BRPI0706936A2 - marcador e método para diagnóstico de cáncer - Google Patents

Abstract

MARCADOR E METODO PARA DIAGNóSTICO DE CANCER A presente invenção refere-se a um marcador para diagnóstico de câncer, utilizando-se a variação de um gene com fator estimulante de uma colónia de granulócitos (G- CSF) e um método para preparo do mesmo e, ainda mais especificamente, relacionado com um método para diagnóstico de câncer e/ou avaliação do estado de progressão do câncer, utilizando-se um oligonucleotídeo que tenha a 3'-extremidade terminal da região do exon 2 ligado à 5' -extremidade terminal da região do exon 4 de um gene G-GSF como marcador de diagnóstico de câncer. De acordo com a presente invenção, o câncer pode ser diagnosticado com rapidez e precisão, utilizando-se a variação de uma expressão de um gene G-CSF.

Description

arcador e método para diagnóstico de câncer

MPO TÉCNICO

A presente invenção refere-se a um marcadorpara diagnóstico de câncer, utilizando-se a variação daexpressão genética de um fator estimulante de uma colônia degranulócitos (G-CSF) e um método para o preparo da mesma e,mais especificamente, refere-se a um método para diagnósticode câncer e/ou avaliação do estado de progressão do câncerusando um oligonucleotideo que tenha a 3'-extremidadeterminal da região do exon 2 ligado à 5'-extremidade terminalda região do exon 4 de um gene G-CSF como um marcador paradiagnóstico de câncer.

ESTADO DA TÉCNICA

O diagnóstico do câncer é geralmentealcançado por (1) análise morfológica utilizandomicroscópios, tais como um microscópio óptico ou microscópioeletrônico, (2) ensaios imunoistoquímicos que detectamproteínas especificamente expressas em tecidos cancerígenos(Iran, Biomed. J., 3:99, 1999; Lancet, 2:483, 1986), ou (3)diagnóstico molecular que analisa biomoléculas anormaisencontradas em tecidos cancerígenos, tais como genesmutantes. Em comparação com o diagnóstico molecular, osdiagnósticos morfológico e imunoistoquímico requerem muitomais tempo e são de custo mais elevado. Uma vez que odiagnóstico molecular tem um processo relativamente simplesem um período de tempo curto para produzir resultados,tornou-se o principal objeto no desenvolvimento de novosmétodos de diagnóstico para câncer. Recentemente, a HealthDigit Inc. desenvolveu um sistema de chip de proteína paradiagnosticar vários cânceres, e ganhou a aprovação paraensaios clínicos do Chinese State Drug Administration (CSDA),pela primeira vez no mundo (www.health-digit.com). Noentanto, o sistema de chip proteína não utiliza apenas umbiomarcador para diagnosticar todos os tipos de câncer, masutiliza 10 ou mais proteínas como biomarcadores.

Para aplicar eficazmente tais métodos dediagnósticos no diagnóstico de câncer, é de extremaimportância selecionar e utilizarem-se marcadores paradiagnósticos de câncer capazes de detectar com mais precisãoe facilidade a incidência do câncer. Diversos genes (Steve,M. et al., J. Clin. Oncology, 20:3165 ~ 3175, 2002; Sridlhar,R. et al., J. Clin. Oncology, 20:1932 ~ 1941, 2002) eproteínas (Goessl, et al., Urology, 58:335 ~ 338, 2001; Zhou,et al., Breast Câncer Res .Treat., 66:217 ~ 224, 2001; KoreaPat. Publication N°. 2001-0061173) foram relatados comomarcadores de diagnóstico do câncer, e alguns deles estãosendo clinicamente utilizados para o diagnóstico de câncer.Entre biomarcadores de câncer convencionais, tais como CEA,BFP, TPA e IAP, que possuem baixa especificidade orgânica,têm baixa sensibilidade, assim gerando falsos dadospositivos. Além disso, os biomarcadores que têm altaespecificidade orgânica, tais como AFP, PIVKA II, Esterase I,CA19-9, CA50, antígeno Span-I, CA15-3 e BCA 225, são úteisapenas para os órgãos alvo.

Muitos pesquisadores têm tentado encontrargenes que tenham aplicações de diagnóstico, nodesenvolvimento de candidatos a marcadores no diagnóstico docâncer, que mostraram diferentes resultados de acordo com acondição patológica e fisiológica, utilizando tecnologia demicro-arranjos (Liu, HX et al., Nat. Genet., 27:55 ~ 58,2001; Wilson, CA et al., Oncogene, 14:1 ~ 16, 1997;Weissensteiner, Tr. Nucleic Acids Res., 26:687, 1998;Zolezzi, F. et al., Am. J. Med. Genet., 71:366 ~ 370, 1997;Mottes JR e Iverson, L.E., Neuron, 14:613 ~ 623, 1995; Crook,R. et al., Nat. Med., 4:452 ~ 455, 1998; Jiang, e ZH Wu, JY,Proc. Soe. Exp. Biol. Med., 220:64 ~ 72, 1999).

No entanto, uma vez que os candidatos amarcadores para diagnóstico do câncer encontrados pelosmétodos acima mencionados são, na sua maioria compostos porseqüência identificadora expressa (EST), eles são definidoscomo uma característica de dados e, assim, é difícilselecionar os candidatos confiáveis específicos e, descobriros genes a partir dos quais eles se originam.

Especificamente, o número de genes é conhecido através daanálise do genoma humano, e também é sabido que muitasisoformas ou variantes são expressas a partir daí para teremfunção biológica e definir a sua complexidade. Por isso,tornou-se uma outra importante questão para o futurodescobrir-se em quais variantes genéticas e condições aolongo de todo o genoma estão expressos e quais são as suasfunções. Estas diversas variantes podem ser uma boa base paradescobrir-se a correlação entre a formação de variantesanormais e a possibilidade de causarem câncer (Cartegni, L.et al., Nat. Rev. Genet., 3:285 ~ 298, 2002; Schweighoffer,F. et al., Pharmacogenomics, 1:187 ~ 197, 2000; Blencowe, BJ,Treds Biochem. Sci., 25:106 ~ 110, 2000; Cooper, TA e Mattox,W., Am. J. Hum . Genet., 61:259 ~ 266, 1997).

Os inventores da presente invenção tambémconduziram estudos por um longo tempo para desenvolver umnovo marcador para diagnóstico do câncer, que podediagnosticar vários tipos de cânceres, conseqüentemente,confirmaram que a supressão da região do exon 3 foiespecificamente mostrada em células de tumores ou tecidos detumores durante a transcrição do gene G-CSF, depositandoassim um pedido de patente referente a um método paradiagnosticar câncer utilizando fragmentos de variantes ouproteínas G-CSF mRNA, cDNA como um marcador para diagnósticode câncer (WO 2003/027288 Al) .No método micro-arranjo que usaum fragmento do gene G-CSF como um marcador para diagnósticodo câncer, do pedido de patente acima referido, qualquer umou mais fragmentos entre os exons 1, 2, 4 e 5, fragmentos deDNA do gene G-CSF juntamente com fragmentos de DNA do exon 3do gene G-CSF são utilizados como testes de ácido nucléicopara a detecção de fragmento do gene G-CSF, tendo suprimido aregião do exon 3 entre as amostras biológicas. Este métodoinventivo para diagnosticar câncer, através da detecção dasupressão da região do exon 3 da expressão genética do G-CSFé uma das tecnologias para diagnosticar o câncer usando ascaracterísticas de variantes genéticas, e é considerado umcandidato útil a marcador para diagnóstico de câncer, uma vezque as variantes aparecem na maior parte dos cânceres.

Entretanto, a maior parte dos genes queincluem o gene G-CSF geralmente expressam muitas isoformas evariantes e, portanto, fragmentos para teste fixados a partirdo método micro-arranjo devem ter alta sensibilidade paradetectar a supressão da região do exon 3 do gene G-CSF. Alémdisso, a expressão do G-CSF normal ou seus fragmentos podemexistir em conjunto com isoformas de G-CSF mutantes emcélulas de tumores ou tecidos de tumores, assim, odiagnóstico de câncer através de apenas detectar-se apresença da região do exon 3 do G-CSF, em sua expressãogenética pode levar à perda de credibilidade ou à baixasensibilidade e, além disso, tem um problema na avaliação doestado de progressão do câncer.

Desse modo, os inventores da presenteinvenção têm feito extensos esforços para desenvolver um novoteste de ácido nucléico para detecção de fragmento do gene G-CSF que não tenha a região do exon 3, que possa satisfazer orequisito acima referido ou resolver o problema acima e, comoresultado, descobriram que tem uma sensibilidade notadamentealta no diagnóstico de câncer, em comparação com outrostestes, quando um oligonucleotideo contendo uma seqüência deácidos nucléicos, que tenham a 3'-extremidade terminal daregião do exon 2 do gene G-CSF ligado à 5'-extremidadeterminal da região do exon 4 do gene G-CSF é utilizado comoum marcador de diagnóstico de câncer, e confirmaram que oestado de progressão do câncer pode ser diagnosticado comprecisão, utilizando um oligonucleotideo que contem aseqüência de ácidos nucléicos tendo a 3'-extremidade terminalda região do exon 2 do gene de G-CSF ligado à 5'-extremidadeterminal da região do exon 4 do gene de G-CSF, juntamente comum oligonucleotideo contendo seqüências de uma parte ou todaa região da região do exon 3 do gene de G-CSF como ummarcador de diagnóstico de câncer, completando assim apresente invenção.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Portanto, o principal objetivo da presenteinvenção é fornecer um oligonucleotideo para diagnosticarcâncer, essencialmente contendo uma seqüência de ácidonucléico de um local de junção (splice junction site) tendo a3'-extremidade terminal da região do exon 2 ligado à 5'-extremidade terminal da região do exon 4, com fator genéticoestimulante de uma colônia de granulócitos.

Outro objetivo da presente invenção éfornecer um kit de diagnóstico, para o diagnóstico de câncer,contendo o oligonucleotideo e um método para diagnosticarcâncer utilizando o oligonucleotideo.Para alcançar os objetivos acima, a presenteinvenção provê um oligonucleotideo para marcador dediagnóstico do câncer, essencialmente contendo uma seqüênciade ácidos nucléicos de um local de junção tendo a 3'-extremidade terminal da região do exon 2 ligado à 5'-extremidade terminal da região do exon 4 de um gene G-CSF.

Preferencialmente, o oligonucleotideo deacordo com a presente invenção contém essencialmenteseqüências de ácido nucléico SEQ ID de números: 1 ou 2.

A presente invenção fornece também um kit dediagnóstico para diagnóstico de câncer contendo ooligonucleotideo.

Na presente invenção, o kit de diagnósticopara diagnóstico de câncer de preferência é um kit dediagnóstico para avaliar o estado de progressão do câncer queadicionalmente contém um oligonucleotideo essencialmentecontendo seqüências de uma parte ou toda a região, da regiãodo exon 3 do gene de G-CSF.

A presente invenção fornece também um métodopara diagnosticar câncer, sendo que o método compreende asetapas de: (a) obtenção de uma amostra de ácido nucléico deG-CSF de uma amostra biológica de um mamífero; (b)amplificação da amostra de ácido nucléico do G-CSF obtida, e(c) detecção de oligonucleotídeos que contenham uma seqüênciaácidos nucléicos de um local de junção que tenha o 3'-extremidade terminal da região do exon 2 ligado à 5'-extremidade terminal da região do exon 4 de um gene G-CSF, naamostra amplificada.No método inventivo, o passo (c)preferencialmente contém uma etapa em que, simultaneamentedetecta-se um oligonucleotideo contendo seqüências de umaparte ou toda a região da região do exon 3, juntamente com umoligonucleotideo contendo uma seqüência de ácidos nucléicosde um local de junção tendo a 3'-extremidade terminal daregião do exon 2 ligado à 5'-extremidade terminal da regiãodo exon 4 de um gene G-CSF, na amostra amplificada.

Outras características e realizações dapresente invenção ficarão mais evidentes a partir da seguintedescrição detalhada e das reivindicações anexas.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

A FIG. 1 é um diagrama esquemático de umprocesso de produção normal de proteínas e variantes do genede G-CSF humano.

A FIG. 2 mostra uma região de junção daregião do exon 2 e da região do exon 3, que pode ser formadapor dois tipos (tipo A, tipo B) da região do exon 2 do geneG-CSF humano.

A FIG. 3 mostra posições a que os iniciadoresutilizados na PCR (Reação em Cadeia da Polimerase) estãoligados e produtos PCR esperados de acordo com as posições.

A FIG. 4 é um desenho de chip de DNA, queconsiste de testes de cada região do gene amplificado de G-CSF (E2: um teste concebido a partir de uma região do exon 2de um gene de G-CSF; E2E3a: um teste concebido a partir de umlocal de junção, tendo a 3'-extremidade terminal da região doexon 2 ligado à 5'-extremidade terminal da região do exon 3de um gene tipo A G-CSF; E2E3b: um teste concebido a partirde um local de junção tendo a 3'—extremidade terminal daregião do exon 2 ligado à 5'-extremidade terminal da regiãodo exon 3 de um gene tipo B G-CSF; E3-1, E3-3, E3-4 e E3-6:testes concebidos a partir de uma região do exon 3 do gene G-CSF; E2E4a: um teste concebido a partir de um local dejunção, tendo a 3'-extremidade terminal da região do exon 2ligado à 5'-extremidade terminal da região do exon 4 de umgene tipo A G-CSF; E2E4b: um teste concebido a partir de umlocal de junção, tendo a 3'-extremidade terminal da região doexon 2 ligado à 5'-extremidade terminal da região do exon 4de um gene tipo B G-CSF; P: um teste concebido de modo adistinguir posições através de indicadores fluorescentes comoum marcador de posição; N: um controle negativo (solução parapontear).

A FIG. 5 mostra os resultados de hibridizaçãoutilizando o chip de DNA da FIG. 4. Círculos vermelhosapresentam testes mostrando sinais.

A FIG. 6 mostra os resultados de hibridizaçãono chip de DNA da FIG. 4 de acordo com tipos de células etecidos (A: sangue humano normal, B: câncer do pulmão (A549),C: câncer do intestino grosso (SES-T), D: câncer do estômago(1: AGS, 2: YCC-2, 3: HwangOO, E: câncer cervical (1: C33A,2: HeLa), F: reprodutores (HT1080), G: câncer da mama (MDA-MB-231), H: câncer do pâncreas (Capan-2), I: câncer do fígado(SK-Hepl), J: melanoma maligno (SK-Mel), K: leucemia (JurketcDNA biblioteca), L: rim embrionário (293)). Círculosvermelhos mostram sinais de testes capazes de distinguirentre tecidos cancerígenos e tecidos normais.

A FIG. 7 é uma vista esquemática de um chipde DNA, que consiste de testes para a detecção de um local dejunção do gene G-CSF (E2E4: um teste concebido a partir de umlocal de junção, tendo a 3'-extremidade terminal da regiãodo exon 2 ligado à 5'-extremidade terminal da região do exon4 de dois tipos de genes G-CSF (tipo A, tipo Β) ; E2E3: umteste concebido a partir de um local de junção, tendo o 3'-extremidade terminal da região do exon 2 e da 5'-extremidadeterminal da região do exon 3 de dois tipos de genes G-CSF(tipo A, tipo Β); P: um teste concebido de modo adistinguir posições através de indicadores fluorescentes comoum marcador de posição; N: um controle negativo (solução parapontear).

A FIG. 8 mostra os resultados de hibridizaçãodo chip de DNA da FIG. 7 de acordo com tipos de células etecidos. Círculos vermelhos apresentam um teste que podemostrar sinais especificamente no caso do câncer.

A FIG. 9 é uma vista esquemática de um chipde DNA no qual testes, projetados a partir de cada região doexon do gene G-CSF para examinar a eficiência de diagnósticode cada teste, são fixadas.

A FIG. 10 é uma vista esquemática mostrandoposições de cada teste no gene G-CSF. Testes incluídos em umaelipse entre provas para o gene G-CSF, não contendo exon 3são projetados a partir da 3'-extremidade terminal do exon 2e a 5'-extremidade terminal do exon 4 de variantes de ligaçãode moléculas de DNA entre si.

A FIG. 11 mostra a intensidade dos sinais detestes de acordo com tipos de células e teste de candidatosmostrando eficácia, o que poderá ser deduzida deles.A FIG. 12 mostra os resultados dehibridização utilizando chip de DNA da FIG. 9. Círculosvermelhos apresentam um teste que pode especificamentemostrar somente sinais de câncer.

A FIG. 13 apresenta os resultados dehibridização, utilizando chip de DNA da FIG. 9 de acordo comtipos de células e tecidos. Imagens de reações dehibridização que são obtidas através de um Scanarray 5000 (R:sangue normal (WBC), B: 293 (linha de células embrionárias),C: SES-N (intestino grosso normal), D: SES-T (câncer dointestino grosso), E: Colo205 (linha celular de câncer docólon), F: DLD-I (linha celular de câncer do cólon), G:HwangOO (células do estômago cancerígenas), H: YCC-3 (linhade celular de câncer do estômago), J: MDA-MB-231 (linhacelular de câncer da mama), K: NCI-H460 (linha celular decâncer do pulmão), L: Caki-2 (linha celular de câncer do rim), M: Capan-2 (linha celular do câncer do pâncreas), N: SK-Mel2 (melanoma maligno), O: HepG-2 (carcinoma hepatocelular),P: SK-Hepl (linha celular do câncer do fígado)). Círculosvermelhos apresentam um teste que pode mostrar sinaisespecificamente em caso do câncer.

A FIG. 14 mostra chips de DNA, que sãopreparados através da mistura de cada teste com uma soluçãopara pontear. A parte marcada com um quadrado azul é umaregião em que um teste representando o câncer estálocalizado.

A FIG. 15 mostra os resultados dehibridização de produtos obtidos através de amplificação daseqüência de nucleotídeos do gene G-CSF humano, derivado dogene normal e de amostras de tumor clínico, usandoiniciadores de SEQ ID NO: 32 e SEQ ID NO: 33, de acordo comExemplo 8 e Exemplo 9 com chips de DNA da FIG. 14.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO E REALIZAÇÕESPREFERENCIAIS

A presente invenção refere-se a um métodopara diagnóstico de câncer e / ou avaliação do estado deprogressão do câncer, utilizando um oligonucleotideo queessencialmente contém uma seqüência de ácidos nucléicos em umlocal de junção tendo a 3'-extremidade terminal da região doexon 2 ligado à 5'-extremidade terminal do exon 4 comofragmento das variantes do gene G-CSF gerados após o processode pós-transcrição com um método de análise genética, queinclui um micro-arranjo. Em outras palavras, a presenteinvenção relaciona-se a um método para diagnosticar o câncere / ou avaliar o estado de progressão do câncer utilizandovariantes do gene G-CSF obtidas suprimindo-se uma região deexon 3 no gene G-CSF para ligar uma região de exon 2 e uma deregião de exon 4, como um marcador para diagnóstico docâncer.

Os exons 1 a 5 do gene G-CSF estãonormalmente ligados durante o processo de ligação demoléculas individuais de DNA entre si, em um corpo humanonormal, no entanto esta ligação ocorre em uma forma de umavariante que não tem o exon 3 em células de tumores oucélulas de tumores progressivos para produzir mRNA não tendoo exon 3 (FIG. 1). A região do Exon 2 de um gene G-CSFhumano tem dois tipos (tipo A, tipo Β), por tanto, o local deligação da região do exon 2 e da região do exon 3 tambémdispõe de dois tipos (Fig. 2). Além disso, como resultadodesta ligação de moléculas do gene G-CSF, G-CSF mRNA tendotodos os exon 1 a exon 5, este é isolado de uma célulanormal, e do mRNA não tendo o exon 3, que é isolado a por umacélula de tumor, e a já referida diferença dos mRNAs pode serconfirmada pela PCR utilizando bases especificas do gene G-CSF (Fig. 3) .

Métodos biológicos moleculares que sãoutilizados na identificação tanto de genes especificamenteexpressos (ou não expressos) em células de tumor e mutaçãogenética são exemplificados por PCR (Bottema, C.D., Mutat.Res., 233:93 ~ 102, 1993; Nelson, D.L., Curr. Opin. Genet.Dev., 1:62 ~ 68, 1991; Pourzand, C. e Cerutti, P., Mutat.Res., 288:113 ~ 121, 1993; Holland, P.M. et al., Proc. Natl.Acad . Sei. USA, 8:7276 ~ 7280, 1991), Single-StrandedConformation Polymorphism (SSCP, Glavac, D., Hum. Mutat.,19:384 ~ 394, 2002; Strippoli, P. et al., Int. J. Mol. Med.,8:567 ~ 572, de 2001), DNA Sequencing Analysis (Sanger, F.et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 74:6463 ~ 5467, 1997),Protein Truncation Test (Hardy, C.A., Methods Mol. Biol.,187:87 ~ 108, 2002), Análise da seqüência automáticanucleotidica (Boutin, P. et al., Hum. Mutat., 15 (2): 201 ~203, 2000), estudo da perda de heterozigose (Yang, P. et al. ,Clin. Câncer Res., 8:2890 ~ 2893, 2002), estudo dainstabilidade micro-satélites (Furlan, D. et al., J. Pathol.,197:603 ~ 609, 2002), análise genética utilizando MALDI-TOF(Leushner J., Expert. Rev. Mol. Dign., 1:11 ~ 18, 2001),análise genética por hibridização (Wetmur, JG, CriticaiReviews in Biochem. Mol . Biol., 26:227 ~ 259, 1991), análisegenética utilizando chips de DNA (Goessl et al., Urologia,58:335 ~ 338, 2001; Zhou et al., Brest Câncer Res. Treat.,66:217 ~ 224, 2001; Korea Pat. Publication No. 2001-0061173),a análise utilizando chips de proteínas (pharmacogenomics,1:385 ~ 393, 2000). Assim os técnicos no assunto entenderãoque podem facilmente detectar a existência de variantesespecíficas em um local de junção de acordo com a presenteinvenção, gerado em um processo pós-transcricional de G-CSF,através do uso apropriado de métodos biológicos molecularesconhecidos, incluindo os métodos acima mencionados. Osinventores da presente invenção descobriram que os testesmais efetivos capazes de detectar a existência de variantessão apenas candidatos a testes capazes de detectar aexistência de um local de junção, assim, inventando um métodode diagnóstico pelo qual a sua existência possa serdetectada. No entanto, entre os métodos acima mencionados, adetecção de variantes especificas geradas durante o processode pós-transcricional do G-CSF, de acordo com a presenteinvenção é preferencialmente e facilmente executada usandoPCR, uma reação de hibridização e o chip de DNA.

Para realizar diagnóstico do câncer, deacordo com a presente invenção, um gene G-CSF, ou variantesdo mesmo, devem ser primeiramente obtidos a partir deespécimes de tecidos ou células. Uma vez que a amostra de DNAde um gene especifico é, tipicamente obtido a partir detecidos normais ou células em uma quantidade muito pequena, ogene especifico deveria ser amplificado pela PCR e para talamplificação, bases adequadas para tal amplificação deveriamser projetadas. Na presente invenção, para amplificar emparte ou todo uma região de um local de junção de uma regiãode exon 2 e uma região de exon 4, os fragmentos de ácidonucléico de DNA a serem utilizados como iniciadores da PCRpara detecção da existência de um local de junção sãonecessários. Ou seja, os iniciadores, como aqui utilizados,referem-se aos oligonucleotideos capazes de amplificar umaseqüência de nucleotideos do gene G-CSF, que compreende umaparte ou toda a região de um local de junção de uma região deexon 2 e uma região de exon 4. Os entendidos na matéria serãocapazes de facilmente projetar tais iniciadores. Por isso,todos os iniciadores capazes de amplificar as variantes dogene G-CSF, compreendendo uma parte ou toda região de umlocal de junção, que podem ser projetados pelos entendidosestão compreendidos no escopo da presente invenção.

De acordo com um aspecto da presenteinvenção, provê-se um micro-arranjo de gene ou membrana, aoqual o fragmento de DNA, contendo um local de junção tendo um3'-final de um exon 2 ligado ao 5'-final do exon 4 do gene G-CSF que está imobilizado, útil para o diagnóstico de câncer.O micro-arranj o do gene inclui chips de DNA eficazes nadetecção de um gene através da hibridização incluindo aaplicação de um teste complementar de oligonucleotideoimobilizado na superfície de uma lâmina de vidro tratada comum reagente químico específico. Exemplos não-limitantes damembrana, que pode ser usada ao em vez da lâmina de vidro nahibridação, pode incluir todas as membranas capazes deimobilizar fragmentos de DNA; e, preferencialmente, membranasde nylon e de nitro celulose.

A fixação de testes na superfície de umalâmina de vidro e uma membrana pode ser facilmente alcançadapela técnica convencional conhecida da técnica. Além disso, apreparação de alvos, hibridização e descascamento, serárealizada de acordo com técnicas convencionais conhecidas datécnica.

Em outro aspecto da presente invenção, estáincluída a composição para diagnóstico de câncer,compreendendo um fragmento de DNA contendo um local de junçãotendo o 3'-final de um exon 2 ligado ao 5'-final do exon 4 deum gene G-CSF e um transportador convencional aceitável paradiagnóstico. Em um outro aspecto da presente invenção, estáincluído um kit para diagnóstico, contendo um fragmento deDNA contendo um 3'-final de um exon 2 ligado ao 5'-final doexon 4 do gene G-CSF e um micro-arranjo de DNA utilizandofragmento de DNA.

Exemplos

Daqui em diante, a presente invenção serádescrita mais detalhadamente através de exemplos específicos.Entretanto, a presente invenção não se limita a essesexemplos, e é óbvio para aqueles que tem um mínimo dehabilidade no ramo da presente invenção, que as numerosasmodificações poderiam ser feitas dentro do espírito e doâmbito da presente invenção.

Exemplo 1: Preparação de amostras de tecidos(células)

As linhas de células normais e linhas decélulas de tumores utilizadas nos Exemplos da presenteinvenção estão apresentados na Tabela 1, abaixo. As amostrasmarcadas têm o mesmo resultado que as de linhas de célulasnormais na Tabela 1.

As linhas de células de tumores listadas naTabela 1 podem ser obtidas a partir de centros derecolhimento de amostras listados na Tabela 1. A linha decélulas de tumores, obtidas do centro de pesquisa de célulasem metástase no College of Medicine, Universidade Yonsei, foipreparada como segue. Após o fluido ascético ter sido obtidode forma asséptica a partir de pacientes doentes com cânceravançado, complementado com heparina em um montante de 10unidades por ml para evitar a aglomeração de células ecentrifugado a 400g por 10 min. As células precipitadasobtidas por centrifugação foram cultivadas em um balão decultura de 25cm2. No caso de conter um grande número dehemácias, a centrifugação do gradiente de densidade Ficoll-hypaque a 800g foi executada para separar as célulasmononucleares das hemácias, e a fase de células mononuclearesobtidas foi incubada a 37°C a 5% de CO2. Após incubação de 1dia (16 ~ 18 horas), o meio da cultura foi centrifugado a400g por 10 minutos, e as células precipitadas foramcultivadas em um novo balão de cultura de 25cm2. Durante acultura, as células foram observadas sob um microscópio decontraste de fase e o meio de cultura foi substituído duas outrês vezes por semana. Quando colônias de células de tumoresforam formadas, as células de tumores aglomeradas foramobtidas por tratamento com tripsina-EDTA ou pela obtenção decolônia ou utilizando raspadeiras, ou o fluido contendocélulas de tumores foi centrifugado para remover célulasnormais. As resultantes células de tumores puras foramarmazenadas em estado congelado de acordo com suas passagens.

Células leucócitos humanas podem ser obtidasda seguinte forma. Após 8ml de sangue ter sido transferidopara um tubo Corning de 50ml, 24ml de RBC foi adicionado paraa quebra do sistema tampão e a mistura foi deixada emrepousar a 4°C por 10 min, agitando-a de vez em quando. Apóscentrifugar a mistura a 2000 rpm a 4°C por 12 min econfirmando um sedimento leucocítico, um sobrenadante foiremovido. Se o RBC (glóbulos vermelhos) permaneceu, omencionado processo foi repetido. TRIZOL foi adicionado parafinalmente obter um sedimento leucocítico para separar o RNA.

Tabela 1

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Exemplo 2: Preparação de mRNA e de cDNA apartir de linhas celulares

0 RNA total foi isolado de cada linha decélulas de tumor, linha de células normais e tecido normalutilizando reagente Trizol (Gibco-BRL, USA) . Iml de reagenteTrizol foi adicionado a uma amostra de tecido triturado apóster sido rapidamente congelada usando nitrogênio liquido,seguido por incubação à temperatura ambiente por 5 min. 0.2ml de clorofórmio foi adicionado à amostra de tecidoresultante, vigorosamente processado por 15 segundos eincubada a temperatura ambiente por 5 min. Após centrifugaçãoa 12000g a 4o C por 15 min, a fase aquosa resultante foitransferida para um novo tubo. Um volume igual de isopropanolfoi adicionado ao tubo, e o tubo foi colocado a 4o C por 10min. Após centrifugação a 12000g a 4o C por 10 min, a partesobrenadante foi cuidadosamente descartada, e o sedimento foilavado com etanol 70%, seguido por centrifugação a 7500g a 4oC por 5 min. Depois de ser seco, o sedimento de RNA foidissolvido em água livre de RNase.

Para sintetizar cDNA do mRNA isolado de cadalinha celular e do tumor de origem humana e da linha celularnormal, a RT-PCR foi realizada como a seguir. 2 μ9 de RNAtotal foi misturada com 1 μ£ de um oligo (dT) i6-iniciador, eágua livre de RNase foi adicionada até um volume final de 11Essa mistura foi aquecida a 90° C por 5 min, e colocadaem gelo, imediatamente após o término do aquecimento. Apóscolocar 4 ul de reagente tampão, 2 de 10 mM de dNTPs, 1de inibidor de RNase e 2 μ2 de transcriptase revertida emoutro tubo, 8,5 de mistura de RNA foi adicionada ao tuboda pré-mistura, seguido por incubação, a temperatura ambientepor IOmin. A mistura da reação foi incubada a 42 ° C por 90min, e, depois, a 95° C para 15 min. Imediatamente após aincubação a 95° C, a mistura foi colocada em gelo paraencerrar a reação, produzindo assim uma amostra de cDNA.

Exemplo 3: Preparação de chip 1 de DNA para oexame de eficácia do teste para diagnóstico do câncer

A fim de investigar se um chip de DNA podeser usado como uma ferramenta para a detecção de um local dejunção do mRNA ou cDNA do G-CSF, vários testes de fragmentode DNA capazes de serem imobilizados sobre uma lâmina devidro foram preparados como segue. Em teste correspondente auma parte do exon 2 do G-CSF, quatro testes não-sobrepostoscorrespondentes ao exon 3 e um teste correspondente a umaparte do exon 4 foram projetados para consistirem de 20nucleotideos cada. Uma vez que dois diferentes mRNAs de G-CSF(G-CSFa humanos e mRNAs de G-CSFb humano) são geradosatravés de ligação de moléculas individuais na região do exon2 (Tshuchiya, M. et al., EMBO J., 5:575 ~ 581, 1986) , Doistipos de testes compreendendo a região que corresponde aoexon 2 foram preparadas, com base em dois diferentes mRNAs doG-CSF. Seqüências de ácidos nucléicos deste são apresentadasna Tabela 2.

Tabela 2

<table>table see original document page 21</column></row><table>

Para conferir a capacidade de ser imobilizadosobre uma lâmina de vidro, ao sintetizar todos os testes defragmentos de DNA, uma base tendo um grupo de amino foiinserido ao 3'- final dos testes usando uma coluna deconectores de amino (Cruachem, Glasgow, Scotland), e lâminade vidro contendo resíduos de aldeído (CEL Associates, Inc.,Texas, Huston, USA) foram utilizados.

Depois de ser dissolvido em 3 χ SSC (0,45 MNaCl, 15 mM C6H5Na3O7, pH 7,0), os testes de DNA foramimobilizadas sobre a lâmina de vidro através do acumulo detestes de DNA utilizando um micro-arranjo fabricado pelospresentes inventores (Yoon et al., J. Microbiol. Biotechnol.,10:21 ~ 26, 2000), e reagindo por mais de Ihr sob cerca de55% de umidade e, em seguida, deixando o vidro à temperaturaambiente por 6hrs (FIG. 4) . Aqui, os testes foram dispostosem intervalos de 180 μm sobre o vidro em uma quantidade de100 μ Μ, produzindo desta forma um micro-arranjo. Aimobilização dos testes através de reação dos grupos aminodos testes e grupos de aldeido sobre os vidros foi estimadacom a coloração verde SYBRO II (Molecular Probes, Inc.,Leiden, Netherlands).

Exemplo 4: Preparação da amostra-alvo para adetecção de variantes especificas

PCR assimétrica foi realizada utilizando mRNAou cDNA isolado de cada linha de célula do Exemplo 2 como ummodelo sob as condições de denaturação a 94° C por 5min, 30ciclos de denaturação a 94° C por lmin, associação ou re-associação de ácidos nucléicos de 50 ~ 56° C por lmin eextensão a 12° C por 30sec, seguida de extensão final a 72° Cpor 5min. Um conjunto iniciador utilizado na PCR Assimétricaé a seguinte. Um iniciador reverso foi marcado com FITC paraa detecção.

Iniciador de Avanço: 5'-ACC CCC CTG GGC CCTGCC-3'(ID SEQ NO: 13)

Iniciador Reverso: FITC-5'CTG CTG CCA GAT GGTGGT-3'(ID SEQ NO: 14)

Os produtos da PCR foram separados em um gelde agarose. A partir do resultado da eletroforese foramproduzidos fragmentos de filamentos duplos de DNA e simplesde DNA em cada amostra da PCR (Fig. 3). Após a amplificaçãodo gene G-CSF pela PCR assimétrica, uma solução dehibridização (6 χ SSPE, 20% (v / v) foramida foi adicionada ado produto amplificado até um volume final de 200 Amistura foi colocada em uma lâmina de vidro (um chip 1 de DNApara diagnóstico do câncer, FIG. 4) contendo um testeimobilizado e um vidro foi coberto com uma câmera deincubação com clipe de teste pré-lacrado (Sigma Co., St.Louis, MO.), Seguido de incubação em uma incubadora emmovimento a 30° C por 6 horas para indução do testecomplementar ao produto amplificado. Posteriormente, o vidrofoi lavado por mais de 5 min com 3 χ SSPE (0,45 M NaCl, 15 mMC6H5Na3O7, pH7.0), 2 χ SSPE (0,3 m NaCl, IOmM C6H5Na3O7,pH7.0) , e, em seguida, 1 χ SSPE (0,15 M NaCl, 5 mM C6H5Na3O7,pH7.0).

Exemplo 5: Resultado do teste do chip 1 deDNA para diagnóstico de câncer

Após os produtos alvo amplificados pela PCR

Assimétrica terem sido aplicados ao chip de DNA, preparado noExemplo 3, eles foram escaneados utilizando Scanarray 5000(GSI Lumonics Inc., Bedford, MA., U.S.A.). Para previsão dosresultados relativos aos testes, no caso em que o plasmideonão tenha qualquer supressão do exon 3 no gene G-CSF, sinaisforam detectados através da aplicação no chip de DNA. Emcontrapartida, no caso do GSF com exon 3-suprimido contendoplasmideo, sinais foram detectados através da aplicação nochip de DNA, onde os plasmideos têm seqüências denucleotideos SEQ ID η ° s: 26 e 27.

Como resultado, conforme mostrado na FIG. 5,apenas o teste E2E4a mostrou sinais em local de supressão.

Este plasmideo tinha tipo A de exon 2 (Fig. 1). Emcontrapartida, no caso do plasmideo no qual o gene G-CSF nãofoi suprimido, o teste E2E3a e testes na região de exon 3mostraram sinais. Se as seqüências de não supressão e desupressão do exon3 no G-CSF fossem misturadas, resultadosmistos dos dois casos, podem ser previstos. A FIG. 6 mostraos resultados da hibridização através do Scanarray 5000segundo o DNA alvo, de acordo com cada célula foi aplicadoao chip de DNA da FIG. 4. Tal como mostrado na FIG. 6, nocaso em que os testes produzidos a partir da região deinterligação de exon 2 e exon 4, que apenas variantesespecificas podem ter, células poderiam ser detectadas emcada teste.

Exemplo 6: Preparação do chip 2 de DNA paraexame da eficácia do teste e resultado dos testes paradiagnóstico de câncer

Para examinar a eficácia do E2E4 nodiagnóstico do câncer, um novo tipo de chip 2 de DNA foipreparado (FIG. 7) . Para decodificar facilmente, o chip 2 deDNA foi projetado para ter dois tipos de exons (E2E4 da FIG.7 contém ambos os tipos A e Β, o E2E3 contém ambos os tipos Ae B do E2E3a e E2E3b). Testes foram imobilizados pelo mesmométodo de imobilização descrito no Exemplo 3, e, comoresultado da hibridização de uma amostra alvo preparada noExemplo 4, como mostrado na FIG. 8, foi confirmado que ostestes produzidos da região de junção do exon 2 e 4 é a maispoderosa no desenvolvimento de um sistema que pode facilmentediagnosticar o câncer usando o chip de DNA produzido. Parafortalecer a intensidade do sinal, testes tendo seqüências deácidos nucléicos da Tabela 3 abaixo foram aplicados na basede uma seqüência de ácidos nucléicos do local de junção.

Tabela 3

<table>table see original document page 24</column></row><table>

Exemplo 7; Preparação do chip 3 de DNA paraexame da eficácia do teste para diagnóstico do câncer.

Para examinar se os testes produzidos dasregiões de junção dos exon 2 e 4 onde estavam as maispoderosas; o chip 3 de DNA foi preparado projetando-se testesde cada seqüência de nucleotideos em cada região (FIG. 9). AFIG. 10 mostra a posição provável de cada teste no gene G-CSFe a Tabela 4 mostra a seqüência de ácido nucléico de cadateste. Os testes foram fixados pelo mesmo método deimobilização descrito no Exemplo 3.

Tabela 4

<table>table see original document page 25</column></row><table>

Exemplo 8: Teste do chip 3 de DNA paraexaminar a eficácia do teste para diagnóstico de câncer

Após os produtos alvos amplificados pela PCRAssimétrica descrita no Exemplo 4 ter sido aplicada ao chip 3de DNA preparado no Exemplo 7 (FIG. 9), eles foram escaneadosutilizando o Scanarray 5000 (GSI Lumonics Inc., Bedford, MA.,USA). De antemão, os sinais do chip foram testados tanto nocaso de utilizar-se a seqüência sem supressão do exon 3 e, nocaso de utilizar-se a seqüência não obtendo o exon 3 no geneG-CSF, aplicado sobre o chip de DNA.

A FIG. 11 mostra os resultados de cada testede acordo com as amostras biológicas aplicadas. As amostrasmarcadas com verde na parte esquerda da tabela mostram osresultados de amostras classificadas como normais, asamostras marcadas com vermelho no meio mostram os resultadosdas amostras classificadas como câncer. O lado direitorepresenta os resultados em candidatos finais para marcadoresde diagnóstico do câncer analisando todos os respectivosresultados. O grau da cor amarela, em cada coluna da Tabelarevela a presença de um sinal e sua respectiva intensidade, ecores vermelhas na coluna do lado direito da Tabelarepresentam fortes candidatos de testes com eficácia, quepodem detectar o câncer.

Tal como foi demonstrado na FIG. 11, testesproduzidos a partir da região de junção dos exons 2 e 4 sãoum poderoso teste que pode detectar câncer entre oscandidatos a teste que foram projetados de cada região deexon. Aqui, um teste para o tipo A mostra sinais com altaintensidade na maioria dos casos de câncer e, em caso ondesinais são detectados no SEQ ID NO: 4 e SEQ ID NO: 1simultaneamente, poderia ser interpretado que o teste temvariantes especificas de câncer tendo o exon 2 do tipo A. Namesma linha, no caso em que os sinais são detectados em SEQID NO: 5 e SEQ ID NO: 2 simultaneamente, poderia serinterpretado que o teste tem variantes especificas de câncertendo o exon 2 do tipo B (Fig. 1).Pelo contrário, candidatos poderosos quepodem distinguir células normais são um teste (SEQ ID NO: 8)da região do exon 3, no entanto, porque os sinais sãomostrados em quase todas as amostras entre as amostras decâncer às quais este teste foi aplicado, é impossíveldistinguir entre amostras normais e amostras de câncer usandoa existência deste teste. Além disso, como testes dediferentes locais da região do exon 3 não mostram sinaistanto na amostra normal quanto na amostra de câncer devido àsua fraca sensibilidade, distinguir entre amostra normal eamostra de câncer é impossível usando os testes.

A amostra alvo foi amplificada por PCR

Assimétrica usando um plasmídeo tendo na região do exon 2 dotipo A como um modelo, tal como descrito no Exemplo 4, e aamostra alvo foi aplicada ao chip 3 de DNA (FIG. 9) . Comoresultado, conforme mostrado na FIG. 12, o teste E2E4a apenasmostrou sinais em uma amostra de plasmídeo em que o exon 3 dogene G-CSF foi excluído. Seqüências de nucleotídeos deplasmídeos não tendo qualquer supressão do gene G-CSF esupressão do gene G-CSF são SEQ NO ID: 26 e SEQ ID NO: 27,respectivamente.

A FIG. 13 apresenta os resultados de detecçãopor Scanarray 5000 após o DNA alvo, de acordo com cadaamostra, ter sido aplicado ao chip 3 de DNA da FIG. 11. Talcomo apresentado na FIG. 13, foi confirmado que a existênciade câncer poderia ser detectada através da existência desinais nos testes projetados a partir de um local de junçãoda região do exon 2 e exon 4, que é a única base paradistinguir células cancerosas através de cada teste. Locaismarcados com círculos vermelhos são marcadores de diagnósticode câncer cuja eficácia foi confirmada pela presenteinvenção.

Exemplo 9: Isolamento de RNA a partir dosangue ou tecidos de indivíduos normais e pacientes

0 RNA total de cada linha de células decâncer, sangue normal e tecidos normais foram isoladosutilizando REAGENTE TRIZOL ® (GIBCO-BRL, USA) . No caso dosangue, este foi isolado utilizando REAGENTE TRIZOL® LS(GIBCO-BRL, USA). Para preparar uma amostra, sangue eREAGENTE LS são adicionados em uma proporção de 1:3.

Dependendo do caso, a amostra de sangue foi previamentediluída em uma proporção de 1:1 e, então, o REAGENTE pode seradicionado em uma proporção de 1:3. 0,75 ml de reagenteTRIZOL LS foi adicionado a uma amostra de sangue de 0,25 ml(ou amostra de sangue diluído) e RNA pode ser extraído deacordo com o protocolo. No caso de tecidos, 1 ml do reagenteTrizol foi adicionado a uma amostra de tecido processado apóso rápido congelamento usando nitrogênio líquido para isolar oRNA de acordo com o protocolo.

A amostra de tecido resultante acrescida com1 ml de reagente Trizol foi incubada a temperatura ambientepor 5 min. A amostra de tecido resultante foi completada com0,2 ml de clorofórmio, vigorosamente misturada por 15sec, eincubada a temperatura ambiente por 5 min. Após centrifugaçãoa 12000g a 4o C por 15 min, a fase aquosa resultante foitransferida para um novo tubo. Um volume igual de isopropanolfoi adicionado ao tubo, e o tubo foi colocado a 4o C por 10min. Após centrifugação a 12000g a 4 C por 10 min, osobrenadante foi cuidadosamente descartado e o sedimento foilavado com etanol 70%, seguido por centrifugação a 7500g a 4oC por 15 min. Depois de ter sido seco, o sedimento de RNA foidissolvido em água livre de RNase.

Exemplo 10: Ampliação de gene G-CSF a partirdo RNA

Para sintetizar o cDNA do mRNA isolado decada linha celular, e tumor de origem humana e linha decélula normal e para amplificar o gene G-CSF, RT-PCR foirealizado como segue. 1 ~ 2 |ig do RNA total e 8 de umaetapa de pré-mistura de PCR (Intron Inc., Korea) forammisturados com os iniciadores da SEQ ID NOs: 28 e 29 daTabela 5, e água livre de RNase foi adicionada até um volumefinal de 20 Em seguida, o gene G-CSF pode ser amplificadoa partir do RNA, realizando-se uma reação de amplificação soba condição descrita na Tabela 5. GAPDH foi amplificadoutilizando iniciadores da SEQ ID NO: 30 e SEQ ID NO: 31, efoi usado como um controle para amplificação do RNA.

Tabela 5

<table>table see original document page 29</column></row><table>Tabela 6

<table>table see original document page 30</column></row><table>

hG-CSF foi amplificado utilizando 1 ~ 2 doprimeiro produto da PCR como modelo, que foi amplificado pelométodo de uma etapa da PCR (Tabela 2), baseado em 50 dovolume da reação total com os iniciadores do SEQ ID NO: 32 eSEQ ID NO: 33, onde SEQ ID NO: 33 foi marcado comfluorescência (Cy5 ou um tipo diferente de fluorescência). APCR assimétrica que tem uma grande diferença em adição àproporção do iniciador de avanço (SEQ ID NO: 32) e iniciadorreverso (SEQ ID NO: 33) de 1:5 a 1:10 foi executada de formasecundária de modo a obter uma amplificação final dosprodutos.

GAPDH também pode ser obtida marcando-se oiniciador reverso (SEQ ID NO: 31), com f luorescência paradesempenhar uma reação de amplificação, tal como descritoacima.

Exemplo 11: Preparação de chip de DNA paraaplicação a diagnósticos de pacientes e_resultados de

O chip de DNA foi preparado por mistura decada teste (E2E4a e E2E4b) em 3X SSC solução para pontear umaconcentração de 50 μΜ (FIG. 14). A parte marcada com umquadrado azul na FIG. 14 é a região na qual os testesindicando câncer estão localizados.

Produtos da PCR de indivíduos e pacientesnormais, amplificados utilizando-se iniciadores da SEQ ID NO:32 e SEQ ID NO: 33 foram hibridizados ao chip de DNA deacordo com os Exemplos 8 e 9 (FIG. 15) . Para identificar umcontrole para o experimento, o GAPDH amplificado utilizandoiniciadores da SEQ ID NO: 30 e SEQ ID NO: 31 também foramhibridizados. Os pacientes com a aplicação dos produtos forammostrados em cada figura. Na FIG. 15, formas elípticas roxasmostram sinais em testes indicando câncer.

Tal como ficou mostrado na FIG. 15, comoresultado da aplicação do chip de DNA para diagnóstico docâncer, de acordo com a presente invenção de diagnóstico depacientes, foi confirmado que testes para diagnóstico decâncer, de acordo com a presente invenção são excelentes comoum marcador para diagnóstico de câncer em um chip de DNApreparado.

Aplicabilidade industrial

Tal como descrito e comprovado detalhadamenteacima, a presente invenção prove um oligonucleotídeo queessencialmente contém uma seqüência de ácidos nucléicos de umlocal de junção tendo a região da 3'-extremidade terminal doexon 2 ligada a região da 5'-extremidade terminal do exon 4de um gene G-CSF, um kit de diagnóstico do câncer contendo ooligonucleotídeo e um método para diagnosticar câncer usandomolécula de ácidos nucléicos. De acordo com a presenteinvenção, o câncer pode ser diagnosticado rapidamente e comexatidão usando uma variação do gene G-CSF.Embora uma realização especifica da presenteinvenção tenha sido descrita detalhadamente, os especialistasna matéria devem estar conscientes de que a descrição émeramente uma realização preferencial e não está realizada deforma a limitar o âmbito da presente invenção. Assim, oescopo substancial da presente invenção será definido pelasreivindicações e equivalentes que acompanham a mesma.LISTAGEM DE SEQUENCIAS

<110> MEDIGENES Co., LTD

<12 0> MARCADOR E MÉTODO PARA DIAGNÓSTICO DE CÂNCER

<130> PF-B0596

<140> 10-2006-0006279<141> 2006-01-20

<150> PCT/KR2007/000300<151> 2007-01-18

<160> 33

<170> PatentIn version 3.2

<210> 1<211> 20<212> DNA<213> Artificial

<220><223> Probe

<400> 1Ggagaagctg gcaggctgct 20

<210> 2<211> 20<212> DNA<213> Artificial

<220><223> Probe

<400> 2ggtgagtgag gcaggctgct 20<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Probe

<400> 3

ctgcagctgc tgctgtggca

<210> 4

<211> 16

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Probe

<400> 4

agaagctgtg tgccac

<210> 5

<211> 16

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Probe

<400> 5

tgagtgagtg tgccac

<210> 6<211> 20<212> DNA<213> Artificial

<220>

<223> Probe

<400> 6

tgtgccacct acaagctgtg

<210> 7

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Probe

<400> 7

gagctggtgc tgctcgga

<210> 8

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Probe

<400> 8

ggacactctc tgggcatc

<210> 9

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Probe<400> 9

ggacactctc tgggcatc

<210> 10

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Probe<400> 10

gcaggctgct tgagccaa

<210> 11

<211> 16

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Probe

<400> 11agaagctggc aggctg

<210> 12

<211> 16

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Probe

<400> 12tgagtgaggc aggctg

<210> 13<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<22 3> Primer

<400> 13

acccccctgg gccctgcc

<210> 14

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<22 3> Primer

<400> 14

ctgctgccag atggtggt

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Probe

<400> 15

gagcttcctg ctcaagtgct

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220><223> Probe

<400> 16

agagcttcct gctcaagtgc

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Probe

<400> 17

gcaagtgagg aagatccagg

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Probe

<400> 18

ccagagcttc ctgctcaagt

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Probe

<400> 19

caagtgagga agatccaggg<210> 20

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Probe

<400> 20

ctggtgagtg gcaggctgct 20

<210> 21

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Probe

<400> 21

cttttcctct accaggggct 20

<210> 22

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Probe

<400> 22

catagcggcc ttttcctcta 20

<210> 23

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial<220>

<223> Probe

<400> 23

ttttcctcta ccaggggctc

<210> 24

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Probe

<400> 24

tagcggcctt ttcctctacc

<210> 25

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Probe<400> 25

cggccttttc ctctaccag

<210> 26<211> 525<212> DNA

<213> Hxoman normal cell<400> 26

acccccctgg gccctgccag ctccctgccc cagagcttcctgctcaagtg cttagagcaa

8/11gtgaggaaga tccagggcga tggcgcagcg ctccaggagaagctgtgtgc cacctacaag

120

ctgtgccacc ccgaggagct ggtgctgctc ggacactctctgggcatccc ctgggctccc 180

ctgagcagct gccccagcca ggccctgcag ctggcaggctgcttgagcca actccatagc 240

ggccttttcc tctaccaggg gctcctgcag gccctggaagggatctcccc cgagttgggt 300

cccaccttgg acacactgca gctggacgtc gccgactttgccaccaccat ctggcagcag 360

atggaagaac tgggaatggc ccctgccctg cagcccacccagggtgccat gccggccttc 420

gcctctgctt tccagcgccg ggcaggaggg gtcctagttgcctcccatct gcagagcttc 480

ctggaggtgt cgtaccgcgt tctacgccac cttgcccagc cctga525

<210> 27<211> 417<212> DNA

<213> Hiiman breast câncer cell<400> 27

acccccctgg gccctgccag ctccctgccc cagagcttcctgctcaagtg cttagagcaa 60

gtgaggaaga tccagggcga tggcgcagcg ctccaggagaagctggcagg ctgcttgagc 120

caactccata gcggcctttt cctctaccag gggctcctgcaggccctgga agggatctcc 180

cccgagttgg gtcccacctt ggacacactg cagctggacgtcgccgactt tgccaccacc 240atctggcagc agatggaaga actgggaatg gcccctgccctgcagcccac ccagggtgcc 300

atgccggcct tcgcctctgc tttccagcgc cgggcaggaggggtcctagt tgcctcccat 360

ctgcagagct tcctggaggt gtcgtaccgc gttctacgccaccttgccca gccctga 417

<210> 28

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Primer

<400> 28

agagccccat gaagctgat

19

<210> 29

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<22 3> Primer

<400> 29

gacacctcca ggaagctctg

20

<210> 30

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220><223> Primer

<400> 30

catcttccag gagcgagacc

<210> 31

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Primer<400> 31

tccaccaccc tgttgctgta

<210> 32

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Primer

<400> 32

acccccctgg gccctgcc

<210> 33

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Primer

<400> 33

ctgctgccag atggtggt

Claims (9)

1. Marcador para diagnosticar câncer,caracterizado essencialmente por ser um oligonucleotideo quecontém uma seqüência de ácidos nucléicos de um local dejunção, tendo a 3'-extremidade terminal da região do exon 2ligado à 5'-extremidade terminal da região do exon 4 de umfator de gene estimulante de uma colônia de granulócitos (G-CSF).

2. Marcador para diagnosticar câncer, deacordo com a reivindicação 1, caracterizado essencialmentepor conter seqüências de ácidos nucléicos dos SEQ ID NOs: 1ou 2.

3. Kit de diagnóstico para diagnosticarcâncer, caracterizado por conter o oligonucleotideo dasreivindicações 1 e 2.

4. Kit de diagnóstico para diagnosticarcâncer de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por serpreferencialmente para avaliar o estado de progressão docâncer, que contém ainda, essencialmente um oligonucleotideocontendo seqüências de uma parte ou de toda a região do exon-3 do gene G-CSF.

5. Kit de diagnóstico para diagnosticarcâncer, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pordito oligonucleotideo conter essencialmente seqüências deácidos nucléicos SEQ ID NOs: 1 ou 2.

6. Kit de diagnóstico para diagnosticarcâncer de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pordito kit ser um micro-arranjo.

7. Método para diagnosticar câncer,caracterizado por compreender as etapas de:(a) obtenção de uma amostra de ácidosnucléicos G-CSF de uma amostra biológica de mamífero;(b) amplificação da amostra de ácidos nucléicos do G-CSFobtida, e(c) detecção de oligonucleotídeo contendo umaseqüência de ácidos nucléicos de um local de junção tendo a3'-extremidade terminal da região do exon 2 ligado à 5'-extremidade terminal da região do exon 4 de um gene G-CSF emuma amostra amplificada.

8. Método para diagnosticar câncer de acordocom a reivindicação 7, caracterizado por a etapa (c)preferencialmente conter a etapa em que, simultaneamentedetecta-se um oligonucleotídeo contendo seqüências de umaparte ou toda a região do exon 3, juntamente com umoligonucleotídeo contendo uma seqüência de ácidos nucléicosde um local de junção tendo a 3'-extremidade terminal daregião do exon 2 ligado à 5'-extremidade terminal da regiãodo exon 4 de um gene G-CSF na amostra amplificada.

9. Método para diagnosticar câncer de acordocom a reivindicação 7 ou a reivindicação 8, caracterizado pordito oligonucleotídeo conter essencialmente seqüências deácidos nucléicos SEQ ID NOs: 1 ou 2.