BRPI0707078A2 - processo aperfeiçoado para a obtenção de elevados rendimentos volumétricos do fator de estimulação de colÈnia de granulócito ( g- csf) em fermentação em um caldo de cultura - Google Patents

Abstract

PROCESSO APERFEIçOADO PARA A OBTENçáO DE ELEVADOS RENDIMENTOS VOLUMéTRICOS DO FATOR DE ESTIMULAçãO DE COLÈNIA DE GRANULóCITO (G-CSF) EM FERMENTAçãO EM UM CALDO DE CULTURA. A presente invenção descreve um processo aperfeiçoado para a produção de G-CSF com alto rendimento por meio de um grande aumento induzido a sal na estabilidade de plasmídeo durante a fase de produção.

Description

"PROCESSO APERFEIÇOADO PARA A OBTENÇÃO DE ELEVADOS RENDIMENTOSVOLUMÉTRICOS DO FATOR DE ESTIMULAÇÃO DE COLÔNIA DE GRANULÓCITO(G-CSF) EM FERMENTAÇÃO EM UM CALDO DE CULTURA"

Campo da Invenção

A presente invenção se refere a um processoaperfeiçoado para a produção de G-CSF com alto rendimento pormeio de um grande aumento induzido a sal na estabilidade deplasmideo durante a fase de produção.

Antecedentes da Invenção

O tratamento com Fator de estimulação de colôniade granulócitos citocina (G-CSF) aprimorou significativamente aqualidade de vida entre pacientes com neutropenia crônica severa[Jones et al. JAMA 270: 1132 - 1133 (1993)]. 0 G-CSF é umgatilho endógeno potente para a liberação de neutrófilos apartir dos depósitos da medula óssea e para a ativação dosmesmos para uma maior atividade antimicrobiana. 0 G-CSF tem sidoamplamente avaliado em diversos modelos de testes pré-clinicosde doença aguda, em geral com resultados promissores [MarshallJ.C. Shock 24: 120 - 9 (2005)]. Em virtude de sua eficáciacomprovada durante ciclos de quimioterapia, o G-CSF é uma drogabiofarmacêutica importante usada em oncologia. 0 G-CSF foiclonado e expresso em diversos tipos de células, por exemplo,células microbianas [Souza L.M. Science 232: 61 - 65 (1986); HuZ.Y. et al., Zhongguo Shenghua Yaowu Zazhi (1999), 20: 55 - 57],células de levedura [Lasnik M.A. et al. Biotechnol. Bioeng. 81:768 - 774 (2003); Lee S.M. et al., patente Korean KR 160934 Bl19981116], células de arroz [Hong et al. Protein Expr Purif.Epub ahead of print (2005)], células de felino [Yamamoto et al.'Gene 274: 263 - 269 (2001)], células ovarianas de Hamster Chinês[Monaco L. et al. Gene. 180:145 - 150 (1996)], células deinsetos [Shinkai et al. , Protein Expr Purif. 10: 379 - 385(1997)], e mesmo em cabra transgênica [Ko J.H. et al. ,Transgenic Res. 9: 215 - 22 (2000)]. Para uso farmacêutico o G-CSF é produzido primeiramente em Escherichia coli [Jevsevar S.et al., Biotechnol. Prog. 21: 632 - 639 (2005)], onde o mesmo éproduzido como corpos de inclusão, os quais são agregadosinsolúveis da proteína recombinante em conformação não nativa[ Baneyx F. & Mujacic M. Nature Biotechnol. 22: 1399 - 1408(2004)], que em geral não apresenta atividade biológica[Bernardez C.E. Curr. Opin. Biotechnol. 9: 157 - 163 (1998)]. Astecnologias de sua produção secretória [Jeong K.J. & Lee S.Y.Protein Expr Purif. 23: 311 - 318 (2001); Lee S.Y. et al.,Methods Mol. Biol. 308: 31 - 42 (2005) ], têm sido tambémreportadas. A expressão secretória em geral resulta na liberaçãoda forma propriamente dobrada ;do G-CSF no espaço periplásmico ouno meio extracelular, mas os rendimentos são bem menores do queaqueles obtidos com os corpos de inclusão. É, portanto,comercialmente benéfico se expressar G-CSF em E. coli comocorpos de inclusão. Adequadamente dobradas, a proteína G-CSFbiologicamente ativa é facilmente obtida a partir de corpos deinclusão de uma maneira comercialmente viável, usando processosde desnaturação e de renaturação aplicados subseqüentemente aoisolamento e à solubilização dos corpos de inclusão [Rudolph R,Em Protein Engineering: Principies e Practice; Cleland, J. L.,Craik, S. C., Eds.; Wiley-Liss, Inc.: New York, 1996; pp 283 -298; Rathore A. S. et al., J Pharm Biomed Anal. 32: 1199 - 1211(2003)].

Um dos métodos mais eficientes de produção deproteína recombinante em E. coli é o processo de alimentação"lote de alimentação", o qual pode ser realizado em modoscíclicos e não cíclicos. Os processos não cíclicos são menoscomplexos e portanto mais adequados para a produção industrial.

De fato, a técnica anterior descreve um dos maiores rendimentosde GCSF a partir de processos de alimentação não cíclicos queestá na faixa de 4,2 g/L - 4.4 g/L [Yim SC et al., Bioprocess eBiosystems Engineering (2001), 24, 249 - 254]. A realização defermentação do processo de alimentação no modo cíclico de modo ase obter maior rendimento cumulativo resulta em maiorinstabilidade de plasmídeo [Choi S. -J. et al. J. Microbiol.Biotechnol. 10: 321 - 326 (2000)], deste modo limitando arobustez do processo.

Em geral, de modo a ter uma alta expressão doproduto é imperativo se manter o plasmídeo extra cromossomalcontendo o produto de gene no interior da célula em sua formaprópria. Isto é em geral alcançado ao se manter a pressão deseleção no microorganismo recombinante ao se adicionar umantibiótico adequado ao caldo de cultura. O aumento no nível deexpressão do G-CSF ao se adicionar antibiótico (Ampicilina) acada 1-2 horas durante a fermentação para reduzir a "nãoestabilidade segregativa" da cepa recombinante foi reportada(Krivopalova G. N. et al., Patente Russa RU 2158303 C220001027) . A necessidade regulatória da evidência da depuraçãodo antibiótico a partir do produto final necessita o limite deseu uso. O uso mais elevado de antibióticos pode também ter umpotencial mais alto de ter um impacto ambiental indesejável. Masa redução na pressão de seleção de antibiótico com freqüênciaresulta em estabilidade de plasmídeo e níveis de expressãoreduzidos, o que compromete a robustez do processo. Portanto, éum desafio técnico se limitar o uso de antibiótico enquanto seaumenta a estabilidade de plasmideo e o nivel de expressão doproduto, em especial durante a fase de produção. Ademais, abaixa estabilidade do plasmideo durante a fase de produção podeainda ser em virtude de tensão metabólica [Saraswat V. et al.FEMS Microbiol. Lett. 179: 367 - 373 (1999)], e pode conduzir abaixos níveis de expressão [Cheng C. et al Biotechnol. Bioeng.56: 23 - 31 (1997)], tipicamente em culturas de alto volume.

Além de manter a alta pressão de seleção deantibiótico, a estabilidade de plasmideo pode ser aprimorada anível da construção de vetor [Schweder T. et al. Appl MicrobiolBiotechnol. 38: 91 - 93 (1992); Pan S. H. e Malcom B.A.Biotechniques. 29: 1234 - 1238 (2000)]. Em processo o mesmopode ser aperfeiçoado ao se ajustar às condições de cultura, talcomo ao evitar a privação de nutrientes [Smith & Bidochka Can.J. Microbiol. 44: 351 - 355 (1998)]. Enquanto se realizaprocessos de alimentação de limitação de substrato em grandeescala, limitação de nutriente/privação é iminente, e a adiçãode antibiótico seja com bastante freqüência ou em grandesquantidades são soluções também impraticáveis e onerosas paramanter o alto rendimento do produto e a alta estabilidade deplasmideo em um processo de baixa complexidade. Portanto, há umaclara necessidade de se desenvolver um processo alternativo parapreparar G-CSF em altos rendimentos volumétricos ao manter aelevada estabilidade de plasmideo usando um processo simples erobusto.

Sumário da Invenção

A presente invenção descreve um processo dealimentação não cíclico para produzir Fator de estimulação decolônia de granulócito (G-CSF) em altos rendimentos volumétricosem Escherichia coli ao manter alta estabilidade de plasmídeo nacultura, com o uso de Potássio em combinação com íons seja demagnésio ou de sódio em altas concentrações no meio de produçãoe caldo de cultura.

Breve Descrição dos Desenhos

A FIGURA 1 mostra o efeito de usar altaconcentração de Cátions de potássio e sódio na fase de produçãona estabilidade de Plasmídeo contendo gene G-CSF em CélulasBL21(DE3) no momento de coleta do lote. O Lote 2 foi realizadocom altas concentrações de sais de potássio e sódio, enquantoque o Lote 1 foi realizado sem altas concentrações de sais depotássio e sódio na fase de produção. Os lotes foram realizadosseparadamente em um fermentador 30-L.

A FIGURA 2 mostra o efeito de usar altaconcentração de cátions de potássio e sódio na fase de produçãoem Rendimento volumétrico de G-CSF no Lotes coletados. 0 Lote 2foi realizado com altas concentrações de sais de potássio esódio, enquanto que o Lote 1 foi realizado sem altasconcentrações de sais de potássio e sódio na fase de produção.Os lotes foram realizados separadamente em um fermentador 30-L.

A FIGURA 3 mostra o efeito de usar altaconcentração de cátions de magnésio e potássio na fase deprodução na estabilidade de plasmídeo contendo gene G-CSF emCélulas BL21 (DE3) no momento de coleta do lote. 0 Lote 4 foirealizado com alta concentração de sal de magnésio, enquanto queno Lote 3 a alta concentração de sal de magnésio não foi usadana fase de produção. Ambos os lotes foram realizados com altaconcentração de Sal de potássio, separadamente em um fermentador 30-L.

A FIGURA 4 mostra o efeito de usar altaconcentração de cátions de magnésio e potássio no rendimentovolumétrico de G-CSF no Lotes coletados. 0 Lote 4 foi realizadocom alta concentração de sal de magnésio, enquanto que no Lote 3a alta concentração de Sal de magnésio não foi usada na fase deprodução. Ambos os lotes foram realizados com alta concentraçãode Sal de potássio separadamente em um fermentador 30-L.

A FIGURA 5 mostra o efeito de usar altocoeficiente de crescimento especifico na fase de produção emrendimento volumétrico de G-CSF no Lotes coletados. Durante afase de produção o Lote 4 apresentou um coeficiente decrescimento especifico médio de cerca de 0.04 l/h, enquanto queo Lote 5 apresentou um coeficiente de crescimento especificomédio de cerca de 0.07 l/h. Ambos os lotes foram realizados comaltas concentrações de sais de potássio e magnésio,separadamente em um fermentador 30-L.

A FIGURA 6 mostra o efeito de usar altaconcentração de tiamina na fase de produção em rendimentovolumétrico de G-CSF no Lotes coletados. Durante a fase deprodução o Lote 1 apresentou 7 g/L de tiamina no meio deprodução, enquanto que o Lote 6 foi realizado sem usar qualquertiamina no meio de produção. Ambos os lotes foram realizadosseparadamente em um fermentador 30-L.

Descrição da Invenção

A presente invenção se refere a um processo defermentação aperfeiçoado para a produção de Fator de estimulaçãode colônia de granulócito (G-CSF) em níveis aperfeiçoados derendimento volumétrico. A mesma descreve também condições decultura para a aprimorada estabilidade de plasmídeo queadicionalmente leva a um alto rendimento volumétrico de G-CSF.O processo da presente invenção envolve um processo dealimentação não cíclico via múltiplas induções, realizado napresença de uma alta concentração de Potássio, em combinação comoutros sais inorgânicos tais como sódio, magnésio e semelhante,em altas concentrações no meio de produção. Surpreendentemente,quando o referido processo usando os sais da presente invençãocomo é descrito daqui adiante em detalhes, foi usado emcombinação com alto coeficiente de crescimento específico, omesmo ainda manteve a alta estabilidade de plasmídeo o que levoua um aumento adicional de rendimento volumétrico.

A presente invenção é adicionalmente descrita emdetalhes abaixo:

Qualquer polipeptídeo de fator de estimulação decolônia de granulócito (também referido aqui como iG-CSF') podeser utilizado. O termo "Fator de estimulação de colônia degranulócito" ou "G-CSF" se refere ao G-CSF nativo, muteínas,fragmentos, fusões, análogos e derivados dos mesmos sejaexibindo pelo menos 60% de atividade biológica ou de ligação areceptor como o hG-CSF nativo ou retendo pelo menos cerca de 80%de identidade de amino ácido. Exemplos da referida seqüência deG-CSF inclui Sequence Genbank ID GI:27437048 e aquelas descritasna patente U.S. No. 4 810 643.

Células de Escherichia coli são transformadas comvetor de expressão adequado compreendendo a seqüência decodificação de G-CSF e um promotor adequado selecionado a partirde 17, tac, e promotores similares junto com outros componentesvetores usando técnicas de transformação bem conhecidas natécnica.

No processo descrito abaixo a fermentação serefere a um desenvolvimento aeróbico de microorganismos, deforma preferida E. coli recombinante, para a produção de G-CSF.No referido processo, a fase de lote do desenvolvimento serefere a um período no qual após a inoculação, nenhum nutriente,exceto hidróxido de amônia é adicionado (se necessário) ao caldode cultura no fermentador. 0 caldo de cultura é uma suspensão decélulas, meio, e derivados de meio e células (se houver). Aalimentação limitante de substrato na fase de crescimento serefere àquela parte da fase de crescimento na qual o grandeaumento em biomassa (pelo menos 2 doubletes) ocorre ao adicionaro meio de desenvolvimento de lote de alimentação ao caldo decultura em de tal forma que a concentração da principal fonte decarbono/energia (por exemplo, glicose) é limitante. 0coeficiente de fluxo do referido meio determina o coeficiente dedesenvolvimento especifico da cultura. Meio de pré-indução serefere ao meio, dotado de uma diferente composição meio dedesenvolvimento, o qual é adicionado ao caldo de cultura antesda adição do indutor (por exemplo, IPTG). Indução é o processode aumentar de forma considerável a concentração do G-CSF nascélulas, conforme determinado por ferramentas conhecidas natécnica anterior, pela adição do indutor (por exemplo, IPTG elactose). 0 meio de produção apresenta uma diferente composiçãodo que aquela do meio de desenvolvimento e é adicionado ao caldode cultura no fermentador durante a indução do gene G-CSF. 0meio de produção foi também adicionado de tal forma que aconcentração do substrato (por exemplo, glicose) permanecelimitante. O coeficiente de fluxo do meio de produção determinao coeficiente de desenvolvimento especifico da cultura durante afase de produção.

As células hospedeiras de E. coli, previamentetransformadas com um vetor de expressão adequado codificando G-CSF, foram inicialmente cultivadas a 37 0C em frascos agitadorespara desenvolver a semente para o fermentador. A cultura desemente foi usada for inocular o meio de desenvolvimento estérilem um fermentador. O modo de lote de alimentação limitante desubstrato da fase de crescimento da fermentação é iniciado umavez que a cultura de E. coli recombinante começa a sedesenvolver e a concentração de glicose no caldo de cultura caipara 0.5 g/L ou menos. A alimentação do meio de desenvolvimentode lote de alimentação, adicionado em modo de lote dealimentação limitante de substrato, é mantida continua(coeficiente exponencial ou constante) ou descontínua durante afase de crescimento. Após alcançar a densidade de célula de 1-60g/L de peso de célula seca e uma concentração de glicoseinferior a 0.5 g/L no caldo de cultura, a adição do pré-meio deprodução é realizada e subseqüentemente a alimentação do meio deprodução iniciou e continuou em um modo contínuo- oudescontínuo- limitante de substrato. Múltiplas induções do GeneG-CSF são realizadas com IPTG. 0 coeficiente de crescimentoespecífico médio não é reduzido durante ou após as adições de umindutor. O pH é mantido em cerca de 5-7. A temperatura é mantidaem cerca de 30°C - 42 °C. Após 2 h a 48 h de adição do pré-meiode produção, o meio de cultura é removido e submetido aprocessamento a jusante de acordo com a técnica descrita naarte.O meio da fase de crescimento compreende carbono efontes de energia selecionadas a partir do grupo compreendendoglicose, glicerol, etc. e semelhante ou misturas dos mesmos,componentes de meio complexo selecionados a partir do grupocompreendendo extrato de levedura, triptona, peptona,hidrolisado de enzima caseina, hidrolisado de enzima caseina esemelhante, ou misturas dos mesmos, sais adequados/nutrientesselecionado a partir do grupo compreendendo ácido citrico,cloreto de potássio, cloreto de sódio, sulfato de magnésio,fosfato de hidrogênio di-amônia, fosfato dihidrogênio depotássio, butirato de sódio, tiamina, glicina, e cloreto dezinco.

Outras condições de fermentação tais como aeração,agitação, inóculo, tempo de inoculação etc., são todosescolhidos como por conveniência como é conhecido na técnicaanterior.

O pré-meio de produção compreende, componentes demeio complexo selecionados a partir de extrato de levedura,triptona, peptona, hidrolisado de enzima caseina, hidrolisado deenzima caseina, junto com nutrientes tais como tiamina, glicinae semelhante ou misturas dos mesmos; antibióticos tais comocanamicina, e ampicilina e semelhante. Sais adequados sãoselecionados a partir do grupo compreendendo ácido citrico,cloreto de potássio, cloreto de sódio, sulfato de magnésio,fosfato de hidrogênio di-amônia, fosfato dihidrogênio depotássio, butirato de sódio, e cloreto de zinco de modo que omeio contém alto nivel de concentração de ions de K emcombinação seja com ions de Na ou de Mg.

O meio de produção contém uma fonte de carbono emadição aos constituintes do pré-meio de produção. A fonte decarbono pode ser selecionada a partir do grupo que consiste emglicerol, glicose, frutose e semelhante ou misturas dos mesmos.A fonte de carbono preferida da presente invenção é a glicose.Durante a fase de produção, o caldo de cultura é mantido comalto nivel de ions de K em combinação seja com ions de Na ou deMg. A concentração de ions de K é mantida em cerca de 60 inM acerca de 300 mM, ions de Na em cerca de 60 mM a cerca de 300 mM,e ions de Mg em cerca de 150 mM a cerca de 250 mM no caldo decultura. Em uma modalidade preferida, a concentração de ions deK é de 90 mM a 150 mM, a concentração de ions de Na é de 60 mM a120 mM, e a concentração de ions de Mg no caldo de cultura estána faixa de 180 mM a 220 mM.

Em uma modalidade adicional, a adição de tiaminaem alta concentração (na faixa de 5 g/L a 10 g/L) proporciona umrendimento de G-CSF na faixa de 5 g/L - 6 g/L.

O processo da presente invenção resulta naprodução de G-CSF com alto rendimento (5 g/L - 9.5 g/L) commanutenção da alta estabilidade de plasmídeo através dodesenvolvimento e a fase de produção (75% - 90%).

Exemplo 1

Efeito de altas concentrações de ions de Na e de Kna Estabilidade de plasmídeo e rendimento volumétrico

O experimento foi realizado em um fermentador 30-L. A cultura semeada de células de E. coli BL21 (DE3)transformadas com o gene G-CSF humano foi inoculada no meio dedesenvolvimento da composição a seguir.

Componente Concentração antes dainoculaçãoKH2PO4 13.3 g/L

(NH4)2HPO4 4·° 9/L

Extrato de levedura 1.0 g/L

Glicose 10.0 g/L

Ácido citrico 1-7 g/L

MgSO4. 7H20 l·2 g/L

Solução de elementos de traços 20.0 mL/L

Canamicina 50 mg/L

Solução de traços de metal:

Componente Concentração

FeCl3.6H20 0.162 g/L

ZnCl2.4H20 0.0144 g/L

CoCl2.6H20 0.12 g/L

Na2MoO4.2H20 0.012 g/L

CaCl2.2H20 0.006 g/L

CuCi2 1·9 g/L

H3BO3 0.5 g/L

Adição do "lote de alimentação de meio dedesenvolvimento" em modo de alimentação de lote limitante desubstrato produziu o maior aumento em biomassa:

<table>table see original document page 13</column></row><table>

Em fase de crescimento, hidróxido de amônia foiusado como o regulador de pH para manter o pH na faixa de 6.8 a7.0. A temperatura foi mantida a 37°C. Após alcançar adensidade ótica de cerca de 50 AU (a 600 nm) no Lote 2 o meio depré-indução, que consiste na composição a seguir, foi adicionadono caldo de cultura:

Componente Concentração

Extrato de levedura 84.38 g/L

Cloreto de potássio 75.41 g/L

Cloreto de sódio 123.13 g/L

Hidrocloreto de tiamina 8.44 g/L

A concentração final de cátions de potássio esódio no caldo de cultura foi cerca de 120 mM e 250 mM,respectivamente.

A alimentação do meio de produção a seguir foisubseqüentemente iniciada:

Componente Concentração

Glicose 270 g/L

MgSO4. 7H20 1 g/L

Extrato de levedura 214 g/L

Hidrocloretd de tiamina 7 g/L

Cloreto de potássio 8.94 g/L (apenas no Lote 2)

Cloreto de sódio 17.5 g/L (apenas no Lote 2)

A expressão do Gene G-CSF foi induzida por múltiplasadições da solução esterilizada a filtro de IPTG ao caldo decultura. Na fase de produção hidróxido de amônia foi usado comoo regulador de pH para manter o pH 6.8. A temperatura foimantida a 37 °C. Canamicina foi adicionada à cultura paracolocar pressão de seleção. A quantidade de Canamicina usadadurante a fase de produção do Lote 2 (37.5 mg, adicionado umavez), foi cerca de 1% da quantidade usada no Lote 1 (2925 mg,múltiplas adições) de modo a grandemente desafiar o efeito de

sais na estabilidade de plasmideo.

A estabilidade de plasmideo conforme determinado

por primeiro assepticamente coletar uma amostra do final do loteem um tubo estéril e assepticamente espalhar um volumeapropriado da amostra diluída adequada no meio de Luria-Bertanicom e sem Canamicina (50 mg/L) . As placas foram incubadas a 370C por 48 horas e as placas, dotadas de colônias estaticamentesignificativas foram contadas. Um valor obtido ao dividir onúmero de colônias obtidas em placas contendo canamicina comaquele das placas não contendo canamicina foi usado paracalcular a estabilidade de plasmideo. A estabilidade doplasmideo no Lote 2 (96.8%) foi mais do dobro, em comparação coma estabilidade de plasmideo no Lote 1 (45.0%), deste modomostrando a importância dos cátions de sódio e potássio emaprimorar a estabilidade de plasmideo (Figura 1).

O rendimento volumétrico de G-CSF, conformedeterminado por quantificação densitométrica da faixa de GCSFcom relação ao gráfico padrão do padrão autêntico, após SDS-PAGE, foi 5.38 g/L no Lote 1 e 5.81 g/L no Lote 2. O rendimentovolumétrico no Lote 2 foi cerca de 8% maior do que aquela doLote 1 (Figura 2) .

Exemplo 2

Efeito de altas concentrações de Cátions demagnésio e potássio na Estabilidade de plasmideo e rendimentovolumétrico

O experimento foi realizado em um fermentador 30-L. Uma vez que as fases de meio de ambos os lotes (Lote 3 e Lote4) foram idênticas incluindo a concentração de cátion depotássio, exceto apenas a concentração de cátion de magnésio, osresultados refletiram o efeito da combinação de Cátions depotássio e magnésio. A cultura semeada de células transformadasde E. coli BL21 (DE3) com o gene G-CSF humano foi inoculada nomeio de desenvolvimento da composição a seguir.

Componente Concentração antes dainoculação

KH2Po4 13·3 g/L

(NH4)2HPO4 4.0 g/L

Extrato de levedura 1.0 g/L

Glicose 10.0 g/L

Ácido citrico 1.7 g/L

MgSO4. 7H20 1-2 g/L

Solução de elementos de traços 20.0 mL/L

Canamicina 50 mg/L

Solução de traços de metal:

Componente Concentração

FeCl3. 6H20 0.162 g/L

ZnCl2.4H20 0.0144 g/L

CoCl2.6H20 0.12 g/L

Na2MoO4. 2H20 0.012 g/L

CaCl2.2H20 0.006 g/L

CuCl2 1.9 g/L

H3BO3 0·5 g/L

A adição do seguinte "meio de desenvolvimento delote de alimentação" em modo de alimentação de lote limitante desubstrato produziu o maior aumento em biomassa:

Componente Concentração<table>table see original document page 17</column></row><table>

Na fase de crescimento hidróxido de amônia foiusado como o regulador de pH para manter o pH na faixa de 6.8 a7.0. A temperatura foi mantida a 37 °C. Após alcançar adensidade ótica de cerca de 50 AU (a 600 nm) o meio de pré-indução, que consiste na composição a seguir, foi adicionado nocaldo de cultura:

<table>table see original document page 17</column></row><table>

Sulfato de magnésio 187.06 g/L (apenas no Lote 4)

A alimentação do meio de produção a seguir foisubseqüentemente iniciada:

<table>table see original document page 17</column></row><table>

A expressão do Gene G-CSF foi induzida pormúltiplas adições da solução esterilizada a filtro de IPTG aocaldo de cultura. Na fase de produção, hidróxido de amônia foiusada como o regulador de pH para manter o pH 6.8. A temperaturafoi mantida a 37 °C. Canamicina foi adicionado à cultura paracolocar pressão de seleção. A quantidade igual de Canamicina(37.5 mg, adicionada uma vez) foi usada durante a fase deprodução. A concentração de cátions de potássio e magnésios nocaldo de cultura durante a fase de produção foi cerca de 120 mMe 200 mM, respectivamente.

A estabilidade de plasmídeo foi determinada comodescrito anteriormente. A estabilidade de plasmideo no Lote 4(97.3%) foi cerca de 6% maior do que a estabilidade de plasmideono Lote 3 (91.8%), deste modo mostrando a eficácia dos cátionsde magnésio e potássio em aprimorar a estabilidade de plasmideo(Figura 3). A estabilidade de plasmideo obtida na presença decátions de magnésio e potássio foi 116.2% superior àquela noLote 1 (sem alta concentração de sais na fase de produção).

O rendimento volumétrico de G-CSF, conformedeterminado por quantificação densitométrica da faixa de GCSFcom relação ao gráfico padrão do padrão autêntico, após SDS-PAGE, foi 5.48 g/L no Lote 3 e 8.35 g/L no Lote 4 (Figura 4). Orendimento volumétrico ' no Lote 4 foi cerca de 55% superioràquele no Lote 1.

Exemplo 3

Efeito de alto coeficiente de crescimentoespecifico durante a fase de produção no rendimento volumétrico

O experimento foi realizado em um fermentador 30-L. A composição de meio de fase de produção de ambos os lotes(Lote 4 e Lote 5) foram idênticas incluindo as concentrações decátions de potássio e magnésio. O coeficiente de crescimentoespecifico médio durante a fase de produção do Lote 5 foisuperior àquela na fase de produção do Lote 4. A cultura semeadade Células transformadas de E. coli BL21 (DE3) com o gene G-CSFhumano foi inoculada no meio de desenvolvimento da composição aseguir.

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A adição do seguinte "meio de desenvolvimento delote de alimentação" em modo de alimentação de lote limitante desubstrato produziu o maior aumento em biomassa:

<table>table see original document page 19</column></row><table><table>table see original document page 20</column></row><table>

Na fase de crescimento, hidróxido de amônia foiusado como o regulador de pH para manter o pH na faixa de 6.8 a7.0. A temperatura foi mantida a 37 °C. Após alcançar adensidade ótica de cerca de 50 AU (a 600 nm) o meio de pré-indução, que consiste na composição a seguir, foi adicionado nocaldo de cultura:

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A alimentação do seguinte meio de produção foisubseqüentemente iniciada:

<table>table see original document page 20</column></row><table>

A expressão do Gene G-CSF foi induzida pormúltiplas adições da solução esterilizada a filtro de IPTG aocaldo de cultura. Na fase de produção hidróxido de amônia foiusada como o regulador de pH para manter o pH 6.8. A temperaturafoi mantida a 37 °C. Canamicina foi adicionado à cultura paracolocar pressão de seleção. Igual quantidade de Canamicina (37.5mg, adicionado uma vez) foi usada durante a fase de produção. 0coeficiente de crescimento especifico médio durante a fase deprodução no Lote 4 foi de cerca de 0.04 l/h, enquanto que aqueleno Lote 5 foi de cerca de 0.07 l/h.

O rendimento volumétrico de G-CSF determinado,

como descrito anteriormente, ser 8.35 g/L no Lote 4 e 9.94 g/Lno Lote 5. O rendimento volumétrico no Lote 5 foi cerca de 19%superior àquela no Lote 4 (Figura 5). A estabilidade deplasmídeo nas amostras de fim de lote de ambos os lotes foielevada (> 75%) .

Exemplo 4

Efeito de usar alta concentração de tiamina nafase de produção no rendimento volumétrico

O experimento foi realizado em um fermentador 30-L. A cultura semeada de Células transformadas de E. coli BL21(DE3) com o gene G-CSF humano foi inoculada no meio dedesenvolvimento da composição a seguir.

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A adição do seguinte "meio de desenvolvimento delote de alimentação" em modo de alimentação de lote limitante desubstrato produziu o maior aumento em biomassa:

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cultura em cada adição apenas no Lote 6. Total seis adiçõesforam feitas durante a fase de "desenvolvimento do lote dealimentação" do lote.

Na fase de crescimento, hidróxido de amônia foiusado como o regulador de pH para manter o pH cerca de 6.8. Atemperatura foi mantida a 37 °C. Após alcançar a densidade óticade cerca de 50 AU (a 600 nm) a alimentação do meio de produção aseguir foi iniciada:

<table>table see original document page 22</column></row><table>MgSO4. 7Η20 1 g/L

Extrato de levedura 214 g/L

Hidrocloreto de tiamina 7 g/L (Apenas no Lote 1)

Canamicina 925g (adicionadomúltiplas vezes no Lote 1)

Ampicilina 2.689 g (adicionadomúltiplas vezes no Lote 6)

A expressão do Gene G-CSF foi induzida pormúltiplas adições da solução esterilizada a filtro de IPTG aocaldo de cultura. Na fase de produção, hidróxido de amônia foiusado como o regulador de pH para manter o pH 6.8. A temperaturafoi mantida a 37 °C.

O rendimento volumétrico de G-CSF foi determinado,como descrito anteriormente. 0 rendimento volumétrico em amostrade fim de lote do Lote 1 (lote com alto teor de tiamina) foicerca de 10.7% maior do que aquele do no Lote 6 (4.86 g/L),deste modo mostrando a eficácia da alta concentração de tiaminaem aprimorar o Rendimento volumétrico de G-CSF (Figura 6).

Vantagens do processo:

(1) rendimento volumétrico mais elevado permite ummaior rendimento em uma menor escala, deste modo limitando osgastos de capital em maior escala.

(2) O maior rendimento volumétrico é alcançadousando componentes de meio (Magnésio, Potássio, e sais demagnésio) de custo bastante baixo.

(3) Uma cultura dotada de alta estabilidade deplasmideo é mais capaz de produzir o rendimento volumétrico deG-CSF em condições de tensão metabólica, tais como a expressãodo Gene G-CSF em condição de alto coeficiente de crescimentoespecifico.

Claims (14)

1. Processo aperfeiçoado para a obtenção deelevados rendimentos volumétricos do fator de estimulação decolônia de granulócito (G-CSF) em fermentação em um caldo decultura, caracterizado pelo fato de que o caldo de culturacompreende ions de K em uma concentração na faixa de 60 mM a 180mM em combinação com alta concentração de cátions inorgânicosselecionados a partir de Na ou Mg.

2. Processo de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que a concentração de ions de Na estána faixa de 90 mM a 300 mM, e ions de Mg está na faixa de 150 mMa 250 mM.

3. Processo de acordo com a reivindicação 1 ou 2,caracterizado pelo fato de que o caldo de cultura compreendecomponentes de meio complexos selecionados a partir do grupo queconsiste em extrato de levedura, triptona, peptona, hidrolisadode enzima caseina, e hidrolisado de caseina de soja.

4. Processo de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o processoé um processo de lote de alimentação limitante de substrato.

5. Processo de acordo com qualquer uma dasreivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de quemúltiplas induções do gene são realizadas durante a fase deprodução.

6. Processo de acordo com qualquer uma dasreivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que ocaldo de cultura adicionalmente compreende fonte(s) decarbono (s) selecionadas a partir de glicose, glicerol e frutose.

7. Processo de acordo com qualquer uma dasreivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que ocoeficiente de crescimento especifico médio é mantido para ser omesmo entre as fases de produção e de pré-produção.

8. Processo de acordo com qualquer uma dasreivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que aconcentração dos ions de K é de 90 mM a 150 mM, dos ions de Na éde 60 mM a 120 mM, e dos ions de Mg é de 180 mM a 220 mM.

9. Processo de acordo com qualquer uma dasreivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que aestabilidade de plasmídeo é de pelo menos 75%.

10. Processo para aprimorar a estabilidade deobtenção do fator de estimulação de colônia de granulócito (G-CSF) em fermentação em um caldo de cultura, caracterizado pelofato de compreender a adição de ions de K na faixa de 60 mM a-180 mM no caldo de cultura.

11. Processo de acordo com qualquer uma dasreivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que aconcentração de antibiótico na fase de produção é inferior doque aquela usada na fase de crescimento.

12. Processo para a produção de fator deestimulação de colônia de granulócito (G-CSF) em fermentação emum caldo de cultura, caracterizado pelo fato de que compreendeas etapas de:(i) inocular o fermentador com uma cultura de E.coli adequada anteriormente transformada com um vetor deexpressão adequado codificando G-CSF;(ii) separar em lotes e alimentar em lotes na fasede crescimento para aumentar a biomassa;(iii) adição de um meio de pré-indução adequado;(iv) adição de um meio de produção adequado nomodo de lote de alimentação limitante de substrato no qualmúltiplas induções do gene são realizadas;(v) onde a concentração final de ions de K, Na, eMg no caldo de cultura é de acordo com o reivindicado em uma oumais das reivindicações precedentes.

13. Processo de acordo com qualquer uma dasreivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que orendimento volumétrico de G-CSF está na faixa de 5 g/L a 9.5 g/L.

14. Processo aperfeiçoado para obtenção deelevados rendimentos volumétricos de G-CSF em fermentação,caracterizado pelo fato de que caldo de cultura compreendetiamina na faixa de 5 g/L a 10 g/L.