionucleotídeo ao antagonista. Vide odocumento WO 94/11026.
Conjugados de um antagonista e uma ou mais toxinas demoléculas pequenas, tais como caliqueamicina, maitansinóides, tricoteno eCC1065 e seus derivados que também apresentam atividades de toxinas, sãocontemplados no presente.
Maitansina ε Maitansinóides
Em alguns exemplos de realizações, o imunoconjugadocompreende o anticorpo da invenção conjugado a uma ou mais moléculasmaitansinóides.
Maitansinóides são inibidores mitóticos que agem através dainibição da polimerização de tubulina. Maitansina foi isolada pela primeira vez apartir do arbusto leste africano Maytenus serrata (Patente US 3.896.111).Descobriu-se em seguida que determinados micróbios também produzemmaitansinóides, tais como maitansinol e ésteres C-3 de maitansinol (PatenteUS 4.151.042). Maitansinol sintético, seus derivados e análogos são descritos,por exemplo, nas Patentes US 4.137.230, US 4.248.870, US 4.256.746, US4.260.608, US 4.265.814, US 4.294.757, US 4.307.016, US 4.308.268, US4.308.269, US 4.309.428, US 4.313.946, US 4.315.929, US 4.317.821, US4.322.348, US 4.331.598, US 4.361.650, US 4.364.866, US 4.424.219, US4.450.254, US 4.362.663 e US 4.371.533.
Frações da droga dos maitansinóides são frações atrativas dadroga em conjugados droga-anticorpo porque são: (i) relativamente acessíveispara serem preparadas pela modificação por fermentação ou modificaçãoquímica, derivada de produtos da fermentação, (ii) por serem receptivos àderivatização com os grupos funcionais apropriados para a conjugação atravésde ligações não dissulfeto aos anticorpos, (iii) o estáveis no plasma, e (iv)eficazes contra uma variedade de linhagens de células tumorais.
Exemplos de realizações de moléculas de drogas maitansinóidesincluem: DM1; DM3 e DM4. Imunoconjugados contendo maitansinóides e seususos terapêuticos são descritos, por exemplo, nas patentes US 5.208.020, US5.416.064 e patente EP 0 425 235 B1, cujos conteúdos são expressamenteincorporados ao presente como referência. Liu et ai, Proc. Nati Acad. Sei.USA 93: 8618-8623 (1996), descreveram imunoconjugados que compreendemum maitansinóide denominado DM1 ligado ao anticorpo monoclonal C242dirigido a câncer colorretal humano. Concluiu-se que o conjugado é altamentecitotóxico com relação a células cancerígenas do cólon cultivadas e exibiuatividade antitumoral em teste de crescimento tumoral in vivo. Chari et al.,Câncer Research 52: 127-131 (1992) descrevem imunoconjugados em que ummaitansinóide foi conjugado por meio de uma ligação dissulfeto ao anticorpo A7murino que se liga a um antígeno sobre linhagens de células cancerígenas decólon humano ou a outro anticorpo TA-1 monoclonal murino que liga ooncogene HER-2/neu. A citotoxicidade do conjugado TA.1- maitansinóide foitestado in vitro em células da linhagem humana SK-BR-3 de câncer de mama,que expressa 3 χ 105 antígenos de superfície HER-2 por célula. O conjugadoda droga conseguiu um grau de citotoxicidade similar a droga maitansinóidelivre, que poderia ser aumentada pelo aumento no número de moléculasmaitansinóide por a molécula de anticorpo. Os conjugados A7- maitansinóidedemonstrou baixa citotoxicidade sistêmica nos camundongos.
Os conjugados anticorpo-maitansinóide são preparadosquimicamente ligando um anticoro a uma molécula de maitansinóide semdiminuir significativamente a atividade biológica do anticorpo ou da moléculamaitansinóide. Vide, por exemplo, a Patente US 5.208.020 (a divulgação doqual é expressamente incorporada a este pela referência). Uma média de 3-4moléculas maitansinóide conjugada por a molécula de anticorpo mostroueficácia em amplificar a citotoxicidade em células alvo sem afetarnegativamente a função ou a solubilidade do anticorpo, embora mesmo umamolécula de anticorpo/toxina se esperasse amplificar a citotoxicidade sobre ouso de um anticorpo nú. Maitansinóide são bem conhecidos no estado datécnica e podem ser sintetizados por técnicas conhecidas ou isolados de fontesnaturais. Maitansinóide apropriados são descritos, por exemplo, na patente US5.208.020 e outras atentes e publicações não patentes referidas abaixo nopresente. Os maitansinóides preferidos são maitansinol e análogos domaitansinol modificados no anel aromático ou em outras posições da moléculado maitansinol, tais como vários ésteres do maitansinol.
Existem diversos grupos de ligação conhecidos no estado datécnica para a fabricação de conjugados de anticorpo e maitansinóide, queincluem, por exemplo, os descritos na patente US 5.208.020 ou EP 0.425.235B1 e Chari et ai., Câncer Research 52: 127-131 (1992) e pedido de Patente US10/960.602, arquivado em 8 de outubro de 2004, a divulgação do qual éexpressamente incorporada a este pela referência. Conjugados anticorpo-maitansinóide contendo o componente Iigante SMCC pode ser preparadoconforme divulgado no pedido de Patente US 10/960602, arquivados em 8 deoutubro de 2004. Os grupos de ligação incluem grupos dissulfeto, grupostioéter, grupos de ácidos lábeis, grupos fotolábeis, grupos lábeis de peptidaseou grupos lábeis de esterase, conforme descrito nas patentes identificadasacima. Grupos de ligação adicionais estão descritos e exemplificados nopresente.
Os conjugados do anticorpo e maitansinóide podem serfabricados através da utilização de uma série de agentes acopladores protéicosbifuncionais, tais com propionato de N-succinimidil-3-(2-piridilditio) (SPDP),cicloexano-1-carboxilato de succinimidil-4-(N-maleimidometila) (SMCC),iminotiolano (IT), derivados bifuncionais de imidoésteres (tais como adipimidatode dimetila HCI), ésteres ativos (tais como suberato de disuccinimidila),aldeídos (tais como glutaraldeído), compostos bis-azido (tais como bis-(para-azidobenzoil)-hexanodiamina), derivados de bis-diazônio (tais como bis-(para-diazoniobenzoil)-etilenodiamina), diisocianatos (tais como 2,6-diisocianato detolueno) e compostos de flúor bis-ativo (tais como 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenzeno). Os agentes acopladores particularmente preferidos incluempropionato de N-succinimidil-3-(2-piridiltio) (SPDP) (Carlsson et ai, Biochem. J.173: 723-737 (1978)) e pentanoato de N-succinimidil-4-(2-piridiltio) (SPP) paraproporcionar ligação dissulfeto.
O ligante pode estar unido à molécula de maitansinóide emdiversas posições, dependendo do tipo da ligação. Uma ligação éster pode serformada, por exemplo, através da reação com um grupo hidroxila, utilizando-setécnicas convencionais de acoplamento. A reação pode ocorrer na posição C-3que possui um grupo hidroxila, na posição C-14 modificada com hidroximetila,na posição C-15 modificada com um grupo hidroxila e na posição C-20 quepossui um grupo hidroxila. Em uma realização preferida, a ligação é formadana posição C-3 de maitansinol ou um análogo do mesmo.
Auristatina ε Dolostatina
Em alguns exemplos de realização, o imunoconjugadocompreende um anticorpo da invenção conjugado com dolastatinas oupeptídicos análogos da dolastatinas e derivados e auristatinas (Patentes US5.635.483; US 5.780.588). Dolastatinas e auristatinas mostraram interferir coma dinâmica do microtúbulo, hidrólise da GTP e divisão nuclear e celular (Woykeet aí (2001) Antimicrob. Agents and Chemother. 45(12):3580-3584) e possuematividade anti-câncer (Patente US 5.663.149) e antifúngica (Pettit et a/ (1998)Antimicrob. Agents Chemother. 42:2961-2965). A fração da droga dolastatinaou auristatina pode ser unida covalentemente a um anticorpo através do(amino) N-terminal ou do C (carboxila) terminal da fração peptídica da droga(WO 02/088172).
Incorporações exemplares da auristatina incluem a ligação do N-terminal da fração DE e DF da droga monometilauristatina, divulgados em"Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands", Ser. USNo. 10/983,340, arquivado em 5 de novembro de 2004, a divulgação do qual éexpressamente incorporada pela referência em sua totalidade.
Incorporações exemplares da auristatina incluem MMAE e MMAF.Incorporações adicionais constam de Iigantes MMAE ou MMAF e várioscomponentes (descrito mais adiante neste documento) incluindo Ab-MC-VC-PAB-MMAF, Ab-MC-VC-PAB-MMAE, Ab-MC-MMAE e Ab-MC-MMAF.
Tipicamente, frações da droga baseadas em peptídeo podemser preparadas formando uma ligação de peptídeos entre dois ou maisaminoácidos e/ou fragmentos de peptídeos. Tais ligações de peptídeospodem ser preparadas, por exemplo, de acordo com o método de síntese defase líquida (vide, E. Schrõder e K. Lübke, "The Peptides", volume 1, págs76-136, 1965, Academic Press) que é bem conhecido no campo da químicade peptídeos. As moléculas das drogas auristatina/dolastatina podem serpreparadas de acordo com os métodos da Patente US 5.635.483; PatenteUS 5.780.588; Pettit et al (1989) J. Am. Chem. Soe. 111:5463-5465; Pettit etal (1998) Anti-Cancer Drug Design 13:243-277; Pettit, GR, et al. Syntesis,1996, 719-725; e Pettit et al (1996) J. Chem. Soe. Perkin Trans. 1 5:859-863.Vide também Doronina (2003) Nat Bioteehnol 21 (7):778-784;"Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands", US N010/983340, arquivado em 5 de Novembro de 2004, incorporado ao presentepela referência na sua totalidade (divulgado, por exemplo, Iigantes emétodos de preparação de compostos monometilvalina como MMAE eMMAF conjugado aos ligantes).
CaliqueamicinaEm outro exemplo de realização, o imunoconjugado compreendeum anticorpo da invenção conjugado a uma ou mais moléculas decaliqueamicina. A família caliqueamicina de antibióticos é capaz de produzirquebras de DNA de fita dupla em concentrações sub-picomolares. Para apreparação de conjugados da família de caliqueamicina, vide as patentes US5.712.374, US 5.714.586, US 5.739.116, US 5.767.285, US 5.770.701, US5.770.710, US 5.773.001 e US 5.877.296 (todas da American CyanamidCompany). Análogos estruturais de caliqueamicina que podem ser utilizadosincluem, mas sem limitar-se a, γΛ α2', α3', N-acetil-γι1, PSAG e G11 (Hinman etai., Câncer Research 53: 3336-3342 (1993), Lode et ai., Câncer Research 58:2925-2928 (1998) e as patentes US da American Cyanamid citadas acima).Outra droga antitumoral à qual o anticorpo pode ser conjugado é QFA, que éum antifolato. Tanto caliqueamicina quanto QFA contêm sítios intracelulares deação e não atravessam facilmente a membrana plasmática. Portanto, aabsorção celular desses agentes através de internalização mediada poranticorpos aumenta grandemente seus efeitos citotóxicos.
Outros Agentes Citotóxicos
Outros agentes antitumor que podem ser conjugados aosanticorpos da invenção incluem BCNU, streptozoicina, vincristina e 5-fluorouracil, a família do complexo LL-E33288 de agentes conhecidoscoletivamente descrito nas patentes US 5.053.394 e US 5.770.710, bem comoas esperamicinas (Patente US 5.877.296).
Toxinas enzimaticamente ativas e seus fragmentos que podemser utilizados incluem cadeia A de difteria, fragmentos ativos não-ligantes datoxina de difteria, cadeia A de exotoxina (de Pseudomonas aeruginosa), cadeiaA rícina, cadeia A de abrina, cadeia A de modeccina, alfa-sarcina, proteínas deAleurites fordii, proteínas de diantina, proteínas de Phytoiaca americana (PAPI,PAPII e PAP-S), inibidor Momordica charantia, curcina, crotina, inibidor deSapaonaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicinae os tricotecenos. Vide, por exemplo, o documento WO 93/21232, publicadoem 28 de outubro de 1993.
A presente invenção contempla adicionalmente um antagonistaconjugado a um composto com atividade nucleolítica (por exemplo,ribonuclease ou uma endonuclease de DNA, tal como deoxirribonuclease;DNase).
Para a destruição seletiva do tumor, o anticoro pode conter umátomo altamente radioativo. Uma série de isótopos radioativos é disponível paraa produção de antagonistas radioconjugados. Exemplos incluem At211, I1311 I125,Y901 Re186, Re188, Sm153, Bi212, P321 Pb212 e isótopos radioativos de Lu. Quando oconjugado for utilizado para diagnóstico, ele pode compreender um átomoradioativo para estudos cintigráficos, por exemplo, tc99m ou 1123, ou uma marcade centrifugação para formação de imagem através de ressonância magnéticanuclear (NMR) (também conhecida como formação de imagem por ressonânciamagnética, MRI), tal como novamente iodo-123, iodo-131, índio-111, flúor-19,carbono-13, nitrogênio-15, oxigênio-17, gadolínio, manganês ou ferro.
A radiomarcação ou outras podem ser incorporadas ao conjugadode formas conhecidas. O peptídeo pode ser, por exemplo, biossintetizado oupode ser sintetizado através de síntese química de aminoácidos, utilizandoprecursores de aminoácidos apropriados, envolvendo, por exemplo, flúor-19 nolugar de hidrogênio. Marcas tais como tc99m, I123, Re186, Re188 e In111 podem serligadas através de um resíduo de cisteína no peptídeo. ítrio-90 pode ser ligadoatravés de um resíduo de lisina. O método Iodogen (Fraker et al. (1978),Biochem. Biophys. Res. Commun. 80: 49-57) pode ser utilizado para aincorporação de iodo-123. Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy(Chatal, CRC Press, 1989) descreve outros métodos em detalhes.
Os conjugados do anticorpo e agente citotóxico podem serfabricados por meio de uma série de agentes acopladores protéicos bifuncionais,tais como propionato de N-succinimidila-3-(2-piridilditio) (SPDP), cicloexano-1-carboxilato de succinimidil-4-(N-maleimidometila) (SMCC), iminotiolano (IT)1derivados bifuncionais de imidoésteres (tais como adipimidato de dimetila HCI),ésteres ativos (tais como suberato de di-succinimidila), aldeídos (tais comoglutaraldeído), compostos bis-azido (tais como bis-(para-azidobenzoil)-hexanodiamina), derivados bis-diazônio (tais como bis-(para-diazoniobenzoil)-etilenodiamina), diisocianatos (tais como 2,6-diisocianato de tolueno) ecompostos de flúor bis-ativo (tais como 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenzeno). Pode-sepreparar, por exemplo, uma imunotoxina rícina, conforme descrito em Vitetta etai, Science 238: 1098 (1987). Ácido 1-isotiocianatobenzil-3-metildietilenotriaminopentaacético marcado por carbono 14 (MX-DTPA) é um exemplo deagente quelante para conjugação de radionucletídeo ao anticorpo. Vide odocumento WO 94/11026. O Iigante pode ser um "ligante capaz de ser clivado"que facilita a liberação da droga citotóxica na célula. Pode-se utilizar, porexemplo, um ligante de ácido lábil, ligante sensível à peptidase, ligante fotolábel,ligante de dimetila ou ligante contendo dissulfeto (Chari et ai, Câncer Research52: 127-131 (1992); patente US 5.208.020).
Os compostos da invenção contemplam expressamente, mas nãosão limitados a, ADC preparado com reagentes reticulantes: BMPS, EMCS,GMBS1 HBVS1 LC-SMCC1 MBS1 MPBH, SBAP1 SIA1 SIAB, SMCC1 SMPB1 SMPH,sulfo-EMCS, sulfo-GMBS, sulfo-KMUS, sulfo-MBS, sulfo-SIAB, sulfo-SMCC, sulfo-SMPB1 e SVSB (succinimidil-(4-vinilsulfona)benzoato) que estão comercialmentedisponíveis (por exemplo, pela Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL., EUA).Veja páginas 467-498, Applications Handbook and Catalog 2003-2004.
Preparação de Anticorpos Conjugados com DrogasNos conjugados de anticorpos com drogas (ADC) da invenção,um anticorpo (Ab) é conjugado a uma ou mais frações da droga (D)1 porexemplo, cerca de 1 a 20 frações da droga por anticorpo, através de um Iigante(L). O ADC da fórmula I pode ser preparado por diversos protocolos,empregando reações de química orgânica, circunstancias e reagentesconhecidos por hábeis na técnica, incluindo: (1) reação de um gruponucleofílico de um anticorpo com um reagente Iigante bivalente a forma Ab-L,através de uma ligação covalente, seguida pela reação com a fração de drogaD; e (2) reação de um grupo nucleofílico de uma fração da droga com umreagente Iigante bivalente, a forma D-L, através de uma ligação covalente,seguida pela reação com o grupo nucleofílico de um anticorpo. Métodosadicionais para preparação de ADC estão descritos no presente.
Ab-(L-D)p I
O Iigante pode ser composto por um ou mais componentes ligante.Exemplos componentes de Iigantes incluem 6-maleimidocaproil ("CM"),maleimidopropanoil ("MP"), valina-citrulina ("val-cit"), alanina-fenilalanina ("Ala-phe"), p-aminobenziloxicarbonil ("PAB"), N-Succinimidil 4-(2-piridiltio) pentanoato("SPP"), N-Succinimidol 4-(N-maleimidometil) ciclohexano-1 carboxilato ("SMCC"),e Succinimidil N-(4-iodo-acetil) aminobenzoato ("SIAB"). Componentes de Iigantesadicionais são conhecidos na arte e alguns estão descritos neste documento. Videtambém "Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands", USN0 10/983340, arquivado em 5 de Novembro de 2004, o conteúdo do qual é aquiincorporado pela referência na sua totalidade.
Em alguns exemplos de realização, o ligante pode compreenderde resíduos de aminoácidos. Exemplos de componentes aminoácidos Iigantesincluem dipeptídeos, tripeptídeos, tetrapeptídeos ou pentapeptídeos. Exemplosde dipeptídeos incluem: valine-citrulina (vc ou val-cit), alanina-fenilalanina (afou ala-phe). Exemplos de tripeptídeos incluem: glicina-valina-citrulina (gly-val-cit) e glicina-glicina- glicina (gly-gly-gly). Resíduos de aminoácidos que incluamum componente ligante de aminoácido incluem aqueles que ocorremnaturalmente, assim como aminoácidos pequenos e aminoácidos análogos quenão ocorrem naturalmente, tais como citrulina. Componentes Iigantes deaminoácidos podem ser concebidos e otimizados em sua seletividade para aclivagem enzimática por uma enzima específica, por exemplo, uma proteaseassociada a tumor, catepsina B, C, D, ou plasmina.
Exemplos de estruturas de componente s Iigantes são mostradosabaixo (onde a linha ondulada indica os sítios de ligação covalente a outroscomponentes da ADC):
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Exemplos de componentes Iigantes e abreviações adicionaisincluem (onde o anticorpo (AB) e ligantes são representados, e ρ é cerca de 1a 8):
<formula>formula see original document page 117</formula><formula>formula see original document page 118</formula>
Os grupos nucleofílico nos anticorpos incluem, mas não sãolimitados: (i) grupos amino N-terminal, (ii) grupos amino da cadeia lateral, porexemplo lisina, (iii) grupos tiol da cadeia lateral, por exemplo cisteína, e (iv)hidroxila do açúcar ou grupos amino onde o anticorpo é glicosilado. Os gruposamino, tiol e hidroxila são nucleofílicos e capazes de reagir às ligações deforma covalente com os grupos eletrofílicos em frações dos Iigantes ereagentes Iigantes incluindo: (i) ésteres ativos tais como ésteres de NHS,ésteres de HOBt1 haloformatos, e halides ácidos; (ii) Alquilas e halides benziltais como haloacetamidas; (iii) grupos dos aldeídos, das cetonas, carboxil emaleimida. Determinados anticorpos têm ligações intercadeias reduzidas, istoé, pontes do cisteina. Os anticorpos podem ser feitos reativos pela cojugaçãocom os reagentes Iigantes pelo tratamento com um agente redutor, tal comoDTT (ditiotreitol). Cada ponte do cisteína dará forma assim, teoricamente, adois tióis nucleofílicos reativos. Os grupos nucleofílicos adicionais podem serintroduzidos em anticorpos pela reação das Iisinas com 2-iminotiolano(reagente de Traut) tendo por resultado a conversão de uma amina em um tiol.Grupos reativos de tiol podem ser introduzidos no anticorpo (ou fragmentodeste) pela introdução de um, dois, três, quatro, ou mais resíduos de cisteína(por exemplo, preparando anticorpos mutantes compreendendo um ou maisresíduos de aminoácidos não-nativos).
Os conjugados de anticorpos com drogas da invenção podemtambém ser produzidos pela modificação do anticorpo para introduzir a regiãoeletrofílicas, que podem reagir com os substituintes nucleofílicos no reagenteligante ou na droga. Os açúcares de anticorpos glicosilados podem seroxidados, por exemplo, com os reagentes de oxidação periodato, para darforma ao aldeído ou aos grupos cetona que podem reagir com o grupo aminodos ligantes reagentes ou frações das drogas. Os grupos iminas resultantes deSchiff do podem dar forma a uma ligação estável, ou podem ser reduzidos, porexemplo, pelo reagente borohidrido para formar ligações amino estáveis. Emum exemplo de realização, a reação da porção do hidrato de carbono de umanticorpo glicosilado com a galactose oxidase ou o metaperiodato de sódiopode formar grupos carbonil (aldeído e cetona) na proteína que desta formapode reagir com os grupos apropriados na droga (Hermanson, BioconjugateTechniques). Em outro exemplo de realização, as proteínas que contêm aserina N-terminal ou os resíduos do treonina podem reagir com o meta-periodato de sódio, tendo por resultado a produção de um aldeído no lugar doprimeiro aminoácido (Geoghegan & Stroh, (1992) Bioconjugate Chem. 3:138-146; Patente US 5.362.852). Tal aldeído pode reagir com um Iigante reagenteou uma fração da droga nucleofílica.
Do mesmo modo, os grupos nucleofílicos em uma fração da drogaincluem, mas não são limitados a: grupos amino, tiol, hidroxila, hidrazida,oxime, hidrazina, tiosemicarbazona, carboxilato de hidrazina e gruposarilhidrazida capazes de reagir na forma de ligações covalente com os gruposelectrofílicos em frações do Iigante e reagente do Iigante incluindo: (i) ésteresativos, tais como, ésteres de NHS, ésteres de HOBt, haloformates e halidesácidos; (ii) Alquilas e halides benzil tais como haloacetamidas;; (iii) grupos dosaldeídos, das cetonas, carboxil e maleimida.
Alternativamente, uma fusão protéica compreendendo doanticorpo e do agente citotóxico pode ser feita, por exemplo, por técnicas oupela síntese de peptídeo recombinante. O comprimento do DNA podecompreender as regiões respectivas que codificam as duas parcelas doconjugado adjacente ou separada por uma região que codifica um peptídeoligante que não destrua as propriedades desejadas do conjugado.
Em outro exemplo de realização, o anticorpo pode estarconjugado a um "receptor" (como, por exemplo, a estreptoavidina) para autilização no tumor pré-alvo em que o conjugado anticorpo- receptor éadministrado ao paciente, seguido pela remoção de conjugado não ligado dacirculação usando um agente de limpeza e então a administração de um"ligante" (por exemplo, avidina) que é conjugado a um agente citotóxico (porexemplo, um radionucleotídeo).
Um anticorpo (Ab)-MC-MMAE pode ser preparado pelaconjugação de qualquer um dos anticorpos aqui fornecido com MC-MMAEcomo se segue. O anticorpo, dissolvido em 500 mM de borato de sódio e 500mM de cloreto de sódio em pH 8,0 é tratado com um excesso de 100 mMditiotreitol (DTT). Após incubação a 37 0C durante cerca de 30 minutos, otampão é trocado por eluição sobre a resina Sephadex G25 e eluída por PBScom 1 mM de DTPA. O valor de tiol/Ab é verificado determinando a redução daconcentração do anticorpo pela absorbância a 280 nm da solução e daconcentração tiol pela reação com DTNB (Aldrich, Milwaukee, Wl) determinadano comprimento de onda de 412 nm. O anticorpo reduzido dissolvido em PBS érefrigerado em gelo. O reagente da droga ligante, auristatina Emaleimidocaproil-monometílico (MMAE), ou seja, MC-MMAE, dissolvido emDMSO1 é diluído em acetonitrila e água a uma concentração conhecida, eadicionada ao anticorpo 2H9 reduzido é refrigerado em PBS. Após cerca deuma hora, um excesso de maleimida é adicionada para parar a reação e fecharqualquer grupo tiol que não tenha reagido com o anticorpo. A mistura dareação é concentrada por ultrafiltração centrífuga e o 2H9-MC-MMAE épurificado e desalinizado por eluição na resina G25 em PBS, filtrado através defiltros de 0,2 μητι em condições estéreis, e congelado para armazenamento.
O anticorpo-MC-MMAF pode ser preparado pela conjugação dequalquer um dos anticorpos aqui fornecida com MC-MMAF seguindo oprotocolo fornecido para a preparação do Ab-MC-MMAE.
O anticorpo-MC-val-cit-PAB-MMAE é preparado pela conjugaçãode qualquer um dos anticorpos aqui fornecida com MC-val-cit-PAB-MMAEseguindo o protocolo fornecido para a preparação do Ab-MC-MMAE.
O anticorpo-MC-val-cit-PAB-MMAF é preparado pela conjugaçãode qualquer um dos anticorpos aqui fornecida com MC-val-cit-PAB-MMAFseguindo o protocolo fornecido para a preparação do Ab-MC-MMAE.
O anticorpo-SMCC-DM1 é preparado pela conjugação dequalquer um dos anticorpos aqui fornecido com o SMCC-DM1 da seguinteforma. O anticorpo é purificado com o derivado (Succinimidil 4-(N-maleimidometil) ciclohexano-1-carboxilato (SMCC, Pierce Biotechnology, Inc)para introduzir o Iigante SMCC. Especificamente, anticorpo é tratada a 20mg/ml em 50 mM de fosfato de potássio/ 50 mM de cloreto de sódio/ 2 mM deEDTA, em pH 6,5 com equivalente molar 7,5 de SMCC (20 mM em DMSO, 6,7mg/ml). Depois de agitar durante 2 horas sob argônio em temperaturaambiente, a reação é filtrada através de uma coluna Sephadex G25balanceada com 50mM de fosfato de potássio/ 50 mM de cloreto de sódio/ 2mM de EDTA, em pH 6,5. As frações contendo o anticorpo são agrupadas edosadas.O anticorpo-SMCC preparado da seguinte maneira é diluído em50mM de fosfato de potássio/ 50 mM de cloreto de sódio/ 2 mM de EDTA, empH 6,5, para uma concentração final de cerca de 10 mg/ml, e reagido com umasolução de 10 mM de DM1 em dimetilacetamida. A reação é agitada àtemperatura ambiente, sob argônio por 16,5 horas. A mistura da reação deconjugação é filtrada através de uma coluna de filtração em gel Sephadex G25(1,5 χ 4,9 cm) com 1 χ PBS em pH 6,5. A relação de droga DM1 paraanticorpos (p) pode ser de cerca de 2 a 5, mensurada pela absorbância a 252nm e a 280 nm.
O Ab-SPP-DMI é preparado pela conjugação de qualquer um dosanticorpos aqui fornecido com SPP-DM1 da seguinte forma: O anticorpoderivado é purificado com N-succinimidil-4-(2-piridiltio) pentanoato paraintroduzir grupos ditiopiridil. O anticorpo (376,0 mg, 8 mg/ml) em 44,7 ml detampão fosfato de potássio 50 mM (pH 6,5) contendo NaCI (50 mM) e EDTA (1mM) é tratado com SPP (5,3 equivalente molar em 2,3 ml de etanol). Apósincubação de 90 minutos, sob argônio em temperatura ambiente, a mistura dareação é filtrada através de uma coluna de gel Sephadex G25 balanceada com35 mM de citrato de sódio, 154 mM de NaCI1 2 mM de tampão EDTA. Asfrações contendo o anticorpo foram agrupadas e mensuradas. O grau demodificação do anticorpo é determinado tal como descrito acima
O anticorpo-SPP-Py (cerca de 10 pmoles de grupos 2-tiopiridinaliberáveis) é diluído em 35 mM de tampão citrato de sódio, pH 6,5, para umaconcentração final de cerca de 2,5 mg/ml. DM1 (1,7 equivalentes, 17 pmoles)em 3,0 mM dimetilacetamida (DMA, 3% v/v na mistura final da reação) é entãoadicionado à solução do anticorpo. A reação procede à temperatura ambiente,sob argônio por cerca de 20 horas. A reação é carregado em uma coluna defiltração em gel Sephacryl S300 (5,0 cm χ 90,0 cm, 1,77 L) balanceada com 35mM de citrato de sódio, NaCI 154 mM, pH 6,5. A velocidade de fluxo pode serde cerca de 5,0 ml/min e 65 fracções (20,0 ml cada) são recolhidos. O númerode moléculas da droga DM1 ligadas à molécula de anticorpo (p') é determinadopela medição da absorbância a 252 nm e 280 nm, e pode ser de cerca de 2 a 4moléculas da droga DM1 por moléculas de anticorpo 2H9.
O anticorpo-BMPEO-DM1 é preparado pela conjugação dequalquer um dos anticorpos aqui fornecido com BMPEO-DM1 da seguinteforma. O anticorpo é modificado pelo reagente bis-maleimido BM(PEO)4(Pierce Chemical), deixando um grupo maleimido não reagido sobre asuperfície do anticorpo. Este pode ser obtido pela dissolução de BM(PEO)4,em uma mistura de 50% de etanol/água a uma concentração de 10 mM eacrescentando um excesso molar dez vezes superior a uma solução contendoos anticorpos em tampão fosfato na concentração de aproximadamente 1,6mg/ml ( 10 micromolar) e permitindo reagir durante 1 hora para formar umIigante do anticorpo intermediário, de 2H9-BMPEO. O excesso de BM(PEO)4 éremovido porfiltração em gel (coluna HiTrap1 Pharmacia), em 30 mM de citrato,pH 6 com 150 mM de tampão NaCI. Um excesso molar 10 vezes superior deDM1 é dissolvido em dimetil acetamida (DMA) e acrescentado ao 2H9-BMPEO.Dimetil Formamida (CPO) também pode ser utilizado para dissolver oagrupamento reagente da droga. A mistura da reação permanece reagindoovernight em seguida é filtrado ou sofre diálise em gel em PBS para remover oDM1 que não reagiu. A filtração em colunas de gel em PBS S200 é utilizadapara remover alto peso molecular agregados, e fornecer o 2H9-BMPEO-DM1purificado.
Anticorpos Derivativos
Os anticorpos da invenção podem ainda ser modificados paraconter moléculas adicionais não-proteinácias que são conhecidos na técnica eprontamente disponíveis. Em um exemplo de realização, as moléculasadequadas para derivatização do anticorpo são polímeros hidrossolúveis.Exemplos não Iimitantes de polímeros hidrossolúveis incluem, mas não selimitando a, polietilenoglicol (PEG)1 copolímeros de etileno-glicol/propilenoglicol,carboximetilcelulose, dextrano, álcool polivinílico, policloreto pirrolidona, poli-1,3-dioxolano, poli-1,3,6-trioxano, copolímero etileno/maleica anidrido,poliaminoácidos (homopolímeros ou copolímeros aleatórios), e dextrano ou poli(n-vinil pirrolidona) polietileno-glicol, homopolímeros de propropileno glicol, co-polímeros de oxido de prolipropileno óxido de etileno, poliálcool polióis (porexemplo, glicerol), álcool polivinílico, e suas misturas. O polietilenoglicolpropionaldeído pode ter vantagens no processo de fabricação devido à suaestabilidade na água. O polímero pode ser de qualquer peso molecular, e podeser ramificada ou sem ramificação. O número de polímeros acoplados poranticorpo pode variar, e se mais de um polímero encontra-se anexo, ospolímeros podem ser a mesma molécula ou moléculas diferentes. Em geral, onúmero e/ou tipo de polímeros utilizado para derivatização pode serdeterminado com base em considerações, incluindo mas não limitado-se a,propriedades específicas ou funções do anticorpo a ser melhorado, se osanticorpos derivados serão utilizados no âmbito de uma terapia, etc.
Em outro exemplo de realização, são fornecidos conjugados deanticorpo e grupamento não-proteinácio que podem ser seletivamenteaquecida por exposição à radiação. Em um exemplo de realização, ogrupamento não-proteinácio é um nanotubo de carbono (Kam et ai, Proc. NatiAcad. Sei. 102: 11600-11605 (2005)). A radiação pode ser de qualquercomprimento de onda, e inclui, mas não se limita a, comprimento de ondas quenão prejudicam células normais, mas que aquece o grupamento não-proteinácio a uma temperatura no qual as células próximas ao conjugadoanticorpo-agrupamento não-proteinácio são mortas.
Formulações Farmacêuticas
Formulações terapêuticas compreendendo o anticorpo dainvenção são preparadas são preparadas para o armazenamento através damistura de um anticorpo que tenha o grau desejado de pureza com veículos,excipientes ou estabilizantes farmaceuticamente aceitáveis opcionais(Remington's Pharmaceutical Sciences, 16a edição, Osol, A. Ed. (1980)), naforma de formulações liofilizadas, soluções aquosas ou outras formulaçõessecas. Veículos, excipientes ou estabilizantes aceitáveis são atóxicos parapacientes nas dosagens e concentrações empregadas e incluem tampões taiscomo fosfato, citrato e outros ácidos orgânicos, antioxidantes que incluemácido ascórbico e metionina; conservantes (tais como cloreto deoctadecildimetilbenzilamônio, cloreto de hexametônio, cloreto de benzalcônio,cloreto de benzetônio; álcool fenólico, butílico ou benzílico; alquilparabenos taiscomo metil ou propilparabeno; catecol; resorcinol; cicloexanol; 3-pentanol emeta-cresol); polipeptídeos de baixo peso molecular (menos de cerca de 10resíduos); proteínas, tais como albumina de soro, gelatina ou imunoglobulinas;polímeros hidrofílicos, tais como polivinilpirrolidona; aminoácidos, tais comoglicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina ou lisina; monossacarídeos,dissacarídeos e outros carboidratos, incluindo glicose, manose ou dextrinas;agentes quelantes tais como EDTA; açúcares, tais como sacarose, manitol,trealose ou sorbitol; contra-íons formadores de sais tais como sódio; complexosmetálicos (por exemplo, complexos protéicos de Zn); e/ou tensoativos não-iõnicos, tais como TWEEN™, PLURONICS™ ou polietilenoglicol (PEG).
A formulação da presente invenção pode também conter mais deum composto ativo, conforme necessário para a indicação específica sendotratada, preferencialmente, ditos compostos apresentam atividadescomplementares que não prejudica um ao outro. Tais moléculas sãoapresentadas de forma apropriada em combinação em quantidade que sãoeficazes para o propósito pretendido.
Os ingredientes ativos podem também ser armazenados emmicrocápsulas preparadas, por exemplo, através de técnicas conservação oupolimerização interfacial, tais como microcápsulas de hidroximetilcelulose oumicrocápsulas de gelatina e de poli-(metacrilato de metila), respectivamente,em sistemas de fornecimento de drogas coloidais (por exemplo, lipossomos,microesferas de albumina, microemulsões, nanopartículas e nanocápsulas), ouem macroemulsões. Ditas técnicas são descritas em Remington'sPharmaceutical Sciences, 16a edição, Osol, A. Ed. (1980).
As formulações a serem utilizadas para administração in vivodeve ser estéril. O que é seguido por filtração através das membranas defiltração.
Podem ser fabricadas preparações de liberação prolongada.Exemplos apropriados de preparações de liberação prolongada incluemmatrizes semipermeáveis de polímeros hidrofóbicos sólidos que contenham oanticorpo, que se encontram na forma de artigos moldados, tais como filmes oumicrocápsulas. Exemplos de matrizes de liberação prolongada incluempoliésteres, hidrogéis (tais como poli-(metacrilato de 2-hidroxietila) ou álcoolpoli-(vinílico)), poli-lactídeos (patente US 3.773.919), copolímeros de ácido L-glutâmico e L-glutamato de g etila, acetato de etilenovinila não-degradável,copolímeros degradáveis de ácido láctico e ácido glicólico, tal como LUPRONDEPOT™ (microesferas injetáveis compostas de copolímero de ácido láctico eácido glicólico e acetato de leuprolide) e ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutírico.
Embora polímeros tais como etilenovinilacetato e ácido láctico-ácido glicólicopermitam a liberação de moléculas por mais de 100 dias, certos hidrogéisliberam proteínas por períodos de tempo mais curtos. Quando anticorposencapsulados permanecem no organismo por um longo período de tempo, elespodem desnaturas ou agregar como resultado da exposição à umidade a 37°C,resultando em uma perda da atividade biológica e possíveis mudanças naimunogenicidade. Estratégias racionais podem ser planejadas paraestabilização, dependendo do mecanismo envolvido. Por exemplo, se omecanismo de agregação for descoberto para ser a formação de ligação S-Sintermolécula através intercadeia tio-sulfeto, a estabilização pode seralcançada por resíduos sulfidrila, liofilização de soluções ácidas, controle doteor da umidade, utilizando aditivos apropriados, e desenvolvimento decomposições matrizes de polímero específicas
Uso
Um anticorpo da invenção pode ser utilizado, por exemplo, invitro, ex vivo e em métodos terapêuticos in vivo. Os anticorpos da invençãopodem ser usados como um antagonista para bloquear parcial ou totalmente aatividade específica do antígeno in vitro, ex vivo e/ou in vivo. Além disso, pelomenos alguns dos anticorpos da invenção podem neutralizar a atividade doantígeno de outras espécies. Assim, os anticorpos da invenção podem serusados para inibir a atividade de um antígeno específico, por exemplo, em umacultura celular contendo os antígenos, em seres humanos ou em outrosmamíferos, em indivíduos que tenham o antígeno com o qual um anticorpo dainvenção reage cruzadamente (por exemplo, chimpanzé, babuíno, mico,cinomolgo e Rhesus, porco ou camundongo). Em um exemplo de realização, oanticorpo da invenção pode ser usado para inibir a atividade do antígenoexpondo o anticorpo com o antígeno de tal maneira que a atividade doantígeno é inibida. Em um exemplo de realização, o antígeno é uma moléculade proteína humana.
Em um exemplo de realização, um anticorpo da invenção podeser usado em um método para inibir um antígeno em um paciente que sofre deuma doença na qual a atividade do antígeno é prejudicial, compreendendo emadministrar ao paciente um anticorpo da invenção na qual a atividade doantígeno do paciente é inibida. Em um exemplo de realização, o antígeno éuma molécula de proteína humana e o paciente é um paciente humano.Alternativamente, o paciente pode ser um mamífero que expressa o antígenocom o qual o anticorpo da invenção se liga. Adicionalmente, o paciente podeser um mamífero no qual foi introduzido o antígeno (por exemplo, aadministração do antígeno ou a expressão de um antígeno transgênico). Oanticorpo da invenção pode ser administrado a um paciente humano para finsterapêuticos. Além disso, o anticorpo da invenção pode ser administrado a ummamífero não-humano que expressa o antígeno com o qual o anticorpo se ligapor reação cruzada (por exemplo, um primata, porco ou rato) para finsveterinários ou como um modelo animal de doenças humanas. Com relação aeste último citado, esses modelos animais podem ser úteis para avaliar aeficácia terapêutica dos anticorpos da invenção (por exemplo, testes dedosagens e curso de tempo da administração). Os anticorpos da invençãopodem ser usados para tratar, inibir, atrasar a progressão, prevenir/atrasar areincidência, atenuar ou prevenir doenças, afecções ou condições associadasà expressão anormal e/ou atividade de RELT, incluindo, mas não se limitado a:distúrbios da proliferação celular, infecções, doenças imunes/inflamatórias eoutros distúrbios relacionados com o interferon.
Em um aspecto, um anticorpo de bloqueio da invenção éespecífico para RELT, e inibe a atividade normal bloqueando ou interferindo nainteração entre a RELT e um ou mais Iigantes de RELT, inibindo assim a via desinalização correspondente e outros eventos moleculares ou celularesassociados.
Em um exemplo de realização especifico um imunoconjugado quecompreende um anticorpo com um agente citotóxico é administrado aopaciente. Em alguns exemplos de realização, o imunoconjugado e/ou oantígeno ao qual este está ligado é internalizado pela célula, resultando emaumento da eficácia terapêutica do imunoconjugado na morte de células a qualse liga. Em uma realização preferida, o agente citotóxico se combina ouinterfere com o ácido nucléico em células cancerosas. Exemplos de ditosagentes citotóxicos incluindo agentes quimioterápicos citados no presente (porexemplo, matasinóides ou caliquiamicinas), isótpos radioativos ouribonucleases e endonucleases de DNA.
Os anticorpos da invenção podem ser utilizados isoladamente ouem combinação com outras composições em uma terapia. Por exemplo, umanticorpo da invenção pode ser co-administrado com outro anticorpo, e/ouagentes adjuvantes / agentes terapêuticos (por exemplo, esteróides). Porexemplo, um anticorpo da invenção pode ser combinado com umantiinflamatório e/ou anti-séptico, em um esquema de tratamento, por exemplo,no tratamento de uma das doenças descritas no presente, incluindo, câncer,doenças musculares, doenças genéticas relacionadas com a via da ubiquitina,desordens imunes/inflamatórias, distúrbios neurológicos e outras doençasligadas a via da ubiquitina. Esta terapia combinada referida acima inclui aadministração combinada (onde dois ou mais agentes estão incluídos namesmo ou em formulações distintas), administração separada, e nesse caso, aadministração do anticorpo da invenção pode ocorrer antes, e/ou após aadministração da terapia ou terapias adjuntas
O anticorpo da invenção (e agente terapêutico adjunto) podem seradministrado por qualquer meio apropriado, que inclui parenteral, subcutâneo,intraperitoneal, intrapulmonar e intranasal e, se desejado para tratamento local,administração intralesional. As infusões parenterais incluem administraçãointramuscular, intravenosa, intraarterial, intraperitoneal ou subcutânea. Alémdisso, o antagonista é administrado adequadamente por meio de infusão nopulso, particularmente com doses decrescentes do antagonista.
Preferencialmente, a dosagem é fornecida por meio de injeções, de maiorpreferência injeções intravenosas ou subcutâneas, dependendo, em parte dese a administração é rápida ou crônica.A localização do alvo de ligação do anticorpo da invenção podeser tomado em consideração na elaboração e administração do anticorpo.Quando o alvo de ligação é uma molécula intracelular, certas realizações ainvenção oferece um anticorpo ou fragmento de ligação do mesmo a serintroduzido na célula onde está localizado alvo de ligação. Em um exemplo derealização, o anticorpo da invenção pode ser expresso intracelularmente comoum "intracorpo". O termo "intracorpo" da forma como utilizado no presente,refere-se a um anticorpo ou porção de ligação ao antígeno deste que éexpresso intracelularmente e é capaz de se ligar seletivamente à molécula-alvo, como descrito em Marasco, GeneTherapy 4:11-15(1997 ); Kontermann,Methods 34:163-170 (2004); Patentes US 6.004.940 e US 6.329.173; Pedidode Patente US 2003/0104402, e Documento W02003/077945. A expressãointracelular de uma intracorpo é efetuada através da introdução de um ácidonucléico que codifica o anticorpo ou porção de ligação do antígeno deste (quenão possua o líder seqüência do tipo selvagem e sinais secretoresnormalmente associados com o gene que codifica anticorpo ou porção deligação do antígeno deste) em uma célula alvo. Qualquer método padrão paraa introdução de ácidos nucléicos em uma célula pode ser utilizado, incluindo,mas não se limitando a, microinjecção, injeção balística, eletroporação,precipitação em fosfato de cálcio, lipossomos, transfecções retrovirais,adenoviral, vírus adeno-associados que transportam vetores e vacinas com osácidos nucléicos de interesse. Um ou mais ácidos nucléicos que codificam todoou parte do anticorpo anti-RELT da invenção pode ser entregue a uma célula-alvo, de tal forma que um ou mais intracorpos são expressos e são capazes dese ligar intracelularmente ao RELT e modular uma ou mais via celular mediadapelo RELT.
Em outro exemplo de realização, a internalização de anticorpos éfornecida. Os anticorpos podem possuir algumas características que aumentama entrega de anticorpos nas células, ou podem ser modificados para possuíremessas características. As técnicas para se alcançar este objetivo sãoconhecidas no estado da arte. Por exemplo, cationização de um anticorpo éconhecida por facilitar a sua utilização em células (vide, por exemplo, PatenteUS 6.703.019). Lipofecções ou Iipossomas também podem ser utilizadas paraentregar os anticorpos nas células. Quando fragmentos de anticorpos sãoutilizados, é geralmente vantajoso o menor fragmento de anticorpos inibitórioque se liga especificamente ao domínio de ligação da proteína alvo. Porexemplo, baseado nas seqüências de regiões variáveis de um anticorpo,moléculas de peptídeo que retém a capacidade de se ligar à seqüência deproteína alvo podem ser designadas. Ditos peptídeos podem ser sintetizadosquimicamente e/ou produzidos a partir da tecnologia de DNA recombinante.Vide, por exemplo, Marasco et ai, Proc. Nati Acad. Sei. USA, 90: 7889-7893(1993).
Entrada de um polipeptídeo modulador na célula alvo pode serreforçada por métodos conhecidos. Por exemplo, algumas seqüências, comoos derivados do proteína Tat do HIV ou da Antennapedia homeodomain sãocapazes de orientar a eficiente absorção de proteínas heterólogas em toda amembrana celular. Vide, por exemplo, Chen et ai, Proc. Natl. Acad. Sei. USA.(1999), 96:4325-4329.
Quando o alvo de ligação está localizado no cérebro, certasrealizações da invenção prevêem que o anticorpo ou fragmento de ligação aoantígeno atravessa a barreira hematoencefálica. Certas doenças neuro-degenerativas estão associadas com um aumento na permeabilidade dabarreira hematoencefálica, de tal forma que o anticorpo ou fragmento deligação ao antígeno pode facilmente ser introduzido no cérebro. Quando abarreira hematoencefálica permanece intacta, vários abordagens bemconhecidas no estado da técnica existem para o transporte de moléculas,incluindo, mas não se limitado a, métodos físicos, métodos a à base de lipídios,e métodos de receptores à base de canal.
Métodos físicos para o transporte do anticorpo ou fragmento deligação ao antígeno em toda a barreira hematoencefálica incluem, mas não selimita a, contornar a barreira hematoencefálica, inteiramente, ou através dacriação de aberturas na barreira hematoencefálica. Métodos de evasão queincluem, mas não se limitam a, injeção direta no cérebro (vide, por exemplo,Papanastassiou et ai GeneTherapy, 9: 398-406 (2002)), e um implante de umdispositivo de entrega no cérebro (vide, por exemplo, Gill et ai, Nature Med.9:589-595 ( 2003); e Gliadel Wafers™, Guildford Pharmaceutical). étodos decriação de aberturas na barreira hematoencefálica incluem, mas não se limitama, ultra-som (vide, por exemplo, Patente Publicada 2002/0038086), pressãoosmótica (por exemplo, através da administração de manitol hipertônico(Neuwelt, EA, Implication of the Blood-Brain Barrier and its Manipulation, Vol 1e 2, Plenum Press, Nova Iorque (1989)), permeabilização, por exemplo, porbradicinina ou permeabilizante A-7 (vide, por exemplo, Patentes US 5.112.596,US 5.268.164, US 5.506.206 e Us 5.686.416), E transfecções de neurôniosque transpõe a barreira hematoencefálica com vetores contendo genes quecodificam o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno (vide, por exemplo,Patente Publicada 2003/0083299).
Métodos baseados em lipídeos para o transporte do anticorpo oufragmento de ligação ao antígeno por toda a barreira hematoencefálicaincluem, mas não se limitam a, englobar o anticorpo ou fragmento de ligaçãoao antígeno em Iipossomas que estão atreladas ao anticorpo ou fragmento deligação ao antígeno que se ligam aos receptores sobre o endotélio vascular dabarreira hematoencefálica (vide, por exemplo, Pedido e Patente US20020025313), e o revestimento do anticorpo ou fragmento de ligação aoantígeno em partículas lipoproteína de baixa densidade (vide, por exemplo,Pedido de Patente US 20040204354) ou apo-lipoproteína E (vide, por exemplo,Pedido de Patente US 20040131692).
Os métodos baseados em receptores e canais de transporte doanticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno por toda a barreirahematoencefálica incluem, mas não estão limitados a, utilização debloqueadores glicocorticóide para aumentar a permeabilidade da barreirahematoencefálica (vide, por exemplo, pedidos de Patentes US 2002/0065259,US 2003/0162695, US 2005/0124533); ativando canais de potássio (vide, porexemplo, pedido de Patente US 2005/0089473), drogas inibidoras detransportadores ABC (vide, por exemplo, pedido de Patente US2003/0073713); anticorpos com um revestimento de transferrina que modulama atividade de um ou mais receptores de transferrina (vide, por exemplo,pedido de Patente US 2003/0129186), e anticorpos cationizantes (vide, porexemplo, Patente US 5.004.697).
A composição de anticorpo deve ser formulada, dosada eadministrada de uma forma consistente com as boas práticas médicas. Fatorespara consideração neste contexto incluem a disfunção particular a ser tratada,o mamífero particular a ser tratado, a condição clínica do paciente, a cousa dadisfunção, o sítio de fornecimento do agente, o método de administração, asincronização de administração e outros fatores conhecidos. O anticorpo nãoprecisa ser, mas é opcionalmente formulado com um ou mais agentenormalmente utilizados para prevenir ou tratar a disfunção em questão. Aquantidade eficaz destes outros agentes depende da quantidade do anticorpopresente na formulação, do tipo de disfunção ou tratamento, e outros fatoresdiscutidos acima. Estes são geralmente utilizados nas mesmas dosagens ecom vias de administração conforme descritas acima ou cerca de 1 a 99% dasdosagens descritas no presente, ou em qualquer dosagem e por qualquer viade administração descrita que é empiricamente/ clinicamente determindadacomo sendo apropriada.
Para a prevenção ou tratamento de doença, a dosagemapropriada de anticorpo (quando utilizado isoladamente ou em combinaçãocom outros agentes tais como agentes quimioterápicos) dependerá do tipo dedoença a ser tratado, do tipo de antagonista, da severidade e do curso dadoença, se o antagonista é administrado para propósitos preventivos outerapêuticos, terapia anterior, histórico clínico do paciente e reação aoantagonista e do critério do médico atendente. O anticorpo é adequadamenteadministrado ao paciente em uma vez ou ao longo de uma série detratamentos. Dependendo do tipo e da severidade da doença, cerca de 1 pg/kga 15 mg/kg (tal como 0,1 mg/kg a 10 mg/kg) de anticorpo é uma possível doseinicial para administração ao paciente, seja, por exemplo, por meio de uma oumais administrações separadas ou por meio de infusão contínua. Umadosagem diária típica poderá variar de cerca de 1 pg/kg a 100 mg/kg ou mais,dependendo dos fatores mencionados acima. Para administrações repetidas aolongo de vários dias ou mais, dependendo da condição, o tratamento é mantidoaté que ocorra supressão desejada de sintomas da doença. Uma dosagemexemplar do anticorpo estará na faixa de cerca de 0,05 mg/kg a cerca de 10mg/kg. Desta forma, uma ou mais doses de cerca de 0,5 mg/kg, 2,0 mg/kg, 4,0mg/kg ou 10 mg/kg (ou qualquer de suas combinações) podem seradministradas ao paciente. Essas doses podem ser administradasintermitentemente, tal como semanalmente ou a cada três semanas (porexemplo, de tal forma que o paciente receba cerca de duas a cerca de vinte, talcomo cerca de seis doses do anticorpo). Uma dose de ataque inicial mais alta,seguida por uma ou mais doses mais baixas, pode ser administrada. Exemplode regime de dosagem compreende a administração de uma dose de ataqueinicial de cerca de 4 mg/kg, seguida por dose de manutenção semanal de cercade 2 mg/kg do anticorpo. Entretanto, outros regimes de dosagens podem serúteis. O andamento desta terapia é facilmente monitorado por meio de técnicase testes convencionais.
Artigos Manufaturados
Em outro aspecto da invenção, um artigo manufaturado, contendoos materiais úteis para o tratamento, prevenção e/ou diagnóstico dasdesordens acima descritas são fornecidos. O artigo manufaturado consta deum recipiente e rótulo ou uma bula sobre ou associado ao recipiente. Osrecipientes apropriados incluem, por exemplo, frascos, seringas, blisters, etc.Os recipientes podem ser feitos de uma variedade de materiais tais como ovidro ou o plástico. O recipiente guarda uma composição a qual está sozinhaou está combinada com outra composição eficaz para tratar prevenir e/oudiagnosticar a condição e que possa ter uma porta de acesso estéril (porexemplo, o recipiente pode ser um bolsa de solução intravenosa ou um frascoque possui um controlador (stopper pierceable) colocado através de umaagulha de injeção hipodérmica). Pelo menos um agente ativo na composição éum anticorpo da invenção. O rótulo ou a bula indicam que a composição é útilpara o tratamento de escolha. Adicionalmente, o artigo manufaturado podecompreender (a) um primeiro recipiente com uma composição nele contida,onde a composição compreende um anticorpo da invenção, e (b) um segundorecipiente com uma composição nele contida que compreende um agentecitotóxico ou outro agente terapêutico. O artigo manufaturado nesta realizaçãoda invenção pode ainda compreender um folheto informativo que indique queas composições podem ser usadas para tratar um caso especial.
Alternativamente, ou adicionalmente, o artigo manufaturado pode aindacompreende de um segundo (ou terceiro) recipiente contendo um tampãofarmaceuticamente aceitável, como água bacteriostática para injeção (BWFI),solução salina tamponada com fosfato, solução de Ringer e solução dedextrose. Pode-se incluir ainda outros materiais desejáveis a partir de umaperspectiva comercial e de uso, que inclui outros tampões, diluentes, filtros,agulhas e seringas.
Os seguintes são exemplos de métodos e composições dainvenção. Entende-se que vários outros exemplos de realização podem serpraticados, dada a descrição geral fornecido acima.
Exemplos
Exemplo 1
Produção ε Caracterização de Anticorpos Monoclonais Anti-RELT
(a) Seleção da Biblioteca
Clones exibidos por fagos expressando bibliotecas de Fab12humanizado foram selecionados pela sua capacidade de se ligar a proteína defusão Fc-RELT, como descrito anteriormente (Lee et ai, J. Moi Biol. 340:1073-1093 (2004) e Pedido de Patente US publicada n° 2005/0106667). Asbibliotecas de anticorpo exibidas por fago contem aminoácidos aleatorizadosem todas as três CDRs de cadeia pesada, e foram baseadas no anticorpo 4D5humanizado. Outras regiões variáveis da região estrutural consenso de cadeialeve e pesada estão definidas nas Figuras 1 e 2, respectivamente, e a regiãoestrutural do anticorpo 4D5 é exibida na Figura 3. Certas variantes daseqüência da região estrutural do 4D5 também são conhecidas, como émostrado na Figura 4.
Após quatro ciclos de seleção, oito clones positivos foramisolados. Os clonas de fago Fab2 foram reformatados, amplificando osfragmentos por PCR e feito o splicing nestes em um IgGI construído paraproduzir um IgGI humano completo. Os oito mAb anti-RELT mAbs foram entãopurificados a partir do sobrenadante de células CHO e marcados com biotina(Pierce). A produtividade das oito linhagens de células CHO variou em cerca de8000 ng/ml a 18000 ng/ml, com o mAb H7 sendo produzido em quantidadesmais baixas e o mAbF4 sendo produzido em quantidades mais altas.As cadeias leves e pesadas de cada mAb foram seqüenciadas.Os CDRs para as cadeias pesadas aparecem na Figura 5. As cadeias levespara cada mAb eram idênticas a seqüência da cadeia leve para o anticorpomonoclonal 4D5-8 humano modificado (SEQ ID No: 2).
(b) Caracterização do μAb Anti-REALT
Ligação à Superfície da Célula
A ligação de cada um dos anticorpos em células que expressamRELT na superfície celular foi avaliada. Células de rins de filhotes de hamster(BHK) transfectadas com cDNA falso (controle) ou de RELT murino forammarcados por coloração separadamente com cada anticorpo anti-RELT no gelodurante 30 minutos. As células foram lavadas com tampão fosfato (PBS) e,posteriormente incubadas com anticorpos anti-lgG humano PE-marcados. Aintensidade de fluorescência das células foram avaliadas por FACSCaIibur (BDScience), seguido pela análise no Cell Quest (BD Science).
Nenhum dos oito anticorpos se ligou especificamente as célulasBHK controle, mas cada anticorpo se ligou especificamente as células BHKtransfectadas com cDNA RELT (vide Figura 6). A ligação específica de cincodos oito anticorpos (F4, C10, H7, H9 e H11) foi também observada nosesplenócitos de camundongo que expressam RELT (Figura 7), utilizando omesmo protocolo, como descrito para a transfecção e ligação das células BHK,acima. Os três mAb anti-RELT que possuíam ligação mais forte aosesplenócitos de camundongo que expressam RELT (H7, H9 e H11) não seligaram aos esplenócitos de camundongos relt -I- (Figura 7, linha inferior).
(2) Relação entre Anticorpos Anti-RELT ε Ativação do Nf-kB
O efeito dos anticorpos anti-RELT na ativação do NF-κΒ nascélulas foi avaliado. Células HEK293 foram transfectadas com a dose indicadade cDNA RELT-xedar (o domínio extracelular de RELT murino e o domíniocitoplasmático do xedar). Após doze horas, cada anticorpo anti-RELT foiadicionado a uma cultura distinta em uma concentração de 10 pg/ML, e ascélulas foram incubadas durante 24 horas. A atividade da Luciferase foimensurada por um kit de dupla-marcação (Dual-Luciferase® Repórter AssaySystems) (Promega). Cada um dos anticorpos anti-RELT estimulou a produçãode NF-κΒ em células de forma dose-dependente (Figura 8), embora em grausdiferentes. A menor estimulação (cerca de 7 vezes para 5ng de RELT-xedar ecerca de 22 vezes para 25 ng de RELT-xedar) foi observada com o anticorpoanti-RELT F4, e o maior estímulo (cerca de 20 vezes para a 5 ng de RELT-xedar e cerca de 50-60-vezes para 25 ng RELT-xedar) foi observada com omAbs C10, H9 e H11.
(3) Afinidade dos Anticorpos Anti-RELT para RELT Murino
Para determinar as afinidades de cada um dos anticorpos anti-RELT para RELT, foi realizado em cada um dos clones um ELISA porcompetição de ligação baseado em fago para cada anticorpo anti-RELTimobilizado, na presença de quantidades tituladas de RELT murino. Placas de96 poços Maxisorp Immunoplates (NUNC) foram revestidas overnight a 4°Ccom RELT murino a ma concentração de 2 pg/ml em PBS contendo 0,5% deBSA e 0,05% de Tween-20 (PBT) por duas horas a temperatura ambiente.
Diluições seriadas dos fagos exibindo os anticorpos anti-RELT em PBT foramincubados nas placas revestidas com o antígeno durante 15 minutos àtemperatura ambiente. As placas foram lavadas com PBS contendo 0,05% deTween 20 ("PBST"). A ligação do fago foi detectada com o anticorpomonoclonal anti-M13 marcado com peroxidase de rábano silvestre (AmershamPharmacia) diluído 1:5000 em PBT, e desenvolvido com o substrato 3,3', 5,5'-tetrametílbenzidina (TMB, Kirkegaard & Perry Labs, Gaithersburg, MD) poraproximadamente 5 minutos, e apagadas com 1,0 M H3PO4, A leitura daabsorbância foi determinada espectrofotometricamente a 450 nm. Asafinidades dos anticorpos variou entre 4 nM (paa mAb H11) a 250 nM (paraMab Η7), como exibido na Tabela B.
Tabela B
Dados da Afinidade do Anticorpo Anti-RELT
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(4) Análise de BIAcore®
A afinidade do anticorpo monoclonal anti-RELT H11 para RELT foiainda avaliada pelo ensaio de ressonância plasmônica de superfície (SRP)utilizando BIAcore ® 3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ). Chips debiosensores de destrano carboximetilados (CM5, BIAcore Inc.) são ativadoscom cloridrato de N-etil-N'-(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida (EDC) e N-hidroxisucinimida (NHS) de acordo com as instruções do fornecedor. Oanticorpo anti-RELT H11 é diluído com 10 mM de acetato de sódio, pH 4,8,para uma concentração de 5 pg/ml. O anticorpo anti-RELT H11 foi injetadosobre o chip de superfície derivatizado a uma velocidade de fluxo de 5μl/minuto para atingir aproximadamente 500 unidades de resposta (RU) deanticorpo que foi acoplado ao fluxo da superfície celular. Grupos que nãoreagiram foram bloqueados pela injeção de 1M de etanolamina. Diluiçõesseriadas RELT his-marcado murino (7.5nM a 500nM), em PBS contendo0,05% de Tween 20 foram injetados ao longo do fluxo de células H11-imobilizada a uma velocidade de fluxo de 25 pL/minuto em temperaturaconstante de 25 °C. A velocidade de associação (kon) e a velocidade dedissociação (k0ff) são calculadas utilizando um modelo de ligação simples um-para-um de Langmuir (BIAcore Evaluation Software version 3.2). A constantede dissociação em equilíbrio (Kd) é calculado como a relação IWIw Osvalores dos anticorpos anti-RELT-H11 para a interação com o RELT decamundongo foram os seguintes: kon: 1,52 χ 105 M"1s"1; k0ff: 1,24 χ 10"3 s"1; eKd: 8,13 χ 10"9 M.
(5) Reatividade Cruzada dos Anticorpos Anti-RELT com o RELT Humano
Foi determinada a capacidade do anticorpo anti-RELT H11 emreconhecer especificamente o RELT humano. Células HEK293 foramtransfectadas com controle um vetor controle ou cDNA RELT humano. Após aincubação de 48 horas, as células transfectadas foram colhidas e coradasutilizando anticorpo anti-RELT H11 biotinilado no gelo durante 30 minutos. Ascélulas foram lavados com PBS1 e coradas com avidina-PE e os anticorposmarcados indicados FITC- ou APC-. A intensidade de fluorescência das célulasforam avaliadas pela análise por FACS (FACSCaIibur (BD Science), seguidopela análise com CeIIQuest (BD Science)). Anticorpos H11 reconhecemespecificamente o RELT humano, como é exibido nas Figuras 10A e 10B,(comparar a Figura 10a com a Figura 10B).
Exemplo 2
a Expressão de Relt em Células Imunitárias
O anticorpo anti-RELT H11 foi utilizado como uma ferramentapara identificar o grau de expressão de RELT em diferentes células imunitáriasdo tipo selvagem de camundongos, incluindo células T, células B, esplenócitos. Células T foram purificadas do baço de camundongos C57/BL6 poresferas magnéticas (Miltenyi), e cultivadas com anti-CD3 e anti-CD28 (10Mg/ml), IFN-a (100 ng / mL), IFN-γ (100 ng/mL), IL-2 (100 U/ml), IL-4 (100ng/ml_), IL-6 (100 ng/mL), ou IL-12 e IL-18 (100 ng/ml) durante 48 horas parainduzir a diferenciação dos diferentes subtipos de células T (vide Figura 11). Ascélulas foram então incubadas com anticorpo anti-RELT H11 biotinilado no gelodurante 30 minutos. As células foram lavadas em PBS e incubadas com avidin-PE. A intensidade da fluorescência das células foi avaliada pelo FACSCaIibur(BD Science), seguido pela análise com Cell Quest (BD Science). O anticorpoH11 se liga especificamente as células T nativas e em cada uma daspopulações de células T tratadas, indicando que tanto células T nativas quantocélulas T tratadas expressam RELT.
As células B foram purificadas do baço de camundongos C57/BL6por esferas magnéticas (Miltenyi), e cultivadas com anti-lgM (10 pg/ml), anti-CD40 (10 Mg/ml), LPS (10 pg/mL), ou IL-4 (100 ng/mL) durante 48 horas parainduzir a diferenciação dos diferentes subtipos de células B (vide Figura 12). Ascélulas foram então incubadas com anticorpo anti-RELT H11 biotinilado no gelodurante 30 minutos. As células foram lavadas em PBS e incubadas com avidin-PE. A intensidade da fluorescência das células foi avaliada pelo FACSCaIibur(BD Science), seguido pela análise com Cell Quest (BD Science). O anticorpoH11 se liga especificamente as células B nativas e em cada uma daspopulações de células B tratadas, indicando que tanto células B nativas quantocélulas B tratadas expressam RELT.
Os esplenócitos foram isolados de camundongos C57/BL6 ecorados com anticorpo anti-RELT H11 biotinilado no gelo durante 30 minutos.As células foram lavadas com PBS e coradas com avidin-PE mais osanticorpos marcados indicados FITC- ou APC- (anti-CD3, anti-B220, anti-CD11b, e/ou anti-Br-1). A intensidade da fluorescência das células foi avaliadapelo FACSCaIibur (BD Science), seguido pela análise com Cell Quest (BDScience). Os resultados são exibidos na Figura 13. O anticorpo H11 se ligou amacrófagos e células T, sugerindo que estas populações de células expressamRELT. Não foram observadas forte ligação do H11 com células B, células NK1ou neutrófilos, sugerindo que essas populações de células não expressamRELT.
Exemplo 3
Interrupção Dirigida do RELT Em Camundongos ε os Efeitos daInterrupção de RELT nas Células Imunitárias em Desenvolvimento(A) Geração de Camundongos com RELT Interrompido
Camundongos com deficiência de RELT foram gerados com umvetor direcionado destinadas a eliminar o exon ll-V, que codifica osaminoácidos 17-210 do RELT (Vide Figura 14A). O vetor direcionado foiconstruído usando um clone relt genômico isolado a partir de uma biblioteca129/SvJ (Incyte Genomics) e eletroporado em células tronco embrionárias (ES)129 R1. ES heterozigóticas clone 18B7 foram identificadas por Southernblotting e microinjetadas em blastocistos de camundongos C57BL/6N.
Descendentes quiméricos foram retrocruzados com camundongos C57BL/6N.
Os camundongos mantiveram a seleção do cassete PGK-neo. A linhagemgerminal de relt interrompida foi confirmada por PCR1 Southern blotting (Figura14B), citometria de fluxo e análise de linfócitos T (Figura 11C). A PCR foirealizada utilizando o kit Expand Long Template PCR System (Roche), e oprímer 5' AGTAGAAGGTGGCGCGAAGG (SEQ ID No: 69), e 3'CTGCCCACAGACAAGATGGTAATCTC (SEQ ID No: 70), seguindo asinstruções do fabricante. O Southern blot foi realizado pela hibridização deDNAs digeridos com Ssp-I e Not-I para a sonda exibida na Figura 14A, que seliga seqüência 5' para o alvo construído. Os fragmentos de DNA de 12,9 e 7,1-kb observado na Figura 14B correspondem aos alelos de relt do tipo selvageme mutante, respectivamente. A análise por citometria de fluxo foi realizadacomo descrito acima no Exemplo 1 (b) (1).
Os camundongos com relt interrompido foram viáveis, férteis enasceram com a freqüência mendeliana esperada. Todos os experimentos foramrealizados com camundongos relt -I- e relt +/+ de 6 a 14 semanas de idadeutilizando protocolos aprovados pelo comitê de revisão institucional de Genentech.
(b) Análise do desenvolvimento de Células Τ. B ε NK em Camundongos comRELT Interrompido
Os linfócitos T nativos são conhecidos para expressarem RELT(vide Figura 11, Figura 15B). Por isso as propriedades do linfócito T relt -I -,foram investigadas. Baços de camundongos relt-l- e relt+/+ foram picados edigeridos com 1 mg/ml de colagenase A (Roche), conforme descritoanteriormente (Nakano et ai, J. Exp. Med. 194: 1171-1178 (2001)) . Para aanálise de citometria de fluxo da expressão de RELT na superfície,esplenócitos foram preparados pela incubação em 20 mM de EDTA-PBSdurante 30 minutos para evitar a degradação proteolítica do epítopo do mABanti-RELT. As células foram bloqueadas com anti-CD16/32 (2.4G2) e, emseguida, foi realizada uma marcação dupla ou tripla com várias combinaçõesdos seguintes anticorpos: CD3 (145-2C11), CD4 (RM4-5), CD8 (53-6,7),CD11b (M1/70), CD11c (HL3), CD45RB (16A), CD80 (IG10), CD86 (GL1), I-Ab(AF6-120.1), B220 (RA3-6B2) e DX5 (todas da BD PharMingen). A ligação doanticorpo biotinilado foi revelada pela adição de estreptoavidina-PE (BDPharmingen). Iodeto de propídio foi usado para excluir células mortas. Ascélulas foram analisadas utilizando um sistema FACSCaIiber (BD Science).
Não foram observadas diferenças evidentes no número de célulasT ou de sua representação proporcional entre as células esplênicas imunitáriasentre camundongos relt-l- e camundongos relt+l+. O número de células T notimo, Iinfonodos e baço foram comparáveis entre camundongos relt-l- e relt +1+(vide Figura 15A). A análise por citometria de fluxo das células marcadas comanticorpos CD4, CD8, CD25 e CD44 não revelaram diferenças na abundânciade vários subgrupos de células T (vide Figura 15C).A proliferação dos linfócitos T1 tanto em células relt-/- quanto emcélulas relt +/+ em resposta ao anti-CD3 foi avaliada por um ensaio deincorporação de timidina marcada com trítio. As células T purificadas decamundongos tipo selvagem e camundongos relt-/- foram cultivadas com aquantidade indicada de anticorpos anti-CD3 isoladamente (Figura 15D, painelesquerdo), ou em conjunto com o anticorpo anti-CD28 aplicado à placa, numaconcentração de 10pg/mL da solução de revestimento (Figura 15D, paineldireito). A proliferação das células em resposta ao anticorpo ou anticorpos foimensurada pela incorporação de [3H]-timidina (vide Coligen et ai, Eds.,Current Protocols in Immunology, Nova Iorque: Wiley1 1991). Os resultadosmostraram que células T relt-/- proliferaram de forma similar a células T do tiposelvagem. Os linfócitos T relt-/- e relt+/+ também não exibiram diferenças naprodução de IL-2 e IFN-γ. Em conjunto, os resultados de todos os ensaiosanteriores sugeriram que RELT não é necessário para o desenvolvimento e aproliferação normal da célula T.
Os linfócitos B e células natural killer (células NK) expressarpouco, ou nenhum RELT na superfície celular (Figura 15B, painel central e adireita, Figura 12 e Figura 13). O número de linfócitos B e células NK foisemelhante nos baços dos camundongos relt-/- e relt +/+, tal como mensuradopela análise de citometria de fluxo (Figura 15A). Análises extensivas porcitometria de fluxo de células da medula óssea, baço, Iinfonodos e cavidadeperitoneal após a marcação com anticorpos CD25, CD44, B220, IgM1 CD5,CD11b, CD21, CD23, e CD43 não revelaram diferenças entre camundongosrelt e relt +/+. Os resultados sugerem que RELT não desempenham umpapel importante na imunidade humoral.
(c) Análise da Produção de Anticorpos em Camundongos RELTInterrompido
Os camundongos foram avaliados para determinar se a produçãode um ou mais subtipos de anticorpos foi prejudicada pela interrupção da relt.Camundongos relt -I- e relt +/+ foram imunizados com o antígeno 2,4-dinitrofenol T-dependente conjugado com ovalbumina (DNP-OVA). Doismililitros de solução injetável contendo hidróxido de alumínio 0,1% adsortivo emgel (# 8000-01, Intergen Company), e 0,09975 mg/ml de solução DNP-OVA emPBS foi feito, e a solução foi misturada por 30 minutos para garantir a eficáciada adsorção do antígeno pelo alumínio. Camundongos do tipo selvagem ecamundongos nocauteados RELT (cada um pesando cerca de 20 g) foramimunizados por injeção intraperitoneal de 100 pL da solução no dia 0 eestimulados com uma segunda injeção de 100 pL em 10 dias. Amostras desoro de camundongo foram coletadas no dia 0 e após 14 semanas, esubmetidos a análise por ELISA para titular anticorpos específicos em placasmulti poços revestidas com DNP-BSA. A quantidade equivalente de anticorposIgGI1 lgG2a, lgG3, IgM, e IgE antígeno específicos foram produzidos porambas as populações de camundongos (Vide Figuras 16A-16E), sugerindo queRELT não desempenha um papel crucial no desenvolvimento da imunidadehumoral.
(D) Análise do Desenvolvimento das Células Dendríticas em CamundongosRELT Interrompidos
Não foram observadas anormalidades evidentes nodesenvolvimento das células T1 B e NK, na ausência de RELT. Assim, foraexaminadas uma população adicional de células imunitárias, em particularcélulas dendríticas (DCs). Baços de camundongos relt-/- e relt +/+ forampicados e digeridos com 1 mg/ml de colagenase A (Roche), como descritoanteriormente. Anticorpos anti-CD11c biotinilados e esferas MACS anti-biotina(MiItenyi) foram utilizadas para identificar as células dendríticas. A marcaçãodos esplenócitos tratados com colagenase com o anticorpos CD11c, ummarcador de superfície de células dendríticas, revelou uma populaçãosignificativamente maior de células dendríticas no camundongo relt-/-, emcomparação com a linhagem controle de camundongo relt +/+ (Figura 17A).
Aumento no número de células dendríticas de camundongos relt-l- foi tambémsuportado pela análise estatística (Figura 17B).
DCs CD11c + podem ser classificadas em duas subpopulaçõesbaseada na expressão na superfície celular de CD11b e B220: cDC (CD11b+B220") e pDC (CD11b~"B220+) (Hochrein et ai, Hum. Immunol. 63: 1103-10(2002) ; Nakano et a/., J. Exp. Med. 194: 1171-8 (2001); Asselin-Paturel et ai,Nat. Immunol. 2: 1144-50 (2001)). Esplenócitos preparado como descrito acimaforam corados com anti-CD11b e anti-B220 biotinilado, e depletados comesferas MACS (MiItenyi) para enriquecer a pDCs e cDCs. A classificação comFACSVantage (BD Science) foi utilizada para purificação adicional daspopulações pDC (CD11c +B220+) e cDC (CD11c+B220"). A análise porcitometria de fluxo e a contagem de células indicou que camundongos relt-l-tinham aproximadamente o dobro do número de pDCs esplênicas quandocomparados com camundongos relt +/+ (Figuras 3A e 3B). Não houvediferença estatisticamente significante no número de cDCs esplênicas entrecamundongos relt +/+ e relt-l-, apesar da (Figuras 3A e 3B) expressão de RELTter sido detectável em ambas as pDCs e cDCs pela análise por citometria defluxo (Figura 3C). Foram encontradas cerca de 1,8 vezes mais pDCs no timode camundongos relt-l- versus camundongos relt +/+.
Para confirmar que a expansão da populaçãoCD11c+B220+CD11b—em pDCs "típicas" representado por esplenócitos relt-l-,esplenócitos relt-l- e relt +/+ CD11c+B220+ foram analisados por citometria defluxo após coloração com anticorpos para MHC classe Il , o marcador de pDCCD45RB (Hochrein et ai, Hum. Immunol. 63:1103-10 (2002); Asselin-Paturel etai, Nat. Immunol. 2: 1144-50 (2001)), ou uma molécula co-estimulatória comoCD80 ou CD86 (Figura 17D). Células CD11c+B220+ a partir de células decamundongos relt -I- e relt +/+ expressam quantidades similares destesmarcadores de superfície, sugerindo que camundongos relt-l- têm um aumentodo número de pDCs.
íe) Análise de Células CD1 Ic+MHCII' em Camundongos RELT Interrompidos
Células CD1 Ic+MHC IΓ do sangue periférico foram demonstradaspor possuir o potencial de se diferenciarem em pDCs (dei Hoyo et al., Nature415: 1043-7 (2002)). Por isso, o precursor da população pDC em camundongosrelt-l- foi investigada. Tal como indicado na Figura 18A, a subpopulaçãoCD1 Ic+MHC II" foi cerca de 3 vezes mais abundante nos camundongos relt-l-do que nos camundongos relt +/+. Este resultado sugere que a diferenciaçãode pDC em camundongos relt-l- é impactada no sangue periférico ou maisprecocemente do que no sangue periférico na fase precursora do pDC. Aanálise por citometria de fluxo revelou um ligeiro, mas significativo nível deexpressão de RELT em células CD1 Ic+MHC II" (Figura 18B).
Exemplo 4
Expressão de IFN-alfa em Camundongos RELT Interrompido
Em seu papel como célula apresentadora de antígeno, pDCs queencontram o DNA viral ou bacteriano não metilado produzem grandesquantidades de IFN-α. Do mesmo modo, no decurso da infecção emcamundongos, o citomegalovírus murino (MCMV) se liga preferencialmente aosToll-Like Receptor 9 nos pDCs, que resulta na produção de IFN-α (Dalod et ai,J. Exp. Med. 195:517-528 (2002); Asselin-Paturel et ai, Nat. Immunoi 2: 1144-1150 (2001); Krug et al., Immunity 21: 107-119 (2004)). Para determinar seRELT causa impacto na função normal da pDC, a produção de IFN-α poresplenócitos de camundongos relt-l- ou relt +/+ foi mensurada. Esplenócitos decamundongos relt-l- ou relt +/+ foram cultivados com CpG-ODN não metiladotipo D de base fosforotioato (D19, GGTGCATCGATGCAGGGGGG (SEQ IDNo: 71) e mensurada como descrito anteriormente (Hemmi et ai, J. Immunoi170 : 3059-64 (2003); Krug et al., Eur. J. Immunol. 31: 2154-63 (2001)). Osesplenócitos derivados de relt -I- secretaram cerca de 4 vezes mais IFN-α doque esplenócitos derivados de camundongos relt +/+ (Figura 19, painelesquerdo). Este aumento da secreção de IFN-α foi consistente com o aumentodo número de pDCs nas culturas de relt-l-, em comparação com as culturas derelt +/+ (vide Figura 17B). A secreção de IFN-α por esplenócitos nessasculturas foi atribuída a células dendríticas porque o IFN-α não pode serdetectado quando os esplenócitos foram depletados de células dendríticasCD11c+ antes da estimulação (Figura 19, painel esquerdo). Quando umnúmero igual de pDCs foi comparado, não houve diferença entre osesplenócitos derivados de relt-l- e relt +/+ em termos de produção de IFN-α(Figura 19, painel direito). De acordo com uma descrição anterior (Hemmi et al.,J. Immunol. 170, 3059-64 ( 2003)), a estimulação das cDCs CD11c+B220"purificadas com CpG-ODN produziu muito pouco IFN-α (Figura 19, paineldireito), este achado foi coerente com pDCs que é a principal fonte decitocinas. Assim, RELT parece ser dispensável para a produção normal de IFN-α pelas pDCs, e a expansão da população CD11c+B220+ observada emcamundongos relt-l- contém pDCs produzindo IFN-α.
Exemplo 5
Análise da Medula Óssea em Camundongos RELT Interrompidos
O efeito da deficiência de RELT em células da medula óssea foiinvestigada. Camundongos do tipo selvagem e camundongos relt-l- foramexpostos a uma única dose de radiação de corpo total de 10 Gy. Oscamundongos foram irradiados e então foi injetado via intravenosa 4x10células de medula óssea de camundongos relt +/+ e relt-l- não tratados. Apopulação de células dendríticas nos camundongos quiméricos foi analisadaapós 8 semanas. pDCs esplênicos e células CD1 Ic+MHC lido sangueperiférico do animais receptores reconstituído foram contados. Células dedoadores de medula óssea relt-l- sempre renderam mais células CD1 Ic+MHCII" e pDCs do que as células de doadores de medula óssea de doadores relt+/+, independentemente do genótipo do receptor (relt-I- ou relt +/+) (Figura 20).Em contraste, pDCs e células CD1 Ic+MHC II" foram gerados em número igualquando as células do doador do tipo selvagem foram utilizadas para semeartanto os receptores relt-l- quanto os relt +/+ (Figura 20). Os resultados sugeremque a pDC expandida e a população CD11c+ MHC II" nos camundongos relt-l-refletiu uma célula com defeito autônomo nas células derivadas da medulaóssea de relt-l-.
Um estudo anterior de transferência de células sugeriu que pDCspossam diferenciar-se de ambos os progenitores linfóide e mielóide no interiorda medula óssea (Shigematsu et ai, Immunity 21:43-53 (2004)). Assim, RELTexpressos em pDCs e/ou progenitoras destas populações podem regulardiretamente a ontogenia de células dendríticas. Células T são candidatas paraexpressar o Iigante de RELT e suprimir o desenvolvimento de pDC. Células Tdo sangue periférico humano foram cultivadas por 24 horas, na presença devários estimulantes e, em seguida, submetidas a uma análise por FACS comproteínas marcadas, incluindo o domínio extracelular do RELT humano(aminoácidos 1-128, tendo a seqüência:
MKPSLLCRPLSCFLMLLPWPLATLTSTTLWQCPPGEEPDLDPGQGTLCRPCPPGTFSAAWGSSPCQPHARCSLWRRLEAQVGMATRDTLCGDCWPGWFGPWGVPRVPCQPCSWAPLGTHGCDEWGRRA (SEQ ID No: 72)) fundidos a regiãoFc da IgGI humana (RELT-Fc solúvel). As células T humanas estimuladas comPMA e ionomicina ligou especificamente (embora de maneira fraca) com aproteína de fusão RELT humana fusão, consistente com a descrição anterior(Sica et ai, Blood 97: 2702-2707 (2001)).Listagem de Seqüência
<110> Vishva Dixit
Nobuhiko KayagakiYan Wu
<120> MÉTODOS E COMPOSIÇÕES PARA RELT ALVO
<130> P2279R1 US
<150> US 60/772,911<151> 13/02/2006
<160> 141
<210> 1<211> 107<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 1
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val15 10 15
Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn
20 25 30
Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys
35 40 45
Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
65 70 75
Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln
80 85 90
His Tyr Thr Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu
95 100 105
Ile Lys
<210> 2<211> 107<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 2
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val15 10 15
Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser
20 25 30Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys
35 40 45
Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
65 70 75
Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln
80 85 90
Ser Tyr Thr Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu
95 100 105
Ile Lys
<210> 3<211> 30<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 3
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly1 5 10 15
Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr
20 25 30
<210> 4<211> 25<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 4
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly15 10 15
Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser
20 25
<210> 5<211> 25<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 5
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly15 10 15
Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser
20 25
<210> 6<211> 25<212> PRT<213> Homo sapiens
<400> 6
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly1 5 10 15
Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser
20 25
<210> 7<211> 30<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 7
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser15 10 15
Gln Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Val Ser
20 25 30
<210> 8<211> 25<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 8
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser15 10 15
Gln Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser
20 25
<210> 9<211> 25<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 9
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser15 10 15
Gln Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser
20 25
<210> 10<211> 25<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 10
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser15 10 15
Gln Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser
20 25<210> 11<211> 30<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 11
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly1 5 10 15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser
20 25 30
<210> 12<211> 25<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 12
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly15 10 15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser
20 25
<210> 13<211> 25<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 13
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly15 10 15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser
20 25
<210> 14<211> 25<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 14
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly15 10 15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser
20 25
<210> 15<211> 30<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 15
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly15 10 15Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys
20 25 30
<210> 16<211> 25<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 16
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly1 5 10 15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser
20 25
<210> 17<211> 25<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 17
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly15 10 15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser
20 25
<210> 18<211> 30<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 18
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly15 10 15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys
20 25 30
<210> 19<211> 25<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 19
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly15 10 15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser
20 25
<210> 20<211> 25<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 20
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly1 5 10 15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser
20 25
<210> 21<211> 25<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 21
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly15 10 15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser
20 25
<210> 22<211> 23<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 22
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val15 10 15
Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys
20
<210> 23<211> 23<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 23
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro15 10 15
Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys
20
<210> 24<211> 23<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 24
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro15 10 15
Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys
20
<210> 25<211> 23<212> PRT<213> Homo sapiens<400> 25
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu1 5 10 15
Gly Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys
20
<210> 26<211> 23<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 26
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val15 10 15
Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys
20
<210> 27<211> 15<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 27
Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr15 10 15
<210> 28<211> 32<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 28
Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe15 10 15
Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr
20 25 30
Tyr Cys
<210> 29<211> 10<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 29
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
5 10
<210> 30<211> 25<212> PRT<213> Homo sapiens<400> 30
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly1 5 10 15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser
20 25
<210> 31<211> 13<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 31
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
5 10
<210> 32<211> 30<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 32
Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu15 10 15
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
20 25 30
<210> 33<211> 11<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 33
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
5 10
<210> 34<211> 23<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 34
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val15 10 15
Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys
20
<210> 35<211> 15<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 35
Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr1 5 10 15
<210> 36<211> 32<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 36
Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe1 5 10 15
Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr
20 25 30
Tyr Cys
<210> 37<211> 10<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 37
Phe Arg Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
5 10
<210> 38<211> 25<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 38
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly15 10 15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser
20 25
<210> 39<211> 13<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 39
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
5 10
<210> 40<211> 30<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 40
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu15 10 15Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
20 25 30
<210> 41<211> 11<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 41
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
5 10
<210> 42<211> 10<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Peptideo Sintético<400> 42
Gly Phe Thr Ile Thr Asn Thr Trp Ile His
5 10
<210> 43<211> 10<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Peptideo Sintético<400> 43
Gly Phe Thr Ile Ser Gly Ser Tyr Ile His
5 10
<210> 44<211> 10<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Peptideo Sintético<400> 44
Gly Phe Thr Ile Asn Asn Ser Tyr Ile His
5 10
<210> 45<211> 10<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Peptideo Sintético
<400> 45Gly Phe Thr Ile Ser Asn Asn Trp Ile His
5 10
<210> 46<211> 10<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Peptideo Sintético<400> 46
Gly Phe Thr Ile Ser Ser Thr Trp Ile His
5 10
<210> 47<211> 10<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Peptideo Sintético<400> 47
Gly Phe Thr Ile Thr Gly Ser Ser Ile His
5 10
<210> 48<211> 10<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Peptideo Sintético<400> 48
Gly Phe Thr Ile Asn Asp Ser Trp Ile His
5 10
<210> 49<211> 10<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Peptideo Sintético<400> 49
Gly Phe Thr Ile Thr Ser Ser Ser Ile His
5 10
<210> 50<211> 10<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Peptídeo Sintético<220>
<221> Características diversas<222> 5
<223> Xaa = Τ, S1 ou N<220>
<221> Características diversas<222> 6
<223> Xaa = Ν, G, S, ou D<220>
<221> Características diversas<222> 7
<223> Xaa = Τ, S1 ou N<220>
<221> Características diversas<222> 8
<223> Xaa = W, Υ, ou S<400> 50
Gly Phe Thr Ile Xaa Xaa Xaa Xaa Ile His
5 10
<210> 51<211> 18<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Peptídeo Sintético<400> 51
Gly Phe Ile Ser Pro Ser Gly Gly Tyr Thr Asn Tyr Ala Asp Ser15 10 15
Val Lys Gly
<210> 52<211> 18<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Peptídeo Sintético<400> 52
Gly Arg Ile Tyr Pro Asn Asn Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser15 10 15
Val Lys Gly
<210> 53<211> 18<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Peptideo Sintético<400> 53
Ala Trp Ile Ser Pro Tyr Gly Gly Tyr Thr Asp Tyr Ala Asp Ser1 5 10 15
Val Lys Gly
<210> 54<211> 18<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Peptideo Sintético<400> 54
Gly Gly Ile Tyr Pro Ser Asn Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser15 10 15
Val Lys Gly
<210> 55<211> 18<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Peptideo Sintético<400> 55
Gly Gly Ile Ser Pro Ala Asp Gly Asp Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser15 10 15
Val Lys Gly
<210> 56<211> 18<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Peptideo Sintético<400> 56
Gly Phe Ile Tyr Pro Asn Gly Gly Tyr Thr Asp Tyr Ala Asp Ser15 10 15
Val Lys Gly
<210> 57<211> 18<212> PRT<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Peptídeo Sintético<400> 57
Gly Asn Ile Thr Pro Ser Ser Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser1 5 10 15
Val Lys Gly
<210> 58<211> 18<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Peptideo Sintético<400> 58
Ala Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Gly Ser Thr Asp Tyr Ala Asp Ser15 10 15
Val Lys Gly
<210> 59<211> 18<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Peptideo Sintético<220>
<221> Características diversas<222> 1
<223> Xaa = G ou A<220>
<221> Características diversas<222> 2
<223> Xaa = F, R, W, G, N ou Y<220>
<221> Características diversas<222> 4
<223> Xaa = S, Υ, T, ou N<220>
<221> Características diversas<222> 6
<223> Xaa = S, Ν, Y, ou A<220>
<221> Características diversas<222> 7<223> Xaa = G, Ν, D, ou S<220>
<221> Características diversas<222> 9
<223> Xaa = Υ, Ν, D, ou S<220>
<221> Características diversas<222> 11
<223> Xaa = Ν, Υ, ou D<400> 59
Xaa Xaa Ile Xaa Pro Xaa Xaa Gly Xaa Thr Xaa Tyr Ala Asp Ser15 10 15
Val Lys Gly
<210> 60<211> 16<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Peptideo Sintético<400> 60
Arg Phe Leu Ser Asp Gly Ala Tyr Ala Arg Asp Tyr Ala Met Asp15 10 15
Tyr
<210> 61<211> 20<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Peptídeo Sintético<400> 61
Arg Trp Asp Tyr Ile Asp Gly Tyr Val Tyr Thr Ser Tyr Ala Arg15 10 15
Tyr Val Met Asp Tyr
20
<210> 62<211> 13<212> PRT
<213> Seqüência Artificial
<220>
<223> Peptídeo Sintético<400> 62Arg Ser Leu Ser Leu Asn Met Trp Gly Val Met Asp Tyr
5 10
<210> 63<211> 18<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Peptideo Sintético<400> 63
Arg Ser Ala Gly Ala Trp Trp Asn His Phe Glu Glu Tyr Ala Val15 10 15
Met Asp Tyr
<210> 64<211> 15<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Peptideo Sintético<400> 64
Lys Gly Ser Trp Trp Ala Asp Asn Glu Gly Tyr Ala Met Asp Tyr15 10 15
<210> 65<211> 17<212> PRT
<213> Seqüência Artificial
<220>
<223> Peptideo Sintético<400> 65
Arg Leu Asp Ser Val Asp Gly Val Arg Val Tyr Asp Tyr Val Met15 10 15
Asp Tyr
<210> 66<211> 17<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Peptideo Sintético
<400> 66
Arg Trp Asp His Val Thr Gly Gly Arg Gly Arg Pro Trp Gly Met15 10 15
Asp Tyr<210> 67<211> 18<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Peptideo Sintético<400> 67
Arg Asp Arg Tyr Leu His Glu Glu Gly Gly Glu Tyr Val Met Asp1 5 10 15
Tyr Asp Tyr
<210> 68<211> 20<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Peptideo Sintético<220>
<221> Características diversas<222> 1
<223> Xaa = R ou K<220>
<221> Características diversas<222> 2
<223> Xaa = F, W, S, G, L, ou D<220>
<221> Características diversas<222> 3
<223> Xaa = L, D, Α, S, ou R<220>
<221> Características diversas<222> 4
<223> Xaa = S, Υ, G, W, ou H<220>
<221> Características diversas<222> 5
<223> Xaa = D, I, L, Α, W, ou V<220>
<221> Características diversas<222> 6
<223> Xaa = G, D, Ν, W, Α, Τ, ou H<220>
<221> Características diversas<222> 7
<223> Xaa = Α, G, Μ, W, D, ou E<220>
<221> Características diversas<222> 8
<223> Xaa = Υ, W, Ν, V, G, ou E
1 <220>
<221> Características diversas<222> 9
<223> Xaa = Α, V, G, Η, Ε, ou R<220>
<221> Características diversas<222> 10
<223> Xaa = R, Υ, V, F, ou G<220>
<221> Características diversas<222> 11
<223> Xaa = D, Τ, Μ, Ε, Υ, ou R<220>
<221> Características diversas<222> 12
<223> Xaa = Υ, S, Ε, Α, D, P ou não está presente<220>
<221> Características diversas<222> 13
<223> Xaa = A, Υ, M, W, V ou não está presente<220>
<221> Características diversas<222> 14
<223> Xaa = Μ, A, V, G, ou não está presente<220>
<221> Características diversas<222> 15
<2-2-3> Xaa = R, V, M, D, ou não está presente<220>
<221> Características diversas<222> 16
<223> Xaa =Y, M ou não está presente<220>
<221> Características diversas<222> 17
<223> Xaa = V ou não está presente<220>
<221> Características diversas<222> 18
<223> Xaa = M ou não está presente
<400> 68Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa1 5 10 15
Xaa Xaa Xaa Asp Tyr
20
<210> 69<211> 20<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Peptideo Sintético
<400> 69agtagaaggt ggcgcgaagg 20
<210> 70<211> 26<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Peptideo Sintético<400> 70
ctgcccacag acaagatggt aatctc 26
<210> 71<211> 20<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Peptideo Sintético
<400> 71ggtgcatcga tgcagggggg 20
<210> 72<211> 128<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 72
Met Lys Pro Ser Leu Leu Cys Arg Pro Leu Ser Cys Phe Leu Met
1 5 10 15
Leu Leu Pro Trp Pro Leu Ala Thr Leu Thr Ser Thr Thr Leu Trp
20 25 30
Gln Cys Pro Pro Gly Glu Glu Pro Asp Leu Asp Pro Gly Gln Gly
35 40 45
Thr Leu Cys Arg Pro Cys Pro Pro Gly Thr Phe Ser Ala Ala Trp
50 55 60Gly Ser Ser Pro Cys Gln Pro His Ala Arg Cys Ser Leu Trp Arg
65 70 75
Arg Leu Glu Ala Gln Val Gly Met Ala Thr Arg Asp Thr Leu Cys
80 85 90
Gly Asp Cys Trp Pro Gly Trp Phe Gly Pro Trp Gly Val Pro Arg
95 100 105
Val Pro Cys Gln Pro Cys Ser Trp Ala Pro Leu Gly Thr His Gly110 115 120
Cys Asp Glu Trp Gly Arg Arg Ala125
<210> 73<211> 14<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 73
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly
5 10
<210> 74<211> 32<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 74
Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met15 10 15
Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
20 25 30
Ala Arg
<210> 75<211> 11 -<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 75
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
5 10
<210> 76<211> 13<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 76
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
5 10
<210> 77<211> 32<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 77
Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met1 5 10 15
Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
20 25 30
Ala Arg
<210> 78<211> 11<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 78
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
5 10
<210> 79<211> 13<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 79
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
5 10
<210> 80<211> 31<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 80
Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met15 10 15
Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
20 25 30
Ala
<210> 81<211> 11<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 81
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
5 10
<210> 82<211> 13<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 82
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
5 10
<210> 83<211> 30<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 83
Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met15 10 15
Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
20 25 30
<210> 84<211> 11<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 84
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
5 10
<210> 85<211> 14<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 85
Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly
5 10
<210> 86<211> 32<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 86
Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
15 10 15
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
20 25 30
Ala Arg
<210> 87<211> 11<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 87
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
5 10
<210> 88<211> 13<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 88
Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
5 10
<210> 89<211> 32<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 89
Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu15 10 15
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
20 25 30
Ala Arg
<210> 90<211> 11<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 90
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
5 10
<210> 91<211> 13<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 91
Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
5 10
<210> 92<211> 31<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 92
Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu15 10 15
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
20 25 30Ala
<210> 93<211> 11<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 93
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
5 10
<210> 94<211> 13<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 94
Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
5 10
<210> 95<211> 30<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 95
Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu15 10 15
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
20 25 30
<210> 96<211> 11<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 96
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
5 10
<210> 97<211> 14<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 97
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser
5 10
<210> 98<211> 32<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 98Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
1 5 10 15
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
20 25 30
Ala Arg
<210> 99<211> 11<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 99
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
5 10
<210> 100<211> 13<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 100
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
5 10
<210> 101<211> 32<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 101
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu15 10 15
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
20 25 30
Ala Arg
<210> 102<211> 11<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 102
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
5 10
<210> 103<211> 13<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 103Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
5 10
<210> 104<211> 31<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 104
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu1 5 10 15
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
20 25 30
Ala
<210> 105<211> 11<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 105
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
5 10
<210> 106<211> 13<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 106
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
5 10
<210> 107<211> 30<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 107
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
15 10 15
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
20 25 30
<210> 108<211> 11<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 108
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
5 10<210> 109<211> 14<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 109
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser
5 10
<210> 110<211> 32<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 110
Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu15 10 15
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
20 25 30
Ser Arg
<210> 111<211> 11<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 111
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
5 10
<210> 112<211> 13<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 112
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
5 10
<210> 113<211> 32<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 113
Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu15 10 15
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
20 25 30
Ser Arg
<210> 114<211> 11<212> PRT<213> Homo sapiens
<400> 114Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 5 10
<210> 115<211> 13<212> PRT<213> Homo sapiens
<400> 115Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 5 10
<210> 116<211> 31<212> PRT<213> Homo sapiens
<400> 116
Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu 1 5 10 15
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 20 25 30
Ser
<210> 117<211> 11<212> PRT<213> Homo sapiens
<400> 117
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 5 10
<210> 118<211> 14<212> PRT<213> Homo sapiens
<400> 118Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser 5 10
<210> 119<211> 32<212> PRT<213> Homo sapiens
<400> 119Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu1 5 10 15
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
20 25 30
Ala Arg
<210> 120<211> 11<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 120
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
5 10
<210> 121<211> 13<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 121
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
5 10
<210> 122<211> 32<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 122
Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu15 10 15
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
20 25 30
Ala Arg
<210> 123<211> 11<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 123
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
5 10
<210> 124<211> 13<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 124Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
5 10
<210> 125<211> 31<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 125
Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu15 10 15
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
20 25 30
Ala
<210> 126<211> 11<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 126
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
5 10
<210> 127<211> 13<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 127
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
5 10
<210> 128<211> 30<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 128
Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu15 10 15
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
20 25 30
<210> 129<211> 11<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 129
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
5 10<210> 130<211> 15<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 130
Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr1 5 10 15
<210> 131<211> 32<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 131
Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe15 10 15
Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr
20 25 30
Tyr Cys
<210> 132<211> 10<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 132
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
5 10
<210> 133<211> 15<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 133
Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr15 10 15
<210> 134<211> 32<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 134Gly Val Pro Asp Arg1 5
Thr Leu Lys Ile Ser
20
Tyr Cys
Phe Ser Gly Ser Gly
10
Arg Val Glu Ala Glu
25
Ser Gly Thr Asp Phe
15
Asp Val Gly Val Tyr
30
<210> 135<211> 10<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 135
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
5 10
<210> 136<211> 15<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 136
Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr15 10 15
<210> 137<211> 32<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 137
Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe15 10 15
Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr
20 25 30
Tyr Cys
<210> 138<211> 10<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 138
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
5 10
<210> 139<211> 15<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 139
Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr15 10 15
<210> 140<211> 32<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 140Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe
1 5 10 15
Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr
20 25 30
Tyr Cys
<210> 141<211> 10<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 141
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
5 10

Claims (48)

1. ANTICORPO ISOLADO, que se liga especificamente a RELT.
2. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 1,compreendendo pelo menos uma seqüência de região hipervariável (HVR)selecionadas a partir de HVR-H1, HVR-H2 e HVR-H3 de uma das SQ ID Nos:-42-49, 51-58 e 60-67, respectivamente.
3. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 2,compreendendo pelo menos uma seqüência selecionada de HVR-H1, HVR-H2,HVR-H3, caracterizado pelo fato de HVR-H1 compreender a seqüência deaminoácido abcdefghij, em que o aminoácido a é glicina; o aminoácido bé fenilalanina; o aminoácido c é treonina; o aminoácido d é isoleucina; oaminoácido e é selecionado entre treonina, serina, e asparagina; o aminoácidof é selecionado de asparagina, glicina, serina, e ácido aspártico; o aminoácidog á selecionado de treonina, serina, e asparagina; o aminoácido h éselecionado de triptofano, tirosina, e serina; o aminoácido i é isoleucina; e oaminoácido j é histidina; em que HVR-H2 compreende a seqüência deaminoácido klmnopqrstuvwxyza'b',em que o aminoácido k éselecionado de glicina e alanina; o aminoácido I é selecionado de fenilalanina,arginina, triptofano, glicina, asparagina, e tirosina; o aminoácido m é isoleucina;o aminoácido η é selecionado de serina, tirosina, treonina, e asparagina; oaminoácido o é prolina; o aminoácido ρ é selecionado de serina, asparagina,tirosina, e alanina; o aminoácido q é selecionado de glicina, asparagina, ácidoaspártico, e serina; o aminoácido r é glicina; o aminoácido s é selecionado detirosina, asparagina, ácido aspártico e serina; o aminoácido t é treonina; oaminoácido u é selecionado de asparagina, tirosina, e ácido aspártico; oaminoácido ν é tirosina; o aminoácido w é alanina; o aminoácido χ á ácidoaspártico; o aminoácido y é serina; o aminoácido ζ é valina; o aminoácido a' élisina; e ο aminoácido b' é glicina; em que HVR-H3 compreende a seqüência deaminoácido c' d' e' f g' h' i' j' k' Γ m' n' o' p' q' r' s' t' u' v', em que o aminoácidoc' é selecionado de arginina e lisina; o aminoácido d' é selecionado deJ fenilalanina, triptofano, serina, glicina, leucina, e ácido aspártico; o aminoácidoe' é selecionado de leucina, ácido aspártico, alanina, serina, e arginina; oaminoácido f é selecionado a partir de serina, tirosina, glicina, triptofano, ehistidina; o aminoácido g' é selecionado de ácido aspártico, isoleucina, leucina,alanina, triptofano, e valina; o aminoácido h' é selecionado de glicina, ácidoaspártico, asparagina, triptofano, alanina, treonina, e histidina; o aminoácido i' éselecionado de alanina, glicina, metionina, triptofano, ácido aspártico, e ácidoglutâmico; o aminoácido j' é selecionado de tirosina, triptofano, asparagina,valina, glicina, e ácido glutâmico; o aminoácido k' é selecionado de alanina,valina, glicina, histidina, ácido glutâmico, e arginina; o aminoácido Γ éselecionado de arginina, tirosina, valina, fenilalanina, e glicina; o aminoácido m'é selecionado de ácido aspártico, treonina, metionina, ácido glutâmico, tirosina,e arginina; o aminoácido n' é selecionado de tirosina, serina, ácido glutâmico,alanina, ácido aspártico, e prolina, ou não está presente; o aminoácido o' éselecionado de alanina, tirosina, metionina, triptofano, e valina, ou não estápresente; o aminoácido p' é selecionado de metionina, alanina, valina, e glicina,ou não está presente, o aminoácido q' é selecionado de arginina, valina,metionina, e ácido aspártico, ou não está presente; r' é selecionado de tirosinae metionina, ou não está presente; s' é valina ou não está presente; t' émetionina, ou não está presente; u' é ácido aspártico ev'é tirosina.
4. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 1,compreendendo as seqüências HVR-H1, HVR-H2 e HVR-H3 correspondentesaos estabelecidos para os clones C21, C10, E5/E7, F4, F5, H7, H9, e H11 nasFiguras 5A e 5B.
5. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 1,compreendendo uma seqüência HVR-H1 da SEQ ID No: 49, uma seqüênciaHVR-H2 da SEQ ID No: 58 e uma seqüência HVR-H3 da SEQ ID No: 67.
6. ANTICORPO, de acordo com uma das reivindicações de 2a 5, que compreende adicionalmente uma seqüência hipervariável de cadeialeve selecionada da SEQ ID No: 1 e SEQ ID No: 2.
7. ANTICORPO ISOLADO, que se liga ao mesmodeterminante antigênico sobre RELT do anticorpo de uma das reivindicaçõesde 1 a 6.
8. ANTICORPO ISOLADO, que compete pela ligação com oRELT com um anticorpo de uma das reivindicações de 1 a 7.
9. ANTICORPO, de acordo com uma das reivindicações de 1 a-8, caracterizado pelo fato do anticorpo se ligar especificamente com o RELThumano.
10. ANTICORPO, de acordo com uma das reivindicações de 1a 9, caracterizado pelo fato do anticorpo inibir a ligação do RELT a pelo menosum Iigante de RELT.
11. ANTICORPO, de acordo com uma das reivindicações de 1a 9, caracterizado pelo fato do anticorpo inibir, pelo menos, uma via desinalização mediada por RELT.
12. ANTICORPO, de acordo com uma das reivindicações de 1a 9, caracterizado pelo fato do anticorpo estimular, pelo menos, uma via desinalização mediada por RELT.
13. ANTICORPO, de acordo com uma das reivindicações de 1a 9, caracterizado pelo fato do anticorpo estimular a produção de NF-κΒ emuma célula que está expressando RELT.
14. ANTICORPO, de acordo com uma das reivindicações de 1a 9, caracterizado pelo fato do anticorpo ser um agonista de RELT.
15. ANTICORPO, de acordo com uma das reivindicações de 1a 9, caracterizado pelo fato do anticorpo ser um antagonista de RELT.
16. MOLÉCULA DE ÁCIDO NUCLÉICO, que codifica oanticorpo de uma das reivindicações de 1 a 9.
17. VETOR, que possuí o ácido nucléico da reivindicação 16.
18. CÉLULA HOSPEDEIRA, que contenha o vetor dareivindicação 17.
19. LINHAGEM CELULAR, capaz de produzir os anticorpos deuma das reivindicações de 1 a 9.
20. MÉTODO PARA A PRODUÇÃO DE ANTICORPO, de umadas reivindicações de 1 a 9, compreendendo o cultivo da célula hospedeiracontendo a molécula de ácido nucléico que codifica o anticorpo sob ascondições nas quais o anticorpo é produzido.
21. COMPOSIÇÃO, compreendendo uma quantidade eficaz deanticorpo conforme descrito em uma das reivindicações de 1 a 13 e um veículofarmaceuticamente aceitável.
22. MÉTODO PARA DETERMINAR A PRESENÇA DE UMPOLIPEPTÍDEO RELT, em uma amostra com suspeita de conter umpolieptídeo RELT compreendendo a exposição da amostra a pelo menos umanticorpo descrito em uma das reivindicações de 1 a 9 e determinar a ligaçãode pelo menos um anticorpo ao polipeptídeo RELT na amostra.
23. MÉTODO PARA TRATAR UMA DOENÇA OU CONDIÇÃOPATOLÓGICA CAUSADA AGRAVADA OU PROLONGADA PELO IFN-α, emum paciente em que o método compreende em administrar ao paciente umaquantidade eficaz de pelo menos um anticorpo descrito em uma dasreivindicações de 1 a 9.
24. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 23, caracterizadopelo fato da doença ou condição ser causada, agravada ou prolongada peladiminuição dos níveis de IFN-α no paciente em relação aos níveis de IFN-α naausência da doença ou condição.
25. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 23, caracterizado-1 pelo fato da doença ou condição ser causada, agravada ou prolongada peloaumento dos níveis de IFN-α no paciente em relação aos níveis de IFN-α naausência da doença ou condição.
26. MÉTODO PARA TRATAR UMA DOENÇA OU CONDIÇÃOPATOLÓGICA ASSOCIADA COM O IFN-α, em um paciente no qual o métodocompreende administrar uma quantidade eficaz de uma forma solúvel de RELTao paciente.
27. MÉTODO, de acordo com uma das reivindicações de 23 a-26, caracterizado pelo fato do paciente ser um paciente mamífero.
28. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 27, caracterizadopelo fato do paciente ser humano.
29. MÉTODO, de acordo uma das reivindicações de 23 a 26,caracterizado pelo fato da doença ou condição ser selecionada a partir de, pelomenos, um distúrbio da proliferação celular, uma infecção, uma doença imune/inflamatória e um distúrbio relacionado com o interferon.
30. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 29, caracterizadopelo fato da doença imune/ inflamatória ser selecionada a partir do lúpus, asmae rinite alérgica.
31. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 29, caracterizadopelo fato da infecção ser selecionada a partir de infecção microbiana, infecçãoviraI e infecção por fungos.
32. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 29, caracterizadopelo fato do distúrbio da proliferação celular ser selecionado a partir dasíndrome mielodisplásica (MDS) e câncer.
33. MÉTODO PARA AUMENTAR A PROPORÇÃO DECÉLULAS DENDRÍTICAS PLASMOCITÓIDES (pDC), produzidas a partir decélulas CD1 Ic+MHC II" em relação às células dendríticas convencionais (cDC)compreendendo inibir a expressão de RELT nas células CD11c+ MHC II".
34. MÉTODO PARA AUMENTAR A PROPORÇÃO DECÉLULAS DENDRÍTICAS PLASMOCITÓIDES (pDC), produzidas a partir decélulas CD1 Ic+MHC II" em relação às células dendríticas convencionais (cDC)compreendendo inibir a atividade de RELT nas células CD11c+ MHC II".
35. MÉTODO, de acordo a reivindicação 33 ou 34,caracterizado pelo fato de que a inibição da expressão ou atividade de RELTcompreender em interromper RELT nas células CD1 Ic+MHC II".
36. MÉTODO, de acordo a reivindicação 33 ou 34,caracterizado pelo fato de que a inibição da expressão ou atividade de RELTcompreende em administrar um oligonucleotídeo antisense para RELT nascélulas CD1 Ic+MHC II".
37. MÉTODO, de acordo a reivindicação 33 ou 34,caracterizado pelo fato de que a inibição da expressão ou atividade de RELTcompreende em administrar para as células CD1 Ic+MHC II" um anticorpo queinibe a ligação do RELT ao seu Iigante normal.
38. MÉTODO, de acordo uma das reivindicações de 33 a 37,caracterizado pelo fato de que a inibição da expressão ou atividade de RELTocorre in vivo.
39. MÉTODO, de acordo uma das reivindicações de 33 a 37,caracterizado pelo fato de que a inibição da expressão ou atividade de RELTocorre in vitro.
40. MÉTODO PARA DIMINUIR A PROPORÇÃO DE CÉLULASDENDRÍTICAS PLASMOCITÓIDES, produzidas a partir de células CD11c+MHC II" em relação às células dendríticas convencionais compreendendoestimular a expressão de RELT nas células CD1 Ic+MHC II".
41. MÉTODO PARA DIMINUIR A PROPORÇÃO DE CÉLULASDENDRÍTICAS PLASMOCITÓIDES, produzidas a partir de células CD11c+MHC II" em relação às células dendríticas convencionais compreendendoestimular a atividade de RELT nas células CD1 Ic+MHC II".
42. MÉTODO, de acordo a reivindicação 40 ou 41,caracterizado pelo fato de que a estimulação da expressão ou atividade deRELT compreende em administrar um anticorpo agonista de RELT para ascélulas CD1 Ic+MHC II".
43. MÉTODO PARA AUMENTAR A PRODUÇÃO DE IFN-a,em um mamífero compreendendo inibir a expressão de RELT no mamífero.
44. MÉTODO PARA AUMENTAR A PRODUÇÃO DE IFN-a,em um mamífero compreendendo inibir a atividade de RELT no mamífero.
45. MÉTODO PARA DIMINUIR A PRODUÇÃO DE IFN-α, emum mamífero compreendendo estimular a expressão de RELT nas célulasCD1 Ic+MHC II" do mamífero.
46. MÉTODO PARA DIMINUIR A PRODUÇÃO DE IFN-α, emum mamífero compreendendo estimular a atividade de RELT nas célulasCD1 Ic+MHC II" do mamífero.
47. MÉTODO PARA DIAGNOSTICAR UMA DOENÇA OUCONDIÇÃO RELACIONADA COM NÍVEIS ANORMAIS DE IFN-α, em ummamífero compreendendo detectar a quantidade de RELT expressa nomamífero.
48. MÉTODO, de acordo a reivindicação 47, caracterizado pelofato de que a doença ou condição é selecionada a partir de, pelo menos, umdistúrbio da proliferação celular, uma infecção, uma doença imune/ inflamatóriae uma desordem relacionada com o interferon.
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