BRPI0707027A2 - método de fabricação de produto quìmico e aparelhos de fermentação contìnua - Google Patents

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Hideki Sawai
Katsushige Yamada
Takashi Mimitsuka
Kenji Sawai
Tetsu Yonehara
Yohito Ito
Masahiro Henmi
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Abstract

MéTODO DE FABRICAçãO DE PRODUTO QUìMICO E APARELHOS DE FERMENTAçãO CONTìNUA. A presente invenção fornece método de fabricação de produto químico por meio de fermentação continua, que inclui a filtragem de cultivo de microorganismo ou células cultivadas com membrana de separação para recuperar produto de filtrado, retenção simultânea de fluido não filtrado no cultivo ou envio para ele em refluxo e adição de materiais de fermentação ao cultivo, em que membrana porosa que possui tamanho médio de poro de 0,01 um ou mais a menos de 1 um é utilizada como membrana de separação e a filtragem é conduzida com diferença de pressão transmembrana na faixa de 0,1 a 20 kPa. Segundo este método, a produtividade de fermentação do produto químico pode ser grandemente elevada sob alta estabilidade e baixo custo.

Description

"MÉTODO DE FABRICAÇÃO DE PRODUTO QUÍMICO E APARELHOS DEFERMENTAÇÃO CONTÍNUA"
Campo da Invenção
A presente invenção refere-se a método de fabricação de produtoquímico e aparelho de fermentação contínua.
Antecedentes da Invenção
O método de fermentação que é método de produção desubstância, que envolve o cultivo de microorganismo ou células cultivadas,pode ser grosseiramente classificado em (1) método de fermentação embateladas ou método de fermentação em bateladas alimentadas e (2) métodode fermentação contínua.
O método de fermentação ou fermentação alimentada possuivantagens tais como instalações simples e menos danos por bactériascontaminantes por ser cultivo de curto prazo. A concentração de produto emcultivo aumenta com o tempo, entretanto, para reduzir a produtividade e orendimento devido à influência de pressão osmótica ou inibição pelo produto.Conseqüentemente, é difícil manter alto rendimento e alta produtividade deforma estável por longo período.
O método de fermentação contínua é caracterizado pelo fato deque alto rendimento e alta produtividade podem ser mantidos por longoperíodo, evitando acúmulo de substância objetiva em alta concentração emfermentador. Foram descritos métodos de fermentação contínua para afermentação de ácido L-glutâmico e L-Iisina (Documento Não de Patente 1).Nestes exemplos, entretanto, materiais brutos são alimentados continuamentea cultivo enquanto cultivo que contém microorganismos e células é retirado, deforma que os microorganismos e as células no cultivo sejam diluídos e,portanto, o aumento da eficiência de produção é limitado.
No método de fermentação contínua, propôs-se quemicroorganismos e células cultivadas sejam filtrados com membrana deseparação para recuperar produto de filtrado, enquanto os microorganismosfiltrados e células cultivadas são retidos em cultivo ou para eles enviados emrefluxo, de forma a manter alta densidade dos microorganismos e célulascultivadas no cultivo.
Foram descritos, por exemplo, métodos de fermentação contínuaem aparelho de fermentação contínua utilizando membrana de cerâmica(Documentos de Patente 1, 2 e 3). Os métodos descritos, entretanto, possuemproblema na redução da velocidade de fluxo de filtragem e eficiência defiltragem causados pela obstrução da membrana de cerâmica e, para evitaresta obstrução, conduz-se lavagem reversa ou similar.
Foi descrito processo de produção de ácido succínico utilizandomembrana de separação (Documento de Patente 4). Neste método, utiliza-sealta pressão de filtragem (cerca de 200 kPa) em separação de membrana. Estaalta pressão de filtragem não apenas apresenta desvantagem de custos, mastambém causa danos físicos para os microorganismos e células por pressãoem tratamento de filtragem e, portanto, não é apropriada para fermentaçãocontínua, em que microorganismos e células são devolvidos continuamentepara cultivo.
Cultivo contínuo convencional é método de cultivo em que meionovo é alimentado em velocidade constante para fermentador e cultivo namesma quantidade do meio é descarregado do fermentador, de forma a mantero volume de fluido no fermentador sempre constante. Em cultivo de bateladas,o cultivo é encerrado quando substrato inicial é consumido, enquanto, emcultivo contínuo, o cultivo pode teoricamente prosseguir infinitamente. Issosignifica que a fermentação infinita é teoricamente viável.
No cultivo contínuo convencional, por outro lado, microorganismosjunto com cultivo são descarregados de fermentador, de forma que adensidade de microorganismos no fermentador dificilmente é mantida alta.Caso microorganismos de fermentação possam ser mantidos em altadensidade em produção de fermentação, a eficiência da produção defermentação por volume de fermentação pode ser aumentada. Com estepropósito, os microorganismos deverão ser retidos em fermentador ou a eleconduzidos em refluxo. O método em que microorganismos são retidos emfermentador, ou a ele conduzidos em refluxo, inclui método que envolve aseparação de sólidos e líquidos de cultivo descarregado por gravidade, talcomo centrifugação, e retorno de microorganismos precipitados parafermentador, bem como método que envolve filtragem para separarmicroorganismos na forma de sólidos e descarga de sobrenadante de cultivosomente a partir de fermentador. O método que utiliza centrifugação,entretanto, não é prático devido ao alto custo de energia. O método que utilizafiltragem necessita de alta pressão para filtragem conforme descrito acima e foiexaminado principalmente em nível de laboratório.
Conforme descrito acima, os métodos de fermentação contínuaconvencionais sofrem vários problemas e dificilmente são industrialmenteaplicáveis.
Isso significa que ainda é difícil no método de fermentaçãocontínua atingir alta produtividade de substâncias por meio da filtragem demicroorganismos e células com membrana de separação, de forma a recuperarproduto de filtrado e causar refluxo simultâneo dos microorganismos e célulaspara cultivo para aumentar a densidade dos microorganismos e células nocultivo e manter a sua densidade alta. Desta forma, tem havido demanda portécnicas inovadoras.
Documento de Patente 1: Pedido de Patente Japonês em Aberton° 5-95778
Documento de Patente 2: JP-A № 62-138184Documento de Patente 3: JP-A N0 10-174594Documento de Patente 4: JP-A N0 2005-333886Documento Não de Patente 1: Toshihiko Hirao et al, AppiMicrobiol. Biotechnol., 32, 269-273 (1989)
Descrição Resumida da InvençãoA presente invenção refere-se a método de fabricação de produtoquímico por meio de fermentação contínua, que inclui a filtragem de cultivo demicroorganismo ou células cultivadas com membrana de separação pararecuperar produto de filtrado, retenção simultânea de fluido não filtrado nocultivo ou envio em refluxo para ele e adição de materiais de fermentação aocultivo, em que membrana porosa que possui tamanho médio de poro de 0,01μιη ou mais a menos de 1 μιτι é utilizada como membrana de separação e afiltragem é conduzida com diferença de pressão transmembrana na faixa de 0,1 a20 kPa.
A presente invenção refere-se ao método de fabricação deproduto químico, em que o coeficiente de permeabilidade a água purificadapara a membrana porosa é de preferencialmente 2 χ 10"9 m3/m2/s/pa ou mais a6 χ 10 7 m3/m2/s/pa ou menos.
A presente invenção refere-se ao método de fabricação deproduto químico, em que o tamanho médio de poro da membrana porosa é depreferencialmente 0,01 μιτι ou mais a menos de 0,2 μιηβο desvio padrão dotamanho de poro da membrana porosa é de preferencialmente 0,1 μΓη oumenos.
A presente invenção refere-se ao método de fabricação deproduto químico, em que a membrana porosa é preferencialmente membranaporosa que possui aspereza de superfície de 0,1 μιτι ou menos.
A presente invenção refere-se ao método de fabricação deproduto químico, em que a membrana porosa é preferencialmente membranaporosa que contém camada de resina porosa.
Um aparelho de fermentação contínua de acordo com a presenteinvenção é aparelho de fabricação de produto químico por meio defermentação contínua que inclui filtragem de cultivo de fermentação demicroorganismo ou células cultivadas com membrana de separação pararecuperar produto de filtrado, retenção simultânea de fluido não filtrado nocultivo, ou envio para ele em refluxo, e adição de materiais de fermentação aocultivo de fermentação, que inclui tanque de reação de fermentação paracultivo de fermentação de microorganismo ou células cultivadas; tanque deseparação de membrana para filtragem do cultivo de fermentação, que éconectado por meios de circulação de cultivo de fermentação para o tanque deretenção de fermentação e equipado no seu interior com membrana deseparação; e meios de regulagem da diferença de pressão transmembrana damembrana de separação na faixa de 0,1 a 20 kPa, em que a membrana deseparação possui tamanho médio de poro de 0,01 μπι ou mais a menos de 1 μιτι.
Outro aparelho de fermentação contínua de acordo com apresente invenção é aparelho de fabricação de produto químico por meio defermentação contínua que inclui filtragem de cultivo de fermentação demicroorganismo ou células cultivadas com membrana de separação pararecuperar produto de filtrado, retenção simultânea de fluido não filtrado nocultivo ou envio para ele em refluxo e adição de materiais de fermentação aocultivo de fermentação, que incluem tanque de reação de fermentação paracultivo de fermentação de microorganismo ou células cultivadas; elemento demembrana de separação para filtragem do cultivo de fermentação, que édisposta no interior do tanque de reação de fermentação e nele equipado commembrana de separação; meios de descarga de produto de fermentaçãofiltrado, que são conectados ao elemento de membrana de separação; e meiosde regulagem da diferença de pressão transmembrana da membrana deseparação na faixa de 0,1 a 20 kPa, em que a membrana de separação émembrana porosa que possui tamanho médio de poro de 0,01 μm ou mais amenos de 1 μm.
A Fig. 1 é vista lateral esquemática para exibir um exemplo doaparelho de fermentação contínua do tipo separação de membranas de acordocom a presente invenção.
A Fig. 2 é vista lateral esquemática para exibir outro exemplo doaparelho de fermentação contínua do tipo separação de membranas de acordocom a presente invenção.
A Fig. 3 é vista em perspectiva esquemática para exibir umexemplo do elemento de membrana de separação de acordo com a presenteinvenção.
A Fig. 4 é vista em seção cruzada para exibir outro exemplo doelemento de membrana de separação de acordo com a presente invenção.
Breve Descrição das Figuras
A Fig. 5 exibe mapa físico do vetor de expressão de levedurapTRS11.
Descrição dos Algarismos de Referência
1 Tanque de reação de fermentação
2 Elemento de membrana de separação
3 Aparelho de regulagem da diferença de cabeça d'água
4 Aparelho de alimentação de gás
5 Agitador
6 Sensor de nível
7 Bomba de alimentação de meio
8 Bomba de alimentação de solução reguladora de pH
9 Sensor/regulador de pH10 Regulador de temperatura11 Bomba de circulação de líquido de fermentação12 Tanque de separação de membrana13 Placa de sustentação14 Material de passagem15 Membrana de separação16 Parte côncava17 Cano de coleta de água18 Feixe de membranas de separação19 Camada de vedação de resina superior20 Camada de vedação de resina inferior21 Quadro de sustentação22 Cano de coleta de água
Descrição Detalhada da Invenção
A presente invenção refere-se a método de fabricação de produtoquímico por meio de fermentação contínua, que inclui a filtragem de cultivo demicroorganismo ou células cultivadas com membrana de separação pararecuperar produto de filtrado, retenção simultânea de fluido não filtrado nocultivo ou envio para ele em refluxo e adição de materiais de fermentação aocultivo, em que membrana porosa que possui tamanho médio de poro de 0,01μηι ou mais a menos de 1 μηι é utilizada como membrana de separação e afiltragem é conduzida com diferença de pressão transmembrana na faixa de 0,1a 20 kPa.
É descrita a membrana porosa utilizada como membrana deseparação na presente invenção.
É descrita a constituição da membrana ρ orosa u tilizada comomembrana de separação na presente invenção. A membrana porosa de acordocom a presente invenção possui desempenho de separação e desempenho depermeação de água, dependendo do uso pretendido e da qualidade de água daágua a ser tratada.
A membrana porosa é preferencialmente membrana porosa quecontém camada de resina porosa do ponto de vista de desempenho deprevenção, desempenho de permeação de água e desempenho de separação,tal como resistência à contaminação.
Preferencialmente, a membrana porosa que contém camada deresina porosa possui camada de resina porosa que desempenha papel emcamada funcional de separação sobre a superfície de material base poroso. Omaterial base poroso sustenta a camada de resina porosa para dar resistênciaà membrana de separação.
A membrana porosa utilizada na presente invenção contémcamada de resina porosa preferencialmente sobre a superfície de materialbase poroso, em que a camada de resina porosa pode ou não penetrar nomaterial base poroso, dependendo do uso.
A espessura média do material base poroso é depreferencialmente 50 ou mais a 3000 μηι ou menos.
O material do material base poroso é elaborado com materialorgânico e/ou material inorgânico e são desejavelmente utilizadas fibrasorgânicas. O material base poroso é preferencialmente material tecido ou nãotecido preparado com fibras orgânicas tais como fibras de celulose, fibras detriacetato de celulose, fibras de poliéster, fibras de polipropileno e fibras depolietileno. De maior preferência, utiliza-se material não tecido de baixo custo efácil fabricação com densidade regulada de forma relativamente fácil.
Como a camada de resina porosa, pode-se preferencialmenteutilizar membrana de polímero orgânico. O material da membrana de polímeroorgânico inclui, por exemplo, resina de polietileno, resina de polipropileno,resina de cloreto de polivinila, resina de fluoreto de polivinilideno, resina depolissulfona, resina de poliéter sulfona, resina de poliacrilononitrila, resina decelulose e resina de triacetato de celulose. A membrana de polímero orgânicopode ser mistura de resina que contém estas resinas como componenteprincipal. O componente principal utilizado no presente designa componenteque está contido em quantidade de 50% em peso ou mais, preferencialmente60% em peso ou mais. O mat erial da membrana de polímero orgânico épreferencialmente resina que possui excelente durabilidade física e resistênciaquímica, cuja solução pode ser formada facilmente em membrana, tal comoresina de cloreto de polivinila, resina de fluoreto de polivinilideno, resina depolissulfona, resina de poliéter sulfona ou resina de poliacrilonitrila e é utilizada,de maior preferência, resina de polivinilideno ou resina que o contém comoprincipal ingrediente.
Como a resina de fluoreto de polivinilideno, é preferencialmenteutilizado homopolímero de fluoreto de vinilideno. Como resina de fluoreto depolivinilideno, pode também ser preferencialmente utilizado copolímero defluoreto de vinilideno e monômero de vinila com ele copolimerizável. Omonômero de vinila copolimerizável com fluoreto de vinilideno pode serexemplificado por tetrafluoroetileno, hexafluoropropileno e tricloreto cloreto deetileno.
É importante que a membrana porosa utilizada na presenteinvenção possua tamanho médio de poro de 0,01 μm ou mais a menos de 1μm. Quando o tamanho médio de poro da membrana porosa for de 0,01 μm oumais a menos de 1 μm, a membrana porosa dificilmente sofre obstrução commicroorganismos utilizados em fermentação e possui desempenho de filtragemque permanece estável por longo período. Além disso, quando o tamanhomédio de poro da membrana porosa for de 0,01 μm ou menos a menos de 1μm, alta taxa de exclusão em microorganismos ou evita-se o vazamento decélulas cultivadas e alta permeabilidade a água podem ser simultaneamentesatisfeitas e, desta forma, permeabilidade a água pode ser mantida por longoperíodo com alta precisão e capacidade de reprodução.
O tamanho médio de poro da membrana porosa é de menos de 1μιτι pois, quando o tamanho de poro estiver próximo do tamanho demicroorganismo ou célula cultivada, o poro pode ser obstruído diretamente como microorganismo ou célula cultivada. O tamanho médio de poro da membranaporosa preferencialmente não é grande demais em comparação com otamanho de microorganismo ou célula cultivada, para evitar vazamento domicroorganismo ou célula cultivada, ou seja, para evitar desvantagem deredução da taxa de exclusão. Quando o microorganismo ou célula cultivada forbactéria que contém célula pequena, o tamanho médio de poro é depreferencialmente 0,4 0.4 μιτι ou menos, particularmente menos de 0,2 μηpara operação de maior preferência.
Microorganismo ou células cultivadas podem produzir substânciasdiferentes de produto químico objetivo, tais como substâncias facilmenteagregadas como proteínas e polissacarídeos, e parte dos microorganismos oucélulas cultivadas em cultivo pode perecer para formar células rompidas. Paraevitar obstrução da membrana porosa com essas substâncias, o tamanhomédio de poro é de preferencialmente 0,1 μηι ou menos.
Geralmente, o tamanho médio de poro da membrana porosa é depreferencialmente 0,4 μιτι ou menos, de maior preferência menos de 0,2 μη,0,1 μιτι ou menos.
Quando o tamanho médio de poro for pequeno demais, odesempenho de permeação de água da membrana porosa pode ser reduzido,de forma a tornar operação eficiente inviável, mesmo quando a membrana nãoestiver suja. Portanto, o tamanho médio de poro da membrana porosa deacordo com a presente invenção é de 0,01 μιτι ou mais, de maior preferência0,02 μιτι ou mais, de preferência ainda maior 0,04 μιτι ou mais.O tamanho médio de poro pode ser determinado por meio demedição dos diâmetros de todos os poros observáveis em área de 9,2 μm χ10,4 μm sob observação com microscópio eletrônico de varrimento emampliação de x10.000 e, em seguida, calculando-se a média dos diâmetrosmedidos. Alternativamente, o tamanho médio de poro pode ser determinadotirando-se fotografia da superfície da membrana com microscópio eletrônico devarrimento em ampliação de x10.000, selecionando-se em seguida dez ou mais(preferencialmente, vinte ou mais) poros aleatoriamente, medindo-se osdiâmetros dos poros selecionados e calculando-se a média numérica dosdiâmetros medidos. Quando o poro não for circular, o tamanho médio de poropode ser determinado por meio de método de determinação de círculo quepossui área equivalente à do poro com processador de imagens ou similares e,considerando que o diâmetro do círculo equivalente é o diâmetro do poro,determina-se o tamanho médio de poro.
A derivação padrão σ do tamanho médio de poro da membranaporosa de acordo com a presente invenção é de preferencialmente 0,1 μηη oumenos. O desvio padrão do tamanho médio de poro é desejavelmente maisbaixo. O desvio padrão σ do tamanho médio de poro pode ser calculadoutilizando a equação (1) a seguir:
<formula>formula see original document page 12</formula>
em que N é o número de poros observável na área mencionadaacima de 9,2 μm χ 10,4 μm, Xk é o diâmetro de cada um dos poros medidos eX (ave) é o tamanho médio de poro.
Para a membrana porosa utilizada na presente invenção, a suapermeabilidade a cultivo é desempenho importante. Como indicador dapermeabilidade da membrana porosa, pode-se utilizar o coeficiente depermeabilidade a água purificada da membrana porosa antes do uso. Napresente invenção, o coeficiente de permeabilidade a água purificada damembrana porosa, conforme calculado por meio de medição, sob pressãosuperior de 1 m de água, a quantidade de água penetrada a 25 0C previamentepurificada com membrana de osmose reversa, preferencialmente não é demenos de 2 χ 10"9 m3/m2/s/Pa. Quando o coeficiente de permeabilidade a águapurificada encontrar-se na faixa de 2 χ 10"9 m3/m2/s/Pa ou mais a 6 χ 10"7m3/m2/s/Pa ou menos, pode-se atingir quantidade praticamente suficiente deágua penetrada.
Na membrana porosa utilizada na presente invenção, a asperezada superfície é a altura média em direção perpendicular à superfície. Aaspereza de superfície da membrana é um dos fatores pelos quais osmicroorganismos ou células cultivadas que se aderem à superfície damembrana de separação tornam-se facilmente removíveis por efeito delavagem de superfície da membrana resultante de fluxo de líquido sob agitaçãoou com bomba de circulação. A aspereza de superfície da membrana porossaé preferencialmente de 0,1 μιη ou menos. Quando a aspereza da superfície forde 0,1 μηι ou menos, microorganismos ou células cultivadas que se aderem àmembrana são facilmente removíveis.
Descobriu-se que membrana porosa que possui aspereza desuperfície de 0,1 μιη ou menos, tamanho médio de poro de 0,01 μηι ou mais amenos de 1 μηι e coeficiente de permeabilidade a água purificada de nãomenos de 2 χ 10~9 m3/m2/s/Pa pode ser utilizada de maior preferência paraconduzir a operação mais facilmente sem a necessidade de potência excessivanecessária para lavagem da superfície da membrana. Quando a aspereza desuperfície da membrana porosa for de 0,1 μηι ou menos, a resistência de cortegerada sobre a superfície da membrana mediante filtragem demicroorganismos ou células cultivadas pode ser reduzida e, desta forma, pode-se evitar que os microorganismos sejam rompidos e pode-se também evitarque a membrana porosa seja obstruída, de forma a permitir filtragem estávelmais facilmente por longo período. A aspereza de superfície da membranaporosa é preferencialmente de 0,1 μηι ou menos, de forma que a membranapermita fermentação contínua com diferença de pressão transmembrana maisbaixa e, mesmo mediante obstrução, é de excelente recuperação por meio delavagem em comparação com o caso de operação com alta diferença depressão transmembrana. Como a fermentação contínua estável é tornadaviável ao evitar-se obstruções, a aspereza de superfície da membrana porosa épreferencialmente mais baixa.
A aspereza de superfície da membrana foi medida com omicroscópio de força atômica (AFM) a seguir sob as seguintes condições:
Unidade:
Microscópio de força atômica (Nanoscope Illa fabricado pelaDigital Instruments)
Condições
Sonda: braço SiN (fabricado pela Digital Instruments)Modo de varrimento: modo de contato (medição em ar)Modo de derivação subaquática (medição em água)
Faixa de varrimento: 10 μηι, 25 μηι sobre um lado (medição em ar)
5 μΐη, 10 μηι sobre um lado (medição em ar)Resolução de varrimento: 512 χ 512
Preparação de amostra: Amostra de membrana foi mergulhadaem etanol sob temperaturas comuns por quinze minutos, mergulhada emseguida em água RO por 24 horas, lavada e seca em ar antes da medição.
A partir da altura na direção do eixo Z em cada ponto, foicalculada rigidez de superfície da membrana dr0Ugh com com o microscópio deforça atômica (AFM) utilizando a equação a seguir (2):
<formula>formula see original document page 15</formula>
A membrana porosa utilizada na presente invenção épreferencialmente membrana de folha plana. Quando a membrana porosa formembrana de folha plana, sua espessura média é selecionada dependendo douso pretendido. Quando a membrana porosa for membrana de folha plana, asua espessura média é preferencialmente de 20 ou mais a 5000 μηπ ou menos,de maior preferência 50 ou mais a 2000 μm ou menos.
A membrana porosa utilizada na presente invenção épreferencialmente membrana de fibra oca. Quando a membrana porosa formembrana de fibra oca, o diâmetro interno da fibra oca é preferencialmente de200 a 5000 μπΐθ3 espessura da membrana é preferencialmente de 20 a 2000μm. Tecido ou material têxtil fabricado com fibras orgânicas ou inorgânicascilíndricas pode estar contido no lado interno da fibra oca.
Método de formação da membrana porosa utilizada na presenteinvenção é descrito por meio de referência a linhas gerais do método.
Será agora descrito resumidamente o método de formação demembrana de folha plana da membrana porosa.
Revestimento de solução padrão que contém resina e solvente éformado sobre a superfície de material base poroso e, simultaneamente, omaterial base poroso é impregnado com a solução padrão. Em seguida,somente a superfície, ao lado do revestimento, do material base poroso écolocada em contato com banho de coagulação que contém não solvente, deforma a coagular a resina e, simultaneamente, formar camada de resina porosasobre a superfície do material base poroso.
A solução padrão é preparada na forma de dissolução de resinaem solvente. Do ponto de vista de propriedade de fabricação de membrana,normalmente é preferível que a temperatura da solução padrão sejaselecionada na faixa de 5 a 120 0C. O solvente dissolve resina e age sobre aresina para promover a formação de camada de resina porosa da resina. Osolvente que pode ser utilizado no presente inclui N-metilpirrolidinona (NMP),Ν,Ν-dimetilacetamida (DMAc), Ν,Ν-dimetilformamida (DMF)1 sulfóxido dedimetila (DMSO), N-metil-2-pirrolidona, metil etil cetona, tetraidrofuran,tetrametil uréia, fosfato de trimetila, ciclohexanona, isoforona, γ-butirolactona,metil isoamil cetona, ftalato de dimetila, propileno glicol metil éter, carbonato depropileno, álcool diacetona, triacetato de glicerol, acetona e metil etil cetona.Dentre estes solventes, podem ser preferencialmente utilizados N-metilpirrolidinona (NMP), Ν,Ν-dimetilacetamida (DMAc), Ν,Ν-dimetilformamida(DMF) e sulfóxido de dimetila (DMSO), que podem apresentar alta dissoluçãoda resina. Estes solventes podem ser utilizados isoladamente ou na forma demistura de dois ou mais destes.
Componentes diferentes do solvente, tais como polietileno glicol,álcool polivinílico, polivinil pirrolidona e glicerina, podem ser adicionados aosolvente. Não solvente pode também ser adicionado ao solvente. O nãosolvente é líquido que não dissolve a resina. O não solvente age comoregulador do tamanho dos poros por meio de regulagem da velocidade decoagulação da resina. Como não solvente, podem ser utilizados água e álcooistais como metanol e etanol. Particularmente, o não solvente épreferencialmente água ou metanol, do ponto de vista do preço. O componentediferente de solvente e o não solvente podem também ser mistura.Agente formador de poros pode também ser adicionado à soluçãopadrão. O agente formador de poros possui papel tal que, mediante imersãoem banho de coagulação, é extraído de camada de resina para tornar porosa acamada de resina. Por meio de adição do agente formador de poros, pode-seregular o tamanho médio de poro da membrana porosa. Preferencialmente, oagente formador de poros é altamente solúvel no banho de coagulação.Exemplos dos agentes formadores de poros utilizáveis incluem saisinorgânicos, tais como cloreto de cálcio e carbonato de cálcio.Alternativamente, como agentes formadores de poros, podem ser utilizadospolioxialquilenos, tais como polietileno glicol e polipropileno glicol; polímeroshidrossolúveis, tais como álcool polivinílico, polivinil butiral e ácidospoliacrílicos; e glicerina.
Será agora descrito resumidamente o método de formação demembrana de folha oca como a membrana porosa.
A membrana de fibra oca pode ser preparada por meio dedescarga de solução padrão elaborada com resina e solvente por meio de canoexterno de base de cano duplo, descarregando simultaneamente fluido deformação de espaços ocos por meio de cano interno da base de cano duplo,solidificando-os por meio de resfriamento em banho de resfriamento.
A solução padrão pode ser preparada por meio de dissolução daresina descrita acima no método de preparação de membrana de folha plana,em concentração de 20% ou mais a 60% ou menos em peso, no solventedescrito acima no método de preparação de membrana de folha plana. O fluidode formação de espaços ocos pode ser normalmente gás ou líquido. Asuperfície externa da membrana de fibra oca resultante pode também serrevestida (laminada) com nova camada de resina porosa. Laminação pode serconduzida para alterar as propriedades (tais comohidrofilicidade/hidrofobicidade, tamanho de poro etc.) da membrana de fibraoca para propriedades desejadas. A nova camada de resina porosa a serlaminada sobre ela pode ser preparada colocando-se a solução padrão quepossui resina dissolvida em solvente em contato com banho de coagulação quenão contém solvente para coagular a resina. Como material da resina, omesmo material da membrana de polímero orgânico, por exemplo, pode serpreferencialmente utilizado. O método de laminação não é particularmentelimitado e a membrana de fibra oca pode ser imersa na solução padrão oupode ser revestida sobre ela com a solução padrão e, após a laminação, parteda solução padrão de adesão pode ser raspada ou soprada com faca de arpara regular a quantidade do laminado.
A membrana porosa utilizada na presente invenção pode serformada em elemento de membrana de separação por meio de união/vedaçãode espaço oco da membrana de fibra oca com membro tal como resina e, emseguida, colocação da membrana sobre suporte.
A membrana porosa utilizada na presente invenção pode sercombinada com suporte para formar elemento de membrana de separação. Oelemento de membrana de separação que possui placa de sustentação comosuporte no qual a membrana porosa utilizada na presente invenção é dispostasobre pelo menos um lado da placa de sustentação é um modo preferível doelemento de membrana de separação que contém a membrana porosautilizada na presente invenção. Elemento de membrana de separação quecontém a membrana porosa sobre os dois lados de placa de sustentação paraaumentar a quantidade de água em penetração também é modo preferível doelemento de membrana de separação.
O método de fabricação de produto químico de acordo com apresente invenção inclui filtragem com diferença de pressão transmembrana nafaixa de 0,1 a 20 kPa. Quando cultivo de fermentação for filtrado com diferençade pressão transmembrana de mais de 20 kPa, é necessário energia elétricapara aplicar pressão, o que reduz a eficácia econômica de fabricação deproduto químico. Dada a diferença de pressão transmembrana de mais de 20kPa, microorganismo ou células cultivaas podem ser rompidas para reduzir acapacidade de fabricação de produto químico. No método de fabricação deproduto químico de acordo com a presente invenção, diferença de pressãotransmembrana, ou seja, pressão de filtragem encontra-se na faixa de 0,1 a 20kPa, que pode ser atingida por diferença de cabeça d'água e, desta forma, nãoé necessário que o lado interno do fermentador seja particularmente mantidosob pressão, de forma que a capacidade de fabricação de produto químico nãoseja reduzida. Como não é necessário que o lado interno do fermentador sejaparticularmente mantido sob pressão, a membrana porosa pode ser dispostano interior do fermentador, o que pode resultar em outra desvantagem dopequeno dimensionamento do aparelho de fermentação. O método defabricação de produto químico de acordo com a presente invenção incluifiltragem com diferença de pressão transmembrana preferencialmente na faixade 0,1 a 2 kPa.
No método de fabricação de produto químico de acordo com apresente invenção, são utilizados materiais de fermentação. Os materiais defermentação utilizados na presente invenção podem ser quaisquer materiaisque promovam o crescimento de microorganismo de cultivo para permitir que omicroorganismo gere satisfatoriamente produto de fermentação objetivo comoproduto químico.
Os materiais de fermentação utilizados na presente invençãoencontram-se preferencialmente na forma de meio líquido comum que contémfonte de carbono, fonte de nitrogênio e sais inorgânicos e que contémadequadamente micronutrientes orgânicos tais como aminoácidos e vitaminas,conforme o necessário. A fonte de carbono que pode ser utilizada no presenteinclui açúcares tais como glicose, sacarose, frutose, galactose e lactose,açúcares de amido que contêm esses açúcares, melaços de batata doce,melaços de beterraba de açúcar e melaços de alto teste, ácidos orgânicos taiscomo ácido acético, álcoois tais como etanol e glicerina. A fonte de nitrogênioque pode ser utilizada no presente inclui gás amônia, água de amônia, sais deamônio, uréia, nitratos e outras fontes de nitrogênio orgânicas utilizadassecundariamente, tais como aglomerados de óleo, hidrolisados de soja,digeridos de caseína, outros aminoácidos, vitaminas líquido de fermentação demilho, leveduras ou extrato de levedura, extrato de carne, pepídeos tais comopeptona e vários microorganismos de fermentação e seus hidrolisados. Os saisinorgânicos que podem ser adequadamente adicionados incluem fosfatos, saisde magnésio, sais de cálcio, sais de ferro e sais de manganês.
Quando os microorganismos utilizados na presente invençãonecessitarem de nutriente específico para o seu crescimento, o nutriente éadicionado na forma de preparação ou de produto natural que o contém.
Agente antiespumante é utilizado, se necessário. O cultivo de acordo com apresente invenção designa líquido obtido como resultado do crescimento demicroorganismo ou células cultivadas com os materiais de fermentação. Acomposição de materiais de fermentação a ser adicionada pode seradequadamente alterada da composição dos materiais de fermentaçãoutilizados no início do cultivo.
Na presente invenção, a concentração de açúcares no cultivo émantida preferencialmente em 5 g/l ou menos. A razão pela qual aconcentração de açúcares no cultivo é mantida preferencialmente em 5 g/l oumenos é que o fluxo de saída de açúcares mediante retirada do cultivo podeser minimizado àquela concentração.
O microorganismo é cultivado normalmente sob pH 4 a 8 sobtemperatura na faixa de 20 a 40 0C. O pH do cultivo é ajustado em valorpreviamente determinado, normalmente na faixa de pH 4 a 8 com ácidoorgânico ou inorgânico, substância alcalina, uréia, carbonato de cálcio, gásamônia ou similares. Quando for necessário aumentar a velocidade defornecimento de oxigênio, é possível empregar meios de adição de oxigênio aar para manter concentração de oxigênio de não menos de 21% ou meios depressurização do cultivo, aumento da velocidade de agitação ou aumento daaeração.
No método de fabricação de produto químico de acordo com apresente invenção, cultivo de bateladas ou cultivo de bateladas alimentadaspode ser conduzido em estágio inicial de cultivo para aumentar a densidade demicroorganismos, seguido por cultivo contínuo (retirada). No método defabricação de produto químico de acordo com a presente invenção, adensidade de microorganismos pode aumentar, seguida por semeadura de altadensidade de microorganismos, de forma a iniciar o cultivo e conduzirsimultaneamente cultivo contínuo. No método de fabricação de produto químicode acordo com a presente invenção, o fornecimento do cultivo inicial e aretirada do cultivo podem ser iniciados em etapa apropriada. O momento deinício do fornecimento do cultivo inicial e o momento de início da retirada docultivo podem nem sempre ser o mesmo. O fornecimento do cultivo inicial e aretirada do cultivo podem ser conduzidos contínua ou intermitentemente.
Os nutrientes necessários para o crescimento do microorganismopodem ser adicionados ao cultivo inicial, de forma que o microorganismocresça continuamente. Para atingir produtividade eficiente, a densidade demicroorganismos ou células cultivadas no cultivo é preferencialmente mantidaalta em faixa em que o ambiente do cultivo não se torna inadequado para ocrescimento dos microorganismos ou células cultivadas para causar alta taxade mortalidade. Os microorganismos ou células cultivadas no cultivo mantidoem densidade de não menos de 5 g/l em peso seco, por exemplo,possibilitaram excelente eficiência de produção.No método de fabricação de produto químico de acordo com apresente invenção, os microorganismos ou células cultivadas podem serretirados conforme o necessário do fermentador. Como a membrana deseparação é facilmente obstruída, por exemplo, quando a densidade dosmicroorganismos ou células cultivadas no fermentador tornar-se alta demais,essa obstrução pode ser evitada por meio de retirada. O desempenho defabricação de produto químico pode variar dependendo da densidade dosmicroorganismos ou células cultivadas no fermentador e o desempenhoprodutivo pode ser mantido por meio de retirada dos microorganismos oucélulas cultivadas com o desempenho produtivo como indicador.
No método de fabricação de produto químico de acordo com apresente invenção, o número de fermentadores não é limitado, desde que aoperação de cultivo contínuo durante a qual microorganismos novos capazesde produção por fermentação são cultivados seja conduzida por meio demétodo de cultivo contínuo em que os microorganismos são cultivados e,simultaneamente, é formado produto. No método de fabricação de produtoquímico de acordo com a presente invenção, é preferível para controle decultivo que a operação de cultivo contínuo seja normalmente conduzida em umúnico fermentador. Uma série de fermentadores pode ser utilizado, entretanto,por motivos tais como pequena capacidade do fermentador. Neste caso, umasérie de fermentadores pode ser conectada em paralelo ou em série, emfermentação contínua para atingir alta produtividade do produto defermentação.
São agora descritos os microorganismos ou células cultivadasque podem ser utilizados no método de fabricação de produto químico deacordo com a presente invenção. Os microorganismos ou células cultivadasque podem ser utilizados no método de fabricação de produto químico deacordo com a presente invenção não são limitados. Os microorganismos oucélulas cultivadas utilizados na presente invenção incluem, por exemplo,leveduras tais como levedura de padaria (Saccharomyces cerevisiae) utilizadafreqüentemente em indústria de fermentação, bactérias tais como Escherichiacoli ou bactérias corineformes, bactérias filamentosas, micobactérias, célulasde animais e células de insetos. Os microorganismos ou células utilizadospodem ser isolados do ambiente natural ou podem ser aqueles que possuempropriedades modificadas parcialmente por meio de mutação ou recombinaçãogenética.
O produto químico fabricado por meio do método de fabricação de10 produto químico de acordo com a presente invenção não é limitado, desde queseja substância produzida em cultivo pelos microorganismos ou célulasdescritos acima. O produto químico fabricado por meio do método defabricação de produtos químicos de acordo com a presente invenção incluisubstâncias tais como álcoois, ácidos orgânicos, aminoácidos e ácidosnucleicos que são produzidos em grandes quantidades na indústria defermentação. Exemplos desses produtos químicos incluem álcoois tais comoetanol, 1,3-propanodiol, 1,4-butanodiol e glicerol, ácidos orgânicos tais comoácido acético, ácido láctico, ácido pirúvico, ácido succínico, ácido málico, ácidoitacônico e ácido cítrico, ácidos nucleicos tais como nucleosídeos como inosinae guanosina e nucleotídeos tais como ácido inosínico e ácido guanílico, bemcomo compostos de diamina tais como cadaverina. A presente invenção podetambém ser aplicada à produção de substâncias tais como enzimas,antibióticos e proteínas recombinantes.
São agora descritos os microorganismos ou células cultivadasque podem ser utilizados no método de fabricação de produto químico deacordo com a presente invenção por meio de referência a produtos químicosespecíficos.
No método de fabricação de produto químico de acordo com apresente invenção, os microorganismos ou células cultivadas que podem serutilizados na fabricação de ácido L-láctico não são particularmente limitados,desde que sejam microorganismos capazes de produzir ácido L-láctico. Nométodo de fabricação de produto químico de acordo com a presente invenção,os microorganismos ou células cultivadas que podem ser utilizados nafabricação de ácido L-láctico são preferencialmente bactérias de ácido láctico.
As bactérias de ácido láctico da forma utilizada no presente podem serdefinidas como microorganismos procarióticos que produzem 50% ou mais deácido láctico na forma de rendimento em açúcar (glicose consumida).
Exemplos preferíveis de bactérias de ácido láctico incluem bactérias de ácidoláctico pertencentes ao gênero Lactobacillus, gênero Pediococcus, gêneroTetragenococcus, gênero Carnobacterium, gênero Vagococcus, gêneroLeuconostoc, gênero Oenococcus, gênero Atopobium, gênero Streptococcus,gênero Enterococcus, gênero Lactococcus e gênero Bacillus. Dentre eles, abactéria de ácido láctico que possui alto rendimento de ácido láctico em açúcarpode ser selecionada e utilizada preferencialmente na produção de ácidoláctico. No método de fabricação de produto químico de acordo com a presenteinvenção, bactérias de ácidos lácticos que possuem alto rendimento de ácidoláctico, particularmente ácido L-láctico, em açúcar podem ser selecionadas eutilizadas preferencialmente na produção de ácido láctico. Ácido L-láctico é umtipo de isômeros óticos de ácido láctico e pode ser claramente diferenciado doseu enantiômero ácido D-láctico. Exemplos de bactérias de ácido láctico quepossuem alto rendimento de ácido L-láctico em açúcar incluem Lactobacillusyamanashiensis, Lactobacillus animalis, Lactobacillus agilis, Lactobacillusaviaries, Lactobacillus casei, Lactobacillus delbruekii, Lactobacillus paracasei,Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus ruminis, Lactobacillus salivarius,Lactobacillus sharpeae, Pediococcus dextrinicus e Lactococcus lactis, e estespodem ser selecionados para produzir ácido L-láctico.Quanto ácido L-láctico for produzido por meio do método defabricação de produto químico de acordo com a presente invenção, pode-seutilizar os microorganismos ou células cultivadas que foram dotadasartificialmente com a capacidade de produção de ácido láctico, ou que sepermitiu ampliarem esta produção. Os microorganismos ou células cultivadasnos quais foi introduzido gene L-Iactato desidrogenase (às vezes indicado aseguir como L-LDH) para proporcionar ou aumentar a capacidade de produçãode ácido L-láctico, por exemplo, podem ser utilizados. O método defornecimento ou aumento da capacidade de produção de ácido L-láctico podetambém ser método de mutagênese química conhecido na técnica. Omicroorganismo é preferencialmente microorganismo recombinante cujacapacidade de produção de ácido L-láctico foi aumentada pela integração de L-LDH. Quando ácido L-láctico for produzido por meio do método de fabricaçãode produto químico de acordo com a presente invenção, um hospedeiro domicroorganismo recombinante é preferencialmente Escherichia coli ou bactériade ácido láctico que é célula procariótica ou levedura que é célula eucariótica,de preferência específica levedura. A levedura é preferencialmente leveduraque pertence ao gênero Saccharomyces, de maior preferência Saccharomyeeseerevisiae.
O L-LDH utilizado na presente invenção não é limitado, desde quecodifique proteína que possui atividade de conversão de dinucleotídeonicotinamida adenina reduzido (NADH) e ácido pirúvico em dinucleotídeonicotinamida adenina (NAD+) oxidado e ácido L-láctico. Pode-se utilizar, porexemplo, L-LDH derivado de bactérias de ácido láctico que possuem altorendimento de ácido L-láctico em açúcar. Preferencialmente, pode-se utilizar L-LDH derivado de mamífero. Pode-se particularmente utilizar L-LDH derivado deHomo sapiens ou de sapo. O L-LDH derivado de sapo que pode ser utilizadona presente invenção é, de preferência específica, L-LDH derivado de sapopertencente a Pipidae, de maior preferência L-LDH derivado de Xenopus laevisque é sapo pertencente a Pipidae.
O L-LDH derivado de sapo ou de seres humanos utilizado napresente invenção inclui genes do tipo mutante resultantes de polimorfismogenético, mutagênese ou similares. Polimorfismo genético designa alteraçãoparcial em seqüência de nucleotídeos de gene por meio de mutaçãoespontânea sobre o gene. Mutagênese designa introdução artificial de mutaçãoem gene. Pode-se atingir mutagênese, por exemplo, por meio de método deuso de kit para mutagênese dirigida a local (Mutan-K fabricado pela Takara Bio)ou método de uso de kit para mutagênese aleatória (Mutagênese AleatóriaPCR BD Diversify fabricado pela CLONTECH). O L-LDH derivado de sereshumanos ou sapos utilizado na presente invenção pode possuir exclusão ouinserção em parte da sua seqüência de nucleotídeos, desde que codifiqueproteína que possua atividade de conversão de NADH e ácido pirúvico emNAD+ e ácido L-láctico.
Quando ácido L-láctico for produzido por meio do método defabricação de produto químico de acordo com a presente invenção, aseparação e a purificação de ácido L-láctico contido no líquido de fermentaçãofiltrado/separado produzido podem ser conduzidas por meio de combinação demétodos convencionalmente conhecidos, tais como concentração, destilação ecristalização. Seus exemplos incluem um método que envolve a redução do pHdo líquido de fermentação filtrado/separado para 1 ou menos e, em seguida,extração de ácido L-láctico com dietil éter, acetato de etila ou similar, métodoque envolve a adsorção do líquido de fermentação para resina de troca deíons, lavagem da resina e eluição de ácido L-láctico, método que envolve areação de ácido L-láctico no líquido de fermentação com álcool na presença decatalisador ácido para convertê-lo no éster correspondente seguido pela suadestilação e método que envolve a cristalização de ácido L-láctico como sal decálcio ou sal de lítio. Preferencialmente, solução de ácido L-láctico concentradaobtida por meio da evaporação de água do líquido de fermentaçãofiltrado/separado pode ser submetida a destilação. Durante a destilação, asolução original a ser destilada é submetida a destilação, preferencialmentedurante a alimentação de água, de forma que a concentração de água dasolução seja mantida constante. Solução aquosa de ácido L-láctico obtida pormeio de destilação pode ser concentrada por meio de evaporação de água sobaquecimento para gerar concentração objeto de ácido L-láctico purificado.
Quando solução aquosa de ácido L-láctico que contém componentes combaixo ponto de ebulição tais como etanol e ácido acético for obtida na forma dedestilado, os componentes com baixo ponto de ebulição são preferencialmenteremovidos em etapa de concentração de ácido L-láctico. Após a operação dedestilação, o destilado pode também ser purificado com resina de troca de íonsou carvão ativado, por meio de separação cromatográfica ou similar conforme onecessário para remover impurezas, para gerar ácido L-láctico com purezamais alta.
Quando ácido D-láctico for produzido por meio do método defabricação de produto químico de acordo com a presente invenção, osmicroorganismos ou células cultivadas que podem ser utilizados na fabricaçãode ácido D-láctico não são limitados, desde que possam produzir ácido D-láctico. Os microorganismos ou células cultivadas que podem ser utilizados emprodução de ácido D-láctico incluem, por exemplo, microorganismospertencentes à linhagem de tipo selvagem dos gêneros Lactobacillus, Bacilluse Pediococcus que possuem capacidade de sintetizar ácido D-láctico.
Quando ácido D-láctico for produzido por meio do método defabricação de produto químico de acordo com a presente invenção, osmicroorganismos ou células cultivadas utilizados são preferencialmenteaqueles em que a atividade enzimática de D-Iactato desidrogenase (às vezesdenominada a seguir D-LDH) da linhagem do tipo selvagem foi aumentada. Ométodo de aumento da atividade enzimática pode também ser método demutagênese química conhecido na técnica. De maior preferência, omicroorganismo é microorganismo recombinante no qual a atividade enzimáticade D-Iactato desidrogenase foi aumentada por meio de integração de gene quecodifica D-Iactato desidrogenase. Quando ácido D-láctico for produzido pormeio do método de fabricação de produto químico de acordo com a presenteinvenção, um hospedeiro do microorganismo recombinante é preferencialmenteEscherichia coli ou bactéria de ácido láctico que é célula procariótica oulevedura que é célula eucariótica, de preferência específica levedura.
Quando ácido D-láctico for produzido por meio do método defabricação de produto químico de acordo com a presente invenção, o gene quecodifica D-Iactato desidrogenase é preferencialmente gene derivado deLactobacillus plantarum, Pediococcus acidilaetiei ou Bacillus laevolaetieus, demaior preferência gene derivado de Bacillus laevolaetieus.
Quando ácido D-láctico for produzido por meio do método defabricação de produto químico de acordo com a presente invenção, aseparação e a purificação de ácido D-láctico contido no líquido de fermentaçãofiltrado/separado produzido podem ser conduzidas por meio de combinação demétodos convencionalmente conhecidos, tais como concentração, destilação ecristalização. Seus exemplos incluem um método que envolve a redução do pHdo líquido de fermentação filtrado/separado para 1 ou menos e, em seguida,extração de ácido D-láctico com dietil éter, acetato de etila ou similar, métodoque envolve a adsorção do líquido de fermentação para resina de troca deíons, lavagem da resina e eluição de ácido D-láctico, método que envolve areação de ácido -láctico no líquido de fermentação com álcool na presença decatalisador ácido para convertê-lo no éster correspondente seguido pela suadestilação e método que envolve a cristalização de ácido D-láctico como sal decálcio ou sal de lítio. Preferencialmente, solução de ácido D-láctico concentradaobtida por meio da evaporação de água do líquido de fermentaçãofiltrado/separado pode ser submetida a destilação quando ácido D-láctico forproduzido por meio do método de fabricação de produto químico de acordocom a presente invenção. Durante a destilação, a solução original a serdestilada é submetida a destilação, preferencialmente durante a alimentaçãode água, de forma que a concentração de água da solução seja mantidaconstante. Solução aquosa de ácido D-láctico obtida por meio de destilaçãopode ser concentrada por meio de evaporação de água sob aquecimento paragerar concentração objeto de ácido D-láctico purificado. Quando soluçãoaquosa de ácido D-láctico que contém componentes com baixo ponto deebulição (etanol, ácido acético etc.) for obtida na forma de destilado, oscomponentes com baixo ponto de ebulição são preferencialmente removidosem etapa de concentração de ácido D-láctico. Após a operação de destilação,o destilado pode também ser purificado com resina de troca de íons ou carvãoativado, por meio de separação cromatográfica ou similar conforme onecessário para remover impurezas, para gerar ácido D-láctico com purezamais alta.
Quando etanol for produzido por meio do método de fabricação deproduto químico de acordo com a presente invenção, os microorganismos oucélulas cultivadas que podem ser utilizados na fabricação de etanol não sãolimitados, desde que sejam microorganismos ou células cultivadas que possamproduzir ácido pirúvico. Os microorganismos ou células cultivadas que podemser utilizados na produção de etanol incluem, por exemplo, microorganismospertencentes ao gênero Saccharomyces, gênero Kluyveromyces e gêneroSchizosaccharomyees. Dentre estes, Saccharomyces eerevisiae,Kluyveromyces Iaetis e Schizosaccharomyees pombe podem serpreferencialmente utilizados. Microorganismos pertencentes ao gêneroLactobacillus e ao gênero Zymomonas podem também ser preferencialmenteutilizados. Dentre eles, Lactobacillus brevis e Zymomonas mobilis podem serpreferencialmente utilizados.
Os microorganismos ou células cultivadas que podem serutilizados na produção de etanol na presente invenção podem sermicroorganismos ou células cultivadas que possuem capacidade aumentadaartificialmente de produção de etanol. Especificamente, os microorganismos oucélulas cultivadas que podem ser utilizados na produção de etanol na presenteinvenção podem ser os que possuem propriedades modificadas parcialmentepor meio de mutação ou recombinação genética. Exemplos dosmicroorganismos ou células cultivadas que possuem propriedadesparcialmente modificadas incluem leveduras dotadas de capacidade deassimilação de amido bruto por meio de integração de gene glicoamilasederivado de fungo pertencente ao gênero Rhizopus (Biseibutsu(Microorganism), 3: 555-564 (1987)). Método de purificação utilizandodestilação ou método de concentração/purificação que utiliza NF1 membrana deRO ou membrana de separação de zeólitos pode ser preferencialmenteutilizado na separação e purificação de etanol contido no líquido defermentação filtrado/separado elaborado por meio do método de produção deacordo com a presente invenção.
Quando ácido pirúvico for produzido por meio do método defabricação de produto químico de acordo com a presente invenção, osmicroorganismos ou células cultivadas que podem ser utilizados na fabricaçãode ácido pirúvico não são limitados, desde que sejam microorganismos oucélulas cultivadas que possam produzir ácido pirúvico. Os microorganismos oucélulas cultivadas que podem ser preferencialmente utilizados na produção deácido pirúvico incluem, por exemplo, microorganismos pertencentes ao gêneroPseudomonas, gênero Corynebaeteríum, gênero Eseheriehia e gêneroAcinetobacter. De maior preferência, podem ser utilizados microorganismostais como Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas aeruginosa e Escherichiacoli. Pode m também ser utilizados microorganismos recombinantes criadossubmetendo-se estes microorganismos a mutação ou recombinação genéticapara modificar parcialmente as suas propriedades. São tambémpreferencialmente utilizados, por exemplo, os microorganismos em que o geneATPase envolvido diretamente na produção de ATP por meio de fosforilaçãooxidativa sofreu mutação ou foi excluído. Fungos e leveduras podem tambémser preferencialmente utilizados. Podem ser utilizados fungos e leveduraspertencentes ao gênero Saccharomyces, gênero Toluropusis, gênero Candidae gênero Sehizophyllum. De maior preferência, fungos e leveduras tais comoSaccharomyees eerevisiae, Saccharomyees eopsis, Candida glabrata, Candidalipolytiea, Toluropusis glabrata e Sehizophyllum eommune podem ser utilizadospara produzir ácido pirúvico.
Quando ácido pirúvico for produzido por meio do método defabricação de produto químico de acordo com a presente invenção, aseparação e a purificação de ácido pirúvico contido no líquido de fermentaçãofiltrado/separado podem ser conduzidas por meio de método que utiliza colunade troca de ânions. Pode ser preferencialmente utilizado, por exemplo, métodode purificação que utiliza trocador de íons fracamente halofíticos exibido emJP-A n° 6-345683.
Quando ácido succínico for produzido por meio do método defabricação de produto químico de acordo com a presente invenção, osmicroorganismos ou células cultivadas que podem ser utilizados na fabricaçãode ácido succínico não são limitados, desde que sejam microorganismos oucélulas cultivadas que possam produzir ácido succínico. Os microorganismosou células cultivadas que podem ser preferencialmente utilizados na produçãode ácido succínico incluem, por exemplo, microorganismos pertencentes aosgêneros Anaerobiospirillum e Actinobacillus. Exemplos específicos dessesmicroorganismos incluem Anaerobiospirillum succiniciproducens, descrito naPatente Norte-Americana n° 5.143.833, e Actinobacillus succinogenes, descritopor James B. Mckinlay et al (Appl. Microbioi Biotechnol., 71, 6651-6656 (2005).
Podem também ser utilizadas bactérias corineformes dos gênerosCorynebacterium e Brevibacterium e Escherichia. Bactérias corineformes sãopreferencialmente Corynebacterium glutamieum, Brevibaeterium flavum eBrevibaeterium Iaetofermentum.
Os microorganismos podem ser aqueles que possuemcapacidade de produção de ácido succínico aprimorada por meio derecombinação genética, por meio do quê a produtividade de ácido succínicopode ser aprimorada. Exemplos dos microorganismos que podem ser utilizadosno presente incluem Brevibaeterium flavum MJ233AB-41 com deficiência deIactato desidrogenase (FERM BP-1498) descrito em JP-A n° 2005-27533,Corynebaeterium glutamieum descrito no Documento Não de Patente 1, elinhagens de Escherichia coli AFP111 com deficiência de Iiase e Iactatodesidrogenase descritas na Patente Norte-Americana n° 5.770.435.
Quando ácido succínico for produzido por meio do método defabricação de produto químico de acordo com a presente invenção, métodohabitual de purificação de ácido succínico pode ser aplicado para separação epurificação de ácido succínico. Pode ser preferencialmente utilizado método depurificação de combinação de tratamento de hidrólise eletrodiálise ecristalização/concentração a vácuo exibido em JP-A- n° 2005-333886.
Quando ácido itacônico for produzido por meio do método defabricação de produto químico de acordo com a presente invenção, osmicroorganismos ou células cultivadas que podem ser utilizados na fabricaçãode ácido itacônico não são limitados, desde que sejam microorganismos oucélulas cultivadas que possam produzir ácido itacônico. Os microorganismosou células cultivadas que podem ser preferencialmente utilizados na produçãode ácido itacônico incluem fungos e leveduras. De maior preferência, fungospertencentes ao gênero Aspergillus ou gênero Ustilago, ou leveduraspertencentes ao gênero Candida ou gênero Rhodotorula, são utilizados naprodução de ácido itacônico. Podem ser particularmente utilizados fungos taiscomo Aspergillus terreus, Aspergillus itaconicus, Ustilago maydis, Ustilagocynodontis e Ustilago rabenhorstina, ou Candia antarctica, na produção deácido itacônico.
Quando ácido itacônico for produzido por meio do método defabricação de produto químico de acordo com a presente invenção, aseparação e a purificação de ácido itacônico podem ser conduzidas utilizandoultrafiltragem e eletrodiálise. Pode ser preferencialmente utilizado, por exemplo,método de purificação por meio de ultrafiltragem e eletrodiálise com membranade resina de troca de cátions do tipo sal exibida na Patente Japonesa n° 50958.
Quando 1,3-propanodiol for produzido por meio do método defabricação de produto químico de acordo com a presente invenção, osmicroorganismos ou células cultivadas que podem ser utilizados na fabricaçãode 1,3-propanodiol não são limitados, desde que sejam microorganismos oucélulas cultivadas que possam produzir 1,3-propanodiol. Os microorganismosou células cultivadas que podem ser preferencialmente utilizados na produçãode 1,3-propanodiol incluem, por exemplo, linhagens do tipo selvagem tais comomicroorganismos pertencentes aos gêneros Klebsiella, Clostridium eLactobacillus que possuem capacidade de produção de 1,3-propanodiol a partirde glicerol.
Quando 1,3-propanodiol for produzido por meio do método deprodução de produto químico de acordo com a presente invenção, omicroorganismo contém preferencialmente (a) pelo menos um gene quecodifica polipeptídeo que possui atividade de glicerol desidratase; (b) pelomenos um gene que codifica fator de reativação de glicerol desidratase; e (c)pelo menos um gene que codifica atividade catalisadora não específica deconversão de 3-hidroxiproponaldeído em 1,3-propanodiol. Na presenteinvenção, o microorganismo é, de preferência específica, microorganismorecombinante que permite a produção de 1,3-propanodiol.
Quando 1,3-propanodiol for produzido por meio do processo defabricação de produto químico de acordo com a presente invenção, omicroorganismo que possui capacidade de produzir 1,3-propanodiol a partir deglicerol é preferencialmente microorganismo recombinante selecionado a partirdo grupo que consiste de Klebsiella, Clostridium, Lactobacillus, Cytrobacter,Enterobacter, Aerobacter, Aspergillus, Saccharomyces, Schizosaccharomyces,Zygosaccharomyces, Piehia, Kluyveromyces, Candida, HansenulalDebaryomyees, Mueor, Torulopsis, Methylobaeter, Salmonella, Baeillus,Aerobacter, Streptomyees, Eseherieia e Pseudomonas, e é de maiorpreferência Eseheriehia eoli.
Quando 1,3-propanodiol for produzido por meio do método defabricação de produto químico de acordo com a presente invenção, omicroorganismo recombinante é preferencialmente modificado para permitir aprodução de 1,3-propanodiol eficientemente a partir de glicose. Omicroorganismo recombinante é preferencialmente microorganismorecombinante que contém (a) pelo menos um gene que codifica polipeptídeoque possui atividade de glicerol-3-fosfato desidratase; e (b) pelo menos umgene que codifica polipeptídeo que possui atividade de glicerol-3-fosfatase e é,de maior preferência, microorganismo recombinante que contém gene no qualfator de reativação de glicerol desidratase é codificado por orfX e orfZ isolado apartir de regulador dha. O microorganismo recombinante é, de preferênciaainda maior, microorganismo recombinante com deficiência na atividade deglicerol quinase e/ou atividade de glicerol desidrogenase e/ou atividade detriose fosfato isomerase.
Quando 1,3-propanodiol for produzido por meio do método defabricação de produto químico de acordo com a presente invenção, aseparação e a purificação de 1,3-propanodiol contido no líquido de fermentaçãofiltrado/separado podem ser conduzidas por meio de concentração ecristalização. Pode ser preferencialmente utilizado, por exemplo, método depurificação que utiliza concnetração sob pressão reduzida e recristalizaçãoexibido em JP-A n° 35785.
Quando cadaverina for produzida por meio do método defabricação de produto químico de acordo com a presente invenção, osmicroorganismos ou células cultivadas que podem ser utilizados na fabricaçãode cadaverina não são limitados, desde que sejam microorganismos ou célulascultivadas que possam produzir cadaverina. Os microorganismos ou célulascultivadas que podem ser preferencialmente utilizados na produção decadaverina incluem, por exemplo, microorganismos que possuem atividade deenzima de Iisina des carboxilase e/ou antiportador de Iisina cadaverina. Osmicroorganismos são, de maior preferência, microorganismos recombinantesaos quais foram integrados genes que codificam Iisina descarboxilase e/ouantiportador de Iisina cadaverina. Os microorganismos recombinantes são, depreferência ainda maior, aqueles aos quais foram integrados um ou mais tiposde genes que codificam Iisina descarboxilase.
Quando cadaverina for produzida por meio do método defabricação de produto químico de acordo com a presente invenção, osmicroorganismos recombinantes são preferencialmente Escherichia coli ebactérias corineformes, de maior preferência bactérias corineformes quepossuem atividade de Iisina descarboxilase e possuem pelo menos umapropriedade selecionada a partir de auxotrofia de homoserina e resistência a S-(2-aminoetil)-L-cisteína. Os microorganismos são, de maior preferência, os quepossuem deficiência na atividade de homoserina desidrogenase, de preferênciaainda maior os que possuem deficiência na atividade de homoserinadesidrogenase por meio de mutação com gene inserido. Na presente invenção,o gênero de bactéria corineforme é preferencialmente pelo menos um gêneroselecionado a partir do grupo que consiste do gênero Corynebacterium eBrevibacterium. O microorganismo é, de maior preferência, Corynebacteriumgulutamicum.
Quando cadaverina for produzida por meio do método defabricação de produto químico de acordo com a presente invenção, aseparação e a purificação de cadaverina contida no líquido de fermentaçãofiltrado/separado podem ser conduzidas por meio de combinação de métodosconhecidos na técnica, tais como concentração, destilação e cristalização.
Pode ser preferencialmente utilizado, por exemplo, método de purificação queutiliza cristalização exibido em JP-A n° 2004-222569. Dependendo do ácidoutilizado em cultivo contínuo, o produto de acordo com a presente invençãopode ser utilizado como material de diversos polímeros e, quando o produto forutilizado como material de polímero que necessita de alta pureza, épreferencialmente empregado método de purificação que utiliza cristalização.
Quando o pH do cultivo for mantido com ácido clorídrico, dicloridrato decadaverina pode ser recuperado do filtrado por meio de etapa de cristalização.
É de maior preferência que o pH do cultivo seja mantido com ácidodicarboxílico durante cultivo contínuo e, a partir do filtrado, dicarboxilato decadaverina pode ser recuperado por meio de etapa de cristalização. O ácidodicarboxílico é, de maior preferência, ácido dicarboxílico alifático e/ouaromático que contém dois grupos carboxila somente como seus gruposfuncionais. O ácido dicarboxílico é, de preferência ainda maior, ácido adípico,ácido sebácico, ácido 1,12-dodecanodicarboxílico, ácido succínico, ácidoisoftálico ou ácido tereftálico.Quando ácido nucleico for produzido por meio do método defabricação de produto químico de acordo com a presente invenção, osmicroorganismos ou células cultivadas que podem ser utilizados na fabricaçãode ácido nucleico não são limitados, desde que sejam microorganismoscapazes de produzir ácido nucleico. Os microorganismos ou células cultivadasque podem ser utilizados na produção de ácido nucleico podem ser os quepossuem inerentemente alta capacidade de produção de ácido nucleicoseparada do mundo natural, ou podem ser microorganismos procarióticos quepossuem capacidade de produção artificialmente aumentada. Especificamente,os microorganismos podem ser aqueles que possuem propriedadesmodificadas parcialmente por meio de mutação ou recombinação genética.
É agora descrita a modificação de parte de propriedades. Para aprodução eficiente de ácido nucleico, o ácido nucleico deverá serbiossintetizado, acumulado e liberado fora do microorganismo.Conseqüentemente, microorganismos ou células cultivadas que produzemeficientemente ácido nucleico podem ser criadas por meio de aprimoramentode enzima envolvida em processo de biossíntese de ácido nucleico, redução daatividade de enzima envolvida em processo de decomposição de ácidonucleico e modificações de proteína envolvida na liberação de ácido nucleicodo microorganismo ou para composição de membrana biológica.
Especificamente, quando é produzida inosina, a modificação departe de propriedades é realizada de tal forma que atividade deadenilossuccinato sintase é desejavelmente liberada ou fraca; atividade deinosinato desidrogenase é desejavelmente livre ou fraca; e atividade denuclosidase é desejavelmente livre ou fraca. Quando é produzida guanosina,atividade de adenilossuccinato sintase é desejavelmente livre ou fraca;atividade de guanilato desidrogenase é desejavelmente livre ou fraca; atividadede nucleosidase é desejavelmente livre ou fraca; e atividade de nucleotidase édesejavelmente livre ou fraca. Quando é produzida uridina, atividade de uridinafosforilase é desejavelmente livre ou fraca. Quando é produzida citidina,atividade de citidina desaminase é desejavelmente livre ou fraca e homosserinadesidrogenase é desejavelmente livre ou fraca.
Quando ácido nucleico for produzido por meio do método defabricação de produto químico de acordo com a presente invenção, osmicroorganismos ou células cultivadas que podem ser utilizados sãopreferencialmente bactérias corineformes e Bacillus subtilis. As bactériascorineformes incluem bactérias pertencentes ao gênero Corynebacterium. Asbactérias do gênero Corynebacterium que podem ser preferencialmenteutilizadas incluem Corynebacterium glutamicum, Corynebacteriumammoniagenes, Corynebaeterium guanofaeiens e Corynebaeteriumpetrophilium. Bacillus subtilis inclui bactérias pertencentes ao gênero Baeillus.Dentre o gênero Baeillus, são preferencialmente utilizados Baeillus subtilis,Baeillus Iiqueniformis e Baeillus pumilus. Quando é produzida guanosina, abactéria corineforme utilizada no presente inclui bactérias pertencentes aogênero Corynebaeterium. Dentre o gênero Corynebaeterium, Corynebaeteriumglutamicum é preferível e Baeillus subtilis inclui bactérias pertencentes aogênero Baeillus. Dentre o gênero Baeillus, são preferencialmente utilizadosBaeillus subtilis, Baeillus Iiqueniformis e Baeillus pumilus. Quando uridina forproduzida, pode-se utilizar Baeillus subtilis e, dentre as bactérias Baeillussubtilis, são preferencialmente utilizadas as bactérias pertencentes ao gêneroBaeillus. Dentre o gênero Baeillus, é preferencialmente utilizada Baeillussubtilis. Quando citidina for produzida, pode-se utilizar Baeillus subtilis e, dentreas bactérias Baeillus subtilis, são preferencialmente utilizadas as bactériaspertencentes ao gênero Baeillus. Dentre o gênero Baeillus, é preferencialmenteutilizada Baeillus subtilis.
Quando ácido nucleico for produzido por meio do método defabricação de produto químico de acordo com a presente invenção, aseparação e a purificação de ácido nucleico contido no líquido de fermentaçãofiltrado/separado podem ser conduzidas preferencialmente por meio decombinação de tratamento de resina de troca de íons, recristalização porresfriamento/concentração, separação de membranas e outros métodos. Paraa remoção de impurezas, pode-se utilizar recristalização e adsorção de carvãoativado convencional na purificação.
Quando aminoácido for produzido por meio do método defabricação de produto químico de acordo com a presente invenção, osmicroorganismos ou células cultivadas que podem ser utilizados na fabricaçãode aminoácido não são limitados, desde que sejam microorganismos quepossam produzir aminoácido. Os microorganismos ou células cultivadas quepodem ser utilizados na produção de aminoácido podem ser os que possuemoriginalmente alta capacidade de produção de aminoácido separados domundo natural, ou podem ser microorganismos ou células cultivadas quepossuem capacidade de produção artificialmente aumentada. Quandoaminoácido for produzido por meio do método de fabricação de produtoquímico de acordo com a presente invenção, o aminoácido é preferencialmenteL-treonina, L-lisine, ácido L-glutâmico, L-triptofano, L-isoleucina, L-glutamina, L-arginina, L-alanina, L-histidina, L-prolina, L-fenilalanina, ácido L-aspártico, L-tirosina, metionina, serina, valina ou leucina.
São agora descritos os microorganismos ou células cultivadasque podem ser utilizados na produção de aminoácido sobre aminoácidosespecíficos. Quando L-treonina for produzida por meio do método defabricação de produto químico de acordo com a presente invenção, osmicroorganismos ou células cultivadas que podem ser utilizados na fabricaçãode L-treonina podem ser microorganismos pertencentes a gênero selecionadoa partir do gênero Escherichia, gênero Providencia, gênero Corynebacterium,gênero Brevibacterium e gênero Serratia. Dentre eles, bactériasparticularmente preferidas são Escherichia coli, Providencia rettgeri,Corynebacterium giutamieum, Brevibaeterium flavum, Brevibaeteriumlaetofermentum e Serratia mareeseens.
Quando L-Iisina for produzida por meio do método de fabricaçãode produto químico de acordo com a presente invenção, os microorganismosou células cultivadas que podem ser utilizados na fabricação de L-Iisina sãopreferencialmente Corynebaeterium giutamieum, Brevibaeterium flavum eBrevibaeterium laetofermentum. Quando ácido L-glutâmico for produzido pormeio do método de fabricação de produto químico de acordo com a presenteinvenção, os microorganismos ou células cultivadas que podem ser utilizadosna fabricação de ácido L-glutâmico são preferencialmente Corynebaeteriumgiutamieum, Brevibaeterium flavum e Brevibaeterium laetofermentum.
Quando L-triptofano for produzido por meio do método defabricação de produto químico de acordo com a presente invenção, osmicroorganismos ou células cultivadas que podem ser utilizados na fabricaçãode L-triptofano são preferencialmente Corynebaeterium giutamieum,Brevibaeterium flavum, Brevibaeterium laetofermentum, Bacillus subtilis,Bacillus amyloliquefaeiens e Eseheriehia coli.
Quando L-isoleucina for produzida por meio do método defabricação de produto químico de acordo com a presente invenção, osmicroorganismos ou células cultivadas que podem ser utilizados na fabricaçãode L-isoleucina são preferencialmente Corynebaeterium giutamieum,Brevibacterium flavum, Brevibacterium laetofermentum e Serratia mareeseens.
Quando L-glutamina for produzida por meio do método defabricação de produto químico de acordo com a presente invenção, osmicroorganismos ou células cultivadas que podem ser utilizados na fabricaçãode L-glutamina são preferencialmente Corynebacterium giutamieum,Brevibacterium flavum, Brevibacterium Iactofermentum e Flavobacteriumrígense.
Quando L-arginina for produzida por meio do método defabricação de produto químico de acordo com a presente invenção, osmicroorganismos ou células cultivadas que podem ser utilizados na fabricaçãode L-arginina são preferencialmente Corynebaeterium glutamieum,Brevibaeterium flavum, Serratia mareeseens, Eseheriehia eoli e Bacillus subtilis.
Quando L-alanina for produzida por meio do método de fabricaçãode produto químico de acordo com a presente invenção, os microorganismosou células cultivadas que podem ser utilizados na fabricação de L-alanina sãopreferencialmente Brevibaeterium flavum e Arthrobaeter oxydans.
Quando L-histidina for produzida por meio do método defabricação de produto químico de acordo com a presente invenção, osmicroorganismos ou células cultivadas que podem ser utilizados na fabricaçãode L-histidina são preferencialmente Corynebaeterium glutamieum,Brevibaeterium flavum, Brevibaeterium ammoniagenes, Serratia mareeseens,Eseheriehia eoli, Bacillus subtilis e Streptomyees eoelieolor.
Quando L-prolina for produzida por meio do método de fabricaçãode produto químico de acordo com a presente invenção, os microorganismosou células cultivadas que podem ser utilizados na fabricação de L-prolina sãopreferencialmente Corynebaeterium glutamieum, Kurthia eatenaforma, Serratiamareeseens e Eseheriehia eoli.
Quando L-fenilalanina for produzida por meio do método defabricação de produto químico de acordo com a presente invenção, osmicroorganismos ou células cultivadas que podem ser utilizados na fabricaçãode L-fenilalanina são preferencialmente Corynebaeterium glutamieum,Brevibaeterium flavum, Brevibaeterium Iaetofermentum e Eseheriehia eoli.
Quando ácido L-aspártico for produzido por meio do método defabricação de produto químico de acordo com a presente invenção, osmicroorganismos ou células cultivadas que podem ser utilizados na fabricaçãode ácido L-aspártico são preferencialmente Brevibacterium flavum, Bacillusmegatherium, Escherichia coli e Pseudomonas fluorescens.
Quando L-tirosina for produzida por meio do método de fabricaçãode produto químico de acordo com a presente invenção, os microorganismosou células cultivadas que podem ser utilizados na fabricação de L-tirosina sãopreferencialmente Corynebacterium glutamieum, Brevibaeterium flavum,Brevibaeterium Iaetofermentum e Eseheriehia coli.
Quando metionina for produzida por meio do método defabricação de produto químico de acordo com a presente invenção, osmicroorganismos ou células cultivadas que podem ser utilizados na fabricaçãode metionina são preferencialmente Corynebaeterium glutamieum.
Quando serina for produzida por meio do método de fabricação deproduto químico de acordo com a presente invenção, os microorganismos oucélulas cultivadas que podem ser utilizados na fabricação de serina sãopreferencialmente Corynebaeterium glutamieum, Brevibaeterium flavum,Brevibaeterium Iaetofermentum e Arthrobaeter oxydans.
Quando valina for produzida por meio do método de fabricação deproduto químico de acordo com a presente invenção, os microorganismos oucélulas cultivadas que podem ser utilizados na fabricação de valina sãopreferencialmente Brevibaeterium Iaetofermentum, Serratia mareeseens eKlebsiella pneumoniae.
Quando Ieucina for produzida por meio do método de fabricaçãode produto químico de acordo com a presente invenção, os microorganismosou células cultivadas que podem ser utilizados na fabricação de Ieucina sãopreferencialmente Corynebaeterium glutamieum, BrevibaeteriumIaetofermentum e Serratia mareeseens.Quando aminoácido for produzido por meio do método defabricação de produto químico de acordo com a presente invenção, osmicroorganismos ou células cultivadas que podem ser utilizados na fabricaçãode aminoácido podem ser microorganismos ou células cultivadas derivadas dosexemplos de microorganismos ou células cultivadas por meio de aumentoartificial da sua capacidade de produção de aminoácido. Os microorganismosou células cultivadas que podem ser utilizados na produção de aminoácidopodem ser os que possuem propriedades parcialmente modificadas por meiode mutação ou recombinação genética. Exemplos dos microorganismos oucélulas cultivadas que possuem propriedades parcialmente modificadas quepodem ser utilizadas na produção de aminoácido incluem Providencia rettgerícom aumento da produtividade de L-treonina descrito em JP-A n° 2-219582 eCorynebacterium glutamicum com aumento da produtividade de L-alaninadescrita no Pedido de Patente Japonês publicado n° 3-500486.
Quando fermentação contínua for conduzida por meio do métodode fabricação de produto químico de acordo com a presente invenção,velocidade de produção de volume mais alta que a de fermentação embateladas convencional pode ser atingida para permitir produção porfermentação extremamente eficiente. A velocidade de produção emfermentação contínua é calculada utilizando a Equação (3) a seguir:
[Equação 3]
Velocidade de produção por fermentação (g/l/h)= concentração deproduto em líquido retirado (g/l) x. velocidade de retirada de líquido defermentação (l/h) quantidade de líquido corrente do aparelho (I) (3)
A velocidade de produção por fermentação em cultivo debateladas é determinada por meio de divisão da quantidade (g) de produtomediante consumo de toda a fonte de carbono inicial pelo tempo (h) necessáriopara consumo da fonte de carbono e a quantidade (I) de líquido de cultivonaquele momento.
É descrito agora o aparelho de fermentação contínua de acordocom a presente invenção. O aparelho de fermentação contínua de acordo coma presente invenção pode ser utilizado na produção de álcoois tais comoetanol, 1,3-propanodiol, 1,4-butanodiol e glicerol, ácidos orgânicos tais comoácido acético, ácido láctico, ácido pirúvico, ácido succínico, ácido málico, ácidoitacônico e ácido cítrico, aminoácidos tais como L-treonina, L-Iisina1 ácido L-glutâmico, L-triptofano, L-isoleucina, L-glutamina, L-arginina, L-alanina, L-histidina, L-prolina, L-fenilalanina, ácido L-aspártico, L-tirosina, metionina,serina, valina e leucina, ácidos nucleicos tais como inosina e guanosina,compostos de diamina tais como cadaverina, enzimas, antibióticos e proteínasrecombinantes.
O aparelho de fermentação contínua de acordo com a presenteinvenção é aparelho de fabricação de produto químico por meio defermentação contínua, que inclui a filtragem de cultivo de fer mentação demicroorganismo ou células cultivadas com membrana de separação pararecuperar produto de filtrado, retenção simultânea de fluido não filtrado nocultivo ou envio para ele em refluxo e adição de materiais de fermentação aocultivo de fermentação.
O aparelho de fermentação contínua de acordo com a presenteinvenção possui tanque de reação de fermentação para cultivo de fermentaçãode microorganismo ou células cultivadas.
Em uma forma, o aparelho de fermentação contínua de acordocom a presente invenção inclui tanque de separação de membrana parafiltragem do cultivo de fermentação, que é conectado por meios de circulaçãode cultivo de fermentação ao tanque de reação de fermentação e neleequipado com membrana de separação; e meios de regulagem da diferença depressão transmembrana da membrana de separação na faixa de 0,1 a 20 kPa,em que a membrana de separação é membrana porosa que possui tamanhomédio de poro de 0,01 μηι ou mais a menos de 1 μηι.
Em outra forma, o aparelho de fermentação contínua de acordocom a presente invenção inclui elemento de membrana de separação parafiltragem do cultivo de fermentação, que é disposto no interior do tanque dereação de fermentação e equipado no seu interior com membrana deseparação; meio de descarga de produto de fermentação filtrado, que éconectado ao elemento de membrana de separação; e meios de regulagem dadiferença de pressão transmembrana da membrana de separação na faixa de0,1 a 20 kPa, em que a membrana de separação é membrana porosa quepossui tamanho médio de poro de 0,01 μίτι ou mais a menos de 1 μηη.
No aparelho de fermentação contínua de acordo com a presenteinvenção, o coeficiente de permeabilidade a área purificada para a membranaporosa é de preferencialmente 2 χ 10"9 m3/m2/s/Pa ou mais a 6 χ 10"7m3/m2/s/Pa ou menos.
No aparelho de fermentação contínua de acordo com a presenteinvenção, é preferível que o tamanho médio de poro da membrana porosa sejade 0,01 μιτι ou mais a menos de 0,2 μΐη e o desvio padrão do tamanho de poroda membrana porosa seja de 0,1 μηι ou menos.
No aparelho de fermentação contínua de acordo com a presenteinvenção, a membrana porosa é preferencialmente membrana porosa quepossui aspereza de superfície de 0,1 μιτι ou menos.
No aparelho de fermentação contínua de acordo com a presenteinvenção, a membrana porosa é preferencialmente membrana porosa quecontém camada de resina porosa. No aparelho de fermentação contínua deacordo com a presente invenção, a camada de resina porosa épreferencialmente camada de resina porosa fabricada com polímero orgânico.
No aparelho de fermentação contínua de acordo com a presente invenção, omaterial da membrana de polímero orgânico é, de maior preferência, fluoretode polivinilideno.
É agora descrito o aparelho de fermentação contínua utilizado nométodo de fabricação de produto químico de acordo com a presente invençãocom referência às figuras.
A Fig. 1 é vista lateral esquemática para exibir um exemplo doaparelho de fermentação contínua do tipo separação de membranas utilizadono método de fabricação de produto químico de acordo com a presenteinvenção. A Fig. 1 é exemplo típico do aparelho em que elemento demembrana de separação é disposto no lado externo de tanque de reação defermentação.
Na Fig. 1, o aparelho de fermentação contínua do tipo separaçãode membrana é composto essencialmente de tanque de reação defermentação 1, camada de separação de membrana 12 e aparelho deregulagem da diferença de cabeça d'água 3. O elemento de membrana deseparação 2 inclui membrana porosa integrada no seu interior. Este elementode membrana de separação utiliza preferencialmente, por exemplo, membranade separação e elemento de membrana de separação descritos na PatenteInternacional n° 2002/064240. O tanque de separação de membrana 12 éconectado por meio de bomba de circulação de líquido de fermentação 11 aotanque de reação de fermentação 1.
Na Fig. 1, é introduzido meio por bomba de alimentação de meio7 para o tanque de reação de fermentação 1, o líquido de fermentação notanque de reação de fermentação 1 é agitado com agitador 5 se necessário e,se necessário, gás necessário pode ser alimentado por meio de aparelho dealimentação de gás 4. Neste momento, gás de alimentação pode serrecuperado, reciclado e novamente alimentado por meio do aparelho dealimentação de gás 4. Se necessário, o pH do líquido de fermentação éregulado com aparelho de regulagem e sensor de pH 9 e bomba dealimentação de solução reguladora de pH 8 e, se necessário, a temperatura dolíquido de fermentação é regulada por regulador de temperatura 10, por meiodo quê pode ser conduzida produção por fermentação com alto rendimento. Olíquido de fermentação no aparelho circula entre o tanque de reação defermentação 1 e o tanque de separação de membrana 12 por meio da bombade circulação de líquido de fermentação 11. O líquido de fermentação quecontém produto de fermentação é filtrado e separado pelo elemento demembrana de separação 2 em microorganismos e produto de fermentação quepode ser retirado do sistema de aparelho em seguida. Os microorganismosfiltrados/separados podem permanecer no sistema de aparelho, de forma aatingir alta densidade de microorganismos no aparelho para atingir produçãode fermentação com alto rendimento. Filtragem/separação pelo elemento demembrana de separação 2 é atingida por diferença de pressão de cabeçad'água a partir da superfície da água do tanque de separação de membrana12, de forma que não necessita de potência especial. Conforme o necessário, avelocidade de filtragem/separação com o elemento de membrana de separação2 e a quantidade do líquido de fermentação no aparelho podem seradequadamente controladas com o sensor de nível 6 e o aparelho deregulagem da diferença de pressão de cabeça d'água 3. Conforme onecessário, gás necessário pode ser alimentado por meio do aparelho dealimentação de gás 4 para o tanque de separação de membrana 12. O aralimentado pode ser recuperado, reciclado e novamente alimentado por meiodo aparelho de alimentação de gás 4. Filtragem/separação por meio doelemento de membrana de separação 2 pode também ser atingida por meio defiltragem de sucção com bomba ou similar ou de pressurização no sistema deaparelho. Microorganismos ou células cultivadas podem ser cultivadascontinuamente em tanque de cultivo e alimentadas conforme o necessário parao fermentador. Cultivando-se os microorganismos ou células cultivadas emtanque de cultivo e alimentando-os conforme o necessário para o fermentador,fermentação contínua com microorganismos ou células cultivadas semprenovas que possuem alta capacidade de fabricação de produto químico épossibilitada para permitir fermentação contínua com alto desempenhoprodutivo mantido por longo tempo.
A Fig. 2 é vista lateral esquemática para explicar outro exemplodo aparelho de fermentação contínua do tipo separação de membranasutilizado na presente invenção. Exemplo típico do aparelho de fermentaçãocontínua em que elemento de membrana de separação é disposto no interiordo tanque de reação de fermentação utilizado no método de fabricação deproduto químico de acordo com a presente invenção é exibido na vistaesquemática da Fig. 2.
Na Fig. 2, o aparelho de fermentação contínua do tipo separaçãode membrana é composto essencialmente de tanque de reação defermentação 1 e aparelho de regulagem da diferença de cabeça d'água 3.Membrana porosa é integrada em elemento de membrana de separação 2 notanque de reação de fermentação 1. Esta membrana porosa pode utilizar, porexemplo, membrana de separação e elemento de membrana de separaçãodescritos na Patente Internacional n° 2002/064240. O elemento de membranade separação será descrito com mais detalhes posteriormente.
Em seguida, é descrita em detalhes a fermentação contínua noaparelho contínuo do tipo separação de membrana da Fig. 2.
Meio é introduzido contínua ou intermitentemente por meio debomba de alimentação de meio 7 para o tanque de reação de fermentação 1.Se necessário, o meio pode haver sido esterilizado por meio de aquecimentoou submetido a esterilização com filtro antes da introdução no tanque dereação de fermentação. Dura nte a produção de fermentação, o líquido defermentação no tanque de reação de fermentação 1 é agitado, se necessário,com agitador 5 no tanque de reação de fermentação 1. No momento daprodução de fermentação, gás necessário pode ser alimentado, se necessário,por meio de aparelho de alimentação de gás 4 para o tanque de reação defermentação 1. No momento da produção por fermentação, o pH do líquido defermentação no tanque de reação de fermentação 1 é regulado, se necessário,com aparelho de regulagem e sensor de pH 9 e bomba de alimentação desolução reguladora de pH 8 e a temperatura do líquido de fermentação notanque de reação de fermentação 1 é regulada, se necessário, por reguladorde temperatura 10, por meio do quê pode ser conduzida produção porfermentação com alto rendimento. Neste exemplo, pH e temperatura sãoilustrados como condições físico-químicas do líquido de fermentação a seremreguladas com aparelhos de medição e aparelhos de controle, mas, senecessário, oxigênio dissolvido ou ORP podem ser regulados, ou aconcentração de produto químico no líquido de fermentação é medida comanalisador tal como sensor químico on-line e condições físico-químicas podemser reguladas utilizando, como indicador, a concentração de produto químicono líquido de fermentação. Em introdução contínua ou intermitente do meio, épreferível que a quantidade e a velocidade do meio introduzido sejamreguladas adequadamente utilizando, como indicador, certo valor de mediçãono ambiente físico-químico do líquido de fermentação com o aparelho demedição.
Na Fig. 2, o líquido de fermentação é filtrado e separado emmicroorganismos e produto de fermentação por elemento de membrana deseparação 2 instalado no tanque de reação de fermentação 1 e o produto defermentação pode ser retirado do sistema de aparelho. Os microorganismosfiltrados/separados permanecem no sistema de aparelho, de forma a atingiralta densidade de microorganismos no sistema de aparelho para alançarprodução por fermentação com alto rendimento. Filtragem/separação com oelemento de membrana de separação 2 é atingida por diferença de pressão decabeça d'água a partir da superfície da água do tanque de reação defermentação 1, de forma que não necessita de potência especial. Conforme onecessário, a velocidade de filtragem/separação com o elemento de membranade separação 2 e a quantidade do líquido de fermentação no tanque de reaçãode fermentação 1 podem ser adequadamente controladas com sensor de nível6 e aparelho de regulagem da diferença de pressão de cabeça d'água 3.Filtragem/separação por meio do elemento de membrana de separação podemtambém ser atingidas por meio de filtragem de sucção com bomba ou similarou de pressurização no sistema de aparelho, se necessário. Microorganismosou células cultivadas podem ser cultivadas continuamente em tanque de cultivoe alimentadas conforme o necessário para o fermentador. Cultivando-se osmicroorganismos ou células cultivadas em tanque de cultivo e alimentando-osconforme o necessário para o fermentador, fermentação contínua commicroorganismos ou células cultivadas sempre novas que possuem altacapacidade de fabricação de produto químico é possibilitada para permitir amanutenção de fermentação contínua com alto desempenho produtivo porlongo tempo.
É agora descrito o elemento de membrana de separação utilizadopreferencialmente no aparelho de fermentação contínua empregado no métodode fabricação de produto químico de acordo com a presente invenção.
É descrito o elemento de membrana de separação exibido na Fig.3. Membrana de separação e elemento de membrana de separação descritosna Patente Internacional n° 2002/064240 podem ser preferencialmenteutilizados no aparelho de fermentação contínua utilizado no método defabricação de produto químico de acordo com a presente invenção. Conformeexibido na Fig. 3, o elemento de membrana de separação é constituído peladisposição de material de passagem 14 e da membrana de separação 15,nesta ordem, sobre os dois lados de placa de sustentação 13 que possuirigidez. A placa de sustentação 13 possui parte côncava 16 sobre os seus doislados. A membrana de separação 15 filtra o líquido de fermentação. Pelomaterial de passagem 14, água permeada filtrada através da membrana deseparação 15 flui eficientemente para a placa de sustentação 13. A águapermeada que fluiu para a placa de sustentação 13 passa através da partecôncava 16 da placa de sustentação 13 e é descarregada por meio de cano decoleta de água 17 para o lado externo do tanque de cultivo de fermentação. Apotência de descarga da água permeada pode ser gerada por meio de métodoque utiliza diferença de pressão de cabeça d'água, filtragem de sucção combomba, líquido, gás ou similar, ou pressurização no aparelho.
É descrito agora o elemento de membrana de separação exibidona Fig. 4. Conforme exibido na Fig. 4, o elemento de membrana de separaçãoé composto essencialmente de feixes de membranas de separação 18compostos de membranas de fibra oca, camada de vedação de resina superior19 e camada de vedação de resina inferior 20. O feixe de membranas deseparação é unido e fixado na forma de feixe pela camada de vedação deresina superior 19 e a camada de vedação de resina inferior 20. Por meio deunião/fixação com a camada de vedação de resina inferior, o oco da membranade fibra oca é vedado para evitar vazamento do cultivo de fermentação. Poroutro lado, a camada de vedação de resina superior 19 não veda o orifíciointerno da membrana de fibra oca, para permitir o fluxo de água permeada parao cano de coleta de água 22. Este elemento de membrana de separação podeser disposto por meio de quadro de sustentação 21 no aparelho defermentação contínua. A água permeada filtrada através do feixe demembranas de separação 18 passa através do espaço oco da membrana defibra oca e é descarregada por meio do cano de coleta de água 22 para o ladoexterno do tanque de cultivo de fermentação. A potência de descarga da águapermeada pode ser gerada por meio de método que utiliza diferença depressão de cabeça d'água, filtragem de sucção com bomba, líquido, gás ousimilar, ou pressurização no aparelho.
O material que constitui o elemento de membrana de separaçãodo aparelho de fermentação contínua utilizado no método de fabricação deproduto químico de acordo com a presente invenção é preferencialmentemembro resistente a esterilização a vapor sob alta pressão. Caso o lado internodo aparelho de fermentação possa ser esterilizado, pode-se evitarcontaminação com microorganismos desfavoráveis durante fermentaçãocontínua, para permitir fermentação contínua mais estável. O membro queconstitui o elemento de membrana de separação é preferencialmente resistenteàs condições (121 0C, quinze minutos) de esterilização a vapor sob altapressão. O material do membro de elemento de membrana de separação podeser adequadamente selecionado, por exemplo, a partir de metais tais como açoinoxidável e alumínio e resinas tais como resina de poliamida, resina de flúor,resina de policarbonato, resina poliacetal, resina de tereftalato de polibutileno,PVDF1 resina de polifenileno éter modificado e resina de polissulfona.
No aparelho de fermentação contínua utilizado no método defabricação de produto químico de acordo com a presente invenção, o elementode membrana de separação pode ser instalado fora do tanque de fermentaçãoou pode ser instalado dentro do tanque de fermentação. No caso de instalaçãofora do tanque de fermentação, o elemento de membrana de separação podeser instalado em tanque de separação de membrana disposto separadamentepara circular o líquido de fermentação entre o tanque de fermentação e otanque de separação de membrana, durante o quê o líquido de fermentaçãopode ser filtrado continuamente através do elemento de membrana deseparação.No aparelho de fermentação contínua utilizado no método defabricação de produto químico de acordo com a presente invenção, o tanquede separação de membrana é desejavelmente capaz de esterilização a vaporsob alta pressão. Caso o tanque de separação de membrana seja capaz deesterilização a vapor sob alta pressão, pode-se facilmente evitar acontaminação devido a bactérias saprofíticas.
Exemplos
A seguir, a fim de explicar a presente invenção em mais detalhes,realizações específicas nas quais ácido D-láctico, etanol, ácido pirúvico, ácidosuccínico, 1,3-propanodiol, ácido itacônico, cadaverina, ácido nucleico eaminoácido foram selecionados como o produto químico e microorganismo oucélulas cultivadas que possuem capacidade de fabricar cada produto químicoforam utilizados em fermentação contínua utilizando os aparelhos exibidos nasvistas esquemáticas nas Figs. 1 e 2 são descritas com referência aosExemplos.
Exemplo de Referência 1
Preparação de Linhagem de Levedura que Possui Capacidade de Produçãode ácido l-láctico
Linhagem de leveduras que possui capacidade de produção deácido L-láctico foi criada conforme segue. Gene LDH derivado de sereshumanos foi ligado abaixo no fluxo de promotor PDC1 sobre genoma delevedura, de forma a criar linhagem de leveduras que possui capacidade deprodução de ácido L-láctico. Reação em cadeia de polimerase (PCR) foiconduzida utilizando La-Taq (Takara Shuzo Co., Ltd.) ou KOD-Plus-polimerase(TOYOBO CO., LTD.) de acordo com as suas instruções anexas.
Após o cultivo e recuperação de linhagem celular estabelecida decâncer de mama humano (MCF-7), o RNA total foi extraído utilizando ReagenteTRIZOL (Invirogen). Utilizando o RNA total resultante como modelo, reação detranscrição reversa foi conduzida utilizando Sistema de Seleção SuperScript(Invitrogen) para sintetizar cDNA. Os detalhes da operação foram de acordocom os protocolos anexos. O cDNA obtido desta forma foi utilizado comomodelo de amplificação para PCR subseqüente.
Gene L-Idh foi clonado por meio de PCR com KOD-PIus-polimerase e conjunto de primers de oligonucleotídeos descrito em SEQ ID N01 e 2, em que o cDNA obtido por meio da operação acima foi utilizado comomodelo de amplificação. Cada fragmento de amplificação de PCR foipurificado, fosforilado em seguida no seu término com T4 polinucleotídeoquinase (fabricada pela TAKARA) e ligado a vetor pUC118 (que havia sidotratado por meio de divisão com enzima de restrição Hincll e submissão emseguida da superfície de divisão a desfosforilação). Esta ligação foi conduzidacom kit de ligação de DNA Ver. 2 (fabricado pela TAKARA). O produto deplasmídeo de ligação foi utilizado para transformar Escherichia coli DH5a doqual DNA de plasmídeo foi recuperado em seguida para gerar plasmídeos emque vários genes L-Idh (SEQ ID N0 3) haviam sido subclonados. Os plasmídeospUC118 resultantes nos quais o gene L-Idh havia sido inserido foram digeridoscom enzimas de restrição Xhol e Notl e cada um dos fragmentos de DNAresultantes foi inserido em local de divisão Xhol/Notl de vetor de expressão delevedura pTRS11 (Fig. 5). O plasmídeo de expressão de gene L-Idh derivadode seres humanos pL-ldh5 (gene L-ldh) foi obtido desta forma. O pL-ldh5mencionado acima que é vetor de expressão de gene L-Idh derivado de sereshumanos foi depositado como plasmídeo isolado sob FERM AP-20421 em 21de fevereiro de 2005 junto ao Depositário do Organismo Internacional dePatentes (IPOD)1 Instituto Nacional de Tecnologia e Ciência IndustrialAvançada (AIST) (Central 6, 1-1-1 Higashi, Cidade de Tsukuba, Prefeitura deIbaraki, Japão).
Fragmento de DNA com 1,3 kb que contém o gene LDH derivadode seres humanos e seqüência de término de gene TDH3 derivado deSaccharomyces cerevisiae foi amplificada por meio de PCR com conjunto deprimers de oligonucleotídeos descrito em SEQ ID N0 4 e 5, em que o plasmídeopL-ldh5 que contém o gene LDH derivado de seres humanos foi utilizado comomodelo de amplificação. Fragmento de DNA com 1,2 kb que contém geneTRP1 derivado de Saccharomyces cerevisiae foi amplificado por meio de PCRcom conjunto de primers de oligonucleotídeos descrito em SEQ ID N0 6 e 7 e oplasmídeo pRS424 na forma de modelo de amplificação. Os fragmentos deDNA correspondentes foram separados por meio de eletroforese de gel deagarose a 1,5% e purificados de forma habitual. Mistura dos fragmentos de 1,3kb e 1,2 kb obtidos desta forma foi utilizada como modelo de amplificação emPCR com conjunto de primers de oligonucleotídeos descritos em SEQ ID N0 4 e7 para gerar produtos que foram submetidos em seguida a eletroforese de gelde agarose a 1,5% para preparar fragmento de DNA de 2,5 kb que consiste dogene LDH derivado de seres humanos e do gene TRP1 a ele ligado de formahabitual. Este fragmento de DNA de 2,5 kb foi transformado de forma habitualem linhagem de levedura de enxerto NBRC10505, de forma a tomá-lotriptofano não auxotrófico.
O fato de que as células transformadas resultantes foram aquelasque contêm o gene LDH derivado de seres humanos ligado abaixo no fluxo depromotor de PDC1 sobre genoma de levedura foi confirmado pela preparação,em primeiro lugar, do DNA de genoma da célula transformada de forma habitual,utilizando-o como modelo de amplificação em PCR com conjunto de primer deoligonucleotídeos descritos em SEQ ID N0 8 e 9 para gerar fragmento de DNAde amplificação com 0,7 kb. A capacidade ou não de produção de ácido lácticopelas células transformadas foi confirmada por meio de determinação, em HPLCsob as condições a seguir, da quantidade de ácido láctico contida emsobrenadante de cultivo das células transformadas cultivadas em meio SC(,Methods in Yeast Genetics, Edição 2000, CSHL Press).
Coluna: Shim-Pack SPR-H (fabricada pela Shimadzu Corporation)Fase móvel: 5 mM de ácido p-toluenossulfônico (velocidade defluxo de 0,8 ml/min)
Solução de reação: 5 mM de ácido p-toluenossulfônico, 20 mM deBis-Tris, 0,1 mM de EDTA-2 Na (velocidade de fluxo de 0,8 ml/min)Método de detecção: condutividade elétrica
Temperatura: 45 °C
A pureza ótica de ácido L-láctico foi medida por meio de HPLCsob as condições a seguir.
Coluna: TSK-gel Enantio L1 (fabricada pela Tosoh Corporation)Fase móvel: 1 mM de solução aquosa de sulfato de cobreVelocidade de fluxo: 1,0 ml/minMétodo de detecção: UV 254 nm
Temperatura: 30 0C
A pureza ótica de ácido L-láctico é calculada utilizando a equaçãoa seguir:
Pureza ótica (%) = 100 χ (L-D)/(L+D)em que L representa a concentração de ácido L-láctico e Drepresenta a concentração de ácido D-láctico.
Como resultado da análise de HPLC, 4 g/l de ácido L-lácticoforam detectados e ácido D-láctico estava abaixo do limite de detecção. A partirdo estudo acima, confirmou-se que este transformador possui capacidade deprodução de ácido L-láctico. As células transformadas resultantes foramutilizadas como linhagem de levedura SW-1 nos Exemplos abaixo.
Exemplo de Referência 2Preparação de Membrana Porosa (N° 1)Resina de fluoreto de polivinilideno (PVDF) e N1N-dimetilacetamida foram utilizadas como resina e solvente, respectivamente, eagitadas suficientemente sob temperatura de 90 0C para gerar solução padrãoque possui a composição a seguir:
fluoreto de polivinilideno: 13,0% em peso; e
N,N-dimetilacetamida: 87,0% em peso
Em seguida, a solução padrão foi resfriada até temperatura de 250C, aplicada em seguida sobre tecido não tecido de fibra de poliéster quepossui densidade de 0,48 g/cm3 e espessura de 220 μΐη previamente fixado aplaca de vidro e que foi imediatamente mergulhado por cinco minutos embanho de coagulação sob temperatura de 25 0C que possui a composição aseguir, para gerar material base poroso que contém camada de resina porosaformada sobre ele.
Água: 30,0% em pesoN,N-dimetilacetamida: 70,0% em peso
Este material base poroso foi destacado da placa de vidro,mergulhado por três vezes em água quente sob temperatura de 80 0C, deforma a ser lavado para remover Ν,Ν-dimetilacetamida, para gerar membranade separação.
A superfície da camada de resina porosa em área de 9,2 μηι χ10,4 μηι foi observada em ampliação de dez mil vezes sob microscópioeletrônico de varrimento. O diâmetro médio de todos os poros observáveis foide 0,1 μητι.
Em seguida, a membrana de separação foi avaliada paradeterminar o seu coeficiente de permeabilidade a água purificada. A mediçãodo coeficiente de permeabilidade a água purificada foi conduzida com águapurificada tratada com membrana de osmose reversa a 25 0C com altura decabeça de um metro.
O desvio padrão do tamanho médio de poro foi de 0,035 μηι e aaspereza da superfície da membrana foi de 0,06 μίτι. A membrana porosapreparada desta forma poderá ser preferencialmente utilizada na presenteinvenção.
Exemplo de Referência 3
Preparação de Membrana Porosa (N0 2)
Resina de fluoreto de polivinilideno (PVDF) foi utilizada comoresina, polietileno glicol (PEG) que possui peso molecular de cerca de 20.000como agente formador de poros, Ν,Ν-dimetilacetamida como solvente e águapurificada como não solvente e estes materiais foram agitados suficientementesob temperatura de 90 °C para gerar solução padrão que possui a composiçãoa seguir:
Fluoreto de polivinilideno: 13,0% em peso
Polietileno glicol: 5,5% em peso
Ν,Ν-dimetilacetamida: 78,0% em peso; eÁgua purificada: 3,5% em peso.
Em seguida, a solução padrão foi resfriada até temperatura de 25°C, aplicada em seguida sobre tecido não tecido de fibra de poliéster quepossui densidade de 0,48 g/cm3 e espessura de 220 μm, imediatamentemergulhada por cinco minutos em água purificada a 25 °C, mergulhada por trêsvezes em água quente a 80 °C de forma a ser lavada para remover Ν,Ν-dimetilacetamida e polietileno glicol para gerar membrana de separação.
A superfície da camada de resina porosa em área de 9,2 μm χ10,4 μm no local da membrana de separação à qual havia sido aplicada asolução padrão foi observada em ampliação de dez mil vezes sob microscópioeletrônico de varrimento. O diâmetro médio de todos os poros observáveis foide 0,02 μm.
A membrana de separação foi avaliada para determinar o seucoeficiente de permeabilidade a água purificada. O coeficiente depermeabilidade a água purificada foi de 2 χ 10"9 m3/m2 s Pa. A medição docoeficiente de permeabilidade a água purificada foi conduzida com águapurificada tratada com membrana de osmose reversa a 25 0C com altura decabeça de um metro.
O desvio padrão do tamanho médio de poro foi de 0,0055 μηθ8aspereza da superfície da membrana foi de 0,1 μηη. A membrana porosapreparada desta forma poderá ser preferencialmente utilizada na presenteinvenção.
Exemplo de Referência 4Preparação de Membrana Porosa (N0 3)
Membrana de separação foi obtida da mesma forma do Exemplode Referência 3, exceto pelo uso de solução padrão que possui a composiçãoa seguir:
Fluoreto de polivinilideno: 13,0% em pesoPolietileno glicol: 5,5% em pesoN,N-dimetilacetamida: 81,5% em peso.
A superfície da camada de resina porosa em área de 9,2 μίτι χ10,4 μίτι no local da membrana de separação à qual havia sido aplicada asolução padrão foi observada em ampliação de dez mil vezes sob microscópioeletrônico de varrimento. O diâmetro médio de todos os poros observáveis foide 0,19 μm.
O coeficiente de permeabilidade a água purificada avaliado destamembrana de separação foi de 100 χ 10~9 m3/m2 s-Pa. A medição docoeficiente de permeabilidade a água purificada foi conduzida com águapurificada tratada com membrana de osmose reversa a 25 0C com altura decabeça de um metro.
O desvio padrão do tamanho médio de poro foi de 0,060 ^eaaspereza da superfície da membrana foi de 0,08 μm. A membrana porosapreparada desta forma poderá ser preferencialmente utilizada na presenteinvenção.
Exemplo de Referência 5
Preparação de Membrana Porosa (N° 4)
Resina de fluoreto de polivinilideno (PVDF) e N1N-dimetilacetamida foram utilizadas como resina e solvente, respectivamente, eagitadas suficientemente sob temperatura de 90 0C para gerar solução padrãoque possui a composição a seguir:
Fluoreto de polivinilideno: 15,0% em peso; e
N,N-dimetilacetamida: 85,0% em peso
Em seguida, a solução padrão foi resfriada até temperatura de 250C, aplicada em seguida sobre tecido não tecido de fibra de poliéster quepossui densidade de 0,48 g/cm3 e espessura de 220 μιτι previamente fixado aplaca de vidro e que foi imediatamente mergulhado por cinco minutos embanho de coagulação sob temperatura de 25 0C que possui a composição aseguir, para gerar material base poroso que contém camada de resina porosaformada sobre ele.
Água: 100,0% em peso
Este material de base porosa foi destacado da placa de vidro,mergulhada por três vezes em água quente sob temperatura de 80 0C1 deforma a ser lavado para remover Ν,Ν-dimetilacetamida, para gerar membranade separação. A superfície da camada de resina porosa em área de 9,2 μιτι χ10,4 μιτι foi observada em ampliação de dez mil vezes sob microscópioeletrônico de varrimento. O diâmetro médio de todos os poros observáveis foide 0,008 μιτι. O coeficiente de permeabilidade a água purificada avaliado destamembrana de separação foi de 0,3 χ 10~9 m3/m2sPa. A medição do coeficientede permeabilidade a água purificada foi conduzida com água purificada tratadacom membrana de osmose reversa a 25 0C com altura de cabeça de um metro.O desvio padrão do tamanho médio de poro foi de 0,002 μΐηθά aspereza dasuperfície da membrana foi de 0,06 μιη.
Exemplo 1
Produção de Ácido L-Láctico por Meio de Fermentação ContínuaUtilizando Levedura (N01)
A produção de ácido L-láctico foi conduzida utilizando o aparelhode fermentação contínua do tipo separação de membrana da Fig. 1 e meio defermentação de ácido láctico de levedura que possui a composição exibida naTabela 1. O meio foi utilizado após esterilização a vapor em alta pressão (1210C1 quinze minutos). Como material de elemento de membrana de separação,utilizou-se moldagem de resina de polissulfona e aço inoxidável. Comomembrana de separação, foi utilizada a membrana porosa preparada noExemplo de Referência 2. A menos que indicado em contrário, as condições deoperação do Exemplo 1 são as seguintes:
Capacidade de tanque de reação: 2 (L)
Capacidade do tanque de separação de membrana: 0,5 (L)Membrana de separação utilizada: membrana de filtragem defluoreto de polivinilideno
Área de filtragem eficaz do elemento de separação de membrana:60 cm2
Controle de temperatura: 30 (0C)Aeração do tanque de reação: 0,05 (l/min)Aeração do tanque de separação de membrana: 0,3 (l/min)Velocidade de agitação do tanque de reação: 100 (rpm)Ajuste de pH: ajustado em pH 5 com 1 N NaOH
Velocidade de alimentação do meio de fermentação de ácidoláctico: controle variável na faixa de 50 a 300 ml/h.
Quantidade de líquido em circulação com aparelho de circulaçãode líquido de fermentação: 0,1 (l/min)
Regulagem da quantidade de água de permeação da membrana:regulagem da velocidade de fluxo por diferença de pressão transmembrana(do início da fermentação contínua até cem horas: regulada em0,1 kPa ou mais a 5 kPa ou menos;
100 horas a 200 horas: regulada em 0,1 kPa ou mais a 2kPa ou menos; e
200 horas a 300 horas: regulada em 0,1 kPa ou mais a 20kPa ou menos).
Levedura SW-1 criada no Exemplo de Referência 1 foi utilizadacomo microorganismo, meio de fermentação de ácido láctico que possui acomposição exibida na Tabela 1 foi utilizada como meio, a concentração deácido láctico na forma de produto foi avaliada por meio de HPLC exibida noExemplo de Referência 1 e a concentração de glicose foi medida com Teste deGlicose Wako C (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.).
Tabela 1
Meio de Fermentação de Ácido Láctico de Levedura
<table>table see original document page 62</column></row><table>Em primeiro lugar, a linhagem de SW-1 foi cultivada com agitaçãopor uma noite em 5 ml de meio de fermentação de ácido láctico em tubo deensaio (antes do cultivo prévio preliminar). O cultivo resultante foi inoculado em100 ml de meio de fermentação de ácido láctico novo e cultivado com agitaçãopor 24 horas a 30 0C em frasco Sakaguchi de 500 ml (cultivo prévio preliminar).
O cultivo prévio preliminar foi inoculado em 1,5 I de meio de fermentação deácido láctico no aparelho de fermentação contínua do tipo de separação demembrana exibido na Fig. 1, tanque de reação 1 foi agitado com agitador a elefixado, seguido pela regulagem de aeração, controle de temperatura e ajustede pH do tanque de reação 1 e, sem operar bomba de circulação de líquido defermentação 10, o microorganismo foi cultivado por 24 horas (cultivo prévio).Imediatamente após o término do cultivo prévio, a bomba de circulação delíquido de fermentação 10 foi operada e o microorganismo foi cultivadocontinuamente sob as condições em que, além das condições de operação nomomento do cultivo prévio, tanque de separação de membrana 2 foi aerado,meio de fermentação de ácido láctico foi alimentado continuamente e aquantidade de água de permeação de membrana foi regulada de tal forma quea quantidade do líquido de fermentação no aparelho de fermentação contínuado tipo separação de membrana tornou-se 2 L, por meio do quê ácido L-lácticofoi produzido por meio de fermentação contínua. Neste teste de fermentaçãocontínua, a quantidade de água de permeação de membrana foi regulada ealterada sob as condições de controle de água de permeação de membranadescritas acima, durante o quê a diferença de cabeça d'água foi medida comoa diferença de pressão transmembrana com aparelho de regulagem dediferença de cabeça d'água 3. A concentração de ácido L-láctico produzida nolíquido de fermentação de permeação de membrana e a concentração deglicose residual foram medidas em momento apropriado.
Os resultados no teste de fermentação contínua por trezentashoras são exibidos na Tabela 2. A produção d© ácido L-láctico por meio defermentação contínua estável foi viável por meio do método de fabricação deproduto químico de acordo com a presente invenção utilizando o aparelho defermentação contínua do tipo de separação de membrana da Fig. 1. Adiferença de pressão transmembrana variou dentro de 2 kPa em todo o períodode fermentação contínua.
Exemplo 2
Produção de Ácido L-Láctico por Meio de Fermentação ContínuaUtilizando Levedura (N0 2)
O mesmo teste de fermentação contínua de ácido L-láctico doExemplo 1 foi conduzido utilizando a membrana porosa do Exemplo deReferência 3 como membrana de separação. Os resultados são exibidos naTabela 2. Como resultado, tornou-se viável a produção estável de ácido L-láctico por meio de fermentação contínua. A diferença de pressãotransmembrana variou dentro de 2 kPa em todo o período de fermentaçãocontínua.
Exemplo 3
Produção de Ácido L-Lãctico por Meio de Fermentação ContínuaUtilizando Levedura iNo 3)
O mesmo teste de fermentação contínua de ácido L-láctico doExemplo 1 foi conduzido utilizando a membrana porosa do Exemplo deReferência 4 como membrana de separação. Os resultados são exibidos naTabela 2. Como resultado, tornou-se viável a produção estável de ácido L-lácticopor meio de fermentação contínua. A diferença de pressão transmembranavariou dentro de 2 kPa em todo o período de fermentação contínua.
Exemplo 4
Produção de Ácido L-Lãctico por Meio de Fermentação ContínuaUtilizando Levedura (N0 4)A produção de ácido L-láctico foi conduzida utilizando o aparelhode fermentação contínua da Fig. 2 e meio de fermentação de levedura quepossui a composição exibida na Tabela 1. O meio foi utilizado após esterilizaçãoa vapor em alta pressão (121 0C1 quinze minutos). Como material de elementode membrana de separação, utilizou-se moldagem de resina de polissulfona eaço inoxidável. Como membrana de separação, foi utilizada a membrana porosapreparada no Exemplo de Referência 1. A menos que indicado em contrário, ascondições de operação deste exemplo são as seguintes:
Capacidade de tanque de reação: 2 (L)
Membrana de separação utilizada: membrana de filtragem defluoreto de polivinilideno
Área de filtragem eficaz do elemento de separação de membrana:120 cm2
Controle de temperatura: 30 (0C)
Aeração do tanque de reação de fermentação: 0,05 (l/min)
Velocidade de alimentação do meio de fermentação de ácidoláctico: controle variável na faixa de 50 a 300 ml/h.
Velocidade de agitação do tanque de reação de fermentação: 800(rpm)
Ajuste de pH: ajustado em pH 5 com 1 N NaOH
Regulagem da quantidade de água de permeação da membrana:regulagem da velocidade de fluxo por diferença de pressão transmembrana(do início da fermentação contínua até 80 horas: regulada em 0,1kPa ou mais a 5 kPa ou menos;
- 80 horas a 160 horas: regulada em 0,1 kPa ou mais a 2kPa ou menos; e
160 horas a 240 horas: regulada em 0,1 kPa ou mais a 20kPa ou menos).Esterilização: o tanque de cultivo, incluindo o elemento demembrana de separação, e o meio utilizado, foram esterilizados com vapor sobalta pressão em autoclave a 121 °C por vinte minutos.
A levedura SW-1 criada no Exemplo de Referência 1 foi utilizadacomo microorganismo, meio de fermentação de ácido láctico que possui acomposição exibida na Tabela 1 foi utilizada como meio, a concentração deácido L-láctico na forma de produto foi avaliada por meio de HPLC exibida noExemplo de Referência 1 e a concentração de glicose foi medida com Teste deGlicose Wako C (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.).
Em primeiro lugar, a linhagem de SW-1 foi cultivada com agitaçãopor uma noite em 5 ml de meio de fermentação de ácido láctico em tubo deensaio (antes do cultivo prévio preliminar). O cultivo resultante foi inoculado em100 ml de meio de fermentação de ácido láctico novo e cultivado com agitaçãopor 24 horas a 30 °C em frasco Sakaguchi de 500 ml (cultivo prévio preliminar).O cultivo prévio preliminar foi inoculado em 1,5 I de meio de fermentação deácido láctico no aparelho de fermentação contínua do tipo de separação demembrana exibido na Fig. 2, tanque de reação 1 foi agitado a 400 rpm comagitador 5 a ele fixado, seguido pela regulagem de aeração, controle detemperatura e ajuste de pH do tanque de reação 1 e o microorganismo foicultivado por 24 horas (cultivo prévio). Imediatamente após o término do cultivoprévio, o microorganismo foi cultivado continuamente com meio defermentação de ácido láctico alimentado continuamente e com a quantidade deágua de permeação de membrana regulada de tal forma que a quantidade dolíquido de fermentação no aparelho de fermentação contínua do tipo deseparação de membrana tornou-se 1,5 I, por meio do quê foi produzido ácido L-láctico por meio de fermentação contínua. Neste teste de fermentaçãocontínua, a quantidade de água de permeação de membrana foi regulada ealterada sob as condições de controle de água de permeação de membranadescritas acima, durante o quê a diferença de cabeça d'água foi medida comoa diferença de pressão transmembrana com aparelho de regulagem dediferença de cabeça d'água 3. A concentração de ácido L-láctico produzida nolíquido de fermentação de permeação de membrana e a concentração deglicose residual foi medida em momento apropriado. O rendimento de ácido L-láctico em açúcar e a velocidade de produção de ácido L-láctico calculada apartir do ácido L-láctico e glicose introduzida calculada a partir da concentraçãode glicose são exibidos na Tabela 2.
Como resultado do teste de fermentação por 240 horas, produçãoestável de ácido L-láctico por meio de fermentação contínua foi viável por meiodo método de fabricação de produto químico de acordo com a presenteinvenção utilizando o aparelho de fermentação contínua da Fig. 2. A diferençade pressão transmembrana variou dentro de 2 kPa em todo o período defermentação contínua.
Exemplo 5
Produção de Ácido L-Láctico por Meio de Fermentação ContínuaUtilizando Levedura (N0 5)
O mesmo teste de fermentação contínua de ácido L-láctico doExemplo 4 foi conduzido utilizando a membrana porosa preparada no Exemplode Referência 3 como membrana de separação. Os resultados são exibidos naTabela 2. Como resultado, tornou-se viável a produção estável de ácido L-lácticopor meio de fermentação contínua. A diferença de pressão transmembranavariou dentro de 2 kPa em todo o período de fermentação contínua.
Exemplo 6
Produção de Ácido L-Lãctico por Meio de Fermentação ContínuaUtilizando Levedura (N0 6i
O mesmo teste de fermentação contínua de ácido L-láctico doExemplo 5 foi conduzido utilizando a membrana porosa preparada no Exemplode Referência 4 como membrana de separação. Os resultados são exibidos naTabela 2. Como resultado, tornou-se viável a produção estável de ácido L-lácticopor meio de fermentação contínua. A diferença de pressão transmembranavariou dentro de 2 kPa em todo o período de fermentação contínua.
Exemplo Comparativo 1
Produção de Ácido L-Láctico por Meio de Fermentação em bateladas
Como forma de fermentação utilizando microorganismo, a maiorparte da fermentação em bateladas típica foi conduzida para avaliar a suaprodutividade de ácido L-láctico. Foi conduzido teste de fermentação embateladas, em que foi utilizado o meio de fermentação de ácido láctico exibidona Tabela 1 e foi utilizado o tanque de reação 1 somente do aparelho defermentação contínua do tipo de separação de membrana da Fig. 1. O meio foiutilizado após esterilização a vapor em alta pressão (121 °C, quinze minutos). Alevedura SW-1 criada no Exemplo de Referência 1 também foi utilizada comomicroorganismo neste exemplo comparativo, a concentração de ácido L-lácticona forma de produto foi avaliada por meio de HPLC exibida no Exemplo deReferência 1 e a concentração de glicose foi medida com Teste de GlicoseWako C (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). As condições de operação doExemplo Comparativo 2 são as seguintes:
Capacidade do tanque de reação (quantidade do meio defermentação de ácido láctico): 1 (L)
Controle de temperatura: 30 (0C)
Aeração do tanque de reação: 0.05 (I/min)
Velocidade de agitação do tanque de reação: 100 (rpm)
Ajuste de pH: ajustado em pH 5 com 1 N NaOH
Em primeiro lugar, a linhagem de SW-1 foi cultivada com agitaçãopor uma noite em 5 ml de meio de fermentação de ácido láctico em tubo deensaio (cultivo prévio preliminar). O cultivo prévio preliminar foi inoculado em100 ml de meio de fermentação de ácido láctico novo e cultivado com agitaçãopor 24 horas em frasco Sakaguchi de 500 ml (cultivo prévio). O cultivo préviofoi inoculado em 1,5 I de meio de fermentação de ácido láctico em aparelho defermentação contínua do tipo de separação de membrana, tanque de reação 1foi agitado a 100 rpm com agitador 5 a ele fixado e o tanque de reação 1 foiaerado. Foram conduzidos ajuste de temperatura e ajuste de pH e, sem operarbomba de circulação de líquido de fermentação 10, foi conduzido cultivo defermentação em bateladas. A quantidade dos microorganismos cultivadosneste cultivo foi de 14 em termos de absorção a 600 nm. Os resultados defermentação em bateladas são exibidos na Tabela 2.
Tabela 2
<table>table see original document page 69</column></row><table>
A velocidade de produção de ácido L-láctico foi significativamenteaprimorada pelo método de fabricação de produto químico de acordo com apresente invenção utilizando o aparelho de fermentação exibido nas Figs. 1 e 2.
Exemplo Comparativo 2
Produção de Ácido L-Láctico por Meio de Fermentação ContínuaUtilizando Levedura
Fermentação contínua foi conduzida da mesma forma que no
Exemplo 1, exceto pelo fato de que a membrana porosa que possui pequenodiâmetro de poro e baixo coeficiente de permeabilidade a água purificada,preparada no Exemplo de Referência 5, foi utilizada como membrana deseparação e a quantidade de água que penetrou através da membrana foiregulada por meio de regulagem da velocidade de fluxo com diferença depressão transmembrana (regulada na faixa de 0,1 ou mais a 20 kPa ou menosem todo o período de fermentação contínua).
Como resultado, a diferença de pressão transmembrana excedeukPa em 96 horas após o início do cultivo, para causar a obstrução damembrana e, desta forma, foi suspensa a fermentação contínua.
Conseqüentemente, revelou-se que a membrana porosa preparada noExemplo de Referência 5 não é apropriada para a produção de ácido L-láctico.
Exemplo Comparativo 3Produção de Ácido L-Láctico por Meio de Fermentação Contínua
Utilizando Levedura
Fermentação contínua foi conduzida da mesma forma que noExemplo 4, exceto pelo fato de que a membrana porosa que possui pequenodiâmetro de poro e baixo coeficiente de permeabilidade a água purificada,preparada no Exemplo de Referência 5, foi utilizada como membrana deseparação e a quantidade de água que penetrou através da membrana foiregulada por meio de regulagem da velocidade de fluxo com diferença depressão transmembrana (regulada na faixa de 0,1 ou mais a 20 kPa ou menosem todo o período de fermentação contínua).Como resultado, a diferença de pressão transmembrana excedeu20 kPa em 80 horas após o início do cultivo, para causar a obstrução damembrana e, desta forma, foi suspensa a fermentação contínua.
Conseqüentemente, revelou-se que a membrana porosa preparada noExemplo de Referência 5 não é apropriada para a produção de ácido L-láctico.
Exemplo 7
Produção de Etanol por Meio de Fermentação Contínua fN° 1)
A produção de etanol foi conduzida utilizando o aparelho defermentação contínua do tipo separação de membrana da Fig. 1 e meio defermentação de etanol que possui a composição exibida na Tabela 3. O meiofoi utilizado após esterilização a vapor em alta pressão (121 0C1 quinzeminutos). Como membrana de separação, foi utilizada a membrana porosapreparada no Exemplo de Referência 2. A menos que indicado em contrário, ascondições de operação deste exemplo são as seguintes:
Capacidade de tanque de reação: 2 (L)
Capacidade do tanque de separação de membrana: 0,5 (L)
Membrana de separação utilizada: membrana de filtragem defluoreto de polivinilideno
Área de filtragem eficaz do elemento de separação de membrana:120 cm2
Controle de temperatura: 30 (0C)Aeração do tanque de reação: 0.05 (l/min)Aeração do tanque de separação de membrana: 0.3 (l/min)Velocidade de agitação do tanque de reação: 100 (rpm)Ajuste de pH: ajustado em pH 5 com 1 N NaOH
Velocidade de alimentação do meio de fermentação de etanol:controle variável na faixa de 50 a 300 ml/h.
Quantidade de líquido em circulação com aparelho de circulaçãode líquido de fermentação: 0,1 (l/min)
Regulagem da quantidade de água de permeação da membrana:regulagem da velocidade de fluxo por diferença de pressão transmembrana(do início da fermentação contínua até 100 horas: regulada em0,1 kPa ou mais a 5 kPa ou menos;
100 horas a 200 horas: regulada em 0,1 kPa ou mais a 2kPa ou menos; e
200 horas a 300 horas: regulada em 0,1 kPa ou mais a 20kPa ou menos).
Linhagem NBRC10505 foi utilizada como microorganismo, meiode fermentação de etanol que possui a composição exibida na Tabela 1 foiutilizado como meio e a concentração de etanol como produto foi quantificadapor meio de cromatografia de gás para avaliação. Em cromatografia de gás,utilizou-se Shimadzu GC-2010 capilar GC TC-1 (GL Science) 15 metros decomprimento χ 0,53 mm de diâmetro interno, df 1,5 μιη, e detector de chama dehidrogênio (FID) na detecção e cálculo. A concentração de glicose foi medidacom Teste de Glicose Wako C (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.).
Tabela 3
<table>table see original document page 72</column></row><table>Em primeiro lugar, a linhagem de NBRC10505 foi cultivada comagitação por uma noite em 5 ml de meio de fermentação de etanol em tubo deensaio (antes do cultivo prévio preliminar). O cultivo resultante foi inoculado em100 ml de meio de fermentação de etanol novo e cultivado com agitação por 24horas a 30 0C em frasco Sakaguchi de 500 ml (cultivo prévio preliminar). Ocultivo prévio preliminar foi inoculado em 1,5 I de meio de fermentação deetanol no aparelho de fermentação contínua do tipo de separação demembrana exibido na Fig. 1, tanque de reação 1 foi agitado a 100 rpm comagitador 5 a ele fixado, seguido pela regulagem de aeração, controle detemperatura e ajuste de pH do tanque de reação 1 e, sem operar bomba decirculação de líquido de fermentação 10, o microorganismo foi cultivado por 24horas (cultivo prévio). Imediatamente após o término do cultivo prévio, a bombade circulação de líquido de fermentação 10 foi operada e o microorganismo foicultivado continuamente sob as condições em que, além das condições deoperação no momento do cultivo prévio, tanque de separação de membrana 2foi aerado, meio de fermentação de etanol foi alimentado continuamente e aquantidade de água de permeação de membrana foi regulada de tal forma quea quantidade do líquido de fermentação no aparelho de fermentação contínuado tipo separação de membrana tornou-se 2 L, por meio do quê etanol foiproduzido por fermentação contínua. Neste teste de fermentação contínua, aquantidade de água de permeação de membrana foi regulada e alterada sob ascondições de controle de água de permeação de membrana descritas acima,durante o quê a diferença de cabeça d'água foi medida como a diferença depressão transmembrana com aparelho de regulagem de diferença de cabeçad'água 3. A concentração de etanol produzida no líquido de fermentação depermeação de membrana e a concentração de glicose residual foram medidasem momento apropriado. Os resultados são exibidos na Tabela 4.
A produção estável de etanol por meio de fermentação contínuado tipo separação de membrana foi viável por meio do método de fabricação deproduto químico de acordo com a presente invenção utilizando o aparelho defermentação contínua da Fig. 1. A diferença de pressão transmembrana varioudentro de 2 kPa em todo o período de fermentação contínua.
Exemplo 8
Produção de Etanol por Meio de Fermentação Contínua (N0 2)
A produção de etanol foi conduzida utilizando o aparelho defermentação contínua da Fig. 2 e meio de fermentação de etanol que possui acomposição exibida na Tabela 3. O meio foi utilizado após esterilização a vaporem alta pressão (121 0C1 quinze minutos). Como material de elemento demembrana de separação, utilizou-se moídagem de resina de polissulfona e açoinoxidável. Como membrana de separação, foi utilizada a membrana porosapreparada no Exemplo de Referência 2. A menos que indicado em contrário, ascondições de operação deste exemplo são as seguintes:
Capacidade de tanque de reação: 2 (L)
Membrana de separação utilizada: membrana de filtragem defluoreto de polivinilideno
Área de filtragem eficaz do elemento de separação de membrana:120 cm2
Controle de temperatura: 30 (0C)
Aeração do tanque de reação de fermentação: 0,05 (l/min)Velocidade de alimentação do meio de fermentação de ácidoláctico: controle variável na faixa de 50 a 300 ml/h.
Velocidade de agitação do tanque de reação de fermentação: 800(rpm)
Ajuste de pH: ajustado em pH 5 com 1 N NaOHRegulagem da quantidade de água de permeação da membrana:regulagem da velocidade de fluxo por diferença de pressão transmembrana(do início da fermentação contínua até 80 horas: regulada em 0,1kPa ou mais a 5 kPa ou menos;
80 horas a 160 horas: regulada em 0,1 kPa ou mais a 2kPa ou menos; e
160 horas a 240 horas: regulada em 0,1 kPa ou mais a 20kPa ou menos).
Esterilização: o tanque de cultivo, incluindo o elemento demembrana de separação, e o meio utilizado, foram esterilizados com vapor sobalta pressão em autoclave a 121 0C por vinte minutos.
Levedura NBRC10505 foi utilizada como microorganismo, meiode fermentação de etanol que possui a composição exibida na Tabela 2 foiutilizado como meio, a concentração de etanol na forma de produto foi avaliadapor meio de cromatografia de gás exibida no Exemplo 7 e a concentração deglicose foi medida com Teste de Glicose Wako C (Wako Pure ChemicalIndustries, Ltd.).
Em primeiro lugar, a linhagem NBRC10505 foi cultivada comagitação por uma noite em 5 ml de meio de fermentação de etanol em tubo deensaio (antes do cultivo prévio preliminar). O cultivo resultante foi inoculado em100 ml de meio de fermentação de etanol novo e cultivado com agitação por 24horas a 30 0C em frasco Sakaguchi de 500 ml (cultivo prévio preliminar). Ocultivo prévio preliminar foi inoculado em 1,5 I de meio de fermentação deetanol no aparelho de fermentação contínua do tipo de separação demembrana exibido na Fig. 2, tanque de reação 1 foi agitado a 400 rpm comagitador 5 a ele fixado, seguido pela regulagem de aeração, controle detemperatura e ajuste de pH do tanque de reação 1 e o microorganismo foicultivado por 24 horas (cultivo prévio). Imediatamente após o término do cultivoprévio, o microorganismo foi cultivado continuamente em meio de fermentaçãode etanol alimentado continuamente e com a quantidade de água depermeação de membrana regulada de tal forma que a quantidade do líquido defermentação no aparelho de fermentação contínua do tipo de separação demembrana tornou-se 1,5 I, por meio do quê foi produzido etanol porfermentação contínua. Neste teste de fermentação contínua, a quantidade deágua de permeação de membrana foi regulada e alterada sob as condições decontrole de água de permeação de membrana descritas acima, durante o quê adiferença de cabeça d'água foi medida como a diferença de pressãotransmembrana com aparelho de regulagem de diferença de cabeça d'água 3.
A concentração de etanol produzida no líquido de fermentação de permeaçãode membrana e a concentração de glicose residual foram medidas emmomento apropriado. O rendimento de etanol em açúcar e a velocidade deprodução de etanol calculada a partir do etanol e glicose introduzida calculadaa partir da concentração de glicose são exibidos na Tabela 4.
A produção estável de etanol por meio de fermentação contínuafoi viável por meio do método de fabricação de produto químico de acordo coma presente invenção utilizando o aparelho de fermentação contínua da Fig. 2. Adiferença de pressão transmembrana variou dentro de 2 kPa em todo o períodode fermentação contínua.
Exemplo Comparativo 4
Produção de Etanol por Meio de Fermentação em bateladas
Como forma de fermentação utilizando microorganismo, a maiorparte da fermentação em bateladas típica foi conduzida para avaliar a suaprodutividade de etanol. Foi conduzido teste de fermentação em bateladas, emque foi utilizado o meio de fermentação de etanol exibido na Tabela 3 e otanque de reação 1 somente do aparelho de fermentação contínua do tipo deseparação de membrana da Fig. 1. O meio foi utilizado após esterilização avapor em alta pressão (121 0C, quinze minutos). Levedura NBRC10505também foi utilizada como microorganismo neste exemplo comparativo, aconcentração de etanol na forma de produto foi avaliada por meio decromatografia de gás exibida no Exemplo 6 e a concentração de glicose foimedida com Teste de Glicose Wako C (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.).
As condições de operação deste exemplo comparativo são as seguintes:
Capacidade do tanque de reação (quantidade do meio defermentação de etanol): 1 (L)Controle de temperatura: 30 (0C)Aeração do tanque de reação: 0,05 (l/min)Velocidade de agitação do tanque de reação: 100 (rpm)Ajuste de pH: ajustado em pH 5 com 1 N NaOH
Em primeiro lugar, a linhagem NBRC10505 foi cultivada comagitação por uma noite em 5 ml de meio de fermentação de etanol em tubo deensaio (cultivo prévio preliminar). O cultivo prévio preliminar foi inoculado em100 ml de meio de fermentação de etanol novo e cultivado com agitação por 24horas em frasco Sakaguchi de 500 ml (cultivo prévio). O cultivo prévio foiinoculado em 1,5 I de meio de fermentação de etanol no aparelho defermentação contínuo do tipo de separação de membrana, tanque de reação 1foi agitado a 100 rpm com agitador 5 a ele fixado e o tanque de reação 1 foiaerado. Foram conduzidos ajuste de temperatura e ajuste de pH e, sem operarbomba de circulação de líquido de fermentação 10, foi conduzido cultivo defermentação em bateladas. A quantidade dos microorganismos cultivadosneste cultivo foi de 18 em termos de absorção a 600 nm. Os resultados defermentação em bateladas são exibidos na Tabela 4.
Tabela 4
<table>table see original document page 77</column></row><table><table>table see original document page 78</column></row><table>
A velocidade de produção de etanol foi significativamenteaprimorada pelo método de fabricação de produto químico de acordo com apresente invenção utilizando o aparelho de fermentação exibido nas Figs. 1 e 2.
Exemplo 9
Produção de Ácido Pirúvico por Meio de Fermentação Contínua (N01)
A produção de ácido pirúvico foi conduzida utilizando o aparelhode fermentação contínua do tipo separação de membrana da Fig. 1 e meio defermentação de ácido pirúvico que possui a composição exibida na Tabela 5. Omeio foi utilizado após esterilização a vapor em alta pressão (121 0C1 quinzeminutos). Como membrana de separação, foi utilizada a membrana porosapreparada no Exemplo de Referência 2. A menos que indicado em contrário, ascondições de operação deste exemplo são as seguintes:
Capacidade do tanque de reação de fermentação: 2 (L)
Membrana de separação utilizada: membrana de filtragem defluoreto de polivinilideno
Área de filtragem eficaz do elemento de separação de membrana:120 cm2
Controle de temperatura: 30 (0C)Aeração do tanque de reação de fermentação: 1,5 (l/min)Velocidade de agitação do tanque de reação de fermentação: 800
(rpm)
Ajuste de pH: ajustado em pH 5,5 com 4 N NaOHEsterilização: o tanque de cultivo, incluindo o elemento demembrana de separação, e o meio utilizado, foram esterilizados sob altapressão em autoclave a 121 °C por vinte minutos.
Regulagem da quantidade de água de permeação da membrana:regulagem da velocidade de fluxo por diferença de pressão transmembrana(do início da fermentação contínua até 100 horas: regulada em0,1 kPa ou mais a 5 kPa ou menos;
100 horas a 180 horas: regulada em 0,1 kPa ou mais a 2kPa ou menos; e
180 horas a 264 horas: regulada em 0,1 kPa ou mais a 20kPa ou menos).
Linhagem P120-5a de Torulopsis glabrata (FERM P-16745) foiutilizada como microorganismo, meio de fermentação de ácido pirúvico quepossui a composição exibida na Tabela 5 foi utilizado como meio e aconcentração de ácido pirúvico como produto foi avaliada por meio de HPLCsob as condições a seguir:
Coluna: Shim-Pack SPR-H (fabricada pela Shimadzu Corporation)Fase móvel: 5 mM de ácido p-toluenossulfônico (velocidade defluxo de 0,8 ml/min)
Solução de reação: 5 mM de ácido p-toluenossulfônico, 20 mM de Bis-Tris, 0,1mM de EDTA-2Na Na (velocidade de fluxo de 0,8 ml/min)Método de detecção: condutividade elétricaTemperatura: 45 °C
A concentração de glicose foi medida com Teste de Glicose WakoC (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.).
Tabela 5
Meio de Fermentação de Ácido Pirúvico
<table>table see original document page 80</column></row><table>
Em primeiro lugar, a linhagem de P120-5a foi cultivada comagitação por uma noite em 5 ml de meio de fermentação de ácido pirúvico emtubo de ensaio (antes do cultivo prévio preliminar). O cultivo resultante foiinoculado em 100 ml de meio de fermentação de ácido pirúvico novo ecultivado com agitação por 24 horas a 30 0C em frasco Sakaguchi de 500 ml(cultivo prévio preliminar). O cultivo prévio preliminar foi inoculado em 1,5 I demeio de fermentação de ácido pirúvico no aparelho de fermentação contínuado tipo de separação de membrana exibido na Fig. 1, tanque de reação defermentação 1 foi agitado a 800 rpm com agitador 5 a ele fixado, seguido pelaregulagem de aeração, controle de temperatura e ajuste de pH do tanque dereação de fermentação 1 e o microorganismo foi cultivado por 24 horas (cultivoprévio). Imediatamente após o término do cultivo prévio, a bomba de circulaçãode líquido de fermentação 10 foi operada e o microorganismo foi cultivadocontinuamente sob as condições em que, além das condições de operação nomomento do cultivo prévio, tanque de separação de membrana 2 foi aerado,meio de fermentação de ácido pirúvico foi alimentado continuamente e aquantidade de água de permeação de membrana foi regulada de tal forma quea quantidade do líquido de fermentação no aparelho de fermentação contínuado tipo separação de membrana tornou-se 2 L1 por meio do quê ácido pirúvicofoi produzido por meio de fermentação contínua. Neste teste de fermentaçãocontínua, a quantidade de água de permeação de membrana foi regulada ealterada sob as condições de controle de água de permeação de membranadescritas acima, durante o quê a diferença de cabeça d'água foi medida comoa diferença de pressão transmembrana com aparelho de regulagem dediferença de cabeça d'água 3. A concentração de ácido pirúvico produzida nolíquido de fermentação de permeação de membrana e a concentração deglicose residual foram medidas em momento apropriado. Os resultados noteste de fermentação contínua por trezentas horas são exibidos na Tabela 6.
A produção estável de ácido pirúvico por meio de fermentaçãocontínua estável foi viável por meio do método de fabricação de produtoquímico de acordo com a presente invenção utilizando o aparelho defermentação contínua do tipo de separação de membrana da Fig. 1. Adiferença de pressão transmembrana variou dentro de 2 kPa em todo o períodode fermentação contínua.
Exemplo 10
Produção de Ácido Pirúvico por Meio de Fermentação Contínua (N° 2)
A produção de ácido pirúvico foi conduzida utilizando o aparelhode fermentação contínua da Fig. 2 e meio de fermentação de ácido pirúvicoque possui a composição exibida na Tabela 5. O meio foi utilizado apósesterilização a vapor em alta pressão (121 0C, quinze minutos). Como materialde elemento de membrana de separação, utilizou-se moldagem de resina depolissulfona e aço inoxidável. Como membrana de separação, foi utilizada amembrana porosa preparada no Exemplo de Referência 2. A menos queindicado em contrário, as condições de operação deste exemplo são asseguintes:
Capacidade de tanque de reação: 2 (L)
Membrana de separação utilizada: membrana de filtragem defluoreto de polivinilideno
Área de filtragem eficaz do elemento de separação de membrana:120 cm2
Controle de temperatura: 30 (0C)
Aeração do tanque de reação de fermentação: 1 (l/min)
Velocidade de alimentação do meio de fermentação de ácidoláctico: controle variável na faixa de 50 a 300 ml/h.
Velocidade de agitação do tanque de reação de fermentação: 800(rpm)
Ajuste de pH: ajustado em pH 5,5 com 4 N NaOH
Regulagem da quantidade de água de permeação da membrana:regulagem da velocidade de fluxo por diferença de pressão transmembrana
(do início da fermentação contínua até 100 horas: regulada em0,1 kPa ou mais a 5 kPa ou menos;
- 100 horas a 180 horas: regulada em 0,1 kPa ou mais a 2kPa ou menos; e
180 horas a 264 horas: regulada em 0,1 kPa ou mais a 20kPa ou menos).
Esterilização: o tanque de cultivo, incluindo o elemento demembrana de separação, e o meio utilizado, foram esterilizados com vapor sobalta pressão em autoclave a 121 0C por vinte minutos.
Linhagem de Torulopsis glabrata P120-5a (FERM P-16745) foiutilizada como microorganismo, meio de fermentação de ácido pirúvico quepossui a composição exibida na Tabela 5 foi utilizado como meio e aconcentração de ácido pirúvico como produto foi avaliada por meio de HPLCsob as condições a seguir:
Em primeiro lugar, a linhagem de P120-5a foi cultivada comagitação por uma noite em 5 ml de meio de fermentação de ácido pirúvico emtubo de ensaio (antes do cultivo prévio preliminar). O cultivo resultante foiinoculado em 100 ml de meio de fermentação de ácido pirúvico novo ecultivado com agitação por 24 horas a 30 0C em frasco Sakaguchi de 500 ml(cultivo prévio preliminar). O cultivo prévio preliminar foi inoculado em 1,5 I demeio de fermentação de ácido láctico no aparelho de fermentação contínua dotipo de separação de membrana exibido na Fig. 2, tanque de reação 1 foiagitado a 800 rpm com agitador 5 a ele fixado, seguido pela regulagem deaeração, controle de temperatura e ajuste de pH do tanque de reação 1 e omicroorganismo foi cultivado por 24 horas (cultivo prévio). Imediatamente apóso término do cultivo prévio, meio de fermentação de ácido pirúvico foialimentado continuamente e o microorganismo foi cultivado continuamente coma quantidade de água de permeação de membrana regulada de tal forma que aquantidade do líquido de fermentação no aparelho de fermentação contínua dotipo de separação de membrana tornou-se 1,5 I, por meio do quê foi produzidoácido pirúvico por meio de fermentação contínua. Neste teste de fermentaçãocontínua, a quantidade de água de permeação de membrana foi regulada ealterada sob as condições de controle de água de permeação de membranadescritas acima, durante o quê a diferença de cabeça d'água foi medida comoa diferença de pressão transmembrana com aparelho de regulagem dediferença de cabeça d'água 3. A concentração de ácido pirúvico produzida nolíquido de fermentação de permeação de membrana e a concentração deglicose residual foram medidas em momento apropriado. O rendimento deácido láctico com relação a açúcar e a velocidade de produção de ácido lácticocalculada a partir do ácido pirúvico e glicose introduzida calculada a partir daconcentração de glicose são exibidos na Tabela 6.
Como resultado do teste de fermentação por 300 horas, produçãoestável de ácido pirúvico por meio de fermentação contínua foi viável por meiodo método de fabricação de produto químico de acordo com a presenteinvenção utilizando o aparelho de fermentação contínua da Fig. 2. A diferençade pressão transmembrana variou dentro de 2 kPa em todo o período defermentação contínua.
Exemplo 11
Produção de Ácido Pirúvico por Meio de Fermentação Contínua (N0 3)
Foi utilizado o aparelho de fermentação contínua do tiposeparação de membrana da Fig. 1, linhagem NBRC0005 foi utilizada comomicroorganismo e todas as demais condições foram idênticas ao Exemplo 9.
Os resultados de fermentação contínua são exibidos na Tabela 6. Comoresultado do teste de fermentação por 300 horas, produção estável de ácidopirúvico por fermentação contínua foi viável por meio do método de fabricaçãode produto químico de acordo com a presente invenção utilizando o aparelhode fermentação contínua do tipo de separação de membrana da Fig. 1. Adiferença de pressão transmembrana variou dentro de 2 kPa em todo o períodode fermentação contínua.
Exemplo 12
Produção de Ácido Pirúvico por Meio de Fermentação Contínua ÍN° 4)
Foi utilizado o aparelho de fermentação contínua da Fig. 2,linhagem NBRC0005 foi utilizada como microorganismo e todas as demaiscondições foram idênticas ao Exemplo 10. Os resultados de fermentaçãocontínua são exibidos na Tabela 6. Como resultado do teste de fermentaçãopor 300 horas, produção estável de ácido pirúvico por fermentação contínua foiviável por meio do método de fabricação de produto químico de acordo com apresente invenção utilizando o aparelho de fermentação contínua da Fig. 2. Adiferença de pressão transmembrana variou dentro de 2 kPa em todo o períodode fermentação contínua.
Exemplo Comparativo 5
Produção de Ácido Pirúvico por Meio de Fermentação em batelapas (N01)
Como forma de fermentação utilizando microorganismo, a maiorparte da fermentação em bateladas típica foi conduzida em fermentador dejarra de dois litros para avaliar a sua produtividade de ácido pirúvico. Comomeio, foi utilizado o meio exibido na Tabela 5 após esterilização a vapor emalta pressão (121 °C quinze minutos). Linhagem P120-5a foi utilizada comomicroorganismo neste exemplo comparativo, a concentração de ácido pirúvicona forma de produto foi avaliada por meio de HPLC exibida no Exemplo 9 e aconcentração de glicose foi medida com Teste de Glicose Wako C (Wako PureChemical Industries, Ltd.). As condições de operação deste exemplocomparativo são as seguintes:
Capacidade do tanque de reação de fermentação (quantidade domeio de fermentação de ácido pirúvico): 1 (L)
Controle de temperatura: 30 (°C)
Aeração do tanque de reação de fermentação: 1 (l/min)
Velocidade de agitação do tanque de reação de fermentação: 600(rpm)
Ajuste de pH: ajustado em pH 5,5 com 4 N NaOH
Em primeiro lugar, a linhagem P120-5a foi cultivada com agitaçãopor uma noite em 5 ml de meio de fermentação de ácido pirúvico em tubo deensaio (cultivo prévio preliminar). O cultivo prévio preliminar foi inoculado em50 ml de meio de fermentação de ácido pirúvico novo e cultivado com agitaçãopor 24 horas em frasco Sakaguchi de 500 ml (cultivo prévio). O cultivo préviofoi inoculado em um litro de meio de fermentação de ácido pirúvico emfermentador de jarra e submetido a fermentação em bateladas. Os resultadosde fermentação em bateladas são exibidos na Tabela 6.
Exemplo Comparativo 6
Produção de Ácido Pirúvico por Meio de Fermentação em bateladas (N0 2)Como forma de fermentação utilizando microorganismo, a maiorparte da fermentação em bateladas típica foi conduzida em fermentador dejarra de dois litros para avaliar a sua produtividade de ácido pirúvico. Nesteexemplo comparativo, linhagem NBRC0005 foi utilizada como microorganismoe todas as demais condições foram idênticas ao Exemplo Comparativo 3. Osresultados de fermentação em bateladas são exibidos na Tabela 6.
Tabela 6
<table>table see original document page 86</column></row><table>
A velocidade de produção de ácido pirúvico foi significativamente
aprimorada pelo método de fabricação de produto químico de acordo com apresente invenção utilizando o aparelho de fermentação exibido nas Figs. 1 e2.
Exemplo 13
Produção de Ácido Succínico por Meio de Fermentação Contínua (N01)A produção de ácido succínico foi conduzida utilizando o aparelhode fermentação contínua do tipo separação de membrana da Fig. 1.
A menos que indicado em contrário, ácido succínico e glicose naprodução de ácido succínico foram medidos por meio do método a seguir.
Ácido succínico em sobrenadante centrifugado de cultivo foi analisado por meiode HPLC (Shimadzu LC10A1 monitor de RI: RID-10A, coluna: Aminex HPX-87H). A temperatura da coluna era de 50 0C1 a coluna foi equilibrada com 0, 01N H2SO4 e amostra foi injetada em seguida na coluna e analisada por meio deeluição com 0, 01 H2SO4. Glicose foi medida por sensor de glicose (BF-4, OjiScientific Instruments).
O meio foi utilizado após esterilização a vapor em alta pressão (1210C1 quinze minutos). Como membrana de separação, foi utilizada a membranaporosa preparada no Exemplo de Referência 2. A menos que indicado emcontrário, as condições de operação deste exemplo são as seguintes:
Capacidade de tanque de reação: 2 (L)Capacidade do tanque de separação de membrana: 0,5 (L)Membrana de separação utilizada: membrana de filtragem defluoreto de polivinilideno
Área de filtragem eficaz do elemento de separação de membrana:60 cm2
Controle de temperatura: 39 (0C)
Aeração de CO2 do tanque de reação: 10 (ml/min)
Aeração de CO2 do tanque de separação de membrana: 1 00(ml/min)
Velocidade de agitação do tanque de reação: 100 (rpm)
Ajuste de pH: ajustado em pH 6,4 com 2 M Na2CO3Velocidade de alimentação do meio de fermentação de ácidoláctico: controle variável na faixa de 50 a 300 ml/h.Quantidade de líquido em circulação com aparelho de circulaçãode líquido de fermentação: 0,1 (l/min)
Regulagem da quantidade de água de permeação da membrana:regulagem da velocidade de fluxo por diferença de pressão transmembrana(do início da fermentação contínua até 100 horas: regulada em0,1 kPa ou mais a 5 kPa ou menos;
100 horas a 200 horas: regulada em 0,1 kPa ou mais a 2kPa ou menos; e
200 horas a 264 horas: regulada em 0,1 kPa ou mais a 20kPa ou menos).
Neste exemplo, foi conduzida a produção contínua de ácidosuccínico por Anaerobiospirillum succiniciproducens ATCC 53488 comomicroorganismo que possui capacidade de produção de ácido succínico. 100ml de meio de cultivo de semente que consiste de 20 g/l de glicose, 10 g/l depolipeptona, 5 g/l de extrato de levedura, 3g/l de K2HPO4, 1 g/l de NaCI, 1 g/Lde (NH4)2SO4, 0,2 g/l de MgCI2 e 0,2 g/l de CaCI2-2H20 foram introduzidos emfrasco Erlenmeyer de 125 ml e esterilizados por meio de aquecimento. Emporta-luvas anaeróbico, adicionou-se 1 ml de 30 mM Na2CO3 e 0,15 ml of 180mM H2SO4 e foram adicionalmente agregados 0,5 ml de solução reduzida queconsiste de 0,25 g/l de cisteína-HCI e 0,25 g/L de Na2S. Em seguida, linhagemATCC53488 foi inoculada no meio e mantida em cultivo estacionário a 39 0Cpor uma noite (cultivo prévio preliminar). 5 ml de solução reduzida que consistede 0,25 g/l de cisteína-HCI e 0,25 g/l de Na2S QH2O foram adicionados a 1,5 Ide meio de fermentação de ácido succínico (Tabela 7) no aparelho defermentação contínua do tipo separação de membrana exibido na Fig. 1 e 50ml do cultivo prévio preliminar foram inoculados. Tanque de reação defermentação 1 foi agitado a 200 rpm com agitador 5 a ele fixado, seguido pelaregulagem de aeração de CO2, controle de temperatura e ajuste de pH dotanque de reação de fermentação 1 e o microorganismo foi cultivado por 24horas (cultivo prévio).
Tabela 7
Meio de Fermentação de Ácido Succínico
<table>table see original document page 89</column></row><table>Imediatamente após o término do cultivo prévio, meio defermentação de ácido succínico foi alimentado continuamente e omicroorganismo foi cultivado continuamente enquanto a quantidade de água depermeação de membrana foi regulada de tal forma que a quantidade do líquidode fermentação no aparelho de fermentação contínua do tipo de separação demembrana tornou-se 2 I1 por meio do quê foi produzido ácido succínico porfermentação contínua. A quantidade de água de permeação de membrana noteste de fermentação contínua foi regulada por meio de alteração adequada dadiferença de cabeça d'água, de tal forma que a diferença de cabeça d'água dotanque de reação de fermentação fosse de até 2 m, ou seja, a diferença depressão transmembrana foi de 0,1 ou mais a 20 kPa ou menos. A concentraçãode ácido succínico produzida no líquido de fermentação de permeação demembrana e a concentração de glicose residual foram medidas em momentoapropriado. A velocidade de produção de ácido succínico e o rendimento deácido succínico, calculados a partir da concentração de ácido succínico e deglicose, são exibidos na Tabela 8. A diferença de pressão transmembranavariou dentro de 2 kPa em todo o período de fermentação contínua.
Exemplo 14
Produção de Ácido Succínico por Meio de Fermentação Contínua (N0 2)
A produção de ácido succínico foi conduzida utilizando o aparelhode fermentação contínua da Fig. 2. O meio foi utilizado após esterilização avapor em alta pressão (121 0C, quinze minutos). As concentrações de ácidosuccínico e glicose foram medidas da mesma forma que no Exemplo 13. Comomembrana de separação, foi utilizada a membrana porosa preparada noExemplo de Referência 2. A menos que indicado em contrário, as condições deoperação deste exemplo são as seguintes:
Capacidade de tanque de reação: 2 (L)
Membrana de separação utilizada: membrana de filtragem defluoreto de polivinilideno
Área de filtragem eficaz do elemento de separação de membrana:120 cm2
Controle de temperatura: 39 (°C)
Aeração de CO2 do tanque de reação de fermentação: 10 (ml/min)
Velocidade de alimentação do meio de fermentação de ácidoláctico: controle variável na faixa de 50 a 300 ml/h.
Velocidade de agitação do tanque de reação de fermentação: 600(rpm)
Ajuste de pH: ajustado em pH 6,4 com 2 M Na2CO3
Regulagem da quantidade de água de permeação da membrana:regulagem da velocidade de fluxo por diferença de pressão transmembrana(do início da fermentação contínua até 80 horas: regulada em 0,1kPa ou mais a 5 kPa ou menos;
- 80 horas a 160 horas: regulada em 0,1 kPa ou mais a 2kPa ou menos; e
160 horas a 280 horas: regulada em 0,1 kPa ou mais a 20kPa ou menos).
Esterilização: o tanque de cultivo, incluindo o elemento demembrana de separação, e o meio utilizado, foram esterilizados com vapor sobalta pressão em autoclave a 121°C por vinte minutos.
Neste exemplo, foi conduzida a produção contínua de ácidosuccínico por linhagem de Anaerobiospirillum succiniciproducens ATCC53488 como microorganismo que possui capacidade de produção de ácidosuccínico. 100 ml de meio de cultivo de semente que consiste de 20 g/l deglicose, 10 g/l de polipeptona, 5 g/l de extrato de levedura, 3g/L de K2HPO4, 1g/l de NaCI1 1 g/L de (NH4)2SO4, 0,2 g/l de MgCI2 e 0,2 g/l de CaCI2-2H20foram introduzidos em frasco Erlenmeyer de 125 ml e esterilizados por meiode aquecimento. Em porta-luvas anaeróbico, adicionou-se 1 ml de 30 mMNa2CO3 e 0,15 ml de 180 mM H2SO4 e foram adicionalmente agregados 0,5ml de solução reduzida que consiste de 0,25 g/l de cisteína-HCI e 0,25 g/L deNa2S. Em seguida, linhagem ATCC53488 foi inoculada no meio e mantida emcultivo estacionário a 39 0C por uma noite (cultivo prévio preliminar). 5 ml desolução reduzida que consiste de 0,25 g/l de cisteína-HCI e 0,25 g/l deNa2S-9H20 foram adicionados a 1,5 I de meio de fermentação de ácidosuccínico (Tabela 7) no aparelho de fermentação contínua exibido na Fig. 2 e50 ml do cultivo prévio preliminar foram inoculados. Tanque de reação defermentação 1 foi agitado a 600 rpm com agitador 5 a ele conectado, seguidopela regulagem de aeração de CO2, controle de temperatura e ajuste de pHdo tanque de reação de fermentação 1 e o microorganismo foi cultivado por24 horas (cultivo prévio).
Imediatamente após o término do cultivo prévio, meio defermentação de ácido succínico foi alimentado continuamente e omicroorganismo foi cultivado continuamente enquanto a quantidade de água depermeação de membrana regulada de tal forma que a quantidade do líquido defermentação no aparelho de fermentação contínua do tipo de separação demembrana tornou-se 1,5 I, por meio do quê foi produzido ácido succínico porfermentação contínua. A quantidade de água de permeação de membrana noteste de fermentação contínua foi regulada por meio de alteração adequada dadiferença de cabeça d'água com aparelho de regulagem da diferença decabeça d'água 3, de tal forma que a cabeça d'água do tanque de reação defermentação fosse de até 2 m, ou seja, a diferença de pressão transmembranafoi de 0,1 a 20 kPa. A concentração de ácido succínico produzida no líquido defermentação de permeação de membrana e a concentração de glicose residualforam medidas em momento apropriado. A velocidade de produção de ácidosuccínico e o rendimento de ácido succínico, calculados a partir daconcentração de ácido succínico e de glicose, são exibidos na Tabela 8. Adiferença de pressão transmembrana variou dentro de 2 kPa em todo o períodode fermentação contínua.
Exemplo Comparativo 7
Produção de Ácido Succínico por Meio de Fermentação em bateladas
A produção de ácido succínico por meio de fermentação embateladas de Anaerobiospirillum succiniciproducens foi conduzida conformesegue.
100 ml de meio de cultivo de semente que consiste de 20 g/l deglicose, 10 g/l de polipeptona, 5 g/l de extrato de levedura, 3 g/L de K2HPO4, 1g/l de NaCI1 1 g/L de (NH4)2SO4, 0,2 g/l de MgCI2 e 0,2 g/l de CaCI2-2H20 foramintroduzidos em frasco Erlenmeyer de 125 ml e esterilizados por meio deaquecimento. Em porta-luvas anaeróbico, adicionou-se 1 ml de 30 mM Na2CO3e 0,15 ml de 180 mM H2SO4 e foram adicionalmente agregados 0,5 ml desolução reduzida que consiste de 0,25 g/l de cisteína-HCI e 0,25 g/L de Na2S.
Em seguida, linhagem Anaerobiospirillum succiniciproducens ATCC53488 foiinoculada no meio e mantida em cultivo estacionário a 39 0C por uma noite. Umlitro de meio de fermentação exibido na Tabela 7 foi adicionado a fermentadorde mini-jarra (2 I1 tipo BMJ1 fabricado pela ABLE) e esterilizado por meio deaquecimento (120 0C, vinte minutos).
Gás CO2 foi introduzido sob velocidade de 10 ml/min comaspersor, adicionou-se 10 ml de solução de 3 M Na2CO3 e o pH foi ajustadoem 6,8 com solução de ácido sulfúrico. Adicionou-se 5 ml de soluçãoreduzida que consiste de 0,25 g/l de cisteína-HCI e 0.25 g/l de Na2S-9H20 e50 ml do cultivo de semente foram inoculados no meio e cultivados sobvelocidade de agitação de 200 rpm sob temperatura de 39 0C enquanto o pHera ajustado em 6,4 com solução de 2 M Na2CO3. Os resultados sãoexibidos na Tabela 8.Tabela 8
<table>table see original document page 94</column></row><table>
A velocidade de produção de ácido succínico foisignificativamente aprimorada pelo método de fabricação de produto químicode acordo com a presente invenção utilizando o aparelho de fermentaçãoexibido nas Figs. 1 e 2.
Exemplo 15
Produção de Ácido Succínico por Meio de Fermentação Contínua (N0 3)
A produção de ácido succínico foi conduzida utilizando o aparelhode fermentação contínua do tipo separação de membrana da Fig. 1. Asconcentrações de ácido succínico e glicose foram medidas da mesma formaque no Exemplo 13. O meio foi utilizado após esterilização a vapor em altapressão (121°C quinze minutos). Como membrana de separação, foi utilizadaa membrana porosa preparada no Exemplo de Referência 2. As condições deoperação neste exemplo são idênticas ao Exemplo 13, exceto pela regulagemda quantidade de água de permeação de membrana a seguir.
Regulagem da quantidade de água de permeação da membrana:regulagem da velocidade de fluxo por diferença de pressão transmembrana(do início da fermentação contínua até 100 horas: regulada em0,1 kPa ou mais a 5 kPa ou menos;100 horas a 200 horas: regulada em 0,1 kPa ou mais a 2kPa ou menos; e
200 horas a 254 horas: regulada em 0,1 kPa ou mais a 20kPa ou menos).
Neste exemplo, foi conduzida a produção contínua de ácidosuccínico por linhagem de Anaerobiospirillum succiniciproducens ATCC 53488como microorganismo que possui capacidade de produção de ácido succínico.75 ml_ de meio de fermentação de ácido succínico para Actinobacillus exibidona Tabela 9 e 4,0 g de MgCO3 foram adicionados a tubo de ensaio de 100 mlde soro, seguidos pela substituição do gás no tubo por CO2 e esterilização sobaquecimento. 7,5 ml de suspensão bacteriana da linhagem ATCC55618 foraminoculados e cultivados a 37 0C por 24 horas para preparar cultivo de semente(cultivo prévio preliminar).
Tabela 9
<table>table see original document page 95</column></row><table><table>table see original document page 96</column></row><table>
O aparelho de fermentação contínua do tipo separação demembrana exibido na Fig. 1 foi carregado com 1,5 I de meio de fermentação deácido succínico (Tabela 9) e 75 ml do cultivo prévio preliminar foraminoculados. O microorganismo foi cultivado continuamente da mesma formaque no Exemplo 13, exceto pelo fato de que a aeração de CO2 no banho dereação de fermentação 1 foi de 75 ml/min, a aeração de CO2 no tanque demembrana de separação foi de 150 ml/min, a temperatura foi de 39 0C e o pHfoi ajustado em 6, 8 com 5,5 M NaCO3. A concentração de ácido succínicoproduzida no líquido de fermentação de permeação de membrana e aconcentração de glicose residual foram medidas em momento apropriado. Avelocidade de produção de ácido succínico e o rendimento de ácido succínico,calculados a partir da concentração de ácido succínico e de glicose, sãoexibidos na Tabela 10. A diferença de pressão transmembrana variou dentro de2 kPa em todo o período de fermentação contínua.Exemplo 16
Produção de Ácido Succínico por Meio de Fermentação Contínua (N0 4)
A produção de ácido succínico foi conduzida utilizando o aparelhode fermentação contínua da Fig. 2. O meio foi utilizado após esterilização avapor em alta pressão (121 0C1 quinze minutos). As concentrações de ácidosuccínico e glicose foram medidas da mesma forma que no Exemplo 13. Comomembrana de separação, foi utilizada a membrana porosa preparada noExemplo de Referência 2. As condições de operação neste exemplo sãoidênticas ao Exemplo 14, exceto pela regulagem da quantidade de água depermeação de membrana a seguir.
Regulagem da quantidade de água de permeação da membrana:regulagem da velocidade de fluxo por diferença de pressão transmembrana
(do início da fermentação contínua até 100 horas: regulada em0,1 kPa ou mais a 5 kPa ou menos;
- 100 horas a 200 horas: regulada em 0,1 kPa ou mais a 2kPa ou menos; e
200 horas a 280 horas: regulada em 0,1 kPa ou mais a 20kPa ou menos).
Neste exemplo, foi conduzida a produção contínua de ácidosuccínico por linhagem de Actinobacillus succinogenes ATCC 55618 comomicroorganismo que possui capacidade de produção de ácido succínico. Ocultivo contínuo foi conduzido da mesma forma que no Exemplo 14, excetopelo fato de que, na produção contínua de ácido succínico por Actinobacillussuccinogenes, a aeração de CO2 no banho de reação de fermentação foi de 75ml/min e o pH foi ajustado em 6,8 com 5,5 M de NaC03.
Em primeiro lugar, 75 mL de meio de fermentação de ácidosuccínico para Actinobacillus exibido na Tabela 9 e 4,0 g de MgCO3 foramadicionados a tubo de ensaio de 100 ml de soro, seguidos pela substituição dogás no tubo por CO2 e esterilização sob aquecimento. 7,5 ml de suspensãobacteriana da linhagem ATCC55618 armazenados anteriormente em estadocongelado foram inoculados no meio e cultivados a 37 0C por 24 horas parapreparar cultivo de semente (cultivo prévio preliminar). O aparelho defermentação contínua exibido na Fig. 2 foi carregado com 1,5 I de meio defermentação de ácido succínico (Tabela 7) e 75 ml do cultivo prévio preliminarforam inoculados no meio e cultivados por 24 horas com pH mantido em 6,8(cultivo prévio). Após o término do cultivo prévio, o meio de fermentação deácido succínico da Tabela 9 foi alimentado continuamente e a quantidade deágua de permeação de membrana foi regulada de forma que a quantidade dolíquido de fermentação no aparelho de fermentação contínua do tipo deseparação da Fig. 2 se tornasse 1,5 I, por meio do quê ácido pirúvico foiproduzido por fermentação contínua. A concentração de ácido pirúvicoproduzida no líquido de fermentação de permeação de membrana e aconcentração de glicose residual foram medidas em momento apropriado. Avelocidade de produção de ácido succínico e o rendimento de ácido succínico,calculados a partir da concentração de ácido succínico e de glicose, sãoexibidos na Tabela 10. A diferença de pressão transmembrana variou dentro de2 kPa em todo o período de fermentação contínua.
Exemplo Comparativo 8
Produção de Ácido Succínico por Meio de Fermentação Contínua (N0 2)
A produção de ácido succínico por Actinobacillus succinogenes foiconduzida conforme segue.
50 ml de meio de fermentação de ácido succínico paraActinobacillus exibido na Tabela 9 e 4,0 g de MgCO3 foram adicionados a tubode ensaio de 100 ml de soro, seguidos pela substituição do gás no tubo porCO2 e esterilização sob aquecimento. 5 ml de suspensão bacteriana deActinobacillus succinofenes ATCC 55618 anteriormente criopreservada foraminoculados no meio e cultivados a 37 °C por 24 horas para preparar cultivo desemente. Um litro de meio de fermentação exibido na Tabela 9 foi ajustado empH 6,8 e adicionado a fermentador de mini-jarra (2 I, tipo BMJ1 fabricado pelaABLE) e esterilizado por meio de aquecimento (120 0C1 vinte minutos). GásCO2 foi introduzido em velocidade de 50 ml/min com aspersor e a temperaturafoi regulada em 39 0C. 50 ml do cultivo de semente àcima foram inoculados nomeio e cultivados mediante agitação a 600 rpm com lâmina de agitação fixadaa ele enquanto o pH era ajustado em 6, 8 com 5, 5 M de NaCO3. Os resultadossão exibidos na Tabela 10.
Tabela 10
<table>table see original document page 99</column></row><table>
A velocidade de produção de ácido succínico foisignificativamente aprimorada pelo método de fabricação de produto químicode acordo com a presente invenção utilizando os aparelhos de fermentaçãoexibidos nas Figs. 1 e 2.
Exemplo 17
Produção Contínua de Ácido Succínico por Meio de Fermentação Contínua(N° 5)
A produção de ácido succínico foi conduzida utilizando o aparelhode fermentação contínua do tipo separação de membrana da Fig. 1. Asconcentrações de ácido succínico e glicose foram medidas da mesma formaque no Exemplo 13. O meio foi utilizado após esterilização a vapor em altapressão (121 0C1 quinze minutos). Como membrana de separação, foi utilizadaa membrana porosa preparada no Exemplo de Referência 2. As condições deoperação neste exemplo são idênticas ao Exemplo 13, exceto pela regulagemda quantidade de água de permeação de membrana a seguir.
Regulagem da quantidade de água de permeação da membrana:
regulagem da velocidade de fluxo por diferença de pressão transmembrana(do início da fermentação contínua até 80 horas: regulada em 0,1kPa ou mais a 5 kPa ou menos;
80 horas a 140 horas: regulada em 0,1 kPa ou mais a 2kPa ou menos; e
140 horas a 200 horas: regulada em 0,1 kPa ou mais a 20kPa ou menos).
Neste exemplo, foi conduzida a produção contínua de ácidosuccínico por linhagem de Escherichia coli B ATCC 11303 comomicroorganismo que possui capacidade de produção de ácido succínico. 150ml de meio de cultivo de semente que consiste de 12 g/l de glicose, 10 g/l depolipeptona, 5 g/l de extrato de levedura, 1 g/L de K2HPO4, 1 g/l de NaCI e 0,2g/l de MgCI2 foram introduzidos em frasco Erlenmeyer de 200 ml e ajustadosem pH 6, 8. Após a adição de 7,5 g de MgCO3, o meio foi esterilizado por meiode aquecimento e resfriado à temperatura ambiente e, em porta-luvasanaeróbica, linhagem ATCC 11303 foi inoculada no meio e mantida em cultivoestacionário por uma noite a 37 0C (cultivo prévio preliminar). O aparelho defermentação contínua exibido na Fig. 1 foi carregado com 1,5 I de meio defermentação de ácido succínico que consiste de 12 g/l de glicose, 10 g/l depolipeptona, 5 g/l de extrato de levedura, 1 g/l de K2HPO4, 1 g/l de NaCI e 0,2g/l de MgCI2 e 150 ml do cultivo prévio preliminar foi inoculado no meio. Afermentação contínua de ácido succínico foi conduzida sob as mesmascondições do Exemplo 13, exceto pelo fato de que a temperatura defermentação foi de 37 0C.
Após cultivo prévio por 24 horas, o microorganismo foi cultivadocontinuamente enquanto o meio de fermentação de ácido succínico exibido naTabela 11 era alimentado continuamente e a quantidade de água depermeação de membrana foi regulada de forma que a quantidade do líquido defermentação no aparelho de fermentação contínua se tornasse 2 I.
Tabela 11
Meio de Fermentação de Ácido Succínico
<table>table see original document page 101</column></row><table>
A concentração de ácido succínico produzida no líquido defermentação de permeação de membrana e a concentração de glicose residualforam medidas em momento apropriado. A velocidade de produção de ácidosuccínico e o rendimento de ácido succínico, calculados a partir daconcentração de ácido succínico e de glicose, são exibidos na Tabela 12. Adiferença de pressão transmembrana variou dentro de 2 kPa em todo o períodode fermentação contínua.
Exemplo 18
Produção Contínua de Ácido Succínico por Meio de Fermentação Contínua(N° 6)
A produção de ácido succínico foi conduzida utilizando o aparelhode fermentação contínua da Fig. 2. O meio foi utilizado após esterilização avapor em alta pressão (121 0C, quinze minutos). As concentrações de ácidosuccínico e glicose foram medidas da mesma forma que no Exemplo 13. Comomembrana de separação, foi utilizada a membrana porosa preparada noExemplo de Referência 2. As condições de operação neste exemplo sãoidênticas ao Exemplo 14, exceto pela regulagem da quantidade de água depermeação de membrana a seguir.
Regulagem da quantidade de água de permeação da membrana:regulagem da velocidade de fluxo por diferença de pressão transmembrana
(do início da fermentação contínua até 80 horas: regulada em 0,1kPa ou mais a 5 kPa ou menos;
80 horas a 120 horas: regulada em 0,1 kPa ou mais a 2kPa ou menos; e
120 horas a 180 horas: regulada em 0,1 kPa ou mais a 20kPa ou menos).
Neste exemplo, foi conduzida a produção contínua de ácidosuccínico por linhagem de Escherichia coli B ATCC 11303 comomicroorganismo que possui capacidade de produção de ácido succínico. 150ml de meio de cultivo de semente que consiste de 12 g/l de glicose, 10 g/l depolipeptona, 5 g/l de extrato de levedura, 1 g/L de K2HPO4, 1 g/l de NaCI e 0,2g/l de MgCI2 foram introduzidos em frasco Erlenmeyer de 200 ml e ajustadosem pH 6,8. Após a adição de 7,5 g de MgCO3, o meio foi esterilizado por meiode aquecimento e resfriado à temperatura ambiente e linhagem ATCC 11303foi inoculada no meio e mantida em cultivo estacionário por uma noite a 37 0C(cultivo prévio preliminar). O aparelho de fermentação contínua exibido na Fig.2 foi carregado com 1,5 I de meio de fermentação de ácido succínico queconsiste de 12 g/l de glicose, 10 g/l de polipeptona, 5 g/l de extrato de levedura,1 g/L de K2HPO4, 1 g/l de NaCI e 0,2 g/l de MgCI2 e 150 ml do cultivo préviopreliminar foram inoculados no meio. O microorganismo foi cultivado por 24horas sob temperatura de 37 0C enquanto o pH era ajustado em 6,8 com 5,5 Mde NaCO3 (cultivo prévio). Após o término do cultivo prévio, o microorganismofoi cultivado enquanto o meio de fermentação de ácido succínico exibido naTabela 11 era alimentado continuamente e a quantidade de água depermeação de membrana foi regulada de forma que a quantidade do líquido defermentação no aparelho de fermentação contínua se tornasse 1,5 I. Avelocidade de produção de ácido succínico e o rendimento de ácido succínico,calculados a partir da concentração de ácido succínico e de glicose, sãoexibidos na Tabela 12. A diferença de pressão transmembrana variou dentro de2 kPa em todo o período de fermentação contínua.
Exemplo Comparativo 9
Produção de Ácido Succínico por Meio de Fermentação em Bateladas (N° 3)
A produção de ácido succínico por meio de fermentação embateladas de Escherichia coli foi conduzida conforme segue.
100 ml de meio de cultivo de semente que consiste de 12 g/l deglicose, 10 g/l de polipeptona, 5 g/l de extrato de levedura, 1 g/L de K2HPO4, 1g/l de NaCI e 0,2 g/l de MgCI2 foram introduzidos em frasco Erlenmeyer de1250 ml e ajustados em pH 6,8. Após a adição de 5 g de MgCO3, o meio foiesterilizado por meio de aquecimento e resfriado à temperatura ambiente e, emporta-luvas anaeróbico, linhagem de Escherichia coli B ATCC 11303 foiinoculada no meio e mantida em cultivo estacionário por uma noite a 37°C. Umlitro de meio de fermentação que consiste de 12 g/l de glicose, 10 g/l depolipeptona, 5 g/l de extrato de levedura, 1 g/l de K2HPO4, 1 g/l de NaCI e 0,2g/l de MgCI2 foram ajustados em pH 6,8, adicionados a fermentador de mini-jarra (2 I, tipo BMJ, fabricado pela ABLE) e esterilizado por meio deaquecimento (120°C, vinte minutos). Gás CO2 foi introduzido em velocidade de50 ml/min com aspersor e a temperatura foi regulada em 37°C. 100 ml docultivo de semente acima foram inoculados no meio e cultivados medianteagitação a 600 rpm com lâmina de agitação fixada a ele enquanto o pH eraajustado em 6,8 com 5,5 M de NaCO3. O cultivo foi conduzido enquanto 200 mlde solução de 100 g/l de glicose eram adicionados pouco a pouco, de formaque a concentração de glicose no cultivo não excedesse 20 g/l. Os resultadossão exibidos na Tabela 12.
Tabela 12
<table>table see original document page 104</column></row><table>
A velocidade de produção de ácido succínico foisignificativamente aprimorada pelo método de fabricação de produto químicode acordo com a presente invenção utilizando os aparelhos de fermentaçãoexibidos nas Figs. 1 e 2.
Exemplo 19
Produção de 1.3-Propanodiol por Meio de Fermentação Contínua (N01)
A produção de 1,3-propandiol foi conduzida utilizando o aparelhode fermentação contínua do tipo separação de membrana da Fig. 1 e meio deprodução de 1,3-propanodiol com a composição exibida na Tabela 13.
Em primeiro lugar, é descrito o método de isolamento, identificação e mediçãode 1,3-propanodiol como produto.
A conversão de glicerol em 1,3-propanodiol foi confirmada pormeio de HPLC. Esta análise foi conduzida utilizando métodos padrão emateriais disponíveis para os técnicos no campo da técnica de cromatografia.Em método apropriado, foi utilizado sistema HPLC Waters Maxima 820utilizando detecção de Rl e UV (210 nm). Amostra recebeu injeção emvelocidade de fluxo de 0,5 ml/min em coluna Shodex SH-1011 (8 mm χ 300mm, adquirida da Waters, Milford MA) regulada em temperatura de 50 0C eequipada com coluna prévia Shodex SH-1011 P (6 mm χ 50 mm) com 0,01 NH2SO4 como fase móvel. Quando a análise quantitativa estava por serconduzida, ácido trimetilacético de quantidade conhecida foi utilizado comopadrão externo para preparar a amostra. Os tempos de retenção de glicose(detecção de RI), glicerol, 1,3-propanodiol (detecção de RI) e ácidotrimetilacético (detecção de Rl e UV) foram de cerca de 15 minutos, 20minutos, 26 minutos e 35 minutos, respectivamente.
A produção de 1,3-propanodiol foi confirmada por meio de GC/MS.Esta análise foi conduzida utilizando métodos padrão e materiais disponíveis paraos técnicos no campo da técnica de GC/MS. Utilizou-se, por exemplo, sistemacromatográfico de gás Hewlett Packard 5890 Série Il conectado a detector seletivode massa Hewlett Packard 5971 Série (El) e coluna HP-INNOWax (comprimentode 30 m, diâmetro interno de 0,25 mm, espessura de filme de 0,25 μίτι). O tempode retenção e espectro de massa de 1,3-propanodiol formado foram comparadoscom os de 1,3-propanodiol padrão (m/e: 57, 58).
Também foi conduzida a derivação de amostra. 30 μΙ de ácidoperclórico concentrado (70% v/v) foram adicionados a 1,0 ml de amostra (talcomo sobrenadante de cultivo). Após a mistura, a amostra foi liofilizada.Mistura 1:1 (300 μΙ) de bis(trimetilsilil)trifluoroacetamida:piridina foi adicionadaao material liofilizado, misturada vigorosamente em seguida e mantida a 65 0Cpor uma hora. A amostra foi tornada transparente por meio de remoção demateriais insolúveis por centrifugação. O líquido resultante foi separado emduas fases e a sua fase superior foi utilizada em análise. A amostra foisubmetida a cromatografia sobre coluna DB-5 (48 m, diâmetro interno de 0,25mm, espessura do filme de 0,25 μπι, da J&W Scientific) e o tempo de retençãoe espectro de massa do derivado de 1,3-propanodiol obtido a partir dosobrenadante de cultivo foram comparados com os obtidos da amostra padrão.O espectro de massa de 1,3-propanodiol derivado de TMS contém 205, 177,130 e 115 unidades de massa atômica (AMU) de íons característicos.
O meio foi utilizado após esterilização a vapor em alta pressão(121 0C, quinze minutos). Como material de elemento de membrana deseparação, utilizou-se moldagem de resina de polissulfona e aço inoxidável.
Como membrana de separação, foi utilizada a membrana porosa preparada noExemplo de Referência 2. A menos que indicado em contrário, as condições deoperação deste exemplo são as seguintes:
Capacidade de tanque de reação: 2 (L)
Membrana de separação utilizada: membrana de filtragem defluoreto de polivinilideno
Área de filtragem eficaz do elemento de separação de membrana:120 cm2
Controle de temperatura: 37 (0C)
Aeração do tanque de reação de fermentação: 0,6 (l/min) de gásnitrogênio
Velocidade de agitação do tanque de reação de fermentação: 800(rpm)
Ajuste de pH: ajustado em pH 7,0 com 5 N NaOH
Esterilização: o tanque de cultivo, incluindo o elemento demembrana de separação, e o meio utilizado, foram esterilizados com vapor sobalta pressão em autoclave a 121 0C por vinte minutos.
Regulagem da quantidade de água de permeação da membrana:regulagem da velocidade de fluxo por diferença de pressão transmembrana
(do início da fermentação contínua até 100 horas: regulada em0,1 kPa ou mais a 5 kPa ou menos;
100 horas a 200 horas: regulada em 0,1 kPa ou mais a 2kPa ou menos; e
200 horas a 320 horas: regulada em 0,1 kPa ou mais a 20kPa ou menos).
Linhagem ATCC 25955 de Klebsiella pneumoniae foi utilizada comomicroorganismo, meio de fermentação de 1,3-propanodiol que possui a composiçãoexibida na Tabela 13 foi utilizado como meio e a concentração de 1,3-propanodiolcomo produto foi avaliada por meio do método de HPLC descrito acima.
A concentração de glicose foi medida com Teste de Glicose WakoC (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.).
Tabela 13
Meio de Fermentação de 1.3-Propanodiol
<table>table see original document page 107</column></row><table>Em primeiro lugar, a linhagem Klebsiella pneumoniae ATCC25955 foi cultivada com agitação por uma noite em 5 ml de meio de produçãode 1,3-propanodiol em tubo de ensaio (antes do cultivo prévio preliminar). Ocultivo resultante foi inoculado em 50 ml de meio de produção de 1,3-propanodiol novo e cultivado com agitação por 24 horas a 30 0C em frascoSakaguchi de 500 ml (cultivo prévio preliminar). O cultivo prévio preliminar foiinoculado em 1,5 I de meio de fermentação de 1,3-propanodiol no aparelho defermentação contínua do tipo de separação de membrana exibido na Fig. 1,tanque de reação de fermentação 1 foi agitado a 800 rpm com agitador 5 a elefixado, seguido pela regulagem de aeração, controle de temperatura e ajustede pH do tanque de reação 1 e o microorganismo foi cultivado por 24 horas(cultivo prévio). Imediatamente após o término de cultivo prévio, a bomba decirculação de líquido de fermentação e o microorganismo foi cultivadocontinuamente sob as condições em que, além das condições de operação nomomento do cultivo prévio, tanque de separação de membrana 2 foi aerado,meio de produção de 1,3-propanodiol (concentração de glicerol: 100 g/l) foialimentado continuamente e a quantidade de água de permeação demembrana foi regulada de forma que a quantidade do líquido de fermentaçãono aparelho de fermentação contínua se tornasse 1,5 I, por meio do quê 1,3-propanodiol foi produzido por fermentação contínua. Neste teste defermentação contínua, a quantidade de água de permeação de membrana foiregulada e alterada sob as condições de controle de água de permeação demembrana descritas acima, durante o quê a diferença de cabeça d'água foimedida como a diferença de pressão transmembrana com aparelho deregulagem de diferença de cabeça d'água 3. A concentração de 1,3-propanodiol produzida no líquido de fermentação de permeação de membranae a concentração de glicose residual foram medidas em momento apropriado.
A velocidade de produção de 1,3-propanodiol calculada a partir do 1,3-propanodiol e glicerol introduzido é exibida na Tabela 14.
Como resultado do teste de fermentação por 320 horas,produção estável de 1,3-propanodiol por fermentação contínua foi viável pormeio do método de fabricação de produto químico de acordo com a presenteinvenção utilizando o aparelho de fermentação contínua do tipo deseparação de membrana exibido na Fig. 1. A diferença de pressãotransmembrana variou dentro de 2 kPa em todo o período de fermentaçãocontínua.
Exemplo 20
Produção de 1.3-Propanodiol por Meio de Fermentação Contínua (N0 2)
A produção de 1,3-propanodiol foi conduzida utilizando o aparelhode fermentação contínua da Fig. 2 e meio de produção de 1,3-propanodiol coma composição exibida na Tabela 13.
O meio foi utilizado após esterilização a vapor em alta pressão(121 0C1 quinze minutos). Como material de elemento de membrana deseparação, utilizou-se moldagem de resina de polissulfona e aço inoxidável.Como membrana de separação, foi utilizada a membrana porosa preparada noExemplo de Referência 2. A menos que indicado em contrário, as condições deoperação deste exemplo são as seguintes:
Capacidade do tanque de reação de fermentação: 2 (L)
Membrana de separação utilizada: membrana de filtragem defluoreto de polivinilideno
Área de filtragem eficaz do elemento de separação de membrana:120 cm2
Controle de temperatura: 37 (°C)
Aeração do tanque de reação de fermentação: 0,6 (l/min) de gásnitrogênio
Velocidade de agitação do tanque de reação de fermentação: 800(rpm)
Ajuste de pH: ajustado em pH 7,0 com 5 N NaOH
Esterilização: o tanque de cultivo, incluindo o elemento demembrana de separação, e o meio utilizado, foram esterilizados com vapor sobalta pressão em autoclave a 121 0C por vinte minutos.
Regulagem da quantidade de água de permeação da membrana:regulagem da velocidade de fluxo por diferença de pressão transmembrana(do início da fermentação contínua até 100 horas: regulada em0,1 kPa ou mais a 5 kPa ou menos;
100 horas a 200 horas: regulada em 0,1 kPa ou mais a 2kPa ou menos; e
200 horas a 264 horas: regulada em 0,1 kPa ou mais a 20kPa ou menos).
Linhagem ATCC 25955 de Klebsiella pneumoniae foi utilizadacomo microorganismo, meio de produção de 1,3-propanodiol que possui acomposição exibida na Tabela 9 foi utilizado como meio e a concentração de1,3-propanodiol como produto foi medida por meio do método de HPLCdescrito acima. A concentração de glicose foi medida com Teste de GlicoseWako C (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.).
Em primeiro lugar, a linhagem Klebsiella pneumoniae ATCC25955 foi cultivada com agitação por uma noite em 5 ml de meio de produçãode 1,3-propanodiol em tubo de ensaio (antes do cultivo prévio preliminar). Ocultivo resultante foi inoculado em 50 ml de meio de produção de 1,3-propanodiol novo e cultivado com agitação por 24 horas a 30 0C em frascoSakaguchi de 500 ml (cultivo prévio preliminar). O cultivo prévio preliminar foiinoculado em 1,5 I de meio de fermentação de 1,3-propanodiol no aparelho defermentação contínua do tipo de separação de membrana exibido na Fig. 2,tanque de reação de fermentação 1 foi agitado a 800 rpm com agitador 5 a elefixado, seguido pela regulagem de aeração, controle de temperatura e ajustede pH do tanque de reação de fermentação 1 e o microorganismo foi cultivadopor 24 horas (cultivo prévio). Imediatamente após o término do cultivo prévio, omicroorganismo foi cultivado continuamente em que meio de produção de 1,3-propanodiol (concentração de glicerol: 100 g/l) foi alimentado continuamente ea quantidade de água de permeação de membrana foi regulada de forma que aquantidade do líquido de fermentação no aparelho de fermentação contínuaintegrada por membrana se tornasse 1,5 I, por meio do quê 1,3-propanodiol foiproduzido por fermentação contínua. Neste teste de fermentação contínua, aquantidade de água de permeação de membrana foi regulada e alterada sob ascondições de controle de água de permeação de membrana descritas acima,durante o quê a diferença de cabeça d'água foi medida como a diferença depressão transmembrana com aparelho de regulagem de diferença de cabeçad'água 3. A concentração de 1,3-propanodiol produzida no líquido defermentação de permeação de membrana e a concentração de glicose residualforam medidas em momento apropriado. A velocidade de produção de 1,3-propanodiol calculada a partir do 1,3-propanodiol medido e glicerol introduzidoé exibida na Tabela 14. Como resultado do teste de fermentação por 264horas, produção estável de 1,3-propanodiol por fermentação contínua foi viávelpor meio do método de fabricação de produto químico de acordo com apresente invenção utilizando o aparelho de fermentação contínua da Fig. 2. Adiferença de pressão transmembrana variou dentro de 2 kPa em todo o períodode fermentação contínua.
E xemplo Comparativo 10Produção de 1.3-Propanepiol por Meio de Fermentação em Bateladas
Alimentadas
Como forma de fermentação utilizando microorganismo, a maiorparte da fermentação em bateladas típica foi conduzida em fermentador dejarra de dois litros para avaliar a sua produtividade de 1,3-propanodiol. O meiofoi utilizado após esterilização a vapor em alta pressão (121 0C1 quinzeminutos). Linhagem de Klebsiella pneumoniae ATCC 25955 foi utilizada comomicroorganismo neste exemplo comparativo, a concentração de 1,3-propanodiol na forma de produto foi avaliada por meio de HPLC e aconcentração de glicose foi medida com Teste de Glicose Wako C (Wako PureChemical Industries, Ltd.). As condições de operação do Exemplo Comparativo10 são as seguintes:
Capacidade do tanque de reação (quantidade do meio deprodução de 1,3-propanodiol): 1,0 (L)
Controle de temperatura: 37 (0C)
Aeração do tanque de reação de fermentação: 0,4 (l/min) de gásnitrogênio
Velocidade de agitação do tanque de reação de fermentação: 300(rpm)
Ajuste de pH: ajustado em pH 7,0 com 5 N NaOH
Em primeiro lugar, a linhagem Klebsiella pneumoniae ATCC25955 foi cultivada com agitação por uma noite em 5 ml de meio de produçãode 1,3-propanodiol em tubo de ensaio (cultivo prévio preliminar). O cultivoprévio preliminar foi inoculado em 50 ml de meio de produção de 1,3-propanodiol novo e cultivado com agitação por 24 horas em frasco Sakaguchide 500 ml (cultivo prévio). O cultivo prévio foi inoculado em 1,5 I de meio deprodução de 1,3-propanodiol em fermentador de jarra. O microorganismo foisubmetido a fermentação por bateladas alimentadas por meio de alimentaçãocontínua de meio de produção de 1,3-propanodiol (concentração de glicerol:500 g/l), de forma que a concentração de glicerol aumentasse de 0 g/l para 10g/l. Os resultados são exibidos na Tabela 14.
Tabela 14<table>table see original document page 113</column></row><table>
A velocidade de produção de 1,3-propoanodiol foisignificativamente aprimorada pelo método de fabricação de produto químicode acordo com a presente invenção utilizando os aparelhos de fermentaçãoexibidos nas Figs. 1 e 2.
Exemplo 21
Produção de Ácido Itacónico por Meio de Fermentação Contínua (N01)
A produção de ácido itacónico foi conduzida utilizando o aparelhode fermentação contínua do tipo separação de membrana da Fig. 1. Foiutilizado o meio que possui a composição exibida na Tabela 15 apósesterilização a vapor em alta pressão (121 0C1 quinze minutos). Como materialde elemento de membrana de separação, utilizou-se moldagem de resina depolissulfona e aço inoxidável. Como membrana de separação, foi utilizada amembrana porosa preparada no Exemplo de Referência 2. A menos queindicado em contrário, as condições de operação deste exemplo são asseguintes:
Capacidade do tanque de reação de fermentação: 2 (L)Membrana de separação utilizada: membrana de filtragem defluoreto de polivinilidenoÁrea de filtragem eficaz do elemento de separação de membrana:120 cm2
Controle de temperatura: 35 (0C)Aeração do tanque de reação de fermentação: 1.5 (l/min)
Velocidade de agitação do tanque de reação de fermentação: 200(rpm)
Esterilização: o tanque de cultivo, incluindo o elemento demembrana de separação, e o meio utilizado, foram esterilizados com vapor sobalta pressão em autoclave a 121 0C por vinte minutos.
Ajuste de pH: ajustado em pH 5 com 4 N NaOH
Regulagem da quantidade de água de permeação da membrana:regulagem da velocidade de fluxo por diferença de pressão transmembrana(do início da fermentação contínua até 100 horas: regulada em0,1 kPa ou mais a 5 kPa ou menos;
100 horas a 200 horas: regulada em 0,1 kPa ou mais a 2kPa ou menos; e
200 horas a 300 horas: regulada em 0,1 kPa ou mais a 20kPa ou menos).
Linhagem de Aspergillus terreus ATCC 10020 foi utilizada comomicroorganismo, meio de fermentação de ácido itacônico que possui acomposição exibida na Tabela 11 foi utilizado como meio, a concentração deácido itacônico na forma de produto foi medida por meio de método deKoppeshaar (Biseibutsu Kogaku Kouza (BactériaI Optics Coourse), Vol. 5,Kabino Riyou Kogyo (Use and Industry of Mold), págs. 72-73, publicado pelaKyoritsu Shuppan Co., Ltd. (1956)). A concentração de glicose foi medida comTeste de Glicose Wako C (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.).
Tabela 15
Meio de Fermentação de Ácido Itacônico<table>table see original document page 115</column></row><table>
Em primeiro lugar, linhagem de Aspergillus terreus ATCC 10020foi cultivada com agitação por uma noite em 5 ml de meio de cultivo prévioexibido na Tabela 15 em tubo de ensaio (antes do cultivo prévio preliminar). Ocultivo resultante foi inoculado em 100 ml de meio de cultivo prévio novo ecultivado com agitação por 48 horas a 35 0C em frasco Sakaguchi de 500 ml(cultivo prévio preliminar). O cultivo prévio preliminar foi inoculado em 1,5 I demeio de fermentação contínua/em bateladas no aparelho de fermentaçãocontínua do tipo de separação de membrana exibido na Fig. 1, tanque dereação de fermentação 1 foi agitado a 200 rpm com agitador 5 a ele fixado,seguido pela regulagem de aeração e controle de temperatura do tanque dereação de fermentação 1 e o microorganismo foi cultivado por 24 horas (cultivoprévio). Imediatamente após o término do cultivo prévio, a bomba de circulaçãode líquido de fermentação foi operada e o microorganismo foi cultivadocontinuamente sob as condições em que, além das condições de operação nomomento do cultivo prévio, tanque de separação de membrana 2 foi aerado,meio de fermentação de ácido itacônico foi alimentado continuamente e aquantidade de água de permeação de membrana foi regulada de tal forma quea quantidade do líquido de fermentação no aparelho de fermentação contínuado tipo separação de membrana tornou-se 2 I, por meio do quê ácido itacônicofoi produzido por fermentação contínua. Neste teste de fermentação contínua,a quantidade de água de permeação de membrana foi regulada e alterada sobas condições de controle de água de permeação de membrana descritasacima, durante o quê a diferença de cabeça d'água foi medida como adiferença de pressão transmembrana com aparelho de regulagem de diferençade cabeça d'água 3. A concentração de ácido itacônico produzida no líquido defermentação de permeação de membrana e a concentração de glicose residualforam medidas em momento apropriado. A velocidade de produção de ácidoitacônico calculada a partir do ácido itacônico e glicose introduzida calculada apartir da concentração de glicose são exibidas na Tabela 16.
A produção estável de ácido itacônico por fermentação contínuafoi viável por meio do método de fabricação de produto químico de acordo coma presente invenção utilizando o aparelho de fermentação contínua do tipo deseparação de membrana da Fig. 1. A diferença de pressão transmembranavariou dentro de 2 kPa em todo o período de fermentação contínua.
Exemplo 22
Produção de Ácido Itacônico por Meio de Fermentação Contínua (N0 2)
A produção de ácido itacônico foi conduzida utilizando o aparelhode fermentação contínua da Fig. 2. Foi utilizado o meio que possui acomposição exibida na Tabela 15 após esterilização a vapor em alta pressão(121 0C1 quinze minutos). Como material de elemento de membrana deseparação, utilizou-se moldagem de resina de polissulfona e aço inoxidável.
Como membrana de separação, foi utilizada a membrana porosa preparada noExemplo de Referência 2. A menos que indicado em contrário, as condições deoperação deste exemplo são as seguintes:
Capacidade do tanque de reação de fermentação: 2 (L)Membrana de separação utilizada: Membrana de filtragem de
PVDFÁrea de filtragem eficaz do elemento de separação de membrana:120 cm2
Controle de temperatura: 35 (0C)Aeração do tanque de reação de fermentação: 1,5 (l/min)Velocidade de agitação do tanque de reação de fermentação: 200
(rpm)
Esterilização: o tanque de cultivo, incluindo o elemento demembrana de separação, e o meio utilizado foram esterilizados com vapor sobalta pressão em autoclave a 121 0C por vinte minutos.
Ajuste de pH: ajustado em pH 5 com 4 N NaOHRegulagem da quantidade de água de permeação da membrana:regulagem da velocidade de fluxo por diferença de pressão transmembrana
(do início da fermentação contínua até 100 horas: regulada em0,1 kPa ou mais a 5 kPa ou menos;
100 horas a 200 horas: regulada em 0,1 kPa ou mais a 2kPa ou menos; e
200 horas a 300 horas: regulada em 0,1 kPa ou mais a 20kPa ou menos).
Levedura ATCC10020 de Aspergillus terreus foi utilizada comomicroorganismo, meio de fermentação de ácido itacônico que possui acomposição exibida na Tabela 11 foi utilizado como meio e a concentração deácido itacônico na forma de produto foi medida por meio do método exibido noExemplo 17. A concentração de glicose foi medida com Teste de Glicose WakoC (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.).
Em primeiro lugar, linhagem de Aspergillus terreus ATCC 10020foi cultivada com agitação por uma noite em 5 ml de meio de cultivo prévioexibido na Tabela 15 em tubo de ensaio (antes do cultivo prévio preliminar). Ocultivo resultante foi inoculado em 100 ml de meio de cultivo prévio novo ecultivado com agitação por 48 horas a 35 0C em frasco Sakaguchi de 500 ml(cultivo prévio preliminar). O cultivo prévio preliminar foi inoculado em 1,5 I demeio de fermentação contínua/em bateladas no aparelho de fermentaçãocontínua do tipo de separação de membrana exibido na Fig. 2, tanque dereação de fermentação 1 foi agitado a 200 rpm com agitador 5 a ele fixado,seguido pela regulagem de aeração e controle de temperatura do tanque dereação de fermentação 1 e o microorganismo foi cultivado por 24 horas (cultivoprévio). Imediatamente após o término do cultivo prévio, o microorganismo foicultivado continuamente enquanto meio de fermentação contínua/em bateladasfoi alimentado continuamente e a quantidade de água de permeação demembrana foi regulada de tal forma que a quantidade do líquido defermentação no aparelho de fermentação contínua tornou-se 1,5 I, por meio doquê foi produzido ácido itacônico por fermentação contínua. Neste teste defermentação contínua, a quantidade de água de permeação de membrana foiregulada e alterada sob as condições de controle de água de permeação demembrana descritas acima, durante o quê a diferença de cabeça d'água foimedida como a diferença de pressão transmembrana com aparelho deregulagem de diferença de cabeça d'água 3. A concentração de ácido itacônicoproduzida no líquido de fermentação de permeação de membrana e aconcentração de glicose residual foram medidas em momento apropriado. Avelocidade de produção de ácido itacônico calculada a partir do ácido itacônicoe glicose introduzida calculada a partir da concentração de glicose são exibidasna Tabela 16.
A produção estável de ácido itacônico por meio de fermentaçãocontínua foi viável por meio do método de fabricação de produto químico deacordo com a presente invenção utilizando o aparelho de fermentação contínuada Fig. 2. A diferença de pressão transmembrana variou dentro de 2 kPa emtodo o período de fermentação contínua.Exemplo Comparativo 11
Produção de Ácido Itacônico por Meio de Fermentação em Bateladas
Como forma de fermentação utilizando microorganismo, a maiorparte da fermentação em bateladas típica foi conduzida em fermentador dejarra de dois litros para avaliar a sua produtividade de ácido itacônico. O meioexibido na Tabela 15 foi utilizado após esterilização a vapor em alta pressão(121 0C1 quinze minutos). No Exemplo Comparativo 11, linhagem deAspergillus terreus ATCC 10020 foi utilizada como microorganismo, aconcentração de ácido itacônico na forma de produto foi avaliada por meio dométodo exibido no Exemplo 17 e a concentração de glicose foi medida comTeste de Glicose Wako C (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). As condiçõesde operação do Exemplo Comparativo 11 são as seguintes:
Capacidade do tanque de reação de fermentação (quantidade demeio de fermentação de ácido itacônico): 1,5 (L)Controle de temperatura: 35 (0C)Aeração do tanque de reação de fermentação: 1,5 (l/min)Velocidade de agitação do tanque de reação de fermentação: 200(rpm)
Ajuste de pH: ajustado em pH 5 com 4 N NaOH
Em primeiro lugar, linhagem ATCC 10020 foi cultivada comagitação por uma noite em 5 ml de meio de cultivo prévio exibido na Tabela 1em tubo de ensaio (cultivo prévio preliminar). O cultivo prévio preliminar foiinoculado em 50 ml de meio de cultivo prévio novo e cultivado com agitaçãopor 48 horas em frasco Sakaguchi de 500 ml (cultivo prévio). O cultivo préviofoi inoculado em 1,5 I do meio de fermentação contínua/em bateladas exibidona Tabela 15 em fermentador de jarra e submetido a fermentação embateladas. Os resultados de fermentação em bateladas são exibidos na Tabela16.Tabela 16
<table>table see original document page 120</column></row><table>
A velocidade de produção de ácido itacônico foi significativamenteaprimorada pelo método de fabricação de produto químico de acordo com apresente invenção utilizando os aparelhos de fermentação exibidos nas Figs. 1e 2.
Exemplo 23
Produção de Cadaverina por Meio de Fermentação Contínua (N01)
A produção de cadaverina foi conduzida utilizando o aparelho defermentação contínua do tipo separação de membrana da Fig. 1 e meio defermentação de cadaverina com a composição exibida na Tabela 17.
Em primeiro lugar, é descrito método de avaliação de cadaverinacomo produto. Cadaverina foi avaliada por meio do método de HPLC a seguir.
Coluna utilizada: CAPCELL PAK C18 (Shiseido Co., Ltd.)
Fase móvel: 0,1% (p/p) ácido fosfórico aquoso: acetonitrila = 4,5:5,5
Detecção: UV 360 nm
Tratamento prévio de amostra: 25 μΙ de 1,4-diaminobutano (0,03M) como padrão interno, 150 μΙ de bicarbonato de sódio e solução em etanolde 2,4-dinitrofluorobenzeno (0,2 M) foram adicionados a 25 μΙ de amostra deanálise, a ela misturados e a mistura foi mantida sob temperatura de 37 0C poruma hora. 50 μΙ da solução de reação foram dissolvidos em 1 ml de acetonitrila,centrifugados em seguida a 10.000 rpm por cinco minutos e 10 μΙ dosobrenadante resultante foram analisados por meio de HPLC.
O meio foi utilizado após esterilização a vapor em alta pressão(121 0C1 quinze minutos). Como material de elemento de membrana deseparação, utilizou-se moldagem de resina de polissulfona e aço inoxidável.Como membrana de separação, foi utilizada a membrana porosa preparada noExemplo de Referência 2. A menos que indicado em contrário, as condições deoperação deste exemplo são as seguintes:
Capacidade do tanque de reação de fermentação: 2 (L)
Membrana de separação utilizada: membrana de filtragem defluoreto de polivinilideno
Área de filtragem eficaz do elemento de separação de membrana:120 cm2
Controle de temperatura: 30 (0C)
Aeração do tanque de reação de fermentação: 1,5 (l/min) arVelocidade de agitação do tanque de reação de fermentação: 800
(rpm)
Ajuste de pH: ajustado em pH 7,0 com 3 M HCI e 3 M de águacom amônia
Esterilização: o tanque de cultivo, incluindo o elemento demembrana de separação, e o meio utilizado, foram esterilizados com vapor sobalta pressão em autoclave a 121 0C por vinte minutos.
Regulagem da quantidade de água de permeação da membrana:regulagem da velocidade de fluxo por diferença de pressão transmembrana
(do início da fermentação contínua até 100 horas: regulada em0,1 kPa ou mais a 5 kPa ou menos;
100 horas a 200 horas: regulada em 0,1 kPa ou mais a 2<table>table see original document page 122</column></row><table>
Linhagem de Corynebacterium glutamicum TR-CAD1 descrita emJP-A n° 2004-222569 foi utilizada como microorganismo produtor decadaverina e meio de produção de cadaverina que possui a composiçãoexibida na Tabela 17 foi utilizado como meio. A concentração de cadaverinacomo produto foi medida por meio do método de HPLC. A concentração deglicose foi medida com Teste de Glicose Wako C (Wako Pure ChemicalIndustries, Ltd.).
Tabela 17
Meio de fermentação de Cadaverina
<table>table see original document page 122</column></row><table>Em primeiro lugar, linhagem de Corynebacterium glutamicum TR-CAD1 foi cultivado com agitação por uma noite em 5 ml de meio defermentação de cadaverina que contém canamicina (25 μg/ml) em tubo deensaio (antes do cultivo prévio preliminar). O cultivo resultante foi inoculado em50 ml de meio de produção de cadaverina novo que contém adição decanamicina (25 μg/ml) e cultivado por 24 horas sob temperatura de 30 0C a 180rpm com amplitude de 30 cm em frasco Sakaguchi de 500 ml (cultivo préviopreliminar). O cultivo prévio preliminar foi inoculado em 2,0 I de meio defermentação de cadaverina no aparelho de fermentação contínua do tipo deseparação de membrana exibido na Fig. 1, tanque de reação de fermentação 1foi agitado a 800 rpm com agitador 5 a ele fixado, seguido pela regulagem deaeração, controle de temperatura e ajuste de pH do tanque de reação defermentação 1, enquanto o microorganismo era cultivado por 24 horas (cultivoprévio).
Imediatamente após o término do cultivo prévio, a bomba decirculação de líquido de fermentação 10 foi operada e o microorganismo foicultivado continuamente sob as condições em que, além das condições deoperação no momento do cultivo prévio, tanque de separação de membrana 2foi aerado, meio de fermentação de cadaverina foi alimentado continuamente ea quantidade de água de permeação de membrana foi regulada de tal formaque a quantidade do líquido de fermentação no aparelho de fermentaçãocontínua tornou-se 2 L, por meio do quê cadaverina foi produzida porfermentação contínua. Neste teste de fermentação contínua, a quantidade deágua de permeação de membrana foi regulada e alterada sob as condições decontrole de água de permeação de membrana descritas acima, durante o quê adiferença de cabeça d'água foi medida como a diferença de pressãotransmembrana com aparelho de regulagem de diferença de cabeça d'água 3.A concentração de ácido láctico produzida no líquido de fermentação depermeação de membrana e a concentração de glicose residual foram medidasem momento apropriado.
Os resultados no teste de fermentação contínua por 160 horassão exibidos na Tabela 18. A produção estável de cadaverina por meio defermentação contínua foi viável por meio do método de fabricação de produtoquímico de acordo com a presente invenção utilizando o aparelho defermentação contínua do tipo de separação de membrana da Fig. 1. Adiferença de pressão transmembrana variou dentro de 2 kPa em todo o períodode fermentação contínua.
Exemplo 24
Produção de Cadaverina por Meio de Fermentação Contínua ÍN° 2)
A produção de cadaverina foi conduzida utilizando o aparelho defermentação contínua da Fig. 2 e meio de fermentação de cadaverina com acomposição exibida na Tabela 17. O meio foi utilizado após esterilização avapor em alta pressão (121 0C1 quinze minutos). Como material de elemento demembrana de separação, utilizou-se moldagem de resina de polissulfona e açoinoxidável. Como membrana de separação, foi utilizada a membrana porosapreparada no Exemplo de Referência 2. A menos que indicado em contrário, ascondições de operação deste exemplo são as seguintes:
Capacidade do tanque de reação de fermentação: 2 (L)Membrana de separação utilizada: membrana de filtragem defluoreto de polivinilideno
Área de filtragem eficaz do elemento de separação de membrana:120 cm2
Controle de temperatura: 30 (°C)
Aeração do tanque de reação de fermentação: 1.5 (l/min) arVelocidade de agitação do tanque de reação de fermentação: 800(rpm)Ajuste de pH: ajustado em pH 7,0 com 3 M HCI e 3 M de água
com amônia
Esterilização: o tanque de cultivo, incluindo o elemento demembrana de separação, e o meio utilizado foram esterilizados com vapor sobalta pressão em autoclave a 121 0C por vinte minutos.
Regulagem da quantidade de água de permeação da membrana:regulagem da velocidade de fluxo por diferença de pressão transmembrana
(do início da fermentação contínua até 100 horas: regulada em0,1 kPa ou mais a 5 kPa ou menos;
100 horas a 200 horas: regulada em 0,1 kPa ou mais a 2kPa ou menos; e
200 horas a 264 horas: regulada em 0,1 kPa ou mais a 20kPa ou menos).
Linhagem TR-CAD1 de Corynebacterium glutamicum foi utilizadacomo microorganismo, meio de fermentação de cadaverina que possui acomposição exibida na Tabela 7 foi utilizado como meio e a concentração decadaverina como produto foi medida por meio do método de HPLC. Aconcentração de glicose foi medida com Teste de Glicose Wako C (Wako PureChemical Industries, Ltd.).
Em primeiro lugar, linhagem de Corynebacterium glutamicum TR-CAD1 foi cultivada com agitação por uma noite em 5 ml de meio de produçãode cadaverina que contém canamicina (25 μg/ml) adicionada em tubo deensaio (antes do cultivo prévio preliminar). O cultivo resultante foi inoculado em50 ml de meio de produção de cadaverina novo que contém adição decanamicina (25 μg/ml) cultivado por 24 horas sob temperatura de 30 0C a 180rpm com amplitude de 30 cm em frasco Sakaguchi de 500 ml (cultivo préviopreliminar).
O cultivo prévio preliminar foi inoculado em 1,5 I de meio deprodução de cadaverina no aparelho de fermentação contínua do tipo deseparação de membrana exibido na Fig. 2, tanque de reação de fermentação 1foi agitado a 800 rpm com agitador 5 a ele fixado, seguido pela regulagem deaeração, controle de temperatura e ajuste de pH do tanque de reação defermentação 1, enquanto o microorganismo era cultivado por 24 horas (cultivoprévio). Imediatamente após o término do cultivo prévio, o microorganismo foicultivado continuamente enquanto meio de fermentação de cadaverina foialimentado continuamente e a quantidade de água de permeação demembrana foi regulada de tal forma que a quantidade do líquido defermentação no aparelho de fermentação contínua tornou-se 1,5 I, por meio doquê foi produzida cadaverina por meio de fermentação contínua. A regulagemda quantidade de água de permeação de membrana no teste de fermentaçãocontínua foi conduzida por meio de alteração adequada da diferença de cabeçad'água com aparelho de regulagem da diferença de cabeça d'água 3, de talforma que a diferença de cabeça d'água do tanque de reação de fermentaçãofosse de até 2 m, ou seja, a diferença de pressão transmembrana foi de até 20kPa. A concentração de cadaverina produzida no líquido de fermentação depermeação de membrana e a concentração de glicose residual foram medidasem momento apropriado. A velocidade de produção de cadaverina calculada apartir da cadaverina e glicose introduzida é exibida na Tabela 18.
Os resultados no teste de fermentação contínua por 320 horassão exibidos na Tabela 18. A produção estável de cadaverina por meio defermentação contínua foi viável por meio do método de fabricação de produtoquímico de acordo com a presente invenção utilizando o aparelho defermentação contínua da Fig. 2. A diferença de pressão transmembrana varioudentro de 2 kPa em todo o período de fermentação contínua.
Exemplo Comparativo 12
Produção de Cadaverina por Meio de Fermentação em bateladasComo forma de fermentação utilizando microorganismo, a maiorparte da fermentação em bateladas típica foi conduzida em fermentador dejarra de dois litros para avaliar a sua produtividade de cadaverina. O meio foiutilizado após esterilização a vapor em alta pressão (121 0C1 quinze minutos).
Neste exemplo comparativo, linhagem de Corynebacterium glutamicum TR-CAD1 foi utilizada como microorganismo, a concentração de cadaverina naforma de produto foi avaliada por meio do método de HPLC e a concentraçãode glicose foi medida com Teste de Glicose Wako C (Wako Pure ChemicalIndustries, Ltd.). As condições de operação do Exemplo Comparativo 8 são asseguintes:
Capacidade do tanque de reação de fermentação (quantidade domeio de produção de cadaverina): 1,0 (L)
Controle de temperatura: 35 (0C)
Aeração do tanque de reação de fermentação: 1,5 (l/min) arVelocidade de agitação do tanque de reação de fermentação: 800(rpm)
Ajuste de pH: ajustado em pH 7,0 com 3 M HCI e 3 M de águacom amônia
Em primeiro lugar, linhagem de Corynebacterium glutamicum TR-CAD1 foi cultivada com agitação por uma noite em 5 ml de meio de produçãode cadaverina que contém canamicina (25 μg/ml) adicionada em tubo deensaio (cultivo prévio preliminar). O cultivo resultante foi inoculado em 50 ml demeio de produção de cadaverina novo que contém adição de canamicina (25μg/ml) e cultivado por 24 horas sob temperatura de 30 0C a 180 rpm comamplitude de 30 cm em frasco Sakaguchi de 500 ml (cultivo prévio).
O cultivo prévio foi inoculado em 1,0 I de meio de produção decadaverina (concentração de glicose: 100 g/l) em fermentador de jarra. Omicroorganismo foi submetido a fermentação em bateladas com o meio deprodução de cadaverina. Os resultados são exibidos na Tabela 18.
Tabela 18
<table>table see original document page 128</column></row><table>
Poder-se-á revelar que a velocidade de produção de cadaverinafoi significativamente aprimorada pelo método de fabricação de produtoquímico de acordo com a presente invenção utilizando os aparelhos defermentação exibidos nas Figs. 1 e 2.
Exemplo 25
Produção de Ácidos Nucleicos por Meio de Fermentação Contínua (N01)
A produção de ácidos nucleicos foi conduzida utilizando oaparelho de fermentação contínua do tipo separação de membrana da Fig. 1.0meio exibido na Tabela 19 foi utilizado após esterilização a vapor em altapressão (121 0C1 quinze minutos). Como material de elemento de membranade separação, utilizou-se moldagem de resina de polissulfona e aço inoxidável.
Como membrana de separação, foi utilizada a membrana porosa preparada noExemplo de Referência 2. A menos que indicado em contrário, as condições deoperação deste exemplo são as seguintes:
Capacidade do tanque de reação de fermentação: 2 (L)Membrana de separação utilizada: membrana de filtragem defluoreto de polivinilideno
Área de filtragem eficaz do elemento de separação de membrana:120 cm2;
Controle de temperatura: 30 (0C)
Aeração do tanque de reação de fermentação: 1000 (ml/min)
Velocidade de agitação do tanque de reação de fermentação: 800(rpm)
Esterilização: o tanque de cultivo, incluindo o elemento demembrana de separação, e o meio utilizado, foram esterilizados com vapor sobalta pressão em autoclave a 121 0C por vinte minutos.
Ajuste de pH: ajustado em pH 6,8 com amônia aquosa a 25%
Regulagem da quantidade de água de permeação da membrana:regulagem da velocidade de fluxo por diferença de pressão transmembrana(do início da fermentação contínua até 150 horas: regulada em0,1 kPa ou mais a 5 kPa ou menos;
150 horas a 300 horas: regulada em 0,1 kPa ou mais a 2kPa ou menos; e
300 horas a 400 horas: regulada em 0,1 kPa ou mais a 20kPa ou menos).
Corynebacterium ammoniagenes ATCC 21479 foi utilizado comomicroorganismo procariótico e meio de fermentação de ácido nucleico quepossui a composição exibida na Tabela 19 foi utilizado como meio. Asconcentrações de guanosina e inosina contidas em líquido de fermentaçãoforam confirmadas por meio de medição das quantidades dos ácidos nucleicoscorrespondentes por meio de HPLC sob as condições a seguir:
Condições de análise:
Coluna: Asahipak GS-220 (7,6 mm de diâmetro interno χ 500 mmde comprimento), tampão: 0,2 M de NaH2PO4 (pH 3,98) com pH ajustado comácido fosfórico, temperatura: 55 0C, velocidade de fluxo: 1,5 ml/min, detecção:UV 254 nm, tempo de retenção (min): inosina 16,1, guanosina 20,5.A concentração de glicose foi medida com Teste de Glicose WakoC (marca registrada) (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.).
Tabela 19
Meio de Fermentação de Ácido Nucleico
<table>table see original document page 130</column></row><table>Em primeiro lugar, Corynebacterium ammortiagenes ATCC 21479foi cultivado com agitação em 150 ml do meio de cultivo prévio exibido naTabela 15 por 24 horas sob temperatura de 30 0C em frasco Sakaguchi (cultivoprévio preliminar). O cultivo prévio preliminar foi inoculado em 1 I de meio decultivo prévio no aparelho de fermentação contínua do tipo de separação demembrana exibido na Fig. 1, tanque de reação de fermentação 1 foi agitado a800 rpm com agitador 5 a ele fixado, seguido pela regulagem de aeração econtrole de temperatura a 30 0C do tanque de reação 1, enquanto omicroorganismo foi cultivado por 24 horas (cultivo prévio). Imediatamente apóso término do cultivo prévio, a bomba de circulação de líquido de fermentaçãofoi operada e o microorganismo foi cultivado continuamente sob as condiçõesem que, além das condições de operação no momento do cultivo prévio, otanque de separação de membrana 2 foi aerado, meio de fermentaçãocontínua foi alimentado continuamente e, após o término do cultivo prévio, omeio de fermentação contínua foi alimentado continuamente, o meio defermentação foi circulado entre o tanque de reação de fermentação 1 e otanque de separação de membrana 12 pela bomba de circulação de líquido defermentação 11 e a quantidade de água de permeação de membrana foiregulada de tal forma que a quantidade do líquido de fermentação no aparelhode fermentação contínua do tipo separação de membrana tornou-se 2 L, pormeio do quê ácidos nucleicos foram produzidos por meio de fermentaçãocontínua. Neste teste de fermentação contínua, a quantidade de água depermeação de membrana foi regulada e alterada sob as condições de controlede água de permeação de membrana descritas acima, durante o quê adiferença de cabeça d'água foi medida como a diferença de pressãotransmembrana com aparelho de regulagem de diferença de cabeça d'água 3.
A concentração de ácidos nucleicos produzida no líquido de fermentação depermeação de membrana e a concentração de glicose residual foram medidasem momento apropriado. A velocidade de produção de ácidos nucleicoscalculada a partir de ácido nucléico e glicose introduzida calculada a partir daconcentração de glicose é exibida na Tabela 20.
Como resultado do teste de fermentação por 400 horas, produçãoestável de ácidos nucleicos por meio de fermentação contínua foi viável pormeio do método de fabricação de produto químico de acordo com a presenteinvenção utilizando o aparelho de fermentação contínua da Fig. 1. A diferençade pressão transmembrana variou dentro de 2 kPa em todo o período defermentação contínua.
Exemplo 26
Produção de Ácidos Nucleicos por Meio de Fermentação Contínua (N0 2)A produção de ácidos nucleicos foi conduzida utilizando oaparelho de fermentação contínua da Fig. 2. O meio exibido na Tabela 19 foiutilizado após esterilização a vapor em alta pressão (121 0C1 quinze minutos).
Como material de elemento de membrana de separação, utilizou-se moldagemde resina de polissulfona e aço inoxidável. Como membrana de separação, foiutilizada a membrana porosa preparada no Exemplo de Referência 2. A menosque indicado em contrário, as condições de operação deste exemplo são asseguintes:
Capacidade do tanque de reação de fermentação: 2 (L)
Membrana de separação utilizada: membrana de filtragem defluoreto de polivinilideno
Área de filtragem eficaz do elemento de separação de membrana:120 cm2;
Controle de temperatura: 30 (°C)
Aeração do tanque de reação de fermentação: 1000 (ml/min)
Velocidade de agitação do tanque de reação de fermentação: 800(rpm)Esterilização: o tanque de cultivo, incluindo o elemento demembrana de separação, e o meio utilizado, foram esterilizados com vapor sobalta pressão em autoclave a 121 0C por vinte minutos.
Ajuste de pH: ajustado em pH 6,8 com amônia aquosa a 25%
Regulagem da quantidade de água de permeação da membrana:regulagem da velocidade de fluxo por diferença de pressão transmembrana(do início da fermentação contínua até 150 horas: regulada em0,1 kPa ou mais a 5 kPa ou menos;
150 horas a 300 horas: regulada em 0,1 kPa ou mais a 2kPa ou menos; e
300 horas a 400 horas: regulada em 0,1 kPa ou mais a 20kPa ou menos).
Corynebacterium ammoniagenes ATCC 21479 foi utilizadocomo microorganismo procariótico e meio de fermentação de ácidonucleico que possui a composição exibida na Tabela 19 foi utilizado comomeio. As concentrações de guanosina, inosina e glicose contidas emlíquido de fermentação foram confirmadas por meio de medição dasquantidades dos ácidos nucleicos correspondentes da mesma forma queno Exemplo 1.
Em primeiro lugar, Corynebacterium ammoniagenes ATCC21479 foi cultivado com agitação por 24 horas sob temperatura de 30 0C em150 ml de meio de cultivo prévio exibido na Tabela 19 em frasco Sakaguchi(cultivo preliminar). O cultivo prévio preliminar foi inoculado em 1 I de meiode cultivo prévio no aparelho de fermentação contínua do tipo de separaçãode membrana exibido na Fig. 2, tanque de reação de fermentação 1 foiagitado a 800 rpm com agitador 5 a ele fixado, seguido pela regulagem deaeração e controle de temperatura a 30 0C do tanque de reação 1, enquantoo microorganismo foi cultivado por 24 horas (cultivo prévio). Imediatamenteapós o término do cultivo prévio, o meio de fermentação contínua foialimentado continuamente e o microorganismo foi cultivado continuamenteenquanto a quantidade de água de permeação de membrana foi regulada detal forma que a quantidade do líquido de fermentação no aparelho defermentação contínua tornou-se 1,5 I, por meio do quê foram produzidosácidos nucleicos por fermentação contínua. Neste teste de fermentaçãocontínua, a quantidade de água de permeação de membrana foi regulada ealterada sob as condições de controle de água de permeação de membranadescritas acima, durante o quê a diferença de cabeça d'água foi medidacomo a diferença de pressão transmembrana com aparelho de regulagemde diferença de cabeça d'água 3. A concentração de ácidos nucleicosproduzida no líquido de fermentação de permeação de membrana e aconcentração de glicose residual foram medidas em momento apropriado. Avelocidade de produção de ácidos nucleicos calculada a partir de á cidonucleico e glicose introduzida calculada a partir da concentração de glicoseé exibida na Tabela 20.
Como resultado do teste de fermentação por 400 horas, produçãoestável de ácidos nucleicos por fermentação contínua foi viável por meio dométodo de fabricação de produto químico de acordo com a presente invençãoutilizando o aparelho de fermentação contínua da Fig. 2. A diferença depressão transmembrana variou dentro de 2 kPa em todo o período defermentação contínua.
Exemplo Comparativo 13Produção de Ácidos Nucleicos por Meio de Fermentação em Bateladas
Como forma de fermentação utilizando microorganismo, amaior parte da fermentação em bateladas típica foi conduzida emfermentador de jarra de dois litros para avaliar a sua produtividade de ácidonucleico. O meio de fermentação contínua exibido na Tabela 19 foiutilizado após esterilização a vapor em alta pressão (121 0C1 quinzeminutos). Neste exemplo comparativo, Corynebacterium ammoniagenesATCC 21479 foi utilizado como microorganismo procariótico, asconcentrações de ácidos nucleicos na forma de produto foram avaliadaspor meio do método exibido no Exemplo 21 e a concentração de glicose foimedida com Teste de Glicose Wako C (marca registrada) (Wako PureChemical Industries, Ltd.). As condições de operação deste exemplocomparativo são as seguintes:
Capacidade do tanque de reação de fermentação: 2 (L)Controle de temperatura: 30 (0C)
Aeração do tanque de reação de fermentação: 1000 (ml/min)Velocidade de agitação do tanque de reação de fermentação: 800(rpm)
Esterilização: o tanque de cultivo, incluindo o elemento demembrana de separação, e o meio utilizado, foram esterilizados com vapor sobalta pressão em autoclave a 121 0C por vinte minutos.
Ajuste de pH: ajustado em pH 6,8 com amônia aquosa a 25%
Em primeiro lugar, Corynebacterium ammoniagenes ATCC21479 foi cultivado com agitação por 24 horas sob temperatura de 30 0Cem 150 ml do meio de cultivo prévio exibido na Tabela 19 em frascoSakaguchi (cultivo prévio). O cultivo prévio resultante foi inoculado em 1 Ido meio de fermentação contínua exibido na Tabela 19 em fermentador dejarra e submetido a fermentação em bateladas. Após o início dafermentação, adicionou-se 5% de glicose de forma a prosseguir com afermentação. Os resultados de fermentação em bateladas por 120 horassão exibidos na Tabela 20.
Tabela 20<table>table see original document page 136</column></row><table>
Pôde-se revelar que a velocidade de produção de ácidosnucleicos foi significativamente aprimorada pelo método de fabricação deproduto químico de acordo com a presente invenção utilizando o aparelho defermentação exibido nas Figs. 1 e 2.
Exemplo 27
Produção de L-Treonina por Meio de Fermentação Contínua (N01)
A produção de L-treonina foi conduzida utilizando o aparelho defermentação contínua do tipo separação de membrana da Fig. 1 e meio defermentação com a composição exibida na Tabela 21.
Em primeiro lugar, é descrito método de avaliação de L-treoninacomo produto. A quantidade de L-treonina contida em cultivo foi medida pormeio do método a seguir. 25 μΙ de cultivo que contém L-treonina a ser medidoforam removidos e receberam em seguida adição de 150 μΙ de NaHCO3 (75mM) e 25 μΙ de L-metionina padrão interno (2 g/l). Além disso, 900 μΙ de etanole 150 μΙ de DNFB (0,2 M) foram adicionados à solução acima e com elamisturados. A solução resultante foi mantida a 37 0C por uma hora e analisadapor meio de HPLC sob as condições a seguir:
Coluna utilizada: CAPCELLPAK C18 TIPO SG120 (Shiseido Co.,Ltd.)
Fase móvel: 0,1% (p/v) H3PO4: acetonitrila = 7: 3 (velocidade defluxo 1,2 ml/min)
Detecção: UV (360 nm)
Temperatura: 23 °C
Curva de calibragem foi preparada por meio de análise deamostras de L-treonina com concentração conhecida como amostra e plotagemdas suas concentrações de L-treonina sobre a abscissa e a razão de área(razão área de L-treonina/área de L-metionina (padrão interno)) sobre aordenada. O meio foi utilizado após esterilização a vapor sob alta pressão (121°C, quinze minutos). Como membrana de separação, foi utilizada a membranaporosa preparada no Exemplo de Referência 2.
A menos que indicado em contrário, as condições de operaçãodeste exemplo são as seguintes:
Capacidade de tanque de reação: 2 (L)
Capacidade do tanque de separação de membrana: 0.5 (L)
Membrana de separação utilizada: membrana de filtragem defluoreto de polivinilideno
Área de filtragem eficaz do elemento de separação de membrana:60 cm2
Controle de temperatura: 37 (0C)
Aeração do tanque de reação: 1,5 (l/min)
Aeração do tanque de separação de membrana: 1 (l/min)
Velocidade de agitação do tanque de reação: 800 (rpm)
Ajuste de pH: ajustado em pH 7 com amônia aquosa a 28%
Velocidade de alimentação do meio de fermentação de l-treonina:controle variável na faixa de 50 a 300 ml/h.
Regulagem da quantidade de água de permeação da membrana:regulagem da velocidade de fluxo por diferença de pressão transmembrana(do início da fermentação contínua até 100 horas: regulada em0,1 kPa ou mais a 5 kPa ou menos; e
100 horas a 200 horas: regulada em 0,1 kPa ou mais a 2kPa ou menos).
Em Providencia rettgeri, Providencia rettgeri SGR 588-77 (FERMP-10528) foi utilizado como o microorganismo que produz L-treonina, meio defermentação que possui a composição exibida na Tabela 21 foi utilizado comomeio, a concentração de L-treonina como produto foi medida por meio dométodo de HPLC descrito acima e a concentração de glicose foi medida comTeste de Glicose Wako C (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.).
Tabela 21
Meio de Fermentação de L-Treonina
<table>table see original document page 138</column></row><table>
Em primeiro lugar Providencia rettgeri SGR 588-77 raspado demeio agar foi inoculado em 100 ml de meio de caldo de glicose (1% de glicose,3% de caldo (fabricado pela Nissui Co., Ltd.)) em frasco Erlenmeyer de 500 mle cultivado a 37 0C sob agitação a 140 rpm (cultivo prévio preliminar). O cultivoprévio preliminar foi inoculado em 1,5 I de meio de cultivo prévio (Tabela 21) noaparelho de fermentação contínua do tipo de separação de membrana exibidona Fig. 1, tanque de reação 1 foi agitado a 800 rpm com agitador 5 a ele fixado,seguido pela regulagem de aeração e controle de temperatura a 37 0C dotanque de reação 1, enquanto o microorganismo foi cultivado por 24 horas(cultivo prévio). Imediatamente após o término do cultivo prévio, a bomba decirculação de líquido de fermentação foi operada e o microorganismo foicultivado continuamente sob as condições em que, além das condições deoperação no momento do cultivo prévio, o tanque de separação de membrana2 foi aerado, meio de fermentação que possui a composição exibida na Tabela17 foi alimentado continuamente e a quantidade de água de permeação demembrana foi regulada de tal forma que a quantidade do líquido defermentação no aparelho de fermentação contínua tornou-se 2 L, por meio doquê L-treonina foi produzida por fermentação contínua. Neste teste defermentação contínua, a quantidade de água de permeação de membrana foiregulada e alterada sob as condições de controle de água de permeação demembrana descritas acima, durante o quê a diferença de cabeça d'água foimedida como a diferença de pressão transmembrana com aparelho deregulagem de diferença de cabeça d'água 3. A concentração de L-treoninaproduzida no líquido de fermentação de permeação de membrana e aconcentração de glicose residual foram medidas em momento apropriado. Adiferença de cabeça d'água foi apropriadamente alterada, de tal forma que acabeça d'água do tanque de reação de fermentação fosse de 2 m ou menos nomáximo, ou seja, a diferença de pressão transmembrana estava dentro de 20kPa. A concentração de L-treonina produzida no líquido de fermentação depermeação de membrana e a concentração de glicose residual foram medidasem momento apropriado. Os resultados do teste de fermentação contínua por200 horas são exibidos na Tabela 22.
A produção estável de L-treonina por meio de fermentaçãocontínua foi viável por meio do método de fabricação de produto químico deacordo com a presente invenção utilizando o aparelho de fermentação contínuado tipo de separação da Fig. 1. A diferença de pressão transmembrana varioudentro de 2 kPa em todo o período de fermentação contínua.
Exemplo 28
Produção de L-Treonina por Meio de Fermentação Contínua (N0 2)
A produção de L-treonina foi conduzida utilizando o aparelho defermentação contínua da Fig. 2 e meio de fermentação com a composiçãoexibida na Tabela 21. O meio foi utilizado após esterilização a vapor em altapressão (121 0C1 quinze minutos). Como material de elemento de membranade separação, utilizou-se moldagem de resina de polissulfona e aço inoxidável.Como membrana de separação, foi utilizada a membrana porosa preparada noExemplo de Referência 2. A menos que indicado em contrário, as condições deoperação deste exemplo são as seguintes:
Capacidade de tanque de reação: 2 (L)
Membrana de separação utilizada: Membrana de filtragem dePVDF
Área de filtragem eficaz do elemento de separação de membrana:120 cm2
Controle de temperatura: 37 (0C)
Aeração do tanque de reação: 1.5 (l/min)
Velocidade de agitação do tanque de reação: 800 (rpm)
Ajuste de pH: ajustado em pH 7 com amônia aquosa a 25%
Velocidade de alimentação do meio de fermentação de l-treonina:controle variável na faixa de 50 a 300 ml/h.
Regulagem da quantidade de água de permeação da membrana:regulagem da velocidade de fluxo por diferença de pressão transmembrana
(do início da fermentação contínua até 100 horas: regulada em0,1 kPa ou mais a 5 kPa ou menos; e
100 horas a 200 horas: regulada em 0,1 kPa ou mais a 2
kPa ou menos).
Esterilização: o tanque de cultivo, incluindo o elemento demembrana de separação, e o meio utilizado, foram esterilizados com vapor sobalta pressão em autoclave a 121 0C por vinte minutos.
Em Providencia rettgeri, Providencia rettgeri SGR 588-77 (FERMP-10528) foi utilizado como o microorganismo que produz L-treonina, meio defermentação que possui a composição exibida na Tabela 21 foi utilizado comomeio, a concentração de L-treonina como produto foi medida por meio deHPLC exibido no Exemplo 23 e a concentração de glicose foi medida comTeste de Glicose Wako C (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.).
Em primeiro lugar, Providencia rettgeri SGR 588-77 raspado demeio agar foi inoculado em 100 ml de meio de caldo de glicose (1% de glicose,3% de caldo (fabricado pela Nissui Co., Ltd.)) em frasco Erlenmeyer de 500 ml.O microorganismo foi cultivado a 37 0C sob agitação a 140 rpm (cultivo préviopreliminar). O cultivo prévio preliminar foi inoculado em 1,5 I de meio de cultivoprévio (Tabela 21) no aparelho de fermentação contínua exibido na Fig. 1,tanque de reação 1 foi agitado a 800 rpm com agitador 5 a ele fixado, seguidopela regulagem de aeração, controle de temperatura e ajuste de pH do tanquede reação 1, enquanto o microorganismo foi cultivado por 24 horas (cultivoprévio). Imediatamente após o término do cultivo prévio, o microorganismo foicultivado continuamente enquanto meio de fermentação que possui acomposição exibida na Tabela 21 foi alimentado continuamente e a quantidadede água de permeação de membrana foi regulada de tal forma que aquantidade do líquido de fermentação no aparelho de fermentação contínuatornou-se 1,5 I, por meio do quê foi produzida L-treonina por meio defermentação contínua. Neste teste de fermentação contínua, a quantidade deágua de permeação de membrana foi regulada e alterada sob as condições decontrole de água de permeação de membrana descritas acima, durante o quê adiferença de cabeça d'água foi medida como a diferença de pressãotransmembrana com aparelho de regulagem de diferença de cabeça d'água 3.
A concentração de L-treonina produzida no líquido de fermentação depermeação de membrana e a concentração de glicose residual foram medidasem momento apropriado. O rendimento de L-treonina com relação a açúcar e avelocidade de produção de ácido láctico com base na L-treonina e glicoseintroduzida calculada a partir da concentração de glicose são exibidos naTabela 18.
Como resultado do teste de fermentação por 200 horas, produçãoestável de L-treonina por meio de fermentação contínua foi viável por meio dométodo de fabricação de produto químico de acordo com a presente invençãoutilizando o aparelho de fermentação contínua da Fig. 2. A diferença depressão transmembrana variou dentro de 2 kPa em todo o período defermentação contínua.
Exemplo Comparativo 14
Produção de L-Treonina por Meio de Fermentação em Bateladas
Como forma de fermentação utilizando microorganismo, a maiorparte da fermentação em bateladas típica foi conduzida em fermentador dejarra de dois litros para avaliar a sua produtividade de L-treonina. O meio decultivo prévio exibido na Tabela 21 foi utilizado como meio ao iniciar-se ocultivo em bateladas. Estes meios foram utilizados após esterilização a vaporem alta pressão (121 0C, quinze minutos). Neste exemplo comparativo,Providencia rettgeri SGR 588-77 foi utilizada como microorganismo e asconcentrações de L-treonina e glicose contidas no líquido de fermentaçãoforam medidas por meio do método exibido no Exemplo 27. As condições deoperação deste exemplo comparativo são as seguintes:
Capacidade do tanque de reação de fermentação (quantidade domeio de fermentação de L-treonina): 1 (L)Controle de temperatura: 37 (0C)
Aeração do tanque de reação de fermentação: 1 (l/min)
Velocidade de agitação do tanque de reação de fermentação: 800
(rpm)
Ajuste de pH: ajustado em pH 7 com amônia aquosa a 28%Em primeiro lugar, Providencia rettgeri SGR 588-77 raspado demeio agar foi inoculado em 90 ml de meio de caldo de glicose (1% de glicose,3% de caldo (fabricado pela Nissui Co., Ltd.)) em frasco Erlenmeyer de 500 ml.
O microorganismo foi cultivado a 37 0C sob agitação a 140 rpm (cultivo prévio).O cultivo prévio foi inoculado em 810 ml do meio de cultivo prévio exibido naTabela 17 em fermentador de minijarra e submetido a fermentação embateladas. A composição de meio adicionada durante o cultivo é exibida emmeio adicional na Tabela 9. O meio foi adicionado em 24, 32, 40 e 48 horasapós o início de cultivo em quantidade de 50 ml, respectivamente. Osresultados de fermentação em bateladas são exibidos na Tabela 22.
Tabela 22
<table>table see original document page 143</column></row><table><table>table see original document page 144</column></row><table>
Poder-se-á revelar que a velocidade de produção de L-treonina foisignificativamente aprimorada pelo método de fabricação de produto químicode acordo com a pr esente invenção utilizando o a parelho de fermentaçãoexibido nas Figs. 1 e 2.
Exemplo 29
Produção de Ácido L-Láctico por Meio de Fermentação ContinuaUtilizando Bactéria de Ácido Láctico (N01)
A produção de ácido L-láctico foi conduzida utilizando o aparelhode fermentação contínua do tipo separação de membrana da Fig. 1. O meio defermentação de ácido láctico por bactérias de ácido láctico exibido na Tabela23 foi utilizado após esterilização a vapor em alta pressão (121 °C quinzeminutos). Como membrana de separação, foi utilizada a membrana porosapreparada no Exemplo de Referência 2. A menos que indicado em contrário, ascondições de operação deste exemplo são as seguintes:
Capacidade do tanque de reação de fermentação: 2 (L)
Membrana de separação utilizada: membrana de filtragem defluoreto de polivinilideno
Área de filtragem eficaz do elemento de separação de membrana:120 cm2
Controle de temperatura: 37 (°C)
Aeração do tanque de reação de fermentação: 50 (ml/min)nitrogênioVelocidade de agitação do tanque de reação de fermentação: 600(rpm)
Esterilização: o tanque de cultivo, incluindo o elemento demembrana de separação, e o meio utilizado foram esterilizados com vapor sobalta pressão em autoclave a 121 0C por vinte minutos.
Ajuste de pH: ajustado em pH 6,5 com 8 N de amônia aquosaRegulagem da quantidade de água de permeação da membrana:regulagem da velocidade de fluxo por diferença de pressão transmembrana(do início da fermentação contínua até 150 horas: regulada em0,1 kPa ou mais a 5 kPa ou menos;
150 horas a 300 horas: regulada em 0,1 kPa ou mais a 2kPa ou menos; e
300 horas a 400 horas: regulada em 0,1 kPa ou mais a 20kPa ou menos).
Linhagem de Lactococcus Iactis JCM 7638 foi utilizada comomicroorganismo procariótico e meio de fermentação de ácido láctico porbactérias de ácido láctico que possuí a composição exibida na Tabela 23 foiutilizado como meio. A concentração de ácido L-láctico contida em líquido defermentação foi avaliada por meio do mesmo método do Exemplo deReferência 1. A concentração de glicose foi medida com Teste de GlicoseWako C (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.).
Tabela 23
Meio de Fermentação de Ácido Láctico por Bactérias Lácteas
<table>table see original document page 145</column></row><table>Em primeiro lugar, linhagem de Lactococcus Iactis JCM 7638 foicultivada de forma estática em 5 ml do meio de fermentação de ácido lácticopurgado com gás nitrogênio exibido na Tabela 23 por 24 horas sob temperaturade 37 °C em tubo de ensaio (antes do cultivo prévio preliminar). O cultivoresultante foi inoculado em 50 ml de meio de fermentação de ácido lácticopurgado com gás nitrogênio novo e cultivado de forma estática por 48 horas a37 °C (cultivo prévio preliminar). O cultivo prévio preliminar foi inoculado em 1,5I de meio de fermentação de ácido láctico purgado com gás nitrogênio noaparelho de fermentação contínua do tipo de separação de membrana exibidona Fig. 1, tanque de reação de fermentação 1 foi agitado a 600 rpm comagitador 5 a ele fixado, seguido pela regulagem de aeração e controle detemperatura a 37 °C do tanque de reação 1, enquanto o microorganismo foicultivado por 24 horas (cultivo prévio). Imediatamente após o término do cultivoprévio, o microorganismo foi cultivado continuamente em meio de fermentaçãode ácido láctico alimentado continuamente enquanto a quantidade de água depermeação de membrana foi regulada de tal forma que a quantidade do líquidode fermentação no aparelho de fermentação contínua tornou-se 2 I, por meiodo quê foi produzido ácido L-láctico por meio de fermentação contínua. Nessemomento, gás nitrogênio foi alimentado de aparelho de alimentação de gáspara o tanque de reação de fermentação e o gás descarregado foi recuperadoe novamente alimentado para o tanque de reação de fermentação. Issosignifica que o gás que contém gás nitrogênio foi fornecido por meio dereciclagem. Neste teste de fermentação contínua, a quantidade de água depermeação de membrana foi regulada e alterada sob as condições de controlede água de permeação de membrana descritas acima, durante o quê adiferença de cabeça d'água foi medida como a diferença de pressãotransmembrana com aparelho de regulagem de diferença de cabeça d'água 3.A concentração de ácido L-láctico produzida no líquido de fermentação depermeação de membrana e a concentração de glicose residual foi medida emmomento apropriado. O rendimento de ácido L-láctico com relação a açúcar e avelocidade de produção de ácido L-láctico calculada a partir do ácido L-lácticoe glicose introduzida calculada a partir da concentração de glicose são exibidosna Tabela 24.
Como resultado do teste de fermentação por 400 horas, produçãoestável de ácido L-láctico por meio de fermentação contínua foi viável por meiodo método de fabricação de produto químico de acordo com a presenteinvenção utilizando o aparelho de fermentação contínua do tipo de separaçãode membrana. A diferença de pressão transmembrana variou dentro de 2 kPaem todo o período de fermentação contínua.
Exemplo 30
Produção de Ácido L-Láctico por Meio de Fermentação ContínuaUtilizando Bactéria de Ácido Láctico (N0 2)
A produção de ácido L-láctico foi conduzida utilizando o aparelhode fermentação contínua da Fig. 2. Como meio, o meio de fermentação deácido láctico por bactérias de ácido láctico exibido na Tabela 23 foi utilizadoapós esterilização a vapor em alta pressão (121 0C1 quinze minutos). O meio foiutilizado após esterilização a vapor em alta pressão (121 0C1 quinze minutos).Como membrana de separação, foi utilizada a membrana porosa preparada noExemplo de Referência 2. A menos que indicado em contrário, as condições deoperação deste exemplo são as seguintes:
Capacidade do tanque de reação de fermentação: 2 (L)Membrana de separação utilizada: membrana de filtragem defluoreto de polivinilideno
Área de filtragem eficaz do elemento de separação de membrana:
120 cm2
Controle de temperatura: 37 (°C)Aeração do tanque de reação de fermentação: 50 (ml/min)nitrogênio
Velocidade de agitação do tanque de reação de fermentação: 600(rpm)
Esterilização: o tanque de cultivo, incluindo o elemento demembrana de separação, e o meio utilizado, foram esterilizados com vapor sobalta pressão em autoclave a 121 0C por vinte minutos.
Ajuste de pH: ajustado em pH 6,5 com 8 N de amônia aquosaRegulagem da quantidade de água de permeação da membrana:regulagem da velocidade de fluxo por diferença de pressão transmembrana(do início da fermentação contínua até 150 horas: regulada em0,1 kPa ou mais a 5 kPa ou menos;
150 horas a 300 horas: regulada em 0,1 kPa ou mais a 2kPa ou menos; e
- 300 horas a 400 horas: regulada em 0,1 kPa ou mais a 20kPa ou menos).
Linhagem de Lactococcus Iactis JCM 7638 foi utilizada comomicroorganismo procariótico e cultivada da mesma forma que no Exemplo 29até o cultivo prévio. Imediatamente após o término do cultivo prévio, omicroorganismo foi cultivado continuamente em meio alimentadocontinuamente enquanto a quantidade de água de permeação de membrana foiregulada de tal forma que a quantidade do líquido de fermentação no aparelhode fermentação contínua tornou-se 1,5 I, por meio do quê foi produzido ácido L-láctico por fermentação contínua. Nesse momento, gás nitrogênio foialimentado de aparelho de alimentação de gás para o tanque de reação defermentação e o gás descarregado foi recuperado e novamente alimentadopara o tanque de reação de fermentação. Isso significa que o gás que contémgás nitrogênio foi fornecido por meio de reciclagem. Neste teste defermentação contínua, a quantidade de água de permeação de membrana foiregulada e alterada sob as condições de controle de água de permeação demembrana descritas acima, durante o quê a diferença de cabeça d'água foimedida como a diferença de pressão transmembrana com aparelho deregulagem de diferença de cabeça d'água 3. A concentração de ácido L-lácticoproduzida no líquido de fermentação de permeação de membrana e aconcentração de glicose residual foram medidas em momento apropriado. Orendimento de ácido L-láctico com relação a açúcar calculado a partir do ácidoL-láctico e glicose introduzida calculada a partir da concentração de glicose e avelocidade de produção de ácido L-láctico são exibidos na Tabela 24.
Como resultado do teste de fermentação por 400 horas, produçãoestável de ácido L-láctico por meio de fermentação contínua foi viável por meiodo método de fabricação de produto químico de acordo com a presenteinvenção utilizando o aparelho de fermentação contínua da Fig. 2. A diferençade pressão transmembrana variou dentro de 2 kPa em todo o período defermentação contínua.
Exemplo Comparativo 15
Produção de Ácido L-Láctico por Meio de Fermentação em Bateladas
Como forma de fermentação utilizando microorganismo, a maiorparte da fermentação em bateladas típica foi conduzida em fermentador dejarra de dois litros para avaliar a sua produtividade de ácido L-láctico. O meioexibido na Tabela 23 foi utilizado após esterilização a vapor em alta pressão(121 0C, quinze minutos). Neste exemplo comparativo, linhagem deLactococcus Iactis JCM7638 foi utilizada como microorganismo procariótico e aconcentração de ácido L-láctico como produto foi avaliada por meio do métodoexibido no Exemplo de Referência 1. A concentração de glicose foi medida comTeste de Glicose Wako C (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). As condiçõesde operação deste exemplo comparativo são as seguintes:Capacidade do tanque de reação de fermentação: 1 (L)Controle de temperatura: 37 (°C)
Aeração do tanque de reação de fermentação: 50 (ml/min)nitrogênio
Velocidade de agitação do tanque de reação de fermentação: 200(rpm)
Ajuste de pH: ajustado em pH 6,5 com 8 N de amônia aquosaEm primeiro lugar, linhagem de Lactococcus Iactis JCM 7638 foicultivada de forma estática em 5 ml do meio de fermentação de ácido lácticopurgado com gás nitrogênio exibido na Tabela 23 por 24 horas sob temperaturade 37°C (cultivo prévio preliminar). O cultivo resultante foi inoculado em 50 mlde meio de fermentação de ácido láctico purgado com gás nitrogênio novo ecultivado de forma estática por 48 horas sob temperatura de 37°C (cultivoprévio). O cultivo prévio resultante foi inoculado em 1 I do meio de fermentaçãocontínua/em bateladas exibido na Tabela 23 em fermentador de jarra esubmetido a fermentação em bateladas. Os resultados de fermentação embateladas são exibidos na Tabela 24.
Tabela 24
<table>table see original document page 150</column></row><table>
Poder-se-á revelar que a velocidade de produção de ácido L-láctico foi significativamente aprimorada pelo método de fabricação de produtoquímico de acordo com a presente invenção utilizando o aparelho defermentação exibido nas Figs. 1 e 2.
Exemplo de Referência 6
Preparação de DNA Cromossòmico de Linhagem de Bacillus laevolacticusJCM2513
Linhagem de Bacillus laevolacticus JCM2513 foi inoculada em100 ml de meio GYP (meio GYP descrito em JP-A n° 2003-088392) e cultivadasob temperatura de 30 0C por 24 horas para obter cultivo. O cultivo resultantefoi centrifugado a 3000 rpm por quinze minutos para obter 0,5 g demicroorganismo umedecido e, a partir do microorganismo umedecido, DNAcromossòmico foi obtido por meio de método de Saito e Miura (Biochem.Biophys. Acta., 72, 619 (1963)). Em seguida, 60 μg do DNA cromossòmico e 3U de enzima de restrição Sau3AI foram misturados em 10 mM de tampão Tris- HCI (50 mM de NaCI1 10 mM de MgSO4 e 1 mM de ditiotreitol (pH 7,4)) ereagidos sob temperatura de 37 0C por trinta minutos. A solução de reação foiextraída com fenol e precipitada com etanol de forma habitual para obter 50 μgde fragmento de DNA cromossòmico digerido por Sau3AI de linhagem deBaciillus laevolacticus JCM2513.
Exemplo de Referência 7
Preparação de Biblioteca de Genes de Linhagem JCM2513 de Bacilluslaevolacticus utilizando DNA de vetor de plasmídeo
20 μg de DNA de vetor de plasmídeo (pUC19) capaz dereprodução autônoma em Escherichia coli e 200 U de enzima de restriçãoBamHI foram misturados em 50 mM de tampão Tris-HCI (que contém 100 mMde NaCI, 10 mM de sulfato de magnésio (pH 7,4)) e reagiram sob temperaturade 37 0C por duas horas para obter solução de digestão e a solução dedigestão foi extraída com fenol e precipitada com etanol de forma habitual.Em seguida, o fragmento de DNA derivado de vetor de plasmídeofoi desfosforilado por meio de tratamento com fosfatase álcali bacteriana paraevitar nova união, extraído com fenol e precipitado com etanol de formahabitual.
1 µg deste pUC19 digerido com BamHI e 1 μg do fragmento deDNA cromossômico de linhagem de Bacillus Iaevolacticus JCM 2513 digeridacom Sau3AI, obtido no Exemplo de Referência 3, e 2 U de T4 DNA Iigase(fabricada pela Takara Shuzo Co., Ltd.) foram adicionados a 66 mM de tampãoTris-HCl (pH 7,5) que contém 66 mM de cloreto de magnésio, 10 mM deditiotreitol e 10 mM de ATP e reagiram sob temperatura de 16 °C por dezesseishoras para ligar os DNAs. Em seguida, a mistura de DNA resultante foi utilizadade forma habitual para transformar Escherichia eoli JM109 que foi colocado emplacas em seguida sobre meio LB agar contendo 50 μg/ml de ampicilina sódio,para obter cerca de vinte mil colônias para uso como biblioteca genética. Dascerca de vinte mil colônias, foi recuperado DNA recombinante. O método derecuperação seguiu-se ao método de Saito & Miura descrito acima.
Exemplo de Referência 8
Preparação de Hospedeiro para Seleção de Gene D-LactatoDesidrogenase
Seleção de gene D-LDH de linhagem JCM2513 de Bacilluslaevolaetieus foi conduzida por meio de complementação funcional. O princípioé descrito em detalhes em Dominique1 G., Appi Environ. Mierobiol., EstadosUnidos (1995), 61 266-272. Isso significa que é necessário preparar linhagemde Eseheriehia eoli com deficiência na atividade de D-Iactato desidrogenase ena atividade de piruvato formato-liase. Linhagem de Eseherichia eoli tornadadeficiente por meio da destruição de gene D-Iactato desidrogenase (IdhA) egene de piruvato formato-liase (pflB e pflD) foi preparada por meio de métodode Kirill et al (Kirill, A., PNAS, Estados Unidos (2000) 97 6640-6645). Alinhagem preparada desta forma foi denominada linhagem TM33 (E. coli AldhAApflB::Kmr ApflD::Cmr) e utilizada como hospedeiro para a seleção de gene D-lactato desidrogenase.
Exemplo de Referência 9
Seleção de Gene D-Lactato Desidrogenase
Linhagem TM33 de Escherichia coli foi inoculada em 100 ml demeio LB que contém 50 μg/ml de sulfato de canamicina e 15 μg/ml decloranfenicol e cultivada sob temperatura de 37°C por 24 horas para obtercultivo. O cultivo obtido desta forma foi centrifugado a 3000 rpm por quinzeminutos para obter 0,8 g de microorganismo úmido. O microorganismo úmidoobtido foi lavado por três vezes com 10 ml de glicerol a 10% e suspenso emseguida em 0,1 ml de glicerol a 10% para obter células competentes. 1 μΙ dabiblioteca genética derivada de linhagem de Bacillus Iaevolacticus JCM2513obtida no Exemplo de Referência 8 foi adicionado e introduzido de formahabitual por meio de eletroporação às células competentes e as linhagensresultantes foram colocadas sobre meio agar M9GP (meio M9 + 0,4% glicose +0,2% peptona) que contém 50 μg/ml de ampicilina sódio para obter diversaslinhagens capazes de cultivo sob condições anaeróbicas.
Exemplo de Referência 10
Análise de Seqüência de Nucleotídeos de DNA que Contém o Gene D-Lactato Desidrogenase
A partir da linhagem de Eseheriehia coli TM33/pBL2 que contém oDNA recombinante obtido acima, foi preparado plasmídeo de forma habitual e oDNA recombinante resultante foi utilizado em seqüenciamento de nucleotídeos.Seqüenciamento de nucleotídeos foi conduzido de acordo com o método deSanger utilizando Kit de Seqüenciamento de Ciclos de Término Taq DyeDeoxy(fabricado pela Applied Biochemical). A seqüência de nucleotídeos resultantedo DNA que contém o gene D-Iactato desidrogenase foi de 2995 pares debases. Conduziu-se pesquisa de quadro de leitura aberta para esta seqüênciae seqüência de DNA (SEQ ID N0 10) do gene D-Iactato desidrogenase com1011 bp foi determinada temporariamente utilizando Genetyx (fabricado pelaSoftware Kaihatsu Co., Ltd.).
Exemplo de Referência 11
Preparação de Vetor de Expressão para Gene D-Lactato DesidrogenaseGene D-LDH foi clonado de Bacillus Iaevolacticus. O gene D-LDHfoi clonado por meio de PCR e introduzido da mesma forma em vetor deexpressão. O método de clonagem é descrito abaixo.
Bacillus laevolactieus foi cultivado e recuperado em seguida pormeio de centrifugação, seguido por extração de DNA de genoma com Kit deIsolamento de DNA Microbiano UItraCIean (fabricado pela MO ΒΙΟ). Aoperação específica seguiu o protocolo ligado ao kit. O DNA de genomaresultante foi utilizado em seguida como modelo em PCR. O DNA obtido acimafoi utilizado como modelo na clonagem de gene D-LDH por meio de PCR. Nareação de amplificação por PCR, utilizou-se KOD-Plus-polimerase (fabricadapela Toyobo) estimada como possuindo precisão de cinqüenta vezes comrelação a Taq. O tampão de reação, mistura de dNTP etc. utilizados foram osligados ao kit. Primers de amplificação de gene D-LDH (SEQ ID N0 11 e 12)foram preparados de tal forma que seqüência de reconhecimento de Xhol eseqüência de reconhecimento de Notl foram adicionadas aos lados 5 e 3-terminais, respectivamente.
Cada fragmento de amplificação de PCR foi purificado, fosforiladoem seguida no seu término com T4 polinucleotídeo quinase (fabricada pelaTAKARA) e ligado a vetor pUC118 (que havia sido tratado por meio de divisãocom enzima de restrição Hincll e submissão em seguida da superfície dedivisão a desfosforilação). Esta ligação foi conduzida com kit de ligação deDNA Ver. 2 (fabricado pela TAKARA). O produto de ligação foi utilizado paratransformar Escherichia coli DH5a do qual DNA de plasmídeo foi recuperadoem seguida para obter plasmídeo em que cada gene D-LDH havia sidosubclonado. O vetor pUC118 resultante no qual o gene D-LDH havia sidoinserido foi digerido com enzimas de restrição Xhol e Notl e cada um dosfragmentos de DNA resultantes foi inserido em local de divisão de Xhol/Notl devetor de expressão de levedura pTRS11 (Fig. 5). O vetor de expressão de geneD-LDH preparado desta forma foi denominado pTM63.
Exemplo de Referência 12
Introdução do Vetor de Expressão de Gene D-LDH em LevedurapTM63 obtido no Exemplo de Referência 11 foi transformado emlinhagem de levedura Saccharomyces cerevisiae NBRC 10505. Estatransformação foi conduzida por meio do método de acetato de lítio utilizandoSistema de Transformação de Levedura YEASTMAKER (fabricado pelaCLONTECH). A operação específica seguiu o protocolo ligado ao kit. Alinhagem de Saccharomyees cerevisiae NBRC 10505 utilizada comohospedeiro é linhagem com deficiência na capacidade de produção de uracil eo seu transformador ao qual havia sido introduzido pTM63 pode serselecionado sobre meio livre de uracil pela função de gene URA3 possuída porpTM63.
A introdução do vetor de expressão de gene D-LDH notransformador obtido desta forma foi confirmada por meio da extração de DNAde genoma que contém DNA de plasmídeo por meio de kit de extração de DNAde genoma Gentrukun (fabricado pela TAKARA) e utilização em seguida doDNA de genoma como modelo em PCR com Mistura Prévia de Taq (fabricadapela TAKARA). Como primer, foi utilizado o primer empregado na clonagem dogene D-LDH. Como resultado, confirmou-se que todos os transformadorescontinham gene D-LDH neles introduzido.
Linhagem de Saccharomyees cerevisiae NBRC 10505 na qualhavia sido introduzido pTM63 é designada a seguir linhagem NBRC10505/pTM63.
Exemplo 31
Produção de Ácido D-Láctico por Meio de Fermentação Contínua (N° 1)
A produção de ácido L-láctico foi conduzida utilizando o aparelhode fermentação contínua do tipo separação de membrana da Fig. 1 e meio deprodução de ácido D-láctico que possui a composição exibida na Tabela 25. Omeio foi utilizado após esterilização a vapor em alta pressão (121 °C quinzeminutos). Como material de elemento de membrana de separação, utilizou-semoldagem de resina de polissulfona e aço inoxidável. Como membrana deseparação, foi utilizada a membrana porosa preparada no Exemplo deReferência 2. A menos que indicado em contrário, as condições de operaçãodeste exemplo são as seguintes:
Capacidade do tanque de reação de fermentação: 2,0 (L)Membrana de separação utilizada: membrana de filtragem de
Área de filtragem eficaz do elemento de separação de membrana:Controle de temperatura: 30 (°C)
Aeração do tanque de reação de fermentação: 0.2 (l/min) arVelocidade de agitação do tanque de reação de fermentação: 800
Ajuste de pH: ajustado em pH 5,0 com 5 N NaOHEsterilização: o tanque de cultivo, incluindo o elemento demembrana de separação, e o meio utilizado foram esterilizados com vapor sobalta pressão em autoclave a 121°C por vinte minutos.
Regulagem da quantidade de água de permeação da membrana:regulagem da velocidade de fluxo por diferença de pressão transmembrana(do início da fermentação contínua até 100 horas: regulada em0,1 kPa ou mais a 5 kPa ou menos;
- 100 horas a 200 horas: regulada em 2 kPa ou menos; e
- 200 horas a 320 horas: regulada em 0,1 kPa ou mais a 20kPa ou menos).
Linhagem NBRC10505/pTM63 foi utilizada como microorganismo,meio de produção de ácido D-láctico que possui a composição exibida naTabela 25 foi utilizado como meio e a concentração de ácido D-láctico comoproduto foi medida por meio do mesmo método de HPLC do Exemplo deReferência 1. A concentração de glicose foi medida com Teste de GlicoseWako C (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.).
Tabela 25
Meio de Fermentação de Ácido Láctico de Levedura
<table>table see original document page 157</column></row><table>
Em primeiro lugar, a linhagem de NBRC10505/pTM63 foicultivada com agitação por uma noite em 5 ml de meio de produção de ácidoD-láctico em tubo de ensaio (antes do cultivo prévio preliminar). O cultivoresultante foi inoculado em 50 ml de meio de produção de ácido D-láctico novoe cultivado com agitação por 24 horas sob temperatura de 30 0C em frascoSakaguchi de 500 ml (cultivo prévio preliminar). O cultivo prévio preliminar foiinoculado em 2,0 I de meio de produção de ácido D-láctico no aparelho defermentação contínua do tipo de separação de membrana exibido na Fig. 1,tanque de reação de fermentação 1 foi agitado a 800 rpm com agitador 5 a elefixado, seguido pela regulagem de aeração, controle de temperatura e ajustede pH do tanque de reação 1 e o microorganismo foi cultivado por 24 horas(cultivo prévio).
Imediatamente após o término do cultivo prévio, a bomba decirculação de líquido de fermentação 10 foi operada e o microorganismo foicultivado continuamente sob as condições em que, além das condições deoperação no momento do cultivo prévio, tanque de separação de membrana 2foi aerado, meio de fermentação de ácido D-láctico foi alimentadocontinuamente e a quantidade de água de permeação de membrana foiregulada de tal forma que a quantidade do líquido de fermentação no aparelhode fermentação contínua do tipo separação de membrana tornou-se 2 I, pormeio do quê cadaverina foi produzida por meio de fermentação contínua. Nesteteste de fermentação contínua, a quantidade de água de permeação demembrana foi regulada e alterada sob as condições de controle de água depermeação de membrana descritas acima, durante o quê a diferença decabeça d'água foi medida como a diferença de pressão transmembrana comaparelho de regulagem de diferença de cabeça d'água 3. A concentração deácido láctico produzida no líquido de fermentação de permeação de membranae a concentração de glicose residual foram medidas em momento apropriado.Os resultados no teste de fermentação contínua por 320 horas são exibidos naTabela 26.
A produção estável de ácido D-láctico por meio de fermentaçãocontínua foi viável por meio do método de fabricação de produto químico deacordo com a presente invenção utilizando o aparelho de fermentação contínuado tipo de separação de membrana. A diferença de pressão transmembranavariou dentro de 2 kPa em todo o período de fermentação contínua.
Exemplo 32
Produção de Ácido D-Láctico por Meio de Fermentação Contínua (N0 2)
A produção de ácido D-láctico foi conduzida utilizando o aparelhode fermentação contínua da Fig. 2 e meio de produção de ácido D-láctico quepossui a composição exibida na Tabela 25. O meio foi utilizado apósesterilização a vapor em alta pressão (121 °C quinze minutos). Como materialde elemento de membrana de separação, utilizou-se moldagem de resina depolissulfona e aço inoxidável. Como membrana de separação, foi utilizada amembrana porosa preparada no Exemplo de Referência 2. A menos queindicado em contrário, as condições de operação deste exemplo são asseguintes:
Capacidade do tanque de reação de fermentação: 1,5 (L)
Membrana de separação utilizada: membrana de filtragem defluoreto de polivinilideno
Área de filtragem eficaz do elemento de separação de membrana:120 cm2
Controle de temperatura: 30 (°C)
Aeração do tanque de reação de fermentação: 0,2 (l/min) ar
Velocidade de agitação do tanque de reação de fermentação: 800(rpm)
Ajuste de pH: ajustado em pH 5,0 com 5 N NaOH
Esterilização: o tanque de cultivo, incluindo o elemento demembrana de separação, e o meio utilizado, foram esterilizados com vapor sobalta pressão em autoclave a 121°C por vinte minutos.
Regulagem da quantidade de água de permeação da membrana:regulagem da velocidade de fluxo por diferença de pressão transmembrana
(do início da fermentação contínua até 90 horas: regulada em 0,1kPa ou mais a 5 kPa ou menos;
- 90 horas a 180 horas: regulada em 0,1 kPa ou mais a 2kPa ou menos; e
- 180 horas a 264 horas: regulada em 0,1 kPa ou mais a 20kPa ou menos).
Linhagem NBRC10505/pTM63 foi utilizada como microorganismo,meio de produção de ácido D-láctico que possui a composição exibida naTabela 25 foi utilizado como meio e a concentração de ácido D-láctico comoproduto foi medida por meio do mesmo método de HPLC do Exemplo deReferência 1. A concentração de glicose foi medida com Teste de GlicoseWako C (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.).
Em primeiro lugar, a linhagem de NBRC10505/pTM63 foicultivada com agitação por uma noite em 5 ml de meio de produção de ácidoD-láctico em tubo de ensaio (antes do cultivo prévio preliminar). O cultivoresultante foi inoculado em 50 ml de meio de produção de ácido D-láctico novoe cultivado com agitação por 24 horas sob temperatura de 30 0C em frascoSakaguchi de 500 ml (cultivo prévio preliminar).
O cultivo prévio preliminar foi inoculado em 1,5 I de meio deprodução de ácido D-láctico no aparelho de fermentação contínua exibido naFig. 2, tanque de reação de fermentação 1 foi agitado a 800 rpm com agitador5 a ele fixado, seguido pela regulagem de aeração, controle de temperatura eajuste de pH do tanque de reação de fermentação 1, enquanto omicroorganismo foi cultivado por 24 horas (cultivo prévio). Imediatamente apóso término do cultivo prévio, o microorganismo foi cultivado continuamenteenquanto meio de produção de ácido D-láctico era alimentado continuamente ea quantidade de água de permeação de membrana foi regulada de tal formaque a quantidade do líquido de fermentação no aparelho de fermentaçãocontínua se tornasse 1,5 I, por meio do quê foi produzido ácido D-láctico porfermentação contínua. Neste teste de fermentação contínua, a quantidade deágua de permeação de membrana foi regulada e alterada sob as condições decontrole de água de permeação de membrana descritas acima, durante o quê adiferença de cabeça d'água foi medida como a diferença de pressãotransmembrana com aparelho de regulagem de diferença de cabeça d'água 3.A concentração de ácido D-láctico produzida no líquido de fermentação depermeação de membrana e a concentração de glicose residual foram medidasem momento apropriado. A velocidade de produção de ácido D-lácticocalculada a partir do ácido D-láctico e glicose introduzida é exibida na Tabela 26.
Como resultado do teste de fermentação por 264 horas, produçãoestável de ácido D-láctico por meio de fermentação contínua foi viável por meiodo método de fabricação de produto químico de acordo com a presenteinvenção utilizando o aparelho de fermentação contínua da Fig. 2. A diferençade pressão transmembrana variou dentro de 2 kPa em todo o período defermentação contínua.
Exemplo Comparativo 16
Produção de Ácido D-Láctico por Meio de Fermentação em Bateladas
Como forma de fermentação utilizando microorganismo, a maiorparte da fermentação de bateladas típica foi conduzida em fermentador de jarrade dois litros para avaliar a sua produtividade de ácido D-láctico. O meio foiutilizado após esterilização a vapor em alta pressão (121 0C1 quinze minutos).Neste exemplo comparativo, linhagem NBRC10505/pTM63 foi utilizada comomicroorganismo, a concentração de ácido D-láctico como produto foi avaliadapor meio de HPLC e a concentração de glicose foi medida com Teste deGlicose Wako C (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). As condições deoperação deste exemplo comparativo são as seguintes:
Capacidade do tanque de reação de fermentação (quantidade domeio de produção de ácido D-láctico): 1,0 (L)
Controle de temperatura: 30 (°C)
Aeração do tanque de reação de fermentação: 0,2 (l/min) ar
Velocidade de agitação do tanque de reação de fermentação: 300(rpm)
Ajuste de pH: ajustado em pH 5,0 com 5 N NaOH
Em primeiro lugar, a linhagem de NBRC10505/pTM63 foicultivada com agitação por uma noite em 5 ml de meio de produção de ácidoD-láctico em tubo de ensaio (cultivo prévio preliminar). O cultivo resultante foiinoculado em 50 ml de meio de produção de ácido D-láctico novo e cultivadocom agitação por 24 horas sob temperatura de 30°C em frasco Sakaguchi de500 ml (cultivo prévio). O cultivo prévio resultante foi inoculado em 1,5 I demeio de produção de ácido D-láctico em fermentador de jarra. Omicroorganismo foi submetido a fermentação em bateladas com o meio deprodução de ácido D-láctico. Os resultados são exibidos na Tabela 26.
Tabela 26
<table>table see original document page 162</column></row><table>Pôde-se revelar que a velocidade de produção de ácido D-lácticofoi significativamente aprimorada pelo método de fabricação de produtoquímico de acordo com a presente invenção utilizando o aparelho defermentação exibido nas Figs. 1 e 2.
Exemplo de Referência 13
Preparação de Membrana Porosa (N° 5)
Homopolímero de fluoreto de vinilideno que possui pesomolecular ponderai médio de 417.000 e γ-butirolactona foram fundidos sobtemperatura de 170°C em quantidades de 38% em peso e 62% em peso,respectivamente, para preparar solução padrão. Esta solução padrão,acompanhada por γ-butirolactona como líquido de formação de espaços ocos,foi descarregada de base e resfriada em banho de resfriamento que consistede solução aquosa de γ-butirolactona a 80% sob temperatura de 20 0C parapreparar membrana de fibra oca.
Em seguida, 14% em peso de homopolímero fluoreto de vinilidenoque possui peso molecular ponderai médio de 284.000, 1% em peso depropionato acetato de celulose (CAP482-0.5 fabricado pela Eastman Chemical),77% em peso de N-metil-2-pirrolidona, 5% em peso de ácido graxo de óleo decoco de polioxietileno sorbitan (nome comercial: Ionet T-20C, fabricado pelaSanyo Chemical Industries, Ltd.) e 3% em peso de água foram misturados efundidos sob temperatura de 95 0C para preparar solução padrão. Esta soluçãopadrão foi aplicada uniformemente sobre a superfície da membrana de fibra ocae imediatamente coagulada em banho de água para preparar membrana de fibraoca. A membrana de fibra oca resultante apresentou tamanho médio de poro de0,05 μιτι sobre a superfície do lado tratado com água. Quando a membrana deseparação foi avaliada para determinar o seu coeficiente de permeabilidade aágua purificada, o coeficiente de permeabilidade a água purificada foi de 5,5 χ10-9 m3/m2s-Pa. A medição do coeficiente de permeabilidade a água purificadafoi conduzida com água purificada tratada com membrana de osmose reversa a25 0C com altura de cabeça de um metro. O desvio padrão do tamanho médio deporo foi de 0,006 μηι.
Exemplo 33
Preparação de Ácido L-Láctico com Membrana de Fibra Oca (N01)
É descrito o elemento de membrana de separação exibido na Fig.4 que possui área de filtragem efetiva de 120 cm2 preparada utilizandomembrana porosa preparada no Exemplo de Referência 13 como membrana deseparação no mesmo teste de fermentação contínua de ácido L-láctico doExemplo 1. Os resultados, junto com os resultados do Exemplo Comparativo 1,são exibidos na Tabela 27. A produção estável de ácido L-láctico por meio defermentação contínua foi viável. A diferença de pressão transmembrana varioudentro de 2 kPa em todo o período de fermentação contínua.
Exemplo 34
Preparação de Ácido L-Láctico com Membrana de Fibra Oca (N0 2)
É descrito o elemento de membrana de separação exibido na Fig. 4que possui área de filtragem efetiva de 120 cm2 preparada utilizando membranaporosa preparada no Exemplo de Referência 13 como membrana de separaçãono mesmo teste de fermentação contínua de ácido L-láctico do Exemplo 4. Osresultados, junto com os resultados do Exemplo Comparativo 1, são exibidos naTabela 27. Pôde-se confirmar que a produção estável de ácido L-láctico por meiode fermentação contínua foi viável. A diferença de pressão transmembrana varioudentro de 2 kPa em todo o período de fermentação contínua.
Tabela 27
<table>table see original document page 164</column></row><table><table>table see original document page 165</column></row><table>
Aplicação Industrial
A presente invenção refere-se a método de fabricação de produtoquímico por meio de fermentação contínua, mantendo alta produtividade deforma estável por longo período por meio de método simples de operação.Segundo a presente invenção, a fermentação contínua mantendo altaprodutividade de forma estável por longo tempo sob condições simples deoperação torna-se viável e produto químico que é produto de fermentação podeser amplamente fabricado de forma estável sob baixo custo na indústria defermentação.Listagem de Seqüências
<110> Toray Industries, Inc
<120> MÉTODO DE FABRICAÇÃO DE PRODUTO QUÍMICO E APARELHO DEFERMENTAÇÃO CONTÍNUA
<130> 06082
<160> 12
<170> PatentIn version 3.1
<210> 1
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> primer<400> 1
ctcgagatgg caactctaaa ggatca 26
<210> 2
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> primer<400> 2
gcggccgctt aaaattgcag ctcctttt 28
<210> 3
<211> 999
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 3
atggcaactc taaaggatca gctgatttat aatcttctaa aggaagaaca gaccccccag 60
aataagatta cagttgttgg ggttggtgct gttggcatgg cctgtgccat cagtatctta 120
atgaaggact tggcagatga acttgctctt gttgatgtca tcgaagacaa attgaaggga 180
gagatgatgg atctccaaca tggcagcctt ttccttagaa caccaaagat tgtctctggc 240
aaagactata atgtaactgc aaactccaag ctggtcatta tcacggctgg ggcacgtcag 300
caagagggag aaagccgtct taatttggtc cagcgtaacg tgaacatatt taaattcatc 360attcctaatg ttgtaaaata cagcccgaacgatatcttga cctacgtggc ttggaagataagtggttgca atctggattc agcccgattccacccattaa gctgtcatgg gtgggtcctttggagtggaa tgaatgttgc tggtgtctctgataaagata aggaacagtg gaaagaggttgtgatcaaac tcaaaggcta cacatcctgggagagtataa tgaagaatct taggcgggtgtacggaataa aggatgatgt cttccttagttcagaccttg tgaaggtgac tctgacttctgatacacttt gggggatcca aaaggagctg<210> 4 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 4 tctcaattat tattttctac tcataacctcatggcaactc taaaggatca <210> 5 <211> 20 <212> DNA
<213> Artificial<220>
<223> primer
<400> 5
aggcgtatca cgaggccctt
<210> 6
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
2
tgcaagttgc ttattgtttc aaatccagtg 420agtggttttc ccaaaaaccg tgttattgga 480cgttacctga tgggggaaag gctgggagtt 540ggggaacatg gagattccag tgtgcctgta 600ctgaagactc tgcacccaga tttagggact 660cacaagcagg tggttgagag tgcttatgag 720gctattggac tctctgtagc agatttggca 780cacccagttt ccaccatgat taagggtctt 840gttccttgca ttttgggaca gaatggaatc 900gaggaagagg cccgtttgaa gaagagtgca 960caattttaa 999acgcaaaata acacagtcaa atcaatcaaa 60
80 20<223> primer
<4 00> 6
gaattaattc ttgaagacga aagggcctcg tgatacgcct agattgtact gagagtgcac
<210> 7
<211> 80
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> primer<4 00> 7
tatttttcgt tacataaaaa tgcttataaa actttaacta ataattagag attaaatcgc
ctgtgcggta tttcacaccg
<210> 8
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> primer<4 00> 8
caaatatcgt ttgaatattt ttccg
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> primer<400> 9
aatccagatt gcaaccactt
<210> 10<211> 1011<212> DNA
<213> Bacillus laevolacticus<400> 10
atgaaattct tgatgtatgg agtacaagat catgagagag caacgatcga gaattgggcaaatcaacatc aggtggagat cgcaacaacc tcagatttcc tctcagaaga tacagtcgct
caatcgaaag gctttgacgg tatctgcatt caacagccga ttgcactcgg aggcccgaatttatacactc aattaaaaaa caacggtatc
gacatgattg atttgaacga agccgagaaa
tactcccctt acgcagtcgc cgagctcgcg
attcctgaat tcaataaacg tgttgcaggc
agagaaatcc gatcattaac ggtcggcata
gcacagctct tcaaaggact aggggcaaaa
cggctaaacg gtatccttga ctatcggcct
atcatttctc ttcacacgcc gctttttgat
ttaaaactga tgaaaaatag tgcctatcta
actgaagatc tgattgaagc acttgaaaac
tttgaaaatg aactcatgat taataaagat
ctttcgaaac ttctcgatat ggaacaagtg
gagaccgcca ttcaaaacat tgttgaaggt
acaggaacaa gcaaaaatct tgttcaagca
<210> 11
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> primer<400> 11
ctcgagatga aattcttgat gtatggagta
<210> 12
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> primer<400> 12
gcggccgctt attttgccga tagcggttgt
aaacagattg ctacacgaac agccggttac 240aacagtttgt tggtgaccaa tgttccagca 300gtcactcagg cgatgcagct cgtccgccat 360aaagattttc gctggtcagg ccttatttcc 420gtcggcaccg gccgcatcgg tgcaacggcc 480atcattggtt ttgatcaata tcccaacgat 540tcacttgaag acgtgcttaa ggaagctgat 600tcgactcggc acatgatcaa taaaagcaca 660atcaatgttg ccagaggcgg cttaattaaa 720ggcgaaattg ccggtgcagc gttagatacc 780ctgagtaagc agccgctcaa tgatccgctt 840ctgctcacac cgcatgtcgg cttctttact 900gccttagaca gtgttgtcga ggttttgaag 960caaccgctat cggcaaaata a 1011
30
30

Claims (26)

1. MÉTODO DE FABRICAÇÃO DE PRODUTO QUÍMICO, pormeio de fermentação contínua que inclui a filtragem de cultivo demicroorganismo ou células cultivadas com membrana de separação pararecuperar produto de filtrado, retenção simultânea de fluido não filtrado nocultivo ou envio para ele em refluxo e adição de materiais de fermentação aocultivo, em que membrana porosa que possui tamanho médio de poro de 0,01μm ou mais a menos de 1 μm é utilizada como membrana de separação e afiltragem é conduzida com diferença de pressão transmembrana na faixa de 0,1a 20 kPa.
2. MÉTODO DE FABRICAÇÃO DE PRODUTO QUÍMICO, deacordo com a reivindicação 1, em que o coeficiente de permeabilidade a áreapurificada para a membrana porosa é de preferencialmente 2 χ 10"9 m3/m2/s/paou mais a 6 x10"7 m3/m2/s/pa ou menos.
3. MÉTODO DE FABRICAÇÃO DE PRODUTO QUÍMICO, deacordo com a reivindicação 1, em que o tamanho médio de poro da membranaporosa é de 0,1 μm ou mais a menos de 0,2 μm e o desvio padrão do tamanhode poro da membrana porosa é de 0,1 μm ou menos.
4. MÉTODO DE FABRICAÇÃO DE PRODUTO QUÍMICO, deacordo com a reivindicação 1, em que a membrana porosa é preferencialmentemembrana porosa que possui aspereza de superfície de 0,1 μm ou menos.
5. MÉTODO DE FABRICAÇÃO DE PRODUTO QUÍMICO, deacordo com a reivindicação 1, em que a membrana porosa é preferencialmentemembrana porosa que contém camada de resina porosa.
6. MÉTODO DE FABRICAÇÃO DE PRODUTO QUÍMICO, deacordo com a reivindicação 5, em que a camada de resina porosa é camada deresina porosa fabricada com polímero orgânico.
7. MÉTODO DE FABRICAÇÃO DE PRODUTO QUÍMICO, deacordo com a reivindicação 5, em que o material da membrana de polímeroorgânico é fluoreto de polivinilideno.
8. MÉTODO DE FABRICAÇÃO DE PRODUTO QUÍMICO, deacordo com a reivindicação 1, em que o cultivo do microorganismo ou célulascultivadas e os materiais de fermentação contêm açúcares.
9. MÉTODO DE FABRICAÇÃO DE PRODUTO QUÍMICO, deacordo com a reivindicação 1, em que o produto químico é ácido orgânico.
10. MÉTODO DE FABRICAÇÃO DE PRODUTO QUÍMICO, deacordo com a reivindicação 1, em que o produto químico é ácido L-láctico.
11. MÉTODO DE FABRICAÇÃO DE PRODUTO QUÍMICO, deacordo com a reivindicação 1, em que o produto químico é ácido D-láctico.
12. MÉTODO DE FABRICAÇÃO DE PRODUTO QUÍMICO, deacordo com a reivindicação 1, em que o produto químico é ácido pirúvico.
13. MÉTODO DE FABRICAÇÃO DE PRODUTO QUÍMICO, deacordo com a reivindicação 1, em que o produto químico é ácido succínico.
14. MÉTODO DE FABRICAÇÃO DE PRODUTO QUÍMICO, deacordo com a reivindicação 1, em que o produto químico é ácido itacônico.
15. MÉTODO DE FABRICAÇÃO DE PRODUTO QUÍMICO, deacordo com a reivindicação 1, em que o produto químico é cadaverina.
16. MÉTODO DE FABRICAÇÃO DE PRODUTO QUÍMICO, deacordo com a reivindicação 1, em que o produto químico é álcool.
17. MÉTODO DE FABRICAÇÃO DE PRODUTO QUÍMICO, deacordo com a reivindicação 1, em que o produto químico é etanol.
18. MÉTODO DE FABRICAÇÃO DE PRODUTO QUÍMICO, deacordo com a reivindicação 1, em que o produto químico é 1,3-propanodiol.
19. MÉTODO DE FABRICAÇÃO DE PRODUTO QUÍMICO, deacordo com a reivindicação 1, em que o produto químico é ácido nucleico.
20. MÉTODO DE FABRICAÇÃO DE PRODUTO QUÍMICO, deacordo com a reivindicação 1, em que o produto químico é inosina.
21. MÉTODO DE FABRICAÇÃO DE PRODUTO QUÍMICO, deacordo com a reivindicação 1, em que o produto químico é aminoácido.
22. MÉTODO DE FABRICAÇÃO DE PRODUTO QUÍMICO, deacordo com a reivindicação 1, em que o produto químico é L-treonina.
23. APARELHO DE FERMENTAÇÃO CONTÍNUA, que éaparelho de fabricação de produto químico por meio de fermentação contínua,que inclui a filtragem de cultivo de microorganismo ou células cultivadas commembrana de separação para recuperar produto de filtrado, retençãosimultânea de fluido não filtrado no cultivo de fermentação ou envio para eleem refluxo e adição de materiais de fermentação ao cultivo de fermentação,que compreende: - tanque de reação de fermentação para cultivo defermentação de microorganismo ou células cultivadas; tanque de separação demembrana para filtragem do cultivo de fermentação, que é conectado pormeios de circulação de cultivo de fermentação ao tanque de reação defermentação e nele equipado com membrana de separação; e meios deregulagem da diferença de pressão transmembrana da membrana deseparação na faixa de 0,1 a 20 kPa; em que a membrana de separação é membrana porosa quepossui tamanho médio de poro de 0,01 μηπ ou mais a menos de 1 μηπ.
24. APARELHO DE FERMENTAÇÃO CONTÍNUA, que éaparelho de fabricação de produto químico por meio de fermentação contínua,que inclui a filtragem de cultivo de fermentação de microorganismo ou célulascultivadas com membrana de separação para recuperar produto de filtrado,retenção simultânea de fluido não filtrado no cultivo ou envio para ele emrefluxo e adição de materiais de fermentação ao cultivo de fermentação, quecompreende:tanque de reação de fermentação para fermentação demicroorganismo ou células cultivadas; elemento de membrana de separaçãopara filtragem do cultivo de fermentação, que é disposto no interior do tanquede reação de fermentação e equipado no seu interior com membrana deseparação; meios de descarga de produto de fermentação filtrado, que sãoconectados ao elemento de membrana de separação; e meios de regulagemda diferença de pressão transmembrana da membrana de separação na faixade 0,1 a 20 kPa;em que a membrana de separação é membrana porosa quepossui tamanho médio de poro de 0,01 μιτι ou mais a menos de 1 μιτι.
25. APARELHO DE FERMENTAÇÃO CONTÍNUA, de acordocom qualquer das reivindicações 23 ou 24, em que o coeficiente depermeabilidade a água purificada da membrana porosa é de 2 χ 10'9m3/m2/s/pa ou mais a 6 χ 10"7 m3/m2/s/pa ou menos.
26. APARELHO DE FERMENTAÇÃO CONTÍNUA, de acordocom qualquer das reivindicações 23 ou 24, em que o tamanho médio de poroda membrana porosa é de 0,01 μηι ou mais a menos de 0,2 μπίθο desviopadrão do tamanho de poro da membrana porosa é de 0,1 μιτι ou menos.
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